(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有してなる抗炎症剤であって、該物質が、ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する、ミンクルに対する抗体であり、該抗体が、配列番号：２で表されるヒトミンクルのアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるアミノ酸配列もしくは他の哺乳動物のオルソログにおける対応するアミノ酸配列を認識する、抗炎症剤。
【請求項２】
ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有してなる抗炎症剤であって、該物質が、ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する、配列番号：２で表されるヒトミンクルのアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるアミノ酸配列もしくは他の哺乳動物のオルソログにおける対応するアミノ酸配列を含むペプチドである、非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を阻止する、抗炎症剤。
【請求項３】
ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有してなる抗炎症剤であって、該物質が、ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する、SAP130に対する抗体である、抗炎症剤。
【請求項４】
ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有してなる抗炎症剤であって、該物質が、ミンクルの発現を阻害する、ミンクル遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイムまたはsiRNAである、非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を阻止する、抗炎症剤。
【請求項５】
ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有してなる抗炎症剤であって、該物質が、ミンクルとFcRγとの相互作用を阻害する、ミンクルの膜貫通ドメイン中の保存されたアルギニン残基を含む部位に結合する抗体である、抗炎症剤。
【請求項６】
非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を阻止する、請求項１または５に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
炎症性疾患の予防および／または治療のための、請求項１、３、５のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項８】
非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応による炎症性疾患の予防および／または治療のための、請求項２または４に記載の抗炎症剤。
【請求項９】
ミンクルもしくはその細胞外領域を含む断片とSAP130とを、被験物質の存在下および非存在下で接触させ、両条件下におけるミンクルもしくはその断片とSAP130との相互作用の程度を比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルもしくはその細胞外および膜貫通領域を含む断片とFcRγとを発現する細胞における、ミンクルもしくはその断片とFcRγとの相互作用の程度を測定・比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ミンクルおよびFcRγを介するシグナル伝達経路の活性化を指標として、ミンクルもしくはその断片とFcRγとの相互作用の程度を比較する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ミンクルおよびFcRγを介するシグナル伝達により活性化される転写因子が結合し得る塩基配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指標とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらにSAP130を共存させることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルを産生する細胞における該蛋白質またはそれをコードするmRNAの量を測定・比較することを特徴とする、非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルを産生する細胞における該蛋白質またはそれをコードするmRNAの量を測定・比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法であって、さらにSAP130を共存させることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
抗炎症作用を有する物質の選択のための、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を阻止する、抗炎症作用を有する物質の選択のための、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
被験動物より採取した試料中のSAP130量を測定することを特徴とする、非恒常性細胞死の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖認識受容体として知られるミンクル (Mincle; Macrophage inducible C-type lectin) の新規用途に関する。詳細には、本発明は、ミンクルの発現または機能 (非恒常性の死細胞から放出される蛋白質もしくはFc受容体共通γサブユニット (FcRγ) との相互作用) を阻害することによる炎症反応の抑制、ミンクルの発現または機能を指標とする炎症反応の調節物質、特に抗炎症作用を有する物質のスクリーニング方法、ならびに死細胞から放出されるミンクルと相互作用する蛋白質を指標とする非恒常性細胞死の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理学的なプログラム細胞死において、死んでいく細胞が炎症を誘発することなく急速に食細胞に飲み込まれ、消化される (非特許文献１) のと対照的に、放射線照射や組織損傷等の非感染性刺激によって引き起こされる過剰または非恒常性の細胞死では、好中球による組織の一過的な浸潤が誘発される (非特許文献２)。細胞がこの過剰または非恒常性の細胞死を認識し、適切に応答する分子機構は十分解明されていない。【０００３】
先天性免疫受容体のToll様受容体 (TLR) ファミリーはヒアルロナン、熱ショック蛋白質 (HSPs)、尿酸、フィブロネクチン、カルジオリピンならびにヌクレオソームおよび核内低分子リボヌクレオ蛋白質 (snRNPs) 等のDNA/RNA-蛋白質複合体等の、死細胞から放出される自己リガンドを認識すると報告された (非特許文献３)。これらのTLR-自己リガンド相互作用のうちのいくつかは、炎症性疾患に関わることが示されている。【０００４】
C型レクチンは、TLRとは別のファミリーの受容体であるが、死細胞の感知に関与し得る。これらの受容体は、病原体糖鎖のパターン認識受容体 (PRR) として、免疫において明確な役割を有する。さらに、最近の証拠から、それらが蛋白質、脂、無機質等のリガンドも認識し得ることが示唆されている。PRRとして作用することに加えて、骨髄性細胞で発現するC型レクチンのうちのいくつかは、死細胞の受容体としても機能する (非特許文献４)。それらの多くは、死細胞の一掃を促進する食細胞の受容体である。【０００５】
C型レクチン受容体のうちミンクル (Clec4eまたはClecsf9としても知られる) は、マクロファージで発現する2型膜貫通C型レクチン受容体である。以前の報告により、ミンクルの転写がいくつかの刺激および細胞のストレスに際して上昇し、転写因子NF-IL6 (C/EBPβ) によって発現が調節されることが示されたが (特許文献１、非特許文献５)、ミンクルの生理学的機能やその生理的リガンドは不明のままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１１２４８２公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Clin Invest 108, 957-62 (2001)
【非特許文献２】Oncogene 20, 7085-95 (2001)
【非特許文献３】Nat Rev Immunol 6, 823-35 (2006)
【非特許文献４】Nat Immunol 7, 1258-65 (2006)
【非特許文献５】J Immunol 163, 5039-48 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、プログラムされていない、過剰または非恒常性の細胞死を認識し、炎症応答を誘発する機構に関与する新規分子、特に死細胞から放出される自己リガンドを認識する受容体分子を同定することであり、該リガンド−受容体相互作用を介したシグナル伝達を調節することによる、新規な炎症反応の調節手段を提供することである。
また、本発明の別の目的は、ミンクルの生理的リガンドを同定し、その生理学的機能を解明することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ミンクルはFcRγと選択的に会合し、マクロファージを活性化して炎症性サイトカイン／ケモカインを産生させること、該受容体は死細胞から放出される、核内低分子リボヌクレオ蛋白質の成分である130kDa蛋白質 (SAP130；「Sf3b3」とも呼ばれる) を認識することを見出した。さらに、放射線照射により胸腺細胞死を誘導したマウスにおいて、抗ミンクル抗体の投与により胸腺への好中球の浸潤が阻害されることを見出して、インビボでのミンクル抑制による抗炎症効果を確認した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有してなる抗炎症剤。
［２］ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する物質がミンクルに対する抗体である、［１］に記載の剤。
［３］抗体が、配列番号：２で表されるヒトミンクルのアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるアミノ酸配列もしくは他の哺乳動物のオルソログにおける対応するアミノ酸配列を認識する、［２］に記載の剤。
［４］ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する物質が、配列番号：２で表されるヒトミンクルのアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるアミノ酸配列もしくは他の哺乳動物のオルソログにおける対応するアミノ酸配列を含むペプチドである、［１］に記載の剤。
［５］ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する物質が、SAP130に対する抗体である、［１］に記載の剤。
［６］ミンクルの発現を阻害する物質が、ミンクル遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイムまたはsiRNAである、［１］に記載の剤。
［７］ミンクルとFcRγとの相互作用を阻害する物質が、ミンクルおよび／またはFcRγに対する抗体である、［１］に記載の剤。
［８］ミンクルとFcRγとの相互作用を阻害する物質が、ミンクルの膜貫通ドメイン中の保存されたアルギニン残基を含む部位に結合する、［１］に記載の剤。
［９］炎症性疾患の予防および／または治療のための、［１］〜［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］ミンクルもしくはその細胞外領域を含む断片とSAP130とを、被験物質の存在下および非存在下で接触させ、両条件下におけるミンクルもしくはその断片とSAP130との相互作用の程度を比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法。
［１１］被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルもしくはその細胞外および膜貫通領域を含む断片とFcRγとを発現する細胞における、ミンクルもしくはその断片とFcRγとの相互作用の程度を測定・比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法。
［１２］ミンクルおよびFcRγを介するシグナル伝達経路の活性化を指標として、ミンクルもしくはその断片とFcRγとの相互作用の程度を比較する、［１１］に記載の方法。
［１３］ミンクルおよびFcRγを介するシグナル伝達により活性化される転写因子が結合し得る塩基配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指標とする、［１２］に記載の方法。
［１４］さらにSAP130を共存させることを特徴とする、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルを産生する細胞における該蛋白質またはそれをコードするmRNAの量を測定・比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法。
［１６］さらにSAP130を共存させることを特徴とする、［１５］に記載の方法。
［１７］抗炎症作用を有する物質の選択のための、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］被験動物より採取した試料中のSAP130量を測定することを特徴とする、非恒常性細胞死の検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
ミンクルの発現、あるいはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害することにより、FcRγ依存的なシグナル伝達を遮断して、非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を阻止することができる。また、ミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用に及ぼす効果を指標として、炎症反応を調節する作用を有する物質を選抜することができる。あるいは、細胞外へのSAP130の放出を指標として、非恒常性細胞死を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】(a)フローサイトメトリーによる抗ミンクルモノクローナル抗体のスクリーニング。Mincle-IRES-GFPを発現する2B4細胞をラットIgG（対照）またはハイブリドーマ上清および抗ラットIgG-PE で染色した。1B6、4A9および6E2抗体の濃度はそれぞれ2.3、1.1および0.05μg/mlであった。(b)結合競合。ミンクルトランスフェクタントを0μg/ml(細黒)、1μg/ml(灰)および10μg/ml(太黒)1B6(上)および4A9(下)存在下で1μg/ml 1B6-biotin (左)および4A9-biotin (右)で染色し、続いてStreptavidin-APC染色を行った。(c)ペプチドエピトープマッピング。ミンクルの細胞外ドメイン(長さ13 a.a、重複 11 a.a.)を包み込むビオチン化ペプチドを合成した。各ペプチドはstreptavidinをコーティングしたマイクロプレートに0.5nMでコーティングした。BSAでブロッキングした後、rIgG、抗ミンクルモノクローナル抗体および抗ラットIgG-HRPをそれぞれ1次および2次として用いた。推定したエピトープ配列(1B6についてはVEGQW、そして4A9についてはFWD)をそれぞれ示す。(d)細胞外ドメインの3-D構造の分子モデリング。VEGQWモチーフおよびFWDモチーフをそれぞれ示す。推定上のマンノース結合EPNモチーフを黒で示す。(e)ウェスタンブロット。2B4およびミンクルをトランスフェクトした2B4細胞由来のライセートを抗ミンクルモノクローナル抗体および抗ラットIgG-HRPでブロットした。(f)刺激活性。抗ミンクルモノクローナル抗体を10μg/mlでコーティングし、NFAT-GFP、ミンクルおよびFcRγを発現する2B4細胞を18時間刺激し、FACSによって解析した。
【図２】(a)ミンクルの膜貫通領域配列のアラインメント。マウス、ラットおよびヒトのミンクルのアミノ酸配列を整列させた。保存されたアルギニン残基を示す。(b)ミンクルはFcRγと結合する。293T細胞をFlagタグ付のDAP12、DAP10およびFcRγとともにマウスミンクルでトランスフェクトした。ライセートを抗Flagで免疫沈降し、抗ミンクルモノクローナル抗体(1B6)および抗Flagでブロットした。全ライセートも抗ミンクルでブロットした。(c)ミンクルは腹膜マクロファージ中でFcRγと結合する。チオグリコール酸で誘起した腹膜マクロファージを0.1μg/ml LPSで18時間刺激し、細胞ライセートを抗ミンクルポリクローナル抗体で免疫沈降し、抗FcRγおよび抗ミンクルでブロットした。(d)ミンクルのR42がFcRγとの結合に重要である。293T細胞をFcRγとともにFlagタグ付のミンクル野生型およびミンクルR42Iでトランスフェクトした。ライセートを抗FcRγ(上パネル)または抗Flag(下パネル)で免疫沈降し、表示した抗体でブロットした。(e)ミンクルのR42がシグナル伝達能力に重要である。2B4 T細胞をFcRγとともにFlagタグ付のミンクル野生型およびミンクルR42Iでトランスフェクトした。細胞をプレ−トにコーティングした抗Flagで刺激し、IL-2産生をELISAによって測定した。データは3回の別々の実験の代表例である。
【図３】(a)ミンクルライゲーションに際してのTNFαおよびMIP-2の産生。チオグリコール酸で誘起した腹膜マクロファージをプレ−トにコーティングしたラットIgG1 (rIgG1)または抗ミンクルモノクローナル抗体(6E2)で18時間刺激し、培養上清におけるサイトカイン産生をELISAによって決定した。他の抗ミンクルモノクローナル抗体クローンの1B6および4A9によっても、同様の結果を得た。(b)ミンクル誘導性活性化はFcRγ依存的である。チオグリコール酸で誘起した野生型、FcRγ-/-およびMyD88-/-マウス由来の腹膜マクロファージをプレ−トにコーティングした抗ミンクルモノクローナル抗体(6E2)または100μg/ml Zymosanで刺激し、MIP-2産生をELISAによって決定した。(c)ミンクルの架橋に際してのSykおよびErkの活性化。チオグリコール酸で誘起したマクロファージを抗ミンクルおよびロバ抗ラット抗体で表示した時間刺激した。細胞ライセートを表示した抗体でブロットした。(d)ミンクルを通したFcRγ依存的なチロシンリン酸化。チオグリコール酸で誘起したFcγRI/III-欠損マウスおよびFcRγ-欠損マウス由来のマクロファージを(c)のように５分間刺激し、抗phosphotyrosine(pY)および抗phospho-Erkでブロットした。(e)チオグリコール酸で誘起した野生型(白)、FcRγ-/-(灰)およびCARD9-/-(黒)マウス由来の腹膜マクロファージをプレ−トにコーティングした抗ミンクルモノクローナル抗体(6E2)または1ng/ml LPSで刺激した。18時間後、MIP-2産生をELISAによって決定した。(f-g)BMMφのミンクル介在性活性化野生型、FcRγ-/-およびMyD88-/-マウス由来のBMMφを10ng/ml LPSで18時間処理し、次いで洗浄し、30μg/mlの固定化抗IgG1、抗ミンクルモノクローナル抗体(1B6)または10ng/ml LPSで6時間刺激し、MIP-2産生をELISAによって決定した。同じ細胞を(d)のように刺激し、それぞれ抗phospho-Syk、抗Sykおよび抗ミンクル-biotinでブロットした。
【図４】骨髄由来のマクロファージ(左パネル)を刺激なしで放っておくか、または1ng/ml LPSで18時間刺激した。細胞をビオチン化ラットIgG1-bio (rIgG)およびビオチン化抗ミンクル(1B6)、ならびにStreptavidine-APC(右パネル)で染色した。
【図５】(a)固定化抗ミンクルによるNFAT-GFP活性化。NFAT-GFPを発現する2B4細胞をFcRγおよび／またはミンクルとトランスフェクトした。細胞を10μg/mlのプレ−トにコーティングした抗rIgG1 (破線)または抗ミンクル(実線)で18時間刺激し、フローサイトメトリーによってGFP発現を解析した。(b)死細胞はミンクルを通してNFAT-GFPを活性化する。ミンクルおよびFcRγを発現するNFATレポーター細胞を表示した時間培地交換なしで10μg/mlラットIgG1 (rIgG)、抗ミンクルクローン1B6(1B6)または抗ミンクルクローン4A9(4A9)存在下または非存在下で培養した。二回繰り返しの試験でGFP発現を、表示した時間フローサイトメトリーによって解析した。データは3回の別々の実験の代表例を示す。(c)培養中のGFP+細胞および死細胞。培養2日目の(b)の細胞をプロピジウムイオダイドで染色し、蛍光顕微鏡(BZ-9000, Keyence)で解析した。典型的なマージした画像(DIC、GFPおよびプロピジウムイオダイドを示す)。(d)Etoposide処理による死細胞がミンクルを通したNFAT活性化を誘導する。5×104の2B4細胞を1μg/ml etoposideで4時間処理して細胞死を誘導し5×104のレポーター細胞に添加した。24時間後、IL-2産生をELISAによって決定した。データは3回の別々の実験の代表例を示す。(e)ミンクルのEPNモチーフではなくVEGQW配列が死細胞誘導性の活性化に重要である。ミンクル野生型(WT)、ミンクルE169Q/N171D(EPN -> QPD)およびミンクルΔVEGQW (ΔVEGQW)をFcRγとともにNFAT-GFPレポーター細胞に発現させた。細胞を(b)のように処理し、フローサイトメトリーでGFP発現を決定した。
【図６】(a)ミンクル、hIgG1 Fc(Ig)およびhIgG1 Fc-Mincle融合タンパク質(Ig-Mincle)の模式的表示。TM、膜貫通。CLD、C-型レクチンドメイン。(b)Ig-Mincleは死細胞を選択的に認識する。胸腺細胞を10μM dexamethasoneで4時間処理し、IgまたはIg-Mincle、そしてAPC-ラベルした抗hIgGで染色した。細胞はAnnexinV-FITC(AnV)およびプロピジウムイオダイド（PI）でも染色した。(c)p130はミンクルと特異的に相互作用する。2B4死細胞を溶解して続いてフリー(-)、Ig-結合(Ig)およびIg-Mincle-結合(Ig-Mincle)Protein G Sepharoseでプルダウンし、銀染色で解析した。(d)p130をSAP130と同定した。マススペクトル法で独立の10ペプチドの配列を解析した（左）。各ペプチドのSAP130中の位置をカッコ内に示す（右）。(e)ミンクル結合タンパク質のウェスタンブロット。2B4死細胞ライセートを表示したSepharoseビーズでプルダウンし、抗SAP130、抗DDB1、抗HMGB1および抗hIgG-HRPでブロットした。矢頭はIg-ミンクルおよびIgを示す。(f)ミンクルは生細胞由来のSAP130に結合する。2B4生(L)または死(D)細胞を表示したビーズでプルダウンし、表示した抗体でブロットした。(g)SAP130は死細胞から分泌されうる。2B4細胞を1日間(生細胞)または4日間(死細胞)培養し、培養上清を回収した。新鮮培地(-)、1日目上清(L)および4日目上清(D)を抗-SAP130(左パネル)および抗histone H1(右パネル)で免疫沈降した。全ライセートおよび免疫沈澱物を抗SAPおよび抗Histoneでブロットした。(h)Fas介在性細胞死におけるSAP130の放出。Fasを発現する2B4を表示した時間leucine zipper化したFasリガンドで刺激した。細胞をAnnexinV-FITCおよびプロピジウムイオダイド(PI)で染色し、フローサイトメトリーで解析した(上パネル)。処理細胞由来の上清を集めて(g)のように解析した(下パネル)。
【図７】(a)ミンクルと相互作用するタンパク質はProteinG、Ig-ProteinGおよびIg-Mincle-ProteinG Sepharoseカラムを用いて連続的に精製した。溶出したタンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDFに転写して金コロイドで染色した。細胞ライセートなしのIg-Mincle-ProteinG も対照としてアプライした。矢頭は細胞ライセートありのIg-Mincle-ProteinGでのみ検出したタンパク質を示す。(b)130-kDaタンパク質(p130)を切り出して調製した。消化したペプチドをMALDI-TOF/MS (matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) によって解析した。(c)p130はSAP130と同定した。ペプチド由来の配列はSAP130の全体のアミノ酸配列上に重ね合わせた。
【図８】(a)SAP130-V5はマクロファージにおいてMIP-2産生を誘導する。V5タグ付きSAP130を293T細胞にトランスフェクトした。細胞ライセートを抗V5アガロースカラムにアプライし、結合タンパク質をV5ペプチドと溶出した。チオグリコール酸で誘起した腹膜マクロファージを抗V5でコーティングしたプレート上で組み換えV5タグ付きSAP130で18時間刺激した。培養上清中のMIP-2濃度をELISAで決定した。(b)SAP130-V5はミンクルを通した細胞活性化を誘導する。FcRγ単独かまたはミンクルおよびFcRγを両方発現するNFATレポーター細胞を抗V5でコーティングしたプレート上で10μg/ml抗ミンクル(1B6)存在下または非存在下で組み換えV5タグ付きSAP130で18時間刺激した。培養上清中のIL-2濃度をELISAで決定した。(c)バキュオウィルスで発現したSAP130の機能解析。HNタグ付きSAP130をQ-SepharoseおよびTALONカラムを用いてSf9細胞から精製した。精製タンパク質はSDS-PAGEで分離し銀染色(レーン1)および抗SAP130ブロットで確認した。チオグリコール酸で誘起したマクロファージを0.5μg/ml組み換えHNタグ付きSAP130(SAP130-HN)および1ng/ml LPSで6時間刺激し、MIP-2産生をELISAによって決定した(右パネル)。
【図９】(a)非処理および1-Gy照射(Irradiation)のマウス(GammaCell, MDS Nordion)由来の胸腺のTUNEL染色。照射後24時間の皮質領域を示す。(b)全身照射に際しての細胞充実度の変化。B6マウスを1Gy放射線照射し、全胸腺細胞(左)およびCD11b+Gr1high好中球のパーセンテージ(右)を照射後表示した日に決定した。(c)全身照射によるミンクルの急速誘導。B6マウスを1Gy放射線照射し、照射後表示した期間で胸腺から全RNAを抽出した。ミンクルに関してリアルタイムPCR解析を行った。TLR2およびFcRγも炎症性細胞の浸潤の指標として解析した。(d-f)抗ミンクルは照射後の好中球の浸潤を抑止した。マウスに0.5mgのラットIgG または抗ミンクル(クローン1B6または4A9)を静脈内投与した。1時間後、同じマウスをγ線照射(1Gy)し、次いで12時間目に胸腺細胞の絶対数と細胞充実度を解析した。CD11bおよびGr1に関して胸腺細胞を解析した。CD11b+Gr1high好中球の絶対数を示す(e)。胸腺マクロファージ由来のMIP-2産生をELISAによって決定した(f)。各グループは少なくとも3匹のマウスを含む。*、p<0.05。
【図１０】(a)dexamethasone(Dex)投与によるDP胸腺細胞の死。各マウスに100μgDexを腹腔膜内投与した。投与後24時間目に、胸腺細胞を計数しCD4およびCD8の発現を解析した。(b)Dex誘導性好中球浸潤への抗ミンクルの効果。500μgラットIgGまたは抗ミンクル(1B6)をDex投与の1時間前に静脈内投与した。Dex投与後24時間目に胸腺細胞を抗Gr1および抗CD11bで染色した。数字は胸腺に囲い込まれた細胞のパーセンテージを示す。未処理の胸腺における同集団のパーセンテージは図９dに記載されたように0.03%を下回った。
【図１１】(a-b)B6マウスに500μgの抗ミンクル(1B6)を静脈内投与した。1時間後、10μg LPSを腹腔膜内注入し、20時間目に腹膜細胞を集めて解析した。腹膜細胞中の好中球のパーセンテージ(a)および絶対数(b)を示した。各グループは少なくとも4匹のマウスを含む。
【図１２】(a)Dexamethasone処理した胸腺細胞を5-chloromethylfluorescein diacetate (CMFDA)でラベルした。ラベルした胸腺細胞をチオグリコール酸で誘起した腹膜マクロファージに4時間加え、蛍光顕微鏡で解析した。矢頭はマクロファージに飲み込まれたラベルした胸腺細胞を示す。(b)チオグリコール酸で誘起した腹膜マクロファージを未処理で放置(None)またはミンクルを誘導するため0.1μg/ml LPSで8時間処理(LPS)した。次いで、ラベルした胸腺細胞を抗体存在下または非存在下で表示したように加えた。4時間後、細胞をtrypsin-EDTAで回収し、フローサイトメトリーによって、囲い込まれたCD11b+集団内で胸腺細胞を含むマクロファージのパーセンテージを決定した。
【図１３】(a)スプライシング因子3ｂサブユニット(SF3b)タンパク質の模式的表示。U2 snRNP 複合体はSF3b、SF3a、Sm、U2A’ およびU2B’から成る。SAP49、SAP130、SAP145、SAP155およびsnRNAがSF3bを形成する。U2 snRNA内のGUAGUA配列は種間でよく保存されており、イントロン内の分岐点のまわりの配列とペアを作る。(b)Fig.4aに記載されたサンプルをIg-MincleおよびProteinG Sepharoseでプルダウンし、U2 snRNP複合体タンパク質に対する抗SAP49、抗SAP145および抗SAP155等の抗体でブロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における「ミンクル」、「SAP130」および「FcRγ」は、それぞれ配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。
これらの蛋白質は、ヒトや他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、平滑筋、骨格筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）など］等から、自体公知の蛋白質分離精製技術により単離・精製されるものであってよい。
【００１４】
「配列番号：ｎ（ｎ＝２、４または６）で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号：ｎで表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、いっそう好ましくは約90％以上、特に好ましくは約95％以上、最も好ましくは約97％以上の類似性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「類似性」とは、該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。
【００１５】
本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の類似性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００１６】
より好ましくは、配列番号：ｎで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：ｎで表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、いっそう好ましくは約90％以上、特に好ましくは約95％以上、最も好ましくは約97％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１７】
「配列番号：ｎで表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」は、配列番号：ｎで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号：ｎで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質である。
ここで「活性」とは、ミンクルの場合、SAP130と相互作用して、FcRγを介して炎症性サイトカイン等の産生を誘導する活性、好中球を輸送させる活性をいい、SAP130の場合、ミンクルと相互作用してミンクルを活性化する能力をいい、FcRγの場合、ミンクルと共役して炎症性サイトカイン等の産生を誘導する活性、好中球を輸送させる活性をいう。また、「実質的に同質」とは、例えば生理学的に、あるいは薬理学的にみて、その性質が定性的に同一であることを意味する。したがって、該活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約0.01〜約100倍、好ましくは約0.1〜約10倍、より好ましくは0.5〜2倍）や、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ミンクルとSAP130およびミンクルとFcRγとの相互作用、好中球の輸送活性は、自体公知の方法に準じて行うことができ、例えば、後記実施例に記載の方法等に従って行うことができる。
【００１８】
また、本発明におけるミンクルには、配列番号：２で表されるアミノ酸配列において1または2個以上（例えば1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された（あるいはそれらが組み合わされた）アミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、SAP130およびFcRγと相互作用する能力が保持される限り、特に限定されない。
同様に、本発明におけるSAP130には、配列番号：４で表されるアミノ酸配列において1または2個以上（例えば1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された（あるいはそれらが組み合わされた）アミノ酸配列を含有する蛋白質も含まれる。また、本発明におけるFcRγには、配列番号：６で表されるアミノ酸配列において、1または2個以上（例えば1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、より好ましくは1
〜数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された（あるいはそれらが組み合わされた）アミノ酸配列を含有する蛋白質も含まれる。
【００１９】
本発明におけるミンクル、SAP130およびFcRγ蛋白質の別の好ましい例として、種々のスプライシングバリアント（例えば、ミンクルの場合、GeneCards（登録商標）のAlternative Splicing Database（ASD）にCLEC4Eに関するSupplice Patterns（SP）1〜SP5として登録されているヒトミンクルのスプライシングバリアント等；SAP130の場合、ASDにSF3B3に関するSP1〜SP13として登録されているヒトSAP130のスプライシングバリアント等；FcRγの場合、ASDにFCER1Gに関するSP1〜SP2として登録されているヒトSAP130のスプライシングバリアント等）あるいは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、ミンクルの場合、GenBankにRefSeq No. NP_064332として登録されているマウスオルソログ、RefSeq No. NP_001005897として登録されているラットオルソログ、RefSeq No. XP_001135204として登録されているチンパンジーオルソログ、RefSeq No. XP_854311として登録されているイヌオルソログ等；SAP130の場合、GenBankにRefSeq No. NP_598714として登録されているマウスオルソログ、RefSeq No. XP_214697として登録されているラットオルソログ、RefSeq No. XP_511081として登録されているチンパンジーオルソログ、RefSeq No. XP_536791として登録されているイヌオルソログ、RefSeq No. XP_001232348として登録されているトリオルソログ等；FcRγの場合、GenBankにRefSeq No. NP_034315として登録されているマウスオルソログ、RefSeq No. NP_001003171として登録されているイヌオルソログ等）、さらにはそれらの天然のアレル変異体もしくは多型などがあげられる。
【００２０】
本発明において「ミンクルとSAP130との相互作用を阻害する物質」とは、SAP130の刺激によりミンクルが活性化され、FcRγと共役してシグナルを伝達するのを阻害し得るいかなるものでもよいが、好ましくは、ミンクルとSAP130との結合を阻害する物質が挙げられる。
【００２１】
具体的には、ミンクルとSAP130との結合を阻害する物質として、例えば、ミンクルもしくはSAP130蛋白質に対する抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
【００２２】
ミンクルは１回膜貫通型の細胞表面受容体であるので、本発明における抗ミンクル抗体は、ミンクルの細胞外領域を認識するものであることが望ましい。後記実施例において示されるように、SAP130との相互作用に重要なミンクルの領域は、ヒトミンクルの場合、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるVEGQW（配列番号：７）（他の哺乳動物のオルソログにおいては、それに対応するアミノ酸配列）を含む。従って、好ましくは、本発明における抗ミンクル抗体は、該領域を認識するものである。そのような抗体は、該領域のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドを固相合成法などの周知のペプチド合成法を用いて合成し、これを適当なキャリア蛋白質と結合させたものを免疫原として、動物を免疫するか、リンパ球等を用いた体外免疫に付すことにより、取得することができる。しかしながら、本発明における抗ミンクル抗体は、SAP130との相互作用に重要な領域以外を認識するものであっても、該抗体の結合により、SAP130がミンクルと結合してこれを活性化するのを阻害しうる限り、同様に好ましく使用することができる。
一方、SAP130は、死細胞から細胞外へ放出されるので、本発明における抗SAP130抗体はSAP130のいずれの領域を認識するものであってもよいが、好ましくは、ミンクルとの相互作用に重要なミンクルの領域、特に、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるVEGQW（配列番号：７）あるいは他の哺乳動物のオルソログにおける対応するアミノ酸配列を含む領域との結合に関与する領域を認識する抗体が挙げられる。
【００２３】
好ましい一実施態様において、ミンクルもしくはSAP130蛋白質に対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
【００２４】
ミンクルとSAP130との結合を阻害する別の物質の例として、ミンクルのSAP130との結合に関与する領域のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、SAP130との結合に関与する領域のアミノ酸配列において、1〜3個、好ましくは1〜2個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、SAP130との結合能を保持する配列を意味する。具体的には、ミンクルのSAP130との結合に関与する領域のアミノ酸配列としては、前記した配列番号：２で表されるヒトミンクルのアミノ酸配列中アミノ酸番号146〜150で示されるVEGQW（配列番号：７）、あるいは他の哺乳動物のオルソログにおける該配列に対応するアミノ酸配列が挙げられる。該ペプチドの長さに特に制限はないが、分子量の大きさ、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると5〜50アミノ酸程度、好ましくは5〜30アミノ酸程度、より好ましくは5〜15アミノ酸程度である。該ペプチドは、SAP130との結合に関与しないアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えば、該結合に関与するアミノ酸配列とSAP130との相互作用に悪影響を及ぼさない範囲で、ペプチドの物理化学的性質（例、疎水性、等電点、熱安定性、ｐＨ安定性、対酵素安定性など）を、改善するようにデザインされたアミノ酸配列を、該結合に関与するアミノ酸配列のＮ末および／またはＣ末側に付加することができる。
【００２５】
本発明におけるミンクルとSAP130との相互作用を阻害する物質は、上記のような抗ミンクル抗体やSAP130結合性ペプチドに限定されず、ミンクルとSAP130との相互作用を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法（I）または（III）により取得することができる。
【００２６】
本発明において「ミンクルの発現を阻害する物質」とは、ミンクル遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、ミンクル蛋白質の発現を阻害する物質としては、例えば、ミンクル遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害する物質、ミンクルポリペプチドの翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。
【００２７】
ミンクルのmRNAから蛋白質への翻訳を特異的に阻害し得る物質として、好ましくは、これらのmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
ミンクルmRNAの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、哺乳動物細胞内の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、mRNAの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、最も好ましくは約97％以上の類似性を有する塩基配列である。
本発明における「塩基配列の類似性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００２８】
より具体的にはミンクルmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a)配列番号：１で表される塩基配列または(b)該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。ここで「実質的に同質の活性」とは前記と同義である。
ストリンジェントな条件下とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【００２９】
ミンクルmRNAは、好ましくは、配列番号：１で表される塩基配列を含むヒトミンクルmRNA（RefSeq Accession No. NM_014358）、あるいは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、GenBankにRefSeq No. NM_019948として登録されているマウスオルソログ、RefSeq No. NM_001005897として登録されているラットオルソログ、RefSeq No. XM_001135204として登録されているチンパンジーオルソログ、RefSeq No. XM_849218として登録されているイヌオルソログ等）、さらにはそれらの天然のアレル変異体、遺伝子多型である。
【００３０】
「ミンクルmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、ミンクルmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからの蛋白質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。
【００３１】
具体的には、ミンクルmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(a)〜(c)のいずれかのものが好ましく例示される。
(a) ミンクルmRNAに対するアンチセンス核酸
(b) ミンクルmRNAに対するsiRNA
(c) ミンクルmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
【００３２】
本発明における「ミンクルmRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的且つ安定した二重鎖を形成して結合することにより、蛋白質合成を抑制する機能を有するものである。アンチセンス核酸は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに公知の修飾の付加されたものであってもよい。ここで「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、CPSF5もしくはCPSF6遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖DNAであるミンクル遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
【００３３】
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてミンクル蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。
【００３４】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどによる分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4'炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
【００３５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミンクルcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいて標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。
【００３６】
本明細書においては、ミンクルmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、ミンクルmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００３７】
生体内でミンクルmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸としては、上記したshRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。
【００３８】
ミンクルmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。本明細書では、リボザイムは、配列特異的な核酸切断活性を有する限り、DNAをも包含する概念として用いられる。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。
【００３９】
ミンクルmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、ポリリジンのようなポリカチオン体、脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性物質が付加された形態で提供され得る。
【００４０】
本発明におけるミンクルの発現を阻害する物質は、上記のようなアンチセンス核酸、siRNA、リボザイムなどに限定されず、ミンクルの発現を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法（IV）により取得することができる。
【００４１】
本発明において「ミンクルとFcRγとの相互作用を阻害する物質」とは、活性化されたミンクルが、FcRγと共役してシグナルを伝達するのを阻害し得るいかなるものでもよいが、好ましくは、ミンクルとFcRγとの会合を阻害する物質が挙げられる。
【００４２】
具体的には、ミンクルとFcRγとの会合を阻害する物質として、例えば、ミンクルおよび／またはFcRγに対する抗体が挙げられる。ミンクルもしくはFcRγに対する抗体は、それぞれミンクルもしくはFcRγに結合することにより、パートナー分子との会合を立体的に阻害するか、あるいはコンフォーメーション変化をもたらすことにより、パートナーと会合する能力を低下させ得る。また、ミンクルおよびFcRγを認識する二重特異性抗体も、それが両抗原分子に結合することにより、それらが相互作用し得る程度にまで接近できなくなれば、FcRγを介したシグナル伝達を遮断することができるので、同様に好ましく用いることができる。これらの抗体が認識するミンクルおよびFcRγの領域は特に制限されないが、好ましくは細胞外領域である。
【００４３】
ミンクルおよび／またはFcRγに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、上記と同様の各種形態のものが用いられ得る。
また、好ましい一実施態様において、これらの抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体は完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであることが好ましく、特に好ましくは完全ヒト抗体である。
【００４４】
本発明におけるミンクルとFcRγとの相互作用を阻害する物質は、上記のようなミンクルおよび／またはFcRγに対する抗体に限定されず、ミンクルとFcRγとの相互作用を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法（II）または（III）により取得することができる。
後記実施例に示されるとおり、ミンクルとFcRγとの会合には、ミンクルの膜貫通ドメイン中の、哺乳動物種間でよく保存されたアルギニン残基（配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号41で示されるアミノ酸）が重要である。したがって、ミンクルの該アルギニン残基を含む膜貫通領域に特異的に結合し得る物質は、ミンクルとFcRγとの相互作用を有効に阻害し得る。膜貫通領域を標的とする場合は疎水性が要求されるので、脂溶性低分子化合物の利用はきわめて有利である。
【００４５】
ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質は、FcRγ依存的なシグナル伝達を遮断して、非恒常性の細胞死によって刺激される炎症反応を阻止することができる。したがって、ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質を含有する医薬は、例えば抗炎症剤として、種々の炎症性疾患（例えば、クローン病、関節リウマチ、ベーチェット病(眼症状)、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬（乾癬性関節炎も含む）、HIV感染症、多発性骨髄腫、うっ血性心不全、GVHD、巨細胞動脈炎（GCA）、リウマチ性多発筋痛症（PMR）、色素性紫斑性苔癬様皮膚炎、サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫、膿皮症、ベーチェット病、TNF受容体関連周期性症候群（TRAPS）、SAPHO症候群、高安病、筋炎、スティル病、結節性動脈周囲炎（PN）、再発性多発軟骨炎、強皮症多発性筋炎、血球貪食症候群、天疱瘡、川崎病アトピー性皮膚炎）の予防および／または治療剤などとして使用することができる。
【００４６】
（１）抗体、低分子化合物等を含有する医薬
ミンクル、SAP130またはFcRγに対する抗体や、ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する低分子化合物を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、ヒトまたは他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００４７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
【００４８】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００４９】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
【００５０】
上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の関節リウマチの治療・予防のために使用する場合には、抗体もしくは低分子化合物を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００５１】
前記した各組成物は、上記抗体や低分子化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の薬剤を含有してもよい。上記抗体や低分子化合物と併用し得る薬物としては、例えば、抗菌薬、抗真菌薬、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド薬、抗凝血薬、血小板凝集防止薬、血栓溶解薬、免疫調節薬、抗原虫薬、抗生物質、抗ウイルス薬、鎮咳・去たん薬、鎮静薬、麻酔薬、抗潰瘍薬、不整脈治療薬、降圧利尿薬、精神安定薬、抗精神病薬、抗腫瘍薬、抗高脂血症薬、筋弛緩薬、抗てんかん薬、抗うつ薬、抗アレルギー薬、強心薬、不整脈治療薬、血管拡張薬、血管収縮薬、降圧利尿薬、糖尿病治療薬、麻薬拮抗薬、ビタミン薬、ビタミン誘導体、関節炎治療薬、抗リウマチ薬、抗喘息薬、頻尿・尿失禁治療薬、アトピー性皮膚炎治療薬、アレルギー性鼻炎治療薬、昇圧薬、タンパク質分解薬、タンパク質分解酵素阻害薬、抗ＳＩＤＳ薬、抗セプシス薬、抗セプティックショック薬、エンドトキシン拮抗薬あるいは抗体、シグナル伝達阻害薬、炎症性メディエーター作用抑制薬、炎症性メディエーター作用抑制抗体、炎症性メディエーター産生抑制薬、抗炎症性メディエーター作用抑制薬、抗炎症性メディエーター作用抑制抗体、抗炎症性メディエーター産生抑制薬、α１アドレナリン作動薬などが挙げられる。上記の抗体もしくは低分子化合物とそれらの他の薬剤とは、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。
【００５２】
（２）アンチセンス核酸、siRNA、リボザイム等の核酸を含有する医薬
ミンクルmRNAに対するアンチセンス核酸、siRNA、リボザイムおよびそれらをコードする核酸を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
これらの核酸を上記の抗炎症剤、炎症性疾患の予防・治療剤などとして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
【００５３】
本発明の核酸は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００５４】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００５５】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００５６】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
【００５７】
本発明の核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の関節リウマチの治療・予防のために使用する場合には、本発明の核酸を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００５８】
なお前記した各組成物は、本発明の核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の薬剤を含有してもよい。他の薬剤としては、上記抗体や低分子化合物と併用し得る薬物として挙げたものが同様に例示される。
【００５９】
上述の通り、ミンクルは、死細胞から放出されるSAP130を認識して活性化され、FcRγと相互作用して炎症性サイトカイン等の産生を誘導し、また、好中球を浸潤させる作用を有する。従って、ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を阻害する物質は、抗炎症剤として、種々の炎症性疾患の予防・治療に使用することができる。一方で、ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を増強する物質は、損傷または病原体が感染した組織への好中球の浸潤を適当なレベルで促進し、組織修復を促進しうるので、組織損傷や感染症の治療剤として使用することができる。
したがって、本発明はまた、ミンクルの発現またはミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を調節する物質を選択することによる、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００６０】
（I）ミンクルとSAP130の相互作用を調節する物質のスクリーニング法
本発明は、ミンクルもしくはその細胞外領域を含む断片とSAP130とを、被験物質の存在下および非存在下で接触させ、両条件下におけるミンクルもしくはその断片とSAP130との相互作用の程度を比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法に用いられるミンクルおよびSAP130蛋白質は、上記本発明の医薬に関する説明において記載されたとおりのものである。ミンクルはその全長を用いてもよいし、その細胞外領域（配列番号：２で表されるアミノ酸配列にあっては、アミノ酸番号45〜219で示されるアミノ酸配列からなる領域）を含む断片を用いてもよい。SAP130蛋白質も、ミンクルとの結合およびミンクルの活性化に関与する領域を含む限り、その断片を用いることができる。以下、特にことわらない限り、ミンクルおよびSAP130という場合、上記の機能的断片を包含する意味で用いることとする。
【００６１】
ミンクルおよびSAP130蛋白質は、上記した該蛋白質を産生する細胞もしくは組織から、自体公知の蛋白質分離精製技術を適宜組み合わせて取得することができる。あるいは、これらの蛋白質は、該蛋白質をコードする核酸を、上記したそれらの塩基配列情報に基づいて作製したプローブもしくはプライマーを用いて、該蛋白質を産生する細胞もしくは組織から調製したRNA、cDNA、cDNAライブラリー等からクローニングし、適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、形質転換細胞を培養して得られる組換え蛋白質を、自体公知の方法により回収することによっても取得することができる。さらには、上記したこれらの蛋白質のアミノ酸配列情報に従って、公知のペプチド合成法により化学的に合成することもできる。
【００６２】
より具体的には、本スクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
(ａ)被験物質と、ミンクルおよびSAP130とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させたミンクルのSAP130との結合活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対照ミンクルのSAP130との結合活性と比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、ミンクルのSAP130との結合活性を調節する被験物質を選択する工程。
【００６３】
工程（ａ）において、被験物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
【００６４】
工程（ａ）において、被験物質は、ミンクルおよびSAP130と接触される。工程（ａ）において、接触方法は特に限定されるものではないが、例えば、25〜37℃の生理条件下でミンクルおよびSAP130を所定の濃度で混合し、被験物質を添加する方法、SAP130を固相に固定し、被験物質の存在下ミンクルと結合させる方法、あるいはミンクルを発現する細胞の培養液に被験物質およびSAP130を添加する方法などが挙げられる。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
【００６５】
工程（ｂ）において、ミンクルとSAP130との結合活性は、以下の例にあげるような方法で測定できる。
b-1）抗ミンクル抗体または抗SAP130抗体を用いて免疫沈降し、免疫沈降で使用しなかった抗体でウェスタンブロッティングを行い、ミンクルとSAP130との結合量を測定する方法。
b-2）ミンクルまたはSAP130のいずれか一方を、ポリヒスチジンもしくはGSTなどの標識との融合蛋白質として発現させ、またはビオチン化させ、ポリヒスチジンはニッケルに、GSTはグルタチオンに、ビオチンはアビジンに結合することから、それらを利用して結合体を回収し、b-1）と同様のウェスタンブロッティングで結合量を測定する方法。
b-3）表面プラズモン共鳴法（ビアコア）。
b-4）蛍光標識したミンクルのSAP130発現細胞への結合をフローサイトメーターで測定する方法。
【００６６】
工程（ｂ）において、結合活性の比較は、例えば、被験物質の存在下、非存在下において、ミンクルとSAP130との結合量の有意差の有無に基づいて行なわれる。
【００６７】
工程（ｃ）において、ミンクルのSAP130との結合活性を低下もしくは増大させる被験物質が選択される。該結合活性を低下させた被験物質は、抗炎症性物質、特に炎症性疾患の予防・治療薬の候補として有用である。また、免疫調節剤や研究用試薬としても有用である。一方、該結合活性を増大させた被験物質は、組織損傷や感染症の治療薬の候補として有用である。
【００６８】
（II）ミンクルとFcRγの相互作用を調節する物質のスクリーニング法
本発明はまた、被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルもしくはその細胞外および膜貫通領域を含む断片とFcRγとを発現する細胞における、ミンクルもしくはその断片とFcRγとの相互作用の程度を測定・比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法に用いられるミンクルおよびFcRγ蛋白質は、上記本発明の医薬に関する説明において記載されたとおりのものである。ミンクルはその全長を用いてもよいし、その細胞外領域および膜貫通領域（配列番号：２で表されるアミノ酸配列にあっては、アミノ酸番号22〜219で示されるアミノ酸配列からなる領域）を含む断片を用いてもよい。FcRγ蛋白質も、ミンクルとの結合および細胞内シグナル伝達に関与する領域を含む限り、その断片を用いることができる。以下、特にことわらない限り、ミンクルおよびFcRγという場合、上記の機能的断片を包含する意味で用いることとする。
【００６９】
より具体的には、本スクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
(ａ)被験物質、ミンクルおよびFcRγを発現し、それらの相互作用により伝達されるシグナル（「活性化シグナル」という）を測定可能な細胞に接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞における活性化シグナルのレベルを測定し、該レベルを被験物質を接触させない対照細胞における活性化シグナルのレベルと比較する工程、および
(ｃ)前記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症反応を調節する被験物質を選択する工程。
【００７０】
工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりのものが用いられる。ミンクルおよびFcRγを発現する細胞は、内在のミンクルおよびFcRγを有する細胞であってもよいし、それらのいずれか一方もしくは両方を導入した組換え細胞であってもよい。ミンクルおよびFcRγを内在的に発現する細胞としては、哺乳動物より単離した胸腺細胞、マクロファージ、樹状細胞、グリア細胞、クッパー細胞、神経節細胞などが挙げられる。組換え細胞の場合、宿主細胞として、例えば、H4IIE-C3細胞、HepG2細胞、293T細胞、HEK293
細胞、COS7細胞、2B4T細胞、CHO、MCF-７細胞、H295R細胞などの動物細胞をあげることができる。ミンクルおよびFcRγをコードする核酸は、スクリーニング法（I）において上記したと同様にして単離し、宿主細胞内で機能しうるプロモーターを有する発現ベクターに挿入して、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより、このベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。
【００７１】
被験物質と上記細胞との接触は、例えば、該細胞の培養に適した培地（例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）や各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被験物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
【００７２】
工程（ｂ）において、活性化シグナルレベルの測定は、該シグナルの結果誘導される細胞の応答を測定することによって行われる。
【００７３】
例えば、活性化シグナルの測定は、ミンクルおよびFcRγを介するシグナル伝達経路の下流に位置するキナーゼ、例えばSyk、Erk、CARD9等のリン酸化を定量することにより行うことができる。これらの分子のリン酸化は、細胞ライセートに対して、それぞれのリン酸化物に特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロッティングやELISA等のイムノアッセイを行うことにより定量可能である。これらのリン酸化物特異抗体は市販されている。
また、活性化シグナルの測定は、上記シグナル伝達経路の活性化によって産生されるMIP-2、TNFα、IL-6、IL-8、IL-12、等の炎症性サイトカイン／ケモカインを、例えば、それらに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングやELISA等のイムノアッセイにより、定量することによって行ってもよい。
【００７４】
さらに別の好ましい態様においては、活性化シグナルレベルは、ミンクルおよびFcRγを介するシグナル伝達により活性化される転写因子が結合し得る塩基配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指標として測定することができる。そのような転写因子としては、例えばNFAT、NFκB、などが挙げられる。これらの転写因子が結合するコンセンサスなシス配列は該分野で周知である。該シス配列を含むプロモーターの下流にレポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）をコードするDNAを連結した発現ベクターを、ミンクルおよびFcRγを発現する細胞に、上記と同様の方法により導入しておけば、活性化シグナルにより該シス配列を活性化する転写因子が活性化されると、該レポーター蛋白質の発現が誘導されるので、これを測定することにより、活性化シグナルレベルを定量することができる。
【００７５】
工程（ｂ）において、活性化シグナルレベルの比較は、被験物質の存在下、非存在下における、活性化シグナルレベルにおける有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞における活性化シグナルレベルは、被験物質を接触させた細胞における活性化シグナルレベルの測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００７６】
工程（ｃ）において、ミンクルとFcRγとの相互作用を介した活性化シグナルレベルを低下もしくは増大させる被験物質が選択される。活性化シグナルレベルを低下させた被験物質は、抗炎症性物質、特に炎症性疾患の予防・治療薬の候補として有用である。また、免疫調節剤や研究用試薬としても有用である。一方、活性化シグナルレベルを増大させた被験物質は、組織損傷や感染症の治療薬の候補として有用である。
【００７７】
（III）ミンクルとSAP130もしくはFcRγとの相互作用を調節する物質のスクリーニング法
上記スクリーニング法（II）において、被験物質と細胞との接触を、SAP130の存在下で行うことにより、ミンクルとFcRγとの相互作用を調節する物質に加えて、ミンクルとSAP130との相互作用を調節する物質をスクリーニングすることが可能である。本スクリーニング法でも、同様に、活性化シグナルレベルを低下させた被験物質は、抗炎症性物質、特に炎症性疾患の予防・治療薬の候補として選択される。一方、活性化シグナルレベルを増大させた被験物質は、組織損傷や感染症の治療薬の候補として選択される。選択された物質がミンクルとSAP130、あるいはミンクルとFcRγのいずれの相互作用に影響するかは、例えば、上記スクリーニング法（I）もしくは（II）を併用することにより、確認することができる。
【００７８】
（IV）ミンクルの発現を調節する物質のスクリーニング法
本発明はまた、被験物質の存在下および非存在下で、ミンクルを産生する細胞における該蛋白質またはそれをコードするmRNAの量を測定・比較することを特徴とする、炎症反応を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７９】
より具体的には、本発明のミンクルの発現を調節する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とミンクルの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるミンクルの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるミンクルの発現量と比較する工程、
（ｃ）前記(ｂ)の比較結果に基づいて、ミンクルの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００８０】
工程（ａ）において、被験物質としては、前記したとおりである。ミンクルの発現を測定可能な細胞としては、内在性および外来性を問わずミンクルを発現する培養細胞全般、あるいはミンクル遺伝子の内在プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞などを挙げることができる。培養細胞においてこれら遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やRT-PCR法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
また、ミンクルの発現を測定可能な細胞は、非ヒト哺乳動物より単離したミンクルを産生する組織もしくは臓器、さらには非ヒト哺乳動物個体の形態で提供されうる。あるいは、ミンクル遺伝子の内在プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を導入したトランスジェニック動物の細胞、組織、臓器もしくは個体であってもよい。
【００８１】
細胞が、培養細胞や単離された組織、臓器などの形態で提供される場合、被験物質と細胞との接触は、前記と同様に行うことができる。一方、細胞が動物個体の形態で提供される場合、被験物質と細胞との接触は、該動物への被験物質の投与により行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約0.5〜20 mg／kgを、1日1〜5回、好ましくは1日1〜3回、1〜14日間投与することができる。
【００８２】
工程（ｂ）において、ミンクルの発現量の測定は、mRNAまたは蛋白質を対象として行なわれる。mRNAの発現量は、例えば、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノーザンブロッティングなどにより測定される。蛋白質の発現量は、例えば、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法、蛍光抗体法などを用いることができる。また、ミンクル遺伝子プロモーターの下流に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞（例えば、ルシフェラーゼ、GFP）を用いた場合、発現量は、レポーター蛋白質のシグナル強度に基づき測定される。
【００８３】
後記実施例において示されるとおり、SAP130の存在によりミンクル遺伝子の発現が誘導される。したがって、工程（ａ）において、被験物質と細胞との接触を、SAP130の存在下で行うことにより、SAP130の刺激により誘導されるミンクル遺伝子の発現を調節し得る物質をスクリーニングすることができる。工程（ａ）においてSAP130を共存させる方法としては、細胞が培養細胞等の形態で提供される場合には、SAP130の培地への添加が挙げられるが、放射線照射等により非恒常性の細胞死を誘導した細胞の添加や、ミンクルの発現を測定可能な細胞自身に適当量の放射線を照射するなどして、部分的に細胞死を誘導することにより行うこともできる。一方、細胞が動物個体の形態で提供される場合は、該動物に放射線照射するなどして、部分的に細胞死を誘導することによりSAP130を提供することができる。
【００８４】
測定対象物としてRNAを利用する場合、具体的には、本発明のスクリーニング方法は、ミンクル遺伝子配列に基づいて公知の方法によりプライマーまたはプローブを調製し、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などにより前記疾患マーカーへのRNAまたはその転写物の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００８５】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記プローブを用いることによって、RNA中のミンクル遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、上記プローブ（相補鎖）を放射性同位元素（RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした上記細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された上記プローブ（DNA）とRNAとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（RIもしくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、Alk Phos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharamcia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って上記プローブ（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００８６】
RT-PCR法を利用する場合は、ミンクル遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはそれに相補的なポリヌクレオチドをプライマーとして用いることによって、RNA中のミンクル遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、上記細胞由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のミンクル遺伝子の領域が増幅できるように、調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００８７】
DNAチップ解析を利用する場合は、ミンクル遺伝子部分配列をDNAプローブ（1本鎖または2本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、例えば、これに上記細胞由来のRNAから常法によって調製し、ビオチンで標識されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、蛍光標識されたアビジンで検出する方法を挙げることができる。
【００８８】
In situハイブリダイゼーション法を利用する場合は、前述の上記細胞を固定・包埋し、切片を調製する。ミンクル遺伝子の特異的アンチセンスプローブまたはセンスプローブを作製する。前記プローブは、RI標識または非RI標識（例えば、DIG標識）でラベリングする。前記切片を脱パラフィン（パラフィン切片の場合）および前処理した後、エタノール等で固定する。固定した切片をプレハイブリダイズし、前記プローブとハイブリダイズした後、洗浄およびRNase処理を行い、標識に応じた検出方法（例えば、RI標識の場合は現像、非RI標識の場合は免疫学的検出と検鏡）により生体組織におけるミンクル遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。
【００８９】
測定対象物として蛋白質を利用する場合、具体的には、本発明のスクリーニング方法は、抗ミンクル抗体を用い、ウェスタンブロット法、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法、蛍光抗体法、免疫細胞染色法などにより前記抗体への蛋白質の結合量が増大していることを指標として行うことにより実施できる。
【００９０】
ウェスタンブロット法を利用する場合は、1次抗体として抗ミンクル抗体を用いた後、2次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した2次抗体（1次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、1次抗体として抗ミンクル抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【００９１】
免疫細胞染色法を利用する場合は、後述する実施例４に記載の方法に準じて、例えば、ミンクル陽性細胞を酵素標識抗体とその発色基質を用いて測定することができる。
【００９２】
工程（ｂ）において、発現量の比較は、被験物質の存在下、非存在下において、ミンクルの発現量における有意差の有無に基づいて行なわれる。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるミンクルの発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるミンクルの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００９３】
工程（ｃ）において、ミンクルの発現を低下もしくは増大させる被験物質が選択される。ミンクルの発現を低下させた被験物質は、抗炎症性物質、特に炎症性疾患の予防・治療薬の候補として有用である。また、免疫調節剤や研究用試薬としても有用である。一方、ミンクルの発現を増大させた被験物質は、組織損傷や感染症の治療薬の候補として有用である。
【００９４】
上記（I）〜（IV）のスクリーニング法により選択された物質を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。投与に用いられる医薬組成物としては、選択された物質と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤としては、上記したとおりのものが使用できる。
【００９５】
上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の関節リウマチの治療・予防のために使用する場合には、活性成分を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００９６】
また、本発明は、被験動物より採取した試料中のSAP130量を測定することを特徴とする、非恒常性細胞死の検出方法を提供する。
【００９７】
被験動物としては、ヒトもしくは他の哺乳動物が挙げられるが、好ましくはヒト、あるいは実験動物として汎用されるマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等である。測定対象試料としては、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、粘膜、尿、涙、精液、関節液が挙げられる。
【００９８】
試料中のSAP130量は、例えば、抗SAP130抗体、ミンクルもしくはそのSAP130との結合に関与する領域を含む断片を用いて、測定することができる。具体的には、例えば、第１の抗SAP130抗体またはミンクルもしくはその断片を固相化した反応容器（マイクロタイタープレート等）に試料液を添加して一定時間インキュベートした後、液相を除き、さらに標識した第２の抗SAP抗体または抗ミンクル抗体を添加して、固相に結合した標識量を測定することにより、SAPを定量することができる。標識物質としては、例えば、放射性同位元素（例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕など）、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど）、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などが用いられる。
上記の方法以外にも、他の免疫学的手法や表面プラズモン共鳴などを用いて試料中のSAP130量を測定しうることは、当業者に自明であろう。
【００９９】
上記測定の結果、被験動物より採取した試料中のSAP130量が、健常対照より採取した試料中のSAP130量と比較して有意に高かった場合、該被験動物体内で非恒常性の細胞死が生じていると判定することができる。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【０１０１】
［方法］
マウス
C57BL/6 (B6)マウスをClea Japanから購入した。B6バックグラウンドのFcRγ-/- マウスはPark, S.Y. et al., J Clin Invest 102, 1229-38 (1998)に記載されたようにして確立した。CARD9-/-マウスはHara, H. et al., Nat Immunol 8, 619-29 (2007)に記載されたようにして確立し、6回B6と戻し交雑した。B6バックグラウンドのMyD88-/-マウスはS. Akira (Osaka University)からいただいた。FcγRI-/-およびFcγRIII-/-マウスはJ. S. Verbeek (Leiden University)からいただいた。マウスは全てエアーフィルターの層流のある飼育ラック中で維持し、標準の餌および水を自由摂取させた。動物実験は全て我々の施設ガイドラインに従って行った。【０１０２】
コンストラクション
ミンクルcDNA はPCRでクローニングし、pMX-IRES-hCD8 vectors 50に挿入した。Mincle-Flagは以前に記載されたものと同じプライマー（Matsumoto, M. et al., J Immunol 163, 5039-48 (1999)）を用いて作製した。Ig-Mincle融合タンパク質を構築するために、PCRでマウスミンクルの細胞外ドメイン(アミノ酸 46-214)をhIgG Fcに融合させた。SAP130 cDNAはPCRでクローニングし、pcDNA3.1-V5-His-TOPO (Invitrogen)に挿入した。【０１０３】
抗体
ウサギ抗ミンクルポリクローナル抗体はマウスミンクルの細胞質側領域に相当するペプチド(アミノ酸1-16)に対して作製した。抗phospho-Erk Ab はPromega、抗phospho-SykはCell Signaling Technology、抗human IgG-HRPおよびProtein G SepharoseはAmersham Biosciences (Piscataway, NJ)、抗rat IgG-HRPはZymed、抗rat IgG-PEはJackson Immunoresearch、抗Histone-H1 および抗SAP145はSanta Cruz、抗SAP49はAbcam、抗SAP130はNovus Biologicals、SAP155はMBL、抗DDB1はBD Biosciences、そして抗FlagはSigmaから購入した。【０１０４】
細胞刺激
チオグリコール酸で誘発した腹膜マクロファージは抗ミンクルおよびマウス抗ラットIgAbsで刺激した。細胞を1% Nonidet P-40溶解緩衝液で溶解し、免疫沈降およびウェスタンブロットは前に記載（Yamasaki, S. et al., Nat Immunol 7, 67-75 (2006)）のとおり行った。LPS (L4516)およびzymosan (Z4250)はSIGMAから購入した。【０１０５】
Ig-Mincleの調製
ミンクルの細胞外ドメイン(アミノ酸46-214)は、PCRで終止コドンを欠くhIgG Fc領域のC末端に融合させ、pME18S-SLAMsig-hIgG FcのXhoI/NotI断片に挿入した。293T細胞をpME18S-SLAMsig-hIgG Fc (Ig)またはpME18S-SLAMsig-hIgG Fc-Mincle (Ig-Mincle)で一過的にトランスフェクトした。細胞は無タンパク質培地(PFMH-II)で培養した。ろ過した上清をProtein A-Sepharose columnにアプライし、結合した画分を50mM diethylamineで溶出し、すぐにTris-HCl(pH 7.5)で中和した。主画分をPBSで透析し精製Ig fusion溶液として用いた。タンパク質の分子量および精製度は銀染色および抗hIgG-HRP (Pierce)を用いたウェスタンブロットによって見積もった。Leucine-zipper化Fas-ligand(FasL)はS. Nagata (Kyoto University)からいただいた。【０１０６】
分子モデリング
ミンクルの配列はNCBI serverから取得した。79〜214残基の範囲のミンクルの部分配列を抽出し、相同性モデリングの一般的方法を用いてその三次元構造を予測した。DC-SIGN (PDB-entry: 1nfd)の結晶構造はProtein Data Bank(PDB)から相同性モデルを生成するための鋳型として取った。ミンクルの部分配列は、NW alignmentを用いて鋳型タンパク質と整列させた。適切なアラインメントを得るべく、ミンクル中のギャップおよびCys残基は鋳型中の対応するCys残基の位置へと手動で置換した。適切なアラインメントを達成し、標的タンパク質中の主鎖の原子をDC-SIGNの鋳型タンパク質中の対応する残基の座標に当てがった。ループ領域中の挿入および欠失を、公知の構造を持つタンパク質の断片から作られた断片データベースから好適な構造を探すことによってモデルにした。Metropolis Monte Carlo法を用いてミンクルモデルのバックボーンに側鎖を構築した。構造を最適化するために、2000段階の最適化を分子動力学パッケージのAMBER8を用いて最急降下法で行った。【０１０７】
図1dはViewerLite (Accelrys)で作製した。【０１０８】
RT-PCR
ゲノムDNAをDNase (Wako Nippon Gene)処理によって除去した後、reverse transcriptase II (Invitrogen)を用いてランダムプライマーによってcDNA鎖を生成した。遺伝子特異的プライマーを用いることによってリアルタイムPCRによってRNAの発現を定量し、値をβ-actinの発現で正規化した。遺伝子特異的プライマー配列は次のとおりである。
β-actin,
5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’ (forward)
5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’ (reverse);
IL-6,
5’-TTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3’ (forward) 
5’-CTTCATGTACTCCAGGTAG-3’ (reverse);
TLR2,
5’-CAGCTTAAAGGGCGGGTCAGA-3’ (forward)
5’-TGGAGACGCCAGCTCTGGCTC-3’ (reverse);
ミンクル,
5’-GCTCCAGCAGGGAACAATAG-3’ (forward)
5’-GCCCTTTGATGGAATTCAGA-3’ (reverse);および
FcRγ,
5’-CCTTCCCTTCCCTCTACACC-3’ (forward)
5’-AAGGTAAGGCAGGGTGGTCT-3’ (reverse).【０１０９】
統計学
統計解析は全て対応のない両側Student’s t 検定を用いて行った。【０１１０】
［実施例１］
マウスミンクルを発現する好塩基球性白血病(RBL-2H3)細胞をウィスターラットに免疫して抗ミンクルモノクローナル抗体を樹立した。Mincle-IRES-GFPを発現する2B4細胞を染色することによってクローン化ハイブリドーマの上清をスクリーニングした。3つの独立クローン1B6 (IgG1,κ), 4A9 (IgG1,κ)および6E2 (IgG2c,κ) の特徴を調べ(図1)、本研究に用いた。それぞれのモノクローナル抗体におけるendotoxinのレベルは1 EU/ml (Limulus Color KY Test, Wako)以下だった。モノクローナル抗体のビオチン化はEZ-link biotinylation kit (Pearce)を用いて行った（図１）。【０１１１】
抗ミンクルモノクローナル抗体のエピトープマッピングはペプチドベースのELISAによって行った。ミンクルの細胞外ドメイン(長さ13 a.a、重複 11 a.a.)を包み込む79のビオチン化ペプチドをJPT Peptide Technologiesによって合成した。各ペプチドは0.5nMでストレプトアビジンでコーティングしたマルチウェルプレート(PerkinElmer)に結合させた。1μg/ml BSAでブロッキングした後、10μg/mlラットIgGおよび抗ミンクルモノクローナル抗体を加えた。洗浄後、1μg/ml抗ラットIgG-HRPを加えてTMBZ peroxidase substrate (SUMILON)を用いて発色を行った（図１）。【０１１２】
［実施例２］
マウス、ラットおよびヒトのミンクルアミノ酸配列のアラインメントから膜貫通ドメイン内に保存されたアルギニン残基があることがわかった(図2a)。他の免疫受容体について書かれているように、この膜貫通部分内の正に帯電した残基の存在によってミンクルがITAMを含むアダプター分子（FcRγ、DAP10、DAP12およびCD3ζ）と相互作用することが示唆される。ミンクルがこれらのサブユニットのうちのいずれかと結合できるかどうか検証するため、ミンクルを、これらのアダプターとともに293Tにトランスフェクトした。新たに確立した抗ミンクル抗体(図1)を用いた免疫沈降およびウェスタンブロット解析により、ミンクルはFcRγと選択的に結合するが、DAP10、DAP12およびCD3ζとは結合しないことがわかった(図2bおよびデータ省略)。重要なことには、内生ミンクルとFcRγとの結合はマウスの腹膜のマクロファージでも明らかであった(図2c)。そして我々はヒトミンクルもFcRγと結合することを確認した(データ省略)。ミンクルとFcRγとの相互作用はミンクルの膜貫通領域内のArg42(R42)残基を通して仲介された。なぜなら相互の免疫沈降によって証明されたように(図2d)、R42I（正の帯電から中性への）変異でFcRγとの結合が無くされるからである。この結合は、ミンクルがシグナルを伝達するのに重要らしい。というのは、ミンクルおよびFcRγをT細胞ハイブリドーマに異所的に発現させると、ミンクルの架橋によって誘導されたIL-2産生がR42に依存したからである(図2e)。ミンクルにはその細胞質側領域に潜在的なセリン／トレオニンリン酸化部位があるが、C末端側尾部を欠くミンクルの欠損変異体(MincleΔ2-18)は同様の系でのシグナル伝達能力を減じなかった(データ省略)。これらの結果から、ミンクルはFcRγを通したシグナル伝達ができることが示唆された。【０１１３】
［実施例３］
次に、内生ミンクルが活性化シグナルを変換できるかどうか検証するために、チオグリコール酸で誘導した腹膜のマクロファージを抗ミンクル抗体で刺激した。固定した抗ミンクルによりTNFα、MIP-2(CXCL2)図3a)、KC(CXCL1)およびIL-6(データ省略)の産生が誘導されたが対照IgGではされなかった。ミンクル誘導性の炎症性サイトカインの産生はFcRγ-/-細胞ではなかったが、FcRγ非依存性LPS刺激で匹敵する量のサイトカインが誘導された(図3b)。TLRシグナル伝達に重要なアダプターのMyD88はミンクルを介したサイトカイン産生には必須ではなかった(図3b)。従って、ミンクルはFcRγ依存的に活性化シグナルを変換してマクロファージに伝えるということになる。【０１１４】
我々は次に、ミンクル刺激の際に引き出される近位のシグナルを調べた。ミンクルの架橋によって腹膜のマクロファージでキナーゼSykおよびErkを含む細胞タンパク質のリン酸化が誘導された(図3c)。多くの免疫受容体中でSykはリン酸化ITAMに直接結合し、下流の複数の基質のリン酸化を誘導した。従って、抗ミンクルモノクローナル抗体による総体的なチロシンリン酸化の誘導がFcRγ-/-マクロファージでは著しく抑止された(図3d、右レーン)が、これはミンクルが、下流シグナルを誘導するためにFcRγ-Sykカスケードを利用することを示唆する。抗ミンクルを介したリン酸化はFcRγ-/-マクロファージでは減じられるが、FcγRI/III(CD64/16)二重欠損マクロファージでは依然として観察される(図3d、左レーン)。このことにより抗ミンクルはFcγ受容体(FcγR)とは無関係にMincle-FcRγ複合体を通して直接シグナル伝達することが示唆された。【０１１５】
最近、アダプター分子のCARD9がSykを炎症反応と結びつけるのに必須であることが示された。ゆえに我々は、野生型、FcRγ-/-およびCARD9-/-マウスのマクロファージにおいて抗ミンクルによって誘導される反応を比較した。ミンクルによって誘発されるMIP-2の産生はCARD9-/-腹膜マクロファージではFcRγ-/-細胞におけるそれと同程度に減じられていた(図3e)。【０１１６】
我々はミンクルシグナル伝達について骨髄由来のマクロファージ(BMMφ)も検証した。腹膜マクロファージと一致して、活性化BMMφにおけるミンクル介在性のMIP-2産生(図3f)およびSyk活性化(図3g)はMyD88ではなくFcRγに依存していた。これらの結果により、ミンクルはFcRγ-Syk-CARD9シグナル伝達軸を通してマクロファージを活性化することが示唆された。【０１１７】
［実施例４］
ミンクルの表面での発現にはFcRγは本質的に必要ではない（データ省略）が、LPS誘導性の内生ミンクルの表面発現の亢進はFcRγ-/- BMMφでは野生型よりも弱かった。しかしながら、興味深いことに、この上昇はMyD88非依存性であることが見出された(図4)。【０１１８】
［実施例５］
次に、我々はミンクルの生理学的リガンドを発見しようとした。骨髄性細胞による炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌はリガンド候補のスクリーニングに用いられ得る可能性のある指標である。しかしながら、そのようなサイトカインおよびケモカインはTLR刺激に際しても大量に産生される。従って推定上のミンクルのリガンドをコンタミする可能性のあるTLRのリガンドと区別するために、我々は非骨髄性T細胞ハイブリドーマを宿主細胞として用い、そしてNFAT-GFPレポーターをITAM介在性シグナルの特異的検出手段として利用した。【０１１９】
我々はミンクル、FcRγおよびNFAT-GFPレポーターを共発現するT細胞ハイブリドーマを確立した。可溶性の抗ミンクルはGFP発現に影響しなかったが（データ省略）、プレートにコーティングされた抗ミンクルによるミンクルの架橋によって激しいGFP発現が誘導された(図5a)。予想したとおり、LPSやザイモサン等のTLRリガンドによってはGFP誘導は観察されなかった(データ省略)。【０１２０】
興味深いことに、我々は、細胞を3〜4日間培地交換なしのまま培養した場合にNFAT-GFP発現が著しく誘導されることを見出した(図5b、冒頭パネル)。この培養期間中、死ぬ細胞の数が増加し、そして同時にGFP+の集団が増加した(図5b、c)。FcRγだけが発現し、ミンクルは発現していない細胞ではGFPの発現は観察されなかったし（データ省略）、NFAT活性化は可溶性抗ミンクルモノクローナル抗体によってほぼ完全に阻害された(図5b、下パネル)。これらの結果により、死細胞由来の成分がミンクルを通してシグナル伝達するかもしれないことが示唆された。【０１２１】
この仮説と一致して、いくらかのGFP+細胞がプロピジウムイオダイド(PI)陽性の死細胞に結合した状態で観察された(図5c)。トポイソメラーゼII阻害剤のetoposideはDNA損傷を誘導することによって細胞死を促進する。etoposide処理した死細胞を単純に添加してもミンクル発現性細胞を活性化できた(図5d)。これらの結果から、明確にされていないミンクルのリガンドが細胞死の間に生成および／または放出されることが示唆された。【０１２２】
ミンクルは、よく調べられたマンノース結合モチーフであるEPNモチーフを、そのC型レクチンドメイン内に含む。ミンクルによる死細胞の認識が、マンノースまたは関連する炭化水素を関与させるかどうか試験するために、我々はミンクルのEPNモチーフを変異させてQPDモチーフにした。QPDモチーフはガラクトースに選択的に結合することが知られている。E169Q/N171D (MincleEPN->QPD)を持つ変異型ミンクルは依然として死細胞に応答した活性化シグナルを野生型と同様に伝達した。このことからミンクルは炭化水素とは関係なくそのリガンドを認識することが示唆された(図5e)。確かに、最近の報告によってC型レクチンが炭化水素リガンドと同様に非炭化水素リガンドを認識することが示されている。強力な阻止的モノクローナル抗体 1B6によって認識されるエピトープのVEGQW配列(図1)を欠くミンクルの変異体ではNFATの活性化が無くなる(図5e)。このことにより、これらの残基が死細胞由来のミンクルリガンドの認識に重要であることが示唆される。【０１２３】
［実施例６］
死細胞由来のミンクルリガンドを更に調べるために、我々は可溶性ミンクルタンパク質を構築した。ミンクルはII型膜タンパク質であることから、ミンクルの細胞外ドメインをヒトイムノグロブリンG Fcドメインに融合させた(Ig-Mincle) (図6a)。我々ははじめにIg-Mincleが死細胞を特異的に認識するかどうか検証した。Ig-MincleはAnnexinV+PI+の胸腺(図6b)および2B4死細胞(データ省略)に選択的に結合したが、対照Igはしなかった。従って、死細胞がミンクル結合タンパク質を発現しているようである。【０１２４】
とりわけ、Ig-Mincleは、たとえCa2+がレクチンにとって炭化水素性のリガンドの認識に必須とわかっていても、Ca2+なしで死細胞に結合する。ゆえに、ミンクルリガンドの候補を捜すため、我々はIg-Mincleを用いてCa2+非存在下で死細胞のライセートからミンクル結合タンパク質を探索した。我々は再現できる方法でIg-Mincleには特異的に結合したが対照Igには結合しなかった130kDのタンパク質(p130)を見出した(図6c)。そこで我々は死細胞のライセートを用いて一連のカラム精製によってミンクル結合タンパク質を精製した(図7)。マススペクトル解析により10すべてのp130由来のペプチドは、U2低分子核内リボヌクレオタンパク質(snRNP)24の成分であるスプライソソーム結合タンパク質130（SAP130、Sf3b3としても知られる）(図6d)に相当することがわかった。【０１２５】
SAP130はUVで損傷したDNAに結合する損傷DNA結合タンパク質1(DDB1)に著しく相同である。しかしながら、抗-SAP130を用いたイムノブロットではIg-MincleはSAP130に選択的に結合し、DDB1にはしないことがわかった(図6e)。死細胞から分泌され、過剰または非恒常性細胞死を免疫系に警告するシグナルとして作用すると報告されている核タンパク質high mobility group box 1(HMGB1)はミンクルリガンドのいまひとつ別の候補である。しかしながら、HMGB1はIg-Mincle(図6e、f)および活性化ミンクル発現性NFAT-GFP（データ省略
）のいずれとも相互作用しなかった。これらの結果から、SAP130がミンクルに選択的に結合することが示された。【０１２６】
細胞死過程の間に起こるリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化またはメチル化等のタンパク質修飾が、SAP130のミンクルに結合する能力を与え得る可能性がある。この考え方を試験するため生および死細胞由来のSAP130の、ミンクルとの結合能について比較した。図6fで、ミンクルが生および死細胞由来のSAP130に等しくよく結合することを示す。このことは過剰な細胞死についてのSAP130のシグナルがタンパク質修飾のレベルでは調節されていないことを暗示する。【０１２７】
SAP130は正常な生細胞で核に局在するから、細胞死に際してのSAP130の外部環境への移行が非恒常性細胞死についての警告シグナルになりうる。確かに、snRNPsの他の構成成分のSmタンパク質は後期のアポトーシスまたはネクローシス細胞から上清に移行することが知られている。この考え方に一致して、いまひとつ別の典型的な核タンパク質のヒストンH1と比べた場合、相当量のSAP130が死細胞から放出された(図6g)。SAP130の放出はFas-リガンド(Fas-L)誘導性細胞死の間も明らかで、プロピジウムイオダイド(PI)+の後期アポトーシス／ネクローシス細胞の出現と密接に相関した(図6h)。【０１２８】
［実施例７］
2B4T細胞ハイブリドーマは死細胞を生成するために4日間培養した。1×108の細胞を1% NP-40 溶解緩衝液(1% NP-40, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10μg/ml aprotinin, 12.5μg/ml chymostatin, 50μg/ml leupeptin, 25μg/ml pepstatin A, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)で溶解した。IgおよびIg-Mincleタンパク質はdimethyl pimelimidate (Pierce)およびethanolamineを用いてProtein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Bioscience)に共有結合させた。細胞ライセートはProteinG Sepharoseを通して2回溶出させ、次いでIg-coupled ProteinG Sepharoseを通して3回溶出させた。フロースルー画分はIg-Mincle-bound ProteinG Sepharose columnにアプライし、カラムを溶解緩衝液で洗浄した。結合画分は試料緩衝液と煮沸することによって溶出し、SDS-PAGEで分離し、続いてPVDFに転写してColloidal Gold Total Protein Stain (Bio-Rad)で染色した。p130に相当するバンドを切り出してMALDI-TOF/MS in Protein Research Network, Inc.で解析した（図７）。【０１２９】
哺乳動物細胞からSAP130を精製するために、293T細胞中でV5タグ付きSAP130を発現させ、細胞ライセートから抗V5アガロースを用いて精製し、続いてV5ペプチドで溶出させた。バキュオウィルスで発現させたSAP130を精製するために、SAP130 cDNAをpLP-BacPAK9-6xHN baculovirus vector (Clontech)に挿入し、組み換えバキュオウィルスをSf9細胞に感染させた。細胞上清をQ-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)およびTALON metal affinity resins (Clontech)で精製した（図７）。【０１３０】
［実施例８］
次に我々は精製SAP130がミンクル発現細胞を活性化できるかどうか検証した。哺乳動物細胞から組み換えSAP130を精製するために、293T細胞でV5タグ付きSAP130を発現させ、抗V5-アガロースを用いてV5ペプチドとともに溶出して細胞ライセートから精製した。プレートにコーティングした抗V5上でSAP130-V5で腹膜マクロファージを刺激すると、相当量のMIP-2が上清中に分泌された(図8a)。同様の刺激によりミンクルおよびFcRγを発現するT細胞ハイブリドーマからIL-2産生も誘導された(図8b)。このことにより、精製タンパク質の活性がコンタミしたエンドトキシンのせいである可能性は極端に小さくなった。我々はSAP-130-V5がミンクルを発現しない親細胞には何ら影響を及ぼさないことも確認した(図8b)。更に、ミンクル発現細胞によるSAP130-V5誘発性IL-2産生が可溶性抗ミンクルモノクローナル抗体によってほぼ完全に阻害された(図8b)。これらの結果によりSAP130がミンクルの内生リガンドとして作用できることが示唆される。【０１３１】
我々はバキュオウィルス発現ベクターを用い、昆虫細胞で組み換えHNタグ付きSAP130も生成した。組み換えSAP130はマクロファージでMIP-2を産生する免疫刺激活性を保有した(図8c)。【０１３２】
これらの結果を合わせると、SAP130がミンクルの機能性リガンドであることが暗示される。SAP130は内生の核タンパク質であるから、ミンクルによるSAP130の認識が過剰細胞死の発生についてのシグナルになり得る。【０１３３】
［実施例９］
最後に、我々はin vivoでミンクルの生理学的機能について調べた。いくつかの報告で、過剰または非恒常性細胞死により感染が無いにもかかわらず炎症性細胞の一過的な浸潤が誘導されることが証明された。この現象を研究するためのモデル系にはマウスの全身放射線照射が含まれるが、これは、皮質領域中でCD4+CD8+二重陽性(DP)胸腺細胞の大量死を誘導し(図9a、b)、且つ結果的に好中球の胸腺への一過的浸潤を誘起する(図9b、右パネル)。p53-/-マウス等のDP胸腺細胞死が起きない変異マウスでは浸潤が減じられることが報告されているので、この好中球の浸潤は過剰な細胞死の結果のようだ。我々は、DP胸腺細胞を欠くRag2-/-マウス（データ省略）同様アポトーシス抵抗性のApaf1-/-マウスでは照射後、好中球の浸潤がずっと少ないことも確認している。【０１３４】
我々は全身照射後、ミンクルmRNAが急速に上昇することを見出した(図9c)。ミンクルの上昇はTLR2およびFcRγの誘導に先立って起こって、それが胸腺内の炎症性細胞の浸潤を示すことから、この上昇はミンクルの転写活性化に起因した(図9c)。【０１３５】
次に、死細胞を認識することによってミンクルが好中球浸潤を誘起するかどうか検証した。阻止用の抗ミンクルモノクローナル抗体投与で照射後の胸腺への好中球の浸潤が劇的に抑制された(図9d、e)が、その一方で胸腺細胞死の頻度自体はモノクローナル抗体処理によって変化しなかった(データ省略)。【０１３６】
胸腺のマクロファージによって産生されたMIP-2が好中球の補充に重要だと報告されている。抗ミンクル処理は胸腺のマクロファージによるMIP-2産生を阻害した(図9f)。このことにより、このモノクローナル抗体が、マクロファージから炎症性サイトカイン／ケモカインを誘導するためにミンクル−リガンド相互作用を阻止することが示唆された。【０１３７】
［実施例１０］
dexamethazone誘導性の胸腺細胞死による好中球の浸潤も、抗ミンクルモノクローナル抗体処理により減じられた(図10)。モノクローナル抗体クローン1B6の、好中球浸潤への阻止効果はクローン4A9のそれよりもより強力であったが、これはin vitroでの1B6のミンクルへのより強力な阻止効果と一致する(図5b)。【０１３８】
［実施例１１］
抗ミンクルはLPS刺激による好中球のin vivo輸送に影響しなかった(図11)。従って、胸腺細胞死に際した好中球の浸潤には、その大半にミンクルが介在する。【０１３９】
［実施例１２］
様々な自己および非自己リガンドを認識するため、C型レクチン受容体は重要な免疫受容体であることを示す証拠が増えている。C型レクチンによって認識される病原体成分はよく書かれてきているが、自己リガンドはそれほどよくわかってはいない。大まかに言えば、それらは組織損傷に関連した分子のように思える。例えば、エンドサイトーシス受容体のMBL、Lox-1およびMGL-1は死細胞からのリガンドを認識し、それらの一掃に関与し得る。抗ミンクルモノクローナル抗体は胸腺死細胞の食作用を阻止しなかったことから、ミンクルはエンドサイトーシス受容体ではないように思える(図12)。これまで損傷した自己を認識するとわかったものは無いが、あるレクチン受容体はITAMを通したシグナル伝達に介在できる。従ってミンクルは死細胞を直接認識する初のITAM共役性受容体である。【０１４０】
［実施例１３］
我々はSAP130をミンクルのリガンドとして同定した。U2 snRNP複合体内で、SAP130はSAP145、SAP155およびSAP49と相互作用してスプライソソームを形成する(図13a)。従って、SAP155、SAP145およびSAP49もIg-Mincleとともに共沈殿するが、SAP130ほど効率はよくない(図13b)。精製SAP130を用いた我々のデータは、それがミンクル発現細胞を独力で活性化することを示唆するが、複合体形成がミンクルの反応性を亢進するかどうかは現時点で不明である。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明のスクリーニング方法により、炎症反応の活性化シグナルを根本から阻害できる新規の抗炎症剤を探索できる。そしてこれにより得られた本発明の抗炎症剤を炎症性疾患の治療に提供できる。また本発明の診断方法により、炎症反応を誘導する組織中の細胞死の有無を診断できる。更に炎症反応のアゴニストを探索し、損傷または病原体が感染した組織への好中球の浸潤を適当なレベルで促進し、その結果組織修復を促進する治療剤として提供できる。【０１４２】
本発明は、２００８年７月１７日出願の日本国特許出願、特願２００８-１８６５７０を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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