(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のサンプルにおける１つ又は複数の遺伝子マーカーのハイスループットでの発見、検出及び遺伝子型決定のための方法であって、
（ａ）複数のサンプルに由来するＤＮＡを提供する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限し、それにより制限断片を製造する、制限工程と、
（ｃ）前記制限断片を加熱して、１２０ｂｐよりも小さな制限断片を選択的に分離する加熱工程と、
（ｄ）各サンプルに対して少なくとも一つのアダプターが夫々異なる識別子タグを付けられ、前記制限断片にアダプターをライゲーションし、それによりアダプターにライゲーションされた制限断片を製造する、ライゲーション工程と、
（ｅ）前記タグ付けされたアダプターにライゲーションされた制限断片をプライマー対を用いて増幅させる工程であって、該プライマーのうち少なくとも１つが、前記アダプターの少なくとも一つの部分に相補的であり、それにより各サンプルに対して、アダプターにライゲーションされた制限断片の、タグ付けされた増幅されたライブラリーを製造する、増幅工程と、
（ｆ）複数のサンプルから誘導された前記ライブラリーをプールするプーリング工程と、
（ｇ）ハイスループットシークエンシング技術を使用して、前記ライブラリーをシークエンシングする工程と、
（ｈ）前記ライブラリー間を区別するための前記タグを使用して、前記ライブラリー内又は前記ライブラリー間で遺伝子マーカーとして配列多型を同定する工程と、
（ｉ）前記複数のライブラリーにおいて前記遺伝子マーカーの（共）優性遺伝子型をもとめる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子マーカーがＡＦＬＰマーカー又はＳＮＰマーカーであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記シークエンシングが合成によるシークエンシングに基づくことを特徴する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法において、前記シークエンシングが固体支持体上で実施されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、
前記シークエンシングが、
増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片をビーズにアニーリングするとともに、各ビーズは単一のアダプターにライゲーションされた断片とアニーリングする工程と、
前記ビーズを、各々が単一のビーズを含む油中水滴型マイクロリアクター内で乳化させる工程と、
エマルジョンＰＣＲを実施し、それにより前記ビーズの表面上で前記アダプターにライゲーションされた制限断片を増幅させる、実施工程と、
前記ビーズを、夫々が単一のビーズを含むように、ウェルに充填する工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、
前記タグ付けされ増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片の平均重複が少なくとも６であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、
各アダプターにライゲーションされた制限断片の配列が少なくとも６倍測定されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法において、
エンドヌクレアーゼ制限とアダプターライゲーションとの間でサイズ選択が変性工程によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法において、
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、全ゲノム増幅ＤＮＡ、ＰＣＲ産物から成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法において、
前記アダプターが、前記制限断片の一端又は両端と適合性がある一端を有する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法において、
前記ＤＮＡが２つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて制限されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法において、
前記ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法において、
前記制限エンドヌクレアーゼのうち少なくとも１つがレアカッターであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法において、
前記制限エンドヌクレアーゼのうち少なくとも１つがフリークエントカッターであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法において、
前記プライマーが１〜１０の選択ヌクレオチドを含有することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法において、
前記ＤＮＡが３つ以上の制限エンドヌクレアーゼの組合せを使用して制限されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法の使用であって、
ＡＦＬＰマーカー配列、ＳＮＰマーカー配列の少なくとも一方の共優性スコアリングのためであることを特徴とする使用。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法における、多型検出のためのハイスループットシークエンシング方法を使用して、遺伝子マッピング、ＱＴＬマッピング、遺伝子／形質の精細マッピング、連鎖不平衡（ＬＤ）マッピング、マーカー利用戻し交配、遺伝距離解析、形質又は表現型と繋がりのあるマーカーの発見、親サンプルの診断用遺伝子型決定を含む遺伝子型の決定をすることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び遺伝学の分野に関する。本発明は、核酸サンプル内又は核酸サンプル間での多型の迅速な発見、検出、及び大規模な遺伝子型決定に関する。同定された多型は遺伝子マーカーとして使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡの調査は、科学関係者、特に医療関係者によって長く望まれてきた。ゲノムＤＮＡは、癌及びアルツハイマー病のような疾患の同定、診断、及び治療の鍵を握る。ゲノムＤＮＡの調査は、疾患の同定及び治療だけでなく、植物及び動物品種改良事業において著しい利点を提供し、食品栄養学の問題に対する答えを世界に示すかもしれない。
【０００３】
多くの疾患が、特異的な遺伝的要素、特に特異的な遺伝子の多型に関連することが知られている。ゲノムのような大きなサンプルにおける多型の同定は、現在、困難且つ多くの時間を要する課題である。しかしながら、そのような同定は、生物医学研究、医薬品の開発、組織適合試験、遺伝子型決定、及び集団研究のような領域に対して非常に価値がある。
【０００４】
マーカー、具体的には遺伝子マーカーは、非常に長い間、遺伝子型決定法として、即ち、表現型形質をＤＮＡ（遺伝子）の特定部分の有無又は量と結び付けるために使用されてきた。最も用途の広い遺伝子型決定技術の１つが、既に何十年にもわたって知られており、任意の生物体に広く適用可能なＡＦＬＰである（概説に関しては、Savelkoul他 J. Clin. Microbiol, 1999, 37(10), 3083-3091; Bensch他 Molecular Ecology, 2005, 14, 2899- 2914を参照）。
【０００５】
ＡＦＬＰ技術（Zabeau & Vos, 1993; Vos他, 1995）は１９９０年代初頭の発明以来、植物の品種改良及び他の分野において普及してきた。これはＡＦＬＰの幾つかの特徴に起因するが、中でも最も重要なのは、事前の配列情報を必要とせずに、再現可能な様式で多数の遺伝子マーカーが生成されることである。また、ＡＦＬＰの要である選択的増幅の原理は、増幅される断片の数が、ゲノムサイズ又は起源とは無関係に検出システムの分解能と調和し得ることを保証する。
【０００６】
ＡＦＬＰ断片の検出は一般にスラブゲル上での電気泳動（Vos他, 1995）又はキャピラリー電気泳動（van der Meulen他, 2002）によって実施される。こうしてスコアリングされるＡＦＬＰマーカーの大部分は、ＡＦＬＰ鋳型調製に使用される制限酵素認識部位又は選択的ＡＦＬＰプライマーによって覆われるそれらのフランキングヌクレオチドのいずれかで生じる（一塩基）多型を表す。残りのＡＦＬＰマーカーは、制限断片の内部配列で生じる挿入／欠失多型、及び小さな制限断片（＜約１００ｂｐ）で生じる一塩基置換における非常に小さな画分であり、これらの断片に対し、両対立遺伝子間での再現可能な移動度の変動を引き起こす。これらのＡＦＬＰマーカーはバンド強度に依存する必要なく、共優性としてスコアリングされ得る。
【０００７】
それゆえ、典型的なＡＦＬＰフィンガープリントでは、ＡＦＬＰマーカーは増幅される断片の少数（５０％未満であるが、２０％未満であることも多い）を構成する一方、残りは一般に定常（constant）ＡＦＬＰ断片と称される。にもかかわらず、後者がゲルスコアリング手順で有用であるのは、それらがＡＦＬＰマーカーの断片移動度を算出するためのアンカーポイントとして働き、共優性スコアリングのためのマーカーを定量する際の助けとなるからである。現在は、ＡＦＬＰマーカーの共優性スコアリング（ホモ接合性又はヘテロ接合性に対するスコアリング）は、分離集団をフィンガープリントするという状況に制限されている。関連のない系統のパネルでは、優性スコアリングのみが可能である。
【０００８】
増幅工程及び検出工程における高い多重レベルのために、ＡＦＬＰのスループットは非常に高いが、律速段階は電気泳動の分解能である。電気泳動により、制限酵素の組合せ（ＥＣ）、プライマーの組合せ（ＰＣ）及び移動度の組合せに基づく、増幅された断片の大部分の一意的な同定が可能となるが、理想的には、検出システムは増幅された断片の配列全体を決定して、全ての多型を捕捉できるべきである。
【０００９】
移動度決定の代わりにシークエンシングによる検出を行うと、スループットが増大する。理由：
１）内部配列に位置する多型は、殆どの（又は全ての）増幅された断片中に検出される。これによりＰＣ毎のマーカー数がかなり増大する。
【００１０】
２）ＡＦＬＰマーカー及び定常バンドの共遊走によるＡＦＬＰマーカーの減少が無い。
【００１１】
３）共優性スコアリングはバンド強度の定量化に依存せず、且つフィンガープリントされる個体の関連性から独立している。
【００１２】
今のところ、シークエンシングによるＡＦＬＰマーカー／配列の検出は、数ある制限の中でも、Sangerのジデオキシシークエンシング技術及び他の従来のシークエンシング技術のコスト的な制限により経済的に実現不可能となっている。
【００１３】
【特許文献１】欧州特許第０５３４８５８号
【特許文献２】米国特許第６０４５９９４号
【特許文献３】国際公開特許第ＷＯ０３／０１２１１８号
【特許文献４】国際公開特許第ＷＯ００／２４９３９号
【特許文献５】国際公開特許第ＷＯ９０／００８８２１号
【特許文献６】国際公開特許第ＷＯ００／２３６２０号
【特許文献７】国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号
【特許文献８】国際公開特許第ＷＯ０３／０５４１４２号
【特許文献９】国際公開特許第ＷＯ２００４／０６９８４９号
【特許文献１０】国際公開特許第ＷＯ２００４／０７０００５号
【特許文献１１】国際公開特許第ＷＯ２００４／０７０００７号
【特許文献１２】国際公開特許第ＷＯ２００５／００３３７５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目標の１つは、シークエンシングに基づきＡＦＬＰマーカー又は他の遺伝子マーカー（ＳＮＰマーカー等）を検出するための経済的に実現可能な方法を提供することである。
【００１５】
遺伝子型決定（即ち、診断）という目的のために、シークエンシングを通じて断片を含有するＡＦＬＰ又はＳＮＰの集合を検出することとさらに関連した重要な問題は、標本抽出変動（sample variation）の問題である。具体的には、マーカーの偽陰性のスコアリングにつながるので、断片の集合を解析して特別な断片が観察されない場合に、このことが関与する断片が断片混合物中に存在するにもかかわらず、検出工程で抽出されなかったという事実に起因しないことを確認しなければならないことを意味する。ゲル上での位置情報が利用可能であるので、この制限は電気泳動による検出には当てはまらない。
【００１６】
したがって、本発明のさらなる目標の１つは、標本抽出変動の問題を解決する方法又は少なくとも標本抽出変動により引き起こされる誤差を許容可能な最小限度まで低減させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は、ハイスループットシークエンシング用の或る特定の適合した手順においてＡＦＬＰを用いることにより、シークエンシングがＡＦＬＰマーカー及びＳＮＰマーカーの検出に実行可能であることを見出した。したがって、本発明は、ＡＦＬＰの能力及び一般的適用可能性を或る特定のハイスループットシークエンシング技術と結びつけて、一般的に適用可能な多型スコアリングシステムを確立する方法又は戦略を提供する。本戦略において、標本抽出変動という課題はまた、高精度での遺伝子型決定、及びデータセットの遺伝子型を決定できない（missing genotypes）数が最小となる可能性の最大化を保証するように扱われる。
本発明によれば、複数のサンプルにおける１つ又は複数の遺伝子マーカーのハイスループットでの発見、検出及び遺伝子型決定のための方法であって、
（ａ）複数のサンプルに由来するＤＮＡを提供する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限し、それにより制限断片を製造する、制限工程と、
（ｃ）前記制限断片を加熱して、１２０ｂｐよりも小さな制限断片を選択的に分離する加熱工程と、
（ｄ）各サンプルに対して少なくとも一つのアダプターが夫々異なる識別子タグを付けられ、前記制限断片にアダプターをライゲーションし、それによりアダプターにライゲーションされた制限断片を製造する、ライゲーション工程と、
（ｅ）前記タグ付けされたアダプターにライゲーションされた制限断片をプライマー対を用いて増幅させる工程であって、該プライマーのうち少なくとも１つが、前記アダプターの少なくとも一つの部分に相補的であり、それにより各サンプルに対して、アダプターにライゲーションされた制限断片の、タグ付けされた増幅されたライブラリーを製造する、増幅工程と、
（ｆ）複数のサンプルから誘導された前記ライブラリーをプールするプーリング工程と、
（ｇ）ハイスループットシークエンシング技術を使用して、前記ライブラリーをシークエンシングする工程と、
（ｈ）前記ライブラリー間を区別するための前記タグを使用して、前記ライブラリー内又は前記ライブラリー間で遺伝子マーカーとして配列多型を同定する工程と、
（ｉ）前記複数のライブラリーにおいて前記遺伝子マーカーの（共）優性遺伝子型をもとめる工程を含むことを特徴とする方法が得られる。
【００１８】
定義
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
【００１９】
多型：多型は、集団中のヌクレオチド配列の２つ以上の変異型の存在を指す。多型は１つ又は複数の塩基変化、塩基挿入、塩基重複、又は塩基欠失を含んでもよい。多型は、例えば、単純重複配列（ＳＳＲ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）を含み、それらはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）の単一のヌクレオチドが変わったときに生じる変異である。集団の通常少なくとも１％で変異が生じたものが、ＳＮＰと考えられる。ＳＮＰは、例えば全てのヒト遺伝的変異の９０％を占め、ヒトゲノムにわたって１００〜３００塩基ごとに起こるものである。３つのＳＮＰ当たり２つのＳＮＰでは、チミン（Ｔ）によってシトシン（Ｃ）が置換される。ＤＮＡ塩基配列の変異は、例えば、ヒト又は植物がどのように疾患、細菌、ウイルス、化学薬品、薬剤等を扱うかに影響し得る。
【００２０】
核酸：本発明に記載の核酸は、ピリミジン塩基及びプリン塩基の任意のポリマー又はオリゴマー、好ましくはシトシン、チミン及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンをそれぞれ含んでもよい（Albert L. Lehninger著「生化学の原理（Principles of Biochemistry）」, 793-800 (Worth Pub. 1982)を参照、これは全ての目的のためにその全体を参照により本明細書において援用される)。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸成分、及びそれら任意の化学的な変異型（例えばこれらの塩基のメチル化された形式、ヒドロキシメチル化された形式又は糖鎖が付加した形式）を検討する。ポリマー又はオリゴマーは、組成物中で不均質また均質であってもよく、天然に存在するソースから単離するか又は人為的若しくは合成的に生成されてもよい。さらに核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はそれらの混合物であってもよく、恒久的に又は一時的に、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、及びハイブリッド状態を含む、一本鎖型又は二本鎖型で存在してもよい。
【００２１】
複雑度低減：用語「複雑度低減」は、サンプルのサブセットの生成によって、ゲノムＤＮＡのような核酸サンプルの複雑度を減少させる方法を指し示すために使用する。このサブセットはサンプル全体（即ち複雑である）の代表になることができ、好ましくは再現可能なサブセットである。本状況において、再現可能は、同一の方法を使用して、同一のサンプルの複雑度が減少される場合、同じ又は少なくとも同程度のサブセットが得られることを意味する。複雑度低減のために使用される方法は、当該技術分野において既知である複雑度低減のための任意の方法であってもよい。複雑度低減のための方法の好ましい例は、例えば、ＡＦＬＰ（登録商標）（Keygene N.V．、オランダ；例えば特許文献１、特許文献２を参照）、Dongにより説明された方法（例えば、特許文献３、特許文献４を参照）、インデックスリンク（indexed linking）（Unrau他、以下参照）、リンカーＰＣＲ（特許文献５）、及びＳＡＬＳＡ−ＰＣＲ（特許文献６）Schouten他）等を含む。本発明で使用される複雑度低減方法は、それらが再現可能であることが共通である。同一のサンプルが同一の様式で複雑度が減少される場合に、サンプルの同一のサブセットが得られるという意味における再現性については、顕微解剖、又は選択された組織で転写されたゲノムの一部を表わし、その再現性については、組織の選択、単離時期等への依存があるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の使用のような、よりランダムな複雑度低減に対立するものである。
【００２２】
ＡＦＬＰ：ＡＦＬＰとは、制限断片を生成するために１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼにより核酸を消化すること、アダプターを制限断片へライゲーションすること、及びアダプターと（一部）相補的であり、制限エンドヌクレアーゼの残りと（一部）相補的であり、少なくとも１つのＡ、Ｃ、Ｔ又はＧ（又は場合によってはＵ）の中からランダムに選択されるヌクレオチドをさらに含有する少なくとも１つのプライマーを用いてアダプターにライゲーションされた制限断片を増幅させることに基づくＤＮＡの選択的増幅法を指す。ＡＦＬＰには任意の事前配列情報は無く、任意の開始ＤＮＡで行なうことができる。一般にＡＦＬＰは、
（ａ）核酸、特にＤＮＡ又はｃＤＮＡを１つ又は複数の特異的な制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより対応する一連の制限断片へとＤＮＡを断片化する、消化する工程と、
（ｂ）このように得られた制限断片を、一末端が制限断片の一末端又は両末端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションし、それによりアダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）開始ＤＮＡの制限断片を生成する、ライゲーションする工程と、
（ｃ）アダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）制限断片を、ハイブリダイズする条件下で、その３’−末端で選択ヌクレオチドを含む１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程と、
（ｄ）プライマーとハイブリダイズされたアダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）制限断片を、プライマーがハイブリダイズする開始ＤＮＡの制限断片に沿ってハイブリダイズされたプライマーのさらなる伸長を引き起こすように、ＰＣＲ又は同様の技術によって増幅する工程と、
（ｅ）このように得られた増幅又は伸長したＤＮＡ断片を、検出、同定、又は回収する工程とを含む。
【００２３】
したがって、ＡＦＬＰはアダプターにライゲーションされた断片の再現可能なサブセットを提供する。ＡＦＬＰは特許文献１、特許文献２及びVos他に記載されている。ＡＦＬＰに関するさらなる詳細についてはこれらの出版物が参照される。ＡＦＬＰは複雑度低減技法及びＤＮＡフィンガープリント技術として汎用される。ＡＦＬＰをフィンガープリント技術として使用する状況の中で、ＡＦＬＰマーカーの概念が発展してきた。
【００２４】
ＡＦＬＰマーカー：ＡＦＬＰマーカーは、同一のプライマーのセットを使用して、ＡＦＬＰを使用して増幅された（フィンガープリントされた）２つのサンプル間で異なる、増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片である。したがって、この増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片の有無は、形質又は表現型と連結するマーカーとして使用され得る。従来のゲル技術では、ＡＦＬＰマーカーは、ゲル中に或る特定の移動度で位置するバンドとして現れる。キャピラリー電気泳動法等の他の電気泳動技法は、これをバンドと称し得ないが概念は同一のままである、即ち、或る特定の長さ及び移動度を有する核酸である。バンドの有無は表現型の有無を示唆し得る（又は表現型の有無と関連し得る）。典型的には、ＡＦＬＰマーカーはエンドヌクレアーゼの制限部位又は選択ヌクレオチド内のＳＮＰを含む。時として、ＡＦＬＰマーカーは制限断片内のインデルを含み得る。
【００２５】
ＳＮＰマーカー：ＳＮＰマーカーは、或る特定の位置で同定された一塩基多型に基づくマーカーである。ＳＮＰマーカーは、ＡＦＬＰマーカーと同一位置に位置し得るが、ＳＮＰマーカーは、制限断片自体にも位置し得る。したがって、ＳＮＰマーカー属はＡＦＬＰマーカー種をこうして包含する。
【００２６】
定常バンド：ＡＦＬＰ技術における定常バンドは、サンプル間で比較的不変の、増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片である。したがって、ＡＦＬＰ技術における定常バンドは、サンプルの範囲を超えて、ゲル中のほぼ同一位置に現れる、即ち、同一の長さ／移動度を有する。従来のＡＦＬＰでは、これらは典型的には、ゲル上のサンプルに対応するレーン又はキャピラリー電気泳動によって検出される複数のＡＦＬＰサンプルの電気泳動図をアンカーする（anchor）のに使用される。典型的には、定常バンドはＡＦＬＰマーカーよりも情報不足である。にもかかわらず、ＡＦＬＰマーカーが通例（customary）選択ヌクレオチド又は制限部位内にＳＮＰを包含するのと同様に、定常バンドは制限断片自体にＳＮＰを含む可能性があり、定常バンドはＡＦＬＰマーカーと相補的な遺伝情報の興味深い代替的なソースとなる。
【００２７】
選択塩基：選択塩基は、アダプターに相補的な部分及び制限部位の残りに相補的な部分を含有するプライマーの３’末端に位置し、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧの中からランダムに選択される。選択塩基を用いてプライマーを伸長することにより、続く増幅ではアダプターにライゲーションされた制限断片の再現可能なサブセットのみ、即ち、選択塩基を担持するプライマーを使用して増幅され得る断片のみが生成される。選択ヌクレオチドは１〜１０の数でプライマーの３’末端に付加され得る。典型的には、１〜４で十分である。両プライマーは様々な数の選択塩基を含有し得る。それぞれ付加された選択塩基に応じて、サブセットはサブセット中の増幅されたアダプターとライゲーションされた制限断片の量を約４分の１に低減させる。典型的には、ＡＦＬＰにおいて使用される選択塩基の数は＋Ｎ＋Ｍで示される（式中、１つのプライマーがＮ個の選択ヌクレオチドを担持し、他のプライマーは、Ｍ個の選択ヌクレオチドを担持する）。したがって、Ｅｃｏ／Ｍｓｅ  ＋１／＋２  ＡＦＬＰとは、開始ＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩによる消化、適切なアダプターのライゲーション、並びに１つの選択塩基を担持するＥｃｏＲＩ制限位置を対象とする１つのプライマー、及び２つの選択ヌクレオチドを担持するＭｓｅＩ制限部位を対象とするもう１つのプライマーを用いた増幅の省略表現である。
【００２８】
クラスタリング：用語「クラスタリング」の意味は、同一または類似のヌクレオチドの短い又は長いストレッチの存在に基づいて、２つ以上のヌクレオチド配列を比較することである。以下でさらに説明するように、幾つかのヌクレオチド配列のアライメント方法が当該技術分野において既知である。用語「アセンブリー」又は「アライメント」が同義語として使用されることもある。
【００２９】
タグ：プライマーに付加され得るか、その配列内に含まれ得るか、そうでなければラベルとして使用されて一意の識別子を提供し得る短い配列。かかる配列識別子は、特定の核酸サンプルを同定するために一意的に使用される、多様であるが規定された長さを有する一意の塩基配列であり得る。例えば、４ｂｐのタグにより、４４＝２５６の異なるタグができる。典型的な例は、ハイブリダイゼーションによる一意的な検出に汎用されるタグとして当該技術分野において既知のＺＩＰ配列である（Iannone他 Cytometry 39:131-140, 2000）。かかるタグを使用することによって、さらなる処理時にＰＣＲサンプルの起源が決定され得る。異なる核酸サンプルに由来する処理産物を組み合わせる場合には、概して、異なる核酸サンプルは異なるタグを使用して同定される。本発明の場合、一意的な配列タグを付加することにより、配列増幅産物のプーリングで個々の植物の座標が同定される。複数のタグが使用され得る。
【００３０】
タグ付け：用語「タグ付け」は、核酸サンプルを第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルと区別することを可能にするために、核酸サンプルへタグを追加することを指す。タグ付けは、例えば、複雑度低減の間の配列識別子の追加により、又は当該技術分野において既知である任意の他の手段により行なうことができる。そのような配列識別子は、特異的な核酸サンプルの同定のために一意的に使用される、例えば多様であるが規定された長さの一意の塩基配列であり得る。その代表例は、例えばＺＩＰ配列である。そのようなタグを使用して、その後の処理に際して、サンプルの起源を決定することができる。異なる核酸サンプルに由来する処理産物を組み合わせる場合には、異なる核酸サンプルは異なるタグを使用して同定されるべきである。
【００３１】
タグ付けされたライブラリー：用語「タグ付けされたライブラリー」は、タグ付けされた核酸のライブラリーを指す。
【００３２】
シークエンシング：用語「シークエンシング」は、核酸サンプル、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ中のヌクレオチド（塩基配列）の順番を決定することを指す。
【００３３】
ハイスループットスクリーニング：ＨＴＳとしばしば略されるハイスループットスクリーニングは、特に生物学分野及び化学分野に関連する、科学的な実験のための方法である。最新のロボット工学と他の特殊な研究室ハードウェアとの組合せによって、研究者が効果的に同時に大量のサンプルをスクリーニングすることを可能にする。
【００３４】
制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子中の特異的なヌクレオチド配列（標的部位）を認識し、標的部位ごとにＤＮＡ分子の両鎖を切断する酵素である。
【００３５】
制限断片：制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成されたＤＮＡ分子は制限断片と称される。任意の所定のゲノム（又はその起源にかかわらず核酸）は、特定の制限エンドヌクレアーゼにより、制限断片の不連続なセットへと消化されるだろう。制限エンドヌクレアーゼ切断に由来するＤＮＡ断片は、様々な技法の中でさらに使用することができ、例えばゲル電気泳動法により検出することができる。
【００３６】
ゲル電気泳動法：制限断片を検出するために、サイズに基づいて二本鎖ＤＮＡ分子を画分するための解析方法が必要になる。そのような画分を達成するために、最も一般に用いられている技法は、（キャピラリー）ゲル電気泳動法である。ＤＮＡ断片のそのようなゲル中での移動率は、ＤＮＡ断片の分子量に依存する。したがって、断片長が増加するにつれて、移動距離は減少する。ゲル電気泳動法により画分されたＤＮＡ断片は、パターンの中に含まれた断片数が十分に少ない場合には、染色手順、例えば、銀染色法又はエチジウムブロマイドを使用する染色法により直接可視化することができる。代替的には、ＤＮＡ断片のさらなる処理では、蛍光色素分子又は放射性ラベルのような、断片において検出可能なラベルを取り込んでもよい。
【００３７】
ライゲーション：２つの二本鎖ＤＮＡ分子を共有結合で共に連結させるリガーゼ酵素により触媒された酵素反応は、ライゲーションと称される。一般に、両方のＤＮＡ鎖は共有結合で共に連結されるが、鎖の１つの末端の化学的修飾又は酵素的修飾によって、２つの鎖のうちの１つの鎖のライゲーションを防ぐことも可能である。その場合には、共有結合が２つのＤＮＡ鎖のうちの１つだけにおいて起こるだろう。
【００３８】
合成オリゴヌクレオチド：化学的に合成することができる、好ましくは約１０〜約５０塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドと称される。関連した配列を有する分子のファミリーを合成することは可能であり、それはヌクレオチド配列中の特異的な位置で異なるヌクレオチド組成を有しているが、一般に、これらの合成ＤＮＡ分子は、一意のヌクレオチド配列又は所望のヌクレオチド配列を有するように設計される。用語「合成オリゴヌクレオチド」は、設計されたヌクレオチド配列又は所望のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を指すために使用されるだろう。
【００３９】
アダプター：限られた数の塩基対、例えば約１０〜約３０塩基対長を有する短い二本鎖ＤＮＡ分子は、制限断片末端にライゲーションすることができるように設計されている。アダプターは、通常互いに部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する２つの合成オリゴヌクレオチドから成る。適切な条件下で溶液中で２つの合成オリゴヌクレオチドを混合した場合、それらは互いにアニーリングして、二本鎖構造を形成するだろう。アニーリング後、アダプター分子の一末端は制限断片の末端と適合し、ライゲーションすることができるように設計されている。アダプターの他の末端は、ライゲーションできないように設計することができるが、そうである必要はない（二重にライゲーションされたアダプター）。
【００４０】
アダプターにライゲーションされた制限断片：アダプターによりキャッピングされた制限断片。
【００４１】
プライマー：一般に、用語「プライマー」は、ＤＮＡの合成をプライミングすることができるＤＮＡ鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしではＤＮＡをデノボ合成することができない。アセンブリーされるヌクレオチドの順序を指定するために、鋳型として相補的な鎖が用いられるような反応において、ＤＮＡポリメラーゼは既存のＤＮＡ鎖のみを伸長することができる。本発明者等は、プライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において用いられる合成オリゴヌクレオチド分子を指すだろう。
【００４２】
ＤＮＡの増幅：用語「ＤＮＡの増幅」は、典型的には、ＰＣＲを用いた二本鎖ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏの合成を指し示すために用いられるだろう。他の増幅方法が存在し、それらは主旨から外れずに、本発明において用いられてもよいことに留意されたい。
【００４３】
選択的ハイブリダイゼーション：ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、非標的核酸配列への、及び非標的核酸を実質的に排除したハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に多い（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）特異的な核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーションに関する。用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、他の配列よりも検出可能な程度に多く（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）、標的配列とハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、場合によって異なる。ハイブリダイゼーション、洗浄条件の少なくとも一方のストリンジェンシーを制御することによって、プローブと１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同プロービング（homologous probing））。代替的に、ストリンジェンシー条件を調整することができ、配列中の幾つかのミスマッチを許容するとより低い類似度が検出される（非相同プロービング（heterologous probing））。概して、プローブは約１００ヌクレオチド長未満、任意選択で５０又は２５ヌクレオチド長以下である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度は、約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）、ｐＨは７．０〜８．３、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより多い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定物質を添加しても達成され得る。低ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃での３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いたハイブリダイゼーション及び５０〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における洗浄が挙げられる。中ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃での４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション及び５５〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃での５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション及び６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の機能であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関しては、ＴｍはMeinkoth and Wahl, Anal. Biochem. , 138:267-284 (1984)の等式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％  ＧＣ）−０．６１（％  ｆｏｒｍ）−５００／Ｌにより近似され得る（式中、Ｍは一価陽イオンのモル濃度であり、％  ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドの割合であり、％  ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対中でのハイブリッドの長さである）。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度（���定のイオン強度及びｐＨ下）である。ミスマッチ１％毎にＴｍは約１℃低下するので、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、洗浄条件の少なくとも一方を調整して、所望の同一性を有する配列とハイブリダイズし得る。例えば、９０％を上回る同一性を有する配列を検索する場合、Ｔｍは１０℃低下し得る。概して、ストリンジェントな条件は規定のイオン強度及びｐＨでの特異的配列及びその相補体の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、極めてストリンジェントな条件は熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション、洗浄の少なくとも一方を利用し得るし、中ストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション、洗浄の少なくとも一方を利用し得るし、低ストリンジェンシー条件は熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション、洗浄の少なくとも一方を利用し得る。等式、ハイブリダイゼーション組成及び洗浄組成、並びに所望のＴｍを使用することによって、当業者はハイブリダイゼーション溶液、洗浄溶液の少なくとも一方のストリンジェンシーにおける変形形態が本質的に記載されていることを理解するだろう。所望のミスマッチ度により、４５℃
（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍとなる場合、より高温を使用し得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対しての広範な指針は、Tijssen著「生化学及び分子生物学における実験技法−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridisation with Nucleic Acid Probes）」、第１部、第２章「ハイブリダイゼーション原理の概要と核酸プローブ分析の戦略（Overview of principles of hybridisation and the strategy of nucleic acid probe assays）」、Elsevier, N. Y. (1993)、及び「分子生物学における現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、第２章、Ausubel他編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)に見出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
第一の態様において、本発明は、１つ又は複数のサンプルにおける１つ又は複数の遺伝子マーカーのハイスループットでの発見、検出及び大規模な遺伝子型決定のための方法であって、
（ａ）１つ又は複数のサンプルに由来するＤＮＡを提供する工程と、
（ｂ）ＤＮＡを少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限し、それにより制限断片を生成する、制限工程と、
（ｃ）アダプターに制限断片をライゲーションし、それによりアダプターにライゲーションされた制限断片を生成する、ライゲーション工程と、
（ｄ）任意選択で、アダプターにライゲーションされた制限断片を少なくともアダプターと相補的なプライマー対を用いて増幅させ、それにより前増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片を生成する、増幅工程と、
（ｅ）（任意選択で前増幅された）アダプターにライゲーションされた制限断片をプライマー対を用いて増幅させる工程であって、プライマーのうち少なくとも１つがプライマーの５’末端に識別子タグを含有し、それにより各サンプルに対して、アダプターにライゲーションされた制限断片の、タグ付けされた増幅されたサブセットのライブラリーを生成する、増幅工程と、
（ｆ）任意選択で、複数のサンプルに由来するライブラリーをプーリングする工程と、
（ｇ）ハイスループットシークエンシング技術を使用して、ライブラリーをシークエンシングする工程と、
（ｈ）識別子タグを使用して、ライブラリー毎に配列をクラスタリングする工程と、
（ｉ）ライブラリー内部、ライブラリー間の少なくとも一方でクラスタリングされた配列を比較することによって遺伝子マーカーを同定する（identify）工程と、
（ｊ）好ましくは全てのサンプル及び全ての同定されたマーカーについて、１つ又は複数のライブラリーにおいて遺伝子マーカーの（共）優性遺伝子型を決定する工程を含む方法に関する。
【００４５】
本方法は１つ又は複数のサンプルにおける１つ又は複数の遺伝子マーカーの発見、検出及び遺伝子型決定に関する。或る特定の実施形態において、本方法は対象とする遺伝子マーカーの有／無スコアリングに関する。或る特定の実施形態において、本方法は１つ又は複数の遺伝子マーカー用の１つ又は複数のサンプルについての（共）優性遺伝子型の決定に関する。これにはサンプル間でのマーカー配列又はマーカー対立遺伝子配列の観測数の標準化が必要とされ得る。
【００４６】
本方法の第一工程（ａ）では、ＤＮＡが提供されるべきである。これ自体は当該技術分野で既知の方法によって為され得る。概して、ＤＮＡの単離は、集団の構成員からの組織採取、ＤＮＡ抽出（例えば、Q-Biogene fast DNA kitを使用）、定量化及び標準化を行ってサンプル毎に等量のＤＮＡを得る等、当該技術分野で一般的な方法を使用して達成される。ＤＮＡは各種ソース（ゲノム、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）及び生物体（ヒト、哺乳類、植物、微生物等）由来であり得る。単離されたＤＮＡはプーリングされ得る。
【００４７】
工程（ｂ）で、ＤＮＡは少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを使用して制限される。場合に応じて、即ち、ゲノムのサイズに応じて、複数のエンドヌクレアーゼが使用され得る。或る特定の実施形態において、２以上のエンドヌクレアーゼが使用され得る。殆どのゲノムでは、２つのエンドヌクレアーゼで十分であり、これがそのため最も好ましい。或る特定の実施形態において、特に、大きい又は複雑なゲノムについては、複数のエンドヌクレアーゼが使用され得る。好ましくは、エンドヌクレアーゼはほぼ２５０〜５００ｂｐ程度の比較的短い制限断片を与えるが、これは必須ではない。典型的には、少なくとも１つの切断頻度の高いエンドヌクレアーゼ、即ち、４又は５塩基対認識配列を有するエンドヌクレアーゼが好ましい。１つのかかる酵素はＭｓｅＩであるが、他に多くのものが市販されており、使用され得る。認識配列の外側で切断する酵素（ＩＩｓ型）又は平滑末端化制限断片を与える酵素も使用され得る。好ましい組合せでは、１つのレアカッター（６以上の塩基対認識配列、例えばＥｃｏＲＩ)及び１つのフリークエントカッターが使用される。
【００４８】
プーリングされたＤＮＡの制限後、又はそれと同時に、アダプターが制限断片にライゲーションされて、アダプターにライゲーションされた制限断片を与える。１つ又は複数の異なるアダプターが使用され得る（例えば２つのアダプター、１つが正アダプター、１つが逆アダプター）。代替的には、１つのアダプターが全ての断片に使用され得るし、又は前選択工程を可能にし得るインデックスリンカーを提供するために、アダプターの突出端にヌクレオチドの置換を含有するアダプターのセットが使用され得る（Unrau他, Gene, 1994, 145, 163-169）。代替的には、平滑末端化制限断片の場合、平滑末端化アダプターが使用され得る。アダプターライゲーションは当該技術分野において既知であり、中でも、特許文献１に記載されている。ＡＦＬＰ技術の１つの有用な変形は選択ヌクレオチドを使用せず（即ち、＋０／＋０プライマー）、リンカーＰＣＲと称されることもある。サルサＰＣＲと同様に、選択工程が制限酵素を用いて提供され、異なる制限酵素が異なるサブセットを生成する。これはまた前増幅として示されることもあり、少なくともアダプターと相補的であり、任意選択で制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残りの部分とも相補的であるプライマーが使用される。前増幅は、各サンプルからのＤＮＡ量を（さらに）標準化するように、又は全ＤＮＡ量を増大させて、複数の解析（即ち、サンプルを分割する)を可能にし、シグナル−ノイズ比を増大させるように機能し得る。また、前増幅を使用して、選択的増幅の前にプーリングを可能にするタグを導入し得る。プライマーの５’末端にヌクレオチドタグ（例えば、４ｂｐ）を導入することによって、異なるサンプルに対する制限断片がタグ付けされ、処理の最後にタグを使用して回収され得る。
【００４９】
アダプターにライゲーションされた制限断片は、任意選択の前増幅後、本発明の方法の工程（ｄ）においてプライマー対を用いて増幅される。プライマーの１つはアダプターの少なくとも一部と相補的であり、エンドヌクレアーゼの認識配列の残りの部分とさらに相補的である可能性があり、３’末端に（ランダムに選択された）選択ヌクレオチドをさらに含有する可能性がある。これは特許文献１の記載と同様である。好ましくは、プライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズすることが可能である。選択的増幅はまた、上記と同様、サンプルの起源を同定するための５’タグを担持するプライマーを用いて実施され得る。その結果が、増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片の（タグ付けされた）サブセットのライブラリーである。
【００５０】
複数のサンプルから調製したライブラリーにおける選択的に増幅された断片は、この時点で任意選択でプーリングされ得る。これは或る特定のサンプル群（或る特定の表現型の特徴を共有するもの等）に対して特異的なマーカーを検索する場合に有用であり得る。プーリングされたサンプルのスクリーニングは一般に混合分離分析（bulked segregant analysis）（BSA；Michelmore, Paran and Kesseli, 1991）と称される。或る特定の実施形態において、プーリングはまたサンプリング段階のＤＮＡ抽出前に実施される可能性があり、ＤＮＡ標本数を減少させる。ＤＮＡのプーリングはさらにＰＣＲ増幅前にＤＮＡを標準化する機能があり、シークエンシング用ライブラリーにおいてより均一な表現が提供される。
【００５１】
任意選択でプーリングされた、選択的に増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片のライブラリーは、ここでハイスループットシークエンシング技術を使用してシークエンシングされる。
【００５２】
シークエンシングは、ダイデオキシ連鎖停止法（サンガーシークエンシング（Sanger sequencing））のような、当該技術分野において既知である任意の手段によって、原則としては行われてもよい。しかしながら、シークエンシングは、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１及び特許文献１２（Seo他 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93）（全て454 Life Sciences名義）に記載された方法のようなハイスループットシークエンシング法、及びヘリオス（Helios）、ソレクサ（Solexa）、ＵＳゲノミクス（US Genomics）等の技術（これらは本明細書中に参照により援用される）を用いて行なわれることが好ましく、且つより有利である。シークエンシングは、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、及び特許文献１２に（全て454 Life Sciences名義）記載された装置、方法の少なくとも一方を用いて行なわれることが最も好ましく、本明細書中に参照により援用される。これまで記述された技術は、一回の実行において４０００万塩基のシークエンシングを可能にし、サンガーシークエンシングに基づくと共に、ＭｅｇａＢＡＣＥ（GE Healthcare）又はＡＢＩ３７００（×１）（Applied Biosystems）のような、現在利用可能なキャピラリー電気泳動装置を使用する競合技術よりも１００倍速く、より安い。これは、反応毎の読み取りの長さの増加、併発反応の数の増加の少なくとも一方に伴って増加する。シークエンシング技術は、１）ＤＮＡの断片化及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーを作成する、特異的なアダプターのライゲーションと、２）ビーズに対するｓｓＤＮＡのアニーリング、油中水滴型マイクロリアクター中のビーズの乳化、及びビーズ上で個々のｓｓＤＮＡ分子を増幅するためのエマルジョンＰＣＲの実施と、３）それらの表面上に増幅されたｓｓＤＮＡ分子を含有するビーズの選択／濃縮と、４）ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）におけるＤＮＡを担持するビーズの沈着と、５）ピロリン酸光シグナルの生成による１０００００ウェルの同時シークエンシングとのおおまかには５つの工程から成る。
【００５３】
好ましい実施形態において、シークエンシングは、
（１）シークエンシングアダプターにライゲーションされた断片をビーズにアニーリングする（各ビーズは単一の断片とアニーリングする）工程と、
（２）ビーズを油中水滴型マイクロリアクター内で乳化させる（各油中水滴型マイクロリアクターは単一のビーズを含む）工程と、
（３）エマルジョンＰＣＲを実施し、それによりビーズの表面上でアダプターにライゲーションされた断片を増幅させる、実施工程と、
（４）増幅されたアダプターにライゲーションされた断片を含有するビーズを選択／濃縮する工程と、
（５）ビーズをウェルに充填する（各ウェルは単一のビーズを含む）工程と、
（６）ピロリン酸シグナルを生成する工程を含む。
【００５４】
上記第一工程（１）では、アダプターにライゲーションされた制限断片中に存在するアダプターをビーズにアニーリングする。本明細書中で先に概略を示したように、シークエンシングアダプターは、少なくともビーズにアニーリングするための「鍵」領域、シークエンシングプライマー領域及びＰＣＲプライマー領域を含む。特に、増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片は、ここで一端に５’−配列プライマー結合部位−−−タグ−−−ＰＣＲプライマー配列−３’という配列を含有する一方、他端には５’−ビーズアニーリング配列−−−タグ−−−アダプター特異的配列−−−制限部位特異的配列（任意選択）−−−（ランダムな）選択配列（任意選択）−３’であり得る区域が存在する。配列プライマー結合部位とビーズアニーリング配列を交換してもよいことは明らかであり得る。ここで、このビーズアニーリング配列は、断片を、末端にヌクレオチド配列を担持するビーズにアニーリングするために使用され得る。
【００５５】
したがって、適合した断片はビーズにアニーリングされる（各ビーズは単一の適合した断片とアニーリングする）。適合した断片のプールに過剰のビーズを添加することにより、大部分のビーズに関して、ビーズ毎に単一の適合した断片のアニーリングが保証される（ポワソン分布）。
【００５６】
好ましい実施形態において、スクリーニングの効率をさらに増大させるために、ＰＣＲ産物をシークエンシング用ビーズ上に一方向に増幅させることは有益である。これは、ＭｓｅＩ（又は他の制限酵素）側にあるアダプターの一方の鎖が配列ビーズと共役したオリゴヌクレオチドと相補的である、アダプターの付いた（adaptor-tailed）ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲを実施することで達成され得る。
【００５７】
次の工程では、ビーズを油中水滴型マイクロリアクター内で乳化させる（各油中水滴型マイクロリアクターは単一のビーズを含む）。ＰＣＲ試薬が油中水滴型マイクロリアクター内に存在することにより、ＰＣＲ反応がマイクロリアクター内部で起こることが可能となる。続いて、マイクロリアクターを破壊して、ＤＮＡを含むビーズ（ＤＮＡポジティブビーズ）を濃縮する。
【００５８】
続く工程では、ビーズをウェルに充填する（各ウェルは単一のビーズを含む）。ウェルは、好ましくは大量の断片の同時シークエンシングを可能にするＰｉｃｏＴｉｔｅｒ（商標）プレートの一部である。
【００５９】
酵素担持ビーズの添加後、ピロシークエンシングを使用して断片の配列を決定する。引き続く工程で、従来のシークエンシング試薬存在下、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ（商標）プレート並びにその中のビーズ及び酵素ビーズを異なるデオキシリボヌクレオチドに付し、デオキシリボヌクレオチドを取り込む際、記録される光シグナルが生成される。正確なヌクレオチドの取り込みにより、検出可能なピロシークエンシングシグナルが生成される。
【００６０】
ピロシークエンシング自体は当該技術分野において既知であり、中でもwww.biotagebio.com; www.pyrosequencing.comの技術欄に記載されている。技術はさらに例えば、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１及び特許文献１２（全て454 Life Sciences名義）において利用されており、本明細書中に参照により援用される。
【００６１】
シークエンシング後、シークエンシング工程から直接得られる断片の配列は、好ましくはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでトリミングされて、任意のビーズアニーリング配列、シークエンシングプライマー、アダプター又はプライマーと関連した配列情報を除去し得る。
【００６２】
典型的には、アライメント又はクラスタリングは任意の付加されたアダプター／プライマー配列に対してトリミングされた配列データ上で実施される。即ち、任意選択の識別子タグと共に、核酸サンプルに由来する断片からの配列データのみを使用する。
【００６３】
比較目的のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において既知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムは、Smith及びWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; Higgins及びSharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins及びSharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet他 (1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90; Huang他 (1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65;及びPearson他 (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31において記載され、本明細書中に参照により援用される。Altschul他 (1994) Nature Genet. 6:119-29（本明細書中に参照により援用される）は、配列アラインメントの方法及び相同性の計算について詳細な考察を提供する。
【００６４】
ＮＣＢＩの基本的局所アライメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）（ＢＬＡＳＴ）（Altschul他, 1990）は、配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連する使用について、国立生体情報センター（National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベテスダ）及びインターネット上を含むいくつかのソースから利用可能である。それは＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/＞でアクセスすることができる。このプログラムを用いて、配列同一性を決定する方法の説明は、＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html＞で利用可能である。データベースは、ＥＳＴ配列、対象となる種のゲノミック配列（genomic sequences）及びＧｅｎＢａｎｋの非冗長配列データベースの少なくとも一方、又は類似の配列データベースを含むことが好ましい。
【００６５】
Shendure他 Science, Vol 309, Issue 5741, 1728-1732に記載されているように、ハイスループットシークエンシング法が使用され得る。その例としては、マイクロ電気泳動シークエンシング、ハイブリダイゼーションシークエンシング／ハイブリダイゼーションによるシークエンシング（ＳＢＨ）、増幅された分子上での環状アレイシークエンシング、単一分子上での環状アレイシークエンシング、ポリメラーゼシークエンシング、エキソヌクレアーゼシークエンシング、ナノポアシークエンシング等の非循環的、単一分子、実時間法が挙げられる。
【００６６】
ライブラリー内部で遺伝子マーカーの存在、遺伝子マーカー用サンプルの遺伝子型の少なくとも一方がここで決定され得る。
【００６７】
本発明の方法は、ＡＦＬＰマーカーの同定、検出、及び遺伝子型決定だけでなく、定常バンドに含有されるＳＮＰマーカーの同定、検出及び遺伝子型決定にも使用され得る。
【００６８】
複数の断片のライブラリーに含有される対立遺伝子の（マーカー）断片をシークエンシングすることにより、遺伝子マーカーの遺伝子型決定の精度に影響を与える標本抽出変動の問題の解決法を提供するために、本発明者等はまた、好ましくはシークエンシングを介したＡＦＬＰマーカーの検出が、少なくとも１回全ての増幅された断片をサンプルするのに十分な重複（深度）で実施され、呼び出される遺伝子型の精度と関連した標本抽出変動の課題を扱う統計的手段を伴うことを見出した。さらに、ＡＦＬＰスコアリングとちょうど同じように、分離集団の状況で、１つの実験における親の個体の同時スコアリングは統計的閾値を決定する際の助けとなる。なぜなら、サンプル中の全ての考えられる対立遺伝子は親１又は親２のいずれかでスコアリングされるからである。なお、親の個体を分離集団の個体よりも高い重複でサンプリングすることが示唆される。
【００６９】
したがって、或る特定の実施形態において、タグ付けされ増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片の重複は少なくとも６、好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、及び最も好ましくは少なくとも９である。或る特定の実施形態において、各アダプターにライゲーションされた制限断片の配列は少なくとも６倍、好ましくは少なくとも７倍、より好ましくは少なくとも８倍、及び最も好ましくは少なくとも９倍測定される。或る特定の実施形態において、重複は、遺伝子座をホモ接合として正確に同定する可能性が全体で５０／５０であると仮定して、遺伝子座を正確に同定する可能性が９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％より高くなるように選択される。
【００７０】
或る特定の実施形態において、サンプル数は１〜１０００００の間で変化し得る。これはまた主に、解析されるゲノムのサイズ及び選択的に増幅される断片の数に依存する。通常、利用されるシークエンシング技術の能力はこの点において最大の制限要因を与える。
【００７１】
［実施例］
方法を以下のように例示する：
１）ＡＦＬＰ鋳型は、制限工程とライゲーション工程との間に８０℃で２０分間の熱変性工程を含む、Vos他のプロトコルの変更形態により調製される。８０℃で２０分間のインキュベーション後、制限酵素消化物は室温に冷却され、ＤＮＡリガーゼが添加される。変性工程により、アダプターが末端にライゲーションしないように１２０ｂｐまでの制限断片の相補的な鎖が解離する。結果として、１２０ｂｐよりも小さい断片は増幅されないので、サイズ選択が達成される。
【００７２】
２）前増幅反応が利用可能である場合、従来のＡＦＬＰと同様に実施される。
【００７３】
３）続く（選択的）増幅工程は、集団／実験における全てのサンプルに対する一意的な識別子タグを有するＡＦＬＰプライマーを使用して実施される（一意的な４ｂｐ識別子配列、ＫＩＳを使用）。ＫＩＳは選択的ＡＦＬＰプライマーの５’末端に位置する。１つのさらなる選択ヌクレオチドは、電気泳動による従来のＡＦＬＰ検出において使用される選択塩基の数との比較において使用される（例えば、コショウにおけるＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩフィンガープリントでは＋４／＋３（ゲル検出＋３／＋３）、トウモロコシにおけるＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩフィンガープリントでは＋４／＋４（ゲル検出＋４／＋３））。適用される選択ヌクレオチドの数は、実験的に決定される必要があり、ゲル検出に使用されるのと同様の選択ヌクレオチドの数が適用され得る。この数がさらに実験に含まれるサンプルの数に依存するのは、シークエンシング技術の現状では、配列トレースの数が２０００００で一定と仮定されるからであるが、これは増加し得るし、おそらく増加するだろう。好ましい開始点はサンプルライブラリー毎に１０倍のＡＦＬＰ断片のサンプリングを達成する。
【００７４】
４）工程１〜工程４により調製されたサンプルの集合を454 Life Sciencesの技術によるシークエンシングに付す。これは、個々のＡＦＬＰ断片をビーズ上でクローニングし、ＰＣＲ増幅し、シークエンシングすることを意味する。１００ｂｐ長の２０００００配列の結果が予想される。このことにより、１００サンプルの集合について、２０００配列トレース／サンプルの平均を均等化し、５’タグを通じてサンプル数が追跡可能となる。
【００７５】
５）ゲル検出で使用される数と比較して１つのさらなる選択ヌクレオチドを使用する場合、ＰＣ毎に１００個のＡＦＬＰ断片の増幅を仮定すると、その９０％が定常バンドであり、ＡＦＬＰ断片は断片毎に２０倍の平均重複でサンプリングされる。しかしながら、シークエンシングは一方向性ではなく、殆どのバンドは＞２００ｂｐであるので、シークエンシング重複は、各断片末端に対して１０倍を僅かに上回る。
【００７６】
６）ＫＲＳタグを使用してサンプル毎に全ての配列をクラスタリングした。サンプリングに対して１０倍とすると、これはサンプル毎に２００の異なる配列トレースが予想されることを意味し、２００×１００ｂｐ＝２０ｋｂ配列／サンプルを表す。これらの配列の１０％がＡＦＬＰマーカー由来である（即ち、１つの対立遺伝子が増幅され、他はＰＣＲ反応中に存在しない）場合、配列の９０％（１８ｋｂ）は定常バンド由来である。
【００７７】
７）２つの型の遺伝子マーカーがスコアリングされる：
Ａ）ＡＦＬＰマーカー：これらはサンプル中に観察されるものもあれば、存在しないものもある配列である。
【００７８】
サンプルの集合における配列の頻度の検査によりこのカテゴリーは明らかとなる。優性スコアリングは全てのサンプルにおけるこれらの配列の有無の観察に応じて実施される。信頼性の高いＡＦＬＰマーカーのスコアリングには、他のＡＦＬＰ配列が実験において観察される頻度に関して設定される統計的閾値が必要となる。即ち、ＡＦＬＰマーカーは、ＡＦＬＰマーカー配列がサンプル中に観察される場合には、有り（優性）としてスコアリングされ得るが、無しというスコアの信頼性は（定常）ＡＦＬＰ断片の（平均）頻度に依存する。統計的閾値のレベルは、特定の用途に必要な許容可能なレベルに応じて、有り／無しのスコアリングが好ましくは少なくとも９９．５％の精度で実施されるように要求される。分離集団及びその親を解析する場合、これらのマーカーはおそらくマーカー配列の頻度カテゴリーを規定することによって共優性としてもスコアリングされ得る。後者は、実際はサンプル間で異なるＡＦＬＰマーカーの標本抽出変動の影響により複雑化され得る。
【００７９】
Ｂ）定常ＡＦＬＰ断片における一塩基（ＳＮ）多型
これは、遺伝子マーカーの最も興味深い（そして豊かな）カテゴリーである。本質は定常ＡＦＬＰ断片の内部配列に含有されるＳＮＰマーカーが共優性ＳＮＰマーカーとしてスコアリングされることである。また、好ましくは、これは統計的閾値レベルを対立遺伝子の有無の正確な呼び出しに適用することを必要とする。断片ライブラリーの１０倍のシークエンシング重複は十分であると予想されるが、各対立遺伝子配列の観察数に応じたＳＮＰマーカー遺伝子型の精度の決定に統計的解析法が必要とされる。理論的根拠は、定常バンドがＳＮＰを含有し、１つの対立遺伝子が例えば５回観察される一方、他の対立遺伝子（を含有する配列）が観察されない場合、サンプルは観察される対立遺伝子に対してホモ接合である可能性が非常に高いことである。結果的に、両対立遺伝子が観察される場合、その頻度とは無関係に、サンプルはＳＮＰマーカーに対してヘテロ接合とスコアリングされる。
【００８０】
８）結果は、全てのマーカーの遺伝子型の正確性についての確率に沿った、（共）優性にスコアリングされたＡＦＬＰマーカー及び共優性にスコアリングされたＳＮＰマーカーの遺伝子型を含有する遺伝子型決定表となる。代替的には、設定の統計的閾値レベルを超えた遺伝子型を含有するデータセットが生成される。
【００８１】
アプローチでは、サンプル毎にＡＦＬＰ断片のサンプリングに対して１０倍を仮定し、１８ｋｂの定常配列／サンプル及び２ｋｂのＡＦＬＰマーカー配列が生成される。
【００８２】
観察される遺伝子マーカーの数は調査される生殖質中のＳＮＰ率に依存する。以下、２０ｋｂの配列をサンプリングする場合、異なる生殖質ＳＮＰ率で遺伝子マーカーの数の推定が提示される。ＡＦＬＰマーカー／断片の平均長を２００ｂｐと仮定する。
【００８３】
【表１】
0005452021.tif 000002
【００８４】
表１に提示される数は平均であり、異なるプライマーの組合せにより異なり得ることに留意することが重要である。従来のＡＦＬＰ決定法と同様、上部のプライマーの組合せ（ＰＣ）の同定により、ＰＣ毎により多数のマーカーが生成され得る。また、表１に存在する数は、要求精度レベルに到達するために必要なサンプリングの要求レベルに応じて変化し得る。
【００８５】
遺伝子型の正確な分類の計算は以下の通りである：
Ｐ（ｃｏｒｒｅｃｔ）＝Ｐ（ａａ）＋Ｐ（ＡＡ）＋Ｐ（Ａａ）×［１−０．５ｎ−１］
（式中、Ｐ（ａａ）は、遺伝子型ａａを有する集団の分画である（同封のグラフ内、図９、０．２５に設定）。Ｐ（ＡＡ）は遺伝子型ＡＡを有する集団の分画である（０．２５に設定）。Ｐ（Ａａ）は遺伝子型Ａａを有する集団の分画である（図６及び下表、０．５に設定）。ｎは個体数に等しい。
【００８６】
【表２】
0005452021.tif 000003
【００８７】
［実施例１  コショウ］
コショウ系統ＰＳＰ−１１及びＰＩ２０１２３４由来のＤＮＡが、ＡＦＬＰ鍵遺伝子認識部位特異的プライマーを用いてＡＦＬＰ産物を生成するために使用された（これらのＡＦＬＰプライマーは、例えば、特許文献１に記載の従来のＡＦＬＰプライマーと本質的に同一であり、概して認識部位領域、定常領域、及び選択領域における１つ又は複数の選択ヌクレオチドを含有する。）。
【００８８】
コショウ系統ＰＳＰ−１１又はＰＩ２０１２３４から、ＤＮＡ  １５０ｎｇを３７℃で１時間、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（５Ｕ／反応）、及びＭｓｅＩ（２Ｕ／反応）を用いて消化した後、８０℃で１０分間不活化した。得られた制限断片を、一端がＥｃｏＲＩ、ＭｓｅＩ制限断片の少なくとも一方の一端又は両端と適合性がある二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションした。制限ライゲーション混合物を１０倍に希釈し、５μｌ（マイクロリットル）の各々のサンプルは、ＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）及びＭｓｅＩ＋１（Ｃ）プライマー（セットＩ）により前増幅された（２）。増幅後に、２つのコショウのサンプルの前増幅産物の品質を、１％アガロースゲル上でチェックした。前増幅産物を２０倍に希釈した後、ＫＲＳＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）及びＫＲＳＭｓｅＩ＋２（ＣＡ）ＡＦＬＰ前増幅を行なった。下記のプライマー配列番号１〜４の３’−末端で、ＫＲＳ（識別子）区域には下線が引かれており、選択ヌクレオチドは太字とする。増幅後に、２つのコショウのサンプルの前増幅産物の品質を、１％アガロースゲル上で、並びにＥｃｏＲＩ＋３（Ａ）及びＭｓｅＩ＋３（ｃ）  （３）  ＡＦＬＰフィンガープリント（４）によりチェックした。２つのコショウ系統の前増幅産物を、キアゲン（Qiagen）ＰＣＲカラムの上で別々に精製した（５）。サンプルの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計で測定した。合計５μｇのＰＳＰ−１１及び５μｇのＰＩ２０１２３４  ＰＣＲ産物を混合し、シークエンシングした。
ＰＳＰ−１１の前増幅に用いられるプライマーセットＩ
【化１】
0005452021.tif 000004
ＰＩ２０１２３４の前増幅に用いられるプライマーセットＩＩ
【化２】
0005452021.tif 000005
【００８９】
（１）ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ制限ライゲーション混合物
制限混合物（４０ｕｌ／サンプル）
ＤＮＡ              ６μｌ（±３００ｎｇ）
ＥＣｏＲＩ（５Ｕ）  ０．１μｌ
ＭｓｅＩ（２Ｕ）    ０．０５μｌ
５×ＲＬ            ８μｌ
ＭＱ                ２５．８５μｌ
合計（Totaal）        ４０μｌ
３７℃における１時間のインキュベーション
ライゲーション混合物（１０μｌ／サンプル）
１０ｍＭ  ＡＴＰ                          １μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ                      １μｌ
ＥＣｏＲＩアダプター（５ｐｍｏｌ／μｌ）  １μｌ
ＭｓｅＩアダプター（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  １μｌ
５×ＲＬ                                  ２μｌ
ＭＱ                                      ４μｌ
合計                              １０μｌ
の添加
３７℃における３時間のインキュベーション
ＥｃｏＲＩアダプター
【化３】
0005452021.tif 000006
ＭｓｅＩアダプター
【化４】
0005452021.tif 000007
【００９０】
（２）前増幅
前増幅（Ａ／Ｃ）：
ＲＬ混合物（１０×）                              ５μｌ
ＥｃｏＲＩプライマー  Ｅ０１Ｌ（５０ｎｇ／ｕｌ）  ０．６μｌ
ＭｓｅＩプライマー  Ｍ０２Ｋ（５０ｎｇ／ｕｌ）    ０．６μｌ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）                              ０．１６μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ）                        ０．０８μｌ
１０×ＰＣＲ                                      ２．０μｌ
ＭＱ                                              １１．５６μｌ
１反応につき合計２０μｌ
前増幅の温度プロファイル
選択的な前増幅を５０μｌの反応容量中で行なった。ＰＣＲをＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で行ない、２０サイクルのプロファイルは、９４℃３０秒間の変性工程で開始した後、５６℃、６０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、６０秒間の伸長工程を行なった。
【００９１】
ＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）１
【化５】
0005452021.tif 000008
ＭｓｅＩ＋１（Ｃ）１
【化６】
0005452021.tif 000009
前増幅  Ａ／ＣＡ：
ＰＡ＋１／＋１混合物（２０×）      ：５μｌ
ＥｃｏＲＩプライマー              ：１．５μｌ
ＭｓｅＩプライマー                ：１．５μｌ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）            ：０．４μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ）        ：０．２μｌ
１０×ＰＣＲ                      ：５μｌ
ＭＱ                              ：３６．３μｌ
合計                              ：５０μｌ
選択的な前増幅を５０μｌの反応容量中で行なった。ＰＣＲをＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で行ない、３０サイクルのプロファイルは、９４℃３０秒間の変性工程で開始した後、５６℃６０秒間のアニーリング工程、及び７２℃６０秒間の伸長工程を行なった。
【００９２】
（３）ＫＲＳＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）及びＫＲＳＭｓｅＩ＋２（ＣＡ）２
【化７】
0005452021.tif 000010
太字の選択ヌクレオチド及び下線を引いたタグ（ＫＲＳ）
サンプルＰＳＰ１１        ：Ｅ０１ＬＫＲＳ１／Ｍ１５ＫＫＲＳ１
サンプルＰＩ１２０２３４  ：Ｅ０１ＬＫＲＳ２／Ｍ１５ＫＫＲＳ２
【００９３】
（４）ＡＦＬＰのプロトコル
選択的な前増幅を２０μｌの反応容量中で行なった。ＰＣＲをＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で行なった。１３サイクルのプロファイルは、９４℃、３０秒間の変性工程で開始した後、アニーリング温度が各々のサイクルにおいて０．７℃低下するタッチダウンフェーズを伴う、６５℃、３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、６０秒間の伸長工程を行なった。このプロファイルの後で、９４℃、３０秒間の変性工程、５６℃、３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、６０秒間の伸長工程を伴う、２３サイクルのプロファイルを行なった。
ＥｃｏＲＩ＋３（ＡＡＣ）及びＭｓｅＩ＋３（ＣＡＧ）
【化８】
0005452021.tif 000011
【００９４】
（５）Qiagenカラム
ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンハンドブック（０７／２００２）第１８頁に従って、ＡＦＬＰ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を使用して精製した。濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を用いて測定した。＋１／＋２  ＰＳＰ−１１  ＡＦＬＰ産物５μｇ及び＋１／＋２  ＰＩ２０１２３４  ＡＦＬＰ産物５μｇの全てを共に投入し、ＴＥ  ２３．３μｌに溶解した。最終的に、＋１／＋２  ＡＦＬＰ産物の濃度４３０ｎｇ／μｌでの混合物を得た。
【００９５】
配列ライブラリーの調製及びハイスループットシークエンシング
両コショウ系統からの混合増幅産物を、Margulies他によって説明されるような、454 Life Sciencesシークエンシング技術を用いて、ハイスループットシークエンシングした（Margulies他, Nature 437, pp. 376-380及びオンライン上の補足）。具体的には、Margulies及び共同研究者等によって説明されるように、エマルジョンＰＣＲ増幅及び続く断片シークエンシングを促進するために、ＡＦＬＰ  ＰＣＲ産物を最初に末端を平滑にし、続いてアダプターにライゲーションした。４５４のアダプター配列、エマルジョンＰＣＲプライマー、配列プライマー及び配列の実行条件は、全てMargulies及び共同研究者等によって記載されるものであった。図１Ａに例示されるように、４５４シークエンシング過程におけるセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョン−ＰＣＲ断片中の機能要素の直線的な順序は、以下のとおりだった：
４５４ＰＣＲアダプター−４５４シークエンスアダプター−４ｂｐ  ＡＦＬＰプライマータグ１−選択ヌクレオチド（複数可）を含むＡＦＬＰプライマー配列１−ＡＦＬＰ断片内部配列−選択ヌクレオチド（複数可）を含むＡＦＬＰプライマー配列２、４ｂｐ  ＡＦＬＰプライマータグ２−４５４シークエンスアダプター−４５４ＰＣＲアダプター−セファロースビーズ
２つのハイスループット４５４シークエンスの実行は、454 Life Sciences（アメリカ合衆国コネチカット州ブランフォード）によって行なわれた。
【００９６】
４５４シークエンス実行のデータ処理
１回の４５４シークエンスの実行に由来する配列データを、バイオインフォマティクスパイプライン（Keygene N.V．）を用いて処理した。具体的には、未処理の４５４ベースコールされた配列読み取りを、ＦＡＳＴＡフォーマットで変換し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、タグ付けされたＡＦＬＰアダプター配列の存在を検査した。既知のタグ付けされたＡＦＬＰプライマー配列への高い信頼性の一致に際して、配列をトリミングし、制限エンドヌクレアーゼ部位を回復し、適切なタグを割り当てた（それぞれ、サンプル１  ＥｃｏＲＩ（ＥＳ１）、サンプル１  ＭｓｅＩ（ＭＳ１）、サンプル２  ＥｃｏＲＩ（ＥＳ２）、又はサンプル２  ＭｓｅＩ（ＭＳ２））。次に、３３塩基よりも長いトリミングされた配列の全てを、全体の配列相同性に基づくｍｅｇａＢＬＡＳＴ手順を用いてクラスタリングした。次に、クラスターを、ＣＡＰ３の多重アライメントアルゴリズムを用いて、１つのクラスター当たり１つ又は複数のコンティグ、シングルトンの少なくとも一方へアセンブリーした。１つ以上の配列を含むコンティグでは、推定上の多型を表わす配列ミスマッチを検査した。配列ミスマッチには、以下の基準に基づく品質スコアを割り当てた：
＊コンティグ中の読み取りの数
＊観察された対立遺伝子の分布
上の２つの基準は、各々の推定上のＳＮＰ／インデルに対応する、いわゆるＱスコアのための根拠を成す。
【００９７】
Ｑスコアは０〜１にわたる；
両対立遺伝子が少なくとも２度観察された場合にのみ、Ｑスコア０．３が達成される。
【００９８】
＊或る特定の長さのホモポリマー中の位置
（調整可能、３塩基以上のホモポリマーに位置する多型を回避するための初期設定）
＊クラスター中のコンティグの数。
【００９９】
＊最近接配列ミスマッチへの距離
（調整可能、フランキング配列を調べる或る特定の型の遺伝子型決定分析にとって重要）
＊サンプル１又はサンプル２で観察された対立遺伝子の関連のレベル；
推定上の多型並びにサンプル１及びサンプル２の対立遺伝子間で一貫して完全な関連が存在する場合には、多型（ＳＮＰ）が推定上の「エリート」多型（ＳＮＰ）として示される。エリート多型は、２つのホモ接合系統が発見過程で用いられた場合に、一意のゲノム配列又は低コピーのゲノム配列に位置する確率が高いと考えられる。反対に、サンプル起源との多型の弱い関連は、コンティグ中の非対立遺伝子配列のアライメントから生じる誤った多型を発見してしまうリスクが高い。
【０１００】
ＳＳＲモチーフを含む配列は、ＭＩＳＡ検索ツール（ＭＩｃｒｏＳＡｔｅｌｌｅｌｉｔｅ同定ツール；http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/から利用可能。）を用いて同定された。
【０１０１】
実行の全体の統計を、以下の表で示す。
【０１０２】
【表３】
0005452021.tif 000012
【０１０３】
推定上のエリート一塩基多型を含む複数のアライメントの一例を、図５に示す。
【０１０４】
［実施例２  トウモロコシ］
トウモロコシ系統のＢ７３及びＭ０１７に由来するＤＮＡを、ＡＦＬＰの鍵遺伝子認識部位特異的プライマーの使用により、ＡＦＬＰ産物を生成するために用いた。（これらのＡＦＬＰプライマーは本質的に従来のＡＦＬＰプライマーと同じであり（例えば、特許文献１欧州特許第０５３４８５８号に記載されている）、認識部位領域、定常領域、及びその３’末端において１つ又は複数の選択なヌクレオチドを通常含むだろう。）。
【０１０５】
コショウ系統のＢ７３又はＭ０１７に由来するＤＮＡを、６５℃で１時間制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩ（１反応につき５Ｕ）で、及び３７℃で１時間ＭｓｅＩ（１反応につき２Ｕ）で消化した後、８０℃で１０分間不活性化を行なった。得られた制限断片を、１つの末端がＴａｑＩ、ＭｓｅＩ制限断片の少なくとも一方の一末端又は両末端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションした。
【０１０６】
＋１／＋１  ＡＦＬＰプライマーによるＡＦＬＰ前増幅反応（１反応につき２０μｌ）を、１０倍に希釈した制限ライゲーション混合物で行なった。ＰＣＲプロファイル：２０×（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。異なる＋２  ＴａｑＩ及びＭｓｅＩ  ＡＦＬＰ鍵遺伝子認識部位プライマーによる追加のＡＦＬＰ反応（１反応につき５０μｌ）が（下記の表、タグは太字とし、選択ヌクレオチドには下線が引かれている）、２０倍に希釈した＋１／＋１  ＴａｑＩ／ＭｓｅＩ  ＡＦＬＰ前増幅産物で行なわれた。ＰＣＲプロファイル：３０×（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。ＡＦＬＰ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンハンドブック（０７／２００２）の１８ページに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用いることによって精製し、濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計により測定した。各々異なる１．２５μｇのＢ７３  ＋２／＋２  ＡＦＬＰ産物及び各々異なる１．２５μｇのＭ０１７  ＋２／＋２  ＡＦＬＰ産物の合計を共にし、３０μｌのＴＥ中で溶解した。最終的に、３３３ｎｇ／μｌの濃度で＋２／＋２  ＡＦＬＰ産物の混合物が得られた。
【０１０７】
【表４】
0005452021.tif 000013
【０１０８】
最終的に、４つのＰ１サンプル及び４つのＰ２サンプルがプーリング及び濃縮された。合計量２５μｌのＤＮＡ産物及び最終濃度４００ｎｇ／ｕｌ（合計１０μｇ）が得られた。中間の品質査定を図３に示す。
【０１０９】
４５４によるシークエンシング
本明細書において以前に記載されたように調製されたコショウ及びトウモロコシのＡＦＬＰ断片サンプルは、以下に記載されるような454 Life Sciencesにより処理された（Margulies他, 2005「微細加工高密度ピコリッターリアクター中のゲノムシークエンシング（Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors）」Nature 437 (7057) :376-80. Epub July 31, 2005）。
【０１１０】
データ処理
処理パイプライン：
入力データ
未処理配列データが各々の実行に対して受け取られた：
−２０００００〜４０００００の読み取り
−ベースコール（塩基呼び出し）品質スコア
トリミング及びタグ付け
これらの配列データを、読み取りの始め及び末端で、鍵遺伝子認識部位（ＫＲＳ）の存在について解析する。これらのＫＲＳ配列はＡＦＬＰアダプター及びサンプルラベル配列の両方から成り、或る特定のサンプルの或る特定のＡＦＬＰプライマーの組合せに対して特異的である。ＫＲＳ配列は、ＢＬＡＳＴによって同定そしてトリミングされ、制限部位が回復される。読み取りは、ＫＲＳ起源の同定のためのタグでマークされる。トリミングされた配列は、その後の処理を行なうために、長さ（最低３３ヌクレオチド）で選択される。
【０１１１】
クラスタリング及びアセンブリー
ＭｅｇａＢｌａｓｔ解析は、相同配列のクラスターを得るために全てのサイズ選択、且つトリミングされた読み取りで行なわれる。引き続いて全てのクラスターは、アセンブリーされたコンティグをもたらすために、ＣＡＰ３によりアセンブリーされる。両工程からの、他の読み取りと一致しない一意の配列の読み取りが同定される。これらの読み取りはシングルトンとしてマークされる。本明細書において以前に記述された工程を行なう処理パイプラインを図４の（Ａ）に示す。
【０１１２】
多型検索及び品質査定
アセンブリー解析からの最終的なコンティグは、多型検出の根拠を成す。各々のクラスターのアライメントにおける各々の「ミスマッチ」は、可能性のある多型である。選択基準を、品質スコアを得るために定義する：
−１つのコンティグ当たりの読み取りの数
−１つのサンプル当たりの「対立遺伝子」の頻度
−ホモポリマー配列の発生
−近接多型の発生
閾値を超えた品質スコアにより、ＳＮＰ及びインデルは、推定上の多型として同定される。ＳＳＲ抽出については、ＭＩＳＡ（ＭＩｃｒｏＳＡｔｅｌｌｉｔｅ同定）ツール（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）を用いる。このツールはジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチド及び化合物ＳＳＲモチーフをあらかじめ定められた基準により同定し、これらのＳＳＲの発生を要約する。多型検索過程及び品質割当過程を図４の（Ｂ）に示す。
【０１１３】
結果
下記の表は、組み合わせたコショウのサンプルについて２回の４５４シークエンシングの実行、及び組み合わせたトウモロコシサンプルについて２回の実行から得られた配列を組み合わせた解析の結果を要約する。
【０１１４】
【表５】
0005452021.tif 000014
【０１１５】
［実施例３  ＰＣＲ増幅及びサンガーシークエンシングによるＳＮＰ妥当性の検証］
実施例１において同定された推定上のＡ／Ｇ  ＳＮＰを検証するために、このＳＮＰのためのタグ付き配列部位（ＳＴＳ）解析を、隣接するＰＣＲプライマーを用いて設計した。ＰＣＲプライマー配列は以下のとおりであった：
【化９】
0005452021.tif 000015
【０１１６】
プライマー１．２ｒが、５’末端でＭ１３配列プライマー結合部位及び長さスタッファーを含むことに留意されたい。ＰＣＲ増幅を、鋳型として、実施例４に記載されるように調製したＰＳＰ１１及びＰＩ２１０２３４の＋Ａ／＋ＣＡ  ＡＦＬＰ増幅産物を用いて行なった。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：
１つのＰＣＲ反応に対して、下記成分を混合した：
５μｌ  １／１０に希釈したＡＦＬＰ混合物（ａｐｐ．１０ｎｇ／μｌ）
５μｌ  １ｐｍｏｌ／μｌプライマー  １．２ｆ（５００μＭストックから直接希釈したもの）
５μｌ  １ｐｍｏｌ／μｌプライマー  １．２ｒ（５００μＭストックから直接希釈したもの）
５μｌ  ＰＣＲ混合物      ２μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液
１μｌ  ５ｍＭ  ｄＮＴＰ
１．５μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．５μｌ  Ｈ２Ｏ
５μｌ  酵素混合物        ０．５μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液（Applied Biosystems）
０．１μｌ  ５Ｕ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）
４．４μｌ  Ｈ２Ｏ
以下のＰＣＲプロファイル：
サイクル１  ２分間、９４℃
サイクル２〜サイクル３４  ２０秒間、９４℃
３０秒間、５６℃
２分３０秒間、７２℃
サイクル３５  ７分間、７２℃
∞、４℃
を使用した。
【０１１７】
ＰＣＲ産物をＴＡクローニング法を用いてベクターｐＣＲ２．１（ＴＡクローニングキット、Invitrogen）へクローニングし、ＩＮＶαＦ’コンピテント大腸菌細胞へ形質転換させた。形質転換体を青／白のスクリーニングに付した。ＰＳＰ１１及びＰＩ−２０１２３４について各々独立した白色の３つの形質転換体を選択し、プラスミド単離のための液体の選択培地中で、一晩、増殖させた。
【０１１８】
プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐスピンＭｉｎｉｐｒｅｐキット（QIAGEN）を用いて単離した。続いて、これらのプラスミドのインサートを、以下のプロトコルに従ってシークエンシングし、ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００（Amersham）で溶解した。得られた配列をＳＮＰ対立遺伝子の存在について検査した。ＰＩ−２０１２３４インサートを含む独立した２つのプラスミド、及びＰＳＰ１１インサートを含む１つのプラスミドは、ＳＮＰに隣接する期待されたコンセンサス配列を含んでいた。ＰＳＰ１１断片に由来する配列は期待されたＡ対立遺伝子（下線が引かれた）を含み、ＰＩ−２０１２３４断片に由来する配列は期待されたＧ対立遺伝子（二重下線が引かれた）を含んでいた：
ＰＳＰ１１（配列１）：（５’−３’）
【化１０】
0005452021.tif 000016
ＰＩ−２０１２３４（配列１）：（５’−３’）
【化１１】
0005452021.tif 000017
ＰＩ−２０１２３４（配列２）：（５’−３’）
【化１２】
0005452021.tif 000018
【０１１９】
この結果は、推定上のコショウＡ／Ｇ  ＳＮＰが、設計されたＳＴＳ解析を用いて検出可能な真の遺伝的多型を表わすことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１Ａ】ビーズ（「４５４ビーズ」）上にアニーリングされる本発明による断片、及び２つのコショウ系統の前増幅に使用されるプライマーの配列を示す図である。「ＤＮＡ断片」は、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化後に得られる断片を指し、「鍵遺伝子アダプター」は、ライブラリーを生成するのに使用される（リン酸化）オリゴヌクレオチドプライマー用のアニーリング部位を提供するアダプターを指し、「ＫＲＳ」は、識別子配列（タグ）を指し、「４５４  ＳＥＱ．アダプター」は、シークエンシングアダプターを指し、「４５４ＰＣＲアダプター」は、ＤＮＡ断片の乳化増幅を可能にするアダプターを指す。ＰＣＲアダプターは、ビーズとのアニーリング及び増幅を可能にすると共に、３’−Ｔ突出部を含有し得る。
【図１Ｂ】複雑度低減工程において使用されるプライマーの概略図である。概して、かかるプライマーは、（２）で示される認識部位領域、（１）で示されるタグ区域を含み得る定常領域、及びその３’−末端に（３）で示される選択領域内の１つ又は複数の選択ヌクレオチドを含む。
【図２】２％アガロースゲル−電気泳動を使用するＤＮＡ濃度推定を示す図である。Ｓ１はＰＳＰ１１を指し、Ｓ２はＰＩ２０１２３４を指す。５０、１００、２５０及び５００ｎｇはそれぞれ５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ及び５００ｎｇを指し、Ｓ１及びＳ２のＤＮＡ量を推定する。（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度法を使用するＤＮＡ濃度決定を示す図である。
【図３】実施例３の中間体品質査定の結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は、配列データの処理パイプライン、即ち、トリミングとタグ付けで既知の配列情報を除去してトリミングされた配列データを生成し、コンティグ及びシングルトン（コンティグにアセンブリーできない断片）がクラスタリング及びアセンブリーされて、その後、推定上の多型が同定、評価され得るという工程を経由する、シークエンシングデータの生成から推定上のＳＮＰ、ＳＳＲ、及びインデルを同定するまでの工程のフローチャート図である。（Ｂ）は、多型検索のプロセスをさらに詳述する図である。
【図５】推定上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含有する、コショウのＡＦＬＰ断片配列の複数のアライメント「１００３７_ＣＬ９８９コンティグ２」を示す図である。なお、ＳＮＰ（黒矢印で示される）は、上の２つの読み取りの名称欄に示されるＭＳ１タグの存在によって指し示されるサンプル１（ＰＳＰ１１）の両読み取りに存在するＡ対立遺伝子、及び下の２つの読み取りの名称欄に示されるＭＳ２タグの存在によって指し示されるサンプル２（ＰＩ２０１２３４）に存在するＧ対立遺伝子によって規定される。読み取りの名称欄を左側に示す。この複数のアライメントのコンセンサス配列は（５’−３’）：ＴＡＡＣＡＣＧＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＡＧＡＡＣＡ［Ａ／Ｇ］ＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧである。
【図６】遺伝子座毎の観察された読み取りの数に基づく遺伝子型の正確な分類の確率を示すグラフである。
【図１Ａ】
0005452021.tif 000019
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005452021.tif 000025
【配列表】
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