(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列は、
ａ）少なくとも１つの折れ曲がりＤＮＡエレメント、
ｂ）およびＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位
を含み、
配列番号２４〜２７の配列、その相補的な配列、少なくとも９０％のヌクレオチド長を共有するその部分、それらの組み合わせおよびそれらの核酸配列の同一性が少なくとも９０％である変異体を含んでなる群から選択され、ＭＡＲヌクレオチド配列からなる核酸を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項２】
折れ曲がりＤＮＡエレメントは、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも１０％のジヌクレオチドＴＡ、および／または少なくとも１２％のジヌクレオチドＡＴを含有することを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
折れ曲がりＤＮＡエレメントは、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも３３％のジヌクレオチドＴＡ、および／または少なくとも３３％のジヌクレオチドＡＴを含有することを特徴とする、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合タンパク質は転写因子である、請求項１〜３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
転写因子はポリＱポリＰドメインタンパク質を含んでなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
転写因子は、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＭＥＦ２、Ｓ８、ＤＬＸ１、ＦＲＥＡＣ７、ＢＲＮ２、ＧＡＴＡ１／３、ＴＡＴＡ、Ｂｒｉｇｈｔ、ＭＳＸ、ＡＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＲＥＢＰ１、ＦＯＸ、Ｆｒｅａｃ７、ＨＦＨ１、ＨＮＦ３α、Ｎｋｘ２５、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｐｉｔ１、ＴＴＦ１、ＸＦＤ１、ＡＲ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃｄｃ５、ＦＯＸＤ３、ＨＦＨ３、ＨＮＦ３β、ＭＲＦ２、Ｏｃｔ１、ＰＯＵ６Ｆ１、ＳＲＦ、Ｖ＄ＭＴＡＴＡ＿Ｂ、ＸＦＤ２、Ｂａｃｈ２、ＣＤＰ ＣＲ３、Ｃｄｘ２、ＦＯＸＪ２、ＨＦＬ、ＨＰ１、Ｍｙｃ、ＰＢＸ、Ｐａｘ３、ＴＥＦ、ＶＢＰ、ＸＦＤ３、Ｂｒｎ２、ＣＯＭＰ１、Ｅｖｉｌ、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ４、ＨＦＮ１、Ｌｈｘ３、ＮＫＸ３Ａ、ＰＯＵ１Ｆ１、Ｐａｘ６、ＴＦＩＩＡおよびＶｍｗ６５またはこれらの転写因子の２つもしくはそれ以上の組み合わせを含んでなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項７】
天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含み、
配列番号２４〜２７の配列、その相補的な配列、少なくとも９０％のヌクレオチド長を共有するその部分、それらの組み合わせおよびそれらの核酸配列の同一性が少なくとも９０％である変異体を含んでなる群から選択されるＭＡＲヌクレオチド配列を含んでなる合成ＭＡＲ配列からなる核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
リンカー配列はＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩリンカーであることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
配列番号２４〜２７の配列、その相補的な配列、少なくとも９０％のヌクレオチド長を共有するその部分、それらの組み合わせおよびそれらの核酸配列の同一性が少なくとも９０％である変異体から選択されるＭＡＲヌクレオチド配列からなる核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも１０％のジヌクレオチドＴＡを含有する請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも３３％のジヌクレオチドＴＡを含有する請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも１２％のジヌクレオチドＡＴをさらに含有する請求項９〜１１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも３３％のジヌクレオチドＡＴをさらに含有する請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
配列番号２４〜２７の配列、その相補的な配列、少なくとも９０％のヌクレオチド長を共有するその部分、それらの組み合わせおよびそれらの核酸配列の同一性が少なくとも９０％である変異体から選択される配列からなる核酸を含む請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記発現ベクターが、少なくとも１つの前記ＭＡＲヌクレオチド配列をさらに含んでなることを特徴とする、請求項１〜１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
プロモーターおよび目的の遺伝子を含む配列の５’および３’両末端のぞれぞれに前記ＭＡＲヌクレオチド配列が配置されることを特徴とする、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
少なくとも２つのＭＡＲ配列はプロモーターおよび目的の遺伝子を含有する配列とは異なる配列上に局在することを特徴とする、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記発現ベクターが、線状ＤＮＡ配列の形態であることを特徴とする、請求項１５〜１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
真核宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするための方法であって、
ａ）前記真核宿主細胞に少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列からなる核酸をさらに含んでなる請求項１〜１４に記載の発現ベクターをトランスフェクトすること、
ｂ）規定の時間内に、前記真核宿主細胞に少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列からなる核酸をさらに含んでなる請求項１〜１４に記載の発現ベクターをさらにトランスフェクトすること、
ｃ）トランスフェクトされた前記真核宿主細胞を選択すること
を含んでなる方法。
【請求項２０】
前記目的のＤＮＡ配列は、プロモーターに操作可能に連結されたタンパク質をコードする目的の遺伝子であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
選択されるトランスフェクト真核宿主細胞は、１日あたり１細胞あたり少なくとも１０ｐｇの産生速度を伴う高タンパク質産生細胞であることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記規定の時間は細胞分裂周期に関連する間隔に対応することを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
規定の時間は宿主細胞が２回目の細胞分裂周期に入ってすぐの時期であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
真核宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするための方法であって、
前記真核宿主細胞に、少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列からなる核酸と、請求項１〜１４に記載の発現ベクターとをコトランスフェクトすることを含んでなる方法。
【請求項２５】
タンパク質の産生のための方法であって、ここで、
ａ）請求項１９〜２４のいずれか一項に従ってトランスフェクトされた真核宿主細胞が、培養培地において前記タンパク質の発現に適切な条件下で培養され、
ｂ）前記タンパク質が回収される、
上記方法。
【請求項２６】
請求項１９〜２４のいずれか一項に従ってトランスフェクトされた真核宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の発現ベクターを含んでなる細胞トランスフェクション混合物またはキット。
【請求項２８】
その細胞の少なくともいくつかは請求項１〜１４のいずれか一項に記載の発現ベクターを安定に組み入れていることを特徴とする、トランスジェニック生物体（ただし、ヒトを除く）。
【請求項２９】
そのゲノムは請求項１〜１４のいずれか一項に記載の発現ベクターを安定に組み入れていることを特徴とする、トランスジェニック生物体（ただし、ヒトを除く）。
【請求項３０】
その細胞のいくつかは請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法に従ってトランスフェクトされていることを特徴とする、請求項２８または２９に記載のトランスジェニック生物体（ただし、ヒトを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、より具体的には、真核細胞においてタンパク質産生活性を増加させるためのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）の使用に関する。また、前記活性な領域、特にＭＡＲヌクレオチド配列の同定のための方法、および新規の多トランスフェクション方法におけるこれらの特徴付けられた活性なＭＡＲ配列の使用についても開示する。
【背景技術】
【０００２】
現在、真核生物の染色体のループドメインの編成のモデルが良好に容認されている（ブーリカスＴ（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ）、「Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５２：１４−２２、１９９３年）。このモデルに従って、クロマチンは、核酸マトリックス、ＲＮＰおよび他の非ヒストンタンパク質からなるタンパク質ネットワークに付着した５０〜１００ｋｂに及ぶループに編成される（ボーデＪ（Ｂｏｄｅ  Ｊ）、ステンゲルト−アイベルＭ（Ｓｔｅｎｇｅｒｔ−Ｉｂｅｒ  Ｍ）、ケイＶ（Ｋａｙ  Ｖ）、ショーケＴ（Ｓｃｈａｌｋｅ  Ｔ）およびダイエッツ−プフェイステッテルＡ（Ｄｉｅｔｚ−Ｐｆｅｉｌｓｔｅｔｔｅｒ  Ａ）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐ．，６：１１５−１３８、１９９６年）。
【０００３】
核マトリックスに付着したＤＮＡ領域は、足場（中期中）もしくはマトリックス（中間期）付着領域に対し、それぞれＳＡＲまたはＭＡＲと称される（ハートＣ（Ｈａｒｔ  Ｃ）およびレムリＵ（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ）（１９９８年）、「Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｂｙ  ＳＡＲｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ８，５１９−５２５）。
【０００４】
従って、これらの領域は、シス調節エレメントを包含することのみによって、ドメイン内の遺伝子の発現が制御されるように、独立したクロマチンドメインの境界を規定することができる。
【０００５】
しかし、付近のクロマチンエレメントから染色体遺伝子座を十分に遮蔽し、従って、位置非依存的遺伝子発現を付与するそれらの能力は、安定にトランスフェクトされた細胞では認められていない（ポルジャックＬ（Ｐｏｌｊａｋ  Ｌ）、スームＣ（Ｓｅｕｍ  Ｃ）、マッチオニＴ（Ｍａｔｔｉｏｎｉ  Ｔ）およびレムリＵ（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ）（１９９４年）「ＳＡＲｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｂｕｔ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２２，４３８６−４３９４）。一方、ＭＡＲ（またはＳ／ＭＡＲ）配列は、エンハンサーと相互作用して、局所クロマチンへのアクセス可能性を増加させることが示されている（ジェヌバインＴ（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ  Ｔ）、フォレスターＷ（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ  Ｗ）、フェルナンデス−ヘレロＬ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｌ）、ライベルＧ（Ｌａｉｂｌｅ  Ｇ）、ダルＭ（Ｄｕｌｌ  Ｍ）、およびグロスシェデルＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  Ｒ）（１９９７年）「Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ３８５，２６９−２７２）。特に、ＭＡＲエレメントは、細胞培養系統（カロスＭ（Ｋａｌｏｓ  Ｍ）およびフルニエＲ（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ｒ）（１９９５年）「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１５，１９８−２０７）、トランスジェニックマウス（カスティヤＪ（Ｃａｓｔｉｌｌａ  Ｊ）、ピンタードウＢ（Ｐｉｎｔａｄｏ  Ｂ）、ソウラ，Ｉ（Ｓｏｌａ，Ｉ）、サンチェス−モルガドＪ（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍｏｒｇａｄｏ  Ｊ）、およびエンジュアネスＬ（Ｅｎｊｕａｎｅｓ  Ｌ）（１９９８年）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｌｋ」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６，３４９−３５４）ならびに植物（アレンＧ（Ａｌｌｅｎ  Ｇ）、ホールＧＪ（Ｈａｌｌ  ＧＪ）、ミカロウスキーＳ（Ｍｉｃｈａｌｏｗｓｋｉ  Ｓ）、ニューマンＷ（Ｎｅｗｍａｎ  Ｗ）、スパイカーＳ（Ｓｐｉｋｅｒ  Ｓ）、ワイシンガーＡ（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  Ａ）、およびトンプソンＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｗ）（１９９６年）、「Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｏｂａｃｃｏ」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ８，８９９−９１３）における異種遺伝子の発現を増強することができる。遺伝子治療のための改善されたベクターを開発するためのＭＡＲ配列の利用もまた、認識されている（アガルワルＭ（Ａｇａｒｗａｌ  Ｍ）、オースチンＴ（Ａｕｓｔｉｎ  Ｔ）、モレルＦ��Ｍｏｒｅｌ  Ｆ）、チェンＪ（Ｃｈｅｎ  Ｊ）、ボーンレインＥ（Ｂｏｈｎｌｅｉｎ  Ｅ）、およびプラベックＩ（Ｐｌａｖｅｃ  Ｉ）（１９９８年）、「Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ  Ｖｉｒｏｌ７２，３７２０−３７２８）。
【０００６】
最近、ＭＡＲを含むクロマチン構造修飾配列は、ニワトリリゾチーム５'ＭＡＲによって例示されるように、安定なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のプールにおいて、レポーター発現を有意に増強することが可能であることが示されている（ザン−ザバルＭ（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ）ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１年、８７（１）：２９−４２頁）。この特性は、高産生クローンの割合を増加し、従って、スクリーニングする必要のあるクローンの数を減少するために使用された。これらの有益性は、導入遺伝子発現カセットに隣接するＭＡＲを伴う構築物について、ならびに構築物を個別のプラスミド上のＭＡＲで同時トランスフェクトする場合の両方において、観察されている。しかし、ＭＡＲによる同時トランスフェクション時の発現レベルは、２つのＭＡＲによって導入遺伝子発現ユニットが限定される構築物について観察されるレベルほど高くはない。第３および好適なプロセスは、導入遺伝子に連結され、かつ個別のプラスミド上にあるＭＡＲによる導入遺伝子のトランスフェクションであることが示された（ギロド（Ｇｉｒｏｄ）ら、投稿中）。しかし、この技術に存続する制限事項は、細胞あたりにおいてトランスフェクトすることができるＤＮＡの量である。高いトランスフェクション効率を達成して、目的の遺伝子の機能を特徴付けするための多くの多トランスフェクションプロトコルが開発されている。ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９９９年（「Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１（４），２４１−２４３）によって適用されるプロトコルは、５回のトランスフェクション事象後、約８０％のトランスフェクション効率をもたらす一方、従来のトランスフェクションプロトコルは、＜４０％の割合しか達成しなかった。この技術は、発現する細胞の割合を増加させることを所望する場合には有用であり得るが、より高い固有の生産性を伴う細胞はもたらさない。従って、高産生のモノクローナル細胞系統を作製するために該技術を使用することはできない。故に、先に記載の技術は、主に以下の２つの欠点を有する。
ｉ）この技術は、さらなる遺伝子コピーの組込みに有利に働くことはできず、導入遺伝子を好適な染色体遺伝子座に指令しないため、トランスフェクト細胞の均質な集団を作製しない、
ｉｉ）多トランスフェクション事象において同じ選択マーカーを使用すると、二重または三重にトランスフェクトされた細胞を選択することができない。
【０００７】
特許出願国際公開第０２／０７４９６９号パンフレットでは、安定な真核細胞系統の開発のためのＭＡＲの利用も実証されている。しかし、この出願は、ＭＡＲ  ＤＮＡエレメントのための任意の保存された相同性についてもまたはＭＡＲ配列であるべきＤＮＡ配列について能力を推定するための任意の技術についても開示していない。
【０００８】
事実、明確なＭＡＲコンセンサス配列は見出されていない（ブーリカスＴ（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ）、「Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５２：１４−２２、１９９３年）が、動物のＭＡＲは植物の核の足場に結合することができ、逆もまた可能であるため、進化の過程で、これらの配列の構造は、真核生物のゲノムにおいて機能的に保存されているようである（ミールケＣ（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ）、コウウィＹ（Ｋｏｈｗｉ  Ｙ）、コウウィ−シゲマツＴ（Ｋｏｈｗｉ−Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｔ）およびボーデＪ（Ｂｏｄｅ  Ｊ）、「Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ａｔｔａｃｈｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：７４７５−７４８５、１９９０年）。
【０００９】
生化学的研究によるＭＡＲの同定は長期および推定不可能なプロセスであり；アッセイに依存して多用な結果を得ることができる（ラジンＳＶ（Ｒａｚｉｎ  ＳＶ）、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．，６：２４７−２６９，１９９６年）。真核生物のゲノムにおける膨大な数の予想されたＭＡＲおよびゲノムプロジェクトに由来する配列の量を考慮すると、標的化された実験を実施するために潜在的なＭＡＲＳをフィルタリングすることが可能なツールは極めて有用である。
【００１０】
現在、ＭＡＲのための２つの異なる推定ツールが、インターネットを介して利用することができる。第１のツール、ＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｆｕｔｕｒｅｓｏｆｔ．ｏｒｇ／ＭａｒＦｉｎｄｅｒ；サイＧＢ（Ｓｉｎｇｈ  ＧＢ）、クレイマーＪＡ（Ｋｒａｍｅｒ  ＪＡ）およびクラウェッツＳＡ（Ｋｒａｗｅｔｚ  ＳＡ）、「Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：１４１９−１４２５、１９９７年）は、いくらかのＭＡＲ内で同定されるパターンの組およびこれらのパターンの同時発生に関する統計解析に基づく。ＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒの推定は配列の状況に依存し、推定されたＭＡＲは、提出された配列の状況に依存することを意味する。他方の推定ソフトウェア、ＳＭＡＲＴｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ；フリッシュＭ（Ｆｒｉｓｃｈ  Ｍ）、フレチＫ（Ｆｒｅｃｈ  Ｋ）、クリンゲンホッフＡ（Ｋｌｉｎｇｅｎｈｏｆｆ  Ａ）、カルタリウスＫ（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ  Ｋ）、リービッヒＩ（Ｌｉｅｂｉｃｈ  Ｉ）およびウェルナーＴ（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｔ）、「Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：３４９−３５４、２００１年）は、実験的に同定されたＭＡＲから誘導される重量マトリックスを使用する。ＳＭＡＲＴｅｓｔは大規模解析を実施するのに適切であるといわれている。しかし、実際には、その相対的に貧弱な特異性の他に、それによって大規模解析を行う場合、仮定ＭＡＲの量が迅速に膨大な量になり、その特異性を増加して仮定ＭＡＲの数を抑制する方法もないまま、ＳＭＡＲＴｅｓｔは、大量のＤＮＡ配列から強力なＭＡＲを対象にスクリーニングするのにほとんど役立たなくなる。
【００１１】
インターネットを介して入手することができない他のいくつかのソフトウェアも存在し；それらも同様にＭＡＲモチーフの頻度（ＭＲＳ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ；バン・デュルネンＣＭ（Ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  ＣＭ）ら、「Ａ  ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ／ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２７：２９２４−２９３０、１９９９年）、（ＣｈｒＣｌａｓｓ；グラズコＧＶ（Ｇｌａｚｋｏ  ＧＶ）ら、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５１７：３５１−３５６、２００１年）に基づくかまたはストレス誘導性ＤＮＡ二重鎖の部位の同定（ＳＩＤＤ；ベンハムＣ（Ｂｅｎｈａｍ  Ｃ）ら、「Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７４：１８１−１９６、１９９７年）に基づく。しかし、完全なゲノム配列を解析するためのそれらの適合性は依然として不明であり、これらのツールがタンパク質産生を増加させる配列の同定を可能にし得るかどうかについては報告されていない。
【００１２】
さらに、これらのソフトウェア（フリッシュＭ（Ｆｒｉｓｃｈ  Ｍ）、フレチＫ（Ｆｒｅｃｈ  Ｋ）、クリンゲンホッフＡ（Ｋｌｉｎｇｅｎｈｏｆｆ  Ａ）、カルタリウスＫ（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ  Ｋ）、リービッヒＩ（Ｌｉｅｂｉｃｈ  Ｉ）およびウェルナーＴ（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｔ）、「Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：３４９−３５４、２００１年）の相対的に貧弱な特異性のため、大規模解析を行う場合、特に、これらのほとんどが実際にはまったく活性を有さないかまたは貧弱な活性を有する場合、ゲノムにおいて同定される仮定ＭＡＲの量は迅速に管理不可能な状態になる。従って、推定特異性を増加して仮定ＭＡＲの数を抑制する方法を有さない多くの利用可能なプログラムは、組換えタンパク質産生を効率的に増加させる観点において強力な遺伝子エレメントを同定するのにはほとんど役立たなくなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記のすべての推定方法は、ゲノムの大規模解析が信頼できる新規かつ強力なＭＡＲを同定するのを妨害するいくつかの欠点を有するため、本発明の目的は、１）改善された組換えタンパク質発現を可能にするＭＡＲの機能的特徴を理解すること；２）機能の推定として、ＭＡＲの構造的特徴を編集する新規のバイオインフォマティクスツールを得て、３）新規かつより強力なＭＡＲを同定するためにゲノムの大規模解析を実施すること、および最後に４）新たに同定されたＭＡＲ配列を使用する場合、真核細胞または生物体からの組換えタンパク質の産生を増加させるための改善された効率を実証することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、タンパク質産生増加活性、特に、ＭＡＲヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列を同定するための改善されたかつ信頼できる方法、および真核細胞における組換えタンパク質の産生を増加させるための新規の多トランスフェクション方法におけるこれらの特徴付けられた活性なＭＡＲ配列の使用を提供することによって、達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列に関し、前記ＤＮＡ配列は、少なくとも１つの折れ曲がり（ｂｅｎｔ）ＤＮＡエレメント、およびＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位を含んでなることを特徴とする。
【００１６】
ＤＮＡの所定の配列は、相対的「静的曲線」を形成することが公知であり、ここで、ＤＮＡは特定の３次元軌道を追跡する。従って、単に普通のＢ−ＤＮＡの構造（「直線」）であるのではなく、ＤＮＡの片は、折れ曲がりＤＮＡとしても規定されるような平坦な平面曲線を形成することができる（マリニ（Ｍａｒｉｎｉ）ら、１９８２年「Ｂｅｎｔ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔ  ＤＮＡ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７６６４−７６６４）。
【００１７】
驚くべきことに、出願人らは、本発明のタンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列の折れ曲がりＤＮＡエレメントは、通常、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも１０％のジヌクレオチドＴＡ、および／または少なくとも１２％のジヌクレオチドＡＴを含有することを示した。好ましくは、折れ曲がりＤＮＡエレメントは、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも３３％のジヌクレオチドＴＡ、および／または少なくとも３３％のジヌクレオチドＡＴを含有する。これらのデータは、後述する方法によって得られている。
【００１８】
本発明に従えば、精製および単離されたＤＮＡ配列は、通常、配列番号１〜２７の配列またはｃＬｙｓＭＡＲエレメントもしくはそのフラグメントを含んでなる群から選択されるＭＡＲヌクレオチド配列を含んでなる。好ましくは、精製および単離されたＤＮＡ配列は、配列番号１〜２７の配列、より好ましくは配列番号２４〜２７の配列を含んでなる群から選択されるＭＡＲヌクレオチド配列である。
【００１９】
ＰＣＲまたは他の手段を使用して産生させることができる上記の配列番号１〜２７の配列およびｃＬｙｓＭＡＲエレメントまたはフラグメントの相補配列も本発明に包含される。
【００２０】
「エレメント」は、共通の機能的特性（即ち、転写因子に対する結合部位）または構造的（即ち、折れ曲がりＤＮＡ配列）特徴を有する保存されたヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号１〜２７の配列の部分およびｃＬｙｓＭＡＲエレメントまたはフラグメントは、配列番号１〜２７のそれぞれの配列と少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有する配列を指す。これらの配列は、それらが派生する生来の配列と同じ特性を示す限り、使用することができる。好ましくは、これらの配列は、配列番号１〜２７のそれぞれの配列と８０％より多く、詳細には、９０％より多くのヌクレオチド長を共有する。
【００２２】
本発明はまた、上記の配列番号１〜２７の配列、および保存ヌクレオチドの置換によって、対照配列から変動するヌクレオチド配列であるｃＬｙｓＭＡＲエレメントまたはフラグメントの変異体を含み、それによって、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドが同じ特徴を伴う別のものによって置換される。
【００２３】
配列番号１〜２３の配列は、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）を使用して、ヒト第１および第２染色体を走査することによって同定されており、新規のＭＡＲ配列の同定は、その後に報告されたツールを使用して実行可能であることが示される一方、配列番号２４〜２７は、組み合わされたＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）方法を使用して、完全なヒトゲノムを走査することによって、同定されている。
【００２４】
第１の工程では、完全な第１および第２染色体をスクリーニングして、図３に示されるような最大の折れ曲がり、主溝の深さ、副溝の幅および最低融解温度に対応する領域として折れ曲がりＤＮＡエレメントを同定した。第２の工程では、配列のこのような収集を、図８Ｂ）に示されるようなＳＡＴＢ１、ＧＡＴＡなどの調節タンパク質の結合部位について走査し、配列番号１〜２３の配列を得た。さらに、配列２１〜２３は、さらに、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ由来の既知の遺伝子の隣に局在することが示された。
【００２５】
配列番号２４〜２７に関して、これらの配列は、組み合わされた方法に従ってヒトゲノムを走査することによって得られており、そのように検出される１７５７ＭＡＲエレメント間の例として選択した。
【００２６】
ＭＡＲ配列の分子キメラもまた、本発明において考慮される。分子キメラとは、ＭＡＲエレメントの機能的部分を含み得、当業者に既知の分子生物学的方法によって得られるであろうヌクレオチド配列を意図する。
【００２７】
ＭＡＲエレメントもしくはフラグメントまたはそれらのサブ部分の特定の組み合わせもまた、本発明において考慮される。これらのフラグメントは、当該分野において公知の様々な方法によって、調製することができる。これらの方法として、制限酵素による消化およびフラグメントの回収、化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
従って、エレメントまたは配列番号１〜２７の配列のフラグメントおよびｃＬｙｓＭＡＲエレメントもしくはフラグメントの特定の組み合わせもまた、入手しようとする機能的結果に依存して、本発明において想定される。ｃＬｙｓＭＡＲのエレメントには、例えば、国際公開第０２／０７４９６９号パンフレット（その開示内容は、本明細書において、その全体が参考として援用される）に記載のＢ、ＫおよびＦ領域がある。本発明において使用されるｃＬｙｓＭＡＲの好適なエレメントは、Ｂ、ＫおよびＦ領域である。ただ１つのエレメントを使用してもよく、または複数コピーの同じまたは異なるエレメント（多量体化されたエレメント）を使用してもよい（図８Ａを参照のこと）。
【００２９】
フラグメントとは、それぞれのヌクレオチド配列の部分を意図する。ＭＡＲヌクレオチド配列のフラグメントは、生物学的活性を保持し得、従って、精製された核マトリックスに結合するおよび／またはプロモーターに操作可能に連結されたコーディング配列の発現パターンを変更する。ＭＡＲヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約１００〜１０００ｂｐ、好ましくは、約２００〜７００ｂｐ、より好ましくは約３００〜５００ｂｐヌクレオチドの範囲であり得る。天然のＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメントよりなる合成ＭＡＲ配列に存在する同数のヌクレオチドを有する任意の組み合わせのフラグメントもまた想定される。フラグメントは、好ましくは、リンカー配列によって集成される。好適なリンカーはＢｇＩＩｌ−ＢａｍＨＩリンカーである。
【００３０】
「タンパク質産生増加活性」は、以下の通りに規定される精製および単離されたＤＮＡ配列の活性を指す。適切な条件下で真核宿主細胞に導入した後、配列は、前記ＤＮＡ配列を伴わずにトランスフェクトされた細胞の培養物と比較して、細胞培養物におけるタンパク質産生レベルを増加させることが可能である。通常、増加は１．５〜１０倍、好ましくは、４〜１０倍である。これは、１日あたり１細胞あたり少なくとも１０ｐｇの産生比または比細胞産生速度に対応する（実施例１１および図１３を参照のこと）。
【００３１】
本明細書において使用する以下の規定は、本発明の理解を容易にするために供給される。
【００３２】
「クロマチン」は、真核細胞の染色体を構成するタンパク質および核酸材料であり、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび関連タンパク質を指す。
【００３３】
「クロマチンエレメント」は、染色体に組み入れる場合、クロマチン構造を修飾する特性を有する染色体上の核酸配列を意味する。
【００３４】
「シス」は、同じ核酸分子（同じベクター、プラスミドまたは染色体など）上における２つもしくはそれ以上のエレメント（クロマチンエレメントなど）の配置を指す。
【００３５】
「トランス」は、異なる２つもしくはそれ以上の核酸分子（２つのベクターまたは２つの染色体など）上における２つもしくはそれ以上のエレメント（クロマチンエレメントなど）の配置を指す。
【００３６】
潜在的に位置効果を克服することが可能であり、従って、安定な細胞系統の開発に興味深いクロマチン修飾エレメントとして、境界エレメント（ＢＥ）、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、および普遍性クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）が挙げられる。
【００３７】
境界エレメント（「ＢＥ」）、またはインスレーターエレメントは、多くの場合、クロマチンにおける境界を規定し（ベルＡ（Ｂｅｌｌ  Ａ）およびフェルゼンフェルドＧ（Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ）、１９９９年；「Ｓｔｏｐｐｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｏｒｄｅｒ：ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９，１９１−１９８）およびインビボで転写ドメインを規定する役割を果たし得る。ＢＥは、固有のプロモーター／エンハンサー活性を欠くが、むしろ、周囲のクロマチンにおける調節エレメントの転写の影響から遺伝子を保護すると考えられる。エンハンサー阻止アッセイは、通常、インスレーターエレメントを同定するために使用される。このアッセイでは、クロマチンエレメントは、エンハンサーとプロモーターとの間に配置され、エンハンサー活性型転写が測定される。境界エレメントは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、酵母および哺乳動物細胞において、位置効果に対して、安定にトランスフェクトされたレポーター遺伝子を保護することが可能であることが示されている。それらはまた、誘導性導入遺伝子発現を伴うトランスジェニックマウスの割合を増加させることも示されている。
【００３８】
遺伝子座制御領域（「ＬＣＲ」）は、それらの生来の局在において、遺伝子座の初期のクロマチン活性およびその後の遺伝子転写に必要とされるシス調節エレメントである（グロスベルド，Ｆ（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ）１９９９年、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ？」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９，１５２−１５７）。ＬＣＲの活性化機能はまた、宿主ゲノムにおける組込みの部位にかかわらず、トランスジェニックマウスの適切な組織における結合された導入遺伝子の発現を可能にする。ＬＣＲが、一般に、連結された遺伝子における発現の組織特異的レベルを付与する一方、トランスジェニックマウスのほぼすべての組織における効率的発現が、短縮型ヒトＴ細胞受容体ＬＣＲおよびラットＬＡＰ  ＬＣＲついて報告されている。最も広範に特徴付けられたＬＣＲは、グロビン遺伝子座のＬＣＲである。鎌形赤血球病および３−サラセミアの遺伝子治療に対するベクターにおけるその使用が、現在評価中である。
【００３９】
良好に受容されたモデルに従う「ＭＡＲ」は、特定のＤＮＡ配列の核マトリックスへの固定を仲介し得、ヘテロクロマチンコアから外側に延在するクロマチンループドメインが作製される。ＭＡＲは任意の明白なコンセンサスまたは認識可能な配列を含有しない一方、それらの最も一貫した特徴は、全体的に高いＡ／Ｔ含有量、および一本鎖上に優位に存在するＣ塩基であるようである（ボーデＪ（Ｂｏｄｅ  Ｊ）、シュラケＴ（Ｓｃｈｌａｋｅ  Ｔ）、リオスラミレスＭ（ＲｉｏｓＲａｍｉｒｅｚ  Ｍ）、ミールケＣ（Ｍｉｅｌｋｅ  Ｃ）、ステンガルトＭ（Ｓｔｅｎｇａｒｔ  Ｍ）、カイＶ（Ｋａｙ  Ｖ）およびクレルウィルスＤ（ＫｌｅｈｒＷｉｒｔｈ  Ｄ）、「Ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ−ａｔｔａｃｈｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｐｒｅｔｉｅｓ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｏｃｉ」、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｔｒｉｘ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｉｔｏｌｏｇｙ，１６２Ａ：３８９−４５３、１９９５年）。これらの領域は、鎖の分離の傾向があり得る折り曲げ二次構造を形成する傾向を有する。それらは、しばしば、塩基不対合領域（ＢＵＲ）と称せられ、それらは、鎖分離の核形成点を表し得るコア巻き戻しエレメント（ＣＵＥ）を含有する（ベンハムＣ（Ｂｅｎｈａｍ  Ｃ）ら、「Ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７４：１８１−１９６、１９９７年）。いくらかの単純なＡＴリッチ配列モチーフは、しばしば、ＭＡＲ配列内において見出されているが、ほとんどの部分について、それらの機能的重要性および潜在的作用態様については明らかにされていない。これらは、Ａボックス（ＡＡＴＡＡＡＹＡＡＡ）、Ｔボックス（ＴＴＷＴＷＴＴＷＴＴ）、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ（ＡＡＴＡＴＡＴＴ、ＡＡＴＡＴＴ）、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ−ｂｏｘ、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）および脊椎動物（ＲＮＹＮＮＣＮＮＧＹＮＧＫＴＮＹＮＹ）またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＮＮＲ）のコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位を含む。
【００４０】
偏在性クロマチン開放エレメント（「ＵＣＯＥ」、「偏在的作用性クロマチン開放エレメント」としても公知である）が国際公開第００／０５３９３号パンフレットに報告されている。
【００４１】
「エンハンサー」は、遺伝子の同一性、遺伝子に関連する配列の位置、または配列の配向とは独立して遺伝子の転写を可能にするように作用するヌクレオチド配列である。本発明のベクターは、場合によりエンハンサーを含む。
【００４２】
「遺伝子」は、所定の成熟タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列である。本明細書において使用する用語「遺伝子」は、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーターまたはエンハンサーのような非翻訳フランキング領域を含むべきではない。
【００４３】
「産物遺伝子」は、診断または治療有用性のような所望の特徴を有するタンパク質産物をコードする遺伝子である。産物遺伝子として、例えば、構造遺伝子および調節遺伝子が挙げられる。
【００４４】
「構造遺伝子」は、構造タンパク質をコードする遺伝子を指す。構造遺伝子の例として、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、核膜孔タンパク質および核足場タンパク質、イオンチャンネルおよびトランスポーター、収縮タンパク質、ならびにチャペロンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な構造遺伝子は、抗生物質または抗体フラグメントをコードする。
【００４５】
「調節遺伝子」は、調節タンパク質をコードする遺伝子を指す。調節タンパク質の例として、転写因子、ホルモン、成長因子、サイトカイン、シグナル伝達分子、発癌遺伝子、癌原遺伝子、膜貫通受容体、およびタンパク質キナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「配向」は、所定のＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの順序を指す。例えば、ＤＮＡ配列の倒置された配向は、配列が得られたＤＮＡにおける参照の箇所と比較する場合、別の配列に対して配列の５'から３'への順序が逆にされる配向である。そのような参照箇所は、供給源のＤＮＡにおける他の特定されたＤＮＡ配列の転写の指令および／または配列を含有する複製可能なベクターの複製開始点を含むことができる。
【００４７】
「真核細胞」は、真核生命体由来の任意の哺乳動物または非哺乳動物細胞を指す。非制限的例示によって、細胞培養条件下で維持し、続いて、トランスフェクトすることが可能である任意の真核細胞も本発明に含まれ得る。特に好適な細胞タイプとして、例えば、肝細胞、胚性肝細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＢＨＫ２１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、Ｃ２Ｃ１２、癌細胞、および一次分化または未分化細胞が挙げられる。他の適切な宿主細胞も当業者に公知である。
【００４８】
用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に使用され、本発明の１つもしくはそれ以上のベクターが導入されている真核細胞を示す。そのような用語は、特定の被験体細胞だけではなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫を指すことが理解される。所定の修飾は変異または環境的影響のいずれかのために、世代を継承するときに生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親細胞とは同一ではないが、なお、本発明において使用する用語の範囲に含まれる。
【００４９】
用語「精製されたＤＮＡを真核宿主細胞に導入すること」または「トランスフェクション」は、付随する物質を伴うかまたは伴わない細胞外ＤＮＡが宿主細胞に進入する任意のプロセスを示す。用語「トランスフェクトされた細胞」または「トランスフェクト細胞」は、細胞外ＤＮＡが導入されており、従って、細胞外ＤＮＡを所有する細胞を意味する。ＤＮＡは、染色体組み込みたいまたは染色体外エレメントのいずれかのように、核酸が複製可能であるように、細胞に導入され得る。
【００５０】
本明細書で使用する「プロモーター」は、遺伝子の発現を調節する核酸配列を指す。
【００５１】
「同時トランスフェクション」は、細胞に対して外来性である１つを超える外因性遺伝子、またはベクター、またはプラスミド（それらの１つは、細胞に選択可能な表現型を付与し得る）で真核細胞をトランスフェクトするプロセスを意味する。
【００５２】
タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列はまた、１つもしくはそれ以上折れ曲がりＤＮＡエレメントの他に、ＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位を含んでなる。
【００５３】
通常、ＤＮＡ結合タンパク質は転写因子である。転写因子の例には、ポリＱポリＰドメインタンパク質を含んでなる群がある。
【００５４】
転写因子の別の例には、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＭＥＦ２、Ｓ８、ＤＬＸ１、ＦＲＥＡＣ７、ＢＲＮ２、ＧＡＴＡ１／３、ＴＡＴＡ、Ｂｒｉｇｈｔ、ＭＳＸ、ＡＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＲＥＢＰ１、ＦＯＸ、Ｆｒｅａｃ７、ＨＦＨ１、ＨＮＦ３α、Ｎｋｘ２５、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｐｉｔ１、ＴＴＦ１、ＸＦＤ１、ＡＲ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃｄｃ５、ＦＯＸＤ３、ＨＦＨ３、ＨＮＦ３β、ＭＲＦ２、Ｏｃｔ１、ＰＯＵ６Ｆ１、ＳＲＦ、Ｖ＄ＭＴＡＴＡ＿Ｂ、ＸＦＤ２、Ｂａｃｈ２、ＣＤＰ  ＣＲ３、Ｃｄｘ２、ＦＯＸＪ２、ＨＦＬ、ＨＰ１、Ｍｙｃ、ＰＢＸ、Ｐａｘ３、ＴＥＦ、ＶＢＰ、ＸＦＤ３、Ｂｒｎ２、ＣＯＭＰ１、Ｅｖｉｌ、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ４、ＨＦＮ１、Ｌｈｘ３、ＮＫＸ３Ａ、ＰＯＵ１Ｆ１、Ｐａｘ６、ＴＦＩＩＡを含んでなる群から選択される転写因子があり、またはこれらの転写因子の２つもしくはそれ以上の組み合わせも好適である。ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＭＥＦ２およびポリＱポリＰドメインタンパク質が最も好適である。
【００５５】
ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４およびＭＥＦ２は、例えば、哺乳動物における発達および／または組織特異的遺伝子発現を調節することが公知である。これらの転写因子は、ＤＮＡジオメトリを変更する能力を有し、アロステリックリガンドがそれらの構造を修飾すると、相互にＤＮＡに結合する。最近、ＳＡＴＢ１がヘテロクロマチンを取り囲むケージ様構造を形成することが見いだされた（カイＳ（Ｃａｉ  Ｓ）、ハンＨＪ（Ｈａｎ  ＨＪ）、およびコウウィ−シゲマツＴ（Ｋｏｈｗｉ−Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｔ）、「Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＳＡＴＢ１」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２００３年、３４（１）：４２−５１頁）。
【００５６】
本発明のさらに別の目的は、精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体を提供することである。
【００５７】
より好適には、ｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメントは、Ｂ、ＫおよびＦ領域から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列よりなる。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列を提供することである。
【００５９】
好ましくは、合成ＭＡＲ配列は、ｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体を含んでなる。また、好ましくは、リンカー配列はＢｇＩｌＩ−ＢａｍＨＩリンカーである。
【００６０】
本発明の他の局面は、ＤＮＡ折れ曲がり、主溝の深さおよび副溝の幅のポテンシャルならびに融解温度に対応する１つもしくはそれ以上のＤＮＡ配列特徴の値を算定することを含んでなるバイオインフォマティクスツールを使用してＭＡＲ配列を同定するための方法を提供することである。好ましくは、１つもしくはそれ以上ＤＮＡ配列特徴の同定は、この方法によっても算定されるＤＮＡ結合タンパク質に対する結合部位に対応するさらなるＤＮＡ配列特徴をさらに含んでなる。
【００６１】
好ましくは、前記バイオインフォマティクスツールのプロフィールまたは重量マトリックスはジヌクレオチド認識に基づく。
【００６２】
本発明の方法において使用されるバイオインフォマティクスツールは、好ましくは、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）であり、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｈｔｔｐ：／／ｓｒｓ６．ｂｉｏｎｅｔ．ｎｓｃ．ｒｕ／ｓｒｓ６ｂｉｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｇｅｔｚ？−ｅ＋［ＦＥＡＴＵＲＥＳ−ＳｉｔｅＩＤ：'ｎＲ'］）により開発され、レビットスキー（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ）ら、１９９９年に基づくアルゴリズムを含有する。これらのアルゴリズムは、ジヌクレオチド重量マトリックスに基づいてプロフィールを認識し、ＤＮＡの構造的および物理化学的特性の理論値を算定する。
【００６３】
好ましくは、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）は、多様なサイズのスキャニングウィンドウを使用して、すべての可能な組み合わせにおいてＤＮＡの折れ曲がり、主溝の深さおよび副溝の幅のポテンシャル、融解温度に対応するＤＮＡ配列特徴としても明示される４つの理論的基準を使用する（図３を参照のこと）。使用する各機能に対し、カットオフ値を設定しなければならない。プログラムは、所定の領域の算定されたスコアが、選択された基準のすべてについて、設定されたカットオフ値を超えた時間ごとに、ヒットを返す。２つのデータ出力態様が、ヒットを取り扱うのに利用可能であり、第１のもの（「プロフィール様」と呼ばれる）は、単純に、質問配列に対するすべてのヒット位置および選択された異なる基準に対するそれらの対応する値を返す。第２の態様（「連続ヒット」と呼ばれる）は、いくらかの連続ヒットの位置およびそれらの対応する配列のみを返す。この態様では、連続ヒットの最小数は、整調可能なウインドウサイズで再度設定することができる別のカットオフ値である。第２の態様は、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）のデフォルト態様である。実際、意味的見地から、ヒットは、コア巻き戻しエレメント（ＣＵＥ）とみなされ、相対タンパク質に対する結合部位のクラスターに随伴するＣＵＥのクラスターはＭＡＲとみなされる。従って、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）は、いくらかの連続ヒットのみを潜在的ＭＡＲとみなす。
【００６４】
４つの理論的構造的基準のデフォルトのカットオフ値を整調するために、ＳＭＡＲｔ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／−ＳＭＡＲｔ  ＤＢ）から実験的に確証されたＭＡＲを使用した。データベース由来のすべてのヒトＭＡＲ配列を回収し、４つの基準を伴い、設定されたカットオフ値を伴わない「プロフィール様」態様を使用して、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商）で解析した。これは、配列の位置ごとに対し各機能の設定を可能にする。次いで、各基準に対する分布を、これらのデータに従って算定した（図１および３を参照のこと）。
【００６５】
折れ曲がりに対するＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）のデフォルトのカットオフ値、主溝の深さおよび副溝の幅を、７５％分位数および中央値の平均で設定した。融解温度について、デフォルトのカットオフ値７５％分異数で設定すべきである。「連続ヒット」態様に対する最小の長さは、ＭＡＲの最小の長さと想定されるため、３００に設定すべきである（図８および９を参照のこと）。しかし、当業者であれば、最小限の実験で所定の生物体に対する上記の基準のカットオフ値を設定することが可能である。
【００６６】
好ましくは、ＤＮＡの折れ曲がり値は、３〜５°（ラジカル度）の間に含まれる。最も好ましくは、それらは、３．８〜４．４°の間に設置され、図１の最も小さなピークに対応する。
【００６７】
好ましくは、主溝の深さの値は、８．９〜９．３Å（オングストローム）の間に含まれ、副溝の幅の値は５．２〜５．８Åの間に含まれる。最も好ましくは、主溝の深さの値は、９．０〜９．２Åの間に含まれ、副溝の幅の値は５．４〜５．７Åの間に含まれる。
【００６８】
好ましくは、融解温度は５５〜７５℃（摂氏度）の間に含まれる。最も好ましくは、融解温度は５５〜６２℃の間に含まれる。
【００６９】
値を、該方法によって算定することができるＤＮＡ結合タンパク質は、通常、転写因子であり、好ましくは、ポリＱポリＰドメイン、あるいはＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＭＥＦ２、Ｓ８、ＤＬＸ１、ＦＲＥＡＣ７、ＢＲＮ２、ＧＡＴＡ１／３、ＴＡＴＡ、Ｂｒｉｇｈｔ、ＭＳＸ、ＡＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＲＥＢＰ１、ＦＯＸ、Ｆｒｅａｃ７、ＨＦＨ１、ＨＮＦ３α、Ｎｋｘ２５、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｐｉｔ１、ＴＴＦ１、ＸＦＤ１、ＡＲ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃｄｃ５、ＦＯＸＤ３、ＨＦＨ３、ＨＮＦ３β、ＭＲＦ２、Ｏｃｔ１、ＰＯＵ６Ｆ１、ＳＲＦ、Ｖ＄ＭＴＡＴＡ＿Ｂ、ＸＦＤ２、Ｂａｃｈ２、ＣＤＰ  ＣＲ３、Ｃｄｘ２、ＦＯＸＪ２、ＨＦＬ、ＨＰ１、Ｍｙｃ、ＰＢＸ、Ｐａｘ３、ＴＥＦ、ＶＢＰ、ＸＦＤ３、Ｂｒｎ２、ＣＯＭＰ１、Ｅｖｉｌ、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ４、ＨＦＮ１、Ｌｈｘ３、ＮＫＸ３Ａ、ＰＯＵ１Ｆ１、Ｐａｘ６、ＴＦＩＩＡまたはこれらの転写因子の２つもしくはそれ以上の組み合わせを含んでなる群から選択される転写因子である。
【００７０】
しかし、当業者であれば、本発明に従う方法を行うために、他の種類の転写因子を決定することが可能であろう。
【００７１】
例えば、大規模解析を実施するためにＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）を考察する場合、好ましくは、上記の方法は、算定を減少するために、ＤＮＡ転写因子に対するＤＮＡ結合部位を推定する少なくとも１つのフィルターをさらに含んでなる。
【００７２】
本方法の原理では、上記の構造的特徴を算定するためのＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）と、いくつかの転写因子の結合を推定するための、例えば、ｐｆｓｅａｒｃｈ（ブッチャーＰ（Ｂｕｃｈｅｒ  Ｐ）、カルプラスＫ（Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｋ）、モエリＮ（Ｍｏｅｒｉ  Ｎ）、およびホフマンＫ（Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｋ）、「Ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ」、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：３２４、１９９６年に記載のｐｆｔｏｏｌパッケージ由来）のようなフィルターとが組み合わされる。
【００７３】
フィルターの例は、ｐｆｓｅａｒｃｈ、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ、ＲＭａｔｃｈ  ＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌおよびＴＲＡＮＳＦＡＣ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを含んでなるが、これらに限定されない。
【００７４】
この組み合わされた方法は、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）の構造的特徴およびＭＡＲを選択するために、任意の順序で連続的に適用することができるフィルターの特定の転写因子の推定される結合を使用し、従って、方法の開始または終了時に適用されるフィルターに依存する。
【００７５】
第１のレベルは、一次入力配列から配列を選択し、フィルターに存する第２のレベルは、選択された配列の中で、フィルターによって使用される基準を満たす配列を抑制するために使用され得る。
【００７６】
この組み合わされた方法では、フィルターは、プロフィールまたは重量マトリックスを使用して、例えば、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（クワントＫ（Ｑｕａｎｄｔ  Ｋ）、フレチＫ（Ｆｒｅｃｈ  Ｋ）、カラスＨ（Ｋａｒａｓ  Ｈ）、ウィンゲンダーＥ（Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  Ｅ）、ベルナーＴ（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｔ）、「ＭａｔＩｎｄ  ａｎｄ  ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ−Ｎｅｗ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，４８７８４８８４、１９９５年）からＤＮＡ結合部位のクラスターを検出する。フィルターはまた、ＤＮＡ結合部位のクラスターの密度を検出することもできる。
【００７７】
組み合わされた方法は、実際には、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）についてパール（Ｐｅｒｌ）が作成した「ｗｒａｐｐｅｒ」であり、ｐｆｓｅａｒｃｈをフィルターとして使用する場合、ｐｆｔｏｏｌ由来である。組み合わされた方法は、各レベルでこれらのツール（ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）またはフィルター）のうちの１つを潜在的「フィルター」として使用して、２つのレベルのプロセシングを実施するが、各フィルターは任意であり、何らフィルタリングを行うことなく推定された特徴を算定するために使用することが可能である。
【００７８】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）を第１のレベルで使用して、サブ配列をフィルター処理する場合、それは、配列を返すために、「すべての連続ヒット」態様と共に使用しなければならない。ｐｆｓｅａｒｃｈを第１のフィルターとして第１のレベルで使用する場合、それは、ただ１つのプロフィールと共に使用しなければならず、ヌクレオチドの距離を提供する必要がある。この距離を使用して、配列を返すために提供された距離に対して下位の距離に局在するｐｆｓｅａｒｃｈヒットをまとめる；組み合わされた方法はｐｆｓｅａｒｃｈを開始し、その出力について構文解析し、提供された距離に従ってまとめられたｐｆｓｅａｒｃｈヒットに対応する配列を返す。次いで、第１のレベルで使用されるツールが何であろうと、選択されるサブ配列の長さは、「ヒット伸長」と呼ばれるパラメータに従って、両末端で体系的に伸長させることができる。
【００７９】
第２および任意のレベルを使用して、フィルター処理で配列（すでにフィルター処理された配列もしくはフィルター未処理の入力配列）を排除するか、あるいはこれらの配列上で何らフィルタリングを行わずにＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）および／またはｐｆｓｅａｒｃｈの結果を得ることができる。組み合わされた第２のレベルを使用してフィルター処理する場合、それぞれの基準について考慮されたカットオフ値（ヌクレオチドあたりのヒット）を提供して、フィルター処理でそれらの配列を排除する必要がある（図２０を参照のこと）。
【００８０】
本発明の別の関心事はまた、プロフィールまたは重量マトリックスを使用してＤＮＡ結合部位のクラスターを検出する少なくとも１つのフィルターを含んでなるＭＡＲ配列を同定するための方法を提供することである。好ましくは、本方法は２つのレベルのフィルターを含んでなり、この場合、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）は、前記方法にはまったく存在しない。通常、２つのレベルはｐｆｓｅａｒｃｈに存する。
【００８１】
また、上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列も本発明に包含される。
【００８２】
ヒトゲノム全体の組み合わされた方法による解析によって、合計で１０６５３０５塩基対を表す合計で１７５７個の推定ＭＡＲが得られた。結果の数を減少させるために、ジヌクレオチド解析をこれらの１７５７ＭＡＲに対して実施し、５'〜３'方向で両鎖を考慮して、各配列について１６の可能なジヌクレオチド百分率を算定した。
【００８３】
驚くべきことに、出願人らは、組み合わされた方法で検出されるすべての「超」ＭＡＲが、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも１０％のジヌクレオチドＴＡを含有することを示している。好ましくは、これらの配列は、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも３３％のジヌクレオチドＴＡを含有する。
【００８４】
出願人らはまた、これらの同じ配列が１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも１２％のジヌクレオチドＡＴをさらに含有することも示している。好ましくは、それらは、１００連続塩基対のストレッチ上に少なくとも３３％のジヌクレオチドＡＴを含有する。
【００８５】
本発明の他の局面は、配列番号１〜２７の配列、その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体から選択される配列を含んでなる、先に記載のＭＡＲのいずれかの精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列を提供する。
【００８６】
好ましくは、前記精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列は、配列番号２４〜２７の配列、その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体から選択される配列を含んでなる。これらの配列２４〜２７は、組み合わされた方法によって検出される配列に対応し、配列１〜２３より高いタンパク質産生増加活性を示す。
【００８７】
本発明はまた、以下を含んでなる群から選択されるＭＡＲヌクレオチド配列である第１の単離されたマトリックス付着領域（ＭＡＲ）ヌクレオチド配列を含んでなる精製および単離されたＤＮＡ配列の使用を包含する。
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体あるいはｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメントのＭＡＲヌクレオチド配列、真核宿主細胞においてタンパク質産生活性を増加させるためのその相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。
【００８８】
前記精製および単離されたＤＮＡ配列は、通常、当該分野において公知の１つもしくはそれ以上の調節配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ポリアデニル化部位ならびにタンパク質の発現のために通常用いられるスプライス接続部をさらに含んでなるか、または場合により選択マーカーをコードしてもよい。好ましくは、前記精製および単離されたＤＮＡ配列は、目的の遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含んでなる。
【００８９】
本発明のＤＮＡ配列は、標準的なＰＣＲプロトコルおよび当該分野において周知の方法に従って単離することができる。
【００９０】
プロモーターが宿主細胞と両立するような条件で使用することができるプロモータは、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、パピローマウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス）、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（例えば、マウスもしくはヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、またはアクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターもしくは熱ショックプロモーターのような異種哺乳動物プロモーターから得られるプロモーターである。そのような調節配列は構成性発現を指令する。
【００９１】
さらに、精製および単離されたＤＮＡ配列は、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を指令することが可能である調節配列を含んでなり得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して、核酸を発現させる）。組織特定調節エレメントは当該分野において公知である。適切な組織特異的プロモーターの非制限的例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；ピンカート（Ｐｉｎｋｅｒｔ）ら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（カラメ（Ｃａｌａｍｅ）およびイートン（Ｅａｔｏｎ）、１９８８年、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（ウィノト（Ｗｉｎｏｔｏ）およびバルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、１９８９年、ＥＭＢＯＪ．８：７２９−７３３）ならびに免疫グロブリン（バネルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、１９８３年、Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０；クイーン（Ｑｕｅｅｎ）およびバルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、１９８３年、Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経細線維プロモーター；バーン（Ｂｙｒｎｅ）およびラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（エドルンド（Ｅｄｌｕｎｄ）ら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州出願第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。
【００９２】
発達段階における調節製プロモーターもまた包含される。そのようなプロモーターの例として、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ケッセル（Ｋｅｓｓｅｌ）およびグルス（Ｇｒｕｓｓ）、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）ならびにα−フェトプロテイン（ｔｈｅａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーター（カンペス（Ｃａｍｐｅｓ）およびチルグマン（Ｔｉｌｇｈｍａｎ）、１９８９年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）が挙げられる。
【００９３】
調節可能な遺伝子発現プロモーターは当該分野において周知であり、非制限的例によって、外因性分子に結合することによって所望されるタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する任意のプロモーター、例えば、ＣＲＥ／ＬＯＸ系、ＴＥＴ系、ドキシサイクリン系、ＮＦκＢ／ＵＶ光系、Ｌｅｕ３ｐ／イソプロピルリンゴ酸系、およびＧＬＶＰｃ／ＧＡＬ４系（例えば、サウアー（Ｓａｕｅｒ）、１９９８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ１４（４）：３８１−９２；レワンドスキ（Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ）、２００１年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ２（１０）：７４３−５５；レグランド−ポエルス（Ｌｅｇｒａｎｄ−Ｐｏｅｌｓ）ら、１９９８、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ．４５：１８；グオ（Ｇｕｏ）ら、１９９６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９０（２）：１９１−５；ワング（Ｗａｎｇ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９９，９６（１５）：８４８３８を参照のこと）が挙げられる。
【００９４】
しかし、当業者であれば、本発明を行うのに適切である他の種類のプロモーターを決定することが可能であろう。
【００９５】
エンハンサーは、場合により、調節配列、例えば、プロモーターに属する本発明の精製されたＤＮＡ配列に含まれ得る。
【００９６】
「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」は、好ましくは、タンパク質（構造または調節タンパク質）をコードする。本明細書で使用する「タンパク質」は、一般に、約１０を超えるアミノ酸を有するペプチドおよびポリペプチドを指す。タンパク質は、宿主に対して「相同」（即ち、利用している宿主細胞に対して内因性）であってもよく、または酵母によって産生されるヒトタンパク質のように、「異種」（即ち、利用している宿主細胞に対して外来性）であってもよい。タンパク質は、細胞のペリプラズム空間または細胞質において、あるいは細胞外の培地において、不溶性の凝集体としてもしくは可溶性タンパク質として産生され得る。タンパク質の例として、ホルモン、例えば、成長ホルモンまたはエリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長因子、例えば、上皮増殖因子、エンケファリンのような鎮痛物質、キモトリプシンの様な酵素、ホルモンまたは成長因子に対する受容体、抗体が挙げられ、可視化マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質として通常使用されるタンパク質も含まれる。
【００９７】
好ましくは、精製されたＤＮＡ配列は、以下を含んでなる群から選択される少なくとも第２の単離されたマトリックス付着領域（ＭＡＲ）ヌクレオチド配列をさらに含んでなる。
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。単離されたマトリックス付着領域（ＭＡＲ）ヌクレオチド配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。あるいは、第１および第２の同一のＭＡＲヌクレオチド配列が使用される。
【００９８】
好ましくは、ＭＡＲヌクレオチド配列は、プロモーターおよび目的の遺伝子を含有する配列の５'および３'末端の両方に局在する。しかし、本発明はまた、前記第１およびまたは少なくとも第２のＭＡＲヌクレオチド配列がプロモーターおよび目的の遺伝子を含有する配列とは異なる配列上に局在するという事実を想定する。
【００９９】
以下を含んでなる群から選択されるＭＡＲヌクレオチド配列である第１の単離されたマトリックス付着領域（ＭＡＲ）ヌクレオチド配列を含んでなる精製および単離されたＤＮＡ配列もまた本発明の範囲に包含される。
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
周知のプロトコルに従い、精製および単離されたＤＮＡ配列を真核宿主細胞に導入することによって、真核宿主細胞におけるタンパク質産生活性を増加させるために使用することができるその相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。適用される真核宿主細胞にＤＮＡを導入するために通常適用される方法は、例えば、マイクロインジェクションもしくは微小粒子衝撃によるクローニングされたＤＮＡの直接導入；エレクトロトランスファー；ウイルスベクターの使用；キャリアシステム内のカプセル化；およびトランスフェクト試薬、例えば、リン酸カルシウム、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランまたはＬｉｐｏｆｅｃｔ−ＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような市販のトランスフェクションシステムの使用である。好ましくは、精製されたＤＮＡ配列を真核宿主細胞に導入するために使用されるトランスフェクション方法は、下記のような真核細胞をトランスフェクトするための方法である。
【０１００】
精製および単離されたＤＮＡ配列は、環状ベクターの形態で使用することができる。好ましくは、精製および単離されたＤＮＡ配列は、ベクターのような線状ＤＮＡ配列の形態で使用される。
【０１０１】
本明細書で使用される「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるならば、交換可能に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むがそれらに限定されない発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【０１０２】
本発明は、真核宿主細胞をトランスフェクトするための方法をさらに包含し、前記方法は、以下を含んでなる。
ａ）前記真核宿主細胞に少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列を含んでなる少なくとも１つの精製されたＤＮＡ配列ならびに／あるいはＭＡＲヌクレオチド配列もしくは他のクロマチン修飾エレメントを含んでなる少なくとも１つの精製および単離されたＤＮＡ配列を導入すること、
ｂ）規定の時間内に、前記トランスフェクト真核宿主細胞を、少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列を含んでなる少なくとも１つの精製されたＤＮＡ配列ならびに／あるいはＭＡＲヌクレオチド配列もしくは他のクロマチン修飾エレメントを含んでなる少なくとも１つの精製および単離されたＤＮＡ配列による少なくとも１つのさらなるトランスフェクション工程に供すること、
ｃ）前記トランスフェクト真核宿主細胞を選択すること。
【０１０３】
好ましくは、少なくとも２から４までのトランスフェクト工程が工程ｂ）に適用される。
【０１０４】
首尾よいトランスフェクト細胞を選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般に目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。選択マーカーをコードする遺伝子は、目的の少なくとも１つのＤＮＡ配列および／またはＭＡＲヌクレオチド配列もしくは他のクロマチン修飾エレメントよりなる少なくとも１つの精製および単離されたＤＮＡ配列を含んでなる精製されたＤＮＡ配列上に局在し得るか、あるいは、場合により、個別の形態、例えば、プラスミド上に同時導入され得る。多様な選択マーカーは、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する選択マーカーを含む。薬物の量は、生産性を増加させるために所望されるように適応することができる。
【０１０５】
通常、１つもしくはそれ以上の選択マーカーが使用される。好ましくは、それぞれの異なるトランスフェクション工程において使用される選択マーカーは異なる。これにより、例えば、異なる２つの抗生物質選択を使用することによって、「多重形質転換」された形質転換細胞を選択することが可能である。
【０１０６】
タンパク質産生が可能であり、かつ細胞壁を欠く任意の真核宿主細胞を、本発明の方法において使用することができる。有用な哺乳動物宿主細胞系統の例として、ヒト細胞、例えば、ヒト胚性腎臓系統（懸濁培養物における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ３６，５９（１９７７年））、ヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；げっ歯類細胞、例えば、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０年））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー（Ｍａｔｈｅｒ）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ２３，２４３−２５１（１９８０年））、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ならびに他の哺乳動物、例えば、ＳＶ４Ｏ（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；骨髄腫（例えば、ＮＳ０）／ハイブリドーマ細胞由来の細胞が挙げられる。
【０１０７】
好ましくは、選択されたトランスフェクト真核宿主細胞は、１日あたり１個の細胞あたり少なくとも１０ｐｇの産生速度を伴う高タンパク質産生細胞である。
哺乳動物細胞が本明細書における使用に最も好適であり、ＣＨＯ細胞がより好適である。
【０１０８】
精製および単離されたＤＮＡ配列の目的のＤＮＡ配列は、通常、上記のようにプロモーターに操作可能に連結されたタンパク質を好適にコードする目的の遺伝子である。目的の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含んでなる精製および単離されたＤＮＡ配列は、目的のＤＮＡ配列に加えて、ＭＡＲヌクレオチド配列または他のクロマチン修飾エレメントを含んでなる。
【０１０９】
ＭＡＲヌクレオチド配列を含んでなる精製および単離されたＤＮＡ配列は、例えば、上記のような配列番号１〜２７の配列および／またはｃＬｙｓＭＡＲの特定のエレメント、例えば、Ｂ、ＫおよびＦ領域、ならびにフラグメントおよびエレメントおよびそれらの組み合わせを含んでなる群から選択される。他のクロマチン修飾エレメントは、例えば、境界エレメント（ＢＥ）、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、および偏在性クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）である（ザン−ザバル（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ）ら、上掲を参照のこと）である。宿主細胞の多トランスフェクションの例を、実施例１２（表３）に示す。第１のトランスフェクト工程（一次トランスフェクション）は、目的の遺伝子（ＳＶ４０ＥＧＦＰ）単独か、ＭＡＲヌクレオチド配列（ＭＡＲ）単独かまたは目的の遺伝子およびＭＡＲヌクレオチド配列（ＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ）で行われる。第２のトランスフェクト工程（二次トランスフェクション）は、第１のトランスフェクト工程から生じる可能なすべての組み合わせで、目的の遺伝子（ＳＶ４０ＥＧＦＰ）単独か、ＭＡＲヌクレオチド配列（ＭＡＲ）単独かまたは目的の遺伝子およびＭＡＲヌクレオチド配列（ＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ）で行われる。
【０１１０】
好ましくは、真核宿主細胞は、以下によってトランスフェクトされる。
ａ）目的の１つのＤＮＡ配列およびさらにＭＡＲヌクレオチド配列を含んでなる精製されたＤＮＡ配列を導入すること、
ｂ）規定の時間内に、前記トランスフェクト真核宿主細胞を、工程ａ）の１つの目的のＤＮＡ配列およびさらなるＭＡＲヌクレオチド配列を含んでなる同じ精製されたＤＮＡ配列による少なくとも１つのさらなるトランスフェクション工程に供すること。
【０１１１】
また、好ましくは、精製および単離されたＤＮＡ配列のＭＡＲヌクレオチド配列は、以下を含んでなる群から選択される
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。
【０１１２】
驚くべきことに、第１および第２のトランスフェクションの間に相乗効果が観察されている。ＭＡＲエレメントがトランスフェクション工程のうちの１つまたは両方に存在する場合、特定の相乗効果が観察されている。上記の方法を使用する、ｐＭＡＲ単独または多様な発現プラスミドとの組み合わせによる細胞の複数回のトランスフェクションが行われている。例えば、表３は、ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰプラスミドで細胞を２回トランスフェクトすると、ＧＦＰの最も高い発現およびすべての状態の最も高い程度の増強（４．３倍）が得られたことを示している。対照的に、ＭＡＲを伴わないベクターで細胞を２回トランスフェクトすると、予想された２倍の増加ではないが、ほとんどまたはまったく増強が認められなかった（２．８倍）。このことから、各トランスフェクション工程でのＭＡＲエレメントの存在は、最大のタンパク質合成を達成するために特に興味深いことが証明される。
【０１１３】
トランスフェクション方法の特定の例として、少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列を含んでなる前記精製されたＤＮＡ配列は、プロモーター、選択マーカー遺伝子、および／またはＭＡＲ配列のようなタンパク質産生増加エレメントに操作可能に連結された目的の遺伝子を含んでなる複数の非連結型プラスミドの形態で導入することができる。
【０１１４】
特定の細胞タイプの使用に必要であれば、第１および以後のＤＮＡ配列の比を適応することができ、当業者には日常的実験である。
【０１１５】
一次形質転換細胞のさらなる形質転換の規定の時間は、細胞周期およびその期間に依存する。通常、規定の時間は、細胞分裂周期に関連する間隔に対応する。
【０１１６】
従って、特定の細胞タイプの使用に必要であれば、この正確なタイミングを適応することができ、当業者には日常的実験である。
【０１１７】
好ましくは、規定の時間は、宿主細胞が第２またはさらなる細胞分裂周期、好ましくは、第２の周期の同じ相に入ってすぐの時期である。この時間は、通常、前回のトランスフェクト事象後、６時間〜８時間の間、好ましくは、２０時間〜２４時間の間に設定される。
【０１１８】
また、真核宿主細胞をトランスフェクトするための方法も本発明に包含され、前記方法は、前記真核宿主細胞に、少なくとも１つの目的のＤＮＡ配列を含んでなる少なくとも１つの第１の精製および単離されたＤＮＡ配列、ならびに以下を含んでなる群から選択される少なくとも１つのＭＡＲヌクレオチドを含んでなる第２の精製されたＤＮＡを同時トランスフェクトすることを含んでなる。
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。
【０１１９】
前記第１の精製および単離されたＤＮＡ配列もまた、上記のような少なくとも１つのＭＡＲヌクレオチドを含んでなることができる。
【０１２０】
また、タンパク質の産生のためのプロセスも想定され、ここで、真核宿主細胞は、本発明において規定されるトランスフェクション方法に従ってトランスフェクトされ、タンパク質の発現に適切な条件下で培養培地において培養される。前記タンパク質は、当業者に既知の任意の回収プロセスに従って、最終的に回収される。
【０１２１】
一例を挙げると、タンパク質産生のための以下のようなプロセスを使用することができる。本発明のトランスフェクション方法によってトランスフェクトした真核宿主細胞は、前記タンパク質の発現に適切な条件下で前記細胞を培養し、前記タンパク質を回収することによって、タンパク質の産生のためのプロセスにおいて使用される。適切な培養条件は、例えば、国際公開第９６／３９４８８号パンフレットに記載のような真核細胞のインビトロでの培養に従来使用される条件である。タンパク質は、例えば、免疫アフィニティーまたはイオン交換カラム上での分画；沈殿；逆相ＨＰＬＣ；クロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ゲルろ過のような従来の分離技術によって細胞培養から単離することができる。当業者であれば、目的のポリペプチドに適切な精製方法は、組換え細胞培養における発現時のポリペプチドの特徴の変化を考慮して、変更が必要であり得ることを理解するであろう。
【０１２２】
本発明に従って産生されるタンパク質は、様々な方法によって機能性について試験することができる。例えば、抗原エピトープの存在およびタンパク質がリガンドに結合する能力は、ウエスタンブロットアッセイ、蛍光細胞分取アッセイ、免疫沈降、免疫化学アッセイおよび／または競合結合アッセイ、ならびに特定の結合活性を測定する他の任意のアッセイによって、決定することができる。
【０１２３】
本発明のタンパク質は、以下を含むが、それらに限定されない多くの実践的アプリケーションにおいて使用することができる。
１．ウイルス／病原体アンタゴニストとしての組換え宿主タンパク質による免疫。
２．診断またはスクリーニングアッセイのための膜タンパク質の産生。
３．生化学的研究のための膜タンパク質の産生。
４．構造研究のための膜タンパク質の産生。
５．オーファン受容体およびイオンチャンネルのマッピングを含む免疫組織化学的マッピングのための抗体の作製のための抗原産生。
【０１２４】
また、先のトランスフェクション方法のいずれかに従ってトランスフェクトされた真核宿主細胞も本発明によって提供される。好ましくは、真核宿主細胞は哺乳動物宿主細胞系統である。
【０１２５】
既に記載のように、有用な哺乳動物宿主細胞系統の例として、ヒト細胞、例えば、ヒト胚性腎臓系統（懸濁培養物における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ３６，５９（１９７７年））、ヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；げっ歯類細胞、例えば、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０年））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー（Ｍａｔｈｅｒ）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ２３，２４３−２５１（１９８０年））、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ならびに他の哺乳動物、例えば、ＳＶ４Ｏ（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；骨髄腫（例えば、ＮＳ０）／ハイブリドーマ細胞由来の細胞が挙げられる。
【０１２６】
ＣＨＯ細胞が本明細書における使用に最も好適である。
【０１２７】
本発明はまた、本発明に従う少なくとも１つの精製および単離されたＤＮＡ配列を含んでなる細胞トランスフェクション混合物またはキットを提供する。
【０１２８】
本発明は、トランスジェニック生物体をさらに含み、ここで、その細胞の少なくともいくつかは、以下のうちの少なくとも１つのＤＮＡ配列を安定に組み入れている
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。
【０１２９】
好ましくは、トランスジェニック生物体の細胞のいくつかは、上記の方法に従ってトランスフェクトされている。
【０１３０】
また、トランスジェニック生物体も本発明において想定され、ここで、そのゲノムは、以下の少なくとも１つのＤＮＡ配列を安定に組み入れている
・タンパク質産生増加活性を有する精製および単離されたＤＮＡ配列、
・上記のバイオインフォマティクスツール、組み合わされた方法または少なくとも１つのフィルターを含んでなる方法を使用してＭＡＲ配列を同定するための方法に従って同定可能な精製および単離されたＭＡＲ  ＤＮＡ配列、
・配列番号１〜２７の配列、
・精製および単離されたｃＬｙｓＭＡＲエレメントおよび／またはフラグメント、
・天然のＭＡＲエレメントおよび／またはリンカー配列間で集成されるフラグメントを含んでなる合成ＭＡＲ配列、
その相補的な配列、少なくとも７０％のヌクレオチド長を共有するその部分、その分子キメラ、それらの組み合わせおよび変異体。
【０１３１】
本発明に有用であり得るトランスジェニック真核生物体は、例えば、哺乳動物（マウス、ヒト、サルなど）ならびに特に研究用動物、例えば、一般にげっ歯類、昆虫（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）など）、魚類（ゼブラフィッシュなど）、両生類（カエル、イモリなど）および他の単純な生物体、例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、酵母などを含んでなる群から選択される。
【０１３２】
本発明のなお別の目的は、本発明に記載のＭＡＲ配列を同定するための方法を実施するためのコンピュータ実行可能な指示を含んでなるコンピュータ読み取り可能な媒体を提供することである。
【０１３３】
上記の説明は、以下の実施例を参考にしてより完全に理解されるであろう。しかし、そのような実施例は、本発明を実践する方法の例示であって、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）およびＭＡＲ配列
実験的に規定されたヒトＭＡＲおよび非ＭＡＲ配列を解析することによって、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）の第１の粗評価を行った。ＭＡＲ配列と同様に、ＳＭＡＲｔ  Ｄｂ由来のヒトＭＡＲの解析の先の結果を使用して、図１に示すような各基準に対する密度ヒストグラムをプロットした。同様に、非ＭＡＲ配列も解析およびプロットした。第２２染色体は、非ＭＡＲ配列の部分に関係するＭＡＲ配列の重要でない部分を含有するのに十分な大きさであることを考慮して、非ＭＡＲ配列と同様に、第２２染色体由来のすべてのＲｅｆ−Ｓｅｑ−コンティグを使用した。
【０１３５】
図１に示された密度分布は、ロングテールを伴いすべて非対称である。最も程度の高い折れ曲がり、最も高い主溝の深さおよび最も高い副溝の幅では、分布が右側に歪んでいる。最も低い融解温度では、分布は左側に歪んでおり、当然のことながら、他の３つに関係するこの基準とは、逆の対応になっている。ＭＡＲ配列では、第２の弱いピークを伴う２相分布が実際に認められる。およびＭＡＲと非ＭＡＲ配列との分布の間では、各プロットにおいて明らかなシフトも見られる。
【０１３６】
使用したすべてのヒトＭＡＲ配列の間では、それらのうち平均で僅か約７０％しかヒトＭＡＲ分布の７５％分位数を超える値を有しておらず、これは、４つの異なる基準を満たす。同様に、各ヒトＭＡＲ分布の第２の弱いピークについても、ヒトＭＡＲ配列のうち、これらの範囲外の値を担うのは、僅か１５％しかない。これらの１５％のヒトＭＡＲ配列の中のほとんどは、極めて良好に記録されたＭＡＲであり、インターフェロン遺伝子座ＭＡＲ、β−グロビン遺伝子座ＭＡＲ（ラメザニＡ（Ｒａｍｅｚａｎｉ  Ａ）、ホーリーＴＳ（Ｈａｗｌｅｙ  ＴＳ）、ホーリーＲＧ（Ｈａｗｌｅｙ  ＲＧ）、「Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ−ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ」、Ｂｌｏｏｄ，１０１：４７１７−４７２４、２００３年）、またはアポリポプロテインＭＡＲ（ナムシウＳ（Ｎａｍｃｉｕ，Ｓ）、ブロチンガーＫＢ（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ  ＫＢ）、フルニエＲＥＫ（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ＲＥＫ）、「Ｈｕｍａｎ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ−ｓｕｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：２３８２−２３９１、１９９８年）のように、導入遺伝子を位置効果から遮断するために使用される。
【０１３７】
すでに、同じデータによって、ヒトＭＡＲ配列も使用して、算定された４種の理論的構造的特性とＡＴ含有量との間の関係を決定した。図２は、基準のすべての対についての分散図および対応する相関係数ｒを表す。
【０１３８】
実施例２：生物体によるＭＡＲ配列の分布プロット
先に例示したのと同様に、他の生物体のＳＭＡＲｔ  ＤＢ由来のＭＡＲ配列も検索および解析した。マウス、ニワトリ、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）およびヒトのＭＡＲ配列密度分布を一緒に図３にプロットする。
【０１３９】
実施例３：第２２染色体全体のＭＡＲ推定
第２２染色体由来のすべてのＲｅｆＳｅｑコンティグを、この時点でのデフォルト設定値を使用するＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって解析した。結果として、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）は、合計で８０３ＭＡＲを推定し、それらの平均の長さは４４６ｂｐであり、これは、４２７７７ｂｐあたりに推定される１つのＭＡＲの平均を意味する。推定されたＭＡＲの合計の長さは、第２２染色体の長さの１％に対応する。推定された領域のＡＴ含有量は６５．１％〜９３．３％の範囲であり；これらのすべての領域の平均のＡＴ含有量は７３．５％である。従って、推定されたＭＡＲはＡＴリッチである一方、第２２染色体はＡＴリッチではない（５２．１％ＡＴ）。
【０１４０】
また、ＳＭＡＲＴｅｓｔも使用して、第２２染色体全体を解析し、１３８７ＭＡＲ候補を得たが、それらの平均の長さは４９４ｂｐであり、これは、２４７６５ｂｐあたりの推定された１つのＭＡＲの平均を表す。推定されたＭＡＲの合計の長さは、第２２染色体の２％に対応する。２種のソフトウェアによって推定されるすべてのＭＡＲの間で、１５４個の推定されたＭＡＲが両プログラムによって見出され、それぞれＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）およびＳＭＡＲＴｅｓｔ推定ＭＡＲの１９％および１１％を表す。推定されたＭＡＲがＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）およびＳＭＡＲＴｅｓｔについて長さを意味するならば、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）およびＳＭＡＲＴｅｓｔ推定間の重複を偶然有する確率は、１つの推定あたり０．００２７％である。
【０１４１】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）推定の特異性を評価するために、第２２染色体の無作為にシャッフルした配列に対して、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）解析を実施した（図４）。シャッフルした配列は、第２２染色体を１０ｂｐの非重複ウィンドウにセグメント化し、各ウィンドウにおいてヌクレオチドを個別にシャッフルすることによる；染色体のすべてのヌクレオチドの並べ替えを意味する「スクランブル」による；１０ｂｐのフラグメントにおける染色体のセグメント化を意味する「分断」およびこれらのフラグメントの無作為の集成による、ならびに、最後に、１次マルコフ連鎖による異なる４つの方法を使用して作製したが、異なる状態は、異なるすべてのＤＮＡジヌクレオチドであり、これらの状態間の推移確率は第２２染色体の走査に基づく。各シャッフル方法では、５つのシャッフルした第２２染色体を作製し、デフォルト設定値を使用するＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって解析した。ヒットの数に関して、１０ｂｐの非重複ウィンドウ内で並べ替えた第２２染色体では平均３５１９１７０ヒット（ｓｄ：１８３５３）、スクランブルした配列では１７１９３６．４ヒット（ｓｄ：２８５９．０４）および分断した第２２染色体では２４７０８．２ヒット（ｓｄ：１１９１．５９）ならびに第２２染色体の１次マルコフ連鎖モデルに従って作製した染色体では平均で２２８２ヒット（ｓｄ：３３４．７）を見出したが、それぞれ、生来の第２２染色体で見出されるヒットの数の１８５％（ｓｄ：平均の０．５％）、９％（ｓｄ：１．５％）、１％（ｓｄ：５％）および０．１％（ｓｄ：１５％）を表す。３００を超える長さの連続ヒットを意味する推定されたＭＡＲの数について、１９９７ＭＡＲを、１０ｂｐのウィンドウ内でシャッフルした第２２染色体（ｓｄ：３１．２）で推定したところ、スクランブルした配列（ｓｄ：０．９６）では僅か２．４ＭＡＲ候補しか見出されず、また、分断した配列およびマルコフ連鎖モデルに従って作製した配列ではまったく見出されなかったが、それぞれ、生来の第２２染色体で見出される推定ＭＡＰ数の２４９％および０．３％未満を表す。これらのデータは、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）がＤＮＡ配列がシャッフルされる場合に編成が失われる特定のＤＮＡエレメントを検出する表示を提供する。
【０１４２】
実施例４：ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によるインターフェロン遺伝子座における既知のマトリックス付着領域の解析
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によるＭＡＲ推定の関連性を、第９染色体の短腕上のヒトインターフェロン遺伝子クラスター（９ｐ２２）の最近公開されたＭＡＲ領域を解析することによって調べた。ゲッツ（Ｇｏｅｔｚｅ）ら（上掲）は、ＢＵＲ（この場合、ストレス誘導性二重鎖脱安定化すなわちＳＩＤＤと呼ばれる）と核マトリックスへのインビトロ結合との間に疑われる相関関係を解析するためのＷＰ１８Ａ１０Ａ７遺伝子座の網羅的解析について報告した（図９、下方部分）。ＳＩＤＤのピークのうちの３つはインビトロ結合アッセイに一致する一方、他はマトリックス付着部位に一致しなかった。ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によるインターフェロン遺伝子座の調査（図９、頂部）は、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４およびＭＥＦ２レギュレーター結合部位のクラスターに付随する３つの主要ピークは、活性なＭＡＲと良好に相関することを示した。従って、本発明者らは、これらの転写因子について推定されたＣＵＥおよび結合部位の発生はｃＬｙｓＭＡＲに限定されず、すべてのＭＡＲの一般的特性であり得ると結論する。これらの結果はまた、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）プログラムが、ゲノム配列から効率的にＭＡＲエレメントを検出することを意味する。
【０１４３】
実施例５：ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）推定の精度および他の推定ツールとの比較
実験的に決定されたＭＡＲがマッピングされている６ゲノム配列を使用して、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）の精度を評価した。他の推定ツールとの比較を実施するため、解析される配列は、ＭＡＲ−ＦｉｎｄｅｒおよびＳＭＡＲＴｅｓｔを比較するために予め使用した配列と同じである。これらのゲノム配列は、３つの植物および３つのヒト配列（表１）であり、合計で３１０１５１ｂｐおよび３７個の実験的に規定されたＭＡＲである。表１におけるＳＭＡＲＴｅｓｔおよびＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒの結果は、先の比較に由来する（フリッシュＭ（Ｆｒｉｓｃｈ  Ｍ）、フレチＫ（Ｆｒｅｃｈ  Ｋ）、クリンゲンホッフＡ（Ｋｌｉｎｇｅｎｈｏｆｆ  Ａ）、カルタリウスＫ（Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ  Ｋ）、リービッヒＩ（Ｌｉｅｂｉｃｈ  Ｉ）およびウェルナーＴ（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｔ）、「Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｐｒｅ−ｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：３４９−３５４、２００１年）。
【０１４４】
０．４に設定されている閾値およびプロタミン遺伝子座の解析を除いてデフォルトのパラメータでＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒを使用し、（プロタミン遺伝子座について行ったように非ＡＴリッチＭＡＲを検出するために）ＡＴリッチ規則を排除している。
【０１４５】
【表１】
0005396653.tif 000002
【０１４６】
【表２】
0005396653.tif 000003
【０１４７】
実験的に規定されたＭＡＲが公知である６つの異なるゲノム配列、３つの植物および３つのヒト配列を、ＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒ、ＳＭＡＲＴｅｓｔおよびＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）で解析した。真陽性に一致するものを太字で印字し、マイナス（−）は偽陰性に一致するものを示す。実験的に規定されたより長いＭＡＲのいくつかは、１つより多いインシリコ推定を含有し、それらのそれぞれは、真陽性に一致するものとして計数した。従って、真のインシリコ推定の数は、見出される実験的に規定されたＭＡＲの数より多い。特異性は真陽性の推定として規定される一方、感受性は、見出される実験的に規定されたＭＡＲの比として規定される。＊ＭＡＲ−Ｆｉｎｄｅｒを使用して排除されるＡＴリッチ規則。
【０１４８】
ＳＭＡＲＴｅｓｔはＭＡＲとして２８領域を推定し、これらのうち１９（真陽性）は実験的に規定されたＭＡＲに相関する（特異性：６８％）一方、９（３２％）は、非ＭＡＲに局在する（偽陽性）。実験的に規定された最も長いＭＡＲのいくつかが１つを超えるインシリコ推定を含有するとき、１９個の真陽性は、実際に、１４個の異なる実験的に規定されたＭＡＲに対応する（感受性：３８％）。ＭＡＲＦｉｎｄｅｒはＭＡＲとして２５領域を推定したが、これらのうち２０（特異性：８０％）は、１２個の異なる実験的に規定されたＭＡＲ（感受性：３２％）に対応する実験的に規定されたＭＡＲと相関する。ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）は２２領域を推定したが、１７は真陽性（特異性：７７％）であり、１４個の実験的に規定されたＭＡＲ（感受性：３８％）と一致した。
【０１４９】
別の例として、ヒト第１および第２染色体に同じ解析が適用されており、２３ＭＡＲ配列（配列番号１〜２３）の決定がもたらされた。これらの配列を、ＳＴ２５形式で付属書１に列挙する。
【０１５０】
実施例６：組み合わされた方法（ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）−ｐｆｓｅａｒｃｈ）を使用するゲノム全体の解析
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって算定される構造的特徴とＳ／ＭＡＲ機能活性との間の潜在的相関関係を試験するために、以下に「超」Ｓ／ＭＡＲと呼ばれる算定された理論的構造的特徴について最も高い値を伴う配列を得ることを目的として、極めてストリンジェントなパラメータを伴う組み合わされた方法でヒトゲノム全体を解析した。これは、導入遺伝子発現および組換えタンパク質産生を増加させる可能性が極めて高い推定されたＭＡＲエレメントが得られることを期待して行った。従って、回収された推定Ｓ／ＭＡＲを特徴付けおよび分類する試みとして、まず、それらをｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｐｅｒｐｅｃｔｉｖｅから解析した。
【０１５１】
６．１ヒトゲノム全体の解析から推測したＳ／ＭＡＲ
ヒトゲノム全体の配列として、すべてのヒトＲｅｆＳｅｑ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩハンドブック［インターネット］．Ｂｅｔｈｅｓｄａ（メリーランド州）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国）、１０月、１７章、Ｔｈｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  （ＲｅｆＳｅｑ）  Ｐｒｏｊｅｃｔ、２００２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｂｏｏｋｓより入手可能）コンティグ（リリース５）を使用して、第１レベルのプロセシングにおいてＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）をフィルターとして使用し、最も高い折れ曲がりカットオフ値を除くデフォルト設定値を用いる一方、（３．２０２度の代わりに）４．０度のストリンジェントな閾値をＤＮＡの折れ曲がり基準に使用している組み合わされた方法で解析した。
【０１５２】
第２のレベルのプロセシングでは、結合している推定された転写因子を、これらの配列を何らフィルタリングしていない先の工程から選択される配列において探査した。
【０１５３】
ヒトゲノム全体の組み合わされた方法による解析により、合計で１０６５３０５ｂｐ（ヒトゲノム全体の０．３５％）を表す合計１７５７推定「超」Ｓ／ＭＡＲが見出された。表２は、各染色体について、そのサイズ、その遺伝子数、その推定されたＳ／ＭＡＲの数、遺伝子あたりのそのＳ／ＭＡＲ密度およびＳ／ＭＡＲあたりのそのｋｂを示す。この表は、異なる染色体について極めて多様な推定されたＳ／ＭＡＲあたりの遺伝子密度が存在することを示す（標準偏差は推定されたＳ／ＭＡＲあたりの遺伝子の密度の平均の５０％を超えた値を表し、Ｓ／ＭＡＲあたりの遺伝子のより高いおよびより低い密度間の倍率差は、６．５である）。表２はまた、Ｓ／ＭＡＲあたりのｋｂはＳ／ＭＡＲあたりの遺伝子の密度よりばらつきが少ないことを示す（標準偏差はＳ／ＭＡＲあたりのｋｂの平均の２５％を表し、より高いおよびより低いＳ／ＭＡＲあたりのｋｂ間の倍率差は３．２である）。
【０１５４】
【表３】
0005396653.tif 000004
【０１５５】
６．２転写因子結合部位に対する「超」ＭＡＲＳのバイオインフォマティクス解析
次いで、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって予め得られた１７５７推定「超」Ｓ／ＭＡＲ配列を、潜在的転写因子結合部位について解析した。これは、ＲＭａｔｃｈＴＭ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ケルＡＥ（Ｋｅｌ  ＡＥ）、ゴスリングＥ（Ｇｏｓｓｌｉｎｇ  Ｅ）、ロイターＩ（Ｒｅｕｔｅｒ  Ｉ）、チュレムスキンＥ（Ｃｈｅｒｅｍｕｓｈｋｉｎ  Ｅ）、ケルモルゴウリスＯＶ（ＫｅｌＭａｒｇｏｕｌｉｓ  ＯＶ）、ウィンゲンダーＥ（Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  Ｅ）、「ＭＡＴＣＨ：  Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３５７６９、２００３年）、ＴＲＡＮＳＦＡＣの基づく重量マトリックスベースのツール（ウィンゲンダーＥ（Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  Ｅ）、チェンＸ（Ｃｈｅｎ  Ｘ）、フリッケＥ（Ｆｒｉｃｋｅ  Ｅ）、ジェファースＲ（Ｇｅｆｆｅｒｓ  Ｒ）、ヘルＲ（Ｈｅｈｌ  Ｒ）、リービッヒＩ（Ｌｉｅｂｉｃｈ  Ｉ）、クルールＭ（Ｋｒｕｌｌ  Ｍ）、メイティスＶ（Ｍａｔｙｓ  Ｖ）、ミカエリスＨ（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈ）、オーンハウザーＲ（Ｏｈｎｈａｕｓｅｒ  Ｒ）、プラスＭ（Ｐｒｕｓｓ  Ｍ）、シャハラーＦ（Ｓｃｈａｃｈｅｒｅｒ  Ｆ）、シーレＳ（Ｔｈｉｅｌｅ  Ｓ）、ウルバッハＳ（Ｕｒｂａｃｈ  Ｓ）、「Ｔｈｅ  ＴＲＡＮＳＦＡＣ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９（１）：２８１３、２００１年）を使用して、達成されている。ＭａｔｃｈＴＭ２．０Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌは、ほとんどのデフォルト設定値で使用されている。ＭａｔｃｈＴＭ解析は、ＴＲＡＮＳＦＡＣ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、リリース８．２（２００４０６３０）に基づくものであった。ＭａｔｃｈＴＭに基づいて解析された１７５７配列に対するすべての転写因子結合の合計を表３にまとめる。この表に基づいて、解析された１７５７配列にわたって合計で少なくとも２０ヒットを有する転写因子のみをさらなる解析のために考慮した。
【０１５６】
１７５７推定Ｓ／ＭＡＲ配列に結合すると最も頻繁に推定されるヒト転写因子およびそれらのＭａｔｃｈの説明は次の通りである。Ｃｄｃ５（細胞分裂制御タンパク質５）  転写調節／リプレッサー、Ｎｋｘ３Ａ  アンドロゲンによって調節されるホメオドメインタンパク質、脳下垂体に特異的であり、細胞増殖を刺激するＰＯＵ１Ｆ１（脳下垂体特異的正の転写因子１）。従って、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４およびＭＥＦ２に加えて、他の転写因子をＭＡＲの活性に加えることもできる。
【０１５７】
【表４】
0005396653.tif 000005
【０１５８】
６．３ジヌクレオチド頻度のために推定された「超」ＭＡＲのバイオインフォマティクス解析
算定することなく同定され得る明確な基準を使用して容易に「超」Ｓ／ＭＡＲ配列を同定するために、多様なコンピュータ解析を実施した。それらのうち、ジヌクレオチド解析は、５'＞３'方向で両鎖を考慮して、各配列についてそれぞれの可能な１６ジヌクレオチド百分率を算定し、１７５７超ＭＡＲに対して実施された。
【０１５９】
概要（最小、最大、中央値、平均、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル）ならびに１７５７  Ｓ／ＭＡＲ配列に上の各ジヌクレオチド百分率のヒストグラムを、それぞれ表４に提示する。ヒトゲノム由来の無作為に選択された配列に対して同様の解析を行ったところ、無作為に選択された非Ｓ／ＭＡＲ配列（しかし、いくつかのＭＡＲを含有し得る）が示された。表５は、それぞれ、これらの配列に対するジヌクレオチド含有量解析の概要を表す。
【０１６０】
【表５】
0005396653.tif 000006
【０１６１】
概要の表の推定されたＳ／ＭＡＲエレメントおよび非Ｓ／ＭＡＲ配列の結果を考慮すると、これらの２つのグループの配列間のＡＴおよびＴＡジヌクレオチド含有量に顕著な差異を認めることができる。ＡＴおよびＴＡは、それぞれ、推定されたＳ／ＭＡＲ配列のジヌクレオチド含有量の少なくとも１８．５％および２８．６％を表すのに対し、非Ｓ／ＭＡＲ配列における同じジヌクレオチドに対する最小百分率は、それぞれ０．３％および０％である。同様に、Ｓ／ＭＡＲ配列における最大ＣＣおよびＧＧ含有量は４．２％であるのに対し、非Ｓ／ＭＡＲ配列におけるこれらの２つのジヌクレオチドの百分率は、２０．８％にまで達し得る。
【０１６２】
ＡＴおよびＴＡジヌクレオチド百分率と、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって算定されるＤＮＡの最大の折れ曲がりとの間の相関関係を、推定されたＳ／ＭＡＲ配列については図１７に、および非Ｓ／ＭＡＲ配列については図１８に示す。これらの図の分散図は、ＴＡ百分率が、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって推定されるように、推定されたＤＮＡの折れ曲がりに相関することを示す。
【０１６３】
【表６】
0005396653.tif 000007
【０１６４】
４つの新規の超ＭＡＲを無作為に拾い出して、ＡＴおよびＴＡジヌクレオチド含有量について解析し、１００塩基対のウィンドウを考慮して、すでに公知のニワトリｌｙｓＭＡＲと比較した（表６）。
【０１６５】
驚くべきことに、出願人らは、すべての超ＭＡＲが、ＤＮＡの１００塩基対のウィンドウにおいて解析したすべてのジヌクレオチドのうち１２％を超えるＡＴジヌクレオチド頻度、および１０％を超えるＴＡジヌクレオチドを有することを示した。最も効率的なＭＡＲは、２つのジヌクレオチド対のうち約３４％の値を示す。
【０１６６】
【表７】
0005396653.tif 000008
【０１６７】
６．４ヒトおよびマウスゲノムのオーソロガス遺伝子間領域の解析
Ｓ／ＭＡＲ進化に対する洞察を得るために、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によってヒトおよびマウスゲノムのオーソロガス遺伝子間領域について解析した。使用したデータの組は、１２本のヒトおよび１２本のマウス染色体上に局在するヒトおよびマウスゲノム由来の８７対の完全なオーソロガス遺伝子間領域（シャバリナＳＡ（Ｓｈａｂａｌｉｎａ  ＳＡ）、オグルツソフＡＹ（Ｏｇｕｒｔｓｏｖ  ＡＹ）、コンドラショフＶＡ（Ｋｏｎｄｒａｓｈｏｖ  ＶＡ）、コンドラショフＡＳ（Ｋｏｎｄｒａｓｈｏｖ  ＡＳ）、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，１７（７）：３７３６，２００１）（平均の長さ  約１２０００ｂｐ）からなり  、これらの配列のシンテニーを、ペアワイズ配列アラインメントおよびフランキング遺伝子のアノテーション（実験または推定）の考察によって確認した。
【０１６８】
８７ヒトおよびマウスオーソロガス遺伝子間配列の解析は、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）により、そのデフォルト設定値を使用して解析した。ヒト配列の解析により、異なる５遺伝子間配列上に局在する合計で１２個のＳ／ＭＡＲ（全体で４７５０ｂｐの長さを表す）を得た。
【０１６９】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）のストリンジェントな設定値を使用して、「超」Ｓ／ＭＡＲを含有することが推定された３つのヒト遺伝子間配列の間で、対応するマウスオーソロガス遺伝子間配列のうちの１つもまた、Ｓ／ＭＡＲを含有することが推定される（マウスＥＭＢＬ  ＩＤ：ＡＣ０１５９３２、５９８８４〜８９９６３位にオーソロガス（ｏｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）なヒトＥＭＢＬ  ＩＤ：Ｚ９６０５０、２８０１０〜７６９５１位）。これら２つのオーソロガス遺伝子間配列の局所アラインメントを実施する場合、これら２つの大きな領域の最も良好な局所アラインメントは、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によってＳ／ＭＡＲエレメントであると推定された領域に対応する。「超」Ｓ／ＭＡＲを含有することが推定された他の２つのヒト遺伝子間配列のマウスオーソログのマニュアルサーチを、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）を使用して実施した。Ｅｎｓｅｍｂｌオーソログ推定（遺伝子の名称に基づく）を使用して、これら２つのヒト配列のマウスオーソロガス遺伝子間配列を回収し、これらの遺伝子間領域に隣接するヒト遺伝子の対についてオーソロガスなマウス遺伝子を探索した。
【０１７０】
ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）はヒト配列に対して整調されており、その結果、マウスゲノム配列に関する「超」ＭＡＲはほとんど得られないため、（３００ｂｐの代わりに２００ｂｐを使用して）Ｓ／ＭＡＲとみなされる連続ヒットの最小サイズについてのそのデフォルトのカットオフ値を若干緩和した。これらのマウス配列のＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）による解析により、算定された異なる構造的特徴について高い値を有するいくらかのＳ／ＭＡＲが推定された。この知見より、ヒトＭＡＲエレメントは種にわたって保存されていることが示唆される。
【０１７１】
実施例７：ニワトリリゾチーム遺伝子５'ＭＡＲの精査
３０００塩基対の５'ＭＡＲをより小さなフラグメントに解体し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における導入遺伝子発現に対する効果についてモニターした。これを行うために、約４００ｂｐの７つのフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製した。これらのＰＣＲ増幅フラグメントは連続的であり、末端間に配置される場合、ＭＡＲ配列全体を含む。天然のＭＡＲの約半分の長さに対応する長さを得るために、これらのフラグメントのそれぞれの４コピーを頭−尾配向で連結した。テトラマーを、ｐＧＥＧＦＰＣｏｎｔｒｏｌ、ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の改変バージョンにおけるＳＶ４０プロモーターの上流に挿入した。ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌのルシフェラーゼ遺伝子をｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＥＧＦＰ遺伝子に交換することによって、プラスミドｐＧＥＧＦＰＣｏｎｔｒｏｌを作製した。そのようにして作製された５'ＭＡＲフラグメント含有プラスミドを、先に記載（ザン−ザバルＭ（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ，Ｍ．）ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１年、８７（１）：２９−４２頁）のように、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において、耐性プラスミドｐＳＶｎｅｏと共に同時トランスフェクトした。抗生物質（Ｇ−４１８）耐性細胞の選択後、ポリクローナル細胞集団を、ＥＧＦＰ蛍光を対象にＦＡＣＳにより解析した。
【０１７２】
導入遺伝子発現は、蛍光レベルが、ＭＡＲを伴わないｐＧＥＧＦＰＣｏｎｔｒｏｌベクターでｔランスフェクトされた細胞の平均蛍光よりも少なくとも４桁大きい細胞として規定される高発現細胞のパーセンタイルで発現された。図５は、本来のＭＡＲ配列と比較してサイズがより小さいにもかかわらず、多量体化されたフラグメントＢ、ＫおよびＦが導入遺伝子発現を増強することを示す。対照的に、他のフラグメントは活性が低いかまたは完全に不活性である。
【０１７３】
実施例８：ＭＡＲコンテキストにおけるＢ、ＫおよびＦ領域の特異性
５'ＭＡＲを、それぞれ５'末端（図６、上部）または３'末端（図６、下部）から連続的に欠失させた。先に記載のセクションに記載の類似のアッセイにおいて、短縮型エレメントの効果をモニターした。図６は、ＣＨＯ細胞において導入遺伝子発現を刺激する能力の消失が均等に分布しなかったことを示す。
【０１７４】
この欠失研究では、ＭＡＲ活性の消失は、それぞれ５'ＭＡＲ  Ｂ−、Ｋ−およびＦ−フラグメントと重複する転移の個別の領域と一致した。５'側の欠失では、フラグメントＫおよびＦが除去された場合に、活性が最も消失した。Ｆおよびｂエレメントを除去した３'側の欠失は、顕著な効果を有した。対照的に、それら事態に対して導入遺伝子発現を刺激する能力をほとんどまたはまったく有さないフランキング領域Ａ、Ｄ、ＥおよびＧ（図５）は、対応して、５'および３'末端欠失研究では、ＭＡＲ活性に寄与しなかった（図６）。
【０１７５】
実施例９：Ｆエレメントの構造
４６５ｂｐ  Ｆフラグメントを、それぞれ、２３４、２４３、２１３ｂｐならびに１２２、１２５および１２１ｂｐのより小さなサブフラグメントにさらに解体した。前者グループのフラグメントを頭−尾配向で八量体化（８コピー）する一方、後者のグループのそれらを、同様に十六量体化（１６コピー）し、一定の長さのＭＡＲ配列を維持した。これらのエレメントをｐＧＥＧＦＰＣｏｎｔｒｏｌベクターにおいてクローニングし、先に記載のように、ＣＨＯ細胞においてそれらの効率をアッセイした。興味深いことに、フラグメントＦＩＩＩは全長Ｆフラグメントの活性のほとんどを保持したが、フラグメントＦＩＩＩの右側の部分を含有するフラグメントＦＩＩは、導入遺伝子発現を刺激するすべての能力を消失した（図７）。これは、ＦＩＢフラグメントのｎｔ１３２〜ｎｔ２２１の間に含まれる活性な領域を指摘している。一貫して、この領域を包含する複数コピーのフラグメントＦＩおよびＦＩＢも類似の活性を示した。ＦＩＩＡ単独では活性を有さない。しかし、ＦＩＢに付加するとＦＩＩＩが生じ、それは前者の活性を増強する。従って、ＦＩＩＡは、それ単独ではほとんど活性を有さないが、ＦＩＢに局在する最小ドメインの活性を強化する補助配列を含有するようである。
【０１７６】
リゾチーム遺伝子５'ＭＡＲ内の個々のモチーフの分布の解析を、本発明者らが解析に追加したさらなるいくつかのモチーフと共に、図８Ａに示す。これらのモチーフのほとんどは、ＭＡＲエレメント全体にわたって分散しており、特に活性な部分に関連していないことを見出した。例えば、転写因子およびＭＡＲと関連している他のモチーフの結合部位が活性領域に局在するのは好ましくない。また、活性なＭＡＲ配列は個別のモチーフの組み合わせよりなることが提唱されている。いくらかのコンピュータプログラム（ＭＡＲ  Ｆｉｎｄｅｒ、ＳＭＡＲＴｅｓｔ、ＳＩＤＤ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）は、ＤＮＡマトリックスに関連するＤＮＡの領域としてＭＡＲを同定することが報告されている。それらは、通常、現在、ＭＡＲ  Ｗｉｚとして公知のＭＡＲ  Ｆｉｎｄｅｒとして例示されるように、ＭＡＲ活性を含有することがすでに示唆されている配列特異的パターンの予め決定されたシリーズを利用するアルゴリズムに基づく。これらのプログラムの出力は、ｃＬｙｓＭＡＲの転写活性部分にそれほど相関しない。例えば、Ｂフラグメントがインビボでは相当に活性であるが、ＭＡＲ  Ｆｉｎｄｅｒによってネガティブを記録する場合、例えば、ＭＡＲ  Ｆｉｎｄｅｒによって得られる活性のピークは活性なＭＡＲサブ部分に明確には一致しない（図８Ｂ、頂部および中間部のパネルを比較すること）。このプログラムによって推定される折れ曲がりＤＮＡ構造は、活性とはいずれもそれほど相関しなかった（図８Ｂ、頂部および底部のパネルを比較すること）。他の利用可能なプログラムによっても同様の結果が得られた（データ示さず）。
【０１７７】
従って、利用可能なＭＡＲ推定コンピュータ方法によって同定されるモチーフは、遺伝子発現を増加させるｃＬｙｓＭＡＲの能力の主要な決定要素ではないようである。従って、他の多くのコンピュータツールを試験した。驚くべきことに、推定されたヌクレオソーム結合性配列およびヌクレオソーム不適切配列（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｆａｖｏｕｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＭＡＲ上に反復的に散在するクラスターの形で整列されていることが見出され、ヌクレオソーム好適部位（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｆａｖｏｕｒｉｎｇ  ｓｉｔｅ）は活性なＢ、ＫおよびＦ領域と重複していた。ヌクレオソームポジショニング配列は、ヌクレオソームヒストンの周りを容易に包むことができるＤＮＡストレッチよりなることが提唱されたが、それらは、これまでＭＡＲ配列との関係が認められていなかった。
【０１７８】
ヌクレオソーム適切配列（Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ−ｆａｖｏｕｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、中等度に反復した配列を含むＤＮＡの特徴ならびに正確なフェージングおよび湾曲したヒストン表面上のＤＮＡの配向を可能にし得る他の物理化学的パラメータを収集することによって、モデル化することができる。これらのＤＮＡ特性の多くの同定をコンピュータ処理することができ、そのような異なる３８までの特性を使用して、潜在的なヌクレオソーム位置を推定した。従って、本発明者らは、ゲノム配列から新規かつおそらくより強力なＭＡＲの同定を可能にするツールを構築する目的で、ヌクレオソーム推定プログラムの特定の成分がＭＡＲ活性と相関するかどうかを決定するように設定した。
【０１７９】
ＤＮＡ一次配列の任意の局面が周囲のＭＡＲ配列から活性なＢ、ＫおよびＦ領域を識別するかどうか決定するために、本発明者らは、ＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）で５'ＭＡＲを解析した。３８個のヌクレオソームアレイ推定ツールのうち、３つが活性なＭＡＲサブドメインの局在に相関することを見出した（図９Ａ）。ＭＡＲ  Ｂ、ＫおよびＦ領域の局在は、ＤＮＡの折れ曲がり、主溝の深さおよび副溝の幅の最大値と一致する。ＧＣ含有量によって決定されるように、ＤＮＡ融解温度の最小値とにもより弱い相関関係が認められた。ＭＡＲ  Ｆフラグメント上での精密なマッピングは、融解温度の谷部およびＤＮＡの折れ曲がりの頂点が、実際にＭＡＲ最小ドメインを含有するＦＩＢサブフラグメントに対応することを示した（図９Ｂ）。従って、活性なＭＡＲ部分は、このプログラムによって湾曲したＤＮＡとして推定される領域に対応し、本発明者らは、以下、これらの領域をＣＵＥ−Ｂ、ＣＵＥ−ＫおよびＣＵＥ−Ｆと呼ぶことにする。それにもかかわらず、ＭＡＲ  Ｗｉｚによって推定されるように、それらが折れ曲がりＤＮＡに対応しない（図９Ｂ）場合、これらの領域が実際の折れ曲がりＤＮＡおよび塩基対巻き戻し領域に対応するかどうかはが不明である。
【０１８０】
実施例１０：Ｆフラグメントにおける他の調節エレメントのインプリント
ヌクレオソームポジショニングの特徴は、ゲノムＤＮＡに含有される多くの特定のクロマチンコードのうちの１つとしてみなすことができる。この特定のコードは、Ｆ領域の活性に寄与することができるが、ＦＩＢ部分に含有される最小のＭＡＲドメインのＦ領域増強型活性の３'部分としてＭＡＲ活性単独を決定することはできないようである。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプログラム（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ）を使用して、本発明者らは、０．９２より高いスコアを伴う転写因子結合部位を探索し、Ｆフラグメントの３'部分におけるＮＭＰ４およびＭＥＦ２タンパク質のＤＮＡ結合配列を見出した（図８Ｂ）。これらの転写因子−結合部位のいずれかがＢおよびＫ活性領域の付近に局在し得るかどうかを決定するために、５'ＭＡＲ配列全体をＮＭＰ４およびＭＥＦ２ならびに一本鎖または二本鎖形態のＢＵＲに結合することが報告されたタンパク質による結合について、解析した。それらのうち、ＳＡＴＢ１（特定のＡＴリッチ結合タンパク質１）は、付近の遺伝子の発現を活性化するかまたは抑制することができるＤＮＡ結合転写因子のクラスに属する。この研究により、ＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４（核マトリックスタンパク質４）およびＭＥＦ２（筋原性エンハンサー因子２）のような特定のタンパク質が特定の分布形態およびｃＬｙｓＭＡＲの最小ＭＡＲドメイン周辺のフレームワークを有することが示された（図１０）。これらのＮＭＰ４およびＳＡＴＢ１結合部位のいくらかの発生は、精製された組換えタンパク質のＥＭＳＡ解析によって、実験的に確認されている（データ示さず）。
【０１８１】
実施例１１：規定された遺伝子エレメントを結合することによる人工ＭＡＲの構築
多様なＭＡＲ成分の相対的な役割にさらに評価するために、３つのすべてのＣＵＥ領域からｃＬｙｓＭＡＲを消失させ（図１１、中間部）、コントロール（図１１、頂部）として、そのすべての成分から同様に集成された完全なＭＡＲ配列と比較する場合に、その活性の部分の消失を生じさせた。一貫して、１コピーの各ＣＵＥ単独、または１コピーのそれぞれの頭−尾集成された３つのＣＵＥは、フランキング配列の非存在下では、ほとんど活性を有さなかった。これらの結果は、至適転写活性には、ＣＵＥとフランキング配列との組み合わせが必要であるという結論を強く支持する。興味深いことに、その成分のそれぞれから作製されるが、各ＤＮＡフラグメントを集成するために使用されるＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩリンカー配列（ＡＧＡＴＣＣ）をも含有する完全なＭＡＲ配列は、このシリーズのアッセイにおいて本来のＭＡＲエレメントについて認められる４．８倍と比較して、高い転写活性（６倍の活性化）を示した（図５を参照のこと）。
【０１８２】
次に、本発明者らは、潜在的に湾曲したＤＮＡ領域もまた、それらの天然のＭＡＲコンテキストにおいて見出されるものとは異なる環境において活性であるかどうかについて調べた。従って、本発明者らは、ＣＵＥ−Ｆ、ＣＵＥ−ＢおよびＣＵＥ−Ｋエレメントを交換するように設定し、変化していないフランキング配列を保持した。ＰＣＲによって、ＣＵＥ−Ｆエレメントに隣接する配列を増幅し、多様なＣＵＥを取り囲むように集成して、それらの本来の配向および距離を保持するか、またはＣＵＥを伴わずに集成した。次いで、これらの操作した約１．８ｋｂのＭＡＲを、上記のように導入遺伝子発現を増強するそれらの能力についてアッセイした。３つのすべてのＣＵＥはこのコンテキストにおいて活性であり、従って、そこでは、作用は、フランキング配列の１つの所定の組に限定されない。興味深いことに、ＣＵＥ−Ｋエレメントは、ＣＵＥ−Ｆフランキング配列間に挿入した場合、ＣＵＥ−Ｆよりも活性でさえあり、前者の複合構築物は、完全な天然のＭＡＲについて観察される（４．８倍の活性化）のと同じ高さの活性を示した。ＣＵＥ−ＫエレメントがＣＵＥ−ＦおよびＣＵＥ−Ｂと識別される点は、そのＣＵＥ特徴に加えて、ＭＥＦ−２およびＳａｔＢ１タンパク質に対する重複結合部位が存在することである。従って、ＣＵＥ−ＢとＣＵＥ−Ｆフランキングドメインとを融合すると、３つのすべての結合部位についてより高い密度が認められ、増加した活性に対して適切に説明している。これらの結果は、ＮＭＰ４、ＭＥＦ−２、ＳａｔＢ１、および／またはポリＰポリＱタンパク質のようなタンパク質に対する結合部位を含有する配列によるＣＵＥの集成は、強力な人工ＭＡＲ配列を構成することを示す。
【０１８３】
実施例１２：発現ベクター
本発明に従う３つの発現ベクターを図１２に表す。
【０１８４】
プラスミドｐＰＡＧ０１は、５６４０ｂｐのｐＵＣ１９誘導体である。それは、ＢａｍＨ１およびＸｂａＩ制限部位においてクローニングされた２９６０ｂｐのニワトリＤＮＡフラグメントを含有する。挿入物は、ニワトリリゾチーム遺伝子座の５'末端の境界由来であり、高いＡ／Ｔ含有量を有する。
【０１８５】
プラスミドｐＧＥＧＦＰ（ｐＳＶ４０ＥＧＦＰとも命名される）ｃｏｎｔｒｏｌは、ルシフェラーゼ遺伝子配列がｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＥＧＦＰ遺伝子配列によって置き換えられているｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の誘導体である。ｐＧＥＧＦＰプラスミドのサイズは４３３４ｂｐである。
【０１８６】
プラスミドｐＵｂＣＥＧＦＰコントロールは、ユビキチンプロモーターを伴うｐＧＬ３の誘導体である。
【０１８７】
プラスミドｐＰＡＧ０１ＧＦＰ（ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰとも命名される）は、ＳＶ４０プロモーターのすぐ上流に局在するＭＣＳにおいてクローニングされた５'Ｌｙｓ  ＭＡＲエレメントを伴うｐＧＥＧＦＰの誘導体である。ｐＰＡＧ０１ＥＧＦプラスミドのサイズは７２８５ｂｐである。
【０１８８】
実施例１３：導入遺伝子発現に対する一次トランスフェクタント細胞のさらなるトランスフェクションの効果
トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞について、細胞を、２４ウェルプレート中、増殖培地において、１．３５×１０５個の細胞／ウェルの密度で配置した。播種の１６時間後、細胞が３０〜４０％のコンフルエンスに達したら、製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ−ＡＭＩＮＥ２０００（以後、ＬＦ２０００）を使用して、細胞をトランスフェクトした。１．４μｌのＬＦ２０００を含有する２７マイクロリットルの無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、８３０ｎｇの線状プラスミドＤＮＡを含有する２７μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合した。抗生物質選択プラスミド（ｐＳＶｎｅｏ）は、ＧＦＰ導入遺伝子を有するレポータープラスミドの１０分の１の量に達した。混合物を、室温で２０分間、インキュベートし、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を形成させた。混合物を３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈し、予め空にした細胞含有ウェルに注いだ。３７℃でＣＯ２インキュベーター中ＤＮＡ混合物を伴う細胞の３時間のインキュベーション後、１ｍｌのＤＭＥＭ基本培地を各ウェルに添加した。細胞を、２４時間、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でさらにインキュベートした。次いで、細胞に対し、耐性プラスミドが別の耐性遺伝子を担持する（ｐＳＶｐｕｒｏ）ことを除いて、上記の方法に従って、２回目のトランスフェクトを行った。第２のトランスフェクションの２４時間後、細胞を継代し、５００μｇ／ｍｌのＧ−４１８および５μｇ／ｍｌピューロマイシンを補充した選択培地を含有するＴ−７５フラスコに拡大培養した。２週間の選択期間後、安定にトランスフェクトされた細胞を、６ウェルプレートにおいて培養した。あるいは、細胞集団を同じ方法（但し、耐性プラスミドとしてｐＴＫｈｙｇｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＳＶｄｈｆｒ）を使用して、再度トランスフェクトした。ＧＦＰの発現を、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）およびＦｌｕｏｒｏｓｃａｎで解析した。
【０１８９】
図１３は、２回トランスフェクトした細胞（以後、二次トランスフェクタントと呼ばれる）の表現型が、ＧＦＰタンパク質由来の緑色を可視化するために、特定のバルブおよびフィルターを必要としない程に強度に発色しただけでなく、親集団（中央のヒストグラム）と比較して、大部分の産生細胞（底部右側のＦＡＣＳヒストグラム）を含有したことを示す。蛍光のこのレベルは、１日あたり細胞あたり少なくとも１０ｐｇの特定の細胞産生性に対応する。実際、マーカータンパク質を発現しない１回だけトランスフェクトした細胞（一次トランスフェクション）は、再トランスフェクション後の細胞集団にはほとんどすべてが存在しなかった。ＧＦＰ蛍光の１０１単位未満の棒は、中央のヒストグラムにおいて３０％および右側のヒストグラムにおいて５％未満の量に達した。このことから、さらなる細胞がトランスフェクトされ、首尾よくＧＦＰを発現したことが示唆された。
【０１９０】
特に、再トランスフェクト細胞によって示される蛍光の量により、ＤＮＡを２回組み入れられた細胞のサブ集団は、予想される２倍の増加よりはるかに多くＧＦＰを発現したことが示唆された。実際、表２に示される結果は、二次トランスフェクタントが、２組の配列（各連続的トランスフェクションにおいて１つ）が独立してかつ類似の効率で組み入れられている場合に予想されるＧＦＰより平均で２倍を超える増加を示したことを示唆する。興味深いことに、ウイルスおよび細胞の両方のプロモーター含有ベクターより類似のＧＦＰ増強が得られるように、これは、レポーター遺伝子を駆動するプロモーター配列に依存しなかった（レーン１および２を比較すること）。しかし、効果は、ＭＡＲ−を伴わないプラスミド（レーン３）と比較して、ＭＡＲ含有ベクターについて特に顕著であり、ここで、２つの連続トランスフェクションにより、２つの個別の実験において、５．３および４．６倍の発現の増加を生じた。
【０１９１】
【表８】
0005396653.tif 000009
【０１９２】
複数回トランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現のレベルの増加は、現在の知識では予想されず、このような効果はこれまでに観察されていない。
【０１９３】
総合すると、ここで提示されたデータは、最初に宿主ゲノムに組み入れられたプラスミド配列が、第２の次の組のプラスミド分子を伴う相同組換えによる他のプラスミドの組込みを容易にするという考えを支持する。プラスミドＤＮＡが核に到達し、培養された哺乳動物細胞において同時注入されたプラスミド分子間の相同組換えの頻度が、極端に高い接近した均一性を示した後、１時間の間隔内にプラスミドの組換え事象が生じ（フォルガーＫ．Ｒ．（Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ．）、Ｋ．トーマス（Ｋ．Ｔｈｏｍａｓ）、およびＭ．Ｒ．カペッチ（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、「Ｎｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｃｏｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｉ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９８５年．５（１）：５９−６９頁］、複数プラスミドコピーの組込みが説明される。しかし、新たに導入されたＤＮＡとその染色体相同物との間の相同組換えは、通常、ＤＮＡを受容した１０３個の細胞中、最大でも１個の頻度で、極めて稀にしか生じない［トーマスＫ．Ｒ．（Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．）、Ｋ．Ｒ．フォルガー（Ｋ．Ｒ．Ｆｏｌｇｅｒ）、およびＭ．Ｒ．カペッチ（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、「Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」Ｃｅｌｌ，１９８６年、４４（３）：４１９−２８頁］。従って、結果は、ＭＡＲエレメントが、驚くべきことに、そのような組換え事象を促進するように作用することを示唆し得る。ＭＡＲは、インビボにおける遺伝子の編成を修飾し、また、おそらく、ウイルスＤＮＡ配列と共同で、ＤＮＡ複製を可能にするだけでなく、ＤＮＡ組換えシグナルとしても作用し得る。
【０１９４】
実施例１４：ＭＡＲは多トランスフェクト細胞における予想外の高レベルの発現を仲介する
ＭＡＲ駆動性組換え事象が多トランスフェクションプロセスにおいて生じるのであれば、本発明者らは、一次および二次プラスミドＤＮＡ間の相乗効果が、トランスフェクション工程の一方または両方におけるＭＡＲエレメントの存在によって、影響を受けることを予想する。本発明者らは、先に記載の方法を使用して、ｐＭＡＲ単独または多様な発現プラスミドとの組み合わせで細胞の多トランスフェクションによるこの確率について調べた。表３は、ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰプラスミドで細胞を２回トランスフェクトすると、ＧＦＰの最も高い発現およびすべての状態の最も高い程度の増強（４．３倍）が得られたことを示している。対照的に、ＭＡＲを伴わないベクターで細胞を２回トランスフェクトすると、予想された２倍の増加ではないが、ほとんどまたはまったく増強が認められなかった（２．８倍）。本発明者らは、各トランスフェクション工程でのＭＡＲエレメントの存在は、最大のタンパク質合成を達成するために必要であると結論する。
【０１９５】
【表９】
0005396653.tif 000010
【０１９６】
興味深いことに、細胞をはじめにｐＭＡＲ単独でトランスフェクトし、次いで、ｐＳＶ４０ＥＧＦＰまたはｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰで再トランスフェクトした場合、ＧＦＰレベルは、後者のプラスミドの単一のトランスフェクションから生じるレベルと比較して、２倍を超えた（予想される１倍の代わりに、それぞれ２．５および２．７倍）。このことは、ＭＡＲの先のトランスフェクションは、第２のトランスフェクション手順において使用されるプラスミドの発現を増加させることができることを示す。ＭＡＲは、クロマチン構造および遺伝子発現に対して局所的にしか作用しないため、このことは、２つのタイプのＤＮＡが類似の染色体遺伝子座において組込み得ることを意味する。対照的に、ＧＦＰ発現ベクター単独、続いて、第２の工程においてＭＡＲエレメントをトランスフェクトしても、ＧＦＰレベルの改善はほとんどまたはまったく得られなかった。このことは、プラスミドトランスフェクションの順序が重要であり、第１のトランスフェクション事象は、有意に高いレベルの導入遺伝子発現を可能にするために、ＭＡＲエレメントを含有すべきであることを示す。
【０１９７】
ＭＡＲエレメントが第１および第２のトランスフェクション手順からエピソーム形態で保持するプラスミドの相同組換え、続いて、１つの染色体座位でのそれらの同時組込みに好適である場合、プラスミドトランスフェクションの順序はＧＦＰレベルに影響を及ぼさないことが予想される。しかし、上記の所見は、第２のトランスフェクション事象よりむしろ第１のトランスフェクション事象においてＭＡＲエレメントをトランスフェクトすることがより好まれることを示す。このことから、以下の分子機構が示唆される。第１のトランスフェクション手順中、ＭＡＲエレメントは、少なくとも部分的に、細胞染色体において、鎖状体化し、組込み得る。この組込まれたＭＡＲ  ＤＮＡは、次いで、第２のトランスフェクション手順中、同じまたは付近の染色体座位において、より多くのプラスミドのさらなる組込みに好適である。
【０１９８】
実施例１５：長期間ＤＮＡ導入促進物としてのＭＡＲ
組込まれたＭＡＲが持続的組換え許容性染色体構造を仲介する場合、第１のトランスフェクションの長期間後、一過的に導入されたエピソームＤＮＡのほとんどが排除されたときに第２のトランスフェクションを実施する場合であっても、高レベルの発現を予想し得る。この可能性に取り組むために、３週間の抗生物質体制のために選択された表３の細胞を、１または２回再度トランスフェクトし、さらなるＤＮＡ耐性マーカーの組み入れのために選択した。三次、または三次および四次トランスフェクションサイクルを、ｐＭＡＲまたはｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰの組み合わせで実施し、先のようにＧＦＰ発現について解析した。
【０１９９】
【表１０】
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【０２００】
ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ／ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ二次トランスフェクタントは、選択プロセスの終了時に三巡目のトランスフェクションに使用した。ｐＭＡＲまたはｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ、および選択プラスミドとしてｐＴＫｈｙｇｒｏで三次トランスフェクションを達成し、三次トランスフェクタントを得た。２４時間後、細胞を、いずれかのプラスミドおよびｐＳＶｄｈｆｒで再度トランスフェクトし、５００μｇ／ｍｌのＧ−４１８および５μｇ／ｍｌピューロマイシン、３００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢおよび５μＭメトトレキサートを含有する培地において選択された四次トランスフェクタントを得た。二次トランスフェクタントは、はじめに、８３００のＧＦＰ蛍光を示した。倍率の増加は、対応する独立したトランスフェクションから得られる蛍光の合計と比較した２連続トランスフェクションから得られる蛍光の比に対応する。有意に高いと判定された倍率の増加は太字で示され、独立したトランスフェクションから得られる蛍光値の加算よりも２倍高い蛍光値に対応する。
【０２０１】
これらの結果は、より多くのコピーのｐＭＡＲまたはｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰを充填することによって、全細胞蛍光のほぼ２倍の増強が生じることを示す。四次トランスフェクションにおけるさらに多くのＭＡＲを充填すると、さらに、この活性はさらに２．４倍増強される。このことは、新たに導入されたＭＡＲ配列が相同組換えによって染色体導入遺伝子座位で組込み、従って、導入遺伝子発現をさらに増加させるという本発明者らの仮説と一致する。
【０２０２】
細胞をｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰプラスミドで３および４回トランスフェクトした場合、ＧＦＰ活性は、独立したトランスフェクションから得られる蛍光レベルの加算からは予想されないレベルまで、再度、さらに増加させる。ＧＦＰ発現は、日中の光で目視できる程度に鮮明な緑色を生じるレベルに到達した（図１４）。これらの結果は、四次トランスフェクションの効率が、第３のＤＮＡ移入の効率から予想されるよりもはるかに大きかったことを示し、トランスフェクション間の適切なタイミングが至適な遺伝子発現増加を得るのに極めて重要であることが示され、１日は、３週間の期間にわたって好適である。
【０２０３】
本発明者らは、それらがヒストンアセチル化の局所増加を仲介するとき、ＭＡＲエレメントは、閉じたクロマチン構造を緩めることによって、染色体組込みのそれらの部位での組換え頻度を増加させる第２の組込み事象に好適であると考えている（ヤスイＤ．（Ｙａｓｕｉ，Ｄ．）ら、「ＳＡＴＢ１  ｔａｒｇｅｔｓ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｖｅｒ  ｌｏｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ，２００２年、４１９（６９０７）：６４１−５頁］。あるいは、または付随して、ＭＡＲは、付近の遺伝子を、トポイソメラーゼのような組換え事象に参加することができるタンパク質を含むトランス作用性因子において富化されたと思われる核内局在に潜在的に移転する。これにより、ＭＡＲ配列がｐＳＶ４０ＥＧＦＰ反復を取り囲むことができる遺伝子座を生じることができ、クロマチン仲介サイレンシング効果から導入遺伝子を効率的に保護する。
【０２０４】
実施例１６：組換えタンパク質の発現を増加させるためにＳＭＡＲ  ＳＣＡＮ（登録商標）ＩＩで同定されたＭＡＲの使用
４つのＭＡＲエレメントを、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）または組み合わされた方法による完全なヒトゲノム配列の解析から得られる配列から無作為に選択した。これらは、１＿６、１＿４２、１＿６８（ここで、第１の数字は配列が起源とする染色体を表し、第２の数字は、この染色体に沿って推定されたＭＡＲに特異的である）ならびにＸ＿Ｓ２９、Ｘ染色体上で同定される「超」ＭＡＲと呼ばれる。これらの推定されたＭＡＲを、ｐＧＥＧＦＰＣｏｎｔｒｏｌベクターに、ＳＶ４０プロモーターおよび緑色蛍光タンパク質の発現を駆動するエンハンサーの上流側で挿入し、先に記載（ザン−ザバルＭ（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  Ｍ）ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１年、８７（１）：２９−４２頁）のように、これらのプラスミドを培養したＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。次いで、蛍光細胞分取（ＦＡＣＳ）機を使用して、安定にトランスフェクトした細胞の全集団において、導入遺伝子の発現を解析した。図１９から見て取れるように、これらのすべての新たに同定されたＭＡＲは、ニワトリリゾチームＭＡＲによって駆動される発現よりも有意に導入遺伝子の発現を増加したが、「超」ＭＡＲ  Ｘ＿Ｓ２９は、新たに同定されたＭＡＲのすべてのうち、最も強力であった。
【０２０５】
実施例１７：ヒトＭＡＲ（１−６８）を伴うまたは伴わずにネットワークシステムのエレクトロトランスファーによるｍＥｐｏのインビボ発現のヘマトクリットに対する影響
治療用遺伝子は、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、貧血の処置のために使用されるホルモンをコードする。ＥＰＯ遺伝子をドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下配置し、先に記載の遺伝子スイッチシステムを、以下、ネットワークシステムと呼ぶ（イムホフＭ．Ｏ．（Ｉｍｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．）、チャテラードＰ．（Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ，Ｐ．）、およびメルモドＮ．（Ｍｅｒｍｏｄ，Ｎ．）（２０００年）「Ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．２，１０７−１１６。次いで、エレクトロトランスファーと呼ばれるインビボエレクトロポレーション手順を使用して、遺伝子が筋肉線維の核に移入されるように、ＥＰＯおよび調節遺伝子をマウスの筋肉に注入する。ドキシサイクリン抗生物質をマウスの飲用水に添加する場合、この化合物はＥＰＯの発現を誘導することが予想され、これは、高い循環レベルのＥＰＯによって仲介される赤血球細胞数の増加により、ヘマトクリットレベルの上昇をもたらす。従って、ＭＡＲがＥＰＯの発現を改善する場合、より高いレベルのヘマトクリットが予想される。
【０２０６】
５週齢のＣ５７ＢＬ６系雌性マウス（Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、仏国）に対し、インビボ実験を行った。生理食塩水中３０μｇのプラスミドＤＮＡを、経皮注入によって、前脛骨筋に送達した。すべての注入は、ケタミノール（Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ）（７５ｍｇ／ｋｇ）およびナルコキシル（Ｎａｒｃｏｘｙｌ）（１０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で行った。ＤＮＡの筋肉内注入後、電場を筋肉に適用した。２００Ｖ／ｃｍの電圧を、８ｍｓパルス、１Ｈｚで適用した（ベッタンＭ（Ｂｅｔｔａｎ  Ｍ）、ダーテイルＲ（Ｄａｒｔｅｉｌ  Ｒ）、カイラウドＪＭ（Ｃａｉｌｌａｕｄ  ＪＭ）、ソイブリヤーＦ（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ  Ｆ）、デラエレＰ（Ｄｅｌａｅｒｅ  Ｐ）、ブレネレックＤ（Ｂｒａｎｅｌｅｃ  Ｄ）、マホルディＡ（Ｍａｈｆｏｕｄｉ  Ａ）、デュヴェルガーん（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ  Ｎ）、シェルマンＤ（Ｓｃｈｅｒｍａｎ  Ｄ）、２０００年「Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｕｌｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ」．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２：２０４−１０）。
【０２０７】
１６匹のマウスに、１＿６８ＭＡＲを伴わずにＥＰＯを発現するネットワークシステムを注入し、他の１６匹のマウスに、アクチベーターおよびＥＰＯ遺伝子の発現を駆動するプロモーター／エンハンサー配列の５'においてＭＡＲを組み入れるネットワークシステムを注入した。各グループにおいて、半数のマウスを、実験のはじめ（エレクトロトランスファーの０日目）から飲用水中のドキシサイクリンに供し、他の半数では、２１日目から、ドキシサイクリンを飲用水に入れた。
【０２０８】
プラスミド注入後、異なる時間に、眼窩後穿刺によりヘパリン処理キャピラリーを使用して、血液サンプルを回収した。キャピラリーを１０分間、５０００ｒｐｍ、室温で遠心分離し、血液細胞の容積画分を全血液容積との比較で評価して、パーセンタイルとして表し、ヘマトクリットレベルを決定した。
【０２０９】
図１６から推測されるように、ＭＡＲネットワークにより注入され、実験のはじめから導入されたマウスのグループは、ＭＡＲを伴わずに本来のネットワークにより注入されたマウスと比較して、ヘマトクリットのより良好な導入を示す。２箇月後、「ＭＡＲ含有グループ」のヘマトクリットはなお、正常なヘマトクリットレベル（４５〜５５％）より高い値（６５％）である。
【０２１０】
より重要なことに、後期の導入（２１日目）は、ＭＡＲの存在のみにおいて可能であるが、ＭＡＲを伴わずにネットワークを注入したマウスからは認められない。従って、ＭＡＲは、サイレンシングから導入遺伝子を保護するようであり、長期間の非誘導条件後でさえも、発現の誘導を可能にする。
【０２１１】
全体として、ＭＡＲエレメントは、ヘマトクリットに対するその増加した生理学的影響から検出されるように、治療用遺伝子の発現を増加させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】ＭＡＲおよび非ＭＡＲ配列の分布プロットを示す。ヒストグラムは、観察されたパラメータのスコアに対する密度プロット（区間幅で割った相対頻度）である。ＳＭＡＲｔＤＢデータベースにおけるヒトＭＡＲに対する密度ヒストグラムを黒色で示し、ヒト第２２染色体に対する密度ヒストグラムを灰色で示す。
【図２】ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって使用される異なる４種の基準およびＳＭＡＲｔＤＢ由来のヒトＭＡＲを伴うＡＴ含有量の分布図を示す。
【図３】生物体によるＭＡＲ配列の分布プロットを示す。他の生物体のＳＭＡＲｔＤＢ由来のＭＡＲ配列を検索および解析した。マウス、ニワトリ、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）およびヒトのＭＡＲ配列密度分布を一緒にプロットする。
【図４】ヒト第２２染色体およびシャッフルした第２２染色体に対するＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）推定を示す。頂部のプロット：次の５種：１０ｂｐの非重複ウィンドウ内で分断、スクランブル、シャッフルしたもの、１次マルコフ連鎖モデルおよび生来の第２２染色体でのＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって得られるヒットの平均数。底部のプロット：次の５種：１０ｂｐの非重複ウィンドウ内で分断、スクランブル、シャッフルしたもの、１次マルコフ連鎖モデルおよび生来の第２２染色体でのＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって推定されるＭＡＲの平均数。
【図５】ニワトリリゾチーム遺伝子５'−ＭＡＲがＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において導入遺伝子発現を刺激する能力の精査を示す。フラグメントＢ、ＫおよびＦは導入遺伝子発現を刺激するための最も高い能力を示す。エレメントの指示された相対的強度は、高発現細胞の数に基づいた。
【図６】導入遺伝子発現を刺激する能力の消失に対する５'ＭＡＲの５'末端（上部）および３'末端（下部）の連続欠失の効果を示す。増加した活性から減少した活性への移動は、Ｂ−、Ｋ−およびＦ−フラグメントに一致する。
【図７】Ｆフラグメントの部分が導入遺伝子発現を有意に刺激することを示す。左側の灰色の矢印によって示されるＦフラグメント領域を多量体化し、ｐＧＥＧＦＰ  Ｃｏｎｔｒｏｌに挿入し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。最も高い活性を示すエレメントはエレメントの中心部に局在し、フラグメントＦＩＩＩ（黒色棒で標記したＭＡＲ）に対応する。さらに、エンハンサー活性はＦＩＩＩフラグメントの３'フランキング部に局在する（暗色棒で標記したＭＡＲエンハンサー）。
【図８】ｃＬｙｓＭＡＲ内の多様なＤＮＡ配列モチーフに対する局在のマップを示す。図８（Ｂ）はｃＬｙｓＭＡＲ内の多様なＤＮＡ配列モチーフに対する局在のマップを表す。垂直線はｃＬｙｓＭＡＲの３０３４塩基対に沿ってコンピュータにより推定された部位または配列モチーフおよび図５に示したその活性領域の位置を表す。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（ゲノマティックス（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ））を使用して、アクチベーターに対する推定転写因子部位（ＭＥＦ２  ０５、Ｏｃｔ−１、ＵＳＦ−０２、ＧＡＴＡ、ＮＦＡＴ）および転写のリプレッサーに対する（ＣＤＰ、ＳＡＴＢ１、ＣＴＣＦ、ＡＲＢＰ／ＭｅＣＰ２）を同定し、ＣＰＧＰＬＯＴでＣｐＧアイランドを同定した。先にＭＡＲエレメントと関連付けられたモチーフは黒色で標記され、ＣｐＧジヌクレオチドおよびＣｐＧアイランド、巻き戻しモチーフ（ＡＡＴＡＴＡＴＴおよびＡＡＴＡＴＴ）、ポリＡおよびＴ、ポリＧおよびＣ、６ｂｐコアおよび高移動度群Ｉ（ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ）タンパク質結合部位に対して同一性を有したショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）トポイソメラーゼＩＩ結合部位（ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＴＮＡＴＮＮＲ）を含む。他の構造モチーフは、ヌクレオソーム結合およびヌクレオソーム不適切（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｆａｖｏｕｒｉｎｇ）部位ならびに超らせん鎖のＤＮＡを遊離すると考えられるモチーフを含む。図８（Ａ）は、ＭａｒＦｉｎｄｅｒによる転写を活性化するｃＬｙｓＭＡＲの部分の能力とＭＡＲ推定スコアプロフィールとの比較を表す。頂部のグラフは、図５におけるようなＭＡＲフラグメント活性を示す一方、中央ならびに底部の曲線は、それぞれＭＡＲ活性および折れ曲がりＤＮＡ構造についてのＭＡＲＦｉｎｄｅｒにより推定されたポテンシャルを示す。
【図９】ＤＮＡの物理化学的特性とＭＡＲ活性との相関関係を示す。図９（Ａ）はＤＮＡ融解温度、二重らせんの折れ曲がり、５'ＭＡＲの主溝の深さおよび副溝の幅のプロフィールを表し、それらは、レビットスキー（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ）ら（レビットスキーＶＧ（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  ＶＧ）、ポノマレンコＭＰ（Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ  ＭＰ）、ポノマレンコＪＶ（Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ  ＪＶ）、フロロフＡＳ（Ｆｒｏｌｏｖ  ＡＳ）、コルチャノフＮＡ（Ｋｏｌｃｈａｎｏｖ  ＮＡ）「Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｄａｔａｂａｓｅ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１５；５８２５９２、１９９９年）のアルゴリズムを使用して決定した。頂部で示された最も活性なＢ、ＫおよびＦフラグメントが図１と同様に示されている。図９（Ｂ）は、融解温度（頂部の曲線）およびＤＮＡの折れ曲がり（底部の曲線）に対応するトレーシングと共に整列されたＦフラグメントマップを示すためにパネルＡにおいて提示されたデータの拡大図を表す。示されるように、最も活性なＦＩＢフラグメントの位置および特定の転写因子に対するタンパク質結合部位が存在する。
【図１０】５'ｃＬｙｓＭＡＲ内の推定転写因子結合部位の分布を示す。大きな矢印は、ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）で同定されるようなＣＵＥエレメントの位置を示す。
【図１１】多様な位置のＭＡＲの集成のスキームを示す。ｃＬｙｓＭＡＲの示された位置をＰＣＲによって増幅して、各末端にＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩリンカーエレメントを導入し、集成して、示されたコンポジットエレメントを作製した。例えば、頂部の構築物は、ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩＩリンカー配列が各エレメントを分離することを除けば、それらの本来の局在ですべてのＣＵＥおよびフランキング配列の集成よりなる。
【図１２】プラスミドマップを表す。
【図１３】一次トランスフェクタントを再トランスフェクトすることのＧＦＰ発現に対する効果を示す。細胞（ＣＨＯ−ＤＧ４４）を、ｐＳＶ４０ＥＧＦＰ（左側のチューブ）またはｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ（中央のチューブ）および耐性プラスミドとしてのｐＳＶｎｅｏで同時トランスフェクトした。ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、２４時間後に、同じプラスミドおよび異なる選択プラスミド、ｐＳＶｐｕｒｏ（右側）で再度トランスフェクトした。選択の２週間後、安定にトランスフェクトされた細胞集団の表現型をＦＡＣＳにより分析した。
【図１４】ＭＡＲを含有するプラスミドの多重充填の効果を示す。ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ／ｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰ二次トランスフェクタントは、選択プロセスの終了時に三巡目のトランスフェクションに使用した。ｐＭＡＲまたはｐＭＡＲ−ＳＶ４０ＥＧＦＰで三次トランスフェクションを達成し、三次トランスフェクタントを得た。２４時間後、細胞を、再度、いずれか一方のプラスミドでトランスフェクトし、四次トランスフェクタントを得た（表４を参照のこと）。
【図１５】領域ＷＰ１８Ａ１０Ａ７によって例示されるＳＭＡＲ推定アルゴリズムの比較性能を示す。（Ａ）デフォルト値の設定でＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）解析を実施した。（Ｂ）ＳＩＤＤ解析（頂部の曲線および左側の目盛り）、ならびにインビトロでのいくらかのＤＮＡフラグメントの核マトリックスへの付着（棒グラフ、右側の目盛り）は、ゲッツ（Ｇｏｅｔｚｅ）ら（ゲッツＳ（Ｇｏｅｔｚｅ  Ｓ）、グルヒＡ（Ｇｌｕｃｈ  Ａ）、ベンハムＣ（Ｂｅｎｈａｍ  Ｃ）、ボーデＪ（Ｂｏｄｅ  Ｊ）、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：１５４−１６６、２００３年）から採用した。
【図１６】ＭＡＲを使用した遺伝子治療様プロトコルの結果を表す。ＭＡＲネットワークにより注入され、実験のはじめから導入されたマウスのグループは、ＭＡＲを伴わずに本来のネットワークにより注入されたマウスと比較して、ヘマトクリットのより良好な導入を示す。２箇月後、「ＭＡＲ含有グループ」のヘマトクリットはなお、正常なヘマトクリットレベル（４５〜５５％）より高い値（６５％）である。
【図１７】ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ（登録商標）によって算定されるような、ＡＴ（頂部）およびＴＡ（底部）ジヌクレオチド百分率対推定されるＤＮＡの折れ曲がりの１７５７Ｓ／ＭＡＲ配列に対する分散図を表す。
【図１８】１７５７個の非Ｓ／ＭＡＲ配列上のジヌクレオチド百分率分布プロットを表す。
【図１９】組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の産生に対する多様なＳ／ＭＡＲエレメントの効果を示す。示されるようなＭＡＲエレメントを含有するＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の集団を、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ（登録商標））によって解析し、典型的なプロフィールを示す。プロフィールは、ＧＦＰ蛍光レベルの関数としての細胞数カウントを示す。
【図２０】ＭＡＲネットワークにより注入されたマウスにおけるヘマトクリットの誘導の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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