(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、試料中の1つまたは複数の細胞集団を固定および検出するための方法：
（a）第一のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第一の細胞集団上の第一のエピトープに対して特異的親和性を有する第一の抗体とを含む第一の捕捉複合体を得る段階；
（b）第二のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第一の細胞集団上の第二のエピトープに対して特異的親和性を有する第二の抗体とを含む第二の捕捉複合体を得る段階；
（c）試料を第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体に接触させる段階；
（d）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；
（e）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体をチャンバーの表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；ならびに
（f）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定される第一の細胞集団を検出する段階。
【請求項２】
第一の細胞集団を計数する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
統計学的に有意な数の第一の細胞集団がチャンバーの表面上に固定されているか否かを決定する段階、ならびに統計学的に有意な数の第一および第二の細胞集団がチャンバーの表面上に固定されるまで、試料の1つまたは複数の追加のアリコートをチャンバーに導入する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
第三のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第二の細胞集団における第三のエピトープに対して特異的親和性を有する第三の抗体とを含む第三の捕捉複合体を試料に接触させる段階、ならびに第三の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定される第二の細胞集団を検出および計数する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第一の細胞集団の第二の細胞集団に対する比率を決定する段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
試料中の第一の細胞集団の濃度を決定する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項７】
試料中の第二の細胞集団の濃度を決定する段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項８】
細胞膜を染色する一般的なレポーター色素または細胞核を染色する一般的なレポーター色素によって細胞集団を染色する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
細胞集団を検出する段階が、第一の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために第一の分類画像を撮影する段階、第二の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために第二の分類画像を撮影する段階、および細胞集団を染色する一般的なレポーター色素からのシグナルを検出するためにレポーター画像を撮影する段階を含む、請求項8記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2008年1月7日に提出された米国仮特許出願第61/019,485号に対する優先権を主張する。上記引用開示の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
A．発明の分野
本発明は全般的には、細胞、胞子、または細菌などの生物学的検体の単離および検出に関する。より詳しくは、本発明は、複合試料からの生物学的物質の免疫磁気的分離に関する。
【背景技術】
【０００３】
B．関連技術の説明
生物学的細胞の研究、特徴付け、およびセンサス（census）は常に、裸眼では直接見ることができないものを可視化する撮像ツールを用いることに依存してきた。1665年にRobert Hooke（The Cell - A molecular approach; Geoffrey M. Cooper. ASM Press. 1997）（非特許文献1）によって細胞に関する最初の科学的観察が報告されて以来、顕微鏡分野が細胞生物学分野を可能にしてきた。基本的な初期の明視野光学顕微鏡から最も近年の走査型電子顕微鏡に至るまで、細胞生物学者は、これらの技術の増加しつつある倍率および解像能を利用した。今日、デジタル撮像とこれらの強力な顕微鏡との統合により、この分野の範囲はさらにいっそう拡大した。顕微鏡は今や、強力な画像処理技術と組み合わせて、広く多様な試料の迅速かつ自動での分析を可能にする。
【０００４】
顕微鏡の撮像能は、何世紀ものあいだに有意に進化してきたが、試料の調製は通常、なおも撮像の前に行われる別の作業である。通常、試料中の関心対象の標的要素（細胞の核、または細胞の膜等）を、その可視化を可能にするために染色するか、または着色する。試料の調製、標的細胞の撮像および特徴付け、ならびに試料の分析後の撮像チャンバーの再生などの、必要な全ての分析段階を行う統合された機器はない。顕微鏡スライドガラスおよびカバーガラスはなおも、その使用が単純であることおよび低コストであるために、試料を適応させるために広く用いられている。多くのラボオンチップ（lab-on-a-chip）技術が、検出器として何らかの形の顕微鏡（明視野または蛍光顕微鏡）と撮像アプローチとを用いているが、小型の撮像チャンバーの周辺ではしばしば統合機器はない。この点において、多くのラボオンチップデバイスはなおも初期段階である。走査型電子顕微鏡（SEM）技術も同様に試料調製の自動化を欠如しており、各々の試料を、個々にピンで留めて分析前に金属によってコーティングする必要がある。ゆえに、顕微鏡の主な欠点は処理量である。試料の調製、試料の焦点平面への配置、および関心対象領域の位置特定はなおも、時間のかかるプロセスである。
【０００５】
細胞の特徴付け（大きさ、形状）および最も具体的には細胞表面上のマーカーの特徴付けは、フローサイトメトリーによっても行うことができる。この技術は、処理量に関する限り大きく改善した。1970年代後半以降、フローサイトメトリーによって、科学者は多様な細胞タイプを分析できるようになり、この技術は他の細胞に基づく技術に対して、以下が含まれる多数の長所を提供した：速さ、細胞生存率および細胞機能の保存、ならびに多数の細胞パラメータの同時測定。
【０００６】
フローサイトメトリーの魅力は、技術の高速性および強力なデータ集積化能と組み合わせた蛍光技術の柔軟性および感度によって生じる。フローサイトメトリーは、現在最も一般的に用いられている方法であり、細胞ソーティングおよび分析の金標準（gold standard）である（Bioinformatics Market Research 2006 Report # 06-030: "influencing brand preference in the flow cytometry market"（非特許文献2））。フローサイトメーターは、細胞分析に対して多くの能力をもたらしたが、それらは高価で技術的に操作が難しい。最も手頃なフローサイトメーターモデルでさえも価格は10万ドルを超え、より洗練されたモデルでは価格は30万ドルを超える。加えて、フローサイトメトリーは、十分に訓練されたオペレーターを必要とし、また、その光学的アラインメントのシフトに対して非常に感受性である。その結果、これらの機器の全体的な購入および操作費用のために、多くの研究所、特に財源に乏しい国に存在する研究所はそれらを得ることができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Robert Hooke（The Cell - A molecular approach; Geoffrey M. Cooper. ASM Press. 1997）
【非特許文献２】Bioinformatics Market Research 2006 Report # 06-030: "influencing brand preference in the flow cytometry market"
【発明の概要】
【０００８】
1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の生物学的検体を固定および検出するための方法を提供する：（a）試料中に存在する可能性がある第一の生物学的検体上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する捕捉物質に連結したコードされた磁気粒子を含む第一の捕捉複合体を得る段階；（b）試料を捕捉複合体に接触させる段階；（c）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；（d）捕捉複合体をチャンバーの表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；および（e）捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された生物学的検体を検出する段階。
【０００９】
もう1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の1つまたは複数の生物学的検体集団を固定および検出するための方法を提供する：（a）第一のコードされた磁気粒子と、試料中に存在する可能性がある第一の生物学的検体集団上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する第一の捕捉物質とを含む第一の捕捉複合体を得る段階；（b）第二のコードされる磁気粒子と、試料中に存在する可能性がある第二の生物学的検体集団上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する第二の捕捉物質とを含む第二の捕捉複合体と得る段階；（c）試料を第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体に接触させる段階；（d）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；（e）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体をチャンバー表面に誘引するために、チャンバーに磁場を適用する段階；ならびに（f）第一の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された第一の生物学的検体集団、および第二の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された第二の生物学的集団を検出する段階。
【００１０】
1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の細胞を固定および検出するための方法を提供する：（a）試料中に存在する可能性がある第一の細胞上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する抗体に連結したコードされた磁気ビーズを含む第一の捕捉複合体を得る段階；（b）試料を捕捉複合体に接触させる段階；（c）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；（d）チャンバーの表面に捕捉複合体を誘引するために、チャンバーに磁場を適用する段階；および（e）捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された細胞を検出する段階。
【００１１】
もう1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の1つまたは複数の細胞集団を固定および検出するための方法を提供する：（a）第一のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第一の細胞集団上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する第一の抗体とを含む第一の捕捉複合体を得る段階；（b）第二のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第二の細胞集団上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する第二の抗体とを含む第二の捕捉複合体を得る段階；（c）試料を、第一の捕捉複合体と第二の捕捉複合体とに接触させる段階；（d）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；（e）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体をチャンバー表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；ならびに（f）第一の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された第一の細胞集団、および第二の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された第二の細胞集団を検出する段階。
【００１２】
試料をチャンバーに導入する前に、または試料をチャンバーに導入した後に、試料を捕捉複合体に接触させてもよい。本発明の一定の局面において、試料を、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第12、第15、またはそれより多い捕捉複合体などの追加の異なる捕捉複合体に接触させてもよい。異なる捕捉複合体の各々は、異なるエピトープに対して特異的親和性を有し、独自にコードされる（たとえば、分光的に別個の）。
【００１３】
一定の態様において、方法はさらに、チャンバーの表面上に固定された生物学的検体（たとえば、細胞）を計数する段階を含む。方法はさらに、生物学的検体の統計学的に有意な数がチャンバーの表面上に固定されたか否かを決定する段階、および生物学的検体の統計学的に有意な数がチャンバーの表面上に固定されるまで、チャンバーに試料の1つまたは複数の追加のアリコートを導入する段階を含んでもよい。一定の局面において、方法はさらに、検出された生物学的検体の数を、試料中の生物学的検体の数に相関させる段階を含む。相関させる段階は、たとえば、試料中の生物学的検体の濃度を決定する段階、および／または試料中の生物学的検体の総数を決定する段階を含んでもよい。2つまたはそれより多い異なる生物学的検体をアッセイする場合、方法は、第一の生物学的検体集団対第二の生物学的検体集団の比率を決定する段階を含んでもよい。方法はさらに、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、またはそれより多くの生物学的検体集団の数、濃度、および／または比率を決定する段階を含んでもよい。
【００１４】
本発明の一定の局面において、コードされた磁気粒子は常磁性または超常磁性である。いくつかの局面において、コードされた磁気粒子は、コードされた磁気ビーズである。ビーズは、たとえば、1つまたは複数の蛍光色素によってコードされてもよい。いくつかの態様において、ビーズは、それらが結合する細胞の大きさとほぼ同じである。一定の態様において、ビーズは直径5〜8μm、6〜8μm、または6〜7μmである。1つの態様において、ビーズは直径約6.7μmである。
【００１５】
いくつかの態様において、方法はさらに、磁場によって固定されていない試料の成分を除去するために、撮像チャンバーにおける生物学的検体の検出および計数の前に洗浄段階を行う段階を含む。洗浄段階は、試料負荷プロセスにおける各々の検出および計数の前に行われてもよく、または最終検出および計数段階の前に限って行われてもよい。
【００１６】
生物学的検体は、関心対象の任意の生物学的標的であってよい。特定の態様において、生物学的標的は細胞である。細胞はたとえば、真核細胞または原核細胞であってよい。真核細胞には、哺乳動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、鳥類細胞、は虫類細胞、昆虫細胞、植物細胞、または真菌細胞が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の一定の局面において、細胞はリンパ球、白血球、または単球である。原核細胞は、たとえば細菌細胞または細菌胞子であってもよい。生物学的標的が細胞である場合、捕捉物質および標識物質によって検出されるエピトープは、好ましくは細胞の表面上のエピトープである。たとえば、生物学的標的がT細胞である場合、エピトープはCD3、CD4、および／またはCD8の1つまたは複数であってもよい。
【００１７】
生物学的標的は試料中に存在してもよい。試料は、細胞を含有する、または細胞を含有することが疑われる任意の組成物であってもよい。本発明の一定の局面において、試料は体液（全血、血清、唾液、尿、精液が含まれるがこれらに限定されるわけではない）であってもよい。本発明の他の局面において、試料は、土壌、水、もしくは空気試料などの環境試料、または周囲で見いだされる他の物質である。
【００１８】
本発明の方法およびシステムは、患者の細菌性敗血症における細菌を検出および同定すること、B細胞およびT細胞の細胞表面における抗原性決定基を同定することによって白血病／リンパ腫の免疫表現型を決定すること；免疫系の細胞成分の変化を検出することによって臓器移植に対する免疫応答をモニターすること；T細胞受容体分析を通して免疫抑制の適切性の尺度を提供するCD34+細胞を検出および計数すること；たとえばマーカーとしてCD42aを用いて血小板を検出および計数すること；PNH（発作性夜間血色素尿症）血液細胞の表面上で欠失しているGPI-接着タンパク質（CD59、CD55）の有無を決定することによるPNH診断が含まれるがこれらに限定されるわけではない、多様な応用において用いられうる。本明細書において記述される方法およびシステムは、血液などの複合試料の分析においていくつかの長所を提供する。たとえば、溶解または遠心による血液試料からの赤血球細胞の枯渇は、撮像チャンバーから非磁性材料を洗浄することによって赤血球を単純に除去できることから、本明細書に記述の方法およびシステムでは不要である。加えて、望ましくない細胞の枯渇を、他のビーズセットによってこれらの細胞を同定することで置き換えることができ、これは本明細書において記述される方法およびシステムの複合能により可能である。その上、この複合化により、その色および形態に基づいて細胞を同定するために多数の染料を用いる必要がなくなる。
【００１９】
捕捉物質は、関心対象の生物学的検体に特異的に結合する天然または合成の、抗体、アプタマー、DNAもしくはRNAなどのしかしこれに限定されない核酸プローブ、タンパク質、または他の任意の分子であってよい。捕捉複合体は、磁気粒子を含むことから磁気応答性である。捕捉複合体の多数の単位を1つの生物学的検体に結合させて、装置の磁場によって誘引可能な磁気応答性の凝集体またはクラスタを作製してもよい。磁気粒子（たとえば、ビーズ）はそれ自身標識される（すなわち、コードされる）ことから、捕捉複合体に結合した生物学的検体を検出および同定するために追加の標識物質は必要ない。検出プロセスには、生物学的検体に結合した捕捉物質の蛍光強度中央値（MFI）を特徴付けるために分類段階が含まれてもよい。本発明の一定の態様において、関心対象細胞は、ビーズの非特異的クラスタ（クラスタ内に細胞は捕捉されていない）から関心対象細胞を取り巻くビーズのクラスタを区別するために、任意の細胞膜（たとえば、グラム染色）または細胞核（たとえば、DAPI）を染色するであろう一般的なレポーター色素によって標識されてもよい。そのような態様において、検出プロセスには、クラスタの蛍光強度中央値（MFI）を特徴付けるための分類段階、および細胞がクラスタ内に存在することを保証するレポーター段階が含まれうる。
【００２０】
もう1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む細菌敗血症患者における細菌を検出および同定するための方法を提供する：（a）細菌敗血症を有することが疑われる患者から試料（たとえば、血液試料）を得る段階；（b）異なる捕捉複合体の各々が、独自にコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある細菌上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する抗体とを含む、異なる複数の捕捉複合体を得る段階；（c）試料を複数の捕捉複合体に接触させる段階；（d）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；（e）捕捉複合体をチャンバーの表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；および（f）捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された細菌を検出する段階。一定の態様において、方法は、細菌を計数および同定する段階をさらに含む。細菌の同一性は、細菌に結合する独自にコードされた磁気ビーズによって決定されうる。1つの態様において、細菌敗血症患者における細菌を検出および同定するための方法はさらに、独自にコードされた磁気ビーズと血小板に対して特異的親和性を有する抗体とを含む捕捉複合体を得る段階、ならびに血小板が検出および同定されうるように、試料をこの捕捉複合体に接触させる段階を含む。試料中の血小板を検出することによって、試料中の細菌の数または濃度を、試料中の血小板の数または濃度と比較することによって、細菌敗血症の程度を決定しうる。一定の態様において、方法は、以下の細菌の1つまたは複数を固定、検出、および同定するために用いられうる：大腸菌（Escherichia coli）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureas）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、および化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）。上記の方法は、細菌性敗血症の状況において記述されているが、関連する体液または組織からの試料を得る段階、および試料中に存在することが疑われる細菌に対して特異的親和性を有する捕捉複合体に試料を接触させる段階によって、他の細菌感染症（たとえば、細菌性髄膜炎）を検出および／または同定するために方法を適合させることもできる。
【００２１】
本発明はまた、本明細書において開示される方法に関連して用いられてもよい様々な成分を提供するキットを提供する。1つの態様において、キットは、1つまたは複数の捕捉複合体を含んでもよい。一定の局面において、キットは、生物学的検体上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する抗体に連結したコードされた磁気ビーズの1つまたは複数の別個の集団を含む。1つの態様において、本発明は、以下の細菌の1つまたは複数に関する捕捉複合体を含む、患者における細菌敗血症を検出するためのキットを提供する：大腸菌、リステリア菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、インフルエンザ菌、緑膿菌、および化膿性連鎖球菌。
【００２２】
1つの態様において、本発明は、免疫原性捕捉を行うおよび生物学的標的を撮像するためのシステムを提供する。一定の局面において、システムは：撮像システム；生物学的標的上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する、撮像システムに導入されるように適合されたコードされた捕捉複合体；捕捉複合体およびそれに結合した任意の生物学的標的を固定するために撮像システムに磁場を選択的に導入するための磁石を含む。
【００２３】
本明細書において記述される任意の方法または組成物は、本明細書において記述される他の任意の方法または組成物に関して実行されうることが企図される。
【００２４】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代用物のみを指すことを明示している場合、または代用物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために用いられるが、開示は、代用物のみと「および／または」を指す定義を支持する。
【００２５】
本明細書を通して、「約」という用語は、値を決定するために使用されるデバイスまたは方法に関する誤差の標準偏差が値に含まれることを示すために用いられる。
【００２６】
積年の特許法に従い、特許請求の範囲または明細書における「含む」という言葉と共に用いる場合の「1つの（a）」および「1つの（an）」という用語は、具体的に記している場合を除き、1つまたは複数を指す。
【００２７】
本発明の他の目的、特色、および長所は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な例は、本発明の具体的態様を示しているが、様々な変化および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうし、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれることから、例証目的のために与えられると理解されるべきである。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
以下の段階を含む、試料中の細胞を固定および検出するための方法：
（a）試料中に存在する可能性がある第一の細胞上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する抗体に連結されたコードされた磁気ビーズを含む第一の捕捉複合体を得る段階；
（b）試料を捕捉複合体に接触させる段階；
（c）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；
（d）捕捉複合体をチャンバーの表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；および
（e）捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定された細胞を検出する段階。
［２］
チャンバーの表面上で固定された細胞を計数する段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［３］
統計学的に有意な数の細胞がチャンバーの表面上に固定されているか否かを決定する段階、および統計学的に有意な数の細胞がチャンバーの表面上に固定されるまで、試料の1つまたは複数の追加のアリコートをチャンバーに導入する段階、をさらに含む、［2］記載の方法。
［４］
試料中の細胞濃度を決定する段階をさらに含む、［3］記載の方法。
［５］
試料が体液である、［1］記載の方法。
［６］
試料が環境試料である、［1］記載の方法。
［７］
細胞がリンパ球、白血球、または単球である、［1］記載の方法。
［８］
細胞が細菌細胞、胞子、または真菌細胞である、［1］記載の方法。
［９］
試料をチャンバーに導入する前に、試料を捕捉複合体に接触させる、［1］記載の方法。
［１０］
試料をチャンバーに導入した後に、試料を捕捉複合体に接触させる、［1］記載の方法。
［１１］
コードされた磁気ビーズが1つまたは複数の蛍光色素によってコードされる、［1］記載の方法。
［１２］
第二の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズが、第一の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズとは分光的に異なり、さらに第二の捕捉複合体の抗体が、第一の細胞とは異なる第二の細胞上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する、抗体に連結されたコードされた磁気ビーズを含む第二の捕捉複合体に試料を接触させる段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１３］
第二の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズが、第一の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズとは分光的に異なり、さらに第二の捕捉複合体の抗体が、第一の細胞上の第二のエピトープに対して特異的親和性を有する、抗体に連結されたコードされた磁気ビーズを含む第二の捕捉複合体に試料を接触させる段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１４］
細胞膜を染色する一般的なレポーター色素または細胞核を染色する一般的なレポーター色素によって細胞を染色する段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１５］
細胞を検出する段階が、コードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために分類画像を撮影する段階、および細胞を染色する一般的なレポーター色素からのシグナルを検出するためにレポーター画像を撮影する段階を含む、［14］記載の方法。
［１６］
以下の段階を含む、試料中の1つまたは複数の細胞集団を固定および検出するための方法：
（a）第一のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第一の細胞集団上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する第一の抗体とを含む第一の捕捉複合体を得る段階；
（b）第二のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第二の細胞集団上の特定のエピトープに対して特異的親和性を有する第二の抗体とを含む第二の捕捉複合体を得る段階；
（c）試料を第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体に接触させる段階；
（d）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；
（e）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体をチャンバーの表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；ならびに
（f）第一の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定される第一の細胞集団、および第二の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定される第二の細胞集団を検出する段階。
［１７］
第一および第二の細胞集団を計数する段階をさらに含む、［16］記載の方法。
［１８］
統計学的に有意な数の第一および第二の細胞集団がチャンバーの表面上に固定されているか否かを決定する段階、ならびに統計学的に有意な数の第一および第二の細胞集団がチャンバーの表面上に固定されるまでチャンバーに試料の1つまたは複数の追加のアリコートを導入する段階をさらに含む、［17］記載の方法。
［１９］
第一の細胞集団の第二の細胞集団に対する比率を決定する段階をさらに含む、［18］記載の方法。
［２０］
試料中の第一の細胞集団の濃度を決定する段階をさらに含む、［18］記載の方法。
［２１］
試料中の第二の細胞集団の濃度を決定する段階をさらに含む、［18］記載の方法。
［２２］
試料中の第一および第二の細胞集団の双方の濃度を決定する段階をさらに含む、［18］記載の方法。
［２３］
細胞膜を染色する一般的なレポーター色素または細胞核を染色する一般的なレポーター色素によって細胞集団を染色する段階をさらに含む、［16］記載の方法。
［２４］
細胞集団を検出する段階が、第一の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために第一の分類画像を撮影する段階、第二の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために第二の分類画像を撮影する段階、および細胞集団を染色する一般的なレポーター色素からのシグナルを検出するためにレポーター画像を撮影する段階を含む、［23］記載の方法。
［２５］
以下の段階を含む、試料中の1つまたは複数の細胞集団を固定および検出するための方法：
（a）第一のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第一の細胞集団上の第一のエピトープに対して特異的親和性を有する第一の抗体とを含む第一の捕捉複合体を得る段階；
（b）第二のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第一の細胞集団上の第二のエピトープに対して特異的親和性を有する第二の抗体とを含む第二の捕捉複合体を得る段階；
（c）試料を第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体に接触させる段階；
（d）試料のアリコートをチャンバーに導入する段階；
（e）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体をチャンバーの表面に誘引するためにチャンバーに磁場を適用する段階；ならびに
（f）第一の捕捉複合体および第二の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定される第一の細胞集団を検出する段階。
［２６］
第一の細胞集団を計数する段階をさらに含む、［25］記載の方法。
［２７］
統計学的に有意な数の第一の細胞集団がチャンバーの表面上に固定されているか否かを決定する段階、ならびに統計学的に有意な数の第一および第二の細胞集団がチャンバーの表面上に固定されるまで、試料の1つまたは複数の追加のアリコートをチャンバーに導入する段階をさらに含む、［26］記載の方法。
［２８］
第三のコードされた磁気ビーズと、試料中に存在する可能性がある第二の細胞集団における第三のエピトープに対して特異的親和性を有する第三の抗体とを含む第三の捕捉複合体を試料に接触させる段階、ならびに第三の捕捉複合体に結合することによってチャンバーの表面上に固定される第二の細胞集団を検出および計数する段階をさらに含む、［25］記載の方法。
［２９］
第一の細胞集団の第二の細胞集団に対する比率を決定する段階をさらに含む、［28］記載の方法。
［３０］
試料中の第一の細胞集団の濃度を決定する段階をさらに含む、［27］記載の方法。
［３１］
試料中の第二の細胞集団の濃度を決定する段階をさらに含む、［28］記載の方法。
［３２］
細胞膜を染色する一般的なレポーター色素または細胞核を染色する一般的なレポーター色素によって細胞集団を染色する段階をさらに含む、［25］記載の方法。
［３３］
細胞集団を検出する段階が、第一の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために第一の分類画像を撮影する段階、第二の捕捉複合体のコードされた磁気ビーズからのシグナルを検出するために第二の分類画像を撮影する段階、および細胞集団を染色する一般的なレポーター色素からのシグナルを検出するためにレポーター画像を撮影する段階を含む、［32］記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の一定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される具体的態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【図１】多数の異なる細胞集団を含有する試料の例証を示す。異なる細胞集団を、白色の細胞、黒色の細胞、縞模様の細胞、およびチェックの細胞として示す。
【図２】異なる4つの細胞集団を標的とする4つのビーズセット（ビーズセットA（白色）、B（黒色）、C（チェック）、およびD（縞模様））を例証する。標的細胞が存在する場合、標的細胞と、標的細胞に結合するビーズとのあいだで複合体が形成される。一部のビーズは単独または非特異的クラスタのままでありうる。
【図３】細胞を含有しない非特異的ビーズクラスタと、細胞が含まれる特異的ビーズ複合体との区別を助けるために、細胞が一般的に染色される（たとえば、核染色）（ダッシュをつけた細胞）態様を例証する。
【図４】図4Aは、特異的クラスタ（細胞＋ビーズ）のみならず、非特異的ビーズクラスタおよび単独のビーズが存在する撮像チャンバーの視野を例証する。特異的クラスタを図4Aにおいて丸で囲む。図4Bは、各クラスタの蛍光強度の中央値（MFI）を用いて生成されうる分類マップを示す。マップの各領域は、ビーズセットに対して特異的であり、標的細胞の表面マーカーに対応する。
【図５Ａ】液体取り扱いシステムのブロックダイアグラムを示す。
【図５Ｂ】液体取り扱いシステムのブロックダイアグラムを示す。
【図５Ｃ】液体取り扱いシステムのブロックダイアグラムを示す。
【図６】撮像デバイスの光学的構成のブロックダイアグラムを示す。
【図７】撮像システムのブロックダイアグラムを示す。
【図８】撮像システムのブロックダイアグラムを示す。
【図９】撮像システムのブロックダイアグラムを示す。
【図１０】撮像システムの側面図を例証する概略図である。
【図１１】1時間および5時間インキュベーション後の標的ビーズおよび陰性対照の捕捉効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
例証となる態様の説明
本発明は、捕捉物質が標識物質としても役立ちうる、生物学的細胞、または試料中に存在する関心対象の他の生物学的検体を、標識、単離、検出、および計数するための方法およびシステムに関する。方法は、本明細書において記述されるシステムなどの撮像システムにおいて、および参照により本明細書に組み入れられる、"Systems and methods for performing measurements of one or more materials,"と題する米国特許出願第11/757,841号において記述される装置において実行されてもよい。本発明の方法およびシステムはまた、標的細胞、細菌、または胞子を計数する必要はないが、検体の有無のみが重要である定性的検出のためにも用いることができる。
【００３０】
試料混合物における他の成分からの関心対象の標的生物学的細胞の単離は、関心対象細胞の表面上の特定のタンパク質に対して特異的親和性を有する抗体に連結した磁気ミクロスフェアが細胞に結合する、免疫磁気分離によって行われる。この結合段階は、装置の磁場によって誘引される磁気応答性の凝集体を作製する。試料を撮像チャンバーに導入すると、凝集体は、磁場の存在によりチャンバー内で保持されるが、試料の残りは洗い流される。
【００３１】
捕捉磁気ミクロスフェアを、Chandler et al.（そのいずれも参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,773,812号、および米国特許出願第11/335,139号）によって記述される内部蛍光色素などによってコードして、このようにして多数の異なる（たとえば、分光的に異なる）ミクロスフェアのセットを作製する。捕捉粒子はまた、他の磁気応答性ナノ粒子、磁鉄鉱を含有するポリスチレンビーズ、磁鉄鉱を含有するラテックスビーズ、および当業者に公知の任意の他の磁気応答性粒子であってよい。捕捉粒子の大きさは、たとえば10ナノメートルから100マイクロメートルまでの範囲であってもよい。磁気粒子の異なるようにコードされたセットを用いることによって、区別可能な凝集体を作製することができ、同じ試料内の異なる細胞または生物学的検体の複合検出を行うことができる。図1および2において例証されるように、たとえば試料中の多数の異なる細胞集団を、異なる細胞集団を標的とするビーズセットを用いて捕捉してもよい。複合体は、標的細胞と、標的細胞に結合するビーズとのあいだで形成される（たとえば、図2を参照されたい）。ビーズの分類は、標的細胞を同定するために役立ち、異なる種類の複合体のセンサスは、異なる標的細胞を計数するために役立つ（たとえば、図4Aおよび4Bを参照されたい）。驚くべきことに、分解能（resolution）は、同じ細胞に結合した非常に多数の個々のビーズを識別できるほどである。たとえば、2、3、または4種類の異なるように標識されたビーズを用いて1つの細胞の表面上の2、3、または4種類の異なる抗原を標識することができるであろう。これは、アッセイの複合能を大きく増加させる。その上、従来の方法では必要であった、分析前の試料から望ましくない細胞を枯渇させるという時間のかかるプロセスを不要にすることができる。磁場を除去すると、撮像チャンバーの完全な洗浄および再生が可能である。磁場は、たとえばチャンバーから磁石を移動させることによって、または磁石が電磁石である場合には、磁石のスイッチを切ることによって、チャンバーから除去されうる。
【００３２】
関心対象の細胞を取り巻くビーズのクラスタを、非特異的ビーズクラスタ（クラスタ内に細胞は捕捉されていない）と区別するために、任意の細胞膜（たとえば、グラム染色）または細胞核（たとえば、DAPI）を染色するであろう一般的なレポーター色素を用いることを、方法に含めることができる（たとえば、図3を参照されたい）。この態様において、検出プロセスには、クラスタの蛍光強度中央値（MFI）を特徴付けする分類段階、および細胞がクラスタ内に存在することを保証するためのレポーター段階が含まれるであろう。
【００３３】
標的生物学的検体に関する磁気ミクロスフェアの特異的親和性は、ミクロスフェアの表面上に連結された抗体などの反応性部分による。用いられてもよい他の特異的親和性物質には、当業者に公知であり、関心対象の標的検体に対して特異的に結合する、天然または合成の、アプタマー、DNAもしくはRNAなどの核酸プローブ、タンパク質、または他の任意の分子が含まれる。
【００３４】
ビーズを試料に非常に高濃度で添加すると、および／またはビーズを試料と共に非常に長い期間インキュベートすると、各細胞に結合するビーズの数が、各々の個々のビーズを識別するには高くなりすぎる可能性がある。細胞が2つまたはそれより多くの異なるように標識されたビーズに結合する場合、個々のビーズが検出されるまで、ビーズの濃度を低減させるおよび／またはインキュベーション時間を低減させることなどによって、アッセイ条件を調節すべきである。一方、各細胞タイプが唯一のビーズタイプによって結合されるようにアッセイを設定する場合は、捕捉されたクラスタを凝集体として分析することができることから、各ビーズを特異的に同定できる能力は必要ない。これらの捕捉されたクラスタは全て同一ではなく、細胞（または細菌もしくは胞子）周囲に異なる数のビーズを含むことから、クラスタの各集団のMFIに関するCVが非常に大きくなり、分類マップにおいて広い領域を必要とする可能性がある。同定され、撮像され、および特徴付けされる物体は細胞そのものではなく、そのかわりに、それらは細胞周囲に多数のコードされたビーズを含むクラスタである。形成されたクラスタは、その蛍光シグナチャーに従って同定されうる。分類モードの2つの例は、Luminex xMAP分類マップアプローチ（2色および多数の強度に基づく分類）および多色分類アプローチ（色のみに基づく分類）である。Luminex xMAP分類マップアプローチの場合、標的細胞周囲でクラスタを形成するために用いられる磁気ビーズは、Luminex MagPlexビーズでありうる。個々のビーズは、2つの色素の異なる比率を用いてコードされ、既存のLuminex xMAPにおいて分類可能である。1種類のビーズによって形成されたクラスタはなおも、クラスタを形成するビーズの数に応じて広範囲の蛍光強度を発現する可能性がある。たとえば、ビーズ6個で形成されたクラスタは、低い蛍光強度を示す可能性があるが、ビーズ10〜15個で形成されたクラスタは、かなり高い蛍光を示す可能性がある。ゆえに、1種類のみのビーズで作出されたクラスタに関して、可能性がある蛍光強度の範囲はかなり大きいであろう。
【００３５】
クラスタの2つの蛍光検出チャンネルへの分類は、各々の軸が検出チャンネルを表す、二次元マップによって例証されうる。各々のクラスタは、2つの検出チャンネルの各々において蛍光を発し、定義された蛍光強度を有するであろう。各々のクラスタに関して可能性がある強度の範囲は、マップにおける領域を定義するであろう。このアプローチの複合能は、各々の領域が異なるクラスタの代表である、マップ内の別個の領域を定義できることにある。
【００３６】
多色分類アプローチの場合、ビーズは、色（分光特徴）のみによって区別され、強度によって区別されない。そうすれば複合性レベルは、ハードウェアによって達成可能な検出チャンネル数によって定義されるであろう。このアプローチは、異なる種類のビーズを含むクラスタの同定を可能にするであろう。各々の色（または検出チャンネル）は、次元を表すであろう。クラスタ（または標的細胞）は、各々の検出チャンネルにおけるその蛍光（またはその欠如）に従って同定（特徴付け）されるであろう。このアプローチにおいて、多次元（n＞3）特徴付けスキームのために、定義された2次元領域（マップ）へのクラスタの分類は可能ではない。クラスタは単純に、各チャンネルにおけるその応答（陽性もしくは陰性、1もしくは0等などのバイナリ応答）に従って分類されるであろう。
【００３７】
異なる大きさの細胞、胞子、または細菌を検出するために、撮像機器の倍率を改変して最適化することができる：検体がより大きくなれば、必要な倍率はより小さくなる。標的の検出に関する制限因子は、全体的な光路の分解能である。ビーズクラスタは典型的に個々のビーズより少なくとも3倍大きい大きさを有することから、ビーズを個々に撮像するために設計されたシステムと比較して、撮像システムの倍率を低減することができるであろう。倍率の低減は、より大きい視野、より大きい測定試料、ゆえにより正確な計数結果を可能にするであろう。1つの細胞上の多数の検体が、異なるように標識されたビーズによって標的化される場合、ビーズを個々に撮像するように設計されたシステムが好ましい。
【００３８】
試料中の細胞の濃度は、撮像チャンバーの視野におけるクラスタ数、装置に負荷された試料の全容積、視野の面積対撮像チャンバーの総面積の比率、および捕捉効率から計算されうる。クラスタが撮像チャンバーに負荷されると、それらは磁場の存在により捕捉されるであろう。具体的応用の場合、システムおよび方法は、クラスタに関する装置の捕捉効率が分かるように特徴付けされるべきである。加えて、撮像チャンバーも、撮像される視野がチャンバーの総表面積のうちの公知のサブセットを表すように十分に特徴付けされるべきである。画像処理アルゴリズムが、視野内のクラスタの計数を可能にして、導入された試料の容積にこの数を相関させるであろう。濃度は、試料の容積およびクラスタのセンサスに基づいて計算される。
【００３９】
チャンバーに負荷された試料の総容積は、たとえば正確なシリンジポンプを用いて、試料を試料ループの中に引き入れ、メインドライブ液体ラインに注入することにより知ることができる。この二重ラインのアプローチにより、試料の導入を遅らせるためだけではなく、試料の粘度を低下させ、捕捉効率を改善するための、試料のリアルタイム希釈が可能となる。ドライブ液は、試料を希釈することができる緩衝液中に存在する。ドライブ液は、洗浄緩衝液と同じ緩衝液でありうる。試料ラインをメインドライブ液体ラインと融合させることによって、ドライブ液は、試料を有効に希釈してそれを撮像チャンバーに運ぶであろう。試料をメインドライブ液ラインに融合させる速度を改変することによって、異なる希釈倍率が得られるであろう。これによって、試料の異なる容積、特に少量の効率的な負荷が可能となる。捕捉効率は、チャンバーに負荷された総数からチャンバーにおいて捕捉された細胞の百分率を表す。以下が含まれる、捕捉効率に影響を及ぼすいくつかの要因が存在する：関心対象細胞の表面上で利用可能な受容体（またはマーカー）の数；利用可能な受容体の数に関連する関心対象細胞周囲の磁気ビーズの数；特異的受容体に対する抗体の親和性、さらに、インキュベーション時間、試薬の濃度等；磁場の強度；チャンバーの大きさおよび深さ；試料の粘度；ならびにチャンバーの中を移動する試料の速度。捕捉効率に関連して2つの独立した目標が存在する：最大化と特徴付け。
【００４０】
本明細書において用いられるように、「捕捉効率」は、比として定義される：検出された細胞数／負荷された実際の細胞数。捕捉効率を最大限にすることによって、より小さい試料サイズを用いることができるであろう。このことは、目的が試料内の濃度を定量することではなくて、一定の細胞、細菌、または胞子の有無を検出することである定性的アッセイの検出限界（環境試料中の炭疽菌胞子の検出など）を低下させるであろう。試料をより小さい撮像チャンバーの中に通すことによって、視野において関心対象検体を有する確率は増加し、ゆえに検出限界が改善する。捕捉効率に影響を及ぼす他の要因には、クラスタを形成するために用いられる磁気ビーズの大きさが含まれる。大きいビーズは、より多くの磁鉄鉱を含有するが、撮像表面に向かって移動する際により強い剪断力を受けるであろう。より小さいビーズはより少ない磁鉄鉱を含有するが、立体妨害がより少ないために細胞周囲のビーズはより多くなり、これらのビーズのより効率的なパッキングを可能にするであろう。これによって細胞周囲の磁鉄鉱はより多くなり、より密集したクラスタが得られる。
【００４１】
定量的アッセイの場合、測定の出力には、試料中の細胞濃度が含まれるであろう。この場合において、捕捉効率は、検出された細胞数を試料中の実際の細胞数に相関させることができるように、特徴付けされて一貫している必要がある。細胞の捕捉効率は、公知の量の細胞を有する標準的な試料を用いる段階、試料を撮像チャンバーに負荷する段階、およびどれほど多くの細胞が検出されうるかを測定する段階によって、特徴付けおよび測定されうる。次に、検出された細胞数を実際の細胞数と比較して捕捉効率を計算することができる。「付加容積」の従来の分析法に基づく代わりの方法は、試料のアリコートを作る段階、および任意の試料処理段階の前に、各々の分割試料（sub-sample）に公知の量の標準溶液を添加する段階を伴う。各々の分割試料の測定によって標準曲線を作製することができ、それには、その内因性パラメータでの捕捉効率（および試料処理プロトコールまたは試料マトリクスからの他の任意の変動）が含まれるであろう。標準曲線を、標準溶液を添加していない試料に対して外挿すると、試料中の細胞濃度に対するアクセスが得られるであろう。この方法は、たとえ全試料が負荷されても、統計学的に有意となるほどには十分な数の細胞が捕捉されないほど、細胞濃度が低い試料に関して特に重要であろう。公知の量の細胞を添加して標準曲線を作製することによって、この方法は、より従来の方法によって定義される閾値より低い濃度の測定を可能にする。
【００４２】
撮像チャンバーはまた、生物学的標的を効率よく捕捉する能力に影響を及ぼし、その設計を特異的応用に合わせて調整することができる。総試料サイズが最小であって、捕捉される生物学的標的の潜在数も同様に低い応用の場合、最小寸法の撮像チャンバーを用いることによって、捕捉効率を増加させることができる。チャンバーの幅および長さが小さいことは、捕捉された生物学的標的が、より小さい撮像表面に分散されて、これが視野内の細胞密度を増加させることを意味する。加えて、チャンバーの深さが浅いことは、磁力のより低い勾配に生物学的標的を供して、試料全体を磁石により近く維持するであろう。生物学的標的が磁石により近づけば、磁場の誘引力はより大きくなり、捕捉効率はより高くなるであろう。このように、最小寸法の撮像チャンバーは、視野における生物学的標的の密度を最大限にする大きさのチャンバーであり、チャンバー中の試料を磁場の最も強い誘引力に供するが、捕捉された生物学的標的をチャンバーに収容できないほど小さい寸法を有しない。たとえば、クラスタ（たとえば、細胞プラスビーズ）が直径20 nmくらいであると予想される場合、最小寸法の撮像チャンバーは、深さ約50〜100 nmを有するであろう（深さは、磁石に対して垂直であるチャンバーの寸法を指す）。加えて、そのようなチャンバーの幅は少なくとも約50 nmであろう。試料の大きさが非常に大きくありえて、定性的反応で十分である応用の場合、同じ時間枠内でより多くの試料を処理するために、試料導入速度を増加させる必要なく、より大きい寸法を有する撮像チャンバーを設計することができる。たとえば、深さおよび幅が約400 nm×400 nmの撮像チャンバーを用いてもよい。
【００４３】
画像処理アルゴリズムは、視野の生の画像を生物学的標的数に変換する。視野における各蛍光目標は、バックグラウンドシグナルに対して同定されるであろう。次に、各目標を、大きさ（ピクセル数の幅およびピクセル数の長さ）、丸さ（目標の周囲の平方を（4×Pi×目標の面積）で除した比として定義）、および／または必要と思われる関心対象の他の測定（直径、面積、半径等）に関して特徴付けしてもよい。このアプローチによって、無作為な大きさおよび形状の非特異的蛍光目標は、全計数から除外される可能性がある。残っている目標は全て生物学的標的数に含まれる。
【００４４】
最初の検出および計数プロセスを行った後、試料中の細胞の最終濃度を計算する前に、反復プロセスを開始してもよい。このようにして、計数された細胞数は、統計学的に有意であると見なされる一定の閾値より上であってもよい。正規分布統計分析は、細胞30個より上の試料サイズについて行われうることから、下限閾値30がしばしば用いられる。しかし、画像処理および測定誤差の影響を最小限にするために、細胞35、40、45、または50個などの他の下限閾値を用いることができる。上限として、閾値は、細胞100、200、300、400、500、または1000個などの生物学的標的の予め決められた数によって定義されうる。閾値はまた、視野に存在するダブレットの数に従って定義されうる：視野における生物学的標的の数が増加すると、重なり合う2つの生物学的標的を有する確率は増加して、ダブレットが突然より多く存在する。ダブレット集団が、負荷された細胞サイズにもはや比例しない場合、上限閾値に達したと定義されうる。
【００４５】
生物学的標的数が低い閾値より下である場合、画像処理アルゴリズムは、追加の試料の負荷を命令するであろう。次に、アルゴリズムは、計数段階を再度再開するであろう。この反復プロセスは、視野における生物学的標的の数が、上限閾値を超えないが既定の下限閾値に達するまで起こるであろう。または、計数と計数のあいだで撮像チャンバーを完全に洗浄して、個別の計数からの数を保存し、最小閾値に達するまで加算することができる。上限閾値を超える場合、磁場を撮像チャンバーから除去してもよく、撮像チャンバーを清浄にして（たとえば、バイパスラインの中におよびチャンバーの中にドライブ／洗浄液を押し出すことによって）、試料のより小さいアリコートを撮像チャンバーに負荷してもよい。最後の計数段階は、細胞濃度のさらなる計算の基礎として役立つであろう。
【００４６】
生物学的標的の多数の集団および／または亜集団を同時に分析する場合、先の段落において記述された計算を、用いる各々の検出チャンネルに関して、およびコードされる粒子の各集団に関して繰り返す。各計算において、生物学的標的の捕捉効率は同じまたは異なってもよい。いずれの場合においても一重モードの場合と同様に、捕捉効率は、試料中の生物学的標的の濃度の計算を可能にするために特徴付けされる必要がある。
【００４７】
A．撮像システム
図5〜10は、本明細書において記述される方法が行われてもよい様々な装置の例証である。図面は縮尺どおりに描かれていないことに注意されたい。特に、図面の要素のいくつかの縮尺は、要素の特徴を強調するために誇張されている。同様に構成される可能性がある1つより多い図面に示される要素は、同じ参照番号を用いて示されている。これらの装置の説明は、例証のために限られ、本発明を実施する全般的様式を当業者に教示する目的のためであることにさらに注意されたい。さらなる改変および代替的態様が、この説明を考慮して当業者に明らかとなるであろう。
【００４８】
図5A〜Cおよび6において例証される態様は、一般的に1つまたは複数の貯蔵容器から測定デバイスの撮像容積に1つまたは複数の材料を移すように構成されたシステムに関する。システムは3つの主要な成分を有する：液体取り扱い、光学的構成、および粒子固定サブシステム。図5A〜Cは、3つの構成における液体取り扱いサブシステムの機能的成分を示し、図6は、光学的サブシステムの機能的成分を例証する。
【００４９】
図5A〜Cの液体取り扱いサブシステムにおいて、試料は、試料貯蔵容器12から測定デバイスの撮像容積10に移される。撮像容積は、撮像チャンバー10として構成されてもよく、これは当技術分野において公知の任意の適した構成を有してもよい。貯蔵容器12は、Vacutainer、遠心管、注入用シリンジ、マイクロタイタープレート、または当技術分野において公知の任意の他の適した試料容器として構成されてもよい。
【００５０】
システムにはまた、液体を貯蔵リザーバーに引き抜いて、後に貯蔵リザーバーから液体をチャンバー10の撮像容積に押し出すように構成された双方向ポンプ14が含まれる。ポンプ14は、当技術分野において公知の任意の適した構成を有してもよい。ビーズ／生物学的標的クラスタは、本明細書においてさらに記述されるように、曝露時間の際に実質的に固定されることから、高価なシリンジポンプから得られるような無脈流（pulse-free flow）は必要ではない。ポンプ14と試料バルブ18のあいだのチューブ16の長さから、十分なリザーバーが形成されうる。そのようなリザーバーは一般的に、「試料ループ」と呼ばれる、チューブは、任意の適した構成を有してもよい。試料バルブ18の機能は、試料貯蔵容器12から吸引する際には試料プローブ15をリザーバー（試料ループ16）に接続し、分配する際にはリザーバーを撮像チャンバー10に接続することである。試料バルブ18には、当技術分野において公知の任意の適したバルブが含まれうる。
【００５１】
ポンプバルブ20は貯蔵リザーバー（試料ループ16）のポンプ端部で利用される。図5Aにおいて、ポンプバルブ20は、ドライブ溶液貯蔵容器および洗浄溶液貯蔵容器に接続される。この構成は、異なる組成のドライブ溶液および洗浄溶液が望ましい場合に用いることができる。しかし、ドライブ溶液と洗浄溶液として同じ溶液を用いてもよく、この場合、1つの貯蔵容器を用いてもよい。図5Bおよび5Cは、ドライブ／洗浄溶液貯蔵容器に接続されたポンプバルブ20を示す。図5Cは、試料の一部を導入後に撮像チャンバー10の洗浄を可能にするバイパスライン17を示し、試料の残りが貯蔵される試料ループ16を用いる必要がない。このようにバイパスラインは、異なる試料濃度を収容するため、および方法のダイナミックレンジを拡大するために、試料ループ16における同じ試料からの小さいアリコートの連続的負荷を可能にする。バイパスライン17がなければ、撮像チャンバー10における洗浄および次の追加の試料の負荷は、試料ループ16の完全な洗い流しを伴い、その後試料ループ16に再負荷するために試料貯蔵容器12からの試料のさらなる採取を伴う−このアプローチは機能的であるが、バイパスラインを用いる場合と比較すると、効率が悪く、より多くの試料を浪費する。ポンプバルブ20には、当技術分野において公知の任意の適したバルブが含まれうる。代替的態様において、ポンプおよび洗浄バルブは、単一のバルブに組み合わせられてもよい。ポンプ14はまた、撮像チャンバー10における1つまたは複数の材料および他の任意の液体を廃棄容器24に移すように構成されてもよい。廃棄容器24は、当技術分野において公知の任意の適した構成を有してよい。
【００５２】
撮像チャンバー10に試料を負荷するために、図5A〜Cにおいて例証した液体取り扱いサブシステムを操作する主な3つの様式、すなわち試料洗浄を伴う負荷技法、試料洗浄を伴わない負荷技法、および反復負荷技法が存在する。図5Aにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、試料の洗浄を行わない負荷技法は一般的に以下のように起こる。
【００５３】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3に移動させる。
5）磁石262を撮像チャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバー10を清浄するためにドライブ溶液をチャンバーの中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００５４】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15を試料貯蔵容器12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブ18の位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262を撮像チャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉する撮像チャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
【００５５】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262を撮像チャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００５６】
図5Aにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、試料の洗浄を伴う負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００５７】
洗浄溶液の前負荷：
1）ポンプバルブ20を位置bにする。
2）洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）洗浄溶液をチャンバーの中に押し出す。
6）試料バルブ18を位置1から2にする。
7）洗浄溶液をプローブ15（洗浄溶液を予め負荷した試料ループ16およびプローブ15）の中に押し出す。
【００５８】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15をウェル12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブ18の位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262をチャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉するチャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体を「洗浄」するために、捕捉複合体の上で試料の背後の試料ループ16の中に洗浄溶液を押し出す。
12）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
【００５９】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００６０】
図5Aにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、反復負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００６１】
洗浄溶液の前負荷：
1）ポンプバルブ20を位置bにする。
2）洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）洗浄溶液をチャンバーの中に押し出す。
6）試料バルブ18を位置1から2にする。
7）洗浄溶液をプローブ15（洗浄溶液を予め負荷した試料ループ16およびプローブ15）の中に押し出す。
【００６２】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15をウェル12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブ18の位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262をチャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉するチャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体を「洗浄」するために、捕捉複合体の上で試料の背後の試料ループ16の中に洗浄溶液を押し出す。
12）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
13）画像分析アルゴリズムを用いて画像を分析して、さらなる試料を負荷する必要があるか否かを決定する。さらなる試料を負荷する必要がある場合、負荷の順序を段階1から再開する。さらなる試料が必要でない場合、次に「システムの清浄」の順序に進む。
【００６３】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００６４】
図5Bにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、試料の洗浄を行わない負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262を撮像チャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバー10を清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバーの中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００６５】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15を試料貯蔵容器12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブ18の位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262を撮像チャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉する撮像チャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
【００６６】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262を撮像チャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを洗浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００６７】
図5Bにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、試料の洗浄を伴う負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００６８】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15をウェル12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブの位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262をチャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉するチャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体を「洗浄する」ために、捕捉複合体の上の試料の背後の試料ループ16の中にドライブ／洗浄溶液を押し出す。
12）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
【００６９】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７０】
図5Bにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、反復負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７１】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15をウェル12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブの位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262をチャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉するチャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体を「洗浄する」ために、捕捉複合体の上の試料の背後の試料ループ16の中にドライブ／洗浄溶液を押し出す。
12）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
13）画像分析アルゴリズムを用いて画像を分析して、さらなる試料を負荷する必要があるか否かを決定する。さらなる試料を負荷する必要がある場合、負荷の順序を段階1から再開する。さらなる試料が必要でない場合、次に「システムの清浄」の順序に進む。
【００７２】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７３】
図5Cにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、試料の洗浄を伴わない負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262を撮像チャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバー10を清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバーの中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７４】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15を試料貯蔵容器12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブ18の位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262を撮像チャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉する撮像チャンバー10に押し出す。
11）捕捉複合体が固定されている画像を撮影する。
【００７５】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262を撮像チャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７６】
図5Cにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、試料の洗浄を伴う負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７７】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15をウェル12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブの位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262をチャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉するチャンバー10に押し出す。
11）ポンプバルブ20を位置aにする。
12）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
13）ポンプバルブ20を位置bにする。
14）捕捉複合体を「洗浄する」ために、撮像チャンバー10における捕捉複合体の上で、ドライブ／洗浄溶液をバイパスライン17の中に押し出す。
15）捕捉複合体が固定された画像を撮影する。
【００７８】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００７９】
図5Cにおいて示される液体取り扱いサブシステムにおいて、反復負荷技法は一般的に以下のように起こる：
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００８０】
試料の負荷：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から2にする。
5）プローブ15をウェル12の中に低下させる。
6）試料を試料ループ16に負荷する。
7）空気が試料バルブの位置になるまで、および試料全体が試料ループ16の中に入るまでプローブ15を上昇させて引っ張る。
8）試料バルブ18を位置1から3にする。
9）磁石262をチャンバー10に向かって移動させる。
10）試料ループ16から試料を、磁気捕捉物質、任意の生物学的標的、およびそれらに会合する検出物質（捕捉複合体）を捕捉するチャンバー10に押し出す。
11）ポンプバルブ20を位置aにする。
12）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
13）ポンプバルブ20を位置bにする。
14）捕捉複合体を「洗浄する」ために、撮像チャンバー10における捕捉複合体の上で、ドライブ／洗浄溶液をバイパスライン17の中に押し出す。
15）捕捉複合体が固定された画像を撮影する。
16）画像分析アルゴリズムを用いて画像を分析して、さらなる試料を負荷する必要があるか否かを決定する。チャンバー10にさらなる試料を負荷する必要がある場合、追加の試料がなおも試料ループ16内に含有される場合には段階10で、または追加の試料を試料ループ16に最初に負荷する必要がある場合には段階1で、負荷順序を再開する。チャンバー10にさらなる試料が必要でない場合、次に「システムの清浄」の順序に進む。
【００８１】
システムの清浄：
1）ポンプバルブ20を位置aにする。
2）ドライブ／洗浄溶液を負荷する。
3）ポンプバルブ20を位置cにする。
4）試料バルブ18を位置1から3にする。
5）磁石262をチャンバー10から離れるように移動させる。
6）チャンバーを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をチャンバー10の中に押し出す。
7）試料バルブ18を位置1から2にする。
8）プローブを清浄するためにドライブ／洗浄溶液をプローブ15の中に押し出す。
【００８２】
試料が「洗浄される」第二および第三の負荷技法を用いる長所は、磁場によって固定されていない試料中の成分を周囲の溶液から除去することである。処理を簡便にするために、いくつかのアッセイは洗浄段階を行わない。
【００８３】
光学サブシステム8を図6においておおまかに例証する。サブシステム8には、システムの光学とは反対の撮像チャンバー10側に配置された磁気要素262が含まれる。磁気要素262には、適した磁場を生成するために用いることができる永久磁石または電磁石などの当技術分野において公知の任意の適した磁気要素が含まれうる。このようにして、磁気粒子に結合した生物学的標的が、チャンバー側で磁気要素262によって生成された磁場を用いて撮像チャンバー10において実質的に固定されうる。磁気要素262は、図6において撮像チャンバー10に隣接して示されているが、磁気要素は撮像チャンバー10に連結されてもよく、撮像チャンバー10と一体型であってもよく、または撮像チャンバー10から離れて存在してもよい。加えて、図6は、撮像チャンバー10の近位に配置される1つの磁気要素を示しているが、システムには、1つより多い磁気要素が含まれてもよいと理解される。
【００８４】
測定デバイスによってシグナルを獲得した後、磁場を除去してもよく（たとえば、永久磁石を移動させるためにソレノイドを用いることによって、または電磁石をスイッチのオンオフで調整することによって）、生物学的標的および磁気ビーズが撮像チャンバー10から出て行ってもよい。
【００８５】
最も単純な撮像チャンバー10の設計は、磁石262がビーズを表面に引っ張るとビーズがこの内部表面全体に無作為に分布するように、磁気要素の近位の撮像チャンバー側に比較的なめらかな内部表面を有する撮像チャンバーである。しかし、撮像チャンバー10はまた、本明細書においてより詳細に記述されるように磁場を適用した場合に、特定のスポットで捕捉複合体を「保持する」ように設計されうる。
【００８６】
捕捉複合体をチャンバー10に固定して、照明モジュール（LED 44、46）を操作して、この態様において蛍光体によって内部標識される、コードされた磁気ビーズを励起する。撮像センサー72（CCD）は画像を捕捉して、画像を処理する（たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、Rothによって2006年9月21日に提出された「Methods and Systems for Image Data Processing」と題する米国特許出願第11/534,166号を参照されたい）。磁石262が試料を放出し、デバイスを清浄にする。
【００８７】
LED 44、46、チャンバー10および磁石262に対する撮像センサー72の位置は、本発明に従って生物学的標的を撮像するために調節されうる。この態様において、ビーズは別個の特徴、すなわち吸収して方向を好むことなく（均一に全ての角度で）光子を再放射する内部蛍光色素の異なる波長および強度を有する。LED 44、46による照明、および撮像センサー（CCD 72）の位置は、撮像センサー（CCD 72）の視野（FOV）において生物学的標的に結合した任意のビーズの「角度空間」を最適化するように選択される。磁石262はチャンバー10の背部に存在することから、照明および撮像システムにとって利用可能な角度空間は、磁石より上の半球である。照明光学（LED 44、46）によってこの照明のより多くの角度空間をカバーすると、より多くの力が撮像の際にビーズに付与される。同様に、収集角度（開口数（numerical aperture））が照明の角度空間に対して高くなればなるほど、撮像レンズ52（図6）はより多くの流れを収集して、撮像センサー72（CCD検出器）に送達することができる。撮像センサーと照明システムに関して割付された角度のあいだでバランスをとらなければならない。
【００８８】
低コスト製造性のために、撮像レンズ52の実際の開口数の限界は、倍率4倍でおよそ0.3である。より高倍率の場合、撮像レンズ52の開口数は、同じコストガイドラインを維持しながら増加しうるであろう。レンズ52のコストに影響を及ぼす他の要因は、視野および周波帯の広さである。開口数0.3は、ほぼ35°の全角である。
【００８９】
照明モジュール、たとえばLED 44、46の配置に関して、制限は、LEDの輝度と共に励起フィルター47のコストである可能性がある。LEDのエタンデュー（etendue）は、視野（FOV）に対して最大LED流を提供するために検出物質のどのような角度空間が必要であるかを指図するであろう。（エタンデューは、ソースの立体角を乗じたソースの面積である：これは放射された流れの幾何学特徴を定義する）。FOVが比較的大きい場合、必要な角度空間はより低くなり、ゆえにより多くのLEDを用いることができる。
【００９０】
本発明に従うそのようなシステムのもう1つの態様を図7に示す。この態様において、試料は貯蔵容器12から撮像容積10に移される。システムにはまた、貯蔵リザーバーへと液体を引き、後に貯蔵リザーバーから液体を撮像容積に押し出すように構成された1つの双方向ポンプ14が含まれる。ポンプ14は、当技術分野において公知の任意の適した構成を有してよい。捕捉複合体は、本明細書においてさらに記述されるように曝露時間のあいだに実質的に固定されることから、高価なシリンジポンプから得られる流れなどの無脈流は、本明細書において記述されるシステムの態様にとって必要ではない。ポンプ14と試料バルブ18のあいだのチューブ16の長さから、十分なリザーバーが形成されうる。そのようなリザーバーは一般的に「試料ループ」と呼ばれる。洗浄バルブ20は、貯蔵容器22から新鮮な水（または他の適した試薬）を撮像容積に流すために、貯蔵リザーバーのポンプ端部で利用される。洗浄バルブ20には、当技術分野において公知の任意の適したバルブが含まれうる。試料および洗浄バルブを、1つのバルブに組み合わせることができることに注意されたい（図示はしていない）。ポンプ14はまた、撮像容積10における1つまたは複数の材料および任意の他の液体を廃棄容器24に移すように構成されてもよい。廃棄容器24は、当技術分野において公知の任意の適した構成を有してよい。
【００９１】
1つまたは複数の貯蔵容器から測定デバイスの撮像容積に1つまたは複数の材料を移すように構成されたシステムのもう1つの態様を図8に示す。この構成において、システムには、試料容器12から撮像容積10に液体を直接引いた後、廃棄容器24に押し出すように構成されたポンプ26が含まれる。ポンプ26には、蠕動ポンプなどの当技術分野において公知の任意の適したポンプが含まれうる。撮像容積10、試料容器12、および廃棄容器24は、先に記述されたように構成されうる。試料容器12、洗浄液容器22、および撮像容積10のあいだの任意のバルブ28は、試料が撮像容積に移されるか否か、または洗浄液が撮像容積に移される（たとえば、洗浄機能を行う場合）か否かに応じて位置を変化させるように構成されてもよい。バルブ28には、当技術分野において公知の任意の適したバルブが含まれうる。加えて、貯蔵容器22は、先に記述されたように構成されてもよい。図8において示される態様には、一時的なリザーバーが含まれず、バルブが1つ少なく、1方向のみに液体を移動させるように構成されたポンプを利用することから、この態様は図7において示される態様とは異なる。
【００９２】
1つまたは複数の貯蔵容器から測定デバイスの撮像容積に1つまたは複数の材料を移すように構成されたシステムの追加の態様を図9に示す。この態様は、図8において示される態様の試料／洗浄バルブ28が2つのバルブ30および32に置き換えられていることを除き、図8において示される態様の構成と類似の構成を有する。バルブ30および32には、当技術分野において公知の任意の適したバルブが含まれうる。たとえば、バルブ30および32には、貯蔵容器12および22からの液体をそれぞれ撮像容積10に個別に同時に移すように構成された開/閉型のバルブが含まれてもよい。貯蔵容器12および22、ならびに撮像容積10は、本明細書において記述されるように構成されうる。
【００９３】
個別の洗浄および試料経路（すなわち、1つの経路は貯蔵容器12から撮像容積10へ、もう1つの経路は貯蔵容器22から撮像容積10へ）をこのように提供することによって、図8において示される態様の全ての局面を達成することが可能となり、試料を撮像容積10に移す際に、測定される試料へ洗浄液および／または1つまたは複数の試薬を混合する能力を加える。試料が撮像容積に移される際に洗浄液および／または1つまたは複数の試薬を試料に混合することは、捕捉複合体が撮像容積内で遠く離れて（たとえば、撮像チャンバーの表面上で遠く離れて）分布するように試料を希釈するために行われてもよい。
【００９４】
図10は、測定デバイスの撮像容積における1つまたは複数の材料を撮像するように構成されたシステムの1つの態様を例証する。このシステムの態様には、検出器34、36、および38が含まれる。検出器34、36、および38は、CCDカメラであってもよく、または当技術分野において公知の他の任意の適した撮像デバイスであってもよい。検出器の各々は、同じ構成または異なる構成を有してよい。検出器の各々は、異なる波長または波長帯で光（たとえば、撮像チャンバー10によって定義される撮像容積において捕捉複合体40から発せられた光）を検出するように構成されうる。加えて、検出器の各々は、撮像チャンバー10における捕捉複合体40の画像または「捕捉蛍光写真」を生成するように構成されてもよい。
【００９５】
システムにはまた、異なる波長または異なる波長帯を有する光を放射するように構成された光源44および46が含まれる（たとえば、光源の1つが赤色光を放射するように構成されてもよく、他の光源は緑色光を放射するように構成されてもよい）。光源44および46から放射される光には、たとえば、可視波長スペクトルの任意の部分における光が含まれてもよい。光源44および46には、LEDまたは当技術分野において公知の任意の適した他の光源が含まれうる。光源44および46は、撮像チャンバー10の辺縁部の上に配置する。加えて、光源は、各光源が撮像チャンバー10における捕捉複合体40に対して異なる方向に光を向けるように、撮像チャンバーの上に配置する。
【００９６】
システムにはまた、光源44および46にそれぞれ連結したフィルター48および50が含まれる。フィルター48および50は、帯域フィルターまたは当技術分野において公知の他の任意の適したスペクトルフィルターであってもよい。このように、システムは、異なる波長または異なる波長帯の光によって捕捉複合体を連続的に照射するために、光源44および46、ならびにフィルター48および50を用いうる。
【００９７】
システムにはまた、照明「環」の中心（またはほぼ中心）に配置されるレンズ52が含まれてもよい。レンズ52には、当技術分野において公知の任意の適した屈折性の光学素子が含まれてもよい。レンズ52は、1つまたは複数の光二色性のおよび1つまたは複数の光学帯域フィルターが含まれてもよい1つまたは複数の光学素子によって、捕捉複合体から散乱したおよび／または蛍光を発せられた光を1つまたは複数の単色CCD検出器（たとえば、検出器34、36、および38）上に撮像するように構成される。たとえば、レンズ52から出た光は、当技術分野において公知の任意の適した光二色性光学素子が含まれてもよい光二色性フィルター54に向けられる。光二色性フィルター54は、1つの波長または波長帯の光を反射して、他の波長または波長帯の光を透過するように構成される。光二色性フィルター54によって反射される光は、帯域フィルターまたは他の適したスペクトルフィルターであってもよいフィルター56に向けられる。フィルター56を出た光は、検出器34に向けられる。
【００９８】
レンズ52によって透過される光はまた、当技術分野において公知の任意の適した光二色性光学素子が含まれてもよい光二色性フィルター58に向けられてもよい。光二色性フィルター58は、1つの波長または波長帯の光を反射して、他の波長または波長帯の光を透過するように構成されてもよい。光二色性フィルター58によって透過された光は、帯域フィルターまたは他の適したスペクトルフィルターであってもよいフィルター60に向けられる。フィルター60を出た光は、検出器36に向けられる。光二色性フィルター58によって反射された光は、帯域フィルターまたは他の適したスペクトルフィルターであってもよいフィルター62に向けられる。フィルター62を出た光は、検出器38に向けられる。さらに、図10において示されるシステムには、2つの光源が含まれるが、システムには任意の適した数の光源が含まれてもよいことが理解されるべきである。加えて、図10において示されるシステムには、異なる波長または波長帯で捕捉複合体から散乱および／または蛍光を発せられた光を撮像するように構成された3つの検出器が含まれるが、システムには、2つまたはそれより多い検出器が含まれてもよいことが理解されるべきである。たとえば、システムには、分類チャンネルおよびレポーターチャンネルを同時に測定するために用いることができ、それによってより高い測定処理量を提供する、2つまたはそれより多いCCD検出器（および任意で固定フィルター）が含まれてもよい。
【００９９】
ゆえに、図10において示されるシステムは、いくつかの関心対象の波長で捕捉複合体40の蛍光発光を表す複数または一連の画像を生成するように構成される。加えて、システムは、捕捉複合体の蛍光放射を表す複数または一連のデジタル画像をプロセッサ（すなわち、処理エンジン）に供給するように構成されてもよい。システムには、プロセッサが含まれても含まれなくてもよい（図示せず）。プロセッサは、検出器34、36、および38からの画像データを獲得（たとえば、受信）するように構成されてもよい。たとえば、プロセッサは、当技術分野において公知の任意の適した様式で（たとえば、各々が検出器の1つをプロセッサに連結する伝達媒体（図示せず）によってや、各々が検出器の1つとプロセッサのあいだを連結するアナログ-デジタル変換器などの1つまたは複数の電子成分（図示せず）によってなど）検出器34、36、および38に連結されてもよい。
【０１００】
プロセッサは、たとえば捕捉された生物学的標的を分類および計数するためにこれらの画像を処理および分析するように構成されうる。この情報は、各々の波長に関する各々の捕捉複合体の蛍光の大きさを登録するデータアレイなどの任意の適したフォーマットでプロセッサによって出力されてもよい。具体的に、プロセッサは、画像を処理して分析するための方法の1つまたは複数の段階を行うように構成されてもよい。図10において示されるシステムなどのシステムによって生成された画像を処理および分析するための方法の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Rothによって2006年9月21日に提出された「Methods and Systems for Image Data Processing」と題する米国特許出願第11/534,166号において例証される。本明細書において記述されるシステムは、この特許出願において記述されるようにさらに構成されてもよい。加えて、本明細書において記述される方法には、この特許出願において記述される任意の方法の任意の段階が含まれてもよい。
【０１０１】
たとえば、1つの態様において、プロセッサは、コードされた磁気ビーズに結合することによって、チャンバーの表面上で標識されて固定された生物学的標的（たとえば、細胞）を検出および計数するために画像を分析して、統計学的に有意な数の標識生物学的標的がチャンバーの表面上で固定されているか否かを決定するように構成されてもよい。プロセッサは、統計学的に有意な数の標識生物学的標的がチャンバーの表面に固定されていない場合に、チャンバーにより多くの試料の添加を促すように構成される。プロセッサは、統計学的に有意な数の標識生物学的標的がチャンバーの表面上で固定されるまで、検出、計数、決定、および試料負荷プロセスを繰り返す。次に、プロセッサは、画像のさらなる処理および分析を続行する。先に言及したように、プロセッサは、統計学的に有意な数の標識生物学的標的がチャンバーの表面に固定されていない場合に、チャンバーにより多くの試料の添加を促すように構成される。プロセッサは、ユーザーが、チャンバーに追加の試料を送達するように手動で注入するまたはポンプを作動させるように促す（聴覚または視覚シグナルなどによって）ことによってより多くの試料の添加を促してもよい。または、ポンプは、プロセッサからのシグナルを受信することによって、チャンバーに追加の試料を送達するようにポンプが作動するように、プロセッサの制御下にあってもよい。
【０１０２】
プロセッサは、典型的なパーソナルコンピュータ、メインフレームコンピュータシステム、ワークステーション等において一般的に含まれるプロセッサなどのプロセッサであってもよい。一般的に、「コンピュータシステム」という用語は、メモリ媒体からの指示を実行する1つまたは複数のプロセッサを有する任意のデバイスを包含するように広く定義されうる。プロセッサは、他の任意の適切な機能的ハードウェアを用いて実行されてもよい。たとえばプロセッサには、ファームウェアで固定プログラムを有するデジタルシグナルプロセッサ（DSP）、書換可能論理回路列（FPGA）、または超高速集積回路（VHSIC）ハードウェア記述言語（VHDL）などの高レベルプログラミング言語で「書かれた」シーケンスロジックを使用する他のプログラム可能なロジックデバイス（PLD）が含まれうる。もう1つの例において、上記で参照した特許出願において記述されるコンピュータ実行法の1つまたは複数の段階を行うためのプロセッサにおいて実行可能なプログラム指示（示していない）は、適当であればC++のセクションを伴うC#、アクティブXコントロール、JavaBeans、Microsoft Foundation Classes（「MFC」）、または望ましければ他の技術もしくは方法論などの高レベル言語で暗号化されてもよい。プログラム指示は、中でも技法に基づく技術、成分に基づく技術、および／または対象に向けられる技術、が含まれる任意の様々な方法で実行されうる。
【０１０３】
上記引用された特許出願において記述される方法などの方法を実行するプログラム指示は、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、磁気または光学ディスク、または磁気テープなどのコンピュータ読み取り可能な媒体に含有されてもよい。
【０１０４】
B．抗体
抗体を調製して特徴付けする方法は当技術分野において周知である。簡単に説明すると、関心対象ポリペプチドを含む免疫原によって動物を免疫する段階、および免疫したその動物から抗血清を収集する段階によって、ポリクローナル抗体を調製する。広範囲の動物種を抗血清の産生のために用いることができる。典型的に、抗血清の産生のために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、またはウマが含まれる非ヒト動物である。ウサギは比較的血液の容量が大きいため、ポリクローナル抗体を産生するためにウサギが好ましい選択である。
【０１０５】
特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質を用いることによって増強されうる。例示的なアジュバントには、フロイントの完全アジュバント（死菌結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
【０１０６】
ポリクローナル抗体の産生において用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質のみならず免疫のために用いられる動物に応じて多様である。多様な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）を用いて免疫原を投与することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫した動物の血液を免疫後の様々な時点で採取することによってモニターされてもよい。2回目の追加注射も同様に行いうる。適した力価が達成されるまで、追加免疫および力価測定のプロセスを繰り返す。望ましいレベルの免疫原性が得られれば、免疫した動物を流血させて、血清を単離して保存するか、または動物を、mAbを生成するために用いることができる。
【０１０７】
MAbは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,196,265号において例示される技術などの周知の技術を用いて容易に調製されうる。典型的に、この技術は、選択された免疫原組成物によって適した動物を免疫する段階を伴う。抗体産生細胞を刺激するために有効な様式で免疫組成物を投与する。マウスおよびラットなどの齧歯類は、モノクローナル抗体産生のために一般的に用いられる。
【０１０８】
免疫後、抗体を産生する可能性がある体細胞、特にB-リンパ球（B-細胞）を、mAb生成プロトコールにおいて用いるために選択する。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血液試料から得てもよい。脾細胞および末梢血細胞が好ましく、前者はそれらが分裂中の形質芽球段階である抗体産生細胞に富む起源であることから、および後者は末梢血が容易にアクセスすることができることから好ましい。しばしば、動物のパネルを免疫して、最高抗体力価を有する動物の脾臓を採取して、脾臓をシリンジによってホモジナイズすることによって脾臓リンパ球を得る。典型的に、免疫したマウス一匹からの脾臓はリンパ球約5×107〜2×108個を含有する。
【０１０９】
免疫した動物からの抗体産生Bリンパ球を、不死化骨髄腫細胞、一般的に、免疫した動物と同じ種の骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合技法において用いるために適した骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成育を支持する一定の選択培地においてそれらを生育することができなくする酵素欠損を有する。
【０１１０】
抗体を産生する脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成する方法は、通常、細胞膜の融合を促進する物質または複数の物質（化学的または電気的）の存在下で体細胞を骨髄腫細胞と2：1の比率で混合する段階を含むが、比率は約20：1〜約1：1まで多様であってもよい。融合技法は通常、低い頻度で生存ハイブリッドを産生する。しかし、これらの生存している融合ハイブリッドは、選択培地において培養することによって、親の非融合細胞（特に、通常無限に分裂し続けるであろう非融合骨髄腫細胞）から分化することから、これは問題ではない。選択培地は一般的に、組織培養培地におけるヌクレオチドのデノボ合成を遮断する物質を含有する培地である。例示的な物質は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの双方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートを用いる場合、ヌクレオチド源として培地にヒポキサンチンおよびチミジンを補給する（HAT培地）。アザセリンを用いる場合、培地にヒポキサンチンを補給する。
【０１１１】
この培養は、そこから特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。典型的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおいて1クローン希釈によって細胞を培養する段階の後に、個々のクローン上清を所望の反応性に関して試験する段階（約2〜3週間後）によって行われる。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞障害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ等などの、感度が高く、単純かつ迅速なものであるべきである。
【０１１２】
選択されたハイブリドーマを連続希釈して、個々の抗体産生細胞株にクローニングし、クローンを無限に繁殖させてmAbを提供することができる。細胞株は、2つの基本的な方法でmAb産生のために利用されうる。当初の融合に体細胞および骨髄腫細胞を提供するために用いたタイプの組織適合性の動物に、ハイブリドーマ試料を注入する（しばしば腹腔に）ことができる。注入された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生させる。血清または腹水などの動物の体液を採取して高濃度のmAbを提供することができる。個々の細胞株はまたインビトロで培養することができ、この場合、mAbは培養培地に自然に分泌され、これをそこから高濃度で容易に得ることができる。いずれの手段によって産生されたmAbも望ましければ、濾過、遠心、およびHPLCまたはアフィニティクロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いてさらに精製してもよい。
【０１１３】
C．アプタマー
アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸、ならびに細胞、組織、および生物などの様々な分子標的に結合するように繰り返し選択ラウンドを通して設計される核酸配列である。アプタマーは、抗体の特性と競合する分子認識特性を提供する。加えて、それらは完全にインビトロで工学操作されうる、化学合成によって容易に産生されうる、および望ましい保存特性を保有しうることから抗体に対して長所を提供する。アプタマーは典型的に、SELEX（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）プロセスおよびそれに対するバリエーションによって作製される。SELEXプロセスは、たとえば米国特許第5,270,163号および第5,475,096号において記述されている（そのいずれも参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１１４】
D．免疫磁気分離
免疫磁気分離（IMS）は、そのマトリクスから生物学的細胞を分離するために用いられる技術である。技術は、標的細胞に選択的に付着するであろう抗体と共に磁気ミクロスフェアを用いる。次に、ミクロスフェアと細胞によって形成された複合体を、磁場を用いることを通して試料マトリクスから選択的に除去する。IMSを用いて、試料から特異的細胞タイプを枯渇させる、または試料から特異的細胞タイプを選択することができる。方法はまた、標的細胞タイプを有する試料を濃縮するために用いることができる。たとえば、従来のアッセイでは、HIVに感染した患者の末梢血からのCD4 T細胞の計数は、その表面上に同様にCD4タンパク質を有し、CD4 Tリンパ球の数を間違って増加させる単球集団を血液試料から枯渇させる必要がある。単球の枯渇は、単球に対して特異的な抗CD14抗体に連結させた磁気ビーズを用いる選択的分離によって行われる。IMS応用のもう1つの例は、自家骨髄移植を受けている患者の骨髄からの腫瘍細胞の除去である。IMSの他の例は、Olsvik Orjan et al. "Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology", Clinical Microbiology reviews, Jan 1994, p43-54において記述される。
【０１１５】
Dynalbeads（登録商標）は、ポジティブまたはネガティブのいずれかの細胞の単離、細胞拡大、タンパク質試料調製、タンパク質単離等が含まれる広く多様な応用において用いられる超常磁性粒子の十分に確立されたラインである。Dynalbeads（登録商標）は、直接または間接法において用いられうる。直接法において、標的細胞は、ビーズに連結した特異的抗体によってビーズに直接付着するであろう。間接法において、細胞はまず、標的に対して特異的な遊離の一次抗体と複合体を形成するであろう。次に、複合体は、一次抗体を標的とする二次抗体に連結したビーズを用いて捕捉されるであろう。間接法を用いる長所は以下のとおりである：最初に、抗体の大きさが小さいことを利用することによって、およびビーズの大きさによる立体妨害を回避することによって、標的細胞に対する一次抗体のよりよい結合を可能にする；第二に、二次抗体と一次抗体のあいだの結合を形成するために高い親和性定数を有する複合体（ビオチン-アビジンなどの）を用いることによって、磁気ビーズの大きさによる立体妨害の短所を代償する。間接法の不便な点は、直接法の1回のかわりに、2回のインキュベーション時間が必要である点である。また、二次抗体が標的細胞（たとえば、CD4）に対して特異的でないが、かわりに一次抗体の種（マウス、ヤギ等）に対して特異的であることから、方法は、多数の検出スキームにはふさわしくない。
【０１１６】
Dynalbeadsは、標的細胞が磁気ビーズによって最初に捕捉されて、その後特異的試薬を用いることによって放出される、細胞のポジティブ単離を可能にする。このアプローチによって、その完全な完全性を維持しながら、およびさらなる下流の応用にとって適した状態で保持しながら細胞が単離される。他のタイプの単離には、ネガティブ単離、または部分的もしくは他の全ての細胞タイプを除去することによって標的細胞が精製される枯渇が含まれる。Dynalbeadsの適用には、Bリンパ球、内皮細胞、顆粒球、造血前駆細胞、ランゲルハンス細胞、神経細胞、ナチュラルキラー細胞、CD3、CD4およびCD8 T細胞が含まれるTリンパ球などのヒト細胞サブセットの単離が含まれる。Dynal: "Cell separation and protein purification" Dynal Technical Handbook; 2nd Edition, 1996。しかし、Dynalbeads（登録商標）は、それらが付着する細胞の同定のためには用いられない。その結果、Dynal技術には複合能はない。
【０１１７】
E．コードされた磁気粒子
コードされたミクロスフェア（すなわち、ビーズ）に関して一定の態様を記述してきたが、照明サブシステム、システムおよび方法はまた他のコードされた磁気粒子と共に用いられてもよいと理解される。粒子は好ましくは超常磁性である。コードされたミクロスフェア、ビーズ、および粒子の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Fultonに対する米国特許第5,736,330号、Chandler et al.に対する第5,981,180号、Fultonに対する第6,057,107号、Chandler et al.に対する第6,268,222号、Chandler et al.に対する第6,449,562号、Chandler et al.に対する第6,514,295号、Chandler et al.に対する第6,524,793号、およびChandlerに対する第6,528,165号において例証される。コードされた粒子内または表面上での色素または蛍光体の励起は、レーザー光、ダイオード光、アーク灯、熱、放射性放出、化学発光、電気発光、化学電気発光、または当業者に公知の他の任意の方法によって成就されてもよい。
【０１１８】
一定の態様において、本発明は、Luminex（登録商標）xMAP（登録商標）、およびMagPlex（商標）技術と共に用いられる。Luminex xMAP技術は、蛍光によってコードされたミクロスフェア上に固定された核酸産物を検出することができる。ミクロスフェアを、各々の2つが分光的に異なる蛍光体の異なる強度の蛍光体10個によって染色することによって、蛍光が異なる100個のミクロスフェア集団が産生される。デジタルシグナル処理は、リアルタイムの定量的データへのシグナルの翻訳を可能にする。Luminex技術はたとえば、その全てが具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,736,330号、第5,981,180号、および第6,057,107号において記述される。Luminex（登録商標）MagPlex（商標）ミクロスフェアは、先に記述したxMAP（登録商標）技術を用いて蛍光によってコードされた超常磁性ミクロスフェアである。ミクロスフェアは、生体分子の共有的接着のために表面カルボキシル基を含有する。
【０１１９】
F．キット
本明細書において記述される組成物はいずれもキットに含まれてもよい。キットは、標的化細胞または細胞集団を単離、分離、または検出するために用いられてもよいことから、抗体（または他の捕捉物質）に連結されたふさわしくアリコートにされたコード磁気ビーズを含んでもよい。キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥型のいずれかで包装されてもよい。キットにはまた、ハイブリダイゼーション緩衝液または洗浄緩衝液などの1つまたは複数の緩衝液が含まれてもよい。キットの容器手段には一般的に、その中に成分が配置される、好ましくはふさわしくアリコートにされて入れられてもよい、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれるであろう。キットにおいて1つより多い成分が存在する場合、キットはまた一般的に、その中に追加の成分が個々に入れられてもよい第二の、第三の、または他の追加の容器を含有するであろう。しかし、成分の様々な組み合わせがバイアルに含まれてもよい。本発明のキットには典型的に、抗体（または他の捕捉物質）に連結されたコードされた磁気ビーズ、および販売用の封鎖された他の任意の試薬容器を含有するための手段が含まれるであろう。そのような容器には、その中に望ましいバイアル、ボトル等が保持される厚紙または注入もしくは吹込成形プラスチック容器が含まれてもよい。
【０１２０】
キットの成分が1つまたは複数の液体溶液において提供される場合、液体溶液は水溶液であってもよく、滅菌水溶液が特に好ましい。
【０１２１】
しかし、キットの一定の成分は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適した溶媒を添加することによって再構成されうる。溶媒はもう1つの容器手段において提供されてもよいと想像される。
【０１２２】
キットにはまた、キット成分を使用するための説明書が含まれてもよい。説明書には、実行されうる変化形が含まれてもよい。
【実施例】
【０１２３】
G．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実践において良好に機能すると本発明者らによって発見された技術を代表し、このように、その実践にとって好ましい様式を構成すると見なされうることは当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は本開示に照らして、多くの変更を、開示される特異的態様に行うことができ、それでもなお同様または類似の結果が得られ、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれると認識すべきである。
【０１２４】
実施例1
CD4およびCD8リンパ球の計数
本実施例において、抗CD14抗体を用いて全血試料から最初にその単球集団を枯渇させる。次に、2組のLuminex MagPlex磁気ビーズを用いて、CD4細胞およびCD8細胞を、機器の撮像チャンバーにおいて免疫磁気的に単離して、試料の残りから分離する。クラスタのその後の検出および分析は、捕捉された細胞の特徴付けおよび計数を可能にする。
【０１２５】
全血試料を収集して、抗凝固剤として2 mM EDTA（BD Biosciences # 366452）を含有するBD Vacutainerに貯蔵する。Luminex MagPlex磁気ビーズ（セット#1）を、製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて抗CD4抗体によってコーティングする。Luminex MagPlex磁気ビーズ（セット#2）を、製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて抗CD8抗体によってコーティングする。
【０１２６】
血液試料から、標準的な免疫磁気分離技術および抗CD14抗体を用いて単球を枯渇させる。試料20μlをピペットによって1.5 mL遠心管に移す。セット#1からのMagPlexビーズ500,000個（CD4細胞に対して特異的）同等量を試料に直接加える。セット#2からのMagPlexビーズ500,000個（CD8細胞に対して特異的）同等量を試料に直接加える。細胞を染色するために核酸染色を添加する。ピペッターを用いて混合を行う。さらに混合段階を行うことなく試料を20分間インキュベートする。
【０１２７】
試料をPBS/BSA（プレパッケージPBS/BSA：Sigma P3688）溶液1 mLを用いて希釈し、撮像装置の注入シリンジに渡す。試料のアリコートを撮像チャンバーに注入する。試料の導入が開始されるや否や装置の磁場のスイッチを入れる。試料の連続的可視化および新しい試料アリコートの導入により、より多くの試料アリコートの連続的負荷を決定する、またはこの段階での終了を決定することができる。負荷段階が終了すると、視野における個々のビーズおよびビーズのクラスタを、画像処理アルゴリズムを用いて分析する。個々のビーズは、その形状、大きさ、および蛍光強度に従って同定される。個々のビーズは、用いた過剰量の捕捉試薬のみならず、標的細胞との連結能の特徴を有する。細胞数と比較してビーズが過剰量であることによって、事実上1個のビーズが多数の細胞に同時に結合しないことを確実にする。
【０１２８】
ビーズおよび有核細胞は、その蛍光シグナルによって同定される。分解能は、各細胞および細胞に結合したビーズの全てが個々に同定されうるような分解能である。しかし、いくつかの場合において、1個の細胞に結合するビーズの数は、ビーズのクラスタのみが観察されうるほどに多いことがある。これは、ビーズのクラスタがその大きさおよび形状に従って同定されることから、各々の細胞タイプが唯一のビーズタイプに結合する試験では問題ではない。関心対象のクラスタは、大きさが15〜24ミクロンであり、丸みは1に近く、分類マップにおいて定義される領域1または2内で蛍光強度の中央値を示す。これらのクラスタは、それらが標的とする細胞の計数に含まれる。ダブレット、トリプレット、または他の特異的マルチプレットなどの他の非特異的ビーズ凝集体は、無作為な大きさ、形状、および蛍光強度の中央値を示すであろう。これらの非特異的凝集体はいかなる細胞数からも除外されるであろう。
【０１２９】
実施例2
敗血症患者における病因物質の計数および分類
本実施例において、敗血症が疑われる患者からの全血試料を収集する。細菌種特異的捕捉抗体に連結された一連のLuminex MagPlex磁気ビーズを用いて、血液中に存在する細菌細胞を、機器の撮像チャンバーにおいて単離して、試料の残りから分離する。捕捉細胞を同定して、計数する。
【０１３０】
全血試料を収集して、抗凝固剤として2 mM EDTA（BD Biosciences # 366452）を含有するBD Vacutainerに収集および貯蔵する。Luminex MagPlexビーズセット1〜8を、製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて、以下の細菌に対する抗体によってコーティングする：大腸菌、リステリア菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、インフルエンザ菌、緑膿菌、および化膿性連鎖球菌。Luminex MagPlexビーズ（セット#9）を製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて抗CD61抗体（血小板細胞表面マーカー）によってコーティングする。
【０１３１】
血液試料から、標準的な免疫磁気分離技術および抗CD14抗体を用いて単球を枯渇させる。試料50μlをピペットによって1.5 mL遠心管に移す。各セットからのMagPlexビーズ100,000個同等量を試料に直接加える。試料を軽く混合（転倒型）しながら20分間インキュベートする。試料をPBS/BSA（プレパッケージPBS/BSA：Sigma P3688）溶液1 mLを用いて希釈して、読み取り基本型の注入シリンジに渡す。試料のアリコートを撮像チャンバーに注入する。試料の導入が始まると装置の磁場を適用する。試料の負荷容積は、視野における細胞密度および分離に関して最適化される。試料の適用後、洗浄液を試料ループの中に、固定試料の上に流して、破片を除去する。負荷段階が終了した後、視野における個々のビーズおよびビーズクラスタを画像処理アルゴリズムを用いて分析する。細菌細胞の同定および計数を、計数された血小板数と比較して細菌負荷量を決定する。
【０１３２】
実施例3
単球枯渇なしでのCD4およびCD8リンパ球の計数
本実施例において、全血試料中のCD4およびCD8リンパ球を、最初の単球集団の枯渇なしで分析する。全血試料を、抗凝固剤として2 mM EDTA（BD Biosciences # 366452）を含有するBD Vacutainerに収集および貯蔵する。Luminex MagPlexビーズ（セット#1）を製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて抗CD4抗体によってコーティングする。Luminex MagPlexビーズ（セット#2）を製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて抗CD8抗体によってコーティングする。Luminex MagPlexビーズ（セット#3）を製造元の説明書に従って2段階カルボジイミドカップリングプロトコールを用いて抗CD14抗体によってコーティングする。
【０１３３】
試料20μlをピペットによって1.5 mL遠心管に移す。セット#1（CD4細胞に対して特異的）、セット#2（CD8細胞に対して特異的）、およびセット#3（CD14細胞に対して特異的）の各々からのMagPlexビーズ500,000個同等量を試料に直接添加する。ピペッターを用いて混合する。さらなる混合段階を行わずに試料を20分間インキュベートする。
【０１３４】
試料をPBS/BSA（プレパッケージPBS/BSA：Sigma P3688）溶液1 mLを用いて希釈して、撮像装置の注入シリンジに渡す。試料のアリコートを撮像チャンバーに注入する。試料の導入が開始されるや否や装置の磁場のスイッチを入れる。試料の連続的可視化および新しい試料アリコートの導入によって、より多くの試料アリコートの連続的負荷またはこの段階の終止の決定が可能となる。負荷段階が終了した後、視野における個々のビーズおよびビーズクラスタを、画像処理アルゴリズムを用いて分析する。個々のビーズはその形状、大きさ、および蛍光強度に従って同定される。したがって、CD4およびCD8リンパ球は、セット#1および#2のビーズに結合することによって同定される。同様にCD4を発現する単球は、単球がビーズセット#3（CD14に対して特異的）にも同様に結合することから、CD4リンパ球と区別されうる。
【０１３５】
実施例4
捕捉特異性、有効性、および複合能
1つのLuminex MagPlexビーズ領域に連結した抗体が捕捉物質であり、第二のビーズ領域が標的実体である細胞捕捉のシミュレーションを行った。標的実体として細胞の代わりに磁気ビーズを用いることによって、「非捕捉」標的（捕捉ビーズに結合していない標的ビーズとして定義される）を同様に単離および同定することができ、これは捕捉効率の測定にとって有用であった。捕捉の特異性は、標的実体が、無関係なタンパク質および関連のない標的であるウシ血清アルブミン（BSA）に連結させた磁気ビーズである、対照を用いて評価した。
【０１３６】
捕捉ビーズおよび標的ビーズを軽く回旋させながら4℃でインキュベートした。各アッセイに関して、1時間インキュベーション後に1つのアリコートを分析して、5時間インキュベーション後にもう1つのアリコートを分析した。試料を、底部白色照明と蛍光励起とを併せて用いてNikon 2000蛍光顕微鏡によって分析した。画像分析のあいだ、ビーズは以下のように分類された：
・捕獲ビーズ4個までに付着した単独の標的を「捕捉された標的」と分類した
・いかなるビーズにも付着しなかった単独の標的を「非捕捉標的」として分類した
・多数の捕捉ビーズとクラスタを形成した単独または複合の標的を「分解不能な凝集体」と見なした。
【０１３７】
捕捉効率を、「非捕捉標的および捕捉された標的」の合計によって除した「捕捉された標的」として定義した。捕捉効率は、分解不能な凝集体を形成する標的ビーズを勘案せず、個々に同定および計数されうる標的ビーズのみを考慮した。この実験の結果は、捕捉効率が1時間のインキュベーション後54％、5時間のインキュベーション後では74％であったことを示した（図11）。
【０１３８】
捕捉の特異性は、陽性のシミュレーションを陰性対照実験と比較することによって証明された。1時間のインキュベーション後、標的ビーズの50％より多くがシミュレーションモデルにおいて捕捉され、陰性対照ではそれらの6％が捕捉されたに過ぎなかった。5時間のインキュベーション後では、類似の特異性が観察された（図11）。
【０１３９】
完全な複合能を達成するために、アッセイ条件は、最適なビーズ数が標的細胞の周りに結合するような条件である必要がある。細胞周囲に十分なミクロスフェアがなければ（細胞あたりミクロスフェア1個未満）、多くの細胞が捕捉されず、勘案されないであろう。これは試料中の一定の種類の細胞、細菌、または胞子の存在を確立しようと試みる診断アッセイ（「あり」または「なし」のアッセイ）に関しては許容されるが、低い捕捉効率は、標的細胞の完全なセンサスを必要とする応用にとっては適していないであろう。一方、細胞周囲のミクロスフェアが多すぎると、標的細胞周囲のビーズの大きいクラスタ、または多数の細胞およびビーズで作出された大きい凝集体が起こるであろう。これは、個々のビーズの解読をかなり複雑にして、方法の複合能を低減するであろう。ゆえに、複合応用の場合、標的細胞周囲のミクロスフェアの最適な数は、各々のミクロスフェアが個々に分析および分類されうるような数である。
【０１４０】
少なくとも1つの標的実体が含まれるクラスタの組成の分析を行った。クラスタは標的実体周囲の捕捉ビーズの数「n」によって同定された。陽性アッセイのみに関して結果を示す（表1）。
【０１４１】
【表１】
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【０１４２】
インキュベーション時間が増加すると、クラスタのサイズも同様に増加した。1時間インキュベーション後では、捕捉された標的実体の79％が捕捉ビーズ1個のみに接しており、16％が捕捉ビーズ2個に接している。5時間インキュベーション後では、より大きいクラスタ（標的実体周囲に捕捉ビーズ3個および4個）がより顕著になるにつれて小さいクラスタの比率は減少する。
【０１４３】
本明細書において開示のおよび特許請求される組成物および方法は、本開示に照らして不当な実験を行うことなく作出および実行されうる。本発明の組成物および方法を、好ましい態様に関して記述してきたが、本明細書において記述される組成物および方法に、ならびに方法の段階または段階の順序に変更を適用してもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは当業者に明らかであろう。より具体的に、化学的および生理的に関連する一定の物質を、本明細書において記述される物質の代わりに用いてもよく、それでも同じまたは類似の結果が達成されるであろうことは明らかであろう。当業者に明らかであるそのような類似の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念に含まれると見なされる。
【０１４４】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書において記述される技法または他の詳細に対して補助的な例示的な技法または他の詳細を提供する程度に、具体的に参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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