(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部プレート、底部プレート、及び互いに概ね平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極、及び電極間で分離媒体を移動させる流体移動システムを有する電気泳動チャンバに分離媒体及び試料を配置する工程、
電気泳動で粒子を操るのに有効な電圧を電極間にかける工程、
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を、電極の方向と概ね平行な第一の方向へ移動させる工程、
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を、第一の方向と概ね反対の第二の方向へ移動させる工程
を含み、かつ１つの分離空間内で第一の方向への移動と第二の方向への移動が行われる、粒子を分離する方法。
【請求項２】
さらに、単数又は複数の流出口を通じて電気泳動チャンバから分離媒体及び試料を溶出させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を分離空間から、個別の回収キャビティ中に溶出させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第一又は第二の方向と同じ方向に分離媒体及び試料を移動させることにより、分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を流出口の方向へ溶出させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
分離媒体及び試料を電気泳動チャンバから溶出させる前に、電気泳動で粒子を操るのに有効な電極間の電圧を取り除く工程を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
電圧をかけている間は、上部プレート及び底部プレートが、電極及び互いに対して固定されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上部プレートと底部プレートの間の分離空間が、０．０１〜１．５ｍｍの厚さを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１回のサイクルが、
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を電極の方向と概ね平行な第一の方向へ移動させる工程、及び
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を第一の方向と概ね反対の第二の方向へ移動させる工程
を含み、そして
サイクルの回数が１回以上であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サイクルの回数が２〜１０回である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、向流媒体を分離空間中に導入して、分離空間中を移動させる工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
電場の方向が、分離媒体の移動の方向と実質的に垂直であり、かつ上部及び底部プレートと実質的に平行である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
アノード安定化媒体をアノードと分離媒体の間に配置し、そしてカソード安定化媒体を電気泳動チャンバ内のカソードと分離媒体の間に配置する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
分離媒体が、少なくとも１種のバッファー酸及び少なくとも１種のバッファー塩基を含む、無担体の水性媒体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
多数の試料を電気泳動チャンバに配置すると同時に、電気泳動で分離する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上部プレート、底部プレート、及び互いに概ね平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極を有する電気泳動チャンバ、
第一の流速で、電極の方向と概ね平行な第一の方向に、電極間に分離媒体及び試料を導入することができるように構成された第一の流体移動システム、並びに
第二の流速で、第一の方向と概ね反対の第二の方向に分離媒体を導入することにより、分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を、１つの分離空間内で第一の方向と第二の方向の間で周期的に移動させることができるように構成された第二の流体移動システム
を含む、粒子を分離する装置であって、第一の流体移動システム及び第二の流体移動システムは、第一の流速：第二の流速の比が１：１０〜１０：１になるように構成されている、前記装置。
【請求項１６】
上部プレート、底部プレート、及び互いに概ね平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極を有する電気泳動チャンバ、並びに
第一の流速で、電極の方向と概ね平行な第一の方向に、分離媒体及び試料を電極間に導入できるように構成され、かつ第二の流速で、第一の方向と概ね反対の第二の方向に分離媒体を導入することにより、分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を、１つの分離空間内で第一の方向と第二の方向の間で周期的に移動させることができるように構成された流体移動システム
を含む、粒子を分離する装置であって、流体移動システムは、第一の流速：第二の流速の比が１：１０〜１０：１になるように構成されている、前記装置。
【請求項１７】
上部プレート及び底部プレートが、電極及び互いに対して固定されている、請求項１５又は１６に記載の装置。
【請求項１８】
請求項１５に記載の装置の第一の流体移動システム又は請求項１６に記載の流体移動システムが、多チャンネルポンプを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
さらに、請求項１５に記載の装置の第一の流体移動システム又は請求項１６に記載の流体移動システムを使用して、分離空間からの分離後に試料を除去する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
第二の流体移動システムが、多チャンネルポンプを含む、請求項１５及び１７〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
２個の流体移動システムが、ともに単一の多チャンネルメディアポンプによって供給される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
さらに、流体移動システム及び／又は電極間の電流の流れを制御できるように構成されたコントローラーを含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
さらに、冷却部及び該冷却部によってチャンバの温度を制御できるように構成された温度コントローラーを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
さらに、試料の分離されたフラクションを分離空間から、個別の回収キャビティ中に移動させることができるように構成されたフラクション回収流出口を含む、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
コンピュータ可読媒体に記録された、電気泳動チャンバ中の粒子の分離を達成するためのコンピュータ実行ソフトウェアコードであって、
電気泳動チャンバが、上部プレート、底部プレート、及び互いに概ね平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極、及び電極間で分離媒体を移動させる流体移動システムを有し、
電気泳動で粒子を操るのに有効な電圧を電極間にかけることを可能にするコード；
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を電極の方向と平行な第一の方向に移動させることを可能にするコード；
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を第一の方向と反対の第二の方向に移動させることを可能にするコード；並びに
分離媒体及び試料の混合物の少なくとも一部分を第一の方向に移動させることを可能にするコード
を含み、かつ１つの分離空間内で第一の方向への移動と第二の方向への移動が行われる、コンピュータ実行ソフトウェアコード。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は無担体の偏向電気泳動に関し、それを実行する装置及び方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
無担体の偏向電気泳動（偏向電気泳動）の基本原則は、特に連続運転の方法に関して、過去３０年に亘って文献に記述されている。この方法は時に用語FFE(フリーフロー電気泳動)又はより一般的にはCFE(連続フロー電気泳動)によって記述されている(K. Hannig：「Carrier-free continuous electrophoresis and its application」, Anal. Chem. 181, p. 233 (1961年)；M. C. Roman及びP. R. Brown：「Free Flow Electrophoresis」, Anal. Chem.  66(N2), p. 86-94 (1994年)；R. Braun, H. Wagner及びG. Weber：「Preparative Free Flow Electrophoresis-a powerful procedure for separating natural substances」 GIT Fachzeitschrift feur das Laboratorium, 39(1995年), p. 317-322)。
【０００３】
一般に、FFE分離法を使用して、生体粒子までの任意の分子量のイオンを分離する。その際には、分離されることになる試料自体が帯電しているかどうか、又は帯電がイオンの付加及び収着によって起こるかどうかは重要でない。
【０００４】
無担体の偏向電気泳動は、主に連続フリーフロー電気泳動(CFFE)と呼ばれる連続的プロセスに昔から使用されていた。ゲルなどの支持担体がない本方法は、可溶性及び不溶性の両方の成分の分離、分画、及び単離を実現することが可能である。分離された試料成分の単離を可能にする他の方法と比較すると、一般に連続フリーフロー電気泳動は３つの主要な利点を提供する。（ｉ）試料が液体培地に／追加の処理に直接使用できる溶液に保持される。（ｉｉ)分離を連続的に行ない、１時間に数百ミリグラムさらには数百グラムもの量の純物質を得ることを可能にする。（ｉｉｉ）分離が穏やかであり、分離された成分の酵素活性を保存する。
【０００５】
ＦＦＥの技法は、複合タンパク質の分離および分画に特に有用であり、よって学術的及び薬学的な研究並びに生物工学全般及び臨床診断の市場で益々重要になりつつあるプロテオミクス（proteomics）という新興分野に応用可能である。例えば、プロテオームの（proteomic）研究の発展に伴って、タンパク質分離性能及び分解能（特に、分解プロセスの信頼性に関して）並びに汎用フロントエンドの向上の需要が高まっていた。後の分析又は追加の分離／分画工程の前にある汎用フロントエンド分離システム及び方法の需要もあった。
【０００６】
FFEの分野の改良は実現している。例えば、連続的な偏向電気泳動(又は連続フリーフロー電気泳動)の方法は、安定化媒体及び向流媒体によって改良された。これは、例えば米国特許第5,275,706号明細書に反映され、この開示は、その全体が参照により本明細書に含まれる。この特許文献によれば、向流媒体は、大半の分離媒体及び電極間を進む試料の連続的な流れの方向に逆行して分離空間に導入される。両媒体(分離媒体及び向流媒体)は、分画流出口から主にマイクロタイタープレート中に放出又は溶出されて、結果として低空隙容量を有する分画プロセスになる。さらに、分画流出口の領域で媒体の層流が維持される(すなわち、乱流が非常に少ない又はない状態である)。
【０００７】
さらに、フリーフロー偏向電気泳動は、不連続的に又はインターバル（interval）プロセスで実行されていた。例えば、不連続的な偏向電気泳動の方法は米国特許第6,328,868号明細書に見られ、その開示は参照により本明細書に含まれる。この特許では、試料及び分離媒体は共に電気泳動チャンバ中に導入され、次にゾーン電気泳動、等速電気泳動、又は等電点電気泳動などの電気泳動モードを使用して分離され、最終的にチャンバから分画流出口を通じて追い出される。第6,328,868号の特許発明の実施形態では、試料及び媒体が流入口端から流出口端へ流体的に動かされていない内に電気泳動を起こす電圧を効果的にかけた状態では、分離媒体及び試料の動きが一方向であり、チャンバの流入口端から流出口端へ移動していくことが記述されている。第6,328,868号の特許発明の実施形態を図1に示す。
【０００８】
各実験的目標が他よりもこのプロセスが適するものを与える要因及び必要性又は仕様を有する特定の条件に、FFEの両方の上記の例(すなわち、連続及び不連続又はインターバルモード)を使用できる。そのような要因としては、分離されるための試料、必須の又は望ましい分離時間、試料寸法、望ましい分離分解、チャンバ寸法などの選択が挙げられる。これらの及び他の要因は、分離のモード並びに使用される装置、特定の方法、技術、及び組成に影響する。単数又は複数のこれら上記要因が、特定の条件及び実験又は分離目標を前提として両方(連続又は不連続)をユーザーが利用できるときに、どの操作のモード(連続又は不連続)を選択するかについて影響するか分からない。注目するべきは、フリーフロー電気泳動を使用しながら、操作の連続及び不連続(又はインターバル)モードの両方において、それぞれには他の分離又は分画の方法論及び技術と比較したときに多くの利益があり得るということである。それにもかかわらず、常に改良が望まれている。
【０００９】
多数の文献に、連続フリーフロー偏向電気泳動の分離中にいわゆる検体の「バンドの拡大」に寄与する物理的又は電気化学的影響が記述されている(J. A. Giannovario, R. Griffin, E. L. Gray：「A mathematical model of free-flow electrophoresis」 Journal of Chromatography, 153, p. 329-352 (1978年)；F. G. Boese：「Contribution to a mathematical theory of free-flow electrophoresis」J. Chromat. 483, p. 145-170 (1988年)；K. Hannig及びH. G. Heidrich：GIT Verlag Darmstadt ISBN 3-921956-88-9の「Free-Flow Electrophoresis（1990年）」)。
【００１０】
連続FFE固有のこれらの影響の中で最も重要なのは、
１．層流プロファイルによるバンドの拡大、
２．熱対流によるバンドの拡大、
３．電気的浸透作用によるバンドの拡大、
４．動電効果によるバンドの拡大
である。
【００１１】
十分に高いイオン強度の適切なイオン成分を有する分離媒体を用いるとともに、試料の濃度を過剰に増やさないことによって、ここまで説明したような全動電効果の悪影響を最小限に抑えるか、解消することができる。
【００１２】
電気的浸透作用の悪影響を最小限に抑える多数の方法（例えば、適切な壁原料の選択(ガラス又は石英の代わりにプラスチック)、又は最適なのは電気的浸透作用を排除する表面活性試薬を分離媒体に加えること）がある。この方法は文献では「直接コーティング」と呼ばれている。
【００１３】
電気泳動チャンバを鉛直ではなく水平に配置して操作することによって、熱対流の悪影響を非常に容易く減らすことができる。さらに、分離プロセス中は電気泳動チャンバを一定温度に適切に冷却して維持することにより、熱の影響を最小限に抑えられる。
【００１４】
十分に長い分離時間が選択されている限りは、層流プロファイルの悪影響は連続的な等電点電気泳動(IEF)において観測されず、それは検体の電気移動も可能にし、その検体は電気泳動チャンバの溝の中央に最高の線速度で運ばれる。
【００１５】
一方で、この悪影響は、電気泳動プロセスの場合に極めて重大である。境界面又はその付近で電気泳動チャンバの壁へ移動する検体は、電気泳動チャンバの溝の中央の検体よりもかなり長い時間をかけて電気泳動チャンバを通過するので、それらのより長い滞留時間のために明らかに大きく偏向する。この影響によって、電気泳動の方向のテーリングとして検出可能なバンドの拡大が生じる。
【００１６】
無担体電気泳動の境界条件下で連続的に実行されている電気泳動プロセスを考慮すると、低分子の検体については層流プロファイルの悪影響を回避できる筈がない。検体の泳動距離が増えるにつれてバンドの拡大の絶対値も増える。粘度が増加した分離媒体を使用することによりそれらの泳動に影響を与えて検体の拡散速度を減少させても、層流プロファイルの好ましくない性質を拡大するから、役に立たない。
【００１７】
生体粒子を分離する場合には、非常に低い拡散のために粒子が10分未満の保持時間中には電気泳動チャンバ壁の領域に入ることはできないから、電気泳動チャンバの溝の中央への試料供給が定量的に減少することによって、結果として分解が進むことがある。しかしながら、層流プロファイルの影響は、試料供給速度を(例えば、分離媒体の流速の僅か０．１%〜0.5%である試料の流速に)はっきりと減少させる方法によってのみ最小限に抑えられる。
【００１８】
本技術分野で知られる連続FFE操作モードと比較して、米国特許第6,328,868号明細書に記述されているようなインターバルFFEモードは、電気泳動プロセスにおいて観測される層流プロファイルの悪影響を避けることができる。
【００１９】
しかしながら、本技術分野ではフリーフロー電気泳動法をさらに改良する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
それ故に、本発明の目的は、連続フリーフロー電気泳動分離に固有の層流プロファイルの影響を解消し、さらに分離能を増加させる及び／又は一巡時間を減らす若しくは電気泳動分離の高い分解能を得るのに必要な分画時間を減らす、無担体偏向電気泳動の方法を提供することである。本願発明の方法及びデバイスを調整用及び分析用分離の両方に使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、第一の態様では、本願発明は、粒子を分離する方法であって、上部プレート、底部プレート、及び互いにほぼ平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極、及び電極間で分離媒体及び試料粒子を移動させる流体移動システムを有する電気泳動チャンバに分離媒体及び試料を配置する工程、電気泳動で粒子を操るのに有効な電圧を電極間にかける工程を含み、そして分離媒体及び試料の少なくとも一部分を、電極の方向と概ね平行な第一の方向へ、そして次に第一の方向と概ね反対の第二の方向に移動させることを特徴とする方法に関する。
【００２２】
ある実施形態では、粒子を分離する方法は、上部プレート、底部プレート、第一のチャンバ端、第二のチャンバ端、及び互いに概ね平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極（電極はチャンバ端のそれぞれに向かって縦方向に伸びている）、及び第一及び第二のチャンバ端の間で分離媒体を移動させる流体移動システムを有する電気泳動チャンバに分離媒体及び試料を配置する工程、電気泳動で粒子を操るのに有効な電圧を電極間にかける工程、分離媒体及び試料の少なくとも一部分を第一のチャンバ端の方向に移動させる工程、分離媒体及び試料の少なくとも一部分を第二のチャンバ端の方向に移動させる工程(すなわち、大きな流れの反転)、そして所望により、例えば、流入口と反対のチャンバ端に位置している単数又は複数の流出口から試料及び／又は分離媒体の少なくとも一部分を一掃する又は溶出させるために、分離媒体及び試料の少なくとも一部分を第一のチャンバ端の方向に移動させる工程を含む。本願発明に関して「概ね平行」とは、分離媒体(例えば、水)中の少なくとも非帯電の粒子の大きな流れの方向が、長い電極と基本的に平行であることを意味する。しかしながら、当業者であれば、さらに電気泳動チャンバ内の帯電種(すなわち、分離媒体中の試料又はイオン)が電極間の電界によって偏向し、それによってカソード又はアノードの方向に移動するか、さらには電極と平行に電気泳動チャンバの流入口又は流出口端の方向に移動することは理解できるであろう。FFE装置内での分離中の粒子の動きは、さらに後段でより詳細に説明されている。
【００２３】
本願発明は、電気泳動分離の性能について、そして長期の安定性についてはっきりとした向上を示し、他の分離法と比べたときに電気泳動分離の高分解を達成する速度を向上させる。さらに、本願発明の方法は、電気泳動分離に使われるFFEデバイスの設計に関する多様性も増加させる。ここで開示された実施形態は、ゾーン電気泳動、等電点電気泳動及び等速電気泳動などの、本技術分野で通常は知られている上述の連続的な又は静電インターバルのフリーフロー電気泳動アプリケーションを用いて通常は実行されている大半の分離プロトコルに適用できる。
【００２４】
典型的には、化学的及び物理的不連続性が、分離領域を横断する電気泳動チャンバにあり、そして媒体の泳動境界と隣接する領域の液体の乱流源としてよく知られている一方で、非泳動境界(安定化媒体と分離媒体との間の境界など)は、(高電界強度又は高電流によって)分離プロセスのみに電流を流しすぎた場合に乱流を引き起こすであろう。概ね固定されている電気泳動チャンバ壁に対して分離媒体が分離セル内を前後に線運動するベクトルで与えられる、せん断力によって泳動境界での乱流を実質的に減少できることが今や分かっている。概ね固定されている電気泳動チャンバ壁に対して分離セル内を往復する周期的前後運動を、本書では周期的フリーフロー電気泳動又は、代替的に、周期的インターバルのフリーフロー電気泳動と呼ぶ。
【００２５】
本願発明のために、周期的FFEは、少なくとも１回の完全なサイクル(すなわち、分離媒体及び試料を試料媒体の流入口から離してFFE装置の反対の端へ移動させる工程、次に第二の(典型的には反対の)方向、すなわち、FFE装置の流入口端の方向へ試料及び分離媒体を移動させる工程)を含む。試料粒子の電気泳動分離が達成されるサイクルに加えて、さらに周期的FFEは、試料及びバルク分離媒体を溶出させるために、方向をFFE装置の流出口端に向けて再び変える段階を含んでよい。同様に、流出口が装置の流入口又はその付近に位置しているときに、１回の完全なサイクルは、流れ方向の単純な転換、すなわち、分離媒体及び試料をFFE装置の第一の方向に移動させる工程、次に試料及び分離媒体を流入口向きの第二の(典型的には反対の)方向に移動させ、そして今回であればFFE装置の流出口端にも移動させる工程によって特徴付けられる。上記サイクルをさらに後述するように複数回繰り返してよいし、或いは一度だけ行なっても良い。好ましくは、単数又は複数の流出口から試料及びバルク分離媒体を除去する／溶出させることにより、本方法を補完する。
【００２６】
好ましい実施形態では、サイクルの回数は、１回よりも多く、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回以上であり、そして試料又は少なくともそのフラクションがFFE装置の流出口端に集まる前に試料を十分に分離するために選択される。当業者には当然であるが、試料及びバルク分離媒体を前後に移動させるサイクルの回数は、特に試料寸法、分離の質、試料の電気泳動移動度などの、複数の要因によって決まるであろう。
【００２７】
電気泳動移動度(EM)とは、本書では、水性媒体における単位時間当たりの所定の電界強度での電界中のアニオン及びカチオンの泳動速度を意味する。電気泳動移動度ｕは次のように算出してよい。
ｕ＝ｓ／Ｈ×ｔ
式中、ｓは泳動の距離(ｍ)を表し、Ｈは電界強度(Ｖ／ｍ)を表し、そしてｔは時間(秒)を表す。
【００２８】
フリーフロー電気泳動（例えば、等速電気泳動(ITP)、ゾーン電気泳動(ZE)及び等電点電気泳動(IEF)）の既知の分離モードのいずれかとともに、本願発明の実施形態による新規の方法及び装置を用いて、分離の質の改良を達成する。具体的には、実施例において、周期的インターバルFFEの利点が、周期的FF等速電気泳動及び周期的FFゾーン電気泳動(ZEの代わりである。図5及び6を参照)の場合に最も重要かつ意外なものであることが示されている。
【００２９】
上記のように、Weberの米国特許第6,328,868号明細書には、一般的なインターバルの態様の電極間に担体を含まない又は自由溶液の電気泳動を行なう方法が記述されている。通常、第6,328,868号の特許発明に記述されているインターバルモードは、試料及び分離媒体を一方向に導き、溶出させる。この方向は、キャピラリーを通る電界と同じ方向に試料が動く従来の(ゲル及び担体を含まない)キャピラリー電気泳動とは異なり、電極の長手方向と共通する。第6,328,868号の発明の一の典型的な実施形態を示している５個の段階(段階０〜段階４)からなる実施例を図1に示す（それぞれ図1a〜1eによって示されている）。図1aに示した通り、段階０は、流れオン及び電圧オフの状態で試料及び分離媒体を電気泳動チャンバ中に導入する工程を構成する。図1bに示した通り、段階1は電圧をオフに保ち、そして試料及び分離媒体の大きな流れは止まっている(流れオフ)。図1cに示した通り、段階2は大きな流れオフを保っているが、電極に電圧をかけて電気泳動分離を起こす。図1dに示した通り、段階3は電圧オフにするが、試料及び分離媒体の大きな流れを、分離媒体が導入された流入口と反対の流出口の方に向けさせる。最後に、図1eに示した通り、段階4は大きな流体の流れ及び電圧をオフにする。次に、もし望むなら段階0〜4を繰り返してよい。
【００３０】
第6,328,868号の発明の場合には、ポンプ又は電極間の電気泳動チャンバの幾つかの他の流体移動部品によって起こる試料の移動及び加速は、電圧がオフのとき又は少なくとも電圧が電気泳動に効かないとき、すなわち、試料のどの部分も有効な電気泳動の電界強度を受けていないときに起こる。さらに、第6,328,868号の発明においてバルク試料及び媒体の絶対変位は、試料流入口から始まり試料流出口で終わる方向のみで発生する。第6,328,868号の発明の方法及び装置のこれら二つの特性並びに他の要素は、本願発明において改良された。
【００３１】
多数の実験から本願発明の実施形態の周期的インターバルモードには新FFEプロセスの多くの利点が観測された。
【００３２】
第一に、試料及び分離媒体は電気泳動分離段階中に動いているから、より高い電界強度をかけることが可能である。より高い電界強度を考慮すれば、新規の周期的インターバルFFEプロセスは高性能を提供することになり、Weberの米国特許第US 6,328,868号明細書に記述されている方法に固有の処理時間と同じ持続時間と仮定すると、検体のより良好な識別に使用できる。また、この新規の方法は、連続的又は標準的なインターバルフリーフロー電気泳動法と比較したときに、検体の識別性能は等しいが、処理時間の持続が減少しても実行できる。後者の利点は、例えば臨床プロテオミクスに使用される電気泳動プロセスに適するであろう確かな分離のより高い処理量を可能にする。
【００３３】
第二に、全ての従来の連続FFE分離法及びプロトコルを周期的インターバルフリーフロー電気泳動プロセス用に容易に取り入れてよい。
【００３４】
第三に、本願発明の実施形態の方法及び装置は、バルク試料の流れの定期的な反転のために、チャンバ中の試料の電気泳動分離の持続時間を延長させる。例えば、ポンプで制御された、バルク試料及び分離媒体の流速が最低である連続フリーフロー電気泳動機には、粘度、ポンプ流速、チャンバの形状、流入口から流出口までの長さの関数である運動の最小持続時間がある。連続フリーフロー電気泳動法と異なり、同じ最低流速、粘度、チャンバの形状、及び流体の流れを逆転させる能力を備えた、本願発明の実施形態の周期的インターバル法は、試料流入口と流出口との間の運動の持続時間を延ばせる。このようにして、例えばFF等電点電気泳動の場合が特に強力で有用である分離の時間を延長する機会を与えられる。周期的インターバルモードの試料を前方及び逆方向に繰り返して往復させてよいから、電極間の試料の有効な運動の長さを無制限に延長できる。分離された粒子の運動の時間又は距離が延長されると、結果として検体のより良好な泳動、特に比較的低い電気泳動移動度を有するものにつながる。
【００３５】
第四に、幾何学的形状及び断面に多くの異なる選択肢がある分離チャンバに、新規の周期的インターバルフリーフロー電気泳動プロセスを利用できる。したがって、これは、小型化された電気泳動チャンバのFFEをどのように実施できるかについて多様性を与えることができ、単数又は複数の電極対の間に入れられた溶出用試料流出口の望ましい数に応じて、その形状及び寸法を変えることができる。さらに、試料及び分離媒体の量を調整して分画及び／又は検出しなければならない試料寸法又は試料及び検体濃度を計上できるように、電極の長さを制御又は設計してよい。
【００３６】
これまではフリーフロー電気泳動分離技術に活かせなかった特定の用途に本願発明の実施形態の新規の周期的インターバルFFEモードを使用できる。例えば、電気泳動の速度が低めの状態のタンパク質イソフォームの分離及び単離を達成するのは困難であった。ここで説明した方法によって、例えば、そのようなイソフォームの単離はここで開示された周期的インターバルフリーフロー電気泳動モードを用いて達成できるが、そのモードは歴史的には本技術分野にある連続FFEプロセスを用いても成立させられなかった、さらに、各種の異なる試料につきものの多くの他の分離の課題は、本願発明の新規の周期的インターバルFFEモードを用いて首尾よく解決した。
【００３７】
下記の説明及び添付の図面は本願発明の幾つかの実施形態を例示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】先行技術のインターバルフリーフロー電気泳動を実行する工程を示す図である。
【図２】本願発明の実施形態を実行する工程を示す図である。
【図３】本願発明の実施形態のフリーフロー電気泳動を実行するのに適したFFE装置を示す図である。
【図４】図4a及び4bは、本願発明の実施形態のフリーフロー電気泳動を実行するのに適した別のセットアップ実施形態を示す図である。
【図５】先行技術の連続FFEの性能結果を示す図である。
【図６】本願発明の実施形態の周期的FFE法の性能結果を示す図である。
【図７】本願発明の実施形態のゾーン電気泳動モードに関するアニオン及びカチオン泳動を示す図である。
【図８】本願発明の実施形態の等電点電気泳動モードに関する各種の等電点(ＰＩ)の粒子の泳動を示す図である。
【図９】本願発明の実施形態の各種のプロファイルを示す図であり、図9A、9B及び9Cは、それぞれ電圧、媒体の流速、及び媒体の変位を表す。
【図１０】本願発明の別の実施形態の各種のプロファイルを示す図であり、図10A、10B、及び10Cは、それぞれ電圧、媒体の流速、及び媒体の変位を表す。
【図１１】本願発明のさらに別の実施形態の各種のプロファイルを示す図であり、図11A、11B、及び11Cは、それぞれ電圧、媒体の流速、及び媒体の変位を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
さらに、本願発明及びその利点は次の非限定的な実施例で説明されている。図面では、通常、類似の参照文字は、各種の図面を通して同じものを意味する。また、図面は必ずしも一定の縮尺ではないが、代わりに重要なのは本発明の原理が説明されていることである。
【００４０】
本願発明の通常の方法は図2(具体的に図2a〜2e)に示されているが、典型的には本発明を実行するのに必要な構成部品は、図3、4、7a、及び8aにまとめて記述されている。電気泳動チャンバ12並びに電気泳動チャンバ12に適合する及び／又は接続されている構成部品を含む電気泳動装置10の２つの実施形態が図3及び4に図式的に示されているが、図7a及び8aは、電気泳動チャンバ12及び電気泳動チャンバ12において図示されたような粒子の電気泳動的挙動を具体的に示す。
【００４１】
本発明の態様を実行できる装置10は、次の構成部品の全部又は一部を含む。
電気泳動チャンバ12、
分離媒体流入口36、
試料流入口38、
電極(カソード24及びアノード26)、
電源(図示せず)、
第一の流体移動システム60、
第二の流体移動システム61、
電源及び／又は流体移動システムを制御するコントローラー
【００４２】
さらに、次の構成部品は、典型的には、本発明の実施形態の制御、柔軟性、及び性能を最適化するのに望ましい。
カソード媒体170、
アノード媒体172、
電極／媒体スペーサー又はバリアー、
チャンバスペーサー22、
温度コントローラー174、
冷却部178、
試料流出口52
【００４３】
上記部品及びそれらをシステムとして相互に関連付ける方法は、本書で具体的に後述されるが、本願発明の実施形態による第一の通常の方法は、図2を参照にして説明されている。
【００４４】
図2aに示された初期状態では、段階0は試料及び分離媒体を電気泳動チャンバの分離空間中に導入することによって始まる。電極間に電圧はかけないか、所望により効果のない電圧をかける。段階0では、電気泳動を成功させるのに効果のない環境が発生する。電極間の電気泳動の電界強度が０又は効果のない量である結果として、或いは所望により、チャンバ中に試料及び分離媒体を急速に導入したことによって、効果的な電気泳動を起こすのに十分な滞留時間を確保できないであろう。
【００４５】
図2bに示された段階1は、特別な順番のない前後運動のサイクルで、まとめられた試料及び分離媒体の流速を反転させることにより始まる。好ましくは、段階1の一部分中には、電気泳動の電場は電気泳動を起こしていない。通常、対象の試料粒子の変位は電極の長さ未満である。電圧を増加させて電極間にかけ、それによって電気泳動を行なうのに有効な電界強度を提供する。分離実験に使われる特定の電界強度は多数の要因に影響されるが、約250Ｖ／ｃｍの範囲内の標準的な電界強度をかける。当業者の技術の範囲内で、所定のFFE装置の周期的FFE操作に最適な電圧を十分に選択できる。
【００４６】
次の段階2及び3は図2cに示されている。電極間にかけられた電圧によって、有効な電場は粒子を電気泳動で移動させる。注目すべきは、段階2及び3において、試料及び分離媒体の変位が対象の試料粒子を電極の長さの範囲内に十分に留まらせるから、対象の試料粒子は常に電極間にあり、そして電極間の電気泳動の電場を受けていることである。
【００４７】
注目すべきことに、段階2及び3中は、試料を電気泳動で移動させる性能は、ユーザーによって選択された電気泳動法の種類(すなわち、等速電気泳動、等電点電気泳動、又はゾーン電気泳動)、並びに選択された分離媒体だけでなく電流を電極間に流す性能の特性に重大な影響を受ける分離媒体中の試料の電気泳動移動度によって決まる。さらに注目すべきことに、段階2及び段階3は、電気泳動中の試料及び分離媒体の流れの方向が異なるだけであり、類似の又は異なる流れの特性で複数回繰り返してよい。一例は、ある平均流速によって段階2中及び段階3中で試料及び分離媒体を動かして、段階2において何分の１かの又は複数の平均流速でそれらを後方へ動かすことであろう。
【００４８】
段階2及び3をもう行わないなら、段階4を図2dに示されたように行なってよい。基本的に、段階4は、試料を移動させて試料流出口へ溶出させる工程に関する。図2、7a、及び8aでは、試料流出口は電気泳動チャンバの反対側に配置されているが、他の実施形態では、試料流出口は、試料流入口及び分離媒体流入口と同じ側にあってもよい。
【００４９】
図2dでは、段階4は、試料流出口へ溶出中の試料が基本的に最小限しか、好ましくはまるで電気泳動しない工程に関する。電極間の電圧を下げるか除去することにより電極間の電場を減少させるか解消することで、これを行なえる。所望により、試料流出口に達する前に粒子又は試料の泳動における電気泳動場の持続時間及びそのための接触を最小にする平均流速で、試料及び分離媒体を試料流出口へ速く泳動させることにより、これを行なえる。電気泳動チャンバ12から電気泳動で分離された試料の溶出又は抽出中に電圧をかけないことにより、段階4は最も容易に行われる筈である。当然のことながら、上記の方法は、ゾーン電気泳動FFE又は等速電気泳動FFE用途に特に有用である。しかしながら、粒子の全電荷又は正味の表面電荷は、電場を連続的にかけてもさらなる泳動は観察されないという結果をともに、電極間のそれらの最終位置では０であるから、等電点電気泳動モード(IEF)中にFFEを行なうときには電圧を除去する又は減少させることは重要ではない。
【００５０】
図2dに示した段階4は、試料及び分離媒体の溶出によって、溶出された試料をさらに分析又は処理する工程を示す。図2eに示された段階5は、段階4(図2d)と同時に又は段階4が終わった後の追加の実施形態で起こり、それによって、さらに追加の試料又は電気泳動環境について電気泳動分離の発生を可能にする。図2は本願発明の実施形態の基本原理を示すが、本発明の他の態様は応用例を通じて示されている。
【００５１】
最後に、段階5が図2eに示したように行なわれ、基本的には図2aに示した段階0を繰り返す。所望により、ユーザーにとってただ１回の電気泳動プロセスが必要ならば、図2eを取りやめるか中断してよい。また、新規の試料を前作業で分離された試料と混合しなくてよいならば、段階5を段階4とまとめてよい。
【００５２】
図9、10及び11に示した通り、図2に示されたような実施形態の工程又は段階0〜4を受けている試料に対応する、様々な電圧、粒子流速、及び粒子変位プロファイルがあってよい。図9〜11については、Y方向は、流入口端壁から流出口端壁に向かう方向と一致するものである。図9〜11は、媒体の流速の加速度及び減速度以外は、多くの点で類似する。図9bでは、試料が前方に動いている(この場合には、Y方向に沿っている)間に電気泳動を起こすのに必要な電圧をかけて、本発明の方法を実行してよいが、図10bでは、電気泳動に必要な電圧をかける前に試料が止められていることが明らかである。図11では、流れのより遅い及びより穏やかな反転が分離性能に影響する乱流を避けるには確かに望ましいが、試料及び分離媒体の流れの反転は瞬間的である(例えば、ポンプの方向が非常に速く切り替わる蠕動ポンプを用いる場合、図11b参照)。
【００５３】
注目すべきことに、図9〜11は典型的な本発明のある実施形態であるが、電圧、媒体及び試料の流速、及び試料変位からなる多くの他の条件が予想され、当業者によって評価されるであろう。さらに、本発明の他の実施形態について行なうことができるサイクルの回数は、変化してよく、減少と増加のいずれでもよく、したがって、操作の周期的インターバルモードでフリーフロー電気泳動を行なう自由度をユーザーに与えることができる。
【００５４】
図2には本発明の実施形態の通常のモードの要点がまとめられていて、図2cには本発明の実施形態の通常の電気泳動分離工程がまとめられているが、注目すべきことに、３つの主要な電気泳動プロセス(すなわち、等速電気泳動、ゾーン電気泳動、及び等電点電気泳動)のそれぞれを電気泳動分離工程に採用してよい。これは、それぞれにゾーン電気泳動及び等電点電気泳動に関する図7a及び8aに、より詳細に図示されている。
【００５５】
連続運転中には、層流断面のためにバンドの拡大が起きて、結果として電界中の検体の保持時間がより高くなることによって、電気泳動チャンバ壁の領域における横方向の泳動が強くなる。これは、拡散によるバンドの拡大の上に重なっている追加的な鎌状のバンドの拡大につながる。
【００５６】
上記と対照的に、電界が検体上に作用する周期的インターバル操作中には、バンドの拡大はもっぱら拡散によって起こるので、連続操作の場合よりも低い。バンドの拡大が低くなるほど、より高い分解になる。つまり、分解は連続操作(CFFE)より周期的インターバル操作で良好である。そのようにして、周期的インターバルフリーフロー電気泳動は、連続フリーフロー電気泳動よりも分離の増加した分解を生み出す。さらに、周期的インターバル操作は、また、かなり短い時間枠でも、静的インターバルフリーフロー電気泳動と比べたときに、分解の水準を同じ又はより良好にすることができる。これは、電気泳動が静的に起こる(流れが止まった)先行技術のインターバルFFEと比べると、試料及び分離媒体が動いているならば適用できる、より高い電界強度を原因とする。
【００５７】
本発明の他の実施形態では、本方法を他の種類のフリーフロー電気泳動法及びデバイスと組み合わせてよい。例えば、多数のデバイス又はセットアップを使用してよく、次にそれらは、例えばWeberの米国同時係属出願第2004/045826号に記述されているように、並列及び／又は直列に配置される。そのような組み合わせでは、他の電気泳動プロセスは、ここで記述したような周期的インターバル、静的インターバルモード又は連続モードで実行してもよい。適切な操作モード(周期的インターバル、インターバル又は連続)と分離モード(ZE、IEF及び／又はITP)を選択することにより、各種の異なる粒子の強力な分離を成し遂げてよい。
【００５８】
図3、4、7a及び8aに示された通り、本発明の態様を実行できる電気泳動装置10は、床面又は底部プレート16、カバー又は上部プレート14、端壁18、20及び側壁56、58で特徴付けられた電気泳動チャンバ12を含む。好ましくは、端壁18、20及び側壁56、58は、向かい合って平行な上部及び底部プレート(14及び16)の間に入っていて、そしてそれらを支持している、実質的に長方形の電気泳動チャンバ12構造体を形成する。
【００５９】
電極空間に位置している複数の電極、すなわち、カソード空間28及びアノード空間30は、電極が概ね互いに平衡になるように、電気泳動チャンバ12内の第一及び第二の側壁(56及び58)と最近接して及び隣接して配置されている。電極が正確に互いに平行である必要は全くないが、電気泳動チャンバ12内の分離空間中に均一な電場を与えるために、長い電極が正確に平行であることが好ましい。通常、アノード26はアノード空間30に配置され、そしてカソード24はカソード空間28に配置されている。典型的には、バリアーを保持して電気泳動で分離された粒子が操作中に電極に達しない、付着しない、或いは干渉しないようにする電極スペーサー32によって、電極(24及び26)は電気泳動チャンバ12から分離している。典型的には、電極スペーサー32は、基本的に流体力学的流動による媒体の交換を防いでいるフィルター膜である膜電極スペーサー48の形態で構成されている。典型的には、膜は電極の非常に近くに位置しているが、明確にするために、図面では膜が電極から離れていることを示す。図7a及び8aに上記のより詳細な記述が見られる。図3及び4に示された断面図は、概ね上部プレート14及び底部プレート16並びに後述する分離媒体流入口36付近の流入口端壁18と垂直な電極と共通の方向に電気泳動チャンバ12を切断した断面図を表す。
【００６０】
通常は、分離空間又は区域34は、電極スペーサー32を含まない電極空間(28及び30)と上部及び底部プレート(14及び16)との間の空間として定義されるか、範囲を定められる。分離空間34は、電源(図示せず)に接続されると電場を発生させるアノード26及びカソード24の側面に位置する。好ましくは、電場の方向は、上部及び底部プレート(14及び16)と実質的に平行であり、そして好ましくは、電気泳動チャンバ12内のバルク分離媒体の移動の方向と実質的に垂直でもある。
【００６１】
好ましくは、上部及び底部プレート(14及び16)は、変位流及び電場による力が分離媒体中の試料及びイオンのみに作用するように、少なくとも電圧が電極にかけられているとき、電極に対してお互いに固定されている。
【００６２】
典型的には、電源は、概ね制御された態様で電極間に電流を供給しているAC‐DCコンバーターを備えた直流(DC)電源である。さらに、コントローラーが存在し、カソード24とアノード26との間の電流の流れを制御してよい。
【００６３】
典型的には、電極(カソード24及びアノード26)は、電場中で容易く酸化されないプラチナなどの金属からなる。所望により、塩又はバッファー溶液で常に電極(24及び26)を洗浄し、処理中に作られる電解生成物を除去する。通常は、ここでの溶液又は媒体は、カソード媒体170及びアノード媒体172と呼ばれている。
【００６４】
電気泳動チャンバ12の底部プレート16及び上部プレート14は、それぞれに独立して、ガラス(好ましくはポリマー被覆ガラス)、又はPVC、ポリカーボネート、Plexiglas（登録商標）、ポリハロヒドロカーボン、若しくはLucite（登録商標）(基本的に重合されたメタクリル酸メチルからなるアクリル樹脂)などの、典型的なプラスチックで作られていてよい。
【００６５】
典型的には、上部及び底部プレート(14及び16)は、ガスケット又はシールとして機能するチャンバスペーサー22(図示せず)で隔てられている。通常は、チャンバスペーサー22は、電気泳動チャンバ12内の分離空間34を区切る。通常は、分離空間34(プレート間の空間)は約０．０１〜約１．５mm、好ましくは約０．０５〜約１mm、そして最も好ましくは約０．１〜約０．５mmの厚さを有する。当然のことながら、分離空間の厚さは、電気泳動チャンバ12の寸法及び分離又は検出される試料の体積などの、多くの要因によって決まり、それに応じて当業者が採用できることは明らかである。
【００６６】
本願発明の実施形態の装置10は、試料及び分離媒体を電気泳動チャンバ12中へ導入し、電気泳動チャンバ12から抽出するのに役立つ構成部品を含む。電気泳動チャンバ12及びそのより低い端壁に不可欠なものは、例えば、柔軟性TEFLON（登録商標）チューブなどの、通常は分離媒体流入口管74としての導管によって接続されているポート(図示せず)を有する、複数の分離媒体流入口36である。管は、流体移動システム60(例えば、蠕動ポンプなどの多チャンネルポンプ)の供給チャンネルと流体連通している。通常は、分離媒体流入口は、例えば、図7a及び8aに示されたように、電気泳動チャンバ12の更に低い端で同一直線上にあり、そして対応する流出口から等距離にある。電気泳動チャンバ12から出入りする試料及び関連媒体並びにバッファーを導入及び溶出又は放出するための試料流入口管72の導管が、図7a及び8aに示され、また図3及び4に図示されている。電極流入口(40及び44)が電極空間(28及び30)に流体連通し、アノード26及びカソード24用の電極安定化媒体が供給される一方で、分離媒体流入口36に分離媒体が供給される。試料流入口38を通じて分離空間34内の所定の位置へ検体を含む試料を注入する。多数の分離を、同時に及び単数又は複数の電極対若しくは伝導壁の間で互いに平行に、行なうことができる場合には、多数の試料流入口38を同時に使用して、的確な試料を分離空間34中に導入できると考えられる。この場合に、多数の試料流入口も、多数の分離媒体流入口を含む実施形態について上記で説明したように、流出口端と同一直線上に及び等距離に位置している。
【００６７】
また、分離媒体流入口36及び試料流入口38をまとめてよい。この実施形態では、分離流入口を通じて試料を導入してよく、例えば、電気泳動チャンバ12の外部にある管74の一部分の流入口ポートを通じて試料を注入する。
【００６８】
本願発明の実施形態の装置10は、３つ程度の流体移動システムを含んでよい。後述されるように、第一の流体移動システムは、分離空間34中の試料及び分離媒体の移動を制御する。典型的には、第一の流体移動システムは、多チャンネル蠕動ポンプであるが、分離空間34内の制御された態様で流体を移動させるのに十分な他のポンプの形態を取ってよい。
【００６９】
第二の流体移動システムは２つの役割、すなわち、分離空間34中への試料の導入並びに分離空間34中への分離媒体の導入及びその内部での変位を担う。第二の流体移動システムは２つの多チャンネル蠕動ポンプを含み、１つは分離空間34中への試料を導入するものであり、１つは分離媒体及び試料を導入及び移動させるものである。しかしながら、１つの多チャンネル蠕動ポンプに両方の役割を行なわせることも可能である。多チャンネル蠕動ポンプを使用するのが好ましいが、第二の流体移動システムは、分離空間34内の制御された態様で流体を移動させるのに十分な他のポンプの形態を取ってよい。
【００７０】
後述されるように、第二の流体移動システムが、分離空間34中に向流媒体を導入して、分離空間34内で移動させる役割を担ってもよい。しかしながら、このために、さらに多チャンネルのポンプを使用することも予想される。
【００７１】
最後に、第三の流体移動システム(図示せず)を、電極空間内の電極媒体を循環させるのに利用してよい。
【００７２】
流体移動システムは、制御された方法で各種の媒体と連動する。典型的には、コントローラー(図面には示していない)を利用して、上記流体の流速及び圧力を管理し、ユーザーが選択した望ましい分離又は分画プロトコルを実行する。
【００７３】
図3に示された本発明を実行できる装置の実施形態では、２つの流体移動システム60及び61又はポンプを利用する。第一の流体移動システム60を利用して、電極の方向に沿って電極間の試料及び分離媒体の大きな流れを移動させる。第二の流体移動システム61を使用して、試料及び分離媒体を分離空間34中に、まとめて又は別々に導入し、そして最初に分離空間34内の両方を移動させる。好ましい実施形態では、第二の流体移動システム61は、２つの流体移動ユニットを含み、１つは分離空間中に導入するものであり、もう１つは分離媒体を導入して移動させるものである。この第二の流体移動システム61も使用して、試料流出口52を通した分離空間34からの電気泳動分離後に試料を除去又は溶出させる。本発明の実施形態の所望の操作によって説明されるように、分離弁を利用して、試料流入口38を通じた分離空間中への試料の導入を可能にしたり、導入を妨げたりしてよい。
【００７４】
流入口端サイクル導管86及び流出口端サイクル導管88を第一の流体移動システム60と動作可能なように接続して、さらに電気泳動チャンバ12の分離空間34と流体連通させる。それらの使用は、分離空間34中への分離及び試料媒体の導入よりもむしろ、電極の方向に沿った分離媒体及び試料が前後に循環することに関連する。
【００７５】
第一の流体移動システム60は、試料及び分離媒体が分離空間34中に導入された後に、試料及び分離媒体の大きな流れを制御する変位力又は圧力を提供する。例えば、分離空間34並びに流入口及び流出口サイクル管に媒体又はバッファー溶液が満たされるとすぐに、第一の流体移動システム60(本件では、蠕動ポンプ)を操作して、試料及び分離媒体を電気泳動チャンバ12の一方の端へ移動させ、そして第一の流体移動システム60の操作を反転させて、試料及び分離媒体を電気泳動チャンバ12の他方の端へ移動させる。望ましくは、試料が分離空間34のいずれかの端に達する前に、第一の流体移動システム60の操作を反転した方がよい。より望ましくは、第一の流体移動システム60の操作は、電極間にある分離空間34の一部分から試料が離れないようにする。
【００７６】
第二の流体移動システム61(例えば、２つの蠕動ポンプの形態)は、試料流入口管72を介して試料流入口38へ接続されている。第二の流体移動システム61は、分離媒体流入口36に流体連通している分離媒体流入口管74にも接続されている。第二の流体移動システム61は、分離空間34中への試料及び分離媒体の輸送を制御するだけでなく、電気泳動チャンバ12から、例えばマイクロタイタープレート80内の個別の回収ウェル、容器又はキャビティ82中への分画された試料の抽出を制御する。
【００７７】
注目すべきことに、第二の流体移動システム61が動いているときに、第一の流体移動システム60は動いていないことが望ましく、その逆も同じである。
【００７８】
操作中、図3に示された実施形態は次のように行なわれる。第二の流体移動システム61が、分離空間34中へ試料及び分離媒体を導入させるだけでなく、試料及び分離媒体の両方を変位空間34の中央域に進める。好ましくは、電気泳動はこの段階中に起こらない。次に、第一の流体移動システム60が、流入口端サイクル導管86及び流出口端サイクル導管88を通じて流体を移動させることにより、電極の方向に沿って試料及び分離媒体を前後に動かす。この運動又は循環の一部分では、電流が電極間を流れることにより、電気泳動を起こし、或いは電気泳動を可能にする。十分な循環及び電気泳動の後に、第一の流体移動システム60をもう使用しないか、或いは停止させるのが好ましく、そして第二の流体移動システム61が追加の分離媒体を分離空間中に導入させることによって、分離された試料を分離空間から、試料流出口を通じて、そして好ましくは回収容器（マイクロタイタープレートにあるものなど）中へ移動させる。この溶出段階中に、追加の試料を分離空間中に移動させることも可能であろう。
【００７９】
また、通常は試料流出口52が試料媒体流入口38と向流入口54との間に設置されている、流出口端壁20中に、向流入口54を通じて、向流媒体を導入することも可能であろう。溶出段階又は工程中に、特にITP及びZE操作モードについて、高電圧が切られるか、少なくとも電気泳動を起こすほどの効果がないことが望ましい。見れば分かるように、IEFモードで分離を行なうときには電圧を切る必要がない(下記参照)。注目すべきことに、この実施形態に含まれる流入口、流出口、又は導管の弁によって、後述の工程が容易になるであろう。
【００８０】
本発明を行なえる装置の別の実施形態では、１つの流体移動システム62は、流体の運動を制御して、周期的インターバルの態様で電気泳動分離を行なうのに利用される。流体移動システム62の第一のポンプは、試料流入口管72を介して試料流入口38に接続されている。流体移動システム62の第二のポンプは、分離媒体流入口36に流体連通された分離媒体流入口管74に接続されている。流体移動システム62は、試料及び分離媒体が分離空間34中に導入された後に、試料及び分離媒体の大きな流れを制御する変位力又は圧力を提供することにより、分離空間34中への試料及び分離媒体の輸送並びに流体の運動を制御する。例えば、分離空間34並びに流入口及び流出口サイクル管に媒体又はバッファー溶液が満たされるとすぐに、流体移動システム60(本件では、蠕動ポンプ)を操作して、試料及び分離媒体を電気泳動チャンバ12の一方の端へ移動させ、そして流体移動システム60の操作を反転させて、試料及び分離媒体を電気泳動チャンバ12の他方の端へ移動させる。望ましくは、試料が分離空間34のいずれかの端に達する前に、流体移動システム60の操作を反転した方がよい。より望ましくは、流体移動システム60の操作は、電極間にある分離空間34の一部分から試料が離れないようにする。
【００８１】
電気泳動分離が起きた後に、向流入口54及び分離媒体流入口36を経由して導入された媒体の体積流量がそれぞれ０又は正になるように維持することにより、分離空間34を行き来する試料の正味の流れを一定に保つと、そこでは両方の流れの合計が正のときに、分画された試料は試料流出口52から、流出口管76を通じて、そして好ましくは、例えばマイクロタイタープレート80に配置された個別の回収容器又はキャビティ82中に溶出できる。
【００８２】
所望により、流体移動システム62の第二のポンプは、向流入口54を介して分離空間34中に流体連通された向流管78に接続されていてもよい。
【００８３】
分離媒体流入口管74の他に、本発明の実施形態の所望の操作によって説明されるように、分離弁を利用して、分離空間34中への試料流入口38を通じた試料の導入を可能にしたり、導入を妨げたりしてよい。
【００８４】
図4a及び4bに示された実施形態は次のように行なわれる。流体移動システム62が、試料及び分離媒体を分離空間34中に入らせる。好ましい実施形態では、流体移動システム62は２つの流体移動システムを含み、１つは分離空間中へ試料を導入するものであり、もう１つは分離媒体を導入及び移動させるものである。好ましくは、電気泳動はこの段階中に起こらない。次に、流体移動システム62が、電極の方向に沿って試料及び分離媒体を前後に動かす。これは、流体移動システム62を操作して、循環運動中に分離媒体及び試料を流入口端壁18から前後に、行き来させるように、行なわれる。図4a及び4bに示された各種の実施形態では、向流管78及び分離媒体流入口管74の両方を流体移動システム62に係合して、向流入口54と分離媒体流入口36との間に圧力差を生み出す。この運動又は循環の一部分では、電流が電極間を流れることにより、電気泳動を起こし、或いは電気泳動を可能にする。十分な循環及び電気泳動の後に、第一の流体移動システム60をもう使用しないか、或いは停止させるのが好ましく、そして第二の流体移動システム61が追加の分離媒体を分離空間中に入らせることによって、分離された試料を分離空間から、試料流出口を通じて、そして好ましくは回収容器（マイクロタイタープレートにあるものなど）中へ移動させる。この溶出段階中に、追加の試料を分離空間中に移動させることも可能であろう。
【００８５】
この運動又は循環の一部分では、電流が電極間を流れることにより、電気泳動を起こし、或いは電気泳動を可能にする。十分な循環、電気泳動又はその両方の後に、流体移動システム62を使用して、分離された試料を分離空間34から試料流出口52を通じてそして好ましくは回収容器又はキャビティ82（マイクロタイタープレート80に見られるものなど）中へ溶出させる。この溶出段階中に、追加の試料を分離空間中に導入することも可能であろう。また、通常は試料流出口52が試料媒体流入口38と向流入口54との間に設置されている、流出口端壁20付近に、向流媒体を導入することも可能であろう。溶出段階又は工程中に、高電圧が切られるか、この時点で少なくとも電気泳動を起こすほどの効果がないことが望ましい。注目すべきことに、この及び他の実施形態に含まれる流入口、流出口、又は導管の弁によって、後述の工程が容易になるであろう。
【００８６】
試料の流れの循環中には、任意の手段によって、試料又は媒体が試料流出口に入らないようにするだけでなく、空気がいずれかの流入口管に入らないようにする必要がある。例えば、図4a及び4bに示された実施形態では、弁を閉じること、分離空間34に対して流出口管76を持ち上げて流出口に圧力水頭を発現させること、又は分離媒体が流出口管76に入るためには向流管78、試料流入口管72、又は分離媒体管74の抵抗よりも、流体抵抗があるように流出口管を圧縮することによって、試料流出口が、試料流れの循環中における試料又は媒体の流出口への流入に耐えられる又は防止できるようにするのが望ましい。当業者であれば、これを達成する別の手段を予想し得る。
【００８７】
さらに、本願発明の実施形態の装置10は、フラクション回収流出口又は試料流出口52及び流出口管76を含んでよい。大抵の操作では、典型的には、上記電気泳動モードの少なくとも１種による電気泳動分離後、分離されたフラクション（すなわち、対象の検体）は、直列に及び流出口端壁20の近傍に、通常は、分離媒体流入口36と隣接している流入口端壁18と向き合って配列された空間個別的な試料流出口52によって回収される。検体又はフラクションは、流出口管76又は導管と通じて、任意の適切な種類の、好ましくはマイクロタイタープレート80(図3及び4参照)中のキャビティ82又はウェルの、個別の回収容器に導かれる。回収容器では、検体が、分離媒体及び所望により向流媒体とともに回収される。通常、並んだ回収流出口の個別の試料流出口52間の距離は、適切な分画／分離を提供するために、可能な限り小さい方がよい。回収流出口の中心から測定した、個別の試料流出口52間の距離は典型的には約０．１ｍｍ〜約２ｍｍ、より典型的には約０．３ｍｍ〜約１．５ｍｍであり、そして大抵は流出口管76の最大直径によって決まる。管口の間の最小限の距離を有するこの種の管口を分画デバイスといい、そして平行な範囲で配列されたこれらの流出口管の数は、２〜最大１０００、好ましくは３０〜２００、より好ましくは２０〜１００である。これらの流出口の数、形状、及び位置を様々な態様で改良して、意図的に分離勾配によって分離された試料の特定の部分を分画又は分離してよい。
【００８８】
選択された試料成分又は回収されたフラクションを分析又は調整のために使用してよい。また、そのフラクションを同じ装置又は所望により遠隔の電気泳動デバイスに直接又は間接に導入して、追加の処理を行なってよい。粗分画の次に微細(より高い分解)分画を行なう場合には、又は単数又は複数の電気泳動モード(ZE、IEF、ITP、これらの組み合わせ)では、そのようにしてよい。
【００８９】
無関係な試料成分（望ましい試料が吸引される回収流出口から回収されないか、別の回収流出口から回収される）は廃棄してもよい。
【００９０】
本発明の様々な実施形態では、分離された試料を、分画工程中に意図的に希釈してよいし、或いは、代わりに向流処理を用いてチャンバから抽出してよい。向流工程では、溶出中の試料の大きな流れの方向と概ね逆向きの向流入口54を通じて、分離空間34から選択的に抽出されることになる分離空間34中の試料及び分離媒体に、向流媒体176を導いてよい。試料及び分離媒体は、抽出物又は試料流出口52で向流媒体と合わさって、それを通じて抽出される。向流は、回収流出口での流れ及び圧力条件の調整及び制御を可能にすることで、所望の試料流出口52に到達する又は試料流出口52から抽出される所望のフラクションを制御し続けることにより、分離物の分解を増強する働きをする。向流プロセスの詳細は、例えばWeberの米国特許第号5,275,706明細書に開示されている。ある条件では、例えば固有の希釈効果のために、そのような向流は好ましくないが、通常は、上記の利点を考慮して、向流を用いるのが好ましい。
【００９１】
前述の図4a及び4bに示された向流を使うことの他に、試料溶出中の本発明の実施形態の電気泳動チャンバ12で向流法を使用することも可能である。例えば図7a及び8aにおいて、試料が向流管78を介して向流入口54の方向へ及び向流入口54を通じて電気泳動チャンバ12中を電気泳動させられている溶出工程中に、向流媒体を導入してよい。向流媒体は、試料及び分離媒体が電気泳動チャンバ12から溶出している方向と反対の方向に導入される。向流は、試料流出口52で流れ及び圧力条件の調整及び制御を可能にして、溶出工程中の試料分解に影響を与えかねない任意の空隙の発生数を減少させることにより、分離を高める。向流の使用法の詳細については、米国特許第号5,275,706明細書にも説明されていて、参照によりその全体がここに含まれる。
【００９２】
通常、向流媒体は、必要ならば、試料流出口52に向かっている分離媒体の緩衝能力を修正できる又は上回ることができるように選択されるので、粘度及び密度などについて同じ物理的性質を有するが、伝導度及び／又はｐＨ値及び／又はそれらの化学成分が異なる物質でよい。標準的な向流及び分離媒体は、同種類の媒体から選択され、尿素、グリコール、炭水化物、及び類似の化合物などの成分を含んでよい。
【００９３】
分離媒体の流速：向流媒体の流速の有用な比は、約１：１０〜約１０：１、より典型的には約１：３〜約３：１である。分離媒体及び向流媒体の実際の流速は、検体の最適な分離を得るために、装置10の幾何学的寸法、使用される特定の分離モード(必要な通過時間に応じて変えてよい)、分離される試料、使用される分離媒体及び使用される向流媒体などの、各種の考慮すべき要因によって、決めてよい。したがって、システム(安定化及び向流)中への全媒体の標準的な流速は、電気泳動チャンバの状況及び配列に応じて決まり、０．３ｍＬ／時間〜３０００ｍＬ／時間の広範囲に亘ってよい。しかしながら、通常、試料及び分離媒体の線速度は、０．０１〜５０ｍｍ／秒、好ましくは０．１〜１０ｍｍ／秒である。
【００９４】
温度制御も本願発明の実施形態では有用である。電流が電解質溶液を通ったときに、チャンバ中の粘度及び／又は流速に影響することにより流れのかく乱を起こすであろうジュール加熱として知られる現象によって、伝導媒体の温度が増加する。そのような熱により起こる媒体流の層流プロファイルに作用しているかく乱を減らすために、通常はジュール熱を周囲に放散させることが望ましい。実際に望ましい冷却法を得る多くの方法は、当業者にとって明らかであろう。例えば、冷却部178(図示せず)を利用して、そのような効果を発生させてよい。電気泳動チャンバ12には、冷却部178に接続された流速チャンネルを含む金属担体上の底部プレート16を配置してよい。冷却部178は、ペルチェ又は熱電(TE)モジュールなどの温度制御デバイス174でよい。電気泳動チャンバ12の温度を測定して制御するサーモスタット閉ループ制御システムは、分離空間34の所望の温度を維持するのに有用である。有用な温度範囲は、約2℃〜約35℃、より典型的には約5℃〜室温(約20〜25℃)である。
【００９５】
膜電極スペーサー48が分離空間34からカソード及びアノード空間(28及び30)を隔てている本発明の実施形態では、ポンプを用いて高流速でカソード媒体170及びアノード媒体172(どちらも電極媒体という)の流れを循環させることにより、電極空間(28及び30)を省くことができる。電極媒体を冷却して、連続的態様で電極空間(28又は30)中に再導入してよい。電極媒体を冷却する方法は図7a及び8aに示されており、カソード媒体はカソード媒体流入口44中に入って、カソード媒体流出口46を経由して出て行く。カソード媒体又はアノード媒体が電気泳動チャンバ12に再流入する前に、それらを冷却部178（再導入の前にアノード及びカソード媒体から熱エネルギーを取り除く熱交換素子など）に接触させてよい。
【００９６】
具体的には、図7a及び8aに示されているように、アノード媒体172がアノード媒体流入口40中に入り、そしてアノード媒体流出口42を経由して出て行く。電極スペーサー32が膜電極スペーサー48などの物理的バリアーである実施形態では、カソード及びアノード媒体(170及び172)の流速は、バルク試料及び分離媒体の流速と異なってよい。
【００９７】
簡単に分かることであるが、電極媒体を冷却する他の適切な方法があり、当業者ならば利用できる。
【００９８】
電源及び流体制御のための上記コントローラーは、１つのユニットとして、又は所望により独立ユニットとして、動作してよい。ユーザーがそれぞれを、互いに独立して制御してよい。電気泳動のモード、回数、サイクルの保持時間などの、コントローラー中で処理されたプロトコルのパラメータの設定は、パラメータ値を入力するためのグラフィカル・ユーザー・インターフェースを与えるソフトウェアプログラムによって、行なわれることが好ましい。
【００９９】
それ故に、別の態様では、本願発明は、コンピュータ可読媒体に保存されたコンピュータ実行ソフトウェアコードに関し、コードは電気泳動チャンバ12中の粒子を分離させるのに適切であり、電気泳動チャンバには、上部プレート、底部プレート、及び互いに概ね平行な複数の電極であって、それらの間に分離空間が配置されている複数の電極、及び電極間の分離媒体を移動させる単数又は複数の流体移動システムがあり、ソフトウェアは、電気泳動によって粒子を操作するのに有効な電圧を選択して電極間にかけることができるコード、分離媒体及び試料の少なくとも一部分を、電極の方向と平行な第一の方向へ移動させることができるコード、並びに分離媒体及び試料の少なくとも一部分を、第一の方向と反対の第二の方向へ移動させることができるコード、並びに分離媒体及び試料の少なくとも一部分を第一の方向へ移動させることができるコードを含む。つまり、ソフトウェアプログラムは、ユーザーが、電圧、電流、分離媒体の流速、試料、及び所望により向流媒体、並びに回数などの、所望の分離プロセスの適切なパラメータ値を選択するのを補助する。通常、これは、余りにかけ離れて入力されたパラメータ値（すなわち、電気泳動の選択モードなど）に対してそれらのレイアウト（例えば、前提となる情報及び入力フィールド）を採択するものがプログラムされている形式をユーザーに提供することにより、達成される。さらに、ソフトウェアプログラムは、入力されたパラメータ値を点検して、不適格なパラメータ値が間違いであり範囲外であることをユーザーに伝えてよい。さらに、ソフトウェアプログラムは、既に設定されたパラメータ値（例えば回数を入力された後の全保持時間及び各サイクルの保持時間）に由来するパラメータ値を自動的に与えることにより、ユーザーを補助してよい。
【０１００】
分離空間34を通過する全媒体流は、層流条件下で行なわれるのが望ましい。図3、4、7a、及び8aに示したように、試料又は分離媒体で電気泳動チャンバ12を満たしているときの、各種の流入口(36及び38)からの流れの方向を、本発明の各種の実施形態について矢印で示す。
【０１０１】
例えば、粒子の等電点(すなわち、両性イオンの等電点電気泳動(IEF))に基づいて、或いは所望により、粒子の正味電荷(すなわち、異なった又は各種の正味電荷を有する粒子のゾーン電気泳動(ZE))に基づいて、電気泳動の様々なモードを採用して、粒子泳動を操作してよい。粒子が最初(速い運動)及び最後(遅い運動)のバッファーシステム(すなわち、アニオン性又はカチオン性粒子の等速電気泳動(ITP))の間に入ったときに、それらの電気泳動移動度を基準として粒子を分離してもよい。
【０１０２】
電気泳動分離の第一のモードでは、ゾーン電気泳動(ZE)FFE分離法が行なわれる。ゾーン電気泳動は、分離されるであろう粒子と採用された分離媒体との間の電気泳動移動度の値の差に基づいている。FFEゾーン電気泳動は、異なる寸法及び／又は形態及び／又は正味の表面電荷を基準として、検体及び粒子を分離することを可能にする。
【０１０３】
ZE FFE法は、分離中の分離媒体に具体的な要求が課せられているときに、「反応しやすい（sensitive）」生体粒子及び複合体を分離するのに特に適している。典型的には、これは分離に続いて粒子の生物学的機能及び健全性を保持しなければならない場合である。これらの場合の特別な必要条件は、例えば、分離媒体の非常に制限されたpH範囲、良好な分離媒体緩衝能力、使用されるバッファー物質の生理学的互換性、及び各種の「必須の」カチオン及びアニオンの最小含有量などである。
【０１０４】
図7bは、均一なpHプロファイル134を有するゾーン電気泳動装置10を示す。分離媒体は、図2cの段階2及び3内で示されたように、両方の電極間を層流の態様で流れる。分離されることになる３種類の粒子(90a、104a、及び118a)を含む試料を、試料流入口38を経由して分離媒体中に導入し、分離媒体の層流によって運ぶ。３種類の粒子は、図2cで示された工程の段階2及び3中で分離され、それによって図2dで示唆されたように、泳動させられ、そして分離媒体中の電極間で発生した電界に由来するpH勾配で、明確なフラクションとして回収される。具体的に、第一の粒子90a、第二の粒子104a、及び第三の粒子118aの進路を図7aに示す。各粒子(90a、104a、118a)は、電気泳動の段階2及び3内の特定の進路又は運動に従う。粒子には、分離媒体内で電気泳動を可能にする条件下で、分離空間内でそれらの運動に影響する正味の電荷がある。第三の粒子118aは僅かに正の正味電荷を有するので、ゾーン電気泳動条件下では、分離媒体の大きな流れがチャンバの流入口及び流出口端に対する第三の粒子118aの正味の粒子運動に作用する間は、僅かにカソード方向へ偏向する。他方、第二の粒子104aは比較的強い正電荷を有するので、ゾーン電気泳動条件下での運動の進路中では、分離媒体の大きな流れがチャンバの流入口及び流出口端に対する第二の粒子104aの正味の粒子運動に作用している間に、大幅にカソード方向へ変更する。他方、第一の粒子90は比較的強い負電荷を有するので、ゾーン電気泳動条件下での運動の進行中に、分離媒体の大きな流れがチャンバの流入口及び流出口端に対する第一の粒子90aの正味の粒子運動に作用している間に、大幅にアノード方向へ偏向する。注目すべきことに、図7aは、粒子が電気泳動の電場の存在下での各々の粒子の正味電荷とは逆の電荷を有する電極の方向へ泳動し続けるであろうゾーン電気泳動(ZE)分離を示す。前後運動の回数がより多くなれば、或いは、より長い時間又は持続時間の電気泳動を起こさせれば、粒子は、電極又は膜電極スペーサー48若しくは所望により、非膜電極スペーサー50（高い伝導壁又はバッファーなど）などの、幾つかの他の電極スペーサー32に達するまで、泳動し続けるであろう。第一、第二、及び第三の粒子(90a、104a、118a)の全ての場合に、図7aに示された第四の進路は、電気泳動が余り影響しない又は各粒子の正味の方向の要素としては存在しない溶出工程によって表される。
【０１０５】
図7aは、試料がそれらの電荷に基づいて分離され、そしてそれらの形態及び寸法に基づいて、より小さい範囲に分離されるようなZE装置を示す。図7bで示したように、２つの電極間の分離媒体の電気伝導度プロファイル136には、カソード空間28及びアノード空間30（両者は電極付近にある）の高い伝導域138が含まれる。これらは高い伝導域138として図7bに示されている一方で、分離媒体は低い伝導域140として示されている。pH値は、全分離媒体を通じて変わらない。均一なpHプロファイル134は、それぞれカソード及びアノード媒体のバッファー170及び172の間の分離媒体に発生する。高pH域144がカソード及びアノード媒体のバッファー内に存在する一方で、低いpH域はそれらの間に存在する。
【０１０６】
電気泳動分離の第二のモードでは、分離法は、分離されることになる粒子の異なるｐｉ値を基準としていて、このｐｉ値は、粒子が中性に見えるような周囲の不均質媒体のpH値と等しい状態である。様々な等電点を基準とした粒子のＦＦＥは、検体又は粒子が、それらのｐｉ値については最小格差のみで分離されることを可能にする。これは、フリーフロー電気泳動(FFE)において行なわれる等電点電気泳動(IEF)と呼ばれる。等電点ｐｉ(すなわち、分離媒体が、正負の電荷の数が所定の粒子、例えばタンパク質分子について等しくなるpH値を示している点)では、この粒子の全電荷又は正味の表面電荷は０である。装置の分離媒体に固有の集束効果によって、ｐｉから離れた粒子は自動的に(正又は負の)正味の表面電荷を受けて、電界によってｐｉの方向に再び運ばれる。
【０１０７】
分離媒体のイオン性分子(好ましくは一価のイオン)による検体又は粒子間の電荷移動(すなわち、電気的相互作用)の結果として、ｐｉ値に大きな変化があり、したがって試料種の残りから、粒子及びイオン性分子からなる複合体の速い及び全ての分離が起こると予想される。周期的な等電点電気泳動法は、通常のバイオポリマー並びに生体粒子（その生物学的機能又は健全性は必ず分離媒体のpH勾配の選択された範囲内にあると見られている）の分取に特に適している。「浸透性拡張剤」を加えることにより、理想的な浸透圧が保持されるようにすることが可能である。例えば、非電荷物質を加える(例えば、非イオン性浸透性拡張剤としてショ糖又はマンニトールなど)及び／又は塩(例えば、イオン性浸透性拡張剤としてＮａＣｌ)を加えることにより、所定の細胞種(例えば、哺乳類細胞については２５０〜３１０ミリオスモル)に最適な浸透圧(すなわち、等重量モル濃度の条件)を実現できる。
【０１０８】
図8bは、線形pHプロファイル勾配142を有するIEF電気泳動装置10を示す。分離媒体は、図2cの段階2及び3内で示されたように、両電極間を層流の態様で流れる。分離されることになる３種類の粒子(90b、104b、及び118b)を有する試料を、試料流入口38を経由して分離媒体中に導入して、分離媒体の層流によって運ぶ。３種類の粒子は図2cの工程の段階2及び3中で分離され、それによって泳動させられ、段階4又は図2dで示された分離媒体中の電極間から発生した電界に由来するpH勾配で、明確なフラクションとして回収される。具体的に、第一の粒子90b、第二の粒子104b、及び第三の粒子118bの進路を図8aに示す。各粒子(90b、104b、118b)は、電気泳動の段階2及び3内の特定の進路及び運動に従う。粒子は、IEF分離媒体内の電気泳動を可能にする条件下で分離空間内のそれらの運動に作用するｐｉを有する。第三の粒子118bは、その元の位置付近の媒体のｐｉよりも僅かに高いｐｉを有するので、電気泳動条件下の運動の進路中では、分離媒体の大きな流れがチャンバの流入口及び流出口端に対する第三の粒子118bの正味の粒子運動に作用している間に、僅かにカソード方向に偏向する。他方、第二の粒子104bは、その元の位置付近の媒体のｐｉよりもかなり高いｐｉを有するので、IEF電気泳動条件下の運動の進路中では、分離媒体の大きな流れがチャンバの流入口及び流出口端に対する第二の粒子104bの正味の粒子運動に作用している間に、大幅にカソード方向に偏向する。他方、第一の粒子90bは、その元の位置付近の媒体のｐｉよりもかなり低いｐｉを有するので、IEF電気泳動条件下の運動の進路中では、分離媒体の大きな流れがチャンバの流入口及び流出口端に対する第一の粒子90bの正味の粒子運動に作用している間に、大幅にアノード方向に偏向する。注目すべきことに、図8aは、粒子がそれらのpｉには決して達しないIEF分離を示す。前後運動の回数がより多くなれば、或いは、より長い時間又は持続時間の電気泳動を起こさせれば、粒子は、最終的にそれらのpｉに達し、試料及び分離媒体の大きな流れがそうであるように、前後の経験的運動のみになるであろう。第一、第二、及び第三の粒子(90b、104b、118b)の全ての場合に、図8aに示された第四の進路は、電気泳動が余り影響しない又は各粒子の正味の方向の要素としては存在しない溶出工程によって表される。
【０１０９】
図8bは、電極付近のカソード空間28及びアノード空間30において高い電気伝導度を有する２つの電極間の分離媒体の電気伝導度プロファイル136を示す。これらが、高伝導域138として図8bに示されている一方で、分離媒体は低伝導域140として示されている。pHプロファイル勾配142は、それぞれ、カソード及びアノード媒体のバッファー170及び172の間の分離媒体に発生する。
【０１１０】
さらに、本願発明の実施形態の装置10は、等速電気泳動モード(ITP)で実行してよい。ITP FFE分離法は、分離されることになる粒子の電気泳動移動度の値の差に基づく。ZE FFEとは対照的に、分離は不均質分離媒体において実行され、固有の「集束効果」のために、より良好な溶解を示す。ITP中に粒子(例えばタンパク質)の分離されたバンドから単一の粒子が拡散するとき、これらの粒子は、電界強度を変化させることにより媒体に入り、結果として、粒子は加速又は減速させられる。固有の集束効果とは、より遅く又は速く移動している粒子が再び主要なフラクションに入ることを意味する。ゾーン及びIEF電気泳動法については上記のように図示していないが、本願発明は、ITP操作モードで使用されたときにとてつもない価値と結果を示す。
【０１１１】
これらの分離法(IEF及びZE FFE又はIEF及びITP)の様々な組み合わせが可能なことが、当業者には明らかであろう。例えば、FFE装置の電気泳動チャンバ内で同時に様々な分離媒体を使うことが可能なので、同時に様々な分離パラメータを採用できる。
【０１１２】
本発明の他の実施形態では、周期的インターバルモードは一対の電極間の分離空間34内の多数の分離部分空間で実行してよいと考えられる。隣接する部分空間の合間の（高伝導度を有する）低い移動度境界は、部分空間の間に配置されたカソード安定化媒体及びアノード安定化媒体の隣接する流れによって定義される。通常、全媒体はポンプ（多チャンネル蠕動ポンプなど）を介してそれらの個別の流入口中へ導入される。この方法の詳細については、国際出願第PCT/US06/016175号（参照によりその全てがここに含まれる）を参照できる。
【０１１３】
好ましくは、分離媒体は、担体を含まない水性媒体である。バッファー成分の選択は、利用モード(ZE、IEF、又はITP)及び試料又は分離対象の性質によって決まる。適切なバッファーシステムは、本技術分野で一般に知られていて、場合によっては市販されている(例えば、BD社（ドイツ）製Planegg)。本願発明の実施形態を行なうのに好ましいバッファーシステムは、例えば、同時係属出願第US2004/101973号明細書、仮出願USSN60/885,792、及びUSSN 60/945,246に記述されていて、それらの全てが参照によりここに含まれる。ここで説明された周期的インターバルFFEに特に好ましいものは、特に分離がZE又は均一勾配IEFモードで行なわれるならば、１つのバッファー酸及び１つのバッファー塩基を含む単一のバッファーシステムである。
【０１１４】
本発明の実施形態では、典型的には水性であるアノード安定化媒体は、例えば、グルコン酸、グルクロン酸、アセチルサリチル酸、２‐（Ｎ‐モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及び両イオン性バッファー(グッド・バッファーとも呼ばれる（Goodらの「Biochemistry」第5号, p.467(1966年)参照)からなる群から選択された酸を含んでよい。本発明の幾つかの実施形態では、典型的には水性であるカソード安定化媒体は、Ｎ‐メチル‐Ｄ‐グルコサミン、トリイソプロパノールアミン及び２‐［ビス(２‐ヒドロキシエチル)アミノ］‐２‐(ヒドロキシメチル)プロパン‐１，３‐ジオール(BISTRIS)からなる群から選択された塩基を含んでよい。
【０１１５】
試料が動いている及びアノードとカソードの間に入れられている期間を最大化することが、電気泳動分離を改良する１つの取り組みである。これを実行するために、媒体及び試料の大きな流れの平均流速、持続時間、及び距離を調製して、その適用例の電気泳動能力を最大化してよい。幾つかの場合には、例えば、滞留時間が主要な関心事になるかもしれないので、回数だけでなく分離媒体の大きな流れの持続時間、距離及び線形粒子速度を調整して生産量及び能力を最適化してよい。他の用途では、層流プロファイルによるバンドの拡大は、制御するのに重要である。システムパラメータを制御する自由度は、男女のいずれかが利用している適用例の種類に基づいて、ユーザーに生産量及び分画の質を最大化させる。本願発明の周期的インターバル法は、単一の電気泳動チャンバ12の内部で任意のFFE分離法を行なう機会を与える。さらに、チャンバは、連続フリーフロー電気泳動機に必要なチャンバ長と比べると、長時間の電気泳動でさえも、より短い長さでもよい。
【０１１６】
上述のように、本願発明は、限定されるものではないが、イオン、ペプチド、バイオポリマー、生体粒子（小胞など）、細胞膜、細胞小器官、ウィルスなど、並びに合成ポリマー及び電気泳動場の影響を受けるであろう通常の任意の粒子の分析及び調製分離に特に適している。
【０１１７】
添付の特許請求の範囲で明らかにされた本願発明の理念と範囲を超えることなく、ここで述べた実施形態の多くの改良及び変化が可能であることは、当業者ならば理解できるであろう。
【図１】
0005475449.tif 000002
【図２】
0005475449.tif 000003
【図３】
0005475449.tif 000004
【図４】
0005475449.tif 000005
【図５】
0005475449.tif 000006
【図６】
0005475449.tif 000007
【図７】
0005475449.tif 000008
【図８】
0005475449.tif 000009
【図９】
0005475449.tif 000010
【図１０】
0005475449.tif 000011
【図１１】
0005475449.tif 000012