(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における免疫学的障害の発症をブロックするかあるいは該障害の重篤度または効果を処置または減少するための組成物であって、該免疫学的障害は、ＳＬＥであり、該組成物は、治療上有効な量の抗ＴＷＥＡＫ抗体を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記動物が哺乳動物である、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、前記哺乳動物がヒトである、組成物。
【請求項４】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、組換え抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、ヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、ヒト定常ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、ＩｇＧである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、非経口、皮下または静脈内の経路による投与に適している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、液体組成物としての投与に適している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記液体組成物が、滅菌の等張性組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、以下：
【化３】
0005550799.tif 000007
のアミノ酸配列を有するヒトＴＷＥＡＫポリペプチドに結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、ＨＴ２９細胞に対するヒトＴＷＥＡＫ−Ｆｌａｇポリペプチドの結合をブロックする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗ＴＷＥＡＫ抗体が、以下：
【化４】
0005550799.tif 000008
のアミノ酸配列を有するマウスＴＷＥＡＫポリペプチドに結合する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ＳＬＥの発症をブロックするかあるいは該ＳＬＥの重篤度または効果を処置または減少するための組成物であって、該組成物は、以下：
【化５】
0005550799.tif 000009
または
【化７】
0005550799.tif 000010
のアミノ酸配列を有するヒトまたはマウスのＴＷＥＡＫポリペプチドに結合する組み換えＩｇＧの治療上有効な量を含む、組成物。
【請求項１６】
前記組換えＩｇＧが、ＨＴ２９細胞へのヒトＴＷＥＡＫ−Ｆｌａｇポリペプチドの結合をブロックする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組換えＩｇＧが、以下：
【化６】
0005550799.tif 000011
のアミノ酸配列を有するヒトＴＷＥＡＫポリペプチドに結合する、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
【０００１】  本発明は、新規なタンパク質ＴＷＥＡＫに結合する試薬を含む組成物および方法、ならびに免疫学的障害の発症をブロックするためのＴＷＥＡＫ結合試薬の使用に関する。ＴＷＥＡＫ結合試薬としては、慢性対宿主性移殖片病の発症をブロックするために本明細書中で使用されるようなモノクローナル抗体、可溶性ＴＷＥＡＫレセプター−Ｉｇ融合タンパク質、あるいはＴＷＥＡＫレセプターへのＴＷＥＡＫの結合を改変する他の分子が挙げられる。本発明の他の実施形態は、ＴＷＥＡＫレセプターに結合して、ＴＷＥＡＫレセプターの活性を改変するか、またはＴＷＥＡＫレセプターの細胞内シグナル伝達を改変する、試薬を含む。
【０００２】  （発明の背景）
免疫学的障害は、広範な種類の疾患および病理（自己免疫疾患、急性炎症障害および慢性炎症障害、器官移植拒絶、対宿主性移殖片病（ＧＶＨＤ）、リンパ系細胞悪性疾患、敗血症および他の形態のショック、ＨＩＶおよびＳＣＩＤＳにて見られる免疫応答性の喪失、ならびに腫瘍増殖に対する免疫応答の欠損を含む）として表される。
【０００３】  多くの免疫学的障害は、抗原に対する異常な応答または制御されていない応答によって誘発される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫系の不適切な応答の結果であり、細胞および組織に対する損傷を生じる。ＧＶＨＤは、骨髄移植片（ＢＭＴ）由来のドナー細胞が宿主（すなわち、患者）の抗原に応答する場合に、発症する。器官移植拒絶は、その患者の免疫系が、移植された器官由来の抗原に対して応答する場合に、結果として生じる。急性炎症障害（例えば、過剰アレルギー性状態およびショック）は、惹起する抗原に対する制御されていない免疫応答の結果である。
【０００４】  Ｔ細胞依存性免疫応答は、Ｔ細胞の抗原認識を必要とする。例えば、ＧＶＨＤは、ドナーＴ細胞と宿主免疫系細胞との間の複雑な相互作用から生じる。この開始事象は、ドナーＴ細胞による非自己（すなわち、非宿主）抗原の認識である。これらは、同種抗原と呼ばれる。これらのドナー細胞による同種抗原認識は、免疫調節性および炎症性のサイトカインおよびケモカインの産生を生じ、これらは、ドナーの抗宿主免疫応答を発生および悪化させる。この疾患は、急性形態または慢性形態のいずれかで発症し得、その形態は、発生する免疫応答の型を制御する複雑なサイトカインネットワークの調節に依存する。免疫応答は、Ｔｈ０、Ｔｈ１、またはＴｈ２として特徴付けられ得、これは、１）その応答の間に活性化したＴ細胞により産生されるサイトカインおよびケモカインの性質、ならびに２）その応答の間に補助細胞および他の細胞により産生されるサイトカインおよびケモカインの性質に依存する。免疫応答の間に重要な非Ｔ細胞の例は、Ｂ細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージ、濾胞樹状細胞および内皮細胞である。共に、産生されたサイトカインは、種々の細胞型の分化に影響し、そして産生されたケモカインは、細胞の移動および限局化に影響する。Ｔｈ０応答は、以前に刺激されていない（未刺激の）Ｔ細胞の短期刺激の特徴である。Ｔｈ０  Ｔ細胞は、中程度の量の多数のサイトカイン（特に、Ｉｌ−２およびＴＮＦ）を産生する。繰り返してかまたは慢性的に刺激されたＴｈ０細胞は、Ｔｈ１またはＴｈ２のいずれかのＴ細胞へと分化し得、それは、多数の因子に依存する。このような因子としては、補助細胞のサイトカイン産生、Ｔ細胞レセプターの関与の強度、および例えば、ＣＤ２８同時刺激レセプターを介して受けた二次シグナルの性質が挙げられるが、これらに限定されない。特に、主に活性化したマクロファージにより産生されるサイトカインＩｌ−１２に対する活性化したＴ細胞の曝露によって、Ｔｈ１  Ｔ細胞への分化が支持されるが、Ｉｌ−４およびＩｌ−１０への曝露によって、Ｔｈ２  Ｔ細胞への分化が支持される。
【０００５】  Ｔｈ１  Ｔ細胞は、炎症応答、Ｔ細胞傷害性、およびマクロファージ活性化と関連するサイトカイン（例えば、Ｉｌ−２およびＩＦＮ−γ）を産生する。Ｔｈ１  Ｔ細胞は、組織炎症の部位へと細胞を誘引するケモカイン（例えば、Ｍｉｐ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０、およびＭＩＧ）に応答する。細胞傷害性Ｔ細胞および活性化したマクロファージは、損傷した細胞および感染した細胞を除去するように作用するので、そのＴｈ１応答は、細胞内病原体に対する免疫応答を制御することを担う。重要なことに、マクロファージおよび内皮細胞によるＴｈ１化学誘引物質ケモカイン（例えば、ＩＰ−１０およびＭＩＧ）の産生は、ＩＦＮ−ｙにより綿密に制御される。このＩＦＮ−ｙは、Ｔｈ１  Ｔ細胞により産生される基本型ケモカインである。従って、フィードバックループが、活性化したＴ細胞とその環境との間に発生し得、これにより特定の時期および位置で特定の型の応答の発生が増強される。
【０００６】  Ｔｈ２  Ｔ細胞は、体液性免疫応答（ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＧの産生を必要とする応答を含む）の発生を支持するサイトカイン（例えば、Ｉｌ−４、Ｉｌ−５、Ｉｌ−６、およびＩｌ−１０）を産生する。これらのＩｇ応答は、Ｂ細胞のＴ細胞媒介性活性化により駆動され、この応答は、そのＩｇ表現型を表面結合ＩｇＭおよびＩｇＤから分泌Ｉｇへと「変換」する。分泌Ｉｇは、循環において（ＩｇＧ）、粘膜表面（例えば、腸および口腔（ＩｇＡ）ならびに呼吸管（ＩｇＥ））にて、病原体からの感染を制御するように通常は機能する。Ｉｇの過剰産生は、疾患（例えば、ＳＬＥ（ＩｇＧおよびＩｇＡ）、アレルギー性（Ｉ型）過敏症（ＩｇＥ）、およびＧＶＨＤ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）を生じ得る。Ｔｈ２  Ｔ細胞はまた、好酸球およびマスト細胞の活性化を支持し得る。好酸球およびマスト細胞は、例えば、呼吸管における病原体に対する急性応答を媒介し得る。Ｔｈ２  Ｔ細胞は、ケモカイン（例えば、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）およびＭＤＣ）に応答し、その産生は、ＮＫ１．１細胞および活性化したＴ細胞により産生される基本型サイトカインである、Ｉｌ−４により綿密に調製される。
【０００７】  Ｂ細胞とのＴ細胞の相互作用は、複雑かつ綿密に調節されたプロセスである。活性化プロセスを始めるために、Ｂ細胞は、Ｂ細胞抗原レセプター（膜Ｉｇ）を介して抗原シグナルを受けなければならない。第２に、Ｂ細胞は、活性化したＴ細胞からの特定の接触依存性シグナルおよび接触非依存性シグナルを受けなければならない。１つの必要とされる接触依存性シグナルは、Ｂ細胞上のＣＤ４０へのＴ細胞上のＣＤ４０Ｌの結合を介して送達される。１つの必要とされる接触非依存性シグナルは、活性化したＴ細胞により分泌されるＩｌ−４によって、そしてＢ細胞上のＩｌ−４レセプターに結合するＮＫ１．１細胞によって、送達される。これらのシグナルは、二次リンパ器官（例えば、脾臓）のＴ細胞領域内で生じるようである。脾臓、リンパ節、扁桃、パイアー斑および他の二次リンパ器官および三次リンパ器官は、Ｔ細胞およびＢ細胞が代表的に存在する、別個の組織学的領域を有する。すべてのリンパ球は、血液またはリンパからこれらの器官のＴ細胞領域へと移動し、それはまず、脾臓中の内皮細胞層（例えば、リンパ節およびパイアー斑中の高内皮性小静脈）ならびに内皮細胞層周縁洞を横切ることによる。次いで、このＢ細胞が、Ｂ細胞濾胞として知られるＢ細胞領域へと移動する。Ｔ細胞領域へと移動したが活性化していないＢ細胞は、２〜３日後にその濾胞を去る。活性化したＢ細胞は、分化のプロセスを経験する。いくつかの活性化したＢ細胞（形質細胞として知られる）は、多量の抗原特異的で低親和性のＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体を分泌する。これらのＢ細胞は、代表的には、免疫応答の誘導の後早くに出現し、そして脾臓およびこれらのＢ細胞が存続する他の組織学的位置の赤色脾髄中に移動し、数日間、抗体を分泌する。他の活性化したＢ細胞は、二次濾胞として知られる濾胞の領域、または胚中心内で分化する。胚中心は、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）として知られる、特化した抗原保持細胞のネットワークの周辺に形成し、この細胞は、この胚中心反応を駆動または改良するために抗原を提示すると考えられる。この胚中心内のＢ細胞は、そのＩｇ表現型を「変換」し、そして「親和性成熟」を経験し、それらＢ細胞がその抗原標的について高い親和性を提示するという結果になる。通常は、その抗原標的は外来抗原であるが、疾患（例えば、慢性ＧＶＨＤおよび自己免疫障害）において、そのＩｇは、自己抗原を認識する。最後に、Ｂ細胞はその濾胞を去り、Ｔ細胞領域を通って戻り、そしてその器官から輸出循環を介して血流中へと去る。
【０００８】  完全に分化して高親和性Ｉｇを発現するＢ細胞は、芽細胞として知られ、そしてそれらは、Ｂ細胞濾胞が他の種々の環境（脾臓の赤色脾髄領域、骨髄、肝臓、または呼吸管および腸の内側を覆う粘膜細胞層を含む）に所在を定めるに任せる。これらの完全に分化したＢ細胞のうちのいくつかは、記憶細胞として知られ、そして長期間、同じ抗原に対して、再び遭遇する場合に応答する準備ができたままであり得る。
【０００９】  Ｂ細胞は、リンパ器官内の位置から位置へ移動するので、それらのＢ細胞は、それらのＢ細胞を案内する特定のシグナル、およびそれらのＢ細胞の生存を確実にする特定のシグナルを必要とする。例えば、複数のシグナルが、脾臓中のＢ細胞濾胞機構を維持するために必要とされる。これらのシグナルとしては、ケモカインレセプターＢＬＲ−１とＢＣＡリガンドの相互作用、ＴＮＦ−Ｒ５５とＴＮＦの相互作用、およびＬＴβ−ＲとＬＴβの相互作用が挙げられる（ＣｈａｐｌｉｎおよびＦｕ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２９８〜２９７（１９９８）に概説される）。これらの分子経路のいずれかが欠損しているマウスは、脾臓におけるＢ細胞濾胞の完全性を失う。さらに、これらの遺伝子欠損マウスすべてがまた、脾臓において胚中心反応を経験する能力も失った。他の分子経路の破壊は、胚中心反応のみに影響する。例えば、ＣＤ４０Ｌが欠損しているマウスは、Ｂ細胞濾胞を維持するが、胚中心は形成しない。胚中心環境内のＢ細胞は、ＣＤ４０を介して、生存を維持するため、そしてＩｇＭをダウンレギュレートし、そしてＩｇ発現に変換するために、シグナルを必要とする。
【００１０】  Ｂ細胞は、濾胞および胚中心内を移動するのみではなく、活性化の後にその濾胞から去り、そして身体中の他の部位へと移動する。記憶Ｂ細胞は、骨髄にて見出され得、そしてＩｇＡを発現するＢ細胞は、腸および他の粘膜部位中の細胞層へ特に移動する。他のシグナルは、おそらく、リンパ画分内およびリンパ画分間の特定の部位へと活性化したＴ細胞を案内する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、感染部位または他の抗原攻撃部位へと移動して、その標的を見出し、そしてそれらを溶解し得る。異なる組織学的位置間のＴ細胞およびＢ細胞を案内するシグナルすべての正体は、未だ知られていない。しかし、複数の経路が、二次リンパ組織、および感染部位または炎症部位の両方において、抗原に対するＴ細胞応答およびＢ細胞応答を調和させるようである。
【００１１】  ＧＶＨＤは、抗原が駆動する免疫応答の十分に研究された例である。ＧＶＨＤはしばしば、ヒト患者における骨髄移植（ＢＭＴ）の致死的な結果である。この疾患は、急性形態かまたは慢性形態で生じ得る。ＧＶＨＤの急性形態または慢性形態は、それぞれ、抗原特異的Ｔｈ１応答および抗原特異的Ｔｈ２応答の発生の、表現型の例である。この疾患の急性形態は、ＢＭＴ後の最初の２ヶ月以内に生じ、そして皮膚、腸、肝臓および他の器官に対する、ドナー細胞傷害性Ｔ細胞媒介性損傷により特徴付けられる。この疾患の慢性形態は、より大いに遅く（ＢＭＴ後１００日を越えて）表れ、そして免疫グロブリン（Ｉｇ）（自己抗体を含む）の過剰産生、ならびにＩｇ沈着により生じる皮膚、腎臓、および他の器官に対する損傷によって特徴付けられる。急性ＧＶＨＤの発症は、後の慢性ＧＶＨＤの発症の前兆となる。従って、同じ患者が、両方の疾患を次々と発症し得る。全ＢＭＴ患者のうちの約５０％が、急性ＧＶＨＤまたは慢性ＧＶＨＤのいずれかを発症する。急性ＧＶＨＤ患者のうちのほぼ９０％が、続けて慢性ＧＶＨＤを発症する。慢性ＧＶＨＤの現在の治療は、患者の大多数にて成功していない。
【００１２】  ＧＶＨＤは、親からＦ１への細胞移殖レジメンを使用して、マウスにてモデル化され得る。本明細書中に記載されるモデルにおいて、マウスのＤＢＡ２系統由来の脾臓細胞が、（ＤＢＡ２×Ｃ５７Ｂ１／６）Ｆ１マウス中にｉｖ注射される。このＦ１マウスは、Ｂ６Ｄ２Ｆ１と呼ばれる。注射された脾臓細胞は、移殖片を構成し、そしてＤＢＡ２マウスが、その移殖片のドナーである。この移殖片を受けるＦ１マウスは、宿主である。この移殖片中に存在するドナーＴ細胞は、宿主細胞上のＭＨＣマーカー（ハプロタイプ）の半分を異種として認識する。なぜならば、これらは、もう一方の、Ｃ５７Ｂ１／６親に由来するからである。これは、宿主に対するドナーＴ細胞応答を誘導して、ＧＶＨＤが生じる。ＤＢＡ／２親脾臓細胞が、Ｂ６Ｄ２Ｆ１宿主中に注入される場合、慢性ＧＶＨＤが発症する。対照的に、Ｃ５７Ｂ１／６脾臓細胞がＢ６Ｄ２Ｆ１宿主に注射される場合、急性ＧＶＨＤが発症する。どのような基礎をなす機構が、これら２つの注射プロトコルを使用する別個の疾患結果の原因であるかは不明確なままであるが、ＤＢＡ／２脾臓細胞移殖片内に含まれる細胞により発現されるサイトカインが、慢性ＧＶＨＤの発症を支持し、一方、Ｃ５７Ｂ１／６脾臓細胞移殖片内に含まれる細胞により発現されるサイトカインが急性ＧＶＨＤの発症を支持することが、考えられる。抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞：ＡＰＣ）とのＴ細胞の相互作用を妨害する試薬は、急性ＧＶＨＤおよび慢性ＧＶＨＤの両方を効果的にブロックする。
【００１３】  多くの分野の証拠が、急性ＧＶＨＤがＴｈ１媒介疾患であることを示唆している（ＫｒｅｎｇｅｒおよびＦｅｒｒａｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１５：５０−７３（１９９６）、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：６８９−６９９（１９９６））。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞による、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による、およびマクロファージのような活性化された顆粒球による、細胞傷害性活性は、Ｔｈ１媒介Ｔ細胞応答の十分に規定された結果であり、代表的なＴｈ１サイトカインであるＩｌ−２およびＩＦＮ−γの発現に特徴的な依存を示す。このような細胞傷害性は、急性ＧＶＨＤの規定している特徴である。さらに、Ｔｈ１  Ｔ細胞の分化に関与する重要なサイトカインをブロックする試薬（例えば、Ｉｌ−２およびＩｌ−１２に対するｍＡｂ）は、急性ＧＶＨＤの発症をブロックする。細胞傷害性は、直接的に細胞性である（例えば、宿主細胞の食作用による）かまたはアポトーシスすなわち細胞死を誘導し得るＴＮＦのような分泌されるサイトカインの作用による。ドナーの抗宿主細胞傷害性の結果は、多くの様式で観察され得る。第１に、宿主リンパ球が急速に破壊され、その結果急性ＧＶＨＤを経験しているマウスは、十分に免疫抑制される。第２に、ドナーリンパ球が宿主脾臓に植え付けられ、そして拡がり、それらの細胞傷害性活性は、ドナー宿主細胞により（異種として）認識され得る宿主抗原を発現する細胞株を利用することにより、インビトロで直接測定され得る。例えば、適切な抗原を発現する細胞株は、放射性クロム５１同位体を用いて標識され得る。培養培地へのこの放射性同位体の放出は、標識された細胞の死の証拠である。第３に、この疾患は、付加された組織および細胞集団が破壊されることから致死となり、従って生存状態（ｓｕｒｖｉｖｏｒｓｈｉｐ）は疾患の測定可能な結果である。
【００１４】  慢性ＧＶＨＤは、Ｔｈ２  Ｔ細胞媒介疾患のようである（Ｄｅ  Ｗｉｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３６１−３６６（１９９３））。マウスモデルにおいて、疾患の発症は、Ｔｈ２サイトカインＩｌ４に依存的で、そして抗Ｉｌ４  ｍＡｂを用いて処置することによりブロックされ得る。このような処置は、宿主Ｂ細胞の拡大および付随する過剰Ｉｇ産生をブロックする。ＧＶＨＤの発症が、多くの様式で引き続き得る。ドナーのＴ細胞集団および宿主Ｂ細胞集団の拡大が、脾臓の指数により測定され得、これはコントロール（非疾患）マウスに対して正規化される、体重に対する脾臓重量の比率である。疾患マウスのＢ細胞の活性化は、Ｂ細胞活性化マーカーの分析を用いて測定され得る。最終的に、Ｂ細胞の活性化の効果は、循環（例えば、血清中）におけるＩｇのレベルか、または疾患誘導の数週間後に回収される宿主脾臓細胞の培養物により産生されたＩｇのレベルに観察され得る。疾患動物における循環するＩｇは、抗自己抗体を含む。最終的に、疾患動物は、蓄積されたＩｇの沈着に起因して、腎不全および他の器官の不全で死に、従って生存状態は、疾患活性の適切な尺度である。
【００１５】  本発明者らは、ＴＷＥＡＫに特異的なモノクローナル抗体が、慢性ＧＶＨＤのマウスモデルを使用して、効率的におよび特異的にＧＶＨＤの発症の局面をブロックすることをここで示す。慢性ＧＶＨＤの発症におけるブロックは、脾臓指数における低減、宿主Ｂ細胞における活性化マーカーの損失、および抗ＴＷＥＡＫ処置動物の低減されたＩｇ産生として示される。
【００１６】  （発明の要旨）
本発明は、動物における免疫学的障害の発症をブロックするため、あるいはその障害の重篤度または効果を処置もしくは低減するための方法を提供し、この方法は、治療上有効な量のＴＷＥＡＫブロッキング剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。この化合物は、ＴＷＥＡＫリガンドに対する抗体；ＴＷＥＡＫレセプターに対する抗体；ＴＷＥＡＫレセプターへのＴＷＥＡＫリガンドの結合を改変する薬剤；細胞表面レセプターのクラスター形成を改変する薬剤；およびＴＷＥＡＫレセプターの細胞内シグナルを妨害し得る薬剤であり得る。好ましい実施形態において、この抗体は、モノクローナル抗体である。より好ましい実施形態において、このモノクローナル抗体は、ＴＷＥＡＫ表面リガンドに対する。この動物は、哺乳動物であり得、そしてヒトであり得る。このＴＷＥＡＫブロッキング剤は、表面ＴＷＥＡＫリガンドに選択的に結合し得るリガンド結合ドメインを有する可溶性ＴＷＥＡＫレセプターであり得る。１つの実施形態において、この可溶性ＴＷＥＡＫレセプターとしては、ヒト免疫グロブリンＩｇＧドメインが挙げられ得る。好ましい実施形態において、このヒト免疫グロブリンＩｇＧドメインは、特異的抗原結合の能力がある領域を含む。
【００１７】  本発明はさらに、動物における免疫応答を阻害するための方法（有効な量のＴＷＥＡＫブロッキング剤および薬学的に有効なキャリアを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する）を包含する。この免疫応答は、Ｔｈ１細胞媒介免疫応答またはＴｈ２細胞媒介免疫応答あるいはその両方であり得る。
【００１８】  本発明はまた、治療上有効な量のＴＷＥＡＫブロッキング剤および薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物を含む。
【００１９】  （発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中に記載される本発明が十分に理解され得るために、以下の詳細な説明が示される。
【００２０】  本明細書中で使用されるような用語「体液性応答」および「細胞性応答」は、抗原に対する動物の免疫学的応答をいい、これによってその動物は、抗原に対する抗体を産生するか、またはその抗原に対する細胞傷害性応答を生じるか、あるいはその両方を産生する。Ｔヘルパー細胞のＴｈ１クラスは、細胞性応答の誘導のために重要であり、そしてＴヘルパー細胞のＴｈ２クラスは、高い親和性の抗体の有効な産生とって重要である。
【００２１】  本明細書中で使用されるような用語「Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞」は、細胞傷害性Ｔ細胞を生成するのを助け、そして抗体産生を刺激するためにＢ細胞と協力するＴ細胞の機能的なサブクラスをいう。ヘルパーＴ細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子と関連して抗原を認識し、そしてエフェクター細胞に対する接触依存性シグナルおよび接触非依存性シグナル（サイトカインおよびケモカイン）を提供する。
【００２２】  用語「Ｔｈ１」は、ＴＮＦ、インターフェロン−γおよびＩＬ−２（および他のサイトカイン）を産生し、そして攻撃に対して細胞性（すなわち、非免疫グロブリン）応答と関連した炎症性反応を誘発するＴヘルパー細胞のサブクラスをいう。
【００２３】  用語「Ｔｈ２」は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、および他のサイトカインを産生するＴヘルパー細胞のサブクラスをいい、これは免疫性攻撃に対する免疫グロブリン（体液性）応答と関連する。
【００２４】  本明細書中で使用されるような用語「胚中心」は、二次Ｂ細胞濾胞をいい、これは抗原免疫化後に形成する。この組織学的部位の出現は、最適な記憶生成、アイソタイプの変換、体細胞の過剰変異に関連し、従って抗体応答の親和性成熟に関連する。
【００２５】  用語「抗体産生細胞」は、Ｔｈ細胞からの接触依存性シグナルおよび接触非依存性シグナルを受け、そしてＩｇＭサブクラス、ＩｇＧサブクラス、ＩｇＡサブクラス、またはＩｇＥサブクラスの免疫グロブリンを分泌している、Ｂ細胞をいう。
【００２６】  用語、抗体の「Ｆｃドメイン」は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むが、抗原結合部位を欠く、分子の一部をいう。この用語はまた、ＩｇＭアイソタイプまたは他の抗体アイソタイプの等価な領域を含むことが意味される。
【００２７】  用語「抗ＴＷＥＡＫ抗体」は、ＴＷＥＡＫタンパク質の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する任意の抗体をいう。
【００２８】  用語「抗ＴＷＥＡＫレセプター抗体」とは、ＴＷＥＡＫレセプターの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する任意の抗体をいう。
【００２９】  用語「ＴＷＥＡＫレセプターシグナル伝達」は、ＴＷＥＡＫレセプター経路と関連する分子反応およびそれから生じる後の分子反応をいう。
【００３０】  用語「ＴＷＥＡＫ改変剤またはＴＷＥＡＫレセプター改変剤」および「ＴＷＥＡＫ改変試薬またはＴＷＥＡＫレセプター改変試薬」は、ＴＷＥＡＫレセプターへのリガンドの結合を改変し得るか、細胞表面ＴＷＥＡＫレセプタークラスター形成またはＴＷＥＡＫレセプターシグナル伝達を改変し得るか、あるいはＴＷＥＡＫレセプターシグナルが細胞内で翻訳される方法に影響し得る、任意の薬剤をいう。
【００３１】  用語「ＴＷＥＡＫリガンド」または「ＴＷＥＡＫタンパク質」は、ＴＷＥＡＫレセプターに特異的に結合し得る、任意のＴＷＥＡＫモノマー複合体、ＴＷＥＡＫポリマー複合体、またはＴＷＥＡＫヘテロマー複合体あるいはそれらの誘導体をいう。
【００３２】  用語「被験体」は、動物、または動物由来の１つ以上の細胞をいう。好ましくは、動物は哺乳動物である。細胞は、任意の形態であり得、組織に保持される細胞、細胞クラスター、不死化細胞、トランスフェクトされた細胞、または形質転換された細胞、および物理的に改変されたかまたは表現型に関して改変された動物由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】  （ＴＷＥＡＫリガンド）
ＴＷＥＡＫは、ＴＮＦファミリーの最近発見されたメンバーのタンパク質である（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））。ＴＮＦファミリーのメンバーのタンパク質は、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーのタンパク質のレセプターに結合する。ＴＮＦファミリーのタンパク質の、それらのレセプターとの相互作用は、免疫系内の広範な種々の機能に影響する。周知の例としては、ＣＤ４０Ｌタンパク質（これは、抗体産生細胞へのＢ細胞の分化を促進するために、ＣＤ４０レセプターと結合する（ＧｒｅｗａｌおよびＦｌａｖｅｌｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１６：５９−７０（１９９７）））、リンホトキシン−βリガンド（ＬＴ−β）（濾胞樹状細胞の分化状態を調節することにより体液性免疫応答に影響するリンホトキシン−βレセプターに結合する（ＭａｃｋａｙおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：２６−２７（１９９８）））およびＯＸ４０Ｌ（Ｔ細胞シグナルに対するＢ細胞応答の応答を調節するためにＯＸ４０レセプターに結合する（Ｆｌｙｎｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２９７−３０４（１９９８）））が挙げられる。免疫系において決定的な役割を果たすことが公知であるＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒファミリー内の他のリガンド／レセプター対としては、ＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒ５５、ＦａｓＬ／Ｆａｓ、およびＣＤ２７／ＣＤ７０が挙げられる。
【００３４】  ＴＷＥＡＫ生物学は、まだほんの一部が理解されているだけである。精製された可溶性ＴＷＥＡＫタンパク質は、いくつかの腫瘍細胞株（ＨＴ２９腺癌細胞（アポトーシスを介した細胞死）、ＨｅＬａ頸部腺癌細胞（形態学的変化）、およびＡ３７５黒色腫細胞（抗増殖））を含む）の分化および／または死を誘導するために使用された。ＴＷＥＡＫはまた、ＨＴ２９細胞株およびＡ３７５細胞株を誘導し、ケモカインＩＬ−８を分泌し、そして線維芽細胞株（ＷＩ−３８）に対して同じ効果を有した（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））。さらに、ＴＷＥＡＫは、種々の正常な内皮細胞株の増殖を誘導した（Ｌｙｎｃｈら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１８：Ａ−４６（１９９８））。
【００３５】  ＴＷＥＡＫに対する推定されたレセプターが記載されている（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：５２５−５２８（１９９８））。このレセプター（ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ３、ＷＳＬ−１、ＤＲ−３、またはＬＡＲＤとして変化して公知）は、ＴＮＦ−Ｒファミリーメンバーである。ＴＲＡＭＰの活性化は、カスパーゼ依存性細胞死シグナル伝達経路またはＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路を介した細胞活性化のいずれかを保証することによりアポトーシスを誘導し得る（ＡｓｈｋｅｎａｚｉおよびＤｉｘｉｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０５−１３０８（１９９８））。
【００３６】  マウス組織およびヒト組織におけるＴＷＥＡＫの発現は広く行き渡り、組織の中でもとりわけ心臓、脳、肺、肝臓、および二次リンパ器官（例えば、脾臓、リンパ節、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））にてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が見出される。ＴＷＥＡＫは、免疫系細胞が発生する一次リンパ器官（例えば、胸腺、骨髄および胎児の肝臓）では発現しないようである。従って、ＴＷＥＡＫが免疫系において果たし得る役割は、免疫系の発生においてではなく、おそらく免疫応答においてであろう。
【００３７】  タンパク質のリガンドとそれらのレセプターとの相互作用は、多くの特異的手段を用いて改変され得る。例えば、そのリガンドを特異的に認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、結合部位の認識によってか、またはその相互作用を物理的に妨げることによって、リガンド／レセプター結合を防止または改変するために使用され得る。あるいは、抗リガンドｍＡｂは、複数のリガンドが１つのレセプターに対して存在する場合、他のリガンドの結合に影響を及ぼすことによってレセプターシグナル伝達に影響を及ぼし得る。このような複雑な効果は、ＣＤ２８リガンドのＢ７ファミリーに対するｍＡｂについて注目されている（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１１４５−１１５５（１９９５））。抗リガンドｍＡｂは、複数のレセプターが１つの特定のリガンドについて存在する系において、例えば、１つのレセプターへのリガンドの結合を改変するが、別のレセプターへの結合を変えないままにすることにより、さらにより微妙な効果を有し得る。そのレセプターを認識するｍＡｂもまた、リガンドの結合を改変するために使用され得るか、あるいはｍＡｂ自身がレセプターシグナル伝達を誘導し得るか、または改変し得る。従って、抗レセプターｍＡｂは、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。ＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒファミリーメンバーのリガンド／レセプター相互作用を改変するためにマウス系またはヒト系において使用されるｍＡｂの例としては、とりわけ、ＴＮＦに対して特異的なｍＡｂ、ＣＤ４０Ｌに対して特異的なｍＡｂ、ＬＴ−βに対して特異的なｍＡｂ、Ｆａｓ−Ｌに対して特異的なｍＡｂおよびＴＲ２／ＨＶＥＭに対して特異的なｍＡｂが挙げられる。ｍＡｂは、免疫学的疾患および他の疾患の開始または発症をブロックするために使用され得る。例えば、抗ＣＤ４０Ｌは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の処置において、および器官移植不全を制御するのに使用されている。
【００３８】  リガンド／レセプター相互作用のタンパク質インヒビタ−はまた、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖をコードする配列に、レセプター配列の細胞外部分をコードする配列をクローニングすること、次いで、適切な細胞株において適切な遺伝子プロモーターを使用して、そのハイブリッド遺伝子を発現することによって、作製され得る。精製されるレセプター−Ｉｇ融合タンパク質は、利用可能なタンパク質リガンドに結合し、従ってネイティブな、細胞結合レセプターとこのリガンドの相互作用を改変するために、インビトロおよびインビボで使用され得る。改変は、抗リガンドｍＡｂについて上で概説された機構と類似の、種々の機構によって起こり得る。ＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒファミリーメンバーのリガンド／レセプター相互作用を改変するために、マウス系またはヒト系において使用されるレセプター−Ｉｇ融合タンパク質の例としては、とりわけ、ＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ、ＴＮＦ−Ｒ７５−Ｉｇ、ＴＬβ−Ｒ−Ｉｇ、およびＯＸ４０−Ｉｇが挙げられる。レセプター−Ｉｇ融合タンパク質は、免疫学的疾患および他の疾患の開始または発症をブロックするために使用され得る。例えば、ＴＮＦ−Ｒ７５−Ｉｇは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するために使用されている。
【００３９】  本明細書中で本発明者らは、マウスＴＷＥＡＫおよびヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合するｍＡｂが、基本型の抗原駆動型免疫学的障害である、対宿主性移植片病の発症をブロックすることを示す。本発明者らの発明は、患者への異種抗原の導入により生じる種々の免疫学的障害（例えば、骨髄移植または幹細胞移植により生じるＧＶＨＤ、および移植片拒絶により生じる器官移植不全）を処置するためのＴＷＥＡＫ改変試薬およびＴＷＥＡＫレセプター改変試薬の使用を期待する。さらに、本発明は、種々の自己免疫障害（例えば、他の例のうちとりわけ、ＳＬＥ、特発性血小板減少性紫斑病、ヴェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、網膜性のブドウ膜炎、急速進行性半月体糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および潰瘍性大腸炎）を処置するためのＴＷＥＡＫ改変試薬およびＴＷＥＡＫレセプター改変試薬の使用を期待する。他の期待される使用としては、急性炎症性状態および慢性炎症性状態（例えば、とりわけ、アレルギー性炎症、喘息、好酸球増加症、グレーヴス病、およびシャーガス病）の処置が挙げられる。
【００４０】  （材料および方法）
（マウス）ＤＢＡ／２系統およびＣ５７Ｂ１／６系統、ならびに（ＤＢＡ／２×Ｃ５７Ｂ１／６）Ｆ１交雑の６〜８週齢の雌のマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ  ＵＳＡ）から購入し、従来の仕切り保護下に収容し、そして業務的指針に従って取り扱った。
【００４１】  （モノクローナル抗体）ヒトＴＷＥＡＫタンパク質およびマウスＴＷＥＡＫタンパク質を認識するモノクローナル抗体は、バキュロウイルス中で産生された可溶性ヒトＴＷＥＡＫタンパク質を使用して、Ａｒｍｅｎｉａｎハムスター中で産生され、そして記載される（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））ように精製された。初めの免疫化については、各々のハムスターは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の５０μｇのＴＷＥＡＫを受けた（腹腔内に注射された）。引き続く免疫化（最初の免疫化の後１４、２８および４２日目）については、各々のハムスターは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の５０μｇ（１４および２８日目）または３３μｇ（４２日目）のＴＷＥＡＫを腹腔内に受けた。ハイブリドーマ形成のための脾細胞の融合前の最後の免疫化は、アジュバントなしで１００μｇのＴＷＥＡＫを腹腔内に用いた。ハイブリドーマの生成は、標準の手順（Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２（１９８１））を使用して実施した。
【００４２】  抗マウスＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１を産生するハイブリドーマ（Ｎｏｅｌｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６５５０−６５５４（１９９２））は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ＵＳＡ）から購入した。抗ＫＬＨ  ｍＡｂ  Ｈａ４／８を産生するハイブリドーマは、Ｍｅｎｄｒｉｃｋ博士（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ＵＳＡ）から入手した。
【００４３】  （ｍＡｂ活性のＥＬＩＳＡ分析）抗ヒトＴＷＥＡＫ  ｍＡｂを、種々の実験形式においてヒトＴＷＥＡＫおよびマウスＴＷＥＡＫへの結合能力について試験した。ヒトＴＷＥＡＫタンパク質に対して惹起されたいくつかのｍＡｂはまた、ＥＬＩＳＡ形式アッセイを使用して行われた、ｍＡｂ活性の最初のスクリーニングにおいて、マウスＴＷＥＡＫタンパク質を認識した。マウスＴＷＥＡＫタンパク質を、ヒトＴＷＥＡＫタンパク質について記載された方法（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））と類似の方法を使用して、バキュロウイルス中で作製した。精製されたヒトＴＷＥＡＫタンパク質およびマウスＴＷＥＡＫタンパク質を９６ウェルプレート上にコートし、そして種々のハムスターｍＡｂを、これらの固定化タンパク質への結合能力について試験した。固定化ＴＷＥＡＫタンパク質によるハムスターｍＡｂの捕獲を、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗ハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ  ＵＳＡ）および適切なペルオキシダーゼ依存的酵素反応を使用して可視化した。
【００４４】  （ｍＡｂ活性のＦＡＣＳ分析）可溶性ＴＷＥＡＫタンパク質は、ＨＴ２９細胞においてアポトーシスを誘導し、このことは、これらの細胞がＴＷＥＡＫレセプターを発現することを示す（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））。ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ、および適切な酵素基質により検出されるので、精製したｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を、ＨＴ２９細胞に対するＦＡＬＧ−タグ化マウスＴＷＥＡＫおよびヒトＴＷＥＡＫの結合をブロックする能力について試験した。
【００４５】  （慢性ＧＶＨＤの誘発）６〜８週齢のＤＢＡ／２およびＢ６Ｄ２Ｆ１の雌のマウスを屠殺し、そして脾臓を無菌技術を使用して取り出した。脾臓を粗いガラススライドの間で穏やかに粉砕し、大きい破片を鎮静させ、次いで清澄な上清をペレット化することにより、単一の細胞の懸濁液を作成した。この細胞のペレットをＧｅｙ緩衝化高張液に再懸濁し、そして氷上で３分間インキュベートし、赤血球を溶解させた。各々の破壊した脾臓あたり５ｍｌのＧｅｙ溶液を使用した。この細胞溶液を再度ペレット化し、無菌の、パイロジェンを含まないＰＢＳに再懸濁し、ペレット化し、そして無菌の、パイロジェンを含まないＰＢＳ中にて二度目の再懸濁を行った。細胞数を、血球計数器を使用して決定し、そして細胞密度を２×１０8／ｍｌに調整した。次いで、この溶液を滅菌７０ｕｍ（μｍ）セルフィルターを通し、そして使用するまで氷上に保った。６〜８週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１の雌マウスをレシピエントとして使用した。各々のレシピエントに、５００μｌ（１×１０8）の細胞を静脈中に注射した。実験群は、ＤＢＡ／２移植片（ＤＢＡ／２＞Ｆ１）を受け、一方、コントロール動物のセットは、Ｂ６Ｄ２Ｆ１移植片（Ｆ１＞Ｆ１）を受けた。動物を、注射の１４日後に慢性ＧＶＨＤの発生についてアッセイした。
【００４６】  （慢性ＧＶＨＤのブロッキング）マウスは、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗−ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂ  Ｈａ４／８を受けるか、または処置を受けなかった。処置スケジュールは、移植片の注射４時間前、ならびにその後２、４および６日目に、腹腔内への２５０μｇのｍＡｂであった。
【００４７】  （疾患の発症のアッセイ）実験の１４日目に、マウスを屠殺し、そして秤量した。次いで、脾臓を無菌的に取り出し、そして秤量した。脾臓の指数を、コントロールＦ１＞Ｆ１群における各々の動物について、体重に対する脾臓の割合として計算し、平均して、群の値を得た。他の全ての群についての平均脾臓指数を、コントロール値に対して標準化する。次いで、上記のように、脾細胞を、これらの脾臓から単離し、次いで、滅菌ＰＢＳ中で１×１０7細胞／ｍｌの濃度に希釈した。ＦＡＣＳ分析のために、１００μｌの細胞を、以下の細胞表面マーカーについて染色した。記載されるすべてのｍＡｂをＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．ＵＳＡ）から購入した。ストレプトアビジンの試薬をＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ．、ＵＳＡ）から購入した。Ｆｃレセプターへの非特異的結合を妨げるために、１０μｇ／ｍｌのＦｃＢｌｏｃｋtm（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＡＳ）／０．１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）中で、脾細胞を、ビオチン化抗Ｈ−２Ｋb（直接的に接合したＦＩＴＣ標識化またはＰＥ標識化の抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗Ｂ２２０、抗ＣＤ６９、抗Ｉ−Ａd、抗Ｌ−セレクチンおよび抗Ｈ２Ｄdとの種々の組み合わせで、宿主細胞（Ｈ−２Ｋb＋）からドナー細胞（Ｈ−２Ｋb−）を区別し得る、ハプロタイプのマーカー）を用いて染色した。この細胞を、１時間氷上でｍＡｂと共にインキュベートした。次いで、各々のサンプルを２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して洗浄し、次いで遠心分離して細胞をペレット化した。この細胞を、ビオチン化ｍＡｂに結合し、ＦＡＣＳ分析のために第三のチャネルを提供する、ＣｙＣｈｒｏｍｅ標識化ストレプトアビジンを含むＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、最終回の洗浄を行い、そしてＦＡＣｓｃａｎ装置およびＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ．ＵＳＡ）を使用して分析した。
【００４８】  Ｉｇ分泌のインビトロ分析のために、細胞をペレット化し、そして、１×１０7細胞／ｍｌの濃度で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）／４ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中に再懸濁した。ウェルあたり１ｍｌを６ウェルプレートに分配した。細胞上清を２４時間後に回収した。
【００４９】  （抗ＴＷＥＡＫ抗体の供給源）本発明の１つの実施形態では、ＴＷＥＡＫに対する抗体（Ａｂ）が、ＴＷＥＡＫブロッキング剤として機能する。Ａｂは、異種サブユニットが存在する場合、異種サブユニットを有するかまたは有さないＴＷＥＡＫタンパク質の、モノマー形態、ダイマー形態またはトリマー形態に対して惹起され得る。さらに、Ａｂは、ＴＷＥＡＫタンパク質の可溶性形態、変異体形態、変更された形態、またはキメラ形態に対して惹起され得る。本発明の抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂは、ポリクローナルまたはモノクローナル（ｍＡｂ）であり得、そして改変され、ＴＷＥＡＫのそのレセプターへの結合をブロックする能力、インビボでの生物学的利用能、安定性、または他の所望の形質を最適化され得る。
【００５０】  ＴＷＥＡＫに対するポリクローナル抗体血清は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のヒトＴＷＥＡＫを用いて動物（例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウス）に皮下注射し、次いで、追加免疫（不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の腹腔内注射または皮下注射）することによる、従来の技術を使用して調製される。ＴＷＥＡＫに対する所望のＡｂを含むポリクローナル抗血清は、従来の免疫学的手順によりスクリーニングされる。
【００５１】
ヒトＴＷＥＡＫに対するハムスターモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＣＦＡ中の組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫを用いてアルメニアン（ａｒｍｅｎｉａｎ）ハムスターに皮下注射し、次いで追加免疫（ＩＦＡ中の腹腔内注射または皮下注射）することによる、従来の技術を使用して調製される。ハムスター抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３を産生するハイブリドーマ細胞株（ＡＢ．Ｄ３．７．２）は、ブタペスト条約の規定に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に、１９９８年１２月１７日に寄託され、そして、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６２２を付与された。上記のＡＴＣＣ寄託の公への入手可能性の全ての制限は、本出願の特許の認可に際して、変更不可能に除去される。
【００５２】  抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂの種々の形態はまた、標準の組換えＤＮＡ技術を使用して作成され得る（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３−２９９頁（１９９１））。例えば、「キメラ」抗体は、動物の抗体由来の抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結されて構築され得る（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１、６８５１〜６８５５頁（１９８４））。キメラＡｂは、ヒトの臨床的処置において用いられる場合、動物Ａｂにより誘発される、観察される免疫原性応答を減少する。
【００５３】  さらに、ＴＷＥＡＫを認識する組換え「ヒト化抗体」は、合成され得る。ヒト化Ａｂは、特異的抗原結合に対して応答性の領域が挿入されている、ほとんどのヒトＩｇＧ配列を含むキメラである（例えば、ＷＯ９４／０４６７９）。動物は所望の抗原で免疫化され、対応するＡｂは単離され、そして特異的抗原結合に応答性の種々の領域配列の部分は除去される。次いで、動物由来抗原結合領域は、抗原結合領域が欠失しているヒト抗体遺伝子の適切な部分にクローンニングされる。ヒト化Ａｂは、ヒトＡｂにおける異種（種間）配列の使用を最小化し、そして処置された被験体における免疫応答をほとんど誘発しないようである。
【００５４】  異なるクラスの組換え抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂの構築物はまた、異なるクラスの免疫グロブリンから単離された抗ＴＷＥＡＫ可変ドメインおよびヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む、キメラＡｂまたはヒト化Ａｂを作成することにより達成され得る。例えば、増加した抗原結合部位の結合価を有する抗ＴＷＥＡＫ  ＩｇＭ  Ａｂは、ヒトＩｇＭの重鎖定常領域を保有するベクターに、この抗体結合部位をクローニングすることにより組換え的に産生され得る（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７、１４３９−１４５０頁（１９９３）；Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２、２５７３−２５７８（１９９３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９、６８−７０頁（１９８９））。
【００５５】  さらに、標準の組換えＤＮＡ技術は、抗原結合部位の近傍のアミノ酸残基を変化させることにより、組換えＡｂの抗原との結合親和性を変化させるために使用され得る。ヒト化Ａｂの抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異誘発により増加され得る（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６、１００２９−１００３３頁（１９８９）；ＷＯ９４／０４６７９）。
【００５６】  標的された組織のタイプまたは想像される特定の処置スケジュールに依存して、ＴＷＥＡＫに対する抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂの親和性を増加または減少することは、望ましくあり得る。例えば、半予防的処置のためにＴＷＥＡＫ経路を改変する減少した能力で、抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂの一定のレベルを有する患者を処置することは、有利であり得る。同様に、ＴＷＥＡＫに対する増加した親和性を有する抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂは、短期間の処置のために有利であり得る。
【００５７】  ハムスター抗ヒトＴＷＥＡＫモノクローナル抗体の産生は、実施例１において例示される。
【００５８】  （慢性ＧＶＨＤ（抗原誘導免疫学的疾患）の発症をブロックするための抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂの使用）ここで、本発明者らは、慢性対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）のマウスモデルにおける免疫学的応答の発生に対するＴＷＥＡＫブロッキング剤（ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３）の効果を示す。慢性ＧＶＨＤをブロックする能力は、Ｂ細胞の活性化および増殖、ならびに分泌されるＩｇＧの産生に対する効果を含む。マウスは、２５０μｇの抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＫＬＨコントロールｍＡｂ  Ｈａ４／８、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１で腹腔内（ｉｐ）に処置されるか、または無処置のままにされた。４時間後、マウスは、静脈内（ｉｖ）に与えられた０．５ｍｌの注射内の、ＤＢＡ／２マウスから単離された１×１０8の脾細胞を受けた。静脈内注射されたＤＢＡ／２脾細胞は、同種移植片から構築された。移植片を与えられた２日、４日および６日後、マウスは、再び２５０μｇの抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＫＬＨコントロールｍＡｂ  Ｈａ４／８、または抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１で処置された。コントロール群のマウスは、Ｂ６Ｄ２Ｆ１レシピエントにおいて疾患を誘導し得ない、１×１０8のＢ６Ｄ２Ｆ１の脾細胞を受けた。あるいは、移植されない、または無処置のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスは、コントロールとして使用された。移植片が与えられた１４日後、マウスは、屠殺され、そして疾患の証拠のために実験された。
【００５９】  無処置の移植片レシピエントであるマウスは、慢性ＧＶＨＤの発症を示す種々の症状を明示する。巨脾腫症、または脾臓の膨張は、ドナーＴ細胞および宿主Ｂ細胞が活性化されたことの証拠であり、そして、細胞数における劇的な増加を有するポリクローナルな膨張を受けている。Ｂ細胞のサブセット上の細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ６９）の出現は、Ｂ細胞の活性化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＬ−セレクチン分子の欠失は、Ｔ細胞の活性化の証拠である。血清中またはインビトロの細胞培養アッセイ中のいずれかにおける、Ｉｇ分子（例えば、ＩｇＧクラス、ＩｇＡおよびＩｇＥ）の分泌は、Ｂ細胞が活性化し、そしてこれらのＩｇクラスを切り換えたことを示す。この点に関して、血清中またはインビトロ細胞培養アッセイにおける抗自己Ｉｇの出現は、産生されたＩｇが不適切な自己抗原認識を有することを示す。結局、生存率は、異なる処置のレジメンの結果として測定され得る。
【００６０】  本発明者らは、ＧＶＨＤの間の、巨脾腫症の拡張、Ｂ細胞の活性化およびＩｇの分泌を試験するために、コントロールマウスを無処置の同種移植片レシピエントであるマウスと比較した。抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１は、これらの実験においてポジティブコントロールとして使用された。なせなら、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用をブロックすることは、慢性ＧＶＨＤの発症を妨害する効果的な手段であることが、以前に示されていたからである（Ｄｕｒｉｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３３３−１３３８（１９９４））。ハムスターｍＡｂ（Ｈａ４／８）は、ネガティブコントロール処置として機能するキーホールリンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）に惹起された。２つの実験からの結果を、表２に示す。両方の実験において、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３での処置は、巨脾腫症の量を（無処置の同種移植片レシピエントと比較して）約３３％減少した。ネガティブコントロールのｍＡｂ  Ｈａ４／８での処置は、効果を有さなかったが、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１での処置は、巨脾腫症をほぼ７０％までブロックした。抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３  ＦＡＣＳでの処置により影響される細胞集団を研究するために、移植片注射の１４日後のレシピエントであるマウスから取り出した脾細胞に対して、分析を実施した。群あたり３〜４匹のマウス由来の脾細胞を単離し、そしてプールした。レシピエントのＢ細胞の活性化は、慢性ＧＶＨＤを規定する特徴である。無処置およびコントロールのｍＡｂ処置されたマウスにおいて、小さいが容易に見られる割合の、Ｂ２００＋Ｂ細胞が、活性化マーカーＣＤ６９を発現する（図４および表３）。対照的に、ＭＲ１またはＡＤ．Ｂ３で処置したマウスにおけるＢ２００＋Ｂ細胞は、実質的にはＣＤ６９を発現しなかった。ＡＢ．Ｄ３マウスの脾臓における、測定可能なＢ細胞の活性化の欠失は、Ｔ細胞活性化不全、Ｂ細胞活性化不全、または細胞死（アポトーシス）を含む作用のいくつかの機構のうちの１つ以上に起因し得た。次いで、本発明者は、Ｂ細胞集団由来ＣＤ６９活性化マーカーの欠失が機能的な読出し（すなわち、ＩｇＧ産生）と相関するか否かを決定するために、異なる処置群由来のマウスにおける脾細胞の培養物中の総ＩｇＧを測定した。無処置のコントロールマウス（ＭＲ１処置のマウス）およびＡＢ．Ｄ３処置マウスは、無処置またはＨａ４／８処置の同種移植片レシピエントであるマウスが産生するよりも、劇的により低い量の総ＩｇＧを産生した（表４）。この結果は、活性化Ｂ細胞によるＩｇ分泌（慢性ＧＶＨＤを規定する特徴）が抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂで処置されることによりブロックされることを示す。慢性ＧＶＨＤの発症をブロックするための抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂの使用を、実施例２に例示する。
【００６１】  （抗体が媒介する他の疾患）多くの器官特異的疾患および全身性自己免疫疾患は、病理学的抗体応答を含む。このような状態としては、以下が挙げられる：重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヴェーゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎および急速進行性半月体形成性糸球体腎炎（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第三版（１９９６）より）。
【００６２】  ＳＬＥの病因学は定義されていないが、観察される病理学の原因である免疫学的機構について、かなりの量が既知である。未知の理由に対して、ＳＬＥを有する患者は、身体の核成分に対する（ネイティブな二重鎖ＤＮＡに対する）抗体（抗核抗体（ＡＮＡ））を著しく産生する。臨床的に、これらの抗体の存在は、ＳＬＥにおいて発達する腎臓病理学に最も相関する。これらの抗体は、明らかに正常な組織の崩壊由来であるＤＮＡと複合体化し、そして任意の免疫凝集疾患における場合、このような複合体は、細動脈壁および関節の滑液のスペースにおいて、糸球体の基底膜に対して捕捉される沈着物を形成する。これらの複合体は、補体カスケードを活性化し、そして顆粒球を誘引する。引き続く炎症反応は、腎臓にダメージを生じさせて、タンパク尿および血尿を誘発する、糸球体腎炎として特徴付けられる。
【００６３】  ＳＬＥは、数十年間、マウスモデルにおいて研究されてきた。ＳＬＥの発症は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化における重要な工程を妨げる試薬（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質および抗ＣＤ４０Ｌ）を使用してブロックされ得る（ＧｒｅｗａｌおよびＦｌａｖｅｌｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５３：８５−１０６（１９９６））。最近、マウスＣＤ４０リガンドに特異的な試薬の治療的効力が、いくつかのモデルにおいて評価された（Ｍｏｈａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４、１４７０−１４８０頁（１９９５））。インビボで病原性抗体の産生を誘導する細胞の移動による狼瘡の促進は、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンドの相互作用をブロックするモノクローナル抗体の投与により阻害されることが示された。さらに、抗ＣＤ４０リガンド抗体での、狼瘡のマウスの簡潔な処置は、抗体がこれらの系から一掃されたかなり後に、自発性疾患に対する持続性の有利な効果を有した。実験は、病原性Ｂ細胞が治療の９ヶ月後でさえ抗体を産生し得なかったことを示し、このことは、長期的治療の利点を生じる自己免疫記憶Ｂ細胞の拡張が遅延したことを示唆する。さらに、抗ＣＤ４０Ｌの処置は、自発的に生じているマウスモデルにおいて確立されたＳＬＥの進行を停止または遅延し得た（Ｋａｌｌｅｄら、Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２１５８−２１６５（１９９８））。本発明者らが、インビボでのＴＷＥＡＫ／ＴＷＥＡＫレセプター相互作用を改変する試薬が、Ｂ細胞活性化およびＩｇ産生を阻害することを示したように、本発明の試薬は、ＳＬＥを処置または予防するために有用である。
【００６４】  いくつかの病原性の病原体（ｉｎｆｅｃｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）に対する正常な免疫応答は、過剰になり得る自己抗体応答を誘発し、そして医学的問題を提示する。１つの例は、シャーガス病（慢性クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）感染を有するヒトおよび実験動物において発症する炎症性心筋症）である。最近、いくつかの研究は、シャーガス病患者の血清中の抗自己抗体を同定した（Ｂａｃｈ−Ｅｌｉａｓら、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｒｅｓ．８４：７９６−７９９（１９９８））。さらに、心臓特異的自己免疫応答の誘導は、最近、ヒトシャーガス心筋症の病因学に関連する可能な機構として、実質的な実験的支持を受けた。最近の研究（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２、１４９３−１４９９頁（１９９４））は、心臓の抗原特異的抗体が、心臓病を有するＴ．Ｃｒｕｚｉ感染Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて産生されることを決定した。Ｔ．ＣｒｕｚｉのＢｒａｚｉｌ系統での感染に際して、Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、慢性的に感染したヒトにおいて観察される心筋症に組織学的に類似する心筋症を発症させる。これらのマウス由来の抗血清は、３つの心臓の抗原と反応するが、心筋症を発症させない、Ｔ．ＣｒｕｚｉのＧｕａｙａｓ系統で感染したＣ５７Ｂ１／６マウスは、このような抗体を産生しなかった。これらのデータは、これらの抗体が、心筋症の特異的マーカーであることを示す。Ｂ細胞活性化およびＩｇ産生をブロックする、ＴＷＥＡＫ改変剤の能力は、シャーガス病患者において起こる心臓のダメージをブロックすることにおいて有用である。
【００６５】  特定の感染疾患の結果として作製される自己抗体によるか、または他の未知の理由のための細胞破壊の別の例は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）である。この状態において、血小板に対する抗体は、出血の原因となり得る（補体、またはＦｃもしくはＣ３ｂレセプターを有する食細胞による）血小板破壊を生じる。インビボで自己免疫反応を媒介するこのような抗体を阻害する治療薬（例えば、本発明のＴＷＥＡＫ改変剤）−−抗体の産生を阻害する−−は、これらの自己免疫疾患を処置または予防するためにさらに有用である。
【００６６】  いくつかの病原性の病原体（ｉｎｆｅｃｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）に対する正常な免疫応答はまた、過剰になり得る過敏性反応を誘発し得、そしてそれら自体を医学的問題として提示し得る。Ｉ型過感受性の最も流行性の例は、アレルギー反応である。これらは、肥満細胞上および好塩基球上のレセプターにＦｃ部分を介して結合するＩｇＥ抗体により媒介され、アナフィラキシーを媒介する薬学的に活性な因子の放出を引き起こす。ＩＴＰおよびグッドパスチャー症候群は時々、ＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体が細胞表面上の抗原に結合し、補体カスケードを活性化する場合に生じる、ＩＩ型反応であると考えられる。次いで、顆粒球は、活性化部位に誘引され、そしてこれらの顆粒細胞由来の溶解酵素の放出からのダメージは、細胞の破壊を生じる。リウマチ性動脈炎は、正常なＩｇＧのＦｃ部分に結合する抗原（この場合は、リウマチ因子（ＩｇＭ自己抗体））の免疫複合体により媒介されるＩＩＩ型過敏性反応から生じると考えられる。これらの免疫複合体は、関節の炎症を引き起こすことおよびこの疾患に特徴的なダメージに関与する。これらの病理学が抗体により部分的に媒介される場合、抗体の産生を阻害する治療薬（例えば、本発明のＴＷＥＡＫ改変剤）はこれらの疾患を処置または予防するためにさらに有用である。
【００６７】  患者に対する有意な抗体媒介性損傷を生じる疾患のさらなる例としては、グレーヴズ病および急性溶血性貧血が挙げられる。ＴＷＥＡＫ改変剤がこのような疾患を予防または処置する際に有効性を示すことが、予測される。
【００６８】  （細胞性免疫応答の阻害）本発明者らは、インビボにおいてＴＷＥＡＫタンパク質の活性を改変する試薬の投与が、抗体媒介性（体液性）免疫障害である慢性ＧＶＨＤの発症をブロックすることを示した。慢性ＧＶＨＤの発症をブロックし得る他の強力な免疫系改変剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）としては、抗ＣＤ４０ＬおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質が挙げられる。これらの試薬は、Ｔ細胞活性化およびＢ細胞活性化における重大な工程をブロックする（ＧｒｅｗａｌおよびＦｌａｖｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５３：８５−１０６（１９９６））。従って、これらの他の強力な免疫系経路の治療的操作は、体液性免疫応答に限定されていない。例えば、抗ＣＤ４０ＬおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇは、動物モデルにおいて器官移植拒絶を制御するために、別々におよび一緒に使用されている（Ｋｉｒｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：８７８９−８７９４（１９９７））。移植された器官に対する多くの免疫応答は、Ｔｈ１  Ｔ細胞媒介性であり、そして細胞傷害性細胞性免疫応答からなる。このような細胞性免疫応答は、自己免疫疾患のような種々の他の免疫障害（例としては、例えば、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、潰瘍性大腸炎およびクローン病）における細胞媒介性損傷の原因である。慢性ＧＶＨＤの発症をブロックする能力に基づいて、本発明者らの発明は、細胞性免疫障害の治療的処置におけるＴＷＥＡＫ改変試薬またはＴＷＥＡＫレセプター改変試薬の使用を予測する。
【００６９】  （ＴＷＥＡＫ改変剤およびＴＷＥＡＫレセプター改変剤を使用する処置）本発明の組成物は、検討される特定の臨床的状態を処置するために有効な用量で投与される。所定の適用について好ましい薬学的処方物および治療上有効な用量レジメントの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度ならびに処置についての患者の寛容を考慮して、十分に当該分野の技術内にある。
【００７０】  約５ｍｇ／ｋｇのＴＷＥＡＫ改変剤またはＴＷＥＡＫレセプター改変剤の用量は、処置用量を最適化するための適切な開始点であることが予測される。
【００７１】  治療上有効な用量の決定はまた、インビトロ実験を実施することによって評価され得る。この実験は、（治療上）適切な時間の間に標的細胞（改変剤に依存するＴＷＥＡＫ陽性細胞またはＴＷＥＡＫレセプター陽性細胞）をコーティングするために必要である改変剤の濃度を測定する。本明細書中に記載されるＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡレセプター−リガンド結合アッセイは、細胞コーティング反応をモニターするために使用され得る。このようなインビトロ結合アッセイの結果に基づいて、適切な改変剤濃度の範囲が、動物において試験するために選択され得る。
【００７２】  本発明の可溶性改変剤（天然に存在する試薬または化学的に誘導された試薬、およびそれらの塩または薬学的に受容可能なそれらの誘導体を含む、単離された形態および精製された形態の抗ＴＷＥＡＫ抗体および抗ＴＷＥＡＫ  Ｒ抗体、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質、他のＴＷＥＡＫ改変試薬およびＴＷＥＡＫレセプター改変試薬を、単独でまたは組み合わせて含む）の投与は、免疫抑制活性を示す薬剤の投与の、従来の受容される任意の様式を使用して達成され得る。
【００７３】  これらの治療において使用される薬学的組成物はまた、種々の形態であり得る。これらとしては、例えば、固体、半固体および液体の投薬形態（例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、坐剤、ならびに注射用溶液および注入用溶液）が挙げられる。好ましい形態は、投与および治療的適用の意図される様式に依存する。投与の様式としては、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病変内投与、または局所的投与が挙げられ得る。
【００７４】  本発明のＴＷＥＡＫ改変剤およびＴＷＥＡＫレセプター改変剤は、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を有するかまたは有さない、滅菌された等張処方物中に配置され得る。処方物は、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥された粉末であり得る。例えば、本発明のＴＷＥＡＫ改変剤およびＴＷＥＡＫレセプター改変剤は、５．０ｍｇ／ｍｌのクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのグリシンおよび１ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０を含む処方緩衝液を用いて希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され得、冷蔵下で保存され得、そして投与される前に、滅菌された注射用水（Ｗａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＳＰ）を用いて再構成され得る。
【００７５】  この組成物はまた、好ましくは、当該分野で周知の従来の薬学的に受容可能なキャリアを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアとしては、他の医薬用薬剤、キャリア、遺伝的キャリア、アジュバント、賦形剤など（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）が挙げられ得る。この組成物は、好ましくは、単位用量の形態であり、そして通常１日に１回以上投与される。
【００７６】  本発明の薬学的組成物はまた、罹患された組織または血流に置かれるか、罹患された組織または血流の近傍に置かれるか、そうでなければ罹患された組織または血流に連絡する、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達システムまたは徐放性処方物を使用して投与され得る。徐放性キャリアの適切な例としては、成形物品（例えば、坐剤またはミクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。移植可能な徐放性マトリクスまたはミクロカプセル徐放性マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５６頁（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，１６７−２７７頁（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８−１０５頁（１９８２））が挙げられる。
【００７７】  （ＴＷＥＡＫ改変剤またはＴＷＥＡＫレセプター改変剤を含む治療組成物の利点）本発明のＴＷＥＡＫ改変剤およびＴＷＥＡＫレセプター改変剤は、慢性ＧＶＨＤモデルにおけるＢ細胞活性化およびＩｇ産生の阻害によって示されるように、免疫応答を阻害し得る。このような免疫媒介性応答を選択的に阻害する能力は、免疫障害（種々の自己免疫疾患、器官移植拒絶、ならびに急性および慢性の炎症状態を含む）の処置に有用である。このような病理学的免疫障害の処置は、一般に、広範な種々の細胞型および免疫学的応答に対して多面発現性効果を有する免疫調節剤および免疫抑制剤を使用する。これらの非特異的免疫抑制剤は、一般に、有害な副作用を生じる高用量で、およびしばしば細胞傷害性用量で、必要とされる。例えば、現在使用される３つの一般的な免疫抑制剤としては、ステロイド、シクロホスファミドおよびアザチオプリンが挙げられる。ステロイドは、多面発現性抗炎症薬剤であり、これは、活性化マクロファージを抑制し、そして多くの病理Ｔ細胞効果を逆にする方法で抗原提示細胞の活性を阻害する。シクロホスファミド（アルキル化剤）は、ＤＮＡの複製および修復を阻害することによって細胞死を媒介する。アザチオプリンは、抗増殖性薬剤であり、これは、ＤＮＡ合成を阻害する。これらの非特異的免疫抑制剤は、一般に、これらの毒性（例えば、腎毒性および肝毒性）を増大しかつ有害な副作用を生じる高用量で必要とされる。従って、これらは、長期間の治療の間には不適切である。
【００７８】  従って、従来の処置によって生じる問題を克服するさらなる薬剤および治療のまだ満たされていない必要性が存在する。
【００７９】  以下は、本発明の抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ、このｍＡｂの特徴において使用される方法、および抗原駆動免疫学的障害をブロックするためのこのｍＡｂの使用を例示する実施例である。これらの実施例は、限定されると解釈されるべきではない：この実施例は、例示の目的のために含まれ、そして本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００８０】  （実施例）
（実施例１：ＴＷＥＡＫタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生）
ヒトＴＷＥＡＫタンパク質およびマウスＴＷＥＡＫタンパク質を認識するモノクローナル抗体を、記載されるように、バキュロウイルスにおいて生成された可溶性ヒトＴＷＥＡＫタンパク質を使用して、アルメニアハムスター（Ａｒｍｅｎｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）において生成した（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））。最初の免疫について、各ハムスターは、ｉｐで、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で５０μｇのＴＷＥＡＫを受けた。引き続く免疫（最初の免疫の１４日後、２８日後および４２日後）について、各ハムスターは、ｉｐで、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で５０μｇのＴＷＥＡＫ（１４日および２８日）または３３μｇのＴＷＥＡＫ（４２日）を受けた。ハイブリドーマ形成のための脾臓細胞の融合の前の最後の免疫は、ｉｐで、アジュバントを有さない１００μｇのＴＷＥＡＫを用いた。ハイブリドーマ生成を、標準的な手順を使用して実施した（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２（１９８１））。
【００８１】  ｍＡｂ活性の最初のスクリーニングを、ＥＬＩＳＡ形式アッセイを使用して行った。マウスＴＷＥＡＫタンパク質を、ヒトＴＷＥＡＫタンパク質について記載される方法と類似の方法を使用して、バキュロウイルスにおいて生成した（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））。精製したヒトＴＷＥＡＫタンパク質および精製したマウスＴＷＥＡＫタンパク質を、９６ウェルプレート上にコーティングし、そして種々のハムスターｍＡｂを、このｍＡｂが、これらの固定化されたタンパク質に結合する能力について、試験した。固定化されたＴＷＥＡＫタンパク質によるハムスターｍＡｂの捕捉を、ＨＲＰを結合したロバ抗ハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ  ＵＳＡ）、および適切な酵素反応を使用して可視化した。２３のｍＡｂのうちの８つが、マウスＴＷＥＡＫタンパク質およびヒトＴＷＥＡＫタンパク質の両方を認識した（表１）。
【００８２】
【表１】
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ＴＷＥＡＫのマウス形態とヒト形態との間に見られるタンパク質相同性の程度を考えれば、種系統を超える抗原性エピトープの保存は、驚くほどではなかった。（図１）。ＦＡＣＳ分析を使用して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂが、細胞の表面上に発現されるＴＷＥＡＫタンパク質に結合し得るかどうかを決定した。ヒトＴＷＥＡＫ  ｃＤＮＡ配列およびマウスＴＷＥＡＫ  ｃＤＮＡ配列を、発現ベクターＣＨ２６９中にクローニングし（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：３２４０１−３２４１０（１９９７））、そしてこれらの構築物をトランスフェクションにおいて使用して、ＥＢＮＡ２９３細胞における一過性のタンパク質発現を生成した。４つのｍＡｂ（ＡＢ．Ｄ３を含む）は、マウスＴＷＥＡＫを発現するＥＢＮＡ２９３細胞に十分結合した（図２）。これら４つのｍＡｂはまた、ヒトＴＷＥＡＫのＨＴ２９細胞（これは、１つ以上のＴＷＥＡＫレセプターを発現することが公知である）への結合を妨げ得た（例えば、図３）。これらのＦＡＣＳ分析とともに、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂが特異的にＴＷＥＡＫタンパク質を認識し、そしてＴＷＥＡＫタンパク質が１つ以上のＴＷＥＡＫレセプターに結合する能力を改変し得たことを、示した。
【００８３】  （実施例２）
（慢性ＧＶＨＤのマウスモデルにおける巨脾腫症の発症、活性化Ｂ細胞およびＩｇ産生をブロックするための抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３の使用）
慢性ＧＶＨＤを、６〜８週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１雌性マウスに、方法において記載されるＤＢＡ／２脾細胞移植片を使用して誘導した。各レシピエントを、尾静脈において５００μｌ（１×１０8）の細胞を用いて注射した。実験群は、ＤＢＡ／２移植片（ＤＢＡ／２＞Ｆ１）を受け、一方、コントロール動物のセットは、Ｂ６Ｄ２Ｆ１移植片（Ｆ１＞Ｆ１）を受けた。マウスは、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロールｍＡｂ  Ｈａ４／８を受けたか、または処置を受けなかった。動物は、移植片注入の４時間前、ならびに２日後、４日後および６日後に、２５０μｇ  ｍＡｂ  ｉｐを投薬された。実験の１４日目に、マウスを屠殺し、そして脾臓指数（ｓｐｌｅｅｎ  ｉｎｄｅｘ）を、コントロールＦ１＞Ｆ１群における各動物の体重に対する脾臓重量の比として計算し、１つの値を与えるために平均化した。全ての他の群についての平均脾臓指数を、コントロール値に対して正規化する。２つの独立実験からの結果を、表２に示す。ＤＢＡ／２移植片（ＤＢＡ／２＞Ｆ１）を受ける動物、および未処置のままかまたはコントロールｍＡｂ  Ｈａ４／８を用いて処置された動物は、Ｆ１＞Ｆ１移植片コントロールと比較した場合に、脾臓重量の劇的な増大を示した。この結果は、脾臓指数に反映され、これは、１．０〜２．６の正規化されたコントロール値からの増大を示した。抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１を用いるマウスの処置は、脾臓指数をコントロールレベルの近く（１．１）に減少させ、そして抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３を用いる処置は、巨脾腫症を３５％、１．７に減少させた（表２）。
【００８４】
【表２】
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ＦＡＣＳ分析を使用して、コントロールマウスおよび疾患を有するマウスの脾臓におけるリンパ球集団の活性化状態を分析し、種々の処置群を示した。最初に、本発明者らは、種々の群のマウスにおけるドナー細胞移植の量を分析した。ドナー細胞を、全てのＤＢＡ／２＞Ｆ１処置群における宿主マウスの脾臓において、ほぼ同じ割合（平均＝６．２％）で検出した（表３）。この結果は、異なるｍＡｂ処置が、ドナー細胞移植に影響を及ぼさなかったことを示した。
【００８５】
【表３】
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次に、リンパ球活性化の２つのマーカーを使用した：Ｂ２２０＋Ｂ細胞上のＣＤ６９発現、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＬ−セレクチン発現。コントロールおよび未処置のＤＢＡ／２＞Ｆ１マウスを比較した場合、本発明者らは、２．５％から６．２％へのＣＤ６９＋Ｂ細胞の増大に注目する（表４）。ＣＤ６９＋Ｂ細胞の数におけるこの増加を、ＭＲ１（３．３％）またはＡＢ．Ｄ３（２．１％）のいずれかを用いる処置によって妨げたが、Ｈａ４／８（６．５％）を用いる処置によっては妨げなかった（図４および表３）。２つの実験からのデータを、表４に示す。
【００８６】
【表４】
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Ｉｇ分泌のインビトロ分析について、ＥＬＩＳＡ分析を、種々の処置群から収集した脾臓由来の脾細胞細胞培養上清上で実施した。表５における結果は、第２の実験（１群あたり３匹のマウスからの結果の平均）からである。ＭＲ１またはＡＢ．Ｄ３を用いる処置は、未処置およびＨａ４／８で処置したＤＢＡ／２＞Ｆ  １群において観察された自発的なＩｇＧ産生において、４〜６倍の増大を妨げた。
【００８７】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、可溶性の組換えマウスＴＷＥＡＫタンパク質およびヒトＴＷＥＡＫタンパク質の配列アライメントを示す。
【図２】  図２は、無関係のタンパク質（キーホールリンペットヘモシアニン）を認識するハムスターｍＡｂの結合と比較した、マウスＴＷＥＡＫタンパク質またはヒトＴＷＥＡＫタンパク質を発現するＥＢＮＡ２９３細胞へのハムスター抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３の結合の蛍光表示式細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を示す。
【図３】  図３は、ＦＬＡＧタグ化組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫの、ＴＷＥＡＫレセプター陽性細胞への結合をブロックするｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３の能力のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ａ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ｂ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ｃ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ｄ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ｅ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ｆ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４ｇ】  慢性ＧＶＨＤを経験して、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＭＲ１、コントロール  ｍＡｂで処置されたか、または処置されていない、マウスにおけるＢ細胞の活性化状態のＦＡＣＳ分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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