(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的リガンドに特異的に結合するための少なくとも６つのアミノ酸の環を含む内部拘束された環状オリゴペプチドであって、前記環は２つのアミノ酸ドメインを含み、各ドメインは、少なくとも２つのエピトープ形成アミノ酸、および１つ以上の非共有結合である環内会合を形成するように配置された２つの会合性官能基を含み；それによって前記環状オリゴペプチドは単一の立体配置に拘束され、その結果前記エピトープ形成アミノ酸は各ドメインでエピトープを形成し、各エピトープは標的リガンドに特異的に結合することができ、
前記環状オリゴペプチドは、２つのエピトープを含み、
各会合性官能基は、飽和または不飽和であっても、直鎖または分枝鎖であっても、置換であっても非置換であってもよいＣ８−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
下記の構造から選択される構造を有する環状オリゴペプチド。
【化１】
0005475451.tif 000015
（ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＺはエピトープ形成アミノ酸であり；ＡおよびＸはＤアミノ酸であり、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＺはＬアミノ酸であるか、またはＡおよびＸはＬアミノ酸であり、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＺはＤアミノ酸であり；１つのエピトープはドメインＣ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープはドメインＺ−Ｘ−Ｙから形成され；かつ各々のΣは会合性脂質アミノ酸であり、前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインおよびＣ−Ａ−Ｂドメインが、それぞれ独立にアミノ酸配列ＲＦＳ、ＲＳＦ、ＦＳＲ、ＦＲＳ、ＳＲＦ、ＳＦＲ、ＱＬＳ、ＱＳＬ、ＳＱＬ、ＳＬＱ、ＬＱＳまたはＬＳＱから選択される）、および、
【化２】
0005475451.tif 000016
（ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺはエピトープ形成アミノ酸であり；１つのエピトープはドメインＤ−Ｃ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープはドメインＺ−Ｘ−Ｙ−Ｗから形成され；各々のΣは会合性脂質アミノ酸であり、前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−ＷドメインおよびＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインが、それぞれ独立にアミノ酸配列ＹＥＫＡ（配列番号１）、ＹＥＡＫ（配列番号２）、ＹＡＫＥ（配列番号３）、ＹＡＥＫ（配列番号４）、ＹＫＡＥ（配列番号５）、ＹＫＥＡ（配列番号６）、ＥＹＫＡ（配列番号７）、ＥＹＡＫ（配列番号８）、ＥＫＡＹ（配列番号９）、ＥＫＹＡ（配列番号１０）、ＥＡＫＹ（配列番号１１）、ＥＡＹＫ（配列番号１２）、ＫＡＹＥ（配列番号１３）、ＫＡＥＹ（配列番号１４）、ＫＹＡＥ（配列番号１５）、ＫＹＥＡ（配列番号１６）、ＫＥＡＹ（配列番号１７）、ＫＥＹＡ（配列番号１８）、ＡＫＥＹ（配列番号１９）、ＡＫＹＥ（配列番号２０）、ＡＹＥＫ（配列番号２１）、ＡＹＫＥ（配列番号２２）、ＡＥＹＫ（配列番号２３）またはＡＥＫＹ（配列番号２４）から選択される）
【請求項２】
前記各ドメインは３つのエピトープ形成アミノ酸を含み、前記３つのエピトープ形成アミノ酸は交互の立体化学的配置を有する請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸類縁体またはそれらのＤ型である請求項１または２に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項４】
前記会合性官能基の間の１つ以上の環内会合が、疎水性である請求項１〜３のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの会合性官能基が、前記ドメインの間に配置される請求項１〜４のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項６】
会合性官能基に隣接する各エピトープ形成アミノ酸が、隣接する会合性官能基と同じ立体化学的配置を有する請求項５に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項７】
前記エピトープが同じものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項８】
前記会合性脂質アミノ酸上に位置する前記会合性官能基が、Ｃ８−Ｃ２０直鎖炭化水素側鎖である請求項１〜７のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項９】
前記直鎖炭化水素側鎖が、Ｃ１０−Ｃ１６直鎖炭化水素側鎖である請求項８に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１０】
前記会合性脂質アミノ酸がシステインであり、
前記会合性官能基が、システイン側鎖のスルフヒドリル官能基に付加されたＣ８−Ｃ２０脂肪族炭化水素鎖である請求項４〜７のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１１】
前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインおよびＣ−Ａ−Ｂドメインのうち少なくともいずれか一方が、ＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１２】
前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインがＲＦＳである請求項１〜１１のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１３】
前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインおよびＣ−Ａ−Ｂドメインがそれぞれ、ＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１４】
フェニルアラニンがＤ立体配置であり、セリンがＬ立体配置であり、アルギニンがＬ立体配置であり、各々の脂質アミノ酸がＬ立体配置である、請求項１２または１３に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１５】
前記Ｃ−Ａ−Ｂドメインが、Ｚ−Ｘ−Ｙドメインと同じである請求項１〜１４のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１６】
前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−ＷドメインがＹＥＫＡ（配列番号１）であり、前記Ｄ−Ｃ−Ａ−ＢドメインがＥＹＡＫ（配列番号８）である請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１７】
前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−ＷドメインおよびＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインがそれぞれ、タンパク質分解活性を阻害し得るエピトープを形成する請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１８】
前記Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインが、Ｚ−Ｘ−Ｙ−Ｗドメインと同じである請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項１９】
少なくとも１つのドメイン中のエピトープ形成アミノ酸として、アミノ酸のセリン、フェニルアラニンおよびアルギニンを含み、
それぞれのドメインが、ＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成する、請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２０】
医薬、予防薬または診断薬として使用するための請求項１〜１９のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２１】
ＴＮＦが増悪因子である疾患を治療するための医薬を製造するために使用される請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２２】
前記疾患が、癌、肥満、心疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患から選択される請求項２１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２３】
前記疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症およびクローン病から選択される自己免疫疾患である、請求項２１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２４】
前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−ＷドメインおよびＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインのうち少なくともいずれか一方が、タンパク質分解活性を阻害し得るエピトープを形成する請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２５】
プロテアーゼ活性が増悪因子である疾患を治療するための医薬を製造するために使用される請求項１に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２６】
前記疾患が、循環器疾患、循環障害およびＨＩＶを原因とする疾患から選択される請求項２５に記載の環状オリゴペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の環状オリゴペプチドと、
薬学的に受容可能な添加剤およびアジュバントのうち少なくともいずれか一方とを含む薬学的組成物。
【請求項２８】
前記添加剤が、トランスクトール、ポロキサマーブロックコポリマー、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤または胆汁酸塩から選択される請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリエチレングリコールのアシルエステル、またはポリエチレングリコールの脂肪族エーテルから選択される請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか１項に定義される、標的リガンドに特異的に結合するための環状オリゴペプチドを製造するための方法であって：
ｉ）エピトープ形成アミノ酸を提供する工程と；
ｉｉ）エピトープ形成アミノ酸を組み込んだ環状オリゴペプチドを製造する工程と、
を包含し、
前記ｉ）の工程は、
（ａ）結合体の１セットを選択する工程であって、各結合体は頭部基および尾部基を含み、頭部基の配列を伴い、各頭部基はアミノ酸を含む、工程と；
（ｂ）そこから非共有結合性の会合を形成する工程であって、尾部基が疎水的に凝集し、結合体が移動性である、工程と；
（ｃ）非共有結合性の会合と標的リガンドとの間の十分な相互作用をアッセイする工程と；
（ｄ）頭部基の修飾された配列との結合体の１セットを用いて、工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｃ）において十分な相互作用を見出した際に、工程（ａ）におけるエピトープ形成アミノ酸として結合体の前記セットの頭部基のアミノ酸を選択する工程と、
を包含する方法。
【請求項３１】
環状オリゴペプチドと標的リガンドとの相互作用を決定するためのスクリーニング方法であって、
前記環状オリゴペプチドは、標的リガンドに特異的に結合するための少なくとも６つのアミノ酸の環を含む内部拘束された環状オリゴペプチドであり、
前記環は、２つのアミノ酸ドメインを含み、
各ドメインは、エピトープ形成アミノ酸、および２つの会合性官能基を含み、
前記会合性官能基は、会合性のアミノ酸の側鎖であり、またはこの会合性のアミノ酸の修飾された側鎖であり、またはこの会合性のアミノ酸の側鎖上に付加された基であり、１つ以上の非共有結合である環内会合を形成するように配置され、それによって前記環状オリゴペプチドは単一の立体配置に拘束され、その結果前記エピトープ形成アミノ酸は各ドメインでエピトープを形成し、各エピトープは標的リガンドに特異的に結合することができ、
前記オリゴペプチドは、２つのエピトープを含み、各会合性官能基は、飽和または不飽和であっても、直鎖または分枝鎖であっても、置換であっても非置換であってもよいＣ８−Ｃ２０炭化水素鎖であり、下記の構造から選択される構造を有する、スクリーニング方法。
【化３】
0005475451.tif 000017
（ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＺはエピトープ形成アミノ酸であり；ＡおよびＸはＤアミノ酸であり、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＺはＬアミノ酸であるか、またはＡおよびＸはＬアミノ酸であり、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＺはＤアミノ酸であり；１つのエピトープはドメインＣ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープはドメインＺ−Ｘ−Ｙから形成され；かつ各々のΣは会合性アミノ酸であり、
【化４】
0005475451.tif 000018
（ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺはエピトープ形成アミノ酸であり；１つのエピトープはドメインＤ−Ｃ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープはドメインＺ−Ｘ−Ｙ−Ｗから形成され；各々のΣは会合性アミノ酸である）
【請求項３２】
前記各ドメインは３つのエピトープ形成アミノ酸を含み、前記３つのエピトープ形成アミノ酸は交互の立体化学的配置を有し、
前記アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸類縁体またはそれらのＤ型である請求項３１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
会合性官能基に隣接する各エピトープ形成アミノ酸が、隣接する会合性官能基と同じ立体化学的配置を有する請求項３１または３２に記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
前記エピトープが同じものである請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
前記会合性のアミノ酸が、脂質アミノ酸であり、
前記脂質アミノ酸上に位置する少なくとも１つの前記会合性官能基が、Ｃ８−Ｃ２０直鎖炭化水素側鎖であるか、前記直鎖炭化水素側鎖が、Ｃ１０−Ｃ１６直鎖炭化水素側鎖である請求項３３または３４に記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
前記会合性アミノ酸がシステインであり、前記会合性官能基が、システインの側鎖のスルフヒドリル官能基に付加されたＣ８−Ｃ２０脂肪族炭化水素側鎖である請求項３３または３４記載のスクリーニング方法。
【請求項３７】
前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインおよびＣ−Ａ−Ｂドメインが、アミノ酸配列ＲＦＳ、ＲＳＦ、ＦＳＲ、ＦＲＳ、ＳＲＦ、ＳＦＲ、ＱＬＳ、ＱＳＬ、ＳＱＬ、ＳＬＱ、ＬＱＳまたはＬＳＱから選択され、かつ各々のΣが、８〜２０個の炭素数の長さの炭化水素鎖を含む直鎖炭化水素側鎖の会合性官能基を有する会合性脂質アミノ酸である請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３８】
前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインおよびＣ−Ａ−Ｂドメインが、ＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成する請求項３１〜３７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインがＲＦＳであり、前記Ｚ−Ｘ−ＹドメインおよびＣ−Ａ−Ｂドメインがそれぞれ、ＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成する請求項３１〜３８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
フェニルアラニンがＤ立体配置であり、セリンがＬ立体配置であり、アルギニンがＬ立体配置であり、各々の脂質アミノ酸がＬ立体配置である請求項３９記載のスクリーニング方法。
【請求項４１】
前記ドメインＣ−Ａ−Ｂが、ドメインＺ−Ｘ−Ｙと同じである請求項３１〜４０のいずれ１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項４２】
前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−Ｗドメインおよび／またはＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインが、アミノ酸配列ＹＥＫＡ（配列番号１）、ＹＥＡＫ（配列番号２）、ＹＡＫＥ（配列番号３）、ＹＡＥＫ（配列番号４）、ＹＫＡＥ（配列番号５）、ＹＫＥＡ（配列番号６）、ＥＹＫＡ（配列番号７）、ＥＹＡＫ（配列番号８）、ＥＫＡＹ（配列番号９）、ＥＫＹＡ（配列番号１０）、ＥＡＫＹ（配列番号１１）、ＥＡＹＫ（配列番号１２）、ＫＡＹＥ（配列番号１３）、ＫＡＥＹ（配列番号１４）、ＫＹＡＥ（配列番号１５）、ＫＹＥＡ（配列番号１６）、ＫＥＡＹ（配列番号１７）、ＫＥＹＡ（配列番号１８）、ＡＫＥＹ（配列番号１９）、ＡＫＹＥ（配列番号２０）、ＡＹＥＫ（配列番号２１）、ＡＹＫＥ（配列番号２２）、ＡＥＹＫ（配列番号２３）またはＡＥＫＹ（配列番号２４）から選択され、かつ各々のΣが、８〜２０個の炭素数の長さの炭化水素鎖を含む直鎖炭化水素側鎖の会合性官能基を有する脂質アミノ酸である請求項３１記載のスクリーニング方法。
【請求項４３】
前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−ＷドメインがＹＥＫＡであり、前記Ｄ−Ｃ−Ａ−ＢドメインがＥＹＡＫであり、前記Ｚ−Ｘ−Ｙ−ＷドメインおよびＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインが、タンパク質分解活性を阻害し得るエピトープを形成し、前記Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインが、Ｚ−Ｘ−Ｙ−Ｗドメインと同じである請求項４２記載のスクリーニング方法。
【請求項４４】
環状オリゴペプチドは、少なくとも１つのドメイン中のエピトープ形成アミノ酸として、アミノ酸のセリン、フェニルアラニンおよびアルギニンを含み、各ドメインがＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成し得る請求項３１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部拘束された環状オリゴペプチド、このようなオリゴペプチドを含む薬学的組成物、このようなオリゴペプチドおよび薬学的組成物の医薬における使用、ならびにこのようなオリゴペプチドを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質レセプターは通常、タンパク質分子全体のうちわずかな部分を構成する、アミノ酸の組み合わせであるエピトープを介して、その標的リガンドに結合することが公知である。
【０００３】
細胞の表面上のタンパク質レセプターはしばしば、タンパク質リガンドと名付けられる他のタンパク質への結合の結果として、細胞内のシグナルを生成する引き金となる。レセプターと相互作用するリガンドの部分は、エピトープと名付けられ、通常、互いに近接する少数のアミノ酸の組み合わせからなり、ペプチド鎖の骨格上に保持される。エピトープの例は、抗体またはＴ細胞レセプターと相互作用する、タンパク質の表面上の構造であるが、実際には、他者によって特異的に認識される、タンパク質の表面上の任意の構造が、エピトープの定義に該当し得る。エピトープを有するタンパク質レセプターの結合は、疾患の病因において、または逆に疾患状態の治療において重要な段階であり得るので、エピトープを形成する官能基の特定は新薬の開発のための潜在的に有意義な手段であり、その場合に、薬物はレセプターに結合するエピトープを含む薬剤である。
【０００４】
新規な薬物開発へのこのアプローチを妨げる２つの課題が存在する。１つは、疾患を治療するために適切なレセプターに結合するための薬物分子として使用され得るエピトープの特定である。第２の課題は、細胞レセプターとの強力な結合相互作用が達成され得るように、エピトープを形成するアミノ酸の組み合わせを保持して提示し得る分子を設計することである。
【０００５】
エピトープを形成し得るアミノ酸の組み合わせを特定するための方法は公知である。伝統的なコンビナトリアル化学では、特定のレセプターに結合するための最も有利な配列の特定のために、アミノ酸などの種々の基の、種々の順序での数百の可能な組み合わせの合成が行われ、各々について効力のための試験がなされなければならない。この過程は、時間がかかり、高価で、異なる成分を一緒に結合させるのに行われ得る化学の性質によって制約を受ける。
【０００６】
ＷＯ０１／０１１４０は、エピトープを特定するための改良法を提供する。リガンドと相互作用するための組成物が提供される。この組成物は、複数の別個の結合体の非共有結合性アセンブリを含み、各々の結合体は、頭部基および尾部基を含む。この結合体の尾部基は、疎水性凝集体を形成して、結合体はアセンブリ内でお互いに関して動きが自由であり、その結果、リガンドの存在下で、その頭部基の少なくとも２つが、各々の頭部基個々の相互作用よりも強力にリガンドと相互作用し得るエピトープを形成するように適切な配置を取る。所望の生物学的活性を有する複数の結合体は、頭部基の１つの配置との結合体のセットを選択すること、そこから、尾部基が疎水的に凝集して、その結合体が別の結合体に関して自由な動きを阻害するように、非共有結合性の会合を形成すること、そして非共有結合性会合とリガンドとの間の十分な相互作用をアッセイすること、によって特定され得る。このプロセスは、非共有結合性会合とリガンドとの間の十分な相互作用を見出すために、頭部基の配置を修飾することで繰り返され得る。このプロセスにより、種々の基の潜在的な数百の組み合わせを合成して伝統的なコンビナトリアル化学を用いる必要はなく、会合由来のエピトープを得るために頭部基の接近に依存することによって、特定のレセプターに結合するための最も有利な配列を特定することが可能になる。この方法は、単に、会合由来のエピトープを得るために頭部基を接近させることに依存する。一旦、結合体のセットが合成されれば、さらなる合成化学は必要なく、単に結合体を混合して、非共有結合性会合による種々のプローブを形成すればよい。
【０００７】
この新規な組成物および方法は、エピトープを形成して標的リガンドに結合する官能基を特定するためには一応成功しているが、所望のエピトープを形成し得て、かつ改善された安定性と特異性を伴って標的リガンドと相互作用して生物学的応答を生じ得る改良された組成物を得ることが依然として必要である。
【０００８】
結合部位を含むアミノ酸のみから構築されたエピトープに類似のペプチドを作る試みは、これらのペプチドがタンパク質レセプターと同じ生物学的活性を有しないため、しばしば失敗している。
【０００９】
タンパク質の結合部位が、タンパク質鎖の種々の非連続部分由来のオリゴペプチドから構築される場合には、単離されたオリゴペプチドを遊離溶液中で混合することによって結合部位を再構築する試みは、活性な結合部位を生じさせない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ０１／０１１４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明は、所望のエピトープを形成し得て、改善された安定性と特異性を伴って標的リガンドと相互作用して生物学的応答を生じ得る、改良されたオリゴペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、標的リガンドに特異的に結合するための少なくとも６つのアミノ酸の環を含む環状オリゴペプチドを提供し、前記環は、複数のアミノ酸ドメインを含み、各ドメインは、少なくとも２つのエピトープ形成アミノ酸と、２つ以上の会合性の官能基であって１つ以上の環内会合を形成するように配置された会合性官能基とを含む；これによって前記環状オリゴペプチドは、単一の立体配置を取るように拘束され、その結果、前記エピトープ形成アミノ酸は、各ドメイン中でエピトープを形成し、各エピトープは、標的リガンドに特異的に結合し得る。
【００１３】
環状ペプチドは、直鎖オリゴペプチドよりも動きが制限された立体配置を有することがこの分野で公知である。ペプチドの末端の自由な動きは、環状ペプチドにおいては、末端が化学的に共に固定されているために制限される。しかし、環状ペプチドは依然として、かなりの程度の柔軟性を有し、そのために標的リガンドとの安定な結合性相互作用に関与するには不適切である。
【００１４】
２つ以上の会合性の官能基であって、１つ以上の環内会合を形成するように配置された会合性官能基により環状オリゴペプチドを構築することによって、環状オリゴペプチドは単一の立体配置を取るように内部拘束される。これによって、エピトープ形成アミノ酸は、各々のドメインにおいて、これまで可能であったよりも高い安定性かつ特異性をもって、標的リガンドに特異的に結合することが可能になる。このエピトープ形成アミノ酸は、リガンドと相互作用して生物学的応答を誘発するための安定なエピトープを形成することができる。エピトープは安定して形成されるため、標的リガンドとの相互作用が改善される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
米国特許出願公開第２００５／０１０７２８９号は、交互のＤ−およびＬ−α−アミノ酸またはβ−アミノ酸のアミノ酸配列を有する環状ペプチドを包含する、抗菌剤および組成物を開示している。この文献はさらに、環状ペプチドが微生物膜内で、または微生物膜との会合によって、超分子構造に自己集合すると考えられることを開示している。このような超分子構造は、例えば、ナノチューブであってもよい。各々のナノチューブは、チューブの中心に細孔を有し、チューブの中心はスタックされた環状ペプチドの一連のペプチド骨格によって囲まれる。イオンおよび小分子はナノチューブの細孔を通じて移動し得る。
【００１６】
米国特許出願公開第２００５／０１０７２８９号は、環状ペプチドがエピトープ形成アミノ酸を含み、これが標的リガンドに特異的に結合し得るエピトープを形成することを開示してはいない。米国特許出願公開第２００５／０１０７２８９号はまた、環状ペプチドが、このようなエピトープの形成を可能にするために環内会合によって拘束されることも開示してはいない。
【００１７】
Ｇ．Ａｂｂｅｎａｎｔｅら、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  Ｔｈｉａｚｏｌｅ  ａｎｄ  Ｏｘａｚｏｌｉｎｅ  Ｒｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎｏｖｅｌ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈａｉｒ  ａｎｄ  Ｂｏａｔ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，１０３８４〜１０３８８」は、海洋の大員環の三次元構造および反応性を調節するための立体構造的な環の拘束（オキサゾリン、チアゾール）としてアミノ酸構築ブロック（Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）の適応を開示する。環状オクタペプチド１，ｃ［Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｙｃ−］は極めて柔軟であって、多くの低エネルギー構造をとる。この環状オクタペプチドは、なんら環内会合を有さず、複数のエピトープを形成する単一の立体配置を取るようには拘束されない。
【００１８】
Ｇ．Ａｂｂｅｎａｎｔｅら、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  Ｔｈｉａｚｏｌｅ  ａｎｄ  Ｏｘａｚｏｌｉｎｅ  Ｒｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｏｒｉｇｉｎ．Ｎｏｖｅｌ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈａｉｒ  ａｎｄ  Ｂｏａｔ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，１０３８４〜１０３８８」はまた、溶液中で単一の擬チェア形（ｐｓｅｕｄｏｃｈａｉｒ）立体配置を示す、環状ペプチド２，ｃ［Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄ−（Ｖａｌ）Ｔｈｚ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄ−（Ｖａｌ）Ｔｈｚ−］を開示している。環状ペプチド７，ｃ［（Ｉｌｅ）Ｏｘｎ−Ｄ−（Ｖａｌ）−Ｔｈｚ−（Ｉｌｅ）Ｏｘｎ−Ｄ−（Ｖａｌ）Ｔｈｚ−］が合成され、高度に拘束された擬ボート形（ｐｓｅｕｄｏｂｏａｔ）またはサドル形状の大員環が製造された。７の酸加水分解によって製造された環状オクタペプチド８は、より高い柔軟性を有するボート形立体配置を示した。これらの環状オクタペプチドは、オキサゾリンおよび／またはチアゾールの存在によってある程度まで拘束されるが、それらは複数のエピトープを形成しない。
【００１９】
Ｒ．Ｍ．Ｃｕｓａｃｋら、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ｕｐｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．２，２０００，３２３−３３１」は、複素環のチアゾールおよびオキサゾリン環拘束の数が異なる４つの環状オクタペプチドを開示する。ペプチド１、２および３は、溶液中で異なる形状をとる。これらの環状オクタペプチドは、オキサゾリンおよび／またはチアゾールの存在によってある程度まで拘束されるが、それらは複数のエピトープを形成しない。
【００２０】
Ｒ．Ｍ．Ｃｕｓａｃｋら、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ｕｐｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．２，２０００，３２３〜３３１」はまた、オキサゾリンおよびチアゾール環を欠くペプチド４を開示しており、分子モデリングによって、水素結合以外になんら拘束のないこれらの環状ペプチドは極めて柔軟であって、溶液中で潜在的に無数の立体配置をとり得ることを示した。ペプチド４は、なんら環内会合を有さず、複数のエピトープを形成する単一の立体配置を取るようには拘束されない。
【００２１】
本発明の環状オリゴペプチドを、以下にさらに詳細に説明する。
【００２２】
この環状オリゴペプチドは、少なくとも６つのアミノ酸の環を含み、この環は複数のアミノ酸ドメインを含み、各ドメインは少なくとも２つのエピトープ形成アミノ酸と、２つ以上の会合性官能基とを含む。
【００２３】
一実施形態では、環状オリゴペプチドは、６つのアミノ酸の環からなり、ここでこの環は２つのアミノ酸ドメインからなり、各ドメインは、２つのエピトープ形成アミノ酸と、２つの会合性官能基とからなる。好ましい実施形態では、この環状オリゴペプチドは、８つのアミノ酸の環からなり、この環は、２つのアミノ酸ドメインからなり、各ドメインは３つのエピトープ形成アミノ酸と、２つの会合性官能基とからなる。
【００２４】
別の実施形態では、この環状オリゴペプチドは、８つを超えるアミノ酸の環を含む。この実施形態では、好ましくは、この環は３つの会合性官能基を含み、この官能基が環内会合を形成して、３つのアミノ酸ドメインを生じ、各ドメインが３つのエピトープ形成アミノ酸を含む。
【００２５】
環状オリゴペプチドで使用されるアミノ酸は、任意の天然のアミノ酸、その置換誘導体、類縁体およびＤ型のいずれでもよい。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、交互する立体化学的配置を有する３つのエピトープ形成アミノ酸があり、すなわち、Ｌ−Ｄ−ＬまたはＤ−Ｌ−Ｄのいずれかである。これは、エピトープ形成アミノ酸の側鎖が平面の立体配置に配向し、全てが同じ方向に向くことを可能にするので、特に有利である。これによって、エピトープ形成アミノ酸は、お互いに近接してエピトープを形成することができる。
【００２７】
別の実施形態では、環状オリゴペプチドは、１０のアミノ酸の環からなり、ここでこの環は２つのアミノ酸ドメインからなり、各ドメインは、４つのエピトープ形成アミノ酸と、２つの会合性官能基とからなる。エピトープ形成アミノ酸は、同じまたは交互する立体化学的配置を有してもよく、すなわち、Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ、Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｄ、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｄ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｄ、Ｄ−Ｌ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｄ−Ｄ、Ｄ−Ｄ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ、Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ、Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｌ、Ｄ−Ｌ−Ｌ−Ｄ、Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｄ、Ｄ−Ｄ−Ｌ−Ｄ、Ｄ−Ｄ−Ｄ−ＬまたはＬ−Ｄ−Ｄ−Ｄである。
【００２８】
会合性官能基は、環状オリゴペプチド中で、１つ以上の環内会合を形成し、それによって環状オリゴペプチドが単一の立体配置をとるように拘束され、その結果エピトープ形成アミノ酸は各ドメイン中でエピトープを形成する。環状オリゴペプチド中での単一の立体配置の形成は、当該分野で周知の多数の異なる方法によって測定され得る。標準的な分光学的方法、例えば、１Ｈ  ＮＭＲ分光法、円二色性、旋光分散またはＸ線結晶学を用いて、環状オリゴペプチドの立体配置を決定してもよい。
【００２９】
エピトープ形成アミノ酸が各ドメイン中でエピトープを形成するのは、環状オリゴペプチドが、１つ以上の環内会合によって、単一の立体配置をとるように拘束されるからである。形成されたエピトープは、標的リガンドに特異的に結合し得る。エピトープおよび標的リガンドの具体的な構造は、本発明においては限定されない。本発明の目的はオリゴペプチドの足場を提供することであって、少なくとも２つのエピトープ形成アミノ酸、それらの類縁体または誘導体の任意の適切な組み合わせからなる複数のエピトープを提示する足場であるオリゴペプチドを、エピトープがレセプターのような特異的な標的リガンドに強力に結合することを可能にするのに十分な立体硬直性をもつ安定な立体配置をこれらのエピトープ形成アミノ酸が維持するような方法で、提供することである。当業者にはエピトープ形成アミノ酸の配列は公知であり得る、または当業者は標的リガンドと相互作用するエピトープを得るためにＷＯ０１／０１１４０号公報に開示されるような方法を用いることができる。当業者は、エピトープを形成するために適切なアミノ酸を容易に選択できるため、全ての可能なエピトープの詳細な化学構造を必要としない。エピトープ形成アミノ酸の任意の配列が任意の所定の状況において適切であり、これは標的リガンドに依存する。さらに、各々のドメイン中のアミノ酸の順序は、形成されたエピトープの活性を決定し得て、かつ標的リガンドにも依存する。標的リガンドの生物学的活性が公知である場合には、リガンドの正確な化学構造を知る必要はない。エピトープ形成アミノ酸は、リガンドの正確な化学構造の知識を必要とすることなく、本発明の環状オリゴペプチド中に含まれてもよい。なぜなら、リガンドと関連する生物学的機能は、エピトープリガンド相互作用が生じるか否かを決定するために測定され得るからである。当業者は、適切な試験モデルで得られる実験データに基づいて、エピトープ形成アミノ酸として環状オリゴペプチドに含まれるアミノ酸を容易に選択し、所望の活性について試験することによって各々のドメインにおけるどの順序のアミノ酸が最適な生物学的活性をもたらすかを決定できる。
【００３０】
環状オリゴペプチドと標的リガンドとの間の相互作用を決定するためのアッセイの例としては、抗体と抗原との間の会合の検出のためのＥＬＩＳＡ原理を利用するアッセイなどの結合アッセイが挙げられ得る。他の適切なインビトロアッセイとしては、環境感受性の膜結合した蛍光プローブの蛍光の改変、沈降反応、酵素活性の促進または阻害などが挙げられる。インビトロで培養された細胞の挙動を変更する材料の能力に依存するアッセイ、例えば、細胞死、細胞増殖、アポトーシス、細胞間接触の阻害または刺激、サイトカインまたは他の可溶性生成物の分泌、特定のｍ‐ＲＮＡの合成、細胞内小胞輸送、細胞シグナル伝達プロセスの変更についてのアッセイなども適切であり得る。動物またはヒトそのものにおけるインビボアッセイ、例えば、環状オリゴペプチドへ放射性標識を組み込み、その後に、種々の経路による投与後の引き続く標識の分布を検討することも、行うことができる。
【００３１】
エピトープは各々のドメインで形成される。従って、環状オリゴペプチドで形成されるエピトープの数は少なくとも２つ、好ましくは２つまたは３つである。環状オリゴペプチドにおけるエピトープは、同じであっても異なってもよい。環状オリゴペプチド中のエピトープが異なる場合、各々のドメインは、異なるアミノ酸を有しても、または同じアミノ酸を異なる順序で有してもよい。そのようなエピトープの例は、アミノ酸のセリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびアルギニン（Ｒ）の組み合わせによって形成されるエピトープであって、マクロファージ上の細胞表面レセプターに結合する。細胞表面レセプターへのエピトープの結合によってＴＮＦ分泌が阻害されることになる。
【００３２】
<環内会合>
１つ以上の環内会合は、複数のアミノ酸ドメインを有する単一の立体配置へと環状オリゴペプチドを拘束するように働く。各々のドメイン中のエピトープ形成アミノ酸は、固く拘束されて、動きの自由度は極めて制限されている。これによって、各々のドメインにおいて安定なエピトープの形成が可能になり、これが、改善された安定性および標的リガンドとの特異性と相互に作用して生物学的応答を生じ得る。
【００３３】
各々の環状オリゴペプチドにおける会合性の官能基の数および選択される会合性の官能基のタイプは、エピトープ形成アミノ酸および標的リガンドに依存する。会合性の官能基の数および性質は、環状オリゴペプチドの生物学的活性に影響し得る。当業者は、所望の活性について試験することによって、用いるべき会合性の官能基の最も有効な数およびタイプを容易に選択し得る。
【００３４】
１つ以上の環内会合は、２つ以上の適切に配置された会合性の官能基によって形成される。少なくとも１つの会合性の官能基は、好ましくは各々のアミノ酸ドメインの間に配置される。
【００３５】
１つ以上の環内会合は、共有結合であっても非共有結合であってもよい。環状オリゴペプチド中の会合性の官能基は、同じであっても異なっていてもよい。
【００３６】
会合性の官能基は、会合性のアミノ酸上に位置し得る。一実施形態では、会合性の官能基は、会合性のアミノ酸の側鎖であり、またはこの会合性のアミノ酸の修飾された側鎖であり、またはこの会合性のアミノ酸の側鎖上に付加された基である。この実施形態の例を、以下の構造Ｉに示す。
【００３７】
また、会合性の官能基は、窒素に結合した水素の置換によって環状オリゴペプチド環におけるペプチド結合の窒素原子上に位置し得る。この実施形態の例を、以下の構造ＩＩに示す。
【００３８】
さらに別の実施形態では、会合性の官能基は、オリゴペプチド環内に位置する、アミノ酸でない他の適切な基の上に位置し得る。このような基の例は、αヒドロキシカルボン酸であり、ここではヒドロキシ基は、ペプチド結合ではなくエステル結合に関与する。
【００３９】
「２つ以上の会合性の官能基」という表現は、以下の実施形態を包含する：
●環内会合が非共有結合である場合：
○会合性の官能基は、その環内の会合性のアミノ酸に位置するオリゴペプチド環由来の２つのペンダント基であって、これらが会合して非共有結合的な会合を形成するか；
○会合性の官能基は、環内のペプチド結合の窒素原子上に位置するオリゴペプチド環由来の２つのペンダント基であって、これらが会合して非共有結合的な会合を形成するか；
○会合性の官能基は、環に配置される他の適切な基上に位置するオリゴペプチド環由来の２つのペンダント基であって、これらが会合して非共有結合的な会合を形成するか；または
●環内会合が共有結合である場合：
○会合性の官能基は、その環内の会合性のアミノ酸に位置する２つの基であり、これらが結合して、直接またはリンカー例えば二官能性基を介して、共有結合を形成するか；
○会合性の官能基は、環内のペプチド結合の窒素原子上に位置する２つの基であって、これらが結合して、直接またはリンカー例えば二官能性基を介して、共有結合を形成するか；または
○会合性の官能基は、環に配置される他の適切な基上に位置する２つの基であって、これらが結合して、直接またはリンカー例えば二官能性基を介して、共有結合を形成する。
【００４０】
「に位置する（ｂｏｒｎｅ  ｏｎ）」という表現は、会合性の基が、会合性のアミノ酸、窒素原子または他の適切な基に対して、直接、または適切なリンカーを介して結合することを意味する。
【００４１】
好ましい実施形態では、会合性の官能基間の１つ以上の環内会合は、非共有結合である。非共有結合の環内会合は、それによって環状オリゴペプチドが、立体的硬直性と柔軟性との間の正しいバランスを有することが可能になるため、本発明では特に好ましい。環状オリゴペプチドは、１つの立体配置においてペプチド骨格を保持するのに十分な硬直性を有し、これによってエピトープ形成アミノ酸は、標的リガンドに対して特異的に結合し得るエピトープを形成するのに十分なほど共にかつ正確に近接して配置されることが保証される。環状オリゴペプチドはまた、エピトープ形成アミノ酸が結合し得る標的リガンドの正確な構造に適合するため、エピトープ形成アミノ酸の側鎖の十分な動きを許容するのに十分な柔軟性を有する。それゆえ、非共有結合的な環内会合を含む本発明の環状オリゴペプチドは、改善された安定性および標的リガンドとの特異性と相互に作用して、生物学的応答を生じ得る。
【００４２】
好ましくは、環内会合は疎水性である。特に好ましい実施形態では、２つのアミノ酸ドメインおよび２つの親油性の会合性官能基が存在する。
【００４３】
非共有結合性の環内会合、特に疎水性相互作用による環内会合の使用は、有利である。なぜなら、これによって、３つ以上の会合性官能基の間の相互作用から、環内会合の形成が可能になるからである。これによって、共有結合性の環内会合が用いられるときには困難な、３つ以上のアミノ酸ドメインの形成が可能になる。従って、本発明の他の好ましい実施形態では、環状オリゴペプチドは、環内会合を形成して３つ以上のアミノ酸ドメインを生じる３つ以上の会合性官能基を含んでいてもよい。疎水性相互作用によって非共有結合性の環内会合を形成するために親油性の会合性官能基を使用することは、環状オリゴペプチドが大きい場合に特に有利である。
【００４４】
非共有結合性の１つ以上の環内会合を形成するように配置される会合性官能基は、環状オリゴペプチド環の一部を形成する適切な立体化学をもつ適切な基に位置する任意の分子を含んでいてもよい。会合性官能基は、好ましくは、会合性のアミノ酸またはそれらの類縁体に位置し、その例を以下に引用するが、環状オリゴペプチド環に挿入され得る他の基が使用されてもよい。会合性官能基が位置する基は、ペプチド結合によって環に連結されることが一般に好ましい。別の実施形態では、１つ以上のペプチド結合は、他のタイプの結合によって置換されてもよい。このような結合の例は、エステル結合、エーテル結合、チオエステル結合およびチオエーテル結合である。これは、体液中のプロテアーゼによる攻撃を制限するために、場合によっては望ましい。
【００４５】
会合性のアミノ酸は、会合性官能基を保有する天然のアミノ酸を含み得る。
【００４６】
好ましくは、会合性のアミノ酸は、脂質アミノ酸の類縁体である。例えば、会合性のアミノ酸は、システイン、グリシン、リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸からなるものであってもよい。システインの場合には、会合性官能基は、スルフヒドリル官能基を介してシステインの側鎖上に付加された脂肪族基であってもよい。リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸も、このように、会合性官能基を側鎖上に付加することによって使用されてもよい。会合性のアミノ酸は、あるいは、側鎖残基が単一の脂肪族基であるアミノ酸であってもよく、この脂肪族基が会合性官能基を構成する。例えば、会合性のアミノ酸がグリシンに基づく場合、グリシンのα位水素は、会合性官能基を構成する脂肪族基によって置換されてもよい。
【００４７】
上記の、会合性官能基を形成し得る脂肪族基は、好ましくは脂肪族炭化水素鎖であり、好ましくは８〜２０個の炭素原子を有し、さらに好ましくは１０〜１６個の炭素原子、最も好ましくは１０個または１２個の炭素を含む脂肪族炭化水素鎖である。脂肪族基は、飽和もしくは不飽和であっても、直鎖もしくは分枝鎖であってもよく、非置換であっても、または例えばハロゲン原子で全部または部分的に置換されてもよい。あるいは、脂肪族基は、シラン部分から構成されてもよい。
【００４８】
下記の例示的な構造Ｉでは、会合性のアミノ酸は、α位水素がＣ１０炭化水素鎖で置換されているグリシンである。
【００４９】
【化１】
0005475451.tif 000002
【００５０】
一実施形態では、会合性官能基が環のペプチド結合の窒素原子上に位置する場合、非共有結合性の環内会合、例えば、疎水性会合は、ペプチド結合の窒素上の水素原子を、例えば上記のような脂肪族基などの会合性官能基によって置換することによってもたらされ得る。
【００５１】
本発明の環状オリゴペプチドにおけるペプチド結合の窒素上の水素原子を会合性官能基により置換することは、先ず、水素原子を、例えば−ＳＨ、−ＯＨまたは−ＮＨ２などの適切な官能基をもつメチレン基で置換し、続いて、上記のような脂肪族基などの会合性官能基で誘導体化することによって行われ得る。
【００５２】
この実施形態の一局面では、窒素は、別々のアミノ酸ドメイン由来の２つのエピトープ形成アミノ酸を連結するペプチド結合由来であり、本発明の環状オリゴペプチドは、下記の構造ＩＩを有してもよい：
【００５３】
【化２】
0005475451.tif 000003
ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＺは、エピトープ形成アミノ酸であり、ＮはＢ／Ｚ間とＣ／Ｙ間のペプチド結合の窒素であり、Φは、窒素に結合した、上記のような脂肪族基などの会合性官能基である。
【００５４】
非共有結合性の、特に疎水性の会合性官能基を用いるさらなる利点は、これによって分子間相互作用が可能になること、すなわち種々の環状オリゴペプチド由来の疎水性の会合性官能基が互いに会合して、異なる方向に配向した複数の反復エピトープを含む二量体またはオリゴマーを生成することができることである。そのような相互作用が生じる範囲は環状オリゴペプチドの配列構造に依存し、それがアミノ酸ドメインの相対的親水性を決定する。これはさらに、会合性官能基の慎重な選択によって制御されてもよく、ここで会合性官能基のキラリティおよびかさ高さは、曝されるオリゴペプチドの疎水性表面の正確な量を制御するために改変されてもよい。これは、他の内部拘束された環状オリゴペプチドとの分子間相互作用、またはタンパク質もしくはシクロデキストリンのような他の分子との相互作用を調節するのに有利であり得る。このことは、本発明の２つ以上の環状オリゴペプチドを含む小さな多量体構造、すなわち、同時に２つ以上の細胞表面レセプターに結合することができ、それによって、強力な開始トリガーが細胞に提示されシグナルカスケードを生じるような方法でそれらのレセプターが架橋している多量体構造を作製するのに有利であり得る。
【００５５】
本発明の環状オリゴペプチドと、本発明の他の同一でない環状オリゴペプチドとの相互作用は、異なるオリゴペプチドによる構造に起因する異なるエピトープのおかげで複数の官能性を有する多量体構造を作製するのに有利であり得る。従って、例えば、１つのオリゴペプチドは、多量体構造が内部移行することを可能にするレセプターに結合する１つ以上のエピトープを含んでもよく、一方、多量体構造内の第２のオリゴペプチドは、内部移行後に、細胞の内側のシグナル伝達カスケードの構成要素と相互作用し得る１つ以上のエピトープを含んでもよい。
【００５６】
本発明の環状オリゴペプチドにシクロデキストリンが結合することは、異なるオリゴペプチドの疎水性部分間の相互作用のレベルを低減することを助け、これによって、大きな凝集体、つまりその活性が、これらの大きい凝集体におけるエピトープの立体障害のせいでモノマーまたはオリゴマーと比較して低下し得るような大きな凝集体の形成を妨げることができる。
【００５７】
アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質の溶液においては、本発明の１つ以上の環状オリゴペプチドはそのタンパク質の表面に結合して、ペプチド中の疎水性の会合性官能基の親油性部分と、アルキルまたはアシル炭化水素鎖に対して親和性を有するタンパク質の領域との会合を生じさせる。本発明の１つ以上の環状オリゴペプチドの、大きいタンパク質の表面へのそのような結合は、細胞中のシグナル伝達相互作用の誘発が最大化されるような形で、環状オリゴペプチド上のエピトープの複数の配列が提示される構成の１方法である。
【００５８】
さらなる実施形態では、会合性官能基の間の１つ以上の環内会合は、共有結合である。この実施形態では、会合性官能基はまた、会合性のアミノ酸上に存在してもよい。例えば、会合性官能基は、システイン（会合性のアミノ酸）の側鎖であってもよく、会合は、これらの側鎖の間の環内ジスルフィド結合によって形成される。また、会合性のアミノ酸は、リジンおよびグルタミン酸であってもよく、その場合はそれらの側鎖（会合性官能基）上の末端基を通じたペプチド結合の形成によって共有結合的に会合することができ、あるいは、反応してエステル結合を形成し得るグルタミン酸およびセリンであってもよい。同じ官能性部分を有するこれらのアミノ酸の類縁体を用いることもできる。
【００５９】
一実施形態では、共有結合的な環内会合は、その環中のペプチド結合の窒素原子に結合した水素を、共有結合的会合を形成する会合性官能基で置換することによって達成され得る。会合性官能基は、チオールであっても、またはそれらの末端で共有結合的な会合を形成し得る官能基を有する他の鎖であってもよい。本発明の環状オリゴペプチド中のペプチド結合の窒素上の水素原子を会合性官能基により置換することは、先ず、例えば、−ＳＨ、−ＯＨ、または−ＮＨ２などの適切な官能基を有するメチレン基で水素原子を置換すること、次いで、その官能基を二官能性反応剤に連結する第２の工程によって行われ得る。共有結合的会合は、さらに、第２の水素原子（環状オリゴペプチド内の適切な位置にあるペプチド結合の窒素上にある）を、適切な官能基を有する第２のメチレン基で置換することによって形成され、上記の二官能性反応剤が、さらにその第２のメチレン基の官能基に連結されて、環状オリゴペプチド中のペプチド結合の２つの窒素原子間に共有結合が作製される。環状オリゴペプチドに組み込まれた会合性官能基の性質に依存して、適切な二官能性反応剤は、短い鎖であって、各末端が、限定はしないが、以下に列挙するものから選択される官能基を有する短い鎖を含む反応剤であってもよい：カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ブロモ基、ヨード基、シアノ基、アゾ基およびボロン酸基。
【００６０】
環状オリゴペプチドが２つのアミノ酸ドメインおよび２つの会合性官能基を含む本発明の特定の局面では、各々が会合性のアミノ酸上に位置し、エピトープが各々のドメイン中の３つのエピトープ形成アミノ酸から形成され、この環状オリゴペプチドは、下記の構造を有する：
【００６１】
【化３】
0005475451.tif 000004
ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＺは、エピトープ形成アミノ酸であり；ＡおよびＸは、Ｄアミノ酸であり、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＺは、Ｌアミノ酸であるか、または、ＡおよびＸは、Ｌアミノ酸であり、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＺはＤアミノ酸である；１つのエピトープは、ドメインＣ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープは、ドメインＺ−Ｘ−Ｙから形成され；各々のΣは、会合性官能基を有する会合性のアミノ酸である。
【００６２】
本発明による環状オリゴペプチドの一例では、Ｚ−Ｘ−Ｙドメインおよび／またはＣ−Ａ−Ｂドメインは、アミノ酸配列ＲＦＳ、ＲＳＦ、ＦＳＲ、ＦＲＳ、ＳＲＦ、ＳＦＲ、ＱＬＳ、ＱＳＬ、ＳＱＬ、ＳＬＱ、ＬＱＳまたはＬＳＱから選択されてもよく、各々のΣは会合性官能基としてＣ１０直鎖炭化水素側鎖を有する脂質アミノ酸である。好ましくは、Ｚ−Ｘ−Ｙドメインは、ＲＦＳであって、ここでフェニルアラニンはＤ配置を有し、セリンはＬ配置を有し、アルギニンはＬ配置を有し、各々の脂質アミノ酸はＬ配置を有することが好ましい。好ましい実施形態では、各々上記の配列から選択されたＺ−Ｘ−Ｙドメインおよび／またはＣ−Ａ−Ｂドメインが、ＴＮＦ分泌を抑制し得るエピトープを形成する。従って、これらの配列は、ＴＮＦが増悪因子である疾患、例えば、癌、肥満、心疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患から選択される疾患の治療において有用であり得る。これらの配列は、関節リウマチ、多発性硬化症およびクローン病から選択される自己免疫疾患を治療するために用いられ得る。
【００６３】
上記の構造では、ドメインＣ−Ａ−Ｂは、ドメインＺ−Ｘ−Ｙと同じであっても、または異なっていてもよい。
【００６４】
本発明のさらなる局面では、環状オリゴペプチドは３つのアミノ酸ドメインを含み、エピトープは、各々のドメインにおける３つのエピトープ形成アミノ酸から形成され、好ましくはそのオリゴペプチドは、３つの会合性官能基を含む。
【００６５】
本発明のさらなる局面では、環状オリゴペプチドは、２つのドメインを含み、エピトープは、各々のドメインにおける４つのエピトープ形成アミノ酸から形成される。本発明のこの局面の一実施形態では、環状オリゴペプチドは、下記の構造を有する：
【００６６】
【化４】
0005475451.tif 000005
ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、エピトープ形成アミノ酸であり；１つのエピトープは、ドメインＤ−Ｃ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープは、ドメインＺ−Ｘ−Ｙ−Ｗから形成され；各々のΣは、会合性のアミノ酸である。
【００６７】
本発明のこの局面の別の実施形態では、環状オリゴペプチドは、下記の構造を有する：
【００６８】
【化５】
0005475451.tif 000006
ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺはエピトープ形成アミノ酸であり；１つのエピトープは、ドメインＤ−Ｃ−Ａ−Ｂから形成され、１つのエピトープは、ドメインＺ−Ｘ−Ｙ−Ｗから形成され；各々のＮは、Ｂ−Ｚ間およびＤ−Ｗ間のペプチド結合の窒素であり、各々のΦは、窒素を介して結合した会合性官能基である。
【００６９】
本発明のこの局面による環状オリゴペプチドの一例では、Ｚ−Ｘ−Ｙ−Ｗドメインおよび／またはＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインは、アミノ酸配列ＹＥＫＡ（配列番号１）、ＹＥＡＫ（配列番号２）、ＹＡＫＥ（配列番号３）、ＹＡＥＫ（配列番号４）、ＹＫＡＥ（配列番号５）、ＹＫＥＡ（配列番号６）、ＥＹＫＡ（配列番号７）、ＥＹＡＫ（配列番号８）、ＥＫＡＹ（配列番号９）、ＥＫＹＡ（配列番号１０）、ＥＡＫＹ（配列番号１１）、ＥＡＹＫ（配列番号１２）、ＫＡＹＥ（配列番号１３）、ＫＡＥＹ（配列番号１４）、ＫＹＡＥ（配列番号１５）、ＫＹＥＡ（配列番号１６）、ＫＥＡＹ（配列番号１７）、ＫＥＹＡ（配列番号１８）、ＡＫＥＹ（配列番号１９）、ＡＫＹＥ（配列番号２０）、ＡＹＥＫ（配列番号２１）、ＡＹＫＥ（配列番号２２）、ＡＥＹＫ（配列番号２３）またはＡＥＫＹ（配列番号２４）から選択されてもよく、各々のΣは８〜２０の炭素数の長さをもつ炭化水素鎖を含む直鎖炭化水素側鎖の会合性官能基を有する脂質アミノ酸である。好ましくは、Ｚ−Ｘ−Ｙ−Ｗドメインは、ＹＥＫＡ（配列番号１）であり、Ｄ−Ｃ−Ａ−ＢドメインはＥＹＡＫ（配列番号８）である。好ましい実施形態では、上記の各々の配列から選択されるＺ−Ｘ−Ｙ−Ｗドメインおよび／またはＤ−Ｃ−Ａ−Ｂドメインは、タンパク質分解活性を阻害し得るエピトープを形成する。従って、これらの配列は、循環器疾患、循環障害およびＨＩＶなどの、プロテアーゼ活性が増悪因子である疾患を治療するために用いられ得る。
【００７０】
本発明のこの局面の一実施形態では、ドメインＤ−Ｃ−Ａ−Ｂは、ドメインＺ−Ｘ−Ｙ−Ｗと同じである。
【００７１】
<組成物>
さらなる局面では、本発明は、上記のような環状オリゴペプチドおよび薬学的に受容可能な添加剤および／またはアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。添加剤は、好ましくは、トランスクトール、ポロキサマーブロックコポリマー、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤または胆汁酸塩から選択される。添加剤が非イオン性界面活性剤である場合、好ましくは、ポリエチレングリコールのアシルエステル、またはポリエチレングリコールの脂肪族エーテルから選択される。
【００７２】
上記のとおり、本発明の一実施形態では、環内会合は、別個の環状オリゴペプチドの間で形成され、その場合には、異なる環状オリゴペプチド由来の疎水性の会合性官能基は互いに会合して、種々の方向に配向した複数の反復エピトープを含む二量体またはオリゴマーを生成し得る。環の間の相互作用の範囲は、疎水性部分の水性媒体中への溶解を補助する添加剤と一緒に混合することによって改変され得る。
【００７３】
<使用>
さらなる局面では、本発明は、医薬、予防薬または診断薬として使用するための、上記の環状オリゴペプチド、または上記の組成物を提供する。
【００７４】
本発明はまた、ＴＮＦが増悪因子である疾患を治療するための医薬を製造するための、上記の環状オリゴペプチドまたは上記の組成物の使用を提供する。好ましくは、その疾患は、肥満、心疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患から選択される。さらに好ましくは、その疾患は、関節リウマチまたはクローン病である。上記の環状オリゴペプチドは、ＴＮＦが増悪因子である癌を処置するために用いられ得る。癌は、良性であっても悪性であってもよい。癌は、好ましくは固形腫瘍である。そのような癌としては、限定はしないが、卵巣癌、乳癌、皮膚癌および上皮性癌が挙げられる。
【００７５】
本発明はまた、循環器疾患、循環障害およびＨＩＶを含む、プロテアーゼ活性が増悪因子である疾患を治療するための医薬を製造するための、上記の環状オリゴペプチドまたは上記の組成物の使用を提供する。本発明の１つの特定の実施形態では、環状オリゴペプチド中の各々のドメインは、エピトープ形成アミノ酸ＳＲＥＲ（配列番号２５）、ＳＥＲＥ（配列番号２６）、ＥＹＫＡ（配列番号７）、ＹＥＡＫ（配列番号２）、ＳＦＲまたはＲＦＳを含み、これらは、実施例７でトロンビンタンパク質分解活性を阻害することが示された。
【００７６】
上記の、本発明の１つの特定の実施形態では、環状オリゴペプチドは、少なくとも１つのドメイン中のエピトープ形成アミノ酸として、アミノ酸のセリン、フェニルアラニンおよびアルギニンを含む。これらのオリゴペプチドは、マクロファージからのＴＮＦの分泌を阻害する活性をもつことが示された。この実施形態の好ましい局面では、会合性官能基は、Ｃ１２炭化水素側鎖を有する脂質アミノ酸であって、エピトープ形成アミノ酸は、ＲＦＳ、ＦＳＲまたはＳＲＦから選択され、ここで、中央のアミノ酸はＤ型であって、外側の２つのアミノ酸はＬ型である。環状オリゴペプチド中の各々のエピトープは、同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００７７】
ＴＮＦ分泌を下方制御する能力のおかげで、これらのオリゴペプチドは、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、肥満、心疾患、自己免疫疾患および炎症の過程が関与する他の病気などの疾患の治療に効力を有し得る。ＴＮＦ分泌を下方制御する能力のおかげで、これらのオリゴペプチドはまた、ＴＮＦが増悪因子である癌の治療に効力を有し得る。癌は、良性であっても、または悪性であってもよい。癌は、好ましくは固形腫瘍である。そのような癌としては、限定はしないが、卵巣癌、乳癌、皮膚癌および上皮性癌が挙げられる。
【００７８】
上記の本発明の１つの特定の実施形態では、環状オリゴペプチドは、ドメインの少なくとも１つにおけるエピトープ形成アミノ酸として、アミノ酸Ａ、Ｋ、ＥおよびＹを含む。これらのオリゴペプチドは、マクロファージからのＴＮＦの分泌の阻害に活性をもつことが示されている。この実施形態の好ましい局面では、会合性の官能基は、Ｃ１０炭化水素側鎖を有する脂質アミノ酸であり、エピトープ形成アミノ酸は、ＹＥＫＡおよびＥＹＡＫから選択される。環状オリゴペプチド中の各々のエピトープは、同じであっても異なっていてもよい。アミノ酸Ａ、Ｋ、ＥおよびＹを含むランダムコポリマーであるコパキソン（グラチラマーアセテート）が多発性硬化症の治療に効力を有することは、この化合物がインビトロでＴＮＦ分泌を下方制御することができることを反映していると考えられる。（Ｗｅｂｅｒ  ＭＳ，Ｓｔａｒｃｋ  Ｍ，Ｗａｇｅｎｐｆｅｉｌ  Ｓ，Ｍｅｉｎｌ  Ｅ，Ｈｏｈｌｆｅｌｄ  Ｒ  ＆  Ｆａｒｉｎａ  Ｃ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｒａｉｎ  １２７  ｐｐ１３７０〜８（２００４）参照）。これに関して、実施例６で試験した環状オリゴペプチド、シクロ（−Ａ−Ｋ−Σ−Ｙ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Σ−Ｅ−Ｙ）はまた、多発性硬化症の処置に有用であり得る。なぜなら、このものは、同じアミノ酸を非ランダム立体配置で含み、マクロファージによるＴＮＦ分泌に対して同じ効果を示すからである。本発明による環状オリゴペプチドにおけるＡ、Ｋ、ＥおよびＹの他の配列構成も、多発性硬化症を治療するのに用いられ得る。
【００７９】
本発明の利点は、本発明の環状オリゴペプチドによって、従来の生物学的レセプターと比較して強力で特異的な結合相互作用が達成され得ることである。環状オリゴペプチドは比較的小さくてもよく、好ましくは６または８個以下のアミノ酸を含む。従って、本発明による環状オリゴペプチドは、そのタンパク質対応物よりも免疫原性をはるかに少なくすることができる。
【００８０】
本発明のこの局面に従えば、本発明の環状オリゴペプチドは、インビトロでリガンドと相互作用するように処方され得るだけでなく、その組成物はまたインビボでも用いられ得る。
【００８１】
本発明による環状オリゴペプチドまたは組成物は、該当の疾患に対して適切な任意の経路を介して投与することができ、投与経路は、限定はしないが、経口、経鼻、直腸、口腔、舌下、肺、膣、局所、眼、耳、皮下、皮内、関節内、クモ膜下腔内、筋肉内、脳内、頭蓋内および静脈内の投与経路を含む。
【００８２】
環状オリゴペプチドは、遊離の水溶液中で投与されても、または本発明の組成物中に薬学的添加剤と組み合わせて投与されてもよい。環状オリゴペプチドまたは組成物はまた、他の活性な分子本体と一緒に混合して、医薬的な治療剤としてその活性に相乗作用を与えるか、もしくはその活性を強化してもよい。特定の経路、例えば、経口または直腸によって投与される場合、オリゴペプチドまたは組成物は、固体、半固体、または液体として処方されてカプセルに充填されてもよいし、または固体として錠剤中に圧縮されても、またはペレット状に押し出されてもよい。この場合、カプセル、錠剤またはペレットは、投与の最終経路が経口である場合、腸溶コーティングされてもよい。局所適用のためには、ゲル、ペーストまたはオイル状の処方物が特に適切であるが、肺または経鼻投与のためには、オリゴペプチドはエアロゾルの形態であってもよい。
【００８３】
<方法>
さらなる局面では、本発明は、上記のような環状オリゴペプチドを製造するための方法を提供し、その方法は：
ｉ）エピトープ形成アミノ酸を選択する工程と；
ｉｉ）エピトープ形成アミノ酸を組み込んだ環状オリゴペプチドを製造する工程と、
を包含する。
【００８４】
エピトープを特定する方法は、公知である。伝統的なコンビナトリアル化学では、特定のレセプターに結合するための最も好ましい配列を特定するには、アミノ酸などの種々の基を、異なる順序で、組み合わせ可能なものを数百も合成し、各々について効力を試験する必要がある。この過程は、時間がかかり、高価で、かつ異なる成分を一緒に結合させる際に行われ得る化学の性質によって制約を受ける。
【００８５】
上記のとおり、エピトープ形成アミノ酸は、当業者に公知の種々の異なる方法によって選択され得る。
【００８６】
ＷＯ０１／０１１４０号公報は、複数の別個の結合体の非共有結合アセンブリを用いる所望のリガンドと相互作用し得るエピトープを形成する分子を決定するための方法を提供する。ＷＯ０１／０１１４０号公報の２〜５ページに記載のとおり、各々の結合体は頭部基および尾部基を含み、この結合体の尾部基は疎水性凝集体を形成して、この結合体はアセンブリ内でお互いに関して動きが自由であり、その結果、リガンドの存在下では、その頭部基の少なくとも２つ（これらは同じであるかまたは異なる）は、各々の頭部基個々よりも強力にリガンドと相互作用し得るエピトープを形成するように適切に配置される。頭部基は代表的には親水性であって、尾部基は代表的には疎水性、例えば、親油性であり、炭化水素鎖からなるか、好塩性であるか、フッ化炭素鎖から構築されるか、またはシランベースである。頭部基と尾部基をもつ結合体を構築することによって、尾部基は会合して、代表的にはミセル、ラメラ構造、リポソームまたは他の脂質構造のような超分子アセンブリである疎水性凝集体を形成することができ、ここで、結合体は、頭部基が水相にあるとき接近するように配向される。結合体はアセンブリ内で移動可能であるため、頭部基はアセンブリ内で多数の異なる位置をとることができる。頭部基は代表的には同一ではなく、従ってアセンブリ内で自由に動き、驚くべきことに、協同的に相互作用して、頭部基が自力で誘発できない生物学的な結果を誘導する。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態では、ＷＯ０１／０１１４０号公報に開示される方法が、エピトープ形成アミノ酸を選択するために用いられ、ここでこの方法は：
（ａ）結合体の１セットを選択する工程であって、各々の結合体が頭部基および尾部基を含み、頭部基の配列を伴い、各々の頭部基がアミノ酸を含む、工程と；
（ｂ）そこから非共有結合性の会合を形成する工程であって、尾部基が疎水的に凝集し、結合体が移動性である、工程と；
（ｃ）非共有結合性の会合と標的リガンドとの間の十分な相互作用をアッセイする工程と；
（ｄ）頭部基の修飾された配列との１セットの結合体を用いて、工程（ａ）〜（ｃ）を適宜繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｃ）において十分な相互作用を見出した際に、工程（ａ）におけるエピトープ形成アミノ酸として結合体のセットの頭部基のアミノ酸を選択する工程と、
を包含する。
【００８８】
「十分な相互作用」についてのアッセイの例としては、抗体と抗原との間の会合の検出のためのＥＬＩＳＡ原理を利用するアッセイなどの結合アッセイを挙げることができる。他の適切なインビトロアッセイとしては、環境感受性の膜結合した蛍光プローブの蛍光の改変、沈降反応、酵素活性の強化または阻害などが挙げられる。インビトロで培養された細胞の挙動を変更する材料の能力に依存するアッセイ、例えば、細胞死、細胞増殖、アポトーシス、細胞間接触の阻害または刺激、サイトカインまたは他の可溶性生成物の分泌、特定のｍ‐ＲＮＡの合成、細胞内小胞輸送、細胞シグナル伝達プロセスの変更についてのアッセイも適切であり得る。動物またはヒトそのものにおけるインビボアッセイ、例えば、超分子アセンブリへの放射性標識の組み込みや、その後に、種々の経路による投与後の標識の分布の検討も、行うことができる。
【００８９】
この方法に従ってコンビナトリアルアプローチを用いるが、ここでは、様々な異なる超分子アセンブリ（または「プローブ」）が調製され、各々が事前合成されたバンクから選択された、異なる組み合わせの結合体を含む。適切な結合体の選択は、標的リガンドの公知の特性に基づいてもよいし、または２つ以上の頭部基がリガンドに対するエピトープを形成する確率を大きくするために、極めて広範囲の頭部基の使用を単に伴うものであってもよい。このように、上記のプローブとリガンドとの間の十分な相互作用についてのアッセイに続いて、さらなる頭部基を付加すること、いくつかの頭部基を除去すること、またはその両方によって、および得られたプローブを再度十分な相互作用についてアッセイすることによって、最も有効であることが見出された結合体の組み合わせを改変してもよい。最終的に、頭部基の最も好ましい組み合わせが、エピトープ形成アミノ酸として使用するために、特定されかつ選択され得る。
【実施例】
【００９０】
（実施例１）
マクロファージ細胞株におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって刺激されたＴＮＦ分泌の抑制における環状オリゴペプチドの用量応答性
【００９１】
１．以下の構造：
シクロ（−ＤＦ−Ｓ−Σ−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−Σ−Ｒ−）
を有する環状オクタペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂ベースの手法に基づく標準的な方法を用い、続いて液相環化によって合成した。精製ペプチドを、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、蒸留水中で溶液として調製した。
【００９２】
Ｒ、ＦおよびＳは、エピトープ形成アミノ酸であって、Σは、会合性のアミノ酸の上に位置する会合性の官能基であって、この会合性のアミノ酸は、Ｌ−αアミノカルボン酸であり、かつこの会合性の官能基は、１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族鎖から構成される側鎖残基である。
【００９３】
全てのアミノ酸は、異なる指示がない限り、Ｌ型である。
【００９４】
全てのアミノ酸は、ペプチド結合によって結合する。
【００９５】
２．Ｊ７７４Ａ．１細胞（マクロファージ細胞株）を、２４ウェルクラスタープレートの全てのウェルに、５×１０５細胞／ｍｌ／ウェル（１ウェルあたり、１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培養媒地）の播種密度でプレートして、３７℃で５％ＣＯ２／空気中で一晩インキュベートした。
【００９６】
３．翌日、工程１からの溶液を、工程２の細胞を含有する１５個のウェルに投与して、５０、２５、１２．５、６．２５または３．１２５μｇ／ｍｌの最終濃度を各々が有する３つのウェルを得た。残りのウェルは、未処置のままにした。そのプレートを３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【００９７】
４．リポポリサッカライド（Ｅ．ｃｏｌｉ株０１１１Ｂ４由来）を、ウェルに添加し、オクタペプチド溶液を与え、３つのウェルにはペプチドを与えなかった。リポポリサッカライドの最終濃度は、０．６２５μｇ／ｍｌであった。
【００９８】
５．プレートを一晩インキュベートし、翌日、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて上清をＴＮＦについてアッセイした。
【００９９】
以下の表に示す結果が得られた。ＬＰＳによって刺激されたＴＮＦ分泌の抑制における環状オリゴペプチドの活性は、用量依存性であることが示される。
【０１００】
【表１】
0005475451.tif 000007
【０１０１】
（実施例２）
マクロファージ細胞株におけるコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）フラグメントによって刺激されたＴＮＦ分泌の抑制における種々の会合性の官能基を有する環状オリゴペプチドの効果
【０１０２】
１．以下の構造をもつ環状オリゴペプチドを調製した：
シクロ（−ＤＦ−Ｒ−Σ１０−Ｓ−ＤＦ−Ｒ−Σ１０−Ｓ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｓ−Σ１０−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−Σ１０−Ｒ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｒ−Σ４−Ｓ−ＤＦ−Ｒ−Σ４−Ｓ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｓ−Σ４−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−Σ４−Ｒ−）
ここで、Ｓ、ＦおよびＲは、エピトープ形成アミノ酸であり、Σは会合性のアミノ酸上に位置する会合性の官能基であり、Σ１０はラセミの会合性のアミノ酸であり、これはアミノカルボン酸であり、会合性の官能基は、未分枝の−Ｃ１０Ｈ２１から構成される側鎖残基であり、Σ４はノルロイシンを示し、会合性の官能基は、４個の炭素の側鎖である。
【０１０３】
これらの環状オリゴペプチドは、５ｍｇ／ｍｌの濃度でトランスクトール中の溶液として調製され、次いで蒸留水の添加によって１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈された。
【０１０４】
２．Ｊ７７４Ａ．１細胞（マクロファージ細胞株）を２４ウェルのクラスタープレートの全てのウェルに、３×１０５細胞／ｍｌ／ウェルの播種密度でプレートし（１ウェルあたり１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地）、５％ＣＯ２／空気中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１０５】
３．翌日、工程１からの溶液を、工程２の細胞を含有する１２個のウェルに投与して、１２．５μｇ／ｍｌの最終濃度を各々が有する３つのウェルを得た。残りのウェルは、未処置のままにした。このプレートを３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【０１０６】
４．コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）フラグメントをウェルに添加し、ここにオクタペプチド溶液を与え、３つのウェルにはペプチドは与えない。コレラ毒素Ｂフラグメントの濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【０１０７】
５．プレートを一晩インキュベートし、翌日、この上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦについてアッセイした。
【０１０８】
以下の表に示す結果が得られた。会合性の官能基としての未分岐の−Ｃ１０Ｈ２１からなる長鎖炭化水素側鎖の存在が、コレラ毒素Ｂフラグメントによって刺激されたＴＮＦ分泌の抑制において環状オリゴペプチドの活性を高めることが示される。会合性の官能基がわずか４個の炭素の鎖長を有する環状オリゴペプチドは、なんら阻害活性を有しない。
【０１０９】
【表２】
0005475451.tif 000008
【０１１０】
（実施例３）
マクロファージ細胞株におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって刺激されたＴＮＦ分泌の抑制における、種々のエピトープ形成アミノ酸および会合性のアミノ酸の立体化学的配置を有する環状オリゴペプチドの効果
【０１１１】
１．以下の構造をもつ環状オクタペプチドを調製した：
シクロ（−ＤＦ−Ｓ−ΣＬ−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−ΣＬ−Ｒ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｓ−ΣＬ−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−ΣＤ−Ｒ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｓ−ΣＤ−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−ΣＤ−Ｒ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｒ−ΣＬ−Ｓ−ＤＦ−Ｒ−ΣＬ−Ｓ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｒ−ΣＬ−Ｓ−ＤＦ−Ｒ−ΣＤ−Ｓ−）
シクロ（−ＤＦ−Ｒ−ΣＤ−Ｓ−ＤＦ−Ｒ−ΣＤ−Ｓ−）
ここで、Ｆ、ＳおよびＲは、エピトープ形成アミノ酸であり、ΣＬは、会合性のアミノ酸であって、Ｌ−αアミノカルボン酸であり、ここで会合性の官能基は未分岐の−Ｃ１０Ｈ２１から構成される側鎖残基である；ΣＤは、会合性のアミノ酸であって、Ｄ−αアミノカルボン酸であり、ここで会合性の官能基は未分岐の−Ｃ１０Ｈ２１から構成される側鎖残基である。これらの環状オリゴペプチドは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、蒸留水中で溶液として調製された。
【０１１２】
２．Ｊ７７４−１細胞（マクロファージ細胞株）を、２４ウェルのクラスタープレートの全てのウェルに、３×１０５細胞／ｍｌ／ウェルの播種密度でプレートし（１ウェルあたり１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地）、５％ＣＯ２／空気中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１１３】
３．翌日、工程１からの溶液を、工程２の細胞を含有する１８個のウェルに投与して、５０μｇ／ｍｌの最終濃度を各々が有する３つのウェルを得た。残りのウェルは、未処置のままにした。このプレートを３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【０１１４】
４．リポポリサッカライド（Ｅ．ｃｏｌｉ株０１１１Ｂ４由来）をウェルに添加し、ここにオクタペプチド溶液を与え、３つのウェルにはペプチドは与えない。リポポリサッカライドの濃度は１．２５μｇ／ｍｌであった。
【０１１５】
５．プレートを一晩インキュベートし、翌日、この上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦについてアッセイした。
【０１１６】
以下の表に示す結果が得られた。Ｒ−ＤＦ−Ｓの順序でアミノ酸を含有する環状オリゴペプチドは、ＬＰＳによって刺激されたＴＮＦの分泌の抑制において高い活性を有すること、および未分岐の−Ｃ１０Ｈ２１からなる側鎖残基である会合性の官能基を有するＬ−αアミノカルボン酸である少なくとも１つの会合性アミノ酸の存在が必要であって、他の会合性アミノ酸は、Ｌ型またはＤ型のいずれかの同じアミノカルボン酸であることが示される。
【０１１７】
【表３】
0005475451.tif 000009
【０１１８】
本発明の環状オリゴペプチドに対するシクロデキストリンの結合によって、種々のオリゴペプチドの疎水性部分の間の相互作用のレベルの低減が助けられ、これによって大きな凝集体、すなわち、その活性が、これらの大きい凝集体におけるエピトープの立体障害のせいでモノマーまたはオリゴマーと比較して低下し得る大きな凝集体の形成が妨げられる。
【０１１９】
（実施例４）
広範なシクロデキストリン濃度において、マクロファージ細胞株におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって刺激されたＴＮＦの分泌の抑制における、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンで処方され、エピトープ形成アミノ酸Ｒ−ＤＦ−Ｓから形成されるエピトープを含む、内部拘束された環状オリゴペプチドの用量依存性の効果
【０１２０】
１．シクロ（−ＤＦ−Ｓ−Σ−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−Σ−Ｒ−）の構造を有する環状オクタペプチドを、トランスクトール中の溶液として５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。ここで、Σは、Ｌ−αアミノカルボン酸としての会合性のアミノ酸であって、会合性の官能基は、会合性のアミノ酸上に、１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族鎖から構成される側鎖残基として存在する。
【０１２１】
２．工程１における溶液２００μｌの６つの別個のアリコートを、新しい８ｍｌバイアルに移して、蒸留水中で５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５または１．５６２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ヒドロキシ−プロピルβシクロデキストリンの溶液８００μｌとゆっくりしたボルテックスで混合した。
【０１２２】
２．Ｊ７７４−１細胞（マクロファージ細胞株）を、２４ウェルのクラスタープレートの全てのウェルに、５×１０５細胞／ｍｌ／ウェルの播種密度でプレートし（１ウェルあたり１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地）、５％ＣＯ２／空気中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１２３】
３．翌日、工程１からの各々の溶液を、工程２の細胞を含有するウェルに適切な容積で投与して、８、４または２μｇ／ｍｌの最終濃度を各々が有する３つのウェルを得た。残りのウェルは、未処置のままにした。このプレートを３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【０１２４】
４．リポポリサッカライド（Ｅ．ｃｏｌｉ株０１１１Ｂ４由来）をウェルに添加し、ここにオクタペプチド溶液を与え、３つのウェルにはペプチドは与えなかった。リポポリサッカライドの最終濃度は０．６２５μｇ／ｍｌであった。
【０１２５】
５．プレートを一晩インキュベートし、翌日、この上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦについてアッセイした。
【０１２６】
以下の表に示す結果が得られた。ＬＰＳによって刺激されたＴＮＦの分泌の抑制におけるオクタペプチドの活性は、用量依存性であったことが示される。
【０１２７】
【表４】
0005475451.tif 000010
【０１２８】
この結果によって、シクロデキストリンを含むオクタペプチドの処方物が、組織培養ウェルにおいて２μｇ／ｍｌの濃度まで減少するＴＮＦ分泌の有意な阻害を生じること、およびこの阻害が、４０：１の重量比から下方へ変化する範囲の広範なシクロデキストリン濃度にわたって、達成されることが示される。
【０１２９】
（実施例５）
ラットにおいて、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって刺激されたＴＮＦの分泌の抑制における、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンで処方され、エピトープ形成アミノ酸Ｒ−ＤＦ−Ｓから形成されるエピトープを含む、内部拘束された環状オリゴペプチドの効果
【０１３０】
１．シクロ（−ＤＦ−Ｓ−Σ−Ｒ−ＤＦ−Ｓ−Σ−Ｒ−）の構造を有する環状オクタペプチドを、実施例４に記載のとおり、トランスクトールおよびヒドロキシプロピルβシクロデキストリン中の溶液として調製した。ここで、Σは、Ｌ−αアミノカルボン酸として会合性のアミノ酸であって、会合性の官能基は、会合性のアミノ酸上に、１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族鎖から構成される側鎖残基として存在する。また、ペプチドの濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、シクロデキストリンの最終濃度は４０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１３１】
２．２５０ｇの体重のラットに、１ｍｌのペプチド溶液（ラット１匹あたり１ｍｇのペプチド）をｉ．ｐ．注射した。第２群のラットには、ペプチドを含有しない１ｍｌのトランスクトール／シクロデキストリンの媒体を与えた。１時間後、ラットにさらに１ｍｇのリポポリサッカライド（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ由来）を注射した。
【０１３２】
３．１５０分後、血液サンプルを採取して、ＴＮＦレベルをＥＬＩＳＡによって２つの群で測定した。以下の表に示す結果によって、ペプチドは、刺激に対する応答において細胞によるＴＮＦ産生を阻害することができ、７５％を超える減少を生じることが示される。
【０１３３】
【表５】
0005475451.tif 000011
【０１３４】
（実施例６）
コパキソン（グラチラマーアセテート）の環状類縁体によるＴＮＦ分泌の抑制
【０１３５】
１．以下の構造をもつ２つの環状オリゴペプチドを調製した：
シクロ（−Ａ−Ｋ−Σ−Ｙ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Σ−Ｅ−Ｙ−）
シクロ（−Ａ−Ｋ−Σ−Ｅ−Ｙ−Ｋ−Ａ−Σ−Ｙ−Ｅ−）
全てのアミノ酸は、異なる指示がない限り、Ｌ型である。
全てのアミノ酸はペプチド結合によって連結される。
Ａ、Ｋ、ＹおよびＥは、エピトープ形成アミノ酸であって、Σは、会合性のアミノ酸上に位置する会合性の官能基であり、会合性のアミノ酸はＬ−αアミノカルボン酸であり、会合性の官能基は、１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族鎖から構成される側鎖残基である。
【０１３６】
環状オリゴペプチドを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でヘキサフルオロ−イソプロパノール（ＨＦＩＰ）中の溶液として調製し、次いでβヒドロキシプロピルシクロデキストリンを含む等容積のＨＦＩＰ溶液と、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で混合した。次いで、その有機溶液を窒素下で乾燥して、蒸留水にペプチド／シクロデキストリン複合体を再溶解して、１ｍｇ／ｍｌという環状オリゴペプチドの最終濃度を得た。
【０１３７】
２．Ｊ７７４Ａ．１細胞（マクロファージ細胞株）を２４ウェルのクラスタープレートの全てのウェルに、３×１０５細胞／ｍｌ／ウェルの播種密度でプレートし（１ウェルあたり１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地）、５％ＣＯ２／空気中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１３８】
３．翌日、工程１からの溶液を、工程２の細胞を含有するウェルに投与して、１２．５μｇ／ｍｌのペプチドの最終濃度を各々が有する３つのウェルを得た。シクロデキストリンのみを６２．５μｇ／ｍｌで含有するさらなるウェルも調製した。残りのウェルは、未処置のままにした。このプレートを３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【０１３９】
４．リポポリサッカライド（Ｅ．ｃｏｌｉ株０１１１Ｂ４由来）をウェルに添加し、ここに環状オリゴペプチド溶液を与え、３つのウェルにはペプチドは与えない。リポポリサッカライドの最終濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。
【０１４０】
５．プレートを一晩インキュベートし、翌日、この上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦについてアッセイした。
【０１４１】
【表６】
0005475451.tif 000012
【０１４２】
得られた結果は、表に示されるように、試験された環状オリゴペプチドのうち両方ではなく一方が、ＬＰＳによって刺激されたＴＮＦ分泌の抑制に効果を有することを示す。従って、各々のドメインにおけるアミノ酸の配列は、オリゴペプチドの生物学的活性に効果を有する。シクロ（−Ａ−Ｋ−Σ−Ｙ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Σ−Ｅ−Ｙ）は、多発性硬化症の治療に有用である。なぜなら、コパキソンと同じアミノ酸を含み（非ランダムの構造を除く）、マクロファージによるＴＮＦ分泌に対して同等の効果を示すからである。
【０１４３】
（実施例７）
トロンビンの酵素活性の阻害
【０１４４】
１．以下の構造をもつ環状オリゴペプチドを前述のとおりに合成し、実施例６に概説した手順を用いてハンクス平衡塩溶液で１ｍｇ／ｍｌの濃度でシクロデキストリンを用いて複合型で調製した。
（ｉ）シクロ（−Ｒ−Ｅ−Σ−Ｓ−Ｒ−Ｅ−Ｒ−Σ−Ｓ−Ｅ−）
（ｉｉ）シクロ（−Ａ−Ｋ−Σ−Ｅ−Ｙ−Ｋ−Ａ−Σ−Ｙ−Ｅ−）
（ｉｉｉ）シクロ（−ｄＦ−Ｒ−Ｃ−Ｓ−ｄＦ−Ｒ−Ｃ−Ｓ−）
（ｉｖ）シクロ（−ｄＦ−Ｓ−Ｃ−Ｒ−ｄＦ−Ｓ−Ｃ−Ｒ−）
全てのアミノ酸は、異なる指示がない限り、Ｌ型である。
全てのアミノ酸は、ペプチド結合によって連結される。
ここでＲ、Ｅ、Ｓ、Ｙ、ＫおよびＡは、エピトープ形成アミノ酸であって、Σは、会合性のアミノ酸上に位置する会合性の官能基であり、会合性のアミノ酸はＬ−αアミノカルボン酸であり、会合性の官能基は、１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族鎖から構成される側鎖残基であり、各々の環におけるシステインが酸化されて内部架橋を形成する。
【０１４５】
２．３９４ウェルのマイクロプレートのウェルに、２０μｌのトロンビン溶液（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を分注して、６０μｌの環状オリゴペプチド溶液と混合した。
【０１４６】
３．２０μｌの基質ｂｏｃ−β−ベンジル−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−７−アミド−４−メチルクマリン塩酸塩（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を各々のウェルに添加し、基質の生成の時間経過を測定した。
【０１４７】
４．以下の表に示す結果から、試験した環状オリゴペプチドは、トロンビンタンパク質分解活性の阻害において異なる効果を有すること、およびこれらの異なる活性は、環に含まれるアミノ酸の性質および組み合わせに関連することが観察され得る。アミノ酸を正確に選択すれば、拘束された環状オリゴペプチドテンプレートに基づく構造であって、酵素の活性に対して有意な効果を発揮するのに十分に強固であるような構造を作製することができることが明らかである。
【０１４８】
従って、トロンビンタンパク質分解活性を阻害する効果を有する、本発明による環状オリゴペプチドは、循環器疾患、循環障害およびＨＩＶを含む、プロテアーゼ活性が増悪因子である疾患を治療するために用いられ得る。
【０１４９】
【表７】
0005475451.tif 000013
【０１５０】
各々のドメインにおけるアミノ酸の順序に依存して、いくつかの環状オリゴペプチドが他よりも大きい活性を有することが、この表から理解され得る。
【０１５１】
（実施例８）
２つの異なるエピトープを含む環状オリゴペプチドによるＴＮＦ分泌の抑制
【０１５２】
１．以下の構造をもつ２つの環状オリゴペプチドを調製した：
（ｉ）シクロ（−ｄＦ−Ｓ−Σ−Ｑ−ｄＬ−Ｓ−Σ−Ｒ−）および
（ｉｉ）シクロ（−ｄＦ−Ｓ−Σ−Ｌ−ｄＱ−Ｓ−Σ−Ｒ）
全てのアミノ酸は、異なる指示がない限り、Ｌ型である。
全てのアミノ酸は、ペプチド結合によって連結される。
ここでＱ、Ｌ、Ｓ、ＲおよびＦは、エピトープ形成アミノ酸であって、Σは、会合性のアミノ酸上に位置する会合性の官能基であり、会合性のアミノ酸はＬ−αアミノカルボン酸であり、会合性の官能基は、１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族鎖から構成される側鎖残基である。
【０１５３】
これらの環状オリゴペプチドは、実施例４に記載したように、トランスクトール／シクロデキストリン中の溶液として調製し、ペプチドの最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、およびシクロデキストリンの最終濃度２０ｍｇ／ｍｌを得た。
【０１５４】
２．Ｊ７７４Ａ．１細胞（マクロファージ細胞株）を３つの２４ウェルのクラスタープレートの全てのウェルに、３×１０５細胞／ｍｌ／ウェルの播種密度でプレートし（１ウェルあたり１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地）、５％ＣＯ２／空気中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１５５】
３．翌日、工程１からの溶液を、工程２の細胞を含有するウェルに投与して、５０、２５、１２．５、６．２５または３．１２５μｇ／ｍｌの最終濃度を各々が有する３つの環状オリゴペプチドのウェルを得た。シクロデキストリンを１、０．５、０．２５、０．１２５および０．０６２５ｍｇ／ｍｌで含有するさらなるウェルも調製した。残りのウェルは、未処置のままにした。このプレートを３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【０１５６】
４．リポポリサッカライド（Ｅ．ｃｏｌｉ株０１１１Ｂ４由来）をウェルに添加し、ここにオクタペプチド溶液を与え、３つのウェルにはペプチドは与えない。リポポリサッカライドの最終濃度は、０．１μｇ／ｍｌであった。
【０１５７】
５．プレートを一晩インキュベートし、翌日、この上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦについてアッセイした。
【０１５８】
得られた結果は、以下の表に示すように、２つの同一でないエピトープで、その１つは、Ｆ、ＲおよびＳアミノ酸から構成されるエピトープを含む環状オリゴペプチドは、用量依存的にＪ７７４細胞からのＴＮＦの分泌を下方制御し得ることを示す。
【０１５９】
【表８】
0005475451.tif 000014