(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳歯又は永久歯の歯髄幹細胞を含み、皮膚組織の再生用であり、創傷治癒に用いられることを特徴とする自家又は同種移植用組成物。
【請求項２】
歯髄幹細胞が、CD13陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD73陽性、CD105陽性、CD146陽性、CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性の細胞である、請求項１に記載の自家又は同種移植用組成物。
【請求項３】
歯髄幹細胞を1.0×10３〜1.0×108個／ml含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の自家又は同種移植用組成物。
【請求項４】
多血小板血漿を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
【請求項５】
歯髄幹細胞が生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
【請求項６】
サイトカインを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織の修復又は再生（再建）に利用される組成物に関する。詳しくは、歯髄幹細胞を用いた、自家又は同種移植に利用される組成物及びその用途（当該組成物を用いた術式など）に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療あるいは再生医療で最も重要な要素は細胞である。例えば、白血病の治療には骨髄細胞や臍帯血幹細胞が用いられてきた。これらの細胞の円滑な利用を図るべく骨髄バンクや臍帯血バンクが設立されているが、必ずしも充分な量が確保されているとは言い難い。
ところで最近、永久歯や子供の歯（乳歯）の中に強力な幹細胞が存在することが発見され注目を集めている（例えば特許文献１、非特許文献１を参照）。特に乳歯の細胞は、骨髄や臍帯血の幹細胞に比べて次のような長所、即ち、（１）細胞の増殖能が高いこと（培養によって細胞を増殖させることができる）、（２）細胞の分化能が高いこと（骨、軟骨、神経、血管などの元になる細胞が含まれている）、（３）採取が簡単であること（乳歯は子供が６〜１０歳の頃に自然に脱落する）、を有する。このように優れた特徴を有する乳歯幹細胞は将来の細胞治療や再生医療で重要な役割を果たすと考えらおり、世界中で研究が進められている。一方、永久歯の歯髄の中にも同様の幹細胞の存在が確認されている（例えば特許文献１を参照）。また、本発明者らは、歯髄細胞を担体マトリックスに混合すると象牙質が形成されたことを報告した（特許文献２を参照）。【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００６／０１０６００号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−２０１６１２号公報
【特許文献３】特開２００６−２３０３１６号公報
【特許文献４】特開２００６−２６５２２１号公報
【非特許文献１】Miura M. et al., SHED:Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, PNAS, May 13, 2003, vol.100, no.10, 5807-5812
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上の背景の下で本発明は、乳歯又は永久歯から採取される歯髄幹細胞の新規な用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は上記の課題を解決すべく鋭意検討した末に完成されたものであって、以下の通りである。
［１］乳歯又は永久歯の歯髄幹細胞を含むことを特徴とする自家又は同種移植用組成物。
［２］歯髄幹細胞が、CD13陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD73陽性、CD105陽性、CD146陽性、CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性の細胞である、［１］に記載の自家又は同種移植用組成物。
［３］歯髄幹細胞を約1.0×10３〜約1.0×108個／ml含有することを特徴とする、［１］又は［２］に記載の自家又は同種移植用組成物。
［４］多血小板血漿を含むことを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
［５］歯髄幹細胞が生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁されていることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
［６］サイトカインを含むことを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
［７］骨組織、軟骨組織、神経組織、皮膚組織、毛髪組織、歯周組織又は血管組織の再生用であることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物。
［８］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の自家又は同種移植用組成物を、組織欠損部に注入、埋入、填入、又は塗布することを特徴とする、組織の再生方法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】乳歯歯髄幹細胞の増殖能を示す顕微鏡像。左上：初代培養７日目、右上：初代培養１２日目、左下：初代培養２１日目、右下：１継代目。
【図２】骨髄由来幹細胞、乳歯歯髄幹細胞と永久歯歯髄幹細胞の増殖率の比較。乳歯歯髄幹細胞（右）の方が、永久歯歯髄幹細胞（中央）よりも増殖能が高いことがわかる。対照としてヒト間葉系幹細胞（hMSC）の増殖率も示した（左）。
【図３】乳歯歯髄幹細胞をサンプルとしたフローサイトメトリー（FCM）の結果。CD13陽性、CD29陽性、CD44陽性及びCD73陽性、CD105陽性、CD146陽性であることがわかる。
【図４】乳歯歯髄幹細胞をサンプルとしたフローサイトメトリー（FCM）の結果。CD14陰性、CD31陰性、CD34陰性、CD45陰性であることがわかる。
【図５】乳歯歯髄幹細胞の骨芽細胞への分化を示す顕微鏡像。左上：分化誘導前、右上：分化誘導６日目、左下：分化誘導１５日目、右下：分化誘導２０日目。
【図６】分化誘導後の乳歯歯髄幹細胞における骨芽細胞マーカー遺伝子の発現。骨芽細胞マーカーの発現が認められる。
【図７】左から順に、２週目の移植部の染色像（対象）、PRP/乳歯歯髄幹細胞混合物移植後２週目の移植部の組織像、PRP/永久歯歯髄幹細胞混合物移植後２週目の移植部の組織像、PRP/骨髄幹細胞混合物移植後２週目の移植部の組織像。
【図８】左から順に、４週目の移植部の染色像（対象）、PRP/乳歯歯髄幹細胞混合物移植後４週目の移植部の組織像、PRP/永久歯歯髄幹細胞混合物移植後４週目の移植部の組織像、PRP/骨髄幹細胞混合物移植後４週目の移植部の組織像。
【図９】左から順に、８週目の移植部の染色像（対象）、PRP/乳歯歯髄幹細胞混合物移植後８週目の移植部の組織像、PRP/永久歯歯髄幹細胞混合物移植後８週目の移植部の組織像、PRP/骨髄幹細胞混合物移植後８週目の移植部の組織像。
【図１０】移植後の創部面積の経日的変化。ヌードマウス背部に形成した創部にヒト乳歯歯髄幹細胞（hSHED）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMHCs）、又はヒト口腔粘膜由来線維芽細胞（hFibro）を移植し、創部の面積の変化を比較した。PBSを移植した場合をコントロールとした。上段は移植後１日目〜１６日目までの変化を示したグラフ。下段は移植後８日目〜１６日目までを抜粋したグラフ。
【図１１】ヒアルロン酸を標的とした蛍光免疫染色。左の列に移植後７日目の蛍光面積染色像（x400）を示す。右の列は同ヘマトキシリン・エオジン染色像（x400）である。上から順にコントロール群（PBS）、ヒト口腔粘膜由来線維芽細胞（hFibro）移植群、ヒト乳歯歯髄幹細胞（hSHED）移植群、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMHCs）移植群。スケールバーは50μm。
【図１２】ヒアルロン酸を標的とした蛍光免疫染色。左の列に移植後１４日目の蛍光面積染色像（x400）を示す。右の列は同ヘマトキシリン・エオジン染色像（x400）である。上から順にコントロール群（PBS）、ヒト口腔粘膜由来線維芽細胞（hFibro）移植群、ヒト乳歯歯髄幹細胞（hSHED）移植群、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMHCs）移植群。スケールバーは50μm。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（自家又は同種移植用組成物）
本発明の第１の局面は自家又は同種移植用組成物に関する。本発明の自家又は同種移植用組成物は、乳歯又は永久歯の歯髄幹細胞を含むことを特徴とする。好ましくは、乳歯の歯髄幹細胞を用いる。永久歯の歯髄幹細胞に比べ、細胞の増殖能が高いからである。また、分化能もより高いと考えられるからである。一方で、採取が簡単であるということも、乳歯の歯髄幹細胞を用いる利点である。【０００８】
本発明に使用される歯髄幹細胞はCD13陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD73陽性、CD105陽性、CD146陽性、CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性の細胞である。【０００９】
本発明の一態様は、細胞成分に加えて多血小板血漿を含む。ここで「多血小板血漿」即ちPRP（Platelet-rich Plasma）とは、血小板を豊富に含む血漿である。換言すれば、血小板が濃縮された血漿のことをいう。PRPは例えば、Whitmanらの方法（Dean H. Whitman et al.:J Oral Maxillofac Surg,55,1294-1299 (1997)）に準じて、採取した血液を遠心分離処理に供することにより調製することができる。PRPはPlatelet-derived Growth Factor（PDGF）、Transforming growth factor β1（TGF-β1）、Transforming growth factor β2（TGF-β2）等の成長因子を豊富に含むことが知られている（Jarry J. Peterson:Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,85,638-646(1998)）。【００１０】
本発明の一態様は、細胞成分に加えてサイトカインを含む。好ましくは、多血漿板血漿に加えてサイトカインを含む。サイトカインとしては例えばBMP、PDGF、bFGFなどが用いられる。２種類以上のサイトカインを併用することにしてもよい。【００１１】
PRP及び／又はサイトカインを使用すれば再生効果の増強が図られる。また、PRPは流動性ないし粘度の調製にも有効である。即ち、PRPを使用すれば、移植に適したゲル状に本発明の自家又は同種移植用組成物を調製することが可能である（以下の「調製法の欄」を参照）。【００１２】
本発明の自家又は同種移植用組成物に期待される効果（即ち適用部位において組織の再生が生ずること）が保持されることを条件として、他の成分を追加的に使用することを妨げない。本発明において追加的に使用され得る成分を以下に列挙する。【００１３】
（１）無機系生体吸収性材料及び有機系生体吸収性材料
無機系生体吸収性材料の種類は特に限定されないが、β−リン酸三カルシウム（「β−ＴＣＰ）、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される材料を用いることができる。これらの材料は単独で用いることができることはもちろんのこと、任意に選択した２種以上を組み合わせて用いても良い。好ましくは、β−ＴＣＰ又はα−ＴＣＰのいずれか、又はこれらを任意の割合で組み合わせて用いる。さらに好ましくはβ−ＴＣＰを無機系生体吸収性材料として用いる。
無機系生体吸収性材料は公知の方法により得ることができる。また、市販される無機系生体吸収性材料を用いることもできる。β−ＴＣＰとしては、例えば、オリンパス光学工業株式会社製のものを利用できる。【００１４】
無機系生体吸収性材料は、本発明の組成物が使用時において流動性となるような粒子径を有する粉末状であることが好ましい。
粉末状の無機系生体吸収性材料は、適当な大きさに加工された無機系生体吸収性材料を、所望の粒子径となるまで破砕、粉砕することにより調製することができる。無機系生体吸収性材料の平均粒子径を、０．５μｍ〜５０μｍとすることが好ましい。さらに好ましくは、平均粒子径０．５μｍ〜１０μｍの無機系生体吸収性材料を用いる。さらにさらに好ましくは、平均粒子径１μｍ〜５μｍの無機系生体吸収性材料を用いる。粒子径の異なる複数種類の無機系生体吸収性材料を組み合わせて用いることも可能である。
無機系生体吸収性材料は本発明の組成物全体に対して３０重量％〜７５重量％含有することが好ましい。【００１５】
尚、本発明の組成物の流動性は、無機系生体吸収性材料の粒子径、及び含有率で調製することができ、両者を適宜調整することにより所望の流動性を得ることができる。また、後述の増粘剤を添加する場合には、増粘剤の添加量によっても流動性の調整を行うことができる。【００１６】
有機系生体吸収性材料としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。【００１７】
（２）ゲル化材料
例えば、トロンビンと塩化カルシウムを添加して本発明の組成物を構成することができる。これらを添加することにより、トロンビンがPRP中のフィブリノーゲンに作用しフィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにPRP中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。【００１８】
また、上記のゲル化材料に加えて、適用後（移植後）に作用して本発明の組成物の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を併用することもできる。このような構成とすれば、使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨又は歯周組織の修復又は再生を効果的に行うことができる。また、予め適用部位の形状に成型する必要がなく、汎用性が高い。【００１９】
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、上記の例の他、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明の組成物の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。骨組織の再生を目的とする場合には、例えば、I型コラーゲンを用いることができる。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。【００２０】
（３）増粘剤
増粘剤を添加することにより、本発明の組成物の流動性を調整することもできる。増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等を用いることができるが、安全性及び／又は骨形成能の観点から、生体親和性が高く、かつ生体吸収性又は生体分解性のものを用いることが好ましい。グリセリン等を添加することにより、凍害防止の効果も得られる。【００２１】
（４）溶媒
本発明の組成物は、水系の溶媒を含むものであってもよい。水系の溶媒としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩溶液等の緩衝液等を用いることができる。尚、調製した細胞を生理食塩水やPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁して本発明の組成物とし（PRP等、他の成分を含有しない）、患部に適用することもできる。【００２２】
（５）その他
本発明の組成物は、上記の成分の他、安定化剤、保存剤、ｐＨ調整剤等を含んでいても良い。また、成長因子、特に骨誘導因子（ＢＭＰ）を含ませることもできる。【００２３】
（適用方法）
本発明の自家又は同種移植用組成物は、自家移植又は同種移植による骨組織、軟骨組織、神経組織、皮膚組織、毛髪組織、歯周組織又は血管組織の再生に利用される。適用方法としては、組織欠損部に注入、埋入、填入、又は塗布を採用することができる。適度な流動性を有するゲル状に調製すれば、填入、注入、又は塗布等、簡便な手法で適用することができる。また、ゲル状であれば注射針等を用いて適用部位に容易に填入でき（創部を開放することなく適用することも可能である）、また、組織欠損部の形状に合わせて予め成型することを要せず、その汎用性が高い。【００２４】
ところで、創傷治癒に骨髄、末梢血、又は臍帯血より分離した間葉系細胞を用いる技術（特開２００６−２３０３１６号公報（特許文献３））やスキンケアに線維芽細胞増殖因子（FGF-1）を応用する技術（特開２００６−２６５２２１号公報（特許文献４））が存在する。これらの技術は侵襲性が高いことに加え、有効な細胞源、確立された培養方法、治療への応用については不明な点も多い。また、治療効果の詳細も不明である。一方、乳歯や永久歯の歯髄に幹細胞（乳歯歯髄幹細胞、永久歯歯髄幹細胞）が存在することが近年明らかになってきているが、創傷治癒に対する効果については十分な研究がなされておらず、その詳細は不明である。このような状況の下で本発明者らは、創傷治癒モデルを用い、乳歯歯髄幹細胞による治療効果を検討した（後述の実施例）。その結果、創傷治癒を促進するとされる間葉系幹細胞と同等の治療効果を乳歯歯髄幹細胞が発揮することが判明した。この知見に基づき、本発明の好ましい一態様では、本発明の組成物は創傷治癒（創傷治癒促進、ケロイド予防、瘢痕予防、及び／又は皮膚質改善）に利用される。【００２５】
（歯髄幹細胞の調製法）
以下、歯髄幹細胞の調製手順の一例を示す。この調製法では（１）歯髄の採取、（２）酵素処理及び細胞の播種、（３）接着性細胞の選択培養、（４）分化誘導、及び（５）細胞の回収を順に行い、再生目的の組織に適合する歯髄幹細胞が調製される。例えば骨組織の再生を目的とする場合、骨系細胞へと分化誘導された歯髄幹細胞が調製されることになる。尚、本明細書では、特定の細胞系譜へと分化誘導された歯髄幹細胞のことも「歯髄幹細胞」と呼称する。従って、本発明の自家又は同種移植用組成物の一態様では、特定の細胞系譜へと分化誘導された細胞が「歯髄幹細胞」として含有されることになる。
以下、この調製法の各ステップを説明する。【００２６】
（１）歯髄の採取
自然に脱落した乳歯（又は抜歯した乳歯、或いは永久歯）をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液に浸した後、培地中に回収する。続いて、生食注水下にて、歯科用バーを用いて乳歯（又は抜歯した乳歯、或いは永久歯）を必要に応じて分割する。歯科用ファイルを用いて歯髄を採取し、培地中に回収する。尚、好ましくは、レシピエントとの関係が２親等以内である者をドナーとする（例えば、祖父母をレシピエントとし孫をドナーとする）。【００２７】
（２）酵素処理及び細胞の播種
回収した歯髄にコラゲナーゼやディスパーゼを作用させる。例えば、培地中にコラゲナーゼ3mg/mlとディスパーゼ4mg/mlを添加し、37℃で１時間放置する。このように酵素処理した後、セルストレーナーを通し、夾雑成分を除去する。細胞を洗浄した後、培養容器に播種する。培養容器をインキュベータ内に移し、培養する（37℃、5%CO2）。尚、培養液としては例えばDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）に血清などを添加したものを使用することができる。培養液の具体例を挙げると、ウシ胎仔血清（20%）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）及びアンフォテリシンB（0.25μg/ml）を添加したDMEMである。培養容器としては培養皿、三角フラスコ等が用いられる。この場合、必ずしも血清を必要としない。【００２８】
（３）接着性細胞の選択培養
このステップではまず接着性細胞を選択する。浮遊成分を除去することによって接着性細胞を選択することができる。浮遊細胞の除去は、培地の交換によって容易に行うことができる。具体的には一部又は実質的に全部の培地を吸引除去し、続いて新しい培地を培養容器に注ぐことによって培地の一部又は全部を交換する。この培地交換操作を複数回繰り返し実施してもよい。浮遊成分を十分に洗浄除去するために、培地交換を３回〜４回／週で実施することが好ましい。【００２９】
浮遊成分を除去することによって残存した、接着性を有する接着性細胞（培養容器に接着した状態の細胞）は更なる培養に供される。ここでの培養はステップ（２）での培養と同条件で行うことができる。培養中は適宜培地交換を行う。例えば３日に一度の頻度で培地交換を行う。【００３０】
細胞がある程度増殖した段階で、継代培養（拡大培養）を実施してもよい。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜３回行い、必要な細胞数（例えば約1×107個/ml）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。
以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば-198℃）。様々なドナーから回収した細胞を歯髄幹細胞バンクの形態で保存することにしてもよい。【００３１】
（４）分化誘導
このステップでは、増殖した細胞が特定の細胞系譜へと分化するよう誘導する。骨組織の再生を目的とした自家又は同種移植用組成物を調製するのであれば、骨系細胞へと分化するよう誘導処理を施す。典型的な手法では、培養液中に３種類の添加剤、即ちデキサメタゾン（Dex）、β−グリセロリン酸ナトリウム（β−GP）、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩（AsAP）を添加することによって（又はこれらの添加剤を含有する培地（骨誘導培地）に交換することによって）、骨系細胞への分化を促す。これらの添加剤の添加量は例えば、デキサメタゾンについては約10 mM、β−グリセロリン酸ナトリウムについては約10-8 M、L−アスコルビン酸二リン酸塩については約0.05mMとする。分化誘導中は適宜培地交換を行う。例えば３日に一度の頻度で培地交換を行う。分化誘導のための培養は例えば１日間〜１４日間継続する。【００３２】
（５）細胞の回収
次に、分化誘導後の細胞を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収することができる。このようにして回収した細胞を用いて移植材料を調製する。以下、移植材料の調製法の一例を示す。【００３３】
（移植材料の調製法）
以下に示す調製法では、(i)トロンビン溶液を用意するステップ、(ii)多血小板血漿（PRP）を調製するステップ及び(iii)各成分を混合してゲル化させるステップが実施される。以下、ステップ毎に説明する。【００３４】
(i)トロンビン溶液を用意するステップ
このステップではトロンビンを所定量含有する溶液を用意する。トロンビン溶液におけるトロンビン濃度は特に限定されないが、後述のステップ(iii)において適切なゲル化を達成できる濃度とする。例えばトロンビン濃度を100U／ml〜10000U／ml含有するトロンビン溶液とする。好ましくはトロンビン濃度を約1000 U／mlとする。安全性や免疫拒絶の観点からヒトトロンビンを使用することが好ましい。ヒトトロンビンとして例えばトロンビン−ヨシトミ（登録商標）を使用することができる。或いは自己血液から調製したヒトトロンビンを使用してもよい。カルシウムイオンの存在下でトロンビンを作用させることによって多血小板血漿（PRP）中のフィブリノーゲンからフィブリンが生成し、凝固（ゲル化）する。従って、カルシウムイオンを含有するトロンビン溶液を用意すれば、トロンビン溶液とPRPとを混合する際（ステップ(iii)）別途カルシウムイオンを添加する必要がない。例えば、トロンビン溶液を5%〜25%塩化カルシウム溶液として調製することが好ましい。更に好ましくは約10%塩化カルシウム溶液として調製したトロンビン溶液を使用する。【００３５】
(ii)多血小板血漿（PRP）を調製するステップ
このステップでは、生体から分離された血液から多血小板血漿（PRP）を調製する。PRPは日赤PC（濃厚血小板）採取法に準じて調製することができる。PRPの調製方法の具体例を以下に示す。まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及び軟膜が分離する条件（例えば約1,100rpmで約10分間）で遠心処理する。これにより２層に分離される。上層を採取した後、更に約2,500rpmで約10分間、遠心処理する。その結果得られた画分（Platelet-rich Plasma：PRP）を採取する。PRPの調製方法は当該方法に限定されるものではなく、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。
毒性ないし免疫拒絶の観点からレシピエント自身（即ち、本発明の自家又は同種移植用組成物を適用する対象）の血液を用いてPRPを調製することが好ましいが、同種由来の血液からPRPを調製することにしてもよい。【００３６】
PRPに含まれる血小板の数（血小板濃縮率）についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約150倍〜約1500倍の血小板を含有する血漿を本発明におけるPRPとすることができる。
本発明においてPRPの「血小板濃縮率」は、次の式で表される。
血小板濃縮率（％）＝（PRP中の平均血小板数／出発材料である全血中の平均血小板数）×100
従って、例えばPRP中の平均血小板数が1,000,000であって、全血中の平均血小板数が300,000であるときの血小板濃縮率は約333％となる。以前の研究によって、PRPの血小板濃縮率が組織の再生効果と関連性を有することが明らかとなった。そこで、一層高い再生効果を得るべく、血小板濃縮率が約150％〜約1500％（平均血小板数に換算した場合には通常、約240,000個／μL〜約6,150,000個／μLに相当する）の範囲にあるPRPを用いることが好ましく。更に好ましくは血小板濃縮率が約300％〜約700％（平均血小板数に換算した場合には通常、約480,000個／μL〜約2,870,000個／μLに相当する）の範囲にあるPRPを用いる。【００３７】
PRPを調製する際の遠心処理の条件を適宜調節することによって、所望の血小板濃縮率のPRPを得ることができる。例えば、上記の如き二段階の遠心処理を実施することとし、最初の遠心処理を約500rpm〜約1500rpm（例えば1,100rpm）、約5分間〜約15分間（例えば約5分）の条件で実施し、２段階目の遠心処理を約2000rpm〜約5000rpm（例えば約2,500rpm）、約5分間〜約15分間（例えば約5分）の条件で実施することで、血小板濃縮率が約300％〜約700％の範囲にあるPRPを得ることができる。出発材料である血液や使用する器具の相違によって、同条件で処理したとしても最終的に得られるPRPの血小板濃縮率が変動することが予想されるが、当業者であれば通常、上記条件を考慮しつつ、得られたPRPの血小板濃縮率に基づいて条件の修正を施すことによって、所望の血小板濃縮率のPRPを調製する条件を見出すことができる。
尚、PRPの血小板濃縮率の計測は常法（例えば、市販のSysmex XE-2100（Sysmex、東京、日本）を使用）を利用して行うことができる。【００３８】
本発明の自家又は同種移植用組成物を構築するために使用するPRPの血小板濃縮率は上記の通りである。一方、最終的な組成物（本発明の自家又は同種移植用組成物）の血小板濃度は、PRPの血小板濃縮率、PRPとそれに組み合わせる他の成分の使用比率等によって変動するものの、例えば約240,000個／μL〜約6,150,000個／μL、好ましくは約480,000個／μL〜約2,870,000個／μLである。このような濃度で血小板を含有することによって、良好な組織再生効果が得られる。尚、例えば血小板濃縮率が約300％〜約700％の範囲にあるPRPを使用すれば、最終的な組成物の血小板濃度を約480,000個／μL〜約2,870,000個／μLの範囲に調整することが可能である。【００３９】
(iii)各成分を混合してゲル化させるステップ
このステップでは、ステップ(i)で用意したトロンビン溶液と、ステップ(ii)で調製した多血小板血漿と、上記調製法で調製した歯髄幹細胞とをカルシウムイオン存在下で混合してゲル化させる。この際、サイトカイン（BMP、PDGF、bFGF等）も併せて混合することも可能である。【００４０】
好ましくは、これらの成分を混合する際に空気を所定割合で混合する。空気を混合することによってゲル化の状態の調整（流動性の調整）が行える。また、空気を混合して得られる組成物では、それを生体に移植した際、適量の空気が周囲に存在することによって、組成物中の細胞が生存・増殖するのに適した環境を作り出すことができ、もって良好な組織再生効果を期待できる。【００４１】
本発明では各成分を例えば次の混合比（体積基準）で混合し、ゲル化させる。
(a)トロンビン溶液：多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量：空気＝１：３〜７：０．１〜５．０
当該混合比で混合することによって、操作性、及び移植後の定着性の観点から適度な流動性を有するとともに、良好な再生効果（治療効果）を発揮するゲル状の組成物が得られる。【００４２】
ここで、多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量の混合率、及び／又は空気の混合率に応じて、得られるゲル状組成物の流動性が変化する。つまり(a)の混合比を操作することによって、得られるゲル状組成物の流動性を調節することができる。具体的には、流動性が比較的低い組成物が必要であれば、上記混合比の範囲内において、多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量の混合率が小さい（及び／又は空気の混合率が小さい）混合比を採用し、流動性が比較的高い組成物が必要であれば、上記混合比の範囲内において、多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量の混合率が大きい（及び／又は空気の混合率が大きい）混合比を採用すればよい。
尚、トロンビン溶液、多血小板血漿、及び歯髄幹細胞は生体由来の成分であるため、採取源の相違などに起因して性状に多少の変動があり、これがゲル化状態へ影響することが考えられるが、本発明者らのこれまでの経験によれば、上記混合比の範囲内で各成分を混合すれば通常、上記の如き優れた特性を有するゲル化状態の組成物が得られる。【００４３】
本発明の好ましい一態様では、各成分の混合比を次の通りとする。
(a1)トロンビン溶液：多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量：空気＝１：４〜６：０．３〜３．０
当該混合比を採用することによって、所望の流動性を有するゲル化状態の組成物をより確実に調製することが可能となる。
各成分の混合比の具体例を以下に示す。
トロンビン溶液：多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量：空気＝１：４：１．０
トロンビン溶液：多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量：空気＝１：５：１．０
トロンビン溶液：多血小板血漿と歯髄幹細胞の総量：空気＝１：６：１．０【００４４】
上記の比率で各成分を混合することによって、典型的には、歯髄幹細胞を約1.0×105〜約1.0×108個／ml含有する組成物を得ることができる。このような組成物によれば、組織欠損部に適用した際、良好な組織再生効果を期待できる。
【実施例】
【００４５】
Ａ．歯髄幹細胞の特性の検討
１．方法
（１）増殖試験
乳歯と永久歯から歯髄幹細胞を調製し、増殖能を比較した。まず、自然に脱落した、あるいは抜歯された乳歯と抜歯後の永久歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液に浸した後、培地中に回収した。生食注水下にて、歯科用バーを用いて乳歯及び永久歯を分割した。続いて、歯科用ファイルを用いて歯髄を採取し、培地中に回収した。コラゲナーゼ3mg/mlとディスパーゼ4mg/mlを用いて、37℃で１時間酵素処理した後、セルストレーナーを通し、夾雑成分を除去した。細胞を洗浄した後、培養皿に播種し、37℃、5%CO2のインキュベータ内で培養した。ウシ胎仔血清（20%）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）及びアンフォテリシンB（0.25μg/ml）を添加したDMEMを培養液とした。
細胞の生着確認後、培地交換を行った。以降、３日毎に培地交換を行い、コンフルエントに達した時点で継代を行った。
以上のようにして得られた、乳歯歯髄幹細胞と、永久歯歯髄幹細胞の増殖能を、BrdU細胞増殖アッセイキットを利用して比較した。【００４６】
（２）フローサイトメトリー
乳歯由来の歯髄幹細胞における各種表面マーカーの発現をフローサイトメトリー（FCM）で調べた。【００４７】
２．結果
（１）増殖能
乳歯歯髄幹細胞は良好な増殖能を示し、培養開始から２１日目にはコンフルエントな状態になった（図１、左下）。また、継代後も良好な増殖能を維持した（図１、右下）。
一方、永久歯歯髄幹細胞よりも乳歯歯髄幹細胞の方が増殖能は高い（図２）。尚、歯髄幹細胞の増殖能は、骨髄幹細胞の増殖能（図２左）を凌駕する。【００４８】
（２）表面マーカー
CD13陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD73陽性、CD105陽性、CD146陽性、CD14陰性、CD31陰性、CD34陰性、CD45陰性であることがわかった（図３、４）。【００４９】
Ｂ．移植実験１
イヌ動物モデルを用いて、歯髄幹細胞の骨形成能を評価した。
１．方法
（１）イヌ動物モデル
抜歯後、直径10mmのトレフィンバーを用いて下顎の両側に、外側皮質に垂直になるように骨欠損を形成した。このように形成した骨欠損部に、PRPとイヌ永久歯歯髄幹細胞、イヌ乳歯歯髄幹細胞（乳歯歯髄幹細胞は同種移植）を用いて調製した移植材料（試験群）及びPRPとイヌ骨髄幹細胞（dMSCs）を用いて調製した移植材料（対照群）を移植し、骨形成を観察した。【００５０】
（２）歯髄幹細胞の調製
上記「歯髄幹細胞の特性の検討」の１．（１）に記載した方法と同様の方法で歯髄幹細胞を採取し、培養した。同様の方法で子イヌの乳歯から歯髄幹細胞を採取し、培養した（乳歯歯髄幹細胞）。尚、骨芽細胞への分化を誘導するため、３種類の添加剤、即ち、デキサメタゾン（Dex）、β−グリセロリン酸ナトリウム（β−GP）、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩（AsAP）を添加した培地を用い、95%空気及び5%CO2の湿潤雰囲気中、37℃で細胞を培養した。培養後、細胞をトリプシン処理し、移植材料の調製に使用した。【００５１】
Ｃ．移植実験２
イヌ動物モデルを用いて、永久歯歯髄幹細胞（自家移植）及び乳歯歯髄幹細胞（同種移植）の骨形成能を骨髄幹細胞（MHCs）と比較・評価した。【００５２】
１．方法
（１）イヌ動物モデル
抜歯後、直径10mmのトレフィンバーを用いて下顎の両側に、外側皮質に垂直になるように骨欠損を形成した。このように形成した骨欠損部に、欠損のみ（対照）、PRPとイヌ永久歯歯髄幹細胞を用いて調製した移植材料（自家移植）、PRPとイヌ乳歯歯髄幹細胞を用いて調製した移植材料（同種移植）、及びPRPと骨髄幹細胞用いて調製した移植材料を移植し、骨形成を観察した。【００５３】
（２）歯髄幹細胞の調製
上記「歯髄幹細胞の特性の検討」の１．（１）に記載した方法と同様の方法で、親イヌの永久歯から歯髄幹細胞を採取し、培養した（永久歯歯髄幹細胞）。同様の方法で子イヌの乳歯から歯髄幹細胞を採取し、培養した（乳歯歯髄幹細胞）。尚、骨芽細胞への分化を誘導するため、３種類の添加剤、即ち、デキサメタゾン（Dex）、β−グリセロリン酸ナトリウム（β−GP）、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩（AsAP）を添加した培地を用い、95%空気及び5%CO2の湿潤雰囲気中、37℃で細胞を培養した。培養後、細胞をトリプシン処理し、移植材料の調製に使用した。【００５４】
（３）骨髄幹細胞の調製
骨髄幹細胞は、イヌ腸骨稜骨髄より穿刺し、既報の方法（Kadiyala, S., Young, R.G., Thiede, M.A., and Bruder, S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant 6, 125, 1997.）に従って単離した。簡単に説明すると、低グルコースDMEMに成長補助剤（間葉系細胞成長添加剤を50mL、200mMのL-グルタミンを10mL、及び2.5ユニットのペニシリン及び25μgのストレプトマイシンを含有するペニシリン−ストレプトマイシン混合物を0.5mL）を添加した培地で培養した後、骨芽細胞への分化を誘導するため、３種類の添加剤、即ち、デキサメタゾン（Dex）、β−グリセロリン酸ナトリウム（β−GP）、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩（AsAP）を添加した培地を用い、95%空気及び5%CO2の湿潤雰囲気中、37℃で細胞を培養した。培養後、細胞をトリプシン処理し、移植材料の調製に使用した。【００５５】
（４）移植材料（細胞／PRP混合物）の調製及び注入
約50mLの全血をイヌから採血し、保存剤非含有のヘパリン（250U/mL）とともに10mLの培養液を含む遠心チューブに入れた。血液は最初に標準的な実験室用遠心機（Himac CT、日立社、東京、日本）を用いて1100rpm、５分間の条件で遠心処理した。続いて、黄色の血漿（血小板と白血球を含んだ軟膜を含む）をカニューレで単層中間層を採取した。血小板をペレットにするために、2500rpm、５分の条件で２回目の遠心処理を行った。そして、乏血小板血漿（PPP）であって、細胞含有量の比較的少ない血漿上清を除去した。得られた血小板ペレット、即ち軟膜／血漿フラクション（PRP）を、残りの血漿5mLに懸濁し、血小板ゲルに使用した。PRPとPPP内の血小板数はSysmex XE-2100（Sysmex、東京、日本）で測定した。その結果、全血小板数は平均値295,000（224,000〜333,000の範囲）であった。一方、PRPの血小板数は平均値1,293,400（935,000〜1,840,000の範囲）であった。これらの測定結果によって、血小板が分離できていることが確認できるとともに、PRPにおける濃縮の度合いは438%（対全血血小板数（100%））であることが判明した。PRPは、使用時まで一般的な振盪機内において室温で保存した。【００５６】
粉状ウシトロンビン（5,000ユニット）を別の滅菌容器内で10%塩化カルシウム溶液5mLに溶解した。次に、1.8mLのPRP、細胞（（２）で調製した歯髄幹細胞（1.0×107cells/mL）又は（３）で調製した骨髄幹細胞（1.0×107cells/mL））、及び0.1mLの空気を2.5mL注射器内に吸引し、また第２注射器（2.5mL）内には300μLのトロンビン−塩化カルシウム混合物を吸引した。ここで細胞を直接PRP内に再懸濁した。上記二つの注射器を三方活栓で連結し、両注射器内で交互に混合し、これによって二つの注射器間を空気のバブルが行き来するようにした。フィブリンに作用し不溶性ゲルを形成させるという、トロンビンの効果によって、5〜30秒内で内容物がゲル状の粘度を呈した。得られたゲル状組成物（PRP/歯髄幹細胞混合物、及びPRP/骨髄幹細胞組成物）を骨欠損部に注入（移植）した。【００５７】
（５）組織学的及び組織形態計測学的分析
移植２週後、４週後、及び８週後にトレフィンバーを用いて各移植部を切り出し（直径2mm）、組織学的分析に供した。標本は８%フォルマリン緩衝液で固定し、脱灰し（K-CX;  Falma、東京、日本）、そしてヘマトキシリン・エオジン染色に供した。これらの標本を光学顕微鏡下で観察し、骨形成を評価した。【００５８】
２．結果
（１）歯髄幹細胞の骨芽細胞への分化
分化誘導開始から１５日目には骨結節が認められ、培養時間の経過とともに骨結節の増大が認められた（図５）。分化誘導開始から２６日目の細胞を分析した結果、骨芽細胞マーカーの発現が確認された（図６）。【００５９】
（２）骨形成能の比較・評価
移植２週後、４週後、及び８週後のヘマトキシリン・エオジン染色像をそれぞれ図７〜９に示す。PRP/乳歯歯髄幹細胞混合物を移植したもの（乳歯歯髄群）、PRP/永久歯歯髄幹細胞混合物を移植したもの（永久歯歯髄群）のいずれについても、経時的な骨組織の増大を認めた。その骨再生効果は、PRP/骨髄幹細胞混合物を移植したもの（骨髄MSCs群）と同等であることがわかる。これに対して、コントロール群では十分な骨再生が観察されていない。【００６０】
Ｄ．移植実験２（創傷治癒モデルによる乳歯歯髄幹細胞の治療効果の検討）
１．実験目的
手術などによる創が瘢痕を形成することなく治癒することはscarless healingと呼ばれており、顎顔面、形成外科領域を含め、外科領域手術において目指すべき重要な課題である。しかしながら、現在のところ口唇裂、外傷、あるいは腫瘍などの手術において、顔面含め多くの領域で傷跡を制御することは困難であり、不幸にして瘢痕が形成された場合には、患者にとって大きな負担となっている。瘢痕などが形成された場合の多くにおいて、現在の治療法としては外科的に切除する方法が主流である。創傷治癒はさまざまな増殖因子やサイトカインが関与する複雑な過程であることから、創が目立たないように治癒させるためには、これら単一の因子で制御することは困難と考えられ、現在までに有効な方法は報告されていない。創傷治癒に対する歯髄幹細胞の有効性を検討するため、創傷治癒モデルを用いた実験を施行した。【００６１】
２．実験方法
（１）細胞培養
ヒト乳歯歯髄幹細胞（hSHED）、ヒト口腔粘膜由来線維芽細胞（hFibro）及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMHCs）を使用し、創傷治癒、瘢痕形成に与える影響について比較・評価した。乳歯はヒトの成長に伴い生理的に脱落するため、より低侵襲な幹細胞源として期待されている。【００６２】
（２）細胞移植実験
既に報告のあるシリコンプレートモデルを使用した。動物はヌードマウス（KSN/slc）を使用し、ヌードマウス背部左右一箇所ずつ計2箇所に既製生検パンチ8mmで創傷を作製した。シリコンプレート（0.5mm）の外径は16mm、内径8mmとし、シリコンプレートは瞬間接着剤で接着させ、さらに4-0絹糸で周囲と皮膚を縫合した。培養した細胞（5×106個）をPBS100μlに混合し、30Gを使用して注入移植した。最後に創部保護の目的でテガダームを貼付した。なお、対照（コントロール）としてPBSを移植した。【００６３】
３．実験結果
（１）創部形態計測
創部面積の経日的変化をデジタルカメラで撮影し、創部面積を計測した。14日後までに細胞移植群とコントロール郡の差を認めた（図１０）。この結果は乳歯歯髄幹細胞が間葉系幹細胞や線維芽細胞と同様に細胞移植療法に有効な細胞あることを示す。【００６４】
（２）蛍光免疫染色
受傷後一時的に創傷治癒に対して細胞外マトリックスであるヒアルロン酸が重要な働きを示し、レベルが上昇するという報告に従えば、ヒアルロン酸が創傷治癒過程において重要な働きを担うと考えられる。そこでヒアルロン酸レベルの変化についても検討した。細胞移植実験後7日、14日後に実験動物をと殺し、あらかじめマーキングしておいたPKH26、ヒアルロン酸結合タンパク、DAPIによる核染色にて3重染色を行い、組織評価を行なった。7日後、14日後の蛍光免疫染色で移植細胞周囲に細胞から放出されたと思われるヒアルロン酸の確認を認めた（図１１、１２）。【００６５】
（３）まとめ
以上の結果より、乳歯歯髄幹細胞には、創傷治癒を促進するとされる間葉系幹細胞（MSCｓ）と同等の創傷治癒効果を期待できる。創傷治癒過程にはヒアルロン酸の合成が関与するとされる。上記の結果は、乳歯歯髄幹細胞及びMSCsがヒアルロン酸を合成し、創傷治癒を促していることを示唆する。しわ、歯間乳頭再生などの審美的改善に加え、口唇口蓋裂などの瘢痕、ケロイド、手術創の治癒促進に乳歯歯髄幹細胞の応用が可能といえる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、自家又は同種移植による組織の再生を可能とする。従って、自家移植による場合と比較して適用範囲は飛躍的に拡大する。本発明の自家又は同種移植用組成物の適用症例の例として骨疾患（歯周病、骨欠損（インプラントのための骨増生、顎裂部、腫瘍切除部などを含む）、骨粗鬆症、骨折、じん帯断裂、スポーツ外傷など）、軟骨疾患（膝関節、顎関節など）、神経疾患（神経再生：アルツハイマー病、パーキンソン病など）、皮膚疾患（ケロイド、瘢痕への応用）、加齢疾患（しわ、あざなどのアンチエイジング疾患）、血管障害（血管の再生など）が想定される。また、毛髪の再生への利用も期待される。
本発明の自家又は同種移植用組成物によれば、従来は医療廃棄物として廃棄されていた細胞を活用できるという効果も奏される。【００６７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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