(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有し、
ｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）という前記ｐＬＤＨのいずれにも結合することを特徴とする、ＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含むマラリア診断用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とするマラリア診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＬＤＨ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー、これを含むマラリア診断用組成物およびマラリア診断キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアの臨床的症状としては頭痛、筋肉痛、発熱、嘔吐などが挙げられるが、このような症状はマラリア固有の症状ではないので、これに基づいて診断することは難しい。一般に顕微鏡検鏡法によって確診が可能であるが、これは、高価の装備と熟練した人員を必要とするため、マラリア流行地域における初期診断向けとしては不適とされている。免疫クロマトグラフィー法を用いた携帯用診断キットは、抗原−抗体反応を利用するため、保管環境によって診断の正確度に大きな差がある。現場で行う初期診断による初期対応は治療過程に大きな影響を及ぼす。よって、携帯用診断キットの性能改善が必須的である。
【０００３】
ｐＬＤＨは、マラリア寄生虫の全生活史から発見される酵素であって、代謝過程に関与する必須酵素である。４種のマラリア寄生虫がいずれもｐＬＤＨを持っており、これらの配列保存率は非常に高い。現在市販されている携帯用マラリア診断キットは、ｐＬＤＨの抗体を用いた場合が大部分であり、４種のマラリアをすべて診断することができる。
【０００４】
アプタマーは、特定の物質に対して高い特異性と親和度を持つ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡである。アプタマーは、特定の物質に対する親和度が非常に高く、安定性があるため、最近多く開発されている。このアプタマーを用いた治療剤および診断用センサーへの応用が盛んに行われている。アプタマーの合成は比較的単純な方法で可能である。細胞、タンパク質および小さい有機物質までも標的物質になれるため、これを用いた新規検出方法の開発が可能であり、既に開発されている抗体に比べてその特異性および安定性が非常に高いため、治療剤の開発並びに薬物伝達システムおよび診断用バイオセンサーへの応用が可能である。
【０００５】
既に開発されている抗体を用いた方法は、生体の免疫システムを利用して作られるため、比較的多くの時間および高い費用がかかるという欠点がある。また、タンパク質であるため、その安定性がアプタマーに比べて低下するという欠点があるので、高感度センサーの開発に制約がある。マラリア流行地域が大部分高温地域または湿っぽい地域であることを考えてみると、抗体を用いた診断システムは正確性が低下する。
【０００６】
したがって、かかる問題点を克服することができるマラリア診断方法に関する研究の必要性が台頭している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ｐＬＤＨ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー、これを含むマラリア診断用組成物、およびマラリア診断キットを提供することにある。
【０００８】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は上述した課題に限定されず、言及されていない別の課題は下記の記載から当業者に明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ｐＬＤＨ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする、ＤＮＡアプタマーが提供される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、前記ｐＬＤＨに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含むマラリア診断用組成物が提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、前記ｐＬＤＨに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、マラリア診断キットが提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のｐＬＤＨ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーは、既存のマラリア診断用抗体より特異性および安定性に優れるという利点を持っている。また、本発明のアプタマーを用いてｐＬＤＨの濃度を敏感且つ正確に測定することができるバイオセンサーを開発すると、マラリア診断の正確性を増加させるのに大きく役立つと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図２】ｐｖＬＤＨタンパク質を分離した後、ゲル濾過（ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム）によって精製した結果である。
【図３】ｐｖＬＤＨに特異的なアプタマー選別段階によってＵＶ分光光度計を用いてｓｓＤＮＡとｐｖＬＤＨとの結合程度を測定した結果を示したグラフである。
【図４】配列番号１で表される選別されたｓｓＤＮＡ（ａ）、および配列番号２で表される選別されたｓｓＤＮＡ（ｂ）の２次構造をＭｆｏｌｄプログラムを用いて予測した結果である。
【図５】配列番号１または配列番号２で表されるアプタマーのｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に対する結合有無を測定するためのＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）結果を示したものである（ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎで染色した結果であって、それぞれのｌａｎｅが意味するところは次のとおりである。１：ＰｖＬＤＨ、２：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２、３：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２＋ＰｖＬＤＨ、４：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１、５：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１＋ＰｖＬＤＨ、６：ＰｆＬＤＨ、７：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２、８：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２＋ＰｆＬＤＨ、９：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１、１０：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１＋ＰｆＬＤＨ）。
【図６】配列番号１または配列番号２で表されるアプタマーのｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に対する結合有無を測定するためのＥＭＳＡ結果を示したものである（クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）で染色した結果であって、それぞれのｌａｎｅが意味するところは次のとおりである。１：ＰｖＬＤＨ、２：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２、３：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２＋ＰｖＬＤＨ、４：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１、５：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１＋ＰｖＬＤＨ、６：ＰｆＬＤＨ、７：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２、８：Ａｐｔａｍｅｒ ＃２＋ＰｆＬＤＨ、９：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１、１０：Ａｐｔａｍｅｒ ＃１＋ＰｆＬＤＨ）。
【図７】配列番号１で表されるアプタマーの予測された２次構造を示したものである。
【図８】本発明の実施例で突然変異分析（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）に使用されたアプタマーの塩基配列および変異部分を表示した突然変異の塩基配列である。
【図９】本発明の実施例に係るＥＭＳＡ方法による突然変異分析結果である（それぞれのｌａｎｅが意味するところは次のとおりである。１：ｐｖＬＤＨ、２：ａｐｔａｍｅｒ ＃１、３：ａｐｔａｍｅｒ ＃１＋ｐｖＬＤＨ、４：ｌｏｏｐ１突然変異、５：ｌｏｏｐ１突然変異＋ｐｖＬＤＨ、６：ｓｔｅｍ突然変異、７：ｓｔｅｍ突然変異＋ｐｖＬＤＨ、８：ｌｏｏｐ２突然変異、９：ｌｏｏｐ２突然変異＋ｐｖＬＤＨ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者は、ｐＬＤＨに対する抗体に代えることが可能なアプタマーを開発するために、ｐＬＤＨをバクテリア発現システムで発現および精製し、これを用いてＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技法でＤＮＡアプタマーを選別し、ＤＮＡアプタマーの配列および構造を確立することにより、本発明を完成するに至った。
【００１６】
具体的に、本発明は、ｐＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡアプタマーを提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記ｐＬＤＨに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含むマラリア診断用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の組成物は、前記ＤＮＡアプタマー以外に、薬理学的または生理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤をさらに含んでもよい。
【００１９】
このような組成物に含まれ得る適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非結質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油などが挙げられる。前記組成物は、薬剤化する場合、通常の充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【００２０】
また、本発明は、ｐＬＤＨに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とするマラリア診断キットを提供する。
【００２１】
前記本発明のＤＮＡアプタマーは、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有することが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明のＤＮＡアプタマーは、配列番号１または配列番号２の塩基配列と７０％以上同一の配列を有する。本発明のＤＮＡアプタマーは、（ｉ）ｌｏｏｐ部分（５'−ＴＴＣＣＮＴＮＧＮ−３'）、（ｉｉ）Ｇ−Ｃ ｒｉｃｈ ｓｔｅｍ部分、あるいは（ｉｉｉ）ｌｏｏｐ２部分（５'−ＡＧＴ−３'）を共通に含み、前記３つの部分の塩基配列が同一であれば、その他の塩基はいずれから構成されていても、本発明の範疇に属する。
【００２２】
前記ｐＬＤＨは、ｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｍＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびｐｏＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
以下、参考形態の例を付記する。
１．ｐＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする、ＤＮＡアプタマー。
２．前記ＤＮＡアプタマーは配列番号１または配列番号２の塩基配列と７０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、１．に記載のＤＮＡアプタマー。
３．前記ｐＬＤＨはｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｍＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびｐｏＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）よりなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、１．に記載のＤＮＡアプタマー。
４．１．に記載のＤＮＡアプタマーを含むマラリア診断用組成物。
５．前記ＤＮＡアプタマーは配列番号１または配列番号２の塩基配列と７０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、４．に記載のマラリア診断用組成物。
６．前記ｐＬＤＨは、ｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｍＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびｐｏＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）よりなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、４．に記載のマラリア診断用組成物。
７．１．に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とするマラリア診断キット。
８．前記ＤＮＡアプタマーは配列番号１または配列番号２の塩基配列と７０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、７．に記載のマラリア診断キット。
９．前記ｐＬＤＨはｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｐｍＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびｐｏＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）よりなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、７．に記載のマラリア診断キット。
【００２３】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１：ｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子クローニング
ｐｖＬＤＨに対する遺伝子を増幅するために、ＢａｍＨ１制限酵素認識配列を含む５'プライマー（ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＴＧＴ）とＸｈｏＩ制限酵素認識配列を含む３'プライマー（ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＧＡＧＣＧＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴ）を使用した。遺伝子増幅のための鋳型として、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘのゲノムＤＮＡを使用し、ｉ−ｐｆｕポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の過程によって増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応の各段階は次のとおりである。１）鋳型の二本鎖ＤＮＡを解離させる段階で（９４℃で３０秒）、２）鋳型とプライマーとが結合する段階（５６℃で３０秒）、および３）新しい鎖を合成する段階で（７２℃で１分）。これらの１）〜３）の段階を１サイクルとして、３５サイクル繰り返し行った。
【００２５】
増幅されたｐｖＬＤＨ遺伝子は、制限酵素切断反応およびＤＮＡライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応によって、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇが含まれたｐＥＴ２８ａベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。
【００２６】
実施例２：ｐｖＬＤＨタンパク質の発現
ｐｖＬＤＨ遺伝子が形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養するが、ＵＶ６００ｎｍで光学密度（ＯＤ；ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）値が０．６に到達するまで３７℃で培養した。その後、タンパク質の発現を誘導するために、最終濃度が０．２ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した後、１８℃で１６時間培養した。タンパク質の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ−ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で確認した。細胞は遠心分離機で培地と分離させた後、ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）バッファで１回洗浄した。発現させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を図１に示した。
【００２７】
実施例３：ｐｖＬＤＨタンパク質の精製
バクテリア細胞Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現したｐｖＬＤＨタンパク質を高純度で精製するために、細胞溶菌バッファ（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）に細胞を溶かした後、ソニケーター（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて１５分間超音波粉砕することにより、細胞を破壊した。水溶液上のタンパク質と細胞を分離するために、１２０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。
【００２８】
また、高純度のタンパク質を得るために、Ｎｉ−ＮＴＡと（Ｈｉｓ）６−ｔａｇアミノ酸が結合する特性を利用した。具体的に、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にＮｉ−ＮＴＡカラムを連結し、水溶液上のｐｖＬＤＨをカラムに流すことにより結合させた。Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合したタンパク質の（Ｈｉｓ）６−ｔａｇはイミダゾールの化合物と競争的に結合するため、標的タンパク質をカラムで分離させるために、溶出バッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、４００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を順次流すことにより、ｐｖＬＤＨを高純度で分離することができた。
【００２９】
分離されたタンパク質からさらに純度の高いタンパク質を得るために、タンパク質のｐＩ値によって分離させるイオン交換カラムとしてのＭｏｎｏＱカラムをＦＰＬＣに連結した後、タンパク質水溶液を流した。ｐｖＬＤＨはカラムに結合せず、残りの不純物のみ結合した。結合していない分画（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を取って大きさによって分離するゲル濾過（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）カラムとしてのｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いてもう一度分離した。その結果を図２に示した。
【００３０】
実施例４：ＳＥＬＥＸを用いたｐｖＬＤＨタンパク質に対するアプタマーの探索
【００３１】
<４−１>ｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）ライブラリーの製造
両末端にＰＣＲ増幅およびクローニングのためのプライマーの結合配列を有し、中央に４０個のランダムＤＮＡ塩基配列を含む９０個の配列を有する合成されたライブラリー（５'−ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡ−Ｎ４０−ＣＴＧＧＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣ−３'）を設計した。
【００３２】
また、ＰＣＲ増幅およびｓｓＤＮＡ生成のために５'プライマー（５'−ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＧＡ−３'）、３'プライマー（５'−ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧ−３'）およびビオチンが結合した３'プライマー（５'−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧ−３'）を使用した。本発明で使用された全てのオリゴヌクレオチドはバイオニック社（韓国）で合成およびＰＡＧＥ精製した。
【００３３】
<４−２>ｐｖＬＤＨのＮｉ−ＮＴＡ磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）への固定化
精製されたｐｖＬＤＨは、表面にコバルトでコートされており、タンパク質のＨｉｓ−ｔａｇと結合する磁性ビーズであるＤｙｎａｌｂｅａｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ノルウェー）を用いてビーズに固定した。
【００３４】
具体的に、タンパク質結合バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）１００μＬに溶けているタンパク質５００ｐｍｏｌｅと２０μＬのビーズを外部磁石を用いて結合バッファで洗浄した後、１時間室温で反応してビーズに固定化させた。
【００３５】
<４−３>ｐｖＬＤＨに特異的なアプタマーの選別
ｐｖＬＤＨに特異的なアプタマーを選別するために、磁性を用いた特異的分離方法を行った。
【００３６】
まず、ｓｓＤＮＡの最も安定な構造形成のために、１００μＬの結合バッファに溶けているｓｓＤＮＡライブラリー（１ｎｍｏｌｅ）を９０℃で３分間培養した後、４℃で１時間全培養した。その後、先立って磁性ビーズに固定化されたｐｖＬＤＨタンパク質と混合して共に弱く振盪しながら１時間反応させた。次いで、ビーズに結合したｐｖＬＤＨタンパク質と結合しないｓｓＤＮＡを除去するために、結合バッファでビーズを２回洗浄した。
【００３７】
その後、磁性ビーズによってタンパク質と結合したｓｓＤＮＡを分離するために、溶出バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ ｔｗｅｅｎ２０、３００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いてタンパク質およびタンパク質に結合したｓｓＤＮＡを溶出させた。溶出したｓｓＤＮＡはエタノールを用いて沈澱させた後、６０μＬの蒸留水に溶解した後、５'プライマー、ビオチンが結合した３'プライマー、およびｉ−ｐｆｕ重合酵素（イントロンバイオテクノロジー、韓国）を用いてＰＣＲによって増幅させた。その後、選別過程のためのｓｓＤＮＡを生成するために、ビオチンが結合したＰＣＲ産物を、ビオチンと結合するストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）がコートされた磁性ビーズと共にカップリングバッファ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）条件で１時間培養した。培養の後、ｓｓＤＮＡのみを分離するために、１００μＬの１００ｍＭ ＮａＯＨと５分間培養し、外部磁石を用いて選別されたｓｓＤＮＡを得ることができた。
【００３８】
一番目に選別されたｓｓＤＮＡを用いて反復的に選別した。この際、厳しい選別のためにｓｓＤＮＡの量およびｐｖＬＤＨの濃度を漸次減少させながら行った。さらに、反復される選別で溶出したｓｓＤＮＡに対してＵＶ分光光度計（ＵＶスペクトロメーター、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｉｂｒａ Ｓ２２ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で濃度を測定し、残っているｓｓＤＮＡのＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉとの結合程度を確認しながら、選別過程を行った。その結果（％）を図３に示した。
【００３９】
<４−４>アプタマーの配列および構造分析
１０番目の反復選別されたｓｓＤＮＡは、変形していない５'プライマーと３'プライマーを用いてＰＣＲ過程によって増幅させ、ｐＥＮＴＲ／ＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質転換させた。ｓｓＤＮＡの挿入されたクローンをｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＧｅｎｅＡｌｌ、韓国）を用いて精製した後、塩基配列を分析（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）した。その結果、下記表１に示すように、配列番号１および配列番号２で表されるｓｓＤＮＡ配列を分析することができた。
【００４０】
また、選別されたｓｓＤＮＡの構造的類似性を分析するために、Ｍｆｏｌｄプログラム（http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)を用いて２次構造を分析することができ、図４および図５に示すように、共通の配列および構造を発見した。
【００４１】
【表１】
0005524990.tif 000002
【００４２】
実施例５：ＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）を用いたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ以外の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が持つＬＤＨに対する結合有無の測定
配列番号１および配列番号２のアプタマーがｐｖＬＤＨだけでなく、他の種のマラリア寄生虫のＬＤＨとも結合することができるかを調べるために、ＥＭＳＡ方法によって結合有無を確認した。
【００４３】
配列番号１および配列番号２のアプタマー０．５μＭをそれぞれ０μＭまたは２．５μＭのｐｖＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）またはｐｆＬＤＨ（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）と１時間常温で２０μＬの結合バッファで培養した後、６％アクリルアミドゲル（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）にランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）した。この際、電圧は１２０Ｖに固定し、電気泳動過程で発生する熱によるタンパク質−アプタマー複合体の変性を防止するために０℃で４０分間ランニングした。ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎとクマシーブルーで染色した結果を図５および図６に示した。
【００４４】
図５および図６においてそれぞれのレーン（ｌａｎｅ）が示すのは下記表２のとおりである。本発明の実施例において、アプタマーの発掘はｐｖＬＤＨタンパク質を用いて進行したが、ｐｖＬＤＨとｐｆＬＤＨは、アミノ酸配列保存率（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）が９０％以上のものであって、機能と構造などが互いに非常に類似している。よって、図５および図６に示すように、配列番号１および配列番号２で表されるアプタマーはｐｖＬＤＨだけでなくｐｆＬＤＨとも結合することを確認した。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
実施例６：蛍光測定によるｐＬＤＨとアプタマー間の結合力の測定
１６μｇのｐｖＬＤＨを１０μＬの磁性ビーズと混合した後、１００μＬの結合バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）で１時間培養した。結合していないｐｖＬＤＨを分離するために、前記結合バッファで２回洗浄した。その後、多様な濃度のＦＡＭで標識されたアプタマーと共に１時間培養し、ｐｖＬＤＨと結合していないアプタマーは洗浄して除去した。
【００４７】
磁石を用いて、ｐｖＬＤＨに結合したＦＡＭが標識されたｓｓＤＮＡのみを分離した後、ｐｖＬＤＨが固定された磁性ビーズに結合したＦＭＡが標識されたｓｓＤＮＡアプタマーの量を蛍光測定（１４２０ Ｖｉｃｔｏｒ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）の方法で測定した。その結果、下記表３に示すように、配列番号１および配列番号２の塩基配列を持つＤＮＡアプタマーのＫｄ値を測定することができた。ｐｆＬＤＨに対しても、前記と同様の過程によってＫｄ値を測定した。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
実施例７：アプタマーの突然変異配列に対する結合有無の測定
本発明の実施例４で発掘したアプタマーは、配列番号１および配列番号２で表示され、図４に示すように２次構造を形成する。配列番号１および配列番号２で表されるアプタマーの２次構造は３つの部分に分けることができ、配列番号１で表されるアプタマーの２次構造を図７に示した。
【００５０】
図７から分かるように、ｐＬＤＨに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの塩基配列は共通に（ｉ）Ｌｏｏｐ１（赤色）、（ｉｉ）Ｇ−Ｃ ｒｉｃｈ ｓｔｅｍ（青色）、および（ｉｉｉ）Ｌｏｏｐ２（緑色）部分を含み、それぞれの配列はタンパク質との結合に必須的な配列である。
【００５１】
本発明者は、ＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）方法を用いて、突然変異分析（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。配列番号１で表されるアプタマーの一部の配列に突然変異を作り、それぞれの突然変異ＤＮＡとｐｖＬＤＨタンパク質との結合有無をＥＭＳＡ方法によって確認した。
【００５２】
本実施例に使用された、配列番号１で表されるアプタマーの突然変異配列は、それぞれ配列番号３乃至５で表され、図８に示された。また、ＥＭＳＡ結果を図９に示した。図９においてそれぞれのレインが表すのは下記表４のとおりである。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
図８および図９から分かるように、Ｌｏｏｐ１とＬｏｏ２の配列を変形させたとき、ｐｖＬＤＨタンパク質と全く結合しないことを確認することができる。これは、Ｌｏｏｐ１およびＬｏｏｐ２がタンパク質と直接的に結合する部分であることを意味する。Ｇ−Ｃ ｒｉｃｈ ｓｔｅｍの部分の場合、塩基配列全体を変形させるとＤＮＡの２次構造が乱れるので、一部のみ変形させたが、図９に示すように、結合力が大幅減少したことが分かった。よって、Ｇ−Ｃ ｒｉｃｈ ｓｔｅｍ部分はＤＮＡの安定な２次構造を形成するように助けるうえ、タンパク質との結合にも大きく関与することが分かる。
【００５５】
したがって、前記三つの部分は結合に必須的な部分であり、それ以外の配列部分はいずれの配列に変形しても構わないことを意味する。
【００５６】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想または必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変更し得ることが理解できるであろう。よって、上述した実施例はすべての面において例示的なもので、限定的なものではないと理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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