(57)【特許請求の範囲】
【請求項６】
炭素源と、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸の前駆物質との存在下に、大腸菌、ラルストニア属菌及びシュードモナス属菌から選ばれる微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から、少なくとも（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法。
【請求項７】
前記前駆物質が、４−メチル吉草酸、４−メチルペンテン酸及びこれらの混合物から選ばれる、請求項６記載の製造法。
【請求項８】
前記前駆物質が０．１〜５．０ｇ／Ｌの濃度で添加される、請求項６記載の製造法。
【請求項９】
前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、アロクロマティウム・ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＩＮＴ００５、ランプロシスティス・ロゼオペルシシナ（Ｌａｍｐｒｏｃｙｓｔｉｓ ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドバクター・シャエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ ｓｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ  ４０１２６、チオカプサ・フェニギー（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、及びアエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）から選ばれる微生物に由来する、請求項６記載の製造法。
【請求項１０】
前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株（ＤＤＢＪアクセション番号：ＡＢ０１４７５８）、又はアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｄ８８８２５）に由来する、請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｄ８８８２５）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンにかつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換されたポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異体をコードするものである、請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
前記炭素源が単糖類である、請求項６記載の製造法。
【請求項１３】
前記単糖類がフルクトースである、請求項１２記載の製造法。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシアルカン酸共重合体が、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位と（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸単位とを含む、請求項６記載の製造法。
【請求項１７】
前記ポリヒドロキシアルカン酸共重合体が、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位と、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸単位と、（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸単位と、場合により（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸単位とを含む、請求項６記載の製造法。
【請求項１８】
前記ポリヒドロキシアルカン酸共重合体が、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を１４ｍｏｌ％以上含む、請求項６記載の製造法。
【請求項１９】
前記ポリヒドロキシアルカン酸共重合体が、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を１４ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％含む、請求項６記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体及びその製造法に関する。本発明は、特に、少なくとも（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体、及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は微生物が細胞内に蓄積するポリエステルである。近年では、ＰＨＡは、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。最も一般的なＰＨＡは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成単位とするホモポリマー（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」）である。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、柔軟性がないのが欠点であった。その後、３ＨＢと（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなるＰＨＡ共重合体（以下、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）」）を、高いＰＨＡ蓄積能を示すラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）を用いて製造する方法が開発されたが（特開昭５７−１５０３９３号公報又は特開昭５９−２２０１９２号公報）、３ＨＢと３ＨＶとが共結晶化するために、柔軟性はほとんど向上しなかった。
近年、３ＨＢと、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）とからなる共重合体（以下、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）」）の製造法が確立され、高い柔軟性を有するポリヒドロキシアルカン酸の製造が可能になった（特開平５−９３０４９号公報又は特開平７−２６５０６５号公報）。これらの公報に記載の方法では、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）は、土壌細菌アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）を用いて植物油から製造される。
また、本発明者らは、３ＨＢと、（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）とからなる共重合体（以下、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）」、但し、３ＨＡ：Ｃ４〜Ｃ１２の（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸））が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子欠損変異株（ＰＨＢ−４株）にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子の変異体を組み込んだ組換え株を用いて、植物油から製造されることを報告している（特開２００７−１２５００４号公報）。
一方、分岐したアルキル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするホモポリマーやそのコポリマーも報告されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１９９０，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．９２−１０１）。しかし、一般的に、分岐したアルキル基を有する３−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするポリマーの製造は、モノマー組成の制御が困難であるために材料物性を考慮したポリマーの合成が難しく、当該公報においても分岐アルキルは分岐オクタン酸に限定されており、その物性についても明らかにされていなかった。
【発明の概要】
【０００３】
従って、本発明は、更に高い柔軟性を有する新規なポリヒドロキシアルカン酸の製造を目的として、少なくとも（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（以下、「３Ｈ４ＭＶ」と言うことがある）単位を含むポリヒドロキシアルカン酸の共重合体、及びその製造法を提供することを目的とする。なお、「（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸」は、「（Ｒ）−３−ヒドロキシイソヘキサン酸」と同義である。
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、炭素源の存在下に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された宿主微生物を培養する、従来のポリヒドロキシアルカン酸の合成系において、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含む新規なポリヒドロキシアルカン酸共重合体が得られることを見出し、培養時に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸の前駆物質を添加することにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位の組成比の高いポリヒドロキシアルカン酸共重合体（以下、単に、「ＰＨＡ共重合体」又は「ＰＨＡ」と言うことがある）が効率よく製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、（１）本発明は、少なくとも（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含む、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（２）本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位と（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸単位とを含む、（１）記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（３）本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位と、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸単位と、（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸単位と、場合により（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸単位とを含む、（２）記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（４）本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を１４ｍｏｌ％以上含む、（１）記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（５）本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を１４ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％含む、（１）記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。
（６）本発明は、炭素源と、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸の前駆物質との存在下に、大腸菌、ラルストニア属菌及びシュードモナス属菌から選ばれる微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から、少なくとも（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法を提供する。
（７）本発明は、前記前駆物質が、４−メチル吉草酸、４−メチルペンテン酸又はこれらの混合物から選ばれる、（６）記載の製造法を提供する。
（８）本発明は、前記前駆物質が０．１〜５．０ｇ／Ｌの濃度で添加される、（６）又は（７）記載の製造法を提供する。
（９）本発明は、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、Ａ３３、アロクロマティウム・ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＩＮＴ００５、ランプロシスティス・ロゼオペルシシナ（Ｌａｍｐｒｏｃｙｓｔｉｓ ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドバクター・シャエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ ｓｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ  ４０１２６、チオカプサ・フェニギー（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、及びアエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）から選ばれる微生物に由来する、（６）〜（８）のいずれか１記載の製造法を提供する。
（１０）本発明は、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株（ＤＤＢＪアクセション番号：ＡＢ０１４７５８）、又はアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｄ８８８２５）に由来する、（９）記載の製造法を提供する。
（１１）本発明は、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｄ８８８２５）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンにかつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換されたポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異体をコードするものである、（１０）記載の製造法を提供する。
（１２）本発明は、前記炭素源が単糖類である、（６）〜（１１）のいずれか１記載の製造法を提供する。
（１３）本発明は、前記単糖類がフルクトースである、（１２）記載の製造法を提供する。
（１４）本発明は、（１）〜（５）のいずれか１記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を含む成形体を提供する。
（１５）本発明は、フィルムである、（１４）記載の成形体を提供する。
本発明の製造法によれば、少なくとも（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むＰＨＡ共重合体を安価かつ収率よく製造できる。また、該ＰＨＡ共重合体は、十分な強度と柔軟性を有し、フィルム等に加工し易く、工業的に有用な高分子材料である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）によって合成されたＰＨＡ共重合体、及び化学的に合成された３Ｈ４ＭＶ、のＧＣ−ＭＳ分析を示す図である。（ａ）フルクトースから合成されたＰＨＡのｍ／ｚ  １０３イオンクロマトグラム；（ｂ）フルクトース及び４−メチル吉草酸（４ＭＶ）から合成されたＰＨＡのｍ／ｚ  １０３イオンクロマトグラム；（ｃ）化学的に合成された３Ｈ４ＭＶ（３Ｈ４ＭＶ標品）のｍ／ｚ  １０３イオンクロマトグラム；並びに（ｄ）ターポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨｘ）のｍ／ｚ  １０３イオンクロマトグラム。ＧＣにおける温度プログラムは、１分間、１００℃で開始し、次いで８℃／分の連続ステップで２８０℃まで昇温した。
図２は、シリル化３ＨＡメチルエステルのＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。（Ａ）総イオンクロマトグラム；（Ｂ）ピーク１（３．５分）、ピーク２（４．６分）及びピーク３（５．３分）のイオンフラグメントパターンは、それぞれ、シリル化３ＨＢ、シリル化３ＨＶ及びシリル化３Ｈ４ＭＶに相当する。
図３は、フルクトース（２０ｇ／ｌ）及び４−メチル吉草酸（４ＭＶ）（１ｇ／ｌ）で培養したＲ． ｅｕｔｒｏｐｈａ（ｐｈａＣ１Ｐｓ）から単離したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の化学式において、ｘ及びｙは繰り返し数を示す。
図４は、フルクトース（２０ｇ／ｌ）及び４−メチル吉草酸（４ＭＶ）（１ｇ／ｌ）で培養したＲ． ｅｕｔｒｏｐｈａ（ｐｈａＣ１Ｐｓ）から単離したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の１２５ＭＨｚ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
図５は、Ｒ． ｅｕｔｒｏｐｈａ（ｐｈａＣＡｃ（ＮＳＤＧ変異体））から単離した様々なＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）サンプルの溶液キャストフィルムのＤＳＣ熱容量変化を示す図である。加熱温度は、２０℃／分である。
図６は、１日、４０日及び１８０日保存後の、Ｒ． ｅｕｔｒｏｐｈａ（ｐｈａＣＡｃ（ＮＳＤＧ変異体））から製造した、（Ａ）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−７ｍｏｌ％  ３Ｈ４ＭＶ）；（Ｂ）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−９ｍｏｌ％  ３Ｈ４ＭＶ）；（Ｃ）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−１４ｍｏｌ％  ３Ｈ４ＭＶ）；（Ｄ）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−１６ｍｏｌ％  ３Ｈ４ＭＶ）；及び（Ｅ）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−２２ｍｏｌ％  ３Ｈ４ＭＶ）の各フィルムの応力−歪み曲線を示す。
図７は、以下の共重合体：Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）フラクション（黒三角）、Ｐ（３ＨＢ−ｃ−３ＨＨｘ）フラクション（白三角）、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）フラクション（黒丸）、及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４Ｂ）フラクション（白丸）についての、（Ａ）融点（Ｔｍ）と第二モノマー単位含量との関係；（Ｂ）ガラス転移点（Ｔｇ）と第二モノマー単位含量との関係；及び（Ｃ）破壊伸びの割合（％）と第二モノマー単位含量との関係を示す図である。横軸の第二モノマーフラクションは、３Ｈ４ＭＶ単位の含量（ｍｏｌ％）を示す。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の傾向線（ｔｒｅｎｄ  ｌｉｎｅ）を太線で示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明の（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むＰＨＡ共重合体は、その（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）単位の組成比が低いながらも、炭素源の存在下に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された宿主微生物を培養する、従来のポリヒドロキシアルカン酸の合成系によって製造できることが本発明者らにより今回初めて明らかにされた（図１参照）。更に、培養時に、３Ｈ４ＭＶの前駆物質を添加することにより、３Ｈ４ＭＶ単位の組成比が増加した共重合体が製造できることも明らかにされた。
すなわち、本発明のＰＨＡ共重合体は、少なくとも、下記式（Ｉ）：
0005396639.tif 000002
で表わされる３Ｈ４ＭＶ単位を含む。式（Ｉ）のＰＨＡ共重合体における３Ｈ４ＭＶ単位の含量は、好ましくは１４ｍｏｌ％以上、より好ましくは１４ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％である。３Ｈ４ＭＶ単位の含量が１４ｍｏｌ％未満では、ＰＨＡ共重合体の結晶化が進行し易く、得られたＰＨＡ共重合体が脆くなりやすい。また、３Ｈ４ＭＶ単位の含量が４０ｍｏｌ％を超えるとエラストマー状となる。
本発明のＰＨＡ共重合体は、好ましくは、下記式（ＩＩ）：
0005396639.tif 000003
［式中、ｘ及びｙは繰り返し数であり、それぞれ独立に１〜２０，０００の整数を示す。］
で表わされる、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）単位と３Ｈ４ＭＶ単位とを含む共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）である。
また、本発明のＰＨＡ共重合体は、３ＨＢ単位と３Ｈ４ＭＶ単位とに加えて（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）単位を更に含む、下記式（ＩＩＩ）：
0005396639.tif 000004
［式中、ｘ、ｙ及びｚは繰り返し数であり、それぞれ独立に１〜２０，０００の整数を示す。］
で表わされる共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）も好ましい。共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）において、該共重合体中の３ＨＶの含量は、共重合体が高い柔軟性を有するためには、できるだけ低いことが好ましく、例えば、３ＨＶの含量が１．６ｍｏｌ％以下であれば柔軟性に支障を与えない。共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）は、場合により、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸単位を更に含んでもよい。
本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、炭素源と、３Ｈ４ＭＶの前駆物質との存在下に、宿主にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入されてなる形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することによって製造できる。
ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体は、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子及び公知のモノマー供給遺伝子を挿入して得られるプラスミドを宿主細胞に導入することによって得られる。
宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、例えば、移動能を有するｍｏｂ領域を持つベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、ｐＪＲＤ２１５及びｐＬＡ２９１７が挙げられる。
ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、例えば、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ａ３３、アロクロマティウム・ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＩＮＴ００５、ランプロシスティス・ロゼオペルシシナ（Ｌａｍｐｒｏｃｙｓｔｉｓ ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドバクター・シャエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ ｓｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ  ４０１２６、チオカプサ・フェニギー（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、及びアエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）から選ばれる微生物に由来するものが挙げられる。これらの中で、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素は、細胞内に共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）（３ＨＡ：Ｃ４〜Ｃ１２の（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸）を蓄積する能力を有し、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素は、共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）（３ＨＡ：Ｃ４〜Ｃ７の（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸）を蓄積する能力を有する点で、特に好ましい。
また、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、上記のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の変異体をコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、野生型のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。このような変異体としては、具体的には、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンに、かつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体（ＮＳＤＧ変異体）が挙げられる。該ＮＳＤＧ変異体の製造法は、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，２７７（２００７），ｐ．２１７−２２２に詳細に記載されている。
公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂＡ、ｐｈｂＢ、ｐｈａＢ、ｐｈｂＢ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３−１５２９７（１９８９））、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪ（Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｄｏｉ，Ｙ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０（１９９７））等が挙げられる。
ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子及び公知のモノマー供給遺伝子を挿入する微生物発現用ベクターは、プロモーター、リボゾーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーター等を有する公知のベクターを用いることができる。
宿主としては、糖類や油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安全性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易である点から、例えば、大腸菌、ラルストニア属菌、シュードモナス属菌等の微生物細胞が挙げられる。本発明では、具体的には、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６のＰＨＡ蓄積能欠損株であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株を使用することができる。
現在のところ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．  ６１−３株由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子（ｐｈａＣ１Ｐｓ）のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株への効率的な形質転換法は確立されていないが、接合伝達によって遺伝子ｐｈａＣ１Ｐｓを再現性よく伝達することができる。具体的には、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、遺伝子ｐｈａＣ１Ｐｓ及び公知のモノマー供給遺伝子を含む上記プラスミドのＤＮＡ断片をライゲーションし、ライゲーションによって得られるプラスミドを、ＤＮＡの移動に直接関わるｔｒａ領域が染色体中に組み込まれている大腸菌中で形質転換した後、得られたプラスミドをＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株と接触させる。大腸菌の形質転換は、例えば、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１８４頁，１９９４年）等によって行うことができる。
３Ｈ４ＭＶの前駆物質としては、例えば、４−メチル吉草酸、４−メチルペンテン酸、又はこれらの混合物が好ましい。３Ｈ４ＭＶの前駆物質の添加量は、約０．１〜約５．０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、約０．５〜約２．０ｇ／Ｌの範囲がより好ましい。
炭素源としては、例えば、糖類、油脂類等を用いることができる。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解物等が挙げられる。油脂類としては、植物油が好ましく、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、又はこれらの分別油、例えばパームＷオレイン油（パーム油を２回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。
培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜４０℃、更により好ましくは２８〜３４℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１〜７日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類などが挙げられる。
本発明のＰＨＡ共重合体の菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、ヘキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。
本発明のＰＨＡ共重合体は、フィルム、シート等の成形体に加工できる。フィルムの厚みは特に特定されないが、通常、１ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ以下である。
本発明のフィルムは、溶液キャスト法、射出成形、プレス成形、ブロー成形等により得られるが、簡便に無色透明なフィルムを得るためにはキャスト法が好ましい。また、本発明のフィルムは機械的特性を向上させることなどを目的として、高温で熱処理してもよい。熱処理温度は共重合体の種類によって異なるが、通常、５０〜２００℃の範囲で行われる。更に、本発明のフィルムは延伸処理を施すことによって、引張強度、弾性率等の機械的特性などを更に向上させることができる。
また、本発明の成形体には本発明の目的を損なわない範囲内で、通常フィルムに用いられる各種添加剤、例えば紫外線吸収剤、熱安定剤、酸化防止剤、着色剤などを添加してもよい。
本発明の（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸単位を含むＰＨＡ共重合体は、十分な強度と柔軟性を有し、医療用材料、食品その他の包装材料、農業用ビニールシートやゴミ袋などに有用である。
【実施例】
【０００６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
材料及び調製方法
（１）微生物
（ａ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株（Ｈ．Ｇ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ（Ｇｅｏｒｇ−Ａｕｇｕｓｔ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ、ドイツより入手）
（ｂ）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６のポリヒドロキシアルカン酸蓄積能欠損株ＤＳＭ５４１、ドイツＤＳＭより入手）
（２）培地
（ａ）Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地
Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ  １０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天１．５〜２％（ｗｔ／ｖｏｌ）となるよう加えオートクレーブ処理して調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度  ５０μｇ／ｍＬ）は、液体培地、寒天培地ともにオートクレーブ処理後に添加した。
（ｂ）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｒｉｃｈ（ＮＲ）培地（ｐＨ７．０）
Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ  １０ｇ、酵母エキス  ２ｇ、肉エキス１０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した後、抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加した。
（ｃ）シモンズクエン酸培地
クエン酸ナトリウム二水和物  ２ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ、０．２ｇ／ｍＬ  ＭｇＳＯ４溶液を脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理して調製した。寒天培地は、まず液体培地をｐＨ６．９に調整し、渇変を防ぐため当該液体培地と寒天成分とを別々に１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した後にこれらを混合した。更に、２００ｇ／Ｌに調整したＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏをフィルター滅菌し、培地全量に対し１／１０００量及び抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えた。
（ｄ）ＭＳ培地
ミネラル培地（ｐＨ７．０）：Ｋ２ＨＰＯ４  １．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ９．０ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  ０．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した後、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、微量金属塩培地１ｍｌ、及びカナマイシン５０ｍｇを加えて調製した。
なお、微量金属塩培地（０．１Ｎ  ＨＣｌ）は、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２１８ｇ、ＦｅＣｌ３  ９．７ｇ、ＣａＣｌ２  ７．８ｇ、ＮｉＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．１１８ｇ、ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．１０５ｇ、及びＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１５６ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして調製した。
（３）プラスミド
（ａ）ｐＢＢＲ１″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅ
ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガより入手）に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子ｐｈａＣ１Ｐｓ（ＤＤＢＪアクセション番号：ＡＢ０１４７５８）と、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のモノマー供給遺伝子ｐｈａＡＢＲｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｊ０４９８７）とを挿入して、ｐＧＥＭ″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅを作製した。
ｐＧＥＭ″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株に形質転換し、抗生物質含有ＬＢ寒天培地で３７℃、１２時間培養した。プレート上に形成された単一コロニーを拾い、抗生物質含有ＬＢ培地１．７ｍＬに植菌し、３７℃、１６０／分で１２時間振盪培養した。当該培養液からＥ． ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を回収し、７５μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を用い、Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＬＩＧＥＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製）によりプラスミドを抽出した。
上記の抽出プラスミドをＢａｍＨＩによって消化し、０．８％アガロースゲル（ＴａＫａＲａ社製）を用いて電気泳動を行った。その後、分離した目的のＤＮＡ断片のゲルを切り出し、Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＬＩＧＥＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用いて精製した。その際、５０μＬのＴＥ溶液を用いて溶出した。更に、このＤＮＡ断片をエタノール沈殿によって濃縮し、１０μＬのＴＥ溶液に溶解した。
このようにして得られた挿入ＤＮＡ断片４μＬとｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２ベクター（Ｍ．Ｅ．Ｋ．Ｋｏｖａｃｈ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，米国より入手）１μＬとを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ社製）を５μＬ加えた後、１６℃で約２〜３時間反応させ、ｐＧＥＭ″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅのＢａｍＨＩ断片（ｐｈａＣ１ＰｓとｐｈａＡＢＲｅとを含む）を挿入したプラスミドｐＢＢＲ１″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅを作製した。
（ｂ）ｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３株由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子（ｐｈａＣ１Ｐｓ）の代わりにＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣＡｃ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：Ｄ８８８２５）を用いる以外は、上記（ａ）と同様にしてプラスミドｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３を作製した。
（４）ＰＨＡ共重合体の構造及び物性の分析法
（ａ）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
菌体内のＰＨＡ共重合体含有率とその組成は、ガスクロマトグラフィーで決定した（Ｂｒａｕｎｅｇｇら，１９７８）。まず、得られた乾燥菌体を耐圧ガラス管に１０〜１５ｍｇ秤量し、ここに硫酸メタノール溶液（硫酸：メタノール＝１５ｖｏｌ％：８５ｖｏｌ％）２ｍＬ及びクロロホルム２ｍＬを加えて密栓し、１００℃、１４０分間ヒートブロックで加熱しメタノール分解した。加熱中は約３０分ごとにサンプルを撹拌した。その後、室温まで冷却し、純水１ｍＬを加えて激しく撹拌した。静置後、二層に分離した下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで吸引し、０．４５μｍ径のＭｉｌｌｅｘ−ＦＨ  ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）でろ過した。ろ過後のクロロホルム層５００μＬに内部標準物質である０．１ｖｏｌ％カプリル酸メチル５００μＬを加え混合したものをサンプルとした。ＧＣ装置は島津製作所製のガスクロマトグラフＧＣ１４Ｂを用い、カラムにはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ−ＢＯＮＤ−１（内径３０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅ及びＮ２を用い、成分の検出には水素炎イオン化検出器を用いた。
（ｂ）ＰＨＡ共重合体の抽出及び精製
ＰＨＡ共重合体を蓄積させた乾燥菌体を１００ｍｇの蓋付ガラス瓶に移し、１００ｍＬのクロロホルムを加えスターラーで７２時間攪拌した。撹拌後の溶液をＮｏ．１濾紙（アドバンテック社製）でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、ロータリーエバポレーターで完全に濾液を揮発させ、共重合体を析出させた。
ついで、析出したＰＨＡ共重合体を少量のメタノールで洗い取り、約２０ｍＬのクロロホルムに完全に溶解させた後、４００ｍＬのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い精製した。精製した共重合体をＮｏ．１濾紙で回収し、４８時間ドラフト中で乾燥させた。
（ｃ）ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）
菌体から精製したＰＨＡ共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（Ｍｗ：重量平均分子量）をＧＰＣ測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、３，７９０、３０，３００、２１９，０００、７５６，０００及び４，２３０，０００である。
ＧＰＣサンプルは、精製したＰＨＡ共重合体を約１ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＦＨ  ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。
ＧＰＣ測定には島津製作所社製のＬＣ−ＶＰシリーズ（システムコントローラー：ＳＣＬ−１０ＡＶＰ、オートインジェクター：ＳＩＬ−１０Ａ  ＶＰ、送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＤ  ＶＰ、カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａ、ディテクター：ＲＩＤ−１０Ａ）を使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ社製のＫ−８０６Ｍ及びＫ−８０２を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は０．８ｍＬ／分、カラム温度は４０℃に設定し、サンプル注入量は５０μＬとした。データの解析にはＣＬＡＳＳ−ＶＰ用ＧＰＣ（島津製作所社製）を用いた。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
（ｄ）示差走査熱量（ＤＳＣ）
ＤＳＣサンプルは、精製したＰＨＡ共重合体を約１０ｍｇ秤り取り、５ｍＬ容のサンプルバイアルに入れ、約１〜２ｍＬのクロロホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で約３週間乾燥させることによりキャストフィルムを作製した。このキャストフィルムから約３ｍｇを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものをＤＳＣ測定サンプルとした。測定には、パーキンエルマー社製のＰｙｒｉｓ  １  ＤＳＣを使用した。測定は２０ｍＬ／分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに２５℃〜２００℃まで２０℃／分の昇温速度で加熱し、２００℃で１分間保持した後、−５００℃／分で−１２０℃まで急冷した。次に、−１２０℃で１分間保持した後、２０℃／分の昇温速度で２００℃に加熱した。解析には、パーキンエルマー社製の解析ソフトＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。測定した試料の融点Ｔｍ及び融解エンタルピーΔＨｍの決定は、最初に昇温した時のサーモグラムより、ガラス転移温度Ｔｇは二度目に昇温した時のサーモグラムより求めた。
（ｅ）３Ｈ４ＭＶ標品の合成
ＮａＢＨ４  １ｇを１００ｍＬナスフラスコに秤り取り、メタノール１０ｍＬを加えた。次に、この溶液にイソブチリル酢酸メチル（東京化成工業）３ｍＬ／メタノール１０ｍＬを氷上で撹拌しながら徐々に滴下した。発熱しなくなるまで氷上で撹拌し、その後室温で１２時間撹拌した。反応終了後、未反応のＮａＢＨ４をろ別し、クロロホルム４０ｍＬを加え、飽和塩化ナトリウム水溶液４０ｍＬで３回洗浄した。クロロホルム層を乾燥後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、無色透明液体を得た。
（ｆ）ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）
ＰＨＡ共重合体に含まれる微量の３−ヒドロキシアルカン酸の組成は、ＧＣ／ＭＳにより決定した。定性はＳＣＡＮモード、定量はＳＩＭ（ｓｅｌｅｃｔｅｄｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードを使用した。
＜装置＞
ガスクロマトグラフ：ＧＣ−２０１０（島津製作所）
ガスクロマトグラフ質量分析計：ＧＣＭＣ−ＱＣ２０１０（島津製作所）
カラム：Ｉｎｅｒｔ  Ｃａｐ  １（ＧＬサイエンス）
検出器：質量分析計（ＭＳ）
イオン化源：電子衝撃イオン化法（ＥＩ）
分析ソフト：ＧＣ  ＭＳ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）
＜サンプル調製＞
・メチルエステル化
ネジ口耐圧試験管にＰＨＡを所定量秤量し、硫酸メタノール溶液２ｍＬ及びクロロホルム２ｍＬを加え、１００℃で１４０分間、数回攪拌しながら加熱した。反応終了後、室温まで冷却し超純水１ｍＬを加え激しく撹拌し、静置後下層をサンプルとした。
・トリメチルシリル化
メチルエステル化サンプル２００μＬにジメチルホルムアミド３００μＬ、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド１００μＬを加え、７０℃で３０分間、数回攪拌しながら加熱した。反応終了後、室温まで冷却し、超純水１ｍＬ、ヘキサン１ｍＬを加え激しく撹拌し、静置後上層をサンプルとした。
＜測定条件＞
ＭＳの質量数較正にはパーフルオロトリブチルアミンを用いた。
キャリアガスとしてヘリウムを用い、入り口圧は１２０ｋＰａとした。
各装置の分析ラインの温度条件  ＧＣ：試料気化温度  ２８０℃；カラム初期温度  １００℃；カラム最終温度  ２８０℃；カラム昇温速度  ８℃／分；注入モード  スプリット、ＧＣ−ＭＳ：イオン源温度  ２３０℃；インターフェース温度  ２５０℃；溶媒溶出時間  １．７分；検出器ゲイン  ０．８ｋＶ。測定条件  ＭＳ  ＳＣＡＮ：開始時間  ２分；終了時間  ２４分；スキャン速度  １２５０；開始ｍ／ｚ  ４５．００；終了ｍ／ｚ  ６００．００。
サンプル注入量は１μＬとした。
（ｇ）１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ測定
ＣＤＣｌ３に３％（ｗｔ／ｖｏｌ）となるようＰＨＡ共重合体を溶解し、測定サンプルとした。核磁気共鳴分光装置を使用し、室温で測定を行った。
（５）ＰＨＡ共重合体の力学的強度の測定
ＰＨＡフィルムを作製し、ＰＨＡのフィルムのヤング率、破壊応力、破壊伸びを、引張試験によって決定した。
＜装置＞
引張試験機：ＡＧＳ−Ｈ／ＥＺＴｅｓｔ（島津製作所）
分析ソフト：ＴＲＡＰＥＺＩＵＭ  ２（島津製作所）
＜サンプル調製＞
（ａ）キャストフィルムの作製
精製したポリマーを適量のクロロホルムの溶解し、フラットシャーレに展開した。ここで用いたポリマー重量は、シャーレの面積を考慮して、厚さが１５０μｍになるように計算した。展開後、穴をあけたアルミホイルでシャーレにふたをして、クロロホルムが完全に気化するまで、平滑な場所に室温で静置した。乾燥後、シャーレからフィルムを丁寧に剥がし、一週間、室温で静置した。シャーレから剥がれにくいポリマーは、シャーレとポリマーの間に超純水を滴下することにより、剥離した。
（ｂ）引張試験片の作製
作製したキャストフィルムを縦２０ｍｍ、横３ｍｍに切断したものをサンプルとした。切断には剃刀を使用し、ポリマーの真上から押さえつけるように切断した。
＜測定条件＞
つかみ間距離１０ｍｍ、引張速度１０ｍｍ／分とし、室温で測定した。
＜データ解析＞
ポリマーが破断しときの応力を破断応力、伸び率を破壊伸びとした。ヤング率は、応力−歪み曲線における開始点の傾きとした。
以下、実施例において用いる語句、「本発明のＰＨＡ共重合体」、「ＰＨＡ」又は「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）」は、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）」及び／又は「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）」を意味するものとする。
実施例１〜２  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６１−３株由来重合酵素を用いるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の製造
（１）形質転換体Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株の作製
Ｅ． ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株のコンピテントセルは、対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得た。当該処理細胞にプラスミドｐＢＢＲ１″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅのＤＮＡを加え、４２℃に温度を上げるヒートショックによって細胞内への取り込みを促進させた。
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株に遺伝子を導入するために接合伝達を行った。プラスミドｐＢＢＲ１″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅが導入されたＥ． ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株を１．７ｍＬ  ＬＢ培地に植菌し、３７℃で１５時間振盪培養した。また、導入する宿主（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株）も１．７ｍＬ  ＮＲ培地に植菌し、３０℃で１５時間培養した。培養後、それぞれの培養液全量をオートクレーブ済みエッペンチューブに移し、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心した。抗生物質を含むＥ． ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株には、５００μＬ  ＬＢ培地を加えて更に遠心して、抗生物質を完全に除去した。上清を５０μＬほど残るように捨てて、Ｅ． ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株とＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ−４株を混合し、ＬＢ寒天培地に滴下し、乾燥後、３０℃で５時間培養した。その後、抗生物質を含むシモンズクエン酸寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。ここで得られた単一コロニーを再度シモンズクエン酸培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。これにより単離したコロニー（形質転換体Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ株）を以降の実験で使用した。
（２）形質転換体Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ株の培養
形質転換体Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ株の培養にはＭＳ培地を用いた。シモンズクエン酸培地上で単離した単一コロニーを白金耳を用いて１．７ｍＬのＮＲ培地に植菌し、３０℃で１２時間振盪培養した（前培養）。この培養液１ｍＬを、フルクトース２０ｇ／Ｌ、抗生物質、３Ｈ４ＭＶの前駆物質として４−メチル吉草酸又は４−メチルペンテン酸（いずれも、１ｇ／Ｌ）を含む１００ｍＬのＭＳ培地に植菌し、３０℃、１３０／分で７２時間振盪培養を行った（本培養）。また、比較のために、Ｌ−バリン又はＬ−ロイシンを添加して同様に培養を行った。
培養後、２５０ｍＬ遠心管に培養液を移し、４℃、６，０００ｒｐｍ（４，０５０×ｇ）で１０分間遠心し集菌した。菌を遠心分離した後、約２０ｍＬの水に菌体を懸濁させ、再度４℃、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌を行い、上清を取り除いた。集菌した菌のペレットを２〜３ｍＬの超純水に懸濁させ、５ｍＬのポリプロピレン容器に移し、風穴を開けたパラフィルムを貼り付け、−８０℃で凍結乾燥し、７２時間真空乾燥させることにより乾燥菌体を得た。
乾燥菌体を前記のようにして精製してＰＨＡを得、ＧＣ−ＭＳ（図１、２）、１Ｈ−ＮＭＲ（図３）及び１３Ｃ−ＮＭＲ（図４）によりその構造を分析した。表１に、３ＨＡメチルエステルの各々の分子量及びＧＣ保持時間を示す。
【表１】
0005396639.tif 000005
ａ）３ＨＢ：（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸；３ＨＶ：（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸；３Ｈ４ＭＶ：（Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸；３ＨＨｘ：（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸
ｂ）ＧＣ温度プログラムは、１分間１００℃で開始し、次いで８℃／分の連続ステップで２８０℃めで昇温した。
図１より、前駆物質の非存在下でも、３Ｈ４ＭＶを構成単位とするＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）が得られることが初めて見出された（図１の（ａ））。以下に、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の１Ｈ−ＮＭＲデータ、及び１３Ｃ−ＮＭＲのデータを示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：５．３０−５．２３（ｍ，３ＨＢのＣＣＨＣＨ３），５．１３（ｄ，３Ｈ４ＭＶのＣＣＨＣＨ２），２．６７−２．４４（ｍ，３ＨＢのＣＣＨ２ＣＯ），１．８９（ｄｄ，３Ｈ４ＭＶのＣＣＨ２ＣＯ），１．２７（ｄｄ，３ＨＢのＣＣＨ３），０．９０（ｄ，３Ｈ４ＭＶのＣ（ＣＨ３）２）。１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１６９．１（３ＨＢ単位のカルボニル炭素），１６９．７（３Ｈ４ＭＶ単位のカルボニル炭素）。
また、前駆物質の存在下では、３Ｈ４ＭＶの組成比が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）が得られることが明らかになった（図１の（ｂ））。結果を表２に纏めた。一方、前駆物質の代わりにＬ−ロイシン又はＬ−バリンを添加した場合には、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）は全く検出されなかった。
【表２】
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実施例３〜６  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ由来重合酵素を導入したＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ株によるフルクトース及び４−メチル吉草酸からのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の製造
プラスミドｐＢＢＲ１″Ｃ１ＰｓＡＢＲｅの代わりにプラスミドｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３を用いる以外は実施例２と同様にして、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が３Ｈ４ＭＶを取り込むか否かについて検討した。また、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンに、かつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体（ＮＳＤＧ変異体）を、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，２７７（２００７），ｐ．２１７−２２２に記載の方法に準じて製造し、該変異体をコードする重合酵素遺伝子が３Ｈ４ＭＶを取り込むか否かについても検討した。結果を表３に示す。
【表３】
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表３より、野生型のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子でも３Ｈ４ＭＶを取り込んだが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子、及びＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ株由来のＰＨＡ合成酵素変異体遺伝子では、更に取り込み率が高くなることが分かった。
実施例７  ４−メチル吉草酸の濃度の影響
４−メチル吉草酸の濃度を変える以外は、実施例４、６と同様にしてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）を製造した。結果を表４に示す。
【表４】
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ａ）乾燥菌体重量、ＰＨＡ含有率及びＰＨＡ組成の値は、少なくとも３つ独立した培養物からの平均及び標準偏差である。細胞は、フルクトース（２０ｇ／Ｌ）及び異なった濃度の４ＭＶを含むＭＳ培地で培養した。
ｂ）微量のため定量できず。
実施例８  Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の分子量、並びにＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）を含む溶液キャストフィルムの熱的特性及び力学的特性
実施例７で作製したサンプル番号（１）〜（１８）の共重合体を含む溶液キャストフィルムを前記のようにして作製し（得られたフィルムのサンプル番号（１′）〜（１８′）とする）、熱的特性及び力学的特性を測定した（表５）。
【表５】
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結晶融解エンタルピー（ΔＨｍ）が高い値ほど、得られたＰＨＡ共重合体の結晶性は高くなる。結晶性が高くなると、該ＰＨＡ共重合体の硬度は増すが、脆くなる。
本発明において、特に３Ｈ４ＭＶを１４ｍｏｌ％以上含むサンプル（６）、（７）及び（１４）〜（１８）では、ＰＨＡ共重合体の結晶性が低く、その内のサンプル（６′）、（７′）及び（１４′）〜（１６′）は、ヤング率及び破壊伸びの値から、高い柔軟性を有することが実際に確認された。サンプル（９′）〜（１６′）及び（１８′）のＤＳＣ熱容量変化を図５に示す。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）、及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）についての、（Ａ）融点（Ｔｍ）と第二モノマー単位含量との関係；（Ｂ）ガラス転移点（Ｔｇ）と第二モノマー単位含量との関係；及び（Ｃ）破壊伸びの割合（％）と第二モノマー単位含量との関係を図７に示す。
参考として、３ＨＶ組成が１４ｍｏｌ％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の融点は、１５０℃（Ｐ．Ｈｏｌｍｓ，ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ−２，Ｄ．Ｃ．Ｂａｓｓｅｔｔ，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８８，ｐｐ．１−６５）、３ＨＨｘ組成が１５ｍｏｌ％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）の融点は、１１５℃（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９５，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．４８２２−４８２８）、３ＨＢのホモポリマーの融点は、１７４℃である。
実施例９  経時的な（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ４ＭＶ）の力学的特性の変化
実施例８で得られたサンプル（１′）〜（１８′）を室温で１日、４０日、１８０日保存した後に、引張強度及び破壊伸びを測定した（表６、図６）。
【表６】
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表６及び図６より、本発明のＰＨＡ共重合体を含む溶液キャストフィルムは、１８０日保存後も製造時の力学的特性を有することから、安定性が高いことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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