(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファセオラス・ブルガリスからの抽出物であって、エタノールと水との混合物により抽出され、α−アミラーゼ阻害物質含量が１０００〜１６００ＵＳＰ／ｍｇ（ＨＰＬＣ滴定量６〜１４重量％）であり、フィトヘマグルチニン含量が８０００〜３００００ＨＡＵ／ｇであることを特徴とする抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の抽出物を調製する方法であって、
ａ）ｐＨが３〜６．５の範囲である水性緩衝剤でファセオラス・ブルガリスを抽出し、続いて、バイオマスから抽出物を分離し、これは要すればα−アミラーゼ阻害物質およびフィトヘマグルチニンが使い尽くされるまで緩衝剤でさらに抽出することができ；
ｂ）併せた抽出物を濾過または遠心分離し、遠心分離後の抽出物の重量の約１０％に相当する体積まで濃縮し、
ｃ）濃縮水性抽出物を、最終的アルコール濃度を６０〜７０体積％として希エタノールで分画沈澱（Differential precipitation）し、
ｄ）沈澱を分離しおよび脱塩水から６０％エタノールを用いて再沈澱または１００００Ｄａカットオフの膜を通してダイアフィルトレーションし、沈澱残渣を乾燥する
ことを含む方法。
【請求項３】
燐酸塩、クエン酸塩または酢酸塩緩衝剤、ジカルボン酸アミノ酸緩衝剤、または緩衝された水−アルコール溶液を用いる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
食欲抑制剤として有用な組成物を調製するための請求項１に記載の抽出物の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の抽出物を活性成分として含む薬剤又は食事製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の概要）
本発明は、ファセオラス属（ｇｅｎｕｓ  Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）の植物の種子から得られる抽出物、およびその調製方法に関する。
【０００２】
より詳しくは、本発明は、食事中の澱粉から生じるグルコースの吸収を減少させると共に繰り返し投与後に食欲を低減させるような確立された比率でα−アミラーゼ阻害物質とフィトヘマグルチニンとを含むことを特徴とする、ファセオラス・ブルガリス種子の抽出物に関する。
【背景技術】
【０００３】
α−アミラーゼ阻害物質（αＡＩ）は、動物起源のアミラーゼ、特にヒトアミラーゼの酵素的活性を示差的種依存的に抑制する、インゲンマメ（ファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））の種子に含まれる糖タンパクである。この阻害物質は、ＭａｒｓｈａｌｌおよびＬａｕｄａにより１９７４年（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０（２０），８０３０−８０３７，１９７５）に初めて精製されたものであり、その膵アミラーゼ阻害活性がグルコース（澱粉の酵素的加水分解から誘導）の腸での吸収に対して発揮し得る効果、特に、食事産業におけるその適用可能性故に、注目を集めた。炭水化物は、カロリーの重要な供給源であり、肥満またはＩＩ型糖尿病にかかりやすい個体において脂肪の合成の原因となるものである。天然には、種の発生の頃には、生存のための食事の入手性は断続的であったため、即時使用に必用な量を超えるエネルギーを蓄積する能力が必須であった。身体の異なる部位において発生する脂肪細胞は、エネルギーが蓄積される部位に含まれるので、身体が必要とするときに容易に利用することができる。内分泌およびニューロン分泌により調整されるこの生理的系により、ヒトは、食物の不存在下でも長期間生き延びることが可能となる。しかしながら、食物が豊富な場合、座りがちな生活様式の場合、および先進工業国の生活様式に係わる遺伝的理由がある場合、この系は、美的損失および、その後の心臓循環系の過負荷のような悪い結果を伴う脂肪エネルギーの蓄積を、制御不能に増加させる。主な問題の一つは、米国のような一部の国において高水準に達している肥満である。肥満は、心臓血管疾患、高血圧および糖尿病の主な原因である。男性と女性の両方において一般的である体重過剰は、より多くの量の食物を食べることにつながり、その結果、健康を損なうことになる。過剰血糖はエネルギー蓄積を増加させるので、グルコースの吸収を低減させる物質を入手できることが非常に重要である。
【０００４】
抗肥満物質が世界的に必用とされているので、体重の増加に対抗する食物が調査および研究されるようになった。
【０００５】
異なるマメ科植物およびトウモロコシにおいてα−アミラーゼ阻害物質が古くから確認されており、近年、特異的臨床試験が行われ、種々の結果を得ている。多くの市販製剤が生体内での効果的な活性を欠くと証明されたように、これらの阻害物質の濃縮および単離に用いられる調製プロセス次第で、結果が矛盾したものとなった。Ｌａｙｅｒ、ＣａｒｌｓｏｎおよびＤｉ  Ｍａｇｎｏの最初の研究（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８（６）：１８９５，１９０２，１９８５）によれば、この問題は、高度に不純な製剤中での阻害剤の高度の希釈が原因であるらしく、実際、精製された阻害剤の調製物は、腸管腔に直接導入されるとα−アミラーゼに対して活性であるとわかっている。
【０００６】
α−アミラーゼ阻害物質の調製のための文献に記載されている断片的プロセスは、燐酸塩緩衝剤を用いた抽出、および硫酸アンモニウムを用いたタンパクの不溶化を含み、いかなる選択性も示していない。得られた抽出物は、高濃度のフィトヘマグルチニンを含み、許容できる程度の毒性を有する抽出物を得るためには希釈しなくてはならない。生物学的局面とは別に、既知のプロセスは、活性かつ安全である生成物を調製することを困難にする幾つかの段階を含む。異なるイオン強度およびｐＨの緩衝剤での抽出中に生じる問題は、タンパクおよび多糖類汚染物質の高い濃度が原因であり、これにより、粘性が高くなり、その結果、濾過性の低下および長い加工時間の問題が生じる。これらは水性抽出液であるので、タンパク抽出物が微生物で汚染される高度の危険性もあり、これは、特に高粘性製剤の場合に制御困難である。これらの全ての条件により、生成物が損失し、フィトヘマグルチニン滴定量が少なくそれに対応して複数の成分が標準化されている最終抽出物を得ることが困難になる。フィトヘマグルチニンを制限する問題を解決するための種々のプロセスが用いられてきており、これらには熱処理があり、熱処理によりフィトヘマグルチニンのみならずα−アミラーゼ阻害物質も分解され、その結果、得られた生成物はほとんど活性がない。実際には、市場での製品は、αＡＩ含量が非常に低い。α−アミラーゼ阻害物質が豊富過ぎる他の生成物は、多量の投与した場合に、鼓腸の不快な問題を生じる。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の説明）
本発明の生成物は、水性または水性エタノール性媒体を用いた抽出、およびエタノールと水との適切な混合物を用いて沈澱させることにより調製される。
【０００８】
驚くべきことに、インゲン豆の適当に濃縮された水性抽出物に対して水性エタノール性混合物を用いると、活性が１０００〜１６００ＵＳＰ／ｍｇ（ＨＰＬＣ滴定量６〜１４重量％）であるα−アミラーゼ阻害物質含量と８０００〜３００００ＨＡＵ／ｇのフィトヘマグルチニン含量を有する豊富化抽出物が生成され、これを、所望の結果を得るために充分に低い投与量で、食事に用いるための生成物中に調製することができることが発見された。この主な利点に加えて、本発明が係わる方法は、微生物の数を著しく低下させる。もう一つの顕著な利点は、（αＡＩ）に富み、フィトヘマグルチニン比が定められている最終生成物を得ることができることである。
【０００９】
本発明の方法は、ｐＨが３〜６．５、好ましくは３．５〜５．５、より好ましくは４である緩衝剤を用いて２〜２５℃、好ましくは４〜１８℃でバイオマスを抽出し、続いて、遠心分離によりバイオマスから抽出物を分離することを含む。
【００１０】
抽出のための適当な緩衝剤は、典型的には、燐酸塩、クエン酸塩または酢酸塩緩衝液、あるいはジカルボン酸アミノ酸緩衝剤、好ましくは燐酸塩またはクエン酸塩緩衝液である。緩衝された水−アルコール混合物を、抽出溶媒として用いることもできる。
【００１１】
用いられた抽出剤および抽出サイクルに依存して、薬剤１部当たり５〜２０体積、好ましくは１０〜１２．５部の緩衝剤を用い、混合物を１〜４時間、好ましくは２時間攪拌し、バイオマスを、適当な量の緩衝剤でさらに３回抽出することができ、いずれの場合にも、そのα−アミラーゼ阻害物質およびフィトヘマグルチニン内容物が使い尽くされるまで抽出する。
【００１２】
併せた抽出物を、濾過または遠心分離により清澄化し、２５〜３５℃、好ましくは３０℃の温度で減圧下に、または、限外濾過（１００００Ｄａカットオフ）により、遠心分離後の抽出物の重量の約１０％に相当する体積まで濃縮する。
【００１３】
濃縮された水性抽出物を、次に、６０〜７０体積％、好ましくは６５体積％の最終濃度まで添加されたエタノールを用いて１８〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の温度で沈澱させる。
【００１４】
得られた沈澱を、遠心分離および／または濾過、脱塩水に再溶解、および６０％エタノール中で再沈澱させて塩類部分を減少させることができる。あるいは、１００００Ｄａカットオフの膜を通してダイアフィルトレーションすることができる。本発明による抽出物を構成する沈澱の沈降物を乾燥する。
【００１５】
これらのプロセスを用いると、以下の特性を有する抽出物を得ることができる。
【００１６】
ＨＰＬＣ滴定量：６重量％以上１４重量％以下
α−アミラーゼ阻害活性：１０００ＵＳＰ／ｍｇ以上１６００ＵＳＰ／ｍｇ以下
血球凝集活性：８０００ＨＡＵ／ｇ以上３００００ＨＡＵ／ｇ以下
これらの抽出物の効果が、特別澱粉豊富食からなる食物を自由に食べさせて、一日当たり２００及び４００ｍｇ／Ｋｇで処理されたラットにおいて証明された。処理中、本発明の抽出物が食物消費を著しく低下させるが、水消費は変わらないままである。
【００１７】
本発明の生成物は完全に寛容され、夕食で摂取するためには、５０〜１０００ｍｇの量で薬剤または食事製剤に混入することができる。抽出物は、食欲抑制剤として摂取するためには、飲用型などとして混入することができる。
【実施例】
【００１８】
以下の実施例により、本発明の製剤および利点を説明する。
【００１９】
（実施例１）
（クエン酸緩衝剤で抽出しエタノールで沈澱させることにより得られたαＡＩに富むインゲン豆抽出物の調製）
クエン酸（５．７５ｇ／Ｌ）１．５Ｌ中にインゲン豆粉１５０ｇを含む懸濁液を、＋４℃で３時間攪拌した。
【００２０】
懸濁液を遠心分離し、水性遠心分離物を７．５倍に濃縮した（乾燥残渣：１５．０重量％）。濃縮物を９５％エタノールを用いて、エタノール６５％の濃度に希釈して沈澱を得、それを＋２２℃で遠心分離することにより取り出した。集められた固形物を、５０℃を超えない温度で減圧下に乾燥した。得られた生成物（収率：２．３６％）は、α−アミラーゼ阻害活性が１０５０Ｕ／ｍｇであり、血球凝集活性が９０００ＨＡＵ／ｇであり、ＨＰＬＣ滴定量が７．３重量％である。
【００２１】
（実施例２）
（クエン酸緩衝剤で抽出しエタノールで沈澱させることにより得られたαＡＩに富むインゲン豆抽出物の調製）
クエン酸（５．７５ｇ／Ｌ）１．５Ｌ中にインゲン豆粉１５０ｇを含む懸濁液を、＋２２℃で２時間攪拌した。
【００２２】
懸濁液を遠心分離し、水性遠心分離物を１０．５倍に濃縮した（乾燥残渣：１７．１重量％）。濃縮物を９５％エタノールを用いて、エタノール６５％の濃度に希釈して沈澱を得、それを＋２２℃で遠心分離することにより回収した。集められた固形物を、５０℃を超えない温度で減圧下に乾燥した。得られた生成物（収率：３．５％）は、α−アミラーゼ阻害活性が１６００Ｕ／ｍｇであり、血球凝集活性が１８６００ＨＡＵ／ｇであり、ＨＰＬＣ滴定量が１０．０重量％である。
【００２３】
（実施例３）
（クエン酸の水−アルコール溶液（３０％エタノール）で２回抽出しエタノールで沈澱させることにより得られたαＡＩに富むインゲン豆抽出物の調製）
クエン酸４．６ｇ／Ｌを含む、水とエタノールとの７０：３０混合物１．０Ｌ中にインゲン豆粉１００ｇを含む懸濁液を、＋２２℃で２時間攪拌した。
【００２４】
懸濁液を遠心分離し、透明な液相を廃棄し、沈降物を、水７５０ｍＬを用いる新しい抽出サイクルに付した。２回目の抽出の液相を１回目のものと併せ、４．３倍に濃縮した（乾燥残渣：４．７８重量％）。濃縮物を９５％エタノールを用いて、エタノール７０％の濃度に希釈して沈澱を得、それを＋２２℃で遠心分離することにより回収した。集められた固形物を、５０℃を超えない温度で減圧下に乾燥した。得られた生成物（収率：０．８８％）は、α−アミラーゼ阻害活性が１５７０Ｕ／ｍｇであり、血球凝集活性が２７０００ＨＡＵ／ｇであり、ＨＰＬＣ滴定量が１３．６重量％である。