(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクター、及び、
前記合成ベクターの少なくとも１つのタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたウイルスからなる、ウイルスベクター、
を含み、前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが投与され、その後時間差で前記ウイルスベクターが投与されるように設計された、医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド性合成ベクターが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクター、及び、
前記合成ベクターの少なくとも１つのタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたウイルスからなる、ウイルスベクター、
を含み、前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが投与され、その後時間差で前記ウイルスベクターが投与されるように設計されており、前記コロイド性合成ベクターが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクター、及び、
前記合成ベクターの少なくとも１つのタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたウイルスからなる、ウイルスベクター、
を含み、前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが投与され、その後時間差で前記ウイルスベクターが投与されるように設計されており、前記コロイド性合成ベクターのサイズが１ミクロン未満であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
前記コロイド性合成ベクターが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのウイルス起源のタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクター、及び、
前記合成ベクターが含有する少なくとも１つのウイルス起源のタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたアデノウイルス又はポックスウイルスからなる、アデノウイルスベクター又はポックスウイルスベクター、
を含み、前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが投与され、その後時間差で前記ウイルスベクターが投与されるように設計されている、医薬組成物。
【請求項７】
前記コロイド性合成ベクターが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記コロイド性合成生体吸収性ベクターのサイズが１ミクロン未満であることを特徴とする、請求項６又は７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記コロイド性合成ベクターとして球状性ベクターを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記コロイド性合成ベクターが、少なくとも１つの天然のポリマーから調製されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記コロイド性合成ベクターが、同じ疾患に関連する抗原を各々構成する異なるタイプのタンパク質基質を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターとして、アデノウイルス又はポックスウイルスを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ポックスウイルスが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記タンパク質基質が、ウイルス起源のものであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ウイルス起源のタンパク質基質が、ＨＩＶウイルスのタンパク質であることを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質基質が、腫瘍に関連する抗原であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項の医薬組成物。
【請求項１７】
前記コロイド性合成生体吸収性ベクターの直径が１５０〜９００ｎｍであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記コロイド性合成生体吸収性ベクターの直径が２５０〜７００ｎｍであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが安定剤及び界面活性剤を含有しないことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクターからなるプライム成分、及び、
前記合成ベクターの少なくとも１つのタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたウイルスからなるウイルスベクターからなるブースト成分、
を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのウイルス起源のタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクターからなるプライム成分、及び、
前記合成ベクターが含有する少なくとも１つのウイルス起源のタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたアデノウイルス又はポックスウイルスからなるアデノウイルスベクター又はポックスウイルスベクターからなるブースト成分、
を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
医薬組成物であって、
少なくとも１つのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のタンパク質基質が結合し、平均粒径が９９９μｍ以下であり、かつポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物の中から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される、コロイド性合成生体吸収性ベクターからなるプライム成分、及び、
前記合成ベクターが含有する少なくとも１つのＨＩＶのタンパク質基質に対応するタンパク質基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列がゲノム内に挿入されたアデノウイルス又はポックスウイルスからなるアデノウイルスベクター又はポックスウイルスベクターからなるブースト成分、
を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが、ポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）のいずれかから調製される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記コロイド性合成生体吸収性ベクターが、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）から調製される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記タンパク質が、前記コロイド性合成生体吸収性ベクターに対して吸着により結合する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、予防的及び治療的ワクチン接種の分野に関する。特に本発明は、タンパク性基質の発現を可能にするウイルスベクター、及びタンパク性基質を有する合成ベクターを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
歴史的にワクチンで使用される抗原は、その病原力が弱毒化されている生きた微生物であるか又は死滅した微生物である。しかしこれらのワクチンは、投与中にしばしば好ましくない２次作用を引き起こし、まれに非常に重篤の合併症を引き起こす。従って何年もの間ワクチンの安全性を確保するために、ワクチンへの微生物の精製画分の使用が優先されてきた。かかる免疫原は単独で投与されると、充分な免疫応答を誘導しないことがある。ワクチン中に存在する精製免疫原により引き起こされる免疫応答を上昇させるか又は方向づけるために、先行技術では多くのワクチン方策が開発されてきた。
【０００３】
最も直接的な方策は、関連するタンパク性基質（免疫原）をアジュバントと組合わせることである。多くのタイプのアジュバントが開発されているが、最近まで水酸化アルミニウム（ミョウバン）のみがヒトへの投与が許された唯一のアジュバントであった。しかしミョウバンは体液性応答を誘導するには弱いアジュバントであり、これはすべての抗原にとって適切ではなく、細胞応答を得ることも不可能である。現在開発されているアジュバントの中では、強い免疫を誘導するための最も有効な系は微粒子に基づく合成ベクターであり、特にポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）の微粒子である。これらの粒子はそのサイズのために、マクロファージ又は樹状細胞のような抗原提示細胞を標的化することを可能にし、免疫系による免疫原の取り込みを改良する。タンパク性基質は微粒子中に封入されるか、又はその表面に吸着される。これらの２つのアプローチはたとえこれらが元々、特に抗体応答を得るために使用された場合でも、細胞性免疫応答と体液性免疫応答の両方を誘導することを可能にする。しかし封入は２つの大きな欠点がある。その１つは、タンパク性基質を免疫系が利用できるようにするために、微粒子の完全な又は部分的分解が必要なことであり、また免疫の樹立が遅れることである。第２の欠点は、封入中にタンパク性基質が変性又は分解され、従ってその免疫原性を喪失し得ることである。これらの理由のためにこの方法は、すべてのタイプのタンパク性基質には使用できず、一方吸着による方法はこれらの欠点が無い。これらの２つの場合でその使用に対する大きな障害は、特異的細胞応答を生成する有効性の欠如である。たとえミョウバンと比較して誘導されるその細胞応答がより良好であっても、それはウイルスベクターで得られるものよりは遙かに低い。
【０００４】
組換えウイルスベクターは、関連タンパク性基質のインビボ（動物又はヒトでの）発現を可能にする。これは免疫系の良好な動員を可能にする有効な方法である。しかし持続する免疫応答の誘導には、ワクチン接種された生物中で複製できる弱毒化された生きたベクターの使用が必要である。ワクチンの安全な使用に関連する法律上の理由により、新世代のワクチンはヒトで非複製性のウイルスベクターを使用し、従って時間とともにその特異的免疫応答が低下していく。従って予防的ワクチン接種の場合、有効な記憶応答を維持するために特異的免疫を再刺激することがときどき必要である。免疫療法の分野では特異的免疫の再刺激は、病原性生物の抑制を可能にする免疫応答の強度を維持するのに有用である。ウイルスベクターの繰り返し投与が必要なようであるが、抗ベクター免疫の問題である大きな問題を伴う。ウイルスベクター自体は免疫原であり数回投与されるため、ベクターの特異的免疫が現れ、次に上昇する。この免疫応答はウイルスベクターを排除することが目的であり、それが有する遺伝子の発現を防ぐので、関連するタンパク性基質に対する免疫応答の有効性が低下する。さらに抗ベクター免疫は、別の疾患に対するワクチン接種のために、問題のベクターの使用を妨害する。Shagenらは、この抗ベクター免疫を弱くすることを可能にするいくつかのアプローチを記載しており、例えばベクターレベルでの修飾、さらにはワクチン接種患者のレベルでの適応がある（2004, Critical Reviews in Oncology/Hematology 50:51-70）。しかしこれらのアプローチの実施は困難であり、すべての疾患又はすべての患者で達成することはできない。従ってウイルスベクターを使用する方法は効果的に使用できない。
【０００５】
ワクチン接種により誘導される免疫応答を改善する別の方法は、プライム・ブースト（prime-boost）法である。これは、同じワクチンを数回投与する代わりに全く同じタンパク性基質を有する２つの異なるワクチンを順に加えて特異的免疫応答を上昇させることからなる。例えば、各注射で異なるウイルスベクターを使用することが可能である（Negri DR, et al, Jopurnal of General Virology, 85: 1191-1201）。しかしこの方法は、ヒトでの使用が認可されているウイルスベクターの数が非常に限定されているため、成功する確率は低い。さらにこれらのウイルスベクターの繰り返し投与は再度、抗ベクター免疫の問題に遭遇する。この問題を避けるために、Ottenらは、ＤＮＡプライムの後に、表面に吸着されたタンパク質抗原を有するＰＬＧＡ微粒子ブーストの使用を記載している（2003, Journal of Virology, 77: 6087-6092）。Sharpeらは、ＰＬＧＡベースの微粒子にＤＮＡを封入するＤＮＡプライムと、ウイルスベクターＭＶＡによるブーストを提唱した（2003, Virology, 313: 13-21）。O'Haganらは、ＰＬＧＡ微粒子上に吸着されたＤＮＡによるプライムの使用に続いて、ウイルスベクターによるブーストの使用を記載している（2001, Journal of Virology, 75: 9037-9043）。国際特許公開第ＷＯ９８／５６９１９Ａは、ＤＮＡプライム後のポックスウイルスによるブーストを記載する。ＤＮＡプライムの使用の欠点は、特に霊長類で及び遺伝子が例えばＨＩＶ−１Ｔａｔ遺伝子のようにあまり免疫原性が強くない時、その有効性が低いことである。国際特許公開第ＷＯ９８／５６９１９Ａはまた、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）によるプライムに続いて、ポックスウイルスによるブーストの使用を記載している。ＶＬＰは、ウイルスゲノムを取り込まずまた複製できない欠陥ウイルス粒子である。これらはしばしば、ＨＩＶ−１の前駆体Ｐｒ５５  Ｇａｇ又はＨＰＶ−１６（ヒトパピローマウイルス）のタンパク質Ｌ１とＬ２のようなレトロトランスポゾン（レトロウイルスに似た内因性要素）のウイルスの構造タンパク質の自己集合により形成される。発現されるウイルスタンパク質により、ＶＬＰの構造は未変性のウイルス粒子に近いか又はそれ以下のことがあり、従ってＶＰＬはウイルスに匹敵する。これらのＶＬＰの欠点は、これらがバイオテクノロジーの結果であり、法的基準に従ってこれらを製造することが非常に困難なことである。
【０００６】
本出願人は予想外に、タンパク性基質を含むコロイド性合成生体吸収性ベクターと、対応するタンパク性基質をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターとの特定の結合が、抗ベクター免疫を低下させながら、タンパク性基質の使用に関連するワクチン接種の有効性を上昇させることを可能にすることを見いだした。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の第１の目的は、
−少なくとも１つのタンパク性基質を含むコロイド性合成生体吸収性ベクター、
−合成ベクターの少なくとも１つのタンパク性基質に対応するタンパク性基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むウイルスベクター、及び
−場合により、薬剤学的に許容される賦形剤と結合していること、
を含む又はからなる医薬組成物である。
【０００８】
本発明の別の目的は、医薬、好ましくはワクチンの調製のための該組成物の使用である。これはまた、本発明の組成物のタンパク性基質に関する病状のインビトロ診断のために使用することもできる。
【０００９】
従って本発明は、少なくとも１つのタンパク性基質を有するコロイド性合成生体吸収性ベクターを含む新規組成物を提唱する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
生体吸収性化合物は毒性ではない化合物であると理解され、すなわちこの化合物は生物に投与しても、致死的で無能力にするか又は不便な生理学的又は日常生活の代謝性変化を引き起こすものではなく、投与後の生物から自然の手段で排除できる化合物であると理解される。
【００１１】
コロイド及びコロイド性という用語は、３つの次元の少なくとも１つが１０μｍ未満であるかまたはこれに等しい、好ましくは１μｍ未満であるかまたはこれに等しい水性連続相内の物質の分散（分散相）を規定する。
【００１２】
水性連続相は組成物の相が主に水、例えば緩衝液もしくは水混和性水／溶媒混合物である相である。もちろん本発明の目的に適した水性連続相は非毒性相である。
【００１３】
分散相は、連続相に不溶性の液体、例えば油、又は油の混合物、又は有機脂肪物質、又はこれはポリマーもしくは無機質固体の混合物でもよい。分散相はいつも生体吸収性である。
【００１４】
分散相の例には、オリーブ油、ヒマワリ油、ピーナツ油、ナタネ油、又はこれらの混合物；トリグリセリド；合成ポリマー、例えばヒドロキシ酸のポリマー、例えば乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ酪酸、又はカプロラクトンから得られる化合物；ポリペプチド、カプロラクトン重合から得られる化合物；天然ポリマー、例えばヒアルロン酸、キトサン、又はデキストランのような多糖がある。
【００１５】
かかる生吸収性コロイドの例は、Benita A. and Levy M.Y., 1993, Journal of Pharmaceutical Sciences, 82(11): 1069-1079 （液体／液体エマルジョン）、Trotta M., et al, 2003, Internation Journal of Pharmaceutics, 257: 152-160 （脂質固体／液体エマルジョン）、及びJiang W., et al, 2005, ワクチン抗原の注射投与のための生体分解性ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）微粒子、Advanced Drug Delivery Reviews, 57: 391, 410に記載されている。
【００１６】
コロイド性合成ベクターの形は、球状であっても球状でなくてもよい、均一でも、又は重なった薄層でもよい分散相により与えられる。
【００１７】
本発明の合成ベクターは好ましくは球状である。さらに好ましくは、当該ベクターは微小球からなる。微小球及び微粒子という用語は、以下の説明で区別無く使用される。微粒子又は微小球は、大きくてもこれらが抗原提示細胞に入ることを可能にするミクロン範囲のサイズの粒子を意味する。大きくてもミクロン範囲のサイズは、９９９μｍより小さいかまたはこれに等しい大きさを意味する。微粒子は好ましくは、３μｍより小さいかまたはこれに等しい粒子径を有する。さらに好ましくは本発明の粒子は、サブミクロンサイズ、好ましくは１５０〜９００ｎｍ、さらに好ましくは２５０〜７００ｎｍの直径を有する。粒子のサイズは当業者に公知の方法、例えば走査電子顕微鏡、光もしくは透過型電子顕微鏡の準弾性光散乱を使用して容易に測定される。
【００１８】
本発明のある実施態様において、前記コロイド性合成ベクターはポリマーベースのベクターである。
【００１９】
ポリマーベースの合成ベクターの例として、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、及びポリ無水物のようなポリマーに基づく微粒子を含むベクターからなり得る。当該合成ベクターは好ましくは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えばポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）（いずれもＰＬＡとして知られている）、ポリグリコール酸（ＰＬＧとして知られている）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物、例えばポリ（Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸）の混合物、ポリ（Ｌ−乳酸）とポリグリコール酸の混合物、ポリ（Ｄ−乳酸）とポリグリコール酸の混合物、又はポリ（Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸）とポリグリコール酸の混合物から選択される少なくとも１つの生体吸収性ポリマーを含む。ポリマーがポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物である時、各成分の比率は当業者により容易に決定される。すなわち例えば、当業者に公知の種々の比率のポリ（Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸）のラセミ混合物又はＰＬＡ／ＰＬＧ混合物を使用することができる。本発明のコロイド性合成ベクターは、好ましくはポリ（α−ヒドロキシ酸）から選択される少なくとも１つのポリマーから調製される。さらに好ましくは本発明の粒子は、安定剤や界面活性剤を含まず、従って非毒性である。毒性微粒子は、微粒子を投与された生物で生物学的問題（例えば代謝の撹乱）を引き起こし得る少なくとも１つの化合物を含む微粒子であると理解される。かかる非毒性粒子は、国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号に記載のプロトコールに従って調製することができる。
【００２０】
別の実施態様においてコロイド性合成ベクターは、上記したような少なくとも１つの天然のポリマーから調製される。
【００２１】
本発明の組成物は、細胞性応答及び体液性応答の両方を刺激するのに有用である。これはまた、予防と治療及び診断において有用である。
【００２２】
本発明の目的に有用で前記合成ベクターにより運搬されるタンパク性基質は、それに対して免疫応答が開始される任意のタンパク性基質である。
【００２３】
免疫応答は、細胞性応答、体液性応答又はこれらの両方であると理解される。
【００２４】
細胞性応答は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球に仲介される応答であると理解される。この応答は、細胞毒性Ｔ細胞による及び／又はＣＤＤ８＋Ｔリンパ球又はヘルパーＴ細胞によるサイトカインの産生による、溶解活性の誘導に反映される。
【００２５】
体液性応答は、Ｂリンパ球により分泌される抗体分子に仲介される応答であると理解される。
【００２６】
タンパク性基質は、本発明の目的に適したベクターへの添加後に抗原の役割を果たす任意のタンパク性基質、例えばペプチド、タンパク質、タンパク質断片、ポリタンパク質、及び糖タンパク質であり、タンパク質断片は関連する構造を保持すると理解される。
【００２７】
抗原は、免疫応答によりその合成を誘導し、かつ少なくとも１つのエピトープを含有する抗体により認識され得る分子である。
【００２８】
タンパク質断片の例には、ペプチド、ポリペプチド、及びエピトープを含む。
【００２９】
エピトープは、３〜１５のアミノ酸及び一般に５〜１５のアミノ酸を含み、それに対して免疫応答が開始される最小のペプチド断片からなるペプチドである。
【００３０】
合成ベクターはタンパク性基質の複数のコピーを有する。「少なくとも１つのタンパク性基質」は、同じタイプの少なくとも数個のタンパク性基質を意味すると理解される。「あるタイプのタンパク性基質」は、同じ抗体の産生により同じ免疫応答を開始させる（すなわち同じ免疫性を有する）タンパク性基質のセットを意味すると理解される。
【００３１】
従って合成ベクターは以下のいずれかを含み得る：
同じタイプであって、それ故同じ疾患に関連する抗原を構成するタンパク性基質。すなわち例えば当該合成ベクターは、タンパク性基質としてタンパク質ｐ２４を天然タンパク質及び／又は変異タンパク質及び／又はタンパク質断片の形態で含有してもよく、変異タンパク質と断片はその免疫性を保持していると理解される。
【００３２】
あるいは、異なるタイプであって、同じ疾患に関連する抗原を構成するタンパク性基質。すなわち例えば合成ベクターは、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のいくつかのタイプのタンパク質であって、例えばＧａｇタンパク質、同じ免疫を有さないＧａｇタンパク質、Ｔａｔタンパク質、Ｒｅｖタンパク質、Ｎｅｆタンパク質、Ｅｎｖタンパク質を含んでよい。
【００３３】
あるいは、異なるタイプであって、同じ疾患に関連する抗原を構成するタンパク性基質。すなわち例えば合成ベクターは、ＨＩＶの少なくとも１つのタイプのタンパク質であって、例えばｐ２４、Ｔａｔ、Ｒｅｖタンパク質、及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の少なくとも１つのタイプのタンパク質、例えばＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４を含んでよい。
【００３４】
本発明のある実施態様の合成ベクターは、異なるタイプのタンパク性基質で、かつ同じ疾患に関連する抗原を構成するタンパク性基質を含む。
【００３５】
前記タンパク性基質は、ウイルスもしくは細菌の起源のようないくつかの起源のもの、あるいは非感染性起源の病理（例えば癌又は代謝疾患）のものでもよい。
【００３６】
本発明の具体例において、前記タンパク性基質は、ウイルス起源の抗原である。
【００３７】
前記タンパク性基質がウイルス起源である時、使用されるウイルスは、免疫応答が可能な基質が公知であるすべてのウイルスである。
【００３８】
例えば、それは、特に限定されないが、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、パピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、異なる菌株のヒトインフルエンザウイルス及びトリインフルエンザウイルスがある。
【００３９】
本発明の目的に適したウイルスの核酸配列、ならびにこれらの配列にコードされるタンパク質は当業者に公知であり、ジーンバンク（GenBank）のようなデータベースで入手できる。
【００４０】
例えばＨＩＶウイルスは、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を有する。Ｇａｇ遺伝子はウイルスのコアを形成するタンパク質（ｐ２４抗原を含む）をコードする。Ｐｏｌ遺伝子は、逆転写（逆転写酵素）、切断（プロテアーゼ）、及び組み込み（インテグラーゼ）に関与する酵素をコードする。Ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードする。これは、ウイルスの遺伝子の発現の制御に関与するタンパク質（制御タンパク質）をコードする他の遺伝子（Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ及びＶｐｕ（ＨＩＶ−１）又はＶｐｘ（ＨＩＶ−２））を含有する。ＨＩＶゲノムはまた、ウイルスの遺伝子発現に関与する制御要素を含む５’及び３’ＬＴＲｓ（長い末端反復配列）を含む。
【００４１】
本発明の実施態様において、本発明の方法で使用されるタンパク性基質は、ＨＩＶウイルスのタンパク質である。ＨＩＶウイルスの抗原の例として、制御タンパク質、又はＧａｇタンパク質、又はＥｎｖ糖タンパク質があり、好適な制御タンパク質は、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、又はＮｅｆタンパク質である。
【００４２】
ＨＣＶの場合、ゲノムの５’末端は、構造タンパク質、ヌクレオカプシドのコアタンパク質、２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１とＥ２、及びｐ７として知られている小さいタンパク質をコードする遺伝子に隣接する非翻訳領域に対応する。５’非翻訳領域とコア遺伝子は、異なる遺伝子型間で比較的よく保存されている。エンベロープタンパク質Ｅ１とＥ２は、分離株毎に変動が大きい領域によりコードされる。ｐ７タンパク質は極めて疎水性の高いタンパク質であり、イオンチャネルを構成するであろう。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）をコードする遺伝子、及びよく保存されたドメインを有する非コード性３’領域をコードする遺伝子を含有する（Major ME, Feinstone SM, Hepatology, June 1997, 25(6): 1527-1538）。
【００４３】
ＨＣＶの非構造タンパク質ＮＳ３は、６３０アミノ酸のタンパク質であり、これは２つの異なる構造ドメインを含む：ウイルスタンパク質の成熟に介入する活性セリンプロテアーゼ活性を付与された８１アミノ酸のＮ末端ドメイン（ＮＳ３プロテアーゼというドメイン）と、ウイルスゲノムの複製に役割を果たすＮＴＰａｓｅ活性に関連するヘリカーゼ活性を含む５４９アミノ酸のＣ末端ドメイン（Ｎ３Ｓヘリカーゼドメインという）である。このタンパク質ＮＳ３は、ウイルスの異なる遺伝子型で比較的よく保存されており、従ってこのタンパク質は好適な「候補ワクチン」抗原となる。
【００４４】
本発明の別の実施態様において、前記タンパク性基質は、腫瘍に関連する抗原である。
【００４５】
いくつかの腫瘍は、強い免疫応答にその起源が無くても、ＣＤ８＋Ｔリンパ球により認識される可能性のある抗原を発現する。これらは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍マーカーである（Houghton AN, 1994, J Exp Med 180:10）。免疫系へのＴＡＡの提示を改良することにより、これらを免疫原性にすることが可能であり、従ってＴＡＡは組換えタンパク質又は合成ペプチドの形態の抗癌ワクチンの開発のための基礎となることができる。
【００４６】
ＴＡＡの知識を増強することを目指す新しい免疫療法を試験するために、Wangらは、マウスで実験モデルを開発した（1995, Journal of Immunology, 154: 4685-4692）。腫瘍株ＣＴ２６．ＷＴ（遺伝子ベースＢＡＬＢ／ｃ）を、酵素ベータガラクトシダーゼをコードする大腸菌（Escherichia coli）のｌａｃＺ遺伝子によりトランスフェクトしてＣＴ２６．ＣＬ２５株を作成した。２つの株はマウスで致死的であり、その増殖動態は似ていた。マウスに投与すると、ＣＴ２６．ＣＬ２５株は腫瘍生成の起源であり、モデルＴＡＡを構成するベータガラクトシダーゼに対する免疫応答の存在下で減速するか又は実際に阻害する。
【００４７】
本発明の目的に適したタンパク性基質は、以下の工程を含む遺伝子工学作成法：
関連するタンパク性基質をコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した微生物又は真核細胞の培養、そして、
−該微生物又は該真核細胞により産生される該タンパク性基質の回収、により得ることができる。
【００４８】
これらの方法は当業者に公知である。この関連でさらなる詳細については、以下の研究を参照されたい：Recombinant DNA Technology I, 編者Ales Prokop, Raskesh K Bajpai: Annals of New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991。
【００４９】
関連するタンパク性基質のサイズが小さい時、これらはまた、当業者に公知の従来のペプチド合成により調製することもできる。
【００５０】
タンパク性基質は、当業者に公知の技術（例えば、含有又は表面への結合）に従ってコロイドベクターと結合される。コロイド性合成ベクターへのタンパク性基質の含有の例として封入がある（Tamber H. et al, 2005, Adv Drug Deliv Rev, 57(3): 357-76）。コロイド性合成ベクターへのコロイド物質の結合の例として、国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号に記載のような吸着、又は例えば、"Protein immobilization Fundamentals and Applications R.F. Taylor編、Marcel Dekker Inc., New York, 1991に記載の方法でコロイドベクターの反応性基とタンパク性基質の別の反応性基との化学結合の形成を含む共有結合性移植がある。
【００５１】
特定の態様において、前記タンパク性基質は、例えば微粒子とタンパク性基質を混合し、これらを例えば周囲温度又は３７℃で攪拌しながらインキュベートして、結合、さらに好ましくは吸着により合成ベクターに付加される。
【００５２】
本発明の組成物は、ウイルスベクターを含む。
【００５３】
前記ウイルスベクターは、前記合成ベクターの少なくとも１つのタンパク性基質に対応するタンパク性基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
「合成ベクターの少なくとも１つのタンパク性基質に対応するウイルスベクターのタンパク性基質」は、ウイルスベクターのタンパク性基質が、上記したように同じタイプであるか又は異なるタイプであるかに拘わらず、合成ベクターのタンパク性基質と同じ疾患に関連する抗原を構成することを意味すると理解される。タンパク性基質が異なるタイプである時、これらは少なくとも１つのエピトープ（例えばＧａｇ及びｐ２４タンパク質）を共通に持っていなければならない。
【００５５】
それ故、同じ疾患又は異なる疾患の抗原を構成する１つまたは数個のタンパク性基質をコードする１つまたは数個のヌクレオチド配列を挿入するように、ウイルスベクターのゲノムが修飾される。これらのタンパク性基質中で少なくとも１つは、合成ベクターのタンパク性基質に対応し、これらのタンパク性基質は同じ疾患に関連する抗原を構成する。
【００５６】
好適な実施態様において、ウイルスベクターは、ＨＩＶのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
合成ベクターのタンパク性基質と同じ疾患に関連する抗原を構成する少なくとも１つのタンパク性基質をコードするヌクレオチド配列とは別に、ウイルスベクターはまた該タンパク性基質の発現に必要な手段を含む。
【００５８】
「タンパク性基質の発現に必要な手段」とは、タンパク性基質を得ることを可能にする任意の手段、例えばプロモーター、転写ターミネーター、複製開始点、及び好ましくは選択マーカーがある。
【００５９】
タンパク性基質の発現に必要な手段は、該物質をコードする核酸配列に機能できる形で結合している。「機能できる形で結合している」とは、発現に必要な該要素とタンパク性基質をコードする遺伝子が並置しており、これらが予測された方法で機能することを可能にする関係であることを意味する。例えば、その機能的関係が維持されるならプロモーターと関連する遺伝子の間に、追加の塩基が存在してもよい。
【００６０】
タンパク性基質の発現に必要な手段は同種の手段（すなわち手段は、使用されるベクターのゲノムに含まれる）か、又は異種でもよい。後者の場合、該手段は発現される関連タンパク質とともにクローン化される。
【００６１】
異種プロモーターの例には、（ｉ）ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ−ＨＳＶ−１）のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前早期プロモーター、及びアデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、ならびに（ii）高等真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の転写を制御する任意の細胞性プロモーター、例えば構成性ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター（Adraら、1987, Gene, 60: 65-74）、肝臓アルファ１−アンチトリプシンとＦＩＸの特異的遺伝子のプロモーター、及び軟筋肉細胞の特異的プロモーターＳＭ２２（Moesslerら、1996, Development, 122: 2415-2425）を含む。
【００６２】
ウイルスベクターに含まれる該配列は、単一のプロモーター及び／又は単一の発現制御要素の制御下で、互いに直接結合することができ、あるいは、独立のプロモーター及び／又は同じか若しくは異なり得る発現制御物質に依存してそれぞれ分離することができる。
【００６３】
本発明の目的に適したウイルスベクターとして、アデノウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス、レトロウイルス型のウイルスベクターが言及される。
【００６４】
アデノウイルスは、多くの動物種で検出されている。これらは組み込まれず、あまり病原性ではない。これらは種々のタイプの細胞（分裂細胞及び休止細胞）に感染することができる。これらは気管支上皮に対する自然の指向性を有する。さらにこれらは、何年もの間、腸ワクチンとして使用されており優れた安全性の記録がある。最後にこれらは容易に増殖し、大量に精製することができる。これらの特性のためにアデノウイルスは、発現ベクターとしての使用に、及び特に治療とワクチン接種目的に遺伝子治療ベクターとしての使用に適している。
【００６５】
好適な実施態様において、本発明のベクターはアデノウイルスである。
【００６６】
本発明で使用されるアデノウイルスの例は、ヒトもしくは動物の任意の起源、特にイヌ起源｛例えば、ＣＡＶ−１又はＣＡＶ−２：それぞれジーンバンク（GenBank）参照ＣＡＶ１ＧＥＮＯＭ及びＣＡＶ７７０８２から｝、トリ起源｛ジーンバンク（GenBank）参照ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ｝、ウシ起源（例えば、ＢＡＶ３、Seshidhar Reddyら、1998, J. Virol., 72: 1394-1402）、ヒツジ、ネコ、又はブタ起源、サル貴遺伝子、又はこれらのハイブリッドに１つから得られる。任意の血清型が使用される。しかしヒト起源のアデノウイルスが好適であり、特にアデノウイルス５（Ａｄ５）が好適である。
【００６７】
一般に、参照されるウイルスはＡＴＣＣコレクションから入手でき、これらの配列、構成、及び生物学を記載する多くの文献のテーマになっており、当業者はこれらを容易に利用することができる。例えばアデノウイルス５型の配列はジーンバンク（GenBank）データベース（Ｍ７３２６０及びＭ２９９７８）に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６８】
アデノウイルスのゲノムは、ウイルスサイクルを停止させるのに必要な約３０を超える遺伝子を有する約３６ｋｂの線状２本鎖ＤＮＡ分子からなる。アデノウイルスのゲノムに４つの早期遺伝子が分布している（Ｅ１〜Ｅ４）。Ｅ１、Ｅ２、及びＥ４領域はウイルス複製に必須である。変異ウイルスが自然に発生する又はＥ３領域を喪失したハイブリッドウイルスが培養細胞中の野生型のウイルスのように複製し続けるという観察結果から、Ｅ３領域は非必須領域であると考えられている（Kelly and Lewis, 1973, J. Virol., 12: 643-652）。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）の大部分は、ウイルスカプシドを形成する構造タンパク質をコードする。これらは少なくとも部分的に第１の転写モチーフと重複し、単一のプロモーターに基づいて転写される（ＭＬＰは「主要後期プロモーター」）。さらに、アデノウイルスゲノムは両端に、ＤＮＡ複製に必須のシス作用性領域、逆方向繰り返し配列モチーフ５’と３’（ＩＴＲは「反転末端繰り返し」）とパッケージング配列を有する。
【００６９】
遺伝子治療プロトコールで現在使用されているアデノウイルスはＥ１領域の大部分が欠如しており、これがこのウイルスを複製レベルで欠陥のウイルスにして、環境及び宿主生物で増えることを防いでいる。さらにアデノウイルスの大部分はそのクローニング能力が上げるため、Ｅ３領域も欠如している。これらのベクターを使用する遺伝子輸送の現実性は、種々の組織でインビボで証明されている（例えば、Yei et al, 1994, Hum. Gen. Ther., 5: 731-744; Dai et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1401-1405; US6,009,831;及びUS6,031,638を参照）。
【００７０】
本発明の目的に特に適した他の発現ベクターは、本発明の別の実施態様を構成するポックスウイルスである。
【００７１】
ポックスウイルスは複合エンベロープウイルスの群を構成し、これは主にその異常な形態（大きなＤＮＡゲノムと細胞質複製部位）により区別される。コペンハーゲン・ワクシニア（Copenhagen vaccinia）（ＶＶ）のウイルス株（Goebel et al, 1990, Virol. 179: 247-266, 及び517-563）及び修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Modified Vaccinia Virus Ankara）（ＭＶＡ）の株（Antoine et al, 1998, Virol, 244: 635-396）を含むポックスウイルス科のいくつかの要素のゲノムが、マッピングされ配列決定されている。ＶＶ株は約１９２ｋｂの２本鎖ＤＮＡゲノムを有し、これは約２００のタンパク質をコードし、その約１００はウイルスの組み立てに関与している。ＭＶＡ株はワクシニアウイルスの高度に弱毒化された株であり、ニワトリ胚繊維芽細胞でのワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）の５００回を超える継代により作成される（Mayr et al, 1975, Infection, 3: 6-16）。ＭＶＡウイルスはCollection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)に番号Ｉ−７２１で寄託されている。ＭＶＡのゲノムの完全な配列決定とＶＶの配列との比較により、ウイルスゲノム及び７つの欠失（Ｉ〜VII）の定義に発生した変化と、断片化読みとり枠を生じる多くの変異の、正確な同定が可能になる（Antoine et al, 1998, Virology, 244: 365-396）。
【００７２】
本発明の目的に適したポックスウイルスの他の例には、カナリア痘ウイルス、鷄痘ウイルス、牛痘ウイルス、昆虫ポックスウイルス、サル痘ウイルス、豚痘ウイルス、及びペンギン痘ウイルスがある。
【００７３】
ポックスウイルスには、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）と細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）として知られている２つの形態学的に異なる型がある。
【００７４】
本発明の目的で使用されるポックスウイルスは、好ましくは修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ankara）である。
【００７５】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列の抑制と挿入法は当業者に広く知られており、特に酵素的消化と結合からなる。ウイルスベクターに挿入されるヌクレオチド配列は、好ましくはＨＩＶウイルスのタンパク質をコードする。
【００７６】
本発明のベクターに基づく組成物は、この組成物のタンパク性基質が抗原を構成する疾患（例えばウイルスによる感染）を阻止、予防、及び治療するのに特に有効である。従ってこれらは、薬剤（特にワクチン、これは治療的でも予防的でもよい）の調製に特に有用である。
【００７７】
本発明はまた、本発明の組成物の有効量を患者に投与することを含む、予防又は治療法、特にワクチン接種法に関する。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、塗布、局所的、気管内、鼻内、皮内、直腸内、膣内、眼内、耳介内投与に適しており、該活性成分は単位投与剤型で投与することができる。
【００７９】
単位投与剤型は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射可能経口液剤又は懸濁剤、経皮パッチ、舌下、バッカル、気管支、眼内、鼻内、耳介内投与型、吸入投与型、直腸又は膣局所的投与型、経皮、皮下、筋肉内、又は静脈内投与型、又はインプラントでもよい。塗布投与には、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、又は洗眼剤も企図される。
【００８０】
これらの生薬型も、この分野の通常の方法により調製される。
【００８１】
該単位投与剤型は、生薬型に依存して体重１ｋｇ当たり１日０．００１〜１０ｍｇの活性成分の投与を可能にするように投与される。
【００８２】
より多い投与量または少ない投与量が適している場合もある；このような投与量は本発明の範囲から逸脱しない。投与モード、患者の体重及び応答に従って、通常の方法により各患者の適切な用量が医師により決定される。
【００８３】
賦形剤の量と性質は、当業者が容易に決定することができる。これらは必要な剤型及び投与モードに応じて選択される。
【００８４】
本発明の組成物は医薬キットに含まれる。本発明の組成物の投与は同時、別々、又は時差的でもよい。
【００８５】
同時投与は、同じ時間及び同じ位置での組成物の投与を意味すると理解される。
【００８６】
時差的投与は、異なる時間でのウイルスベクター又は合成ベクターの投与を意味すると理解される。各投与間の間隔は、数分間〜数年間、好ましくは数週間〜数ヶ月間、及びさらに好ましくは３又は４週間でもよい。
【００８７】
別々の投与は、ウイルスベクターと合成ベクターの体の異なる位置での投与を意味すると理解される。ウイルスベクターと合成ベクターは、同じ賦形剤中又は好ましくは適切な異なる賦形剤中でもよい。
【００８８】
本発明の組成物は好ましくは時差的に投与される。さらに好ましくは合成ベクターはウイルスベクターの前に投与される。
【００８９】
本発明の実施態様において、本発明の組成物は、以下を含む：
ｉ）少なくとも１つのタンパク性基質を含むコロイド性合成生体吸収性ベクターからなる主要な成分、及び
ii）当該合成ベクターの少なくとも１つのタンパク性基質に対応するタンパク性基質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むウイルスベクターからなるブースト成分。
【００９０】
治療的及び予防的応用以外に本発明はまた、診断的応用を有する。すなわち本発明はまた、合成ベクターのタンパク性基質が抗原を構成する病態（特にウイルス感染もしくは癌）のインビトロ診断のための、本発明の組成物の使用に関する。
【００９１】
本発明は、単に例示目的で提供されるものであり、決して限定的ではない以下の例、及び添付の図１〜図２０を参照して、よりよく理解されるであろう。
【実施例】
【００９２】
実施例１：本発明のワクチン組成物を用いるマウスの免疫
使用されるワクチン組成物は、タンパク質ｐ２４と結合したポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）の微粒子（以後ＰＬＡ／ｐ２４と呼ぶ）ベースの合成ベクターと、配列番号１のＧａｇ配列を含むウイルスベクターＭＶＡ（以後ＭＶＡＧａｇウイルスと呼ぶ）とを含む。
【００９３】
１．動物モデル
免疫実験を、最初の免疫時に６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｋd）マウスで実施した。
【００９４】
２．投与した免疫原
この実験シリーズでは、以下の免疫原を単独で又は組合せて使用した：
国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号の溶媒排除及び吸着法に従って調製した微粒子ＰＬＡ／ｐ２４、
タンパク質ｐ２４をコードする、ＨＩＶ−１ウイルスのＧａｇ遺伝子の組み換え体であるウイルスＭＶＡＧａｇ（修飾ワクシニアウイルスアンカラ、弱毒化ワクシニアウイルス、アンカラ株）。当該組換えウイルスは、Antoine G. et al, 1998、「修飾ワクシニアアンカラ株の完全なゲノム配列：他のオルソポックスウイルスとの比較」、Virology, 244: 365-396に記載のように、野生型株（ＭＶＡＴＧＮ３３）からTransgeneで組換えウイルスを構築した。次に、当該組換えウイルスを産生し、以下のように精製した：ＭＶＡをニワトリ胚細胞で複製した。感染の４８〜７２時間後、細胞を採取し、次に凍結／融解及び超音波処理により溶解した。溶解物を精製し／２サッカロースパッドにより濃縮し、場合により２サッカロース勾配を行った。
【００９５】
より正確な詳細については、教科書"Currrent Protocols in Molcular Biology", 第２巻、１６．１６章、Ausubel FM, Brent R, Kigston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K編、John Wiley and Sons, Inc., New York、３巻を参照されたい。
【００９６】
野生型ＭＶＡウイルスＭＶＡＴＧＮ３３。これは陰性対照であり、免疫中にウイルスベクターが非特異的免疫応答を誘導するかどうかの尺度となる。
ＧａｇＤＮＡ。Ｇａｇ遺伝子（配列番号１から）は真核生物発現プラスミドｐｈＣＭＶ｛ヒトサイトメガロウイルスの前早期プロモーター、及びウサギベータ−グロビン遺伝子からのポリアデニル化シグナルを含有する（Y K Yee et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(20): 9564-9568）｝でクローン化した。エンドトキシンの無い大量のＤＮＡ調製物を、Macherey-NagelのGigaprepエンドトキシン不含キットを使用して産生した。マウスにおいて裸のＤＮＡの筋肉内投与が良好な細胞障害性応答（ＣＴＬ）の誘導を可能にすると知られているため、このＤＮＡは陽性対照として役立つ。
【００９７】
３．免疫
実験１
３５匹のマウスに、上記２記載の免疫原を０週及び３週に２回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表１に示す。筋肉内経路で投与したＤＮＡ以外は、すべての注射は皮下に行った。
【００９８】
【表１】
0005524486.tif 000002
ｐｆｕ＝プラーク形成単位、これは使用したＭＶＡの用量の測定単位である。ウイルス力価は、上記Current Protocols in Molecular Biologyに記載のように、ウイルスストックの投与法に従ってｐｆｕで表す。
【００９９】
最初の注射の６週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０１００】
実験２
この実験では注射の数を増やした。３０匹のマウスに、上記２に記載の免疫原を０、３、及び６週に２回又は３回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表２に示す。すべての注射は皮下に行った。
【０１０１】
【表２】
0005524486.tif 000003
【０１０２】
最後の注射の３週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０１０３】
実験３
３０匹のマウスに、上記２に記載の免疫原を０、３、及び６週に２回又は３回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表３に示す。すべての注射は皮下に行った。
【０１０４】
【表３】
0005524486.tif 000004
【０１０５】
最後の注射の３週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０１０６】
４．免疫学的分析
体液性応答と細胞応答を以下のように調べた：
体液性応答：屠殺する前にマウスから血液を採取した。抗ｐ２４抗体の存在はＥＬＩＳＡにより測定した。タンパク質ｐ２４｛大腸菌（Escherichia coli）で産生させ、Cheynet V. et al, 1993, Protein Expr Purif, 45(5): 367-72に従って金属キレート親和性クロマトグラフィーにより精製した｝を捕捉で使用し、血清中に存在する特異抗体を、検出抗体としてのポリクローナル抗マウス抗体により証明した｛これは西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたAffinipureヤギ抗マウスＩｇＧ抗体である（Ｈ＋Ｌ、Jackson Immunoresearch, カタログ番号１１５−０３５−０６２）｝。力価は、使用したＥＬＩＳＡプロトコールで０．１  ＯＤ単位の吸光度が得られる希釈倍数の逆数である。
【０１０７】
細胞応答：マウスを屠殺後、脾臓を無菌的に取り出し、細胞懸濁物を調製した。得られた細胞懸濁物について以下の分析を行い、各マウスは個々に、あるいは細胞量が個々の分析に充分ではない時は、プールで分析した。
【０１０８】
（ｉ）ＣＴＬ試験：細胞懸濁物を免疫優性Ｈ−２Ｋd−制限ＣＴＬエピトープに対応する９量体のタンパク質ｐ２４（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ−配列番号２）のペプチドとＩＬ−２の存在下で培養した。５日後、ペプチドで刺激した放射線照射ナイーブ細胞によりエフェクター集団を再刺激した。７日目の最後に細胞毒性エフェクター集団を採取し、５１Ｃｒを標的として標識したＰ８１５（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−６４）を使用してＣＴＬ活性を測定した。
【０１０９】
（ii）ＥＬＩＳＰＯＴ：ＥＬＩＳＰＯＴは、特異的刺激に応答してあるサイトカインを分泌する細胞の数を測定することを可能にする。我々は、Ｔｈ１型のサイトカインＩＦＮ−γとＴｈ２型のＩＬ−４に関心がある。脾臓から得られた細胞懸濁物をインビトロでペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩにより２０時間再刺激し、ＣＤ８型の応答を分析した。脾臓から得られた細胞懸濁物をインビトロでタンパク質ｐ２４（エンドトキシン無し）により４２時間再刺激して、ＣＤ４型の応答を分析した。
【０１１０】
ＰＶＤＦ膜を有する９６ウェルのＥＬＩＳＰＯＴプレート（Multiscreen IP, Millipore）を抗ＩＦＮ−？又は抗ＩＬ−４抗体により被覆した。再刺激中、脾臓細胞の懸濁物をこれらのプレートで、各細胞が分泌したサイトカインを捕捉するようにインキュベートした。関連サイトカインを分泌する各細胞に対応するスポットを、関連するサイトカインの特異的ビオチン化検出抗体により証明した。
【０１１１】
iii）サイトカインの分泌：脾臓細胞を完全培養培地中｛培養培地：１０％胎児牛血清、１０ｍＭヘペス、５×１０-5Ｍ  β−メルカプトエタノール、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン、８０Ｕ／ｍｌのペニシリン、８０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、非必須アミノ酸１×（カタログ番号１１１４０−０３５）、ピルビン酸ナトリウム１×（カタログ番号１１３６０−０３９）（Invitrogen，Cergy Pointoise，フランスの成分）を含有するアルファ最小基本培地（αＭＥＭ）｝で、関連するｐ２４抗原の存在下又は非存在下で３日間刺激し、培養上清中に分泌されるサイトカインを、Bender Medsystems（カタログ番号ＢＭＳ７２０ＦＦ）からのマウスキットFlowCytomix Th1/Th2 10plexにより定量した。
【０１１２】
５．結果
５．１ＣＴＬ応答
表４は、３つの連続実験で得られた結果を要約する。
【０１１３】
【表４】
0005524486.tif 000005
【０１１４】
表１は、免疫実験番号第１で得られたＣＴＬ応答を示す。各群は５匹のマウスからなり、脾臓をプールした後、ＣＴＬ投与を行った。すべての群で非特異的刺激（ペプチド無し）は０だったため、これは示していない。同様に、成分Ａ、Ｄ及びＥで得られたＣＴＬ応答は０だったため、これは示していない。Ｘ軸はエフェクター細胞（ＣＴＬ）対標的細胞（溶解される）の比に対応する。Ｙ軸は平均溶解パーセントに対応する。
【０１１５】
誘導されたＣＴＬ応答は、ＤＮＡを最後に投与された実験１のＧ群を除いて、使用したすべての免疫原（ＭＶＡ、ＰＬＡ、又は組合せ）について低強度であった（図１）。ＤＮＡ群中のＣＴＬの誘導は正常であり：ＤＮＡはこの目的に最適化され、これはマウス中で陽性対照であるが、霊長類であまりうまく作用しない。
【０１１６】
応答が低いままであっても、ＭＶＡとＰＬＡの両方を含む遺伝子は、ＭＶＡ単独又はＰＬＡ単独を投与された群より良好なＣＴＬ応答を示す。
【０１１７】
２回の注射をした時、ＭＶＡを２回又はＰＬＡを２回投与された群では、保存した屠殺物（ＡとＤ）でＣＴＬは検出されず、ＰＬＡとＭＶＡの両方を投与された群（ＢとＣ）では、ＣＴＬは低頻度であった。注射の順序も重要である：ＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｃ）がＭＶＡ＋ＰＬＡ（Ｂ）より良好な結果を与える。
【０１１８】
３回の注射をした時、応答の誘導頻度は低いままである。ＣＴＬ応答は、２回注射と比較しても改善されない。ＭＶＡを使用するワクチン法は、ＰＬＡとＭＶＡの組合せと同じ結果を得るために、３回の注射が必要である。
【０１１９】
５．２ＧａｇペプチドＡＭＱに対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
図２は、ＧａｇペプチドＡＭＱの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に含めた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でＧａｇペプチドＡＭＱによる１８時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（群により、ｎ＝５、１０、又は１５）から計算された平均に対応する。
【０１２０】
ガンマインターフェロン又はII型インターフェロンはまた、ＣＤ４＋型Ｔリンパ球、ＣＤ８＋型Ｔリンパ球、及びＮＫ細胞により分泌されるため、免疫インターフェロンとも呼ばれる。これはウイルス感染に対して細胞を防御する。これはマクロファージの食作用活性を刺激して、これらが腫瘍細胞を死滅させることを可能にする。これはＴリンパ球及びＢリンパ球の成熟を刺激し、抗体の産生を上昇させる。これはマクロファージによるクラスＩＨＬＡ及びクラスIIＨＬＡ分子の発現を上昇させる。これはＴｈ１型サイトカインである。
【０１２１】
ワクチン組成物は、得られたＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答に応じていくつかの範疇に分類することができる。最適の応答は、組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｃ）とＭＶＡ＋ＭＶＡ（Ａ）により誘導される。これらの場合、３回目の注射でも改善が得られない（組成物ＭＶＡ＋ＭＶＡ）（Ａ’）か、又は観察される応答を低下させることがある（組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ）（Ｃ’）。組成物ＭＶＡ＋ＰＬＡ（ＢとＢ’）及びＤＮＡ＋ＰＬＡ（Ｆ）は即時的な強い応答を生成することができ、ＰＬＡのみを使用する方法（ＤとＤ’）は低い応答を誘導する。
【０１２２】
従って我々は、ワクチン組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｃ）が、ペプチドＡＭＱの特異的ＩＦＮ−γの分泌を誘導するのに、組合せＭＶＡ＋ＭＶＡ（Ａ）より優れていることはなくても、少なくともこれと同等であることを証明することができた。
【０１２３】
５．３タンパク質ｐ２４に対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
図３は、タンパク質ｐ２４の特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に含めた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でタンパク質ｐ２４による４２時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（群により、ｎ＝５、１０、又は１５）から計算された平均に対応する。
【０１２４】
再度、ワクチン組成物は、得られたＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答に応じていくつかの範疇に分類することができる。最適の応答は、組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ（ＣとＣ’）とＤＮＡ＋ＰＬＡ（Ｆ）により誘導される。３回目の注射は、組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｃ’）の場合に観察された応答をさらに低下させる。組成物ＭＶＡ＋ＰＬＡ（ＢとＢ’）及び組成物ＭＶＡ＋ＭＶＡ（ＡとＡ’）は即時的な強い応答を生成することができ、ＰＬＡのみを使用する方法（ＤとＤ’）は低い応答を誘導する。
【０１２５】
従って我々は、ワクチン組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡがタンパク質ｐ２４の特異的ＩＦＮ−γの分泌を誘導するのに最適の選択であることを証明することができた。
【０１２６】
５．４タンパク質ｐ２４に対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＬ−４応答
図４は、タンパク質ｐ２４の特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＬ−４応答を示す。３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に含めた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でタンパク質ｐ２４による４２時間の刺激に応答して、特異的にＩＬ−４を分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（群により、ｎ＝５、１０、又は１５）から計算された平均に対応する。
【０１２７】
再度、ワクチン組成物は、得られたＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＬ−４応答に応じていくつかの範疇に分類することができる。最適の応答は、組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ（ＣとＣ’）により誘導される。再度、３回目の注射は組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｃ’）により誘導される応答をわずかに改善するのみであるため、必要とは考えられない。組成物ＭＶＡ＋ＰＬＡ（ＢとＢ’）及び組成物ＤＮＡ＋ＰＬＡ（Ｆ）及びＰＬＡ＋ＰＬＡ（ＭＶＡ＋ＭＶＡ（ＤとＤ’）は即時的な強い応答を生成することができ、ＭＶＡのみを使用する方法（ＡとＡ’）は低い応答を誘導する。
【０１２８】
従って我々は、ワクチン組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡがタンパク質ｐ２４の特異的ＩＬ−４の分泌を誘導するのに最適の選択であることを証明することができた。
【０１２９】
５．５サイトカインの分泌
サイトカイン分泌の研究は、ワクチン組成物を投与された動物の免疫活性化状態の表を作成することを可能にする。サイトカインはその性質により４つの群に分類される：
【０１３０】
１）天然の免疫のメディエーター（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８・・・）
２）リンパ球活性化、増殖、及び分化のアクチベーター（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）
３）炎症の非特異的活性化（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−８）
４）未成熟白血球のアクチベーターと分化誘導物質（differentiator）（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
【０１３１】
多重キットの使用により我々は、屠殺した動物から得られた脾臓細胞の培養上清に１０個の異なるサイトカインの分泌を測定することができた。これらのサイトカインは：ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０である。
【０１３２】
試験したワクチン組成物のいずれも、サイトカインＩＬ−１αとＩＬ−１７の顕著な分泌を誘導しない。
【０１３３】
試験したすべての他のサイトカインについて我々は、群間の差を証明することができた。
【０１３４】
図５は、タンパク質ｐ２４の特異的サイトカインＧＭ−ＣＳＦの分泌を示す。利用できる細胞の量から可能な時は、３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に加えた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。分泌試験のために培養する前に、同じ群のマウスから得られた細胞をプールした。Ｙ軸は、タンパク質ｐ２４による３日間の刺激に応答して培養培地中に分泌されたＧＭ−ＣＳＦの濃度（ｐｇ／ｍｌで）を示す。
【０１３５】
サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）は強力免疫刺激物質であり、マクロファージ、好中球、及び好酸球の接着、食作用などの免疫機能を活性化することを可能にする。図５から明らかなように我々は、ＭＶＡに関連して又は関連せずに（ＰＬＡについて注射回数を３回に増やした時は除く）ＰＬＡを含有する群でＧＭ−ＣＳＦの多量の分泌を証明し、ＭＶＡのみで免疫した群はほとんどまたは全くこれを分泌しないことを証明した。
【０１３６】
図６は、タンパク質ｐ２４の特異的なサイトカインＩＬ−５の分泌を示す。利用できる細胞の量から可能な時は、３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に加えた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。分泌試験のために培養する前に、同じ群のマウスから得られた細胞をプールした。Ｙ軸は、タンパク質ｐ２４による３日間の刺激に応答して培養培地中に分泌されたＩＬ−５の濃度（ｐｇ／ｍｌで）を示す。
【０１３７】
試験したすべてのＴｈ２型サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０）について、分泌プロフィールは、図６（これはＩＬ−５の分泌に対応する）に示すものに非常によく似ている。野生型のＭＶＡ（これは正常であり、陰性対照である）を投与された群では、まったく分泌は観察されなかった。ＭＶＡＧａｇ群（２回又は３回の注射）及びＤＮＡとＰＬＡを組合せた群では低濃度が得られた。組成物ＰＬＡとＭＶＡにより免疫したマウス群では、平均的濃度が得られた。ＰＬＡのみを投与された群で最も高い濃度が得られた。従ってサイトカインの分泌は、ワクチン組成物に応じて大体Ｔｈ２型サイトカインに向けられる：
【０１３８】
ＰＬＡのみで免疫した群について、主にＴｈ２型の応答が観察される｛ＩＬ−２のＩＦＮ−γ、Ｔｈ１型サイトカインの分泌は低い（図７）｝、
ＰＬＡとＭＶＡの組合せで免疫した群について、Ｔｈ１とＴｈ２の両方の偏向していない応答、
ＭＶＡ群について、Ｔｈ２型サイトカインの分泌は低い。
【０１３９】
我々はまた、４つの投与したＴｈ２サイトカインが同じ濃度で分泌されないことに注目する。ＩＬ−４とＩＬ−１０は高レベルで分泌される。以下の表は、組成物ＰＬＡとＭＶＡを投与された群で観察された異なるサイトカインの平均濃度を要約する。
【０１４０】
【表５】
0005524486.tif 000006
【０１４１】
インターロイキン４（ＩＬ−４）はＣＤ４＋型のＴリンパ球により分泌される。これは、すでに活性化されたＢリンパ球の増殖と分化を増強し、ＩｇＥ（これは即時型過敏反応で重要な役割を果たす）の産生を促進する。これはまたマクロファージを活性化する。
【０１４２】
インターロイキン５（ＩＬ−５）は、好酸球（これは寄生体感染に対する闘いにおいて重要な役割を果たす）の増殖、分化、及び活性化を刺激する。好酸球数の増加は寄生体の攻撃の兆候のみではなく、防御の手段でもある。ＩＬ−５はＢリンパ球の増殖と免疫グロブリンの分泌を誘導する。これは細胞毒性Ｔリンパ球を活性化する。いくつかの寄生体疾患の治療におけるその使用が企図される。
【０１４３】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂリンパ球の増殖と分化を刺激し、血小板の生成を増強する。これは肝細胞の活性化により、フィブリノゲンや反応性タンパク質Ｃのような炎症タンパク質の分泌を引き起こす。これは炎症を促進する役割を有する。これはいくつかの腫瘍について細胞障害作用を有する。
【０１４４】
図７は、タンパク質ｐ２４の特異的サイトカインＩＬ−２の分泌を示す。利用できる細胞の量から可能な時は、３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に加えた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。分泌試験のために培養する前に、同じ群のマウスから得られた細胞をプールした。Ｙ軸は、タンパク質ｐ２４による３日間の刺激に応答して培養培地中に分泌されたＩＬ−２の濃度（ｐｇ／ｍｌで）を示す。
【０１４５】
ＩＬ−２はＴリンパ球の成長因子である。これは、インターフェロンαを分泌するＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球へのその形質転換を活性化し、これはマクロファージを刺激してＴＮＦαとＴＧＦα（トランスフォーミング増殖因子α）を放出させる。ＩＬ−２はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の増殖と細胞溶解活性を刺激する。これはＢリンパ球の成熟と抗体の合成を刺激する。これはＴｈ１型サイトカインである。
【０１４６】
タンパク質ｐ２４の特異的ＩＬ−２の分泌に応じて、ワクチン組成物をいくつかの範疇に分類することが可能である。最適な応答は、ＭＶＡ＋ＰＬＡ（Ｂ）、次にＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｃ）、ＰＬＡ単独（Ｄ）、及びＭＶＡ単独（Ａ）により誘導される。
【０１４７】
５．６タンパク質ｐ２４の特異的体液性応答
図８は、タンパク質ｐ２４の特異的体液性応答の見かけの動態を示す。３つの連続実験で免疫したすべての動物を分析に加えた。各ワクチン組成物について、この組成物を投与された動物の数をカッコ内に示す。Ｙ軸は、ｐ２４の捕捉のためのＥＬＩＳＡにより測定した抗ｐ２４ＩｇＧの力価を示す；この軸のスケールは対数である。抗体の力価は個々に各マウスについて測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（群により、ｎ＝５、１０、又は１５）から計算された平均に対応する。Ｓ３＝第３週、Ｓ６＝第６週、Ｓ９＝第９週。
【０１４８】
抗ｐ２４体液性応答に関する限り、このシリーズの実験で初めて、注射の回数を増やすことが、測定される免疫応答を顕著に改善することを可能にする。試験した群には無関係に、免疫原注射を２回から３回に変化させると、抗ｐ２４応答が約１ｌｏｇ上昇する（ただし、ＰＬＡのみの群は除き、ここでは上昇は低かったが有意であった）。
【０１４９】
３回注射された群について、ＭＶＡとＰＬＡ又はＰＬＡ単独を含有するすべての組成物は、ＭＶＡ単独で誘導された力価より１ｌｏｇ高い高力価（１０E６）を誘導する。
【０１５０】
同様に、２回注射された群について、ＭＶＡとＰＬＡ又はＰＬＡ単独を含むすべての組成物は、ＭＶＡ単独で誘導された力価より１ｌｏｇ高い高力価を誘導する。
【０１５１】
ワクチン接種計画でＰＬＡからＭＶＡ注射への変更は、抗体力価に悪影響を与えず、ＰＬＡベクターのみで生成されるものに関して細胞性応答を拡張することを可能にする。
【０１５２】
結論
いくつかの組成物では非常に良好な応答を特異的に得られため、分析した応答のタイプにより、最適の組成物は必ずしも同じではない。
【０１５３】
しかしながら、広く強い免疫応答を得るために、最適な組成物は組成物ＰＬＡ＋ＭＶＡである。
【０１５４】
実施例２：ワクチン組成物ＰＬＡ／ｐ２４微粒子とアデノウイルスＧａｇによるマウスの免疫
１．動物モデル
免疫実験は、最初の免疫時に６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｋd）マウスで行った。
【０１５５】
２．投与した免疫原
この実験シリーズでは、以下の免疫原を単独又は組合せて使用した：
【０１５６】
国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号の溶媒排除法に従って調製した微粒子ＰＬＡ／ｐ２４。
【０１５７】
タンパク質ｐ２４をコードする、ＨＩＶ−１ウイルスのＧａｇ遺伝子の組み換え体であるアデノウイルス５型Ｇａｇ（Genethon）。
【０１５８】
増強された緑色蛍光タンパク質の組換え体であるアデノウイルス５型ｅＧＦＰ（Genethon）。これは陰性対照であり、免疫中にウイルスベクターが非特異的免疫応答を誘導するかどうかを測定する。
【０１５９】
ＤＮＡＧａｇ。Ｇａｇ遺伝子（配列番号１）を真核生物発現プラスミドｐｈＣＭＶ（市販されていないプラスミド）でクローン化した。エンドトキシンの無い大量のＤＮＡ調製物を、Macherey-NagelのGigaprepエンドトキシン不含キットを使用して産生した。マウスにおける裸のＤＮＡの筋肉内投与は良好な細胞障害性応答（ＣＴＬ）の誘導を可能にすることが知られているため、当該ＤＮＡは陽性対照となる。
【０１６０】
３．免疫
３０匹のマウスに、上記２に記載の免疫原を０、及び３週に２回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表６に示す。すべての注射は、アデノウイルスとＤＮＡについて筋肉内経路で、ＰＬＡについて皮下で行った。
【０１６１】
【表６】
0005524486.tif 000007
【０１６２】
最後の注射の３週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０１６３】
４．免疫学的分析
実施例１と同じ方法で行った。さらに我々は、ＥＬＩＳＡ法を使用してアデノウイルス５に対する体液性応答を測定した。この操作は、捕捉でアデノウイルス溶解物を使用した以外は、抗ｐ２４ＥＬＩＳＡについて使用したものと同じである。
【０１６４】
５．結果
５．２ＣＴＬ応答
図９は、免疫実験番号第２で得られたＣＴＬ応答を示す。各群は５匹のマウスからなり、個々に分析した。すべての群で非特異的刺激（ペプチド無し）は０であるため、これは示していない。Ｘ軸はエフェクター細胞（ＣＴＬ）対標的細胞（溶解される）の比に対応する。Ｙ軸は平均溶解パーセントに対応する；これはある群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された算術平均である。
【０１６５】
Ａｄ５Ｇａｇ１０7＋ＰＬＡ群の１匹のマウスを除いて、すべての群で５匹のマウスのうちの５匹がＣＴＬ応答を示した。
【０１６６】
試験したウイルスの２回投与について同じことが観察される：組合せＡｄ＋Ａｄ（ＨとＨ’）及びＰＬＡ＋Ａｄ（ＪとＪ’）は、組合せＡｄ＋ＰＬＡ（ＩとＩ’）より良好なＣＴＬ応答を誘導する。
【０１６７】
５．３ＧａｇペプチドＡＭＱに対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
図１０は、ＧａｇペプチドＡＭＱの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でＧａｇペプチドＡＭＱによる１８時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した（各マウスについて１〜５の番号を付けた、すなわちＨ１は、組成物ＨＡｄ５Ｇａｇ１０8ｉｐとＡｄ５Ｇａｇ１０8ｉｐを投与されたマウス１を示す、など）。このグラフに示す数は、三重測定の平均に対応する。
【０１６８】
図１０から留意され得ることは：
１０8では：応答ＰＬＡ＋Ａｄ＞Ａｄ＋Ａｄ＞Ａｄ＋ＰＬＡであり、
１０7では：応答Ａｄ＋Ａｄ≧ＰＬＡ＋Ａｄ＞Ａｄ＋ＰＬＡなことである。組成物Ａｄ＋ＡｄとＰＬＡ＋Ａｄの差はあまり明確ではない。全体としてＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答はＣＴＬ試験と一致する：組成物ＰＬＡ＋Ａｄ及びＡｄ＋Ａｄは、Ａｄ＋ＰＬＡより有効である。
【０１６９】
５．４サイトカインの分泌
実施例１のように我々は、上清中の１０個のサイトカインの分泌を試験した。これらのうち、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、及びＩＦＮ−γは分泌されなかったか、又は非常に低濃度で分泌された。ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１αについてこれらの分泌は、使用した投与法ではタンパク質ｐ２４に特異的ではなかった。これらのサイトカインの分泌を引き起こすのはアデノウイルスによる免疫である可能性が非常に高い。タンパク質ｐ２４の特異的分泌が存在するなら、これはアデノウイルスにより引き起こされると推定される。
【０１７０】
３つの他のサイトカイン｛すなわち、ＩＬ−２（Ｔｈ１）、ならびにＩＬ−４とＩＬ−１０（Ｔｈ２）｝について我々は、タンパク質ｐ２４の特異的分泌を測定することができた。結果を図１１に示す。
【０１７１】
図１１は、タンパク質ｐ２４に特異的なサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０の分泌を示す。各ワクチン組成物を５匹のマウスに投与した。分泌試験のために培養する前に、同じ群のマウスから得られた細胞をプールした。Ｙ軸は、タンパク質ｐ２４による３日間の刺激に応答して培養培地中に分泌された各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍｌで）を示す。
【０１７２】
図１１の結果は以下を示す：
組成物Ａｄ５Ｇａｇ＋Ａｄ５Ｇａｇ（ＨとＨ’）は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はＩＬ−１０のいずれの分泌も与えない。
【０１７３】
組成物ＰＬＡ＋Ａｄ５Ｇａｇ（ＪとＪ’）のみがＩＬ−２とＩＬ−４の分泌を与える。
【０１７４】
組成物ＰＬＡ＋Ａｄ５Ｇａｇ（ＪとＪ’）及びＡｄ５Ｇａｇ＋ＰＬＡ（ＩとＩ’）はＩＬ−１０の分泌を可能にする。
【０１７５】
組成物Ａｄ＋Ａｄ（ＨとＨ’）は、やや偏向したＴｈ−１サイトカイン応答を誘導する（ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γにより測定した）。
【０１７６】
ＩＦＮ−γ（ＥＬＩＳＰＯＴにより）やＩＬ−２のようなＴｈ−１サイトカインのみではなく、ＩＬ−４やＩＬ−１０のようなＴｈ２サイトカインも検出されるため、組成物ＰＬＡ＋Ａｄ５（ＪとＪ’）は偏向していないサイトカイン応答を誘導する。
【０１７７】
５．５体液性応答
図１２は、体液性応答の見かけの動態を示す。図１２（Ａ）は、タンパク質ｐ２４に対する抗体応答を示し、図１２（Ｂ）はアデノウイルスに対する抗体応答を示す。各ワクチン組成物を５匹のマウスに投与した。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡにより測定したＩｇＧの力価を示す；この軸のスケールは対数である。抗体の力価は個々に各マウスについて測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された幾何平均に対応する。Ｓ３＝第３週、Ｓ６＝第６週。
【０１７８】
抗アデノウイルス応答（又は抗ベクター応答）は、Ａｄ＋Ａｄ（ＨとＨ’）より、Ａｄ＋ＰＬＡ（ＩとＩ’）及びＰＬＡ＋Ａｄ（ＪとＪ’）を投与された群で約１ｌｏｇ低い。
【０１７９】
従って、本発明の組成物は、抗アデノウイルス免疫を低下させることを可能にする。
【０１８０】
実施例３：マウスにおけるワクチン組成物ＰＬＡ／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇとミョウバン／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇの比較
１．動物モデル
免疫実験を、最初の免疫時に６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｋd）マウスで行った。
【０１８１】
２．投与した免疫原
この一連の実験では、以下の免疫原を単独又は組合せて使用した。
【０１８２】
国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号の溶媒排除法に従って調製した微粒子ＰＬＡ／ｐ２４。
【０１８３】
ミョウバン／ｐ２４：ミョウバン（Imject Alum, Pierce, カタログ番号７７１６１）を、ＰＢＳで希釈したタンパク質ｐ２４と容量対容量（１：１）で混合した。１回の投与で動物１匹当たり４０μgのｐ２４を投与した。
【０１８４】
タンパク質ｐ２４をコードする、ＨＩＶ−１ウイルスのＧａｇ遺伝子の組換え体であるＭＶＡＧａｇウイルス（Modified Vaccinia Virus Ankara, 弱毒化ワクシニアウイルス、アンカラ株）。組換えウイルスはTransgeneで実施例１に記載のように構築された。
【０１８５】
ＤＮＡＧａｇ。Ｇａｇ遺伝子（配列番号１）は真核生物発現プラスミドｐｈＣＭＶでクローン化された。エンドトキシンの無い大量のＤＮＡ調製物を、Macherey-NagelのGigaprepエンドトキシン不含キットを使用して産生した。マウスにおける裸のＤＮＡの筋肉内投与は、良好な細胞障害性応答（ＣＴＬ）を誘導することを可能にすることが知られているため、当該ＤＮＡは陽性対照となる。
【０１８６】
３．免疫
３０匹のマウスに、上記２に記載の免疫原を第０及び第３週に２回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表７に示す。すべての注射は、筋肉内経路で投与されたＤＮＡ以外は、皮下で実施した。
【０１８７】
【表７】
0005524486.tif 000008
【０１８８】
ｐｆｕ＝プラーク形成単位、これは使用したＭＶＡの用量の測定単位である。ウイルス力価を、使用されたウイルスストックの投与法に従ってｐｆｕで表す。
【０１８９】
最初の注射の６週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０１９０】
４．免疫学的分析
実施例１と同じ方法で行った。さらに我々は、ＥＬＩＳＡ法を使用してＭＶＡに対する体液性応答を測定した。この操作は、捕捉でＭＶＡ溶解物を使用した以外は、抗ｐ２４ＥＬＩＳＡについて使用したものと同じである。
【０１９１】
５．結果
５．１ＧａｇペプチドＡＭＱに対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
図１３は、ＧａｇペプチドＡＭＱの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でＧａｇペプチドＡＭＱによる１８時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。
【０１９２】
この実験で得られたＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答は通常より低い。この低下は試験群と対照群の両方について観察され、これは実験の進行と関連している。このため、互いに異なる組合せを比較する時、この実験は解釈可能なままであり、組成物ＰＬＡ／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇ（Ｃ）が、試験した他の群、すなわちＭＶＡＧａｇ＋ＰＬＡ／ｐ２４（Ｂ）、ＭＶＡＧａｇ＋ミョウバン／ｐ２４（Ｋ）、ミョウバン／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇ（Ｌ）より、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるＩＦＮ−γの良好な分泌を誘導することを明瞭に示す。
【０１９３】
５．２タンパク質ｐ２４に対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
図１４は、タンパク質ｐ２４のＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でタンパク質ｐ２４による４２時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。
【０１９４】
ＩＬ−４型ＥＬＩＳＰＯＴ応答について、最適な免疫原は、組合せＭＶＡＧａｇとＰＬＡ／ｐ２４（ＢとＣ）からなる。この組成物の投与順序には無関係に、得られるＩＬ−４応答は、組成物ＭＶＡＧａｇ＋ミョウバン／ｐ２４（順序には無関係に）（ＫとＬ）、ＰＬＡ／ｐ２４＋ＤＮＡＧａｇ（Ｇ）及びミョウバン／ｐ２４＋ＤＮＡＧａｇ（Ｍ）で誘導されたものより大きい。もし生成物の投与順序を考慮すると、これは逆の組合せＭＶＡＧａｇ＋ＰＬＡ／ｐ２４（Ｂ）より良好な結果を与える組成物ＰＬＡ／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇ（Ｃ）である。
【０１９５】
５．３タンパク質ｐ２４の特異的体液性応答
図１５は、タンパク質ｐ２４の特異的体液性応答の見かけの動態を示す。Ｙ軸は、ｐ２４捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した抗ｐ２４ＩｇＧの力価を示す；この軸のスケールは対数である。抗体の力価は個々に各マウスについて測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。Ｓ２＝第２週、Ｓ４＝第４週、Ｓ６＝第６週。
【０１９６】
特異的タンパク質ｐ２４抗体応答の誘導のために、最適な免疫原は再度組合せＭＶＡＧａｇとＰＬＡ／ｐ２４（ＢとＣ）からなる。この組成物の投与の順序には無関係に、得られた抗Ｐ４ＩｇＧの力価は、第６週で組成物ＭＶＡＧａｇ＋ミョウバン／ｐ２４（順序には無関係に）（ＫとＬ）、ＰＬＡ／ｐ２４＋ＤＮＡＧａｇ（Ｇ）、及びミョウバン／ｐ２４＋ＤＮＡＧａｇ（Ｍ）により誘導されるものより０．６〜１．２ｌｏｇ高い。もし生成物の投与順序を考慮すると、逆の組合せＭＶＡＧａｇ＋ＰＬＡ／ｐ２４（Ｂ）より良好な結果（しかしわずかに０．４ｌｏｇである）を与える組成物ＰＬＡ／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇ（Ｃ）である。
【０１９７】
５．４ＭＶＡウイルスの特異的体液性応答
図１６は、ＭＶＡウイルスの特異的体液性応答の見かけの動態を示す。Ｙ軸は、ＭＶＡの捕捉のためにＥＬＩＳＡにより測定した抗ＭＶＡＩｇＧの力価を示す。この軸のスケールは対数である。抗体の力価は個々に各マウスについて測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。Ｓ４＝第４週、Ｓ６＝第６週。
【０１９８】
ＰＬＡ／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇ（Ｃ）群とミョウバン／ｐ２４＋ＭＶＡＧａｇ（Ｌ）群では、ＭＶＡを第３週に投与した。図１６から明らかなように、抗ＭＶＡ応答は分析の時点（第６週）では樹立されるのに充分な時間が無かった。一方最初にＭＶＡ注射を受けた群では、抗ベクター応答を測定することができる。驚くべきことに第４週から、ＭＶＡＧａｇ＋ＰＬＡ／ｐ２４（Ｂ）群では抗ＭＶＡ応答は、ＭＶＡＧａｇ＋ミョウバン／ｐ２４（Ｋ）群よりはるかに低かった。さらに組合せＭＶＡＧａｇ＋ＰＬＡ／ｐ２４では、抗ＭＶＡ力価は時間とともに上昇せず、これは組合せＭＶＡＧａｇ＋ミョウバン／ｐ２４の場合は異なっていた。
【０１９９】
ＭＶＡとともにＰＬＡは抗ＭＶＡ抗体応答を制限することを可能にするが、組合せＭＶＡ＋ミョウバンの場合は異なっていた。これは非常に興味深く、免疫とワクチン接種応用にとって非常に有用な性質である。
【０２００】
結論
本発明の組成物ＰＬＡ／ｐ２４及びＭＶＡＧａｇは、組成物ミョウバン／ｐ２４やＭＶＡＧａｇより良好な細胞応答及び体液性応答を誘導することを可能にする。さらにこれらは、抗ベクター応答を制限することを可能にする。
【０２０１】
実施例４
ワクチン組成物ＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇの鼻内投与
１．動物モデル
免疫実験は、最初の免疫時に６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｋd）マウスで行った。
【０２０２】
２．投与した免疫原
この一連の実験シリーズでは、以下の免疫原を単独又は組合せて使用した。
【０２０３】
国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号の溶媒排除法に従って調製した微粒子ＰＬＡ／ｐ２４。
【０２０４】
タンパク質ｐ２４をコードする、ＨＩＶ−１ウイルスのＧａｇ遺伝子の組換え体であるＭＶＡＧａｇウイルス（Modified Vaccinia Virus Ankara, 弱毒化ワクシニアウイルス、アンカラ株）。組換えウイルスをTransgeneですでに記載のように構築した。
【０２０５】
３．免疫
１０匹のマウスに上記２に記載の免疫原を０、１０及び２０日に３回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表８に示す。すべての注射は鼻内に行った。
【０２０６】
【表８】
0005524486.tif 000009
【０２０７】
ｐｆｕ＝プラーク形成単位、これは使用したＭＶＡの用量の測定単位である。ウイルス力価は、使用したウイルスストックの投与法に従ってｐｆｕで表す。
【０２０８】
最初の注射の３２日後に動物を屠殺した。血液、膣分泌物、便、脾臓、及び生殖器（膣）を免疫学的分析のために採取した。
【０２０９】
４．免疫学的分析
実施例１と同じ方法で行った。
【０２１０】
５．結果
実験データの要約
【表９】
0005524486.tif 000010
【０２１１】
ＥＬＩＳＰＯＴは、分析した１０E６細胞当たりのサイトカイン分泌細胞の数を測定する。
【０２１２】
【表１０】
0005524486.tif 000011
【０２１３】
【表１１】
0005524486.tif 000012
【０２１４】
組合せＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇの鼻内投与は、血液と脾臓の採取物中で測定される全身性免疫応答と、粘膜レベル、特に泌尿生殖器のレベルで末梢血免疫応答との両方を誘導することを可能にする。各場合に、免疫系の２つの領域が活性化される：これらの２つの部位のレベルで、タンパク質ｐ２４に対する細胞応答及び体液性応答を証明することが可能である。泌尿生殖器のレベルで広い末梢血応答を誘導する能力は、予防または治療目的のワクチンの応用で、組合せＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇの大きな利点を構成する。
【０２１５】
実施例５：ＰＬＡ／ベータ−ｇａｌ微粒子とＭＶＡベータ−ｇａｌウイルスのワクチン組合せによるマウスの免疫
１．動物モデル
免疫実験を、最初の免疫時に６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｋd）マウスで行った。
【０２１６】
２．投与した免疫原
この一連の実験では、以下の免疫原を単独又は組合せて使用した：
国際特許公開第ＷＯ２００５／０２７８７１号の溶媒排除法に従って調製した微粒子ＰＬＡ／ベータ−ｇａｌ。
酵素ベータガラクトシダーゼ（ベータ−ｇａｌ）をコードする、大腸菌（E. coli ）のｌａｃＺ遺伝子の組換え体であるＭＶＡベータ−ｇａｌウイルス（Modified Vaccinia Virus Ankara, 弱毒化ワクシニアウイルス、アンカラ株）。組換えウイルスはTransgeneで構築され、上記したように産生、精製された。
【０２１７】
３．免疫
３５匹のマウスに上記２に記載の免疫原を０〜３週に２回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表１０に示す。すべての注射は皮下に行った。
【０２１８】
【表１２】
0005524486.tif 000013
【０２１９】
ｐｆｕ＝プラーク形成単位、これは使用したＭＶＡの用量の測定単位である。ウイルス力価は、使用したウイルスストックの投与法に従ってｐｆｕで表す。
【０２２０】
最初の注射の６週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０２２１】
４．免疫学的分析
体液性応答と細胞応答を以下のように調べた：
細胞応答：マウスを屠殺後、脾臓を無菌的に取り出し、細胞懸濁物を調製した。ＥＬＩＳＰＯＴは、特異的刺激に応答してあるサイトカインを分泌する細胞の数を測定することを可能にする。我々は、Ｔｈ１型のサイトカインＩＦＮ−γに関心がある。脾臓から得られた細胞懸濁物をインビトロでペプチドＴＰＮ（ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ−配列番号３）で２０時間再刺激し、ＣＤ８型の応答を分析した。ＰＶＤＦ膜を有する９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（Multiscreen IP, Millipore）を抗ＩＦＮ−γ抗体で被覆した。再刺激中に、各細胞により分泌されるサイトカインを捕捉するように、脾臓細胞の懸濁物をこれらのプレートでインキュベートした。関連するサイトカインを分泌する各細胞に対応するスポットを、関連するサイトカインの特異的ビオチン化検出抗体により証明した。
【０２２２】
体液性応答：屠殺する前にマウスから血液を採取した。抗ベータ−ｇａｌ抗体の存在はＥＬＩＳＡにより測定した。タンパク質ベータ−ｇａｌを捕捉で使用し、血清中に存在する特異抗体を、検出抗体としてのポリクローナル抗マウス抗体により証明した｛これは西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたAffinipureヤギ抗マウスＩｇＧ抗体である（Ｈ＋Ｌ、Jackson Immunoresearch, カタログ番号１１５−０３５−０６２）｝。力価は、使用したＥＬＩＳＡプロトコールで０．１ＯＤ単位の吸光度が得られる希釈倍数の逆数である。
【０２２３】
５．結果
５．１ＧａｇペプチドＡＭＱに対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
結果は、ベータ−ｇａｌペプチドＴＰＨの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す図１７に示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でベータ−ｇａｌペプチドＴＰＨによる１８時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答は各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。
【０２２４】
これらの結果は、ワクチン組合せを、得られたＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答に応じていくつかの範疇に分類することができることを示す。最適の応答は、組合せＰＬＡ＋ＭＶＡで別々の注射（Ｏ）又は２つの同時注射（Ｓ）により誘導される。ＰＬＡ＋ＭＶＡの１回の同時投与により即時型応答が得られる（Ｑ群とＲ群）。単一の免疫原ＰＬＡのみ（Ｍ）又はＭＶＡのみ（Ｎ）を含有する群では、より低い応答が得られる。
【０２２５】
従ってベータガラクトシダーゼにおいても我々は、ワクチン組合せＰＬＡ＋ＭＶＡが、ペプチドＴＰＨの特異的ＩＦＮ−γの分泌を誘導するのに、組合せＭＶＡ＋ＭＶＡより優れていることを証明することができた。さらに試験したすべての組合せＰＬＡ＋ＭＶＡの中で、Ｏ群（ＰＬＡの次にＭＶＡ）が最適の結果を得ることを可能にしたため、注射の順序も重要なようであった。これはｐ２４モデル（実施例１）で最も有効であることが証明された組合せと同じであることに注意されたい。
【０２２６】
５．２タンパク質ベータ−ｇａｌの特異的体液性応答
結果は、タンパク質ベータ−ｇａｌの特異的体液性応答の見かけの動態を比較する図１８に示す。Ｙ軸は、ベータ−ｇａｌ捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した抗ベータ−ｇａｌ  ＩｇＧの力価を示す；この軸のスケールは対数である。抗体の力価は個々に各マウスについて測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。Ｓ３＝第３週、Ｓ６＝第６週。
【０２２７】
これらの結果は、ＰＬＡ＋ＰＬＡ群（Ｍ）について最適の結果が得られることを示す。各注射（Ｓ）でＰＬＡとＭＶＡを投与されたマウスで誘導された力価が同等である。Ｏ、Ｐ、Ｑ、及びＲ群では、力価は約１ｌｏｇだけ低い。試験したすべての組合せの中で、抗ベータ−ｇａｌ抗体の最も弱いインデューサーはＭＶＡ＋ＭＶＡである。ベータガラクトシダーゼモデルではｐ２４モデルのように、ＭＶＡとＰＬＡを含有するすべての組合せが、ＭＶＡ単独により誘導される力価より１ｌｏｇ高い高力価を誘導する。
【０２２８】
実施例１（ｐ２４）と同様にワクチン接種計画でＰＬＡからＭＶＡ注射への変更は、得られる抗体力価に悪影響を与えず、ＰＬＡベクターのみで生成されるものと比較して細胞応答を拡張することを可能にする。
【０２２９】
ＰＬＡ＋ＭＶＡ（Ｓ）免疫は、分析した応答のタイプにより最適の免疫応答を誘導することを可能としないが、全体としてこれは、最も広く最も強力応答が観察される群である。
【０２３０】
実施例６：ＣＰＬ／ｐ２４微粒子とＭＶＡＧａｇウイルスのワクチン組合せによるマウスの免疫
１．動物モデル
免疫実験は、最初の免疫時に６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｋd）マウスで行った。
【０２３１】
２．投与した免疫原
この一連の実験では、以下の免疫原を単独又は組合せて使用した。
【０２３２】
この試験で使用したＣＰＬ微粒子は、２つの多糖｛キトサン（Mahtani chitosan PVT、バッチ１２４）とデキストラン硫酸（Sigma: 31404）｝の共沈殿により生成される。２つのポリマーを、あらかじめ５０ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ４の水に溶解する。その溶液を、１２時間磁気攪拌した後、粒子を沈殿させる。２０ｍｌの０．１％キトサン溶液（モル量は１０５０００ｇ／ｍｏｌでアセチル化度は９）を９．３５ｍｌの０．１％デキストラン硫酸溶液と混合する。１０００ｒｐｍで磁気攪拌している過剰の溶液に、欠損溶液を迅速に注ぐ。混合物を攪拌器上に５００ｒｐｍで３０秒放置し、次に７８００ｇで３０分遠心分離する。転倒させて上清を捨て、残渣を水に取り、次に再度８０００ｇで３０分遠心分離する。こうして得られた残渣を水に取り、周囲温度で絶えず攪拌して維持する。得られた粒子は、サイズの測定（Coulter粒度計）と電荷の測定（Malvern Zeasizer）により解析される。
【０２３３】
ＣＰＬ上へのタンパク質ｐ２４の吸着のために、リン酸緩衝液１０ｍＭ  ｐＨ５．７中の１ｇ／ｌのｐ２４を、１％の固形分のＣＰＬ粒子と容量対容量で混合する（すなわち最終的に０．５％）。試料を回転板上で、周囲温度で２０時間攪拌する。インキュベーション後、チューブを回収し、１８００ｇ、２０℃で１０分間遠心分離する。上清を回収し、３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離して、懸濁物中に残っている可能性のある粒子を除去し、次にタンパク質濃度をＢＣＡ適量を使用して測定する（BCA Protein Assay kit, Pierce: 23225）。残渣を４０μｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に取る。得られた粒子をサイズと電荷を測定して解析する。
【０２３４】
ｐ２４をコードするＨＩＶ−１ウイルスのＧａｇ遺伝子の組み換え体であるＭＶＡＧａｇウイルス（Modified Vaccinia Virus Ankara, 弱毒化ワクシニアウイルス、アンカラ株）。組換えウイルスをTransgeneで上記したように産生し、精製した。
【０２３５】
３．免疫
３５匹のマウスに上記２に記載の免疫原を０〜３週に２回投与した。各群のマウスに投与したワクチン組成物を以下の表１１に示す。すべての注射は皮下に行った。
【０２３６】
【表１３】
0005524486.tif 000014
【０２３７】
ｐｆｕ＝プラーク形成単位、これは使用したＭＶＡの用量の測定単位である。ウイルス力価は、使用したウイルスストックの投与法に従ってｐｆｕで表す。
【０２３８】
最初の注射の６週間後に動物を屠殺し、血液と脾臓を免疫学的分析のために採取した。
【０２３９】
４．免疫学的分析
実施例１と同じ方法に従って行った。
【０２４０】
５．結果
５．１ＧａｇペプチドＡＭＱに対するＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答
結果を、ｐ２４ペプチドＡＭＱの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す図１９に示す。Ｙ軸は１００万個の刺激細胞でｐ２４ペプチドＡＭＱによる１８時間の刺激に応答して、特異的にＩＦＮ−γを分泌する細胞の平均数を示す。この応答を各マウスについて個々に測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。
【０２４１】
これらの結果は、ワクチン組合せを、得られたＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答に応じていくつかの範疇に分類することができることを示す。最適の応答は、組合せＭＶＡ＋ＭＶＡ（Ｕ）により誘導される。２つめの範疇は、別々の注射（Ｖ）又は２つの同時注射（Ｚ）の組合せＣＰＬ＋ＭＶＡを含有する。ＣＰＬとＭＶＡ（ＸとＹ）の１回の同時投与は、高いＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を誘導するのに充分有効である。最後に組合せＣＰＬ＋ＣＰＬ（Ｔ）はあまり有効ではない。
【０２４２】
組合せＰＬＡ＋ＭＶＡについては、組合せＣＰＬ＋ＭＶＡがペプチドＡＭＱの特異的ＩＦＮ−γの分泌を誘導するのに有効である。しかし２つの免疫原の同時注射は、３週間離れた投与（Ｚ対Ｖ）について性能を改良することを可能としない。
【０２４３】
５．２タンパク質ｐ２４の特異的体液性応答
結果を、タンパク質ｐ２４の特異的体液性応答の見かけの動態を比較する図２０に示す。Ｙ軸は、ｐ２４の捕捉についてＥＬＩＳＡにより測定した抗ｐ２４  ＩｇＧの力価を示す；この軸のスケールは対数である。抗体の力価を、個々に各マウスについて測定した。このグラフに示す数は、群のすべてのマウス（ｎ＝５）から計算された平均に対応する。Ｓ３＝第３週、Ｓ６＝第６週。
【０２４４】
これらの結果は、２回注射された群について、ＣＰＬとＭＶＡを含むすべての組合せ（Ｖ、Ｗ、Ｚ）又はＣＰＬ単独（Ｔ）が、ＭＶＡ単独で誘導される力価より２〜３ｌｏｇ高い高力価（１０E６）を誘導することを示す。しかし組合せＣＰＬ＋ＭＶＡ（Ｖ）は、逆の順序の注入（Ｗ）より有効である。ＣＰＬとＭＶＡの１回のみの注射を受けた群（ＸとＹ）では、抗体の力価はさらに低かったが、それでもＭＶＡ単独で得られるものよりは高かった。
【０２４５】
組合せＰＬＡ＋ＭＶＡと同様に、ワクチン接種計画でＣＰＬからＭＶＡ注射への変更は、得られる抗体力価に悪影響を与えず、ＰＬＡベクターのみで生成されるものと比較して細胞応答を大きく上昇させることを可能にする。
【０２４６】
結論
すべての実施例から、コロイド性合成生体吸収性ベクター（例えばＰＬＡ、ＣＰＬ）及びウイルスベクター（例えばＭＶＡ及びアデノウイルス）の組合せが、有効で広い免疫応答を誘導することを可能にすることを、我々は証明可能である。最も有効であるためには、組合せは好ましくは合成ベクター、次にウイルスベクターの順で投与することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】図１は、タンパク質ｐ２４と一緒にしたポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（以後ＰＬＡ／ｐ２４と呼ぶ）の微粒子に基づく合成ベクターと、Ｇａｇ配列を含むウイルスベクターＭＶＡ（以後ＭＶＡＧａｇウイルスと呼ぶ）とを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた、免疫実験１中のＣＴＬ応答を示す。
【図２】図２は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のＧａｇＡＭＱペプチドの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。
【図３】図３は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のタンパク質ｐ２４の特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。
【図４】図４は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のタンパク質ｐ２４の特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＬ−４応答を示す。
【図５】図５は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のタンパク質ｐ２４の特異的サイトカインＧＭ−ＣＳＦの分泌を示す。
【図６】図６は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のタンパク質ｐ２４の特異的サイトカインＩＬ−５の分泌を示す。
【図７】図７は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のタンパク質ｐ２４の特異的サイトカインＩＬ−２の分泌を示す。
【図８】図８は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた３つの免疫実験中のタンパク質ｐ２４の特異的体液性応答の見かけの動態を示す。
【図９】図９は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターアデノウイルスＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫実験番号第２におけるＣＴＬ応答を示す。
【図１０】図１０は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターアデノウイルスＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後のＧａｇＡＭＱペプチドの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。
【図１１】図１１は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターアデノウイルスＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後のサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０のタンパク質ｐ２４の特異的分泌を示す。
【図１２】図１２は、合成ベクターＰＬＡ／ｐ２４とウイルスベクターアデノウイルスＧａｇとを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後の、タンパク質ｐ２４（１２Ａ）又はアデノウイルス（１２Ｂ）の特異的体液性応答の見かけの動態を示す。
【図１３】図１３は、ＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含むか又はミョウバン／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含む組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後のＧａｇＡＭＱペプチドの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を比較する。
【図１４】図１４は、ＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含むか又はミョウバン／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含む組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後のリンｐ２４の特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＬ−４応答を比較する。
【図１５】図１５は、ＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含むか又はミョウバン／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含む組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後のタンパク質ｐ２４の特異的体液性応答の見かけの動態を比較する。
【図１６】図１６は、ＰＬＡ／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含むか又はミョウバン／ｐ２４とＭＶＡＧａｇを含む組成物を含む異なるワクチン組成物を用いた免疫後のＭＶＡウイルスの特異的体液性応答の見かけの動態を比較する。
【図１７】図１７は、合成ベクターＰＬＡ−ベータ−ｇａｌとウイルスベクターＭＶＡベータ−ｇａｌを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いたマウスの免疫後のベータ−ｇａｌ  ＴＰＨの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。
【図１８】図１８は、合成ベクターＰＬＡ−ベータ−ｇａｌとウイルスベクターＭＶＡベータ−ｇａｌを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いたマウスの免疫後のベータ−ｇａｌの特異的体液性応答の見かけの動態を比較する。
【図１９】図１９は、合成ベクターＣＰＬ−Ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いたマウスの免疫後のペプチドｐ２４  ＡＭＱの特異的ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γ応答を示す。
【図２０】図２０は、合成ベクターＣＰＬ−Ｐ２４とウイルスベクターＭＶＡＧａｇを含む本発明の組成物を含む異なるワクチン組成物を用いたマウスの免疫後のペプチドｐ２４  ＡＭＱの特異的体液性応答の見かけの動態を比較する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0005524486.tif 000029
【図１６】
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【図１７】
0005524486.tif 000031
【図１８】
0005524486.tif 000032
【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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