(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養培地中に第VIII因子又は第VIII因子誘導体をコードするｃＤＮＡを含有する発現ＤＮＡベクターで形質転換された哺乳類宿主細胞から組み換え第VIII因子を生産し、前記第VIII因子を固相支持体に結合された第VIII因子特異的親和性分子を使用して精製する方法であって、
（ａ）前記哺乳類宿主細胞を、プロテアーゼ阻害活性を有する硫酸化多糖類が補充された培養培地で培養し、前記硫酸化多糖類は、約20,000〜約5,000,000Daの分子量を有する硫酸デキストランであり、前記培養培地中の前記硫酸デキストランの量が２５ｍｇ／Ｌ乃至２００ｍｇ／Ｌである工程、
（ｂ）限外ろ過を通して前記第VIII因子を含有する培養培地を濃縮し、
（ｃ）前記第VIII因子を免疫親和性クロマトグラフィーにより前記濃縮された培養培地から精製することを含み、ここで、前記親和性クロマトグラフィーは、（ｉ）抗第VIII因子特異抗体が結合されたアガロース及びセファロースを含む固相支持体で充填されたカラム、及び（ｉｉ）前記抗体が結合された固相支持体に結合された第VIII因子分子のための緩衝剤、塩、塩化カルシウム、界面活性剤及びエチレングリコールを含有する溶出緩衝剤を含む方法。
【請求項２】
前記培養培地が動物性タンパク質を含まない培地である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類宿主細胞がＣＨＯ、ＢＨＫ及びＣＯＳ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記生産された第VIII因子分子の均質性を増加させる方法である、請求項１〜３のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
第VIII因子は血液凝固と関連する血漿糖タンパク質である。その機能の欠陥又は異常は血友病Ａと呼ばれる深刻な遺伝性疾患を招く（Eaton, D. et al., 1986, Biochemistry 25:505-512; Toole, J.J. et al., 1984, Nature 312:342-347; Vehar, G.A. et al., 1984, Nature 312:337-342）。今まで、血友病Ａの唯一の治療はヒトの血液又は組み換え供給源から製造された第VIII因子の静脈内投与であった。安全性の理由により、組み換え第VIII因子が血漿由来第VIII因子より好まれる。しかし、第VIII因子の発現水準は同一の発現システムで他の分子より１００〜１０００倍程度低いため（Lynch C.M., 1993, Human Gene Therapy 4:259-272）、組み換え第VIII因子の生成はその需要を充足できなかった。
【０００２】
様々な試みが、第VIII因子の補助因子活性度にいずれの機能も持たないことが知られているＢ−ドメインを除去することで、第VIII因子の改善された発現を達成した（Eaton et al., 1986, Biochemistry 25:8343-8347; Burke, R.L. et al., 1986, J. Biol. Chem., 261:12574-12578; Toole, J.J. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5939-5942; Fay et al., 1986, Biochem. Biophys. Acta, 871:268-278）。米国特許第５，６６１，００８号及び国際公開第９１／０９１２２号には、血漿第VIII因子の最も短い形態と類似した第VIII因子のＢ−ドメイン欠失形を提示した。米国特許第５，１１２，９５０号及び米国特許第７，０４１，６３５号には、単一鎖形態のＢ−ドメイン欠失第VIII因子分子が提示されている。
【０００３】
哺乳類細胞発現のための選択として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現システムが第VIII因子を含む多数の治療タンパク質の生産に使用されていた（Chu, L et al., 2001, Curr. Opin. Biotehnol. 12:180-187）。ＣＨＯ細胞株の特徴は明らかにされている。ＣＨＯ細胞株は血清含有培地又は無血清培地に適合した、固定依存的な方法又は懸濁方法で成長することができ、特に、ヒトの糖鎖付加パターンとほぼ同一のタンパク質の翻訳後変更を支援することができる（Brooks S.A., 2004, Mol. Biotechnol., 28:241-255; Jenkins, N., et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:975-981; Chen, Z., et al., 2000, Biotechnol. Lett., 22:837-941; Mols, J., et al., 2005, 41:83-91）。大概は、動物由来ウイルス又はプリオンの伝染に係る安全性を解決してより容易な精製のために、治療タンパク質を生産するＣＨＯ細胞を動物由来無タンパク質培地で培養した（Chu, L., et al., 2001, Curr. Opin. Biotechnol., 12:180-187）。しかし、前記培養培地から血清の除去は血清補充物のうち天然的に含有されたプロテアーゼ抑制剤も除去し、前記生産過程中に細胞生存率を維持することが困難となる（Mols, J., et al., 2005, 41:83-91; Sandberg, H., et al., 2006, Biotechnol Bioeng., 95:961-971）。
【０００４】
減少した生存率及びストレスが多い環境は、死んだ細胞から分泌されたり放出されるプロテアーゼの生産を増加させると見られており、これは前記治療タンパク質を攻撃して不均質性（heterogeneity）を誘発し得る。治療タンパク質の内部切断により誘発された不均質性は大きな問題となり得るが、その理由は切断されたタンパク質が不活性となり、生産及び精製過程中に“ロット間（lot to lot）”同一性を維持することが困難となるためである。従って、生産中に比較的低い水準のプロテアーゼを維持しプロテアーゼ活性を防止することが重要である。
【０００５】
培養中にＣＨＯ細胞株から放出されたプロテアーゼにより誘発されるこのようなタンパク質分解を防止するためのいくつかの成功した努力が報告されているが、ＣＨＯ細胞株から生産された全ての治療タンパク質に適用できる普遍的な抑制剤は未だに発見されていない。Ｓａｔｏｈ ＭらはＣＨＯ細胞から放出されたシステイン及びセリンプロテアーゼの存在を報告している。Ｃｈｏｔｔｅａｕら（Chotteau, V., et al., 2001, in Animal cell technology: from target to market, Kluwer Academic publishers, pp. 287-292）はＣＨＯ細胞培養培地からの未確認細胞外の金属依存性プロテアーゼが切断された第VIII因子のタンパク質分解に寄与することを明らかにした。国際公開第９０／０２１７５号には、ＣＨＯ細胞培養物からの一部のセリン又はシステインプロテアーゼが抑制剤ペプチドにより遮断され、前記抑制剤は第VIII因子の生産性を増加させることが記載されている。欧州特許公開第０３０６９６８号は、アプロチニンを培養培地に添加することで、ＣＨＯ細胞培地で第VIII因子の発現を３倍まで増加したことを記述している。
【０００６】
米国特許第５，８５１，８００号で、発明者らはメタロプロテアーゼ及びキモトリプシンの抑制剤が細胞培養物で第VIII因子生産に対する有害影響を減少させることができることを開示した。Ｓａｎｄｂｅｒｇ Ｈらは、細胞培養物でＣＨＯ細胞により放出された２種類のタンパク質分解活性の特性を明らかにした。一つはメタロプロテアーゼが起源であり、もう一つはセリンプロテアーゼが起源であった。専らメタロプロテアーゼのみが第VIII因子活性に対して強い悪影響を与えることが分かった。しかし、ＥＤＴＡ及び１，１０−ｏ−フェナントロリンのようなメタロプロテアーゼの抑制剤がＳａｎｇｂｅｒｇ Ｈらにより提示されたように、第VIII因子切断を遮断することができたとしても、これら抑制剤は我々の実験から判断すると、細胞毒性効果によりＣＨＯ細胞培養培地に直接添加することができない。
【０００７】
前記言及した全てのプロテアーゼ抑制剤及びアプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、Ｅ−６４及びペプスタチンＡのようなセリン、システイン、アスパラギン酸及びアミノペプチダーゼに対する抑制剤を含有する、商業的に得ることができるプロテアーゼ・カクテルを単一鎖第VIII因子誘導体（米国特許第７，０４１，６３５号に開示）培養物に適用したが、それらは全て、培養途中にＣＨＯ細胞培養物から放出されたプロテアーゼによる切断から第VIII因子誘導体を保護するのに有効ではないことを発見した。
【０００８】
米国特許第６，３００，１００号には、ヘパリンのような硫酸化多糖類が培養培地に存在するプロテアーゼによる切断から無傷の組織因子経路抑制剤（ＴＦＰＩ）を保護することが提示されている。更に、米国特許第５，１１２，９５０号は、無血清培地で第VIII因子に対するフォン・ヴィレブランド因子の安定化効果を代替する硫酸化デキストランを提示する。しかし、我々の知っている限りでは、第VIII因子分子と関連してプロテアーゼに対する硫酸デキストランの抑制効果に関する報告は存在しない。
【０００９】
本発明は、ＣＨＯ細胞培養中に生産されたプロテアーゼからの第VIII因子又はその誘導体の切断に対する硫酸デキストランの保護効果を立証することを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６６１，００８号
【特許文献２】国際公開第９１／０９１２２号
【特許文献３】米国特許第５，１１２，９５０号
【特許文献４】米国特許第７，０４１，６３５号
【特許文献５】国際公開第９０／０２１７５号
【特許文献６】欧州特許公開第０３０６９６８号
【特許文献７】米国特許第５，８５１，８００号
【特許文献８】米国特許第７，０４１，６３５号
【特許文献９】米国特許第６，３００，１００号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Eaton, D. et al., 1986, Biochemistry 25:505-512; Toole, J.J. et al., 1984, Nature 312:342-347; Vehar, G.A. et al., 1984, Nature 312:337-342
【非特許文献２】Lynch C.M., 1993, Human Gene Therapy 4:259-272
【非特許文献３】Eaton et al., 1986, Biochemistry 25:8343-8347
【非特許文献４】Burke, R.L. et al., 1986, J. Biol. Chem., 261:12574-12578
【非特許文献５】Toole, J.J. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5939-5942
【非特許文献６】Fay et al., 1986, Biochem. Biophys. Acta, 871:268-278
【非特許文献７】Chu, L et al., 2001, Curr. Opin. Biotehnol. 12:180-187
【非特許文献８】Brooks S.A., 2004, Mol. Biotechnol., 28:241-255
【非特許文献９】Jenkins, N., et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:975-981
【非特許文献１０】Chen, Z., et al., 2000, Biotechnol. Lett., 22:837-941
【非特許文献１１】Mols, J., et al., 2005, 41:83-91
【非特許文献１２】Chu, L., et al., 2001, Curr. Opin. Biotechnol., 12:180-187
【非特許文献１３】Mols, J., et al., 2005, 41:83-91
【非特許文献１４】Sandberg, H., et al., 2006, Biotechnol Bioeng., 95:961-971
【非特許文献１５】Chotteau, V., et al., 2001, in Animal cell technology: from target to market, Kluwer Academic publishers, pp. 287-292
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の一様態において、硫酸デキストランが補充された無血清培地に適用された哺乳類宿主細胞株で第VIII因子又はその誘導体の生産方法を提供する。培養培地に硫酸デキストランを添加すると、ＣＨＯ細胞培養培地が起源である（ａ）いくつかのプロテアーゼの第VIII因子−切断機能が有効に減少されたり遮断され、同時に前記生産された第VIII因子分子の均質性が増加する。
本発明の別の様態において、単クローン抗体依存精製方法を使用して硫酸デキストラン含有培地から第VIII因子分子を効率的に精製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、哺乳類宿主細胞培養中に放出されるプロテアーゼによる切断から米国特許第７，０４１，６３５号に開示された単一鎖第VIII因子誘導体を保護することができる有効抑制剤及び前記生産された第VIII因子誘導体の均質性を増加させることに関する。また、本発明は、前記プロテアーゼ抑制剤の添加による影響なく前記第VIII因子を精製する方法に関する。
【００１４】
前記哺乳類宿主細胞は、組み換え第VIII因子を発現できる任意の動物細胞であり得、好ましくは目的とする形質転換細胞を容易に分離させることができる動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、又はＣＯＳ細胞、より好ましくはＣＨＯ細胞である。
【００１５】
先行特許である米国特許第６，３００，１００号には、いくつかのプロテアーゼに対する標的タンパク質に対する硫酸化多糖類の保護効果に対して記述されており、ここで標的タンパク質は組織因子経路抑制剤（ＴＦＰＩ）であった。従って、前記硫酸化多糖類が標的分子−第VIII因子を保護できるかの試験を行った。本発明は、硫酸デキストランのみが培養過程中に培養培地に添加されるとき、第VIII因子切断に対して非常に強い保護効果を有することを立証した。
【００１６】
硫酸デキストランを細菌発酵又は化学合成から得ることができる。硫酸デキストランの分子量は２０乃至５，０００ｋＤａの分子量で異なり得、好ましくは５０乃至２，０００ｋＤａである。
【００１７】
硫酸デキストランの硫黄含量はまた、その供給源物質によって異なり得る。硫酸デキストランの硫黄含量に関係なく、前記硫酸デキストランが細胞培養過程から放出されたプロテアーゼによる切断から第VIII因子を保護することができれば、本発明に使用することができる。硫酸デキストランの硫黄含量は好ましくは、硫酸化多糖類の５乃至２０質量％、より好ましくは１７質量％を超過する範囲である。
【００１８】
成長培地に添加される硫酸デキストランの量は第VIII因子の発現水準及びその宿主細胞株によって調節することができ、本発明の好ましい実施様態に制限されない。
【００１９】
本発明の好ましい実施様態において、第VIII因子分子は、米国特許第７，０４１，６３５号に提示されているｄＢＮ（６４−５３）（以下、Ｉ２ＧｄＢＮと呼ぶ）と命名された第VIII因子誘導体のうち一つである。前記第VIII因子誘導体はＢ−ドメインの一部及びＡ３のＮ−末端部分に内部欠失を有し、その融合部位に新しいＮ−グリコシル化認識配列を有するようにデザインされた。米国特許第７，０４１，６３５号の実施例６に開示された方法のように、前記Ｉ２ＧｄＢＮを安定に発現するＣＨＯ細胞株を製造し、これを商業的に立証できる無血清培地に適用させた。以下、前記クローンを“＃３９クローン”と表示し、実施例に言及された全ての細胞は前記ＣＨＯ細胞株（＃３９）を称する。
【００２０】
本発明はまた親和性クロマトグラフィーを使用して、硫酸デキストランが補充された培養培地から哺乳類宿主細胞で発現された第VIII因子又は誘導体を精製する方法に関する。前記親和性クロマトグラフィーは、アガロース又はセファロースのような固相支持体に結合された親和性分子を含有する親和性カラムを含む。前記親和性分子は、単クローン性又は多クローン性の抗第VIII因子に対して高い親和性を有するペプチドであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】無傷の第VIII因子の切断の保護に対する相異の硫酸化多糖類の比較効果を表す。
【図２】Ｂ−ドメインが欠失された第VIII因子、Ｉ２ＧｄＢＮの断片化に対する硫酸デキストランの分子量及び濃度効果を表す。
【図３】Ｉ２ＧｄＢＮの断片化に対する硫酸塩、デキストラン及び硫酸デキストランの効果を表す。
【図４】本発明の実施様態によるかん流培養でＩ２ＧｄＢＮの断片化に対する硫酸デキストランの効果を表す。
【図５】本発明の実施様態による免疫親和性クロマトグラフィーからの溶出分画のクマシーブリリアントブルーＲ２５０−染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明を下記実施例により更に例示するが、当分野の熟練者により理解されるように、他の第VIII因子分子及び別の細胞株に適用することができる。従って、下記の実施例を本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
【００２３】
ヘパリン、低分子量のヘパリン（〜３ｋＤａ及び４〜６ｋＤａ）、デルマタン硫酸、デキストラン（５００ｋＤａ）、硫酸ナトリウム、硫酸デキストリン（５００ｋＤａ、１０ｋＤａ、８ｋＤａ）をシグマ社から購入した。デキストランは、ロイコノストック・メセンテロイデス、菌株Ｂ５１２から由来した。相異する分子量の硫酸デキストランを制限された加水分解及び分別化により生成させた。硫酸群を温和な条件下で硫酸によるエステル化により添加した。前記硫酸デキストランは約１７％の硫黄を含有した。
（http://www.sigmaaldrich.com/sigmaaldrich/product_information_sheet/d6001pis.pdf）
【００２４】
＃３９ＣＨＯ細胞株の塗抹
Ｉ２ＧｄＢＮをコードするＤＮＡ断片を持つ前述した＃３９クローンを無血清培地（Cambrex社から購入したＰｒｏＣＨＯ５培地）で培養した。解凍後、２度の継代培養時、４×１０5細胞を６−ウェルプレートの各ウェルに分株した。
【００２５】
ウエスタンブロット分析
発現された第VIII因子を含有する培養培地を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用し、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ブロッティングされた膜を本発明の発明者らにより生成された＃２６−１と称するＡ２ドメイン−特異抗体で精査した。セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合された２次マウスＩｇＧを使用して前記ブロット上の第VIII因子−抗体複合体を視覚化した。
【実施例】
【００２６】
実施例１
Ｉ２ＧｄＢＮの断片化に対する多様な硫酸化多糖類の保護効果の比較
高分子量の硫酸デキストラン（約５００ｋＤａ）、ヘパリン、２種類の低分子量ヘパリン（〜３ｋＤａ及び４〜６ｋＤａ）、及びデルマタン硫酸をシグマ社から購入し、水に再懸濁してフィルター殺菌した。細胞を先で言及したように分株して２４時間後に、培地を新しいものと換え、５種類の硫酸化多糖類を各ウェルに各々２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、又は２００ｍｇ／Ｌの最終濃度で添加した。４８時間培養した後、培養上澄液を除去し、ウエスタンブロット分析を通して分析した。図１に示したように、その他の特許で記述したＴＦＰＩを有効に保護する３種のヘパリンの保護効果はほとんどなかった。しかし、硫酸デキストランは濃度−依存的方式で効率的に第VIII因子の切断を保護した。添加剤がない培養培地中の第VIII因子（４１％；図１−（Ｄ）でレーン１）及びヘパリン又はデルマタン硫酸がある培養培地中の第VIII因子（５２％〜６７％；図１−（Ｄ）でレーン３〜６）に比べて硫酸デキストランを含む培地内には９２％を超える第VIII因子（図１−（Ｄ）でレーン２）が完全に残っていた。これは全ての硫酸化多糖類が全ての標的タンパク質を保護することができず、いくつかの硫酸化多糖類の保護効果は標的タンパク質に非常に特異的であることを示している。
【００２７】
実施例２
Ｉ２ＧｄＢＮの切断に対する硫酸デキストランの分子量の効果
より少ない分子量の硫酸デキストランを適用して前記切断を保護することができれば、より少ない分子量の硫酸デキストランをそのサイズの差に根拠して第VIII因子からより容易に分離することができる。従って、より少ない分子量の硫酸デキストランが細胞培養中に発現されたＩ２ＧｄＢＮの切断を保護することができるかを調べるために、同一含量の硫黄を有し、同一の供給源から起源する８ｋＤａ、１０ｋＤａ及び５００ｋＤａの硫酸デキストランを１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、及び１０００ｍｇ／Ｌの多様な濃度で前記培地に加えた。硫酸デキストランを添加して７２時間後、培養培地を収穫し、ウエスタンブロット分析により分析した。図２に示されるように、低分子量の硫酸デキストランの量を増加させて（図２でレーン１〜レーン８）、細胞培養培地に添加したが、Ｉ２ＧｄＢＮ切断に対する効率的な保護効果が全く観察されなかった。５００ｋＤａの硫酸デキストラン（レーン９〜レーン１２）のみが単一鎖Ｉ２ＧｄＢＮの断片化を保護することが分かった。
【００２８】
実施例３
硫酸化デキストランのみが切断を保護することができる。
硫酸デキストランの別途の官能基が切断抑制効果を有するかを調べるために、等モル量のデキストラン（５００ｋＤａ）、硫酸ナトリウム及び硫酸デキストラン（５００ｋＤａ）を培養培地に加えた。細胞を前記のように分株した。分株２４時間後、２５０ｍｇ／Ｌ乃至１０００ｍｇ／Ｌ範囲の様々な濃度の硫酸デキストラン（５００ｋＤａ）及びデキストラン（５００ｋＤａ）又は７１ｇ／Ｌ乃至３８４ｇ／Ｌ範囲の様々な濃度の硫酸ナトリウムを前記培地に加えた。添加４８時間後、培地を各々のウェルから回収し、ウエスタンブロット分析により分析した。図３に示したように、５００ｋＤａの硫酸デキストラン（レーン５〜レーン７）のみがＩ２ＧｄＢＮの切断に対して保護効果を示した。デキストラン単独（レーン２〜レーン４）や硫酸ナトリウム（レーン８〜レーン１０）は全てＣＨＯ培養途中に放出されたプロテアーゼのプロテアーゼ活性を抑制できないことが分かった。デキストランや硫酸ナトリウムのみを含む培養培地のフラグメンテーションパターンは添加剤がない培養培地（対照群、レーン１）の場合と類似していた。
【００２９】
実施例４
懸濁培養に対する硫酸デキストランの適用
硫酸デキストラン（５００ｋＤａ）をかん流培養システムに適用した。１本のバイアルの細胞を解凍し、Ｔ７５フラスコで細胞数を増大させ、Ｔ１２５フラスコで更に増大させた。Ｔ１２５フラスコ中の細胞を２５０ｍＬ、１Ｌ及び３Ｌスピナーフラスコに連続的に移し、１００ｒｐｍの回転速度で５％のＣＯ2／空気混合物下に３７℃で磁気攪拌器プレート上で懸濁培養状態で培養させた。３Ｌスピナーフラスコの中で幾何級数的に成長する細胞を回収し、５Ｌの可動範囲を有する７．５Ｌ生物反応器に接種した。硫酸デキストラン（５００ｋＤａ）を前記生物反応器中の無血清培地に２００ｍｇ／Ｌの濃度で加えた。培養かん流の間、細胞生存率が９２．７％以上で維持され、培養過程の間、ウエスタンブロットでの各バンドの密度測定分析より判断したとき、第VIII因子の断片は５％未満で検出された。６日、１２日及び１８日目に回収した培養培地の例示的なウエスタンブロットを図４に示す。
【００３０】
実施例５
免疫親和性クロマトグラフィーによる培養培地からＩ２ＧｄＢＮの精製
硫酸デキストランの強い陰電荷特長により、硫酸デキストランが補充された培養培地で分泌された第VIII因子を精製するのにイオン交換クロマトグラフィーを適用することができない。したがって、実施例４で精製された培養培地を接線流限外ろ過により濃縮させ、平行緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．０］、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＬＣａＣｌ2、３ｍＭ ＥＤＴＡ）であらかじめ平衡化させた免疫親和性カラムに加えた。
免疫親和性カラムを第VIII因子重鎖のＡ２部位を認識する単クローン抗第VIII因子をＣＮＢｒ−活性化されたセファロースに結合させることで製造した。第VIII因子−結合された免疫親和性カラムを２．５層体積の平衡緩衝剤及び２．５層体積の洗浄緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．０］、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＬＣａＣｌ2、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％エチレングリコール）で洗浄した。４０〜６０％範囲の濃度でエチレングリコールを含有する溶出緩衝剤を使用して段階的勾配溶出で溶出を行った。１２個の溶出分画中９個（図５でＥ１〜Ｅ９に相当する溶出分画１〜９番）をサンプリングし、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染料で染色した。図５で例示したように、前記培養培地の単一段階の精製のみでも９５％を超過する非常に純粋な単一鎖第VIII因子を提供した。
本発明は、また、以下の態様であり得る。
〔１〕  培養培地中にFVIII又はFVIII誘導体をコードするｃＤＮＡを含有する発現ＤＮＡベクターで形質転換された哺乳類宿主細胞から組み換え第VIII因子を生産し、前記第VIII因子を固相支持体に結合された第VIII因子特異的親和性分子を使用して精製する方法であって、（ａ）前記哺乳類宿主細胞を硫酸デキストランが補充された培養培地で培養し、
（ｂ）限外ろ過を通して前記第VIII因子を含有する培養培地を濃縮し、
（ｃ）前記第VIII因子を免疫学的方法により前記濃縮された培養培地から精製すること
を含む方法。
〔２〕  前記硫酸デキストランの平均分子量が２０乃至５，０００ｋＤａである、〔１〕記載の方法。
〔３〕  前記培養培地中の前記硫酸化多糖類の量が１０ｍｇ／Ｌ乃至２ｇ／Ｌである、〔１〕記載の方法。
〔４〕  前記培養培地が動物性タンパク質を含まない培地である、〔１〕記載の方法。
〔５〕  前記哺乳類宿主細胞がＣＨＯ、ＢＨＫ及びＣＯＳ細胞である、〔１〕記載の方法。
〔６〕  前記免疫学的方法が免疫沈降又は免疫親和性クロマトグラフィーである、〔１〕記載の方法。
〔７〕  前記クロマトグラフィーが、
（ａ）抗第VIII因子特異抗体が結合されたアガロース及びセファロースを含む固相支持体で充填されたカラム、及び
（ｂ）前記抗体が結合された固相支持体に結合された第VIII因子分子のための緩衝剤、塩、塩化カルシウム、界面活性剤及びエチレングリコールを含有する溶出緩衝剤
を含む、〔６〕記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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