(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ethyl methane sulfonateで処理した酵母を、ピルビン酸輸送阻害剤の存在下で培養し、当該阻害剤に耐性の酵母を分離することを特徴とする、ピルビン酸の生産能が低下した酵母の育種方法。
【請求項２】
ピルビン酸の生産能が低下した酵母は、より酸味の感じられる酒類を製造することができるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵母がサッカロマイセス・セレビシアエである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ピルビン酸輸送阻害剤がα−シアノ桂皮酸である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって分離された、ピルビン酸の生産能が低下した酵母。
【請求項６】
受託番号がNITE P-761又は受託番号がNITE P-904である、ピルビン酸の生産能が低下した酵母。
【請求項７】
より酸味の感じられる酒類を製造することができる請求項５又は６に記載の酵母。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵母を用いてアルコール発酵を行うことを特徴とする酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルビン酸を低生産しかつよい酸味の感じられる酒類を製造できる酵母及びその育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類醸造中において残存するピルビン酸は、つわり香を発生させる。つわり香は、ダイアセチルという物質が原因で生じる匂いであり、清酒、焼酎、ビール、ワインなど多くの酒類でオフフレーバーとして認識される物質である。ダイアセチルは乳酸菌の汚染によって発生するが、酵母自身によっても、ピルビン酸からαアセト乳酸を経て生産される。
このため、ピルビン酸の低減を図るべく、ピルビン酸の生産量が低い酵母の開発が求められていた。
【０００３】
ピルビン酸を低減するため、従来、発酵期間を長引かせ酵母に資化させる方法が採用されてきた。しかしながら、この方法は、発酵期間が長くなるため処理が煩雑である。また、発酵タンクを回転させることができない等の不都合がある。
また、従来、ピルビン酸低生産性の清酒酵母について育種が行われ、ピルビン酸輸送阻害剤として「α- シアノ桂皮酸とその誘導体」の作用が知られている（非特許文献１〜５）。
しかし、上記文献には、ピルビン酸輸送阻害剤に耐性を有する酵母について記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】関東東海北陸農業研究成果情報、Vol.2003 No.2 Page. 220-221 (2004)
【非特許文献２】日本農芸化学会大会講演要旨集、Vol.2002 Page.57 (2002)
【非特許文献３】KONG Qing-Xue et. al., Appl Microbiol Biotechnol: Vol. 75 No.6 Page. 1361-1366 (2007)
【非特許文献４】KONG Qing-Xue et. al., Appl Microbiol Biotechnol: Vol.73 No. 6 Page. 1382-1386 (2007)
【非特許文献５】久保義人, 食品加工に関する試験成績: Vol.1999 Page.9 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、発酵期間を長引かせることなくピルビン酸を低減せしめる酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、α-シアノ桂皮酸（Ethyl α-transcyanocinnamate）に耐性の酵母はピルビン酸生産量が低いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）酵母を、ピルビン酸輸送阻害剤の存在下で培養し、当該阻害剤に耐性の酵母を分離することを特徴とする、ピルビン酸の生産能が低下した酵母の育種方法。
酵母としては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエが挙げられる。また、使用するピルビン酸輸送阻害剤は、α-シアノ桂皮酸（Ethyl trans-α-cyanocinnamate）であることが好ましい。ピルビン酸の生産能が低下した酵母は、よい酸味の感じられる酒類を製造することができる。
（２）前記（１）に記載の方法によって分離された、ピルビン酸の生産能が低下し酵母。本発明の酵母は、よい酸味の感じられる酒類を製造することができる。本発明において、この性質を持つ酵母は、例えば受託番号がNITE P-761又は受託番号がNITE P-904のものが挙げられる。
（３）前記酵母を用いてアルコール発酵を行うことを特徴とする酒類の製造方法。 
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ピルビン酸の生産能が低下した酵母及びその育種方法が提供される。本発明によれば、発酵期間を長引かせることなく、短期間発酵によりピルビン酸を低減させかつよい酸味をもつ酒類を製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】清酒酵母とそれから育種した株(TCR6)の清酒醸造中のピルビン酸の濃度の推移を示す図である。
【図２】清酒酵母とそれから育種した株(TCR7)の清酒醸造中のピルビン酸の濃度の推移を示す図である。**; p<0.005
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者は、アルコール醸造において酵母ミトコンドリアが醸造の最後まで存在するという知見に基づき、ミトコンドリアの輸送担体を介して酵母を育種する方法を検討した。その結果、ピルビン酸のミトコンドリアへの輸送阻害剤であるα-シアノ桂皮酸（Ethyl trans-α-cyanocinnamate）等に耐性の酵母を選抜することで、ピルビン酸を低生産する酵母の育種に成功した。
【００１１】
本発明は、ピルビン酸輸送阻害剤の存在下で酵母を培養し、当該阻害剤に耐性の酵母を分離することを特徴とする酵母の育種方法に関する。このように分離選抜された酵母は、ピルビン酸の生産能が低く抑えられている。
【００１２】
従って、本発明の酵母を使用すれば、ピルビン酸が原因で生じるつわり香を無くすために発酵期間を長引かせる必要がなく、簡便にアルコール発酵を行うことができる。
【００１３】
本発明において、親株として用いる酵母としては特に制限はなく、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属又はクリベロミセス（Kluyveromyces）属に属する酵母が挙げられが、好ましくは、サッカロマイセス属に属する酵母である。サッカロマイセス属に属する酵母としては、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００１４】
ピルビン酸輸送阻害剤は、特に限定されるものではく、α-シアノ桂皮酸、alpha-cyano-h-(1-phenylindol-3-yl)-acrylate、UK5099（alpha-cyano-beta-(1-phenylindol-3-yl)acrylate）、GW604714X、GW450863X等が挙げられるが、α-シアノ桂皮酸が好ましい。なお、GW604714X及びGW450863Xは、いずれも公知のチアゾリジン化合物である（Biochimica et biophysica acta 2005; 1707(2-3): 221-30）。
本発明においては、ピルビン酸輸送阻害剤の存在下で酵母を培養する。
培養条件は特に限定されるものではなく、使用される酵母やピルビン酸輸送阻害剤の種類により適宜設定することができる。
【００１５】
例えば、酵母としてサッカロマイセス・セレビシエを用いるときは、通常の酵母培養用培地にピルビン酸輸送阻害剤を添加してピルビン酸輸送阻害剤含有培地とし、この培地を用いて培養する。ピルビン酸輸送阻害剤の濃度は、例えば0.3mg/ml〜0.6mg/mlであり、好ましくは 0.3 mg/mlである。培養時間は、例えば15日〜20日であり、好ましくは19日である。培養温度は例えば25℃〜37℃であり、好ましくは３０℃である。
【００１６】
培養後、ピルビン酸輸送阻害剤に耐性の株を分離する。「耐性」とはピルビン酸輸送阻害剤の存在下でも増殖できる性質を意味する。ピルビン酸輸送阻害剤耐性株であってピルビン酸低生産性の株を選択するためには、ピルビン酸輸送阻害剤の存在下で培養後、生存した株について、酵素試験によりピルビン酸濃度を測定し、親株又は野生型酵母よりもピルビン酸の生産性が低下した株を目的の菌株として選択すればよい。酵素試験は公知方法を用いることができ、また、市販のキット（例えばJK International社F-kitピルビン酸）を使用してもよい。
【００１７】
本発明のピルビン酸低生産性株の一つは、「TCR6」と称し、2009年５月２１日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒 292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に寄託した。その受託番号（受託証に記載）は、「NITE P-761」である。「NITE P-761」は、実施例１で「TCR6」として樹立した株である。
【００１８】
また、本発明のピルビン酸低生産性株の一つは、「TCR7」と称し、2010年２月２４日付で、上記特許微生物寄託センターに寄託した。その受託番号（受託証に記載）は、「NITE P-904」である。「NITE P-904」は、実施例１で「TCR7」として樹立した株である。
このようにして選択されたピルビン酸輸送阻害剤耐性株は、ピルビン酸生産能が低下した性質を有するとともに、それを用いて酒類を醸造したときに、よい酸味を付与できる性質を有する。従って、本発明の株は、ピルビン酸が低下し、かつ、良い酸味の感じられる種類の製造に有用である。
【００１９】
「生産能が低下した」又は「低生産性」とは、親株又は野生株と比較してピルビン酸の生産量が少ないことを意味し、
(i) 親株又は野生株と比較して１０％以下、好ましくは５％以下のピルビン酸しか生産できないこと、及び 
(ii) ピルビン酸の量は発酵の推移に依存するので、14日の発酵期間中1日又は2日以上ピルビン酸が早く低減すること
のいずれか一方又は両者を意味するものである。
本発明の酵母を用いてアルコール発酵を行い、常法に従って酒類を製造すると、ピルビン酸が低下し、かつよい酸味の感じられる酒類が得られる。「よい酸味」とは、キレの感じられる酸味である。
【００２０】
アルコール発酵は常法に従って行うことができる。例えば、穀類（例えば米）と麹を混合し、アルコール存在下で糖化させる方法、あるいは麦芽を４０−１００℃の間の適温で糖化する方法などにより所望の糖化液を得る。ワインを製造する場合は、ぶどうの絞汁液を準備する。
【００２１】
次に上記糖化液又は絞汁液に対して本発明の酵母を添加して発酵することにより4℃から４０℃の間の適温において、4日から70日の適当な期間でアルコール発酵を行う。蒸留酒を製造するときは、アルコール発酵後の発酵液（発酵醪）を蒸留すればよい。
酒類は特に限定されるものではなく、清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウィスキー、ブランデーなどが挙げられる。
【００２２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
清酒酵母協会7号をOD600=3.3にまでYPD培地で30℃において振とう培養した。その3mlを取り、1.7 mlの0.1MK-P buffer (pH7.0)に溶かし、ethyl methane sulfonate を50μl加え、30℃で60分ゆっくり振とうした。これに8mlのsodium thiosulfateを加え、遠心して水で洗う操作を2回行い、300μlの滅菌水に溶かし、100μlを 0.3 mg/mlのα-シアノ桂皮酸を含むYPD培地に塗布し30℃で19日間培養した。
培養後、酵素試験キット（JK International社F-kitピルビン酸）を用いてピルビン酸輸送阻害剤に耐性の10種の株を分離し、そのうち２株を「TCR6」（NITE P-761）及び「TCR7）（NITE P-904）と命名した。
【００２４】
TCR6による清酒醸造及びピルビン酸生産能の試験を行った結果、図１に示す通り、TCR６は清酒醸造中においてピルビン酸の生産量が低いことが明らかとなった。また、TCR7についても上記と同様の試験を行った結果、図２に示す通り、TCR7は清酒醸造中においてピルビン酸の生産量が低いことが明らかとなった。
図２は、前培養から独立した各々6回の仕込みにより実施した結果を示すものである。
【実施例２】
【００２５】
本発明のTCR7株を用いて清酒醸造を行なった。得られた香味について、5名の訓練されたパネルにより官能評価を行なった。比較対照として、親株である協会7号を用いて醸造した酒を用いた。
官能評価項目は自由記述とした。
その結果、本発明の株で醸造した酒について、「よい酸味」と指摘した人は5人中3人であった。
一方、親株である協会7号で醸造した酒では、「よい酸味」と指摘した人は5人中０人でした。
従って、本発明の株を用いて醸造された酒は、親株よりも有意に（χ２検定、危険率５％）酸味が優れていた。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、発酵期間を長引かせることなく、短期間発酵によりピルビン酸を低減させることができ、効率よく酒類を製造することができ、さらによい酸味をもつ酒類を製造することができる。
【受託番号】
【００２７】
NITE P-761：2009年５月２１日で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒 292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に寄託した。識別の表示：TCR6。
NITE P-904：2010年２月２４日で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒 292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に寄託した。識別の表示：TCR7。
【図１】
0005413847.tif 000002
【図２】
0005413847.tif 000003