(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された試料において、配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法であって、前記ポリペプチドの発現の測定は、前記試料に含まれる、測定すべき前記ポリペプチドに対し前記生体内で誘導された抗体を免疫測定することにより行われる、方法。
【請求項２】
測定すべき前記ポリペプチドは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又は該ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生体が、ヒト、イヌ又はネコである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記生体がイヌであり、測定すべき前記ポリペプチドは配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記生体がイヌであり、測定すべき前記ポリペプチドは配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記生体がヒトであり、測定すべき前記ポリペプチドは配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、血清、血漿、腹水又は胸水である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮、又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺又は子宮の腺癌、腎癌、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫及び褐色細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種の癌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの発現量が対照と比べて多い場合に癌の悪性度が高くなることに基づき、癌の悪性度をさらに検出することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの発現量が対照と比べて多い場合に癌の進行度が進んでいることに基づき、癌の進行度をさらに検出することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するポリペプチドを含む癌検出試薬。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法において使用するためのものである、請求項１１に記載の癌検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１を腫瘍マーカーとする癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせた、対処療法が主となっている。これまで医療技術の発達により、早期発見できれば癌は治せる可能性の高い病となってきている。そのため、癌患者の体力的、経済的負担なく、血清や尿などを用いて簡便に検査できる癌の検出方法が求められている。【０００３】
血液や尿を用いた癌診断法として、最近では腫瘍マーカーなどの腫瘍生産物を測定する方法が普及してきた。腫瘍生産物とは、腫瘍に関連する抗原、酵素、特定のタンパク質、代謝産物、腫瘍遺伝子、腫瘍遺伝子生産物及び腫瘍抑制遺伝子などを指し、癌胎児性抗原ＣＥＡ、糖タンパク質ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原ＰＳＡ、甲状腺で産生されるペプチドホルモンであるカルシトニンなどが一部の癌で腫瘍マーカーとして癌診断に活用されている。しかし多くの癌種においては、癌診断に有用な腫瘍マーカーは存在しない。また、現在知られている腫瘍マーカーの大部分は、体液中にはごく微量（ｐｇ／ｍＬオーダー程度）しか存在しないため、それらを検出するためには、高感度な測定法や特殊な技術が必要とされる。このような現状の中で、各種癌を簡便な操作で高感度に検出できる新規な癌検査手段が提供されれば、各種癌に対する診断用途が開かれると期待される。【０００４】
また、癌の検出が可能なだけでなく、目に見えない部分に発生した癌診断、癌の進行度診断、癌の悪性度や術後の経過診断、再発診断、転移診断などが可能であれば、非常に有用である。【０００５】
具体的には、目に見えない部分に発生した癌診断が可能となれば、腹腔内など気づきにくい部分の癌の早期発見に有用である。また、腫瘍が肉眼で確認できるほど大きくない場合、超音波検査、ＣＴ（コンピュータトモグラフィー）又はＭＲＩ（核磁気共鳴イメージング）でも発見できないような癌を発見することができる。【０００６】
また、癌の進行度については、腫瘍の原発部位での拡がりの程度と、所属リンパ節や遠隔臓器への転移の有無とに基づき分類される。一般に、ステージと呼ばれる病期は５段階に分類されており、数字が大きくなるほど進行している。厳密には臓器によって定義が異なるが、例えば病期０は上皮内に留まっている癌、病期ＩＶは遠隔転移を起こしているような癌である。こういった癌の進行度がわかった場合には、適切な治療方針の決定のほかに、抗癌剤治療効果診断が可能となる。治療方針の決定の具体例としては、前立腺癌などは悪性度が非常に低く、ほとんど進行しないまま治療を必要としないものも存在する一方、骨などに転移を起こして痛みを伴って患者を死に至らしめるような進行性のものも存在する。ホルモン療法や摘出手術などの治療にはそれぞれ副作用が伴うため、治療法を適切に判断し決定する必要がある。また、抗癌剤選択が適切か否かや、抗癌剤投与を終えるタイミングなどを適切に判断することができれば、患者の体力的、経済的負担も軽減できる。そのため、進行度が診断できることは重要である。【０００７】
癌細胞は特徴の一つに幼若化すなわち脱分化するという性質がある。一部の癌を除いて、低分化あるいは未分化な分化度の低い癌細胞ほど、転移後の増殖も早く治療予後も不良である。このような癌を悪性度が高いという。逆に、高分化な癌細胞すなわち細胞分化度が高いものほど臓器の構造・機能的性質を残しており、比較的悪性度が低いと言える。こういった癌の悪性度がわかった場合、腫瘍が小さくても悪性度が高ければ腫瘍摘出時のマージンを多く確保したり、周辺組織の広範囲に注意して経過観察したりすることができる。【０００８】
再発、転移を含む術後の経過診断ができる場合には、手術によって腫瘍が完全に摘出できたかどうかという診断が可能となる。摘出が完全でなかった場合は再発が起こる可能性が高いため、より注意深く短い間隔で経過観察を行ったり、場合によっては早期に再手術に踏み切ったりする判断材料となる。また、再発した場合にも早期に発見できる可能性が高い。遠隔転移を起こしている場合には発見が遅れがちであるが、転移診断が可能となれば、摘出部位とその周辺以外にも検査範囲を広げる判断材料となる。【０００９】
ところで、イヌはヒトと比べ７倍早く年を取るということが知られている。最近、コンパニオンアニマルは家族の一員として飼育され、飼い主と同様の生活習慣を持っていることが多い。そのため、コンパニオンアニマルの癌罹患により、飼い主が将来癌を発症する危険性が高いことを予測することができる。コンパニオンアニマルの簡便で正確な癌診断が可能となれば、飼い主の癌予防の手がかりとなることが期待される。【００１０】
現在、イヌの飼育数は日本では約６７０万頭、また米国では約１７６４万頭ともいわれている。狂犬病予防接種のほかに５種、７種、８種などの混合ワクチンが一般に普及し、イヌパルボウィルス感染症、イヌジステンパーウィルス感染症、イヌパラインフルエンザ（ケンネルコフ）、イヌアデノウィルス２型感染症（ケンネルコフ）、イヌ伝染性肝炎、イヌコロナウィルス感染症、レプトスピラ病といった致死率の高い感染症が減少した。そのため、イヌの平均寿命は延び、７歳以上の高齢犬は全飼育数の３５．５％を占めている。死亡原因もヒトと同じく癌や高血圧、心臓病などが増加の一途をたどっている。米国では１年間に約４００万頭が癌と診断されており、日本においても潜在的に約１６０万頭に何らかの腫瘍があるといわれている。【００１１】
しかしながら、これまで簡便な動物用の癌診断薬は存在せず、動物医療においてはＸ線、ＣＴ、ＭＲＩによる撮影などの検査法も普及していない。触診や簡単な血液検査、Ｘ線撮影による検査を行って、獣医の経験に大きく依存した診断が行われているのが現状である。血清を用いた検査法も一部では行われ始めたが、イヌの腫瘍マーカーはまだ見つかっていないため、ヒトの腫瘍マーカーを用いたものとなっている。【００１２】
正確な癌診断のためには、開腹手術が必要であり、イヌの体力的負担、飼い主の費用負担の問題が大きい。イヌやネコといったコンパニオンアニマルの癌診断を簡便に行うことができれば、早期発見や正確な診断につながりコンパニオンアニマルの癌治療に有用であると期待される。また、そういった血清を用いた簡便な癌診断が可能になれば、癌診断が可能になるだけでなく、定期的な健康診断や手術前診断、治療方針の決定に大きく貢献することが期待される。【００１３】
コンパニオンアニマルはヒトのように健康診断が普及していないため発見が遅れ、腫瘍が大きくなって初めて飼い主が気づき、来院することが多い。その大きくなってしまった腫瘍が悪性である場合、手術などの外科的療法や抗癌剤などの投薬を行ったとしても、すでに手遅れとなる場合が非常に多い。そのため、獣医が悪性と判断した場合には手術せずに抗癌剤治療を行うのが一般的である。手術を行う場合にも、マージン確保の大きさや手術中の血液、細胞飛散対策といった手術中の対策も厳重に施す必要がある。手術後すぐに抗癌剤治療を開始し、経過観察も短い間隔で行うことが望ましい。最近普及しつつあるドッグドックといわれるイヌ健康診断に取り入れられれば、早期発見につながることが期待される。【００１４】
一方、良性腫瘍である場合には、腫瘍が大きくとも手術に踏み切れる。手術後は切除部分のケアだけですみ、高価な抗癌剤治療を行う必要はなく、経過観察に神経を尖らせる必要もない。【００１５】
このような現状から、動物の癌診断に適用できる高感度で簡便な癌検出手段が提供されれば、正確で無駄のない治療が可能になり、飼い主にとっても獣医にとってもメリットが大きい。【００１６】
Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質である。一方で、ＣＡＰＲＩＮ−１には色々な別名が存在しており、その一例としてＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １やＭｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｍ１１Ｓ１）などがあり、あたかも本タンパク質が細胞膜タンパク質であることが知られていたかのような名称がある。これらの別名は、元々、ＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列がＧＰＩ結合領域を有し、大腸由来細胞株に発現する膜タンパク質であるとする報告（非特許文献９）に由来するが、後にこの報告でのＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列は誤りであり、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列が１塩基欠損することによりフレームシフトが起きることでＣ末端から８０アミノ酸が欠損し、その結果生じるａｒｔｉｆａｃｔ（７４アミノ酸）が前報告でのＧＰＩ結合部分であり、さらに５’側にも遺伝子配列のエラーがあり、Ｎ末端から５３アミノ酸が欠損していることが証明されている（非特許文献１０）。また、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列がコードするタンパク質は細胞膜タンパク質ではないことも報告されている（非特許文献１０）。【００１７】
なお、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるとする非特許文献９の報告に基づき、特許文献１及び２には、Ｍ１１Ｓ１の名称で、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質の１つとして癌治療などのターゲットとなりうることが記載されている（実施例には記載は一切ない）。しかし、非特許文献１０の報告の通り、特許文献１及び２の出願当時から現在まで、ＣＡＰＲＩＮ−１は細胞表面には発現していないものであることが通説になっており、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるという誤った情報のみに基づく特許文献１及び２の内容は、当業者の技術常識として理解されるべきものではないことは明らかである。さらに、ＣＡＰＲＩＮ−１が乳癌などの癌細胞で、正常細胞に比べて高発現するという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】ＵＳ２００８／００７５７２２
【特許文献２】ＷＯ２００５／１００９９８
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】２００８年度厚生労働省調査資料（日本）
【非特許文献２】日経サイエンス、２００７年、３月号、ｐ．８０−８８（日本）
【非特許文献３】臨床検査２００３年、１２月発行、Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．１３、ｐ．１６４１−１６５４（日本）
【非特許文献４】イヌ・ネコの疾病統計２００５年１月発行（日本）
【非特許文献５】Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ：  ２００６  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｔｉｍ  Ｗｅｓｌｅｙ，  ＡＮＩＭＡＬ  ＰＨＡＲＭ  ＲＥＰＯＲＴＳ
【非特許文献６】がんの拡がりと進行度、大阪府立成人病センター調査部  津熊秀明（日本）
【非特許文献７】Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ９：２４３−５４（１９９５）
【非特許文献８】Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４５：８３−９８（１９９９）
【非特許文献９】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２０７１７−２０７２３（１９９５）
【非特許文献１０】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２：２３８９−２４００（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、癌の診断に有用な癌の検出手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号６、８、１０、１２及び１４で示されるアミノ酸配列を有するイヌＣＡＰＲＩＮ−１を作製した。また、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＡＰＲＩＮ−１を作製した。そして、それらタンパク質をコードする遺伝子が、イヌ及びヒトの精巣と悪性の癌細胞に特異的に発現すること（後述の実施例１を参照）、及びそれらタンパク質のアミノ酸配列を基に作製された組換えポリペプチドが、担癌生体中の血清とのみ特異的に反応することを見出し、さらに、該組換えポリペプチドを用いて調製した抗体を利用して、担癌生体から特異的にＣＡＰＲＩＮ−１を検出できることを見出し、本願発明を完成した。【００２２】
すなわち、本発明は、生体から分離された試料に対して行なう方法であって、ＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定することを含む癌の検出方法を提供する。また、本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１に対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応するポリペプチドを含む癌検出用試薬を提供する。さらに、本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌検出試薬を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３等に示される塩基配列中の１５塩基以上、好ましくは２０〜２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上の部分配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む癌検出試薬を提供する。【００２３】
具体的には、本発明は以下の特徴を有する。【００２４】
（１）  生体から分離された試料において、配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法。【００２５】
（２）  測定すべき前記ポリペプチドは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又は該ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、上記（１）の方法。【００２６】
（３）  上記生体が、ヒト、イヌ又はネコである、上記（１）又は（２）の方法。【００２７】
（４）  上記生体がイヌであり、測定すべき前記ポリペプチドは配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有する、上記（３）の方法。【００２８】
（５）  上記生体がイヌであり、測定すべき上記ポリペプチドは配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列を有する、上記（４）の方法。【００２９】
（６）  上記生体がヒトであり、測定すべき上記ポリペプチドは配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有する、上記（３）の方法。【００３０】
（７）  前記ポリペプチドの発現の測定は、前記試料に含まれ得る、測定すべき前記ポリペプチドに対し前記生体内で誘導された抗体を免疫測定することにより行われる（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。【００３１】
（８）  上記試料が、血清、血漿、腹水又は胸水である、上記（１）〜（７）のいずれかの方法。【００３２】
（９）  前記ポリペプチドの発現の測定は、上記試料中に含まれる、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを測定することにより行われる、上記（１）〜（６）のいずれかの方法。【００３３】
（１０）  上記ｍＲＮＡの塩基配列中の１５塩基以上、好ましくは２０〜２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上の部分配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、前記試料中の前記ｍＲＮＡの存在量を調べる、上記（９）の方法。【００３４】
（１１）  上記生体がイヌであり、前記ポリヌクレオチドは配列番号５、７、９、１１又は１３に示される塩基配列中の１５塩基以上、好ましくは２０〜２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上の部分配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、上記（１０）の方法。【００３５】
（１２）  上記生体がヒトであり、前記ポリヌクレオチドは配列番号１又は３に示される塩基配列中の１５塩基以上、好ましくは２０〜２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上の部分配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、上記（１０）の方法。【００３６】
（１３）  上記試料が組織又は細胞である、上記（９）〜（１２）のいずれかの方法。【００３７】
（１４）  前記癌が、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮、又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺又は子宮の腺癌、腎癌、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫及び褐色細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種の癌である、上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。【００３８】
（１５）  上記ポリペプチドの発現量が対照と比べて多い場合に癌の悪性度が高くなることに基づき、癌の悪性度をさらに検出することを含む、上記（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。【００３９】
（１６）  前記ポリペプチドの発現量が対照と比べて多い場合に癌の進行度が進んでいることに基づき、癌の進行度をさらに検出することを含む、上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。【００４０】
（１７）  配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するポリペプチドを含む癌検出試薬。【００４１】
（１８）  配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有し生体内で産生されるポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌検出試薬。【００４２】
（１９）  前記ポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が、癌細胞の表面に結合する抗体又はその抗原結合性断片である、（１８）の癌検出試薬。【００４３】
（２０）  前記ポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号２〜３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数の配列番号で表されるいずれかのアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号５０−９８又はアミノ酸残基番号２３３−３０５の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする、（１８）又は（１９）の癌検出試薬。【００４４】
（２１）  前記ポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号４３に結合する抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４５のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４６のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４７のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４８のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４９と５０のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５１と５２のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５３と５４のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５５と５６のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５７と５８のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、あるいは配列番号５９と６０のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、（１８）〜（２０）のいずれかに記載の癌検出試薬。【００４５】
（２２）  配列表の配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号に示されるいずれかの塩基配列中の１５塩基以上、好ましくは２０〜２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上の部分配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む癌検出試薬。
【発明の効果】
【００４６】
本発明により、新規な癌の検出方法が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、ＣＡＰＲＩＮ−１（又はＣａｐｒｉｎ−１ともいう）のアミノ酸配列を基に作製した組換えポリペプチドは、癌患者の血清中に特異的に存在する抗体と反応する。したがって、本発明の方法により試料中の該抗体を測定すれば、生体内の癌を検出することができる。また、ＣＡＰＲＩＮ−１自体を測定することによっても、生体内の癌を検出することができる。本発明の方法によれば、眼に見えない小さいサイズの癌や体内深部の癌も検出することができるため、健康診断等における癌の早期発見にも有用である。また、癌治療後の患者の経過観察に本発明の方法を利用すれば、再発した癌を早期に検出することもできる。さらに、本発明の方法によれば、腫瘍の増大や周辺組織への浸潤、リンパ節及び遠隔臓器への癌の転移といった、癌の進行度の診断も可能である。また、上記抗体の血清中存在量は、悪性度の高い癌患者において悪性度の低い癌患者よりも多いため、本発明の方法によれば、癌の悪性度の診断も可能である。また、下記実施例に記載される通り、精巣及び癌細胞において、ＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡが特異的に高発現している。従って、該ｍＲＮＡを測定することによっても、癌の検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクをコードする遺伝子の、正常組織及び腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】実施例において大腸菌で製造し精製した、本発明で用いられるポリペプチドの１例であるイヌＣＡＰＲＩＮ−１由来ポリペプチドをクマシー染色で検出した図である。参照番号３；イヌＣＡＰＲＩＮ−１由来ポリペプチドのバンドを示す。
【図３】実施例で調製したイヌＣＡＰＲＩＮ−１由来ポリペプチドを用いて行った担癌犬の癌診断結果の一部である。
【図４】実施例で調製したイヌＣＡＰＲＩＮ−１由来ポリペプチドを用いて行った担癌犬の癌詳細診断結果の一部である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の方法では、生体から分離された試料を用いて、ＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定する。ＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定する方法としては、試料中に含まれるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を免疫測定する方法（第１の方法）、試料中に含まれるＣＡＰＲＩＮ−１自体を免疫測定する方法（第２の方法）、及び試料中に含まれるＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡを測定する方法（第３の方法）が挙げられる。本発明の方法では、これらのいずれの方法でＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定してもよい。なお、本発明において、「測定」という用語には、検出、定性、定量及び半定量のいずれもが包含される。
【００４９】
配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列はイヌのＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列を有するイヌＣＡＰＲＩＮ−１は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして同定されたものである（実施例１参照）。すなわち、担癌犬体内では、配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が特異的に誘導されている。従って、上記第１の方法により配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対する上記した抗体を測定することで、イヌの癌を検出できる（実施例３及び４参照）。また、上記第２の方法により抗原たる配列番号６、８、１０、１２又は１４のＣＡＰＲＩＮ−１自体を測定することでも、イヌの癌を検出できる（実施例５及び６参照）。また、下記実施例に記載される通り、ＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡは精巣と癌細胞で有意に高発現しているため（実施例１参照）、該ｍＲＮＡを測定することによっても、イヌの癌を検出することができる。
【００５０】
なお、本明細書で使用する「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号２に示されるＭｅｔ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ・・（中略）・・Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｎのアミノ酸配列を持つ、７０９アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号２のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
【００５１】
また、本明細書中で使用する「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示すアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１の全長タンパク質も包含される。
【００５２】
本発明の方法では、配列番号６、８、１０、１２又は１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１のみならず、その他の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１（以下、イヌＣＡＰＲＩＮ−１に対する「相同因子」（又は「ホモログ」）ということがある。また、単に「ＣＡＰＲＩＮ−１」という場合には、イヌに限らず、他の哺乳動物由来のＣＡＰＲＩＮ−１も包含される。）も測定対象となる。下記実施例に具体的に記載される通り、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡは、配列番号６、８、１０、１２又は１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１同様、ヒトの精巣と癌細胞で有意に高発現しており、健常ヒト体内には該ヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が検出されない。また、ネコＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、健常ネコ体内では検出されず、担癌ネコでのみ検出される。従って、イヌ以外の哺乳動物におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定することによっても、該哺乳動物の癌を検出することができる。本発明の方法で測定対象となるイヌ以外のＣＡＰＲＩＮ−１としては、例えば、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１、ネコＣＡＰＲＩＮ−１等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、３及び２、４にそれぞれ示される通りであり、イヌＣＡＰＲＩＮ−１との配列同一性は塩基配列で９４％、アミノ酸配列で９８％である。イヌとヒトのように遺伝的に遠縁な哺乳動物間であっても、それぞれのＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列の配列同一性は９８％と非常に高く、そのため、ヒト以外の哺乳動物との間でも、イヌＣＡＰＲＩＮ−１とその相同因子とは８５％程度以上の高い配列同一性を有するものと考えられる。すなわち、本発明の方法において発現を測定するＣＡＰＲＩＮ−１は、特に限定されないが、配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるイヌＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列と好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
【００５３】
上記第１の方法において、試料中に存在し得る上記抗体の測定は、該抗体と抗原抗体反応する抗原物質を用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定法自体は下記に詳述するとおり周知の常法である。免疫測定の抗原物質としては、例えば、担癌イヌ体内で該抗体を誘導するもととなった配列番号６、８、１０、１２又は１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１を用いることができる。また、抗体には交叉反応性があり、実際に免疫原となった抗原物質以外の分子であっても、分子上に免疫原のエピトープと類似した構造が存在すれば、その分子は免疫原に対して誘導された抗体と抗原抗体反応により結合し得る。特に、ある哺乳動物由来のタンパク質と、他の哺乳動物由来のその相同因子との間では、アミノ酸配列の配列同一性も高く、エピトープの構造も類似している場合が多い。下記実施例に具体的に記載される通り、配列番号６、８、１０、１２又は１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１は、該イヌＣＡＰＲＩＮ−１に対し担癌イヌ体内で誘導された抗体と抗原抗体反応するほか、担癌ネコ体内でネコＣＡＰＲＩＮ−１に対して誘導された抗体とも抗原抗体反応するし、また、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１は、担癌イヌ体内及び担癌ネコ体内で誘導された上記抗体と抗原抗体反応する。従って、本発明の第１の方法では、免疫測定の抗原として、いずれの哺乳動物由来のＣＡＰＲＩＮ−１を用いることもできる。
【００５４】
通常、タンパク質等のような、複雑な構造をとる分子量の大きい抗原物質の場合、分子上に構造の異なる複数の部位が存在している。従って、生体内では、そのような抗原物質に対し、複数の部位をそれぞれ認識して結合する複数種類の抗体が生産される。すなわち、生体内でタンパク質等の抗原物質に対して生産される抗体は、複数種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体である。本願発明者らが見出した、担癌生体由来の血清中に特異的に存在し組換えＣＡＰＲＩＮ−１タンパクと抗原抗体反応により特異的に結合する抗体もまた、ポリクローナル抗体である。なお、本発明において「ポリクローナル抗体」といった場合には、抗原物質を体内に含む生体由来の血清中に存在する抗体であって、該抗原物質に対して該生体内で誘導された抗体を指す。
【００５５】
後述の実施例では、担癌動物生体に特異的な抗体を免疫測定するための抗原として、配列番号６及び配列番号８（イヌＣＡＰＲＩＮ−１）のポリペプチド、及び配列番号２（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１）のポリペプチドを調製し、これらのポリペプチドと担癌生体由来の血清中の前記抗体との反応性を確認している。しかしながら、前記抗体はポリクローナル抗体であるから、配列番号６、８又は２の相同因子から成るポリペプチドであれば当然結合するし、また、該ポリペプチドの断片であっても、前記ポリクローナル抗体中にはその断片の構造を認識する抗体が含まれ得るため、やはり担癌生体由来の血清中に含まれる前記抗体と結合できる。すなわち、配列番号６、８又は２の相同因子のポリペプチド（すなわちＣＡＰＲＩＮ−１全長タンパク質）であっても、その断片であっても、同様に担癌生体血清中に特異的に含まれる前記ポリクローナル抗体の測定に用いることができ、癌の検出に有用である。従って、本発明の第１の方法で免疫測定の抗原として用いられるポリペプチドは、ＣＡＰＲＩＮ−１（例えば配列番号６、８又は２）の全長領域から成るポリペプチドのみに限定されず、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列中の連続する７個以上、好ましくは連続する８個以上、９個以上、又は１０個以上のアミノ酸から成るポリペプチド断片であって、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応するポリペプチド（以下、便宜的に「特異反応性部分ポリペプチド」ということがある）も包含される。なお、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性を発揮することがこの分野において知られている。ただし、アミノ酸残基の数があまりに少ないと、試料中に存在する、ＣＡＰＲＩＮ−１以外のタンパク質に対する抗体とも交叉反応してしまう可能性が高くなる。従って、免疫測定の精度を高める観点からは、ポリペプチド断片のアミノ酸残基の数は好ましくは３０以上、もしくは５０以上、さらに好ましくは１００以上、もしくは１５０以上、さらに好ましくは３００以上、さらに好ましくは６００以上とするのが望ましく、さらには１０００以上、１５００以上としてもよい。
【００５６】
抗原として用いるポリペプチドの好ましい具体例としては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチド又はその断片が挙げられる。
【００５７】
なお、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・２７，２９）に示されている。
【００５８】
一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、付加され、又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換され、欠失され、及び／又は挿入された配列を有するポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応により特異的に結合するポリペプチド（以下、便宜的に「特異反応性修飾ポリペプチド」ということがある）も、上記したポリペプチドと同様に癌の検出に用いることができる。好ましくは、該特異反応性修飾ポリペプチドは、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、付加され、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有する。本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。
【００５９】
本明細書中で使用する、アミノ酸配列の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８７：２２６４−２２６８，  １９９３；  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７）。
【００６０】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｌｅｕ，  Ａｌａ，  Ｍｅｔ，  Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，  Ｇｌｎ，  Ｔｈｒ，  Ｓｅｒ，  Ｔｙｒ，  Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，  Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，  Ｌｙｓ，  Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｔｒｐ，  Ｈｉｓ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換、すなわち保存的置換、であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、対応抗体との結合性を維持できる可能性が高くなる。しかしながら、本発明では、上記改変体は、未改変体と同等もしくはほとんど同等の免疫誘導活性を付与する限り、非保存的置換を有していてもよい。
【００６１】
本発明で用いられる上記ポリペプチドを部分配列として含み（すなわち、本発明で用いられるポリペプチドの一端又は両端に他の（ポリ）ペプチドが付加されたもの）、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応により特異的に結合するポリペプチド（以下、便宜的に「特異反応性付加ポリペプチド」ということがある）も、上記したポリペプチドと同様に癌の検出に用いることができる。
【００６２】
本発明で用いられる上記ポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。あるいは、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓなど）を用いて容易に調製することができる。例えば、配列番号２のヒトＣＡＰＲＩＮ−１又はその相同因子をコードする遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、該遺伝子のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該ｃＤＮＡの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするポリペプチドを得ることができる。配列番号６、８、１０、１２及び１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列はそれぞれ配列番号５、７、９、１１及び１３に、そのヒト相同因子である配列番号２及び４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列はそれぞれ配列番号１及び３に示されているため、ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーはこれらの塩基配列を参照して容易に設計できる。また、後述するとおり、ヒト以外の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子は、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号の塩基配列を参照して設計したプライマーにより増幅し得るため、例えばネコＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡも上記と同様の手法により容易に調製し得る。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのｃＤＮＡの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は、例えば以下に記載するとおり、周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。
【００６３】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられる。
【００６４】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば上記したようにＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを調製して得ることができ、また後述するように市販の核酸合成機を用いて常法により合成することもできる。なお、配列番号２及び４のＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号１及び３に示されている。
【００６５】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、本発明で用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６〜（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００６６】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
【００６７】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００６８】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記した特異反応性付加ポリペプチドに包含され、本発明の第１の検出方法に用いることができる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するポリクローナル抗体との結合性を有する限り、本発明の第１の検出方法において使用可能である。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００６９】
試料中の抗体の測定は、上記したポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等がある。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、いずれの方法を用いても上記抗体の免疫測定を行うことができる。特に限定されないが、サンドイッチＥＬＩＳＡや凝集法は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないため、本発明の方法における上記抗体の免疫測定方法として好ましく適用することができる。抗体の標識として酵素を用いる場合、酵素としては、ターンオーバー数が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たす物であれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫測定法に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてはアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトルフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては１２５Ｉや３Ｈ等の通常ラジオイムノアッセイで用いられている物を使用することができる。蛍光色素としては、フルオロレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられる物を使用することができる。
【００７０】
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、抗原として用いる上記ポリペプチドを固相に不動化し、血清等の試料と反応させ、洗浄後、適当な二次抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した二次抗体を測定する。抗原ポリペプチドを固相に不動化することにより、未結合の二次抗体を容易に除去することができるため、本発明の癌の検出方法の態様として好ましい。二次抗体としては、例えば試料がイヌ由来であれば、抗イヌＩｇＧ抗体を用いることができる。二次抗体を上記に例示した標識物質で標識しておくことにより、固相に結合した二次抗体を測定することができる。こうして測定した二次抗体量が血清試料中の上記抗体量に相当する。標識物質として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって抗体量を測定できる。標識物質として放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定することができる。
【００７１】
本発明の第２の方法では、生体から得た試料中に含まれ得るＣＡＰＲＩＮ−１が測定される。上述した通り、癌患者においてはイヌやヒト等のＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体の量が有意に多いが、このことは、癌細胞において抗原であるＣＡＰＲＩＮ−１の蓄積量が有意に多いことを示している。ＣＡＰＲＩＮ−１自体を測定することによっても、癌を検出することができるということは、下記実施例に具体的に記載されている通りである。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１自体を測定することによっても、上記第１の方法と同様に、生体内の癌を検出することができる。
【００７２】
試料中のポリペプチドの測定は、周知の免疫測定法により容易に行なうことができる。具体的には、例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中に存在し得るＣＡＰＲＩＮ−１を測定することができる。上述した通り、抗体には交叉反応性があるため、例えば、配列番号６のイヌＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いて、配列番号６のイヌＣＡＰＲＩＮ−１のみならず、その他の哺乳動物におけるその相同因子、例えば配列番号２又は４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１やネコＣＡＰＲＩＮ−１等も測定することができる。免疫測定方法自体は、上述した通り周知の常法である。
【００７３】
なお、本検討において、ＣＡＰＲＩＮ−１は癌細胞の表面に発現する細胞膜タンパクであることが判明した。癌の生体中には多くのタンパク質分解酵素が含まれていることから、癌の生体中では、ＣＡＰＲＩＮ−１配列中の癌細胞の細胞外に発現する部分が分解を受けて癌細胞から分離し、ＣＡＰＲＩＮ−１配列中の癌細胞の細胞内に発現する部分よりも多く存在する。従って、本測定において用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体又はその抗原結合性断片として、癌細胞の細胞表面に結合するものを用いれば、より多くのＣＡＰＲＩＮ−１を検出でき、より高感度に癌を診断できる。従って本発明では、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の内、癌細胞の細胞表面に発現する部分に結合する抗体が好ましく用いられる。癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中の部分ペプチドとして、配列表の配列番号２〜３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数番号で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号（ａａ）５０−９８又はアミノ酸残基番号（ａａ）２３３−３０５の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列から成るポリペプチドが挙げられ、具体的には例えば、配列番号４３又は配列番号６１（配列番号６１で表されるアミノ酸配列の中でも、配列番号６２又は配列番号６３で表されるアミノ酸配列の領域が好ましい。）で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、本発明で用いられる抗体は、これらペプチドに結合するすべての抗体が含まれる。具体的には、配列番号４３に結合する抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４５のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４６のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４７のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４４と４８のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号４９と５０のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５１と５２のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５３と５４のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５５と５６のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、配列番号５７と５８のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片あるいは配列番号５９と６０のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が挙げられる。
【００７４】
本明細書中で使用する「抗原結合性断片」とは、抗体分子中に含まれるＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナルでもよいが、免疫測定等のためには、再現性が高いモノクローナル抗体が好ましい。ポリペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行うことが出来る。例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１をキーホールリンペットヘモシアン（ＫＬＨ）、カゼイン、血清アルブミン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、ＣＡＰＲＩＮ−１と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて、培養上清からＣＡＰＲＩＮ−１を対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることが出来る。なお、上記の方法は周知の常法である。
【００７５】
本発明の第３の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、ＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡが測定される。下記実施例に具体的に示される通り、配列番号６、８、１０、１２又は１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１又は配列番号２又は４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡは、癌細胞において有意に高発現している。従って、試料中の該ｍＲＮＡを測定することによっても、生体内の癌を検出することができる。
【００７６】
試料中のｍＲＮＡは、例えば、該ｍＲＮＡを鋳型とするリアルタイム検出ＲＴ−ＰＣＲのような常法により定量することができ、常法であるノーザンブロットにおける染色強度等によっても概ね定量することができる。配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡの配列は、それぞれ配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号に示される通りであるから、これらの配列をもとに、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号に示される塩基配列中の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「癌検出用ポリヌクレオチド」という）を調製し、該ポリヌクレオチドをプローブや核酸増幅法におけるプライマーとして用いて、該ｍＲＮＡの試料中存在量を測定することができる。後述するとおり、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号に示される塩基配列中の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであれば、イヌ及びヒト以外の哺乳動物におけるＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡも測定することができる。なお、本発明において、ポリヌクレオチドはＲＮＡでもＤＮＡでもよい。
【００７７】
本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象とする部分領域とのみハイブリダイズし、その他の領域とは実質的にハイブリダイズしないという意味である。
【００７８】
「通常のハイブリダイズの条件下」とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下のことをいい、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合には、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３〜９．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２といった一般的な緩衝液を用いて、５４℃〜６０℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいい、また、例えばノーザンハイブリダイゼーションの場合には、５  ｘ  ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５  ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１〜０．５％ＳＤＳ、あるいは０．１〜５  ｘ  ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ、といった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、４２℃〜６５℃程度の適当なハイブリダイゼーション温度で反応を行なうことをいう。さらにハイブリダイゼーションのあとで、例えば０．１〜０．２  ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて洗浄を行う。ただし、適当なアニーリング温度又はハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブとして用いる癌検出用ポリヌクレオチドのＴｍ値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。
【００７９】
「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、ハイブリダイズするとしても対象とする部分領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。そのような条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、対象の部分領域の塩基配列と一定以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。最も好ましくは、該ポリヌクレオチドは、対象の部分領域の塩基配列と同一の塩基配列を有する。配列同一性の定義は、上記したアミノ酸配列の同一性と同様である。なお、癌検出用ポリヌクレオチドの末端に対象とハイブリダイズしない領域が含まれていても、プローブの場合には、ハイブリダイズする領域がプローブ全体のおよそ半分以上を占めていれば検出に用いることができるし、また、プライマーの場合には、ハイブリダイズする領域がプライマー全体のおよそ半分以上を占め、かつ３’末端側にあれば、正常にアニーリングして伸長反応を生じ得るので、検出に用いることができる。そのように、癌検出用ポリヌクレオチドの末端にハイブリダイズしない領域が含まれている場合において、対象の塩基配列との配列同一性を算出するときは、ハイブリダイズしない領域は考慮せず、ハイブリダイズする領域のみに着目して算出するものとする。
【００８０】
なお、本発明において、「部分配列」とは、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号に示される塩基配列中の一部の配列を言い、連続する１５塩基以上、好ましくは連続する１８塩基以上、より好ましくは連続する２０塩基以上又は２５塩基以上、さらに好ましくは連続する３０、４０又は５０塩基以上の配列である。なお、本明細書において、「配列番号５に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号５に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、例えば「配列番号５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号５に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリヌクレオチドを調製する場合や、本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
【００８１】
癌検出用ポリヌクレオチドの塩基数は、特異性を確保する観点から、１８塩基以上が好ましい。サイズは、プローブとして用いる場合には、好ましくは１８塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上からコード領域の全長以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１８塩基以上が好ましく、５０塩基以下が好ましい。癌検出用ポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号に示される塩基配列中の連続する１８塩基以上からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８２】
本明細書を参照した当業者には明らかであるが、配列番号６、８、１０、１２又は１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡ量の測定には、配列番号５、７、９、１１又は１３中の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが用いられ、また、配列番号２又は４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡ量の測定には、配列番号１又は３中の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが用いられる。ただし、ある哺乳動物由来のタンパク質と他の哺乳動物由来のその相同因子とは、通常、塩基配列レベルでも配列同一性が高く、配列番号１から１３の塩基配列との配列同一性も９４〜１００％と非常に高い。そのため、例えば配列番号５中の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、該部分領域に対応する配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号中の部分領域とも特異的にハイブリダイズし得る。
【００８３】
実際に、後述の実施例に記載されるように、例えば配列番号３３及び３４にそれぞれ示される塩基配列を有する一対のプライマーセットを用いれば、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号中の部分領域とも配列番号５中の部分領域とも特異的にハイブリダイズするので、配列番号６のイヌＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡも、その相同因子をコードするｍＲＮＡも、いずれも測定することができる。従って、例えば、配列番号５中の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、配列番号６のイヌＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡのみならず、配列番号２又は４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡも測定できるし、同様に、ネコ等のその他の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡも測定することができる。癌検出用ポリヌクレオチドを設計する場合には、各配列番号（１〜２９のうち奇数の配列番号）の間で配列同一性が特に高い（好ましくは塩基配列が同一である）部分領域を選択することがより望ましい。イヌとヒトとの間で配列同一性が特に高い部分領域であれば、その他の動物種の相同遺伝子中にも該領域と配列同一性が非常に高い領域が存在すると予想されるので、そのように部分領域を選択すれば、イヌやヒト以外の動物種のＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡを測定する精度も高めることができる。
【００８４】
被検核酸の部分領域と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをＰＣＲのような核酸増幅法のプライマー又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、例えば下記実施例に具体的に詳述されるＲＴ−ＰＣＲの他、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等が挙げられる。本発明においてｍＲＮＡ量を測定する場合には、これら周知の測定方法のいずれをも採用できる。
【００８５】
ＰＣＲのような核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので、容易に行うことができる。すなわち、例えば、鋳型となる被検核酸（例えば、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡ）と、癌検出用ポリヌクレオチド（プライマー）の一対とを、公知の緩衝液中で、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ（ここで、Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ又はＧ）の存在下で、変性、アニーリング、伸長の各工程を反応液の温度を変化させることにより行う。通常、変性工程は、９０〜９５℃、アニーリング工程は、鋳型とプライマーのＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）、伸長工程はＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温度である７２℃又はその付近の温度で行われる。各工程は３０秒〜２分程度で適宜選択される。この熱サイクルを例えば２５〜４０回程度繰り返すことにより、一対のプライマーで挟まれた鋳型核酸の領域が増幅される。なお、核酸増幅法はＰＣＲに限定されるものではなく、この分野において周知の他の核酸増幅法も用いることができる。このように、癌検出用ポリヌクレオチドの一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、試料中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより試料中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００８６】
プローブとしては、癌検出用ポリヌクレオチドに蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。ポリヌクレオチドの標識方法自体は周知である。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、試料中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、癌検出用ポリヌクレオチドを固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した癌検出用ポリヌクレオチドもプローブと呼ばれる。なお、ポリヌクレオチドプローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、ポリヌクレオチドプローブを被検核酸とＴｍ又はその近傍（好ましくは±４℃以内）で接触させることによりハイブリダイズさせ、洗浄後、ハイブリダイズした標識プローブ又は固相プローブに結合された鋳型核酸を測定することにより行うことができる。このような方法には、例えばノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロット法等の周知の方法が包含される。本発明においては、周知のいずれの方法をも適用できる。
【００８７】
本発明の検出方法では、上記のとおりに測定したＣＡＰＲＩＮ−１の発現量に基づいて、対象動物が癌であるか否か等を判断する。癌の検出は、対象動物におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定するのみでも可能であるが、検出精度を高める観点からは、１ないし複数の健常者試料におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量（抗体量、ポリペプチド量又はｍＲＮＡ量）を調べて健常者基準値を取得し、対象動物の測定値を該健常者基準値と比較することが好ましい。さらに検出精度を高めたい場合には、癌を罹患していることがわかっている多数の患者から得た試料についてＣＡＰＲＩＮ−１発現量を調べて癌患者基準値を取得し、対象動物の測定値を健常者基準値及び癌患者基準値の双方と比較してもよい。上記基準値は、例えば、各試料におけるＣＡＰＲＩＮ−１発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、健常者基準値と癌患者基準値は、予め多数の健常者及び癌患者についてＣＡＰＲＩＮ−１発現量を調べて定めておくことができる。そのため、本発明の方法で基準値との比較を行なう場合には、予め定めた基準値を用いてもよい。
【００８８】
本発明の検出方法では、他の癌抗原や癌マーカーによる診断を組み合わせて用いてもよい。これにより、癌の検出精度をさらに高めることができる。例えば、本発明の方法において、癌患者特異的に存在する抗体を測定する際には、上記したポリペプチドと同様に、癌組織で多く発現する別のポリペプチドを抗原として組み合わせて用いることができる。また、本発明の方法と既に知られている癌マーカーによる診断とを組み合わせて行なってもよい。
【００８９】
本発明の検出方法によれば、生体内の癌を検出することができる。特に、後述の実施例に記載される通り、本発明の方法によれば眼に見えない小さいサイズの腫瘍や体内深部の腫瘍をも検出できるので、癌の早期発見に有用である。また、癌の治療後経過観察中の患者について本発明の検出方法を適用すれば、癌の再発があった場合にその癌を早期に検出することができる。
【００９０】
また、担癌生体において、本発明で測定対象となるＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞の数が増加すればそれだけ、該生体内における該タンパク質及びそのｍＲＮＡの蓄積量が増大し、血清中にＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が多く産生される。一方、癌細胞の数が減少すればそれだけ、生体内の該タンパク質及びそのｍＲＮＡの蓄積量が減少し、血清中のＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が減少する。従って、対照と比べてＣＡＰＲＩＮ−１の発現量が多い場合には、腫瘍の増大や癌の転移が生じている、すなわち癌の進行度が進んでいると判断することができる。実際に、後述の実施例に具体的に記載される通り、腫瘍の増大や転移といった癌の進行（悪性型）に伴い、担癌生体血清中の上記抗体量の上昇が観察されている。このように、本発明の方法によれば、癌の進行度を検出することもできる。
【００９１】
また、後述の実施例に示される通り、同一種類の腫瘍において、悪性型では良性型よりも有意に上記抗体量が多い。そのため、ＣＡＰＲＩＮ−１の発現量が多い場合には、癌の悪性度がより高いと判断することができる。すなわち、本発明の方法によれば、癌の悪性度を検出することもできる。
【００９２】
本発明の癌の検出方法の対象となる癌としては、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現している癌であり、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮、又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺又は子宮の腺癌、腎癌、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫、褐色細胞腫などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明の方法の対象となる生体は哺乳動物であり、ヒトやイヌ、ネコが好ましい。
【００９３】
本発明の方法に供する試料としては、血液、血清、血漿、腹水、胸水などの体液、組織、細胞が挙げられる。特に、上記第１の方法及び第２の方法においては、血清、血漿、腹水及び胸水を好ましく用いることができ、また、ｍＲＮＡを測定する上記第３の方法においては、組織試料及び細胞試料が好ましい。
【００９４】
第１の方法で免疫測定の抗原として用いられる上記したポリペプチド（すなわち、配列番号２のイヌＣＡＰＲＩＮ−１及びその相同因子、特異反応性部分ポリペプチド、特異反応性修飾ポリペプチド、並びに特異反応性付加ポリペプチド）は、癌検出試薬として提供することができる。該試薬は、上記ポリペプチドのみからなっていてもよく、また、該ポリペプチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該試薬は、プレートやメンブレン等の固相に固定化した状態で提供することもできる。なお、該ポリペプチドの好ましい例は上述した通りである。
【００９５】
第２の方法でＣＡＰＲＩＮ−１自体を免疫測定する際に用いられる、ＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片も、癌検出試薬として提供することができる。この場合の癌検出試薬も、上記抗体又は抗原結合性断片のみから成るものであってもよく、また、該抗体又は抗原結合性断片の安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該抗体又は抗原結合性断片は、マンガンや鉄等の金属を結合させたものであってもよい。そのような金属結合抗体又は抗原結合性断片を体内に投与すると、抗原タンパク質がより多く存在する部位に該抗体又は抗原結合性断片がより多く集積するので、ＭＲＩ等によって金属を測定すれば、抗原タンパク質を産生する癌細胞の存在を検出することができる。
【００９６】
さらにまた、第３の方法でｍＲＮＡの測定に用いられる上記した癌検出用ポリヌクレオチドも、癌検出試薬として提供することができる。この場合に癌検出用試薬も、該ポリヌクレオチドのみから成るものであってもよく、また、該ポリヌクレオチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。該試薬中に含まれる該癌検出用ポリヌクレオチドは、好ましくはプライマー又はプローブである。癌検出用ポリヌクレオチドの条件及び好ましい例は上述した通りである。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。【００９８】
実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。【００９９】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。【０１００】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａ：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【０１０１】
上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢＬｕｅ  ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液、反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【０１０２】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｄｏｇ  ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：  ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％  ゼラチン  ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、５個の陽性クローンを単離した。【０１０３】
（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【０１０４】
精製したプラスミドは、配列番号３１に記載のＴ３プライマーと配列番号３２に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号５，７，９，１１，１３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号６，８，１０，１２，１４）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた５個の遺伝子全てがＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子であることが判明した。５個の遺伝子間の配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において塩基配列１００％、アミノ酸配列９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９８％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１，３に、アミノ酸配列を配列番号２，４に示す。また、取得したイヌ遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９３〜９７％であった。また、取得したイヌ遺伝子のウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９７％であった。ウマ相同因子の塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８７〜８９％、アミノ酸配列９５〜９７％であった。マウス相同因子の塩基配列を配列番号１９，２１，２３，２５，２７に、アミノ酸配列を配列番号２０，２２，２４，２６，２８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８９〜９１％、アミノ酸配列９５−９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８２％、アミノ酸配列８７％であった。ニワトリ相同因子の塩基配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８１〜８２％、アミノ酸配列８６％であった。【０１０５】
（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号３３及び３４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号５の塩基配列（イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の２０６番〜６３２番及び配列番号１の塩基配列（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の６９８番〜１１２４番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号３５及び３６に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ乳癌及び腺癌組織で発現が見られた。さらに、取得した遺伝子のヒト相同因子の発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞では乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、食道癌細胞株など、多種類の癌細胞株で発現が検出され、特に多くの乳癌細胞株で発現が確認された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ−１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、多くの癌細胞で発現しており、特に乳癌細胞株に発現していることが確認された。【０１０６】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。【０１０７】
（５）免疫組織化学染色
（５）−１  マウスおよびイヌ正常組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）およびイヌ（ビーグル犬、雌）をエーテル麻酔下およびケタミン／イソフルラン麻酔下で放血させ、開腹後、各臓器（胃、肝臓、眼球、胸腺、筋肉、骨髄、子宮、小腸、食道、心臓、腎臓、唾液腺、大腸、乳腺、脳、肺、皮膚、副腎、卵巣、膵臓、脾臓、膀胱）をそれぞれＰＢＳの入った１０ｃｍディッシュに移した。ＰＢＳ中で各臓器を切り開き、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩還流固定した。還流液を捨て、ＰＢＳで各臓器の組織表面をすすぎ、１０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を５０ｍｌ容の遠心チューブに入れ、その中に各組織を入れて４℃で２時間ローターを用いて振とうした。２０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置後、３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置した。組織を取り出し、必要な部分を手術用メスで切りだした。次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ社製）をかけて組織表面になじませた後、クライオモルドに組織を配置した。ドライアイスの上にクライオモルドをおいて急速凍結させた後、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、マウス組織はＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を、イヌ組織は１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ−Ｔ溶液をそれぞれのせ、モイストチャンバー上で室温で１時間静置した。次に実施例３で作製した癌細胞表面に反応する、配列番号：５５の重鎖可変領域と配列番号：５６の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体＃８）をブロッキング液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃下で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内に室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジンービオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温で５分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ  １０ｍｇ＋３０％  Ｈ２Ｏ２  １０μｌ／０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌ）をのせ、モイストチャンバー内に室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は、��液腺、腎臓、結腸、胃の各組織において細胞内で僅かに発現が認められたが、細胞表面での発現は認められず、また、その他の臓器由来の組織では全く発現が認められなかった。【０１０８】
（５）−２  イヌ乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
病理診断で悪性乳癌と診断されたイヌの凍結された乳癌組織１０８検体を用いて、上述と同様の方法で凍結切片スライド作製および実施例３で作製したモノクローナル抗体＃８を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は１０８検体中１００検体（９２．５％）で発現が確認され、特に異型度の高い癌細胞表面に強く発現していた。【０１０９】
（５）−３  ヒト乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌組織１８８検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト乳癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノールおよびＰＢＳ−Ｔで同様の操作を行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト乳癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。次に実施例３で作製したモノクローナル抗体＃８を５％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内に４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌組織１８８検体の内、１３８検体（７３％）で強い発現が認められた。【０１１０】
（５）−４  ヒト悪性脳腫瘍におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト悪性脳腫瘍組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の悪性脳腫瘍組織２４７検体を用いて、上述（５）−３と同様の方法で実施例３で作製したモノクローナル抗体＃８を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全悪性脳腫瘍組織２４７検体の内、２２７検体（９２％）で強い発現が認められた。【０１１１】
（５）−５  ヒト乳癌転移リンパ節におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌転移リンパ節組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌転移リンパ節組織１５０検体を用いて、上述（５）−３と同様の方法で実施例３で作製したモノクローナル抗体＃８を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌転移リンパ節組織１５０検体の内、１３６検体（９０％）で強い発現が認められた。すなわち、乳癌から転移した癌組織においてもＣＡＰＲＩＮ−１は強く発現することが判った。【０１１２】
実施例２：イヌ及びヒト新規癌抗原タンパクの作製
（１）組換えタンパク質の作製
実施例１で取得した配列番号５の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを１μｌ、ＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３７及び３８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃／１０秒、６８℃／１．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号６（Ｐ４７）のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【０１１３】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【０１１４】
また、配列番号７の遺伝子を基に、以下の方法にてイヌ相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３９及び４０に記載）を各０．４μＭ，  ０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃／１０秒、６８℃／２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号８のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【０１１５】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【０１１６】
また、配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号４１及び４２に記載）を各０．４μＭ，  ０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃／１０秒、６８℃／２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【０１１７】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【０１１８】
（２）組換えタンパク質の精製
上記で得られた、配列番号１，５，７の遺伝子を発現するそれぞれの組換え大腸菌を３０μｇ／ｍｌ  カナマイシン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。【０１１９】
この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。【０１２０】
可溶性画分を、定法に従って調製したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｅｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社）、カラム容量５ｍＬ、平衡化緩衝液としての５０ｍＭ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の５０ｍＭ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて６ベッド溶出した。クマシー染色によって目的タンパク質の溶出を確認した１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶出画分を強陰イオン交換カラム（担体：Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社）、カラム容量５ｍＬ、平衡化緩衝液としての２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、４００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５ベッド溶出を行い、配列番号２、６、８に示されるアミノ酸配列を有する各タンパク質の精製画分を得、以降これら精製画分を投与試験用の材料とした。この内、配列番号２のタンパク質を電気泳動し、クマシー染色により検出したものを図２に示す。【０１２１】
上記方法によって得られた各精製標品のうち、２００μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．４）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）２μｌ添加した後、室温にて一晩静置・反応を行い、Ｈｉｓタグを切断し、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１．２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ  １０Ｋ  ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。【０１２２】
実施例３：ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体の作製
（１）ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体の作製
ＣＡＰＲＩＮ−１に結合する抗体を得るために、ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチド（Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（配列番号４３））を合成した。このペプチド１ｍｇを抗原として、等容量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、ウサギの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清をプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製し、ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体を得た。次に得られたポリクローナル抗体の乳癌細胞表面に対する反応性を検討した。具体的には、１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記ポリクローナル抗体を含む０．１％牛胎児血清（ＦＢＳ）入りＰＢＳ溶液を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ポリクローナル抗体の代わりに０．１％  ＦＢＳを含むＰＢＳを添加したものをコントロールとした。その結果、ポリクローナル抗体を処理した細胞は、コントロールの細胞に比べて蛍光強度が強く、従って、得られたポリクローナル抗体が乳癌細胞の細胞表面に結合するものであることが判った。【０１２３】
（２）ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対するモノクローナルの作製
実施例２で調製した配列番号２に示される、抗原タンパク（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１）１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに３回投与を行った。最後の免疫から３日後に摘出した脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、ギブコ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。【０１２４】
作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５−３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。【０１２５】
選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５−３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマ株を得、ハイブリドーマの培養上清をプロテインＧ担体を用いて精製し、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに結合するモノクローナル抗体１５０個を得た。【０１２６】
次にそれらモノクローナル抗体の内、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに培地を添加したものをコントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１０個（＃１〜＃１０）を選抜した。これらモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域それぞれの配列を配列番号：４４〜６０に示す。上記モノクローナル抗体＃１は配列番号：４４の重鎖可変領域と配列番号：４５の軽鎖可変領域から成り、＃２は配列番号：４４の重鎖可変領域と配列番号：４６の軽鎖可変領域から成り、＃３は配列番号：４４の重鎖可変領域と配列番号：４７の軽鎖可変領域から成り、＃４は配列番号：４４の重鎖可変領域と配列番号：４８の軽鎖可変領域から成り、＃５は配列番号：４９の重鎖可変領域と配列番号：５０の軽鎖可変領域から成り、＃６は配列番号：５１の重鎖可変領域と配列番号：５２の軽鎖可変領域から成り、＃７は配列番号：５３の重鎖可変領域と配列番号：５４の軽鎖可変領域から成り、＃８は配列番号：５５の重鎖可変領域と配列番号：５６の軽鎖可変領域から成り、＃９は配列番号：５７の重鎖可変領域と配列番号：５８の軽鎖可変領域から成り、＃１０は配列番号：５９の重鎖可変領域と配列番号：６０の軽鎖可変領域から成る。【０１２７】
（３）癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が結合するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中のペプチドの同定
上記で取得した、癌細胞の細胞表面に反応する＃１〜＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を用いて、それらが認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中の部分配列の同定を行った。【０１２８】
まず、ＰＢＳで１μｇ／μｌの濃度に溶解した組換えＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質溶液１００μｌに、終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を添加し、９５℃、５分間反応させてＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質内のジスルフィド結合の還元を行い、次に終濃度２０ｍＭのヨードアセトアミド（和光純薬社製）を添加し、３７℃、遮光条件下にて３０分間チオール基のアルキル化反応を行った。得られた還元アルキル化ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質４０μｇに、＃１〜＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体をそれぞれ５０μｇ添加し、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬにメスアップして撹拌混合しながら４℃で一晩反応させた。【０１２９】
次に、トリプシン（プロメガ社製）を終濃度０．２μｇとなるように添加し、３７℃１時間、２時間、４時間、１２時間反応させた後、予め１％  ＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄したプロテインＡ−ガラスビーズ（ＧＥ社製）と１ｍＭ炭酸カルシウム、ＮＰ−４０緩衝液（２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０）中で混合し、それぞれ３０分間反応させた。【０１３０】
反応液を２５ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．１％  ギ酸１００μｌを用いて抗原抗体複合体を溶出し、溶出液についてＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ−ＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製）を用いてＬＣ−ＭＳ解析を行った。解析は機器に付属のプロトコールに従った。【０１３１】
その結果、＃１〜＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体がいずれも認識するＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列として、配列番号６１のポリペプチドが同定された。さらに、モノクローナル抗体＃１〜＃４、＃５〜＃７および＃９が認識する、上記配列番号６１のポリペプチド中の部分配列として配列番号６２のペプチドが同定され、さらにその部分配列ペプチドである配列番号６３のペプチドをモノクローナル抗体＃１〜＃４が認識することが判った。【０１３２】
実施例４：  ＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチドを用いた癌診断
（１）イヌの癌診断
悪性又は良性腫瘍の確認された患犬３４２頭と健常犬６頭の血液を採取し、血清を分離した。実施例２で作製したイヌＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチド（配列番号８）、抗イヌＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法にて該ポリペプチドに特異的に反応する血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。【０１３３】
作製したポリペプチドの固相化は、リン酸緩衝化生理食塩水にて５μｇ／ｍＬに希釈した組換えタンパク質溶液を９６穴イモビライザーアミノプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置して行った。ブロッキングは、０．５  ％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ウシ血清アルブミン）、シグマアルドリッチジャパン社製）含有５０  ｍＭ  重炭酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ８．４）（以下ブロッキング溶液）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうした。希釈にブロッキング溶液を用いた１０００倍希釈血清を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３時間振とうして反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）含有リン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液にて３０００倍希釈したＨＲＰ修飾イヌＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｄｏｇ  ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうして反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＲＰ基質  ＴＭＢ（１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）、ＰＩＥＲＣＥ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分間酵素基質反応させた。その後、０．５Ｍ硫酸溶液（シグマアルドリッチジャパン社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応停止後、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度測定を行った。コントロールとしては、作製した組換えタンパク質を固相化しないもの、担癌犬血清を反応させないものを上記と同様に行い比較することとした。【０１３４】
上記癌診断に用いた全３４２検体中２１５検体で、摘出された腫瘍組織を用いた病理診断の結果、悪性と確定診断がされている。【０１３５】
具体的には、悪性黒色腫、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、扁平上皮癌、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫、褐色細胞腫などの癌診断を受けている検体である。【０１３６】
これら担癌犬生体由来の血清は、図３に示したように有意に高い組換えタンパク質に対する抗体価を示した。本診断法による悪性判断を健常犬平均値の２倍以上とした場合、１０８検体、５０．２％で悪性と診断できることがわかった。この１０８検体の癌の種類は以下のとおりである。なお、検体によっては複数種類の癌を罹患しているものもあるが、以下に示す数値は癌の種類ごとの累計値である。【０１３７】
悪性黒色腫６例、リンパ腫１１例、化膿性炎症１例、顆粒膜細胞腫１例、肝細胞癌４例、悪性精巣腫瘍３例、口腔内腫瘤３例、肛門周囲腺癌７例、肉腫１２例、乳腺癌３５例、肺癌１例、腺管癌６例、皮脂腺癌２例、肥満細胞腫５例、平滑筋肉腫１例、扁平上皮癌３例、悪性混合腫瘍２例、血管周皮腫１例、移行性上皮癌１例、血管周皮腫１例、血管外膜細胞腫１例、皮脂腺上皮腫１例。【０１３８】
さらに、末期癌患犬より採取した胸水、腹水を用いて、同様の診断を行った結果、血清を用いた本診断法による結果と同様の値を検出することができ、癌と診断することができた。【０１３９】
また、本診断法を用いることにより、さらに目に見えない部分の癌診断、進行度診断、悪性度診断、術後の経過診断、再発診断、転移診断などのような診断が可能であることがわかった。以下に図４に示した詳細診断の具体例について数例をあげる。【０１４０】
（２）−１  目に見えない腫瘍の癌診断
患犬１（フラットコーテットレトリバー）は、２００７年６月７日時点で腫瘤が確認されていなかったが、その２０日ほど後の２００７年６月２４日に左上顎犬歯の付け根の歯肉に有茎状の直径２ｍｍの腫瘤が発見された患犬である。発見された日に有茎部を結糸し、切除を行っている。肉眼で腫瘤を確認できる以前の４５０ｎｍでの吸光度は０．０６であり、腫瘍発見時０．０４と比較しても大きく変わらなかった。この結果から本手法を用いることにより、腹腔内など目に見えない部分の癌診断でも可能なことがわかった。【０１４１】
また、腫瘍が肉眼で確認できる以前から値の上昇が確認され、腫瘍発生の前兆を示していたもの言える。よって、定期健診などの健康診断にも有用であることがわかる。【０１４２】
（２）−２  癌の進行度診断
癌の進行度は腫瘍の大きさや深さ、周辺組織にどれほど影響を及ぼしているか、転移をしているかなどによって判断される。転移すなわち癌が進行すると以前より高い値が検出されることがわかった。【０１４３】
（２）−３  癌の悪性度診断
基底細胞腫には悪性型と良性型とがあり、近年、新ＷＨＯでは悪性型を基底細胞癌、良性型を毛芽腫と分類するという傾向にあるとのことである。【０１４４】
基底細胞癌（悪性）と診断された患犬２（ビーグル）は、手術時の血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０．０４であった。一方、毛芽腫（良性）と診断された患犬３（雑種）は、手術時の血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０と全く検出されなかった。よって、同じ基底細胞腫でも、悪性型の基底細胞癌と良性型の毛芽腫を診断できることがわかった。【０１４５】
次に、乳腺腫瘍について例を挙げる。乳腺腫瘍には、乳腺癌や乳腺悪性混合腫瘍といった悪性腫瘍と、悪性所見を示さない良性乳腺腫瘍がある。【０１４６】
患犬４（シェットランドシープドッグ）は、２００７年７月１７日に乳腺癌にて、摘出手術を受けた患犬である。患犬４の腫瘍は３ヶ所あり、その摘出組織を用いた病理診断では、すべて同一診断名であった。強い異型性と浸潤性を有する乳腺組織が、やや広範囲に乳頭状−腺様−増殖しており脈管浸潤も標本上確認されたため、高度の悪性度を有する乳癌と診断されていた。この手術時に採血した血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０．４１であった。【０１４７】
一方、患犬５（トイプードル）は、２００７年１０月９日に、乳腺腫瘍の摘出手術を受けた患犬である。このときの摘出組織を用いた病理診断では、乳腺上皮細胞と筋上皮細胞両成分が増殖する腫瘍が形成されていたものの、筋上皮細胞成分は均一な紡錘形細胞で悪性所見は見られず、また、腺上皮細胞成分は軽度の大小不同や核異型が見られたものの、悪性所見の見当たらない良性乳腺腫と診断された。この手術時に採血した血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０であった。【０１４８】
以上の２検体の結果からも悪性度の高い腫瘍は、悪性度の低い、すなわち良性の腫瘍に比べ、値が大きいことがわかった。【０１４９】
また、乳腺癌や乳腺悪性混合腫瘍といった悪性腫瘍（乳癌）５４検体と、悪性所見を示さない良性乳腺腫瘍２１検体について診断結果の分布を調べたところ、良性乳腺腫瘍検体が健常犬と同様の分布を示すのに対し、乳癌検体では高い値を示す分布を示した。【０１５０】
（２）−４  術後の経過診断
患犬６（雑種）は、肥満細胞腫で来院し２００５年５月２３日に摘出手術を行っている。この際行った血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０．１０であった。肥満細胞腫は完全に採りきれていない場合、再発や転移を繰り返す腫瘍のため、手術により腫瘍の完全切除ができたか否かということは、重要である。２００６年１２月１９日の経過観察の際には、４５０ｎｍでの吸光度は０．０５と抗体価の低下が確認された。このとき再発は確認されていない。よって患犬６では、完全に腫瘍を切除できたために血清診断結果は手術時よりも低下したといえる。【０１５１】
患犬７（ビーグル）は、２００８年２月１４日に肥満細胞腫の摘出手術を行っている。この際行った血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０．１７であった。摘出した組織を用いた病理組織診断では、浸潤性増生が認められた中等度分化型（ＰａｔｎａｉｋＩＩ型）に相当する肥満細胞腫と診断された。２００８年３月１０日に経過観察で再来院した際、再び血清診断を行った結果、４５０ｎｍでの吸光度は０．０７であった。このとき転移や再発は確認されていない。よって患犬７では、完全に腫瘍を切除できたために血清診断結果は手術時よりも低下したといえる。【０１５２】
（２）−５  再発診断
患犬８（ハスキー）は、２００７年５月８日に乳腺癌の摘出手術を行っている。この際行った血清診断の結果、４５０ｎｍでの吸光度は０．０５であった。摘出した組織を用いた病理診断では、異型性の強い上皮系細胞が主に腺管構造を形成、増殖しており乳腺原発の腺癌と診断された。そのとき既にリンパ管内に多数の癌細胞が入っているのが確認されており、リンパ節や遠隔部への転移、再発のリスクが高いということであった。手術から約一ヶ月半後の２００７年６月２８日に同部位に再発が確認された。このときの血清診断の結果は０．０９と値の上昇が確認された。患犬８では、腫瘍が切除しきれていなかったか又は、再発したために、診断結果が５月初旬よりも６月下旬のほうが大きく検出されたとわかった。【０１５３】
（２）−６  転移診断
患犬９（スコティッシュテリア）は、２００３年２月  乳腺腫瘍、２００３年８月  口腔内悪性黒色腫、２００５年１月  口唇に悪性黒色腫、２００５年４月１３日  口腔内黒色腫と転移・再発を繰り返し、これらすべて手術で切除済みの患犬である。２００５年４月の口腔内黒色腫の再発の後に、経過観察で再来院した２００６年１２月１７日の血清診断の結果は、４５０ｎｍでの吸光度が０．０９であった。その半年後の２００７年６月２０日には頚部リンパ、膝きょうリンパが肥大して再来院している。リンパ腫であれば全身のリンパが腫れるが、患犬９については２箇所のみであったため、おそらく転移によるリンパ腫である可能性が高いとの臨床診断であった。本手法による診断によっても、４５０ｎｍでの吸光度は０．１０と上昇しており、以前存在した腫瘍の転移であることがわかった。【０１５４】
患犬１０（柴犬）は、２００６年３月１１日に右口唇部口腔悪性黒色腫にて腫瘍の摘出を行った患犬である。２００６年６月１０日から同年９月２６日まで抗がん剤（シクロホスファシド）の治療歴があり、２００６年５月２３日から有機ゲルマニウム主成分のビレモＳ投薬継続中である。この腫瘍の転移と考えられる２００７年３月２０日の腫瘍摘出時に行った血清診断の結果は、４５０ｎｍでの吸光度がほぼ０．０３とほとんど検出されなかった。このときの摘出した組織を用いた病理診断では、転移性悪性黒色腫と診断されている。しかし、転移した黒色種の手術３ヵ月後の２００７年６月２７日に再び転移を起こしている。２００７年３月２０日は右頚部に腫瘍が発生したが、２００７年６月２７日はその反対側に発生し、腫瘍の形状も前回と類似した黒色の塊を形成しているとのことである。大きさは３．１×３．２×０．８ｃｍ大であり、臨床診断でも転移とのことである。このとき行った血清診断の結果は、４５０ｎｍでの吸光度は、０．２３と上昇しているのが確認され、以前存在した腫瘍の転移であることがわかった。【０１５５】
（２）−７  ヒトＣＡＰＲＩＮ−１由来ポリペプチドを用いた癌診断
実施例２で作製したヒトＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチド（配列番号２）を用いて、上記と同様にして、該ポリペプチドに反応する、イヌ血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。健常犬血清を用いた検討結果では、上記と同様に４５０ｎｍでの吸光度はほとんど検出されなかった。【０１５６】
一方、患犬１１（シーズー）は、２００７年６月２１日に乳腺癌の摘出手術を受けた患犬である。摘出した組織を用いた病理診断では、線維性結合織のややび慢性の増生に混じて、強い異型性と浸潤性を有する乳腺組織が大小の塊状に腺様−管状−乳頭状増殖している中等度の悪性度を持つ乳腺癌と診断されている。この患犬１１の４５０ｎｍでの吸光度は、０．２６であった。【０１５７】
（３）ネコの癌診断
次に担癌猫及び健常猫の診断を行った。上記で用いたイヌＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチドと抗ネコＩｇＧ抗体を用いて、上記と同様にして、該ポリペプチドに特異的に反応するネコ血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。２次抗体は、ＨＲＰ修飾抗ネコＩｇＧ抗体（ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ−ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤ  ＧＯＡＴ  ＩｇＧ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＣＡＴ  ＩｇＧ  （ＷＨＯＬＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＥ）：  ＣＡＰＰＥＬ  ＲＥＳＥＲＣＨ  ＲＥＡＧＥＮＴＳ社製）をブロッキング溶液にて８０００倍希釈して用いた。【０１５８】
患猫１（雑種）は２００７年５月８日に乳腺癌にて腫瘍の摘出手術を受けた患猫である。患猫１の４５０ｎｍでの吸光度は、０．２１であった。また、２００６年１０月１７日に腺管癌にて摘出手術を受けた、患猫２（ヒマラヤン）においても４５０ｎｍでの吸光度は、０．１８であった。一方、健常猫では全く検出されなかった。【０１５９】
また、実施例２で作製したヒトＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチド（配列番号２）を用いて、上記と同様にして、該ポリペプチドに反応する、ネコ血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。その結果、健常猫において、該ポリペプチドを固相化した場合には、４５０ｎｍでの吸光度はほとんど検出されなかった。一方、患猫３（アメリカンショートヘアー）は、２００８年４月１５日に乳腺癌の摘出手術を受けている。摘出した組織を用いた病理診断では、大小の壊死組織を伴い、強い異型性と浸潤性を有する乳腺組織が大小の塊状に筵状増殖している高度の悪性度を有する乳腺癌と診断されている。この患猫においても、４５０ｎｍでの吸光度は、０．１２であった。【０１６０】
従って犬と同様、猫の場合も、癌を患った検体では値が検出され、一方健常の検体ではまったく検出されなかったため、猫についても犬と同様に、本手法にて癌診断が可能であることがわかった。【０１６１】
（４）ヒトの癌診断
実施例２で作製したヒトＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチド（配列番号２）と抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、該ポリペプチドに特異的に反応する健常人血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。作製したポリペプチドの固相化は、リン酸緩衝化生理食塩水にて１００μｇ／ｍＬに希釈した組換えタンパク質溶液を９６穴イモビライザーアミノプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置して行った。ブロッキングは、ブロックエース粉末（ＤＳファ−マバイオメディカル株式会社製）４ｇを精製水１００ｍｌに溶解した溶液を精製水で４倍希釈したもの（以下ブロッキング溶液）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうした。希釈にブロッキング溶液を用いた１０００倍希釈血清を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３時間振とうして反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）含有リン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液にて１００００倍希釈したＨＲＰ修飾抗ヒトＩｇＧ抗体（ＨＲＰ−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：  Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうして反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＲＰ基質  ＴＭＢ（１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）、ＰＩＥＲＣＥ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分間酵素基質反応させた。その後、０．５Ｍ硫酸溶液（シグマアルドリッチジャパン社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応停止後、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度測定を行った。ポジティブコントロールとしてリン酸緩衝化生理食塩水にて５０μｇ／ｍｌに調製した卵白アルブミン抗原を固相化したものを用いた。その結果、４５０ｎｍでの吸光度は、卵白アルブミン抗原に対して健常人７人の平均で０．４５と高い値を示した。一方、上記ポリペプチドに対しては０と全く検出されなかった。【０１６２】
さらに、上記と同様にして、悪性乳癌を患っている患者由来の血清１７検体（Ｐｒｏｍｅｄｄｘ社から購入）に対して、上記と同様にしてヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）に特異的に反応する血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。その結果、４５０ｎｍでの吸光度は、上記ポリペプチドに対して乳癌患者１７人の平均で０．４８と高い値を示した。【０１６３】
また、実施例２で作製したイヌＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチド（配列番号８）と抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、上記と同様にして、該ポリペプチドに特異的に反応するヒト血清中のＩｇＧ抗体価を測定した。その結果、健常人７人の平均は０．０４であったのに対し、乳癌患者１７人の平均は０．５５と高い値を示した。【０１６４】
以上のことから、ヒトにおいても、本手法によって癌を検出できることが判った。【０１６５】
実施例５：抗原ポリペプチドを測定することによる癌診断
実施例３（１）で取得した、ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチド（配列番号４３）に対するポリクローナル抗体と実施例３（２）で取得した、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する各モノクローナル抗体を組み合わせて用いることによる、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、実施例４（１）〜（３）においてＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチドを用いた癌診断で陽性反応が得られた検体（担癌個体由来血清）中に含まれる該抗原ポリペプチド自体の検出を行った。１次抗体としてポリクローナル抗体を、２次抗体として各モノクローナル抗体を用いた。上記各抗体に特異的に反応する、血清中の該タンパク量を測定した。【０１６６】
１次抗体の固相化は、リン酸緩衝化生理食塩水にて５μｇ／ｍｌの濃度に希釈したポリクローナル抗体を９６穴イモビライザーアミノプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２時間振とうして行った。ブロッキングは、０．５％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ウシ血清アルブミン）、シグマアルドリッチジャパン社製）含有５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ  ８．４）（以下ブロッキング溶液）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうした。その後、ブロッキング溶液を用いて希釈した担癌生体由来血清を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３時間振とうして反応させた。このとき希釈倍率は１０−１０００倍の１０倍希釈系列で調整した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）含有リン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、２次抗体は、ブロッキング溶液にて１μｇ／ｍｌの濃度に希釈した各モノクローナル抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうして反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、３次抗体は、ブロッキング溶液にて５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５−３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度測定を行った。【０１６７】
その結果、２次抗体に癌細胞の細胞表面に反応する＃１〜＃１０のモノクローナル抗体を用いた場合には、乳癌、悪性黒色腫などの担癌犬、担癌猫で、いずれの検体も０．３以上の吸光度値（ポリペプチドの値）が検出され、健常犬、健常猫では検出されなかった。一方、２次抗体にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を用いた場合には、いずれの検体もポリペプチドの値は検出されたものの、吸光度値はいずれも０．０５以下であり、上記癌細胞の細胞表面に反応する抗体同士の組み合わせと比較すると低い値であった。【０１６８】
従って、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を用いて抗原ポリペプチドを検出するこの手法においても、癌を診断することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明は、癌の診断または検出のために産業上有用である。【０１７０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−２０２３２０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】
配列番号３１〜４２：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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