(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着され、
前記フッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する化合物であり、
式１：
【化１】
0005614897.tif 000021
前記フッ素原子含有置換基は、下記式２に示される構造を含む、
式２：
【化２】
0005614897.tif 000022
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
糖ペプチド被覆シリカ。
【請求項２】
前記フッ素原子含有糖ペプチド誘導体が、下記式３に示される化合物と前記アミノ基が反応することにより得られる化合物である、請求項１に記載の糖ペプチド被覆シリカ。
式３：
【化３】
0005614897.tif 000023
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【請求項３】
シリカ繊維又はシリカ粒子である、請求項１又は２に記載の糖ペプチド被覆シリカ。
【請求項４】
請求項３に記載の糖ペプチド被覆シリカ繊維により構成される不織布又はフィルター。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖ペプチド被覆シリカ又は請求項４に記載の不織布若しくはフィルターを含む、インフルエンザウイルス結合材。
【請求項６】
フッ素処理シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を、溶液中で接触させる工程を含む、
フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着され、
前記フッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する化合物であり、
式１：
【化４】
0005614897.tif 000024
前記フッ素原子含有置換基は、下記式２で示される化合物からなる構造を含む、
式２：
【化５】
0005614897.tif 000025
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
糖ペプチド被覆シリカの製造方法。
【請求項７】
シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を、フッ素塩化合物の共存下で、溶液中で接触させる、請求項６に記載の糖ペプチド被覆シリカの製造方法。
【請求項８】
シリカとフッ素塩化合物を溶液中で接触させてフッ素処理シリカを得る工程をさらに含む、請求項６に記載の糖ペプチド被覆シリカの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖ペプチド被覆シリカ及びその製造方法に関する。具体的には、本発明は、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着された糖ペプチド被覆シリカ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
無機材料であるシリカは、材料としての高い強度及び衝撃強さ、優れた熱安定性及び寸法安定性等を有しており、液晶表示装置の液晶の厚みを制御するスペーサー、シーラント、ゴム等のエラストマーの補強材等に用いられている（非特許文献１）。
しかし、シリカ粒子をスペーサー粒子として使用する場合、シリカ表面が硬いために、液晶表示装置の配向膜を損傷させる恐れがある。そのため、高分子で被覆したシリカ粒子を用いる場合が多い。一般的に、無機粒子は、高分子中では良好な分散状態が得られないことが知られており、エラストマー等への高分子中での分散状態を良好にするために、無機微粒子表面のシランカップリング剤処理又は高分子被覆を行うことによって分散性の向上を図る研究も行われている（非特許文献２）。
【０００３】
非特許文献３には、シリカの表面に高分子材料を被覆する方法として、大別して、「粒子表面でモノマーを重合し、生成した高分子でシリカを被覆する方法」と「予め調製した高分子材料を用いる方法」が開示されている。
【０００４】
「粒子表面でモノマーを重合し、生成した高分子でシリカ粒子を被覆する方法」には、シリカ粒子表面の活性種による重合法（非特許文献４）、開始剤の吸着又は結合による重合法（非特許文献５）、生長鎖の沈着による重合法（非特許文献６）等が知られている。その他、モノマーの吸着、結合又は吸蔵による重合法、モノマーの表面吸着層への可溶化による重合法等、各種方法も知られている。
【０００５】
一方、「予め調製した高分子材料を用いる方法」として、非特許文献７及び非特許文献８には、予め調製した高分子材料をシリカ粒子に吸着又は化学的に結合させる方法、コアセルベーション法、ヘテロ凝集法、ドライブレンド法等が開示されている。これの方法によれば、被覆に使用する高分子の物性及び高分子が共重合体である場合の共重合組成等の情報を知ることができる上、高分子中の有機官能基を損ねることなく被覆することも可能である。
【０００６】
また、有機ケイ素化学の分野では、シリカカチオンは固い酸（Ｈａｒｄ  ａｃｉｄ）として知られ、フッ素アニオンは固い塩基（Ｈａｒｄ  ｂａｓｅ）として知られている。そして、両者の結合で生じる「シリカ−フッ素結合」は「シリカ−酸素結合」よりも強固であることが知られている（非特許文献９）。そこでこのようなシリカ−フッ素原子の間の相互作用を活用することはシリカへ高分子材料被覆させる場合に有効な手段となり得る。
【０００７】
従来、シリカへ高分子材料を吸着させることによる被覆方法は、シリカ表面と高分子材料の親和性が被膜形成に影響を与え、その親和性が低い場合には、高分子材料による被覆が不十分となる場合も多い。そのため、化学的に結合させる方法が採用されており、１）シリカ表面にあるシラノール基を介して直接結合させることにより高分子材料を被覆させる方法、２）シラノール基にシランカップリング剤を反応させて導入した有機官能基を介して結合させることにより高分子材料を被覆させる方法、等の多くの研究が報告されている。しかし、いずれの場合においても、シリカ表面に十分な量のシラノール基が存在しないと、高分子材料の被覆は不十分となることが懸念される。従って、シリカへ高分子材料を化学的又は物理的に吸着させることによって被覆させる場合には、その被覆効率を増加させるために、シリカ表面にあるシラノール基を増加させることが最も重要である。
【０００８】
シラノール基を介してシランカップリング剤を導入する方法として、特許文献１には、ケイ素原子に直結したアルコキシ基を有する有機ケイ素化合物を、フッ素含有ケイ素化合物又はフッ素塩化合物触媒の存在下、溶媒中に分散させたシリカと、限定されたシランカップリング剤とを反応させる表面処理シリカの製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第２８２０８７３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】川口春馬監修、「微粒子・粉体の最先端技術」、第４章  光と微粒子、２．液晶セル用スペーサー、２０００年、シーエムシー
【非特許文献２】齋藤文良等編、「粉砕・分級と表面改質」、第５章  実際の応用例、５．４表面改質による混練物の流動性・分散性向上、２００１年、（株）ＮＧＴ
【非特許文献３】柳田博明監修、「微粒子工学大系  第１巻  基本技術」、第６章  安定化・改質および複合化、２００１年、フジ・テクノシステム
【非特許文献４】Ｏ．  Ｐｒｕｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｒｕｈｅ、  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｚｏ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、  １９９８、  ｖｏｌ．３１、  ｐ．６０２−６１３
【非特許文献５】長井勝利、シリカ粒子のポリマー修飾、高分子、１９９９、４８（４）、ｐ．２６５
【非特許文献６】嶋田遵生子、ゾル−ゲル法を用いた有機―無機ハイブリット材料の設計とその応用、高分子、１９９９、４８、ｐ．２６７
【非特許文献７】田中真人、微粒子応用講座（第ＶＩＩ講）  マイクロカプセル、色材、１９９８、７１（９）、ｐ．５９３−５９８
【非特許文献８】古澤邦夫、有機・無機複合化粒子の作製技術、高分子、１９９９、４８（４）、ｐ．２５２−２５５
【非特許文献９】Ｔｓｅ−Ｌｏｋ  Ｈｏ、  Ｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｏｆｔ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂａｓｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  ｐ．４−１２，１９７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、この特許文献１には、１）処理する物質は、シランカップリング剤に限定されている、２）シランカップリング剤以外の通常の高分子化合物、糖鎖又は糖鎖ペプチドを用いた被覆についての記載は無い。
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体によって被覆されたシリカ及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、シリカ表面へ糖ペプチドを被覆させる場合には、シリカ表面のフッ素処理と同時に糖鎖ペプチドのペプチド部分にフッ素原子含有置換基を導入することが有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）
フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着され、
前記フッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する化合物であり、
式１：
【化１】
0005614897.tif 000002
前記フッ素原子含有置換基は、下記式２に示される構造を含む、
式２：
【化２】
0005614897.tif 000003
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
糖ペプチド被覆シリカ。
（２）
前記フッ素原子含有糖ペプチド誘導体が、下記式３に示される化合物と前記アミノ基が反応することにより得られる化合物である、（１）に記載の糖ペプチド被覆シリカ。
式３：
【化３】
0005614897.tif 000004
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
（３）
シリカ繊維又はシリカ粒子である、（１）又は（２）に記載の糖ペプチド被覆シリカ。
（４）
（３）に記載の糖ペプチド被覆シリカ繊維により構成される不織布又はフィルター。
（５）
（１）〜（３）のいずれかに記載の糖ペプチド被覆シリカ又は請求項４に記載の不織布若しくはフィルターを含む、インフルエンザウイルス結合材。
（６）
フッ素処理シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体と、溶液中で接触させる工程を含む、
フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着され、
前記フッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する化合物であり、
式１：
【化４】
0005614897.tif 000005
前記フッ素原子含有置換基は、下記式２で示される化合物からなる構造を含む、
式２：
【化５】
0005614897.tif 000006
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
糖ペプチド被覆シリカの製造方法。
（７）
シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を、フッ素塩化合物の共存下で、溶液中で接触させる、（６）に記載の糖ペプチド被覆シリカの製造方法。
（８）
シリカとフッ素塩化合物を溶液中で接触させてフッ素処理シリカを得る工程をさらに含む、（６）に記載の糖ペプチド被覆シリカの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体によって被覆されたシリカ及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】製造例１において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】製造例１において製造された糖ペプチドの1Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】製造例１において再度ＯＤＳ樹脂で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】製造例３において製造されたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】製造例５において製造された糖ペプチド誘導体（２）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図６】実施例１において、フッ化カリウム水溶液で希釈することでフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-8Ｍ、１ｘ１０-9Ｍ、１ｘ１０-10Ｍに調製された溶液中でグラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。なお、図６中、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）を除いたコントロール群を比較対照とする多重比較検定から＊は危険率５％未満で有意な差があることを、＊＊は危険率１％未満で有意な差があることを意味する。
【図７】参考例１において、フッ化カリウム水溶液で希釈することで糖ペプチド誘導体（２）濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-10Ｍに調製された溶液中でグラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。
【図８】参考例２において、ＰＢＳで希釈することでフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-8Ｍ、１ｘ１０-9Ｍ、１ｘ１０-10Ｍに調製された溶液中でグラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。
【図９】実施例２において、ＰＢＳで希釈することでフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-10Ｍに調製された溶液中でフッ素塩処理グラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。なお、図９中、＊は、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）を除いたコントロール群を比較対照とする多重比較検定から危険率５％未満で有意な差があることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１８】
本実施の形態の糖ペプチド被覆シリカは、フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着され、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する化合物であり、
式１：
【化６】
0005614897.tif 000007
フッ素原子含有置換基は、下記式２で示される化合物からなる構造を含む、
式２：
【化７】
0005614897.tif 000008
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
糖ペプチド被覆シリカである。
【００１９】
本実施の形態においては、従来シリカ表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を被覆する場合において従来使用されてきた複雑な工程やシランカップリング剤を必要とせずに、糖ペプチドをシリカに保持又は固定化することで糖ペプチド被覆シリカを簡便に得ることができる。シアル酸含有糖鎖を保持又は固定化したシリカ繊維やシリカ粒子として、糖ペプチド被覆シリカを容易に製造することができ、この粒子等を用いてウイルス種の判別やウイルスの濃縮ができるので有用である。
また、本実施の形態においては、フッ素処理された、グラスフィルター等のシリカに対してフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を保持又は固定化し、シリカ表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着された糖ペプチド被覆シリカを製造することができる。
【００２０】
本実施の形態においては、糖ペプチドのアミノ基に対しフッ素原子含有置換基を導入すると共に、フッ素塩処理を行いシリカ表面にあるシラノール基を増加させると同時にＳｉ−Ｆを増加させることにより、シリカに対して糖ペプチドを容易に保持又は固定化することを可能にすると考えられる。
ここで模式的に記載するが、下記構造を有するシリカは、フッ化カリウムやテトラブチルアンモニウムフルオライド等のフッ素塩化合物により処理することで容易に酸素−ケイ素結合を切断することができる。その結果、酸素はシラノールを生成し、シリカはＳｉ−Ｆ構造を生成する。フッ素塩化合物により処理されたシリカを含有する基材は、−Ｓｉ−Ｆ構造をシリカ基材中に有するため、フッ素原子含有置換基を有する糖ペプチド誘導体を保持又は固定化しやすくなると考えられる。これは、疎溶媒相互作用（ｓｏｌｖｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）であると考えられる。
【化８】
0005614897.tif 000009
【００２１】
インフルエンザウイルス表面には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼが存在する。インフルエンザウイルスは、これらのタンパク質の種類の違いによって鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型を含む１４４の亜種に分類されている。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面たんぱく質であるヘマグルチニンが細胞表面のシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して結合することによって開始される。ヒトインフルエンザウイルスはＮ−アセチルノイラミン酸−α−２，６−ガラクトースを有する糖鎖に対し高い結合親和性を示す。このことから、本実施の形態におけるシアル酸含有糖固定化シリカはインフルエンザウイルスとの親和性が強く、低濃度のインフルエンザウイルス液であっても濃縮効果が期待され、高感度分析を可能にすることが期待される。
本実施の形態の糖ペプチド被覆シリカは、インフルエンザウイルス結合材として用いることができる。
【００２２】
本実施の形態の糖ペプチド被覆シリカは、フッ素処理シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体と、溶液中で接触させることにより製造することができる。
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を、フッ素処理シリカと溶液中で接触させることにより、フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着される。
フッ素処理シリカの表面に吸着されるとは、模式的に記載すると、シリカは、下記構造を連続して有しており、
【化９】
0005614897.tif 000010
シリカ表面においては、下記のようにシラノール（Ｓｉ−ＯＨ）を有していると考えられる。
【化１０】
0005614897.tif 000011
そして、かかるシラノールの存在するシリカ表面において、フッ素塩化合物をシリカと接触させて処理をすることで、下記のように、シラノールとＳｉ−Ｆが生成するものと考えられる。
【化１１】
0005614897.tif 000012
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体がフッ素処理シリカに接触すると、ガラス表面においては下記のようにフッ素原子同士の相互作用により見かけ上吸着されたようになると考えられる。
【化１２】
0005614897.tif 000013
本実施の形態において、フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が吸着したとは、フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体が保持又は固定化された上記説明したような状態を意味する。
【００２３】
フッ素処理シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体と、溶液中で接触させる工程は、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体とシリカを接触させる際に、フッ素塩化合物を共存させて接触させる工程として行ってもよく、シリカとフッ素塩化合物を溶液中で接触させてフッ素処理シリカを得てから、次いで、フッ素処理シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を接触させる工程として行ってもよい。
【００２４】
（フッ素処理シリカ）
シリカとフッ素塩化合物によりフッ素処理シリカが得られるが、フッ素塩化合物を共存させて接触させる場合であっても、先にフッ素処理シリカを得てから接触させる場合であっても、水又は含水有機溶剤又は有機溶媒等の溶剤中で行うことができる。
【００２５】
有機溶剤としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、１−プロピルアルコール、プロピルアルコール等のアルコール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル等のエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、アセト酢酸エチル等のエステル、アセトン、ジエチルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルエチルケトン等のケトン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００２６】
フッ素処理シリカと、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体と、溶液中で接触させる際の溶剤の量は、処理するシリカ１質量部に対して２〜１０００質量部が好ましく、より好ましくは５〜５００質量部である。
溶剤の量が２質量部以上であることにより、シリカ表面に均一にフッ素処理することができ、１０００質量部以下であることにより、工業的規模においても反応装置等を大きくすることなく十分量のシリカを回収することができる。
【００２７】
フッ素塩化合物を直接添加してもよいが、フッ素塩化合物を溶剤に溶解させて使用することが好ましい。
フッ素塩化合物の量は、溶剤１質量部に対して０．０００１〜１質量部が好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量部である。
フッ素塩化合物の量が０．０００１質量部以上であることにより、シリカへの均一なフッ素処理を短時間で行うことができ、１質量部以下であることにより、溶剤へ溶解させることができる。
【００２８】
シリカの溶液に所定量のフッ素塩化合物を加え、シリカ中のシロキサン結合にフッ素塩化合物を反応させることにより、改質された表面を有するシリカをフッ素処理シリカとして得ることができる。この際、フッ素塩化合物が反応系内に残っている場合、シリカをろ過、遠心分離等の方法により、フッ素塩化合物が含まれている溶液からフッ素処理シリカを分離してもよい。
【００２９】
フッ素塩化合物としては、フッ化物イオン（Ｆ-）と金属イオン（Ｍn+、ｎは陽電荷の価数を示す。）との塩化合物を用いることができ、例えば、例えば、ＬｉＦ、ＮａＦ、ＫＦ、ＲｂＦ、ＣｓＦ等の周期律表Ｉ族元素のフッ化物塩、ＢｅＦ2、ＭｇＦ2、ＣａＦ2、ＳｒＦ2、ＢａＦ2等のＩＩ族元素のフッ化物塩、ＢＦ3、ＡｌＦ3、ＧａＦ3、ＩｎＦ3、ＴｌＦ3等のＩＩＩ族元素のフッ化物塩、ＣｕＦ2、ＺｎＦ2、ＳｎＦ2、ＰｄＦ2、ＳｂＦ3、ＣｒＦ3、ＹＦ3等のフッ化物塩、ＬａＦ3、ＣｅＦ3、ＰｒＦ3、ＮｄＦ3、ＳｍＦ3、ＥｕＦ3、ＧｄＦ3、ＴｂＦ3、ＤｙＦ3、ＨｏＦ3、ＥｒＦ3等のランタノイド系のフッ化物塩、これらの水和物等が挙げられる。
また、フッ素塩化合物としては、例えば、（ＣＨ3）4Ｎ・Ｆ、（ＣＨ3ＣＨ2）4Ｎ・Ｆ、（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2）4Ｎ・Ｆ、（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）4Ｎ・Ｆ等のフッ化物イオンとアンモニウム塩との塩化合物が挙げられる。
中でも、水溶解性、操作性及び安全性を考慮すると、ＮａＦ、ＫＦ及びテトラブチルアンモニウムフルオライド（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）4Ｎ・Ｆが好ましい。
有機溶媒中でシリカとフッ素塩化合物を反応させる場合、有機溶剤中に容易に溶解するため、ベンジルトリメチルアンモニウムフルオライドを用いることもできる（佐藤史衛・山本經二・今本恒雄／編、「合成化学者のための実験有機金属化学」、第Ｉ部、典型金属を用いる反応、６：ケイ素、講談社サイエンティフィク、１９９２年、ｐ．７６−７８）。
【００３０】
（フッ素処理シリカとフッ素原子含有糖ペプチド誘導体の接触）
フッ素処理シリカとフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を溶液中で接触させることにより、フッ素処理シリカの表面にフッ素原子含有糖ペプチドが吸着させられる。
本実施の形態においては、フッ素塩化合物により表面改質されたシリカ（フッ素処理シリカ）に、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を含む溶液を所定の温度で添加することにより実施することができる。
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体は水、リン酸緩衝液を含む種々の塩水溶液、あるいはエタノール、メタノール等を用いた含水アルコール類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、ジオキサン等の水溶性有機溶媒等を用いた含水有機溶媒に溶解してシリカに添加することで接触させ実施することができる。
温度は、フッ素処理シリカ表面にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を十分に吸着させるために、０℃〜１００℃であることが好ましい。
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を被覆した後に、シリカを反応液中から分離するには、遠心分離法、ろ過法等の方法でも行うことができる。
【００３１】
（シリカ）
本実施の形態におけるシリカとは、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）又は二酸化ケイ素により構成される物質であるが、少なくとも表面にシロキサン結合部分又はシラノール基を有するケイ素化合物である。
シリカの主成分は、二酸化ケイ素であるが、少量成分として、アルミナ、アルミン酸ナトリウム等を含んでいてもよく、さらに安定剤として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、アンモニア等の無機塩基、テトラメチルアンモニウムのような有機塩基等が含まれていてもよい。
また、石英ガラス、硼珪酸ガラス等のガラス製品より形成されるシリカ繊維やシリカ粒子であってもよい。
【００３２】
本実施の形態においては、シリカ繊維やシリカ粒子である糖ペプチド被覆シリカは、フッ素処理を行ったシリカ繊維やシリカ粒子に対して、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を吸着させることにより製造することができる。糖ペプチド被覆シリカ繊維により構成される不織布又はフィルターについては、糖ペプチド被覆シリカ繊維から不織布又はフィルターを製造してもよいが、シリカ繊維を不織布又はフィルターとした後に、不織布又はフィルターに対してフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を吸着させることにより糖ペプチド被覆シリカとすることが好適である。
【００３３】
本実施の形態において、シリカ繊維として、溶融石英繊維と非晶質の高ケイ酸質繊維等が挙げられる。
溶融石英繊維は、石英棒をガスバーナーで溶かしながら延伸する溶融法、またはシリカアルコキシドを原料とし、重合させながら紡糸し、その後焼成するゾル−ゲル法により製造することができ、非晶質の高ケイ酸質繊維は通常のガラス繊維の製法で得たアルカリボロシリケート繊維を酸洗いして製造することができる。
【００３４】
本実施の形態においては、例えば、シリカ繊維により構成されるフィルターの場合、粒子保持能０．１〜１００μｍ、厚み０．１〜５ｍｍ、重量１〜６００ｇ／ｍ2、好ましくは粒子保持能０．１〜３０μｍ、厚み１０〜１０００μｍ、重量１０〜３００ｇ／ｍ2、より好ましくは粒子保持能０．１〜１０μｍ、厚み２００〜７００μｍ、重量４０〜２００ｇ／ｍ2のグラス（シリカ）フィルターを好適に用いることができる。
【００３５】
本実施の形態においては、シリカ粒子である場合、平均粒径が０．１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは１μｍ〜１００μｍである。
シリカ粒子の形状は限定されるものではないが、例えば、真球状、楕円球状、円柱状等があげられる。
このようなシリカ粒子は、例えば、特開平５−１９３９２８号公報、特開平６−４８７２０号公報等に記載された方法により調整することができる。
【００３６】
（フッ素原子含有糖ペプチド誘導体）
本実施の形態におけるフッ素原子含有糖ペプチド誘導体とは、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する化合物であり、
式１：
【化１３】
0005614897.tif 000014
フッ素原子含有置換基は、下記式２に示される構造を含む。
式２：
【化１４】
0005614897.tif 000015
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【００３７】
本実施の形態におけるフッ素原子含有糖ペプチド誘導体において、糖ペプチド部分構造は、式１に示されるとおり、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖を有し、また、２ヶ所の非還元末端にガラクトースに結合するシアル酸を有する。
ＮｅｕＡｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、及びＭａｎは、糖の表記であり、それぞれ、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びマンノースを意味すする。
糖は、Ｄ−糖であっても、Ｌ−糖であってもよく、Ｄ−糖とＬ−糖の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｄ−糖であることが好ましい。また、各糖は、各糖と実質的に等価な誘導体であってもよい。
【００３８】
本実施の形態におけるフッ素原子含有糖ペプチド誘導体の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）からなるペプチド鎖が結合している（配列番号１）。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。
【００３９】
本実施の形態において、「アミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する」とは、アミノ基とフッ素原子含有置換基が結合することにより、糖ペプチドにフッ素原子含有置換基が導入されフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を形成することを意味する。
Ｌｙｓ（リジン）は、側鎖に４−アミノブチル基を有するアミノ酸であり、式１に示される糖ペプチド中には、Ｌｙｓが２残基含まれるため、Ｎ末端のＬｙｓが２つのアミノ基を、ＡｓｎとＴｈｒに結合するＬｙｓが、１つのアミノ基を有する。
式１に示される糖ペプチドには、２つのＬｙｓに由来する合計３個の遊離アミノ基が存在し、フッ素原子含有置換基は、３ヶ所のアミノ基の少なくとも一つ、好ましくは二つ、さらに好ましくは三つに結合している。二つ以上のアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合している場合、フッ素原子含有置換基は同一のものでも異なるものでもよい。
【００４０】
本実施の形態において、フッ素原子含有置換基としては、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体において、アミノ基と結合し、式２で示される構造を含むのであれば特に限定されるものではないが、フッ素原子含有置換基とは、糖鎖ペプチド誘導体におけるＬｙｓアミノ基に結合した部分構造となる構造を意味する。
式２において、ｍ及びｎについては、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体の水に対する溶解性の観点から、ｍは４以下の整数であり、ｎは１５以下の整数であることが好ましく、ｎは１０以下の整数であることがより好ましい。シリカに対する保持又は固定化の効果の観点から、ｎは１以上の整数であり、３以上の整数であることが好ましい。
式２における左側のメチレン炭素から延びる実線は、他の原子との結合手を意味する。式２に示される構造において、かかる結合手を介して、Ｌｙｓアミノ基と直接結合していてもよく、アミノ基と結合し得る他の構造を介してアミノ基と結合していてもよい。
【００４１】
（フッ素原子含有糖ペプチド誘導体の製造方法）
本実施の形態におけるフッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、式１に示される糖ペプチドのＬｙｓに由来する合計３個の遊離アミノ基の少なくとも一つのアミノ基に、フッ素原子含有置換基を導入することにより、製造することができる。
アミノ基にフッ素原子含有置換基を導入することにより、フッ素原子含有置換基がアミノ基に結合する。
【００４２】
本実施の形態においては、式１、好ましくは下記式４に示される糖ペプチドは抽出工程、沈殿工程、及び脱塩工程により、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で選択的に、安価に糖ペプチドを精製することができるので、このようにして得られる糖ペプチドにフッ素原子含有置換基を導入することで、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を製造することができる。
式４：
【化１５】
0005614897.tif 000016
【００４３】
本実施の形態においては、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入する工程、
式１：
【化１６】
0005614897.tif 000017
前記フッ素原子含有置換基導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加してフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程を含む、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体の製造方法により、本実施の形態におけるフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を得ることができる。
【００４４】
（導入工程）
導入工程とは、式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入する工程を意味する。
反応液のｐＨ、反応時間、反応温度、反応試薬の当量などの反応条件を選択することにより、３個のアミノ基に対しフッ素原子含有置換基を１〜３つのアミノ基に導入することができる。フッ素原子含有置換基の増加によるシリカ表面との反応性向上のために、フッ素原子含有置換基は好ましくは２ヶ所、より好ましくは３ヶ所全てのアミノ基に導入する。
【００４５】
フッ素原子含有置換基をアミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いることができる。
かかる縮合反応としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドや、ニトロフェノール又はペンタフルオロフェノール等でカルボン酸を活性化させた活性エステルを、必要に応じて、反応試薬を溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミン等の有機塩基、又は炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液若しくは炭酸緩衝液等の無機塩基の存在下、氷冷下又は室温下で１５分〜１８０分、必要に応じて１日反応させる方法が挙げられる。
フッ素原子含有置換基を導入するための反応試薬は、糖ペプチドのアミノ基（糖ペプチド１モルあたり３モルのアミノ基を有する）に対して過剰量、例えば、アミノ基に対して１．１〜５倍モル添加して、糖ペプチドのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入することができる。
【００４６】
かかる縮合反応に用いる、フッ素原子含有置換基を導入するための反応試薬として、下記式３又は下記式５に示される化合物が挙げられる。
【００４７】
式３：
【化１７】
0005614897.tif 000018
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【００４８】
式５：
【化１８】
0005614897.tif 000019
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【００４９】
式３に示される化合物や式５に示される化合物と、式１に示される糖ペプチドとを反応させることにより、式３又は式５に示される化合物中の、フッ素原子含有置換基に相当する部分が、糖ペプチド中のアミノ基と結合し、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体が合成される。
フッ素原子含有置換基は、アミノ基と、式３に示される化合物を用いた場合には、アミド結合により導入され、式５に示される化合物を用いた場合には、Ｃ−Ｎ結合により導入される。
フッ素原子含有置換基は、アミノ基と結合する際に、かかる結合は特に限定されるものではないが、アミノ基と結合し得る公知の結合を利用することができ、アミド結合、Ｃ−Ｎ結合、カーバメート結合、イミド結合などの結合によりフッ素原子含有置換基は導入される。
【００５０】
フッ素原子含有置換基に相当する反応試薬としては、フッ素原子含有置換基と、アミノ基と結合し得る脱離基とに相当する構造を有していることが好ましく、脱離基部分が脱離してアミノ基と求核置換反応することにより、フッ素原子含有置換基とアミノ基との結合が形成される。
【００５１】
反応試薬として、式３に示される化合物を用いた場合を例示して説明すると、下記式６に示される構造を有するフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を得ることができる。
式６：
【化１９】
0005614897.tif 000020
式６中、アミド結合は、アミノ基とフッ素原子含有置換基との結合を意味し、破線で囲まれた部分が、フッ素原子含有置換基を意味する。
該フッ素原子含有置換基においては、式２に示される構造が、Ｃ＝Ｏ（カルボニル）基を介して、Ｌｙｓのアミノ基と結合している。
【００５２】
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を精製するためには、沈殿工程及びさらに必要に応じて脱塩工程を組み合わせることで達成される。
【００５３】
（沈殿工程）
沈殿工程とは、導入工程によるフッ素原子含有置換基導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加してフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程を意味する。
沈殿工程により、精製度の向上したフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を沈殿物として得ることができる。沈殿工程においては、抽出液に水溶性有機溶媒を添加して粗精製物として、沈殿物を沈殿させてもよい。
【００５４】
本実施の形態において、水溶性有機溶媒とは、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド、及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される溶媒が挙げられる。これら溶媒は、１種で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
水溶性有機溶媒として炭素数１〜５のアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、抽出液をアルコールに添加してアルコール沈殿する工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）である。抽出工程で得られた、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を含有する抽出液をアルコールに添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上したフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。沈殿工程は、アセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程として行うこともできる。
【００５５】
以下、沈殿工程をアルコール沈殿工程として説明するが、アルコール以外の炭素数１〜５の水溶性有機溶媒を用いた沈殿工程においても同様に実施することができる。用いる水溶性有機溶媒量や沈殿させる際の溶媒温度などの条件は、溶媒ごとに適宜選択することができるが、以下に例示するアルコール沈殿工程と同様に設定することができる。
【００５６】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量は、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で２〜２０倍のアルコールを用いることができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールは、炭素数１〜５個のアルコールであればよく、好ましくは炭素数１〜３個のアルコールである。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、中でも毒性を含めた安全性の面からエタノールが好ましい。
本実施の形態において、アルコール沈殿工程において用いるアルコールは１種類であってもよいし、アルコールの混合物又は他の溶媒との混合物であってもよい。
アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００５７】
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を含む沈殿物を分離する温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００５８】
アルコール沈殿工程で用いる、先の抽出工程により得られた抽出液は、ろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮した抽出液として用いてもよい。
【００５９】
アルコール沈殿工程において、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を含む沈殿物を分離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を含む沈殿物を、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された沈殿物を得ることができる。
【００６０】
（脱塩工程）
脱塩工程とは、沈殿工程で得られたフッ素原子含有置換基が導入されたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を含有する沈殿物から塩を除去する工程を意味する。
脱塩工程は、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができるが、例えば、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することも可能である。脱塩工程としては、例えば、沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂に保持させて水で洗浄することにより脱塩することもできる。
【００６１】
沈殿物を樹脂に保持させる方法は、吸着、担持など公知の結合様式を利用した方法とすることができる。また、沈殿物は、水で洗浄する際に沈殿物が洗浄液と共に流出しない程度に、保持されていればよい。
また、樹脂としては、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂等が挙げられる。逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂とは、シリカゲル系、ポリマー系を代表的とする樹脂を意味し、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）ポリマーゲル樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂、スチレンビニルベンゼン共重合体樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、化学結合型シリカゲル樹脂などが挙げられる。
化学結合型シリカゲル樹脂とは、例えば、多孔性シリカゲルにジメチルオクタデシルクロロシランの様なシランカップリング剤を反応させて製造するＯＤＳ樹脂などが挙げられ、シリカゲルに対し、同様の手法で異なるシリル化剤を用いることで、オクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル基からなる群から選択される基を化学結合させることで得られる樹脂等も挙げられる。また、炭素数２２のドコシル基又は炭素数３０のトリアコンチル基を結合して得られる樹脂であってもよい。
【００６２】
脱塩工程は、脱塩した後に樹脂に保持されているフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を、有機溶媒水溶液により溶出する工程を含むことが好ましい。溶出工程を行うことによりフッ素原子含有糖ペプチド誘導体の純度を向上させることができる。
溶出工程では、例えば、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることができる。また水洗浄の工程では、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体ができるだけ、水と共に流出せず、有機溶媒水溶液による溶出工程によって溶出することが好ましい。
溶出工程に用いる有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有するものが挙げられる。有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜２０％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは０．５〜２０％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは１０％（ｖ／ｖ）以下、さらに好ましくは５％（ｖ／ｖ）以下である。
有機溶媒水溶液によりフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
脱塩工程又は溶出工程を行う温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００６３】
樹脂を用いた脱塩方法以外で（例えば分離膜による方法で）脱塩工程を行った後の処理液中に含まれるフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を精製する方法としては、公知のペプチド、糖質、糖ペプチド等の精製方法を用いることができるが、例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル、ドコシル、トリアコンチル基などを充填剤表面に固定化したものが用いられるが、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００６４】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液によりフッ素原子含有糖ペプチド誘導体を溶出する工程を含んでいてもよい。
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体を添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することによりフッ素原子含有糖ペプチド誘導体の脱塩を行うことができる。
【００６５】
溶出されたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状のフッ素原子含有糖ペプチド誘導体として得ることができる。
本実施の形態において、得られたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体は、再度アルコール沈殿工程又は脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。
【実施例】
【００６６】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００６７】
［ＨＰＬＣ分析］
１）糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  （Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ  ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸）
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６８】
２）フッ素原子含有糖ペプチド誘導体の分析例
測定条件：
グラジエント；２０％→１００％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６９】
［1Ｈ−ＮＭＲ測定］
Ｄ2Ｏ  ０．４ｍＬに試料  ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００７０】
［ＬＣ／ＭＳ測定］
以下の測定条件でＬＣ／ＭＳ測定を行った。用いたＬＣ及びＭＳのシステムは以下のとおりである。
ＬＣ：アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  （Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；２０％→１００％（２０ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ  ｉｎ  ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ
【００７１】
［製造例１］鶏卵卵黄からの糖ペプチドの製造
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
得られた脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
ＯＤＳ（オクタデシルシリル）樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び図２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式１に示される構造であることが分かった。
さらにＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。上記で得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。
【００７２】
［製造例２］
３３６ｍｇの４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸を１５ｍＬ塩化メチレンに溶解し、９５９ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩、６９１ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、５５０μＬのＮ−メチルモルホリン、６１ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え室温で終夜攪拌した。
反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加え、分液後、有機溶媒層を除去した。更に水層を酢酸エチルで洗浄後、１０％クエン酸水溶液を加え酸性にした後、水層から酢酸エチルで抽出した。有機溶媒層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮し上記４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル３３５ｍｇを得た。
【００７３】
［製造例３］フッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）の製造
製造例１と同様の手法で得られた糖ペプチド１１ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）１．５ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後１ｍＬのＤＭＦに溶解した製造例２で得られた４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル１１．９ｍｇを加え１２時間反応を行った。
反応終了後、エタノールを加え８，０００ｒｐｍで５分遠心し、フッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体を沈殿させ、上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を０．５ｍＬ蒸留水に溶解し、再度エタノール−エーテル混合液１５ｍＬに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心し沈殿を回収した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することでフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）４．９ｍｇを得た。
得られたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図４に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。
その結果、１２．５分に検出されるピークは検出イオンが１７６９．４（［Ｍ＋２Ｈ］2+）及び１７６７．５（［Ｍ−２Ｈ］2-）であることから推定分子量３５３６．９であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個の４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸が導入された糖ペプチド誘導体であると推定された。
【００７４】
［製造例４］
５８０ｍｇのヘキサン酸を１５ｍＬ塩化メチレンに溶解し、９５９ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩、１１５０ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、５５０μＬのＮ−メチルモルホリン、６１ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え室温で終夜攪拌した。
反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加え、分液後、有機溶媒層を除去した。更に水層を酢酸エチルで洗浄後、１０％クエン酸水溶液を加え酸性にした後、水層から酢酸エチルで抽出した。有機溶媒層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮しヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル８３１ｍｇを得た。
【００７５】
［製造例５］糖ペプチド誘導体（２）の製造
製造例１と同様の手法で得られた糖ペプチド１０ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）１．５ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後１ｍＬのＤＭＦに溶解した製造例４で得られたヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル１１ｍｇを加え１２時間反応を行った。
反応終了後、エタノールを加え８，０００ｒｐｍで５分遠心し、糖ペプチド誘導体を沈殿させ、上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を０．５ｍＬ蒸留水に溶解し、再度エタノール−エーテル混合液１５ｍＬに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心し沈殿を回収した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体（２）９．０ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図５に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、１０．２分に検出されるピークは検出イオンが１５８０．２（［Ｍ＋２Ｈ］2+）及び１５７８．５（［Ｍ−２Ｈ］2-）であることから推定分子量３１５８．７であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のヘキサン酸が導入された糖ペプチド誘導体であると推定された。
【００７６】
［実施例１］
＜フッ化カリウム水溶液存在下でのフッ素原子含有糖ペプチド誘導体とグラスフィルターとの接触＞
製造例３で得られたフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）を１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液で希釈し、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-8Ｍ、１ｘ１０-9Ｍ、１ｘ１０-10Ｍとなるように被検溶液を調製した。
ＮＵＮＣ製４８穴細胞培養用プレートに１ウエルあたり１枚入れたミリポア製グラスフィルター（１０ｍｍφ、厚さ４７５μｍ）に対し、被検溶液を各濃度群あたり３例で各ウエルあたり３００μＬずつ添加し、４℃で終夜静置した。比較対照群としてミリポア製グラスフィルターに対し１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液を１群３例、１ウエルあたり３００μＬずつ添加し、４℃で終夜静置した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
次にレクチンとの反応を実施した。ＮＵＮＣ製４８穴細胞培養用プレート中にあるグラスフィルターをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれの４８穴細胞培養用プレートに入れ、各ウエルに対し、５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＪ−ＯＩＬＭＩＬＬＳ製ＳＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ  Ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を各ウエルあたり３００μＬ加え室温で１時間静置した。
グラスフィルターをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれの４８穴細胞培養用プレートに入れ、各ウエルに対し、３．１ｘ１０-8ｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を各ウエルあたり３００μＬ加え室温で１時間静置した。
グラスフィルターをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれの４８穴細胞培養用プレートに入れ、各ウエルに対し、クエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ  ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図６に示す。
その結果、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体と１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液存在下で反応させたグラスフィルター群（１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-8Ｍ、１ｘ１０-9Ｍ各群３例）は、１ｘ１０-10Ｍ群を除き、１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液による比較対照群（１群３例）と比べて、吸光度（４９０ｎｍ）において有意に高いことが確認された。
このことからフッ化カリウム水溶液存在下でフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）と接触したグラスフィルターは、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体との結合が可能であり、その結果としてその特異性がＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）と結合している可能性が示唆された。
更にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体と反応させたグラスフィルターすなわちフッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体と反応させたグラスフィルターは、ＳＳＡレクチンとの結合能を有することから、ヒト型インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンと結合する可能性が示唆された。
【００７７】
［参考例１］
＜フッ化カリウム水溶液存在下での糖ペプチド誘導体とグラスフィルターとの接触＞
製造例５で得られた糖ペプチド誘導体（２）を１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液で希釈し、糖ペプチド誘導体濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-10Ｍとなるように被検溶液を調製した。比較対照群として１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液を用い、実施例１と同様に実施した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
実施例１と同様にして、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図７に示す。
その結果、糖ペプチド誘導体（２）と１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液存在下で反応させたフッ素塩処理グラスフィルター群（１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-10Ｍ、各１群３例）は、いずれの群も１ｘ１０-5Ｍフッ化カリウム水溶液による比較対照群（１群３例）と比べて、吸光度（４９０ｎｍ）において有意な差が無かった。
このことから糖ペプチド誘導体（２）と接触したフッ素塩処理グラスフィルターはフッ素原子含有糖ペプチド誘導体との結合が出来ず、その結果としてレクチンＳＳＡと出来ない可能性が示唆された。
【００７８】
［参考例２］
＜ＰＢＳ存在下でのフッ素原子含有糖ペプチド誘導体とグラスフィルターとの接触＞
フッ化カリウム水溶液の代わりにＰＢＳで希釈した以外は、実施例１と同様に実施した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
実施例１と同様にして、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図８に示す。
その結果、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）とＰＢＳ存在下で反応させたグラスフィルター群（１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-8Ｍ、１ｘ１０-9Ｍ、１ｘ１０-10Ｍ各群３例）は、ＰＢＳによる比較対照群（１群３例）と比べて吸光度（４９０ｎｍ）において有意差が見られない事が確認された。
このことからＰＢＳ存在下でフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）と接触したグラスフィルターは、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体との結合が十分に出来ず、その結果としてレクチンＳＳＡと結合しない可能性が示唆された。
【００７９】
［実施例２］
＜フッ素塩処理グラスフィルターの製造＞
ミリポア製グラスフィルター（１０ｍｍφ、厚さ４７５μｍ）１００枚に対し１Ｍフッ化カリウム水溶液（ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ＝９０：１０）を３０ｍＬ加え４℃で終夜静置した。次いで、グラスフィルターを濾別し、ＭｅＯＨで洗浄後、減圧下乾燥し、フッ素塩処理グラスフィルターを得た。
＜ＰＢＳ存在下でのフッ素原子含有糖ペプチド誘導体とフッ素塩処理グラスフィルターとの接触＞
フッ素原子含有糖ペプチド誘導体をＰＢＳで希釈し、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体濃度がそれぞれ１ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-10Ｍとなるように被検溶液を調製し、得られたフッ素処理グラスフィルターを用いた以外は、実施例１と同様に実施した。
＜レクチンとの結合評価＞
実施例１と同様にして、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図９に示す。
その結果、フッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）とＰＢＳ存在下で反応させたフッ素塩処理グラスフィルター（１ｘ１０-7Ｍ、１群３例）は、ＰＢＳによる比較対照群（１群３例）と比べて、吸光度（４９０ｎｍ）において有意に高いことが確認された。
このことからフッ素原子含有糖ペプチド誘導体（１）と接触したフッ素塩処理グラスフィルターはフッ素原子含有糖ペプチド誘導体との結合が可能であり、その結果としてその特異性がＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）と結合している可能性が示唆された。
更にフッ素原子含有糖ペプチド誘導体と反応させたグラスフィルターすなわちフッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体と反応させたグラスフィルターは、ＳＳＡレクチンとの結合能を有することから、ヒト型インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンと結合する可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の糖ペプチド被覆シリカは、医療及び医薬品開発の分野又はウイルス感染診断の分野における有効なリサーチツールとして産業上の利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１は、式１に示される糖ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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