(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記パラジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、「R」はいずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、NO2-、Ar-NH2、Ar-CN（Arは不飽和有機基）、N2、SO32-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、及びN3-から選ばれる配位子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNからなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記パラジウム錯体が、ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム (II)、ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム (II)、ジアンミンジクロロパラジウム (II)、ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム (II)、及び、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(II) ジアセテートからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パラジウム錯体が、パラジウム化合物を、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するパラジウム錯体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム(II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジドからなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム又は酢酸パラジウムであって、塩化パラジウムが塩化パラジウム（II）であり、酢酸パラジウムが酢酸パラジウム（II）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターゲット領域が、５０〜５０００塩基のターゲット領域である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ターゲット領域が、被検試料のＤＮＡの５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、細菌、又はウイルスである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、グラム陰性細菌、又はグラム陽性細菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
１）パラジウム錯体、又は、
配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときにパラジウム錯体を生成するパラジウム化合物、
２）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【請求項２２】
前記パラジウム錯体が、NH3、NH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、「R」はいずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、NO2-、Ar-NH2（Arは不飽和有機基）、N2、SO32-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、及びN3-から選ばれる配位子を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記配位子が、NH３、RNH２、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R３P、及びAr-CNからなる群から選ばれる、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記パラジウム錯体が、ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム (II)、ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム (II)、ジアンミンジクロロパラジウム (II)、ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム (II)、及び、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (II) ジアセテートからなる群から選ばれる、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム (II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジドからなる群から選ばれる、請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】
前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム又は酢酸パラジウムであって、塩化パラジウムが塩化パラジウム（II）であり、酢酸パラジウムが酢酸パラジウム（II）である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
さらに、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒を含む、請求項２１、２５又は２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
さらに界面活性剤を含む、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や生体試料中に含まれる微生物、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や生体試料、拭き取り試料、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の生細胞の選択的な検出が可能な検出法及び微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や生体試料、拭き取り試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間から一ヶ月程度の時間を要し、細菌の同定も困難であるという問題があった。【０００３】
近年では、被検試料をエチジウムモノアザイド（ＥＭＡ、ethidium monoazide）等のＤＮＡを架橋する架橋剤や、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した後、試料中の微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、試料中の生菌を検出する技術が提案され、成果を挙げている（特許文献１〜４）。【０００４】
上記のような架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、細胞内に侵入すると、ＤＮＡに結合もしくはインターカレートしたりしてトポイソメラーゼやＤＮＡジャイレース（酵素）の働きを阻害したり、又はＤＮＡを架橋し、その結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化・切断）される。これらの薬剤は、生菌の細胞壁よりも死菌及び損傷菌の細胞壁の方が透過しやすいため、生菌よりも損傷菌や死菌の染色体ＤＮＡが優先的に断片化される。したがって、染色体ＤＮＡの特定の領域をターゲットとしたＰＣＲにより、生菌を損傷菌や死菌に比べて選択的に検出することができる。【０００５】
尚、上記ＰＣＲの鋳型としては、従来、被検試料に含まれる微生物細胞から抽出した核酸が用いられていたが、細胞からの核酸の抽出を行わずに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の存在下でＰＣＲを行うことで、迅速に生菌を検出する方法が開示されている（特許文献４）。【０００６】
前記ＥＭＡは、ＤＮＡに水素結合した後、３５０〜７００ｎｍの波長の光照射を行うことによりＤＮＡの分子間を架橋する。したがって、試料への光照射が必須であるが、光源による試料への加熱を防ぐため、通常、氷水中に試料を浸漬して光照射が行われており、工程が煩雑となっている。また、光源にＬＥＤを用いる方法も提案されているが、光強度が不十分であり、また、経時的に架橋剤の架橋能の低下がみられる等の問題がある。さらに、ＥＭＡ等の薬剤やそれを含む試料は、薬剤の変性等を防ぐため、前記の試料への光照射を除いて、暗室中などの遮光下におく必要がある。【０００７】
また、これまでの方法では、生菌を死菌及び損傷菌と区別するために、ＰＣＲのターゲット領域としては、一定以上の長さ、例えば９００塩基（ｂｐ）以上の長さを有する領域を用いるのが一般的である。しかしながら、現在一般的な定量ＰＣＲにて使用されている８０〜２００ｂｐ程度のターゲット領域に比べて、９００ｂｐ以上の領域をＰＣＲにより増幅するためには、各サイクルに数倍の時間を要し、また、定量性にも問題がないとはいえない。【０００８】
一方、試料を架橋剤で処理した後、試料に培地を加えて加温し、再度架橋剤による処理を行うこと（特許文献３）、又は、ＥＭＡとトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤とを併用すること（特許文献２）により、１００ｂｐ程度のターゲット領域であっても、生菌と死菌又は損傷菌との区別が可能なことが知られている。しかしながら、これらの方法は、工程または薬剤調製が煩雑である。【０００９】
ところで、シスプラチン（cisplatin、cis-ジアンミンプラチナム(II)ジクロライド、cis-diammineplatinum (II) dichloride）、カルボプラチン（Carboplatin）等のプラチナ錯体は、抗悪性腫瘍剤として知られている（非特許文献１、２）。それらの作用機序は、腫瘍細胞のＤＮＡ合成の阻害であり、殺細胞の作用様式は濃度依存的速効性といわれている。なかでも、シスプラチン及びカルボプラチンは、核酸（アデニン(A)又はグアニン(G)：これらは生物無機化学では中間的（メデイアム）なルイス塩基として定義される）への配位結合（共有結合）を介した抗癌剤として近年臨床でも利用されている薬剤である。【００１０】
通常抗生物質は、細菌の対数増殖期に最も威力を発揮するといわれているが、シスプラチンは腫瘍細胞の如何なる時期においても抗腫瘍効果を発揮する（非特許文献３）。【００１１】
また、白金族元素であるパラジウムに関しては、ジアンミンジクロロパラジウム（II）（diamminedichloro-palladium (II)）等のパラジウム錯体について、抗ウイルス効果・抗腫瘍効果を期待して基礎的研究がなされたものの（非特許文献４）、これまで臨床現場でも利用実績はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第4340734号
【特許文献２】国際公開第2007/094077
【特許文献３】国際公開第2009/022558
【特許文献４】国際公開第2011/010740
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Rosenberg, B. et al., Nature, 205:698-699, 1965
【非特許文献２】Lovejoy. K.S. et al., PNAS, 105(26):8902-8907, 2008
【非特許文献３】「ブリプラチン注10 mg、ブリプラチン注25 mg、ブリプラチン注50 mg  BRIPLATIN INJECTION（シスプラチン注射液）製品情報概要」、ブリストール・マイヤーズ株式会社、２００７年１２月
【非特許文献４】Graham, R.D. et al., J. Inorg. Nucl. Chem., 41:1245-1249, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、簡便な工程で、かつ、好ましい形態ではターゲット領域が比較的短くても、微生物の生細胞の検出が可能な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、被検試料を薬剤で処理し、試料中の微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、試料中の生細胞を検出する技術において、使用する薬剤について検討した。そして、パラジウム錯体を用いると、試料への光照射、冷却、及び遮光環境を必要とせずに、微生物の生細胞の検出ができること、及び、ターゲット領域として比較的短鎖長の領域を設定した場合でも、高精度で微生物の生細胞を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程、
を提供する。【００１７】
前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを好ましい態様としている。【００１８】
また、前記方法は、前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記微生物が、細菌、又はウイルスであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記細菌が、グラム陰性細菌、又はグラム陽性細菌であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、５０〜５０００塩基のターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、被検試料のＤＮＡの５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを好ましい態様としている。【００１９】
また、本発明は、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
１）パラジウム錯体、又は、
配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときにパラジウム錯体を生成するパラジウム化合物、
２）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、
を提供する。【００２０】
前記本発明のキットは、さらに配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒を含むことを好ましい形態としている。
前記本発明のキットは、さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含むことを好ましい形態としている。
また、前記キットは、さらに界面活性剤を含むことを好ましい形態としている。【００２１】
また、本発明の方法及びキットは、前記パラジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、NO2-、Ar-NH2、Ar-CN（Arは不飽和有機基）、N2、SO32-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、及びN3-から選ばれる配位子を含むものであることを好ましい形態としている。
また、前記方法及びキットは、前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNからなる群から選ばれることを好ましい態様としている。【００２２】
また、前記方法及びキットは、前記パラジウム錯体が、ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム (II)、ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム (II)、ジアンミンジクロロパラジウム (II)、ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム (II)、及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (II) ジアセテートからなる群から選ばれることを好ましい形態としている。【００２３】
また、前記方法及びキットは、前記パラジウム錯体が、パラジウム化合物を、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するパラジウム錯体であることを好ましい形態としている。【００２４】
また、前記方法及びキットは、前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム (II)、四硝酸パラジウム (IV)、酢酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジドからなる群から選ばれることを好ましい形態としている。
また、前記方法及びキットは、前記パラジウム化合物が塩化パラジウム（II）、又は酢酸パラジウム（II）であることを好ましい形態としている。【００２５】
また、本発明の方法及びキットは、前記有機溶媒がジメチルスルホキシドであることを好ましい形態としている。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２７】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００２８】
本発明の方法においては、増幅の対象は核酸全般のいずれであってもよく、具体的には１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、及び２本鎖ＲＮＡを例示することができる。
【００２９】
本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生細胞を検出する対象であり、核酸増幅法による染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等が挙げられる。
【００３０】
特に、食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品等が好ましい。
【００３１】
また、生体試料としては、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、喀痰試料、糞便試料、鼻腔粘液試料、喉頭粘液試料、胃洗浄液試料、膿汁試料、皮膚粘膜試料、口腔粘液試料、呼吸器粘膜試料、消化器粘膜試料、眼結膜試料、胎盤試料、生殖細胞試料、産道試料、母乳試料、唾液試料、嘔吐物、又は水疱内容等が例示される。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
【００３２】
本発明においては、被検試料は、前記のような食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよく、これらを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。
【００３３】
また、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物は、これらを分解する活性を有する酵素による処理等によって除去又は低減させてもよい。前記被検試料中に存在する微生物以外の細胞としては、被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、ウシ白血球及び乳腺上皮細胞等が挙げられる。また、被検試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等の生体試料の場合には、赤血球、白血球（顆粒球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球等）、及び血小板等が挙げられる。
【００３４】
前記酵素としては、前記夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生細胞を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
【００３５】
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
【００３６】
「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、核酸増幅法により検出することが可能であって、かつ、ＤＮＡ結合性タンパク質又はＲＮＡ結合性タンパク質に結合するパラジウム錯体の微生物に対する作用が生細胞と死細胞や損傷細胞とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母、又はウイルス等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。
【００３７】
グラム陽性菌としては、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis））等のスタフィロコッカス属細菌、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)）、ストレプトコッカス・ピオジェネス（Streptcoccus pyogenes）等のストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）、炭疽菌（バチラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)）等のバチラス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラー（Mycobacterium intracellulare）等のマイコバクテリウム属細菌、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)）、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)）等のクロストリジウム属細菌等が挙げられる。
【００３８】
また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）（旧名、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii））等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌、レジオネラ属細菌等が挙げられる。
【００３９】
ウイルスとしては、エンベロープを有するインフルエンザウイルス等のウイルス、及び、エンベロープを有さずヌクレオカプシドのみを有するノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルスなどが挙げられる。
【００４０】
ウイルスに関しては、後記実施例１〜４、６〜８に示されるように、パラジウム錯体であるジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム (II)（dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)）、ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム (II)（bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)）、ジアンミンジクロロパラジウム (II)（diamminedichloropalladium (II)）、ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム (II)（dichloro(ethylenediamine)palladium (II)）、もしくはビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (II) ジアセテート（bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate）又は、塩化パラジウムをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して得られる錯体による処理により、グラム陰性細菌であるクロノバクター・サカザキ、又はエシェリヒア・コリの生細胞と死細胞の識別が可能であることが示されたことにより、グラム陰性細菌細胞壁外膜と同成分であるインフルエンザウイルス等の最外殻エンベロープについても、完全性を保ったエンベロープを有する活性型ウイルス（生きたウイルス）は上記のようなパラジウム錯体は透過せず、損傷エンベロープを有する不活性型ウイルス（死んだウイルス）はパラジウム錯体を容易に透過することが類推できる。さらに、実施例５に示されるように、diamminedichloropalladium (II)により、スタフィロコッカス・アウレウスの生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。これらの結果から、パラジウム錯体は、微生物全般について生細胞と死細胞の識別に使用できると考えられる。
【００４１】
本発明において「生細胞」（Live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞壁の損傷はほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。「生細胞」は、ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染し、増殖できる状態をいう。
【００４２】
「死細胞」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染できない状態をいう。
【００４３】
「損傷細胞」（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生細胞と比較すると低下しているものの死細胞と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染したとしても、細胞中で増殖できない状態をいう。
本明細書においては、特記しない限り、「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
【００４４】
特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷細胞の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明においては、生細胞の検出のみならず、生細胞と死細胞又は損傷細胞との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【００４５】
尚、生細胞、損傷細胞及び死細胞の細胞数単位は、通常、いずれも細胞数（cells）／ｍｌで表される。
生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml（colony forming units / ml））で近似させることができる。また、損傷細胞の標準試料は、例えば、生細胞けん濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、加熱処理する前の生細胞けん濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、損傷細胞を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、５０秒程度で損傷細胞を調製することができる。
さらに、損傷細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長600nm）の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数濃度が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml）で近似させることができる。
ウイルスでは、細胞数単位は、プラーク形成単位（pfu又はPFU（plaque-forming units））で表される。
【００４６】
尚、本発明の方法は、生細胞の検出が目的であり、生細胞と区別される微生物は、損傷細胞であっても死細胞であってもよい。
【００４７】
本発明において、「生細胞の検出」とは、被検試料中の生細胞の有無の判別及び生細胞の量の決定のいずれをも含む。また、生細胞の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。また、「生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する」とは、死細胞又は損傷細胞に比べて選択的に検出することを意味する。尚、「生細胞と死細胞又は損傷細胞との識別」には、生細胞と、死細胞及び損傷細胞の両方との識別も含まれる。
【００４８】
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。尚、前記したように、以下の工程の前に、任意の工程として、被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素で処理する工程を含んでいてもよい。
【００４９】
（１）工程ａ）
被検試料に、パラジウム錯体（以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」とも記載する。）を添加する。すなわち、被検試料中の微生物を、前記薬剤で処理する。
微生物細胞内では、前記薬剤は核酸には実質的に結合せず、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えばHUヒストン様タンパク質）やＲＮＡ結合性タンパク質（例えばＳｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ，  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ「ＳＹＮＣＲＩＰ」分子量66 kDa（特開2002-101890号公報）や核内ＲＮＡ−タンパク質複合体・パラスペックル（paraspeckle）（Sasaki, Y. T. et. al., (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106 : 2525-2530）を形成するタンパク質、もしくはリボゾームタンパク質のようなタンパク質を介して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害すると推定される。従って、ＤＮＡ結合性タンパク質もしくはリボゾームタンパク質のようなタンパク質と核酸が存在する細胞内では、主として同タンパク質に結合する薬剤であり得る。本発明の薬剤とタンパク質との結合は、配位結合（共有結合）であり得る。
【００５０】
前記薬剤は、生細胞と、損傷細胞又は死細胞及びウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生細胞の細胞壁よりも損傷細胞もしくは死細胞の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。
【００５１】
パラジウム錯体としては、生細胞と損傷細胞又は死細胞の細胞壁に対する透過性が異なり、かつ、細胞内の核酸結合性タンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質又はＲＮＡ結合タンパク質）に直接結合してターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害し得る限り、特に制限されないが、例えば、配位子として、少なくともNH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、NO2-、Ar-NH2、Ar-CN（Arは芳香環等の不飽和有機基）、N2、SO32-、N3-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、又はN3-から選ばれる一つを含むパラジウム錯体が挙げられる。パラジウム錯体は、上記のような配位子を一つ含んでいてもよく、同一又は異なる配位子を複数含んでいてもよい。
【００５２】
前記飽和有機基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のアルキル基等が挙げられる。また、不飽和有機基としては、ベンジル基（ベンゼン環）、ナフチル基（ナフタレン環）、アリル基、シクロオクタジエニル基等の不飽和環状有機基、等が挙げられる。これらの飽和有機基及び不飽和有機基は置換基を有していてもよい。
【００５３】
上記配位子としては、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO32-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R3P、Ar-CN、不飽和環状有機基が好ましい。これらの中では、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNが特に好ましい。
ハロゲン元素としては、Cl（塩素）が好ましい。
【００５４】
Lippardら（生物無機化学 Lippard, S.J. and Berg, J.M.著；松本和子監修、21-23頁“生物無機化学の研究における配位化学の原理”）の表2・1には、金属（ソフト、中間、ハードのルイス酸）と配位子（ソフト、中間、ハードのルイス塩基）の関係が記載されており、個々の例外はあるものの、パラジウムのようなソフトなルイス酸と各ルイス塩基との結合性は、［ソフトなルイス塩基］（システイン[スルフヒドリル基]やメチオニン[チオエーテル部位]のようなタンパク質構成アミノ酸など）＞［中間のルイス塩基］（アデニン（A）やグアニン（G）など）＞［ハードなルイス塩基］（ClやNH3基など）の順であることが示唆されている（hard-soft acid-base theory；Lippardら、21-22頁参照）。
このように、パラジウムは、ソフトなルイス塩基であるシステインやメチオニンを配位結合の相手として一番好むので、ハード又は中間のルイス塩基とパラジウムを予め配位結合させたパラジウム錯体は、細胞中でタンパク質中のアミノ酸に配位結合して安定化されると推定される。したがって、核酸結合性タンパク質を介した核酸増幅抑制能の観点からは、本発明の薬剤は、ハード又は中間のルイス塩基とパラジウムが配位結合した化合物が好ましく、ハードなルイス塩基とパラジウムが配位結合した化合物がより好ましい。
尚、ソフトなルイス塩基、例えばR2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）を配位子として含むパラジウム錯体であっても、本発明に使用できる。
【００５５】
一方、一般に生細胞と比較して死細胞は形態学的に損傷が激しく（損傷の程度が軽度なのが損傷細胞）、ハード又は中間のルイス塩基を配位子として含む錯体は、一般に生細胞より死細胞（損傷細胞も含む）の方が透過性は高いと考えられる。また、錯体は、全体としてプラスチャージかマイナスチャージの方が、無極性の場合よりも、一般には生細胞内へ透過し難いといわれている。したがって、本発明の薬剤は、薬剤全体としてプラスチャージかマイナスチャージであることが好ましいと考えられる。しかしながら、実施例に示すように、化合物全体として無極性であっても、作用時間をある程度短くすることによって、生細胞への透過は有意に抑制され得るので、無極性であってもよい。
【００５６】
パラジウム錯体として具体的には、下記の化合物が挙げられる。
ジクロロ(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)パラジウム(II)、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム(II)、ジアンミンジクロロパラジウム(II)、ジクロロ(エチレンジアミン)パラジウム(II)、クロロ(η2-P,C(-)トリス(2,4-ジ-tert-ブチルフェニル)ホスファイト)(トリシクロフェニルホスフィン)パラジウム(II)、ジ-μ-クロロ-ビス-[5-ヒドロキシ-2-[1-(ヒドロキシイミノ-κN)-エチル]-フェニル-κC]-パラジウム(II) ダイマー、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジクロリド、ブロモ(トリ-tert-ブチルホスフィン)パラジウム(I) ダイマー、1,2-ビス(フェニルスルフィニル)エタン パラジウム(II) アセテート、クロロ[2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)-3,6-ジメトキシ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル][2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ-(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ[2-(ジ-tert-ブチルホスフィノ)-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル][2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、ビス[(ジシクロヘキシル)(4-ジメチルアミノフェニル)ホスフィン] パラジウム(II) クロリド、ビス[ジ-(tert-ブチル)(4-トリフルオロメチルフェニル)ホスフィン]パラジウム(II) クロリド、2-(ジメチルアミノメチル)フェロセン-1-イル-パラジウム(II) クロリド ジノルボルニルホスフィン、1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾール-2-イリデン (1,4-ナフトキノン)パラジウム(0) ダイマー、サリチルアルデヒド チオセミカルバゾン パラジウム(II) クロリド、2-[ビス(2,4-ジ-tert-ブチル-フェノキシ)ホスフィノキシ]-3,5-ジ(tert-ブチル)フェニル-パラジウム(II) クロリド ダイマー、ジ-μ-クロロビス[5-クロロ-2-[(4-クロロフェニル)(ヒドロキシイミノ-κN)メチル]フェニル-κC]パラジウム ダイマー、パラジウム(II) アセテート-S-Phos(Pd:P 1:2)、トリス[ジベンジリデンアセトン]ジパラジウム(0)-S-Phos (Pd:P 1:2)、2-(ジメチルアミノ)-2-ビフェニリル-パラジウム(II) クロリド ジノルボルニルホスフィン コンプレックス、パラジウム ピバレート、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II) クロリド、パラジウム(II) トリフルオロアセテート、パラジウム(π-シンナミル) クロリド ダイマー、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジアセテート、1,4-ビス(ジフェニルホスフィノ)ブタン-パラジウム(II) クロリド、パラジウム(II) シアニド、パラジウム(II) プロピオネート、(2-メチルアリル)パラジウム(II) クロリド ダイマー、[2,6-ビス[(ジ-1-ピペリジニルホスフィノ)アミノ]フェニル]パラジウム(II) クロリド、[1,2-ビス(ジシクロヘキシルホスフィノ)エタン]パラジウム(II) クロリド、トリフェニルホスフィン パラジウム(II) ジクロリド ホスファアダマンタン エチル シリカ、ジクロロビス(トリシクロフェニルホスフィン)パラジウム(II)、ジクロロ(1,5-���クロオクタジエン)パラジウム(II)、(1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン)パラジウム(II) クロリド、1,1'-ビス(ジ-イソプロピルホスフィノ)フェロセン パラジウム ジクロリド、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ビス(3,5,3',5'-ジメトキシジベンジリデンアセトン)パラジウム(0)、ジクロロ(1,10-フェナンスロリン)パラジウム(II)、ジクロロビス(トリ-o-トリルホスフィン)パラジウム(II)、trans-ベンジル(クロロ)ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、トリス(3,3',3''-ホスフィニジントリス(ベンゼンスルホナト)パラジウム(0) 九ナトリウム塩九水和物、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]-ジアクオ-パラジウム(II) ビス(トリフレート)、trans-ビス(ジシクロヘキシルアミン)パラジウム(II) アセテート、(R)-1-[(SP)-2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)フェロセニル]エチルジ-tert-ブチルホスフィン パラジウム(II) ジクロリド、ジクロロ[2-(4,5-ジヒドロ-2-オキサゾリル)キノリン]パラジウム(II)、ポリマー修飾のビス[(ジフェニルホスファニル)メチル]アミン パラジウム(II) ジクロリド, trans-ジブロモビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]パラジウム(II) クロリド、2-[ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ブロミド]ベンジルアルコール、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジ-p-トリルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]パラジウム(II) クロリド、[ビス[((R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル)パラジウム(II)]ビス(μ-ヒドロキソ)] ビス(トリフレート)、ジクロロビス(トリエチルホスフィン)パラジウム(II)、[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]-ジアクオ-パラジウム(II) ビス(トリフレート)、ジアセトビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、[ビス[((S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル)パラジウム(II)]ビス(μ-ヒドロキソ)] ビス(トリフレート)、[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジ-p-トリルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]パラジウム(II) クロリド、クロロ[(1,2,5,6-η)-1,5-シクロオクタジエン](2,2-ジメチルプロピル)-パラジウム、クロロ[(トリシクロフェニルホスフィン)-2-(2'-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(トリフェニルホスフィン) [2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]パラジウム(II)、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II) ブロミド、クロロ[(トリ-tert-ブチルホスフィン)-2-(2-アミノビフェニル)] パラジウム(II)、ジブロモ[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)、ジブロモ(1,5-シクロオクタジエン)パラジウム(II)、ジクロロ[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II) アセトン付加物、ジクロロ[8-(ジ-tert-ブチルホスフィノキシ)キノリン]パラジウム(II)、ジクロロ(クロロ-tert-ブチルシクロヘキシルホスフィン)パラジウム (ii) ダイマー、ジクロロ(クロロジ-t-ブチルホスフィン)パラジウム(ii) ダイマー、ジクロロ(クロロジシクロヘキシルホスフィン)パラジウム (ii) ダイマー、ジクロロビス(クロロt-ブチルシクロヘキシルホスフィン)パラジウム(ii)、ジクロロビス(クロロジ-tert-ブチルホスフィン) パラジウム (ii)、ジクロロビス(メチルジフェニルホスフィン)パラジウム(II)、trans-ジブロモ[ビス(トリ-o-トリルホスフィン)]パラジウム(II)、トリス[μ-[(1,2-η:4,5-η)-(1E,4E)-1,5-ビス(4-メトキシフェニル)-1,4-ペンタジエン-3-オン]]ジ-パラジウム、[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]クロロ[3-フェニルアリル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、[1,3-ビス(2,6-ジ-イソプロピルフェニル)-4,5-ジヒドロイミダゾール-2-イリデン]クロロ)[3-フェニルアリル]パラジウム(II)、ジクロロ[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-1,3-ジヒドロ-2H-イミダゾール-2-イリデン]パラジウム(II) ダイマー、ジクロロ-[1,3-ビス(ジイソプロピルフェニル)イミダゾリデン-2-イリデン]パラジウム(II) ダイマー、ビス[トリス(4-(1H,1H,2H,2H-パーフルオロデシル)フェニル)ホスフィン]パラジウム(II) ジクロリド、ブロモ[(2-(ヒドロキシ-κO)メチル)フェニルメチル-κC](トリフェニルホスフィン)パラジウム (II)、[(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-3,6-ジメトキシ-2',4',6'- トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)-2-(2'-アミノ1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、[(4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン)-2-(2'-アミノ1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、[(ジ(1-アダマンチル)-ブチルホスフィン)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、アリルクロロ[1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]パラジウム(ii)、ビス[トリス(4-(ヘプタデカフルオロオクチル)フェニル)ホスフィン]パラジウム(II) ジクロリド、クロロ[(1,3,5,7-テトラメチル-5-フェニル-2,4,8-トリオキサ-6-ホスファアダマンタン)-2-(2-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ[(4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ[(ジ(1-アダマンチル)-N-ブチルホスフィン)-2-(2-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(ソディウム-2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル-3'-スルホネート)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ[(S)-N,N-ジメチル-1-[(R)-2-(ジフェニルホスフィノ)フェロセニル]エチルアミン]パラジウム(II)、ジクロロ[ビス(2-(ジフェニルホスフィノ)フェニル)ether]パラジウム(II)、ジクロロビス(3,7-ジアセチル-1,3,7-トリアザ-5-ホスファビシクロ[3.3.1]ノナン) パラジウム(II)、[(2-[ビス[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ホスフィン]-3,6-ジメトキシ-2',4',6'- トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル )-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、クロロ[(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ビス(N,N-ジメチルアミノ)-1,1'-ビフェニル)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]クロロパラジウム(II)、(1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾリデン)(3-クロロピリジル)パラ��ウム(II)ジクロリド、2-(2'-ジ-tert-ブチルホスフィン)ビフェニルパラジウム(II) アセテート、テトラクロロパラジウム酸(II)ナトリウム、ビス(アセトニトリル)ジクロロパラジウム(II)、テトラクロロパラジウム酸(II)アンモニウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)アンモニウム、テトラクロロパラジウム酸(II)カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)カリウム、(2,2'-ビピリジン)ジクロロパラジウム(II)、(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2,5-ジエン)ジクロロパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-2-イミダゾリジニリデン]クロロパラジウム(II)、ジ-μ-クロロビス[1-[(1R)-1-(ジメチルアミノ)エチル]-2-ナフチル-C,N]ジパラジウム(II)、(2,2'-ビピリジン)ジクロロパラジウム(II)、(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2,5-ジエン)ジクロロパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-2-イミダゾリジニリデン]クロロパラジウム(II)、ジ-μ-クロロビス[1-[(1R)-1-(ジメチルアミノ)エチル]-2-ナフチル-C,N]ジパラジウム(II)、ビス(ジ-tert-ブチル(4-ジメチルアミノフェニル)ホスフィン)ジクロロパラジウム(II)、trans-ビス(アセタト)ビス[o-(ジ-o-トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(メシチル)イミダゾール-2-イリデン]クロロパラジウム(II)、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)、テトラクロロパラジウム酸(II)カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)カリウム、アリルパラジウム(II) クロリド ダイマー、[1,1'-
ビス(ジ-tert-ブチルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)、(2-ブテニル)クロロパラジウム ダイマー
（英名：dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium(II)、bis(benzonitrile)dichloropalladium(II)、diamminedichloropalladium(II)、dichloro(ethylenediamine)palladium(II)、chloro(η2-P,C(-)tris(2,4-di-tert-butylphenyl)phosphite)(tricyclohexylphosphine)palladium(II)、di-μ-chloro-bis-[5-hydroxy-2-[1-(hydroxyimino-κN)-ethyl]-phenyl-κC]-palladium(II) dimer、bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride、bromo(tri-tert-butylphosphine)palladium(I) dimer、1,2-bis(phenylsulfinyl)ethane palladium(II) acetate、chloro[2-(dicyclohexylphosphino)-3,6-dimethoxy-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl][2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro-(2-Dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro[2-(di-tert-butylphosphino)-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl][2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、bis[(dicyclohexyl)(4-dimethylaminophenyl)phosphine] palladium(II) chloride、bis[di-(tert-butyl)(4-trifluoromethylphenyl)phosphine]palladium(II) chloride、2-(dimethylaminomethyl)ferrocen-1-yl-palladium(II) chloride dinorbornylphosphine、1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)imidazol-2-ylidene (1,4-naphthoquinone)palladium(0) dimer、salicylaldehyde thiosemicarbazone palladium(II) chloride、2-[bis(2,4-di-tert-butyl-phenoxy)phosphinooxy]-3,5-di(tert-butyl)phenyl-palladium(II) chloride dimer、di-μ-chlorobis[5-chloro-2-[(4-chlorophenyl)(hydroxyimino-κN)methyl]phenyl-κC]palladium dimer、palladium(II) acetate-S-Phos(Pd:P 1:2)、tris[dibenzylideneacetone]dipalladium(0)-S-Phos (Pd:P 1:2)、2-(dimethylamino)-2-biphenylyl-palladium(II) chloride dinorbornylphosphine complex、palladium pivalate、bis(benzonitrile)palladium(II) chloride、palladium(II) trifluoroacetate、palladium(π-cinnamyl) chloride dimer、bis(triphenylphosphine)palladium(II) diacetate、1,4-bis(diphenylphosphino)butane-palladium(II) chloride、palladium(II) cyanide、palladium(II) propionate、(2-methylallyl)palladium(II) chloride dimer、[2,6-bis[(di-1-piperidinylphosphino)amino]phenyl]palladium(II) chloride、[1,2-bis(dicyclohexylphosphino)ethane]palladium(II) chloride、triphenylphosphine palladium(II) dichloride phosphaadamantane ethyl silica、dichlorobis(tricyclohexylphosphine)palladium(II)、dichloro(1,5-cyclooctadiene)palladium(II)、(1,3-bis(diphenylphosphino)propane)palladium(II) chloride、1,1'-bis(di-isopropylphosphino)ferrocene palladium dichloride、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、bis(3,5,3',5'-dimethoxydibenzylideneacetone)palladium(0)、dichloro(1,10-phenanthroline)palladium(II)、dichlorobis(tri-o-tolylphosphine)palladium(II)、trans-benzyl(chloro)bis(triphenylphosphine)palladium(II)、tris(3,3',3''-phosphinidynetris(benzenesulfonato)palladium(0) nonasodium salt nonahydrate、[(R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]-diaquo-palladium(II) bis(triflate)、trans-bis(dicyclohexylamine)palladium(II) acetate、(R)-1-[(SP)-2-(dicyclohexylphosphino)ferrocenyl]ethyldi-tert-butylphosphine palladium(II) dichloride、dichloro[2-(4,5-dihydro-2-oxazolyl)quinoline]palladium(II)、bis[(diphenylphosphanyl)methyl]amine palladium(II) dichloride, polymer-bound、trans-dibromobis(triphenylphosphine)palladium(II)、[(R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、2-[bis(triphenylphosphine)palladium(II)bromide]benzyl alcohol、[(R)-(+)-2,2'-bis(di-p-tolylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、[bis[((R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)palladium(II)]bis(μ-hydroxo)] bis(triflate)、dichlorobis(triethylphosphine)palladium(II)、[(S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]-diaquo-palladium(II) bis(triflate)、diacetobis(triphenylphosphine)palladium(II)、[bis[((S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)palladium(II)]bis(μ-hydroxo)] bis(triflate)、[(S)-(-)-2,2'-bis(di-p-tolylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、chloro[(1,2,5,6-η)-1,5-cyclooctadiene](2,2-dimethylpropyl)-palladium、chloro[(tricyclohexylphosphine)-2-(2'-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro(triphenylphosphine) [2-(2′-amino-1,1′-biphenyl)]palladium(II)、dichloro[(S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II)、bis(benzonitrile)palladium(II) bromide、chloro[(tri-tert-butylphosphine)-2-(2-aminobiphenyl)] palladium(II)、dibromo[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II)、dibromo(1,5-cyclooctadiene)palladium(II)、dichloro[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II) acetone adduct、dichloro[8-(di-tert-butylphosphinooxy)quinoline]palladium(II)、dichloro(chloro-tert-butylcyclohexylphosphine)palladium (ii) dimer、dichloro(chlorodi-t-butylphosphine)palladium(ii) dimer、dichloro(chlorodicyclohexylphosphine)palladium (ii) dimer、dichlorobis(chloro-t-butylcyclohexylphosphine)palladium(ii)、dichlorobis(chlorodi-tert-butylphosphine) palladium (ii)、dichlorobis(methyldiphenylphosphine)palladium(II)、trans-dibromo[bis(tri-o-tolylphosphine)]palladium(II)、Tris[μ-[(1,2-η:4,5-η)-(1E,4E)-1,5-bis(4-methoxyphenyl)-1,4-pentadien-3-one]]di-palladium、[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-ylidene]chloro[3-phenylallyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、dichloro(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、[1,3-bis(2,6-di-isopropylphenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-ylidene]chloro)[3-phenylallyl]palladium(II)、dichloro[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,3-dihydro-2H-imidazol-2-ylidene]palladium(II) dimer、dichloro-[1,3-bis(diisopropylphenyl)imidazoliden-2-ylidene]palladium(II) dimer、bis[tris(4-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl)phenyl)phosphine]palladium(II) dichloride、bromo[(2-(hydroxy-κO)methyl)phenylmethyl-κC](triphenylphosphine)palladium (II)、[(2-di-cyclohexylphosphino-3,6-dimethoxy-2',4',6'- triisopropyl-1,1'-biphenyl)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、[(4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、[(di(1-adamantyl)-butylphosphine)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、allylchloro[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)imidazol-2-ylidene]palladium(ii)、bis[tris(4-(heptadecafluorooctyl)phenyl)phosphine]palladium(II) dichloride、chloro[(1,3,5,7-tetramethyl-5-phenyl-2,4,8-trioxa-6-phosphaadamantane)-2-(2-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro[(4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、chloro[(di(1-adamantyl)-N-butylphosphine)-2-(2-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro(sodium-2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl-3'-sulfonate)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、dichloro[(S)-N,N-dimethyl-1-[(R)-2-(diphenylphosphino)ferrocenyl]ethylamine]palladium(II)、dichloro[bis(2-(diphenylphosphino)phenyl)ether]palladium(II)、dichlorobis(3,7-diacetyl-1,3,7-triaza-5-phosphabicyclo[3.3.1]nonane) palladium(II)、[(2-[bis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]phosphine]-3,6-dimethoxy-2',4',6'- triisopropyl-1,1'-biphenyl )-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、chloro[(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-bis(N,N-dimethylamino)-1,1'-biphenyl)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-ylidene]chloropalladium(II)、(1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazolidene)(3-chloropyridyl)palladium(II)dichloride、2-(2'-di-tert-butylphosphine)biphenylpalladium(II) acetate、sodium tetrachloropalladate(II)、bis(acetonitrile)dichloropalladium(II)、ammonium tetrachloropalladate(II)、ammonium hexachloropalladate(IV)、potassium tetrachloropalladate(II)、potassium hexachloropalladate(IV)、(2,2'-bipyridine)dichloropalladium(II)、(bicyclo[2.2.1]hepta-2,5-diene)dichloropalladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-2-imidazolidinylidene]chloropalladium(II)、di-μ-chlorobis[1-[(1R)-1-(dimethylamino)ethyl]-2-naphthyl-C,N]dipalladium(II)、(2,2'-bipyridine)dichloropalladium(II)、(bicyclo[2.2.1]hepta-2,5-diene)dichloropalladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-2-imidazolidinylidene]chloropalladium(II)、di-μ-chlorobis[1-[(1R)-1-(dimethylamino)ethyl]-2-naphthyl-C,N]dipalladium(II)、bis(di-tert-butyl(4-dimethylaminophenyl)phosphine)dichloropalladium(II)、trans-bis(acetato)bis[o-(di-o-tolylphosphino)benzyl]dipalladium(II)、allyl[1,3-bis(mesityl)imidazol-2-ylidene]chloropalladium(II)、[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)、potassium tetrachloropalladate(II)、potassium hexachloropalladate(IV)、allylpalladium(II) chloride dimer、[1,1'-bis(di-tert-butylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)、(2-butenyl)chloropalladium dimer）から選ばれるパラジウム錯体が挙げられる。
【００５７】
好ましい錯体としては、下記の化合物が挙げられる。
ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム(II)（dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium(II)）（化１、分子量285.51）、
ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム(II)（bis(benzonitrile)dichloropalladium(II)）（化２、分子量383.57）、
ジアンミンジクロロパラジウム(II)（diamminedichloropalladium(II)）（化３、分子量211.39）、
ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム(II)（dichloro(ethylenediamine)palladium(II)）（化４、分子量237.41）、
ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(II) ジアセテート（bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate）（化５、分子量749.08）。
【００５８】
【化１】
0005433820.tif 000002
【００５９】
【化２】
0005433820.tif 000003
【００６０】
【化３】
0005433820.tif 000004
【００６１】
【化４】
0005433820.tif 000005
【００６２】
【化５】
0005433820.tif 000006
【００６３】
また、パラジウム錯体として、パラジウム化合物を、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するパラジウム錯体が挙げられる。このようなパラジウム化合物としては、例えば、パラジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するパラジウム化合物が挙げられる。
前記元素又は基としては、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、OH-、NO3-、CH3COO-、NO2-、CO32-、PO43-、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、SO32-、及びN3-等が挙げられる。
【００６４】
前記パラジウム化合物として具体的には、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、及び、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム(II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、ジニトロパラジウム、炭酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジド等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化パラジウム、臭化パラジウム、フッ化パラジウム、及びヨウ化パラジウムが挙げられ、特に好ましい化合物として塩化パラジウムが挙げられる。塩化パラジウムとしては、塩化パラジウム（II）、及び塩化パラジウム（IV）が挙げられる。酢酸パラジウムとしては、酢酸パラジウム（II）（palladium(II)acetate、化６、分子量224.5）が挙げられる。
【００６５】
有機溶媒としては、DMSO等が挙げられる。塩化パラジウムをDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス（ジメチルスルホキシド）パラジウム（II）、及び、テトラキス（ジメチルスルホキシド）パラジウム（II）が挙げられる。
【００６６】
【化６】
0005433820.tif 000007
【００６７】
また、配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液としては、ハルマリン（harmaline）溶液、例えばハルマリン塩酸塩の水溶液等、及び、ジフェロセニル・ホスフィン（diferrocenyl-phosphine）溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液等、が挙げられる。前記のようなパラジウムを含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、パラジウムはハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、パラジウム錯体として低分子化される。このようにして生成するパラジウム錯体も、本発明に使用することができる。
パラジウム錯体は、二量体等の多量体であってもよい。
【００６８】
パラジウム錯体、及び、パラジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するパラジウム化合物は、各種市販されており（例えば、和光純薬工業、シグマ）、それらを使用することができる。また、例えばNishiyama M, Yamamoto T. (1998) Tetrahedron Lett, 39: 617-620やJ. Am. Chem. Soc. (1999) 121: 9550-9561等に記載の方法にしたがって合成することもできる。
【００６９】
本発明の方法において、薬剤は１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００７０】
薬剤による処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生細胞及び死細胞もしくは損傷細胞のけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と死細胞もしくは損傷細胞を区別しやすい条件を決定することができる。さらに、検出対象の微生物の生細胞、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等のけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。
【００７１】
このような条件として、具体的には、ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム (II)では終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム (II)では終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。ジアンミンジクロロパラジウム (II)では終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム (II)では終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜２５０μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジアセートでは終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。
【００７２】
また、塩化パラジウム（II）をDMSOに溶解して得られる錯体では、塩化パラジウム（II）の量として終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。酢酸パラジウム（II）をDMSOに溶解して得られる錯体では、酢酸パラジウム（II）の量として終濃度１〜３００μＭ、好ましくは１〜１０μＭ、４〜４３分、５分〜２時間が例示される。
【００７３】
被検試料への薬剤の添加は、上記のように被検試料のけん濁液に薬剤を添加することによって行ってもよいが、薬剤の溶液に被検試料を添加することによって行ってもよい。
【００７４】
尚、エチジウムモノアザイド等を用いる従来の方法では、それらの架橋剤をＤＮＡ又はＲＮＡと水素結合させた後に、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子間を架橋させるために３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を必要としているが、本発明の薬剤を用いる本発明の方法では、光照射を必要としない。また、そのため、光照射による試料の加熱を防ぐための冷却、例えば氷水への試料の浸漬も必要としない。
また、ＥＭＡ等の薬剤では、露光による薬剤の変性を防ぐため、試料への光照射を除けば、暗室中などの遮光下におく必要があるが、本発明の薬剤を用いる場合は、遮光の必要もない。
【００７５】
本発明の薬剤は、生細胞の細胞壁よりも、死細胞及び損傷細胞の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば微生物の生細胞の細胞壁・細胞膜は実質的に透過せず、微生物の損傷細胞もしくは死細胞または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。その結果、薬剤は、体細胞の死細胞及び微生物の死細胞並びに損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、前記薬剤は前記核酸結合性タンパク質のシステインやメチオニン部位に配位結合するため、薬剤自身は直接核酸には作用していないものの、核酸と核酸結合性タンパク質は複合体様に一体化している（円状の核酸結合性タンパク質に糸状の核酸が巻き付いている）。その結果、核酸伸長酵素（ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼ等）が伸長反応を行っている時に、鋳型核酸の近隣で多数の本パラジウム錯体が前記タンパク質に固定化されて存在しているので、前記伸長酵素の伸長反応が著しく阻害されると推定される。
【００７６】
生細胞よりも損傷細胞や死細胞に優先的に薬剤が透過すると、生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷細胞や死細胞では染色体ＤＮＡ結合性タンパク質又はＲＮＡ結合性タンパク質に薬剤が配位結合することにより、核酸伸長酵素の伸長反応を阻害するため、生細胞を損傷細胞や死細胞に比べて選択的に検出することができる。
【００７７】
工程ａ）の薬剤による処理は、一回でもよく、又はそれ以上の回数を繰り返して行ってもよい。薬剤の濃度は、一回目の薬剤処理では、二回目以降よりも高くし、二回目以降の薬剤処理では、一回目よりも低くすることが好ましい。
また、一回目の薬剤処理では、二回目以降の薬剤処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
【００７８】
先の薬剤処理と、それ以降の薬剤の間で、未反応の薬剤を除去する工程を追加してもよい。薬剤を除去する方法としては、被検試料を遠心分離して、微生物を含む沈殿と薬剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、薬剤を除去した後、適宜、洗浄剤で微生物を洗浄する工程を追加することも可能である。更には、本薬剤はシステインやメチオニンというアミノ酸残基を有するタンパク質には、核酸より好んで配位結合するので、一回目の高濃度薬剤の作用を無効化するために、ウシ血清アルブミン溶液や酵母エキス等タンパク質を含む培地（ラクトースブロスやブレイン・ハート・インフュージョン培地）を添加し、未反応のパラジウム錯体は前記タンパク質に結合・吸着させ（パラジウムがタンパク質に配位結合するため）てもよい。
また、薬剤処理した試料は、下記工程ｂ）の前に、未反応の薬剤を除去しておくことが好ましい。
【００７９】
（２）工程ｂ）
次に、薬剤処理後の被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する。
【００８０】
核酸増幅の鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡは、微生物の細胞から抽出したものを用いてもよいし、細胞からの核酸の抽出を行わずに薬剤処理した試料をそのまま用いてもよいが、細胞からの核酸の抽出を行わないことが好ましい。
細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい（特許第4825313号、WO2011/010740参照）。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらにマグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を添加することがより好ましい。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらに界面活性剤を添加することが特に好ましい。
【００８１】
さらに、増幅反応液には、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤に追加して、界面活性剤、マグネシウム塩、又は有機酸塩又はリン酸塩を添加することも可能である。これらは、いずれか一種、又は任意の二種以上の組合わせで使用することができる。これらの全てを添加することが特に好ましい。前記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、界面活性剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に添加してもよい。必要に応じ、核酸伸長酵素も通常のＰＣＲ法で使用している濃度の２倍〜１０倍の濃度で添加してもよい。
【００８２】
核酸増幅阻害物質とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等が挙げられる。前記正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（heme）等が挙げられる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性細菌細胞壁外膜等が挙げられる。食品や臨床検体中には、このような核酸増幅反応を阻害する物質が多く含まれているといわれている。
【００８３】
上記のような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチームから、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素選択される１種又は複数種を例示することができる。
【００８４】
前記ポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が例示される。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等が挙げられる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素が挙げられる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂが好ましい。
特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、又はリゾチームを使用することが好ましい。
【００８５】
血液、糞便、及び肉を検査材料として想定し、それら検査材料中に含まれる核酸増幅阻害物質の阻害作用を低減させる試みとして上記のような物質をＰＣＲ反応液に加えて、前記阻害作用の低減が評価されている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000）。
【００８６】
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に代表されるアルブミンは、ヘム（heme）のような核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅阻害を低減させている可能性が示唆されている（前記Abu Al-Soudら）。また、Ｔ４ジーン３２プロテインは１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質であり、核酸増幅過程で鋳型となっている１本鎖ＤＮＡに予め結合して鋳型が核酸分解酵素による分解から免れ、核酸増幅反応が阻害されず促進されるか、又は、ＢＳＡと同様の核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅が阻害されず進行する、という二つの可能性が考えられている（前記Abu Al-Soudら）。
さらに、ＢＳＡ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤（proteinase inhibitor）はタンパク質分解酵素（proteinase）に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際、ＢＳＡ又はタンパク質分解酵素阻害剤（大豆トリプシンインヒビターやα２-マクログリブリン）の添加により核酸合成酵素が分解を受けず、核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている（前記Abu Al-Soudら）。
【００８７】
また、デキストランは一般にグルコースを原料として乳酸菌が合成する多糖類である。ムチンという同様の多糖類−ペプチド複合体が腸管粘膜に接着することも報告されており（Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74:1936-1940, 2008）、デキストランが負電荷阻害物質（核酸合成酵素に吸着）、又は正電荷阻害物質（核酸に吸着）に予め吸着することにより、それら阻害物質に結合する可能性は十分あるものと推察される。
また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される（前記Abu Al-Soudら）。
【００８８】
以上のことから、アルブミン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、デキストラン、及びリゾチームに代表される上記物質は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤であるといえる。
【００８９】
アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。これらの中ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。アルブミンは精製品でもよく、本発明の効果を損わない限りグロブリン等の他の成分を含んでいてもよい。また、分画物であってもよい。被検試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、例えば、通常０．０００１〜１質量％、好ましくは０．０１〜１質量％、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。
【００９０】
デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられる。これらの中ではデキストラン４０が好ましい。被検試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１〜８％、好ましくは１〜６％、より好ましくは１〜４％である。
【００９１】
Ｔ４ジーン３２プロテイン（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）の被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１〜１％、好ましくは０．０１〜０．１％、より好ましくは０．０１〜０．０２％である。
【００９２】
リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームが挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは６〜１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは９〜１３μｇ／ｍｌである。
【００９３】
界面活性剤としては、Triton（ユニオンカーバイド社の登録商標）、Nonidet（シェル社）、Tween（ICI社の登録商標）、Brij（ICI社の登録商標）等の非イオン系界面活性剤、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）等の陰イオン系界面活性剤、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム等の陽イオン界面活性剤が挙げられる。TritonとしてはTriton X-100（ポリエチレングリコール tert−オクチルフェニルエーテル）等が，NonidetとしてはNonidet P-40（オクチルフェニル−ポリエチレングリコール）等が、TweenとしてはTween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミタート）、Tween 60（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアラート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート）等が、BrijとしてはBrij56（ポリオキシエチレン(10) セチルエーテル）、Brij58（ポリオキシエチレン(20) セチルエーテル）等が挙げられる。
【００９４】
被検試料（核酸増幅反応液中の界面活性剤の種類及び濃度は、微生物の細胞内へのＰＣＲ試薬の透過を促進し、核酸増幅反応を実質的に阻害しない限り特に制限されない。具体的には、SDSの場合は、例えば、通常０．０００５〜０．０１％、好ましくは０．００１〜０．０１％、より好ましくは０．００１〜０．００５％、より好ましくは０．００１〜０．００２％である。
【００９５】
他の界面活性剤の場合、例えば、Nonidet P-40の場合は、通常、０．００１〜１．５％、好ましくは０．００２〜１．２％、より好ましくは０．９〜１．１％、Tween 20の場合は、通常、０．００１〜１．５％、好ましくは０．００２〜１．２％、より好ましくは０．９〜１．１％、Brij56及びBrij58の場合は、通常０．１〜１．５％、好ましくは０．４〜１．２％、より好ましくは０．７〜１．１％である。
核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、同酵素溶液由来の界面活性剤のみでもよいし、さらに同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
【００９６】
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度は、例えば、通常１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜６ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭである。
【００９７】
有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。被検試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度は、例えば、通常合計量で０．１〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭである（特許第4127847号、WO2007/094077参照）。
【００９８】
被検試料から核酸を抽出する場合は、抽出方法は、抽出されたＤＮＡが核酸増幅における鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法にしたがって行うことができる。但し、核酸抽出操作又はその後の操作において、タンパク質分解酵素処理操作は行わない。
【００９９】
ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載されている。
【０１００】
被検試料からの核酸の抽出を行わない場合は、上記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、及び必要に応じて他の各成分の存在下で、細胞内に存在していたＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。核酸増幅の鋳型には、微生物細胞けん濁液、又はタンパク質分解酵素、脂質分解酵素、又は糖分解酵素等で処理した微生物細胞のけん濁液を用い、鋳型調製のための核酸の抽出は行わない。
【０１０１】
被検試料から核酸の抽出を行う場合は、抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、通常の方法によりターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。
【０１０２】
核酸増幅法は、高温、例えば９０〜９５℃、好ましくは９３〜９５℃、より好ましくは９４〜９５℃における核酸の熱変性のステップを含むことが好ましい。
【０１０３】
核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification：新規遺伝子増幅法（LAMP法）の原理と応用 、納富継宣、長谷哲、BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：Edward L. Chan, et al.,Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）、ＴＭＡ法（Transcription-Mediated-Amplification：Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855 (2001)）、ＴＲＣ法（Transcription-Reverse Transcription-Concerted method：Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4248-4292 (2004)）、ＨＣ法（Hybrid Capture：Nazarenko I., Kobayashi L. et al., J. Virol. Methods, vol.154: p.76-81, 2008）、ＳＭＡＰ法（Smart Amplification Process、Smart Amp法；Mitani Y., et al., Nature Methods, vol.4, No.3, p.257-262 (2007)）、マイクロアレイ法（Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p.1620-1627, 2008）等がそれぞれ例示される。なお、本発明においては、ＰＣＲ法を利用することが特に好ましいが、これに制限されない。
【０１０４】
本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡのうち、本発明に用いるプライマーを用いた核酸増幅法により増幅され得る領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。
【０１０５】
検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の核酸に対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生細胞量と、多数種の微生物の生細胞量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとしては、通常５０〜５０００塩基、又は５０〜３０００塩基が挙げられる。
本発明の方法では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば４００塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び損傷菌との識別が可能である。
【０１０６】
核酸の増幅に用いるプライマーは、各種核酸増幅法の原理に基づいて、適宜設定することが可能であって、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
【０１０７】
好ましいターゲット領域の例は、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、及び病原遺伝子等の各種特異遺伝子である。これらの遺伝子の一つ又はその一部をターゲットとしてもよく、２又はそれ以上の遺伝子にまたがる領域をターゲットとしてもよい。例えば、配列番号１及び２に示すプライマーセットを用いることにより、クロノバクター・サカザキ特異的１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅することができる。また、市販されている１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマーを用いてもよい。
【０１０８】
また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のenterotoxin（エンテロトキシン）遺伝子やinvasion（ｉｎｖＡ）遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１等のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属又はクロノバクター属細菌のouter-membrane-proteinA（ｏｍｐＡ）遺伝子（クロノバクター・サカザキ菌）及びmacromolecular synthesis（ＭＭＳ）オペロン（クロノバクター・サカザキ菌）、レジオネラ属細菌のmacrophage-invasion protein（ｍｉｐ）遺伝子、腸炎ビブリオ細菌の耐熱性溶血毒遺伝子、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子、赤痢菌及び腸管侵入性大腸菌のｉｐａ遺伝子（invasion plasmid antigen gene）や、ｉｎｖＥ遺伝子（invasion gene）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
【０１０９】
また、エンベロープを有するインフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニン（Ｈタンパク質）遺伝子やノイラミニダーゼ（Ｎタンパク質）遺伝子、ノロウイルスに代表されるカリシウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、各種カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域等が挙げられる。食中毒ウイルスとしてノロウイルスの他、ロタウイルス、アデノウイルスもあり、対象遺伝子はノロウイルス同様、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域が標的領域となる。
【０１１０】
複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生細胞を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生細胞を検出することができる。
【０１１１】
核酸増幅反応の条件は、各核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、及びマイクロアレイ法等）の原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【０１１２】
（３）工程ｃ）
核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。増幅産物の解析は、工程ｂ）で採用する核酸増幅法に応じて、工程ｂ）に続いて行われるか、又は、工程ｂ）と同時に行われる。例えば、リアルタイムＰＣＲの場合は、工程ｃ）は工程ｂ）と同時に行われ得る。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。尚、核酸増幅法にＰＣＲ法を用いた場合は、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）を利用することが可能である。
【０１１３】
電気泳動法によれば、核酸増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出し、そのＳＤ値に１０を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【０１１４】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
【０１１５】
本発明の方法によって生細胞を検出する場合、核酸増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生細胞の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各工程を行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量又はＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡを標準試料として用いることもできる。
【０１１６】
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、パラジウム錯体を含む。
【０１１７】
本発明のキットは、さらに、検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマーを含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明のキットは、好ましい態様では、さらに核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩のいずれか、又はこれらの２種以上を含んでいてもよい。より好ましい態様では、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩のすべてを含んでいてもよい。更に、核酸伸長酵素を、通常のＰＣＲもしくは通常のリアルタイムＰＣＲ時に使用する濃度の２倍〜１０倍濃度を含んだ方が、より好ましい。また、本発明のキットは、さらに界面活性剤を含んでいてもよい。
本発明のキットは、前記本発明の方法を実施するために用いることができる。
また、本発明のキットには、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素を追加することが可能である。
【０１１９】
酵素、パラジウム錯体、及び必要に応じて、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、並びにマグネシウム塩、有機酸塩又はリン酸塩、及び界面活性剤は、これらの成分を全て含む単一の組成物であってもよいし、各成分を任意の組合わせで含む複数の溶液又は組成物であってもよい。
【０１２０】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法であることが好ましい。なお、上記キットにおいて、架橋剤や培地は、本発明の方法で説明したものと同様である。
【０１２１】
本発明のキットに含まれるパラジウム錯体として好ましいものは、前記本発明の方法について記載した化合物と同様である。
【０１２２】
また、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、及びＴ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチーム、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素から選択されるいずれか一種又は複数種を例示することができる。
【０１２３】
また、マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。
【０１２４】
また、有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
【０１２５】
また、酵素としては、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生細胞を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
【０１２６】
本発明のキットは、さらに、希釈液、パラジウム錯体による反応用の反応液、核酸増幅用の酵素及び反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【０１２７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
尚、以下の実施例において、特記しない限り、各操作は非遮光下で行った。【０１２８】
〔実施例１〕dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)、bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)、又はdiamminedichloropalladium (II)による、クロノバクター・サカザキの生細胞・死細胞の識別
クロノバクター・サカザキを対象として、各パラジウム錯体を用いて細菌の生細胞と死細胞との識別を明瞭とするための条件の検討を行った。【０１２９】
１．試験材料及び培養方法
１−１）クロノバクター・サカザキATCC29544をBHIブロスを用いて、37℃、16時間培養した。
前記培養液1 mlを冷却遠心処理（4℃、3,000×G、10分間）し、上清除去後、ペレットに1 mlの滅菌水を添加し、更にその一部を滅菌水にて100倍希釈して、生細胞けん濁液（4.7×106〜1.0×107 CFU/ml）を調製した。【０１３０】
また、上記生細胞けん濁液1 mlを、1.5 mlのマイクロチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）に分取し、沸騰水に3分間浸漬処理した後、急冷した。各けん濁液中の細胞は、標準寒天培地（Eiken, Tokyo, Japan）によりコロニーを形成しないことを確認し、損傷細胞／死細胞けん濁液（4.7×106〜 6.1×107 cells/ml。以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記する。）を得た。【０１３１】
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90μl（diamminedichloropalladium処理に供したけん濁液のみ50μl）を、下記試験に供した。【０１３２】
１−２）各パラジウム錯体溶液の調製及び試料の処理
dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 3.11 mg (10.89μmol)を218μlのDMSO (D8418-50ML, Sigma)に溶解し 、50 mM溶液を調製した。また、bis(benzonitrile)dichloropalladium (II) 4.34 mg (11.31μmol)を226μlのDMSO (Sigma)に溶解し、50 mM溶液を調製した。これらの50 mMの各パラジウム錯体溶液を、生理食塩水にて希釈し、25μM、250μM、500μM、1mM、5mM、10mM、25mMの各錯体溶液を調製した。【０１３３】
また、diamminedichloropalladium (II)(323-04961 Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan）2.00 mg (9.46μmol)を946μlのDMSO （Sigma）に溶解し、10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水にて希釈し、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、及び100μMのdiamminedichloro-palladium (II) 生理食塩水溶液を調製した。【０１３４】
その後、上記各パラジウム錯体溶液10μl（diamminedichloropalladium (II)のみ50μl）を、クロノバクター・サカザキ生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μl（diamminedichloropalladium (II)については50μl）に添加し、恒温水槽PERSONAL-11（TAITEC, Tokyo, Japan）にて37℃で30分間（diamminedichloropalladium (II)については10分間）保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、10,000×G、5分）し、上清を除去し、そのペレットを150μlの滅菌水にけん濁させ、よく攪拌した後、同様の冷却遠心処理を行い、上清を除去した。得られたペレット（細胞けん濁液5μl相当）をＰＣＲ増幅用試料とした。【０１３５】
１−３）ＰＣＲ増幅
細胞からの核酸の抽出を行わずにＰＣＲ増幅を効率よく行うために、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の混合物の濃縮液（この濃縮液を、濃縮ダイレクトコンポーネント、cDBCと記載する。）を調製した。
具体的には、ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma A7906）、クエン酸三ナトリウム2水和物（TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; 関東化学、東京）、塩化マグネシウム6水和物（31404-15 ナカライテスク、京都）、卵白リゾチーム（126-02671 Lysozyme from egg white; 和光純薬、大阪）、Brij58（P5884-100G; Sigma）の各ストック溶液を、表１に示す濃度となるように混合し、cDBCを調製した。【０１３６】
例えば、ＰＣＲ増幅 200検体用として16.6％ Brij58、4.8％ BSA、333 mM TSC、1 M MgCl2、2.5 mg/ml lysozymeの各ストック溶液を、それぞれ250μl、200μl、15μl、15μl、20μlの容量にて混和すれば、表１に示す500μlのcDBC（10×DBC）を調製することができる。尚、後述するTaqManFast Universal PCR Master Mix (2×)を用いて、メーカーマニュアルに従いマスターミックスを調製すると、終濃度として2 mM相当のMgCl2が含まれていると推察されるため、合計のMgCl2は5 mM相当と推測された。【０１３７】
尚、Brij 58、MgCl2、及びTSCは滅菌水にて溶解後、オートクレーブ（121℃、20分）し、水冷後室温に戻し、ストック溶液として使用した。BSA及びLysozymeは滅菌水にてストック溶液を調製し、0.22 μmフィルターにて濾過滅菌し、ストック溶液とした。【０１３８】
【表１】
0005433820.tif 000008
【０１３９】
次に、表２に示される、細胞からの核酸の抽出を行わずにリアルタイムＰＣＲ（細胞からの核酸の抽出せずに行うリアルタイムＰＣＲを、以降「ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ」と記載する。）行うためのマスターミックス（ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックス）を調製した。
ＰＣＲ増幅には、Primer 16S forward: C. sakazakii検出用16Sフォワードプライマー（5'-TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTG-3'：配列番号１）、Primer 16S reverse: C. sakazakii検出用リバースプライマー（5'-CGGGTAACGTCAATTGCTGCGGT-3'：配列番号２）をＰＣＲ増幅用プライマーとして使用した。増幅されるrRNA遺伝子の断片長は426 bpであった。16S TaqMan probeとしては、配列番号３（5'-CCGCATAACGTCTACGGACCAAA-3'）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。尚、各プライマー及び16S TaqMan probeの塩基配列情報は、Kang, Eun Sil et al., J. Microbiol. Biotechnol. 17:516-519, 2007から入手した。上記プライマーを用いて、前記ＰＣＲ増幅用試料を鋳型として、ＰＣＲ増幅を行った。リアルタイムＰＣＲ増幅は２回実施した。【０１４０】
【表２】
0005433820.tif 000009
【０１４１】
リアルタイムＰＣＲ装置（StepOnePlus Real-Time PCR System; Applied Biosystems）を用いて、下記のＰＣＲサーマルサイクル条件により、リアルタイムＰＣＲを実施した。
3)95℃, 20秒（1サイクル）
4)95℃, 5秒; 55℃, 10秒; 72℃, 30秒（40サイクル）【０１４２】
陽性コントロールとして前記C. sakazakiiの生細胞けん濁液（4.7×107 CFU/ml）5μlを鋳型として使用した。又、陰性コントロールとして滅菌水5μlを鋳型として使用した。【０１４３】
２． 結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表３及び４に示す。【０１４４】
【表３】
0005433820.tif 000010
【０１４５】
【表４】
0005433820.tif 000011
【０１４６】
３．考察
表３及び４に示されるように、dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 25μMでは、生細胞のCt値が未処理のそれと比較して殆ど上がっておらず、かつ、死細胞のＰＣＲ増幅は完全に抑制された。同様に、bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)、及び、diamminedichloropalladium (II) 10μMでは、生細胞のCt値が未処理と比較して殆ど上がっていないか、あるいは、僅かに上がっている程度であり、かつ、死細胞のＰＣＲ増幅は完全に抑制された。したがって、パラジウム錯体により、クロノバクター・サカザキの生細胞と死細胞を区別することができることが明らかとなった。本方法は、光照射を必要としない。また、ターゲット領域が短くても（426 bp）、生細胞と死細胞の区別が可能であった。【０１４７】
〔実施例２〕パラジウム錯体の作用に関する検討
本実施例２では、パラジウム錯体としてDichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞・死細胞の識別を行った。【０１４８】
１．試験材料及び培養方法
１−１）実施例１と同様にして、生理食塩水を用いてクロノバクター・サカザキATCC29544の生細胞けん濁液（1.5×109 CFU/ml）及び損傷細胞／死細胞けん濁液（1.5×109 cells/ml。以下、包括して「死細胞けん濁液」と表記する。）を調製した。【０１４９】
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を滅菌水にて100倍希釈し(1.5×107 cells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。【０１５０】
１−２）Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)溶液の調製及び試料の処理
Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 6.28mg (22.0μmol)を正確に秤量し、440μlのDMSO （Sigma）に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1 mM溶液（パラジウム錯体溶液）を調製した。【０１５１】
250μM又は1 mMのDichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 10μlを、上記生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃、30分間保持した。その後、滅菌水1 mlを加え、冷却遠心処理（4℃、3,000×G、5分）し、上清を除去し、そのペレットに細胞破砕用ガラスビーズ（10個）を入れ、30秒ボルテックスミキサーにより激しく攪拌し、細菌細胞を破砕した。その後、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)を500μl加え、緩やかに攪拌後、冷却遠心処理（3,000×G、5分、4℃）し、上清（500μl相当）を新しい2.0 mlマイクロチューブに移した。【０１５２】
これらの試料をproteinase K処理群、及びproteinase K/SDS処理群に分け、proteinase K処理群には10μlのproteinase K (1,250U/ml; Sigma)を加えた。また、proteinase K/SDS処理群には5μlの10% SDS、及び10μlのproteinase K (1,250U/ml; Sigma)を加えた。これらの試料をブロックインキュベーターにて50℃、14時間保持した。【０１５３】
その後、各試料に1 M Tris-HCl/フェノール（飽和フェノール）0.5 mlを加え、15分穏やかに振とうした。更にクロロホルム 0.5 mlを加え、5分穏やかに振とうした。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000×G、10分）し、上清約600μlを新しい2 mlマイクロチューブに移し、60μlの3M 酢酸ナトリウム水溶液を添加した後、1500μlの冷エタノールを加え、緩やかに攪拌し、5分氷上に置いた。
冷却遠心処理（15,000×G、10分、4℃）して上清を除去し、1000μlの70％冷エタノールでマイクロチューブ内を洗浄後、同様に冷却遠心処理した。上清を除去後、エタノールを真空乾燥（5分）にて除去し、沈澱物に20μlのTEバッファーを加え、37℃にて1時間静置した。その後、試料を穏やかに攪拌後、その5μlをＰＣＲ増幅用試料とした。【０１５４】
また、前記細胞破砕用ガラスビーズ投入直前ペレットの1/4量に対して、前記のようなＤＮＡ抽出工程を行わず、細菌から直接にリアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ）増幅を行った。【０１５５】
１−３）ＰＣＲ増幅
実施例１と同様にして、上記の各ＰＣＲ増幅用試料のリアルタイムＰＣＲ増幅を２回実施した。【０１５６】
２． 結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表５に示す。【０１５７】
【表５】
0005433820.tif 000012
【０１５８】
表５によれば、細胞をDichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)で処理し、細胞からのＤＮＡ抽出を行わずに細胞内に存在する染色体ＤＮＡに対して直接ＰＣＲを行った場合、パラジウム錯体濃度25μMで、クロノバクター・サカザキの生細胞のCt値は未処理と比較して1.6程度高かったが、死細胞のＰＣＲ増幅は完全に抑制され、明瞭な生死判定が可能であった。
一方、細胞をパラジウム錯体で処理後、ガラスビーズで細胞を破砕した後、プロテイナーゼＫ処理して細胞内のタンパク質（ＤＮＡ結合性タンパク質であるヒストン様プロテインも含む）を分解し、その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈澱により、それらのタンパクを除去して抽出精製されたＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を実施した場合は、パラジウム錯体の濃度、及びＳＤＳ存在の有無に関わらず、生細胞及び死細胞のCt値は、いずれも無処理と比較して有意な差異は観測されず、ほぼ一定の値であった。【０１５９】
３．考察
表５に示されるように、パラジウム錯体処理後の細胞のペレットからＤＮＡを抽出せずに、直接、リアルタイムＰＣＲ増幅を実施した場合は、生細胞と死細胞の区別が可能であったが、細胞を破砕後プロテアーゼＫ処理した場合は、生細胞と死細胞を識別できなかった。【０１６０】
〔実施例３〕Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)のC. sakazakii死細胞に対する作用機序に関する検討
前述のとおり、パラジウム錯体を微生物細胞に作用させた場合、ほとんどのパラジウム錯体はＤＮＡ結合性タンパク質に共有結合する可能性が高いことを示されたが、この可能性についてさらに検討を行った。
具体的には、死細胞にパラジウム錯体を作用させた後、ガラスビーズで細胞を破砕し、その後、プロテアーゼK処理せずにＤＮＡを抽出した場合、パラジウム錯体結合・ＨＵプロテインが死細胞染色体（ＤＮＡ）に強固に結合した状態を維持しているかどうかを検討した。【０１６１】
１．試験材料及び培養方法
１−１）クロノバクター・サカザキATCC29544を用いて、実施例２と同様にして、生理食塩水を用いて1 mlの生細胞けん濁液（6.7×108 CFU/ml）及び損傷細胞／死細胞けん濁液（以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記; 6.7×108 cells/ml）を調製した。【０１６２】
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を滅菌水にて100倍希釈し(6.7×106 cells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。【０１６３】
１−２）Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)溶液の調製及び試料の処理
Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 4.24mg (14.85μmol)を正確に秤量し、297μlのDMSO （Sigma）に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1 mM溶液（パラジウム錯体溶液）を調製した。【０１６４】
250μM又は1 mMのDichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 10μlを上記生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃、30分間保持した。
その後、滅菌水1 mlを加え、冷却遠心処理（4℃、3,000×G、5分）し、上清を除去し、そのペレットに細胞破砕用ガラスビーズ（10個）を入れ、30秒ボルテックスミキサーにより激しく攪拌し、細菌細胞を破砕した。その後、TEバッファーを200μl加え、緩やかに攪拌後、冷却遠心処理（3,000×G、5分、4℃）し、上清（およそ200μl相当）を新しい1.5 mlマイクロチューブに移した。【０１６５】
その後、各試料に20μlの3M 酢酸ナトリウム水溶液を添加し、500μlの99.5％冷エタノールを加え、緩やかに攪拌し、5分氷上に置いた。冷却遠心処理（15,000×G、10分、4℃）して上清を除去し、500μlの70％冷エタノールでマイクロチューブ内を洗浄後、同様に冷却遠心処理した。上清を除去後、エタノールを真空乾燥（5分）にて除去し、ペレットに20μlのTEバッファーを加え、4℃にて1晩静置した。室温に戻した後、穏やかに攪拌し、ＤＮＡ溶液を得た。その5μlをＰＣＲ増幅用試料とし、残り15μlを以下で使用した。【０１６６】
前記ＤＮＡ溶液15μlにTEバッファー200μlを加え、1 M Tris-HCl/フェノール（飽和フェノール）0.5 mlを加え、15分穏やかに混合した後、更にクロロホルム0.5 mlを加え、5分穏やかに混合した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000×G、10分）し、上清およそ300μlを新しい1.5mlマイクロチューブに移し、30μlの3M 酢酸ナトリウム水溶液を添加した後、750μlの99.5％冷エタノールを加え、緩やかに攪拌し、5分氷上に置いた。冷却遠心処理（15,000×G、10分、4℃）して上清を除去し、500μlの70％冷エタノールでマイクロチューブ内を洗浄後、同様に冷却遠心処理した。上清を除去後、エタノールを真空乾燥（5分）にて除去し、ペレットに15μlの滅菌水を加え、37℃で30分保持して、ＤＮＡ溶液を調製した。その5μlをＰＣＲ増幅用試料とした。【０１６７】
また、パラジウム錯体溶液により処理した後、前記細胞破砕用ガラスビーズ投入直前のペレットに対して、前記のようなＤＮＡ抽出を行わず、細菌から直接にリアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ）増幅を行った。【０１６８】
１−３）ＰＣＲ増幅
実施例２と同様にして、上記の各ＰＣＲ増幅用試料を用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を２回実施した。【０１６９】
２．結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表６に示す。【０１７０】
【表６】
0005433820.tif 000013
【０１７１】
表６に示されるように、Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)処理し、細胞からのＤＮＡ抽出を行わずに細胞内に存在する染色体ＤＮＡに対して直接ＰＣＲを行った場合、同パラジウム錯体25μMでクロノバクター・サカザキの生細胞と死細胞の明瞭な生死判定が可能であることを確認した。【０１７２】
また、パラジウム薬剤で細胞を処理後、ガラスビーズで細胞を破砕し、直接エタノール沈澱によりＤＮＡを抽出してリアルタイムＰＣＲ増幅を実施した場合は、上記と同様にパラジウム錯体25μMで明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
さらに、エタノール沈殿の前にフェノール／クロロホルム抽出を行った場合でも、パラジウム錯体25μMで明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。【０１７３】
３．考察
本実施例３（表６）と前述実施例２（表５）の大きな違いは、ガラスビーズで細胞を破砕した後のプロテアーゼＫ処理の有無である。本実施例３では、プロテアーゼＫ処理を行っていない。
すなわち、プロテアーゼＫ処理を行った実施例２では、精製した死細胞ＤＮＡを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅では生細胞と死細胞を識別できなかったのに対して、プロテアーゼＫ処理を行っていない本実施例３では生細胞と死細胞の識別が可能であった。【０１７４】
〔実施例４〕Dichloro(ethylenediamine)palladium (II)のC. sakazakii死細胞に対する作用機序に関する追加検討
パラジウム錯体として、Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)に代えて、Dichloro(ethylenediamine)palladium (II)を用いて、C. sakazakii死細胞に対する作用を検討した。【０１７５】
１．試験材料及び培養方法
１−１）クロノバクター・サカザキATCC29544を用いて、実施例１と同様にして、滅菌水にて1 mlの生細胞けん濁液（6.1×108 CFU/ml）及び損傷細胞／死細胞けん濁液（以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記; 6.1×108 cells/ml）を調製した 。
上記のクロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を滅菌水にて10倍希釈し(6.1×107 CFU/ml、又はcells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。【０１７６】
１−２）Dichloro(ethylenediamine)palladium (II)溶液の調製及び試料の処理
Dichloro(ethylenediamine)palladium (II) 3.60 mg (15.16μmol)を正確に秤量し、303μlのDMSO （Sigma）に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1 mM溶液（パラジウム錯体溶液）を調製した。【０１７７】
各Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)溶液10μlを、上記生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、滅菌水0.5 mlを加え、冷却遠心処理（4℃、3,000×G、5分）し、上清を除去し、そのペレットにQuickGene SP kit DNA tissue (SP-DT)（界面活性剤を含む。FUJIFILM、東京、日本）を添付したMDT（Tissue Lysis Buffer; 細胞溶解バッファー）180μl、及びEDT（Proteinase K）20μlを加え、55℃で3時間インキュベートした。そこへ20μlの3M 酢酸ナトリウム水溶液を添加した後、500μlの99.5％冷エタノールを加え、緩やかに攪拌し、5分氷上に置いた。【０１７８】
冷却遠心処理（15,000×G、10分、4℃）にて上清を除去し、500μlの70％冷エタノールでマイクロチューブ内を洗浄後、同様に冷却遠心処理した。上清を除去後、エタノールを真空乾燥（５分）にて除去し、ペレットに50μl滅菌水を加え、37℃で１時間保持し、ＤＮＡ溶液を調製した。その5μlをＰＣＲ増幅用試料とした。【０１７９】
前記パラジウム錯体溶液にて処理した後、遠心分離処理により得たペレットに対して、前記のようなＤＮＡ抽出を行わず、細菌から直接にリアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ）増幅を行った。【０１８０】
１−３）ＰＣＲ増幅
前記の実施例と同様にして、各ＰＣＲ増幅用試料のリアルタイムＰＣＲ増幅を２回実施した。【０１８１】
２．結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表７に示す。【０１８２】
【表７】
0005433820.tif 000014
【０１８３】
表７によれば、Dichloro(ethylenediamine)palladium (II)で処理し、細胞内に存在する染色体ＤＮＡに対して直接ＰＣＲを行った場合（表中の"Cells"の欄）、パラジウム錯体濃度25μMで、クロノバクター・サカザキの生細胞のリアルタイムＰＣＲのCt値は、未処理に比較して3.6上昇したのに対し、死細胞のCt値は、未処理と比較して13.4上昇し、上昇幅の違いにより生細胞と死細胞の生死判定の可能性が示唆された。また、パラジウム錯体250μMでは、死細胞のＰＣＲは完全に抑制された。【０１８４】
一方、細胞をパラジウム錯体溶液で処理した後、界面活性剤存在下でプロテアーゼＫにて処理し、エタノール沈澱により抽出精製したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行った場合（表中の"PK(+) + Detergent + EtOH法"の欄）は、死細胞及び生細胞のいずれにおいてもCt値の有意な上昇は認められなかった。
３．考察【０１８５】
上記の結果からは、dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)に限られず、パラジウム錯体は一般に、死細胞の膜を透過後、ほとんどがＨＵタンパク質に代表されるＤＮＡ結合性タンパク質に結合する可能性が高いと考えられる。【０１８６】
〔実施例５〕Diamminedichloropalladium (II)による、スタフィロコッカス・アウレウスの生細胞・死細胞の識別
本実施例５では、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）について、パラジウム錯体による生細胞と死細胞との識別が可能であるかどうかを検討した。【０１８７】
１．試験材料及び培養方法
１−１）Staphylococcus aureus（スタフィロコッカス・アウレウス）ATCC 6538P株を用いて、実施例１と同様にして、滅菌水にて1 ml生細胞けん濁液（2.1×107 CFU/ml）及び死細胞けん濁液（2.1×107 cells/ml）を調製した。
上記スタフィロコッカス・アウレウスの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ50μlを、下記試験に供した。【０１８８】
１−２）Diamminedichloropalladium(II)溶液の調製及び試料の処理
diamminedichloropalladium(II) 1.70 mgを秤量し、804μl DMSO (Sigma)に溶解し10 mM溶液を調製した。その10 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、及び100μMの各溶液を調製した。【０１８９】
各Diamminedichloropalladium (II)溶液50μlを、上記S. aureus生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液50μlに添加し、恒温水槽にて37℃で10分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、3,000×G、5分）し、上清を除去し、そのペレットを150μlの滅菌水にけん濁させ、よく攪拌した後、同様の冷却遠心処理を行い、上清を除去した。得られたペレット（5μl相当）をＰＣＲ増幅用試料とした。【０１９０】
１−３）ＰＣＲ増幅
前記実施例と同様にして、上記の各ＰＣＲ増幅用試料のリアルタイムＰＣＲ増幅を２回実施した。【０１９１】
２． 結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表８に示す。【０１９２】
【表８】
0005433820.tif 000015
【０１９３】
表８によれば、Diamminedichloropalladium (II) 1μMで、生細胞のCt値は未処理のCt値と比較して3.4程度の上昇に留まったのに対し、死細胞ではターゲット遺伝子増幅は完全に抑制された。したがって、同パラジウム錯体によりS. aureusの生細胞と死細胞の明瞭な識別ができた。【０１９４】
３．考察
上記のとおり、パラジウム錯体を用いることにより、S. aureusでも生細胞と死細胞の明瞭な識別が可能となることが明らかとなった。以上の実施例により、パラジウム錯体により、グラム陰性細菌、及び形態学的にグラム陰性細菌の外膜と同一組成をエンベロープとして含むインフルエンザウイルス等のウイルスのみならず、外膜を有さず形態学的にグラム陰性細菌やインフルエンザウイルスと異なるグラム陽性細菌においても、生細胞と死細胞の明瞭な識別も可能であることが判明した。したがって、パラジウム錯体は、微生物全般の生細胞と死細胞の識別が可能と考えられる。【０１９５】
〔実施例６〕塩化パラジウム（II）（PdCl2(II)）をDMSOに溶解して得られる錯体による微生物の生細胞と死細胞の識別に関する検討
本実施例６では、共有結合による巨大分子として定義されている塩化パラジウム（II）（PdCl2 (II)）をDMSOに溶解して得られるパラジウム錯体を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞と死細胞の識別に関する検討を行った。【０１９６】
１．試験材料及び培養方法
１−１）クロノバクター・サカザキATCC29544を、BHIブロスを用いて、37℃、16時間培養を行った。
前記培養液1 mlを冷却遠心処理（4℃、3,000×G、10分間）し、上清除去後、ペレットに1 mlの滅菌水を添加し、更に滅菌水にて100倍希釈して、生細胞けん濁液（9.4×106 CFU/ml）を調製した。また、上記生細胞けん濁液1 mlを、1.5 mlのマイクロチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）に分取し、沸騰水に3分間浸漬処理し、その後、急冷した。沸騰水に浸漬処理した各けん濁液は、標準寒天培地（Eiken, Tokyo, Japan）によりコロニーを形成しないことを確認し、損傷細胞／死細胞けん濁液（以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記; 9.4×106 cells/ml）を得た。
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ50μlを、下記試験に供した。【０１９７】
１−２）塩化パラジウム（II）溶液の調製及び試料の処理
塩化パラジウム（II）4.9 mg (27.63μmol)を、1104μl DMSO (Sigma)に溶解し 25 mM溶液を調製した。その25 mMの各塩化パラジウム（II）溶液を生理食塩水にて100μM、1mM、及び10mMの各溶液を準備した。
上記塩化パラジウム（II）溶液10μlをクロノバクター・サカザキ生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、3,000×G、5分）し、上清を除去し、そのペレットを150μlの滅菌水にけん濁させ、よく攪拌した後、同様の冷却遠心処理を行い、上清を除去した。得られたペレット（5μl相当）をＰＣＲ増幅用試料とした。【０１９８】
１−３）ＰＣＲ増幅
前記の実施例と同様にして、各ＰＣＲ増幅用試料のリアルタイムＰＣＲ増幅を実施した。【０１９９】
２． 結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表９に示す。【０２００】
【表９】
0005433820.tif 000016
【０２０１】
３．考察
表９に示されるように、塩化パラジウム（II）20μM にてクロノバクター・サカザキの生細胞のリアルタイムＰＣＲのCt値は未処理に比較して7.2上昇した程度に留まったのに対して、死細胞処理群では未処理と比較して15.7程度上昇し、更に30μMで、クロノバクター・サカザキの生細胞のリアルタイムＰＣＲのCt値は未処理に比較して10.2上昇した程度に留まったのに対し、死細胞ではターゲット遺伝子の増幅が完全に抑制され、生細胞と死細胞の生死判定の可能性が示唆された。
従って、生細胞と死細胞を明瞭に識別するパラジウム錯体には、本実施例６にて開示されたような、他の元素もしくは基との共有結合により巨大分子として定義されているパラジウム化合物を有機溶媒に溶解して得られるパラジウム錯体も含まれると考えられる。【０２０２】
〔実施例７〕bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate、又はpalladium(II)acetate による大腸菌（Esherichia coli）の生細胞・死細胞の識別
本実施例７では、ハードなルイス塩基であるカルボキシレート基を配位子とするパラジウム錯体bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate、及び、palladium(II)acetateをDMSOに溶解して生成させたパラジウム錯体を用いて、生細胞・死細胞の識別を行った。【０２０３】
１．試験材料及び培養方法
１−１）滅菌水を用いてE. coli JCM1649株を用いて、滅菌水にて生細胞けん濁液（2.2 × 107 CFU/ml）及び死細胞けん濁液（2.2 × 107 cells/ml；沸騰水2分浸漬）を調製し、それぞれ90 μlを下記試験に供した。JCM1649株は、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（〒305-0074 茨城県つくば市高野台３−１−１）から入手することができる。【０２０４】
１−２）パラジウム錯体溶液の調製及び試料の処理
bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate (II)(Sigma)3.11 mg（14.15 μmol）を正確に秤量し、415.2 μlのジメチルスルフォキシド（DMSO、Sigma）に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100 μM、500 μM、1000 μM溶液を準備した。
同様に、palladium(II)acetate(Palladium(II)Acetate Recrystallized、Aldrich)4.02 mg（17.9 μmol）を正確に秤量し、1790.0 μlのDMSOに溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して10 μM、20 μM、250 μM、及び500 μM溶液を準備した。【０２０５】
前記の各薬剤溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000 × G、5分）し、上清を除去しそのペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。【０２０６】
１−３）ＰＣＲ増幅
下記表１０に示す組成にてダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックスを調製した。具体的には、Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (New England Biolabs Japan Inc.; M0273S)をリアルタイムＰＣＲバッファーとして用い、Taqポリメラーゼを通常使用の4倍量加え、同バッファーにcDBC（10 × DBC）を所定量添加した。ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ増幅(40 cycles)を２回実施した。以下、New England Biolabs製品はNEBと記載する。【０２０７】
【表１０】
0005433820.tif 000017
【０２０８】
ＰＣＲ増幅には、Primer ENT-16S forward: 腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用フォワードプライマー（5'- GTTGTAAAGCACTTTCAGTGGTGAGGAAGG -3'：配列番号４）、Primer ENT-16S reverse: 腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用リバースプライマー（5'- GCCTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3'：配列番号５）をＰＣＲプライマーとして使用した（両プライマーはニッポンジーンに製造委託した）。増幅されるrRNA遺伝子の断片長は424 bpである。腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）ENT-16S TaqMan probeとしては、5'- /56-FAM/AACTGCATC/ZEN/TGATACTGGCAGGCT/3lABkFQ/ -3'（配列番号６）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。このプローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光物質56-FAM、中央部にZEN、３’末端に31ABkFQという消光色素（クエンチャー）を配置した仕様で、Integrated DNA Technologies社にて委託製造した。
尚、配列番号４及び５のプライマーに関する塩基配列情報は、Nakano, S. et al., J. Food Prot. 66:1798-1804, 2003から入手し、配列番号６のENA-16S TaqMan probeの塩基配列は、各腸内細菌科菌群の16S rRNA遺伝子情報はthe GenBank database（http://www.ebi.ac.uk/genbank/）より腸内細菌科菌群内で相補的領域を選択した。【０２０９】
リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、下記のＰＣＲサーマルサイクル条件により、リアルタイムＰＣＲを実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（40サイクル）
尚、陰性コントロール（Negative Control）として、滅菌水5μlを鋳型として使用した。リアルタイムＰＣＲは２回実施した。【０２１０】
２．結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表１１に示す。【０２１１】
【表１１】
0005433820.tif 000018
【０２１２】
３．考察
表１１によれば、bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetateをE. coliの生細胞及び死細胞に作用させた時、死細胞のターゲット遺伝子増幅は50 μM以上で完全に抑制されていた。生細胞の場合、本薬剤の濃度依存的にCt値が上昇する傾向が観測されたが、50 μMの濃度にて明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
また、palladium(II)acetateのDMSO溶液は、1 μMの濃度にて死細胞由来のターゲット遺伝子増幅が完全に抑制され、生細胞に関しては、2 μMまでの濃度であれば無処理と比較してもCt値が若干上昇する程度で抑制されており、明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。【０２１３】
本実施例７により、パラジウム金属にソフトなR3P基（triphenylphosphine基）を配位結合させたパラジウム錯体を用いても、生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。また、palladium(II)acetateをDMSOに溶解させることにより生成するパラジウム錯体を用いた場合も、明瞭な生細胞と死細胞の判定が可能であった。
以上により、途中経過を問わず最終的に生成したパラジウム錯体は、配位子がハードなルイス塩基、中間のルイス塩基、ソフトなルイス塩基何れであっても、良好な生細胞と損傷細胞・死細胞の識別が可能である。【０２１４】
〔実施例８〕
Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)を用いた牛乳中のE. coliの生細胞・死細胞の識別【０２１５】
食品サンプルや臨床検体には、パラジウム錯体の配位子になり得る成分が混在している。例えば、殺菌した牛乳では、ウシ体細胞やウシ乳腺上皮細胞が含まれている。これらの細胞は死細胞であっても、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えばHUヒストン様タンパク質）、ＲＮＡ結合性タンパク質（例えばSynaptotagmin-binding, cytoplasmic RNA-interacting protein「SYNCRIP」分子量66 kDa（特願2000-299812）、核内ＲＮＡ−タンパク質複合体・パラスペックル（paraspeckle）（Sasaki Y.T.et.al.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:2525-2530）を形成するタンパク質、及び、リボゾームタンパク質のようなタンパク質を保持している可能性が高い。また、これらのタンパク質がウシ体細胞やウシ乳腺上皮細胞から殺菌した牛乳中に流出している可能性も可能性も高く、これらのタンパク質はパラジウム錯体の配位子になり得る（実施例1〜７参照）。
また、パラジウム錯体はタンパク質（又は、システイン残基など硫黄を含むアミノ酸、もしくは、他のアミノ酸）を配位子とすることも既に示唆されているので、乳中の各種カゼイン、ホエイタンパク質にも、パラジウム錯体は一部配位する可能性もある（Lippardら（生物無機化学 Lippard, S.J. and Berg, J.M.著；松本和子監修  21-23頁“生物無機化学の研究における配位化学の原理））。
そこで、殺菌した牛乳に含まれる生細胞と死細胞が、パラジウム錯体を用いて識別可能かどうかを試験した。【０２１６】
１．試験材料及び培養方法
１−１）生理食塩水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液（8.2 × 108 CFU/ml）及び死細胞けん濁液（8.2 × 108 cells/ml）（生細胞けん濁液を沸騰水にて3分ボイル後急冷）を調製し、更にそれらを生理食塩水にて10倍希釈し、生細胞けん濁液及び死細胞けん濁液を調製した。【０２１７】
１−２）パラジウム錯体溶液の調製及び試料の処理
Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II) (Sigma)3.01 mg（10.54 μmol）、及び、Diamminedichloropalladium (II)（Wako）2.48 mg（11.73 μmol）を正確に秤量し、前者は211 μl、後者は1173 μlのDMSOに溶解して、各々50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して、さらに100 μM、500 μM、1 mM、5 mM、10 mM溶液を準備した。【０２１８】
市販の牛乳（殺菌済み：以下、「殺菌ミルク」と記載する。）12 mlを採取し、前記10倍希釈生細胞けん濁液20 μlを接種し、1.6 × 106 CFU/12 ml殺菌ミルクを調製した。また、同様に、殺菌ミルク12 mlに前記10倍希釈死細胞けん濁液20 μlを接種し、1.6 × 106 cells/12 ml殺菌ミルクの死細胞接種殺菌ミルクを調製した。
尚、試験に用いた市販の牛乳（殺菌ミルク）は、E. coli生細胞は検出限界以下（<1 CFU/2.22 ml）であることを培養法により確認した。
また、この殺菌ミルクに既知濃度のE. coli死細胞を接種し、薬剤処理をせずに後述のミルクから細菌を回収する工程のみを行い、その後、前述の実施例７と同様のダイレクト・リアルタイムＰＣＲを行うことにより、検出されるE. coli死細胞が最大でも103 cells/mlであることを予備検討にて確認したものを試験材料として使用した。
従って、E. coli死細胞を1.6 × 106 CFU/12 ml殺菌ミルクとなる濃度にて接種した死細胞接種殺菌ミルクは、元来含まれているE. coli死細胞は無視できるレベルである。
尚、殺菌ミルクにおいて、比較的高濃度にて混在することが想定されるE. coliを始めとする大腸菌群（サルモネラを含めると腸内細菌科菌群）死細胞は、1.6 × 106 CFU/12 ml殺菌ミルクのレベルが充分想定されるので、本方法において、その死細胞由来のＰＣＲは完全に抑制される必要がある。【０２１９】
前記各生細胞接種殺菌ミルク、および死細胞接種殺菌ミルクを、それぞれ冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）し、デカンテーションにより上清を除去して生細胞乳ペレット(a)、死細胞乳ペレット(a)を回収した。
回収した各乳ペレット(a)にPBS10 mlを加えよく攪拌し、冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）後、デカンテーションにより上清を除去して各ペレット(b)を回収した。回収した各ペレット(b) に990 μl滅菌水を添加してけん濁した。この各ペレット(b)けん濁液に、前記100 μM、500 μM、1 mM、5 mM、10 mM、又は50 mM Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)溶液を10 μl添加し、37℃の恒温槽にて30分間攪拌（恒温水槽PERSONAL-11; TAITEC恒温槽 60 rpm）しながら保持した。
また、これとは別に、Diamminedichloropalladium (II)溶液を用いて、Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)と同様の希釈系列にて試験を実施した。
その後、各々の試料に10 ml PBSを加え、よく攪拌後、冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）し、デカンテーションにより上清を除去して、各ペレット(c)を得た。さらに同様の工程を再び実施した。各ペレット(c) に100 μlの滅菌水を添加してけん濁させ、ABI製100 μl容 PCRチューブに移し、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、ピペットにより上清を除去して各ペレット(d)を回収した。回収した各ペレット(d) （5 μl相当）をＰＣＲ増幅用試料とした。【０２２０】
１−３）ＰＣＲ増幅
前述の実施例７の表１０と同様のダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックスを用いて、ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ増幅(40 cycles)を２回実施した。【０２２１】
２．結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表１２に示す。【０２２２】
【表１２】
0005433820.tif 000019
【０２２３】
３．考察
表１２によれば、死細胞接種殺菌ミルクでは、薬剤処理を施さない場合（パラジウム錯体未添加）のCt値が 30.9であったのに対し、Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)で処理した場合は10〜500 μMにて、Diamminedichloropalladium (II)で処理した場合は50〜500 μMにて、PCR増幅は見られなかった。
一方、生細胞接種殺菌ミルクの場合は、Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)では0〜100 μMにて、またDiamminedichloropalladium (II)では0〜50 μMにて、ＰＣＲ増幅が観測され、パラジウム錯体未添加の場合のCt値と比較しても殆ど差がなかった。
すなわち、２種類のパラジウム錯体を用いて、殺菌ミルク中における生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。【０２２４】
〔実施例９〕Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)を用いた牛乳中のE. coli生細胞の特異的識別の検出限界
本実施例９では、殺菌ミルク中のE. coli生菌の特異的識別の検出限界を調べた。【０２２５】
１．試験材料及び培養方法
１−１）生理食塩水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液（1.5 × 109 CFU/ml）を調製し、更に生理食塩水にて10、100、1000、及び104倍希釈し、生細胞けん濁液を調製した。【０２２６】
１−２）パラジウム錯体溶液の調製及び試料の処理
Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II) (Sigma)3.01 mg（10.54 μmol）を正確に秤量し、211 μlのDMSOに溶解して50 mM溶液を調製した。これを生理食塩水にて希釈し、5 mM溶液を調製した。【０２２７】
市販の牛乳（殺菌済み：以下、「殺菌ミルク」と記載する。）12 mlを採取し、前記10、100、1000、及び104倍希釈生細胞けん濁液10 μlを接種し、1.5 × 106〜1.5 × 103 CFU/12 mlミルクの試料を調製した。
尚、試験に用いた市販の牛乳（殺菌ミルク）は、E. coli生細胞は検出限界以下（<1 CFU/2.22 ml）であることを培養法により確認した。
また、この殺菌ミルクに既知濃度のE. coli死細胞を接種し、薬剤処理をせずに後述のミルクから細菌を回収する工程のみを行い、その後、前述の実施例７と同様のダイレクト・リアルタイムＰＣＲを行うことにより、検出されるE. coli死細胞が最大でも103 cells/mlであることを予備検討にて確認したものを試験材料として使用した。【０２２８】
前記各生細胞接種殺菌ミルクを冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）し、デカンテーションにより上清を除去して乳ペレット(a)を回収した。回収した乳ペレット(a)にPBSを10 ml加えてよく攪拌し、再び冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）した後、デカンテーションにより上清を除去してペレット(b)を回収した。回収したペレット(b)を990 μlの滅菌水にけん濁し、前記5 mM Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)溶液を10 μl添加し、37℃の恒温槽にて30分間攪拌（恒温水槽PERSONAL-11; TAITEC恒温槽 60 rpm）しながら保持した。
その後、PBSを10 ml加えて、よく攪拌した後、冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）し、デカンテーションにより上清を除去してペレット(c)を得た。さらに同様の工程を再び実施した。ペレット(c)を100 μlの滅菌水にけん濁させ、ABI製100 μl容 PCRチューブに移し、冷却遠心分離（4℃、3,000 × G、5分）し、ピペットにより上清を除去してペレット(d)を回収した。回収したペレット(d)（5 μl相当）をＰＣＲ増幅用試料とした。【０２２９】
１−３）ＰＣＲ増幅
前述の実施例７の表１０と同様のダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックスを用いて、ＰＣＲ増幅(40 cycles)を２回実施した。【０２３０】
２．結果
リアルタイムＰＣＲの結果を表１３に示す。【０２３１】
【表１３】
0005433820.tif 000020
【０２３２】
３．考察
表１３によれば、dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II) 50 μMにて、殺菌ミルク中のE. coli生細胞（1.5 × 104 CFU/12 mlミルク＝1.3 × 103 CFU/ml）からのターゲット遺伝子増幅を確認した。【０２３３】
本実施例で用いたダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）を網羅的に検出可能とする16S rRNA遺伝子をターゲットとするプライマーであるため、E. coliの生細胞・死細胞の識別に留まらず、殺菌ミルク中のEnterobacteriaceaeの生細胞・死細胞判定試験に利用可能である。【０２３４】
本実施例では、殺菌ミルク中にE. coliが103 CFU/mlの濃度で存在する場合、又はそれより低濃度で当初E. coli生細胞が汚染していたとしても、103 CFU/ml濃度になるまで短時間培養することにより、生細胞のみ検出できることが示された。従って、ミルクと類似組成を有する血液などの臨床検体でも明瞭なターゲット細胞の生細胞・死細胞の識別が容易に類推される。【０２３５】
以上の各実施例で示されるように、パラジウム錯体を用いることにより、食品、環境サンプル、及び臨床検体中のターゲット細胞の生細胞と死細胞（損傷細胞も含む）の明瞭な識別が可能と結論される。
【産業上の利用可能性】
【０２３６】
本発明の方法によれば、簡便な工程で、微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出することができる。本発明により、核酸増幅法による簡易かつ迅速な食品及び生体試料、拭き取り試料、工業用水、環境用水、排水等の環境中の微生物の生細胞・損傷細胞・死細胞の簡便な判別が可能となる。【０２３７】
また、本発明に用いるパラジウム錯体のうち、例えばジアンミンジクロロパラジウム（II）（diamminedichloro-palladium (II)）は、臨床的には実績がないが、抗ウイルス効果・抗腫瘍効果について基礎検討されており、ＥＭＡ等の薬剤に比べて危険性が低いと考えられる。さらに、好ましいパラジウム錯体は、ＥＭＡ等の薬剤に比べて安価であり、産業上有利である。
【要約】
以下の工程により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する。
ａ）前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程。【配列表】
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