(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの縮合部位がＦｌａｖａｎ−３−ｏｌの４−６位の炭素間で縮合した構造である３量体以上のプロシアニジンを有効成分とし、
前記プロシアニジンがリンゴ、ブドウ種子、ピーナッツ渋皮、及び松樹皮からなる群より選択される植物に由来することを特徴とするレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品。
【請求項２】
前記プロシアニジンの含有量が５０％以上である、請求項１に記載のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体と酸化ＬＤＬとの結合を阻害する阻害用医薬品、及び当該阻害用医薬品を含む動脈硬化予防医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本を含む先進国において、生活環境の変化や食生活の変化による様々な生活習慣病の患者が増加している。主要な生活習慣病として糖尿病、高血圧症、高脂血症等が挙げられ、これらの疾患の発症者が増加している。また、重篤な症状に至らなくともその兆候を示す、いわゆる予備軍も増加の傾向を示している。そして、これらの生活習慣病は、しばしば重篤な疾患の原因となる。
【０００３】
動脈硬化性疾患は、生活習慣病から引き起こされる疾患の１つであり、高脂血症、特に高コレステロール血症が主要な要因であるとされている。現在のところ、動脈硬化性疾患等の循環器疾患の予防や治療を目的とする薬剤や特定保健用食品は、血中のコレステロールや中性脂肪の濃度（量）を低下させることを指標に認定がなされている。例えば、コレステロール合成阻害薬のスタチンや、中性脂肪の血中濃度を低下させるＰＰＡＲアゴニストは、虚血性心疾患等の循環器疾患に対して効果を示し、広く使われている。
【０００４】
動脈硬化性疾患及びその主要原因たる生活習慣病は慢性疾患であることから、効果的な予防のためには、長期間安全に服用可能であって効果的な予防剤が望まれる。例えば、動脈硬化の予防に効果的な薬剤として、リンゴ由来ポリフェノールを有効成分として含有してなることを特徴とするアディポネクチン調節剤が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）は脂肪細胞に特異的に高発現する分泌蛋白質として発見されたが、その後の研究で単球の血管内皮細胞への接着や、平滑筋細胞の増殖を抑制するなど、抗動脈硬化的な作用を持つことが明らかとなっており、血中のアディポネクチン量を調節することにより、抗動脈硬化的な作用が奏される。
【０００５】
リンゴ由来ポリフェノールには、様々な作用効果が報告されており、その中には脂質代謝に関する作用効果もある。例えば、リンゴ由来ポリフェノールに含まれているプロシアニジンは、膵臓リパーゼを阻害し、このため、トリグリセリドの吸収が抑制されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００６】
また、ＬＤＬ（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の酸化によって生成する酸化ＬＤＬは、動脈硬化に対して促進的に機能することが分かっており、血中の酸化ＬＤＬ量を低減することにより、抗動脈硬化作用が奏される。例えば、プロアントシアニジンを乾燥重量換算で９５重量％未満の割合で含む松樹皮抽出物を有効成分とする動脈硬化予防剤が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。松樹皮抽出物は血管における高い脂質の酸化抑制効果を有しており、このため、松樹皮抽出物を服用することにより酸化ＬＤＬの血中量を低減させることができる。
【０００７】
一方、酸化ＬＤＬによる動脈硬化促進作用は、酸化ＬＤＬがレクチン様酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１；Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）を介して血管内皮細胞に取り込まれるために生ずると考えられている。ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞の酸化ＬＤＬ受容体として同定されたが、現在では、炎症、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、カテーテル治療後の血管再狭窄等の循環器疾患を促進する因子として知られている。つまり、酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１との結合及び血管内皮細胞への取り込みを抑制することによっても、抗動脈硬化作用が得られる。
【０００８】
このようなＬＯＸ−１阻害作用を有する予防剤として、コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を有効成分として含有する、ＬＯＸ−１アンタゴニスト作用を有する組成物（例えば、特許文献３参照。）や、ミカン科に属する植物抽出物を有効成分として含有してなり、ＬＯＸ−１アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤（例えば、特許文献４参照。）等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−１９３５０２号公報
【特許文献２】特開２００５−２３０３２号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３８１号公報
【特許文献４】特開２００７−３２０９５６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】スギヤマ（Sugiyama）、外６名、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Journal of Agricultural and Food Chemistry）、２００７年、第５５巻、第４６０４〜４６０９ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１及び２に記載の予防剤は、スタチン等と同様に、血中脂質レベルを抑制することによって動脈硬化を予防することを目的とする。これに対して、特許文献３及び４に記載の予防剤は、酸化ＬＤＬ等の動脈硬化惹起性リポタンパク質の作用点をブロックすることを目的とする、全く新しいメカニズムによる予防・治療法である。
しかしながら、これらの予防剤による酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１との結合及び血管内皮細胞への取り込みに対する抑制効果は十分であるとは言い難く、より効果的な動脈硬化予防剤が求められている。
【００１２】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、優れたレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害作用を有する化合物を同定し、ＬＯＸ−１が増悪因子として働く疾患、特に動脈硬化性疾患の治療・予防に有用な医薬品を提供することを目的とする。
【００１３】
なお、本発明及び本願明細書において、「レクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害作用」とは、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合を阻害し、酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害する作用を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記先行技術を踏まえ、さらに高いレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害作用をもつものを探索した結果、プロアントシアニジンの中でも３量体以上のものに特に強い効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）少なくとも１つの縮合部位がＦｌａｖａｎ−３−ｏｌの４−６位の炭素間で縮合した構造である３量体以上のプロシアニジンを有効成分とし、前記プロシアニジンがリンゴ、ブドウ種子、ピーナッツ渋皮、及び松樹皮からなる群より選択される植物に由来することを特徴とするレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品、
（２）前記プロシアニジンの含有量が５０％以上であることを特徴とする、前記（１）に記載のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品及びそれを用いた動脈硬化予防医薬品は、酸化ＬＤＬのレクチン様酸化ＬＤＬ受容体への結合を阻害し、酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを効果的に抑制することができる。また、本発明のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品等の有効成分であるプロシアニジンは、従来から飲食品に含まれている化合物であって、長期間服用したとしてもほとんど副作用が報告されていない、安全性の高い化合物である。このため、本発明のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品等を継続的に摂取することにより、動脈硬化性疾患を効果的に予防し、当該疾患に罹患するリスクを低減させ得ることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１において、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）の測定結果を、プロシアニジンの重合度ごとに示した図である。
【図２】実施例２において、算出された酸化ＬＤＬ取込率（％）を、プロシアニジンの重合度ごとに示した図である。
【図３】実施例３において、各ポリフェノールを添加した場合の酸化ＬＤＬ取込率（％）を示した図である。
【図４】実施例４において、各種プロシアニジンを添加した場合の酸化ＬＤＬ結合率（％）を示した図である。
【図５】実施例５において、４種類の構造の異なる３量体プロシアニジンを添加した場合の酸化ＬＤＬ結合率（％）を示した図である。
【図６】実施例７において、ＡＰを経口摂取させたラットの腸管膜動脈中の脂質の染色像（Ａ）、及び腸管膜動脈中に観察された脂質沈着個数（Ｂ）を示した図である。
【図７】実施例７において、ＡＰを経口摂取させたラットの血中酸化ＬＤＬ濃度を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
プロシアニジンは、Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌが４−８位若しくは４−６位の炭素間で繰り返し縮合した構造の化合物であり、代表的なプロシアニジンは（＋）−カテキンと（−）−エピカテキンが４−８位もしくは４−６位の炭素間で繰り返し縮合した構造をしている。プロシアニジンは、Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌが６位又は８位のどちらに結合するかといった結合位置の違い、どのＦｌａｖａｎ−３−ｏｌが結合するのかといった結合種の違い、さらには結合した単量体の間で生じる立体配座の影響により、複雑な構造をとる。
【００１９】
本発明者らは、ヒトＬＯＸ−１タンパク質と酸化ＬＤＬとの結合を測定するＥＬＩＳＡ系を用いて、約５００種類の食品素材の中からレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害作用（以下、「ＬＯＸ−１阻害作用」）を有する化合物を探索した。ＥＬＩＳＡ系は、Satoらの方法（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２００８年、第２００巻第２号、第３０３〜３０９ページ参照。）を改良して行った。この結果、リンゴ由来ポリフェノールにＬＯＸ−１阻害作用があることが見出された。さらに、細胞表面にＬＯＸ−１を発現している細胞に対して、リンゴ由来ポリフェノールの存在下で酸化ＬＤＬを反応させると、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合が阻害され、引いては細胞内への酸化ＬＤＬの取り込みも阻害されることを、すなわち、リンゴ由来ポリフェノールがＬＯＸ−１阻害作用を有することを、新たに見出した。また、このリンゴ由来ポリフェノールによるＬＯＸ−１阻害作用は、主にプロシアニジン、特に３量体以上のプロシアニジンにおいて強く観察されることも見出した。
【００２０】
本発明のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品（以下、「ＬＯＸ−１阻害用医薬品」）は、３量体以上のプロシアニジンを有効成分とすることを特徴とする。プロシアニジンが有するＬＯＸ−１阻害作用は、プロシアニジンの重合度に依存し、重合度の大きいプロシアニジンほど、高いＬＯＸ−１阻害作用を有する。本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品は、重合度が３以上という比較的大きなプロシアニジン類化合物を有効成分とすることにより、重合度が２以下のプロシアニジン類化合物（２量体若しくは単量体のプロシアニジン）又は重合度別に精製していないプロシアニジンよりも、顕著に優れたＬＯＸ−１阻害作用を奏することができる。なお、プロシアニジンが有するＬＯＸ−１阻害作用がプロシアニジンの重合度に依存することは、本発明者らによって初めて見出された知見である。
【００２１】
本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品は、特定の重合度のプロシアニジンのみを有効成分とするものであってもよく、重合度が相違する複数種類のプロシアニジンの混合物を有効成分とするものであってもよい。本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品においては、後述する原料植物から抽出・精製したプロシアニジンの中から、１量体及び２量体のプロシアニジンを除いた、重合度が３以上の全てのプロシアニジンを有効成分として用いることが好ましい。
なお、本願明細書において、「１量体のプロシアニジン」はカテキン類（カテキンやエピカテキン）を意味する。
【００２２】
また、本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品の有効成分としては、重合度が３以上のプロシアニジンであればよく、特定の構造の化合物に限定されるものではない。重合度が３以上であれば、いずれの構造を有するプロシアニジンであっても、ＬＯＸ−１阻害作用を有するためである。なお、少なくとも１つの縮合部位がＦｌａｖａｎ−３−ｏｌの４−６位の炭素間で縮合した構造であるプロシアニジンや、末端がエピカテキンであるプロシアニジンが、比較的強いＬＯＸ−１阻害作用を有するため、これらの構造を有するプロシアニジンが有効成分として含まれていることが好ましい。
【００２３】
３量体以上のプロシアニジンは、公知の有機合成法により合成したプロシアニジンであってもよく、プロシアニジンを含有する植物を原料として、この原料植物からプロシアニジン画分を得た後に重合度に基づいて精製した天然のプロシアニジンを用いてもよい。天然のプロシアニジンは、例えば、原料植物からプロシアニジンを抽出した抽出物からプロシアニジンを含有するプロシアニジン画分を得た後、このプロシアニジン画分からカラムクロマトグラフィー法等により重合度が３以上のプロシアニジンを精製することにより得ることができる。
【００２４】
原料植物としては、例えば、バラ科のリンゴ、オトギリソウ科のマンゴスチン、モクセイ科のオリーブ、ブドウ科のブドウ、ツツジ科のクランベリーやコケモモ、ザクロ科のザクロ、ユキノシタ科のカシス、アオギリ科のカカオ、マメ科の大豆（黒豆）やラッカセイ（ピーナッツ）、松等の樹皮等が挙げられる。これらの植物のうち、プロシアニジン含有量の比較的多い組織や抽出し易い組織を原料として用いることができる。本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品の有効成分としては、リンゴ、ブドウ、ピーナッツ、又は松由来のプロシアニジンであることが好ましく、リンゴの果実、ブドウの種子、ピーナッツの渋皮、松の樹皮から抽出・精製したプロシアニジンであることがより好ましい。中でも、リンゴの果実由来のプロシアニジンであることが特に好ましい。
【００２５】
原料植物からのプロシアニジンの抽出は、プロシアニジンを損なうことなく植物から抽出可能な方法であれば特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、原料植物から果実、種子、葉、茎、樹皮等の組織を採取し、適宜細断・粉砕処理等を行った後、水やアルコール類等の有機溶媒中で加熱抽出を行うことにより、プロシアニジンを含む抽出物を得ることができる。有機溶媒を用いて抽出した場合には、蒸留法等により抽出物から有機溶媒を除去してもよい。また、リンゴ等の果実の場合には、常法により得られる原料果実の搾汁果汁を抽出物とすることもできる。なお、搾汁果汁や有機溶媒を除去した抽出物は、そのままでも使用することは可能であるが、遠心分離やろ過等の工程を経て、清澄な果汁若しくは抽出物としたものを使用することが好ましい。
【００２６】
このようにして得られた抽出物から、常法によりプロシアニジン画分を得る。プロシアニジン画分は、１段階の精製操作により調製してもよく、多段階の精製操作を行うことにより調製してもよい。例えば、原料植物から得られた抽出物から、ポリフェノールを吸着し得る吸着剤等を用いてポリフェノール画分を分離精製し、得られたポリフェノール画分から、吸着クロマトグラフィー法等を用いて、プロシアニジン画分を精製することができる。
【００２７】
ポリフェノールを吸着し得る吸着剤としては、例えば、イオン交換樹脂や合成吸着樹脂、シリカゲル等の吸着剤、ゲルろ過剤等が挙げられる。抽出物中のポリフェノールの吸着剤への吸着や溶出は、常法により行うことができる。例えば、吸着剤を充填したカラムに原料植物から得られた抽出物を通液し、ポリフェノール類を吸着させる。なお、カラムに通液する前に、当該抽出物のｐＨを４〜９、好ましくは５〜７、より好ましくは５〜６に調整しておく。続いて該カラムに純水又は脱イオン水（ｐＨ５〜７）を十分に通液して、カラム中の非吸着物質（糖類、有機酸類等）を除去した後、アルコール溶媒、例えば、１０〜９０％、好ましくは３０〜８０％のエタノールでポリフェノールを溶出させることができる。このようにして得られるポリフェノール画分は、プロシアニジンを主要成分とし、その他にも、クロロゲン酸等のカフェ酸誘導体（エステル）やｐ−クマル酸誘導体、フラバン−３−オール類（カテキン類）、ケルセチン配糖体等のフラボノール類、フロレチン配糖体等のカルコン類等のポリフェノール類が含まれている。
【００２８】
ポリフェノール画分からのプロシアニジン画分の分離精製に用いる吸着クロマトグラフィーのカラム固定相としては、前述の吸着剤と同様のものを用いることができる。なお、カラムに通液する前に、当該ポリフェノール画分のｐＨを４〜９、好ましくは５〜７、より好ましくは５〜６に調整しておく。さらに、溶出前に、カラムを純水又は脱イオン水（ｐＨ５〜７）にて十分に洗浄しておくことが好ましい。また、溶出溶媒（移動相）としては、カラム固定相からのプロシアニジンの溶出時間と、プロシアニジン以外のポリフェノールの溶出時間とを十分に相違させることが可能な溶媒であればよく、カラム固定相の種類や使用する装置等を考慮して適宜決定することができる。
【００２９】
例えば、メタノールに溶解させたポリフェノール画分を、シリカゲルをカラム固定相とし、溶出溶媒としてヘキサン−メタノール−アセトンを用いたバイナリグラジエント溶出による吸着クロマトグラフィーにより、プロシアニジン以外のポリフェノールを、プロシアニジンよりも先に溶出させることができ、かつ、プロシアニジンを重合度の小さいものから順次溶出させることができる（例えば、非特許文献１参照。）。したがって、標準品等を用いて予め各重合度のプロシアニジンの溶出時間を調べておくことにより、所望の重合度のプロシアニジンのみを含むプロシアニジン画分を得ることができる。また、３量体のプロシアニジン以降の溶出画分を全て回収することにより、重合度が３以上の全てのプロシアニジンを含む画分を得ることもできる。その他、例えば、２量体のプロシアニジン以降の溶出画分を回収して濃縮・凍結乾燥後、再度メタノールに溶解させて、同様に吸着クロマトグラフィーにより分離することによって、所望の重合度のプロシアニジン画分を、より精製度の高い状態で回収することができる。
【００３０】
本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品の有効成分としては、上記手法により得られたプロシアニジン画分をそのまま用いてもよく、該プロシアニジン画分を濃縮した濃縮液を用いてもよい。例えば、２５〜１００℃、好ましくは３５〜９０℃で減圧濃縮することにより、該プロシアニジン画分からメタノール等の溶媒を除去し、濃縮することができる。また、得られたプロシアニジン画分を濃縮後、得られた濃縮液をそのままあるいはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥処理することにより、粉末状としたものを用いてもよい。さらに、粉末状のプロシアニジンを、エタノール等の有機溶媒やクエン酸等の有機酸等に溶解させることにより、好ましい溶剤に溶解させたプロシアニジンとしたものを用いてもよい。なお、プロシアニジンを溶解させる溶剤としては、例えば、エタノール等の有機溶媒やクエン酸などの有機酸等を用いることができる。
【００３１】
本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品に含有される３量体以上のプロシアニジンの量は、ＬＯＸ−１阻害作用が奏されるために十分な量であれば特に限定されるものではなく、プロシアニジンの精製度、剤型、又は摂取方法等を考慮して適宜決定することができる。本発明においては、より十分なＬＯＸ−１阻害作用を奏することができるため、３量体以上のプロシアニジンの含有割合は、ＬＯＸ−１阻害用医薬品の５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、１００％であることがさらに好ましい。
【００３２】
また、本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品は、３量体以上のプロシアニジンによるＬＯＸ−１阻害作用を損なわない限りにおいて、その他の成分を含有していてもよい。例えば、賦形剤、安定化剤、保存剤、粘度調製剤等の、通常用いられている補助的な原料や添加物を含有させることができる。
【００３３】
本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品は、服用により優れたＬＯＸ−１阻害効果が得られるため、ＬＯＸが増悪因子として働く疾患、例えば炎症、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、カテーテル治療後の血管再狭窄等の治療又は予防を目的として摂取される医薬品の有効成分として添加されることが好ましい。特に、本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品を有効成分とする、すなわち、３量体以上のプロシアニジンを有効成分とすることにより、安全性に優れ、かつ予防効果の高い動脈硬化予防医薬品を製造することができる。
【００３４】
本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品を有効成分とする動脈硬化予防医薬品（以下、本発明の動脈硬化予防医薬品）は、常法により製造することができる。また、これらを製造するにあたり、通常用いられている補助的な原料や添加物を添加することができる。このような原料及び添加物としては、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存料等が挙げられる。
【００３５】
また、本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品又は本発明の動脈硬化予防医薬品の剤型としては、ＬＯＸ−１阻害作用が奏される剤型であれば特に限定されるものではなく、錠剤、液剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等が挙げられる。
【００３６】
本発明の動脈硬化予防医薬品中の３量体以上のプロシアニジン量は、ＬＯＸ−１阻害作用が奏されるために十分な量であれば特に限定されるものではなく、プロシアニジンの精製度、剤型、又は摂取方法や、摂取対象者の性別、年齢、体重、健康状況等を考慮して適宜決定することができる。
【００３７】
ＬＯＸ−１阻害効果及び動脈硬化予防効果を得るために、本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品又は動脈硬化予防医薬品に、３量体以上のプロシアニジンを、例えば、３量体以上のプロシアニジンの摂取量が乾燥重量として成人１日当たり１０〜３０００ｍｇ、好ましくは３０〜１０００ｍｇとなるように含有させることができる。また、本発明のＬＯＸ−１阻害用医薬品及び動脈硬化予防医薬品は、１日に１〜数回に分けて経口摂取してもよい。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［調製例１  リンゴ由来ポリフェノール（ＡＰ）の調製］
青森県産リンゴ幼果３００ｋｇを破砕、圧搾し果汁２１０ｋｇを得た。得られた果汁にペクチナーゼを３０ｐｐｍとなるよう加えて清澄化し、遠心分離後、珪藻土（シリカ３００Ｓ、中央シリカ社製）ろ過により、さらに清澄化を行い、清澄果汁を得た。清澄果汁を吸着樹脂（ダイアイオンＳＰ−８５０、三菱化学社製）を充填したカラムに通液し、ポリフェノール類を吸着させた。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物質（糖類、有機酸類等）を除去したのち、４０％アルコールでポリフェノール類を溶出した。得られたポリフェノール画分からアルコールを減圧濃縮し、抽出粉末（ＡＰ）約２ｋｇを調製した。抽出粉末中の成分を、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した結果、クロロゲン酸類（約２０重量％）、フロレチレン配糖体類（約５重量％）、フラボノール類（約１５重量％）、プロシアニジン（約５０重量％）及びその他褐変物質（約１０重量％）からなることが確認できた。さらに、このプロシアニジン類は、マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、アプライドバイオシステム社製）による解析の結果、フラボノール類であるカテキンやエピカテキンから構成される２量体から１５量体までのオリゴマーやポリマーであることが確認された（Ｍ．Ｏｈｎｉｓｈｉ−ｋａｍｅｙａｍａ，ｅｔ．ａｌ．、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、１９９７年、第１１巻、第３１〜３６ページ参照。）
以下の実施例においてＡＰを使用する場合には、この抽出粉末ＡＰを生化学用試薬グレードのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬社製）に懸濁したものを、反応溶液のＤＭＳＯの終濃度が１％以下となるように、超純水を用いて適宜希釈して使用した。
【００４０】
［調製例２  重合度別のプロシアニジンの調製］
非特許文献１に記載の手法（吸着クロマトグラフィー法）に準じて、ＡＰからプロシアニジンを重合度ごとに分離精製した。
まず、上記で調製した粉末状のＡＰを、メタノールに溶解させた後、シリカゲルが充填されたカラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＰＲＥＰ−ＳＩＬ（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライし、溶出溶媒としてヘキサン−メタノール−アセトンを用いたバイナリグラジエント溶出を行った。これにより、プロシアニジン以外のポリフェノールが先に溶出され、その後、プロシアニジンが重合度の小さいものから順次溶出された。２量体のプロシアニジン以降に溶出されたフラクションを全て回収し、これをプロシアニジン画分とした。
次いで、このプロシアニジン画分を濃縮・凍結乾燥後、再度メタノールに溶解させて、同様に吸着クロマトグラフィーにより分離し、各重合度のプロシアニジンの画分を別個に回収した。但し、８量体以上のプロシアニジンは全て１の画分として回収した。これらの回収された画分は、濃縮・凍結乾燥後、生化学用試薬グレードのＤＭＳＯ（和光純薬社製）により懸濁させて使用した。なお、以下の実施例において使用する場合には、このＤＭＳＯ懸濁液を、反応溶液のＤＭＳＯの終濃度が１％以下となるように、超純水を用いて適宜希釈して使用した。
なお、本調製例では、ＡＰを用いているが、他の植物由来ポリフェノールを用いた場合でも、同様に、各重合度のプロシアニジンの画分を別個に調製することが可能である。
【００４１】
［調製例３  ｅｘ−ｈＬＯＸ−１の作製］
ｈｕｍａｎ  ＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ００２５４３）のうち、細胞外ドメイン（ｅｘ−ｈＬＯＸ−１）をコードする領域（６１〜２７３番目の塩基配列）を、発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ／ＦＲＴ／Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込み、さらに、ｅｘ−ｈＬＯＸ−１のＮ末端にＩｇＫ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌが付加されるように当該シグナルをコードする塩基配列を組み込むことにより、ｅｘ−ｈＬＯＸ−１発現用プラスミドを作製した。このプラスミドを、２９３Ｆ細胞に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションし、ｅｘ−ｈＬＯＸ−１を発現させた。トランスフェクションした細胞を４日間培養した後、培養液からＮｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｃａｒｔｒｉｄｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて発現させたタンパク質ｅｘ−ｈＬＯＸ−１を回収した。
【００４２】
［調製例４  ｅｘ−ｈＬＯＸ−１を固定したＥＬＩＳＡ用プレートの作製］
まず、調製例３において作製したｅｘ−ｈＬＯＸ−１を、ＰＢＳを用いて５μｇ／ｍｌとなるように調整したタンパク質溶液を、３８４ウェルのＥＩＡ  Ｐｌａｔｅ（ＧＲＥＩＮＥＲ社製、製品番号：７８１０６１）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。このプレートを４℃で一晩静置することにより、ウェルにｅｘ−ｈＬＯＸ−１を固定した。その後、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、３％ＢＳＡ含有ＨＥＰＥＳバッファーを、８０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注してブロッキング処理を行った。その後さらに、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄したものをＥＬＩＳＡ用プレートとした。なお、ＢＳＡは、Ｓｉｇｍａ社のＡ−７８８８を、ＨＥＰＥＳバッファーは１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌとなるように、ＧＩＢＣＯ社の１５６３０とＷＡＫＯ社の１９１−０１６６５を用いて調整したものをｐＨ７．０に調整したものを、それぞれ用いた。
【００４３】
［調製例５  酸化ＬＤＬの作製］
まず、健常人からＡＣＤ（ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）含有バッファーが添加されている採血管に採取した血液から血漿を分離回収した。得られた血漿に臭化カリウムを加えて比重を１．０１９に調整した後、５８０００ｒｐｍで２０時間遠心分離処理を行った。得られた下層を別のチューブに移し、臭化カリウムにて比重を１．０６３に調整した後、５８０００ｒｐｍで２０時間遠心分離処理を行った。なお、超遠心機は、Ｂｅｃｋｍａｎ社製のＬ−８０を使用した。回収した上層を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ（ｔａｋａｒａ社製）を用いて、ＰＢＳを外液として透析し（外液４回交換）、精製ヒトＬＤＬを得た。
ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてタンパク質量を測定し、精製ヒトＬＤＬ濃度が３ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで調整した溶液に、硫酸銅を７．５μＭとなるように添加した後、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１６時間インキュベートした。続いて、当該溶液を、２ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を外液として透析し（外液４回交換）、ヒト酸化ＬＤＬを得た。
【００４４】
［調製例６  ＤｉＩ標識酸化ＬＤＬの作製］
作製したヒト酸化ＬＤＬを、２ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いて希釈し、１ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。このヒト酸化ＬＤＬ溶液に、終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるようにＤｉＩ（＃Ｄ２８２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるようにＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｅｒｕｍ（ｓｉｇｍａ社製）を、それぞれ添加し、３７℃で１８時間反応させた。なお、ＤｉＩは、３０μｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに懸濁した溶液を用いた。反応後、塩化ナトリウムと臭化カリウムにて比重を１．１５に調整した後、５８０００ｒｐｍで２０時間遠心分離処理を行った。回収した上層を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ（ｔａｋａｒａ社製）を用いて、２ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を外液として透析し（外液４回交換）、ＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを得た。
【００４５】
［調製例７  ＴｅｔＯｎ  ｈＬＯＸ−１  ＣＨＯ細胞の作製］
テトラサイクリン発現調節システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを添加することによりｈＬＯＸ−１の発現誘導が可能な培養細胞を作製した。なお、細胞の培養培地としては、終濃度が１０％となるようにＦＢＳを、終濃度が１％となるようにＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃｓ（ｇｉｂｃｏ社製）を、それぞれ添加したＨａｍ‘ｓ  Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ｇｉｂｃｏ社製）を用いた。
まず、ｈｕｍａｎ  ＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ００２５４３）を発現ベクターｐＴＲＥ２ｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に組み込んだｈＬＯＸ−１発現用ベクターを作製した。このｈＬＯＸ−１発現用ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１  Ｔｅｔ−Ｏｎ  ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にトランスフェクトした。培養培地に、終濃度が４００μｇ／ｍｌとなるようにｈｙｇｒｏｍｙｓｉｎＢ（ｗａｋｏ社製）を、終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにＧ４１８（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を、それぞれ添加して培養することにより、ｈＬＯＸ−１発現用ベクターが導入された細胞を選抜し、これをＴｅｔＯｎ  ｈＬＯＸ−１  ＣＨＯ細胞として用いた。
【００４６】
［調製例８  抗ＬＯＸ−１抗体の作製］
抗ＬＯＸ−１抗体は、Sawamuraらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、第３８６巻、第７３〜７ページ参照。）に準じて製造した。
即ち、ｈＬＯＸ−１を発現しているＣＨＯ細胞を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理（室温、５分間）した後、プロテアーゼ阻害剤含有緩衝液〔２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．２５Ｍ  シュークロース、及びプロテアーゼ阻害剤（１０Ｕ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ、２μｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、５０μｇ／ｍＬ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、及び０．３５ｍｇ／ｍＬ  ＡＰＭＳＦ）〕中に懸濁し、ポッター式ホモゲナイザーで破砕し、低速遠心分離処理（１５００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。次いで、上清を回収し、超遠心分離処理（１００，０００×ｇ、１時間、４℃）し、沈殿した膜画分を回収しリン酸緩衝液中に懸濁し−２０℃で保存した。この懸濁液を、ヒト抗体の作製（免疫源）として用いた。
得られた細胞膜画分を正常マウスに免疫し、ｈＬＯＸ−１に対するマウスモノクローナル抗体を調製した。
モノクローナル抗体の作製は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、ｐ６６−７４、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）に記載される一般的方法に従って調製した。
なお、抗ＬＯＸ−１抗体とは、ＬＯＸ−１を抗原とした特異抗体であり、抗原抗体反応によりＬＯＸ−１のアンタゴニストとして作用するものをいう。
【００４７】
［実施例１  ＥＬＩＳＡによるＬＯＸ−１とプロシアニジンの結合評価］
Satoらの方法（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２００８年、第２００巻第２号、第３０３〜３０９ページ参照。）をさらに改良した方法により、調製例１及び２において調製したＡＰ及び各重合度のプロシアニジンのＬＯＸ−１との結合性を評価した。具体的には、調製例４で作製したＥＬＩＳＡ用プレートと、調製例５で作製した酸化ＬＤＬを用いて、反応溶液にプロシアニジン等を添加した場合に、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬの結合が阻害されるかどうかを調べた。
まず、前記ＥＬＩＳＡ測定用バッファーに、終濃度が２５０ｎｇ／ｍｌとなるように酸化ＬＤＬを、終濃度が１２．５、２５、５０、１００、２００、又は４００μｇ／ｍｌとなるように各種プロシアニジン（ＡＰを含む）を、それぞれ添加して調製したサンプルを、ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに４０μｌずつ、それぞれ分注した。このプレートを室温で２時間静置した後、各ウェルをＰＢＳで５回洗浄した。次いで、１％ＢＳＡ及び２ｍＭＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳバッファーを用いて５００倍希釈した抗ヒトアポリポプロテインＢ抗体ａｎｔｉ  Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ＰＥＲＯＸ（ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  site：ＰＰ０８６）の希釈液を、各ウェルに５０μｌずつ分注した後、室温で１時間静置した。静置後、各ウェルをＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、製品番号：６８−１２−２（Ａ）  ２７２２−８４−１（Ｂ））を用いてＴＭＢを発色させた。各ウェルに２Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４８】
図１は、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）の測定結果を、プロシアニジンの重合度ごとに示した図である。図中、「Ｘｍｅｒ」はＸ量体のプロシアニジンを、「≦８ｍｅｒ」は８量体以上のプロシアニジンを、それぞれ意味する。吸光度が小さいほど、ＬＯＸ−１と結合した酸化ＬＤＬが少なく、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合が、プロシアニジン又はＡＰによって阻害されていることを示す。この結果、ＡＰがＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合を阻害すること、すなわち、ＬＯＸ−１阻害作用を有することが明らかとなった。また、このＬＯＸ−１阻害作用は、プロシアニジンにおいても観察されたことから、ＡＰによるＬＯＸ−１阻害作用は主にプロシアニジンによるものと推察された。特に、３量体以上のプロシアニジンが、強いＬＯＸ−１阻害作用を有することが分かった。
【００４９】
［実施例２  ＬＯＸ−１発現細胞による酸化ＬＤＬの取り込み阻害評価］
続いて、プロシアニジンがどの程度ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬの結合を阻害するかを、ＬＯＸ−１を発現している細胞への酸化ＬＤＬ取り込み量により評価した。具体的には、ヒトＬＯＸ−１を強制過剰発現させたＣＨＯ細胞（以下、ＬＯＸ−１発現細胞）が酸化ＬＤＬを取り込むことを利用して、ＬＯＸ−１を介した蛍光標識酸化ＬＤＬの取り込みに対する、ＡＰ及びプロシアニジンによる影響を観察した。なお、ＬＯＸ−１発現細胞として、調製例７において作製したＴｅｔＯｎ  ｈＬＯＸ−１  ＣＨＯ細胞を、蛍光標識酸化ＬＤＬとして調製例６において作製したＤｉＩ標識酸化ＬＤＬをそれぞれ用いた。また、ＡＰ及びプロシアニジンは、調製例１及び２で調製したＡＰ及び各重合度のプロシアニジンを用いた。
まず、前記の培養培地により１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整したＬＯＸ−１発現細胞溶液を、９６ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ社製、製品番号：３６０３）の各ウェルに１００μｌずつ、それぞれ分注した。また、ＬＯＸ−１の発現誘導をかけるため、終濃度が１μｇ／ｍｌとなるようにｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を添加した。この９６ウェルプレートを３７℃で２４時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、各ウェルをＦＢＳ（−）培地で洗浄した。なお、ＦＢＳ（−）培地は、前記の培養培地からＦＢＳのみを除いた培地である。
次いで、ＦＢＳ（−）培地により０．３、１、３、又は１０μｇ／ｍｌとなるように調整した各種プロシアニジン（ＡＰを含む）を、各ウェルに１００μｌずつそれぞれ分注した後、３７℃で１時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。各ウェルをＦＢＳ（−）培地で洗浄した後、ＦＢＳ（−）培地により１μｇ／ｍｌとなるように調整したＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを、各ウェルに１００μｌずつそれぞれ分注し、３７℃で２時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。各ウェルをＦＢＳ（−）培地で２回洗浄した後、各ウェルに１０％中性緩衝ホルマリン液（ｗａｋｏ社製）を添加して細胞固定処理を行い、さらに、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液（ｓｉｇｍａ社製）を添加して核染色を行った。
この９６ウェルプレートをＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、各ウェル当たりのＤｉＩ蛍光強度及び核数を測定した。測定結果から、下記式（１）により、一細胞当たりの蛍光強度を求めた。
式（１）：  一細胞当たりの蛍光強度  ＝［ウェル当たりのＤｉＩ蛍光強度］／［ウェル当たりの核数］
【００５０】
さらに、下記式（２）により、酸化ＬＤＬ取り込み率（％）を算出した。なお、Ａは各種プロシアニジン（ＡＰを含む）を添加しなかったウェルの一細胞当たりの蛍光強度であり、ＢはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを添加しなかったウェルの一細胞当たりの蛍光強度であり、Ｘは各種プロシアニジン（ＡＰを含む）とＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを添加したウェルの一細胞当たりの蛍光強度である。
式（２）：  酸化ＬＤＬ取込率（％）＝（Ｘ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）×１００
【００５１】
図２は、算出された酸化ＬＤＬ取込率（％）を、プロシアニジンの重合度ごとに示した図である。図中の「Ｘｍｅｒ」及び「≦８ｍｅｒ」は図１と同様である。この結果、酸化ＬＤＬ取込率が低下していることから、実施例１の結果と同様に、ＡＰ及び２量体以上のプロシアニジンは、濃度依存的に、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合を阻害することが確認された。特に、３量体以上のプロシアニジンは、ＡＰよりも、低濃度において高いＬＯＸ−１阻害効果を奏することが分かった。一方、１量体のプロシアニジンではＬＯＸ−１阻害作用は観察されなかった。
なお、本実施例のように、ＬＯＸ−１発現細胞と蛍光標識酸化ＬＤＬを用いたアッセイ系により、動脈硬化が抑制されたか否かを指標とする他の動脈硬化抑制剤の選抜方法とは異なり、様々な循環器疾患増悪に関与するＬＯＸ−１に焦点を絞り、ＬＯＸ−１に対する阻害物質を選抜することができる。
【００５２】
［実施例３  他の植物由来のプロシアニジンの酸化ＬＤＬの取り込み阻害評価］
リンゴ以外の他の植物由来のプロシアニジンも、同様にＬＯＸ−１阻害作用を有するか否かを調べた。なお、プロシアニジンに代えて、プロシアニジンを多く含有する各種ポリフェノール〔ＡＰ（調製例１で調製したもの）、ブドウ種子由来ポリフェノール（キッコーマン社製、商品名：グラヴィノール）、ピーナッツ渋皮由来ポリフェノール（岸本産業社製）、及び松樹皮由来ポリフェノール（トレードピア社製）〕を測定試料として用いた。
具体的には、各種プロシアニジンに代えて、ＦＢＳ（−）培地により１０μｇ／ｍｌとなるように調整した各種ポリフェノールを用いた以外は、実施例２と同様にして測定を行い、酸化ＬＤＬ取り込み率（％）を算出した。なお、各ポリフェノールに代えて、これらと等濃度のＤＭＳＯ溶液を添加したものをブランクとした。
図３は、ブランク又は各ポリフェノールを添加した場合の酸化ＬＤＬ取込率（％）を示した図である。この結果、さらに、ＡＰにおいて観察された酸化ＬＤＬとＬＯＸ−１との結合抑制作用は、他のプロシアニジン含有素材である、松樹皮、ぶどう種子、ピーナッツ渋皮由来のポリフェノールにおいても同様に観察され、これらがＬＯＸ−１阻害作用を有することが確認された。
各ポリフェノールは、ＡＰと同様にプロシアニジンを多く含有しているため、本実施例の結果から、各ポリフェノールから分離精製した３量体以上のプロシアニジンも、各ポリフェノールと同様にＬＯＸ−１阻害作用を有することが分かる。
【００５３】
［実施例４  ＬＯＸ−１発現細胞による酸化ＬＤＬの結合阻害評価］
細胞内への酸化ＬＤＬの取り込みは、ＬＯＸ−１を介したもの以外にも、カベオラやクラスリンも作用しているといわれている。そこで、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合に対する阻害効果をより直接的に評価するために、細胞を低温条件下に置いてエンドサイトーシスを抑制した条件で、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合をプロシアニジンが阻害するかを評価した。
まず、前記の培養培地により１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整したＬＯＸ−１発現細胞溶液を、９６ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ社製、製品番号：３６０３）の各ウェルに１００μｌずつ、それぞれ分注した。また、ＬＯＸ−１の発現誘導をかけるため、終濃度が１μｇ／ｍｌとなるようにｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を添加した。なお、コントロールとして、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを添加せず、発現誘導をかけないウェルも調製した。この９６ウェルプレートを３７℃で２４時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、各ウェルを、４℃に冷却した前記のＦＢＳ（−）培地で洗浄した。
この９６ウェルプレートを、氷上で３０分間、冷蔵庫中で静置した後、４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地により０．１μｇ／ｍｌとなるように調整した各種プロシアニジン（ＡＰを含む）を、各ウェルに１００μｌずつそれぞれ分注した後、氷上で１時間、冷蔵庫中で静置した。この際、各種プロシアニジンに代えて、これらと等濃度になうようにＤＭＳＯを添加した４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地を分注したものをブランクとした。また、各種プロシアニジンに代えて、４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地により０．３μｇ／ｍｌとなるように調整した抗ＬＯＸ−１抗体溶液を分注したものをポジティブコントロールとした。なお、抗ＬＯＸ−１抗体は、調製例８において作製したものを用いた。
各ウェルを４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地で洗浄した後、４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地により１μｇ／ｍｌとなるように調整したＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを、各ウェルに１００μｌずつそれぞれ分注し、氷上で１時間、冷蔵庫中で静置した。各ウェルを４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地で２回洗浄した後、各ウェルに４℃に冷却した１０％中性緩衝ホルマリン液（ｗａｋｏ社製）を添加して細胞固定処理を行い、常温に戻した後、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液（ｓｉｇｍａ社製）を添加して核染色を行った。
この９６ウェルプレートをＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、各ウェル当たりのＤｉＩ蛍光強度及び核数を測定し、実施例２と同様にして一細胞当たりの蛍光強度を求めた。
さらに、下記式（３）により、酸化ＬＤＬ結合率（％）を算出した。なお、Ａ、Ｂ、及びＸは、上記式（２）と同様である。
式（３）：  酸化ＬＤＬ結合率（％）＝（Ｘ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）×１００
【００５４】
図４は、各種プロシアニジンを添加した場合の酸化ＬＤＬ結合率（％）を示した図である。図中の「Ｘｍｅｒ」及び「≦８ｍｅｒ」は図１と同様である。また、「誘導なし」は、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを添加せず、発現誘導をかけなかったウェルの結果を示している。この結果、ＬＯＸ−１の発現を誘導させなかったウェルではほとんど酸化ＬＤＬは結合していなかった。また、ＬＯＸ−１と結合することが分かっている抗ＬＯＸ−１抗体を添加したウェルでは酸化ＬＤＬ結合率が５３％程度であり、酸化ＬＤＬとの結合が阻害されたことが確認できた。これらの結果から、本実施例のアッセイ系が、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合に対する各種プロシアニジンの影響を測定できることが確認できた。
図４に示すように、ＡＰ及び２量体以上のプロシアニジンは、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合を阻害することが確認された。特に、３量体以上のプロシアニジンは、ＡＰよりも高いＬＯＸ−１阻害効果を奏することが分かった。一方、１量体のプロシアニジンではＬＯＸ−１阻害作用は観察されなかった。
【００５５】
［実施例５  構造の異なるプロシアニジンによる酸化ＬＤＬの結合阻害評価］
プロシアニジンの構造により、ＬＯＸ−１阻害作用の効果が相違するかを調べた。
調製例２において調製した３量体プロシアニジンを、逆相クロマトグラフィーによりさらに構造ごとに分離精製し、これを用いて、実施例４と同様にして酸化ＬＤＬの結合阻害を評価した。
まず、調製例２において調製された３量体プロシアニジンを、水に溶解させた後、カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、４μｍ  φ２０×２５０ｍｍ）にアプライし、移動層を２０％メタノールとして、流速が１２．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度が４０℃の条件で溶出した。ＵＶ検出器を用いて、溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定したところ、保持時間（溶出時間）が１４〜２４分の間に３本のピークが、４０〜５５分の間に１本のピークが、検出された。
各ピークの画分の再精製を行った。まず、保持時間が１４〜２４分間の画分を濃縮し凍結乾燥後、再度水に溶解させて、カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、４μｍ  φ２０×２５０ｍｍ）にアプライし、移動層を１５％メタノールとして、流速が１２．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度が４０℃の条件で溶出した。ＵＶ検出器を用いて、溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定したところ、保持時間が３３〜３７分の間に１本（ｐｅａｋ１）、４０〜４４分の間に１本（ｐｅａｋ２）、及び４８〜５８分の間に１本（ｐｅａｋ３）のピークが、それぞれ検出された。
これとは別に、１回目の逆相クロマトグラフィーにおける保持時間が４０〜５５分の間の画分を濃縮し凍結乾燥後、再度水に溶解させて、カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、４μｍ  φ２０×２５０ｍｍ）にアプライし、移動層を２０％メタノールとして、流速が１２．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度が４０℃の条件で溶出した。ＵＶ検出器を用いて、溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定したところ、保持時間が４０〜５５分の間に１本のピーク（ｐｅａｋ４）が、検出された。
ｐｅａｋ１〜４の各画分は、それぞれ濃縮・凍結乾燥後、生化学用試薬グレードのＤＭＳＯ（和光純薬社製）により懸濁させて使用した。酸化ＬＤＬの結合阻害を測定する際には、反応溶液のＤＭＳＯの終濃度が１％以下となるように、超純水を用いて適宜希釈して使用した。
【００５６】
各ピークの３量体プロシアニジンの構造を調べたところ、表１の化合物であることが分かった（J.Agric.Food Chem., 2003, vol.51, p3806-3813）。表中、「ｅｐｉ」はエピカテキンを、「ｃａｔ」はカテキンを、「（４β→８）」は４−８位の炭素間で縮合した構造であることを、意味する。
【００５７】
【表１】
0005569716.tif 000002
【００５８】
次いで、これら４種の３量体プロシアニジンのＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合に対する阻害効果を評価した。具体的には、４℃に冷却したＦＢＳ（−）培地により０．１μｇ／ｍｌとなるように調整した各種３量体プロシアニジンを用いた以外は、実施例４と同様にして行った。
図５は、ブランク又は４種類の構造の異なる３量体プロシアニジンを添加した場合の酸化ＬＤＬ結合率（％）を示した図である。図中の「３ｍｅｒ」及び「誘導なし」は図４と同様である。この結果、構造ごとに精製した４種類の３量体プロシアニジン（ｐｅａｋ１〜４）は、いずれも高いＬＯＸ−１阻害効果を示した。特に、ｐｅａｋ２及び３の３量体プロシアニジンがｐｅａｋ１及び４の３量体プロシアニジンよりもＬＯＸ−１阻害作用が強かったことから、縮合部位がＦｌａｖａｎ−３−ｏｌの４−６位の炭素間で縮合した構造であるプロシアニジンや、末端がエピカテキンであるプロシアニジンが、比較的強いＬＯＸ−１阻害作用を有することが示唆された
【００５９】
なお、ｐｅａｋ１〜４のいずれも、分離精製前の３量体プロシアニジン（図５中、「３ｍｅｒ」）よりもＬＯＸ−１阻害作用が強かった。これは、分離精製前の３量体プロシアニジンには、表１記載の４種の３量体プロシアニジン以外にも何らかの不純物が混入していたためと考えられる。実際に、１回目の逆相クロマトグラフィーにおいて、ｐｅａｋ１よりも前、ｐｅａｋ３とｐｅａｋ４の間、及びｐｅａｋ４の後において、明確なピークは検出できないものの、２８０ｎｍの吸光度がベースラインよりも高かったことから、何らかの化合物が溶出されており、プロシアニジン以外の何らかの不純物が含まれていることが示唆される。
【００６０】
［実施例６  ＢＩＡＣＯＲＥ測定によるＬＯＸ−１とプロシアニジンの結合評価］
プロシアニジンとＬＯＸ−１の直接的な結合を、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて評価した。ＬＯＸ−１タンパク質は、調製例３において作製したタンパク質ｅｘ−ｈＬＯＸ−１を用いた。一方、プロシアニジンは、調製例２において調製した各重合度のプロシアニジン（１〜７量体）と、実施例５において３量体プロシアニジンからｐｅａｋ３として分離精製したｅｐｉ(４β→６)ｅｐｉ(４β→８)ｅｐｉ（以下、「３量体ｐｅａｋ３」ということがある。）と、を用いた。
センサーチップ上にＬＯＸ−１を固定し、プロシアニジンを液相としてＢＩＡＣＯＲＥ測定を行った。ＢＩＡＣＯＲＥ測定及び解析は、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。また、センサーチップとしてセンサーチップＣＭ５を用い、アミンカップリング法を用いて、タンパク質ｅｘ−ｈＬＯＸ−１をセンサーチップ上に固定化した。ランニングバッファーとして、ＨＥＰＥＳ溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）を脱気したものを用いた。
チップに流すプロシアニジンのうち、１〜７量体のプロシアニジンは、それぞれ、ランニングバッファーを用いて２０μＭに調整したものを測定に用いた。一方、３量体ｐｅａｋ３は、同じくランニングバッファーを用いて、２０、１０、５、２．５、１．２５μＭの濃度にそれぞれ調整したものを測定に用いた。
また、センサーチップへプロシアニジンを反応させる時には、流速２０μｌ／ｍｉｎとし、結合１２０秒、乖離１２０秒で乖離定数を測定した。一方、再生時には、流速６０μｌ／ｍｌｎで５０ｍＭ  ＮａＯＨを５秒間流し、プロシアニジンとＬＯＸ−１の結合を乖離させた。
【００６１】
各プロシアニジンの乖離定数の測定結果を表２に示す。その結果、１量体以外のプロシアニジンにおいて、ＬＯＸ−１との結合が見られた。また、重合度が高くなるほど乖離定数が小さくなっており、ＬＯＸ−１と強く結合していることが明らかとなった。この結果は、ＥＬＩＳＡ法やＬＯＸ−１発現細胞を用いて測定された結果と一致している。この結果より、プロシアニジン類はＬＯＸ−１に直接的に結合し、酸化ＬＤＬとＬＯＸ−１の結合を阻害しているといえる。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
［実施例７  プロシアニジンによる動脈硬化予防効果の評価］
動脈硬化の評価系として用いられているＳＨＲ−ＳＰラット腸間膜脂質沈着数評価系を用いて、プロシアニジンの動脈硬化に対する影響を観察した。
まず、８週齢のＳＨＲ−ＳＰラット８匹に対して、２週間、ＡＰを１％含有させた高脂肪食と生理食塩水とを自由摂食自由飲水させた（ＡＰ１％群）。一方、コントロールとして、同じく８週齢のＳＨＲ−ＳＰラット８匹に対して、２週間、ＡＰを含有させていない高脂肪食と生理食塩水とを自由摂食自由飲水させた（コントロール群）。２週間経過後、血清を採取し、調製例５と同様にして作製した酸化ＬＤＬを検量線として、ＥＬＩＳＡ法により血中酸化ＬＤＬ濃度を測定した。さらに、解剖して各ラットから腸間膜動脈を取り出し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（染色剤）により腸間膜動脈中の脂質を染色し、脂質沈着個数を測定した。図６（Ａ）は、ラットの腸管膜動脈中の脂質の染色像であり、図６（Ｂ）は、ラットの腸管膜動脈中に観察された脂質沈着個数を示した図である。図６（Ａ）中、動脈（図中の白色チューブ）中の黒丸点が脂質沈着部位である。また、図７は、ラットの血中酸化ＬＤＬ濃度を示した図である。
この結果、図６に示すように、コントロール群に比べＡＰ１％群では、有意に脂質沈着個数の減少が見られ、ＡＰを摂取することにより、動脈硬化が予防し得ることが確認された。一方、図７に示すように、両群では、血中酸化ＬＤＬ濃度に差は見られなかった。このため、ＡＰは、酸化ＬＤＬの生成を抑制したのではなく、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合を阻害することにより細胞内への酸化ＬＤＬの取り込みを阻害したことが確認された。つまり、ＡＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＬＯＸ−１阻害作用を有することが確認された。
すなわち、これらの結果から、３量体以上のプロシアニジンを含むポリフェノールを摂取することにより、動脈硬化等の循環器疾患の発症を抑制できることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品及びそれを用いた動脈硬化予防医薬品は、非常に優れたＬＯＸ−１阻害作用を有している上に、安全性が高く継続的に摂取可能である。このため、ＬＯＸ−１が増悪因子として働く疾患、例えば炎症、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、カテーテル治療後の血管再狭窄等の治療・予防のための医薬品の製造分野で利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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