(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 配列番号：２のアミノ酸1〜759と少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
b) 配列番号：２のアミノ酸65〜347と少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
c) 非常に高いストリンジェント条件下で、(i)配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、(ii)配列番号：１のヌクレオチド193〜1041、または(iii)(i)もしくは(ii)の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
d) 配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、または配列番号：１のヌクレオチド193〜1041を含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、から成る群から選定される、エンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸368〜569と少なくとも90％同一性を含んで成る糖質結合モジュール活性を含んで成る、請求項１に記載のa)、c)又はd)のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの以下の特質：
a) 4.4のpl、
b) 9の至適pH、
c) 40°Cの至適温度、及び
d) pH5〜10.5での安定性、を有する請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：１の配列をコードする成熟ポリペプチドにおいて少なくとも１つの突然変異を有し、該突然変異ヌクレオチド配列が配列番号：２のアミノ酸1〜759から成るポリペプチドをコードする、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
発現宿主の中で該ポリペプチドの生産を導く１種以上の制御配列に作用可能式に連結された請求項４または５に記載のポリヌクレオチド含んで成る核酸構造体。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項９】
(a) 該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構造体を含んで成る宿主細胞を、該ポリペプチドの生産を助長する条件下で培養すること；及び
(b) 該ポリペプチドを回収すること、を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産するための方法。
【請求項１０】
非常に高いストリンジェント条件下で、
(i) 配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、
(ii) 配列番号：１のヌクレオチド193〜1041、
(iii) 配列番号：１のヌクレオチド1104〜1707、または
(iv) (i)、(ii)、または(iii)の相補鎖とハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドであって、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んで成る酵素組成物。
【請求項１２】
プロテアーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ぺクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ(rhamnogalacturonase)、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ；またはそれらの混合物から成る群から選定される１種以上の酵素をさらに含んで成る、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
バイオマスが有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１１または１２に記載の酵素組成物で処理される、セルロース含有バイオマスの分解方法。
【請求項１４】
セルロース含有バイオマスの分解のための請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１または１２に記載の酵素組成物の使用。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１または１２に記載の酵素組成物の洗剤組成物中での使用。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１または１２に記載の酵素組成物の布地最終加工における使用。
【請求項１７】
染色繊維において局所化した色落ちを得るための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１または１２に記載の酵素組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１または１２に記載の酵素組成物を含んで成る洗剤組成物。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１または１２に記載の酵素組成物を含んで成る布地処理組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
配列
配列番号：１、バチルス種,ACE160エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド配列、
配列番号：２、バチルス種,ACE160エンドグルカナーゼ及び糖質結合モジュールのポリペプチド配列。
【０００２】
技術分野
本発明は、エンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。さらに本発明は、当該ポリヌクレオチドを含む核酸構造体、ベクター、及び宿主細胞、並びに当該ポリペプチドを生産するための方法、並びに洗剤、紙及びパルプ、オイル掘削、オイル抽出、ワイン及びジュース、食品添加物、動物飼料または繊維産業において使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
セルロースは、β-1,4-グリコシド結合によって連結したグルコースのポリマーである。セルロース鎖は多数の分子内及び分子間の水素結合を形成し、不溶性のセルロース微小繊維の形成をもたらす。セルロースのグルコースへの細菌による加水分解は、以下の３つの主要なセルロース分類：(i)セルロース分子中のβ-1,4-グリコシド結合を無作為に開裂する、エンド-β-1,4-グルカナーゼとも呼ばれるエンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.4)；(ii)非還元末端からセルロースを消化し、セロビオースを放出するセロビオヒドラーゼ(EC 3.2.1.91 )；及び(iii)セロビオースと低分子量のセロデキストリンを加水分解し、グルコースを放出するβ-グルコシダーゼ(EC 3.2.1.21)に関与する。
【０００４】
β-1,4-グリコシド結合は、他の天然ポリマー、例えば大麦及びオート麦等の植物由来のβ-グルカン中にも存在する。いくつかの場合では、エンドグルカナーゼは、非-セルロースポリマー等の加水分解も提供する。
【０００５】
セルラーゼは、多くの微生物によって生み出され、またしばしば多数の形態で存在する。セルロースの酵素分解の経済的意義の認識は、産業上使用され得る細菌性セルラーゼについての広範な探索を促進してきた。結果として多くのセルラーゼの酵素特質及び一次構造が調査されてきた。触媒ドメインのアミノ酸配列の疎水性クラスター分析の結果に基づき、これらのセルラーゼはグリコシルヒドロラーゼの多様なファミリーに入れられ；真菌性及び細菌性グリコシルヒドロラーゼは、35のファミリーにグループ化された(Henrissat, B.：A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), 309-316. Henrissat, B.,及びBairoch, A.：New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993), 781-788.)。大部分のセルラーゼは、プロリン及びヒドロキシアミノ酸残基を多く含み得るリンカーによって分離される糖質結合モジュール(CBM)及び触媒ドメイン(CAD)から成る。他のセルラーゼの分類は、それらのCBMの類似性に基づき確立され(Gilkes等.(1991))、グリコシルヒドロラーゼ(I-V)の５つのファミリーを提供する。
【０００６】
セルラーゼは、真菌類、放射菌類、粘液細菌類及び真正細菌類、さらに植物によるものも含む多くの微生物によって合成される。特にエンド-β-1,4-グルカナーゼの多種多様な特性が同定されてきた。多くの細菌性エンドグルカナーゼが発表されている(Gilbert, H.J.及びHazlewood, G. P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194. Henrissat, B.,及びBairoch, A.: New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993), 781-788.)。
【０００７】
セルロース分解酵素の重要な産業的使用は、例えば排水の改良のため、または再生紙の脱インキのために紙パルプを処理することを目的とする。セルロース分解酵素の他の重要な産業的使用は、セルロースの布地または繊維を、例えば洗剤組成物または繊維柔軟剤組成物中の成分として、新規の繊維のバイオポリッシング(衣類の最終加工)のために、またセルロース含有繊維、特にデニムの"ストーンウォッシュされた"外観を得るために処理することを目的し、またかかる処理のためのいくつかの方法は、例えばGB-A-1 368 599、EP-A-O 307 564及びEP-A-O 435 876、WO 91/17243、WO 91/10732、WO 91/17244、WO 95/24471及びWO 95/26398に示唆されている。日本国特許出願No.13049/1999は、洗剤に適するバチルス種,KSM-S237(FERM-P-16067として寄託されている)由来の耐熱性アルカリ性セルラーゼを開示する。
【０００８】
セルラーゼ、好適にはエンド-β-1,4-グルカナーゼ、活性(エンドグルカナーゼ、EC 3.2.1.4)を所望される場所に適用するために使用され得る新規のセルラーゼ酵素または酵素調製品を提供するための必要性がなお存在している。 
【０００９】
本発明の目的は、弱酸性からアルカリ性条件下で実質的なβ-1,4-グルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びポリペプチド組成物を提供し、また紙パルプ工程、布地処理、洗濯工程、抽出工程または動物飼料においてエンドグルカナーゼの改良された性能を提供することである。好適にはかかる新規の良好に挙動するエンドグルカナーゼは、組換え技術を使用することによって、高収率で生産可能であり、または生産される。
【００１０】
発明の概要
本発明は：
(a) 配列番号：２のアミノ酸１〜759と少なくとも72％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(b) (i)配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、または(ii)(i)の相補鎖と少なくとも低いストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；及び
(c) 配列番号：２のアミノ酸1〜759の１又は数個の保存的置換、欠失、及び/または挿入を含む変異体、から成る群から選定されるエンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する。
【００１１】
さらに本発明は：
(a) 配列番号：２のアミノ酸１〜759と少なくとも72％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b) (i)配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、または(ii)(i)の相補鎖と少なくとも低いストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド：から成る群から選定されるエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
さらに本発明は、当該ポリヌクレオチドを含む核酸構造体、組換え発現ベクター、及び組換え宿主細胞に関する。
【００１３】
さらに本発明は、
(a) 当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構造体を含む組換え宿主細胞を、当該ポリペプチドの生産を助長する条件下で培養すること；及び
(b) 当該ポリペプチドを回収すること、を含むかかるエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを生産するための方法に関する。
【００１４】
本発明のエンド-β-1,4-グルカナーゼは安定性と活性特質を有し、それは界面活性剤及び/または酸化活性剤（化学漂白剤等）を含む水性アルカリ性溶液を伴う適用において使用する際に、並外れて良好に適合される。かかる適用条件は、家庭用・産業用洗剤、布地最終加工処理及びセルロースパルプの製造またはリサイクルにおいて非常に一般的に見出される。
【００１５】
本発明のエンドグルカナーゼは、かかる関連の適用条件下で並外れた範囲までその活性を維持するので、例えば洗剤、紙/パルプ工程、または布地処理のために使用する場合に、他の公知の酵素よりも有用であると考えられる。したがって本発明は、洗剤または布地処理組成物、紙パルプの処理またはバイオマスの分解（例えばエタノール生産）のための組成物において本発明のポリペプチドを使用するための方法にも関する。さらに本発明は、布地、台所用品または硬表面を、当該ポリペプチドを含む洗剤で洗浄するための方法、セルロース布地または繊維を柔軟化、バイオポリッシングまたはストーンウォッシン等に処理するための方法にも関する。また排水または再生紙の脱インキを改良するための方法も含まれる。
【００１６】
さらに本発明は、タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構造体にも関し、当該遺伝子は、配列番号：１のヌクレオチド1〜99から成るシグナルペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列の一方または両方に作用可能式に連結される。
【００１７】
定義
エンドグルカナーゼ活性：用語"エンドグルカナーゼ活性"は、本明細書においてセルロース、リケニン及び穀物のβ-D-グルカン、EC 3.2.1.4.中の1,4-β-D-グルコシド結合のエンド型での加水分解を触媒する加水分解活性として定義される。エンドグルカナーゼ活性の測定方法は以下に示す。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸1〜759として示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、または配列番号：２のアミノ酸65〜347から成る触媒コアドメインの少なくとも70%、より好適には少なくとも80%、さらにより好適には少なくとも90%、さらにより好適には少なくとも95%、最適には少なくとも98%、及びさらに最適には少なくとも100%のエンドグルカナーゼ活性を有する。
【００１９】
単離ポリペプチド：本明細書において使用される用語"単離ポリペプチド"とは、少なくとも純度20％、好適には少なくとも純度40％、より好適には少なくとも純度60％、さらにより好適には少なくとも純度80％、最適には少なくとも純度90％、及びさらに最適には少なくとも純度95％であるとSDS-PAGEによって決定されたようなポリペプチドを言う。
【００２０】
実質的に純粋なポリペプチド：本明細書において用語"実質的に純粋なポリペプチド"とは、天然で付随して存在する他のポリペプチド材料を最大で10重量%、好適には最大で8重量%、より好適には最大で6重量%、より好適には最大で5重量%、より好適には最大で4重量%、最大で3重量%、さらにより好適には最大で2重量%、最適には最大で1重量%、及びさらに最適には最大で0.5重量%を含むポリペプチド調製品を言う。すなわち、実質的に純粋なポリペプチドは、当該調製品において存在する総ポリペプチド材料の重量で少なくとも純度92%、好適には少なくとも純度94%、より好適には少なくとも純度95%、より好適には少なくとも純度96%、より好適には少なくとも純度96%、より好適には少なくとも純度97%、より好適には少なくとも純度98%、さらにより好適には少なくとも純度99%、最適には少なくとも純度99.5%、及びさらに最適には純度100%であることが好適である。 
【００２１】
本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形態にあることが好適である。詳細には、当該ポリペプチドが"本質的に純粋な形態"にあること、すなわち当該ポリペプチド調製品が天然で付随して存在する他のポリペプチド材料を本質的に含まないことが好適である。これは、例えば周知の組換え方法の手段によって、または古典的な精製方法によって当該ポリペプチドを調製することによって達成され得る。
【００２２】
本明細書における用語"実質的に純粋なポリペプチド"とは、用語"単離ポリペプチド"及び"単離形態にあるポリペプチド"と同義である。
【００２３】
同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性は、パラメーター"同一性"によって記載される。
【００２４】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の配置がEMBOSSパッケージ(http://emboss.org)バージョン2.8.0のNeedleプログラムを用いることによって決定される。当該Needleプログラムは、Needleman, S. B.及びWunsch, C. D. (1970) J. Mo1. Biol. 48, 443-453において発表された広範囲の配置アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップオープニングペナルティーは10であり、またギャップエクステンションペナルティーは0.5である。
【００２５】
本発明のアミノ酸配列("発明配列"；例えば配列番号：２のアミノ酸1〜759、または配列番号：２のアミノ酸65〜347の触媒コアドメイン)と異なるアミノ酸配列("外来配列")間の同一性の程度は、それらの２つの配列の配置における正確な対の数として算出され、いずれかの最も短い"発明配列"の長さまたは"外来配列"の長さで割られる。結果はパーセント同一性で表される。
【００２６】
"発明配列"及び"外来配列"が、重複する同一の部位において同一のアミノ酸残基を有する場合に正確な対が起こる(下記の例の配置中では、これは「ｌ」で表される)。配列の長さは、配列中のアミノ酸残基の数である(例えば配列番号：２の"発明配列"の長さは、759個のアミノ酸である)。
【００２７】
以下の例の配置における重複は、配列１のアミノ酸配列"HTWGER.NLG"；または配列２のアミノ酸配列"HGWGEDANLA"である。ギャップは"."で示されている。
【００２８】
配置例
【化１】
0005571310.tif 000002
【００２９】
"発明配列"の重複の長さは、“発明配列”の少なくとも20%の長さ、より好適には“発明配列”の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、または少なくとも90%の長さであり得る。
【００３０】
"外来配列"の重複の長さは、“外来配列”の少なくとも20%の長さ、より好適には”発明配列”の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、または少なくとも90%の長さであり得る。
【００３１】
ポリペプチドフラグメント：本明細書における用語"ポリペプチドフラグメント"は、配列番号：２またはそれらの相同配列のアミノ及び／またはカルボキシ末端から欠失した１又は数個のアミノ酸を有するポリペプチドとして定義され、当該フラグメントはエンドグルカナーゼ活性を有する。好適には当該フラグメントは、少なくとも283個のアミノ酸残基、例えば配列番号：２のアミノ酸65〜347を含む。
【００３２】
サブシークエンス：本明細書における用語"サブシークエンス"とは、配列番号：１またはその相同配列の5'及び/または3'末端から欠失した１又は数個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として定義され、当該サブシークエンスは、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。好適にはサブシークエンスは、少なくとも849個のヌクレオチド、例えば配列番号：１の核酸193〜1041を含む。
【００３３】
対立遺伝子変異体：本明細書における用語"対立遺伝子変異体"とは、同一の染色体の遺伝子座を占める遺伝子の任意の２つ以上の代替形態を言う。対立遺伝子変異は、突然変異を介して天然に発生し、且つ個体群内に多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレント(コードされたポリペプチド中に変化がない)であってよく、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
【００３４】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書において使用される用語"実質的に純粋なポリヌクレオチド"とは、他の外来または所望されないヌクレオチドが存在せず、且つ遺伝子操作されたタンパク質生産系の中で使用するために適切な形態にあるポリヌクレオチド調製品を言う。したがって実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然で付随して存在する他のポリヌクレオチド材料を最大で10重量%、好適には最大で8重量%、より好適には最大で6重量%、より好適には最大で5重量%、より好適には最大で4重量%、より好適には最大で3重量%、さらにより好適には最大で2重量%、最適には最大で1重量%、及びさらに最適には最大で0.5重量%を含む。しかしながら実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモーター及びターミネーター等の天然の5'及び3'で翻訳されない領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、少なくとも純度90重量%、好適には少なくとも純度92重量%、より好適には少なくとも純度94重量%、より好適には少なくとも純度95重量%、より好適には少なくとも純度96重量%、より好適には少なくとも純度97重量%、さらにより好適には少なくとも純度98重量%、最適には少なくとも純度99重量%、及びさらに最適には少なくとも純度99.5重量%であることが好適である。本発明のポリヌクレオチドは、好適には実質的に純粋な形態にある。詳細には本発明において開示されるポリヌクレオチドは、"本質的に純粋な形態"、すなわち当該ポリヌクレオチド調製品が、天然で付随して存在する他のポリヌクレオチド材料を本質的に含まないことが好適である。本明細書における用語"実質液に純粋なポリヌクレオチド"は、用語"単離ポリヌクレオチド"及び"単離形態にあるポリヌクレオチド"と同義である。当該ポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起源、または任意のそれらの組み合せであってよい。
【００３５】
核酸構造体：本明細書において使用される用語"核酸構造体"とは、単鎖または二重鎖の核酸分子であって、天然遺伝子から単離されたもの、または核酸のセグメントを天然で他に存在しないような様式で含むように修飾されたものを言う。用語核酸構造体は、核酸構造体が本発明のコード配列の発現に要求される制御配列を含む場合は、用語"発現カセット"と同義である。 
【００３６】
制御配列：本明細書における用語"制御配列"とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必須または有利となる全ての要素を含むものと定義される。それぞれの制御配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然または外来であり得る。かかる制御配列は、制限されずにリーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを含む。最低でも制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする当該ヌクレオチド配列のコード領域を有する制御配列の結紮を促進する特定の制限部位を導入する目的でリンカーを備え得る。
【００３７】
作用可能式に連結した：本明細書における用語"作用可能式に連結した"とは、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を導くように、制御配列が当該ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に置かれた配置を言う。
【００３８】
コード配列：本明細書において使用される用語"コード配列"とは、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームによって決定され、通常、ATG開始コドンまたはGTG及びTTG等の代替開始コドンにより開始する。コード配列は、DNA、cDNA、または組換えヌクレオチド配列であり得る。
【００３９】
発現：用語"発現"とは、制限されずに転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むポリペプチドの生産に関与する任意のステップを含む。
【００４０】
発現ベクター：本明細書における用語"発現ベクター"とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む直鎖または環状DNA分子として定義され、当該発現ベクターは、その発現を提供するために更なるヌクレオチドに作用可能式に連結される。
【００４１】
宿主細胞：本明細書において使用される用語"宿主細胞"は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構造体により形質転換、トランスフェクション、トランスダクション等を受けやすい任意の細胞型を含む。 
【００４２】
発明の詳細な説明
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド
第一の観点では本発明は、配列番号：２のアミノ酸1〜759と同一の程度を有するアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、すなわち成熟ポリペプチドの少なくとも72%、より好適には少なくとも75%、より好適には少なくとも80%、より好適には少なくとも85%、さらにより好適には少なくとも90%、最適には少なくとも95%、及びさらに最適には少なくとも97%のエンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチド(以後"相同ポリペプチド")に関する。好適な観点では当該相同ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸1〜759とは10個のアミノ酸まで、好適には5個のアミノ酸まで、より好適には4個のアミノ酸まで、さらにより好適には3個のアミノ酸まで、最適には2個のアミノ酸まで、及びさらに最適には1個のアミノ酸まで相違するアミノ酸配列を有する。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、好適には配列番号：２のアミノ酸配列またはそれらの対立遺伝子変異体；或いはエンドグルカナーゼ活性を有するそれらのフラグメントを含む。好適な観点ではポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含む。他の好適な観点ではポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列またはそれらの対立遺伝子変異体；或いはエンドグルカナーゼ活性を有するそれらのフラグメントから成る。他の好適な観点ではポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列から成る。
【００４４】
他の好適な観点ではポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸65〜347、またはそれらの対立遺伝子変異体；或いはエンドグルカナーゼ活性を有するそれらのフラグメントにおける触媒コアドメインを含む。当該触媒コアドメインのポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸65〜347と少なくとも86%、より好適には少なくとも88%、さらにより好適には少なくとも90%、最適には少なくとも95%、及びさらに最適には少なくとも97%の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する。他の好適な観点ではポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸65〜347における触媒コアドメイン、またはそれらの対立遺伝子変異体；或いはエンドグルカナーゼ活性を有するそれらのフラグメントを含む。他の好適な観点ではポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸65〜347から成る。
【００４５】
当該触媒コアドメインの注釈は、グリコシルヒドロラーゼファミリー5のセルラーゼに対する相同に基づく(Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 309-316 (1991); Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 781-788 (1993); Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316 695-696 (1996); Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3 853-859 (1995); Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemesle L., Mornon J. -P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. Gene 81 83-95 (1989); Py B., Bortoli-German I., Haiech J., Chippaux M., Barras F. Cellulase EGZ of Erwinia chrysanthemi: structural organization and importance of His98 and Glu133 residues for catalysis. Protein Eng. 4 325-333 (1991))。触媒コアドメインのドメイン注釈は、http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/, http://www.ebi.ac.uk/interpro/, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/, またはhttp://www.expasy.org/prosite/を介して入手できる。
【００４６】
本発明の他の観点は、当該ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸368〜569において糖質結合モジュールを含む。他の好適な観点では、本発明は、配列番号：２のアミノ酸368〜569と少なくとも67%、より好適には少なくとも70%、より好適には少なくとも75%、より好適には少なくとも80%、より好適には少なくとも85%、さらにより好適には少なくとも90%、最適には少なくとも95%、及びさらに最適には少なくとも97%の同一性の程度を有する糖質結合モジュールを含むポリペプチドに関する。他の好適な態様では、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸368〜569における糖質結合モジュール、またはそれらの対立遺伝子変異体：或いは糖質結合活性を有するそれらのフラグメントを含む。他の好適な観点では、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸368〜569から成る。
【００４７】
糖質結合モジュールは、ファミリー17/28に属する。CBMの注釈は、公知の配列、特にKSM-635のCBM(Ozaki,K. Shikata,S. Kawai,S. lto,S. Okamoto,K.; "Molecular cloning and nucleotide sequence of a gene for alkaline Cellulase from Bacillus sp. KSM-635."; J. Gen. Microbiol. 136:1327-1334 (1990), Uniprot No. P19424)との相同に基づき、それは以下に発表されたガラクトース結合様ドメインに基づくCBMとして注釈された。Ito N., Phillips S. E., Stevens C, Ogel Z. B., McPherson M. J., Keen J. N., Yadav K.D., Knowles P. F. Novel thioether bond revealed by a 1.7 A crystal structure of galactose oxidase. Nature 350 87-90 (1991); Macedo-ribeiro S., Bode W., Huber R., Quinn-Allen M.A., Kim S.W., Ortel T.L., Bourenkov G. P., Bartunik H. D., Stubbs M.T., Kane W.H., Fuentes-prior P. Crystal structures of the membrane-binding C2 domain of human coagulation factor V. Nature 402 434-439 (1999); Himanen J. P., Rajashankar K. R., Lackmann M., Cowan CA. , Henkemeyer M., Nikolov D. B. Crystal structure of an Eph receptor-ephrin complex. Nature 414 933-938 (2001) [PUBMED:1 1780069] [PUB00010665];及びMarintchev A., Mullen M.A., Maciejewski M. W., Pan B., Gryk M. R., Mullen G. P. Solution structure of the single-strand break repair protein XRCC1 N-terminal domain. Nat. Struct. Biol. 6 884-893 (1999)。糖質結合モジュールのドメイン注釈は、http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/, http://www.ebi.ac.uk/interpro/, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/,またはhttp://www.expasy.org/prosite/を介して入手できる。
【００４８】
第二の観点では、本発明は、非常に低いストリンジェント条件下、好適には低いストリンジェント条件下、より好適には中程度のストリンジェント条件下、より好適には中程度から高いストリンジェント条件下、さらにより好適には高いストリンジェント条件下、及び最適には非常に高いストリンジェント条件下で、(i)配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、(ii)(i)のサブシークエンスまたは(iii)(i)もしくは(ii)の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるエンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する(J. Sambrook, E. F. Fritsch, 及びT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d 編, Cold Spring Harbor, New York)。配列番号：１のサブシークエンスは、少なくとも100個の連続ヌクレオチドまたは好適には少なくとも200個の連続ヌクレオチド、より好適には300、400、500、600、700、800、900個の連続ヌクレオチド、またはさらにより好適には少なくとも1000個の連続ヌクレオチドを含む。さらにサブシークエンスは、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし得る。
【００４９】
配列番号：１のヌクレオチド配列またはそれらのサブシークエンス、並びに配列番号：２のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントは、当業界において周知の方法によって多様な属または種の株からエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定及びクローニングするための核酸プローブを設計するために使用され得る。詳細には、かかるプローブは、それらが中に存在する対応の遺伝子を同定または単離するために、標準的なサザンブロット手段によって注目の属または種のゲノムまたはcDNAとのハイブリダイゼーションに使用され得る。かかるプローブは、全配列よりも顕著に短くてよいが、少なくとも14、好適には少なくとも25、より好適には少なくとも35、及び最適には少なくとも70個のヌクレオチド長であるべきである。しかしながら核酸プローブは、少なくとも100個のヌクレオチド長であることが好適である。例えば核酸プローブは、少なくとも200個のヌクレオチド、好適には少なくとも300個のヌクレオチド、より好適には少なくとも400個のヌクレオチド、または最適には少なくとも500個のヌクレオチド長であってよい。さらに長いプローブ、例えば少なくとも600個のヌクレオチド、好適には少なくとも700個のヌクレオチド、より好適には少なくとも800個のヌクレオチド、または最適には少なくとも900個のヌクレオチド長の核酸プローブを使用してもよい。DNA及びRNAプローブの両方を使用することができる。プローブは、典型的に対応の遺伝子を検出するために(例えば32P、3H、35S、ビオチン、またはアビジンで)ラベル化される。かかるプローブは、本発明に包含される。
【００５０】
したがってかかる他の生物から調製されるゲノムDNAライブラリーは、上記プローブとハイブリダイズし、且つエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーニングされ得る。他の生物由来のゲノムまたは他のDNAは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または他の分離技術によって分離され得る。ライブラリーまたは分離されたDNA由来のDNAは、ニトロセルロースまたは他の適切な担体材料上に移されて固定され得る。配列番号：１またはそのサブシークエンスと相同するクローンまたはDNAを同定するための担体材料は、サザンブロットにおいて使用される。
【００５１】
本発明の目的のためのハイブリダイゼーションは、当該ヌクレオチド配列が、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列、その相補鎖、またはそれらのサブシークエンスに対応するラベル化核酸プローブと、非常に低いストリンジェント条件から非常に高いストリンジェント条件下でハイブリダイズすることを示す。それらの条件下で当該核酸プローブにハイブリダイズする分子は、X-線フィルムを用いて検出できる。
【００５２】
好適な観点では、当該核酸プローブは、配列番号：１のヌクレオチド193〜1041である。他の好適な観点では、当該核酸プローブは、配列番号：２のポリペプチド、またはそのサブシークエンスをコードするポリヌクレオチド配列である。他の好適な観点では、当該核酸プローブは配列番号：１である。他の好適な観点では、当該核酸プローブは配列番号：１の領域をコードする成熟ポリペプチドである。
【００５３】
少なくとも100個のヌクレオチド長の長いプローブについては、非常に低いストリンジェント条件から非常に高いストリンジェント条件は、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして、42℃、5×SSPE、0.3% SDS、200 μg/mlのせん断及び変性サケ精子DNA、並びに非常に低い及び低いストリンジェント条件については25%ホルムアミド、中等度〜高いストリンジェント条件については35%ホルムアミド、または高い及び非常に高いストリンジェント条件については50%ホルムアミド、その後、最適には12〜24時間の標準的なサザンブロット手段が続くと定義される。
【００５４】
少なくとも100個のヌクレオチド長の長いプローブについては、担体材料は、2×SSC、0.2% SDSを用いて、好適には少なくとも45℃(非常に低いストリンジェント条件)、より好適には少なくとも50℃(低いストリンジェント条件)、より好適には少なくとも55℃(中等度のストリンジェント条件)、より好適には少なくとも60℃(中等度〜高いストリンジェント条件)、さらにより好適には少なくとも65℃(高いストリンジェント条件)、及び最適には少なくとも70℃(非常に高いストリンジェント条件)で、最終的に３回、それぞれ15分ずつ洗浄される。好適には、洗浄は、0.2×SSC、0.2% SDSを用いて、好適には少なくとも45℃(非常に低いストリンジェント条件)、より好適には少なくとも50℃(低いストリンジェント条件)、より好適には少なくとも55℃(中等度のストリンジェント条件)、より好適には少なくとも60℃(中等度〜高いストリンジェント条件)、さらにより好適には少なくとも65℃(高いストリンジェント条件)、及び最適には少なくとも70℃(非常に高いストリンジェント条件)で行われる。
【００５５】
約15個のヌクレオチドから約70個のヌクレオチド長の短いプローブについてのストリンジェント条件は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、並びに約5℃〜約10℃のBolton及びMcCarthy(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)による計算を用いて以下に算出したTmで、0.9 MのNaCI、0.09 MのTris-HCI、pH 7.6、6 mMのEDTA、0.5%のNP-40、1×Denhardt溶液、1 mMのピロリン酸ナトリウム、1 mMのリン酸一ナトリウム(sodium monobasic phosphate)、0.1 mMのATP、及び0.2 mgの酵母RNA／ml中での洗浄ポストハイブリダイゼーション、その後の標準的なサザンブロット手段が続くと定義される。
【００５６】
約15個〜約70個のヌクレオチド長の短いプローブについての担体材料は、6×SCC＋0.1%のSDS中で15分間を１回、及び6×SSCを用いて、5℃〜10℃の以下に算出したTmで15分間をそれぞれ２回で洗浄される。
【００５７】
第三の観点では本発明は、ユニークモチーフとして配列番号：１のヌクレオチド193〜1041を含むポリヌクレオチドによってコードされるエンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する。
【００５８】
第四の観点では、本発明は、以下の物理化学特質：4.4のpl、9の至適pH、40℃の至適温度、及びpH5〜10.5での安定性を有する単離ポリペプチドに関する。本発明のβ-1,4-グルカナーゼは、Fe(II)イオンによって有意に不活性化されない。第一鉄イオンの存在に対する当該ポリペプチドの酵素活性の感受性は、当該ポリペプチドの適用性（金属容器または機材において発生するプロセス等）に制限を与え得る。
【００５９】
第五の観点では、本発明は、配列番号：２またはその成熟ポリペプチドの１又は数個のアミノ酸の保存的置換、欠失、及び/または挿入を含む人工的な変異体に関する。アミノ酸の変化は天然には稀なタンパク質のフォールディング及び/または活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的に１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；アミノ末端のメチオニン残基等の小さなアミノ-またはカルボキシル末端伸長；約20〜25残基までの小さなリンカーペプチド；またはポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープまたは結合ドメイン等の正味電荷または他の機能を変えることによって精製を促進する小さな伸長が好適である。
【００６０】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシン、及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、及び低分子アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン)の群にある。一般に特異的活性を変化させないアミノ酸置換は当業界において公知であり、例えばH. Neurath及びR. L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New Yorkにおいて発表されている。最も普通に起こる変化は、Ala/Ser、Val/lle、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/lle、Leu/Val、Ala/Glu、及びAsp/Glyである。
【００６１】
20個の標準的なアミノ酸に加えて、標準的ではないアミノ酸(4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリシン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα-メチルセリン等)は、多種多様なポリペプチドのアミノ酸残基で置換され得る。遺伝子コードによりコードされていない限られた数の非保存的アミノ酸、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基の代わりに成り得る。"非天然アミノ酸"はタンパク質合成の後に修飾され、及び/またはそれらの側鎖に標準的なアミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然アミノ酸は化学的に合成でき、また好適には商業的に入手可能であり、またピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、及び3,3-ジメチルプロリンを含む。
【００６２】
或いは当該アミノ酸変化は、当該ポリペプチドの物理化学的特性を変化させるような性質のものである。例えばアミノ酸変化は、当該ポリペプチドの熱安定性を改善し、基質特異性を変え、至適pH等を変化させ得る。
【００６３】
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン-スキャニング突然変異誘発(Cunningham及びWells, 1989, Science 244: 1081-1085)等の公知の手段によって同定され得る。後者の技術における単一のアラニン突然変異は、分子中の全ての残基に導入され、そして得られた突然変異分子は、生物アッセイ(即ちエンドグルカナーゼ活性)について検査され、当該分子の活性に対して決定的なアミノ酸残基を同定する。Hilton等., 1996, J. Biol. Chem. 271：4699-4708も参照。当該酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の突然変異接触部位にあるアミノ酸との結合において、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識等の技術によって決定されるような構造の物理学的分析によっても決定され得る。例えばde Vos等., 1992, Science 255: 306-312; Smith等., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver等., 1992, FEBS Lett. 309:59-64を参照。必須アミノ酸の同定は、本発明にかかるポリペプチドに関するポリペプチドによる同定の分析からも推論され得る。
【００６４】
単一または複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え、及び/またはシャフリング、その後の関連のスクリーニング手段（Reidhaar-Olson及びSauer, 1988, Science 241：53-57；Bowie及びSauer, 1989, Proc. Natl. Acad. ScL USA 86：2152-2156；WO 95/17413；またはWO 95/22625によって開示されている手段等）の公知の方法を用いて作製及び試験され得る。使用され得る他の方法は、エラープローンPCR、ファージディスプレイ(例えばLowman等., 1991 , Biochem. 30:10832-10837；米国特許No. 5,223,409；WO 92/06204)、及び領域指定突然変異誘発(Derbyshire等., 1986, Gene 46:145；Ner等., 1988, DNA 7:127)を含む。
【００６５】
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド起源
本発明のポリペプチドは、任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的のために、取得源に関連して本明細書において使用される用語"得られた形態"とは、ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドが当該起源によって、または当該起源由来の当該ヌクレオチド配列が挿入された株によって生産されたことを意味する。好適な観点では、取得源から得られた当該ポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【００６６】
本発明のポリペプチドは、細菌性ポリペプチドであってよい。例えば当該ポリペプチドは、バチルスポリペプチド等のグラム陽性細菌性ポリペプチド、例えばバチルス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリクエファシネス(amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス（brevis）、バチルス・サーキュランス(circulans)、バチルス・コアグランス(coagulans)、バチルス・ロータス(lautus)、バチルス・レンタス(lentus)、バチルス・リチェニホルミス(licheniformis)、バチルス・メガテリウム(megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィルス(stearothermophilus)、バチルス・スブチリス(subtilis)、またはバチルス・チューリンゲンシス(thuringiensis)ポリペプチド；またはストレプトミセスポリペプチド、例えばストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)またはストレプトミセス・ムリナス(murinus)ポリペプチド；またはグラム陰性細菌性ポリペプチド、例えば大腸菌（E.coll）またはシュードモナス(Pseudomonas)種ポリペプチドであってよい。
【００６７】
他の好適な観点では、当該ポリペプチドは、バチルス種、ACE160ポリペプチド、例えば配列番号：２のポリペプチドである。
【００６８】
前述の種について、本発明は完全な状態及び不完全な状態の両方、並びに公知である種の名前に関わらず、他の分類上の同等物、例えばアナモルフ含むことが理解されるだろう。当業者は適切な同等物の同一性を容易に理解するだろう。
【００６９】
それらの種株は、American Type Culture Collection (ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center(NRRL)等の多くの菌株保存機関において公に容易に入手することができる。
【００７０】
さらにかかるポリペプチドは、天然(例えば土壌、たい肥、水等)から単離された微生物を含む他の起源から、上記プローブを用いて同定及び取得され得る。微生物を天然生息環境から単離するための技術は、当業界において周知である。そして当該ポリヌクレオチドは、他の微生物のゲノムまたはcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって得てもよい。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が当該プローブによって一度検出されれば、当該ポリヌクレオチドは、通常の当業者に周知の技術を利用することによって単離またはクローン化することができる(例えばSambrook等.,1989,前掲を参照)。
【００７１】
さらに本発明のポリペプチドは、他のポリペプチドがそれらのポリペプチドまたはフラグメントのN-末端またはC-末端で融合した融合ポリペプチドまたは開裂可能な融合ポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(またはそれらの部分)を本発明のヌクレオチド配列(またはそれらの部分)に融合することによって生産される。融合ポリペプチドを生産するための技術は当業界において公知であり、またそれらがフレーム中にあり、且つ融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミナーターの制御下にあるように、当該ポリペプチドをコードするコード配列を結紮することを含む。
【００７２】
ポリヌクレオチド
さらに本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドに関する。好適な観点では、当該ポリヌクレオチド配列は、配列番号：１に発表される。他の好適な観点では、当該ヌクレオチド配列は、配列番号：１の成熟ポリペプチドコード領域である。さらに本発明は、遺伝子コードの縮退の利点によって配列番号：１とは異なる配列番号：２のアミノ酸配列またはそれらの成熟ポリペプチドを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに本発明は、配列番号：２のアミノ酸65〜347の触媒コアドメイン、または配列番号：２のアミノ酸368〜569のフラグメント等のエンドグルカナーゼ活性を有する配列番号：２のフラグメントをコードする配列番号：１のサブシークエンスに関する。
【００７３】
さらに本発明は、配列番号：１の配列をコードする成熟ポリペプチド中の少なくとも１つの突然変異を含む成熟ポリペプチドに関し、当該突然変異のヌクレオチド配列は、配列番号：２のアミノ酸1〜759から成るポリペプチドをコードする。
【００７４】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローン化するために使用される技術は当業界において公知であり、且つゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、またはそれらの組み合せを含む。本発明のポリヌクレオチドのかかるゲノムDNAからのクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または共通構造の特徴を有するクローン化DNAフラグメントを検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることによって達成され得る。例えばlnnis等., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照。リガーゼ連鎖反応(LCR)、結紮活性化転写(ligated activated transcription：LAT)及びヌクレオチド配列に基づく増幅(NASBA)等の他の核酸増幅手段も使用され得る。当該ポリヌクレオチドは、バチルス、または他のもしくは関連の生物の株からクローン化され得るので、例えば当該ヌクレオチド配列の領域をコードするポリペプチドの対立遺伝子の変異体または種変異体であってよい。
【００７５】
さらに本発明は、配列番号：１の配列をコードする成熟ポリペプチド(すなわち、ヌクレオチド100〜2376)に対して、少なくとも60%、好適には少なくとも65%、より好適には少なくとも70%、より好適には少なくとも75%、より好適には少なくとも80％、より好適には少なくとも85%、より好適には少なくとも90%、さらにより好適には少なくとも95%、及び最適には少なくとも97%の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を有する、活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００７６】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の修飾は、当該ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であり得る。用語当該ポリペプチドに"実質的に類似"とは、当該ポリペプチドの非天然形態を言う。これらのポリペプチドは、その天然源から単離されたポリペプチドとはいくつか遺伝子操作された方法において異なり得る（例えば特異的活性、熱安定性、至適pH等において異なる人工的な変異体）。当該変異体配列は、配列番号：１の領域をコードするポリペプチド、例えばそれらのサブシークエンスとして存在するヌクレオチド配列を基礎として、及び/または当該ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドとは異なる他のアミノ酸配列を生じないが、酵素の生産を意図する宿主生物のコドン利用に対応するヌクレオチド置換を導入することによって、或いは多様なアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換を導入することによって構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的な説明は、例えばFord等., 1991 , Protein Expression and Purification 2: 95-107を参照。
【００７７】
かかる置換が当該分子の機能に重要な領域の外側に成され、なお活性ペプチドをもたらすことができることは、当業者にとって明白であろう。当該ポリペプチドの活性に必須のアミノ酸残基は、本発明の単離ポリヌクレオチドによってコードされるので、好適には置換にかけられず、部位指定突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発(例えばCunningham及びWells, 1989, Science 244:1081-1085参照)等の当業界に公知の手段によって同定され得る。後者の技術における突然変異は、当該分子において全て正に電荷した残基が導入され、そして得られた突然変異分子は当該分子の活性に対して重要であるアミノ酸残基を同定するためにエンドグルカナーゼ活性を試験される。さらに基質−酵素相互反応の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学、または光親和性標識(例えばde Vos等., 1992, Science 255: 306-312; Smith等., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver等., 1992, FEBS Letters 309: 59-64参照)等の技術によって決定されるような３次元構造の分析によって決定され得る。
【００７８】
さらに本発明は、非常に低いストリンジェント条件下、好適には低いストリンジェント条件下、より好適には中等度のストリンジェント条件下、より好適には中等度〜高いストリンジェント条件下、さらにより好適には高いストリンジェント条件下、及び最適には非常に高いストリンジェント条件下で、(i)配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、(ii)配列番号：１のヌクレオチド193〜1041、(iii)配列番号：１のヌクレオチド1104〜1707、または(iv)(i)〜(iii)の相補鎖とハイブリダイズする本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；或いは本明細書において定義されたそれらの対立遺伝子変異体及びサブシークエンス(Sambrook等.,1989、前掲)に関する。
【００７９】
さらに本発明は、(a)あるDNAの個体群を非常に低い、低い、中等度、中等度〜高い、または非常に高いストリンジェント条件下で、(i)配列番号：１のヌクレオチド100〜2376、または(ii)(i)の相補鎖とハイブリダイズさせること；及び(b)エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするハイブリダイズしているポリペプチドを単離することによって得られる単離ポリペプチドに関する。
【００８０】
核酸構造体
さらに本発明は、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞中でコード配列を発現させるようにした１種以上の制御配列に作用可能式に連結された本発明の単離ポリペプチドを含む核酸構造体に関する。
【００８１】
本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、当該ポリペプチドの発現のために提供される多様な方法において操作され得る。ベクターに挿入される前の当該ポリヌクレオチド配列の操作は、発現ペクターによって所望または必要とされ得る。組換えDNA方法を利用するポリヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当業界において周知である。
【００８２】
制御配列は適切なプロモーター配列であり、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するための宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、当該ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、突然変異、切り詰め、及びハイブリッドプロモーターを含む選定の宿主細胞中で転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってよく、また宿主細胞と同種または異種の細胞外または細胞間のポリペプチドをコードする遺伝子から獲得され得る。
【００８３】
特に細菌性宿主細胞中で、本発明の核酸構造体の転写を指示するために適したプロモーターの例は、大腸菌(E.coli)lacオペロン、ストレプロミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、バチルス(Bacillus)・スブチリス(subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リへニホルミス(licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・ステアロサルモフィルス(stearothermophilus)マルトース生成性(maltogenic)アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリクエファシエンス(amyloliquefaciens)αアミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リへニホルミス(licheniformis)ぺニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルス・スブチリスxylAおよびxylB遺伝子、および原核生物性β-ラクタマーゼ遺伝子(Villa-Kamaroff等., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)から得られるプロモーター、並びにtacプロモーター(DeBoer等., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25)である。さらにプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria"、Scientific American, 1980, 242: 74-94;及びSambrook等., 1989,前掲に発表されている。
【００８４】
糸状菌宿主細胞において、本発明の核酸構造体の転写を指示するのに適したプロモーターの例は、アスペルギルス(Aspergillus)・オリザエ(oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコール(Rhizomucor)・ミエへイ(miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー(niger)中性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・酸安定性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリ(awamori)グルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミエへイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ・アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニダランス(nidulans)アセトアミダーゼ、フサリウム(Fusarium)・ベネナタム(venenatum)アミログルコシダーゼ (WO 00/56900)、フサリウム・ベネナタム(venenatum)・ダリア(Daria)(WO 00/56900)、フサリウム・ベネナタム・クイン(Quinn)(WO 00/56900)、フサリウム・オキシスポラム(oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(WO 96/00787)、トリコデルマ(Trichoderma)・リーセイ(reesei)β-グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイ・セロビオヒドロラーゼI、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーセイ・キシラナーゼI、トリコデルマ・リーセイ・キシラナーゼII、トリコデルマ・リーセイ・β-キシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、並びにNA2-tpiプロモーター(アスペルギルス・ニガー・中性α-アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるプロモーターのハイブリッド)；及びそれらの突然変異体、切り詰め、及びハイブリッドプロモーターである。
【００８５】
酵母宿主において有用なプロモーターは、サッカロミセス(Saccharomyces)・セレビシエ(cerevisiae)エノラーゼ(ENO-1)、サッカロミセス・セレビシエ・ガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロミセス・セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH1、ADH2/GAP)、サッカロミセス・セレビシエ・トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、サッカロミセス・セレビシエ・メタロチオニン(CUP1)、およびサッカロミセス・セレビシエ・3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos等., 1992, Yeast 8: 423-488に発表されている。
【００８６】
さらに制御配列は、適切な転写ターミネーター配列であり、転写を終了するために宿主細胞によって認識される配列であり得る。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3'末端に作用可能式に連結される。宿主細胞の選定において機能的である任意のターミネーターは、本発明において使用され得る。
【００８７】
糸状菌宿主細胞に好適なターミネーターは、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーα-グルコシダーゼ、およびフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００８８】
酵母宿主細胞にとって好適なターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ・チトクロームC(CYC1)、及びサッカロミセス・セレビシエ・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞にとって有用な他のターミネーターは、Romanos等, 1992,前掲に発表されている。
【００８９】
さらに制御配列は、適切なリーダー配列であり、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域であり得る。リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’末端に作用可能式に連結される。選定の宿主細胞において機能する任意のリーダー配列は、本発明において使用され得る。
【００９０】
糸状菌宿主細胞に好適なリーダーは、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニダランス・トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【００９１】
酵母宿主細胞に適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ・エノラーゼ(ENO-1)、サッカロミセス・セレビシエ3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエα-因子、及びサッカロミセス・セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。
【００９２】
さらに制御配列は、ポリアデニル化配列、当該ヌクレオチド配列の3'末端に作用可能式に連結された配列、及び転写の際に転写されるmRNAにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列であってよい。選定の宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明において使用され得る。
【００９３】
糸状菌宿主細胞のために好適なポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランス・アントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガーα-グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【００９４】
酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、Guo及びSherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15：5983-5990に発表されている。
【００９５】
さらに制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列についてコードし、且つ当該細胞の分泌経路の中に当該コードされたポリペプチドを導くシグナルペプチドコード領域であり得る。当該ヌクレオチド配列のコード配列の5'末端は、翻訳読み取りフレームの中で当該分泌ペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結したシグナルペプチドコード領域を本質的に含み得る。或いは、コード配列の5'末端は、当該コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含み得る。外来のシグナルペプチドコード領域は、当該コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場所に要求され得る。或いは外来のシグナルペプチドコード領域は、当該ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域に単純に置き換わり得る。しかしながら、発現ポリペプチドを選定の宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域は、本発明において使用され得る。
【００９６】
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、バチルスNCIB 11837マルトース生成性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスα-アミラーゼ、バチルス・リチェニホルミス・スブチリシン、バチルス・リチェニホルミスβ-ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、及びバチルス・スブチリスprsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらにシグナルペプチドは、Simonen及びPalva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137によって発表されている。
【００９７】
糸状菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエへイ・アスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ(Humicola)・インソレンス(insolens)セルラーゼ、及びフミコラ・ラヌギノース(lanuginose)リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００９８】
好適な観点では、当該シグナルペプチドコード領域は、配列番号：２のアミノ酸-33〜-1をコードする配列番号：１のヌクレオチド1〜99である。
【００９９】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ・α-因子及びサッカロミセス・セレビシエ・インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos等, 1992,前掲に発表されている。
【０１００】
さらに制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列についてコードするペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド(またはいくつかの場合ではチモーゲン)として公知である。プロポリペプチドは一般に不活性であり、また当該プロポリペプチドから当該プロペプチドの触媒的または自己触媒的な開裂によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・スブチリス・アルカリ性プロテアーゼ(aprE)、バチルス・スブチリス・中性プロテアーゼ(nprT)、サッカロミセス・セレビシエα-因子、リゾムコール・ミエへイ・アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びミセリオフトラ(Myceliophthora)・サーモフィラ(thermophila)ラッカーゼの遺伝子から入手され得る(WO 95/33836)。
【０１０１】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域が共にポリペプチドのアミノ末端に存在する場合には、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、且つシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端に位置する。
【０１０２】
さらに宿主細胞の成長に関するポリペプチドの発現を調節することができる調節配列を付加することが所望され得る。調節系の例は、制御化合物の存在を含み、化学的または物理的刺激への応答において遺伝子の発現を開始または停止させるものである。原核細胞系における調節系は、lac、tac、及びtrpオペレーターシステムを含む。酵母では、ADH2 系またはGAL1系が使用され得る。糸状菌では、TAKAα-アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ・グルコアミラーゼプロモーターが調節配列として使用され得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅が可能なものである。真核細胞系では、メトトレキサートの存在中で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及び重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含むものである。これらの場合において、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節遺伝子と共に作用可能式に連結される。
【０１０３】
発現ベクター
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。上記の多様な核酸及び制御配列は、制限部位で当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入または置換できる１種以上の慣用の制限部位を含み得る組換え発現ベクターを生み出すために共に連結され得る。或いは本発明のヌクレオチド配列は、発現に適するベクター中に当該配列を含むヌクレオチド配列または核酸構造体を挿入することによって発現され得る。発現ベクターの作製において、コード配列は発現に適した制御配列と共に作用可能式に連結されるように、ベクター中に位置付けられる。
【０１０４】
組換え発現ベクターは、組換えDNA手段に都合よくかけることができ、また当該ヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター(例えばプラスミドまたはウィルス)であり得る。ベクターの選定は、典型的にベクターと当該ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するだろう。ベクターは線状または閉環プラスミドであり得る。
【０１０５】
ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外に存在するようなベクターであってよく、その複製は染色体複製から独立し、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含み得る。或いはベクターは宿主細胞に導入される際にゲノム中に統合されたものであってよく、そしてベクターが統合されたゲノム中の染色体と共に複製される。さらに宿主細胞のゲノムへ導入される全てのDNAを一緒に含む単一のベクターもしくはプラスミド、または２種以上のベクターまたはプラスミド、或いはトランスポゾンが使用され得る。
【０１０６】
本発明のベクターは、好適には形質転換細胞の選定を容易にする１種以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物剤またはウィルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対するプロトトロフィー等を提供する遺伝子である。
【０１０７】
条件付での必須遺伝子は、非抗生物質選択マーカーとして機能し得る。細菌性の条件付での必須な非抗生物質選定マーカーの非限定的な例は、バチルス・スブチリス、バチルス・リチェニホルミス、または他のバチルス由来のdal遺伝子であり、それらは細菌がD-アラニンの不存在下において培養される場合のみに必須である。さらにUDP-ガラクトースのターンオーバーに関与する酵素をコードする遺伝子は、細胞がガラクトースの存在中で成長する、またはガラクトースの存在に対して生じる培地中で成長する場合に細胞中で必須マーカーとして機能し得る。かかる遺伝子の非限定的な例は、UTP-依存性ホスホリラーゼ(EC 2.7.7.10)、UDP-グルコース依存性ウリジリルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.12)、またはUDP-ガラクトースエピメラーゼ(EC 5.1.3.2)をコードするB.スブチリスまたはB.リチェニホルミス由来のものである。さらにxylA等のバチルスのキシロースイソメラーゼ遺伝子は、キシロースと共に唯一の炭素源として最小限の培地中で細胞成長における選択マーカーとして使用され得る。さらにグルコン酸塩、gntK、及びgntPを利用するために必要な遺伝子は、グルコン酸塩と共に唯一の炭素源として最小限の培地中で細胞成長における選択マーカーとして使用され得る。条件付で必須の遺伝子の他の例は、当業界において公知である。抗生物質選択マーカーは、アンピリシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の抗生物質に対する抗生物質抵抗性を与える。
【０１０８】
酵母宿主細胞に適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1 、及びURA3である。糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーは、制限されずに、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチン・カルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸還元酵素)、pyrG(オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(アデニル硫酸トランスフェラーゼ)、及びtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、並びにそれらの同等物を含む。アスペルギルス細胞での使用のためには、アスペルギルス・ニダランスまたはアスペルギルス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピカス(hygroscopicus)のbar遺伝子が好適である。
【０１０９】
本発明のベクターは、好適には宿主細胞のゲノム中へのベクターの統合、またはゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自己複製を許容する要素を含む。
【０１１０】
宿主細胞ゲノムへの統合のために、ベクターは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、または相同もしくは非相同の組換えによるゲノムへの統合のためのベクターの任意の他の要素を頼りにし得る。或いはベクターは、染色体中の正確な位置で、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる統合を導くために、更なるヌクレオチド配列を含み得る。正確な位置での統合の見込みを増加させるための統合の要素は、好適には十分な数の核酸、例えば100〜10,000塩基対、好適には400〜10,000塩基対、及び最適には800〜10,000塩基対の核酸であって、対応の標的配列と高い同一性を有し、相同性組換えの可能性を強める核酸を含むべきである。統合の要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同する任意の配列であり得る。さらに統合の要素は、非コード化またはコード化ヌクレオチド配列であり得る。他方、ベクターは、非相同性組換えによって宿主細胞のゲノム中に統合され得る。
【０１１１】
自己複製のためのベクターは、問題の宿主細胞において当該ベクターの自己複製を可能にする複製起源を更に含み得る。複製起源は、細胞中で機能する自己複製を仲介する任意のプラスミドレプリケーターであり得る。用語"複製起源"または"プラスミドレプリケーター"は、本明細書においてin vivoでプラスミドまたはベクターを複製できるヌクレオチド配列として定義される。
【０１１２】
細菌の複製起源の例は、大腸菌(E.coli)での複製を許容するプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、及びpACYC184、及びバチルスでの複製を許容するpUB110、pE194、pTA1060、及びpAMβ1の複製起源である。
【０１１３】
酵母宿主細胞において使用するための複製起源の例は、2ミクロンのARS1、ARS4、ARS1及びCEN3の組み合せ、並びにARS4及びCEN6の組み合せの複製起源である。
【０１１４】
糸状菌細胞において有用な複製起源の例は、AMA1及びANS1である(Gems等., 1991, Gene 98:61-67; Cullen等., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175;WO 00/24883)。AMA1遺伝子の単離及び当該遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構造は、WO 00/24883に開示された方法によって達成され得る。
【０１１５】
本発明のポリペプチドの２個以上のコピーは、宿主細胞に挿入され、遺伝子産物の生産を増加させ得る。当該ポリヌクレオチドのコピーの数の増加は、当該配列の少なくとも１個の追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することによって、または当該ポリヌクレオチドを有する増幅可能な選択マーカー遺伝子を、増幅した選択マーカー遺伝子のコピーを含む細胞に含ませることによって得ることができ、それによって当該ポリヌクレオチドの更なるコピーは、適切な選定因子の存在中で当該細胞を培養することによって選定され得る。
【０１１６】
上記の要素を構造体に結紮するために使用される手段である本発明の組換え発現ベクターは、当業者に周知である(例えばSambrook等., 1989,前掲を参照)。
【０１１７】
宿主細胞
さらに本発明は、当該ポリペプチドの組換え体生産において都合よく使用される本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、染色体成分として、または上記のような自己複製する染色体外のベクターとして維持されるために宿主細胞中に導入される。用語"宿主細胞"とは、複製の間に起こる突然変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を含む。宿主細胞の選定は、当該ポリペプチドをコードする遺伝子及びその起源に広範囲で依存するだろう。
【０１１８】
宿主細胞は、単細胞性微生物、例えば原核生物、または非単細胞性微生物、例えば真核生物であり得る。
【０１１９】
有用な単細胞性微生物は、制限なく、バチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシネス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジイ(clausii)、バチルス・コアグランス、バチルス・ロータス、バチルス・レンタス、バチルス・リチェニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・スブチリス、及びバチルス・チューリンゲンシス；または例えばストレプトミセス・リビダンス及びストレプトミセス・ムリナスを含むグラム陽性細菌、または大腸菌（E.coll）及びシュードモナス種等のグラム陰性細菌等の細菌性細胞である。好適な観点では、細菌性宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リチェニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス、またはバチルス・スブチリス細胞である。他の好適な観点では、バチルス細胞は、好アルカリ性バチルスである。
【０１２０】
ベクターの細菌性宿主細胞への導入は、例えばコンピテント細胞(例えばYoung及びSpizizin, 1961 , Journal of Bacteriology 81 : 823-829、またはDubnau及びDavidoff-Abelson, 1971 , Journal of Molecular Biology 56: 209-221を参照)、エレクトロポレーション(例えばShigekawa及びDower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照)、または接合(例えばKoehler及びThorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照)を用いたプロトプラスト形質転換によって成立し得る(例えばChang及びCohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115を参照)。
【０１２１】
宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、または真菌細胞等の真核生物であってもよい。
【０１２２】
好適な観点では、宿主細胞は真菌性細胞である。本明細書において使用される"真菌類"とは、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、及び接合菌門(Hawksworth等, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8版編, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにおいて定義される)、並びに卵菌門(Hawksworth等., 1995,前掲、頁171において引用される)及び全ての栄養胞子性真菌(Hawksworth等., 1995,前掲)を含む。
【０１２３】
より好適な観点では真菌性宿主細胞は、酵母細胞である。本明細書において使用される"酵母"は、子嚢胞子形成酵母(エンドミケス目(Endomycetales))、担子胞子形成酵母、及び不完全菌類(ブラストミセテス(Blastomycetes)) に属する酵母を含む。酵母の分類は将来的に変化するかもしれないので、本発明の目的のための酵母は、Biology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S.M及びDavenport, R. R.,編, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No.9, 1980)において発表されるように定義される。
【０１２４】
また更に好適な観点では、酵母宿主細胞は、カンジダ、ハンセヌラ、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、またはヤロウィア(Yarrowia)細胞である。
【０１２５】
最適な観点では、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ディアスタチカス（diastaticus）、サッカロミセス・ドゥグラシィ(douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(norbensis)またはサッカロミセス・オビホルミス(oviformis)細胞である。他の最適な観点では、酵母宿主細胞は、クリヴェロミセス・ラクティス(lactis)細胞である。他の最適な観点では、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリチカ（lipolytica）細胞である。
【０１２６】
他のより好適な観点では、真菌性宿主細胞は、糸状菌細胞である。"糸状菌"とは、細分類の真菌類及び卵菌類（Oomycota）の全ての糸状形態を含む(Hawksworth等, 1995,前掲により定義された)。糸状菌は、一般にキチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖から構成される菌糸壁によって特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、また炭素異化は偏性好気性である。対照的にサッカロミセス・セレビシエ等の酵母による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽によるものであり、また炭素異化は発酵性であり得る。
【０１２７】
さらにより好適な観点では糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス、オーレオバシヂウム(Aureobasidium)、ジェルカンデラ(Bjerkandera)、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)、コプリヌス(Coprinus)、コリオルス(Coriolus)、クリプトコッカッス(Cryptococcus)、フィロバシジウム(Filobasidium)、フサリウム、フミコラ、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロマイセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロキーテ(Phanerochaete)、フレビア(Phlebia)、ピロミセス(Piromyces)、プレウロータス(Pleurotus)、シゾフィラン(Schizophyllum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、トラメテス(Trametes)、またはトリコデルマ細胞である。
【０１２８】
最適な観点では糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガツス(fumigatus)、アスペルギルス・フォエティダス(foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(japonicus)、アスペルギルス・ニダランス, アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザエ細胞である。他の最適な観点では、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス(bactridioides)、フサリウム・セレアリス(cerealis)、フサリウム・クロックウェルレンス(crookwellense)、フサリウム・クルモラム(culmorum)、フサリウム・グラミネアラム(graminearum)、フサリウム・グラミナム(graminum)、フサリウム・ヘテロスポルム(heterosporum)、フサリウム・ネグンジ(negundi)、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レティクラツム(reticulatum)、フサリウム・ロゼウム(roseum)、フサリウム・サムブキヌム(sambucinum)、フサリウム・サルコクロウム(sarcochroum)、フサリウム・スポロトリキオイデス(sporotrichioides)、フサリウム・スルフレウム(sulphureum)、フサリウム・トルロスム(torulosum)、フサリウム・トリコテコイデス(trichothecioides)、またはフサリウム・ベネナタム細胞である。他の最適な観点では、糸状菌宿主細胞は、ジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(aneirina)、セリポリオプシス・カレギエ(caregiea)、セリポリオプシス・ギルベッセンス(gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(subrufa)、またはセリポリオプシス・サブバーミスポラ(subvermispora)、コプリヌス・シネレウス、コリオルス・ヒルスタス(hirsutus)、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノーサ(lanuginosa)、ムコール・ミエへイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ(crassa)、ペニシリウム・パルロゼラム(purpurogenum)、ファネロキーテ・クリソスポリウム(chrysosporium)、フレビア・ラジエート(radiate)、プレウロータス・エリンジ(eryngii)、チエラビア・テレストリス(terrestris)、トラメテス・ビローサ(villosa)、トラメテス・ヴェルシコロル(versicolor)、トリコデルマ・ハルジアヌム(harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ(reesei)、またはトリコデルマ・ビリデ(viride)株細胞である。
【０１２９】
真菌細胞は、プロトプラスト形態、プロトプラストの形質転換、及び当該細胞壁の再生に伴う方法によって、それ自体が公知の方法において形質転換され得る。アスペルギルス及びトリコデルマ宿主細胞の適切な形質転換の手段は、EP 238 023及びYelton等., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474に発表されている。フサリウム種を形質転換するために適した方法は、Malardier等., 1989, Gene 78: 147-156、及びWO 96/00787に発表されている。酵母は、Becker及びGuarente, Abelson, J.N.及びSimon, M. I.,編、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194,頁182-187, Academic Press, Inc., New York; lto等, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163；及びHinnen等., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920によって発表された方法を用いて形質転換され得る。
【０１３０】
生産方法
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを生産するための方法に関し、(a) 野生型において当該ポリペプチドの生産が可能な細胞を、当該ポリペプチドの生産を助長する条件下で培養し；そして(b)当該ポリペプチドを回収することを含んで成る。好適には当該細胞はバチルス属のものである。
【０１３１】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを生産するための方法に関し、(a) 当該ポリペプチドの生産を助長する条件下で宿主細胞を培養し；そして(b)当該ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【０１３２】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを生産するための方法に関し、(a) 当該ポリペプチドの生産を助長する条件下で宿主細胞を培養し、当該宿主細胞は配列番号：１の成熟ポリペプチドコード領域において少なくとも１つ以上の突然変異を有する突然変異ヌクレオチド配列を含んで成り、当該突然変異ヌクレオチド配列は配列番号：２のアミノ酸1〜759、または配列番号：２のアミノ酸65〜347、または配列番号：２のアミノ酸368〜569を含んで成るポリペプチドをコードし；そして(b)当該ポリペプチドを回収することを含んで成る。
【０１３３】
本発明の生産方法における細胞は、当業界において周知の方法を用いて当該ポリペプチドの生産のための適した培養液の中で培養される。例えば当該細胞は、振盪フラスコ培養、及び小規模または大規模発酵(連続的、バッチ、流加、または固体状態発酵を含む)によって、適切な培地中で実行される研究室用または産業用の発酵装置において、当該ポリペプチドが発現及び／または単離されることを許容する条件下で培養され得る。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含む適切な培養液中で、当業界において公知の手段を用いて行う。適切な培地は、商業的な供給元から入手でき、または公表された組成物(例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ中)に従って調製され得る。当該ポリペプチドが栄養培地に分泌されれば、当該ポリペプチドは当該培地から直接的に回収され得る。当該ポリペプチドが分泌されなければ、細胞溶解物から回収できる。
【０１３４】
当該ポリペプチドは、当該ポリペプチドに対して特異的である当業界において公知の方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特異的抗体、酵素産物の形成、または酵素基質の消失の使用を含み得る。例えば酵素アッセイは、本明細書において発表されたようなポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。
【０１３５】
得られたポリペプチドは、当業界において公知の方法を用いて回収され得る。例えば当該ポリペプチドは、制限されずに、遠心分離、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発、または沈殿を含む慣用的な手段によって栄養培地から回収され得る。
【０１３６】
本発明のポリペプチドは、制限されずに、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画、及びサイズ排除)、電気泳動手段(例えば予備等電点電気泳動法)、差異溶解性(例えば硫酸アンモニウム沈殿)、SDS-PAGE、または抽出(例えばProtein Purification, J.-C. Janson 及びLars Ryden,編, VCH Publishers, New York, 1989を参照)を含む当業界において公知の多様な手段によって精製され得る。
【０１３７】
さらに本発明は、エンド-β-1,4-グルカン活性を有する単離酵素に関し、それは上記方法の一つ、好適には組換え生産技術によって生産される。当該単離酵素は、好適には同種の不純物が存在しない。かかる不純物は、内因性のエンド-β-1,4-グルカン遺伝子から生じ得るので、生産がエンド-β-1,4-グルカン活性を有する内因性ポリペプチドを発現しない宿主細胞中で行われるのならば、当該酵素には同種の不純物が存在しないだろう。
【０１３８】
組成物
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを含んで成る組成物に関する。好適には当該組成物はかかるポリペプチドに富む。用語"富む"とは、当該組成物のエンドグルカナーゼ活性が、例えば因子1.1が富むことにより上昇していたことを示す。
【０１３９】
当該組成物は、本発明のポリペプチドを、主要な酵素成分として、例えば単一成分組成物として含み得る。或いは当該組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼ等の複数の酵素活性を含み得る。さらなる酵素は、例えばアスペルギルス属に属する微生物、好適にはアスペルギルス・アクレアータス(aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ジャポニカス、アスペルギルス・ニダランス、アスペルギルス・ニガー、またはアスペルギルス・オリザエ；フサリウム属に属する微生物、好適にはフサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロックウェレンス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レティクラツム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブキヌム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロセウム(toruloseum)、フサリウム・トリコテコイデス、またはフサリウム・ベネナタム；フミコラ属に属する微生物、好適にはフミコラ・インソレンスまたはフミコラ・ラヌギノース(lanuginose)；或いはトリコデルマ属に属する微生物、好適にはトリコデルマ・ハルジアヌム、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ、またはトリコデルマ・ビリデによって生産され得る。
【０１４０】
当該ポリペプチド組成物は当業界において公知の方法によって調製でき、且つ液体または乾燥組成物の形態にあってよい。例えば当該ポリペプチド組成物は、粒状または微粒状の形態にあってよい。当該組成物中に含まれるポリペプチドは、当業界において公知の方法によって安定化され得る。
【０１４１】
本発明のポリペプチド組成物の好適な用途の例を以下に示す。本発明のポリペプチド組成物の用量及び使用される組成物における他の条件は、当業界において公知の方法に基づき決定され得る。
【０１４２】
用途
布地適用
他の態様では、本発明は、バイオポリッシング等の布地最終加工における本発明のエンドグルカナーゼの使用に関する。バイオポリッシングは、繊維の湿潤性を失わない手触り(handle)及び外観に関し、繊維品質を改良する糸表面の特定の処理である。バイオポリッシングの最も重要な効果は、より少ない毛羽及び小玉、増加した光沢/つや、改良された繊維手触り、増加した耐久性、柔軟性及び変えられた水吸収性によって特徴付けることができる。バイオポリッシングは、通常、編まれた繊維及び織られた繊維の製造中の湿潤処理において行われる。湿潤処理は、例えば湯通し、精錬、漂白、洗浄、染色/印刷及び最終加工等のステップを含む。個々のそれらのステップの際に、繊維は、多少なりとも機械的作用にかけられる。一般に、布地が編まれ、または織られた後には、繊維は任意の湯通し段階に進み、引き続き精錬段階等に進む。湯通しは、布地からサイズを取り除く行為である。機械織機で織る前に、縦糸の引張強度を上げるために、縦糸にデンプンまたはデンプン誘導体から成るサイズをしばしばコーティングする。織った後には、サイズコーティングは、均質性及び洗浄保証結果を確実にするために、繊維のさらなる加工に進む前に除去されなければならない。精錬工程では、不純物が繊維から除去される。本発明のエンドグルカナーゼは、セルロース布地及び綿布地、並びに靱皮繊維の精錬において都合よく使用でき、また不純物の除去の効率を改良し得る。
【０１４３】
セルロース布地に耐久プレス加工を施すために最も通常に使用される方法の一つは、セルロース架橋化学による最終加工を経ることである。架橋はセルロースを分子レベルで固定し、また実質的にセルロース衣類の収縮及びしわを減少させる。本発明のエンドグルカナーゼにより耐久プレス処理されたセルロース布地の処理は、加圧領域の選択的な弛緩をもたらし、縁の磨耗を最小化し得る。さらに本発明のエンドグルカナーゼは、過剰なカルボキシメチルセルロースを基礎とする捺染糊を布地から効率的に除去し、及び印刷工程において使用される器具を効率的に除去するために使用され得る。
【０１４４】
バイオポリッシングの効果を達成するために、セルロース分解作用と機械的作用の組み合せが要求されることが公知である。またセルラーゼによる処理が柔軟剤との慣用処理と組み合わされる場合に"超柔軟性"が達成され得ることも公知である。セルロース誘導体(天然及び製造されたセルロースの繊維、衣類、糸及び繊維質)のバイオポリッシングのために本発明のエンドグルカナーゼの使用及び当該酵素と他の酵素の組み合せの使用が好都合であると考えられる（例えばより完全なポリッシングが達成され得る）。バイオポリッシングは、例えばWO 93/20278において発表された方法を適用することによって得られると信じられる。さらに本発明のエンドグルカナーゼは、湯通し、精錬、漂白、バイオポリッシング、染色、及び最終加工の多様な組み合わせを含む同時の、または順次的な布地湿潤工程に適用することができると考えられる。 
【０１４５】
ストーンウォッシング
染色繊維において、特にデニム繊維またはジーンズにおいて"ストーンウォッシュされた"外観は(色素が局所的に剥離した)、繊維の色の所望される局所化した明るさを提供するために軽石の存在中でかかる繊維から作られたデニムまたはジーンズを洗浄することによって、または繊維を酵素的に、特にセルロース分解酵素により処理することによって提供され得ることが公知である。本発明のエンドグルカナーゼ単独または他の酵素との組み合わせによる処理は、US 4,832,864で開示されるように単独で、伝統的な工程において要求されるよりも少量の軽石と共に、またはWO 95/09225において開示されるように真珠岩と共に実行され得る。デニム繊維の本発明のエンドグルカナーゼによる処理は、慣用方法と比較して汚染戻り(backstaining)を減少させ得る。
【０１４６】
バイオマス分解
本発明にかかる酵素または酵素組成物は、例えば下記に都合よく適用され得る：
- 脱皮(debarking)のため、すなわち加水分解酵素による前処理であって、機械式ドラムにおける脱皮に先立ち、ペクチンに富む形成層を部分的に分解し、都合よくエネルギー節約をもたらし得る。
- 脱繊維(defibration)(精錬(refining)またはたたき(beating))のため、すなわち精錬またはたたきに先立つ加水分解酵素によるセルロース繊維を含む材料の処理であって、繊維の表面上の酵素の加水分解効果のためにエネルギー消費の減少をもたらす。
- 繊維修飾(fibre modification)のための、すなわち繊維壁に渡り部分的な加水分解が必要とされ、より深い浸透酵素を必要とする場所での繊維特質の改良(例えばより柔軟な粗い繊維を作るため)。
- 排水のため：紙を作るためのパルプの排水能は、パルプを加水分解酵素により処理することによって改良され得る。本発明にかかる酵素または酵素組成物の使用は、より効果的であり得る（例えば微粉フラクションの中で強度に水和した微小繊維の束を高い程度で解き放し、ペーパーマシーンの繊維とワイヤーメッシュ中の間の空洞スペースを遮断することによって排水速度の制限をもたらす）。
【０１４７】
リグノセルロースパルプの処理は、例えばWO 93/08275、WO 91/02839及びWO 92/03608に発表されるように実行され得る。
【０１４８】
洗濯
本発明の酵素または酵素組成物は、布地及び衣類の家庭または工業洗濯用の洗剤組成物において、並びに本発明の酵素または酵素調製品を含む洗浄溶液により機械洗浄工程の１回以上の洗浄サイクルの間に繊維を処理することを含む繊維の機械洗浄処理の工程において有用であり得る。
【０１４９】
典型的に洗浄工程において使用される洗剤組成物は、界面活性剤(陰イオン性、非イオン性、両性イオン性、両性)、原材料、漂白剤(過ホウ酸塩、過炭酸塩または過酸化水素)及び例えばその全体が参照によって本明細書に導入されているWO 97/01629において発表されるような他の成分等の慣用的な成分を含む。
【０１５０】
洗剤適用
本発明の酵素は添加されてよく、それによって洗剤組成物の成分になり得る。
【０１５１】
本発明の洗剤組成物は、例えば染色した繊維の前処理に適する洗濯添加剤組成物及び繊維柔軟剤を付加したリンスを含む手洗いまたは機械洗濯用の洗剤組成物として、または一般に家庭の硬表面クリーニング操作において使用するための洗剤組成物として、或いは手または機械での食器洗浄操作、特に自動食器洗浄(ADW)用に製剤化され得る。 
【０１５２】
本発明のエンド-β-1,4-グルカナーゼは、汚れの除去を改良し、また再汚染を減少させる等の利点を提供する。ある種の汚れ、例えばある種の食物汚れは、その汚れを完全に除去することが困難であるβ-グルカンを含む。さらに繊維品のセルロース性繊維は、特に"非結晶構造"及び表面領域において、当該酵素によって分解するβ-グルカンポリマーを有し得る。汚れ中または繊維上でのかかるβ-グルカンの加水分解は、洗浄工程の間の繊維上への汚れの結合を減少させる。
【０１５３】
家庭用洗濯工程は、ある条件の範囲下で実施される。一般に洗浄時間は5〜60分であり、また洗浄温度は15〜60℃の範囲であり、最も一般的には20〜40℃の範囲である。洗浄溶液は通常は中性またはアルカリ性であり、最も一般的にはpH 7〜10.5を有する。漂白剤は通常に使用され、特に白色繊維の洗濯に使用される。これらの漂白剤は、通常、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウムまたは過酸化水素等の過酸化物漂白剤である。
【０１５４】
特定の観点では、本発明は、本発明の酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤は、洗剤組成物と同様にプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び/またはペルオキシダーゼ等の１種以上の他の酵素を含み得る。
【０１５５】
一般に選定された酵素の特質は選定された洗剤との適合性であり(すなわち最適pH、他の酵素性及び非酵素性成分との適合性等)、また酵素は有効量で存在すべきである。
【０１５６】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物または微生物起源のものを含む。微生物起源は好適である。化学的修飾物またはタンパク質遺伝子操作突然変異体は含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたは金属性プロテアーゼ、好適にはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルス由来のもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168(WO 89/06279において発表されている)である。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン(例えばブタまたはウシ起源)並びにWO 89/06270及びWO 94/25583において発表されるフサリウムプロテアーゼである。
【０１５７】
有用なプロテアーゼの例は、WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、及びWO 98/34946において発表された変異体、特に以下の位置：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235及び274で１以上の置換を有する変異体である。
【０１５８】
好適な商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は、Relase(商標)、Alcalase(商標)、Savinase(商標)、Primase(商標)、Everlase(商標)、Esperase(商標)、Ovozyme(商標)、Coronase(商標)、Polarzyme(商標)、Kannase(商標)(Novozymes A/S)、Maxatase(商標)、Maxacal(商標)、Maxapem(商標)、Properase(商標)、Purafect(商標)、Purafect OxP(商標)、FN2(商標)、FN3(商標)、FN4(商標)及びPurafect Prime(商標)(Genencor International, Inc.)、BLAP X及びBLAP S(Henkel)を含む。
【０１５９】
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌または真菌起源のものを含む。化学的修飾物またはタンパク質遺伝子操作突然変異体は含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ（シノニム(synonym)・テルモミセス(Thermomyces)）由来のリパーゼ（例えばEP 258 068及びEP 305 216において発表されたH.ラヌギノーサ(T.ラヌギノーサス(lanuginosus))由来またはWO 96/13580において発表されたH.インソレンス由来）、シュードモナスリパーゼ（例えばP.アルカリゲネス(alcaligenes)またはP.シュードアルカリゲネス(pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、P.セパシア(cepacia)(EP 331 376)、P.シュトゥッツェリ(stutzeri)(GB 1,372,034)、P.フルオレスセンス(fluorescens)、シュードモナス種株SD 705(WO 95/06720及びWO 96/27002)、P.ウィスコンシネンシス(wisconsinensis)(WO 96/12012)由来）、バチルスリーパーゼ(例えばB.スブチリス(Dartois等(1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360)、B.ステアロサーモフィルス(JP 64/744992)またはB.プミルス(pumilus)(WO 91/16422)由来)を含む。
【０１６０】
他の例は、WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079及びWO 97/07202等において発表されたリパーゼ変異体である。好適な商業的に入手可能なリパーゼ酵素は、Lipolase(商標)及びLipolase Ultra(商標)(Novozymes A/S)を含む。
【０１６１】
アミラーゼ：適切なアミラーゼ(α及び/またはβ)は、細菌または真菌起源のものを含む。化学的修飾物またはタンパク質遺伝子操作突然変異体は含まれる。アミラーゼは、例えばバチルス、例えばGB 1,296,839においてより詳細に発表されたB.リチェニホルミスの種株から得られたα-アミラーゼを含む。
【０１６２】
有用なアミラーゼの例は、WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、及びWO 97/43424において発表された変異体、特に以下の１つ以上の位置：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、及び444で置換を有する変異体である。
【０１６３】
商業的に使用されるアミラーゼは、Duramyl(商標)、Termamyl(商標)、Stainzyme(商標)、Fungamyl(商標)、BAN(商標)(Novozymes A/S)、Rapidase(商標)、Purastar(商標)及びPurastar OxAm(商標)(Genencor International Inc)である。
【０１６４】
セルラーゼ：他の適切なセルラーゼは、細菌または真菌起源のものを含む。化学的修飾物またはタンパク質遺伝子操作突然変異体は含まれる。適切なセルラーゼは、バチルス、シュードモナス、フミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えばUS 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757及びWO 89/09259において開示されたフミコラ・インソレンス、ミセリオフトラ・サーモフィラ及びフサリウム・オキシスポラムから生産された真菌性セルラーゼを含む。
【０１６５】
特に適切なセルラーゼは、色彩ケアを有するアルカリ性または中性セルラーゼである。かかるセルラーゼの例は、EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940において発表されたセルラーゼである。他の例は、WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307及びWO 99/01544に発表されたようなセルラーゼ変異体である。
【０１６６】
商業的に入手可能なセルラーゼは、Celluzyme(商標)、Renozyme(商標)及びCarezyme(商標)(Novozymes A/S)、Clazinase(商標)、及びPuradax HA(商標)(Genencor International Inc)、及びKAC-500(B)(商標)(Kao Corporation)を含む。 
【０１６７】
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌または真菌起源のものを含む。化学的修飾物またはタンパク質遺伝子操作突然変異体は含まれる。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス、例えばWO 93/24618、WO 95/10602、及びWO 98/15257において発表されたようなC.シネレウス由来、及びそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、Guardzyme(商標)(Novozymes A/S)を含む。
【０１６８】
ヘミセルラーゼ：適切なヘミセルラーゼは、細菌または真菌起源のものを含む。化学的修飾物またはタンパク質遺伝子操作突然変異体は含まれる。適切なヘミセルラーゼは、WO 95/35362に発表されたようなマンナナーゼ、リケナーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼアセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ(glucorunidase)、フェルラ酸エステラーゼ、クマリン酸エステラーゼ及びアラビノフラノシダーゼを含む。適切なマンナナーゼは、WO 99/64619に発表されている。
【０１６９】
洗剤酵素は、１種以上の酵素を含む別個の添加剤を付加することによって、またはそれらの酵素の全てを含む組み合わされた添加剤を付加することによって洗剤組成物中に含まれ得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別個の添加剤または組み合わされた添加剤は、例えば粒体、液体、スラリー等として製剤化され得る。好適な洗剤添加剤の製剤は、粒体、特に非ダスト状の粒体、液体、詳細には安定化された液体、またはスラリーである。
【０１７０】
非ダスト状の粒体は、例えばUS 4,106,991及び4,661,452において開示されたように生産されてよく、また任意に当業界において公知の方法によってコーティングされ得る。ろう状のコーティング材料の例は、1000〜20000の平均分子量有するポリ(エチレンオキシド)製品(ポリエチレングリコール、PEG)；16〜50個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコール部分が12〜20個の炭素原子を含み、且つ15〜80個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ-、ジ-及びトリグリセリドである。流動層技術への適用に適する膜形成コーティング材料の例は、GB 1483591において提供される。液体酵素調製品は、確立されている方法に従い、例えばプロピレングリコール等のポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を付加することによって安定化され得る。保護された酵素は、EP 238,216において開示された方法によって調製され得る。
【０１７１】
本発明の洗剤組成物は、例えば棒、錠剤、粉体、粒体、ペーストまたは液体といった任意の便利な形態にあってよい。液体洗剤は典型的に70％までの水、及び0〜30％の有機溶媒を含む水性物であってよく、または非水性物であってもよい。
【０１７２】
洗剤組成物は、半極性を含む非イオン性及び/または陰イオン性及び/または陽イオン性及び/または両性イオン性であり得る１種以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は典型的に0.1重量％〜60重量％のレベルで存在する。
【０１７３】
洗剤組成物に含まれる場合の洗剤は、一般に約1％〜約40％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α-オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩(脂肪アルコール硫酸塩)、アルコールエトキシ硫酸塩、２級アルカンスルホン酸塩、α-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル-またはアルケニルコハク酸または石鹸等の陰イオン性界面活性剤を含むだろう。
【０１７４】
洗剤組成物に含まれる場合の洗剤は、一般に約0.2％〜約40％のアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミンのN-アシルN-アルキル誘導体("グルカミド")等の非イオン性界面活性剤を含むだろう。
【０１７５】
洗剤は、0〜65％の洗剤材料、またはゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、アルキル-またはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または重構造ケイ酸塩(例えばSKS-6 Hoechst製)等の錯化剤を含み得る。
【０１７６】
洗剤は１種以上のポリマーを含み得る。例示すると、カルボキシメチル-セルロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピリジン-N-オキシド)、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリカルボン酸塩（ポリアクリル酸塩等）、マレイン酸/アクリル酸コポリマー、及びメタクリル酸ラウリル/アクリル酸コポリマーである。
【０１７７】
洗剤は、過ホウ酸塩または過炭酸塩等のH2O2源を含み得る漂白系を含んでよく、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩等の過酸形成漂白活性化剤と組み合わされ得る。或いは漂白系は、例えばアミド、イミド、またはスルホンタイプのペルオキシ酸を含み得る。
【０１７８】
本発明の洗剤組成物の酵素は、慣用の安定化剤、例えばポリオール（ポリエチレングリコールまたはグリセロール等）、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、或いはフェニルボロン酸誘導体（4-ホルミルフェニルボロン酸等）を用いて安定されてよく、及び当該組成物は、例えばWO 92/19709及びWO 92/19708に発表されたように製剤化され得る。
【０１７９】
さらに洗剤は、例えば粘土、フォームブースター(foam boosters)、消泡剤(suds suppressors)、腐食防止剤、汚れ浮遊剤(soil-suspending agents)、汚れ再堆積防止剤、染料、殺細菌剤、蛍光増白剤、可溶化剤(hydrotrope)、変色防止剤、または香料を含む繊維コンディショナー等の他の慣用の洗剤成分を含み得る。
【０１８０】
洗剤組成物中の任意の酵素、特に本発明の酵素は、１リットルの洗浄液あたり0.01〜100 mgの酵素タンパク質、好適には１リットルの洗浄液あたり0.05〜5 mgの酵素タンパク質、特に１リットルの洗浄液あたり0.1〜1 mgの酵素タンパク質に相当する量を付加してよい。
【０１８１】
本発明の酵素は、本明細書に参照として導入されているWO 97/07202において開示される洗剤製剤に追加的に導入され得る。
【０１８２】
シグナルペプチド及びプロペプチド
さらに本発明は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用可能式に連結したタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構造体に関し、当該遺伝子はシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して外来である。
【０１８３】
さらに本発明は、かかる核酸構造体を含む組換え発現ベクター及び組換え宿主細胞に関する。
【０１８４】
さらに本発明は、(a)かかる組換え宿主細胞を当該タンパク質の生産に適した条件下で培養すること；及び(b)当該タンパク質を回収することを含んで成るタンパク質を生産するための方法に関する。
【０１８５】
第一及び第二のヌクレオチド配列は、他の制御配列と共に、または他の制御配列との組み合せにおいて、それぞれの外来遺伝子に作用可能式に連結され得る。かかる他の制御配列は上記に発表されている。上記の通り、シグナルペプチド及びプロペプチドの両領域にタンパク質のアミノ末端が存在する場合、プロペプチド領域はタンパク質のアミノ末端の隣に位置し、またシグナルペプチド領域は当該プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１８６】
タンパク質は、宿主細胞に対して同種のものまたは異種のものであり得る。用語"タンパク質"とは、本明細書ではコードされた産物の特定の長さを言うものとの意味ではないので、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。さらに用語"タンパク質"とは、コードされた産物を形成するために組み合わされた２種以上のポリペプチドを包含する。さらにタンパク質は、１種以上が宿主細胞に対して異種または同種であってよい少なくとも２種の異なるタンパク質から得られる部分的または完全なポリペプチド配列の組み合せを含むハイブリッドポリペプチドを含む。さらにタンパク質は、天然の対立遺伝子並びに上記タンパク質及びハイブリッドタンパク質の遺伝子操作された変異を含む。
【０１８７】
好適には、当該タンパク質は、ホルモンまたはそれらの変異体、酵素、受容体またはそれらの部分、抗体またはそれらの部分、或いはレポーターである。より好適な観点では、タンパク質は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼである。さらにより好適な観点では、タンパク質は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ(mutanase)、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼである。
【０１８８】
遺伝子は、任意の原核生物起源、真核生物起源、または他の起源から得られる。
【０１８９】
さらに本発明は、本発明の範囲を制限するように構成されるべきではない以下の実施例によって説明される。
【実施例】
【０１９０】
緩衝剤及び基質として使用した化学物質は、少なくとも試薬級の商業製品であった。
【０１９１】
エンドグルカナーゼ活性アッセイ
材料：
Berol 537、非イオン性界面活性剤は、Akzo Nobel等から提供された。
Cellazyme C錠は、Megazyme International、アイルランド、から提供された。
ガラスマイクロファイバーフィルター、GF/C、直径9cmは、Whatmanから提供された。
【０１９２】
pH9.5 緩衝溶液：
21.O gのNaHCO3と14.6 gのNaCIを、約900mlの脱イオン水に溶解する。10 mlのBerol 537(Akzo Nobelから提供された非イオン性界面活性剤)を付加する。4 NのNaOHを付加することによってpHを9,5に調整する。その後、最終容量を1000 mlに調整する。
【０１９３】
方法：
試験管の中で、1 mlのpH 9.5の緩衝剤と5 mlの脱イオン水を混合する。100 マイクロリットルの酵素サンプル(または公知の重さ：重量希釈係数を有する酵素サンプルの希釈物)を付加する。１つのCellazyme C錠を個々の試験管に加え、これらの試験管に蓋をし、そしてボルテックスミキサーで10 秒間混合する。これらの試験管を40 ℃の温度のサーモスタット水槽に設置する。15、30及び45 分後に、試験管の内容物を、試験管を反転させることによって混合し、そして当該水槽中に設置する。60 分後に、試験管の内容物を反転によって混合し、その後、GF/Cフィルターにかける。ろ液をきれいな試験管に集める。
【０１９４】
分光光度計で590 nmでの吸光度(Ａ［酵素］)を測定する。100 マイクロリットルの酵素希釈物の代わりに100 μlの水を付加することによって、ブランク値Ａ［水］を決定する。
【０１９５】
計算Ａ［デルタ］＝Ａ［酵素］−Ａ［水］。
Ａ［デルタ］は＜0.5であるべきである。より高度な結果を得るならば、異なる酵素希釈物係数で繰り返す。DF0.1がＡ［デルタ］＝0.1を与えるために必要とされる希釈係数である場合は、DF0.1を決定する。
【０１９６】
単位定義：
１エンド-β-グルカナーゼ活性単位(1 EBG)は、上記で特定されたアッセイ条件下でＡ［デルタ］＝0.10を与える酵素の量である。したがって例えば100の希釈係数によって希釈した後に与えられた酵素サンプルがＡ［デルタ］＝0.10を与えるならば、その後の酵素サンプルは、100 EBG/gの活性を有する。
【０１９７】
エンドグルカナーゼの最適温度及び最適pHは、pHが固定された場合には多様な温度範囲で、また逆に温度が固定された場合には多様なpHの範囲で活性アッセイを行うことにより決定される。
【０１９８】
実施例１、新規エンドグルカナーゼのスクリーニング
多くのバチルス株を、0.1％のAZCL-βグルカン(barley、Megazyme)を付加したTY寒天上で細菌を成長させることによって、アルカリ性エンドグルカナーゼの生産についてスクリーニングした。当該基質上でブルーハロ(blue haloe)を産する株ACE160の細菌は、16S rDNAの一部を決定することによって、またバチルス群を有する新規の種を代表するACE160を示す系統樹への配列の挿入によって同定された。
【０１９９】
実施例２、全長スブチラーゼ(subtilases)の生産
ゲノムライブラリー構造
ACE160由来の染色体DNAは、標準的な分子生物学技術を用いて調製した(Ausuble等. 1995 "Current protocols in molecular biology" Publ: John Wiley及びsons)。調製したDNAをSau3Aにより部分的に開裂し、アガロースゲル上で分離した。3〜8キロベースのフラグメントを溶出し、沈殿させ、そして適切な緩衝剤中に再懸濁させた。
【０２００】
ゲノムライブラリーは、供給元の指示／推奨に従って、Stratagene ZAP Express(商標)前消化されたベクターキット及びStratagene ZAP Express(商標)前消化されたGigapack(商標)クローニングキット(前消化したBam HI)(Stratagene Inc., USA) を用いて作製した。得られたλZAPライブラリーは、38000 pfu (プラーク形成単位)を含み、ここでの10000は、マス除去(mass excision)で収集した。得られた70000個の大腸菌(E. coli)コロニーはプールした。当該大腸菌(E coli)クローンのプールは、100 μlのプールを100 ml LB培地と共に混合することによって希釈し、そして0.1 %のAZCL.βグルカン(大麦、Megazyme)及び50 μg/mlのカナマイシンを補ったLB上の寒天プレートあたり100 μlをプレートから取り除き、そして2〜3日間培養した。50個の寒天プレート上のプレートあたり1600〜1800個のコロニーの中で、ブルーハロ(blue haloes)を有する３個のコロニーが得られた。これらの３個のコロニー由来のプラスミドDNAを回収し、そしてベクタープライマーにより配列を確認した。
【０２０１】
サブシークエンスプライマーウォーキングによって、エンド-1,4-βグルカナーゼオープンリーディングフレーム(ORF)の全ヌクレオチド配列が特徴付けられた。これらの３個のコロニーは、配列番号：１として示される同一のORFを含んだ。
【０２０２】
全長エンドグルカナーゼの生産
エンド-1,4-βグルカナーゼを生産するために当該遺伝子を野生型株バチルス種ACE160の染色体DNAから増幅した。当該酵素を固有の膜貫通シグナルペプチドを用いて発現させた。
【０２０３】
プライマー
ACE160-Bglu-Mlu1-4: GATTAACGCGTTCCTCGTGCTGAGCACAGAGG (配列番号：３)
ACE160-Bglu-Sac1 : TTATGGAGCTCAAATCAACTCTAGGAGGCTG (配列番号：４) 
【０２０４】
エンド-1,4-βグルカナーゼ遺伝子を、およそ2500 ntのPCR産物として増幅した。プライマーACE160-Bglu-Sac1及びACE160-Bglu-Mlu1-4を用いた。テンプレートDNAは、バチルス種、ACE160の染色体DNAであった。PCR産物は、推奨される通りにQiaquick(商標)スピンカラム(Qiagen,独)を用いて回収した。単離テンプレートの品質は、アガロースゲル電気泳動法により評価した。PCRは以下のプロトコールで行った：94℃、2 分間、(94℃30秒間、52℃30秒間、68℃１分間)を40サイクル、68℃10分間で完了した。PCR産物を、エチジウムブロマイドで染色したTAE緩衝剤中の1 ％のアガロースゲル上で分析し、正確な大きさの単一バンドを確認した。PCR産物を制限酵素Sac1及びMIu1で消化し、そしてGFX(商標)PCR及びゲルバンド精製キット(Amerham Biosciences)上で精製した。
【０２０５】
消化及び精製したPCRフラグメントを、Sac1及びMIu1消化プラスミドpDG268NeoMCS-PramyQ/Prcrylll/crylllAstab/Sav(米国特許：5,955,310)に結紮した。当該結紮混合物は、大腸菌(E.coli)TOP10F'(Invitrogen BV、オランダ)に形質転換するために使用され、またいくつかのコロニーをミニプレップ(QIAprep(商標)スペイン、QIAGEN GmbH、独)用に選定した。精製したプラスミドを、バチルス・スブチリス株TH1への形質転換前の挿入のためにチェックした(TH1は、バチルス・スブチリス株(amy-、spo-、apr-、npr-)であり、形質転換及びエリスロマイシンの選定による株DN3(Noone等.2000, J Bacteriol 182 (6) 1592-1599)由来の構造体の挿入によって修飾されている。変化した遺伝子型は：ykdA：：pDN3(PykdA-lacZ Pspac-ykdA)Ermrである。TH1は、以下の特徴：全ykdAプロモーターは、LacZレポーター遺伝子に融合されること、を含む。さらにykdA遺伝子は、IPTG-誘導Pspacプロモーターの制御下に置かれるので、ykdA遺伝子はもはやその天然調節を有しない。当該株は、発現クローン及びライブラリーのための宿主として使用でき、またタンパク質を発現及び分泌する形質転換体は、X-gal及びIPTGを含むプレート上で選定され得る。TH1は、LB寒天＋6 μg/mLのエリスロマイシン上で維持され得る)。
【０２０６】
形質転換された細胞は、１％の脱脂粉乳、100 μg/LのX-gal、1 mMのIPTG、6 μg/mlのクロラムフェニコール及び12 μg/mlのエリスロマイシンを補ったLB-PG寒天プレート上に置かれる。プレート上に置かれた細胞を一晩、37℃で培養し、そして青色で透明域を有さないコロニーを拾い、PCR及びヌクレオチド配列解析によって正確な挿入を確認した。
【０２０７】
実施例３、バチルス種、ACE160由来のエンドグルカナーゼの精製
エンドグルカナーゼは、670 mlの発酵ブロスから精製し、ここでの細胞は、当該ブロスの遠心分離及びろ過の組み合せによって除去された。脱イオン水で容量を2 Lに調整し、そしてpHを8.5に滴定した。当該材料を25 mMのTris 緩衝剤でpH 8.5に平衡化したQ-セファロースカラムに添加した。当該酵素を同一の緩衝剤中で、NaCI勾配の適用により溶出し、そしてエンドヌクレアーゼを含むフラクションをプールした。このプールの一部を液体フェース(fase)として、100 mMの酢酸ナトリウム pH 6を有するS-200ゲルろ過カラムにおいて分画した。エンドグルカナーゼを含むフラクションをプールし、そしてAmicon限外ろ過単位において、およそ３回濃縮した。当該濃縮物をSDS PAGEにより分析し、およそ80 kDのタンパク質バンドを得た。
【０２０８】
実施例４、バチルス種、ACE160由来のエンドグルカナーゼの洗浄能
本手順は、"酵素洗浄益"を決定するために用いられる。当該洗浄試験は、汚れた綿繊維のサンプル、及びきれいな綿繊維のサンプルを、両方一緒に小規模洗浄試験器具において洗浄することによって成される。洗浄後の綿繊維上の汚れを光の反射率によって評価する。もともと汚れていた綿繊維と、もともときれいな綿繊維の両サンプルについて評価する。
【０２０９】
綿繊維：#2003 白色の織られた100％の綿繊維は、Tanigashira、4-11-15 Komatsu 淀川区、大阪、533-0004、日本、より提供された。新しい綿繊維を洗浄試験において使用する前に３回前洗いする。当該前洗いは、ヨーロッパの家庭用フロント-ローダー洗濯機、及び標準化された40℃の洗浄工程を用いて実施する。LAS(Surfac(商標)SDBS80 アルキルベンゼン硫酸ナトリウム、80％)を１リットルあたり0.5 gの濃度で洗浄水に加え、そして洗浄液のpHを炭酸ナトリウムの付加によって10に調整する。前洗浄の後に、繊維を回転式乾燥機で乾燥させる。前洗浄された綿繊維の見本材料は、5×5cmの大きさで、それぞれおよそ0.3 gの重量に切り出され、これらの見本材料が洗浄試験に使用される。
【０２１０】
汚れた綿見本材料：これらは上記の5×5cmの見本材料から準備される。汚れた見本材料は、β-グルカン(中等度の粘度、大麦由来であり、Megazymes International、アイルランド、より提供された)及びカーボンブラック("洗浄試験用の炭素"、Sentaku Kagaku Kyokai、東京、日本、から提供された)を用いて作製する。約0.67 gのβ-グルカンを、撹拌し、50℃超まで暖めることによって100 mlの水道水に溶かす。0.33g のカーボンブラックを付加する。UltraTurrax T25 ブレンダーで、4000 rpmの速度で、2 分間混合する。それぞれの見本材料の中心に250マイクロリットルのβ-グルカン／カーボンを適用する。一晩、室温で乾燥させる。
【０２１１】
洗浄試験：３つの汚れた見本材料と３つのきれいな見本材料をMini-Terg-O-Tometerマシーンで洗浄する。Mini-Terg-O-Tometerは、Jay C. Harris, "Detergency Evaluation and Testing"、lnterscience Publishers Ltd.(1954)頁60-61において発表されたTerg-O-Tometer試験洗浄マシーンの小規模版である。以下の条件が使用される：
ビーカーサイズ  250ml
洗浄溶液容量  100ml
洗浄温度  40℃
洗浄時間  30分
撹拌  150rpm
【０２１２】
洗剤溶液は、試験開始前に予め40℃まで暖める。繊維及び酵素を30分間の洗浄期間の開始時に付加する。洗浄後、繊維見本材料を5分間、水道水流水下ですすぎ洗いし、その後、平らに広げ、そして室温で一晩、空気乾燥する。
【０２１３】
計測評価：繊維見本材料の光反射率評価は、Macbeth Color Eye 7000 反射率分光光度計を用いて行う。測定は500 nmで成される。UVフィルターは盛り込まれない。測定はそれぞれの見本材料の表面と裏面で成される。汚れた見本材料は汚れ部分の中心で測定する。その後、汚れた見本材料ときれいな見本材料の反射率(R、500nm)の結果の平均をそれぞれのタイプにおいて６回測定することによって算出する。
【０２１４】
洗剤溶液：洗剤溶液は以下の通りに調製する：脱イオン水の中に0.5g の炭酸カルシウム及び1.0g の炭酸水素ナトリウムを溶解し、そして117.8 g/lのCaCI2.2H2O及び54.3 g/lのMgCI2.6H20を含む2 mlの溶液を付加して、1 リットルの溶液を調製する。当該カルシウム/マグネシウムの添加は、12°dHの硬度の水を提供する。0.2g の非イオン性界面活性剤(Berol(商標) 537、Akzo Nobel)及び0.5g のLAS(Surfac(商標) SDBS80 アクリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、80%)を付加し、そして最終容量を1 リットルに調整する。pHをpH 9.5±0.1に調整する(炭酸ナトリウムまたは10％のクエン酸溶液の付加による)。
【０２１５】
酵素付加：試験された酵素は、公知の濃度で予め水に溶解され、そして洗浄工程の開始時に要求される量の酵素が洗剤溶液に付加される。
【０２１６】
酵素洗浄益の算出：酵素洗浄益は、もともと汚れた見本材料ともともときれいな見本材料の両方が、どのくらいよりきれいになるのかを測定することであり、洗浄試験において酵素を含むことの結果となる。酵素洗浄益は、以下のように算出される：
汚れた見本材料の洗浄試験後のR,500 nm平均値は、R,汚染である。
きれいな見本材料の洗浄試験後のR,500 nm平均値は、R,クリーンである。
酵素による洗浄試験の酵素洗浄益は、酵素有りのR,汚染＋R,クリーンの合計から酵素を付加しないR,汚染＋R,クリーンの合計を引いた値である。
【０２１７】
当該方法において決定された酵素洗浄益値は、繊維の汚れ、及び繊維上の汚れの再堆積物の除去の両方を組み合わせて測定される。したがって酵素洗浄益値は、正または負の値を有し得る。酵素洗浄益値は、多様な酵素能を比較するために使用され得る。最も高い正の洗浄値は、好適な結果である。比較については、バチルス種,ACE160由来のエンドグルカナーゼの洗浄能をWO 2002/099091において開示された公知のバチルスエンドグルカナーゼMB1181-7の洗浄能と比較した。
【０２１８】
結果：
洗浄溶液中での酵素活性      酵素洗浄益
ACE160, 6 EBG／リットル        28,1
ACE160, 12 EBG／リットル       29,9
MB1181-7, 6 EBG／リットル      15,2
MB1181-7, 12 EBG／リットル     22,2
【０２１９】
結果は、バチルス種,ACE160由来のエンドグルカナーゼは、公知のエンドグルカナーゼよりも高い酵素洗浄益を与えることを示す。
【０２２０】
ここで開示及び特許請求された発明は、本明細書において開示された特定の観点によって範囲を制限されるものではない。これらの観点は、本発明のいくつかの観点の説明を目的とするものであるからである。任意の同等物の観点は、本発明の範囲内にあると意図される。実際に、本明細書において示され、且つ発表された事項に加えられる本発明の多様な改変は、上記の記載から当業者にとって明白になるだろう。さらにかかる改変は、添付の特許請求の範囲の中にあることが意図される。コンフリクトの際は、定義を含む現存の開示が調整するだろう。
図面の簡単な説明
図１  従来の関連ポリペプチドによる本発明のポリペプチドのアミノ酸配列(ACE160、配列番号：２)の配置。従来のポリペプチドは以下のように開示されている：
【表１】
0005571310.tif 000003
図２  本発明のエンドグルカナーゼ(ACE160, 配列番号：２)の従来のポリペプチド配列との関連性を示す系統樹は、DNAStar(商標)プログラムパッケージ中のプログラムMegAlign(商標)5.05版のClustalV機能における初期設定によって配置を構成した。
【配列表】
0005571310000001.xml