(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
孔径が５００ nm〜５００μmの１個又は複数の貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルのそれぞれに脂質二重膜形成性脂質溶液を添加する工程と、各ウェルに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させる工程と、この状態で放置して前記貫通孔の部分に脂質二重膜を形成させる工程とを含む、脂質二重膜の形成方法。
【請求項２】
前記貫通孔の孔径が５０μm〜２００μmである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記隔壁が、前記貫通孔を形成した自己支持性のポリマーフィルムである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
２つのウェルの少なくともいずれかに添加される水又は水溶液が、脂質二重膜中に保持すべきタンパク質を含む水溶液である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質の水溶液が、水系緩衝液中に該タンパク質を含む水溶液である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、イオンチャンネルを形成するタンパク質である請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
各ウェルの底面に、ウェル外と接続される電極が配設されている請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記隔壁を介して接する２つのウェルから構成されるダブルウェルチャンバーが１枚の基板中に複数個形成された基板を用い、前記複数のダブルウェルチャンバーに同時並行して脂質二重膜を形成する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
孔径が５００ nm〜５００μmの１個又は複数の貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルを具備し、各ウェルの底面に、ウェル外と接続される電極が配設されている脂質二重膜形成器具。
【請求項１０】
前記貫通孔の孔径が５０μm〜２００μmである請求項９記載の器具。
【請求項１１】
前記隔壁が、前記貫通孔を形成した自己支持性のポリマーフィルムである請求項９又は１０記載の器具。
【請求項１２】
前記隔壁を介して接する２つのウェルから構成されるダブルウェルチャンバーが１枚の基板中に複数個形成された基板を具備する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物を構成する細胞や、細胞内に存在するミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体等の各種オルガネラ、細胞核等は、外側が生体膜で覆われており、この生体膜は、基本的に脂質二重膜から構成されている。生理活性を有する様々なタンパク質、すなわち、レセプターや酵素等がこの脂質二重膜を貫通する形で脂質二重膜上に保持されている。これらの膜貫通タンパク質は、生体内で重要な役割を果たしている。特に、細胞膜上に存在する各種レセプターは、生体内に存在するリガンドと結合することにより、様々な生理学的反応を引き起こす引き金になることがわかっている。このため、レセプターの機能を亢進する各種リガンドや、レセプターの機能を阻害する阻害剤等が医薬品として用いられており、また、新たな医薬品として利用可能な天然又は人工のリガンドや阻害剤が研究されている。
【０００３】
これらの膜貫通タンパク質や、そのリガンド、阻害剤等を開発するためには、生体内と同じ状態、すなわち、膜貫通タンパク質が生体膜に保持された状態で各種測定を行うことが望まれる。脂質二重膜の形成方法として、浅い円筒状の凹部（ウェル）を２個隣接して配置し、かつ、２個のウェルが互いに接する境界部分を空隙（一辺数mm程度）としたダブルウェルチャンバーを用いる方法が知られている（非特許文献１〜３）。この方法は、このダブルウェルチャンバーの各ウェルに脂質溶液を充填し、次いで、各ウェルに水系緩衝液を添加して脂質溶液中に緩衝液の液滴を形成させると、ウェルの境界部分で脂質溶液と緩衝液との界面が形成され、この部分に脂質二重膜が形成されることを利用するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】K. Funakoshi et al., Anal. Chem. 2006, 78, 8169-8174
【非特許文献２】J. Poulos et al., J. Schmidt Biosens. Bioelectron. 2009, 24, 1806-1810
【非特許文献３】G. Maglia et al., Nat. Nanotech. 2009, 4, 437-440
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した方法は、簡便に脂質二重膜を形成できる方法であるが、創薬スクリーニング等においては、自動化装置を用いて多数の脂質二重膜を同時に形成し、形成された多数の脂質二重膜を用いて同時並行的にスクリーニングを行うことができれば、スクリーニングの効率を高めることができ、有利である。このような自動化を達成するためには、脂質二重膜が自動化装置（ロボット）を用いた場合でも再現性良く形成され、かつ、一旦形成された脂質二重膜は、自動化装置内での輸送や測定処理中に破壊されることなく安定に存在することが望まれる。
【０００６】
従って、本発明の目的は、脂質二重膜を再現性よく形成することができ、形成された脂質二重膜が安定に維持される、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定のサイズの貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルのそれぞれに脂質二重膜形成性脂質溶液を添加し、各ウェルに水系緩衝液を添加して脂質溶液中に緩衝液の液滴を形成させ、この状態で放置すると、貫通孔の部分に脂質二重膜が再現性よく形成され、かつ、一旦形成された脂質二重膜が安定に維持されることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、孔径が５００ nm〜５００μmの１個又は複数の貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルのそれぞれに脂質二重膜形成性脂質溶液を添加する工程と、各ウェルに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させる工程と、この状態で放置して前記貫通孔の部分に脂質二重膜を形成させる工程とを含む、脂質二重膜の形成方法を提供する。また、本発明は、孔径が５００ nm〜５００μmの１個又は複数の貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルを具備し、各ウェルの底面に、ウェル外と接続される電極が配設されている脂質二重膜形成器具を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、脂質二重膜を簡便に再現性よく形成することができ、形成された脂質二重膜が安定に維持される、新規な脂質二重膜の形成方法及びそのための器具が提供された。本発明の方法によれば、脂質二重膜を簡便に再現性よく形成することができるので、ロボットを用いて多数の脂質二重膜を同時並行的に形成することが可能になる。また、形成された脂質二重膜は安定に維持されるので、脂質二重膜を用いた各種試験を自動化装置により再現性よく行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法に用いられるダブルウェルチャンバーを具備する基板の一具体例を模式的に示す図である。
【図２】本発明の方法における水又は水溶液添加工程を説明するための模式図である。
【図３】本発明の実施例で作製した隔壁の作製方法を説明するための模式断面図である。
【図４】本発明の実施例で作製した基板の作製方法を説明するための模式図である。
【図５】本発明の実施例で行った電気化学的測定のための配線を示す模式図である。
【図６】本発明の実施例で行った電気化学的測定（各ウェル間の電流測定）の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００１１】
１０  基板
１２  隔壁（パリレン樹脂フィルム）
１４  ウェル
１６  ウェル
１８  貫通孔
２０  脂質溶液
２２  マイクロピペット
２４  水又は水溶液の液滴
２６  シリコンウェハ
２８  パリレン樹脂フィルム
３０  アルミニウム膜
３２  フォトレジスト膜
３４  ポリメチルメタクリレート樹脂フィルム
３６  AgCl電極
３８  銀電極
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法では、孔径が５００ nm〜５００μmの１個又は複数の貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルを用いる。貫通孔の孔径は、好ましくは１０μm〜２００μmである。孔径が上記範囲よりも小さい場合も大きな場合も、脂質二重膜形成の再現性が低くなり、また、上記範囲よりも大きな場合には形成された脂質二重膜の安定性が低下する。また、貫通孔の形状は、脂質二重膜を再現性良く形成し、かつ、安定に維持する観点及び貫通孔の形成の容易さの観点から円形が最も好ましいが、脂質二重膜が形成可能であれば、他の形状、例えば楕円形や正多角形等の多角形を採用することも可能である。楕円形の場合、孔径は長径を意味し、多角形の場合にはそれに外接する円の直径を孔径とする。
【００１３】
上記隔壁で隔てられた２つのウェルから構成されるチャンバーを「ダブルウェルチャンバー」(DWC)と呼ぶことがある。本発明で用いることができるDWCの好ましい１例を図１に模式的に示す。図１の(a)は平面図であり、(b)は(a)中のb-b'線切断部端面図である。なお、図１は、発明の理解のためにDWCを模式的に示すものであり、各構成要素の寸法比率は実物とは大きく異なる。
【００１４】
図１に模式的に示す具体例では、基板１０中に、２つのウェル１４及び１６が形成され、それらの境界が隔壁１２により隔てられている。隔壁１２には、貫通孔１８（図１の(b)参照）が設けられている。図１に示す例では、ウェルの平面形状が基本的に円形であり、２つの円が接する境界部分のみが直線状になっているが、ウェルの形状は限定されるものではなく、上記範囲の孔径の貫通孔を有する隔壁によって隔てられていれば、他の形状でも問題はない。ウェルのサイズは、特に限定されないが、後述のように水又は水溶液の液滴を脂質溶液中に形成した際に脂質溶液が液滴によって圧迫されやすくなるように孔径が2mm〜8mm程度、さらに好ましくは3mm〜5mm程度、深さは孔径の50%〜200%、さらに好ましくは50%〜100%程度が好ましいが、この範囲よりも大きくても小さくても本発明の方法を実施することが可能である。隔壁に設けられた貫通孔の数は１個でも複数個でもよく、通常、１個〜１０個程度、好ましくは１個〜６個程度である。貫通孔が複数存在する場合には、必ずしも全ての貫通孔において脂質二重膜が形成されるわけではなく、脂質溶液が液滴によって強く圧迫される貫通孔においてのみ脂質二重膜が形成される。
【００１５】
なお、上記DWCは、ウェル１４を透孔として設けた基板部材と、ウェル１６を透孔として設けた基板部材と、貫通孔を形成した自己支持性のポリマーフィルム等から構成される隔壁１２と、各ウェルの底部を構成する底板とを接着剤で接着することにより容易に作製可能である。これについては下記実施例において具体的に説明する。
【００１６】
本発明の方法では、上記した２つのウェル１４及び１６のそれぞれに、脂質二重膜形成性脂質溶液を添加して各ウェルに該脂質溶液を充填する。ここで、脂質二重膜形成性脂質としては、リポソームの作製に用いられている周知のリン脂質でよく、生体膜における反応を模するためには、生体膜と同じか類似したものが好ましく、この分野において従来から広く用いられているリン脂質、例えば、ジフィタノイルフォスファチジルコリン(diphytanoyl phosphatidylcholine, DPhPC)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(dipalmytoyl phosphatidylcholine)、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン(1-Palmitoyl 2-Oleoyl phosphatidylcholine, POPC)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(Dioleoyl phosphatidylcholine, DOPC)等を好ましい例として挙げることができる。これらの多くは市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。また２つのウェルに異なる種類の脂質を導入することにより、簡便に非対称膜を形成可能なことも本発明の特徴である。
【００１７】
脂質二重膜の形成に用いられる溶液中のリン脂質の濃度は、脂質二重膜が形成可能な濃度であれば特に限定されないが、通常、5g/L〜30g/L程度、好ましくは10g/L〜20g/L程度である。また、リン脂質溶液の溶媒は、特に限定されないが、有機溶媒が好ましく、n-デカンのような脂肪族炭化水素溶媒が好ましい。
【００１８】
次に、各ウェルに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させる。この様子を図２に模式的に示す。図２は、各ウェルに充填された脂質溶液２０内にマイクロピペット２２を挿入して水又は水溶液の液滴２４を形成する様子を示す。図２は、一方のウェル中に液滴２４が形成され、もう一方のウェルに液滴２４を形成しつつある状態を模式的に示すものである。この工程で液滴を形成する液は、純水であってもよいし、水系緩衝液（主たる溶媒が水である緩衝液）のような水溶液であってもよい。各ウェルに添加する水又は水溶液の量は、特に限定されないが、脂質二重膜を効率良く形成する観点から、各ウェルに充填されている脂質溶液の体積の１倍〜５倍程度が好ましく、さらに好ましくは1.5倍〜３倍程度である。
【００１９】
本発明の脂質二重膜は、該脂質二重膜に保持された状態におけるタンパク質の性質や機能を調べたり、該タンパク質に結合して、その生理活性を変化させるリガンドをスクリーニングしたりその性質を調べたりする各種測定に好適に用いられるものであるので、脂質二重膜は、タンパク質を含んでいることが好ましく、特に生体内で生体膜に保持された状態で機能している膜貫通タンパク質が好ましい。脂質二重膜に保持するタンパク質としては、各種レセプターや酵素を挙げることができ、例としては、α−ヘモリシン、グラミシジン、アラメチシンなどのペプチドタンパク質類、各種イオンチャンネル、ABCトランスポータタンパク質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。タンパク質が水溶性の場合、上記水溶液としてタンパク質の水溶液を用いることが好ましく、水系緩衝液中にタンパク質を含む水溶液を用いることがさらに好ましい。これらの溶液中のタンパク質の濃度は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができるが、通常、1nM〜1mM程度、好ましくは0.1μM〜10μM程度である。なお、タンパク質は、２つのウェルのいずれか一方に添加される水溶液中に含まれていればよいが、両方のウェルに添加される水溶液中に含まれていてもよい。また、脂質二重膜に保持するタンパク質が脂溶性の場合には、膜タンパク質を発現させたプロテオリポソームを本デバイス中の脂質膜に融合させることで使用可能である。
【００２０】
脂質溶液内で上記液滴を形成すると、脂質溶液が圧迫されて隔壁に押しつけられ、この部分で脂質溶液の層と水層とがある程度の圧力で接することとなる。この際に隔壁の貫通孔内に脂質二重膜が形成される。脂質二重膜は、水又は水溶液の液滴を形成した状態で、通常３分間〜１時間程度放置することにより、隔壁の貫通孔を塞ぐ形で形成される。
【００２１】
タンパク質がα−ヘモリシンやアラメチシン等のイオンチャネルを形成するタンパク質である場合、脂質二重膜にタンパク質が正しく保持されると、保持されたタンパク質の部分がイオンチャネルを形成して、２つのウェルが電気的に導通される。従って、２つのウェル間に所定の電圧をかけ、脂質二重膜を介して流れる電流を測定することにより、タンパク質が脂質二重膜中に正しく保持された脂質二重膜が形成されたことを確認することができる。また、タンパク質に種々の物質を作用させることにより、タンパク質の構造を変化させてイオンチャネルを閉じたり広げたりする物質をスクリーニングすることもでき、このような物質は何らかの生理活性を発揮する可能性があり、医薬品の候補となり得る。従って、２つのウェル間の電流を測定することが望まれる場合が少なくない。下記実施例で具体的に説明するように、本発明の方法に用いられるDWCは、各ウェルの底部を構成する底板の上面に電極を配置し、この電極をウェル外に接続することにより容易に各ウェルを配線することができる。公知の方法では、各ウェルの上部から電極を浸漬して電気的測定を行っていたが、本発明の好ましい態様では、電極はウェル底部に配置されるので、自動装置を用いた測定が容易になり、さらに機械的刺激が軽減されるという利点がもたらされる。
【００２２】
DWCは、１枚の基板に１個だけ形成してもよいが、複数形成することもできる。DWCが１枚の基板中に複数個形成された基板を用い、複数のDWC内で同時並行して脂質二重膜を形成してもよい。この場合には、創薬スクリーニング等の測定も各DWCで同時並行して行うことが可能となり、創薬スクリーニング等の効率を大幅に高めることができる。
【００２３】
本発明はまた、上記DWCを具備する脂質二重膜形成器具をも提供するものである。この脂質二重膜形成器具の好ましい態様は上記した通りである。
【００２４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
１．  隔壁の作製
上記の通り、隔壁としては、自己支持性のポリマーフィルムに上記貫通孔を設けたものを好ましく用いることができる。隔壁が自己支持性のポリマーフィルムであれば、DWCを具備する基板を容易に組み立てることができるので有利である。
【００２６】
この実施例では、パリレン（ポリ-p-キシリレン）樹脂にフォトリソグラフィーにより貫通孔を形成したものを作製し、隔壁とした。以下、図３に基づき説明する。なお、パリレン樹脂フィルムをフォトリソグラフィーによりパターニングする手法は周知であり、各工程は常法により容易に行うことができる。
【００２７】
図３の(1)に示すように、シリコンウェハ２６上にパリレン樹脂膜２８（厚さ10μm）を化学蒸着によりコーティングした。次に、アルミニウム膜３０及びフォトレジスト膜３２を順次コーティングした。次に貫通孔を形成する部分に選択的に紫外線を露光し、現像してフォトレジスト膜３２に透孔を形成し、このフォトレジスト膜３２をマスクとして下層のアルミニウム膜３０を混酸アルミ液を用いたウェットエッチング法により食刻してアルミニウム膜３０に透孔を形成した。次に酸素プラズマエッチングによりパリレン樹脂膜２８に貫通孔（図１中の１８に対応）を形成した (図１(2))。アルミニウム膜３０を混酸アルミ液で除去した（図１(3))。貫通孔が形成されたパリレン樹脂フィルム２８をシリコンウェハ２６から剥離して隔壁を得た。なお、貫通孔の孔径が１０μm、３０μm、５０μm、１００μm、１５０μm、２５０μm、５００μmである７種類のパリレン樹脂フィルムを作製した。また、各フィルム中、貫通孔は５個形成した。５個の透孔は、正方形の４個の頂点のそれぞれと、正方形の中心にそれぞれ位置するように配置した。
【００２８】
なお、この実施例の方法では、パリレン樹脂を用いたが、フォトリソグラフィーによるパターニングが可能で自己支持性フィルムを与えることができる他のポリマー（例えばポリイミド等）も用いることができる。また、本発明で規定される貫通孔の孔径であれば、フォトリソグラフィー以外の手法、例えば、マイクロドリルを用いた機械的な手法により形成することも可能である。この場合には、フォトリソグラフィーができない自己支持性の種々のポリマーフィルムも利用可能である。
【００２９】
２．DWCを具備する基板の作製
基本的に図１に模式的に示す形状及び構造のDWCを作製した。具体的な構成を図４に模式的に示す。図４の左側の上の図は、平面図であり、その下が側面図である。側面図は、分解組み立て図になっている。右側の図は、隔壁部分の拡大図である。
【００３０】
以下、作製方法を説明する。厚さ3mmのアクリル板10aにドリルで透孔14'を開けた。透孔14'は、最終的にウェル１４（図１参照）を構成するものであるので、その平面形状は、図１に示すウェル１４と同様である。同様に、厚さ3mmのアクリル板10bにドリルで透孔16'を開けた。透孔16'は、最終的にウェル１６（図１参照）を構成するものであるので、その平面形状は、図１に示すウェル１６と同様である。透孔14'及び16'の円形部の直径は4mmであった。アクリル板10aと10bの間に上記１で作製したパリレン樹脂フィルム（隔壁）１２を挟み込んだ。この際、パリレン樹脂フィルム１２を補強するために、パリレン樹脂フィルム１２の両側にそれぞれポリメチルメタクリレート樹脂フィルム３４を添えて挟み込んだ。ポリメチルメタクリレート樹脂フィルム３４は、孔径1.5mmの透孔を有しており、この透孔の中にパリレン樹脂フィルム１２中の５個の貫通孔が位置するように配置した。この状態で、アクリル板10a、ポリメチルメタクリレート樹脂フィルム３４、パリレン樹脂フィルム１２、もう一方のポリメチルメタクリレート樹脂フィルム３４、アクリル板10bを接着剤で接着した。得られた板の下方から、透孔14'及び16'を塞ぐ底板10cを貼り合わせ、透孔14'及び16'の底部を形成してウェル１４及び１６を具備する基板１０（図１）を形成した。この際、底板10cの端部に銀電極３８を形成し、さらにその端部にAg/AgClペーストを塗布してAg/AgCl電極３６を形成し、Ag/AgCl電極を構成した。なお、Ag/AgCl電極３６及び銀電極３８の一部は、各ウェルの底部に露出する位置に形成した。各銀電極３８はさらにDWCの外部に接続した。このようにして、各ウェルの底部に電極を配設したDWCを有する基板を作製した。
【００３１】
なお、上記では、理解を容易にするために１個のDWCに着目して説明したが、実際に作製した基板は、縦長のアクリル板10a中に、同じ形状の透孔14'を縦に８個並べたものと、同様に縦長のアクリル板10b中に、同じ形状の透孔16'を縦に８個並べたものとの間に上記の通りパリレン樹脂フィルム１２とポリメチルメタクリレート樹脂フィルム３４を挟んで貼り合わせたものを２枚作製し、それらをさらに貼り合わせて合計１６個のDWCを１枚の基板中に有するものであった。従って、１６個のDWCについて同時に電気的測定が可能である。そして、各ウェルへの脂質溶液や水溶液の添加は、８つのマイクロピペットを持つロボットにより自動的に行った。また、上記のようにパリレン樹脂フィルムは、貫通孔の孔径が異なる７種類のフィルムを作製したので、基板もこれらの７種類のパリレン樹脂フィルムを配置した７種類の基板を作製した。
【００３２】
３．脂質二重膜の形成
卵黄フォスファチジルコリン（EggPC)のデカン溶液(20 mg/mL)８μLずつを各ウェルに加えた。各DWCの一方のウェルに１８μLのリン酸緩衝液(0.1M KCl、溶媒は水)をマイクロピペットで加え液滴を形成した。他方のウェルには、上記緩衝液に0.3μMのα−ヘモリシンを含む水溶液１８μLをマイクロピペットで加え液滴を形成した。この状態で放置することにより、下記電気化学的測定データから明らかなようにパリレン樹脂フィルムの貫通孔部分に、α−ヘモリシンを保持する脂質二重膜が形成された。
【００３３】
４．電気化学的測定
α−ヘモリシンは、生体内では生体膜中に保持されてイオンチャネルを形成するタンパク質であるので、脂質二重膜中に適切に保持されればイオンチャネルを形成して、脂質二重膜の両側が電気的に導通される。従って、DWCの２つのウェル間に直流電圧をかけると、電流が測定される。図５に示すように各DWCを配線し、各ウェル間を流れる電流を経時的に測定した。上記したように作製した基板は１６個のDWCを有するので、１６個のDWCの全てについて同じ測定を行った。なお、図５には示していないが、回路中には、１００ｍＶの印加電圧がかけられている。
【００３４】
結果を図６に示す。α−ヘモリシンを適切に保持する脂質二重膜が貫通孔に形成されると、イオンチャネルが形成されるので、電流が流れる。さらに、上記の通り、貫通孔は５個存在するので、α−ヘモリシンを適切に保持する脂質二重膜が形成された貫通孔の数が増えるごとに電流は増大するので、電流の大きさはステップ状に増大する。なお、図６に示す結果は、貫通孔の孔径が１５０μmであるパリレン樹脂フィルムを有する基板を用いた場合の結果である。
【００３５】
図６に示すように、１６個のDWCのうち、１４個（4chと16ch以外）でα−ヘモリシンを適切に保持する脂質二重膜が形成された。従って、本発明により、再現性よく脂質二重膜が形成されることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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