(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌細胞の存在を検出する方法であって、
(a)  患者由来のサンプルを、I型コラーゲン又はIII型コラーゲンの標識された繊維を含み、接着分子で被覆されることで細胞接着マトリックスを形成する繊維組成物を含む標識された細胞接着マトリックスに接種し、
(b)  この標識された細胞接着マトリックスに癌細胞を接着させ、癌細胞が該細胞接着マトリックスを分解且つ取り込むのに十分な時間、該サンプルをインキュベートし、且つ、
(c)  該サンプル中の癌細胞の存在を示すように癌細胞による該標識されたマトリックスの取り込みを検出する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
上記サンプルが血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記サンプルが組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌患者由来の癌細胞の転移能を調べる方法であって、
(a)  癌患者由来の癌細胞を、I型コラーゲン又はIII型コラーゲンの標識された繊維を含み、接着分子で被覆されることで細胞接着マトリックスを形成する繊維組成物を含む標識された細胞接着マトリックスに接種し、
(b)  この標識された細胞接着マトリックスに接着し、該細胞接着マトリックスを分解且つ取り込むように癌細胞による該マトリックスの取り込みを可能とするのに十分な時間、癌細胞をインキュベートし、
(c)  癌細胞による該標識されたマトリックスの取り込みを検出する、
ことを含んでなり、その際、該マトリックスの癌細胞接着及び取り込みの検出が転移能を有する癌細胞の指標となる、上記方法。
【請求項５】
上記マトリックスが蛍光タグで標識されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記マトリックスが放射性同位元素で標識されている、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】1.  緒言
本発明は、転移癌患者由来の血液、腹水および腫瘍組織から転移能を有する癌細胞を検出および単離する新規な方法に関する。本発明はさらに、癌細胞の検出および単離のための細胞接着マトリックスとして使用するための、ならびに転移癌患者による血液フィルターとして使用するための新規な組成物に関する。本発明の方法および組成物はまた、単離された癌細胞の転移能の判定や癌転移予防薬の同定のために設計されたアッセイにおいて使用可能である。さらに本発明は、転移癌細胞の表面に発現されたセリン膜内在性プロテアーゼ活性をモジュレートすることによる癌細胞の転移能の阻害に関する。本発明は患者の血液、腹水または腫瘍から単離された癌細胞がコラーゲンマトリックス材料に優先的に接着し、それを分解して取り込むという発見に基づく。さらに、セプラーゼおよびジペチジルペプチダーゼIV(DPPIV)サブユニットからなるセリン膜内在性プロテアーゼ(SIMP)が移動中の細胞表面上で活性化されることも見出した。
【０００２】2.  発明の背景
従来の骨髄採取および白血球フェレーシス法を行う際の、転移癌患者の組織からの癌細胞分離に伴う問題が報告されている(Campana, D.ら, Detection of Minimal Residual Disease in Acute Leukemia: Methodologic Advances and Clinical Significance, Blood, 1995 Mar 15, 85(6): 1416-34; Brugger, W.ら, Mobilization of Tumor Cells and Hematopoietic Progenitor Cells into Peripheral Blood of Patients with Solid Tumors, Blood, 83(3): 636-40, 1994)。1人の患者から採取した単核細胞総数100億個ほどには25,000から1200万個の癌細胞が混在する。遺伝的マーキングにより、これらの癌細胞が再発の原因となることがわかってきている(Rill, E Rら, Direct Demonstration that Autologous Bone Marrow Transplantation for Solid Tumors Can Return a Multiplicity of Tumorigenic Cells, Blood, 84(2): 380-383, 1994)。
【０００３】  転移性疾患の癌患者の循環系中にも、多数の癌細胞が認められる。Glaves, D., RP Huben, およびL. Weiss(1988. Br. J. Cancer. 57:32-35)は、腎細胞癌の手術直前に10人の患者の腎静脈から血液サンプルを採取し、癌細胞が107から109個／日の割合で放出されていると推定した。これらの循環癌細胞がどのように転移に寄与するのかは依然として知られていない。数千分の1から数百万分の1の細胞というごくわずかな転移性循環癌細胞の小集団を同定することの困難さが主な障害となっている。循環癌細胞の大多数が宿主免疫により死滅していることは明らかである。例えば、抗体に基づく細胞分離法の信頼性が高い実験動物腫瘍モデルでは、移植可能なB16黒色腫またはルイス肺癌の増殖中(約20日間)、約1千万から1億個の腫瘍細胞が血液中に放出されると推定されるが、これら細胞のうち肺へ転移するのはマウスあたり100個未満である(Glaves, D., 1983, Br. J. Cancer, 48:665-673)。さらに、マウスまたはラットの循環系中に直接腫瘍細胞を導入した多くの実験では、かかる細胞が腫瘍小結節を形成する割合が0.01％を上回るのは稀である。より一般的にはその効率は2桁以上低い。これらの実験結果から、原発腫瘍からの癌細胞の初期段階の放出は転移進行の限定因子ではないことが示唆される。なぜなら放出された癌細胞のうちのごくわずかなものだけが生存能力を有し、浸潤し、その結果転移するからである。転移のメカニズムを理解するため、かかる転移細胞を標的とする細胞分離システムおよび検出システムの開発が極めて重要である。
【０００４】  血液または体液から癌細胞を分離するいくつかの方法が知られている。かかる方法には、例えば、顕微解剖により癌細胞をひとつひとつ分離する方法(Suarez-Quianら, 1999, Biotechniques, 26:328-35; BeltingerおよびDebatin, 1998, Mol. Pathol 51:233-6)、蛍光活性化セルソーティングを用いる抗体ベースの方法(Pituch-Noworolskaら, 1998, Int. J. Mol. Med. 1:573-8)、抗体で被覆した癌細胞を磁場を用いて磁性体上に分離する方法(Denisら, 1997, Int. J. Cancer 74:540-4; Racilaら, 1998, Proc. Natl. Acad Sci USA 95-4589-94)、または密度勾配で循環癌細胞を分離する方法(Sabileら, 1999, Am. J. Clin. Pathol. 112:171-8)などがある。しかし、かかる癌細胞分離法は腫瘍特異的抗体が利用できるかどうか、または種々の癌細胞特有の浮遊密度と形態学に負うところが大きい。従って、造血細胞移植物から癌細胞を除去するための効率的な方法が大いに必要とされている(Gulati, S Cら, Rationale for Purging in Autologous Stem Cell Transplantation. Journal of Hematotherapy, 2(4):467-71, 1993)。
【０００５】  初期の実験において転移形成の初期段階で原発癌が新生細胞を循環系中に放出し始めることが示された(Fidler IJ, 1973, European Journal of Cancer 9:223-227; Liotta LAら, 1974, Cancer Research 34:997-1004)。癌細胞はひとたび循環系中に放出されると血管壁の下にある基底膜に接着し、隣接する結合組織に浸潤して微小転移巣形成を引き起こす(Liotta ら, 1991, Cell 64:327-336)。浸潤最前部の癌細胞と循環系に放出された癌細胞が転移性疾患の進行に決定的に関与していると考えられている。
【０００６】  この転移プロセスは複雑で、原発腫瘍からの癌細胞の逸脱、新しい場所への移動および新しい部位での増殖の確立が含まれる。転移を成功させるためには浸潤癌細胞が以下に示す転移性の性質を獲得しなければならない：(i)原発癌から放出され、(ii)循環系中で生存し血管壁上で増殖し、(iii)コラーゲンマトリックスへ浸潤する(接着して、引き続いて分解して取り込む)能力を持ち、かつ(iv)血管外遊出、転移増殖および血管新生と連携する(Chambersら, 1998, Cancer & Metastasis Review 17:263-269)。
【０００７】  このプロセスに関連するさまざまなステップは、細胞がリンパ管に逸脱しようと血管に逸脱しようと本質的に同じであり、それらは極めて重要な細胞の特徴、すなわち細胞浸潤性を必要とする。癌の浸潤には、浸潤癌細胞による細胞外マトリックス(ECM)への接着ならびに分解および取り込みが必要であり、細胞のECM中への転移または移動を伴う。このような細胞の活動は動的な膜流動性、ECM接着および分解を示す、浸潤先端と呼ばれる隆起した膜上で起こる。最近、細胞表面のタンパク質分解においてジペチジルペプチダーゼIV(DPPIV)/CD26およびセプラーゼ(seprase)を含むセリン膜内在性プロテアーゼ(SIMP)が関与するという新しい証拠が示された(Chen, W-T, 1996, Enzyme Protein 49:59-71)。
【０００８】  SIMPのメンバーは、N末端に6個のアミノ酸を含む細胞質テイル、それに続いて20個(セプラーゼ)または22個(DPPIV)のアミノ酸からなる膜貫通ドメイン、C末端に非古典的配位で触媒セリンを含有する触媒領域を構成する200個のアミノ酸からなるストレッチを含んでなるII型膜貫通タンパク質である(Goldstein, LA. ら， 1997, Biochem. Biophys. Acta. 1361:11-19)。DPPIVは最後から2番目の位置にL-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、またはL-アラニンのいずれかを有するオリゴペプチドからN末端ジペプチドを特異的に除去する。かかるペプチドには、ニューロペプチドYおよび他のペプチドホルモンが含まれる(Heins, Jら, 1988, Biochim. Biophys. Acta 954:161-169; Walter, Rら, 1980, Mol. Cell Biochem. 30:111-126)。さらに、最近の報告では、DPPIVもセプラーゼ様ゼラチナーゼおよびエンドペプチダーゼ活性を有することが示され、これはコラーゲン分解におけるその関与を示唆するものである(Bermpohl Fら, 1998, FEBS Letters 428:152-156)。さらに、DPPIVは小腸および腎臓上皮細胞の刷子縁膜上で構成的に発現され(YaronおよびNaider, F, 1993, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28:31-81; Morimoto C. およびSchlossman SF, 1994,Immunologist 2:4-7)、またT細胞上では一過性に発現されるのでDPPIVはT細胞活性化のマーカーとなりうる(Morimoto C.およびSchlossman SF, 1994, Immunologist 2:4-7)。
【０００９】  もともと170kDaの膜結合型ゼラチナーゼとして同定されたセプラーゼは、極めて悪性の黒色腫LOXの浸潤先端で発現される(Aoyama A. およびChen, W.T., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8296-8300; Mueller, SCら, 1999, J. Biol Chem. 274:24947-24952; Monsky, WLら, 1994, Cancer Res. 54:5702-5710)。この活性酵素はLOX細胞の細胞膜および放出小胞から単離された。セプラーゼは97kDaサブユニットのホモダイマーである(Pineiro-Sanchez, MLら, 1997, J. Biol. Chem. 272:7595-7601)。97kDaのサブユニットをコードするｃDNA由来の推定アミノ酸配列の分析から、97kDaのサブユニットはDPPIVに相同であり、繊維芽細胞活性化タンパク質α(FAPα)と本質的に同一であることが明らかになった(Goldsteinら, 1997 Biochem. Biophys. Acta. 1361, 11-19; Scanlon, M.Jら, 1994, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:5657-5661)。FAPαは上皮癌の反応性間質繊維芽細胞上および創傷治癒時に発現されるが、成人組織においては発現されない(Garin-Chesa P. ら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:7235-7239)。
【００１０】  しかしながら、癌腫の場合、癌腫中または内皮細胞中でのFAPαの発現は認められていない(Garin-Chesaら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7235-7239)。セプラーゼとFAPαは主として活性部位セリンを含む高度に保存されたモチーフGXSXGに隣接する45アミノ酸残基のストレッチの点で相違する(Scanlanら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5657-5661; Goldsteinら, 1997 Biochem. Biophys. Acta. 1361, 11-19)。最近、選択的スプライシングされたセプラーゼのmRNAが新規なトランケート型27kDaセプラーゼイソフォームをコードするヒト黒色腫細胞系LOXから同定されたが、それは97kDaセプラーゼのカルボキシル末端の触媒領域とまさに正確にオーバーラップする(GoldsteinおよびChen, 2000 J. Biol. Chem. 275:2554-2559)。このスプライス変異体mRNAは、セブラーゼ97kDaサブユニットの細胞質テイル、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの膜近位−中心領域の部分(Val(5)からSer(412))をコードする1223塩基対のエクソン領域のフレーム外欠失により生成される。セプラーゼはゼラチナーゼ活性とGly-Proジペプチダーゼ活性の両方を示すが、トランケート型セプラーゼは後者のジペプチダーゼ活性のみを示すと考えられる。
【００１１】  コラーゲンリモデリングはマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)により媒介されるものと長い間考えられてきた。しかしながら、MMP阻害薬(Marimastat,AG3340)を脈管形成阻害薬(アンギオスタチンおよびエンドスタチン)とともに癌患者に試用したが、抗転移、抗浸潤効果の明らかな証拠は得られなかった。これらのデータは、腫瘍の浸潤最前部においてはMMPに代わる他の酵素系が必要とされることを示している。
【００１２】  In vitroにおける癌細胞の浸潤性は腫瘍の転移能の直接的な指標となり得る。患者の生存率と生活の質を最大限に高める癌治療法の開発において、細胞の浸潤表現型を知ることは重要である。また、癌の進行と転移を検出するための診断用ツールを製剤化するうえでそれを利用することも重要である。このため、癌腫の転移能の特徴である癌細胞の浸潤性の測定に多大な努力が注がれてきた。
【００１３】  細胞の浸潤性は、しばしばその細胞表面において細胞外マトリックス(ECM)成分を分解しECM断片を吸収するタンパク質分解活性によって推測される。かかる活性のin vitroアッセイは、接着、細胞表面タンパク質分解および膜流動性のような他の細胞表面現象によりしばしば困難をきたす。細胞浸潤性を測定するために設計された、ある特別なアッセイでは架橋ゼラチン基層の表面への蛍光標識または放射性標識したフィブロネクチン(または他のECM成分)の共有結合が利用されている(Chenら, 1984, J. Cell Biol 98:1546-1555; Chenら, 1985, Nature, 316:156-158; Chenら, 1989, J. Exp. Zool. 251:167-185; Chenら, 1994, J. Tiss. Cult. Meth. 16:177-181; Meullerら, 1989, J. Cell. Biol. 109:3455-3464)。この技術ではフィブロネクチンを標識して、上固定(over-fixed)タンパク質フィルムを被覆するのに使用される。このフィルムは次いでフィルム中の浸潤先端拡張部の増殖巣および表面のへこみによって細胞表面のタンパク質分解活性ならびに細胞浸潤表現型を測定するために使用される。しかしながら、このフィブロネクチン−ゼラチンフィルムアッセイは効果が限られている。なぜなら、(i)従来の上固定タンパク質フィルムを使用している；(ii)大部分の培養腫瘍細胞系、繊維芽細胞および脈管形成内皮細胞などの中程度の浸潤性を有する細胞のタンパク質分解活性の検出には感度が不足している；(iii)架橋ゼラチン断片は癌細胞によって取り込まれない；および(iv)フィブロネクチンおよび架橋ゼラチン材料から三次元培養ゲル系を構築するのは困難なためである。従って、かかる細胞の浸潤性を測定するための信頼性の高い方法は、癌の臨床診断および治療用途の双方に大きな影響を及ぼすであろう。
【００１４】  本発明は、転移癌患者の血液、腹水および原発腫瘍組織から種々の形態の癌細胞を、ならびに健常ドナーの血液から内皮細胞を含む末梢血単核細胞を単離するための類のない、機能に基づく細胞分離法を提供する。さらに、本発明は、セプラーゼおよび／またはDPPIVが浸潤癌細胞中で、また、悪性組織の活性化繊維芽細胞(または他の組織細胞)および発芽しつつある内皮細胞中で選択的に誘導される証拠を提供し、それにより腫瘍の浸潤と転移を阻害する薬物の開発のための標的を提供する。
【００１５】3.  発明の概要
本発明は、癌患者の血液、腹水および／または組織から浸潤癌細胞を迅速かつ効率的に検出および選択する新規な癌細胞捕捉系に関する。末期癌患者では、いくつかの癌細胞が血液成分と結びついて大きな細胞集塊を形成していることがわかっている。かかる細胞の塊状化は末期癌に関連する臓器機能不全の一因となりうるものである。本発明は、転移性疾患の癌患者の血液中のかかる細胞を検出でき、また、患者の血液、腹水および／または組織からかかる細胞集塊、さらにはフリーで生存している個々の癌細胞を除去するのに使用できる組成物および方法を提供する。
【００１６】  癌細胞を単離および検出するためのこれまでの抗体法とは対照的に、本発明の細胞分離系は癌細胞の機能的性質、すなわち、細胞外マトリックスに接着し、それを分解し、さらに取り込む能力に基づいている。このように、本発明の細胞分離およびアッセイ系は、癌患者の血液、腹水および腫瘍組織中のごく小さな割合の生存、浸潤、および転移癌細胞を同定して単離するよう設計されている。富化した癌細胞集団を使用して、例えば、その転移能および最も有効な治療計画を調べることも可能である。富化した細胞は、癌ワクチン開発に向けて樹状細胞との融合にも使用しうる。
【００１７】  本発明は、転移癌患者による血液フィルターとして使用するための細胞接着マトリックスとして使用される、血液運搬接着分子（blood-borne adhesion molecule）で被覆されたコラーゲン、フィブリン、綿およびプラスチック繊維を含んでなる天然繊維組成物に関する。重合および解重合のサイクルによっていずれの形態にも容易に構成され、かつ容器表面に被覆しうるマトリックスの形成には、例えば、胎盤組織またはラット尾由来のI型コラーゲンが特に有用である。コラーゲンマトリックスは、限定されるものではないが、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンをはじめとする血液により運搬される種々の異なる接着分子で被覆される。個々の癌細胞または細胞クラスターとかかる細胞接着マトリックスとの接着が細胞単離の基礎となっている。
【００１８】  本発明の組成物を使用して、例えば、望まれない癌細胞を除去したり、骨髄移植でドナー細胞として使用するための血液または骨髄由来の造血前駆細胞を富化したりすることが可能である。さらに、本発明の細胞分離法により全血から異なる癌腫の特定の癌細胞を富化し、これをex vivo増殖した後、樹状細胞と反応させて有効な腫瘍ワクチンを開発するために使用してもよい。さらに、患者から循環癌細胞を単離した後、これを一連のin vitro化学療法計画に付すことが可能である。その結果として、有効な投薬量または薬物の組合せをその患者に投与できるようになろう。
【００１９】  本発明の組成物および方法によって、癌患者の血液、腹水および組織の浸潤癌細胞を検出および単離する迅速な方法が提供される。かかる癌としては、限定されるものではないが、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、頭部頸部癌、脳癌、膀胱癌、リンパ腫、卵巣癌、腎および精巣癌、黒色腫、肝臓癌、膵臓癌、またはその他の胃腸癌が挙げられる。癌細胞は本発明の免疫細胞化学および細胞機能アッセイ、すなわち、コラーゲン分解および取り込みを用いて検出され、同定される。
【００２０】  本発明の方法は、癌の予後判定、治療的および外科的処置のモニタリングならびに早期発見に使用するための、癌患者の血液、腹水または腫瘍組織中の浸潤癌細胞を調べる高感度アッセイの開発に使用することが可能である。癌転移能を測定する感度および精度は、癌細胞の組織起源の判別、細胞の脈管形成能の測定、および白血球減少または補体結合の測定といった、当業者に公知のさらなるアッセイを用いてさらに高めることが可能である。
【００２１】  本発明の細胞接着マトリックスは、全血、バッフィーコート、末梢血幹細胞調製物または骨髄からの生存癌細胞の高収率で効率的な除去を可能にする癌細胞トラップを提供する。本発明の細胞分離法は、治療アフェレーシス法および白血球フェレーシス法（ここでは、汚染癌細胞を除去した自己血液の輸血が行われる）において使用することが意図される。本発明は、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、頭部頸部癌、脳癌、膀胱癌、リンパ腫、卵巣癌、腎および精巣癌、黒色腫、肝臓癌、または膵臓癌、およびその他の胃腸癌患者の全血から癌細胞を除去するための非常に効率のよい方法を提供する。
【００２２】  転移を抑制し、それによって癌細胞の転移能をモジュレートすることが可能な薬剤のスクリーニングに使用しうるアッセイもまた提供する。かかるアッセイは、試験薬剤の存在下で細胞接着マトリックスを癌細胞サンプルと接触させた後に癌細胞のマトリックスへの接着、その分解または取り込みの検出および定量を行うものである。本発明のアッセイ系を使用して、有望な抗癌剤の効力を治療中にモニターすることも可能である。例えば、全血中の癌細胞の転移能を治療前または治療中に調べることも可能である。薬剤の効力は治療を通じて癌細胞の転移能を比較することにより追跡できる。癌浸潤性を低下させ、宿主免疫力を高め、癌増殖を抑制することが可能であり、かつ、正常組織細胞への影響がほとんどないか、全くないものが効力を示す薬剤である。例えば、かかる抗転移薬スクリーニングアッセイ系によって、遊走細胞がコラーゲンマトリックスに接着し、それを分解および浸潤する能力を阻止する、セプラーゼ-DPPIV複合体に対するモノクローナル抗体およびペプチド阻害剤が同定される(図13および14)。さらに、かかるアッセイ系により、セプラーゼおよびDPPIVに対するアンチセンスおよびリボザイム構築物が乳癌細胞の浸潤性を低下させうることが示された(図19)。
【００２３】  セリン膜内在性プロテアーゼのモジュレーターを投与することを含んでなる、癌細胞の転移能を阻害するための方法および組成物が提供される。本発明のこの態様は、セプラーゼおよびDPPIVを含んでなる新規なプロテアーゼ複合体の形成がコラーゲンマトリックスへの細胞浸潤の必須条件であるという知見に基づいている。かかるプロテアーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、DPPIVおよびセプラーゼの活性を阻害しうるものが挙げられる。セプラーゼおよびDPPIV活性の活性化が細胞浸潤および移動の必須条件であるという知見により、癌細胞移動の阻害剤を同定するように設計された薬物スクリーニングアッセイの標的分子が提供される。
【００２４】4.  図面の説明
図１Ａ−Ｂ．  細胞接着マトリックスの組成および調製。図１Ａ：  I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの調製を、マトリックス調製、細胞分離、および癌細胞の浸潤性の顕微鏡測定に関係する７つのステップで示している。図１Ｂ：  I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの、細胞による全コラーゲン分解のマイクロタイター測定における利用。癌細胞によるBodipy-ローダミンコラーゲンマトリックスの分解および取り込みは、蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて赤色蛍光の増強として測定される。下のグラフから、放出蛍光単位(RFU)は細菌性コラーゲナーゼの存在下、37℃で30分間、各マイクロタイターウェルにオーバーレイしたBodipy-ローダミンコラーゲンの量に比例することがわかる。
【００２５】  図２Ａ−Ｂ．  細胞接着マトリックスに基づく細胞分離およびアッセイ系の診断的および治療的用途。図２Ａ：  診断、治療または術後応答のモニタリング、および早期癌検出などの診断用途に使用しうる細胞分離およびアッセイ法の断面図。血液、腹水または組織細胞集団から癌細胞を単離し、検出し、特徴づける各ステップを示している。図２Ｂ：  治療および予防用途に使用しうる本発明の細胞分離およびアッセイ法の断面図。血液、腹水または組織細胞集団から癌細胞を単離し、培養するステップを示している。
【００２６】  図３Ａ-Ｆ．  患者および対照由来の血液サンプルの癌細胞分離解析。完全培地単独に、または対照健常ドナーおよび膀胱癌(BLC)患者の血液にスパイクした蛍光タグ付きHs578T乳癌細胞の代表例を示す。赤色蛍光タグ付きHs578T乳癌細胞を3mlの培地または血液サンプルに加え、細胞をマイクロタイターウェル中のコラーゲンマトリックスで捕捉し、18時間培養した。示した画像はスーパーインポーズした蛍光照明により位相差顕微鏡を用いて撮影したものであり、マイクロタイターウェルの一部を示すものでしかない。図３Ａ：  培地単独に加えられたHs578T乳癌細胞(500細胞)の蛍光解析。概算で495個の細胞がマトリックスに接着して広がった明るいスポットとして認められた。図３Ｂ：  健常ドナーの血液にスパイクしたHs578T乳癌細胞(500細胞)の蛍光解析。概算で415個の赤色蛍光癌細胞がマトリックス基層に残留する培養物中で他の血液細胞(蛍光シグナルなし)の間に認められた。図３Ｃ：  健常ドナーの血液にスパイクしたHs578T乳癌細胞(19細胞)の蛍光解析。概算で11個の赤色蛍光癌細胞がマトリックス基層に残留する培養物中で他の血液細胞(蛍光シグナルなし)の間に認められた。図３Ｄ：  BLC患者の血液にスパイクしたHs578T乳癌細胞(200細胞)の蛍光画像。概算で182個のHs578T乳癌細胞が循環BLC細胞とともに癌患者の血液から捕捉された。Hs578T細胞は患者の単核血液細胞とともに集塊を形成しやすく、この画像では暗いスポットととして表れている。図３Ｅ：  BLC患者の血液にスパイクした、マトリックスにより捕捉されたHs578T乳癌細胞(19細胞)の蛍光解析。概算で16個の赤色蛍光癌細胞がそれ以外の血液細胞の間に認められ、視野には1個のHs578T乳癌細胞が認められる。図３Ｆ：  図3Eに示すマトリックス捕捉Hs578T乳癌細胞と循環BLC細胞の免疫蛍光解析。ここでは、Hs578T乳癌細胞と血液由来の4個の膀胱癌細胞がフルオレセイン結合抗サイトケラチンPCK抗体を用いて染色された。Hs578T乳癌細胞(図4Eでは赤色蛍光として示される)は緑色蛍光サイトケラチン標識された患者の血液由来の膀胱癌細胞の間に見ることができる。画像サイズA-D、662μｍ×478μm; 画像サイズE-F、331μm×239μm。
【００２７】  図４Ａ-Ｉ．  細胞接着マトリックスに接着した循環細胞。図４Ａ-Ｃ：  頭部頸部扁平上皮細胞癌(HN)患者の血液中の1つの組織断片上で塊状化した循環細胞。細胞組織クラスターをコラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、4日間(Aのd4)、6日間(Bのd6)、および13日間(Cのd13)培養した。図４Ｄ：  転移性前立腺癌(PC)患者の血液中の1つの組織断片上で塊状化させ、3日間(d3)培養した細胞。図４Ｅ：  転移性前立腺癌(PC)患者の、フィブリン繊維(フィブリン)上で塊状化させ、3日間(d3)培養した循環癌細胞。図４Ｆ：  転移性前立腺癌(PC)患者の、プラスチックスクラップ(plastic)上で塊状化させ、3日間(d3)培養した循環癌細胞。視野では大型の推定癌細胞がプラスチックスクラップに優先的に接着することがわかる。図４Ｇ：  Ｆと同じ培地で12日間(d12)培養した循環細胞。視野では大型の推定癌細胞がプラスチックスクラップに優先的に接着することがわかる。図４Ｈ：  転移性前立腺癌(PC)患者の、精製綿(綿)上で塊状化させ、3日間(d3)培養した循環細胞。図４Ｉ：  脳腫瘍(BN)患者の、精製綿(綿)上で塊状化させ、20日間(d20)培養した推定癌細胞の増殖。画像サイズA-G、662μｍ×478μm; 画像サイズH-I、1324μm×956μm。
【００２８】  図５Ａ-Ｈ．I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスに接着した循環細胞。図５Ａ-Ｃ：  転移性膵臓癌(PnC)患者の、I型コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、洗浄し、マトリックス上で5日間(A)、9日間(B)、および16日間(C)培養した細胞集塊。これらは、I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスと、マトリックスに浸潤してプラスチック表面で増殖する癌細胞の位相差顕微鏡での観察結果を示すものである。癌細胞（ほとんどの健常ドナーの血液中には存在しない）は明確に区別される形態を有しており、培養下でその細胞サイズおよび数が増大する。一方、同時に単離された白血球は小さく、また、培養下でその数が減少する。図５Ｄ：  転移性膵臓癌(PnC)患者の、I型コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉された循環細胞集塊。細胞をマトリックスから溶離し、プラスチック表面(plastic)上で完全培地にて7日間培養した。紡錘形の細胞が細胞コロニー周囲の上皮型癌細胞と会合している。図５Ｅ-Ｆ：  間質繊維芽細胞のI型コラーゲン基層への浸潤。頭部頸部扁平上皮細胞(HN)癌患者の腫瘍生検から細胞を分離し、単離した。形態学的に異なる2つの細胞型をマトリックス表面で単離した: HN扁平上皮細胞はマトリックス表面で静止状態にある(E)が、間質繊維芽細胞はコラーゲンゲルに浸潤しており(F)、Nikon Eclipse TE300 倒立顕微鏡の微調整ダイアルでの測定では図5Eに見られるレベルより約80μm下部にある。図５Ｇ：  I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの形態。マトリックスと、それに接着する、転移性大腸癌(CC)患者の血液から単離された癌細胞の透過電子顕微鏡での観察結果を示している。図５Ｈ：  図5Hに示すコラーゲン繊維の拡大図。構成されたコラーゲン繊維の透過電子顕微鏡での観察結果を示している。画像サイズA-F、662μｍ×478μm; 画像サイズG-H、バーの範囲で示す。
【００２９】  図６Ａ-Ｄ．  循環癌細胞の浸潤表現型の形態学的基準。図６Ａ-Ｂ：  転移性大腸癌(CC)患者の循環細胞集塊。細胞を新たに単離し、1日間(d1)および9日間(d9)培養した。これらは、I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの癌細胞によって生じた分解ホールと、異なる形態、すなわち、d1(A)では小型、d9(B)では大型で上皮形態を有する癌細胞の特徴についての位相差顕微鏡での観察結果を示すものである。癌細胞は、培養下でその細胞サイズおよび数が増大する。一方、同時に単離された白血球は小さく、また、培養下でその数が減少する。さらに、紡錘形の細胞がコロニーの上皮型癌細胞と会合している(B)。図６Ｃ-Ｄ：  転移性胃癌(SC)患者の循環細胞集塊。細胞をI型コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、19日間培養した。上皮型癌細胞がコラーゲンフィルムの分解ホール内のプラスチック表面で増殖する(C)か、またはコラーゲンフィルムの縁に一列に並んでいる(D)。画像サイズA-B、1324μｍ×956μm; 画像サイズC-D、662μm×478μm。
【００３０】  図７Ａ-Ｄ．  細胞分離法により単離された対照血液サンプル由来の細胞。図７Ａ：  39歳の健常ドナーの血液から単離された細胞およびそれらの下にあるI型コラーゲンマトリックス。培養7日後に生存する細胞はほとんどなく、マトリックス膜は無傷のままであった。図７Ｂ：  良性大腸腫瘍(CTN)患者の血液から単離された細胞およびそれらの下にあるI型コラーゲンマトリックス。細胞はほとんど単離されず、マトリックス膜は無傷のままであった。図７Ｃ-Ｄ：  転移性乳癌(BC)患者の循環細胞およびそれらの下にあるI型コラーゲンマトリックス。化学療法化合物での治療中に血液サンプルを採取した。単離され、d1(C)およびd4(D)培養で生存する細胞はほとんどなく、マトリックス膜は無傷のままであった。画像サイズA-D、662μｍ×478μm。
【００３１】  図８Ａ-Ｌ．  蛍光標識コラーゲンを用いた細胞浸潤表現型の細胞分離およびアッセイ系、および上皮マーカーに対する抗体を用いた循環癌細胞の免疫細胞化学。乳癌(BC, A-C)、頭部頸部扁平上皮細胞癌(HN, D-F)、大腸癌(CC, G-I)、前立腺癌(PC, K)患者と、健常ドナー(対照, L)の血液、ならびにHs578T乳癌細胞系(Hs578T, J)から細胞を誘導した。細胞をローダミン-コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、1日間(d1)または63日間(d63)培養した。図８Ａ-Ｃ：  乳癌(BC)患者の循環癌細胞の浸潤表現型マーカーとしての取り込まれたローダミン-コラーゲンブロッチ(blotch)。細胞をマトリックスに18時間接種し、試験用に固定した。背景にある多数の白血球の中で、個々のおよびクラスターの推定癌細胞(Aに示す位相差画像、PH)は、Col+(Bに示す赤色蛍光)の印をつけたローダミン-コラーゲン断片を取り込むことがわかった。パネルCに示すスーパーインポーズした画像は、ローダミン-コラーゲンスポットと推定癌細胞との厳密なマッチングを示している。これらから患者の血液1ml当たり2,067個のCol+細胞と計測される。図８Ｄ-Ｆ：  頭部頸部扁平上皮細胞癌(HN)患者の循環癌細胞の浸潤表現型マーカーとしての取り込まれたローダミン-コラーゲンブロッチ。推定癌細胞の大きいクラスターおよび各細胞(Dの位相差画像、PH)は、広域サイトケラチンサブユニットについて陽性に抗体染色された細胞(EのPCK+)およびローダミン−コラーゲンCol+をロードされた細胞(Fの赤色蛍光)と同じ位置を占めることがわかった。これらから患者の血液1c.c.当たり各々20,814個のPCK+細胞および18,003個のCol+細胞と計測される。Col+細胞数に比べてPCK+細胞数が多い理由として、抗体染色に陽性であり、かつ細胞接着マトリックスに接着する生存力の低い癌細胞が存在するためであると考えられる。図８Ｇ-Ｉ：  大腸癌(CC)患者の循環癌細胞の浸潤表現型マーカーとしての取り込まれたローダミン-コラーゲンブロッチ。推定癌細胞のクラスターおよび各細胞(Gの微分干渉画像)を上皮表面抗原に対する抗体で標識した(ESA+; Gの赤色染色）。ESA+細胞は内皮マーカー因子VIIIに対する抗体で染色されたもの(F8+; Hの緑色蛍光細胞)およびローダミン-コラーゲン断片を取り込んだものCol+(Iの赤色蛍光細胞)と同じ位置を占めることがわかった。これらから患者の血液1ml当たり各々2,284個のESA+、7,308個のF8+、および1,978個のCol+細胞と計測される。Col+またはESA+細胞数に比べてF8+細胞数が多い理由として、血液中に正常内皮細胞が存在するためであると考えられる。図８Ｊ：  癌(上皮)マーカー対照としての、抗PCK抗体で染色したHs578T乳癌細胞系。図８Ｋ：  63日間(d63)培養し、ESA+染色したPC細胞。これらの大型細胞は複数の核を有し、その直径が大きくGのd1細胞の5倍を超えていることに着目されたい。図８Ｌ：  健常ドナー由来の血液細胞を1日間(d1)培養した後に無傷のままであったローダミン-コラーゲンマトリックス。画像サイズA-C、1324μｍ×956μm; 画像サイズD-F、331μm×239μm; 画像サイズG-L、662μｍ×478μm。
【００３２】  図９Ａ-Ｌ．  循環癌細胞の脈管形成性。頭部頸部扁平上皮細胞癌(HN、A-C; I-J)、大腸癌(CC、D-F)および前立腺癌(PC、G-H)患者の血液から細胞を誘導した。細胞をコラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、1〜11日間(d1またはd11と記載)培養した。図９Ａ-Ｃ：  F8+について強く標識された(B)、およびコラーゲン断片Col+を取り込んだ(C)、HN細胞の大きなクラスターおよび７個の各細胞(Aに示す位相差画像)。位相差(PH)画像(A)で示されるHN細胞は、F8抗体に陽性反応を示す同じ視野内にあるもの(B)およびローダミン-コラーゲンマトリックスを取り込んだもの(C)と密接に会合している。これらから患者の血液1c.c.当たり各々42,495個のF8+および15,611個のCol+細胞と計測される。Col+細胞数に比べてF8+細胞数が多い理由として、血液中にF8+内皮細胞が存在しているためである。図９Ｄ-Ｆ：  Col+CC細胞に相当するCD31+およびF8+細胞のサブセット。ローダミン-コラーゲンマトリックス上の細胞を内皮細胞マーカーCD31に対する抗体および内皮マーカー因子VIII(F8)に対するフルオレセイン結合抗体で標識した。鮮紅色に染色されたCD31+細胞とCC細胞との会合は微分干渉(DIC)画像(D)にて確認される。同じ視野内にあるCC細胞はF8抗体に陽性反応を示し(E)、また、これらはローダミン-コラーゲンマトリックスを取り込んだ(F)。これらから患者の血液1c.c.当たり各々11,693個のCD31+、6,577個のF8+および2,558個のCol+細胞と計測される。Col+細胞数に比べてCD31+およびF8+細胞数が多い理由として、血液中にCD31+およびF8+内皮細胞が存在していることが考えられる。図９Ｇ-Ｈ：    アセチル化LDLを取り込むPC細胞。微分干渉(DIC)画像(G)にて確認される鮮紅色に染色された上皮表面抗原(ESA)陽性細胞は、フルオレセイン-LDL(H)の取り込みを示す。これらから患者の血液1c.c.当たり各々9,744個のESA+および34,105個のLDL+細胞と計測される。ESA+細胞数に比べてLDL+が多い理由として、アセチル化LDLを取り込む別の内皮細胞が存在していることが考えられる。図９Ｉ-Ｊ：  アセチル化LDLを取り込む初代培養HN細胞。三重フルオレセイン-Rhodymenia-Hoechst画像(J)にて確認されるように、中心に向かう１個の特定の細胞だけがフルオレセイン-LDLおよびローダミン-コラーゲンの両方を取り込んでいることから、この細胞が12日間培養した後に浸潤表現型を保持する細胞であることが示されることに着目されたい。図９Ｋ-Ｌ：  コラーゲンゲル上の循環CC細胞による毛管網状構造の発達。網状構造の形成(K)およびコード様構造(L)は循環CC細胞をI型コラーゲンゲル（厚さ0.5mm）上にプレートした後2日目に観察された。画像サイズA-C; G-J、331μm×239μm; 画像サイズD-F; K-L、662μｍ×478μm。
【００３３】  図１０Ａ-Ｌ：  培養下での循環癌細胞の免疫癌死滅および増殖。コラーゲンマトリックスを用いて大腸癌(CC、A-E)、前立腺癌(PC、F-I)、または膀胱癌(BLC、J-L)患者の血液から細胞を単離し、10〜20％のヒト血漿を含有する培地で培養した。図１０Ａ-Ｃ：  F8+/Col+ CC細胞とクラスター化するCD34+末梢血幹細胞。鮮紅色に染色されたCD34+細胞とCC細胞との会合は微分干渉(DIC)画像(A)にて確認される。同じ視野内にあるCC細胞はF8抗体に陽性反応を示し(B)、また、これらはローダミン-コラーゲンを取り込んだ(C)。これらから患者の血液1c.c.当たり各々111,082個のCD34+、7,673個のF8+および2,558個のCol+細胞と計測される。Col+細胞数に比べてCD34+およびF8+数が多いのは、血液中にCD34+幹細胞およびF8+内皮細胞が存在するためである。図１０Ｄ-Ｅ：  Col+ CC細胞とクラスター化するCD45+白血球。ローダミン-コラーゲンマトリックス上で単離された細胞を白血球共通抗原CD45に対する抗体で標識した。鮮紅色に染色されたCD45+白血球とCC細胞との会合はDIC画像(D)にて確認される。同じ視野内にあるCC細胞はローダミン-コラーゲンマトリックスの取り込みを示した(E)。これらから患者の血液1c.c.当たり各々125,670個のCD45+白血球および1,827個のCol+細胞と計測される。図１０Ｆ-Ｉ：  良好な予後と判定された前立腺癌(PC)患者由来の免疫および癌細胞クラスターの細胞溶解の連続写真。癌細胞の大半が白血球により攻撃され、1日培養した後にはばらばらになった(F-H)。しかし、白血球はかかる培養7日後に消滅し、数個のPCコロニーが残った(I)。図１０Ｊ-Ｌ：  同一患者由来の自己免疫血漿による膀胱癌(BLC)細胞の細胞溶解。BLC細胞をその癌患者の血液由来の10%自己血漿(J-Kのau.血漿)、または健常ドナーに由来するもの(Lのn.血漿)の存在下で培養した。BLC細胞は2日目に溶解して自己血漿含有培地(J-Kのau．血漿）が褐変したが、正常血漿含有培地(Lのn.血漿)では6週間を超えても生存していた。これらのことから補体性細胞溶解における自己癌抗体の役割が示され、転移に対する宿主免疫が明らかになった。画像サイズA-L; 662μｍ×478μm。
【００３４】  図１１Ａ-Ｂ．  セプラーゼおよびDPPIVについてのゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび免疫ブロット。図１１Ａ：  WGA精製した、WI38細胞由来の界面活性剤可溶性タンパク質をSepharase12(Pharmacal-LKB, Piscataway, N.J.)のゲル濾過カラムで分離した。カラムの較正に使用したタンパク質標準品は、ビタミンB-12(1.35kDa)、ミオグロビン(17kDa)、卵アルブミン(44kDa)、γグロブリン(158kDa)、カタラーゼ(232kDa)、フェリチン(440kDa)、およびチログロブリン(670kDa)であった。図１１Ｂ：  セプラーゼおよびDPPIVに対するmAbを用いた免疫ドットブロット法により画分を解析した。セプラーゼおよびDPPIVは、200kDa(画分17)、440kDa(画分14)、および670kDa(画分13)の範囲に見出され、このことから440〜670kDaの大きさのセプラーゼ-DPPIV複合体が存在することが示唆される。
【００３５】  図１２Ａ-Ｄ．  WI38ヒト胚性肺繊維芽細胞由来のセプラーゼ-DPPIV複合体の特徴づけ。図１２Ａ：  表面ビオチン化WI38繊維芽細胞の免疫沈降(Ip)。セプラーゼ(D28)およびDPPIV(E19)に対する両mAbにより、170および200kDaにそれぞれセプラーゼおよびDPPIVを示す2つの大きなバンドを有するRIPA可溶化タンパク質複合体が同定された。図１２Ｂ：  Ipおよび免疫ブロット法(Ib)により確認されたセプラーゼ-DPPIV複合体。WI38 RIPA溶解物から単離されたセプラーゼ-またはDPPIV-免疫沈降物が、β1またはβ3インテグリンブロットではなく、セプラーゼ-またはDPPIV-免疫ブロットにおいて確認された。このことから、プロテアーゼ複合体がRIPAにおいてβ1およびβ3インテグリンとは会合しないことが示唆される。図１２Ｃ：  セプラーゼ-DPPIV複合体のゼラチン分解活性。プロテアーゼ複合体をCa++の不在下、2mM EDTAの存在下でゼラチンザイモグラフィーにより解析した。セプラーゼおよびDPPIV免疫単離物(Ip)はどちらも170kDaゼラチナーゼ(セプラーゼ)活性を示した。図１２Ｄ：  複合体のDPPIVプロリン特異的ペプチダーゼ活性。蛍光Ala-Pro-AFC(7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン)基質オーバーレイアッセイにより、セプラーゼおよびDPPIV免疫単離物(Ip)はどちらも同じペプチダーゼ活性を示した。αv、α2、α6もしくはβ3インテグリンまたは対照免疫単離物には活性は認められなかった。
【００３６】  図１３Ａ-Ｅ．  コラーゲンゲルにおける細胞移動および創傷により活性化されたWI38繊維芽細胞によるコラーゲン分解。図１３Ａ：  細胞単層に創傷を与えて1時間(a、b、c)および18時間(d、e、f)後のWI38の形態(細胞の生存中に写真撮影)。パネルaおよびd: 創傷縁部と細胞を含まないガラス表面との境界面のWI38の位相差コントラスト。紡錘形細胞が18時間(d)の時点でコラーゲン繊維上に移動したことがわかる。パネルbおよびe: パネルaおよびdと同じ視野での蛍光コラーゲンゲル。1時間(b)の時点ではTRITC標識コラーゲンの均一層が見られるが、18時間(e)の時点では活性化された移動性細胞によって創傷縁部に蛍光コラーゲンの局所的除去が起こっている。パネルCおよびf:左および中央のパネルの顕微鏡によるスーパーインポーズ画像。バー=10μm。図１３Ｂ：  阻害性mAb E19(DPPIVに対する)による細胞移動の用量依存的阻害。対照mAb C37(細胞表面糖タンパク質gp-90に対する)による阻害は見られない。各抗体に対し24時間単層創傷モデルを用いて3回ずつ試験を行った。最初の創傷縁部からの細胞進行の領域を測定することにより細胞移動を定量した。値は平均±SDである。図１３Ｃ：  細胞移動についての抗体阻害の逆転。すべての抗体、mAb E19(DPPIVに対する)およびmAb C37(gp-90に対する）を1ml当たり5μgで適用した。3日後、抗体を除去し、抗体阻害効果を逆転させた。図１３Ｄ：  創傷により活性化された細胞による蛍光コラーゲンゲルの局所的除去についてのヒストグラム。コラーゲン分解を移動性細胞による蛍光コラーゲン除去領域として測定した。ｍAb E19(DPPIVに対する)は移動性細胞によるコラーゲン除去を阻害したが、対照mAb C37(抗gp-90)は阻害しなかった。すべての抗体を1ml当たり5μgで適用した。各抗体に対し3回ずつ試験を行った。値は平均±SDである。図１３Ｅ：  低密度培養下の移動性細胞によるコラーゲン分解。コラーゲン分解を移動性WI38細胞によるコラーゲンゲルからの蛍光コラーゲンペプチドの放出により測定した。蛍光ペプチド放出の陽性対照として細菌性コラーゲナーゼを用いた。すべての抗体を1ml当たり5μgで適用した。各抗体に対し3回ずつ試験を行った。値は平均±SDである。
【００３７】  図１４Ａ-Ｂ．  コラーゲン基層上でのWI38細胞の接着および広がりは、主として、β1インテグリンを媒介としている。DPPIVによる媒介は見られない。図１４Ａ：  mAb C27(β1インテグリンに対する)によるコラーゲン基層上でのWI38細胞広がりの阻害。mAb E19(DPPIVに対する)またはmAb C37(抗gp-90)による阻害は見られない。図１４Ｂ：  mAb C27(β1インテグリンに対する)によるコラーゲン基層へのWI38細胞接着の阻害。mAb E19(DPPIVに対する)またはmAb C37(抗gp-90)による阻害は見られない。各値は独立した3回の測定の平均±S.D.である。2回反復試験で同様の結果が得られた。
【００３８】  図１５．  コラーゲンゲルを移動するWI38細胞の浸潤先端におけるセプラーゼおよびDPPIVの共局在。I型コラーゲンゲルを移動するWI38細胞の浸潤先端(矢印で示す)の位相差画像(a)。DPPIVに対するTRITC-mAb E19で直接標識した浸潤先端(矢印で示す)におけるDPPIVの免疫蛍光画像(b)。セプラーゼに対するFITC-mAb D28で直接標識した浸潤先端(矢印で示す)におけるセプラーゼの免疫蛍光画像(c)。コラーゲンゲルを移動するWI38繊維芽細胞の浸潤先端(矢印で示す)にセプラーゼおよびDPPIVが共局在することを示す、パネルbおよびCのスーパーインポーズ画像(d)。バー=10μm。
【００３９】  図１６．  パラフィン包埋した腫瘍組織の連続切片の免疫組織化学により示される、ヒト悪性乳癌の結合組織細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの分布。セプラーゼおよびDPPIVはともに浸潤性乳癌に隣接する結合組織の繊維芽細胞様細胞中に存在している。離れた正常組織のものには存在していない(示されていない)。矢印は陽性の褐色を示す、繊維芽細胞のセプラーゼまたはDPPIV染色を指している。癌細胞のクラスターもセプラーゼ(中央および下のパネルの大きい細胞集塊）およびDPPIV(上のパネルの大きい細胞集塊)に対し陽性である。乳癌および隣接する正常組織のパラフィン切片を同じスライドに載せ、セプラーゼに対するmAb D8(中央および下のパネル)またはDPPIVに対するmAb E26(上のパネル)で染色した。バー=100μm。
【００４０】  図１７．  治癒中のヒト歯肉創傷部の粘膜細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの分布。3日(a、b、c、dおよびg)および7日(e、fおよびh)経過した治癒中の粘膜創傷の凍結切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン(aおよびe)で、セプラーゼに対するTRITC-mAb D28(b-d、およびf)で、またはDPPIVに対するmAb E19、続いてTRITC抗ラット二次抗体(gおよびh)で染色した。3日経過した創傷(a-d、およびg)では、結合組織(CT)にセプラーゼ抗体(b、c、およびd)およびDPPIV抗体(g)で強く染色された細胞が存在していた。共焦顕微鏡画像から、結合組織では繊維芽細胞様細胞の糸状仮足(矢印)および細胞体の形態をとる浸潤先端にセプラーゼが分布していることがわかる(パネルd)。7日経過した創傷(e、fおよびh)では、創傷肉芽組織(GT)にセプラーゼ染色が認められたが(f)、DPPIVについては認められなかった(h)。点線は肉芽組織と結合組織との境界を示している。Eは創傷上皮; CTは結合組織; FCはフィブリン塊; およびGTは肉芽組織を示している。バー=200μm。
【００４１】  図１８．  ヒト悪性乳腺管癌の浸潤最前部にある微細血管内皮細胞、繊維芽細胞、および癌細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの共局在。ホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋したヒト悪性乳腺管癌サンプルを連続切片にし、mAb D8を用いた褐色染色によりセプラーゼ分布(左の３つのパネル)を、mAb E26を用いて隣接切片におけるDPPIV分布(右の3つのパネル)を示した。上の2つのパネルは、腫瘍部位から約2cm離れたところにある正常乳房組織を示す。上皮細胞(白抜きの矢印)、繊維芽細胞(黒の矢印)および内皮細胞(白抜きの矢尻)では、セプラーゼおよびDPPIV染色に陰性であることがわかった。中央の2パネルは、低分化型(悪性度の高い)癌細胞の浸潤状態を示したシートである。このシートでは、腫瘍細胞(橙色の白抜きの矢印)、繊維芽細胞(橙色の矢印)、およびいくつかの内皮細胞(橙色の白抜きの矢尻)で、セプラーゼおよびDPPIVの強い褐色細胞染色が示されているが、いくつかの大きい血管壁細胞(黒色の白抜きの矢印)には染色がなされていない。上および中央のパネルにある矢印は、100μmのスケールを示す。下の2つのパネルは低分化型(悪性度の高い)腫瘍細胞の浸潤状態を低倍率で示したシートである。このシートでは、腫瘍細胞(橙色の白抜きの矢印)、繊維芽細胞(橙色の矢印)、およびいくつかの内皮細胞(橙色の白抜きの矢尻)で、セプラーゼおよびDPPIVの強い褐色細胞染色が示されている。視野内の大部分の腫瘍細胞から、セプラーゼおよびDPPIVが浸潤最前部の腫瘍細胞で特異的に発現されることがわかるが、視野中央に示される腫瘍の中心部のものには存在していない。下のパネルの矢印は800μmのスケールを示す。
【００４２】  図１９．  MDA-MB-436細胞のプロテアーゼ発現とコラーゲン分解能との関係。Ａ：  セプラーゼおよびDPPIVを特異的に発現するMDA-MB-436細胞による蛍光コラーゲンペプチドの放出。コラーゲン分解を、親細胞(Parent)、ベクターでトランスフェクトした細胞(pA11)、セプラーゼcDNAでトランスフェクトした細胞(pA15)およびDPPIVリボザイムでトランスフェクトした細胞(pZ8)による蛍光コラーゲンペプチドの放出により測定した。各々、3回ずつ試験を行った。値は平均±SDである。星印"*”は、pA15セプラーゼセンスおよびpZ8 DPPIVリボザイムトランスフェクト細胞が親およびpA11ベクタートランスフェクト細胞に比べてp<0.05であることを示している。Ｂ：  上記MDA-MB-436細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの示差的発現。細胞をRIPAバッファーで抽出し、mAb D8(抗セプラーゼ)およびmAb F4(抗DPPIV)を用いて免疫ブロットを行った。
【００４３】5.  発明の開示
本発明は、癌患者由来のサンプルから生存能がある浸潤性かつ転移性の癌細胞小集団を単離および検出する細胞接着マトリックスを形成するための新規な方法に関する。特に、癌細胞の単離および検出にコラーゲンマトリックス系を使用する方法を説明する。以下の小節に記載する本発明はさらに、癌の転移能を測定するための新規な高感度in vitroアッセイに関する。このアッセイの重要な特徴として、血液、骨髄、腹水、体液、および腫瘍組織に含まれる癌細胞、またはあらゆる確立された癌細胞系に応用可能であることが挙げられる。
【００４４】  本発明の「細胞接着マトリックス」は、全血、バッフィーコート、末梢血幹細胞調製物または骨髄からの生存癌細胞の高収率かつ効率的な除去が可能な癌細胞トラップを提供する。本発明の細胞分離法は、癌診断目的、例えば、早期発見、治療および術後応答のモニタリング、ならびに癌進行の予後診断に使用しうる。また、本発明の細胞分離法は、癌細胞トラップとしての血液フィルター、遺伝および細胞遺伝解析、新規な薬物標的探索、ならびに癌ワクチン開発における使用をはじめとする癌の予防および治療目的にも使用しうる。
【００４５】  本発明のin vitroアッセイ系はさらに、抗転移活性を有する薬剤を同定するスクリーニング方法も提供する。かかる薬剤は癌患者の癌細胞の転移による拡散を阻害するのに使用しうる。さらに、このアッセイは抗転移能を有する核酸分子のスクリーニングにも使用しうる。例えば、アンチセンスおよびリボザイム分子をそれらの転移阻害能についてスクリーニングできる。本発明のさらにもう1つの実施形態によれば、セプラーゼまたはDPPIVの活性を測定して癌細胞の転移能を判定することができる。
【００４６】5.1  本発明のマトリックス
本発明は、癌患者由来のサンプルから癌細胞を単離および検出するのに使用しうる新規な天然の細胞接着マトリックス系を提供する。本発明の天然細胞接着マトリックスは、限定されるものではないが、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンをはじめとする血液により運搬される細胞接着成分に対して特異的な結合親和性を有している。本発明は、転移性疾患の患者の循環系中に存在する癌細胞が組織断片に付着して大きい細胞クラスターを形成することができ、このことは、天然の構造的スカフォードが血液運搬接着分子と高い親和性を有しており、そのため、転移癌細胞の付着を促進することを示している、という知見に基づいている。さらに、I/III型コラーゲン、フィブリン、精製綿をはじめとする天然繊維、および組織培養プラスチックの機械的引掻面が癌細胞の接着を促進する血液運搬接着成分を選択的に吸着することが見出された。
【００４７】  本発明は、in vivo生存ヒト細胞を検出および単離するための細胞基層として使用する、コラーゲン繊維、フィブリンゲル、精製綿またはプラスチック繊維を含んでなる細胞接着マトリックスを包含するものであり、これらの細胞としては、限定されるものではないが、癌、内皮および組織細胞が挙げられる。種々の市販のコラーゲン材料、限定されるものではないが、Calbiochem-Novabiochem Co. (La Jolla, CA)より購入できるヒト胎盤I型コラーゲン; およびCollaborative Biomedical Products (Becton and Dickinson Labware, Bedford, MA)から入手可能なラット尾I型コラーゲンなどを使用してコラーゲンマトリックスを製造することが可能である。コラーゲンを発現する細菌、酵母または哺乳動物細胞をはじめとする組換え宿主細胞から得られるような、いずれの形態の組換えコラーゲンを使用してもよい。
【００４８】  I型コラーゲンは、重合および解重合のサイクルによっていずれの形態にも容易に構成および再構成され、容器表面を被覆することが可能である。例えば、I型コラーゲン単量体は0.3mg/mlを超える濃度で、天然のpH、中温(25〜37℃)および生理食塩水含有媒体の条件下で重合すること、ならびにコラーゲン繊維はpH2〜4、低温(2〜10℃)、および低塩媒体の条件で解重合することがよく知られている(Klasson, S.C.ら、1986, Coll. Relat. Res. 6:397)。かかる細胞接着マトリックスは体液中の癌細胞捕捉用のマイクロキャピラリー、細胞単離カラム、組織培養プレート、またはマイクロメッシュの壁の内側を覆うように形成することが可能である。
【００４９】  本発明のマトリックススカフオードは、限定されるものではないが、コラーゲン、フィブリンおよび精製綿をはじめとする天然繊維からなってよい。これらのマトリツクススカフォードの一般特性は、それらの表面が、限定されるものではないが、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンをはじめとする血液運搬接着分子との親和性を有することである。マトリックススカフォードを、全血、血漿または血清中に存在する細胞接着分子で被覆すると、高密度細胞集団からの癌細胞および組織細胞の接着を助ける接着面が提供される。これらの集団は血液、リンパ、骨髄および腫瘍組織から誘導され、多くの異なる細胞タイプが含まれる。
【００５０】  コラーゲンマトリックスの製造方法について本出願で詳細に説明する。血漿の抗凝血薬含有率を引き下げることによりフィブリン繊維を含むマトリックススカフォードを容器表面に作製した。動物またはヒト血漿をまず、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で10〜20%に希釈し、細胞単離容器またはウェルに加えた。この容器またはウェルをCO2インキュベーター中、37℃で30分間インキュベートし、容器表面でフィブリン繊維を重合させた。精製綿繊維を10〜20%ウシ血清含有DMEM中に単純に懸濁させ、細胞接着分子で被覆するための細胞培養ウェルに接種した。同様に、10〜20％ウシ血清含有DMEMに懸濁させてガラスおよびプラスチック繊維を細胞接着分子で被覆した。細胞培養プレートをエッペンドルフペプチドチップでスクラップにし、マトリックススカフォードとして作製した。全血またはバッフィーコートをマトリツクススカフォードに適用する場合には、マトリツクススカフォードへ細胞接着分子を前もって被覆する必要がないことに留意すべきである。しかし、全血またはバッフィーコートは、細胞分離手順の間、凝血が起こらないように抗凝血薬で処理しなければならない。詳細には、血液またはバッフィーコートを、同量の0.5mM EDTA含有媒体または50単位/mlのヘパリンを含有する10%抗凝血薬クエン酸デキストロース(ACD; Baxter Healthcare Corporation, IL)で予め希釈した。
【００５１】  コラーゲンマトリックスに結合した癌細胞の検出を容易にし、かつ、かかる細胞の転移能を測定するため、マトリックスを、限定されるものではないが、蛍光色素、ビオチン、着色色素、および放射性プローブをはじめとする種々の異なる薬剤で標識することが可能である。例えば、コラーゲン繊維は色素との直接結合により標識することができ、これによりコラーゲンの重合部位を標識化から保護することが可能である。コラーゲン繊維は、この方法で標識されたものでも、または非標識のものでも可溶性コラーゲン単量体へと容易に分解でき、続いて、これを容器表面でいずれの形態へも集合させることが可能である。コラーゲンの標識に好ましい色素としては、消光−蛍光色素であるMolecular Probes, Inc.から入手可能なBodipy-ローダミンまたはフルオレセイン色素が挙げられる。図1Aおよび1Bで示すように、Bodipy-ローダミンの蛍光シグナルは2種類の色素分子がコラーゲン上で密着して存在すると弱くなる(黄色)が、コラーゲンが酵素により分解または切断されて2種類の色素分子が離れると増強される(赤色)。マトリックスの標識法は、当業者には十分に公知なものである。また、細胞毒性化合物をかかるコラーゲン繊維に結合させることにより、特定の癌細胞へ薬物を送達する新規なビヒクルが得られる。例えば、細胞毒素を結合させたコラーゲンミクロスフェアを癌患者に注入することで癌細胞の特異的な死滅を果たすことが可能である。
【００５２】  マトリックススカフォード表面は血液運搬接着分子でさらに被覆される。マトリックスの被覆には、種々の市販されている血液運搬接着分子を含有する溶液、限定されるものではないが、ウシ血清、ウシ胎児血清(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA); ヒト血清(Sigma); ならびにヒト血漿フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)など、を使用することが可能である。マトリックススカフォード表面は10〜20%のウシ血清、ウシ胎児血清、ヒト血清(もしくは血漿)、または0.01〜0.5mg/mlのヒト血漿フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンのいずれかを用いる接着分子で被覆することが可能である。
【００５３】  本発明は、非常に望ましい目的、すなわち、細胞分離系による癌患者の転移形成を予防および介入する方法の提供を果たすものである。特に、本発明は、癌患者由来の癌細胞を単離する方法であって、
(a)  上記患者由来の癌細胞サンプルを細胞接着マトリックスに接種し、
(b)  このマトリックスに癌細胞を接着させ、その後、非接着細胞を除去するのに十分な時間、癌細胞サンプルをインキュベートし、さらに
(c)  マトリックスに結合した癌細胞をex vivo増幅する、
ことを含んでなる方法を包含する。
【００５４】  本発明の細胞分離法は、限定されるものではないが、体液、例えば、循環血液、尿、骨髄、髄および胸膜液、腹水、唾液; 分離した腫瘍組織標本; ならびに培養腫瘍細胞を含めて、in vivoまたはin vitro起源のいずれかの所望の癌細胞集団の単離に使用しうる。所望の癌細胞集団の例としては、限定されるものではないが、前立腺癌、乳癌、大腸癌、脳癌、肺癌、頭部頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、腎および精巣癌、黒色腫、リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、およびその他の胃腸癌の癌細胞が挙げられる。特に、種々の癌由来の所望の癌細胞集団としては、肺癌細胞、肺腺癌細胞、結腸腺癌細胞、腎臓癌細胞、直腸腺癌細胞、回腸盲腸腺癌細胞、胃腺癌、膵臓癌、肝臓癌細胞、肝細胞癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌、卵巣奇形癌、メラニン欠乏性黒色腫細胞、悪性黒色腫細胞、子宮頸部、喉頭および口部起源の扁平上皮細胞癌; グリア芽腫細胞、子宮内膜腺癌、星状細胞腫、バーキットリンパ腫細胞、ならびに非ホジキンリンパ腫細胞が挙げられる。
【００５５】  マトリックスに結合した癌細胞の存在は、新生細胞の機能、免疫表現型、および細胞形態の特徴を用いることを含む種々の方法を使用して、検出することが可能である。さらに、細胞による標識コラーゲンマトリックスの取り込みに基づいて、結合したどのような細胞も検出することができる。
【００５６】5.2  本発明の治療的および予防的用途
本発明は、例えば、所望でない癌細胞を除去するために、また、骨髄移植でドナー細胞として使用する血液または骨髄由来の造血前駆細胞を富化するために使用しうる細胞分離法を提供する。細胞分離法に続けて、上皮マーカーなどの癌腫エピトープと反応する抗体、または抗CD31もしくは抗CD34などの内皮細胞と反応する抗体を使用して、癌または内皮細胞集団各々を富化することが可能である。
【００５７】  特定の実施形態では、本発明の細胞分離法によりヒト全血から異なる癌由来の癌細胞を富化し、これをex vivo増幅に付した後、これを樹状細胞との反応に使用し、記載された方法(Bruggerら, 1999, Annals of the New York Academy of Science 872:363-371)を含む手法を用いて有効な腫瘍ワクチンを開発することができる。
【００５８】  本発明のもう1つの実施形態では、癌患者から循環癌細胞を単離した後、これを一連のin vitro化学療法計画に付して特定の治療の効果を調べることが可能である。その結果として、有効量または組合せ薬物をその患者に投与できるようになる(デザイナードラッグ)。
【００５９】  本発明のもう1つの実施形態では、癌細胞を選択的に死滅させるために細胞毒素を結合させたコラーゲンミクロスフェアを転移癌患者に注入することが可能である。in vivo癌細胞の特異的な接着および毒性コラーゲンの介入によって新規な治療を提供する。
【００６０】  さらに、本発明は、転移癌患者による血液フィルター用の細胞接着マトリックスとして使用される、限定されるものではないが、血液運搬接着分子で被覆されたコラーゲン、フィブリン、綿およびプラスチック繊維をはじめとする繊維組成物もまた提供する。かかる細胞接着マトリックスの使用では、細胞接着マトリックス中への患者血液の潅流を必要とする。血液潅流プロトコールでは、患者の血液を採取して、細胞接着マトリツクスと接触させて輸送する。かかる輸送の間に患者の血液に存在する癌細胞が細胞接着マトリックスに優先的に接着され、患者の循環系から除去される。
【００６１】  細胞接着マトリックスを作製するため、コラーゲンまたは上記の材料を、限定されるものではないが、体液中の癌細胞捕捉用のカラム、組織培養プレート、マイクロキャピラリー、またはマイクロメッシュなどの容器内に形成させる。この容器には患者血液を保持容器の中を通過させるための1つの流出入口が備わっている。本発明の特定の実施形態では、動作可能なように通常の蠕動ポンプと連結させた血液流入ラインを備えた保持容器内に細胞接着マトリックスを形成させうる。さらに、血液流出ラインも備えられる。流出入ラインは、例えば、患者の前腕に移植される好適な動静脈瘻に連結される。また、アフェレーシスされる末梢血を、細胞接着マトリックスによる上記の癌細胞単離と共に使用することが可能である。白血球数が1.times.l0.sup.9/L以上に回復した後にアフェレーシスを開始した。アフェレーシスまたは白血球フェレーシスはCobe Spectra Cell Separator(Lakewood, Colo.)を用いて80ml/分の速度で200分間行うことができる(全量16L)。本発明の細胞接着マトリックスの使用により、転移性の高い癌細胞を有する患者の循環系から癌細胞を除去できる新規な方法が提供される。
【００６２】5.3  癌細胞の転移能を測定するアッセイ
転移能の高い癌を有する患者を同定する方法を提供することが本発明の1つの目的である。本発明は、コラーゲンに基づく細胞接着マトリックス系を使用して、患者の癌細胞の浸潤能、すなわち、コラーゲンマトリックスに接着し、分解し、さらに取り込む能力を検出することによる転移能の判定に関する。癌細胞の脈管形成性、細胞の生存力および増殖の検出および測定によって、癌の予後に向けたさらなる新規な戦略が立てられる。
【００６３】  本明細書において記載する細胞分離およびアッセイ法は種々の診断に使用しうる。これらの用途としては、早期発見、治療および術後応答のモニタリング、ならびに癌進行の予後診断の際の形態学的、分子的、生化学的または免疫学的アッセイが挙げられる。例えば、循環癌細胞からRNAを調製し、これをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNAマイクロアレイ解析および遺伝子発現の網羅的解析(SAGE)に付して、癌の診断マーカーまたは転移を制御する薬物標的となる示差発現遺伝子を同定することができる。さらに、プロテオミクス解析により単離された癌細胞のタンパク質プロファイリングを行って、新規な転移マーカーおよび薬物標的を発見することが可能である。癌の転移能を判定する目的で、単離された癌細胞の上皮特異的抗原、セプラーゼおよびDPPIV抗原または内皮細胞マーカーを染色し、これを定量して存在する癌細胞数を調べてもよい。単離された癌細胞を、通常の癌の病理学的評価として形態学的に評価してもよい。単離された癌細胞を無菌条件下で培養し、細胞遺伝学的解析に付して染色体異常および変異決定因子の存在を検出してもよい。単離された癌細胞を、DNAマイクロアレイ、PCRおよびFISHを使用して、より感度の高い変異検出用の分子プローブと反応させてもよい。このように、この方法によって、かかる判定のためにこれまで依存してきた侵襲的かつ高価な外科的処置を利用しなくてすむ。
【００６４】  本発明は、非常に望ましい目的、すなわち、癌患者の予後評価をする、および転移癌が発生しやすい素因を有する患者を同定する方法の提供を果たすものである。特に、本発明は、本発明の細胞接着マトリックスを使用して、患者から単離された癌細胞の転移能を調べる機能アッセイを包含する。
【００６５】  特に、本発明は、癌患者由来の癌細胞の転移能を調べる方法であって、
(a)  癌患者由来の癌細胞サンプルを細胞接着マトリックスに接種し、
(b)  癌細胞によるマトリックスへの接着、それに沿った移動またはその取り込みを起こさせるのに十分な時間、癌細胞サンプルをインキュベートし、
(c)  癌細胞によるマトリックスへの接着、それに沿った移動またはその取り込みを検出する、
ことを含んでなり、その際、マトリックスの癌細胞接着、移動または取り込みの検出が転移能を有する癌細胞の指標となる、上記方法を包含する。
【００６６】  本発明のアッセイには、癌細胞を接種するための、人工的に生み出したマトリックスの作製が必要である。マトリックスに接種しうる細胞としては、限定されるものではないが、血液細胞、癌細胞系および癌患者の腫瘍由来の細胞、すなわち生検腫瘍組織などを含めて、哺乳動物腫瘍由来の細胞が挙げられる。
【００６７】  癌細胞をマトリックスに接種したら、接着、取り込みまたは浸潤を起こさせるのに十分な時間マトリックスをインキュベートする。接種時間は接種する癌細胞の転移能に応じて変更する。
【００６８】  インキュベーション後、マトリックスへの癌細胞接着および／または癌細胞によるマトリックスの取り込みを種々の方法を用いて検出する。例えば、コラーゲンマトリックスを、例えば、蛍光色素、ビオチン、着色色素、および放射性プローブなどの薬剤で標識してもよい。癌細胞によりマトリックスが取り込まれることで細胞の標識化がなされる。標識マーカーを表示している癌細胞の検出は、当業者には十分に公知であり、限定されるものではないが、蛍光顕微鏡法、蛍光励起セルソーティング(FACS)法またはシンチレーションカウンター放射能測定をはじめとする種々の方法を用いて行うことができる。かかる標識を用いることで、マトリックス材料の細胞接着および取り込みレベルを定量でき、細胞の転移能を調べることが可能である。
【００６９】  さらに、本発明のマトリックスを用いて単離された癌細胞の転移能は、当業者には十分に公知な種々のアッセイを用いてもまた調べられる。例えば、癌細胞サンプルを標識アセチル化低密度リポタンパク(acLDL+)とともにインキュベートし、毛管網状構造を形成させるためコラーゲンゲル上に接種するか、または癌細胞による内皮表現型の獲得の測定を可能にするのに十分な時間、限定されるものではないが、CD31+、Flk1+、および因子VIII(F8+)をはじめとする、内皮細胞マーカーに対する抗体で染色することが可能である。また、癌細胞のアポトーシスへの進行性を、アポトーシスアッセイキット(Molecular Probes, Inc.)を用いて測定してもよい。癌細胞生存力、免疫細胞(白血球、T細胞およびキラー細胞)との会合および細胞性または補体性細胞融解への抵抗性の測定を可能にするのに十分な時間、癌細胞クラスターを、限定されるものではないが、CD45、CD19、CD8、およびCD4をはじめとする、白血球マーカーに対する抗体と反応させてもよい。また、単離された癌細胞を10〜20%ヒト血漿含有組織培養培地で1〜5週間増殖させて、癌細胞にクローンを形成させることにより、培養下の癌細胞のコロニー形成能も調べることができる。
【００７０】  本発明のアッセイ系を使用して、有望な抗癌剤の効力を治療中にモニターすることも可能である。例えば、癌細胞の転移能を治療前または治療中に調べることも可能である。薬剤の効力は治療を通じて癌細胞の数または転移能を比較することにより追跡できる。コラーゲンマトリックスの検出可能な癌細胞接着、分解または取り込みレベル、癌細胞生存力、およびコロニー形成能を低下させることが可能であるものが効力を示す薬剤である。
【００７１】5.4  抗転移薬を同定するためのin vitroスクリーニングアッセイ
本発明はさらに、原発腫瘍から転移形成部位への癌細胞の拡散を阻害することが可能な薬剤を同定するスクリーニングアッセイを提供する。本発明によれば、薬剤をそれらの癌細胞転移を阻害する能力についてスクリーニングすることができる。抗転移薬を同定する目的での本発明のアッセイの使用では、試験薬剤は癌細胞とともにコラーゲンマトリックスに同時接種される。試験薬剤の存在下での癌細胞によるコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解を、ビヒクル対照の存在下でのコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解と比較する。その際、抗転移薬は癌細胞によるコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解を阻害できるものとして同定される。
【００７２】  特に、本発明は、癌細胞の転移を阻害する薬剤を同定する方法であって、
(a)  癌細胞サンプルおよび試験薬剤またはビヒクル対照のいずれかを細胞接着マトリックスに接種し、
(b)  癌細胞によるマトリックスの接着、分解および／または取り込みを起こさせるのに十分な時間、マトリックスをインキュベートし、
(c)  癌細胞によるマトリックスの接着および／または取り込みを検出する、ことを含んでなり、その際、ビヒクル対照の存在下で検出された癌細胞数に比べて、試験薬剤の存在下での癌細胞によるコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解が低下していることで、転移形成を阻害する化合物が同定される、上記方法を包含する。
【００７３】  本発明によりスクリーニングしうる薬剤としては、限定されるものではないが、原発腫瘍から転移形成部位への癌細胞の拡散を阻害することが可能な、無機化合物、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびに他の有機化合物(例えば、ペプチドミメティックス)が挙げられる。薬剤としては、限定されるものではないが、可溶性ペプチドなどのペプチド、例えば、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Lam, K.S.ら, 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R.ら, 1991, Nature 354:84-86を参照）、およびコンビナトリアルケミストリーにより誘導されるD-および／またはL-型アミノ酸、ホスホペプチドから作製された分子ライブラリーのメンバー(限定されるものではないが、ランダムまたは部分縮重指令ホスホペプチドライブラリーのメンバーなど; 例えば、Songyang, Z.ら, 1993, Cell 72:767-778を参照)が挙げられる。
【００７４】  本明細書に記載するものなどのアッセイにより同定された薬剤は、例えば、移動および浸潤を可能にする癌細胞の特性を確認したり、癌患者の転移形成を阻害したりするために有用である。スクリーニングで同定した化合物の効力を調べるアッセイを動物転移形成モデル系で試用することが可能である。かかるモデル動物は癌転移治療に有効と考えられる薬物、医薬、治療および介入の確認をするための試験基体として使用されうる。
【００７５】  本発明のアッセイを使用して、癌細胞の転移能を阻害しうる核酸配列をスクリーニングしてもよい。かかる核酸分子としては、タンパク質コード配列またはアンチセンス配列を含んでなる分子が挙げられる。エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によりアッセイ前に核酸分子を癌細胞に導入することができる。
【００７６】  本発明によれば、DPPIVおよびセプラーゼをはじめとする、セリン膜内在性プロテアーゼ活性をモジュレートすることによって癌細胞の転移能をモジュレートする薬剤をスクリーニングするのにこのアッセイ系を使用することが可能である。このためには、DPPIVおよびセプラーゼを内部発現する細胞を使用して薬剤をスクリーニングすることが可能である。また、293細胞、COS細胞、CHO細胞、繊維芽細胞などの細胞系を、スクリーニングに使用するためにDPPIVおよびセプラーゼを発現するように遺伝子操作する。好ましくは、DPPIVおよびセプラーゼを発現するように遺伝子操作した宿主細胞を、例えば、化学的変化、生理学的変化、生物学的変化または表現型変化により測定して、アッセイのエンドポイントとして使用する。
【００７７】  かかる細胞系を使用する場合、DDPIVおよびセプラーゼを発現する細胞を試験化合物またはビヒクル対照に暴露する。暴露後、DDPIVおよびセプラーゼプロテアーゼ活性の発現および／または活性を測定するために細胞をアッセイする。例えば、暴露後、細胞溶解物をゼラチン分解活性(セプラーゼ)、またはH-Gly-Pro-p-ニトロアニリドまたはアミノメチルクマリン(DPPIVおよびセプラーゼ)およびZ-Gly-Pro-p-ニトロアニリドまたはアミノメチルクマリン(セプラーゼ)などのプロリンに隣接するリン酸化残基を含有する基質(Kaspariら, 1996)についてアッセイすることが可能である。試験化合物がDPPIVおよび／またはセプラーゼプロテアーゼ活性レベルをビヒクル対照で処置した細胞に認められるレベルよりも低いレベルに低下させうることで、試験化合物がDDPIVおよびセプラーゼプロテアーゼ活性を阻害することが示される。
【００７８】  さらに、アッセイを使用してDDPIVとセプラーゼとの相互作用をアンタゴナイズすることによりタンパク質複合体の活性を阻害する薬剤を同定してもよい。かかる薬剤を同定するために、DPPIVおよびセプラーゼタンパク質を試験化合物の存在および不在下でインキュベートし、その後、複合体形成の検出を行う。複合体形成の減少により、DPPIVとセプラーゼとの相互作用をアンタゴナイズしうる薬剤の存在が示される。
【００７９】  本発明の1つの態様では、可溶性DDPIVおよびセプラーゼを組換えにより発現させ、標識し、無細胞アッセイに使用して、DPPIVとセプラーゼとの相互作用を阻害する化合物を同定することができる。かかるアッセイでは、DDPIVまたはセプラーゼのいずれかを、当業者には十分に公知な手段により試験管またはマイクロタイターウェルなどの固相支持体に結合させることが可能である。その後、固相支持体上でDPPIVまたはセプラーゼとの相互作用を阻害するそれらの能力について試験薬剤をアッセイする。
【００８０】5.5  組成物および使用
本発明は、癌患者の血液および／または組織から浸潤癌細胞を迅速かつ効率的に検出および選択する新規な癌細胞捕捉系に関する。本発明は、細胞接着マトリックスとして使用される、血液運搬接着分子で被覆されたコラーゲン、フィブリン、綿およびプラスチック繊維を含んでなる繊維組成物に関する。本発明はさらに、癌患者の転移細胞の存在を検出するための、また転移癌患者の血液を濾過するためのかかる被覆繊維の使用に関する。癌患者に投与しうる細胞接着マトリックスには、上記第5.l.-5.2.節に記載したものが含まれる。
【００８１】  本発明はさらに、本発明の細胞接着マトリックスにより単離することが可能な細胞組成物を提供する。かかる細胞組成物は、転移能を有する腫瘍細胞の小さなサブ集団、および末期癌に関連する臓器機能不全の一因となりうる血液中の癌細胞クラスターを含んでなる。富化した癌細胞の集団を使用して、例えば、新規な薬物標的、関係する遺伝的欠陥、その転移能および最も有効な治療計画を調べることも可能である。富化した細胞は、癌ワクチン開発に向けて樹状細胞との融合にも使用しうる。
【００８２】  本発明は、癌細胞の転移活性を調節する薬剤の投与による、癌などの増殖障害の治療を提供する。癌患者に投与しうる化合物には、上記第5.3.節に記載したアッセイを使用して同定された薬剤が含まれる。
【００８３】  本発明の特定の実施形態では、組織浸潤表現型に必要とされる重要なプロテアーゼが同定された。例えば、セプラーゼおよびDPPIVなどのセリン膜内在性プロテアーゼの活性化が組織細胞移動および浸潤に必要であることがわかったため、癌細胞の転移活性の阻害にかかるプロテアーゼの阻害剤を使用することができる。かかる阻害剤としては、セプラーゼまたはDPPIVに免疫特異的な抗体が挙げられる(図13A-E)。また、セプラーゼまたはDPPIVのアンチセンスRNAまたはリボザイムを発現するベクターの癌細胞へのトランスフェクションを使用して癌細胞の転移能を低下させてもよい(図19)。
【００８４】  さらに、プロテアーゼ阻害剤を投与して原発腫瘍から転移形成部位への癌細胞の拡散を阻害してもよい。第7節、実施例2に示すように、DPPIV阻害剤、すなわち、抗DPPIV抗体によって癌細胞移動を阻害することができた。腫瘍細胞の体内の別の場所への転移を伴う癌は、癌細胞の移動および組織浸潤を阻害する薬剤の投与により治療される。かかる癌としては、例えば、乳癌および前立腺癌などの癌腫が挙げられる。
【００８５】  癌細胞転移の予防に使用するために同定された化合物は、ヒトで試験する前に、限定されるものではないが、イヌ、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどの好適なモデル動物系で試用することが可能である。in vivo試験では、ヒトへの投与に先立ち、当技術分野では公知のどのようなモデル動物系を使用してもよい。
【００８６】  特定の実施例では、癌患者の癌細胞が高い転移能を有すると判定された患者に癌転移を阻害する化合物を投与する。転移能が高いことは、例えば、血液サンプル(または患者由来の生検組織)を取得し、本発明の細胞分離およびアッセイ系を用いて単離された癌細胞の転移能をアッセイすることにより容易に検出することが可能である。
【００８７】  本発明は、細胞の転移能を阻害する有効量の化合物を被験体に投与することにより癌を治療する方法を提供する。好ましい態様では、被験体が動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００８８】  本発明はさらに、本発明の細胞接着マトリックスまたはその単離された細胞成分と結合可能な医薬組成物を提供する。かかる組成物は、治療上有効な量の、癌細胞の移動および浸潤を制御することが可能な化合物と製薬上許容される担体とを含んでなる。特定の実施形態おいて「製薬上許容される」とは、動物、より詳しくはヒトに使用するために、連邦政府または州政府の規制当局によって認可された、または米国薬局方もしくは一般的に認められた薬局方のリストに記載された、という意味である。「担体」とは、化合物とともに投与される希釈剤、助剤、賦形剤、またはビヒクルをいう。かかる医薬担体は、無菌の液体、例えば水やオイル（落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油などの石油、動物、植物起源のものまたは合成によるもの）でありうる。医薬組成物を静脈投与する場合、好ましい担体は水である。また、食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を液体担体として、特に注射液に使用することも可能である。
【００８９】6.  実施例: 脈管形成および転移に関与する循環癌細胞の単離
以下に記載するデータから、新規な細胞接着マトリックス細胞分離およびアッセイ法により転移性疾患の癌患者の末梢血から生存癌細胞を単離することが可能であり、さらにこれらの細胞が脈管形成および転移を起こさせるのに必要な分子的決定因子を獲得していることが立証される。原発腫瘍由来の細胞に比べ、かかる生存循環癌細胞は転移能を有する小さなサブセットの癌細胞集団に相当する。
【００９０】6.1  材料および方法
6.1.1  血液サンプルの採取
in vivo起源から採取した血液または細胞を、細胞がそれらの生存能を失わないように、それらの採取後、比較的短時間内に細胞単離に供する。癌細胞の単離を最適に維持するため、血液、腹水または組織サンプルを4℃で保存し、採取後24時間以内に使用することが好ましく、最も好ましくは、4時間以内である。1回当たり約10〜20mlの血液を抗凝血薬としてリチウムヘパリンを含有するバキュテイナー採血管(Vacutainer tube)(Becton Dickinson, 緑色トップ、各管に7mlずつ収容する)に採取した。患者のカルテから患者年齢、性別、診断日、治療的介入、臨床状態、および生検報告を調べた。施設内治験審査委員会によりプロトコールの承認を受けた。
【００９１】6.1.2  血液または腫瘍組織からの癌細胞の単離
コラーゲン重合溶液を調製し、これを容器基層へのゲル化直前に氷上で所定の濃度、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中1〜2mg/mlコラーゲンに調整した(図1A)。特に、I型コラーゲン溶液(ラット尾I型コラーゲン、4.0mg/ml, Collaborative Biomedical Products, Becton and Dickinson Labware, Bedford, MA)を同量のDMEMと4℃で混合した。この混合物を4℃で96ウェルマイクロタイターまたは6ウェル培養プレート(Nunc, Inc,, Naperville, IL)の底に薄層としてオーバーレイした(overlaid)。コラーゲン繊維のゲルを形成させるため、プレートを37℃で30分間インキュベートし、コラーゲン層を重合させた。
【００９２】6.1.3  血液、腹水または腫瘍組織からの癌細胞の単離
細胞集団から癌細胞を分離するため、コラーゲンマトリックスをまず、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と、10%子ウシ血清、15%Nu-血清(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)、2mM L-グルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、1単位/mlペニシリン、および10μg/mlストレプトマイシンを補足したRPMI1640との1:1混合物からなる細胞培養培地で被覆した。しかしながら、癌細胞は全血から直接単離することが可能であり、その場合には血液中に存在する接着分子をさらに被覆する必要はない。
【００９３】  サンプルを4℃で血漿および細胞単離処理に付した。血液サンプルを遠心分離して血漿を採取し、細胞ペレットを2%のウシ血清および0.5mM EDTAを含有するPBSで原体積に希釈した後、Ficoll-Paque(Pharmacia)を用いて分画して単核細胞を回収した。細胞接着マトリックスへの接着性の違いにより単核細胞画分を生存および浸潤癌細胞にさらに選別した。手短に言えば、単核細胞を完全培地(血液と同量)に懸濁した。一部の単核細胞、すなわち、コラーゲンマトリックスで被覆した96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル当たり0.1mlまたは6ウェル組織培養プレート(NUNC)の各ウェル当たり1〜10ml、を15分〜1時間接種した。培養物を培地で穏やかに洗浄し、非接着細胞を除去した。免疫細胞化学および機能アッセイに向け、処理に付す前にマイクロタイタープレート中の細胞を12〜24時間培養した。細胞分離研究では、マトリックスに接着した細胞をその後、トリプシン/EDTA溶液(GIBCO)に5分間懸濁するか、または単にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で十分に洗浄した。洗浄液中の細胞を6ウェル組織培養プレートに移し、CO2インキュベーター中、37℃で12時間〜24日間培養した。白血球数が高い患者、すなわち、リンパ腫または白血病患者の場合、単核細胞画分を6ウェル組織培養プレートの1つのウェルに対し1ml当たり細胞100万〜200万個になるまで完全培地で希釈する必要があることに注意すべきである。癌細胞の回収はマトリックスでの細胞密度に依存する(以下を参照)。細胞の生存能をトリパンブルー排除法またはアポトーシスアッセイによって評価した。
【００９４】  あるいは、I型コラーゲンまたは精製綿で作製したフィルターなどの細胞接着マトリックスで被覆した細胞培養ビーズに通すことで、全血から直接生存および浸潤癌細胞が得られる。精製綿またはコラーゲンで被覆したビーズを滅菌30mlピペットに充填し、同量の0.5mM EDTA含有培地または50単位ヘパリン/mLを含有する10%の抗凝血薬クエン酸デキストロース(ACD; Bakter Healthcare Corporation, IL)で予め希釈した10mlごとの血液に対し、0.1mlのコラーゲン被覆ビーズを使用した。10%のヒト血漿または血清含有培地でカラムを予備洗浄した。1分間当たり0.1〜0.7mlの流量で、上記の基層方法から誘導される細胞と類似した特徴を共有する細胞の捕捉がなされる。
【００９５】6.1.4  コラーゲンマトリックスの標識および細胞浸潤表現型の測定
重合部位を妨害しないように、ビオチン、フルオレセインまたはローダミンで標識する前にコラーゲンを重合させた。その後、標識したコラーゲン繊維を酸性水(pH2.0)中で可溶化したが、実験条件下で容易に重合してコラーゲン繊維に戻ることができた。特に、10mlのI型コラーゲン溶液(ラット尾I型コラーゲン、4mg/ml、Collaborative Biomedical Products, Becton and Dickinson Labware, Bedford,MA)を10mlのDMEMと混合し、4℃で10cm組織培養プレートに加えた。プレートを37℃で30分間インキュベートし、コラーゲン繊維を重合させた(ゲル)。ゲルを30mlのカップリングホウ酸バッファー、pH9.3(Sigma)で30分間洗浄した後、3mgのスルホ-NSH-ビオチン(Pierce)、フルオレセインイソチオシアネート I ヒドロクロリド(FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)(Research Organics Inc, Cleveland, OH)または1mgのBodipy-ローダミンまたはフルオレセイン色素(Molecular Probes, Inc.)を含有する30mlのホウ酸バッファーとともに振盪機で25℃でインキュベートした。PBSで3回洗浄してコンジュゲーションを停止させ、次いで、50mlのPBSでの2日間の洗浄、さらに50mlの蒸留水でのさらに2日間の洗浄を行った。標識コラーゲン繊維を酸性水(0.02N酢酸)中で可溶化し、最終濃度を1mg/mlとした。標識コラーゲン単量体を同量の非標識のコラーゲン溶液と混合し、2倍容量のDMEMでさらに希釈し、容器表面にオーバーレイして薄層を形成し、さらに37℃で30分間インキュベートしてゲルを形成させた。
【００９６】  標識コラーゲンマトリックスで16ウェルマイクロタイタープレート−ガラススライド(96ウェルマイクロタイタープレートフォーマット中; Lab-Tek, Rochester, NY)または6ウェル組織培養プレート(NUNC)を被覆した。一部の単核細胞、すなわち、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル当たり0.lmlまたは6ウェル組織培養プレート(NUNC)の各ウェル当たり1.6mlをかかる基層に接種し、15分〜1時間培養して接着細胞を捕捉した。非接着細胞を洗浄した後、細胞を標識マトリックス上で12〜24時間増殖させ、図1A、1Bで示すようにSONY DC5000 Cat Eye イメージングシステムと連動するNikon Eclipse E300 倒立光学顕微鏡またはWindowsソフトウェアコンピューター解析用のSOFTmaxPRO 1.2Fと連動するMolecular Devices fMax蛍光マイクロプレートリーダーを用いて細胞浸潤性を測定した。まず、上記のBodipy-蛍光コラーゲン基層を16ウェル培養チャンバーに調製し、マトリックスにより単離する細胞の浸潤性の特性決定のための細胞培養および顕微鏡画像解析条件を最適化した(図1A)。次いで、基体調製物を96ウェルマイクロタイタープレート型に向けて最適化した。最適化パラメーターには、サンプル処理能の実施可能性、および定量精度に対する解像度が含まれる。
【００９７】6.1.5  その他の細胞機能アッセイ
製造マニュアル(L-3485, Molecular Probes, OR, USA)に記載されるように、アセチル化低密度リポタンパク質(acLDL)Bodipy FL コンジュゲートを用いて内皮細胞活性についての機能アッセイを行った。マトリックス上で同時に単離された、アポトーシスを起こしたまたは壊死状態の血液細胞を分離するため、固定する前にVybrant アポトーシスアッセイキット #5 Hoechst/ヨウ化プロジジウム (V-13244, Molecular Probes, OR, USA)を用いて細胞を染色した。
【００９８】6.1.6  細胞系および培養
ヒト乳癌細胞系MDA-MB-436およびHs578TをAmerican Type Culture Collection(Rockville, MD)から入手し、ヒトメラニン欠乏性黒色腫細胞系LOXをOystein Fodstad教授（Institute for Cancer Research, The Norwegian Radium Hospital, Oslo, Norway）から入手した。細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と、10%の子ウシ血清、5%のNu-血清(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)、2mM L-グルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、1単位/mlペニシリン、および10μg/mlストレプトマイシンを補足したRPMI1640との1:1混合物中で培養した。これらの細胞を使用して免疫細胞化学的検出のための試薬を評価し、さらに機能アッセイの感度を決定した。
【００９９】6.1 7  免疫細胞化学のためのサンプル調製
白血球および末梢血組織細胞との比較により血液中の形質転換上皮細胞を計数するために、16ウェルチャンバーのあるガラススライド(Lab-Tek, Rochester, NY)を被覆した標識コラーゲンマトリックスで捕捉し、同じ基層上で、CO2インキュベーター中、37℃で12〜24時間培養した、癌患者の血液由来の単核細胞を免疫細胞化学用に固定した。この研究に使用した一次mAbには、ヒト上皮特異的抗原(ESA; クローンVU-1D9, NeoMarkers, CA, USA; SIGMA, MS, USA)、Muc-1上皮膜糖タンパク質(Muc-l; クローンE29, NeoMarkers, CA, USA)、サイトケラチン4、5、6、8、10、13および18(PCK; クローンC-11, SIGMA, MS, USA); CD31/PECAM-1内皮細胞マーカー(CD31; クローンJC/70A, NeoMarkers, CA, USA)、Flk-1、血管内皮増殖因子の受容体(Flk-1, クローンsc-6251, Santa Cruz, USA)、VE-カドヘリン内皮マーカー(VE-cad; クローンsc 9989, Santa Cruz, USA); CD34末梢血幹細胞マーカー(CD34; クローン581, Pharmingen, USA)、CD45白血球共通抗原(CD45; クローンT29/33, DAKO, Denmark)、CD8サプレッサーT細胞マーカー(CD8; クローンc8/144B, NeoMarkers, CA, USA)、CD43T細胞マーカー(CD43; クローン84-3C1, NeoMarkers, CA, USA)、前立腺特異的酸ホスファターゼ(PSAP; クローンPASE/4LJ, NeoMarkers, CA, USA)、前立腺特異的抗原(PSA; クローンER-PR8, NeoMarkers, CA, USA)、c-erbB-2/Her-2/neu癌タンパク質(oncoprotein)(erB-2; クローンe2-4001 + 3B5, NeoMarkers, CA, USA)、c-erbB-2(クローンTAB250, Zymed, CA, USA)、CA 19-9/シアリル ルイス(sialyl Lewis)GI 腫瘍マーカー(CA19-9; クローン121 SLE, NeoMarkers, CA, USA)、またはp53腫瘍サプレッサータンパク質(p53; クローンDO-7 + BP53-12, NeoMarkers, CA, USA)を認識するマウスmAbが含まれる。さらに、Muc-1上皮細胞マーカーに対するフルオレセインコンジュゲート抗体(DAKO, Denmark)および第VIII因子内皮マーカーに対するヤギ抗体のフルオレセインコンジュゲート(F8; Atlantic)を、その他の細胞マーカーに対する上記の一次抗体に加えて使用して癌細胞および内皮細胞各々を二重染色した。さらに、本発明者らの研究室で作製したラットmAb D28(セプラーゼ(seprase)に対する)、E19、E26(DPPIVに対する)およびC27(β1インテグリンに対する)を使用した。
【０１００】  抗体染色には、2%のBSAで30分間非特異的結合部位をブロッキングした後に一次抗体および／またはフルオレセイン-F8もしくは-Muc-1をスライドに加えることが含まれる。サンプルを室温で20分間インキュベートし、PBSで5分間2回洗浄し、次いで、二次ウサギ抗マウスIg(ZO259, Dako)にさらに20分間曝露した。3回以上洗浄した後、サンプルをアルカリ性ホスファターゼ−抗アルカリ性ホスファターゼ(APAAP)マウスIg複合体とともに15分間インキュベートした。最後に、酵素-基質[NewFuchsin(Dako)]を加えた結果、赤色の沈殿物が生じた。このデータは、SONY DC5000 Cat Eye イメージングシステムと連動するNikon Eclipse E300 倒立光学顕微鏡を用いて記録したものであり、後の参照用にコンピューターサーバーに保存した。
【０１０１】6.1.8  フローサイトメトリー解析のためのサンプル調製
6ウェル組織プレートを被覆した標識コラーゲンマトリックスで捕捉される、血液中の形質転換上皮細胞を計数するために、マトリックス基層から放出される単核細胞をフローサイトメトリーにより製造業者の推薦する手順に従って解析した。免疫細胞化学に関与する手順と同様に、固定する前にVybrant アポトーシスアッセイキット #5 Hoechst/ヨウ化プロジジウム(V-13244, Molecular Probes, OR, USA)を用いた染色により細胞をアポトーシスまたは壊死について決定した。簡単に言えば、単核細胞を、サイトケラチン4、5、6、8、10、13、18に対するフルオレセイン(FITC)コンジュゲートマウスmAb C11(PCK; Sigma)またはMuc-1に対するフルオレセイン-抗体(DAKO)、フィコエリトリン(PE)コンジュゲート抗CD31内皮マーカー(CD31; Becton-Dickinson)およびペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)標識抗CD45(CD31; Becton-Dickinson)を含有する溶液で15分間染色した。インキュベートし、洗浄した後、回収した細胞を0.5mlのバッファーに再懸濁し、サンプルをFACScanまたはFACSVantageフローサイトメーター(Becton Dickinson)で解析した。
【０１０２】6.2  結果
6.2.1  細胞接着マトリックスを用いた癌細胞の単離: 血液運搬細胞接着分子の役割
表Iでは、LOXヒト悪性黒色腫細胞および頭部頸部癌患者から単離された癌細胞の、ヒト血漿フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン、ならびにヒトおよびウシ血清の存在下での種々の天然繊維表面への接着を示している。ヒト癌細胞の接着を種々の量の精製血清タンパク質(1ウェル当たり0.1〜1μg)または10%血清のいずれかで被覆した96ウェルプレート(Nunc, Inc., Naperville, IL)でアッセイし、記載のように行った(Nomizu ら, 1995)。天然繊維の細胞接着性は、マイクロタイターウェルの1.27mm2の領域に依然として接着したままである領域内の細胞数を計数して決定した。ヒトもしくはウシ血清またはフィブロネクチン + ラミニン + ビトロネクチンの存在下で、LOX黒色腫細胞はプレーンなプラスチックよりも精製コラーゲン、フィブリン、および綿繊維、ならびにラインドプラスチック表面との接着性に優れており、さらに依然として接着したままである細胞数がより多い(表1)。同様に、頭部頸部癌細胞もプレーンなプラスチックよりも精製コラーゲン、フィブリン、および綿繊維、ならびにラインドプラスチック表面との接着性に優れており、さらに依然として接着したままである細胞数がより多い(表2)。これらの結果から、細胞接着マトリックス表面が血液運搬接着分子に対する結合親和性を介して癌細胞接着に影響を与えていることが示唆される。
【０１０３】
【表１】
0005433840.tif 000002
【０１０４】  細胞、1ウェル当たり4×103個(マイクロタイターウェルの1.27mm2の領域に依然として接着したままである領域内の細胞数を計数した)を、10%のヒト血清(Sigma)、10%のウシ血清(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)、またはヒト血漿フィブロネクチン + ラミニン + ビトロネクチン(FN+LM+VN; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)で、各々10μg/mlの濃度で被覆した96ウェルプレート(Nunc, Inc., Naperville, IL)中の種々のマトリックス表面に接種した。タンパク質で被覆しなかったウェルを陰性対照として使用した。以下に記載の手順に従ってI型コラーゲン繊維をマイクロタイターウェルの底に形成した。マイクロタイターウェルのダルベッコ改変イーグル培地中で20%のヒト血漿を凝固させてフィブリン繊維を形成させた。また、精製綿繊維をダルベッコ改変イーグル培地に再懸濁し、マイクロタイターウェルに接種した。「ラインドプラスチック」(lined plastic)とは、マイクロタイターウェルの表面をエッペンドルフ(Eppendorf)ペプチドチップでスクラップにしたものを示す。各値は独立した3回の実験の平均±S.D.を表す。
【０１０５】
【表２】
0005433840.tif 000003
【０１０６】  細胞、１ウェル当たり2×103個(マイクロタイターウェルの1.27mm2の領域に依然として接着したままである領域内の細胞数を計数した)を、10%のヒト血清(Sigma)、10%のウシ血清(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)、またはヒト血漿フィブロネクチン + ラミニン + ビトロネクチン(FN+LM+VN; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)で、各々10μg/mlの濃度で被覆した96ウェルプレート(Nunc, Inc., Naperville, IL)中の種々のマトリックス表面に接種した。タンパク質で被覆しなかったウェルを陰性対照として使用した。以下に記載の手順に従ってI型コラーゲン繊維をマイクロタイターウェルの底に形成した。マイクロタイターウェルのダルベッコ改変イーグル培地中で20%のヒト血漿を凝固させてフィブリン繊維を形成させた。また、精製綿繊維をダルベッコ改変イーグル培地に再懸濁し、マイクロタイターウェルに接種した。「ラインドプラスチック」とは、マイクロタイターウェルの表面をエッペンドルフペプチドチップでスクラップにしたものを示す。各値は独立した3回の実験の平均±S.D.を表す。
【０１０７】6.2.2  細胞分離法の感度
ヒト浸潤性乳癌細胞系MDA-MB-436およびHs578T(American Type Culture Collection, Rockville, MD)を使用して細胞分離法の感度を決定し、さらに免疫細胞化学的検出のための試薬を評価した(以下を参照)。これらの乳癌細胞を蛍光色素でタグ付けし、単離手順の感度を決定した。図3A〜Gは、PKH26赤色蛍光細胞リンカー(Sigma)でタグ付けした、種々の数のHs578T乳癌細胞を加えた、正常および膀胱癌血液サンプルの解析を示している。示されるように、癌細胞はその他の血液細胞との識別が可能である。乳癌細胞の回収は頻度範囲、1mlの健常ドナーの血液(1ml当たり単核細胞1000万〜2000万個）にスパイクしたHs578T細胞1〜500個、にわたり一致しており、回収率は75〜100%であった。しかしながら、Hs578T乳癌細胞を単核細胞が1ml当たり1000万個未満である膀胱癌ドナーの血液にスパイクした場合、Hs578T細胞の回収率は95〜100%であった。このことから細胞密度がマトリックスへの細胞接着の限定要因であることが示唆された。さらに、19個の赤色蛍光タグ付Hs578T細胞を1mlの膀胱癌ドナーの血液にスパイクした場合には、単離されたHs578Tおよび膀胱癌細胞の双方が抗サイトケラチン抗体C11での陽性染色により確認された(図3E〜3F)。1mlの血液中に16個の蛍光タグ付Hs578T細胞および468個の膀胱癌細胞が検出された。これらの結果から、マトリックス捕捉方法による感度レベルは血液1ml当たり生存癌細胞1個であり、回収率は85%に達しうることが示唆される。
【０１０８】6.2.3  細胞接着マトリックスを用いた癌細胞単離
血液中の癌細胞の検出では、16ウェルチャンバーのあるガラススライド(Lab-Tek, Rochester, NY)または96ウェル培養プレート(Nunc)上に被覆され、続いて血液運搬接着分子を含有する子ウシ血清とともにインキュベートするローダミン-コラーゲン溶液の薄層が、「マトリックス」の好ましい実施形態である。1.6mlの全血から誘導したバッフィーコート中の単核細胞を同アリコート(各々0.1ml)に16ウェルチャンバーのあるガラススライドの各ウェルに接種し、37℃で10分〜18時間インキュベートし、コラーゲンマトリックスへの接着性の違いにより癌細胞を選択する。
【０１０９】  図4A〜Dでは、かかるI型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスを用いた組織断片を有する循環癌クラスターの単離を示している。頭部頸部扁平上皮細胞癌(図4A〜C)および前立腺癌(図4D)を含む進行性転移性疾患の患者の血液では種々の大きさを有する細胞クラスターが共通して認められた。III〜IV期癌患者の血液には、血液1cm3当たり数百〜2万個に至る多数の癌細胞クラスターが存在すると予想されている。しかしながら、健常ドナーまたは初期癌患者の血液にはかかる細胞クラスターは全く見られない。さらに、フィブリン繊維(図4E)、プラスチックスクラップ(図4F〜G)、精製綿繊維(図4H〜I)、およびI型コラーゲン繊維(図5A〜H)は、培養下で増殖し、上皮細胞形態を示す循環癌細胞を捕捉する。これらの材料の表面は、腫瘍細胞の接着および拡散を順に促進する血液運搬細胞接着分子を吸収する(上記の表IIを参照)。このプロセスでの細胞接着分子の役割を、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびラミニンに対するポリクローナル抗体とともに被覆コラーゲンマトリックスをインキュベートすることでさらに証明した。この処理により、マトリックスの細胞捕捉能は低下した。
【０１１０】  図5A〜Hでは、血液運搬細胞接着分子の存在下での循環細胞とそれらの下部にあるI型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの形態を示している。これらの癌細胞は接触後10分〜60分以内に優先的にコラーゲンマトリックスに接着する。次いで、それらはマトリックスを分解および取り込み、平らな基層に穴を形成した後、プラスチック表面上を移動し、さらに増殖する(図5A〜D; 6A〜D)。かかる癌細胞はほとんどの健常ドナー(図7A)、良性疾患の患者(図7B)、または化学療法を受けている癌患者(図7C〜D)の血液には存在しない。新しく単離される循環癌細胞の大きさは小さいが、マトリックス上で同時に単離された大部分の単核血液細胞よりは比較的大きい(図6A)。これらの推定癌細胞は急速に増殖してサイズがより大きくなり、培養4日以内に上皮形態をとる(図5A〜D; 6A〜D)。しかしながら、同時に単離された白血球は小さく、また、培養によってその数は減少する(図5A〜D)。また、細胞接着マトリックスを用いて頭部頸部生検の扁平上皮細胞癌(SCCHN)から単離された少数の癌細胞(図5E〜F)しか循環癌細胞の浸潤表現型または増殖特性を示さなかった。このことは循環癌細胞が転移する癌細胞集団の特異なサブセットを表すことを示唆している。かかるSCCHN組織では、それらはコラーゲンゲルに浸潤し、培養下で増殖する繊維芽細胞である(図5E〜F)。細胞分離系は循環系でまたは実験操作により損傷を受けた細胞を捕捉するものではなく、依然として生存している細胞、すなわち、接着能力を保持する細胞を捕捉するものであることに注目すべきである。
【０１１１】  コラーゲンマトリックスの厚さは、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡測定により測定したところ、推定約100μmであった(図5E〜H)。アセンブルされたコラーゲンにより混合細胞集団、すなわち、組織生検由来の血液または細胞懸濁物から10分〜1時間以内に癌細胞を捕捉することが可能である。マトリックスにより捕捉された細胞は1〜2週間のインキュベーション中にマトリックスにさらに浸潤しうるが、マトリックスの表面上には増殖しない非浸潤細胞も幾分残っている(図5E〜F)。アセンブルされたコラーゲン繊維は直径70nmの細いストリングであり、それらがコラーゲン結合パターンを欠いていることを除いてin vivoのコラーゲン束状構造のものと外見が類似している(図5G〜H)。
【０１１２】6.2.4  循環癌細胞の機能的特徴および免疫表現型的特徴
マトリックスにより捕捉された上皮細胞の機能的特徴および免疫表現型的特徴は新生物細胞のものと一致する。これらの細胞の浸潤表現型の測定では、ローダミン-コラーゲンマトリックスを用いて癌患者の血液から単離した細胞を、ローダミン-コラーゲン基層に接着し、それを分解して取り込む細胞の能力について解析した。図8A〜Iでは、推定癌細胞が広範なコラーゲン分解/取り込み活性(Col+)を示し、これらの細胞が癌細胞に特有の免疫学的および形態学的特徴も示すことを示している(以下を参照)。
【０１１３】  癌細胞の性質を決定するために、ローダミン-コラーゲンマトリックスを用いて癌患者の血液から単離した細胞を、それらの可能性のある上皮起源について上皮特異的抗原(ESA)、上皮膜抗原(Muc-1)、およびサイトケラチン4、5、6、8、10、13および18(PCK)に対する抗体を用いる免疫組胞化学により解析した。ESA+、Muc-1+、またはPCK+に陽性反応を示すこれらの細胞は上皮起源のものであり、それゆえ、それらの転移性の性質と一致している。マトリックス上では、富化された癌細胞を含む接着細胞が、上皮、癌腫、内皮、末梢血幹細胞、または白血球に対するものなどの細胞型特異的モノクローナル抗体で染色される。上皮細胞マーカーで陽性に標識される接着細胞(図8E、G、J、K)、およびコラーゲン断片を取り込んだ接着細胞、Col+(図8B、C、F、I、L)、を癌細胞と同定する。循環癌細胞は大部分の健常ドナー(図8L)、良性疾患の患者、または化学療法を受けている癌患者の血液にはほとんど存在しない。本明細書に記載する免疫細胞化学的解析と同様に、マトリックスから放出された、癌患者の血液由来の単核細胞を蛍光活性化セルソーティング(FACS)解析に供することが可能である。
【０１１４】6.2.5  循環細胞による内皮細胞表現型の獲得
循環系中の転移癌細胞には、浸潤の他、明らかに新たな脈管形成性が含まれる。細胞接着マトリックスを用いて癌患者の血液から単離された循環癌細胞は確かに内皮的特徴を獲得している。これらの頭部頸部扁平上皮細胞癌(HN、図9A〜C;9I〜J)、大腸癌(CC、図9D〜E)および前立腺癌(PC、図9G〜H)細胞はCol+であり(図9C、F)、フォンビルブランド因子または第VIII因子(F8)(図9B、E)およびCD31(図9D)を含む内皮細胞マーカーについて染色され、アセチル化低密度リポタンパク質(LDL)の取り込み(図9H、J)ならびに上皮表面抗原(図9G中のESA)により内皮細胞能力を発現する。さらに、内在化された単離癌細胞をフルオレセイン-LDLで標識した後、厚さ0.5mmのコラーゲンゲルにプレーティングすると、それらによって細胞網状構造および管様構造の形成を含む増強された内皮分化が示された（図9K、L)。これらの構造は主としてLDL標識癌細胞で構成されていた。さらに、循環癌細胞は、先に発現した上皮マーカーを欠損することなく血管内皮増殖因子Flk-1およびVE-カドヘリンの受容体の発現を含むさらなる内皮的特徴を示す。この脈管形成性は、腫瘍組織に残存する細胞ではなく、循環系に侵入する癌細胞に限られたものである。脈管形成表現型のかかる空間的制限が、遊出し、コロニーを形成し、さらに微小転移巣の形成へと至る脈管形成に協力する循環癌細胞の明確に区別される機能的能力を反映する。
【０１１５】6.2.6  培養下の循環癌細胞の免疫死滅および増殖
循環癌細胞は白血球共通抗原CD45およびT細胞マーカーCD8を発現する白血球(WBC)とともにクラスターを形成する。細胞接着マトリックスにより、望みのある予後と判定された癌患者から免疫および癌細胞複合体のかかるクラスターを容易に単離することができた。循環癌細胞全数により転移形成能が示されうるが、細胞傷害性WBCと相互作用する癌細胞の計測(図10A〜I)または自己免疫抗癌抗体介在補体性細胞溶解(図10J〜L)によって転移に対する宿主免疫が示される。良好な予後と判定されたこれらの癌患者では、白血球により大部分の癌細胞が攻撃され、1日培養した後には分解され、数個のコロニーだけが増殖した(図10F〜I)。また、抗癌抗体介在補体性細胞溶解はほとんどの癌細胞に起こりうるものである。ここでは、癌細胞のかかる死滅を、健常ドナー由来(図10L)のものではなく、その同じ癌患者の血液由来(図10J〜K)の10%の自己血漿の存在下で単離BLC細胞を培養することにより立証した。結果として生じた癌細胞の細胞溶解は、溶解した細胞の暗く見える相の材料の形態学的外見により測定することが可能である(図10J〜K)。重要なこととして、Molecular Probes, Inc製のアポトーシスおよび細胞溶解キットを用いた蛍光染色により測定したところ、血液から新しく単離された約97%の細胞がアポトーシス細胞である。2ヶ月間の培養増殖が可能な癌細胞もあるが、大部分の癌細胞はそれらが単離された直後にアポトーシスまたは細胞溶解を示し、このことにより宿主免疫により癌細胞が死滅することが示される。1週間後には大部分のWBCが培養物から消滅しているが、癌細胞クラスターまたはコロニーは残っている(図10F〜L)。このように、免疫死滅に抵抗する生存および浸潤癌細胞の計測が、高度の悪性腫瘍を保持する患者の最も有力な指標となるであろう。
【０１１６】6.2.7  循環癌細胞の計測
細胞分離法を用いて単離した循環癌細胞を、それらの浸潤活性、上皮性、脈管形成性、および上記の宿主免疫に対する抵抗力について分析した。SONY DKC5000 3CCD イメージングシステムでコンピューター処理するNikon倒立顕微鏡を用いて結果を記録した。全血またはバッフィーコートに存在する癌細胞の計測は本明細書に記載するこの細胞分離およびアッセイ法により最高の感度および解像度が与えられる。前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、頭部頸部癌、脳癌、膀胱癌、リンパ腫、腎および精巣癌、肝臓癌、または膵臓癌およびその他の胃腸癌患者の200を超える血液サンプルが調べられた。Col+、LDL+、ESA+、Muc-1+、PCK+、F8+、またはCD31+細胞と定義される循環癌細胞は転移性疾患の癌患者由来の全血1ml当たり2,000〜20,000個のオーダーである。この研究から、転移する可能性のある癌患者の循環系中に800万〜8000万個の生存癌細胞が存在していると推測される。これはこれまでの抗体に基づくアプローチよりも解像度が100倍以上高い(Racila, E., Euhus, D., Weiss, A.J., Rao, C,, McConnell, J., Terstappen, L.W., およびUhr, J.W., 1998,「血液中の癌細胞の検出および特性決定(Detection and Characterization of Carcinoma Cell in the Blood)」. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 4589-4594)。しかしながら、この研究で推定された転移細胞数はこれまでの調査で報告された循環癌細胞全体の0.1%にすぎない(Glaves ら, 1988, Br. J. Cancer 57:32-35)。
【０１１７】7.  実施例: コラーゲンマトリックス上での繊維芽細胞移動の調節は新規な細胞表面プロテアーゼ複合体に依存する
以下に記載するデータは、移動中の繊維芽細胞の浸潤先端(invadopodia)でのセプラーゼおよびジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)を含むセリン膜内在性プロテアーゼ(SIMP)からなる新規なプロテアーゼ複合体の形成がコラーゲンマトリックス上での細胞浸潤および移動に関係していることを実証する。
【０１１８】7.1  材料および方法
7.1.1  細胞培養
ヒト胚性肺繊維芽細胞系WI38およびヒト乳癌細胞系MDA-MB-436をAmerican Type Culture ColIection(Rockville, MD)から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と、10%の子ウシ血清、5%のNu-血清(Collaborative Research, Inc., Bedford, MA)、2mM L-グルタミン、1単位/mlペニシリン、10μg/mlストレプトマイシン、0.1mM非必須アミノ酸、および1mMピルビン酸ナトリウムを補足したRPMI1640との1:1混合物で細胞を培養した。ラットmAb E26、E19およびF4はヒト胎盤DPPIVに対して誘導されたものであり、ラットmAb D8およびD28はヒト胎盤セプラーゼに対するものであり(Goldstein LA ら, 1997, Biochim. Biophys. Acta. 1361:11-19; Pinereiro-Sanchez, ML ら, 1997, J. Biol. Chem 272: 7595-7601; correction (1998) J. Biol. Chem. 272:13366)、mAb C27はヒト黒色腫β1インテグリンに対して誘導されたものであり、また、ラットmAb C37は細胞表面糖タンパク質 gp-90に対して誘導されたものである(Meuller, SC.ら, 1999, J. Biol. Chem. 274:24947-24952)。マウス抗αvインテグリンおよび抗β3インテグリンmAbはAmerican Type Culture Collection(各々クローンL230、カタログ番号HB8448およびクローンAP-3、カタログ番号HB242)からのものであった。
【０１１９】7.1.2  セプラーゼ-DPPIV複合体の単離
WI38細胞を水和したI型コラーゲンフィルム(0.2mg/mlのラット尾I型コラーゲン、Collaborative Biomedical Products, Becton and Dickinson Labware, Bedford, MA)上に接種し、90%の集密状態になるまで培養した。WI38単層の表面ビオチン化を製造業者の使用説明書に従い、Suffo-NSH-ビオチン(Pierce, Rockford, IL)を用いて行った。溶解物を回収するため、各培養プレートをPBSで3回洗浄し、125 l/cm2のPIPA溶液(50mM Trisバッファー(pH7.5)中1.25%のNonidet P-40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS)で抽出した。抽出は回転式振盪機(Bellco Orbital Shaker, Vineland, NJ)で25℃、25rpmで2時間行った。細胞層およびバッファーを除去し、50ml円錐管に移し、4℃でさらに3時間回転攪拌しながらインキュベートした。この抽出物を4℃、10,000×gで20分間の遠心分離により清澄化し、この上清を免疫沈降反応に使用した。
【０１２０】  免疫親和性マトリックスを調製するため、膜タンパク質に対する精製ラットmAb(2.5mg)を1mlのCNBr-セファロース 4MB(Pharmacal Biotech Inc., Piscataway, NJ)とカップリングさせた。0.25mlのmAb-ビーズを使用し、4℃で一晩回転攪拌しながら25mlの細胞抽出物から複合体を免疫沈降させた。25mlの抽出バッファーで3回洗浄した後、カップリングした抗体-抗原複合体を有するビーズを0.1%のグリシン-HCl(pH2.4)バッファー(ビーズと同量)に再懸濁し、さらにサンプルを4℃で5分間インキュベートした。直ちに、サンプルをAmiconフィルターインサート(0.45m 400l容量)に移し、エッペンドルフマイクロフュージ(microfuge)で4℃、10,000rpmで10分間遠心分離した。ビーズ濾液を2M Trizma塩基を加えて中和した。単離されたタンパク質複合体のサブユニット組成を決定するため、表面ビオチン化複合体の免疫沈降物をSDS-PAGEによりそれらのタンパク質プロフィールについて解析し、ニトロセルロース膜に移し、HPR-ストレプトアビジン(Sigma, St. Louis, MO)およびECLシステム(Amersham, St. Louis, MO)を用いて検出した。また単離されたタンパク質複合体を免疫ブロット(抗セプラーゼ、抗DPPIV、抗β1および抗β3インテグリンmAbを用いる)、ゼラチンザイモグラフィー(セプラーゼゼラチナーゼ活性の検出)、および記載のDPPIV基質膜オーバーレイ(overlay)(Pinereiro-Sanchez, ML ら, 1997, J. Biol. Chem. 272: 7595-7601; correction (1998) J. Biol. Chem. 272:13366)にも使用した。タンパク質がビーズから完全溶離したことを試験するため、Laemmliサンプルバッファー(ビーズと同量)を加え、サンプルをマイクロ波により加熱した(低設定、各30秒で2サイクル、次に中間設定で30秒間を1サイクル)。その後、直ちにサンプルを4℃で遠心分離した。この濾液を上記のアッセイに供した。
【０１２１】7.1.3  コラーゲン繊維の標識
重合部位を妨害しないように、ビオチン、フルオレセインまたはローダミンで標識する前にコラーゲンを重合させた。その後、標識したコラーゲン繊維を酸性水(pH2.0)中で可溶化したが、実験条件下で容易に重合してコラーゲン繊維に戻ることができた。特に、10mlのI型コラーゲン溶液(ラット尾I型コラーゲン、4.66mg/ml、Collaborative Biomedical Products, Becton and Dickinson Labware, Bedford, MA)を10mlのDMEMと4℃で混合した。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、コラーゲン繊維を重合させた(ゲル)。ゲルを30mlのカップリングホウ酸バッファー、pH9.3(Sigma)で30分間洗浄した後、3mgのスルホ-NSH-ビオチン(Pierce)、フルオレセインイソチオシアネート I ヒドロクロリド(FITC)、またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)(Research Organics Inc, Cleveland, OH)を含有する30mlホウ酸バッファーとともに振盪機で25℃でインキュベートした。PBSで3回洗浄してコンジュゲーションを停止させ、次に、50mlのPBSでの2日間の洗浄、さらに50mlの蒸留水でのさらに2日間の洗浄を行った。標識コラーゲン繊維を酸性水(0.02N酢酸)に可溶化し、最終濃度を1mg/mlとした。標識コラーゲン単量体を同量のDMEMまたはp-バッファー(50mM 重炭酸アンモニウムバッファー中300mM NaCl、pH8.4)と混合し、さらに37℃で30分間インキュベートしてゲル形成させた。
【０１２２】7.1.4  細胞移動および蛍光コラーゲン分解アッセイ
単層創傷培養物をオーバーレイする蛍光コラーゲン繊維を使用して、創傷閉鎖中のコラーゲンゲルにおける細胞移動を調べた。WI38細胞を2-ウェルチャンバーのあるカバースリップ(Lab-Tek, Rochester, NY)で集密状態になるまで増殖させた。ピペットチップで単層を引っ掻き、創傷縁部を作製した。次いで、培地をDMEM中のTRITC-コラーゲン(600g/ml; 501/ウェル)と取換え、この培養物をCO2インキュベーター中、37℃で30分間ゲル化させた。次いで、血清または阻止mAb(300l/ウェル)を含有する培地を加え、リアルタイムで細胞移動およびコラーゲン分解に及ぼすそれらの影響を位相差および蛍光顕微鏡(Nikon 倒立顕微鏡)を使用して観察した。NIH Image 1.62b4/fat解析プログラムを用いて移動性細胞による細胞移動および蛍光コラーゲン除去の領域を測定することで細胞移動およびコラーゲン分解を定量した。
【０１２３】  移動性細胞によるコラーゲン分解を測定するためにマイクロタイター形式の上記アッセイが開発された。96ウェル組織培養プレート(Nunc, Rochester, NY)中に、まず、50 l/ウェルのTRITC-コラーゲン溶液(600g/ml)を装填し、この溶液を37℃のインキュベーター中で30分間ゲル化させた。次いで、TRITC-コラーゲンゲルに50 l/ウェルの、2×105細胞およびmAb(50g/ml)を含有するTRITC-コラーゲン溶液をオーバーレイし、この培養物をCO2インキュベーター中、37℃で30分間ゲル化させた。次いで、培養物に1ウェル当たり150lの新鮮培地を補足した。総ての培地をフェノールレッドを含まずに調製した。時々、各ウェルから100lの培地を取り出し、蛍光マイクロプレートリーダー(Molecular Devices fMax: 蛍光マイクロプレートリーダー)を励起波長544nmおよび蛍光波長590nmで用いてTRITC-コラーゲンペプチドの放出を測定した。ロイシンの取り込みを利用して、150 l/ウェルの2Ci/ml3H-ロイシンを含有する培地を培養物に添加するという培養条件において細胞の代謝活性を測定した。この際、細胞-コラーゲン層を5mlのシンチレーション液に可溶化し、シンチレーションカウンター(Beckman LS-7500)で計数した。
セプラーゼおよびDPPIVを構成的に発現する乳癌系MDA-MB-436の安定したトランスフェクタントが得られた。プラスミドpA11(pCR3.1ベクター単独)、pA15(ベクター+全長セプラーゼ)、およびpZ8(DPPIVリボザイム構築物)を製造業者の使用説明書に従い、リポフェクタミン(Gibco/BRL)を用いてMDA-MB-436細胞にトランスフェクトした。選択培地は300g/mlの濃度でG418を含有した。
【０１２４】7.1.5  セプラーゼおよびDPPIVの免疫蛍光標識
WI38細胞をコラーゲンゲルで培養し、固定し、記載のようにセプラーゼに対するローダミンコンジュゲートmAbD28およびDPPIVに対する蛍光コンジュゲートmAbE26(Meuller, SCら, 1999, J. Biol. Chem. 274:24947-24952)を用いて単一ステップで免疫標識した。染色されたサンプルを落射蛍光(epifluorescence)下、Zeiss PhotomicroscopeIII(Carl Zeiss, Inc.)でPlanapo 25/1.2または63/1.4対物レンズを用いて写真撮影した。
【０１２５】7.1.6  ヒト歯肉創傷および浸潤性ヒト乳癌
ヒト歯肉生検はトゥルク大学(the University of Turku)(フィンランド)から入手した。2人の健康なボランティアに口腔粘膜の全厚創傷を作製し、創傷3、7、14および28日後に生検を回収した。生検直後に、新鮮な組織塊をHistoprep(登録商標)(Fisher Scientific, New Jersey)にマウントし、即液体窒素で凍結した。凍結切片(6m)を切断し、-20℃のアセトンで5分間固定し、-70℃で保存した。ルーチンの組織学のために、その切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学的染色では、切片を0.1%のウシ血清アルブミン(BSA; Sigma Chemical Co., St. Louis, M.O.)を含有するPBSで洗浄し、PBS/BSA中のセプラーゼに対するローダミンコンジュゲートmAb D28とともに加湿チャンバー内、4℃で16時間インキュベートした。その後、切片をPBS/BSAおよび水で洗浄し、短時間風乾し、シアノアクリレートグルー(glue)(Krazy Glue, Borden Company LTD)を使用してマウントした。
【０１２６】  染色をZeiss Axioskop 20 光学、蛍光および共焦点顕微鏡を使用して調べ、MC 80 Zeiss顕微鏡カメラを用いて写真撮影した。対照染色はローダミンコンジュゲート二次抗体を用いて行ったが、特異的な染色は認められなかった。浸潤性ヒト乳癌の免疫組織化学染色を記載のとおり行った(Kelly T ら, 1998, Mod. Pathol. 11:855-863)。
【０１２７】7.2  結果
示されたデータにより、LOXヒト悪性黒色腫細胞におけるセプラーゼ(Pineiro-Snachez ML, 1997, J. Biol. Chem. 272:7595-7601)と同様に、WI38ヒト胚性繊維芽細胞における大部分のセプラーゼおよびDPPIVが、Triton X-100、Triton X-114、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有するRIPAバッファー、およびオクチルグルコシドを含む非イオン性界面活性剤中、ならびにWGA-アガロースアフィニティー精製材料中では>400kDaの複合体として存在していたことが示される。>400kDaの複合体はSephacryl S-200ゲル濾過クロマトグラフィーではボイドボリューム画分に溶出した。WGA-精製材料を単離し、続けてSuperose 12 ゲル濾過液体クロマトグラフィーに供すると、主要な形態として、約200kDa(画分17)、440kDA(画分14)、および670kDa(画分13)が示された(図11A)。セプラーゼが97kDaサブユニットを、そして、DPPIVが110kDa単量体を含有すること、さらにセプラーゼおよびDPPIVの双方が非イオン性界面活性剤中では二量体である(10)ことより、ゲル濾過データから440〜670kDaの大きさのセプラーゼ−DPPIV複合体が存在することが示唆される(図11B)。
【０１２８】  mAb D28(セプラーゼに対する)およびmAb E19(DPPIVに対する)を用いた免疫沈降では、表面ビオチン化したWI38細胞の抽出物において2つの主要な、密度が類似したバンドを同定した(図12A)。mAb D28またはE19によって交差免疫沈降された2つのバンドはセプラーゼおよびDPPIV二量体各々を示している。サンプルを1%のSDS中で可溶化しかつ煮沸しないSDSゲルでは、200kDaの上方つまり比較的遅いバンドがDPPIVとして、170kDaに移動する下方つまり比較的速いバンドがセプラーゼとして、各々免疫ブロットにより同定された(図12B)。サンプルのSDS可溶化後のSDSゲルでは350〜400kDaのヘテロマー会合物は検出されなかった(図12A、12B)。このことから、ヘテロマー会合物が2つの安定した200kDa DPPIVおよび170kDaセプラーゼの二量体各々に解離したことが示唆される。RIPA細胞抽出物に関する3回の独立した実験では、セプラーゼおよびDPPIVの安定した会合がセプラーゼおよびDPPIVに対するmAbを用いて検出されたが、β1およびβ3インテグリンに対するものでは検出されなかった(図12A、12B)。さらに、かかるヘテロマー複合体は免疫的に単離された複合体のタンパク質分解活性により立証された。セプラーゼまたはDPPIV各々を認識するmAb D28またはmAb E19のいずれかを用いるアフィニティ精製によりWI38 RIPA抽出物から抗原を単離した。溶離物を170kDa(セプラーゼ)ゼラチナーゼ(図12C)および200kDa(DPPIV)プロリン特異的ジペプチジル-アミノペプチダーゼ(図12D)について分析した。ゼラチンザイモグラフィーでは、抗セプラーゼmAb D28(図12C、IP: セプラーゼ)または抗DPPIV mAb E19(図12C、IP: DPPIV)の免疫沈降物において170kDaゼラチナーゼ活性が検出された。単離されたDPPIV二量体にはゼラチナーゼ活性がなく、DPPIV抗体を用いたゼラチンザイモグラムで170kDaバンドが同定されたことから複合体中にセプラーゼが存在することが示される。同様に、DPPIV基質オーバーレイアッセイでは、抗セプラーゼmAb D28(図12D、IP: セプラーゼ)または抗DPPIV mAb EI9(図12D、IP: DPPIV)の免疫沈降物において200kDaプロリン特異的ジペプチジル-アミノペプチダーゼ活性が検出された。αv、α2、α6もしくはβ3インテグリン、または対照免疫沈降物にはDPPIV活性の170kDaゼラチナーゼは全く認めることができなかった。これらの結果からも、セプラーゼおよびDPPIVはSDSバッファー中ではホモ二量体であるが、これらは熱(>60℃)および酸に感受性で、これらの単量体サブユニットへの解離に向かうという先の観察が確認される。よって、プロテアーゼ複合体は同量のセプラーゼおよびDPPIVタンパク質(図11A、11B、12A、12B)を含有しており、170kDaゼラチナーゼおよび200kDa DPPIVジペプチジル-アミノペプチダーゼ活性(図12C、12D)を誘導するのに等しく有効であったことがわかる。
【０１２９】  コラーゲンゲルでの細胞移動および可能性のあるコラーゲン分解におけるセプラーゼ-DPPIV複合体の役割を調べるため、本発明者らは形態学的試験用の細胞単層創傷モデルに、また生化学的研究用の希薄な培養物に薄層のコラーゲンをオーバーレイした(図13)。コラーゲンゲルでの細胞移動および細胞による局部的なコラーゲン除去は、細胞移動／コラーゲン除去の領域を位相差および蛍光顕微鏡とともに画像解析を用いて計測して測定した(図13A〜13D)。創傷閉鎖モデルにmAb E19(DPPIVに対する)を加えると細胞移動(図13B、13C)および細胞による局部的なコラーゲン除去(図13D)が阻止されたが、一方クラスが適合したmAb(IgG)を添加しても阻止されなかった(図13B、13C、13D)。mAb E19の量を増やすと阻止が増大され(図13B)、E19を除去すると抗体阻止効果が逆転しうるため、このmAbに毒性はなかった(図13C)。さらに、活性化細胞による局部的コラーゲン分解を、96ウェルプレートで希薄な培養物としてのWI38細胞により蛍光コラーゲン繊維から放出される蛍光ペプチドを分光蛍光分析を用いて計数することにより定量した(図13E)。希薄な培養物における細胞は「移動の接触阻害」が少ないことから移動性であることが知られている(Chen, W-T, 1979, J. Cell Biol 81:684-691)。移動性WI38細胞は4日以内では時間依存性コラーゲン分解を示した。さらに、mAb E19(DPPIVに対する)は移動性細胞によるコラーゲン分解を阻止したが、一方対照mAb C37(抗gp-90)は阻止しなかった(図13E)。これらのデータからコラーゲンゲルでの細胞移動および創傷により活性化された繊維芽細胞によるコラーゲン分解におけるセプラーゼ-DPPIV複合体の役割が示される。
【０１３０】  DPPIVはコラーゲン(Bauvois B, 1988, Biochem. J. 252:723-731; Hanski C, 1988, Exp. Cell Res. 178:64-72; Loster K., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 217:341-348)またはフィブロネクチン(Cheng, HC 1998, J. Biol. Chem. 272:24207-24215; Johnson RC ら, 1993, J. Cell Biol 121:1423-1432; Piazza, GA ら, 1989, Biochem J.: 262:327-334)に対する接着受容体であることが示されていたので、mAb E19(DPPIVに対する)のコラーゲンゲルでの細胞移動および移動性細胞によるコラーゲン分解への阻止効果が、接着活性へのその影響によるものであるか否かを検討した。図14は、コラーゲン繊維へのインテグリン接着と平行した比較により、mAb E19(DPPIVに対する)はコラーゲンゲルでの細胞移動および移動性細胞によるコラーゲン分解を阻止するが、一方コラーゲン基層上でのWI38細胞の拡散(図14A)およびコラーゲン基層への接着(図14B)には作用しないことを示している。しかしながら、mAb C27(β1インテグリンに対する)はコラーゲン基層上でのWI38細胞の拡散およびコラーゲン基層への接着を阻止するが、mAb E19(DPPIVに対する)またはmAb C37(抗gp-90)は阻止しない(図14Aおよび14B)。これらのことから、β1インテグリンがセプラーゼ-DPPIV複合体の基体結合に関与するWI38細胞における主要なコラーゲン受容体でありうることが示される。
【０１３１】  セプラーゼおよびDPPIVが移動性細胞の浸潤先端で会合することを立証するため、二重標識免疫蛍光実験を行った(図15)。コラーゲンゲルにおいて移動する細胞の浸潤先端(a)がセプラーゼに対するTRITC-mAb D28(b)またはDPPIVに対するFITC-mAb E26(c)で陽性染色されることが認められた。スーパーインポーズ画像でもセプラーゼおよびDPPIVがコラーゲンゲルにおいて移動するWI38繊維芽細胞の浸潤先端に共局在化していることが示される(d)。
【０１３２】  かかるセプラーゼおよびDPPIVの共局在化が見出されうるか否かを調べるため、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋したヒト乳癌組織の連続切片(図16および18)でin vivo免疫組織化学実験を行った。浸潤最前部の腫瘍細胞と同様に、ヒト浸潤性乳癌の結合組織細胞はセプラーゼに対するmAb D28またはDPPIVに対するmAb E26と強く反応を示した(図16、矢印)。しかし、離れた正常組織の結合組織細胞ではかかるセプラーゼおよびDPPIV染色は検出されなかった(図18)。セプラーゼ-DPPIV発現は癌浸潤に応答した結合組織細胞の活性化と関係があり、さらにセプラーゼおよびDPPIVがこれらの活性化組織細胞、ならびに浸潤性癌細胞において共局在化すると考えられる。
【０１３３】  培養下のヒト臍帯平滑筋細胞とは異なり(Goldstein LA ら, 1997, Biochim. Biophys. Acta. 1361:11-19)、セプラーゼおよびDPPIVの双方は、間葉細胞の間に優先的に分布するが、胎盤および臍帯を含むヒト胚組織の分化した筋細胞および大きい血管の内皮細胞には分布しない。間質繊維芽細胞でのセプラーゼおよびDPPIV発現がin vivoで創傷閉鎖中に誘導されるか否かを調べるため、ヒト歯肉粘膜-創傷閉鎖の免疫組織化学を検討した(図17)。創傷後3日目にセプラーゼおよびDPPIVの強い発現が結合組織細胞で見られた(b〜d、g)。隣接する正常粘膜組織では免疫反応が全く見られなかった。フィブリン凝塊領域および上皮組織では特異的反応が全く見られなかった。共焦点顕微鏡により、in vivoでの浸潤先端の存在を示す結合組織細胞の突出部にセプラーゼ(d)およびDPPIVが局在化していることが示される。その後、創傷後7日目では、肉芽組織の中央にあるほんの数個の細胞だけが抗セプラーゼ抗体(f)と反応性であった。しかし、抗DPPIV抗体(h)と反応性ではなかった。1週間後、結合組織細胞からセプラーゼおよびDPPIV染色が消失し、さらに、14または28日経過した創傷細胞は抗体とも反応しなかった。このデータから、セプラーゼおよびDPPIVが繊維芽細胞、内皮細胞および癌細胞における活性化酵素であり、それらが細胞移動に必要な局部的なコラーゲン分解に関係していることが示される。
【０１３４】  細胞トランスフェクション実験を用いてセプラーゼおよびDPPIVの細胞表面会合を調べた。セプラーゼ-DPPIV複合体を構成的に発現するMDA-MB-436乳癌細胞を使用した。セプラーゼを過剰発現するかまたはDPPIVもしくはセプラーゼ産生に欠陥のある細胞をそれらのコラーゲン分解およびコラーゲンゲルでの移動性活性について調べた(図19)。親またはベクタートランスフェクト細胞(図19A; 親、pAll)と比べ、セプラーゼをコードするプラスミドpA15でトランスフェクトしたMDA-MB-436 細胞ではTRITC-コラーゲンペプチド放出の増大が観察され(図19A、pA15)、DPPIV特異的リボザイムをコードする構築物でトランスフェクトした細胞ではペプチド放出の減少が認められた(図19A、pZ8)。また、セプラーゼの過剰発現がDPPIVのわずかな減少と関係しているとも考えられる。またDPPIVリボザイムでトランスフェクトした細胞は検出可能なDPPIVを産生せず、実質的にセプラーゼが減少した(図19B)。
【０１３５】  本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態による範囲に限定されるものではなく、これらの特定の実施形態は本発明の各々の態様を単に例示するものであり、さらに機能的に同等の方法および構成要素が本発明の範囲内にある。実際には、本明細書で示しかつ説明したものに加えて、本発明の種々の変形は当業者ならば上述の説明および添付の図面から明らかとなるだろう。かかる変形は添付の特許請求の範囲内に入るものと意図される。本明細書では種々の刊行物を引用しているが、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  細胞接着マトリックスの組成および調製を示す。
【図２】  細胞接着マトリックスに基づく細胞分離およびアッセイ系の診断的および治療的用途を示す。
【図３】  患者および対照由来の血液サンプルの癌細胞分離解析を示す。
【図４】  細胞接着マトリックスに接着した循環細胞を示す。
【図５】  I型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスに接着した循環細胞を示す。
【図６】  循環癌細胞の浸潤表現型の形態学的基準を示す。
【図７】  細胞分離法により単離された対照血液サンプル由来の細胞を示す。
【図８】  蛍光標識コラーゲンを用いた細胞浸潤表現型の細胞分離およびアッセイ系、および上皮マーカーに対する抗体を用いた循環癌細胞の免疫細胞化学を示す。
【図９】  循環癌細胞の脈管形成性。頭部頸部扁平上皮細胞癌(HN、A-C; I-J)、大腸癌(CC、D-F)および前立腺癌(PC、G-H)患者の血液から細胞を誘導した。細胞をコラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、1〜11日間(d1またはd11と記載)培養した。
【図１０】  培養下での循環癌細胞の免疫癌死滅および増殖。コラーゲンマトリックスを用いて大腸癌(CC、A-E)、前立腺癌(PC、F-I)、または膀胱癌(BLC、J-L)患者の血液から細胞を単離し、10〜20%のヒト血漿を含有する培地で培養した。
【図１１】  セプラーゼおよびDPPIVについてのゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび免疫ブロットを示す。
【図１２】  WI38ヒト胚性肺繊維芽細胞由来のセプラーゼ-DPPIV複合体の特徴づけを示す。
【図１３】  コラーゲンゲルにおける細胞移動および創傷により活性化されたWI38繊維芽細胞によるコラーゲン分解を示す。
【図１４】  コラーゲン基層上でのWI38細胞の接着および広がりは、主として、β1インテグリンを媒介としており、DPPIVによる媒介は見られないことを示す。
【図１５】  コラーゲンゲルを移動するWI38細胞の浸潤先端におけるセプラーゼおよびDPPIVの共局在を示す。
【図１６】  パラフィン包埋した腫瘍組織の連続切片の免疫組織化学により示される、ヒト悪性乳癌の結合組織細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの分布を示す。
【図１７】  治癒中のヒト歯肉創傷部の粘膜細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの分布を示す。
【図１８】  ヒト悪性乳腺管癌の浸潤最前部にある微細血管内皮細胞、繊維芽細胞、および癌細胞におけるセプラーゼおよびDPPIVの共局在を示す。
【図１９】  MDA-MB-436細胞のプロテアーゼ発現とコラーゲン分解能との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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