(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の自己免疫疾患を予防および／または治療するためのワクチンであって、
ａ）自己免疫疾患をもたらす自己抗原及びそのエピトープポリペプチドから成る群から選択されるタンパク質；及び
ｂ）当該自己抗原又はそのエピトープポリペプチドをコードする挿入断片を含んで成る組換え真核細胞発現ベクター、
を含んで成り、前記自己抗原が、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素及び卵透明帯タンパク質３から成る群から選択され、当該ワクチンが調節性Ｔ細胞を刺激して抗原特異性のＴ細胞反応を抑制する、自己免疫疾患を予防および／または治療するためのワクチン。
【請求項２】
１）前記自己免疫疾患がＩ型糖尿病であり、
２）i）前記タンパク質が前記自己抗原であり、且つ前記挿入断片が前記自己抗原をコードするか；
ii）前記タンパク質が前記自己抗原のエピトープポリペプチドであり、且つ前記挿入断片が前記自己抗原のエピトープポリペプチドをコードするか；
iii）前記タンパク質が前記自己抗原であり、且つ前記挿入断片が前記自己抗原のエピトープポリペプチドをコードするか；あるいは
iv）前記タンパク質が前記自己抗原のエピトープポリペプチドであり、且つ前記挿入断片が前記自己抗原をコードし、そして
３）前記自己抗原がインスリン及びグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）から成る群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記インスリンがヒト、イヌ及びネコから成る群から選択される哺乳類由来のものである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記自己抗原がヒトインスリンである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記自己抗原のアミノ酸配列が配列番号１の配列を有する、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ベクターが哺乳動物の細胞発現ベクターである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項７】
前記哺乳動物の細胞発現ベクターが、ｐｃＤＮＡ３．０またはｐＶＡＸ１及びｐｒｏｖａｘから成る群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記タンパク質がヒトインスリンであり、前記挿入断片がインスリンをコードし、前記ベクターがｐＶＡＸである、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記タンパク質がヒトインスリン断片Ｂ９−２３であり、前記挿入断片がヒトインスリン断片Ｂ９-２３をコードし、前記ベクターがｐｃＤＮＡ３．０である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記タンパク質と前記ベクターとの質量比が５：１〜１：５である、請求項２に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記前記タンパク質と前記ベクターとの質量比が１：１〜１：２である、請求項２に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患を予防および／または治療するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、自己抗原に免疫反応が発生し、自己の組織に傷害を及ぼすことにより引き起こされる疾患である。自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、卵巣炎、心筋炎、慢性甲状腺炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、バセドウ病（グレーブス病）、シェーグレン症候群、ブドウ膜網膜炎など、一般的な病気である。中国での有病率は５％を超える。この疾患を治療する際には、免疫抑制剤が第一選択の薬剤として用いられ、臨床上、通常使用される免疫抑制剤および方法は、プログラフ（ＦＫ５０６）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、セルセプト（ＭＭＦ）、アザチオプリン（Ａｚａ）、プレドニゾン（Ｐｒｅｄ）、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）などの化学薬品としての利用、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＯＫＴ４）などの抗体としての利用の面がある。毎年の治療費用は数十億元ほどになっている。以上の免疫抑制剤は、いずれも毒性・副作用を有し、使用が適切でない場合、過度の抑制剤有機体免疫反応性により多種の合併症が引き起こされる可能性があり、それ自体の毒性・副作用により臓器の機能障害をもたらす可能性もある。そのため、現在、特効の治療手段はない。
【０００３】
Ｉ型糖尿病は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、マクロファージがランゲルハンス島に浸潤し、ランゲルハンス島の中でインスリンを生成する細胞が破壊されることを特徴とする自己免疫疾患で、糖尿病患者群の５〜１０％ほどを占める（ＡＤＡ［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ］．１９９７．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｔ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２０：１１８３−１１９７；Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＡ，Ｌｅｉｔｅｒ  ＥＨ．１９９９．Ｔｈｅ  ＮＯＤ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ａｓ  ｇｏｏｄ  ａｓ  ｉｔ  ｇｅｔｓ？Ｎａｔｕｒｅ  ５：６０１−６０４）。主な発病機序は、自己反応性Ｔ細胞が、膵臓の中でインスリンを生成する細胞を破壊することによって引き起こされる。ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、マクロファージがランゲルハンス島に浸潤し、ランゲルハンス島の中でインスリンを生成する細胞が破壊されることを特徴とする自己免疫疾患である（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＡ，Ｍａｃｌａｒｅｎ  ＮＫ．１９９４．Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３１：１４２８−１４３６；Ｂｅｎｏｉｓｔ  Ｃ，  Ｍａｔｈｉｓ  Ｄ．１９９７．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ａｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ，ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｏｒ  ｏｒ  ｍａｒｋｅｒ？  Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：８３３−８３４；Ｂｊｏｒｋ  Ｓ．２００１．Ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｃａｒｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  ５４（Ｓｕｐｐｌ１）：１３−１８）。欧州系人種での罹患率が比較的高く、約２００万人の患者がいる。罹患率には有意な地理的分布の特徴があり、フィンランドの小児におけるＩ型糖尿病の罹患率は、ベネズエラの小児の４００倍となっている。報道によれば、Ｉ型糖尿病の全世界での罹患率は、２０１０年には１９９８年に比べ４０％上昇する見込みである。この急速な増加スピードは、環境因子が疾患感受性遺伝子に作用し、Ｉ型糖尿病の罹患率の上昇を共同で引き起こしていることを示している。
【０００４】
Ｉ型糖尿病の膵島炎現象、すなわちリンパ球がランゲルハンス島に浸潤することが発見されたことに続き、Ｉ型糖尿病患者において膵島細胞抗体（ＩＣＡ）がインスリン、カルボキシペプチダーゼ、熱ショックタンパク質に対して自己反応性Ｔ細胞を生成することが発見された。１９９０年には、Ｂｅａｋｋｅｓｋｏｖが、Ｉ型糖尿病患者の血清中に存在する６４Ｋ抗体がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）自己抗体および自己反応性Ｔ細胞であることを証明し、ＧＡＤがＩ型糖尿病の自己免疫反応の鍵となる抗原であると考えた（Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｉｔａｍａｒ  Ｒａｚｌ，Ｒｏｙ  Ｅｌｄｏｒ２  ａｎｄ  Ｙａａｋｏｖ  Ｎａｐａｒｓｔｅｋ．ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１２８，２００５．龍秀栄，杜文斌，蘇鐘浦，魏慶瑶「小児糖尿病のグルタミン酸脱炭酸酵素抗体測定」『中華小児科雑誌』１９９８年第１０期）。
【０００５】
現在、臨床上、主にインスリン補償療法が採用されているが、発病を予防または遅延させることが可能なよい方法はまだない。Ｉ型糖尿病をめぐる研究の方向性は多く、自己免疫の発生に抵抗することを主要目的とし、晩期患者に対しては細胞再生誘導などの方法も採用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、自己免疫疾患を予防および／または治療するワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明で提供する自己免疫疾患を予防および／または治療するワクチンの有効成分は、自己免疫疾患をもたらすタンパク質抗原またはそのエピトープポリペプチドと、自己タンパク質抗原またはそのエピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物である。
【０００８】
前記自己タンパク質抗原は、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素、熱ショックタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、２種のミエリン抗原（ＭＢＰおよびＰＬＰプロテオリピドタンパク質）、卵透明帯タンパク質３（ＺＰ３）、ミオグロブリン、ＩＩ型コラーゲン、サイログロブリン、細胞膜表面抗原、II型コロイド抗原（ＣＡ２）、アセチルコリン受容体、甲状腺細胞表面抗原（ＴＳＨ）、唾液腺導管タンパク質、サイログロブリン、スーパー抗原（Ｓ−Ａｇ）または光受容体間レチノイド結合タンパク質である。
【０００９】
前記自己免疫疾患を予防および／または治療するワクチンは、具体的には、Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンとすることができる。
【００１０】
前記Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンの有効成分は、下記のいずれかの混合物である。
１）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原と、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物
２）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物
３）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原と、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物
４）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物
【００１１】
前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原は、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素または熱ショックタンパク質である。
【００１２】
共免疫組成物においても、Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原と、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物を採用することができる。この混合物は同様に、調節性Ｔ細胞を生成し、Ｉ型糖尿病の発生を抑制することができる。
【００１３】
同様に、Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物を採用することもできる。この混合物は同様に、調節性Ｔ細胞を生成し、Ｉ型糖尿病の発生を抑制することができる。
【００１４】
上記２種の混合物を採用した免疫生成の効果は、Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物が生成する効果と同じである。
【００１５】
前記インスリンは、ヒト、イヌ、ネコ由来のものとすることができる。ヒトのインスリンは、マウスのＩ型糖尿病治療に用いることができる。ヒト、イヌ、ネコおよびマウスの遺伝子配列は非常に相似している。核酸配列レベルで、マウスとヒトのインスリンの相似性は９５％であり、ネコとヒトの相似性は８４％であり、ネコとヒトの相似性は８９％である。
【００１６】
前記グルタミン酸脱炭酸酵素は、ヒト、イヌ、ネコ由来のものとすることができる。ヒトのグルタミン酸脱炭酸酵素は、マウスのＩ型糖尿病治療に用いることができる。核酸配列レベルで、両者の配列の相似性は９０％である。
【００１７】
前記熱ショックタンパク質は、ヒト、イヌ、ネコ由来のものとすることができる。
【００１８】
前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原は、具体的には、ヒトインスリンとすることができる。前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表における配列１であり、当該ポリペプチドの名称はＢ９−２３である。前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子または前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子の挿入に用いる真核細胞発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．０またはｐＶＡＸ１またはｐｒｏｖａｘなどの哺乳動物の細胞発現ベクターとすることができる（塗亦嫻，金華利，張馨玉，楊若耶，楊富，張富春，王賓「豚コレラウイルスＥ２遺伝子真核発現ベクターの発現効率と免疫効果の比較」『中国農業大学学報』２００５，１０（６）：３７〜４１）。
【００１９】
前記Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンの有効成分は、具体的には、ヒトインスリンタンパク質およびｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎとすることができ、さらにＢ９−２３およびｐｃＤＢ９−２３とすることができる。
【００２０】
前記Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンの有効成分のうち、１）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原と、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとの質量比は１：５〜５：１とし、１：１〜１：２であることが好ましい。
２）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとの質量比は１：５〜５：１とし、１：１〜１：２であることが好ましい。
３）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原と、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとの質量比は１：５〜５：１とし、１：１〜１：２であることが好ましい。
４）Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとの質量比は１：５〜５：１とし、１：１〜１：２であることが好ましい。
【００２１】
前記Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンは、注射、スプレー、点鼻、点眼、浸透、吸収、物理的または化学的介在の方法を介して、筋肉、皮内、皮下、静脈、粘膜組織などの有機体に導入することができ、またはその他の物質で混合または被覆した後に有機体に導入することができる。
【００２２】
前記Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンの用量は、一般に、有効成分２００μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／回とし、７〜３０日に１回投与し、一般に計２〜５回必要である。
【００２３】
マウスの実験によって、Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原と、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原のコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物、およびＩ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドと、前記Ｉ型糖尿病自己タンパク質抗原エピトープポリペプチドのコード遺伝子がマルチクローニング部位に挿入された組換え真核細胞発現ベクターとからなる混合物は、免疫マウスのＴ細胞増殖を抑制し、免疫抑制の生成を誘導することができ、Ｉ型糖尿病の発生を有効に予防することができる。同様に、このワクチンの方法および手段は、自己抗原に誘発されるその他の自己免疫疾患にも採用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ａ】ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎのＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素切断法による同定結果である。
【図１ｂ】ｐｃＤＢ９−２３ベクターのＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素切断法による同定結果である。
【図１ｃ】ＲＴ−ＰＣＲ方法でｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎのＢＨＫ２１細胞における発現を解析したものである。
【図２ａ】４８時間刺激したｐｃＤＢ９−２３およびＢ９−２３共免疫群のＴ細胞増殖の状況である。
【図２ｂ】９６時間刺激したｐｃＤＢ９−２３およびＢ９−２３共免疫群のＴ細胞増殖の状況である。
【図３ａ】４８時間刺激した各免疫群のＴ細胞増殖の状況である。
【図３ｂ】図３ａにおける各免疫群のＴ細胞増殖の状況の比較である。
【図３ｃ】異なる共免疫群における異なる免疫投与量のＴ細胞増殖の状況の比較である。
【図４】ＮＯＤマウス発病予防の比較試験である。
【図５】免疫のＮＯＤマウスの膵臓組織切片ＨＥ染色の結果である。
【図６ａ】マウスＭＺＰ３遺伝子配列と、マーモセット、ヒト、イヌ、ネコ、二花臉ブタおよびアジア原牛の核酸同源性分析である。ＭＺＰ３：マウス、Ｍａｒｍｏｓｅｔｓ：マーモセット、Ｈｕｍａｎ：ヒト、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ：イヌ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ：ネコ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ：二花臉ブタ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ：アジア原牛。
【図６ｂ】マウスＭＺＰ３遺伝子配列と、マーモセット、ヒト、イヌ、ネコ、二花臉ブタおよびアジア原牛のアミノ酸同源性分析である。ＭＺＰ３：マウス、Ｍａｒｍｏｓｅｔｓ：マーモセット、Ｈｕｍａｎ：ヒト、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ：イヌ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ：ネコ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ：二花臉ブタ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ：アジア原牛。
【図７】真核細胞発現ベクターｐｃＤｍｚｐ３の同定および発現分析である。（ａ）ベクターについてＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで制限酵素切断を行った。Ｍ：ＤＮＡ標準分子量（２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐおよび１００ｂｐ）、１，２：組換えプラスミドｐｃＤｍｚｐ３についてＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで制限酵素切断を行った。（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ法でｐｃＤｍｚｐ３のＢＨＫ２１細胞における発現を分析した。Ｍ：ＤＮＡ標準分子量（２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐおよび１００ｂｐ）、１：ｐｃＤｍｚｐ３をトランスフェクションした細胞ＭＺＰ３の発現。２：トランスフェクションしていない細胞の対照。
【図８】原核細胞発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１／ＭＺＰ３の同定、タンパク質発現および純化である。（ａ）組換えプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１／ＭＺＰ３の制限酵素切断同定。Ｍ：ＤＮＡ標準分子量（２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐおよび１００ｂｐ）、１，２：組換えプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１／ＭＺＰ３についてＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで制限酵素切断を行った。（ｂ）タンパク質の誘導発現。Ｍ：ＤＮＡ標準分子量（２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐおよび１００ｂｐ）、１：ＩＰＴＧで誘導されていない全菌体タンパク質。２、ＩＰＴＧ誘導した全菌体タンパク質。３、超音波破砕した上清タンパク質。４、超音波破砕した沈殿タンパク質。（ｃ）純化後のＭＺＰ３タンパク質。Ｍ：タンパク質標準分子量、１：純化後のタンパク質タンパク試料。矢印は標的バンドを指す。
【図９ａ】自己免疫疾患卵巣炎の罹患率および重篤度である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ１００μｌを足底および筋肉注射したものを陰性対照群とし、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）１００μｌのみを注射したマウスをアジュバント群とし、ＭＺＰ３タンパク質１００μｇを含むＣＦＡ乳化液１００μｌを注射した。
【図９ｂ】注射後１４日に卵巣の組織学的変化を測定したものである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ１００μｌを足底および筋肉注射したものを陰性対照群とし、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）１００μｍのみを注射したマウスをアジュバント群とし、ＭＺＰ３タンパク質１００μｇを含むＣＦＡ乳化液１００μｌを注射した。陰性対照群，正常な卵巣組織。ＣＦＡ，ＣＦＡのみを注射したマウスの卵巣組織，卵巣に炎症反応がない。長い矢印は成長中の卵胞を示し、矢印は原始卵胞を示す（拡大倍率は１００および４００倍）。ＭＺＰ３，卵巣に炎症細胞の浸潤が現れ、卵子を重篤に喪失した。
【図９ｃ】抗体価（各群マウス３匹）である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＺＰ３タンパク質１００μｇおよびＣＦＡを足底および筋肉注射し、対照はＣＦＡのみを注射したマウスである。注射の１４日間後に、血清を収集し、ＥＬＩＳＡ法を介して抗体を測定し、抗体価はＯＤ値に基づき計算した。
【図９ｄ】足の湾曲箇所のリンパ節リンパ細胞からのＭＺＰ３タンパク質に対する特異性Ｔ細胞反応である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ１００μｌを足底および筋肉注射したものを陰性対照群とし、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）１００μｌのみを注射したマウスをアジュバント群とし、ＭＺＰ３タンパク質１００μｇを含むＣＦＡ乳化液１００μｌを注射した。Ｔ細胞をマウスの中から分離し（各群マウス３匹）、体外でＭＺＰ３タンパク質を特異性抗原として刺激し、かつ、ＣＦＳＥ法で測定した。図における百分比は増殖の幅である。数値が大きいほど増殖の幅が大きくなり、Ｍ１は細胞増殖の百分比を示す。
【図１０ａ】サイトカインＩＬ−２の発現である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ１００μｌを足底および筋肉注射したものを陰性対照群（Ｎａｉｖｅ）とし、ＣＦＡ１００μｌのみを注射したマウスをアジュバント群とし、ＭＺＰ３タンパク質１００μｇを含むＣＦＡ乳化液１００μｌを注射した。
【図１０ｂ】フローサイトメトリーでＩＦＮ  −γの発現を分析したものである。注射１４日後にＴ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓および足の湾曲箇所のリンパ節から分離し、ＭＺＰ３タンパク質を用いて体外で８時間刺激した。細胞内染色法を用いてＣＤ４+Ｔ細胞ＩＮＦ−γの発現および全細胞ＩＬ−１２の発現を分析した。陽性細胞の百分比を図中に示した。ａ，リンパ節、ｂ，脾臓。
【図１０ｃ】フローサイトメトリーで分析したＩＬ−１２の発現である。注射１４日後にＴ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓および足の湾曲箇所のリンパ節を分離し、ＭＺＰ３タンパク質を用いて体外で８時間刺激した。細胞内染色法を用いてＣＤ４+細胞ＩＮＦ−γの発現および全細胞ＩＬ−１２の発現を分析した。陽性細胞の百分比を図中に示した。ａ，リンパ節、ｂ，脾臓。
【図１１ａ】対照群に比べ、共免疫ｐｃＤｍｚｐ３およびＭＺＰ３タンパク質群のＡＯＤが軽減されたものである。
【図１１ｂ】２回目の免疫後７日目の卵巣の組織学的測定である。
【図１１ｃ】フローサイトメトリーでサイトカインＩＬ−１２の発現を測定したものである。Ａ，リンパ節、Ｂ，脾臓。
【図１１ｄ】フローサイトメトリーでサイトカインＩＮＦ−γの発現を測定したものである。Ａ，リンパ節、Ｂ，脾臓。
【図１１ｅ】共免疫ＤＮＡおよびタンパク質が抗原特異性の免疫抑制を誘導したものである。抗原マッチ型および抗原ミスマッチ型ＤＮＡとタンパク質を同時免疫したマウスのＴ細胞増幅状況を比較した。２回目の免疫後７日目にＴ細胞を分離し、体外で特異性抗原ＭＰＺ３タンパク質で再刺激し、ＢＳＡを無関係タンパク質対照とし、Ｃｏｎ  Ａを陽性対照とした。ＭＴＴ法を用いて測定し、刺激指数の方式で示した。
【図１１ｆ】ＥＬＩＳＡ法で血清中の抗体レベルを測定したものである。
【図１２ａ】共免疫誘導の調節性Ｔ細胞発現ＩＬ−１０である。２回目の免疫後７日目にＴ細胞を分離し、フローサイトメーターを用いて、サイトカインＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３の発現を分析した。Ａ，リンパ節、Ｂ，脾臓。
【図１２ｂ】共免疫誘導の調節性Ｔ細胞発現ＦｏｘＰ３である。２回目の免疫後７日目にＴ細胞を分離し、フローサイトメーターを用いて、サイトカインＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３の発現を分析した。Ａ，リンパ節、Ｂ，脾臓。
【図１３】共免疫でＣＤ４+ＣＤ２５+細胞が変更されていない数である。異なる免疫の組み合わせのマウスからＴ細胞を分離し、抗ＣＤ４および抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を染色して、フローサイトメトリーで分析した。Ａ，リンパ節、Ｂ，脾臓。
【図１４】プラスミドＴ−ＭＯＧ３５２ｃの制限酵素切断法による同定結果である。
【図１５】プラスミドｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃの制限酵素切断法による同定結果である。
【図１６】プラスミドｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃのＢＨＫ２１細胞の一過性発現結果である。
【図１７】免疫誘導マウスＥＡＥモデルの罹患状況である。縦軸は罹患指数、横軸は日数である。
【図１８】陰性マウスに、罹患したマウスの脾臓由来のＴ細胞を養子移入した後、ＣＦＡアジュバント乳化したＭＯＧ抗原２００μｇを１回皮下免疫した後の罹患状況である。縦軸は罹患指数、横軸は日数である。
【図１９】陰性マウスに、発病したマウスのリンパ節由来のＴ細胞を養子移入した後、ＣＦＡアジュバント乳化したＭＯＧ抗原２００μｇを１回皮下注射した後の罹患状況である。縦軸は罹患指数、横軸は日数である。
【図２０】マウスの発病を誘導した後の自己ＭＯＧ抗原に対するＴ細胞の増幅状況である。
【図２１】マウスの発病を誘導した後の自己ＭＯＧ抗原に対するＴ細胞内部のサイトカインを発現した状況である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
下記実施例における試験方法は、特別な説明がない場合、いずれもルーチンの方法である。
【実施例１】
【００２６】
Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチン
【００２７】
本実施例において、Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンには、１）ヒトインスリンタンパク質（Ｓｉｇｍａ製，Ｉ−９２７８）およびｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎからなる、２）ヒトインスリンにおけるＢ鎖上の９−２３タンパク質（Ｂ９−２３）およびｐｃＤＢ９−２３からなる、３）ヒトインスリンタンパク質（Ｓｉｇｍａ製，Ｉ−９２７８）およびｐｃＤＢ９−２３からなる、４）Ｂ２９−２３およびｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎからなる、の４種がある。
【００２８】
Ｂ２９−２３のアミノ酸配列は、ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ（配列１）である。インスリンにおけるＢ鎖上の９−２３タンパク質（Ｂ９−２３）は、北京ａｏｋｅ社が合成した。
【００２９】
ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびｐｃＤＢ９−２３は、下記の方法で調製した。
ヒト膵臓組織を抽出し、タカラ製のＲＮＡ抽出試薬キットを用いて、ＴｒｉｚｏＬ試薬において充分に研磨し、取扱説明書に基づき全ＲＮＡの抽出を行った。発表されている遺伝子配列に基づきプライマーを設計した。プライマーの配列は、下記のとおりである。
ヒトインスリンｃＤＮＡ遺伝子を増幅するプライマー、
【化１】
0005524823.tif 000002
ヒトインスリンのＢ鎖上のアミノ酸末端９〜２３位のアミノ酸残基からなるポリペプチドＢ９−２３を増幅するプライマー、
【化２】
0005524823.tif 000003
Ｂ９−２３のアミノ酸配列は、ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧである。
【００３０】
タカラ社ＲＮＡ  ＰＣＲキットの操作マニュアルにより行い、逆転写はＯｌｉｇｏ（ｄＴ）を下流プライマーとした。反応条件：４２℃３０分間、９９℃５分間、５℃５分間。ＰＣＲ反応は、遺伝子配列を用いて特異性プライマーを設計した。増幅パラメータ：９４℃２分間、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃７０秒間３５サイクル、７２℃１０分間。反応生成物は、１％アガロースゲル電気泳動測定を行った。その結果、ヒトインスリンのＲＴ−ＰＣＲ生成物で約７５０ｂｐのバンドが得られ、Ｂ９−２３のＲＴ−ＰＣＲ生成物で約２５０ｂｐのバンドが得られることが示された。
【００３１】
タカラ社ＰＣＲ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔを用いて、取扱説明書に基づきＰＣＲ生成物の回収を行った。回収したｃＤＮＡ断片とｐＭＤ  １８−Ｔベクター（タカラ社製）は、Ｔ4ＤＮＡリガーゼの作用下１６℃で１晩置き、ヒトインスリンのｃＤＮＡまたはＢ９−２３のコード配列をｐＭＤ  １８−Ｔのベクター上に結合した。結合生成物をコンピテントセルに形質転換し、コンピテントセルの調製および形質転換と、プラスミドの抽出は、参考文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（２nd  ｅｄ）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９．１９―５６）に基づいた。抽出後のプラスミドは、ＥｃｏＲ  ＩおよびＨｉｎｄ  III 二重制限酵素切断を用いて組換えプラスミドの同定を行い、制限酵素切断反応の終了後にアガロースゲル電気泳動同定を行い、正確なクローンでプラスミドの大量抽出を行った。クローンのｃＤＮＡ配列を同定するため、組換えプラスミドに対して純化を行い、ＢｃａＢＥＳＴ  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−ＭおよびＢｃａＢＥＳＴ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１３−４７を用いてｃＤＮＡのＰＥ３７７全自動シーケンサーで双方向ＤＮＡシークエンシングを行い、得られた配列を、ＰＥ社ＳｅｑＥｄ  ｖ１．０．３ソフトウェアで分析した。制限酵素切断およびシークエンシング同定を経たヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ８９９３０４とする５´端第５６位から３８８位までのデオキシリボヌクレオチドを含むヒトインスリンｃＤＮＡ遺伝子のプラスミドをｐＭＤインスリンと命名し、ヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ８９９３０４とする５´端第１５２位から１９６位までのデオキシリボヌクレオチドを含むＢ９−２３のｃＤＮＡ遺伝子のプラスミドをｐＭＤ−Ｂ９−２３と命名した。
【００３２】
ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉを用いて、ｐＭＤインスリンおよびｐＭＤ−Ｂ９−２３から、ヒトインスリン遺伝子断片およびＢ９−２３断片をそれぞれ切り取った。ヒトインスリン遺伝子断片は、同様に制限酵素切断した真核細胞発現ベクターｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に結合し、Ｂ９−２３断片は、同様に制限酵素切断した真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）上に結合し、組換えプラスミドは、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉを用いて二重制限酵素切断同定およびシークエンシング同定を行った。制限酵素切断およびシークエンシング同定を経たヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ８９９３０４とする５´端第５６位から３８８位までのデオキシリボヌクレオチドを含むヒトインスリンｃＤＮＡ遺伝子のプラスミドをｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎと命名し、ヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ８９９３０４とする５´端第１５２位から１９６位までのデオキシリボヌクレオチドを含むＢ９−２３のｃＤＮＡ遺伝子のプラスミドをｐｃＤＢ９−２３と命名した。
【００３３】
ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎのＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素切断の同定結果は、図１ａに示すとおりであり、０．７％アガロースゲル電気泳動によって、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎは、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素切断後に、約７５０ｂｐのヒトインスリンｃＤＮＡ遺伝子断片が得られることが示された。図１ａにおいて、１：ＤＮＡ標準分子量（１００００ｂｐ、５０００ｂｐ、２５００ｂｐ、１０００ｂｐおよび２５０ｂｐ，タカラ製）、２，３：組換えプラスミドｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎについてＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで制限酵素切断を行った。
【００３４】
ｐｃＤＢ９−２３ベクターのＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素切断の同定結果は、図１ｂに示すとおりであり、０．７％アガロースゲル電気泳動によって、ｐｃＤＢ９−２３は、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素切断後に、約２５０ｂｐＢ９−２３ｃＤＮＡ遺伝子断片が得られることが示された。図１ｂにおいて、３はＤＮＡ標準分子量（２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐおよび１００ｂｐ，タカラ製）であり、２：組換えプラスミドｐＣＤＢ９−２３についてＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで制限酵素切断を行った。
【００３５】
ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎは、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの製品マニュアルを参照し、リポソームトランスフェクション法でＢＨＫ２１細胞（米ＡＴＣＣ社）をトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションしてから４８時間後に細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出して、ｍＩｎｓｕｌｉｎｐ１およびｍＩｎｓｕｌｉｎｐ２をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子の発現を測定した。その結果は図１ｃに示すとおりであり、トランスフェクション細胞のうち、７５０ｂｐのヒトインスリンｃＤＮＡ断片があることを示し、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎはｍＲＮＡレベルで有効に体外で発現可能であることを説明している。１：ＤＮＡ標準分子量（１００００ｂｐ、５０００ｂｐ、２５００ｂｐ、１０００ｂｐ、および２５０ｂｐ，タカラ製）、２，３：ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎをトランスフェクションした細胞ｉｎｓｕｌｉｎの発現。２：トランスフェクションしていない細胞の対照。
【実施例２】
【００３６】
Ｉ型糖尿病を予防および／または治療するワクチンの効果試験
【００３７】
試験用のＢａｌｂ／ｃマウスおよびＮＯＤマウスをそれぞれ免疫した。筋肉注射。Ｂａｌｂ／ｃマウスは各群３匹。ＮＯＤマウスは各群１６匹。
一、Ｂａｌｂ／ｃマウス試験
１、Ｂａｌｂ／ｃマウス上の細胞免疫反応
【００３８】
Ｂａｌｂ／ｃマウス９匹を３群に均等に分け、各群３匹とした。第１群（ｐｃＤＢ９−２３免疫群）は、１匹当たり、ｐｃＤＢ９−２３を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第２群（Ｂ９−２３免疫群）は、１匹当たり、Ｂ９−２３を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第３群（ｐｃＤＢ９−２３およびＢ９−２３共免疫群）は、１匹当たり、ｐｃＤＢ９−２３を１００ｍｇおよびＢ９−２３を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。１回目の免疫後、１４日目に同等の投与量で１回強化免疫し、２回目の免疫の後、以下の方法でＴ細胞増殖試験を行った。
【００３９】
Ｔ細胞増殖試験、ＣＦＳＥ染色、フローサイトメトリー測定をすることによって、Ｔ細胞の特定抗原に対する増殖能力を反映した。体内のリンパ球は、抗原などの特異性または非特異性の刺激を受けた後、細胞の活性化、サイトカインの合成、サイトカイン受容体の発現をもたらし、細胞に増殖が発生した。細胞増殖反応は、細胞の機能状態をある程度反映することができる。
【００４０】
具体的な方法は次のとおりである。１、マウスを頸椎脱臼で処分し、７０％エタノールに１５分間浸した。２、事前に２０分間紫外滅菌したクリーンベンチにおいて、無菌条件下で、事前にＲＰＭＩ１６４０培養液２ｍｌを加えた細胞培養シャーレの中にマウスの脾臓を摘出した。３、銅金網を強熱した後、降温してシャーレの中に入れた。無菌注射器で脾臓を磨砕し、細胞浮遊液を調製し、１３ｍｌ細胞遠心管内にろ過した。４、遠心管の口をシーリングフィルムで密封し、１０分間で２０００回転、遠心分離した。５、上層の培養液を捨て、赤血球溶解液２〜３ｍｌを加え、細胞を懸濁し、２分間溶解した後、等体積のＰＲＭＩ１６４０培地（またはウシ胎児血清）を加えて反応を停止し、遠心管の口をシーリングフィルムで密封し、１０分間で２０００回転、遠心分離した。６、上層の培養液を捨て、ＰＲＭＩ１６４０（２％ウシ胎児血清を含む）培地浮遊細胞３〜４ｍｌを加え、細胞を懸濁した。７、グラスウールを用いて３７℃で細胞をゆっくりとろ過し、細胞が充分にグラスウールと結合し、Ｂ細胞を除去することを保証した。８、血球計数板で細胞を計数した。９、ＰＢＳで培地を洗浄し、最後にＰＢＳ溶液１ｍｌで２×１０7個の細胞を懸濁した。１０、３μＭ  ＣＦＳＥ貯蔵液を採集濃度が１．５μＭになるまで加え、常温で８分間軽く振盪した。１１、等体積のウシ胎児血清を加えて反応を停止し、細胞を入れて１０分間水浴し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を棄てた。細胞を懸濁し、細胞１０6個当たりの含有ＰＢＳ溶液１ｍｌで細胞を洗い、遠心分離して上清を棄て、３回繰り返した。各群の細胞浮遊液を４部に分け、９６ウェルプレートに添加した。うち１部はＣｏｎ  Ａ（マイトジェン）１００μｌを添加して最終濃度を５μｇ／ｍｌとし、１部は対応する特異性抗原（Ｂ９−２３）を添加して刺激物とし、最終濃度を５μｇ／ｍｌとし、１部は刺激物を加えず、１部はＢＳＡ１００μｌを添加して最終濃度を２μｇ／ｍｌとし無関係抗原とした。同時に、刺激物を添加せず、およびＣＦＳＥ染色を用いない細胞を設けて対照とした。１３、細胞を細胞インキュベータに入れ、３７℃、５％、ＣＯ2培養し、それぞれ４８、９６時間、フローサイトメトリーで細胞増殖状況を測定した。
【００４１】
４８時間および９６時間の測定結果によって、ｐｃＤＢ９−２３およびＢ９−２３共免疫群のＴ細胞増殖の程度（０．０８％増殖）が、ｐｃＤＢ９−２３免疫群（２２．３２％）およびＢ９−２３免疫群（８．９４％増殖）よりも有意に低く、ｐｃＤＢ９−２３およびＢ９−２３共免疫群に免疫抑制現象が現れたことが証明された。図２ａおよび図２ｂにおける百分比は増殖の程度であり、数値が大きいほど増殖の程度が高くなり、Ｍ１は細胞増殖の百分比を示す。
２、細胞免疫反応の特異性
【００４２】
免疫抑制反応が特異性を有するか否か、すなわち、インスリン抗原を有するタンパク質とＣＮＡとの間にしか抑制現象が発生しないかどうかをさらに研究した。Ｂａｌｂ／ｃマウス２１匹を７群に均等に分け、各群３匹とした。第１群（陰性対照群）は、１匹当たり、０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第２群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎ免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第３群（ヒトインスリンタンパク質免疫群）は、１匹当たり、ヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第４群（ｐＶＡＸ１免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ１を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第５群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびＶＰ１共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇおよび口蹄疫ウイルスＶＰ１（金華利，張富春，単文娟，張愛蓮，李軼傑，王賓「口蹄疫ＶＰ１タンパク質の酵母における発現および免疫原性分析」『細胞と分子免疫学誌』２００４年，２０（５）５１３〜５１６に記載された方法に基づき調製した）を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫し、対照群とした。第６群（ｐＶＡＸ１およびヒトインスリンタンパク質共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ１を１００ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第７群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。１回目の免疫後、１４日目に同等の投与量で１回強化免疫し、２回目の免疫の後、７日目に前記ステップ１の方法でＴ細胞増殖試験を行った。刺激後４８時間の結果は、図３ａおよび３ｂに示すとおりであり、インスリンタンパク質とその対応するＤＮＡとを一緒に混合した場合（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群）にのみ、免疫抑制現象が現れ、その他の混合群は、対照群に比べ、Ｔ細胞活性に有意な降下が認められなかった。共免疫には、同種の抗原のタンパク質とＤＮＡとの間に免疫抑制現象の特異的関係が存在していることを説明している。図３ａにおける百分比は増殖の程度であり、数値が大きいほど増殖の程度が高くなり、Ｍ１は細胞増殖の百分比を示す。図３ｂにおいて、ｐＩはｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎ免疫群を、Ｉｎｓｕｌｉｎはヒトインスリンタンパク質免疫群を、ｐＶＡＸはｐＶＡＸ１免疫群を、ｐＩ＋ＶＰ１はｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびＶＰ１共免疫群を、ｐＶＡＸ＋ＩｎはｐＶＡＸ１およびヒトインスリンタンパク質共免疫群を、ｐＩ＋ＩｎはｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群を表し、Ｎａｉｖｅは陰性対照群を表す。
３、細胞免疫反応の用量関係試験
【００４３】
現象の抑制で最適な効果が現れたときのタンパク質とＤＮＡとの間の用量関係をさらに研究するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス２４匹を８群に均等に分け、各群３匹とした。第１群（陰性対照群）は、１匹当たり、０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第２群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎ免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第３群（ヒトインスリンタンパク質免疫群）は、１匹当たり、ヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第４群（ｐＶＡＸおよびヒトインスリンタンパク質１：４共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを２５ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第５群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質１：２共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを５０ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第６群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質１：１共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第７群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質２：１共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを２００ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第８群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質４：１共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを４００ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。１回目の免疫後、１４日目に同等の投与量で１回強化免疫し、２回目の免疫の後、７日目に前記ステップ１の方法でＴ細胞増殖試験を行った。刺激後４８時間の結果は、図３ｃに示すとおりであり、プラスミドとタンパク質との間の比が２：１であるときに、抑制現象が最も顕著であった。図３ｃにおいて、Ｎａｉｖｅは陰性対照群を、ｐＩはｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎ免疫群を、Ｉｎはヒトインスリンタンパク質免疫群を、１：４、１：２、１：１、２：１、４：１はそれぞれｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質１：４共免疫群、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質１：２共免疫群、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質１：１共免疫群、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質２：１共免疫群、並びにｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質４：１共免疫群を表す。
二、ＮＯＤマウス上の共免疫予防試験
【００４４】
雌性ＮＯＤマウス６４匹を４群に均等に分け、各群１６匹とした。第１群（陰性対照群）は、１匹当たり、０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第２群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎ免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第３群（ヒトインスリンタンパク質免疫群）は、１匹当たり、ヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。第４群（ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群）は、１匹当たり、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎを１００ｍｇおよびヒトインスリンタンパク質を１００ｍｇ含む０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌをそれぞれ免疫した。１回目の免疫後、１４日目に同等の投与量で１回強化免疫し、２回目の免疫の後、毎週血糖計（北京恰成公司製）でマウスの血糖の変化を測定し、記録した。２週間連続でマウスの血糖レベルが２００ｍｌ／ｄｌを超えた場合、このマウスは糖尿病であるとした。
【００４５】
図４に示すとおり、各群のＮＯＤマウスの罹患率を統計し、正常な状況の下で、雌性ＮＯＤマウスの糖尿病の罹患率は６０％程度であった。ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群において、雌性ＮＯＤマウスの糖尿病の罹患率は有意に低下し、１匹のマウスが発病しただけであり、かつ発病の時間にも有意な遅延が認められた。ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質の共免疫によって、Ｉ型糖尿病を有効に予防できることを説明している。図４において、Ｎａｉｖｅ  ＮＯＤは陰性対照群マウスを、Ｉｎｓｕｌｉｎはヒトインスリンタンパク質免疫群マウスを、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎはｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎ免疫群マウスを、Ｉｎｓｕｌｉｎ＋ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎはｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群マウスを表す。
【００４６】
陰性対照群マウス、すでに糖尿病を罹患したマウスおよびｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群の膵臓組織に対し、切片化し、ＨＥ染色を行い、その結果によっても、ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎおよびヒトインスリンタンパク質共免疫群の膵臓組織において、リンパ球の浸潤比はその他の発病群の状況より軽微であり、正常な未発病ＮＯＤマウス（陰性対照群マウス）に近いことが示された（図５）。
【００４７】
この試験によって、インスリンＤＮＡとタンパク質とを同時免疫することによって、Ｉ型糖尿病の発生を有効に予防できることが証明された。今回の試験において、共免疫現象の免疫抑制性が繰り返し検証された。特に、ＮＯＤマウスにおいて、Ｉ型糖尿病の発生を予防することができた。
【００４８】
総合すると、この試験によって、Ｉ型糖尿病の新しい予防方法が証明された。さらに、関連機序でヒトおよび動物の自己免疫疾患治療の新しい方法が開発される可能性が研究された。
【実施例３】
【００４９】
共免疫の方法を採用して自己免疫性卵巣炎を治療／予防する
【００５０】
要約
自己免疫性卵巣疾患（ＡＯＤ：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヒトの早発卵巣不全（ＰＯＦ：ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）の誘引の１つである。ＡＯＤの自己タンパク質抗原には、卵透明帯タンパク質３（ＺＰ３）がある。
【００５１】
ＭＺＰ３タンパク質およびＣＦＡ誘導のＡＯＤマウスモデルを用いて、さらに実用的な卵巣炎治療技術を研究した。共免疫にマッチするＤＮＡおよびタンパク質はＴ細胞反応の免疫抑制を誘導できるという以前観察された結果に基づき、共免疫の方法を採用してＡＯＤを改善した。その結果、ＭＺＰ３  ＤＮＡおよびタンパク質の共免疫によって、ＡＯＤが改善され、抗原特異性のＴ細胞反応が抑制され、炎症性サイトカインＩＬ−１２およびＩＮＦ−γの発現レベルが下がることが認められた。これらの作用は、共免疫により特異性の調整性Ｔ細胞が誘導されたことにより起った可能性がある。これらの調整性Ｔ細胞の特徴は、ＣＤ４+／ＣＤ２５-／ＦｏｘＰ３+であり、ＩＬ−１０を発現することができる。我々は、ＤＮＡおよびタンパク質の共免疫の方法を用いて自己免疫疾患を治療することを初めて発表した。
【００５２】
この１００年、特に近年の研究において免疫系および生殖系との間に密接で複雑な関係が存在することが発見されていた[1,2]。この関係に基づき、新型免疫避妊技術が確立されている。この技術は、遺伝子組換えなどの分子生物学の技術に基づいて利用し、生殖プロセスにおける主要因子を標的抗原のワクチンとし、免疫系が追加された標的抗原に対して生成する対応免疫応答により、体内の標的生殖抗原に機能を喪失させ、過度の繁殖動物の生殖力を阻害し、過度の繁殖動物の正常な生殖プロセスを破壊し、生物種間およびその環境との間の動的均衡を維持する[3]。ネズミの卵膜外は、卵透明帯によって完全に包囲されている。卵透明帯は、一次卵母細胞の成熟プロセスの初期において、卵母細胞および一次卵母細胞が分泌し形成された糖タンパク質を含む好酸性膜であり、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３からなる[4]。卵透明帯は、受精プロセスにおいて２つの重要な作用を有する。１つは、精子を卵透明帯上に付着させることであり、もう１つは精子の結合後に精子の先体反応を誘導し、精子を卵中に入れることである[5]。ＺＰ３はＺＰの主要糖タンパク質であり、精子の一次受容体として、精子と卵子の結合プロセスにおいてさらに重要であり、理想的な免疫避妊とみなされている[6]。
【００５３】
しかしながら、免疫避妊ワクチンの製造プロセスにおいて、卵巣炎の発生をよく伴うことが分かっており、Ｄｕｍｂｅｒら[7]は、天然のブタＺＰ糖タンパク質および脱グリコシルしたＺＰタンパク質を用いて雌性個体を主体的に免疫し、受精の阻害をもたらした。しかしながら、研究によって、免疫後の動物の排卵周期、ホルモンレベルおよび卵巣における卵胞の発育の面で、一過性の変化が現れるものや、非可逆性の変化が現れることが認められている。
【００５４】
女性の更年期の正常な年齢は５０歳であり、４０歳以前に卵胞の機能を喪失した場合、早発卵巣不全（ＰＯＦ：ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）に罹ったと考えられる。この疾患は、女性における罹患率は、一般に１〜２％であり、重篤な場合、十数歳でこの疾患に罹ることがある[8]。自己免疫性卵巣疾患（ＡＯＤ：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ＰＯＦの主な誘引の１つであると考えられている[9-11]。Ｒｈｉｍらは、ＭＺＰ３の短いペプチド（３３０〜３４０）を足底および皮下注射することを採用し、新しいマウス実験動物モデルを確立し、卵巣の自己免疫疾患の研究に用いた。このモデルは、女性の早発卵巣不全をある程度シミュレーションすることができる[12]。この自己免疫疾患はＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介され、Ｌｏｕらは、自己抗体の生成によって、Ｔ細胞が媒介する炎症反応の分布を変えることができ、標的臓器機能単位の喪失をもたらすことがあることを発見している[13]。
【００５５】
有機体免疫系の調節者として、調節性Ｔ細胞は、有機体の自己抗原に対する免疫反応を調節することができ、これによって有機体が自己免疫疾患の傷害を受けないようにする。天然の調節性Ｔ細胞は、一般にＣＤ４＋ＣＤ２５＋両陽性Ｔ細胞であり、この細胞は機能性転写因子ＦｏｘＰ３を発現することができる。この細胞因子は、正常な免疫系の重要な細胞構成成分である[14]。この細胞の存在によって、研究者は抗原特異性の調節性Ｔ細胞を使用して自己免疫疾患および同種異体移植拒絶を治療することができる[16-17]。Ｓａｍｙらは抗原依存性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋両陽性調節Ｔ細胞を使用して自己免疫疾患−卵巣炎の発生を制御した[18]。Ｊｉｎらは、タンパク質およびＤＮＡ共免疫の方法を採用して、抗原特異性の細胞反応を抑制可能であることを発見している[19]。この抑制機能は、抗原特異性を誘導した調節性Ｔ細胞に関連する可能性があるため、本発明はマウスを動物モデルとし、タンパク質およびＤＮＡ共免疫で細胞免疫反応を抑制する方法を利用して、自己免疫疾患−卵巣炎の治療方法および対応する機序を研究している。
１  材料と方法
１．１  材料と試薬
【００５６】
ｐＭＤ１８−Ｔシークエンシングベクターはタカラ社から購入したものである。大腸菌ＤＨ５α菌株は、本試験所の貯蔵菌種である。ＲＮＡ抽出試薬キット、ＰＣＲ生成物回収試薬キット、ＤＮＡマーカー、制限性エンドヌクレアーゼ、ｅｘＴａｑ酵素およびＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲプライマーは、いずれもタカラ社から購入した。シークエンシング試薬キットは、米ＰＥ社から購入し、その他の試薬はいずれも分析用とした。
１．２  ｍｚｐ３遺伝子のクローン
【００５７】
性成熟マウスの卵巣を摘出し、Ｔｒｉｚｏにおいて充分に研磨し、取扱説明書に基づき全ＲＮＡの抽出を行った。すでに発表されている遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＣ１０３５８５）に基づきプライマーを設計し、プライマーの配列は次のとおりとした。
【化３】
0005524823.tif 000004
増幅断片はＭＺＰ３の核酸配列第６３〜１１４３位塩基とした。
【００５８】
タカラ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットの操作マニュアルに基づき行い、逆転写はＯｌｉｇｏ（ｄＴ）を下流プライマーとした。反応条件：４２℃３０分間、９９℃５分間、５℃５分間。ＰＣＲ反応は、ｍｚｐ３遺伝子配列を用いて特異性プライマーを設計した。増幅パラメータ：９４℃２分間、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃７０秒間３５サイクル、７２℃１０分間。反応生成物は、アガロースゲル電気泳動測定を行った。タカラ社ＰＣＲ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔを用いて、取扱説明書に基づきＰＣＲ生成物の回収を行った。回収したｍｚｐ３  ｃＤＮＡ断片とｐＭＤ  １８−Ｔベクターは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの作用下１６℃で１晩置き、ｍｚｐ３  ｃＤＮＡをｐＭＤ  １８−Ｔのベクター上に結合した。結合生成物をコンピテントセルに形質転換し、コンピテントセルの調製および形質転換は、参考文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら１９８９）に基づいた[20]。関連する参考文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら１９８９）に基づきプラスミドＤＮＡの小量抽出を行い、抽出後のプラスミドはＢａｍＨ  ＩおよびＨｉｎｄ  III 二重制限酵素切断を用いて組換えプラスミドの同定を行い、制限酵素切断反応の終了後にアガロースゲル電気泳動同定を行い、正確なクローンでプラスミドの大量抽出を行った。クローンのｃＤＮＡ配列を同定するため、組換えプラスミドに対して純化を行い、ＢｃａＢＥＳＴ  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−ＭおよびＢｃａＢＥＳＴ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１３−４７を用いてｍｚｐ３  ｃＤＮＡのＰＥ３７７全自動シーケンサーで双方向ＤＮＡシークエンシングを行い、得られた配列を、ＰＥ社ＳｅｑＥｄ  ｖ１．０．３ソフトウェアで分析した。
１．３  真核細胞発現ベクターの構築および組換えプラスミドのＢＨＫ２１細胞における一過性発現
【００５９】
前記ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ二重制限酵素切断を経て、同様に制限酵素切断した真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３に結合し、前記ベクターをｐｃＤｍｚｐ３と命名し、正確な組換えプラスミドの配列同定を経て、真核トランスフェクション試験を行った。具体的なトランスフェクション方法は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの製品取扱説明書を参照した。リポソームトランスフェクション法でｐｃＤｍｚｐ３をＢＨＫ２１細胞にトランスフェクションした。具体的な操作ステップは取扱説明書のとおりである。細胞をトランスフェクションしてから４８時間後に細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出して、ＭＺＰ３  Ｐ１およびＭＺＰ３  Ｐ２をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子の発現を測定した。
１．４  原核細胞発現ベクターの構築、タンパク質発現およびタンパク質純化
【００６０】
組換えプラスミドｐＭＤ  １８−Ｔ／ＭＺＰ３は、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ二重制限酵素切断を経て、同様に制限酵素切断した真核細胞発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１に結合し、正確な組換えプラスミドの配列同定を経て、タンパク質発現を行った。シングルのコロニーを選び、新鮮なＬＢ（Ａｍｐ+５０ｍｇ／Ｌ）培地に接種し、３７℃で培養し１晩置いた。翌日、１％の接種量を新鮮なＬＢ（Ａｍｐ+５０ｍｇ／Ｌ）培地に移植した。Ａ６００が０．６〜０．８に達したときに、１．０  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＰＴＧの誘導下、３７℃で５時間発現した。菌液１ｍＬを抽出し、遠心分離して菌体を収集してから、二重蒸留水で１回洗い、１×ＳＤＳ試料添加液の中に懸濁し、沸騰水浴中に入れ１０分間煮沸した。１２０００ｇで２分間遠心分離し、上清液１５μＬを抽出し、１００  ｇ／Ｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色した。
【００６１】
誘導後のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌体を遠心分離して収集し、ＰＢＳで洗浄した後、原培養体積の１／２０の細胞溶解液Ｌ１（１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ  ８．０）、１  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび２００  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）で細胞を再懸濁して沈殿させ、１５分間氷浴した後、菌液に粘性がなくなるまで細胞を超音波溶解した。その後、４℃、１２０００ｇで１０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿して得られた最初に調製されたＭＺＰ３封入体タンパク質を収集した。最初に調製された封入体タンパク質を、Ｌ１および４Ｍ尿素で洗浄し、７０℃で１０分間保温し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、３回繰り返した。Ｌ３（１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、１  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、８Ｍ  尿素、５  ｍｍｏｌ／Ｌ  β−メルカプトエタノールおよび５  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ，ｐＨ１０）で封入体タンパク質を溶解し、５５℃で１０分間保温し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、沈殿を除去した。上清を透析チューブに入れ、４Ｍ尿素を含むＬ２（１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ  ８．０）および１  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）の中で８時間透析した。その後、２Ｍ尿素を含むＬ２の中で８時間透析し、尿素がタンパク質溶液の中から除去されるまで尿素の濃度を徐々に逓減し、Ｂｒａｄｆｏｒｄを用いてタンパク質含量を測定した。
１．５  卵巣炎モデルの誘導
【００６２】
６〜８週齢，雌性，Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、中国医科科学院実験動物研究所から購入した。濃度２ｍｇ／ｍｌのタンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）と１：１で混合し、乳化が完了した後、各マウスを足底および筋肉注射で１００μｌ免疫し、各マウスを１００μｇタンパクで免疫した。ＣＦＡのみを注射したマウスを対照とした。１４日後に採血し、血清を収集し、対応する抗体価を間接ＥＬＩＳＡ法で測定した。純化したＧＳＴ−ＭＺＰ３融合タンパク質を標準抗原とし、ＥＬＩＳＡ法で血清中のＭＺＰ３タンパク質の特異性抗体レベルを測定した。タンパク質を５μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で１晩置いた。コーティングバッファーを棄て、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂粉乳−ＰＢＳＴは３７℃で１時間遮断した。プレートの洗浄後、異なる希釈度のマウス血清を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。１：１０００西洋わさびペルオキシダーゼヤギ抗ネズミ二次抗体（ＨＲＰ−ＩｇＧ）を添加し、５０μｌ／ウェル、３７℃で２時間インキュベートした後に棄てた。プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルＴＭＢを添加し、常温で光を避けて３０分間呈色反応した。２ｍｏｌ／Ｌ硫酸で反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ４５０／６５０の値を測定した。卵巣疾患の組織学的評価：卵巣は、ブアン固定液の中で２４時間固定し、パラフィン包埋を行った後、連続切片（５μｍ）し、Ｈ．Ｅ．（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色を行った。重篤の程度に基づき、卵巣病理学について等級分けした。１  間質領域に炎症が現れた。２および３  増加した複数の部位の炎症反応または卵胞の間および内部の肉芽腫。４  卵胞消失および卵胞閉鎖。抗原特異性リンパ球増殖反応：免疫後１４日目にマウスを処分し、無菌で足の湾曲箇所のリンパ節を摘出し、リンパ節を磨砕し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を棄て、培地で細胞を再懸濁した。血球計数板で計数した後、細胞濃度を１×１０7／ｍＬに調整した。細胞２×１０7個をとり、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を棄て、無菌ＰＢＳを用いて再懸濁し、ＣＦＳＥ（１ｍｏｌ／ｍｌ）１．５μｌを添加し、３７℃で１０分間軽く振り、等体積のウシ血清を添加し反応を停止させる。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を棄て、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、最後に１ｍｌの培地で細胞を再懸濁した。各ウェルに１００μｌ細胞を添加し、ＭＺＰ３（１０μｇ／ｍｌ）タンパク質でＴ細胞増殖を刺激し、ＢＳＡ（２μｇ／ｍｌ）を非特異性抗原対照とし、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ）を陽性対照とし、フローサイトメトリーで増殖状況を検査した。細胞内染色法を採用してサイトカインＩＬ−１２およびＩＮＦ−γを測定した。免疫後１４日目にマウスを処分し、無菌で脾臓を摘出し、脾臓組織を磨砕し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を棄て、赤血球溶解液１〜２ｍＬで細胞を２〜３分間処理し、４％血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地６〜１２ｍＬを加えて停止し、２０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した後、上清を棄て、培地で細胞を再懸濁した。血球計数板で計数した後、細胞濃度を２×１０6／ｍＬに調整した。リンパ節単細胞浮遊液の調製は前記と同じであり、各ウェルに細胞２×１０6個（１００μｌ）を添加し、１０μｇ／ｍｌのＭＺＰ３タンパク質で４〜６時間刺激し、モネンシン（ｍｏｎｅｎｃｉｎ）を添加して１〜２時間抑制した。その後、細胞内染色を行い、フローサイトメトリーでサイトカインの発現状況を測定した。具体的なプロセスは次のとおり。（１）マウスを免疫後２１日目に処分し、脾臓単細胞浮遊液を調製し、赤血球溶解液２ｍＬを添加して赤血球を溶解し、洗浄液で１回洗浄し、細胞を遠心分離して再懸濁し、計数した。（２）抗Ｆｃｇ抗体遮断：各群で細胞を１×１０6個取り、抗Ｆｃｇ抗体を適量添加し（用量は試薬の取扱説明書を参照）、３０分間遮断した。（３）洗浄液２〜３ｍｌを添加し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を棄て、各管に蛍光標識抗体を適量添加し、充分に混ぜ、４℃で光を避けて３０分間反応した。（４）洗浄液２〜３ｍｌを添加し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を棄て、膜透過剤０．２ｍｌを添加して細胞に穴をあけ、充分に混ぜ、常温で光を避けて１５分間反応した。（６）洗浄液２〜３ｍｌを添加し、充分に混ぜ、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を棄て、各管に細胞内標識の蛍光標識モノクローナル抗体を適量添加し（用量は試薬の取扱説明書を参照して取る）、細胞内分析物の標識とした。（７）細胞内染色抗体と細胞を充分に混ぜ、常温で光を避けて３０分間反応した。（８）洗浄液２〜３ｍｌを添加し、充分に混ぜ、５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を棄て、各管に洗浄液３００μｌを添加し、細胞を再懸濁した。（９）フローサイトメトリー分析。ＲＴ−ＰＣＲ法を採用してサイトカインＩＬ−２を測定した。ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）の取扱説明書に基づき、各群で細胞を１０7個取り、ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １ｍｌで溶解した後、クロロホルム２００μｌを加え、均一に混ぜた後、１２０００ｒ／分で、４℃で１５分間遠心分離した。上層の水相を取り、新しいＥＰ管に移した。イソプロパノール５００μｌを加え、均一に混ぜた後、常温で１０分間静置した。１２０００ｒ／分、４℃で１０分間遠心分離し、上清を棄て、ＲＮＡを沈殿させ、７５％のエタノールで洗浄した後、ＤＥＰＣ処理した超純水２０μｌに溶かし、−８０℃で保存した。ＲＮＡ試料１μｌを取り、超純水５９９μｌを加え、紫外線分光光度計で比色し、Ａ２６０およびＡ２８０のＣＤ値を読み取った。試薬キットの操作説明に基づき、ＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅後の生成物を１％アガロースゲル電気泳動で測定した。
１．６  共免疫による卵巣炎の治療
【００６３】
濃度２ｍｇ／ｍｌのタンパク質をＣＦＡと１：１で混合し、乳化が完了した後、各マウスを足底および筋肉注射で１００μｌ免疫し、１４日後に筋肉注射を介してｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を各１００μｇタンパクで免疫し、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３、ｐｃＤｍｚｐ３、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＯＶＡおよびＭＺＰ３を免疫して対照群とした。１４日後に強化免疫し、強化免疫の１週間後に、無菌でマウスの脾臓細胞を取り、ＭＩＴ法を介してＴ細胞増幅試験を行った。ＭＺＰ３タンパク質抗原でＴ細胞増幅を刺激し、ＢＳＡを非特異性抗原対照とし、ＣｏｎＡを陽性対照とした。具体的なプロセスは次のとおり。ＭＴＴ法でマウスのＴ細胞体外増殖活性を測定する。（１）脾臓を摘出：強化免疫の７日後にマウスを処分し、無菌で脾臓を摘出した。（２）単細胞浮遊液の調製：脾臓組織を磨砕し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を棄て、赤血球溶解液１〜２ｍＬで細胞を２〜３分間処理し、４％血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地６〜１２ｍＬを加えて停止し、２０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した後、上清を棄て、培地で細胞を再懸濁した。（３）細胞計数：血球計数板で計数した後、細胞濃度を３×１０6／ｍＬに調整した。（４）細胞プレートに添加：各ウェルに細胞１００μｌを添加し、ＣｏｎＡ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＭＺＰ３タンパク質（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（非特異性抗原，最終濃度２μｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、４８〜７２時間刺激した。（５）呈色：各ウェルにＭＴＴ溶液２０μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ2で３〜４時間培養し、２０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上清を棄て、各ウェルにジメチルスルホキシド１００μｌを加え、３７℃で２０〜３０分間軽く振った。（６）数値読み取り：ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍａｇｅｌｌａｎ，Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ）で５９５ｎｍのＯＤ値を測定した。（７）結果の計算：刺激指数
ＳＩ＝（各刺激ウェルのＯＤ値−培地のＯＤ値）／（刺激していないウェルのＯＤ値−培地のＯＤ値）。
【００６４】
リンパ球増幅試験：無菌条件下でマウスの足の湾曲箇所のリンパ節を摘出し、リンパ節を磨砕し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を棄て、培地で細胞を再懸濁し、単細胞浮遊液を調製した。細胞濃度を３×１０6／ｍＬに調整した。その他のプロセスは前記と同じとする。
【００６５】
サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０、ＦｏｘＰ３およびＣＤ２５の検査および卵巣炎の評価は、前記と同じとする。
２．結果
２．１  遺伝子クローンおよび配列分析
【００６６】
抽出した全ＲＮＡを採用し、オリゴデオキシチミンをプライマーとして逆転写を行い、単鎖ｃＤＮＡを得てから、設計したＰＣＲプライマーで増幅を行い、ＭＺＰ３遺伝子断片を得た。ＲＴ−ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル電気泳動で同定し、約１２００ｂｐのバンドが見られ、予測したものと一致した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物をクローンベクターｐＭＤ１８−Ｔと結合し、組換えプラスミドｐＭＤ１８−Ｔ／ＭＺＰ３を作製した。組換えプラスミドはＢａｍ Ｈ Ｉ およびＨｉｎｄ III で酵素切断し、１２００ｂｐのＤＮＡ断片で切断し、予想した結合断片と大きさが同じ。ｐＭＤ１８−Ｔ／ＭＺＰ３組換えプラスミドに対して、ＢｃａＢＥＳＴｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ２ＭおよびＢｃａＢＥＳＴｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１３２４７で双方向シークエンシングを行った。シークエンシングの結果、すでに発表されている配列との同源性が９９％であることが示された。ＤＮＡＭＡＮでマーモセット、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、およびウシのＭＺＰ３遺伝子について同源性分析を行い、相同性は７３％に達し（図６ａ）、アミノ酸配列の相同性は７１％に達した（図６ｂ）。
２．２  真核細胞発現ベクターの構築および組換えプラスミドのＢＨＫ２１細胞における一過性発現
【００６７】
組換えプラスミドｐＭＤ１８−Ｔ／ＭＺＰ３および真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで二重制限酵素切断し、回収し純化した後で、結合した。ＭＺＰ３遺伝子クローンを真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３の中に入れ、組換えベクターｐｃＤｍｚｐ３を得た。組換えプラスミドをＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで二重制限酵素切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動を経て約１２００ｂｐの箇所にバンドを示し（図７のうちａ）、組換えプラスミドｐｃＤｍｚｐ３の作製に成功したことを説明している。純化し、定量されたプラスミドをリポソームで成長状態が良好なＢＨＫ２１細胞にトランスフェクションし、７２時間細胞を収集した。ＭＺＰ３ｐｌおよびＭＺＰ３ｐ２をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法で標的遺伝子の発現状況を測定し、１２００ｂｐの箇所に図７のうちｂに示す対応するバンドが現れ、組換えベクターがｍＲＮＡレベルで有効に体外で発現可能であることを示した。
２．３  原核細胞発現ベクターの構築、タンパク質発現およびタンパク質純化
【００６８】
組換えプラスミドｐＭＤ１８−Ｔ／ＭＺＰ３および真核細胞発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで二重制限酵素切断し、回収し純化した後、結合した。ＭＺＰ３遺伝子クローンを真核細胞発現ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１の中に入れ、組換えベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１／ＭＺＰ３を得た。組換えプラスミドをＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで二重制限酵素切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動を経て約１２００ｂｐの箇所にバンドを示し（図８のうちａ）、組換えプラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１／ＭＺＰ３の作製に成功したことを説明している。純化し、定量されたプラスミドがコンピテントセルＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、作製されたＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭＺＰ３形質転換体を新鮮なＬＢ培地の中で培養し、ＩＰＴＧで誘導した後、形質転換菌を収集した。その全菌体タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質電気泳動の結果、ＭＰ３遺伝子はＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の中で大量の発現が得られることが示された（図８のうちｂ）。発現を誘導した後の菌体を収集し、超音波で溶菌処理を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、発現を誘導したタンパク質のバンドに細菌溶解物の沈殿が存在することが示され、タンパク質が封入体の方式で発現したものであることを説明している。本実施例は封入体を純化する方法を用いて、タンパク質を溶解、洗浄、復元し、純度が比較的高いタンパク質を得た（図８のうちｃ）。
２．４  自己免疫疾患−卵巣炎の誘導
【００６９】
前記の純化したＭＺＰ３タンパク質の濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整し、等体積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と完全に乳化させ、足底および筋肉注射の方法で８〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫した。各マウス１００μｌとし、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）１００μｌを注射したマウスをアジュバント対照群とし、ＰＢＳ１００μｌを注射したマウスを陰性対照群とした。１４日後にマウスを処分し、卵巣を摘出し、ブアン固定液の中で２４時間固定した後、パラフィンで包埋し、連続切片およびＨ．Ｅ．（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）染色を行った。その結果、ＭＺＰ３タンパク質およびＣＦＡを免疫したマウス８匹のうち、７匹に程度の異なる卵巣炎が現れ、罹患率は８７．５％であった（図９ａ）。卵巣の間質、並びに成長中および成熟した卵胞の中で、いずれも炎症反応が認められた。卵胞は炎症細胞に浸潤され、卵子の喪失が重篤にもたらされた（図９ｂ）。これに比べ、ＣＦＡのみを注射したマウスには卵巣炎が認められなかった。
【００７０】
採集した血清について、抗ＭＺＰ３の抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した。１４日間免疫した後、対照群と比較し、血清中にＭＺＰ３抗体が現れ、抗体価は２５６００に達した（図９ｃ）。ＭＺＰ３タンパク質およびＣＦＡを免疫することによって、強烈なＴ細胞反応を引き起こし（図９ｄ）、サイトカインＩＬ−２（図１０ａ）、ＩＮＦ−γ（図１０ｂ）およびＩＬ−１２（図１０ｃ）の発現レベルが向上した。このことは、ＴｈＩ型の免疫反応が活性化されたことを示している。これらの結果は、卵巣炎の誘導に成功し、この方法の治療効果の評価に用いることができることを示している。
２．５  ＭＺＰ３  ＤＮＡおよびタンパク質の共免疫によりＡＯＤの発生の抑制
【００７１】
作製したＡＯＤモデルを用いて、共免疫の方法により卵巣炎を治療する能力を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＺＰ３タンパク質およびＣＦＡを足底および筋肉注射し、１４日後に、ＭＺＰ３タンパク質およびプラスミドｐｃＤｍｚｐ３を筋肉免疫し、２週間後に強化免疫した。２回の免疫の７日後に、卵巣炎の罹患状況を検査した。その結果、プラスミドｐｃＤｍｚｐ３およびＭＺＰ３タンパク質を同時免疫した（ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３と命名）マウスにのみＡＯＤの抑制現象が現れることが認められた（図１１ａ）。プラスミドのバックボーン配列または無関係なタンパク質など、非特異性因子の影響を排除するため、ｅｍｐｔｙプラスミドｐｃＤＮＡ３およびＭＺＰ３タンパク質共免疫（ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３と命名）、プラスミドｐｃＤｍｚｐ３およびＯＶＡタンパク質共免疫（ｐｃＤｍｚｐ３＋ＯＶＡと命名）を免疫した群を対照とした。その結果、対照群にはＡＯＤの抑制現象は現れておらず、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を同時免疫したマウスにしかＡＯＤの抑制を発生することができないことが説明され、こうした抑制は抗原特異性のものであることが説明された。組織学的分析によっても、ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３またはｐｃＤｍｚｐ３＋ＯＶＡを免疫したマウスの卵巣に炎症細胞浸潤が現れ、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を免疫したマウスの卵巣には炎症細胞浸潤が現れないことが示された（図１１ｂ）。
【００７２】
ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＮＦ−γの高レベルの発現は、ＴｈＩ型ＣＤ４＋Ｔ細胞反応の特徴であり、これらの免疫調節因子は、数種の自己免疫疾患において重要な作用を起こす[21-26]。ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を同時免疫したマウスのこれらのサイトカインの発現に変化が発生したか否かを測定した。ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３またはｐｃＤｍｚｐ３＋ＯＶＡを免疫したマウスのＩＬ−１２およびＩＮＦ−γの発現は抑制されていないが、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を免疫したマウスのＩＬ−１２（図１１ｃ）およびＩＮＦ−γ（図１１ｄ）の発現は抑制されている。これは、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を同時免疫したマウスに抗炎症免疫調節の機能が現れたことを暗示している。
【００７３】
Ｔ細胞反応は、ＡＯＤの発生に関与していると考えられているため、我々はマウスの脾臓から分離したＴ細胞を測定した。これらのマウスは、まずＭＺＰ３タンパク質およびＣＦＡを免疫され、１４日後にｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３、ｐｃＤｍｚｐ３、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＯＶＡおよびＭＺＰ３を免疫し、２週間後に強化免疫し、２回の免疫の７日後に脾臓を摘出した。これらのＴ細胞は、ＭＺＰ３タンパク質抗原の反応能力の分析に用いられた。ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を免疫したマウスから分離されたＴ細胞は、基本的に増幅能力がないが、その他の群から分離されたＴ細胞は強力な増幅能力が示された（図１１ｅ）。これらの結果は、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を同時免疫したものに現れたＡＯＤ抑制現象が、抗原特異性を有さないＴ細胞反応に関連していることを示している。さらに、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３を同時免疫したものに現れたＡＯＤ抑制現象は、炎症抑制因子の発現とＴ細胞反応発生の抑制によるものであることが説明される。総合すると、ＡＯＤの抑制は抗原特異性のものであり、ミスマッチの組み合わせのためにｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３の共免疫と同様の結果が発生していない。
【００７４】
ＭＰＺ３自己抗体は、自己免疫炎症反応の分布ガイドの面で重要な作用を起こしており、自己免疫疾患の重篤の程度を増強することができる[13]。そのため、次に、共免疫によって、抗ＭＺＰ３抗体の生成が抑制されているか否かを検査した。しかしながら、その結果、自己抗体の抗体価は、免疫群ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３、ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３またはＭＺＰ３の間で同じであることが示された（図１１ｆ）。この結果は、以前の研究と一致しており、Ｔ細胞反応がなければ、抗体を移すだけでは、自己免疫性卵巣炎疾患を誘導できない。
２．６  定性共免疫誘導の調節性Ｔ細胞の特徴
【００７５】
調節性Ｔ細胞は、Ｔ細胞反応を抑制し、自己免疫疾患の発生を阻止することができる。サイトカインＩＬ−１０およびＦＯＸＰ３は、Ｔ細胞反応の抑制プロセスにおいて重要な作用を起こす[27-29]。共免疫誘導の調節性Ｔ細胞が特徴的なサイトカインおよびマーカーを発現できるか否かを検査するため、それぞれｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３＋ＭＺＰ３、ｐｃＤｍｚｐ３、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３、ｐｃＤｍｚｐ３＋ＯＶＡおよびＭＺＰ３を免疫したマウスからＴ細胞を分離した。これらのサイトカインまたはマーカーは、特異性の蛍光標識の抗体を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで分析した。ｐｃＤｍｚｐ３＋ＭＺＰ３から分離されたＴ細胞は、ＩＬ−１０（図１２ａ）およびＦｏｘＰ３（図１２ｂ）を高レベルで発現することができたが、逆に、対照群は低レベルのＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３しか発現できなかった。転写因子ＦｏｘＰ３は、調節性Ｔ細胞の特徴的因子である[30,31]ため、共免疫が調節性Ｔ細胞を誘導可能であると推測した。この調節性Ｔ細胞がＣＤ４+ＣＤ２５+両陽性に属すものか否かを検査し、ＣＤ２５の発現状況を測定し、各群の間でＣＤ２５の発現は基本的に同じであることと示される（図１３）。
【００７６】
以上のデータを総合すると、同じ遺伝子のＤＮＡおよびタンパク質の共免疫を採用することによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５−調節性Ｔ細胞を誘導できる可能性がある。このＴ細胞は、抗原特異性のＴ細胞反応を抑制することができ、自己免疫疾患の発生を阻止することができる。
研究
【００７７】
本実施例においてＭＰＺ３  ＤＮＡおよびタンパク質によって調節性Ｔ細胞を誘導することを研究し、この調節性Ｔ細胞は自己免疫疾患の卵巣炎の発生を抑制することができることを証明した。この調節性Ｔ細胞の発現型は、ＣＤ４+ＣＤ２５Ｆｏｘｐ３+であり、ＩＬ−１０を発現し、抗原特異性Ｔ細胞反応を抑制し、サイトカインＩＬ−１２およびＩＮＦ−γの発現を減少することができる。
【００７８】
卵透明帯タンパク質は、哺乳動物において非常に保守的であり、マウスにおいてＡＯＤモデルを確立し、その他の動物、特にヒトの自己免疫疾患、卵巣炎の発病機序をよりよく理解することができる。１５のアミノ酸のＺＰＰ３の短いペプチド（３２８〜３４２）およびＣＦＡを足底および皮下注射することを介して、Ｂ６ＡＦ１マウス［（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  Ａ／Ｊ）Ｆ１］上に自己免疫疾患の卵巣炎を誘導したが[12,13]、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに卵巣炎の発生はなかった。ＭＺＰ３タンパク質およびＣＦＡを足底および筋肉注射することを介して、疾患の重篤の程度は以前発表されたものに及ばなかったが[13]、本実施例においてＣ５７ＢＬ／６マウスに卵巣炎モデルを確立することに成功した。以下の２つの原因によってこの差がもたらされたことが推測される。（１）使用したＭＺＰ３タンパク質は、さらに多くのＴ細胞エピトープを含み、これらの細胞エピトープがさらに強力なＴ細胞免疫反応を引き起こし、ＡＯＤはＴ細胞反応が引き起こしたものである。（２）皮下注射を筋肉注射に変更したことと、さらに多くのＢ細胞エピトープの誘導により、さらに高レベルの自己免疫抗体が生成された。自己免疫抗体は、Ｔ細胞媒介の炎症反応の分布を変えることができ、炎症反応を重くする。
【００７９】
天然の調節性Ｔ細胞ＣＤ４＋ＣＤ２５＋は、Ｔ細胞反応を抑制し、自己免疫耐性を維持することができる。調節性Ｔ細胞を除去すると疾患の発生を引き起こす[32,33,34]ため、これらの細胞は、自己免疫疾患の発生の阻止において重要な役割を果たす。これらの特徴によって、調節性Ｔ細胞は潜在的な自己免疫疾患の治療手段となっている[30]。最近のいくつかの研究の結果、調節性Ｔ細胞は自己免疫疾患を確実に治療することができ、これらの調節性Ｔ細胞は抗原非特異性のものであっても[36-38]、抗原特異性のものであっても[18,39]よいことが示されている。以前、ｐｃＤ−ＶＰ１および１４６Ｓ抗原を同時免疫しＴ細胞反応免疫抑制を誘導したことを発表した[19]。この研究において、当該方法を用いてＡＯＤを抑制し、ＭＺＰ  ＤＮＡおよびタンパク質を同時免疫した。抗原特異性のＴ細胞反応が抑制され、サイトカインＩＬ−１２およびＩＮＦ−γの発現も抑制された。しかし、ＩＬ−１０およびＦｏｘＰ３の発現レベルは上昇したため、抗原特異性の調節性Ｔ細胞を誘導した可能性があると推測された。ＣＤ２５の染色の結果、誘導されたこの調節性Ｔ細胞はＣＤ２５−である可能性があることが示された。そのため、同時免疫によって抗原特異性の免疫抑制が誘導され、この免疫抑制はＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３＋ＩＬ１０＋調節性Ｔ細胞媒介であるとの結論が得られた。
【００８０】
総合すると、自己免疫疾患を改善する新しい方法が証明される。新しい調節性Ｔ細胞は、抗原特異性のＴ細胞免疫抑制によって誘導され媒介された可能性がある。そのため、関連する機序をさらに研究することによって、ヒトと動物の自己免疫疾患の治療について、新しい方法を開発できる可能性がある。
【００８１】
この実施例における参考文献の出所は次のとおりである。
１  鄒邵林、郭聡、劉新平「洞庭湖地区中州の環境の変化の東側のノネズミの爆発的増加に対する影響」［Ｊ］『自然災害報』，第９巻２期２０００年５月１１８−１２２。
２  包維楷ら「生態回復再建研究と発展の現状および存在する主な課題」［Ｊ］『世界科学技術の研究と発展』第２３巻１期４４−４８。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【実施例４】
【００８２】
共免疫の方法を採用して多発性硬化症を治療／予防する
【００８３】
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）は、中枢神経系の炎症性脱髄疾患の代表であり、自己免疫疾患に属する。ＭＳの研究で最もよく見られる動物モデルは「実験的アレルギー性脳脊髄炎」（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）と呼ばれる。動物のＥＡＥの臨床症状および病変は多発性硬化症に極めて相似しているため、ＥＡＥ動物モデルの確立に成功することは、ＥＡＥ研究の前提条件である。
【００８４】
本試験の主題の目的は、併用免疫によって引き起こされる免疫抑制に基づき、マウスのＥＡＥモデルに基づきＥＡＥの治療または発生の予防を行い、研究プロセスにおいて、ＭＳ発病の関連免疫機序をさらに研究することである。
【００８５】
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）の自己タンパク質抗原には、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）と２種のミエリン抗原（ＭＢＰおよびＰＬＰプロテオリピドタンパク質）がある。
【００８６】
これまでの試験の結果は、ＥＡＥマウスモデルの誘導および関連ＭＯＧ遺伝子ＤＮＡの作製に限り、さらなる展開を見せておらず、初歩的な結果は下記のとおりである。
１、ＭＯＧ３５−５５  ２コピーの遺伝子のクローンと発現
１．１  材料と試薬
【００８７】
ｐＭＤ１８−Ｔシークエンシングベクターはタカラ社から購入し、大腸菌ＤＨ５α菌株は、我々の試験所の貯蔵菌種である。ＰＣＲ生成物回収試薬キット、ＤＮＡマーカー、制限性エンドヌクレアーゼ、ｅｘＴａｑ酵素およびＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲプライマーは、いずれもタカラ社から購入した。シークエンシング試薬キットは、米ＰＥ社から購入し、その他の試薬はいずれも分析用とする。
１．２  方法
１．２．１  ＭＯＧ３５−５５遺伝子のクローン
【００８８】
動物のＥＡＥモデルの誘導でよく用いられる自己抗原はＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の３５−５５個のアミノ酸（アミノ酸配列は、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）であり、そのＤＮＡ配列は
【化４】
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である。
【００８９】
遺伝子配列に基づき、プライマーおよびＤＮＡ断片を設計して合成し、Ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ法で２コピーのＭＯＧ３５−５５のプラスミドＤＮＡを作製した。
【００９０】
Ｏｖｅｒｌａｐ  ＤＮＡ断片の設計：
【化５】
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プライマーの設計：
【化６】
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【００９１】
ＰＣＲ反応は設計したＤＮＡおよびプライマーを用い、増幅パラメータは、９４℃２分間；９４℃３０秒間、６０℃４０秒間、７２℃３５秒間、３５サイクル；７２℃１０分間とし、反応生成物にアガロースゲル電気泳動測定を行った。タカラ社ＰＣＲ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔの取扱説明書に基づきＰＣＲ生成物の回収を行った。回収したＭＯＧ３５−５５  ２コピーの断片とｐＭＤ  １８−Ｔベクターは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの作用下１６℃で１晩置き、ｐＭＤ  １８−Ｔのベクター上に結合した。作製したプラスミドをＴ−ＭＯＧ３５２ｃと命名した。結合生成物をＤＨ５α菌株のコンピテントセルに形質転換した。プラスミドを小量抽出し、ＥｃｏＲＩ  ＩおよびＨｉｎｄ  III 二重制限酵素切断を用いて組換えプラスミドの同定を行い、制限酵素切断反応の終了後にアガロースゲル電気泳動同定を行った。クローンのＤＮＡ配列を同定するため、組換えプラスミドに対して純化を行い、さらに配列分析した後、ＤＮＡＭＡＮソフトウェアで結果を分析した。
１．２．１  真核細胞発現ベクターの構築および組換えプラスミドのＢＨＫ２１細胞における一過性発現
【００９２】
配列分析が正確なプラスミドを、ＢａｍＨ  ＩおよびＨｉｎｄ  III 二重制限酵素切断を経て、同様に制限酵素切断した真核発現ベクターｐＶＡＸ１に結合し、前記ベクターをｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃと命名し、正確な組換えプラスミドの配列同定を経て、真核トランスフェクション試験を行った。具体的なトランスフェクション方法は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの製品取扱説明書を参照した。リポソームトランスフェクション法でｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃをＢＨＫ２１細胞にトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションしてから４８時間後に細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出して、ＭＯＧ３５  Ｐ１およびＭＯＧ３５  Ｐ２をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子の発現を測定した。
１．３  試験結果
【００９３】
プラスミドＴ−ＭＯＧ３５２ｃの制限酵素切断同定の結果は、図１４に示すとおり。プラスミドｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃの制限酵素切断同定の結果は、図１５に示すとおり。プラスミドｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃのＢＨＫ２１細胞における一過性発現の結果は、図１６に示すとおり。
２、ＥＡＥ動物モデルの誘導および同定
２．１  直接免疫の方法：
【００９４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、フロイント完全アジュバントを用いて充分乳化した短いペプチドＭＯＧ３５−５５  ２００μｇ（１μｇ／μｌ，２００μｌ，かつ結核菌ＢＣＧ  ７５０μｇを含む）を背部に皮下免疫したとともに、免疫の０、２日後に百日咳菌（１０8-１０9個）を尾静脈注射し、７日後に１回ＭＯＧ  ２００μｇを強化免疫した。
評価基準：
０−いかなる臨床症状もない。
１−動物の尾部の脱力、麻痺
２−動物の尾部の脱力、前肢または後肢の中等度の脱力。
３−前肢または後肢の重篤な脱力、人為的に仰臥位にした後に元に戻ることができない
４−肢体の麻痺、人為的に仰臥位にした後に元に戻ることができない
５−瀕死状態。
【００９５】
結果は図１７のとおり（色の違いはマウスの固体の違いを表す）：４０日後の比較的重篤な罹患率（罹患指数＞２）は７０％に達した。
☆最後に免疫したロット（２０匹）は、最初の免疫の後５週間で４まで罹患したものが４匹いた。
２．２  罹患したマウスのＴ細胞誘導モデルの養子移入
【００９６】
図１８は、陰性マウスに、罹患したマウスの脾臓由来のＴ細胞を養子移入した後、ＣＦＡアジュバント乳化したＭＯＧ抗原２００μｇを１回皮下免疫したものである。
【００９７】
図１９は、陰性マウスに、罹患したマウスのリンパ節由来のＴ細胞を養子移入した後、ＣＦＡアジュバント乳化したＭＯＧ抗原２００μｇを１回皮下免疫したものである。
【００９８】
結論：リンパ節由来のＴ細胞を養子移入したものは、脾臓由来のＴ細胞のマウスに比べ罹患が早く、症状の変化が安定していた。しかしながら、脾臓Ｔ細胞を移入したマウスの罹患指数の方が高かった。
２．３  罹患したマウスの生理指標の測定
【００９９】
図２０は、マウスの発病を誘導した後の自己ＭＯＧ抗原に対するＴ細胞の増幅状況である。
【０１００】
結論：罹患したマウスの末梢免疫器官には、自己抗原ＭＯＧに対する強烈なＴ細胞増殖反応が認められた。
【０１０１】
図２１は、マウスの発病を誘導した後の自己ＭＯＧ抗原に対するＴ細胞内部のサイトカインを発現した状況である。
３、ＥＡＥマウスの併用免疫治療
３．１  起案
【０１０２】
２．１の方法に基づき、Ｃ５７マウスを用いてＥＡＥモデルを誘導し、すべてのマウスの臨床指数が３以上のレベルに達するまで臨床症状を記録した。罹患したマウスは次のとおり割付け、それぞれ免疫を行った。免疫方法は筋肉注射とした。
１、ＭＯＧ３５−５５ペプチドｌ００μｌ（フロイント完全アジュバントと１：１で混合し、濃度１μｇ／μｌまで完全に乳化させる）
２、ｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃプラスミドＤＮＡｌ００μｌ（濃度１μｇ／μｌ）
３、ｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃＭＯＧ３５−５５ペプチド＋ｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃそれぞれｌ００μｌ（濃度は同上）
４、ｐＶＡＸＭＯＧ３５２ｃＭＯＧ３５−５５ペプチド＋ｐＶＡＸ−ｉｎｓｕｌｉｎそれぞれｌ００μｌ（濃度は同上）
５、不治療群
【０１０３】
１４日後に１回強化免疫した。
【０１０４】
１回目の治療免疫から臨床発病症状を観察して記録し、採点した。強化免疫の７日後に、無菌で各試験群のマウスの脾臓を摘出し、ＭＴＴ法でＴ細胞増幅試験を行った。同時にマウスの大脳、小脳、脊髄を抽出し、４％パラホルムアルデヒドで組織を固定し、組織切片の作製を行い、病変の状況を顕微鏡による検査した。
【０１０５】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＦｏｘＰ３、ＩＬ−１７、ＴＧＦなどのサイトカインの測定：脾臓細胞サイトカインの発現状況および脳脊髄液におけるサイトカインの発現状況の２種類に分けた。
【０１０６】
本試験に引き続いて行なわれるべき試験は、動物モデルにおいて、健全な基礎の上で免疫学的試験を行い、共免疫の応用を検証することである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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