(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本人女性被験者のヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、１４９４４Ｔを有するサブハプログループＡ１ａ１ａと、３７５９Ｇを有するサブハプログループＤ５ｂ１ｂと、１３１０Ｔを有するＤ５ａ２と、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃと、１４２８７Ｃを有するサブハプログループＤ４ｂ２ａと、５２３１Ａを有するハプログループＮ９ａと、１４９１４Ｇを有するハプログループＹ２または４５０５Ｔを有するサブハプログループＧ２ａ１ｂであるかを調べ、前記ハプログループＡを有する場合に、該日本人女性被験者はアテローム血栓性脳梗塞の危険性が高いことを評価するための判断材料の一つとすることを特徴とするアテローム血栓性脳梗塞に関する遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記ハプログループの検出方法が、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法であり、この方法の実施に用いるためのオリゴヌクレオチドのうち、  ハプログループＡを検出するために、６６３Ｇ及び８７９４Ｔを限定して指標とし、  ６６３Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１：acatcacccc ataaacaaat aggttと、配列番号２：gcttctattg acttgggtta atcgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１５７：gctaatagaa aggccaggaであり、  ８７９４Ｔの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号２７：caaatatctc atcaacaacc gactaと、配列番号２８：cagggctatt ggttgaatga gtagであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１０７：tggtgtaaat gagtaaggca ggであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子検出方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム血栓性脳梗塞に関する遺伝子検出方法に関し、特にヒトミトコンドリアＤＮＡのハプログループを分類することによりアテローム血栓性脳梗塞に関する遺伝子検出を行うものに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、３７個の遺伝子を含む１６５６９塩基対の環状二重鎖分子である（非特許文献１：文献名については、末尾にまとめて示す）。ｍｔＤＮＡは、母親を通じてのみ遺伝するという特徴がある。ｍｔＤＮＡ中の母系遺伝性の変異は、過去二十万年以上に渡り、ホモサピエンスがアフリカからアジアおよびヨーロッパに拡張した時代に、新たな突然変異が連続的に追加された事に起因している。ミトコンドリアゲノムの突然変異率は核ゲノムの突然変異率に比べると非常に速い（非特許文献２）ので、ホモサピエンスに蓄積されて来た古代のミトコンドリア多型は、比較的短い歴史を持つものではあっても、現代人類の代謝特性に影響している可能性がある。世界の様々な地域で発見されたミトコンドリアハプログループが、寒冷気候と栄養条件への適応を通じて選択されて来たものであると推測することができる。
【０００３】
ｍｔＤＮＡにおける多型は、核ＤＮＡの多型に比べて、個々人の機能的差により広範囲に寄与する。このような事情に鑑みて、本発明者らは、ｍｔＤＮＡの多型（ｍｔＳＮＰｓ）と、エネルギー代謝に関係する疾患等（例えば、長寿（非特許文献３）、パーキンソン病（非特許文献４、５）、アルツハイマー病、肥満（非特許文献６）、やせ（非特許文献７）、２型糖尿病（非特許文献６）、動脈硬化）との関係を明らかにするために研究を重ねてきた。この目的のために、百寿者、パーキンソン患者、アルツハイマー病患者、若年肥満者、非肥満者、血管障害のない２型糖尿病患者、及び血管障害を持つ２型糖尿病患者の７つのグループに属する６７２名（個々のグループについて、それぞれ９６名）のｍｔＤＮＡの１６５６９塩基対の塩基配列を全て決定した。更に、この結果に基づき、東アジアにおけるｍｔＤＮＡ進化系統樹を構築した。これらの知見から、ヒトミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）を構築した。これらのｍｔＳＮＰデータに基づいて、本発明者らは、蛍光ビーズ法を用いた包括的なｍｔＳＮＰ分析システムを開発した。
【０００４】
最近、ヨーロッパ人に関する研究から、１６１８４−１６１９３のｐｏｌｙ（Ｃ）ｔｒａｃｔの遺伝変異が、２型糖尿病発症においては主要な役割を担っていないことが示された（非特許文献８）。従って、非コード領域のみに於ける多型分析は、個々人の代謝特性とミトコンドリアゲノムに於ける機能的多型との間の相互関係については、直接的な証拠を提供し難いと思われる。
また、アテローム血栓性脳梗塞と、核ＤＮＡの変異との関係に関する報告は散見されるものの、これらの結果については、現在も議論が行われている。その理由としては、遺伝子と疾患との関係が明確でないこと、研究対象のサイズが小さいこと、多型に影響については集団の相違が認められるために特定の集団において認められる関係が他の集団に応用できるか否かに議論があること、環境要因が複雑であるために多型と疾患との関係が明らかと成り難いこと等が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の諸点に留意しつつ、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域に於ける包括的な多型分析に基づいて、日本人に於けるアテローム血栓性脳梗塞と主要な１１個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，およびＤ５）との関係を調べる大規模な関連解析を行った。
本研究者らの研究目的は、ｍｔＤＮＡのハプログループ分けに基づき、アテローム血栓性脳梗塞の遺伝的リスクを予測し、それによってアテローム血栓性脳梗塞の一次予防に役立てることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、長年に亘ってヒトミトコンドリアゲノムに関する研究を行っている。ヒトミトコンドリアＤＮＡは、強固に連鎖した複数のｍｔＳＮＰを有するハプログループに分類することができる。図３〜図５には、ｍｔＳＮＰとハプログループ（及びサブハプログループ）との関係を示した。このハプログループの分布は、人種間において、かなり大きな隔たりがある。個々の日本人は、主要な１１個のハプログループによって、そのほとんど（約９０パーセント以上）を分類することができる。各ハプログループは、数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰによって特徴付けられる。例えば、ハプログループＦは、８７０１、９５４０、１０３９８、１０８７３、１５３０１、１６５１９、１２７０５、１６２２３、１６１８３、１６５１９、３９７０、１３９２８、１６３０４、２４８、６３９２、１０３１０等の位置にｍｔＳＮＰを有している（その他のハプログループについても、同様の状況が存在する）。ハプログループ分類をするために、これら全てのｍｔＳＮＰを調べようとするのは、大変な労力が掛かるため大規模な研究には向きにくい。しかしながら、これらのうちのいずれのｍｔＳＮＰを選択・検出すれば、適切にハプログループを分類することが可能であるかについては明確には知られていなかったことに加え、選択したｍｔＳＮＰを迅速かつ的確に検出する方法については開発が十分に進んでいなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、新たなｍｔＳＮＰの検出法を開発し、日本人における主要な１１個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５）を迅速かつ的確に分類する検出法を開発した。
つまり、各ハプログループが持っている数個〜二十個程度のｍｔＳＮＰのうち、適当に１個〜５個のｍｔＳＮＰを選択することにより、表１に記載のｍｔＳＮＰｓを検出すれば、１１個のハプログループへの分類が可能であることを見出した。更に、この方法を用いて、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域における包括的な多型分析を基にして、日本人におけるアテローム血栓性脳梗塞と主要な１１個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４およびＤ５）との関係を調べるために、１０８１名を対象とした大規模な関連解析を行った。その結果、ハプログループＡを持つ者は、アテローム血栓性脳梗塞の危険性が高いこと（特に、女性の場合）を明らかとし、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００８】
こうして、上記課題を解決するために、本発明に係るアテローム血栓性脳梗塞に関する遺伝子検出法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、１４９４４Ｔを有するサブハプログループＡ１ａ１ａと、３７５９Ｇを有するサブハプログループＤ５ｂ１ｂと、１３１０Ｔを有するＤ５ａ２と、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃと、１４２８７Ｃを有するサブハプログループＤ４ｂ２ａと、５２３１Ａを有するハプログループＮ９ａと、１４９１４Ｇを有するハプログループＹ２と、４５０５Ｔを有するサブハプログループＧ２ａ１ｂとを検出することを特徴とする。
【０００９】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）＞多型塩基」の順で記載する。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ」は、５２３１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、その多型が生じている遺伝子（ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の位置について、カッコ書きで情報を示すことがある。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）」とは、上記多型について、ＮＤ２遺伝子において、アミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置（欠失または挿入に関する塩基情報）」の順で記載する。例えば、「８２７２（9-bp deletion in non-coding region）」とは、８２７２位の非コード領域における９個の塩基の欠失多型であることを意味している。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。
【００１０】
一般にミトコンドリアＤＮＡ多型（ｍｔＳＮＰｓ）或いはミトコンドリアＤＮＡハプログループは、対象となる集団（例えば、日本人・中国人・韓国人を含む東アジア人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。このため、日本人以外の集団において、アテローム血栓性脳梗塞との関係が指摘されているハプログループであっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人におけるハプログループおよびアテローム血栓性脳梗塞との関連が裏付けられるわけではない。
【００１１】
本発明において、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出する方法としては、従来公知の方法、例えばＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ（或いはＤＮＡマイクロアレイ）、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法などの方法を用いることができる。これらの中でも、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることにより、数百個程度の多型であれば迅速に測定することができる。なお、同方法の詳細については後に詳述する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、アテローム血栓性脳梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。この発明を用いることにより、アテローム血栓性脳梗塞に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１４】
＜研究対象＞
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人１０８１名（男性６４１名、女性４４０名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月までに３つの参加病院（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院）の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。アテローム血栓性脳梗塞を伴う患者群は、３４６名（男性２３４名、女性１１２名）であった。患者群について虚血性や出血性脳卒中の鑑別は、新たに突然発症した神経学的な巣症状や徴候が２４時間以上持続すること、および脳ＣＴ或いは脳ＭＲＩ（または、その両者の検査）により確認された。脳卒中の分類は、Classification of Cerebrovascular Diseases III (非特許文献９)を用いて決定した。心原性塞栓症とラクナ梗塞、一過性脳虚血発作、脳血管奇形、脳腫瘍、外傷性脳血管障害、心臓弁膜症を伴うか心房細動、心臓弁膜症を伴わない心房細動に関する患者は除外した。７３５名（男性４０７名、女性３２８名）の健常者である対照群は、健康診断のために参加病院を受診した者であった。対照群には、虚血性あるいは出血性脳卒中、冠動脈疾患、末梢性動脈閉塞性疾患、他の動脈硬化性疾患、他の血栓、塞栓、出血性疾患の既往歴は無かった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１５】
＜ハプログループ分類のためのミトコンドリア多型の選択＞
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）および日本人の系統樹（非特許文献１０）を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である１４９個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において見出された１１個の主要なハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，およびＤ５）を定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表１に示した。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、および各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「Syn」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
本発明者らは、上記１０８１名の被験者について、これらハプログループとアテローム血栓性脳梗塞との間の関係について研究を行った。
【００１８】
＜多型の遺伝子タイピング＞
各参加者から５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含む試験管に、７ｍＬの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてＤＮＡを分離した。
ＤＮＡをＰＣＲにかけ、特定のＤＮＡを増幅した。その際に使用したプライマーを表２および表３に示した。ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社、日本）で決定した。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１１）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。
【００１９】
また、ハプロタイピングのために使用したプライマーは、表４〜表９に示した。今回のタイピングには、最大で１００種類の多型の判定が行えるものを用いた。１８６種類のプローブを用いるために、全体を１００種類のセット（プローブセットＡ）と８６種類のセット（プローブセットＢ）とに分けて、タイピングを行った。表４〜表６にはプローブセットＡの詳細を、表７〜表９にはプローブセットＢの詳細を示した。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
【表３】
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【００２２】
【表４】
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【００２３】
【表５】
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【００２４】
【表６】
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【００２５】
【表７】
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【００２６】
【表８】
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【００２７】
【表９】
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【００２８】
表２および表３については、左欄よりＰＣＲ法によって合成されるフラグメント番号（Fragment）、フォワードプライマー（Forward primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列（Sequence）、リバースプライマー（Reverse primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列、および合成されるＤＮＡフラグメント長（Product）を示している。
表４〜表６については、第１のセット（プローブセットＡ）について、ｍｔＤＮＡにおける位置（Position）、目的（Purpose）、プローブの塩基配列（Sequence）を示している。また、目的の欄については、「ａ」が多型チェック用、「ｂ」が野生型チェック用、「ｐ」がＰＣＲ産物チェック用、「ｍ」および「ｎ」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表７〜表９については、第２のセット（プローブセットＢ）について、上記と同じ意味である。
表４〜表９に示したプローブセットは、前述の１１個のハプログループを分類するｍｔＳＮＰに加えて、更に細かいサブハプログループを検出するためのプローブを含んでいる。
【００２９】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１１に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズ（本発明における固相に該当する）の微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている（本発明における核酸プローブの固相化に該当する）。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている（Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社（Austin）、米国テキサス州）。こうして、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。
【００３０】
複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
本実施例においては、表４〜表６に記載の１００種類のプローブを第１セット（セットＡ）とし、表７〜表９に記載の８６種類のプローブを第２セット（セットＢ）として、２セットを用いることで、合計１８６種類の多型を検出可能な検出系とした。これら１８６種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアＤＮＡを少なくとも１１種類のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４およびＤ５）に分類することができる。
【００３１】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡフラグメントを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチン化したプライマーを用いた。ｍｔＤＮＡフラグメントを増幅するために２８−ｐｌｅｘ  ＰＣＲを行った。２ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（３０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２.５％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０.１μＭずつのプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０.６２５Ｕ）と１ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００３２】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、および４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（１.５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、および５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００３３】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに７５μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００３４】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００３５】
この方法に拠る遺伝子タイピングの精度を確かめるために、９１個のＤＮＡサンプルを材料に使用した。これらのＤＮＡサンプルは、ミトコンドリアゲノムの全塩基配列が直接シーケンスによって既に決定されているものである。各例において、ルミネックスシーケンス特異性オリゴヌクレオチドハイブリッドアッセイシステム（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によって決定された遺伝子型は、直接シーケンスによって決定されたものと一致した。
【００３６】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、アテローム血栓性脳梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定、またはマン・ホイットニーＵ検定（the Mann−Whitney U test）を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
アテローム血栓性脳梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、ＢＭＩ（body mass index）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、アテローム血栓性脳梗塞を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【００３７】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１１個のハプログループを調べたので、０.０５を１１で除して、０.００４５とした。こうして、０.００４５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
＜結果＞
１０８１名の被験者に関する基礎的データを表１０に示した。
【００３８】
【表１０】
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【００３９】
表中において、最左欄は上段から順に、対象数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、２型糖尿病（Type-2 diabetes）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群（CI）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、男性（Male）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値、女性（Female）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本より多くの喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇより大きい、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。２型糖尿病については、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％より大きい、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、または高脂血症剤を服用している者とした。
【００４０】
ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症、総コレステロール値、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、空腹時血糖値、ヘモグロビンＡｌｃはアテローム血栓性脳梗塞患者の全員と対照群とでは差がなかった。年齢、高血圧、収縮期血圧、拡張期血圧、２型糖尿病では、アテローム血栓性脳梗塞患者群の方が対照群よりも有意に高値であった（P < 0.005）。反対に、女性/男性比は、アテローム血栓性脳梗塞患者群が対象群よりも有意に低かった（P = 0.0001）。ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症については、いずれも疾患群と対照群との間に差異は認められなかった。
表１１には、カイ二乗検定により、ミトコンドリアハプログループの分布を評価した結果を示した。
【００４１】
【表１１】
0005396586.tif 000012
【００４２】
表に示す通り、全対象者を評価した場合には、Ｎ９ａ(P = 0.0174, OR = 0.435)とＭ７ｃ(P = 0.0260, OR = 0.251)の二つのハプログループが、アテローム血栓性脳梗塞に関連していることがわかった。女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、オッズ比０.１３９で疾患の危険性が低い傾向があった（P = 0.0073)。
年齢、性別、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表１２に示した。
【００４３】
【表１２】
0005396586.tif 000013
【００４４】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である性別（Gender）・２型糖尿病（Type-2 diabetes）・高血圧（Hypertension）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）（対象となるハプログループなし）を、女性における従来の危険因子である高血圧・２型糖尿病と遺伝的危険因子であるハプログループＡを、男性における従来の危険因子である２型糖尿病・高血圧と遺伝的危険因子（該当なし）を、それぞれ意味している。
【００４５】
女性の場合には、ハプログループＡでアテローム血栓性脳梗塞への感受性（オッズ比２.０９）が認められた（P=0.0409）。なお、全員を対象とした場合、および、男性の場合には、いずれのハプログループについても有意差は認められなかった。
表１３には、ｍｔＳＮＰｓのうち、アテローム血栓性脳梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【００４６】
【表１３】
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【００４７】
年齢、性別、喫煙状態、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、全対象群では、ハプログループＤ５のサブハプログループであるハプログループＤ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰの３７５９Ａ＞Ｇは、アテローム血栓性脳梗塞に対する抵抗性を示すことがわかった（P < 0.05）。また、ハプログループＡ１のサブハプログループであるハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰの１４９４４Ｃ＞Ｔと、ハプログループＤ５のサブハプログループであるハプログループＤ５ａ２を代表するｍｔＳＮＰの１３１０Ｃ＞Ｔは、アテローム血栓性脳梗塞に罹患しやすいことがわかった（P < 0.05）。
女性の場合には、年齢、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症で補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔが、アテローム血栓性脳梗塞に罹りやすいことがわかった（P < 0.05）。男性の場合には、ハプログループＤ５ａ２（ハプログループＤ５のサブハプログループ）を代表するｍｔＳＮＰである１３１０Ｃ＞Ｔが、アテローム血栓性脳梗塞に罹患しやすいことがわかった（P < 0.05）。
表１４には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【００４８】
【表１４】
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【００４９】
表中、「＊」は表１において示すように、１１個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。
全対照群において、３個のｍｔＳＮＰ（すなわち、ハプログループＤ５ｂ１ｂを代表する３７５９Ａ＞Ｇ、ハプログループＭ７ｃを代表する４８５０Ｃ＞Ｔ、およびハプログループＤ４ｂ２ａを代表する１４２８７Ｔ＞Ｃ）がアテローム血栓性脳梗塞に抵抗性があることがわかった（P < 0.05）。また、２個のｍｔＳＮＰ（すなわち、ハプログループＤ５ａ２を代表する１３１０Ｃ＞Ｔ、およびハプログループＡ１ａ１ａを代表する１４９４４Ｃ＞Ｔ）が、アテローム血栓性脳梗塞に感受性があることがわかった（P < 0.05）。これら５個のｍｔＳＮＰの総合的な寄与（各ｍｔＳＮＰの寄与率（R2）の総和）は、０.１２１であった。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａは、アテローム血栓性脳梗塞に対して抵抗性が認められた（P = 0.0214)。男性の場合には、ハプログループＤ５ａ２を代表するｍｔＳＮＰである１３１０Ｃ＞Ｔは、アテローム血栓性脳梗塞に対する感受性が認められた（P = 0.0235）。
【００５０】
＜考察＞
我々は１０８１名の日本人に基づく大規模な関連解析を行い、１１個の主要なミトコンドリアハプログループのそれぞれとアテローム血栓性脳梗塞との間の関係を調査した。カイ二乗検定によって、患者群と対照群との間の定性的な比較を行ったところ、ミトコンドリアハプログループＮ９ａとＭ７ｃについては、有意に（P<0.05）疾患の罹患率が低いことがわかった。また、女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、アテローム血栓性脳梗塞の罹患率が低くなる傾向が認められた（P = 0.0073）。
多項ロジスティック回帰分析法によれば、女性の場合には、ハプログループＡは、アテローム血栓性脳梗塞に有意に（P<0.05)関係していた。ハプログループＮ９ａ及びＭ７ｃと、アテローム血栓性脳梗塞との関係は、２型糖尿病についての補正を行うと、消失するようにも見える。我々の最近の知見によれば、ハプログループＭ７ｃについての理由は明確ではないものの、ハプログループＮ９ａは、メタボリック症候群と２型糖尿病に対して抵抗性があることがわかった。
この報告は、ミトコンドリアハプログループとアテローム血栓性脳梗塞との関係を調べた最初の報告である。
【００５１】
ハプログループＡを代表するｍｔＳＮＰである８７９４Ｃ＞Ｔは、ＡＴＰａｓｅサブユニット６においてＨ９０Ｙ置換（９０位のヒスチジンをチロシンに置換する）を引き起こす。ＡＴＰ６遺伝子は、サブユニットａをコードしている。サブユニットａは、ＡＴＰａｓｅ（Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖ）のＦｏセクタを横断してプロトンを輸送する際に重要な役割を果たす（非特許文献１０）。Ｈｉｓ９０Ｔｙｓの置換のグランサム値は８３であることから（非特許文献１２）、この多型は機能的多型である可能性がある。Ｌ１５６Ｒ置換を引き起こす８９９３Ｔ＞Ｇトランスバージョンは、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、および色素視神経網膜炎）症候群（非特許文献１３、１４）の原因となる病原性突然変異である。従って、８７９４Ｃ＞Ｔによって惹き起こされたＨ９０Ｙ置換がＡＴＰ６サブユニットとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖ）の機能に影響を与える可能性がある。しかしながら、ミトコンドリア機能および代謝に対する８７９４Ｃ＞Ｔ（ＡＴＰ６：Ｈ９０Ｙ）の実際の効果については未知であることから、この多型とアテローム血栓性脳梗塞に対する感受性との関係を理解するために更なる調査が望まれる。
【００５２】
本実施形態によれば、女性の場合には、ハプログループＡとアテローム血栓性脳梗塞との関係が示されたが、男性の場合には、そのような関係は認められなかった。性別による相違の原因は、今のところ不明である。一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると１０歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、ＮＯやＰＧＩ２の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン１の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす（非特許文献１５）。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するｍｔＳＮＰが男性と女性とで異なるのかも知れない。
【００５３】
虚血性脳卒中は多くの病因に基づく不均一な疾患であるが、小動脈及び大動脈に発生することが一般的である。脳卒中と頸動脈アテローム血栓に関しては、いくつかの遺伝的リスクに関する報告がある（非特許文献１６、１７、１８）。頸動脈での脈管内膜−中膜壁厚（ＩＭＴ）は、無症状アテローム血栓性脳梗塞の代理指標であり、将来の虚血性脳卒中に対する強力な予測指標である。近親関係（双子、兄弟、及び家族）の調査結果によれば、ＩＭＴには遺伝的な関連が認められるが、関連する遺伝子は同定されていない。細胞間物質（stromelysin-1、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ３）、炎症(インターロイキン６）、脂質代謝（肝リパーゼ、アポリポ蛋白Ｅ、コレステロールエステルトランスファ蛋白、パラオキソナーゼ）、及び凝固系（ファクターＶライデン、フィブリノーゲン）に関与する遺伝子の機能的な変異があるとＩＭＴが高いという報告がある。更に、ラクナ脳梗塞は、アテローム血栓性脳梗塞の初期において発症原因の元になることが示唆されている。ラクナ脳梗塞を含む血栓性梗塞は、アメリカ人やヨーロッパ各国人に比べて、日本人を含むモンゴリアンを起源とする東アジア人に多く発症する（非特許文献１９〜２２）。ミトコンドリアＤＮＡのＤループ中の高変異部位における１６１８９Ｔ＞Ｃトランジションは、インスリン抵抗性糖尿病、２型糖尿病、ラクナ脳梗塞に罹患しやすいという報告がある。フィニーラらによれば、ｍｔＳＮＰの１２３０８Ａ＞Ｇによって代表されるミトコンドリアハプログループＵは、片頭痛における後頭梗塞の危険性が高い危険因子であることが示された（非特許文献２３、２４）。
このように、本実施形態によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、アテローム血栓性脳梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、アテローム血栓性脳梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００５４】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図３】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（１）である。図の下端には、ハプログループ及びサブハプログループを示している（図４及び図４においても同じである）。
【図４】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（２）である。
【図５】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（３）である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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