(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ポリマーまたはその塩が過酸処理により架橋された構造体であって、
前記タンパク質ポリマーまたはその塩が、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩である構造体。
【化１４】
0005413786.tif 000022
前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または、−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ2）n1−、−（Ｃ6Ｈ4）n5−、−（ＣＨ2）n1−（Ｃ6Ｈ4）n5−、−（Ｃ6Ｈ4）n5−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−（Ｃ6Ｈ4）n5−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、前記（Ｃ6Ｈ4）は、１以上の置換基を有していてもよく、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
Ｍは、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｃｏ3+、Ｍｎ2+および
Ｍｎ3+からなる群から選択され、
ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００であり、
Ｘは、ヘムタンパク質の変異体中のＸを意味し、前記ヘムタンパク質の変異体は式（ＩＩ）で表わされ、
【化１５】
0005413786.tif 000023
前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘは、前記変異体のアポ体を意味する。
【請求項２】
前記天然のヘムタンパク質が、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼである請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ2）n1−、−（Ｃ6Ｈ4）n5−、−（ＣＨ2）n1−（Ｃ6Ｈ4）n5−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択される請求項１または２に記載の構造体。
【請求項４】
タンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体の製造方法であって、
一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を、分子間で共有結合を形成する条件に付し、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を分子間で架橋して前記構造体を得、
前記共有結合を形成する条件が、ラジカルを発生させる条件であり、
前記ラジカルを発生させる条件が、過酸との接触である
る製造方法。
【化１６】
0005413786.tif 000024
前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または、−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ2）n1−、−（Ｃ6Ｈ4）n5−、−（ＣＨ2）n1−（Ｃ6Ｈ4）n5−、−（Ｃ6Ｈ4）n5−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−（Ｃ6Ｈ4）n5−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、前記（Ｃ6Ｈ4）は、１以上の置換基を有していてもよく、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
Ｍは、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｃｏ3+、Ｍｎ2+および
Ｍｎ3+からなる群から選択され、
ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００であり、
Ｘは、ヘムタンパク質の変異体中のＸを意味し、前記ヘムタンパク質の変異体は式（ＩＩ）で表わされ、
【化１７】
0005413786.tif 000025
前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘは、前記変異体のアポ体を意味する。
【請求項５】
前記過酸が、過酸化水素、過酢酸、メタクロロ過安息香酸およびクメンヒドロペルオキシドからなる群から選択される請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の構造体を含む生体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質ポリマーが架橋された構造体に関する。より詳細には、本発明は、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子をビルディングブロックとして集積した構造体が、バイオマテリアルとして注目を集めている。例えば、ヘモグロビン同士をグルタルアルデヒドと反応させて重合させて得られた構造体が知られている（例えば、特許文献１および２参照）。この構造体は、大量失血を被っている哺乳動物を処置する際への適用が試みられている（例えば、特許文献３参照）。また、ミオグロビンのヘムを、長鎖で修飾されたヘムと置き換え、そのミオグロビンをミセル化させて得られた構造体が知られている（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
しかしながら、ヘムタンパク質のスポンジ状三次元構造体については、知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１−５０１４７１号公報
【特許文献２】特表２００６−５１６９９４号公報
【特許文献３】特表２００６−５０２２３１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】I.C.Reynhoutら, ”Self-Assembled Architectures from Biohybrid Triblock Copolymers ”, J. Am. Chem. Soc., ２００７年、１２９巻、p.2327-2332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、生体分子を集積したスポンジ状の三次元構造体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、タンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体であって、前記タンパク質ポリマーまたはその塩は、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩である。【０００８】
【化１】
0005413786.tif 000002
【０００９】
前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または、−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、前記（Ｃ６Ｈ４）は、１以上の置換基を有していてもよく、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００であり、
Ｘは、ヘムタンパク質の変異体中のＸを意味し、前記ヘムタンパク質の変異体は式（ＩＩ）で表わされ、【００１０】
【化２】
0005413786.tif 000003
【００１１】
前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘは、前記変異体のアポ体を意味する。【００１２】
また、本発明は、タンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体の製造方法であって、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を、分子間で共有結合を形成する条件に付し、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を分子間で架橋して前記構造体を得る。【００１３】
【化３】
0005413786.tif 000004
【００１４】
前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または、−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、前記（Ｃ６Ｈ４）は、１以上の置換基を有していてもよく、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００であり、
Ｘは、ヘムタンパク質の変異体中のＸを意味し、前記ヘムタンパク質の変異体は式（ＩＩ）で表わされ、【００１５】
【化４】
0005413786.tif 000005
【００１６】
前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘは、前記変異体のアポ体を意味する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の構造体は、生体分子であるヘムタンパク質をビルディングブロックとして有する、スポンジ状の三次元構造体である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】図１ａは、天然型ミオグロビンのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図１ｂ】図１ｂは、実施例１で製造したタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図１ｃ】図１ｃは、天然型ミオグロビンの酸素錯体のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図１ｄ】図１ｄは、実施例１で製造したタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の酸素錯体のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図２ａ】図２ａは、実施例１で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）について、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２ｂ】図２ｂはサイズ排除クロマトグラフィーを示す。実線は、実施例１で得られた架橋された構造体について、破線は実施例１で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）について、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２ｃ】図２ｃはサイズ排除クロマトグラフィーを示す。実線は、実施例１で得られた架橋された構造体について、破線は実施例１で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）について、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図３】図３は、実施例１で得た前記タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）について、濃度を変化させた条件下で測定したサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図４ａ】図４ａは、実施例１で得たタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の全体のＡＦＭイメージを示す。
【図４ｂ】図４ｂは、図４ａ中の白色の線に沿ったＡＦＭの高さプロファイルを示す。
【図５ａ】図５ａは、実施例１で得た前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図５ｂ】図５ｂは、前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図６】図６は、実施例１で得た架橋された構造体の変性状態における電気泳動の結果を示す。
【図７ａ】図７ａは、実施例１で得た架橋された構造体のＳＥＭ画像を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、実施例１で得た架橋された構造体のＳＥＭ画像を示す。
【図７ｃ】図７ｃは、実施例１で得た架橋された構造体のＳＥＭ画像を示す。
【図８ａ】図８ａは、実施例１で得た架橋された構造体のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図８ｂ】図８ｂは、実施例１で得た架橋された構造体の酸素錯体のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、前記のように、タンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体であって、前記タンパク質ポリマーまたはその塩が、一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩である。
【００２０】
また、本発明は、前記のように、タンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体の製造方法であって、一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を、分子間で共有結合を形成する条件に付し、前記一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を分子間で架橋して前記構造体を得る。
【００２１】
本発明において、一般式（ＩＡ）および（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーは、ランダム共重合体およびブロック共重合体のいずれも含み、いずれか一方に限定されない。
【００２２】
本発明の製造方法において、前記共有結合を形成する条件は、ラジカルを発生させる条件であるのが好ましい。このラジカルを発生させる条件は、過酸化水素、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、クメンヒドロペルオキシドなどの過酸との接触、Ｘ線照射、電子ビーム照射、イオンビーム照射、ガンマ線照射、光（ＵＶ）照射からなる群から選択される１以上であるのが好ましい。
【００２３】
また、本発明は、本発明の構造体を含む生体デバイスである。
【００２４】
本発明において、「低級」は特に指示がなければ、炭素原子が１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
【００２５】
「低級アルキル基」および「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」中の「低級アルキル基」としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等のような直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカンの残基を意味する。低級アルキル基の好ましい例としては、炭素数１〜５のアルキルが挙げられる。好ましい炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００２６】
「低級アルケニル基」としては、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−、２−もしくは３−ブテニル、１−、２−、３−もしくは４−ペンテニル、１−、２−、３−、４−もしくは５−へキセニル等の炭素数２〜６個を有する直鎖または分枝鎖アルケニル基が挙げられる。好ましい低級アルケニル基としては、ビニルが挙げられる。
【００２７】
「ハロゲン原子」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、中でもフッ素が好ましい。
【００２８】
「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」の例としては、前記低級アルキル基の１以上の水素原子が、前記ハロゲン原子で置き換えられたものを意味する。前記ハロゲン原子で置換された低級アルキル基の好ましい例としては、ヨウ化メチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル等が挙げられる。好ましいハロゲン原子で置換された低級アルキル基としては、トリフルオロメチルが挙げられる。
【００２９】
ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００である。好ましくは、１０≦ｍ＋ｎ≦１００、より好ましくは３０≦ｍ＋ｎ≦１００である。
【００３０】
Ｙ１およびＹ２として、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−で表される場合、前記のように、（Ｃ６Ｈ４）は、１以上の置換基を有していてもよい。ｎ５が２以上の場合、（Ｃ６Ｈ４）はそれぞれ独立して、１以上の置換基を有していてもよい。この置換基としては、ヒドロキシ基、環状、直鎖状または分岐状の脂肪族飽和または不飽和炭化水素基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アリール基、ニトロ基、オキソ基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【００３１】
前記式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、Ｙが−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−で表される場合、Ｙとしては、例えば、以下の表で表されるＮｏ．１〜Ｎｏ．４２の式が挙げられる。
【００３２】
【表１】
0005413786.tif 000006
0005413786.tif 000007
【００３３】
Ｙが−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−で表される場合、Ｙとしては、前記表１中のＮｏ．1〜６、１０〜１５、１９〜２６、３１〜３８が好ましくＮｏ．1、２、３、１０、１１、１２、１９、２０、２１、２２、３１、３２、３３、３４がより好ましい。
【００３４】
前記式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、Ｙが−Ｚ１−Ｙ１−で表される場合、Ｙとしては、例えば、以下の表で表されるＮｏ．４３〜Ｎｏ．５１の式が挙げられる。
【００３５】
【表２】
0005413786.tif 000008
【００３６】
Ｙが−Ｚ１−Ｙ１−で表される場合、前記表２中のＮｏ．４３〜４８の式で表される基が好ましく、Ｎｏ．４３〜４５の式で表される基がより好ましい。
【００３７】
本発明におけるポリマーおよびその塩は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００３８】
前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩において、前記天然のヘムタンパク質は、ヘムを１以上有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼが挙げられる。前記シトクロムとしては、例えばシトクロムｂ５６２、シトクロムｂ５、シトクロムＰ４５０CAMが挙げられ、中でもシトクロムｂ５６２が好ましい。前記ヘモグロビンとしては、例えばヘモグロビン（human）、ヘモグロビン（bovine）、ヘモグロビン(equine)、ヘモグロビン(rat)が挙げられ、中でもヘモグロビン（human）が好ましい。前記ミオグロビンとしては、例えばミオグロビン(sus scrofa)、ミオグロビン(equine)、ミオグロビン(human)、ミオグロビン（sperm whale）が挙げられ、中でもミオグロビン（sperm whale）およびミオグロビン(sus scrofa)が好ましい。前記ペルオキシダーゼとしては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、カタラーゼが挙げられ、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。
【００３９】
本発明において、式（II）
【００４０】
【化５】
0005413786.tif 000009
【００４１】
で表わされるヘムタンパク質の変異体は、前記ヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、シトクロムの場合、（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、天然のシトクロムb５６２のアミノ酸配列である。天然のシトクロムb５６２のアミノ酸配列は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1QPU（１９９９年６月２日付）のものが挙げられ、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1QPUのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記シトクロムが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記シトクロムに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号１のアミノ酸配列において、第１〜１０６番目のアミノ酸残基、好ましくは第６０、６２、６３、６６、６７、７０、７３、７４、７６、７８、８９、９０、９６、９９および１００番目のアミノ酸残基、より好ましくは第６０、第６３、第６６、第６７および第１００番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
【００４２】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ヘモグロビンの場合、（ａ）配列番号４または配列番号５で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号４または配列番号５で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモグロビン（human）として機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号４で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンαサブユニットのアミノ酸配列であり、前記配列番号５で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンのβサブユニットのアミノ酸配列である。天然のヘモグロビンのアミノ酸配列は、配列番号４および配列番号５で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1GZX（２００２年７月８日付）のものが挙げられ、前記配列番号４および配列番号５で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1GZXのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ヘモグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ヘモグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
【００４３】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ミオグロビンの場合、（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつミオグロビンとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、野生型のミオグロビン（sperm whale）のアミノ酸配列である。前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、天然型のアミノ酸配列（実際に鯨から抽出したタンパク質のアミノ酸配列）の第１番目のアミノ酸残基Ｖａｌの前に、アミノ酸残基としてＭｅｔをさらに含むものである。さらに、天然型のアミノ酸配列の第１２２番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸は、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第１２３番目に対応するが、そのアミノ酸残基は、アスパラギンに置き換えられている。野生型のミオグロビンのアミノ酸配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号2MBW（１９９６年６月２０日付）のものが挙げられ、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号2MBWのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ミオグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ミオグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号２のアミノ酸配列において、第１〜１５４番目のアミノ酸残基、好ましくは第９、１３、１７、５４，１０３，１０７，１１４、１１８、１２２、１２６、１２７、１３４、１４１および１４８番目のアミノ酸残基、より好ましくは第１２６および第１３４番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
【００４４】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列である。天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で表わされるものに限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1ATJ（１９９８年２月４日付）のものが挙げられ、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1ATJのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記西洋ワサビペルオキシダーゼが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記西洋ワサビペルオキシダーゼに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
【００４５】
前記変異体中、前述のように、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘは、前記変異体のアポ体を意味する。
【００４６】
本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）または（ＩＢ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
ＭはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋またはＭｎ３＋である式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体が好ましい。
【００４７】
本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
ＭはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋またはＭｎ３＋である式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体が好ましい。
【００４８】
本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
ＭはＦｅ２＋またはＦｅ３＋である式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体が好ましい。
【００４９】
本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ２およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または、−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
ＭはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋またはＭｎ３＋であり、
前記ヘムタンパク質がシトクロムまたはミオグロビンである式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体がより好ましい。
【００５０】
本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ２およびＲ４は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−であり、Ｚ１は、ＯまたはＮＨであり、Ｙ１は、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、ＭはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋またはＭｎ３＋であり、前記ヘムタンパク質がシトクロムまたはミオグロビンである式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体がより好ましい。
【００５１】
本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ２およびＲ４は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−であり、Ｚ１は、ＮＨであり、Ｙ１は、式−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−で表わされる基であり、ＭはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋またはＭｎ３＋であり、前記ヘムタンパク質が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるか、または、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するミオグロビンであり、前記１つのアミノ酸残基が第１２６番目のアラニンである式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体がさらに好ましい。
【００５２】
また、本発明の構造体としては、前記式（ＩＡ）中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ２およびＲ４は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−であり、Ｚ１は、ＮＨであり、Ｙ１は、式−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−で表わされる基であり、ＭはＦｅ２＋またはＦｅ３＋であり、前記ヘムタンパク質が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるか、または、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するミオグロビンであり、前記１つのアミノ酸残基が第１２６番目のアラニンである式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体がさらに好ましい。
【００５３】
本発明の構造体において、前記タンパク質ポリマーの塩は、前記式（ＩＡ）および（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーの塩、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００５４】
次に、タンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された本発明の構造体の製造方法の一例を説明する。
【００５５】
その製造方法は、一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を、分子間で共有結合を形成する条件に付し、前記一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩を分子間で架橋して前記構造体を得ることを特徴とする。前記分子間で共有結合を形成する条件は、特に限定されないが、例えば、ラジカルを発生させる条件である。前記ラジカルを発生させる条件としては、例えば、過酸化水素、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、クメンヒドロペルオキシドなどの過酸との接触、Ｘ線照射、電子ビーム照射、イオンビーム照射、ガンマ線照射、光（ＵＶ）照射が挙げられ、過酸化水素との接触が好ましい。
【００５６】
前記製造方法において、分子間で共有結合を形成する条件が過酸化水素との接触である場合、タンパク質ポリマーまたはその塩に、それらに含まれる金属ポルフィリンに対して過酸化水素を例えば０．０１〜１００当量、好ましくは０．１〜５当量、より好ましくは０．５〜１．５当量接触させる。この際、タンパク質ポリマーまたはその塩は水溶液中で過酸化水素と反応させることができる。このタンパク質ポリマーまたはその塩の水溶液中の濃度は、例えば、０．０１〜５ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭである。タンパク質ポリマーまたはその塩と過酸化水素との接触は、例えば、２〜６０℃の範囲、好ましくは２０〜３０℃の範囲で行うことができる。また、タンパク質ポリマーまたはその塩と過酸化水素との接触は、例えば、０．１〜７２時間、好ましくは２〜２４時間行うことができる。
【００５７】
または、前記共有結合を形成する条件は、前記タンパク質ポリマーを構成するアミノ酸のうち２箇所のアミノ酸の側鎖と結合することが可能な官能基を有する架橋剤と反応させる条件が好ましい。この前記架橋剤と反応する前記官能基としては、ホルミル基、イミド酸エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソシアナート基（これらに対応するアミノ酸の側鎖はアミノ基）、メタンチオスルホナート基、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、（これに対応するアミノ酸の側鎖は−ＳＨ基）、ジアゾ基（これに対応するアミノ酸の側鎖はカルボキシル基）等が挙げられる。前記架橋剤としては、例えば、ホモ二官能性リンカー（homo-bifunctional linker）と、ヘテロ二官能性リンカー（hetero-bifunctional linker）が挙げられる。前記ホモ二官能性リンカーとしては、例えば、グルタルアルデヒド、マロンジアルデヒド、アジポアルデヒド、アジプイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルスルホナート）、１，６−ヘキサメチレンジイソシアナート、Ｓ，Ｓ’‐ヘキサメチレンビス（メタンチオスルホナート）、Ｎ，Ｎ’−トリメチレンビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビス（２−ヨードアセトアミド）、１,６−ジアゾヘキサン）等が挙げられる。また、前記ヘテロ二官能性リンカーとしては、例えば、Ｎ−スクシイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート、スクシイミジル４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ピリジル−２，２’−ジチオベンジルジアゾアセテート等が挙げられる。
【００５８】
前記製造方法において、分子間で共有結合を形成する条件が前記架橋剤と反応させる条件である場合、前記タンパク質ポリマーまたはその塩と、前記架橋剤との反応条件は、当該分野の技術常識の範囲であれば、特に制限は無い。
【００５９】
本発明の製造方法において用いる一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーは、例えば特開２００８−２２５６５号公報に従い製造することができる。
【００６０】
前記式（ＩＡ）で表わされるタンパク質ポリマーは、例えば、以下のようにして得る（スキーム１参照）。
【００６１】
【化６】
0005413786.tif 000010
【００６２】
また、前記式（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーは、例えば、以下のようにして得る（スキーム２参照）。
【００６３】
【化７】
0005413786.tif 000011
【００６４】
前記式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＩ−１Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）、（ＩＩＩ−１Ｂ）、（ＩＩＩ−２Ｂ）、（ＩＶ−１Ａ）、（ＩＶ−２Ａ）、（ＩＶ−１Ｂ）、（ＩＶ−２Ｂ）、（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）および式（Ｖ−２Ｂ）中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、−Ｚ１−Ｙ１−Ｚ２−Ｙ２−または、−Ｚ１−Ｙ１−で表される基であり、ただし、Ｚ１は、式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、−ＣＯ−と結合する基を意味し、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨおよびＳからなる群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、式−（ＣＨ２）ｎ１−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−、−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ１、−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｃ６Ｈ４）ｎ５−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−または−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ３−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ４−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
Ｚ２は、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨ、ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃからなる群から選択され、
Ｍは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋およびＭｎ３＋からなる群から選択され、
ｍおよびｎはそれぞれ整数であり、１≦ｍ＋ｎ≦１０００であり、
Ｘは、ヘムタンパク質の変異体中のＸを意味し、前記ヘムタンパク質の変異体は式（ＩＩ）で表わされる。
【００６５】
【化８】
0005413786.tif 000012
【００６６】
前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘは、前記変異体のアポ体を意味する。
【００６７】
前記式中、低級アルキル基および低級アルケニル基の定義は、前記のとおりである。
【００６８】
前記製造方法において、式（ＩＶ−１Ａ）、（ＩＶ−２Ａ）、（ＩＶ−１Ｂ）または式（ＩＶ−２Ｂ）で表わされる金属ポルフィリンリンカーと、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質との反応は、不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、触媒存在下に溶媒中で行うことができる。前記触媒としては、例えば弱酸、弱塩基等が挙げられる。前記弱酸としてはクエン酸、塩酸、硫酸、硝酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸等が挙げられる。前記弱塩基としては、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が上げられる。
【００６９】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。また、前記反応溶媒には、式（ＩＶ−１Ａ）、（ＩＶ−２Ａ）、（ＩＶ−１Ｂ）または式（ＩＶ−２Ｂ）で表わされる金属ポルフィリンリンカーおよび／または一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質の溶解性を高めるための添加物を含有してもよい。前記添加物としては、ヒスチジン等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、前記添加物してもよいジメチルスルホキシドおよび緩衝液から選択されるのが好ましく、ジメチルスルホキシドおよびトリス塩酸緩衝液の混合物、ヒスチジンを含有する水等がより好ましい。
【００７０】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃、より好ましくは２０℃〜３０℃である。
【００７１】
前記製造方法において、反応時間は限定されないが、例えば３０分〜２４時間、好ましくは２時間〜１０時間、より好ましくは５時間〜８時間である。
【００７２】
前記製造方法において、式（ＩＶ−１Ａ）、（ＩＶ−２Ａ）、（ＩＶ−１Ｂ）または式（ＩＶ−２Ｂ）で表される金属ポルフィリンリンカーに対し使用される式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質のモル比（式（ＩＶ−１Ａ）、（ＩＶ−２Ａ）、（ＩＶ−１Ｂ）または式（ＩＶ−２Ｂ）で表される金属ポルフィリンリンカー：式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質）は、例えば１００：１〜５：１、好ましくは５０：１〜１０：１、より好ましくは２０：１〜１０：１である。
【００７３】
前記製造方法において、前記式（ＩＶ−１Ａ）、（ＩＶ−２Ａ）、（ＩＶ−１Ｂ）または式（ＩＶ−２Ｂ）で表される金属ポルフィリンリンカーは、市販で入手してもよいし、公知文献を参照して自家製造してもよい。
【００７４】
前記製造方法において、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００７５】
前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質の遺伝子は、天然のヘムタンパク質の遺伝子の塩基配列に基づいて、モルモットのトータルＲＮＡ等を利用してクローニングしてもよく、また、ホスホロアミダイト法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して行える。また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質の遺伝子を宿主細胞内に導入すればよい。
【００７６】
前記宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等が挙げられる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型を用いて、それを導入してよい。
【００７７】
前記宿主細胞内に導入する遺伝子は、宿主細胞内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００７８】
また、前記式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００７９】
その製造方法は、式（ＩＩＩ−１Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）または式（ＩＩＩ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩を酸で処理することにより、式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩を得ることを特徴とする。
【００８０】
前記製造方法において、式（ＩＩＩ−１Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）または式（ＩＩＩ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩の酸処理反応は、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等で処理することにより行う。
【００８１】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、ジメチルスルホキシドおよび緩衝液から選択されるのが好ましく、ジメチルスルホキシドおよびトリス塩酸緩衝液の混合物、リン酸緩衝液等がより好ましい。
【００８２】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜５℃である。
【００８３】
前記製造方法において、酸処理は、ｐＨが、例えば０．５〜３．０、好ましくは１．５〜２．５、より好ましくは１．８〜２．１で行うことができる。
【００８４】
前記式（ＩＩＩ−１Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）、（ＩＩＩ−２Ａ）または式（ＩＩＩ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩および前記式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼであるのが好ましい。
【００８５】
つぎに、一般式（ＩＡ）または（ＩＢ）で表わされるタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００８６】
その製造方法は、前記式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩を中性条件下で処理することにより、タンパク質ポリマーまたはその塩を得ることを特徴とする。
【００８７】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、緩衝液から選択されるのが好ましく、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等がより好ましい。
【００８８】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜５℃である。
【００８９】
前記製造方法において、中性条件下での処理は、ｐＨが、例えば６．０〜１０．０、好ましくは６．５〜８．５、より好ましくは７．０〜８．０で行うことができる。
【００９０】
前記製造方法において、式（Ｖ−１Ａ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩は、式（Ｖ−２Ａ）で表されるタンパク質モノマーまたはその塩と、位置異性体の関係にある。また、式（Ｖ−１Ｂ）で表されるタンパク質モノマーまたはその塩は、式（Ｖ−２Ｂ）で表されるタンパク質モノマーまたはその塩とが、位置異性体の関係にある。式（ＩＶ−１Ａ）で表される金属ポルフィリンリンカーおよび式（ＩＶ−２Ａ）で表される金属ポルフィリンリンカーの段階で混合したまま反応が進行した場合、得られるタンパク質モノマーは、式（Ｖ−１Ａ）で表されるタンパク質モノマーと、式（Ｖ−２Ａ）で表されるタンパク質モノマーの混合物である。その場合、最終的に得られるタンパク質ポリマーは、式（ＩＡ）で表される共重合体になる。式（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）についても、同様である。
【００９１】
本発明のタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体は、前記ヘムタンパク質がシトクロムである場合、電子プールとして機能する生体ポリマーとして有用である。また前記ヘムタンパク質がヘモグロビンおよびミオグロビンである場合、酸素を貯蔵または運搬する生体ポリマーとして有用である。また、前記ヘムタンパク質がペルオキシダーゼである場合、酵素の集合体として有用である。
【００９２】
本発明のタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体は、酸性もしくは塩基性条件下で、式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩および、式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩の二量体、ならびに式（Ｖ−１Ａ）、（Ｖ−２Ａ）、（Ｖ−１Ｂ）または式（Ｖ−２Ｂ）で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩の少なくとも１つに分解することができる。従って、本発明のタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体は、ｐＨによって集合状態を制御するｐＨ応答性タンパク質ポリマーとして有用である。
【００９３】
本発明のタンパク質ポリマーまたはその塩が架橋された構造体は、前記のようにｐＨに応じて構造を変化させることができる。例えば、本発明の構造体中に薬物を抱合させることにより、本発明の構造体はドラッグデリバリー材料として用いることもできる。
【００９４】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
【００９５】
種々のスペクトルは、以下の機器を用いて測定した。
【００９６】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは日本電子ＪＥＯＬ  ＥＸ２７０核磁気共鳴装置（２７０ＭＨｚ）もしくはBruker DPX-400核磁気共鳴装置（４００ＭＨｚ）を用いて測定し、測定溶媒の残存シグナルを内部基準として使用した。エレクトロスプレーイオン化法による飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）はアプライド・バイオシステム・マリナー（Applied Biosystems Mariner）ＡＰＩ−ＴＯＦワークステーション（Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて測定した。紫外可視吸収スペクトルは島津製作所製自記分光光度計ＵＶ−２５５０もしくはＵＶ−３１５０を用いて測定した。水溶液のｐＨは堀場製作所製ｐＨメーターＦ−５２を用いて測定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡＦＰＬＣシステムにスーパーデックス(Superdex）２００  １０／３００  ＧＬカラム（排除限界１．３×１０６Ｄａ）またはＳｈｏｄｅｘ社製ＫＷ４０５−４Ｆカラム（排出限界２×１０７Ｄａ）を接続し、検出にはＵＰＣ−９００検出器を用いて測定した。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）はデジタル・インスツゥルメンツ（Digital Instruments）社製ナノスコープ（Nanoscope）Ｖを用いて測定した。電気泳動測定には、ＧＥヘルスケア社製全自動電気泳動システムＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、日立ハイテク社製Ｓ−５５００を用いて測定した。
【００９７】
また、出発原料は、以下の文献を参考にして製造した。
プロトポルフィリンＩＸモノｔ−ブチルエステル２：T. Matsuo, T. Hayashi, Y. Hisaeda, J. Am. Chem. Soc. 124, 11234 (2002)。
モノN-Boc保護ジアミン類：M. Trester-Zedlitz, K. Kamada, S. K. Burley, D. Fenyo, B. T. Chait, T. W. Muir, J. Am. Chem. Soc. 125, 2416 (2003)；およびR. Schneider, F. Schmitt, C. Frochot, Y. Fort, N. Lourette, F. Guillemin, J.-F. Mueller, M. Barberi-Heyob, Bioorg. Med. Chem. 13, 2799 (2005)。
N-メトキシカルボニルマレイミド：O. Keller, J. Rudinger, Helv. Chim. Acta. 58, 531(1975)。
その他の一般試薬は市販品をそのまま用いた。
【実施例１】
【００９８】
（１）ミオグロビン変異体(A125C)二量体の調製
変異体タンパク質のプラスミドを持つ大腸菌については文献処方(S. Hirota, K. Azuma, M. Fukuda, S. Kuroiwa, N. Funasaki, Biochemistry 44, 10322 (2005))に従って調製した。変異体タンパク質はEscherichia coli菌株 TB-１を用い、文献処方(B. A. Springer, S. G. Sliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8961 (1987))に従って野生型ミオグロビンの発現と同様の操作で大量発現した。発現したタンパク質は、陰イオン交換カラム(DEAE Sepharose FF、2.7 cm×10 cm)、陽イオン交換カラム(CM-52、2.7 cm×18 cm)とゲル濾過カラム(Sephadex G-50、1.5 cm×100 cm)によって精製し、マッコウクジラ由来のミオグロビン変異体A125C二量体のフラクションを回収して以下の実験に使用した。【００９９】
（２）式１（１３）で示す化合物の製造
式１（１３）で示す化合物は、以下のスキーム３に従い製造した。【０１００】
【化９】
0005413786.tif 000013
【０１０１】
スキーム３中、それぞれの「位置異性体」は、以下のとおり。化合物２の位置異性体は化合物２’、化合物３（１３）の位置異性体は化合物３（１３）’、化合物４（１３）の位置異性体は化合物４（１３）’、化合物５（１３）の位置異性体は化合物５（１３）’、化合物１（１３）の位置異性体は化合物１（１３）’である。【０１０２】
【化１０】
0005413786.tif 000014
【０１０３】
（ｉ）式３（１３）およびその位置異性体で表わす化合物の製造
窒素雰囲下、５０ｍＬのナス型フラスコにプロトポルフィリンＩＸモノｔ−ブチルエステル２およびその位置異性体（１００ｍｇ，１．６×１０−４ｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ビス［２-（３-アミノプロポキシ）エチル］エーテル（ジアミン（１３）、１５５ｍｇ，４．９×１０−４ｍｏｌ）およびＤＭＦ（２５ｍＬ）を加えて溶解させた。溶液を氷浴によって冷却し、そこへジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ，１１１ｍｇ，４．０×１０−４ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）およびトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ，６５ｍｇ，４．５×１０−４ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）をそれぞれ加えた。この溶液を遮光下、室温にて４時間撹拌した後、再び同じ量のＤＰＰＡおよびＥｔ３ＮのＤＭＦ溶液を加えた。さらに２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／アセトン＝５／１）によって精製した。得られた固体を最小量のクロロホルムに溶解させ、そこへヘキサンを加えることによって生じた沈殿を集め、標題化合物３（１３）およびその位置異性体との混合物を得た（７３．３ｍｇ，５０％、紫色、固体））。【０１０４】
1H-NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.34 (s, 1H) 10.21 (s, 0.5H) 10.17 (s, 1H) 10.14 (s, 1H) 10.03 (s, 0.5H) 9.95 (s, 0.5H) 8.39-8.25 (m, 2H) 6.41-6.14 (m, 4H) 4.60-4.38 (m, 4H) 3.62-3.45 (m, 16H) 3.34-3.15 (m, 12H) 3.06 (m, 2H) 2.76 (m, 2H) 2.61 (m, 2H) 2.44 (m, 2H) 1.74 (m, 2H) 1.49 (s, 9H) 1.43 (s, 9H) 1.39 (m, 2H), −3.80 (s, 2H); 
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 921.83 (M + H)+, C53H72N6O8について計算値： 922.18; 
UV-vis (CHCl3) λmax / nm (吸光度) 630 (0.032) 576 (0.042) 540 (0.072) 506 (0.088) 408 (1.05)。【０１０５】
（ｉｉ）式４(１３)で表わす化合物の製造
窒素雰囲気下、５０ｍＬのナス型フラスコに化合物３（１３）およびその位置異性体（６３．３ｍｇ，６．９×１０-５ｍｏｌ）、ジクロロメタン（５ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２ｍＬ）を氷浴で冷却しながらそれぞれ加えた。その後、反応溶液を室温に戻し、撹拌した。７時間後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣へ最小量のメタノールを加えて溶解させた。そこへジエチルエーテルを加えて、生じた沈殿を集めて標題化合物４（１３）およびその位置異性体との混合物を得た（４３ｍｇ，８２％、紫色、固体）。【０１０６】
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.41 (s, 1H) 10.19 (s, 0.5H) 10.14 (br, 1.5H) 10.00 (s, 0.5H) 9.94 (s, 0.5H) 8.42-8.27 (m, 2H) 6.43-6.12 (m, 4H), 4.60-4.41 (m, 4H), 3.61-3.47 (m, 16H) 3.33-3.22 (m, 8H) 3.13 (m, 2H) 2.93 (m, 2H) 2.80 (m, 2H) 2.71 (m, 2H) 1.90 (m,2H) 1.44 (m, 2H) -3.88 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 765.55 (M - TFA)+, C44H57N6O6について計算値：765.96;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸光度) 628 (0.035) 574 (0.044) 538 (0.073) 504 (0.090) 401 (1.02)。【０１０７】
（ｉｉｉ）式５（１３）で表わす化合物の製造
５０ｍＬのナス型フラスコに化合物４（１３）およびその位置異性体（３５．０ｍｇ，４．６×１０-５ｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩ）一水和物（１８０ｍｇ）および炭酸水素ナトリウム（７．７ｍｇ）を加え、窒素飽和にしたクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１０／１、１０ｍＬ）に溶解させ、加熱還流を行った。４時間後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝２／１）に溶解させ、０．０５Ｍ塩酸で洗浄した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に最小量のメタノールを加えて溶解させ、そこへジエチルエーテルを加えて生じた沈殿を集めて、標題５（１３）およびその位置異性体との混合物を得た（３８ｍｇ，９２％、紫色、固体）。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 818.70 (M -Cl--HCl)+, C44H54FeN6O6 について計算値：818.72 
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸光度) 601 (0.037) 494 (0.080) 396 (1.07)。【０１０８】
（ｉｖ）式１（１３）で表わす化合物の製造
１００ｍＬのナス型フラスコに、化合物５（１３）およびその位置異性体（５０．０ｍｇ，５．６×１０−５ｍｏｌ）およびＮ−メトキシカルボニルマレイミド（１２０ｍｇ，７．７０×１０−４ｍｏｌ）を、アセトンと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の混合溶媒（アセトン／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液＝２／１、１０ｍＬ）に溶解させた。室温にて２時間撹拌した後、水（４０ｍＬ）を加え、さらに１時間攪拌した。前記混合物に、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、ついでクロロホルムを加えて、クロロホルムで抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５／１）によって精製した。得られた固体を最小量のクロロホルムに溶解させ、そこへヘキサンを加えることによって生じた沈殿を集め、標題化合物１（１３）およびその位置異性体との混合物を得た（２３ｍｇ、４６％、暗紫色、固体）。【０１０９】
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 898.38 (M−Cl−)＋, C44H46FeN6O7 について計算値：898.34 
UV-vis (CHCl3/MeOH = 1/1, v/v) λmax / nm (吸光度) 596 (0.064) 483 (0.087) 398 (0.78)。【０１１０】
（３）タンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするタンパク質ポリマーの製造（スキーム４参照）【０１１１】
【化１１】
0005413786.tif 000015
【０１１２】
前記式（ＩＩ−２）【０１１３】
【化１２】
0005413786.tif 000016
【０１１４】
は、実施例１（１）において発現したタンパク質変異体由来の単量体である、マッコウクジラ由来のミオグロビン変異体（Ａ１２５Ｃ）を意味し、前記変異体は、野生型のミオグロビンのアミノ酸配列（配列番号２）中、第１２６番目のアラニン残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、前記Ｈｅｍｅは、天然ヘムを意味し、式ＨＳ−Ｘ’’は、前記変異体のアポ体を意味する。【０１１５】
スキーム４中、それぞれの「位置異性体」は、以下のとおり。化合物１（１３）の位置異性体は化合物１（１３）’、化合物（ＩＩＩ−１３）の位置異性体は化合物（ＩＩＩ−１３）’、化合物Ｖ−１３）の位置異性体は化合物（Ｖ−１３）’である。【０１１６】
【化１３】
0005413786.tif 000017
【０１１７】
実施例１（１）で調製したＡ１２５Ｃ二量体のストック溶液（２００μＬ，１．１０×１０−３Ｍ（単量体換算濃度）、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）に、大過剰のＤＴＴ（ジチオスレイトール）を加え溶解させた後、３０分間２℃で静置した。０．１Ｍ  Ｌ−ヒスチジン水溶液で平衡化した脱塩バッファー交換用カラム（Ｈｉｔｒａｐ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（登録商標）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）でこの溶液を精製し、Ａ１２５Ｃ単量体（ＩＩ−２）を得た。前記Ａ１２５Ｃ単量体（ＩＩ−２）を、前記０．１Ｍ  Ｌ−ヒスチジン水溶液で１．５ｍＬにメスアップして、Ａ１２５Ｃ単量体溶液を調製した。前記Ａ１２５Ｃ単量体溶液へ、化合物１（１３）（１．１×１０−６ｍｏｌ）溶液を加えた後、その混合物を２４時間室温で攪拌して、化合物１（１３）およびその位置異性体とＡ１２５Ｃ単量体（ＩＩ−２）の結合体であるタンパク質モノマー（１ＩＩ−１３）およびその位置異性体を得た。前記化合物１（１３）およびその位置異性体の溶液は、０．１Ｍ  Ｌ−ヒスチジン水溶液とＤＭＳＯと、ジチオナイトとの混合溶媒（０．１Ｍ  Ｌ−ヒスチジン水溶液：ＤＭＳＯ＝６：１、ジチオナイトは、Ａ１２５Ｃ単量体と当量）（０．６ｍＬ）中に化合物１（１３）およびその位置異性体（１．１×１０−６ｍｏｌ）を溶解させて調製した。前記全ての操作はグローブボックス中、窒素雰囲気下で行った。【０１１８】
反応溶液を透析膜（Ｗａｋｏ，ＭＷＣＯ１４，０００Ｄａ）に移し、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ６．０）を用いて４℃で透析を行った（１Ｌ×１時間×２）。透析により得られたタンパク質モノマー（ＩＩＩ−１３）およびその位置異性体の溶液に０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ２．２５へ調整し、タンパク質モノマー（Ｖ−１３）およびその位置異性体を得た。前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）およびその位置異性体の溶液へ２−ブタノン（５ｍＬ×４）を加えて抽出操作を行った。水層を分離して透析膜（Ｗａｋｏ，ＭＷＣＯ１４，０００Ｄａ）へと移し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）を用いて４℃で透析を行った（１Ｌ×２時間×３）。得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の水溶液から遠心分離により沈殿を除去し、上澄みのタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）溶液を限外ろ過によって約１０−３Ｍまで濃縮し、冷暗所にて保管した。【０１１９】
（４）タンパク質ポリマーを架橋して構造体を製造
タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）（ヘム換算濃度０．３ｍＭ、１０μＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に過酸化水素水溶液（２．２５ｍＭ、２μＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））を加え、混合物を２５℃で２時間静置してタンパク質ポリマーを架橋した。得られた構造体は、その後、冷暗所にて保管した。【０１２０】
（５）前記構造体の酸素錯体を製造
前記タンパク質ポリマーが架橋された構造体の水溶液（０．２５ｍＭ（ヘム換算濃度）、３０μＬ、０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）に過剰量のジチオナイトを加え、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。その混合物へＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いてジチオナイトを除去して前記構造体の酸素錯体を精製した。【０１２１】
［実施例１で得られたタンパク質ポリマーおよびそのポリマーを架橋して得られた構造体の物性］【０１２２】
＜タンパク質ポリマーの酸素錯体を製造＞
前記タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の水溶液（０．２５ｍＭ（ヘム換算濃度）、３０μＬ、０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）に過剰量のジチオナイトを加え、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。その混合物をセファデックス−Ｇ２５カラムにより精製して前記タンパク質ポリマーの酸素錯体を得た。
また、前記タンパク質ポリマーの代わりに天然型ミオグロビンを用いた以外は前記と同様にして、天然型ミオグロビンの酸素錯体を得た。【０１２３】
（ｉ）ＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定
図１ａに天然型ミオグロビンのＵＶ−ｖｉｓスペクトル、図１ｂに実施例１で製造したタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。図１ａならびに図１ｂより、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のスペクトルが、前記天然型ミオグロビンのものと非常によく似たスペクトルを有していることが確認できた。従って、変異体ミオグロビンにポルフィリンリンカーを導入したタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のヘムが、天然型ミオグロビンと同様にヘムポケットに保持されていることが確認できた。【０１２４】
さらに、図１ｃに、天然型ミオグロビンの酸素錯体のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、図１ｄにタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の酸素錯体のＵＶ−ｖｉｓスペクトルをそれぞれ示す。酸素貯蔵能を有するミオグロビンは大気中、還元剤でヘム鉄を２価に還元することで非常に安定な酸素錯体を形成し、特徴的な紫外可視吸収スペクトルを示すことが知られている。この図１ｃと図１ｄは、特徴的な４１７ｎｍ、５４３ｎｍおよび５８０ｎｍの吸収を同様に有する。従って、式（Ｖ−１３）で表わされるタンパク質モノマーおよびその位置異性体またはその塩をモノマー単位とするタンパク質ポリマー(Ｉ−１３)が、非常に安定な酸素錯体を形成することが、確認できた。さらに、このことから、式（Ｉ−１３）で表わされるタンパク質ポリマーが、本来のタンパク質の機能を保持したまま、超分子集合体を形成していることが確認できた。【０１２５】
（ｉｉ）酸素との親和性の測定
タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の酸素錯体と天然型ミオグロビンの酸素錯体のカイネティクス測定はリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中で、２５℃で行った。自動酸化過程の測定は３７℃で行った。酸素の結合定数ＫＯ２は、結合速度定数ｋＯ２ｏｎを解離速度定数ｋＯ２ｏｆｆで割ることで求められる。以下の測定で得られた結果を表２に示す。なお、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）は、タンパク質モノマーが１１個（ｎ＝１１）重合されたものに対応していた。このタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）またはその位置異性体全体を一分子として計算した。【０１２６】
［酸素の結合速度定数ｋＯ２ｏｎの測定］
大気下（［Ｏ２］＝２．６４×１０−４Ｍ）でリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中の天然型ミオグロビンの酸素錯体または酸素結合型タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の酸素錯体をそれぞれ、レーザーフラッシュフォトリシス（励起波長５３２ｎｍ、５ｎｓパルス）により励起させた。その後、天然型ミオグロビンまたは実施例１で製造したタンパク質ポリマー（ミオグロビンのＦｅ（ＩＩ）ヘム錯体、deoxy-Mb）のそれぞれの極大吸収波長である４３４ｎｍの吸光度変化を追跡した。プローブ光はモノクロメーターを通過させた。反応曲線を非線形最小二乗法によりフィッティングし、一次反応速度定数を決定した。次いで、得られた速度定数をＯ２の濃度で割ることにより、酸素の結合速度定数ｋＯ２ｏｎを算出した。【０１２７】
［酸素の解離速度定数ｋＯ２ｏｆｆの測定］
酸素の解離速度はフェリシアン化カリ法により求めた。測定にはストップトフロー装置を用い、プローブ光はモノクロメーターを通過させた。［Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］］＞＞［Ｍｂ］］の条件で５８０ｎｍの吸光度変化を一次速度式でフィッティングした。以下の式（１）に従い、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］が大過剰の条件で観測される速度定数からｋＯ２ｏｆｆを決定した。【０１２８】
【数１】
0005413786.tif 000018
【０１２９】
ここでｋｏｘはｄｅｏｘｙ体からｍｅｔ体への酸化速度定数である。定常状態の近似が成り立つとき、反応は一次速度定数に従い、見かけの速度定数ｋｏｂｓは式（２）のように表すことができる。【０１３０】
【数２】
0005413786.tif 000019
【０１３１】
ｋｏｘ［Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］］＞＞ｋＯ２ｏｎ［Ｏ２］の条件が満たされるとき、以下のように酸素の解離速度定数ｋＯ２ｏｆｆが算出できる。【０１３２】
【数３】
0005413786.tif 000020
【０１３３】
［自動酸化速度定数ｋａｕｔｏの測定］
３７℃で、天然型ミオグロビンの酸素錯体またはタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の酸素錯体を試料として５００〜６５０ｎｍの範囲でＵＶ−ｖｉｓスペクトルを３０分毎に測定した。５８０ｎｍの吸光度変化を時間に対してプロットし、一次速度式でフィッティングすることにより自動酸化速度定数ｋａｕｔｏを算出した。得られた結果を表１に示す。【０１３４】
【表３】
0005413786.tif 000021
【０１３５】
表１の結果から、式（Ｖ−１３）またはその位置異性体で表わされるタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）が、天然型より優れた酸素との親和性を有することが確認できた。【０１３６】
（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラムの測定
実施例１で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）について、サイズ排除クロマトグラフィーを測定した。カラムとしてはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムを用いた。溶出溶媒には１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。測定は温度４℃、流速０．５ｍＬ／分にて行った。その結果を図２ａに示す。図２ａ中、溶出成分の早い成分ほど大きな分子量を持つ。ミオグロビン変異体Ａ１２５Ｃ単量体の溶出量は、１７．６ｍＬであり、ミオグロビン変異体Ａ１２５Ｃ二量体の溶出量は、１６．２ｍＬである（図示せず）。タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の溶出量は、９．３ｍＬであった。従って、タンパク質ポリマーは、これらミオグロビン変異体Ａ１２５Ｃ単量体と、二量体より溶出量が少なく、これらのポリマーの分子量が大きいことが確認できた。さらに、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）は、検出限界の８ｍＬから大きくクロマトグラフィーが立ち上がっており、大きな分子量成分を多く含むことが確認できた。なお、分子量の常用対数と溶出量とは比例関係にあるので、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の分子量が概算で算出できる。その分子量とモノマーの分子量から、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の重合度は、３３と算出できた。【０１３７】
実施例１（４）で得られた架橋された構造体について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを測定した。その結果を図２ｂに示す。図２ｂ中、実線が実施例１の架橋された構造体のチャート、破線が実施例１で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のチャートである。図２ｂから、本発明の構造体は、排除限界（溶出量：７．５ｍＬ、分子量：１．３×１０６Ｄａ）に達する成分が主成分であり、非常に大きな分子量を有することが確認できた。【０１３８】
また、実施例１で得られた架橋された構造体について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムの代わりにＳｈｏｄｅｘ社製ＫＷ４０５−４Ｆカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを測定した。その結果を図２ｃに示す。図２ｃ中、実線が実施例１の架橋された構造体のチャート、破線が実施例１で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のチャートである。図２ｃから、本発明の構造体は、非常に大きな分子量を有することが確認できた。【０１３９】
（ｉｖ）濃度を変化させた条件下でのサイズ排除クロマトグラムの測定
実施例１で得た前記タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）について、前記ポリマーの濃度を１０μＭ、１００μＭ、５００μＭおよび１０００μＭのそれぞれにおいて、前記（ｉｉ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラムを測定した。その結果を図３に示す。図３から、前記ポリマー（Ｉ−１３）の濃度が高くなるにつれ、前記タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の長さが長くなり、かつタンパク質ポリマーの低分子量成分の量が低下することが確認できた。これはタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）が濃度に依存して分子量分布を変えることを示しており、熱力学的な平衡に支配されていることがわかる。【０１４０】
（ｖ）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定
ＡＦＭ測定に用いたサンプルは以下のように調製した。高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ）基板の表面を壁開し、その壁開面を実施例１（３）で得たタンパク質ポリマーの水溶液（約１０−８Ｍ、０．０５Ｍトリス緩衝液中、ｐＨ７．３もしくは０．１Ｍリン酸緩衝液中、ｐＨ７．０）に数秒間浸漬した。基板を溶液から引き上げた後、水でよく洗浄し、室温にて塩化カルシウムの入ったデシケーター内にてよく乾燥させた後、ＡＦＭ測定装置にセットした。測定はタッピングモードで行い、スキャン速度は２Ｈｚ、探針には曲率半径が約１０ｎｍのシリコン単結晶を用いた。実施例１（３）で得たタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）のＡＦＭイメージを図４（ａ）および（ｂ）に示す。【０１４１】
図４の（ａ）では、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）の全体図を、(ｂ)では（ａ）中の白色の線に沿ったプロファイルを示す。このタンパク質ポリマーについて、高さが均一な線状ポリマー構造体を示す像が確認できた。また、数十量体に相当する長さの線状ポリマー構造体も確認できた。【０１４２】
（ｖｉ）質量スペクトルの測定
また、実施例１（３）で得た前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）またはその位置異性体のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図５（ａ）に、前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図５（ｂ）に示す。前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）の分子量の計算値は、１８２６０．９である。図５（ｂ）から、前記タンパク質モノマー（Ｖ−１３）またはその位置異性体の分子量は計算値と一致していることが確認できた。【０１４３】
（ｖｉｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
実施例１（４）で得られた架橋された構造体（７．２×１０−７ｇ、ヘム換算で４．０×１０−１１ｍｏｌ）へドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（８．０×１０−５ｇ、２．８×１０−７ｍｏｌ）を添加してタンパク質を変性させたのち、ゲル（ＧＥヘルスケア社製、Ｐｈａｓｔｇｅｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｏｕｓ １２．５）を用いて１５℃で電気泳動を行った。泳動後のゲルはクマシーブリリアントブルー色素を用いてタンパク質の染色を行った。得られた電気泳動の結果を図６に示す。【０１４４】
図６において、レーン１は実施例１（３）で得られたタンパク質ポリマー（Ｉ−１３）、レーン２〜５は、左から、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）に対して０．５当量、１．０当量、１．５当量および２．０当量の過酸化水素と反応させて得られた架橋された構造体、レーン６は、天然のミオグロビンに対して１．５当量の過酸化水素を反応させて得られた架橋された天然ミオグロビン構造体、レーン７は、標準タンパク質を用いたマーカーである。図６から、タンパク質ポリマー（Ｉ−１３）に対して０．５当量、１．０当量、１．５当量および２．０当量の過酸化水素と反応させて得られた架橋された構造体は、共有結合的に架橋した二量体が生成していることが確認できた。なお、架橋されたミオグロビンの構造体は、O. M. Lardinoisらの文献（O. M. Lardinois, P. R. Ortiz de Montellano, J. Biol. Chem. 278, 36214 (2003)）に従い製造した。【０１４５】
（ｖｉｉｉ）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）測定
高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ）基板の表面を壁開し、その壁開面に実施例１（４）で得られた架橋された構造体の溶液（１０ｎＭ、５μＬ、超純水溶液）を滴下した。その基板を液体窒素に浸し、液滴を氷結させ、次いで真空下で水を凍結乾燥させた。充分に乾燥させた後、その基板をＳＥＭ測定装置にセットした。測定は走査型電子顕微鏡（日立ハイテク社製Ｓ−５５００）を用い、２次電子検出モード、加速電圧１．５ｋＶにて測定した。得られたＳＥＭ画像を図７に示す。図７（ａ）、７（ｂ）および７（ｃ）は縮尺が異なる画像である。図７（ａ）に示すように、本発明の架橋された構造体は、数十〜数百ｎｍ程度の大きさを有するスポンジ状の構造体であることが確認できた。また、図７（ｃ）に示すように、実施例１のスポンジ状の構造体を構成するファイバーの幅は、４〜９ｎｍであることが確認できた。天然のミオグロビンの大きさを考慮すると、タンパク質モノマー（Ｖ−１３）を単量体とする一次元ポリマーが架橋することによって製造されていることが確認できた。【０１４６】
（ｉｘ）実施例１の架橋された構造体の酸素錯体
実施例１（４）で得られた架橋された構造体の紫外可視吸収スペクトルを図８（ａ）に、実施例１（５）で得られた前記構造体の酸素錯体の紫外可視吸収スペクトルを図８（ｂ）に示す。図８（ａ）に示すように、架橋された構造体の紫外可視吸収スペクトルは、天然のミオグロビンの紫外可視吸収スペクトルと非常によく一致しており、構造体中のタンパク質に鉄ポルフィリンが正しく取り込まれていることが確認できた。また図８（ｂ）に示すように、構造体の酸素錯体の紫外可視吸収スペクトルは、天然のミオグロビンの酸素錯体の紫外可視吸収スペクトルと非常によく一致しており、構造体が酸素貯蔵能を有していることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明の構造体は、酵素の集合体として用いることも可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４８】
配列番号１  シトクロムｂ５６２
配列番号２  マッコウクジラ由来野性型ミオグロビン（sperm whale）
配列番号３  西洋ワサビペルオキシダーゼ
配列番号４  ヘモグロビンαサブユニット（human）
配列番号５  ヘモグロビンβサブユニット（human）
【図１ａ】
0005413786.tif 000026
【図１ｂ】
0005413786.tif 000027
【図１ｃ】
0005413786.tif 000028
【図１ｄ】
0005413786.tif 000029
【図２ａ】
0005413786.tif 000030
【図２ｂ】
0005413786.tif 000031
【図２ｃ】
0005413786.tif 000032
【図３】
0005413786.tif 000033
【図５ａ】
0005413786.tif 000034
【図５ｂ】
0005413786.tif 000035
【図８ａ】
0005413786.tif 000036
【図８ｂ】
0005413786.tif 000037
【図４ａ】
0005413786.tif 000038
【図４ｂ】
0005413786.tif 000039
【図６】
0005413786.tif 000040
【図７ａ】
0005413786.tif 000041
【図７ｂ】
0005413786.tif 000042
【図７ｃ】
0005413786.tif 000043
【配列表】
0005413786000001.app