(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ビリオンまたは細胞である、表面を有する生物学的粒子；
該表面と結合される固定ドメインを含む固定タンパク質；
該固定タンパク質に融合されかつ該表面から配置されるリガンド結合ドメインを有するレセプタータンパク質；
該リガンド結合ドメインに結合されるリガンド；および
該リガンドに結合される非生物学的触媒、
を含む、触媒物質組成物であって、
酸化触媒として、細胞、ビリオンおよびタンパク質が分解しない条件下で用いられる触媒物質組成物。
【請求項２】
複数の異なるレセプタータンパク質が複数の固定タンパク質に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生物学的粒子は、酵母細胞、細菌細胞およびビリオンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ビリオンは、λファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｒ１７ファージ、Ｍ１３ファージ、ＭＳ２ファージ、Ｇ４ファージ、Ｐ１ファージ、Ｐ２ファージ、Ｎ４ファージ、Φ６ファージ、およびΦ２９ファージからなる群より選択されるバクテリオファージである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記生物学的粒子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群より選択される属の微生物である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の酵母細胞である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記生物学的粒子は、酵母細胞でありかつ前記固定タンパク質およびレセプタータンパク質は、酵母細胞表面ディスプレイ系を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵母細胞表面ディスプレイ系は、α−アグルチニンに融合されたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー（ａｎｃｈｏｒ）；該細胞表面上にα−アグルチニンのＣ末端領域のジスルフィド結合で合わせられたａ−アグルチニンのＮ末端領域に融合されたＧＰＩアンカー；ＦｌｏｌｐのＣ末端領域に融合されたＧＰＩアンカー；およびＧＰＩなしのＦｌｏｌｐの凝集機能ドメインのＮ末端固定（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）からなる群より選択されるポリペプチド成分を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記レセプタータンパク質は、アビジンとストレプトアビジンからなる群より選択されるタンパク質を含み；前記リガンドはビオチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記レセプタータンパク質はレクチンを含み、前記リガンドは該レクチンに結合するグリカンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記触媒は、［｛Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチリデン）１，２−シクロヘキサンジアミナト（−２−）｝コバルト（２）］、クロロメチルポリスチレン樹脂−１，１０−フェナントロリンルテニウム、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）ファミリーのポリ（エチレングリコール）支持ニトロキシルラジカル、Ｒｈ６クラスター触媒およびＯｓ６クラスター触媒、バナジウム触媒、マンガンポルフィリン、ビス（サリチリデンエチレンジアミン）のＣｏ（ＩＩ）錯体、ニトロキシルラジカル、遷移金属、銅（ｉｉ）イオン、ホモキラルパラジウム錯体、貴金属、ポリマー性の２’−固定，６−固定および６’−固定の２−ジフェニルホスフィノ−１−１’−ビナフチル（ＭＯＰ）リガンド、ならびにオキソアザボリリジン（ｏｘａｚａｂｏｒｏｌｉｄｉｎｅ）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
以下：
ビリオンまたは細胞である、表面を有する生物学的粒子；
該表面に結合された固定ドメインを含む固定タンパク質；
該固定タンパク質に融合されかつ該表面から配置されたリガンド結合ドメインを有するレセプタータンパク質；および
選択された触媒に結合するためのドメインを有する、該リガンド結合ドメインに結合されたリガンド
を含み、前記触媒が酸化触媒である、触媒支持体組成物であって、
細胞、ビリオンおよびタンパク質が分解しない条件下で用いられる、触媒支持体組成物。 
【請求項１３】
化学反応のための反応物と、ビリオンまたは細胞である、表面を有する生物学的粒子、該表面に結合（ｅｎｇａｇｅｄ）された固定ドメインを含む固定タンパク質、該固定タンパク質に融合されかつ該表面から配置されたリガンド結合ドメインを有する、レセプタータンパク質、該リガンド結合ドメインに結合されたリガンド、ならびに該リガンドに結合された非生物学的触媒、を含む触媒物質組成物とを接触させる工程を包含する、化学反応を触媒するための方法であって、前記触媒物質組成物が、酸化触媒として、細胞、ビリオンおよびタンパク質が分解しない条件下で用いられる、方法。
【請求項１４】
ビリオンまたは細胞である、生物学的粒子の表面から非生物学的触媒をディスプレイする工程を包含する、触媒物質組成物を作製するための方法であって、前記触媒物質組成物が、酸化触媒として、細胞、ビリオンおよびタンパク質が分解しない条件下で用いられる、方法。
【請求項１５】
前記生物学的粒子の表面から前記非生物学的触媒をディスプレイする工程は、以下：
外側にディスプレイされたレセプタータンパク質に融合した内側の固定タンパク質を含む、膜貫通融合タンパク質を提供することによって、
少なくとも１種のレセプタータンパク質を該生物学的粒子の表面上にディスプレイする工程；
リガンドに結合された少なくとも１種の非生物学的触媒分子を提供する工程；および
該リガンドを該レセプタータンパク質に結合して、該触媒物質組成物を形成する工程、
を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的粒子は、酵母細胞、細菌細胞およびビリオンからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビリオンは、λファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｒ１７ファージ、Ｍ１３ファージ、ＭＳ２ファージ、Ｇ４ファージ、Ｐ１ファージ、Ｐ２ファージ、Ｎ４ファージ、Φ６ファージ、およびΦ２９ファージからなる群より選択されるバクテリオファージである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的粒子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群より選択される属の微生物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的粒子は、酵母細胞ディスプレイ系の一部である固定タンパク質に融合されるレセプタータンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母細胞表面ディスプレイ系は、α−アグルチニンに融合されたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー；該細胞表面上にα−アグルチニンのＣ末端領域のジスルフィド結合で合わせられたａ−アグルチニンのＮ末端領域に融合されたＧＰＩアンカー；ＦｌｏｌｐのＣ末端領域に融合されたＧＰＩアンカー；およびＧＰＩなしのＦｌｏｌｐの凝集機能ドメインのＮ末端固定からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵母ディスプレイ系は、前記レセプタータンパク質に融合された前記固定タンパク質をコードする組換え核酸配列を含み、該レセプタータンパク質は、前記酵母細胞において該レセプタータンパク質に融合される固定タンパク質を発現するプロモーター配列と、該酵母細胞の表面に該レセプタータンパク質を融合した該固定タンパク質を輸送するように機能するペプチドドメインをコードする輸送配列とともに、作動可能に構成されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換え核酸は、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記レセプタータンパク質は、アビジンとストレプトアビジンからなる群より選択されるタンパク質を含み；前記リガンドはビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記レセプタータンパク質はレクチンであり、前記リガンドは該レクチンに結合するグリカンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記触媒分子は、［｛Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチリデン）１，２−シクロヘキサンジアミナト（−２−）｝コバルト（２）］、クロロメチルポリスチレン樹脂−１，１０−フェナントロリンルテニウム、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）ファミリーのポリ（エチレングリコール）支持ニトロキシルラジカル、Ｒｈ６クラスター触媒およびＯｓ６クラスター触媒、バナジウム触媒、マンガンポルフィリン、ビス（サリチリデンエチレンジアミン）のＣｏ（ＩＩ）錯体、ニトロキシルラジカル、遷移金属、銅（ｉｉ）イオン、ホモキラルパラジウム錯体、貴金属、ポリマー性の２’−固定，６−固定および６’−固定の２−ジフェニルホスフィノ−１−１’−ビナフチル（ＭＯＰ）リガンド、ならびにオキソアザボリリジンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年１０月１３日に出願された、係属中の米国仮特許出願第６０／８５１，４３４号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８５１，４３４号は、あたかも完全に本明細書中に再び記載されているかのように参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、合成触媒用の均質な触媒支持体としての表面ディスプレイ技術の使用に関する。本発明の触媒支持体は、それら表面に触媒の均一な（ｕｎｉｆｏｒｍ）層を含み、均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）触媒の特性を有する触媒を可能にすると同時に、上記触媒の効率的な分離およびリサイクルをさらに可能にする。種々の生物学的支持体が本明細書中に教示されているが、酵母細胞支持触媒（ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｃａｔａｌｙｓｔ）が特に好ましい。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
Ａ．細胞表面ディスプレイ
多くの微生物およびビリオンは、タンパク質がそれら表面に遺伝子的にディスプレイされるように操作され得る。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、しばしばこの目的で使用される。多くの方法、構造、および酵母細胞表面ディスプレイの適用が報告されてきた。非特許文献１；非特許文献２。
【０００４】
ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが哺乳動物細胞のものに類似した、分泌装置およびタンパク質折りたたみ機構の両方を持っていることから、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがタンパク質の細胞表面ディスプレイにとって理想的であると報告している（非特許文献３）。他の利点としては、１細胞あたり多数の表面融合物があること、およびフローサイトメトリーを使用して上記細胞を試験できることが挙げられる（非特許文献３）。酵母細胞は、非特許文献４によって報告されるように、異なる安定性および発現レベルのタンパク質をディスプレイし得る。
【０００５】
酵母細胞表面ディスプレイ技術は、特許文献１（Ｗｉｔｔｒｕｐら，「Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）においてさらに報告されている。Ｗｉｔｔｒｕｐらは、酵母細胞壁にポリペプチドを固定する（ａｎｃｈｏｒ）ための遺伝的方法を報告している。特許文献２（Ｋｉｅｋｅら，「Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，」）は、「目的のポリペプチド」のＮ末端を、酵母Ａｇａ２ｐ細胞壁タンパク質のＣ末端に融合するための方法を報告している。
【０００６】
Ｋｉｅｋｅの方法は、評判によれば、ｓｃＦｖ抗体フラグメントを酵母細胞壁の外部に固定するために使用され得る。酵母細胞表面ディスプレイはまた、抗体エピトープマッピングにおける使用が報告された。非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；Ｗｅａｖｅｒ−Ｆｅｌｄｈａｕｓら，「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ」１８（１１）：５２７−５３６（２００５）；Ｌｉｔｔｌｅら，「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｐｈａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ？」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１９９３）もまた参照のこと。
【０００７】
細胞表面ディスプレイはまた、報告によれば、環境金属（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｌ）の吸収に使用されてきた。Ｗｅｒｎｅｒｕｓ，Ｈ．＆Ｓｔａｈｌ，Ｓ．，「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ−  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：２０９−２２８（２００４）。細胞表面ディスプレイはまた、報告によれば、真核生物細胞ディスプレイライブラリーを固体表面に結合するために使用されてきた。Ｐｅｅｌｌｅら，特許文献３「Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」；Ａｎｄｒｅｓら，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．＆Ｂｉｏｔｅｃｈ．５（３）１６１−１６６（２００３）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからのＺＺドメイン（これは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分に結合する）の発現がまた、報告された。Ｓｈｉｍｏｊｙｏら，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ＩｇＧ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  ＺＺ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ＆Ｂｉｏｅｎｇ．９６（５）：４９３−４９５（２００３）。
【０００８】
Ｋｏｎｄｏは、酵母細胞表面ディスプレイが生体触媒作用のために使用されたことを報告している；しかし、Ｋｏｎｄｏの生体触媒は、それらの一般的適用性を妨げる多くの欠点を有する。例えば、生体触媒は、酵母細胞の表面に直接結合される。このような触媒は、必要性が生じたときに他の触媒の代わりに交換されない可能性があり、そして科の（ｆａｍｉｌｉａｌ）酵母株が単一の生体触媒形態に限定される。さらに、求められていない標的に吸着される生体触媒は、細胞に変更できない損傷を与えることなく、この細胞を除去または分離するのが困難であるかまたは不可能である。生体触媒はまた、伝統的に、細胞表面上に直接発現され得るそれら触媒（例えば、タンパク質分子または酵素）に限定される。
【０００９】
酵母以外の微生物を使用する細胞表面ディスプレイがまた、報告された。例えば、Ｗａｎｇら，「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｎｅｒｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｔｒａｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ」，Ａｐｐ．ａｎｄ  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８（４）：１６８４−１６８９（２００２）は、有機リン化合物加水分解酵素（ＯＰＨ）およびセルロース結合ドメインをディスプレイするあるＥ．ｃｏｌｉ株を使用した、パラチオンおよびパラオクソンの分解を報告している。上記ＯＰＨは、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ融合系または短縮された氷核形成タンパク質アンカー（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｉｃｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｃｈｏｒ）を使用して、細胞表面上に発現された。
【００１０】
Ｂ．触媒支持体
大きさが均一でかつ触媒を触媒支持体の表面を均一に覆うように配置させた触媒支持体が必要である。均一な支持体は、多くの利点を提供し、その利点としては、拡散の効果および触媒部位間の差異を最小にすることが挙げられる。触媒支持体はまた、いくつかの触媒の便利な取り扱いを補助し得る。
【００１１】
概して均一な無機触媒支持体の一例は、特許文献４（Ｙｕｅｎｇら）において見いだされ得る。この特許文献４は、金属酸化物結晶に固定された金属触媒を含む触媒性物質を報告している。この金属触媒は、金属酸化物の表面上のヒドロキシル基との相互作用によって、金属酸化物の表面に固定される。
【００１２】
触媒（例えば、特許文献４において報告されるもの）は、多くの欠点を有する。例えば、これらは、有機的用途には不適切であり得る。さらに、これらは、金属触媒の使用のみを許容し得る。それらの生成はまた、高価であり得、そしてそれらの構築は、触媒再生を困難にし得る。各支持体は、単一の触媒に限定され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，４２３，５３８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３００，０６５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／０００３３８７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／０００９３５４号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｋｏｎｄｏ，Ａ．，およびＵｅｄａ，Ｍ．，「Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｐｌａｙ」，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）６４：２８−４０
【非特許文献２】Ｕｅｄａ，Ｍ．＆  Ｔａｎａｋａ，Ａ．，「Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｍｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ」Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．（２０００）９０（２）：１２５−１３６
【非特許文献３】Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｄ．Ｋ．，「Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９７）１５：５５３−５５７
【非特許文献４】Ｐａｒｋら，「Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ」，ＰＥＤＳ，（２００６）１９（５）：２１１−２１７
【非特許文献５】Ｃｈａｏら，「Ｆｉｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（２００４）３４２（２）：５３９−５５０
【非特許文献６】Ｃｏｌｂｙら，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  （ＶＬ）  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｖｉａ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（２００４）３４２（３）：９０１−９１２
【非特許文献７】Ｍｉｎ  Ｌｉ，「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０００）１８：１２５１−１２５６
【非特許文献８】Ｆｅｌｄｈａｕｓ，ＭＪ．＆Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｗ．，「Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：Ａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４）２９０（１−２）：６９−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の実施形態は、先行技術の上記欠点のうちの１つ以上に対処し得る触媒および触媒支持体を提供する。これら触媒の構築方法、使用方法、および再生方法もまた、提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、生物学的支持体の表面から処理される（ｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｆｒｏｍ）１種以上のレセプタータンパク質を含む触媒物質を提供する。代表的な実施形態において、上記レセプタータンパク質は、上記生物学的支持体の表面を均一に覆うように配置される。上記レセプタータンパク質は、同一のタンパク質であってもよいし、異なるタンパク質であってもよい。各レセプタータンパク質は、生物学的支持体の表面と結合される（ｅｎｇａｇｅｄ）固定タンパク質に連結される。
【００１７】
代表的実施において、上記レセプタータンパク質は、融合タンパク質の形態において上記固定タンパク質に連結され、それによって、上記固定タンパク質ドメインのアミノ酸は、上記レセプタータンパク質のアミノ酸との連続ポリペプチド配列として連結され、それによって、上記固定タンパク質由来の固定ドメインおよび上記レセプタータンパク質由来のリガンド結合ドメインを有する異種融合タンパク質を形成する。上記固定ドメインは、上記生物学的支持体の表面に上に配置される他のタンパク質もしくは炭水化物に結合されるか、それらの中に吸着されるかまたはそれらに架橋されることによって、上記生物学的支持体の表面を結合し得る。代表的には、上記生物学的支持体が細胞である場合、上記固定ドメインは、上記細胞の外膜に埋め込まれるかまたは細胞壁タンパク質もしくは炭水化物に結合する。使用される固定タンパク質に依存して、上記固定ドメインは、上記生物学的支持体の表面内に、例えば、表在性膜タンパク質の形態において、部分的に配置され得るか、または生物学的支持体支持体を貫通して、例えば、内在性膜タンパク質の形態において、伸長し得る。各レセプタータンパク質は、リガンド結合ドメインを含み、リガンド結合ドメインは、リガンドにさらに結合され、次に、各リガンドは、触媒に結合される。レセプター−リガンド結合およびリガンド−触媒結合は、共有結合（例えば、化学的架橋）または非共有結合によって達成され得る。
【００１８】
本発明はさらに、生物学的支持体の表面上にディスプレイされる１種以上のレセプタータンパク質を含む触媒支持体を提供する。上記レセプタータンパク質は、それによって、上記表面を均一に覆うように代表的にはディスプレイされる。上記レセプタータンパク質は、同一のタンパク質であってもよいし、異なるタンパク質であってもよい。上記レセプタータンパク質は、選択されたリガンドに結合するために選択され、この選択されたリガンドは、次いで、支持されるべき選択された触媒に結合するために選択される。
【００１９】
本発明はまた、上記のような触媒物質および／または触媒支持体系を作製するための方法を提供する。１種以上のレセプタータンパク質は、固定タンパク質との融合タンパク質として発現され、生物学的支持体の表面の周りに配置される。一実施形態において、上記タンパク質は、同一のタンパク質であり、そして別の実施形態において、上記タンパク質は、１種以上の異なるタンパク質である。一実施形態において、上記タンパク質は、生物学的支持体の表面の周りに均一にディスプレイされ、触媒支持体物質を形成する。１種以上の触媒分子は、リガンド／触媒構築物を形成するために、それぞれのリガンドに結合される。上記リガンドは、上記レセプタータンパク質の結合ドメインに選択的に結合するかまたは架橋される（本明細書中で「つなぐ（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）」といわれる。）ように設計または選択される。上記レセプタータンパク質をディスプレイする上記リガンド／触媒構築物、および上記生物学的支持体は混合され、上記リガンド／触媒構築物が上記レセプタータンパク質につながれることを可能にし、触媒物質を形成する。
【００２０】
生物学的支持体は、例えば、ビリオンおよび微生物から選択され得る。微生物は、例えば、細菌または酵母であり得る。細菌は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択され得る。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが好ましい細菌である。本発明における使用について、酵母は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属またはＣａｎｄｉｄａ属に由来するものを包含し得る。好ましい酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の単一の酵母細胞表面ディスプレイ触媒系の２次元図を模式的に示す。
【図２】図２は、Ａ  α−アグルチニン（配列番号１）、Ｂ  ａ−アグルチニン（配列番号２）、Ｃ  Ｆｌｏｌｐ（配列番号３）のＣ末端領域、およびＤ  Ｆｌｏｌｐ（配列番号３）のＮ末端凝集機能ドメインを使用する、酵母細胞表面ディスプレイ系を示す。（Ｋｏｎｄｏ，前出；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｓ  ａｎｃｈｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ａｐｐ．＆Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３（２）：６１５−６２０（１９９７））。
【図３】図３は、酵母細胞およびこの酵母細胞の表面に示される１種以上のレセプタータンパク質を含む、触媒性支持体物質を示す。
【図４】図４は、プラスミドｐＣＴ３０２（Ｂｏｄｅｒ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ）を示し、このプラスミドは、ＧＡＬ１，１０ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で酵母Ａｇａ２ｐアグルチニン接合タンパク質への融合物として、レセプタータンパク質を発現するために使用され得る。ｐＣＴ３０２の上記Ｎ末端隣接配列は、配列番号４として示され、そのＣ末端隣接配列は、配列番号５として示される。
【図５】図５は、プラスミドｐＹＤ１（配列番号６）のマップを示す。
【図６】図６は、プラスミドｐＹＤ１（配列番号７）のポリリンカーを示す。
【図７ａ】図７ａは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｃ】図７ｃは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｄ】図７ｄは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｅ】図７ｅは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｆ】図７ｆは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｇ】図７ｇは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｈ】図７ｈは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【図７ｉ】図７ｉは、プラスミドｐＹＤ１の制限マップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
以下の説明は、当業者が本発明の種々の局面を理解または実施するのを補助し得る種々の言及を引用する。このような言及に対する引用は、本発明を実施するために使用され得る、当業者を先行技術のより詳細な技術および例示材料およびシステムに方向付けるために略式の方法として意図される。従って、各々のこのような言及は、その目的を達成するために必要な程度まで、本明細書中に参考として援用される。本明細書中での言及の引用は、このような言及が特許性の何らかの決定のための先行技術を構成するという容認ではない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、本明細書および特許請求の範囲において使用される単数形「ａｎ」、「ａ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のものを示さなければ、単数形および複数形の両方を含む。特に、当業者は、触媒物質および触媒支持体の設計および作製が、単一の細胞または他の生物学的支持体に関して記載される一方で、より有効な系が、１つ以上の細胞または生物学的支持体（各々が、１種以上のレセプタータンパク質を発現する）を含むことを認識する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「固定タンパク質（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、ポリペプチド配列であって、このポリペプチドを生物学的粒子（例えば、細胞、ウイルスまたはビリオン殻）の表面と結合するように機能するアミノ酸配列ドメイン、またはドメインの組み合わせを有するものを意味する。上記ポリペプチド配列は、本質的に天然に存在するようなタンパク質全体を具現化する必要はなく、代表的には具現化しないが、むしろ、その固定ドメインを提供するために必要な十分な量のアミノ酸配列を有するようなタンパク質のフラグメントのみを含む必要がある。特定の場合において、固定ドメインが、細胞の膜（これは、その膜と結合しない１または数個の連続する配列によって隔てられる）内で結合するアミノ酸の２個または数個の連続する配列を含み得ることが、当業者によって理解される。このような場合において、膜と結合しかつ固定機能を提供するために必要であるドメインのみが含まれる必要がある一方で、上記膜と結合しないアミノ酸配列が、全て欠失され得るか、または上記天然に存在するタンパク質に対して異種である配列によって置換され得る。
【００２５】
本発明の一局面は、生物学的支持体表面上に１種以上のレセプタータンパク質をディスプレイする生物学的支持体を含む触媒支持体物質を提供する。上記触媒支持体は、均一の利用性を、レセプタータンパク質につながれるリガンドに結合された触媒に提供する。これら触媒は、有機性であっても無機性であってもよい。先行技術の表面ディスプレイ触媒作用技術とは異なって、上記触媒は、天然の固定タンパク質に融合され得かつ上記生物学的支持体によって発現され得る酵素またはタンパク質に限定されない。
【００２６】
一実施形態において、上記触媒作用支持体物質は、図３によって表されるような、酵母細胞、および上記酵母細胞の表面上にディスプレイされた１種以上のレセプタータンパク質を含む。上記レセプタータンパク質は、天然の酵母細胞機構の機能によって上記細胞壁に固定するタンパク質への融合によって、上記細胞の表面に固定される。例えば、アグルチニンシステムおよびフロキュリン（ｆｌｏｃｃｕｌｉｎ）システムは、当業者に周知であり、そして本発明の実施形態において使用され得る。固定は、例えば、（１）上記レセプタータンパク質がα−アグルチニン構築物のＣ末端側半分に融合されているか；（２）上記レセプタータンパク質がａ−アグルチニン構築物のＮ末端側半分に融合されているか；（３）上記レセプタータンパク質がＦｌｏ１ｐのＣ末端領域に融合されているか；または（４）上記レセプタータンパク質がＦｌｏ１ｐの凝集機能ドメインに融合されている、融合タンパク質を作製することによって達成され得る。考えられるレセプタータンパク質としては、アビジン（配列番号２６）、セルロース結合ドメイン、レクチン、および抗体結合ドメインが挙げられる。
【００２７】
本発明の一実施形態において、上記レセプタータンパク質は、上記酵母細胞に付加されたかまたは上記酵母細胞の親に付加されたかのいずれかである１種以上の遺伝子の発現によって、上記酵母細胞に導入される。遺伝子は、例えば、リチウム塩、スフェロプラスト、遺伝子銃、またはエレクトロポレーションを使用する形質転換によって、付加され得る。
【００２８】
触媒作用支持体物質を作製するための方法はまた、本明細書に提供される。本発明の一実施形態において、生物学的支持体は、上記酵母細胞の外膜に運ばれる天然の酵母タンパク質に融合されるレセプタータンパク質を発現する。１種以上のレセプタータンパク質が、上記酵母細胞の表面の周りにディスプレイされる。上記レセプタータンパク質は、同一のタンパク質であってもよいし、異なるタンパク質であってもよい。上記レセプタータンパク質は、上記酵母細胞の表面の周りに均一に配置され得る。上記レセプタータンパク質は、上記触媒支持体系によって支持されるべき触媒に接着され得るリガンドに結合する。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態において、本発明は、触媒物質を含む。上記触媒物質は、リガンドに結合される有機触媒または無機触媒を含み、上記リガンドは、次に、本明細書に記載されるような酵母触媒作用性支持体物質上のレセプタータンパク質につながれる。本発明の触媒物質は、図１において二次元図に示される。上記触媒は、上記酵母細胞表面上の単層を形成する。これは、均質な触媒作用の特性を与え、さらに、上記触媒の効率的な分離および迅速なリサイクルを可能にする。
【００３０】
Ｉ．細胞および他の生物学的支持体
種々の生物学的細胞は、本発明の実施形態における使用に適切である。当業者は、多くの微生物株が本発明の実施形態における使用に適していることを認識する。酵母株が好ましい。酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、本発明の実施形態において特に有用である。なぜなら、一部は、酵母ゲノムは広範囲に研究されているからであり、食品医薬品局によるＧＲＡＳ（「一般に安全と考えられる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）」）状態を享受するからである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、迅速に増殖し得かつ融通の利くＤＮＡ形質転換系を有するモデル真核生物として認識される。
【００３１】
背景情報、ならびに一般に酵母、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを増殖し、試験しそして保存するための例示的方法および培地は、例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，「Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｙｅａｓｔ」，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．（Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，「Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｙｅａｓｔ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３５０：３−４１（２００２）（本明細書中以降「Ｓｈｅｒｍａｎ（Ｉ）」）から改作されている）において；そしてＳｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．（１９９８）（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，「Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」６：３０２−３２５（Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓにより編集，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９７）から変更）；ならびにＢｕｒｋｅ，Ｄ．ら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）；Ｃｏｌｂｙら，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｙ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３４８−５８（２００４）に見いだされる。
【００３２】
いくつかの非酵母微生物およびビリオンはまた、研究されかつ本発明の実施形態において有用であり得るディスプレイ機構を有する。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、ＰｇｓＡアンカーの補助により、酵素の表面ディスプレイのために使用され得る。Ｎａｒｉｔａら，「Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ＰｇｓＡ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ」，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５）。アンカーとしてｆａｄＬを使用するリパーゼのディスプレイが報告された。Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．ら，「Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＦａｄＬ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ」，Ａｐｐｌ．＆Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（９）：５０７４−８０（２００４）。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ上でのタンパク質の細胞表面ディスプレイがまた報告された。Ｓｔｅｉｄｌｅｒら，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  Ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ａｎｃｈｏｒ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ」  Ａｐｐｌ．＆Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（１）：３４２−３４５（１９９８）。
【００３３】
他の実施形態において、上記生物学的支持体はビリオンであり得る。ビリオンは、完全なビリオン粒子としてかまたは「裸の」ビリオンと呼ばれるかのいずれかである（これらは、ウイルスゲノムを欠いているウイルス粒子である）、真核生物ウイルスまたはバクテリオファージであり得る。適切な真核生物ウイルスとしては、遺伝子操作目的で一般に使用されるものが挙げられ、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。同様に、適切なバクテリオファージとしては、例えば、λファージ（Ｌｙｓｏｇｅｎ）、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｒ１７ファージ、Ｍ１３ファージ、ＭＳ２ファージ、Ｇ４ファージ、Ｐ１ファージ、Ｐ２ファージ、Ｎ４ファージ、φ６ファージ、およびφ２９ファージが挙げられる。Ｍ１３の繊維状ファージ（Ｍ１３、ｆｄ、およびｆｌが挙げられるが、これらに限定されない）が好ましい。バクテリオファージの表面上にレセプターをディスプレイする方法は、当該分野で周知である。ファージディスプレイは、例えば、Ｗｉｌｌａｔｓ，Ｗ．Ｇ．Ｔ．，「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０：８７３−５４（２００２）；Ｂａｓｓら，「Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｈａｇｅ：Ａｎ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：３０９−３１４（１９９０）；およびＺｕｃｃｏｎｉら，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｐａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｏｊａｎｉｎ  １」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：１３２９−１３３９（２００１）（これらは全て、本明細書に参考として援用される）に報告されている。アビジンディスプレイバキュロウイルスの作製および使用は、Ｒａｔｙら，「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ」，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（２）：２８２−２９１（２００４）によって報告されている。バクテリオファージＴ７を使用する表面ディスプレイは、「Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ」，ＴＢ  １７８  Ｒｅｖ．Ｂ０２０３，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．による著作権（２００３）において報告されている。
【００３４】
ＩＩ．固定タンパク質
当業者は、種々の固定タンパク質が本発明の実施形態において使用され得ることを認識する。理想的には、固定タンパク質は、細胞機能または細胞構造にとって必須ではなく、それによって、細胞または他の生物学的支持体に対する増殖欠陥または機能的問題を避ける。Ｌｅｅら，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（１）：４５−５２（２００３）。Ｌｅｅらは、固定タンパク質の有益な特徴を報告している：
首尾よいキャリアは、以下の４つの要件を満たすべきである：上記キャリアは、未熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）融合タンパク質が内膜を通って行くことを可能にするのに効率的なシグナルペプチドまたは輸送シグナルを有するべきである；上記キャリアは、細胞表面上に融合タンパク質を分離することなく保持するために、強い固定構造（ｓｔｒａｉｎ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有するべきである；上記キャリアは、挿入または融合されるべき外来の配列と適合性であるべきである（すなわち、上記キャリアは、異種配列の挿入または融合に対して不安定にならないはずである）；そして、上記キャリアは、細胞周辺腔または培地中に存在するプロテアーゼによる攻撃に抵抗するべきである。
【００３５】
ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（前出）は、目的のタンパク質に融合され得かつ細胞壁に固定され得る２種の細胞表面レセプターを報告している。これらレセプター（ａ−アグルチニンおよびα−アグルチニン）は、酵母が二倍体形成の前に細胞融合を可能にするために通常使用される。
【００３６】
ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁上での機能的抗フルオレセインｓｃＦｖおよびｃ−ｍｙｃエピトープタグの酵母細胞表面ディスプレイの開発において、ａ−アグルチニンを使用することを報告している。彼らは、このことがＡｇａ２タンパク質（配列番号８）へ目的のタンパク質をＣ末端融合することによって達成されたことを主張している。上記Ａｇａ２タンパク質は、Ａｇａｌタンパク質サブユニット（配列番号２）にジスルフィド結合によって連結される。次に、上記Ａｇａｌサブユニットは、β−グルカン共有結合によって細胞壁に固定される。ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐは、Ａｇａ２−ｓｃＦｖ融合物が誘導性ＧＡＬ１プロモーター（配列番号９）の制御下に置かれているベクターの構築物をさらに報告している。上記Ａｇａｌタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１０に示される。上記Ａｇａ２タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１１に示される。α−アグルチニン遺伝子（ｓａｇｌ）をコードする核酸配列は、配列番号１２に報告される。
【００３７】
これらタンパク質を固定するための多くの方法が、図１に示されるように、記載されてきた。これら方法としては、α−アグルチニンのＣ末端側半分のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー接着、ａ−アグルチニンのＮ末端側半分のＧＰＩアンカー接着（Ｃ末端部分への硫黄結合と組み合わせられる）、フロキュリンＦｌｏｌｐのＣ末端領域のＧＰＩ固定、フロキュリンＦｌｏｌｐのＮ末端固定（ＧＰＩ固定なし）が挙げられる。フロキュリンＦｌｏｌｐ（配列番号３）のＣ末端領域の上記ＧＰＩアンカー長は、例えば、４２アミノ酸、１０２アミノ酸、１４６アミノ酸、３１８アミノ酸、４２８アミノ酸、および１３２６アミノ酸の長さを有し得る。Ｆｌｏｌｐは、例えば、配列番号１３の核酸配列によってコードされる。ＧＰＩアンカー（これは、タンパク質−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＰＯ４−６−マンノース（Ｍａｎ）α１，２−Ｍａｎ−α１，６−Ｍａｎ−α１，４−ＧｌｃＮ−α１，６−イノシトール−ＰＯ４−脂質の保存されたコア構造を有する）は、Ｎｅｗｍａｎら，「Ｇｐｉ１９，ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＰＩＧ−Ｐ，  Ｉｓ  ａ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，４（１１）：１８０１−１８０７（２００５）；Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒら，「Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ａｕｘｉｌｉａｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＧＰＩ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，２５：３６７−３８５（２００３）；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．＆Ｉｎｏｕｅ，Ｎ．，「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ａｎｃｈｏｒ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：６３２−６３８（２０００）；ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅ，Ｍ．Ｊ．＆Ｍｅｎｏｎ，Ａ．Ｋ．，「Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ｌｉｐｉｄｓ」，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１７：１−１７（２０００）；Ｐｒｉｎｇｌｅら，（編），「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．におけるＯｒｌｅａｎ，Ｐ．，「Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｗａｌｌ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」，ｐ．２２９−３６２；ならびにＴｉｅｄｅら，「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ」，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：５０３−５２３（１９９９）において議論されている。
【００３８】
酵母細胞において有用な他の固定タンパク質は、本発明の実施形態において使用され得る。これらとしては、例えば、例えば、配列番号２１の核酸配列によってコードされるＣｗｐｌｐ（配列番号１４）のＣ末端フラグメント；例えば、配列番号２２の核酸配列によってコードされるＣｗｐ２ｐ（配列番号１５）；例えば、配列番号２３の核酸配列によってコードされるＴｉｐｌｐ（配列番号１６）；例えば、配列番号２４の核酸配列によってコードされるＴｉｒｌｐ（配列番号１７）；例えば、配列番号３８の核酸配列によってコードされるＳｅｄｌｐ（配列番号１８）；ＹＣＲ８９（配列番号２５）のフラグメントであるＹＣＲ８９−３１３（配列番号１９）；ＹＣＲ８９−７４４（配列番号２０）、Ｆｌｏｌｐ−３４４、およびＦｌｏｌｐ−５９６が挙げられるが、これらに限定されない。これら固定タンパク質の使用方法、およびそれらの効力は、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｓ  ａｎｃｈｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ａｐｐ．＆Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３（２）：６１５−６２０（１９９７）に報告されている。
【００３９】
ＩＩＩ．レセプタータンパク質
広い範囲のタンパク質が、報告されるところによれば、細胞表面上にディスプレイされてきた。これらタンパク質は、細胞の形質膜を貫通して伸びることによってかまたは細胞膜表面との共有結合的相互作用もしくは非共有結合的相互作用によってかのいずれかで、細胞の外側にディスプレイされ得る。代表的には、酵母細胞は、上記細胞の表面上にタンパク質を発現することによって、そして上記タンパク質を、上記固定タンパク質のうちの１つと融合することによって、つなげられる（ａｒｍｅｄ）。必須ではないものの、理想的には、上記融合タンパク質をコードする遺伝子は、上記酵母細胞のゲノムに組み込まれ得る。この組み込みは、当業者に公知の方法によって達成され得る。例えば、上記酵母細胞は、リチウム塩法、組み込み複製ベクター、スフェロプラスト、「遺伝子銃」、またはエレクトロポレーションを使用して形質転換され得る。
【００４０】
Ｋｏｎｄｏ（前出）によれば、報告されるところによれば、α−アグルチニン結合を用いて酵母細胞の表面上にディスプレイされたタンパク質としては、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ  β−グルコシダーゼ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉエンドグルカナーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅリパーゼ、およびＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ（ＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、アポエクオリン、ヘキサ−Ｈｉｓ、ＺＺ、および抗体のＦａｂフラグメントを含む）が挙げられる。ａ−アグルチニン系を用いてディスプレイされたタンパク質としては、一本鎖抗体および一本鎖Ｔ細胞レセプターが挙げられる。ＦｌｏｌｐのＣ末端領域を用いてディスプレイされたタンパク質としては、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼおよびＥＧＦＰが挙げられる。Ｆｌｏｌｐの凝集機能ドメインを用いてディスプレイされたタンパク質としては、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅリパーゼおよびＥＧＦＰが挙げられる。当業者は、この開示の利益から、ディスプレイされ得る他のタンパク質を認識する。
【００４１】
適切な結合するリガンドの本体は、触媒作用支持体物質によって示されるレセプタータンパク質に依存して変化する。例えば、上記触媒支持体がレクチンをディスプレイするのであれば、有機性触媒は、そのレクチンと結合するグリカンが、上記触媒上の側鎖に接着されるように改変され得る。
【００４２】
上記触媒支持体はまた、抗原抗体結合対のうちの一方のメンバーをディスプレイし得る。用語「抗体」は、可変性領域および定常領域（ここで上記可変領域が抗原に結合する）を有する任意のタンパク質分子を含むために、最も広い範囲で本明細書において使用される。従って、用語抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡクラスのＳｃＦｖ分子、一本鎖Ｔ細胞レセプター分子、ならびにジスルフィド結合によって連結された一本鎖Ｔ細胞レセプター分子の複数鎖バージョンを包含する。上記触媒支持体が抗体に融合された固定タンパク質を含む場合、上記抗体は、好ましくは、ＳｃＦｖであり、その大部分の場合、上記リガンドは、その対応する抗原である。上記抗原は、少なくとも、上記抗体を結合するエピトープタグを含み、上記リガンドまたはリガンド触媒対をつなぐために使用され得る１種以上の非エピトープ領域もまた含み得る。Ｋｉｅｋｅらは、エピトープタグとして使用され得る多くのポリペプチド配列を報告している。Ｋｉｅｋｅによって報告されたタンパク質は、表面タンパク質によって融合され得、抗体によって結合され得る。本明細書中の開示を利用して、当業者は、Ｋｉｅｋｅの抗体が触媒に結合され得、次に、それらエピトープタグをディスプレイする細胞表面につながれることに気づく。
【００４３】
当業者は、本発明における使用に適切であり得る他のレセプター／リガンド組み合わせを企図する。これらは、例えば、アビジン／ビオチン組み合わせおよびストレプトアビジン／ビオチン組み合わせを含む。
【００４４】
レセプタータンパク質を発現する酵母細胞は、上記ディスプレイされたレセプタータンパク質に結合するように設計されたリガンドに結合され得る任意の触媒のための触媒作用支持体物質として作用し得る。従って、単一の酵母系統が、支持体に使用され得、次に、複数触媒に使用され得る。
【００４５】
ビオチン／アビジン相互作用
好ましい実施形態において、ビオチン／アビジン結合は、上記レセプタータンパク質に上記触媒をつなぐために使用され得る。ビオチン／ストレプトアビジン結合もまた、使用され得る。これらは、例えば、アビジンもしくはストレプトアビジンを酵母細胞の表面上にレセプタータンパク質としてディスプレイし、ビオチンを上記触媒に結合させることによって達成され得る。上記細胞および触媒は混合され、強いビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンの結合相互作用が、上記細胞に上記触媒をつなぐ。
【００４６】
上記ビオチン／アビジン相互作用は、広く研究されてきており、同様に、ビオチン化に必要とされる手順および試薬が広く研究されてきている。ビオチン／アビジン化学作用およびビオチン／ストレプトアビジン化学作用は、ビオチン化のための試薬および方法、ならびにビオチン化分子の検出を含め、Ｍ．Ｄ．Ｓａｖａｇｅら，「Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，１９９２）において議論されている。ストレプトアビジンとともに組み込んだビオチン化金属触媒を使用する金属酵素の作製は、Ｓｋａｎｄｅｒら，「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｖｉｄｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：（Ｓ）−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｏｌｖｅｎｔ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｐａｃｅｒｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４８１５−４８１７（２００５）において報告されている。
【００４７】
タンパク質（抗原および抗体の両方を含む）のビオチン化は、ＥＬＩＳＡ／ＥＩＡ手順において広く使用されている。この広範にわたる使用は、当業者がどのようにして分子を最もよくビオチン化するかを決定する方法および試薬のライブラリーを提供する。この開示の利益から、それら技術は、酵母細胞につながれるべき触媒をビオチン化するために使用され得る。例えば、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌは、ロングアームビオチン（ｌｏｎｇ−ａｒｍ  ｂｉｏｔｉｎ）（アミノヘキサノイル−ビオチン  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用して、タンパク質のビオチン化するための以下の試薬および方法を報告している。上記ＡＤＩビオチン化は、上記ビオチン化タンパク質上に少なくとも１つの遊離アミノ基を要し、理想的には、そのタンパク質は、カップリング効率を改善するために、アミン含有緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）を含まない：
ＡＤＩキット中に提供される試薬：
１．ビオチン１バイアル（１０ｍｇ；Ｃａｔ＃８０３０１）
２．結合緩衝液（ｐＨ８．４，１００ｍｌ，Ｃａｔ＃８０３０２）
３．安定化緩衝液；５ｍｌ，Ｃａｔ＃８０３０３。
【００４８】
必要であるがＡＤＩキット中に提供されていない試薬：
１．結合体を透析するためのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（０．２６ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、２．１７ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、および８．７１ｇのＮａＣｌを１Ｌ  Ｈ２Ｏに溶解する）。
２．透析バッグ（カットオフサイズ＜１０，０００ｋＤａ）
３．ビオチンを溶解するためのＤＭＦ。
【００４９】
手順
１．１×結合緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．４）中で結合させるためにタンパク質を徹底的に透析する。上記タンパク質濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌであるべきである。上記タンパク質が純粋形態であるかまたは生理食塩水中もしくはＨ２Ｏ中に存在するのであれば、１０×結合緩衝液を添加し、透析を省略することによって、そのｐＨを調整することが可能である。
２．使用前に、ビオチンをＤＭＦ中に、１０ｍｇ／ｍｌで溶解する。所定の比率の溶解したビオチンタンパク質溶液を、タンパク質溶液に、連続して混合しながらゆっくりと添加する。１：１０（ビオチン：タンパク質）の比率が、ヤギ抗体またはウサギ抗体のために使用され得る。室温で１時間または４℃で一晩、それを混合する。
３．そのビオチン−結合体をＰＢＳに対して４℃で徹底的に透析する。
４．安定化緩衝液を、その透析した結合体に添加する（出発タンパク質容量各５００μｌに対して２ｍｌ添加する）。
５．その結合体は、４℃で６ヶ月間まで保持され得る。凍結および融解を回避する。
【００５０】
アビジンをコードする代表的な核酸配列は、配列番号２８に提供される。ストレプトアビジンをコードする代表的な核酸配列は、配列番号２９に提供される。アビジンの代表的なアミノ酸配列は、配列番号２６に提供される。ストレプトアビジンの代表的なアミノ酸配列は、配列番号２７に提供される。
【００５１】
ＩＶ．プラスミド
多くのプラスミドが、固定タンパク質、レセプタータンパク質およびこれらの融合物の発現のために適切である。多くのプラスミドがまた、酵母ゲノムへのこれらタンパク質をコードする核酸の組み込みのためおよびそのコード配列の発現のために利用可能である。発現プラスミドは、代表的には、上記タンパク質をコードする核酸の発現のためのプロモーターエレメントを含む。発現プラスミドはまた、発現されたタンパク質を細胞表面にタンパク質を運ぶための細胞輸送装置に指向するように、コード配列への融合のために、シグナルペプチドおよび輸送ペプチド配列（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得る。Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，「Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：４３０−４４４（２０００）（本明細書中以降「Ｂｏｄｅｒ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ（ＩＩ）」）は、ｐＣＴ３０２プラスミドの構築を報告している。このｐＣＴ３０２プラスミド（図４に示される）は、Ａｇａ２ｐアグルチニン接合タンパク質へのタンパク質融合物の発現を可能にする。発現は、ＧＡＬ１，１０ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある。上記プロモーターの５’隣接配列（配列番号４）および３’隣接配列（配列番号５）の両方が報告された。Ｂｏｄｅｒ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ（ＩＩ）はまた、この報告されたプラスミドの使用を通じて、細胞表面上に固定されたタンパク質の検出法を報告している。
【００５２】
酵母細胞表面ディスプレイに有用な別のプラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるｐＹＤ１  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔである。ｐＹＤ１（配列番号６）のマップは、図５として含められる。ｐＹＤ１のポリリンカー（配列番号７）は、図６として含められ、制限マップは、図７として含められる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによれば、「ｐＹＤ１は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の細胞外表面上にタンパク質を発現、分泌、およびディスプレイするために設計された、５．０ｋｂの発現ベクターである。このベクターの特徴は、発現されるタンパク質の制御された発現、分泌および検出を可能にする・・・。」このベクターは、以下のエレメントを含む：
（ａ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＧＡ２遺伝子。この遺伝子は、ａ−アグルチニンレセプターのサブユニットのうちの１つをコードする。ＡＧＡ２への目的の遺伝子の融合は、目的のタンパク質の分泌およびディスプレイを可能にする。
【００５３】
（ｂ）ＡＧＡ２遺伝子融合物の制御された発現のためのＧＡＬ１プロモーター
（ｃ）ディスプレイされるタンパク質の検出のためのＸｐｒｅｓｓＴＭエピトープおよびＶ５エピトープ
（ｄ）検出および金属キレート化樹脂上での考えられる精製のためのポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ
（ｅ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける選択のためのＴＲＰｌ遺伝子
（ｆ）酵母における安定なエピソーム複製のためのＣＥＮ６／ＡＲＳ４
（ｇ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および複製のためのアンピシリン耐性遺伝子およびｐＵＣ起点。
ｐＹＤ１プラスミドの調製および使用のための方法は、「ｐＹＤ１  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ」，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｖ８３５−０１，Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １０，２００２，２５−０２５９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに示されている。
【００５４】
Ｖ．触媒
種々の触媒が、本発明の実施形態において有用である。本発明における使用に適切であるために、触媒は、レセプタータンパク質につながれる（例えば、吸着されるかまたは結合されるかのいずれか）リガンドに、触媒が結合されるように、改変され得るべきである。次に、上記レセプタータンパク質は、細胞表面に固定される。理想的には、触媒はまた、上記酵母細胞によって有害でもなく、破壊的でもないべきである。触媒は、無機性であってもよいし、有機性であってもよい。
【００５５】
例えば、［｛Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチリデン）１，２−シクロヘキサンジアミナト（−２−）｝コバルト（２）］は、グリカンが上記触媒の側鎖に接着されるように、改変され得る。このグリカンに適切なレクチンは、上記酵母触媒支持体上にディスプレイされる。上記グリカン保有コバルト触媒およびレクチンディスプレイ酵母支持体は混合され、コバルト触媒が酵母支持体に吸着されるのを可能にする。このことは、コバルト触媒を酵母に固定化し、コバルト触媒が酸化反応において使用されることを可能にする。
【００５６】
酸化反応および還元反応に有用な多くの触媒が、本明細書において教示されるように、リガンドに結合され得、細胞表面、特に酵母細胞表面につながれ得る。例えば、触媒は、遷移金属、ニトロキシルラジカル、または支持貴金属であり得る。以下の支持触媒は、当業者に公知でありかつ本明細書に示される方法に従ってビオチン化され得、次いで、アビジンディスプレイ酵母細胞もしくはストレプトアビジンディスプレイ酵母細胞につながれる。上記酵母細胞は、各場合において記載される支持体として作用する。各触媒は、触媒：クロロメチルポリスチレン樹脂−１，１０−フェナントロリンルテニウム（Ｋａｎｇ，Ｑ．ら，「Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｕｎｄｅｒ  Ｍｉｌｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」，Ｊ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．，２６：６９０（２００５））；２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）ファミリーのポリ（エチレングリコール）支持ニトロキシルラジカル（Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｐ．ら，「Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｎｉｔｒｏｘｙｌ  Ｒａｄｉｃａｌｓ」，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，６１：３−４（２００５））およびＣｉｒｉｍｉｎｎａら，「Ｓｏｌ−ｇｅｌ  Ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  ＴＥＭＰＯ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌ  α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ」，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４４１−１４４２（２０００）；Ｒｈ６クラスター触媒およびＯｓ６クラスター触媒（Ｐｏｍｏｇａｉｌｏ，Ｓ．Ｉ．ら，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｎｏｂｌｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ」，ＰＭＳＥ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，９３：９４５（２００５））；バナジウム触媒（Ｋｉｒｉｈａｒａ，Ｍ．ら，「Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｖａｎａｄｉｕｍ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」，ＩＴＥ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５（５）：４７９−４８２（２００４）；マンガンポルフィリン（Ｍｏｇｈａｄａｍ，Ｍ．ら，「Ａ  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｕｓｅ  ａｓ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２１７（１−２）：９−１２（２００４）；ビス（サリチリデンエチレンジアミン）のＣｏ（ＩＩ）錯体（ＣｏＳａｌｅｎ）（Ｆｉｎａｓｈｉｎａ，Ｅ．Ｄ．ら，「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｏ（ＩＩ）  Ｓａｌｅｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，２０４：２０５−２１７��２００３）；銅（ｉｉ）イオン（Ｏｗｓｉｄ，Ｉ．ら，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｕ（ＩＩ）  Ｉｏｎｓ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ」，Ｚｅｓｚｙｔｙ  Ｎａｕｋｏｗｅ  Ｐｏｌｉｔｅｃｈｎｉｋｉ  Ｓｌａｓｋｉｅｊ，Ｃｈｅｍｉａ，１４６：１１３−１１６（２００１）；ホモキラルパラジウム錯体  ポリマー性ポリマー性の２’−固定，６−固定および６’−固定の２−ジフェニルホスフィノ−１−１’−ビナフチル（ＭＯＰ）リガンド（Ｈｏｃｋｅ，Ｈ．＆Ｕｏｚｕｍｉ，Ｙ．，「ＰＳ−ＰＥＧ  Ｒｅｓｉｎ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ＭＯＰ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  π−ａｌｌｙｌｉｃ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６０（４１）：９２９７−９３０６（２００４）；オキソアザボリリジン（ｏｘａｚａｂｏｒｏｌｉｄｉｎｅ）（Ｆｒａｎｏｔ，Ｃら，「Ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｏｕｎｄ  Ｏｘａｚａｂｏｒｏｌｉｄｉｎｅ  Ｃａｔａｌｙｓｔ：Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｏｒａｎｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｋｅｔｏｎｅｓ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，６（１１）：２７５５−６６（１９９５）を記載する刊行物によって理解される。
【００５７】
複数の触媒が、単一の細胞表面につながれ得る。上記細胞が単一のタイプのレセプタータンパク質のみを有しているのであれば、これは、各触媒を同一のリガンドに結合させることによって達成され得る。例えば、上記細胞表面がアビジンをディスプレイしているのであれば、２種以上の異なる触媒が、別個のビオチン分子に接着され得る。類似の結果が、細胞の表面上に１種より多いレセプタータンパク質を発現させ、次いで、異なるリガンド（各リガンドは、異なるレセプタータンパク質に結合するように設計され得る）に結合される異なる触媒を提供することによって達成され得る。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本発明の実施にあたって、当業者を導くことが意図される。実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって外延が規定される。
【００５９】
（実施例１）
実施例１は、ｓｅｃ−フェネチルアルコールのアミノスルホンアミドルテニウム錯体酸化を提供する。この触媒ビオチン複合体は、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｔら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２５（２００３）に報告される方法によって調製する。この複合体を、水中でアビジンディスプレイ酵母と混合して、固定化無機触媒／酵母複合体を調製し、この酵母を、全ての非結合触媒から遠心分離によって分離する。以下の条件下で酸化を行う：室温で９０時間、窒素雰囲気：６２．５ミリモルのフェネチルアルコール、および７５ミルモルのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを、５００ｍｌの水と１００ｍｌのアセトンとの混合物中で混合する。この混合物に、０．２５ミリモルのビオチン金属酵素複合体を有する固定化複合体を添加する。反応が完了すると、酸化フェネチルアルコールが観察される。上記酵母金属酵素複合体を、濾過または遠心分離により、反応混合物から除去する。
【００６０】
（実施例２）
実施例２は、ビオチン化触媒合成を提供する。ビオチン（０．１ｍｏｌ）を、６０℃で、９０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解する。（上記アミドの１つの合成は、Ｓ．Ａｍｓｌｉｎｇｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６０（２００４）１１５６５−１１５６９に報告されている）。次いで、上記溶液を室温に冷却し、０．１ｍｏｌのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを窒素下で添加する（約７時間）。反応が完了したときに、二酸化炭素放出は止まる。等モル量（０．１ｍｏｌ）の所定のＮＨ２−Ｒ（ここでＲは適切な触媒作用部位である）を、１２５ｍＬのＤＭＦ中で添加し、２４時間攪拌する。例えば、上記ＮＨ２−Ｒ化合物は、アミノ−ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシ−４−ピペリジニル）アミンであり得る。ＤＭＦを、６０℃で、真空下で除去し、次いで、その生成物を、フラッシュクロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーまたは再結晶化によって精製し得る。
【００６１】
（実施例３）
実施例３は、アビジン酵母細胞表面ディスプレイプラスミドの構築を報告する。短縮化アビジンタンパク質（配列番号４２）をコードする短縮化アビジンＤＮＡ（配列番号４１）を、ＰＣＲのテンプレートとしてニワトリアビジンｃＤＮＡクローンを使用して、以下のプライマーを使用する３０サイクルのＰＣＲ増幅によって行う：順方向，ＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＣＴＧ（配列番号３０）および逆方向，ＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＣＧ（配列番号３１）。この増幅したＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結する。
【００６２】
得られたクローンをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、形質転換体を単離し、配列決定して、アビジンおよびａｇａ２タンパク質の適切なインフレーム融合物を確認する。次いで、正確な構築物を、コンピテントＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を調製するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ  Ｋｉｔを用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＢＹ１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。アビジン−Ａｇａ２融合タンパク質の発現を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に従って、２％  ガラクトースを含有するＹＮＢ−ＣＡＡ培地中、少なくとも約４時間、形質転換細胞を増殖させることによって達成する。アビジン分子の細胞表面ディスプレイは、蛍光分子（例えば、Ａｔｔｏ  ４２５−ビオチン（Ｆｌｕｋａから市販）と結合体化したビオチンを使用して確認される。
【００６３】
（実施例４）
実施例４は、グルコピラノシドのＴＥＭＰＯ触媒酸化を提供する。ｔｅｍｐｏ／ビオチン複合体は、実施例２の方法によって調製される。次いで、この複合体を、アビジンタンパク質をディスプレイして、固定化Ｔｅｍｐｏ複合体を形成する酵母細胞の懸濁物と混合し；非結合Ｔｅｍｐｏを、遠心分離によって酵母から分離する。この複合体を、ｐＨ１０および２０℃において、αメチルグルコシド（２５ｍＭ）およびＮａＯＣｌ（５０ｍＭ）の水溶液と混合する。反応が完了すると、αメチルグルクロン酸が観察される。上記触媒複合体は、遠心分離によって上記混合物から容易に分離される。例えば、Ｒ．  Ｃｉｒｉｍｉｎｎａら，「Ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  ＴＥＭＰＯ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ」，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１４４１−１４４２（２０００）から、上記ＴＥＭＰＯ触媒に関するさらなる情報が得られ得る。
【００６４】
（実施例５）
実施例５は、カップリング酵素反応を示す。グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼのビオチン化形態は、上記で議論されるように調製される。これらを、６  ＩＵのカタラーゼ  対  １  ＩＵのグルコースオキシダーゼの割合で混合する。アビジンをディスプレイする酵母細胞を、酵素活性の全てを吸収する量でこの混合物に添加する。この触媒作用性複合体を、約２５℃で６．０にｐＨ制御した１０％  デキストロース溶液に添加する。約２４時間通気する。この反応が完了すると、グルコン酸が観察され、この反応の間に精製された過酸化水素の全てが、カタラーゼによって分解される。この触媒複合体は、濾過によって容易に回収される。
【００６５】
一般に、酵素の挙動および触媒作製に関するさらなるガイダンスは、Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０１：５７１６−５７２２（２００４）、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．およびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，「Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ａ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  ｂｙ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅｒｈｏｄｉｕｍ（Ｉ）  Ｍｏｉｅｔｙ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１００：３０６−３０７（１９７８）；ならびにＣ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓら，「Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌｓ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｖｉｄｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，６９０：４４８８（２００５）から得られ得る。
【００６６】
（実施例６）
実施例６は、ストレプトアビジンが表面上にディスプレイされたＴ７バクテリオファージの構築を示す。短縮化ストレプトアビジンタンパク質（配列番号４４）をコードする短縮化ストレプトアビジンＤＮＡ（配列番号４３）を、以下のプライマー：
順方向，ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＧ（配列番号３２）および逆方向，ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＣ（配列番号３３）、
を使用して、ならびにテンプレートとしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ（ＡＴＣＣ  ２７４１９Ｄ）のゲノムＤＮＡを使用して、３０サイクルのＰＣＲ増幅によって作製する。
【００６７】
上記増幅ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＮｏｖａｇｅｎのＴ７Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ中で提供される、ＮｏｖａｇｅｎのＴ７Ｓｅｌｅｃｔ  １０−３ｂ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩベクターアームに連結する。この連結反応物を、Ｎｏｖａｇｅｎによって供給される手順に従うインビトロパッケージングのために、Ｔ７パッケージング抽出物に添加する。種々のクローンを配列決定のために選択し、Ｔ７キャプシドタンパク質１０Ｂへの上記ストレプトアビジン遺伝子の適切な融合物を有するものを、さらなる研究のために選択する。表面上にアビジンがディスプレイされた正確なＴ７ファージを適用し、ファージ粒子を回収する。
【００６８】
（実施例７）
実施例７は、Ｅ．ｃｏｌｉの株の細胞表面上にストレプトアビジンをディスプレイするためのプラスミドの構築を報告する。短縮化ｆａｄＬ遺伝子（配列番号４０）を、以下のプライマー：
順方向，ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣ（配列番号３４）および逆方向，ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＧＡＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣ（配列番号３５）
を使用して、ならびにＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ７００９２６Ｄ）を使用して、ＰＣＲ増幅によってクローニングする。
【００６９】
このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａにクローニングして、ｐＴｒｃＦａｄＬといわれるプラスミドを作製する。このストレプトアビジンＤＮＡを、以下のプライマー：
順方向，ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＧ（配列番号３６）、および逆方向，ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＣ（配列番号３３）を使用して、ならびにテンプレートとしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ（ＡＴＣＣ  ２７４１９Ｄ）ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲによって作製する。
【００７０】
上記ストレプトアビジンＤＮＡを、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃＦａｄＬに連結する。これは、ｐＴｒｃＦａｄＬ−ストレプトアビジン（配列番号３７）といわれるプラスミドを生じ、このプラスミドは、ｆａｄＬ遺伝子生成物（配列番号４０）およびストレプトアビジンタンパク質のインフレーム融合物である。このプラスミドを、ＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢに対して選択する。個々のコロニーを試験して、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）およびイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）含有ＬＢ中で上記形質転換細胞を増殖させることによって、細胞表面上でのストレプトアビジンの発現が達成されているか否かを決定する。
【００７１】
ストレプトアビジン分子の上記細胞表面ディスプレイは、蛍光分子（例えば、Ａｔｔｏ  ４２５−ビオチン（Ｆｌｕｋａから市販））とのビオチン結合体を使用して確認される。ストレプトアビジンが細胞表面上にディスプレイされた正確なＥ．ｃｏｌｉを、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）および種々の濃度のＩＰＴＧの存在下で増殖させて、それらの細胞表面上にストレプトアビジンがディスプレイされた細胞を作製する。
【００７２】
本明細書において使用される短縮化ｆａｄＬ遺伝子の開始コドンは、配列番号３９の塩基８で始まる。本実施例および他の実施例において使用されるアビジンおよびストレプトアビジンは、ペプチドリーダー配列の除去に起因して短縮されている。当業者は、ＰＣＲプライマー配列に基づいて、これらタンパク質が短縮化形態において精製されることを認識する。
【００７３】
本発明の特定の実施形態が例示目的で記載されてきたのに対して、本教示の詳細についての多くのバリエーションが、添付の特許請求の範囲において規定されるような本発明から逸脱することなく作製され得ることは、当業者にとって明らかである。本明細書において議論されている特許および刊行物は、当該分野の技術水準を示すものとして示されているべきであるが、任意の文書が先行技術の参考文献であるということを認めるものではない。本明細書において議論される前述の特許および刊行物は全て、参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
0005571955.tif 000008
【図７ｂ】
0005571955.tif 000009
【図７ｃ】
0005571955.tif 000010
【図７ｄ】
0005571955.tif 000011
【図７ｅ】
0005571955.tif 000012
【図７ｆ】
0005571955.tif 000013
【図７ｇ】
0005571955.tif 000014
【図７ｈ】
0005571955.tif 000015
【図７ｉ】
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【配列表】
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