(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検液中の測定対象物質である、メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p)および(q)：
(p)メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体X、水素供与体YおよびコエンザイムAの存在下、反応式1：
【化１】
0005524865.tif 000128
の反応を触媒する酵素および反応式2：
【化２】
0005524865.tif 000129
の反応を触媒する酵素を作用させる工程；および
(q)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程；
を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。
【請求項２】
被検液中の測定対象物質である、コエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p')および(q')：
(p')コエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体Xと水素供与体Yとメバロン酸の存在下、反応式1：
【化３】
0005524865.tif 000130
を触媒する酵素および反応式2：
【化４】
0005524865.tif 000131
を触媒する酵素を作用させる工程；および
(q')生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程；
を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。
【請求項３】
前記測定対象物質の濃度が30nMより小さく、
前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、請求項1または2記載の測定方法。
【請求項４】
前記水素受容体Xが酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の測定方法。
【請求項５】
前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、請求項1〜4のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4または5記載の測定方法。
【請求項７】
前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項5または6記載の測定方法。
【請求項８】
前記測定対象物質の濃度が100nMより小さく、
前記水素受容体Xが、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、
前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、
前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、請求項1または2記載の測定方法。
【請求項９】
前記反応式1を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、請求項1〜8のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１０】
前記反応式2を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、請求項1〜9のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１１】
前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼが、Pseudomonas属、Variovorax属、Delftia属、Comamonas属またはArchaeoglobus属由来である、請求項9または10記載の測定方法。
【請求項１２】
前記反応式1および／または反応式2を触媒する酵素が：
(i)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(ii)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1および／または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質；
である、請求項1〜8のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１３】
前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質が3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAであり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o)：
(o)前記被検液からメバロン酸を除く工程；
をさらに含む、請求項1および3〜12のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１４】
前記工程(o)が、酵素反応により行われる、請求項13記載の測定方法。
【請求項１５】
前記酵素反応が、メバロン酸キナーゼによる酵素反応である、請求項14記載の測定方法。
【請求項１６】
前記工程(o)が、メバロン酸キナーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、請求項13記載の測定方法。
【請求項１７】
前記メバロン酸キナーゼが：
(i)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(ii)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式21の反応を触媒する活性を有するタンパク質；
である、請求項16記載の測定方法。
【化５】
0005524865.tif 000132
【請求項１８】
前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質がメバロン酸であり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o')：
(o')前記被検液から3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを除く工程；
をさらに含む、請求項1および3〜12のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１９】
前記工程(o')が、酵素反応により行われる、請求項18記載の測定方法。
【請求項２０】
前記酵素反応が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応である、請求項19記載の測定方法。
【請求項２１】
前記工程(o')が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、請求項18記載の測定方法。
【請求項２２】
前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼが：
(i)配列番号7のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(ii)配列番号7のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式22の反応を触媒する活性を有するタンパク質；
である、請求項21記載の測定方法。
【化６】
0005524865.tif 000133
【請求項２３】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
【請求項２４】
前記試薬中にメバロン酸が実質的に混在しないことを特徴とする、請求項23記載の測定用試薬。
【請求項２５】
前記試薬中に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAが実質的に混在しないことを特徴とする、請求項23または24記載の測定用試薬。
【請求項２６】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、コエンザイムA測定用試薬。
【請求項２７】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、コエンザイムA、リン酸供与体、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
【請求項２８】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸測定用試薬。
【請求項２９】
菌株Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)または反応式1：
【化７】
0005524865.tif 000134
または反応式2：
【化８】
0005524865.tif 000135
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異株。
【請求項３０】
菌株Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)または反応式1：
【化９】
0005524865.tif 000136
または反応式2：
【化１０】
0005524865.tif 000137
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異株。
【請求項３１】
菌株Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)または反応式1：
【化１１】
0005524865.tif 000138
または反応式2：
【化１２】
0005524865.tif 000139
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異株。
【請求項３２】
菌株Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)または反応式1：
【化１３】
0005524865.tif 000140
または反応式2：
【化１４】
0005524865.tif 000141
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異株。
【請求項３３】
以下の(A)〜(E)のいずれかに記載のタンパク質：
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1：
【化１５】
0005524865.tif 000142
または反応式2：
【化１６】
0005524865.tif 000143
の反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(C) 菌株Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)由来の、配列番号25に記載のN末端配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(D) 菌株Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来の、配列番号26に記載のN末端配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質；および
(E) 菌株Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来の、配列番号27に記載のN末端配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項３４】
サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i),(ii)の工程；
(i)サンプル中のメバロン酸に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)、コエンザイムA存在下、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼを作用させ3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程；
(ii)(i)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程；
を含む、前記の標準測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メバロン酸、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAおよびコエンザイムAの測定方法ならびに測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内におけるコレステロール合成量を把握することは、様々な病態の診断等に非常に重要である。コレステロールは、生体内において、アセチルコエンザイムAから、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA(以下、HMGCoAともいう)、メバロン酸(以下、MVAともいう)等を経由するメバロン酸経路で合成される。ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼによるHMGCoAからMVAへの変換はこのメバロン酸経路における律速段階であるため、生体内のコレステロール合成量はメバロン酸量を測定することにより推測することができる(非特許文献1)。これまで、生体試料中のMVAは、ラジオエンザイムアッセイ(非特許文献2)、GC-MS(非特許文献3)、LC-MS(非特許文献4)、抗体を用いた測定方法(非特許文献5)などによって測定されてきた。しかしながら、血清中のMVA濃度は、上記各文献の記載からも明らかなように非常に低濃度であり(63〜200nM(非特許文献1)、20〜75nM(非特許文献2)、18nM(非特許文献3)、7.7nM〜86.2nM(非特許文献6))、酵素を用いた比色法による血清中のMVA濃度の測定はこれまでに報告されていなかった。MVAと同様にHMGCoAも生体内におけるコレステロール代謝の指標として重要であると考えられるが、酵素を用いた比色法によるHMGCoA濃度の測定はこれまでに報告されていなかった。【０００３】
メバロン酸には２つの光学異性体があり、それぞれD/L表記法ではD-メバロン酸,L-メバロン酸、R/S表記法ではR-メバロン酸,S-メバロン酸と表記される。生体内で代謝される（メバロン酸キナーゼやハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼの基質となることができる）のはD-メバロン酸（R-メバロン酸と表記することもある）であり、L-メバロン酸（S-メバロン酸と表記することもある）は生体内では代謝されない。
本明細書中ではD,L-メバロン酸またはD,L-MVAとの表記はD体、L体が混合したラセミのメバロン酸を表し、単にメバロン酸またはMVAとの表記はD-メバロン酸またはR-メバロン酸を表す。
同様に、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAにも２つの光学異性体がありそれぞれD/L表記法ではD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA,L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA、R/S表記法ではR-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA,S-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと表記される。生体内で代謝される（ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼの基質となることができる）のはD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA（S-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと表記することもある）であり、L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA（R-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと表記することもある）は生体内では代謝されない。
本明細書中ではD,L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはD,L-HMGCoAとの表記はD体、L体が混合したラセミの3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表し、単に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはHMGCoAとの表記はD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはS-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表す。【０００４】
また、コエンザイムA(以下、CoAともいう)は生体内における脂質代謝の指標等として重要であると考えられるが、酵素を用いた比色法によるCoA濃度の簡便な測定はこれまでに報告されていなかった。【０００５】
酵素を用いた比色法により測定対象の濃度を高感度に測定するための方法として、酵素サイクリング法が報告されている。酵素サイクリング法とは、水素受容体Xと水素供与体Yとを介した酵素サイクリング反応(ここで、水素供与体Yと、還元型水素受容体Xとは同一物質でない)により、測定対象A由来のシグナルを増幅する方法である。酵素サイクリング法の概要は、以下の反応式3：
【化１】
0005524865.tif 000002
および反応式4：
【化２】
0005524865.tif 000003
の組み合わせを用いて表される。ここで、Aは測定対象であり、水素供与体Yと還元型水素受容体Xとは同一物質でなく、測定対象Aを含む被検液に、反応式3および反応式4を触媒する酵素、水素受容体Xならびに水素供与体Yを加えて上記の酵素反応を行う。反応中に測定対象Aは、AとA(酸化物)との間をサイクルし、サイクルした回数に応じて還元型水素受容体Xおよび酸化型水素供与体Yが生成するため、測定対象A由来のシグナルが増幅し、還元型水素受容体Xの量または酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を比色測定することにより、測定対象Aの高感度な測定を行うことができる。【０００６】
一般に、酵素サイクリング反応において反応液中に加える酵素量を増加させると、単位時間当たりの酵素サイクリング反応の回数が増加して感度が上がるが：1)反応に関与する酵素の反応速度定数kcat；2)反応液に溶解することができる酵素の量；3)用いる酵素の純度；などにより、一定量以上の酵素を反応液に添加することは不可能であるか測定感度の向上に効果が無い。したがって、酵素サイクリング反応において、測定可能な測定対象濃度の下限値が存在する。上記の酵素サイクリング法において、水素受容体Xが酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、T-NADともいう)または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、T-NADPともいう)であり、水素供与体Yが還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NADHともいう)または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、NADPHともいう)であるとき、測定対象について測定可能な濃度の下限値は、通常1〜10μM程度であった(特許文献1、特許文献2、非特許文献7、非特許文献8)。【０００７】
酵素サイクリング法を用いた、より高感度な測定方法における測定可能な濃度の下限値の例として：測定対象Aがコール酸、酵素サイクリング反応を触媒する酵素が3α-ステロイドデヒドロゲナーゼである場合の下限値は0.2μM(特許文献3)；測定対象Aがグルコース-6-リン酸、酵素サイクリング反応を触媒する酵素がグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼである場合の下限値は0.2μM(特許文献4)；測定対象Aがコレステロール、酵素サイクリング反応を触媒する酵素がコレステロールデヒドロゲナーゼである場合の下限値0.1μM(非特許文献9)であった。また、水素受容体Xが酸素、水素供与体YがNADHまたは還元型NADPHである場合、リゾフォスファチジン酸をリゾフォスファチジン酸リパーゼで分解して得られるグリセロール-3-リン酸を測定対象として、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼをサイクリング反応の酵素として用いて、還元型水素受容体Xである過酸化水素をパーオキシダーゼ、4-アミノアンチピリン、TOOSを用いて検出することで、0.03μMの下限値まで測定可能であった(非特許文献10)。【０００８】
特に、水素受容体XがT-NADまたはT-NADP、水素供与体YがNADHまたはNADPHである場合の酵素サイクリング反応としては、例えば：測定対象Aに対するデヒドロゲナーゼを用いた、以下の反応式5：
【化３】
0005524865.tif 000004
および反応式6：
【化４】
0005524865.tif 000005
の組み合わせによる反応(特許文献1、特許文献3、特許文献4、非特許文献7、非特許文献8)；測定対象がグルタミン酸もしくはα-ケトグルタル酸またはアンモニアであり、これらに対するグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いた、反応式7：
【化５】
0005524865.tif 000006
および反応式8：
【化６】
0005524865.tif 000007
の組み合わせによる反応(特許文献2)；あるいは測定対象がD-グリセロアルデヒド-3-リン酸、無機リン、または1,3-ジホスホグリセリン酸であり、これらに対しD-グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを用いた反応式9：
【化７】
0005524865.tif 000008
および反応式10：
【化８】
0005524865.tif 000009
の組み合わせによる反応(特許文献５)等が知られていた。そして、特許文献2においては、塩化アンモニウム測定の下限値として40μM、L-グルタミン酸測定の下限値として40μM、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの代わりにロイシンデヒドロゲナーゼを用い、反応式7および反応式8においてグルタミン酸をロイシンに、α-ケトグルタル酸を2-オキソイソカプロエイトに変更した酵素サイクリング反応におけるL-ロイシンの測定の下限値として4μMが報告されていた。特許文献4においては、リン酸測定の下限値として10μM、3-ホスホグリセリン酸キナーゼを用いて3-ホスホグリセリン酸を1,3-ジホスホグリセリン酸に変換した後に測定した下限値として0.2μMが報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平04-158799号公報
【特許文献２】特開平04-278099号公報
【特許文献３】特開平03-224498号公報
【特許文献４】特開平04-335898号公報
【特許文献５】特開平04-349898号公報
【特許文献６】特開平01-144976号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 May;79(9):3037-41
【非特許文献２】J Lipid Res. 1979 Aug;20(6):716-28
【非特許文献３】J Lipid Res. 1991 Jun;32(6):1057-60
【非特許文献４】J Lipid Res. 2006 Oct;47(10):2340-5
【非特許文献５】Clin Chem. 1998 Oct;44(10):2152-7
【非特許文献６】Rapid Commun Mass Spectrom. 2003;17(15):1723-34
【非特許文献７】Clin Chim Acta. 2003 Feb;328(1-2):163-71
【非特許文献８】Clin Chem. 1994 May;40(5):817-21
【非特許文献９】Clin Chem. 2002 May;48(5):737-41
【非特許文献１０】Clin Chim Acta. 2003 Jul 1;333(1):59-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
生体試料中の生体内コレステロール合成量の指標であるMVAを測定するための従来の手法において、例えば、ラジオエンザイムアッセイは放射性同位元素を使用するため、GC-MSおよびLC-MSは特殊な装置が必要なため、また、抗体を用いた測定方法は抗原抗体反応を利用するため、多検体を処理し、簡便に、かつ超高感度および高精度に測定できる方法とは言えなかった。MVAと同様に生体内におけるコレステロール代謝の指標として重要であると考えられるHMGCoAおよび生体内における脂質代謝の指標として重要であると考えられるCoAについても、多検体を処理可能で、簡便に、かつ超高感度および高精度に測定できる方法はこれまで知られていなかった。【００１２】
また、酵素サイクリング法を用いても、被検液中の測定対象物質の検出限界はこれまでの報告から0.03μM程度であると考えられ、被検液中の測定対象物質の濃度が30nMより低濃度の場合、例えば20nM、10nM、1nM、0.5nM、0.25nM等の場合には、酵素サイクリング法を用いても高感度で高精度な測定はできなかった。特に、水素受容体XがT-NADまたはT-NADP、水素供与体YがNADHまたはNADPHであり、反応式5および反応式6の組み合わせによる酵素サイクリング反応において、被検液中の測定対象物質の濃度が100nMより低濃度の場合、例えば50nM、25nM、20nM、10nM、1nM、0.5nM、0.25nM等の場合に、高感度で高精度な測定はできなかった。【００１３】
さらに、上述の通り、水素受容体XがT-NADまたはT-NADP、水素供与体YがNADHまたはNADPHである場合の酵素サイクリング反応は：水素受容体X、水素供与体Y、測定対象Aのみが関与する反応系；水素受容体X、水素供与体Y、測定対象Aに加え、リン酸が関与する反応系；または、水素受容体X、水素供与体Y、測定対象Aに加え、水およびアンモニアが関与する反応系；により行われてきたが、水素受容体X、水素供与体Y、測定対象Aに加えてコエンザイムAが関与する反応系による酵素サイクリング反応は、これまでに行われていなかった。また、これらの反応は：反応式3と反応式4；反応式5と反応式6；反応式7と反応式8；または、反応式9と反応式10；との組み合わせで示されるように、1分子の基質と1分子の水素受容体、または1分子の基質と1分子の水素供与体との間で行われる、水素授受に関しての単段階反応であり、例えば、1分子の基質と2分子の水素受容体、または1分子の基質と2分子の水素供与体との間で行われる、水素授受に関しての2段階反応を含む、3段階の反応で構成される酵素サイクリング法はこれまで知られてなかった。【００１４】
本発明は、生体試料中の生体内コレステロール合成量の指標としてのMVAおよびHMGCoAならびに生体内における脂質代謝の指標としてのコエンザイムAを、簡便に、かつ超高感度および高精度に測定する方法ならびに該測定に用いるための測定試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼを用いて、被検液中のメバロン酸、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはコエンザイムAを酵素サイクリング法により簡便かつ超高感度／高精度に比色測定する方法を考案し、本発明を完成した。【００１６】
上記反応式5および反応式6において、測定対象Aがメバロン酸の場合に反応を触媒するメバロン酸デヒドロゲナーゼはこれまで報告されていない。メバロン酸に作用する酵素としては、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ(EC1.1.1.34および／またはEC1.1.1.88：以下、HMGRともいう：「酵素ハンドブック：朝倉書店1982年」)が知られている。HMGRが触媒する反応は、反応式11：
【化９】
0005524865.tif 000010
および反応式12：
【化１０】
0005524865.tif 000011
で示されるように、1分子のメバロン酸と2分子の水素受容体、または1分子のHMGCoAと2分子の水素供与体との間で行われる、水素授受に関する2段階の反応である。上記反応式11および反応式12は、Genome Biol. 2004;5(11):248およびProtein Sci. 2000 Jun;9(6):12
26-34において、以下の反応式13：
【化１１】
0005524865.tif 000012
および反応式14：
【化１２】
0005524865.tif 000013
で示されるように水素授受に関しての2段階反応を含む3段階の反応で構成されていることが示唆されている。【００１７】
よって、メバロン酸について、HMGRを用いて反応式13および反応式14のメバロン酸とメバアルデヒドとの反応の部分のみ、すなわち以下の反応式15：
【化１３】
0005524865.tif 000014
および反応式16：
【化１４】
0005524865.tif 000015
の組み合わせによる、水素授受に関して単段階反応となるような酵素サイクリング反応をコエンザイムAの非存在下で行うことで、1段階の反応で1分子のT-NAD(P)Hが生成することから、3段階の反応で2分子のT-NAD(P)Hを生成することに比べて、T-NAD(P)Hの生成効率が高くなり、メバロン酸を高感度に測定することが考えられる。また、HMGCoAについて、HMGRを用いて反応式13および反応式14のメバジルコエンザイムAとHMGCoAとの反応の部分のみ、すなわち以下の反応式17：
【化１５】
0005524865.tif 000016
および反応式18：
【化１６】
0005524865.tif 000017
の組み合わせによる、水素授受に関して単段階反応となるような酵素サイクリング反応をコエンザイムAの非存在下で行うことで、同様にHMGCoAを高感度に測定することが考えられる。しかし、予想に反して、上記反応式15および反応式16の組み合わせによる酵素サイクリング反応は、MVAが低濃度の場合、例えば反応液中で45nM以下（D,L-MVAである場合は90nM以下）、9nM以下（D,L-MVAである場合は18nM以下）の場合には進行せず、メバロン酸の高感度な測定はできないことが判明した。また、上記反応式17および反応式18の組み合わせによる酵素サイクリング反応も同様に、HMGCoAが低濃度の場合、例えば反応液中で9nM以下（D,L-HMGCoAである場合は18nM以下）の場合には進行せず、HMGCoAの高感度な測定はできないことが判明した。【００１８】
一方、以下の反応式19：
【化１７】
0005524865.tif 000018
および反応式20：
【化１８】
0005524865.tif 000019
の組み合わせによる、水素授受に関しての2段階反応を含む3段階の反応で構成される酵素サイクリング反応は、多段階反応であることから酵素サイクリング反応が進まない、またはこれまでに報告されている単段階反応で構成される酵素サイクリング反応に比べて反応効率が非常に悪いと考えられていたが、驚くべきことに、この酵素サイクリング反応は効率よく進行し、被検液中のメバロン酸またはHMGCoAを、これまでになく超高感度に測定できることを本発明者は見出した。【００１９】
したがって、本発明者は、1)これまで知られていなかったコエンザイムAが関与する酵素サイクリング反応が可能であることを見出し、2)酵素HMGRを用いて、水素授受に関しての2段階反応を含む3段階の反応で構成されている反応式11および反応式12の組み合わせによる酵素サイクリング反応が可能であることを見出し、さらに、3)上記2)の酵素サイクリング反応により、被検液中のMVA、HMGCoAおよび／またはコエンザイムAが100nMより低濃度の場合、例えば50nM、25nM、20nM、10nM、1nM、0.5nM、0.25nMといった濃度であっても、これまでになく超高感度に比色測定できることを見出し、本発明を完成した。【００２０】
すなわち、本発明は、以下のものに関する。
被検液中の測定対象物質である、メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p)および(q)：(p)メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体X、水素供与体YおよびコエンザイムAの存在下、反応式1：
【化１９】
0005524865.tif 000020
の反応を触媒する酵素および反応式2：
【化２０】
0005524865.tif 000021
の反応を触媒する酵素を作用させる工程；および(q)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程；を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。
被検液中の測定対象物質である、コエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p’)および(q’)：(p’)コエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体Xと水素供与体Yとメバロン酸の存在下、反応式1：
【化２１】
0005524865.tif 000022
を触媒する酵素および反応式2：
【化２２】
0005524865.tif 000023
を触媒する酵素を作用させる工程；および(q’)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程；を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。
前記測定対象物質の濃度が30nMより小さく、前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、前記の測定方法。
前記水素受容体Xが酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、前記の測定方法。
前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、前記の測定方法。
前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記の測定方法。
前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記の測定方法。
前記測定対象物質の濃度が100nMより小さく、前記水素受容体Xが、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Ｙの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、前記の測定方法。
前記反応式1を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、前記の測定方法。
前記反応式2を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、前記のいずれかに記載の測定方法。
前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼが、Pseudomonas属、Variovorax属、Delftia属、Comamonas属またはArchaeoglobus属由来である、前記の測定方法。
前記反応式1および／または反応式2を触媒する酵素が：(i)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；または(ii)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1および／または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質；である、前記の測定方法。
前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質が3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAであり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o)：(o)前記被検液からメバロン酸を除く工程；をさらに含む、前記の測定方法。
前記工程(o)が、酵素反応、好ましくはメバロン酸キナーゼによる酵素反応により行われる、前記の測定方法。
前記工程(o)が、メバロン酸キナーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、前記の測定方法。
前記メバロン酸キナーゼが：(i)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；または(ii)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式21の反応を触媒する活性を有するタンパク質；である、前記の測定方法。
【化２３】
0005524865.tif 000024
前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質がメバロン酸であり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o’)：(o’)前記被検液から3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを除く工程；をさらに含む、前記の測定方法。
前記工程(o’)が、酵素反応により行われる、前記の測定方法。
前記酵素反応が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応である、前記の測定方法。
前記工程(o’)が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、前記の測定方法。
前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼが：(i)配列番号7のアミノ酸配列を有するタンパク質；または(ii)配列番号7のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式22の反応を触媒する活性を有するタンパク質；である、前記の測定方法。
【化２４】
0005524865.tif 000025
【００２１】
本発明は、また、以下のものに関する。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
前記試薬中にメバロン酸が実質的に混在しないことを特徴とする、前記の測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬の製造方法であって、混在するメバロン酸を、メバロン酸キナーゼを用いて除去する工程を含む、前記の製造方法。
前記試薬中に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAが実質的に混在しないことを特徴とする、前記の測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および／または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬の製造方法であって、混在する3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼを用いて除去する工程を含む、前記の製造方法。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、コエンザイムA測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、コエンザイムA、リン酸供与体、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸測定用試薬。
菌株Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)又は、16SrDNAの配列が配列番号8と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
菌株Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)又は、16SrDNAの配列が配列番号9と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
菌株Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)又は、16SrDNAの配列が配列番号10と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
菌株Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)又は、16SrDNAの配列が配列番号11と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
以下の(A)〜(C)のいずれかに記載のタンパク質：(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質；および(C)配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質。
サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i)〜(iv)の工程；
(i)サンプル中のメバロン酸にATP存在下、メバロン酸キナーゼを作用させメバロン酸とATPをメバロン酸リン酸とADPに変換する工程；
(ii)(i)で生じたADPにグルコース存在下でADP依存ヘキソキナーゼを作用させグルコース-6-リン酸とAMPに変換する工程；
(iii)(ii)で生じたグルコース-6-リン酸を酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)存在下、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、6-ホスホグルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程；および
(iv)(iii)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程、を含む、前記の標準測定法。
サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i),(ii)の工程;
(i)サンプル中のメバロン酸に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)、コエンザイムA存在下、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼを作用させ3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程;および
(ii)(i)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程；を含む、前記の標準測定法。
前記の標準測定法により正確なメバロン酸量が値付けされたメバロン酸標準物質。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、生体内コレステロール合成量の指標としての生体試料中のMVAおよび／またはHMGCoAあるいは生体内脂質代謝の指標としての生体試料中のCoAを、簡便かつ超高感度／高精度に測定することが可能となり、また、汎用の自動分析機を用いて多検体について、前記の測定が可能となる。したがって、日常の臨床検査等において多検体を正確に測定することが可能になり、病態診断等に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例21における酵素サイクリング反応を用いたMVA測定の結果を示すグラフである。
【図２】実施例21における酵素サイクリング反応を用いたHMGCoA測定の結果を示すグラフである。
【図３】実施例25におけるHMGR-Vの残存活性の測定の結果を示すグラフである。
【図４】実施例25におけるHMGR-Dの残存活性の測定の結果を示すグラフである。
【図５】実施例25におけるHMGR-Cの残存活性の測定の結果を示すグラフである。
【図６】実施例25におけるHMGR-Pの残存活性の測定の結果を示すグラフである。
【図７】実施例25におけるHMGR-Aの残存活性の測定の結果を示すグラフである。
【図８】実施例25におけるHMGR-Vの各pHでの相対活性の測定の結果を示すグラフである。
【図９】実施例25におけるHMGR-Dの各pHでの相対活性の測定の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例25におけるHMGR-Cの各pHでの相対活性の測定の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例25におけるHMGR-Pの各pHでの相対活性の測定の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例25におけるHMGR-Aの各pHでの相対活性の測定の結果を示すグラフである。
【図１３】実施例29におけるMVK法を用いた反応タイムコース測定の結果を示すグラフである。
【図１４】実施例30におけるHMGR法を用いた反応タイムコース測定の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、反応式1：
【化２５】
0005524865.tif 000026
および反応式2：
【化２６】
0005524865.tif 000027
の組み合わせによる酵素サイクリング反応を用いた、被検液中の測定対象の測定方法に関する。
【００２５】
本明細書中において、「被検液」とは、本発明の測定方法における測定対象であるMVA、HMGCoAおよび／またはコエンザイムAが溶解している溶液であり、水、酸、塩基、金属イオン、糖類、アルコール類、アミノ酸類、タンパク質、塩類、緩衝成分、界面活性剤、キレート剤、その他有機化合物を含む溶液であり得る。食品の被検液としては、ビール、ジュース、固形食品からの抽出液等およびそれらの希釈水溶液が含まれ、生体試料の被検液としては、血液、血漿、血清、血球などの細胞内液、尿、唾液、涙、組織抽出液およびそれらの希釈水溶液が含まれ、それらに酸、塩基、金属イオン、糖類、アルコール類、アミノ酸類、タンパク質、塩類、緩衝成分、界面活性剤、キレート剤、その他有機化合物などの添加物を測定対象物の安定性の向上、容器への付着低減、測定感度の向上等のため適宜加えたものも含まれる。
被検液が尿である場合はその濃淡の指標として尿中の物質の濃度、例えばクレアチニン濃度を測定し、尿中のMVA濃度、HMGCoA濃度、またはCoA濃度をクレアチニン濃度で除した値を指標として使うこともできる。
【００２６】
本明細書中において、「水素受容体」とは、酵素による基質の酸化反応に際し、広義には、電子を受け取るものであり、より特定すれば、基質から抜き取られた水素を受け取るものである。例えば、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、酸化型キノン類、フラビン類、インドフェノール類、テトラゾリウム化合物、酸素分子、システイン等のSH基を有する化合物、フェレドキシン、チトクロムc3、チトクロムc6などが挙げられる。酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類としては酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NADともいう)、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、NADPともいう)、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、T-NADともいう)、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、T-NADPともいう)、酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などが挙げられる。フラビン類としてはFAD、FMN、リボフラビンなどが挙げられる。インドフェノール類としては2,6-ジクロロフェノールインドフェノールなどが挙げられる。テトラゾリウム化合物としてはニトロテトラゾリウムブルー、WST-1、WST-3、WST-8などが挙げられる。
【００２７】
本明細書中において、「水素供与体」とは酵素による基質の還元反応に際し、広義には、電子を供与するものであり、より特定すれば、基質に付与する水素を提供するものである。例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、還元型キノン類、還元型リボフラビン類、グルタチオンのようなS-S結合を有する化合物が挙げられる。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類としては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NADHともいう)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、NADPHともいう)、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、T-NADHともいう)、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、T-NADPHともいう)、還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などが挙げられる。
【００２８】
本明細書中における水素受容体は、一般には電子受容体と呼ばれることもあり、電子伝達体の電子を受け取りやすい状態(酸化型)を表すものである。一方、本明細書中における水素供与体は、一般には電子供与体と呼ばれることもあり、電子伝達体の電子を放出しやすい状態(還元型)を表すものである。ここで、電子伝達体とは電子伝達反応を担う化合物の総称であり、水素伝達体と呼ばれることもある。
【００２９】
上記反応式1において、水素受容体Xとしては、酸素、酸化型キノン類、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類などが挙げられるが、反応式1を触媒する酵素がHMGRである場合、水素受容体Xは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が好適であり、その具体例として、NAD、NADP、T-NAD、T-NADP、酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が挙げられる。
【００３０】
上記反応式2において、水素供与体Yとしては、還元型キノン類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類などが挙げられるが、反応式2を触媒する酵素がHMGRである場合、水素供与体Yは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が好適であり、その具体例として、NADH、NADPH、T-NADH、T-NADPH、還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が挙げられる。
【００３１】
HMGR等の酵素が触媒する反応式1および反応式2の組み合わせによる酵素サイクリング反応を用いた測定方法において、測定対象物質がMVAおよび/またはHMGCoAあるいはCoAである際の水素受容体Xと水素供与体Yの組み合わせとして、T-NADとNADH、T-NADとNADPH、T-NADPとNADH、またはT-NADPとNADPHの組み合わせを用いると、酵素サイクリング反応で生成されるT-NADHまたはT-NADPHの量は波長380〜430nmの吸光度により測定できることから望ましく、用いるHMGR等の酵素の反応性から好適な組み合わせを選べばよい。例えば該酵素として、Pseudomonas属、Variovorax属、Delftia属、Comamonas属、Archaeoglobus属由来のHMGRを用いる場合、T-NADとNADHの組み合わせが好ましい。
【００３２】
本発明の測定方法は、上記反応式1および2の反応を触媒する酵素を、上記の被検液に作用させる工程を含む。そのような酵素は、反応式1および2の反応を触媒して、これらの組み合わせによる酵素サイクリング反応を形成する限り特に限定されないが、代表的な酵素としてはハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ(HMGR)が挙げられる。
【００３３】
HMGRは、反応式1および反応式2の反応、より特定すれば反応式11およびその逆反応である反応式12の反応を触媒する酵素である。よって、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類、酵母、古細菌、真性細菌等に存在するHMGR等、既報の全てのHMGRを本発明の測定方法において用いることができる。また、後述の実施例1に記載の測定方法と同様に、測定試薬Aを用いてHMGR活性を測定することができ、これにより、組織、細胞等の抽出液にHMGRが存在するかを容易に確認することができるので、新たなHMGRを発見して該新規HMGRを本発明のHMGRとして用いることができる。該新規HMGRとして、本発明者は、Pseudomonas属、Variovorax属、Delftia属、Comamonas、Archaeoglobus属属由来のHMGR、より具体的にはPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)、Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGRを見出した。
【００３４】
すなわち、本発明は、上記の菌株Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)、Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)およびComamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)ならびにこれらの菌株の変異体であって、16SrDNAの配列がこれらの菌株のいずれかと95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは98.5%以上、特に好ましくは98.7%以上の相同性を有し、かつ、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有する変異体も提供する。一般に、16SrDNAの配列が97%以上、特に98.7%以上の相同性を有する菌株は、同一種に属する可能性が高いことが知られている(Microbiology today 2006;33:152-155)。
【００３５】
また、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素として、アミノ酸配列(膜貫通領域をもつHMGRにおいては好ましくは膜貫通領域を除いた部分のアミノ酸配列)が、既知のHMGR(例えばGenome Biol. 2004;5(11):248のTable1に記載のHMGR)と60%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは90%以上の相同性を有するタンパク質であって、反応式1および反応式2の反応を触媒するものも用いることができる。例えば配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質はHMGR活性を持ち、これらを用いることができる。さらにHMGRの塩基配列またはアミノ酸配列を改変し、そのアミノ酸配列において１または数個(例えば、1〜9個、より好ましくは1〜5個)のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換したアミノ酸配列あるいはこれらのいずれかのアミノ酸配列に他のタンパク質又はペプチドを融合させたものであって、反応性、安定性、生産性、精製効率などの性能を向上させた、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素も用いることもできる。HMGRをPEG等で化学修飾または重合化して反応性、安定性などの性能を向上させた、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素も用いることができる。被検液中にヒトのHMGRの阻害剤、例えばスタチン系薬剤等、が含まれる場合にはその阻害剤により阻害を受けないまたは受ける阻害の程度が少ないHMGR（例えばヒト由来以外のHMGR、改変されたHMGR、修飾されたHMGR等）を用いることができるし、阻害を受けても影響がでないように高濃度のHMGRを用いることもできる。例えば、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRはmevastatin、mevinolinによる阻害を受けないので用いることができる。
【００３６】
反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素としてHMGRを用いる場合、以下に記載するように、当業者に公知の手法に準じてHMGRを製造することができる。例えば、HMGRを生産する酵母、古細菌、真性細菌等を培養し、その細胞内にHMGRを蓄積させた後、またはその培養液にHMGRを分泌させて生産させた後、酵素精製法に従って精製すればよい。HMGRを生産する酵母、カビ、古細菌、真性細菌等を培養するには、HMGRの生産量が増大するような適切な培地(酵母エキス、塩化アンモニウムなどの窒素源、グルコースなどの炭素源、塩類などを組み合わせ、必要に応じてHMGRの生産が増加するような添加剤、例えばメバロン酸を加えたもの)で、適切な培養条件下(pH、温度、溶存酸素量、培養時間を適切に設定する)、培養すればよい。HMGRを効率よく生産する遺伝子組換生物は、HMGR遺伝子を適切なプロモーターの下流に配置したものを自律複製可能なプラスミドに連結して大腸菌等の細菌、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳類細胞等に導入することで、またはHMGR遺伝子を適切なプロモーターの下流に配置したものを大腸菌等の細菌、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳類細胞の染色体DNAに組み込むことで、作製することができる。上記のHMGR遺伝子やプロモーターは、それらを保有する生物のゲノムDNAやcDNAから公知の方法でクローニングをしたり、配列情報をもとに化学合成することで得ることができる。例えば遺伝子組換大腸菌においてHMGRを発現させるには、pUC18、pHSG396などの自律複製型の多コピープラスミドに、Lacプロモーター、Trpプロモーター、PLプロモーター、T7プロモーターなどの誘導型プロモーター、ピルビン酸オキシダーゼプロモーター(以下、POPプロモーターともいう。配列番号4、特許文献6参照)などの非誘導型プロモーターの下流にHMGR遺伝子を連結して組み込んだものを大腸菌に導入して作製することができる。細胞内に蓄積させたHMGRを精製するには、培養液から菌体をろ過、遠心分離等によって分離し、菌体を適切なpHの緩衝液(例えばpH5.0〜8.0のリン酸緩衝液、例えばpH7.0〜10.0のトリス緩衝液)中で、必要に応じて界面活性剤、金属塩、糖類、アミノ酸、ポリオール、キレート剤等を加えて懸濁し、リゾチーム、浸透圧、超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、ホモジナイザー等によって破砕した後、ろ過、遠心分離などにより不溶物を除去して粗製のHMGR含有液を得る。培養液に分泌させたHMGRを精製するには、培養液から菌体をろ過、遠心分離等によって除去して粗製のHMGR含有液を得る。得られた粗製のHMGR含有液を、公知のタンパク質、酵素の精製手段を用いて処理することにより、精製されたHMGRを得ることができる。例えば、アセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、加熱処理、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択し、組み合わせて用いることで、また、適切なpHの緩衝液に必要に応じて塩類、界面活性剤、金属塩、糖類、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、補酵素等を加えた溶液を、精製過程で用いることで、HMGRを精製することができる。精製されたHMGRは、必要に応じて安定化剤、例えば塩類、緩衝成分、界面活���剤、金属塩、糖類、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、補酵素等を単独または2種以上組み合わせて加え、溶液保存、凍結保存、凍結乾燥保存等することができる。
【００３７】
被検液中の測定対象がMVAおよび／またはHMGCoAである場合、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させる工程において、酵素を作用させる際の反応液には、コエンザイムA、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を、反応式1および反応式2の反応の組み合わせによる酵素サイクリング反応が適切に進行するように、また被検液および反応液構成原料由来の夾雑物の影響を回避できるように、適宜選択して構成成分として適切な量を加えることができる。
【００３８】
上記の反応液に加えることができるものとして、より具体的な例を以下に列記するが、これらに限定されるものではない。酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類としては、既に上述したものが挙げられる。酸としては塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、酢酸などが挙げられ、アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、エタノールアミン、エチレンジアミンなどが挙げられる。緩衝成分としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、エタノールアミン緩衝液、グリシンなどのアミノ酸緩衝液、トリス、HEPES、PIPES、CAPS、CAPSOなどのグッド緩衝液などが挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウムなどの無機および有機ナトリウム塩または同様のカリウム塩、アンモニウム塩、リチウム塩などが挙げられる。炭酸イオンまたは炭酸水素イオンを含む緩衝成分、塩類は液状の試薬のpHが高いとき(例えばpH8.5以上またはpH9.0以上)に大気中の二酸化炭素の影響を回避するのに好適である。界面活性剤としてはSDS、SLSなどの陰イオン性界面活性剤、DTACなどの陽イオン性界面活性剤、パルミトイルリゾレシチン、CHAPS、CHAPSOなどの両性界面活性剤、Triton、Tweenなどの非イオン性界面活性剤、DOCなどのステロイド骨格を持つ界面活性剤、n-デシル-β-D-マルトシド、n-オクチル-β-D-グルコシドなどの糖骨格を持つ界面活性剤、N-アシルアミノ酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩などの界面活性剤などが挙げられる。キレート剤としてはEDTA、EGTA、IDA、NTPO、TPENなどが挙げられる。金属イオンとしてはナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、金、銀、銅などの金属イオンが挙げられる。糖類としてはグルコース、フルクトース、キシロース、イノシトール、ソルビトール、シュークロース、トレハロースなどの単糖類、多糖類が挙げられる。アミノ酸類としては、グリシン、アラニン、オルニチン、ノルロイシンなどのDおよびLアミノ酸が挙げられる。ペプチド類としては、長さ2〜10程度のアミノ酸がつながったもの、例えばジペプチド類、トリペプチド類、およびタンパク質のプロテアーゼ分解物などが挙げられる。タンパク質類としては、リゾチーム、アルブミン、セリシン、カゼイン、カタラーゼ、パーオキシダーゼなどが挙げられる。核酸類としては各種デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドが挙げられる。色素類としてはクロロフィル、クロロフィリン、タートラジン、メチレンブルー、メチルレッド、フェノールフタレインなどが挙げられる。アルコール類としてはメタノール、エタノール、オクタノールなどが挙げられる。ポリオール類としてはエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコールなどが挙げられる。有機溶媒としてはジメチルスルオキシド、ジメチルホルムアミド、フェノールなどが挙げられる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、ケーソンCG、プロクリンなどの抗菌物質や静菌物質、カナマイシンなどの抗生物質などが挙げられる。
【００３９】
被検液中の測定対象がMVAおよび／またはHMGCoAである場合、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させる工程において、酵素の反応条件は適宜調整することができる。例えば、反応温度としては20〜55℃、好ましくは25〜45℃、より好ましくは30〜40℃、反応時間としては1分〜2時間、好ましくは3分〜35分、より好ましくは5分〜31分、pHとしては6.0〜11.0、好ましくは7.0〜11.0、より好ましくは7.5〜11.0、さらに好ましくは8.5〜10.5の条件を用いることができる。また、反応液全量に対し、緩衝液成分の濃度は、例えばトリス緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、CAPS緩衝液、CAPSO緩衝液を用いる場合、5〜500mM、好ましくは10〜200mM、より好ましくは20〜100mMであることができ、コエンザイムAの濃度は、0.001mM〜20mM、好ましくは0.01〜10mM、より好ましくは0.1〜5mMであることができる。
【００４０】
被検液中の測定対象がMVAおよび／またはHMGCoAである場合、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させる工程において、反応液全量に対し、水素受容体XがT-NAD(P)である場合、その濃度は0.01mM〜20mM、好ましくは0.1〜10mM、より好ましくは0.2〜4mM、好ましくは0.5〜8mMであり、水素供与体YがNAD(P)Hである場合、その濃度は0.001mM〜5mM、好ましくは0.01〜2mM、より好ましくは0.02〜1mMである。反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素がHMGRである場合、反応液全量に対し、その濃度は適切な感度が出るように調節できるが、例えば1〜1000U/mL、好ましくは10〜500U/mL、より好ましくは20〜200U/mLである。ここで、酵素活性1UはMVA、CoAおよびNAD存在下、37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを生成させる酵素量である。
【００４１】
上記の酵素を作用させる工程により生成した、還元型水素受容体Xまたは酸化型水素供与体Yの量あるいは該工程により減少した、水素受容体Xの量または水素供与体Yの量を測定する方法としては、比色分析による方法、蛍光、化学発光、生物発光、ボルタメトリーやアンペロメトリーなどの電極を用いての電圧や電流を測定する方法があるが、測定の簡便さから比色分析による方法が望ましい。例えば、還元型水素受容体XがT-NADHまたはT-NADPHである場合、波長380〜430nmの吸光度における比色分析による方法が望ましい。なお、本明細書中において、「比色分析」とは、吸光分析または吸光光度法とも呼ばれ、特定波長の光(例えば340±5nmの波長の光)を測定対象溶液に透過させることにより吸光度を測定し、得られた吸光度からランベルト−ベールの法則に従って対象溶液中に存在する物質の濃度を測定する方法である。
【００４２】
本発明の測定方法においては、被検液中の測定対象が非常に低濃度であっても、超高感度および高精度な濃度測定が可能となる。例えば、被検液中の測定対象がMVAおよび／またはHMGCoAである場合、被検液中のMVAおよび／またはHMGCoAの濃度は、最小検出限界濃度以上であって、1000nM以下、好ましくは500nM以下、より好ましくは250nM以下、さらに好ましくは100nM以下、さらにより好ましくは50nM以下であり、被検液中のMVAおよび／またはHMGCoAの最小検出限界濃度は20nM以下、好ましくは10nM以下、より好ましくは5nM以下、さらに好ましくは2.5nM以下、さらにより好ましくは0.5nM以下である。なお、ここで言う最小検出限界濃度とは、いくつかの濃度系列の被検液を複数回測定したときの平均値±3SDの範囲が、濃度0の被検液を同様の手法を用いて測定したときの平均値±3SDの範囲と交差しない最小の濃度をあらわすものとする。ここで、SDは標準偏差をさす。
【００４３】
被検液中の測定対象がCoAであって、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させる工程において、酵素を作用させる際の反応液は、上記の測定対象がMVAおよび／またはHMGCoAである場合の反応液において、CoAをMVAに変更した成分で構成されたものを用いることができる。ここで、MVAの濃度は、0.0005〜10mM、好ましくは0.005〜2.5mM、より好ましくは0.05〜0.5mMであることができる。また、ここでD,L-MVAも用いることができるがD,L-MVAの濃度で表す場合、該濃度は、本発明において用いられる指標である上記MVA濃度に対して約2倍となる。
【００４４】
また、本発明の測定方法においては、被検液中の測定対象の超高感度および高精度な濃度測定が可能となるため、被検液中の測定対象がCoAである場合、被検液中のCoAの濃度は、最小検出限界濃度以上であって、10μM以下、好ましくは5000nM以下、より好ましくは1000nM以下、さらに好ましくは500nM以下であり、被検液中の最小検出限界濃度は100nM以下、好ましくは50nM以下である。なお、ここで言う最小検出限界濃度とは、いくつかの濃度系列の被検液を複数回測定したときの測定値の平均値±3SDの範囲が、濃度0の被検液を同じく測定したとき測定値の平均値±3SDの範囲と交差しない最小の濃度をあらわすものとする。
【００４５】
本発明に係る測定方法において、被検液中の測定対象がMVAまたはHMGCoAであって、被検液中にMVAおよびHMGCoAの両物質が存在する場合、測定により、両物質の和の濃度が得られ、MVAまたはHMGCoAのいずれかのみの濃度は得られない。そこで、被検液中にMVAおよびHMGCoAの両物質が存在する場合であって、HMGCoAのみの濃度を測定しようとする際には、1)被検液中のHMGCoAを除去したサンプルと除去しないサンプルの2つを準備し、それぞれのサンプルに反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させ、それらの測定量の差から被検液中のHMGCoAを算出する、または2)被検液に反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させる工程に先立って、被検液中のMVAを除く工程を行うことが望ましい。上記1)については後述する被検液中のHMGCoAを除く工程を用いて被検液のHMGCoAを除去したサンプルを準備して行うことができる。上記2)について、被検液中のMVAを除く工程は、測定対象であるHMGCoAを除くことなく行うことができれば特に制限されず、例えば、MVA特異的な吸着剤や選択的な膜によって被検液を処理する方法や、MVAを反応式1に関与しないような物質に変換する方法を用いることができる。MVAを反応式1に関与しないような物質に変換する方法としては例えば酵素反応を用いる方法が挙げられる。酵素を用いて、例えば以下の反応式21：
【化２７】
0005524865.tif 000028
記載のようにATPのようなリン酸供与体およびマグネシイムイオンまたはマンガンイオンの存在下、MVAを、反応式1に関与しないメバロン酸リン酸に変換することができる。該酵素の例として、例えばメバロン酸キナーゼ(EC2.7.1.36：以下、MVKともいう)が挙げられる。酵素反応によってMVAを除く工程において、反応液のpH、緩衝液、塩濃度等を最適になるように変化させることができる。また、必要に応じ、反応式21の生成物であるメバロン酸リン酸をさらにリン酸化するホスホメバロン酸キナーゼ(EC2.7.4.2)の添加、ADPを除去する目的でのホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼの添加、またはグルコースとADP依存ヘキソキナーゼの添加を行うことができる。
【００４６】
上述のように、酵素(例えばMVK)反応を用いて被検液中のMVAを除く工程の後、そのまま反応式1および反応式2の組み合わせによる酵素サイクリング反応に供すると、反応式2によってHMGCoAから変換されたMVAに前記酵素(例えばMVK)が作用することになる。したがって、酵素反応を用いて被検液からMVAを除く工程の後、用いた酵素を取り除くか、または酵素の反応を停止させることが望ましい。例えば、膜を用いた限外ろ過によって、酵素を取り除くことができ、酵素がMVKである場合、例えば分画分子量5000〜30000の膜を用いて限外ろ過することで、HMGCoAを除くことなくMVKを除くことができる。また、酵素の反応を停止させるには、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、酵素失活物質の添加など、HMGCoAを分解することなく所望の酵素を失活させる方法、所望の酵素(例えばMVK)の活性を阻害するが、反応式1および2の反応を触媒する酵素(例えば、HMGR)の活性を阻害しない物質を反応液に加える方法などを用いることができる。例えば、MVKの反応を阻害するがHMGRの酵素サイクリング反応を阻害しない物質として、マグネシウムイオンをキレートするキレート剤(例えばEDTA、EGTA、NTAなど)が挙げられる。上記の酵素を取り除くか、または酵素の反応を停止させる方法のうち、アルカリ処理による方法およびキレート剤を添加する方法は、分離操作を必要とせず、自動分析機において同一反応槽で一連の操作を行うことができるため好ましい。ここで、分離操作とは、被検液中のHMGCoAを測定する一連の工程の過程で行われる、カラムクロマトグラフィー操作、膜ろ過操作、吸着分離操作、抽出分離操作、沈殿分離操作などをいう。
【００４７】
MVAを除く工程において用いることのできる酵素は、MVAを反応式1に関与しないような物質に変換することができるものであれば限定されず、例えば反応式21を触媒する酵素を用いることができる。そのような酵素の特定の例として、例えばヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来、酵母などの真核生物由来、Enterococcus faecalisなどの原核生物由来のMVKが挙げられる。またそれらのMVKと、アミノ酸配列において、60%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは90%以上の相同性を有するタンパク質であって、酵素反応によりMVAを除くことができる酵素もまた、これらの安定性、反応性、生産性などを考慮し適宜選択して用いることができる。例えばSaccharomyces cerevisiae由来の配列番号5の塩基配列(Curr. Genet. 1991 Jan;19(1):9-14)でコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質は反応式21を触媒する酵素であり、これを用いることができる。さらにMVKの塩基配列またはアミノ酸配列を改変し、そのアミノ酸配列において欠失、付加、および／または置換を加えたものであって、反応性、安定性、生産性、精製効率などの性能を向上させた、酵素反応によりMVAを除くことができる酵素も用いることができる。MVKをPEG等で化学修飾または重合化して反応性、安定性などの性能を向上させた、酵素反応によりMVAを除くことができる酵素も用いることができる。
【００４８】
MVAを除く工程において用いることのできる酵素は、上記HMGRの製造について記載したように、当業者に公知の手法に準じて行うことができる。例えば、MVKを生産する酵母、古細菌、真性細菌等を培養し、その細胞内に蓄積させて、または培養液に分泌させて生産した後、一般に用いられる酵素精製法に従って精製すればよい。
【００４９】
被検液中からMVAを除く工程において、酵素反応を用いる場合、反応液には、酵素に加えて、リン酸供与体、マグネシウム化合物、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を、酵素によるMVAの除去が適切に行われるように、また、被検液および反応液構成原料由来の夾雑物の影響を回避できるように、適宜選択して構成成分として適切な量を添加することができる。リン酸供与体としてATPのほかに、GTP、CTP、TTP、UTP、ITPなどのヌクレオチドを用いてもよいし、マグネシウム化合物としては硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硝酸マグネシウム等マグネシウムイオンを含む化合物であればよく、マグネシウム化合物の代わりにマンガン化合物を用いてもよい。
【００５０】
被検液中からMVAを除く工程において、酵素反応を用いる場合の反応条件は適宜調整することができる。例えば、反応温度としては20〜55℃、好ましくは25〜45℃、より好ましくは30〜40℃、反応時間としては0.5分〜24時間、好ましくは1分〜30分、より好ましくは1分〜5分、pHとしては6.0〜11.0、好ましくは7.5〜11.0、より好ましくは8.5〜10.5の条件を用いることができる。また、反応液全量に対し、緩衝液成分の濃度は、例えばトリス緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、CAPS緩衝液、CAPSO緩衝液を用いる場合、5〜500mM、好ましくは10〜200mM、より好ましくは20〜100mMであることができ、リン酸供与体がATPである場合の濃度としては0.01〜20mM、好ましくは0.1〜10mMであることができ、マグネシウム化合物が塩化マグネシウムである場合の濃度は0.01〜20mM、好ましくは0.1〜10mMであることができ、MVKの濃度は0.01〜1000U/mL、好ましくは0.1〜10U/mLであることができる。ここで、酵素活性1UはMVA、ATP、NAD、グルコース、ADP-依存ヘキソキナーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ存在下、37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを生成させる酵素量とする。
【００５１】
被検液中からMVAを除く工程において、酵素反応を用いた後、アルカリ処理によって該酵素反応を停止させる場合、例えばNaOHを反応液に0.01〜0.5M、好ましくは0.02〜0.2Mの濃度になるよう加えてpHを高く調整して該酵素を失活させる。0.1分〜10分、好ましくは0.5分〜5分後に、緩衝液として例えばグリシンを反応液に0.01〜0.5M、好ましくは0.02〜0.2Mの濃度、酸として例えばクエン酸を反応液に0.005〜0.1M、好ましくは0.01M〜0.05Mの濃度になるように添加して反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素が反応できるようにpHを調整した後、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させ、HMGCoA濃度を測定すればよい。
【００５２】
また、被検液中からMVAを除く工程において、酵素反応を用いた後、キレート剤としてEDTAを添加して酵素の反応を阻害する場合、酵素反応のために反応液に添加したマグネシウムイオンのモル量の0.5〜50倍、好ましくは1〜20倍のモル量のEDTAを添加し、その後、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させ、HMGCoA濃度を測定すればよい。
【００５３】
MVAおよび/またはHMGCoAを測定するための測定用試薬中にMVAが混在する場合、上記の手法を用いて、または上記の手法で例えばMVKを用いる場合、反応時間を1日〜100日、好ましくは1日〜30日、反応温度を2〜20℃、MVKの濃度を0.0001〜1U/mlで酵素反応を行う手法を用いて、または反応時間を1分〜3時間、反応温度を25〜40℃、MVKの濃度を0.001〜10U/mlで酵素反応を行う手法を用いて、MVAを除く処理を施すことで、MVAが実質的に混在しない測定用試薬を得ることができる(例えば後述の実施例18及び19参照)。例えば、MVAを除く処理を施す前と比較して、MVAが50%以下、好ましくは30%以下、より好ましくは20%以下に減少した測定用試薬を得ることができる。これをMVAおよび／またはHMGCoAの測定に用いることで、ブランク反応が低減してS/N比が向上するため測定感度も向上する。
【００５４】
一方、本発明に係る測定方法において、被検液中にMVAおよびHMGCoAの両物質が存在する場合であって、MVAのみの濃度を測定しようとする際には、1)被検液中のMVAを除去したサンプルと除去しないサンプルの2つを準備し、それぞれのサンプルに反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させ、それらの測定量の差から被検液中のMVAを算出する、または2)被検液に反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させる工程に先立って、被検液中のHMGCoAを除く工程を行うことが望ましい。上記1)については上述の被検液中のMVAを除く工程を用いて被検液中のMVAを除去したサンプルを準備して行うことができる。上記2)について、被検液中のHMGCoAを除く工程は、測定対象であるMVAを除くことなく行うことができれば特に制限されず、例えば、HMGCoA特異的な吸着剤や選択的な膜によって被検液を処理する方法や、HMGCoAを反応式2に関与しないような物質に変換する方法を用いることができる。HMGCoAを反応式2に関与しないような物質に変換する方法としては例えば酵素反応を用いる方法が挙げられる。酵素反応を用いる方法の例として：酵素として例えばハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼ(EC4.1.3.4：以下、HMGLともいう)を用い、以下の反応式22：
【化２８】
0005524865.tif 000029
に記載のように、HMGCoAをアセト酢酸とアセチルコエンザイムAに変換する方法；
酵素として例えばハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAハイドロラーゼ(EC3.1.2.5)を用い、以下の反応式23：
【化２９】
0005524865.tif 000030
に記載のように、HMGCoAを3-ハイドロキシメチルグルタリル酸とコエンザイムAに変換する方法；
酵素として例えばハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAシンセターゼ(EC2.3.3.10)を用い、以下の反応式24：
【化３０】
0005524865.tif 000031
に記載のように、HMGCoAをアセチルコエンザイムAとアセトアセチルコエンザイムAに変換する方法などが挙げられる。酵素反応によってHMGCoAを除く工程において、反応液のpH、緩衝液、塩濃度等を最適になるように変化させることができる。また、必要に応じ、生成物にさらに作用する酵素(例えば、反応式22の生成物であるアセト酢酸を二酸化炭素と酢酸に分解するアセト酢酸脱炭酸酵素(EC4.1.1.4))添加を行うことができる。
【００５５】
上述のように、酵素(例えばHMGL)反応を用いて被検液中のHMGCoAを除く工程の後、そのまま反応式1および反応式2の組み合わせによる酵素サイクリング反応に供すると、反応式1によってMVAから変換されたHMGCoAに前記酵素(例えばHMGL)が作用することになる。したがって、酵素反応を用いて被検液からHMGCoAを除く工程の後、用いた酵素を取り除くか、または酵素の反応を停止させることが望ましい。例えば、膜を用いた限外ろ過によって、酵素を取り除くことができ、酵素がHMGLである場合、例えば分画分子量5000〜30000の膜を用いて限外ろ過することで、MVAを除くことなくHMGLを除くことができる。また、酵素の反応を停止させるには、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、酵素失活物質の添加など、MVAを分解することなく所望の酵素を失活させる方法、所望の酵素(例えばHMGL)の活性を阻害するが、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素(例えば、HMGR)の活性を阻害しない物質を反応液に加える方法などを用いることができる。上記の酵素を取り除くか、または酵素の反応を停止させる方法のうち、アルカリ処理による方法は、分離操作を必要とせず、自動分析機において同一反応槽で一連の操作を行うことができるため好ましい。ここで、分離操作とは、被検液中のMVAを測定する一連の工程の過程で行われる、カラムクロマトグラフィー操作、膜ろ過操作、吸着分離操作、抽出分離操作、沈殿分離操作などをいう。
【００５６】
HMGCoAを除く工程において用いることのできる酵素は、HMGCoAを反応式2に関与しないような物質に変換することができるものであれば限定されず、例えば上記の反応式22〜24を触媒する酵素を用いることができる。そのような酵素の特定の例として、例えばヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来、Pseudomonas mevaloniiなどの原核生物由来のHMGLが挙げられる。またそれらのHMGLと、アミノ酸配列において、60%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは90%以上の相同性を有するタンパク質であって、酵素反応によりHMGCoAを除くことができる酵素もまた、これらの安定性、反応性、生産性などを考慮し適宜選択して用いることができる。例えば配列番号6のアミノ酸配列を有するPseudomonas mevalonii由来のHMGL(J Bacteriol. 1989 Dec;171(12):6468-72)と60%の相同性を有する、配列番号7のアミノ酸配列を有するPseudomonas putida KT2440(ATCC47054)由来のタンパク質は、反応式22を触媒する酵素であることを本発明者は見出したので、これを用いることができる。さらにHMGLの塩基配列またはアミノ酸配列を改変し、そのアミノ酸配列において欠失、付加、および／または置換を加えたものであって、反応性、安定性、生産性、精製効率などの性能を向上させた、酵素反応によりHMGCoAを除くことができる酵素も用いることができる。HMGLをPEG等で化学修飾または重合化して反応性、安定性などの性能を向上させた、酵素反応によりHMGCoAを除くことができる酵素も用いることができる。
【００５７】
HMGCoAを除く工程において用いることのできる酵素は、上記HMGRの製造について記載したように、当業者に公知の手法に準じて行うことができる。例えば、HMGLを生産する酵母、古細菌、真性細菌等を培養し、その細胞内に蓄積させて、または培養液に分泌させて生産した後、一般に用いられる酵素精製法に従って精製すればよい。
【００５８】
被検液中からHMGCoAを除く工程において、酵素反応を用いる場合、反応液には、酵素に加えて、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を、酵素によるHMGCoAの除去が適切に行われるように、また、被検液および反応液構成原料由来の夾雑物の影響を回避できるように、適宜選択して構成成分として適切な量を添加することができる。
【００５９】
被検液中からHMGCoAを除く工程において、酵素反応を用いる場合の反応条件は適宜調整することができる。例えば、反応温度としては20〜55℃、好ましくは25〜45℃、より好ましくは30〜40℃、反応時間としては0.5分〜24時間、好ましくは1分〜30分、より好ましくは1分〜5分、pHとしては6.0〜11.0、好ましくは7.5〜11.0、より好ましくは8.5〜10.5の条件を用いることができる。また、反応液全量に対し、緩衝液成分の濃度は、例えばトリス緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、CAPS緩衝液、CAPSO緩衝液を用いる場合、0.1〜500mM、好ましくは1〜100mM、より好ましくは3〜50mMであることができ、HMGLの濃度は0.01〜1000U/mL、好ましくは0.1〜10U/mLであることができる。ここで、酵素活性1UはHMGCoA、NADHおよび3-ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ存在下、37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを減少させる酵素量とする。
【００６０】
被検液中からHMGCoAを除く工程において、酵素反応を用いた後、アルカリ処理によって該酵素反応を停止させる場合、例えばNaOHを反応液に0.01〜0.5M、好ましくは0.02〜0.2Mの濃度になるよう加えてpHを高く調整して該酵素を失活させる。0.1分〜10分、好ましくは0.5分〜5分後に、緩衝液として例えばグリシンを反応液に0.01〜0.5M、好ましくは0.02〜0.2Mの濃度、酸として例えばクエン酸を反応液に0.005〜0.1M、好ましくは0.01〜0.05Mの濃度になるように添加して反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素が反応できるようにpHを調整した後、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素を作用させ、MVA濃度を測定すればよい。
【００６１】
MVAおよび/またはHMGCoAを測定するための試薬中にHMGCoAが混在する場合、上記の手法を用いて、または上記の手法で例えばHMGLを用いる場合、反応時間を1日〜100日、好ましくは1日〜30日、反応温度を2〜20℃、HMGLの濃度を0.0001〜1U/mlで酵素反応を行う手法を用いて、または反応時間を1分〜3時間、反応温度を25〜40℃、HMGLの濃度を0.001〜10U/mlで酵素反応を行う手法を用いて、HMGCoAを除く処理を施すことで、HMGCoAが実質的に混在しない測定用試薬を得ることができ(例えば後述の実施例20参照)、これをMVAおよび／またはHMGCoAの測定に用いることで、ブランク反応が低減してS/N比が向上するため測定感度も向上する。
【００６２】
本発明はまた、MVA、HMGCoAまたはCoAを測定するための測定用試薬も提供する。本明細書中において、測定用試薬(測定試薬ということもある)とは、1種の試薬のみならず、複数の種類の試薬から構成される試薬の組み合わせをも含む。測定用試薬が複数の種類の試薬から構成される場合、それぞれの試薬は、測定対象の測定時に同時に用いることも、個別の工程で用いることもできる。2種〜4種の測定用試薬から構成される場合には複数の試薬を同時に添加してもよいし、サンプルにそれぞれの試薬を添加後に所望の反応が完了するような適切な時間を選定して、例えば1秒から30分、好ましくは1分から10分の時間の間隔をあけて順番に添加してもよい。
【００６３】
被検液中のMVAおよび／またはHMGCoAを測定するために用いる測定用試薬は、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素、CoA、水素受容体Xおよび水素供与体Yを含み、より特定すれば、HMGR、CoA、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む。さらに該測定用試薬は、反応式1および反応式2の組み合わせによる酵素サイクリング反応に好適となることや、被検液中および反応液中の夾雑物の影響を回避することを考慮して(例えば、前記のMVAおよび／またはHMGCoAを測定する方法における反応液と同様の組成になるように)、あるいは測定用試薬の保存安定性を高めることを考慮して、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を適宜選択し、組み合わせて含むことができる。
【００６４】
特に、被検液中のHMGCoAを測定するために用いる測定用試薬は、上記のMVAおよび／またはHMGCoA測定用試薬に加え、さらに、被検液からMVAを除く工程に用いるもの、より特定すれば、MVKおよびリン酸供与体を含むことが好ましい。このような測定用試薬として、例えば、HMGR、MVK、CoA、リン酸供与体、T-NAD(P)およびNAD(P)Hを含有する測定用試薬が挙げられる。ここで、好ましくは、該測定用試薬は複数種の試薬から構成され、MVKおよびリン酸供与体と、HMGR、CoA、T-NAD(P)またはNAD(P)Hとは、それぞれ別種の試薬に含まれる。さらに該測定用試薬は、MVAを除く酵素反応やMVAを除いた後の該酵素反応の停止に好適となるよう(例えば、前記のMVKによる酵素反応を含むHMGCoAの測定方法における反応液と同様の組成になるよう)、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を適宜選択し、組み合わせて含むことができる。
【００６５】
特に、被検液中のMVAを測定するために用いる測定用試薬は、上記のMVAおよび／またはHMGCoA測定用試薬に加え、さらに、被検液からHMGCoAを除く工程に用いるもの、より特定すれば、HMGLを含むことが好ましい。このような測定用試薬として、例えば、HMGR、HMGL、CoA、T-NAD(P)およびNAD(P)Hを含有する測定用試薬が挙げられる。ここで、好ましくは、該測定用試薬は複数種の試薬から構成され、HMGRとHMGLとは、それぞれ別種の試薬に含まれる。さらに該測定用試薬は、HMGCoAを除く酵素反応やHMGCoAを除いた後の該酵素反応の停止に好適となるよう(例えば、前記のHMGLによる酵素反応を含むMVAの測定方法における反応液と同様の組成になるよう)、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を適宜選択し、組み合わせて含むことができる。
【００６６】
被検液中のCoAを測定するために用いる測定用試薬は、反応式1および反応式2の反応を触媒する酵素、MVA、水素受容体Xおよび水素供与体Yを含み、より特定すれば、HMGR、MVA、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む。さらに該測定用試薬は、反応式1および反応式2の組み合わせによる酵素サイクリング反応に好適となることや、被検液中および反応液中の夾雑物の影響を回避することを考慮して(例えば、前記のCoAを測定する方法における反応液と同様の組成になるように)、あるいは測定用試薬の保存安定性を高めることを考慮して、酸、アルカリ、緩衝成分、塩類、界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、核酸類、色素類、アルコール類、ポリオール類、有機溶媒、防腐剤等を適宜選択し、組み合わせて含むことができる。
【００６７】
上記の測定試薬の保存時の形態は溶液、溶液の凍結物、凍結乾燥品とその溶解液などであることができる。また、上記の測定試薬の使用時の形態は、1種〜4種の測定試薬液から構成されるものであることが望ましい。
【００６８】
例えば、MVAおよびHMGCoAを測定する試薬は1〜4種の試薬で構成することができ：1種からなる場合、少なくともHMGR、CoA、NADHおよびT-NADの4成分を含む試薬から構成され；2種からなる場合、前記4成分を試薬の安定性などを勘案して適宜2つに分け、例えば少なくともHMGR、CoAおよびT-NADを含む試薬と、少なくともNADHを含む試薬とから構成することができ；3種からなる場合、前記4成分を3つに分け、例えば少なくともHMGRおよびT-NADを含む試薬と、少なくともCoAを含む試薬と、少なくともNADHを含む試薬とから構成することができ；4種からなる場合、前記4成分を4つに分け、例えば少なくともHMGRを含む試薬と、少なくともT-NADを含む試薬と、少なくともCoAを含む試薬と、少なくともNADHを含む試薬とから構成することができる。
【００６９】
例えば、被検液中にMVAおよびHMGCoAの両物質が存在する場合にHMGCoAのみの濃度を測定する試薬は2〜4種の試薬で構成することができる。2種からなる場合、HMGR、CoA、NADHおよびT-NADの4成分を、少なくともMVKによる反応式21の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともMVKによる反応を停止させる成分を含む第二試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分け、第二試薬添加後に酵素サイクリング反応が開始するよう構成することができ、例えば第一試薬がMVK、ATPおよび塩化マグネシウムを含み、第二試薬がEDTA、HMGR、CoA、NADHおよびT-NADを含むよう構成することができる。3種からなる場合、HMGR、CoA、NADHおよびT-NADの4成分を：少なくともMVKによる反応式21の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともMVKによる反応を停止させる成分を含む第二試薬と、第三試薬添加後に酵素サイクリング反応が開始される成分を含む第三試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成する；または、少なくともMVKによる反応式21の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と少なくともMVKによる反応を停止させる成分を含む第三試薬であって第三試薬添加後に酵素サイクリング反応が開始される成分を含む第三試薬と、その他の成分を含む第二試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成することができる。4種からなる場合、HMGR、CoA、NADH、T-NADの4成分を：少なくともMVKによる反応式21の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともMVKによる反応を停止させるのに必須な成分を含む第二試薬と、第四試薬添加後に酵素サイクリング反応が開始される成分を含む第四試薬と、その他の成分を含む第三試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成する；少なくともMVKによる反応式21の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともMVKによる反応を停止させる成分を含む第三試薬と、第四試薬添加後に酵素サイクリング反応がを開始される成分を含む第四試薬と、その他の成分を含む第二試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成する；または、少なくともMVKによる反応式21の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともMVKによる反応を停止させる成分を含む第四試薬であって第四試薬添加後に酵素サイクリング反応を開始する成分を含む第四試薬と、その他の成分を含む第二試薬および第三試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成することができる。
【００７０】
例えば、被検液中にMVAおよびHMGCoAの両物質が存在する場合にMVAのみの濃度を測定する試薬は、2〜4種の試薬で構成することができる。2種からなる場合、HMGR、CoA、NADH、T-NADの4成分を、少なくともHMGLによる反応式22の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともHMGLを失活させる成分を含む第二試薬であって第二試薬添加後に酵素サイクリング反応が開始される成分を含む第二試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成することができる。3種からなる場合、HMGR、CoA、NADH、T-NADの４成分を：少なくともHMGLによる反応式22の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともHMGLを失活させる成分を含む第二試薬と、第三試薬添加後に酵素サイクリング反応を開始する成分を含む第三試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成する；または、少なくともHMGLによる反応式22の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともHMGLを失活させる成分を含む第三試薬であって第三試薬添加後に酵素サイクリング反応を開始する成分を含む第三試薬と、その他の成分を含む第二試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成することができる。4種からなる場合、HMGR、CoA、NADHおよびT-NADの4成分を：少なくともHMGLによる反応式22の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともHMGLを失活させる成分を含む第二試薬と、第四試薬添加後に酵素サイクリング反応を開始する成分を含む第四試薬と、その他の成分を含む第三試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成すること、例えば、HMGLを含む第一試薬と、水酸化ナトリウムを含む第二試薬と、緩衝成分、酸、HMGR、CoA、T-NADを含む第三試薬と、NADHを含む第四試薬とに分けて構成すること；少なくともHMGLによる反応式22の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともHMGLを失活させる成分を含む第三試薬と、第四試薬添加後に酵素サイクリング反応を開始する成分を含む第四試薬と、その他の成分を含む第二試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成すること；または、少なくともHMGLによる反応式22の反応を進行させるのに必須な成分を含む第一試薬と、少なくともHMGLを失活させる成分を含む第四試薬であって第四試薬添加後に酵素サイクリング反応を開始する成分を含む第四試薬と、その他の成分を含む第二試薬および第三試薬とに、試薬の安定性などを勘案して適宜分けて構成することができる。
【００７１】
一般に、測定試薬を用いて被検液中に存在する物質Aの量を吸光度、発光量、電気量などのシグナル量に変換することで測定する場合には、既知量の物質Aを含む被検液（キャリブレーターと呼ばれる）を用いてシグナル量と物質Aの濃度の関係を表す検量線が必要である。だから、通常の実験室では、測定試薬だけではなくキャリブレーターをも用いて量が未知である被検液中の物質Aの量を測定することになる。
異なった実験室で物質Aの量を測定するようになると、同じ被検液中の物質Aの量が実験室aで測定した値と実験室ｂで測定した値で誤差が出てくる。この誤差は測定試薬およびその測定手順、測定装置、キャリブレーター、測定者などが異なるために生じるのであるが、実験室間の誤差をできるだけ小さくすることが医療の現場の臨床検査室などで求められている。この実験室間の誤差をできるだけ小さくするためには、物質Aの標準物質と物質Aの標準測定法を定めて、それを基に日常に用いられるキャリブレーター中に存在する物質Aの量を値付けて日常の測定法で測定するという物質A測定のトレーサビリティ（Clin Chem. 2009 Jun;55(6):1067-75）が確立できればよい。
ここで、MVA測定のトレーサビリティを確立しようとすると、まず標準物質と標準測定法を定めなければならない。一般に試薬として販売されているMVAおよびD,L-MVA（例えば東京化成工業株式会社の製品コードM1374：D-Mevalonolactoneやシグマ社の製品番号M4667：(±)-Mevalonolactone（DL-Mevalonic acid lactone））はその正確な純度は不明であるし、その純度測定法も滴定などの特異性が低い方法か、GCなど標準物質が存在しないと絶対量を測定できない方法か、光学異性体の含量比率のみを測定する偏光分析やNMRによる方法（J Lipid Res. 1982 May;23(4):645-52）か、MVKにピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを共役させてNADHの減少で測定する（Methods Enzymol. 1969;15:393-454）という後述するように精度が不十分であると考えられる方法しか知られておらず、適切な標準物質と標準測定法と呼べるものはなかった。そこで標準測定法の候補として、本発明者は酵素の特異性を利用したNAD(P)Hが増加する反応系において、NAD(P)Hの吸光係数を基にMVAの正確な量を測定する方法を二つ考案した。
一つの方法は、MVKを用いた反応式21：
【化３１】
0005524865.tif 000032
ADP依存ヘキソキナーゼ（ADP特異グルコキナーゼ（EC2.7.1.47）ともいう）を用いた反応式25：
【化３２】
0005524865.tif 000033
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.49)を用いた反応式26：
【化３３】
0005524865.tif 000034
6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.31)を用いた反応式27：
【化３４】
0005524865.tif 000035
を組み合わせる方法であって、MVA（D-MVA）をNAD(P)Hにすべて変換することができNAD(P)Hの吸光係数を用いて正確なMVA（D-MVA）量を測定することができる。ここで反応式27はpHを調節する（例えば8.0以上、好ましくは8.5以上、より好ましくは9.0以上）と酵素を介在せずとも反応式27が進行するので6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.3.3.31)を用いなくてもよい場合がある。また、反応式25においてグルコースの代わりにADP依存ヘキソキナーゼが作用する基質を用い、その生成物に対応するデヒドロゲナーゼを用いて反応式26に対応する反応を行うことも可能である。
もう一つの方法はHMGRを用いた反応式11：
【化３５】
0005524865.tif 000036
による方法であり、好ましくはHMGLを用いた反応式22：
【化３６】
0005524865.tif 000037
を組み合わせる方法であって、MVA（D-MVA）をNAD(P)Hにすべて変換することができNAD(P)Hの吸光係数を用いて正確なMVA（D-MVA）量を測定することができる。ここで反応式22はハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAハイドロラーゼ(EC3.1.2.5)を用いた反応式23：
【化３７】
0005524865.tif 000038
に、またはハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAシンセターゼ(EC2.3.3.10)を用いた反応式24：
【化３８】
0005524865.tif 000039
に置き換えることも可能である。
水溶液中のMVAは分子内のヒドロキシ基とカルボキシル基が脱水縮合したラクトンとラクトンが加水分解されたヒドロキシカルボン酸の平衡状態にあると考えられるが、反応に関与する基質と生成物の構造の観点からMVKやHMGRはラクトンでなくヒドロキシカルボン酸のMVAに作用していると考えられる。MVKによるMVAからメバロン酸リン酸への反応およびHMGRによるMVAからHMGcoAへの反応の至適pHが高pH領域にあることの要因のひとつとして、高pH領域でラクトンが加水分解され平衡がヒドロキシカルボン酸に偏っていることが挙げられる。よって、MVAをMVKまたはHMGRを用いた酵素反応で正確に測定しようとする場合には、平衡をヒドロキシカルボン酸に偏らせることが重要であり、そのためにはMVAのラクトンを加水分解するラクトナーゼを添加することも考えられるが、簡便性の点からはその反応pHが高pH領域であること（試薬または反応液のpHが8.5以上、好ましくは9.0以上、より好ましくは9.5以上、さらに好ましくは10.0以上であること）が望ましい。一方、デヒドロゲナーゼ等によるNAD(P)Hが生成する反応の至適pHは酵素や基質など反応に関与する成分の安定性が保てる範囲において高pH領域にあり、NAD(P)が生成する反応の至適pHは酵素や基質など反応に関与する成分の安定性が保てる範囲において低pH領域にあることが一般に知られており、デヒドロゲナーゼによるNAD(P)Hの増加を測定する場合には高pH領域、NAD(P)Hの減少を測定する場合には低pH領域であることが望ましい。しかし、上述したMVKにピルビン酸キナンーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを共役させてNADHの減少で測定する方法ではMVKによる反応においては高pH領域が望ましく、乳酸デヒドロゲナーゼによる反応では低pH領域が望ましいという矛盾したpH設定の問題があり（Methods Enzymol. 1969;15:393-454において、pHは7.3-7.4に設定されている）、それに加えて吸光度の問題から反応系に添加できるNADH量に限りがあり、高いブランク反応等の問題もあり、正確なMVA量を測定するには不十分な反応系である。また、MVAをMVKまたはHMGRを用いた酵素反応で正確に測定しようとする場合には、平衡をヒドロキシカルボン酸に偏らせるために、その反応pHは高pH領域であること、例えば試薬または反応液のpHが8.5以上、好ましくは9.0以上、より好ましくは9.5以上、さらに好ましくは10.0以上であることが重要であることは先に述べたが、そのような高pH領域において補酵素（例えばCoA）の安定性の観点、またMVK、HMGRおよびそれらと共役させて用いる酵素の安定性と反応性の観点から、安定かつ十分に反応が進行するとは考えもしないものであった。しかし、驚くべきことに本発明者は上記のMVKまたはHMGRを用いたNAD(P)Hが増加する反応系において、安定かつ十分に反応が進行することを発見し、NAD(P)Hの吸光係数を基にMVAの正確な量を短時間（例えば30分以内、15分以内、10分以内）の反応で精度よく測定する方法を発見したのである。
これらの方法により、正確なMVA量が値付けされた標準物質を提供することができ、MVA測定のトレーサビレティを確立することができる。
【００７２】
CoAの場合においてもMVAと同様にHMGRとHMGLの反応式を組み合わせる方法、HMGRとハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAハイドロラーゼの反応式を組み合わせる方法、またはHMGRとハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAシンセターゼの反応式を組み合わせる方法により、正確なCoA量が値付けされた標準物質を提供することができ、CoA測定のトレーサビレティを確立することができる。
HMGCoAの場合においてはHMGRでHMGCoAからMVAとCoAを生成させ、その生成させたMVAを上記のMVK、ADP依存ヘキソキナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼを用いた反応式を組み合わせる方法により、MVAと同様に、正確なHMGCoA量が値付けされた標準物質を提供することができ、HMGCoA測定のトレーサビレティを確立することができる。
また、このようなMVA、CoAまたはHMGCoAの標準物質には酸、塩基、金属イオン、糖類、アルコール類、アミノ酸類、タンパク質、塩類、緩衝成分、界面活性剤、キレート剤、血液成分などその他有機化合物の添加物を保存安定性など性能向上のために適宜加えてもよく、その形態は溶液、凍結品、凍結乾燥品であってもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定されるものではない。また、各実施例で用いた培地および試薬については、後述の製造例にまとめる。
以下の実施例の表、図においても本明細書中と同様にD,L-メバロン酸またはD,L-MVAと表記した場合はD体、L体が混合したラセミのメバロン酸を表し、単にメバロン酸またはMVAと表記した場合はD-メバロン酸またはR-メバロン酸を表す。
また、以下の実施例の表、図においても本明細書中と同様にD,L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはD,L-HMGCoAと表記した場合はD体、L体が混合した3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表し、単に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはHMGCoAと表記した場合はD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはS-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表す。
さらに実施例においては、特に断りがない限りD,L-MVAはシグマ社製M4667を、D,L-HMGCoAはシグマ社製H6132を用いた。そして実施例において記載したMVA濃度（つまりD-MVA濃度）およびHMGCoA（つまりD-HMGCoA濃度）は、それぞれD,L-MVA、D,L-HMGCoAの1/2として換算して表記した。
測定に自動分析機7170S(日立製)を用いる場合には明記した測定波長を主波長として、660nmを副波長として測定した。同様に、測定に自動分析機BM9020(日本電子製)を用いる場合には明記した測定波長を主波長として、658nmを副波長として測定した。【００７４】
[実施例１] Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRの製造
Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の同定
土壌から分離したPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)は、以下の表1に示す特徴およ
び16SrDNAの配列(配列番号8)から、Pseudomonas migulaeに近縁なPseudomonas sp.と同定
し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
0005524865.tif 000040
【００７５】
Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRの製造
500mL容量の三角フラスコに培地Aを167mL入れたもの3本を用意し、それぞれに1コロニーの約1/3を植菌してこの三角フラスコ中で、28℃で約18時間、Pseudomonas sp.1-MV(FERM BP-11063)を振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離(8krpm、20min)して集菌し、菌体を30mLの10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁して超音波破砕により菌体を可溶化した。可溶化した液を遠心分離(15krpm、50min)して粗酵素液を得た。【００７６】
得られた粗酵素液を、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAEsepharoseFFカラム(14.5X90mm)に吸着させ、0 → 0.5MのNaClのグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分に、13%になるように硫酸アンモニウムを加え、12%硫酸アンモニウム、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したPhenylsepharoseFFカラム(14.5X90mm)に吸着させ、12%硫酸アンモニウム、0%エチレングリコール → 0%硫酸アンモニウム、20%エチレングリコールのグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分を10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で透析した後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したBluesepharoseCL6Bカラム(14.5X90mm)に吸着させ、0M NaCl、0%エチレングリコール → 1M NaCl、20%エチレングリコールのグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収し、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で透析した後、分画分子量10000の膜で限外ろ過をして濃縮して、17Uの精製したHMGRを得た。【００７７】
HMGR活性の測定方法
試薬B 0.45mLを試験管に入れ、37℃で5分間予備加温した後、0.05mLの酵素液を添加し、37℃で5分間反応させた。反応終了後、0.1N HClを1mL添加して反応を停止させ、波長550nmにおける吸光度(Aa)を測定した。また、ブランクとして酵素液の代わりに酵素希釈液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH9)、0.1% Tween80)を用いて同様な操作を行い、吸光度(Ab)を測定した。これらの吸光度差(Aa-Ab)より、酵素液1mL当たりの酵素活性1Uは、U/mL＝0.316X(Aa-Ab)と計算される。ただし、酵素活性1Uは37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを生成させる酵素量とし、酵素液は適宜酵素希釈液で希釈して測定するものとする。【００７８】
[実施例２] Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)由来のHMGRの製造
Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)の同定
土壌から分離したVariovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)は、以下の表2に示す特徴およ
び16SrDNAの配列(配列番号9)から、Variovorax属に属するVariovorax sp.と同定し、平成
20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技術
総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【表１】
0005524865.tif 000041
【００７９】
Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)由来のHMGRの製造
上記Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)から、培地Aを培地Bに変更した以外は実施例1と同様の手法により精製して、10Uの精製したHMGRを得た。【００８０】
[実施例３] Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来のHMGRの製造
Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)の同定
土壌から分離したDelftia sp.12-MV(FERM BP-11065)は、以下の表3に示す特徴および16
SrDNAの配列(配列番号10)から、Delftia acidovoransに近縁なDelftia sp.と同定し、平
成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技
術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【表３】
0005524865.tif 000042
【００８１】
Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来のHMGRの製造
上記Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)から、実施例1と同様の手法により精製して、60Uの精製したHMGRを得た。【００８２】
[実施例４] Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGRの製造
Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)の同定
土壌から分離したComamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)は、以下の表4に示す特徴およ
び16SrDNAの配列(配列番号11)から、Comamonas testosteroniに近縁なComamonas sp.と同
定し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法
人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【表４】
0005524865.tif 000043
【００８３】
Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGRの製造
培地Aを培地Cに変更した以外は実施例1と同様の手法により、上記Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)から、27Uの精製したHMGRを得た。【００８４】
[実施例５] Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRの大腸菌での発現と精製
実施例1のPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号14および配列番号15記載の配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、HMGR遺伝子(配列番号12)を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpHSG398のマルチクローニングサイトのHindIII部位からEcoI部位をPOPプロモーター配列を含むDNA断片(配列番号 24)で置換したプラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRpsを、大腸菌W3110株に導入して、HMGR生産遺伝子組換菌を得た。この菌を、酵母エキス3%、ソルビトール4.5%、アンチフォーム028 0.1%、クロラムフェニコール30μg/ml含有培地1.6L中で、培養中のpHの下限が7.2になるようコントロールしながら30℃で2日培養した。培養液から遠心分離で菌体を得た後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、5mM EDTAで菌体を懸濁した。その後、リゾチームを添加して37℃で30分処理して菌体を破砕し、遠心分離で不溶物を除いて粗酵素液を得た。【００８５】
得られた粗酵素液を、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したQsepharoseBigBeadsカラム(45.5X510mm)に吸着させ、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、0.1M NaCl、0.1%Tween80で溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分に硫酸アンモニウムを37.5%添加し、沈殿を遠心分離した後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で溶解し、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、5%グリセロールに透析した。透析したHMGRを含む溶液を、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、5%グリセロールで平衡化したDEAEsepharoseFFカラム(22.5X210mm)に吸着させ、0 → 0.25MのNaClのグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分に、20%になるよう硫酸アンモニウムを加え、20%硫酸アンモニウム、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、5%グリセロールで平衡化したPhenylsepharoseFFカラム(22.5X410mm)に吸着させ、20%硫酸アンモニウム、0%Tween80 → 0%硫酸アンモニウム、0.1%Tween80のグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分を、10mMビストリス塩酸緩衝液(pH6.0)、5%グリセロールで透析した後、10mMビストリス塩酸緩衝液(pH6.0)、5%グリセロールで平衡化したBluesepharoseCL6Bカラム(45.5X310mm)に吸着させ、0M NaCl、0%Tween80 → 2.5M NaCl、0.1%Tween80のグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分を、10mMビストリス塩酸緩衝液(pH6.0)、5%グリセロールで透析した後、10mMビストリス塩酸緩衝液(pH6.0)、5%グリセロール、0.1%Tween80で平衡化したHydroxyapatiteカラム(25.5X210mm)に吸着させ、10mMビストリス塩酸緩衝液(pH6.0) → 80mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)のグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収し、分画分子量10000の膜で限外ろ過をして濃縮して、13kUの精製したHMGRを得た。【００８６】
[実施例６] Pseudomonas mevalonii由来のHMGR(J Bacteriol. 1989 Jun;171(6):2994-3001)の大腸菌での発現
Pseudomonas mevaloniiのHMGR遺伝子(配列番号13)の5’側にXbaI部位を3'側にSacI部位を連結したDNA断片を化学合成した。このDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRpmを、大腸菌W3110株に導入してHMGR生産遺伝子組換菌を得た。この菌を、酵母エキス3%、ソルビトール0.3%、クロラムフェニコール30μg/ml、pH7.5の培地160mLに植菌し、37℃で1日培養した。培養液1mLあたり約0.2U/mLのHMGR活性が確認された。【００８７】
[実施例７] Archaeoglobus fulgidus(NBRC100126)由来のHMGR (Protein Sci. 2000 Jun;9(6):1226-34)の大腸菌での発現と精製
Archaeoglobus fulgidus(NBRC100126)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号16および配列番号17記載の配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、HMGR遺伝子を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRafを、大腸菌W3110株に導入してHMGR生産遺伝子組換菌を得た。
【００８８】
得られた菌を、酵母エキス3%、ソルビトール0.3%、クロラムフェニコール30μg/ml、pH7.5の培地160mLが入ったフラスコ5本に植菌し、37℃で2日培養した。培養液から遠心分離で菌体を得た後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で菌体を懸濁した。その後、超音波で菌体を破砕し、遠心分離で不溶物を除いて315UのHMGRを含む粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を80℃で30分熱処理してから不溶物を遠心分離で除き、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したDEAEsepharoseFFカラム(14.5X90mm)に吸着させ、0 → 0.5MのNaClのグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収した。得られた画分に、15%になるよう硫酸アンモニウムを加え、15%硫酸アンモニウム、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したPhenylsepharoseFFカラム(14.5X35mm)に吸着させ、15%硫酸アンモニウム、0%グリセロール、0%Tween80  →  0%硫酸アンモニウム、5%グリセロール、0.1%Tween80のグラジエントで溶出させてHMGR活性を含む画分を回収し、分画分子量10000の膜で限外ろ過をして濃縮して、17Uの精製したHMGRを得た。【００８９】
[実施例８] Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKの大腸菌での発現と精製
Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号18および配列番号19記載の配列のプライマーを用いてPCRを行いMVK遺伝子の前半部分のDNA断片を、配列番号20および配列番号21記載の配列のプライマーを用いてPCRを行いMVK遺伝子の後半部分のDNA断片を、それぞれ得た。得られたこれらの前半部分と後半部分のDNA断片を鋳型にして、配列番号18および配列番号21記載の配列のプライマーを用いてPCRを行い、MVK遺伝子の全長を含むDNA断片を得た。なお、得られたDNA断片中のMVK遺伝子は、配列番号5記載の配列において819番目のAがTに置換したものであるが、翻訳されるアミノ酸配列に変化はない。得られたMVK遺伝子の全長を含むDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-MVKを、大腸菌W3110株に導入してMVK生産遺伝子組換菌を得た。【００９０】
得られた菌を、酵母エキス3%、ソルビトール0.3%、クロラムフェニコール30μg/ml、pH8.0の培地160mLが入ったフラスコ3本に植菌し、25℃で3日培養した。培養液から遠心分離で菌体を得た後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で菌体を懸濁した。その後、超音波で菌体を破砕し、遠心分離で不溶物を除いて5660UのMVKを含む粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAEsepharoseFFカラム(14.5X90mm)に吸着させ、0 → 0.5MのNaClのグラジエントで溶出させてMVK活性を含む画分を回収した。得られた画分に、15%になるように硫酸アンモニウムを加え、15%硫酸アンモニウム、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したHiTrapPhenylFF(highsub)カラム(5mL)に吸着させ、15%硫酸アンモニウム → 0%硫酸アンモニウムのグラジエントで溶出させてMVK活性を含む画分を回収し、分画分子量10000の膜で限外ろ過をして濃縮して、3304Uの精製したMVKを得た。【００９１】
MVK活性の測定方法
試薬C 0.5mLを試験管に入れ、37℃で5分間予備加温した後、0.01mLの酵素液を添加して37℃で5分間反応させた。反応終了後、0.1N HClを1mL添加して反応を停止させ、波長550nmにおける吸光度(Aa)を測定した。また、ブランクとして試薬Cbを用いて同様な操作を行い、吸光度(Ab)を測定した。これらの吸光度差(Aa-Ab)より、酵素液1mLあたりの酵素活性1Uは、U/mL＝1.589X(Aa-Ab)と計算される。ただし、酵素活性1Uは37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを生成させる酵素量とし、酵素液は適宜酵素希釈液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.1%BSA)で希釈して測定するものとする。【００９２】
[実施例９] Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLの大腸菌での発現と精製
Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号22および配列番号23記載の配列のプライマーを用いてPCRを行い、HMGL遺伝子を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGLを、大腸菌W3110株に導入してHMGL生産遺伝子組換菌を得た。【００９３】
得られた菌を、酵母エキス3%、ソルビトール4.5%、アンチフォーム028 0.1%、クロラムフェニコール30μg/mlの培地1.6L中で、培養中のpHの下限が7.0になるようコントロールしながら30℃で2日培養し、HMGL活性35.7U/mLの培養液を得た。また、同菌を、同じ組成の培地1.6L中で、培養中pHの下限が6.5になるようコントロールしながら30℃で2日培養し、HMGL活性36.7U/mLの培養液を得た。これらの培養液をまとめて遠心分離して菌体を得た後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で菌体を懸濁した。その後、超音波で菌体を破砕し、遠心分離で不溶物を除いてHMGLを含む粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したQsepharoseBigBeadsカラム(45.5X510mm)に吸着させ、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.1M NaClで洗浄し、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、0.3M NaClで溶出させてHMGL活性を含む画分を回収し、その画分に硫酸アンモニウムを37.5%添加し、沈殿を遠心分離して10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で溶解し、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)に透析した。透析したHMGLを含む溶液を、10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)、5%グリセロールで平衡化したDEAEsepharoseFFカラム(22.5X210mm)に吸着させ、0 → 0.5MのNaClのグラジエントで溶出させてHMGL活性を含む画分を回収した。この画分に15%になるように硫酸アンモニウムを加え、15%硫酸アンモニウム、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したPhenylsepharoseFFカラム(22.5X100mm)に吸着させ、15%硫酸アンモニウム、0%エチレングリコール → 0%硫酸アンモニウム、10%エチレングリコールのグラジエントで溶出させてHMGL活性を含む画分を回収した。得られた画分を、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で透析した後、分画分子量10000の膜で限外ろ過をして濃縮して、20kUの精製したHMGLを得た。【００９４】
HMGL活性の測定方法
試薬D1 0.070mLと酵素液0.006mLをセルに入れ、37℃で５分間保温した後、0.020mLの試薬D2を添加して37℃で5分間反応させ、試薬D2添加後の波長340nmにおける吸光度が直線的に減少する部分から1分間あたりの吸光度速度(Aa)を測定した。また、ブランクとして酵素液の代わりに酵素希釈液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH9))を用いて同様な操作を行い、1分間あたりの吸光度減少速度(Ab)を測定した。これらの吸光度減少速度差(Aa-Ab)より、酵素液1mL当たりの酵素活性1Uは、U/mL＝2.54X(Aa-Ab)と計算される。ただし、酵素活性1Uは37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを減少させる酵素量とし、酵素液は適宜酵素希釈液で希釈して測定するものとする。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。【００９５】
[実施例１０] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRを用いた酵素サイクリング法によるMVA、HMGCoAの測定
15μLのサンプル溶液(蒸留水、10nM、50nM、100nMのMVAおよび10nM、50nM、100nMのHMGCoA)に、37℃で135μLの第1測定試薬として試薬E1〜E5のいずれかを加え、5分後に15μLの第2測定試薬として試薬E11またはE12を加えてから、37℃5分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表5に示す。CoA存在下ではサンプル溶液中のMVA、HMGCoAともに少なくとも10〜100nMの範囲で定量できることがわかる。CoA非存在下では酵素サイクリング反応が起きていないことから、反応式15と反応式16で構成される酵素サイクリング反応は起きていないこと、また反応式17と反応式18で構成される酵素サイクリング反応も起きていないことがわかる。CoA存在下でもHMGL存在下ではサンプルがMVAであっても酵素サイクリング反応が起きていないことからも、反応式15と反応式16で構成される酵素サイクリング反応は起きておらず、起きている酵素サイクリング反応は反応式19と反応式20で構成されている多段階反応での酵素サイクリング法であることがわかる。CoA存在下でもMVK存在下ではサンプルがHMGCoAであっても酵素サイクリング反応が起きていないことからも、反応式17と反応式18で構成される酵素サイクリング反応は起きておらず、起きている酵素サイクリング反応は反応式19と反応式20で構成されている多段階反応での酵素サイクリング法であることがわかる。また、第1測定試薬として試薬E3を用いるとE2を用いるときと比べてサンプルが蒸留水のときの吸光度値が上昇し、E4を用いると上昇したものがもとに戻ることから、ATP中にMVAが混在していることが示唆される。
【表５】
0005524865.tif 000044
【００９６】
[実施例１１] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRを用いた酵素サイクリング法によるMVAの測定
20μLのサンプル溶液(0nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2.5nM、5nM、10nM、25nMまたは50nMになるよう、MVAを蒸留水または管理血清コンセーラN(日水製薬製)に溶解したもの)に180μLの試薬F1を加え、37℃で5分放置した。次に20μLの試薬F2を加えた後17分間の波長405nmの吸光度変化を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて4重測定で行った。結果を表6および表7に示す。MVAの測定限界が表6では0.5nM、表7では0.25nMまであることがわかる。
【表６】
0005524865.tif 000045
【表７】
0005524865.tif 000046
【００９７】
[実施例１２] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRを
用いた酵素サイクリング法によるCoAの測定
15μLのサンプル溶液(蒸留水、100nM、1000nMのCoA)に試薬G1を135μL加えて5分間保温後、15μLのMVA溶液(0mM、0.0005mM、0.005mM、0.05mM)を加え、26分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。この結果を表8に示す。
【表８】
0005524865.tif 000047
同様に、15μLのサンプル溶液(蒸留水、10nM、20nM、50nM、100nM、200nMのCoA)に試薬G1を135μL加えて5分間保温後、15μLのMVA溶液(0.5mM、2.5mM、5mM)を加え、5分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。この結果を表9に示す。
【表９】
0005524865.tif 000048
さらに、同様にサンプル溶液(蒸留水、5nM、10nM、20nM、50nM、100nMのCoA)に試薬G2を135μL加えて5分間保温後、15μLのMVA溶液(2.5mM)を加え、5分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を4重測定した。この結果を表10に示す。
【表１０】
0005524865.tif 000049
CoAの最小検出限界濃度が少なくとも50nM以下であることがわかる。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。【００９８】
[実施例１３] 大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いてサンプルを処理した後の、大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRを用いた酵素サイクリング法によるMVAおよびHMGCoAの測定
100μLのサンプル溶液(蒸留水、250nMのMVAまたは750nMのHMGCoA)に、100μLの試薬H1または試薬H2を加えて37℃で5分間保温後、1)分画分子量10000の膜で限外ろ過してMVKを除いた、または2)100mMのEDTA溶液を1μL添加してMVKの反応を止めた。次に、1)または2)のサンプル20μLに180μLの試薬F1を加え、37℃で5分放置した。20μLの試薬F2を加えた後5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、膜ろ過後またはEDTA添加後の測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表11に示す。MVKで処理することでMVAがサンプルから除かれていることがわかる。MVKで処理することはHMGCoAの測定に影響を及ぼさないことがわかる。
【表１１】
0005524865.tif 000050
【００９９】
[実施例１４] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRと大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いた酵素サイクリング法によるHMGCoAの測定(アルカリ処理)
16μLのサンプル溶液(蒸留水、10nMのMVA、50nMのMVA、100nMのMVA、10nMのHMGCoA、50nMのHMGCoA、100nMのHMGCoA)に37℃で試薬J1(+)またはJ1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬J2を加えて更に3.3分間保温し、その後、40μLの試薬J3を加えて更に3.8分間保温した。次に16μLの試薬J4を加えた後、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。この結果を表12に示す。サンプル中のMVAはMVK処理により1.7分間でほぼ99%除去されたことがわかる。また、サンプル中のHMGCoAの測定値はMVK処理により影響を受けないこともわかる。さらに、試薬J1(+)中に混在していたMVAがMVK処理により除去されたこともわかる。
【表１２】
0005524865.tif 000051
【０１００】
[実施例１５] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRと大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae(NBRC1136)由来のMVKを用いた酵素サイクリング法によるHMGCoAの測定(EDTA処理)
16μLのサンプル溶液(表13に記載のMVA、HMGCoA濃度の水溶液)に37℃で試薬K1(+)またはK1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬K2を加えて更に3.3分間保温し、40μLの試薬K3を加えて更に3.8分間保温した。その後、16μLの試薬K4(+)またはK4(-)を加え、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組合せとその結果を表13に示す。
【表１３】
0005524865.tif 000052
同様に、サンプル溶液を管理血清に表14記載のMVA、HMGCoA濃度になるように添加して作製したもので、上記測定を行った結果を表14に示す。
【表１４】
0005524865.tif 000053
サンプル中に存在する50nMまでのMVAは1%未満にまで除去されていることがわかる。また、MVKによる処理はHMGCoAの測定には影響を与えないことがわかる。
【０１０１】
[実施例１６] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRと大腸菌で発現させたPseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLを用いた酵素サイクリング法によるMVAの測定(膜ろ過)
表15記載のサンプル溶液1〜6各70μLに、70μLの試薬L1または試薬L2を加えて37℃で5分間保温後、分画分子量10000の膜で限外ろ過してHMGLを除いた。次にろ過済みのサンプル20μLに180μLの試薬F1を加え、37℃で5分放置し、20μLの試薬F2を加えた後、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、膜ろ過後の測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表16に示す。HMGLで処理することでHMGCoAがサンプルから除かれていることがわかる。また、HMGLで処理することはMVAの測定に影響を及ぼさないことがわかる。
【表１５】
0005524865.tif 000054
【表１６】
0005524865.tif 000055
【０１０２】
[実施例１７] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRと大腸菌で発現させたPseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLを用いた酵素サイクリング法によるMVAの測定(アルカリ処理)
16μLのサンプル溶液(表17に記載のMVA、HMGCoA濃度の水溶液)に37℃で試薬M1(+)またはM1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬M2を加えて更に3.3分間保温し、その後、40μLの試薬M3を加えて更に3.8分間保温し、更にその後16μLの試薬M4を加えた後、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組合せとその結果を表17に示す。
【表１７】
0005524865.tif 000056
同様に、管理血清コンセーラN(日水製薬製)に表18および表19記載のMVA濃度、HMGCoA濃度になるようにこれらを添加して作製したものをサンプル溶液とし、上記測定を行った結果を、それぞれ表18および表19に示す。
【表１８】
0005524865.tif 000057
【表１９】
0005524865.tif 000058
サンプル中に存在する、250nMまでのHMGCoAは4%未満にまで、100nMまでのHMGCoAは1%未満にまで、除去されていることがわかる。また、HMGLによる処理はMVAの測定には影響を与えないことがわかる。【０１０３】
[実施例１８] 大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いて混在するMVAを除去する工程を含む、MVAおよび／またはHMGCoA測定用酵素サイクリング試薬の製造(EDTA添加)
試薬N1にATPを1mM、塩化マグネシウムを1mMになるように添加した試薬N2、および試薬N2にMVKを0.3U/mLになるように添加した試薬N3を、それぞれ10mL作製し、37℃で20分間放置した後、それぞれに0.5MのEDTAを0.1mL添加して試薬N2EおよびN3Eを作製した。【０１０４】
15μLのサンプル溶液(蒸留水または10mMのTris-HCl(pH7.5)に溶解した、570U/mLの大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来HMGR溶液)に、37℃で135μLの試薬N1、N2EまたはN3Eのいずれかを加え、5分後に15μLの蒸留水または50nMのMVA溶液を加えてから22分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表20に示す。
【表２０】
0005524865.tif 000059
試薬N1中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が70.85から13.92に低下し、MVA50nM測定時の感度は121.27(192.12-70.85で計算)から135.02(148.94-13.92で計算)へと若干の向上を示した。また、試薬N2E中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が96.01から13.92に低下し、MVA50nM測定時の感度は130.47(226.48-96.01で計算)と、135.02(148.94-13.92で計算)とほぼ同等であった。CoA、T-NAD、NADH、ATPなどに混在する可能性があるMVAおよび試薬製造工程で混入する可能性があるMVAを、MVK処理で処理前の17.3%以下または12.8%以下に低減させることができ、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。【０１０５】
[実施例１９] 大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いて混在するMVAを除去する工程を含む、MVAおよび／またはHMGCoA測定用酵素サイクリング試薬の製造(膜ろ過)
試薬N1にATPを1mM、塩化マグネシウムを1mMになるように添加した試薬N4、および試薬N4にMVKを0.4U/mLになるように添加した試薬N5を、それぞれ2mL作製し、37℃で20分間放置した後、分画分子量10000の膜で限外ろ過して試薬N4Fおよび試薬N5Fを作製した。【０１０６】
15μLのサンプル溶液(蒸留水または10mMのTris-HCl(pH7.5)に溶解した、320U/mLの大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来HMGR溶液)に、37℃で135μLの試薬N4F、N5Fのいずれかを加え、5分後に15μLの蒸留水または50nMのMVA溶液を加えてから26分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表21に示す。
【表２１】
0005524865.tif 000060
試薬N4F中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が58.57から10.41に低下し、MVA50nM測定時の感度は70.47(129.04-58.57で計算)および76.37(86.78-10.41で計算)とほぼ同等であった。CoA、T-NAD、NADH、ATPなどに混在する可能性があるMVA、および試薬製造工程で混入する可能性があるMVAを、MVK処理で9.1%以下に低減させることができ、実施例18と同様、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。
【０１０７】
[実施例２０] 大腸菌で発現させたPseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLを用いて混在するHMGCoAを除去する工程を含む、MVAおよび／またはHMGCoA測定用酵素サイクリング試薬の製造(膜ろ過)
試薬N1、試薬N1にHMGLを0.5U/mLになるように添加した試薬N6、試薬N1にHMGCoAを125nMになるように添加した試薬N7、試薬N7にHMGLを0.5U/mLになるように添加した試薬N8を、それぞれ2mL作製し、37℃で20分間放置した後に、分画分子量10000の膜で限外ろ過して試薬N1F、試薬N6F、試薬N7F、試薬N8Fを作製した。【０１０８】
15μLのサンプル溶液(蒸留水または10nM、50nMもしくは100nMのMVA溶液)に、37℃で135μLの試薬N1F、試薬N6F、試薬N7F、試薬N8Fのいずれかを加え、5分後に15μLの10mMのTris-HCl(pH7.5)に溶解した320U/mLの大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来HMGR溶液を加えてから、4.6分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表22に示す。
【表２２】
0005524865.tif 000061
試薬N7F中に混在するHMGCoAをHMGLで消去することでブランクの吸光度が305.99から3.81に低下し、MVA100nM測定時の感度は50.71(356.70-305.99で計算)から67.41(71.22-3.81で計算)へと向上した。仮に試薬製造工程でHMGCoAが混入した場合においても、125nMのHMGCoAであればHMGL処理で完全に除去することができ、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。【０１０９】
[実施例２１] 大腸菌で発現させたArchaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGRを用いた酵素サイクリング法によるMVA、HMGCoAの測定
15μLのサンプル溶液(蒸留水または表23記載のMVA溶液またはHMGCoA溶液)に、37℃で135μLの実施例18記載の試薬N3Eを加え、5分後に15μLの10mM Tris-HCl(pH7.5)に溶解した12U/mLのHMGR溶液を加え、26分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表23ならびに図1および図2に示す。MVAおよびHMGCoAを精度よく測定できたことがわかる。
【表２３】
0005524865.tif 000062
【０１１０】
[実施例２２] Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)から製造したHMGRを用いた酵素サイクリング反応
10μLのHMGR溶液(実施例1記載の方法で製造した3.3U/mLのHMGR溶液または実施例1記載の方法に加え実施例5記載と同様にHydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーを行って製造した3.3U/mLのHMGR溶液)に37℃で180μLの試薬P1(+)または試薬P1(-)を加え、5分後に20μLの試薬P2を加え、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表24に示す。酵素サイクリング反応が起き、MVAを測定できることがわかる。また、Hydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーを行った精製純度が高いHMGR溶液を用いた場合、ブランクが低く抑えられ、測定感度も高いことがわかる。
【表２４】
0005524865.tif 000063
【０１１１】
[実施例２３] Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)から製造したHMGRを用いた酵素サイクリング反応
10μLのHMGR溶液(実施例2記載の方法で製造した6.3U/mL、3.2U/mLまたは1.6U/mLののHMGR溶液)に、37℃で180μLの試薬P1(+)または試薬P1(-)を加え、5分後に20μLの試薬P2を加え、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表25に示す。酵素サイクリング反応が起き、MVAを測定できること、HMGR量が増えると測定感度が高くなることがわかる。
【表２５】
0005524865.tif 000064
【０１１２】
[実施例２４] Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)から製造したHMGRおよびComamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)から製造したHMGRを用いた酵素サイクリング反応
10μLのHMGR溶液(実施例3記載の方法で製造した12.0U/mLのHMGR溶液または実施例4記載の方法で製造した5.4U/mLのHMGR溶液)に、37℃で180μLの試薬P1(+)または試薬P1(-)を加え、5分後に20μLの試薬P2を加え、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表26に示す。酵素サイクリング反応が起き、MVAを測定できることがわかる。
【表２６】
0005524865.tif 000065
【０１１３】
[実施例２５] Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)由来のHMGR(HMGR-V)、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来のHMGR(HMGR-D)、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGR(HMGR-C)、 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR（HMGR-P）、大腸菌で発現させたArchaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGR (HMGR-A)の理化学的性質
＜熱安定性>
各HMGRを10mMTris-HCl(pH7.5)、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液を各温度で10分処理した後の残存活性(%)を測定した。結果を表27に示す。
【表２７】
0005524865.tif 000066
＜pH安定性＞
各HMGRをそれぞれのpHの20mM  緩衝液、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液をHMGR-Vは72.5℃、HMGR-Dは60℃、HMGR-Cは65℃、HMGR-Pは65℃、HMGR-Aは80℃で10分処理した後の残存活性(%)を測定した。緩衝液は、pH4.0-6.0：酢酸-酢酸ナトリウム、pH6.0-7.5：リン酸カリウム、pH7.0-10.0：Tris-HCl、pH9.5-11.0：CAPSを使用した。結果を図3から図7に示す。HMGR-VはpH6.0-8.0、HMGR-DはpH5.5-8.5、HMGR-CはpH4.0、pH6.0-10.0、pH11.0、HMGR-PはpH4.5-8.5、HMGR-AはpH4.0、pH6.0-11.0で安定である。
＜至適pH＞
各HMGRを10mMTris-HCl(pH7.5)、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液を試薬Bの50mMTris-HCl(pH8.5)を50mMの各pHの緩衝液に変更して0.05%BSAを含む反応液でHMGRの活性を測定した。各pHでの相対活性(%)を図8から図12に示す。なお、緩衝液は、pH6.0-7.5：リン酸カリウム、pH7.0-10.0：Tris-HCl、pH9.5-11.0：CAPSを使用した。すべてのHMGRにおいてpH9.0-10.5において活性が一番高くなるが、HMGR-VはpH7.5-10.0、HMGR-DはpH8.5-10.0、HMGR-CはpH7.0-10.0、HMGR-PはpH7.0-10.0、HMGR-AはpH7.0-10.5に至適pHがある。
＜Km値：MVA＞
試薬BのMVAの濃度を0.005mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.36mM、HMGR-Dは0.18mM、HMGR-Cは0.66mM、HMGR-Pは0.47mM、HMGR-Aは0.25mMであった。
＜Km値：CoA＞
試薬Bに0.5%になるようにBSAを加えて、CoAの濃度を0.01mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.066mM、HMGR-Dは0.038mM、HMGR-Cは0.073mM、HMGR-Pは0.097mM、HMGR-Aは0.035mMであった。
＜Km値：NAD＞
試薬Bに0.5%になるようにBSAを加えて、CoAの濃度を0.5mMにして、NADの濃度を0.005mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.19mM、HMGR-Dは0.08mM、HMGR-Cは0.26mM、HMGR-Pは0.29mM、HMGR-Aは0.17mMであった。
＜分子量：ゲル濾過＞
TSKgel  G3000SWxL（東ソー製）を用いて移動相として50mMPi-K(pH7.5)、0.2M硫酸ナトリウム、0.05%アジ化ナトリウムでのゲル濾過により、各HMGR分子量を測定した。HMGR-Vは330000、HMGR-Dは260000、HMGR-Cは270000、HMGR-Pは280000、HMGR-Aは410000であった。
＜分子量：SDS-PAGE＞
SDS-PAGEにより、各HMGR分子量を測定した。HMGR-Vは42000、HMGR-Dは42000、HMGR-Cは42000、HMGR-Pは45000、HMGR-Aは40000であった。
＜アミノ酸配列＞
HMGR-VのN末端アミノ酸配列は配列番号25に示した。ただし、1番目はMetまたはValである。HMGR-DのN末端アミノ酸配列は配列番号26に示した。ただし、1番目はMet、ValまたはThr、24番目はAspまたはAlaである。HMGR-CのN末端アミノ酸配列は配列番号27に示した。ただし、1番目はMet、AlaまたはThr、23番目はThrまたはLeu、35番目はLeuまたはGluである。
【０１１４】
[実施例２６] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRおよび大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いた酵素サイクリング法によるヒト血漿、血清中のMVA測定
5μLのサンプル液（蒸留水、50nM  MVA(100nM  D,L-MVA)、血漿1、血漿2、血清1、血清2）に150μLの試薬Q1Aまたは試薬Q1Bを加え、37℃で5分放置した後、50μLの試薬Q2を加えた後1分後から4分間の波長405nm（副波長660nm）の吸光度変化を測定した。結果を表28に示す。MVKで消去後の測定値を用いた計算値はサンプル中に存在するHMGcoAによる反応または非特異反応によるブランクを差し引いたものでより正確なD-MVA濃度である。なお、測定は自動分析機7170S（日立製）を用いて行い、血漿および血清サンプルはコージンバイオから購入したものを使用した（血漿1：正常ヒト血漿・プール クエン酸Na 、血漿2：1正常ヒト血漿・プール ヘパリン、血清1：正常ヒト血清・プール、血清2：正常ヒト血清・個体別）。
【表２８】
0005524865.tif 000067
【０１１５】
[実施例２７] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRおよび大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いた酵素サイクリング法によるヒト尿中のMVA測定
7.5μLのサンプル液（蒸留水、50nM  MVA(100nM  D,L-MVA)、蒸留水で200倍に希釈した尿1(希釈尿1)、蒸留水で200倍に希釈した尿2(希釈尿2)）に120μLの試薬R1を加え、37℃で5分放置した後、30μLの試薬R2を加えた後10分間の波長410nmの吸光度変化を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。尿1および尿2は同一人物の同一日の4:00および17:00の尿であり、その尿中クレアチニン値をクレアチニン測定試薬（LタイプワコーCRE・M：和光純薬製）を用いて測定した。結果を表29と表30に示す。クレアチニンで補正した値は尿の濃淡の影響が軽減された指標となる。
【表２９】
0005524865.tif 000068
【表３０】
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【０１１６】
[実施例２８] 大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRおよび大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVKを用いた酵素サイクリング法による食品中のMVA測定
16μLのサンプル液（蒸留水、MVA液、表33のsample1-12）に37℃で試薬K1(+)またはK1(-)を80μL加えて、1.7分間保温後、24μLの試薬K2を加えて更に3.3分間保温し、40μLの試薬K3を加えて更に3.8分間保温した。その後16μLの試薬K4(+)またはK4(-)を加え、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組み合わせと測定値を表31、表32に示す。測定値MVA[nM]は蒸留水とD-MVA100nM（D,L-MVAとして200nM）で検量線を作成して計算した。試薬K1(+)、K2、K3、K4(+)、試薬K1(-)、K2、K3、K4(-)の組み合わせとで蒸留水を測定したときの吸光度[mABS]に差があるのは実施例19にも記載したように試薬中に混在するMVAによるものであると推定される。sample1-12の調製法は表33に示す。なお、表33中のsample番号と表31および表32のサンプル番号は対応している。
【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
0005524865.tif 000072
【０１１７】
[実施例２９]MVA標準測定法（MVK法）とMVA標準品
D,L-Mevalonic  acid  lactone(シグマM4667)を正確に秤量して0.5M溶液を作製し、その溶液を正確に希釈することで0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mMのD,L-MVA液を作製した。D-Mevalonic  acid  lactone（東京化成M1347）を正確に秤量して0.5M溶液を作製し、その溶液を正確に希釈することで0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mMのD-MVA液を作製した。
二種類のNADH水溶液A、Bを作製し、ダブルモノクロメーターの分光光度計（島津UV-2550）で340nm、1cmの吸光度を測定すると1.0915と2.683であった。
自動分析機BM9020(日本電子製)の測定波長340nm、副波長658nmでの精度を確認するために、25μLのNADH水溶液AまたはNADH水溶液Bに37℃で75μLの蒸留水を加えて吸光度Aaを測定し、さらに8.8分後に75μLの蒸留水を加えて吸光度Abを測定した。水溶液Aの吸光度Aaは0.23602、吸光度Abは0.13452で、NADH水溶液Bの吸光度Aaは0.59107、Abは0.33786であった。それぞれの場合でBM9020の装置係数を求めると、0.86(=0.23602/(1.0915x25/(25+75)))、0.86(=0.13425/(1.0915x25/(25+75+75)))、0.88(=0.59107/(2.683x25/(25+75)))、0.88(=0.33786/(2.683x25/(25+75+75)))となり、平均すると0.87になる。
MVKは大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来を使用した。
25μLの蒸留水、D,L-MVA液またはD-MVA液に、37℃で75μLの試薬S1を加え、8.8分後に75μLの試薬S2を加え、測定波長340nmのS2添加前の吸光度A1［ABS］、S2添加6分後の吸光度A2［ABS］を自動分析機BM9020(日本電子製)で測定した。サンプルが蒸留水、0.5mM  D,L-MVA、0.5mM  D-MVAのときの反応タイムコースを図13に示す。
これらの結果とNADHのモル吸光係数6.3ｘ1000［l/(mol・cm)］から、
生成したNADH(nmol)=（A2x175-A1x100）/(6.3x0.87)
であり、サンプルが蒸留水であるブランク反応との差がD-MVAから生成したNADH量である。これにより、D,L-MVA液またはD-MVA液に含まれるD-MVA量を測定した。この結果を表34に示す。平均するとD,L-Mevalonic  acid  lactone(シグマM4667)のD-MVA含量は0.50、D-Mevalonic  acid  lactone（東京化成M1347）のD-MVA含量は0.88となる。このように、標準測定法を定めることで、正確なMVA量を測定できるようになり、MVA標準品を作成することができることがわかる。
【表３４】
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【０１１８】
[実施例３０]MVA標準測定法（HMGR法）とMVA標準品
各濃度のD-MVA液は実施例２９で作製したものを使用した。
自動分析機BM9020(日本電子製)の装置係数は実施例２９で測定した0.87を使用した。
HMGRは大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来、HMGLは大腸菌で発現させたPseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来を使用した。
25μLの蒸留水、D,L-MVA液またはD-MVA液に、37℃で75μLの試薬T1を加え、5分後に75μLの試薬T2を加え、測定波長340nmのT2添加前の吸光度A1［ABS］、T2添加13分後の吸光度A2［ABS］を自動分析機BM9020(日本電子製)で測定した。サンプルが蒸留水、0.5mM  D,L-MVA、0.5mM  D-MVAのときの反応タイムコースを図14に示す。
これらの結果とNADHのモル吸光係数6.3ｘ1000 ［l/(mol・cm)］から、
生成したNADH(nmol)=（A2x175-A1x100）/(6.3x0.87)
であり、サンプルが蒸留水であるブランク反応との差がD-MVAから生成したNADH量である。これにより、D,L-MVA液またはD-MVA液に含まれるD-MVA量を測定した。この結果を表35に示す。平均するとD,L-Mevalonic  acid  lactone(シグマM4667)のD-MVA含量は0.50、D-Mevalonic  acid  lactone（東京化成M1347）のD-MVA含量は0.90となる。このように、標準測定法を定めることで、正確なMVA量を測定できるようになり、MVA標準品を作成することができることがわかる。
【表３５】
0005524865.tif 000074
【０１１９】
[製造例１]  培地
上記実施例において用いた培地を以下に記載する。
培地A
A1に、A2を3%、A3を0.5%添加して作製した。
【表３６】
0005524865.tif 000075
【０１２０】
培地Ｂ
B1に、B2を3%、B3を0.5%添加して作製した。
【表３７】
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【０１２１】
培地Ｃ
C1に、C2を3%、C3を0.5%添加して作製した。
【表３８】
0005524865.tif 000077
【０１２２】
[製造例２]  試薬
上記実施例において用いた試薬の組成を以下に記載する。
【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【０１２３】
本出願は、２００９年１月１９日出願の日本特許出願（特願２００９−009177号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明によれば、生体内コレステロール合成量の指標としての生体試料中のMVAおよび／またはHMGCoAあるいは生体内脂質代謝の指標としての生体試料中のCoAを、簡便かつ超高感度／高精度に測定することが可能となり、また、汎用の自動分析機を用いて多検体について、前記の測定が可能となる。したがって、日常の臨床検査等において多検体を正確に測定することが可能になり、病態診断等に産業上の利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【０１２５】
配列番号1は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号2は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号3は、Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号4は、POPプロモーターの塩基配列である。
配列番号5は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)のMVK遺伝子の塩基配列である。
配列番号6は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGLのアミノ酸配列である。
配列番号7は、Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLのアミノ酸配列である。
配列番号8は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号9は、Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号10は、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号11は、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号12は、Pseudomonas sp.1-MV (NBRC-11063)由来のHMGR遺伝子の塩基配列である。
配列番号13は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGR遺伝子の塩基配列である。
配列番号14は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号15は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号16は、Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGR増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号17は、Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGR増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号18は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK前半増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号19は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK前半増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号20は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK後半増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号21は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK後半増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号22は、Pseudomonas putida KT2440由来のHMGL増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号23は、Pseudomonas putida KT2440由来のHMGL増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号24は、POPプロモーターにクローニング部位が連結した塩基配列である。
配列番号25は、Variovoraxsp.5-MV (FERM BP-11064)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
配列番号26は、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
配列番号27は、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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