(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを含む試料を、２，４−ジヒドロキシアセトフェノンをマトリクスとしたマトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析に供し、インソースディケイにより前記ＲＮＡ由来のフラグメントイオン群を得て、前記フラグメントイオン群のイオンのピーク間の質量差に基づいて前記ＲＮＡの配列解析を行う、ＲＮＡ配列決定法。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、リボースに２’修飾基を有するものである、請求項１に記載のＲＮＡ配列決定法。
【請求項３】
前記ＲＮＡが、リボースに２’−Ｏ−メチル基を有するものである、請求項２に記載のＲＮＡ配列決定法。
【請求項４】
前記ＲＮＡの塩基長が２０〜３０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ配列決定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの配列決定をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって行う技術に関する。核酸医薬を開発している製薬企業やオリゴヌクレオチドを合成・販売している企業、及び核酸を研究しているライフサイエンス系分野などの領域での利用が期待される。
【背景技術】
【０００２】
近年の核酸医薬開発の活発化に伴い、数十塩基長程度のオリゴヌクレオチドの配列解析技術が求められている。核酸医薬品では、リボース２’−ＯＨ基の修飾やリン酸エステルのチオエステル化など、非天然部位の導入により生体内での滞留性をよくすることが一般的であり、これら非天然部位を含めた核酸配列解析技術が求められている。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いてオリゴヌクレオチドの配列解析を行った例として、酸で部分的にリン酸エステルを加水分解したＲＮＡについてラダー状のマススペクトルを取得し、ピーク間の質量差から配列を解析する手法（非特許文献１）と、エンドヌクレアーゼにより３’−末端もしくは５’−末端から順にＲＮＡを分解し、経時的にマススペクトルを取得して配列情報を得る手法（非特許文献２）とが報告されている。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのイオン源での解裂（インソースディケイ：in-source decay, ISD）は主にペプチドのアミノ酸配列解析に応用されている技術であるが（非特許文献３，４）、核酸の塩基配列解析へ応用された例についても数例報告されている（非特許文献５，６）。
非特許文献５では、１１塩基長のＤＮＡについて、ピコリン酸をマトリクスとし、266 nmの波長のレーザーを照射することによりフラグメントイオンを発生させたことが開示されている。
非特許文献６では、７塩基長のＤＮＡについて、2,5-ヒドロキシ安息香酸（2,5-dihydroxybenzoic acid（2,5-DHB））をマトリクスとし、フラグメントイオンを発生させたことが開示されている。レーザー波長は文献に明記されていないが、Voyager Elite（Perspective Biosystems社）を使用していることから、337 nmの波長と推測される。
【０００５】
非特許文献７では、ジヒドロキシアセトフェノン（Dihydroxyacetophenone（DHAP））と1.5-ジアミノナフタレン（1,5-Diaminonaphtalene（DAN））との混合物をマトリクスとし、ＩＳＤによってＤＮＡの配列解析を行ったことが開示されている。また、ＲＮＡではＩＳＤによるフラグメントイオンはほとんど検出されなかったことが開示されている。
【０００６】
非特許文献８では、ＴＣリピートの配列からなる１００塩基長のＤＮＡと１０２塩基長のＤＮＡとをマススペクトル上で分離して検出するために、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（2,4-Dihydroxyacetophenone）をマトリックスとして用いたことが開示されている。
【０００７】
なお、質量分析による核酸の塩基配列解析において、核酸から生じうるフラグメントイオンは、リン酸結合における開裂部位によって、５’−ＯＨ基を有するフラグメントイオンはａ、ｂ、ｃ又はｄと、３’−ＯＨ基を有するフラグメントイオンはｗ、ｘ、ｙ又はｚと命名される（非特許文献９）。
【０００８】
しかしながら、ＲＮＡ（非修飾のもの）及び修飾基を有するＲＮＡについてＩＳＤによりフラグメントイオン群を発生させ、生じたフラグメントイオン群のマススペクトルを利用し、配列解析を行ったことの報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bahr U. et al., Anal. Chem. 2009, 81, 3173-3179.
【非特許文献２】Gao H. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009, 23, 3423-3430.
【非特許文献３】Takayama M. et al. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2002, 50, 304-310.
【非特許文献４】Demeure K. et al., Anal. Chem. 2007, 79, 8679-8685.
【非特許文献５】Juhasz P. et al., Anal. Chem. 1996, 68, 941-946.
【非特許文献６】Koomen J. M. et al., J. Mass Spectrom. 2000, 35, 1025-1034.
【非特許文献７】島津アプリケーションニュース、No.B17、２００９年１０月
【非特許文献８】Y. Yoshikawa, K. Nakajima, N. Kimura, M. Gonda, K. Okamoto, G. Tamiya, H. Inoko、“An efficient application of MALDI-TOF/MS coupled with microarray for detection of microsatellite polymorphisms.”、Program Nr: 1239 from 2002 ASHG Annual Meeting、[online]、[平成２２年８月１８日検索]、インターネット＜URL：http://www.ashg.org/genetics/abstracts/abs02/f1239.htm＞
【非特許文献９】McLuckey, S. A. et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1992, 3, 60-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非特許文献１の方法において、ＲＮＡのリン酸エステルの酸加水分解にはリボースの２’−ＯＨ基が必要である。従って、２’−ＯＨ基がメチル化などの修飾を受けたＲＮＡではリン酸エステルの分解が起こらないため、前記メチル化修飾を受けた塩基の場所を特定することができない点で問題がある。
【００１１】
非特許文献２の方法は、酵素消化時間などの諸条件の検討、および経時的に質量分析を行なう必要があるため、煩雑かつ時間を要する点で問題がある。
【００１２】
非特許文献５の方法は、オリゴヌクレオチドのＩＳＤ解析に用いられたレーザーの波長（２６６ｎｍ）が汎用的でないため、解析を可能にする装置が上記波長のレーザーを有する装置に限られる点で問題がある。
また、非特許文献５の方法では１１塩基長のＤＮＡでのフラグメント解析例が記載されているが、核酸医薬として検討されている２０塩基長以上のＲＮＡのＩＳＤ分析例は記載されていない。
【００１３】
非特許文献６で分析されたＤＮＡは７塩基長であり、かつ、ＩＳＤにより得られたフラグメントイオンは少なく、配列情報としては一部しか得られていない。従って、核酸医薬として検討されている２０塩基長以上のＲＮＡについて配列解析をすることができない点で問題がある。
【００１４】
非特許文献７の方法では、開示されているとおり、ＲＮＡについてＩＳＤによる配列解析ができない点で問題がある。
【００１５】
非特許文献８では、長鎖ＤＮＡの親イオンが検出されたのみであり、配列決定を可能にするようなフラグメントイオンは検出されていない。
【００１６】
ペプチドのＩＳＤによる分解機構は、カルボニル酸素への水素原子付加から引き起こされると考えられている。オリゴヌクレオチドのＩＳＤによる解裂は、リン酸エステルの酸素への水素原子付加に起因すると考えられ、２’−ＯＨの有無に関わらず分解すると推測できる。
一方、非特許文献５には、オリゴヌクレオチドのＩＳＤフラグメント効率によると、インタクトイオンに対して数%のイオン強度しか得られないことが開示されている。従って、ＩＳＤイオンを豊富に得るためには、オリゴヌクレオチド自体のイオン化効率のよいマトリクスが必要であると考えられる。
【００１７】
以上に鑑み、本発明は、非修飾ＲＮＡ及び修飾ＲＮＡのＩＳＤを引き起こし、多くのフラグメントイオンを生じさせることによって、多くの配列情報が得られる分析手法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで一般的な波長のレーザーを有する装置で、２０塩基長以上のＲＮＡについて効率よくＩＳＤによる分解を引き起こすマトリクスを用いた分析手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、鋭意検討の結果、２，４−ジヒドロキシアセトフェノンが効率よくＲＮＡのＩＳＤを引き起こすことを見出した。また、本発明者は、２，４−ジヒドロキシアセトフェノンが汎用性の高い波長３３７ｎｍの窒素レーザーでＩＳＤによるフラグメントイオンを生じさせることを見出した。さらに、本発明者は、２，４−ジヒドロキシアセトフェノンが修飾を含んだＲＮＡのＩＳＤも引き起こすことを見出した。
本発明者は、上記知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
ＲＮＡを含む試料を、２，４−ジヒドロキシアセトフェノンをマトリクスとしたマトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析に供し、インソースディケイにより前記ＲＮＡ由来のフラグメントイオン群を得て、前記フラグメントイオン群のイオンのピーク間の質量差に基づいて前記ＲＮＡの配列解析を行う、ＲＮＡ配列決定法。
上記において、ＲＮＡには、非修飾ＲＮＡ及び修飾ＲＮＡの両方を含む。
（２）
前記ＲＮＡが、リボースに２’修飾基を有するものである、（１）に記載のＲＮＡ配列決定法。
（３）
前記ＲＮＡが、リボースに２’−Ｏ−メチル基を有するものである、（２）に記載のＲＮＡ配列決定法。
（４）
前記ＲＮＡの塩基長が２０〜３０である、（１）〜（３）のいずれかに記載のＲＮＡ配列決定法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、非修飾ＲＮＡ及び修飾ＲＮＡのＩＳＤを引き起こし、多くのフラグメントイオンを生じさせることによって、多くの配列情報が得られる分析手法を提供することができる。
本発明によると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで一般的な波長のレーザーを有する装置で、ＲＮＡからＩＳＤによる分解を効率よく引き起こすマトリクスを用いた分析手法を提供することができる。
本発明によると、解析対象のＲＮＡから生じる、ＩＳＤに特徴的なｗ系列やｙ系列、ｄ系列のフラグメントイオンを帰属することにより、全配列のうち例えば少なくとも９０％に相当するイオンの帰属が行うことができる。
本発明によると、核酸医薬の対象となる２０ｍｅｒ以上のＲＮＡの配列解析に有用な分析手法を提供することができる。また、酸処理などの前処理を不要とする簡便なオリゴヌクレオチド配列解析手段を手供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＮＡがＩＳＤによりｗ系列に分解する推定メカニズムを示す。式中、B1及びB2は塩基を表す。
【図２】２１塩基長であり５’末端から８塩基目のアデノシンが２’−Ｏ−メチル化されたＲＮＡ（5'-UCG AAG U(Am)U UCC GCG UAC GdTdT-3', Amは、2’-O-methyl- adenosineを表す）のＩＳＤにより発生したフラグメントイオン群のマススペクトルを示す。マトリクスとして２，４−ＤＨＡＰ、２，５−ＤＨＡＰ（比較用）、２，６−ＤＨＡＰ（比較用）及び２，４，６−ＴＨＡＰ（比較用）を使用したスペクトルを示す。
【図３】２１塩基長の非メチル化ＲＮＡのＩＳＤにより生じたフラグメントイオン群のマススペクトル（ａ）、及び５’末端から８塩基目のアデノシンが２’−Ｏ−メチル化されたＲＮＡのＩＳＤにより生じたフラグメントイオンのマススペクトル（ｂ）を示す。
【図４】２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡのＩＳＤにより発生したフラグメントイオン群のスペクトル（ａ）、及び前処理として酸処理に供された２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡのマススペクトル（ｂ）（比較用）を示す。
【図５】ＲＮＡのフラグメントイオンの命名法について示す。ＲＮＡの構造式はリン酸結合部位を除く部位は簡略化した。n1、n2、n3はヌクレオシド部を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［１．ＲＮＡ］
本発明で対象となるＲＮＡ（リボ核酸）は、基本的に塩基部位を構成するアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)と、糖部を構成するリボースと、リン酸部位を構成するリン酸結合とを有するものであれば特に限定されるものではない。また、本発明において、ＲＮＡは、天然型ＲＮＡ及び非天然型ＲＮＡアナログの両方を含む。（本明細書においては、天然型ＲＮＡの一態様を非修飾ＲＮＡ、非天然型ＲＮＡアナログの一態様を修飾ＲＮＡと記載する場合がある。）
【００２２】
非天然型ＲＮＡアナログの態様としては特に限定されるものではなく、塩基部位修飾ＲＮＡ、糖部位修飾ＲＮＡ、及びリン酸部位修飾ＲＮＡを問わない。これらの態様は、核酸医薬の分野において許容される修飾態様であることが好ましい。
【００２３】
塩基部位修飾ＲＮＡの例として、メチル化シトシン等が挙げられる。
糖部位修飾ＲＮＡの例として、リボースに２’修飾基を有するＲＮＡや、２’位と４’位が結合したlinked nucleic acid (LNA)等が挙げられる。好ましい例として、リボースに２’−Ｏ−メチル基を有するＲＮＡ（２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）やリボースに２’−Ｆ基を有するＲＮＡ（２’−フルオロ化ＲＮＡ）等が挙げられる。
リン酸部位修飾ＲＮＡの例として、リン酸エステルの酸素原子（Ｐ＝Ｏ）が硫黄原子に置き換わったホスホロチオエートＲＮＡが挙げられる。
【００２４】
ＲＮＡの塩基長としては限定されないが、低分子のＲＮＡであることが好ましい。一例として、３０塩基長まで（例えば２０〜３０塩基長）でありうる。ＲＮＡが核酸医薬である場合は、２０〜２５塩基長であることが好ましく、２１〜２３塩基長であることがより好ましい。ＲＮＡが医薬代謝物である場合や医薬に限らない場合には、２０塩基長未満であってもよい。
【００２５】
本発明に供されるＲＮＡのスケールは特に限定されない。特に、本発明は、微量のＲＮＡを取り扱う場合に有用であるため、ＲＮＡはピコモルレベル、例えば５〜２０ピコモル程度でありうる。
【００２６】
［２．マトリクス］
本発明においては、マトリクスとして２，４−ジヒドロキシアセトフェノンを用いる。  ２，４−ジヒドロキシアセトフェノンは、汎用性の高い３３７ｎｍのレーザーでフラグメントイオンを生じさせることができ、ＩＳＤによる分解を効率よく引き起こすことができる。２，４−ジヒドロキシアセトフェノンの使用量としては特に限定されず、通常のマトリクスと同様に当業者が適宜決定する事ができる。例えば、解析対象となるＲＮＡに対し数千〜数万倍量、例えば２０００〜５００００倍量（モル基準）で用いることができる。
【００２７】
２，４−ジヒドロキシアセトフェノンは、適切な溶液中に溶解して用いられうる。上記溶液の組成としては特に限定されず、当業者が適宜決定する事ができる。例えば、アセトニトリル、メタノールなどの有機溶媒の水溶液に溶解して用いることができる。前記有機溶媒の濃度としては特に限定されないが、例えば３０％〜５０％（体積基準）でありうる。
【００２８】
本発明においては、マトリクスは２，４−ジヒドロキシアセトフェノン単独で用いられ、他のマトリクスと混合しては用いられないことが好ましい。特に、ＩＳＤを効率よく引き起こすマトリクスとして知られている１，５−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）と混合して用いられることはない。
【００２９】
本発明においては、マトリクス添加剤が用いられてよい。マトリクス添加剤としては、有機酸又は無機酸のアンモニウム塩を用いることができる。具体的には、クエン酸ジアンモニウム（Ammonium citrate dibase (ACDB)）、酢酸アンモニウム（Ammonium Acetate (AA)）、塩化アンモニウム（Ammonium Chloride (ACl)）、クエン酸トリアンモニウム（Ammonium citrate tribase (ACTB)）、フッ化アンモニウム（Ammonium fluoride (AF)）、酒石酸アンモニウム（Ammonium tartarate (AT)）などが挙げられる。
【００３０】
添加剤の使用量としては特に限定されず、当業者が適宜決定する事ができる。例えば、マトリクスである２，４−ジヒドロキシアセトフェノンに対し４分の１〜等倍量（モル基準）で用いることができる。
【００３１】
［３．質量分析］
上記ＲＮＡは上記マトリクスと混合され質量分析に供される。質量分析においては、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）型質量分析装置を用い、イオン源内解裂（インソースディケイ；ＩＳＤ）により前記ＲＮＡ由来のフラグメントイオン群を得る。ＩＳＤによるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析においては、ＲＮＡにレーザーを照射することにより、レーザー照射と同時にイオン源内でＲＮＡが断片化し、断片化により生じた励起分子イオン、すなわちフラグメントイオンを検出することによって、ＲＮＡの配列情報を得る。ＩＳＤによるフラグメントイオンはポジティブ、ネガティブの両モードにおいて検出されるため、極性に関する検出モードについては限定されないが、一般的にオリゴヌクレオチドの測定に用いられるネガティブモードが好ましい。
【００３２】
ＲＮＡのＩＳＤ推定メカニズムを図１に示す。図１に示すように、ＲＮＡのＩＳＤによる分解は、ホスホリル（Ｐ＝Ｏ）酸素原子への水素原子付加から引き起こされると考えられる。
同様に、例えばホスホロチオエート型のＲＮＡのＩＳＤによる分解も、Ｐ＝Ｓ硫黄原子への水素原子付加から引き起こされると考えられる。
従って、ＲＮＡの塩基部位や糖部（２’水酸基）、及びリン酸部のいずれに修飾がある場合であっても、ＩＳＤによる分解が引き起こされうる。
【００３３】
本発明のＲＮＡ配列決定法においては、上述のマトリクスを用いることによって、ＲＮＡのＩＳＤを効率よく引き起こし、配列情報を与えるに十分なＲＮＡフラグメントイオンをｗ系列、ｙ系列、ｄ系列のイオンとして得ることができる。ここで、ＲＮＡの各フラグメントイオンの名称は、図５に示すオリゴヌクレオチド命名法に基づく。特にｗ系例のフラグメントイオンは酸処理などでは生じない系列であり、ＩＳＤに特徴的である。ＩＳＤで得られるマススペクトルは、各系列のイオンのピーク間の質量差が、ＲＮＡを構成するヌクレオチドの質量を示すものとして得ることができる。従って、ピーク間の質量差を読むことによって、ＲＮＡ配列決定を非常に容易に行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下において、%で表された量は特に断りのない限り体積を基準にしたものである。また、実施例で得られたマススペクトルにおいては、横軸は質量／電荷（m/z）を表し、縦軸は相対強度を表す。
【００３５】
［実施例１］
以下の構造を有する４種の化合物（２，４−ジヒドロキシアセトフェノン、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（比較用）、２，６−ジヒドロキシアセトフェノン（比較用）、及び２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（比較用））をマトリクスとして、ＲＮＡサンプルをＩＳＤ解析に供した。解析対象としたＲＮＡサンプルは、２１塩基長、５’末端から８塩基目のアデノシンが２’−Ｏ−メチル化されたものであり、具体的な配列は5'-UCG AAG U(Am)U UCC GCG UAC GdTdT-3'（UCG AAG U(Am)U UCC GCG UAC Gを配列番号１とする。Amは、2’-O-methyl- adenosineを表す。）である（以下、このＲＮＡサンプルを２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡと記載する）。
【００３６】
【化１】
0005569264.tif 000002
【００３７】
各マトリクスを、７０ｍＭのクエン酸ジアンモニウム及び５０％アセトニトリルを含む水溶液に溶解した。２，４−ＤＨＡＰ、２，６−ＤＨＡＰ、及び２，４，６−ＴＨＡＰは前記水溶液中２０ｍｇ／ｍＬ、２，５−ＤＨＡＰは１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、マトリクス溶液とした。
５０ｐｍｏｌ／μＬの２１塩基長２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡをマトリクス溶液と１：１（体積比）で混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定用のステンレスプレートに滴下し、乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定に供した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定では、ＡＸＩＭＡ  Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ（登録商標）(島津製作所製)により、リニア、ネガティブモードを用いた。
【００３８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定により得られたマススペクトルを図２に示す。解析対象のＲＮＡの分子量関連イオン（m/z 6658)のイオン強度は２，４−ＤＨＡＰをマトリクスに用いた場合において、他のマトリクスを用いた場合と比較して最も強かった。また、図２が示すように、m/z 3500-m/z 6000付近のフラグメントイオンが他のマトリクスの場合よりも強い強度で検出され、ＩＳＤ効率が高いことが確認できた。
【００３９】
［実施例２］
マトリクスとして２，４−ＤＨＡＰを用い、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、及び２’−Ｏ−メチル化されていないＲＮＡ（非メチル化ＲＮＡ）それぞれを、実施例１と同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定に供した。非メチル化ＲＮＡの具体的な配列は5'-UCG AAG UAU UCC GCG UAC GdTdT-3'（UCG AAG UAU UCC GCG UAC Gを配列番号２とする。）である。
ＩＳＤにより生じたフラグメントイオンのマススペクトルを図３に示す（（ａ）：非メチル化ＲＮＡ、（ｂ）２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ）。ｗ系列のフラグメントイオンが検出され、２１塩基中、３’末端の２塩基を除くすべてのイオンを帰属することができ、ＲＮＡの配列解析を行うことができた。また、メチル化修飾塩基（ｍＡ）の位置を確認することができた。
【００４０】
［比較例１］
２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡサンプルを１０ｐｍｏｌ／μｌ水溶液に調製した。さらに、５％トリフルオロ酢酸水溶液中に５０ｍｇ／ｍｌの濃度で３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）を含む試薬溶液を調製した。
上記サンプル水溶液と上記試薬溶液とを同体積混合して反応混合液とした（すなわちトリフルオロ酢酸の終濃度を２．５％とした）後、直ちに反応混合液１μｌをＭＡＬＤＩ用ステンレスプレートにアプライし、風乾させた。得られた乾燥スポットに、０．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌクエン酸ジアンモニウム水溶液を重ねてアプライし、さらに風乾させた。乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより測定を行った。
【００４１】
酸処理及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定によって得られたマススペクトルを、図４（ｂ）に示す。合わせて、実施例２で得られた２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡサンプルに関する図３（ｂ）のマススペクトルにおけるｍ／ｚ３７００〜４６００のスペクトル部分を拡大したものを図４（ａ）に示す。
【００４２】
図４（ｂ）が示すように、酸処理ではｙ１３が検出されていないことから、メチル化部位の切断が起こっていないことを確認した。一方、図４（ａ）が示すように、ＩＳＤにより生じたフラグメントイオンにおいては、ｗ１３イオンが検出されていることから、メチル化の有無の関わらずリン酸エステル結合の切断が起こっていることを確認した。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１は、８番目に２’−Ｏ−メチルアデノシンを有する合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、合成オリゴヌクレオチドである。
【図１】
0005569264.tif 000003
【図５】
0005569264.tif 000004
【図２】
0005569264.tif 000005
【図３】
0005569264.tif 000006
【図４】
0005569264.tif 000007
【配列表】
0005569264000001.app