(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に改変して、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロールへのネイティブな代謝経路が欠失した又は破壊され、このネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、若しくは少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子、又はこれらの両方が欠失した若しくは破壊された、この細胞によって代謝可能な炭素源の存在下の発酵条件下で培養すると生育し、この炭素源の２重量％より少ない部分がこの細胞により消費されてグリセロールへ代謝される、種Issatchenkia orientalisの酵母細胞。
【請求項２】
機能性乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）遺伝子カセットを持ち、ラクタートを産生する請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子が欠失した又は破壊された請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなジヒドロキシアセトンホスファターゼ遺伝子が欠失した又は破壊された、ネイティブなグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失した又は破壊された、又はネイティブなジヒドロキシアセトンホスファターゼ遺伝子及びネイティブなグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両者が欠失した又は破壊された請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ピルビン酸からエタノールへのネイティブな代謝経路が欠失した又は破壊された請求項２〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞を、発酵条件下かつ所望の発酵産物を産生するための炭素源の存在下で、培養することから成る発酵方法であって、グリセロール収量が、この細胞により消費される炭素源に対して２重量％より少ない発酵方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、米国エネルギー省との契約番号DE-FC36-03GO13145の契約のもとに完成された。米国政府は、この発明に関する一定の権利を有する。この出願は、2006年3月13日に出願された米国仮出願60/781,674の優先権を主張する。
この発明は、遺伝子改変されたある種の酵母、及び遺伝子改変した酵母を用いて乳酸を産生する発酵方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、多くの発酵産業において生体触媒として用いられる。酵母を用いて、発酵により砂糖を乳酸のような有機酸に変換することに対して興味が増加している。これらの発酵において有機酸がより多く産生されるに従い、発酵培地は益々酸性になる。これらの有機酸を産生する大部分のバクテリアは、高い酸性の環境では、機能が低下し、これらの条件では生存できない又はそうでなければ産生速度が低下し、この産生過程は経済的に成り立たなくなる。その結果として、より高いｐＨを維持するために培地に緩衝作用を持たせることが必要となる。培地に緩衝作用を持たせることは、産物を酸の形で回収することを困難にする。産物が部分的又は全面的に酸の形である低いｐＨで、発酵を行うことが好ましい。
【０００３】
酵母は、このような低ｐＨでの発酵のための候補と考えられる。多くの酵母種は、本来（ネイティブに）発酵によりヘキソース糖をエタノールに変換するが、乳酸のような有機酸をネイティブにかなりの収率で産生する酵母種は存在したとしても少ない。従って、様々な酵母種を遺伝的に改変して、１又は２以上の遺伝子を挿入し、酵母細胞が乳酸を産生することができるようにする試みが為されてきた。糖代謝をエタノール産生から乳酸産生へ転換するために、これらの細胞を遺伝的に改変して、ネイティブなピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）遺伝子を破壊又は欠失させた。このような仕事は、例えばWO 99/14335、WO 00/71738 Al、WO 02/42471 A2、WO 03/049525 A2、WO 03/102152 A2及びWO 03/102201 A2等に記載されている。
【０００４】
グリセロールは、これら酵母発酵の多くにおいて、かなりの収率で産生される。グリセロールは細胞にとって浸透圧保護剤として働くのかも知れない。グリセロール形成は、発酵条件下で、レドックスコファクターの再生を助けるのかも知れない。
多くの酵母細胞において、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）を代謝することにより、グリセロールが産生される。多くの酵母種において、DHAPは、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD、系統名はsn-グリセロール−３−リン酸：NAD＋２−オキシドリダクターゼ、EC 1.1.1.8）酵素により還元されて、グリセロール−３−リン酸（G3P）を形成する。G3Pは、グリセロール前駆体のみならず、脂質生合成のための前駆体の役目をする。G3Pは、グリセロール−３−ホスファターゼ酵素（GPP，系統名はグリセロール−１−リン酸ホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.21）により脱リン酸化されて、グリセロールになる。
【０００５】
グリセロール産生には他の経路が存在し、これはS. pombeのような若干の酵母において重要である。この経路において、ジヒドロキシアセトンリン酸はジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼにより脱リン酸化され、ジヒドロキシアセトンになる。その後、ジヒドロキシアセトンは、NADH+-依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ（系統名は、グリセロール：NAD＋２−オキシドリダクターゼ、EC1.1.1.1.6）によるNADH酸化と連係して、グリセロールに転換される。
グリセロール産生は、グリセロール産生がなければより望ましい発酵産物を産生するために用いられる炭素を消費するので、グリセロール産生は、収量低下のかなりの原因である。さらに、グリセロールは、ATP及びNADH両者を消費して産生される。このことは、バイオマスや望ましい産物の産生からエネルギーを失わせる。これら両者の理由により、細胞によるグリセロール産生を減少させる又は除くことが望まれる。さらなる考察によると、グリセロール産生を減少又は除去することは、所望の産物の回収及び精製を単純化するであろう。
【０００６】
Saccharomyces cerevisiae株のネイティブのGPD遺伝子を、遺伝子工学により、欠失させると、細胞からGPD酵素が失われ、グリセロール産生が阻止される。Nissen他"Anaerobic and aerobic batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis"Yeast, 2000:16:463-474を参照されたい。Nissen他は、好気的及び嫌気的条件の下で、ネイティブの両GPD遺伝子を破壊した、変異細胞の生育は非常に悪いと報告している。Nissen他によると、変異細胞は野生型細胞より、遙かに少ないグリセロールを産生する。Nissen他の仮定によると、二重欠失株で見られる生育不良は、細胞内のNADH酸化に使われるグリセロール産生の欠失の為に、細胞のNAD+プールが枯渇することによる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
殆ど又は全くグリセロールを産生せず、好気的条件、嫌気的条件、又は好気的及び嫌気的条件で生育が良好であり、望ましい有機酸を産生する酵母細胞を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様において、本発明は、遺伝的に改変して、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロールへのネイティブな代謝経路が欠失した又は破壊された、全ゲノム重複以前の（又は、プレ全ゲノム重複の）酵母細胞である。このネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD）遺伝子が欠失し又は破壊されてもよい。またこのネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−ホスファターゼ（GPP）遺伝子が欠失し又は破壊されてもよい。さらに、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子が欠失し又は破壊されてもよい。また、ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなジヒドロキシアセトンホスファターゼ遺伝子が欠失し又は破壊された、ネイティブなグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失し又は破壊された、又はこれらの両者が欠失し又は破壊されてもよい。
【０００９】
他の態様において、本発明は、以下の標準的ミクロ好気的条件下：
Ａ．培養開始の際の規定された液体培地の組成が、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類、１５０ｇ／Ｌグルコースを含む；
Ｂ．培養の際ｐＨが３．０以下への低下又は７．０以上に上昇することを防ぐことが必要な場合、緩衝効果を持った発酵培地で、開始時のｐＨが３．５である；
Ｃ．培養がＯＤ６００が１．０までの酵母細胞を蒔種した；
Ｄ．培養温度が３０℃；
Ｅ．培養が、グルコース濃度が１０g/Lに低下するまで連続するが、１２０時間以上は連続しない；
Ｆ．空気混入及び攪拌を十分に行い、酸素取り込み速度が５．０±１．０mmol/L/hrになるようにする；
で培養された場合に、２．０ｇ／Ｌ以下のグリセロールを産生する、全ゲノム重複以前の酵母種の変異酵母細胞である。
【００１０】
他の態様において、本発明は、活性なグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD）酵素の産生力を欠く全ゲノム重複以前の酵母種の変異酵母細胞である。本発明の目的にとって、ある細胞中の酵素の活性が、野生型株中のその酵素の活性と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％減少する場合には、その細胞は活性な酵素を産生する能力を欠くといえる。いかなる特定の酵素の酵素活性も適切な検定方法で測定することができる。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定する市販用の検定キットは入手可能である。このような商品は、例えば、タカラバイオ株式会社MK426の商品名でFisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvaniaから入手可能である。
【００１１】
他の態様として、本発明は、活性なグリセロール−３−ホスファターゼ酵素の産生力を欠く全ゲノム重複以前の酵母種の変異酵母細胞である。
他の態様として、本発明は、野生型の酵母細胞種により本来産生される活性型ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ酵素の産生能を欠く、又は野生型の酵母細胞種により本来産生される活性型ＮＡＤＨ＋依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の産生能を欠く、又は両者を欠く、遺伝的に改変された酵母種の細胞である。
【００１２】
他の態様として、本発明は、産物である有機酸を産生するように遺伝的に改変された変異酵母細胞であり、この酵母細胞では、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロールへのネイティブな代謝経路が欠失し又は破壊され、またピルビン酸塩からエタノールへのネイティブな代謝経路が欠失し又は破壊されている。このネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失し又は破壊されてもよい。またこのネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子が欠失し又は破壊されてもよい。さらに、ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び少なくとも１個のネイティブなグリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子が欠失し又は破壊されてもよい。
【００１３】
本発明に従う細胞は、発酵条件下で培養した場合、非常に低レベルのグリセロールを産生することが分かった。グリセロール産生は、発酵条件の範囲内で、０．２g/L以下であることが分かった。驚いたことに、本発明の細胞は、グリセロール産生を欠くにも拘わらず、またいくつかの態様では、グリセロール−３−リン酸産生を欠くにも拘わらず、発酵条件下で良く生育する。いくつかの例において、本発明の細胞の酸寛容性が改善されたことが分かった。従って、本発明はまた、本発明の上記の態様の何れかの細胞を、発酵産物を産生する発酵条件下で培養することから成る発酵方法であって、炭素源に対するグリセロールの収量が２重量％より少ない発酵方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の酵母細胞は、宿主酵母細胞に特定の遺伝的な改変を行うことにより作成される。この宿主酵母細胞は、野生型株として、本来少なくとも１個の糖をグリセロールに代謝できる細胞である。ネイティブな代謝経路は、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール−３−リン酸を経由してグリセロールへの代謝経路を含んでもよい。またこのネイティブの経路は、ジヒドロキシアセトンリン酸からジヒドロキシアセトンを経由してグリセロールへの代謝経路を含んでもよい。宿主細胞は、これら両者の代謝経路を含んでもよい。
【００１５】
遺伝子材料（例えば、遺伝子、プロモーター、ターミネーター（転写終結区）又は他のＤＮＡ配列）に関して本明細書で用いる用語"ネイティブ"は、（機能に影響を持たない個別的変異とは区別して）ある酵母種の野生型細胞のゲノム内に見出される遺伝子材料を表す。"ネイティブな能力"（及び"本来可能である"というような派生語も含めて）野生型細胞が指定した機能を行う能力を示す。例えば、もしある種類の野生型細胞が、何らかの遺伝子改変を受ける以前に、その能力を有するならば、ある細胞は、糖をグリセロールに代謝するネイティブな能力がある。もしある遺伝子が細胞内で活性なタンパク質を産生するならば、その遺伝子は細胞内で"機能的"と考えられる。"ネイティブな経路"又は"ネイティブな代謝経路"は、ある酵母種の野生型細胞内に存在して、また活性な代謝経路を表わす。もしある酵素が、ある酵母種の野生型細胞内で活性型として産生されるならば、その酵素は酵母種により"本来産生される"。
本発明において"外因性"は宿主細胞にとってネイティブではない全ての遺伝子材料に関して意味する。
【００１６】
本発明のある態様に適切な宿主酵母細胞としては、Wolf他"Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome", Nature 387, 708-713 (1997) (以後"Wolf et al 1997"と表示する）, Langkjaer 他"Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes", Nature 421, 848-852 (2003)及びMerico 他., "Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex", FEBS Journal 274, 967-989 (2007) (以後 "Merico 2007"と表示する）.により記載された古代の（約１億年前）全ゲノム重複事象を経験した株の子孫ではない酵母細胞がある。その代わり、このような酵母細胞は、全ゲノム重複事象の当時存在した１又は２以上の他の酵母株からの子孫であり、以後"全ゲノム重複以前の酵母"と表される。全ゲノム重複事象は、Saccharomyces cerevisiae及びゲノム重複が生じた共通の祖先からの子孫種の発酵能力の進化に対して決定的であるように見える(Merico 2007)。ゲノム重複における重複された遺伝子セットに含まれる遺伝子として、レドックスバランスを維持する上で含まれるフマル酸リダクターゼをコードする遺伝子と同じく、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロール−３−ホスファターゼをコードする遺伝子がある（Wolfe他 1997）。
【００１７】
適切な全ゲノム重複以前の酵母細胞の中には、半子嚢菌綱酵母細胞がある。半子嚢菌綱酵母は、Saccharomycetales目内に分類される単細胞酵母である。
他の適切な酵母細胞は、Kurtzman and Robnett, "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.", FEMS Yeast Res. Vol. 4, pp. 417-432. (2003)図９(p430) に記載されたSaccharomyces コンプレックスの7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14クレード（単系統群）の何れかに属する細胞である。上記Merico 2007及びKurtzmann著, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae ..." FEMS Yeast. Res. Vol. 4, pp. 233-245 (2003) (以後 "Kurtzman 2003"と表示する）において、これらのクレードは、それぞれ、Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluyveromyces, Eremothecium, Hanseniaspora及びSaccharomycodesの名前により表される。
他の適切な酵母細胞としては、Candida、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Issatchenkia、及びHansenula属のもとに分類される酵母種である（しかしながらこれらに制限されない）。
【００１８】
特に興味のある綱の宿主細胞としては、I. orientalis/I. terricolaクレードに含まれるいずれかの酵母種である。I. orientalis/I. terricolaクレードのメンバーは、Kurtzman and Robnett 著 "Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences", Antonie van Leeuwenhoek 73:331-371, 1998, (以後"Kurtzman and Robnett 1998"と表示する）に記載された方法を用いて、酵母種の２６ＳリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２可変領域の解析で同定された。特にｐ３４９及びｐ３６１を参照されたい。何百もの子嚢菌類から２６ＳリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２可変領域の解析から、I. orientalis/I. terricolaクレードは、近接した種類を含むことが明らかとなった。I. orientalis/I. terricolaクレードのメンバーは、クレード外の酵母種の２６ＳリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２可変領域より、クレードの他のメンバーのＤ１／Ｄ２可変領域に類似したＤ１／Ｄ２可変領域を示す。従って、Kurtzman及びRobnettの方法を用いて、I. orientalis/I. terricola のそれぞれのリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域を比較して、また他のクレードのメンバーの可変領域及びクレード外の近縁種の可変領域の比較により、I. orientalis/I. terricolaクレードの他のメンバーが、同定された。I. orientalis/I. terricolaクレードに属する酵母種は、すべてより広いPichia/Issatchenkia/  Saturnispora/ Dekkeraクレード内の半子嚢菌綱酵母である。興味ある他の綱の宿主細胞は、Kurtzman及びRobnett 1998に記載されたI. orientalis/P. fermentasクレードである。このクレードは、少なくとも種Issatchenkia orientalis、Pichia galeiformis、Pichia、sp. YB-4149 (NRRL 記号表示する）、Candida ethanolica、P. deserticola、P. membranifaciens及びP. fermentansを含む最末端のクレードである。
【００１９】
特に興味のある他の宿主細胞は、Kurtzman and Robnett"Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.". FEMS Yeast Res. Vol. 4, pp. 417-432.(2003)の図９(p.430)に（１１クレードとして）、及びKurtzmann, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae ..." FEMS Yeast. Res., Vol. 4, pp. 233-245 (2003) (以後 "Kurtzman 2003"と表示する）、図１に記載されたSaccharomyces コンプレックスのKluyveromycesクレードに含まれるいずれかの酵母種である。Kluyveromycesクレードは、少なくとも種S. kluyveri、K. aestuaryii、K. nonfermentans、K. lactic、K. marxianus及びK. dobzhanskiiを含む、またKurtzman 2003に記載された多重遺伝子配列解析方法を用いて、そのクレード内に分類できるさらなる種を含むかも知れない。
【００２０】
このような酵母細胞は、遺伝的に改変し有機酸、特に乳酸、を産生する時、特に興味がある。一般的にCandida、Kluyveromyces及びIttatchenkia属からの宿主細胞が好ましい。変異細胞が有機酸に加えて又は有機酸の代わりに他の発酵産物（例えば、エタノールのような）を産生する場合と同様に、変異酵母細胞が有機酸を産生できる態様において、前に記載したKluyveromyces and I. orientalis/P. fermentansクレードからの宿主細胞は特に好ましい。とりわけ好ましい宿主細胞は、C. sonorensis、K. marxianus、K. thermotolerans、C. methanosorbosa、及びI. orientalisである。最も好ましい細胞は、K. marxianus、C. sonorensis、及びI. orientalisである。最初特徴付けられた際、種I. orientalisはPichia kudriavzeviiと名付けられた。I. orientalisのアナモルフ（無生殖型）は、Candida kruseiとして知られている。K. marxianus及びC. sonorensisの適切な株はWO 00/71738 Al、WO 02/42471 A2、WO 03/049525 A2、WO 03/102152 A2及びWO 03/102201A2に記載された株を含む。I. orientalisの適切な株は、ATCC株32196及びATCC株PTA-6648である。
【００２１】
代謝経路の"欠失又は破壊"は、経路が完全に作動不能になる、又はその活性が、野生型細胞と比較して、少なくとも７５％、好ましくは９０％減少することを意味する。経路の活性は、産生された活性な酵素量の減少により、又は産生された酵素の活性の減少により、又は両者のあるコンビネーションにより減少してもよい。遺伝子の"欠失又は破壊"によって、遺伝子の全コード領域が除去（欠失）される、又は遺伝子のコード領域、そのプロモーター、及び／又はそのターミネーター領域が改変され（欠失、挿入又は突然変異）その結果遺伝子が活性な酵素を産生せず又は遺伝子が活性酵素量を非常に減少して（少なくとも７５％減少、好ましくは９０％減少）産生する又は遺伝子が非常に活性が減少した酵素（少なくとも７５％減少、好ましくは９０％減少）を産生することを意味する。
【００２２】
多くの場合、ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊は、少なくとも１個のGPD遺伝子、又は少なくとも１個のGPP遺伝子、又は両者の欠失又は破壊を含むであろう。ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼに基づく変更した代謝経路を持つ、S. pombeの様な細胞において、ネイティブ代謝経路の欠失又は破壊は、通常ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ遺伝子、又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子又は両者の欠失又は破壊を含むであろう。両経路を有する細胞において、両経路の欠失又は破壊は可能である。
【００２３】
本明細書において、用語"グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子"及び"GPD遺伝子"は、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を持つタンパク質をコードする全ての遺伝子及び／又は（ｂ）配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６又は配列番号７と同一なアミノ酸配列のいずれかに、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、またより好ましくは少なくとも６５％同一である酵素をコードする全ての染色体ＤＮＡ配列を表わすために用いられる。"グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性"は、DHAPをグリセロール−３−リン酸に変える反応を触媒するタンパク質の能力を表す。本発明の目的のために、ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はタンパク質のアミノ酸配列のパーセント同一性を、デフォルトのパラメータによるBLAST（NCBI Basic Local Alignment Search Tool）バージョン2.2.1ソフトウェアーを用いて都合よく計算できる。デフォルトパラメーターによるBLASTバージョン2.2.13アルゴリズムを用いて少なくともＸＸ％の同一性スコアを持つ配列は、少なくともＸＸ％同一であると考えられる。BLASTソフトウェアーはNational Center for Biological Information, Bethesda, Marylandより入手可能である。
【００２４】
同様に、本明細書において"グリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子"及び"ＧＰＰ遺伝子"は、（ａ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を持つタンパク質をコードする全ての遺伝子及び／又は（ｂ）配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，又は配列番号１２と同一なアミノ酸配列のいずれかに、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、またより好ましくは少なくとも６５％同一であるタンパク質をコードする全ての染色体ＤＮＡ配列を表わすために用いられる。"グリセロール−３−ホスファターゼ活性"は、グリセロール−３−リン酸を脱リン酸化してグリセロール生成を触媒するタンパク質の能力を表す。
【００２５】
本明細書において、用語"ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ"遺伝子は、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする全ての遺伝子を表すために用いられる。本明細書において"グリセロールデヒドロゲナーゼ"遺伝子は、（ａ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を持つタンパク質をコードする全ての遺伝子、及び／又は（ｂ）配列番号１３と同一なアミノ酸配列に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、またより好ましくは少なくとも６５％同一であるタンパク質をコードする全ての染色体ＤＮＡ配列を表わすために用いられる。"ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ活性は、ジヒドロキシアセトンリン酸をジヒドロキシアセトンに変える反応を触媒するタンパク質の能力を表す。"グリセロールデヒドロゲナーゼ活性"は、ジヒドロキシアセトンをグリセロールへの還元反応を触媒するタンパク質の能力を表す。
前記いずれかの遺伝子の欠失又は破壊は、強制的進化、突然変異誘発、又は遺伝子工学法により為し遂げることができて、その後の適切な選択又はスクリーニングにより変異体を同定することができる。
【００２６】
突然変異誘発法において、細胞の高い致死率（６０〜９９．９％、好ましくは９０〜９９．９％）を得るに十分な条件下で、細胞を、紫外線又は突然変異誘発物質に暴露する。次に、生存細胞をプレートに蒔種して、欠失又は破壊された代謝活性を持つ細胞を選択又はスクリーニングする。所望の変異を有する細胞を、弱められたグリセロール産生力をベースにスクリーニングすることができる。前記いずれかの遺伝子の破壊又は欠失は、PCR又はSouthern解析法により確認することができる。
グリセロールへの代謝経路を欠失又は破壊する遺伝子工学は、適切な欠失構築物の設計及び構築、また宿主細胞のこれらの構築物による形質変換を経る１又は２以上の手順を用いて通常為し遂げられる。本明細書において、用語"構築物"は、細胞を形質転換するために使われるＤＮＡ配列を表すために用いられる。この構築物は、例えば、円形のプラスミド又はベクターの形で、線型のプラスミド又はベクターの形であってもよく、又は円形プラスミド又はベクターの一部（プラスミド又はベクターを１又は２以上の制限酵素で消化して得られるような）であってもよく、又はプラスミド又はベクターを鋳型とするPCR産物であってもよい。成功した形質転換体を同定するために、選択又はスクリーニングを続ける。電気穿孔及び／又は化学的（塩化カルシウム−、又は酢酸リチウム−ベースの）形質転換法を用いることができる。
【００２７】
以下の欠失構築物の考察は、同様に、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の何れかの欠失又は破壊に同様に適用できる。
欠失構築物は、標的遺伝子及び／又はその上流（５'）又は下流（３'）隣接領域の２つのＤＮＡ配列を最初にクローニングすることにより都合よく組み立てられる。この配列は、好ましくは、不連続であるが、もし他の遺伝子材料（例えば、選択マーカーカセット）が構築物上のこの配列間に挿入されるならば、連続でもよい。この文脈において"不連続"は、野生型ゲノム内でＤＮＡ配列が互いに直接隣り合っておらず、野生型ゲノム内で、この遺伝子を欠失又は破壊するために、欠失されるべき領域によって互いに分けられていることを意味する。"連続した"配列は、野生型ゲノム内で互いに直接隣り合っている。これらの配列の１方は、標的遺伝子のプロモーターに対して５'領域プロモーター領域の全て又は一部、標的遺伝子コード領域の全て又は一部、又はこれらのいくつかの組合せを含んでもよい。他方の配列は標的遺伝子のターミネーターに対して３'領域、ターミネーター領域の全て又は一部、及び／又は標的遺伝子コード領域の全て又は一部を含むかもしれない。次に、欠失構築物は、宿主細胞の染色体上にネイティブに表れるように、互いに、同一方向に配向した２個の配列を含むように作成される。以下においてより詳細に記載するように、形質転換体の選択を可能にするために、一般的に、選択マーカーはこの２個の配列の間にクローンニングされる。宿主細胞を形質変換するために、この構築物を用いる。電気穿孔及び／又は化学的（塩化カルシウム−、又は酢酸リチウム−ベースの）形質転換法を用いることができる。
【００２８】
成功した形質転換体において、標的遺伝子の座位における相同的再結合事象により、結果として機能性遺伝子の破壊又は欠失が起こる。ネイティブ標的遺伝子、そのプロモーター、及び／又はターミネーターの全て又は一部が、この再結合事象の間に欠失される。もし欠失構築物が、標的座位から取り出された２個の配列の間に遺伝子材料を含むならば（選択マーカーカセット又は構造遺伝子カセットのような）、この遺伝子材料は、宿主ゲノムの欠失した材料の座位に挿入される。PCR又はSouthern解析により、希望した欠失が生じたことを確認することができる。
【００２９】
欠失構築物がまた機能性の選択マーカーカセットを含むことが通常望ましい。単一欠失構築物を用いた場合、マーカーカセットは、標的座位から５'配列のベクター下流（即ち、３'方向に）及び標的座位から３'配列の上流（即ち５'方向に）存在する。成功した形質転換体は、選択マーカーカセットを含むが、これにより、成功した形質転換細胞には、選択のためのベースを提供するいくつかの特性が与えられる。ある"選択マーカー遺伝子"は、選択培地において、形質転換細胞の生存及び／又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。一般的な選択マーカー遺伝子は、以下のタンパク質をコードする：即ち（ａ）抗生物質又は他の毒素（例えば、ゼオシン（Streptoalloteichus hindustanus bleブレオマイシン抵抗性遺伝子のような）、G418（Tn903のカナマイシン抵抗性遺伝子）又はヒグロマイシン（E. coliからのアミノグリコシド抗生物質抵抗性遺伝子）に抵抗性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損（例えば、アミノ酸ロイシン欠損(K. marxianus LEU2遺伝子)又はウラシル欠損（例えば、K. marxianus又はS. cerevisiae URA3遺伝子）を相補する；（ｃ）細胞が、単純な培地からは取得できない重要な栄養素を合成することを可能にする、又は（ｄ）特定の炭素源で細胞が増殖する能力を与える（アルファガラクトシダーゼ（メリビアーゼ）酵素をコードし、また唯一の炭素源としてメリビオース上での増殖能を与えるS. cerevisiaeのMEL5遺伝子のような）タンパク質である。好ましい選択マーカーとしては、ゼオシン抵抗性遺伝子、G418抵抗性遺伝子、MEL5遺伝子及びヒグロマイシン抵抗性遺伝子が挙げられる。他の好ましい選択マーカーは、もし宿主細胞がネイティブにこのような遺伝子を持たない、又はそのネイティブCYB2遺伝子が最初に欠失し又は破壊されているならば、Ｌ−ラクタート：フェリチトクロームｃオキシドリダクターゼ（CYB2）遺伝子カセットである。
【００３０】
さらに、選択マーカーカセットは、作動的に選択マーカー遺伝子に連結され、また宿主細胞により作動可能な、プロモーター及びターミネーター配列を含むであろう。適切なタイプのプロモーターは、酵母遺伝子に対してネイティブなプロモーターに対して、少なくとも、５０％、７０％、９０％、９５％、又は９９％同一である。より適切なタイプのプロモーターは、宿主細胞にネイティブな遺伝子のプロモーターに対して、少なくとも、５０％、７０％、９０％、９５％、又は９９％同一である。特に有用なプロモーターとしては、特に宿主細胞の各遺伝子由来の、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC1），ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK），キシロースリダクターゼ'（XR），キシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH），L-(+)-乳酸チトクロームｃオキシドリダクターゼ（CYB2）、飜訳伸長因子−１（TEF1），及び飜訳伸長因子−２（TEF2）遺伝子がある。特に有用なプロモーターとしては、宿主細胞にとってネイティブであるPDCl、PGK、TEFl又はTEF2遺伝子に対するプロモーターの機能性部分、又はそのようなPDCl、PGK、TEFl又はTEF2プロモーターに対して少なくとも８０％，８５％，９０％又は９５％同一な配列である。
【００３１】
ある適切なタイプのターミネーターは酵母細胞に対してネイティブである遺伝子のターミネーターに少なくとも５０％，７０％，９０％，９５％又は９９％同一である。ターミネーターは宿主細胞に対してネイティブである遺伝子のターミネーターに少なくとも５０％，７０％，９０％，９５％又は９９％同一であってもよい。特に有用なターミネーターとしては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC1），キシロースリダクターゼ（XR），キシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH），Ｌ−乳酸：フェリチトクロームｃオキシドリダクターゼ（CYB2）又はイソ−２−チトクロームｃ（CYC）遺伝子に対するターミネーター、又は酵母内のガラクトースファミリー遺伝子由来のターミネーター、特にいわゆるGAL10ターミネーターである。特に好ましいターミネーターとしては、宿主細胞にとってネイティブなGAL10遺伝子に対するターミネーターの機能性部分、又はその様なターミネーターに対して少なくとも８０，８５，９０又は９５％同一な配列である。
【００３２】
欠失構築物を、選択マーカーカセットが、引き続く相同組換え事象の結果として自発的に欠失できるように設計してよい。これを為し遂げる便利な方法は、構造遺伝子カセットが直列反復配列に隣接するようにベクターを設計することである。直列反復配列は、同一のＤＮＡ配列であり、宿主細胞に対してネイティブでもネイティブでなくともよく、また構築物上でお互いに同一方向に向いている。直列反復配列は、約５０〜１５００ｂｐ長が有利である。直列反復配列が何かをコードしている必要はない。この構築物は、相同組換えが起こることを可能にする。この事象は、低頻度で生じ、選択マーカー遺伝子及び直列反復配列の１つを欠失した細胞をもたらす。形質転換体を数世代非選択培地で増殖させ、いくつかの細胞内で自発的な相同組換えが生ずることを許す必要がある。選択マーカー遺伝子により与えられた、選択特性の喪失をベースにして、選択マーカー遺伝子が自発的に欠失した細胞の選択又はスクリーニングが可能となる。
【００３３】
５'隣接領域の下流及び３'隣接領域の上流に再び位置するが、好ましくは、存在する如何なる選択マーカーカセット内部にも位置しない構造遺伝子カセットを、標的遺伝子欠失構築物は含んでもよい。その様な構築物は、標的遺伝子及び構造遺伝子の挿入物を同時に欠失することを可能にする。"構造遺伝子"により、上記の標的遺伝子又は選択マーカー遺伝子以外の、タンパク質をコードする全ての遺伝子を意味する。広く様々な構造遺伝子を用いることができるが、本発明に対して特に興味のある遺伝子は、細胞に有機酸産生を与える遺伝子、又はペントース糖のような特別な炭素源を消費する能力を細胞に与える遺伝子である。
【００３４】
選択マーカーを用いる場合、形質転換は単一欠失構築物の代わりに一対の欠失構築物を用いて行うことができる。この一対の欠失構築物の一方は、標的遺伝子の座位からの第１配列及びマーカー遺伝子カセットの非機能性部分を含むであろう。この一対の欠失構築物の他方は、標的遺伝子座位からの第２の配列及びマーカー遺伝子カセットの他の非機能性部分を含むであろう。このマーカー遺伝子カセットの２つの部分は、２つの部分が一緒になって完全なカセットを形成するように、選択される。マーカー遺伝子カセットの２部分の各々の末端は、共通の配列を共有する、即ちカセットの一部は、２部分の各々の末端で重複する。これらによって形質転換した細胞は、同時に所望の欠失又は破壊を行い、完全な、機能性マーカー又は構造遺伝子カセットを作成する。細胞の一部は、標的座位において、両欠失構築物を相同的に組み込み、及びさらなる相同組換え事象を行い、２つの非機能性断片から機能性の選択遺伝子カセットを再構成する。成功した形質転換体は、選択マーカーにより与えられた特性をベースに選択できる。
【００３５】
細胞のネイティブ代謝経路がジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール−３−リン酸を経由するグリセロールへの経路を含む（GPD及びGPPにより）場合、GPD遺伝子（単数又は複数）又はGPP遺伝子（単数又は複数）のいずれかが欠失し又は破壊されてもよいし、GPD及びGPP遺伝子の両者が欠失していてもよい。このような場合、GPD及びGPP遺伝子の両者の欠失又は破壊は、同時に又はどちらかの順で順次に行われてもよい。もし細胞が多重GPD又はGPP遺伝子又はそれらの遺伝子の多重対立遺伝子を有する場合、細胞内で機能性であるこれら全ての遺伝子の欠失が好ましい。
細胞のネイティブ代謝経路がジヒドロキシアセトンリン酸からジヒドロキシアセトンを経由するグリセロールへの経路を含む（ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼにより）場合、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一方が欠失し又は破壊されてもよいし、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両者が欠失し又は破壊されてもよい。これは同時に又は順次に起こってもよい。順次の場合いずれかの順に行われる。前記のように、このような遺伝子の機能性多重コピー又は多重対立遺伝子は全て欠失されることが好ましい。
【００３６】
本発明のある態様において、細胞は所望の有機酸（又はその塩）を産生することができる。この能力は、少なくとも１セットの発酵条件下で培養された場合、炭素源から所望の有機酸へ重量当たり、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％変換する能力により表される。このような酸を産生するネイティブ能力を持つ酵母細胞は殆ど無いので、本発明の細胞は、多くの場合、酸を産生できる少なくとも１個の機能性、外因性遺伝子を含む。
特に興味ある細胞は、乳酸又はその塩を意味するラクタートを産生する。この場合、本発明の細胞は、ゲノムに組み込まれた、少なくとも１個の機能性外因性乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）遺伝子を含む。LDH遺伝子は、機能性乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコード化した遺伝子である。機能性LDH酵素は、ピルビン酸塩からラクタートへの還元反応を触媒する酵素である。LDH遺伝子は、それぞれから細胞がL-又はD-乳酸エナンチオマー（対掌体、又はその塩））を産生する、L-LDH又はD-LDH、の何れかの産生に対して特異的である。本発明の改変した細胞は、L-及びD-LDH遺伝子の両者を含むことは可能である、従って、この細胞は両者の乳酸エナンチオマーを産生することができる。しかしながら、L-又はD-LDH遺伝子のみが存在して、細胞がより光学的に純粋な乳酸産物を産生することが好ましい。
【００３７】
適切なLDH遺伝子としては、細菌、菌類、酵母又は哺乳動物源から得たものがある。特定のL-LDH遺伝子の例は、L. helveticus、L. casei、B. megaterium、P. acidilactici及びウシ源から得たものである。特定のD-LDH遺伝子の例としては、L. helveticus、L. johnsonii、L. bulgaricus、L. delbrueckii、L. plantarum,及びL. pentosusから得たものである。これらのL-LDH又はD-LDH遺伝子のいずれかに対して同一又は少なくとも８０％同一な機能性遺伝子が適切である。これらの供給源のいずれかから得られるネイティブな遺伝子は、通常の真核生物開始コドン（ATG）で開始するコード配列を提供するために、又は他の目的のために、必要ならば突然変異を施してもよい。好ましいL-LDH遺伝子は、L. helveticusから得た遺伝子又は、このような遺伝子に対して、少なくとも８０％，８５％，９０％又は９５％同一な遺伝子である。他の好ましいL-LDH遺伝子は、B. megateriumから得た遺伝子又は、このような遺伝子に対して、少なくとも８０％，８５％，９０％又は９５％同一な遺伝子である。好ましい、D-LDH遺伝子は、L. helveticusから得た遺伝子又は、このような遺伝子に対して、少なくとも８０％，８５％，９０％又は９５％同一な遺伝子である。
特に適したLDH遺伝子としては、WO 03/049525の配列番号４５に少なくとも６０％、特に少なくとも８０％、８５％又は９５％同一な、又はWO 03/049525の配列番号４９と比較される、アミノ酸配列を持つ酵素をコード化する遺伝子がある。特に適したLDH遺伝子としてはまた、WO 03/049525の配列番号４６又は５０に少なくとも６０％、８０％、８５％又は９５％同一な、タンパク質配列を持つ酵素をコード化する遺伝子がある。
【００３８】
形質転換細胞は、単一LDH遺伝子又は１から１０個のLDH遺伝子、特に１から５個のLDH遺伝子の様な、複数のLDH遺伝子を持ってもよい。形質転換細胞が、複数のLDH遺伝子を持つ場合、個々の遺伝子は、同一遺伝子のコピーであってもよい、又は２又は３個以上の異なるLDH遺伝子のコピーを含んでもよい。外因性LDH遺伝子の複数のコピーは、単一座位（従ってこれら遺伝子は互いに隣接する）又は、宿主細胞ゲノム内のいくつかの座位に組み込まれてもよい。 
外因性LDH遺伝子は、１又は２以上のプロモーター及び１又は２以上のターミネーターの転写制御下にあり、これら両者は、改変した酵母細胞内で機能を有する。適切なプロモーター及び、ターミネーターは、選択マーカー遺伝子カセットに関して以前に記載した、及び、WO 99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152及びWO 03/049525にもまた記載した。特に有用なプロモーターは、宿主細胞のPDCl、PGK、TEFl、又はTEF2遺伝子に対するプロモーターの機能性部分を含み、又はこのようなプロモーターに少なくとも８０％，８５％，９０％又は９５％同一である。特に好ましいターミネーターは、宿主細胞のPDC1遺伝子に対するターミネーターの機能性部分を含み、又はこれらに対して少なくとも８０％，８５％，９０％又は９５％同一である。
【００３９】
複数の外因性LDH遺伝子が宿主細胞に導入されると、それぞれのLDH遺伝子は、異なるタイプのプロモーター及び／又はターミネーターの制御の下にあることが可能である。
外因性LDH遺伝子は、宿主細胞のゲノム中にランダムに組み込まれる、又は１又は２以上の標的となる位置に組み込まれる。標的位置の例としては、PDC1遺伝子、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、グリセロール−３−ホスファターゼ遺伝子、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ遺伝子又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のような、意図的に欠失又は破壊した遺伝子の座位がある。外因性LDH遺伝子カセットは、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失又は破壊のための構築物上に存在してもよい、またこのようにして、同時に欠失又は破壊を備えた遺伝子の座位に挿入されたものでもよい。
酵母細胞を形質転換して、外因性LDH遺伝子カセットを導入するための方法は、WO 99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152及びWO 03/049525に記載されている。いくつかの方法は、本発明に適用できる。
【００４０】
この細胞は、また改変を受けて、１又は２以上の有機酸を産出できるようになる。例えば、この細胞を、機能性ベーターアラニン／ピルビン酸、アミノトランスフェラーゼ酵素、をコードする外因性遺伝子カセットで形質転換をしてもよい、従ってこの細胞は、３−ヒドロキシプロピオン酸を産生できる。これを遂行するための方法は、WO 2005/118719に記載されている。
本発明の遺伝的に改変した酵母細胞は、細胞に１又は２以上の所望の特性を与える付加的な遺伝的改変を含んでもよい。
【００４１】
いくつかの実施態様において特に興味のある付加的改変としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（単数又は複数）の欠失又は破壊である。これにより、細胞のエタノール生産能が低下し、このことは、所望の産物が乳酸のような有機酸である場合特に望ましい。もし宿主細胞が、複数のPDC遺伝子を有するならば、全てのPDC遺伝子より少ない遺伝子の欠失も可能であるが、全てのPDC遺伝子を欠失又は破壊することが特に好ましい。PDC欠失は、WO 99/14335、WO 02/42471、WO 03/049525、WO 03/102152及びWO 03/102201に記載されたものと類似の方法を用いて行うことができる。PDC欠失は、また、LDH遺伝子カセット、又は他の構造的又は選択マーカー遺伝子カセットの同時の挿入により行うことができる。特に興味ある方法において、（１）PDC遺伝子（単数又は複数）の座位からの非連続配列がクローンニングされる、（２）非連続配列を含む構築物が作られる、及び（３）宿主細胞がこの構築物により形質転換される。相同組換え事象により、形質転換体の一部において機能性PDC遺伝子の欠失又は破壊が生ずる。これは、必要ならば、複数のPDC遺伝子又は対立遺伝子を欠失又は破壊するために繰り返すことができる。I. orientalisの様な、いくつかの酵母種において、非常に相同的な複数のPDC遺伝子又は対立遺伝子が存在する。少なくともいくつかのこのような例において、遺伝子又は対立遺伝子のどちらかの座位から取った非連続配列を、両方のPDC遺伝子又は対立遺伝子を欠失又は破壊するために構築物の中で用いることができる。PDC遺伝子（単数又は複数）を破壊するために用いられる構築物は、ネイティブなPDC遺伝子の５'隣接部分の下流、及びネイティブPDC遺伝子の３'隣接部分の上流に挿入された、１又は２以上の機能性マーカー又は構造遺伝子カセットを含んでもよい。この方法により、単一の形質転換手順で、PDC遺伝子の欠失、及び機能性遺伝子カセットの挿入が可能となる。
【００４２】
特に興味のある他の付加的な改変は、個別に又は集団的に、細胞がペントース糖を所望の発酵産物に発酵する能力を与える１（又は２以上の）改変である。後者のタイプの改変としては、（１）機能性キシロースイソメラーゼ遺伝子の挿入、（２）キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産生するネイティブ遺伝子の欠失又は破壊、（３）機能性キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失又は破壊及び／又は（４）細胞に機能性キシルロキナーゼを過剰発現させる改変である。酵母細胞に、これらの改変を導入する方法は、本明細書の参考文献に取り込まれている、WO 04/099381において記載されている。機能性キシロースイソメラーゼ遺伝子を挿入する適切な方法、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産生するネイティブ遺伝子を欠失又は破壊する適切な方法、細胞が機能性キシルロキナーゼを過剰発現するよう改変する機能性キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失又は破壊する適切な方法は、例えば、本明細書の参考文献に取り込まれているWO 04/099381に記載されている。
本発明のラクタート産生細胞において特に興味ある他の付加的な改変としては、少なくとも１個のL-又はD-ラクタート：フェリチトクロムｃオキシドリダクターゼ遺伝子の欠失又は破壊である。
【００４３】
一般的に、本発明の細胞は、グリセロール合成能の低下により特徴付けられる。細胞のグリセロール生産能を評価するための有用な方法は、細胞を前述の標準的ミクロ好気的条件下で培養することによる。培養開始時に５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類及び１５０ｇ／Ｌグルコースを含む規定された発酵培地溶液が使われる。培養開始時にｐＨ３．５に合わせる。培養時にｐＨは自由に変動してもよいが、ｐＨを３．０以下に落とす、又は７．０以上に上昇させることを防ぐために必要ならば、培地に緩衝効果を持たせる。発酵培地には、評価の主題である酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるように蒔種する。培養温度は、３０℃である。グルコース濃度が５ｇ／Ｌに減少するまで培養を続けるが、１２０時間以上は続けない。培養中、空気混入及び攪拌条件は、酸素取り込み速度が５．０±１．０mmol/L/hrになるまで続けた。これらの標準的条件下で、本発明の細胞は、一般的に２．０ｇ／Ｌ以上のグリセロールを産生しない。より一般的に、これらの条件下で、細胞は０．６ｇ／Ｌ以上のグリセロールを、多くの場合は、０．２ｇ／Ｌ以上のグリセロールを産生しない。またこれらの標準的ミクロ好気的条件下で、好ましい細胞は、少なくとも１０ｇ／Ｌの、エタノール、又はラクタートのような有機酸のように、少なくとも１種類の希望する発酵産物を産生する。より好ましい細胞は、これらの条件下で、少なくとも４０ｇ／Ｌ，また特に少なくとも５０ｇ／Ｌの所望の発酵産物を産生する。
【００４４】
１又は２種類以上の所望の発酵産物を産生するために、本発明の細胞を、上記の標準的ミクロ好気的条件下、又は何らかの他の有用な発酵条件のセットの下で培養できる。エタノールは、多くの酵母種が自然に産生する発酵産物の例である。上記考察のように、細胞は改変され、ラクタート又は３−ヒドロキシプロピオン酸のような有機酸を含む、他の有用な発酵産物を産生できるようになる。これらの細胞は、同様に、他の酸、又は酸でない他の産物を含む、他の発酵産物を産生するように改変してもよい。
【００４５】
本発明の発酵過程において、本発明の細胞を、形質転換細胞により発酵可能な炭素源を含む発酵培地中で培養する。炭素源は、グルコース又はオリゴマー又はグリカン、マルトース、マルトトリオース又はイソマルトトリオースのような他のグルコースポリマーのようなヘキソース糖でもよい。炭素源は、パノース；フラクトース；フラクトース及びそれらのオリゴマー；及びポリマーが例である他のヘキソース糖でもよい。もし細胞が、ペントース糖の発酵能を、ネイティブに持つ、又は改変して持つようになるならば、炭素源はキシロース、又はキシロースオリゴマー又はキシランのようなポリマーのようなペントース糖を含んでもよい。このようなペントースは、適切に、ヘミセルロースを含有するバイオマスの加水分解物である。オリゴマー糖の場合、オリゴマー糖を消化して細胞による発酵のために対応する単量体糖まで消化するために、発酵培地に酵素を加える必要がある。
【００４６】
一般的に培地は、（アミノ酸、タンパク質、アンモニア又はアンモニア塩等のような、無機窒素源等のような）窒素源及びビタミン類、無機物等を含む特定の細胞に要求される、栄養素を含む。いわゆる"複雑な"培地、又はいわゆる"規定された"培地を用いることができる。
温度、細胞密度、基質（単数又は複数）の選択、栄養素の選択等のような他の発酵条件は、本発明にとって重要ではなく、また一般的に処理を経済的に行うために選択される。増殖期及び産生期の各期間の温度は、酵母株が高温に何処まで耐えられるかにある程度依存するが、培地の凍結温度から約５０℃の範囲である。特に産生期において、好ましい温度は、約３０〜４５℃である。
産生期の間、発酵培地中の細胞濃度は、０．１から２０乾燥細胞／Ｌ発酵培地の間、好ましくは０．１から５乾燥細胞／Ｌ発酵培地の間、より好ましくは１から３ｇ乾燥細胞／Ｌ発酵培地である。発酵は、好気的に、ミクロ好気的に、又は嫌気的に行われる。もし望むならば、WO 03/102200に記載されているように、酸素取り込み速度をプロセス制御に用いることができる。本発明の細胞は、酸素取り込み速度が４から１２，特に５から１０mmol/L/hrにより特徴付けられるミクロ好気的条件下で培養する時、特によい成果を発揮することができる。
【００４７】
細胞がラクタートなどの有機酸を産生するような好ましい場合、培地は、発酵の産生期の間緩衝作用を持ってもよく、その結果ｐＨは約３．５から約９．０の範囲、又は約４．５から約７．０の間に維持される。適切な緩衝試薬は、酸が産生されるに従い中和する塩基性材料であり、また例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム等を含む。従来の発酵過程で用いられるこれらの緩衝試薬を、ここでも同様に用いることができる。
緩衝効果を伴う発酵において、酸の発酵産物は中和され、生成した相当する塩になる。従って、酸の回収は自由酸の再生を伴う。一般的に、これは細胞を取り除き、硫酸のような強酸で酸性にすることにより行われる。塩副産物が形成され（カルシウム塩が中和試薬であり、また硫酸が酸性化試薬である場合塩副産物はセッコウ）、これは、培地から分離される。その後、酸は培地から、T.B. Vickroy, Comprehensive Biotechnology, (M. Moo-Young編), Vol. 3, 38章, Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta,他, FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231; U.S. Patent Nos. 4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406、及び5,831,122,及びWO 93/00440に記載されたように、液−液抽出、蒸溜、吸着等々の技術により回収される。
【００４８】
もう一つの方法として、発酵培地のｐＨは、培養の間、一般的には５．５又はそれ以上の、酸産物のｐＫａ以上で、酸発酵産物のｐＫａ値まで、又は以下；即ち約１．５から約３．５の間の範囲、約１．５から約３．０の間の範囲、又は約１．５から約２．５の間の範囲の開始ｐＨからの低下は許容されてもよい。
また、発酵過程の開始前又は開始時に、発酵培地のｐＨを酸産物のｐＫａと等しい又はそれ以下に合わせることにより酸産物を産生するための発酵を行うことは可能である。従って、培養を通してｐＨは、産物のｐＫａに等しい、又は以下に保たれる、又は発酵が進むに従い、酸のｐＫａ以上まで増加することは許されてもよい。前者の場合、ｐＨは好ましくは、約１．５から約３．５の間の範囲；約１．５から約３．２の間の範囲；又は約２．０から約３．０の間の範囲に保たれる。
【００４９】
本発明の細胞は、多くの発酵条件下で、グリセロール産生能をはっきり減少させた。細胞のグリセロール産生能の減少は低グリセロール収量により表される。本発明の細胞は、一般的に、消費した炭素源の２重量％より少なくグリセロールに代謝する。大部分の場合、グリセロール収量は、培養で消費される炭素源の重量に基づき、１％以下又は０．１％以下でさえある。好ましくは、細胞は、所望の発酵産物に消費する炭素源の、例えば少なくとも５０，６０，７０、８０又は８５％の様に、少なくとも４０％を代謝する。
本発明の細胞が発酵条件下で高い増殖能を示すことを見出した。細胞は、様々な用途にグリセロールを使うのでこれは驚くべきことであり、また野生型の酵母細胞において、グリセロールの役割は、NADH/NAD+をバランスさせる働きがあると信じられてきた。細胞自体のためのグリセロール産生量の低下を補うために、グリセロールを発酵培地中に加える事は、本発明の範囲内である。しかしながら、申請者等は、少なくともいくつかの発酵過程において、このようなことをしても少しも利益がなかったことを見出した。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供するものであり、この発明範囲を制限付けるものではない。全ての割合及びパーセンテージは特に指示されなければ重量による。
実施例１Ａ：K. marxianus CD607株の突然変異誘発及びグリコール酸耐性の変異株（CD853）の選択。
K. marxianus CD607株はWO 03/102152の実施例３Ｄに記載されている。この株には、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の欠失があり、またその座位に外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の挿入がある。CD607株の細胞を、紫外線に暴露して、突然変異誘起させた。
新しいＹＰ（酵母抽出物プラスペプトン）＋２０ｇ／Ｌグルコースプレートからの細胞を、２ｍＬの酵母ペプトン＋５０ｇ／Ｌグルコースに約６ＯＤ６００単位を再懸濁した。１０個のこの懸濁液の各１２５μＬ分量を１０個の３００μＬ９６穴マイクロタイタープレートのウェルにピペットして加える。９０〜９９％の細胞を殺すために、このマイクロタイタープレートを１２，５００μJoule/cm２紫外線に対して暴露する。その後、細胞を選択培地にプレートする前に、このマイクロタイタープレートを暗黒中で、一晩、３０℃で、攪拌（２２５ｒｐｍ）し、細胞を回復させる。
その後、１００μＬのＵＶ処理細胞懸濁液をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）＋１５ｇ／Ｌグリコール酸プレートに蒔種し、グリコール酸耐性株を選択する。これらのプレートを、コロニーが表れるまで、３０℃で、数日間インキュベートする。更なる解析のために単一コロニーを取り出す。
約２×１０８個の紫外線処理（突然変異誘発処理）した細胞を１５ｇ／Ｌグリコール酸を含むＰＤＡプレートに蒔種し、３０℃でインキュベートした。これらのプレート上で増殖したコロニーを３０℃、２２５ｒｐｍ振盪で一晩バッフル振盪フラスコ中及び緩衝剤なしのＹＰ（酵母ペプトン）＋１００ｇ／Ｌグルコース中で増殖させた。その後これらのフラスコから２ｇ／Ｌ乾燥細胞重量取り出して、産生用のフラスコに接種した。ＹＰ＋グルコース５０ｇ／Ｌの入った産生用フラスコを、３０℃、７０ｒｐｍ振盪で培養した。WO 03/102201の実施例１Ｍに記載した方法を用いて、グルコース、ラクタート、エタノール及びピルビン酸塩をHPLCで時間を決めて測定するためにサンプルを取り出した。８８時間後に２６ｇ／Ｌラクタートを産生する株をCD635株と表した。CD635株は、ラクタートを唯一の炭素源として増殖可能である。
【００５１】
CD635株の細胞に、上記のように付加的な突然変異誘発処理を行う。得られた突然変異誘発細胞から２５ｇ／Ｌグリコール酸を含むＰＤＡ上で増殖できるコロニーを選択した。グリコール酸に耐性なコロニーを、振盪フラスコ中、ＹＰ＋１００ｇ／Ｌグルコース中、３０℃、２５０ｒｐｍ振盪で一晩別々に増殖させた。遠心により菌体を集め、２ｇ／Ｌ乾燥細胞重量を５０ｍＬＹＰ＋５０ｇ／Ｌグルコースの入ったバッフル振盪フラスコに接種した。フラスコを約９２時間、３０℃、２５０ｒｐｍ振盪で培養した。親株であるCD607及びCD635と比較して、顕著に高濃度の最終ラクタートを産生する突然変異体をCD853株と表わす。
CD853株はラクタートを唯一の炭素源として増殖できないので、ネイティブなL-乳酸：フェリチトクロムｃオキシドリダクターゼ遺伝子(KmCYB2)がこの突然変異体では、非機能的になっていると示唆される。従って、フィデリティの高いFailSafe酵素及び鋳型としてゲノムＤＮＡを用いたPCRにより、KmCYB2コード領域プラスKmCYB2コード領域から〜５００ｂｐ上流及び下流をこの株から増幅する。得られた〜２．７５ｋｂｐPCR産物をＱｉａｇｅｎカラムにより精製して、全KmCYB2コード領域について配列決定した。CD853株は、KmCYB2遺伝子の６２番目アミノ酸位置で４塩基の挿入が発見され、これがフレームシフト変異を起こし、７６番目アミノ酸位置で停止コドン及び切り取られたタンパク質をもたらす。
【００５２】
実施例１Ｂ：GPD1F欠失ベクターpBH158（図１）及びpBH159（図２）の構築。
pVR29（WO 03/102152の実施例１Ｃ及び図４に記載）と表されるプラスミドは、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター及びGAL10ターミネーターの制御下のTn903のカナマイシン抵抗性遺伝子（G418遺伝子）を含む。プラスミドpVR29を、MluI及びPstIで消化し、得られたG419遺伝子カセットを含む５．１ｋｂｐ断片をゲルにより精製して、脱リン酸化する。K. marxianus GPD(KmGPD1F)遺伝子の上流の１．２ｋｂｐ領域ＤＮＡを、配列番号１４及び配列番号１５をプライマーとして、K. marxianusゲノムＤＮＡを鋳型として、PCR増幅する。PCR産物をゲルにより精製し、MluI及びPstIで消化し、pVR29プラスミド由来の５．１ｋｂｐ断片と連結し、pBH158（図１）と名付けるプラスミドを作成する。プラスミドpBH158は、転写順に、KmGPD1F遺伝子の隣接１．２ｋｂｐ上流及びＧ４１８発現カセットを含む。
第２の欠失ベクターのために、プラスミドpVR29をNgoMIV及びAatIIで消化し、G418発現カセットを含む４．７ｋｂｐ断片をゲルで精製し、脱リン酸化する。KmGPD1F遺伝子の下流０．７ｋｂｐ領域ＤＮＡを、配列番号１６及び配列番号１７と表されるプライマー及び、K. marxianusゲノムＤＮＡを再び鋳型としてPCRで増幅する。このPCR産物をゲルで精製し、NgoMIV及びAatIIで消化し、pVR29の４．７kbp断片に連結し、pBH159（図２）と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpBH159は、転写順に、Ｇ４１８発現カセット及びKmGPD1F遺伝子の隣接０．７ｋｂｐ下流を含む。
【００５３】
実施例１Ｃ：CD853株（実施例１Ａ）をプラスミドpBH158及びpBH159（実施例１Ｂ，図１及び２）で形質転換し、外因性LDH遺伝子、欠失したネイティブPDC遺伝子、破壊されたネイティブCYB2遺伝子、及び欠失したネイティブGPD1F遺伝子を持つ形質転換体（CD1606株）を作成
プラスミドpBH158をMluI及びHindIIIで消化する。これらの制限酵素は、プラスミドを切断し、KmGPD1F遺伝子の隣接上流１．２ｋｂｐ断片及びG418発現カセットの一部を含む、２．６ｋｂｐ断片を作る。この断片を、アガロースゲルから抽出する。プラスミドpBH159をXhoI及びNgoMIVで消化する。これらの制限酵素は、プラスミドを切断し、G418発現カセットの一部及びKmGPD1F遺伝子の隣接下流０．７ｋｂｐ断片を含む２．０ｋｂｐ断片を作る。この断片をアガロースゲルから抽出する。２個の抽出した断片は、断片の末端に幾らかの重複部分をもつ全G418発現カセットを含む。
CD853株を一晩、ＹＰ＋６０ｇ／Ｌグルコース＋０．２Ｍ  ＭＥＳ＋１％エタノール、ｐＨ  ６．５中で増殖させ、プラスミドpBH158からの２．６ｋｂｐ断片及びpBH159からの２．０ｋｂｐ断片を同時にエレクトロポレート（電気穿孔）させる。形質転換体を、３０℃、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコース＋３００μｇ／ｍＬG418プレート上に藩種し、その後２日間増殖させて、選択する。１５個の形質転換体を拾い上げ、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコース＋G418プレートに再ストリーク（筋状に再蒔種）して、一晩増殖させる。両断片で共形質転換し、また両断片がKmGPD1F座位に相同的に組み込まれた細胞だけがG418耐性であろう。
KmGPD1F遺伝子の欠失は、配列番号１８及び配列番号１９と表されるプライマーを用いたPCRにより証明される。７個の形質転換体は、PCRにより３．４ｋｂｐの単一バンドを示し、KmGPD1F遺伝子がこれらの形質転換体において、欠失されていることを示す。これらの形質転換体の１つは、CD1606株と表される。
【００５４】
実施例２Ａ：GPP遺伝子欠失ベクターpBH160（図３）及びpBH161（図４）の構築
プラスミドpVR29をMluI及びKpnIで消化し、得られたG418遺伝子カセットを含む５．１ｋｂｐ断片をゲルで精製し、脱リン酸化を行う。ネイティブGPP遺伝子（KmHOR2遺伝子）の直接上流０．９ｋｂｐ領域ＤＮＡを、配列番号２０及び配列番号２１と表わすプライマー及び、K. marxianusゲノムＤＮＡを鋳型としてPCR増幅を行う。このPCR産物をゲルで精製し、MluI及びKpnIで消化し、プラスミドpVR29からの５．１ｋｂｐ断片に連結し、pBH160（図３）と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpBH160は、転写順に、KmHOR2遺伝子の隣接上流０．９ｋｂｐ断片及び、G418発現カセットを含む。
プラスミドpVR29をNgoMIV及びSpeIで消化し、G418遺伝子カセットを含む４．７ｋｂｐ断片をゲルで精製し、脱リン酸化を行う。KmHOR2遺伝子の直接下流０．８ｋｂｐ領域ＤＮＡを、配列番号２２及び配列番号２３と表わすプライマー及び、K. marxianusゲノムＤＮＡを鋳型としてPCR増幅を行う。このPCR産物をゲルで精製し、NgoMIV及びSpeIで消化し、pVR29からの４．７ｋｂｐ断片に連結し、pBH16１（図４）と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpBH16１は、転写順に、KmHOR2遺伝子の隣接下流０．８ｋｂｐ断片及び、G418発現カセットを含む。
【００５５】
実施例２Ｂ：CD853株（実施例１Ａ）をプラスミドpBH160及びpBH161（実施例２Ａ，図３及び４）で形質転換し、外因性LDH遺伝子、欠失したネイティブPDC遺伝子、破壊されたネイティブCYB2遺伝子及び欠失したネイティブGPP遺伝子を有する形質転換体（CD1608）を作成。
プラスミドpBH160をMluI及びHindIIIで消化する。これらの制限酵素によるプラスミド切断により、K. marxianus GPP遺伝子（KmHOR2遺伝子）の隣接上流０．９ｋｂｐ領域ＤＮＡ及びG418発現カセットの一部を含む２．３ｋｂｐ断片が作成される。この断片をアガロースゲルから抽出する。プラスミドpBH161をXhoI及びNgoMIVで消化する。これらの制限酵素によるプラスミドの切断により、KmHOR2遺伝子の隣接上流０．８ｋｂｐ及びG418発現カセットの一部を含む２．０ｋｂｐ断片が作成される。この断片をアガロースゲルから抽出する。抽出したこの２個の断片は組みとなって、この断片の末端に幾らかの重複を持った全G418発現カセットを含む。
CD853株を一晩、ＹＰ＋６０ｇ／Ｌグルコース＋０．２Ｍ  ＭＥＳ＋１％エタノール、ｐＨ６．５中で増殖させ、プラスミドpBH160からの２．３ｋｂｐ断片及びプラスミドpBH161からの２．０ｋｂｐ断片を電気穿孔する。形質転換体をＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコース＋３００μｇ／ｍＬＧ４１８プレート上で、３０℃、２日間の増殖し、その後選択する。１５個の形質転換体をＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコース＋３００μｇ／ｍＬＧ４１８プレートに再ストリークし、一晩増殖させる。全ての形質転換体はこの培地で増殖する。両断片で共形質転換し、両断片がKmHOR2遺伝子座位に相同的に組み込まれた細胞のみが、G418耐性であろう。
KmHOR2遺伝子の欠失は、配列番号２０及び配列番号２１と表されるプライマーを用いたPCRにより証明される。３個の形質転換体は、３．８ｋｂｐの単一バンドを示し、KmHOR2遺伝子がこれらの形質転換体において、欠失されていることを示す。これらの形質転換体の１つは、CD1608株と表される。
【００５６】
実施例３：CD853（実施例１Ａ）、CD1606（実施例１Ｃ）及びCD1608（実施例２Ｂ）株のミクロ好気的バッチ菌株培養
CD853、CD1606及びCD1608株を個別にミクロ好気的条件下で培養する。CD1606及びCD1608株の場合、デュプリケート（一対の試料）の発酵を行う。夫々の場合、１段階バッチ培養反応容器を用いる。発酵培地は、規定された培地であり、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、及び硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類、発泡抑制剤、及び約９０ｇ／Ｌグルコースを含む。培地のｐＨは、水酸化カリウムを加えて、３．０に合わせる。培地を３０℃に設定し、１ｍＬの細胞を接種する。細胞を、３０℃で攪拌しながら、酸素取り込み速度５〜６mmol/L/hrになるような好気的条件で、培養する。酸素取り込み速度は、WO 03/102,200に記載された方法に従い測定する。
発酵培地の試料を定時的に取りだし、ラクタート、酢酸塩、グリセロール及びピルビン酸塩を検定する。二酸化炭素産生は、反応容器から排出した気体の二酸化炭素含量の測定により行う。
CD853株（本発明の実施例ではない）は、発酵の初期段階からラクタート滴定濃度が約２０ｇ／Ｌになるまで、０．８５g/L-hrの速度でラクタートを産生する。この時点までのラクタートの収量は、約７０％である。その後、乳酸産生は約０．７６g/L-hrまで低下し、またラクタート収量も僅かに低下する。この株による産生は、８６時間後に停止し、この時点で、発酵培地は１１ｇ／Ｌグルコースを含む。ラクタート滴定濃度は、５９ｇ／Ｌである。全体としてのラクタート産生速度は、０．６５g/L-hrであり、また全体としてのラクタート収量は７０％である。CD853株の場合のピルビン酸塩、酢酸塩、グリセロール及び二酸化炭素収量は、それぞれ、０．６％、０％、５．１％及び１４％である。バイオマス収量は、６．４％である。
【００５７】
CD1606株は初期の発酵段階から、ラクタート滴定濃度が約２０ｇ／Ｌになるまで、０．７７〜０．８４g/L-hrの速度で乳酸を産生する。この時点までの、ラクタート収量は、約７２〜８０％である。その後、乳酸産生は約０．３９〜０．４１g/L-hrまで低下し、またラクタート収量は僅かに低下する。この株による産生は１３７時間後に停止し、この時点で、発酵培地は、１４〜１９ｇ／Ｌグルコースを含む。ラクタート滴定濃度は、４３〜４５ｇ／Ｌである。全体としてのラクタート産生速度は、０．３２〜０．３４g/L-hrであり、全体としてのラクタート収量は、６０〜６３％である。CD1606株の場合のピルビン酸塩、酢酸塩、グリセロール及び二酸化炭素収量は、それぞれ、０．１％、０．５％、０％及び２６〜２９％である。バイオマス収量は、７．９％である。これらの結果より、ネイティブKmGPD1F遺伝子の欠失は、細胞のグリセロール産生能を妨害する。驚くべきことに、この遺伝子の欠失（及び結果としての、グリセロール産生の欠乏）は細胞増殖に殆ど又は全く影響を持たない。
CD1608株は初期の発酵段階から、ラクタート滴定濃度が約２０ｇ／Ｌになるまで、０．６６g/L-hrの速度で乳酸を産生する。この時点までの、ラクタート収量は、約７０〜７５％である。その後、乳酸産生は約０．３７g/L-hrまで低下し、またラクタート収量は僅かに低下する。この株による産生は１３７時間後に停止し、この時点で、発酵培地は、１９ｇ／Ｌグルコースを含む。ラクタート滴定濃度は、４２ｇ／Ｌである。全体としてのラクタート産生速度は、０．３１g/L-hrであり、全体としてのラクタート収量は、５９〜６０％である。CD1608株の場合のピルビン酸塩、酢酸塩、グリセロール及び二酸化炭素収量は、それぞれ、０〜０．１％、０．８％、０％及び２６〜２８％である。バイオマス収量は、７．９〜８．２％である。これらの結果より、ネイティブKmHOR2遺伝子の欠失は、また、細胞のグリセロール産生能を妨害する。再び、この遺伝子の欠失（及び結果としてのグリセロール産生の欠乏）は細胞増殖に全く影響を持たない。
【００５８】
実施例４Ａ：I. orientalisネイティブGPD1遺伝子、及びその隣接上流及び下流領域のクローニング。
いくつかの酵母種（S. cerevisiae、K. marxianus、Y. lipolytica、P. jadinii、D. hansenii及びC. glabrata）由来の既知のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をアライン（整列化）して、様々な遺伝子の間で高度に保存されている領域を同定する。２セットのディジェネレート（縮退した）プライマーを、高い相同性を有するこれらの領域から設計する。これらのセットは、それぞれ、配列番号２４，配列番号２５，及び配列番号２６及び配列番号２７と表わす。最初のセットのプライマー及びI. orientalisゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、PCRを行い、予想した〜２００ｂｐ産物を得る。２番目のセットのプライマー及び鋳型としてI. orientalisゲノムＤＮＡを用いて、再び、PCRを行い、予想通り〜４００ｂｐの産物を得る。２つのPCR産物をゲルで精製して、同一プライマーを用いて配列決定を行う。得られた部分配列を用いて、ゲノムウオーキングのためのプライマーを設計する。BD Clontech Genome Walking Kitを用いて、製造者の使用説明書に従い、配列番号２８及び配列番号２９と表されるプライマー及び、配列番号３０及び配列番号３１と表されるネステッドPCRプライマーを用いて、ゲノムウオーキングを行う。ゲノムウオーキングの上流及び下流から得られた配列をアラインして、以前に得た部分配列と融合させて、I orientalisグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を構築する。
【００５９】
実施例４Ｂ：KmCYB2遺伝子カセットをK. thermotolerans直列反復配列の間に含むプラスミド（pMM28、図５）の構築。
プロモーター及びターミネーター領域を含む全K. marxianus CYB2(KmCVB2)遺伝子カセットを、CD21と表される野生型K. marxianus株のゲノムＤＮＡより、配列番号３２及び配列番号３３と表されるプライマーを用いて、BamH1及びSalI制限酵素位置を導入して、PCR増幅する。PCR産物は、BamHI及びSalIで消化済みのpUC18と命名された商品ベクター（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA）と連結する。得られプラスミドをpMM25と表わす。
配列番号３４と表される７０５ｂｐ配列をK. thermotoleransのゲノムＤＮＡより、配列番号３５及び配列番号３６と表されるプライマーを用いて、Sph1及びSalI制限酵素位置を導入して、PCR増幅する。このK. thermotolerans配列は、如何なる活性タンパク質もコードしてない。プラスミドpMM25をSphI及びSalIで消化し、K. thermotolerans配列をKmCYB2カセットの上流（５'）に連結し、pMM27として表されるプラスミドを作成する。
同一K. thermotolerans配列を、配列番号３７及び配列番号３８と表されるプライマーを用いて、BamHI及びXmaI制限酵素位置を加えてPCR増幅する。プラスミドpMM27をBamHI及びVmaIで消化し、このK. thermotolerans配列をKmCYB2カセットの下流（３'）に連結し、pMM28（図５）と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpMM28は、K. thermotolerans直列反復配列に隣接したKmCYB2カセットを、どちらも同一方向で、含む。
【００６０】
実施例４Ｃ：ヒグロマイシン遺伝子カセット及びL. helveticus LDH遺伝子カセットを含むプラスミド（pMI321、図７）の構築。
C. sonorensisのゲノムＤＮＡから、C. sonorensis PGK1遺伝子の９２０ｂｐ断片を、配列番号３９及び配列番号４０と同定したプライマーを用いて、WO 02/042471の実施例２２に記載した同一方法で得る。ゲノムＤＮＡを増殖期のI. orientalis株から抽出し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（ＴＥ）に再懸濁する。I. orientalisゲノムＤＮＡをHindIIIで切断し、Southernブロットを調整し、C. sonorensis PGK1遺伝子をプローブとして、標準的方法で、ハイブリダイズする。アガロースゲルより〜２ｋｂ長の断片を抽出し、HindIII切断プラスミドにクローニングし、サイズ分画ライブラリーを作成し、E. coliに形質導入する。配列決定により証明されるように、PGK1プローブによるサイズ分画ライブラリーのコロニーハイブリダイゼーションにより、I. orientalis PGK1(IoPGK1)タンパク質コード配列の大部分持つが、プロモーター配列は持たないHindIII断片を含むプラスミドを抽出できる。
IoPGK1プロモーター領域を含むゲノム断片をライゲーションーメディエイティッド（連結反応介在）PCR増幅によって得る（Mueller, P.R.及びWold, B. 1989, "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." Science 246:780-786）。配列番号４１と表されるリンカー及び配列番号４２と表されるリンカーの混合物を、HaeIII−消化のI. orientalisゲノムＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England BioLabs）を用いて連結する。この連結混合物の試料を、配列番号４３と表される０．１μＭのプライマー及び配列番号４４と表される１μＭプライマーを含む５０μＬ  PCR反応の鋳型として用いた。２ＵのDynazyme EXTを添加後、反応混合物を９４℃３分加熱する。反応混合物を以下のように３０サイクル繰り返す：９４℃、１分；６８℃、２分；及び７２℃、２分；そして最後の伸長のために７２℃、１０分行う。第１PCR増幅の稀釈した試料を、０．０５μＭの配列番号４５と同定したプライマー及び０．５μＭの配列番号４６と同定したプライマーを含む、ネステッドPCR反応（５０μＬ）の鋳型として用いる。２ＵのDynazyme EXTを加えた後、反応混合物を９４℃、３分加熱する。その後反応を以下のように３０サイクル繰り返す：９４℃、１分；６７℃、２分；及び７２℃、２分；そして最後の伸長に７２℃、１０分行う。
【００６１】
６００ｂｐPCR断片を抽出し、配列決定する。配列番号４７及び配列番号４８と同定したネステッドプライマーを設計して、配列番号４９及び配列番号５０と同定したオリゴヌクレオチドと共に、上記と同じように,但しSsp I -消化したI. orientalis DNAを用いて、ライゲーションメディエイテッドPCR増幅に用いる。またPCRは６５℃のアニーリング温度で行う。
I. orientalis PGK1プロモーター領域を、配列番号５１及び配列番号５２と表わすプライマー、及び鋳型としてI. orientalisゲノムＤＮＡを用いてPCR増幅する。断片をKlenow酵素を用いて埋めて平滑末端にし、XbaIで切断する。６３３ｂｐ断片をゲルで抽出し；その後pMI270（WO 03/049525の図４に記載）と表わすプラスミドをXhoIで消化し、Klenow酵素及び０．１ｍＭdNTPを用いて埋めて平滑末端にし、XbaIで消化した４４２８ｂｐ断片に連結する。プラスミドpMI270はC. sonorensis PGK1プロモーター及びS. cerevisiae GAL10ターミネーターに連結したE. coliヒグロマイシン遺伝子を含む。得られたプラスミドは、pMI318（図６）と表される。プラスミドpMI318は、I. orientalis PGK1プロモーター及びS. cerevisiae GAL10ターミネーター制御下にあるE. coliヒグロマイシン遺伝子を含む。
【００６２】
I. orientalis PGK1プロモーターを、配列番号５３及び配列番号５４と表されるプライマー及び、鋳型としてI. orientalisゲノムＤＮＡを用いて、PCR増幅する。この断片をKlenow酵素及び０．１ｍＭ dNTPを用いて埋め、NcoIで切断する。６３３ｂｐ断片をゲルから抽出する。プラスミドpVR1（WO 03/102152図７に記載）は、S. cerevisiae TEF1プロモーター及びS. cerevisiae CYC1ターミネーター制御下にあるL. helviticus LDH遺伝子を含む。プラスミドpVR1（WO 03/102152図７に記載）をXhoIで消化し、Klenow酵素で埋め、NcoIで切断する。プラスミドpVR1由来の７３８６ｂｐ断片を６３３ｂｐIoPGK1プロモーター断片と連結する。得られたプラスミドをpMI320と表わす。プラスミドpMI320はIoPGK1プロモーター及びS. cerevisiae CYC1ターミネーター制御下にあるL. helveticus LDH遺伝子を含む。
プラスミドpMI318及びpMI320を、ApaI及びNotIで消化する。プラスミドpMI318由来の５００８ｂｐ断片をプラスミドpMI320由来の１９９５ｂｐ断片と連結し、プラスミドpMI321（図７）を作成する。
ヒグロマイシン遺伝子（及びそのターミネーター）はプラスミドpMI321上の２コピーのIoPGK1プロモーター（これは直列反復配列として働く）の間に位置する。
【００６３】
実施例４Ｄ：E. coliヒグロマイシン遺伝子カセット、L. helveticus LDH遺伝子カセット、及びIoPDC1A５'隣接流域を有するプラスミド（pMI355、図８）の構築。
野生型I. orientalis株ATCC PTA-6658のゲノムライブラリーを、製造者の提供した説明書に従い、SuperCos1 (Staratagene)コスミドベクターに構築する。PDC類似の配列を配列番号５５及び配列番号５６で表されるプライマーを用いて、本株のゲノムＤＮＡよりPCR増幅する。PDC遺伝子の７００ｂｐ断片を増幅する。WO 03/049525に記載される様に、プローブとして標識したPCR断片を用いたハイブリダイゼーション技法を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、PDC遺伝子を含むコスミドクローンを抽出し、配列決定する。オープンリーディングフレーム（読み取り枠）の開始点の１０００ｂｐから１６７ｂｐ上流のI. orientalis PDC1A５'領域を、配列番号５７及び配列番号５８で表されるプライマー、及び鋳型としてI. orientalis PDC1AコスミドＤＮＡを用いて、PCR増幅する。この断片をSalI及びSacIで切断する。８３６ｂｐ断片をゲルから抽出して、SalI及びSacIで消化したプラスミドpMI321（図７，実施例４Ｃ）から得た６９９２ｂｐ断片と連結する。得られたプラスミドをpMI355（図８）と名付ける。
【００６４】
実施例４Ｅ：IoPDC1A５'隣接領域、E. coliヒグロマイシン遺伝子カセット、L. helveticus LDH遺伝子カセット及びIoPDC1A３'隣接領域を含むプラスミド（pMI356及びpMI357（図９））の構築。
PDC飜訳停止コドンの５２４ｂｐ上流から２１７ｂｐ下流の配列に相当するI. orientalis PDC1A３'領域を、配列番号５９及び配列番号６０で表されるプライマー及び鋳型として、I. orientalis PDC1AコスミドＤＮＡ（実施例４Ｄ）を用いて、PCR増幅する。断片をApaI及びSmaIで切断する。６３０ｂｐの断片をゲルから抽出して、ApaI及びSmaIでpMI355プラスミド（図８、実施例４Ｄ）を消化して得た７８０９ｂｐ断片と連結する。得られたプラスミドをpMI357（図９）と名付ける。このプラスミドは、pMI355プラスミドのIoPDC1A遺伝子の５'隣接及び３'隣接の一部の間由来のヒグロマイシン及びLDHカセットを含む。
I. orientalis PDC1A３'領域の異なる区域を用いる以外、同じ方法で、プラスミドPMI356を構築する。
【００６５】
実施例４Ｆ：IoPDC1A５'隣接領域、ScMEL5遺伝子カセット、L. helveticus LDH遺伝子カセット、及びIoPDC1A３'隣接領域を含むプラスミドpMI433（図１０）の構築.
I. orientalis PGK1プロモーターを、配列番号６１及び配列番号６２で表されるプライマー及び鋳型としてI. orientalis ゲノムＤＮＡを用いてPCR増幅する。断片をKlenow酵素及び０．１ｍＭ dNTPを用いて埋め、SphIを用いて切断する。６６９ｂｐ断片をゲルで抽出する。pMI233（WO 03/049525の図２３Ｃに記載）と名付けられたプラスミドをXhoIで切断する。この断片をKlenow酵素で埋め、SphIで切断する。4534bp断片と６６９ｂｐ断片を連結し、得られたプラスミドをpMI319と名付ける。プラスミドpMI319は、S. cerevisiae MEL5 (ScMEL5)遺伝子及びIoPGK1プロモーター領域を含む。
プラスミドpMI319をApaIで切断し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端にして、NotIで切断する。２３１７ｂｐ断片をゲルから抽出する。この断片をプラスミドpMI357（実施例４Ｅ）をSalIで消化して得られる６４９８ｂｐ断片と連結し、Klenow酵素で平滑末端化し、NotIで切断する。得られたプラスミドは、pMI357プラスミドのヒグロマイシン遺伝子の代わりにScMEL5遺伝子（ネイティブターミネーターと共に）を含む。得られたプラスミドをpMI433（図１０）と表わす。
【００６６】
実施例４Ｇ：I. orientalis CYB2５'隣接領域、K. thermotolerans 直列反復配列の間のScMEL5遺伝子カセット及びI. orientalis CYB2３'隣接領域を含む、プラスミドpMI449（図１１）及びpMI454（図１２）の構築。
プラスミドpMM28（図５，実施例４Ｂ）をBamHIで消化し、Klenow酵素で埋め、SalIで消化する。得られた４０７７ｂｐ断片をpMI433（図１０，実施例４Ｆ）の２３１７ｂｐのNotI（Klenow酵素で埋める）-SalI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI445と表わす。
I. orientalis Ｌ−乳酸：フェリチトクロムｃオキシドリダクターゼ（IoCYB2A）遺伝子（予想されたオープンリーディングフレームの開始の９０から６７６ｂｐ下流の配列に相当）の３'隣接領域を、配列番号６３及び配列番号６４で表されるプライマー及び鋳型として、CYB2-2コスミドクローンを用いて、PCR増幅する。このPCR産物をSacI及びSmaIで消化し、６０７ｂｐ断片をプラスミドpMI445の６３８６ｂｐSacI-SmaI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI448と表わす。
IoCYB2A５'隣接領域（予想したオープンリーディングフレームの開始の９１３から４８７ｂｐ上流の配列に相当）を、配列番号６５及び配列番号６６で表されるプライマー及び鋳型として、再度、CYB2-2コスミドクローンを用いてPCR増幅を行う。PCR産物をSphIで消化し、この４５４ｂｐ断片をpMI448の部分消化により得られる６９９３ｂｐSphI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI449（図１１）と表わす。
IoCYB2A５'隣接領域（予想したオープンリーディングフレームの開始の４６６から４６７ｂｐ上流の配列に相当）を、配列番号６７及び配列番号６８で表されるプライマー及び鋳型として、再度、CYB2-2コスミドクローンを用いてPCR増幅を行う。PCR産物をSphIで消化し、この４９３ｂｐ断片をpMI448の部分消化により得られる６９９３ｂｐSphI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI453と表わす。
IoCYB2A３'隣接領域（予想した停止コドンの４０２ｂｐ上流から７７ｂｐ下流の配列に相当）を、配列番号６９及び配列番号７０で表されるプライマー及び、鋳型としてCYB2-2コスミドを用いてPCR増幅を行う。PCR産物をApaI及びSmaIで消化し、この５０６ｂｐ断片をプラスミドpMI453の６８８６ｂｐApaI-SmaI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI454（図１２）と表わす。
【００６７】
実施例４Ｈ：IoGPD1遺伝子の上流断片、K. thermotolerans第１直列反復区域、MEL5遺伝子カセット、K. thermotolerans第２直列反復区域、及びIoGPD1遺伝子の下流断片を含む、プラスミド（pBH165、図１３）の構築。
5'CYB2A隣接相同体を削除するために、プラスミドpMI449をNdeI及びSbfIで消化する。６．８ｋｂｐ断片をゲルで抽出し、脱リン酸化する。実施例４ＡからのIoGPD1遺伝子の３０２ｂｐ断片（この遺伝子の開始コドンから１〜３０２塩基対に相当）を、配列番号７１及び配列番号７２で表されるプライマーを用いて、PCR増幅する。PCR産物をゲルで精製し、NdeI及びSbfIで消化し、PMI449由来の６．８ｋｂｐ断片と連結して、プラスミドpBH164を作成する。プラスミドpBH164をXmaI及びEcoRIで消化して、３'CYB2A隣接相同体を削除する。６．５ｋｂｐ断片をゲルで精製し、脱リン酸化する。実施例４Ａ由来のIoGPD1遺伝子の３４６ｂｐ断片（開始コドンから３２２〜６６８塩基対に相当）を、配列番号７３及び配列番号７４で表されるプライマーを用いてPCR増幅する。このPCR産物をゲルから精製し、XmaI及びEcoRIで消化し、pBH164から得た６．５ｋｂｐ断片と連結して、pBH165を作成する（図１３）。
プラスミドpBH165は、転写順に、IoGPD1遺伝子の３０２ｂｐ断片、第１のK. thermotolerans直列反復区域、MEL5遺伝子カセット、第２のK. thermotolerans直列反復区域、及びIoGPD1遺伝子の３４６ｂｐ断片を含む。ネイティブIoGPD1遺伝子座位（遺伝子の破壊を伴い）での挿入、その後MEL5遺伝子カセットのループアウトが設計される。
【００６８】
実施例４Ｉ：プラスミドpMI356（実施例４Ｆ）により野生型I. orientalis株を形質転換することで、IoPDC1A及びIoPDC1B遺伝子を欠失し、及び１段階でLhLDH遺伝子を組み込んだ、I. orientalis変異株（CD1184）の生成。
標準的方法で、野生型I. orientalis株ATCC PTA-6658をプラスミドpMI356で形質転換する。ヒグロマイシンプレート上で増殖する形質転換株を培養する。エタノールを産生しない形質転換体を選択して、Southern解析を行い、IoPDC1A両対立遺伝子の欠失、及び少なくとも１コピーのLhLDH遺伝子の組み込みを確認する。この株をCD1184と表わす。
【００６９】
実施例４Ｊ：プラスミドpMI449（実施例４Ｇ，図１１）及びpMI454（実施例４Ｇ，図１２）によりCD1184株（実施例４Ｉ）を成功裏に形質転換し、その後突然変異誘発による、I. orientalis変異株（CD1496）の生成。
酢酸リチウム法を用いて、CD1184株をプラスミドpMI449で形質転換し、形質転換体（青色コロニー）をYPD X-α-galプレート上のメリビアーゼ活性をベースに選択する。いくつかの形質転換体について、CD1184株のIoCYB2A遺伝子の置き換えを、コロニーPCR及びSouthern解析により確認した。Southern解析により確認したように、K. thermotolerans反復配列について相同組換え事象を介して、MEL5マーカーは、これらの形質転換体の一つからループアウトする。その後、プラスミドpMI454を用いて、第２のCYB2A対立遺伝子が、この形質転換体から欠失される。コロニーPCRによりこれらの形質転換体を解析により、１０００ｂｐCYB2A特異的PCR産物が不在なことが示される。前記のような組換えにより、プラスミドpMI454由来のMEL5マーカーは、第２のＣＹＢ２Ａ対立遺伝子を欠失した形質転換体からループアウトする。この形質転換体は、CD1436株と表される。CD1436株は、両PDC1遺伝子（機能性L-LDH遺伝子カセットの置き換えにより）を欠失し、また２個のネイティブなIoCYB2A遺伝子の各々を欠失する。
暴露条件が８μＬ、１時間という以外、実施例１Ａに述べた条件を用いて、CD1436株を、EMS突然変異誘起処理させる。突然変異誘起した細胞を６時間、２００μＬのＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコース培地中で回復させ、その後PDA＋３５ｇ／Ｌ乳酸プレートに蒔種し、１週間、３０℃で培養する。CD1436株より、より多くのラクタート、またより少ないグリセロールを産生する株を、CD1496株と表わす。
【００７０】
実施例４Ｋ：プラスミドpBH165（実施例４Ｈ，図１３）によるCD1184（実施例４Ｉ）及びCD1496株（実施例４Ｊ）の形質転換、その後選択マーカーのループアウトにより、それぞれ、形質転換体CD1667及びCD1671株が産生され、どちらも単一GPD1対立遺伝子を欠失する。
CD1184株を増殖させ、プラスミドpBH165をNdeI及びEcoRIで消化して得られた４．４ｋｂｐ断片５μｇで形質転換する。形質転換体を、X-α-gal(−−４−クロロー３−インドリル−ａＤ―ガラクトピラノシド)を重層した酵母窒素塩基(YNB)+２％メリビオースプレート上で選択する。３０℃で〜４日間の増殖後、青色形質転換体を見ることができる。８個の形質転換体を拾い上げ、X-α-galを含むＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコースプレート上に単一コロニーを蒔種する。各形質転換体当たり単一青色コロニーを拾い上げ、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコースプレートに再ストリークする。ゲノムＤＮＡを形質転換体より抽出する。IoGPD1遺伝子の１個の対立遺伝子の破壊が、配列番号７５及び配列番号７６と表わすプライマーを用いたPCRにより証明される。５個の形質転換体は、予期した〜２ｋｂ産物を示す。これらの形質転換体の一つを、CD1655株と表わす。ネイティブIoGPD1遺伝子の１コピーの破壊が、さらに、配列番号７７及び配列番号７８と表わすプライマーを用いたPCRにより証明される。
CD1665株をＹＰ＋１００ｇ／Ｌグルコース中、３０℃で、数世代増殖させる。稀釈シリーズをx-α-galを重層したＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコースプレートに蒔種し、３０℃一晩増殖させる。白色コロニー（MEL5マーカーカセットがループアウトしたことを示す）を選択し、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコース＋x-α-galプレートに再ストリークする。白色コロニーを選択する。ネイティブIoGPD1遺伝子の１対立遺伝子の破壊が配列番号６９及び配列番号８０で表されるプライマーを用いたPCRにより証明される。この形質転換体をCD1667株と表わす。
CD1496株を同様に形質転換する。PCRによる予期した〜２ｋｂｐバンドを表わす形質転換体をCD1657株と表わす。ネイティブIoGPD1遺伝子の１個の対立遺伝子の破壊が、CD1655株に対して記載した様に、PCRにより証明される。CD1657株をさらに数世代増殖させ、欠失したMEL5マーカー遺伝子カセットを示すコロニーを選択し、CD1671株と表わす。ネイティブIpGPD1遺伝子の１個の対立遺伝子の破壊が、以前に記載した様に、PCRにより証明される。
【００７１】
実施例４Ｌ：両IoGPD1対立遺伝子の欠失したプラスミドpBH165（実施例４Ｈ，図１３）によるCD1667（実施例４Ｋ）及びCD1671（実施例４Ｋ）株の形質転換による、夫々、CD1688及びCD1690株の産生。
CD1667株を、プラスミドpBH165をNdeI及びEcoRIによる消化で得た、４．４ｋｂｐ断片５μｇで形質転換する。形質転換体を、x-α-galを重層したＹＮＢ＋２％メリビオースプレート上で選択する。３０℃〜４日間の増殖後、青色の形質転換体が可視となる。１０個の形質転換体を拾い、単一コロニーをx-α-galを含むＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコースプレートに蒔種する。各形質転換体について、単一青色コロニーを拾い、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコースプレートに再ストリークする。形質転換体より、ゲノムＤＮＡを単離する。IoGPD1遺伝子の第２の対立遺伝子の破壊が、配列番号８１及び配列番号８２と表されるプライマーを用いたPCRにより、３個の形質転換体について証明される。これらの形質転換体の一つは、CD1688株と表される。
CD1671株を、同様に形質転換する。PCRにより、IoGPD1遺伝子の第２の対立遺伝子が１個の形質転換体において破壊されていることが証明され、この株をCD1690株と表わす。
【００７２】
実施例５：５．５〜５．６OUR（酸素取り込み速度）でのCD1184（実施例４Ｉ）及びCD1688（実施例４Ｌ）株のミクロ好気的バッチ培養。
１ｍＬのCD1688株を、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、及び硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類、発泡抑制剤、及び、約５０ｇ／Ｌグルコースを含む、規定された培地を含む１段階バッチ培養反応器に接種する。細胞を加える前に、培地のｐＨを約３．５に合わせる。培養のｐＨは、細胞の増殖、及び乳酸の産生に従い、３，０まで低下することを認める。その後、水酸化カリウムの添加により、ｐＨを約３．０に維持する。グルコースを、全体で１３６．１ｇ／Ｌグルコースを添加するまで、発酵培地に約１〜２g/L/hr加える。細胞を空気混和の条件下で３０℃で培養するが、この条件では酸素取り込み速度は約５．５〜５．６mmol/L/hrである。
CD1688株は、ラクタートをラクタート濃度が約７０ｇ／Ｌになるまで、１．０２g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約７４％である。この株による産生は、７７時間後に停止するが、この時点で発酵培地は、１５．３ｇ／Ｌグルコースを含む。全体としてのラクタートの産生速度は、１．０６g/L-hrであり、また全体としてのラクタートの収量は、７０％である。CD1688株の場合のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、１．９％、０％及び２３．７％である。バイオマスの収量は３．５％である。
比較のために、ＣＤ1184株（本発明の例ではない）を同様な条件で培養する。CD1184株は、ラクタート濃度が約７０ｇ／Ｌになるまで、ラクタートを１．２４g/L-hrの速度で産生する。この時点でのラクタート収量は約７４％である。この株による産生は、７７時間後に停止し、この時点での発酵培地は１５．３ｇ／Ｌグルコースを含む。全体としてのラクタート産生速度は、１．０６g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、７０％である。CD1184株のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、２．１％、９．３％、及び１５．９％である。バイオマスの収量は、３．２％である。
これらの結果から、これらの発酵条件下で、ネイティブIoGPD1遺伝子の欠失により、細胞が測定できる量のグリセロールを産生しなくなることを示す。前と同様、この遺伝子の欠失（及び結果としてのグリセロール産生の欠如）は、細胞増殖に殆ど又は全く効果を持たない。
【００７３】
実施例６：CD1184株（実施例４Ｉ）及びCD1688株（実施例４Ｌ）の９．９〜１０  ＯＵＲでのミクロ好気的バッチ培養。
CD1688及びCD1184株を別々に、空気混合条件を酸素取り込み速度（ＯＵＲ）が９．９〜１０．０mmol/L/hrになるように選び、また培養中グルコースを加えないという以外は、実施例５に記載した一般的手法で培養する。CD1688株培養の際は、酵母殻を培地に加える。
これらの条件下で、CD1184株は、ラクタート濃度が約７０ｇ／Ｌになるまで、ラクタートを１．８７g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約７３％である。この株による産生は、６７．５時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は６０ｇ／Ｌから２．１ｇ／Ｌに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、１．４３g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、７０％である。CD1184株のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、２．１％、５．７％、及び２１．５％である。バイオマスの収量は、４．４％である。
CD1688株は、ラクタート濃度が約７０ｇ／Ｌになるまで、ラクタートを１．６８g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約８０％である。この株による産生は、７８時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は５３．５ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、１．２６g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、７７％である。CD1688株のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、１．２％、０％、及び２３．２％である。バイオマスの収量は、５．９５％である。前と同様、これらの結果から、これらの発酵条件下で、ネイティブIoGPD1遺伝子の欠失により、細胞が測定できる量のグリセロールを産生しなくなることまた、この遺伝子の欠失（及び結果としてのグリセロール産生の欠如）は、細胞増殖に殆ど又は全く効果を持たないことを示す。さらに、IoGPD1の欠失は、全体としてのラクタート収量を改善する。
【００７４】
実施例７：CD1690株（実施例４Ｌ）の５〜６ＯＵＲでのミクロ好気的バッチ培養。
空気混合条件を選択して酸素取り込み速度が５．７５mmol/L/hrになるようにし、また発酵培地がＹＰ＋７０ｇ／Ｌグルコースを含む以外、CD1690株を、実施例５に記載した一般的手法で培養する。
CD1690株は、ラクタート濃度が約７０ｇ／Ｌになるまで、ラクタートを０．６６g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約７８％である。この株による産生は、１２１時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は１２７．９ｇ／Ｌから２３．８ｇ／Ｌに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、０．６１g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、７７％である。ピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、０％、０％、及び３１．１％である。バイオマスの収量は、２．４％である。再び、これらの結果から、これらの発酵条件下で、ネイティブIoGPD1遺伝子の両対立遺伝子の欠失により、細胞が測定できる量のグリセロールを産生しなくなることまた、この遺伝子の欠失は、細胞増殖に殆ど又は全く効果を持たないことを示す。
ＯＵＲを５．２mmol/L/hrにして、またグリセロールを発酵培地に添加する以外、実施例５に記載した一般的手法（この実施例に記載した確立した培地を用いて）で、CD1690株を２回以上培養する。第１回目の培養において、０．１ｇ／Ｌグリセロールを添加し、また第２回の培養において１．０ｇ／Ｌグリセロールを添加する。
０．１ｇ／Ｌグリセロールを添加する場合、CD1690株は、ラクタート濃度が約７０ｇ／Ｌになるまで、ラクタートを０．７４g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約７８％である。この株による産生は、１２１時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は１１７．８ｇ／Ｌから１０．２ｇ／Ｌに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、０．６８g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、７６％である。ピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、０.２％、０％、及び２５．３％である。バイオマスの収量は、４．１％である。
非常に類似した結果が１．０ｇ／Ｌグリセロール添加の場合得られる。期待とは外れて、これらの結果より、発酵培地にグリセロール添加しても、細胞のネイティブなグリセロール産生能を破壊しても、これらの形質転換体の増殖能、及びラクタート産生能には殆ど、又は全く効果がないことを示す。
【００７５】
実施例８Ａ：IoGPD1５'隣接領域、直列反復の間のE. coliヒグロマイシン遺伝子カセット、及びIoGPD1３'隣接領域を含む、プラスミド(pTMC61（図１４）)の構築。
ヒグロマイシン遺伝子カセットを配列番号８３及び配列番号８４と表わすプライマー及び鋳型としてプラスミドpMI356（実施例４Ｅ，図９を参照）を用いて、PCR増幅する。PCR条件は、９５℃５分間（１回）；３０サイクルの９５℃（３０秒）、５６℃（３０秒）、及び７２℃（２分間）；その後７２℃１０分間を１回である。得られたPCR産物をSpeI及びSalIで消化し、同様に消化したプラスミドpBH165（実施例４Ｈ，図１３）に連結し、プラスミドpTMC61を作成する（図１４）。
【００７６】
実施例８Ｂ：プラスミドpBH165（実施例４Ｈ，図１３）で選択した野生型I. orientalis株を形質転換し、その後選択マーカーをループアウトし、単一GPD1対立遺伝子を欠失した、形質転換体CD2624株を作成。
野生型I. orientalis株ATCC PTA-6658を低濃度のグルコース及び高濃度の乳酸を含む培地中で連続的に、多数世代増殖させる。この条件下で良く増殖する１個の細胞を分離して、CD1822株と表わす。CD1822株は、炭素源としてグルコースを含む培地中で培養する場合、エタノール及びグリセロールを産生する。CD1822株を増殖させ、実施例４Ｋに記載した同様の手順で、プラスミドpBH165で形質転換する。実施例４Ｋに記載したように、形質転換体を、x-α-gal（５−ブロモー４−クロロ−３−インドリル−ａ―Ｄ−ガラクトピラノシド）を重層した酵母窒素塩基（YNB）＋２％メリビオースプレート上で選択する、即ち青色コロニーを拾い上げ、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌグルコースプレートに再ストリークする。形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、２セットのPCR反応により、欠失構築物の組み込みについて解析する。第１のPCRは、配列番号８５及び配列番号８６と表わすプライマーを用い、また第２のPCRは、配列番号８７及び配列番号８８と表わすプライマーを用いる。これらにより、産生されたPCR産物は、夫々２．０ｋｂｐ及び１．４ｋｂｐであり、１つのGPD1対立遺伝子が破壊されていることを示す。配列番号８５及び配列番号８８で表すプライマーを用いて、第３のPCR反応を行い、０．８ｋｂｐ産物を産生し、このことは形質転換体の中にGPD1対立遺伝子がなお存在することを示す。この形質転換体をCD2624株と表わす。
【００７７】
実施例８Ｃ：プラスミドpTMC61（実施例８Ａ，図１４）でCD2624株（実施例８Ｂ）を形質転換し、IoGPD1両対立遺伝子を欠失した形質転換体CD2627株を作成。
配列番号８９及び配列番号９０で表すプライマー及び鋳型として、pTMC61を用いて、PCRを行う。４．１ｋｂｐ断片を得て、CD2624株を形質転換するために用いる。形質転換体をＹＰＤ＋３００μｇ／ｍｌヒグロマイシン上で選択する。１００個の形質転換体より夫々ゲノムＤＮＡを抽出し３セットのPCR反応の鋳型として用いる。第１セットのPCRは、配列番号９１及び配列番号８８で表すプライマーを用いて、３０個の形質転換体において、１．５ｋｂｐ産物を産生する。第２のPCR反応は、これら３０個の形質転換体からのゲノムＤＮＡについて、配列番号８５及び配列番号９２のプライマーを用いて行う。１０株は、予想した２．５ｋｂｐ産物を示した。その後、これら１０株由来のゲノムＤＮＡを、配列番号８５及び配列番号８８で表すプライマーを用いて解析する。０．８ｋｂｐ断片を産生しない２株において、GPD1両対立遺伝子が破壊されている。これらをＹＮＢ＋２．０％メリビオースプレート上での増殖テストを行った。１株は、増殖可能で、CD2627株と表わす。
【００７８】
実施例８Ｄ：CD1822株、CD2624株（実施例８Ｂ）、及びCD2627株（実施例８Ｃ）のミクロ好気的培養。
CD1822、CD2624、及びCD2627株をデュプリケートのミクロ好気的振盪フラスコ発酵容器中で培養する。これらの株を、〜１００ｇ／ｍＬグルコースを含む規定された培地２５ｍＬを入れた２５０ｍＬバッフルフラスコ中で、３０℃、２５０ｒｐｍ攪拌で一晩培養する。規定された培地については、指定量のグルコース添加及びニコチン酸量を５ｍｇ／Ｌまで増やす以外、Peter M. Bruinenberg, Johannes P. Van Dijken及びW. Alexander Schefferes, 1983, An Enzymatic Analysis of NADPH Production and Consumption in Candida utilis, J. General Microbiology vol.129, pp.965-971に記載されている。
１００ｇ／Ｌグルコースを含む５０ｍＬの規定された培地を入れた２５０ｍＬバッフルフラスコにＯＤ６００が０．２になるまで、上記の培養液を接種する。これらのフラスコを３０℃、２２時間、１００ｒｐｍで攪拌してインキュベートする。その後、グルコース、グリセロール、及びエタノールについて、培地をＨＰＬＣで解析する。バイオマス収量も測定する。
CD1822株は、２２時間の培養中全てのグルコースを消費して、６．０ｇ／ｋｇグリセロール、３４．５４ｇ／ｋｇエタノール及び１４．８ＯＤ６００のバイオマスを産生する。
１個のGPD1対立遺伝子を破壊したCD2624株は、全グルコースを消費して、５．８８ｇ／ｋｇグリセロール及び３５．２５ｇ／ｋｇエタノールを産生する。１４．５ＯＤ６００のバイオマスを産生する。
GPD1両対立遺伝子を破壊したCD2627株は、２２時間に１２．３９ｇ／ｋｇを残して全てのグルコースを消費する。グリセロール産生は、０．３４ｇ／ｋｇである。エタノール産生は、２３．０６ｇ／ｋｇであり、バイオマス産生は１１．５ＯＤ６００である。これらの結果から、I. orientalisにおけるGPD1対立遺伝子の破壊により、これらの条件下で、グルコース消費量は僅かに低下し、エタノール産生及びバイオマスは僅かに低下することが示される。しかしながら、CD2627株は、良く増殖し、また最低のグリセロール産生を伴いエタノールを良く産生する。これらの結果からさらに、GPD1欠失体の成長能及び、産生能は、PDC活性の破壊に依存せず、またピルビン酸塩からラクタートの経路の付加にも依らないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】pBH158プラスミドを表わす図である。
【図２】pBH159プラスミドを表わす図である。
【図３】pBH160プラスミドを表わす図である。
【図４】pBH161プラスミドを表わす図である。
【図５】pMM28プラスミドを表わす図である。
【図６】pMI318プラスミドを表わす図である。
【図７】pMI321プラスミドを表わす図である。
【図８】pMI355プラスミドを表わす図である。
【図９】pMI357プラスミドを表わす図である。
【図１０】pMI433プラスミドを表わす図である。
【図１１】pMI449プラスミドを表わす図である。
【図１２】pMI454プラスミドを表わす図である。
【図１３】pBH165プラスミドを表わす図である。
【図１４】pTMC61プラスミドを表わす図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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