(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（ＩＶ）の２つ以上の化合物：
【化２７】
0005413836.tif 000068
、あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む標識のセットであって、該標識のセット中の該化合物の１つ以上が、２個以上の重原子で同位体濃縮されており、
式中、
Ｒ１が、置換または非置換の
【化２６】
0005413836.tif 000069
を表し；
Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；そして
Ｒ２が、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリール基を表す、
標識のセット。
【請求項２】
前記標識のセットの一般式（ＩＶ）の化合物の１つ以上が、３個以上の重原子で同位体濃縮される、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項３】
前記標識のセットの一般式（ＩＶ）の化合物の１つ以上が、４個以上の重原子で同位体濃縮される、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項４】
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項５】
前記標識が非塩形態または非水和形態の同重体であり、そして同重体標識のそれぞれが２個以上の重原子で同位体濃縮されている、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項６】
前記標識の質量が非塩形態または非水和形態で０．０５ａｍｕ未満異なる、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項７】
Ｒ１が
【化２８】
0005413836.tif 000070
を表す、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項８】
一般式（ＩＶ）の前記２つ以上の化合物が、モノ−ＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビス−ＨＣｌ塩またはビス−ＴＦＡ塩、あるいはそれらの水和物の形態である、請求項１に記載の標識のセット。
【請求項９】
ヒドロキシル化化合物を標識するためのキットであって、請求項１に記載の標識のセットと、１つ以上の試薬、容器、緩衝液および使用説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年５月２６日に出願された、同時係属中の米国仮出願番号６０／８０９１３３の利益、および上記出願に対する優先権を主張し、この出願の全体の内容を本明細書中で参考として援用する。
【背景技術】
【０００２】
序論
多くの生体試料のスクリーニングおよび／または分析を迅速に行う能力は、多くの分野で大きな関心の的となっている。質量分析法は、迅速な試料分析を提供することができる１つの技法である。しかし、質量分析法による多くの生理学的に重要な分子の検出は、質量の干渉や低い試料の濃度により問題となる可能性がある。さらに、化合物の種類によっては、質量分光分析のための試料を調製するのに使用されることが多い従来の化学的性質および／または条件に好都合でないものもある。
【０００３】
生理学的に重要な化合物の１つには、ステロイドがある。試料中のステロイドを定量化する従来の方法には、イムノアッセイ、紫外線（ＵＶ）蛍光剤による高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ならびに質量分析（ＬＣ／ＭＳ）および／またはタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と併用する液体クロマトグラフィが含まれる。
【０００４】
上述の方法によるステロイドの絶対定量化は問題となる可能性がある。現代の臨床検査室で使用されるイムノアッセイは感度が不足しており、交差反応物質による干渉を受けやすい。ＬＣまたはＨＰＬＣの後にＵＶ、ＭＳまたはＭＳ／ＭＳ検出を行う従来の手法もまた、感度不足を欠点とする。例えば、ＨＰＬＣによって多くのステロイドを分析するためには、困難で時間のかかる誘導体化工程を分析の前に行わなければならない。さらに、ＨＰＬＣには、分析時間が長い、実行毎の偏差が大きい、多重化能力に欠けている、および特異的でないなどの欠点がある。
【０００５】
より最近になって化合物の検出や定量化に使用されているＬＣ／ＭＳやＭＳ／ＭＳは、速度や特異性が向上しており、かつ１つの試料で複数の化合物を高速測定できるという利点を備えているが、これらの手法もまた、多重化能力が欠けており、感度不足を欠点とする可能性がある。絶対定量化を行うためには、高価な同位体濃縮化合物が内部標準として使用されているが、これらはタンデム質量分析法によっては適合しない場合がある。さらに、これらの同位体濃縮内部標準では、検体化合物検出の感度が向上しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
以下の一般式（Ｉ）の２つ以上の化合物：
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
、あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む標識のセットであって、該標識のセット中の該化合物の１つ以上が、１つ以上の重原子同位体を含有し、
式中、
Ｚが、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環状アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；
Ｒ１が、置換または非置換の
【化２６】
0005413836.tif 000002
を表し；
Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；そして
Ｒ２が、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリール基を表す、
標識のセット。
（項目２）
前記標識のセットの一般式（Ｉ）の化合物の１つ以上が、２個以上の重原子で同位体濃縮される、項目１に記載の標識のセット。
（項目３）
前記標識のセットの一般式（Ｉ）の化合物の１つ以上が、３個以上の重原子で同位体濃縮される、項目１に記載の標識のセット。
（項目４）
前記標識のセットの一般式（Ｉ）の化合物の１つ以上が、４個以上の重原子で同位体濃縮される、項目１に記載の標識のセット。
（項目５）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである、項目１に記載の標識のセット。
（項目６）
前記標識が非塩形態または非水和形態の同重体であり、そして同重体標識のそれぞれが１つ以上の重原子同位体を含有する、項目１４に記載の標識のセット。
（項目７）
前記標識の質量が非塩形態または非水和形態で約０．０５ａｍｕ未満異なる、項目１に記載の標識のセット。
（項目８）
前記２つ以上の化合物が、以下の一般式（ＩＶ）：
【化２７】
0005413836.tif 000003
の化合物、あるいはその塩形態または水和物形態である、項目１に記載の標識のセット。
（項目９）
Ｒ１が
【化２８】
0005413836.tif 000004
を表す、項目８に記載の標識のセット。
（項目１０）
前記２つ以上の化合物が、以下の一般式（Ｖ）：
【化２９】
0005413836.tif 000005
の化合物、あるいはその塩形態または水和物形態であり、
式中、
Ｒ３がＣ、Ｎ、ＯまたはＳを表し；
Ｒ４が、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し；
各Ｒ５が独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表し、該アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して、１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合する、
項目１に記載の標識のセット。
（項目１１）
Ｒ１が
【化３０】
0005413836.tif 000006
を表す、項目１０に記載の標識のセット。
（項目１２）
前記標識のセット中の各標識が、該セット中の別の標識と、約１ａｍｕを超える質量差で区別される、項目１０に記載の標識のセット。
（項目１３）
Ｒ１が
【化３１】
0005413836.tif 000007
を表す、項目１２に記載の標識のセット。
（項目１４）
Ｒ１が
【化３２】
0005413836.tif 000008
を表す、項目１０に記載の標識のセット。
（項目１５）
前記標識が非塩形態または非水和形態の同重体であり、そして同重体標識のそれぞれが１つ以上の重原子同位体を含有する、項目１４に記載の標識のセット。
（項目１６）
前記標識の質量が非塩形態または非水和形態で約０．０５ａｍｕ未満異なる、項目１４に記載の標識のセット。
（項目１７）
一般式（Ｉ）の前記２つ以上の化合物が、モノ−ＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビス−ＨＣｌ塩またはビス−ＴＦＡ塩、あるいはそれらの水和物の形態である、項目１に記載の標識のセット。
（項目１８）
ヒドロキシル化化合物を標識するためのキットであって、項目１に記載の標識のセットと、１つ以上の試薬、容器、緩衝液および使用説明書とを含む、キット。
（項目１９）
以下の一般式（ＩＩ）の標識化合物であって：
【化３３】
0005413836.tif 000009
式中、
Ａが、該標識化合物の形成前に１個以上のヒドロキシル基を含有する化合物を表し；
Ｚが、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環状アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；
ｎが、１から、該標識化合物の形成前におけるＡ中のヒドロキシル基の数までの整数を表し；
ＲＸが、置換または非置換の
【化３４】
0005413836.tif 000010
を表し；そして
ＲＹが、該標識化合物の形成前にヒドロキシル基を含有したＡの炭素原子への結合を形成する酸素原子を表す、
化合物、あるいはその塩形態または水和物形態。
（項目２０）
前記標識化合物のＺ−ＲＸ部分が、２個以上の重原子で同位体濃縮される、項目１９に記載の標識化合物。
（項目２１）
前記標識化合物のＺ−ＲＸ部分が、３個以上の重原子で同位体濃縮される、項目２０に記載の標識化合物。
（項目２２）
前記標識化合物のＺ−ＲＸ部分が、４個以上の重原子で同位体濃縮される、項目２１に記載の標識化合物。
（項目２３）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである、項目２０に記載の標識化合物。
（項目２４）
Ａが多環式環含有化合物を含む、項目１９に記載の標識化合物。
（項目２５）
Ａが四環式環含有化合物を含む、項目２４に記載の標識化合物。
（項目２６）
Ａが、以下の一般式（ＩＩＩ）の四環式環を含み：
【化３５】
0005413836.tif 000011
ここでＲＹとの結合を形成しない四環式環上の位置の１つ以上がそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカル
ボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アルコキシル、シアノ、アルキルアリール、芳香族基または複素芳香族基で置換される、項目２５に記載の標識化合物。
（項目２７）
ＲＹが３位で炭素との結合を形成する、項目２６に記載の標識化合物。
（項目２８）
ＲＹが１７位で炭素との結合を形成する、項目２６に記載の標識化合物。
（項目２９）
Ｚ−ＲＸが以下の一般式（ＩＩａ）：
【化３６】
0005413836.tif 000012
のものである、項目１９に記載の標識化合物。
（項目３０）
ＲＸが
【化３７】
0005413836.tif 000013
を表す、項目２９に記載の標識化合物。
（項目３１）
Ｚ−ＲＸが、以下の一般式（ＩＩｂ）のものであり：
【化３８】
0005413836.tif 000014
式中、
Ｒ３がＣ、Ｎ、ＯまたはＳを表し；
Ｒ４が、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し；そして
各Ｒ５が独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表し、ここで該アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して、１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合する、
項目１９に記載の標識化合物。
（項目３２）
ＲＸが
【化３９】
0005413836.tif 000015
を表す、項目３１に記載の標識化合物。
（項目３３）
ＲＸが
【化４０】
0005413836.tif 000016
を表す、項目３１に記載の標識化合物。
（項目３４）
標識でヒドロキシル化化合物を標識する方法であって、
以下の一般式（ＸＩＩａ）の化合物：
Ｌ−Ｒ１  （ＸＩＩａ）
、あるいはその塩形態または水和物形態をヒドロキシル化化合物と反応させて、以下の一般式（ＸＩＩＩａ）の標識化合物前駆体：
Ｌ−ＲＸ−ＲＹ−Ａ  （ＸＩＩＩａ）
を形成する工程と；
以下の一般式（ＸＩＶｂ）の化合物：
ＺＲ８  （ＸＩＶｂ）
、あるいはその塩形態または水和物形態を該標識化合物前駆体と反応させて、以下の一般式（ＩＩ）の標識化合物：
【化４１】
0005413836.tif 000017
、あるいはその塩形態または水和物形態を形成する工程と、
を含み、
式中、
Ｌが脱離基を表し；
Ｒ８が脱離基、対イオンまたは水素を表し；
Ａが、前記標識化合物の形成前に１個以上のヒドロキシル基を含有する化合物を表し；
Ｚが、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環状アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；
ｎが、１から、該標識化合物の形成前におけるＡ中のヒドロキシル基の数までの整数を表し；
ＲＸが、置換または非置換の
【化４２】
0005413836.tif 000018
を表し；
ＲＹが、該標識化合物の形成前にヒドロキシル基を含有したＡの炭素原子への結合を形成する酸素原子を表し；
Ｒ１が、置換または非置換の
【化４３】
0005413836.tif 000019
を表し；
Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；
Ｒ２が、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリールを表す、
方法。
（項目３５）
標識でヒドロキシル化化合物を標識する方法であって、
以下の一般式（Ｉ）の化合物：
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
あるいはその塩形態または水和物形態をヒドロキシル化化合物と反応させて、以下の一般式（ＩＩ）の標識化合物：
【化４４】
0005413836.tif 000020
、あるいはその塩形態または水和物形態を形成する工程を含み、
式中、
Ａが、該標識化合物の形成前に１個以上のヒドロキシル基を含有する化合物を表し；
Ｚが、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環状アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；
ｎが、１から、該標識化合物の形成前におけるＡ中のヒドロキシル基の数までの整数を表し；
ＲＸが、置換または非置換の
【化４５】
0005413836.tif 000021
を表し；
ＲＹが、該標識化合物の形成前にヒドロキシル基を含有したＡの炭素原子への結合を形成する酸素原子を表し；
Ｒ１が、置換または非置換の
【化４６】
0005413836.tif 000022
を表し；
Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；
Ｒ２が、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリール基を表す、
方法。
（項目３６）
脱離基がＣｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルである、項目３４および３５の１項以上に記載の方法。
（項目３７）
前記Ｚ部分およびＲＸ部分がともに、２個以上の重原子で同位体濃縮される、項目３４および３５の１項以上に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｚ部分およびＲＸ部分がともに、３個以上の重原子で同位体濃縮される、項目３８に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｚ部分およびＲＸ部分がともに、４個以上の重原子で同位体濃縮される、項目３９に記載の方法。
（項目４０）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
Ａが多環式環含有化合物を含む、項目３４および３５の１項以上に記載の方法。
（項目４２）
Ａが四環式環含有化合物を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
Ａが、以下の一般式（ＩＩＩ）の四環式環を含み：
【化４７】
0005413836.tif 000023
ここで、ＲＹとの結合を形成しない四環式環上の位置の１つ以上がそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アルコキシル、シアノ、アルキルアリール、芳香族基または複素芳香族基で置換される、
項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ＲＹが３位で炭素との結合を形成する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＲＹが１７位で炭素との結合を形成する、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
Ｚ−ＲＸが以下の一般式（ＩＩａ）
【化４８】
0005413836.tif 000024
のものである、項目３４および３５の１項以上に記載の方法。
（項目４７）
ＲＸが
【化４９】
0005413836.tif 000025
を表す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
Ｚ−ＲＸが、以下の一般式（ＩＩｂ）のものであり：
【化５０】
0005413836.tif 000026
式中、
Ｒ３がＣ、Ｎ、ＯまたはＳを表し；
Ｒ４が、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し；そして
各Ｒ５が独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表し、ここで、該アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して、１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合する、
項目３４および３５の１項以上に記載の方法。
（項目４９）
ＲＸが
【化５１】
0005413836.tif 000027
を表す、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
ＲＸが
【化５２】
0005413836.tif 000028
を表す、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
反応工程が、カップリング剤の存在下における反応を含む、項目３４および３５の１項以上に記載の方法。
（項目５２）
前記カップリング剤が、ヘキサフルオロリン酸塩化合物、テトラフルオロホウ酸塩化合物およびエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミド化合物の１つ以上を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
１つ以上の試料中のヒドロキシル化化合物の１つ以上を分析する方法であって、
標準化合物を提供する工程と；
以下の一般式（Ｉ）：
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
あるいはその塩形態または水和物形態の標識のセットの標識で該標準化合物を標識する工程であって、該標識のセットの１つ以上の標識が、１つ以上の重原子同位体を含有する、工程と；
１つ以上のヒドロキシル化化合物をそれぞれ、該標識のセットとは異なる標識で標識して、標識検体化合物を形成する工程と；
標識標準化合物の少なくとも一部を該標識検体化合物のそれぞれの少なくとも一部と組み合わせて、混合試料を作製する工程と；
クロマトグラフィカラムに該混合試料の少なくとも一部を充填する工程と；
該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程であって、
第１の遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識検体化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、そして第１の遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識検体化合物の標識の少なくとも１つに対応する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含み、
第２の遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識標準化合物のｍ／ｚ値を含み、そして第２の遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識標準化合物の標識に対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
遷移したレポーターイオンのイオン信号を測定する工程と；
対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、該標識標準化合物に対応するレポーターイオンの測定したイオン信号との比較に少なくとも基づいて、前記標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程と、
を含み；
式中、
Ｚが、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環状アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；
Ｒ１が、置換または非置換の
【化５３】
0005413836.tif 000029
を表し；
Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；
Ｒ２が、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリール基を表す、
方法。
（項目５４）
１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析する方法であって、
以下の一般式（Ｉ）
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
あるいはその塩形態または水和物形態の標識のセットとは異なる標識で１つ以上のヒドロキシル化化合物をそれぞれ標識して、標識検体化合物を形成する工程であって、該標識のセットの１つ以上の標識が、１つ以上の重原子同位体を含有する、工程と；
該標識検体化合物のそれぞれの少なくとも一部を組み合わせて、混合試料を作製する工程と；
クロマトグラフィカラムに該混合試料の少なくとも一部を充填する工程と；
該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程であって、該遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識検体化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、該遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識検体化合物の標識の少なくとも１つに対応する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
該遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程と；そして
該対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と標準化合物の濃度曲線との比較に少なくとも基づいて、該標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程と、
を含み；
式中、
Ｚが、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環状アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；
Ｒ１が、置換または非置換の
【化５４】
0005413836.tif 000030
を表し；
Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；
Ｒ２が、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリール基を表す、
方法。
（項目５５）
前記標識のセットの各標識がそれらの非塩形態または非水和形態の同重体であり、そして該標識のそれぞれが１つ以上の重原子同位体を含有する、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目５６）
前記標識のセットの各標識の質量が、非塩形態または非水和形態で約０．０５ａｍｕ未
満異なる、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目５７）
前記標識のセットの標識の１つ以上が、２個以上の重原子で同位体濃縮される、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目５８）
前記標識のセットの標識の１つ以上が、３個以上の重原子で同位体濃縮される、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目５９）
前記標識のセットの標識の１つ以上が、４個以上の重原子で同位体濃縮される、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６０）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６１）
前記試料の１つ以上が生理液を含む、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６２）
前記標準化合物が非同位体濃縮化合物である、項目５３に記載の方法。
（項目６３）
前記１つ以上のヒドロキシル化化合物が、１つ以上のステロイドを含む、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６４）
１つ以上のステロイドが、コルチゾール、１１−デオキシコルチゾール（化合物Ｓ）、コルチコステロン、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、エストラジオール、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７  ＯＨプレグネノロン、１７  ＯＨプロゲステロン、１７  ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Ｄ４Ａ（デルタ４  アンドロステンジオン）、スチグマステロール、およびコレステロールの１つ以上を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記１つ以上のヒドロキシル化化合物が、１つ以上の形態のビタミンＤまたはその代謝産物を含む、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６６）
前記１つ以上の形態のビタミンＤが、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、代謝産物およびそれらの類似体の１つ以上を含む、項目６５の方法。
（項目６７）
前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程が、三重四重極型質量分析計、四重極／飛行時間型質量分析計、線形イオントラップ型質量分析計、またはタンデム飛行時間型質量分析計の１つ以上を使用する工程を含む、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６８）
前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程が、マトリックスに前記混合試料を混合する工程と、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を使用して、該親−娘イオン遷移モニタリングのためのイオンを生成する工程とを含む、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目６９）
前記標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程が、前記標識検体化合物の１つ以上の絶対濃度を測定する工程を含む、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目７０）
前記標識のセットの標識が、以下の一般式（ＩＶ）：
【化５５】
0005413836.tif 000031
の化合物、あるいはその塩形態または水和物形態である、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目７１）
Ｒ１が
【化５６】
0005413836.tif 000032
を表す、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記標識のセットの標識が、以下の一般式（ＶＩ）：
【化５７】
0005413836.tif 000033
の化合物、あるいはその塩形態または水和物形態であり、
式中、
Ｒ３がＣ、Ｎ、ＯまたはＳを表し；
Ｒ４が、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し；そして
各Ｒ５が独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表し、ここで、該０アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して、１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合する、
項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目７３）
Ｒ１が
【化５８】
0005413836.tif 000034
を表す、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記標識のセット中の各標識が、前記セット中の前記別の標識と、約１ａｍｕを超える質量差で区別される、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
Ｒ１が
【化５９】
0005413836.tif 000035
を表す、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
Ｒ１が
【化６０】
0005413836.tif 000036
を表す、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
前記標識のセットの前記１つ以上の標識が、モノ−ＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビス−ＨＣｌ塩またはビス−ＴＦＡ塩、あるいはそれらの水和物の形態である、項目５３および５４の１項以上に記載の方法。
（項目７８）
前記標準化合物の前記濃度曲線が、
（ａ）第１の濃度を有する標準化合物を提供する工程と；
（ｂ）前記標識のセットの標識で該標準化合物を標識する工程と；
（ｃ）クロマトグラフィカラムに標識標準化合物の少なくとも一部を充填する工程と；
（ｄ）前記クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程であって、前記遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が、前記標識検体化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、前記遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、前記標識検体化合物の標識に対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
（ｅ）前記遷移したレポーターイオンのイオン信号を測定する工程と；
（ｆ）１つ以上の異なる標準化合物濃度で工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と；
（ｇ）複数の標準化合物濃度における前記遷移したレポーターイオンの測定イオン信号に少なくとも基づいて、前記標準化合物の濃度曲線を作成する工程と、
によって作成される、
項目５４に記載の方法。
（項目７９）
前記標準化合物が非同位体濃縮化合物である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
以下の一般式（ＸＩＶ）の２つ以上の化合物：
【化６１】
0005413836.tif 000037
、あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む同重体標識のセットであって、該移動重体標識のセットの該同重体標識のそれぞれが、１つ以上の重原子同位体を含有する、標識のセット。
（項目８１）
前記標識のセットの各標識が、２個以上の重原子で同位体濃縮される、項目８０に記載の標識のセット。
（項目８２）
前記標識のセットの各標識が、３個以上の重原子で同位体濃縮される、項目８０に記載の標識のセット。
（項目８３）
前記標識のセットの各標識が、４個以上の重原子で同位体濃縮される、項目８０に記載の標識のセット。
（項目８５）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏである、項目８０に記載の方法。
（項目８６）
一般式（Ｉ）の前記２つ以上の化合物が、モノ−ＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビス−ＨＣｌ塩またはビス−ＴＦＡ塩、あるいはそれらの水和物の形態である、項目８０に記載の標識のセット。
（項目８７）
以下の一般式（ＸＶ）の２つ以上のＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン化合物：
【化６２】
0005413836.tif 000038
、あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む、標識のセットであって、
式中、
Ｒ９がハロゲン化物、−ＯＨ、または−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１１（式中、Ｒ１１は水素あるいは直鎖または分枝鎖アルキル基である）を表し；
Ｒ１０がＣ、ＮまたはＯを表し；
Ｒ４が、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し；そして
各Ｒ５が独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表し、ここで該アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して、１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合し、
ここで、タグのセット中の前記化合物の１つ以上が、１つ以上の重原子同位体を含有する、
標識のセット。
（項目８８）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである、項目８７に記載の標識のセット。
（項目８９）
Ｒ９が−ＯＨを表す、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９０）
Ｒ９が塩素またはフッ素を表す、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９１）
Ｒ９が−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１１（式中、Ｒ１１は水素あるいは直鎖または分枝鎖アルキル基である）を表す、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９２）
Ｒ１１がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９３）
Ｒ１０が窒素を表す、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９４）
Ｒ４が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９５）
各Ｒ５が独立して、水素、メチルまたはメトキシを表す、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９６）
前記２つ以上のＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン化合物が、以下の一般式（ＸＶＩ）：
【化６３】
0005413836.tif 000039
の化合物である、項目８７に記載の標識のセット。
（項目９７）
Ｒ４が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基である、項目９６に記載の標識のセット。
（項目９８）
２つ以上の一般式（ＸＶＩＩ）のＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン化合物、：
【化６４】
0005413836.tif 000040
あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む、同重体標識のセットであって、
該同重体標識のセットの該同重体標識のそれぞれが、１つ以上の重原子同位体を含有し、
式中、
Ｒ１０がＣ、ＮまたはＯを表し；
Ｒ４が、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し；そして
各Ｒ５が独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表し、ここで該アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して、１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合する、
標識のセット。
（項目９９）
前記標識のセットの各標識が、４個以上の重原子で同位体濃縮される、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１００）
前記重原子同位体がそれぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏである、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１０１）
Ｒ１２が＝Ｃ＝Ｏを表す、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１０２）
Ｒ１０が窒素を表す、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１０３）
Ｒ４が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル基またはｔｅｒｔ−ブチルである、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１０４）
各Ｒ５が独立して、水素、メチルまたはメトキシを表す、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１０５）
前記２つ以上のＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン化合物が、以下の一般式（ＸＶＩＩＩ）：
【化６５】
0005413836.tif 000041
の化合物である、項目９８に記載の標識のセット。
（項目１０６）
Ｒ４が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル基またはｔｅｒｔ−ブチルである、項目１０５に記載の標識のセット。
（項目１０７）
２つ以上の試料中の１つ以上のステロイド含有化合物、ステロール含有化合物、またはそれらの類似体を分析する方法であって、
対象の１つ以上の試料のそれぞれに、質量差次タグのセットとは異なる質量差次タグを添加して、標識試料を提供し、タグが、該対象の試料の１つ以上における１つ以上のステロイド含有化合物を標識して、以下の一般式（ＸＩ）の標識ステロイドを生じるようにする工程：
ＲＰ−ＢＸ−ＬＧ−Ｏ−ＢＹ−ＡＲ    （ＸＩ）
（式中、ＲＰは質量差次タグのレポーター部分であり、ＬＧは連結基であり、Ｏは酸素であり、ＡＲはステロイド含有化合物、ステロール含有化合物またはそれらの類似体の環含有化合物であり、ＢＸはＲＰとＬＧの原子の間の結合を表し、そしてＢＹは、酸素Ｏと、標識化反応前にヒドロキシル化されたＡの炭素との間の結合を表す）と；
該標識試料のそれぞれの少なくとも一部を組み合わせて、混合試料を提供する工程と；
クロマトグラフィカラムに該混合試料の少なくとも一部を充填する工程と；
該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程であって、
所定の標識ステロイド含有化合物の遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が、標識環含有化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、そして第１の遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、標識ステロイド含有化合物のタグの少なくとも１つに対応する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程と；
前記対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標準化合物に対応するレポーターイオンの測定したイオン信号との比較に少なくとも基づいて、該標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を測定する工程と、
を含む、
方法。
（項目１０８）
前記クロマトグラフィカラムで前記標識ステロイド含有化合物の１つ以上を分離する工程もさらに含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を測定する工程が、１つ以上のステロイドの絶対濃度を測定する工程を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１０）
前記標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を測定する工程が、２つ以上のステロイド間の相対濃度の変化を測定する工程を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１１）
前記対象の試料の１つ以上が、１つ以上の標準化合物を含有する標準試料を含み、そして標準化合物に対応するレポーターイオンの測定したイオン信号が、該標準試料中の１つ以上の標識標準化合物の測定したレポーターイオン信号に対応する、項目１０７に記載の方法。
（項目１１２）
前記標準試料が、対照試料、基準試料、またはそれらの両方を含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
２つ以上の試料中の１つ以上のステロイド含有化合物、ステロール含有化合物、またはそれらの類似体を分析する方法であって、
対象の１つ以上の試料のそれぞれに、質量差次タグのセットとは異なる質量差次タグを添加して、標識試料を提供し、タグが、該対象の試料の１つ以上における１つ以上のステロイド含有化合物を標識して、以下の一般式（ＸＩ）の標識ステロイドを生じるようにする工程：
ＲＰ−ＢＸ−ＬＧ−Ｏ−ＢＹ−ＡＲ    （ＸＩ）
（式中、ＲＰは同重体タグのレポーター部分であり、ＬＧは連結基であり、Ｏは酸素であり、ＡＲはステロイド含有化合物、ステロール含有化合物またはそれらの類似体の環含有化合物であり、ＢＸはＲＰとＬＧとの原子の間の結合を表し、そしてＢＹは、酸素Ｏと、前記標識化反応前にヒドロキシル化されたＡの炭素との間の結合を表す）と；
該標識試料のそれぞれの少なくとも一部を組み合わせて、混合試料を提供する工程と；
クロマトグラフィカラムに該混合試料の少なくとも一部を充填する工程と；
該クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程であって、
所定の標識ステロイド含有化合物の遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が、標識環含有化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、そして第１の遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該標識ステロイド含有化合物のタグの少なくとも１つに対応する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む、工程と；
遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程と；
対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標準化合物に対応するレポーターイオンの測定したイオン信号との比較に少なくとも基づいて、該標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を測定する工程と、
を含む、
方法。
（項目１１４）
前記クロマトグラフィカラムで前記標識ステロイド含有化合物の１つ以上を分離する工程もさらに含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を測定する工程が、１つ以上のステロイドの絶対濃度を測定する工程を含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を測定する工程が、２つ以上のステロイド間の相対濃度の変化を測定する工程を含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１７）
前記対象の試料の１つ以上が、１つ以上の標準化合物を含有する標準試料を含み、そして標準化合物に対応するレポーターイオンの測定したイオン信号が、前記標準試料中の１つ以上の標識標準化合物の測定したレポーターイオン信号に対応する、項目１１３に記載の方法。
（項目１１８）
前記標準試料が、対照試料、基準試料、またはそれらの両方を含む、項目１１７に記載の方法。
本教示内容は、１つ以上のヒドロキシル化化合物を含有する試料を分析するための試薬および方法を提供する。種々の実施形態において、これらの提供される試薬および方法は、１つ以上の試料中の１つ以上のステロイドの相対濃度、絶対濃度、あるいはそれらの両方を測定するのに使用することができる。本教示内容は、同重体標識試薬および同重体標識方法、ならびに質量差次標識試薬およびそれらの試薬の同位体置換の適切な選択による質量差次標識方法に使用することができる。本明細書で使用される「標識」および「タグ」という用語は、交換可能に使用される。同位体濃縮化合物を合成する方法の例については、内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願公開第２００５／０１４８７７４号に記載されている。
【０００７】
本教示内容の種々の実施形態を適用することができるヒドロキシル化化合物は、例えば、生理液試料、細胞溶解物または組織溶解物の試料、タンパク質試料、細胞培養物試料、発酵ブロス培地試料、農産物試料、動物産物試料、動物飼料試料、ヒトが消費する食品または飲料の試料、およびそれらの組み合わせなどの多種多様な供給源から得ることができる。種々の実施形態において、本教示内容は、天然で生成したステロイドと合成のステロイドとの両方に適用することができる。多種多様なステロイドには、コルチゾール、１１−デオキシコルチゾール（化合物Ｓ）、コルチコステロン、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、エストラジオール、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７−ＯＨプレグネノロン、１７−ＯＨプロゲステロン、１７−ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Ｄ４Ａ（デルタ４−アンドロステンジオン）、スチグマステロール、およびコレステロールが含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
種々の態様において、本教示内容は、質量差次タグを使用して１つ以上のヒドロキシル化化合物を含有する試料を分析するための試薬および方法を提供する。種々の実施形態においては、質量差次標識のセットが提供され、このセットの１つ以上の標識は、１つ以上の重原子同位体を含有する。質量差次標識のセットは、全体的な質量が異なりかつ１次レポーターイオンの質量が異なる標識を調製することによって提供することができる。質量差次タグのすべてのメンバーが、本教示内容にしたがって重原子同位体の濃縮が行われるわけではないことを理解するものとする。種々の実施形態において、本教示内容は、質量差次標識および親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析するための試薬および方法を提供する。種々の実施形態において、本教示内容は、質量差次タグ付け試薬および質量分析を使用してヒドロキシル化化合物の定性分析および定量分析を行うために使用することができる。質量差次タグには、非同重体の同位体がコードされる試薬が含まれるが、これに限定されない。種々の実施形態において、本教示内容は、同位体濃縮標準化合物を使用することなくヒドロキシル化化合物の絶対定量化を行うための試薬および方法を提供する。種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物は、ヒドロキシル化環含有化合物を含む。種々の実施形態において、ヒドロキシル化環含有化合物は、ヒドロキシル化多環式環含有化合物を含む。
【０００９】
種々の態様において、本教示内容は、同位体濃縮した同重体タグを使用して１つ以上のヒドロキシル化化合物を含有する試料を分析するための試薬および方法を提供する。種々の実施形態においては、同重体標識のセットが提供され、このセットの各標識は、１つ以上の重原子同位体を含む。同重体標識のセットは、各標識が実質的に同じ質量を有するものの、各標識が質量の異なる１次レポーターイオンを有する標識を調製することによって提供することができる。種々の実施形態において、同重体タグ付け試薬のセットは、質量分析を使用してヒドロキシル化化合物の定性分析および定量分析を行うために使用することができる。例えば、種々の実施形態においては、同位体濃縮した同重体タグおよび親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物の存在および／または濃度を測定する方法が提供される。種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物は、ヒドロキシル化環含有化合物を含む。種々の実施形態において、ヒドロキシル化環含有化合物は、ヒドロキシル化多環式環含有化合物を含む。
【００１０】
種々の態様において、本教示内容は、ヒドロキシル化環含有化合物を含むがこれに限定されないヒドロキシル化化合物の相対定量化、絶対定量化、あるいはそれらの両方を行うための標識試薬および標識試薬のセットを提供し、前記標識試薬は、以下の一般式（Ｉ）：
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
で表すことができ、かつ塩形態または水和物形態で提供および／または使用することができる。一般式（Ｉ）において、（ａ）Ｚは、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環式のアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；（ｂ）Ｒ１は、置換または非置換の
【００１１】
【化１】
0005413836.tif 000042
を表し；（ｃ）Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；（ｅ）Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリールを表す。
【００１２】
種々の態様において、本教示内容は、本教示内容の標識で標識化するために少なくとも１個のヒドロキシル基を含む標識検体を提供する。種々の実施形態において、標識化合物は、以下の一般式（ＩＩ）：
【００１３】
【化２】
0005413836.tif 000043
により表すことができ、かつその塩形態または水和物形態として提供および／または使用することができる。一般式（ＩＩ）において、（ａ）Ｚは、式（Ｉ）で挙げた通りであってよく、（ｂ）Ａは、標識化合物の形成前に１つ以上のヒドロキシル基を含有した化合物を表し、（ｃ）ＲＹは、標識化合物の形成前にヒドロキシル基を含有したＡの炭素原子への結合を形成する酸素原子を表し、（ｄ）ｎは、１から、前記標識化合物の形成前におけるＡ中のヒドロキシル基の数までの整数を表し、（ｅ）ＲＸは、置換または非置換の
【００１４】
【化３】
0005413836.tif 000044
を表す。
【００１５】
本教示内容は、ヒドロキシル化化合物の分析に限定されず、本教示内容の一実施形態のタグによる標識化前にカルボニル基を還元することによってか、標識反応によりｉｎ  ｓｉｔｕにて還元を行うことによってか、あるいはそれらを組み合わせることによって、非ヒドロキシル化カルボニル担持化合物に適用することができる。
【００１６】
種々の実施形態において、標識検体化合物は四環式環を含む。種々の実施形態において、四環式環は、以下の一般式（ＩＩＩ）：
【００１７】
【化４】
0005413836.tif 000045
により表すことができ、ここでＲＹとの結合を形成しない四環式環上の位置の１つ以上はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アルコキシル、シアノ、アルキルアリール、芳香族基または複素芳香族基で置換される。一般式（ＩＩＩ）に付与される数字は、単に位置の参照を目的としたものである。種々の実施形態において、Ａが由来するヒドロキシル化化合物は、３位、１７位またはそれらの両方でヒドロキシル化される式（ＩＩＩ）の多環式環構造を含む。
【００１８】
種々の実施形態において、本教示内容は、質量差次標識、同重体標識、あるいはそれらの両方、ならびに親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１つ以上の試料中の１つ以上のステロイドを分析するための試薬および方法を提供することができる。種々の態様において、本教示内容は、１つ以上の試料中の１つ以上のステロイドの相対濃度、絶対濃度、あるいはそれらの両方を測定する方法を提供することができる。種々の実施形態において、本教示内容は、１つの試料中の２つ以上のステロイド、２つ以上の試料中の１つ以上のステロイド、あるいはそれらの組み合わせの相対濃度、絶対濃度、あるいはそれらの両方を多重化方法で測定することができる方法を提供することができる。種々の実施形態において、本教示内容は、質量差次タグ付け試薬、同重体タグ付け試薬、あるいはそれらの両方、ならびに質量分析を使用して、ステロイドの定性分析および／または定量分析を行うために使用することができる。
【００１９】
図１を参照すると、一般式（Ｉ）によって表される標識のセットの標識は、例えばヒドロキシル含有検体（１０６）を標識するために使用することができる、リンカー基部分（１０２）および少なくとも１つのレポーター基部分（１０４）を含む。
【００２０】
同重体標識のセットを提供する実施形態において、リンカー基部分（ＬＧ）およびレポーター基部分（ＲＰ）の重原子置換は、同重体タグのそれぞれの質量が実質的に等しくなりつつ、各レポーター基部分の質量が異なるように選択される。同重体標識のセットを含む実施形態において、リンカー基部位は残余基と呼ぶことができる。例えば、図２を参照すると、種々の実施形態において、４つの同重体標識のセットが１つ以上の検体のセット（２０２）に添加され、組み合わされて、混合試料（２０４）を形成し、これをＭＳ／ＭＳ分析に供して、標識検体化合物のフラグメンテーションを行い、異なる質量（２０６）の４つのレポーターイオンを生成する。前記標識は、レポーター部分（ＲＰ）と残余基部分（ＢＧ）の重原子置換の適切な併用によって、同重体とすることができ、例えば、図２において、ＲＰおよびＢＧの質量は、前記セットの各標識の質量が約１８６ａｍｕとなるような質量となる。
【００２１】
質量差次標識のセットを提供する実施形態において、レポーター基部分（ＲＰ）（１０４）の重原子置換は、各レポーター基部分の質量が異なるように選択される。種々の実施形態において、質量差次標識のセットの１つの標識は、実質的に重原子置換を含有しない。
【００２２】
本教示内容の種々の実施形態において、リンカー基部分は、標識検体（１０８）をフラグメンテーションに供すると、少なくともレポーター基部分（１０４）の窒素と残余基（１０２）の間の結合（１１０）が切断されることによってフラグメンテーションが起こるように、選択される。
【００２３】
種々の実施形態において、標識のそれぞれにおける重原子同位体の分布は、質量分析器（ＭＳ）による分析で異なるレポーターイオン信号を生成するように設計することができる。したがって、種々の実施形態において、混合物の種々の標識成分（例えば、種々の検体、種々の試料、標準物に由来する検体など）に会合したイオン信号は、それぞれの標識と会合したレポーターイオン信号を使用してデコンボリューションすることができる。デコンボリューションには、例えば、混合物中の１つ以上の標識成分の相対量および／または絶対量（濃度または量で表現される場合が多い）を測定する方法が含まれる。本教示内容の標識試薬を使用することができる種々の実験分析の例には、経時的試験、バイオマーカー分析、多重分析、親和性プルダウン、および各種対照実験が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
種々の態様において、本教示内容は、式（Ｉ）の標識および親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化環含有化合物を分析する方法を提供する。
【００２５】
「親−娘イオン遷移モニタリング」または「ＰＤＩＴＭ」という用語は、例えば、第１の質量分離器の遷移した質量対電荷（ｍ／ｚ）範囲（質量分析の第１次元と呼ぶことが多い）を選択し、イオンフラグメンター（例えば、衝突セル、光解離領域など）に分子イオン（「親イオン」または「前駆対イオン」と呼ぶことが多い）を遷移させて、フラグメントイオン（「娘イオン」と呼ぶことが多い）を生成し、次いで、第２の質量分離器の遷移ｍ／ｚ範囲（質量分析の第２次元と呼ぶことが多い）を選択して、娘イオン信号を測定する検出器に１つ以上の娘イオンを遷移させる、質量分析を使用した測定を指す。モニタリングした親イオンの質量と娘イオンの質量の組み合わせは、モニタリングした「親−娘イオン遷移」と呼ぶことができる。モニタリングした特定の親イオン−娘イオンの組み合わせに使用する検出器の娘イオン信号は、「親−娘イオン遷移信号」と呼ぶことができる。
【００２６】
例えば、親−娘イオン遷移モニタリングの一実施形態には、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）（選択的反応モニタリングとも呼ぶ）がある。ＭＲＭの種々の実施形態において、特定の親−娘イオン遷移のモニタリングは、第１の質量分離器（例えば、対象の親イオンのｍ／ｚにある第１の四重極）使用して、対象の親イオンを遷移させる工程、および第２の質量分離器（例えば、対象の娘イオンのｍ／ｚにある第２の四重極）を使用して、対象の１つ以上の娘イオンを遷移させる工程を含む。種々の実施形態において、ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器（例えば、対象の親イオンのｍ／ｚにある四重極）を使用して親イオンを遷移させ、対象の１つ以上の娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたって第２の質量分離器をスキャンすることにより、行うことができる。
【００２７】
例えば、ＰＤＩＴＭ（例えば、ＭＲＭ）には、タンデム質量分析器（ＭＳ／ＭＳ）、あるいはより一般的には多次元質量分析器（ＭＳｎ）を使用することができる。適切な質量分析システムの例には、三重四重極型、四重極線形イオントラップ、四重極ＴＯＦ、およびＴＯＦ−ＴＯＦの１つ以上を含むものが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
種々の実施形態において、本教示内容の標識を使用して１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析する方法は、（ａ）式（Ｉ）の標識のセットとは異なる標識で１つ以上のヒドロキシル化化合物をそれぞれ標識して、それぞれレポーターイオン部分を有する式（ＩＩ）の標識検体化合物を提供する工程と；（ｂ）標識検体化合物のそれぞれの少なくとも一部を組み合わせて、混合試料を作製する工程と；（ｃ）混合試料の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程と；（ｄ）遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程と；（ｅ）対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標準化合物の１つ以上の測定したイオン信号との比較に少なくとも基づいて、標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程と、を含む。したがって、種々の実施形態において、１つ以上の試料中の複数のヒドロキシル化化合物の濃度は、多重化方法、例えば、複数の標識検体化合物を組み合わせて、混合試料を作製し、この混合試料をＰＤＩＴＭに供する工程、および標識検体化合物の複数のレポーターイオンをモニタリングする工程によって測定することができる。
【００２９】
種々の実施形態において、１つ以上の標識検体化合物の濃度を測定する工程は、標識検体化合物の１つ以上の絶対濃度を測定する工程、標識検体化合物の１つ以上の相対濃度を測定する工程、あるいはそれらの両方を含む。
【００３０】
種々の実施形態において、クロマトグラフィカラムは、複数の標識検体化合物を分離するために使用される。例えば、種々の実施形態においては、前記試料の１つ以上に認められる第１の標識検体化合物が、クロマトグラフィカラムによって、前記試料の１つ以上に認められる第２の標識検体化合物と分離される。
【００３１】
種々の実施形態において、対象の前記試料の１つ以上は、１つ以上の標準化合物を含有する標準試料を含み、この方法で測定した、標準化合物に対応するレポーターイオンのイオン信号は、標準試料中の１つ以上の標識標準化合物の測定したレポーターイオン信号に対応する。
【００３２】
本教示内容の種々の実施形態において、標準化合物の濃度曲線は、（ａ）第１の濃度を有する非同位体濃縮標準化合物を提供する工程と；（ｂ）式（Ｉ）の標識のセットの標識あるいはその塩形態または水和物形態で、レポーターイオン部分を有する標準化合物を標識する工程と；（ｃ）クロマトグラフィカラムに標識標準化合物の少なくとも一部を充填する工程と；（ｄ）クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程と；（ｅ）遷移したレポーターイオンのイオン信号を測定する工程と；（ｆ）１つ以上の異なる標準化合物濃度で工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と；（ｇ）複数の標準化合物濃度の遷移したレポーターイオンの測定したイオン信号に少なくとも基づいて、標準化合物の濃度曲線を作成する工程と、によって作成することができる。
【００３３】
標準化合物は標準試料に含有されてよく、標準試料は１つ以上の標準化合物を含有することができる。本教示内容の種々の実施形態において、標準化合物の濃度曲線は、（ａ）第１の濃度を有する１つ以上の非同位体濃縮標準化合物を含む標準試料を提供する工程と；（ｂ）式（Ｉ）の標識、あるいはその塩形態または水和物形態を標準試料に添加して、試料中の標準化合物の１つ以上を標識する工程であって、標識標準化合物がそれぞれレポーターイオン部分を有する、工程と；（ｃ）クロマトグラフィカラムに標識試料の少なくとも一部を充填する工程と；（ｄ）クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程と；（ｅ）遷移したレポーターイオンのイオン信号を測定する工程と；（ｆ）異なる濃度の前記標準化合物の１つ以上を含有する１つ以上の異なる標準試料で工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程と；（ｇ）複数の標準化合物濃度の対応する標準化合物の遷移したレポーターイオンの測定したイオン信号に少なくとも基づいて、標準化合物の１つ以上の濃度曲線を作成する工程と、によって作成することができる。種々の実施形態において、式（Ｉ）の標識、あるいはその塩形態または水和物形態を標準試料に添加して、試料中の標準化合物の１つ以上を標識する工程は、標識の第１の部分（例えば、式（Ｉ）の部分Ｒ１を含む部分）の後、第２の工程で標識の第２の部分（例えば、式（Ｉ）における部分Ｚを含む部分）を添加して、標準化合物の標識化を行う、２段階の反応を含む。
【００３４】
上述のおよびその他の本教示内容の態様、実施形態および特徴は、添付の図面とともに以下の説明によってより詳細に理解することができる。図面において、一般的に、同じ参照文字は、種々の図を通して同じ特徴および構造要素を指す。これらの図面は必ずしも倍率が一定していないが、その代わりに本発明の原理を例示する部分が強調されて示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本教示内容の種々の実施形態による標識、標識反応、標識検体化合物、およびレポーターイオンの生成についての概略図である。
【図２】図２は、本教示内容の同重体標識化試薬を使用して１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析する方法の種々の実施形態の概略図である。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｋは、種々のヒドロキシル化環含有化合物の構造の概略図を示す。図３Ａ〜３Ｅは、ステロイドの概略図を示す。図３Ｆ〜３Ｈは、ビタミンＤ３および種々の代謝産物、ならびにそれらの類似体の概略図を示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｋは、種々のヒドロキシル化環含有化合物の構造の概略図を示す。図３Ｉ〜３Ｋは、本教示内容の種々の実施形態による分析の対象となる種々のヒドロキシル化化合物の概略図を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析する方法の種々の実施形態の概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析する方法の種々の実施形態の概略図である。
【図５】図５は、本教示内容の標識の種々の実施形態でコレステロールを標識した例と、得られた標識検体化合物の例との概略図を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、一般式（Ｉ）の化合物のイソシアン酸塩Ｒ１部分を有する本教示内容のタグによる標識化の種々の実施形態の概略図を示す。図６Ａは、一般的な反応を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、一般式（Ｉ）の化合物のイソシアン酸塩Ｒ１部分を有する本教示内容のタグによる標識化の種々の実施形態の概略図を示す。図６Ｂは、イソシアン酸ピペラジンとの２段階標識反応を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、一般式（Ｉ）の化合物のイソシアン酸塩Ｒ１部分を有する本教示内容のタグによる標識化の種々の実施形態の概略図を示す。図６Ｃは、標識検体がヨウ素塩であるイソシアン酸トリメチル標識検体の作製を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、ヒドロキシル化化合物（コレステロール）をジエチルアンモニア（図７Ａ）のタグまたはトリメチルアンモニウム（図７Ｂ）のタグで標識した標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、ヒドロキシル化化合物（コレステロール）をジエチルアンモニア（図７Ａ）のタグまたはトリメチルアンモニウム（図７Ｂ）のタグで標識した標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のピペラジンＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図８Ａ〜８Ｃは、検体での複数のヒドロキシルの標識化を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のピペラジンＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図８Ａ〜８Ｃは、検体での複数のヒドロキシルの標識化を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のピペラジンＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図８Ａ〜８Ｃは、検体での複数のヒドロキシルの標識化を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のピペラジンＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のピペラジンＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のベンゾイルまたは置換フェニルＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図９Ａ〜９Ｃは、イソシアン酸ベンゾイルと検体との直接反応による標識化を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のベンゾイルまたは置換フェニルＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図９Ａ〜９Ｃは、イソシアン酸ベンゾイルと検体との直接反応による標識化を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のベンゾイルまたは置換フェニルＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図９Ａ〜９Ｃは、イソシアン酸ベンゾイルと検体との直接反応による標識化を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のベンゾイルまたは置換フェニルＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図９Ａ〜９Ｃは、イソシアン酸ベンゾイルと検体との直接反応による標識化を示す。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｅは、一般式（Ｉ）の化合物のベンゾイルまたは置換フェニルＺ部分を有する本教示内容のタグによる標識検体の種々の実施形態の概略図を示す。図９Ａ〜９Ｃは、イソシアン酸ベンゾイルと検体との直接反応による標識化を示す。
【図１０】図１０は、アンモニウム標識試薬と、その試薬によって標識した検体との種々の実施形態の概略図である。
【図１１】図１１は、標識検体の種々の実施形態と、複数のフラグメンテーション地点の例との概略図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、質量差次タグでヒドロキシル化化合物を標識する方法の種々の実施形態の概略図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、質量差次タグでヒドロキシル化化合物を標識する方法の種々の実施形態の概略図である。
【図１３】図１３は、ピペラジン標識試薬、標識検体、およびレポーターイオンの種々の実施形態の概略図である。
【図１４】図１４は、本教示内容の同重体タグと、それらの会合したレポーターイオンの種々の実施形態の概略図を示す。
【図１５】図１５は、本教示内容の同重体タグ、標識コレステロールを生成するそれらのタグとコレステロールとの反応、およびＭＳ／ＭＳ分析に供した標識コレステロールの会合したレポーターイオンの種々の実施形態の概略図を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本教示内容の標識化合物の種々の実施形態の概略図を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本教示内容の標識化合物の種々の実施形態の概略図を示す。
【図１７】図１７は、本教示内容の標識試薬を形成する方法の種々の実施形態の概略図を示す。
【図１８】図１８は、本教示内容の標識試薬を形成する方法の種々の実施形態の概略図を示す。
【図１９】図１９は、実施例１〜４の種々の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図２０】図２０は、実施例１〜４の種々の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図２１】図２１は、実施例１に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃは、実施例１の種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの概略図を示す。
【図２３】図２３は、実施例２に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、実施例２の種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの概略図を示す。
【図２５】図２５は、実施例３に関する、本実施例の標識検体（ビタミンＤ３）の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図２６】図２６は、電子ボルト（ｅＶ）で示される衝突エネルギー（Ｘ軸）の関数となる種々のＭＲＭ（親−娘イオン遷移）の信号強度（Ｙ軸）に関する実施例３の実験データの概略図を示す。
【図２７】図２７は、４５ｅＶの衝突エネルギーでの実施例３の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの概略図を示す。
【図２８】図２８は、実施例３に関する、本実施例（２５（ＯＨ）ビタミンＤ３）の標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、実施例３の種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの概略図を示す。
【図３０Ａ】図３０Ａは、実施例３の種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの概略図を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、実施例３の種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの概略図を示す。
【図３１】図３１は、実施例３に関する、本実施例（１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３）の標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３２Ａは、衝突エネルギー（ＣＥ）の関数となる全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３２Ｂ〜Ｄは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３２Ｂ〜Ｄは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図３２Ｄ】図３２Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３２Ｂ〜Ｄは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３３Ａは、衝突エネルギー（ＣＥ）の関数となる全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３３Ｂ〜Ｄは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３３Ｂ〜Ｄは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図３３Ｄ】図３３Ａ〜Ｄは、実施例３の実験データの概略図を示す。図３３Ｂ〜Ｄは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図３４】図３４は、本教示内容の種々の実施形態の標識で標識した検体と、非標識検体との信号および／または検出限界の改善に関する実施例４の実験データの概略図を示す。
【図３５】図３５は、本教示内容の種々の実施形態の標識で標識した検体と、非標識検体との信号および／または検出限界の改善に関する実施例４の実験データの概略図を示す。
【図３６】図３６は、本教示内容の種々の実施形態の標識で標識した検体と、非標識検体との信号および／または検出限界の改善に関する実施例４の実験データの概略図を示す。
【図３７】図３７は、本教示内容の種々の実施形態の標識で標識した検体と、非標識検体との信号および／または検出限界の改善に関する実施例４の実験データの概略図を示す。
【図３８】図３８は、本教示内容の種々の実施形態の標識で標識した検体と、非標識検体との信号および／または検出限界の改善に関する実施例４の実験データの概略図を示す。
【図３９Ａ】図３９Ａ〜３９Ｅは、実施例５の実験データの概略図を示す。図３９Ａは、標識エストラジオール試料のクロマトグラムの概略図を示す。
【図３９Ｂ】図３９Ａ〜３９Ｅは、実施例５の実験データの概略図を示す。図３９Ｂおよび３９Ｃは、図３９Ａの約５．０分および５．３分それぞれにおける溶離液のエレクトロスプレー（ＥＳ１）質量スペクトルの概略図を示す。
【図３９Ｃ】図３９Ａ〜３９Ｅは、実施例５の実験データの概略図を示す。図３９Ｂおよび３９Ｃは、図３９Ａの約５．０分および５．３分それぞれにおける溶離液のエレクトロスプレー（ＥＳ１）質量スペクトルの概略図を示す。
【図３９Ｄ】図３９Ａ〜３９Ｅは、実施例５の実験データの概略図を示す。図３９Ｄおよび３９Ｅは、図３９Ａの約５．０２分および５．３分それぞれにおける溶離液のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図３９Ｅ】図３９Ａ〜３９Ｅは、実施例５の実験データの概略図を示す。図３９Ｄおよび３９Ｅは、図３９Ａの約５．０２分および５．３分それぞれにおける溶離液のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図３９Ｆ】図３９Ｆである。
【図４０−１】図４０Ａ〜４０Ｄは、実施例６の実験データの概略図を示す。図４０Ａおよび４０Ｂは、標識テストステロンおよび非標識テストステロンそれぞれのクロマトグラムの概略図を示す。
【図４０−２】図４０Ａ〜４０Ｄは、実施例６の実験データの概略図を示す。図４０Ｃおよび４０Ｄは、非標識テストステロンおよび標識テストステロンそれぞれのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４１−１】図４１Ａ〜４１Ｄは、実施例６の実験データの概略図を示す。図４１Ａおよび４１Ｂは、非標識エピテストステロンおよび標識エピテストステロンそれぞれのクロマトグラムの概略図を示す。
【図４１−２】図４１Ａ〜４１Ｄは、実施例６の実験データの概略図を示す。図４１Ｃおよび４ＩＤは、非標識エピテストステロンおよび標識エピテストステロンそれぞれのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４２Ａ】図４２Ａ〜４２Ｃは、実施例７の実験データの概略図を示す。図４２Ａおよび４２Ｂは、非標識スチグマステロールおよび標識スチグマステロールそれぞれのクロマトグラムの概略図を示す。
【図４２Ｂ】図４２Ａ〜４２Ｃは、実施例７の実験データの概略図を示す。図４２Ａおよび４２Ｂは、非標識スチグマステロールおよび標識スチグマステロールそれぞれのクロマトグラムの概略図を示す。
【図４２Ｃ】図４２Ａ〜４２Ｃは、実施例７の実験データの概略図を示す。図４２Ｃは、標識スチグマステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４３Ａ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ａは、標識コレステロールのクロマトグラムの概略図を示す。
【図４３Ｂ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｂは、標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４３Ｃ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｃおよび４３Ｄは、質量差次タグのセットの質量差次タグで標識したコレステロールのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを比較する概略図を示す。
【図４３Ｄ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｃおよび４３Ｄは、質量差次タグのセットの質量差次タグで標識したコレステロールのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを比較する概略図を示す。
【図４３Ｅ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｅおよび４３Ｆは、質量差次タグのセットの質量差次タグで標識したコレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較する概略図を示す。
【図４３Ｆ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｅおよび４３Ｆは、質量差次タグのセットの質量差次タグで標識したコレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較する概略図を示す。
【図４３Ｇ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｇおよび４３Ｈは、ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルそれぞれのより細かな詳細とより広範な詳細を示す。
【図４３Ｈ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｇおよび４３Ｈは、ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルそれぞれのより細かな詳細とより広範な詳細を示す。
【図４３Ｉ】図４３Ａ〜４３Ｉは、実施例８の実験データの概略図を示す。図４３Ｉは、非標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図４４Ａ】図４４Ａ〜４４Ｄは、実施例９の実験データの概略図を示す。図４４Ａおよび４４Ｂは、標識コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）および標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ３の代謝産物）それぞれのＥＳＩ−ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４４Ｂ】図４４Ａ〜４４Ｄは、実施例９の実験データの概略図を示す。図４４Ａおよび４４Ｂは、標識コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）および標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ３の代謝産物）それぞれのＥＳＩ−ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４４Ｃ】図４４Ａ〜４４Ｄは、実施例９の実験データの概略図を示す。図４４Ｃおよび４４Ｄは、標識コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）および標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロールそれぞれのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４４Ｄ】図４４Ａ〜４４Ｄは、実施例９の実験データの概略図を示す。図４４Ｃおよび４４Ｄは、標識コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）および標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロールそれぞれのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４５Ａ】図４５Ａおよび４５Ｂは、実施例１０の実験データの概略図を示す。図４５Ａは、標識プロスタグランジンのＥＳＴ−ＭＳスペクトルの概略図を示し、図４５Ｂは、標識プロスタグランジンのＥＳＴ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４５Ｂ】図４５Ａおよび４５Ｂは、実施例１０の実験データの概略図を示す。図４５Ａは、標識プロスタグランジンのＥＳＴ−ＭＳスペクトルの概略図を示し、図４５Ｂは、標識プロスタグランジンのＥＳＴ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。
【図４６】図４６は、実施例１１の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図４７】図４７は、実施例１１に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。実施例１１では、フラグメントがナトリウムイオンに捕捉されることが認められた。
【図４８Ａ】図４８Ａ〜Ｆは、実施例１１の実験データの概略図を示す。図４８Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図４８Ｂ】図４８Ａ〜Ｆは、実施例１１の実験データの概略図を示す。図４８Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図４８Ｃ】図４８Ａ〜Ｆは、実施例１１の実験データの概略図を示す。図４８Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図４８Ｄ】図４８Ａ〜Ｆは、実施例１１の実験データの概略図を示す。図４８Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図４８Ｅ】図４８Ａ〜Ｆは、実施例１１の実験データの概略図を示す。図４８Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図４８Ｆ】図４８Ａ〜Ｆは、実施例１１の実験データの概略図を示す。図４８Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図４９】図４９は、実施例１２の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図５０】図５０は、実施例１２に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。実施例１２では、フラグメントがナトリウムイオンに捕捉されることが認められた。
【図５１Ａ】図５１Ａ〜Ｆは、実施例１２の実験データの概略図を示す。図５１Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図５１Ｂ】図５１Ａ〜Ｆは、実施例１２の実験データの概略図を示す。図５１Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５１Ｃ】図５１Ａ〜Ｆは、実施例１２の実験データの概略図を示す。図５１Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５１Ｄ】図５１Ａ〜Ｆは、実施例１２の実験データの概略図を示す。図５１Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５１Ｅ】図５１Ａ〜Ｆは、実施例１２の実験データの概略図を示す。図５１Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５１Ｆ】図５１Ａ〜Ｆは、実施例１２の実験データの概略図を示す。図５１Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５２】図５２は、実施例１３の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図５３】図５３は、実施例１３に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図５４Ａ】図５４Ａ〜Ｆは、実施例１３の実験データの概略図を示す。図５４Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図５４Ｂ】図５４Ａ〜Ｆは、実施例１３の実験データの概略図を示す。図５４Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５４Ｃ】図５４Ａ〜Ｆは、実施例１３の実験データの概略図を示す。図５４Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５４Ｄ】図５４Ａ〜Ｆは、実施例１３の実験データの概略図を示す。図５４Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５４Ｅ】図５４Ａ〜Ｆは、実施例１３の実験データの概略図を示す。図５４Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５４Ｆ】図５４Ａ〜Ｆは、実施例１３の実験データの概略図を示す。図５４Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５５】図５５は、実施例１４の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図５６】図５６は、実施例１４に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図５７Ａ】図５７Ａ〜Ｆは、実施例１４の実験データの概略図を示す。図５７Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図５７Ｂ】図５７Ａ〜Ｆは、実施例１４の実験データの概略図を示す。図５７Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５７Ｃ】図５７Ａ〜Ｆは、実施例１４の実験データの概略図を示す。図５７Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５７Ｄ】図５７Ａ〜Ｆは、実施例１４の実験データの概略図を示す。図５７Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５７Ｅ】図５７Ａ〜Ｆは、実施例１４の実験データの概略図を示す。図５７Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５７Ｆ】図５７Ａ〜Ｆは、実施例１４の実験データの概略図を示す。図５７Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図５８】図５８は、実施例１５の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図５９】図５９は、実施例１５に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図６０Ａ】図６０Ａ〜Ｆは、実施例１５の実験データの概略図を示す。図６０Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図６０Ｂ】図６０Ａ〜Ｆは、実施例１５の実験データの概略図を示す。図６０Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６０Ｃ】図６０Ａ〜Ｆは、実施例１５の実験データの概略図を示す。図６０Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６０Ｄ】図６０Ａ〜Ｆは、実施例１５の実験データの概略図を示す。図６０Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６０Ｅ】図６０Ａ〜Ｆは、実施例１５の実験データの概略図を示す。図６０Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６０Ｆ】図６０Ａ〜Ｆは、実施例１５の実験データの概略図を示す。図６０Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６１】図６１は、実施例１６の標識検体を形成するための反応の概略図を示す。
【図６２】図６２は、実施例１６に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図６３Ａ】図６３Ａ〜Ｆは、実施例１６の実験データの概略図を示す。図６３Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図６３Ｂ】図６３Ａ〜Ｆは、実施例１６の実験データの概略図を示す。図６３Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６３Ｃ】図６３Ａ〜Ｆは、実施例１６の実験データの概略図を示す。図６３Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６３Ｄ】図６３Ａ〜Ｆは、実施例１６の実験データの概略図を示す。図６３Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６３Ｅ】図６３Ａ〜Ｆは、実施例１６の実験データの概略図を示す。図６３Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６３Ｆ】図６３Ａ〜Ｆは、実施例１６の実験データの概略図を示す。図６３Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６４】図６４は、実施例１７に関する、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーション地点（破線）と、その位置でのフラグメンテーションにより見込まれるレポーターイオンのおおよその基準質量（破線に付随する数値）との概略図を示す。
【図６５Ａ】図６５Ａ〜Ｆは、実施例１７の実験データの概略図を示す。図６５Ａは、時間を関数として全イオン電流（ＴＩＣ）を示す。
【図６５Ｂ】図６５Ａ〜Ｆは、実施例１７の実験データの概略図を示す。図６５Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６５Ｃ】図６５Ａ〜Ｆは、実施例１７の実験データの概略図を示す。図６５Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６５Ｄ】図６５Ａ〜Ｆは、実施例１７の実験データの概略図を示す。図６５Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６５Ｅ】図６５Ａ〜Ｆは、実施例１７の実験データの概略図を示す。図６５Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【図６５Ｆ】図６５Ａ〜Ｆは、実施例１７の実験データの概略図を示す。図６５Ｂ〜Ｆは、種々の衝突エネルギー（ＣＥ）の実験的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本教示内容について詳細に記載する前に、本明細書で使用する特定の用語の定義を示すことは、本教示内容を理解する上で役立つ場合がある。
【００３７】
本明細書で使用される冠詞「ａ」は、「１つ以上」または「少なくとも１つ」を意味する不定的な意味で使用される。すなわち、不定冠詞「ａ」で本教示内容の任意の要素が言及される場合は、前記元素が複数存在する可能性が排除されない。
【００３８】
「標識」、「タグ」および「標識試薬」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【００３９】
「質量差次標識」、「質量差次タグ」および、「質量差次標識試薬」という語句は、本明細書で交換可能に使用される。「質量差次標識のセット」、「質量差次タグのセット」という語句は交換可能に使用され、例えば、セットのメンバー（すなわち、個々の「質量差次標識」または「質量差次タグ」）が実質的に同様の構造的性質および化学的性質を有するが、セットのメンバー間の重同位体濃縮の差によって質量が異なる、試薬または化学的部分のセットを指す。質量差次タグのセットの各メンバーは、イオンフラグメンテーションに供されると種々の娘イオン信号を生じることができる。イオンフラグメンテーションは、例えば、不活性ガスとの衝突（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、衝突活性化解離（ＣＡＤ）など）によって、解離を生じる光子との相互作用（例えば、光誘起解離（ＰＩＤ））によって、表面との衝突（例えば、表面誘起解離（ＳＩＤ））によって、解離を生じる電子ビームとの相互作用（例えば、電子誘起解離（ＥＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ））によって、熱／黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）によって、ポストソース分解によって、またはそれらの組み合わせによって起こり得る。セットのメンバーを区別するために使用することができる質量差次タグまたは質量差次標識の娘イオンは、質量差次タグまたは質量差次標識のレポーターイオンと呼ぶことができる。種々の実施形態において、質量差次タグのセットは、セットのメンバー間の重同位体濃縮の差によって質量だけが異なる、式（Ｉ）の化合物、あるいはその塩形態または水和物形態を含む。
【００４０】
「同重体標識」、「同重体タグ」および「同重体標識試薬」という語句は、交換可能に使用される。「同重体標識のセット」、「同重体タグのセット」、および「同重体標識試薬のセット」という語句は交換可能に使用され、例えば、セットのメンバー（個々の「同重体標識」、「同重体タグ」または「同重体標識試薬」）が実質的に同じ質量を有するが、セットの各メンバーがイオンフラグメンテーション（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、光誘起解離（ＰＩＤ）などによる）に供されると種々の娘イオン信号を生じることができる、試薬または化学的部分を指す。種々の実施形態において、同重体タグのセットは、式（Ｉ）の化合物、あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む。セットのメンバーを区別するために使用することができる同重体タグの娘イオンは、同重体タグのレポーターイオンと呼ぶことができる。種々の実施形態において、同重体タグのセットは、フラグメンテーションを行わないとクロマトグラフィで実質的に区別がつかず、かつ質量分析でも実質的に区別がつかないが、ＣＩＤの後にシグネチャーイオンを生成する、ヒドロキシル化環含有化合物および生成した標識化合物を標識するために使用される。
【００４１】
原子または分子の質量は、原子質量単位の整数の近似値、あるいは原子質量単位の１０分の１または１００分の１の近似値に概算できることが理解されるものとする。本明細書で使用される「質量」とは、絶対質量を指すとともに、使用する種々の同位体の質量の差を検出できるかどうかにかかわらず、種々の原子の同位体が、例えば同重体標識のレポーターと残余反応部分の質量のバランスをとるために（同重体標識のセットまたはキット内の同重体標識の総質量が実質的に同じとなるように）機能的等価物となるほど質量がほとんど同じとなるように使用される範囲内の近似の質量を指す。
【００４２】
例えば、最も一般的な２種類の地球上の酸素の同位体は、総質量が１６（実際の質量は１５．９９４９）および１８（実際の質量は１７．９９９２）であり、最も一般的な２種類の地球上の炭素の同位体は、総質量が１２（実際の質量は１２．０００００）および１３（実際の質量は１３．００３３６）であり、最も一般的な２種類の地球上の窒素の同位体は、総質量が１４（実際の質量は１４．００３１）および１５（実際の質量は１５．０００１）である。これらの値は近似であるが、例えば、１６Ｏ原子の代わりに１８Ｏ原子を使用することは、２個の１２Ｃ原子の代わりに２個の炭素１３Ｃ原子を使用すること、２個の１４Ｎ原子の代わりに２個の１５Ｎ原子を使用すること、および／または１個の１２Ｃおよび１個の１４Ｎの代わりに１個の１３Ｃ原子および１個の１５Ｎ原子を使用することと機能的に質量が同等であることを、当業者は理解するであろう。
【００４３】
本明細書で使用される「同位体濃縮」とは、化合物（例えば、標識試薬）が、１つ以上の重原子同位体（例えば、重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌ、８１Ｂｒなどの安定同位体）によって合成により濃縮されたことを意味する。同位体濃縮が１００％効果的であることはないことから、濃縮の状態がより少ない化合物の不純物が存在する可能性があり、それらの不純物の質量はより少ないものとなる。同様に、過剰濃縮（望ましくない濃縮）や天然の同位体存在度の変動によって、質量がより多い不純物が存在する可能性もある。
【００４４】
本明細書で使用される「天然の同位体存在度」とは、天然における１つ以上の同位体の地球上における存在率に基づいた、化合物中に認められる１つ以上の同位体のレベル（または分布）を指す。例えば、生存する植物の材料から得られる天然の化合物は、通常約０．６％の１３Ｃを含有する。
【００４５】
「置換」という用語は、１個の分子の１個以上の原子（例えば、炭素、窒素、酸素など）上で水素原子を置換する置換基を有する基を説明するものとして意図される。置換基には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルボキシレート基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、ジアルキルアミノカルボニル基、アルコキシル基、シアノ基、アミノ基（アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基、およびアルキルアリールアミノ基を含む）、アシルアミノ基（アルキルカルボニルアミノ基、アリールカルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびウレイド基を含む）、アミジノ基、イミノ基、スルフヒドリル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、アジド基、ヘテロシクリル基、アルキルアリール基、芳香族基、または複素芳香族基が含まれる。したがって、「本明細書に記載の置換基」などという語句は、上記の置換基の内の１つ以上およびそれらの組み合わせを指す。
【００４６】
「アルキル」という用語は飽和脂肪族基を含み、飽和脂肪族基としては「非置換アルキル基」と「置換アルキル基」の両方が含まれ、後者は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上で水素原子を置換する置換基を有するアルキル基を指す。「アルキル」という用語には、直鎖アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基など）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基など）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基）、およびシクロアルキル置換アルキル基が含まれる。「アルキル」という用語にはまた、天然および非天然のアミノ酸の側鎖も含まれる。
【００４７】
「アルキルアリール」または「アラルキル」基は、アリール基（例えば、フェニルメチル（ベンジル）基）で置換されるアルキル基である。
【００４８】
「アリール」という用語には、５員および６員の単環式芳香族基、ならびに多環式（例えば、三環式、ニ環式）アリール基（例えば、ナフタレン基、アンスラセン基、フェナントレン基など）が含まれる。１つ以上の芳香族環は、１つ以上の環位置で上記のような置換基で置換することができる。アリール基は、例えば多環を形成するような芳香族環ではない脂環や複素環などで縮合または架橋させることができる。
【００４９】
「アルケニル」という用語には、長さや、上記のアルキル基への置換の可能性がほぼ同じであるが、少なくとも１個の二重結合を含有する、不飽和脂肪族基が含まれる。例えば、「アルケニル」という用語は、直鎖アルケニル基（例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基など）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環）基（シクロプロペニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基が含まれる。アルケニルという用語には、「非置換アルケニル基」と「置換アルケニル基」の両方が含まれ、後者は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上で水素原子を置換する置換基を有するアルケニル基を指す。
【００５０】
「アルキニル」という用語には、長さや、上記のアルキル基への置換の可能性がほぼ同じであるが、少なくとも１個の三重結合を含有する、不飽和脂肪族基が含まれる。例えば、「アルキニル」という用語には、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニル基、デシニル基など）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基が含まれる。アルキニルという用語には、「非置換アルキニル基」と「置換アルキニル基」の両方が含まれ、後者は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上で水素原子を置換する置換基を有するアルキニル基を指す。
【００５１】
「アシル」という用語には、アシルラジカル（ＣＨ３ＣＯ−）またはカルボニル基を含有する化合物および基が含まれる。「置換アシル」という用語には、水素原子の１個以上を置換する置換基を有するアシル基が含まれる。
【００５２】
「アシルアミノ」という用語には、アシル基がアミノ基に結合する基が含まれる。例えば、本用語には、アルキルカルボニルアミノ基、アリールカルボニルアミノ基、カルバモイル基およびウレイド基が含まれる。
【００５３】
「アロイル」という用語には、カルボニル基に結合するアリール基または複素芳香族基を有する化合物および基が含まれる。アロイル基の例には、フェニルカルボキシ基、ナフチルカルボキシ基などが含まれる。
【００５４】
「アルコキシアルキル」、「アルキルアミノアルキル」および「チオアルコキシアルキル」という用語には、上記のようなアルキル基が含まれ、さらに、炭化水素骨格の１個以上の炭素（例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子）を置換する酸素原子、窒素原子または硫黄原子も含まれる。
【００５５】
「アルコキシ」という用語には、酸素原子に共有結合する置換および非置換アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基が含まれる。アルコキシ基の例には、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、およびペントキシ基が含まれ、シクロペントキシ基などの環式基が含まれる場合もある。
【００５６】
「アミン」または「アミノ」という用語には、窒素原子が少なくとも１個の炭素またはヘテロ原子に共有結合する化合物が含まれる。「アルキルアミノ」という用語には、窒素が少なくとも１個のさらなるアルキル基に結合する基および化合物が含まれる。「ジアルキルアミノ」という用語には、窒素原子が少なくとも２個のさらなるアルキル基に結合する基が含まれる。「アリールアミノ」および「ジアリールアミノ」という用語には、窒素が少なくとも１個または２個のアリール基にそれぞれ結合する基が含まれる。「アルキルアリールアミノ」、「アルキルアミノアリール」または「アリールアミノアルキル」という用語は、少なくとも１個のアルキル基と少なくとも１個のアリール基とに結合するアミノ基を指す。「アルカミノアルキル」という用語は、アルキル基にも結合する窒素原子に結合したアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を指す。
【００５７】
「アミド」または「アミノカルボキシ」という用語には、カルボニル基またはチオカルボニル基の炭素に結合する窒素原子を含有する化合物または基が含まれる。本用語には、カルボキシ基に結合したアミノ基に結合したアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を含む「アルカミノカルボキシ」基が含まれる。これには、カルボニル基またはチオカルボニル基の炭素に結合するアミノ基に結合したアリール基またはヘテロアリール基を含むアリールアミノカルボキシ基が含まれる。「アルキルアミノカルボキシ」、「アルケニルアミノカルボキシ」、「アルキニルアミノカルボキシ」および「アリールアミノカルボキシ」という用語には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基がそれぞれ窒素原子に結合し、その窒素原子がさらにカルボニル基の炭素に結合する基が含まれる。
【００５８】
「カルボニル」または「カルボキシ」という用語には、酸素原子への二重結合に結合する炭素を含有する化合物および基、ならびにそれらの互変異性型が含まれる。カルボニル基を含有する基の例には、アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル酸、アミド、エステル、無水物などが含まれる。「カルボキシ基」または「カルボニル基」という用語は、アルキル基がカルボニル基に共有結合する「アルキルカルボニル」基、アルケニル基がカルボニル基に共有結合する「アルケニルカルボニル」基、アルキニル基がカルボニル基に共有結合する「アルキニルカルボニル」基、アリール基がカルボニル基に共有結合する「アリールカルボニル」基などの基を指す。さらに、本用語はまた、１個以上のヘテロ原子がカルボニル基に共有結合する基を指す。例えば、本用語には、例えば、アミノカルボニル基（窒素原子がカルボニル基（例えば、アミド）の炭素に結合する）、アミノカルボニルオキシ基（酸素原子および窒素原子が両方ともカルボニル基（例えば、「カルバミン酸塩」とも呼ぶ）の炭素に結合する）などの基が含まれる。さらに、アミノカルボニルアミノ基（例えば、尿素基）にはまた、ヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子など、ならびに炭素原子）に結合したカルボニル基の他の組み合わせも含まれる。さらに、ヘテロ原子は、１個以上のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基などでさらに置換することもできる。
【００５９】
「エーテル」という用語には、２種類の炭素原子またはヘテロ原子に結合する酸素を含む化合物または基が含まれる。例えば、本用語には、別のアルキル基と共有結合する酸素原子と共有結合するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を指す「アルコキシアルキル」が含まれる。
【００６０】
「エステル」という用語には、カルボニル基の炭素に結合する酸素原子に結合する炭素またはヘテロ原子を含有する化合物および基が含まれる。「エステル」という用語には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ペントオキシカルボニル基などのアルコキシカルボキシ基が含まれる。アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、上に定義する通りである。
【００６１】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語には、−ＯＨまたは−Ｏ−を有する基が含まれる。
【００６２】
「ハロゲン」という用語には、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などが含まれる。「過ハロゲン化」という用語は一般的に、すべての水素がハロゲン原子によって置換される基を指す。
【００６３】
「ヘテロ原子」という用語には、炭素または水素以外の任意の元素の原子が含まれる。好ましいヘテロ原子は、窒素および酸素である。「複素環」または「複素環式」という用語には、１個以上のヘテロ原子を含有する飽和環、不飽和環、芳香族環（「ヘテロアリール環」または「複素環式芳香族環」）および多環式環が含まれる。複素環は、置換される場合もあれば、置換されない場合もある。複素環の例には、例えば、ベンゾジオキサゾール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾキサゾール、クロメン、デアザプリン、フラン、インドール、インドリジン、イミダゾール、イソオキサゾール、イソインドール、イソキノリン、イソチアゾール、メチレンジオキシフェニル、ナフチリジン、オキサゾール、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キノリン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、およびトリアゾールが含まれる。他の複素環には、モルホリノ、ピペラジン、ピペリジン、チオモルホリノ、およびチオアゾリジンが含まれる。
【００６４】
「多環式環」および「多環式環構造」という用語には、複数の炭素が２個の隣接する環（例えば、これらの環は「縮合環」である）に共通している複数の環（例えば、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、シクロアルキニル環、アリール環および／またはヘテロシクリル環）を有する基が含まれる。隣接しない原子を介して接合する環は、「架橋」環と呼ばれる。多環式環のそれぞれの環は、上記のような置換基で置換することができる。
【００６５】
「ヒドロキシル化環含有化合物」という用語は、ヒドロキシル基で置換される環の少なくとも１個の水素原子を有する化合物を指す。
【００６６】
「ヒドロキシル化化合物」という用語は、ヒドロキシル基で置換される少なくとも１個の水素原子を有する化合物を指す。
【００６７】
「ヒドロキシル化多環式環含有化合物」という用語は、ヒドロキシル基で置換される少なくとも１個の環の少なくとも１個の水素原子を有する化合物を指す。
【００６８】
本明細書で使用される「塩形態」という用語には、化合物の塩、または化合物の塩の混合物が含まれる。さらに、化合物の双性イオン形態もまた、「塩形態」という用語に含まれる。アミン基または他の塩基性基を有する化合物の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などの適切な有機酸または無機酸との反応によって得ることができる。また、第四級アンモニウム基を有する化合物は、塩素物、臭素物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などの対アニオンを含有する場合もある。カルボキシル酸または他の酸性官能基を有する化合物の塩は、化合物を適切な塩基（例えば、水酸化物塩基）と反応させることによって調製することができる。したがって、酸性官能基の塩は、対カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）を有する場合がある。
【００６９】
本明細書で使用される「水和物形態」とは、化合物または混合物のいずれかの水和状態、あるいは化合物の複数の水和状態を指す。例えば、本明細書で考察される標識試薬は、半水和物、一水和物、二水和物などであってよい。さらに、本明細書に記載される標識試薬の試料は、一水和物形態、二水和物形態および半水和物形態を含むことができる。
【００７０】
標識試薬
種々の態様において、本教示内容は、標識試薬、標識のセット、および標識検体を提供する。種々の実施形態においては、一般式（Ｉ）の質量差次標識のセットが提供される。種々の実施形態においては、非塩形態および／または非水和形態の一般式（Ｉ）の同重体標識のセットが提供される。種々の実施形態において、標識の質量は、非塩形態および／または非水和形態で約０．０５ａｍｕ未満異なる。提供される標識のセットは、以下の一般式（Ｉ）の２つ以上の化合物であって：
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
標識のセット内の化合物の１つ以上が１つ以上の重原子同位体を含有する、化合物；あるいはその塩形態または水和物形態を含む。種々の実施形態において、重原子同位体は、それぞれ独立して１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである。
【００７１】
一般式（Ｉ）において、Ｚは、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環式アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換アミノ、あるいは置換または非置換チオを表し；Ｒ１は、置換または非置換の
【００７２】
【化５】
0005413836.tif 000046
を表し；Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはアセチルを表し；Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ハロゲン化アルキル、あるいは置換または非置換アリール基を表す。
【００７３】
式（Ｉ）の化合物は、モノ−ＴＦＡ塩、モノ塩酸塩、ビス−塩酸塩、またはビス−ＴＦＡ塩、あるいはそれらの水和物が含まれるがこれらに限定されない、多種多様な塩形態および水和物形態で提供することができる。
【００７４】
種々の実施形態において、標識のセットの化合物の１つ以上は、２個以上の重原子、３個以上の重原子および／または４個以上の重原子で同位体濃縮される。種々の実施形態において、式の標識のセットは、同位体が少なくとも８０パーセントの同位体純度、少なくとも９３パーセントの同位体純度、および／または少なくとも９６パーセントの同位体純度で存在するように重原子同位体を組み込んだ。
【００７５】
種々の実施形態において、標識のセットは、以下の一般式（ＩＶ）トリメチルアンモニウム化合物であって：
【００７６】
【化６】
0005413836.tif 000047
式中、Ｒ１は式（Ｉ）について記載した通りであってよい、化合物；あるいはその塩形態または水和物形態を含む。種々の実施形態において、Ｒ１は、
【００７７】
【化７】
0005413836.tif 000048
表す。
【００７８】
式（Ｉ）または式（ＩＶ）の標識のセットは、例えば、質量差次標識のセット、同重体標識のセット、あるいは質量差次標識と同重体標識の両方の組み合わせでもあってよいことが理解されるものとする。例えば、本教示内容に含まれる質量差次標識のセットは、一般式（ＩＶａ）〜（ＩＶｂ）の化合物から選択される２つ以上の化合物を含むことができると考えられ、本教示内容に含まれる同重体標識のセットは、以下の一般式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｆ）：
【００７９】
【化８】
0005413836.tif 000049
（式中、アスタリスクは重原子置換を示す）の化合物から選択される複数種の化合物を含むことができると考えられる。
【００８０】
本教示内容のタグセットのメンバーは、それらのメンバーが質量差次タグであり、そのセットのメンバー間の重同位体濃縮の差により質量が異なっている場合でも、実質的に同様の構造的性質を有することがきる。したがって、種々の実施形態において、タグのセットとは異なる標識によってそれぞれ標識された２つの同じ化合物は、異なる質量を有することができるが、前記標識化合物は、例えばクロマトグラフ分離やイオン化などの差によって、質量分析器を通過した標識化合物の相対量に実質的な差が生じないように、実質的に同様の化学反応性およびクロマトグラフ分離性を有することができる。本教示内容において、質量差次タグならびに同重体タグのセットの各メンバーは、（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）や光誘起解離（ＰＩＤ）などによる）イオンフラグメンテーションに供されると種々の娘イオン信号を生じることができる。このような娘イオンは、セットのメンバーを区別するために使用することができ、前記タグまたは前記標識のレポーターイオンと呼ぶことができる。種々の実施形態において、特定のタグは、複数のレポーターイオン信号を生じる場合がある。
【００８１】
種々の実施形態において、標識のセットは、以下の一般式（Ｖ）の複数の５員、６員または７員複素環式環：
【００８２】
【化９】
0005413836.tif 000050
あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む。式（Ｖ）において、ｍは０、１または２（それぞれ４員環、５員環、６員環または７員環を提供する）であり、Ｒ１は式（Ｉ）について記載した通りであってよく、Ｒ３はＣ、Ｎ、ＯまたはＳを表し、Ｒ４は水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基を表し、各Ｒ５は独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、あるいは場合により置換または非置換アリール基を含有する場合があり、アルキル基およびアリール基の炭素原子がそれぞれ独立して１個以上の水素原子、重水素原子またはフッ素原子に結合する、アミノ酸側鎖、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表す。
【００８３】
種々の実施形態において、標識のセットは、以下の一般式（ＶＩ）の２つ以上のＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン化合物：
【００８４】
【化１０】
0005413836.tif 000051
；あるいはそれらの塩形態または水和物形態を含む。式（ＶＩ）において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、式（Ｉ）および／または式（Ｖ）について記載した通りであってよい。
【００８５】
種々の実施形態において、Ｒ１は
【００８６】
【化１１】
0005413836.tif 000052
を表し、式中、ＸおよびＲ２は、式（Ｉ）について記載した通りであってよい。
【００８７】
また、式（Ｖ）および（ＶＩ）の標識のセットは、例えば、質量差次標識のセット、同重体標識のセット、または質量差次標識と同重体標識の両方の組み合わせであってよいことも理解されるものとする。
【００８８】
種々の実施形態においては、以下の一般式（ＶＩＩ）の複数のＮ置換ピペラジン化合物であって：
【００８９】
【化１２】
0005413836.tif 000053
式中、Ｒ９がハロゲン化物、−ＯＨ、または−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１１を表し、Ｒ１１が水素あるいは直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ４およびＲ５が既述の通りであってよい、化合物を含む質量差次タグのセットが提供される。種々の実施形態において、質量差次タグのセットは、以下の一般式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）のＮ置換ピペラジン化合物であって：
【００９０】
【化１３】
0005413836.tif 000054
式中、Ｒ９およびＲ４が既述の通りである、化合物を含む。種々の実施形態において、タグのセット内のタグを区別するために使用される重原子同位体濃縮では、このような同位体濃縮がピペラジン環の原子、ピペラジン環の原子に直接結合する原子、Ｒ４の原子、またはそれらの組み合わせに対するものであるタグが使用される。
【００９１】
質量差次タグのすべてのメンバーが本教示内容にしたがって同位体濃縮される重原子というわけではないということが理解されなければならない。例えば、本教示内容に含まれる質量差次タグのセットは、以下の一般式（ＩＸａ）〜（ＩＸＩ）の化合物：
【００９２】
【化１４】
0005413836.tif 000055
【００９３】
【化１５】
0005413836.tif 000056
【００９４】
【化１６】
0005413836.tif 000057
（例えば、メンバー（ＩＸａ）は同位体濃縮されない）から選択される２つ以上の化合物、あるいはその塩形態または水和物形態を含むことができると考えられる。
【００９５】
種々の実施形態においては、以下の一般式（Ｘ）の複数のＮ置換ピペラジン化合物であって：
【００９６】
【化１７】
0005413836.tif 000058
式中、Ｒ４がメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基であり、同重体タグのセットの各メンバーが、同位体濃縮された重原子である、化合物を含む同重体タグのセットが提供される。種々の実施形態において、同重体タグのセットは、以下の一般式（Ｘａ）〜（Ｘｄ）の複数のタグであって：
【００９７】
【化１８】
0005413836.tif 000059
式中、Ｒ４がメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基である、タグを含む。
【００９８】
同重体標識
種々の実施形態において、本教示内容は、同重体標識試薬、標識検体、ヒドロキシル化化合物の標識および分析方法を提供する。一般的に、本教示内容の同重体標識は、少なくとも１個のレポーター基部分および残余基部分を含む。例えば、図１３、図１４および図１６は、本教示内容の種々の実施形態における同重体標識として機能し得る標識構造の種々の非限定例を提供する。
【００９９】
種々の実施形態において、図１３を参照すると、レポーター基部分（１３０２）は、レポーター基部分の窒素原子（１３０６）により残余基部分（１３０４）に連結したＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリンを含む。種々の残余基部分を使用して同重体タグを提供することができる。種々の実施形態において、残余基は、対象の検体におけるヒドロキシル基との反応の反応中心を含む。例えば、種々の実施形態において、残余基は、検体への直接の結合および検体の酸素原子への結合を形成するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）の反応中心を含む。
【０１００】
種々の実施形態において、標識検体（１３０８）がフラグメンテーションに供されると、少なくとも標識検体（１３０８）の窒素（１３０６）と残余基部分（１３１０）の間の結合によって、種々の実施形態においてはアセトアミドＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン（１３１２）のイオンであるレポーターイオンの生成が中断する。
【０１０１】
図１４を参照すると、本教示内容の同重体タグの種々の実施形態、ならびにその会合レポーターイオンの種々の実施形態の概略図が示されており、各タグがレポーター部分（ＲＰ）と残余基部分（ＢＧ）を含む、同重体タグのセットの４種の同重体タグが示されている。この例において、各タグは、種々の重原子同位体置換（アスタリスクで示す）を有する（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−イソシアン酸アセチルである。種々の実施形態において、１つ以上の試料から得られる１つ以上の検体は、同重体タグで標識され、前記標識検体は、質量フィルターにかけられ（例えば、ＴＯＦ  ＭＳ、ＲＦ多重極ＭＳ、イオン移動度ＭＳなどによる）、フラグメンテーション（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、光解離など）に供され、質量分析によって検出することができるレポーターイオン（１４２２、１４２４、１４２６、１４２８）を生成する。
【０１０２】
レポーター基およびイオン
本教示内容の同重体タグのレポーター基部分は、標識検体がフラグメンテーションに供されると標識検体からレポーターイオン（このレポーターイオンは、質量分析によって測定することができる実質的に一定の質量および／または質量電荷比を有する）を生成する基であってよい。本教示内容において、同重体タグのセット内の異なる同重体タグのレポーターイオンは、異なる質量および／または質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。異なるレポーター基およびイオンは、異なるタグ間における質量またはｍ／ｚの差を実現する１つ以上の重原子同位体を含むことができる。例えば、炭素の重原子同位体（１２Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ）、窒素の重原子同位体（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素の重原子同位体（１６Ｏおよび１８Ｏ）、硫黄の重原子同位体（３２Ｓ、３３Ｓおよび３４Ｓ）、および／または水素の重原子同位体（水素、重水素および三重水素）は、レポーター基およびイオンの多様な群の調製に使用することができる。
【０１０３】
レポーターイオンは、対象の試料と会合し、それによって対応するレポーター基を有する本教示内容の同重体タグで前記試料の１個以上の検体を標識することができる。このように、例えば、レポーターイオンに関する情報は、試料の検体の１個またはすべてに関する情報に関連する可能性がある。種々の実施形態において、標識検体のイオンのフラグメンテーションが行われ、それにより娘フラグメントイオンおよび検出可能なレポーターイオンが生成される。検出されたレポーターイオン信号を使用して、例えば、検体を得た試料を同定することができる。検出されたレポーターイオン信号を使用して、１個以上の試料中の検体の相対量または絶対量（多くの場合、濃度および／または量として表される）を測定することができる。例えば、試料中の標識検体の量は、レポーターイオン信号を他のレポーターイオンの信号、校正標準などと比較することにより測定することができる。種々の実施形態において、特定の試料中の１個以上の検体の量などの情報は、それぞれの特定の試料を標識するのに使用される同重体タグのレポーター基に対応するレポーターイオンに関連する可能性がある。種々の実施形態において、１個以上の検体の同一性に関する情報は、異なるレポーターイオンに関連する情報と相関させ、それによって１個以上の試料中における各標識検体の同一性および量の測定を促進することができる。
【０１０４】
レポーター基は、固定電荷を含むこともできれば、あるいはイオン化することもできる。種々の実施形態においては、固定電荷を有するかもしくはイオン化が可能なレポーター基を使用し、同重体タグを分離および／または使用して、塩、塩の混合物、双性イオン形態、またはそれらの組み合わせの検体を標識することができる。レポーター基のイオン化により、質量分析器での前記基の測定が容易になる。イオン化されると、レポーター基は、１つ以上の正または負の実効電荷を含むことができる。したがって、このような基の種々の実施形態が質量分析器で容易にイオン化できることから、レポーター基は１個以上の酸性基または塩基性基を含むことができる。例えば、レポーター基は、１個以上の塩基性窒素原子（正電荷）または１個以上のイオン化可能な酸性基（例えば、カルボキシル酸基、スルホン酸基、リン酸基（負電荷））を含むことができる。塩基性窒素を含むレポーター基の例には、置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
検体の分析に典型的な条件下で実質的にサブフラグメントを生じないレポーターイオンが生成されるように、レポーター基を選択することができる。種々の実施形態において、レポーターイオンは、レポーター基のアルキルアミドの窒素と残余基の間の結合のフラグメンテーションを生じさせるために加えられる解離エネルギーの条件下で実質的にサブフラグメントを生じないように選択することができる。「実質的にサブフラグメントを生じない」とは、レポーターイオンのフラグメントが、対象の検体の成功した分析に適用する際にバックグラウンドノイズを超えて検出することが困難または不可能であることを意味する。
【０１０６】
レポーターイオンの質量は、対象の検体の質量、および／または検体の予測されるフラグメントのいずれかの質量と異なるように選択することができる。例えば、タンパク質またはペプチドが検体である場合、レポーターイオンの質量は、いずれかの天然のアミノ酸またはペプチド、あるいはそれらの予測されるフラグメントと異なるように選択することができる。
【０１０７】
本教示内容の種々の実施形態において、親イオンは同重体タグで標識されるステロイドであり、娘イオンは同重体タグのレポーターイオンであり、したがって、特定の同重体標識ステロイド親イオンが検出器で測定されるレポーターイオンのイオン信号は、「標識ステロイド−レポーターイオン遷移信号」と呼ぶことができる。同様に、特定の同重体標識標準化合物について検出器で測定されるレポーターイオンのイオン信号は、「標識標準−レポーターイオン遷移信号」と呼ぶことができる。
【０１０８】
残余基
種々の実施形態において、本教示内容の同重体タグは、レポーター基および残余基の合わせた質量が、同重体タグのセットの各タグが実質的に同じ質量を有するような質量であるレポーター基および残余基を含む。種々の実施形態において、残余基は、１個以上のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を含む。種々の実施形態において、検体は、残余基のカルボニル炭素を介して酸素原子によりタグと連結され、標識化合物を形成する。
【０１０９】
種々の実施形態において、残余基はまた、標識検体がフラグメンテーションに供されると、脱離基としても機能する。例えば、種々の実施形態において、残余基は、フラグメンテーション時に二酸化炭素として脱離する検体の酸素原子を介して検体と結合したカルボニル部分を含む。
【０１１０】
本教示内容は、標識試薬の多くの実施形態を提供する。図５は、３種類の標識（５０２）によるコレステロールの標識化を示す多くの可能な試薬のごく一部を示している。図６Ａ〜図９Ｅは、本教示内容に含まれる種々の標識化方法および標識検体化合物のさらなる非限定例を示している。
【０１１１】
本明細書において、標識化方法（化合物に標識を添加する方法）および例えば標識の提供および添加に関する説明は、例えば式（Ｉ）の化合物の一段階反応や、多段階反応による式（Ｉ）の化合物の添加の両方を含む（図６Ｂ、図１７、図１９および図５２を参照）ことが理解されるものとする。例えば、種々の実施形態において、化合物に式（Ｉ）の標識あるいはその塩形態または水和物形態を添加して化合物を標識する工程は、標識の第１の部分（例えば、式（Ｉ）のＲ１部分を含む部分）の後、第２の工程で標識の第２の部分（例えば、式（Ｉ）における部分Ｚを含む部分）を添加して、標準化合物の標識化を行う、２段階の反応を含む。
【０１１２】
図１０は、一般式（Ｉ）の種々の実施形態によればレポーター基（１００２）および残余基（１００４）を含み、一般式（ＩＩ）の種々の実施形態によれば標識検体化合物（１００８）を含む標識の概略図を示し、標識化合物のＣＩＤ時における結合切断の種々の実施形態を示す。種々の実施形態において、標識化合物は、アミン（１００６）とカルボニル（１０１０）の間の結合のフラグメンテーションによってレポーターイオンを生成する。種々の実施形態において、標識化合物は、複数の地点でフラグメンテーションを行うことができる。
【０１１３】
標識検体
種々の態様において、本教示内容は、以下の一般式（ＸＩ）により表すことができる標識ヒドロキシル含有化合物であって：
ＲＰ−ＢＸ−ＬＧ−Ｏ−ＢＹ−ＡＲ    （ＸＩ）
式中、ＡＲが環含有化合物であり、ＬＧがリンカー基を表し、ＢＸがＲＰとＬＧの原子の間の結合を表し、Ｏが酸素であり、ＢＹが、酸素Ｏと、標識化反応の前にヒドロキシル化したＡＲの炭素との間の結合を表す、化合物を提供する。種々の実施形態において、ＬＧは残余基（ＢＧ）として機能する。種々の実施形態において、ＬＧおよびＯは、共に残余基（ＢＧ）として機能する。種々の実施形態において、ＢＸは、標識多環式環含有化合物を衝突誘起解離（ＣＩＤ）に供すると切断される結合を表す。種々の実施形態において、ＢＸとＢＹの両方は、標識多環式環含有化合物を衝突誘起解離（ＣＩＤ）に供すると切断される結合を表す。
【０１１４】
種々の実施形態において、標識検体含有化合物は、タグのセットのメンバー当たり複数のレポーターイオン質量を生じることができる。例えば、種々の実施形態において、ＣＩＤに供される標識化合物の試料は、２種類のｍ／ｚ値のレポーターイオン、すなわち、結合ＢＸのフラグメンテーションにより生じるものと、結合ＢＹのフラグメンテーションにより生じるものを生成する。
【０１１５】
図１１は、本教示内容の種々の実施形態による標識検体化合物の概略図を示し、標識化合物のＣＩＤ時における結合切断の種々の実施形態を示す。種々の実施形態において、標識化合物は、結合ＢＸのフラグメンテーションによってレポーターイオン（ＲＰフラグメント１）を生成する（スキーム１１０１）。種々の実施形態において、標識化合物は、複数の地点でフラグメンテーションを行うことができる。スキーム１１０２において、標識化合物は、結合ＢＸ、結合ＢＹまたはそれらの両方の解離によってフラグメンテーションを行うことができ、結合ＢＹの切断によって、異なるレポーターイオン（ＲＰフラグメント２）が生成される。したがって、種々の実施形態において、タグのセットのメンバーを区別するための重原子同位体の濃縮は、化合物のＲＰフラグメント２部分の原子のものであるのが好ましい。
【０１１６】
図１６Ａ〜Ｂは、標識環含有化合物（標識コレステロール）の種々の実施形態の概略図を示す。図１６Ａは、ＢＧ（１６０４）がカルボニル基（−Ｃ＝Ｏ）であり、結合ＢＸ（１６０６）が前記カルボニルの窒素と炭素の間の結合である、同重体タグで標識されたコレステロールを示し、別の可能なフラグメンテーション地点（結合ＢＹ）も示される。図１６Ｂは、ＢＧ（１６１４）がカルボニル（−Ｃ＝Ｏ）であり、結合ＢＸ（１６１６）が前記カルボニル基の炭素間の結合である、同重体タグで標識されたコレステロールを示し、別の可能なフラグメンテーション地点（結合ＢＹ）も示される。種々の実施形態において、標識化合物は、複数の地点でフラグメンテーションを行うことができる。
【０１１７】
種々の態様において、本教示内容は、標識検体であって、前記検体が、本教示内容の標識による標識化を行う少なくとも１個のヒドロキシル基を含む、標識検体を提供する。種々の実施形態において、標識化合物は、以下の一般式（ＩＩ）により表すことができ：
【０１１８】
【化１９】
0005413836.tif 000060
、その塩形態または水和物形態として提供および／または使用することができる。一般式（ＩＩ）において、（ａ）Ｚは式（Ｉ）で挙げた通りであってよく、（ｂ）Ａは、標識化合物の形成前に１個以上のヒドロキシル基を含有した化合物を表し、（ｃ）ＲＹは、標識化合物の形成前にヒドロキシル基を含有したＡの炭素原子への結合を形成する酸素原子を表し、（ｄ）ｎは、１から、標識化合物の形成前のＡ中のヒドロキシル基の数までの整数を表し、（ｅ）ＲＸは、置換または非置換の
【０１１９】
【化２０】
0005413836.tif 000061
を表す。
【０１２０】
本教示内容は、ヒドロキシル化化合物の分析に限定されないが、本教示内容の一実施形態のタグによる標識化前のカルボニル基の還元によって、標識化反応によるｉｎ  ｓｉｔｕでの還元によって、またはそれらの組み合わせによって、非ヒドロキシル化カルボニル担持化合物に適用することができる。
【０１２１】
種々の実施形態において、Ｚ−ＲＸは、以下の一般式（ＩＩａ）のものであり：
【０１２２】
【化２１】
0005413836.tif 000062
、種々の実施形態においては、式中、ＲＸが
【０１２３】
【化２２】
0005413836.tif 000063
を表す。
【０１２４】
種々の実施形態において、標識検体化合物は四環を含む。種々の実施形態において、四環は、以下の一般式（ＩＩＩ）により表すことができ：
【０１２５】
【化２３】
0005413836.tif 000064
、式中、ＲＹとの結合を形成しない四環上の位置の１つ以上はそれぞれ独立して、水素基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルボキシレート基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシル基、シアノ基、アルキルアリール基、芳香族基または複素芳香族基で置換される。一般式（ＩＩＩ）において挙げた数は、単に位置の参照を目的としたものである。種々の実施形態において、Ａが由来するヒドロキシル化化合物は、３位、１７位またはそれらの両方でヒドロキシル化される式（ＩＩＩ）の多環式環構造を含む。
【０１２６】
種々の実施形態において、ヒドロキシル化環含有化合物は、ヒドロキシル化多環式環含有化合物であってよい。種々の実施形態において、ヒドロキシル化多環式環含有化合物は、四環式化合物（例えば、天然で生成したステロイドならびに合成のステロイドやステロールを含めたステロールやステロイドなど）であってよい。ヒドロキシル担持環含有ステロイドの例には、コルチゾール、１１−デオキシコルチゾール（化合物Ｓ）、コルチコステロン、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、エストラジオール、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７−ＯＨプレグネノロン、１７−ＯＨプロゲステロン、１７−ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Ｄ４Ａ（デルタ４−アンドロステンジオン）、スチグマステロール、およびコレステロールが含まれるが、これらに限定されない。本教示内容は、ヒドロキシル化ステロイドの分析に限定されないが、本教示内容の一実施形態のタグによる標識化前のカルボニル基のヒドロキシル化によって、標識化反応によるｉｎ  ｓｉｔｕでのヒドロキシル化によって、またはそれらの組み合わせによって、非ヒドロキシル化カルボニル担持化合物に適用することができる。
【０１２７】
種々の実施形態において、多環式化合物は、アリール、シクロアルキルまたはシクロアルケンに連結する多環式環を含み、例としては、ビタミンＤ２（場合によっては、エルゴカルシフェロールとも呼ばれる）、ビタミンＤ３（場合によっては、コレカルシフェロールとも呼ばれる）、それらの代謝産物および類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
種々の実施形態において、ヒドロキシル化環含有化合物には、プロスタグランジン、それらの代謝産物、および類似体を含むがこれらに限定されない、環含有ホルモン様化合物が含まれる。種々の実施形態において、ヒドロキシル化環含有化合物には、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＡ、ビタミンＡ２、ビタミンＥ、ビタミンＫ、それらの代謝産物および類似体を含むがこれらに限定されない、環含有ビタミンが含まれる。
【０１２９】
本教示内容の種々の態様および実施形態を適用することができるヒドロキシル化化合物は、例えば、生理液試料、細胞溶解物または組織溶解物の試料、タンパク質試料、細胞培養物試料、発酵ブロス培地試料、農産物試料、動物産物試料、動物飼料試料、ヒトが消費する食品または飲料の試料、およびそれらの組み合わせなどの多種多様な供給源から得ることができる。前記試料は、例えば、異なる時点（例えば配列形成）の対照試料と実験試料、疾患状態の試料と健康状態の試料、実験試料と疾患状態の試料、汚染試料と非汚染試料など、異なる供給源、条件またはそれらの両方に由来することができる。生理液の例には、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、腹腔液、リンパ液、膣分泌物、精液、脊髄液、腹水、唾液、喀痰、乳房滲出液、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
標識化方法
種々の態様において、本教示内容は、ヒドロキシル化化合物を標識して標識検体化合物を形成する方法を提供する。種々の実施形態において、前記方法は、１つ以上のカップリング剤の存在下において一般式（Ｉ）の標識化化合物あるいはその塩形態または水和物形態をヒドロキシル化環含有化合物と反応させて、一般式（ＩＩ）の標識環含有化合物を形成する工程を含む。種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物に式（Ｉ）の標識あるいはその塩形態または水和物形態を添加してそれを標識する工程は、標識の第１の部分（例えば、式（Ｉ）の部分Ｒ１を含む部分）を添加した後、第２の工程で標識の第２の部分（例えば、式（Ｉ）における部分Ｚを含む部分）を添加して、式（Ｉ）の標識による化合物の標識化を行う、２段階の反応を含む。
【０１３１】
種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物は、以下の一般式（ＸＩＩａ）の化合物：
Ｌ−Ｒ１  （ＸＩＩａ）
、あるいはその塩形態または水和物形態をヒドロキシル化化合物と反応させて、以下の一般式（ＸＩＩＩａ）の標識化合物前駆体：
Ｌ−ＲＸ−ＲＹ−Ａ  （ＸＩＩＩａ）
を形成し、次いで
以下の一般式（ＸＩＶｂ）の化合物：
ＺＲ８  （ＸＩＶｂ）
、あるいはその塩形態または水和物形態を標識化合物前駆体と反応させて、以下の一般式（ＩＩ）の標識化合物：
【０１３２】
【化２４】
0005413836.tif 000065
、あるいはその塩形態または水和物形態を形成することによって、標識することができ、式中、Ｌは脱離基を表し、ＲＸは脱離基、対イオンまたは水素を表す。Ａ、Ｚ、ｎ、ＲＸ、ＲＹ、Ｘ、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）および（ＩＩ）で既述した通りであってよい。
【０１３３】
種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物は、以下の一般式（Ｉ）の化合物：
Ｚ−Ｒ１  （Ｉ）
あるいはその塩形態または水和物形態をヒドロキシル化化合物と反応させて、以下の一般式（ＩＩ）の標識化合物：
【０１３４】
【化２５】
0005413836.tif 000066
、あるいはその塩形態または水和物形態を形成することによって、標識することができる。Ａ、Ｚ、ｎ、ＲＸ、ＲＹ、Ｘ、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）および（ＩＩ）で既述した通りであってよい。
【０１３５】
種々の実施形態において、前記方法は、最初に対象の化合物に１個以上のヒドロキシル基を形成して、その後の標識化のためにヒドロキシル化化合物を作製する工程を含むことができる。例えば、種々の実施形態において、前記方法は、前記化合物のカルボニル基をヒドロキシル基に変換する工程を含む。種々の実施形態においては、１つ以上のカップリング試薬とともに塩基を使用して、標識化反応を促進する。
【０１３６】
標識化反応の種々の実施形態では多種多様なカップリング剤を使用することができ、これには、ヘキサフルオロリン酸化合物（例えば、ＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−ヘキサフルオロリン酸テトラメチルウロニウム）、ＨＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサフルオロリン酸テトラメチルウロニウム）、ＨＣＴＵ（１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−，ヘキサフルオロリン酸（１−），３−オキシド））、テトラフルオロボウ酸化合物（例えば、ＴＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラフルオロボウ酸テトラメチルウロニウム））、およびエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミド化合物（例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド））が含まれるが、これらに限定されない。ジイソプロピルエチルアミン（例えば、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン））を含むがこれに限定されない、多種多様な塩基を使用してさらに標識化反応を促進することもできる。
【０１３７】
本教示内容の標識検体化合物は、多環式環含有化合物を含むがこれに限定されない多種多様なヒドロキシル化化合物を含むことができる。本教示内容の方法は、標識検体化合物を形成するために多種多様なヒドロキシル化化合物に適用することができる。図３Ａ〜図３Ｈは、本教示内容の方法の種々の実施形態に都合のよい、いくつかのヒドロキシル化多環式環含有化合物の概略図を示しており、図３Ｉ〜図３Ｋは、本教示内容の方法の種々の実施形態に都合のよい、いくつかのヒドロキシル化環含有化合物の概略図を示す。
【０１３８】
本教示内容は、種々の実施形態において、天然で生成したステロイドと合成ステロイドの両方に適用することができる。ステロイドの例には、コルチゾール、１１−デオキシコルチゾール（化合物Ｓ）、コルチコステロン、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、エストラジオール、エストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−メトキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン、１６−ケトエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７−ＯＨプレグネノロン、１７−ＯＨプロゲステロン、１７−ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Ｄ４Ａ（デルタ４−アンドロステンジオン）、スチグマステロール、およびコレステロールが含まれるが、これらに限定されない。本教示内容は、架橋多環式環含有化合物ならびに縮合環化合物に適用することができる。例えば、種々の実施形態において、本教示内容は、ビタミンＤ３およびその代謝産物に適用することができる。例えば、図３Ｆ〜３Ｈを参照されたい。
【０１３９】
図１２Ａ〜図１２Ｂを参照すると、質量差次タグのセットのメンバーでテストステロンおよびエピテストステロンを標識化する例が示されている。スキーム１２０１〜１２０４は、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡの存在下において（４−メチル−ピペラジン−１−イル）酢酸タグとの反応によるテストステロンの標識化を示す。スキーム１２０５〜１２０８は、エピテストステロンの標識化を示す。図示した反応では、（４−メチルピペラジン−１−イル）酢酸の酢酸部分が、テストステロンまたはエピテストステロン化合物のヒドロキシルと反応して、標識化合物を形成する。
【０１４０】
スキーム１２０１および１２０５では、非同位体濃縮（４−メチル−ピペラジン−１−イル）酢酸が使用されており、他のスキームでは、タグのセットから得た重原子同位体タグが使用されている。このような質量差次標識によって、異なる試料を区別する手段が提供される。例えば、それぞれスキーム１２０１および１２０５の反応に供されるテストステロンおよびエピテストステロンは、基準試料から得られる場合があり、残りのスキームのものは、例えば潜在的な性能を増強するステロイドの用途について現在調査中の試料から得られる場合がある。
【０１４１】
図１５を参照すると、標識検体化合物を形成するために一般式（Ｘ）の同重体タグで標識された標識コレステロール検体の種々の実施形態が、会合レポーターイオンの種々の実施形態とともに示されている。図１５では、４個の試料のコレステロールの標識化（スキーム１５００〜１５０３）が示されており、それぞれ同位体置換（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−イソシアン酸アセチルを含む異なる同重体標識が、試料間で使用されている。種々の実施形態において、このような標識試料は、例えば、標識化合物を第１の質量フィルターを介してイオンフラグメンター（例えば、衝突セル）に通し、標識化合物を解離エネルギーに供し、得られたフラグメントを質量フィルターに通し、レポーターイオンを検出して、レポーターイオン信号に基づいて検体の１つ以上の相対濃度および／または絶対濃度を測定することによって、ＭＳ／ＭＳ分析に供することができる。同重体タグがＮ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン、イソシアン酸アセチルまたはアセチルヒドラジルを含む種々の実施形態において、得られるレポーターイオンは、Ｎ置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリンカルボキシアミンのイオン（例えば、アンモニウムイオン）である。図１５のスキームではカップリング剤が使用されているものの、このような薬剤は省略することができるが、反応の脱離基がＯＨである場合には一般的に使用される。
【０１４２】
図１５のスキーム１５００および１５０３では、同重体タグのセット内のタグ間でレポーター部分の質量が異なる同位体濃縮（４−メチルピペラジン−１−イル）−イソシアン酸アセチルが使用されている。このような標識化によって、異なる試料を区別する手段が提供される。例えば、スキーム１５００および１５０１の環含有化合物がコレステロールではなくテストステロンであり、スキーム１５０２および１５０３の環含有化合物がコレステロールではなくエピテストステロンである場合は、例えばスキーム１５００および１５０３のステロイドが分析対象の試料に由来し、スキーム１５０１および１５０３のステロイドが標準試料に由来する種々のレポーターイオンのモニタリングが、例えば、潜在的な性能を増強するステロイドの用途を見出すために使用することができる。
【０１４３】
所望の重原子同位体置換による本教示内容の標識を形成するには、種々の合成法を使用することができる。図１７を参照すると、種々の実施形態において、本教示内容の同位体濃縮標識は、同位体濃縮置換または非置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン（１７０２）を反応させることによって作製することができる（式中、ｎは０、１または２（それぞれ、５、６、７員環を提供する）であり、図１７のＲ２は、置換または非置換の炭素、窒素または酸素である）。例えば、図１７のＲ２は、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基で置換することができる。前記環の炭素原子は、１つ以上の位置で、独立して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、場合により置換または非置換アリール基を含有し得る直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基で置換することができる。同位体濃縮置換または非置換ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリン（１７０２）を、脱離基（ＬＧ）を有する同位体濃縮アセトアミド（１７０４）と反応させて、カルボキシアミン（１７０６）含有化合物を形成する。次いで、カルボキシアミン（１７０６）を、求電子体（例えば、ホスゲン（１７０８））と反応させて、同重体タグ（１７１０）を形成することができる。
【０１４４】
図１８を参照すると、（４−メチルピペラジン−１−イル）−イソシアン酸アセチル同重体タグのセットを形成する種々の実施形態が示されており（スキーム１８００〜１８０３）、図１７および１８のアスタリスクは重原子同位体置換を示している。
【０１４５】
分析方法
種々の態様において、本教示内容は、式（Ｉ）の標識および親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を分析する方法を提供する。
【０１４６】
種々の実施形態において、本教示内容は、各試料に異なる標識を添加し、異なって標識した試料を組み合わせ、ＰＤＩＴＭを使用して試料中のヒドロキシル化化合物の１つ以上の濃度を測定することによって、２つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物の濃度を測定する方法を提供する。種々の実施形態において、前記試料の１つは、例えば、対照試料、基準試料、既知の濃度の化合物を有する試料などの標準試料を含む。このようにして、前記方法により、多様な試料に由来する多様な化合物の分析を提供することができる。
【０１４７】
例えば、図４Ａを参照すると、種々の実施形態において、前記方法は、対象の各試料に式（１）のタグのセットの異なるタグ、あるいはその塩形態または水和物形態を添加することによって複数の対象試料中の１つ以上のヒドロキシル化化合物を標識する工程（工程４１０ａ）を含み、それによって標識検体化合物が形成され、各タグはレポーターイオン部分を含むタグのセットに由来する。標識検体化合物は、化合物が由来する試料に関して区別して標識されている。種々の実施形態において、式（Ｉ）の標識、あるいはその塩形態または水和物形態を添加してヒドロキシル化化合物を標識する工程は、標識の第１の部分（例えば、式（Ｉ）の部分Ｒ１を含む部分）を添加した後、第２の工程で標識の第２の部分（例えば、式（Ｉ）における部分Ｚを含む部分）を添加して、式（Ｉ）の標識による化合物の標識化を行う、２段階の反応を含む。
【０１４８】
前記方法では、次いで、試料のそれぞれの少なくとも一部を組み合わせて、混合試料を作製し（工程４２０ａ）、混合試料の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供して（遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲が標識検体化合物のｍ／ｚ値を含み、遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲が、標識検体化合物のタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する（工程４３０ａ）。次いで、標識検体化合物の１つ以上の濃度を、少なくとも、標準化合物の１つ以上の測定したイオン信号と、対応するレポーターイオンの測定イオン信号との比較に基づいて測定することができる（工程４４０ａ）。１つ以上のイオン信号は、例えば、イオンピークの強度（平均値、中央値、最大値など）、イオンピークの面積、またはそれらの組み合わせを基にすることができる。種々の実施形態において、対象の複数の試料の１つ以上は、１つ以上の標準化合物を含有する標準試料であってよい。
【０１４９】
種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物の濃度は、対応する標識検体化合物−レポーターイオン遷移信号の測定したイオン信号を、以下の１つ以上と比較することによって測定される：
（ｉ）標準化合物−レポーターイオン遷移の濃度曲線；および
（ｉｉ）標識検体化合物との混合試料中の標準化合物における標準化合物−レポーターイオン遷移信号。
【０１５０】
種々の実施形態において、ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器と、イオンフラグメンターと、第２の質量分離器とを備えた質量分析器システムで行うことができる。ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器により選択）は、標識検体化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器により選択）は、遷移した標識検体化合物のタグに対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択される。
【０１５１】
種々の実施形態において、複数の試料に添加されるタグは、例えば、１つの実験測定内で、（ｉ）異なる試料（例えば、対照試料、処理試料、試料の時系列）に由来する複数のヒドロキシル化化合物が比較および／または定量化できるように；（ｉｉ）異なる試料に由来する同じヒドロキシル化化合物において複数の濃度測定値が測定できるように；（ｉｉｉ）血液試料の異なる分離株がベースライン時の試料と対照して評価できるように、式（Ｉ）のタグのセット、あるいはその塩形態または水和物形態から選択される。
【０１５２】
再度図４Ａを参照すると、種々の実施形態において、混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を使用して適切な溶液に混合試料を導入することによって、混合試料を質量分析システムに直接導入する工程（ワークフロー経路４２１ａおよび工程４３０ａ）を含む。
【０１５３】
種々の実施形態において、混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、混合試料の一部をクロマトグラフィカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）カラム、またはそれらの組み合わせ）に充填する工程（ワークフロー経路４２２ａおよび工程４２５ａ）、クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程、および遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（ワークフロー経路４２３ａおよび工程４３０ａ）を含む。
【０１５４】
種々の実施形態において、混合試料は、レポーターイオン信号の測定に使用する前に、（例えば、干渉試料、人工緩衝液などを除去するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、カチオン交換、高分解カチオン交換など、ならびにそれらの組み合わせによって）洗浄される。
【０１５５】
種々の実施形態において、クロマトグラフィカラムは、標識化合物の検体部分が異なる複数の標識検体化合物を分離するために使用される。例えば、種々の実施形態において、試料の１つ以上に認められる第１の標識検体化合物は、クロマトグラフィカラムによって、前記試料の１つ以上に認められる第２の標識検体化合物から分離される。種々の実施形態において、複数の標識検体化合物は、異なる化合物が実質的に共溶出しないように分離される。このようなクロマトグラフィ分離によって、例えば化合物に関するクロマトグラフィの滞留時間の情報を提供することで、２つ以上の試料中の複数の化合物の分析がさらに容易になる。
【０１５６】
再度図４Ａを参照すると、標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程（工程４４０ａ）で使用される標準化合物の測定した１つ以上のイオン信号は、様々な方法で提供することができる。種々の実施形態においては、１つ以上の非同位体濃縮標準化合物を、式（Ｉ）のタグのセットのタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で標識し、標識した１つ以上の標準化合物の少なくとも一部を、標識検体化合物のそれぞれの少なくとも一部と組み合わせて、混合試料を作製し（工程４５０ａ）、その後、この混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供し、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する（工程４３０ａ）。
【０１５７】
種々の実施形態においては、前記タグのセットのタグを１つ以上の標準試料に添加して１つ以上の標識標準試料を得るが、各標準試料は、前記タグで標識した１つ以上の非同位体濃縮標準化合物を含有し、１つ以上の標準試料に添加した前記タグは、対象の試料に添加したタグとは異なる。種々の実施形態においては、１つ以上の標識標準試料の少なくとも一部を、対象の試料のそれぞれの少なくとも一部と組み合わせて、混合試料を作製し（工程４５０ａ）、その後、この混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供し、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する（工程４３０ａ）。
【０１５８】
次いで、混合試料中の標識した１つ以上の標準化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上の測定したイオン信号を、標識検体化合物の１つ以上の濃度の測定に使用することができる。したがって、種々の実施形態において、標識検体化合物の濃度の測定は、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定イオン信号と、混合試料中の標識した１つ以上の標準化合物に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較（工程４４０ａ）に基づく。この混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、例えば、質量分析システムに直接導入する工程（ワークフロー経路４５２ａおよび工程４３０ａ）；最初にこの混合試料の少なくとも一部をクロマトグラフィカラムに充填し（ワークフロー経路４５３ａおよび工程４２５ａ）、その後、クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供して、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（ワークフロー４２３ａおよび工程４３０ａ）；あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１５９】
種々の実施形態において、１つ以上の標準試料中の標識標準化合物の複数は、それらの基準となる１つ以上の化合物と実質的に共溶出するように、クロマトグラフィカラムによって分離される。
【０１６０】
種々の実施形態において、標識検体化合物の１つ以上の濃度の測定（工程４４０ａ）は、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、１つ以上の標準化合物の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較に基づく。種々の実施形態においては、第１の濃度を有する非同位体濃縮標準化合物を提供して（工程４６０ａ）、式（Ｉ）のタグのセットのタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で標識する（工程４７０ａ）。標識標準化合物の少なくとも一部を、親−娘イオン遷移モニタリングに供して（遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲は、標識標準化合物のｍ／ｚ値を含み、遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲は、標識標準化合物のタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）、レポーターイオンのイオン信号を測定する（工程４８０ａ）。これらの標識化工程（工程４７０ａ）、およびＰＤＩＴＭに供して、遷移したレポーターイオンのイオン信号を測定する工程（工程４８０ａ）を、第１の濃度とは異なる少なくとも１つ以上の標準化合物濃度において繰り返し、標準化合物の濃度曲線を作成する（工程４９０ａ）。
【０１６１】
標識標準化合物の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、例えば、質量分析システムに直接導入する工程（ワークフロー経路４７１ａおよび工程４８０ａ）（例えば、ＥＳＩイオン源を使用して適切な溶液に混合試料を導入することによるか、あるいは混合試料を適切なマトリックスと組み合わせて、適切なＭＡＬＤＩイオン源を使用して試料を導入することによる）；最初にこの混合試料の少なくとも一部をクロマトグラフィカラムに充填し（ワークフロー経路４７２ａおよび工程４７５）、その後、クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供して、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（ワークフロー経路４７３ａおよび工程４８０ａ）；あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１６２】
種々の実施形態において、標準化合物でのＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器と、イオンフラグメンターと、第２の質量分離器とを備えた質量分析システムで行うことができる。ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器により選択）は、標識標準化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器により選択）は、遷移した標準化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択される。
【０１６３】
種々の実施形態において、濃度曲線の作成では、例えば濃度の測定を促進する、注入量の差を明らかにするなどのために、標準化合物の少なくとも一部に含まれる１つ以上の内部標準を使用することができる。
【０１６４】
種々の実施形態において、濃度曲線の作成は、ＰＤＩＴＭを使用して、対応する標準化合物と会合するレポーターイオンのイオン信号を測定し、濃度０がレポーターイオン信号なしに対応するように測定濃度の直線外挿によって濃度曲線を作成することにより行うことができる。種々の実施形態において、濃度曲線の作成は、ＰＤＩＴＭを使用して、複数の既知の濃度で対応する標準化合物と会合するレポーターイオンのイオン信号を測定し、測定したレポーターイオン信号に関数をフィッティングすることによって濃度曲線を作成することにより行うことができる。適切なフィッティング関数は、例えば検出器の応答（例えば、検出器の飽和、非線形性など）により変動する可能性がある。種々の実施形態において、フィッティング関数は一次関数である。
【０１６５】
再度図４Ａを参照すると、種々の実施形態において、標識検体化合物の１つ以上の濃度の測定（工程４４０ａ）は、少なくとも以下の両方に基づく：（ｉ）対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、１つ以上の標準化合物の１つ以上の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較、および（ｉｉ）対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標識検体化合物と組み合わせた１つ以上の標識標準化合物に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較。種々の実施形態においては、第１の濃度を有する非同位体濃縮標準化合物を提供し（工程４６０ａ）、式（Ｉ）のタグのセットのタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で標識する（工程４７０ａ）。標識標準化合物の一部を標識試料のそれぞれの少なくとも一部と組み合わせて、混合試料を作製し（ワークフロー経路４７６ａおよび工程４５０ａ）、次いで、本明細書に記載の通り、この混合試料をさらに分析することができる。種々の実施形態においては、混合試料の作製に使用される同じ標識標準化合物の一部はまた、本明細書に記載の通りに濃度曲線を作成する際にも使用される。
【０１６６】
種々の実施形態において、本教示内容は、１つ以上の試料中の１つ以上のヒドロキシル化検体化合物の濃度を測定する方法を提供する。例えば、図４Ｂを参照すると、種々の実施形態において、前記方法は、式（Ｉ）のタグのセットの異なるタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で１つ以上のヒドロキシル化化合物をそれぞれ標識する工程（工程４１０ｂ）であって、タグのセットの各タグがレポーターイオン部分を含む、工程と；標識検体化合物のそれぞれの少なくとも一部を組み合わせて、混合試料を作製し（工程４２０ｂ）、混合試料の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供し（遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲は、標識検体化合物のｍ／ｚ値を含み、遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲は、標識検体化合物のタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（工程４３０ｂ）と；次いで、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標準化合物の測定した１つ以上のイオン信号との比較に基づいて、標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程（工程４４０ｂ）とを含む。１つ以上のイオン信号は、例えば、イオンピークの強度（平均値、中央値、最大値など）、イオンピークの面積、またはそれらの組み合わせを基にすることができる。
【０１６７】
種々の実施形態において、ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器と、イオンフラグメンターと、第２の質量分離器とを備えた質量分析システムで行うことができる。ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器により選択）は、標識検体化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器により選択）は、遷移した標識検体化合物のタグに対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択される。
【０１６８】
種々の実施形態において、１つ以上のヒドロキシル化化合物試料は、例えば、１つの実験測定内で、（ｉ）異なる試料（例えば、対照試料、処理試料）に由来する複数のヒドロキシル化化合物が比較および／または定量化できるように；（ｉｉ）同じ試料に由来する同じヒドロキシル化化合物において複数の濃度測定値が測定できるように；（ｉｉｉ）血液試料の異なる分離株がベースライン時の試料と対照して評価できるように、式（Ｉ）の質量差次タグのセットから選択されるタグの１つ以上、あるいはその塩形態または水和物形態で標識される。
【０１６９】
再度図４Ａを参照すると、種々の実施形態において、混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を使用して適切な溶液に混合試料を導入することによって、混合試料を質量分析システムに直接導入する工程（ワークフロー経路４２１ａおよび工程４３０ａ）を含む。
【０１７０】
種々の実施形態において、混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、混合試料の一部をクロマトグラフィカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）カラム、またはそれらの組み合わせ）に充填する工程（ワークフロー経路４２２ａおよび工程４２５ａ）、クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに供する工程、および遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（ワークフロー経路４２３ａおよび工程４３０ａ）を含む。
【０１７１】
種々の実施形態において、混合試料は、レポーターイオン信号の測定に使用する前に、（例えば、干渉試料、人工緩衝液などを除去するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、カチオン交換、高分解カチオン交換など、ならびにそれらの組み合わせによって）洗浄される。
【０１７２】
種々の実施形態において、ヒドロキシル化化合物の濃度は、対応する標識検体化合物−レポーターイオン遷移信号の測定したイオン信号を、以下の１つ以上と比較することによって測定される：
（ｉ）標準化合物−レポーターイオン遷移の濃度曲線；および
（ｉｉ）標識検体化合物との混合試料中の標準化合物における標準化合物−レポーターイオン遷移信号。
【０１７３】
再度図４を参照すると、標識検体化合物の１つ以上の濃度を測定する工程（工程４４０ｂ）で使用される標準化合物の１つ以上の測定イオン信号は、様々な方法で提供することができる。種々の実施形態においては、１つ以上の非同位体濃縮標準化合物を、式（Ｉ）のタグのセットのタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で標識し、１つ以上の標識標準化合物の１つ以上の少なくとも一部を、標識検体化合物のそれぞれの少なくとも一部と組み合わせて、混合試料を作製し（工程４５０ｂ）、その後、この混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供し、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する（工程４３０ｂ）。
【０１７４】
次いで、混合試料中の１つ以上標識標準化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上の測定したイオン信号を、標識検体化合物の１つ以上の濃度の測定に使用することができる。したがって、種々の実施形態において、標識検体化合物の濃度の測定は、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、混合試料中の１つ以上の標識標準化合物に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較（工程４４０ｂ）に基づく。この混合試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、例えば、質量分析システムに直接導入する工程（ワークフロー経路４５２ｂおよび工程４３０ｂ）；最初にこの混合試料の少なくとも一部をクロマトグラフィカラムに充填し（ワークフロー経路４５３ｂおよび工程４２５ｂ）、その後、クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供して、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（ワークフロー４２３ｂおよび工程４３０ｂ）；あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１７５】
種々の実施形態において、標識検体化合物の１つ以上の濃度の測定（工程４４０ｂ）は、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、１つ以上の標準化合物の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較に基づく。種々の実施形態においては、第１の濃度を有する非同位体濃縮標準化合物を提供して（工程４６０ｂ）、式（Ｉ）のタグのセットのタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で標識する（工程４７０ａ）。標識標準化合物の少なくとも一部を、親−娘イオン遷移モニタリングに供して（遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲は、標識標準化合物のｍ／ｚ値を含み、遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲は、標識標準化合物のタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）、レポーターイオンのイオン信号を測定する（工程４８０ｂ）。これらの標識化工程（工程４７０ｂ）、およびＰＤＩＴＭに供して、遷移したレポーターイオンのイオン信号を測定する工程（工程４８０ｂ）を、第１の濃度とは異なる少なくとも１つ以上の標準化合物濃度において繰り返し、標準化合物の濃度曲線を作成する（工程４９０ｂ）。
【０１７６】
標識標準化合物の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供する工程は、例えば、質量分析システムに直接導入する工程（ワークフロー経路４７１ｂおよび工程４８０ｂ）（例えば、ＥＳＩイオン源を使用して適切な溶液に混合試料を導入することによるか、あるいは混合試料を適切なマトリックスと組み合わせて、適切なＭＡＬＤＩイオン源を使用して試料を導入することによる）；最初にこの混合試料の少なくとも一部をクロマトグラフィカラムに充填し（ワークフロー経路４７２ｂおよび工程４７５ｂ）、その後、クロマトグラフィカラムからの溶離液の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに供して、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する工程（ワークフロー経路４７３ｂおよび工程４８０ｂ）；あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１７７】
種々の実施形態において、標準化合物でのＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器と、イオンフラグメンターと、第２の質量分離器とを備えた質量分析システムで行うことができる。ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した親イオンのｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器により選択）は、標識標準化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの遷移した娘イオンのｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器により選択）は、遷移した標準化合物に対応するレポーターイオンの１つ以上のｍ／ｚ値を含むように選択される。
【０１７８】
種々の実施形態において、濃度曲線の作成では、例えば濃度の測定を促進する、注入量の差を明らかにするなどのために、標準化合物の少なくとも一部に含まれる１つ以上の内部標準を使用することができる。
【０１７９】
種々の実施形態において、濃度曲線の作成は、ＰＤＩＴＭを使用して、対応する標準化合物と会合するレポーターイオンのイオン信号を測定し、濃度０がレポーターイオン信号なしに対応するように測定濃度の直線外挿によって濃度曲線を作成することにより行うことができる。種々の実施形態において、濃度曲線の作成は、ＰＤＩＴＭを使用して、複数の既知の濃度で対応する標準化合物と会合するレポーターイオンのイオン信号を測定し、測定したレポーターイオン信号に関数をフィッティングすることによって濃度曲線を作成することにより行うことができる。適切なフィッティング関数は、例えば検出器の応答（例えば、検出器の飽和、非線形性など）により変動する可能性がある。種々の実施形態において、フィッティング関数は一次関数である。
【０１８０】
種々の実施形態において、標識検体化合物の１つ以上の濃度の測定（工程４４０ｂ）は、少なくとも以下の両方に基づく：（ｉ）対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、１つ以上の標準化合物の１つ以上の濃度曲線に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較、および（ｉｉ）対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標識検体化合物と組み合わせた１つ以上の標識標準化合物に対応する１つ以上のレポーターイオンの測定したイオン信号との比較。種々の実施形態においては、第１の濃度を有する非同位体濃縮標準化合物を提供し（工程４６０ｂ）、式（Ｉ）のタグのセットのタグ、あるいはその塩形態または水和物形態で標識する（工程４７０ｂ）。標識標準化合物の一部を標識試料のそれぞれの少なくとも一部と組み合わせて、混合試料を作製し（ワークフロー経路４７６ｂおよび工程４５０ｂ）、次いで、本明細書に記載の通り、この混合試料をさらに分析することができる。種々の実施形態においては、混合試料の作製に使用される同じ標識標準化合物の一部はまた、本明細書に記載の通りに濃度曲線を作成する際にも使用される。
【０１８１】
図４Ａおよび図４Ｂの状況で考察される実施形態を含むがこれらに限定されない、本教示内容の種々の実施形態において、レポーターイオン信号の測定に使用される同じ標準化合物部分または別の部分は、質量分析システムの親−娘イオン遷移モニタリング条件の測定に使用することができる。例えば、質量分析システムが液体クロマトグラフィ（ＬＣ）成分を含む場合、標準化合物は、クロマトグラフィの滞留時間の測定に使用することができる。種々の実施形態において、標準化合物は、種々の条件下での、イオン源におけるヒドロキシル化化合物のイオン化効率およびイオンフラグメンターにおけるヒドロキシル化化合物のフラグメンテーション効率を測定する際に使用することができる。
【０１８２】
本教示内容の種々の実施形態を適用することができるヒドロキシル化化合物は、例えば、生理液試料、細胞溶解物または組織溶解物の試料、タンパク質試料、細胞培養物試料、発酵ブロス培地試料、農産物試料、動物産物試料、動物飼料試料、ヒトが消費する食品または飲料の試料、およびそれらの組み合わせなどの多種多様な供給源から得ることができる。前記試料は、例えば、異なる時点（例えば配列形成）の対照試料と実験試料、疾患状態の試料と健康状態の試料、実験試料と疾患状態の試料、汚染試料と非汚染試料など、異なる供給源、条件またはそれらの両方に由来することができる。生理液の例には、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、腹腔液、リンパ液、膣分泌物、精液、脊髄液、腹水、唾液、喀痰、乳房滲出液、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
多種多様な化合物を標準化合物として使用することができる。種々の実施形態において、標準化合物は、対象の非同位体濃縮ヒドロキシル化化合物を含む。種々の実施形態において、標準化合物は、１つ以上の対照試料、既知の濃度の試料またはそれらの組み合わせに含まれる１つ以上の化合物であってよい。種々の実施形態において、標準化合物は、分析において対象のヒドロキシル化化合物毎に提供される。
【０１８４】
種々の実施形態において、標準化合物の濃度曲線は、複数の既知の濃度の標準化合物と会合するレポーターイオンレポーターイオンのイオン信号を測定するためにＰＤＩＴＭを使用して作成することができる。種々の実施形態においては、例えば時系列の試料に由来する１つ以上の化合物の組織学的プロファイルを一定期間の濃度曲線として使用して、１つ以上の化合物の定性的、相対的または定量的な濃度の１つ以上を測定することができる。種々の実施形態においては、組織学的プロファイルを使用して、例えば、疾患状態の存在、または疾患状態の素因の増大、遺伝的もしくは代謝的病態、ステロイドの使用などを確認することができる。
【０１８５】
１つ以上の標識標準化合物、１つ以上の標識標準化合物を含有する１つ以上の標準試料、１つ以上の標識検体化合物、１つ以上の標識検体化合物を含有する１つ以上の試料、またはそれらの組み合わせのいずれかの適切な組み合わせを、例えば混合試料を提供するために本教示内容の方法で使用することができる。例えば、一般的に、混合試料中の異なる標識成分の数（Ｎ）は、タグのセット中のタグの数（Ｔ）以下である。いずれか１つの混合試料において、標識標準化合物と１つ以上の標識検体成分の可能な組み合わせは、
（Ｓ＋Ｃ）≦Ｔ      （１）
（式中、Ｔはタグのセット中のタグの数を表し、Ｓは異なる標識による標識標準化合物の数を表し、かつ０からＴまで（０とＴを含む）の範囲に及び、Ｃは異なる標識による標識検体成分の数を表し、かつ０からＴまで（０とＴを含む）の範囲に及ぶ。ここで、成分は化合物を指すことができ、かつ例えば試料中のすべての化合物がタグのセットの同じタグで標識された試料中のすべての化合物を指すことができる。
【０１８６】
例えば、種々の実施形態において、１つ以上の標識標準化合物（例えば、対照試料に由来するものや、既知の濃度の試料に由来するものなど）は、（例えば内部濃度標準として機能し得る１つ以上のレポーターイオン信号を提供する）対象の１つ以上の標識検体化合物と組み合わせる。種々の実施形態において、標識標準化合物の添加は、混合試料中の１つ以上の対象のヒドロキシル含有化合物の内部標準として機能し得る。種々の実施形態において、異なる標識標準化合物は、混合試料中の異なる対象ヒドロキシル化化合物毎（例えばＳ＝Ｃ）に添加され、それぞれの異なる標識標準化合物は、例えば、対象の異なるヒドロキシル化化合物の内部標準として機能する。
【０１８７】
種々の実施形態においては、混合試料中の分析対象のヒドロキシル化化合物の複数が、同じ対象ヒドロキシル化化合物を含む。例えば、ヒドロキシル化化合物１〜Ｘ（Ｘ＞１）は、同じ対象ヒドロキシル化化合物を含むことができるが、例えば異なる試料毎に異なる標識が使用されている異なる試料に由来する。例えば、異なる試料は、同じ系統（例えば、強壮者、患者、場所など）の異なる時点に得ることができ、例えばいくつかのプロセス（例えば、疾患、発酵など）の進行や、性能を増強するステロイドの使用などをモニターするために使用することができる。したがって、種々の実施形態において、第１の試料中の実質的にすべての標識化合物は、タグのセットの第１のタグで標識され、第２の試料中の実質的にすべての標識化合物は、第１のタグとは異なるタグのセットの第２のタグで標識され、その他も同様である。種々の実施形態において、前記試料の１つ以上は標準試料を含むが、前記標準試料中の標識化合物は、他の試料で使用されるものとは異なるタグのセットのタグで標識される。
【０１８８】
種々の実施形態においては、同じヒドロキシル化化合物に異なるタグが使用されて、試料が処理される。例えば、試料を３つに分けて処理し、これらの３つの部分のそれぞれには異なるタグを使用して、次いで、これらの３つの部分を組み合わせて、（１つ以上の標準化合物も含み得る）混合試料を少なくとも部分的に得て、例えば、混合試料の単一の実験分析においてヒドロキシル化化合物の濃度の３つの測定値を得る。統計学的に有意および／または正確な結果を得るには、３つまたはより一般的には多数の測定値が必要な場合が多い。このように本教示内容の種々の実施形態では単一の実験でヒドロキシル化化合物の濃度の多数の測定値を得られることから、実験実行毎の偏差による誤差を容易に低減することができる。
【０１８９】
種々の実施形態においては、標識標準化合物が混合試料に添加されず、そして種々の実施形態においては、例えば、対象のヒドロキシル化化合物の１つ以上の濃度を、少なくとも、ヒドロキシル化化合物の対応するレポーターイオン信号と、標準化合物、標準試料あるいはそれらの両方の濃度曲線との比較に基づいて測定することができる。種々の実施形態において、混合試料は、レポーターイオン信号の測定に使用する前に、（例えば干渉試料、人工緩衝液などを除去するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、交換分画、カチオン交換、高分解カチオン交換など、ならびにそれらの組み合わせによって）洗浄される。
【０１９０】
種々の実施形態においては、２つ以上の試料中の１つ以上のステロイド含有化合物、ステロール含有化合物、またはそれらの類似体を分析する方法が提供される。種々の実施形態において、前記方法は、（ａ）対象の１つ以上の試料のそれぞれに、質量差次タグのセットの異なる質量差次タグを添加して、標識試料を提供し、タグが、対象の試料の１つ以上における１つ以上のステロイド含有化合物を標識して、以下の一般式（ＸＩ）の標識ステロイドを生じるようにする工程を含む：
ＲＰ−ＢＸ−ＬＧ−Ｏ−ＢＹ−ＡＲ    （ＸＩ）
（式中、ＲＰは質量差次タグまたは同重体タグのレポーター部分であり、ＬＧは連結基であり、Ｏは酸素であり、ＡＲはステロイド含有化合物、ステロール含有化合物またはそれらの類似体の環含有化合物であり、ＢＸはＲＰとＬＧの原子の間の結合を表し、ＢＹは、酸素Ｏと、標識化反応前にヒドロキシル化されたＡの炭素との間の結合を表す）。
【０１９１】
標識試料を組み合わせて混合試料を得て、前記混合試料をクロマトグラフィカラムに充填する。クロマトグラフィカラムからの溶離液を親−娘イオン遷移モニタリングに供し（（ｉ）所定の標識ステロイド含有化合物の遷移した親イオンのｍ／ｚの範囲は、標識環含有化合物の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、第１の遷移した娘イオンのｍ／ｚの範囲は、標識ステロイド含有化合物のタグの少なくとも１つに対応する少なくとも１つのレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）、遷移したレポーターイオンの１つ以上のイオン信号を測定する。標識ステロイド含有化合物の１つ以上の濃度を、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定したイオン信号と、標準化合物に対応するレポーターイオンの測定したイオン信号との比較に基づいて測定する。
【０１９２】
キット
種々の態様において、本教示内容は、ヒドロキシル化化合物を分析するためのキットを提供する。種々の実施形態において、キットは、一般式（Ｉ）の同重体タグのセットの複数の同重体タグのセット、あるいはその塩形態または水和物形態、ならびに１つ以上の試薬、容器、酵素、緩衝液および／または使用説明書を含む。
【０１９３】
種々の実施形態において、本教示内容のキットは、担体の１つ以上のセットを含み、各担体は、切断可能なリンカーを介して担体に切断可能に連結した、一般式（Ｉ）の異なる同重体標識試薬、あるいはその塩形態または水和物形態を含む。切断可能なリンケージの例には、化学的または光分解的に切断可能なリンカーが含まれるが、これに限定されない。担体を異なる試料と反応させて、それによりそれぞれの担体と会合する同重体タグで試料の検体を標識することができる。例えば、異なる試料に由来する検体を異なる担体と接触させて、それにより異なるレポーター／リンカーの組み合わせで標識することができる。
【０１９４】
質量分析器
本教示内容では、ＰＤＩＴＭを行うために多種多様な質量分析システムを使用することができる。適切な質量分析システムは２つの質量分離器を備え、それらの２つの質量分離器間のイオン飛行経路にイオンフラグメンターが配置されている。適切な質量分離器の例には、四重極型質量分離器、ＲＦ多重極型質量分離器、イオントラップ型質量分離器、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分離器、および時限式イオンセレクタと連動したＴＯＦ型質量分離器が含まれるが、これらに限定されない。適切なイオンフラグメンターには、衝突誘起解離（ＣＩＤ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）とも呼ばれる）、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、ポストソース分解、電子ビームとの相互作用による解離（例えば、電子誘起解離（ＥＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ））、熱放射との相互作用による解離（例えば、熱／黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ））、ポストソース分解、またはそれらの組み合わせの原理で作動するものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
質量分析器に適切な質量分析システムの例には、三重四重極型、四重極線形イオントラップ（例えば、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）、四重極ＴＯＦ（例えば、ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）、およびＴＯＦ−ＴＯＦが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
質量分析システムに適切なイオン源には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）源、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源、および大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）源が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＥＳＩイオン源は、質量分離装置にＬＣカラムから得たイオン化試料を導入する手段として機能し得る。ＥＳＩのいくつかの望ましい特徴の１つに、クロマトグラフィカラムから得た分画物を、カラムから直接ＥＳＩイオン源へ移すことができる点がある。
【０１９７】
種々の実施形態において、質量分析システムはＭＡＬＤＩイオン源を含む。種々の実施形態においては、混合試料の少なくとも一部をＭＡＬＤＩマトリックス材料と混合して、ＭＡＬＤＩイオン源を備えた質量分析器を使用して親−娘イオン遷移モニタリングに供する。種々の実施形態においては、混合試料の少なくとも一部をクロマトグラフィカラムに充填し、溶離液の少なくとも一部をＭＡＬＤＩマトリックス材料と混合して、ＭＡＬＤＩイオン源を備えた質量分析器を使用して親−娘イオン遷移モニタリングに供する。
【０１９８】
種々の実施形態において、質量分析システムは、親イオンを選択し、そのフラグメント娘イオンを検出するための三重四重極型質量分析計を含む。種々の実施形態において、第１の四重極は親イオンを選択する。第２の四重極は、複数の低エネルギー衝突が生じて親イオンの一部がフラグメント化するように十分に高い圧力および電圧で維持される。第３の四重極は、選択した娘イオンを検出器に通過させるように選択される。種々の実施形態において、三重四重極型質量分析計は、イオン源と三重四重極との間に配置されたイオントラップを備えることができる。イオントラップは、イオン（例えば、すべてのイオン、特定のｍ／ｚ範囲を有するイオンなど）を回収し、充填時間後、端電極を律動的にすることによって選択イオンを第１の四重極に通過させて、イオントラップからの選択イオンの送出が可能となるように設定することができる。所望の充填時間は、例えば、イオンの数、イオントラップ内の電荷密度、異なるシグネチャーペプチドの溶出間の時間、デューティーサイクル、励起状態種もしくは多荷イオンの崩壊速度、またはそれらの組み合わせに基づいて測定することができる。
【０１９９】
種々の実施形態において、三重四重極型質量分析計内の四重極の１つ以上は、（例えば、端電極を追加して、四重極内の実質的に細長い円筒状のトラップ容量を提供することによって）線形イオントラップとして構成することができる。種々の実施形態において、第１の四重極は親イオンを選択する。第２の四重極は、複数の低エネルギー衝突が生じて親イオンの一部がフラグメント化するように十分に高い衝突ガス圧力および電圧で維持される。第３の四重極は、フラグメントイオンを捕捉し、充填時間後、端電極を律動的にすることによって選択娘イオンを検出器に通過させて、イオントラップからの選択娘イオンの送出が可能となるように選択される。所望の充填時間は、例えば、フラグメントイオンの数、イオントラップ内の電荷密度、異なるシグネチャーペプチドの溶出間の時間、デューティーサイクル、励起状態種もしくは多荷イオンの崩壊速度、またはそれらの組み合わせに基づいて測定することができる。
【０２００】
種々の実施形態において、質量分析システムは、２つの四極質量分離器と、親イオンを選択し、そのフラグメント娘イオンを検出するためのＴＯＦ質量分析計とを含む。種々の実施形態において、第１の四重極は親イオンを選択する。第２の四重極は、複数の低エネルギー衝突が生じてイオンの一部がフラグメント化するように十分に高い圧力および電圧で維持され、ＴＯＦ質量分析計は、例えば、対象の娘イオンと作成した抽出イオンクロマトグラムを包含する質量範囲全体のイオンをモニターすることによって、検出器から離れた、選択した娘イオンの時間窓の外側に出現するイオンを偏向させることによって、選択した娘イオンの到着時間窓に検出器の時間ゲート制御を行うことによって、またはそれらの組み合わせによって、検出のための娘イオンを選択する。
【０２０１】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、２つのＴＯＦ質量分析器とイオンフラグメンター（例えば、ＣＩＤまたはＳＩＤなど）を含む。種々の実施形態において、第１のＴＯＦは、イオンフラグメンターへの導入のために、（例えば、前記フラグメンターから離れた、選択した親イオンの時間窓の外側に出現するイオンを偏向させることによって）親イオンを選択し、第２のＴＯＦ質量分析計は、例えば、対象の娘イオンと作成した抽出イオンクロマトグラムを包含する質量範囲全体のイオンをモニターすることによって、検出器から離れた、選択した娘イオンの時間窓の外に出現するイオンを偏向させることによって、選択した娘イオンの到着時間窓に検出器の時間ゲート制御を行うことによって、またはそれらの組み合わせによって、検出のための娘イオンを選択する。
【０２０２】
種々の実施形態において、前記質量分析システムは、対象の親イオンを選択するための時限型イオンセレクタを有する第１の無電界ドリフト領域を含むタンデムＭＳ−ＭＳ機器と、娘イオンを作成するためのフラグメンテーションチャンバー（またはイオンフラグメンター）と、検出のために選択娘イオンを通過させる質量分離器とを含む。種々の実施形態において、時限型イオンセレクタはパルスイオン偏向器を含む。種々の実施形態において、イオン偏向器はパルスイオン偏向器として使用することができる。質量分離器は、イオン反射器を備えることができる。種々の実施形態において、フラグメンテーションチャンバーは、イオンのフラグメンテーションを生じ、抽出を遅延させるように設計された衝突セルである。種々の実施形態において、フラグメンテーションチャンバーはまた、飛行時間質量分析によりフラグメントイオンを分析するための遅延抽出イオン源としても機能し得る。
【実施例】
【０２０３】
本教示内容の態様は、以下の実施例に鑑みればさらに理解することができるが、これらの実施例は網羅的なものではなく、いかなる方法によっても本教示内容の適用範囲を限定するものとして解釈しれてはならない。
【０２０４】
（実施例１〜４）
特に明記しない限り、実施例１〜４では、以下の材料および方法を使用した。
【０２０５】
標識試薬は、実質的に図１９に示した通りに２段階の反応で添加した。第１段階は、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液で行い、第２段階は、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４Ｎ＋Ｉ−）触媒の存在下において酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で行った。
【０２０６】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ３２００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標、または５０００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、クロマトグラフデータと質量スペクトルデータとを得た。窒素衝突ガス（約１ミリトール〜１０ミリトールの範囲の圧力）を使用してＭＳ／ＭＳデータを得た。クロマトグラフの構成には、オートサンプラと、Ｃ１８逆相カラムと、カラムヒーターとを備えたバイナリー勾配ＨＰＬＣシステムが含まれていた。
【０２０７】
表１には、実施例１〜４の種々の実験条件が詳細にまとめられており、化合物名の前に付いた「Ｎ−Ｍ−ＰＩＰ」という表記は、標識検体を指す。
【０２０８】
【表１】
0005413836.tif 000067
。
【０２０９】
（実施例１〜３）  イソシアン酸ピペラジン標識
実施例１〜３では、本教示内容に記載のイソシアン酸ピペラジン標識で標識した種々の検体のフラグメンテーションに対する、窒素衝突ガスによるＣＩＤ衝突エネルギー（ＣＥ）の作用に関するデータを示す。実施例１では、標識したエストラジオールに関するデータを、実施例２では、標識したコレステロールに関するデータを、そして実施例３では、種々の標識ビタミンＤ化合物および代謝産物に関するデータを示す。
【０２１０】
標識検体をＰＤＩＴＭに供したが、ここでは親イオンが標識検体であり（例えば、実施例１、実施例２および実施例３については、それぞれ図２１、図２３および図２５を参照）、生成イオンをスキャンした。図２１、図２３および図２５はまた、実施例１（図２２Ａ〜Ｃ）および実施例２（図２４Ａ〜Ｂ）の質量スペクトルで認められた種々のフラグメントを生じるフラグメンテーション地点（結合の切断）も示している。実施例３の図２６は、種々の親−娘イオン遷移の信号強度の概要を示している（例えば、図２６の「５６８→１５８」という表記は、親イオン透過率が約５６８ａｍｕであり、娘イオン透過率が約１５８ａｍｕであることを示している）。図２７の矢印は、ＣＥ＝４５ｅＶで非常に小さいピーク（１８４ａｍｕ）が認められたことを示している。
【０２１１】
実施例３はまた、種々の実施形態において、イソシアン酸ピペラジン標識が、例えば、１つ以上の試料中のビタミンＤ３とその代謝産物の１つ以上との濃度を測定するため使用できることも示している。例えば、種々の実施形態において、同重体イソシアン酸ピペラジン標識のセットは、本教示内容の方法にしたがって１つ以上の試料中のビタミンＤ３とその代謝産物の１つ以上との濃度を測定するために使用することができた。
【０２１２】
（実施例４）  クロマトグラフィの改善
種々の態様において、本教示内容は、クロマトグラフ分離に供した検体の検出限界を改善する方法を提供する。理論に拘束されるわけではないが、本教示内容の標識検体の種々の実施形態によって、システムキャリオーバーの低減による検出限界の改善が容易になると考えられる。
【０２１３】
実施例４では、クロマトグラフィ信号の改善を容易にすることができる本発明の標識の種々の実施形態の能力に関するデータを示す。図３４では、標識検体と、得られた信号の増大とが比較されており、検体と標識検体の濃度（図３４のＸ軸）の広範囲にわたって少なくとも１桁の増大が示されている。例えば、図３４では、標識信号と非標識信号の比が約１２：１を超えている。図３４において、黒塗りの菱形が非標識検体のデータを表し、黒塗りの正方形が標識検体のデータを表す。
【０２１４】
図３６および図３８は、標識検体のみのデータを示しており、図３６は、モニターしたＭＲＭ遷移のピーク面積と高さに関するデータを示す。また、図３６および図３８には、標識検体の推定検出限界（ＤＬ）も示されている。
【０２１５】
図３５および図３７では、標識検体と非標識検体のＭＲＭスペクトルが比較されている。
【０２１６】
（実施例５〜１０）  質量差のデータ
以下の実施例５〜１０では、特定の質量差および所定の質量差を有する２つの質量差次タグを使用して、２組の環含有化合物試料のセット（例えば、標準試料および試験試料）を標識し、質量分析計による分析時に質量差によって分離することができる修飾環含有化合物誘導体を得た。種々の実施形態においては、２つのｍ／ｚピークの強度の比によって、２組の試料セットにおける検体の相対的定量化が可能となる。ＣＩＤは、標識環含有化合物から１つ以上のレポーターイオンを生成するために使用することができる。また、種々のタグのレポーターフラグメントの強度の比によっても、２組の試料セットにおける検体の相対的定量化に関する情報が得られる。したがって、例えば、同定、定量化またはそれらの両方のために検体をＰＤＩＴＭモニタリングに供することができた。
【０２１７】
実施例５〜１０では質量差次標識に関するデータを示すが、前記方法は、標識中の適切な同位体置換による同重体標識の使用に適用することができる。
【０２１８】
特に明記しない限り、実施例５〜１０では、以下の材料および方法を使用した。
【０２１９】
標識化反応は、０．１Ｍのヒドロキシル含有化合物と、１ＭのＤＩＰＥＡと、０．５ＭのＨＡＴＵとを含むＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液で行った。標識試薬はメチルピペラジン酢酸を含んでおり、使用した特定の１つ以上の試薬が種々の実施例で示されている。
【０２２０】
標識化反応のための活性化したメチルピペラジン酢酸の調製は、実質的に以下の通りに行った。メチルピペラジン酢酸を秤量し、このメチルピペラジン酢酸に、ＤＭＦ中の１Ｍジイソプロピルエチルアミンを２当量添加し、ボルテックスして前記酸を溶解する。次いで、ＤＭＦ中の０．５Ｍ  ＨＡＴＵを１当量添加して、ボルテックスし、２０分間静置する。種々のメチルピペラジン酢酸標識の例は、一般式（ＩＸａ）〜（ＩＸＩ）に示す。
【０２２１】
標識ヒドロキシル化環含有化合物の調製は、実質的に以下の通りに行った。ヒドロキシル化環含有化合物のＤＭＦ溶液０．１Ｍを調製し、上で調製した活性化したメチルピペラジン酢酸を添加し、ボルテックスして、室温にて一晩反応させる。乾燥させた後、メタノールに再度溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度にする。
【０２２２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ３２００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標、または５０００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、クロマトグラフデータと質量スペクトルデータとを得た。窒素衝突ガス（約１ミリトール〜１０ミリトールの範囲の圧力）を使用してＭＳ／ＭＳデータを得た。クロマトグラフの構成には、オートサンプラと、Ｃ１８逆相カラムと、カラムヒーターとを備えたバイナリー勾配ＨＰＬＣシステムが含まれていた。
【０２２３】
（実施例５）  エストラジオール
以下の実施例は、標識（質量差次タグで標識した）エストラジオールの標識化および質量分析測定値を示す。図３９Ａの挿入図の構造は、ヒドロキシル基の一方または両方のエストラジオール（３位および１７位）が質量差次標識を受けることができることを示している。
【０２２４】
エストラジオールは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。標識エストラジオールは、式（ＩＸｈ）のタグとの反応によって標識した。
【０２２５】
図３９Ａは、標識エストラジオール試料のクロマトグラムの概略図を示している。四環式環の３位と１７位でエストラジオールが標識される可能性が２つあるため、２つの溶離液のピークが認められる。
【０２２６】
図３９Ｂおよび３９Ｃは、図３９Ａの約５．０分と５．３分における溶離液のエレクトロスプレー（ＥＳＩ）質量スペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約４１７のピークが、標識エストラジオールに相当する。
【０２２７】
図３９Ｄおよび３９Ｅは、図３９Ａの約５．０分と５．３分における溶離液のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約１１７のピークが、図３９Ｄの挿入図に示したように結合Ｙでフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。ｍ／ｚ値約１５９および１６３のピークは、結合Ｘでフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。
【０２２８】
本実施例のＭＳデータによって、標識ヒドロキシル化環含有化合物の質量が確認されている。ＭＳ／ＭＳデータでは、ＣＩＤによるフラグメンテーション時のレポーターイオンの生成が示されており、レポーターイオンの生成の一貫性が、レポーターイオンフラグメント信号（すなわち、ｍ／ｚ値約１１７、１５９および／または１６３）に存在するイオン信号の実質的な分画物によって示されている。
【０２２９】
比較のため、図３９Ｆは、非標識エストラジオールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示しており、非標識エストラジオールのフラグメンテーションが数多くの経路によって起こっており、それによってＭＲＭの感度が大幅に低下していることが認められる。
【０２３０】
（実施例６）  テストステロンおよびエピテストステロン
以下の実施例は、標識（質量差次タグで標識した）テストステロンおよびエピテストステロンと、非標識（標識していない）テストステロンおよびエピテストステロンの標識化および質量分析測定値を示す。図４０Ａおよび４１Ａの挿入図の構造は、１７位における標識化を示している。
【０２３１】
テストステロンおよびエピテストステロンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。標識テストステロンと標識エピテストステロンは、式（ＩＸｈ）のタグとの反応によって標識した。
【０２３２】
図４０Ａおよび４０Ｂでは、標識テストステロンと非標識テストステロンそれぞれのクロマトグラムが比較されており、標識テストステロンの溶出の方が早いことが示されている。図４０Ｃおよび４０Ｄは、標識テストステロンと非標識テストステロンそれぞれのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約１１７のピークは、挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当し、ｍ／ｚ値約１５９および１６３のピークは、図４０Ｄの挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。
【０２３３】
図４１Ａおよび４１Ｂは、それぞれ非標識および標識のエピテストステロンのクロマトグラムを比較したものであり、それによって標識エピテストステロンの溶出がより早いことが示される。図４１Ｃおよび４１Ｄは、それぞれ非標識および標識のエピテストステロンのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約１１７のピークは、挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当し、ｍ／ｚ値約１６３のピークは、図４１Ｄの挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。
【０２３４】
本実施例のＭＳデータによって、標識ヒドロキシル化環含有化合物の質量が確認されている。ＭＳ／ＭＳデータでは、ＣＩＤによるフラグメンテーション時のレポーターイオンの生成が示されており、レポーターイオンの生成の一貫性が、レポーターイオンフラグメント信号（すなわち、ｍ／ｚ値約１１７、１５９および／または１６３）に存在するイオン信号の実質的な分画物によって示されている。
【０２３５】
（実施例７）  スチグマステロール
以下の実施例は、標識（質量差次タグで標識した）スチグマステロールと非標識（標識していない）スチグマステロールの標識化および質量分析測定値を示す。図４２Ｂの挿入図の構造は、３位における標識化を示している。
【０２３６】
スチグマステロールは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。標識スチグマステロールは、式（ＩＸｈ）のタグとの反応によって標識した。
【０２３７】
図４２Ａおよび４２Ｂでは、非標識スチグマステロールと標識スチグマステロールそれぞれのクロマトグラムが比較されており、標識スチグマステロールの溶出の方が早いことが示されているる。図４２Ｃは、標識スチグマステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約１６３のピークは、図４２Ｃの挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。
【０２３８】
本実施例のＭＳデータによって、標識ヒドロキシル化環含有化合物の質量が確認されている。ＭＳ／ＭＳデータでは、ＣＩＤによるフラグメンテーション時のレポーターイオンの生成が示されており、レポーターイオンの生成の一貫性が、ｍ／ｚ値約１６３でのレポーターイオンフラグメント信号に存在するイオン信号の分画物によって示されている。
【０２３９】
（実施例８）  コレステロール
以下の実施例は、２種類の質量差次タグで標識した（質量差次タグで標識した）コレステロールの標識化および質量分析測定値を示す。図４３Ａの挿入図の構造は、３位における標識化を示している。
【０２４０】
コレステロールは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。コレステロールの標識には２種類のタグを使用し、「重い」試薬標識コレステロール（Ｈ）は、式（ＩＸｈ）のタグとの反応によって標識し、「軽い」試薬標識コレステロール（Ｌ）は、式（ＩＸａ）のタグにより標識した。
【０２４１】
（ＩＸａ）タグを使用して標識したコレステロールに相当するデータは、「軽い」またはＬと呼び、（ＩＸｈ）タグを使用して標識したコレステロールに相当するデータは、「重い」またはＨと呼ぶ。
【０２４２】
図４３Ａは、ＨおよびＬの両方の標識コレステロールのクロマトグラムの概略図を示しており、各成分は実質的に共溶出している。図４３Ｂは、標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約１６３のピークは、図４３Ｂの挿入図に示したように結合Ｘでフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。図４３Ｃおよび図４３Ｄでは、Ｈ標識コレステロールとＬ標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳスペクトルがそれぞれ比較されており、図４３Ｅおよび図４３Ｆでは、Ｈ標識コレステロールとＬ標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳがそれぞれ比較されている。
【０２４３】
図４３Ｇおよび図４３Ｈには、より細かな詳細とより広範な詳細が示されている。図４３Ｇは、Ｌ標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳスペクトルのより小さな部分を示しているのに対し、図４３Ｈは、Ｌ標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルのより大きな部分を示している。
【０２４４】
本実施例のＭＳデータによって、標識ヒドロキシル化環含有化合物の質量が確認されている。ＭＳ／ＭＳデータでは、ＣＩＤによるフラグメンテーション時のレポーターイオンの生成が示されており、レポーターイオンの生成の一貫性が、レポーターイオンフラグメント信号（すなわち、ｍ／ｚ値約１１７、１５９および／または１６３）に存在するイオン信号の実質的な分画物によって示されている。
【０２４５】
図４３Ｉは、非標識コレステロールのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示しており、非標識コレステロールのフラグメンテーションが数多くの経路によって起こっており、それによってＭＲＭの感度が大幅に低下していることが認められる。
【０２４６】
（実施例９）  ビタミンＤ
以下の実施例は、標識（質量差次タグで標識した）コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）と標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ３の代謝産物）の標識化および質量分析測定値を示す。図４４Ａおよび図４４Ｂの挿入図の構造は、標識位置を示している。
【０２４７】
コレカルシフェロールおよび２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。コレカルシフェロールおよび２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、式（ＩＸａ）のタグとの反応によって標識した。
【０２４８】
図４４Ａおよび４４Ｂは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）および標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロールそれぞれのＥＳＩ−ＭＳスペクトルの概略図を示しており、図４４Ｃおよび図４４Ｄは、標識コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）と標識２５−ヒドロキシコレカルシフェロールそれぞれのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。
【０２４９】
ｍ／ｚ値約１５９のピークは、図４４Ｃおよび図４４Ｄの挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。
【０２５０】
（実施例１０）  プロスタグランジン
以下の実施例は、標識（質量差次タグで標識した）プロスタグランジンの標識化および質量分析測定値を示す。プロスタグランジンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手し、式（ＩＸａ）のタグとの反応によって標識した。図４５Ａおよび図４５Ｂの挿入図の構造は、標識位置を示している。
【０２５１】
図４５Ａは、標識プロスタグランジンのＥＳＩ−ＭＳスペクトルの概略図を、図４５Ｂは、標識プロスタグランジンのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示している。ｍ／ｚ値約１５９のピークは、図４５Ｂの挿入図に示したようにフラグメンテーションが発生した際のタグのレポーターイオンに相当する。
【０２５２】
本実施例のＭＳデータによって、標識ヒドロキシル化環含有化合物の質量が確認されている。ＭＳ／ＭＳデータでは、ＣＩＤによるフラグメンテーション時のレポーターイオンの生成が示されており、レポーターイオンの生成の一貫性が、ｍ／ｚ値約１５９でのレポーターイオンフラグメント信号に存在するイオン信号の実質的な分画物によって示されている。
【０２５３】
（実施例１１〜１２）  イソシアン酸ベンゾイル標識
特に明記しない限り、実施例１１〜１２では、以下の材料および方法を使用した。
【０２５４】
標識は、実質的に実施例１１および１２についてそれぞれ図４６および図４９に示した通りに、１段階の反応で行った。
【０２５５】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ３２００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標、または５０００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、クロマトグラフデータと質量スペクトルデータとを得た。窒素衝突ガス（約１ミリトール〜１０ミリトールの範囲の圧力）を使用してＭＳ／ＭＳデータを得た。クロマトグラフの構成には、オートサンプラと、Ｃ１８逆相カラムと、カラムヒーターとを備えたバイナリー勾配ＨＰＬＣシステムが含まれていた。
【０２５６】
両実施例１１および１２のいずれにおいても、すべてのフラグメントにナトリウムイオンが付加されており、塩基フラグメントの質量が約２２ａｍｕシフトしていることが認められた。一定範囲の衝突エネルギーにわたって１２２＋２２＝１４４ａｍｕのレポーターイオンが認められ、約３０ｅＶを超える衝突エネルギーでは１６６＋２２＝１８８ａｍｕのレポーターイオンが実質的に還元した。
【０２５７】
（実施例１３〜１４）  トリメチルアンモニウム標識
特に明記しない限り、実施例１３〜１４では、以下の材料および方法を使用した。
【０２５８】
標識試薬は、実質的に実施例１３および１４についてそれぞれ図５２および図５５に示した通りに、２段階の反応で添加した。
【０２５９】
実施例１３では、実質的に以下の通りに標識検体化合物の調製を行った。室温のコレステロール（０．６５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液にイソシアン酸クロロアセチル（２．６ｍｍｏｌ）を添加し、ボルテックスにより混合した後、５０℃にて１時間加熱した。次いで、反応を周囲温度に平衡させ、水（４ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に分割した。イソシアン酸クロロアセチル標識コレステロールを含有するＥｔＯＡｃ層を２５ｍＬのＭｅ３Ｎ溶液（ＥｔＯＨの３５％）で処理し、周囲温度にて４０分間反応させた。次いで反応混合物を回転式蒸発器で濃縮し、ジクロロメタン−メタノール−１％Ｅｔ３Ｎ溶媒系を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製した。塩化物として単離した精製材料は白色の固体であった。ＥＳ−ＭＳ：計算値  Ｍ＋＝５２９．４４、観測値＝５２９．４０。
【０２６０】
実施例１４では、実質的に以下の通りに標識検体化合物の調製を行った。工程１では、ビタミンＤ３のカルバミン酸クロロアセチルを実質的に以下の通りに調製した。ビタミンＤ３の無水ＴＨＦ（５００μＬ）溶液（２０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）に、４当量のイソシアン酸クロロアセチル（２５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を加熱ブロックで５０℃にて１時間加熱した。この時点でＴＬＣにより、反応が完了していることが確認された。反応混合物を酢酸エチルで５ｍＬに希釈し、５ｍＬの水を添加した。次いで、得られた混合物を２分間ボルテックスして、混濁した溶液を得た。層を遠心分離によって分離した。パスツールピペットを使用して上層の有機物層を慎重に抜き取り、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾過液をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃで濃縮した。得られた黄色の固体を、さらなる精製を行うことなく次の工程に直接使用した。
【０２６１】
工程２を実質的に以下の通りに行った。上記の工程で得たビタミンＤ３の粗カルバミン酸クロロアセチルを酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、トリメチルアミンのエタノール溶液（２４．５ｍｇ、９９μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、混合物を室温にて一晩攪拌した。アリコートをＴＬＣで分析して、反応が完了していることを確認した。次いで、混合物をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃで濃縮し、残渣をエーテルで粉末にした。スピンダウンの後、エーテルをデカントした。高真空下で残渣を乾燥させて、白色の固体を得た（２４ｍｇ、総収量８３％）（ＭＳ５２７（Ｍ＋Ｈ））。
【０２６２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ３２００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標、または５０００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、クロマトグラフデータと質量スペクトルデータとを得た。窒素衝突ガス（約１ミリトール〜１０ミリトールの範囲の圧力）を使用してＭＳ／ＭＳデータを得た。クロマトグラフの構成には、オートサンプラと、Ｃ１８逆相カラムと、カラムヒーターとを備えたバイナリー勾配ＨＰＬＣシステムが含まれていた。
【０２６３】
実施例１３では、標識コレステロール検体に関するデータを示す。本実施例の衝突エネルギーの範囲にわたって１１７ａｍｕの１次レポーターイオン信号が認められた。実施例１４では、標識ビタミンＤ３に関するデータを示している。実施例１４でもまた、１１７ａｍｕのレポーターイオンが、本実施例の衝突エネルギーの範囲にわたって認められた１次イオンレポーターイオン信号であった。このようにモニターする１１７ａｍｕのイオン信号は、トリメチルアンモニウム標識を使用する種々の実施形態においてレポーターイオンとして機能することができる。
【０２６４】
（実施例１５〜１７）
実施例１５〜１７では、本教示内容の種々の実施形態におけるヒドロキシル化化合物の標識化に関するさらなるデータと、標識検体化合物のフラグメンテーションデータとを示す。実施例１５〜１７では、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ３２００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標、または５０００  Ｑ  Ｔｒａｐ（登録商標）という商標のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、クロマトグラフデータと質量スペクトルデータとを得た。窒素衝突ガス（約１ミリトール〜１０ミリトールの範囲の圧力）を使用してＭＳ／ＭＳデータを得た。クロマトグラフの構成には、オートサンプラと、Ｃ１８逆相カラムと、カラムヒーターとを備えたバイナリー勾配ＨＰＬＣシステムが含まれていた。
【０２６５】
（実施例１５）  ジエチルアミノ標識
ジエチルアミノ標識試薬は、実質的に図５８に示した通りに２段階反応で添加した。図５９には、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーションが示されており、図６０Ａ〜Ｆにはフラグメンテーションに関するデータが示されている。
【０２６６】
（実施例１６）  ４−ジメチルアミノフェニル標識
４−ジメチルアミノフェニル標識試薬は、実質的に図６１に示した通りに２段階反応で添加した。図６２には、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーションが示されており、図６３Ａ〜Ｆにはフラグメンテーションに関するデータが示されている。
【０２６７】
（実施例１７）  Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミノ標識
Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミノ標識試薬をコレステロールに添加した。図６４には、標識検体の種々の理論上のフラグメンテーションが示されており、図６５Ａ〜Ｆにはフラグメンテーションに関するデータが示されている。
【０２６８】
特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびウェブページを含むがこれらに限定されない、本願で引用するすべての文献および類似の資料は、かかる文献および類似の資料の形式に関係なく、すべての目的のために全体が参考として明示的に援用される。援用した文献および類似の資料の１つ以上が、定義した用語、用語の用法、記載した手法などについて本願と異なるか、矛盾する場合には、本出願が優先される。
【０２６９】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成上の目的のためのもであり、いかなる方法によっても記載した主題を制限するものとして解釈されないものとする。
【０２７０】
以上において本教示内容を種々の実施形態および実施例とともに説明してきたが、本教示内容はこのような実施形態または実施例に限定されるものとして意図されることはない。反対に本教示内容は、当業者が理解するであろう種々の代替物、改変および等価物を包含する。
【０２７１】
本教示内容は、その旨の記載がない限り、記載した順序または要素に限定されるものとして解釈してはならず、本教示内容の適用範囲から逸脱することなく形式や詳細の種々の変更が可能であることを理解しなければならない。例えば、開示した方法の工程のいずれかを他の開示した工程のいずれかと組み合わせて、本教示内容の種々の実施形態にしたがって環含有化合物を分析する方法を提供することができる。そのため、本教示内容の適用範囲および趣旨に含まれるすべての実施形態、ならびにそれらの等価物が請求される。
【図１】
0005413836.tif 000071
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
0005413836.tif 000078
【図６Ｂ】
0005413836.tif 000079
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４３Ｇ】
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【図４３Ｈ】
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【図４３Ｉ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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