(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列表の配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１−３８７位からなるＮ末端領域から選択されるペプチドであって、配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能なペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを発現しうるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードする遺伝子を組み込むことによる、トランスジェニック非ヒト動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａ２＋チャネルであるＴＲＰＶ２(transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 2)の、細胞膜での発現を抑制しうるＴＲＰＶ２の部分ペプチドに関する。さらには、当該ＴＲＰＶ２の部分ペプチドを発現し、ＴＲＰＶ２に関連する疾患の病因や治療方法の解明に寄与する非ヒトモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Trp (transient receptor potential)遺伝子産物スーパーファミリーは、ＴＲＰＣ（７種）、ＴＲＰＶ（６種）、ＴＲＰＭ（８種）の３ファミリーに分類され、いずれも形質膜を６回貫通するイオンチャネルであり、主としてＣａ２＋を通過させる。細胞膜に存在する多くのイオンチャネルはそれぞれに異なったチャネル特性を有し、これらに特異的に反応する薬物をスクリーニングするためには、それらに適合したアッセイ系を構築する必要がある。これらは、細胞応答が比較的限定されるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）とは大きく異なる点である。
【０００３】
ＴＲＰＶ２及びそのアゴニストの２ＡＰＢの存在は公知であり、Ｃａ２＋チャネルの電気生理学的な性質を利用したＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３の測定系について報告がある（非特許文献１）。ＴＲＰＶ２はストレッチ活性化Ｃａ２＋チャネルであり（非特許文献２−４）、正常組織では細胞内膜系に存在するが、筋ジストロフィー、心筋症などの筋変性疾患に伴って細胞膜に移行し、活性化されて細胞内への異常なＣａ２＋流入に寄与する（非特許文献３、５）。
【０００４】
従来からストレッチ感受性Ｃａ２＋チャネルのブロッカーとして用いられているガドリニウムは、Ｃａ２＋チャネル全般に作用すると考えられ、ルテニウムレッドは、ＴＲＰＶファミリー（ＴＲＰＶ１〜ＴＲＰＶ６）全般に作用すると考えられ、いずれも非特異的な薬物である（非特許文献６、７）。また、心筋症などの病態に対する効果は全く調べられていない。
【０００５】
一方、ＴＲＰＶ２は上述のような特徴を有するため、ＴＲＰＶ２を特異的に阻害する薬剤は変性を起こした筋肉のみに作用し、筋変性を軽減することが期待できる。ＴＲＰＶ２の機能については、未解明な部分が多く、ＴＲＰＶ２に関連する疾患については、今後の解明が期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Biological Chemistry; 279(34): 35741-35748 (2004)
【非特許文献２】Circulation Research; 93: 829-838 (2003)
【非特許文献３】J. Cell Biology; 161(5): 957-967 (2003)
【非特許文献４】J. Endocrinology; 191: 515-523 (2006)
【非特許文献５】Hum Mol Genet.; 18(5): 824-834 (2009)
【非特許文献６】J. Neuroscience; 28(24): 6231-6238 (2008)
【非特許文献７】Diabetologia; 51: 2252-2262 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＴＲＰＶ２の細胞膜での発現を抑制しうるＴＲＰＶ２の部分ペプチドを提供することを課題とする。本発明はさらに、当該ＴＲＰＶ２の部分ペプチドを発現しうるトランスジェニック（Ｔｇ）非ヒト動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、ＴＲＰＶ２発現培養細胞にＴＲＰＶ２の特定の領域の部分ペプチドを共発現させたところ、通常では細胞膜にＴＲＰＶ２の発現が認められるのに対し、当該部分ペプチドを共発現させた培養細胞では細胞内にＴＲＰＶ２が移動し、Ｃａ２＋の過剰流入が抑制されたことを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸配列のＮ末端領域を含む配列から選択されるペプチドであって、細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能なペプチド。
２．Ｎ末端領域が、配列表の配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端から１−３８７位の領域である前項１に記載のペプチド。
３．ＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸配列のＮ末端領域を含む配列から選択されるペプチドが、少なくとも１７残基のアミノ酸を含む、前項１又は２に記載のペプチド。
４．配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列を含む、前項１〜３のいずれか１に記載のペプチド。
５．前項１〜４のいずれか１に記載のペプチドを発現しうるＴｇ非ヒト動物。
６．前項１〜４のいずれか１に記載のペプチドをコードする遺伝子を組み込むことによる、Ｔｇ非ヒト動物の作製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＴＲＰＶ２の部分ペプチドは、細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能である。さらに、本発明のペプチドを発現させてなるＴｇ非ヒト動物を拡張型心筋症モデル動物と交配し、当該拡張型心筋症モデル動物にこのペプチドを発現させたモデル動物では、心肥大の程度、心エコーによる心機能及び生存率のいずれにおいても、拡張型心筋症モデル動物に比べて改善効果が認められた。これにより、本発明のＴＲＰＶ２の部分ペプチドは、病態時においてＴＲＰＶ２を細胞膜より消失させ、不活化させることが可能と考えられ、移植しか治療手段がない拡張型心筋症に対する有力な治療薬候補となりうる。また、本発明のペプチドを発現させてなるＴｇ非ヒト動物は、ＴＲＰＶ２を特異的に阻害する実験ツールとなるなどの効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＴＲＰＶ２発現ヒト胎児腎臓細胞（ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞）にＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）又はＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）を共発現させたときのＴＲＰＶ２の発現分布を示す写真図である。（実施例１）
【図２】ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞にＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）又はＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）を共発現させたときの、外液高Ｃａ２＋又はアゴニスト刺激による細胞内Ｃａ２＋動態を示す図である。（実験例１）
【図３】野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、４Ｃ３０マウス、ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス各々１８０日令の心筋縦断面写真図である。（実験例２）
【図４】野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、４Ｃ３０マウス、ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス各々１８０日令の心エコー検査結果を示す図である。（実験例２）
【図５】野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、４Ｃ３０マウス、ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス各々の生存率を示す図である。（実験例２）
【図６】ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞に各種のＴＲＰＶ２−ＮＴを共発現させたときのＴＲＰＶ２の発現分布を示す写真図である。（実施例３）
【図７】ＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端領域を含む配列から選択される各種ペプチドを示す図である。（実施例４）
【図８】ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞に各種のＴＲＰＶ２−ＮＴを共発現させたときのアゴニスト刺激による細胞内Ｃａ２＋の上昇の割合を示す図である。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ＴＲＰＶ２の細胞膜での発現を抑制しうるＴＲＰＶ２の部分ペプチドに関する。本発明者らは、培養細胞を用いてＴＲＰＶ２の部分ペプチドを共発現させ、in vitroの系で確認したところ、ＴＲＰＶ２の特定の部位の部分ペプチドを共発現させた場合に、当該培養細胞において、通常では細胞膜にＴＲＰＶ２の発現が認められるのに対し、細胞内にＴＲＰＶ２が移動し、Ｃａ２＋の流入が抑制されたことを確認した。本発明はさらに、当該ＴＲＰＶ２の部分ペプチドを発現しうるＴｇ非ヒト動物に関する。
【００１３】
ＴＲＰＶ２の遺伝子は、ヒトＴＲＰＶ２としてGenbank accession No.NM_016113（配列番号１）、マウスＴＲＰＶ２としてGenbank accession No.NM_011706（配列番号３）及びラットＴＲＰＶ２としてGenbank accession No. NM_017207（配列番号５）が報告されている。ＴＲＰＶ２タンパク質のアミノ酸配列は、上記配列番号で特定される塩基配列のうち、ＣＤＳ部分により特定されるアミノ酸配列（配列番号２、４、６）である。
【００１４】
本発明のペプチドは、配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端を含む領域から選択され、細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能なペプチドであればよい。前記Ｎ末端を含む領域とは、具体的には配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端から１−３８７位の領域をいう。本発明の細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能なペプチドは、前記Ｎ末から１−３８７位の領域から選択され、好ましくは同２９０−３８７位の領域から選択される。本発明のペプチドは、少なくとも１７残基、好ましくは９７残基、より好適には３８７残基のアミノ酸を含むペプチドが好適である。具体的には、配列表の配列番号７(LSRKFTEWCYGPVRVSL)に示すアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。以下、本明細書において、本発明の細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能なペプチドを、「ＴＲＰＶ２−ＮＴ」といい、当該ペプチドをコードする遺伝子を、「ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子」という。
【００１５】
本発明のＴｇ非ヒト動物は、上記ペプチドを発現させてなる非ヒト動物である。本明細書において、ＴＲＰＶ２−ＮＴを発現しうる非ヒト動物を、「ＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物」ともいう。本発明におけるＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子は、上述のＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端領域を含む配列から選択されるペプチドを発現しうる塩基配列からなるＤＮＡであればよい。そのような塩基配列としては、上述の配列番号１、３又は５に示す塩基配列の対応部分から選択することができ、あるいは上記のペプチドをコードしうる配列からなるＤＮＡの他、遺伝子コドンの縮重のため、上記のペプチドと同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいずれかのＤＮＡであってもよく、さらにはそれらの相補鎖であってもよい。
【００１６】
本発明におけるＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物を作製する宿主動物としては、ヒト以外の哺乳動物が挙げられ、例えば、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、モルモット、ラット、マウスなどのげっ歯類の取扱いが容易であるため好ましく、中でもマウスが好ましい。
【００１７】
本発明のＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物は、未受精卵、受精卵、精子及びその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞又は受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより上述のＮＴ遺伝子を導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とするＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもできる。さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることで、ＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物を作製することもできる。
【００１８】
ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子のｃＤＮＡを対象動物に導入させる際、当該ｃＤＮＡを対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入することが好ましい。特に心筋特異的にＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端を含むペプチドを発現させるために、心筋α−ミオシン重鎖プロモーターに結合したプラスミドコンストラクションを行うのが好適である。このプロモーターの制御下では、心筋のみに目的遺伝子を発現させることができる。全身に発現させる場合には、各種哺乳動物由来のＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端を含むペプチドを発現させうる各種プロモーターに結合したプラスミドコンストラクションを行うことが必要である。
【００１９】
ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルス又はバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、たとえばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、など）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）及び鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子［例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０及びＫ１４、コラーゲンＩ型及びＩＩ型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ及びＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子］のプロモーターなどが挙げられる。上記ベクターは、ＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物において、目的とするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を終結するターミネターを有していてもよい。
【００２０】
その他、ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも所望により可能である。
【００２１】
受精卵細胞段階におけるＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子の導入は、対象動物の胚芽細胞及び体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。トランスジェニック後の作出動物の胚芽細胞においてＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てにＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を過剰に有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞及び体細胞の全てにＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を過剰に有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体の動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００２２】
Ｔｇ対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性のＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を、好ましくはマウスなどの対象動物、又はその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ））、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
【００２３】
得られた受精卵に前述の方法により外来性のＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を導入した後、雌動物に人工的に移植、着床させることにより、外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト動物が得られる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）を投与後、雄動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌動物に得られた受精卵を人工的に移植・着床させることができる。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、Ｔｇ非ヒト動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡのマイクロインジェクションが好ましい。
【００２４】
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物又は他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）又は両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作製することができる。
【００２５】
あるいは、本発明のＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物は、上記したＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を導入遺伝子としてＥＳ細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞に由来するＨＰＲＴ陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞(embryonic stem cell)に、ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を導入する。ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクション法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラＴｇマウスが生まれる。該キメラＴｇマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロＴｇマウスを得ることができる。該ヘテロＴｇマウス同士を交配することにより、ホモＴｇマウスが得られる。
【００２６】
上記した本発明のＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物の子孫、並びに該ＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物の一部も本発明の範囲内である。ＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物の一部としては、該ＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物の組織、器官及び細胞などが挙げられる。
【００２７】
以下哺乳動物としてマウスを用いた場合を例にして、ＮＴ−Ｔｇマウスを製造する方法の一例についてさらに具体的に説明する。
【００２８】
１．遺伝子のクローニング
本発明の病理モデル動物を製造するには、まず、ヒト型若しくはマウス型のＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子をクローニングする。このクローニング方法としては公知の様々な方法が可能である。例えば、配列番号１又は３に示すＴＲＰＶ２のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをプラスミド等のベクターのＤＮＡに組込み、更に該ＤＮＡ組替えベクターを大腸菌等の宿主に組込んで、大腸菌を増殖させる。大量に産生された大腸菌からＤＮＡ組替えベクターを取りだし、ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子をカラムクロマトグラフ法、あるいは電気泳動法等により分取、精製することによりクローニングすることができる。目的の塩基配列をもつ遺伝子が精製されていることの確認は、ＤＮＡシーケンシングなどにより確定することが望ましい。
【００２９】
２．ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子のスクリーニング
マウス遺伝子ライブラリーから得られた本件ＴＲＰＶ２をコードするｃＤＮＡ、あるいは、マウスｍＲＮＡから直接ＲＴ−ＰＣＲ等の方法により得られた同ｃＤＮＡをプラスミドベクター等にライゲーションにより挿入する。ＴＲＰＶ２−ＮＴは、ＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸残基から、一部のアミノ酸を欠失しているものであるので、ＲＴ−ＰＣＲ等の方法により得られた同ｃＤＮＡを用いることができる。
【００３０】
３．ベクター
クローニング用ベクターとしては、宿主内で特定遺伝子を増幅できる細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。
【００３１】
４．宿主
本発明のＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子は、好ましくはベクターを経由して宿主細胞により増殖させる。本件ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986)及びSambrookら(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Habor LABORATORY Press, Cold Spring Habor, NY., 1989)などの自体公知の実験室マニュアルに記載される形質転換や感染等により行うことができる。
そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞等を挙げることができる。
【００３２】
５．Ｔｇマウスの製造
ＴＲＰＶ２−ＮＴ発現Ｔｇマウスを製造するには、例えばマウスの受精卵の細胞核に上記方法で得たＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子をマイクロインジェクトする。注入する遺伝子の量は１個の受精卵当り２００〜１０００コピーであることが好ましい。別に精管切断術を施した雄マウスと交尾させ偽妊娠状態にした仮親を用意して、この仮親の卵管内にこの受精卵を移植し、マウスを誕生させる。
【００３３】
ＴＲＰＶ２−ＮＴ遺伝子を導入する方法としては、他に受精卵にレトロウイルスベクターを感染させる方法も採用しうる。また、受精卵の代わりにＥＳ細胞を用いて同様の方法によりＴＲＰＶ２−ＮＴを発現するマウスを製造することができる。
【００３４】
上記方法でクローニングされたＴＲＰＶ２−ＮＴをコードするｃＤＮＡを、心筋−αミオシン重鎖プロモーターに結合してプラスミドコンストラクションを行い、トランスジーンベクターを作製する。作製されたトランスジーンベクターを線状化し、マイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた感染等によって受精卵に導入する。
【００３５】
マイクロインジェクション後、一般的には生まれた胚の１０−４０％に染色体への導入遺伝子の安定な組み込みが起こっている。選択されたマウス染色体に目的とする遺伝子の組み込みが起こっているかどうかをＰＣＲ法、サザンブロット法等により確認することが好ましい。このマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、本発明の本件ＴＲＰＶ２−ＮＴ発現マウスを作製することができる。
【００３６】
本件ＴＲＰＶ２−ＮＴ発現マウスが生起しているか否かを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べ、又はタンパク質を抽出してウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の理解を深めるために、実施例及び実験例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００３８】
（実施例１）ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞でのＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端を含むペプチドの発現
本実施例では、マウスＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸配列（配列番号４）のうち、１−３８７位のアミノ酸残基からなるＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端を含むペプチド（以下、「ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）」という。）及びＦＬＡＧ配列を融合したものを、ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞に共発現させた。比較例として、マウスＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸配列（配列番号４）のうち、Ｃ末端を含む領域より選択されるペプチド、具体的には、Ｎ末より６３３−７５６位のアミノ酸残基からなるペプチド（以下、「ＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）」という。）及びＦＬＡＧ配列を融合したものを、同様にＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞に共発現させた。各ペプチドのＮ末のアミノ酸をコードするコドン及びＦＬＡＧ配列のアミノ酸をコードするコドンに適切な制限酵素認識配列を組み込んだプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）の場合はＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩを付加し、ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）はＮｏｔＩと ＢａｍＨＩ認識配列を付加した。
【００３９】
該ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１で消化し、同じくＥｃｏＲ１で消化したＰ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶＴＭ−１４発現ベクターに導入し、発現ベクターＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）ＦＬＡＧとＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）ＦＬＡＧを調製した。作製した発現ベクターをＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞に導入し、ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３７８）又は比較例としてＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）を組み込んだ。
【００４０】
上記各ペプチドを共発現させたＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＴＲＰＶ２の分布を免疫組織染色にて確認した。上記ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞を１０％ホルマリンで固定し、界面活性剤（０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて透過処理を行ったものに、ＴＲＰＶ２検出用一次抗体として抗ＴＲＰＶ２抗体（自家製：非特許文献３参照）を付加し、ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）又はＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）を検出する抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ製）を付加し、免疫組織染色を行なった。
【００４１】
上記の結果、ＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）を導入したＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞では、ＴＲＰＶ２は細胞膜に発現が認められたのに対して、ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）を導入したＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞では、細胞質内にＴＲＰＶ２の発現が認められた（図１）。
【００４２】
（実験例１）細胞内Ｃａ２＋動態試験
本実験例では、実施例１で作製したＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）共発現ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞及び比較例としてのＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）共発現のＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞について、各々細胞内Ｃａ２＋動態を確認した。
細胞内Ｃａ２＋濃度指示薬ｆｕｒａ−２を負荷した細胞を、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２・ＢＳＳ(Balanced Salt Solution)：１４６ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ ＣａＣｌ２ ，１０ｍＭ グルコース，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で２回洗浄後、ＢＳＳ存在下測定開始した。
高Ｃａ２＋はＢＳＳに最終濃度５ｍＭ ＣａＣｌ２を加えることにより行った。高Ｃａ２＋刺激５分後、２ＡＰＢ (2-aminoethoxydiphenyl borate)溶液（０．５ｍＭ ２ＡＰＢ），５ｍＭ ＣａＣｌ２ ＭＥＳ (2-Morpholinoethanesul phonic acid)−ＢＳＳ：１４６ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ ＣａＣｌ２ １０ｍＭ グルコース，１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．８）で刺激し、５分後０ｍＭ ＣａＣｌ２  ＢＳＳで洗いイオノマイシン１０μＭ ５ｍＭ ＣａＣｌ２ ＢＳＳ刺激で最大Ｃａ２＋反応を確認した。
【００４３】
その結果、ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞にＴＲＰＶ２−ＣＴ（６３３−７５６）を共発現させた場合は、ＴＲＰＶ２単独発現細胞とほとんど変わらない細胞内Ｃａ２＋動態を示すが、ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）を共発現させた場合は高Ｃａ２＋刺激２ＡＰＢ刺激とも顕著な抑制を示した（図２）。
【００４４】
（実施例２）マウスＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）発現Ｔｇマウスの作製
本実施例において、マウスＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）を発現するＴｇマウス（以下、「ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス」）を構築した。
【００４５】
マウスＴＲＰＶ２遺伝子はマウスｃＤＮＡライブラリーからクローニングし、哺乳動物発現ベクターｐＥＣＥのマルチクローニングサイトにクローニングされている。そのプラスミドを元にして、ＰＣＲ法によりＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）遺伝子のｃＤＮＡを得た。
【００４６】
上記調製したｃＤＮＡを基にして、ＰＣＲ法で制限酵素ＮｏｔＩ及びｐｏｌｙＡ配列と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを付加したｃＤＮＡを作製し、あらかじめ制限酵素Ｓａｌ１とＨｉｎｄＩＩＩで消化切断したサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐｈＣＭＶトランスファーベクターに組込み、発現ベクターｐＣＭＶ−ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）を作製し、トランスジーンを作製した。
【００４７】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスにＰＭＳ及びｈＣＧを腹腔投与して過排卵を誘発し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスと同居・交配した。交尾の成立した雌マウスを頚椎脱臼により殺し、腹腔を開き卵管膨大部を切り出して、ヒアルロニダーゼを含むＭ１６培地中に移し、実体顕微鏡下で卵管膨大部を裂いて受精卵を培地中に移し、ガラスピペットを用いて受精卵を回収した。
【００４８】
次に、ガラスディッシュに受精卵を含むＭ１６培地及び注入ＤＮＡ（濃度は５ｎｇ／μｌ）のドロップをそれぞれ作製し、パラフィンオイルでカバーした。マイクロマニュピレーター付き倒立顕微鏡下でインジェクション用ピペットに注入ＤＮＡをおおよそ０．１μｌ吸引して、ホールディング用ピペットで固定した受精卵の前核内にＤＮＡを注入した。
【００４９】
ＤＮＡ注入した受精卵を移植するための偽妊娠雌マウス（ＩＣＲマウス）を、精管を切除した雄マウス（ＩＣＲマウス）と交配させることにより作製した。受精卵にＤＮＡを注入した当日に、偽妊娠雌マウスを麻酔し、後背部より卵巣、卵管を引出し、卵管開口部を露出する。実体顕微鏡下で移植用ピペットを用いておよそ１０個の受精卵を吸引して、左右の卵管開口部からそれぞれ受精卵を移植した。受精卵の移植後、偽妊娠雌マウスは約２０日で子マウス（ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス）初代(Founder)（ヘテロ）を出産した。
【００５０】
（実験例２）拡張型心筋症モデル（４Ｃ３０）と本発明のＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスの交配試験
本実験例では、拡張型心筋症モデル（４Ｃ３０）マウスと、実施例２で作製したＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスと交配し、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス（Ｆ３マウス）を作製し、心筋縦断面像、エコーによる心機能検査及び生存率の各試験を行なった。４Ｃ３０は、シアル酸転移酵素を導入したマウスのラインの一つであり、拡張型心筋症モデルとして国立感染症研究所獣医学部第四室（実験動物開発室）より分与された。ホモ導入個体は７ヶ月程度で心拡大を伴う呼吸不全で全例死亡するといわれている。交配は、７−８週令の４Ｃ３０マウスと７−８週令の実施例２で作製したＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスとで行ない、ヘテロ４Ｃ３０／ＮＴ―Ｔｇ（Ｆ１）マウスを得、それと４Ｃ３０（ホモ）との交配で得た４Ｃ３０（ホモ）／ＮＴ―Ｔｇ（Ｆ２）マウス同士の交配で得た４Ｃ３０（ホモ）／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇ（Ｆ３）マウスを使用した。
【００５１】
１）心筋縦断面像
野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、４Ｃ３０マウス、ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウス各々１８０日令の心筋縦断面をマッソントリクローム染色を行い、確認した。マッソントリクローム染色は、核をヘマトキシリン染色、細胞質を酸性フクシン染色、膠原線維をアニリン青で染め分ける染色方法である。その結果、４Ｃ３０マウスでは心肥大が認められたが、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスでは、ＷＴ及びＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスと同様に心肥大は認められなかった。この結果より、ＴＲＰＶ２−ＮＴ（１−３８７）を発現するＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスとの交配により、心肥大が改善しうることが認められた（図３参照）。
【００５２】
２）エコーによる心機能検査
上記、各マウスの心機能をエコーを用いて測定した。その結果、４Ｃ３０マウスにおける収縮能(Fractional shortning)減少が４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスにおいて改善された（図４参照）。
【００５３】
３）生存率
上記、各マウス（ｎ＝２２）の生存曲線を調べた。その結果、４Ｃ３０マウスでは雄、雌ともに３００日未満で全てが死亡したが、４Ｃ３０／ＮＴ（１−３８７）−Ｔｇマウスでは死亡率に改善が認められ、特に雌では４００日以上の生存を認めたものもあった。
【００５４】
（実施例３）ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端領域を含む配列から選択される各種ペプチドの発現
本実施例では、マウスＴＲＰＶ２タンパク質を構成するアミノ酸配列（配列番号４）のうち、１−１０３位のアミノ酸残基からなるペプチド（ＮＴ１）、１０４−１９８位のアミノ酸残基からなるペプチド（ＮＴ２）、１９９−２８９位のアミノ酸残基からなるペプチド（ＮＴ３）、２９０−３８７位のアミノ酸残基からなるペプチド（ＮＴ４）を、各々ＦＬＡＧ配列を付加し、ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞に共発現させた。発現の方法は、実施例１と同手法にて行なった。上記ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＲＰＶ２の分布を、実施例１と同手法にて免疫組織染色し、確認した。
【００５５】
上記の結果、ＮＴ１、ＮＴ２又はＮＴ３のいずれかのペプチドを導入したＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞では、ＴＲＰＶ２は細胞膜に発現が認められたのに対し、ＮＴ４ペプチドを導入したＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞では、細胞質でＴＲＰＶ２の発現が認められた（図６）。このことより、ＮＴ４ペプチドが、細胞膜でのＴＲＰＶ２の発現抑制に有効であることが確認された。
【００５６】
（実施例４）ＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＲＰＶ２タンパク質のＮ末端領域を含む配列から選択される各種ペプチドの発現
本実施例では、実施例３に示すＮＴ４のペプチドをさらに分類し、図７に示すペプチド１（ＮＴ４−ｐ１）、ペプチド２（ＮＴ４−ｐ２）、ペプチド３（ＮＴ４−ｐ３）及びペプチド４（ＮＴ４−ｐ４）ペプチド５（ＮＴ４−ｐ５）それぞれに、膜透過性ＴＡＴペプチド（RRRRRRRRRRR(配列番号８)）を付加したものをＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞とインキュベートすることにより細胞に発現させた。各発現細胞について、２ＡＰＢ刺激による細胞内Ｃａ２＋の濃度の上昇割合を以下の方法にて確認した。
先行出願である「ＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法及びＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング方法（特開２００７−２５９７４５号公報）」に基づき行った。
９６穴マイクロプレートにＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞を培養したものを用いた。培養したＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞を、あらかじめ膜透過性ＴＡＴペプチドを付加した各々ペプチドＮＴ４−ｐ１からｐ５を、それぞれ１〜６μｇ／ｍｌ又はペプチドなし（none）と２時間３７℃でインキュベートした後、定法に従いｆｕｒａ−２負荷し、細胞内Ｃａ２＋濃度を測定した。０．５ｍＭ ２ＡＰＢ刺激後の最大Ｃａ２＋濃度変化を示した。Δratioは３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起したとき５１０ｎｍでの蛍光強度の比で示した。
【００５７】
上記の結果、ＮＴ４−ｐ２（LSRKFTEWCYGPVRVSL(配列番号７)）を導入したＴＲＰＶ２発現ＨＥＫ２９３細胞では、２ＡＰＢ刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が抑制される傾向が認められ、ＮＴ４−ｐ２がＴＲＰＶ２活性の抑制に有効であることが確認された（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上説明したように、本発明のＴＲＰＶ２の部分ペプチドは、細胞膜でのＴＲＰＶ２タンパク質発現を抑制可能である。さらに、本発明のＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物を拡張型心筋症モデル動物（４Ｃ３０）と交配し、４Ｃ３０／ＮＴ−Ｔｇ動物を作製したとき、４Ｃ３０／ＮＴ−Ｔｇ動物は心肥大の程度、心エコーによる心機能及び生存率のいずれにおいても、４Ｃ３０モデル動物に比べて改善効果が認められた。
【００５９】
ＴＲＰＶ２の活性化は、心筋、骨格筋を問わず、筋肉細胞の変性・細胞死を伴う広範囲の疾患で起こることがわかっている。従って、本発明のペプチドは、拡張型心筋症のみならず、筋ジストロフィー又は心不全一般の治療薬、あるいは心筋保護薬として適用することも可能と考えられる。さらに、病態時においてＴＲＰＶ２を細胞膜より消失させ、不活化させることで、従来移植しか治療手段がない拡張型心筋症に対する有力な治療薬候補となりうる。また、本発明のＮＴ−Ｔｇ非ヒト動物は、ＴＲＰＶ２を特異的に阻害する実験ツールとなり、ＴＲＰＶ２活性化で起こる心筋病態解明に重要であるとともに、様々な心筋病態でのＴＲＰＶ２関与を確かめる手段としても利用できる。
【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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