(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣ１２細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散とを添加し、培地中のＰＣ１２細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項２】
ＰＣ１２細胞を培養する培地中のグルタミン酸の濃度が１μＭ〜５０ｍＭである請求項１記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項３】
ＰＣ１２細胞を培養する培地中の抑肝散の濃度が１０〜１０００μｇ／ｍｌである請求項１または２に記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかの項記載のバイオアッセイ法により、抑肝散基準製剤と被検製剤の薬理活性価を同一条件で求め、基準製剤と被検製剤を比較することを特徴とする抑肝散の品質同等性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑肝散のアッセイ方法に関し、更に詳細には、神経系培養細胞を用い、漢方製剤である抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を定量的に評価しうるアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。また、単一の活性成分のみで効果を発揮するわけではなく、複合的に作用するものであるため、その品質を保証するには、漢方薬全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている（特許文献１、特許文献２）。【０００３】
この測定方法中には、個別の成分を測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。そしてバイオアッセイには、生体内（in  vivo）試験と、試験管内（in  vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。【０００４】
一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められており、実際ミオスタチンについては、バイオアッセイ法が報告されている（特許文献３）。しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬についは、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、それらの確立が待たれている。【０００５】
例えば、漢方製剤である抑肝散は、一般的には下の組成のものであるが、このものについても適切なバイオアッセイ系は見出されておらず、より高い品質保証を行うためには、その開発が求められている。【０００６】
【表１】
0005434909.tif 000002
【０００７】
【特許文献１】特表２０００−５１２６２１
【特許文献２】特表２００１−５２１８７６
【特許文献３】特表２００５−５２０４８６
【非特許文献１】“PlantaMed.”2004  May;70(5):427-31.（Hong  H,  Liu  GQ.  Scutellarin  attenuates  oxidative  glutamate  toxicity  in  PC12  cells.）
【非特許文献２】“J．Ethnopharmacol.”2005  Apr  8;98(1-2):89-94.（Yu  D,  Duan  Y,  Bao  Y,  Wei  C,  An  L.  Isoflavonoids  from  Astragalus  mongholicus  protect  PC12  cells  from  toxicity  induced  by  L-glutamate.）
【非特許文献３】“Clin.  Exp.  Pharmacol.  Physiol.”  2004  Aug;31(8):530-6.（Lee  JH,  Song  DK,  Jung  CH,  Shin  DH,  Park  J,  Kwon  TK,  Jang  BC,  Mun  KC,  Kim  SP,  Suh  SI,  Bae  JH.  (-)-Epigallocatechin  gallate  attenuates  glutamate-induced  cytotoxicity  via  intracellular  Ca  modulation  in  C12  cells.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、抑肝散について、より高い品質保証を可能とする試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、抑肝散の作用として、グルタミン酸による細胞死を直接保護する作用を有する可能性があるとの着想から、鋭意検討を行っていたところ、一般的に細胞死に関する研究で用いられる神経系培養細胞をグルタミン酸の存在下で培養し、細胞死を誘発させ、同時に抑肝散を添加させると、細胞死が用量依存的に抑制されることを確認した。そして、この知見を応用すれば、神経細胞死に対する抑肝散のバイオアッセイ法が構築できることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち本発明は、細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散とを添加し、培地中での培養細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のバイオアッセイ法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、試験管内試験により、簡単かつ安定に抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を求めることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の抑肝散のバイオアッセイ法は、神経系培養細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散とを添加し、培地中の神経系培養細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価するというものである。【００１３】
本願発明の抑肝散のバイオアッセイ法において、神経系培養細胞としては、同種細胞として公知の細胞を利用できるが、ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞を用いることが好ましい。このＰＣ１２細胞は、一般的に細胞死に関する研究において多岐に使用されており、その特徴は、神経栄養因子（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）に応答することである。ＮＧＦ非存在の培養では副腎髄質クロム親和細胞の形質を示すが、ＮＧＦ存在下によって長い神経線維を伸ばし交感神経節細胞様に分化する。その利用はきわめて広く、特に分子生物学的利用については膨大な利用度を記録している。また、ＰＣ１２細胞は、グルタミン酸により細胞死を起こすが、スカッテラリン（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｎ）、イソフラボノイド（Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）、(−)−エピガロカテキン  ガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）等の植物由来成分がこの細胞死を抑制する事が知られている（非特許文献１ないし３）。
【００１４】
本発明において使用されるＰＣ１２細胞は、コラーゲンをコーティングしたフラスコ中で５％ウシ胎児血清と１０％非動化ウマ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、一定期間、例えば、３日間ないし７日間培養することにより作製することができる。
【００１５】
また、ＰＣ１２細胞は、神経栄養因子（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）に応答するが、ＮＧＦ刺激の有無に関わらずＰＣ１２細胞はグルタミン酸の濃度に依存した細胞死を起こす。よって、本願発明を実施する上で、ＰＣ１２細胞に対するＮＧＦ刺激の有無は影響しない。【００１６】
本願発明の抑肝散のバイオアッセイ法においては、神経系培養細胞を培養する培地中のグルタミン酸濃度を、これら培養細胞に細胞死の誘発を引き起こすに十分な濃度とする必要がある。しかしながら、グルタミン酸を高濃度で培地に添加した場合には、培地中のｐＨが酸性側へ傾く結果、培養環境変化による細胞死の影響が懸念されるので、より低濃度でグルタミン酸による細胞死を誘発できる条件を選択する必要がある。【００１７】
具体的には、血清中にはグルタミン酸が存在し、これらが神経細胞の生存率に影響を及ぼすことを考慮し、血清の影響を検討する必要がある。更に、神経系の細胞を培養する場合、細胞の培養容器への接着を高めるため細胞外基質(コラーゲン、ポリリジン等)をコーティングする事が通例であるが、これらについてもより良いものを検討する必要がある。更に加えて、培地添加物であるフェノールレッドはエストロジェン様活性を有しており、吸光測定あるいは蛍光測定に影響を及ぼす場合があるので、これも検討が必要となる。【００１８】
そして、これらの結果選定された最良の細胞死誘発条件としては、培地に透析血清を用い、プレートとしてはコラーゲンでコートしたものを使用し、フェノールレッドを添加しない培地を用いることである。しかしながら、本発明のバイオアッセイ法の実施は、これら条件に限定されるものではない。【００１９】
本発明において、効果的に細胞死を誘発するための培地中のグルタミン酸の濃度は、１μＭ〜５０ｍＭであることが好ましく、更に好ましくは、１ｍＭ〜２０ｍＭである。【００２０】
本発明のバイオアッセイ法での評価法の一つの態様は、細胞死を誘発するのに十分な程度の量のグルタミン酸と一定量の抑肝散を添加した培地中で、ＰＣ１２細胞の細胞死を誘発し、ＭＴＴアッセイ法で生存細胞数を測定し、これらから抑肝散の薬理活性価を評価する方法である。【００２１】
かかるＭＴＴアッセイ法とは、３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）が細胞内のミトコンドリアの脱水酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるＭＴＴ量が多く、その結果生じる黄色〜赤色のホルマザン量が生存細胞数とよく対応することを利用したものである。この方法は、生細胞のみを測定することができる方法であり、６９０ｎｍを参照波長とし５７０ｎｍの波長におけるサンプルの光吸度を測定するものである。もちろん、生存細胞数が測定できる方法であれば他の公知方法を用いても良いことはいうまでもない。【００２２】
この測定において、一般的には、既知濃度の抑肝散を含む試料を同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性価を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、既知濃度の抑肝散を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。【００２３】
以上のようにして、神経系培養細胞において抑肝散の薬理活性価を評価することができるが、この作用機序は、直接抑肝散の作用に基づくものである。すなわち、本発明者らの研究により、抑肝散は、グルタミン酸により誘発された神経系培養細胞の細胞死を抑制することが見出され、このことにより、抑肝散における細胞死抑制の薬理活性価を評価することが可能となったのである。【００２４】
更に、本発明のバイオアッセイ法で、抑肝散として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を、同一条件で薬理活性価を評価し、基準製剤と被検製剤を比較することにより、製剤の品質同等性を評価することができる。【００２５】
更にまた、複数の製剤ロットについて本発明のバイオアッセイ法で薬理活性価の評価を行いその平均等から導き出される上下限の範囲に対し、被検試料の薬理活性価がその範囲に該当するかどうかにより品質同等性を評価することもできる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。【００２７】
実  施  例  １
ＰＣ１２細胞の培養：
ＰＣ１２細胞（供給源：大日本住友製薬株式会社）の培養は、次のようにして行った。すなわち、コラーゲン（コラーゲン酸性溶液ＩＡＣ−１５：株式会社  高研製）をコーティングした培養面積７５ｃｍ２のフラスコを用い、この中に、増殖培地として、５００ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ２２４００−０８９）に５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン溶液(ＧＩＢＣＯ  １５０７０−０６３)を添加した抗生物質含有培地に、更に５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＩＣＮ  ２９１６７５４）と １０％の非動化ウマ血清（ＨＳ；ＧＩＢＣＯ  ２６０５０）を含有させた培地を入れた。凍結保存したＰＣ１２細胞を解凍後、この増殖培地にて１週間以上培養し、実験に使用した。ここで、ＰＣ１２細胞の継代は、パスツールピペット、シリンジを用いて機械的剥離法により行った。なお、以下の実施例も含み、すべての細胞培養は３７℃で５％ＣＯ２を含む空気下のＣＯ２インキュベーター内で行った。【００２８】
実  施  例  ２
グルタミン酸による細胞死誘発：
実施例１で得たＰＣ１２細胞を用い、グルタミン酸による細胞死を効率よく引き起こす培養条件を検討した。それらは、以下の通りである。【００２９】
（１）血清  
グルタミン酸細胞死に対する血清の影響を検討した。通常の血清(ＦＢＳおよびＨＳ)と透析血清（排除限界１００００ダルトンの限外ろ過膜で透析した血清）の比較において、グルタミン酸細胞死に対する血清の影響に顕著な差は認めらないが、透析血清で細胞死を誘発しやすい傾向が見られた。結果を図１に示す。【００３０】
（２）コーティング
ＰＣ１２細胞の培養容器への接着を効率よくする細胞基質を探索した。そして、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リシン（Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ；ＳＩＧＭＡ  Ｐ４７０７、分子量：７０，０００−１５０，０００）およびＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標登録）（窒素含有陽イオンを表面に添加した初代培養用プレート）の３種類の培養プレートについて検討した。顕微鏡下の観察では、ポリ−Ｌ−リシンとＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標登録）のプレートでは凝集した細胞が浮遊しており、細胞の接着が弱かったことにより細胞数が減少していた。ＭＴＴアッセイ法により生存細胞を測定した結果を図２に示す。
【００３１】
（３）培地添加物
細胞死を検出し易しくする為に、培地中の添加物の検討を行った。フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０  (ＧＩＢＣＯ  ２２４００−０８９)培地をＰＲ(＋)とし、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有しないＲＰＭＩ  １６４０  (ＧＩＢＣＯ  １１８３５−０３０)培地をＰＲ(−)として比較検討した。その結果、培地にフェノールレッドを含有しない培地は、細胞死が起こり易かった。この結果を図３に示す。
【００３２】
以上の検討により、グルタミン酸による細胞死誘発には、コラーゲンでコートしたプレートに細胞を播種し、透析血清を添加したフェノールレッドを含有しない培地を誘発培地として用いることを最良の培養条件と判断した。誘発培地は、５００ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ  １１８３５−０３０）に５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン溶液を添加した抗生物質含有培地で、その中に５％の透析ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ２６４００−０４４）と１０％の透析ウマ血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ  Ｓ０９０Ｄ）を含有する培地である。【００３３】
実  施  例  ３
抑肝散のバイオアッセイ：
上記（１）〜（３）の条件を基に、ＰＣ１２細胞を以下のように培養した。【００３４】
ＰＣ１２細胞をコラーゲンでコーティングした９６穴プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、播種日から誘発培地で３日間培養し、播種２日目に１ｍＭ〜２０ｍＭ濃度のグルタミン酸をそれぞれ添加し細胞死を誘発した。【００３５】
上記細胞死の誘発から２４時間後に、上記の９６穴プレート中の培地１００μＬに対し２０μＬの０．５％ＭＴＴ液（Ｄｏｊｉｎｄｏ  ３４５−０１８２１）を添加し、５時間培養し、１００μＬの停止液（１０％  ＳＤＳ  ｉｎ  ０．０１Ｎ  ＨＣｌ）の添加で反応を停止した。ホルマザンの結晶をピペットにより溶解し、一晩放置後に６９０ｎｍを参照波長として５７０ｎｍの波長における吸光度を分光光計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣＣ／３４０、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ社製）で測定した。その後、得られた吸光度を基に、下記の計算式により細胞生存率を算出した。その結果を図４に示す。なお、測定値（コントロールに対する％）は、グルタミン酸無添加群を対照としたものである。
細胞生存率（％）＝[（As-Abs）/（Ac-Abc）]×100
式中、Asは、検体の吸光度（細胞、被検物質添加培地およびMTT溶液の入ったウ
ェル）
Acは、陰性対照の吸光度（細胞、対照培地およびMTT溶液の入ったウェル）
Absは、検体のブランク吸光度（被検物質添加培地およびMTT溶液の入ったウ
ェル）
Abcは、陰性対照のブランク吸光度（対照培地およびMTT溶液の入ったウェル）【００３６】
次に、図４から効果的に細胞死を引き起こしたグルタミン酸濃度１７．５ｍＭを選択し、抑肝散（ＴＪ−５４；株式会社ツムラ製）（以下、「ＴＪ−５４」という）を添加し、ＰＣ１２細胞のグルタミン酸細胞死に対するＴＪ−５４の抑制効果を、上記と同様細胞生存率から測定した。ＰＣ１２細胞において、ＴＪ−５４が１０〜１，０００μｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に細胞死を抑制していることが示された。その結果を、図５に示す。【００３７】
この結果により、ＴＪ−５４は、グルタミン酸添加によるＭＴＴ活性の低下を、濃度依存的に抑制することが示された。（図５）。また、１７．５ｍＭグルタミン酸で誘発した細胞死を基準にＴＪ−５４を添加した際の濃度依存的な細胞死の抑制効果を検量線化することで、抑肝散のバイオアッセイ系の構築に利用できることが明らかになった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、試験管内試験により、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単かつ安定に抑肝散の薬理活性価を求めることが可能である。【００３９】
従って、従来の含有される一定成分を分析する方法に比べ、抑肝散をより高い程度で品質保証することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】通常血清と透析血清を使用した際のグルタミン酸添加量と生存細胞率の関係を示す図面である。図中、Ｎｏｒｍａｌは、通常血清を、Ｄｉａｌｙｚｅｄは、透析血清を意味する。
【図２】３種プレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標登録））における、グルタミン酸濃度と生存細胞の関係を示す図面である。
【図３】グルタミン酸濃度と細胞生存率の関係を、培地添加物の有無により示した図面である。図中、ＰＲ（＋）は、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地、ＰＲ（−）は、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有しないＲＰＭＩ  １６４０培地を意味する。
【図４】グルタミン酸濃度と細胞生存率の関係を示す図面である。
【図５】グルタミン酸濃度１７．５ｍＭの培地中での、ＴＪ−５４の添加量と細胞生存率の関係を示す図面である。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは、グルタミン酸無添加での細胞生存率を意味する。
【図６】図５の結果から、１７．５ｍＭグルタミン酸で誘発した細胞死を基準に、グルタミン酸誘発細胞死に対するＴＪ−５４の濃度依存的な抑制作用を示した検量線である。
【図１】
0005434909.tif 000003
【図２】
0005434909.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005434909.tif 000008