(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
開閉自在のカバーを設けた筐体ベースと、前記筐体ベース内に設けられ、後記分注ヘッドを前後、左右方向に移動させる分注ヘッド移動機構と、
一列に並んで保持された複数の分注針を昇降機構によって一斉に上下させる分注ヘッドと、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した、マイクロプレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を中蓋を有する蓋体で覆うようになした第１恒温槽と、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した試薬ラック及び複数の混合用マイクロプレートと、
前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧し、フィルタープレートのフィルターを通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第１減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧吸引し、フィルターを通過した液を廃棄する第１吸引廃棄装置、フィルタープレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を自動的に開閉する蓋体で覆うようになした第２恒温槽と、
フィルタープレートを保持し、フィルタープレートを前記第１減圧回収装置、第１吸引廃棄装置、第２恒温槽の夫々に順次移動させるフィルタープレート移動機構と、  前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧し、ＳＰＥプレートの固相体を通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第２減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧吸引し、固相体を通過した液を廃棄する第２吸引廃棄装置、上面に最終処理工程を終了した試料を点着するターゲットプレートを載受するターゲットプレート受台と、
ＳＰＥプレートを保持し、前記第２減圧回収装置と第２吸引廃棄装置との間で移動させるＳＰＥプレート移動機構と、
前記筐体ベースに設置し、作業工程を入力した制御装置と、
複数のウエルがマトリックス配列され、生体試料を各ウエルに注入した状態においてシートで覆うマイクロプレートと、複数のフィルターがマトリックス配列されたフィルタープレートと、複数の固相体がマトリックス配列された微量の試料用のＳＰＥプレートとを備え、
前記制御装置に入力された作業工程により前記各装置を作動させるようになしたことを特徴とし、ここで、糖鎖をメチルエステル化する手段を備えることを特徴とする糖鎖自動前処理装置。
【請求項２】
開閉自在のカバーを設けた筐体ベースと、前記筐体ベース内に設けられ、後記分注ヘッドを前後、左右方向に移動させる分注ヘッド移動機構と、
一列に並んで保持された複数の分注針を昇降機構によって一斉に上下させる分注ヘッドと、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した、マイクロプレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を中蓋を有する蓋体で覆うようになした第１恒温槽と、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した試薬ラック及び複数の混合用マイクロプレートと、
前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧し、フィルタープレートのフィルターを通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第１減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧吸引し、フィルターを通過した液を廃棄する第１吸引廃棄装置、平面状の払拭材を上面に設け、フィルタープレートの底部下面に付着している液を払拭するための底拭き、フィルタープレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を自動的に開閉する蓋体で覆うようになした第２恒温槽と、
フィルタープレートを保持し、フィルタープレートを前記第１減圧回収装置、第１吸引廃棄装置、底拭き、第２恒温槽の夫々に順次移動させるフィルタープレート移動機構と、
前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧し、ＳＰＥプレートの固相体を通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第２減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧吸引し、固相体を通過した液を廃棄する第２吸引廃棄装置、上面に最終処理工程を終了した試料を点着するターゲットプレートを載受するターゲットプレート受台と、
ＳＰＥプレートを保持し、前記第２減圧回収装置と第２吸引廃棄装置との間で移動させるＳＰＥプレート移動機構と、
前記筐体ベースに設置し、作業工程を入力した制御装置と、
複数のウエルがマトリックス配列され、生体試料を各ウエルに注入した状態においてシートで覆うマイクロプレートと、複数のフィルターがマトリックス配列されたフィルタープレートと、複数の固相体がマトリックス配列された微量の試料用のＳＰＥプレートとを備え、
前記制御装置に入力された作業工程により前記各装置を作動させるようになしたことを特徴とし、ここで、糖鎖をメチルエステル化する手段を備えることを特徴とする糖鎖自動前処理装置。
【請求項３】
前記分注ヘッドが、支承枠と、該支承枠に分注針と平行に設けたガイド杆に沿って上下方向に摺動する昇降台と、前記支承枠に固定した駆動モータと、該駆動モータの回転軸に接続したボールネジをもって前記昇降台を上下方向に移動させる昇降台移動機構と、前記昇降台に設けた分注針ホルダーに保持された分注針とをもって構成された分注ヘッドである請求項１又は２記載の糖鎖自動前処理装置。
【請求項４】
前記分注ヘッドにおける支承枠の下部に垂直に下向きにシリンダーを固定すると共に該シリンダーのピストンロッドの先端に加圧プレートを固着してなる請求項１又は２記載の糖鎖自動前処理装置。
【請求項５】
前記第１恒温槽が、アルミブロックからなる受台の内部中央にカートリッジヒータを内蔵すると共に該受台の下部にペルチェ及びヒートシンクを配置して本体部を構成し、該本体部における受台の上部を、内側に、シリコンシートを貼設し、内部中央にカートリッジヒータを内蔵した中蓋をスプリングを介して弾性的に支持してなる蓋体で覆うようになした第１恒温槽である請求項１又は２記載の糖鎖自動前処理装置。
【請求項６】
前記フィルタープレート移動機構及びＳＰＥプレート移動機構が、前記筐体ベースに前後方向に沿って立設した支承板の長さ方向の両端部にプーリを取付けると共に、該プーリの一方をステッピングモータをもって回転駆動させるようになし、該両プーリ間に掛け回したベルトに水平移動板を連結し、該水平移動板上に上下移動ユニットを設け、該上下移動ユニットを、上端部に中枠を受ける受枠を水平に支持し、支承枠内に垂直に設けたガイドに沿って上下方向に摺動する垂直移動杆と、支承枠内に固定したモータの回転軸に連結したボールネジをもって昇降し、前記垂直移動杆に接続した昇降作動杆とをもって構成してなる移動機構である請求項１又は２記載の糖鎖自動前処理装置。
【請求項７】
前記第２恒温槽が、アルミブロックからなる受台の内部中央にカートリッジヒータを内蔵すると共に内部中央から上面にかけて空気の循環路を設け、該受台の下部にペルチェ及びヒートシンクを配置して本体部を構成し、該本体部における受台の上部とこれに載置するフィルタープレートとの間に前記空気の循環路に連通する空気の循環路を設け、更にダクト及びファンを設けて前記フィルタープレートの外に流出した空気を再び受台内に流入させて循環させるようになし、前記本体部における受台の上部を蓋体で覆うようになした第２恒温槽である請求項１又は２記載の糖鎖自動前処理装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置と、糖鎖の分析を実行する手段とを備える糖鎖自動分析装置。
【請求項９】
前記糖鎖の分析を実行する手段は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化  質量分析（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  −  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）または等価物である、請求項８に記載の糖鎖自動分析装置。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の糖鎖自動分析装置であって、該装置において、
以下の工程：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって：
該試料は
Ａ−１）タンパク質分解酵素、および
Ａ−２）糖鎖遊離酵素
と接触される、糖鎖遊離工程；
Ｂ）遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程であって、以下の工程：
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した試料を、糖鎖捕捉ビーズと接触させて、該試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件下に置いて捕捉糖鎖試料を生成させ、その後、該ビーズをメチルエステル化する工程；
Ｂ−２）タンパク質変性剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程；および
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料から、糖鎖試料を遊離させる工程であって、ここで、該捕捉糖鎖試料中の糖鎖を標識試薬によりタグ化し，ビーズより遊離させる工程；
を包含する、検出試料調製工程；
Ｃ）該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程であって；
Ｃ−１）Ｂ）工程で得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；
Ｃ−２）有機溶媒を糖鎖が固相に吸着する濃度になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液および該有機溶媒を混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相に応じて該固相担体封入プレートを活性化し洗浄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、該固相担体封入プレートの相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を吸引回収する工程；および
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液を質量分析用マトリクスと混合し測定用プレートに点着させる工程；
を包含する、質量分析用プレートを生成する工程；ならびに
Ｄ）測定されるべき糖鎖の分析を実行する工程、
を包含する、方法が実行される、
装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖分析のための装置に関する。本発明は、疾患の診断等に応用することができる。特に、本発明は糖鎖自動前処理装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖を定量的に解析するための前処理法（特許文献１；非特許文献１。糖鎖を迅速に分析するため、糖タンパク質より遊離した糖鎖のみを選択的に捕捉ビーズに固定化し、洗浄することで高感度かつ迅速に糖鎖を検出する方法が報告されている（非特許文献２）。しかし、一時に大量の血清サンプルなどのサンプルを自動的に糖鎖分析する装置またはそのための前処理装置は知られていない。【０００３】
また、従来技術においては、血液（血清）などの体液及び細胞・組織抽出液の生体由来混合物中に含まれる糖鎖の精製は、次の工程に従って行われている。【０００４】
イ．試料中の糖蛋白質を可溶物存在下で還元アルキル化する。【０００５】
ロ．蛋白質分解酵素を加え、蛋白質部分を酵素で消化した後加熱して酵素を失活させる。【０００６】
ハ．糖鎖をペプチドから遊離させる酵素処理或いは化学処理を行い、糖鎖を遊離させる。【０００７】
ニ．糖鎖を捕捉する官能基を表出したポリマービーズに上記ハ．の処理を終えた試料を接触させ、遊離した糖鎖をポリマービーズの官能基に捕捉させる。【０００８】
ホ．洗浄濾過してポリマービーズの官能基に捕捉されない不純物を除去する。【０００９】
ヘ．ポリマービーズの官能基に捕捉された糖鎖のシアル酸残基のカルボン酸をメチルエステル化して保護する。【００１０】
ト．ポリマービーズの官能基に捕捉された糖鎖をヒドラゾン結合を還元してポリマービーズとの結合を安定化させる。【００１１】
チ．ビーズ上の糖鎖捕捉分子に含まれるジスルフィド結合を切断するか、又はアミノオキシ含有化合物を分注し、ヒドラゾン−オキシム交換反応により糖鎖をポリマービーズから遊離させる。後者の場合、上記トの処理は施さない。【００１２】
リ．遊離した糖鎖を濾液中に回収する。【００１３】
ヌ．糖鎖含有濾液にＭＡＬＤＩマトリックスを加えた後、ＭＡＬＤＩプレートに滴下する。
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８６８７号パンフレット
【非特許文献１】Mol. Cell.Proteomics. 2007;6:1437-45. Quantitative glycomics of human whole serumglycoproteins based on the standardized protocol for liberating N-glycans. KitaY，Miura Y，Furukawa J，Nakano M，Shinohara Y，Ohno M，Takimoto A，Nishimura S
【非特許文献２】Chem. Euro. J. 2007;13:4797-804. Rapid and simple solid-phase esterification of sialic acid residuesfor quantitative glycomics by mass spectrometry. Miura Y，Shinohara Y，Furukawa J，NagahoriN，Nishimura S.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、従来斯かる工程の実施は、その殆どが人手によって行われていたから、多大な時間と労力を要し、且つまた高精度の精製を行うことは困難であった。【００１５】
本発明は上記の点に鑑みなされたものであって、処理工程を自動化することにより、高速且つ高精度で精製を行うことができるようになした糖鎖自動前処理装置を提供しようとするものである。【００１６】
すなわち、本発明は、血清サンプル中に含まれる糖鎖を分析するための自動分析装置を提供することを目的とする。これにより、大量のサンプルを同時に自動的に解析することが可能とすることを目的とする。糖タンパク質より定量的に糖鎖を遊離するには可溶化剤を始め、還元アルキル化さらにはトリプシン消化など、煩雑な前処理が必要である。また定量的に遊離した糖鎖はケモセレクティブな捕捉を行うことで、煩雑な侠雑物を容易に除去し迅速な糖鎖の分析を行うことが可能だが、多検体のサンプルを一度に処理することは困難である。上記各工程をオプティマイズし、自動分析に適応可能なシステムを構築することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、血清サンプルをアプライすれば、自動的に質量分析用サンプルを調製することができる装置を見出した。その後、質量分析を行うことにより、糖鎖自動分析が可能となった。前処理から糖鎖捕捉・シアル酸修飾から遊離まですべての工程を行うことが可能な装置を開発することができた。【００１８】
本発明は、以下を提供する。
（１）試料中の糖鎖を分析する方法であって、以下の工程：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって、以下の工程：
Ａ−１）試料を反応用プレートに提供する工程；
Ａ−２）可溶化剤を上記試料に加えて、上記試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−３）還元剤を上記試料に加えて、上記試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−４）−ＳＨ保護剤を上記試料に加えて、上記試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−５）タンパク質分解酵素を上記試料に加えて、反応条件下に置く工程；
Ａ−６）上記タンパク質分解酵素を失活させる工程；および
Ａ−７）糖鎖遊離酵素を上記試料に加えて、糖鎖を遊離させる工程、
を含む、糖鎖遊離工程
Ｂ）遊離した上記糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程であって、以下の工程：
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した試料を、糖鎖捕捉ビーズと接触させて、上記試料中の遊離糖鎖と上記ビーズとが結合する条件下に置いて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）タンパク質変性剤を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程；
Ｂ−３）上記捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）ビーズ上の糖鎖捕捉剤の塩遊離剤を上記捕捉糖鎖試料に加えて、その後上記塩遊離剤を吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）保護化剤を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程
Ｂ−６）酸を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）反応有機溶媒を上記捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）上記ビーズの水分および溶媒を除去する工程；
Ｂ−９）アルキルエステル化剤を上記捕捉糖鎖試料に加え、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、シアル酸のカルボン酸をアルキル化する工程；
Ｂ−１０）上記反応有機溶媒を上記捕捉糖鎖試料に加え、上記反応有機溶媒を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）上記捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）上記捕捉糖鎖試料から、糖鎖試料を遊離させる工程であって、ここで、タグ化が必要な分析をする場合、上記捕捉糖鎖試料中の糖鎖を標識試薬によりタグ化し，ビーズより遊離させる工程；
Ｂ−１３）遊離された上記糖鎖試料を溶解して糖鎖試料溶液を生成する工程；
を包含する、検出試料調製工程；
Ｃ）プレートによる質量分析を行う場合、上記捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程であって；
Ｃ−１）Ｂ）工程で得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；ならびに、必要に応じてＣ−２〜Ｃ−６工程を行い
Ｃ−２）有機溶媒を糖鎖が固相に吸着する濃度になるように、上記回収用プレートから上記タグ化糖鎖試料溶液および上記有機溶媒を混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）上記固相担体封入プレートの相に応じて上記固相担体封入プレートを活性化し洗浄する工程；
Ｃ−５）上記固相担体封入プレートに上記タグ化糖鎖試料溶液を加え、上記固相担体封入プレートの相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる工程；
Ｃ−６）上記固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに上記タグ化糖鎖試料溶液を吸引回収する工程；
上記タグ化糖鎖試料溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに供する場合以下のＣ−７）を行い、
Ｃ−７）上記タグ化糖鎖試料溶液を質量分析用マトリクスと混合し測定用プレートに点着させる工程；
を包含する、質量分析用プレートを生成する工程；ならびに  
Ｄ）測定されるべき糖鎖の分析を実行する工程、
を包含する、方法。
（２）項１に記載の方法あって、上記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらにを特徴とする方法：
上記Ａ）試料中の糖鎖を遊離させて分析用糖鎖試料を調製する糖鎖遊離工程において：
Ａ−１）上記試料は、体液、細胞抽出液または組織抽出液である；
上記Ａ−２）において、上記可溶化剤は１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）、１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）、ラウリン酸２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル（ＨＳＤ）またはその等価物であり
上記反応条件は、２５℃〜４２℃である；
Ａ−３）上記還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド溶液  ０．５  Ｍ）、または等価物であり、
上記反応条件は、室温〜８０℃である；
Ａ−４）上記−ＳＨ保護剤は、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）または等価物であり、
上記反応条件は、暗所にて２０〜３７℃である；
Ａ−５）上記タンパク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、または等価物であり、
上記反応条件は、２５〜４２℃である；
Ａ−６）上記失活の条件は、６５℃以上に加熱することを含み、
Ａ−７）上記糖鎖遊離酵素は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ，ペプチド−Ｎ４−（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、Ｅｎｄｏ  Ｈまたは等価物であり、
上記糖鎖遊離酵素の反応条件は、２５℃〜４２℃であり、
上記Ｂ工程において、
Ｂ−１）において
上記ビーズは、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含む糖鎖捕捉基が結合したビーズまたは磁性ビーズであり、
上記試料中の遊離糖鎖と上記ビーズとが結合する条件は、２５〜８０℃である
Ｂ−２）上記変性剤は、塩酸グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムまたは等価物であり、
上記反応条件は、室温に加え，ビーズを十分に膨潤させる保温を行う（１０秒から５分）ものであり；
Ｂ−３）上記洗浄は、水を用い；
Ｂ−４）上記ビーズ上の糖鎖捕捉剤は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体であり、上記塩遊離剤は、ヒドラジドの場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり、Ｎ−アルキルアミノオキシ基の場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり；
Ｂ−５）
上記保護化剤は、無水酢酸、無水コハク酸、他の酸無水物または等価物であり、
上記反応条件は、無水酢酸／メタノール  １５〜３７℃であり
Ｂ−６）上記酸は、塩酸、または他の無機塩酸、あるいは等価物のｐＨ２〜３の酸であり、
Ｂ−７）上記反応有機溶媒への置換の前に、親水性有機溶媒に置換する工程を含み、上記親水性有機溶媒は、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトニトリルまたはアセトンであり、上記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物である、
Ｂ−８）上記ビーズの水分および溶媒を除去する工程は、濾紙、吸い取り紙、ガーゼ、タオル、手ぬぐい、テイッシュペーパーまたは綿つきシートでの底拭きを含む；
Ｂ−９）上記アルキルエステル化剤は、メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）、エチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＥＴＴ）、ブチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＢＴＴ）または等価物であり、
上記反応条件は、１００  ｍＭ  ＭＴＴ／ジオキサン、２０〜８０°Ｃ、３０分〜５時間（たとえば、６０分）であり；
Ｂ−１０）上記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物である；
Ｂ−１１）上記洗浄は、メタノール、ＮａＣｌ溶液および水からなる群より選択される少なくとも１つを用い；
Ｂ−１２）上記タグ化が行われ、上記タグ化は、紫外・可視光を吸収する発色団、蛍光を発する構造を有するタグ、他分子と相互作用しうる分子（Ｈｉｓ  ｔａｇ、ビオチンなど）を有するアフィニティータグ、官能基と特異的に反応する官能基（光反応性分子（架橋用）、アジド基、ＳＨ基、アミノ基、カルボン酸など）を有するタグ、疎水性構造に官能基を有するタグまたは金属イオン配位子を有するタグを用いて行われ、上記タグ化は、酢酸、アセトニトリル、酢酸緩衝液、または等価物を加えて行われる；
Ｂ−１３）上記タグ化された捕捉糖鎖試料の溶解は、水、水溶液または等価物によって行われる；
Ｃ）上記捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程であって；
Ｃ−１）上記回収用プレートへの配置は、タグ化のための試薬を取り除く条件で行われる；
Ｃ−２）上記糖鎖が固相に吸着する濃度は、８０〜９０％の有機溶媒であり；
Ｃ−３）上記固相担体封入プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含み；
Ｃ−４）上記固相担体封入プレートの相が順相の場合、水、およびアセトニトリルで順次洗浄し、上記固相担体封入プレートの相が逆相の場合、メタノール等低級アルコール、水で順次洗浄する；
Ｃ−５）上記反対の極性を有する溶媒は、順相の場合、疎水性有機溶媒であり、逆相の場合、親水性溶媒である；
Ｃ−６）上記第２の回収用プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含み；
Ｃ−７）上記質量分析用マトリクスは、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、もしくはイオン性液体マトリクスまたは等価物であり、上記質量分析用マトリクスへの上記タグ化糖鎖試料溶液の点着は、混合または順次行われ、必要に応じて希釈される；
Ｄ）上記測定されるべき糖鎖の分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化  質量分析（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  −Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）または等価物であり、上記タグ化に発色試薬またはビオチンを用いる場合、必要に応じて過剰の発色試薬を除く工程を行い；
上記ビーズが磁性ビーズである場合、上記磁性ビーズは、修飾可能な官能基あるいはヒドラジド基，アミノオキシ基を有するビーズである、
を包含する、方法。
（３）項１に記載の方法であって、以下のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって、以下の工程：
Ａ−１）試料である血清をフィルタープレートに提供する工程；
Ａ−２）１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）または１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）／重炭酸アンモニアを上記試料に加えて、２５〜４２（たとえば、３７）℃で５〜６０（たとえば、１０）分間反応させる工程；
Ａ−３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を上記試料に加えて、５０〜８０（たとえば、６０）℃で１０〜６０（たとえば、３０）分間反応させ、その後室温に冷却する工程；
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を上記試料に加えて、室温、暗所にて０．５〜２（たとえば、１）時間反応させる工程；
Ａ−５）トリプシンを上記試料に加えて、２５〜４２（たとえば、３７）℃で３０〜１２０（たとえば、６０）分間反応させる工程；
Ａ−６）上記試料を１〜１０（たとえば、５）分間８０〜１００（たとえば、９０）℃に加熱し、その後室温に冷却する工程；
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦを加えて、２５〜４２（たとえば、３７）℃で６〜２４（たとえば、１２）時間反応させる工程；
Ｂ）遊離した上記糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程であって、以下の工程：
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した捕捉糖鎖試料を、糖鎖捕捉のためのビーズと接触させて、４０〜（たとえば、）８０℃にて結合させて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）塩酸グアニジンを上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、その後反応液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−３）上記捕捉糖鎖試料を水で洗浄して、その後上記水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）上記捕捉糖鎖試料をトリエチルアミンで洗浄して、その後上記トリエチルアミンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）無水酢酸を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記捕捉糖鎖試料をたとえば、１０％無水酢酸／メタノール、温で１０分〜２時間（たとえば、３０）分という反応条件下に置き、その後上記無水酢酸を吸引廃棄する工程
Ｂ−６）塩酸を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記塩酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）メタノールを上記捕捉糖鎖試料に加え、上記メタノールを吸引廃棄後ジオキサンを上記捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）綿つきシートにおいて底拭きをする工程；
Ｂ−９）メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）を上記捕捉糖鎖試料に加えて、６０〜（たとえば、８０）℃で３０〜１２０（たとえば、６０）分間反応させる工程；
Ｂ−１０）ジオキサンを上記捕捉糖鎖試料に加え、上記ジオキサンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）上記捕捉糖鎖試料をメタノールで洗浄し該メタノールを吸引廃棄し、ＮａＣｌ溶液で洗浄し該ＮａＣｌ溶液を吸引廃棄し、および水で順次洗浄して、その後上記水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）酢酸およびアセトニトリルを上記捕捉糖鎖試料に加え、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水を用いて上記捕捉糖鎖試料中の糖鎖をタグ化する工程；
Ｂ−１３）タグ化された上記捕捉糖鎖試料に水を加えてタグ化糖鎖試料溶液を生成する工程；
を包含する、検出試料調製工程；
Ｃ）上記タグ化捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程であって；
Ｃ−１）Ｂ）工程で得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；
Ｃ−２）アセトニトリルを最終濃度８０〜９０％になるように、上記回収用プレートから上記タグ化糖鎖試料溶液およびアセトニトリルを混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）順相である上記固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）上記固相担体封入プレートを水、およびアセトニトリルで順次洗浄および吸引廃棄する工程；
Ｃ−５）上記固相担体封入プレートに上記タグ化糖鎖試料溶液を加え、液体を廃棄し、アセトニトリルで洗浄し、さらに１〜２０（たとえば、５）％アセトニトリルを加える工程；
Ｃ−６）上記固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに上記ビーズを吸引回収する工程；
Ｃ−７）上記タグ化糖鎖試料溶液に２０〜４０（たとえば、３０）％アセトニトリル中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸を加え混合点着させる工程、
を包含する、質量分析用プレートを生成する工程；ならびに  
Ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより質量を分析する工程、
を包含する、方法。
（４）  上記糖鎖捕捉ビーズは、磁性ビーズであり、上記吸引廃棄に代えて磁場による分離が行われる、項３に記載の方法。
（５）試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製する方法であって、以下の工程：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって、以下の工程：
Ａ−１）試料を反応用プレートに提供する工程；
Ａ−２）可溶化剤を上記試料に加えて、上記試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−３）還元剤を上記試料に加えて、上記試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−４）−ＳＨ保護剤を上記試料に加えて、上記試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−５）タンパク質分解酵素を上記試料に加えて、反応条件下に置く工程；
Ａ−６）上記タンパク質分解酵素を失活させる工程；および
Ａ−７）糖鎖遊離酵素を上記試料に加えて、糖鎖を遊離させる工程、
を含む、糖鎖遊離工程、ならびに
Ｂ）遊離した上記糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程であって、以下の工程：
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した試料を、ビーズと接触させて、上記試料中の遊離糖鎖と上記ビーズとが結合する条件下に置いて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）タンパク質変性剤を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程；
Ｂ−３）上記捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）ビーズ上の糖鎖捕捉剤の塩遊離剤を上記捕捉糖鎖試料に加えて、その後上記塩遊離剤を吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）保護化剤を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程
Ｂ−６）酸を上記捕捉糖鎖試料に加えて、上記酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）反応有機溶媒を上記捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）上記ビーズの水分および溶媒を除去する工程；
Ｂ−９）アルキルエステル化剤を上記捕捉糖鎖試料に加え、上記捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、シアル酸のカルボン酸をアルキル化する工程；
Ｂ−１０）上記反応有機溶媒を上記捕捉糖鎖試料に加え、上記反応有機溶媒を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）上記捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）上記捕捉糖鎖試料から、糖鎖試料を遊離させる工程であって、ここで、タグ化が必要な分析をする場合、上記捕捉糖鎖試料中の糖鎖を標識試薬によりタグ化し，ビーズより遊離させる工程；
Ｂ−１３）遊離された上記糖鎖試料を溶解して糖鎖試料溶液を生成する工程；
を包含する、検出試料調製工程、
を包含する、方法。
（６）項２、３または４に記載の特徴を有する、項５に記載の方法。
（７）糖鎖分析装置であって、以下の手段：
１）プレート配置台であって、必要に応じて加熱可能および／または移動可能である、配置台；
２）保存すべき温度に調製される１または複数の試薬格納部分であって、上記試薬格納部分は、ラックまたはバルブに連結された格納庫であり、上記試薬格納部分には、可溶化剤；還元剤；−ＳＨ保護剤；タンパク質分解酵素；糖鎖遊離酵素；糖鎖捕捉ビーズ；タンパク質変性剤；洗浄液；糖鎖捕捉剤の塩遊離剤；保護化剤；酸；反応有機溶媒；アルキルエステル化剤；タグ化薬剤；タグ化糖鎖試料用の溶媒；固相に吸着するための有機溶媒；馴化のための溶媒；質量分析用マトリクスからなる群より選択される１または数個の試薬が格納される、試薬格納部分
３）上記試薬格納部分から、各々の試薬を分注するためのノズルおよび／またはバルブ
４）プレート移動手段；
５）必要に応じて吸引廃棄手段または磁場発生手段；
６）必要に応じて振とう／攪拌手段；
７）プレート格納部分；
８）質量を分析する手段；
を備える、装置。
（８）項２〜４のいずれか１項に記載の特徴を有する、項７に記載の装置。
（９）糖鎖分析のための前処理装置であって、以下の手段：
１）プレート配置台であって、必要に応じて加熱可能および／または移動可能である、配置台；
２）保存すべき温度に調製される１または複数の試薬格納部分であって、上記試薬格納部分は、ラックまたはバルブに連結された格納庫であり、上記試薬格納部分には、可溶化剤；還元剤；−ＳＨ保護剤；タンパク質分解酵素；糖鎖遊離酵素；糖鎖捕捉ビーズ；タンパク質変性剤；洗浄液；糖鎖捕捉剤の塩遊離剤；保護化剤；酸；反応有機溶媒；アルキルエステル化剤；タグ化薬剤；タグ化糖鎖試料用の溶媒；固相に吸着するための有機溶媒；馴化のための溶媒；質量分析用マトリクスからなる群より選択される１または数個の試薬が格納される、試薬格納部分
３）上記試薬格納部分から、各々の試薬を分注するためのノズルおよび／またはバルブ
４）プレート移動手段；
５）必要に応じて吸引廃棄手段または磁場発生手段；
６）必要に応じて振とう／攪拌手段；および
７）プレート格納部分；
を備える、装置。
（１０）項２〜４のいずれか１項に記載の特徴を有する、項９に記載の装置。【００１９】
あるいは、本発明は、装置（９）に関連して以下を提供する。
（１１）  開閉自在のカバーを設けた筐体ベースと、前記筐体ベース内に設けられ、後記分注ヘッドを前後、左右方向に移動させる分注ヘッド移動機構と、
一列に並んで保持された複数の分注針を昇降機構によって一斉に上下させる分注ヘッドと、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した、マイクロプレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を中蓋を有する蓋体で覆うようになした第１恒温槽と、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した試薬ラック及び複数の混合用マイクロプレートと、
前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧し、フィルタープレートのフィルターを通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第１減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧吸引し、フィルターを通過した液を廃棄する第１吸引廃棄装置、フィルタープレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を自動的に開閉する蓋体で覆うようになした第２恒温槽と、
フィルタープレートを保持し、フィルタープレートを前記第１減圧回収装置、第１吸引廃棄装置、第２恒温槽の夫々に順次移動させるフィルタープレート移動機構と、  前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧し、ＳＰＥプレートの固相体を通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第２減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧吸引し、固相体を通過した液を廃棄する第２吸引廃棄装置、上面に最終処理工程を終了した試料を点着するターゲットプレートを載受するターゲットプレート受台と、
ＳＰＥプレートを保持し、前記第２減圧回収装置と第２吸引廃棄装置との間で移動させるＳＰＥプレート移動機構と、
前記筐体ベースに設置し、作業工程を入力した制御装置と、
複数のウエルがマトリックス配列され、生体試料を各ウエルに注入した状態においてシートで覆うマイクロプレートと、複数のフィルターがマトリックス配列されたフィルタープレートと、複数の固相体がマトリックス配列された微量の試料用のＳＰＥプレートとを備え、
前記制御装置に入力された作業工程により前記各装置を作動させるようになしたことを特徴とする糖鎖自動前処理装置。
（１２）  開閉自在のカバーを設けた筐体ベースと、前記筐体ベース内に設けられ、後記分注ヘッドを前後、左右方向に移動させる分注ヘッド移動機構と、
一列に並んで保持された複数の分注針を昇降機構によって一斉に上下させる分注ヘッドと、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した、マイクロプレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を中蓋を有する蓋体で覆うようになした第１恒温槽と、
前記筐体ベースの設置スペース上に配設した試薬ラック及び複数の混合用マイクロプレートと、
前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧し、フィルタープレートのフィルターを通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第１減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧吸引し、フィルターを通過した液を廃棄する第１吸引廃棄装置、平面状の払拭材を上面に設け、フィルタープレートの底部下面に付着している液を払拭するための底拭き、フィルタープレートを載受する受台の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台の上部を自動的に開閉する蓋体で覆うようになした第２恒温槽と、
フィルタープレートを保持し、フィルタープレートを前記第１減圧回収装置、第１吸引廃棄装置、底拭き、第２恒温槽の夫々に順次移動させるフィルタープレート移動機構と、  前記筐体ベースの設置スペース上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧し、ＳＰＥプレートの固相体を通過した液を内部に設置したマイクロプレート中に受ける第２減圧回収装置、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧吸引し、固相体を通過した液を廃棄する第２吸引廃棄装置、上面に最終処理工程を終了した試料を点着するターゲットプレートを載受するターゲットプレート受台と、
ＳＰＥプレートを保持し、前記第２減圧回収装置と第２吸引廃棄装置との間で移動させるＳＰＥプレート移動機構と、
前記筐体ベースに設置し、作業工程を入力した制御装置と、
複数のウエルがマトリックス配列され、生体試料を各ウエルに注入した状態においてシートで覆うマイクロプレートと、複数のフィルターがマトリックス配列されたフィルタープレートと、複数の固相体がマトリックス配列された微量の試料用のＳＰＥプレートとを備え、
前記制御装置に入力された作業工程により前記各装置を作動させるようになしたことを特徴とする糖鎖自動前処理装置。
（１３）  前記分注ヘッドが、支承枠と、該支承枠に分注針と平行に設けたガイド杆に沿って上下方向に摺動する昇降台と、前記支承枠に固定した駆動モータと、該駆動モータの回転軸に接続したボールネジをもって前記昇降台を上下方向に移動させる昇降台移動機構と、前記昇降台に設けた分注針ホルダーに保持された分注針とをもって構成された分注ヘッドである項１又は２記載の糖鎖自動前処理装置。
（１４）  前記分注ヘッドにおける支承枠の下部に垂直に下向きにシリンダーを固定すると共に該シリンダーのピストンロッドの先端に加圧プレートを固着してなる項１３記載の糖鎖自動前処理装置。
（１５）  前記第１恒温槽が、アルミブロックからなる受台の内部中央にカートリッジヒータを内蔵すると共に該受台の下部にペルチェ及びヒートシンクを配置して本体部を構成し、該本体部における受台の上部を、内側に、シリコンシートを貼設し、内部中央にカートリッジヒータを内蔵した中蓋をスプリングを介して弾性的に支持してなる蓋体で覆うようになした第１恒温槽である項１１、１２、１３又は１４記載の糖鎖自動前処理装置。
（１６）  前記フィルタープレート移動機構及びＳＰＥプレート移動機構が、前記筐体ベースに前後方向に沿って立設した支承板の長さ方向の両端部にプーリを取付けると共に、該プーリの一方をステッピングモータをもって回転駆動させるようになし、該両プーリ間に掛け回したベルトに水平移動板を連結し、該水平移動板上に上下移動ユニットを設け、該上下移動ユニットを、上端部に中枠を受ける受枠を水平に支持し、支承枠内に垂直に設けたガイドに沿って上下方向に摺動する垂直移動杆と、支承枠内に固定したモータの回転軸に連結したボールネジをもって昇降し、前記垂直移動杆に接続した昇降作動杆とをもって構成してなる移動機構である項１１、１２、１３、１４又は１５記載の糖鎖自動前処理装置。
（１７）  前記第２恒温槽が、アルミブロックからなる受台の内部中央にカートリッジヒータを内蔵すると共に内部中央から上面にかけて空気の循環路を設け、該受台の下部にペルチェ及びヒートシンクを配置して本体部を構成し、該本体部における受台の上部とこれに載置するフィルタープレートとの間に前記空気の循環路に連通する空気の循環路を設け、更にダクト及びファンを設けて前記フィルタープレートの外に流出した空気を再び受台内に流入させて循環させるようになし、前記本体部における受台の上部を蓋体で覆うようになした第２恒温槽である項１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載の糖鎖自動前処理装置。
（Ａ１）
試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離方法であって、以下の工程：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって、以下の工程：
Ａ−１）試料を反応用プレートに提供する工程；
Ａ−２）可溶化剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−３）還元剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−４）−ＳＨ保護剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−５）タンパク質分解酵素を該試料に加えて、反応条件下に置く工程；
Ａ−６）該タンパク質分解酵素を失活させる工程；および
Ａ−７）糖鎖遊離酵素を該試料に加えて、糖鎖を遊離させる工程、
を含む、方法。
（Ａ２）
項Ａ１に記載の方法あって、前記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらに特徴とする方法：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させて分析用糖鎖試料を調製する糖鎖遊離工程において：
Ａ−１）前記試料は、体液、細胞抽出液または組織抽出液である；
Ａ−２）において、前記可溶化剤は１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）、１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）、ラウリン酸２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル（ＨＳＤ）またはその等価物であり
前記反応条件は、２５℃〜４２℃である；
Ａ−３）前記還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド溶液  ０．５  Ｍ）、または等価物であり、
前記反応条件は、室温〜８０℃である；
Ａ−４）前記−ＳＨ保護剤は、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）または等価物であり、
前記反応条件は、暗所にて２０〜３７℃である；
Ａ−５）前記タンパク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、または等価物であり、
前記反応条件は、２５〜４２℃である；
Ａ−６）前記失活の条件は、６５℃以上に加熱することを含み、
Ａ−７）前記糖鎖遊離酵素は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ，ペプチド−Ｎ４−（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、Ｅｎｄｏ  Ｈまたは等価物であり、
前記糖鎖遊離酵素の反応条件は、２５℃〜４２℃である。
（Ａ３）
項Ａ１またはＡ２に記載の方法であって、以下の工程のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする方法：
Ａ−１）試料である血清をフィルタープレートに提供する工程；
Ａ−２）１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）または１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）／重炭酸アンモニアを該試料に加えて、２５〜４２℃で５〜６０分間反応させる工程；
Ａ−３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を該試料に加えて、５０〜８０℃で１０〜６０分間反応させ、その後室温に冷却する工程；
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を該試料に加えて、室温、暗所にて０．５〜２時間反応させる工程；
Ａ−５）トリプシンを該試料に加えて、２５〜４２℃で３０〜１２０分間反応させる工程；
Ａ−６）該試料を１〜１０分間、８０〜１００℃に加熱し、その後室温に冷却する工程；
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦを加えて、２５〜４２℃で６〜２４時間反応させる工程。
（Ａ４）
試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製するために使用される、項Ａ１〜Ａ３のいずれか１項に記載の方法。
（Ｂ１）
遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製方法であって、以下の工程：
Ｂ−１）試料を、糖鎖捕捉ビーズと接触させて、該試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件下に置いて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）タンパク質変性剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程；
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）ビーズ上の糖鎖捕捉剤の塩遊離剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、その後該塩遊離剤を吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）保護化剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程
Ｂ−６）酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）反応有機溶媒を該捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）該ビーズの水分および溶媒を除去する工程；
Ｂ−９）アルキルエステル化剤を該捕捉糖鎖試料に加え、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、シアル酸のカルボン酸をアルキル化する工程；
Ｂ−１０）該反応有機溶媒を該捕捉糖鎖試料に加え、該反応有機溶媒を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）該捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）該捕捉糖鎖試料から、糖鎖試料を遊離させる工程であって、ここで、タグ化が必要な分析をする場合、該捕捉糖鎖試料中の糖鎖を標識試薬によりタグ化し，ビーズより遊離させる工程；
Ｂ−１３）遊離された該糖鎖試料を溶解して糖鎖試料溶液を生成する工程；
を包含する、方法。
（Ｂ２）
項Ｂ１に記載の方法あって、前記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらに特徴とする方法：
Ｂ−１）において
前記ビーズは、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含む糖鎖捕捉基が結合したビーズまたは磁性ビーズであり、
前記試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件は、２５〜８０℃である
Ｂ−２）前記変性剤は、塩酸グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムまたは等価物であり、
前記反応条件は、室温に加え，ビーズを十分に膨潤させる保温を行う（１０秒から５分）ものであり；
Ｂ−３）前記洗浄は、水を用い；
Ｂ−４）前記ビーズ上の糖鎖捕捉剤は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体であり、前記塩遊離剤は、ヒドラジドの場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり、Ｎ−アルキルアミノオキシ基の場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり；
Ｂ−５）
前記保護化剤は、無水酢酸、無水コハク酸、他の酸無水物または等価物であり、
前記反応条件は、無水酢酸／メタノール  １５〜３７℃でであり
Ｂ−６）前記酸は、塩酸、または他の無機塩酸、あるいは等価物のｐＨ２〜３の酸であり、
Ｂ−７）前記反応有機溶媒への置換の前に、親水性有機溶媒に置換する工程を含み、該親水性有機溶媒は、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトニトリルまたはアセトンであり、前記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物である、
Ｂ−８）該ビーズの水分および溶媒を除去する工程は、濾紙、吸い取り紙、ガーゼ、タオル、手ぬぐい、テイッシュペーパーまたは綿つきシートでの底拭きを含む；
Ｂ−９）前記アルキルエステル化剤は、メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）、エチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＥＴＴ）、ブチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＢＴＴ）または等価物であり、
前記反応条件は、１００  ｍＭ  ＭＴＴ／ジオキサン，２０〜８０°Ｃ、３０分〜５時間であり；
Ｂ−１０）前記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物である；
Ｂ−１１）前記洗浄は、メタノール、ＮａＣｌ溶液および水からなる群より選択される少なくとも１つを用い；
Ｂ−１２）前記タグ化が行われ、前記タグ化は、紫外・可視光を吸収する発色団、蛍光を発する構造を有するタグ、他分子と相互作用しうる分子を有するアフィニティータグ、官能基と特異的に反応する官能基を有するタグ、疎水性構造に官能基を有するタグまたは金属イオン配位子を有するタグを用いて行われ、該タグ化は、酢酸、アセトニトリル、酢酸緩衝液、または等価物を加えて行われる；
Ｂ−１３）前記タグ化された捕捉糖鎖試料の溶解は、水、水溶液または等価物によって行われる。
（Ｂ３）
項Ｂ１またはＢ２に記載の方法であって、以下の工程のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする方法：
Ｂ−１）捕捉糖鎖試料を、糖鎖捕捉のためのビーズと接触させて、４０〜８０℃にて結合させて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）塩酸グアニジンを該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、その後反応液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を水で洗浄して、その後該水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）該捕捉糖鎖試料をトリエチルアミンで洗浄して、その後該トリエチルアミンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）無水酢酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を１０％無水酢酸／メタノール  室温で１０分〜２時間分という反応条件下に置き、その後該無水酢酸を吸引廃棄する工程
Ｂ−６）塩酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該塩酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）メタノールを該捕捉糖鎖試料に加え、該メタノールを吸引廃棄後ジオキサンを該捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）綿つきシートにおいて底拭きをする工程；
Ｂ−９）メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）を該捕捉糖鎖試料に加えて、６０〜℃で３０〜１２０（６０）分間反応させる工程；
Ｂ−１０）ジオキサンを該捕捉糖鎖試料に加え、該ジオキサンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）該捕捉糖鎖試料をメタノール、ＮａＣｌ溶液、水で順次洗浄して、その後該水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）酢酸およびアセトニトリルを該捕捉糖鎖試料に加え、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水を用いて該捕捉糖鎖試料中の糖鎖をタグ化する工程；
Ｂ−１３）タグ化された該捕捉糖鎖試料に水を加えてタグ化糖鎖試料溶液を生成する工程。
（Ｂ４）
前記糖鎖捕捉ビーズは、磁性ビーズであり、前記吸引廃棄に代えて磁場による分離が行われる、項Ｂ３に記載の方法。
（Ｂ５）
試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製するために使用される、Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１項に記載の方法。【００２０】
（Ｃ１）
プレートによる質量分析において、該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する方法であって以下；
Ｃ−１）タグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；ならびに、必要に応じてＣ−２〜Ｃ−６工程を行い
Ｃ−２）有機溶媒を糖鎖が固相に吸着する濃度になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液および該有機溶媒を混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相に応じて該固相担体封入プレートを活性化し洗浄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、該固相担体封入プレートの相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を吸引回収する工程；
該タグ化糖鎖試料溶液をMALDI-TOF MSに供する場合以下のＣ−７）を行い、
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液を質量分析用マトリクスと混合し測定用プレートに点着させる工程；
を包含する、方法。
（Ｃ２）
項Ｃ１に記載の方法あって、前記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらに特徴とする方法：
Ｃ−１）前記回収用プレートへの配置は、タグ化のための試薬を取り除く条件で行われる；
Ｃ−２）前記糖鎖が固相に吸着する濃度は、８０〜９０％の有機溶媒であり；
Ｃ−３）前記固相担体封入プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含み；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相が順相の場合、水、およびアセトニトリルで順次洗浄し、該固相担体封入プレートの相が逆相の場合、メタノール等低級アルコール、水で順次洗浄する；
Ｃ−５）前記反対の極性を有する溶媒は、順相の場合、疎水性有機溶媒であり、逆相の場合、親水性溶媒である；
Ｃ−６）前記第２の回収用プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含み；
Ｃ−７）前記質量分析用マトリクスは、２，５−ジヒドロキシ安息香酸または等価物であり、該質量分析用マトリクスへの前記タグ化糖鎖試料溶液の点着は、混合または順次行われ、必要に応じて希釈される、方法。
（３）
項Ｃ１またはＣ２に記載の方法であって、以下の工程のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする方法：
Ｃ−１）タグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；
Ｃ−２）アセトニトリルを最終濃度８０〜９０％になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液およびアセトニトリルを混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）順相である該固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートを水、およびアセトニトリルで順次洗浄および吸引廃棄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、液体を廃棄し、アセトニトリルで洗浄し、さらに１〜２０％アセトニトリルを加える工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該ビーズを吸引回収する工程；
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液に２０〜４０％アセトニトリル中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸を加え混合点着させる工程、
を包含する、質量分析用プレートを生成する工程。
（Ｃ４）
前記糖鎖捕捉ビーズは、磁性ビーズであり、前記吸引廃棄に代えて磁場による分離が行われる、項Ｃ３に記載の方法。
（Ｃ５）
試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製する方法に使用される、Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１項に記載の方法。
（１８）試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する反応用プレートの作製キットであって、
Ａ−１）該試料：
Ａ−２）１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）または１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）／重炭酸アンモニア；
Ａ−３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）；
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）；
Ａ−５）トリプシン；
Ａ−６）加熱手段
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦ
Ｂ−１）糖鎖捕捉ビーズ；
Ｂ−２）塩酸グアニジン；
Ｂ−３）水；
Ｂ−４）トリエチルアミン；
Ｂ−５）１０％無水酢酸／メタノール；
Ｂ−６）塩酸；
Ｂ−７）メタノール；
Ｂ−８）綿つきシート；
Ｂ−９）メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）；
Ｂ−１０）ジオキサン；
Ｂ−１１）メタノール、ＮａＣｌ溶液および水；
Ｂ−１２）酢酸およびアセトニトリル、ならびにアミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水；
Ｂ−１３）水；
Ｃ−１）回収用プレート
Ｃ−２）アセトニトリルおよび混合用プレート
Ｃ−３）固相担体封入プレート
Ｃ−４）水、およびアセトニトリル
Ｃ−５）アセトニトリルおよび１〜２０％アセトニトリル
Ｃ−６）第２の回収用プレート
Ｃ−７）２０〜４０％アセトニトリル中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸
を備える、キット。
（１８Ａ）（１）〜（５）の任意の操作を実現するための手段を備える、試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する反応用プレートの作製キット。
（１９）試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する分析用プレートであって、該試料から遊離された糖鎖に結合された糖鎖捕捉ビーズが、該プレートの少なくとも１つの穴に点着され、該糖鎖は、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水等のタグ化試薬によってタグ化されたものである、分析用プレート。
（２０）試料中の糖鎖分析のためのプレートであって、該プレートは、少なくとも１つの分析用の区画を有し、該区画の少なくとも１つに糖鎖捕捉ビーズがあらかじめ分注されたものである、プレート。【００２１】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読めば、明白である。
【発明の効果】
【００２２】
そして、本発明により、血清サンプルなどのサンプル中に含まれる糖鎖を分析するための自動分析装置を提供することに成功した。これにより、大量のサンプルを同時に自動的に解析することが可能とした。糖タンパク質より定量的に糖鎖を遊離するには可溶化剤を始め、還元アルキル化さらにはトリプシン消化など、煩雑な前処理が自動化された。また定量的に遊離した糖鎖はケモセレクティブな捕捉を行うことで、煩雑な侠雑物を容易に除去し迅速な糖鎖の分析を行うことが可能だが、多検体のサンプルを一度に処理することを可能にした。上記各工程をオプティマイズし、自動分析に適応可能なシステムを構築した。【００２３】
本発明は、糖鎖精製の処理工程を自動化することができるものであるから、従来の人手による場合に比してはるかに能率的に行うことができ、高速且つ高精度で精製を行うことができるものである。【００２４】
本発明の装置により多検体分析が可能となることで、糖鎖バイオマーカー探索が期待され、さらには診断などへの利用、病気などへの早期診断への利用が考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００２６】
（用語の定義および基本的な技術の説明）
（糖鎖）
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトー ス、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。【００２７】
本明細書において「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中 に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。【００２８】
本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンならびにその誘導体をいう。通常単糖は、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表されるがそれらに限定されず、フコース（デオキシヘキソース）、Ｎ−アセチルグルコサミンなども含まれる。ここで、上の式において、ｎ＝２、３、４、 ５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース、後者をケトースという。【００２９】
本明細書において特に言及するときは、「単糖の誘導体」は、置換されていない単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質をいう。 そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体 （例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオ キシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。本明細書では、単糖という場合は、上記誘導体も包含する。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の範囲内にある。【００３０】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物体について言及するとき、その２つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワ−ルス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに 限定されない。好ましくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などである。本明細書において「共有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電子対が２つの原子に共有されて形成する化学結合をいう。本明細書において「水素結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電気的陰性度の高い原子に一つしかない水素原子の核外電子が引き寄せられて水素原子核が露出し、これが別の電気的陰性度の高い原子を引き寄せて生じる結合をいい、例え ば、水素原子と電気的陰性度の高い（フッ素、酸素、窒素などの）原子との間にできる。【００３１】
本明細書において「糖鎖または糖鎖含有物質の捕捉」とは、本発明において用いられる糖鎖捕捉ビーズを用いて糖鎖または糖鎖含有物質が捕捉されることをいう。本発明におけるビーズの糖鎖捕捉部位または糖鎖捕捉基は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含むことが好ましい。【００３２】
本明細書において「糖鎖捕捉担体」とは、糖鎖を捕捉するための担体をいう。本明細書において「糖鎖捕捉ビーズ」とは、糖鎖を捕捉するためのビーズをいう。そのような担体またはビーズは、糖鎖を捕捉する部分および担体またはビーズとして使用する部分を含む。糖鎖を捕捉する部分には、本発明の糖鎖と特異的に相互作用する物質を用いることができる。担体には、支持体を用いることもできるし、本発明の糖鎖と特異的に相互作用する物質そのものが担体としての働きを有していてもよく、前記一般式（Ｉ）における「Ｘ」を有する担体が挙げられる。ビーズとしては、任意のものが用いられ、好ましくは磁性ビーズが好ましい。磁性ビーズの例としては、Ｄｙｎａｂｅａｄから販売されるものが挙げられるがそれに限定されない。【００３３】
本明細書において、「捕捉糖鎖試料」とは、上記のような糖鎖捕捉担体または糖鎖捕捉ビーズによって捕捉された糖鎖試料（たとえば、糖鎖が結合したビーズ）をいう。【００３４】
具体的には、「Ｘ」、「Ｘ−Ｙ」、および「Ｘ−Ｙ−Ｚ」が支持体に結合した担体、ならびに一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）で表される化合物が重合した担体が挙げられる。一般的には、以下のような基を持つものが例示される。【００３５】
（糖鎖捕捉官能基）−（スペーサー）−（重合性官能基）        
ここで、糖鎖捕捉官能基は、例えば、糖鎖のアルデヒド基と流体中で反応し得る官能基とも記載することができ、図２に例示したような構造を有する。図２中のＲは、上で定義した置換基を意味するが、好ましくは、重合反応および糖鎖との相互作用に悪影響を与えないようなものが好ましい。より具体的には、本発明の糖鎖と特異的に相互作用し得る物質は、以下：
一般式（Ｉ）：Ｘ−Ｙ−Ｚ
で表すことができる化合物であり、式中のＸは式：【００３６】
【化１】
0005396277.tif 000002
【００３７】
（式中、Ｘ１は置換されていてもよいアルキレンまたは置換されていてもよいアルケニレンであり、Ｘ２は酸素原子または硫黄原子であり、Ｘ３は酸素原子または硫黄原子であり、Ｘ４はメチレンまたはエチレンであり、Ｒ１は水素原子またはアルキルであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素原子またはアルキルである）で表される基であり；Ｙ（Ｙの長さは、Ｃ０〜Ｃ２５に対応する）は、単結合；−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｂ）−、および置換されていてもよいフェニレンからなる群から選択される少なくとも１つの基が介在していてもよく、置換されていてもよいアルキレンであるか；または、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｂ）−、および置換されていてもよいフェニレンからなる群から選択される少なくとも１つの基が介在していてもよく、置換されていてもよいアルケニレンであり（式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して、水素原子またはアルキルである）；Ｚは、式：【００３８】
【化２】
0005396277.tif 000003
【００３９】
（式中、Ｚ１は酸素原子または硫黄原子であり、Ｚ２およびＺ３はそれぞれ独立してフェニレンが介在していてもよく、置換されていてもよいアルキレンまたはフェニレンが介在していてもよく、置換されていてもよいアルケニレンであり、Ｚ４は酸素原子または硫黄原子であり、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して水素原子またはアルキルである）で表される基である。本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物において、Ｘ１はＣ１〜Ｃ１０アルキレンまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであることが好ましく、Ｙの鎖長はＣ１〜Ｃ２５アルキルに相当する鎖長が好ましく、さらにＹの好ましい例として、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎ＝１〜８が好ましく、特にｎ＝１〜６が好ましい）が挙げられ、Ｚ２およびＺ３はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ１０アルキレンまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであることが好ましい。また、置換されていてもよいフェニレンの具体例として、以下：【００４０】
【化３】
0005396277.tif 000004
【００４１】
が挙げられる。好ましい実施形態において、上記一般式（Ｉ）の化合物を重合させて得られるポリマーが用いられる。このことにより、本発明の糖鎖と特異的に相互作用し得る物質から種々の膜を形成する際に、膜自体の強度および安定性が増大し、さらに基板などの支持体に固定化することができるとの効果が得られる。膜を支持体に固定化する場合には、一般式（Ｉ）で表される化合物のＺ部位を支持体上に物理吸着させて得られる単分子膜を重合させるという手法が好ましい。これによって、膜を固定化した支持体をそのまま本発明の糖鎖捕捉担体として使用することができる。また、上記重合は、熱重合であってもよいし、光重合であってもよいが、好ましくは、Ｚ部位内のジアセチレン基またはビニル基同士のラジカル重合をスムーズに進行させることができ、比較的簡便な操作で重合させることができるという利点を考慮して、ジアセチレン基またはビニル基の特性吸収波長の２５４ｎｍ付近の紫外線（ＵＶ）照射による光重合が採用される。また、上記一般式（Ｉ）における「Ｘ」と支持体とが直接結合した物質、「Ｘ−Ｙ」と支持体とが直接結合した物質も採用される。また、Ｘ１における「置換されていてもよいアルキレン」および「置換されていてもよいアルケニレン」の置換基としては、無置換が好ましい。Ｙにおける「置換されていてもよいアルキレン」および「置換されていてもよいアルケニレン」の置換基としては、無置換が好ましい。Ｚ２およびＺ３における「置換されていてもよいアルキレン」および「置換されていてもよいアルケニレン」の置換基としては、無置換が好ましい。【００４２】
別の好ましい実施形態では、本発明の糖鎖と特異的に相互作用し得る物質は、一般式（Ｉ）：Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｉ）
［式中、Ｘは式：【００４３】
【化４】
0005396277.tif 000005
【００４４】
（式中、Ｘ１は置換されていてもよいアルキレンまたは置換されていてもよいアルケニレンであり、Ｘ２は酸素原子または硫黄原子であり、Ｘ３は酸素原子または硫黄原子であり、Ｘ４はメチレンまたはエチレンであり、Ｒ１は水素原子またはアルキルであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素原子またはアルキルである）で表される基であり；Ｙ（Ｙの長さは、Ｃ０〜Ｃ２５に対応する）は、単結合；−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｂ）−、および置換されていてもよいフェニレンからなる群から選択される少なくとも１つの基が介在していてもよく、置換されていてもよいアルキレンであるか；または、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｂ）−、および置換されていてもよいフェニレンからなる群から選択される少なくとも１つの基が介在していてもよく、置換されていてもよいアルケニレンであり（式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して、水素原子またはアルキルである）；Ｚは、式：【００４５】
【化５】
0005396277.tif 000006
【００４６】
（式中、Ｚ１は酸素原子または硫黄原子であり、Ｚ２およびＺ３はそれぞれ独立してフェニレンが介在していてもよく、置換されていてもよいアルキレンまたはフェニレンが介在していてもよく、置換されていてもよいアルケニレンであり、Ｚ４は酸素原子または硫黄原子であり、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して水素原子またはアルキルである）で表される基である］で表される化合物；および
一般式（ＩＩ）：Ａ１−Ａ２（ＩＩ）
［式中、Ａ１はＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−（ｎは、１〜５の整数である）または式：【００４７】
【化６】
0005396277.tif 000007
【００４８】
（式中、Ａ３はアルキレンであり、Ｒ６は同一にアルキルである）で表される基であり；
Ａ２は式：【００４９】
【化７】
0005396277.tif 000008
【００５０】
（式中、Ａ４は同一にアルキレンであり、Ａ５は同一に式：【００５１】
【化８】
0005396277.tif 000009
【００５２】
（Ａ６はアルキレンであり、Ａ７は酸素原子または硫黄原子であり、Ｒ７は水素原子またはアルキルである）で表される基である］で表される化合物を重合させて得られる共重合体である。本発明の上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の共重合体において、Ｘ１はＣ１〜Ｃ１０アルキレンまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであることが好ましく、Ｙの鎖長はＣ１〜Ｃ２５アルキルに相当する鎖長が好ましく、さらにＹの好ましい例として、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎ＝１〜８が好ましく、特にｎ＝１〜６が好ましい）が挙げられ、Ｚ２およびＺ３はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ１０アルキレンまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであることが好ましく、Ａ３はＣ１〜Ｃ５アルキレンであることが好ましく、特にＣ２アルキレンであることが好ましく、Ａ４およびＡ６はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ１０アルキレンであることが好ましい。また、置換されていてもよいフェニレンの具体例として、以下：【００５３】
【化９】
0005396277.tif 000010
【００５４】
が挙げられる。上記重合は、熱重合であってもよいし、光重合であってもよいが、上記と同じ理由により、ジアセチレン基またはビニル基の特性吸収波長の２５４ｎｍ付近の紫外線（ＵＶ）照射による光重合が好ましい。【００５５】
（糖鎖分析用の前処理技術）
本明細書において、糖鎖の「遊離」とは、生体材料などにおいて糖鎖を含む複合体から、その糖鎖を遊離させることをいう。【００５６】
本明細書において「試料」または「サンプル」とは、糖鎖の分析を目的とする任意の試料をいう。好ましくは、生体材料に由来する試料（たとえば、体液、細胞抽出液，組織抽出液）であり、より好ましくは、体液、細胞抽出液，組織抽出液などであり、さらに好ましくは、血液成分（たとえば、血清、血漿）を含む体液であり、さらにより好ましくは血液であり、もっとも好ましくは血清である。【００５７】
本明細書において、「反応用プレート」とは、糖鎖を含む試料の化学反応を行う任意のプレートをいう。プレートは、プラスチック等の生体材料と反応しないか反応しにくい材料から構成される。プレートはコーティングされていてもされていなくてもよい。プレートとしては、マルチウェルプレートなどの汎用される実験用プレートを用いることができる。【００５８】
本明細書において、「可溶化剤」とは、タンパク質を可溶化することができる薬剤をいう。可溶化剤としては、たとえば、１−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ラウラミド (PHL)、１−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド （ＰＨＭ）、ラウリン酸２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル（ＨＳＤ）またはその等価物を使用することができる。好ましくは、１−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ラウラミド(ＰＨＬ)／重炭酸アンモニアを用いることができる。【００５９】
本明細書において、可溶化剤の「反応条件」とは、可溶化剤の可溶化反応を起こす任意の反応条件をいい、たとえば、２５℃〜４２℃、好ましくは３７℃で１０分間という条件を挙げることができる。【００６０】
本明細書において、「還元剤」とは、元素または化合物に水素を付加する任意の物質を言う。本明細書では、タンパク質における−Ｓ−Ｓ−結合を切断するために用いられる。還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド溶液  ０．５  Ｍ）、または等価物などを挙げることができる。好ましくは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が用いられる。【００６１】
本明細書において、還元剤の「反応条件」とは、還元剤の還元反応が進行する任意の反応条件をいう。本明細書では、たとえば、５０℃〜８０℃での条件を用いることができ、好ましくは、６０℃で３０分間反応させることができる。高温であることから、この後の反応を行うために室温に戻してもよい。【００６２】
本明細書において、「−ＳＨ保護剤」とは、タンパク質中の−Ｓ−Ｓ−結合を切断した後の−ＳＨ基を保護する任意の薬剤をいう。本明細書では、たとえば、アセチル化することができる薬剤を例示することができ、たとえば、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）または等価物などを挙げることができる。【００６３】
本明細書において、−ＳＨ保護剤の「反応条件」とは、−ＳＨ保護剤の保護反応が進行する任意の条件をいい、たとえば、暗所にて２０〜３７℃、好ましくは、室温、暗所にて１時間反応させる条件を挙げることができる。【００６４】
本明細書において、「タンパク質分解酵素」とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどペプチド結合で結合された任意のアミノ酸のポリマーを分解することができる任意の酵素をいう。本明細書では、たとえば、トリプシン、キモトリプシン、または等価物を用いることができ、好ましくは、トリプシンを用いる。【００６５】
本明細書において、タンパク質分解酵素の「反応条件」とは、タンパク質分解酵素によるタンパク質分解反応が進行する任意の条件をいい、たとえば、２５〜４２℃、好ましくは、３７℃で６０分間反応させる条件を挙げることができる。【００６６】
本明細書において、タンパク質分解酵素の「失活」とは、タンパク質分解酵素の酵素活性が消失することをいい、通常、タンパク質分解酵素もタンパク質であることから、高温でタンパク質自体を変性させることによって「失活」させることができるがこれに限定されない。【００６７】
本明細書において、「糖鎖遊離酵素」とは、糖鎖複合体から糖鎖を遊離させることができる任意の酵素をいう。本明細書では、たとえば、ＰＮＧａｓｅＦ、Ｅｎｄｏ  Ｈまたは等価物、好ましくはＰＮＧａｓｅＦをもちいることができる。【００６８】
本明細書において、糖鎖遊離酵素の「反応条件」とは、糖鎖遊離酵素による糖鎖の遊離が進行する任意の条件をいう。本明細書では、たとえば、２５℃〜４２℃であり、好ましくは、３７℃で６０分間から１２時間反応させる条件を挙げることができる。【００６９】
本明細書において、「糖鎖捕捉ビーズ」とは、本明細書において記載される糖鎖捕捉のための化学反応性官能基を有する任意のビーズをいう。そのようなビーズは、たとえば、特許文献１に例示されている。市販品ではＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト）、ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｈｚ  （ＢｉｏＲａｄ），ＣａｒｂｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）、Ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いることができる。【００７０】
本明細書において、「糖鎖捕捉ビーズと結合する条件」とは、糖鎖捕捉ビーズ（たとえば、ビーズまたは磁性ビーズ）上にある糖鎖捕捉基（たとえば、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含む）と、糖との結合が進行する任意の条件をいう。たとえば、２５〜８０℃であり、好ましくは、８０℃での反応を例示することができる。【００７１】
本明細書において、「タンパク質変性剤」とは、タンパク質およびぺプチドの分子構造を変質させ，溶解度などの性質を変えることをいう。たとえば、加熱，アルカリ処理，酸処理などによって、タンパク質は変性する。したがって、これらの要因を引き起こす任意のものがタンパク質編成剤として例示することができる。本明細書では、たとえば、塩酸グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムまたは等価物を挙げることができる。好ましくは、塩酸グアニジンを用いることができる。【００７２】
本明細書において、タンパク質変性剤の「反応条件」とは、タンパク質およびぺプチドの変性が進行する任意の条件をいう。本明細書では、たとえば、室温で１０秒から１０分の条件をあげることができるがそれより長い時間しようしてもよい。【００７３】
本明細書において、「洗浄残液」とは、水などの洗浄液で洗浄した後に発生する残液をいう。次の反応の障害となりうることから、通常廃液されることが好ましい。【００７４】
本明細書において、ビーズ上の糖鎖捕捉基の「塩遊離剤」とは、糖鎖捕捉ビーズ（たとえば、ビーズまたは磁性ビーズ）上にある糖鎖捕捉基（たとえば、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含む）に形成された塩（たとえば、ヒドラジドの場合は、ヒドラジドと結合した塩）を遊離させる任意の薬剤をいう。ヒドラジドの場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり、アミノオキシ基の場合は、トリエチルアミンまたは等価物である。他の場合について、当該分野で公知の技術を用いて保護させることがで脱離させることができる。【００７５】
本明細書において、「吸引廃棄」とは、減圧ないし陰圧条件下で液体が吸引される膜（たとえば、市販のマルチウェルフィルタープレート）を用いて吸引により、液体を除去することをいう。【００７６】
本明細書において、「保護化剤」とは、過剰のビーズの官能基を保護することをいう。本明細書では、たとえば、無水酢酸、無水コハク酸、他の酸無水物または等価物を用いることができ、好ましくは、無水酢酸を用いることができ、この場合アセチル基による保護（アセチル化）が行われる。【００７７】
本明細書において、保護化剤の「反応条件」とは、過剰のビーズの官能基を保護することができる任意の条件をいう。本明細書では、１０％無水酢酸／メタノール室温３０分であり、好ましくは、３７℃での条件を用いることができる。【００７８】
本明細書において、「酸」とは、捕捉された糖鎖中シアル酸のカルボキシル基から塩を外してフリーにさせるために用いられる。酸処理無しだとメチルエステル化反応の収率が低くなると予想されることから、酸処理を行うことが好ましい。ここでは、塩酸のほか、希硫酸などpH 2〜3の無機酸を用いることができる。【００７９】
本明細書において、「反応有機溶媒」とは、アルキルエステル化反応などの反応に用いられる任意の有機溶媒をいう。たとえば、ジオキサンのほか、アセトニトリル、テトラヒドロフランを用いることができる。ビーズにより、ジオキサンまたはアセトニトリルのいずれかの優先性が異なりうる。【００８０】
本明細書において、「親水性有機溶媒」とは、疎水性有機溶媒と水とを置換する（すなわち、水系と有機溶媒の橋渡しをする）場合に中間に用いられる任意の有機溶媒をいう。たとえば、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトニトリルまたはアセトンなどを用いることができる。【００８１】
本明細書において、「水分および溶媒」の「除去」とは、水分および溶媒を除去することができる任意の工程をいう。あるいは、水系溶媒使用後に有機溶媒でビーズの溶媒環境を置換し，水系溶媒を排除することも含まれる。たとえば、濾紙、吸い取り紙、ガーゼ、タオル、手ぬぐい、テイッシュペーパー、綿つきシートなどでの底拭きが例示される。「水分および溶媒」の「除去」に使用される手段（本明細書において「溶媒吸収シート」ともいう。）は、プレートを減圧吸引した後に、プレートの下側に付着している水、アセトニトリル（ＡＣＮ），メタノール等の溶媒を吸い取るものであり、水分・溶媒を吸収する素材でできていれば、綿などの特定の素材に限られない。拭き取らないと溶媒がフィルターの上に滲みもどりって、フィルター上のビーズが水分・溶媒をより含有されることから、これを防止することが好ましい。【００８２】
本明細書において、「＊＊＊での底拭き」とは、水分および溶媒を吸収する手段（たとえば、綿つきのシートなどの溶媒吸収シート）を下に敷いておき、その上に吸引ろ過したプレートを置き、上から押さえつけてプレートの底に付着するろ過溶媒を吸収するシートに吸い取り除去することをいう。【００８３】
本明細書において、「アルキルエステル化剤」とは、アルキルエステル化させることができる任意の薬剤をいう。たとえば、メチル化の場合は、メチルエステル化という。シアル酸のカルボン酸をメチル化することによって、糖鎖の検出を容易にすることができるという効果がある。その技術は、国際公開２００７／０９９８５６号パンフレットに記載されており、必要に応じてこの記載を参考として本明細書中で援用する。本明細書では、たとえば、メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）、エチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＥＴＴ）、ブチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＢＴＴ）または等価物を用いることができる。【００８４】
本明細書において、アルキルエステル化剤の「反応条件」とは、アルキルエステル化剤によるアルキルエステル化反応が進行する任意の条件をいう。本明細書では、たとえば、１００  ｍＭ  ＭＴＴ／ジオキサン、６０°Ｃ、６０分を使用することができる。【００８５】
本明細書において、「タグ化」とは、糖鎖などの質量分析の資料を、検出を用意とするために標識などの追加の分子を結合させることをいう。そのようなタグ化は、紫外・可視光を吸収する発色団、蛍光を発する構造を有するタグ、他分子と相互作用しうる分子（Ｈｉｓ  ｔａｇ、ビオチンなど）を有するアフィニティータグ、官能基と特異的に反応する官能基（光反応性分子（架橋用）、アジド基、ＳＨ基、アミノ基、カルボン酸、）を有するタグ、疎水性構造に官能基を有するタグまたは金属イオン配位子を有するタグを用いて行われる。タグ化は、酢酸、アセトニトリル、酢酸緩衝液、または等価物を加えてもよい。【００８６】
本明細書において、タグ化のための「試薬」とは、タグ化をさせることができる任意の試薬をいい、たとえば、紫外・可視光を吸収する発色団、蛍光を発する構造を有するタグ、他分子と相互作用しうる分子（Ｈｉｓ  ｔａｇ、ビオチンなど）を有するアフィニティータグ、官能基と特異的に反応する官能基(光反応性分子（架橋用）、アジド基、SH基、アミノ基、カルボン酸、）を有するタグ、疎水性構造に官能基を有するタグまたは金属イオン配位子を有するタグをあげることができる。【００８７】
本明細書において、「紫外・可視光を吸収する発色団」とは、紫外・可視光を吸収する任意の発色団をいい、たとえば、ｐ−ニトロベンジルオキシルアミンなどの芳香族化合物が例示される。【００８８】
本明細書において、「蛍光を発する構造を有するタグ」とは、蛍光を発する構造を有する任意のタグをいい、たとえば、アントラニロイルヒドラジンが例示される。【００８９】
本明細書において、「他分子と相互作用しうる分子を有するアフィニティータグ」とは、他分子と相互作用しうる分子を有する任意のタグをいい、たとえば、His tag、ビオチン、ビオチンヒドラジドなどが例示される。【００９０】
本明細書において、「官能基と特異的に反応する官能基を有するタグ」とは、官能基と特異的に反応する官能基を有する任意のタグをいい、たとえば、光反応性分子（架橋用）、アジド基、ＳＨ基、アミノ基、カルボン酸、Ｎ−アミノオキシグリシンおよび該化合物構造をその分子中に有する化合物が例示される。【００９１】
本明細書において、「疎水性構造に官能基を有するタグ」とは、疎水性構造に官能基を有する任意のタグをいい、たとえば、疎水性芳香族あるいは疎水性脂肪鎖を持つヒドラジド化合物；例えばＧｉｒａｒｄ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｐ．が例示される。【００９２】
本明細書において、「金属イオン配位子を有するタグ」とは、金属イオン配位子を有する任意のタグをいい、たとえば、ヒスチジンタグあるいは金属イオン坦持樹脂に吸着しうるタグが例示される。【００９３】
本明細書において、「タグ化糖鎖試料溶液」とは、本発明の方法によって、調製され、タグ化された糖鎖を含む任意の試料をいう。この溶液は、そのままＨＰＬＣあるいは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）などで分析を行うこともできるが、さらにMALDI-TOF質量分析用プレートに固定して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行うこともできる。【００９４】
本明細書において、「検出試料」とは、質量分析などにおいて検出のための試料をいう。【００９５】
本明細書において、「質量分析用プレート」とは、質量分析用に用いられる任意のプレートをいう。プレートは、プラスチック、金属等の生体材料と反応しないか反応しにくい材料から構成される。プレートはコーティングされていてもされていなくてもよい。たとえば、MALDI装置に依存する試料点着プレートを使用することができる。【００９６】
本明細書において、「回収用プレート」とは、試料の回収のために用いられる任意のプレートをいう。プレートは、プラスチック等の生体材料と反応しないか反応しにくい材料から構成される。プレートはコーティングされていてもされていなくてもよい。プレートとしては、マルチウェルプレートなどの汎用される実験用プレートを用いることができる。【００９７】
本明細書において、「マルチウェル」とは、多数のウェルをいい、マルチウェルプレートとは、多数のウェルが備わったプレートをいう。たとえば、９６ウェルのマルチウェルプレート、３８４ウェルのマルチウェルプレート、１５３６ウェルのマルチウェルプレートなどを例示することができる。【００９８】
本明細書において、「固相抽出のために適切な樹脂または膜」とは、固相抽出のために用いられる任意の樹脂または膜をいう。本明細書では、C１８シリカゲル，順相用固相担体，アミノシリカ樹脂などが例示される。【００９９】
本明細書において、「固相」とは、固体の状態をいう。【０１００】
本明細書において、「固相に吸着する濃度」とは、固体の状態にある基板などへの試料（たとえば、糖鎖）の吸着が促進される任意の濃度をいう。【０１０１】
本明細書において、「混合用プレート」とは、２以上の試薬または試料を混合するために用いられる任意のプレートをいう。プレートは、プラスチック等の生体材料と反応しないか反応しにくい材料から構成される。プレートはコーティングされていてもされていなくてもよい。プレートとしては、マルチウェルプレートなどの汎用される実験用プレートを用いることができる。【０１０２】
本明細書において、「固相担体封入プレート」または「ＳＰＥプレート」とは、固相抽出用担体をを封入した多検体処理用カラムタイププレートをいう。プレートは、プラスチック等の生体材料と反応しないか反応しにくいプレート材料と、固相抽出用担体として封入されたアミノプロピルやオクタデシルなどの官能機を持ったシリカやスチレン等のマイクロビーズと、固相抽出用担体を保持するためのフィルターより構成されている。プレートはコーティングされていてもされていなくてもよい。プレートとしては、マルチウェルプレートなどの汎用される実験用プレートを用いることができる。製品例の一つとして、ウオーターズ社製の「ＭａｓｓＰＲＥＰ  ＨＩＬＩＣ  μＥｌｕｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ」が挙げられる。【０１０３】
本明細書において、「相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる」とは、ある材料についてその反対の極性（水であれば、疎水性、疎水性有機溶媒であれば、親水性物質など）を有する溶媒になじませることをいう。馴化のためには、その溶媒に長時間浸すか、または何度か溶媒を入れ替えることが好ましい。【０１０４】
本明細書において、「第２の回収用プレート」とは、回収用プレートを用いた後、固相担体封入プレートで精製作業を行った場合にその後に再度回収を行うためのプレートをいう。【０１０５】
本明細書において、「質量分析用マトリクス」とは、質量分析用の試料を調製するための任意のマトリクスをいう。マトリクスについては、本明細書において他の場所でも詳説される。【０１０６】
本明細書において、「糖鎖の質量の分析」とは、糖鎖についてその質量を分析する任意の手法をいう。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなど本明細書において記載された方法および当該分野において知られる任意の手法を用いることができる。【０１０７】
本明細書において、「過剰」の試薬を「除く工程」とは、反応に用いた試薬を除く任意の工程をいう。たとえば、除くためには、溶媒のみでの数回の洗浄を行うことなどを例示することができる。【０１０８】
本明細書において「試料中の糖鎖を分析するための前処理試料」とは、試料中の糖鎖を分析するために使用される試料をいう。通常質量分析等では、生の試料での分析は不可能であることから、不純物を取り除いたりタグ化するなどの前処理を行うことが必要であり、その前処理を行った試料を本明細書ではこのように呼ぶ。【０１０９】
（質量分析方法）
本明細書において「質量分析」とは、原子、分子、クラスター等の粒子を気体状のイオンとし（つまり、イオン化し）、真空中で運動させ電磁気力を用いてそ  れらイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離・検出することを意味する。ｍ／ｚに応じて分離・検出されたイオンをもとに、横軸にｍ／ｚ、縦軸にイオンの相対強度をとったスペクトルが、マススペクトルである。分子量情報を与えるイオンは、一般に分子量関連イオン（中性分子Ｍから電子１個が失われたＭ＋．、電子１個が付加したＭ−．、プロトンが付加した［Ｍ＋Ｈ］＋、プロトンが失われた［Ｍ−Ｈ］−、ハイドライドが失われた［Ｍ−Ｈ］＋、アルカリ金属（Ｎａなど）が付加した［Ｍ＋Ｎａ］＋な  どがある）と呼ばれる。試料やイオン化法（特にＥＩ法では）によっては全く分子量関連イオンが出現しない場合があるが、その場合はソフトなイオン化法を用  いることで分子量関連イオンを確認できる。分子イオンより低質量側に出現するイオンをフラグメントイオンと呼び、このフラグメントイオンは分子イオンが分  解したもので、試料分子の構造情報を与える。スペクトル中最もイオン強度の高いイオンをベースピークと呼び、相対強度を１００％としスペクトルを規格化するために用いる。【０１１０】
本発明における「イオン化」は、以下の７通りの方法の中から適宜選択して行われる。【０１１１】
１）電子イオン化法（ＥＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ法）
電子イオン化法は、気化した試料に熱電子をあててイオン化する方法で、最も普及しているイオン化法である。イオン化は試料をガス化して行なうため、液体 あるいは個体試料は予め気化させる必要がある。気化させるのに熱を加えるため熱不安定物質、難揮発性物質の測定は不可能である。ただし、メチル化、シリル化、アシル化等の誘導体化により揮発性、熱安定性が得られる物質の場合は測定が可能となる。通常７０ｅＶのエネルギーでイオン化を行なうため、分子イオン の生成とともに過剰エネルギーによりフラグメントイオンが生成する（一般的な有機化合物のイオン化エネルギーは、１０数ｅＶである）。このフラグメントイオンの情報より化合物の構造解析が可能となる。しかし、分子イオンが出にくいため分子量情報が得られない場合が多い。この場合はイオン化エネルギーを ２０ｅＶ程度に落すか、よりソフトなイオン化法（ＣＩ、ＤＥＩ、ＤＣＩ、ＦＡＢ、ＥＳＩ）を選択する必要がある。【０１１２】
２）化学イオン化法（ＣＩ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ法）
あらかじめイオン化された反応ガス（試薬ガス）の中に気化した試料を送り込みイオン化する方法である。イオン分子反応を用いてイオン化するため、イオン 化エネルギーが有機化合物のイオン化エネルギーに近いためフラグメントイオンが非常に少なく、分子量情報を持ったイオン（（Ｍ＋Ｈ）＋、（Ｍ＋ＮＨ４）＋、（Ｍ−Ｈ）−など）がベースイオンとして現れる。反応ガスとしては一般的にメタン、イソブタン、アンモニアが用いられている。【０１１３】
３）脱離電子イオン化法（ＤＥＩ：ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ法）
電子線の近傍で瞬間加熱を行ない試料が熱分解を起こす前に、気化させイオン化させる方法で、熱不安定物質や難揮発性物質の測定が可能となる。さらに、通常の直接導入法におけるＥＩ法より分子イオンが強く出るため分子量情報が得やすくなる。測定法は、試料溶液をポイント・フィラメント（直径１００μｍの白金線）の先端に付着させ、イオン源内に挿入後フィラメントを急速加熱し試料を気化させる。【０１１４】
４）脱離化学イオン化法（ＤＣＩ：ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ法）
イオン源をＣＩの状態でＤＥＩの操作を行なった場合が、ＤＣＩである。【０１１５】
５）高速原子衝撃）法（ＦＡＢ：ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ法）
試料とマトリックス分子を良く混合し、ターゲット上に塗布しＸｅ等の高速中性原子を衝突させイオン化させる方法である。ＥＩ、ＣＩと違い、試料を気化さ せる必要がないため、熱不安定物質や難揮発性物質の測定に適している。しかし、低質量域にはマトリックス由来のバックグラウンドピークが強く現れるため低分子量の試料は測定が難しい場合がある。その場合はＦＲＩＴ−ＦＡＢによる測定が有効である。【０１１６】
６）フリット高速原子衝撃法（ＦＲＩＴ−ＦＡＢ：ＦＲＩＴ−ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ法）
Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗ  ＦＡＢとも呼ばれ、マトリックス溶液に溶解した試料を連続的に流し溶出液出口を高速中性原子で衝突させイオン化させる方法である。【０１１７】
７）エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ法）
大気圧イオン化法の一種で、キャピラリに高電圧を印加すると試料溶液が自ら噴霧、イオン化を行なう現象を利用したイオン化法である。ＦＡＢ同様、試料を 気化させる必要がないため、熱不安定物質や難揮発性物質の測定に適している。このことは、質量範囲の小さい四重極型のタイプでも分子量の大きなペプチドやタンパクなどが測定できるようになる。通常のＥＳＩ測定では構造情報を持つフラグメントイオンが得られないため、通常より高めに電圧を Ｃａｐｉｌｌａｙ／Ｓｋｉｍｍｅｒ−１に印加することによりＩｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ＣＩＤが起き構造情報を持つフラグメントイオンを測定することが可能となる。【０１１８】
本明細書において「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ」とは、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  − Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）の略語である。ＭＡＬＤＩとは、田中らによって見いだされ、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐらによって開発された技法である（Ｋａｒａｓ  Ｍ．，Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，６０，２２９９−２３０１）。この方法では、試料とマトリックス溶液をモル比で（１０−２〜５×１０−４）：１に混合した後、混合溶液を標的上で乾固し、結晶状態にする。パルスレーザー照射により、大きなエネルギーがマトリックス上に与えられ、（Ｍ＋Ｈ）＋、（Ｍ＋Ｎａ）＋などの試料由来イオンとマトリックス由来イオンとが脱離する。微量のリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グアニジンなどで汚染されていても分析可能である。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＭＳ）は、ＭＡＬＤＩを利用して飛行時間を元に質量を測定するものである。イオンが一定の加速電圧Ｖで加速される場合、イオンの質量をｍ、イオンの速度をｖ、イオンの電荷数をｚ、電気素量をｅ、イオンの飛行時間をｔとしたとき、イオンのｍ／ｚは、
ｍ／ｚ＝２ｅＶｔ２／Ｌ２
で表すことができる。このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定には、島津／ＫｒａｔｏｓのＫＯＭＰＡＣＴ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ／ＩＩＩなどを使用することができ る。その測定の際には、製造業者が作成したパンフレットを参照することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの測定時に使用されるレーザー照射の照射エネルギーを本明細書において「解離エネルギー」という。【０１１９】
本明細書において「ＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ」とは、上で定義した「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ」とは対照的に、低分子マトリックス試薬を使用せずに、レーザー照射により目的の分子を脱離・イオン化する方法を意味する。【０１２０】
本明細書において「同一実体」とは、本明細書において便宜上複数で表現されている実体が同じ個体そのものであることを意味する。【０１２１】
本明細書において「金属」とは、その少なくとも一部に、硫黄原子含有物質（例えば、チオールまたはジスルフィドなど）が結合可能な金属を含む、金属単体または金属複合体を意味し、硫黄原子含有物質が結合可能である代表的な金属の種類として、金、銀、カドミウムおよびセレンなどが挙げられる。あるいは、金属は磁性体であってもよい。【０１２２】
本明細書において「金属微粒子」とは、平均粒径１０ｎｍ〜１μｍを有する上で定義した金属の粒子を意味し、単分散型であってもよいし、多分散型であってもよい。ビーズは、このような金属微粒子から構成されていてもよい。本発明の金属微粒子が金属複合体である場合には、その複合体のコアとなる粒子の表面が、上記硫黄原子含有物質が結合可能な金属の層で覆われた構造をとる。本発明で使用する代表的な金属微粒子として、金または銀の金属単体の微粒子、あるいは鉄、ニッケル、コバルトまたは酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）などの磁性粒子の表面が金または銀で覆われた金属複合体の微粒子が挙げられる。本発明の「金属微粒子」は、溶液中でコロイドを形成する。上で挙げた金属微粒子の例のほかにも、商品名Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ、以下「ＱＤｓ」と示す）も使用可能である。ＱＤｓに用いられる金属の種類としては、例えばＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅなどが挙げられる。典型的な例として、コ アにＣｄＳｅ、その周りにＺｎＳを持つナノパーティクルがある。表面にでているＺｎと−ＳＨの結合（この結合はＡｕ−Ｓと同じ種類）を介して−ＳＨ化合物をＱＤｓ表面に提示することができる。金微粒子の作製およびその応用については、ＪＡＣＳ  １２５，７７９０−７７９１（２００３）；Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４０（１２），２２５７−２２６１（２００１）；Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ  ９，１９０９−１９２１（２００３）に記載されている。【０１２３】
（本発明の装置の応用）
本発明により実現する質量分析法などによる糖鎖の分析法と、２次元電気泳動法とを組み合わせたプロテオーム解析により、疾患に関与するタンパク質マーカーの迅速な同定やゲノム創薬のターゲットとなる標的タンパク質のハイスループット探索等を目指した研究も活発に進められる。【０１２４】
糖鎖修飾はリン酸化やアシル化、プレニル化反応等と並んでタンパク質の動的な構造・機能制御機構にとって極めて重要かつ基本的生合成プロセスである。このようなタンパク質の多様な修飾反応は広く「遺伝情報の翻訳後修飾」と言われ、癌や免疫をはじめ多くの疾患にも深く関与する現象であるため、新しい診断支援技術の開発や医薬品の研究開発、さらに臨床の現場からも有用である。【０１２５】
本発明を用いれば、網羅的・定量的糖鎖構造解析（Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）から出発してそれら糖鎖のキャリアータンパク質のペプチド配列情報の解析、さらにゲノム情報の同定へと遡る「グライコフォームフォーカストリバースゲノミクス法（Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ−ｆｏｃｕｓｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」を基本戦略とする新しい疾患バイオマーカーの探索研究を行うことも可能である。【０１２６】
本発明を用いれば、糖鎖をタグとみなして糖ペプチド断片を釣り上げてプロテオーム解析さらにゲノム情報の獲得までを一気に進めて糖タンパク質の同定や糖鎖の不均一性などのプロファイリングを行う方法であるＧｌｙｃｏｆｏｒｍ−ｆｏｃｕｓｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＧＦＲＧ）が可能である。血清、細胞、組織、臓器などの生体試料に含まれる多種多様な糖タンパク質からＮ−グリカナーゼ消化等により得られる糖鎖を選択的かつ網羅的に捕捉・標識して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ法等により全ての糖鎖構造とそれらの定量的な分布状態を解析する「網羅的・定量的グライコミクス（Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）」が可能である。同じ試料からぺプチダーゼ処理によって得られる部分消化糖ペプチド断片を、それぞれ対象とする糖鎖構造グループ別に捕捉してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳ解析等によりそれぞれのペプチド配列を決定し、前述の網羅的・定量的グライコミクス解析の結果と照合することで個々の糖ペプチド構造を確定する「グライコフォームフォーカストプロテオミクス（Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ−ｆｏｃｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」を行うことができる。この際に、たとえば、ＭＡＳＣＯＴアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いることによりそのペプチド構造を含むタンパク質をピックアップできれば遺伝子情報を含む糖タンパク質の全体像が瞬時に分析・同定することができる。糖鎖タグからキャリアータンパク質、さらに遺伝子の構造を逆向きに遡って解析するＧＦＲＧ法は新しい疾患マーカーの高スループット探索法の１つとして有望な戦略となることが期待される。【０１２７】
ＧＦＲＧ法では（１）糖鎖の網羅的・定量的構造解析と（２）糖ペプチドの構造解析という２つのタイプの微量糖鎖構造解析技術が用いられている。【０１２８】
そこで、糖鎖ブロッティング（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法が使用されうる。【０１２９】
糖タンパク質、プロテオグリカンや糖脂質等の複合糖質から遊離した糖鎖は必ず分子内の還元末端にアルデヒド基と等価のヘミアセタール基を持つので、タンパク質を構成するアミノ酸・ペプチド、ＤＮＡ／ＲＮＡを構成するヌクレオチド、さらに脂質等他の生体分子との完璧な化学的差別化はこのへミアセタール基に特異的・選択的な求核付加反応により実現する。あらゆる糖鎖の還元末端と網羅的に反応する官能基（アミノオキシ基やヒドラジド基等）を含む種々の物質（高分子・低分子などを問わない）を用いて、糖鎖捕捉と高感度化試薬等によるプローブ標識、さらにそれらの質量分析法による構造解析を連続的に高速で行う（特許文献１；図３）。【０１３０】
本手法を用いることで、血清試料（約５０マイクロリットル）に含まれる種々の糖タンパク質から遊離したアスパラギン結合型糖鎖の網羅的・定量的構造解析の工程が大幅に簡素化・短縮できる。各種クロマト操作を組み合わせた従来の方法のみでは大量の夾雑物が含まれる検体からの糖鎖精製や蛍光標識などの前処理の工程だけでも２−３週間程度の煩雑な作業を必要としていたが（N. Tomiya，et al. Anal. Biochem. 171，73 (1988)）、この新手法によれば糖鎖捕捉からMALDI-LIFT-TOF/TOFやナノLC/ESI-TOFMSなどの各種質量分析法による網羅的構造解析までの一連の工程を半日以内で完了できる。また、非還元末端のガラクトースやシアル酸残基での選択的酸化反応（官能基変換）の後にこの位置でのオキシム形成反応等を行えば糖ペプチド断片をブロットできるため図３と同様のスキームが糖ペプチドの構造解析に応用できる。【０１３１】
壊れる前に糖鎖のフラグメントイオンを検出することができる。【０１３２】
質量分析法はプロテオーム研究において極めて有効な分析法として既に広く様々な局面で用いられている。これは酵素消化等によって生成する全てのペプチド断片をそれらの構造によることなく容易にイオン化できること、さらにその安定な１次イオンピークからの選択的断片化（フラグメンテーション）も簡単でMS/MSスペクトルパターンを前述のMASCOTアルゴリズム解析等を用いて照合すればそのペプチド配列を含む候補タンパク質が容易に推定できるなどのメリットが大きいからである。【０１３３】
また、ペプチドやタンパク質等への酵素的あるいは化学的糖鎖修飾反応をモニタリングする簡単かつ汎用的な方法としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（例えばＲＥＦＬＥＸ  ＩＩＩおよびＢＩＦＬＥＸ  ＩＩＩ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社など）を使用することができる。これらの装置では主として１価の分子イオンピークの情報のみから単純に反応生成物の分子量を同定して、反応条件の最適化や反応収率の評価等を行うことができる。上記２台の装置の上位機種であるＵｌｔｒａｆｌｅｘではＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ法により不安定なフラグメントイオンを高速で感度良く検出・解析することができる。同様のTOF/TOFモードでの測定は他社のMALDI型質量分析装置でも可能であると思われるが、基本原理は図４に示すようにレーザー照射に引き続きTOF-1ではプリカーサーイオンに対して選択的に加速電圧をかけてフラグメントイオンを生成させる。次いでこれらの各フラグメントイオンはTOF-2と呼ばれる領域に到達した段階で再び速やかに瞬間的な加速電圧を受けてそのまま一定電圧のリフレクターを介して直接検出器へと移動してそれぞれの質量が同定されることになる。ここで最も重要なことはTOF-2の領域で加速されてそれぞれ異なるスピードで移動することとなった全てのフラグメントイオンが数マイクロ秒後から検出され始めそれからの数百マイクロ秒までの間に連続的に検出される。比較のためにPSDモードでの測定を同じ時間軸で表したが、この場合、全てのフラグメントイオンが等速直線運動で一気に検出器に向かって来るため途中のリフレクターでの電圧を適宜変化させてそれぞれのフラグメントイオンを選別してから検出する過程が必要となる。結果的にいずれのフラグメントイオンも検出器に到達するまでにはイオン化してから１ミリ秒程度かかってしまうことになる。糖鎖において観察された不安定なフラグメントイオンを迅速に高感度で検出して構造解析する際にこの数百マイクロ秒の「時間差攻撃」は重要である。このように、種々の方法を用いる際に、本発明の自動分析方法は応用することができる。【０１３４】
ＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ法を用いることにより、セリンやトレオニンとのＯ−グリコシド結合を切断することなく（切断されるより速く）これらの構造を含む様々なムチン型糖ペプチドの分子イオンピークやフラグメントイオンピークを再現性良く観察できるようになった。シアル酸やフコースを含む比較的大きな糖鎖のＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトルも簡単な操作で再現性良く得られることから、いわゆる既知化合物のＴＯＦ／ＴＯＦＭＳスペクトルとの照合（スペクトルマッチィング法）により構造異性体の識別や未知試料中の異性体の組成比等も解析できるようになった。糖鎖のスペクトルマッチィングに関しては例えばＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社が開発したＧｌｙｃｏＳｕｉｔｅＤＢ  に搭載されているＧｌｙｃｏｓｉｄｉＱＴＭによるユニークなＭＳ／ＭＳパターンの予測法も既に報告されている。この方法では実際に観測したフラグメントイオンのスペクトルパターンと糖鎖の崩壊挙動の特徴をもとに理論的にシミュレーションして得られた計算フラグメントイオンのデータベースとを自動的に照合させ、その相同性から候補となる構造を推定している。より多様で複雑な糖鎖関連化合物のＭＳ／ＭＳデータベースを用いて、精度の高いスペクトルマッチィングが可能となる。【０１３５】
天然物や代謝中間体などの不安定な分子のイオン化に優れたソニックスプレーイオン化法（ＳＳＩ：  Ｓｏｎｉｃ  ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）は糖鎖の非破壊的な直接イオン化に最適の方法の一つでるといえる。このＳＳＩ法が搭載されているＨｉｔａｃｈｉ  Ｍ−８０００  ３ＤＱ型質量分析装置（日立ハイテクノロジーズ社）では中性糖鎖はもとより、シアル酸を含む様々なオリゴ糖サンプルについても負イオンモードで測定すれば高感度で安定な分子イオンピークが検出され、ヘリウムガスによるＣＩＤ（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）から得られるＭＳｎスペクトルマッチィング  によりシアル酸の結合様式の違いにより生成する４種類の構造異性体も完全に識別できる。これらの異性体のＭＳ、ＭＳ２、ＭＳ３スペクトルが示されておりＭＳ２で分枝の位置が同定され、ＭＳ３スペクトルを比較すればシアル酸とガラクトース残基を連結するα２，６結合とα２，３結合の識別が簡単にできる。しかし、このような分子量も構造も酷似した糖ペプチドを分析する場合にはｎａｎｏＬＣ技術などの優れた分離法を組み合わせた高スループット化が期待されている。【０１３６】
Ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  （ＭＤＳＦ）法
２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＨＢ）とα−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）はＭＡＬＤＩ法で頻繁に用いられる典型的な２つのマトリックスである。この２種のマトリックスを用いてそれぞれ独立して生成させた同じ質量の分子イオンに対して全く同じ加速電圧をTOF-2で与えてTOF/TOFMSを測定したにもかかわらず全く異なるフラグメントイオンパターンが観察される。活性化された分子イオンにおける電荷の分布様式の違いによるものと考えられ、DHBから生成した分子イオンからのフラグメント化では単糖が端から一つずつ解離するエクソ型の崩壊パターンがほとんどであったのに対して、ＣＨＣＡからの場合は逆に比較的大きな糖鎖フラグメントイオンが顕著に見られるエンド型の崩壊が優先する。ＤＨＢから生成した分子イオンｍ／ｚ  １８６２．７９（Ｍ  ＋  Ｈ＋）を選択してフラグメント化を行うと末端からの糖鎖のエクソ型崩壊に加えてペプチド部位での良好なフラグメント化も起こる。一方、同じ構造の糖鎖を持ったアグリコン部分が異なる３種類の化合物（糖ペプチド、糖アミノ酸、蛍光ラベル化糖鎖）を今度はＣＨＣＡをマトリックスとしてイオン化した。その際に生じたそれぞれ当然異なる質量数の分子イオン（Ｍ  ＋  Ｎａ＋）をフラグメント化するとスペクトルマッチィングによる糖鎖部位の構造解析も可能である。このマトリックス依存選択的フラグメント化法（ｍａｔｒｉｘ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：  ＭＤＳＦ）はグリコシド結合とアミド結合が同一分子内に共存する糖ペプチドの選択的フラグメント化に有効な方法である。【０１３７】
ＧＦＲＧ法においては網羅的・定量的グライコミクスの結果を受けてターゲットとなる糖鎖構造ごとにその根元のペプチド構造を含めた系統的な解析を行う必要がある（グライコフォームフォーカストプロテオミクス）。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおけるＭＤＳＦ法やＥＳＩ（ＳＳＩ）イオントラップＭＳ法などにおける選択的ＭＳ３スペクトル、さらに電子捕獲解離法（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：  ＥＣＤ）などのより選択的で精密なフラグメント化を指向した技術を用いることが好ましい。【０１３８】
（分析装置の構成）
本発明の装置の１例として、図９に提示する構成を用いることができる。【０１３９】
図９における各々の位置番号では、以下の工程が行われうる。
位置番号                                位置で行う反応、処理
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（１） ・糖蛋白質を蛋白分解酵素及び糖鎖遊離酵素処理して、糖鎖を遊離する        
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（２）〜（５）・BlotGlycoABCビーズで糖鎖を捕捉し、糖鎖の還元末端をラベル化する                                 
・ビーズに捕捉されない不純物をろ過して除く                                     
・シアル酸残基のカルボン酸をメチルエステル化して保護する                                       
・ヒドラゾン結合を還元してビーズとの結合を安定化する                                   
・S-S結合を切断して、糖鎖をビーズから遊離させる                                
・糖鎖をろ過する
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（６）〜（７）・糖鎖含有ろ過液/糖鎖流出液にMALDIマトリックスを加えて後、MALDIプレートに滴下する
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（８）〜（１０）・糖含量が少ない場合や、HPLC分析する場合は、この操作を行う                                      
・ACNで洗浄したSPEプレートに、糖鎖を含むろ過液にACNを混合した液を流し、                                      
糖鎖をSPEプレートに吸着する                                 
・SPEプレートを95%ACNで洗浄し、過剰試薬を除去する                                     
・10%ACNを流しSPEプレートから糖鎖流出する                                     
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
別の実施形態の例示を、図５〜図６に示す。この図では、図１で示した、装置内での位置が番号で示されている。図７には、分注例が示される。図８では、この実施形態の俯瞰図を示す。【０１４０】
図８における洗浄バルブのＡ〜Ｈは、以下のとおりである。【０１４１】
さらに好ましい実施形態を図１に示す。【０１４２】
この図１では以下の工程が行われる。
試料中の糖鎖を分析する方法であって、以下の工程：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって、以下の工程：
Ａ−１）試料である血清をフィルタープレートに提供する工程；
Ａ−２）１−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ラウラミド(ＰＨＬ)／重炭酸アンモニアを該試料に加えて、３７℃で１０分間反応させる工程；
Ａ−３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を該試料に加えて、６０℃で３０分間反応させ、その後室温に冷却する工程；
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を該試料に加えて、室温、暗所にて１時間反応させる工程；
Ａ−５）トリプシンを該試料に加えて、３７℃で６０分間反応させる工程；
Ａ−６）該試料を５分間９０℃に加熱し、その後室温に冷却する工程；
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦを加えて、３７℃で１２時間反応させる工程；
Ｂ）遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程であって、以下の工程：
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した捕捉糖鎖試料を、糖鎖捕捉のためのビーズと接触させて、３７℃にて結合させて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）塩酸グアニジンを該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、その後反応液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を水で洗浄して、その後該水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）該捕捉糖鎖試料をトリエチルアミンで洗浄して、その後該トリエチルアミンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）無水酢酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、その後該無水酢酸を吸引廃棄する工程
Ｂ−６）塩酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該塩酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）メタノールを該捕捉糖鎖試料に加え、該メタノールを吸引廃棄後ジオキサンを該捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）綿つきシートにおいて底拭きをする工程；
Ｂ−９）メチル-p-トリル-トリアゼン（ＭＴＴ）を該捕捉糖鎖試料に加えて、８０℃で６０分間反応させる工程；
Ｂ−１０）ジオキサンを該捕捉糖鎖試料に加え、該ジオキサンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）上記捕捉糖鎖試料をメタノールで洗浄し該メタノールを吸引廃棄し、ＮａＣｌ溶液で洗浄し該ＮａＣｌ溶液を吸引廃棄し、および水で順次洗浄して、その後上記水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）酢酸およびアセトニトリルを該捕捉糖鎖試料に加え、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、benzylhydroxylamine hydrochloride／水またはアントラニロイルヒドラジン／水を用いて該捕捉糖鎖試料中の糖鎖をタグ化する工程；
Ｂ−１３）タグ化された該捕捉糖鎖試料に水を加えてタグ化糖鎖試料溶液を生成する工程；
を包含する、検出試料調製工程；
Ｃ）該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程であって；
Ｃ−１）Ｂ）工程で得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；
Ｃ−２）アセトニトリルを最終濃度８０〜９０％になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液およびアセトニトリルを混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）順相である該固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートを水、およびアセトニトリルで順次洗浄および吸引廃棄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、液体を廃棄し、さらに５％アセトニトリルを加える工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該ビーズを吸引回収する工程；
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液に３０％アセトニトリル中の2,5-ジヒドロキシ安息香酸を加え混合点着させる工程、
を包含する、質量分析用プレートを生成する工程；ならびに  
Ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより質量を分析する工程。【０１４３】
図１における番号は、符号の説明に記載されているとおりである。
試薬ラック４℃、試薬ラック、洗浄バルブには以下のものが配備される。【０１４４】
【表１】
0005396277.tif 000011
【０１４５】
。【０１４６】
上記工程は、必要に応じて改変することができることが理解される。【０１４７】
（本発明の詳説）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【０１４８】
（糖鎖分析方法）
１つの局面では、本発明は、試料中の糖鎖を分析する方法を提供する。この方法は、Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程；Ｂ）遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程；プレートによる質量分析を行う場合、以下のＣ工程Ｃ）該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程；および測定されるべき糖鎖の分析を実行する工程を包含する。【０１４９】
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程では、以下の工程が行われうる。【０１５０】
Ａ−１）試料を反応用プレートに提供する工程；
Ａ−２）可溶化剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−３）還元剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−４）−ＳＨ保護剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−５）タンパク質分解酵素を該試料に加えて、反応条件下に置く工程；
Ａ−６）該タンパク質分解酵素を失活させる工程；および
Ａ−７）糖鎖遊離酵素を該試料に加えて、糖鎖を遊離させる工程、
を含む、糖鎖遊離工程。【０１５１】
Ａ工程における上記サブ工程では、以下のような条件を用いることが好ましいがそれに限定されない。また、以下の条件は、いずれか１つ採用されてもよく、複数採用されてもよい。【０１５２】
Ａ−１）試料を反応用プレートに提供する工程は、手動であってもよく自動化してもよい。代表的には、前記試料は、体液、細胞抽出液または組織抽出液であり、より代表的には血清である。代表的には、試料は、フィルタープレートに提供される。【０１５３】
Ａ−２）において、前記可溶化剤は１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド  （ＰＨＬ）、１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）、ラウリン酸２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル（ＨＳＤ）またはその等価物であり、これらは、Ｒ−ＯＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−ＳＯ２−ＯＮａ（ここで、Ｒはアルキル基を示す。）とあらわすことができる。たとえば、１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）または１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）／重炭酸アンモニアを使用することが好ましい。このような可溶化剤としては、ＷＯ２００８／００１８８８（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６３１００）に列挙されているものを使用することができる。【０１５４】
前記反応条件は、代表的には２５℃〜４２℃であり、好ましくは、３７℃であり、反応時間は、代表的には５〜６０分であり、好ましくは約１０分程度である。【０１５５】
Ａ−３）前記還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド溶液  ０．５  Ｍ）、または等価物であり、
前記反応条件は、通常室温〜８０℃であり、好ましくは５０℃〜８０℃であり、代表的には６０℃であり、反応時間は、代表的には３０分間〜２時間であり、好ましくは約１時間程度である。【０１５６】
Ａ−４）前記−ＳＨ保護剤は、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）または等価物であり、
前記反応条件は、暗所にて２０〜３７℃（代表的には、室温）である。反応時間は、代表的には、０．５〜２時間、たとえば、１時間である。【０１５７】
Ａ−５）前記タンパク質分解酵素は、代表的には、トリプシン、キモトリプシン、または等価物であり、好ましくはトリプシンであり、
前記反応条件は、２５〜４２℃であり、代表的には３７℃である。反応時間は、代表的には、３０〜１２０分であり、たとえば約６０分である。【０１５８】
Ａ−６）前記失活の条件は、代表的には、６５℃以上、好ましくは、８０〜１００℃（たとえば、９０℃）に加熱することを含み、ここで、加熱時間は代表的には１〜１０分間（たとえば、５分間）であり、必要に応じて室温に冷却する。【０１５９】
Ａ−７）前記糖鎖遊離酵素は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ，ペプチド−Ｎ４−（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、Ｅｎｄｏ  Ｈまたは等価物であり、その間溶媒の蒸発をみないことが好ましい。天井において加温処理により対応することができる。【０１６０】
前記糖鎖遊離酵素の反応条件は、２５℃〜４２℃（たとえば、３７℃）であり、反応時間、代表的には、２〜２４時間であり、たとえば、１２時間である。【０１６１】
Ｂ）遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程では、以下の工程が行われうる。【０１６２】
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した試料を、糖鎖捕捉ビーズと接触させて、該試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件下に置いて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）タンパク質変性剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程；
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）ビーズ上の糖鎖捕捉剤の塩遊離剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、その後該塩遊離剤を吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）保護化剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程
Ｂ−６）酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）反応有機溶媒を該捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）該ビーズの水分および溶媒を除去する工程；
Ｂ−９）アルキルエステル化剤を該捕捉糖鎖試料に加え、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、シアル酸のカルボン酸をアルキル化する工程；
Ｂ−１０）該反応有機溶媒を該捕捉糖鎖試料に加え、該反応有機溶媒を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）該捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）該捕捉糖鎖試料から、糖鎖試料を遊離させる工程であって、ここで、タグ化が必要な分析をする場合、該捕捉糖鎖試料中の糖鎖を標識試薬によりタグ化し，ビーズより遊離させる工程；
Ｂ−１３）遊離された該糖鎖試料を溶解して糖鎖試料溶液を生成する工程。【０１６３】
Ｂ工程における上記サブ工程では、以下のような条件の１つまたは複数の特徴を含む工程を用いることが好ましいがそれに限定されない。【０１６４】
Ｂ−１）において前記ビーズは、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含む糖鎖捕捉基が結合したビーズまたは磁性ビーズであり、
前記試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件は、代表的には、２５〜８０℃であり、より代表的に、４０〜８０℃であり、たとえば８０℃が使用され。【０１６５】
Ｂ−２）前記変性剤は、塩酸グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムまたは等価物であり、
前記反応条件は、室温に加え，ビーズを十分に膨潤させる保温を行う（たとえば、１０秒から５分）ものである。【０１６６】
Ｂ−３）前記洗浄は、水を用い、必要に応じてその後上記水を吸引廃棄する。【０１６７】
Ｂ−４）前記ビーズ上の糖鎖捕捉剤は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体であり、前記塩遊離剤は、ヒドラジドの場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり、Ｎ−アルキルアミノオキシ基の場合は、トリエチルアミンであり、必要に応じてその後上記トリエチルアミンを吸引廃棄する。【０１６８】
Ｂ−５）
前記保護化剤は、無水酢酸、無水コハク酸、他の酸無水物または等価物であり、
前記反応条件は、（たとえば、１０％の）無水酢酸／メタノール  １５〜３７℃（たとえば、室温）１０分〜２時間（たとえば、３０）分であり、必要に応じてその後上記無水酢酸を吸引廃棄する。【０１６９】
Ｂ−６）前記酸は、塩酸、または他の無機塩酸、あるいは等価物のｐＨ２〜３の酸であり、必要に応じて、上記酸を吸引廃棄する。【０１７０】
Ｂ−７）前記反応有機溶媒への置換の前に、親水性有機溶媒に置換する工程を含み、該親水性有機溶媒は、代表的には、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトニトリルまたはアセトンであり、前記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物であり、必要に応じて上記メタノール等を吸引廃棄後ジオキサンを上記捕捉糖鎖試料に加える。【０１７１】
Ｂ−８）該ビーズの水分および溶媒を除去する工程は、代表的には、綿つきシート、紙、吸い取り紙、ガーゼ、タオル、手ぬぐい、テイッシュペーパーなどでの底拭きを含む。【０１７２】
Ｂ−９）前記アルキルエステル化剤は、代表的には、メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）、エチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＥＴＴ）、ブチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＢＴＴ）または等価物であり、メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）が好ましく、
前記反応条件は、１００  ｍＭ  ＭＴＴ／ジオキサン，６０〜８０℃で、３０〜１２０分間（たとえば、６０分）である。【０１７３】
Ｂ−１０）前記反応有機溶媒は、代表的には、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物であり、ジオキサンが好ましく、必要に応じてジオキサン等を吸引廃棄する。【０１７４】
Ｂ−１１）前記洗浄は、メタノール、ＮａＣｌ溶液および水からなる群より選択される少なくとも１つを用い、必要に応じてその後上記メタノール、ＮａＣｌ溶液および水を吸引廃棄する。洗浄に十分な量が使用されればよく、たとえば１００μｌ〜１ｍｌなど、たとえば、２００μｌの量が使用されるがこれに限定されない。ＮａＣｌ溶液は任意の濃度のものが使用されうるが、たとえば、１０〜１００ｍＭのものが使用され、たとえば、２０ｍＭのものが使用されうる。【０１７５】
Ｂ−１２）前記タグ化が行われ、代表的には、前記タグ化は、紫外・可視光を吸収する発色団、蛍光を発する構造を有するタグ、他分子と相互作用しうる分子（Ｈｉｓ  ｔａｇ、ビオチンなど）を有するアフィニティータグ、官能基と特異的に反応する官能基（光反応性分子（架橋用）、アジド基、ＳＨ基、アミノ基、カルボン酸など）を有するタグ、疎水性構造に官能基を有するタグまたは金属イオン配位子を有するタグを用いて行われ、該タグ化は、酢酸、アセトニトリル、酢酸緩衝液、または等価物を加えて行われる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに供する場合は，好ましい。質量分析でも他のイオン化法を用いることができる。たとえばＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、また，それぞれの質量分析でＭＳ／ＭＳなどマルチステージ質量分析を行うことができる（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなど）。他には，蛍光色素タグで回収してＨＰＬＣ分析およびＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（／ＭＳ）が考えられる。たとえば、酢酸およびアセトニトリルを上記捕捉糖鎖試料に加え、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水を用いて上記捕捉糖鎖試料中の糖鎖をタグ化することができる。ビオチンタグで回収してＢＩＡＣＯＲＥなどＳＰＲにもとづく相互作用解析にも供するあるいはマイクロアレイプレートの作製に供することができる。蛍光色素タグで回収した場合，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析ができない訳ではなく、適切な条件を選択することにより実施することができる。【０１７６】
Ｂ−１３）前記タグ化された捕捉糖鎖試料の溶解は、代表的には、水、水溶液または等価物によって行われる。【０１７７】
プレートによる質量分析を行う場合、以下のＣ工程を行うことができ、Ｃ）該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程では、以下のうちの少なくとも１つの特徴を含むことができる。【０１７８】
Ｃ−１）Ｂ）工程で得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；
必要に応じてＣ−２〜Ｃ−６工程を行う：
Ｃ−２）有機溶媒を糖鎖が固相に吸着する濃度になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液および該有機溶媒を混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相に応じて該固相担体封入プレートを活性化し洗浄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、該固相担体封入プレートの相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を吸引回収する工程；
該タグ化糖鎖試料溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに供する場合以下のＣ−７）を行い、
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液を質量分析用マトリクスに点着させる工程。【０１７９】
Ｃ工程における上記サブ工程では、以下のような条件の１つまたは複数の特徴を含む工程を用いることが好ましいがそれに限定されない。【０１８０】
Ｃ−１）前記回収用プレートへの配置は、タグ化のための試薬を取り除く条件で行われる。【０１８１】
Ｃ−２）前記糖鎖が固相に吸着する濃度は、代表的には８０〜９０％の有機溶媒であり、好ましくは、アセトニトリルを最終濃度８０〜９０％になるように、上記回収用プレートから上記タグ化糖鎖試料溶液およびアセトニトリルを混合用プレートに配置され。【０１８２】
Ｃ−３）前記固相担体封入プレートは、代表的には、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含む。【０１８３】
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相が順相の場合、水、およびアセトニトリルで順次洗浄し、該固相担体封入プレートの相が逆相の場合、メタノール等低級アルコール、水で順次洗浄する。【０１８４】
Ｃ−５）前記反対の極性を有する溶媒は、順相の場合、疎水性有機溶媒であり、逆相の場合、親水性溶媒であり、ここでたとえば、固相担体封入プレートに上記タグ化糖鎖試料溶液を加え、液体を廃棄し、代表的には、アセトニトリルで洗浄し、さらに１〜２０％（たとえば、５％）アセトニトリルを加えることができる。【０１８５】
Ｃ−６）前記第２の回収用プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含む。【０１８６】
Ｃ−７）前記質量分析用マトリクスは、代表的には、２，５−ジヒドロキシ安息香酸または等価物であり、該質量分析用マトリクスへの前記タグ化糖鎖試料溶液の点着は、混合または順次行われ、必要に応じて希釈される。また、好ましくは、上記タグ化糖鎖試料溶液に２０〜４０％（たとえば、３０）％アセトニトリル中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸を加え混合点着させることができる。【０１８７】
Ｄ）測定されるべき糖鎖の分析を実行する工程では、任意の質量分析方法、代表的には、ＭＡＤＬＩ−ＴＯＦを用いることができる。Ｄ工程でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを行うときは、Ｃ工程はすべて行うことが好ましい。測定されるべき糖鎖の質量の分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化  質量分析（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  −Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）または等価物であり、前記タグ化に発色試薬またはビオチンを用いる場合、必要に応じて過剰の発色試薬を除く工程を行うことが好ましい。また、ビーズが磁性ビーズである場合、該磁性ビーズは、修飾可能な官能基を有するビーズ（たとえば、カルボキシル基，アミノ基，エポキシ基，トシル基，あるいはストレプトアビジン結合磁性ビーズ）であることが好ましい。【０１８８】
回収用プレート１に回収された状態でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどの次の解析に問題が無ければ、ＳＰＥプレートによる工程は省くことができる。その場合でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳする場合は、回収用プレート１から混合用ＭＰ２プレートに移してマトリックスと混和後、ＭＡＬＤＩプレートに点着する。ＨＰＬＣや  ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳなどでそのまま使う場合があれば、省くことができる。【０１８９】
発色試薬を用いる場合、過剰の発色試薬を除く必要があれば、逆相、順相などあるいはイオン交換などの固相抽出を行うことが好ましい。従って、ＳＰＥプレートの種類および活性化・洗浄の溶媒は、試薬の特性に依存するが、同様の手順を行うことが好ましい。過剰の試薬が問題にならないのであれば（例えば、糖鎖に結合して初めて蛍光を発するような場合）、そのままオートサンプラーに持っていって解析に供することができる。ビオチンタグの場合もまた、遊離の（糖鎖についていない）試薬を除くことが好ましい。ＳＰＥプレートは行うことが好ましい。【０１９０】
以上の好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０１９１】
（試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離方法）
本発明は、試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離方法を提供する。この方法は、以下の工程：
Ａ−１）試料を反応用プレートに提供する工程；
Ａ−２）可溶化剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−３）還元剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−４）−ＳＨ保護剤を該試料に加えて、該試料を反応条件下に置く工程；
Ａ−５）タンパク質分解酵素を該試料に加えて、反応条件下に置く工程；
Ａ−６）該タンパク質分解酵素を失活させる工程；および
Ａ−７）糖鎖遊離酵素を該試料に加えて、糖鎖を遊離させる工程、
を含む。【０１９２】
好ましい実施形態では、前記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらに特徴とする方法：
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させて分析用糖鎖試料を調製する糖鎖遊離工程において：
Ａ−１）前記試料は、体液、細胞抽出液または組織抽出液である；
Ａ−２）において、前記可溶化剤は１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）、１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）、ラウリン酸２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル（ＨＳＤ）またはその等価物であり
前記反応条件は、２５℃〜４２℃である；
Ａ−３）前記還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド溶液  ０．５  Ｍ）、または等価物であり、
前記反応条件は、室温〜８０℃である；
Ａ−４）前記−ＳＨ保護剤は、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）または等価物であり、
前記反応条件は、暗所にて２０〜３７℃である；
Ａ−５）前記タンパク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、または等価物であり、
前記反応条件は、２５〜４２℃である；
Ａ−６）前記失活の条件は、６５℃以上に加熱することを含み、
Ａ−７）前記糖鎖遊離酵素は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ，ペプチド−Ｎ４−（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、Ｅｎｄｏ  Ｈまたは等価物であり、
前記糖鎖遊離酵素の反応条件は、２５℃〜４２℃である。【０１９３】
さらに好ましい形態では、以下の工程のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする方法：
Ａ−１）試料である血清をフィルタープレートに提供する工程；
Ａ−２）１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）または１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）／重炭酸アンモニアを該試料に加えて、２５〜４２℃で５〜６０分間反応させる工程；
Ａ−３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を該試料に加えて、５０〜８０℃で１０〜６０分間反応させ、その後室温に冷却する工程；
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を該試料に加えて、室温、暗所にて０．５〜２時間反応させる工程；
Ａ−５）トリプシンを該試料に加えて、２５〜４２℃で３０〜１２０分間反応させる工程；
Ａ−６）該試料を１〜１０分間、８０〜１００℃に加熱し、その後室温に冷却する工程；
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦを加えて、２５〜４２℃で６〜２４時間反応させる工程。【０１９４】
ある実施形態では、上記方法は、試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製するために使用される。【０１９５】
以上の好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０１９６】
（遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製方法）
本発明はまた、遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製方法を提供する。この方法は、以下の工程：
Ｂ−１）試料を、糖鎖捕捉ビーズと接触させて、該試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件下に置いて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）タンパク質変性剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程；
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）ビーズ上の糖鎖捕捉剤の塩遊離剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、その後該塩遊離剤を吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）保護化剤を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置く工程
Ｂ−６）酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）反応有機溶媒を該捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）該ビーズの水分および溶媒を除去する工程；
Ｂ−９）アルキルエステル化剤を該捕捉糖鎖試料に加え、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、シアル酸のカルボン酸をアルキル化する工程；
Ｂ−１０）該反応有機溶媒を該捕捉糖鎖試料に加え、該反応有機溶媒を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）該捕捉糖鎖試料を洗浄して、その後洗浄残液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）該捕捉糖鎖試料から、糖鎖試料を遊離させる工程であって、ここで、タグ化が必要な分析をする場合、該捕捉糖鎖試料中の糖鎖を標識試薬によりタグ化し，ビーズより遊離させる工程；
Ｂ−１３）遊離された該糖鎖試料を溶解して糖鎖試料溶液を生成する工程；
を包含する。【０１９７】
好ましい実施形態では、前記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらに特徴とする方法：
Ｂ−１）において
前記ビーズは、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含む糖鎖捕捉基が結合したビーズまたは磁性ビーズであり、
前記試料中の遊離糖鎖と該ビーズとが結合する条件は、２５〜８０℃である
Ｂ−２）前記変性剤は、塩酸グアニジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムまたは等価物であり、
前記反応条件は、室温に加え，ビーズを十分に膨潤させる保温を行う（１０秒から５分）ものであり；
Ｂ−３）前記洗浄は、水を用い；
Ｂ−４）前記ビーズ上の糖鎖捕捉剤は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体であり、前記塩遊離剤は、ヒドラジドの場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり、Ｎ−アルキルアミノオキシ基の場合は、トリエチルアミンまたは等価物であり；
Ｂ−５）
前記保護化剤は、無水酢酸、無水コハク酸、他の酸無水物または等価物であり、
前記反応条件は、無水酢酸／メタノール  １５〜３７℃でであり
Ｂ−６）前記酸は、塩酸、または他の無機塩酸、あるいは等価物のｐＨ２〜３の酸であり、
Ｂ−７）前記反応有機溶媒への置換の前に、親水性有機溶媒に置換する工程を含み、該親水性有機溶媒は、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトニトリルまたはアセトンであり、前記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物である、
Ｂ−８）該ビーズの水分および溶媒を除去する工程は、濾紙、吸い取り紙、ガーゼ、タオル、手ぬぐい、テイッシュペーパーまたは綿つきシートでの底拭きを含む；
Ｂ−９）前記アルキルエステル化剤は、メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）、エチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＥＴＴ）、ブチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＢＴＴ）または等価物であり、
前記反応条件は、１００  ｍＭ  ＭＴＴ／ジオキサン，２０〜８０°Ｃ、３０分〜５時間であり；
Ｂ−１０）前記反応有機溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたは等価物である；
Ｂ−１１）前記洗浄は、メタノール、ＮａＣｌ溶液および水からなる群より選択される少なくとも１つを用い；
Ｂ−１２）前記タグ化が行われ、前記タグ化は、紫外・可視光を吸収する発色団、蛍光を発する構造を有するタグ、他分子と相互作用しうる分子を有するアフィニティータグ、官能基と特異的に反応する官能基を有するタグ、疎水性構造に官能基を有するタグまたは金属イオン配位子を有するタグを用いて行われ、該タグ化は、酢酸、アセトニトリル、酢酸緩衝液、または等価物を加えて行われる；
Ｂ−１３）前記タグ化された捕捉糖鎖試料の溶解は、水、水溶液または等価物によって行われる。【０１９８】
さらに好ましい実施形態では、以下の工程のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする方法：
Ｂ−１）捕捉糖鎖試料を、糖鎖捕捉のためのビーズと接触させて、４０〜８０℃にて結合させて捕捉糖鎖試料を生成する工程；
Ｂ−２）塩酸グアニジンを該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、その後反応液を吸引廃棄する工程；
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を水で洗浄して、その後該水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−４）該捕捉糖鎖試料をトリエチルアミンで洗浄して、その後該トリエチルアミンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−５）無水酢酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を１０％無水酢酸／メタノール  室温で１０分〜２時間分という反応条件下に置き、その後該無水酢酸を吸引廃棄する工程
Ｂ−６）塩酸を該捕捉糖鎖試料に加えて、該塩酸を吸引廃棄する工程；
Ｂ−７）メタノールを該捕捉糖鎖試料に加え、該メタノールを吸引廃棄後ジオキサンを該捕捉糖鎖試料に加える工程；
Ｂ−８）綿つきシートにおいて底拭きをする工程；
Ｂ−９）メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）を該捕捉糖鎖試料に加えて、６０〜℃で３０〜１２０（６０）分間反応させる工程；
Ｂ−１０）ジオキサンを該捕捉糖鎖試料に加え、該ジオキサンを吸引廃棄する工程；
Ｂ−１１）該捕捉糖鎖試料をメタノール、ＮａＣｌ溶液、水で順次洗浄して、その後該水を吸引廃棄する工程；
Ｂ−１２）酢酸およびアセトニトリルを該捕捉糖鎖試料に加え、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水を用いて該捕捉糖鎖試料中の糖鎖をタグ化する工程；
Ｂ−１３）タグ化された該捕捉糖鎖試料に水を加えてタグ化糖鎖試料溶液を生成する工程。【０１９９】
別の好ましい実施形態では、前記糖鎖捕捉ビーズは、磁性ビーズであり、前記吸引廃棄に代えて磁場による分離が行われる。【０２００】
ある実施形態では、上記方法は、試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製するために使用される。【０２０１】
以上の好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０２０２】
（プレートによる質量分析において、該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する方法）
別の局面では、本発明は、プレートによる質量分析において、該捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する方法を提供する。この方法は、以下；
Ｃ−１）タグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；ならびに、必要に応じてＣ−２〜Ｃ−６工程を行い
Ｃ−２）有機溶媒を糖鎖が固相に吸着する濃度になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液および該有機溶媒を混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相に応じて該固相担体封入プレートを活性化し洗浄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、該固相担体封入プレートの相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を吸引回収する工程；
該タグ化糖鎖試料溶液をMALDI-TOF MSに供する場合以下のＣ−７）を行い、
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液を質量分析用マトリクスと混合し測定用プレートに点着させる工程；
を包含する。【０２０３】
好ましい実施形態では、前記工程において、以下のうち少なくともいずれか１つをさらに特徴とする方法：
Ｃ−１）前記回収用プレートへの配置は、タグ化のための試薬を取り除く条件で行われる；
Ｃ−２）前記糖鎖が固相に吸着する濃度は、８０〜９０％の有機溶媒であり；
Ｃ−３）前記固相担体封入プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含み；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートの相が順相の場合、水、およびアセトニトリルで順次洗浄し、該固相担体封入プレートの相が逆相の場合、メタノール等低級アルコール、水で順次洗浄する；
Ｃ−５）前記反対の極性を有する溶媒は、順相の場合、疎水性有機溶媒であり、逆相の場合、親水性溶媒である；
Ｃ−６）前記第２の回収用プレートは、マルチウェル型であり、固相抽出のために適切な樹脂または膜の表面を含み；
Ｃ−７）前記質量分析用マトリクスは、２，５−ジヒドロキシ安息香酸または等価物であり、該質量分析用マトリクスへの前記タグ化糖鎖試料溶液の点着は、混合または順次行われ、必要に応じて希釈される。【０２０４】
さらに好ましい実施形態では、以下の工程のうち少なくとも１つの特徴をさらに特徴とする方法：
Ｃ−１）タグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；
Ｃ−２）アセトニトリルを最終濃度８０〜９０％になるように、該回収用プレートから該タグ化糖鎖試料溶液およびアセトニトリルを混合用プレートに配置する工程；
Ｃ−３）順相である該固相担体封入プレートを提供する工程；
Ｃ−４）該固相担体封入プレートを水、およびアセトニトリルで順次洗浄および吸引廃棄する工程；
Ｃ−５）該固相担体封入プレートに該タグ化糖鎖試料溶液を加え、液体を廃棄し、アセトニトリルで洗浄し、さらに１〜２０％アセトニトリルを加える工程；
Ｃ−６）該固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに該ビーズを吸引回収する工程；
Ｃ−７）該タグ化糖鎖試料溶液に２０〜４０％アセトニトリル中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸を加え混合点着させる工程、
を包含する、質量分析用プレートを生成する工程。【０２０５】
別の好ましい実施形態では、前記糖鎖捕捉ビーズは、磁性ビーズであり、前記吸引廃棄に代えて磁場による分離が行われる。【０２０６】
ある実施形態では、上記方法は、試料中の糖鎖を分析するための前処理試料を調製するために使用される。【０２０７】
以上の好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０２０８】
（試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する反応用プレートの作製キット）
本発明は、本発明の試料中の糖鎖を分析する方法の任意の操作を実現するための手段を備える、試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する反応用プレートの作製キットを提供する。そのようなキットの例としては、  Ａ−１）該試料：
Ａ−２）１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）または１−プロパンスルホン酸，２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）／重炭酸アンモニア；
Ａ−３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）；
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）；
Ａ−５）トリプシン；
Ａ−６）加熱手段
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦ
Ｂ−１）糖鎖捕捉ビーズ；
Ｂ−２）塩酸グアニジン；
Ｂ−３）水；
Ｂ−４）トリエチルアミン；
Ｂ−５）１０％無水酢酸／メタノール；
Ｂ−６）塩酸；
Ｂ−７）メタノール；
Ｂ−８）綿つきシート；
Ｂ−９）メチル−ｐ−トリル−トリアゼン（ＭＴＴ）；
Ｂ−１０）ジオキサン；
Ｂ−１１）メタノール、ＮａＣｌ溶液および水；
Ｂ−１２）酢酸およびアセトニトリル、ならびにアミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水；
Ｂ−１３）水；
Ｃ−１）回収用プレート
Ｃ−２）アセトニトリルおよび混合用プレート
Ｃ−３）固相担体封入プレート
Ｃ−４）水、およびアセトニトリル
Ｃ−５）アセトニトリルおよび１〜２０％アセトニトリル
Ｃ−６）第２の回収用プレート
Ｃ−７）２０〜４０％アセトニトリル中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸
を備えるものが例示される。【０２０９】
以上の各特徴は本明細書において記載された好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０２１０】
（試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する分析用プレート）
本発明はまた、本発明の試料中の糖鎖を分析する方法において作製されたプレートも提供する。そのようなプレートは、試料由来の糖鎖および糖鎖捕捉ビーズを包含する分析用プレートともいうことができ、該試料から遊離された糖鎖に結合された糖鎖捕捉ビーズが、該プレートの少なくとも１つの穴に点着され、該糖鎖は、アミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水等のタグ化試薬によってタグ化されたものである。【０２１１】
以上の各特徴は本明細書において記載された好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０２１２】
（試料中の糖鎖分析のためのプレート）
本発明はまた、試料中の糖鎖分析のためのプレートであって、該プレートは、少なくとも１つの分析用の区画を有し、該区画の少なくとも１つに糖鎖捕捉ビーズがあらかじめ分注されたものである、プレートを提供する。プレートとしては、たとえば、９６穴などのマルチウェルプレートまたはフィルタープレートが使用される。図１の１２１（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ  Ｈ）と、図８のＳｔａｒｔ２（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ  ＡＢＣ）において、手で糖鎖捕捉ビーズを手で分注する代わりに、このようなあらかじめ糖鎖捕捉ビーズを分注されたプレートを使用することができる。このようなプレートは、糖鎖の自動分析装置と組み合わせることにより、より便利に分析することができる。【０２１３】
以上の各特徴は本明細書において記載された好ましい実施形態での各特徴は１つ含んでもよく、２つ以上組み合わされてもよい。【０２１４】
（糖鎖自動前処理装置の例示的具体的実施形態）
さらに、以下、本発明に係る糖鎖自動前処理装置を実施するための最良の形態について、図面を参照して説明する。【０２１５】
図１５は本発明の実施形態に係る糖鎖自動前処理装置の一部省略して示した平面図、図１６は分注ヘッドの正面図、図１７は図２中Ａ−Ａ線断面図、図１８は第１恒温槽の中央縦断面図、図１９は第１減圧回収装置とフィルタープレート移動機構の分解斜視図、図２０はフィルタープレート移動機構の一部省略して示した平面図、図２１はフィルタープレート移動機構における上下移動ユニットの一部省略して示した縦断面図、図２２はフィルタープレート移動機構と第２恒温槽の斜視図、図２３は第２恒温槽の中央縦断面図、図２４及び図２５は処理作業のフロー図である。【０２１６】
本発明は、糖鎖精製処理を自動化して高速、高精度で行うことができるようにするものであり、筐体ベース１内に、移動機構１１をもって分注ヘッド２を前後、左右に移動するように設ける。該分注ヘッド２に上下動するように分注針１０、１０、１０・・・を保持する。受台の加熱と冷却を行う手段を備え、受台の上部を蓋で覆う第１、第２の恒温槽１２、２９を設ける。試薬ラック２２、混合用マイクロプレート２３、２４を設ける。前記第２恒温槽２９の前方に第１減圧回収装置２６、第１吸引廃棄装置２７、底拭き２８を並べて配設する。ターゲットプレート受台５９の前方に第２減圧回収装置５６、第２吸引廃棄装置５７を配設する。筐体ベース１に配設した制御装置６０に入力された作業工程により前記各装置を作動させる。【０２１７】
本実施形態に係る糖鎖自動前処理装置は、開閉自在のカバー（図示せず。）を設けた筐体ベース１と、前記筐体ベース１内に設けられ、後記分注ヘッドを前後、左右方向に移動させる分注ヘッド移動機構１１と、一列に並んで保持された複数の分注針を昇降機構によって一斉に上下させる分注ヘッド２と、前記筐体ベース１の設置スペース１ａ上に配設した、マイクロプレートを載受する受台１３の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台１３の上部を中蓋１９を有する蓋体２１で覆うようになした第１恒温槽１２と、前記筐体ベース１の設置スペース上に配設した試薬ラック２２及び複数の混合用マイクロプレート２３、２４と、前記筐体ベース１の設置スペース１ａ上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧し、フィルタープレートのフィルターを通過した液を内部に設置したマイクロプレート２５中に受ける第１減圧回収装置２６、枠形をなし、上部開口にフィルタープレートを載せた状態において減圧吸引し、フィルターを通過した液を廃棄する第１吸引廃棄装置２７、フィルタープレートを載受する受台３０の加熱と冷却を行う手段を備え、該受台３０の上部を自動的に開閉する蓋体３８で覆うようになした第２恒温槽２９と、フィルタープレートを保持し、フィルタープレートを前記第１減圧回収装置２６、第１吸引廃棄装置２７、第２恒温槽２９の夫々に順次移動させるフィルタープレート移動機構３９と、前記筐体ベース１の設置スペース１ａ上に前後方向に一列に並んで配設した、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧し、ＳＰＥプレートの固相体を通過した液を内部に設置したマイクロプレート５５中に受ける第２減圧回収装置５６、枠形をなし、上部開口にＳＰＥプレートを載せた状態において減圧吸引し、固相体を通過した液を廃棄する第２吸引廃棄装置５７、上面に最終処理工程を終了した試料を点着するターゲットプレート５８を載受するターゲットプレート受台５９と、ＳＰＥプレートを保持し、前記第２減圧回収装置と第２吸引廃棄装置との間で移動させるＳＰＥプレート移動機構３９′と、前記筐体ベース１に設置し、作業工程を入力した制御装置６０と、複数のウエルがマトリックス配列され、生体試料を各ウエルに注入した状態においてアルミシートで覆うマイクロプレート６１と、複数のフィルターがマトリックス配列されたフィルタープレート６２と、複数の固相体がマトリックス配列された微量の試料用のＳＰＥプレート（図示せず。）とを備え、前記制御装置６０に入力された作業工程により前記各装置を作動させるようになしたことを特徴とするものである。【０２１８】
また、上記構成において、必要に応じ、第１吸引廃棄装置２７と第２恒温槽２９の間に、平面状の払拭材を上面に設け、フィルタープレートの底部下面に付着している液を払拭するための底拭き２８を設けてもよい。【０２１９】
また、上記構成における分注ヘッド移動機構１１は、モータやレールを用いた周知の移動機構を採用すればよい。【０２２０】
また、前記分注ヘッド２は、支承枠３と、該支承枠３に分注針と平行に設けたガイド杆４に沿って上下方向に摺動する昇降台５と、前記支承枠３に固定した駆動モータ６と、該駆動モータ６の回転軸に接続したボールネジ７をもって前記昇降台５を上下方向に移動させる昇降台移動機構８と、前記昇降台５に設けた分注針ホルダー９に保持された分注針１０、１０、１０・・・とをもって構成された分注ヘッドである。【０２２１】
また、本実施形態にあっては、前記分注ヘッド２における支承枠３の下部に垂直に下向きにシリンダー２Ａを固定すると共に該シリンダー２Ａのピストンロッドの先端に加圧プレート２Ｂを固着している。このようになした場合には、第１、第２減圧回収装置２６、５６並びに第１、第２吸引廃棄装置２７、５７において減圧吸引を行うときに、フィルタープレートやＳＰＥプレートを上から押さえつけることにより気密性を高めることができ、効率が向上する。【０２２２】
また、前記第１恒温槽１２は、アルミブロックからなる受台１３の内部中央にカートリッジヒータ１４を内蔵すると共に該受台１３の下部にペルチェ１５及びヒートシンク１６を配置して本体部１２Ａを構成し、該本体部１２Ａにおける受台１３の上部を、内側に、シリコンシート１７を貼設し、内部中央にカートリッジヒータ１８を内蔵した中蓋１９をスプリング２０を介して弾性的に支持してなる蓋体２１で覆うようになした第１恒温槽である。尚、該第１恒温槽１２は、本実施形態では手動で蓋体１７の開閉を行うようにしているが、自動的に行うようにしてもよい。また前記シリコンシート１７は、分注針１０、１０、１０・・・によってマイクロプレート６１のアルミシート６１ａに穿孔されたとき、内部の試料が蒸発することを防止するためのものである。【０２２３】
また、前記フィルタープレート移動機構３９は、前記筐体ベース１に前後方向に沿って立設した支承板４０の長さ方向の両端部にプーリ４１、４２を取付けると共に、該プーリ４１、４２の一方をステッピングモータ４３をもって回転駆動させるようになし、該両プーリ４１、４２間に掛け回したベルト４４に水平移動板４５を連結し、該水平移動板４５上に上下移動ユニット４６を設け、該上下移動ユニット４６を、上端部に中枠４７を受ける受枠４８を水平に支持し、支承枠４９内に垂直に設けたガイド５０に沿って上下方向に摺動する垂直移動杆５１と、支承枠４９内に固定したモータ５２の回転軸５２ａに連結したボールネジ５３をもって昇降し、前記垂直移動杆５１に接続した昇降作動杆５４とをもって構成してなる移動機構である。また、前記中枠４７と受枠４８との間には気密を保持するためのパッキン４７ａ、４８ａが取り付けられている。【０２２４】
また、ＳＰＥプレート移動機構３９′は、前記フィルタープレート移動機構と同一の構成であるから、説明は省略する。【０２２５】
また、前記第２恒温槽２９は、アルミブロックからなる受台３０の内部中央にカートリッジヒータ３１を内蔵すると共に内部中央から上面にかけて空気の循環路３２を設け、該受台３０の下部にペルチェ３３及びヒートシンク３４を配置して本体部２９Ａを構成し、該本体部２９Ａにおける受台３０の上部とこれに載置するフィルタープレートとの間に前記空気の循環路３２に連通する空気の循環路３５を設け、更にダクト３６及びファン３７を設けて前記フィルタープレートの外に流出した空気を再び受台３０内に流入させて循環させるようになし、前記本体部２９Ａにおける受台３０の上部を蓋体３８で覆うようになした第２恒温槽である。また、該第２恒温槽２９は、蓋体３８を自動的に開閉するようになしている。【０２２６】
次に、上記実施形態に係る糖鎖自動前処理装置の処理作業について、図２４及び図２５に示したフロー図に従って説明する。
＜以下では、工程番号との対応も記載される。＞
１．筐体ベース１のカバーを開いて、生体試料を各ウエルに注入した状態においてアルミシートで覆ったマイクロプレート６１を、第１恒温槽１２を開いてその受台１３上に置く。
（以上は、おおむね工程Ａ−１）に対応する。）
２．分注ヘッド２を移動させて試薬ラック２２の容器中から０．３３Ｍ重炭酸アンモニア１５μｌを吸引し、移動して前記マイクロプレート６１の各ウエルに分注する。【０２２７】
３．２．と同様にして０．４％可溶化剤を３０μｌ分注する。【０２２８】
４．第１恒温槽１２を閉じて３７°Ｃで１０分加温する。
（以上は、おおむね工程Ａ−２）に対応する。）
５．蓋を開いて１２０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を５μｌ（ＣＶ（Ｃｏｅｆｆｃｉｅｉｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）５％）分注する。【０２２９】
６．蓋を閉じて６０°Ｃで３０分加温する。【０２３０】
７．蓋を開いて室温で冷却する。
（以上は、おおむね工程Ａ−３）に対応する。）
８．１２３ｍＭ  ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を１０μｌ（ＣＶ５％）分注する。【０２３１】
９．室温、暗所で６０分冷却する。
（以上は、おおむね工程Ａ−４）に対応する。）
１０．蓋を開けた第１恒温槽１２内に再セットしたマイクロプレート６１の各ウエルに、トリプシン  ４００Ｕ、５μｌ分注する。【０２３２】
１１．蓋を閉じて３７°Ｃで６０分加温する。【０２３３】
１２．更に、９０°Ｃで５分加温する。【０２３４】
１３．蓋を開いて室温で冷却する。
（以上は、おおむね工程Ａ−５）に対応する。）
１４．マイクロプレート６１の各ウエルにペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ，ペプチド−Ｎ４−（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、２Ｕ、５μｌ分注する。【０２３５】
１５．蓋を閉じて３７°Ｃで１２時間加温する。
（以上は、おおむね工程Ａ−６）に対応する。）
１６．吸引廃棄装置２７にセットされたポリマービーズ入りのフィルタープレート６２の各ウエルに１Ｍ酢酸（ＡｃＯＨ）を２００μｌ分注する。【０２３６】
１７．吸引廃棄する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−１）に対応する。）
１８．５０％ＡＣＮを３００μｌ分注する。【０２３７】
１９．吸引廃棄する。【０２３８】
２０．ＡＣＮを３００μｌ分注する。【０２３９】
２１．吸引廃棄する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−２、３）に対応する。）
２２．ポリマービーズ入りのフィルタープレート６２を底拭き３８の位置に移動させ、底拭きを行う。フィルタープレートを第２恒温槽２９に移動させる（恒温槽は自動的に開く。）。【０２４０】
２３．サンプルを酵素処理したもの２０μｌを、第２恒温槽２９を開いて受台３０に置いたポリマービーズ入りのフィルタープレート６２に分注する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−４）に対応する。）
２４．２％ＡｃＯＨ／ＡＣＮを２００μｌ分注する。【０２４１】
２５．蓋を閉じて８０°Ｃで６０分加温する。【０２４２】
２６．６Ｍ塩酸グアニジンを３００μｌ分注する。【０２４３】
２７．開いた状態で室温で１０分冷却する。【０２４４】
２８．フィルタープレート６２を吸引廃棄装置２７に移動させる。【０２４５】
２９．吸引廃棄する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−５）に対応する。）
３０．６Ｍ塩酸グアニジンを３００μｌ分注する。【０２４６】
３１．吸引廃棄する。【０２４７】
３２．水を３００μｌ分注する。【０２４８】
３３．吸引廃棄する。【０２４９】
３４．１０Ｍ塩酸を３００μｌ分注する。【０２５０】
３５．吸引廃棄する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−６）に対応する。）
３６．ＭｅＯＨを３００μｌ分注する。【０２５１】
３７．吸引廃棄する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−７）に対応する。）
３８．フィルタープレート６２を底拭き２８の位置に移動させ、底拭きを行う。【０２５２】
３９．フィルタープレート６２を第２恒温槽２９に移動させる。
（以上は、おおむね工程Ｂ−８）に対応する。）
４０．還元試薬を２００μｌ分注する。【０２５３】
４１．遮光、室温で３０分冷却する。【０２５４】
４２．フィルタープレート６２を吸引廃棄装置２７に移動させる。【０２５５】
４３．吸引廃棄する。【０２５６】
４４．ＭｅＯＨを３００μｌ分注する。【０２５７】
４５．吸引廃棄する。【０２５８】
４６．フィルタープレート６２を底拭き２８の位置に移動させ、底拭きを行う。【０２５９】
４７．水を３００μｌ分注する。【０２６０】
４８．吸引廃棄する。【０２６１】
４９．ＡＣＮを３００μｌ分注する。【０２６２】
５０．吸引廃棄する。【０２６３】
５１．底拭きを行う。【０２６４】
５２．フィルタープレート６２を第２恒温槽２９に移動させる。【０２６５】
５３．１００ｍＭＭＴＴｉｎＤＭＳＯ／ＡＣＮを１００μｌ分注する。【０２６６】
５４．蓋を閉じて６０°Ｃで６０分加温する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−９）に対応する。）
５５．フィルタープレート６２を吸引廃棄装置２７に移動させる。【０２６７】
５６．吸引廃棄する。【０２６８】
５７．ＡＣＮを３００μｌ分注する。【０２６９】
５８．吸引廃棄する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−１０）に対応する。）
５９．フィルタープレート６２を底拭き２８の位置に移動させ、底拭きを行う。【０２７０】
６０．フィルタープレート６２を吸引廃棄装置２７に移動させる。【０２７１】
６１．水を３００μｌ分注する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−１１）に対応する。）
６２．吸引廃棄する。【０２７２】
６３．５０ｍＭＤＴＴを５０μｌ分注する。【０２７３】
６４．フィルタープレート６２を第２恒温槽２９に移動させる。【０２７４】
６５．蓋を閉じて６０°Ｃで５分加温する。【０２７５】
６６．蓋を開き、室温で１５分冷却する。【０２７６】
６７．フィルタープレート６２を減圧回収装置２６に移動させる。【０２７７】
６８．減圧してマイクロプレート２５内に引き落として回収する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−１２）前半に対応する。）
６９．１０°Ｃに冷却して終了。【０２７８】
以降試料の量によって処理手順が分かれる
〔試料が充分ある場合〕
７０．マイクロプレート２５内の試料を、混合用マイクロプレート２４に分注する。【０２７９】
７１．混合用マイクロプレート２４にＭＡＬＤＩマトリックスを２μｌ分注する。【０２８０】
７２．混合用マイクロプレート２４内の試料をターゲットプレート受台５９上のターゲットプレート５８上に２μｌ点着する。
（以上は、おおむね工程Ｂ−１２）後半に対応する。）
７３．終了。
（以上は、おおむね工程Ｂ−１３）に対応する。）
〔試料が微量の場合〕
７４．マイクロプレート２５内の試料を、混合用マイクロプレート２３に２０μｌ分注する。【０２８１】
７５．混合用マイクロプレート２３にＡＣＮを４００μｌ分注する。【０２８２】
７６．吸引廃棄装置５７に位置するＳＰＥプレートに水を２００μｌ分注する。【０２８３】
７７．吸引廃棄する。【０２８４】
７８．ＳＰＥプレートにＡＣＮを２００μｌ分注する。【０２８５】
７９．吸引廃棄する。【０２８６】
８０．ＳＰＥプレートに、混合用マイクロプレート２３内の試料を４２０μｌ分注する。【０２８７】
８１．吸引廃棄する。【０２８８】
８２．ＳＰＥプレートに９５％ＡＣＮを２００μｌ分注する。【０２８９】
８３．吸引廃棄する。【０２９０】
８４．ＳＰＥプレートに１０％ＡＣＮを２０μｌ分注する。【０２９１】
８５．ＳＰＥプレートを減圧回収装置５６に移動させる。【０２９２】
８６．減圧してマイクロプレート５５内に引き落として回収する。【０２９３】
８７．マイクロプレート５５内の試料を、２μｌ混合用マイクロプレート２４に分注
する。【０２９４】
８８．混合用マイクロプレート２４にＭＡＬＤＩマトリックスを２μｌ分注する。【０２９５】
８９．混合用マイクロプレート２４内の試料をターゲットプレート受台５９上のターゲットプレート５８上に２μｌ点着する。【０２９６】
９０．終了。【０２９７】
Ｃ）プレートによる質量分析を行う場合、上記捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程を行う。【０２９８】
９１．７３．までで得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する工程；ならびに、必要に応じて９２．〜９３．を行う。【０２９９】
９２．有機溶媒を糖鎖が固相に吸着する濃度になるように、上記回収用プレートから上記タグ化糖鎖試料溶液および上記有機溶媒を混合用プレートに配置する。【０３００】
９３．固相担体封入プレートを提供する。【０３０１】
９４．上記固相担体封入プレートの相に応じて上記固相担体封入プレートを活性化し洗浄する。【０３０２】
９５．上記固相担体封入プレートに上記タグ化糖鎖試料溶液を加え、上記固相担体封入プレートの相に応じた極性を有する溶媒に馴化させる。【０３０３】
９６．上記固相担体封入プレートから第２の回収用プレートに上記タグ化糖鎖試料溶液を吸引回収する。【０３０４】
上記タグ化糖鎖試料溶液をMALDI-TOF MSに供する場合以下を行う。【０３０５】
９７．上記タグ化糖鎖試料溶液を質量分析用マトリクスと混合し測定用プレートに点着させる。【０３０６】
９８．測定されるべき糖鎖の分析を実行する。この分析は、本明細書に記載されるように、任意の公知の方法を用いることができる。【０３０７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０３０８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０３０９】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。【０３１０】
（実施例１：ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭ：迅速かつ大規模な臨床グライコミクスのための統合型グライコブロッティング技術）
必要に応じて以下の略語を用いる。【０３１１】
ＣＤＧ：先天的糖鎖不全症
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＨＣＣ：肝細胞癌
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型
（実験手順）
（材料）
本実施例の臨床研究は、北海道大学病院の地方倫理委員会により承認された。すべての血清ドナーから、インフォームドコンセントを得た。ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。３−メチル−１−ｐ−トリルトリアゼン（ＭＴＴ）、８Ｍボラン−ピリジン錯体、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭは、別途記載されるように調製した。これは、現在は、住友ベークライト株式会社（日本国、東京都）から市販されている。他の試薬および溶媒は、そうではないと記載されてない限りは、和光純薬工業株式会社（日本国、東京都）から得た。ＣＤＧ患者の血清は、Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＨ．Ｈ．Ｆｒｅｅｚｅ教授により親切にも提供された。【０３１２】
（ヒト血清からのＮ−グリカンの遊離）
全ヒト血清を、本発明者らのグループによって以前に報告された条件（Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J. I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.，andNishimura，S. I. (2007)  Mol. Cell. Proteomics 6，1437-1445.）に従って処理して、還元型Ｎ−グリカンを遊離させた。簡単に述べると、１０μｌの血清アリコートを、界面活性剤と１０ｍＭ  ＤＴＴとを含む８３ｍＭ炭酸水素アンモニウムの中に６倍希釈した。６０℃にて３０分間のインキュベーションの後、１容積（１０μｌ）の１２３ｍＭヨードアセトアミドを添加し、その混合物を、暗中で室温にて１時間インキュベートした。この溶液に、４００ユニットのトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、その混合物を３７℃にて１時間インキュベートした。トリプシンを熱不活化した後、その混合物に２ユニットのＰＮＧａｓｅ  Ｆを添加して、３７℃にて一晩インキュベートした。消化混合物における全遊離Ｎ−グリカン（中性グリカンおよびシアリルグリカン）を、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズによる以下のグライコブロッティングに直接使用した。【０３１３】
（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭによるグライコブロッティングの一般的プロトコル）
４０μｌのＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズ（５０％懸濁物）を、フィルタープレートＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルに分注した。それらのビーズを、減圧マニホルドを使用して、１Ｍ水性酢酸（ＡｃＯＨ）、５０％水性アセトニトリル、アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いて順次洗浄した。トリプシンとＰＮＧａｓｅ  Ｆとで消化した２０μｌの全血清サンプル（２．５μｌの血清と等価である）を、このウェルに移し、その後、アセトニトリル中の２％  ＡｃＯＨ  ２００μｌを添加した。このプレートを、窒素ガス流を用いないＴｕｒｂｏＶａｐ  ９６濃縮機（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）中にて８０℃でインキュベートして乾燥させた。通常は３０分間かかった。このプレートを、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の６Ｍ塩酸グアニジン  ３００μｌで３回洗浄し、その後、３００μｌの水で３回洗浄した。ビーズ上でのメチルエステル化の後（Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J. I.，Nagahori，N.，and Nishimura，S. I.(2007) Chem. Eur. J. 13，4797-4804）、そのビーズを、３００μｌの１０ｍＭ  ＨＣｌ、５０％水性アセトニトリル、およびアセトニトリルを順次用いて洗浄した。このウェルを、ジメチルスルホキシド−ＡＣＮ（１：１）中の１００ｍＭ  ３−メチル−１−ｐ−トリルトリアゼン  １００μｌとともに６０℃にて６０分間インキュベートした。減圧を適用することによってその溶液を取り除き、その後、ビーズを、ＡＣＮ、水、およびＭｅＯＨ（３×３００μｌ）で順次洗浄した。オリゴ糖とビーズ上の蛍光プローブとの間でのヒドラゾン結合を、以前に報告された方法Lohse，A.，Martins，R.，Jorgensen，M.R.，and Hindsgaul，O. (2006) Solid-phase oligosaccharide tagging (SPOT):Validation on glycolipid-derived structures. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.45，4167-4172）に従って、還元剤（０．８Ｍボラン−ピリジン）とのインキュベーションによって安定化させた。この還元は、暗中で室温にて３０分間かけて実施した。その反応混合物を除去した後、ビーズを、ＭｅＯＨ、ＡＣＮ、および水（３×３００μｌ）で順次洗浄した。このウェルに、５ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の５０ｍＭ  ＤＴＴ  ５０μｌを添加し、そのプレートを、６０℃にて５分間インキュベートし、室温にてさらに１５分間インキュベートした。上記ように処理した濃縮Ｎ−グリカンを、ＤＴＴ溶液中のビーズから回収した。【０３１４】
（質量分析法）
ＤＴＴ溶液中にある回収したＮ−グリカン（０．５μｌ）を、標的プレートであるＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ  ４００／３８４（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に直接配置し、等容積のマトリックス溶液（ＤＨＢとＤＨＢナトリウム塩との９：１混合物（各々３０％  ＡＣＮ中１０ｍｇ／ｍｌ））と混合し、減圧下で乾燥して、分析物結晶を得た。その質量スペクトルを、ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）をｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅにて用いて、代表的には、１００×５ショットを合計して、得た。【０３１５】
（統計分析）
本研究において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルにおける最大４４個のＮ−グリカンピークを、ソフトウェアであるＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎ）を使用して選択した。すべての統計分析は、そうではないと記載されない限り、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｂｏｘを用いてＭＡＴＬＡＢ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．４）（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）言語にて元々開発されたものを使用して実施した。【０３１６】
（ＣＤＧケース）
各サブタイプを繰り返し（ｎ＝６）測定した。なぜなら、各サンプルたった１つだけしか、これらのサブタイプのための利用可能ではなかったからである。各グリカンの同位体ピーク面積を、既知量の内部標準（Ａ２アミドグリカン）に対して正規化した。ＣＤＧ−Ｉサブタイプと正常コントロールとの区別のために使用され得るＮ−グリカンを同定するために、本発明者らは、期待値最大化アルゴリズムを使用する分類を実施した。このアルゴリズムは、最尤評価法の反復工程において、種々のデータ分布混合物を分離する（Redner，R. A.，and Walker，H. F. (1984) Soc. Indust. Appl. Math.Rev. 26，195-239.）。臨床前成分分析（ＰＣＡ）を、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＡ）を使用して実施した。本発明者らは、最初の２つの主要成分をプロットした。【０３１７】
（ＨＣＣケース）
計算のためのカットオフラインを、全面積のうちの０．３％として規定した。スチューデントｔ検定を使用して、正常状態に対する疾患状態の統計学的差を計算した。差は、Ｐ＜０．００１である場合に統計学的に有意であると見なした。疾患状態および正常状態という２つの状態の間で血清を最適に分類するための本質的特徴を同定するために、本発明者らは、連続的前進的選択アルゴリズムを適用した。このアルゴリズムは、ｋ−最近傍識別器（ｋ＝３）の一つ抜き法（ＬＯＯ）の誤り率に基づいて、Ｎ−グリカンピークのより良い組み合わせを順次選択した。【０３１８】
（結果）
（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭベースの臨床グライコミクスの原理的説明）
本明細書に記載の新規な方法は、何ら特別な訓練を積まなくても、複合型糖結合体の濃縮分析についての極めて簡便かつ好都合なアプローチを提供し得る（図１０ａ）。「オールインワン」プロトコルを確立するために、本発明者らは、多機能性分子プローブであるＮ−（２−アミノベンゾイル）システインヒドラジド（ＡＢＣｈ）を設計し、この結合体をチオプロピルセファロース６Ｂと結合させて、安定なヒドラジド官能化ポリマー支持体（すなわち、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズ（図１０ｂ、（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズの合成および特徴付け）以降の説明を参照および以下のスキーム１）を得るために使用した。
（表２）ＡＢＣｈ（Ｎ−（２−アミノベンゾイル）システインヒドラジド）の合成経路およびＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズの調製【０３１９】
【表２】
0005396277.tif 000012
【０３２０】
このヒドラジド基は、還元ヘミアセタール末端を有する糖質を除いて、一般的な生物学的サンプル中で非常にまれであるアルデヒド基またはケトン基と反応する。ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズとグリカンとの間のヒドラゾン結合の形成は、可逆的であり、部分還元糖の放出を可能にする。さもなければ、安定なＣ−Ｎ結合を変換するために還元されうる（Lohse，A.，Martins，R.，Jorgensen，M. R.，and Hindsgaul，O. (2006)  Angew.Chem. Int. Ed. Engl. 45，4167-4172）。この化学的性質は、種々の試薬（例えば、ジチオスレオトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド、界面活性剤など）を含む、プロテオミクスサンプル調製において使用される種々のアミンおよび試薬の存在下ですら、複雑な生物学的材料から糖質を富化するために適している。本発明者らの方法によって、シアル酸を全く失わずに、一般的なＮ結合型オリゴ糖の定量的なライゲーションが生じた。チオプロピルセファロース６ＢとＡＢＣｈプローブとを結合するジスルフィド結合は、溶出緩衝液中でＤＴＴで処理することによって富化されたＮ−グリカンの定量的回収を可能にした。この回収されたサンプルは、中性糖質および酸性糖質を含み、ＨＰＬＣおよびＭＳ分析適用のいくつかを使用して以下の定量的分析のためにすぐに使用可能である。【０３２１】
インタクトな中性グリカンおよびシアル化グリカンは上記の方法によって回収されるが、シアル化オリゴ糖は、それらの負電荷によって一般的なＭＳ分析で分解してしまうことが公知である。シアル酸の安定化は、シアリルオリゴ糖の定量的ＭＳ分析に必須であるので、３−メチル−１−ｐ−トリルトリアゼン（ＭＴＴ）によるシアル酸残基の簡便なＯ−メチルエステル化をプロトコルに組み込んだ。ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズによる安定なヒドラゾン結合を介する総Ｎ−グリカンの捕捉に際して、シアル酸のビーズ上でのメチルエステル化およびヒドラゾン結合のビーズ上での還元を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおけるポジティブリフレクターモード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ）で中性グライコフォームおよび酸性グライコフォームの両方について信頼性の高い／再現性の高い質量測定を可能にするために行った。【０３２２】
新規な方法を例示するために、ヒト血清（２．５μｌ）を、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズを使用して最適化したプロトコルに供した。２５ｎｌの血清に等しい「すぐ分析できる」サンプル溶液の一部を、標的プレートに直接沈着させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供した（ポジティブリフレクターモード）。本発明者らは、４４種類のＮ−グリカン（図１１Ａ、表３）を定量した。ヒト血清由来の４４種のＮ−グリカンを、本研究における標的とした。ピーク３３は、定量のために入れられた内部標準である。組成の注釈および略記の欄に示した推定構造は、ＧｌｙｃｏＳｕｉｔｅオンラインデータベース、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ／ｇｌｙｃｏｄｂ）によって得た。【０３２３】
【表３】
0005396277.tif 000013
【０３２４】
これらのグリカンは、全サンプルにおいて検出可能であり、これらの量を、内部標準としてピーク番号３３（スパイクすなわち急上昇したＡ２アミド）に対して正規化した。一旦Ｎ−グリカンが全血清糖タンパク質のＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理（Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J. I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.，andNishimura，S. I. (2007) Mol. Cell. Proteomics 6，1437-1445.）によって利用可能になると、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの慣用的な操作で全体のＮ−グリカンプロフィールを同定するために４時間未満の時間しかかからない。この固相プロトコルは、単一の自動化ワークフローにおける「オールインワン」グライコブロッティング技術の初めての例であることに注目すべきである。本発明者らは、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用する自動化グライコブロッティングに適したサンプル処理機を研究開発している最中である。実際に、このＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭに基づく「オールインワン」グライコブロッティングプロトコルは、ヒト血清適用のために最適化されたフロー図の下で標準的なマルチウェルフィルタープレート形式と併用することにより、自動化プラットフォームに予備的に移されうる（図８）。この自動化プロトコルの有効性は、同じヒト血清消化物を同時に実施することによって評価した（図１４）。そして良好な再現性によってその正確な信頼度を確認した（表４）。【０３２５】
（表４）ＣＶ；変動計数
酸処理による還元糖形態のオリゴ糖を回収するために、自動化グライコブロッティングではヒドラゾン結合が還元されず、表３および表４の質量と比較して−２Ｄａの質量の差異を生じることに注意されたい。【０３２６】
【表４】
0005396277.tif 000014
【０３２７】
（先天的糖鎖不全症（ＣＤＧ）における変化の検出）
全血清タンパク質中のＮ−グリカンの検出およびプロフィール決定は、先天的な変化および後天的な変化によって引き起こされる異常なタンパク質グリコシル化の迅速な同定にとって非常に有益である。本発明者らは、タンパク質グリコシル化における変化によって特徴付けられる遺伝的なヒトの障害のグループ（Mandato，C.，Brive，L.，Miura，Y.，Davis，J. A.，Di Cosmo，N.，Lucariello，S.，Pagliardini，S.，Seo，N.S.，Parenti，G.，Vecchione，R.，Freeze，H. H.，and Vajro，P. (2006) Pediatric Res.59，293-298.）であるまれな疾患の先天的糖鎖不全症（ＣＤＧ）に罹患している患者由来の血清に対して本発明者らの技術を試験した。これまで、１９の亜群を超えるＣＤＧが同定されてきた（Freeze，H.H.，and Aebi，M. (2005)  Curr. Opin. Struc. Biol. 15，490-498.）。これらＣＤＧは、タンパク質結合糖鎖の排除（１型ＣＤＧ）または未熟なプロセシング（２型ＣＤＧ）から引き起こされる、Ｎ−グリカン前駆体または特定の型のＮ−グリカンアセンブリの生合成いずれかの欠損から生じる。本発明者らのグライコブロッティング技術は、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに基づくが、本発明者らは、患者由来の全血清糖タンパク質において異常なグリコシル化パターンを検出することができた。各分析を６回反復し（ｎ＝６）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルにおけるピーク面積を、内部標準であるＡ２アミドの所定量に対して正規化した。予測されるように、グリコシル化欠損の具体的な段階を経た２型ＣＤＧ（ＣＤＧ−ＩＩ）患者については、本発明者らは、異常なＮ−グリカンプロフィール（例えば、いくつかの未成熟な小型Ｎ−グリカン鎖を観察した（図１１Ｂ、ｉｖ〜ｖｉｉの増加）［ＣＤＧ−ＩＩｘ，ＣＤＧ−ＩＩの未分類亜型］。他方、１型ＣＤＧ（ＣＤＧ−Ｉ）患者血清から富化されたＮ−グリカンは、正常被験体に極めてよく似たＮ−グリカンプロフィールを示した（図１１Ｂ  ｉｉ、ｉｉｉ）。しかし、その結果はまた、正常ドナー（１０１１±６９μＭ）と比較して、総Ｎ−グリカンの有意な減少を示した（ＣＤＧ−Ｉａ患者およびＣＤＧ−Ｉｂ患者それぞれにつき、５７５±４６μＭおよび６９２±４１μＭ；また表４を参照のこと）。このことは、ＣＤＧ−Ｉにおける欠損が、前駆体生合成ができないことにある程度起因して、グリカン鎖全体を失うことになることを明らかに示唆する。【０３２８】
ＣＤＧ−Ｉ患者の診断マーカーにおける定量的グライコミクスの利点は明らかである。なぜなら、検出される４２種類のＮ−グリカンの量によって形成されるデータ分布が正常血清からの患者の簡便な差別化のために使用されうるからである（図１１Ｃ、左側パネルおよび中央パネル）。この結果によって、Ｎ−グリカンの量の組み合わせの対は、ＣＤＧ−Ｉ患者、ＣＤＧ−Ｉａ患者とＣＤＧ−Ｉｂ患者との間の診断上の差異を立証することが明らかにされた（図１１Ｃ、右側パネル）。さらに、本発明者らは、複雑なマルチスペクトルデータセットを解釈するために、獲得した総Ｎ−グリカンプロフィールのＣＤＧ亜系全ての主要成分分析（ＰＣＡ）を使用した。最初の２つの主要成分は、正常ドナーを含むＣＤＧ亜系を明らかに区別した。これらの結果から、全血清Ｎ−グリカンセットのプロフィールによって、健常コントロールから区別されるのと同様に、ＣＤＧの特定の亜系をＣＤＧの他の亜系から明瞭に区別することができることが確認された。【０３２９】
（肝細胞癌の診断的区別）
大規模臨床グライコミクスにおける本プロトコルの融通性を実証するために、本発明者らは、本発明者らの技術を、肝細胞癌（ＨＣＣ）に罹患している複数の患者血清に対して適用した。認識されるように、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に基づくグライコブロッティングプロトコルの使用は、１０３個のヒト血清サンプル（８３名の患者および２０名の正常コントロール）の迅速かつ定量的なＮ−グリカンプロフィール決定を可能にした。本質的な特徴を同定して、２つの関連性のあるクラス、疾患と、正常と間で血清を最適に分類するために、本発明者らは、ｋ最近傍識別子の１つ抜き法（ＬＯＯ）の誤り率（ｋ＝３）に基づいて、Ｎ−グリカンピークのよりよい組み合わせを連続して選択する連続フォワード選択アルゴリズムを適用した（図１２ａおよび図１２ｂ）。本発明者らが、疾患とコントロールとの間で有意差（両側ｔ検定、Ｐ＜０．００１）を示す獲得ピーク間でのあらゆる２ピークの割合を選択した場合、このアルゴリズムは、３つの特徴、すなわち、ＨＣＣサンプルを正常コントロールから１００％の精度で区別した（図１２ａ）Ｎ−グリカン量の割合（図１２ｃ）を最終的に選択した。従って、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭベースの全血清Ｎ−グリカンプロフィール決定は、早期の診断または区別において以前は困難であった疾患についての簡便な非侵襲性の診断ツールを提供することが実証された。【０３３０】
（細胞グライコミクスへの応用）
血清の他に、細胞および組織は、臨床グライコミクスにおいて重要な生物材料である。本発明者らは、培養細胞に対して上記で確立された精製プロトコルを、総細胞Ｎ−グライコフォームを調査するために適合させた。ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞および正常ヒト前立腺上皮ＰｒＥＣ細胞を培養し、それらの全タンパク質抽出物を、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズ処理に供した。血清のＮ−グリカンプロフィールと同様に、総細胞グリコフォームが少量の出発物質（５〜８×１０６細胞）で明らかになった。その結果によって、各細胞株に特有のＮ−グリカンプロフィールが、成功裏に検出され、血清グライコミクスについて上記に示される本発明者らのアプローチが、細胞グライコミクスに対して等しく適していることを示した（図１３）。細胞グライコミクス／組織グライコミクスの最適化は、一般的プロトコルをさらなるハイスループットの特徴に適応しやすいものにすることもできる。【０３３１】
（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズの合成および特徴付け）
一般的方法および材料：全ての市販される出発物質および溶媒は、試薬グレードであり、購入時のまま使用した。２−アミノ安息香酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢｔ）、Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドモノヒドロクロリド（ＷＳＣ）を、ＴＣＩ（日本）から購入した。チオプロピルセファロース６Ｂを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。全ての他の化学物質は、超高純度グレードであり、和光純薬（日本）から購入した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、溶媒としてＤＭＳＯを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−６００  分光計で６００  ＭＨｚにおいて測定した。全ての化学反応を、別段記載されなければ、遮光して窒素雰囲気下、無水溶媒中で行った。ＴＬＣを、Ｍｅｒｃｋプレコートプレート（２０×２０ｃｍ；層厚０．２５ｍｍ；Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４）において行った；スポットを、９０：５：５（ｖ／ｖ／ｖ）のメタノール：ｐ−アニスアルデヒド：濃硫酸の溶液を噴霧し約３０秒間１８０度で加熱することにより、または適用可能である場合には紫外線下（２５６ｎｍまたは３６５ｎｍ）で可視化した。有機抽出物を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶液を５０℃未満で減圧濃縮した。【０３３２】
Ｎ，Ｎ’−（２−アミノベンゾイル）シスチンジメチルエステル３：２−アミノ安息香酸２（８．２２ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコにおいて６０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、アイスバスで冷却した。この溶液に、ＨＯＢｔ（９．１８ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリド１（１０．２３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（８．３７ｍＬ）を添加した。ＷＳＣ（１１．４９ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、この溶液を、アイスバス上で１５分間攪拌し、続いて、室温で一晩攪拌した。反応が完了した後、溶媒をエバポレーションによって除去し、その残渣を、１５０ｍＬのクロロホルム中に溶解した。このクロロホルム溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および飽和ＮａＣｌ水溶液で連続して洗浄し、その有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、その溶媒を、エバポレーションによって除去して、黄色の粉末３を得た（１６．４ｇ、３２．４ｍｍｏｌ、１０８％）。1H NMR (500 MHz，CDCl3) δ: 3.32 (d，J = 5.3 Hz，2 H，CH2)，3.77 (s，3 H，CH3)，5.03(dd，J = 5.3，12.6 Hz，1 H，CH)，3.32 (d，J = 5.3 Hz，2 H，CH2),6.62 (t，J = 7.3 Hz，1 H，Ph)，6.69(d，J = 8.1 Hz，1 H，Ph)，6.98 (bd，J = 6.6 Hz，1 H，NH)，7.20 (t，J = 7.2 Hz，1 H，Ph)，7.43(d，J = 8.0 Hz，1 H，Ph)。【０３３３】
Ｎ，Ｎ’−（２−アミノベンゾイル）シスチンジヒドラジド５：３２０ｍＬのメチルアルコール中の３（１６．０ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（３１．６ｇ、６３１ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温で一晩攪拌し、沈殿物を得た。この沈殿物を濾過によって回収し、３２０ｍＬのメチルアルコールで洗浄した。その残渣を減圧乾燥して、純粋化合物５を得た（１０．８ｇ、２１．３ｍｍｏｌ、６７．４％）。【０３３４】
Ｎ−（２−アミノベンゾイル）システインヒドラジド６：９６ｍＬのアセトニトリル−水（５０％，ｖ／ｖ）中の５（２．４ｇ、４．７４ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｍ  塩酸（１４．２２ｍＬ）を添加し、この溶液を攪拌した。１Ｍ  炭酸水素アンモニウム水溶液（１７．０６ｍＬ）を添加することによってこの溶媒のｐＨを７．０に調節し、次いで、１Ｍ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液（４．７４ｍＬ）を添加し、続いて室温で２時間攪拌した。ＴＬＣ試験で反応が完了した後、この溶液を酢酸エチルで抽出した。この有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、その溶媒をエバポレーションによって除去して、白色粉末６を得た（２．４ｇ、９．４４ｍｍｏｌ、定量）。1H NMR(500MHz,DMSO) δ:2.36 (bs，1 H，SH )，2.84 (m，2 H，CH2)，4.26 (bs，2H，NHNH2)，4.45 (dd，J = 2.1，8.0 Hz，1 H，CH)，6.36 (bs，2 H，PhNH2)，6.52 (t，J = 7.5 Hz，1H，Ph)，6.69 (d，J = 8.2 Hz，1 H，Ph)，7.15 (t，J = 8.2 Hz，1 H，Ph)，7.60 (d，J = 7.9 Hz，1H，Ph)，8.16 (d，J = 7.9 Hz,CHNH)，および 9.21 (s，1 H，NHNH2)。【０３３５】
ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズの調製；１０ｍＬのチオプロピルセファロース６Ｂ樹脂を、使い捨てカラムの中で、０．１Ｍ  炭酸水素アンモニウム水溶液で洗浄した。これらビーズを、６．７ｍＬのアセトニトリル／水（５０％，ｖ／ｖ）中に浸漬し、次いで、アセトニトリル／水（５０％，ｖ／ｖ）（３．３ｍＬ）中のＡＢＣｈの０．１Ｍ溶液を添加した。そのスラリーを室温で３０分間混合した。反応度、そのビーズを、アセトニトリル／水（５０％，ｖ／ｖ）、０．１Ｍ酢酸、およびエタノール／水（２０％，ｖ／ｖ）で十分に洗浄した。得られた物質を、使用時まで、１０ｍＬのエタノール／水（２０％，ｖ／ｖ）の中で４℃で保存した。【０３３６】
（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用することによる細胞グライコミクス）
細胞培養：ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３および正常ヒト前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を、それぞれＨｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ＢａｎｋおよびＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ＰＣ−３細胞を、１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ中で維持した。ＰｒＥＣ細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ（ＰｒＥＧＭＴＭ）  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＲを使用して、製造業者の説明に従って維持した。これら細胞を、３７℃および５％  ＣＯ２において加湿インキュベーター中で培養した。【０３３７】
細胞からのＮ−グリカンの調製：１０ｃｍディッシュにおいて増殖させた細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中で掻き取り、続いてＰＢＳで洗浄した。１．５ｍｌチューブ中に回収した細胞を、６０μｌのＰＢＳ中に懸濁し、１／１０体積の１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加することによって溶解し、氷上に１時間静置した。この溶解物を、１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃において遠心分離した。この上清に、４体積の冷アセトンを添加して、タンパク質性物質を沈殿させ、−２０℃で一晩放置した。１２，０００ｒｐｍで１５分間、４℃において遠心分離することによって沈殿物を回収し、そのペレットを、２００μｌのアセトニトリルで洗浄し、上記のように遠心分離した。そのペレットを、５０μｌの８０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（０．０２％  １−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ラウリンアミド（ＰＨＬ）を含む）中に溶解し、６０℃で１０分間インキュベートした。この溶液に、１μｌの０．５Ｍ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液を添加し、６０℃で３０分間インキュベートし、続いて、遮光して室温で３０分間インキュベートすることにより、ヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、この混合物を、トリプシンで３７℃で一晩処理し、９０℃で１０分間で熱不活化した。室温まで冷却した後、その混合物を、２．５ＵのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｒｏｃｈｅ）とともに一晩、３７℃でインキュベートした。１／２培養ディッシュあたりの細胞に等しい調製物２０〜４０μｌを、本文中に記載されるように、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用する以下のグライコブロッティングプロトコルにおいて使用した。【０３３８】
（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用するグライコブロッティングプロトコルの自動化実施）
フィルタープレートの８つのウェルを使用して、同量（２０μｌ）のＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化血清サンプルを、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣビーズに適用し、図８に示されるように、グライコブロッティングプロトコルをフロー図に従って同時に実施した。回収したＮ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析し、検出面積を統計学的に分析した。【０３３９】
（考察）
質量分析法における最近の進歩は、グライコミクスにおいて新たな難問をもたらした。この難問としては、迅速なグリカン濃縮技術の開発が挙げられる。糖質に関連するバイオマーカーを探索するための容易な技術が、重要である。なぜなら、プロテオミクス研究は、翻訳後修飾である糖化を標的とするからである。本明細書において、本発明者らは、ハイスループット臨床グライコミクスのための「オール−イン−ワン」型プロトコルを報告する。この新規な技術は、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズ上へのグライコブロッティングベースのグリカン濃縮と、シアル酸のビーズ上での安定化と、オリゴ糖の蛍光標識とを、マルチウェルフィルタープレート上での１つのワークフローにて統合する。このプロトコルおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の利点が、先天性糖化障害を有する被験体の血清Ｎ−グリカンプロフィールと、肝細胞癌を有する被験体の血清Ｎ−グリカンプロフィールと、健常ドナーの血清Ｎ−グリカンプロフィールとの区別を介して実証された。上記方法はまた、ヒト前立腺癌細胞および正常ヒト前立腺上皮細胞の全体的細胞グライコミクスを可能にした。これらの結果は、バイオマーカー発見のためのグリカン濃縮／処理についての可能性を示す。【０３４０】
大規模定量的グライコミクスは、重要かつ有望なアプローチである。なぜなら、疾患状態と健常状態との間におけるグリカン発現の差は、疾患の診断または予後判定のための良好なツールであると予期されるからである（Hakomori，S. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 491，369-402.）。質量分析（ＭＳ）法は、糖質の構造分析および配列決定研究のために、現在独占的に適用されている（Zaia，J.(2004) Mass Spectrom. Rev. 23，161-227.；Dell，A.，and Morris，H. R.(2001)  Science 291，2351-2356.）。ＭＳ技術における顕著な改良（イオン化、フラグメント化、および検出の方法が挙げられる）（Kurogochi，M.，andNishimura，S. (2004) Anal. Chem. 76，6097-6101.；Takegawa，Y.，Deguchi，K.，Ito，S.，Yoshioka，S.，Nakagawa，H.，andNishimura，S. (2005) Anal. Chem. 77，2097-2106.；Takegawa，Y.，Deguchi，K.，Ito，S.，Yoshioka，S.，Nakagawa，H.，andNishimura，S. (2005) Anal. Chem. 77，2097-2106.）に起因して、ＭＳは、グライコミクスにおいて他の分析方法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ））よりも好ましい。特に、グリカンの穏やかなイオン化およびハイスループット分析を送達するマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳおよびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳは、主要技術についての潜在的候補である。【０３４１】
しかし、グリコノミクスのためのＰＣＲ様グリカン増幅技術は存在しない。なぜなら、グリカン生合成プロセスは、テンプレート駆動型ではなく、複数回の連続的かつ競合的な酵素工程に供されるからである。プロテオミクスにおいて検出される部分ペプチドフラグメントは、全長タンパク質配列データベース／全長ＤＮＡ配列データベースによって完全に支持されるが、グライコミクスには、高複合型混合物（例えば、血清、細胞、および組織）からの全グリカンの濃縮が必要である。従って、構造−機能グライコミクスにおける１つの重大なボトルネックは、微量のグリカンを精製するための退屈でありかつ時間がかかる多工程プロセスである。例えば、グリカンは、一旦糖タンパク質または糖脂質から遊離された後、ＨＰＬＣ分析における検出のために、蛍光標識および精製にしばしば供される（Neville，D. C.，Coquard，V.，Priestman，D. A.，te Vruchte，D. J.，Sillence，D.J.，Dwek，R. A.，Platt，F. M.，and Butters，T. D. (2004) Anal. Biochem. 331，275-282.；Tomiya，N.，Kurono，M.，Ishihara，H.，Tejima，S.，Endo，S.，Arata，Y.，andTakahashi，N. (1987) Anal. Biochem. 163，489-499.）。さらに、シアル酸を含むオリゴ糖は、ＭＳ測定におけるアニオン性グリカンの感度を安定化または増大させるためにさらに改変される（Powell，A. K.，and Harvey，D. J. (1996) Rapid Commun. Mass Spectrom.10，1027-1032.；Sekiya，S.，Wada，Y.，and Tanaka，K. (2005) Anal. Chem. 77，4962-4968.；Mechref，Y.，Kang，P.，andNovotny，M. V. (2006) Rapid Commun. Mass Spectrom. 20，1381-1389.）。いくつかの場合において、重要な情報が失われるけれども、シアル酸が、検出の簡素化または制限のための除去される。最近、ＤＮＡ配列決定機もまた、臨床Ｎ−グリカンプロファイリングのために使用されている（Callewaert，N.，VanVlierberghe，H.，Van Hecke，A.，Laroy，W.，Delanghe，J.，and Contreras，R. (2004)  Nat.Med. 10，429-434.；Laroy，W.，Contreras，R.，and Callewaert，N. (2006) Nat.Protoc. 1，397-405.）。この臨床Ｎ−グリカンプロファイリングにおいては、キャピラリー電気泳動に適した上記の多工程精製・誘導化手順が、依然として必要である。一般的には、グリカン誘導体の調製のためのプロトコルは、分析方法に依存して変動し、工程ごとの取り扱いにおいて専門技術を必要とする。グリカン濃縮におけるこれらの技術的であるが重大な問題により、信頼がおけるハイスループットグライコミクスを達成することが不可能である（Morelle，W.，Canis，K.，Chirat，F.，Faid，V.，andMichalski，J. C. (2006) Proteomics 6，3993-4015.）。【０３４２】
本発明者らの最近の努力は、実用的なグリカン濃縮方法（すなわち、「グライコブロッティング」）の確立に向けられた（Nishimura，S.，Niikura，K.，Kurogochi，M.，Matsushita，T.，Fumoto，M.，Hinou，H.，Kamitani，R.，Nakagawa，H.，Deguchi，K.，Miura，N.，Monde，K.，andKondo，H. (2005) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44，91-96.；Lohse，A.，Martins，R.，Jorgensen，M.R.，and Hindsgaul，O. (2006) Solid-phase oligosaccharide tagging (SPOT):Validation on glycolipid-derived structures. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.45，4167-4172.；Niikura，K.，Kamitani，R.，Kurogochi，M.，Uematsu，R.，Shinohara，Y.，Nakagawa，H.，Deguchi，K.，Monde，K.，Kondo，H.，andNishimura，S. (2005)  Chem. Eur. J. 11，3825-3834.；Shimaoka，H.，Kuramoto，H.，Furukawa，J.，Miura，Y.，Kurogochi，M.，Kita，Y.，Hinou，H.，Shinohara，Y.，andNishimura，S. (2007) Chem. Eur. J. 13，1664-1673.；Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J.I.，Nagahori，N.，and Nishimura，S. I. (2007) Chem. Eur. J. 13，4797-4804；Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J.I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.，and Nishimura，S. I. (2007)  Mol.Cell. Proteomics 6，1437-1445.）。その最適なプロトコルは、５時間〜８時間以内に３０種〜４０種の主要グライコフォームを定量的プロファイリングするために、５μｌのヒト血清しか必要としない（Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J.I.，Nagahori，N.，and Nishimura，S. I. (2007) Chem. Eur. J. 13，4797-4804）。これらの試みは、濃縮グリカンの容易かつ効率的な操作に固体支持体を組み込んで、より高い回収を得かつ複雑な操作を減らすという利点を、明確に示した。本発明者は、本明細書において、自動化ハイスループットＮ−グリカン濃縮・処理のための「オール−イン−ワン」型解決法を提示する。この解決法は、「実世界」臨床グライコミクスにおいて非常に有益である。このシステムによって、多工程（例えば、全グリカンの選択的捕捉、シアル酸のメチルエステル化、および蛍光タグ化）を、ヒドラジド官能化ビーズとマルチウェルフィルタープレート取り扱いとの組み合わせ使用に基づいて、１つのワークフローにおいて統合することが可能である。本発明者らは、このデファクトスタンダード技術によって、大規模臨床グライコミクス／大規模臨床グリコプロテオミクスが可能になり、かつ新規な疾患関連バイオマーカーの発見が加速されると、考えられる。【０３４３】
（結論）
疾患状態によるタンパク質のグリコシル化における変化を実証する、数多くの研究が報告されている（Baldus，S. E.，Wienand，J. R.，Werner，J. P.，Landsberg，S.，Drebber，U.，Hanisch，F.G.，and Dienes，H. P. (2005) Int. J. Oncol. 27，1289-1297.；Comunale，M. A.，Lowman，M.，Long，R.E.，Krakover，J.，Philip，R.，Seeholzer，S.，Evans，A. A.，Hann，H. W.，Block，T. M.，andMehta，A. S. (2006) J. Proteome Res. 5，308-315.；Dwek，M. V.，Lacey，H. A.，andLeathem，A. J. (1998)  Clin. Chim. Acta 271，191-202.；J. ProteomeRes. 6，1822-1832.）。著者らの結果は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって取得される全血清Ｎ−グリカンプロフィールについての定量分析の潜在的な臨床上の価値を示す。最近、血清中のＮ−グリカンのプロファイリングのためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの有用性が、臨床的に関連する腫瘍の検出を促進するために、定量分析および定性分析の両方において期待されている（Morelle，W.，Flahaut，C.，Michalski，J.C.，Louvet，A.，Mathurin，P.，and Klein，A. (2006) Glycobiology 16，281-293.；Kranz，C.，Ng，B.G.，Sun，L.，Sharma，V.，Eklund，E. A.，Miura，Y.，Ungar，D.，Lupashin，V.，Winkel，D. R.，Cipollo，J.F.，Costello，C. E.，Loh，E.，Hong，W.，and Freeze，H. H. (2007)  Hum. Mol.Genet. 16，731-741.）。著者らの方法は、臨床的な評価における定量的かつ網羅的なＭＳ分析に対して、グリカンの濃縮および誘導体化の非常に高い実行可能性を付与する。統合型グライコブロッティングビーズ（ここで紹介されたＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭ）およびビーズ上のメチルエステル化を組み込むことによって、真の総Ｎ−グライコミクス分析が可能になった。本プロトコルは、ヒト全血清の２．５μｌのアリコートしか必要とせず、続く誘導体化のための多段階のプロセスを、４時間の操作（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを含む）での単回の掃引によって固相上で成功裏に実行した。このことにより、効率および操作時間に劇的な改善がもたらされた。血清グリカンの調製および分析に有意義な改善が実証されたことで、著者らのプロトコルはまた、細胞サンプルからのグリカン濃縮分析に使用することもできる。著者らは、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を使用するグライコブロッティングによって、単一の１０ｃｍデッシュで増殖させたヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞およびそれに対応する正常細胞について、それらの全体的な細胞Ｎ−グライコームを明らかにしたことを予備的に実証した。細胞グライコームプロファイリング法は、サンプルの前処理におけるわずかな改変を除いて、血清グライコームプロファイリング法と本質的に同一であった（図１３）。本結果は、ＰＣ−３細胞と正常な前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）とにおいて、Ｎ−グリカン構造（グリカンのパターンおよび量）において有意な差があることを明確に示した。著者らのアプローチを使用することによって、細胞レベルおよび組織レベルのグライコミクスが大幅に促進されることが考えられる。各ＣＤＧの原因となる欠陥についての最近の知見は、グリカン分析が一部のＣＤＧ−ＩＩにおける欠陥を正確に指摘するには不十分であるようであることを明らかにした（Wu，X.，Steet，R.A.，Bohorov，O.，Bakker，J.，Newell，J.，Krieger，M.，Spaapen，L.，Kornfeld，S.，and Freeze，H.H. (2004)  Nat. Med. 10，518-523.；Redner，R. A.，and Walker，H. F.(1984)  Soc. Indust. Appl. Math. Rev. 26��195-239.）。しかしながら、本結果は、各亜型に関して複数回の試験を行うことができなかったが、各亜型の患者におけるＮ−グリカンのアバンダンスについてのデータセットが、主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により発現場所においてはっきりと分離したことを明確に実証した。したがって、ＣＤＧのために、一般的なスクリーニング試験（例えば、新生児スクリーニングプログラム）において定量的グライコミクスによって稀な症例の発見がより必須になり得る。なぜなら、単純な血液検査によって他の疾患とともにＣＤＧを検出することができるからである。そして、本グライコブロッティング技術が、その再現性および容易さのため、上記を実現する方法になり得る。トランスフェリンのグリコシル化の変更を特徴とする他の疾患（例えば、先天性ガラクトース血症および慢性的なアルコール摂取）にこの技術を応用し、この研究で実施された分析の有効性を明らかにすることも興味深い。【０３４４】
ＨＣＣサンプルの大規模グライコミクス（８３人の患者および２０人の正常なドナー）によるＮ−グリカンプロファイリングに基づき、統計的なアプローチにより、パターン分類のために最適な特定のＮ−グリカン発現比のセットを同定することが可能になった。著者らは、上記の特異的なＮ−グリカンプロフィールによって、１００％の精度でＨＣＣサンプルと正常コントロールとを区別した。したがって、本研究で得られた情報は、他の臨床上の変量およびＢ型肝炎ウイルス感染および／またはＣ型肝炎ウイルス感染の医学的事実との相関を使用して検証されなければならないが、選択したグライコフォームの定量的なプロフィールは、ヒトＨＣＣ用の新規かつ有効な診断バイオマーカーとして潜在的な臨床情報を有する。【０３４５】
シアル酸残基の定量的メチルエステル化によって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析全体にわたって再現性のある質量分析を実現した。このことは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを中性Ｎ−グリカンおよび酸性Ｎ−グリカンについての同時かつ定量的なプロファイリングに耐えうるものにする。このように他の分析法よりも優れた点があるにもかかわらず、質量シグナルの強度が、広範囲の分子量のＮ−グリカンを分析する間に使用される個々のＭＡＬＤＩ装置にしばしば左右されるという事実に留意せねばならなかった。これは、各ＭＡＬＤＩシステムに装備されるレーザー源が、特定の分子（例えば、複数のシアル酸残基を有する高分子量のグリカン）のイオン化効率に顕著に影響されるためのようである。本結果（表４）と先のデータ（Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J. I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.，andNishimura，S. I. (2007) Mol. Cell. Proteomics 6，1437-1445.）とを比較して、完全にシアル酸付加された三叉（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）グリカンの量は、先のデータでの量よりも少なくなったと推定された。【０３４６】
（表５）ヒト血清Ｎ−グリカン濃縮／処理（ｎ＝８）の自動化試行の統計。ピーク面積は、２０４５のｍ／ｚに対して正規化した。【０３４７】
【表５】
0005396277.tif 000015
【０３４８】
この結果は、ペプチドベースの高感受性タグ（Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J. I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.，andNishimura，S. I. (2007) Mol. Cell. Proteomics 6，1437-1445.）とＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭで指定されるプローブとの化学構造の違い、ならびに各測定で使用されるレーザー出力および波長の違いの両方に起因し得る。ＭＡＬＤＩ質量分析ベースのグライコミクスにおいて、さらにより正確で信頼できる定量分析を達成するために、このような高分子量グリカンを提供する、さらにより高いイオン化効率の新型分子プローブを開発する必要があり得る。ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを利用する統合型グライコブロッティング技術が、複数の血清サンプルおよび細胞サンプルを使用して、種々の疾患についての新規のバイオマーカーを発見することを大幅に容易にする。富化されたＮ−グリカンを固相で取り扱うために使用される化学的性質は、引き続く分析法で必要とされる誘導体化に良く適しているので、回収された、最適な化学プローブでタグ付けされたＮ−グリカンは、従来のＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳおよび／またはＤＮＡシークエンサーベースの分析に使用することができる。【０３４９】
（実施例２：Ｈ型の例）
本実施例では、Ｈ型を用いた解析例を例示する。本質的には実施例１に記載した条件で実験を行う。図１にその模式図を例示する。具体的には、以下の工程を行う。ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＨＴＭビーズの調製は、実施例１の（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズの合成および特徴付け）に準じ、ＡＢＣを用いて行い、特願２００６−２１７１６５号および特願２００６−７３１７０号に記載されるように行う。【０３５０】
Ａ）試料中の糖鎖を遊離させる糖鎖遊離工程であって、以下の工程：
Ａ−１）試料である血清１０μｌをＰＣＲプレートに提供する。【０３５１】
Ａ−２−１）  １−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）もしくは２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）０．２６％／重炭酸アンモニア０．１１Ｍを４５μｌ（ＣＶ５％）で該試料に加えて、３７℃で１０分間反応させる、または
Ａ−２−２）１−プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−ラウラミド（ＰＨＬ）もしくは２−ヒドロキシ−３−ミリスタミド（ＰＨＭ）０．２４％／重炭酸アンモニウム１０５ｍＭ／ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１２ｍＭを５０μｌ（ＣＶ５％）で試料に加える。【０３５２】
上記でＡ−２−１）を採用した場合は、
Ａ−３−１）  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１２０ｍＭの５μｌを（ＣＶ５％）で該試料に加える。【０３５３】
上記でＡ−２−２）を採用した場合、または上記Ａ−３−１）の終了後、
Ａ−３−２）内部標準であるＡ２アミド糖鎖（表３中のピーク番号３３）を１２μｌ加え、６０℃で３０分反応させ、その後室温に冷却する。【０３５４】
Ａ−４）ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）１２３ｍＭを１０μｌ（ＣＶ５％）で該試料に加えて、室温、暗所にて１時間反応させる。【０３５５】
Ａ−５）トリプシン４００Ｕを５μｌを該試料に加えて、３７℃で６０分間反応させる。【０３５６】
Ａ−６）該試料を１０分間９０℃に加熱し、その後室温に冷却する。冷却は、ＰＮＧａｓｅＦが失活しないように十分行う。【０３５７】
Ａ−７）ＰＮＧａｓｅＦ２Ｕ、５μｌを加えて、３７℃で１２時間反応させる。ここで、その間溶媒の蒸発をみないことに留意する。天井に加温処理により対応している。【０３５８】
Ｂ）遊離した該糖鎖を検出用に調製する検出試料調製工程：
Ｂ−１）Ａ）工程で調製した捕捉糖鎖試料を、糖鎖捕捉のためのビーズと接触させて、８０℃にて結合させて捕捉糖鎖試料を生成する。ここで、２％酢酸／アセトニトリルを１８０μｌ加えて８０℃で４５分間保温し洗浄する。【０３５９】
Ｂ−２）２Ｍ塩酸グアニジンを２００μｌを必要に応じて２回該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件下に置き、その後反応液を吸引廃棄する。【０３６０】
Ｂ−３）該捕捉糖鎖試料を水で２００μｌを必要に応じて２回洗浄して、その後該水を吸引廃棄する。【０３６１】
Ｂ−４）該捕捉糖鎖試料をトリエチルアミン／メタノールで２００μｌを必要に応じて２回洗浄して、その後該トリエチルアミンを吸引廃棄する。吸引後綿付きシートにおいて底拭きを行う。【０３６２】
Ｂ−５）１０％無水酢酸／メタノールを１００μｌ該捕捉糖鎖試料に加えて、該捕捉糖鎖試料を反応条件である室温に３０分間置き、その後該無水酢酸を吸引廃棄する。無水酢酸にメタノールを加え１０％無水酢酸／メタノールを調製する。【０３６３】
Ｂ−６）１０ｍＭ塩酸２００μｌを必要に応じて２回該捕捉糖鎖試料に加えて、該塩酸を吸引廃棄する。【０３６４】
Ｂ−７）メタノール２００μｌを必要に応じて２回該捕捉糖鎖試料に加え、該メタノールを吸引廃棄後ジオキサンを２００μｌを必要に応じて２回該捕捉糖鎖試料に加え、吸引廃棄する。【０３６５】
Ｂ−８）綿つきシートにおいて底拭きをする。【０３６６】
Ｂ−９）１００ｍＭ  メチル-p-トリル-トリアゼン（ＭＴＴ）／ジオキサンを１００μｌ該捕捉糖鎖試料に加えて、８０℃で６０分間反応させる。【０３６７】
Ｂ−１０）ジオキサンを２００μｌ該捕捉糖鎖試料に加え、該ジオキサンを吸引廃棄する。【０３６８】
Ｂ−１１）（１）メタノールを２００μｌを該糖鎖捕捉試料に加え、吸引廃棄し；（２）２０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液２００μｌを該糖鎖捕捉試料に加え、吸引廃棄し；（３）該捕捉糖鎖試料を水２００μｌで洗浄して、その後該水を吸引廃棄する。【０３６９】
Ｂ−１２）２％酢酸／アセトニトリルを１８０μｌ該捕捉糖鎖試料に加え、２０〜５０ｍＭのアミノオキシトリプトファニルアルギニンメチルエステル／水、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロリド／水またはアントラニロイルヒドラジン／水２０μｌを用いて該捕捉糖鎖試料中の糖鎖をタグ化し、吸引廃棄する。。【０３７０】
Ｂ−１３）タグ化された該捕捉糖鎖試料に水１００μｌを加えてタグ化糖鎖試料溶液を生成する。【０３７１】
Ｃ）該タグ化捕捉糖鎖試料が点着された質量分析用プレートを生成する工程：
Ｃ−１）Ｂ）工程で得られたタグ化糖鎖試料溶液を回収用プレートに配置する。【０３７２】
Ｃ−２）混合用のプレートへ液体マトリクスであるＣＨＣＡジエチルアミン塩の５０％メタノール／１％グリセロール水溶液を１５μｌ加える。【０３７３】
Ｃ−３）回収用プレートから、該タグ化糖鎖試料を１５μｌ混合用のプレートへ加え、ピペッティングにより混合した後、点着させる。【０３７４】
これから、２μｌ分注して、ＭＡＬＤＩプレート（＃２０９５１２  ＭＴＰ  ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐTM  ４００／３８４  Ｔ  Ｆ  （３８４  ａｎｃｈｏｒｓ，４００  μｍ  ｄｉａｍｅｔｅｒ；＃２０９５２０  ＭＴＰ  ３８４  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ  ｐｏｌｉｓｈｅｄ  ｓｔｅｅｌ  Ｔ  Ｆ，Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ）に点着し、質量分析用プレートを生成する。【０３７５】
Ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを定法に基づいて実行する。【０３７６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３７７】
そして、本発明により、血清サンプルなどのサンプル中に含まれる糖鎖を分析するための自動分析装置を提供することに成功した。これにより、大量のサンプルを同時に自動的に解析することが可能とした。糖タンパク質より定量的に糖鎖を遊離するには可溶化剤を始め、還元アルキル化さらにはトリプシン消化など、煩雑な前処理が自動化された。また定量的に遊離した糖鎖はケモセレクティブな捕捉を行うことで、煩雑な侠雑物を容易に除去し迅速な糖鎖の分析を行うことが可能だが、多検体のサンプルを一度に処理することを可能にした。上記各工程をオプティマイズし、自動分析に適応可能なシステムを構築した。【０３７８】
本発明の装置により多検体分析が可能となることで、糖鎖バイオマーカー探索が期待され、さらには診断などへの利用、病気などへの早期診断への利用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０３７９】
【図１】図１は、本発明の糖鎖自動分析装置または糖鎖自動分析用前処理装置の代表的実施形態である、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＨのフローチャートを示す。各番号の説明は符号の説明または明細書中に記載されている。
【図１Ａ】図１の拡大図（左上部分）である。
【図１Ｂ】図１の拡大図（左下部分）である。
【図１Ｃ】図１の拡大図（中上部分）である。
【図１Ｄ】図１の拡大図（中下部分）である。
【図１Ｅ】図１の拡大図（右上部分）である。
【図１Ｆ】図１の拡大図（右下部分）である。
【図２】図２は、糖鎖捕捉分子の模式図を示す。
【図３】図３は、糖鎖ブロッティングの概念図を示す。糖タンパク質、プロテオグリカンや糖脂質等の複合糖質から遊離した糖鎖は必ず分子内の還元末端にアルデヒド基と等価のヘミアセタール基を持つので、タンパク質を構成するアミノ酸・ペプチド、DNA/RNAを構成するヌクレオチド、さらに脂質等他の生体分子との完璧な化学的差別化はこのへミアセタール基に特異的・選択的な求核付加反応により実現する。あらゆる糖鎖の還元末端と網羅的に反応する官能基（アミノオキシ基やヒドラジド基等）を含む種々の物質（高分子・低分子などを問わない）を用いて、糖鎖捕捉と高感度化試薬等によるプローブ標識、さらにそれらの質量分析法による構造解析を連続的に高速で行う。右下のＭＡＤＬＩ分析、ＭＳ分析およびＭＳ／ＭＳ分析は例示である。
【図４】図４は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの基本原理を示す。
【図５】図５〜図６には、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用した際の例示的フローチャートを示す。
【図６】図５〜図６には、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用した際の例示的フローチャートを示す。図６は図５の続きである。
【図７】図７には、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用した際の例示的分注例が示される。
【図８】図８は、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用した際の例示的俯瞰図を示す。自動化グライコブロッティングプロトコルのフローダイアグラムを示す。９６ウェルフォーマットロボットへの適用が示される。図８では、図１に対して、さらに８Ｍボラン−ピリジン錯体を用いたヒドラゾン結合の還元処理が含まれることが異なる。このような処理は、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００６  Ｊｕｎ  １９；４５（２５）：４１６７−７２．  Ｌｏｈｓｅ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｒ，  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＭＲ，  Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ  Ｏ．などを参酌することによって、実行することができる。各番号の説明は符号の説明または明細書中に記載されている。
【図８Ａ】図８の拡大図（左上部分）である。
【図８Ｂ】図８の拡大図（左下部分）である。
【図８Ｃ】図８の拡大図（中上部分）である。
【図８Ｄ】図８の拡大図（中下部分）である。
【図８Ｅ】図８の拡大図（右上部分）である。
【図８Ｆ】図８の拡大図（右下部分）である。
【図９】図９は、本発明の装置の１例としての配置例を示す。点線四角は、試薬等分注針が来る位置を示す。実線の四角は、試薬等分注針が来ない位置を示す。点線矢印は、試薬等分注針で液を移動するものを示す。実線矢印は、フィルタープレート／ＳＰＥプレートが移動するものを示す。二重線の矢印は、真空ポンプにつながるものを示す。位置＊は、１０％に冷却される位置を示す。
【図１０】図１０は、本発明の複合型糖結合体の濃縮分析についての極めて簡便かつ好都合なアプローチ例を示す（図１０ａ）。図１０ｂには、多機能性分子プローブであるＮ−（２−アミノベンゾイル）システインヒドラジド（ＡＢＣｈ）を設計し、この結合体をチオプロピルセファロース６Ｂと結合させて、安定なヒドラジド官能化ポリマー支持体（すなわち、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭビーズを示す。統合型グライコブロッティング技術の一般的なプロトコルである。（ａ）グライコブロッティングベースのハイスループット臨床グライコミクスのワークフロー。工程は、以下を含む：１）グライコブロッティング技術１５を用いてハイブリダイズ官能化ビーズ上に還元糖を化学選択的に捕獲する、２）洗浄してあらゆる不純物を除去する、３）シアル酸残基をオンビーズメチルエステル化し、その後ヒドラゾン結合を還元する、４）ジスルフィド結合を還元することによって修飾Ｎ−グリカンを回収する。（ｂ）ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭによるグライコブロッティング。プローブであるＮ−（２−アミノベンゾイル)-システインヒドラジド（ＡＢＣｈ）の化学構造が含まれる；合成については、明細書中の記載を参照のこと。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明に例示的に用いた４４種類のＮ−グリカンを示す。ヒト血清グライコフォームのプロファイリング。（ａ）代表的な正常ヒト血清Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。トリプシンおよびＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて消化した血清を、直接、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを用いてＮ−グリカンの濃縮および誘導体化のためのプロトコルに供した。オンビーズメチルエステル化で処理したシアリルＮ−グリカンは脱シアリル化に対して安定であり、その結果、総Ｎ−グリカンの定量的グライコミクス分析が可能であることに注意されたい。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、グリコシル化欠損の具体的な段階を経た２型ＣＤＧ（ＣＤＧ−ＩＩ）患者についての結果を示す。本発明者らは、異常なＮ−グリカンプロフィール（例えば、いくつかの未成熟な小型Ｎ−グリカン鎖を観察した。（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって明らかにされたＣＤＧ患者の血清Ｎ−グリカンプロフィール。ｉ：健常なドナー、ｉｉ：ＣＤＧ−Ｉａ、ｉｉｉ：ＣＤＧ−Ｉｂ、ｉｖ：ＣＤＧ−ＩＩｈ、ｖ：ＣＤＧ−ＩＩｘ１、ｖｉ：ＣＤＧ−ＩＩｘ２、ｖｉｉ：ＣＤＧ−ＩＩｘ３。アスタリスクは、所定の量の内部標準（Ａ２アミド）を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｎ−グリカンの量の組み合わせの対は、ＣＤＧ−Ｉ患者、ＣＤＧ−Ｉａ患者とＣＤＧ−Ｉｂ患者との間の診断上の差異を示す。検出される４２種類のＮ−グリカンの量によって形成されるデータ分布が正常血清からの患者の簡便な差別化のために使用されうることを示す。（ｃ）期待値最大化アルゴリズムを用いたＣＤＧ−Ｉ患者の分類。選択しされたＮ−グリカンの濃度のセットが、健常な患者とＣＤＧ−Ｉ患者との区別のために使用される（左側および中央のパネル）。同様に、ＣＤＧ−ＩａおよびＣＤＧ−Ｉｂが、同じセットのＮ−グリカンを用いて首尾よく区別され得る。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＣＤＧの症例について本研究で試験した血清の全７種の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。第１（ＰＣ１）および第２（ＰＣ２）の主成分をプロットした。これらの２つの主成分は、それぞれ、分散の４１％および３７％を占める。
【図１２Ａ】図１２は、肝細胞癌および正常なコントロールの血清に由来するＮ−グリカンによる分類を示す。（ａ）特徴−サブセット選択（ｆｅａｔｕｒｅ−ｓｕｂｓｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のプロセス。このプロセスにおいて、各工程で最も有意なＮ−グリカン比を連続的に加え、合計２７６モデルを試験した結果、最小誤差率が０％になった。（ｂ）分類のための特徴として選択した３種のＮ−グリカン比のヒートマップ図（より明るい色は、より高いグリカンの存在比を示す）。（ｃ）選択した特徴のボックスプロット発現（Ｎ−グリカンの存在比、オリゴ糖構造およびピーク数が図中に示されている）。
【図１２Ｂ】図１２は、肝細胞癌および正常なコントロールの血清に由来するＮ−グリカンによる分類を示す。（ａ）特徴−サブセット選択（ｆｅａｔｕｒｅ−ｓｕｂｓｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のプロセス。このプロセスにおいて、各工程で最も有意なＮ−グリカン比を連続的に加え、合計２７６モデルを試験した結果、最小誤差率が０％になった。（ｂ）分類のための特徴として選択した３種のＮ−グリカン比のヒートマップ図（より明るい色は、より高いグリカンの存在比を示す）。（ｃ）選択した特徴のボックスプロット発現（Ｎ−グリカンの存在比、オリゴ糖構造およびピーク数が図中に示されている）。
【図１２Ｃ】図１２は、肝細胞癌および正常なコントロールの血清に由来するＮ−グリカンによる分類を示す。（ａ）特徴−サブセット選択（ｆｅａｔｕｒｅ−ｓｕｂｓｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のプロセス。このプロセスにおいて、各工程で最も有意なＮ−グリカン比を連続的に加え、合計２７６モデルを試験した結果、最小誤差率が０％になった。（ｂ）分類のための特徴として選択した３種のＮ−グリカン比のヒートマップ図（より明るい色は、より高いグリカンの存在比を示す）。（ｃ）選択した特徴のボックスプロット発現（Ｎ−グリカンの存在比、オリゴ糖構造およびピーク数が図中に示されている）。
【図１３】図１３は、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞および正常ヒト前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）の総細胞グライコームを示す。１０ｃｍのディッシュで増殖させた細胞を、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを用いるグライコブロッティングおよびＭＳ分析に供した（明細書中の記載も参照のこと）。
【図１４】図１４は、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏＡＢＣＴＭを使用した自動化グライコブロッティングプロトコルによって調製された血清サンプル（ｎ＝８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。
【図１５】本発明の実施形態に係る糖鎖自動前処理装置の一部省略して示した平面図である。
【図１６】分注ヘッドの正面図である。
【図１７】図１６中Ａ−Ａ線断面図である。
【図１８】第１恒温槽の中央縦断面図である。
【図１９】第１減圧回収装置とフィルタープレート移動機構の分解斜視図である。
【図２０】フィルタープレート移動機構の一部省略して示した平面図である。
【図２１】フィルタープレート移動機構における上下移動ユニットの一部省略して示した縦断面図である。
【図２２】フィルタープレート移動機構と第２恒温槽の斜視図である。
【図２３】第２恒温槽の中央縦断面図である。
【図２４】処理作業のフロー図である。
【図２５】図２４の処理作業に続く処理作業のフロー図である。
【符号の説明】
【０３８０】
１  筐体ベース
１ａ  筐体ベースの配置スペース
２  分注ヘッド
２Ａ  シリンダー
２Ｂ  加圧プレート
３  支承枠
４  ガイド杆
５  昇降台
６  駆動モータ
７  ボールネジ
８  昇降台移動機構
９  分注針ホルダー
１０  分注針
１１  分注ヘッド移動機構
１２  第１恒温槽
１２Ａ  本体部
１３  受台
１４  カートリッジヒータ
１５  ペルチェ
１６  ヒートシンク
１７  シリコンシート
１８  カートリッジヒータ
１９  中蓋
２１  蓋体
２２  試薬ラック
２３、２４  混合用マイクロプレート
２５  マイクロプレート
２６  第１減圧回収装置
２７  第１吸引廃棄装置
２８  底拭き
２９  第２恒温槽
２９Ａ  本体部
３０  受台
３１  カートリッジヒータ
３２  空気の循環路
３３  ペルチェ
３４  ヒートシンク
３５  空気の循環路
３６  ダクト
３７  ファン
３８  蓋体
３９  フィルタープレート移動機構
４０  支承板
４１、４２  プーリ
４３  モータ
４４  ベルト
４５  水平移動板
４６  上下移動ユニット
４７  中枠
４８  受枠
４９  支承枠
５０  ガイド
５１  垂直移動杆
５２  モータ
５３  ボールネジ
５４  昇降作動杆
５５  マイクロプレート
５６  第２減圧回収装置
５８  ターゲットプレート
５９  ターゲットプレート受台
６０  制御装置
６１  マイクロプレート
６２  フィルタープレート
１０１  １０μｌ血清
１０２  血清入りフィルタープレート
１０３  保温３７℃、１０分
１０４  血清入りフィルタープレート
１０５  保温６０℃、３０分
１０６  血清入りフィルタープレート
１０７  冷却、室温
１０８  血清入りフィルタープレート
１０９  保温、室温、暗所１時間
１１０  血清入りフィルタープレート
１１１  保温、３７℃、６０分
１１２  血清入りフィルタープレート
１１３  保温、９０℃、５分
１１４  血清入りフィルタープレート
１１５  冷却、室温
１１６  血清入りフィルタープレート
１１７  保温、３７℃、１２時間
１１８  血清入りフィルタープレート
１１９  試薬ラック、４℃、１．５ｍｌ
１２０  試薬ラック、室温、遮光
１２１  血清入りフィルタープレート
１２２  保温、８０℃、４５分
１２３  血清入りフィルタープレート
１２４  吸引廃棄
１２５  血清入りフィルタープレート
１２６  吸引廃棄
１２７  血清入りフィルタープレート
１２８  吸引廃棄
１２９  血清入りフィルタープレート
１３０  保温、室温、３０分
１３１  血清入りフィルタープレート
１３２  吸引廃棄
１３３  吸引廃棄
１３４  血清入りフィルタープレート
１３５  吸引廃棄
１３６  血清入りフィルタープレート
１３７  吸引廃棄
１３８  底拭き
１３９  血清入りフィルタープレート
１４０  保温、８０℃、６０分
１４１  血清入りフィルタープレート
１４２  吸引廃棄
１４３  血清入りフィルタープレート
１４４  吸引廃棄
１４５  血清入りフィルタープレート
１４６  保温、８０℃、４５分
１４７  血清入りフィルタープレート
１４８  吸引抽出
１４９  洗浄バルブ
１５０  回収用プレート１
１５１  ２０μｌ分注
１５２  混合用ＭＰ１
１５３  ３８０μｌ分注
１５４  ＳＰＥプレート
１５５  吸引廃棄
１５６  ＳＰＥプレート
１５７  吸引廃棄
１５８  ＳＰＥプレート
１５９  廃棄
１６０  ＳＰＥプレート
１６１  吸引廃棄
１６２  ＳＰＥプレート
１６３  吸引回収
１６４  回収用プレート２
１６５  ２μｌ分注
１６６  混合用ＭＰ２
１６７  ２μｌ分注
１６８  ＭＡＬＤＩプレート
１６９  Ｅｎｄ
２０１  トリプシン  ４００Ｕ、５μｌ
２０２  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ，２Ｕ，５μｌ
２０３  ０．２６％ＰＨＬ（可溶化剤）／０．１１Ｍ重炭酸アンモニア、４５μｌ（ＣＶ５％）
２０４  １２０ｍＭ  ＤＴＴ，５μｌ（ＣＶ５％）
２０５  １２３ｍＭ  ＩＡＡ、１０μｌ（ＣＶ５％）
２０６  １０％Ａｃ２Ｏ／ＭｅＯＨ、１００μｌ
２０７  １５０ｍＭ  ＭＴＴ／ジオキサン、１００μｌ
２０８  ２０ｍＭ試薬、２０μｌ
２０９  ２％  ＡｃＯＨ／ＡＣＮ，１８０μｌ
２１０  ２Ｍ塩酸グアニジン、２００μｌ×２
２１１  水、２００μｌ×２
２１２  １％  ＴＥＡ／ＭｅＯＨ、２００μｌ×２
２１３  １０ｍＭ  ＨＣｌ，２００μｌ×２
２１４  ＭｅＯＨ，２００μｌ×２
２１５  ジオキサン、２００μｌ×２
２１６  ジオキサン、２００μｌ×１
２１７  水、２００μｌ×１
２１８  ２％  ＡｃＯＨ／ＡＣＮ，１８０μｌ
２１９  水、１００μｌ×１
２２０  ９５％、ＡＣＮ、３６０μｌ
２２１  水、２００μｌ
２２２  ９５％、ＡＣＮ、２００μｌ
２２３  ９５％、ＡＣＮ、２００μｌ
２２４  ５％、ＡＣＮ、１００μｌ
２２５  ＤＨＢ／３０％ＡＣＮ、１８μｌ
１４９中
Ａ  ２％酢酸（ＡｃＯＨ）／アセトニトリル（ＡＣＮ）
Ｂ  水
Ｃ  ２Ｍ塩酸グアニジン
Ｄ  ９５％アセトニトリル（ＡＣＮ）
Ｅ  ジオキサン
Ｆ  メタノール（ＭｅＯＨ）
Ｇ  １０ｍＭ  ＨＣｌ
Ｈ  １％  ＴＥＡ／メタノール（ＭｅＯＨ）
３０１：１０  μｌ  血清
３０２：ＰＣＲプレート
３０３：血清入りＰＣＲプレート
３０４：保温  ３７°Ｃ，１０分
３０５：血清入りＰＣＲプレート
３０６：保温  ６０°Ｃ，３０分
３０７：血清入りＰＣＲプレート
３０８：冷却  室温
３０９：血清入りＰＣＲプレート
３１０：保温  室温  暗所  １時間
３１１：血清入りＰＣＲプレート
３１２：保温  ３７°Ｃ，６０分
３１３：血清入りＰＣＲプレート
３１４：保温  ９０°Ｃ，５分
３１５：血清入りＰＣＲプレート
３１６：冷却  室温
３１７：血清入りＰＣＲプレート
３１８：保温  ３７°Ｃ，１２時間
３１９：血清入りＰＣＲプレート
３２０：試薬ラック  ４℃，１．５ｍｌ
３２１：試薬ラック  室温
３２２：２０  μｌ  分注
３２３：吸引廃棄
３２４：吸引廃棄
３２５：吸引廃棄
３２６：底拭き
３２７：ビーズ入りフィルタープレート
３２８：ビーズ入りフィルタープレート
３２９：ビーズ入りフィルタープレート
３３０：ビーズ入りフィルタープレート
３３１：保温  ８０°Ｃ，６０分
３３２：ビーズ入りフィルタープレート
３３３：保温  室温，１０分
３３４：吸引廃棄
３３５：ビーズ入りフィルタープレート
３３６：吸引廃棄
３３７：ビーズ入りフィルタープレート
３３８：吸引廃棄
３３９：ビーズ入りフィルタープレート
３４０：吸引廃棄
３４１：ビーズ入りフィルタープレート
３４２：吸引廃棄
３４３：底拭き
３４４：ビーズ入りフィルタープレート
３４５：保温，遮光  室温，３０分
３４６：ビーズ入りフィルタープレート
３４７：吸引廃棄
３４８：ビーズ入りフィルタープレート
３４９：吸引廃棄
３５０：底拭き
３５１：ビーズ入りフィルタープレート
３５２：吸引廃棄
３５３：ビーズ入りフィルタープレート
３５４：吸引廃棄
３５５：底拭き
３５６：ビーズ入りフィルタープレート
３５７：保温  ６０°Ｃ，６０分
３５８：ビーズ入りフィルタープレート
３５９：吸引廃棄
３６０：ビーズ入りフィルタープレート
３６１：吸引廃棄
３６２：底拭き
３６３：ビーズ入りフィルタープレート
３６４：吸引廃棄
３６５：ビーズ入りフィルタープレート
３６６：５０  ｍＭの重炭酸アンモニア中の５０  ｍＭ  ＤＴＴ，５０  μｌ
３６７：保温  ６０°Ｃ，５分
３６８：保温  室温，１５分
３６９：ビーズ入りフィルタープレート
３７０：吸引回収
３７１：回収用プレート  １
３７２：保温  １０°Ｃ，〜終了
３７３：ＳＰＥ  開始
３７４：２０  μｌ  分注
３７５：混合用ＭＰ  １
３７６：４２０  μｌ  分注
３７７：ＳＰＥプレート
３７８：吸引廃棄
３７９：ＳＰＥプレート
３８０：吸引廃棄
３８１：ＳＰＥプレート
３８２：吸引廃棄
３８３：ＳＰＥプレート
３８４：吸引廃棄
３８５：ＳＰＥプレート
３８６：吸引回収
３８７：回収用プレート  ２
３８８：保温  １０°Ｃ，〜終了
３８９：２  μｌ  分注
３９０：ＭＡＬＤＩ分注  開始
３９１：混合用ＭＰ  ２
３９２：２  μｌ  分注
３９３：ＭＡＬＤＩ  プレート
３９４：洗浄バルブ
３９５：ビーズ入りフィルタープレート
３９６：吸引廃棄
３９７：底拭き
３９４中
Ａ  ２％酢酸（ＡｃＯＨ）／アセトニトリル（ＡＣＮ）  ２０ｍｌ
Ｂ  水中９５％アセトニトリル（ＡＣＮ）  ２０ｍｌ
Ｃ  メタノール（ＭｅＯＨ）  ２００ｍｌ
Ｄ  水
Ｅ  ９５％アセトニトリル（ＡＣＮ）  ３３０ｍｌ
Ｆ  ５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）
Ｇ  １０ｍＭ塩酸  １００ｍｌ
Ｈ  ６Ｍ塩酸グアニジン  １００ｍｌ
４０１：還元試薬用事調整
４０２：還元試薬
４０３：試薬ラック  室温・遮光
４０４：２０  μｌ  分注
４０５：４０  μｌ  分注
４０６：Ｒ９  （２  ｍｌ）
４０７：８  Ｍ  ボラン−ピリジン
４０８：空きラック
４０９：Ｒ１１  （２０  ｍｌ）
４１０：Ｒ１０  （４  ｍｌ）
４１１：ＭｅＯＨ，１４０  μｌ
４１２：５０％  トリクロロ酢酸水溶液
５０１：０．３３  Ｍ  重炭酸アンモニア，１５  μｌ，ＣＶ  ５％
５０２：０．４％  可溶化剤，３０  μｌ，ＣＶ  ５％  
５０３：１２０  ｍＭ  ＤＴＴ，５  μｌ，ＣＶ  ５％  
５０４：１２３  ｍＭ  ＩＡＡ，１０  μｌ，ＣＶ  ５％  
５０５：トリプシン，４００  Ｕ，５  μｌ
５０６：ＰＮＧａｓｅ  Ｆ，２  Ｕ，５  μｌ
５０８：Ｒ１  （１．５  ｍｌ）
５０９：Ｒ２  （３  ｍｌ）
５１０：Ｒ１２  （２０  ｍｌ）
５１１：Ｒ３  （０．５  ｍｌ）
５１２：Ｒ４  （１  ｍｌ）
５１３：Ｒ５  （２  ｍｌ）
５１４：Ｒ６  （０．２  ｍｌ）
５１５：Ｒ７  （１０  ｍｌ）
５１６：Ｒ８  （５  ｍｌ）
５１７Ａ：ＡＣＮ，３００  μｌ×３
５１７Ｂ：５０％  ＡＣＮ，３００  μｌ×３
５１８：１  Ｍ  ＡｃＯＨ，２００  μｌ
５１９：１０％  ＡＣＮ，２０  μｌ
５２０：ＭＡＬＤＩ  マトリックス，２  μｌ
５２１：２００  μｌ
５２２：ＤＭＳＯ／ＡＣＮ中  １００  ｍＭ  ＭＴＴ，１００  μｌ
５２３：２％  ＡｃＯＨ／ＡＣＮ，２００  μｌ
５２４：６  Ｍ  塩酸グアニジン，３００  μｌ
５２５：６  Ｍ  塩酸グアニジン，３００  μｌ×２
５２６：水，３００  μｌ
５２７：１０  ｍＭ  塩酸，３００  μｌ×３
５２８：ＭｅＯＨ，３００  μｌ×３
５２９：ＭｅＯＨ，３００  μｌ×３
５３０：水，３００  μｌ×３
５３１：ＡＣＮ，３００  μｌ×３
５３２：ＡＣＮ，３００  μｌ×３
５３３：水，３００  μｌ×３
５３４：水，２００  μｌ
５３５：ＡＣＮ，４００  μｌ
５３６：ＡＣＮ，２００  μｌ
５３７：９５％  ＡＣＮ，２００  μｌ
５３８：ＭＡＬＤＩ分注のみ
５３９：ＳＰＥ処理後  ＭＡＬＤＩ分注
【図２】
0005396277.tif 000016
【図５】
0005396277.tif 000017
【図６】
0005396277.tif 000018
【図７】
0005396277.tif 000019
【図９】
0005396277.tif 000020
【図１５】
0005396277.tif 000021
【図２３】
0005396277.tif 000022
【図１】
0005396277.tif 000023
【図１Ａ】
0005396277.tif 000024
【図１Ｂ】
0005396277.tif 000025
【図１Ｃ】
0005396277.tif 000026
【図１Ｄ】
0005396277.tif 000027
【図１Ｅ】
0005396277.tif 000028
【図１Ｆ】
0005396277.tif 000029
【図３】
0005396277.tif 000030
【図４】
0005396277.tif 000031
【図８】
0005396277.tif 000032
【図８Ａ】
0005396277.tif 000033
【図８Ｂ】
0005396277.tif 000034
【図８Ｃ】
0005396277.tif 000035
【図８Ｄ】
0005396277.tif 000036
【図８Ｅ】
0005396277.tif 000037
【図８Ｆ】
0005396277.tif 000038
【図１０】
0005396277.tif 000039
【図１１Ａ】
0005396277.tif 000040
【図１１Ｂ】
0005396277.tif 000041
【図１１Ｃ】
0005396277.tif 000042
【図１１Ｄ】
0005396277.tif 000043
【図１２Ａ】
0005396277.tif 000044
【図１２Ｂ】
0005396277.tif 000045
【図１２Ｃ】
0005396277.tif 000046
【図１３】
0005396277.tif 000047
【図１４】
0005396277.tif 000048
【図１６】
0005396277.tif 000049
【図１７】
0005396277.tif 000050
【図１８】
0005396277.tif 000051
【図１９】
0005396277.tif 000052
【図２０】
0005396277.tif 000053
【図２１】
0005396277.tif 000054
【図２２】
0005396277.tif 000055
【図２４】
0005396277.tif 000056
【図２５】
0005396277.tif 000057