(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターで第１の宿主細胞を形質転換させる工程；
（ｉｉ）前記分泌ポリペプチドの天然のプロモーターが前記分泌ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに連結された場合に、分析された前記ポリペプチドの分泌レベルと比較して、前記第１の宿主細胞から分泌ポリペプチドが過分泌されるかどうかを決定する工程；
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび工程（ｉｉ）で過分泌されたものとして決定されたポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むコンストラクトで第２の宿主細胞を形質転換させる工程であって、ここで、前記第１および第２のポリヌクレオチドは、前記異種プロモーターの制御下において互いに任意の順序であり、同じフレーム内にあるものであることを特徴とする、工程；
（ｉｖ）前記コンストラクトが前記目的ポリペプチドおよび前記過分泌されたポリペプチドの融合ポリペプチドを発現させる条件下で、前記第２の宿主細胞を培養する工程；および
（ｖ）前記融合ポリペプチドが培養培地に分泌されるかどうかを決定することによって、前記過分泌されたポリペプチドがＳＦＰであるかどうかを同定する工程を含む、セクレトームから分泌融合パートナー（ＳＦＰ）を同定する方法。
【請求項２】
前記セクレトームが、酵母、バクテリア、植物または動物から単離されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セクレトームが、酵母から単離されたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＦＰがＢＧＬ２（配列番号８０）、ＧＡＳ３（配列番号８１）、ＧＡＳ５（配列番号８２）、ＰＳＴ１（配列番号８３）、ＳＣＷ４（配列番号８４）、ＳＣＷ１０（配列番号８５）、ＳＩＭ１（配列番号８６）、ＵＴＨ１（配列番号８７）、ＹＧＰ１（配列番号８８）、ＹＰＳ１（配列番号８９）、およびＺＰＳ１（配列番号９０）からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記目的ポリペプチドがヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）、エキセンディン−３、エキセンディン−４（ＥＸＤ４）、グルカゴン−類似−ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒトインターロイキン−１β、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−３２α、ヒトインターロイキン−３２β、ヒトインターロイキン−３２γ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン−β、ヒトインターフェロン−γ、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子、ヒト顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血小板−由来成長因子、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、ヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒトインスリン−類似成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト形質転換成長因子β−１、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウシガラクトース−１−ポスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、クラゲ緑色蛍光蛋白質、カンジダアンタクチカリパーゼＢ、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、菌類クロロペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レゾルバーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、トレハロースシンターゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト成長分化因子１５、ヒトガレクチン−３結合蛋白質、ヒトセリンプロテアーゼ抑制剤、クニッツ類型２、ヒトヤヌスキナーゼ２、ヒトｆｍｓ−類似チロシンキナーゼ３リガンド、ヒトＹＭ１＆２、ヒトＣＥＭＩ、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ヒトレプチン、ヒトｍＬ２５９、ヒトプロテイナーゼ３、ヒトリゾチーム、ヒトデッドボックス蛋白質４１、ヒトエトポシド誘導された蛋白質２４、マウスカスパーゼ１、ウシアンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＦＰが、配列番号１のアミノ酸１７６−２１３またはその断片または誘導体を含む親水性（ＨＬ）ドメインを含み、膜貫通ドメイン（ＴＭ）が欠如している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＦＰが配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるポリヌクレオチド、またはその断片もしくは誘導体を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記異種プロモーターが、原核生物、真核生物またはウイルスプロモーターである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記異種プロモーターが、バクテリオファージラムダのＰＲ、バクテリオファージラムダのＰＬ、Ｌａｍｂｄａ ＩＩ、エシェリキア・コリのｔｒｐ、エシェリキア・コリのｒｅｃＡ、エシェリキア・コリの熱衝撃、エシェリキア・コリのｌａｃＺ、ＳＶ４０初期、酵母のＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＴＥＦ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫欠乏ウイルスの長い末端反復、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス即時初期、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインからなる群より選択されるプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種プロモーターがＧＡＬ１０である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分泌ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、植物細胞、バクテリア細胞、菌類細胞、酵母細胞または動物細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の宿主細胞が酵母細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、カンジダ、デバリオミセス、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、ピキア、シゾサッカロミセス、ヤロウィア、サッカロミセス、シュワンニオミセスおよびアルクスラ種からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、カンジダ・ユチリス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・アルビカンス、クルイベロミセスラクティス、ピキアパストリス、ピキアスチピチス、シゾサッカロミセスポンベ、サッカロマイセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウィア・リポリティカ、シュワンニオミセス・オクシデンタリスおよびアルクスラ・アデニニボランスからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え蛋白質発現の技術分野に関する。特に、本発明は、分泌融合パートナー（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ：ＳＦＰ）および適切なＳＦＰをスクリーニングするための技術に関する。目的ポリペプチドの過量分泌生産を達成するために最適化されたＳＦＰが記載されている。本発明のＳＦＰは、組換え蛋白質の高分泌生産を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
関心のある蛋白質の組換え発現は、研究目的または、治療用および他の商業的用途のために、大量の蛋白質生産のために広く用いられる方法である。バクテリア、酵母、および哺乳動物宿主細胞系を含む様々な組換え発現系が当業者に知られており、多数の異なる蛋白質はこれらの発現系で成功的に生産される。しかし、このような発現系を用いても容易に生産されない多数の蛋白質が存在し、場合によっては全く発現及び分泌されない場合がたくさんある。組換え発現する蛋白質の分泌生産を増進させるための方法、例えば、分子シャペロンおよびフォールダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）の過剰発現（Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２３：７９０（２００６）；Ｐｏｅｗｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２３：３６４（２００７）；Ｓｈｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：７７３（１９９８））、分泌経路に関連した遺伝子の過剰発現（Ｃａｒｌａ  Ｆａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７７３：２３２（２００７）；Ｗｅｎｔｚ  ａｎｄ  Ｓｈｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：１１８９（１９９８））、リーダー配列の操作（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０６：２６７（１９９１）；Ｋｊａｅｒｕｌｆｆ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３６：９７４（２００５）；Ｓａｇｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４２：３５８（１９９４）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １８：８３１（２００２））などが報告されているが、この場合、いくつかの特定の蛋白質のみで効果的であることが確認された。
【０００３】
また蛋白質生産を増加させる他の方式としては、目的蛋白質を融合パートナーに連結して生産することが挙げられる。ヒト血清アルブミン（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ５３：３３１（２００７）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ  １４：５８８（２００８））、α−ラクトアルブミン（ＷＯ１９９５０２７７８２Ａ１）、ルブレドキシン（ＷＯ２００００３９３１０Ａ１）、ヒトグルカゴン（ＷＯ２００００５３７７７Ａ１）、メクラウナギから由来したカテリシジン関連ペプチド（ＷＯ２００５０１９２４２Ａ２）、ホスホリブロキナーゼ（ＵＳ６５００６４７Ｂ１）、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ［Ｋａｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：６３８（２０００）］、ブドウ状球菌蛋白質Ａ［Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  １８：２４２（２０００）］、Ｈｓｐ１５０蛋白質［Ｓｉｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：１３６８（２００３）］、セルロース結合ドメイン［Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：８３３（２００４）］および金結合ペプチド（ＵＳ２００５０１０６６２５Ａ１）などのような融合パートナーを使用して、いくつかの分泌蛋白質の生産を増加させた。
【０００４】
分泌蛋白質および新規な分泌シグナル配列を確保するために努力して、様々な分泌シグナル配列トラップシステムが開発された。米国特許第６，２２８，５９０号には、レポーター蛋白質欠乏酵母をレポーター蛋白質に融合した哺乳動物コード配列を含む核酸に形質転換させ、レポーター蛋白質を分泌する細胞を検出することによって哺乳動物分泌シグナル配列をスクリーニングするための技術が記載されている。インベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）欠乏酵母およびインベルターゼレポーター蛋白質を用いた類似のシステムがＥＰ０９０７７２７に開示されている。酵母に基づいた分泌シグナル配列トラップは、ヒトＤＮＡ（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国  ９３：７１０８（１９９６）；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９８：２８９（１９９７））、マウスＤＮＡ（Ｇａｌｌｉｃｉｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．１８３：１７５（２００１））、ゼブラフィッシュＤＮＡ（Ｃｒｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２２２：６３７（２００１））、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＤＮＡ（Ｇｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：４１５（１９９９））、ジャガイモＤＮＡ（Ｓｕｒｐｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｉｓ  ｄｅ  Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ  ｄｅ  Ｃｉｅｎｃｉａｓ  ７４：５９９（２００２））、およびカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＤＮＡ（Ｍｏｎｔｅｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  １：５１４（２００２））から分泌される蛋白質を確認するために使用された。哺乳動物宿主細胞（Ｇａｌｌｉｃｉｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ。  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ。  １８３：１７５（２００１））およびバクテリア宿主細胞（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８２０９（２０００））を用いた類似のトラップシステムが開発された。分泌シグナル配列トラップで使用されたレポーター蛋白質には、インベルターゼ（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国  ９３：７１０８（１９９６））、αアミラーゼ（米国特許第６，２２８，５９０号）、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）（Ｓｕｒｐｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｉｓ  ｄｅ  Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ  ｄｅ  Ｃｉｅｎｃｉａｓ  ７４：５９９（２００２））、およびβ−ラクタマーゼ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８２０９（２０００））が含まれる。
【０００５】
目的蛋白質の分泌に有用な翻訳融合パートナー（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ：ＴＦＰ）を確認するための方法は、ＷＯ２００５／０６８６５８に開示されている。前記方法は、（ｉ）核酸断片のライブラリおよびレポーター蛋白質をコードするヌクレオチド配列と共に融合した目的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む様々なベクターで形質転換された、レポーター蛋白質が欠乏された多数の宿主細胞を収得する工程、および（ｉｉ）前記宿主細胞から、目的蛋白質の分泌を個別的に誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリを確認する工程を含む。
【０００６】
酵母でめったに分泌されない蛋白質の分泌生産のための翻訳融合パートナー（ＴＦＰ）技術は、ＷＯ２００７／０１５１７８に記載されている。酵母ゲノムからのＴＦＰスクリーニング過程で、ＹＧＲ１０６Ｃ（Ｖｏａ１ｐ）遺伝子を発見した。Ｖｏａ１ｐ蛋白質の細胞における位置は、ＥＲ膜であることが最近確認された（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，Ｓｅｐ  １７，２００８）。Ｖｏａ１ｐは、液胞ＡＴＰａｓｅに対する５個の組立因子のうちの１つとして提示された。
【０００７】
当業界において、目的蛋白質の発現を増進させるさらなる配列、およびそのような配列を確認するための方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）分析によって得られる分泌融合パートナー（ＳＦＰ）を用いた、様々な組換え蛋白質の高分泌生産および効率的精製に関する。組換え蛋白質は、分泌融合パートナーと共に融合形態で細胞外に生産され、インビトロのプロテアーゼ処理によってＳＦＰから分離され得る。本発明に記載されたＳＦＰは、バイオ製薬およびバイオ産業において価値のある目的蛋白質およびポリペプチドの分泌レベルを有意に向上させる。ＳＦＰの選択／スクリーニングのための方法も記載されている。たとえ特定の蛋白質が分泌されるかどうかを決定したり、あるいはこれを予想できたとしても、分泌される蛋白質がＳＦＰとして作用するかどうかを予想することは不可能である。本発明の選択／スクリーニング方法は、ＳＦＰとして作用する蛋白質、およびそのような蛋白質の断片および誘導体の選択を可能にする。本発明のスクリーニング／選択方法によって選択されたＳＦＰは、バイオ−製薬およびバイオ−産業において有用な蛋白質の組換え生産を増進させる。また、本発明は、確認されたＳＦＰおよびその断片および誘導体を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の目的は、下記工程（ｉ）〜（ｖ）を含む、分泌融合パートナー（ＳＦＰ）を確認する方法を提供することである：
（ｉ）分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターで、第１の宿主細胞を形質転換させる工程；
（ｉｉ）前記分泌ポリペプチドの天然のプロモーターが前記分泌ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに連結された場合に、分析された前記ポリペプチドの分泌レベルと比較して、前記第１の宿主細胞から分泌されたポリペプチドが過分泌されるかどうかを決定する工程；
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび工程（ｉｉ）で過分泌されたものとして決定されたポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含むコンストラクトで第２の宿主細胞を形質転換させる工程であって、ここで、前記第１および第２のポリヌクレオチドは、互いに任意の順序であり、同じフレーム内にあるものであることを特徴とする、工程；
（ｉｖ）前記コンストラクトが前記目的ポリペプチドおよび前記過分泌されたポリペプチドの融合ポリペプチドを発現させる条件下で、前記第２の宿主細胞を培養する工程；そして
（ｖ）前記融合ポリペプチドが培養培地に分泌されるかどうかを決定することによって、前記過分泌されたポリペプチドのＳＦＰを確認する工程。
【００１０】
また本発明の他の目的は、（ｉ）前述したＳＦＰまたはその断片または誘導体；および（ｉｉ）目的ポリペプチドを含む、単離された融合ポリペプチドを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１７６−２１３を含む親水性（ＨＬ）ドメイン、またはその断片または誘導体を含む、膜貫通ドメイン（ＴＭ）が欠如されたＳＦＰ；および（ｉｉ）目的ポリペプチドを含む、単離された融合ポリペプチドを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前述したＳＦＰまたはその断片または誘導体をコードする第１のポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、コンストラクトを提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、前述したコンストラクトを含む宿主細胞を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、（ｉ）ＳＦＰをコードするポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換させる工程；（ｉｉ）前記目的ポリペプチドに融合した前記ＳＰＦを含む融合ポリペプチドが宿主細胞から生成され、分泌される条件下で、前記宿主細胞を培養する工程；そして（ｉｉｉ）前記融合ポリペプチドを単離する工程を含む、目的ポリペプチドを組換え的に生成する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前述した方法によって組換え的に生産された目的ポリペプチドを提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の前記および他の目的、特性および利点は、添付の図面と共に提示された下記の詳細な説明からより明確に理解されるだろう。
【図１】図１の（Ａ）は、ＳＦＰ１蛋白質の予測されたアミノ配列およびドメインを、（Ｂ）は、順次的に欠失されたＳＦＰ１遺伝子を発現させるベクターの模式図を、（Ｃ）は、相対的ＳＦＰ１蛋白質の発現レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。アセトン０．４ｍｌで濃縮させたそれぞれの培養ブロス０．６ｍｌの１０％トリス−トリジンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：ＹＧａＴ９１ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン２：ＹＧａＴ９２ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン３：ＹＧａＴ９３ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン４：ＹＧａＴ９４ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン５：ＹＧａＴ９５ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン６：ＹＧａＴ９６ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン７：ＹＧａＴ９７ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。
【図２】図２の（Ａ）は、ＳＦＰ１−ＩＬ２融合蛋白質を発現するベクターの模式図を、（Ｂ）は、ＳＦＰ１−ＩＬ２融合蛋白質の発現レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。アセトン０．４ｍｌで濃縮させたそれぞれの培養ブロス０．６ｍｌの１０％トリス−トリジンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：ＹＧａＴ９２−ＩＬ２ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン２：ＹＧａＴ９３−ＩＬ２ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン３：ＹＧａＴ９４−ＩＬ２ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン）。
【図３】図３は、ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４を含有する組換え酵母菌株の流加式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵に対するプロファイルおよび発酵時間に応じた培地に分泌された蛋白質分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図４】図４は、異なる濃度のエンテロキナーゼ（インビトロジェン、米国）で消化した精製ＳＦＰ１−ＥＸＤ４融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：精製ＳＦＰ１−ＥＸＤ４融合蛋白質；レーン２：エンテロキナーゼ０．１μｌで１時間、３７℃で消化した精製ＳＦＰ１−ＥＸＤ４融合蛋白質；レーン３：エンテロキナーゼ０．２μｌで１時間、３７℃で消化した精製ＳＦＰ１−ＥＸＤ４融合蛋白質；レーン４：エンテロキナーゼ０．３μｌで１時間、３７℃で消化した精製ＳＦＰ１−ＥＸＤ４融合蛋白質；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン）。
【図５】図５の（Ａ）は、エンテロキナーゼ消化したＳＦＰ１−ＥＸＤ４融合蛋白質のＨＰＬＣ分析を、（Ｂ）は、ＨＰＬＣ分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲル上の数は、ＨＰＬＣ分画数を示す。
【図６】図６は、精製ＥＸＤ４蛋白質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析である。
【図７】図７の（Ａ）は、ＳＦＰ１変異体−ＥＸＤ４融合蛋白質を発現するベクターの模式図を、（Ｂ）は、ＳＦＰ１変異体−ＥＸＤ４融合蛋白質の発現レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。アセトン０．４ｍｌで濃縮されたそれぞれの培養ブロス０．６ｍｌの１０％トリス−トリジンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン２：ＹＧａＴ９２１−ＥＸＤ４ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン３：ＹＧａＴ９２２−ＥＸＤ４ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーン４：ＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４ベクターで形質転換された２８０５菌株の培養ブロス；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン）。
【図８】図８は、ＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４を含有する組換え酵母菌株の流加発酵の、提示された発酵時間におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】図９は、ＹＧａＳＴ６−ＥＸＤ４−ＨＬを含有する組換え酵母菌株の流加発酵に対するプロファイル、および培地に分泌された蛋白質分析に対する、発酵時間に応じたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１０】図１０は、ＹＧａＭＫＨ−ＥＧＦを含有する組換え酵母菌株の流加発酵に対するプロファイル、および培地に分泌された蛋白質分析に対する、発酵時間に応じたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１】図１１の（Ａ）は、ＨＬ−ＥＧＦ融合蛋白質のＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーの結果を示す。添付された小さい図面は、提示された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。（Ｂ）は、エンテロキナーゼで消化した後の、ＨＬ−ＥＧＦ融合蛋白質のＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーの結果を示す。添付された小さい図面は、提示された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図１２】図１２は、ＹＧａＭＫＨ−ＰＴＨを含有する組換え酵母菌株の流加発酵に対するプロファイル、および培地に分泌された蛋白質分析に対する、発酵時間に応じたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１３】図１３は、エンテロキナーゼ（インビトロジェン、米国）および組換え体Ｋｅｘ２ｐ（ＪＨ  Ｓｏｈｎ，ＫＲＩＢＢ）の分泌形態で消化した精製ＨＬ−ＰＴＨ融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：精製ＨＬ−ＰＴＨ融合蛋白質；レーン２：Ｋｅｘ２ｐで１時間、３７℃で切断させた精製ＨＬ−ＰＴＨ融合蛋白質；レーン３：エンテロキナーゼで１時間、３７℃で切断させた精製ＨＬ−ＰＴＨ融合蛋白質；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン）。
【図１４】図１４の（Ａ）は、２８０５菌株の成長曲線を示し、矢印は、サンフリングポイントを示し、（Ｂ）は、蛍光染料ヘキスト（ｈｏｃｈｅｓｔ）で染色した後、サンフリングした細胞の共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真を示す。
【図１５】図１５は、Ｍ２サンプルの２Ｄゲル電気泳動の結果を示す。
【図１６】図１６は、１−ＤＥ／ＭｕｄＰＩＴ（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１７】図１７の（Ａ）は、セクレトーム分析から選択された１９個の遺伝子を発現するＹ２８０５形質転換体の培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。アセトン０．４ｍｌで濃縮させたそれぞれの培養ブロス０．６ｍｌの１０％トリス−グリシン  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：ＢＧＬ２遺伝子を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン２：ＣＩＳ３を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン３：ＣＲＨ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン４：ＣＷＰ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン５：ＤＳＥ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン７：ＥＧＴ２を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン８：ＥＸＧ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン９：ＧＡＳ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１０：ＧＡＳ３を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１１：ＧＡＳ５を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１２：ＰＳＴ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１３：ＳＣＷ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１５：ＳＩＭ１を発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１６：ＴＯＳ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１７：ＵＴＨ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１８：ＹＧＰ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１９：ＹＰＳ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン２０：ＺＰＳ１を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン）。（Ｂ）は、エンド−Ｈ処理後の培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１８】図１８は、ＥＸＤ４遺伝子と融合した１１個の遺伝子を発現するＹ２８０５形質転換体の培養上澄液のそれぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。アセトン０．４ｍｌで濃縮させたそれぞれの培養ブロス０．６ｍｌの１０％トリス−トリジンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：ＢＧＬ２−ＥＸＤ４遺伝子を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン２：ＧＡＳ３−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン３：ＧＡＳ５−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン４：ＰＳＴ１−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン５：ＳＣＷ４−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン６：ＳＣＷ１０−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン７：ＳＩＭ１−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン８：ＵＴＨ１−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン９：ＹＧＰ１−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１０：ＹＰＳ１−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーン１１：ＺＰＳ１−ＥＸＤ４を過剰発現する２８０５菌株の培養ブロス；レーンＭ：予め染色された蛋白質のサイズマーカー（インビトロジェン）。
【図１９】図１９の（Ａ）は、ＳＣＷ４およびＥＸＤ４融合の欠失断片に対するカイト−ドゥーリットル疏水性（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）分析および模式図を、（Ｂ）は、徐々に欠失されたＳＣＷ４−ＥＸＤ４融合断片を含有するそれぞれの形質転換体の培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２０】図２０は、ＹＧａ−ＳＣＷ４−１−ＥＸＤ４およびＹＧａ−ＳＣＷ４−３−ＥＸＤ４をそれぞれ含有する組換え２８０５酵母菌株の流加発酵の間に培地に分泌された蛋白質を分析するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２１】図２１は、エンテロキナーゼの処理前および後の分泌された融合蛋白質、ＳＣＷ４−１−ＥＸＤ４およびＳＣＷ４−３−ＥＸＤ４を分析するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２２】図２２は、（Ａ）それぞれのベクターを含有する細胞の培養ブロス１０マイクロリットルの、（Ｂ）エンテロキナーゼの処理前および後のサンプルの培地に分泌された、ＳＣＷ４−ｈＧＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【図２３】図２３は、ＹＧａ−ＳＣＷ４−２−ｈＧＨを含有する組換え酵母菌株の流加発酵の間に培地に分泌された蛋白質を分析するための、発酵時間に応じたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２４】図２４は、ＩＬ−２発現ベクターｐＹＧａＴ９２−ＩＬ２の地図を示す。
【図２５】図２５は、エキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４発現ベクターｐＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４の地図を示す。
【図２６】図２６は、エキセンディン−４発現ベクターｐＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４の地図を示す。
【図２７】図２７は、エキセンディン−４発現ベクターｐＹＧａＳＴ６−ＥＸＤ−ＨＬの地図を示す。
【図２８】図２８は、ＥＧＦ発現ベクターｐＹＧａＭＫＨ−ＥＧＦの地図を示す。
【図２９】図２９は、ＰＴＨ発現ベクターｐＹＧａＭＫＨ−ＰＴＨの地図を示す。
【図３０】図３０は、エキセンディン−４発現ベクターｐＹＧａＳＣＷ４−１−ＥＸＤ４の地図を示す。
【図３１】図３１は、エキセンディン−４発現ベクターｐＹＧａＳＣＷ４−３−ＥＸＤ４の地図を示す。
【図３２】図３２は、ｈＧＨ発現ベクターｐＹＧａＳＣＷ４−２−ｈＧＨの地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明では、目的ポリペプチドの高いレベルの分泌や、目的ポリペプチドの高いレベルの分泌を達成するのに使用できるＳＦＰ確認のための、迅速且つ効率的なスクリーニング技術のために必要なことに対して苦心した。本発明は、任意の蛋白質の組換え発現を最適化するのに有用な一方、公知の発現系でその低いレベルの発現により大規模および／または低コストで生産され得ない蛋白質の生産を可能にするのに特に有用である。目的ポリペプチドを高レベルで分泌するための、最適化されたＳＦＰが記載されている。
【００１８】
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」独立体は、１つ以上のその独立体を表するものであって、例えば、「１つのベクター」は、１つ以上のベクターを示すものとして理解されなければならない。このように、用語「１つの」（または「１つ」）、「１つ以上の、」および「少なくとも１つの」は、本願において相互に交換可能に使用され得る。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」だけでなく、多数の「ポリペプチド」を含もうとするものであり、アミド結合（ペプチド結合とも公知される）によって線型に連結されたモノマー（アミノ酸）などからなる分子を示す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または鎖などを示し、生産物の具体的な長さを示すのではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「蛋白質」、「アミノ酸鎖」，または、２つ以上のアミノ酸の鎖または鎖などを示すために使用された任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代りに、または、相互に交換可能に使用され得る。また、用語「ポリペプチド」は、これに制限されないが、公知の保護／ブロッキング基によるグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、蛋白質分解性の消化、または自然的に発生しないアミノ酸による変形を含むポリペプチドの発現後変形の生産物を示すとするものである。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するかまたは組換え技術によって製造され得るが、指定された核酸配列から翻訳される必要性はない。これは、化学合成を含む任意の方式で生産され得る。
【００２０】
「単離されたポリペプチド」またはその断片、変異体もしくは誘導体は、その自然環境に存在しないポリペプチドを意図する。特定レベルの精製が要求されない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然状態または自然環境から除去され得る。組換え的に製造されたポリペプチドおよび宿主細胞内で発現した蛋白質は、本発明の目的のために単離されたものとして考慮されるが、これは、天然状態または任意の適合な技術によって分離、分画、または部分的にまたはかなり精製された組換えポリペプチドである。
【００２１】
また、本発明のポリペプチドに含まれるのは、前記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびこれらの任意の組合わせである。本発明のポリペプチドを指して呼ぶ場合、用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、対応する天然のポリペプチドの生物学的、抗原的、または免疫的特性の少なくとも幾つかを保有するポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、蛋白質分解された断片だけでなく、欠失断片、また、本願で議論された他の特異的断片を含む。本発明のポリペプチドの変異体は、前記に記載された断片、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入によって変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、自然的に発生することもあるし、あるいは自然的に発生しないことがある。自然的に発生しない変異体は、当業者に知られている突然変異誘発技術を用いて製造され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。本発明のポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチド上で発見されないさらなる特徴を示すようにするために変更されたポリペプチドを含む。また本明細書において変異体ポリペプチドは、「ポリペプチド類似体」と呼ぶことができる。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」は、機能性側基の反応によって化学的に誘導された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを示す。また「誘導体」として含まれるのは、２０個の標準アミノ酸のうち、１つ以上の自然的に発生するアミノ酸誘導体を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに置換でき、５−ヒドロキシリジンは、リジンに置換されることができ、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに置換でき、ホモセリンは、セリンに置換でき、オルニチンは、リジンに置換され得る。
【００２２】
「参照アミノ酸配列」は、任意のアミノ酸置換を導入することなく、特定された配列を意味する。当業者に通用されるように、置換がない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本願に記載されたポリペプチドは、様々な変更、例えば、置換、挿入または欠失を有することができる。ポリペプチドで置換され得る例示的アミノ酸は、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００２４】
本願に記載されたポリペプチドおよび参考ポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドの対応する断片もまた考慮される。
【００２５】
配列同一性は、比較対象になる部位が最適に整列された２つの配列を比較し、２つの配列のいずれにも現れる同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較対象部位の総位置の数で分り（すなわち、ウィンドウサイズ）、結果を１００で乗じて、配列同一性の百分率を求めることによって計算することができる。１つの態様として、整列を極大化するために１００個のアミノ酸またはヌクレオチドの長さから４個のギャップが導入され得る場合、同一性％は、比較する配列で同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを整列した２つの配列より小さい配列でのアミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率で計算される（Ｄａｙｈｏｆｆ，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，ｐ．１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２），本明細書中に参考として含まれる）。同一性の決定は、当業者に知られているコンピュータ相同性のプログラムによって典型的に行われる。例示的なプログラムは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）のアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２：４８２−４８９，その全文が本明細書中に参考として含まれる）を用いる、デフォルトセッティングを用いたギャッププログラムである（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  ＵＮＩＸ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【００２６】
好ましくは、任意の置換は、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基に代替されたものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当業界で定義されている。これらの群には、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および方向性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００２７】
一実施態様において、本発明は、（ｉ）分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターで、第１の宿主細胞を形質転換させる工程；（ｉｉ）前記ポリペプチドの天然のプロモーターが前記分泌ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに連結された場合に、前記ポリペプチドの分泌レベルと比較して、前記第１の宿主細胞から前記分泌ポリペプチドが過分泌されるかどうかを決定する工程；（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび工程（ｉｉ）で過分泌されたものとして決定されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトで第２の宿主細胞を形質転換させる工程であって、ここで、前記目的ポリペプチドおよび前記過分泌されたポリペプチドが任意の順序で融合することを特徴とする、工程；（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトが融合ポリペプチドを発現する条件下で、前記第２の宿主細胞を培養する工程；および（ｖ）前記融合ポリペプチドが細胞外培養培地へ分泌されるかどうかを決定し；これで前記過分泌されたポリペプチドが分泌融合パートナーであるかを確認する工程を含む、分泌融合パートナー（ＳＦＰ）を確認する方法に関する。
【００２８】
本発明の方法において、ＳＦＰは、「セクレトーム」または「総分泌されたポリペプチド」から確認され得る。セクレトームは、細胞外の培養培地へ分泌され、それから収集したポリペプチドを含む。セクレトームは、バクテリア、菌類（例えば、酵母）、植物、および動物（例えば、哺乳動物）を含む任意の真核または、原核生物のＤＮＡによってコードされる。適したバクテリアには、これに制限されないが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種が含まれる。適した酵母としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、テバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ），クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ），シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワンニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、およびアルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）種が挙げられるが、これらに制限されない。
【００２９】
具体的な種の例としては、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ），およびアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）が挙げられる。ＤＮＡ供給源として提供され得るその他の菌類としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種が挙げられるが、これらに制限されない。ＤＮＡ供給源として提供され得る植物としては、アラビドプシス、トウモロコシ、タバコ、およびジャガイモが挙げられるが、これらに制限されない。適した動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、および猿が挙げられるが、これらに制限されない。一実施態様において、セクレトームは、酵母、バクテリア、植物または動物に由来しうる。
【００３０】
高分泌されたポリペプチドを選択するためのセクレトーム分析は、当業界で入手可能な技術を用いて達成され得る。例えば、培養上澄液を濃縮することによって単離された全てのポリペプチドは、２−Ｄゲル電気泳動および／または多次元蛋白質同定技術（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：１−ＤＥ／ＭｕｄＰＩＴ）を用いて分析され得る。セクレトームからのポリペプチドは、任意の種類の蛋白質精製カラム、例えば、イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム、ゲルろ過カラム、親和性カラム、および逆相カラムによって分析され得る。
【００３１】
一実施態様において、正常酵母細胞成長の間に生産された酵母総分泌されたポリペプチド（酵母セクレトーム）を分析した。正常細胞成長は、最小培地（例えば、アミノ酸無しの０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、２％グルコースおよび０．００２％ウラシル）で培養される細胞を意味する。グルコースの代わりに異なる炭素源、例えば、ガラクトース、キシロース、フルクトース、マンノース、スクロース、ラフィノース、およびセロビオースを含めうる、変更された条件が利用され得る。変更された条件はまた、培地の任意の成分、例えば、窒素またはリン酸塩のレベルを制限することを含む。
【００３２】
用語「高分泌された」は、セクレトームから分泌されたポリペプチドのレベルが上位４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％以上であるポリペプチドを示す。高分泌されたポリペプチドは、分泌された蛋白質の数に比例できる蛋白質数度指数（ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ：ＰＡＩ）により決定され得る（文献［Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１２３１−４５（２００２）］）。高分泌された蛋白質の例は、表１に示されている。
【００３３】
用語「過分泌された」は、ポリペプチドの天然プロモーターから発現される場合、ポリペプチドの分泌レベルより少なくとも５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘまたは、１０Ｘのレベルで宿主細胞からポリペプチドが分泌されることとして定義される。高分泌はまた、野生型の蛋白質分泌レベルと比較して、高分泌されるポリペプチドの分泌レベルを比較することによって分析することができる。例えば、野生型の酵母で分泌された蛋白質は、正常細胞成長の間に分泌レベルが約２０ｍｇ／Ｌを超過しないが、強力な異種プロモーターと連結された場合、これらの蛋白質のうち一部は高分泌され、分泌レベルが２０ｍｇ／Ｌを超過する。
【００３４】
一実施態様において、本発明の方法は、融合ポリペプチドの分泌のためのＳＦＰの最適なサイズを決定することをさらに含む。ＳＦＰの最適なサイズは、前記ＳＦＰの欠失分析によって決定されることができ、ここでＳＦＰの異なる欠失コンストラクトをそれぞれ含有する融合ポリペプチドの分泌レベルを比較する。幾つかのＳＦＰは、初期に同定されたＳＦＰで得た発現より、融合ポリペプチドのはるかに高い発現を可能にする最適なサイズを持ちうる。ＳＦＰの最適なサイズは、次善のＳＦＰに融合した場合の目的ポリペプチドの分泌レベルに比べて目的ポリペプチドの増加された分泌レベルを可能にすることができる。ＳＦＰの最適なサイズは、目的ポリペプチドとの間で多様であり、ＳＦＰが先ず確認されると、本願に開示された方法または当業者に知られている方法を用いて決定され得る。
【００３５】
一実施態様において、親水性配列で終わるＳＦＰ欠失断片が選択される。蛋白質の親水性ドメインは、一般的に蛋白質の表面近傍に位置する。従って、ＳＦＰおよび目的ポリペプチドの接合部は、２つのポリペプチドの間で容易に露出されることができ、これは、プロテアーゼが前記接合部を消化することをより容易にして目的ポリペプチドをインビトロへ放出するようにする。
【００３６】
ＳＦＰに適用されるとき、用語「その断片」は、ＳＦＰのアミノ酸配列の任意の部分を含むポリペプチドを示し、ここで断片は、融合した目的ポリペプチドの分泌を誘導できる能力を実質的に保有する。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、用語「融合した目的ポリペプチドの分泌を誘導できる能力を実質的に保有する」ということは、融合した目的ポリペプチドの分泌を誘導する親ＳＦＰの能力の少なくとも５０％を保有するＳＦＰの断片または誘導体のことをいう。特定の実施態様において、融合した目的ポリペプチドの分泌を誘導する能力が６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％以上保有される。目的ポリペプチドの分泌を誘導する能力は、当業者によく知られているルーチン技術および前記に記載された技術によって決定され得る。
【００３８】
ＳＦＰに適用されるとき、用語「その誘導体」は、ＳＦＰのアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドを示し、ここで、ポリペプチドは、融合した目的ポリペプチドの分泌を誘導する能力を実質的に保有する。特定の実施態様において、誘導体は、ＳＦＰのアミノ酸配列と７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一のアミノ酸配列を含む。誘導体は、ＳＦＰのアミノ酸配列に付加、欠失、置換、またはその組合わせを含むことができる。誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１−１５、１６−２０、２１−２５、２６−３０個の付加、置換、または欠失を有する突然変異ポリペプチドを含むことができる。付加または置換はまた、自然的に発生しないアミノ酸の使用を含む。
【００３９】
ＳＦＰの誘導体の例としてはこれに制限されないが、ＳＦＰ内で確認された、欠失突然変異（例えば、単一方向性欠失）、機能性配列の付加（例えば、グリコシル化部位、制限酵素部位）、およびプロ−配列またはプレ−配列の欠失または付加（例えば、スワッピング）が含まれる。当業者は、ルーチンの突然変異誘発技術、例えば前述した参照文献に記載された技術を用いて、ＳＦＰの誘導体またはＳＦＰをコードする核酸を用意し、融合した目的ポリペプチドの分泌を誘導する能力を実質的に保有する誘導体を確認することができる。
【００４０】
一実施態様において、ＳＦＰまたはその誘導体または断片は、本発明の方法によって確認される。他の実施態様において、ＳＦＰをコードするヌクレオチド配列は、ＢＧＬ２（配列番号６２）、ＧＡＳ３（配列番号６３）、ＧＡＳ５（配列番号６４）、ＰＳＴ１（配列番号６５）、ＳＣＷ４（配列番号６６）、ＳＣＷ１０（配列番号６７）、ＳＩＭ１（配列番号６８）、ＵＴＨ１（配列番号６９）、ＹＧＰ１（配列番号７０）、ＹＰＳ１（配列番号７１）、およびＺＰＳ１（配列番号７２）から選択される。また他の実施態様において、ＳＦＰは、ＢＧＬ２（配列番号８０）、ＧＡＳ３（配列番号８１）、ＧＡＳ５（配列番号８２）、ＰＳＴ１（配列番号８３）、ＳＣＷ４（配列番号８４）、ＳＣＷ１０（配列番号８５）、ＳＩＭ１（配列番号８６）、ＵＴＨ１（配列番号８７）、ＹＧＰ１（配列番号８８）、ＹＰＳ１（配列番号８９）、およびＺＰＳ１（配列番号９０）から選択される。
【００４１】
本発明の方法は、高いレベルの組換え発現に対する要求が存在する「目的ポリペプチド」またはその誘導体をもって利用され得る。目的ポリペプチドに適用されるとき、用語「その誘導体」は、目的ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であるポリペプチドのことをいい、ここでポリペプチドは、その生物学的活性を実質的に保有する。特定の実施態様において、誘導体は、目的ポリペプチドのアミノ酸配列と７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一のアミノ酸配列を含む。誘導体は、目的ポリペプチドのアミノ酸配列に付加、欠失、置換、またはその組合わせを含むことができる。誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１−１５、１６−２０、２１−２５、２６−３０個の付加、置換、または欠失を有する変異体ポリペプチドを含むことができる。付加または置換は、また、自然的に発生しないアミノ酸の使用を含む。
【００４２】
目的蛋白質またはポリペプチドの誘導体の例としては、これに制限されないが、目的ポリペプチド内で確認された、欠失突然変異（例えば、単一方向性欠失）、機能性配列の付加（例えば、グリコシル化部位、制限酵素部位）、およびプロ−配列またはプレ−配列の欠失または付加（例えば、スワッピング）が含まれる。当業者は、ルーチンの突然変異誘発技術、例えば、前述した参照文献に記載された技術を用いて目的ポリペプチドの誘導体または目的ポリペプチドをコードする核酸を用意することができ、目的ポリペプチドの生物学的活性を実質的に保有する誘導体を確認することができる。
【００４３】
目的ポリペプチドがＳＦＰに融合する場合、目的ポリペプチドおよびＳＦＰは、同様の自然発生する蛋白質のポリペプチドではない。目的ポリペプチドは、学術目的のために研究されるものであるとか、または商業的な目的、例えば、治療または産業的用途のために製造されるものであり得る。目的ポリペプチドは任意の植物、動物または微生物から得ることができ、自然発生したり、核酸によってコードできる限り変形され得る。一実施態様において、目的ポリペプチドは、ヒト蛋白質である。また他の実施態様において、目的ポリペプチドは、サイトカイン、血清蛋白質、コロニー刺激因子、成長因子、ホルモン、または酵素である。
【００４４】
例えば、目的ポリペプチドは、インターロイキン、凝集因子、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、組織成長因子、上皮成長因子、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、表皮成長因子、血小板−由来成長因子、線維芽細胞成長因子、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素分泌ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン−放出ホルモン、炭水化物−特異的酵素、蛋白質分解性酵素、リパーゼ、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ、免疫グロブリン、サイトカイン受容体、ラクトフェリン、ホスホリパーゼＡ２−活性化蛋白質、インスリン、腫瘍壊死因子、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチト、エンケファリン、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性因子、成長ホルモン放出ペプチド、胸腺体液性因子、抗癌ペプチド、または抗生剤ペプチドから選択され得る。具体的な例としては、ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）、エキセンディン−３、エキセンディン−４（ＥＸＤ４）、グルカゴン−類似−ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒトインターロイキン−１β、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−３２α、ヒトインターロイキン−３２βまたはヒトインターロイキン−３２γ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン−βまたはヒトインターフェロン−γ、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子、ヒト顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血小板−由来成長因子、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、ヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒトインスリン−類似成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト形質転換成長因子β−１、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウシガラクトース−１−ポスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、クラゲ緑色蛍光蛋白質、カンジダアンタクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、菌類クロロペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レゾルバーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、トレハロースシンターゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト成長分化因子１５、ヒトガレクチン３結合蛋白質、ヒトセリンプロテアーゼ抑制剤、クニッツ類型（Ｋｕｎｉｔｚ  ｔｙｐｅ）２、ヒトヤヌス（Ｊａｎｕｓ）キナーゼ２、ヒトｆｍｓ−類似チロシンキナーゼ３リガンド、ヒトＹＭ１＆２、ヒトＣＥＭＩ、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ヒトレ���チン、ヒトｍＬ２５９、ヒトプロテイナーゼ３、ヒトリゾチーム、ヒトデッドボックス（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ）蛋白質４１、ヒトエトポシド導入蛋白質２４（ｈｕｍａｎ  ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２４）、マウスカスパーゼ１、ウシアンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼが挙げられが、これらに制限されない。
【００４５】
一実施態様において、目的ポリペプチドは、ルーチンの組換え生産方法を用いて製造し難いポリペプチド、すなわち、全く生産されなかったり、または低いレベルでしか生産されないポリペプチドである。また他の実施態様において、目的ポリペプチドは、公知の発現系を用いて容易に生産されるが、より高いレベルの発現を達成しようとする望みがあるポリペプチドである。
【００４６】
一実施態様において、本発明の融合ポリペプチドは、任意の順序で目的ポリペプチドに融合した分泌ポリペプチドを含む、ポリペプチドを示す。また他の実施態様において、本発明は、目的ポリペプチドに融合した本発明のＳＦＰを含む単離された融合ポリペプチドに関する。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「融合した」は、組換え的に製造された融合ポリペプチドを示す。一実施態様において、融合ポリペプチドは、目的ポリペプチドに融合した分泌ポリペプチドを含み、ここで、分泌ポリペプチドおよび目的ポリペプチドは、任意の順序で融合する。また他の実施態様において、ＳＦＰは、目的ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合する。ＳＦＰおよび目的ポリペプチドは、介入するアミノ酸、例えば、リンカーＤＮＡによってコードされたアミノ酸と共に、あるいはそれ無しで、融合することができる。特定の実施態様において、ＳＦＰと目的ポリペプチドとの間の距離は、０〜１０；０〜２０；０〜３０；０〜４０；またはそれ以上のアミノ酸であり得る。特定の実施態様において、融合ポリペプチドは、プロテアーゼ認識配列および／または親和性タグを含む。
【００４８】
一実施態様において、単離された融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸の１７６−２１３を含む親水性（ＨＬ）ドメインを含むＳＦＰまたはその誘導体、および目的ポリペプチドを含む。一実施態様において、変形されたＨＬドメインは、配列番号４５によってコードされる。
【００４９】
本発明は、さらに本発明のＳＦＰを使用して目的ポリペプチドを組換え的に生産する方法に関する。一実施態様において、前記方法は、ＳＦＰまたはその誘導体または断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトを用意する工程、宿主細胞を前記コンストラクトで形質転換させる工程、融合ポリペプチドが生産され、宿主細胞から分泌される条件下で宿主細胞を培養する工程、そして前記目的ポリペプチドから前記ＳＦＰを分離する工程を含む。
【００５０】
目的ポリペプチドは、当業者に知られている任意の発現系を用いて組換え的に生産され得る。好ましくは、目的ポリペプチドは、例えば、バクテリア、酵母、または哺乳動物細胞培養物で組換え的に発現される。組換え発現は、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用意する工程、ベクターを宿主細胞へ輸送する工程、目的ポリペプチドが発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、目的ポリペプチドを分離する工程、を含むことができる。組換えベクターを用意し、これを使用して宿主細胞を形質転換させ、宿主細胞でベクターを複製し、生物学的に活性である外部ポリペプチドおよび蛋白質を発現させるための方法および物質は、本明細書中で議論されており、そして文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１］および［Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００）］に記載されており、これらは、それぞれ参考として本明細書中に組み込まれる。
【００５１】
目的ポリペプチドは、宿主細胞が成長した培地から、当業者に知られている精製方法、例えば、培地からの沈殿法、またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、レセプターアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除ろ過、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなどを含む従来型のクロマトグラフィー方法によって単離され得る。また他の精製方法は、所望のポリペプチドが発現され、特異的結合パートナーまたは作用剤によって認識される特異的親和性ペプチド、タグ、ラベル、またはキレート残基を有する融合ポリペプチドとして精製される方法を含む。精製されたポリペプチドは切断されて、所望のポリペプチドを得ることができるし、または無傷の融合ポリペプチドとして残ることもできる。親和性タグ成分の切断は、切断過程の結果としてさらなるアミノ酸残基を有する所望のポリペプチドの形態を生成することができる。一実施態様において、親和性タグは、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、ユビキチン、ＦＬＡＧ、ＢＡＰ、６ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ、ＣＢＰ、ＣＢＤ、Ｓ−タグ、またはその任意の組合わせである。
【００５２】
本発明の目的ポリペプチドは、分泌融合パートナーとの融合形態で細胞外生産されることができ、インビトロプロテアーゼ処理によってＳＦＰから分離され得る。単離手法が行われた後に単離された目的ポリペプチドが生物学的に活性でない場合には、「リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）」またはポリペプチドのその３次構造への転換およびジスルフィド結合の生成のための様々な方法が生物学的活性を回復させるために使用され得る。当業者に知られている方法は、可溶化されたポリペプチドのｐＨを通常ｐＨ７より上に調整したり、特定濃度のカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在下に置くことを含む。カオトロープの選択は、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）可溶化のために利用された選択肢と非常に類似するが、一般的により低い濃度で行われ、必須的に可溶化のために使用されたような同一のカオトロープである必要はない。蛋白質のシステインブリッジ（など）を形成させるジスルフィドシャッフリングを起こす特定酸化還元電位を生成するために、還元剤または還元剤に特定の割合でその酸化された形態を加えたものを使用することが要求され得る。いくつかのルーチンに使用される酸化還元カップルとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。リフォールディングの効率を増加させるために、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンのような共溶媒を使用することが必要になることがある。
【００５３】
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸だけでなく、複数の核酸も含むものを意図し、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のことをいう。ポリヌクレオチドは、従来型のリン酸ジエステル結合または従来型でない結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で発見される）を含むことができる。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸切片、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を示す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その自然環境状態から除去された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含有された治療的ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されることが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞に残っている組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的にまたは相当に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写体だけでなく、本願に開示されたペスチウイルスベクターの陽性および陰性鎖形態、および二重鎖形態を含む。
【００５４】
本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成されたこのような分子をさらに含む。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節要素、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであることもあったり、またはこれらを含むことができる。
【００５５】
本明細書中で使用されるような「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。たとえ「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）がアミノ酸に翻訳されなくても、それはコード領域の一部で考慮されるかもしれないが、存在する場合、任意の側面配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非−翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域は、単一ポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば、単一ベクター上に、または分離ポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば、分離（異なる）ベクター上に存在することができる。また、任意のベクターは、単一コード領域を含有することができたり、または、２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、本発明のベクターは、蛋白質分解性の切断を介して最終ポリペプチドに翻訳後、または翻訳と同時に分離される１つ以上のポリペプチドをコードすることができる。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明のポリペプチドをコードする第１または第２の核酸、またはその変異体または誘導体に融合したりまたは融合しなかった異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、制限なく、細分化された要素またはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインを含む。
【００５６】
特定の実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、正常的にポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常１つ以上のコード領域と作動可能に連結されたプロモーターおよび／または、他の転写または翻訳制御要素を含むことができる。作動可能な連結とは、遺伝子生成物、例えば、ポリペプチドに対するコード領域が１つ以上の調節配列に連結され、そのような方式で調節配列（など）の影響または制御下で遺伝子生成物の発現が起こるようにする場合のことである。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれに連結されたプロモーター）は、プロモーター機能の導入が所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡの転写を招く場合、そして２つのＤＮＡ断片間の連結特性が遺伝子生成物の発現を指示するための発現調節配列の能力に干渉しない、または転写されたＤＮＡ鋳型の能力に干渉しない場合に、「作動可能に連結」されたものである。従って、プロモーターがその核酸の転写に作用できる場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結されたものである。プロモーターは、予め決定された細胞のみでＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞−特異的プロモーターであり得る。プロモーターの他に他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルがポリヌクレオチドと作動可能に連結されて細胞−特異的転写を指示することができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書中に開示されている。
【００５７】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、脊椎動物細胞で作用する転写制御領域、例えば、これに制限されないが、サイトメガロウイルス（例えば、即時初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）プロモーター、イントロン−Ａと共に）、類人猿ウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）からのプロモーターおよびエンハンサー切片が挙げられるが、これらに制限されない。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から由来したもの、例えば、アクチン、熱衝撃蛋白質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンだけでなく、真核細胞で遺伝子発現を制御できる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織−特異的プロモーターおよびエンハンサーだけでなく、リンフォカイン−誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００５８】
同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に公知である。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、およびウイルス系から由来した要素（特に内部リボソームエントリー部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列にも称する）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態を含むことができる。本発明のＲＮＡは、単鎖または二重鎖であり得る。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と連結され得る。シグナル仮説によれば、成長する蛋白質鎖が粗面小胞体を経て出現しはじめたとたんに、哺乳動物細胞によって分泌された蛋白質は、成熟蛋白質から切断されたシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を持つ。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドがポリペプチドのＮ−末端に融合したシグナルペプチドを一般的に持っており、これは、ポリペプチドの分泌または「成熟」型を生産するために、完全なまたは「全長」ポリペプチドから切断されるということを認知するだろう。特定の実施態様において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、またはそれに作動可能に連結されたポリペプチドの分泌を指示する能力を保有するその配列の機能性誘導体が使用される。別の法としては、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能性誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【００６１】
用語「コンストラクト」は、自然的に発生しない核酸分子を示す。コンストラクトは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一実施態様において、コンストラクトは、ＳＦＰまたは候補ＳＦＰおよび目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする。コンストラクトは、円型または線型のベクターをさらに含むことができ、例えば、相同組換えによって他のポリヌクレオチドと組合わせることができる。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ベクター」は、それが連結されたまた他の核酸を輸送できる核酸分子を示す。ベクターの１つの類型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡ切片がライゲーションされ得る円型の二重鎖ＤＮＡループを示す。他の類型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡ切片は、ウイルスゲノムでライゲーションされ得る。特定ベクターは、これらが導入された宿主細胞で自律的複製が可能である（例えば、バクテリア複製起点を持つバクテリアベクターおよびエピゾーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非−エピゾーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へ導入されて宿主細胞のゲノムに統合されることによって、宿主ゲノムと共に複製される。本発明のベクターは、作動的に連結された目的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書中「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本願において、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換的に使用されるが、プラスミドは、ベクターの最も通常的に使用される形態であるためである。しかし、本発明は、同等の機能をするそのような他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウイルス）ベクターを含む。
【００６３】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質感染技術を介して原核または真核細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」および「形質感染」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介性形質感染、リポフェクション、または電気穿孔法を含む外部核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、様々な当業者に認知された技術を示す。宿主細胞を形質転換させたりまたは形質感染させるための適切な方法は、文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９］、および他の実験マニュアルで探してみることができる。
【００６４】
利用された発現ベクターおよび形質感染技術に応じて変わるが、哺乳動物細胞の安定した形質感染のために、細胞の小さい分画だけが外部ＤＮＡをそのゲノムに統合させ得るということが公知されている。これらの統合体を確認および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生剤耐性）をコードする遺伝子が関心のある遺伝子と共に宿主細胞へ一般的に導入される。様々な選択可能なマーカーは、薬物に耐性を付与するものなど、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン  およびメトトレキサートを含む。選択可能なマーカーをコードする核酸は、目的ポリペプチドをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入されることができたり、または分離ベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定に形質感染された細胞は、薬物選択、栄養要求性マーカー選択、培地組成、炭素源選択、または当業者に知られている他の方法（例えば、他の細胞は死ぬ一方、選択可能なマーカー遺伝子を統合した細胞は生存すること）により確認され得る。
【００６５】
一実施態様において、本発明の方法で使用されたポリペプチドまたはその断片または誘導体をコードするヌクレオチド配列は、５’末端および３’末端で本発明の線型ベクターにてインビボ相同組換えのために使用されるＤＮＡをさらに含むことができる。５’末端および３’末端ＤＮＡは、十分な相同的配列を提供し、これらが宿主細胞に共形質転換される場合、ポリペプチドまたはその断片または誘導体をコードするヌクレオチド配列および線型ベクターの間にインビボ組換えができるようにする。一実施態様において、５’末端および３’末端ＤＮＡのそれぞれは、線型ベクターの配列と重なる２０個以上の塩基対、例えば、３０または４０個以上の塩基対を含む。５’および３’ＤＮＡの付加は、通常的組換えＤＮＡ技術、例えば、ＰＣＲおよび／または制限酵素切断およびライゲーションを用いて行うことができる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、親和性タグ、例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、ユビキチン、ＦＬＡＧ、ＢＡＰ、６ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ、ＣＢＰ、ＣＢＤ、またはＳ−タグをさらにコードすることができる。親和性タグは、リンカーＤＮＡによってコードされ得るとか、または本発明のポリヌクレオチドのまた他の部分、例えば、融合蛋白質をコードする領域の５’または３’部分によってコードされ得る。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドは、リンカーＤＮＡをさらに含むことができる。一実施態様において、リンカーＤＮＡは、リンカーペプチドをコードする。
【００６８】
本発明のリンカーＤＮＡは、十分な長さであることもあり、線型ベクターのヌクレオチド配列の一部に対して十分な配列同一性を持ち、これらが宿主細胞に共形質転換される場合、ポリペプチド−コードヌクレオチド配列および線型ベクターの間にインビボ組換えを可能にする。一実施態様において、リンカーＤＮＡは、２０個以上の塩基対の長さ、例えば、３０または４０個以上の塩基対の長さである。さらなる実施態様において、リンカーＤＮＡは、線型ベクター上で対応する配列と８０％以上、例えば、８５％、９０％、９５％、または９９％以上同一である。
【００６９】
一実施態様において、リンカーＤＮＡは、プロテアーゼ認識配列をコードすることによって、ＳＦＰおよび目的ポリペプチドの接合部で切断されるようにする。例えば、リンカーＤＮＡは、酵母ｋｅｘ２ｐ−またはＫｅｘ２−類似プロテアーゼ認識配列（例えば、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、またはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列（配列番号７４））、哺乳動物フリン−認識配列（例えば、Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列）、因子Ｘａ−認識配列（例えば、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列（配列番号７５））、エンテロキナーゼ認識配列（例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを含むアミノ酸配列）、サブチリシン認識配列（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒを含むアミノ酸配列（配列番号７６））、タバコエッチウイルスプロテアーゼ−認識配列（例えば、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙを含むアミノ酸配列（配列番号７７））、ユビキチン加水分解酵素−認識配列（例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含むアミノ酸配列）またはトロンビン−認識配列（例えば、Ａｒｇ−ＧｌｙＰｒｏ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列（配列番号７８））をコードすることができる。
【００７０】
リンカーのプロテアーゼ部位内における、あるいは分泌ポリペプチドまたは目的ポリペプチド内における、内在的宿主プロテアーゼによる融合ポリペプチドの望まれない切断を避けることが好ましい。これと同様に、目的ポリペプチドまたは分泌ポリペプチド、あるいはＳＦＰまたはその断片もしくはその誘導体内で目的ポリペプチドから分泌されたポリペプチドを切断するために使用される、プロテアーゼによる切断を避けることが好ましい。従って、プロテアーゼ認識配列をコードするリンカーＤＮＡが融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分として宿主細胞に形質転換される場合、宿主細胞は、好ましくは、リンカーでプロテアーゼ配列を認知するプロテアーゼを発現しない。宿主細胞は、プロテアーゼを自然的に発現しないこともあるとか、または宿主細胞は、プロテアーゼを発現しないように変形され得る（例えば、ｋｅｘ２突然変異宿主細胞、ｋｅｘ２−類似プロテアーゼ突然変異宿主細胞、およびフリン突然変異宿主細胞）。融合ポリペプチドが分泌ポリペプチドおよび目的ポリペプチドを含む場合、分泌ポリペプチド、ＳＦＰまたはその断片もしくは誘導体ならびに／あるいは目的ポリペプチドは、宿主プロテアーゼ認識配列を自然的に含めないこともあり得、あるいは分泌ポリペプチド、ＳＦＰ、その断片もしくは誘導体および／または目的ポリペプチドは、宿主プロテアーゼによって認識される配列を含有しないように変形され得る。融合ポリペプチドが分泌ポリペプチド、ＳＦＰまたはその断片もしくは誘導体、目的ポリペプチド、およびプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーを含む場合、分泌ポリペプチド、ＳＦＰまたはその断片もしくは誘導体ならびに／あるいは目的ポリペプチドは、プロテアーゼ認識配列を自然的に含めないこともあり得、あるいは分泌ポリペプチド、ＳＦＰまたはその断片もしくは誘導体ならびに／あるいは目的ポリペプチドは、ペプチドリンカーのプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼによって認識される配列を含有しないように変形され得る。
【００７１】
また他の実施態様において、リンカーＤＮＡは、親和性タグ、例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、ユビキチン、ＦＬＡＧ、ＢＡＰ、６ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ、ＣＢＰ、ＣＢＤ、またはＳ−タグをコードする。
【００７２】
さらなる実施態様において、リンカーＤＮＡは、制限酵素認識部位およびプロテアーゼ認識配列（例えば、ｋｅｘ２ｐ−類似プロテアーゼまたはｋｅｘ−２ｐ−認識配列）をコードする。
【００７３】
原核生物におけるポリペプチドの発現は、目的ポリペプチド−レポーターポリペプチド融合の発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターで行うことができる。適したエシェリキア・コリ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が含まれる。
【００７４】
酵母細胞における発現のために適切な酵母発現ベクターとしては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（（Ｋｕｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３（１９８７））、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（インビトロジェン）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００７５】
昆虫細胞における発現のために、バキュロウイルス発現ベクターが使用され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるポリペプチドの発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９））が挙げられる。
【００７６】
また他の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞であり、ベクターは哺乳動物発現ベクターである。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（文献［Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０（１９８７）］）およびｐＭＴ２ＰＣ（文献［Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７）］）が含まれる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素によってしばしば提供される。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよび類人猿ウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系としては、例えば、文献［Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６  ａｎｄ  １７  ｏｆ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９］を参照すること。
【００７７】
好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルス、および統合可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同的組換えによって宿主ゲノムに統合可能な断片）が挙げられるが、これらに制限されない。
好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルスが挙げられるが、これらに制限されない。好ましい発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに制限されない。他の発現ベクターとしては、ｐＳＰＯＲＴＴＭベクター、ｐＧＥＭＴＭベクター（プロメガ社）、ｐＰＲＯＥＸベクターＴＭ（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＴＭベクター（ストラタジーン社）、ｐＱＥＴＭベクター（キアゲン社）、ｐＳＥ４２０ＴＭ（インビトロジェン）、およびｐＹＥＳ２ＴＭ（インビトロジェン）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００７８】
一実施態様において、発現ベクターは、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が作動可能にリンクされたり、あるいは適した宿主で目的ポリペプチドの発現に影響を与えうる適切な制御配列に連結された、複製可能なＤＮＡコンストラクトである。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連された場合、作動可能にリンクされたり、または連結されている。例えばプロモーターは、配列の転写を制御する場合にコード配列に作動可能にリンクされたり、または連結されている。ベクターの増幅には、発現制御ドメインを要求しないが、複製起点によって通常付与された宿主での複製能力、および形質転換体の認識を促進するための遺伝子選択能力だけが要求される。発現ベクターにおける制御配列に対する要件は、選択された宿主および選択された形質転換方法に応じて異なるだろう。一般的に、制御配列としては、転写プロモーター、エンハンサー、転写を制御するための選択的オペレーター配列、ポリアデニル化シグナル、適切なｍＲＮＡリボソーム結合をコードする配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられるが、これらに制限されない。このような調節配列は、例えば、文献［Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）］に記載されている。調節配列は、多くの類型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定宿主細胞のみでヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織−特異的調節配列）を含む。当業者は、発現ベクターの考案が形質転換される宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの因子に応じて変わる可能性があることを認知するだろう。
【００７９】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞へ導入されることによって、本明細書中に記載された核酸によってコードされる融合蛋白質またはペプチドを含む、蛋白質またはペプチドを生成することができる。好ましいベクターは、宿主有機体によって認識されるプロモーターを含有する。
【００８０】
一実施態様において、本発明のプロモーターは、外部ポリペプチドの組換え生成のために使用される強力な異種プロモーターである。異種プロモーターは、誘導性であり得るし、あるいは構成的であり得る。好ましい異種プロモーターは、蛋白質の商業的生成のために使用されるものなど、例えば、下記に記載されたものなどである。本発明の異種プロモーターは、天然または野生型ＳＦＰプロモーターから区別可能である。
【００８１】
本発明のプロモーター配列は、原核生物、真核生物またはウイルス由来であり得る。適切な原核生物配列の例としては、バクテリオファージラムダのＰＲおよびＰＬプロモーター（Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９７３）、その全文が本明細書中に参考として組み込まれる；Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８０）、その全文が本明細書中に参考として組み込まれる）；エシェリキア・コリのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱衝撃、およびｌａｃＺプロモーターおよびＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０（１９８１）、その全文が本明細書中に参考として組み込まれる）が挙げられる。酵母に対しては、適切なプロモーターの例としては、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＴＥＦ、ＧＡＬ１、およびＧＡＬ１０が挙げられるが、これらに制限されない。さらなるプロモーターとしては、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫欠乏ウイルスの長い末端反復、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインが挙げられるが、これらに制限されない。
【００８２】
またさらなる調節配列を、好ましいベクターに含めることができる。適切な調節配列の例は、ファージＭＳ−２のレプルリカーゼ遺伝子およびバクテリオファージラムダの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列によって表される。
【００８３】
また、適切な発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする適したマーカーを含みうる。選択された宿主の形質転換は、当業者に十分公知された様々な技術のうち、任意の１つを用いて行われ、サムブルックなど（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）の前記文献に記載されている。
【００８４】
複製起点は、また、ベクターの作製によって外因性起点を含むように提供され得るか、あるいは、宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供され得る。ベクターが宿主細胞染色体に統合される場合、後者が十分であることもできる。これとは異なって、ウイルス複製起点を含有するベクターを使用するよりも、当業者は、選択可能なマーカーおよび目的ポリペプチドＤＮＡで共形質転換の方法によって哺乳動物細胞を形質転換させ得る。適切なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼ（米国特許第４，３９９，２１６号参照）である。
【００８５】
目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ライゲーションのためのブラント−エンド（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）またはスタガード−エンド（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、粘着性末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）を適切な位置に埋めること、好ましくない連結を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および適したリガーゼでライゲーションさせることを含む従来技術によって、ベクターＤＮＡに組換えされ得る。このような操作に対する技術は、サムブルックなど（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）の前記文献に開示されており、当業界に良く公知されている。哺乳動物発現ベクターの作製方法は、例えば、文献［Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３）］、［Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５（１９８６）］、［Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）］、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、およびＷＯ９１／１８９８２に記載されており、これらのそれぞれは、その全文が本明細書中に参考として組み込まれる。
【００８６】
本発明で使用した宿主細胞は、当業者に公知の任意の宿主細胞であり得る。適した宿主細胞としては、バクテリア、菌類（例えば、酵母）、植物、または動物（例えば、哺乳動物または昆虫）細胞が挙げられる。適した酵母細胞としては、カンジダ、デバリオミセス、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、ピキア、シゾサッカロミセス、ヤロウィア、サッカロミセス、シュワンニオミセス、およびアルクスラ種が挙げられる。具体的な例としては、カンジダ・ユチリス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・アルビカンス、クルイベロミセスラクティス、ピキアパストリス、ピキアスチピチス、シゾサッカロミセスポンベ、サッカロマイセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウィア・リポリティカ、シュワンニオミセス・オクシデンタリス、およびアルクスラ・アデニニボランスが挙げられる。他の適切な菌類としては、アスペルギルス、ペニシリウム、リゾプス、およびトリコデルマ種が挙げられる。宿主細胞として使用され得るバクテリアとしては、エシェリキア、シュードモナス、およびバチルス種が挙げられる。適切な植物宿主細胞としては、アラビドプシス、トウモロコシ、タバコ、およびジャガイモが挙げられる。動物細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、猿、および昆虫から由来した細胞が挙げられる。例としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、およびＳｆ９細胞が挙げられる。特定の実施態様において、宿主細胞は、酵母細胞である。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリペプチドコード領域またはウイルスベクターを含む原形プラスミドの一部として、または線型ＤＮＡとして宿主細胞に導入され得る。当業者によく知られ従来より用いられるＤＮＡの宿主細胞への導入方法としては、形質転換法、形質感染法、電気穿孔法、核注入法、または運搬体、例えば、リポソーム、ミセル、皮細胞、およびプロトプラストとの融合法が挙げられる。
【００８８】
迅速且つ効率的に検出可能なレポーター蛋白質が本発明で使用され得る。一実施態様において、レポーター蛋白質は、スクリーニング過程を自動化するために陽性的に選択され得る活性を有する。さらなる実施態様において、レポーター蛋白質は、細胞外空間に分泌された蛋白質、例えば、インベルターゼ、スクラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、アミラーゼ、クルコアミラーゼ、ガラクトシダーゼ（例えば、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、メリビアーゼ）、ホスファターゼ（例えば、ＰＨＯ５）、β−ラクタマーゼ、リパーゼまたはプロテアーゼである。特定の実施態様において、分泌された蛋白質は、細胞が特定基質上で成長するようにする。哺乳動物細胞におけるレポーターシステムの例として、マウス胚芽幹細胞で分泌経路遺伝子を探すために、抗生剤Ｇ４１８を含有する培地でＣＤ２／ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｃｅｏ）遺伝子が、分泌レポーターとして使用され得る（Ｄｅ−Ｚｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：ｅ２５（２００６））。
【００８９】
一実施態様において、宿主細胞は、酵母であり、レポーター蛋白質は、インベルターゼであり、形質転換された酵母細胞は、スクロスまたはラフィノース上で成長できるその能力について選択される。また他の実施態様において、宿主細胞は、酵母であり、レポーター蛋白質は、メリビアーゼであり、形質転換された酵母細胞は、メリビオース上で成長できるその能力について選択される。さらなる実施態様において、宿主細胞は、酵母であり、レポーター蛋白質は、アミラーゼ（例えば、エンドアミラーゼ、エキソアミラーゼ、β−アミラーゼ、またはグルコアミラーゼ）であり、酵母細胞は、非−澱粉分解性であり、形質転換された細胞は、澱粉を分解できるその能力についてスクリーニングされる。
さらなる実施態様において、レポーター蛋白質の活性を示す細胞を確認する工程は、成長抑制剤、例えば、抗生剤に耐性を提供するレポーター蛋白質を使用することによってなされる。また他の実施態様において、レポーター蛋白質は、視覚的に検出され得る蛋白質、例えば、緑色蛍光蛋白質またはルシフェラーゼである。一実施態様において、レポーター蛋白質の活性を示す細胞を確認する工程は、２つ以上のレポーター蛋白質、例えば、リパーゼおよびインベルターゼを使用することによってなされる。
【００９０】
本発明の宿主細胞は、レポーター蛋白質活性を示さない。一実施態様において、宿主細胞はレポーター蛋白質を自然的に発現させない。他の実施態様において、レポーター蛋白質をコードする遺伝子（など）は、全体または一部が欠失されたり、レポーター蛋白質が発現しなかったりまたは非活性形態で発現するように突然変異される。細胞に特定の蛋白質が欠乏されるようにする方法は、当業者によく知られており、任意のそのような方法が本発明の宿主細胞を用意するために利用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前記文献）。酵母において、レポーター遺伝子欠乏は、良く公知された遺伝子代替技術を用いて導入され得る（文献［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：２８１（１９９１）］）。
【００９１】
目的ポリペプチドをコードする核酸は、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからの単離、ＰＣＲによる増幅、または化学的合成を含む当業者によく知られた従来の技術を用いて任意の供給源から得ることができる。
【００９２】
核酸またはその断片のライブラリは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および組換えＤＮＡを含む任意の類型のＤＮＡから得ることができる。ＲＮＡおよび自然的に発生しない核酸を含むＤＮＡ以外の核酸もまた使用され得る。
予め選択された核酸断片のライブラリは、以前に確認された核酸断片を多様化することによって、例えば、単一方向性欠失、突然変異、機能性配列（例えば、グリコシル化部位）の付加または、核酸断片の間でのプレおよびプロ−シグナル配列のスワッピングによって得ることができる。一実施態様において、核酸断片は、１０００塩基対未満、例えば、７００、５００、または、３００塩基対未満のサイズを持つ。核酸断片のライブラリは、ＤＮＡの酵素的切断、ｃＤＮＡ合成、または組換えＤＮＡ技術（例えば、単一方向性欠失、突然変異誘発）によって作製され得る。
【００９３】
核酸断片は、有機体の全体ゲノム、例えば、全体ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリに由来しうる。断片は、また、全体ゲノムの任意の部分、例えば、サブトラクションライブラリまたはサイズ分類したライブラリ由来することができる。
【００９４】
下記の実施例は、本発明の方法および組成物を例示するが、これらに制限されない。当業者に明らかであり、臨床治療において一般的に含まれる様々な条件およびパラメータの他の適切な変形および適用は、本発明の精神および範囲内にある。
【実施例】
【００９５】
実施例１
細胞外分泌のためのＹＧＲ１０６Ｃ遺伝子の最適サイズの決定
この実施例は、細胞外分泌のために必要なＹＧＲ１０６の最適領域を立証する。図１Ａに示されたように、ＹＧＲ１０６Ｃ（以下、分泌融合パートナー１、ＳＦＰ１）蛋白質（配列番号１）は、シグナルペプチド、３つのグリコシル化部位、１つの親水性ドメイン（ＨＬ）および１つの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する２６５個のアミノ酸残基からなる。
【００９６】
ＧＡＬ１０プロモーターの制御下で無傷のＹＧＲ１０６Ｃ遺伝子の過剰発現は、培養培地でＹＧＲ１０６Ｃ蛋白質を生成しなかった。しかし、末端切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＳＦＰ１（配列番号１のアミノ酸１−２１３）は、ＹＧＲ１０６ＣのＣ−末端切断型形態を用いて酵母ＧＡＬ１０プロモーターの制御下で培養培地に高いレベルで分泌した。
【００９７】
ＳＦＰ１遺伝子の最適ドメインのさらなる同定は、分泌に対して決定した。ＳＦＰ１蛋白質には、いくつかの機能性ドメインが存在するが、例えば、シグナル分泌シグナル（配列番号１のアミノ酸１−１９）、親水性ドメイン（ＨＬ）（配列番号１のアミノ酸１７６−２１３）および膜貫通ドメイン（ＴＭ）（配列番号１のアミノ酸２２０−２４７）をカイト−ドゥーリトル疏水性分析によって決定した（図１Ａ）。
【００９８】
ＳＦＰ１遺伝子が順次に欠失された異なるベクターを含有する組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ２８０５（Ｍａｔ  ａ  ｕｒａ３  ＩＮＶ２  ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３  ｃａｎ１）菌株を作製し、それぞれのベクターからＳＦＰ１関連蛋白質の分泌を比較した（図１Ｂ）。最初に、無傷のＳＦＰ１蛋白質を発現させるために、ＳＦＰ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をサッカロマイセス・セレビシエ２８０５ゲノムＤＮＡからＰＣＲプライマー、ＢａｍＨＩ部位を含有するセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびＳａｌＩ部位を含有するアンチセンスプライマーＨ１５９（配列番号３）で増幅させた。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社製、米国）またはＥｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社：ＴａＫａＲａ  Ｋｏｒｅａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で実施した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間１回の変成工程、および９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２５回増幅サイクル、続いて７２℃で７分間の最終延長を含んだ。増幅されたＳＦＰ１ＯＲＦをＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで消化し、ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位でサブクローニングし（文献［Ｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：６５３（１９９５）］）、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９１と命名した。
【００９９】
Ｃ−末端からＴＭドメインまで欠失した末端切断型ＳＦＰ１蛋白質を発現させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１ベクターからセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびアンチセンスプライマーＨ１６０（配列番号４）で増幅させた。増幅した部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１の作製と同様の方法を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にクローニングし、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９２と命名した。
【０１００】
また、Ｃ−末端からＨＬドメインの半分まで欠失した異なる末端切断型ＳＦＰ１蛋白質を発現させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１ベクターからセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびアンチセンスプライマーＨ１６１（配列番号５）で増幅させた。増幅した部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１の作製と同様の方法を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にクローニングし、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９３と命名した。
【０１０１】
また、Ｃ−末端からＨＬドメインまで欠失した異なる末端切断型ＳＦＰ１蛋白質を発現させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１ベクターからセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびアンチセンスプライマーＨ１６２（配列番号６）で増幅させた。増幅した部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１の作製と同様の方法を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にクローニングし、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９４と命名した。
【０１０２】
また、Ｃ−末端から第３のグリコシル化部位まで欠失した異なる末端切断型ＳＦＰ１蛋白質を発現させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１ベクターからセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびアンチセンスプライマーＨ２０５（配列番号７）で増幅させた。増幅した部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１の作製と同様の方法を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にクローニングし、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９５と命名した。
【０１０３】
また、Ｃ−末端から第２のグリコシル化部位までが欠失した異なる末端切断型ＳＦＰ１蛋白質を発現させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１ベクターからセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびアンチセンスプライマーＨ２０４（配列番号８）で増幅させた。増幅した部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１の作製と同様の方法を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にクローニングし、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９６と命名した。
【０１０４】
また、Ｃ−末端から第１のグリコシル化部位までが欠失された異なる末端切断型ＳＦＰ１遺伝子を発現させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１ベクターからセンスプライマーＴ９Ｆ（配列番号２）およびアンチセンスプライマーＨ２０３（配列番号９）で増幅させた。増幅した部分ＳＦＰ１遺伝子を、ＹＧａＴ９１の作製と同様の方法を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５にクローニングし、これで生成されたプラスミドをＹＧａＴ９７と命名した。
【０１０５】
酵母サッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株（Ｍａｔ  ａ  ｕｒａ３  ＩＮＶ２  ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３  ｃａｎ１）を、作製したベクター（ＹＧａＴ９１、ＹＧａＴ９２、ＹＧａＴ９３、ＹＧａＴ９４、ＹＧａＴ９５、ＹＧａＴ９６、およびＹＧａＴ９７）で形質転換させた。異なる形質転換のＵＤプレート（アミノ酸無し０．６７％酵母窒素ベース、０．７７ｇ／ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％アガー）から選択される単一コロニーを、ＹＰＤＧブロス培地（１％酵母抽出物、２％バクト−ペプトン、１％グルコース、１％ガラクトース）で４０時間３０℃で培養した。それぞれの培養ブロス０．６ｍｌのうち、分泌された蛋白質をアセトン０．４ｍｌで濃縮させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。図１Ｃに示されたように、ＳＦＰ１関連蛋白質は、ＹＧａＴ９２、ＹＧａＴ９３およびＹＧａＴ９４を保有する細胞（それぞれレーン２、３、および４）のみで確認した。１つのグリコシル化された形態および他の非−グリコシル化された２つのバンドを３つの陽性菌株の全てで検出した。しかし、他の細胞、ＹＧａＴ９１、ＹＧａＴ９５、ＹＧａＴ９６、およびＹＧａＴ９７では、そのようなバンドを示さなかった（それぞれレーン１、５、６、および７）。これらの結果は、ＴＭドメインの除去および３つのグリコシル化部位全てを含有するドメインを保有することによって、ＳＦＰ１の細胞外分泌が可能になるということを示している。
【０１０６】
実施例２
目的蛋白質の分泌のための融合パートナーとしての、ＳＦＰ１遺伝子の最適サイズの決定
この実施例は、ＳＰＦ１誘導体の融合パートナーとしての用途を立証する。例示的な目的蛋白質である、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）の分泌のための融合パートナーとしてのＳＦＰ１誘導体を試験するために、ＹＧａＴ９２、ＹＧａＴ９３およびＹＧａＴ９４の３つのＳＦＰ１誘導体（ＳＦＰ１−９２（配列番号３９）、ＳＦＰ１−９３（配列番号４０）、およびＳＦＰ１−９４（配列番号４１））との融合蛋白質として、それぞれｈＩＬ−２を発現させるための３つのベクターを作製した（図２Ａ）。ＹＧａＴ９１とのｈＩＬ−２融合もまた生成し、ＳＦＰ１−９１（配列番号３８）のデータは示さなかった。ｈＩＬ２遺伝子をＹＧａＴ９２のＳＦＰ１−９２と融合させるために、部分ＳＦＰ１遺伝子をＹＧａＴ９２ベクターからＧＡＬ１０プロモーターを認識するセンスプライマーＧＡＬ１００（配列番号１０）およびアンチセンスプライマーＨ１２１（配列番号１１）で増幅させた。ｈＩＬ２遺伝子との融合を促進し、ｈＩＬ２融合蛋白質の酵母ジペプチジルプロテアーゼＫｅｘ２ｐによるインビボ切断を誘導するために（Ｍｉｚｕｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５６：２４６（１９８８））、Ｈ１２１プライマー（配列番号１１）をＫｅｘ２ｐ切断配列およびＮ−末端ｈＩＬ２配列を含有するように考案した。ヒトＩＬ−２遺伝子をＨ１２１プライマー（配列番号１１）に相補的なＳＦＰ１配列の一部を含有するセンスプライマーＩＬ２Ｆ（配列番号１２）およびアンチセンスプライマーＩＬ２Ｒ（配列番号１３）で増幅させた。ＩＬ２Ｒプライマーは、ＧＡＬ７ターミネーター配列の一部を含有する。ＳＦＰ１−９２およびｈＩＬ−２遺伝子を含有する増幅されたＰＣＲ断片を重複−延長（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲによってＧＡＬ１００およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）プライマーで融合させた。ＧＴ５０Ｒプライマーは、ＧＡＬ７ターミネーターを認識するアンチセンスプライマーである。これで生成されたＰＣＲ生産物を、１００ｂｐのＧＡＬ１０プロモーター配列および５０ｂｐのＧＡＬ７ターミネーター配列でフランキングさせた。発現宿主としてサッカロマイセス・セレビシエの長所のうちの１つは、効率的且つ正確な相同的組換えストラテジーを利用することが可能であるということである。断片末端の一側面上にＤＮＡ配列重複を共有する線型化されたベクターおよびＤＮＡ断片は、プラスミドの円型トポロジーを復旧する組換えを行うことができるということが当業界で公知されている（文献［Ｋｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１５：７３（１９８７）］）。サッカロマイセス・セレビシエのこの特性を発現宿主系の作製のために利用した。
【０１０７】
インビボ組換え骨格としてＹＧａＴ９２ベクターを使用するために、ＹＧａＴ９２ベクターをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断させた。線型化されたベクター断片をアガロースゲルからゲル抽出キット（バイオニア、韓国）を用いて単離した。ＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで増幅されたＰＣＲ生成物は、線型化されたベクターと５０個以上のヌクレオチドを共有した。インビボ組換えのための最小要件は、約３０個のヌクレオチド重複である［Ｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４５１（１９９７）］。５０個のヌクレオチド重複は、サッカロマイセス・セレビシエでプラスミドを再作製するのに十分である。組換えサッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株を前記記載のＰＣＲ生成物およびベクター断片で共形質転換させることによって、直接作製した。組換えによって作製、生成されたプラスミドをＹＧａＴ９２−ＩＬ２と命名した（図２４）。ＹＧａＴ９３−ＩＬ２ベクターで形質転換されたサッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株の作製のために、本発明者らは、Ｈ１２０プライマー（配列番号１５）をＨ１２１プライマー（配列番号１１）の代わりに使用したことを除いては、ＹＧａＴ９２−ＩＬ２プラスミド作製で使用したものと同様の手法を用いた。Ｈ１２０プライマーは、ＹＧａＴ９３ベクターのＳＦＰ１遺伝子の３’末端を認識し、Ｋｅｘ２ｐ切断配列およびＮ−末端ｈＩＬ２配列を含有するアンチセンスプライマーである。サッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株をＹＧａＴ９４−ＩＬ２ベクターで形質転換させるために、Ｈ１１９プライマー（配列番号１６）をＨ１２１プライマー（配列番号１１）の代わりに使用し、その他には、ＹＧａＴ９２−ＩＬ２プラスミド作製に対して記載したものと同様の手法を用いた。Ｈ１１９プライマーは、ＹＧａＴ９４ベクターのＳＦＰ１遺伝子の３’末端を認識するアンチセンスプライマーであり、Ｋｅｘ２ｐ切断配列およびＮ−末端ｈＩＬ２配列を含有する。
【０１０８】
ＵＤプレート（アミノ酸無し０．６７％酵母窒素ベース、０．７７ｇ／ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％アガー）から選択される単一コロニーを、ＹＰＤＧブロス培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、１％グルコース、１％ガラクトース）で４０時間３０℃で培養した。それぞれの培養ブロス０．６ｍｌのうち分泌された蛋白質をアセトン０．４ｍｌで濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。図２Ｂに示されたように、ＳＦＰ１誘導体蛋白質およびｈＩＬ２は、ＹＧａＴ９２−ＩＬ２（配列番号５８）およびＹＧａＴ９３−ＩＬ２（それぞれレーン１および２）を保有するサッカロマイセス・セレビシエ細胞から分泌されたが、ＹＧａＴ９４−ＩＬ２細胞（レーン３）は、分泌しなかった。この結果は、融合形態で発現される場合、ＨＬドメインがＳＰＦ１誘導体蛋白質の分泌に重要であることを示唆する。
【０１０９】
実施例３
ＳＦＰ１誘導体と融合した目的蛋白質の発現
ＹＧａＴ９２から実施例２で作製されたＳＦＰ１−９２（配列番号３９）を、エキセンディン−４（ＥＸＤ４）、グルカゴン−類似ペプチド−１（ＧＬＰ１）の３９個のアミノ酸ペプチド類似体の分泌生成のために使用した。無傷のＥＸＤ４蛋白質の単純且つ効率的な精製のために、６−ヒスチジンタグおよびエンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ（配列番号７９）、Ｄ：アスパラギン酸、Ｋ：リジン）をＳＦＰ１のＣ−末端に付加した。従って、融合蛋白質のＮ−末端からＣ−末端では、ＳＦＰ１断片、６−ヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位およびＥＸＤ４配列を含んでいた。ＳＦＰ１−９２  ＥＸＤ４融合蛋白質を発現するＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターを作製するために、ＳＦＰ１−９２遺伝子をＹＧａＴ９２ベクターからＨＬ配列を認識し、６個のヒスチジンコドンを含有するアンチセンスプライマーＨＤＫ−Ｒ（配列番号１７）およびＧＡＬ１００プライマー（配列番号１０）で増幅させた。ＥＸＤ４遺伝子をＤＤＤＤＫコドンおよびＨＤＫ−Ｒプライマーに相補的な１８個のヌクレオチドを含有するセンスプライマーＨＤＫ−Ｆ（配列番号１８）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）プライマー配列の１８個のヌクレオチドを含有するアンチセンスプライマーＥＸＤ−Ｒ（配列番号１９）で増幅させた。増幅されたＳＦＰ１−９２およびＥＸＤ４遺伝子を重複−延長ＰＣＲによってＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで融合させた。ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターを保有する組換えサッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株を、実施例２に記載したように融合した断片およびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したＹＧａＴ９２ベクター断片の共形質転換を介してインビボ組換えによって直接作製した。
【０１１０】
ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４で形質転換された組換え酵母菌株を５−Ｌ発酵槽（ｊａｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）で流加培養によって培養して、ＳＦＰ１−９２−ＥＸＤ４融合蛋白質の分泌生成を誘導するその能力について評価した。発酵槽で接種させる種菌培養物をフラスコで種菌培養培地（アミノ酸無し６．７％酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸および２％グルコース）を使用して培養した。初期発酵培地として発酵培養培地（４％酵母抽出物、１％ペプトン、２％グルコース）を使用して培養する場合、ＯＤ６００が約１５に達し、流加培地（１５％酵母抽出物、３０％グルコース、３０％ガラクトース）を細胞成長速度に応じて様々な量で供給した。約４８時間の培養後、培養物は、ＯＤ６００が約１６０に達した。培地１０μｌを提示された時点で収集し、分泌された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図３Ａ−Ｂ）。標準蛋白質バンドと比較して、分泌されたＳＦＰ１−ＥＸＤ４は、約５００ｍｇ／Ｌと測定された。上澄液を遠心分離によって回収して酵母細胞を除去し、限外ろ過（クイックスタンド、アマシャム：Ｑｕｉｃｋｓｔａｎｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）により濃縮させて脱塩させた。
【０１１１】
融合蛋白質、ＳＦＰ１−９２−ＥＸＤ４をＮｉ−ＮＴＡ親和性カラム（キアゲン、米国）で精製した（図４、レーン１）。ＳＦＰ１−９２融合蛋白質からＥＸＤ−４を回収するために、精製された融合蛋白質を異なる濃度のエンテロキナーゼ（インビトロジェン、米国）で切断させた。サンプルをエンテロキナーゼ緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２］に溶解させた。同量の蛋白質サンプルを０．１、０．２および０．３μｌのエンテロキナーゼで１時間、３７℃で切断させた。これで生成された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４、それぞれレーン２、３および４）。
【０１１２】
２つのバンドでないいくつかの小さい蛋白質バンドが生成された。これらの小さい断片は、エンテロキナーゼによるＳＦＰ１の非特異的消化の結果として見える。ＳＦＰ１蛋白質は、ＤＤＫ（１３７番目アミノ酸）およびＥＤＫ（１６８番目アミノ酸）残基を含有し、これはエンテロキナーゼの基質として使用可能である。
【０１１３】
ＳＦＰ１−９２−ＥＸＤ４から回収したＥＸＤ−４のさらなる分析のために、エンテロキナーゼを処理したサンプル（図４、レーン３）をＨＰＬＣによって分画化した（図５Ａ）。ＨＰＬＣクロマトグラムでピークとして検出された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図５Ｂ）。ＨＰＬＣ分画数４１は、ＥＸＤ−４と予想される単一バンドを示した。蛋白質をさらに分析してマトリックス支援レーザー脱離質量時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；韓国基礎科学支援研究院、大田、韓国）によりその分子量（ＭＷ）を決定した（図６）。ＳＦＰ１−９２融合から生成されたＥＸＤ−４のＭＷは、４１８７．８Ｄａであり、そのアミノ酸配列によって計算されたＭＷと一致した。
【０１１４】
エンテロキナーゼに耐性のある強力なＳＦＰ１−９２融合パートナーを作製するために、ＤＤＫおよびＥＤＫ残基をＤＧＫおよびＥＧＫ残基にそれぞれ交替した（図７Ａ）。ＤＤＫ残基をＤＧＫ残基に交替するために、５’ＳＦＰ１−９２断片をＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４からＧＡＬ１００プライマー（配列番号８）およびＤＤＫ残基のアスパラギン酸コドンの代りにグリシンコドンを含有するアンチセンス突然変異誘発性プライマーＨ３０７（配列番号２０）で増幅させた。３’ＳＦＰ１−９２−ＥＸＤ４断片もまた、Ｈ３０７（配列番号２０）に相補的なセンスプライマーＨ３０６（配列番号２１）およびＧＴ５０Ｒプライマー（配列番号１４）でＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターから増幅させた。これらの断片を重複延長ＰＣＲによってＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで融合させた。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断させた後、融合した断片をＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。これで生成されたプラスミドのヌクレオチド配列を確認し、ＳＦＰ１−９２１（配列番号４２）を含有するＹＧａＴ９２１−ＥＸＤ４と命名した。
【０１１５】
ＥＤＫ残基をＥＧＫ残基に交替するために、５’ＳＦＰ１断片をＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４からＧＡＬ１００プライマー（配列番号１０）およびＥＤＫ残基のアスパラギン酸コドンの代りにグリシンコドンを含有するアンチセンス突然変異誘発性プライマーＨ３０９（配列番号２２）で増幅させた。３’ＳＦＰ１−９２−ＥＸＤ４断片をまた、Ｈ３０９（配列番号２２）に相補的なセンスプライマーＨ３０８（配列番号２３）およびＧＴ５０Ｒプライマー（配列番号１４）でＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターから増幅させた。これらの断片をＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで重複延長ＰＣＲによって融合させた。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断させた後、融合した断片をＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。これで生成されたプラスミドのヌクレオチド配列を確認し、ＳＦＰ１−９２２（配列番号４３）を含有するＹＧａＴ９２２−ＥＸＤ４と命名した。
【０１１６】
ＤＤＫおよびＥＤＫ残基の両方をＤＧＫおよびＥＧＫでそれぞれ交換するために、５’ＳＦＰ１断片をＧＡＬ１００プライマー（配列番号１０）およびＥＤＫ残基のアスパラギン酸コドンの代わりにグリシンコドンを含有するアンチセンス突然変異誘発性プライマーＨ３０９（配列番号２２）でＹＧａＴ９２１−ＥＸＤ４から増幅させた。３’ＳＦＰ１−ＥＸＤ４断片をまた、Ｈ３０９（配列番号２２）に相補的なセンスプライマーＨ３０８（配列番号２３）およびＧＴ５０Ｒプライマー（配列番号１４）でＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターから増幅させた。これらの断片をＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで重複延長ＰＣＲによって融合させた。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断させた後、融合した断片をＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４ベクターのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。これで生成されたプラスミドのヌクレオチド配列を確認し、ＳＦＰ１−９２３（配列番号４４）を含有するＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４と命名した（図２５）。
【０１１７】
サッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株を、ベクター：ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４、ＹＧａＴ９２１−ＥＸＤ４、ＹＧａＴ９２２−ＥＸＤ４、およびＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４で形質転換させた。ＵＤプレート（アミノ酸無し０．６７％酵母窒素ベース、０．７７ｇ／ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％アガー）から選択される単一コロニーをＹＰＤＧブロス培地（１％酵母抽出物、２％バクト−ペプトン、１％グルコース、１％ガラクトース）で４０時間３０℃で培養した。培養上澄液０．６ｍｌ中に含まれた蛋白質をアセトン０．４ｍｌで沈殿させ、エンテロキナーゼ緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２］に溶解させた。同量の蛋白質サンプルをエンテロキナーゼ０．１μｌで１時間、３７℃で切断させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【０１１８】
図７Ｂに示されたように、ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４形質転換体から生成されたＳＦＰ１を約１５ｋＤａ断片（図７Ｂ、レーン１）で切断させたが、ＹＧａＴ９２１−ＥＸＤ４およびＹＧａＴ９２２−ＥＸＤ４形質転換体から生成されたＳＦＰ１（図７Ｂ、それぞれレーン２および３）は、ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４からのＳＦＰ１より内部ＳＦＰ１エンテロキナーゼ切断に対してより耐性があった。最終的に、ＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４（配列番号５９）形質転換体から生成されたＳＦＰ１断片の大部分は無傷であった（図７Ｂ、レーン４）。従って、結果は、ＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４からのＳＦＰ１変異体は、目的蛋白質の発現および精製に成功的に適用されたことを示唆する。
【０１１９】
実施例４
ＳＦＰ１のＨＬドメインと融合した目的蛋白質の分泌
実施例２に示されたように、ＨＬドメインは、目的蛋白質の分泌において重要な役割を果たす。目的蛋白質の分泌において、ＨＬの機能は、ＨＬドメイン内の酸性荷電されたアミノ酸によったことによるが、蛋白質の可溶性は蛋白質の純電荷（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）と密接に関連していることによる。ＨＬドメインの融合パートナーとしての機能を調査するために、本発明者らはＥＸＤ４の分泌のためにＨＬドメインを使用した。
【０１２０】
ＨＬドメインを目的蛋白質のＮ−末端に融合させた。ＨＬ−ＥＸＤ４遺伝子をＹＧａＴ９２３−ＥＸＤ４ベクターからＨ２２１（配列番号２４）／ＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）プライマーセットで増幅させ、メイティング因子α（ＭＦα）のプレ−プロリーダーペプチドをＧＡＬ１００／ＬＮＫ−Ｒ（配列番号２５）プライマーセットで増幅させた。Ｈ２２１およびＬＮＫ−Ｒプライマー（配列番号２５）が相補的なリンカー配列を含有するので、これらの２つの断片をＧＡＬ１００（配列番号８）／ＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）プライマーセットで重複−延長ＰＣＲによって融合させた。ＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４（図２６）形質転換体を実施例２に記載されたように融合した断片およびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したＹＧａＴ９２ベクター断片で共同形質転換させることによって直接作製した。ＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４プラスミドは、Ｋｅｘ２ｐによるインビボプロセシングのためにＭＦαのプレ−プロリーダーペプチドとＨＬペプチドとの間にリンカーペプチド（ＡＡＳＡＳＡＧＬＡＬＤＫＲ）を含有する。ＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４で形質転換された組換え酵母菌株を５−Ｌ発酵槽で流加培養によって培養して、ＨＬ−ＥＸＤ４の分泌生成を誘導するその能力について評価した。発酵槽に接種する種菌培養物を、種菌培養培地（６．７％アミノ酸無し酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸および２％グルコース）を使用してフラスコで培養した。初期発酵培地として発酵培養培地（４％酵母抽出物、１％ペプトン、２％グルコース）を使用して培養する場合、ＯＤ６００が約１５に達した時、流加培地（１５％酵母抽出物、３０％グルコース、３０％ガラクトース）を細胞成長速度に応じて様々な量で供給した。約４８時間培養後、培養物はＯＤ６００が約１５０に達した。培地１０μｌを提示された時点で収集し、分泌された蛋白質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図８）。標準蛋白質バンドと比較する場合、分泌されたＨＬ−ＥＸＤ４は、約２００ｍｇ／Ｌと測定された。
【０１２１】
ＨＬペプチドの目的蛋白質へのＣ−末端融合の効果を試験するために、プラスミド、ＹＧａＳＴ６−ＥＸＤ−ＨＬ（図２７）を作製した。ＥＸＤ４遺伝子をＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４からのセンスプライマーＨ４１２（配列番号２６）およびアンチセンスプライマーＨ４１３（配列番号２７）で増幅させ、ＨＬペプチドをＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４からのＨＬ−Ｆ（配列番号２８）およびＨＬ−ＧＴ５０Ｒ（配列番号２９）で増幅させた。Ｈ４１３プライマー（配列番号２７）は、ＨＬ−Ｆプライマーに相補的な配列を含有するので、これらの２つの断片をＨ４１２（配列番号２６）／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで重複−延長ＰＣＲによって融合させた。Ｈ４１２プライマー（配列番号２６）は、リンカー配列を含有し、ＧＡＬ１００（配列番号１０）／ＬＮＫ−Ｒ（配列番号２５）プライマーセットで増幅されたＭＦαのプレ−プロリーダーと融合させ得る。それぞれの増幅された断片をＭＦαのプレ−プロリーダー、ＥＸＤ４およびＨＬドメイン遺伝子の順序でＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで重複−延長ＰＣＲによって融合させた。ＹＧａＳＴ６−ＥＸＤ−ＨＬ形質転換体を、実施例２に記載されたように、融合した断片およびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したＹＧａＴ９２ベクター断片で共形質転換することによって直接作製した。ＹＧａＳＴ６−ＥＸＤ４−ＨＬで形質転換された組換え酵母菌株を５−Ｌ発酵槽で流加培養によって培養して、ＥＸＤ４−ＨＬの分泌生成を誘導するその能力について評価した。約４８時間培養後、培養物はＯＤ６００が約１６０に達した。培地１０μｌを提示された時点で収集し、分泌された蛋白質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図９ＡおよびＢ）。標準蛋白質バンドと比較して、分泌されたＥＸＤ４−ＨＬは、約５００ｍｇ／Ｌと測定された。ＨＬがＥＸＤ４で融合する場合、Ｃ−末端融合は、Ｎ−末端融合よりはるかに高いＥＸＤ４の分泌レベルを示した。従って結果は、ＨＬドメインが目的蛋白質のＮ−末端およびＣ−末端の両方で融合形態で蛋白質の分泌に有用であることを示唆する。しかし、Ｃ−末端融合が目的蛋白質の増加した分泌を示した。
【０１２２】
ＨＬドメインの融合パートナーとしてのさらなる試験のために、ＨＬドメインをヒト表皮成長因子（ｈＥＧＦ）の発現のために使用した。ＹＧａＭＫＨ−ＥＧＦプラスミド（図２８）を作製した。ＹＧａＭＫＨ−ＥＧＦで、ＨＬドメインをｈＥＧＦのＮ−末端に融合させ、ＭＦαプレ−プロペプチドＨＬ融合ペプチド遺伝子をＧＡＬ１００（配列番号１０）／ＤＤＫ−Ｒ（配列番号３０）プライマーセットでＹＧａＭＫＨ−ＥＸＤ４ベクターから増幅させ、ｈＥＧＦ遺伝子をＤＤＫ−Ｒプライマーに相補的な配列を含有するセンスプライマーＨ４１０（配列番号３１）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）と同じ配列を含有するアンチセンスプライマーＨ４１１（配列番号３２）で増幅させた。それぞれの増幅された断片をＧＡＬ１００／ＧＴ５０Ｒプライマーセットで重複−延長ＰＣＲによって融合させた。ＹＧａＭＫＨ−ＥＧＦ形質転換体を、実施例２に記載されたように、融合した断片およびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したＹＧａＴ９２ベクター断片で共形質転換させた。
【０１２３】
ＹＧａＭＫＨ−ＥＧＦで形質転換された組換え酵母菌株を５−Ｌ発酵槽で流加培養によって培養して、ＨＬ−ＥＧＦの分泌生成を誘導するその能力について評価した。約４８時間培養後、培養物は、ＯＤ６００が約１５５に達した。培地１０μｌを提示された時点で収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分泌された蛋白質について分析した（図１０ＡおよびＢ）。標準蛋白質バンドと比較して、分泌されたＨＬ−ＥＧＦは、約４００ｍｇ／Ｌと測定された。
【０１２４】
ＨＬ−ｈＥＧＦ融合蛋白質をＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって直接精製した（図１１Ａ）。ｈＥＧＦおよびＨＬペプチドを分離するために、精製された融合蛋白質をエンテロキナーゼで切断させ、これで生成された断片をＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって再分画化した。図１１Ｂに示されたように、無傷且つ純粋なｈＥＧＦ（６ｋＤ）を効率的に精製した。
【０１２５】
ＨＬドメインをまた、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）の分泌生成に対して適用した。ＨＬドメインをｈＰＴＨのＮ−末端に融合させることによってＹＧａＭＫＨ−ＰＴＨ（図２９）ベクターを作製した。ｈＰＴＨ遺伝子をＤＤＫ−Ｒプライマー（配列番号３０）に相補的な配列を含有するセンスプライマーＨ３１０（配列番号３３）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）と同じ配列を含有するアンチセンスプライマーＨ３１１（配列番号３４）で増幅させた。この断片をＧＡＬ１００（配列番号１０）／ＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）プライマーセットを用いた重複−延長ＰＣＲによってＭＦαプレ−プロペプチドＨＬ融合ペプチド遺伝子と融合させた。ＹＧａＭＫＨ−ＰＴＨ形質転換体を、実施例２に記載されたように、融合した断片およびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したＹＧａＴ９２ベクター断片で共形質転換することによって直接作製した。ＹＧａＭＫＨ−ＰＴＨで形質転換された組換え酵母菌株を５−Ｌ発酵槽で流加培養によって培養して、ＨＬ−ＰＴＨの分泌生成を誘導するその能力について評価した。約４８時間培養後、培養物は、ＯＤ６００が約１２０に達した。培地１０μｌを提示された時点で収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分泌された蛋白質について分析した（図１２ＡおよびＢ）。ＨＬ−ＰＴＨと関連した２つの主要バンドが検出された。大多数のｈＰＴＨがＫｅｘ２ｐによる不完全インビボ切断によってＭＦαｐｒｏ−ＨＬ−ＰＴＨの融合形態で６０ｋＤで検出された。ＨＬ−ＰＴＨのＫｅｘ２ｐ切断を示すバンドも検出された。ＰＴＨと関連した総分泌された蛋白質は、５００ｍｇ／Ｌ以上と測定された。発酵上澄液中のＨｉｓタグされた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって直接精製した。精製された蛋白質を予想した通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥで２種類のバンドに分離した（図１３、レーン１）。より大きいバンド（Ｐｒｏ−ＨＬ−ＰＴＨ）がＫｅｘ２ｐを用いたインビトロプロセシング後に消えた（図１３、レーン２）。融合蛋白質（ＨＬ−ＰＴＨ）をエンテロキナーゼ切断によってＨＬペプチドおよびｈＰＴＨペプチドに正確に分離した（レーン３）。
【０１２６】
実施例１〜４は、ＹＧＲ１０６Ｃ遺伝子の最適領域の同定および変形によって、組換え蛋白質の分泌生成および単離のための、ＳＦＰ１に由来した効率的なマルチ機能性の融合パートナーを構築することを示している。
【０１２７】
実施例５
酵母セクレトームからの分泌融合パートナーの選択
この実施例は、融合パートナーとして有用な、高分泌された蛋白質を確認するための技術を立証した。
【０１２８】
まず、正常酵母細胞成長中に生成された酵母の総分泌された蛋白質（酵母セクレトーム）を分析した。酵母セクレトームの単離のために、酵母サッカロマイセス・セレビシエ２８０５菌株を最小培地（アミノ酸無し０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸、２％グルコースおよび０．００２％ウラシル）で２０時間（Ｍ１）および４０時間（Ｍ２）培養した。培養上澄液５００ｍｌを膜ろ過を用いて濃縮させ、総分泌された蛋白質を回収した。酵母細胞を蛍光染料ヘキストで染色した後、共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて無傷であることを確認した（図１４ＡおよびＢ）。
【０１２９】
Ｍ２セクレトームサンプルを２−Ｄゲル電気泳動によって分析した（図１５）。総蛋白質サンプルでリボ核酸汚染を除去するために付加したＲＮａｓｅを除いて、大部分のセクレトーム蛋白質を酸性領域で確認した。図１５に示されたように、２−Ｄゲル電気泳動は、サンプルＭ２に存在するすべての分泌された蛋白質を確認するのに十分ではなかった。従って、１−ＤＥ／ＭｕｄＰＩＴ（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）方法をまた、酵母セクレトームのより完璧な確認のために適用した（図１６）。結果として、５７および８３個の蛋白質をＭ１およびＭ２からそれぞれ確認した。これと共に、９８個のユニークな蛋白質を確認した。これらのうち、４２個の蛋白質がＭ１およびＭ２サンプルで共通的に検出された。分泌された蛋白質と最も類似の蛋白質を確認するために、蛋白質位置設定予測およびシグナル予測のための２つのプログラムＷｏＬＦ  ＰＳＯＲＴおよびｐＴＡＲＧＥＴを用いた。４２個の蛋白質のうち、３５個（８０％を示す）の蛋白質を分泌蛋白質として予測した（表１）。
【０１３０】
【表１】
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【０１３１】
多数の分泌蛋白質を細胞壁蛋白質およびＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーを有する蛋白質として確認した。高分泌された蛋白質を、分泌された蛋白質の数に比例できるＰＡＩ（蛋白質数度指数）により決定した（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１２３１−４５（２００２））。この分析を基に、２０個の高分泌された蛋白質を選択した。
【０１３２】
１９個の高分泌された蛋白質の遺伝子を１９個の異なるセンスプライマー（配列番号３５）およびアンチセンスプライマー（配列番号３６）を用いてゲノムＤＮＡから増幅させた。増幅されたＤＮＡ断片の５’および３’末端は、前記に記載されたように、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化したＹＥＧα−ＨＩＲ５２５とインビボ組換えのためにＧＡＬ１０プロモーターおよびＧＡＬ７ターミネーターのそれぞれの一部と共に、相同的な配列の延長を含有していた。酵母形質転換体を、インビボによる組換えを介して線型化されたベクターおよびＰＣＲ断片の両方の形質転換によって容易に得た。１９個の異なるＰＣＲ断片から得た２０個の異なる形質転換体をＹＰＤＧ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グルコース、および１％ガラクトース）培地で培養した。それぞれの培養上澄液３００μｌをアセトンで濃縮させた。それぞれのアセトン−濃縮した培養上澄液を、図１７Ａに示されたように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１３３】
高効率のＳＦＰを選別するために、強いプロモーターを使用して高発現を誘導し、結果的に高分泌された蛋白質の分泌レベルを、形質転換しなかった野生型酵母の蛋白質分泌レベルと比較して決定した。図１７ＡのレーンＷＴに示された野生型蛋白質分泌レベルと比較して、強いＧＡＬ１０プロモーターを用いて発現された、試験された蛋白質の部分集合（１１個）は、明らかに強いバンドを示したが、これは培養上澄液に高分泌されたことを示唆する。それぞれのサンプルのグリコシダーゼ、エンド−Ｈ処理は、それぞれの蛋白質のアミノ酸配列から予想される正確な蛋白質サイズで示され（図１７Ｂ）、これは大部分の高分泌された蛋白質がグリコシル化されたことを立証する。１９個の選択された高分泌された蛋白質中の１１個であるＢＧＬ２（配列番号８０）、ＧＡＳ３（配列番号８１）、ＧＡＳ５（配列番号８２）、ＰＳＴ１（配列番号８３）、ＳＣＷ４（配列番号８４）、ＳＣＷ１０（配列番号８５）、ＳＩＭ１（配列番号８６）、ＵＴＨ１（配列番号８７）、ＹＧＰ１（配列番号８８）、ＹＰＳ１（配列番号８９）、およびＺＰＳ１（配列番号９０）を異種蛋白質の分泌に対する候補ＳＦＰとして試験した。１１個の蛋白質は、下記のポリヌクレオチド：ＢＧＬ２（配列番号６２）、ＧＡＳ３（配列番号６３）、ＧＡＳ５（配列番号６４）、ＰＳＴ１（配列番号６５）、ＳＣＷ４（配列番号６６）、ＳＣＷ１０（配列番号６７）、ＳＩＭ１（配列番号６８）、ＵＴＨ１（配列番号６９）、ＹＧＰ１（配列番号７０）、ＹＰＳ１（配列番号７１）およびＺＰＳ１（配列番号７２）によってコードされる。
【０１３４】
ＥＸＤ４にそれぞれ融合した１１個の高分泌された蛋白質をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）を使用して、融合蛋白質の発現のためのベクターを作製した。１１個の融合蛋白質を培養上澄液へのこれらの分泌レベルについて試験した。ＹＧａ−ＯＲＦベクターを図１７のようにそれぞれの蛋白質を生成するそれぞれの形質転換体から回収した。それぞれの融合蛋白質発現ベクターの作製のために、１１個のＰＣＲ断片を異なるＯＲＦを含有する１１個のＹＧａ−ＯＲＦベクターからプライマーＧＡＬ１００（配列番号１０）および１１個の異なるアンチセンスプライマー（配列番号３７）を使用して増幅させた。増幅されたＤＮＡ断片の５’および３’末端は、ＧＡＬ１０プロモーターおよびエキセンディン−４のそれぞれと共に、相同的な配列の延長を含有していた。ＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４からプライマーＥＸＤ−Ｆ（配列番号４６）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）で増幅された１１個のＰＣＲ断片およびエキセンディン−４を、プライマーＧＡＬ１００（配列番号１０）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）のそれぞれを使用する１１回の異なる重複延長ＰＣＲに対する鋳型として使用した。それぞれの延長されたＰＣＲ断片を前記に記載されたように、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化したＹＥＧα−ＨＩＲ５２５で形質転換させた。それぞれの形質転換からの２つの形質転換体をＹＰＤＧ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グルコースおよび１％ガラクトース）で４０時間培養した。上澄液からのサンプル０．６ｍｌをアセトン０．４ｍｌを使用して濃縮させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって図１８に示されたように分析した。６個の融合蛋白質（ＧＡＳ３−ＥＸＤ４、ＧＡＳ５−ＥＸＤ４、ＰＳＴ１−ＥＸＤ４、ＳＣＷ４−ＥＸＤ４、ＹＧＰ１−ＥＸＤ４、およびＹＰＳ１−ＥＸＤ４）は、細胞外培地に効率的に分泌されることが明らかになった。
【０１３５】
実施例５は、酵母セクレトームから選択された、高分泌された蛋白質が組換え蛋白質の分泌生成に対する分泌融合パートナーとして作用することを示した。実施例５では、酵母から分泌された蛋白質を使用したが、任意の生物が分泌したポリペプチド、例えば、明細書の全体に記載されたものなどを使用することができる。この実施例に示されたように、本発明のスクリーニング方法は、可能な候補ＳＦＰを３５個の分泌された蛋白質から１１個に狭め、この中で６個が効果的なＳＦＰとして明らかにしたように、ＳＦＰを確認するための効率的な方法である。
【０１３６】
実施例６
融合パートナーとしての、ＳＣＷ４遺伝子の最適サイズの決定
この実施例は、目的蛋白質、例えば、エキセンディン−４の分泌用融合パートナーとしての、ＳＣＷ４の最適サイズの決定を立証する。８個のＳＣＷ４欠失クローンをカイト−ドゥーリトル疏水性分析に基づいて作製した（図１９Ａ）。８個のＳＣＷ４断片を、ＧＡＬ１００（配列番号１０）および６個のヒスチジン配列をそれぞれ含有する８個の異なるアンチセンスプライマーＨ４５３−Ｈ４６０（配列番号４７〜５４）で増幅させた。増幅された断片をＹＧａＴ９２−ＥＸＤ４からセンスプライマー（配列番号５５）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）で増幅されたＥＸＤ４遺伝子と重複延長ＰＣＲによって、プライマー、ＧＡＬ１００（配列番号１０）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）をそれぞれ使用して、融合させた。それぞれの延長されたＰＣＲ断片を、以前の実施例に記載されたように、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化したＹＥＧα−ＨＩＲ５２５で形質転換させた。８個の異なる形質転換体の３つのコロニーをＹＰＤＧ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グルコース、および１％ガラクトース）培地で培養した。それぞれのサンプルに対する培養ブロス１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（濃縮無し）で直接分析した。図１９Ｂに示されたように、ＳＣＷ４の異なるＣ−末端断片を含有するＳＣＷ４−１、ＳＣＷ４−２、ＳＣＷ４−３およびＳＣＷ４−４は、ＥＸＤ４の分泌に対する融合パートナーとして強い活性を示した。ＥＸＤ４に対する融合パートナーとしてＳＣＷ４の最適なサイズは、ＳＣＷ４蛋白質全体（３８０個のアミノ酸）のうち、１６９個未満のアミノ酸で示された。
【０１３７】
ＹＧａＳＣＷ４−１−ＥＸＤ４（図３０）およびＹＧａＳＣＷ４−３−ＥＸＤ４（図３１）で形質転換された組換え酵母菌株を、５−Ｌ発酵槽で流加培養によって培養して、融合蛋白質の分泌生成を誘導する能力について評価した。約４８時間培養後、培養物はＯＤ６００が約１３０に達した。培地１０μｌを提示された時点で収集し、分泌された蛋白質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２０）。標準蛋白質バンドと比較して、分泌されたＳＣＷ４−１−ＥＸＤ４（配列番号６０）およびＳＣＷ４−３−ＥＸＤ４（配列番号６１）は、リットル当り３グラム以上と測定された。
【０１３８】
エンテロキナーゼに対するＳＣＷ４蛋白質のロバスト性を試験するために、発酵ブロスをエンテロキナーゼで１時間、３７℃で、精製することなく消化した。図２１に示されたように、融合蛋白質は、ＳＣＷ４蛋白質およびエキセンディン−４ペプチドに正確に分かれた。従ってこれらの結果は、変形されたＳＣＷ４融合パートナーがエキセンディン−４蛋白質の収率を有意に増加させ、精製過程を単純化させるということを示す。
【０１３９】
他の蛋白質に対する一般的な融合パートナーとしてのＳＣＷ４の効果を試験した。ＳＣＷ４−１、ＳＣＷ４−２、ＳＣＷ４−３およびＳＣＷ４−４をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の分泌生成に対して適用した。ｈＧＨ遺伝子をセンスプライマー（配列番号５６）およびアンチセンスプライマー（配列番号５７）で増幅させた。この断片を６個のヒスチジンの延長およびＧＡＬ７ターミネーター配列でフランキングさせた。ＰＣＲ増幅されたＳＣＷ４−１、−２、−３および−４断片をプライマー、ＧＡＬ１００（配列番号１０）およびＧＴ５０Ｒ（配列番号１４）をそれぞれ使用して重複延長ＰＣＲによってｈＧＨ遺伝子と融合させた。それぞれの延長されたＰＣＲ断片を、前記に記載されたようにＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化したＹＥＧα−ＨＩＲ５２５で形質転換させた。４個の異なる形質転換体の２つのコロニーをＹＰＤＧ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グルコース、および１％ガラクトース）培地で培養した。それぞれのサンプルの培養ブロス１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（濃縮無し）で直接分析した。図２２Ａに示されたように、異なるサイズのＳＣＷ４−ｈＧＨ融合蛋白質のバンドをそれぞれのサンプルに対して検出した。融合蛋白質を確認するために、培養上澄液をエンテロキナーゼと共に１時間、３７℃でインキュベーションして融合蛋白質を消化した。正確なサイズのｈＧＨをＳＣＷ４−１−ｈＧＨ、ＳＣＷ４−２−ｈＧＨおよびＳＣＷ４−４−ｈＧＨから回収した（図２２Ｂ）。従って、ＳＣＷ４のＮ−末端断片は、ｈＧＨだけでなく、ＥＸＤ４の分泌に対する融合パートナーとして強い活性を示した。
【０１４０】
ＹＧａＳＣＷ４−２−ｈＧＨで形質転換された組換え酵母菌株（図３２）を５−Ｌ発酵槽で流加培養によって培養して融合蛋白質の分泌生成を誘導するその能力について評価した。約４８時間培養後、培地１０μｌを提示された時点で収集し、分泌された蛋白質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２３）。標準蛋白質のバンドと比較して、分泌されたＳＣＷ４−２−ｈＧＨ（配列番号７３）は、リットル当り３グラム超過と測定された。
【０１４１】
従って、実施例６の結果は、ＳＣＷ４およびその断片が目的蛋白質の組換え発現に対する融合パートナーとして作用し、大量の目的蛋白質を生成するのに使用され得ることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明は、セクレトーム分析によって得られる分泌融合パートナー（ＳＦＰ）を用いた様々な組換え蛋白質の超分泌生成および効率的な精製を提供する。組換え蛋白質は、分泌融合パートナーとの融合形態で細胞外に生成され、ＳＦＰからインビトロプロテアーゼ処理によって分離され得る。本発明に記載されたＳＦＰは、バイオ製薬およびバイオ産業で価値のある目的蛋白質およびポリペプチドの分泌レベルを顕著に向上させる。本発明の選択／スクリーニング方法は、ＳＦＰとして作用する蛋白質、およびそのような蛋白質の断片および誘導体の選択を可能にする。本発明のスクリーニング／選択方法によって選択されたＳＦＰは、バイオ−製薬およびバイオ−産業に有用な蛋白質の組換え生成を増進させる。また本発明は、確認されたＳＦＰおよびその断片および誘導体を含む。
【０１４３】
これまで本発明を十分に説明してきたところ、本発明の範囲または任意の実施態様に影響を及ぼすことなく、広範かつ等価な範囲の条件、処方および他のパラメータ内で、本発明を実施することができることを、当業者は理解するだろう。本明細書で言及されたすべての特許、特許出願および公開文献は、その全文が参考として本明細書中に組み込まれる。
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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