(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
半減期延長ペプチドと目的ペプチドの複合ペプチドであって、
前記半減期延長ペプチドが、以下の（Ｉ）のペプチドであり、
前記半減期延長ペプチドが目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合してなり、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて当該複合ペプチドの血漿中の半減期が延長している複合ペプチド（但し、複合ペプチドのアミノ酸配列が、グレリンのアミノ酸配列と同じであるものを除く）。
（Ｉ）  式：Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、又はＡ−Ｂ−Ｃで表され、式中、
Ａが、SPEHQRVQQR、EHQRVQQR、QRVQQR、VQQR、VQQ、QR、RPQLKAPP、及びAGSVDHKGKQRからなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｂが、KESKK、KKSEK、KEKK、KEFKK、KETKK、KEPKK、KELKK、KEAKK、KDSKK、KRDSRR、KKSEKR、KGESKK、KESGKK、KGGESKK、KGGESGKK、KKAYSPDKERK、及びKVVDHPKRからなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｃが、PPAKLQPR、RQQV、PPAKLQ、PPAK、PP、AKLQPR、AKLAALKA、PPAKLAALKA、PPAELAALEA、PPAELAALKA、及びPPALQPRからなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
他の目的ペプチドに結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチド
【請求項２】
半減期延長ペプチドが、前記目的ペプチドのＮ末端又はＣ末端に結合している場合には、以下の群から選択される１つのペプチド、又は半減期延長ペプチドが前記目的ペプチドのＮ末端及びＣ末端に結合している場合には、以下の群から選択される同一若しくは異なる２つのペプチドである請求項１に記載の複合ペプチド；
配列番号106のアミノ酸番号23から39 (VQQRKESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号108のアミノ酸番号1から17 (RPQLKAPPKKSEKRQQV) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号111のアミノ酸番号13から35 (SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号112のアミノ酸番号13から33 (EHQRVQQRKESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号113のアミノ酸番号13から31 (QRVQQRKESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号115のアミノ酸番号13から27 (QRKESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号116のアミノ酸番号13から25 (KESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号118のアミノ酸番号13から27 (VQQRKESKKPPAKLQ) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号119のアミノ酸番号13から25 (VQQRKESKKPPAK) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号120のアミノ酸番号13から23 (VQQRKESKKPP) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号121のアミノ酸番号13から21 (VQQRKESKK) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号131のアミノ酸番号13から28 (VQQRKEKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号132のアミノ酸番号13から29 (VQQRKEFKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号133のアミノ酸番号13から29 (VQQRKETKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号134のアミノ酸番号13から29 (VQQRKEPKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号135のアミノ酸番号13から29 (VQQRKELKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号136のアミノ酸番号13から29 (VQQRKEAKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号139のアミノ酸番号13から29 (VQQRKDSKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号141のアミノ酸番号13から29 (VQQKRDSRRPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号142のアミノ酸番号13から29 (VQQKKSEKRPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号143のアミノ酸番号13から30 (VQQRKGESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号144のアミノ酸番号13から30 (VQQRKESGKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号145のアミノ酸番号13から31 (VQQRKGGESKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号146のアミノ酸番号13から32 (VQQRKGGESGKKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号147のアミノ酸番号13から27 (VQQRKESKKAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号148のアミノ酸番号13から29 (VQQRKESKKAKLAALKA) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号149のアミノ酸番号13から31 (VQQRKESKKPPAKLAALKA) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号150のアミノ酸番号13から31 (VQQRKESKKPPAELAALEA) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号151のアミノ酸番号13から31 (VQQRKESKKPPAELAALKA) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号154のアミノ酸番号13から27 (KESKKPPAKLAALKA) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号155のアミノ酸番号13から33 (VQQKKAYSPDKERKPPALQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号156のアミノ酸番号13から34 (VQQKKAYSPDKERKPPAKLQPR) のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号158のアミノ酸番号18から36 (AGSVDHKGKQRKVVDHPKR) のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、モチリン、グルカゴン様ペプチド−１、副甲状腺ホルモン、若しくはカルシトニン、又はこれらの誘導体である請求項１又は２に記載の複合ペプチド。
【請求項４】
目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリンである請求項３に記載の複合ペプチド。
【請求項５】
複合ペプチドが、配列番号106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 139, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 156, 157又は158に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項１に記載の複合ペプチド。
【請求項６】
複合ペプチドが、配列番号106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 139, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 156, 157又は158に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１に記載の複合ペプチド。
【請求項７】
複合ペプチドが、配列番号110、125 又は 157に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１に記載の複合ペプチド。
【請求項８】
半減期延長ペプチドが、目的ペプチドのＮ末端に結合した請求項１に記載の複合ペプチド。
【請求項９】
半減期延長ペプチドが、目的ペプチドのＣ末端に結合した請求項１に記載の複合ペプチド。
【請求項１０】
半減期延長ペプチドが、目的ペプチドの両末端に結合した請求項１に記載の複合ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれに記載の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分とし、複合ペプチド中の目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である医薬組成物。
【請求項１２】
急性心不全、慢性心不全、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞から選択される疾患の治療用である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分とし、複合ペプチド中の目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である医薬組成物。
【請求項１４】
異型軟骨形成不全症、冠状動脈狭窄後のPTCA後の再狭窄、肺性高血圧症、末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎から選択される疾患の治療用である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分とし、複合ペプチド中の目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である医薬組成物。
【請求項１６】
機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎から選択される疾患の治療用である請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
半減期延長ペプチドと目的ペプチドの複合ペプチドの製造方法であって、
以下の（Ｉ）の半減期延長ペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長され且つ当該目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチドの製造方法。
（Ｉ）  式：Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、又はＡ−Ｂ−Ｃで表され、式中、
Ａが、SPEHQRVQQR、EHQRVQQR、QRVQQR、VQQR、VQQ、QR、RPQLKAPP、及びAGSVDHKGKQRからなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｂが、KESKK、KKSEK、KEKK、KEFKK、KETKK、KEPKK、KELKK、KEAKK、KDSKK、KRDSRR、KKSEKR、KGESKK、KESGKK、KGGESKK、KGGESGKK、KKAYSPDKERK、及びKVVDHPKRからなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｃが、PPAKLQPR、RQQV、PPAKLQ、PPAK、PP、AKLQPR、AKLAALKA、PPAKLAALKA、PPAELAALEA、PPAELAALKA、及びPPALQPRからなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
他の目的ペプチドに結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチド
【請求項１８】
半減期延長ペプチドを、目的ペプチドのＮ末端に結合させる請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
半減期延長ペプチドを、目的ペプチドのＣ末端に結合させる請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
半減期延長ペプチドを、目的ペプチドの両末端に結合させる請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
目的ペプチドが、ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的ペプチドの体内動態を改善し、治療目的に適った体内動態を付与することにより治療上の有用性を与えることができるペプチド、体内動態が改善され且つ目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチド、この複合ペプチドを含む医薬組成物、及びこの複合ペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬として応用可能な生理活性ペプチドが存在していても、当該ペプチド中には血漿中半減期が短いものがあり、治療目的への応用には静脈内や皮下への持続的な投与、又は持続放出型DDS製剤の投与などによって実現を図る必要がある。このため、実際の応用には長期間に亘る多大な時間と費用を費やすことが必要である。
例えば、生理活性ペプチドの血漿中半減期を延長させて医薬として開発した例として、Glucagon-like Peptide-1の事例が知られている（非特許文献１）。生理活性ペプチドの作用を明確にするための臨床研究は持続静脈内投与が多く用いられたが（非特許文献２）、２型糖尿病治療のためにはボーラス皮下投与が可能な半減期を延長させたペプチドが創製された。このように、実際の治療薬として開発するためには半減期を延長させた誘導体の開発が必要である事例があり、その事例では、生理活性ペプチド誘導体が化学合成され、又は異種の天然のペプチドであっても半減期の長いものが開発されてきた（非特許文献３〜５）。
また、半減期の短い生理活性ペプチドを医薬として応用しようとするとき、半減期の長いタンパク質に結合させることにより、生理活性ペプチドの半減期をこのタンパク質の半減期に近づける試みがなされており、例えば血清アルブミンに結合基を持つスペーサーを介して目的の生理活性ペプチドと当該タンパク質とを結合させること等が試験段階にある（非特許文献６）。
従って、半減期の短い生理活性ペプチドを実用に供するために、当該半減期を延長させることができる物質を付加することで体内動態を改善し、従来の技術では治療効果を示すことができなかった生理活性ペプチドを医療に応用することが期待されている。
短半減期の生理活性ペプチドを改変し、医薬として応用する試みはこれまでに幅広くなされてきており、ペプチドを安定化すること、製剤的な工夫により持続性を持たせること等が試みられ、実用化に成功した例も知られている。【０００３】
一方、グレリン(Ghrelin)は1999年に胃から発見されたホルモンであり、２８残基からなるアミノ酸配列を有し、当該配列のアミノ末端から3番目のアミノ酸が脂肪酸でアシル化された極めて珍しい化学構造を有するペプチドである（非特許文献6、特許文献1）。グレリンは成長ホルモン分泌促進因子レセプター１ａ（Growth Hormone Secretagogue-Receptor 1a：GHS-R1a）に働き（非特許文献７）、下垂体からの成長ホルモン(GH)の分泌を亢進させる内因性の脳−消化管ホルモンである（非特許文献7）。
また、グレリンはGHS-R1aに対する内因性のGHSとして、ラットから初めて単離精製され、ラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス、イヌ等からも、類似した一次構造を有するグレリンが単離され、それらのアミノ酸配列が知られている（特許文献1、非特許文献8）。上記グレリンはいずれも、３位のセリン残基又はスレオニン残基の側鎖水酸基がオクタン酸、デカン酸などの脂肪酸によりアシル化された特異的な構造を有するペプチドであり、このような疎水性修飾構造を有する生理活性ペプチドは、グレリン以外に生体から単離された例はない。
最近の研究では、グレリンが食欲を亢進させること、皮下投与することにより体重及び体脂肪が増加すること（非特許文献9〜11）、及び心機能を改善する等などの作用を有することも明らかにされている（非特許文献12〜14）。更にグレリンはGH分泌促進作用や食欲亢進作用を持ち、GHの作用を介して脂肪を燃焼してエネルギーに変換する作用、あるいはGHのアナボリックな作用を発現して筋肉を増強させる効果を、食欲亢進によって更に、有効に引き出せることが期待されている（非特許文献15）。
但し、グレリンの活性中心はアシル基を有するＮ末端部分であることが示されているが（特許文献１）、Ｃ末端部分の生理学的意義については不明な点が多いのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO01/07475
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mojsov S, Weir GC, Habener JF.  J Clin Invest. 1987, 79(2):616-619.
【非特許文献２】Nauck MA, Heimesaat MM, Orskov C, Holst JJ, Ebert R, Creutzfeldt W., J Clin Invest. 1993, 91(1):301-307.
【非特許文献３】O'Harte FP, Mooney MH, Lawlor A, Flatt PR., Biochim Biophys Acta. 2000, 6;1474(1):13-22.
【非特許文献４】Madsbad S, Schmitz O, Ranstam J, Jakobsen G, Matthews DR, .Diabetes Care. 2004, 27(6):1335-1342.
【非特許文献５】DeFronzo RA, Ratner RE, Han J, Kim DD, Fineman MS, Baron AD.、Diabetes Care. 2005, 28(5):1092-1100.
【非特許文献６】Kim JG, Baggio LL, Bridon DP, Castaigne JP, Robitaille MF, Jette L, Benquet C, Drucker DJ., Diabetes. 2003, ;52(3):751-759.
【非特許文献７】Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K., 1: Nature. 1999, 9;402(6762):656-660.
【非特許文献８】児島 将康, 寒川 賢治, 生化学, 第79巻, 第9号, pp.853-867, 2007年
【非特許文献９】Choi K, Roh SG, Hong YH, Shrestha YB, Hishikawa D, Chen C, Kojima M, Kangawa K, Sasaki S., Endocrinology. 2003, 144(3):754-9.
【非特許文献１０】Neary NM, Small CJ, Wren AM, Lee JL, Druce MR, Palmieri C, Frost GS, Ghatei MA, Coombes RC, Bloom SR.,J Clin Endocrinol Metab. 2004, 89(6):2832-6
【非特許文献１１】Akamizu T, Iwakura H, Ariyasu H, Hosoda H, Murayama T, Yokode M, Teramukai S, Seno H, Chiba T, Noma S, Nakai Y, Fukunaga M, Nakai Y, Kangawa K, FD Clinical Study Team . Eur J Endocrinol. 2008, 158(4):491-8
【非特許文献１２】Nagaya N, Kojima M, Uematsu M, Yamagishi M, Hosoda H, Oya H, Hayashi Y, Kangawa K., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001, 80(5):R1483-7.
【非特許文献１３】Nagaya N, Miyatake K, Uematsu M, Oya H, Shimizu W, Hosoda H, Kojima M, Nakanishi N, Mori H, Kangawa K., 1: J Clin Endocrinol Metab. 2001, 86(12):5854-5859.
【非特許文献１４】Nagaya N, Uematsu M, Kojima M, Ikeda Y, Yoshihara F, Shimizu W, Hosoda H, Hirota Y, Ishida H, Mori H, Kangawa K., Circulation. 2001, 18;104(12):1430-1435
【非特許文献１５】Korbonits M, Goldstone AP, Gueorquiev M, Grossman AB, Front Neuroendocrinol., 2004, 25:27-68
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血漿中の半減期が短いために医薬品として適さなかった生理活性ペプチドの半減期を延長する作用を有するペプチド、目的ペプチドの生理活性を有しながら血漿中半減期が延長されていることにより医薬品として実用できる複合ペプチド、及び当該複合ペプチドの製造方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血漿中の半減期が短く医薬品として応用するためには静脈内や皮下に持続注入する等しなければならなかった目的の生理活性を有するペプチド（以下、目的ペプチドと称する）に付加することにより、血漿中半減期を延長することができるペプチドを開発することを試み、グレリンのアミノ酸配列のＣ末端部分に半減期延長モチーフとなるアミノ酸配列を見出した。当該半減期を延長させることができるアミノ酸配列を有するペプチドを、本発明では半減期延長ペプチドと称する。
即ち、当該半減期延長ペプチドを目的ペプチド（例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）、モチリン等）のＮ末端側、Ｃ末端側又は両端に結合させることにより、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、血漿中の半減期を延長させることができることを見出した。本発明では半減期延長ペプチドを目的ペプチドに結合させることにより得られ、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長されたペプチドを、複合ペプチドと称する。
また、半減期延長ペプチドに係るアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列に基づく場合のみならず、そのＮ末端とＣ末端が逆に入れ替わった逆配列や、部分的にＮ末端とＣ末端が逆に入れ替わった配列に基づく場合でも用いることができることを見出した。
また、複合ペプチドは、目的ペプチドを分解する酵素（例えば、Neutral Endopeptidase）に対して抵抗性を有することや、天然型の目的ペプチドと同様に、反復投与を行なっても抗原性を示さず安全に用いることが可能であることを見出した。【０００８】
更に、天然型の目的ペプチドと複合ペプチドを、個体に対して同じ用量及び用法で投与したところ、目的ペプチドのみでは十分な目的の生理作用が得られない用量であっても、当該ペプチドに半減期延長ペプチドを結合させて半減期を延長することにより、生体において十分な目的の生理作用を示すことができることを見出した。これにより、持続注入によらない用法で医薬品としての適性を付与できることが示された。即ち、短半減期であるために静脈内又は皮下への持続投与が必要であった目的ペプチドに本発明に係る半減期延長ペプチドを付加することによりボーラス投与が可能となり、且つ天然の目的ペプチドに比べて複合ペプチドでは目的の活性が容易に得られることを見出した。【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の事項に関する。
項１．
以下の（Ｉ）又は（ＩＩ）のペプチド
（Ｉ）  式：Ｂ、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、又はＡ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ及びＣが、それぞれ以下の（１）、（２）、及び（３）に示されるものであり、他の目的ペプチドに結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチド
（ＩＩ）  （Ｉ）のペプチドとは逆向きの配列、（Ｉ）においてＡ−Ｂで表されＡ若しくはＢが逆向きの配列、（Ｉ）においてＢ−Ｃで表されＢ若しくはＣが逆向きの配列、又は（Ｉ）においてＡ−Ｂ−Ｃで表されＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、若しくはＡ及びＣが逆向きの配列からなるペプチド
（１）Ａは、1〜14の任意のアミノ酸からなるペプチド
（２）Ｂは、式1：(Wk-Xl-Y-Zm-Wn)-(Wo-Xp-Y-Zq-Wr）sで表されるペプチド
（式1中、Wは塩基性アミノ酸であり、X及びZは任意のアミノ酸であり、Yは酸性アミノ酸である。k=1又は2、4≧l≧0の整数、2≧m≧0の整数、4≧l+m≧０、n=1又は2である。o=1又は2、4≧p≧0の整数、2≧q≧0の整数、4≧p+q≧0、r=1又は2である。s=0又は1である。）
（３）Ｃは、2〜14の任意のアミノ酸からなるペプチド
項２．
Ｂが式1においてs=1のペプチドである項１に記載のペプチド。
項３．
上記式1において、o＝0、ｐ=0、ｑ=0、ｒ=２である項２に記載のペプチド。
項４．
Ｃが、αヘリックス構造を取り得る4〜9個のアミノ酸配列を含む、項１に記載のペプチド。
項５．
Ｃが、その末端とαヘリックス構造を取り得るアミノ酸配列との間にPro配列を有する、項４に記載のペプチド。【００１０】
項６．
式：Ｂ、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、又はＡ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、及びＣが以下の(1)又は(2)であり、他のペプチドに結合させた場合にその生理活性を保持しつつ、その半減期を延長できるペプチド。
(1)  Ａは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号1〜4の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列
Ｂは、配列番号34におけるアミノ酸番号5〜9のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
Ｃは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号10〜17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
(2)  Ａは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号1〜8の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
Ｂは、配列番号67におけるアミノ酸番号9〜13のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
Ｃは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号14〜17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。【００１１】
項７．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜57におけるアミノ酸番号5〜9、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号4〜8、及び配列番号58〜60におけるアミノ酸番号2〜6、配列番号61,62におけるアミノ酸番号3〜6、配列番号63〜65におけるアミノ酸番号3〜7、及び配列番号66におけるアミノ酸番号1〜3から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項８．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜57におけるアミノ酸番号5〜9、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号4〜8、及び配列番号58〜60におけるアミノ酸番号2〜6、配列番号61,62におけるアミノ酸番号3〜6、配列番号63〜65におけるアミノ酸番号3〜7、及び配列番号66におけるアミノ酸番号1〜3から成る群から選択される配列であり、
Ａが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,52〜57におけるアミノ酸番号1〜4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号1〜3のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号58〜60におけるアミノ酸番号1の配列、及び配列番号61〜65におけるアミノ酸番号1〜2のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列であり、
Ｃが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜54におけるアミノ酸番号10〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号9〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号57におけるアミノ酸番号10〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号58におけるアミノ酸番号7〜20のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号61におけるアミノ酸番号7〜13のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号63におけるアミノ酸番号8〜14のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号66におけるアミノ酸番号4〜18のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項９．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中Ａ，Ｂ，Ｃは項８と同じである項６に記載のペプチド。
項１０．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号67〜87におけるアミノ酸番号9〜13、配列番号91におけるアミノ酸番号15〜19、配列番号94におけるアミノ酸番号8〜11、配列番号96におけるアミノ酸番号8〜12、及び配列番号99におけるアミノ酸番号16〜18から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。【００１２】
項１１．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号67〜87におけるアミノ酸番号9〜13、配列番号90におけるアミノ酸番号8〜12、配列番号91におけるアミノ酸番号15〜19、配列番号94におけるアミノ酸番号8〜11、配列番号96におけるアミノ酸番号8〜12、及び配列番号99におけるアミノ酸番号16〜18から成る群から選択される配列であり、
Ａが配列番号67〜87におけるアミノ酸番号1〜8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号1〜7のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号91におけるアミノ酸番号1〜14のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号94,96におけるアミノ酸番号1〜7のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号99におけるアミノ酸番号1〜15のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列からなる群より選択される配列であり、
Ｃが配列番号67,69,72〜74,80,81,83,86〜87におけるアミノ酸番号14〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号68,70,71,75〜79,82,85におけるアミノ酸番号14〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号13〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号91におけるアミノ酸番号20、配列番号94におけるアミノ酸番号12〜13のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号96におけるアミノ酸番号13〜14のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１２．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃは項１１と同じである項６に記載のペプチド。
項１３．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜57におけるアミノ酸番号5〜9、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号4〜8、及び配列番号58〜60におけるアミノ酸番号2〜6から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
【００１３】
項１４．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜57におけるアミノ酸番号5〜9、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号4〜8、及び配列番号58〜60におけるアミノ酸番号2〜6から成る群から選択される配列であり、
Ａが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜57におけるアミノ酸番号1〜4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号1〜3のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号58〜60におけるアミノ酸番号1から成る群から選択される配列であり、
Ｃが配列番号34,36,39〜41,47,48,50,53〜54におけるアミノ酸番号10〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号9〜16のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号57におけるアミノ酸番号10〜16のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号58におけるアミノ酸番号7〜20のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１５．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項１４と同じである項６に記載のペプチド。
項１６．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号67〜87におけるアミノ酸番号9〜13、配列番号90におけるアミノ酸番号8〜12、及び配列番号91におけるアミノ酸番号15〜19から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
【００１４】
項１７．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号67〜87におけるアミノ酸番号9〜13、配列番号90におけるアミノ酸番号8〜12、及び配列番号91におけるアミノ酸番号15〜19から成る群から選択される配列であり、
Ａが配列番号67〜87におけるアミノ酸番号1〜8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号1〜7のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号91におけるアミノ酸番号1〜14のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列の場合であり、
Ｃが配列番号67,68,72〜74,80,81,83,86〜87におけるアミノ酸番号14〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号68,70,71,75〜79,82,85におけるアミノ酸番号14〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号13〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号91におけるアミノ酸番号20から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１８．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項１７と同じである項６に記載のペプチド。
項１９．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39〜41,47,48,50におけるアミノ酸番号5〜9、及び配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号4〜8から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。【００１５】
項２０．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39〜41,47,48,50におけるアミノ酸番号5〜9、及び配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号4〜8から成る群から選択される配列であり、
Ａが配列番号34,36,39〜41,47,48,50におけるアミノ酸番号1〜4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号1〜3のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列であり、
Ｃが配列番号34,36,39〜41,47,48,50におけるアミノ酸番号10〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号35,37,38,42〜46,49,52におけるアミノ酸番号9〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項２１．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２０と同じである項６に記載のペプチド。
項２２．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号67〜85におけるアミノ酸番号9〜13からなる群から選択される配列である項６に記載のペプチド。【００１６】
項２３．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号67〜85におけるアミノ酸番号9〜13からなる群から選択される配列であり、
Ａが配列番号67〜85におけるアミノ酸番号1〜8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列であり、
Ｃが配列番号67,69,72〜74,80,81,83におけるアミノ酸番号14〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号68,70,71,75〜79,82,85におけるアミノ酸番号14〜16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項２４．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２３と同じである項６に記載のペプチド。
項２５．
Ｂで表され、式中、
式：Ｂが配列番号34におけるアミノ酸番号5〜9の配列である項６に記載のペプチド。
項２６．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号34におけるアミノ酸番号5〜9の配列であり、
Ａが配列番号34におけるアミノ酸番号1〜4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列であり、
Ｃが配列番号34におけるアミノ酸番号10〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列である項６に記載のペプチド。
項２７．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２６と同じである項６に記載のペプチド。
項２８．
式：Ｂで表され、式中、
Ｂが配列番号67におけるアミノ酸番号9〜13の配列である項６に記載のペプチド。
【００１７】
項２９．
式：Ａ−Ｂ又はＢ−Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号67におけるアミノ酸番号9〜13の配列であり、
Ａが配列番号67におけるアミノ酸番号1〜8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列であり、
Ｃが配列番号67におけるアミノ酸番号14〜17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列である項６に記載のペプチド。
項３０．
式：Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２９と同じである項６に記載のペプチド。【００１８】
項３１．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合し、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長している複合ペプチド。
項３２．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＮ末端に結合した項３１に記載の複合ペプチド。
項３３．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＣ末端に結合した項３１に記載の複合ペプチド。
項３４．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドの両末端に結合した項３１に記載の複合ペプチド。
項３５．
目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である項３１〜３４のいずれか１項に記載の複合ペプチド。【００１９】
項３６．
項３１〜３５のいずれか１項に記載の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
項３７．
複合ペプチドが、項３５に記載のペプチドである項３６に記載の医薬組成物。
項３８．
複合ペプチド中の目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項３７に記載の医薬組成物。
項３９．
急性心不全、慢性心不全、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞から選択される疾患の治療用である項３８に記載の医薬組成物。
項４０．
複合ペプチド中の目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項３７に記載の医薬組成物。
項４１．
異型軟骨形成不全症、冠状動脈狭窄後のPTCA後の再狭窄、肺性高血圧症、末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎から選択される疾患の治療用である項４０に記載の医薬組成物。
項４２．
複合ペプチド中の目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である項３７に記載の医薬組成物。
項４３．
機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎から選択される疾患の治療用である項４２に記載の医薬組成物。
【００２０】
項４４．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長され且つ当該目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチドの製造方法。
項４５．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端に結合させる項４４に記載の方法。
項４６．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＣ末端に結合させる項４４に記載の方法。
項４７．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドの両末端に結合させる項４４に記載の方法。
項４８．
目的ペプチドが、ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
項４９．
目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項４８に記載の方法。
項５０．
目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項４８に記載の方法。
項５１．
目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である項４８に記載の方法。【００２１】
項５２．
項３６〜４３のいずれかに記載の医薬組成物から選択される医薬組成物を個体に投与することを含む、当該医薬組成物に含まれる目的ペプチドによる治療が可能な疾患の治療方法。
項５３．
医薬組成物が、項３７に記載の医薬組成物である項５２に記載の治療方法。
項５４．
医薬組成物が、項３８に記載の医薬組成物である項５３に記載の治療方法。
項５５．
上記疾患が、急性心不全、慢性心不全、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞から選択される疾患である項５４に記載の治療方法。
項５６．
医薬組成物が、項４０に記載の医薬組成物である項５３に記載の治療方法。
項５７．
上記疾患が、異型軟骨形成不全症、冠状動脈狭窄後のPTCA後等の再狭窄、肺性高血圧症、末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎から選択される疾患である項５６に記載の治療方法。
項５８．
医薬組成物が、項４２に記載の医薬組成物である項５３に記載の治療方法。
項５９．
上記疾患が、機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎から選択される疾患である項５８に記載の治療方法。
【００２２】
項６０．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドの血漿中の半減期を延長する方法。
項６１．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端に結合させる項６０に記載の方法。
項６２．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＣ末端に結合させる項６０に記載の方法。
項６３．
項１〜３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドの両末端に結合させる項６０に記載の方法。
項６４．
目的ペプチドが、ナトリウム利尿ペプチド、若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
項６５．
目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項６４に記載の方法。
項６６．
目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項６４に記載の方法。
項６７．
目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である項６４に記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る半減期延長ペプチドを短半減期である目的ペプチドに付加することにより、体内動態が改善されて医薬として実用的な半減期を有するものとなる。抗原性が天然型の目的ペプチドとほぼ同様であるため安全性に優れ、また体内で生理活性ペプチドを分解する酵素に対して抵抗性を示す。当該半減期延長ペプチドを用いることにより、これまで体内動態が改善された生理活性ペプチドの開発にかかってきたコストや時間を大きく削減することが可能となる。また、持続静脈内又は持続皮下投与によって治療されている生理活性ペプチドの投与方法を、単回ボーラス投与することが可能となり個体（患者）や医療現場のコンプライアンスを改善できることも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】雄性ラットにANP及びその複合ANP(A〜C)（0.1mg/kg）を静脈内又は皮下投与したときの血漿中ANP免疫活性濃度推移を示す図である。
【図２】雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(A、B)（0.1mg/kg）を単回静脈内又は皮下投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。
【図３】雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(B)（0.1mg/kg）を皮下投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度及び血漿中cGMP濃度推移を示す図である。
【図４】雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(B)（0.02mg/kg）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移に及ぼすNEP阻害剤の影響を示す図である。
【図５】雌性マウスに天然型CNP-22及びその複合CNP(B)（0.25mg/kg）を１日２回、２９日間反復皮下投与したときの身長、尾長及び体重推移を示す図である。
【図６】雄性ラットにモチリン及びその複合モチリン(A〜M)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中モチリン免疫活性濃度推移を示す図である。
【図７】雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(C〜I)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。
【図８】複合モチリン(N〜V、X〜Z、I〜XIII)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。
【図９】雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(D、J及びK）(20nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。
【図１０】雌性マウスに複合CNP(D及びJ)(50及び200nmol/kg)を１日１回、５６日間反復皮下投与したときの身長、尾長及び体重推移を示す図である。
【図１１】雌性マウスに複合CNP(J)(50及び200nmol/kg)を１日１回、５６日間反復皮下投与した後の全身像である。
【図１２】雌性ラットに複合CNP(D)(12.5、50及び200nmol/kg)を１日１回、２８日間反復皮下投与したときの身長、尾長及び体重推移を示す図である。
【図１３】雄性ラットに天然型CNP-22及びCNP-53並びに複合CNP(D)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）半減期延長ペプチド
本発明の半減期延長ペプチドは、Ｂ、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、及びＣが以下の（１）〜(３)であり、他の目的ペプチド（生理活性ペプチド）に結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチドである。
（１）Ａは、カエルグレリン由来Ｃ末端フラグメント（配列番号91）における1-14位のアミノ酸配列（14アミノ酸：表5）、複合モチリン(A〜F，及びG〜K)（以上、表14）、MG-d12/14(表16)、複合CNP(J)及び複合CNP(K) (表17)が示すとおり、存在しなくてもよく又は任意のアミノ酸数の配列が存在してもよい。当該配列が存在する場合の長さは1〜14アミノ酸程度の配列を選択することができ、望ましくは3〜10アミノ酸、より望ましくは3アミノ酸である。具体的には、VQQやAGSVDHKGKQを挙げることができる。
（２）  Bは、後述するヒトグレリン由来の本発明ペプチドの半減期延長作用に必要な構造（コア配列：RKESKK配列部分）に対応する部分であり、ヒトグレリン由来の本発明ペプチドのBについて例示すれば以下の事項が導かれる。下記の具体的なペプチドは表16及び表17に記載されている。【００２６】
RKESKK中のE(Glu)については、複合モチリン(T)(MG-17E/N)、(U)(MG-17E/Q)及び(W)(MG-dES)が示すとおり、必要なアミノ酸であり、また複合モチリン(V)(MG-ES/DS)、(X)(MG-17E/D)、複合CNP(J) 及び複合CNP(K)が示すとおりD(Asp)であってもよい。即ち、上記E(Glu)の位置のアミノ酸は酸性アミノ酸であればよく、望ましくはGluである。
RKESKK中のS(Ser)については、複合モチリン(O)(MG-18S/F)、(P)(MG-18S/T)、(Q)(MG-18S/P)、(R)(MG-18S/L)及び(S)(MG-18S/A)が示すとおり、芳香族アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び極性無電荷アミノ酸等のいずれの側鎖構造をもつアミノ酸でも置換可能である。即ち、上記S(Ser)の位置のアミノ酸はいずれの側鎖構造をもつアミノ酸でもよく、望ましくはSer,Pro,Leu,Phe又はAlaであり、より望ましくはSer,Thr,Pro,Alaであり、更に最も望ましくはSerである。またはペプチドMG-dSが示すとおり、上記S(ser)の位置のアミノ酸は無くても良い。
RKESKK中のR(Arg)及びK(Lys)については、複合モチリン(X)(MG-17E/D)が示すとおり、塩基性アミノ酸であれば置換可能である。
RKESKKは、塩基性アミノ酸クラスター（塩基性アミノ酸２個の連続配列）と酸性アミノ酸を含むことを特徴とするが、クラスター間の距離は複合モチリン(Z)(MG-i17G)、(I)(MG-i19G)、(II)(MG-i17G2)及び(III)(MG-i17G2-i19G)が示すとおり任意のアミノ酸の挿入により拡張可能である。
塩基性アミノ酸クラスター間の距離は、表16や表17等に記載された各ペプチドが示すように、1〜５アミノ酸が存在する程度が望ましい。
更に、RKESKK中の塩基性アミノ酸クラスターとE(Glu）の間には、複合モチリン(Z)(MG-i17G)、(I)(MG-i19G)、(II)(MG-i17G2)、(III)(MG-i17G2-19iG)、(IV)(MG-dPP)、 (V)(MG-dPPH1)、(VI)(MG-H1)、(VII)(MG-H3)、(VIII)(MGH4)、(XI)(MG-d12/14)、(XII)(MGP1)、(XIII)(MGP)2等や複合CNP（K）が示すとおり、任意のアミノ酸が存在していてもよい。例えば、塩基性アミノ酸クラスター（RK相当部位）とEの間にG,A,Y,S,P及び／又はVを、Eと塩基性アミノ酸クラスター（KK相当部位）の間にS,H及び／又はPを存在させることもできる。【００２７】
以上のことより、本願発明に係る半減期延長作用に必要な構造B（コア配列：ヒトについてはRKESKK部分）は、先ずは次の式2で表される配列を有する。
式2: Wk-Xl-Y-Zm-Wn
ここで、Wは塩基性アミノ酸であり、X及び Zは任意のアミノ酸であり、Yは酸性アミノ酸である。また、k, l, m, nは0又は自然数であり、ｋ=1又は2、4≧l≧0、2≧m≧0（但し、lとmは4≧l+m≧0である）、n=1又は2である。
更に、RKESKKの並び方については、複合モチリン(Y)(MG-BR)が示すとおり、逆向き（KKSEKR）でもよい。
また、複合モチリン(XII)(MGP1)及び(XIII)(MGP2)が示すとおり、コア配列を２個タンデムに配置した場合（例えばKKAYSPDK+ERK）、半減期延長作用が増強されることから、より長い半減期延長を達成するために、次の一般式で表されるように分子内に複数のコア配列を有する場合も半減期延長作用において有効な手段である。【００２８】
よって、本願発明に係る半減期延長作用に必要な構造（コア配列：RKESKK部分）は、次の式1で表される。
式1：（Wk-Xl-Y-Zm-Wn）＋（Wo-Xp-Y-Zq-Wr）s
ここで、W,X,Y,Z,k,l,m,nは上記式2に係る定義と同じであり、s＝0又は 1である。また、o, p, q, rは0又は自然数であり、2≧o≧0、4≧p≧0、2≧q≧0（但し、pとqは4≧p+q≧0である）、r=1又は2である。
酸性アミノ酸Yは、E(Glu)又はD(Asp)であり、好ましくはE(Glu)である。任意のアミノ酸であるX,Zは、XとZとが互いに同一又は異なっていてよく、又、複数ある場合はそれらが互いに同一又は異なっていてよい。X,Zは、望ましくはSer,Pro,Leu,Phe又はAlaであり、より望ましくはSer,Thr,Pro,Alaであり、更に最も望ましくはSerである。塩基性アミノ酸Wは、両Wが互いに同一又は異なっていてよく、又、複数ある場合はそれらが互いに同一又は異なっていてよい。Wは、望ましくはR(Arg)又はK(Lys)である。
また、式1において、望ましくは、sは1であり、o,p,qは0であり、rは2である。
Ｃは、複合モチリン(J)における22-23位のアミノ酸配列（2アミノ酸：表14）カエルグレリン由来Ｃ末端フラグメント（配列番号58）における7−20位のアミノ酸配列（14アミノ酸：表5）や、公知の二次構造予測法（例えば、Chou-Fasman法：Biochemistry. 1974 Jan 15;13(2):222-45  Prediction of protein conformation.  Chou PY, Fasman GDや、Garnier法： J Mol Biol. 1978 Mar 25;120(1):97-120.  Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins.  Garnier J, Osguthorpe DJ, Robson B.等）によりαヘリックス構造を形成すると予測されうる配列（例えば、AK(orE)LAALK(orE)A）を配置した複合モチリン(VI)(MG-H1)、(VII)(MG-H3)、(VIII)(MG-H4)が示すとおり、2〜14アミノ酸程度の任意のアミノ酸数の配列を選択することができる。
望ましくはαヘリックス構造を形成しうる3〜11アミノ酸からなる任意の配列であり、より望ましくは、KKPPAKLQPR（複合モチリン(C)におけるＮ末端から22位〜29位のアミノ酸からなる配列）、又はPPAELAALEA (複合モチリン(VII)(MG-H3)におけるＮ末端から22位〜31位のアミノ酸からなる配列）であり、更に望ましくはPPAELAALEAである。また、前述の予測法によりシート構造を形成しうる任意の配列を用いることもできる。【００２９】
更に、複合モチリン(IV)(MG-dPP)と複合モチリン(D)との比較、複合モチリン(V)(MG-dPPH1)と複合モチリン(VI)(MG-H1)との比較，複合モチリン(IX)(MG-dPPS)と複合モチリン(X)(MG-S)との比較が示すとおり、本願発明に係る半減期延長ペプチドの式Ｃに相当するアミノ酸配列と式Bに相当するアミノ酸配列の間にProが存在しない場合は、当該式Ｃに相当するアミノ酸配列の末端部位にPro配列（Ｃのアミノ酸数が2〜14となる範囲のPro数、望ましくは、Pro- Pro）を配置することが望ましい。
なお、複合CNP(J)及び(K)が示すように、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ（コア配列）に相当する配列を含む複合CNPも半減期延長作用を示したことから、複合モチリンの半減期の比較から導かれる本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＡ及びＣの要件を複合CNPに適用した場合に同様の半減期延長作用効果が得られることは当業者であれば容易に予測できることである。反対に複合CNPの半減期の比較から導かれる本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ及びＣの要件を複合モチリンに適用した場合に同様の半減期延長作用効果が得られることは当業者であれば容易に予測できることである。
またその他の目的ペプチドとの複合体においても本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＡ、Ｂ及びＣの要件を適用した場合に同様の半減期延長作用効果が得られることは当業者であれば容易に予測できることである。
Ａ、Ｂ及び／又はＣは各々が順方向又は逆方向であっても良い。即ち、Ａ、Ｂ及びＣは各々独立して順方向又は逆方向であっても良く、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ及びＡ−Ｂ−Ｃが全体として順方向又は逆方向であっても良い。ここで順方向と逆方向とは、Ｎ末端からＣ末端の配列方向が逆になっていることを意味する。
本発明のペプチドがB単独である場合には、目的ペプチド側にＡ及び／又はＣの要件を満たす配列が存在する場合が含まれる。【００３０】
本発明の半減期延長ペプチドの好ましいものは、以下の(1)又は(2)のペプチドである。
(1)  Ａは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号1〜4の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列
Ｂは、配列番号34におけるアミノ酸番号5〜9のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
Ｃは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号10〜17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
(2)  Ａは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号1〜8の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
Ｂは、配列番号67におけるアミノ酸番号9〜13のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
Ｃは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号14〜17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
配列番号67は配列番号34の逆配列である。
Ｂは必須のコア配列である。
換言すれば、本発明の半減期延長ペプチドは、配列番号34においてアミノ酸番号5〜9のアミノ酸配列又はその逆配列に係る配列番号67においてアミノ酸番号9〜13のアミノ酸配列を含み最大17アミノ酸のアミノ酸配列からなるペプチド、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。この場合の「１若しくは数個」は、例えば1〜35個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、より好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個である。【００３１】
本発明の半減期延長ペプチドには、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ネズミ、スンクス（ジャコウネズミ）、クジラのような哺乳類；シチメンチョウ、ニワトリのような鳥類；カメのような爬虫類；カエルのような両生類；ウナギ、ナマズ、サメのような魚類などのグレリンのＣ末端部分配列からなる半減期延長ペプチドが含まれる。
上記配列番号34又は配列番号67の各Ａ、Ｂ、Ｃのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加については、各種由来のアミノ酸配列の比較から、当業者であれば適宜当該修飾を行なうための適切なアミノ酸の位置及び種類を選択することができる。
各種生物由来のグレリンのアミノ酸配列と、そのＣ末端部分の半減期延長ペプチド、コア配列Ｂの全長、コア配列のＮ末端側に存在することがある配列Ａの全長、及びコア配列のＣ末端側に存在することがある配列Ｃの全長を以下の表１〜表７に示す。【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２】
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【００３４】
【表３】
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【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
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【００３７】
【表６】
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【００３８】
【表７】
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【００３９】
表１〜表７中の各生物由来のグレリンのアミノ酸配列を以下に示す。下線部が半減期延長ペプチドに相当する部分である。【００４０】
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【００４１】
また、表１〜表７中の各生物由来の半減期延長ペプチド（正配列）のアミノ酸配列を以下に示す。下線部がコア配列Ｂに相当する部分であり、コア配列ＢのＮ末端側が配列Ａに相当する部分であり、コア配列ＢのＣ末端側が配列Ｃに相当する部分である。【００４２】
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【００４３】
また、表１〜表７中の各生物由来の半減期延長ペプチド（逆配列）のアミノ酸配列を以下に示す。下線部がコア配列Ｂに相当する部分であり、コア配列ＢのＮ末端側が配列Ａに相当する部分であり、コア配列ＢのＣ末端側が配列Ｃに相当する部分である。【００４４】
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【００４５】
これらの半減期延長ペプチドは、それが由来する種の個体に対して用いることが望ましく、例えばヒトに対してはヒト由来グレリンのＣ末端配列を用いることが望ましい。また、半減期延長ペプチドが、ＡＢ、ＢＣ、又はＡＢＣの配列からなる場合は、配列Ａ、Ｂ、Ｃは同一生物種由来のものを用いることが好ましいが、互いに異なる種由来の配列Ａ、Ｂ、Ｃを組み合わせたキメラペプチドであってもよい。キメラペプチドは、哺乳類、鳥類、爬虫類、及び両生類由来の配列を組み合わせることが好ましく、哺乳類由来の配列を組み合わせることがより好ましく、ヒト由来の配列を組み合わせることがさらにより好ましい。
本発明において、目的ペプチドに結合させた場合にその生理活性を保持するとは、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端の何れに結合させた場合でも、目的ペプチドの活性の１％ 以上の活性を維持していることを指す。また、目的ペプチドの半減期を延長するとは、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端の何れに結合させた場合でも、当該目的ペプチドに比べて半減期が少しでも延長していることを指す。【００４６】
（２）複合ペプチド
生理活性を有するペプチドに、上記説明した本発明の半減期延長ペプチドをＮ末端側、Ｃ末端側又は両末端側に結合させることにより、体内動態が改善された本発明の複合ペプチドが得られる。両末端に半減期延長ペプチドを結合させる場合は、両方のペプチドは同じでもよく異なっていてもよい。
Ａ及び／又はＣは目的ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にペプチド結合していてよい。或いは、Ａ及び／又はＣをＢに含まれるアミノ酸の側鎖、例えばリジン残基のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシル基等に付加することも本発明の一態様である。付加する場合の態様は、ペプチド結合又は所望により適宜他の適切な結合方法を選択することも可能である。
目的ペプチドとしては、天然の生理活性ペプチド又は当該ペプチドに係るアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し且つ当該ペプチドの生理活性を有するペプチドである誘導体を用いることができる。本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸に関し「１若しくは数個が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体が所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば１〜４個、又は１〜２個程度であり、さらには複数箇所の選択も可能である。性質（電荷及び／又は極性）の似たアミノ酸への置換等であれば、多数のアミノ酸が置換されていても、所望の機能を消失しないと考えられる。また、本明細書中において、「アミノ酸」には、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、天然アミノ酸、合成アミノ酸等あらゆるアミノ酸が含まれる。
更に、目的ペプチドが天然の生理活性ペプチドの誘導体である場合、そのアミノ酸配列としては、天然型のアミノ酸配列と比較して70％以上、好ましく80以上、より好ましくは90％以上、特に好ましく95以上、最も好ましくは97％以上の相同性を有することが望ましい。【００４７】
半減期延長ペプチドが結合する側の目的ペプチドの構造がA又は／及びCの構造要因を満たすものであればBが単独で結合しても良い。
好適な目的ペプチドとしては、例えば、ナトリウム利尿ペプチド、望ましくは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP：由来は限定されないが、例えば配列番号100のヒトANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP：由来は限定されないが、例えば配列番号160のヒトBNP)、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP：由来は限定されないが、例えば配列番号101のCNP-22）、モチリン（由来は限定されないが、例えば配列番号102のヒトモチリン）、グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1：由来は限定されないが、例えば配列番号103のヒトGLP-1(7-36)アミド）、副甲状腺ホルモン（PTH：由来は限定されないが、例えば配列番号104のヒトPTH（1-34））、カルシトニン（CT：由来は限定されないが、例えば配列番号105のヒトCT）等の短い半減期を示す生理活性ペプチド又はそれらの誘導体が挙げられる。
当該誘導体は、元の生理活性ペプチドに係るレセプターを発現している培養細胞に作用させた後に培養液中の指標物質を測定することにより選択することができる。例えば、ANPやCNPにおいては、それらのレセプターであるGC-A又はGC-Bを発現している培養細胞に作用させた後に培養液中cyclic GMPを測定することにより選択することができる。また、GLP-1やモチリンのようなGPC-Rを発現している細胞に作用する活性ペプチドでは、細胞内カルシウム測定や培養液中のcyclic AMP測定等のシグナル伝達系活性化を測定することにより選択することができる。【００４８】
本発明には、複合ペプチドの塩も含まれる。塩は毒性がないものであればよいが、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などの塩が挙げられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
以上の塩の中でも無機塩基との塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩が最も好ましい。【００４９】
ANP及びBNPを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、ANP及びBNPのレセプターであるNPRA（GCA）を介する生理作用に基づく急性心不全及び慢性心不全の急性増悪の治療に有効であり、また近年では心筋梗塞後の予後の改善に非常に高い効果が認められている。これらを含め、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞等の治療剤の有効成分として用いることができる。
CNPを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、CNPのレセプターであるNPRB（GCB）を介する生理作用に基づく異型軟骨形成不全症や冠状動脈狭窄後のPTCA後等の再狭窄予防、肺性高血圧症や末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。
モチリンを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、モチリンのレセプターであるmotilin-Rを介する生理作用に基づく機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。
GLP-1を目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、糖尿病等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。また、PTHを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、副甲状腺機能低下等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。【００５０】
（３）複合ペプチドの製造方法
本発明は、上記説明した本発明の半減期延長ペプチドを目的ペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側、又は両末端側に結合させる、血漿中半減期が延長しかつ目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチドの製造方法も包含する。
本発明に係る複合ペプチドは常法により得ることができる（例えば、J.Med.Chem.,43,pp.4370-4376,2000参照）。例えば、組換えDNA技術及び／又は化学的合成によって製造することができる。例えば組換えDNA技術を用いた製法においては、本発明に係る複合ペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、当該培養物から目的のペプチドを採取することにより本発明に係る複合ペプチドを得ることができる。
遺伝子を組み込むベクターとしては、例えば大腸菌のベクター（pBR322、pUC18、pUC19等）、枯草菌のベクター（pUB110、pTP5、pC194等）、酵母のベクター（Yep型、YRp型、Yip型）、又は動物細胞のベクター（レトロウィルス、ワクシニアウィルス等）等が挙げられるが、その他のものであっても、宿主細胞内で安定に目的遺伝子を保持できるものであれば、いずれをも用いることができる。当該ベクターは、適当な宿主細胞に導入される。目的の遺伝子をプラスミドに組み込む方法や宿主細胞への導入方法としては、例えば、Molecular Cloning (Sambrook et al.,1989)に記載された方法が利用できる。
上記プラスミドにおいて複合ペプチド遺伝子を発現させるために、当該遺伝子の上流にはプロモーターを機能するように接続させる。【００５１】
本発明において用いられるプロモーターとしては、目的遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、形質転換する宿主細胞がEscherichia属の場合はlacプロモーター、trpプロモーター、lppプロモーター、λPLプロモーター、recAプロモーター等を用いることができ、Bacillus属の場合はSPO1プロモーター、SPO2プロモーター等を用いることができ、酵母の場合はGAPプロモーター，PHO5プロモーター、ADHプロモーター等を用いることができ、動物細胞の場合は、SV40由来プロモーター、レトロウィルス由来プロモーター等を用いることができる。
上記のようにして得られた目的とする遺伝子を含有するベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌（例えば、Escherichia属、Bacillus属等）、酵母（Saccharomyces属、Pichia属、Candida属等）、動物細胞（CHO細胞、COS細胞等）等を用いることができる。培養時の培地としては液体培地が適当であり、当該培地中には培養する形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源等が含まれることが特に好ましい。所望により培地にビタミン類、成長促進因子、血清などを添加することができる。
培養後、培養物から本発明に係る複合ペプチドを常法により分離精製する。例えば、培養菌体又は細胞から目的物質を抽出するには、培養後、菌体又は細胞を集め、これをタンパク質変性剤（塩酸グアニジンなど）を含む緩衝液に懸濁し、超音波などにより菌体又は細胞を破砕した後、遠心分離を行う。次に上清から目的物質を精製するには、目的物質の分子量、溶解度、荷電（等電点）、親和性等を考慮して、ゲル濾過、限外濾過、透析、SDS-PAGE、各種クロマトグラフィーなどの分離精製方法を適宜組み合わせて行うことができる。【００５２】
また、本発明に係る複合ペプチドは常法により化学合成することができる。例えば、保護基の付いたアミノ酸を液相法及び／又は固相法により縮合、ペプチド鎖を延長させ、酸で全保護基を除去し、得られた粗生成物を精製することにより得られる。複合ペプチドの製造に用いることができる方法は従来既に種々の方法が知られており、本発明に係る物質としての複合ペプチドの製造も公知の方法に従って容易に製造でき、例えば古典的なペプチド合成法に従ってもよいし、固相法に従っても容易に製造できる。
更に、組換えDNA技術と化学合成を併用した製法を用いてもよく、半減期延長ペプチドを目的ペプチドに係るアミノ酸中の側鎖、例えばリジン残基のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシル基等に付加する場合は化学合成により製造し、それ以外の部分については組換えDNA技術を用いて製造し、その後各々のフラグメントを融合させる方法でも製造することができる。
この方法は、上記説明した本発明の半減期延長ペプチドを目的ペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側、又は両末端側に結合させて、目的ペプチドの血漿中半減期を延長する方法と把握することもできる。【００５３】
（４）製剤
本発明の複合ペプチドはヒトを含む動物(個体)の医薬として使用できる。本発明の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体とともに配合して、医薬組成物（医薬製剤）にすることができる。剤形は、特に限定されず、例えば経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤、又は非経口投与のための注射剤などとして用いられる。
経口投与のための内服用固形剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤又は顆粒剤等が挙げられ、内服用液剤としては、シロップ剤などが挙げられる。
薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、D-マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。【００５４】
本発明の医薬の製剤形態としては非経口投与に適する製剤形態が好ましく、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、又は筋肉内投与用等の注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤又は吸入剤などを挙げることができるが、上記注射剤の製剤形態が好ましく、特に個体がヒト成人であり在宅治療の場合には経粘膜吸収剤、吸入剤、坐剤等の製剤形態も好ましい。これらの製剤形態は当業者に種々知られており、当業者は所望の投与経路に適する製剤形態を適宜選択し、必要に応じて当業界で利用可能な１又は２以上の製剤用添加物を用いて医薬用組成物の形態の製剤を製造することが可能である。
例えば、注射剤又は点滴剤の形態の医薬は、有効成分である長い半減期を付与した複合ペプチドと共に適切な緩衝液、糖溶液、等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、防腐剤などの１又は２以上の製剤用添加物を注射用蒸留水に溶解して滅菌（フィルター）濾過後にアンプル又はバイアル詰めするか、滅菌濾過した溶液を凍結乾燥して凍結乾燥製剤とすることにより調製し提供することができる。添加剤としては、例えばグルコース、マンニトール、キシリトール、ラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマー類、グリセロールなどのアルコール類、グリシンなどのアミノ酸類、血清アルブミンなどのタンパク類、NaCl、クエン酸ナトリウムなどの塩類、酢酸、酒石酸、アスコルビン酸、ヒアルロン酸などの酸類、Tween80などの界面活性剤、亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などを使用することができる。このような製剤は、用時に注射用蒸留水や生理食塩水などを添加して溶解することにより注射剤又は点滴剤として使用できる。また、経粘膜投与には、点鼻剤や鼻腔内スプレー剤などの鼻腔内投与剤（経鼻投与剤）等も好適であり、経肺投与には吸入剤等も好適である。
製剤中の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩の含量は、剤形によって異なるが、例えば0.001〜1000 mg程度とすればよく、好ましくは0.01〜100 mg程度、より好ましくは0.1〜100mg程度、特に好ましくは1〜100mg程度とすればよい。
上記の投与量を1日1〜3回、又は1週1〜7回投与することが好ましく、投与期間は、目的ペプチドの種類によって異なり、特に限定されない。
本発明の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用量は、目的ペプチドの種類や、複合ペプチドの半減期によって適宜決定できる。
このように、本発明は、上記説明した本発明の医薬組成物を個体に投与することを含む、当該医薬組成物に含まれる目的ペプチドによる治療が可能な疾患の治療方法を包含する。
【実施例】
【００５５】
以下に、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。
実施例１（天然型ANP、及び複合ANPの血漿中濃度推移）
天然型ANP、及び天然型ANPに半減期延長ペプチドを付加した複合ペプチド（複合ANP）をラットの静脈内に投与したときの血漿中ANP免疫活性濃度の推移を検討した。
実験は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、7週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、天然型ANP（α-hANP：配列番号100）又は複合ANP(A,B及びC)をそれぞれ0.1mg/kgの用量で静脈内又は背部皮下に投与し、投与前から投与後90分又は180分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより経時的に採取した。採取した血液に安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離し、血漿中濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した（図1）。その際、抗体としてはANPのリング部分を認識するウサギポリクローナル抗体（＃8）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr28］α-hANPを用いた。【００５６】
なお、複合ANP(A,B及びC)の各アミノ酸配列は以下のとおりであり、いずれもヒト型グアニレートシクラーゼ受容体Ａ（GC-A受容体）アゴニスト活性を保持していた。
複合ANP(A)：  CFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYVQQRKESKKPPAKLQPR（下線部でS-S結合）（配列番号106）
複合ANP(B)：  VQQRKESKKPPAKLQPRCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY（下線部でS-S結合）（配列番号107）
複合ANP(C)：  RPQLKAPPKKSEKRQQVCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY（下線部でS-S結合）（配列番号108）
得られた血漿中免疫活性濃度の推移から、薬物動態パラメータを算出した。その際、解析ソフトは、WinNonlin Professional Ver4.0.1（Pharsight Corporation社製、USA）を用いた。以下に各パラメータの算出方法を記載した。
時間０における濃度（C0；外挿値、ng/mL）、血漿中濃度−時間曲線下面積（AUC；ng・min/mL）及び消失半減期（T1/2；分）を以下のとおり算出した。C0は各採血時点における血漿中免疫活性濃度の推移から時間０のときの値を外挿して算出した。AUCは、全ての測定時点（ｔ）における血漿中免疫活性濃度を用いて台形法によりを算出し、無限大時間までの外挿値を求めた。T1/2は血漿中免疫活性濃度の消失相における数点を結ぶ直線の傾きから、最小二乗法により算出した。皮下投与の際は、C0を求めずに最高血漿中濃度（Cmax；ng/mL）、最高血漿中濃度到達時間（Tmax；min）を求めた。Cmaxは各採血時点における血漿中免疫活性濃度のうち、最も高い値とし、TmaxはCmaxを示した血漿の採血時間を採用した。
結果を、以下の表8及び表9に示す。【００５７】
【表８】
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【００５８】
【表９】
0005524049.tif 000013
【００５９】
複合ANP(A,B及びC)を静脈内投与した場合、いずれの誘導体でも天然型ANPに比べて血漿中濃度が上昇して持続性を示した。
また、複合ANP(A,B及びC)を皮下投与した場合、いずれの誘導体でも天然型ANPに比べて血漿中濃度が上昇して持続性を示した。
【００６０】
実施例２（天然型CNP-22、及び複合CNPの血漿中濃度推移及び生物活性）
天然型CNP-22及びCNPに半減期延長ペプチドを付加した複合ペプチド（複合CNP）の血漿中CNP免疫活性濃度の推移を検討した。
実験は、実施例1と同様に予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施し、7週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を1群3匹として実験に供した。ラットに、天然型CNP-22（配列番号101）又は複合CNPのＡ及びＢを、それぞれ0.1mg/kgの用量で尾静脈内又は背部皮下に投与し、投与前及び投与後90分又は180分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中濃度を競合RIA法により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22のリング部分を認識するウサギポリクローナル抗体（＃2）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNPを用いた。薬物速度論的解析は実施例１と同様の方法で実施した。【００６１】
なお、複合CNPのＡ及びＢの各アミノ酸配列は以下のとおりであり、どちらもヒト型グアニレートシクラーゼ受容体Ｂ（GC-B受容体）アゴニスト活性を保持していた。
複合CNP(A)：  RPQLKAPPKKSEKRQQVCFGLKLDRIGSMSGLGC（下線部でS-S結合）（配列番号109）
複合CNP(B)：  CFGLKLDRIGSMSGLGCVQQRKESKKPPAKLQPR（下線部でS-S結合）（配列番号110）
結果を図２、並びに以下の表10及び表11に示す。【００６２】
【表１０】
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【００６３】
【表１１】
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【００６４】
静脈内投与後、天然型CNP-22は短半減期で速やかに血漿中から減少したが、複合CNPは投与後90分でも天然型CNP-22のおよそ100倍高い血漿中濃度を維持した。
一方、天然型CNP-22及び複合CNPを皮下投与したとき、天然型CNP-22に比べて複合CNP投与時では最高血漿中濃度がおよそ1/2であり、血漿中からの消失が緩やかであった。以上のことから、複合CNPはラットにおいて、静脈内投与でも皮下投与でも天然型CNP-22に比べて長い半減期を示すことが明らかとなった。
また、天然型CNP-22及び複合CNP(B)（構造前述）を皮下投与してCNPの生物活性を反映する血漿中cGMP濃度を競合RIA法により測定した（文献）。薬物の投与及び採血は血漿中CNP免疫活性濃度測定時と同じとした。血漿中cGMP濃度の測定には測定キットとしてYAMASA cGMP Assay Kit（ヤマサ醤油株式会社製）を使用した。結果を図3に示す。
天然型CNP-22を皮下投与後の血漿中CNP免疫活性濃度は速やかに上昇した後、急速に減少して投与後60分でほぼ消失した。血漿中cGMP濃度は血漿中CNP免疫活性濃度よりも僅かに遅れて上昇し、投与後15〜30分にピークに達した後、速やかに減少した。
一方、複合CNPを皮下投与したとき、血漿中CNP免疫活性濃度の最高値は天然型CNP-22に比べて低く、血漿中cGMP濃度も天然型CNP-22投与時の約6割で投与後30〜90分にかけて一定レベルで持続した。
【００６５】
実施例３（天然型CNP-22及び複合CNPのペプチド分解酵素耐性）
天然型CNP-22及び複合CNPのペプチド分解酵素に対する耐性を検討した。
実験は各サンプルN＝2で実施した。天然型CNP-22並びに複合CNP(A,B)（構造前述、最終濃度0.5μg/mL）ヒト型リコンビナント中性エンドペプチダーゼ（hNEP、R＆D systems Inc．製、USA）の100μL反応溶液（媒体：20mM MES pH6.5）を調整した。初期値試料は、調整後は直ちに5分間煮沸した。安定性評価試料は37℃に設定した恒温槽にて酵素反応を１時間実施した後に5分間煮沸した。煮沸後のサンプルに蒸留水を100μL添加し、よく混和したのちに50μLを高速液体クロマトグラフシステムLC-10A（株式会社島津製作所製）を用い、水・アセトニトリル系で解析した。解析データをクロマトパック（CRA-10A、株式会社島津製作所製）で解析し、未変化体のピークエリア面積を算出した。37℃で反応させたときの未変化体の平均エリア面積を煮沸サンプルの平均エリア面積で除することで１時間後の未変化体残存率を算出した。結果を以下の表12に示す。
【００６６】
【表１２】
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【００６７】
天然型CNP-22溶液中にhNEPを加えて37℃に設定した恒温槽にて１時間反応させた後の試料中の天然型CNP-22未変化体の残存率は初期値の16.7％に低下したのに対し、複合CNP(A,B)の残存率はそれぞれ、84.3％及び83.8％であり、いずれもhNEPに対し、天然型CNP-22よりも代謝抵抗性を示すことが確認された。
更に、天然型CNP-22及び複合CNP(B)のin vivoにおけるNEP抵抗性を静脈内投与後の血漿中CNP免疫活性濃度の推移に及ぼすNEP阻害剤の併用効果を指標にして評価した。
本試験もまた、予め大腿動脈に採血用にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製、USA）、NEP阻害剤投与用に大腿静脈にポリエチレンチューブ（PE-10、クレイ・アダムス社製、USA）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製、体重約250g）を１群３匹として実験に供した。大腿静脈から媒体（5％マンニトール、100μL/min/body）又はNEP阻害剤（30μg/100μL/min/body）を定速静脈内投与した。投与時間は天然型CNP-22又は複合CNP(B)の投与10分前から投与後60分の採血終了までとした。天然型CNP-22及び複合CNP(B)は20μg/kgの用量で尾静脈内投与し、NEP阻害剤投与開始前（−10分）及びCNP投与前（0分）、投与60分後までの血液を大腿動脈カニューレより採取した。採取した血液は安定化剤及び抗凝固剤を加えた後に遠心分離後に血漿とし、血漿中免疫活性濃度を前述した競合RIA法により測定した。薬物速度論的解析は実施例１と同様の方法で実施した。
結果を図4及び以下の表13に示す。【００６８】
【表１３】
0005524049.tif 000017
【００６９】
天然型CNP-22を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度は、NEP阻害剤を併用することにより顕著に増加した。NEP阻害剤を併用したときのAUCは非併用時の約3.7倍であり、半減期は約5倍であった。
一方、複合CNPを投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移はNEP阻害剤を併用しても変わらず、ラット体内において複合CNP(B)は天然型CNP-22よりもNEPに分解されにくいことが確認された（表13）。
【００７０】
実施例４（天然型CNP-22及び複合CNPの伸長促進作用）（１）
天然型CNP-22及び複合CNPの伸長促進作用を、マウスを用いて検討した。
実験は３週齢の雌性S/VAF  Crlj：CD1（ICR）マウス（日本チャールズ・リバー社製）を用い、１群10匹として合計30匹を実験に供した。動物は母マウス3匹と一緒に2週齢で購入し、母マウス１匹に対して子マウス10匹を付けて１週間群飼いにした後に離乳させ、投与期間中は、各群とも5匹×2ケージでシースルーケージに群飼した。水は水道水を自由に摂取させ、餌は固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由に摂取させた。媒体、天然型CNP-22又は複合CNP(B)（構造前述）をそれぞれ10mL/kg、0.25mg/kg及び0.25mg/kgの用量で1日2回、29日間背部皮下に反復投与し、投与期間中の身長、尾長及び体重を測定した。結果を図５に示す。
図５に示すように、CNPに半減期延長ペプチドを結合した複合CNP(B)を反復皮下投与したマウスの身長は、媒体投与群に対して有意に増加したが、天然型CNP-22投与群の身長は媒体投与群と差はなかった。
一方、体重については全ての投与群の間に差はみられなかった。
【００７１】
実施例５（天然型CNP-22及び複合CNPの抗原性）
実施例４において、4週間反復投与終了後のマウスから採取した血清を用いて、天然型CNP-22又は複合CNP(B)に対する抗体が産生したかを検討するために、indirect ELISA法によりそれぞれの抗原性を評価した。
マキシソープ処理済96wellプレート（Nalge Nunc International社製、Denmark）に50mM   NaHCO３、pH8.5で1.0ng/μLに調整したペプチド溶液100μLを添加し4℃で終夜コーティング操作を行なった。2.0％ブロックエース（雪印乳業株式会社製）溶液を用い、１時間室温でブロッキングを行なった。ブロッキング後、10２〜10５倍まで希釈した血清サンプルを添加し、１時間室温で抗原抗体反応を実施した。ウェルを洗浄した後、Anti-mouse IgG HRP Ab（Zymed Laboratories社製、USA）を添加した。１時間の抗原抗体反応を室温で行い、ウェルを洗浄した後、基質ABTS（KPL社製、USA）を添加した。室温で１時間反応の後に、405nmの吸光度をSPECTRA MAX 190（Molecular devices社製、USA）で測定し、発色の程度を抗体価として解析した。
その結果、天然型CNP-22又は複合CNPのＢをそれぞれ0.25mg/kgの用量で１日２回、２９日間背部皮下に反復投与しても、天然型CNP-22及び複合CNP(B)に対する抗体価の上昇は認められなかった。
【００７２】
実施例６（天然型モチリン及び複合モチリンの血漿中半減期）(1)
天然型モチリン（配列番号102）及び天然型モチリンの活性中心である配列番号102のアミノ酸番号１〜１２のアミノ配列に、5〜22個のアミノ酸残基からなる各種長さの半減期延長ペプチドを結合した１３種の複合モチリンＡ〜Ｍ（配列番号111〜123）を静脈内投与したときの血漿中モチリン免疫活性濃度推移を検討した。実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、ヒト型モチリン又は誘導体をそれぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後60分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中モチリン免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した（図６）。その際、抗体としては配列番号102に示す天然型モチリンのアミノ酸番号１〜１２を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃870623）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr７］ヒト型モチリンを用いた。
天然型モチリン及び複合モチリン（A〜M）のアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を以下の表14に示す。【００７３】
【表１４】
0005524049.tif 000018
【００７４】
結果を図6にも示す。
評価した全13種の複合モチリンは、すべてヒトモチリン受容体アゴニスト活性を保持していた。複合モチリン(Ｇ、Ｌ及びＭ)については天然型モチリンよりも体内からの有意な消失半減期延長作用が確認できず、アミノ酸配列ESKKの構造を失うと、作用が消失することが確認された。そのほかのモチーフに関してはいずれも天然型モチリンよりも体内半減期を延長させる作用があったが、その中でもRKESKKの構造を保持しているかどうかが、最も半減期延長作用に及ぼす影響が大きいことが確認された。
【００７５】
実施例７（天然型CNP-22及び複合CNPの血漿中半減期）（１）
配列番号101に示す天然型CNP-22及び天然型CNP-22の活性中心である配列番号101におけるＮ末端から6位〜22位のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両端に17アミノ酸残基からなる半減期延長ペプチドが結合した７種の複合CNP(C〜I)（配列番号124〜130）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移を検討した。
実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、天然型CNP-22又は複合CNPを、それぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後６０分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中CNP免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22のリング部分構造を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃２）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNPを用いた。
複合CNPのアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を表15に示す。
【００７６】
【表１５】
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【００７７】
結果を図７にも示す。
評価した複合CNP(C〜I)は、全てヒトCNP受容体アゴニスト活性を保持していた。
今回評価した複合CNPは全て、天然型CNP-22よりも消失半減期が長かった。このことより、今回評価した半減期延長ペプチドは、目的ペプチドのＮ末側若しくはＣ末側のどちらか片方又は両方に結合しても半減期延長作用があり、また、アミノ酸配列を逆にひっくり返してもその性質は損なわれないことが分った。さらにＣ末構造アミド化しても半減期延長作用があり、目的とするペプチドの構造に合わせて結合方式を選択することができることが示された。
【００７８】
実施例８（天然型モチリン及び複合モチリンの血漿中半減期）(２)
天然型モチリン（配列番号102）及び天然型モチリンの活性中心である配列番号102のアミノ酸番号1〜12のアミノ配列に14〜22のアミノ酸残基からなる各種長さの半減期延長ペプチドを結合した26種の複合モチリン(N〜Ｚ、及びＩ〜XIII)（配列番号131〜156）を静脈内投与したときの血漿中モチリン免疫活性濃度推移を検討した。
実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、ヒト型モチリン又は誘導体をそれぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後60分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより経時的に採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中モチリン免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した（図8）。その際、抗体としては配列番号102に示す天然型モチリンのアミノ酸番号1〜12を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃870623）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr７］ヒト型モチリンを用いた。
天然型モチリン及び複合モチリン(Ｎ〜Ｚ、及びＩ〜XIII)のアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を以下の表16及び図８に示す。
【００７９】
【表１６−１】
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【００８０】
【表１６−２】
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【００８１】
複合モチリン(XI)(MG-d12/14)の結果から、実施例6に係る複合モチリン(A〜M)の結果と共に、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のうちＡについては、存在しなくても又は任意のアミノ酸数の配列が存在してもよいことが示された。当該配列が存在する場合の長さは1〜9アミノ酸程度の長さがよく、望ましくは3〜9アミノ酸、より望ましくは3アミノ酸であり、最も望ましくはVal−Gln−Glnであることが示された。
複合モチリン(T)(MG-17E/N)、(U)(MG-17E/Q）、(W)(MG-Des)の結果から、本願発明に係る半減期延長作用に必要な構造（コア配列：RKESKK配列部分）におけるRKESKK中のE(Glu)は半減期延長作用に必要なアミノ酸であり、複合モチリン(V)(MG-ES/DS)及び(X)(MG-17E/D)の結果から、当該アミノ酸はD(Asp)に置換可能であることが示された。即ち、上記E(Glu)の位置のアミノ酸は酸性アミノ酸であればよいことが示された。
複合モチリン(O)(MG-18S/F）、(P)(MG-18S/T）、(Q)（MG-18S/P）、(R)(MG-18S/L）、及び(S)(MG-18S/A）の結果から、RKESKK中のS(Ser)については、T(Thr）、P（Pro）、L(Leu）、F(Phe）又はA(Ala）に置換可能であることが示された。即ち、上記S(Ser)の位置のアミノ酸は、芳香族アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び極性無電荷アミノ酸等のいずれの側鎖構造をもつアミノ酸でも置換可能であることが示された。また、複合モチリン(N)(MG-dS）の結果から、上記S(Ser)の位置のアミノ酸は存在しなくてもよいことが示された。
複合モチリン(X)(MG-17E/D)の結果から、RKESKK中のR(Arg)及びK(Lys)については、各々塩基性アミノ酸であれば置換可能であることが示された。
RKESKK配列部分は、塩基性アミノ酸クラスター（塩基性アミノ酸２個の連続配列）と酸性アミノ酸を含むことを特徴とするが、複合モチリン(Z)(MG-i17G）、 (I)(MG-i19G）、(II)(MG-i17G2）、及び(III)(MG-i17G2-i19G)の結果から、当該クラスター間の距離は任意のアミノ酸の挿入により拡張が可能であることが示された。【００８２】
塩基性アミノ酸クラスター間の距離は、表16に記載された各複合ペプチドの結果から、1〜5アミノ酸であることが示された。
複合モチリン(Y)(MG-BR)の結果から、RKESKKの並び方については逆向き（KKSEKR）でもよいことが示された。
また、複合モチリン(XII)(MGP1）、(XIII)(MGP2)の結果から、コア配列に相当する配列を２個タンデムに配置した場合でも半減期延長作用が増強されることが示され、分子内に複数のコア配列を有することも、より長い血中半減期延長を達成するために有効な手段であることが示された。
複合モチリン(VI)（MG-H1）、(VII)（MG-H3）、(VIII)（MG-H4）は、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のうちＣに係る部分において、２つのPro（Pro-Pro配列）に続いて、公知の二次構造予測法（Chou-Fasman法：Biochemistry. 1974 Jan 15;13(2):222-45  Prediction of protein conformation.  Chou PY, Fasman GD、又はGarnier法： J Mol Biol. 1978 Mar 25;120(1):97-120.  Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins.  Garnier J, Osguthorpe DJ, Robson B.）によりαヘリックス構造を形成すると予測されうる配列を配置したペプチドである。これらの複合ペプチドの結果から、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のうちＣについては、αヘリックス構造を形成しうる任意のアミノ酸配列を配置することが望ましいことが示された。
更に、複合モチリン(IV)(MG-dPP)と複合モチリンＤとの比較、複合モチリン(V)(MG-dPPH1)と複合モチリン(VI)(MG-H1)との比較，複合モチリン(IX) (MG-dPPS)と複合モチリン(X)(MG-S)との比較が示すとおり、本願発明に係る半減期延長ペプチドの式Ｃに相当するアミノ酸配列のＮ末端にP(Pro)が存在しない場合は、当該部位にP(Pro)配列（Ｃのアミノ酸数が2〜14となる範囲のPro数、望ましくは、Pro−Pro）を配置することが望ましいことが示された。
【００８３】
実施例９（天然型CNP-22及び複合CNPの血漿中半減期）（２）
配列番号101に示す天然型CNP-22及び天然型CNP-22の活性中心である配列番号101におけるＮ末端から6位〜22位のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端に17又は20アミノ酸残基からなる半減期延長ペプチドが結合した複合CNP（D、J、K）（複合CNPのＪは配列番号157、複合CNPのＫは配列番号158）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移を検討した。
実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、7週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群3匹として実験に供した。ラットに、天然型CNP-22又は複合CNPを、それぞれ20nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後90分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22のリング部分構造を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃2）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNPを用いた。
複合CNPのアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を表１７及び図9に示す。
【００８４】
【表１７】
0005524049.tif 000022
【００８５】
今回評価した複合CNPは全て、天然型CNP-22よりも消失半減期が有意に長かった。
複合CNP(J）の結果より、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ（コア配列）に係るRKESKK中のE(Glu）については、Eの代わりにD(Asp)であってもよいことが示された。
また、複合CNP(K)の結果より、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ（コア配列）に係るRKESKK中の塩基性アミノ酸クラスター（RK、KK）とEの間には、任意のアミノ酸（例えば、Val(複数可)、H又はP）が存在していてもよいことが示された。更に、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＡに係る部分については、特に特定のアミノ酸配列が必要なわけではなく、任意のアミノ酸でよいことが示された。例えば、Ａに係る部分のアミノ酸数は10以内であればよいことが示された。
【００８６】
実施例１０（複合CNPの伸長促進作用）（２）
複合CNP(D、J)の伸長促進作用の用量依存性について、マウスを用いて検討した。
実験は3週齢の雌性S/VAF  Crlj：CD1（ICR）マウス（日本チャールズ・リバー社製）を用い、１群10匹として合計30匹を実験に供した。動物は母マウス3匹と一緒に2週齢で購入し、母マウス１匹に対して子マウス10匹を付けて１週間群飼いにした後に離乳させ、投与期間中は、各群とも5匹×2ケージでシースルーケージに群飼した。水は水道水を自由に摂取させ、餌は固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由に摂取させた。媒体又は複合CNP(D、J)（構造前述）をそれぞれ5mL/kg、50nmol/kg及び200nmol/kgの用量で1日1回、56日間背部皮下に反復投与し、投与期間中の身長、尾長及び体重を測定した。結果を図10に、複合CNPＪ投与終了翌日のマウスの全身写真を図11に示す。
図10に示すように、天然型CNP-22に半減期延長ペプチドを結合した複合CNP(D、J)を反復皮下投与することにより、マウスの身長及び尾長は用量に依存して有意に増加した。
【００８７】
実施例１１（複合CNPの伸長促進作用）（３）
複合CNPの伸長促進作用を、ラットを用いて検討した。
実験は３週齢の雌性SD(IGS)系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を用い、１群５匹として合計20匹を実験に供した。動物は17日齢で購入し、母ラット１匹に対して子ラット10匹を付けて予備飼育した後に離乳させた。投与期間中は各群ともアルミハンギングケージにて飼育した。水は水道水を自由に摂取させ、餌は固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由に摂取させた。媒体又は複合CNP（D）（構造前述）を5mL/kg、50nmol/kg及び200nmol/kgの用量で1日１回、56日間背部皮下に反復投与し、投与期間中の身長、尾長及び体重を測定した。結果を図12に示す。
図12に示すように、天然型CNP-22に半減期延長ペプチドを結合した複合CNP（D）を12.5、50及び200nmol/1mL/kgの用量で反復皮下投与したラットの身長は、媒体投与群に対して有意に増加した。
【００８８】
実施例１２（天然型CNP-22及び天然型CNP-53並びに複合CNPの血漿中半減期比較）
配列番号101に示す天然型CNP-22を単独投与又は中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害剤と併用投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移を測定し、天然型CNP-53(配列番号159)及び複合CNP(D)（構造前述）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移と比較した。
実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。天然型CNP-22を単独投与又はNEP阻害剤と併用投与した群では大腿静脈にもポリエチレンチューブ（PE-10、クレイ・アダムス社製）を挿入した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。NEP阻害剤としてはDL-Thiorphan（Sigma社製）を用い、天然型CNP-22の投薬開始10分前から投与開始後60分の採血終了まで５％マンニトール(100μL/min/body）又はNEP阻害剤（30μg/100μL/min/body）をInfusion Pump（CFV2100、日本光電株式会社製）を用いて70分間定速静脈内投与した。ラットに、天然型CNP-22、天然型CNP-53又は複合CNP(D)を、それぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後60分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中CNP免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22及び天然型CNP-53の共通構造であるリング部分構造を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃２）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNP-22を用いた。
天然型CNP-22、天然型CNP-53及び複合CNP(D)のアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を表18及び図13に示す。
【００８９】
【表１８】
0005524049.tif 000023
【００９０】
表18及び図13より、複合CNP(D)は天然型CNP-22、天然型CNP-22+NEP阻害剤及び天然型CNP-53のいずれに対しても半減期が長いことが示された。天然型CNP-53はNEP抵抗性があるために、天然型CNP-22に比べると半減期が長く、天然型CNP-22にNEP阻害剤を併用した場合の薬物動態パターンは両者でほぼ同等なので、天然型CNP-53の1-21位内にNEP耐性をもたらすアミノ酸配列が存在すると考えられる。また天然型CNP-53の1-21位内には本願発明に係る一般式B（コア配列相当部分）に類似した配列が存在する(RKYKGANKK)。
複合CNP(D)は天然型CNP-53に比べ、より良好な薬物動態パターンを示したことから、一般式Bで表される塩基性アミノ酸クラスター間に酸性アミノ酸が配置されることが、より長い半減期の特性を有するには必要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明に係る半減期延長ペプチドを短半減期である目的ペプチドに付加することにより、体内動態が改善されて医薬として実用的な半減期を有するものとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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