(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の子宮頸部から採取した試料中のヒトパピローマウイルスのゲノムDNAのL1領域の5'-(CG)-3'(CpG)のメチル化の頻度を測定する工程と、
測定されたメチル化の頻度に基づいて、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が試料に含まれているか否かを判定する工程と
を含み、
前記ヒトパピローマウイルスが、HPV-16、HPV-18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV-52およびHPV-58からなる群より選択される少なくとも１つであり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-16のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-18のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-18のL1領域の5'末端側から１〜２５番目のCpGの少なくとも１つを含み、２６〜３２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-31のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-31のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-33のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-33のL1領域の5'末端側から１〜１６番目のCpGの少なくとも１つを含み、１７〜２１番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-35のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-35のL1領域の5'末端側から１〜１３番目のCpGの少なくとも１つを含み、１４〜１７番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-52のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-58のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない領域であり、
前記判定工程が、測定されたメチル化の頻度と予め設定された閾値とを比較し、メチル化の頻度が閾値より高い場合に、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が試料に含まれていると判定する、
試料に含まれる子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞の有無を判定する方法。
【請求項２】
被験者の子宮頸部から採取した試料中のヒトパピローマウイルスのゲノムDNAのL1領域の5'-(CG)-3'(CpG)のメチル化の頻度を測定する工程と、
測定されたメチル化の頻度に基づいて、被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上の病変に進行するか否かを予測する工程と
を含み、
前記ヒトパピローマウイルスが、HPV-16、HPV-18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV-52およびHPV-58からなる群より選択される少なくとも１つであり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-16のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-18のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-18のL1領域の5'末端側から１〜２５番目のCpGの少なくとも１つを含み、２６〜３２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-31のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-31のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-33のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-33のL1領域の5'末端側から１〜１６番目のCpGの少なくとも１つを含み、１７〜２１番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-35のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-35のL1領域の5'末端側から１〜１３番目のCpGの少なくとも１つを含み、１４〜１７番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-52のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-58のとき、メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない領域であり、
前記予測工程が、測定されたメチル化の頻度と予め設定された閾値とを比較し、メチル化の頻度が閾値より高い場合に、被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上の病変に進行すると予測する、
被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上への病変に進行するか否かを予測する方法。
【請求項３】
メチル化の頻度が、メチル化の頻度について測定される前記L1領域に存在するメチル化されたCpGの数を、該領域に存在する全てのCpGの数で除することで得られる値である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
高度異形成以上の病変が、高度異形成、上皮内癌、微小浸潤扁平上皮癌及び浸潤扁平上皮癌を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒトパピローマウイルスのゲノムDNAのL1領域に存在する全CpGのうち、5'末端側から数えて80%以内に含まれるCpGの少なくとも１つを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマーセットであって、
前記ヒトパピローマウイルスが、HPV-16、HPV-18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV-52およびHPV-58からなる群より選択される少なくとも１つであり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-16のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-18のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-18のL1領域の5'末端側から１〜２５番目のCpGの少なくとも１つを含み、２６〜３２番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-31のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-31のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-33のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-33のL1領域の5'末端側から１〜１６番目のCpGの少なくとも１つを含み、１７〜２１番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-35のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-35のL1領域の5'末端側から１〜１３番目のCpGの少なくとも１つを含み、１４〜１７番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-52のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域であり、
- 前記ヒトパピローマウイルスがHPV-58のとき、核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない領域である、
子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞の有無を判定又は子宮頸部の高度異形成以上への進行を予測するためのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の子宮頸部から採取された試料に含まれるヒトパピローマウイルス（以下、「HPV」ともいう）のゲノムDNAのメチル化を検出することにより、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が試料に含まれているか否かを判定する方法、子宮頸部の組織が高度異形成以上への病変に進行するか否かを予測する方法、及びその方法に用いられるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
HPVへの感染は、子宮頸癌のリスクファクターの重要な部分を占めることが知られている。HPVへの感染は、ほとんどの場合、感染成立から一定期間後に感染細胞からHPVが自然消失する一過性の感染である。しかし、HPV感染者のうち5〜10%では、HPVが消失せず、持続感染となり、子宮頸癌を発症する。【０００３】
子宮頸癌は、子宮頸部の表層上皮に発生する癌であり、大部分は扁平上皮癌である。通常の子宮頸癌の検査では、まず、子宮頸部から採取した細胞を細胞診によるスクリーニング検査に供し、ここで異常と判断された場合に、組織診などの精密検査が行われる。【０００４】
子宮頸部の組織診では、癌細胞が発生する前段階として、上皮内に出現してくる異型細胞の出現の程度により、軽度、中等度又は高度の３段階の異形成に分類する。高度異形成からさらに悪化すると、上皮内に癌細胞が出現する段階となる。そして、癌細胞が上皮内に限局する「上皮内癌」、及び癌細胞が上皮から皮下組織に浸潤する「微小浸潤扁平上皮癌」、「浸潤扁平上皮癌」へと進行する。【０００５】
軽度異形成又は中等度異形成の病変は、そのほとんどが消失する。したがって、過剰治療を避けるため、特に治療を行わずに経過観察されることがほとんどである。しかし、高度異形成の前駆病変を治療せずに放置すると、浸潤癌に進行する可能性が高いので、高度異形成と判断された被験者には、手術などの治療を施すことが多い。
また、組織診による病理判定は、検査者の技量によって判定結果にばらつきが生じることがある。そのため、病理判定の再現性は低く、該判定により中等度異形成と診断されても、高度異形成及び浸潤癌に対する治療の開始が遅延することを恐れて、被験者に手術などの治療を施す場合がある。しかし、この場合、治療開始の遅延は避けられるが、過剰治療となる可能性がある。
よって、被験者の病変が高度異形成又はそれよりも重篤であるか否かを判断することは、被験者に対する治療方針を決定するために重要である。【０００６】
また、子宮頸部の組織診において、軽度異形成又は中等度異形成と診断された場合でも、後に高度異形成に進展する場合がある。当然、予め高度異形成に進展する病変を予測することは、早期治療の観点から重要である。しかし、従来の診断では、高度異形成に進展する病変を予測することは困難であった。【０００７】
子宮頸部の組織診は、従来、スクリーニング検査として細胞診を行った後に必要と判断された被験者から生検（バイオプシー）により子宮頸部の組織を少量採取し、ヘマトキシリン−エオシン（HE）染色などにより染色した後に、顕微鏡などで観察する組織診により行われている。
組織診は、検査者の観察に基づく判断が必要であり、例えば検査試料の調製によっては子宮頸癌を見逃す可能性がある。また、検査者の熟練した技術が必要となるので、多量の試料を迅速かつ高精度に検査することが困難である。【０００８】
HPVは、環状二本鎖DNAをゲノムとするウイルスであり、100種類以上のサブタイプに分類されている。このサブタイプのうち、子宮頸癌を引き起こす可能性が高いHPVは、ハイリスク型HPVとして分類される。具体的なハイリスク型HPVとしては、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73及びHPV-82が挙げられる。これらの中でも、HPV-16、HPV-18、HPV-52及びHPV-58は、特に子宮頸癌を発症した患者から検出されやすいハイリスク種として知られている。HPVのゲノムDNAには、キャプシドタンパク質をコードするL1領域、L2領域及びLCR、並びに非構造タンパク質をコードするE1領域、E2領域、E4領域、E5領域、E6領域及びE7領域など、サブタイプ間で保存された領域が存在する。【０００９】
最近、T. Turanらは、HPVのゲノムDNAのL1、LCRなどの領域における5'-(CG)-3'(CpG)のメチル化を、子宮頸癌を検出する指標として用い得ることを報告している（非特許文献1）。T. Turanらは、L1領域のメチル化が、いくつかの前駆病変を除いて癌の試料においてのみ検出されることから、L1領域のメチル化を検出することが、癌を診断するための重要な分子マーカーとなり得ることを明らかにしている（例えばAbstract参照）。【００１０】
また、国際公開文献２００８／０７１９９８号パンフレット（特許文献1）には、患者から得られた試料中のHPVゲノムの過剰なメチル化が、HPV感染により引き起こされる疾患が進行していることを示すことが開示されている。特許文献1では、HPVゲノムDNAのL2及びE2領域のメチル化を検出することが具体的に開示されている。
【特許文献１】国際公開第２００８／０７１９９８号パンフレット
【非特許文献１】T. Turanら, "Methylation of human papillomavirus-18 L1 gene: A biomarker of neoplastic progression?" Virology 349 (2006) p.175-183
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、被験者の子宮頸部の病変が高度異形成以上であるか否かを、より正確かつ簡便に判定できる方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、被験者の子宮頸部の病変が高度異形成以上に進行するか否かを、より正確かつ簡便に予測できる方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、上記の検出方法及び判定方法に用いられるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、種々の段階の病変であると組織診により診断された被験者の子宮頸部から採取した試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域のメチル化の頻度を測定した。その結果、L1領域のメチル化の頻度が、高度異形成もしくはそれより重篤な病変であるか、又は高度異形成よりも軽症であるかを判断する指標となり得ることを見出した。さらに、L1領域のメチル化の頻度が、組織診において高度異形成よりも軽症であると診断された病変が、高度異形成若しくはそれより重篤な病変に変化するかを判断する、指標となり得ることを見出した。これら知見から、本発明者等は、本発明を完成した。【００１３】
よって、本発明は、
（１）被験者の子宮頸部から採取した試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域の5'-(CG)-3'(CpG)のメチル化の頻度を測定する工程と、
測定されたメチル化の頻度に基づいて、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が、試料に含まれているか否かを判定する工程と
を含む、試料に含まれる子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞の有無を判定する方法；
（２）判定工程が、測定されたメチル化の頻度と予め設定された閾値とを比較し、メチル化の頻度が閾値より高い場合に、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が試料に含まれていると判定する、（１）に記載の方法；
（３）被験者の子宮頸部から採取した試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域の5'-(CG)-3'(CpG)のメチル化の頻度を測定する工程と、
測定されたメチル化の頻度に基づいて、被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上の病変に進行するか否かを予測する工程と
を含む、被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上への病変に進行するか否かを予測する方法；
（４）予測工程が、測定されたメチル化の頻度と予め設定された閾値とを比較し、メチル化の頻度が閾値より高い場合に、被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上の病変に進行すると予測する、（３）に記載の方法；
（５）メチル化の頻度が、メチル化の頻度について測定される前記L1領域に存在するメチル化されたCpGの数を、該領域に存在する全てのCpGの数で除することで得られる値である、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法；
（６）メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、L1領域の全CpGのうち、5'末端側から数えて80%以内に含まれるCpGの少なくとも１つを含む領域である（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法；
（７）HPVが、HPV-16、HPV-18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV-52およびHPV-58からなる群より選択される少なくとも１つである、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法；
（８）HPVがHPV-16であり、
メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない領域である、（７）に記載の方法；
（９）HPVがHPV-31であり、
メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-31のL1領域の5'末端側から１〜１7番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域である、（７）に記載の方法；
（１０）HPVがHPV-52であり、
メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域である、（７）に記載の方法；
（１１）HPVがHPV-58であり、
メチル化の頻度について測定される前記L1領域が、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない領域である、（７）に記載の方法；
（１２）高度異形成以上の病変が、高度異形成、上皮内癌、微小浸潤扁平上皮癌及び浸潤扁平上皮癌を含む、（１）〜（１１）に記載のいずれか１つに記載の方法；
（１３）HPVのゲノムDNAのL1領域に存在する全CpGのうち、5'末端側から数えて80%以内に含まれるCpGの少なくとも１つ含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するための、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が、試料に含まれているか否かを判定、又は子宮頸部の高度異形成以上への進行を予測するためのプライマーセット；
（１４）HPVが、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV33、HPV35、HPV-52およびHPV-58からなる群より選択される少なくとも１つである、（１３）に記載のプライマーセット；
（１５）HPVがHPV-16であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
（１６）HPVがHPV-18であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-18のL1領域の5'末端側から１〜２５番目のCpGの少なくとも１つを含み、２６〜３２番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
（１７）HPVがHPV-31であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-31のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
（１８）HPVがHPV-33であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-33のL1領域の5'末端側から１〜１６番目のCpGの少なくとも１つを含み、１７〜２１番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
（１９）HPVがHPV-35であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-35のL1領域の5'末端側から１〜１３番目のCpGの少なくとも１つを含み、１４〜１７番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
（２０）HPVがHPV-52であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
（２１）HPVがHPV-58であり、
核酸増幅法により増幅される領域が、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない領域である、（１４）に記載のプライマーセット；
を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、被験者の子宮頸部から採取した試料中のHPVのゲノムDNAの特定領域のメチル化を測定するという簡便な方法により、臨床上重要な高度異形成以上の病変由来の異常細胞が試料に含まれているか否かの判定、又は子宮頸部の組織が高度異形成以上の病変に進行するか否かの予測をすることができる。
また、本発明の方法は、試料中のHPVのゲノムDNAのメチル化の頻度を測定するので、検査者の技量などに左右されず、正確な判定又は予測を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】被験者から採取した試料中のHPV-16のゲノムDNAのL1領域又はLCRにおいて、メチル化されているCpGを検出した結果を示す。
【図２】被験者から採取した試料中のHPV-52のゲノムDNAのL1領域又はLCRにおいて、メチル化されているCpGを検出した結果を示す。
【図３】被験者から採取した試料中のHPV-58のゲノムDNAのL1領域又はLCRにおいて、メチル化されているCpGを検出した結果を示す。
【図４】HPV-16の全ゲノム配列、並びにその中のL1領域及びLCRに含まれるCpGの位置を示す。
【図５】HPV-52の全ゲノム配列、並びにその中のL1領域及びLCRに含まれるCpGの位置を示す。
【図６】HPV-58の全ゲノム配列、並びにその中のL1領域及びLCRに含まれるCpGの位置を示す。
【図７】メチル化頻度の算出方法を示す。
【図８】オペ試料について、HPV-16、HPV-58及びHPV-52のL1領域中のメチル化の頻度を、組織診により診断された各病変の程度における分散図として示す。
【図９】L1領域のCpGのうち、５’末端側から数えて80％までに含まれるCpGについてのメチル化頻度を、組織診により診断された各病変の程度における分散図として組織診の結果と対比した結果を示す。
【図１０】L1領域のCpGのうち、５’末端側から数えて80％を超えて３’末端側に存在するCpGについてのメチル化頻度を、組織診により診断された各病変の程度における分散図として示す。
【図１１】生検試料について、組織診の結果、メチル化頻度に基づく判定結果及び同じ被験者から採取されたオペ試料に対して行われた組織診の結果を示す。
【図１２】各経過の患者の初診時のL1領域中のメチル化頻度（％）を分散図として示す。
【図１３】組織診により診断された各病変の程度の患者の初診時のL1領域中のメチル化頻度（％）を分散図として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「メチル化の頻度」とは、メチル化について解析すべき領域中のメチル化されたCpGの数の割合を示すものであれば良い。例えば、後述のように、解析すべき領域に存在する全CpGの数は決まっているので、該領域に存在するメチル化ＣｐＧの数自体を、メチル化の頻度とすることができる。また、解析すべき領域に存在するメチル化ＣｐＧの数を、該領域に存在する全CpGの数で除して得られる値を、メチル化の頻度とすることもできる。なお、本発明の方法においては、解析すべき領域に存在するメチル化ＣｐＧの数を、該領域に存在する全CpGの数で除して得られる値を、メチル化の頻度とすることが好ましい。この場合、メチル化の頻度は、例えば下記の式Ｉを用いて求めることができる。
【数１】
0005396396.tif 000002
【００１７】
「解析すべき領域」とは、HPVのゲノムDNAのL1領域の全体又はその一部分である。好ましくは、解析すべき領域は、該L1領域中の全CpGのうち、5'末端側から数えて80%以内に含まれるCpGの少なくとも１つを含む領域である。さらに、3'末端側から数えて20%以内に含まれるCpGを含まない領域がより好ましい。
このような領域のCpGのメチル化の頻度を測定することにより、より正確に高度異形成以上の病変由来の異常細胞が子宮頸部から採取した試料に含まれるか否かの判定又は子宮頸部の高度異形成以上への進行の予測をできる。
より具体的には、HPV-16のＬ１領域については、全部で１９あるCpGのうち、5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない領域を、解析すべき領域とすることが好ましい。HPV-52のＬ１領域については、全部で２２あるCpGのうち、5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない領域を、解析すべき領域とすることが好ましい。HPV-58のＬ１領域については、全部で２５あるCpGのうち、5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない領域を、解析すべき領域とすることが好ましい。
【００１８】
本明細書において、「メチル化CpG」、「CpGのメチル化」及び「メチル化されたCpG」とは、HPVのゲノムDNA中の連続する5'-(CG)-3'中のシトシンが、シトシン塩基の５又は６位でメチル化されることをいう。
【００１９】
本明細書において、「HPVのゲノムDNAのL1領域」とは、HPVのゲノムDNAの配列情報を公開した公共のデータベース(例えばNational Center for Biotechnology Information (NCBI)によるGenBankなど)から閲覧できる配列において、L1領域と定義される領域のことである。例えば、HPV-16の全ゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：NC_001526；配列番号１)では、5559〜7154位がL1領域であり、HPV-52のゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：NC_001592；配列番号２)では、5565〜7154位、HPV-58のゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：NC_001443；配列番号３)では、5565〜7139位、HPV-18のゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：NC_001357)では、5430〜7136位がL1領域であり、HPV-31のゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：J04353)では、5552〜7066位がL1領域であり、HPV-33のゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：NC_001528)では、5594〜7093位がL1領域であり、HPV-35のゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号：M74117)では、5574〜7091位がL1領域である。
【００２０】
本発明において、「高度異形成以上の病変」とは、日本産婦人科学会による「子宮頸癌取り扱い規約1997」に基づく分類により、「高度異形成」、「上皮内癌」、「微小浸潤扁平上皮癌」及び「浸潤扁平上皮癌」に分類される病変のことである。
これらの病変であると判断された場合、被験者はほとんどの場合、手術などの治療を必要とするので、高度異形成以上の病変であるか否かを判断することは、臨床上非常に重要である。
「高度異形成」より軽症の病変は、「上皮異常なし」、「軽度異形成」及び「中等度異形成」に分類される。これらの病変であると判断された場合、被験者は、特別の治療を施さずに経過観察されることがほとんどである。
【００２１】
本発明において、「異常細胞」は、異型細胞及び癌細胞を示す。ここで、異型細胞とは、癌細胞ではないが、核腫大、クロマチン増量、核形不整などの核の異常が認められる細胞を示す。
【００２２】
本発明において、被験者の子宮頸部から採取される試料は、子宮頸部を擦ることにより採取されたスワブ、子宮頸部から採取した組織などに含まれるDNAを有するものであれば特に制限されない。好ましくは、スワブ、組織または組織のパラフィンブロックを、適切な処理液により処理して得られた処理試料である。そのような処理液としては、界面活性剤を含む緩衝液が好ましい。また、処理試料は、処理液にスワブ、組織または組織のパラフィンブロックを懸濁した後、ホモジナイズして得られたものがより好ましい。
子宮頸部から組織を採取する方法としては、外科的手術による切除（円錐切除、子宮全摘出など）、コルポスコピーなどの観察下に行われる生検（バイオプシー）など、当該技術において公知の方法が挙げられる。
【００２３】
上記の試料に含まれるDNAは、精製工程に付されなくてもよいが、精製工程に付されるのが好ましい。試料中のDNAの精製は、当該技術において公知の方法、例えばエタノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、市販の核酸精製キットを用いる方法などにより行うことができる。
【００２４】
上記の試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域のメチル化が予期されるCpGのメチル化を検出する方法は、従来技術において公知である。該方法としては、亜硫酸水素塩でのDNAの処理によりメチル化されていないシトシンをウラシルに変換し、PCRで目的領域のDNAを増幅させ、増幅領域のDNA配列を決定することに基づくバイサルファイトシークエンス法（例えば、T. Turanら, "Methylation of human papillomavirus-18 L1 gene: A biomarker of neoplastic progression?" Virology 349 (2006) p.175-183を参照）、メチル化特異的PCR法（James G.HERMANら, Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, pp.9821-9826, September 1996を参照）、ガイドプローブを用いてメチル化されたシトシンを酸化させることに基づく国際公開第２００６／１３２０２２号パンフレットに記載される方法などが挙げられる。
【００２５】
上記のバイサルファイトシークエンス法では、まず、試料中のDNAを亜硫酸水素塩、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウムなどと反応させることにより、DNA中のメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する。この際、メチル化されたシトシンは、ウラシルに変換されない。
亜硫酸水素塩を用いた非メチル化シトシン変換処理における、亜硫酸水素塩の濃度は、試料中に含まれるＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換できる程度であれば、特に限定されない。より具体的な亜硫酸水素塩の濃度としては、１Ｍ以上、好ましくは１〜１５Ｍ、より好ましくは３〜１０Ｍである。例えば、試料中の最終濃度が、４Ｍとなるように亜硫酸水素ナトリウムを添加する場合、１０〜９０分間、５０〜８０℃でインキュベートすることにより非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行うことができる。また、亜硫酸水素塩を低濃度で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の時間及び温度に適宜変更すればよい。
【００２６】
次いで、亜硫酸水素塩と反応させたDNAを、後述する本発明のプライマーセットを用いて、核酸増幅法により増幅させる。なお、核酸増幅法は、PCR法やLAMP法など公知の核酸増幅法であれば特に制限されない。また、核酸増幅法の条件についても、核酸増幅法の種類、増幅させる領域のDNAの塩基配列、プライマーの塩基配列などに応じて当業者が適宜選択できる。
【００２７】
本発明のプライマーセットは、HPVのゲノムDNAのL1領域に存在する全CpGのうち、5'末端側から数えて80%以内に含まれるCpGの少なくとも１つを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅できる。特に、3'末端側から数えて20%以内に含まれるCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。
本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの塩基配列は、亜硫酸水素塩で処理した後の解析すべき領域を含むDNAの塩基配列の一部とハイブリダイズし、核酸増幅法により該領域に対応するDNAの増幅を開始できるものであればよい。
【００２８】
なお、解析対象となるHPVがHPV-16の場合、プライマーセットとしては、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜１５番目のCpGの少なくとも１つを含み、１６〜１９番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００２９】
下記の配列番号８および配列番号９の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、HPV-16のL1領域の5'末端側から１１〜１５番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号８：AATAGGGTTGGTATTGTTGGTGAAAAT
配列番号９：TTCCAATCCTCCAAAATAATAAAATTCATA
【００３０】
下記の配列番号２４および配列番号２５の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜８番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号２４：TTGTTGATGTAGGTGATTTTTATTTATATTTTAGTT
配列番号２５：CCACTAATACCCACACCTAATAACTAACC
【００３１】
下記の配列番号３２および配列番号３３の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、HPV-16のL1領域の5'末端側から１〜６番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号３２：GATGTAGGTGATTTTTATTTATATTTTAGTT
配列番号３３：ATCCAACTACAAATAATCTAAATATTC
【００３２】
また、解析対象となるHPVがHPV-18の場合、プライマーセットとしては、HPV-18のL1領域の5'末端側から１〜25番目のCpGの少なくとも１つを含み、26〜32番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００３３】
下記の配列番号３８および配列番号３９の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-18のL1領域の5'末端側から9〜16番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号３８：GTTATTTGATTTAAATAAATTTGGTTTATTTGA
配列番号３９：TCCATAACACCATATCCAATATCTACC
【００３４】
また、解析対象となるHPVがHPV-31の場合、プライマーセットとしては、HPV-３１のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００３５】
下記の配列番号３６および配列番号３７の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-31のL1領域の5'末端側から１１〜１７番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号３６：GGTGATTGTTTTTTATTAGAATTAAAAA
配列番号３７：AATACCATTATTATATCCCTAAACAC
【００３６】
また、解析対象となるHPVがHPV-33の場合、プライマーセットとしては、HPV-33のL1領域の5'末端側から１〜16番目のCpGの少なくとも１つを含み、17〜21番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００３７】
下記の配列番号４０および配列番号４１の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-33のL1領域の5'末端側から4〜9番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号４０：TGGTAGTTTTAGATTTTTTGTTGTT
配列番号４１：CTTTACCCCAATATTCCCCTA
【００３８】
また、解析対象となるHPVがHPV-35の場合、プライマーセットとしては、HPV-35のL1領域の5'末端側から１〜13番目のCpGの少なくとも１つを含み、14〜17番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００３９】
下記の配列番号４２および配列番号４３の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-35のL1領域の5'末端側から8〜13番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号４２：TTTTTAGTGGTTTTATGGTAATTTT
配列番号４３：AAATTTTTAACAAATTACAACCTATAATA
【００４０】
また、解析対象となるHPVがHPV-52の場合、プライマーセットとしては、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜１７番目のCpGの少なくとも１つを含み、１８〜２２番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００４１】
下記の配列番号１２および配列番号１３の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-52のL1領域の5'末端側から１〜９番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号１２：TTTATTTATATTTATTATTGTTGATGGTAT
配列番号１３：TAAAAAACCAAATTTATTAAAATCC
【００４２】
下記の配列番号２６および配列番号２７の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-52のL1領域の5'末端側から１３〜１８番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号２６：TTTAGGTGATTTTGTGTTAGGT
配列番号２７：TCCTCTAAAATAATAACATCCATCT
【００４３】
下記の配列番号２８および配列番号２９の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、特に、HPV-52のL1領域の5'末端側から１０〜１５番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号２８：TTGGTTGTATGGATTTTAATATTT
配列番号２９：AACAAACAACTAATTACCCCA
【００４４】
また、解析対象となるHPVがHPV-58の場合、プライマーセットとしては、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜１９番目のCpGの少なくとも１つを含み、２０〜２５番目のCpGを含まない、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するものが好ましい。より具体的なプライマーセットを以下に示す。
【００４５】
下記の配列番号１８および配列番号１９の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、HPV-58のL1領域の5'末端側から１〜９番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号１８：ATGGTGTTGATTTTATGTTGTATT
配列番号１９：AACTATCCCCTACCTATTTCAAAAC
【００４６】
下記の配列番号３０および配列番号３１の塩基配列で示されるプライマーからなるプライマーセットは、HPV-58のL1領域の5'末端側から１２〜１９番目のCpGを含む、亜硫酸水素塩で処理した後の領域を、核酸増幅法により増幅するプライマーセットである。
配列番号３０：TGGTTAGTGAATTTTATGGGG
配列番号３１：TTACAAAACTAAAAAACAAACTATAAATCA
【００４７】
次に、核酸増幅法により増幅された領域のDNAの塩基配列を決定する。この決定された配列において、上記の公共のデータベースから得られる配列情報に基づいてシトシンであると予測される位置の塩基がウラシル(チミン)に変化している場合、この塩基はメチル化されていないシトシンであると判断できる。
一方、シトシンであると予測され、配列決定においてもシトシンであることが決定された位置の塩基は、メチル化されたシトシンであると判断できる。
なお、DNAの塩基配列の決定は、当該技術において公知の方法により、例えばDNAシーケンサーを用いて行うことができる。
【００４８】
上記の方法により、解析の対象となったHPVのゲノムDNAのL1領域中でメチル化されているCpGの個数を検出することで、メチル化の頻度を測定することができる。また、メチル化されているCpGの個数を、該領域中に含まれるCpGの全個数で除することで、メチル化の頻度を測定することもできる。
【００４９】
上記のようにして測定したメチル化の頻度に基づいて、子宮頸部の高度異形成以上の病変由来の異常細胞が被験者の試料に含まれるか否かの判定、又は被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上の病変に進行するか否かの予測をする。該検出及び予測は、例えば、測定したメチル化の頻度と、予め設定された閾値とを比較することにより行うことができる。
【００５０】
より具体的には、被験者の試料について測定したメチル化の頻度が上記の閾値より高い場合に、該試料に異常細胞が存在すると判定することができる。この判定は、メチル化の頻度が上記の閾値以下の場合に、該試料に異常細胞が存在しないと判定することと同義である。
【００５１】
また同様に、被験者の試料について測定したメチル化の頻度が上記の閾値より高い場合は、被験者の病変が従来の診断法によって「高度異形成」よりも軽症であると判断されていたとしても、該被験者の子宮頸部の病変は高度異形成以上へ進行すると予測することもできる。この判定は、メチル化の頻度が上記の閾値以下の場合に、被験者の子宮頸部の病変は高度異形成以上へ進行しないと予測することと同義である。
なお、被験者の試料について測定したメチル化の頻度が上記の閾値以下の場合は、被験者の子宮頸部の病変は消失すると予測することもできる。
【００５２】
ここで、上記の異常細胞の有無の判定に用いる閾値は、病変の程度が既知である患者の病変の程度と、該患者からの試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域のメチル化の頻度とに基づいて設定することができる。
以下に、閾値の設定方法について具体的に述べる。閾値の設定のための試料として、組織診などの本発明の方法以外の方法により病変の程度が既知である被験者の子宮頚部から採取した試料を用いる。該試料について、HPVのゲノムDNAのL1領域のメチル化の頻度を測定する。次に、この測定結果と、本発明の方法以外の方法により判断された病変の程度とを比較する。すなわち、本発明の方法以外の方法において高度異形成以上であると判断された被験者の試料についてのメチル化の頻度の値と、高度異形成よりも軽症であると判断された被験者の試料についてのメチル化の頻度の値とを、最も明確に区別できるメチル化の頻度の値を、閾値として設定できる。
【００５３】
例えば、L1領域において、全CpG数が１０である解析対象の領域を設定する。該領域について、組織診により高度異形成以上であると判断された被験者の試料では、２つ以上のメチル化CpGが検出され、組織診により高度異形成よりも軽症であると判断された被験者の試料では１つ以下のメチル化CpGが検出された場合、閾値を２と設定することができる。したがって、測定されたメチル化CpGの個数が２以上であれば、被験者の試料中に高度異形成以上の病変由来の異常細胞が存在すると判定できる。
また、メチル化の頻度を上記の式Iにより算出する場合、上記の例においては、閾値を２０％と設定することができる。したがって、測定されたメチル化CpGの個数の割合が、全体の２０％以上であれば、被験者の試料中に高度異形成以上の病変由来の異常細胞が存在すると判定できる。
【００５４】
なお、上記の異常細胞の有無の判定に用いる閾値は、病変の進行の予測にも用いることができる。また、経過情報が既知である患者の病変の進行の情報と、経過観察中に採取した該患者からの試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域のメチル化の頻度とに基づいて設定することもできる。
以下に、この場合の閾値の設定方法を具体的に述べる。閾値の設定のための試料として、病変が消失したこと又は病変が高度異形成以上に進行したことが、経過情報から既知の被験者から経過観察中に採取した試料を用いる。該試料について、HPVのゲノムDNAのL1領域のメチル化の頻度を測定する。次に、該測定結果と経過情報とを比較する。すなわち、経過情報において高度異形成以上の病変に進行した被験者の試料についてのメチル化の頻度の値と、経過情報において病変が消失した被験者の試料についてのメチル化の頻度の値とを、最も明確に区別できるメチル化の頻度の値を、閾値として設定できる。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されることを意図しない。
【実施例１】
【００５６】
１．試料
被験者から、手術により摘出された子宮頸部の組織のパラフィンブロックを薄切し、組織診(ヘマトキシリン−エオシン染色)により、「軽度異形成(CIN1)」、「中等度異形成(CIN2)」又は「高度異形成以上(CIN3以上)」に分類した。
同じ被験者から得られた10μmに薄切したパラフィンブロック３枚に、1 mlキシレンを加えて混合した。混合物を遠心分離した後に上清を捨て、沈殿物に1 mlの100%エタノールを加えて洗浄した。このエタノールによる洗浄をもう1回繰り返した後、洗浄した沈殿物を37℃にて10分間インキュベートして、エタノールを蒸発させた。ここで得られた沈殿物を、以下、「オペ試料」という。【００５７】
また、被験者から、コルポスコピー観察下で子宮頸部の一部の組織をかきとることにより得られた試料のパラフィンブロックを薄切し、上記と同様にして、組織診により病変の程度を分類した。
同じ被験者から得られた10μmに薄切したパラフィンブロック３枚に、1 mlキシレンを加えて混合した。混合物を遠心分離した後に上清を捨て、沈殿物に1 mlの100%エタノールを加えて洗浄した。このエタノールによる洗浄をもう1回繰り返した後、洗浄した沈殿物を37℃にて10分間インキュベートして、エタノールを蒸発させた。ここで得られた沈殿物を、以下、「生検試料」という。【００５８】
２．バイサルファイトシークエンス
2.1バイサルファイト処理
上記のオペ試料又は生検試料に、1% (w/v) SDSと0.1M NaOHとを含む溶液を500μl添加した。得られた混合物を、100℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後の混合物を４℃で遠心分離した後、上清を回収した。
得られた上清に、10Mの亜硫酸水素塩溶液500μlを添加して混合した。そして、得られた混合物を80℃で40分間インキュベートすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれる核酸を、核酸精製キット（QIAGEN社、商品名：QIAquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度0.3Mとなるように水酸化ナトリウムを添加した。次に、得られた混合物を室温で５分間インキュベートした。その後、得られた生成物を核酸精製用スピンカラム（GEヘルスケア社、商品名MicroSpin S-300 HR Columns）で精製し、亜硫酸水素塩処理された鋳型DNA試料50μlを得た。【００５９】
2.2 PCR反応
亜硫酸水素塩処理された鋳型DNA試料中の核酸に対して、以下の表1に示すプライマーセットを用いて、PCR反応を行った。
これらのプライマーセットは、表1に「増幅部位」として示す各HPVのゲノムDNAの領域の一部分を増幅するために適する配列を有する。【００６０】
【表１】
0005396396.tif 000003
【００６１】
PCRの反応液の組成は、次のとおりである。なお、DNAポリメラーゼとして、Ex Taq（登録商標）ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いた。
10×バッファー                      1.5μl
2.5mM dNTP                          1.2μl
フォワードプライマー(１０μM)       0.6μl
リバースプライマー(１０μM)         0.6μl
DNAポリメラーゼ                     0.075μl
水                                  9.025μl
鋳型DNA試料                         2μl 
合計                               15μl【００６２】
PCRの条件は、次の表２に示すとおりである。
【表２】
0005396396.tif 000004
【００６３】
2.3 TAクローニング及びDNA配列決定
PCRにより得られた増幅産物を、TAクローニングキット（Invitrogen社、商品名：TA cloning kit）に含まれるベクターに組み込んだ。得られた構築物を用いて、大腸菌（TOP10）を形質転換した。形質転換した大腸菌を、LB寒天培地（組成：1%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)酵母エキス、1%(w/v)塩化ナトリウム、1.5%(w/v)寒天）上で、37℃で一晩培養した。
得られた大腸菌コロニーから、コロニーPCR法により、PCR産物が組み込まれたベクターを有する大腸菌を選択し、LB液体培地を用いて37℃で一晩培養した。【００６４】
培養した大腸菌のグリセロールストックを作製し、TAKARA社に、大腸菌が有するベクターのDNA配列決定を依頼して、配列を決定した。
配列番号1〜3の配列に基づいてシトシンであると予測され、上記の配列決定においてもシトシンであると決定された位置のシトシンを、メチル化されていると判定した。配列番号1〜3の配列においてシトシンであると予測されるが、上記の配列決定により、ウラシル（チミン）に変換されている位置のシトシンは、メチル化されていないと判定した。【００６５】
３．結果
このようにして、各試料中のHPVのゲノムDNAのL1又はLCR領域において、メチル化されているCpGを検出した。結果のいくつかを、図１〜３に示す。
図１は、HPV-16のゲノムDNAのL1領域又はLCRにおいて、メチル化されているCpGを検出した結果を示す。
図２はHPV-52のゲノムDNAのL1領域又はLCRにおいて、メチル化されているCpGを検出した結果を示す。
図３はHPV-58のゲノムDNAのL1領域又はLCRにおいて、メチル化されているCpGを検出した結果を示す。
図１〜３では、亜硫酸水素塩での処理後のPCR反応において用いたプライマーセットを、各図の上部に「6F/6R」のように示す。また、「L1」及び「LCR」の各領域中の「CpGの位置」は、図４〜６に示す番号の位置のCpGに対応する。例えば、図1に示すように、「6F/6R」のプライマーセットを用いると、HPV-16のL1領域の5'末端側から11番目〜15番目のCpGを含む領域を増幅でき、これらのCpGのメチル化を測定できる。【００６６】
また、図１〜３では、各プライマーセットを用いたPCRによる増幅産物をTAクローニングして得られた複数の大腸菌クローンについて配列決定を行った結果を示している。例えば、図1に示す被験者No. 1では、「6F/6R」のプライマーセットを用いて得られたPCR増幅産物を含む7つの大腸菌クローンについてメチル化の測定を行っている。メチル化について測定されたHPV-16のL1領域のCpGのうち、メチル化されていると測定されたものを●で、メチル化されていないと測定されたものを○で示す。【００６７】
メチル化の頻度の計算は、図7に示すようにして行った。すなわち、解析した領域中の全CpGの個数のうち、メチル化されていたCpGの個数を、測定を行った全てのクローンの結果から求めた。【００６８】
3.1オペ試料についての結果及び考察
延べ２２人の被験者から得られたオペ試料について、上記のようにして得られたHPV-16、HPV-58及びHPV-52のL1領域中のメチル化の頻度を、組織診により診断された各病変の程度における分散図として図8に示す。
なお、２２人の被験者は、組織診により、5人が軽度異形成(図中、「１」で示す及び◆で示す)、６人が中等度異形成(図中、「２」、■及び□で示す)、１１人が高度異形成以上(図中、「３」及び▲で示す)と診断された。ここで、６人が中等度異形成と診断された被験者の試料うち、□で示される試料は、組織診により、「高度異形成」であることが疑われた試料である。【００６９】
図8の結果から、10％のメチル化頻度を閾値とすることにより、高度異形成以上の被験者からの試料と、それら以外の被験者の試料とを明確に区別できることがわかる。また、組織診で中等度異形成であると診断され、メチル化頻度が10％を超える試料が４つあった。そのうち、2つの試料は、組織診により、「高度異形成」であることが疑われた試料であった。【００７０】
次に、L1領域のCpGのうち、5'末端側から数えて80％までに含まれるCpGのみをメチル化の解析対象とし、図8と同様に、メチル化の頻度を組織診により診断された各病変の程度における分散図として図9に示す。ここで、5'末端側から数えて80％までに含まれるCpGとは、HPV-16では5'末端側から1〜15番目（15/19＝0.789）のCpGを示す。HPV-52では1〜17番目（17/22＝0.772）CpGを示す。HPV-58では1〜19番目（19/25＝0.76）のCpGを示す。【００７１】
さらに、残りのCpG、すなわちHPV-16について5'末端側から16〜19番目、HPV-52について18〜22番目、HPV-58について20〜25番目のCpGについてのメチル化頻度を、図8と同様に、メチル化の頻度を組織診により診断された各病変の程度における分散図として図10に示す。【００７２】
図9及び10の結果から、L1領域の全CpGのうち、5'末端側から数えて80%の領域内に位置するCpGについてのメチル化の頻度を測定する（図9）方が、それ以外のCpGについてのメチル化の頻度を測定する（図10）よりも、組織診の結果により一致する結果が得られることがわかる。【００７３】
3.2生検試料についての結果及び考察
10人の被験者から得られた生検試料について、本発明の方法に基づいて、HPV-16、HPV-58及びHPV-52のL1領域中のメチル化の頻度を測定し、10％のメチル化頻度を閾値として、高度異形成以上であるか（●）又はそうでないか（○）を検出した。
本発明の方法に基づく判定結果を、生検試料の組織診の結果、及び同じ被験者から採取したオペ試料に対して行われた組織診の結果と合わせて、図11に示す。【００７４】
なお、一般に、生検試料を用いる組織診は、試料の保存状態、標本作製における組織切片の調製の困難さなどのため、正しい診断結果を得られにくい傾向にある。一方、オペ試料を用いる組織診は、該試料はより多くの細胞を含む組織であるため、生検試料を用いる組織診よりも正確な診断結果を得られやすい傾向にある。【００７５】
図11の結果から、本発明の方法によれば、生検試料を用いた場合であっても、オペ試料を用いる組織診の診断により近い結果を得ることができることがわかる。
よって、本発明の方法によれば、オペ試料、生検試料のいずれであっても、該試料に含まれる高度異形成以上の病変由来の異常細胞の有無をより正確に判定できることがわかる。
【実施例２】
【００７６】
初診からの経過情報を有し、かつ初診から３年以内に子宮頸部の病変が消失した７人の被験者の初診時における生検のパラフィンブロックを用い、L1領域中のメチル化頻度を測定した。ここで、７人の被験者のうち、２人はHPV-16に、１人はHPV-52に、４人はHPV-58に感染した患者であった。【００７７】
また、初診からの経過情報を有し、かつ初診から３年以内に子宮頸部の病変が高度異形成以上に進行した９人の被験者の初診時における生検のパラフィンブロックを用い、同様にL1領域中のメチル化頻度を測定した。ここで、９人の被験者のうち、２人はHPV-16に、１人はHPV-31に、３人はHPV-52に、３人はHPV-58に感染した患者であった。【００７８】
なお、L1領域中のメチル化頻度の測定は、以下の表３に示すプライマーセットを用いた以外、実施例１と同様にして行った。なお、ＨＰＶ−３１のプライマーセットのＰＣＲ条件は、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−５２のプライマーセットと同一のＰＣＲ条件を用いた。【００７９】
【表３】
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【００８０】
図１２に、各経過の患者の初診時のL1領域中のメチル化頻度（％）を分散図で示す。図１２から、初診後に高度異形成以上の病変に進行した被験者の初診時のメチル化頻度は、初診後に病変が消失した被験者のそれよりも高いことが明らかとなった。【００８１】
また、図１３に、組織診により診断された各病変の程度の患者の初診時のL1領域中のメチル化頻度（％）を分散図で示す。図１３において、「×」は、初診後に病変が消失した被験者を示し、「●」は、初診後に高度異形成以上の病変に進行した被験者を示す。図１３から、初診時の組織診の結果が軽度異形成であっても、L1領域中のメチル化頻度が高い場合は、高頻度で初診後に高度異形成以上の病変に進行することが分かる。逆に、初診における組織診の結果が、高度異形成以上であっても、L1領域中のメチル化頻度が低い場合は、初診後に病変が消失する場合があることが示唆された。【００８２】
これらの結果から、試料中のHPVのゲノムDNAのL1領域中のメチル化頻度を測定することにより、被験者の子宮頸部の組織が高度異形成以上へ進行するか否かを予測できることがわかる。【００８３】
本出願は、２００８年１０月２３日に出願された日本国特許出願特願２００８−２７３２５７号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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