(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナーゼ阻害剤の存在下での前記キナーゼ阻害剤の非存在下と比較した１種または複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化の測定方法であって、
（ａ）血清除去によって細胞を飢餓状態にするステップと、
（ｂ）キナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、血清、増殖因子および／またはサイトカインを添加することによってキナーゼ自己リン酸化を誘導するステップと、
（ｃ）細胞を溶解して、細胞から細胞溶解物を遊離させるステップと、
（ｄ）複数のチロシンキナーゼ特異的抗体を添加することによって、細胞溶解物中のキナーゼを捕捉するステップであって、該抗体のそれぞれが特有の色素と結合しているステップと、
（ｅ）ｄ）のいずれの該色素とも区別できるマーカーをタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｆ）ｄ）の該色素およびｅ）の該マーカーを検出することにより自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｇ）キナーゼ阻害剤の存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化とキナーゼ阻害剤の非存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと、
を有し、自己リン酸化を有する場合には、該色素の第一のシグナルと該マーカーの第二のシグナルとが検出され、自己リン酸化がない場合には、該色素の第一のシグナルのみを検出することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
キナーゼ阻害剤の存在下での前記キナーゼ阻害剤の非存在下と比較した１種または複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化の測定方法であって、
（ａ）特定のチロシンキナーゼを特有の色素に結合するステップと、
（ｂ）キナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、キナーゼ自己リン酸化を誘導するステップと、
（ｃ）ａ）のいずれの該色素とも区別できるマーカーをタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｄ）ａ）の該色素およびｃ）の該マーカーを検出することにより自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｅ）キナーゼ阻害剤の存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化とキナーゼ阻害剤の非存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと、
を有し、自己リン酸化を有する場合には、該色素の第一のシグナルと該マーカーの第二のシグナルとが検出され、自己リン酸化がない場合には、該色素の第一のシグナルのみを検出することを特徴とする測定方法。
【請求項３】
キナーゼ活性化因子の存在下での前記キナーゼ活性化因子の非存在下と比較した１種または複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化の測定方法であって、
（ａ）血清除去によって細胞を飢餓状態にするステップと、
（ｂ）キナーゼ活性化因子の存在下または非存在下で、血清、増殖因子および／またはサイトカインを添加することによってキナーゼ自己リン酸化を誘導するステップと、
（ｃ）細胞を溶解して、細胞から細胞溶解物を遊離させるステップと、
（ｄ）複数のチロシンキナーゼ特異的抗体を添加することによって、細胞溶解物中のキナーゼを捕捉するステップであって、該抗体のそれぞれが特有の色素と結合しているステップと、
（ｅ）ｄ）のいずれの該色素と区別できるマーカーをタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｆ）ｄ）の該色素およびｅ）の該マーカーを検出することにより自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｇ）キナーゼ活性化因子の存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化とキナーゼ活性化因子の非存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと、
を有し、自己リン酸化を有する場合には、該色素の第一のシグナルと該マーカーの第二のシグナルとが検出され、自己リン酸化がない場合には、該色素の第一のシグナルのみを検出することを特徴とする測定方法。
【請求項４】
前記色素が蛍光またはルミネセンス色素であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーが蛍光またはルミネセンスマーカーであることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞飢餓（ａ）の前に、チロシンキナーゼをコードする核酸で該細胞を形質転換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は真核細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記真核細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
チロシンキナーゼを阻害する特異性についてキナーゼ阻害剤をプロファイリングするための方法であって、
（ａ）血清除去によって細胞を飢餓状態にするステップと、
（ｂ）キナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、血清、増殖因子および／またはサイトカインを添加することによってキナーゼ自己リン酸化を誘導するステップと、
（ｃ）細胞を溶解して、細胞から細胞溶解物を遊離させるステップと、
（ｄ）複数のチロシンキナーゼ特異的抗体を添加することによって、細胞溶解物中のキナーゼを捕捉するステップであって、該抗体のそれぞれが特有の色素と結合しているステップと、
（ｅ）ｄ）のいずれの該色素とも区別できるマーカーをタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｆ）ｄ）の該色素およびｅ）の該マーカーを検出することにより自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｇ）キナーゼ阻害剤の存在下と非存在下での該チロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと
を有し、キナーゼ阻害がない場合には、該色素の第一のシグナルと該マーカーの第二のシグナルとが検出され、キナーゼ阻害の場合には、該色素の第一のシグナルのみを検出することを特徴とする検出方法。
【請求項１０】
チロシンキナーゼを活性化する特異性についてキナーゼ活性化因子をプロファイリングするための方法であって、
（ａ）血清除去によって細胞を飢餓状態にするステップと、
（ｂ）キナーゼ活性化因子の存在下または非存在下で、血清、増殖因子および／またはサイトカインを添加することによってキナーゼ自己リン酸化を誘導するステップと、
（ｃ）細胞を溶解して、細胞から細胞溶解物を遊離させるステップと、
（ｄ）複数のチロシンキナーゼ特異的抗体を添加することによって、細胞溶解物中のキナーゼを捕捉するステップであって、該抗体のそれぞれが特有の色素と結合しているステップと、
（ｅ）ｄ）のいずれの該色素とも区別できるマーカーをタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｆ）ｄ）の該色素およびｅ）の該マーカーを検出することにより自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｇ）キナーゼ活性化因子の存在下と非存在下での該チロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと
を有し、キナーゼ活性化の場合には、該色素の第一のシグナルと該マーカーの第二のシグナルとが検出され、キナーゼ活性化のない場合には、該色素の第一のシグナルのみを検出することを特徴とする検出方法。
【請求項１１】
キナーゼ阻害剤の非存在下でのチロシンキナーゼのリン酸化をプロファイルすることを含む、チロシンキナーゼ活性の増強又は過剰発現を特徴とする腫瘍の診断を補助する方法であって、
（ａ）血清除去によって細胞を飢餓状態にするステップと、
（ｂ）キナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、血清、増殖因子および／またはサイトカインを添加することによってキナーゼ自己リン酸化を誘導するステップと、
（ｃ）細胞を溶解して、細胞から細胞溶解物を遊離させるステップと、
（ｄ）複数のチロシンキナーゼ特異的抗体を添加することによって、細胞溶解物中のキナーゼを捕捉するステップであって、該抗体のそれぞれが特有の色素と結合しているステップと、
（ｅ）ｄ）のいずれの該色素とも区別できるマーカーをタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｆ）ｄ）の該色素およびｅ）の該マーカーを検出することにより自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｇ）キナーゼ阻害剤の存在下と非存在下での該チロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと
を有し、自己リン酸化を有する場合には、該色素の第一のシグナルと該マーカーの第二のシグナルとが検出され、自己リン酸化がない場合には、該色素の第一のシグナルのみを検出することを特徴とする測定方法。
【請求項１２】
前記チロシンキナーゼが、上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)、ＰＤＧＦ受容体、インシュリン受容体チロシンキナーゼ(ＩＲＫ)、Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ、繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)受容体、インシュリン受容体、インシュリン増殖因子(ＩＧＦ−１)受容体、ＴｒｋＡ受容体、ＴＩＥ−１、Ｔｅｋ／Ｔｉｅ２、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ(ＨＥＲ−１、ＥＲＢＢ２(ＨＥＲ−２)、ＥＲＢＢ３(ＨＥＲ−３)、ＥＲＢＢ４(ＨＥＲ−４)、Ｒｅｔ、Ｋｉｔ、Ａｌｋ、Ａｘｌ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＥｐｈ受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、ビーズ又は小球体の上にコーティングされていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
キナーゼ阻害剤の存在下での前記キナーゼ阻害剤の非存在下と比較した１種または複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化の測定方法であって、
（ａ）血清飢餓した細胞試料の複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化を、血清、増殖因子、又はサイトカインを加えることにより、キナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下において活性化するステップと、
（ｂ）該（ａ）から得られた細胞試料の溶解物中の複数のキナーゼを、抗体に特有である色素と接合し、さらにチロシンキナーゼに特異的に結合する、複数のチロシンキナーゼ特異的抗体で捕捉するステップと、
（ｃ）該（ｂ）のいずれの色素とも区別できるマーカーをタグ付けした第２のリン酸化チロシンキナーゼ特異的抗体を添加するステップと、
（ｄ）該色素と該マーカーとを検出することにより、自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｅ）キナーゼ阻害剤の存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化とキナーゼ阻害剤の非存在下でのチロシンキナーゼの自己リン酸化のレベルを比較するステップと、
を有し、自己リン酸化を有する場合には、該色素の第一の蛍光シグナルと該マーカーの第二の蛍光シグナルとが検出され、自己リン酸化がない場合には、該色素の第一の蛍光シグナルのみを検出することを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、１腔中の１００個までの異なるチロシンキナーゼの自己リン酸化を検出するための免疫測定法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
増大する配列データベースの普及と共に、ゲノム分野では、細胞におけるタンパク質発現のより迅速で、より効率的な全体的スクリーニング方法が要求されている。しかし、タンパク質翻訳後の修飾も考慮するならば、細胞プロテオームの複雑さは大幅に拡大する。
【０００３】
タンパク質の翻訳後の動的修飾は、タンパク質構造および機能の維持および調節に重要である。今まで特徴づけられた数百もの様々な種類の翻訳後修飾の中でも、タンパク質リン酸化は際だった役割を担っている。タンパク質の酵素触媒によるリン酸化および脱リン酸化は、生細胞において鍵となる調節現象である。細胞周期、細胞増殖、細胞分化および代謝などの複雑な生物学的プロセスは、タンパク質活性、安定性、相互作用および局在化を調節する可逆的リン酸化現象によって調和し、しっかり調節されている。例えば、構造的に活性化または不活性化したタンパク質キナーゼおよびホスファターゼを生じる変異によって、タンパク質のリン酸化状態を混乱させると、腫瘍形成において際だった役割を果たす。このようなタンパク質のリン酸化部位の正確な位置確認と結びつけてリン酸化タンパク質を総合的に分析し同定すること（ホスホプロテオミクス）は、複雑な生体系および疾患を引き起こす分子的特徴を理解するために必要不可欠である。
【０００４】
タンパク質リン酸化は、共有結合修飾の最も一般的な機構の１つである。哺乳類細胞に存在する全タンパク質の３分の１がリン酸化されており、このリン酸化に関与する酵素、キナーゼは、発現したゲノムの約１から３％に相当すると推定される。生体は、情報伝達、遺伝子発現、細胞周期、細胞骨格調節およびアポトーシスを含む多くの細胞プロセスを制御するためにタンパク質の可逆的リン酸化を利用している。リン酸基は、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、システイン、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基を修飾することができる。しかし、セリン（９０％）、トレオニン（１０％）またはチロシン（０．０５％）残基のヒドロキシル基のリン酸化が最も一般的で、代謝、細胞分割、細胞増殖および細胞分化におけるその他のプロセスに関与している。生命の調節において、リン酸化は中心的役割を果たすので、タンパク質リン酸化を特徴づける方法の開発に多大な労力が注がれてきた。これらのリン酸化部位の多くは、重要な生物学的プロセスを制御し、分子医学の重要な診断または治療標的となることが判明している。例えば、今までに同定された１００個を超える優性癌遺伝子のうち４６個がタンパク質キナーゼである。
【０００５】
多くの癌は、癌細胞の制御不能な成長および増殖を引き起こす、細胞情報伝達経路の破壊が特徴である。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、これらの情報伝達経路で極めて重要な役割を担っており、細胞の細胞質および／または核に細胞外からの分子信号を送っている。ほとんど全種の組織の細胞が固有のチロシンキナーゼ活性を備えた膜貫通受容体分子を発現しており、それによって、様々な増殖および分化因子が一連の生物学的効果を媒介している（Ａａｒｏｎｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１１４６〜５２（１９９１）に概説されている）。
【０００６】
チロシンキナーゼの触媒活性は、活性部位と呼ばれるキナーゼドメインの１領域内の自己リン酸化によって刺激されることが多く（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ他、（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７、５５９〜５６８）、実際に、これはＲＴＫが活性化される主要な機構と見なされている（ＨｕｂｂａｒｄおよびＴｉｌｌ(２０００)Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.６９、３７３〜３９８、およびＨｕｂｂａｒｄ、(１９９７)ＥＭＢＯ Ｊ.１６、５５７２〜５５８１）。いくつかの受容体から単離されたキナーゼドメインの構造分析によって、活性化部位がどのようにしてキナーゼ活性を抑制し、それによってリン酸化がこの自己阻害を緩める方法が明らかになった。不活性化インシュリン受容体の場合、活性化部位のＴｙｒ１１６２が活性部位に突き出しており、この活性化部位がＡＴＰ結合部位への接近を遮断している（Ｈｕｂｂａｒｄ他、(１９９４)Ｎａｔｕｒｅ ３７２、７４６〜７５４）。Ｔｙｒ１１６２および隣接する２個のチロシン残基の自己リン酸化は、活性化部位の位置を変化させ、それによって活性部位が外来基質と自由に結合するようになり、触媒作用に必要な残基を機能的構造に再構成する（Ｈｕｂｂａｒｄ(１９９７)ＥＭＢＯ  Ｊ.１６、５５７２〜５５８１）。対照的に、繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)受容体の活性化部位は、比較的動きやすく、受容体活性化によってリン酸化されるチロシンは活性部位を占有していない。しかし、ＦＧＦＲ１活性化部位のＣ末端は、基質の接近を遮断するようである（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、(１９９６)Ｃｅｌｌ ８６、５７７〜５８７）。
【０００７】
本発明の範囲内の受容体チロシンキナーゼには、限定はしないが、上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)、ＰＤＧＦ受容体、インシュリン受容体チロシンキナーゼ(ＩＲＫ)、Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ、繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)受容体、インシュリン受容体、インシュリン増殖因子(ＩＧＦ−１)受容体、ＴｒｋＡ受容体、ＴＩＥ−１、Ｔｅｋ／Ｔｉｅ２、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ(ＨＥＲ−１、ＥＲＢＢ２(ＨＥＲ−２)、ＥＲＢＢ３(ＨＥＲ−３)、ＥＲＢＢ４(ＨＥＲ−４)、Ｒｅｔ、Ｋｉｔ、Ａｌｋ、Ａｘｌ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＥｐｈ受容体が含まれる。
【０００８】
様々なヒト悪性腫瘍と増殖因子−ＲＴＫシグナル経路の破壊との間には生物学的関係が存在することが知られている。例えば、ＥＧＦＲファミリー受容体の過剰発現は、胸部、膀胱、肺および胃の癌などの様々な侵襲性ヒト上皮癌にしばしば認められる（例えば、Ｎｅａｌ他、Ｌａｎｃｅｔ  １：３６６〜６８（１９８５）、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ他、Ｌａｎｃｅｔ  １：１３９８〜１４０２（１９８７）参照）。同様に、ＨＥＲ２の過剰発現はまた、胃、子宮内膜、唾液腺、膀胱および肺の癌を含むその他のヒト癌と相関している（例えば、Ｙｏｋｏｔａ他、Ｌａｎｃｅｔ  １：７６５〜６７（１９８６）、Ｆｕｋｕｓｈｉｇｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：９５５〜５８（１９８６）参照）。このようなＲＴＫのリン酸化は、それらの細胞質ドメインキナーゼ機能を活性化し、次に下流情報伝達分子を活性化する。ＲＴＫは、異なるチロシン残基などの複数の異なる部位をリン酸化することが多い。これらの酵素は、癌治療の有望な薬剤標的としての人気が高まっている。例えば、ＥＧＦＲの阻害剤、イレッサ（商標）は、近年乳癌治療の臨床試験に移行した。同様に、ＢＣＲ／ＡＢＬの阻害剤、グリベック（商標）は、ＣＭＬの治療に現在広く使用されている。単一のタンパク質の活性を改変しようとする標的化治療が従来の化学毒性治療または放射線療法よりも非常に有利であるのは、それらが調節解除された細胞を特異的に標的化し、したがって、現在の治療に見られるような広範な細胞毒性および有害な副作用がないことである。細胞の異常な増殖、分化および／または機能障害は、多くの疾患の原因であると考えられる。タンパク質キナーゼおよび関連分子は、これらの細胞の制御において重要な役割を果たし、したがってそれらは非常に重要な薬剤標的である。
【０００９】
タンパク質キナーゼは、細胞増殖および外部刺激に対するその他の応答を制御する細胞情報伝達カスケードの重要な成分である。キナーゼを阻害することによってこれらの情報伝達カスケードを変更すると、癌、炎症、糖尿病および脳卒中を含めた多くの疾患および症状に影響が及ぶ可能性がある。
【００１０】
癌は、西欧では死因の第２位である。診断および治療は進歩しているものの、患者の全体的な生存率は低いままである。近年科学の進歩によって、癌の生物学的理解は深まってきた。ヒトタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、ヒトの発癌において中心的な役割を担っており、有望な新規標的として浮上してきた。チロシンキナーゼを阻害するいくつかのアプローチが開発されてきた。これらの薬剤は、前臨床研究では印象的な抗癌作用を示し、臨床では有望な薬剤となってきている。慢性骨髄性白血病の治療におけるＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤、イマチニブ(グリベック(商標))のめざましい成功は、この分野の熱心な研究を特に刺激した。少なくとも３０種の阻害剤が、癌における臨床的応用の様々な段階にあり、約１２０種の臨床試験が世界中で進行中である。これらの薬剤の潜在力を十分に評価するには画期的なアプローチが必要であり、国際的に一致団結した努力が役立って、近い将来、癌治療にこれらの阻害剤を組み入れることが期待される。
【００１１】
結果的に、タンパク質キナーゼは、薬剤開発のための最も顕著な標的ファミリーの１つとなってきた。したがって、患者の予後を改善するために、より新しく、より効果的な治療を開発することが緊急に必要とされている。
【００１２】
近年、科学の目覚ましい進歩によって、癌の生物学に対する我々の理解が深まってきた。その結果、いくつかの新たな標的が同定された。チロシンキナーゼは、癌治療の新たな有望な標的として浮上してきた。多くの小分子キナーゼ阻害剤が現在開発中で、グリベック(商標)（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、白血病、消化器官腫瘍）およびイレッサ(商標)（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、肺癌）の承認によって、非常に有望な治療戦略としてキナーゼの阻害の妥当性が確認された。
【００１３】
ヒトゲノム配列の分析によって、約５１８個のヒトタンパク質キナーゼ（ヒト遺伝子全体の約１．７％を構成する）が同定された。この大きなタンパク質キナーゼ補体の中で、少なくとも９０個のチロシンキナーゼ遺伝子（５８個の受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ、表１)および３２個の非受容体チロシンキナーゼ(ＮＲＴＫ、表２)が同定された。それらが引き起こす細胞シグナル伝達経路は複雑である(Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｊ.他、Ｃｅｌｌ １０３(２０００)、ｐｐ.２１１〜２２５)。簡単に説明すると、受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)は、アミノ末端細胞外リガンド結合ドメイン(通常グリコシル化されている)、疎水性膜貫通ヘリックス、ならびに保存されたタンパク質チロシンキナーゼ核および付加的な調節配列を含有する細胞質ドメイン(非常に重要なＣ末端チロシン残基および受容体調節モチーフを含有する)を含有する。細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に対するリガンド結合(ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦその他)は、受容体の２量体化／オリゴマー化を生じ、細胞質チロシンキナーゼ活性の活性化およびチロシン残基のリン酸化を引き起こす(Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｎ(１９９２)９：３８３〜３９１)。自己リン酸化されたチロシン残基は、多様な細胞シグナル伝達応答を調節する特異的な一連のシグナル伝達タンパク質(例えば、ＳＨ２(Ｓｒｃ相同性２)ドメインおよびＰＴＢ(リン酸化チロシン結合)ドメイン)の認識および動員の基盤として役立つ。非受容体チロシンキナーゼは、異なるアダプタータンパク質モチーフを有するモジュラーＮ末端を備えた通常保存された触媒ドメイン(ＲＴＫと同様)を有する。チロシンキナーゼは、細胞発達、分化、増殖、生存、成長、アポトーシス、細胞形成、接着、移動、細胞周期制御、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化、血管新生、細胞外刺激に対する応答、神経伝達物質のシグナル伝達、血小板活性化、転写ならびにグルコース摂取を含む基本的な細胞プロセスの調節に重要な役割を担っている(Ｈｕｎｔｅｒ Ｔ.Ｐｈｉｌｏｓ.Ｔｒａｎｓ.Ｒ.Ｓｏｃ.Ｌｏｎｄ.、Ｂ Ｂｉｏｌ.Ｓｃｉ.３５３(１９９８)、ｐｐ.５８３〜６０５)。通常のホメオスタシスにおいてそれらが中心的役割を担うとすれば、発達異常(頭蓋骨癒合症候群その他)、免疫不全(重症複合免疫不全病(ＳＣＩＤ)、遺伝性無ガンマグロブリン症)、非インシュリン依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)、アテローム性動脈硬化、乾癬、腎疾患、神経疾患、白血病および固形癌を含むいくつかのヒト障害に関与することはおそらく驚くべきことではない(Ｍａｄｈｕｓｕｄａｎ Ｓ.およびＧａｎｅｓａｎ ＴＳ.Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ.２００４ Ｊｕｌ、３７(７)：６１８〜３５）。
【００１４】
【表１−１】
0005524481.tif 000002
【００１５】
【表１−２】
0005524481.tif 000003
【００１６】
【表２−１】
0005524481.tif 000004
【００１７】
【表２−２】
0005524481.tif 000005
【００１８】
チロシンキナーゼは、細胞の発癌形質転換に中心的な役割を担っている。これは、いくつかの方法で実現される(Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｐ.他、Ｎａｔｕｒｅ ４１１(２００１)、ｐｐ.３５５〜３６５)。ＰＴＫの遺伝子増幅および／または過剰発現(例えば、いくつかの癌で通常見られるＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２の過剰発現)は、チロシンキナーゼ活性の増加を引き起こし、下流シグナル伝達の定量的および定性的な改変を伴う。ゲノム再構成(染色体転座など)は、構成的活性型キナーゼ活性を備えた融合タンパク質をもたらすことができる(例えば、慢性骨髄性白血病に見られるｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質)。キナーゼドメインまたは細胞外ドメイン内のＰＴＫの機能獲得型(ＧＯＦ)変異または欠失は、構成的活性型チロシンキナーゼを生じる(例えば、細胞外ドメインのアミノ酸６〜２７３を欠失したＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体は、構成的活性型であり、固形腫瘍に見られる)。リガンドの過剰発現による自己分泌−パラ分泌刺激は、持続性チロシンキナーゼ刺激を生じる(例えば、ＴＧＦ−は、神経膠芽種ならびに頭部および頚部の癌で過剰発現する(Ｇｒａｎｄｉｓ Ｊ.Ｒ.他、Ｊ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.６９(１９９８)、ｐｐ.５５〜６２)。最後に、構造変化の調節解除に伴うＰＴＫ対応癌原遺伝子のレトロウイルスによる形質導入は、動物(齧歯類および鶏)で生じる癌遺伝子形質転換の一般的な機構である(Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｐ.他、Ｎａｔｕｒｅ ４１１(２００１)、ｐｐ.３５５〜３６５)。
【００１９】
非常に多数の(受容体型および非受容体型両方の)チロシンキナーゼが癌に関係している。臨床研究によって、チロシンキナーゼの過剰発現／調節解除は、患者において予後的／予測的価値を有し得る（すなわち、侵襲性腫瘍の生物学的特徴を示すか、または治療に対する応答性の低さおよび生存の短さを予測できる）。チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーは最も多岐にわたって研究されている。ＥＧＦＲ(ＨＥＲ−１)過剰発現は、卵巣癌、頭部および頚部の癌、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、胃癌および子宮内膜癌の予後不良と関係がある(Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｒ.Ｉ他、Ｅｕｒ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ ３７ Ｓｕｐｐｌ.４(２００１)、ｐｐ.Ｓ９〜Ｓ１５)。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳癌(Ｔａｎｄｏｎ Ａ.Ｋ.他、Ａ.Ｋ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌ.７(１９８９)、ｐｐ.１１２０〜１１２８)、卵巣癌(Ｍｅｄｅｎ Ｈ.他、Ｅｕｒ.Ｊ.Ｏｂｓｔｅｔ.Ｇｙｎｅｃｏｌ.Ｒｅｐｒｏｄ.Ｂｉｏｌ.７１(１９９７)、ｐｐ.１７３〜１７９)、前立腺癌(Ｓａｄａｓｉｖａｎ Ｒ.他、Ｊ.Ｕｒｏｌ.１５０(１９９３)、ｐｐ.１２６〜１３１)、肺癌(Ｓｅｌｖａｇｇｉ Ｇ.他、Ｃａｎｃｅｒ ９４(２００２)、ｐｐ.２６６９〜２６７４)および骨癌(Ｚｈｏｕ Ｈ.他、Ｊ.Ｐｅｄｉａｔｒ.Ｈｅｍａｔｏｌ.Ｏｎｃｏｌ.２５(２００３)、ｐｐ.２７〜３２)の患者における予後不良と関係がある。Ｃ−ＫＩＴチロシンキナーゼにおける変異は、消化管間質腫瘍の患者における生存の低さに関係し（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ.他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.５９(１９９９)、ｐｐ.４２９７〜４３）、急性骨髄性白血病における再発率に悪影響を及ぼす(Ｃａｒｅ Ｒ.Ｓ.他、Ｂｒ.Ｊ.Ｈａｅｍａｔｏｌ.１２１(２００３)、ｐｐ.７７５〜７７７)。小細胞肺癌では、Ｃ−ＫＩＴ発現が生存率の低さと関係していた(Ｎａｅｅｍ Ｍ.他、Ｈｕｍ.Ｐａｔｈｏｌ.３３(２００２)、ｐｐ.１１８２〜１１８７）。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２と共にＩＧＦ−１Ｒの発現は、結腸癌患者の一部において予後的価値を有し得る(Ｐｅｔｅｒｓ Ｇ.他、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ.(２００３)。急性骨髄性白血病では、ＦＬＴ３変異は、高い再発率および無再発生存率の低さを予測する(Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ Ｓ.他、Ｂｌｏｏｄ １００(２００２)、ｐｐ.５９〜６６)。ＶＥＧＦは、腫瘍血管新生を引き起こす主要な増殖因子であり、固形癌における重要な予後マーカーである(Ｆｏｘ Ｓ.Ｂ.他、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ.２(２００１)、ｐｐ．２７８〜２８９)。最近の研究で、肺癌におけるＶＥＧＦＲ３発現は著しく低い生存率と関係があり(Ａｒｉｎａｇａ Ｍ.他、Ｃａｎｃｅｒ ９７(２００３)、ｐｐ.４５７〜４６４)、結腸癌では予後的に重要でありうる(Ｐａｒｒ Ｃ.他、Ｉｎｔ.Ｊ.Ｏｎｃｏｌ.２３(２００３)、ｐｐ.５３３〜５３９)ことが示唆された。Ｔｒｋチロシンキナーゼは、神経芽細胞種(ＮＢ)の重要なマーカーである。ＴｒｋＡは、好ましい生物学的特性を備えたＮＢに存在し、患者生存率と高い相関性があるが、一方、ＴｒｋＢはＭＹＣＮ増幅を伴う好ましくない侵襲性のＮＢで主に発現している(Ｅｇｇｅｒｔ Ａ.他、Ｋｌｉｎ.Ｐａｄｉａｔｒ.２１２(２０００)、ｐｐ.２００〜２０５)。ＨＧＦＲ(Ｍｅｔ)過剰発現は、早期浸潤性子宮頸癌における疾患予後、再発および生存率の低さと関係があり(Ｂａｙｃ��ｌ Ｃ.他、Ｇｙｎｅｃｏｌ.Ｏｎｃｏｌ.８８(２００３)、ｐｐ.１２３〜１２９)、滑膜肉腫における予後不良と関係があり（Ｏｄａ Ｙ.他、Ｈｕｍ.Ｐａｔｈｏｌ.３１(２０００)、ｐｐ.１８５〜１９２)、肝細胞癌における５年生存率の有意な低さを予測する(Ｕｅｋｉ Ｔ.他、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５(１９９７)、ｐｐ.８６２〜８６６)。Ａｘｌチロシンキナーゼ発現は、急性骨髄性白血病における予後不良と関係があった(Ｒｏｃｈｌｉｔｚ Ｃ.他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３(１９９９）、ｐｐ.１３５２〜１３５８)。Ｔｉｅ−１キナーゼ発現は、胃癌(Ｌｉｎ Ｗ.Ｃ.他、Ｃｌｉｎ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.５(１９９９)、ｐｐ.１７４５〜１７５１)および早期慢性期慢性骨髄性白血病(Ｖｅｒｓｔｏｖｓｅｋ Ｓ.他、Ｃａｎｃｅｒ ９４(２００２)、ｐｐ.１５１７〜１５２１)における生存率と逆相関している。可溶性Ｔｉｅ−２受容体レベルは独立して、頭部および頚部の扁平上皮細胞における局所領域的再発を予測する(Ｈｏｍｅｒ Ｊ.Ｊ.他、Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ ２４(２００２)、ｐｐ.７７３〜７７８)。ＡＬＫタンパク質発現は、生存率の独立した予測変数であり、未分化大細胞型リンパ腫の範囲内の特異的疾病の有用な生物学的マーカーとして役立つ(ＡＬＣＬ、Ｇａｓｃｏｙｎｅ Ｒ.Ｄ.他、Ｂｌｏｏｄ ９３(１９９９)、ｐｐ.３９１３〜３９２１)。Ｓｒｃチロシンキナーゼは、ヒト結腸癌の全病期における臨床的予後不良の独立した指標である(Ａｌｉｇａｙｅｒ Ｈ.他、Ｃａｎｃｅｒ ９４(２００２)、ｐｐ.３４４〜３５１)。ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼは、予後的に価値があり、慢性骨髄性白血病(Ｏｌａｖａｒｒｉａ Ｅ.他、Ｂｌｏｏｄ ９７(２００１)、ｐｐ.１５６０〜１５６５およびＯ'Ｄｗｙｅｒ Ｍ.他、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ７ Ｓｕｐｐｌ.１(２００２)、ｐｐ.３０〜３８)および急性リンパ芽球性白血病(Ｇｌｅｉｓｓｎｅｒ Ｂ.他、Ｂｌｏｏｄ ９９(２００２)、ｐｐ.１５３６〜１５４３)を含む血液学的腫瘍の治療に対する応答性を予測する。ＦＡＫ過剰発現は、食道扁平上皮細胞癌における腫瘍浸潤およびリンパ節転移と相関しており(Ｍｉｙａｚａｋｉ,Ｔ.他、Ｂｒ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ ８９(２００３)、ｐｐ.１４０〜１４５)、Ｓｙｋ遺伝子の発現減少は、乳癌における予後不良と相関している(Ｔｏｙａｍａ Ｔ.他、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ.１８９(２００３)、ｐｐ.９７〜１０２)。
【００２０】
チロシンキナーゼを標的とするいくつかのアプローチが開発されてきた。チロシンキナーゼドメイン阻害剤、チロシンキナーゼ受容体遮断薬(例えば、モノクローナル抗体)、リガンド調節因子(例えば、モノクローナル抗体)、ＲＮＡ干渉およびアンチセンス技術、遺伝子治療戦略、Ｓｒｃチロシンキナーゼの阻害剤、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、下流情報伝達経路阻害剤は、癌治療の有望な戦略である。作用様式に基づいたこのような阻害剤の分類を表３にまとめて示す。受容体チロシンキナーゼは多領域タンパク質である。触媒ドメイン(Ｍｇ−ＡＴＰ複合体結合部位)は近年薬剤設計の最も有望な標的となってきた。化合物ライブラリーのランダムスクリーニングによって、触媒ドメインの小分子化学阻害剤が最初に同定された。コンビナトリアル化学、インシリコクローニング、構造をベースにした薬剤設計およびコンピュータ化学は現在、リード化合物同定およびこれらの阻害剤の最適化に不可欠な手段となっている。阻害剤をスクリーニングするための高感度、正確かつ信頼性の高いハイスループットアッセイ（シンチレーション近接アッセイ、蛍光偏光アッセイ、均一時間分解蛍光測定法および不均一時間分解解離増強蛍光技術(ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｄｉｓｓｏｃａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)(Ｆ.Ａ.Ａｌ−ＯｂｅｉｄｉおよびＫ.Ｓ.Ｌａｍ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９(２０００)、ｐｐ.５６９０〜５７０１)を含む）が開発された。タンパク質キナーゼの３次構造に関する知識は増大しており、５０個を超えるタンパク質キナーゼのＸ線結晶学的構造が解析されている。「ＡＴＰ結合部位」の様々な部分（アデニン領域、糖領域、疎水性ポケット、疎水性溝およびリン酸結合領域）の分子相互作用の理解が、薬剤開発を加速させてきた(Ｆａｂｂｒｏ Ｄ.他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.Ｔｈｅｒ.９３(２００２)、ｐｐ.７９〜９８）。
【００２１】
【表３−１】
0005524481.tif 000006
【００２２】
【表３−２】
0005524481.tif 000007
【００２３】
ＡＴＰ結合部位は、チロシンキナーゼの中で高く保存されているが、キナーゼドメイン構造における小さな違いが選択性の高い阻害剤の開発を可能にしている(Ｌｅｖｉｔｚｋｉ Ａ.Ｅｕｒ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ ３８ Ｓｕｐｐｌ.５(２００２)、ｐｐ.Ｓ１１〜Ｓ１８)。阻害剤ＯＳＩ−７７４(Ｔａｒｃｅｖａ(商標))と一緒に結晶化したＥＧＦＲに関するデータが最近発表され、この化合物の作用機構に有益な知識がもたらされた(Ｓｔａｍｏｓ Ｊ.他、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７７(２００２)、ｐｐ.４６２６５〜４６２７２)。臨床開発における最も小さい分子が、ＡＴＰのアデニン部分の結合を模倣するために骨格の一部を使用して、標的キナーゼのＡＴＰ結合部位の近辺に結合する。このようなＡＴＰ模倣体は、触媒ドメイン内の基質結合部位の競合的阻害剤であり(Ｌａｉｒｄ Ａ.Ｄ.他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.Ｄｒｕｇｓ １２(２００３)、ｐｐ.５１〜６４およびＦｒｙ Ｄ.Ｗ.Ｅｘｐ.Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ.２８４(２００３)、ｐｐ.１３１〜１３９)、(しばしば細胞中にミリモルレベルで存在する)内在性ＡＴＰと競合して結合する。早期の潜在的リード化合物は溶解性が低く、最適な標的阻害を必要とする患者において適切な血漿レベルを実現し維持するためには、継続して複数回投与する計画が必要であった。溶解性を高めるため、新たな化合物が製造されたが、キナーゼドメインに対する親和性は減少した。これらの問題を回避するために、キナーゼドメインに選択的阻害剤を共有結合させて、触媒活性が完全に消失した効力のある薬剤に変換することを期待して、不可逆的な阻害剤を現在開発中である(Ｄｅｎｎｙ Ｗ.Ａ.他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.Ｔｈｅｒ.９３(２００２)、ｐｐ.２５３〜２６１)。このような阻害剤２種が開発の実用段階にある(ＣＩ−１０３３)(Ｐｆｉｚｅｒ)およびＥＫＢ−５６９(Ｗｙｅｔｈ)で、それぞれＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２に不可逆的に結合する(Ｌａｉｒｄ Ａ.Ｄ.他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.Ｄｒｕｇｓ １２(２００３)、ｐｐ.５１〜６４)。複数のチロシンキナーゼを標的とする小分子も開発されており、これらは複数の経路を遮断し、増強された抗癌作用を生じる潜在力を備えている(表３)。ＰＫＩ−１６６は、ＥＧＦＲを阻害し、ＨＥＲ−２(Ｍｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆ Ｉ.Ｋ.他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.６２(２００２)、ｐｐ.５２５４〜５２５９ＣＩ−１０３３)は汎用ＥｒｂＢ阻害剤であり(Ｓｌｉｃｈｅｎｍｙｅｒ，Ｗ.Ｊ.他、Ｓｅｍｉｎ.Ｏｎｃｏｌ.２８(２００１)、ｐｐ.８０〜８５)、ＳＵ６６６８はＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲを阻害し(Ｈｏｅｋｍａｎ Ｋ.他、７ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ.Ｓｕｐｐｌ.３(２００１)、ｐｐ.Ｓ１３４〜Ｓ１３、ＳＴＩ５７１はＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｃ−ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲおよびＡＲＧを阻害する(Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ,Ｅ.他、Ｅｕｒ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ ３８ Ｓｕｐｐｌ.５(２００２)、ｐｐ.Ｓ２８〜Ｓ３６、およびＮｉｓｈｉｍｕｒａ Ｎ.他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２(２００３)、ｐｐ.４０７４−４０８２。
【００２４】
１９８０年代、最初の天然チロシンキナーゼ阻害剤ケルセチンおよびゲニステインが報告された(Ａｋｉｙａｍａ Ｔ.他、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６２(１９８７)、ｐｐ.５５９２〜５５９５およびＪ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｊ.Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌ.２０(２００２)、ｐｐ.１Ｓ〜１３Ｓ)。
【００２５】
それ以来、数え切れないほど多くの天然および合成の小分子阻害剤が報告されてきた。チロシンキナーゼ阻害剤は、天然産物および関連誘導体(ケルセチン、ゲニステイン、スタウロスポリン、エルバスタチン、クラビラクトン)、キナゾリン、ピリドピリミジンおよび関連複素環(例えばＺＤ１８３９)、フェニルアミノピリミジン(例えばＳＴＩ５７１)、チロホスチンおよび類似体(例えば、ＳＵ１４９８、ＳＵ１０１、ＳＵ００２０)、インドールおよびオキシインドール(例えばＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ５４０２、Ｆ.Ａ.ＡＩ−ＯｂｅｉｄｉおよびＫ.Ｓ.Ｌａｍ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９(２０００)、ｐｐ.５６９０〜５７０１)に大きく分類することができる。
【００２６】
小分子キナーゼ阻害剤の開発における主な問題の１つは、特異性である(ＭｃＭａｈｏｎ他、(１９９８)Ｃｕｒｒ.Ｏｐ.ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖ.１(２)、１３１〜１４６)。ほとんどの化合物は最近、キナーゼの保存性の高いＡＴＰ結合部位を標的としているので、その種の複数の酵素に結合し、阻害する傾向がある。５００種を超えるヒトタンパク質キナーゼがあり(Ｍａｎｎｉｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ(２００２)２９８、１９１２)、複数のキナーゼ(または「間違った」キナーゼ)の阻害が副作用を引き起こすので、化合物の特異性を評価することは非常に重要である。しかし、ほとんどの「標的外」相互作用は予測不可能で、従来の実験によるキナーゼ活性測定法の開発は非常に時間と資源を消費することが問題であった。結果的に、化合物特異性を評価することが非常に重要であるにもかかわらず、総合的かつ系統的に実施することは、不可能でないにしても極めて困難である。タンパク質キナーゼは、真核細胞のほとんどの細胞シグナル伝達経路の鍵となる調節因子である。多くのタンパク質キナーゼ阻害剤が開発され、シグナル伝達経路における、および有望な治療薬としてのキナーゼの特異的機能が研究されてきた(Ｃｏｈｅｎ,Ｐ.(２００２)Ｎａｔ.Ｒｅｖ.Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ.１、３０９〜３１５)。タンパク質キナーゼスーパーファミリーが大きいこと(ヒトで５００超)、およびほとんどのキナーゼ阻害剤が保存性の高いＡＴＰ結合ポケットに結合するという事実から、キナーゼ阻害剤は複数の標的を阻害することが広く受け入れられている(Ｄａｖｉｅｓ,Ｓ.Ｐ.、Ｒｅｄｄｙ,Ｈ.、Ｃａｉｖａｎｏ,Ｍ.＆Ｃｏｈｅｎ,Ｐ.(２０００)Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.３５１、９５〜１０５)。結果として、理解が不十分であることが多いシグナル伝達経路におけるキナーゼの役割を調べる化学的手段として使用された阻害剤は、裏を返せば、特異性の特徴づけが不完全である。同様のことがキナーゼ活性化因子にも当てはまる。本発明はまた、１腔中の複数のキナーゼのキナーゼ活性化因子を並行してプロファイルするために有用である。
【００２７】
発明の最良の実施形態
上記の問題は、(１腔において１００個までの)非常に多数のヒトキナーゼに対する多くの化合物の試験を可能にする測定様式によって解決される。この測定は、特異性の効率的、定量的、総合的および体系的な評価を可能にする。少数のキナーゼのみに対する試験に基づいて化合物特異性を全体的に推定することはもはや必要ない。特異性のプロファイリングは、薬剤開発プロセスの早期および開発方針全体に沿って組み入れることができ、特異性は、体系的かつ迅速に、より多くの化合物について評価することができる。このこれまでにない能力によって、医化学と分子試験との間の緊密なフィードバックが可能になる。効力および特異性は並行して最適化することができ、はるかに少ない時間で品質のより高い前臨床候補をもたらすことができる。
【００２８】
既存の後期候補または薬剤の特異性を総合的に評価することによって、これらの確認済み化合物の今までに知られていない標的も明らかにすることができる。新規標的を同定することによって、新たな徴候を示唆することができる場合があり、公知の、主要な標的では説明できなかった副作用の原因も明らかにすることができる場合もある。
【００２９】
本発明の対象は、小分子キナーゼ阻害剤または活性化剤の開発において、主な障害の１つである特異性プロファイリング先への新たな取り組みであり、重要な種類の新薬の開発に重大な影響を及ぼすことが期待される。
【００３０】
本発明の対象は、チロシンキナーゼの自己リン酸化を検出するサンドイッチ−ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)技術と細胞溶解物などのタンパク質混合物中の特定のタンパク質を同定するＬｕｍｉｎｅｘ(商標)−ｘＭＡＰ検出システムとを組み合わせた測定法である。この測定法によって、例えば、１腔中の細胞溶解物の様々なキナーゼ１００種までについて、潜在的キナーゼ阻害剤の存在下でのＲＴＫまたはＮＴＫの自己リン酸化の有無の検出が可能となる。この測定様式によって、抗ホスホチロシン抗体で１腔におけるリン酸化状態を検出することによって、１００個までの異なるチロシンキナーゼについて、潜在的キナーゼ阻害剤をプロファイリングすることが可能となる。例えば、この測定法によって、ウェル当たり１００種までのキナーゼに対して、１ＨＴＳの９６種の異なる潜在的キナーゼ阻害剤について、９６ウェルプレートにおけるサンドイッチ−ＥＬＩＳＡでプロファイリングを実施することが可能である。関心のあるチロシンキナーゼ受容体の活性化(すなわち、自己リン酸化)を測定する測定法は、ＥＰ０７３０７４０に記載されており、以下のステップを含む。
【００３１】
ａ）細胞培養物または動物材料からの実質的に均一な細胞が第１の固相に接着するように、第１の固相をその細胞集団でコーティングする。この細胞は、内因性チロシンキナーゼを有するか、またはチロシンキナーゼをコードしているＤＮＡで形質転換されており、このＤＮＡは、チロシンキナーゼ構築物が細胞膜または細胞の細胞質ゾルに存在するように発現した。ｂ）次に、チロシンキナーゼがリガンドに曝露するように、リガンドを前記接着細胞を有する固相に添加する。ｃ）リガンドに曝露した後、接着細胞を可溶化し、それによって細胞溶解物を放出させる。ｄ）第２の固相を、特異的抗体として、チロシンキナーゼか、または受容体構築物の場合はポリペプチドエピトープタグに特異的に結合する捕捉因子でコーティングする。ｅ）ウェルにチロシンキナーゼを捕捉するために、ステップｃ）で得られた細胞溶解物を、接着捕捉因子を含有するウェルに添加する。ｆ）次に、未結合の細胞溶解物を除去し、捕捉されたチロシンキナーゼを遊離するために、洗浄ステップを実施する。ｇ）捕捉されたチロシンキナーゼ構築物を、チロシンキナーゼ中のリン酸化残基を同定する標識化抗ホスホチロシン抗体に曝露する。ｈ）捕捉されたチロシンキナーゼに対する抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する。１個のウェル中で１００種までのチロシンキナーゼの自己リン酸化状態の並行検出を可能にする本発明で使用した捕捉因子は、Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)−ｘＭａｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。この捕捉因子は、結合タンパク質でコーティングしたビーズまたは小球体であることができる。結合したタンパク質は、最も一般的にはタンパク質またはポリヌクレオチドなどの生体分子である。この生体分子は、場合によって天然に生じる、組換え、または合成された生体分子であってよい。抗体または抗体断片は、タンパク質−捕捉因子として非常に適している。結合タンパク質はまた、アプタマーまたはアンチカリンまたはその他の任意の結合分子であることができる。Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)−ｘＭａｐ技術は、２種類の蛍光色素の比によって特徴づけられた色素を互いに備えた１００種の異なるビーズまたは小球体を生成するために、２種類の蛍光色素の正確な比を使用する証明済み多重基盤である。各群は、２種類の異なる色素の内部蛍光色素比に基づいて区別され、したがって、特異的抗体または特定のチロシンキナーゼに対するモノクローナル抗体のような特有の生物学的試薬に結合することができる。ビーズまたは小球体表面に結合した抗体は、既に記載したサンドイッチＥＬＩＳＡ試験において、捕捉試薬として役立つ。異なるキナーゼに特異的なそれぞれの抗体は、各特異的抗体−小球体複合体について異なる色を生じる様々な蛍光色素比でビーズ表面に結合した。この蛍光色は、限定されたキナーゼの特定のエピトープを認識して結合する特異的抗体の抗原として役立つ特定のキナーゼに割り当てることができる。
【００３２】
リン酸化チロシンを認識するリン酸特異的抗体は一般的に、チロシンキナーゼの自己リン酸化の測定のために使用された。リン酸特異的抗体はビオチン化され、小球体の蛍光色素から区別することができるストレプトアビジン結合２次蛍光標識（例えば、フィコエリトリン）によって検出することができる。
【００３３】
リン酸特異的抗体は、広く市販されており(例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｉｎｃ.；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ,Ｉｎｃ.；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｉｎｃ.；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｉｎｃ.から入手できる）、当業界の周知の技術によって生成することもできる。
【００３４】
各捕捉キナーゼの自己リン酸化は、特有の蛍光色素で色づけされた小球体のすべておよびビオチン化抗リン酸化チロシン抗体に結合したストレプトアビジン結合蛍光マーカーを検出することができる装置によって分析される。これらの装置は、当業界では周知である。Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)装置は様々な蛍光リポーターシグナルを検出する。Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)装置では、ビーズは２本のレーザービームを迅速に通過し、そこで高速デジタルシグナル処理装置が２種類の蛍光シグナル(小球体のシグナルおよび抗リン酸化チロシン抗体のシグナル)または１種類の蛍光シグナル(小球体のシグナルのみ)を有するビーズ間を区別する。自己リン酸化現象の場合、リン酸特異的抗体は、特定のビーズに結合した特異的抗体によって捕捉されたリン酸化キナーゼに結合することができ、２種類の蛍光シグナルを検出することができる。自己リン酸化現象がない場合、小球体シグナルのみをレーザーによって検出することができる。
【００３５】
自己リン酸化を遮断する添加された特定のキナーゼ阻害剤によって阻害された試験細胞溶解物中のキナーゼはすべて小球体シグナルのみを示し、試験したキナーゼ阻害剤によって阻害されるチロシンキナーゼとして認識することができる。試験したキナーゼ阻害剤は、両方のシグナルを示すキナーゼは阻害しない。キナーゼ阻害剤を含まない同一の対照細胞溶解物では、試験溶解物中で１種類のシグナルのみを示すキナーゼは両方のシグナル(小球体のシグナルおよび抗リン酸化チロシン抗体のシグナル)を示す。これらのキナーゼは、細胞溶解物中のキナーゼ群であり、試験した特定の阻害剤によって阻害される。
【００３６】
細胞中のキナーゼの活性化は、組織培養研究室で広く使用されている周知の技術である。牛胎児血清またはその他の血清を除去すると細胞は飢餓状態になる。飢餓の後、牛胎児血清(ＦＣＳ)またはその他の血清を加えることによってキナーゼの活性化を誘導する。この活性化はまた、増殖因子およびサイトカイン、例えば、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、インシュリン、様々なインターロイキンおよびインターフェロンによって誘導することができる。この増殖因子およびサイトカインは、複数のキナーゼを誘導するために、カクテルとして適用しなければならない。活性化によって、様々なキナーゼの自己リン酸化が生じる。
【００３７】
本発明の他の態様では、これらのキナーゼを小球体に直接結合させる。これらの結合は、グルタチオンによってコーティングされたときはグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼのような融合タンパク質によって、または６×ヒスチジンタグでコーティングされた場合は抗ヒスチジン抗体によって実現することができる。結合後、ＡＴＰの存在下でキナーゼ自己リン酸化反応が生じる。
【００３８】
本発明の主要な実施形態は、キナーゼ阻害剤の存在下での前記キナーゼ阻害剤の非存在下と比較した１種または複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化の測定方法であって、この方法は、
（ａ）血清除去によって細胞を飢餓状態にするステップと、
（ｂ）キナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、血清、増殖因子および／またはサイトカインを添加することによってキナーゼ自己リン酸化活性を誘導するステップと、
（ｃ）細胞を可溶化して、それによって細胞から細胞溶解物を遊離させるステップと、
（ｄ）様々なチロシンキナーゼ特異的結合タンパク質を添加することによって、細胞溶解物中のキナーゼを捕捉するステップであって、様々な結合タンパク質それぞれが特有の色素と結合しているステップと、
（ｅ）ｄ）の特有の色素のいずれかから区別できるマーカーでタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｆ）ｄ）の特有の色素およびｅ）のリン酸化チロシン特異的抗体のマーカーを有する自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｇ）キナーゼ阻害剤の存在下での誘導から生じたｆ）の自己リン酸化チロシンキナーゼと前記キナーゼ阻害剤の非存在下での誘導を比較するステップとを含む。
【００３９】
それらの変法は、キナーゼ阻害剤の存在下での前記キナーゼ阻害剤の非存在下と比較した１種または複数のチロシンキナーゼの自己リン酸化の測定方法であって、この方法は、
（ａ）限定されたチロシンキナーゼを特有の色素に結合するステップと、
（ｂ）キナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で、キナーゼ反応をするステップと、
（ｃ）ａ）の特有の色素のいずれかから区別できるマーカーにタグ付けしたリン酸化チロシン特異的抗体を添加するステップと、
（ｄ）ａ）の特有の色素およびｃ）のリン酸化チロシン特異的抗体のマーカーを有する自己リン酸化チロシンキナーゼを同定するステップと、
（ｅ）キナーゼ阻害剤の存在下での誘導から生じたｄ）の自己リン酸化チロシンキナーゼと前記キナーゼ阻害剤の非存在下での誘導を比較するステップとを含む。
【００４０】
使用した色素は好ましいが、蛍光色素またはルミネセンス色素に限定はしない。
【００４１】
本発明の他の実施形態では、細胞飢餓の前に、細胞中でリン酸化を誘導することができるタンパク質のポリペプチドをコードする核酸で形質転換する。
【００４２】
この細胞は、真核細胞であることができ、好ましい実施形態では、この細胞は哺乳類細胞である。
【００４３】
本発明の他の実施形態は、並行して１から１００個の異なるキナーゼの自己リン酸化を測定するために、捕捉抗体が特異的に結合できるエピトープを有する限定されたチロシンキナーゼに特異的に結合する１個の異なる捕捉抗チロシンキナーゼ抗体とそれぞれ結合した１から１００個の特有の色素を含有する組成物である。
【００４４】
並行して１から１００個の異なるキナーゼの自己リン酸化を測定するための特有の色素の数は、１と１００との間であることができる。
【００４５】
並行して測定できるキナーゼの好ましい数は、１から２０、１から４０、１から６０および１から８０個の間のキナーゼである。
【００４６】
本発明の他の実施形態は、キナーゼ阻害剤の特異性をプロファイリングする前述の方法で使用するためのキットであって、
（ａ）捕捉抗体が特異的に結合できるエピトープを有する限定されたチロシンキナーゼに特異的に結合する異なる捕捉抗チロシンキナーゼ抗体と結合した１から１００個の特有の色素の組成物、および
（ｂ）ａ）の色素から区別可能な色素で標識された抗リン酸化チロシン抗体を含むキットである。
【００４７】
この方法、キットおよび組成物は、キナーゼ阻害剤の非存在下で１から１００個の異なるキナーゼの自己リン酸化の並行測定と比較した、キナーゼ阻害剤の存在下での１から１００個の異なるキナーゼの自己リン酸化の並行測定による、潜在的キナーゼ阻害剤それぞれの特異性プロファイリングに使用できる。Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)装置は、自己リン酸化の測定のために使用できる。キナーゼ阻害剤は、キナーゼ阻害剤の非存在下でのみ自己リン酸化を示すキナーゼを阻害できる。この方法は、マイクロタイタープレートで実施できる。
【００４８】
本発明の方法の他の使用は、腫瘍標本中の様々なキナーゼの自己リン酸化状態のプロファイリングである。様々なキナーゼの活性状態は、患者を治療するための診断および適切な治療方法に影響を与える手がかりとなる(Ｅｓｐｉｎａ Ｖ.他、(２００５)Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ、２３(１)、ｐｐ.３６〜４６)。この特定の場合、分析すべき試料は、タンパク質上清または腫瘍標本の溶解物(生検またはレーザー捕獲顕微解剖試料)、血液試料または動物材料である。分析は、キナーゼ阻害剤の非存在下で前述のように実施することができる。
【００４９】
図面の説明
図１は、４種の独立した実験(Ａ：ＥＧＦＲ−リン酸化、Ｂ：ＦＡＫ−リン酸化、Ｃ：ＩＧＦＲ１−リン酸化およびＤ：Ｍｅｔ−リン酸化)の結果を示す。自己リン酸化は、平均蛍光強度(ＭＦＩ)を測定することによって検出した。縦棒は、以下の実験設定のＭＦ１率を示す(淡灰色は、１腔中の蛍光色素小球体と結合した多数の捕捉抗体の設定であり、濃灰色は、１腔中の蛍光色素小球体と結合した１個の捕捉抗体の設定である)。
【００５０】
縦棒Ａ１（ＭＦＩ＝５３）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
ＥＧＦキナーゼ阻害剤および
ＥＧＦ。
【００５１】
縦棒Ａ２（ＭＦＩ＝１７）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
ＥＧＦキナーゼ阻害剤および
ＥＧＦ。
【００５２】
縦棒Ａ３（ＭＦＩ＝２１１９）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体および
ＥＧＦ
縦棒Ａ４（ＭＦＩ＝２２１３）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体およびＥＧＦ。
【００５３】
縦棒Ｂ１（ＭＦＩ＝３９）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
ＦＡＫ−キナーゼ阻害剤および
ＦＣＳ。
【００５４】
縦棒Ｂ２（ＭＦＩ＝３７）
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
ＦＡＫキナーゼ阻害剤および
ＦＣＳ。
【００５５】
縦棒Ｂ３（ＭＦＩ＝１１４３）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＦＣＳ、
縦棒Ｂ４（ＭＦＩ＝９５７）
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体およびＦＣＳ。
【００５６】
縦棒Ｃ１（ＭＦＩ＝３）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
ＩＧＦＲ−１キナーゼ阻害剤および
ＩＧＦ。
【００５７】
縦棒Ｃ２（ＭＦＩ＝３）
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲ１の捕捉抗体、
ＩＧＦＲ１キナーゼ阻害剤および
ＩＧＦ。
【００５８】
縦棒Ｃ３（ＭＦＩ＝６７３）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＩＧＦ
縦棒Ｃ４（ＭＦＩ＝５２９）
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体およびＩＧＦ。
【００５９】
縦棒Ｄ１（ＭＦＩ＝９）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
Ｍｅｔキナーゼ阻害剤および
ＨＧＦ。
【００６０】
縦棒Ｄ２（ＭＦＩ＝９）
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
Ｍｅｔ−キナーゼ阻害剤および
ＨＧＦ。
【００６１】
縦棒Ｄ３（ＭＦＩ＝８１７）
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＨＧＦ
縦棒Ｄ４（ＭＦＩ＝６７５）
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＨＧＦ。
【００６２】
図２
Ａ部
陽性対照の％で表したＥＧＦＲ（−◆−）、ＦＡＫ（−■−）、ＩＧＦＲ１（−▲−）およびＭｅｔ（−●−）の自己リン酸化の測定（１００％＝ＥＧＦＲ阻害剤の非存在下でのＥＧＦ活性化に対するＥＧＦＲの自己リン酸化）
濃度を増加させたＥＧＦＲ阻害剤の存在下でのＥＧＦ、ＩＧＦおよびＨＧＦとの共刺激（図の通り）。
【００６３】
Ｂ部
陽性対照の％で表したＥＧＦＲ（−◆−）、ＦＡＫ（−■−）、ＩＧＦＲ１（−▲−）およびＭｅｔ（−●−）の自己リン酸化の測定（１００％＝ＩＧＦＲ１阻害剤の非存在下でのＩＧＦ活性化に対するＩＧＦＲ１の自己リン酸化）
濃度を増加させたＩＧＦ１Ｒ阻害剤の存在下でのＥＧＦ、ＩＧＦおよびＨＧＦとの共刺激（図の通り）。
【００６４】
Ｃ部
陽性対照の％で表したＥＧＦＲ（−◆−）、ＦＡＫ（−■−）、ＩＧＦＲ１（−▲−）およびＭｅｔ（−●−）の自己リン酸化の測定（１００％＝Ｍｅｔ阻害剤の非存在下でのＨＧＦ活性化に対するＭｅｔの自己リン酸化）
濃度を増加させたＭｅｔ阻害剤の存在下でのＥＧＦ、ＩＧＦおよびＨＧＦとの共刺激（図の通り）。
【００６５】
図３
Ａ部
ＰＴＫ７８７キナーゼ阻害剤濃度を増加させたときの、陽性対照の％で表した、蛍光色素小球体と結合したＦＧＦＲ１（１）、ＦＧＦＲ２（２）、ＦＧＦＲ３（３）、ＩＧＦ１Ｒ（４）、Ｍｅｔ（５）、ＣＳＦ１Ｒ（６）触媒ドメインの自己リン酸化の測定（１００％＝キナーゼ阻害剤の非存在下での（ＤＭＳＯのみ）自己リン酸化）。
【００６６】
Ｂ部
ＰＴＫ７８７キナーゼ阻害剤濃度を増加させたときの、陽性対照の％で表した、蛍光色素小球体と結合したＩｎｓＲ（１）、ＶＥＧＦＲ１（２）、ＦＧＦＲ４（３）、ＰＤＧＦＲＡ（４）、ＰＤＧＦＲＢ（５）、Ｆａｋ（６）、Ｔｙｋ（７）、ＥＧＦＲ（８）触媒ドメインの自己リン酸化の測定（１００％＝キナーゼ阻害剤なしでの（ＤＭＳＯのみ）自己リン酸化）。
【００６７】
Ｃ部
ＰＴＫ７８７キナーゼ阻害剤濃度を増加させたときの、陽性対照の％で表した、蛍光色素小球体と結合したＴｉｅ２（１）、ＮＴＲＫ（２）、Ａｘｌ（３）、ＶＥＧＦＲ２（４）、Ｔｅｋ（５）、Ｒｏｓ１（６）触媒ドメインの自己リン酸化の測定（１００％＝キナーゼ阻害剤なしでの（ＤＭＳＯのみ）自己リン酸化）。
【００６８】
実施例
実施例１
細胞培養、阻害剤処理および細胞溶解物
ヒト腫瘍細胞系ＨＴ２９（結腸癌）は、ＡＴＣＣから入手し、牛胎児血清１０％を含有するダルベッコ変法イーグル培地中で、３７℃、５％ＣＯ2で維持した。阻害剤処理の１６から２０時間前に、牛胎児血清を含まない培地中でＨＴ２９細胞を飢餓状態にした。細胞をキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ阻害剤、ＦＡＫ阻害剤、ＩＧＦＲ１阻害剤またはＭｅｔ阻害剤）３０μＭと共に、または陽性対照としてキナーゼ阻害剤を含まない培地中で４５分間インキュベートした。
【００６９】
キナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲでは(３−クロロ−４−フルオロ−フェニル)−[７−メトキシ−６−(３−モルホリン−４−イル−プロポキシ)−キナゾリン−４−イル]−アミン(イレッサ)、Ｍｅｔでは５−(２,６−ジクロロ−フェニルメタンスルホニル)−３−[１−[３,５−ジメチル−４−((Ｒ)−２−ピロリジン−１−イルメチル−ピロリジン−１−カルボニル)−１Ｈ−ピロール−２−イル]−メス−(Ｚ)−イリデン]−１,３−ジヒドロ−インドール−２−オン(ＰＨＡ６６５７５２、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他(２００３)Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.(６３)、ｐｐ.７３４５〜７３５５)ならびにＦＡＫおよびＩＧＦＲ１ではＮ4−キノリン−３−イル−Ｎ2−(３,４,５−トリメトキシフェニル)−ピリミジン−２,４−ジアミンである。
【００７０】
キナーゼの活性化は、Ｍｅｔキナーゼでは対応するリガンドＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、またはＦＡＫキナーゼでは牛胎児血清１００ｎｇ／ｍｌによって、１０から１５分間惹起した。細胞を氷冷ＴＢＳで洗浄し、グリセロール１０％、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ（Ｓｉｇｍａ）１％、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ（Ｓｉｇｍａ）１％、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）０．１％、ベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）０．０１％を補給した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、ＮａＣｌ  １５０ｍＭに溶かした１％ＮＰ４０で、氷上で２０分間溶解した。
【００７１】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ビーズアッセイ
Ｌｕｍｉｎｅｘ小球体２．５×１０6個を製造者によって記載された通りに抗体５０μｇ／ｍｌと結合させた(ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＭＥＴおよびＦａｋの捕捉抗体は、Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｕｐｓｔａｔｅから入手した)。ウェル当たり抗体結合小球体１０００個をアッセイ緩衝液(ブロック試薬、Ｒｏｃｈｅ、Ｔｗｅｅｎ２０ １％)に溶かしたＨＴ２９細胞溶解物と４℃で一晩攪拌しながらインキュベートした。アッセイ緩衝液で洗浄ステップを３回行った後、リン酸化チロシン残基をビオチン化抗リン酸化チロシン抗体(室温で１時間攪拌、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)およびフィコエリトリン結合ストレプトアビジン(室温で４５分間攪拌、Ｄｉａｎｏｖａ)で検出した。小球体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)１００機器で製造者によって記載された通りに分析した。
【００７２】
適切なキナーゼ阻害剤を含んで、または含まないで、１回の実験または並行実験で自己リン酸化の測定を試験するために、以下の設定を試験した（図１も参照）。
【００７３】
Ａ１
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
ＥＧＦ−キナーゼ阻害剤および
ＥＧＦ。
【００７４】
Ａ２
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
ＥＧＦキナーゼ阻害剤および
ＥＧＦ。
【００７５】
Ａ３
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体および
ＥＧＦ
Ａ４
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体および
ＥＧＦ。
【００７６】
Ｂ１
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
ＦＡＫ−キナーゼ阻害剤および
ＦＣＳ。
【００７７】
Ｂ２
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
ＦＡＫ−キナーゼ阻害剤および
ＦＣＳ。
【００７８】
Ｂ３
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＦＣＳ
Ｂ４
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体およびＦＣＳ。
【００７９】
Ｃ１
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
ＩＧＦＲ１−キナーゼ阻害剤および
ＩＧＦ。
【００８０】
Ｃ２
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲ１の捕捉抗体、
ＩＧＦＲ１−キナーゼ阻害剤および
ＩＧＦ。
【００８１】
Ｃ３
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＩＧＦ
Ｃ４
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体およびＩＧＦ。
【００８２】
Ｄ１
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
Ｍｅｔ−キナーゼ阻害剤および
ＨＧＦ。
【００８３】
Ｄ２
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体、
Ｍｅｔ−キナーゼ阻害剤および
ＨＧＦ。
【００８４】
Ｄ３
蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＩＧＦＲの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＦＡＫの捕捉抗体、
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＨＧＦ
Ｄ４
蛍光色素小球体と結合したＭｅｔの捕捉抗体およびＨＧＦ。
【００８５】
実施例２
細胞培養、阻害剤処理および細胞溶解物
ヒト腫瘍細胞系ＨＴ２９(結腸癌)は、ＡＴＣＣから入手し、牛胎児血清１０％を含有するダルベッコ変法イーグル培地中で、３７℃、５％ＣＯ2で維持した。阻害剤処理の１６から２０時間前に、牛胎児血清を含まない培地中でＨＴ２９細胞を飢餓状態にした。細胞を様々な濃度のキナーゼ阻害剤(０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１．０μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、ＥＧＦＲ−阻害剤[図２Ａ]、ＩＧＦＲ１−阻害剤[図２Ｂ]およびＭｅｔ−阻害剤[図２Ｃ])と共に４５分間インキュベートした。キナーゼ阻害剤を含まないＤＭＳＯの陽性対照を参照キナーゼ活性(１００％)として使用する。
【００８６】
キナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲでは(３−クロロ−４−フルオロ−フェニル)−[７−メトキシ−６−(３−モルホリン−４−イル−プロポキシ)−キナゾリン−４−イル]−アミン(イレッサ)、Ｍｅｔでは５−(２,６−ジクロロ−フェニルメタンスルホニル)−３−[１−[３,５−ジメチル−４−((Ｒ)−２−ピロリジン−１−イルメチル−ピロリジン−１−カルボニル)−１Ｈ−ピロール−２−イル]−メス−(Ｚ)−イリデン]−１,３−ジヒドロ−インドール−２−オン(ＰＨＡ６６５７５２、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他(２００３) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.(６３)、ｐｐ.７３４５〜７３５５)およびＩＧＦＲ１ではＮ4−キノリン−３−イル−Ｎ2−(３,４,５−トリメトキシフェニル)−ピリミジン−２,４−ジアミンである。
【００８７】
キナーゼの活性化は、ＭｅｔキナーゼではＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ１００ｎｇ／ｍｌによって、１０から１５分間惹起した。細胞を氷冷ＴＢＳで洗浄し、グリセロール１０％、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ(Ｓｉｇｍａ)１％、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ(Ｓｉｇｍａ)１％、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ(Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ)０．１％、ベンゾナーゼ(Ｎｏｖａｇｅｎ)０．０１％を補給した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、ＮａＣｌ １５０ｍＭに溶かした１％ＮＰ４０で、氷上で２０分間溶解した。
【００８８】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ビーズアッセイ
Ｌｕｍｉｎｅｘ小球体２．５×１０6個を製造者によって記載された通りに抗体５０μｇ／ｍｌに結合させた(ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＭｅｔおよびＦａｋの捕捉抗体は、Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｕｐｓｔａｔｅから入手した)。ウェル当たり抗体結合小球体１０００個をアッセイ緩衝液(ブロック試薬、Ｒｏｃｈｅ、Ｔｗｅｅｎ２０ １％)に溶かしたＨＴ２９細胞溶解物と共に４℃で一晩攪拌しながらインキュベートした。アッセイ緩衝液で洗浄ステップを３回行った後、リン酸化チロシン残基をビオチン化抗リン酸化チロシン抗体(室温で１時間攪拌、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)およびフィコエリトリン結合ストレプトアビジン(室温で４５分間攪拌、Ｄｉａｎｏｖａ)で検出した。小球体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ(商標)１００機器で製造者によって記載された通りに分析した。
【００８９】
実施例３
構築物、細胞培養および細胞溶解物
ＩｎｓＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＦＧＦＲ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ｆａｋ、Ｔｙｋ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｍｅｔ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＮＴＫＲＫ１、Ａｘｌ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｅｋ、Ｒｏｓ１チロシンキナーゼの触媒ドメインを、Ｎ末端６×Ｈｉｓ親和性タグおよびＳタグと共に発現させるため、ベクターｐＩＥＸ１(Ｎｏｖａｇｅｎ)にサブクローニングした。Ｈｉ５昆虫細胞(ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１〜４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を、グルタミン１８ｍＭ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)中で２７℃で維持した。製造者によって記載された通りに、Ｈｉ５昆虫細胞１×１０6個をＤＮＡ２μｇおよびＧｅｎｅ Ｊｕｉｃｅ形質移入試薬(Ｎｏｖａｇｅｎ)１０μｌで一時的に形質移入した。４８時間後の形質移入細胞を氷冷ＴＢＳで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ(Ｓｉｇｍａ)１％、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ(Ｓｉｇｍａ)１％、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ(Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ)０．１％、ベンゾナーゼ(Ｎｏｖａｇｅｎ)０．０１％を補給した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、ＮａＣｌ １５０ｍＭに溶かした１％ＮＰ４０で氷上で１５分間溶解した。溶解物を３３６００×ｇで４５分間遠心した。上清をすぐに使用するか、またはグリセロール３０％で衝撃冷凍した。
【００９０】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ
製造者によって記載された通りに、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｌｕｍｉｎｅｘ小球体(Ｑｉａｇｅｎ)０．５μｌを組換えタンパク質を発現させた細胞溶解物と４℃で６０分間結合させた。特定のキナーゼの触媒ドメインそれぞれを特定の区別可能な小球体に結合させた。キナーゼ自己リン酸化反応は、測定用緩衝液(ＢＳＡ０．１％およびＢｒｉｊ３５  ０．０３％を補給したＭＯＰＳ２０ｍＭ、β−グリセロリン酸２５ｍＭ、ＥＧＴＡ５ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、バナジン酸ナトリウム１ｍＭ、ｐＨ７．２)に溶かしたＡＴＰ５μＭおよびＭｇＣｌ2４０ｍＭで３７℃で３０分間攪拌して開始した。キナーゼ自己リン酸化反応は、キナーゼ阻害剤(ＰＴＫ７８７)１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭの存在下で、または陽性対照としてキナーゼ阻害剤の非存在下(ＤＭＳＯのみ)で実施した。キナーゼ反応は、ＥＤＴＡ１５０ｍＭで停止した。検出緩衝液(ＰＢＳに溶かしたＢＳＡ１％、Ｂｒｉｊ３５  ０．０３％)で洗浄ステップを３回行った後、リン酸化チロシン残基をビオチン化抗リン酸化チロシン抗体(室温で１時間攪拌、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)およびフィコエリトリン結合ストレプトアビジン(室温で４５分間攪拌、Ｄｉａｎｏｖａ)で検出した。小球体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ100機器で製造者によって記載された通りに分析した。
【００９１】
１腔内でＰＴＫ阻害剤の存在下での並行実験で自己リン酸化の測定を試験するために、以下の設定を試験した（図３も参照）。
【００９２】
Ａ
グラフ１：蛍光色素小球体と結合したＦＧＦＲ１（触媒ドメイン）
グラフ２：蛍光色素小球体と結合したＦＧＦＲ２（触媒ドメイン）
グラフ３：蛍光色素小球体と結合したＦＧＦＲ３（触媒ドメイン）
グラフ４：蛍光色素小球体と結合したＩＧＦ１Ｒ（触媒ドメイン）
グラフ５：蛍光色素小球体と結合したＭｅｔ（触媒ドメイン）
グラフ６：蛍光色素小球体と結合したＣＳＦ１Ｒ（触媒ドメイン）。
【００９３】
Ｂ
グラフ１：蛍光色素小球体と結合したＩｎｓＲ（触媒ドメイン）
グラフ２：蛍光色素小球体と結合したＶＥＧＦＲ１（触媒ドメイン）
グラフ３：蛍光色素小球体と結合したＦＧＦＲ４（触媒ドメイン）
グラフ４：蛍光色素小球体と結合したＰＤＧＦＲＡ（触媒ドメイン）
グラフ５：蛍光色素小球体と結合したＰＤＧＦＲＢ（触媒ドメイン）
グラフ６：蛍光色素小球体と結合したＦａｋ（触媒ドメイン）
グラフ７：蛍光色素小球体と結合したＴｙｋ（触媒ドメイン）
グラフ８：蛍光色素小球体と結合したＥＧＦＲ（触媒ドメイン）。
【００９４】
Ｃ
グラフ１：蛍光色素小球体と結合したＴｉｅ２（触媒ドメイン）
グラフ２：蛍光色素小球体と結合したＮＴＲＫ１（触媒ドメイン）
グラフ３：蛍光色素小球体と結合したＡｘｌ（触媒ドメイン）
グラフ４：蛍光色素小球体と結合したＶＥＧＦＲ２（触媒ドメイン）
グラフ５：蛍光色素小球体と結合したＴｅｋ（触媒ドメイン）
グラフ６：蛍光色素小球体と結合したＲｏｓ１（触媒ドメイン）。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】４種の独立した実験（Ａ：ＥＧＦＲ−リン酸化、Ｂ：ＦＡＫ−リン酸化、Ｃ：ＩＧＦＲ１−リン酸化およびＤ：Ｍｅｔ−リン酸化）の結果を示すグラフである。
【図２】陽性対照の％で表したＥＧＦＲ、ＦＡＫ、ＩＧＦＲ１およびＭｅｔの自己リン酸化の測定を示す図である。
【図３】ＰＴＫ７８７キナーゼ阻害剤濃度を増加させたときの、陽性対照の％で表した、蛍光色素小球体と結合したＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、Ｍｅｔ、ＣＳＦ１Ｒ触媒ドメインの自己リン酸化の測定を示す図である。
【図１】
0005524481.tif 000008
【図２】
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【図３】
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