(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてガロカテキンガレート（gallocatechin gallate: GCG）、テオブロミン（theobromine）及びケルセチン（quercetin）を含有した保湿用皮膚外用剤組成物であって、
前記ガロカテキンガレートは組成物の全体重量に対して０．００１〜３０．０重量%の量で含有され、
前記有効成分は、各々モル濃度として、（i）ガロカテキンガレートが０．７モル以下である時、テオブロミンが少なくとも０．４モルであって、ケルセチンが少なくとも０．４モルであり、（ii）ガロカテキンガレートが０．７〜１．４モルである時、テオブロミンが少なくとも０．３モルであって、ケルセチンが少なくとも０．３モルであり、（iii）ガロカテキンガレートが１．４モル以上である時、テオブロミンが少なくとも０．２モルであって、ケルセチンが少なくとも０．２モルであることを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【請求項２】
前記有効成分は、組成物の全体重量に対して各々０．００１〜３０．０重量%の量で含有されることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項３】
前記組成物は、ＰＰＡＲ−αの活性化用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
前記組成物は、皮膚のフィラグリン（filaggrin）の発現促進用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
前記組成物は、皮膚のインボルクリン（involucrin）の発現促進用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてガロカテキンガレート（gallocatechin gallate）を含有する保湿用皮膚外用剤組成物に関する。より詳細には、本発明の皮膚外用剤組成物は、有効成分としてガロカテキンガレートを含有し、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体亜型アルファ（PPAR-α）を活性化させ、皮膚保湿因子であるフィラグリン（filaggrin）及びインボルクリン（involucrin）の発現を促進させて、優秀な皮膚乾燥防止及び皮膚保湿効果を示す。特に、本発明の皮膚外用剤組成物は、ガロカテキンガレートにテオブロミン（theobromine）及びケルセチン（quercetin）を最適の割合で含有することによって、上記効果をさらに極大化させることができる。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外部から順に表皮、真皮、皮下組職の３つの層で大きく区分され、体内の諸器官を気温及び湿度変化、紫外線、その他の物理的、化学的な外部環境の刺激から保護する機能を有する。特に、表皮では、人体内部の水分蒸発を防止する重要な役目をする。
【０００３】
上記表皮は、外部から順に角質層（stratum corneum）、顆粒層（stratum granulosum）、有棘層（stratum spino）、基底層（stratum basale）に区分され、そして、角質層の細胞（keratinocytes）は煙瓦（bricks）のような役目をし、また、角質細胞間の細胞間脂質（intercellular lipids）はモルタル（mortar）のような役目をし、それによって皮膚障壁を構成している〔J. Invest. Dermatol. 80(Suppl.), 44-49. 1983〕。また、元気な人の角質細胞には、高濃度の自然保湿因子（Natural Moisturing Factor、ＮＭＦ）が存在し、皮膚の水分保有を助け、例えば、アミノ酸のような物質は、水溶性なので、効果的に水分と結合し、皮膚で水分が乾燥することを抑制する（J. Invest. Dermatol. 54, 24-31, 1970）。
【０００４】
しかし、最近、環境の変化や生活パターンの変化による冷／暖房の人為的な温度調節、社会生活で発生する各種ストレスと環境汚染による皮膚ストレス、化粧習慣による頻繁な洗顔及び年齢増加による自然的な皮膚老化などの様々な原因に起因して、角質層の水分が減少し、皮膚が乾燥しやすくなり、表面が荒くなり、皮膚がばさばさになり、湿っぽいを失って生気がなくなるなどの現象が発生するので、皮膚保湿剤の必要が増加している。
【０００５】
従来、このために保湿剤として水分を吸収する性質があるヒューメクタント（humectant）や水分蒸発を防止する閉鎖保湿剤（Occlusive Moisturizer）を使用して角質層での水分保有を増加させる方式が行われて来た。上記ヒューメクタントとしては、グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、2-ピロリドン-5-カルボン酸ナトリウムなどの物質が挙げられるが、皮膚への塗布時、べたつきが激しいか、粘り強い感じがする短所がある。また、閉鎖保湿剤としては、セラマイドなどの脂質成分や必須脂肪酸及び脂質複合体などが使用されたが（J. Invest. Dermatol. (5), 731-740, 1994）、乳化剤型の安定度を維持するのに難点があり、透明なゼル状の製品を製造するに適しない短所がある。
【０００６】
一方、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPAR）は、多様な組職分布の３種の亜型α、β／δ、γを有する核ホルモン受容体の公知された部類である。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体亜型α（以下、「PPAR-α」という）は、初めにフィブリン酸の誘導体のようなペルオキシソーム増殖因子と反応して脂肪酸酸化酵素を暗号化する遺伝子に対する調節に基づいて同定された（Issemann and Green, Nature, 1990, 347:645-650）。また、文献（Leone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1999, 96:7473-7478）には、ＰＰＡＲ−αによって行われる組職での脂肪酸の重要な役目が立証されている。ＰＰＡＲ−αの脂質活性化剤、例えばリノール酸などは当業界に公に知られている。これらは、試験管内皮膚上皮障壁形成を促進するものとして証明された（Hanley et. Al., J. Clin. Inv., 1977, 100:705-712）。しかし、皮膚においてＰＰＡＲ活性調節を利用した効果は、老化防止治療を提供するための美容組成物（WO 01／008653）以外には当業界に教示または提案されたところがない。
【特許文献１】WO 01／008653
【非特許文献１】J. Invest. Dermatol. 80(Suppl.), 44-49. 1983
【非特許文献２】J. Invest. Dermatol. 54, 24-31, 1970
【非特許文献３】J. Invest. Dermatol. (5), 731-740, 1994
【非特許文献４】Issemann and Green, Nature, 1990, 347:645-650
【非特許文献５】Leone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1999, 96:7473-7478
【非特許文献６】Hanley et. Al., J. Clin. Inv., 1977, 100:705-712
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これより、本発明者らは、皮膚保湿と保護に影響を及ぼす様々な要因のうちペルオキシソーム増殖剤活性化受容体亜型アルファ（PPAR-α）の活性調節を通じた皮膚保湿効果を示すことができる成分を研究した結果、皮膚外用剤組成物に有効成分として緑茶の構成成分のうちガロカテキンガレートを含有する場合、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体亜型アルファ（PPAR-α）を活性化させ、皮膚保湿因子であるフィラグリン及びインボルクリンの発現を促進させて、優秀な皮膚保湿及び皮膚乾燥防止効果を示すことを知見した。特に、上記組成物にガロカテキンガレート以外にテオブロミン及びケルセチンを最適の割合でさらに含有する場合、上記効果を最大化することができることを知見し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、有効成分としてガロカテキンガレートを含有する保湿用皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、上記組成物にテオブロミン及びケルセチンを最適の割合でさらに含有する保湿用皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の保湿用皮膚外用剤組成物は、有効成分としてガロカテキンガレートを含有し、前記ガロカテキンガレートは組成物の全体重量に対して０．００１〜３０．０重量%の量であることを特徴とする。また、上記皮膚外用剤組成物は、テオブロミン及びケルセチンを最適の割合でさらに含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の保湿用皮膚外用剤組成物は、ＰＰＡＲ−α活性調節を目的にして緑茶成分であるガロカテキンガレートを含有し、これにテオブロミン及びケルセチンを最適の割合でさらに含有することによって、皮膚の乾燥防止及び保湿強化効果を付与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明の保湿用皮膚外用剤組成物は、有効成分としてガロカテキンガレートを含有することによって、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体亜型アルファ（PPAR-α）の活性を活性化させて、優秀な皮膚保湿及び皮膚乾燥防止効果を示す。
【００１３】
また、本発明による保湿用皮膚外用剤組成物は、有効成分としてガロカテキンガレート以外に緑茶の構成成分のうちテオブロミン及びケルセチンをさらに含有することができる。
【００１４】
本発明による保湿用皮膚外用剤組成物において上記有効成分は、組成物の全体重量に対して各々０．００１〜３０重量%の量で含有することを特徴とする。
【００１５】
ＰＰＡＲ−αの活性化効果を確認することができる広く知られた方法は、レポーター遺伝子分析（reporter gene assay）である（Kliewer et. Al., Nature, 1992, 358:771-774）。上記レポーター遺伝子分析は、関心あるプロモーター（promoter）とレポーター遺伝子（reporter gene）を含む塩基配列をクローニング（cloning）し、真核細胞（eukaryotic cell）に注入、転写（transcription）を活性化し、タンパク質（protein）の発現を調節する分析法である。この場合、プロモーターが活性化されるほどタンパク質の発現が増加する。最初に利用されたレポーター遺伝子は、ＣＡＴ（chloramphenicol acetyltransferase）遺伝子であり、最近には、ルシフェラーゼ遺伝子（luciferase gene)を最も多く利用する。本発明では、Promega社で提供したDual-Luciferase Reporter Assay System Kitを利用した。
【００１６】
一方、本発明による保湿用皮膚外用剤組成物は、有効成分としてガロカテキンガレート以外に緑茶の構成成分のうちテオブロミン及びケルセチンを最適の割合でさらに含有する場合、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体亜型アルファ（PPAR-α）の活性を活性化させて、皮膚保湿効果にさらに優れている。
【００１７】
上記本発明の皮膚外用剤組成物に含有されるガロカテキンガレート、テオブロミン及びケルセチンの最適の割合は、モル濃度でガロカテキンガレート（GCG）が０．７モル以下である時、テオブロミンが少なくとも０．４モルであって、ケルセチンが少なくとも０．４モルであり、また、ガロカテキンガレート（GCG）が０．７〜１．４モルである時、テオブロミンが少なくとも０．３モルであって、ケルセチンが少なくとも０．３モルであり、更に、ガロカテキンガレート（GCG）が１．４モル以上である時、テオブロミンが少なくとも０．２モルであって、ケルセチンが少なくとも０．２モルである。
【００１８】
緑茶の多様な成分間の役目を分析するにあたって、与えられた費用と時間及び予算下で最大の情報を得るために、総合的な実験方法と分析方法が必要であり、このために実験計画法（Design of Experiments、DOE）を利用した。ＤＯＥは、科学研究を体系的に計画、実行及び統計的に分析する方法論であり、特定工程の出力値変化の原因を明らかにするために、統制可能な入力因子の水準値を変化させて行く一連の実験過程を計画し実施する方法論である。これにより、実験の目的を満足させ、適切な成果物を得るために、最も多い情報を最も効率的に得ることができる一連の実験条件を決定する実験戦略を立てることができる。実験計画法を利用すれば、検定にシステム的に接近が可能であり、プロセスと結果測定値との関係定義及び評価が可能であり、変動の少数重要因子（vital few）の源泉の把握が可能であり、反応変数に対する少数重要因子の効果の測定値を提供し、一度に１つの要因だけを検定することより、効果的な測定値と高品質のデータを提供し、不確実性の測定が可能であり、施行すべき回数の最小化が可能であり、雑音変数（nuisance variables）の管理が可能になるなどの多様な効果を得ることができる。このような実験計画法としては、部分要因配置法（fractional factorial designs）、完全要因配置法（full factorial designs）、反応表面分析法（responsive surface methodology）、混合物実験法（mixture designs）、タグチ実験法（Taguchi design）などが挙げられる。
【００１９】
本発明による皮膚外用剤組成物は、その剤型において特に限定されるものではなく、例えば、ローション、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、パック、ゼル、エッセンスなど多様な皮膚粘着タイプ化粧料の剤型であることができ、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチまたは噴霧剤のような経皮投与型剤型であることができる。また、各剤型の皮膚外用剤組成物において、上記成分以外の他の成分は、その他の外用剤の剤型または使用目的などによって当業者が困難性なしに適宜選定して配合することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例及び試験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明がこれらの例に限定されるわけではない。
【００２１】
［試験例１］一因子一回実験法（OFAT）を通じたＰＰＡＲ−αの活性化能力測定
ＰＰＡＲ−α活性化能力測定実験は、次のように進行された。
猿の腎臓上皮細胞株であるＣＶ−１細胞（ATCC CCL 70）をチャコール（charcoal）／デキストリン処理された１０%牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に継代培養し、フェノールレッド（phenol red）のエストロゲンによる効果を除去するために、フェノールレッド無処理培地を使用した。プラスミドは、一般的な培養条件でも発現されるユニバーサルプローモーター（universal promoter）後方にＰＰＡＲ−（遺伝子を有するものとリガンド結合型のPPAR-）が結合して活性化されるＰＰＲＥ（PPARs Response Element）をプローモーターとして有し、後にレポーターとして役目をするホタル（firefly）ルシフェラーゼ遺伝子を有するもの、及び参照として使用されるレニラルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子が結合されたプラスミドが使用された。
【００２２】
ＣＶ−１細胞を５×１０4の濃度で２４ウェル型プレートに敷設した後、２４時間培養した後、上記３種類のプラスミド遺伝子をPromega社のTransFast Kitを利用して、一時的形質転換（transient transfection）を実施した。次に、２４時間培養した後、１ｘＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で１回洗浄した後、候補物質を適当な濃度別に処理し、さらに２４時間培養した後、１ｘＰＢＳで２回反復洗浄した。次に、１ｘＰＬＢ（passive lysis buffer, Promega）で細胞を壊した後、Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit (Promega)を利用して試料と参照のルシフェラーゼ活性を測定した。本実験で、陽性対照群は、ＰＰＡＲ−αのリガンドのうち最も強力なものとして知られたＷｙ１４６４３を使用し、陰性対照群は、試料を溶解する時に使用したＤＭＳＯと無処理群にした。計算値は、陰性対照群との割合で示し、３回反復実験に対する結果を下記表１（PPAR-α活性化分析結果）に示した。
【００２３】
【表１】
0005524483.tif 000002
【００２４】
上記表１から分かるように、多様な緑茶の構成成分のうちガロカテキンガレート（(-)GCG）、テオブロミン、及びケルセチンの場合に、有意な程度のＰＰＡＲ−α活性化傾向が示された。
【００２５】
［試験例２］反応表面分析法（RSM）を通じたＰＰＡＲ−αの活性化能力測定
上記試験例１で確認された緑茶の構成成分のうちガロカテキンガレート、テオブロミン、及びケルセチンのＰＰＡＲ−α活性化能力を最適化させるために、反応表面分析法（responsive surface method、RSM）を利用した。これを利用すれば、独立変数のどの値で反応値が最適化されるかを把握することができ、独立変数と従属変数間の関数関係をデータから推正し、独立変数が反応変数にどんな影響を及ぼすかを予測することができ、変数間の最適の実験条件を捜し出すことができる。本発明では、MiniTab 14を利用して反応表面分析法のうち中心合成計画法（central composite designs）を行い、その結果を表２（中心合成計画法による設計とその測定値）に示した。
【００２６】
【表２】
0005524483.tif 000003
【００２７】
上記表２の実験計画によって実験を行い、実験測定値を利用してＳ／Ｗ上で次の表３に示すように分析を実施した。
その結果を図１〜図２、及び下記表４（PPAR-α活性化のための最適濃度の割合）に示した。
【００２８】
【表３】
0005524483.tif 000004
【００２９】
【表４】
0005524483.tif 000005
【００３０】
上記Ｓ／Ｗ上の分析（software analysis）結果、Ｒ2＝８０．７%であり、Ｒ2（adj）＝７１．８%であって、比較的高い程度の相関関係を示すことが分かり、回帰模型式も有意であることが分かった。また、図１の反応値調節器（response optimizer）を用いて望大特性（larger-the-better）において最大値を有する最適条件を有する濃度、すなわちガロカテキンガレート１３５μM、テオブロミン１００μM、ケルセチン１００μMを最適条件として確認することができ、図２の重ね合わせ等高線プロット（overlaid contour plot）を通じて最適の濃度範囲を類推することができた。その結果を上記表４に記載している。
【００３１】
［試験例３］ＲＴ−ＰＣＲ分析を通じたフィラグリンの発現測定
実験に使用した細胞株は、ドイツ癌研究センターのDr. Fuseningから分譲された ＨａＣａＴ細胞株（Human kerationocyte HaCaT cell line）であって、上記細胞を６０mmディッシュに１×１０5個に分株し、１日間培養した後、各々の試験物質を処理した後、２４時間培養した。上記試験物質は、陰性対照群（lane 1, 5）、ガロカテキンガレート：テオブロミン：ケルセチンの１３０μM：１００μM：１００μMの混合物（lane 2, 6）、ガロカテキンガレート：テオブロミン：ケルセチンの６５μM：５０μM：５０μMの混合物（lane 3, 7）である。細胞培養のために１０%の牛胎児血清（fetal bovine serum, FBS）が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecos modified eagles medium, GibcoBRL, Life Technology）培地で３７℃、５%ＣＯ2条件で培養した。陰性対照群は、上記と同一の培地で試験物質を添加しない状態で培養したものを利用した。
【００３２】
上記の方法で培養及び試験した細胞からトリゾール（Trizol, Gibco Laboratories, USA）を利用してtotal ＲＮＡを抽出した後、one step RNA PCR kit（AMV）（Takara Bio Inc., Japan）で提供される方法に準してＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcriptional polymerase chain reaction）分析を施行した。この時、プライマー（primer）としては、フィラグリンに対するプライマー（バイオニア社、韓国）を使用し、internal controlとしては、β−アクチン（actin）を利用して発現量を比較した。その結果を図３に示した。
【００３３】
図３から分かるように、ガロカテキンガレート、テオブロミン、ケルセチンの１３０μM：１００μM：１００μM混合物（lane 2）と６５μM：５０μM：５０μM混合物（lane 3）は、陰性対照群である無処理群（lane 1）と比較してフィラグリンの発現を約１．８〜２．０倍増加させる効能があることを確認し（lane 1乃至3は、フィラグリンの発現量であり、lane 5乃至7は、β−アクチンの発現量であり、lane 4は、マーカー（marker）である１００bp ladderである）。したがって、このような混合物を含有する皮膚外用剤は、皮膚保護及び保湿作用を示すものと予想し、下記試験例４を行った。
【００３４】
［試験例４］人体での皮膚保湿力増加測定
下記表５の組成で製造した参考例１、実施例２〜５及び比較例１の化粧水の皮膚保湿力改善効果を測定した。
皮膚乾燥症を示す５０〜８０代の成人男女５０名を５個グループに分け、各グループに下記比較例１、参考例１及び実施例２〜５の化粧水を毎日２回ずつ４週間顔面に塗布した。塗布開始前と塗布後１週、２週、４週経過した時点、そして塗布を中止してから２週経過（全体６週経過）後に恒温、恒湿条件（２４℃、相対湿度４０%）でコニオメータを用いて皮膚水分量を測定した。
【００３５】
その結果を下記表６（水分増加率測定）に示した。表６の結果は、試験開始直前に測定したコニオメータ値を基準にして一定期間処置した後の測定値の増加分を百分率で表示したものである。上記コニオメータは、表皮の電気伝導度の値を測定し、皮膚に存在する水分量を測定する皮膚水分測定器である。
【００３６】
これとは別に、試験を終了した時点に試験対象者にとってアンケート紙を作成するようにして、器機的な評価と同時に主観的な効能評価をも実施した。その結果を下記表７（アンケート調査評価結果）に示した。
【００３７】
【表５】
0005524483.tif 000006
【００３８】
【表６】
0005524483.tif 000007
【００３９】
【表７】
0005524483.tif 000008
【００４０】
上記表６から明らかなように、ガロカテキンガレート、テオブロミン、ケルセチンが含有された参考例１及び実施例２〜５の物質を塗布した群が、比較例１を塗布した群に比べて、皮膚水分量が増加し、その程度は、濃度依存的であった。また、試験物質の最初塗布日から６週経過（試験物質４週塗布後に２週経過）後の皮膚水分を測定した数値が、１週〜２周経過後の数値と類似に現れ、試験物質を塗布しなくても、ある程度は上記物質によって皮膚水分が持続的に維持されることが分かった。
【００４１】
上記表７から明らかなように、アンケート調査を通じた調査結果でも、上記混合物が含有された参考例１及び実施例２〜５の化粧水を塗布する場合、皮膚乾燥症が改善されることを確認することができた。
【００４２】
［試験例５］動物試験を通じた皮膚障壁改善効果試験
本発明者らは、上記組成物が長期間の皮膚損傷による皮膚障壁（skin barrier）の回復に及ぶ効果を評価するための試験を実施した。生後８乃至１０週が経過した若い無毛マウスの背中にアセトンを１日２回ずつ５日間周期的に塗布し、実験動物の背中皮膚の障壁機能を損傷させた後、蒸発計（evaporimeter）で経皮水分損失量（TEWL；transepidermal waterloss）を測定し、４０g/m2/hr以上の経皮水分損失を示す皮膚を有する実験動物だけを対象にしてビヒクル（vehicle）（プロピレングリコール：エタノール＝７：３）と下記表８の参考例６、実施例７及び比較例２〜３を含有する試験物質を皮膚面積５cm2当たり２００μlの用量で１日２回ずつ３日間連続塗布しながら、一定時間毎にＴＥＷＬを測定し、下記数学式１によって障壁回復率を求め、その結果を表８（障壁回復率（%））に示した。
【００４３】
［数式１］
障壁回復率（%）＝（TEWL0−TEWLX）／（TEWL0−TEWLbasal）×１００
TEWL0：皮膚損傷直後のＴＥＷＬ測定値
TEWLX：皮膚障壁損傷後、一定時間経過後のＴＥＷＬ測定値
TEWLbasal：初期TEWL測定値
【００４４】
【表８】
0005524483.tif 000009
【００４５】
上記表８から明らかなように、ガロカテキンガレート（参考例６）またはガロカテキンガレート：テオブロミン：ケルセチン混合物（実施例７）を塗布した処理群が対照群（比較例２及び比較例３）に比べてさらに速く障壁損傷が回復され、正常皮膚に戻ることを確認し、このような障壁損傷回復とともに、皮膚水分量も増加し、皮膚保湿改善に優れていることを確認した。
【００４６】
また、上記実験で得られた実験動物の皮膚組職を切り出して、パラフィンに固定し、インボルクリン（INV）抗体を利用して皮膚組職の免疫組職化学染色を行い、皮膚表皮層の変化を観察し、その結果を図４に示した。インボルクリンは、茶色の染色部分を示す。
【００４７】
図４から明らかなように、ガロカテキンガレート（参考例６）またはガロカテキンガレート：テオブロミン：ケルセチン混合物（実施例７）を塗布した処理群が対照群（比較例２）よりインボルクリンの発現がさらに多いことが分かり、これは、損傷された皮膚障壁がさらに速く改善されていることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の保湿用皮膚外用剤組成物は、ＰＰＡＲ−α活性調節を目的にして緑茶成分であるガロカテキンガレートを含有し、これにテオブロミン及びケルセチンを最適の割合でさらに含有することによって、皮膚の乾燥防止及び保湿強化効果を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、反応値調節器（Response optimizer）による最適条件の濃度を選定したグラフである。
【００５０】
【図２】図２は、重ね合わせ等高線プロット（Overlaid contour plot）による最適条件の濃度範囲を選定したグラフである。
【００５１】
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲ分析を通じたフィラグリン発現測定結果である。
【００５２】
【図４】図４は、インボルクリン抗体を利用した皮膚組職の免疫組職化学染色を行って皮膚表皮層を観察した図である。
【図１】
0005524483.tif 000010
【図２】
0005524483.tif 000011
【図３】
0005524483.tif 000012
【図４】
0005524483.tif 000013