(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）遺伝子組み換え野芝の花に60Ｃｏの放射線を１０（Ｇｙ）〜５０（Ｇｙ）の線量で照射する段階と、
（ｂ）60Ｃｏの放射線を照射された遺伝子組み換え野芝を栽培し、その種子を採種する段階と、
（ｃ）その種子を栽培して非抽薹された個体を選別することによって不稔性の誘導された遺伝子組み換え野芝を取得する段階とを含んでなり、
前記不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝は、非抽薹の遺伝的な形質を呈することを特徴とする、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造方法。
【請求項２】
前記遺伝子組み換え野芝は、除草剤抵抗性芝であることを特徴とする、請求項１に記載の不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造方法。
【請求項３】
（ａ）遺伝子組み換え野芝の花に60Ｃｏの放射線を１０（Ｇｙ）〜５０（Ｇｙ）の線量で照射する段階と、
（ｂ）60Ｃｏの放射線を照射された遺伝子組み換え野芝を栽培してその種子を採種する段階と、
（ｃ）その種子を栽培して非抽薹された個体を選別することによって不稔性の誘導された遺伝子組み換え野芝を取得する段階と、
（ｄ）その不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝から地下茎を採取する段階とを含んでなり、
前記不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝は、非抽薹の遺伝的な形質を呈することを特徴とする、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地下茎または地上匍匐茎の製造方法。
【請求項４】
前記遺伝子組み換え野芝は、除草剤抵抗性芝であることを特徴とする、請求項３に記載の不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地下茎または地上匍匐茎の製造方法。
【請求項５】
請求項１の製造方法によって得られた、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝。
【請求項６】
請求項３の製造方法によって得られた、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地下茎または地上匍匐茎。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球の温暖化、農地の荒廃化、急速な産業化などにより、全世界的に農耕地の面積が減少しつつあり、化学肥料や化学農薬などの使用が環境保存の必要性のため制約されるので、食糧生産は鈍化しているが、全世界の人口はこれを上回って増加している。
【０００３】
このような時代現象により人類食糧問題の解決が依然として要求されているが、その代案として認識されているものが、生命工学技術の発達に励まされて開発された遺伝子組み換え作物（ＧＭＯ）である。
【０００４】
遺伝子組み換え作物とは、遺伝子組み換えなどの生命工学技術を用いた人為的な遺伝子操作によって人間に有用な特性を持たせた作物として定義できる。
【０００５】
１９９４年にカルジーン社の日持ちの良いトマトが開発されて以来、モンサント社の除草剤抵抗性ダイズ、ノバティス社の害虫抵抗性トウモロコシなどが開発されながら、遺伝子組み換え作物の商業化が本格化し始め、害虫抵抗性稲(Tu et al., 2000)、ビタミンＡが強化された稲(Ye et al., 2000)、鉄分含量が強化された稲(Vasconcelos et al., 2003)などが商業化準備段階にある。
【０００６】
最近まで開発された遺伝子組み換え作物は、その種類が大豆、トウモロコシ、小麦、トマト、ジャガイモ、綿花、稲などを含んで１００余種に達し(Mohan Babu et al., 2003)、その栽培面積も１９９６年に１７０万ｈａ、２００３年には６，７７０万ｈａに達しているという報告がある(James, 2004)。
【０００７】
遺伝子組み換え作物は、除草剤抵抗性、病虫害抵抗性、および品質向上などヒトに有用性を与える目的で開発されるが、組み換えられた遺伝子の移動によるヒトおよび環境に対する危害性が常に論難になっている。
【０００８】
遺伝子組み換え作物の遺伝子移動は、遺伝子組み換え作物自体およびその種子による遺伝子移動と、花粉飛散による遺伝子移動に分けられる。
【０００９】
現在まで知られている大部分の遺伝子移動は花粉飛散によるものであり、花粉飛散による遺伝子移動は同種および近縁種の形質を変化させて環境生態系を撹乱・破壊させる危険性を持っている(Karevar et al., 1994)。
【００１０】
除草剤抵抗性キャノーラ(Brassica napus)の場合は、３ｋｍ離れているところで花粉飛散による遺伝子移動が観察されたという報告があり(Rieger et al., 2002)、除草剤抵抗性ベントグラス(Creeping bentgrass)の場合は、２１ｋｍ離れているところでも遺伝子移動が観察されたという報告がある(Watrud et al., 2004)。
【００１１】
本発明は、遺伝子組み換え野芝の花粉飛散による遺伝子移動を防止するために完成したものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的または具体的な様態などは、以下に提示されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、遺伝子組み換え野芝において花粉飛散による遺伝子移動を遮断することが可能な技術を開示する。
【００１５】
本発明者は、下記の実施例から確認されるように、遺伝子組み換え芝としてバスタ除草剤抵抗性野芝を使用し、その野芝の開花時期にγ線を照射した後、種子を採種し、その種子を発芽させて成熟な植物体に成長させたとき、γ線処理区において４％（２２３個体のうち９個体）の比率で不稔性が誘導されることを確認することができた。
【００１６】
本発明は、このような実験結果に基づいて提供されるものである。
【００１７】
本発明の不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造方法は、（ａ）遺伝子組み換え芝の花に物理的突然変異原を処理する段階と、（ｂ）物理的突然変異原が処理された遺伝子組み換え野芝を栽培し、その種子を採種する段階と、（ｃ）その種子を栽培し、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝を選別する段階とを含んでなる。
【００１８】
本明細書において、前記「野芝」は、パスパルム属グラス(Paspalum sp.)、アグロスチス属グラス(Agrostis sp.)、シノドン属グラス(Cynodon sp.)、フェスク属グラス(Festuca sp.)、ポア属グラス(Poa sp.)、ロリウム属グラス(Lolium sp.)、ステノタフルム属グラス(Stenotaphrum sp.)、およびゾイシア属グラス(Zoysia spp.)を意味し、好ましくは、バイアグラス(Bahia Grass, Paspalum notatum)、ベントグラス(Bentgrass, Agrostis stolonifera, Agrostis capillaris)、バミューダガラス(Bermuda Grass, Cynodon dactylon)、フェスキュ(Fescue, Festuca arundinacea)、ケンタッキーブルーグラス(Kentucky Bluegrass, Poa pratensis)、ライグラス(Rye Grass, Lolium perenne)、セントオーガスチングラス(St. Augustine Grass, Stenotaphrum secundatum)、ノシバ(Zoysia japonica)、コウシュンシバ(Zoysia matrella)、コウライシバ(Zoysia tenuifolia)、オニシバ(Zoysia macrotachya)、およびコオニシバ(Zoysia sinica)を意味する。
【００１９】
また、本明細書において、前記「遺伝子組み換え野芝」は、遺伝子組み換え、化学的・物理的突然変異原の処理などの遺伝子操作技術を用いて人為的に意図した特性が誘導された野芝を意味する。ここで、人為的に意図した特性としては、除草剤抵抗性、矮性、病虫害抵抗性などが例示できる。好ましくは、除草剤抵抗性芝、特にバスタ除草剤抵抗性芝を意味する。
【００２０】
また、本明細書において、前記「野芝の花」とは、花の各器官である雌蕊、雄蕊、花弁およびウテナが分化した状態にあることを意味する。一般に、開花は、花芽の形成後に花軸が形成され、この花軸から花の各器官、すなわち雌蕊、雄蕊、花弁およびウテナが分化し、その分化した花の各器官が成熟する過程を経て行われる。よって、「野芝の花」とは、花芽の形成後に花の各器官が分化した時点から閉花するまでの状態にある花を意味するものと理解できる。
【００２１】
本発明者が野芝の花に突然変異原を処理した理由は、開花時期が授粉・授精の行われる次期であって、この時期に突然変異原を処理する場合、突然変異の効率を高めることができるという点に着目したことにある。参考として、本発明者が野芝の種子に突然変異原を処理したとき、特に化学的突然変異原（ＥＭＳ、ＥＥＳ(ethyl ethane sulfonate)、ＥＯ(Ethylene oxide)、ＮＭＣなど）を処理したときは不稔性が誘導されていないことを明らかにしておく。
【００２２】
また、本明細書において、前記「不稔性」とは、有性生殖が不可能な形質を意味し、抽薹(bolting)されない（すなわち、花芽・花軸が形成されない）形質、或いは抽薹されなくて種子が生成されない形質の意味としても理解することができる。
【００２３】
また、本明細書において、前記「不稔性が誘導された」とは、その突然変異された形質、すなわち不稔性が次の世代でも発現できるように遺伝的変異が起こった場合を意味する。ゾイシア属芝を含む芝類は、地下茎と地上匍匐茎を通じた栄養繁殖能力を持っている。よって、前記「不稔性が次の世代でも発現される」というのは、地下茎と地上匍匐茎を通じて栄養繁殖した場合にもその栄養繁殖した個体に不稔性の形質が現れることを意味する。
【００２４】
本発明において、物理的突然変異原としては、当業界で使用されるＸ線、γ線（60Ｃｏ）、β線（32Ｐ、35Ｓなど）、中性子ビーム(Hasegawa et al. 1995; Ling et al. 1991; Wang et al. 1988; Honda et al. 2006; Naito et al. 2005)などが全て使用でき、特に好ましくは60Ｃｏを使用する場合である。
【００２５】
前記物理的突然変異原をどれほどの時間照射するかは、使用しようとする突然変異原の種類によって当業者における通常の能力範囲内で決定できる。一般に、ある物理的突然変異原の強度が高ければ、相対的に強度の低い他の物理的突然変異原に比べて照射量を短くしても、目的の突然変異を誘発することができる。
【００２６】
したがって、野芝の花に物理的突然変異原を処理して不稔性の誘導された野芝を得ることができる限りは、その物理的突然変異原の種類やその物理的突然変異原の処理時間などが本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。
【００２７】
但し、下記実施例を参照するとき、物理的突然変異原の場合、その突然変異原の種類を問わず、線量が１０（Ｇｙ）〜１００（Ｇｙ）の範囲内で処理されることが好ましく、さらに好ましくは線量が１０（Ｇｙ）〜５０（Ｇｙ）の範囲内で処理される。特に、物理的突然変異原としては-60Ｃｏを使用することが好ましい。
【００２８】
また、本発明において、不稔性の誘導された野芝を矮性の形質が共に誘導された野芝であることが好ましい。
【００２９】
本明細書において、「矮性」は、野芝のサイズ（または生物量(biomass)）が野生型のそれに比べて小さい形質を意味し、具体的には野芝の高さ、節間(internode)、および／または葉の長さと広さが野生型のそれに比べて小さい形質を意味する。
【００３０】
また、本明細書において、「矮性が誘導された」とは、その突然変異された形質、すなわち矮性が次の世代でも発現できるように遺伝子変異が起こった場合を意味する。ここで、前記「矮性が次の世代でも発現する」というのは、地下茎と地上匍匐茎を通じて栄養繁殖した場合にもその繁殖した個体に矮性の形質が現れることを意味する。
【００３１】
このような矮性の形質は野芝の刈り草作業を省略することができるため、労働力の節減に直結する形質である。
【００３２】
一方、不稔性の誘導された遺伝子組み換え野芝の選別は、下記実施例での如く、花芽・花軸の形成有無から判断することができ、さらに葉節位の数を比較して判断することができる。
【００３３】
他の側面において、本発明は、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地下茎の製造方法に関する。
【００３４】
本発明の不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地下茎の製造方法は、（ａ）遺伝子組み換え野芝の花に物理的突然変異原を処理する段階と、（ｂ）突然変異原が処理された遺伝子組み換え野芝を栽培し、その種子を採種する段階と、（ｃ）その種子を栽培して不稔性の誘導された遺伝子組み換え野芝を選別する段階と、（ｄ）その不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝から地下茎を採取する段階とを含んでなる。
【００３５】
別の側面において、本発明は、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地上匍匐茎の製造方法に関する。
本発明の不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の地上匍匐茎の製造方法は、（ａ）遺伝子組み換え野芝の花に物理的突然変異原を処理する段階と、（ｂ）突然変異原の処理された遺伝子組み換え野芝を栽培し、その種子を採種する段階と、（ｃ）その種子を栽培して不稔性の誘導された遺伝子組み換え野芝を選別する段階と、（ｄ）その不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝から地上匍匐茎を採取する段階とを含んでなる。
【００３６】
これらの方法によって得られた地下茎または地上匍匐茎は、不稔性を有する遺伝子組み換え野芝を増殖させることが可能な材料として有用である。
【００３７】
これらの方法において、前記地下茎または地上匍匐茎は、矮性が共に誘導された野芝から得られることが好ましい。
【００３８】
前記地下茎または地上匍匐茎の製造方法において、「野芝」、「遺伝子組み換え野芝」、「不稔性」、「矮性」などに関連しては前述した意味がそのまま有効である。
【００３９】
別の側面において、本発明は、前記方法によって得られた地下茎または地上匍匐茎を土壌に移植する段階、およびこれを繁殖させる段階を含む、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の増殖方法に関する。
【００４０】
前記地下茎または地上匍匐茎を土壌に移植するとき、その土壌は露地の土壌または植木鉢の土壌であってもよい。
【００４１】
また、前記繁殖段階には通常的な野芝の栽培条件、例えば日光条件や温度条件などを適用してもよく、繁殖効率を高めるために日光条件、温度条件などを変化させて適用してもよい。
【発明の効果】
【００４２】
前述したように、本発明によれば、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造方法を提供することができる。このような方法によって得られる、不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝は、生態系を撹乱・破壊させる原因となる花粉飛散による遺伝子移動が源泉的に遮断された遺伝子組み換え野芝である。  
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】γ線（60Ｃｏ）を０（無処理区）、１０（Ｇｙ）、２０（Ｇｙ）、３０（Ｇｙ）、４０（Ｇｙ）、５０（Ｇｙ）、７５（Ｇｙ）および１００（Ｇｙ）線量でバスタ除草剤抵抗性ｂａｒ遺伝子の導入された遺伝子組み換え野芝に照射し、その野芝から種子を採種して発芽させたときの種子の枯死率をグラフで示す。
【図２】無処理区の抽薹された植物体のいずれか一つ（Ａ）と処理区の非抽薹された植物体のいずれか一つ（Ｂ）との葉節位の数を比較することが可能な写真である。
【図３】矮性形質が共に誘導された野芝を野生型芝と比較して示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明について実施例を参照して説明する。ところが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【００４５】
<実施例>不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝の製造
<実施例１>γ線（60Ｃｏ）照射のための予備実験
<実施例１−１>γ線（60Ｃｏ）の照射および種子（Ｍ1）の採種
本実験に使用された遺伝子組み換え野芝は、バスタ除草剤抵抗性ｂａｒ遺伝子が導入された遺伝子組み換え野芝(Zoysia japonica Steud.)(Toyama K, Bae CH, Kang JG, Lim YP, Adachi T, Riu KZ, Song PS, Lee HY(2003) Production of herbicide-tolerant zoysiagrass by Agrobacterium-mediated transformation Mol Cells. 16:19-27)のうち、導入遺伝子の遺伝的安定性が検証されたＴ6世代植物体(Bae TW, Vanjildorj E, Song SY, Nishiguchi S, Yang SS, Song IJ, Chandrasekhar T, Kang TW, Kim JI, Koh YJ, Park SY, Lee J, Lee YE, Ryu KH, Riu KZ, Song PS, Lee HY(2008) Environmental risk assessment of genetically engineered herbicide-tolerlant Zoysia japonica. J. Environ. Qual. 37:207-218)であって、直径２５ｃｍの植木鉢に移植して自然光条件のＧＭＯ隔離温室で栽培したものである。
適正のγ線照射線量を定めるために、開花状態の遺伝子組み換え野芝（授粉・授精次期の野芝であって、穂内に葯(Anther)が２／３以上伸長した野芝である）にγ線（60Ｃｏ）を処理した。
γ線（60Ｃｏ）の処理は、０（無処理区）、１０（Ｇｙ）、２０（Ｇｙ）、３０（Ｇｙ）、４０（Ｇｙ）、５０（Ｇｙ）、７５（Ｇｙ）および１００（Ｇｙ）線量で済州大学校（韓国済州島に所在）放射線研究所の照射施設を用いて行われた。
γ線が処理された各植物体を済州大学校の温室内で３２℃±７の自然光条件で栽培して３ヶ月後に各処理区から種子（Ｍ1）を採種した。
採種された種子は自然光条件で３日間乾燥させた後、−１５℃で保管してから種子発芽実験に使用した。
【００４６】
<実施例１−２>種子（Ｍ1）の発芽率の調査
まず、発芽率を高めるために、γ線照射後に得られたＭ1野芝の種子を５Ｍ水酸化カリウム(potassium hydroxide)(Junsei, Japan)に３０分間浸漬した後、１Ｍ酢酸(acetic acid)(Junsei, Japan)で５分間中和させて種皮を軟化させた。
次に、種子を２％次亜塩素酸ナトリウム(sodium hypochlorite)(Daejung, Korea)で１５分間浸漬した後、滅菌水で５回洗浄し、その洗浄された種子を、吸湿した濾過紙上に播種した。播種の後、暗条件で２日間水分を吸収させた後、３日間３２℃±２の連続光（４０００ｌｕｘ）条件で栽培して発芽を誘導した。
各処理区による種子の枯死率（発芽していない種子の比率）を図１に示した。図１を参照すると、１０〜２５Ｇｙ処理区では平均３２％の枯死率を示し、５０〜７５Ｇｙ処理区では５９．５％の枯死率を示し、１００Ｇｙ処理区では７５％の枯死率を示したことが分かる。
このような結果を考慮し、γ線照射線量を、半数致死量（ＬＤ50）を含む５０（Ｇｙ）線量以下である０（無処理区）、１０、２０、３０、４０および５０Ｇｙに決定した。
【００４７】
<実施例２>不稔性が誘導された遺伝子組み換え野芝を得るためのγ線（60Ｃｏ）の照射、種子の採種、および発芽
前記実施例１と同様の方式で、γ線（60Ｃｏ）を０、１０、２０、３０、４０および５０Ｇｙの線量で照射し、Ｍ1種子を採種・発芽させた。
発芽率および生存率を下記表１に示した。ここで、発芽率は最初発芽した植物体から５週まで発芽した植物体までの総個数を調べて計算した。また、生存率は種子から発芽した幼植物体を植木鉢に移植し、８ヶ月間生育させ、生存した植物体の総個数を調べて計算した。
【００４８】
（表１）γ線処理された遺伝子組み換え野芝（Ｍ1）の発芽率および生存率
0005550642.tif 000002
【００４９】
前記生存したＭ1植物体（無処理区７０個体および処理区２２３個体）を直径１０ｃｍの植木鉢で２５℃±７の自然光条件で３ヶ月間順化させた後、直径１５ｃｍの植木鉢に移植し、２年間２５℃±７の自然光条件で栽培した後、１次的に不稔性有無を調べ、さらに直径２５ｃｍの植木鉢に移植して２５℃±７の自然光条件でＧＭＯ隔離温室で２年間栽培して２次的に不稔性有無を調べた。不稔性有無の調査は野芝の抽薹性(bolting)／非抽薹性(unbolting)によって１次的に選抜した後、その選抜された各個体の葉節位(leaf-node stage)の数を比較して２次的に選抜した。
下記表２には各処理区による非抽薹／抽薹された個体の数を示す。
【００５０】
（表２）非抽薹／抽薹された個体の数と百分率
0005550642.tif 000003
【００５１】
表２に示すように、２年目では、無処理区の場合は５．７％（４／７０）が抽薹されておらず、処理区の場合は５２％（（１５＋２０＋３４＋３８＋９）／（４２＋４２＋５６＋６４＋１９））が抽薹されていない。４年目では、無処理区の場合は全ての植物体が抽薹されており、処理区の場合は４％（（１＋１＋２＋３＋２）／（４２＋４２＋５６＋６４＋１９））が抽薹されていない。
ゾイシア属芝(Zoysia spp.)は、冬季の休眠期に葉が枯死してから、季節が変わって野芝の生育期に入ると、既存の直立茎の葉節位の次に新しい葉が発生しながら成長していくが、葉節位の数が通常１２個程度に達すると、抽薹されながら開花する(Yeam DY, Murray JI, Portz HL, Joo YK(1985) Optimum seed coat scarification and light treatment for the germination of Zoysiagrass(Zoysia japonica Steud)seed. J. Kor. Soc. Hort. Sci. 26:179-185)。よって、ゾイシア属芝(Zoysia spp.)の葉節位の数は開花有無に対する指標になれる。
このような理由から葉節位の数を観察したが、２年目の場合、非抽薹植物体では葉節位の数が平均１１．４個観察されており、抽薹された植物体では葉節位の数が平均１３．６個観察されている。よって、２年目の非抽薹植物体は、葉節位の数からみて、追って抽薹される可能性がある。
したがって、４年目でさらに葉節位の数を観察したが、４年目の場合、抽薹された植物体の葉節位の数は、無処理区では平均１４．８個が観察されており、処理区では平均１５．７個が観察されているが、これに対し、非抽薹された処理区では平均１５．４個が観察されている。
図２には無処理区の抽薹された植物体のいずれか一つ（Ａ）と、処理区の非抽薹された植物体のいずれか一つ（Ｂ）との葉節位の数を比較することが可能な写真を例示した。図２において、バー(bar)の１ｃｍである。
非抽薹された処理区で葉節位の数が平均１５．４個であるにも拘らず抽薹されていないというのは、上記で引用した論文の内容、および前記の結果をまとめるとき、不稔性が誘導されたことを示すといえる。
一方、４年目の非抽薹された植物体のうち、２個体は矮性の形質を共に持っており、その２個体のうち１個体に対して図３に野生型植物体と比較した写真を示した。
【図１】
0005550642.tif 000004
【図２（Ａ）】
0005550642.tif 000005
【図２（Ｂ）】
0005550642.tif 000006
【図３（Ａ）】
0005550642.tif 000007
【図３（Ｂ）】
0005550642.tif 000008