(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーキシンを有効成分とする、雄性不稔を生じたムギ類植物用稔性回復剤。
【請求項２】
稔性回復剤中のオーキシン濃度が10-4M〜10-6Mである、請求項１記載の稔性回復剤。
【請求項３】
遅くとも幼穂期における第５葉展開日またはその前までの間に少なくとも１回ムギ類植物へ散布または塗布するための、請求項１または２記載の稔性回復剤。
【請求項４】
第５葉展開日から連続して夜間気温が25℃以上である日が３日以上続くことが予測される際に、第５葉展開日の１日前までに少なくとも１回ムギ類植物へ散布または塗布するための、請求項１または２記載の稔性回復剤。
【請求項５】
第５葉展開日から５日後までの間に少なくとも１回ムギ類植物へ散布または塗布するための、請求項１または２記載の稔性回復剤。
【請求項６】
散布がムギ類植物の葉および茎の地上部全体へ均一に散布する、または幼穂、または幼穂が位置する葉柄若しくは茎に散布することである、請求項３〜５のいずれか１項記載の稔性回復剤。
【請求項７】
塗布がムギ類植物の幼穂、または幼穂が位置する葉柄若しくは茎に塗布することである、請求項３〜５のいずれか１項記載の稔性回復剤。
【請求項８】
オーキシンが、3-インドール酢酸（IAA）、4-クロロインドール酢酸、フェニル酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、α-ナフタレン酢酸（NAA） 、2,6-ジクロロ安息香酸、インドール酪酸（IBA）、4-クロロフェノキシ酢酸、5-クロロインタゾール酢酸エチル、ナフトキシ酢酸または2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸である、請求項１〜６のいずれか１項記載の稔性回復剤。
【請求項９】
ムギ類植物が、オオムギ属、コムギ属、ライムギ属またはカラスムギ属植物である、請求項１〜８のいずれか１項記載の稔性回復剤。
【請求項１０】
10-4M〜10-6Mの濃度のオーキシンを含む溶液をムギ類植物へ散布または塗布することを含む、雄性不稔を生じたムギ類植物の雄性不稔を回復させる方法。
【請求項１１】
遅くとも幼穂期における第５葉展開日またはその前までの間に少なくとも１回オーキシンを含む溶液を散布または塗布する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第５葉展開日から連続して夜間気温が25℃以上である日が３日以上続くことが予測される際に、第５葉展開日の１日前までに少なくとも１回オーキシンを含む溶液を散布または塗布する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
第５葉展開日から５日後までの間に少なくとも１回オーキシンを含む溶液を散布または、塗布する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
散布がムギ類植物の葉および茎の地上部全体へ均一に散布する、または幼穂、または幼穂が位置する葉柄若しくは茎に散布することである、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
塗布がムギ類植物の幼穂、または幼穂が位置する葉柄若しくは茎に塗布することである、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
オーキシンが、3-インドール酢酸（IAA）、4-クロロインドール酢酸、フェニル酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、α-ナフタレン酢酸（NAA） 、2,6-ジクロロ安息香酸、インドール酪酸（IBA）、4-クロロフェノキシ酢酸、5-クロロインタゾール酢酸エチル、ナフトキシ酢酸または2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸である、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ムギ類植物が、オオムギ属、コムギ属、ライムギ属またはカラスムギ属植物である、請求項１０〜１４のいずれか１項項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雄性不稔を生じた植物、例えばイネ科植物、特にムギ類植物の不稔性を回復する方法およびムギ類の不稔性を回復させる組成物に関する。特に、本発明は、高温または低温ストレスによって雄性不稔を生じた植物、例えばイネ科植物、特にムギ類植物の不稔性を回復する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネ科植物のコムギやオオムギなどのムギ類では、地球規模での温暖化や異常気象による気温上昇で花粉形成過程に不全が生じ、世界的な穀物生産量の減少につながっている。また、イネにおいては東北地方の冷害に知られるように、約10年に１度の頻度で生じるといわれている「やませ」による異常低温は花粉形成過程に不全を生じさせ収穫を大幅に低下させる。
東北地方におけるイネの低温障害（冷害）は、穂ばらみ期（花粉母細胞の減数分裂直後）に、最高気温が20℃に満たない低温ストレスに数日間曝されると、葯壁タペート細胞の肥大が生じ、花粉形成が阻害される。葯壁タペート細胞は、花粉に影響を供給し、最終的には細胞死により崩壊するべく運命決定された細胞である。
一方、コムギやオオムギなどのムギ類植物は、イネとは逆に、高温ストレスに対して感受性が高く、昼30℃夜25℃（特に夜間25℃以上の条件では）の高温条件では、葯壁細胞ならびに花粉母細胞の細胞分裂の停止が生じ、この高温条件が４日間以上継続すると、もはや完全に回復不能な状況に陥り、葯壁タペート細胞の早期崩壊が生じる。その結果、正常な花粉が形成できず花粉不稔を生じ（雄性不稔）、最終的に種子稔性の低下につながる。これら細胞分裂の停止や早期崩壊は、葯においてのみ観察されるものであり、雌蕊や葉、茎などの生育には影響なく、雄性の花粉形成においてのみ観察される（Sakataら、Journal of Plant Research (2000) 113，395-402、Abikoら、Sexual Plant Reproduction (2005) 18，91-100）。この高温障害時には、大規模な遺伝子発現の変化が生じていることが、DNAマイクロアレイによる網羅的な発現解析により明らかになった。なかでもオーキシンによりその遺伝子発現が抑制される遺伝子であるオーキシン・リプレスド・プロティン遺伝子（auxin repressed protein genes）の発現が幼穂の高温障害時に誘導される（Oshinoら、Molecular Genetics and Genomics (2007) 278，31-42）。すなわち、植物ホルモンの１つで、細胞の分裂や成長、発生分化に重要な役割を担うオーキシンが、高温条件下では葯特異的に発現が低下する可能性が考察された。特に、５葉期開始時前述のような高温環境に置かれるとタペート細胞並びに花粉母細胞の発生および分化が止まり、その後形成される葯中には花粉が形成されないことが知られている（Oshinoら、Molecular Genetics and Genomics (2007) 278，31-42）。
これらの問題を解決するためには、高温や低温ストレスにより耐性を示す品種が従来の育種や遺伝子組換え技術による組換体の作出などによって開発が続けられている。【０００３】
オーキシンは主に植物の生長を促進する植物ホルモンの総称であり、天然オーキシンおよび合成オーキシンが知られている。天然オーキシンとしては3-インドール酢酸（IAA）やインドール酪酸（IBA）が知られており、合成オーキシンとして，4-クロロインドール酢酸、フェニル酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、α-ナフタレン酢酸（NAA） 、2,6-ジクロロ安息香酸、インドール酪酸（IBA）、4-クロロフェノキシ酢酸、5-クロロインタゾール酢酸エチル、ナフトキシ酢酸および2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸などが知られている。これらのオーキシンは生長調節剤として利用されており、実験室環境下では組織培養等に使用され、圃場では2,4-D等が除草剤として利用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tadashi  Sakaraら、Journal of Plant Research (2000) 113， 395-402
【非特許文献２】Mafumi Abikoら、Sexual Plant Reproduction (2005) 18，91-100
【非特許文献３】Takeshi Oshinoら、Molecular Genetics and Genomics (2007) 278，31-42
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
イネ科植物の雄性不稔、特に高温または低温ストレスによる雄性不稔を回復させるための方法、およびイネ科植物の雄性不稔、特に高温または低温ストレスによる雄性不稔を回復させるための組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、オーキシンを有効成分とする、雄性不稔を生じたイネ科植物、特にムギ類植物用の稔性回復剤、および、オーキシンを植物に散布することを含む、雄性不稔を生じたイネ科植物、特に、ムギ類植物の稔性回復方法である。
より具体的には、本発明は以下の通りである。
（１）オーキシン濃度が10-4 M〜10-7 M（M:モル濃度）となるようにイネ科植物へ散布するための、雄性不稔を生じたイネ科植物用稔性回復剤。
（２）遅くとも幼穂期における第５葉展開日またはその前までの間に少なくとも１回散布するための、（１）記載の稔性回復剤。
（３）第５葉展開日から連続して夜間気温が25℃以上である日が３日以上続くことが予測される際に、第５葉展開日の１日前までに少なくとも１回散布するための、（１）記載の稔性回復剤。
（４）第５葉展開日から５日後までの間に少なくとも１回散布するための、（１）記載の稔性回復剤。
（５）オーキシンが、3-インドール酢酸（IAA）、4-クロロインドール酢酸、フェニル酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、α-ナフタレン酢酸（NAA） 、2,6-ジクロロ安息香酸、インドール酪酸（IBA）、4-クロロフェノキシ酢酸、5-クロロインタゾール酢酸エチル、ナフトキシ酢酸または2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸である、（１）〜（４）のいずれかに記載の稔性回復剤。
（６）オーキシン濃度が10-4 M〜10-6 Mとなるようにムギ類へ散布することを含む、雄性不稔を生じたイネ科植物の雄性不稔を回復させる方法。
（７）遅くとも幼穂期における第５葉展開日またはその前までの間に少なくとも１回オーキシンを散布する、（６）記載の方法。
（８）第５葉展開日から連続して夜間気温が25℃以上である日が３日以上続くことが予測される際に、第５葉展開日の１日前までに少なくとも１回オーキシンを散布する、（６）記載の方法。
（９）第５葉展開日から５日後までの間に少なくとも１回オーキシンを散布するための、（６）記載の方法。
（１０）オーキシンが、3-インドール酢酸（IAA）、4-クロロインドール酢酸、フェニル酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、α-ナフタレン酢酸（NAA） 、2,6-ジクロロ安息香酸、インドール酪酸（IBA）、4-クロロフェノキシ酢酸、5-クロロインタゾール酢酸エチル、ナフトキシ酢酸または2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸である、（６）〜（９）のいずれかに記載の方法。
本発明において、イネ科植物にはイネ、ムギ類植物が含まれる。ムギ類植物には、オオムギ属、コムギ属、ライギ属およびカラスムギ属植物が含まれる。【０００７】
また、本発明は、オーキシンの作用を阻害する物質を有効成分とする、雄性不稔を生じたイネ用の稔性回復剤、および、オーキシンの作用を阻害する物質を有効成分とする、雄性不稔を生じたイネの稔性を回復させる方法でもある。オーキシンの作用を阻害する物質としては、アミノオキシ酢酸（AOA）、L-α-(2-アミノエトキシビニル)グリシン（AVG）、p-クロロフェノキシイソ酪酸(PCIB)、トリヨード酢酸（TIBA）およびナフチルサラミック酸（NPA）が含まれる。
本明細書において雄性不稔の「稔性回復」とは、植物において花粉形成過程の不全を抑制し、正常な花粉を形成する能力を回復させることをいう。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、高温や低温によって雄性不稔となったイネ科植物、特にムギ類植物およびイネの稔性を簡便に回復させることができる。本方法により、高温障害による壊滅的な雄性不稔（花粉形成不全）による種子生産の被害をオーキシン水溶液の適切な散布により完全に回避できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、シロイヌナズナにおけるオーキシン応答性融合遺伝子DR5-GUSの、適温栽培条件下の花の発生過程における発現を示す。発現は葯の発生時期に最も強く見られた。
【図２】図２はシロイヌナズナにおけるオーキシン応答性融合遺伝子DR5-GUSの高温による発現変動を示す。時間経過に伴って、葯においては顕著なGUS活性の低下と雌蘂や花弁におけるGUS活性誘導が観察される。（A）対照（適温栽培）、（B）高温処理第１日、（C）高温処理第５日、（D）高温処理第７日
【図３】図３は、オオムギの生殖生長過程に見られる幼穂の発達を示す。（A）：高温処理時期を示す。（B）: 幼穂の発達時期を示す。第５葉展開期に雄蕊の初生突起(sp)および初生突起（pp）が見られる。この時期に高温障害が最も生じやすい。
【図４】図４は、オオムギの雄蕊発生過程にみられる高温障害を表す。高温処理は幼穂が２〜３mmになった第５葉展開期から幼穂が10mm程度になるまで行った。（A）高温処理の時期と幼穂の長さの対応を示す。（B）対照区および高温処理区（雄性不稔を生じる）における花粉母細胞の減数分裂およびタペート細胞の崩壊を示す。C10、C15、C20はそれぞれ対照区の幼穂長10mm、15mm、20mmの時期における雄蕊顕微鏡写真である。H10、H15およびH20はそれぞれ高温実験区の幼穂長10mm、15mm、20mmの時期における雄蕊顕微鏡写真である。
【図５】図５は、オオムギ第５葉展開期から開始して昼３０℃夜２５℃の高温に５日間曝し、その後は通常の昼２０℃夜１５℃に戻して生育を続けた場合に観察される未発達な葯と完全な花粉形成不全を示す。（A）対照個体（適温栽培）における出穂期の雄蕊および雌蘂並びに葯内における花粉を示す。（B）高温処理個体における出穂期の異常な雄蕊および雌蘂並びに葯内における花粉粒形成の欠如を示す。
【図６】図６は、DNAマイクロアレイ22K Barley1 GeneChip （Affymetrix社製）上のContig 7516_atのauxin-repressed protein geneの各幼穂長における遺伝子発現レベルの相対比をリアルタイムRT-PCR法により定量化した結果を示す。縦軸はauxin-repressed protein geneの相対的発現量、横軸は幼穂長を表す。白抜きバーは対照区（適温栽培）、黒いバーは高温処理区を示す。「芽生え」は播種後５日目の個体を用いて、５日間、同様の高温処理した地上部における同遺伝子の高温処理による発現変動を示す。
【図７】図７は、オオムギ第５葉展開期の高温処理時期を表す。各濃度のオーキシン水溶液をポット１つ（４個体）につき25ml植物体に散布した。散布は播種後18日、19日、21日および23日目に行った。
【図８】図８は、オーキシン水溶液の散布による出穂期の葯長の回復を示す。点線は対照区（適温栽培）、実線は高温処理区を表す。
【図９】図９は、オーキシン水溶液の散布による出穂期の雄蕊と雌蕊の形態と花粉稔性の回復の例を示す。（A）対照区（適温栽培）の個体、（B）高温処理区の個体、（C）高温処理および各濃度のオーキシンを散布した実験区の個体。
【図１０】オーキシン散布による種子稔性の回復例を示した。対照区（適温栽培）および高温処理区の個体につきそれぞれ10-4Mのオーキシン（NAA）散布を散布した。左の２つの写真はオーキシンによる高温処理区個体の種子稔性の回復を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明を適用するために適した植物は高温または低温ストレスによりオーキシンレベルが大きく変化し、オーキシンレベルが結果花粉形成過程に大きく影響する植物である。そのような植物には、イネ科植物、特に、オオムギ属植物（オオムギ等）、コムギ属植物（パンコムギ、デュランコムギ、クラブコムギ、スペルトコムギ、エンマコムギ等）ライムギ属植物（ライムギ等）およびカラスムギ属植物（エンバク、オーツムギ、カラスムギ等）を含むムギ類植物並びにイネが含まれる。
一般にムギ類植物を含む単子葉植物および双子葉植物において、葯の初期発生過程では高いオーキシン活性がみられるが、高温により顕著にその活性が低下することが明らかになった。その結果、高温によるオーキシンの欠乏が生じ、花粉母細胞ならびに葯壁細胞の細胞分裂の停止と早期崩壊が生じ、最終的に花粉不稔、種子稔性の低下に至ると考えられる。一方、イネの低温障害は、通常の葯の成熟に伴って低下すべきオーキシンシグナルが、低温により低下しなくなり、その結果葯壁タペート細胞の崩壊が阻害され、雄性不稔を生じると考えられる。
従って、コムギやオオムギなどのムギ類植物の葯の発生分化過程において高温ストレスが生じた際には、オーキシン作用を有する物質を人為的に散布することで、高温ストレスにより想定される葯特異的なオーキシンの欠乏を補い、正常に花粉母細胞ならびに葯壁細胞の細胞分裂、発生分化を進行させることにより、雄性不稔を生じたムギ類植物の稔性を回復させることができる。
一方、イネの葯の発生分化過程で低温ストレスにさらされた場合には、オーキシン作用を阻害する物質をイネに与えることにより、低温ストレスにより想定される葯特異的なオーキシン作用の過剰を補い、正常に葯壁細胞の崩壊を進行させる、その結果雄性不稔から回復させることができる。
【００１１】
本明細書によって、天然オーキシンである3-インドール酢酸と同様な作用を有する物質を総称して「オーキシン」、または「オーキシン作用を有する物質」と称する。本発明において使用するオーキシンは天然オーキシンであっても合成オーキシンであっても良い。本明細書において、天然オーキシンには3-インドール酢酸（IAA）が含まれ、合成オーキシンには4-クロロインドール酢酸、フェニル酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、α-ナフタレン酢酸（NAA）、2,6-ジクロロ安息香酸、インドール酪酸（IBA）、4-クロロフェノキシ酢酸、5-クロロインタゾール酢酸エチル、ナフトキシ酢酸および2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸が含まれる。本発明において使用し得るオーキシンには特に制限はなく、全ての天然および合成オーキシンが使用可能である。植物へ散布したオーキシンの微量残留の影響が懸念される場合は、安価ではあるが安定で分解しにくい人工オーキシン2,4-Dよりも、分解がよりはやい天然IAAの利用が安全性ならびに消費者からの受入れ評価の観点からより好ましい。
また本発明において使用するオーキシン作用を阻害する物質には、アミノオキシ酢酸（AOA）、L-α-(2-アミノエトキシビニル)グリシン（AVG）、p-クロロフェノキシイソ酪酸(PCIB)、トリヨード酢酸（TIBA）およびナフチルサラミック酸（NPA）が含まれる。
【００１２】
本発明が利用できる植物は高温または低温によって雄性不稔となりやすい植物、特に高温ストレスによって雄性不稔を生じ得る植物である。そのような植物には、イネ科植物、特にムギ類植物の他、イネ科トウモロコシ属（例えばトウモロコシ）、ナス科ナス属（例えばトマト、ナス、トウガラシ、ピーマンおよびパプリカ）、マメ科ササゲ属（例えばアズキおよびササゲ）、アブラナ科アブラナ属（例えばナタネ）の植物が含まれる。本発明によって雄性不稔を回復させるために特に適した植物はイネ科植物である。イネ科植物には、イネ、ムギ類植物が含まれる。ムギ類植物には、オオムギ属、コムギ属、ライムギ属およびカラスムギ属植物が含まれる。オオムギ属植物にはオオムギが含まれ、コムギ属植物にはパンコムギ、デュランコムギ、クラブコムギ、スペルトコムギおよびエンマコムギが含まれ、ライムギ属植物にはライムギが含まれ、カラスムギ属植物にはエンバク、オーツムギおよびカラスムギが含まれる。
【００１３】
ムギ類植物にオーキシンまたはオーキシン作用を阻害する物質を与える方法としては、これらの水溶液または、植物体への有害性の低い溶媒を用いたこれらの溶液の植物体への散布、例えば葉および茎の地上部全体またはそれらの一部への散布が好ましい。散布はスプレー（噴霧）によるのが好ましい。また、幼穂が位置する葉柄または茎の部分にオーキシンを塗布することもできる。オオムギやイネの場合は、オーキシンを散布するために適切な時期には幼穂が出穂していないので直接幼穂に散布することができないが、適切な時期に幼穂が露出している場合はその幼穂に直接オーキシンを散布または塗布することも出来る。さらに、特に双子葉植物の場合、外部に露出している花序や花芽に直接オーキシンを散布または塗布することも出来る。
本発明によりイネ科植物、特にムギ類の稔性を回復させる目的でオーキシンを与える場合は、オーキシンの濃度は10-4 M〜10-8 Mが好ましく、10-4 M〜10-7 Mがより好ましく、10-5 M〜10-6 Mが特に好ましい。特にムギ類以外単子葉植物の場合は10-4 M〜10-7 Mがより好ましく、10-5 M〜10-6 Mが特に好ましい。双子葉植物は一般にオーキシンへの感受性が単子葉植物よりも高いので、10-5 M〜10-8 Mがより好ましく、10-6 M〜10-7 Mが特に好ましい。散布するオーキシン濃度が高すぎる場合は、オーキシン誘導性のエチレン合成が植物体内で生じ、その作用として老化や成長阻害につながる可能性がある。従って、散布するオーキシン濃度が比較的高い場合は、この誘導性エチレン合成の阻害効果を示すアミノオキシ酢酸（AOA）またはL-α-(2-アミノエトキシビニル)グリシン（AVG）を加えることもできる。これによりオーキシン誘導性のエチレン合成による副作用を軽減することができる。
場合により、本発明の稔性回復剤の植物体への展着性を向上させるため本発明の稔性回復剤に界面活性剤を添加することもできる。または本発明によりイネ科植物へオーキシンを与える場合にも必要により界面活性剤，例えばTween20を添加することもできる。界面活性剤の濃度は約0.1％(v/v)が好ましい。
【００１４】
本発明に従ってイネ科植物にオーキシンを与える場合、オーキシンレベルが花粉形成に影響を与え得る時期に行うのが好ましい。オーキシンを与える好ましい時期は、一般には雄蕊の分化開始時期あるいは茎頂が幼穂に分化を始めた時期（第４葉展開期あたり）から花粉母細胞の減数分裂終了（第６葉展開期あたり）と小胞子期に至るまでの間である。より正確には、例えば各植物種または植物品種についてオーキシン応答性の転写活性化配列DR5にβ-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）を融合させた組換え植物を作製し、その組換え植物の雄蕊、特に葯におけるGUS活性の経時変化を調べることによってオーキシンを与える好ましい時期を明らかにすることができる。葯におけるGUS活性が有意に上昇または減少する時期が、オーキシンを与えるべき適切な時期であろう。雄蕊の分化開始時期が知られていない植物についても前述のようにしてオーキシンを与える好ましい時期を決めることができる。組換え植物体の作製は各植物種について公知の方法に従って行うことができる。また、抗オーキシン抗体を用いて、葯内のオーキシンレベルを組織学的ならびに生化学的に直接、測定することも可能である。各植物種または植物品種について最適なオーキシン濃度も同様にして調べることができる。
【００１５】
より具体的には、たとえばオオムギやコムギ等のムギ類植物の場合、幼穂期における第５葉展開日またはその前までの間に少なくとも本発明の稔性回復剤または本発明に従ってオーキシンを１回与えることが好ましい。特に、日中の気温よりも夜間の気温の高さがムギ類植物における花粉不稔性を生じやすい。従って、第５葉展開日から連続して夜間気温が25℃以上である日が３日以上続くことが予測される際に、第５葉展開の１日前までに少なくとも１回本発明の稔性回復剤または本発明に従ってオーキシンを与えることが特に好ましい。さらに、第５葉展開日から５日後までの間に少なくとも１回本発明の稔性回復剤または本発明に従ってオーキシンを与えることが好ましく、例えば、第５葉展開日またはその前までに少なくとも1回、さらに５日後までの間にイネ科植物に数回与えることが好ましいが、生分解性のはやいオーキシン（例えばIAA）を使用する場合は連日の散布してもよい。また、温度ならびに濃度に対する適応範囲は個別の植物種でそれぞれ異なるので、それぞれの植物種または植物品種が栽培されている条件下において高温障害の発生が予想される場合に、前述のように各植物種または植物品種について予め決定した最適濃度で利用することが好ましい。
イネの低温障害では、穂ばらみ期（花粉母細胞の減数分裂直後）に、最高気温が20℃に満たない低温ストレスに数日間曝されることにより生じるもので、従って、花粉母細胞の減数分裂直後の時期に低温が予想される場合、オーキシン活性を阻害する物質の散布が有効である。また、処理濃度はそれぞれの物質を用いた既知の生理学的影響を及ぼす範囲内での使用方法に準ずる。
【実施例１】
【００１６】
１．葯特異的および発生特異的なオーキシン発現
モデル植物の１つであるシロイヌナズナを用いて葯特異的および発生時期特異的なオーキシン発現および高温条件下における葯特異的なオーキシン低下を解析した。
実験にはオーキシン応答性の転写活性化配列DR5にβ-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）を融合させた融合遺伝子を組み込んだシロイヌナズナは組換え体（Plant Cell 9，1963-1971,1997）を使用した。この株はオーキシンに応答して融合遺伝子DR5-β-グルクロニダーゼを発現する。なお本株はTom Guilfoyle氏（University of Missouri, Columbia）から入手した。
DR5-GUS系統のシロイヌナズナを直径８センチのポットに約10-20粒播種して、23℃のインキュベーターで育成すると約4週間で花芽の形成が開始した。この花芽をサンプリングして、アセトン処理後に、β-グルクロニダーゼの基質であるX-Glucを2mMの濃度で作用させ、β-グルクロニダーゼ(Gus)を発現している細胞を検出した。23℃の条件下では、花粉の減数分裂期前後から小胞子期までの期間において、葯壁タペート細胞と花粉母細胞に強いGUSの発現（青緑色に染色）が観察された（図１）。その後、葯壁タペート細胞の崩壊の時期から花粉形成が進行するに従ってGUS発現は低下し、成熟花粉においては完全に消失した（図１）。すなわち、葯におけるオーキシンレベルは、葯の発生時期に最も強く、葯壁タペート細胞が消失して花粉が成熟する過程で徐々に低下するという、発生時期特異的にダイナミックな変化をすることが示された。【００１７】
23℃で生育した花芽を持つ植物体を、高温処理として31℃のインキュベーターに移してGUS発現を経時的に行った。高温処理後1日後の花芽では、葯壁タペート細胞と花粉母細胞のシグナルが顕著に弱くなった（図２-B）。高温処理5日間、7日間行うと、葯のGUSのシグナルは完全に消失した（図２-C、図２-D）。そして、これらの結果、花粉形成不全による雄性不稔が、オオムギと同様に生じた。
一方で、雌蕊や花弁などの他の組織においてはGUSの発現シグナルが、高温で増加することが確認された（図２）。これまで、芽生えなど栄養成長組織においては、高温はオーキシンの発現シグナルを増加させることが報告されており、雌蕊や花弁での発現増加はこの点で一致するが、雄蕊の葯の発生分化過程においては高温が全く逆な影響を及ぼすことは、高温障害が雄蕊により顕著に生じ易い原因であろうと思われる。【００１８】
２．オオムギにおける高温ストレスによる雄性不稔
実験に使用したオオムギは、二条オオムギの栽培品種であるはるな二条(Hordeum vulagare L.cv Haruna-nijo)である。暗黒下4℃で保存した種子を25℃暗黒下で48時間、催芽し、発芽した種子を園芸用育苗培土（全農クレハ培土：窒素  0.4,リン酸  1.9,カリ  0.6,クド  0.2g kg-1）を1リットル詰めた直径11cmの円形ポッドに円形に10粒播種した。それらを人工気象器（株式会社日本医科器械製作所BIOTRON LH300RDS）で、昼温20℃、夜温15℃、日長16時間の条件で育成させた。光源として、20本の植物育成用蛍光灯（16本；National FL40S FR-P、4本；National FL20S FR-P）を用いた。播種当日を0日目とし、第５葉が出現する播種後18〜19日目から、昼温30℃、夜温25℃、日長16時間の高温条件で育成し、5日間（120時間）の高温処理を行った。5日経過した播種後23〜24日目に昼温20℃、夜温15℃の栽培条件に戻し、高温処理を停止させ、その後の出穂、種子の登熟まで栽培を継続させた。  【００１９】
オオムギにおいては、第５葉が展開する時期に幼穂長が２〜３mmになり、各穎花では雄蕊ならびに雌蕊の初生突起が発生分化し、その後、生殖成長が連続的に進行する（図３、４）。この第５葉展開から５日間で幼穂は10mm程度に達し、タペート細胞を含む４層からなる葯壁細胞は完成し、花粉母細胞の減数分裂への移行がはじまる。その後、15mmの幼穂長において花粉母細胞は減数分裂を開始して、20mmの幼穂長において花粉小胞子が形成されるとともに葯壁タペート細胞の崩壊が進行する。上記の10mm程度から20mmの幼穂に達するのに、５日間を要する。
一方で、第５葉が展開する時期から５日間の高温処理区においては、幼穂長の伸長は対照区と比べ同等もしくはより促進される傾向にあるが、葯壁細胞ならびに花粉母細胞では、細胞分裂が早期停止し、さらに10mmの幼穂長において、花粉母細胞は未成熟な状況での減数分裂が開始されるが、最終的には花粉小胞子も退化する（図４）。
この高温条件下では雌蕊を含むその他の組織や器官における発生分化の異常は生じず、その結果、開花期には花粉を全く持たない葯が形成されるが、雌蕊は稔性を有しており完全な雄性不稔（花粉不全）が生じる（図５）。
これらの幼穂において、遺伝子オーキシン・リプレスド・プロティン遺伝子（auxin repressed protein genes）の発現が、高温条件下で対照区と比較して有意に発現上昇していることが観察された（図６）。すなわち、シロイヌナズナと同様、高温条件下ではオオムギにおいてもオーキシンが低下することが強く示唆された。【００２０】
３．高温ストレスによる雄性不稔のオーキシン処理による回復
オーキシンの効果を確認する実験では、上記の園芸用育苗培土を用いる他に、オーキシン水溶液の処理の制御がし易いように、２つの角型プラントボックス（60mm×60mm×100mm（タテ×ヨコ×高さ）、AGCテクノグラス株式会社  プラントボックス(型番CUL-JAR300)）を上下二段に重ねて、上段側の底部中央には直径1cmほどの穴をあけ、結び目を作った長さ6cmのアルコールランプの芯を通し、その上にバーミキュライト（ニッタイ株式会社  農園芸用バーミキュライト）を300ml詰めた。下段のボックスにはHYPONEX 0.2%(v/v)（株式会社ハイポネックスジャパン）を入れ、植物の養水源とした。暗黒下4℃で保存した種子を25℃にて暗黒下で48時間、催芽したオオムギはるな二条を１ポットあたり４粒、上段容器の４隅に播種した。それらを人工気象器（株式会社日本医科器械製作所BIOTRON LH300RDS）で、昼温20℃、夜温15℃、日長16時間の条件で育成させた。光源として、20本の植物育成用蛍光灯（16本；National FL40S FR-P、4本；National FL20S FR-P）を用いた。
この栽培法においても、培養土を用いた場合と同様に、播種当日を0日目と数えると、第5葉が出現し展開を開始するのは播種後18〜19日目となる。播種後19日目から昼温30℃、夜温25℃、日長16時間の高温条件下で栽培し、5日間（120時間）の高温処理を行い、その後（播種後24日目）に通常の昼温20℃、夜温15℃、日長16時間の条件に戻した。【００２１】
3-インドール酢酸（IAA:和光純薬工業（株）製造コード  094-00183）、1-ナフチル酢酸（NAA:和光純薬工業（株）製造コード 148-00092）2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D:和光純薬工業（株）製造コード 040-18532）をそれぞれ用いて、最初にジメチルスルホキシド（DMSO:和光純薬工業（株）製造コード 043-07216）で各10-3 M、10-2 M、10-1 Mのストック溶液を調整し、使用時まで-20℃暗黒下で保存した。これらストック液を散布する直前に解凍し、蒸留水でそれぞれ1000倍に希釈して、10-6 M、10-5 M、10-4 Mの３段階に調整してオーキシン水溶液として使用した。その際に、界面活性剤としてTween20相当の薬品（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート（ICI社商標Tween20相当品）：和光純薬工業（株）製造コード 167-11515）を0.1%(v/v)になるように添加した。オーキシン処理区の比較対照区としてDMSOと界面活性剤をそれぞれ0.1%（v/v）の濃度にした混合液を作成し、植物体への散布を行った。植物体への散布は前記ストック液を蒸留水で希釈してから30分以内に実施した。【００２２】
植物体へのオーキシン水溶液の散布は、播種してから18日目（高温処理前日）、19日目（高温処理の直前）、21日目（高温処理期間）、23日目（高温処理期間）の計4回行った（図７）。高温処理期間中のオーキシン水溶液の散布は、人工気象器の外に一度植物体を出して10分以内に、地上部の葉や茎の全体にほぼ均一にスプレー散布を行い、人工気象器内に速やかに戻した。散布したオーキシン水溶液の量は1ポットあたり25ml（オオムギ1個体あたり約6ml）である。
播種33〜40日目にかけて出穂してきたオオムギの穂から、３粒ずつ開花受粉前の穎花を採取した。これらをFAA固定液（ホルムアルデヒド 5%,酢酸 5%,エタノール 45%,H2O 45%）で4℃暗黒下、24時間固定し、最終的には0.1 Mリン酸バッファー（pH7.2）につけて4℃で保存した。
固定した穎花から雄蕊ならびに雌蕊を実体顕微鏡下(OLYMPUS SZX12)で解剖し、顕微鏡カメラ（OLYMPUS DP70）によりデジタル写真撮影を行った。それぞれの葯長は、デジタル画像を元に、画像処理ソフトのImage J（葯の大きさの測定は、アメリカ国立衛生研究所よりフリーに公開）を用いて測定した。各オーキシンの各濃度において3個体分9粒（1個体あたり３粒）の種子を観察し、それぞれの種子内に3つ存在する葯の大きさを測定し、その平均値と標準誤差を求めた（一つの濃度処理区あたり約27個の葯を測定した）。花粉の成熟度を調べる目的で、ヨードカリウム染色液（MERCK社製  ルゴール溶液（製品番号  109261））を用いて、一つの濃度処理区あたり3個の葯を染色し、顕微鏡（OLYMPUS BX51）による花粉観察と顕微鏡カメラ（OLYMPUS DP70）によりデジタル写真撮影を行った。【００２３】
オオムギの出穂期における正常な葯長は、3mm前後であり、実験対照区では10-6 M、10-5 M、10-4 MのIAA、2,4-D、NAA、いずれのオーキシンの散布においても、ほとんど変化はみられなかった。また、花粉も正常に形成されていた。但し、10-4 Mの2,4-D処理区においては、早期に葉が枯れはじめ、植物体にとってはオーキシンによる負の影響が生じていた。
高温処理区では、オーキシン効果の比較対照として、DMSOと界面活性剤をそれぞれ0.1%（v/v）の濃度にした混合液、水のみを散布した場合、出穂期の葯の伸長は顕著に抑制され、葯長は1.5mm程度にしか伸長せず（図８）、さらに内部には全く正常な花粉粒の形成がみられず（図９B）、何も散布しない場合と同様で、回復効果は得られなかった。10-6 MのIAA、2,4-DまたはNAAの散布では葯長が1.8mm〜2mm程度に、10-5 Mおよび10-4 Mのオーキシン水溶液の散布ではいずれの場合も葯長が2.5mm前後まで伸長し、高温条件下でも有意に回復することが明らかになった（図８）。また、10-6 M、10-5 M、10-4 M のいずれかのオーキシン処理により葯長が回復した葯内はヨードカリウム染色液で黒紫色に染色され、デンプンを十分に蓄積した正常な成熟花粉が形成されていることも確認できた（図９C）。前述のように、高温処理サンプルにおいても、10-4 Mの2,4-D処理区においては早期に葉が枯れはじめ、植物体にとってはオーキシンによる負の影響が生じていたが、IAAならびにNAAでは10-4 Mでも副作用はほとんど観察されなかった。【００２４】
オオムギは、自然においては、ほとんど自家受粉する結果、高温処理区では、出穂は見られるものの受粉が成立せずに種子が結実しない（図１０）。一方で、今回の花粉稔性が回復したいずれのオーキシン処理区（早期枯れ上がった10-4 M  2,4-D処理区を除く）においても、高温下で種子が結実し、10-6 Mではいずれのオーキシンも30%〜80%程度に、10-5 M処理区ではいずれのオーキシンも70%〜85%程度に、10-4 M IAAならびにNAA処理区では90%程度にまで各穂の種子が結実し、種子稔性も回復させることが確認できた（図１０）。
また、オーキシンの散布を当初の１回にした場合でも、有意な稔性の回復効果がみられるとともに、園芸培養土を用いた栽培においても、全く同様に、オーキシン処理による高温障害の回避が可能であることが確かめられている。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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