(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、Ｌ７Ａｅ結合配列もしくはスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列から選択される蛋白質結合配列に相補的な塩基配列を有する人工ｍＲＮＡ。
【請求項２】
リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、Ｌ７Ａｅ結合配列もしくはスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列から選択される蛋白質結合配列を組み込んでなる人工ｍＲＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のｍＲＮＡと、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質とを含んでなるＲＮＡ−蛋白質複合体であって、
前記蛋白質結合配列がＬ７Ａｅ結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がＬ７Ａｅ蛋白質であり、
前記蛋白質結合配列がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素である、
ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項４】
請求項２に記載のｍＲＮＡと、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質とを含んでなる、翻訳制御システムであって、
前記蛋白質結合配列がＬ７Ａｅ結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がＬ７Ａｅ蛋白質であり、
前記蛋白質結合配列がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素である、
翻訳制御システム。
【請求項５】
請求項２に記載のｍＲＮＡと、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質とを接触させることを特徴とするｍＲＮＡの翻訳制御方法（ヒトに対するin vivoでの方法を除く）であって、
前記蛋白質結合配列がＬ７Ａｅ結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がＬ７Ａｅ蛋白質であり、
前記蛋白質結合配列がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素である、
ｍＲＮＡの翻訳制御方法。
【請求項６】
（ａ）リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、Ｌ７Ａｅ結合配列もしくはスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列から選択される蛋白質結合配列に相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡと、
（ｂ）前記蛋白質結合配列を有するＲＮＡと、
（ｃ）前記（ｂ）のＲＮＡの蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質と
を含んでなる、翻訳制御システムであって、
前記蛋白質結合配列がＬ７Ａｅ結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がＬ７Ａｅ蛋白質であり、
前記蛋白質結合配列がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素である、
翻訳制御システム。
【請求項７】
（ａ）リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、Ｌ７Ａｅ結合配列もしくはスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列から選択される蛋白質結合配列に相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡと、
（ｂ）前記蛋白質結合配列を有するＲＮＡと、
（ｃ）前記（ｂ）のＲＮＡの蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質と、
（ｄ）リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、前記蛋白質結合配列を有するｍＲＮＡであって、（ａ）のｍＲＮＡとは異なる遺伝子をコードするｍＲＮＡと
を含んでなる、異なる遺伝子の翻訳抑制と活性化を一つの蛋白質で制御する同時翻訳制御システムであって、
前記蛋白質結合配列がＬ７Ａｅ結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がＬ７Ａｅ蛋白質であり、
前記蛋白質結合配列がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素である、
同時翻訳制御システム。
【請求項８】
請求項１または２に記載のｍＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなるプラスミドベクター。
【請求項９】
請求項２に記載のｍＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる第１のプラスミドベクターと、
該ベクターにより産生されるｍＲＮＡの、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質をコードする核酸配列を含んでなる第２のプラスミドベクターと
を含んでなる、細胞内翻訳制御システムであって、
前記蛋白質結合配列がＬ７Ａｅ結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がＬ７Ａｅ蛋白質であり、
前記蛋白質結合配列がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素結合配列であるとき、前記蛋白質結合配列に特異的に結合する蛋白質がスレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素である、
細胞内翻訳制御システム。
【請求項１０】
ヒトがん細胞内において、蛋白質の翻訳を制御するための、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
タグ配列としてのＬ７Ａｅと第１の蛋白質とを含む融合蛋白質と、
Ｌ７Ａｅに特異的に結合する配列と、第２の蛋白質をコードする配列とを有するｍＲＮＡと
を含んでなる、細胞内翻訳制御システム。
【請求項１２】
Ｌ７Ａｅと、第１の蛋白質とをコードするｍＲＮＡをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターと、
Ｌ７Ａｅに特異的に結合する配列を有するｍＲＮＡであって、第２の蛋白質をコードするｍＲＮＡをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターと
を含む、細胞内翻訳制御システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ−蛋白質相互作用を活用した翻訳制御可能なｍＲＮＡ、翻訳制御システム及び翻訳制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム科学の進展により、蛋白質やＲＮＡなどの生体分子の構造、機能に関する情報が蓄積している。そのような増加していく情報を活用し、これまでの還元的、分析的な生物学とは対照的に、「合成」を通して生命システムを理解しようとする合成生物学（シンセティックバイオロジー）の気運が高まっている。中でも、生体分子や遺伝子回路を人工的に（再）構成することは、生命科学研究にとどまらず産業応用の面からも非常に注目されている。中でも、特定の蛋白質を認識し任意の遺伝子発現を調節できる翻訳制御システムの発展が望まれている。
【０００３】
従来、ＤＮＡの転写の誘導を低分子または蛋白質で制御する先行技術が知られている（非特許文献１を参照）。この技術は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写の制御を調節する方法である。しかし、この技術には、ＲＮＡから蛋白質への翻訳の制御技術としては、直接応用できないという問題点があった。また、天然には、蛋白質が自身のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に結合することで、翻訳レベルを制御するシステムが存在する（Ｓ１５、ＴｈｒＲＳなど）。しかし、このようなＲＮＰ相互作用モチーフを利用して、細胞内外で、目的遺伝子の人工的な翻訳抑制／活性化システムを構築した例はない。
【０００４】
また近年、代謝産物に応答してｍＲＮＡが構造変化を誘起し、遺伝子発現を制御する「リボスイッチ」というＲＮＡがバクテリアで発見され、注目されている。しかしながら天然のリボスイッチでは、基質がビタミンやアミノ酸など低分子のものに限られているため、ＲＮＡや蛋白質などの生体高分子に応答して、遺伝子発現を制御することはできない。さらに天然のリボスイッチは、自分自身の発現をｆｅｅｄｂａｃｋ制御するシステムに限られているため、任意の遺伝子の発現を制御する人工システムの開発に直接応用した例はない。したがって、このような機能をもった、人工リボスイッチの開発が期待されている。
【０００５】
ＲＮＡアプタマーやアンチセンスを利用した翻訳制御に関する先行技術が知られている。酵母を利用して、人工ＲＮＡに低分子テオフィリンに結合するアプタマーを導入し、テオフィリンの存在に依存して、遺伝子発現のＯＮ／ＯＦＦを制御する「ＲＮＡスイッチ」を作成した技術も存在する（非特許文献２）。しかし、この技術には、低分子のアプタマーに応答するシステムであるため、基質として蛋白質などの生体高分子には適用できない、という問題点があった。
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．  ２００５  ；３０（６）：２７５−９．
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４  ２２（７）：８４１−７．  ２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より応用がしやすく、特異的なオン−オフ制御をすることができる、翻訳制御可能なｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡ−蛋白質複合体、およびこれを用いた翻訳制御システム、及び翻訳制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するｍＲＮＡである。
【０００８】
本発明は、別の実施の形態によれば、リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡである。
【０００９】
前記ｍＲＮＡにおいて、前記相互作用モチーフが、Ｌ７Ａｅ由来の塩基配列であることが好ましい。
【００１０】
前記ｍＲＮＡにおいて、前記相互作用モチーフが、スレオニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｈｒＲS）由来の塩基配列であることが好ましい。
【００１１】
本発明は、また別の実施の形態によれば、前記ｍＲＮＡと、前記塩基配列に特異的に結合する蛋白質とからなるＲＮＡ−蛋白質複合体である。
【００１２】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、前記ｍＲＮＡと、前記塩基配列に特異的に結合する蛋白質とを含んでなる、翻訳制御システムである。
【００１３】
本発明は、さらに、前記ｍＲＮＡと、前記蛋白質結合モチーフに特異的に結合する蛋白質とを接触させることを特徴とするｍＲＮＡの翻訳制御方法でもある。ここで、接触させるとは、例えば、細胞のような、その中で移動可能な系中で混合することをいう。
【００１４】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、前記ｍＲＮＡと、前記塩基配列に特異的に結合する前記塩基配列に相補的なＲＮＡと、該相補的なＲＮＡに特異的に結合する蛋白質とを含んでなる、翻訳制御システムである。このシステムはまた、別の表現では、（ａ）リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡと、（ｂ）前記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡと、（ｃ）前記（ｂ）のＲＮＡに特異的に結合する蛋白質と、を含んでなる、翻訳制御システムともいえる。
【００１５】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、任意の基質蛋白質の入力情報を、任意の目的蛋白質の出力情報に変換する人工情報変換システムである。
【００１６】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、異なる遺伝子の翻訳抑制と活性化を一つの蛋白質で制御する同時翻訳制御システムであって、（ａ）リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡと、（ｂ）前記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡと、（ｃ）前記（ｂ）のＲＮＡに特異的に結合する蛋白質と、（ｄ）リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、（ｂ）における塩基配列と同一の塩基配列を有するｍＲＮＡであって、（ａ）のｍＲＮＡとは異なる遺伝子をコードするｍＲＮＡとを含んでなる。
【００１７】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、プラスミドベクターであって、前述のいずれかのｍＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。
【００１８】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、細胞内翻訳制御システムであって、前述のｍＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる第１のプラスミドベクターと、該ベクターにより産生されるｍＲＮＡの、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合する蛋白質をコードする核酸配列を含んでなる第２のプラスミドベクターとを含んでなる。
【００１９】
これらの細胞内翻訳制御システムは、好ましくは、ヒトがん細胞内において、蛋白質の翻訳を制御するためのシステムである。
【００２０】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、翻訳制御システムであって、タグ配列としてのＬ７Ａｅと、第１の蛋白質とを含む融合蛋白質を含んでなる。かかる翻訳制御システムは、Ｌ７Ａｅに特異的に結合する配列と、第２の蛋白質をコードする配列とを有するｍＲＮＡをさらに含んでなることが好ましい。
【００２１】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、細胞内翻訳制御システムであって、Ｌ７Ａｅと、第１の蛋白質とをコードするｍＲＮＡをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターを含んでなる。かかる細胞内翻訳制御システムは、Ｌ７Ａｅに特異的に結合する配列を有するｍＲＮＡであって、第２の蛋白質をコードするｍＲＮＡをコードする核酸配列を含むプラスミドベクターをさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の効果として、本発明のｍＲＮＡによれば、所望の遺伝子の翻訳反応を制御することができる。また、細胞内での翻訳制御、異なる遺伝子の翻訳抑制と活性化を一つの蛋白質で制御する同時翻訳制御システムを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。しかし、以下の説明は本発明を限定するものではない。
【００２４】
２０世紀後半から現在に至る、分子生物学の急速な発展により、膨大な数の遺伝子が同定され、それらがコードする蛋白質を中心に、さまざまな生体高分子の機能が明らかにされて来た。さらにはＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質の詳細な立体構造が解明され、それらは分子間の相互作用および選択的な化学反応により機能することが原子レベルで証明された。よって、これら相互作用および化学反応を自在に制御することができれば、新しい病気治療法や、エネルギー問題などを解決する方法が開発できるはずである。
【００２５】
これを実現する手法としては、ターゲットとなる分子の機能を、分子間相互作用により、直接制御する機能をもつ新しい分子をデザイン、作成し、それにより細胞や組織を制御することがあげられる。ＲＮＡは多様な立体構造を形成できる。蛋白質に加え、ＲＮＡには酵素機能をもつものがあり、その機能と構造の相関関係は、立体構造の解析を通じて詳細に解明されて来た。また、４つの基本ユニットで作られるＲＮＡは、シンプルな構築原理により形成される。よって、ナノブロックとしての高度な立体構造を持つ分子の設計・構築に広くＲＮＡを用いることができる。一方、２０もの基本ユニットで作られる蛋白質は、ＲＮＡよりはるかに多彩かつ複雑な立体構造および機能をもつ。現在、天然の蛋白質の構造が、膨大な数、高分解能で解析されているものの、その分子設計・構築は難しく、単純な構造を持つものに限られている。これらから、現時点では、ナノスケールで、複雑な機能と構造を持つ３Ｄオブジェクトとしては、ＲＮＡやＲＮＰ（ＲＮＡ−蛋白質複合体）を設計・構築することが、現実的であり、具体的には「分子設計により作成する人工ＲＮＡ」と「天然の構造既知の蛋白質」を組み合わせることが、分子デザインによる機能をもつ分子の開発へ向けての実現性の高い手法である。
【００２６】
本発明者らは、ｍＲＮＡのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の５’側またはオープンリーディングフレームの５’側に、特定の蛋白質を結合させることによってリボソームによる翻訳反応を阻害することを考え、本発明を完成するに至った。
【００２７】
本発明は、第一実施の形態によれば、リボソーム結合部位の５’側に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の蛋白質結合モチーフを有するｍＲＮＡである。図１（Ａ）は、本実施形態にかかるｍＲＮＡを模式的に表す図である。図１（Ａ）中、ｍＲＮＡ１は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２と、リボソーム結合部位３と、オープンリーディングフレーム４とから構成される。
【００２８】
［オープンリーディングフレーム］
本実施形態によるｍＲＮＡ１は、リボソーム結合部位３を有し、翻訳機能を有する任意のｍＲＮＡであってよく、オープンリーディングフレーム４の配列は特定の配列には限定されない。したがって、オープンリーディングフレーム４の配列は、所望の蛋白質を発現することができる遺伝子を有するものであってよく、特定の配列に限定されるものではないが、開始コドンを有するものである。例えば、翻訳機能が作用しているかどうかを確認する目的では、蛍光蛋白質をコードする遺伝子を有するオープンリーディングフレーム４を備えるｍＲＮＡとすることができる。蛍光蛋白質としては、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ−ＵＶ、ＤＳ−ＲＥＤなどが挙げられ、これらの配列は一般に知られている。
【００２９】
そのほかに、オープンリーディングフレーム４の配列は、特定の医薬物質として働く蛋白質をコードするものであってもよい。具体的には、がん細胞アポトーシスを制御するＢｃｌ−２ファミリー蛋白質、がん細胞表面を特異的に認識する抗体などが挙げられるが、これらには限定されない。
【００３０】
［ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列］
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２は、特定の蛋白質が特異的に結合する部位である。塩基配列２は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列、あるいは当該塩基配列に変異を挿入した塩基配列を含んでもよい。
【００３１】
本発明において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、天然の、既知のＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の配列として知られている塩基配列と、試験管内進化法により得られた人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおけるＲＮＡ側の配列である塩基配列とが含まれる。ＲＮＡ−蛋白質複合体とは、生体において多数確認されている蛋白質とＲＮＡとの会合体であり、複雑な構造を持つ３Ｄオブジェクトである。
【００３２】
天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、通常、約１０〜80塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｒｎａ／ｒｎａ．ｈｔｍｌから選択することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフは、ｍＲＮＡの翻訳機能を阻害するような立体構造を有するものである。阻害することができる立体構造とは、ＲＮＡ−蛋白質相互作用の親和性が高く、リボソームとｍＲＮＡの相互作用に競合できる構造をいう。具体的には、蛋白質−ＲＮＡ相互作用モチーフのＫｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度のものをいうが、かかるＫｄの範囲には限定されない。
【００３３】
【表１】
0005538691.tif 000002
【００３４】
【表２】
0005538691.tif 000003
【００３５】
人工のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、人工的に設計したＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の塩基配列である。このような塩基配列は、通常、約１０〜８０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するように設計する。このような人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列としては、アポトーシス誘導蛋白質Ｂｃｌ−２ファミリーに特異的に結合するＲＮＡアプタマーや、がん細胞表面抗原を特異的に認識するＲＮＡアプタマーなどが挙げられるが、これらには限定されない。また、以下の表３に挙げる塩基配列もしられており、これらもまた本発明のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２として用いることができる。
【００３６】
【表３】
0005538691.tif 000004
【００３７】
人工のＲＮＡ−蛋白質複合体は、分子デザイン方法と試験管内進化法を併用することで、作成することができる。試験管内進化法では、様々な配列多様性をもつ分子ライブラリーから、機能性ＲＮＡを選別し、その遺伝子（ＤＮＡ）を増幅、転写するといった反応を繰り返すことで、アプタマーやリボザイムを得ることができる。従って、分子デザインであらかじめ目的の機能構造をもったＲＮＰに適応したＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを天然ＲＮＰ分子から抽出、または試験管内進化法により人工的に作成することが可能となる。
【００３８】
本実施形態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２は、その塩基配列の由来となるＲＮＡ−蛋白質複合体の解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度であるものが好ましい。この理由は、リボソームとｍＲＮＡとの相互作用と競合するに十分な親和性が必要となるからである。
【００３９】
具体的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２としては、ＲＮＡのメチル化やシュードウリジン化といったＲＮＡ修飾に関わることが知られているＬ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  １２，  ｐｐ．  ８０７−８１８  （２００４））が結合する塩基配列である、５’−ＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＧＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣ−３’、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているＴｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）  ｖ９７，  ｐｐ．３７１−３８１  （１９９９））が結合する塩基配列である、５’−ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ−３’などの塩基配列が挙げられるが、これらには限定されない。
【００４０】
また、癌細胞特異的な内在性蛋白質であるＢｃｌ−ＸＬに特異的に結合するＢｃｌ−ＸＬアプタマーの蛋白質と相互作用する部分を、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２として使用することもできる。このようなＢｃｌ−２ファミリーＣＥＤ−９由来のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２の塩基配列は、Ｒ９−２；５’−ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣ−３’であり、Ｙａｎｇ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００６  ；２８１（１４）：９１３７−４４．に、詳述されている。そのほかにも、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  に結合するＲＮＡ配列のアプタマー由来の塩基配列を、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２として用いることができる。
【００４１】
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２は、ｍＲＮＡ１のリボソーム結合部位３の５’側に組み込む。ｍＲＮＡのリボソーム結合部位の５’側とは、リボソーム結合部位から５’側に向かって２塩基以上１０塩基以下離れた個所をいう。図１（Ａ）においては、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２とリボソーム結合部位３との間に存在していてもよい塩基配列を線で記載しているが、本実施形態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２とリボソーム結合部位３とのあいだに存在してもよい塩基配列は、特定の塩基配列に限定されるものではない。
【００４２】
また、本実施形態にかかるｍＲＮＡ１においては、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２のさらに５’側である５’末端に、ステム−ループ構造を形成する配列を有していてもよい（図示せず）。ｍＲＮＡ１の転写効率を高めるためである。ステム−ループ構造を形成する配列の例としては、通常知られている構造が挙げられ、当業者であれば、常法にしたがって、転写効率を高めるための任意のステム構造を５’末端に導入することができる。
【００４３】
次に、第一実施形態による翻訳制御のメカニズムにつき、具体的に説明する。
［ＯＮからＯＦＦへの翻訳制御］
図１（Ａ）に示す状態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２に特異的に結合する蛋白質が存在しない場合には、約３３〜４１℃、ｐＨ６．０〜８．０の条件下で、リボソームが存在すれば、リボソームは、リボソーム結合部位３に自由に結合することができる。よって、ｍＲＮＡの翻訳は、通常通り行われることになる。ここに、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２に特異的に結合する蛋白質５を添加する。図１（Ｂ）は、蛋白質５が存在する場合のｍＲＮＡ１と蛋白質との関係を示す。図１（Ｂ）において、蛋白質５は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２に特異的に結合している。そして、蛋白質５による立体障害のため、リボソーム結合部位３が遮蔽されている。このため、リボソームが存在しても、リボソーム結合部位３に結合することができない。よって、ｍＲＮＡ１による翻訳反応が機能しなくなる。このように、特定の蛋白質５を、蛋白質が存在しないｍＲＮＡ１の系（図１（Ａ）の状態）に添加することで、ｍＲＮＡ１による翻訳反応を、ＯＮからＯＦＦへと制御することができる。
【００４４】
また、同様のＯＮからＯＦＦへの翻訳制御は、系に特定の蛋白を添加させる場合だけでなく、例えば、生体において内在的に発現する蛋白質に応答させる場合にも行うことが可能である。具体的には、例えば、ある種のがん細胞で特異的に発現する蛋白質（Ｂｃｌ-ｘＬなど）に対するアプタマーをＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２として有し、オープンリーディング配列として、蛍光蛋白質をコードする配列を有するｍＲＮＡ１を生体の細胞に導入しておけば、ある種のがん細胞で特異的に発現する蛋白質を発現させている細胞においてのみ、蛍光蛋白質の発現がＯＮからＯＦＦへと制御されるため、蛍光を発しない細胞、すなわち、がんを産生している細胞を特異的に検出することができる。
【００４５】
したがって、このようなｍＲＮＡと、蛋白質とは、翻訳制御システムとして用いることができる。また、上記メカニズムに照らして、ｍＲＮＡと、蛋白質とを接触させることにより、翻訳制御方法を提供することが出来る。さらに、ｍＲＮＡと、蛋白質との複合体を、そのような翻訳システムまたは翻訳制御方法において用いることもできる。また、これらを用いることで、任意の基質蛋白質の入力情報を、任意の目的蛋白質の出力情報に変換する人工情報変換システムの構築が可能となる。
【００４６】
本発明の第一実施形態によるｍＲＮＡによれば、上述のように翻訳反応の制御が可能になる。また、第一実施形態によるｍＲＮＡの応用的な使用態様として、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２を、特定の疾患により生成される蛋白質が特異的に結合するように設計し、オープンリーディングフレームにおいて、当該疾患を緩和し、あるいは治療する蛋白質をコードする遺伝子を組み込むように設計したｍＲＮＡを、特定の疾患のための医薬として使用することができる。
【００４７】
本発明の第二実施形態によれば、オープンリーディングフレーム内部にＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するｍＲＮＡである。図２は、本実施形態にかかるｍＲＮＡを模式的に表す図である。図２中、本実施形態によるｍＲＮＡ１ａは、オープンリーディングフレーム４ａと、その内部にあるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２ａとから構成される。
【００４８】
かかる実施形態は、上述のリボソーム結合部位が存在しないｍＲＮＡ、具体的には、大腸菌などのバクテリア以外のｍＲＮＡにおける翻訳制御にも好ましく用いられるが、リボソーム結合部位が存在するｍＲＮＡにおいても同様に用いられる。図２中、リボソーム結合部位の記載を省略したが、本実施形態は、リボソーム結合部位の存在を排除するものではない。
【００４９】
本実施形態においては、オープンリーディングフレーム４ａの内部に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２ａが設けられる。ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２ａの位置は、オープンリーディングフレーム４ａの内部であれば任意の場所とすることができるが、例えば、開始コドンＡＵＧの３’側に隣接して配置することができる。また、開始コドンＡＵＧの３’側に開始コドンから約１〜２０塩基を介して配置してもよく、特には、開始コドンＡＵＧの３’側に開始コドンから約１〜１０塩基を介して配置することもできる。なお、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２ａを、オープンリーディングフレーム４ａの内部に挿入する場合に、読み枠がずれないようにするために、挿入される塩基配列が、３の倍数になるように、必要に応じて、モチーフ由来の塩基配列２ａに、１塩基、もしくは２塩基を加えることができる。
【００５０】
図２に示す状態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２ａに特異的に結合する蛋白質が存在しない場合には、３６〜４２℃、ｐＨ６〜７．６の条件下で、リボソームが存在すれば、ｍＲＮＡ１ａの翻訳が開始される。しかし、蛋白質が存在する場合には、蛋白質がＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列２ａに特異的に結合し、隣接するオープンリーディングフレーム４ａを、立体的に遮蔽する。このため、リボソームによる翻訳が抑制される。
【００５１】
第二実施形態によれば、オープンリーディングフレーム４ａを、立体的に遮蔽することで、ｍＲＮＡの翻訳の制御が可能となる。なお、本実施形態によるｍＲＮＡを用いても、ｍＲＮＡと蛋白質とを含む翻訳制御システム、ｍＲＮＡと蛋白質との複合体、翻訳制御方法が第一実施形態と同様に実施可能である。
【００５２】
本発明は第三実施形態によれば、リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡである。図３（Ａ）は、本実施形態にかかるｍＲＮＡを模式的に表す図である。図３（Ａ）中、本実施形態によるｍＲＮＡ１ｂは、オープンリーディングフレーム４ｂと、その内部にあるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列２ｂとから構成される。この場合にも、必要に応じて、挿入される塩基配列が、３の倍数になるように、相補的な塩基配列２ｂに、１塩基、もしくは２塩基を加えることができる。
【００５３】
本実施形態によるｍＲＮＡ１ｂは、第二実施形態におけるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列２ｂとなっている点において、第二実施形態のｍＲＮＡと異なる。ここで、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列２ｂとは、完全に相補的な配列のみならず、変異が挿入されている配列を含んでもよい場合もある。
【００５４】
［ＯＦＦからＯＮへの翻訳制御］
次に、本実施形態にかかるｍＲＮＡ１ｂを用いた、ｍＲＮＡのＯＦＦからＯＮへの翻訳制御について説明する。図３（Ａ）に示す状態において、ｍＲＮＡ１ｂのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列２ｂには、ｍＲＮＡ１ｂのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有する競合ＲＮＡ６を結合させておく。細胞内においては、図３（Ｂ）における蛋白質５ｂが存在しない場合には、競合ＲＮＡ６がｍＲＮＡ１ｂ中の配列である２ｂに結合した状態になっており、図３（Ａ）に示す状態になる。この競合ＲＮＡ６は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と完全に同一でなくても、変異を含んでも良い場合がある。この状態においては、リボソームが存在しても翻訳は開始しない。競合ＲＮＡ６が、リボソームのｍＲＮＡ１ｂへの結合を遮蔽しているためである。
【００５５】
この系に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有する競合ＲＮＡ６に特異的に結合する蛋白質５ｂを添加する。添加した状態を図３（Ｂ）に示す。細胞内においては、蛋白質５ｂが発現すると、ここでいう図３（Ｂ）の状態になる。ここでは、蛋白質５ｂを添加することによって、蛋白質結合モチーフ由来の配列をもつ競合ＲＮＡ６とｍＲＮＡ１ｂとの特異的な結合を阻害させることができる。特定の蛋白質５ｂに反応したＲＮＡ６とｍＲＮＡ１ｂとの結合の阻害により、リボソームによるオープンリーディングフレーム４ｂの翻訳反応が開始される。このように、特定の競合ＲＮＡ６とｍＲＮＡ１ｂとが結合している系（図３（Ａ）の状態）に蛋白質５ｂを添加することで、ｍＲＮＡ１ｂによる翻訳反応を、ＯＦＦからＯＮへと制御することができる。
【００５６】
なお、図３においては、オープンリーディングフレーム４ｂ内にＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列２ｂを設ける実施形態を示したが、本実施形態の変形例として、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列は、リボソーム結合部位の５’側に設けることもできる。リボソーム結合部位の５’側に設ける態様は、第一実施形態においてＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列をリボソーム結合部位の５’側に設ける態様と同様であって良い。その場合も、上記第三実施形態と同様に作用させてＯＦＦからＯＮへの翻訳制御を行うことができる。また、本実施形態によるｍＲＮＡを用いても、ｍＲＮＡと蛋白質とを含む翻訳制御システム、ｍＲＮＡと蛋白質との複合体、翻訳制御方法が実施可能である。
【００５７】
本発明は、第４実施形態によれば、第３実施形態の変形であって、ＯＦＦからＯＮへ、及びＯＮからＯＦＦへの同時翻訳制御システムに関する。
本発明の第４実施形態による同時翻訳制御システムは、第３実施形態において説明した、図３（Ａ）に示すｍＲＮＡ１ｂ、競合ＲＮＡ６、競合ＲＮＡ６に特異的に結合する蛋白質５ｂに加え、リボソーム結合部位の５’側、またはオープンリーディングフレームの５’側内部に、競合ＲＮＡ６と同一の配列を有し、ｍＲＮＡ１ｂとは異なる遺伝子をコードする第２のｍＲＮＡを含んでなる。第２のｍＲＮＡは競合ＲＮＡ６と同一の配列を有するものであるから、蛋白質５ｂに特異的に結合する。すなわち、蛋白質５ｂの存在により、翻訳が阻害されるタイプのｍＲＮＡである。以下の説明において、図３（Ａ）に示すｍＲＮＡ１ｂを、第1のｍＲＮＡと指称する。
【００５８】
［ＯＦＦからＯＮへ、及びＯＮからＯＦＦへの同時翻訳制御］
ここで、第１のｍＲＮＡ１ｂ、競合ＲＮＡ６が存在する系に、蛋白質５ｂを添加すると、第３の実施形態で説明したように、ＯＦＦからＯＮへの翻訳制御が実現される。さらに、過剰の蛋白質５ｂが存在する状態で、この系に第２のｍＲＮＡが存在する場合、蛋白質５ｂが第２のｍＲＮＡに特異的に結合し、翻訳を妨害するため、第２のｍＲＮＡの翻訳は制御され、ＯＮからＯＦＦへの翻訳制御が実現されることになる。このように、第4の実施形態によれば、ＯＦＦからＯＮへ、及びＯＮからＯＦＦへの同時翻訳制御が可能となる。
【００５９】
例えば、第１のｍＲＮＡ１ｂと、第２のｍＲＮＡとが、異なる種類の蛍光蛋白質遺伝子をＯＲＦに有する場合、一方ではＯＦＦからＯＮへ、他方ではＯＮからＯＦＦへの翻訳制御が行われ、その観察は、一方の蛍光蛋白質遺伝子をＥＧＦＰ（緑色）、他方をＤｓＲｅｄ（赤色）にすることにより、蛍光顕微鏡等を用いて容易に行うことができるため、有用であると考えられる。
【００６０】
本発明は第５実施形態によれば、細胞内翻訳制御システムであって、第１から第４の実施形態において用いたＲＮＡ及び／または蛋白質をコードする核酸を含むベクターを含むものである。
【００６１】
翻訳制御は、特にがん細胞中で好ましく行うことができ、蛋白質の発現抑制及び発現促進のいずれも、上記ＯＮからＯＦＦへの翻訳制御、ＯＦＦからＯＮへの翻訳制御の手順に従って行うことができる。また、そのような制御が行われたかどうかは、マーカー蛋白質を発現させることで確認することができる。この際、細胞内へのmＲＮＡ及び蛋白質を発現する遺伝子の導入は、プラスミドベクターによって行うことができる。
【００６２】
所望のＲＮＡまたは蛋白質を発現させるプラスミドベクターを作成する技術は当業者には既知であり、慣用的な手段によってベクターを作成することができる。たとえば、Ｌ７Ａｅを発現するベクターは、ヒト細胞内蛋白質発現に慣用的に用いられるベクター内部、ＣＭＶプロモーター下流にＬ７Ａｅをコードする遺伝子を挿入することで、構築できる。一方、Ｌ７Ａｅが特異的に結合する配列として知られているＢｏｘＣ／Ｄまたは、これを変異させたＢｏｘＣ／ＤｍｕｔをＥＧＦＰオープンリーディングフレームの５’側内部挿入したｍＲＮＡを発現するベクターも、該当する遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ヒト細胞内蛋白質発現に慣用的に用いられるベクター内部に挿入することで作成できる。さらに、目的のタイミングで細胞内にＬ７Ａｅを発現させたい場合は、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）の培地への付加によりＬ７Ａｅを発現できるベクターを作成することもできる。このような、テトラサイクリンの培地への付加によりＬ７Ａｅを発現できるベクターは、Ｔｅｔオペレーター配列の下流にＬ７Ａｅをコードする遺伝子を含み、かつＴｅｔリプレッサーを恒常的に発現するベクターまたは細胞を構成要素として含むものである。
【００６３】
本発明の第５実施形態によれば、細胞内での翻訳制御が可能になる。特にがん細胞などの細胞内での翻訳制御は、治療に応用できる可能性が高く、非常に有用な手段となりうる。
【００６４】
本発明は第６実施形態によれば、翻訳制御システムであって、タグ配列としてのＬ７Ａｅと、第１の蛋白質とを含む融合蛋白質を含んでなる。
【００６５】
かかる融合蛋白質は、具体的には、Ｌ７Ａｅと、他の任意の蛋白質である第１の蛋白質とから構成される融合蛋白質である。以下において、このような融合蛋白質を、タグ配列融合型蛋白質ともいう。任意の蛋白質である第１の蛋白質としては、例えば、蛍光蛋白質、アポトーシス誘導蛋白質、アポトーシス抑制蛋白質、細胞小器官局在蛋白質等が挙げられるが、これらには限定されない。理論的には、所望の蛋白質とすることができる。
【００６６】
本実施形態における翻訳制御システムは、Ｌ７Ａｅに特異的に結合する配列と、第２の蛋白質をコードする配列とを有するｍＲＮＡをさらに含んでなる。すなわち、上記融合蛋白質は、好ましくはｍＲＮＡとともに用いられる。ｍＲＮＡ中の、Ｌ７Ａｅに特異的に結合する配列は、好ましくはＢｏｘ  Ｃ／Ｄ配列である。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ配列に、Ｋｉｎｋ−ｔｕｒｎモチーフの構造を維持する範囲内の変異を導入したものであってもよい。いっぽう、このｍＲＮＡにおいてコードされる第２の蛋白質は、好ましくは融合蛋白質とは異なる蛋白質である。理論的には、第２の蛋白質は、任意の蛋白質であってよいが、融合蛋白質を構成する第１の蛋白質との組み合わせで決定され、第１の蛋白質が赤色蛍光蛋白質の場合には、ｍＲＮＡにおいてコードされる第２の蛋白質は緑色蛍光蛋白質とすることが好ましく、第１の蛋白質がアポトーシス誘導蛋白質の場合には、ｍＲＮＡにおいてコードされる第２の蛋白質はアポトーシス抑制蛋白質とすることが好ましい。そのほかにも、第１の蛋白質の発現により第２の蛋白質の翻訳を抑制することが好ましい、細胞内シグナル伝達蛋白質の一部などのいくつかの組み合わせが可能である。
【００６７】
このような、タグ配列融合型蛋白質と、ｍＲＮＡとは、所望の第１の蛋白質と、第２の蛋白質との遺伝子がわかれば、既知の方法にしたがって作成することができる。また、細胞内における翻訳制御システムに用いる場合は、これらを発現するプラスミドベクターを調製し、細胞内に導入することができる。プラスミドベクターの作成については、上記第５の実施形態において説明したのと同様に、所望の遺伝子を挿入するように実施することができる。
【００６８】
次に、このようなタグ配列融合型蛋白質と、ｍＲＮＡとにより実現される、翻訳制御システムの作用について説明する。ここでは、タグ配列融合型蛋白質が、Ｌ７Ａｅと赤色蛍光蛋白質との融合蛋白質であり、ｍＲＮＡが、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ配列を有し、緑色蛍光蛋白質をコードする場合に関して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。このｍＲＮＡを発現するプラスミドベクターを細胞に導入すると、タグ配列融合型蛋白質が存在しない場合には、ｍＲＮＡが翻訳されて、緑色蛍光蛋白質を発現する。この細胞に、タグ配列融合型蛋白質を導入するために、タグ配列融合型蛋白質をコードする核酸配列を有するプラスミドベクターを細胞に導入する。すると、細胞内で、タグ配列融合型蛋白質が発現する。そして、発現したタグ配列融合型蛋白質はｍＲＮＡに結合する。より具体的に言うと、タグ配列融合型蛋白質を構成するＬ７Ａｅが、ｍＲＮＡ上のＢｏｘ  Ｃ／Ｄ配列に特異的に結合する。すると、ｍＲＮＡの翻訳が抑制されて、緑色蛍光蛋白質の産生が抑制されることになる。そのいっぽうで、タグ配列融合型蛋白質は産生され続けるので、タグに融合した蛋白を構成する赤色蛍光蛋白質が増加していく。これを蛍光顕微鏡で観察すると、時間の経過とともに、緑色が薄くなり、赤色が濃くなる。このように、タグ配列融合型蛋白質と、ｍＲＮＡとの組み合わせを用いれば、所定の遺伝子の発現に応答して、目的遺伝子の翻訳を行わせる翻訳制御システムが実現できる。
【００６９】
第６実施形態によれば、Ｌ７Ａｅをタグ配列として蛋白質に付加することで、任意の遺伝子の発現、例えば赤色蛍光蛋白質の発現に応答して、目的遺伝子の翻訳、例えば緑色蛍光蛋白質の翻訳を抑制するシステムを細胞内で構築することができる。さらに、Ｌ７Ａｅタグ配列に融合する蛋白質を例えばアポトーシス抑制蛋白質にし、制御する目的遺伝子をアポトーシス誘導蛋白質にすれば、がん細胞のようにアポトーシス抑制蛋白質を過剰発現した細胞で、効果的にアポトーシスを誘導できるような、シグナル伝達回路のリワイアリングが可能となる。このような、所定の遺伝子の発現に応答して、目的遺伝子の翻訳を行わせる翻訳制御システムは、人工遺伝子回路の構成ツールとして有望である。
【００７０】
［実施例］
本発明にかかる蛋白質−ＲＮＡ相互作用モチーフ（ＲＮＰモチーフ）を利用した蛋白質応答翻訳制御システムは、天然から抽出、または人工的に作製したＲＮＰモチーフを利用し、翻訳反応をＯＮからＯＦＦ、またはＯＦＦからＯＮに制御する技術である。具体的には、ＯＮからＯＦＦへの制御はｍＲＮＡにＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を挿入し、目的蛋白質存在下で、蛋白質のｍＲＮＡへの結合によってリボソームの結合や進行と競合し、翻訳阻害を起こすものである。ＯＦＦからＯＮへの制御は、まず、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム５’側に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列のアンチセンス配列を挿入する。次に、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列からなるＲＮＡを反応液に加えることで、ｍＲＮＡに挿入されたアンチセンス鎖と相補鎖を形成し、翻訳が阻害される。そこに基質蛋白質を加えることで、蛋白質結合モチーフからなるＲＮＡのｍＲＮＡへの結合を阻害し、翻訳を活性化させるものである。本実施例では、一般的にＬ７Ａｅ、ＴｈｒＲＳと呼ばれる蛋白質を利用しているが、反応に利用できる蛋白質はＬ７Ａｅ、ＴｈｒＲＳだけに限定されない。以下具体的実験例を挙げる。
【実施例１】
【００７１】
［翻訳制御に利用する、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ（ＲＮＡ、蛋白質）の作製］
［Ｌ７Ａｅ結合ＲＮＡ  ＢｏｘＣ／Ｄの作製］
Ｌ７Ａｅ結合ＲＮＡ  ＢｏｘＣ／Ｄ（配列番号５）はＴ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型を作製し、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた転写反応で作製した。詳細は以下に示す。まず、ＤＮＡの作製に１００μＬ反応液を調整した。反応液には、１ｎｇ  ＢｏｘＣ／Ｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＡＧＧＡＡＡＣＴＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣ−３’）（配列番号１）、１０μＭ  ＢｏｘＣ／Ｄ  Ｆｗｄ（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号２）、ＢｏｘＣ／Ｄ  Ｒｅｖ（５’−ＧＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴ−３’）（配列番号３）  各５μＬ  、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ）８μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  １０×バッファー（ＴＡＫＡＲＡ）１０μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）０．５μＬが混合してあり、グラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社）を用いて９４℃  ３０秒、５３℃  ３０秒、７２℃  １分で２５サイクルを行い、伸張させた（配列番号４）。反応後、フェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、１０μＬの超純水に溶解し、転写の鋳型として用いた。転写の反応は３２Ｐで放射性標識する場合には、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１．２５ｍＭ  ＣＴＰ、１．２５ｍＭ  ＵＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、［３２Ｐ−α］ＧＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、２０Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、３５ｎｇ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ条件下で行い、１００μＬの系に上記の鋳型５μＬを使い、３７℃、３時間から一晩で反応させた。非標識の場合は、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて転写反応を行った。ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した鋳型ＤＮＡ  １μｇ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合し，超純水で全２０μＬにした反応液を３７℃で４時間から一晩反応させた。共に反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ）１μＬを加え、３７℃で１５分インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。その後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い精製した。沈殿後、変性色素２０μＬ（８０％  ホルムアミド、０．１７％  ＸＣ、  ０．２７％  ＢＰＢ）に溶解させ、１２％  ポリアクリルアミド（２９：１）変性ゲル電気泳動で分離した。目的のサイズのゲルを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０））を加え、３７℃、一晩溶出を行った。溶出したＲＮＡは再びフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈殿を行って精製した。
【００７２】
［ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉｍｕｔの作製］
Ｌ７Ａｅ結合ＲＮＡ  Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ（配列番号９）、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉｍｕｔ（配列番号１０）はＢｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ−３’）（配列番号７）、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉｍｕｔ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ−３’）（配列番号８）をテンプレートとしてＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた転写反応で作製した。反応は３２Ｐで放射性標識する場合には、０．７５μＭ  Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’）（配列番号６）、０．７５μＭ  テンプレート、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１．２５ｍＭ  ＣＴＰ、１．２５ｍＭ  Ｕ  ＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、［３２Ｐ−α］ＧＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、２０Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、３５ｎｇ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ条件で行い、１００μＬの系で、３７℃、３時間から一晩で反応させた。非標識の場合は、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて転写反応を行った。ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した１００μＭ  Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒ  ０．７５μＬ、１００μＭ  Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ０．７５μＬ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合し，超純水で全２０μＬにした反応液を３７℃で４時間から一晩反応させた。反応後は、上記と同様の方法で１５％  ポリアクリルアミド（２９：１）変性ゲル電気泳動を使い精製した。
【００７３】
［ＴｈｒＲＳ結合ＲＮＡ  Ｄｏｍａｉｎ２３４、Ｄｏｍａｉｎ２の作製］
ＴｈｒＲＳ結合ＲＮＡ  Ｄｏｍａｉｎ２３４（配列番号１５）、Ｄｏｍａｉｎ２（配列番号１９）はＢｏｘ  Ｃ／Ｄと同様、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型を作製し、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた転写反応で作製した。まず、ＤＮＡの作製に１００μＬ反応液を調整した。Ｄｏｍａｉｎ２３４の反応液には、１０ｎｇ／μＬ  ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４  ｔｅｍｐｌａｔｅ（５’−ＧＡＴＴＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡ−３’）（配列番号１１）１μＬ、１０μＭ  ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４  Ｆｗｄ（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧ−３’）（配列番号１２）、ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４  Ｒｅｖ（５’−  ＴＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣ−３’）（配列番号１３）各５μＬ  、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ）  ８μＬ  、Ｅｘ  ｔａｑ  １０×バッファー（ＴＡＫＡＲＡ）  １０μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）  ０．５μＬが混合してあり、グラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社）を用いて９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分で２５サイクルを行い、伸張させた（配列番号１４）。Ｄｏｍａｉｎ２の反応液には、１０μＭ  ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２  Ｆｗｄ（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣ−３’）（配列番号１６）、ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２  Ｒｅｖ（５’−ＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣ−３’）（配列番号１７）  各５μＬ  、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ）  ８μＬ  、Ｅｘ  ｔａｑ  １０×バッファー（ＴＡＫＡＲＡ）  １０μＬ、Ｅｘ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）  ０．５μＬが混合してあり、グラディエントマスターサイクラー（エッペンドルフ社）を用いて９４℃  ３０秒、５２℃  ３０秒、７２℃  １分で１０サイクルを行い、伸張させた（配列番号１８）。反応後、共にフェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、１０μＬの超純水に溶解し、転写の鋳型として用いた。転写の反応、精製は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄと同様の方法で、Ｄｏｍａｉｎ２３４は１２％  ポリアクリルアミド（２９：１）  変性ゲル、Ｄｏｍａｉｎ２は１５％  ポリアクリルアミド（２９：１）  変性ゲルを用いて行った。
【００７４】
［Ｌ７Ａｅの作製］
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフの蛋白質、Ｌ７ＡｅはＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｈｕｔｔｅｎｈｏｆｅｒ博士から譲り受けたプラスミドを利用して発現させた（配列番号６６）。そのプラスミドはＡ．  ｆｕｌｇｉｄｕｓからＬ７Ａｅ  Ｆｗｄ（５’−ＣＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣ−３’）（配列番号６４）、Ｌ７Ａｅ  Ｒｅｖ（５’−ＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＣ−３’）（配列番号６５）のプライマーを使って増幅したインサートを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ−２８ｂ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み作製されていた。発現精製法は以下に示す。
【００７５】
まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬクロラムヘェニコールを含むＬＢ  培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振蕩培養した。続いて培養液全量を２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００ｍＬに植え継いだ。Ｏ．Ｄ．６００が０．６〜０．７になるまで３７℃で振蕩培養し、その後、発現誘導をするため１Ｍ  ＩＰＴＧを５００μＬ加え（終濃度１ｍＭ）、３０℃で一晩振蕩培養した。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、２０分）で菌体を回収し、ソニケーションバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、超音波処理を行い、菌体を破砕した。なお、超音波処理は、氷上で冷却後、１５秒間超音波を当てる、という操作を６回繰り返した。その後、８０℃  １５分で、不純蛋白質を変性させた。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ  、２０分）により、上清を回収し、ヒスチジンタグが付いた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてバッチ法により精製した。具体的には、まず上清とＮｉ−ＮＴＡ  １ｍＬを混合し、４℃、１時間撹拌を行った。その後、カラムに充填し、ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）４ｍＬで２回洗浄した。５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０にｉｍｉｄａｚｏｌｅを加えて作製）を各１ｍＬ  ２回で段階的に溶出させた。確認は１７％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。続いて、マイクロコンＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、蛋白質の濃縮行い、透析バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５％  グリセロール  ｐＨ７．５）に置換した。また、蛋白質の濃度はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。
【００７６】
［ＴｈｒＲＳの作製］
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフの蛋白質、ＴｈｒＲＳは清水義宏博士から譲り受けたプラスミドを利用して発現させた（配列番号６７）。そのプラスミドはＥ．ｃｏｌｉから抽出したＴｈｒＲＳがｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に組み込み作製されていた。発現精製法は以下に示す。
【００７７】
まず、大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）に形質転換した。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ  培地３ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振蕩培養した。続いて培養液全量を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍＬに植え継いだ。Ｏ．Ｄ．６００が０．４〜０．６になるまで３７℃で振蕩培養し、その後、発現誘導をするため１Ｍ  ＩＰＴＧを２５μＬ加え（終濃度０．５ｍＭ）、３７℃で一晩振蕩培養した。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、２０分）で菌体を回収し、ソニケーションバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、超音波処理を行い、菌体を破砕した。なお、超音波処理は、氷上で冷却後、１５秒間超音波を当てる、という操作を６回繰り返した。その後、８０℃  １５分で、不純蛋白質を変性させた。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ  、２０分）により、上清を回収し、ヒスチジンタグが付いた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて上記と同様、バッチ法により精製した。確認は８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。続いて、マイクロコンＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、蛋白質の濃縮行い、透析バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％  グリセロール  ｐＨ７．５）に置換した。また、蛋白質の濃度はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。
【実施例２】
【００７８】
［ＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）によるＲＮＰ複合体形成の確認］
［Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔのＥＭＳＡ］
Ｌ７ＡｅとＢｏｘ  Ｃ／Ｄ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔの反応は最終濃度がそれぞれ１０ｎＭ、２５ｎＭ、２５ｎＭ  ＲＮＡで行った。反応条件は１０ｎＭ  ２５ｎＭ  ＲＮＡ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．００１Ｕ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、３％  グリセロール、０〜５００ｎＭ蛋白質となるよう、以下ように行った。まず３２Ｐで標識したＲＮＡ  １μＬ  を８０℃  ５分で変性した後、５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．００５Ｕ／μＬ  ｔＲＮＡ、１５％  グリセロール）  ４μＬ、超純水を加えた。その後、蛋白質と混合し、全量を２０μＬとし、反応溶液を氷上で６０分間放置した。色素（０．２５％  ＢＰＢ、０．２５％  ＸＣ、３０％  グリセロール）を２μＬ加え、４℃で、８％  非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を３〜４時間行った。その後、ゲルドライヤーでゲルを１時間乾燥させ、ゲルの放射線量の強さをＢｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＢＡＳ２５００；  富士写真フィルム）で解析した（図４、図５）。
【００７９】
結果、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ共にＬ７Ａｅ蛋白質濃度に依存したバンドの上昇が確認された。これはＢｏｘ  Ｃ／ＤとＬ７Ａｅ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉとＬ７Ａｅが結合することを示す。逆に変異体であるＢｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉｍｕｔではバンドの上昇が見られず、この蛋白質濃度ではＬ７Ａｅと結合しないことが示された。
【００８０】
［Ｄｏｍａｉｎ２３４、Ｄｏｍａｉｎ２のＥＭＳＡ］
ＴｈｒＲＳとＤｏｍａｉｎ２３４、Ｄｏｍａｉｎ２の反応は最終濃度が２０ｎＭ  ＲＮＡ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％  グリセロール、０〜４０μＭ蛋白質となるよう、以下の条件で行った。まず３２Ｐで標識した２００ｎＭ  ＲＮＡ  ４μＬ  を８０℃  ５分で変性した後、５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５％  グリセロール）４μＬ、超純水を加えた。その後、蛋白質と混合し、全量を２０μＬとし、反応溶液を氷上で６０分間放置した。色素（０．２５％  ＢＰＢ、０．２５％  ＸＣ、３０％  グリセロール）を２μＬ加え、４℃で、１２％  非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を３〜４時間行った。その後、ゲルドライヤーでゲルを１時間乾燥させ、ゲルの放射線量の強さをＢｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＢＡＳ２５００；  富士写真フィルム）で解析した（図６、図７）。
【００８１】
結果、ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４、Ｄｏｍａｉｎ２共に、ＴｈｒＲＳ蛋白質濃度に依存したバンドの上昇が確認された。これはＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４とＴｈｒＲＳ、ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２とＴｈｒＲＳが結合することを示す。なかでもＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２ではバンドのスーパーシフトが見られている。これは、Ｄｏｍａｉｎ２と結合したＴｈｒＲＳが二量化したために起こったと考えられるが、バンドのスメア具合からもＤｏｍａｉｎ２３４の方がＤｏｍａｉｎ２だけよりも強く結合することがわかる。
【実施例３】
【００８２】
［Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ及び蛋白質応答人工ＲＮＡスイッチの作製］
Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰ並びに蛋白質応答人工ＲＮＡはｐＥＧＦＰ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より、２回または３回ＰＣＲを行い作製した。
【００８３】
［Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＥＧＦＰの作製］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、ＥＧＦＰ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’）（配列番号２０）、ＥＧＦＰ  Ｒｅｖ（５’−ＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡ−３’）（配列番号２２）をプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。５０μＬ反応液には、テンプレート  １ｎｇ、各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μＬ  、１０×ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ｂｕｆｆｅｒ  ｖｅｒ．２  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、反応は初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９４℃  １５秒、５０℃  ３０秒、６８℃  １分を２０サイクルで行った。
【００８４】
以下すべて同じＰＣＲ条件で行っているため、テンプレートとプライマーだけを今後は示す。
反応後、反応液をフェノール処理、エタノール沈殿をし、非変性色素（３０％グリセリン、０．０７５％  キシレンシアノール、０．０７５％  ブロモフェノールブルー、６９．８５％  超純水）に溶解した。低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）を用いて目的のバンドを分離し、切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え６５℃  ３０分インキュベートした後フェノール処理を３回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。
【００８５】
次にその産物をテンプレート、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡ−３’）（配列番号２１）、ＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号２３）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応はＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）と同様である。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号２４）はＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。Ｒｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いた精製は以下の通りである。
【００８６】
転写反応液に超純水８０μＬを加え１００μＬとし、さらにＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ３５０μＬを添加して十分に混和した。２５０μＬのエタノールを添加し、ピペッティングにより完全に混和した。２ｍＬコレクションチューブにセットしたＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに上記サンプルをアプライし微量高速冷却遠心機ＭＸ−１００（ＴＯＭＹ）を用いて１０，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心し、フロースルーは捨てた。スピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブ上に移し、スピンカラム上に５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをピペットで添加した。１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心しフロースルーは捨てた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬの８０％エタノールを添加、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心しフロースルーは捨てた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬコレクションチューブに移し、スピンカラムのキャップを開け、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心、フロースルーは捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬコレクションチューブに移し、シリカゲルメンブレンの真ん中に２０μＬの超純水を加え、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心して溶出した。この溶出液をＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。
【００８７】
［Ｌ７−ＵＴＲ２の作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、Ｌ７−ＵＴＲ２  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号２５）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣ−３’）（配列番号２６）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号２７）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ  （配列番号２８）をＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いて精製、濃度測定を行った。
【００８８】
［Ｌ７−ＵＴＲ５の作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、Ｌ７−ＵＴＲ５  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号２９）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号３０）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号３１）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００８９】
［Ｌ７−ＵＴＲ９の作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、Ｌ７−ＵＴＲ９  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号３２）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号３３）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号３４）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９０】
［Ｌ７−ＵＴＲ１３の作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、Ｌ７−ＵＴＲ１３  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号３５）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号３６）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号３７）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９１】
［Ｌ７−ＵＴＲ２  ｍｕｔの作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、Ｌ７−ＵＴＲ２  ｍｕｔ  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＧＴＣＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号３８）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号３９）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号４０）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９２】
［Ｌ７−ＵＴＲ２  ｍｉｎｉｍｕｔの作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、Ｌ７−ＵＴＲ２  ｍｉｎｉｍｕｔ  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号４１）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号４２）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号４３）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９３】
［Ｌ７−ＯＲＦ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ＧＦＰ）の作製］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、Ｌ７−ＯＲＦ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’）（配列番号４４）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号４５）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号４６）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９４】
［Ｌ７−ＯＲＦ  ｍｕｔ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ）の作製］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、Ｌ７−ＯＲＦ  ｍｕｔ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’）（配列番号４７）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、プライマーとしてＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号４８）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号４９）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９５】
［ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲＷの作製］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲＷ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’−ＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’）（配列番号５０）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４  ｔｅｍｐｌａｔｅとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４  ＦｗｄとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号５１）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号５２）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９６】
［ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２の作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’）（配列番号５３）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号５４）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号５５）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９７】
［ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２  ｍｕｔの作製］
ＥＧＦＰ  １ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレート、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２  ｍｕｔ  ２ｎｄ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’）（配列番号５６）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて３ｒｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号５７）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号５８）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【００９８】
［ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈの作製］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’）（配列番号５９）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号６０）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号６１）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。このＲＮＡはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に、以下に示したａｎｔｉｓｅｎｃｅとハイブリダイズさせる配列を挿入してある。
【００９９】
［ａｎｔｉｓｅｎｃｅの作製］
ａｎｔｉｓｅｎｃｅはＴ７  ｐｒｉｍｅｒとａｔｉｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ−３’）（配列番号６２）を用いてＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）で作製した。このａｎｔｉｓｅｎｃｅは、中にＬ７Ａｅ結合部位（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ）が含まれている。反応後は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉと同様の方法で１５％  ポリアクリルアミド（２９：１）  変性ゲル電気泳動を使い精製した（配列番号６３）。
【実施例４】
【０１００】
［Ｌ７−ＵＴＲの翻訳制御アッセイ］
Ｌ７−ＵＴＲの翻訳制御のアッセイはＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所）を利用して行った。ＯＮからＯＦＦへの翻訳制御はすべて以下のように測定した。まず、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ５μＬ、３．７５μＭ  ＲＮＡ  １μＬ、蛋白質を加え、超純水で全量を８μＬにし、４℃、１時間放置した。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ２μＬを加え、３７℃、７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長４８５ｎＭ、吸収波長５３５ｎＭで測定した。コントロールとして用いたＥＧＦＰ  ＵＴＲの二次構造は図８Ａに示してある。Ｌ７−ＵＴＲ２の二次構造は図８Ｂに、Ｌ７−ＵＴＲ５の二次構造は図８Ｅに、Ｌ７−ＵＴＲ９の二次構造は図８Ｆに、Ｌ７−ＵＴＲ１３の二次構造は図８Ｇに示してある。これらの図中、４は、オープンリーディングフレームを、３はリボソーム結合部位を、２は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を、７はエンハンサーをそれぞれ示す。全てのＲＮＡでＥＧＦＰの５’−ＵＴＲにＬ７Ａｅ結合モチーフ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ）の塩基配列が挿入されており、それぞれＲＢＳ−モチーフ間の距離を２塩基、５塩基、９塩基、１３塩基開けて設計されている。
【０１０１】
アッセイの結果から、Ｌ７Ａｅモチーフを入れたものでは、蛋白質の濃度が上昇に応じて翻訳の阻害が起こっていることが分かる。また、モチーフ−ＲＢＳの距離に応じて翻訳阻害効果が減少していることが分かる（図９）。Ｌ７ＡｅのＬ７−ＵＴＲ２  ｍｕｔの二次構造は図８Ｃに、Ｌ７−ＵＴＲ２  ｍｉｎｉｍｕｔの二次構造は、図８Ｄに示してある。これらはＬ７−ＵＴＲ２のＬ７Ａｅ結合部位に変異を入れたものである。この変異体でも少しの翻訳阻害がみられるもののＬ７−ＵＴＲ２に比べ翻訳阻害効果は減少していることが分かる（図１０）。
【０１０２】
競合実験では、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄをｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして用いＬ７−ＵＴＲ２を使ってアッセイした。具体的には、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ５μＬ、３．７５μＭ  ＲＮＡ  １μＬ、１０〜１００μＭ  ｃｏｍｅｔｉｔｏｒ  １μＬ、５０μＭ  蛋白質  １μＬを加え、超純水で全量を８μＬにし、４℃、１時間放置した。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ２μＬを加え、３７℃、７５分間で反応させた。反応後の測定は上記と同じ方法で行った。結果、蛋白質の添加で下がった翻訳効率がｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒであるＢｏｘ  Ｃ／Ｄを加えることで回復することが分かる。この結果から、この翻訳阻害はＬ７Ａｅとその結合部位が影響していることが示唆される（図１１）。これらの実験の結果から、設計通り蛋白質の立体障害によりリボソームのｍＲＮＡへの結合を制御できることが示唆された。
【０１０３】
［ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲの翻訳制御アッセイ］
ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲでもＬ７−ＵＴＲと同様のアッセイを行った。アッセイ条件はＬ７−ＵＴＲと同じである。ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲＷ、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２  ｍｕｔの二次構造は図１２に示してある。これらの図中、４は、オープンリーディングフレームを、３はリボソーム結合部位を、２は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列をそれぞれ示す。Ｌ７−ＵＴＲと同様に蛋白質結合ＲＮＡが５’−ＵＴＲに挿入されており、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲＷ（図１２Ａ）はＤｏｍａｉｎ２３４が、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２（図１２Ｂ）はＤｏｍａｉｎ２が５’−ＵＴＲに挿入されている。ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２  ｍｕｔ（図１２Ｃ）はＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２  のＴｈｒＲＳ結合部位（Ｄｏｍａｉｎ２）に変異を入れたものであり、変異体として用いた。
【０１０４】
結果、ＴｈｒＲＳ蛋白質の濃度に依存して翻訳が阻害されることが分かる。ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲＷの方が結合力の違いからＴｈｒＲＳ−ＵＴＲ２よりも阻害効果は大きかった。また、Ｌ７−ＵＴＲと同様、変異体では、翻訳阻害効果は減少した。（図１３）。これらの結果から、ＯＮからＯＦＦへの翻訳制御は、mＲＮＡ上の蛋白質結合モチーフを入れ替える事で、入力蛋白質を自由に選択できることが示唆される。
【０１０５】
［Ｌ７−ＯＲＦ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ＧＦＰ）の翻訳制御アッセイ］
Ｌ７−ＯＲＦ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ＧＦＰ）でもＬ７−ＵＴＲと同様のアッセイを行った。アッセイ条件はＬ７−ＵＴＲと同じである。Ｌ７−ＯＲＦ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ＧＦＰ）、Ｌ７−ＯＲＦ  ｍｕｔ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ）の二次構造は図１４に示してある。これらの図中、４は、オープンリーディングフレームを、３はリボソーム結合部位を、２は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を、７はエンハンサーをそれぞれ示す。Ｌ７−ＵＴＲとは違い蛋白質結合ＲＮＡモチーフがＯＲＦに挿入されており、Ｌ７−ＯＲＦ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ＧＦＰ）（図１４Ａ）はＬ７Ａｅ結合部位（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ）が、開始コドンのすぐ後ろのＯＲＦに挿入されている。Ｌ７−ＯＲＦ  ｍｕｔ（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ）（図１４Ｂ）は変異体として用いるため同様の場所にＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐが挿入されている。結果、Ｌ７Ａｅ蛋白質の濃度が上昇すると翻訳が阻害される。また、Ｌ７−ＵＴＲ、ＴｈｒＲＳ−ＵＴＲと同様、変異体では、翻訳阻害効果は減少していることが分かる。この結果は、ｍＲＮＡオープンリーディングフレームに結合したＬ７Ａｅ蛋白質がリボソームの進行を阻害することを示唆している（図１５）。
【０１０６】
［ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈの翻訳制御アッセイ］
ＯＦＦからＯＮへの翻訳制御は、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ５μＬ、５００ｎＭ  ＲＮＡ  １μＬ、１０μＭ  ａｎｔｉｓｅｎｃｅＲＮＡ  １μＬ、蛋白質を加え、超純水で全量を８μＬにし、６０℃、３分の熱処理を行い、すぐに氷冷した。１５分間、氷上に置いた後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ２μＬを加え、３７℃、７５分間で反応させた。反応後の測定は上記と同じ方法で行った。結果、ａｎｔｉｓｅｎｃｅＲＮＡを加えることで、阻害されていた翻訳が、蛋白質の添加で回復した（図１６）。これは、ａｎｔｉｓｅｎｃｅＲＮＡにＬ７Ａｅが結合することで、翻訳阻害を抑制したためと考えられる。
【実施例５】
【０１０７】
次に、出力遺伝子の改変が自由であることを示すために、赤色蛍光蛋白質の一種である、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｓＲｅｄ−Ｅｘ）をターゲットとして翻訳制御を行い、かつ、異なる二つの遺伝子の翻訳制御／活性化を同時に進行させた実施例を示す。
【０１０８】
［コントロール  ＤｓＲｅｄ-Ｅｘ  及び蛋白質応答人工ＲＮＡスイッチの作製］
コントロール  ＤｓＲｅｄ-Ｅｘ  並びに蛋白質応答人工ＲＮＡは、ｐＤｓＲｅｄ-Ｅｘベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より、２回ＰＣＲを行い作製した。
【０１０９】
［コントロール  ＤｓＲｅｄ-Ｅｘの作製］
ｐ  ＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  をテンプレート、ＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  １ｓｔ  Ｆｗｄ  （５’‐ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡ  Ｃ‐３’）（配列番号６８）、ＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  Ｒｅｖ（５’‐ＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣ‐３’）（配列番号６９）をプライマーとして用いて、１ｓｔ  ＰＣＲを行った。５０μＬ反応液には、テンプレート  １ｎｇ、各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μＬ  、１０×ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐ｂｕｆｆｅｒ  ｖｅｒ．２  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ、ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、反応は初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９４℃  １５秒、５０℃  ３０秒、６８℃  １分を２０サイクルで行った。
【０１１０】
以下すべて同じＰＣＲ条件で行っているため、テンプレートとプライマーだけを今後は示す。反応後、反応液をフェノール処理、エタノール沈殿をし、非変性色素（３０％グリセリン、０．０７５％  キシレンシアノール、０．０７５％  ブロモフェノールブルー、６９．８５％  超純水）に溶解した。低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）を用いて目的のバンドを分離し、切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え６５℃  ３０分インキュベートした後フェノール処理を３回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。
【０１１１】
次にその産物をテンプレート、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ（５’‐ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡ‐３’）（配列番号２１）、ＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄＰＣＲを行った。反応後、上記と同じ方法で分離、精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号７０）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた転写反応はＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）と同様である。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号７１）はＲｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。Ｒｎｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔを用いた精製は以下の通りである。
【０１１２】
転写反応液に超純水８０μＬを加え１００μＬとし、さらにＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ３５０μＬを添加して十分に混和した。２５０μＬのエタノールを添加し、ピペッティングにより完全に混和した。２ｍＬコレクションチューブにセットしたＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに上記サンプルをアプライし、微量高速冷却遠心機ＭＸ‐１００（ＴＯＭＹ）を用いて１０，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心し、フロースルーは捨てた。スピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブ上に移し、スピンカラム上に５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをピペットで添加した。１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心しフロースルーは捨てた。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬの８０％エタノールを添加、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心しフロースルーは捨てた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬコレクションチューブに移し、スピンカラムのキャップを開け、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心、フロースルーは捨てた。スピンカラムを新しい１．５ｍＬコレクションチューブに移し、シリカゲルメンブレンの真ん中に２０μＬの超純水を加え、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心して溶出した。この溶出液をＤＵ６４０  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて濃度測定を行った。
【０１１３】
［ＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの作製］
ｐＤｓＲｅｄ  Ｅｘをテンプレート、ＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’‐ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣ‐３’）（配列番号７２）とＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒとＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号７３）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号７４）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【０１１４】
［Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔａｎｔ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの作製］
ｐＤｓＲｅｄ  Ｅｘをテンプレート、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔａｎｔ  １ｓｔ  Ｆｗｄ（５’‐ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣ‐３’）（配列番号７５）とＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、プライマーとしてＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒとＤｓＲｅｄ  Ｅｘ  Ｒｅｖを用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号７６）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号７７）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。
【０１１５】
［ＯＮ ｓｗｉｔｃｈの作製］
ｐＥＧＦＰをテンプレート、ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈ１ｓｔ  Ｆｗｄ（５’‐ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ‐３’）（配列番号５９）とＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。次にその産物をテンプレート、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒとＥＧＦＰ  Ｒｅｖをプライマーとして用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行った。反応後、分離・精製を行い、超純水に溶解して、それを転写反応の鋳型とした（配列番号６０）。転写反応はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。転写反応によって得られたＲＮＡ（配列番号６１）を上述の方法で精製、濃度測定を行った。このＲＮＡはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に、以下に示したａｎｔｉｓｅｎｃｅとハイブリダイズさせる配列を挿入してある。
【０１１６】
［ａｎｔｉｓｅｎｃｅ２５ｍｅｒの作製］
ａｎｔｉｓｅｎｃｅ２５ｍｅｒはＴ７ｐｒｉｍｅｒとａｎｔｉｓｅｎｃｅ２５ｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（５’‐ＧＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ‐３’）（配列番号７８）を用いてＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）で作製した。このａｎｔｉｓｅｎｃｅは、中にＬ７Ａｅ結合部位（ＢｏｘＣ／Ｄｍｉｎｉ）が含まれている。反応後は、ＢｏｘＣ／Ｄｍｉｎｉと同様の方法で１５％  ポリアクリルアミド（２９：１）変性ゲル電気泳動を使い精製した。
【０１１７】
［Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの翻訳制御アッセイ］
Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの翻訳制御のアッセイはＰＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所）を利用して行った。ＯＮからＯＦＦへの翻訳制御はすべて以下のように測定した。まず、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ５μＬ、３．７５μＭ  ＲＮＡ  １μＬ、蛋白質を加え、超純水で全量を８μＬにし、４℃、１時間放置した。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ２μＬを加え、３７℃、７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長５３５ｎＭ、吸収波長５９５ｎＭで測定した。ＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの二次構造は図１７（ａ）に示した。また、コントロールとして用いたＤｓＲｅｄ−Ｅｘ  の二次構造は図１７（ｃ）に示した。これらの図中、３はリボソーム結合部位を、２は、ＲＮＡ‐蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列をそれぞれ示す。
【０１１８】
アッセイの結果から、Ｌ７Ａｅが結合するＢｏｘ  Ｃ／ＤモチーフをｍＲＮＡのＯＲＦの５’側内部に入れたものでは、蛋白質の濃度が上昇に応じて翻訳の阻害が起こっていることが分かる。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの二次構造は図１７（ｂ）に示した。これらは、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−ＥｘのＬ７Ａｅ結合部位（Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄモチーフ）に変異を入れたものである。図１８に、Ｌ７Ａｅが０μＭのときの蛍光量を１としたときの、Ｌ７Ａｅの添加濃度に対する蛍光量の比率を示す。コントロールＤｓＲｅｄ−Ｅｘ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘにおいては、高濃度のＬ７Ａｅ（５〜１０μＭ）で少しの翻訳阻害がみられるものの、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘと比較して、翻訳阻害効果は顕著に減少していることが分かる。
【０１１９】
［ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈとＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの同時翻訳制御アッセイ］
ＥＧＦＰ遺伝子をターゲットにしたＯＮ  ｓｗｉｔｃｈと、ＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの同時翻訳制御は、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ５μＬ、１μＭ  ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈ  ＲＮＡ（配列番号６１）  ０．５μＬ  ３．７５μＭＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘ  ＲＮＡ（配列番号７４）  １μＬ  ２０μＭ  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ２５ｍｅｒ（配列番号６３）０．５μＬ、Ｌ７Ａｅ蛋白質（配列番号６６）を加え、超純水で全量を８μＬにし、７０℃、３分の熱処理を行い、すぐに氷冷した。１５分間、氷上に置いた後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ２μＬを加え、３７℃、７５分間で反応させた。反応後、超純水で２００μＬにし、ｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長４８５ｎＭ、吸収波長５３５ｎＭで測定した。さらにｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて、励起波長５３５ｎＭ、吸収波長５９５ｎＭで測定した。図１９に結果を示す。その結果、ａｎｔｉｓｅｎｃｅＲＮＡを加えることで、阻害されていたＯＮ  ｓｗｉｔｃｈ  ＲＮＡの翻訳（ＥＧＦＰの発現で確認）が、Ｌ７Ａｅ蛋白質の添加で回復し、ＢｏｘＣ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘの翻訳は、Ｌ７Ａｅ蛋白質の添加で抑制された。これは、一種類の蛋白質の添加で、同時に異なる二つのｍＲＮＡの翻訳を逆方向に（翻訳の抑制／活性化）制御できたことを示唆している。
【０１２０】
［ｐｃＤＮＡ-Ｌ７Ａｅの制限酵素処理による作製］
ｐＬ７Ａｅをテンプレート、Ｆｗｄ（５’‐ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣ‐３’）（配列番号７９）、Ｒｅｖ（５’‐ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＣ‐３’）（配列番号８０）をプライマーとして用いて  ＰＣＲを行った。５０μＬ反応液には、テンプレート  ５ｎｇ、各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ、１０×ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐ｂｕｆｆｅｒ  ｖｅｒ．２  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  １．６μＬ、ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、反応は初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９４℃  １５秒、５２℃、３０秒、６８℃  １分を２５サイクルで行った。フェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。これを１５μＬ  の超純水に溶かしテンプレートとして制限酵素処理を行った。テンプレート５μＬ、バッファー２μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩを１μＬ、ＸｈｏＩを１μＬ、１０×ＢＳＡ２μＬ、超純水９μＬ、計２０μＬの系で３７℃２ｈインキュベートし、低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）を用いて目的のバンドを分離し、切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え６５℃  ３０分インキュベートした後フェノール処理を２回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。ｐｃＤＮＡベクター（インビトロジェン）も同様に制限酵素処理を行った。テンプレート２ｎｇ、バッファー２μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩを１μＬ、ＸｈｏＩ  １μＬ、１０×ＢＳＡ２μＬ、超純水１３μＬ、計２０μＬ  の系。３７℃２ｈインキュベートし、低融点アガロースＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）を用いて目的のバンドを分離し、切り出した。切り出したアガロース断片に、ＴＥ  ２００μＬ加え６５℃  ３０分インキュベートした後フェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。これを１０μＬの超純水に溶かし、ＢＡＰ  処理を行った。テンプレート１０μＬ、超純水３３μＬ，ＢＡＰ２μＬ，バッファー５μＬ，計５０μＬ  の系３７℃２ｈインキュベートし、低融点アガロースＳＥＡＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ  ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ）を用いて目的のバンドを分離し、切り出した。切り出したアガロース断片にＴＥ  ２００μＬ加え６５℃  ３０分インキュベートした後フェノール処理２回、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製した。
【０１２１】
インサート１μＬ、ベクター１μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ２μＬの計４μＬを１６℃２ｈインキュベート。ＪＭ１０９に形質転換。ミニプレップしてｐｃＤＮＡ-Ｌ７Ａｅを精製した。
【０１２２】
［Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの部位特異的変異導入による作製］
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプラスミドをＴｅｍｐｌａｔｅにし、リン酸化したプライマーを用いて、全長を高正確性のＰＣＲ酵素、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて増幅させた。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ産物をつなげることによって作製した。Ｆｗｄ  Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＥＧＦＰ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号８１），Ｒｅｖ  Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＥＧＦＰ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣ−３’）（配列番号８２）。５０μＬ反応液には、テンプレート  ５ｎｇ、各１０μＭ  ＤＮＡプライマー  １．５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ  、１０×ＫＯＤ‐ＰＬＵＳｂｕｆｆｅｒ５μＬ、ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ‐ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬが混合してあり、反応は初めに９４℃  ２分インキュベートした後、９８℃  １０秒、６８℃  ４分を２５サイクルで行った。次に、メチル化されているＤＮＡを特異的に分解する制限酵素ＤｐｎＩを作用させて、鋳型Ｐｌａｓｍｉｄを消化し、さらにＰＣＲ産物のＳｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＰＣＲ産物を自己環状化させた。
【０１２３】
［ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰの部位特異的変異導入による作製］
Ｆｗｄ  ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＥＧＦＰ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号８３）を作成し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプラスミドをＴｅｍｐｌａｔｅにして遺伝子を増幅させた。それ以外は、上と同様に作成した。
【実施例６】
【０１２４】
ヒト癌培養細胞内でのＬ７Ａｅの発現を確認するためにウエスタンブロッティングを行った。
前日に子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞を６ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。ｐｃＤＮＡ−Ａ（図２０）（配列番号８４）、及びＬ７Ａｅ発現ベクターｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ（配列番号８５）（図２１）の添加量を１μｇ、２μｇ、４μｇとしこれに合わせてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の量を２．５μｌ、５μｌ、１０μｌとした。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。なお、Ｌ７Ａｅ発現ベクターｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅとは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）のＣＭＶプロモーター下流に、Ｌ７Ａｅ遺伝子を挿入したプラスミドベクターである。４時間後に培地交換を行った。
【０１２５】
トランスフェクション２９時間後、ｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄後３００μｌ  ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ）を加え、セルスクレーパーで細胞をｗｅｌｌから剥がした。そのライセートを、２１ゲージの針をつけたシリンジにより破砕した。１０μｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦを加え３０分氷上に静置し、遠心分離（４℃、１５０００ｇ、２０分）により上清を回収した。同様にトランスフェクション５３時間後の蛋白質を回収した。蛋白質の濃度はＤＣ−プロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いＬｏｗｒｙ法で決定した。
【０１２６】
ウエスタンブロッティングにより、Ｌ７Ａｅの検出を行った。細胞より抽出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開しウエスタンブロッティングを行った。一次抗体Ａｎｔｉ−ｃ−Ｍｙｃ（Ａｂ−１）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１／５００）、二次抗体二次抗体Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  （ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いた。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（商標）により発色させＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いて検出した。これらの結果より、ＨｅＬａ細胞内でのｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ導入によるＬ７Ａｅ発現を確認できた。以下細胞の蛋白質抽出およびＬ７Ａｅの検出には同様の方法で行った。図２２は、細胞内でのＬ７Ａｅ発現を示す図である。図中、レーン１は、ｐｃＤＮＡ−A４μｇ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ１０μｌ、レーン２は、ｐｃＤＮＡ−Ａ  ２μｇ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ５μｌ、レーン３は、ｐｃＤＮＡ−Ａ１μｇ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２．５μｌ、レーン４は、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ４μｇ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ１０μｌ、レーン５は、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ  ２μｇ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ５μｌ、レーン６は、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ  １μｇ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２．５μｌを、それぞれ添加したものである。この図から、トランスフェクション２９時間後において、Ｌ７Ａｅがヒト癌細胞内部において発現することがわかった。トランスフェクション５３時間後においても、発現量が減少するものの、その発現は確認された。
【０１２７】
Ｌ７Ａｅ発現させたことによる細胞毒性への影響を評価するために、ＷＳＴ１アッセイを行った。前日にＨｅＬａ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに、１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。ｐｃＤＮＡ−Ａ、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅの添加量を０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．４０μｇとし、１サンプルにつき０．２５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。トランスフェクション２４時間後生細胞数をＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）（商標）を用いＷＳＴ１アッセイにより測定した。この時間内ではＬ７Ａｅを発現させたことによる細胞毒性がないことが示された。図２３は、トランスフェクション２４時間後、Ｌ７Ａｅを発現させたことによる細胞毒性がないことを示す図である。
【０１２８】
Ｌ７ＡｅによるＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ蛋白質発現抑制をウエスタンブロッティングにより測定した。
前日にＨｅＬａ細胞を６ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ（図２４）（配列番号８６）、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ（図２５）（配列番号８７）１．０μｇに、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを、各０、０．５、１．０、１．５、２．０μｇ加え、１サンプルにつき５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。トランスフェクション２４時間後、上記の方法により蛋白質抽出しウエスタンブロッティングによりＬ７Ａｅ（図２６）、ＥＧＦＰ（図２７）の検出を行った。ＥＧＦＰの一次抗体はＧＦＰ（Ｂ−２）ＳＣ９９９６（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）（１／２００）、二次抗体Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  （ＢＩＯＲＡＤ）（１／２０００）を用いた。Ｌ７Ａｅの発現によるＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ特異的なＥＧＦＰ発現抑制を確認することができた。図２６は、Ｌ７Ａｅの発現を示した図である。この図より、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰまたはＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰとＬ７Ａｅを共発現させた場合、Ｌ７Ａｅの発現量に差はないことをウエスタンブロッティングにより確認できた。図２７は、Ｌ７ＡｅによるＥＧＦＰの翻訳抑制を示した図である。この図より、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを発現させると、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの発現は顕著に抑制されることがわかる。一方、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰの発現抑制効果は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰと比較して小さいことがわかった。
【０１２９】
また、ＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いて、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  Ｖｅｒ３．０（富士フィルム）により、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで得られたバンドの解析を行った。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ  １．０μｇにｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを加えなかったもの（−）をそれぞれ１として、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ  を０．５μｇ加えたもの（＋）の値を算出した。このＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの定量結果を、図２８に示す。
【０１３０】
Ｌ７Ａｅによる蛋白質発現抑制をＦＡＣＳにより測定した。
前日にＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに、０．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃のＣＯ２インキュベーション内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ  ０．２μｇに、ｐｃＤＮＡ−Ａ、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを、各０、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．４０、０．８０、１．６０μｇを加え、１サンプルにつき１μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。
【０１３１】
トランスフェクション２４時間後に培地を除去し、２００μｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎｅ  ＥＤＴＡで細胞を剥離し２００μｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えた。ＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ）により解析を行った。なおＦＡＣＳとは遊離した細胞を細い管に通過させる際、レーザー光線を当てて、その細胞から発生する蛍光の強弱により、細胞の分画を解析する方法である。ここでは、生細胞にゲーティングを行い１００００  個についてＦＩＴＣを測定した。結果よりｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰをトランスフェクションした細胞特異的に、ＥＧＦＰ発現抑制がおこることが示された。また上記のウエスタンブロットの結果と比較して、より詳細に解析することができた。図２９は測定結果を示すグラフである。図中、Ｍｏｃｋは、ＤＮＡを添加せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）のみをトランスフェクションしたものを表し、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ（実線）とＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ（点線）を０．２μｇに固定したものに、ｐｃＤＮＡ−Ａを０、０．１０、０．２０、０．８０μｇを加えたものを左列に表し、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを０、０．１０、０．２０、０．８０μｇを加えたものを右列に表した。図３０では、図２９のＦＡＣＳデータを元に解析し、Ｌ７Ａｅの発現が、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの翻訳を特異的に抑制する結果を定量した。
【０１３２】
次に、Ｌ７Ａｅによる蛋白質発現抑制される時のｍＲＮＡ量の変化をＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより測定した。
前日にＨｅＬａ細胞を６ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ  １．０μｇにｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを、各０、０．５、１．０、２．０μｇ加え、１サンプルにつき５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。また、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ  １．０μｇにｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ、ｐｃＤＮＡ−Ａを０、０．５、１．０、２．０μｇ加え、１サンプルにつき、５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。トランスフェクション２４時間後、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  ４ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （Ａｍｂｉｏｎ（商標））を用いてＲＮＡ抽出およびＤＮＡ除去を行った。
【０１３３】
抽出したＲＮＡ  １．５μｇ（または０．５μｇ）をテンプレートとしてＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を用いランダムプライマーと逆転写酵素によりｃＤＮＡ合成をした。リアルタイムＰＣＲは２００００分の１希釈したｃＤＮＡを鋳型として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ  Ｍａｓｔｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）  （商標）を用いたインターカレーション法により行った。ＰＣＲ反応とリアルタイム蛍光検出は、ライトサイクラー４８０  （Ｒｏｃｈｅ）（商標）を用いて実施した。反応条件は、初期変性工程は９５℃、５分間、増幅工程は、変性９５℃、１０秒、アニーリング６０℃、１０秒、伸長７２℃、３秒に設定し、これを４５サイクル行った。融解曲線分析では、変性９５℃、５秒、アニーリング６５℃、１５秒、目標温度９８℃とし、最後に反応液を５０℃、１０秒間冷却して測定を終了した。Ｃｔ値をＳｅｃｏｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ法により決定した。４８１Ｐ  Ｆｗｄ（５’−ＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡ−３’）（配列番号８８）、Ｒｅｖ（５’−ＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’）（配列番号８９）を用いて、目的遺伝子であるＥＧＦＰの増幅を行った。ＧＡＰＤＨ  Ｆｗｄ（５’−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ−３’）（配列番号９０）、Ｒｅｖ（５’−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号９１）を用いて、リファレンス遺伝子であるＧＡＰＤＨの増幅を行った。融解曲線分析および電気泳動により増幅産物が単一であること目的産物あることを確認し、結果を相対定量により評価した。ＧＡＰＤＨによりＥＧＦＰの量を正常化し、その正常化した値を用いてＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ（ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ）のみを添加したサンプルを１としてサンプル間の比較を行った。サンプル間の発現量の差が２倍以内であることが示された。これらの結果よりＬ７Ａｅ特異的なＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰのｍＲＮＡ量の変化がないことを確認し、Ｌ７Ａｅにより、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰｍＲＮＡの転写レベルは制御されないことが示された。
【０１３４】
図３１は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰと、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅとに由来するサンプル、及びＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰとｐｃＤＮＡ−Ａとに由来するサンプルに関し、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰのｍＲＮＡ量をＢｏｘＣ／Ｄ−ＧＦＰのみのサンプルを１としてサンプル間で比較したグラフである。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ  １．０μｇに固定しｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ、ｐｃＤＮＡ−Ａをそれぞれ０、０．５、１．０、２．０μｇ加えたものである。左側の棒グラフはＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰにｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ  を添加したものを表し、右側の棒グラフはＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ  にｐｃＤＮＡ−Ａ  を添加したものを表した。縦軸は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ  １．０μｇを添加したサンプルのＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰのｍＲＮＡ量を１としたときの他のサンプルの発現量を表し、横軸は、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７ＡｅおよびｐｃＤＮＡ−Ａの添加量を表した。図３２は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰと、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅとに由来するサンプル、及びＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰと、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅとに由来するサンプルに関し、ｍＲＮＡ量をＢｏｘｃ／Ｄのみのサンプルを１としてサンプル間で比較したグラフである。（図８）  Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰをそれぞれ  １．０μｇに固定しｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを０、０．５、１．０、２．０μｇ加えたものである。左側の棒グラフはＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ  にｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ  を添加したものを表し、右側の棒グラフはＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ  にｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅ  を添加したものを表した。縦軸は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、またはＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰを  １．０μｇを添加したサンプルのＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、またはＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰのｍＲＮＡ量を１としたときの他のサンプルの発現量を表し、横軸は、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅの添加量を表した。
【０１３５】
蛍光顕微鏡写真によるＬ７Ａｅ発現によるＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ発現の抑制の観察を行った。
前日にＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ  ０．２μｇにｐｃＤＮＡ−Ａ、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを各０、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０μｇを加え１サンプルにつき１μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。トランスフェクション２４時間後に蛍光顕微鏡で写真をとった。図３３は、Ｌ７ＡｅによるＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの発現抑制効果を示す蛍光顕微鏡写真である。この図から、四角で囲んだ領域で、顕著にＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの蛍光量が低下することがわかった。すなわち、Ｌ７Ａｅの発現が、特異的にＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの翻訳を抑制することがわかる。
【０１３６】
次に、Ｌ７Ａｅが目的蛋白のタグ配列として利用できることを示した実験について説明する。ｐｃＤＮＡ−Ｌ７ＡｅをｐｃＤＮＡ３．１−Ｌ７Ａｅ  ＤｓＲｅｄに置換することができた。
前日にＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに０．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように捲種し、３７℃ＣＯ２インキュベーション内で培養した。翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）によりトランスフェクションを行った。Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰ、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰ  ０．２μｇにｐｃＤＮＡ３．１−ＤｓＲｅｄ、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｌ７Ａｅ  ＤｓＲｅｄを各０、０．２、０．４、０．８、１．６μｇを加え１サンプルにつき１μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を加えた。これらのＤＮＡ−脂質複合体を室温、２０分インキュベーションを行い、細胞に滴下した。４時間後に培地交換を行った。トランスフェクション２４時間後に蛍光顕微鏡で写真をとった。図３４は、蛍光顕微鏡写真である。この図から、四角で囲んだ領域で、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｌ７Ａｅ−ＤｓＲｅｄの発現とともに、顕著にＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰの蛍光量が低下することがわかった。細胞が赤色蛋白質を発現するにつれ、緑色蛋白質の発現が抑制される。すなわち、Ｌ７Ａｅをタグ配列として蛋白質に付加することで、任意の遺伝子の発現、例えば赤色蛍光蛋白質の発現に応答して、目的遺伝子の翻訳、例えば緑色蛍光蛋白質の翻訳を抑制するシステムが細胞内で構築できることがわかった。
【実施例７】
【０１３７】
上記の実施例において用いた、Ｌ７Ａｅと、ＲＮＡ複合体との結合特性を調べるために、生体分子間相互作用解析装置「ＢＩＡＣＯＲＥ３０００」での反応速度定数の算出を行った。
【０１３８】
［Ｌ７Ａｅ結合ＲＮＡ  ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｂｉａ，  ｂｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔａｎｔ  ｂｉａの作製］
ＢＩＡＣＯＲＥで使用するＬ７Ａｅ結合ＲＮＡは、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ，ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔａｎｔの３’末端にＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップ上に固定化させているＤＮＡ配列（５’−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９２）の相補鎖とＴ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型を作製し、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた転写反応で作製した。反応液には、０．１μＭ  ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｂｉａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（５’−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ−３’）（配列番号９３），１０μＭ  Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（５’−ＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号９４），１０μＭ  ｂｉａｃｏｒｅ  Ｒｅｖ  （５’−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴ−３’）（配列番号９５）  各５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  （ＴＡＫＡＲＡ）  ８μｌ，Ｅｘ  Ｔａｑ  １０×ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）１０μＬ，  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）０．５μＬが混合してあり，ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＣＴ−２００（ＢＩＯＲＡＤ社）を用いて９４℃  ３０秒，６０℃  ３０秒，７２℃  ３０秒で２５サイクルを行い伸長させた。反応後、フェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈澱を行い、１０μＬの超純水に溶解し、転写の鋳型として用いた。ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔａｎｔ  ｂｉａは反応液のテンプレートに０．１μＭ  ｂｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（５’−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣ−３’）（配列番号９６）を用いて同様に行った。
【０１３９】
転写の反応はｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  １０μＬ，１０×Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＤＴＴ，１０ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，  １５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）  ７０μＬ，１０×ｒＮＴＰｓ（１２．５ｍＭ  ｒＡＴＰ，１２．５ｍＭ  ｒＣＴＰ，１２．５ｍＭ  ｒＵＴＰ，１２．５ｍＭ  ｒＧＴＰ）７０μＬ，Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １４μＬを混合し、３７℃，３時間反応させた。反応液にＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）５μＬを加え３７℃で１時間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。その後、フェノール処理、エタノール沈澱を行い精製した。沈澱後、変性色素（８０％  ホルムアミド，０．１７％  ＸＣ，０．２７％  ＢＰＢ）２０μＬに溶解させ、１２％  ポリアクリルアミド（２９：１）変性ゲル電気泳動で分離した。目的のサイズのゲルを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０），０．１％  ＳＤＳ）を加え、３７℃、一晩溶出を行った。溶出したＲＮＡは再びフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈澱を行って精製した。
【０１４０】
［ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップ上へのリガンド（ｂｉｏｔｉｎ  ＤＮＡ）の固定化］
ストレプトアビジン固定化センサーチップ（ＳＡチップ）（ＧＥヘルスケア）上に、アミノカップリングキット（ＧＥヘルスケア）を用いて１μＭのＮ末端−ビオチン化修飾したＤＮＡ（５’−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９７）を１０μＬ／ｍｉｎの流速で８０μＬ添加し、固定化させた。
【０１４１】
［ＳＡチップへのリガンドＲＮＡの固定化］
ＲＮＡはＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）（ＧＥヘルスケア）で１μＭに調整し、８０℃で１０ｍｉｎ，室温で１０ｍｉｎ反応させリフォールディングを行った後、１Ｍ  ＫＣｌで１／１００に希釈し、１０μＬ／ｍｉｎの流速で３００μＬ添加し、ＳＡチップ上に固定化したＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ５２ＲＵ（レゾナンスユニット）固定化させた。
【０１４２】
［Ｌ７Ａｅの結合と解離］
Ｌ７Ａｅはｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１２５μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ，６２．５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で０ｎＭ，２．５ｎＭ，５ｎＭ，７．５ｎＭ，１０ｎＭ，１５ｎＭ，２０ｎＭ，２５ｎＭに調整し、５０μＬ／ｍｉｎの流速で５０μＬ添加しＲＮＡと結合させた。解離は同流速で５分間行った。結合、解離の測定後、２Ｍ  ＫＣｌを２０μＬ／ｍｉｎの流速で１０μＬ添加を数回繰り返し、５分間で解離しなかったＬ７Ａｅを強制的にＲＮＡから解離させた。各濃度３回ずつ測定した。
【０１４３】
［反応速度定数の算出］
ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｂｉａ  ＲＮＡを結合させたフローセルのセンサーグラムから、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｉｎｉ  ｍｕｔａｎｔ  ｂｉａ  ＲＮＡを結合させたフローセルのセンサーグラムを差し引き、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ解析ソフトの１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）ｂｉｎｄｉｎｇ様式、Ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇで反応速度定数（結合速度定数（ｋａ），解離速度定数（ｋｄ），  結合定数（ＫＤ），解離定数（ＫＡ））を算出した。結果を、表４及び図３５に示す。この図から、細胞内で翻訳制御に使用できるＲＮＰモチーフは、強い結合親和性（ＫＤ＝〜１ｎＭ）をもつとともに、遅い解離速度（Ｋｄ＝〜１ｘ１０−４）をもつこと、すなわち一度ＲＮＰ複合体を形成すると、再びＲＮＡと蛋白質に解離しにくいという特徴に持つことが示された。
【０１４４】
【表４】
0005538691.tif 000005
【０１４５】
上記の実施例中、遺伝子及びＲＮＡの名称表記において、ＧＦＰ、ＥＧＦＰという二つの表現を用いているが、いずれもＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子由来の遺伝子及びＲＮＡを意味するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の活用例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは任意の蛋白質の発現に応答して、下流のシグナル蛋白質（蛍光、発光蛋白質など）に応答するバイオセンサー、人工遺伝子回路として機能できる。また細胞内に導入することで、細胞を破壊することなく、特定の遺伝子を発現する細胞を検出するシステムや、任意の蛋白質の発現に応答して、任意の蛋白質の発現をＯＮからＯＦＦまたはＯＦＦからＯＮに変換する人工遺伝子回路のデバイスとして機能できる。したがって、細胞運命を制御する技術へと展開できる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１（Ａ）は、第一実施形態によるｍＲＮＡを示す図であり、図１（Ｂ）は、第一実施形態によるｍＲＮＡに、蛋白質が結合した状態を示す図である。
【図２】第二実施形態によるｍＲＮＡを示す図である。
【図３】図３（Ａ）は、第三実施形態によるｍＲＮＡを示す図であり、図３（Ｂ）は、第三実施形態によるｍＲＮＡにおいて、相補鎖が外れた状態を示す図である。
【図４】Ｂｏｘ  Ｃ／ＤのＥＭＳＡを示す図である。
【図５】Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｉｎｉｍｕｔのＥＭＳＡを示す図である。
【図６】ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２のＥＭＳＡを示す図である。
【図７】ＴｈｒＲＳ  Ｄｏｍａｉｎ２３４のＥＭＳＡを示す図である
【図８Ａ】図８Ａは、ＥＧＦＰ  ＵＴＲの二次構造を表す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｌ７−ＵＴＲ２の二次構造を表す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｌ７ＡｅのＬ７−ＵＴＲ２  ｍｕｔの二次構造を表す図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、Ｌ７−ＵＴＲ２  ｍｉｎｉｍｕｔの二次構造を表す図である。
【図８Ｅ】図８Ｅは、Ｌ７−ＵＴＲ５の二次構造を表す図である。
【図８Ｆ】図８Ｆは、Ｌ７−ＵＴＲ９の二次構造を表す図である。
【図８Ｇ】図８Ｇは、Ｌ７−ＵＴＲ１３の二次構造を表す図である。
【図９】リボソーム結合部位と、Ｌ７Ａｅ結合部位との距離の影響を示す図である。
【図１０】変異体における翻訳制御との比較を示す図である。
【図１１】競合実験を示す図である。
【図１２】ＴｈｒＲＳ  ＵＴＲの二次構造を示す図である。
【図１３】ＴｈｒＲＳ  ＵＴＲとＴｈｒＲＳ複合体が翻訳を阻害できることを示す図である。
【図１４】Ｌ７−ＯＲＦの二次構造を示す図である。
【図１５】ＯＲＦでの翻訳制御を示す図である。
【図１６】ＯＮ  ｓｗｉｔｃｈの翻訳制御アッセイの結果を示す図である。
【図１７】図１７中、（ａ）は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＤｓＲｅｄ  Ｅｘの二次構造を示す模式図であり、（ｂ）は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ  ｍｕｔ−ＤｓＲｅｄ  Ｅｘの二次構造を示す模式図であり、（ｃ）コントロールとして用いた、通常の５’−ＵＴＲ配列をもつＤｓＲｅｄ  Ｅｘの二次構造を示す模式図である。
【図１８】図１８は、Ｌ７Ａｅが０μＭのときの蛍光量を１としたときの、Ｌ７Ａｅの添加濃度に対する蛍光量の比率を示すグラフである。
【図１９】図１９は、蛋白質の添加で同時に二つのｍＲＮＡの翻訳を制御した結果を表すグラフである。
【図２０】図２０は、ｐｃＤＮＡ−Ａベクターを示すベクター図である。
【図２１】図２１は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）のＣＭＶプロモーター下流に、Ｌ７Ａｅ遺伝子を挿入したプラスミドベクターである、Ｌ７Ａｅ発現ベクターｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅを示すベクター図である。
【図２２】図２２は、ヒト培養細胞内でのＬ７Ａｅ発現を示す図である。
【図２３】図２３は、ヒト培養細胞内でＬ７Ａｅを発現させたことによる細胞毒性がないことを示す図である。
【図２４】図２４は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰベクターを示すベクター図である。
【図２５】図２５は、ＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰベクターを示すベクター図である。
【図２６】図２６は、Ｌ７Ａｅの発現を示した図である。
【図２７】図２７は、ＥＧＦＰの発現を示した図である。
【図２８】図２８は、Ｌ７ＡｅによるＥＧＦＰの翻訳抑制をウエスタンブロッティングで定量した図である。
【図２９】図２９は、Ｌ７ＡｅによるＥＧＦＰの翻訳抑制をＦＡＣＳで測定した図である。
【図３０】図３０は、ｐｃＤＮＡまたはｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅの添加量が０〜１．６μｇの時のＥＧＦＰ翻訳抑制の結果を定量した図である。
【図３１】図３１は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰと、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅとに由来するサンプル、及びＢｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰとｐｃＤＮＡ−Ａとに由来するサンプルに関し、ｍＲＮＡ量をＢｏｘｃ／Ｄのみのサンプルを１としてサンプル間で比較したグラフである。
【図３２】図３２は、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰと、ｐｃＤＮＡ−Ｌ７Ａｅとに由来するサンプル、及びＢｏｘＣ／Ｄ  ｍｕｔ  ＧＦＰと、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰとに由来するサンプルに関し、ｍＲＮＡ量をＢｏｘｃ／Ｄのみのサンプルを１としてサンプル間で比較したグラフである。
【図３３】図３３は、空ベクター、Ｌ７Ａｅを発現するベクターの添加量と、ＢｏｘＣＤ−ｍｕｔ-ＧＦＰ、Ｂｏｘ  Ｃ／Ｄ−ＧＦＰにおける翻訳制御の関係を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図３４】図３４は、Ｌ７Ａｅを目的蛋白のタグ配列として利用できることを示した蛍光顕微鏡画像である。
【図３５】図３５は、ＢｏｘＣ／Ｄ  ＲＮＡとＬ７Ａｅ蛋白質の結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄ）、結合（ＫＡ）、解離（ＫＤ）定数を測定し、このＲＮＡ−蛋白質複合体において、親和性が高く、解離速度が遅いモチーフが細胞内翻訳制御に有効であることを示すグラフである。
【符号の説明】
【０１４８】
１    ｍＲＮＡ
１ａ  ｍＲＮＡ
１ｂ  ｍＲＮＡ
２    ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列
２ａ  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列
２ｂ  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に相補的な塩基配列
３    リボソーム結合部位
４    オープンリーディングフレーム
４ａ  オープンリーディングフレーム
４ｂ  オープンリーディングフレーム
５    蛋白質
５ｂ  蛋白質
６    競合ＲＮＡ
【図１】
0005538691.tif 000006
【図２】
0005538691.tif 000007
【図３】
0005538691.tif 000008
【図８Ａ】
0005538691.tif 000009
【図８Ｂ】
0005538691.tif 000010
【図８Ｃ】
0005538691.tif 000011
【図８Ｄ】
0005538691.tif 000012
【図８Ｅ】
0005538691.tif 000013
【図８Ｆ】
0005538691.tif 000014
【図８Ｇ】
0005538691.tif 000015
【図９】
0005538691.tif 000016
【図１０】
0005538691.tif 000017
【図１１】
0005538691.tif 000018
【図１２】
0005538691.tif 000019
【図１３】
0005538691.tif 000020
【図１４】
0005538691.tif 000021
【図１５】
0005538691.tif 000022
【図１６】
0005538691.tif 000023
【図１７】
0005538691.tif 000024
【図１８】
0005538691.tif 000025
【図１９】
0005538691.tif 000026
【図２０】
0005538691.tif 000027
【図２１】
0005538691.tif 000028
【図２３】
0005538691.tif 000029
【図２４】
0005538691.tif 000030
【図２５】
0005538691.tif 000031
【図２８】
0005538691.tif 000032
【図２９】
0005538691.tif 000033
【図３０】
0005538691.tif 000034
【図３１】
0005538691.tif 000035
【図３２】
0005538691.tif 000036
【図３５】
0005538691.tif 000037
【図４】
0005538691.tif 000038
【図５】
0005538691.tif 000039
【図６】
0005538691.tif 000040
【図７】
0005538691.tif 000041
【図２２】
0005538691.tif 000042
【図２６】
0005538691.tif 000043
【図２７】
0005538691.tif 000044
【図３３】
0005538691.tif 000045
【図３４】
0005538691.tif 000046
【配列表】
0005538691000001.app