(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚モデル構築物の製造方法。
【請求項２】
前記表皮基底細胞が、外因的に核酸が導入された遺伝子導入表皮基底細胞である請求項１記載の皮膚モデル構築物の製造方法。
【請求項３】
前記支持体が、コラーゲンゲルである請求項１又は２に記載の皮膚モデル構築物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の製造方法により得られる皮膚モデル構築物。
【請求項５】
表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなり、
前記細胞クラスターの最表部に形成され、前記表皮基底細胞を含有した基底層と、
前記基底層の内側に形成され、前記表皮基底細胞の分化細胞を含有した分化細胞層と
を有してなり、
前記分化細胞層の内側に空間が形成されてなる皮膚モデル構築物。
【請求項６】
前記分化細胞層が、前記基底層の内側に形成され、有棘細胞を含有した有棘層と、
前記有棘層の内側に形成され、顆粒細胞を含有した顆粒層と、
前記顆粒層の内側に形成された角化層と
からなる請求項５記載の皮膚モデル構築物。
【請求項７】
表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚の分化のシミュレーション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚モデル構築物に関する。より詳しくは、本発明は、皮膚モデル構築物、前記皮膚モデル構築物の製造方法及び皮膚の分化のシミュレーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物において、細胞分化や形態形成に際しては、種々の因子が発現していることが知られている。例えば、マウスにおいて、集塊状で培養された間充織細胞では、上皮の形態形成が行なわれるが、偏平な細胞形態をとる単層で培養された間充織細胞では、上皮の形態形成が行なわれないことが知られている。マウスにおける前記上皮の形態形成に関与する因子として、集塊状で培養された間充織細胞で産生され、偏平な細胞形態をとる単層で培養された間充織細胞では産生されないエピモルフィンが単離されている（特許文献１を参照）。さらに、前記特許文献１には、マウスのエピモルフィンのホモログとして、ヒトのエピモルフィンが開示されている。
【０００３】
一方、皮膚の疾患の発症機構の解明や前記疾患の治療又は予防薬の開発には、疾患モデル動物や、三次元培養皮膚モデル（非特許文献１、非特許文献２を参照のこと）が用いられている。
【０００４】
しかしながら、前記疾患モデル動物の場合、個体間でのバラツキが大きく、多検体のスクリーニングに十分な再現性を得ることが困難であるという欠点がある。さらに、前記疾患モデル動物の場合、ヒトにおける特定の疾患状態を示すモデルの樹立が困難である場合があり、疾患モデルの種類そのものが少ないという欠点がある。
【０００５】
また、非特許文献１及び非特許文献２記載の三次元培養皮膚モデルは、培養法が確立されている正常表皮細胞を、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル層などの支持体に播種し、三次元に培養して、層形成を行なうことにより、正常状態の皮膚構造を擬した構造を構築したモデルである。そのため、非特許文献１及び非特許文献２記載の三次元培養皮膚モデルは、前記疾患モデル動物に比べて、モデル間のバラツキが小さいため、多検体のスクリーニングに適した再現性を得ることができる。しかしながら、非特許文献１及び非特許文献２記載の三次元培養皮膚モデルは、製造に際して、層形成による正常状態の皮膚構造を擬した構造の構築に時間がかかるという欠点がある。
【特許文献１】特許第２８４９５１７号公報
【非特許文献１】ベル(Bell E)ら、「再構築皮膚の製法（Recipes for reconstituting skin.)」、ジャーナル  オブ  バイオメカニカル  エンジニアリング(Journal of Biomechanical Engineering)、1991年、第113巻、p.113-119
【非特許文献２】スクープ(Schoop VM)ら、「ヒト皮膚線維芽細胞との器官型培養におけるＨａＣａＴケラチノサイトの表皮形成及び分化(Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytesin organotypic coculture with human dermal fibroblasts.)」、ジャーナル  オブ  インベスティゲイティブ  ダーマトロジー(Journal of Investigative Dermatology)、1991年、第112巻、p.343-353
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、皮膚モデル構築物を、短時間で簡便に製造することができる、皮膚モデル構築物の製造方法を提供することを１つの目的とする。また、本発明は、短時間で簡便に製造することができ、種々の皮膚状態を簡便に再現することができる、皮膚モデル構築物を提供することを他の目的とする。本発明は、短時間で簡便に皮膚の分化をシミュレーションすることができる、皮膚の分化のシミュレーション方法を提供することをさらに他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）  表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚モデル構築物の製造方法、
（２）  前記表皮基底細胞が、外因的に核酸が導入された遺伝子導入表皮基底細胞である前記（１）記載の皮膚モデル構築物の製造方法、
（３）  前記支持体が、コラーゲンゲルである前記（１）又は（２）に記載の皮膚モデル構築物の製造方法。
（４）  前記（１）〜（３）いずれかに記載の製造方法により得られる皮膚モデル構築物、
（５）  表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなり、
前記細胞クラスターの最表部に形成され、前記表皮基底細胞を含有した基底層と、
前記基底層の内側に形成され、前記表皮基底細胞の分化細胞を含有した分化細胞層と
を有してなり、
前記分化細胞層の内側に空間が形成されてなる皮膚モデル構築物、
（６）  前記分化細胞層が、前記基底層の内側に形成され、有棘細胞を含有した有棘層と、
前記有棘層の内側に形成され、顆粒細胞を含有した顆粒層と、
前記顆粒層の内側に形成された角化層と
からなる前記（５）記載の皮膚モデル構築物、並びに
（７）  表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚の分化のシミュレーション方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の皮膚モデル構築物の製造方法は、皮膚モデル構築物を、短時間で簡便に製造することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の皮膚モデル構築物は、短時間で簡便に製造することができ、種々の皮膚状態を簡便に再現することができるという優れた効果を奏する。本発明の皮膚の分化のシミュレーション方法は、短時間で簡便に皮膚の分化をシミュレーションすることができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の皮膚モデル構築物の製造方法は、表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴としている。したがって、本発明の製造方法は、皮膚モデル構築物を、短時間で簡便に製造することができるという優れた効果を奏する。
【００１０】
また、本発明の製造方法では、表皮基底細胞の細胞凝集物を前記支持体内で培養するため、本発明の製造方法は、従来の三次元培養皮膚モデルの製造方法のように、例えば、線維芽細胞を含む支持体を用いることに比べ、より均質化された条件下で行なうことができる。これにより、本発明の製造方法は、皮膚モデル構築物を、再現性よく実質的に均質に製造することができるという優れた効果を奏する。
【００１１】
表皮基底細胞の細胞凝集物は、例えば、表皮基底細胞を細胞との接着性の極めて低い表面上で旋回培養すること、細胞との接着性の極めて低い容器で静置培養することなどにより得られる。前記旋回培養は、水平面上の回転運動を培養容器に負荷することにより行なわれる。なお、前記細胞との接着性は、細胞を播種後、少なくとも１時間、好ましくは細胞塊形成が完了する１０時間以上、静置させても表面に接着しない程度であればよい。
【００１２】
前記旋回培養における旋回速度は、細胞凝集物を良好に形成させる観点から、好ましくは１０ｒｐｍ以上、より好ましくは５０ｒｐｍ以上であり、細胞の状態を良好に維持する観点から、好ましくは１８０ｒｐｍ以下、より好ましくは１５０ｒｐｍ以下である。
【００１３】
前記旋回培養における二酸化炭素（ＣＯ2）濃度は、適宜設定することができる。前記ＣＯ2濃度は、好ましくは５体積％である。
【００１４】
前記旋回培養における培養温度は、細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは３６℃〜３８℃、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃（例えば、３７℃など）である。
【００１５】
前記表皮基底細胞の旋回培養に用いられる培地は、表皮基底細胞の生育に適した培地であればよい。前記培地としては、特に限定されないが、例えば、熱不活性化血清（例えば、熱不活性化ＦＣＳなど）を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍＦ１２との混合培地（熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地）、熱不活性化血清を含むＤＭＥＭ培地、熱不活性化血清を含むＭＥＭ培地などが挙げられる。なかでも、細胞のコロニー増殖に適する観点から、好ましくは熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地である。なお、前記熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地は、遺伝子導入表皮基底細胞の三次元培養に際して当該熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を用いた場合、例えば、特定の物質に対する抗体により当該物質を阻害する操作を行なうことが可能になり、疾患の発症機構の解明や前記疾患の治療又は予防薬の開発への応用性に優れる点で有利である。
【００１６】
前記旋回培養における培養容器には、細胞凝集物を形成させる観点から、細胞との接着性が低い培養容器、好ましくは細胞非接着性の培養容器が用いられる。
【００１７】
前記旋回培養における培養時間は、用いられる表皮基底細胞の種類に応じて適宜設定することができる
【００１８】
前記表皮基底細胞としては、表皮の基底層を構成する細胞であればよく、ケラチノサイト及びメラノサイトが挙げられる。前記表皮基底細胞は、ケラチノサイト単独又はメラノサイト単独であってもよく、ケラチノサイトとメラノサイトとの混合物であってもよい。
【００１９】
前記表皮基底細胞としては、特に限定されないが、例えば、ヒト表皮基底細胞、マウス表皮基底細胞などが挙げられる。なかでも、ヒトの皮膚構造を良好に再現する観点及びヒトの皮膚の状態を十分に再現する観点から、正常に分化する能力を有したヒト表皮基底細胞が好ましい。前記ヒト表皮基底細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨａＣａＴ細胞（ブライトクロイツ（Breitkreutz D）、ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー(European Journal of Cell Biology)、1998年発行、第75巻、p.273-286.）、正常ヒト皮膚表皮角化細胞(ＮＨＥＫ)などが挙げられる。なかでも、前記ヒト表皮基底細胞は、細胞の性質が継代回数によらず比較的均一であり、細胞分化状態が正常である観点から、好ましくは、ＨａＣａＴ細胞が望ましい。
【００２０】
前記表皮基底細胞は、正常表皮基底細胞であってもよく、外因的に核酸が導入された遺伝子導入表皮基底細胞であってもよい。表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、本発明の製造方法における支持体内における前記細胞凝集物の培養の過程において、正常な表皮基底細胞から角質層の細胞への分化過程が再現される。このように、表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、本発明の製造方法によれば、正常な皮膚と同様の層を有する皮膚モデル構築物を得ることができる。また、表皮基底細胞が遺伝子導入表皮基底細胞である場合、本発明の製造方法によれば、導入された核酸に含まれる遺伝子に応じる挙動を反映する皮膚モデル構築物を得ることができる。
【００２１】
前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記正常表皮基底細胞の増殖性を維持して、良好な状態の皮膚モデル構築物を得る観点から、前記正常表皮基底細胞は、好ましくは未分化状態に維持され、かつ継代培養の回数が少ない細胞である。
【００２２】
前記遺伝子導入表皮基底細胞は、核酸を、前記正常表皮基底細胞に、外因的に導入することなどにより得ることができる。かかる遺伝子導入表皮基底細胞では、外因的に導入された前記核酸に由来するタンパク質などが発現する。
【００２３】
なお、前記遺伝子導入表皮基底細胞は、正常表皮基底細胞が有する特定の内因性タンパク質の発現量を増加又は減少させるための転写調節エレメントからなる核酸を、前記正常表皮基底細胞に、外因的に導入することなどにより得られる細胞であってもよい。かかる遺伝子導入表皮基底細胞では、正常表皮基底細胞の特定の内因性タンパク質の発現量が、正常状態での発現量に比べ増加又は減少する。
【００２４】
前記核酸としては、特に限定されないが、発生分化制御因子の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、皮膚構成タンパク質の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、皮膚構成物質の産生に関与する因子の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、皮膚疾患関連因子の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、細胞死制御因子の遺伝子をコードする核酸、転写調節因子をコードする核酸、転写調節エレメントからなる核酸などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、前記発生分化制御因子とは、分化に関与する分子であり、個体の形態形成過程で発現し、機能する因子をいう。前記発生分化制御因子の中では、好ましくは皮膚組織の分化に作用する発生分化制御因子である。また、本明細書において、皮膚構成タンパク質とは、皮膚構造を構成するタンパク質をいう。前記皮膚構成タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ケラチンなどが挙げられる。さらに、本明細書において、皮膚構成物質の産生に関与する因子とは、セラミド脂質などの皮膚構成物質の合成・分解に関与する酵素などが挙げられる。なお、本明細書においては、前記発生分化制御因子の概念及び皮膚構成タンパク質の概念には、それぞれ、皮膚疾患関連因子の概念が包含されていてもよい。また、前記転写調節因子とは、前記発生分化制御因子、前記皮膚構成タンパク質又は前記皮膚疾患関連因子の発現制御に関与する転写調節因子をいう。前記転写調節因子としては、特に限定されないが、例えば、Ｃ/ＥＢＰなどが挙げられる。さらに、前記転写調節エレメントとは、前記発生分化制御因子、前記皮膚構成タンパク質又は前記皮膚疾患関連因子の発現制御に関わる塩基配列からなるエレメントをいう。
【００２６】
前記核酸としては、具体的には、例えば、エピモルフィンの遺伝子をコードする核酸、コラーゲンの遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、ケラチンの遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、セラミダーゼの遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸などが挙げられる。
【００２７】
正常表皮基底細胞への核酸の導入は、特に限定されないが、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる方法〔例えば、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、ザンブルーク（Sambrook）ら、コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press）、1989年発行など参照）などにより行なうことができる。前記ウイルスベクターを用いる方法のなかでは、前記核酸の発現産物を安定に発現させる場合には、レトロウイルスベクターを用いる方法が望ましく、発現量を自在に制御して前記核酸の発現産物を発現させる場合、アデノウイルスベクターを用いる方法が望ましい。なお、本発明の皮膚構築物の製造方法では、前記正常表皮基底細胞への核酸の導入は、表皮基底細胞の旋回培養に際して、前記レトロウイルスベクターに前記核酸を挿入して得られたベクターを用いて得られた組換えレトロウイルスを、前記正常表皮基底細胞を含む培養物に添加して、前記組換えレトロウイルスを前記正常表皮基底細胞に感染させること、又は前記アデノウイルスベクターに前記核酸を挿入して得られたベクターを用いて得られた組換えアデノウイルスを、前記正常表皮基底細胞を含む培養物に添加して、前記組換えアデノウイルスを前記正常表皮基底細胞に感染させることにより行なうことができる。
【００２８】
前記遺伝子導入表皮基底細胞は、得られた細胞中における導入された核酸の存在、細胞における前記核酸の発現産物の機能の発現などを指標として選択することができる。
【００２９】
前記細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体は、基底膜成分である細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ内部で表皮基底細胞を生育させることができる支持体であればよい。前記支持体としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、細胞外マトリックス成分代用物、これらの少なくとも１つを含有する合成高分子化合物などが挙げられる。前記細胞外マトリックス成分代用物としては、特に限定されないが、例えば、ＥＨＳザルコーマ（Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma）抽出物などが挙げられる。前記合成高分子化合物としては、特に限定されないが、例えば、メチルセルロース、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。また、前記支持体は、前記細胞外マトリックスの成分を含むものであれば、温度、光照射などの物理的刺激によりゾル−ゲル転移を生じるポリマーであってもよい。これらのなかでは、真皮に豊富に含まれており、高純度で均一なものが容易に、かつ安価に調製できるとともに、細胞の接着・増殖を良好に促進する観点から、好ましくは前記コラーゲンゲル、より好ましくはＩ型コラーゲンからなるコラーゲンゲルである。
【００３０】
前記コラーゲンゲルは、前記細胞凝集物から皮膚モデル構築物を効率よく得る観点から、好ましくは前記細胞凝集物の最表部の細胞を前記コラーゲンゲルに接触させて足場依存性増殖条件下に維持しつつ、当該細胞凝集物の内部の細胞を前記コラーゲンゲルから隔離させて足場非依存性増殖条件下に維持できるゲル強度を有するゲルである。
【００３１】
前記支持体がコラーゲンゲルである場合、前記細胞凝集物は、コラーゲンゲル内に包埋される。前記コラーゲンゲルは、例えば、氷水浴中で、表皮基底細胞の培養に適した培地の１０倍濃縮培地に、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２−〔４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．４）を最終濃度：２０ｍＭ、炭酸水素ナトリウムを最終濃度：２６ｍＭ、水酸化ナトリウムを最終濃度：５ｍＭ、０．５質量％Ｉ型コラーゲン酸可溶化溶液をＩ型コラーゲンの最終濃度として０．４質量％となるように添加することにより混合物を得、得られた混合物を３７℃で維持してゲル形成を行なうことにより製造することができる。コラーゲンゲル内への前記細胞凝集物の包埋は、前記ゲル形成に際して、前記混合物中に前記細胞凝集物を入れ、得られた混合物を３７℃で維持してゲル形成させることにより行なわれる。
【００３２】
前記コラーゲンゲルの製造に用いられる前記表皮基底細胞の培養に適した培地は、表皮基底細胞の生育に適した培地であればよい。前記培地としては、特に限定されないが、例えば、熱不活性化血清（例えば、熱不活性化ＦＣＳなど）を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍＦ１２との混合培地（熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地）、熱不活性化血清を含むＤＭＥＭ培地、熱不活性化血清を含むＭＥＭ培地などが挙げられる。なかでも、細胞のコロニー増殖に適する観点から、好ましくは熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地である。なお、前記熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地は、遺伝子導入表皮基底細胞の三次元培養に際して当該熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を用いた場合、例えば、特定の物質に対する抗体により当該物質を阻害する操作を行なうことが可能になり、疾患の発症機構の解明や前記疾患の治療又は予防薬の開発への応用性に優れる点で有利である。なお、前記培地は、例えば、
【００３３】
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に際して、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度は、適宜設定することができる。前記ＣＯ2濃度は、好ましくは５体積％である。
【００３４】
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養における培養温度は、細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは３６℃〜３８℃、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃（例えば、３７℃など）である。
【００３５】
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養は、前記支持体を、表皮基底細胞が生育できる培地中に浸漬させて維持することにより行なわれる。前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に用いられる培地としては、特に限定されないが、ケラチノサイト用無血清培地に５〜２０質量％程度の牛胎仔血清を添加した培地などが挙げられる。前記ケラチノサイト用無血清培地としては、特に限定されないが、例えば、無血清のダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍＦ１２との混合培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地）、α―ＭＥＭ、ＤＭＥＭなどが挙げられる。前記培地は、インスリン等の細胞増殖促進因子を適宜含有していてもよい。
【００３６】
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に用いられる培養容器としては、特に限定されるものではなく、通常の培養容器に、アガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどを均一にコートした容器、超低接着表面プレート（コーニング社製、商品名：ウルトラローアタッチメントプレート）などが挙げられる。
【００３７】
前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養における培養時間は、この正常表皮基底細胞の分化により細胞凝集物から形成される細胞クラスターの内部に空間が形成されるに適した時間であればよい。前記培養時間は、細胞凝集物から形成される細胞クラスターの内部に空間を形成させる観点から、好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは５日間以上であり、短期間に分化を追跡することができる観点から、好ましくは１０日以下である。このように、本発明の製造方法は、例えば、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルなどの支持体を調製し、当該支持体上で正常表皮細胞の三次元培養を行なう従来の三次元培養皮膚モデルの製造方法に比べ、短い時間で皮膚モデル構築物を得ることができるという優れた効果を奏する。
【００３８】
一方、前記表皮基底細胞が遺伝子導入表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養における培養時間は、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３９】
前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に際しては、培養時間の経過に伴い、前記細胞凝集物から表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターが形成される。細胞クラスターでは、当該細胞クラスターの最表部から内部方向に向かって、正常な皮膚と同様に、前記正常表皮基底細胞を含有する基底層と、前記正常表皮基底細胞が分化した細胞を含有する分化細胞層、具体的には、細胞凝集物の内部方向に向かって順に、有棘層と、顆粒層と、角質層とが形成され、この細胞凝集物の最内部に空間が形成されていく。
【００４０】
ここで、ヒトの正常な皮膚構造は、下層から順に、真皮と、基底層と、有棘層と、顆粒層と、角質層とからなる。また、ヒトの正常な皮膚構造では、基底層のケラチノサイトは、サイトケラチン−５及びサイトケラチン−１４が発現し、その後、分化の過程で、正常な皮膚構造の有棘層のケラチノサイトでは、サイトケラチン−１及びサイトケラチン−１０が発現し、エンボプラキン、ペリプラキン、インボルクリンが発現するようになる。さらに、前記エンボプラキンとペリプラキンとがヘテロダイマーを形成し、形成されたヘテロダイマーと前記インボルクリンとが細胞膜上で結合するとともに、トランスグルタミナーゼ１が、発現し、ヘテロダイマーと前記インボルクリンとの間以外に、細胞膜上の他のタンパク質との間に架橋構造を形成する。また、正常な皮膚構造の顆粒層では、上層部で、ロリクリンが発現し、発現したロリクリンが、トランスグルタミナーゼ−３の作用によりＳＰＲ分子との架橋を形成し、これにより、前記有棘層で生成した架橋構造が補強される。正常な皮膚構造の角質層では、前記顆粒層まで存在していた細胞核や、細胞内小器官が消失する。また、正常な皮膚構造の角質層では、成熟コーニファイドエンベロープが生成する。
【００４１】
このように、表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより、短時間で簡便に皮膚の分化をシミュレーションすることができる。
【００４２】
本発明には、表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚の分化のシミュレーション方法も含まれる。
【００４３】
本発明の皮膚の分化のシミュレーション方法では、前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に際して、正常な皮膚と同様の表皮基底細胞の分化過程を再現することができる。
【００４４】
本発明の皮膚モデル構築物は、本発明の製造方法により得られる皮膚モデル構築物である。
【００４５】
また、本発明の皮膚モデル構築物は、表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなり、
前記細胞クラスターの最表部に形成され、前記表皮基底細胞を含有した基底層と、
前記基底層の内側に形成され、前記表皮基底細胞の分化細胞を含有した分化細胞層と
を有し、
前記分化細胞層の内側に空間が形成されている構築物である。本発明の皮膚モデル構築物は、本発明の製造方法で得ることができるため、短時間で簡便に製造することができる。
【００４６】
また、本発明の皮膚モデル構築物は、前記表皮基底細胞と、前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなるため、前記表皮基底細胞として用いる細胞の種類などに応じて、種々の皮膚状態を簡便に再現することができるという優れた効果を奏する。
【００４７】
前記表皮基底細胞の分化細胞としては、前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞などが挙げられる。
【００４８】
また、前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記分化細胞層は、前記基底層の内側に形成され、有棘細胞を含有した有棘層と、
前記有棘層の内側に形成され、顆粒細胞を含有した顆粒層と、
前記顆粒層の内側に形成された角化層と
からなる。
【００４９】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（シグマ−アルドリッチ社製）に、終濃度：１０質量％となるように熱不活性化ＦＣＳを添加し、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（以下、「ＤＨ１０」という）を得た。
【００５１】
正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴ細胞を、ＤＨ１０中、５体積％ＣＯ2下、３７℃で培養した。
【００５２】
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＤＨ１０  ３５０μｌに懸濁した。得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（コーニング社製、超低接着表面）中、１００ｒｐｍで回転させながら、５体積％ＣＯ2下、３７℃で２４時間旋回培養して、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【００５３】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液（株式会社高研製）で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。包埋後の細胞凝集物を、終濃度５μｇ／ｍｌのインスリンを含むＤＨ１０中、５体積％  ＣＯ2下、３７℃で３日間培養して、細胞クラスターを得た。また、得られた細胞クラスターを位相差顕微鏡下で観察した。結果を図１に示す。図１は、実施例１で培養開始から３日目の細胞クラスターの位相差顕微鏡により観察結果を示す図面代用写真である。図中、スケールバーは、５０μｍを示す。
【００５４】
図１の結果から、培養開始から３日目の細胞クラスターは、複数の層が形成され、その最内部に空間が形成されたほぼ球状の構造を有することがわかる。
【００５５】
以上のように、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより、複数の層が形成され、その最内部に空間が形成されたほぼ球状の構造を有する細胞クラスターが得られることがわかる。
【００５６】
（実施例２）
（１）培養期間の経過に伴う細胞クラスターの構造の変化
実施例１と同様にして、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
【００５７】
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液（株式会社高研製）で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋し、終濃度５μｇ／ｍｌのインスリンを含むＤＨ１０中、５体積％  ＣＯ2下、３７℃で培養するとともに、培養過程での細胞クラスターの構造の変化を電子顕微鏡下で観察した。結果を図２に示す。
【００５８】
図２は、実施例２における培養過程での細胞クラスターの構造の変化を概略的に示す概略説明図である。図中、１は、培養開始から一日目の細胞クラスターを示し、２は、培養開始から４日目の細胞クラスターを示し、３は、培養開始から８日目の細胞クラスターを示す。図中、スケールバーは、１００μｍを示す。
【００５９】
また、図２に示されるように、細胞クラスターは、培養開始から１日目では、密に凝集した構造であったが、培養開始から４日目では、複数の層が形成され、その最内部に空間が形成されたほぼ球状の構造を形成していった。その後、培養開始から８日目では、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、細胞クラスターの内部に形成されている空間が大きくなり、培養物の大きさ自体も大きくなっていた。
【００６０】
以上のことから、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより、培養期間の経過とともに、細胞凝集物から生じる細胞クラスターの構造が変化することがわかる。
【００６１】
（２）培養期間の経過に伴う細胞クラスターにおける各種分化マーカーの発現プロファイル
前記培養開始から１日目の細胞クラスター、培養開始から４日目の細胞クラスター及び培養開始から１日目の細胞クラスターについて、皮膚の分化の各分化段階の分化マーカーの発現を調べた。
【００６２】
培養開始から１日目、４日目及び８日目の細胞クラスターそれぞれを、ＳＤＳサンプルバッファー（組成：６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０質量％グリセロール、２質量％  ＳＤＳ、５体積％  ２−メルカプトエタノール、０．００２５質量％ブロモフェノールブルー）に添加して、５分間煮沸し、全細胞ライゼート試料を得た。
【００６３】
得られた各全細胞ライゼート試料を、４−２０質量％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷した後、電気泳動を行なった。つぎに、全てのタンパク質バンドをＰＶＤＦ膜（商品名：イモビロン−Ｐ、ミリポアコーポレーション製）に転写させた。転写後のＰＶＤＦ膜を、５質量％スキムミルクＴＢＳ溶液とともに室温で６０分間インキュベーションした。その後、得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体とともに、室温で６０分間インキュベーションし、その後、ＨＲＰ−標識二次抗体とともに、室温で６０分間インキュベーションした。前記一次抗体として、サイトケラチン−１４に対するポリクローナル抗体（コバンス社製）、サイトケラチン−５に対するモノクローナル抗体（コバンス社製）、サイトケラチン−１に対するポリクローナル抗体（コバンス社製）、インボルクリンに対するモノクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジーインコーポレーティッド製）、β−アクチンに対するモノクローナル抗体（シグマ−アルドリッチ社製）、プロカスペース−３および活性化カスペース−３について、カスペース−３に対するポリクローナル抗体（ストレスジェン社製）、プロカスペース−１４および活性化カスペース−１４について、カスペース−１４に対するポリクローナル抗体（イムジェネックス社製）それぞれを用いた。また、ＨＲＰ−標識二次抗体として、一次抗体に応じて、ＨＲＰ−標識抗マウスＩｇＧ抗体及びＨＲＰ−標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いた。サイトケラチン−１は、有棘層及び顆粒層、サイトケラチン−５は、基底層、サイトケラチン−１４は、基底層の分化マーカーであり、インボルクリンは、有棘層及び顆粒層の分化マーカーであり、β−アクチンは、内部対照であり、プロカスペース−３は、アポトーシスの最終段階で働くプロテアーゼのマーカーであり、活性化カスペース−３は、プロカスペース−３が切断され実行因子としての機能をもったもののマーカーであり、プロカスペース−１４は、皮膚の終末分化において発現する角質層の分化マーカーであり、活性化カスペース−１４は、プロカスペース−１４が切断され実行因子としての機能をもったもののマーカーである。結果を図３に示す。
【００６４】
図３は、培養開始から１日目、４日目及び８日目の細胞クラスターにおける各種分化マーカーのイムノブロット解析の結果を示す図面代用写真である。図中、レーン１、レーン２及びレーン３は、それぞれ、図２の１、２及び３に対応する。また、図中、（ａ）は、サイトケラチン−１４、（ｂ）は、サイトケラチン−５、（ｃ）は、サイトケラチン−１、（ｄ）は、インボルクリン、（ｅ）は、β−アクチン、（ｆ）は、プロカスペース−３、（ｇ）は、活性化カスペース−３、（ｈ）は、プロカスペース−１４、（ｉ）は、活性化カスペース−１４を示す。
【００６５】
図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスターに比べ、最内部に空間が形成されている培養開始から４日目の細胞クラスター及び培養開始から８日目の細胞クラスターでは、有棘層及び顆粒層の分子マーカーであるインボルクリン及びサイトケラチン１の発現が増加していることがわかる。したがって、細胞クラスター中において、表皮基底細胞が有棘層の細胞及び顆粒層の細胞へ分化していることが示唆される。
【００６６】
また、図３の結果から、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、最内部に空間が形成されている培養開始から８日目の細胞クラスターでは、有棘層及び顆粒層の分子マーカーであるインボルクリン及びサイトケラチン１の発現が、より増加していることがわかる。したがって、培養期間の経過に伴って、表皮基底細胞から有棘層の細胞及び顆粒層の細胞への分化が進行することがわかる。
【００６７】
また、図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から４日目の細胞クラスターにおいて、基底層の分子マーカーであるサイトケラチン５及びサイトケラチン１４が増加していることがわかる。さらに、図３の結果から、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から８日目の細胞クラスターにおいて、基底層の分子マーカーであるサイトケラチン５及びサイトケラチン１４がやや増加していることがわかる。これらの結果より、培養期間の経過に伴って、最内部に形成される空間が大きくなることに伴い、細胞クラスターにおいて、基底層の分子マーカーであるサイトケラチン５及びサイトケラチン１４が増加していることがわかる。かかる結果より、培養期間の経過に伴って、細胞クラスターの球状の構造の直径が大きくなり、コラーゲンゲルと接触している細胞が多くなるためであることが示唆される。
【００６８】
さらに、図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスター、培養開始から４日目の細胞クラスター及び培養開始から８日目の細胞クラスターにおいて、プロカスペース−３の量の変化が見られず、活性化カスペース−３の発現量にも変化がないことがわかる。したがって、培養期間の経過に伴う細胞クラスターの最内部における空間の形成は、プロカスペース−３からの活性化カスペース−３の生成が見られないため、細胞傷害由来のアポトーシスにより引き起こされる事象ではないことが示唆される。
【００６９】
また、図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から４日目の細胞クラスターにおいて、プロカスペース−１４が減少し、活性化カスペース−１４が増加しているため、カスペース−１４の活性化が生じていることがわかる。さらに、図３の結果から、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から８日目の細胞クラスターにおいて、プロカスペース−１４が減少し、活性化カスペース−１４が増加しているため、カスペース−１４の活性化が生じていることがわかる。これらの結果より、細胞クラスターにおいて、三次元培養皮膚モデル及びヒトの皮膚の角質層で見られるのと同様に、培養期間の経過に伴って、カスペース−１４の活性化が見られるため、培養期間の経過に伴う細胞クラスターの最内部における空間の形成は、表皮基底細胞から角質層の細胞への終末分化により引き起こされることが示唆される。
【００７０】
以上のことから、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより得られる細胞クラスターは、ヒトの皮膚と同様に、コラーゲンの接している基底層から脱核した角質層までの各層の分化状態を反映していることがわかる。したがって、前記細胞クラスターは、皮膚のモデルとして用いることができる皮膚モデル構築物であることが示唆される。また、前記細胞クラスターは、前記支持体内での培養時間の経過に伴って、皮膚における表皮基底細胞の分化と同様の分化過程が見られるため、前記皮膚モデル構築物の製造方法は、皮膚の分化過程モデルとして有用である。
【００７１】
従来の三次元培養皮膚モデルは、製造に際して、煩雑な操作を行なう必要があるとともに、製造に、２０日間を要する。
【００７２】
しかしながら、前記皮膚モデル構築物は、表皮基底細胞の旋回培養の開始から、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成するまでの期間は、わずか４日間である。したがって、前記皮膚モデル構築物は、従来の三次元培養皮膚モデルに比べ、製造が簡単で、製造に要する時間が少ない点で優れる。また、平板培養では、表皮基底細胞は、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成せず、かつヒトの皮膚の角質層で見られるカスペース−１４の活性化が見られないのに対し、前記皮膚モデル構築物では、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成し、ヒトの皮膚や三次元培養皮膚モデルと同様に、カスペース−１４の活性化が見られる。したがって、前記皮膚モデル構築物は、平面培養により培養された表皮基底細胞に比べ、より皮膚に近いモデルである点で優れる。
【００７３】
（実施例３）
ＩＬ−２シグナルペプチド（配列番号：３）をコードする核酸（配列番号：４）を、発生分化制御因子であるエピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるエピモルフィン（配列番号：２）のＮ末端に対応する部位に付加し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られたＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸と、アデノウイルス発現システム（クローンテック社製、商品名：Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １）とを用いて、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィン発現用の組換えアデノウイルスを構築した。
【００７４】
ＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＤＨ１０  ３５０μｌに懸濁し、得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（超低接着表面、コーニング社製）中、１００ｒｐｍで回転させた。
【００７５】
いくつかのウェルに、前記組換えアデノウイルス（１０７ｐｆｕ）を添加して、ＨａＣａＴ細胞に導入し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンを一過性発現する遺伝子導入表皮基底細胞（ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞）を得た。
【００７６】
また、いくつかのウェルに、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードするｃＤＮＡをもたないアデノウイルスを添加して、ＨａＣａＴ細胞に導入し、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞を得た。
【００７７】
得られたＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞を、前記実施例１と同様に培養して、細胞クラスターを形成させた。その後、形成された細胞クラスターを、前記実施例１と同様に、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液（株式会社高研製）で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋し、終濃度５μｇ／ｍｌのインスリンを含むＤＨ１０中、５体積％  ＣＯ2下、３７℃で３日間培養し、細胞クラスターを得た。
【００７８】
また、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞に代えて、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞を用い、同様にして、細胞クラスターを得た。
【００７９】
前記ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスター及び前記ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターそれぞれを、インボルクリンに対するアフィニティー精製抗体（サンタクルズバイオテクノロジーインコーポレーティッド製）と、室温で６０分間インキュベーションし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−標識二次抗体（インビトロジェン社製、商品名：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−標識抗マウスＩｇＧ抗体）とともに、室温で６０分間インキュベーションして、免疫細胞化学染色を行なった。なお、細胞核を、ヨウ化プロピジウムで対比染色した。また、前記ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスター及びＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターそれぞれを位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡により観察した。これにより、表皮基底細胞に発生分化制御因子をコードする核酸を導入した場合の細胞クラスターの形態及び前記細胞クラスターでのマーカーの発現を調べた。結果を図４に示す。
【００８０】
図４は、表皮基底細胞に発生分化制御因子をコードする核酸を導入した場合の細胞クラスターの形態及び前記細胞クラスターでのマーカーの発現への影響を調べた結果を示す図面代用写真である。図中、スケールバーは、いずれも５０μｍである。図４（Ａ）の（ａ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターの位相差顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（ｂ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターの免疫細胞化学染色の結果を示す図面代用写真であり、図４（Ｂ）の（ａ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターの蛍光顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（ｂ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターの免疫細胞化学染色の結果を示す図面代用写真である。図中、４は、形成された空間、５は、インボルクリンに対する染色位置の一例、６は、ヨウ化プロピジウムに対する染色位置の一例である。
【００８１】
図４（Ａ）の（ａ）の結果及び図４（Ａ）の（ｂ）の結果から、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターの最内部に空間が形成され、前記空間に隣接する層では、細胞核が見られないことがわかる。かかる図４の結果と、図３の結果とから、この空間の形成は、表皮基底細胞から角質層の細胞への終末分化に起因する脱核を伴うことが示唆される。
【００８２】
また、図４（Ａ）の（ｂ）の結果から、コラーゲンゲルと接触しておらず、形成された空間の内側に沿って、有棘層及び顆粒層の分子マーカーであるインボルクリンの発現が見られている。したがって、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターでは、コラーゲンと接している基底層、コラーゲンとの結合が消失することにより分化し、インボルクリンを発現した有棘層と顆粒層および脱核した空間が示す角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成していることが示唆される。
【００８３】
一方、図４（Ｂ）の（ａ）の結果及び図４（Ｂ）の（ｂ）の結果から、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターは、空間が形成されず、インボルクリンの粒子が沈着している構造を有している。図４（Ａ）の（ａ）、（ｂ）、図４（Ｂ）の（ａ）及び（ｂ）の結果から、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターでは、外因的に導入されたエピモルフィンの遺伝子の過剰発現が、ヒトの皮膚と同様の層の形成を阻害していることが示唆される。これらの結果から、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養する前記皮膚モデル構築物の製造方法において、表皮基底細胞として、発生分化制御因子をコードする核酸などを導入した遺伝子導入基底細胞を用いることにより、当該発生分化制御因子の機能を調べることができることがわかる。また、前記皮膚モデル構築物の製造方法において、表皮基底細胞として、疾患関連因子の遺伝子を導入した遺伝子導入表皮基底細胞を用いることにより、簡便に、皮膚の疾患状態を再現できる可能性があることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】実施例１における培養開始から８日目の細胞クラスターの位相差顕微鏡により観察結果を示す図面代用写真である。図中、スケールバーは、５０μｍを示す。
【図２】実施例２における培養過程での細胞クラスターの構造の変化を概略的に示す概略説明図である。図中、スケールバーは、１００μｍを示す。
【図３】実施例２における培養開始から１日目、４日目及び８日目の細胞クラスターの各種分化マーカーのイムノブロット解析の結果を示す図面代用写真である。
【図４】実施例３における表皮基底細胞に発生分化制御因子をコードする核酸を導入した場合の細胞クラスターの形態及び前記細胞クラスターでのマーカーの発現への影響を調べた結果を示す図面代用写真である。図中、スケールバーは、いずれも５０μｍである。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号：３は、ＩＬ−２シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号：４は、ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸の塩基配列である。
【図１】
0005408520.tif 000002
【図２】
0005408520.tif 000003
【図３】
0005408520.tif 000004
【図４】
0005408520.tif 000005
【配列表】
0005408520000001.app