(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原が入っていない正常な成熟樹状細胞による活性化の後に、癌/精巣抗原の発現をDNA脱メチル化又はヒストンアセチル化により化学的に誘導しているCD4+リンパ細胞を含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する組成物。
【請求項２】
前記リンパ細胞がリンパ球である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記リンパ球が末梢血リンパ球である、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原は対数増殖期に誘導されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記DNA脱メチル化が、5-アザ-2-デオキシシチジンによる処理を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒストンアセチル化が、ヒストン脱アセチル化インヒビターによる処理を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物と、許容可能な担体とを含む、予防処置又は治療処置用のワクチン。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物を含む、前記抗原に対する免疫応答を刺激するワクチン。
【請求項９】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞傷害性Tリンパ球を活性化する抗原提示細胞。
【請求項１０】
抗原提示細胞として請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物を使用して、生体外でTリンパ球を活性化することを含む、腫瘍特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球を製造する方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の方法によって得られた腫瘍特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球を含む、養子T細胞免疫療法用の医薬組成物。
【請求項１２】
抗原が入っていない正常な成熟樹状細胞を使用して、生体外で正常な非活性化リンパ細胞の増殖を刺激すること、及びDNA脱メチル化又はヒストンアセチル化を誘導する作用物質で、生体外で増殖細胞を化学処理して癌/精巣抗原の発現を誘導することを含む、CD4+細胞が豊富な抗原提示組成物を製造する方法。
【請求項１３】
前記リンパ細胞が、他家血液又は自己血液から抽出した末梢血リンパ球である請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原は対数増殖期に誘導されている請求項12又は13に記載の方法。
【請求項１５】
請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法で抗原提示組成物を調製すること、及び該抗原提示組成物を使用して、生体外でT細胞リンパ球を活性化させ、それにより腫瘍特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球を含有する細胞傷害性組成物を得ることを含む、細胞傷害性組成物を製造する方法。
【請求項１６】
前記T細胞リンパ球の数が、該抗原提示組成物の使用による活性化の後に増える請求項15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主に、悪性腫瘍に対する免疫応答を誘導するのに好適な組成物に関し、したがってこの組成物は、ワクチンとして又は養子免疫療法用に細胞傷害性細胞を生成するのに使用することができる。より具体的には、本発明は免疫系の正常細胞だけの使用に基づく細胞抗腫瘍ワクチンの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行癌は、ヒトの死の主な原因の１つであるが、今のところ十分に効果がある治療法は提案されていない。細胞ベースの免疫療法は、最も有望な非毒性の癌の治療方法である。癌免疫療法は、免疫機構によって腫瘍細胞を破壊することを目的としている。癌免疫療法は、単一治療として、又は外科手術、放射線及び化学療法等の他の種類の治療の補助として使用することができる。この戦略は、腫瘍特異的な免疫応答を誘導するために免疫能力を回避する細胞産物のex vivo操作及び再導入に基づく。このようにして、このような細胞ベースの免疫療法の最終目的は、腫瘍特異的なエフェクター細胞の導入であり、近年の進歩によって、腫瘍細胞を認識し、殺すことが可能なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に注目が集まっている。これらのＣＴＬは、迅速に再活性化し、且つ生物中で腫瘍細胞の再発を拡大することができる記憶細胞の形態で生物中に長時間生存することができるものとすることが重要である。
【０００３】
癌細胞を攻撃するのに免疫系を利用することができるかは、癌細胞が、免疫学的攻撃の標的となり得る、新規のタンパク質を含有するか、又は現存のタンパク質を過剰発現するということに従う。T. Boonのグループによる１９９１年の最初のヒト腫瘍抗原ＭＡＧＥ−１の記載以来、このようなＣＴＬで認識される有意数の腫瘍関連抗原は同定されている（非特許文献１）。腫瘍抗原の３つの主なグループが現在、能動免疫療法の考えられる標的として集中的に研究中である：（i）黒色腫に対するＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００及びチロシナーゼ、前立腺癌に対するＰＳＡ及びＰＳＭＡ等の分化抗原、（ii）テロメラーゼ及びスルビビン等の過剰発現抗原、並びに（iii）ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＢＯＲＩＳ等の癌／精巣抗原（ＣＴＡ）。
【０００４】
腫瘍細胞に対する免疫応答の特異的な標的化の点から、ＣＴＡは、免疫系によっては認識されない精巣の生殖細胞以外の正常細胞で発現しないので最も見込みがある（生殖細胞は、組織適合性分子の発現を欠いている）（ＣＴＡに関する総説を参照（非特許文献２、非特許文献３））。腫瘍細胞におけるＣＴＡの活性化はＣｐＧ領域のプロモータ脱メチル化によるものであり、多くの癌で起こるゲノム規模の脱メチル化プロセスの結果であり、且つ腫瘍進行に関連することが示された（非特許文献４）。実際に、ＣＴＡ発現は腫瘍進行に関連があることが示された（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。このグループの腫瘍抗原の治療可能性は、多くの研究によって確認されている。例えば、（ａ）転移した黒色腫患者ＭＺ−２に、幾つかのＣＴＡ（ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ及びＢＡＧＥ、総説を参照されたい（非特許文献９））に対してＣＴＬ応答を進行させ、無病期間が長く続く、破壊自己腫瘍細胞を複数回ワクチン接種し（P. Coulie、私信）、（ｂ）ＭＡＧＥ−Ａ３由来のペプチドが入っている樹状細胞を黒色腫患者にワクチン接種することによって、抗原陽性転移の退縮を誘導し（非特許文献１０）、及び（ｃ）多価ワクチンの治療効率は、ＭＡＧＥ−３抗原に対する免疫応答の誘導に関連があった（非特許文献１１）。それにもかかわらず、別々のＣＴＡ成員の発現における高い不均一性のために、このグループの抗原は、分化抗原又は過剰発現抗原に比べて免疫学的標的として一般的ではない。
【０００５】
ＣＴＡの不均一な発現に関連する問題を克服するために、これらの抗原を標的とするワクチンはできるだけ多価でなければならない。特許文献１の特許出願は、高レベルのＣＴＡを発現するが、メラノサイト分化抗原を発現しない予め選択したヒト黒色腫細胞株に基づくＣＴＡを標的とする、このような多価ワクチンを記載している。他の腫瘍細胞ベースのワクチンは全て、自己腫瘍、又は「異なった腫瘍抗原であればあるほど良い（the more different tumor antigens, the better）」という原則で選択した標準的な細胞株のいずれかを用いる。抗原源としてワクチンにおいて自己腫瘍細胞を用いると、樹状細胞ベースのワクチン接種の形態で適用される場合、場合によっては腫瘍の退縮を誘導する（非特許文献１２、非特許文献１３）。多価ワクチンアプローチの主要な制限は、抗原混合物の生産及び標準化が困難であることである。オリジナルの生検材料を直接使用すると標準化が失われ、またこのような材料は入手不可能であることが多い。今までのところ、標準的な細胞株の使用では臨床的に高い有効性は示されていない（非特許文献１４、非特許文献１５）。
【０００６】
全腫瘍細胞材料を使用すると効率が低い理由の１つは、交差提示の効率が低いことである。細胞傷害性Ｔ細胞の生成を刺激するために、外因性の腫瘍タンパク質抗原は、エンドサイトーシスプロセスを介して、抗原提示細胞に取り込まれ、その後エンドサイトーシス小胞からサイトゾルに移動する必要がある（総説を参照されたい（非特許文献１６））。タンパク質抗原のプロセシング及び抗原ペプチドの形成には、このことが必要となる。その後、ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子に関連して表面上に提示される。外から添加したほんの一部の抗原が細胞内に入り、その後取り込まれたほんの一部のタンパク質が交差提示を受ける。交差提示の低効率性を克服するために、何人かの著者等が、抗原提示細胞のトランスフェクションのために腫瘍細胞から単離したＲＮＡを使用することを提案していた（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。ＲＮＡトランスフェクションの主な限定要因は、抗原ペプチドと、Ｔ−ヘルパー応答の誘導に必要なＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体の形成を欠くことである。Ｔ−ヘルパー応答なしでは、ＣＤ８＋免疫学的記憶の形成は起こらず（非特許文献２０、非特許文献２１）、記憶が形成されなければ、初期増殖後にＣＤ８＋ＣＴＬが破壊される。また、腫瘍増殖の条件下で、ＣＤ８＋記憶応答の形成が制御性細胞の存在により、破損される（非特許文献２２）。
【０００７】
５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ）は、主に腫瘍細胞において癌／精巣抗原の発現を誘導することが知られている（非特許文献２３）。また、５−アザ−ＣｄＲも、ＰＨＡ活性化末梢血リンパ球におけるＣＴＡ、ＭＡＧＥ−Ａ１の少なくとも１つの発現を誘導し得ることは、これまでに１つのグループによって示された（非特許文献４）が、別のグループでは示されなかった（非特許文献２３）。
【０００８】
この技法は、抗原提示細胞を生成する方法の一部として特許文献２で使用され、細胞を被験者から回収すること、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）及びフィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）等の作用物質で細胞を活性化すること、ex vivoで活性化細胞を培養すること、及び細胞が複数の腫瘍関連抗原（ＣＴＡ）を発現するように、ＤＮＡ低メチル化剤で培養細胞を処理することを含む。このように産生したＣＴＡは、癌ワクチンとしての使用が提案されている。しかし、この手法の大きな問題点は、細胞を活性化するためにヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）及びフィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）等の外来作用物質を使用することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ０３／０４５４２７
【特許文献２】ＷＯ０３／０１２０８６
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Novellino,L., Castelli,C., and Parmiani,G. (2005). A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207.
【非特許文献２】Kirkin,A.F., Dzhandzhugazyan,K.N., and Zeuthen,J. (2002). Cancer/testis antigens: structural and immunobiological properties. Cancer Invest 20, 222-236.
【非特許文献３】Zendman,A.J., Ruiter,D.J., and van Muijen,G.N.P. (2003). Cancer/testis-associated genes: Identification, expression profile, and putative function. J. Cell Physiol 194, 272-288.
【非特許文献４】De Smet,C., De Backer,O., Faraoni,I., Lurquin,C., Brasseur,F., and Boon,T. (1996). The activation of human gene MAGE-1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 7149-7153.
【非特許文献５】Brasseur,F., Rimoldi,D., Lienard,D., Lethe,B., Carrel,S., Arienti,F., Suter,L., Vanwijck,R., Bourlond,A., Humblet,Y., Vacca,A., Conese,M., Lahaye,T., Degiovanni,G., Deraemaecker,R., Beauduin,M., Sastre,X., Salamon,E., Dreno,B., Jager,E., Knuth,A., Chevreau,C., Suciu,S., Lachapelle,J.M., Pouillart,P., Parmiani,G., Lejeune,F., Cerottini,J.C., Boon,T., and Marchand,M. (1995). Expression of MAGE genes in primary and metastatic cutaneous melanoma. Int. J. Cancer 63, 375-380.
【非特許文献６】Eura,M., Ogi,K., Chikamatsu,K., Lee,K.D., Nakano,K., Masuyama,K., Itoh,K., and Ishikawa,T. (1995). Expression of the MAGE gene family in human head-and-neck squamous-cell carcinomas. Int. J. Cancer 64, 304-308.
【非特許文献７】Katano,M., Nakamura,M., Morisaki,T., and Fujimoto,K. (1997). Melanoma antigen-encoding gene-1 expression in invasive gastric carcinoma: correlation with stage of disease. J. Surg. Oncol. 64, 195-201.
【非特許文献８】Patard,J.J., Brasseur,F., Gil-Diez,S., Radvanyi,F., Marchand,M., Francois,P., Abi-Aad,A., Van Cangh,P., Abbou,C.C., Chopin,D., and Boon,T. (1995). Expression of MAGE genes in transitional-cell carcinomas of the urinary bladder. Int. J. Cancer 64, 60-64.
【非特許文献９】van Pel,A., van der Bruggen,P., Coulie,P.G., Brichard,V.G., Lethe,B., Van den Eynde,B.J., Uyttenhove,C., Renauld,J.C., and Boon,T. (1995). Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes. Immunol. Rev. 145, 229-250.
【非特許文献１０】Thurner,B., Roder,C., Dieckmann,D., Heuer,M., Kruse,M., Glaser,A., Keikavoussi,P., Kampgen,E., Bender,A., and Schuler,G. (1999b). Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application. J. Immunol. Methods 223, 1-15.
【非特許文献１１】Reynolds,S.R., Zeleniuch-Jacquotte,A., Shapiro,R.L., Roses,D.F., Harris,M.N., Johnston,D., and Bystryn,J.C. (2003). Vaccine-induced CD8+ T-cell responses to MAGE-3 correlate with clinical outcome in patients with melanoma. Clin. Cancer Res. 9, 657-662.
【非特許文献１２】O'Rourke,M.G., Johnson,M., Lanagan,C., See,J., Yang,J., Bell,J.R., Slater,G.J., Kerr,B.M., Crowe,B., Purdie,D.M., Elliott,S.L., Ellem,K.A., and Schmidt,C.W. (2003). Durable complete clinical responses in a phase I/II trial using an autologous melanoma cell/dendritic cell vaccine. Cancer Immunol. Immunother. 52, 387-395.
【非特許文献１３】Marshall,J.A., Forster,T.H., Purdie,D.M., Lanagan,C.M., O'Connor,L.E., O'Rourke,M.G., Johnson,M.K., See,J.L., Ellem,K.A., Martinez,N.R., Lopez,J.A., and Schmidt,C.W. (2006). Immunological characteristics correlating with clinical response to immunotherapy in patients with advanced metastatic melanoma. Immunol. Cell Biol. 84, 295-302.
【非特許文献１４】Palucka,A.K., Ueno,H., Connolly,J., Kerneis-Norvell,F., Blanck,J.P., Johnston,D.A., Fay,J., and Banchereau,J. (2006). Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells can induce objective clinical responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity. J. Immunother. 29, 545-557.
【非特許文献１５】Salcedo,M., Bercovici,N., Taylor,R., Vereecken,P., Massicard,S., Duriau,D., Vernel-Pauillac,F., Boyer,A., Baron-Bodo,V., Mallard,E., Bartholeyns,J., Goxe,B., Latour,N., Leroy,S., Prigent,D., Martiat,P., Sales,F., Laporte,M., Bruyns,C., Romet-Lemonne,J.L., Abastado,J.P., Lehmann,F., and Velu,T. (2005). Vaccination of melanoma patients using dendritic cells loaded with an allogeneic tumor cell lysate. Cancer Immunol. Immunother. 55, 819-829.
【非特許文献１６】Cresswell,P., Ackerman,A.L., Giodini,A., Peaper,D.R., and Wearsch,P.A. (2005). Mechanisms of MHC class I-restricted antigen processing and cross-presentation. Immunol. Rev. 207, 145-157.
【非特許文献１７】Gilboa,E. and Vieweg,J. (2004). Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol. Rev. 199, 251-263.
【非特許文献１８】Schaft,N., Dorrie,J., Thumann,P., Beck,V.E., Muller,I., Schultz,E.S., Kampgen,E., Dieckmann,D., and Schuler,G. (2005). Generation of an optimized polyvalent monocyte-derived dendritic cell vaccine by transfecting defined RNAs after rather than before maturation. J. Immunol. 174, 3087-3097.
【非特許文献１９】Kyte,J.A., Mu,L., Aamdal,S., Kvalheim,G., Dueland,S., Hauser,M., Gullestad,H.P., Ryder,T., Lislerud,K., Hammerstad,H., and Gaudernack,G. (2006). Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells transfected with autologous tumor-mRNA. Cancer Gene Ther. 13, 905-918.
【非特許文献２０】Bevan,M.J. (2004). Helping the CD8+ T-cell response. Nat. Rev. Immunol. 4, 595-602.
【非特許文献２１】Castellino,F. and Germain,R.N. (2006). Cooperation between CD4+ and CD8+ T cells: when, where, and how. Annu. Rev. Immunol. 24, 519-540.
【非特許文献２２】Klebanoff,C.A., Gattinoni,L., and Restifo,N.P. (2006). CD8 T-cell memory in tumor immunology and immunotherapy. Immunol. Rev. 211, 214-224.
【非特許文献２３】Weber,J., Salgaller,M., Samid,D., Johnson,B., Herlyn,M., Lassam,N., Treisman,J., and Rosenberg,S.A. (1994). Expression of the MAGE-1 tumor antigen is up-regulated by the demethylating agent 5-Aza-2'-deoxycytidine. Cancer Res. 54, 1766-1771.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これらの問題を克服し、生産的且つ長く続くＣＴＬ媒介性の抗腫瘍免疫応答を誘導することができる効果的な細胞ベースのワクチンの開発に対する要求は依然として満たされていない。
【００１２】
本発明は、外来作用物質を使用せず、正常細胞だけを使用して細胞を活性化する化学処理によって、抗原提示組成物を調製するプロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この最も広範な態様において、本発明は、腫瘍抗原の発現が成熟樹状細胞で活性化した後、化学的に誘導されるリンパ細胞を含む、哺乳動物における免疫応答を誘導する組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、正常細胞のみを、即ち体液から単離されるような純粋なリンパ細胞及び樹状細胞のみを使用する、したがって植物由来の活性化因子、例えばＰＷＭ及びＰＨＡ等のどのような外来作用物質で処理した細胞も除く。また本発明は、合成腫瘍抗原調製物又は腫瘍細胞から単離した腫瘍抗原調製物のいずれも用いない。結果としてワクチンの調製及び規制当局の認可は非常に容易且つ安全である。好ましくは患者自身の細胞を使用する。
【００１５】
腫瘍抗原は、特に対数増殖期での（正常な）リンパ細胞の増殖において誘導される。正常なリンパ細胞の増殖は、（正常な）成熟樹状細胞により刺激される。
【００１６】
リンパ細胞はリンパ球、特に末梢血リンパ球であるのが最も好都合である。
【００１７】
好ましくは腫瘍抗原は、癌／精巣抗原（ＣＴＡ）であり、それはＤＮＡ脱メチル化により、例えば５−アザ−２’−デオキシシチジンでの処理により化学的に誘導することができる。代替的な手法は、腫瘍抗原を、ヒストンアセチル化により、例えばトリコスタチン（ＴＳＡ）等のヒストンデアセチラーゼインヒビターで処理することにより化学的に誘導するものである。
【００１８】
癌／精巣抗原は広範な腫瘍で発現し、本発明の組成物は、正常細胞に由来するにもかかわらず、広範な腫瘍に対して効果的である免疫応答を誘起することができる。
【００１９】
別の態様において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物、即ち抗腫瘍ワクチンの調製のための組成物の使用を提供する。ワクチンは、予防的に又は存在する腫瘍を直接処理するために使用してもよい。
【００２０】
本発明は、例えば養子Ｔ細胞免疫療法における細胞傷害性Ｔリンパ球のin vitro活性化のための抗原提示細胞としての組成物の使用を提供する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を調製する方法を提供し、抗原提示細胞として組成物を使用してＴリンパ球を活性化することを含む。（正常な）活性樹状細胞によって、細胞傷害性細胞の増殖を誘導するのが好ましい。この方法は、in vivoで治療手法として行われ得るか、又はin vitroで養子Ｔ細胞免疫療法におけるＴ細胞が使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】成熟樹状細胞の表現型を示す図である。
【図２】自己成熟樹状細胞と培養した後に得られた増殖リンパ球培養液の表現型を示す図である。
【図３】無傷のリンパ球及び５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球、並びにＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出される腫瘍細胞におけるＭＡＧＥ−Ａグループの抗原の発現を示す図である。
【図４】無傷のリンパ球及び５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球、並びにＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出される腫瘍細胞におけるＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、ＧＡＧＥ−３−７抗原及びＢＯＲＩＳ抗原の発現を示す図である。
【図５】無傷のリンパ球及び５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球、並びに細胞ベースのＥＬＩＳＡ解析によって検出される腫瘍細胞におけるＭＡＧＥ−Ａグループのタンパク質発現を示す図である。
【図６】５−アザ−ＣｄＲ処理自己リンパ球による一次刺激後のリンパ球の表現型を示す図である。
【図７】単離ＣＤ８＋細胞の表現型を示す図である。
【図８】初代培養由来の単離ＣＤ８＋リンパ球を様々な腫瘍標的細胞とインキュベートした後のＩＦＮ−γの産生を示す図である。
【図９】初代培養由来の単離ＣＤ８＋リンパ球による様々な標的細胞の破壊の顕微鏡による検出を示す図である。
【図１０】長時間培養した免疫リンパ球を様々な標的細胞とインキュベートした後のＩＦＮ−γの産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、抗原提示細胞が、腫瘍関連抗原の発現を化学的に誘導し、またＣＤ４＋細胞が豊富にあり、そのため細胞傷害性Ｔリンパ球を直接刺激し、免疫記憶の形成に必須のＣＤ４＋媒介性の補助を与えることができる正常細胞である手法によって効果的な免疫応答を提供することを目的とする。これらの抗原提示細胞は、免疫応答のin vivo刺激のための細胞ベースのワクチンとして又は細胞傷害性Ｔリンパ球をin vitroで刺激する養子Ｔ細胞療法において使用することができる。
【００２４】
本発明は、正常なリンパ細胞は成熟樹状細胞によって増殖するように誘導することができ、増殖中、癌／精巣抗原等の腫瘍抗原を発現するように化学処理によって誘導することができ、これによってＣＤ４＋細胞を含有し、このためＴ細胞に対して腫瘍抗原を提示し、細胞傷害性ＣＤ８＋細胞（そのいくつかはＣＤ６２Ｌ記憶細胞マーカーを含む）を生成することができる組成物が得られるという発見に基づいている。
【００２５】
正常なリンパ細胞は、リンパ球、特に末梢血リンパ球であるのが最も都合が良く、癌／精巣抗原を発現するために、ＤＮＡ脱メチル化剤で処理することによって誘導することができる。
【００２６】
したがって、本発明の好ましい態様を用いて、
成熟樹状細胞によってリンパ細胞の増殖を刺激すること、
増殖リンパ細胞を処理し、癌／精巣抗原の発現を誘導し、それによって、ＣＤ４＋細胞が豊富なリンパ球を含む抗原提示組成物を得ること、及び
抗原提示組成物を癌患者に投与し、癌／精巣抗原に対する免疫応答を刺激することを含む、腫瘍に対して免疫応答を刺激すること
によって癌を治療する方法、あるいは、
成熟樹状細胞によってリンパ細胞の増殖を刺激すること、
増殖リンパ細胞を処理し、癌／精巣抗原の発現を誘導し、それによって、ＣＤ４＋細胞が豊富な正常なリンパ球を含有する抗原提示組成物を得ること、
抗原提示組成物を使用して、増殖してＣＤ６２Ｌ記憶細胞マーカーを有する腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含有する細胞傷害性組成物を得ることができるＴ細胞リンパ球をex vivoで活性化すること、及び
細胞傷害性組成物を癌患者に投与すること
を含む、養子Ｔ細胞療法によって癌を治療する方法など、様々な癌治療経路を提案することができる。
【００２７】
また増殖を刺激するために正常な成熟樹状細胞を使用することによって、細胞傷害性組成物の増殖を達成することが都合が良い。
【００２８】
リンパ細胞は、他家血液又は自己血液から抽出した末梢血リンパ球であるのが最も好適である。
【００２９】
その好ましい実践的実施において、本発明は以下の手順を含む：
Ａ：末梢血リンパ球の単離、
単球からの成熟樹状細胞の生成、
Ｂ：ＣＤ４＋細胞の優先的増殖を導く成熟樹状細胞によるリンパ球の刺激、
癌／精巣抗原の発現の誘導を導く化学物質による活性化リンパ球の処理、及び
Ｃ：活性化及び処理リンパ球からのワクチンの調製
腫瘍の予防的治療又は直接治療としてのワクチンの使用、又は
Ｄ：活性化リンパ球及び処理リンパ球によるリンパ球の共培養による細胞傷害性リンパ球の生成、
フィーダー細胞としての樹状細胞の存在下での細胞傷害性リンパ球の増殖、
養子免疫療法による腫瘍の治療のための細胞傷害性リンパ球の使用。
【００３０】
本発明は、ヒトにおける癌の治療に関して記載されているが、本発明の手法は、非ヒト哺乳動物における腫瘍の治療のための物質を生成する獣医学にも適用可能である。
【００３１】
本発明は、上記の発見を発展する際、本発明者らが採用した方法を以下のように考慮することによってより十分に理解される。
【００３２】
本発明に記載される細胞ベースのワクチンと、抗腫瘍免疫を誘導するように設計された現行の他のワクチンとの主な違いは、本発明の手法が、合成にせよ又は腫瘍細胞から単離したものにせよ、如何なる腫瘍抗原調製物も用いないことである。この新規のワクチンにおいて、腫瘍抗原は、化学処理によって免疫系の抗原提示細胞を増殖する際、内因的に誘導される。このようにして、抗原の取り込み、交差提示の必要なく、腫瘍抗原特異的なＣＴＬの形成によって免疫応答が開始する。Ｔヘルパー応答の誘導による課題は、抗原提示細胞として、また抗原特異的なＣＤ８＋細胞を補助するように機能する活性化Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋リンパ球）を用いることによって解決される。このアプローチを使用して、ＣＤ４＋細胞を増殖する際に、広範の腫瘍関連癌／精巣抗原の発現を誘導することが可能であり、且つこれらの細胞は、広範な腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球の形成を刺激することが可能である。このように誘導される免疫ＣＴＬ細胞は、記憶細胞の特徴も幾つか有する。
【００３３】
本発明者らが取り組んだ最初の仕事は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が豊富な増殖リンパ球の培養液をどのように生成するかであった。抗原特異的なＴ−ヘルパー細胞を生成する最良の方法は、抗原が入っている成熟樹状細胞を用いることであることが既に知られている（Jonuleit et al., 2001、De Vries et al., 2003）。しかし、本発明者らは、抗原が入っていない成熟樹状細胞とリンパ球の非接着性分画とを混合し、７日〜８日のインキュベート後に、リンパ球が強く増殖したことを見出した。増殖培養液は主に、ＣＤ４＋リンパ球が豊富なＴリンパ球であった。
【００３４】
増殖リンパ球の培養液を生成する方法を発展し、本発明者らは、これらの培養液で癌／精巣抗原の発現を誘導させようとした。５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ）は、主に腫瘍細胞において癌／精巣抗原の発現を誘導するものとして知られている（非特許文献２３）。また、５−アザ−ＣｄＲが、ＰＨＡ活性化末梢血リンパ球におけるＣＴＡ、ＭＡＧＥ−Ａ１の少なくとも１つの発現を誘導し得ることは、既に１つのグループによって示されたが（非特許文献４）、別のグループ（非特許文献２３）では示されなかった。癌細胞に比べて正常細胞においてＣＴＡの発現を誘導することがはるかに困難であること（非特許文献４、非特許文献２３）、又はこれらの抗原が、正常細胞において５−アザ−ＣｄＲでは誘導できないこと（Karpf et al., 2004）が一般的に受け入れられている。それにもかかわらず、リンパ球の増殖及びそれらの処理の条件を最適化した後、本発明者らは、腫瘍で発現する最も一般的なものの１つとして選択された癌／精巣抗原、即ちＣＴＡ：ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−３−７、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＢＯＲＩＳの全てを誘導することができた。
【００３５】
進行性の癌細胞でのそれらの発現に類似した広範なＣＴＡの発現を得て、ＣＴＬ応答の誘導に関する実験を行った。全ての実験は、ＨＬＡ−Ａ２＋健常ドナー由来のリンパ球を使用して行い、この場合、抗腫瘍ＣＴＬ応答を検出するのにＨＬＡ−Ａ２陽性の腫瘍細胞を使用することが可能である。放射線処理又はマイトマイシンＣ処理をせずに刺激因子として、５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球を使用した。リンパ球自体の増殖能は実際には５−アザ−ＣｄＲ処理期間の終了時にはなくなっていた。単球の単離後に凍結させておいたリンパ球の非接着性分画を５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球と混合し、９日間インキュベートした。ＩＬ−２を２日目に添加した。この培養期間の終了時に、リンパ球が強く増殖した。増殖培養液のＦＡＣＳ解析によって、ＣＤ８＋リンパ球の割合が、ＣＤ４＋細胞の割合の２倍〜５倍超えていたこと、及びＣＤ８＋細胞の半分が、中枢記憶細胞のＣＤ６２Ｌマーカーを発現していたことが示された。
【００３６】
一次刺激後の細胞培養液では珍しくはないナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も有意数存在していた。したがって、生成されたＣＤ８＋  ＣＴＬのみの溶解活性を検出するために、ＣＤ８＋細胞を単離した。ＨＬＡ−Ａ２抗原に対して陽性及び陰性の両方である腫瘍細胞株のパネルを使用して、細胞傷害性活性の測定を行った。刺激サイクルの終了時における細胞の細胞傷害性活性は低かったが、２４時間ＩＬ−２の存在下で細胞をインキュベートした後に、有意に増大した。溶解はＨＬＡ−Ａ２制限を示し、ＣＴＬ媒介性の溶解を示し、ＮＫ媒介性の溶解を示さなかった。
【００３７】
したがって、本発明者らは、広範な抗腫瘍特異性及び記憶応答の特徴を有する細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導のために新規の抗原提示細胞組成物を開発したと結論付けることができる。この組成物は、癌患者の直接的なワクチン接種に、又は養子免疫療法のための細胞傷害性Ｔリンパ球のin vitro生成及び増殖のいずれかに用いることができる。
【００３８】
正常なリンパ細胞の化学処理には、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ）によるＤＮＡ脱メチル化が好ましい。ＤＮＡ脱メチル化に使用し得る他の試薬は、５−アザシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、及びシチジン類似体でもあるゼブラリンである。
ゼブラリンは、５−アザ−ＣｄＲと同様の効果を生じ得る（Chong et al., 2003）。非ヌクレオシド脱メチル化剤も幾つか存在するが、例えば腫瘍細胞においてＭＡＧＥ−１発現を誘発する際、それらの効果は、５−アザ−ＣｄＲのものより弱い（Chong et al., 2005）。
【００３９】
抗原を誘導する代替的な化学処理は、ヒストンデアセチラーゼインヒビターを使用することによって達成できるヒストンアセチル化である。最も一般的に使用され、最も良く研究されているのは、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）である。トリコスタチンＡは、癌／精巣抗原を含む幾つかのタンパク質の弱い発現を誘導することができるが、これらの抗原の範囲が５−アザ−ＣｄＲで発現されるものと完全に重なり得ない。一緒に用いる場合、これらの試薬は、付加的効果を超え得る「沈黙」遺伝子の強い発現を誘導することができる（Wlachnewski et al., 2006）。別のグループのヒストンデアセチラーゼインヒビターは、５−アザ−ＣｄＲと併用することもできる幾つかのデプシペプチドである（Weiser et al., 2001）。
【００４０】
本発明者らの実験研究は、この段階で正常なドナー由来の血液を必ず使用していた。患者への使用が承認される場合、本発明によって提供される治療では通常、癌患者由来の血液を使用する。しかし、本発明は、正常細胞で抗原を誘導することを伴うので、癌患者の治療のために正常ドナーからワクチンを生成する可能性が指摘される。この場合、ドナーのリンパ球に対するアロ抗原特異的な反応を低減するために、ドナー−レシピエントの組の非常に注意深い選択が必要となる。
【００４１】
また、実験研究は、リンパ球と同じ血液サンプルから得られる樹状細胞を使用している。同じヒト以外の樹状細胞を使用することはかなり都合が良いが、ドナーの樹状細胞の安全性試験という問題が生じる。さらに、腫瘍抗原に対する応答の他にアロ抗原応答を刺激し得るリンパ球によって、樹状細胞由来の微量のアロ抗原が得られる可能性があり、腫瘍特異的な応答の低減を導く場合がある。
【００４２】
本発明の臨床用途において、組成物は、所望又は必要に応じて従来のアジュバントを含んでいてもよい。例えば、抗原提示組成物は、ＩＬ−２の別々の注入と共に時々使用されることもあるが、より頻繁に細胞組成物として単独で使用される。細胞傷害性リンパ球組成物は、通常、ＩＬ−２等のアジュバントの注入と共に使用される。さらに、リンパ球枯渇（lymphodepletlon）を導く化学療法（シクロホスファミドとフルダラビンとの組合せ等）を行ってから、細胞傷害性リンパ球組成物を注入することも時々ある。注入のために、細胞は、通常、ヒト血清アルブミン又は自己血漿を補充したリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁する。送達調製物に関するさらなる情報は、例えば養子Ｔ細胞療法に関する総説（Gattinoni et al, 2006、Yee, 2005）に見ることができる。
【００４３】
ＩＬ−２等のインターロイキンを、リンパ球の増殖を高めるのに使用してもよい。これらは任意であり、異なるインターロイキンを使用することができる。例えば、ＩＬ−２の代わりに、ＩＬ−７やＩＬ−１５を使用することができる。単球からの樹状細胞の生成には通常、サイトカインの存在が必要であり、これにはＧＭ−ＣＳＦが最も好ましいが、他のものに置き換えることができる。
【００４４】
本発明の実施は、以下の実験的な実施例でさらに説明する。
【実施例１】
【００４５】
ＣＤ４＋細胞が豊富なリンパ球の増殖培養液の生成
化学処理（例えば、アザ−５−ＣｄＲ）によって抗原提示細胞におけるＣＴＡの発現を誘導するために、この培養物を増殖する必要がある。プロフェッショナル抗原提示細胞、樹状細胞は通常の条件下では増殖せず、したがって本発明者らは別の種類の抗原提示細胞を探し求めた。ＣＤ８＋  Ｔリンパ球の抗原特異的な活性化を刺激し得る抗原提示細胞が数種類存在する。特に、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を抗原提示細胞として用いることができることが示されている（Naota et al., 2006、Kennedy et al., 2005）。抗原提示細胞としてのＣＤ４＋細胞のさらなる利点は、これらが記憶ＣＤ８＋細胞の形成を刺激することができることである（Kennedy et al., 2005）。したがって、本発明者らは最初に、ＣＤ４＋が豊富なリンパ球の増殖培養液の調製を最適化することにした。下記の実施例では、末梢血から単離したリンパ球の培養液への成熟樹状細胞の添加を利用するのに成功した。
【００４６】
成熟樹状細胞を原法（Romani et al., 1994、Thurner et al., 1999b）に従い、修正して調製した。献血血液から取り出した軟膜成分を地方の血液バンクから得た。到着時に、軟膜をＣａ及びＭｇを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、製品番号ＢＥ１７−５１２Ｆ、Cambrex, Belgium）６０ｍｌの入ったフラスコに移し、そして、約３０ｍｌを５０ｍｌ試験管中でLymphoprep（製品番号１０５３９８０、AXIS-SHIELD PoC AS, Norway）１５ｍｌの上に層状に重ねた。２０℃、４６０ｇで３０分間の遠心分離の後、培養培地への添加物としてのさらなる使用、及び細胞の凍結のために希釈血漿（約４０％）を含有する上層を回収した。ヘパリン（最終で２５ＩＵ／ｍｌ）の添加後、血漿を１５００ｇで１５分間遠心分離し、使用するまで−８０℃で凍結させておいた。単核細胞を予め冷却させたＤＰＢＳ−ＥＤＴＡ（Cambrex）２５ｍｌ中のLymphoprep勾配の界面から回収し、予め冷却させたＤＰＢＳ−ＥＤＴＡで、最初に２５０ｇ、次に２００ｇ、それから１５０ｇでの遠心分離によって、４、５回、それぞれ４℃で１２分間洗浄した。最後の洗浄の後、細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地（Cambrex）中で再懸濁し、コールターカウンター、Ｚ２モデルを使用して計数した。細胞の対応するピークをゲーティングすることで、リンパ球及び単球の濃度を求めた。細胞懸濁液は、９０％の希釈血漿及び１０％のＤＭＳＯから成る凍結培地において約１０７個の単球と可変数のリンパ球をそれぞれ含有するアリコート中で凍結した。細胞懸濁液を−８０℃のフリーザボックス（Nalgen）に入れ、この温度で最大６〜９ヶ月保存した。全ての培養液は、凍結された単球細胞から定着させた。樹状細胞の生成を、実験前の少なくとも３０分間、ＲＰＭＩ  １６４０培地中で５％ヒト血清５ｍｌで予め処理したＴ２５組織培養フラスコにおいて行った。凍結した単球細胞の１つのアンプルを、ウォーターバス（３７℃）で解凍し、細胞懸濁液１ｍｌを、予め温めたＡＩＭ−Ｖ培地（Gibco, Invitrogen）１３ｍｌ中に直ちに希釈した。予め処理した培地をフラスコから取り出し、すぐに細胞懸濁液７ｍｌに置き換えた。３７℃で４５分のインキュベート後、非接着リンパ球を回収し、接着単球を予め温めたＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗い流した。０.５％の血漿を含むＡＩＭ−Ｖ培地５ｍｌを添加した後、フラスコを３７℃のＣＯ２インキュベータに入れた。回収した単球を遠心分離し、ＡＩＭ−Ｖ（７０％）、ヒト血清（２０％）及びＤＭＳＯ（１０％）から成る凍結培地中で再懸濁して、凍結させた。一晩インキュベートした後（１日目）、１００ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４（両方ともGentaur（Belgium）製）を細胞に添加した。３日目に、０.５％の血漿を含むＡＩＭ-Ｖ  １ｍｌを、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に添加した。４日目に、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）（全てGentaur製）及びＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）（Sigma）から成る成熟カクテルを添加した。５日目又は６日目に、実験のために非接着細胞を採取し、計数して、実験に使用するか、又はＡＩＭ−Ｖ（７０％）、ヒト血清（２０％）及びＤＭＳＯ（１０％���から成る凍結培地中の１０６個の細胞を有するアリコートで凍結した。
【００４７】
生成した樹状細胞の純度は９５％を超えていた。直接標識抗体、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ−ＦＩＴＣ及びＣＤ８６−ＰＥ（BD Biosciences, Denmark、カタログ番号５５５５１６及び５５５５５８）及びＣＤ３−ＦＩＴＣ（Beckman Coulter, Sweden、ｐｎ.ＩＭ１２８１）で染色することによって、樹状細胞の表現型決定を行った。推奨されるアイソタイプ対照を細胞の表現型決定に使用した。細胞サンプルを、ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター（Beckman Coulter）及びＣＸＰ解析ソフトウェア（Beckman Coulter）を使用して解析した。図１で示すように、共刺激分子ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩが高レベルに発現する細胞の割合によって定義された成熟度は９５％を超えていた。
【００４８】
増殖リンパ球培養液の調製のために、成熟樹状細胞が自己リンパ球の増殖を誘導するという既知の特性を利用した。リンパ球培地は、ＡＩＭ−Ｖ培地（Gibco, Invitrogen）及び５％の部分的に脱脂されたヒトＡＢ血清から成っていた。脱脂は、以下の手順で行った。−８０℃で保存したヒト血清を冷蔵庫中で一晩解凍し、混合することなく３０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離した。上清を底から３つの部分に分画化し、上記のように再び遠心分離した。底を起端とする画分を新たな試験管に分け、残りの浮遊液層を廃棄した。画分を２９５００×ｇ、４℃で１時間遠心分離した。液体を、不活性化タンパク質のペレット及び上部の脂質層が試験管中に残るように、シリンジで回収した。複合画分を、０.２μｍフィルターによる濾過によって滅菌し、アリコート中で−８０℃で冷凍保存した。樹状細胞及び非接着リンパ球を解凍、洗浄し、及びリンパ球培地で再懸濁し、そして１０４個の樹状細胞及び４〜８×１０４個のリンパ球を含有する細胞懸濁液０.１ｍｌをＵ底組織培養９６ウェルプレートのウェルに分注した。２日目及び５日目に、インターロイキン２（ＩＬ−２、最終濃度１５ＩＵ／ｍｌ）を含有するリンパ球培地０.０５ｍｌを各ウェルに添加した。７日目又は８日目に、リンパ球がおよそ１０６／ｍｌの濃度に達したら、細胞を採取し、癌／精巣抗原発現の誘導に関する実験に使用した（実施例２）。直接標識抗体、ＣＤ４−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（BD Biosciences, Denmark、５５５３４６、５５５６３５、５５５５１６及びBeckman Coulter, Sweden、ＩＭ１２８１）で染色することによって、細胞サンプルの表現型決定を行った。図２で示すように、フローサイトメトリ解析によって行われた細胞の表現型の特徴付けによって、元の培養液に比べてＣＤ４＋細胞の割合の増大が示された。
【実施例２】
【００４９】
増殖リンパ球における癌／精巣抗原の発現の誘導
反応速度及びアザ−５−ＣｄＲ濃度依存性に関する予備実験において、リンパ球培養液におけるＣＴＡの発現の誘導が観察された。最も容易に誘導可能なのは、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ４及びＭＡＧＥ−Ａ１２であった（図示せず）。誘導条件を標準化するために、細胞の対数増殖期に取り込んだリンパ球（通常７日又は８日、細胞濃度が約１０６／ｍｌであったとき）におけるＣＴＡの誘導を、「安定期」に取り込んだリンパ球（９日又は１０日、リンパ球濃度が２×１０６／ｍｌを超えるとき）と比較した。自己成熟樹状細胞の存在下での末梢血から増殖するリンパ球集団を回収し、洗浄して、１０μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（Sigma）と１５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２とを含有するリンパ球培養培地で０.５×１０６／ｍｌで再懸濁し、１つのウェル当たり２ｍｌで２４ウェル組織培養プレートのウェルに入れた。細胞を３日間インキュベートした後、これらを採取し計数した。幾つかの細胞を自己リンパ球と共に培養液中で使用し（実施例３）、他の細胞を非接着リンパ球に関して実施例１で記載したように、アリコートで凍結した。約２×１０６個の細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＲＴ−ＰＣＲ解析のためにペレットとして凍結した。
【００５０】
個々の抗原の発現を、これらのタンパク質をコードするＲＮＡの発現を同定するＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて検出した。２×１０６個の細胞を遠沈して、上清を廃棄し、ペレットを細胞溶解溶液（Purescript（登録商標）ＲＮＡ単離キット、Gentra Systems, Minneapois, MN）０.３ｍｌ中で可溶化した。総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って単離し、溶解溶液を覆って、２体積の１００％イソプロパノールを添加することによって析出させ、７０％エタノールで洗浄し、ＲＮＡアーゼ無含有蒸留水１０μｌ中で再び水和した。単離ＲＮＡを、ＤＮＡフリー（商標）キット（Ambion, Austin, TX）の試薬を使用して、ＤＮＡアーゼで処理した。１０×ＤＮＡアーゼバッファー１μｌ及びＤＮＡアーゼ１μｌ（２単位）をサンプルに添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、そしてＤＮＡアーゼ不活性化試薬２μｌを添加することによって反応を終わらせた。製造業者のプロトコルに従って、総量２０μｌで、ランダム六量体、オリゴ（ｄＴ）プライマー、SuperScript III ＲＮＡアーゼＨリバース転写酵素キット（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）及びＲＮＡ  １０μｌを使用してｃＤＮＡを合成した。５０℃で６０分、その後７０℃で１５分逆転写（ＲＴ）を行った。合成されたｃＤＮＡを、ＲＮＡアーゼ無含有蒸留水中で等量の１０％ＤＭＳＯを添加して２倍に希釈した。ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、及びＭＡＧＥ−Ａ１２の発現プロファイル、並びにＲＮＡの反応能及び完全性に関する陽性対照としてグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を、先に記載したフォワード（センス）プライマー及びリバース（アンチセンス）プライマー（De Plaen et al, 1994、thor Straten et al, 1997）を使用してＰＣＲによって検出した。５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、０.２ｍＭのクレゾール、１２％スクロース、０.５％  ＤＭＳＯ、０.０５％  ＢＳＡ（ｐＨ８.６／２５℃）、１０ｐｍｏｌの各プライマーを含有する培地中のＰＣＲ増幅において、２０倍希釈のｃＤＮＡを使用し、「ホットスタート」での第１のサイクル中、１.２５ＵのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, CA）及び５０μＭの最終濃度の各ｄＮＴＰを総量３０μｌ添加した。ＭＡＧＥ及びＧＡＰＤＨの増殖に使用するパラメータは、初期変性９５℃で２分；第１のサイクル９５℃で３０秒、「ホットスタート」での８０℃で１分〜３分、６０℃で３０秒、及び７２℃で４０秒；その後２７〜３６サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で１分）；及び最後の増殖７２℃で１０分であった。ＮＹ−ＥＳＯ−１の検出のために、遺伝子構造中のＢＬＥ７３とＢＬＥ７１との間の特異的な断片２７２ｂｐを増幅し（Lethe et al., 1998）、そしてＧＡＧＥ３−７を特異的断片ＶＶ１−ＶＤＥ２４、２４４ｂｐの増幅によって検出した（De Backer et al., 1999）。「ホットスタート」後のＮＹ−ＥＳＯ−１及びＧＡＧＥ３−７に関する反応パラメータは、ＭＡＧＥ抗原と同じ培地中で９５℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分の３２〜３６サイクルであった。ヒトＢＯＲＩＳ中の特異的断片１０７４ｂｐの増幅のために、Vatolin et al., 2005で選択されたプライマーを使用した。培地及び第１のサイクルは、反応中、２ＵのＴａｑポリメラーゼと１５０μＭのｄＮＴＰ、「ホットスタート」後の４０〜４５サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分）、最終増殖７２℃で１５分である以外は、上記と同じであった。全ての反応をサーモサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Applied Biosystems）で行った。陰性対照は、ｃＤＮＡの代わりにアリコートの水を含有しており、またＮＹ−ＥＳＯ−１の検出に関する幾つかの実験では（ＲＴなし）反応を行い、ここで、ｃＤＮＡに由来しないバンドを排除するために、ＤＮＡアーゼ処理の後ではあるが、逆転写工程前のＲＮＡサンプルをｃＤＮＡの代わりに使用した。ＰＣＲ産物を、最も強いバンドとして１００ｂｐ及び８００ｂｐを示す１００ｂｐラダー（Amersham Pharmacia Biotech）と共に１００Ｖで２％アガロースゲルによる電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで染色して、ＵＶ照射下で視覚化し、画像記録システムで記録した。
【００５１】
図３及び図４は、５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球におけるＣＴＡ発現の誘導に関するデータを示す。また比較として、以下の実施例３で使用する腫瘍細胞株における癌抗原の発現も示している。この実験では、２つの増殖リンパ球培養液の５−アザ−ＣｄＲ処理を比較する：１つは対数増殖期に採取し（８日目）、もう１つは細胞密度が高いために増殖が停止した「安定期」に採取した（１０日目）。認められるように、希釈及び５−アザ−ＣｄＲによる処理の後、全ての研究抗原が、誘導されたリンパ球に存在し、「安定期」に採取した細胞よりも対数増殖期に採取した培養液での発現が高かった。このことは、ＣＴＡ発現の最も高い誘導を得るために、細胞を対数増殖期中に採取する必要があり、速い増殖速度が、ＣＴＡ発現の誘導に重要であることを示している。このようなリンパ球で得られたＣＴＡ発現プロファイルは、全ての試験抗原をカバーし、さらに幾つかの腫瘍細胞のプロファイルよりも広範でさえある。
【００５２】
また、タンパク質レベルでの或る群の癌／精巣抗原、即ちＭＡＧＥ−Ａ抗原の５−アザ−ＣｄＲ処理細胞における発現を、細胞ベースのＥＬＩＳＡで確認した。ｇｐ１００の定量化に関して記載した元々の手法（Erdile et al, 2001）を修正した。全ての細胞を、カルシウム及びマグネシウムを含有するＤＰＢＳ中で２回洗浄し、計数後、２倍に滴定して、それぞれの希釈液を４つのウェル（総結合に関して２つ、及びＡＢの非特異的な結合に関して２つ）に入れた。細胞を、元々の手法と同じように１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、乾燥して、透過させて、そしてメタノールで固定した。遮断のために、０.０５％アジ化ナトリウムを含有する脱脂ＨＳを、カルシウム及びマグネシウムを含有するＤＰＢＳで１０％に希釈した後に、使用した。一晩４℃で遮断した後、ウェルを３７℃で１時間、それから室温で１時間、抗ＭＡＧＥ又はアイソタイプ適合対照抗体のいずれかとインキュベートした。抗ＭＡＧＥ抗体として、ＭＡＧＥ−Ａ１０以外の上述のＭＡＧＥ抗原全てを検出する、広範のＭＡＧＥ特異的５７Ｂクローン（Dr. Spagnoli, Switzerlandが快く提供）のハイブリドーマ上清を使用した（Rimoldi et al., 2000）。これを、カルシウム及びマグネシウムを含有する５％  ＨＳ／アジド−ＤＰＢＳ中で１０倍に希釈し、ＩｇＧが等濃度の対照アイソタイプ適合Ａｂを対照ウェルに加えた。次に、ウェルをビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１.５時間、その後ストレプトアビジン−ＨＲＰと室温で３０分インキュベートした（両方とも「Dako」製であり、それぞれ１％  ＢＳＡ−ＤＰＢＳで５００倍及び１０００倍に希釈した）。ウェルを、工程の間に０.０５％  Ｔｗｅｅｎ−ＤＰＢＳで洗浄した。高感度のＴＭＢ液体基質（Sigma）１００μｌをＨＲＰの酵素反応に使用し、そして等容量の１Ｎ  ＨＣＬを添加することによって反応を終わらせた。可溶性産物の吸光を、５５０ｎｍの参照フィルターによって、４５０ｎｍで測定した。総結合と非特異的結合とに関する読み取りの差を、１つのウェル当たりの細胞数に応じた特定の光学密度（ＯＤ）としてプロットした。
【００５３】
細胞株のそれぞれのサンプルにおける総タンパク量によるＭＡＧＥタンパク質発現の正規化のために、タンパク質を、製造業者によって推奨される手法に従って、標準としてビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, Illinois）及びＢＳＡを使用し、ＤＰＢＳ洗浄細胞のアリコート中、０.２５％ Triton X-100の存在下で測定した。
【００５４】
図５は、非処理リンパ球及び５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球、並びに乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＭＡＧＥ−Ａ発現の細胞ベースのＥＬＩＳＡ解析の結果を示している。認められるように、ＭＡＧＥタンパク質の発現は通常のリンパ球では検出されないが、５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球では有意量のタンパク質を発現し、このことはＲＮＡだけでなくタンパク質レベルでのＭＡＧＥ抗原発現の誘導を示している。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球に関する曲線の比較分析によって、１つの細胞当たりのＭＡＧＥタンパク質の絶対数が、リンパ球よりも腫瘍細胞において約４０倍高いことが示される。他方で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、有意に大きく、リンパ球では１０７個当たりタンパク質が０.８１ｍｇであるのに比べて、細胞では１０７個当たり３.６１ｍｇの総タンパク質を含有している（上記のようにＢＣＡ法によって測定）。このように、進行性のＭＡＧＥ発現が高い腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図３）と５−アザ−ＣｄＲ処理リンパ球との間の総細胞タンパク質中のＭＡＧＥの割合は、１０倍未満しか異なっていない。この量のＭＡＧＥタンパク質が細胞内（サイトゾル内）に、及び既に抗原提示細胞内に局在し、これにより取り込み工程及び交差提示工程の効率が低くなるのを避け、このことが腫瘍抗原特異的なＣＴＬ応答の刺激には必須であることが示唆されることは注目に値する。
【実施例３】
【００５５】
５−アザ−ＣｄＲ処理したＣＤ４が豊富な増殖自己リンパ球に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答の誘導
これらのリンパ球を、５−アザ−ＣｄＲ処理後の正常なリンパ球におけるＣＴＡの誘導後に、in vitroでの腫瘍特異的な免疫応答の発生のために利用した。５−アザ−ＣｄＲ処理培養液を採取し、計数して、リンパ球培地０.１ｍｌ中で２０〜４０×１０３個の解凍非接着自己リンパ球と共に、１つのウェル当たり２０×１０３個で９６ウェルプレートに播種した。２日のインキュベート後、７５ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補充したリンパ球培地０.０５ｍｌをそれぞれのウェルに添加した。リンパ球培地０.０５ｍｌの単独添加を５日目及び７日目に繰り返した。９日目に、培養液を採取し、計数して、免疫応答解析に使用した。直接標識抗体、ＣＤ４−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ及びＣＤ６２Ｌ−フィコエリトリン−シアニド５（ＰＣ５）（BD Biosciences, Denmark、５５５３４６、５５５６３５、５５５５１６、Beckman Coulter, Sweden、ＩＭ１２８１、ＩＭ２６５５）で染色することによって、細胞の表現型決定を行った。推奨されるアイソタイプ対照を細胞の表現型決定に使用した。細胞サンプルを、ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメータ（Beckman Coulter）及びＣＸＰ解析ソフトウェア（Beckman Coulter）を使用して解析した。このような培養液の１つの解析結果を図７で示す。認められるように、ＣＤ４＋細胞に比べたＣＤ８＋細胞の相対的割合が刺激の結果として有意に増大し、このことは、これらの刺激条件がＣＤ８＋細胞の生成を促進することを示している。特筆すべきは、生成されたＣＤ８＋細胞の有意な部分が、中枢記憶細胞のマーカーであるＣＤ６２Ｌを発現することである（Sallusto et al., 2004）。他方では、中でもＣＤ５６＋  ＮＫ細胞で二重陰性細胞が有意数存在していた。したがって、生成されたＣＤ８＋細胞のみの細胞傷害性の活性を試験するために、ＣＤ８のＴ細胞精製に関するMiltenyi Biotec, Germanyの標準的手法を使用して、これらの細胞を単離した。細胞を、０.５％胎児ウシ血清（Cambrex、ＤＥ１４−８０１Ｆ）を含有する冷ＤＰＢＳバッファー（Cambrex, Denmark、ＢＥ０２−０１７Ｆ）を細胞懸濁液に添加することによって２回洗浄した。バッファーを取り除いた後、細胞を、ＣＤ８マイクロビーズ（Miltenyi Biotec、１３０−０４５−２０１）で磁気標識した。
【００５６】
細胞懸濁液を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に置いたカラム上に充填した。磁気標識したＣＤ８陽性細胞をカラム上に保持した。非標識細胞を流し、ＣＤ８陽性細胞のこの細胞画分を失くす。磁場からのカラムの除去後、磁気的に保持されたＣＤ８陽性細胞を陽性として選択した画分として溶離した。
【００５７】
図７は、陽性として単離した細胞の表現型を示し、単離ＣＤ８＋細胞の純度が９０％を超えることを示している。単離後、リンパ球を激しく洗浄し、２５ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補充した培養培地で再懸濁して、２４ウェルプレートに入れた。一晩インキュベートした後、リンパ球を採取し、１回洗浄して、１×１０６／ｍlで再懸濁して、そして前立腺癌細胞株及び乳癌細胞株のパネルに添加した。以下の腫瘍細胞株を使用した：前立腺癌細胞株：ＬＮＣａＰ（ＨＬＡ−Ａ２＋）及びＰＣ３（ＨＬＡ−Ａ２−）；乳癌細胞株：ＭＣＦ−７（ＨＬＡ−Ａ２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＬＡ−Ａ２＋）及びＴ４７Ｄ（ＨＬＡ−Ａ２−）。２５×１０３個の腫瘍細胞を、１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌの４８ウェルプレート中に播種し、試験前に２日間インキュベートした。リンパ球の添加前に、培養上清０.５ｍｌを除去し、０.２５×１０６個の細胞を含有する単離リンパ球の懸濁液０.２５ｍｌを腫瘍細胞に添加した。細胞を１８〜２０時間共に培養した。
【００５８】
培養上清中のＩＦＮ−γの産生の検出、及び腫瘍細胞の消失の顕微鏡観察によって、単離リンパ球の細胞傷害性の活性を求めた。ＩＮＦ−γを求めるために、培養上清０.３５ｍｌを回収し、解析するまで凍結しておいた（−２０℃）。培養上清中のＩＦＮ−γの濃度を、捕捉Ａｂ、標準的なビオチン化検出Ａｂ、及びＨＲＰ−ストレプトアビジンを含む「Ready-Set-Go」キット（eBioscience, San Diego, Ca, USA）を使用したサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定した。本質的に製造業者の推奨に従って、以下の修正を加えた手法で行った：（１）捕捉抗体をNunc Maxisorp 96ウェルプレートに一晩結合し、プレートを洗浄した後、遮断工程を室温で少なくとも３時間まで延長した；（２）５００ｐｇ／ｍｌ又は１０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γのいずれかから開始した、標準の７段階希釈によって、検量線を作成し、そして三重の標準及びサンプルを室温で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートした。次の工程は、製造業者のプロトコルに従って行った。同じキット由来のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液をＨＲＰの酵素反応に使用し、反応を終わらせた後、４５０ｎｍと５５０ｎｍでの読み取りの差として波長補正して光学密度を測定した。
【００５９】
図８は、様々な腫瘍細胞との一晩のインキュベートの後のリンパ球によるＩＦＮ−γの放出を示している。ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞株ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１の存在下での放出は、ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞株ＰＣ３及びＴ４７Ｄの存在下での放出よりも高いことをはっきりと示している。
【００６０】
混合培養液の顕微鏡観察をデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡を使用して行った。ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の数の有意の低減が、一晩の免疫リンパ球との接触後に、観察された（図９）が、ＭＣＦ−７細胞の消失には２、３日のインキュベートが必要である（図示せず）。
【００６１】
図８で見られるＨＬＡ−Ａ２陰性細胞株とのインキュベート後のＩＦＮ−γの幾らかの放出は、ＣＤ８＋が豊富なリンパ球集団に依然として存在するＣＤ５６＋ＮＫ細胞によって媒介され得る（図７を参照されたい）。患者組織（organism）でのさらなる進行を模倣するために、一例として、リンパ球を腫瘍細胞との接触後に回収し、樹状細胞及びＩＬ−２の存在下で増殖した。３週間の増殖後、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞株に対する高細胞傷害性を示すこのような培養液の１つは、ＨＬＡ−Ａ２が制限される方法でのみＩＦＮ−γを産生した（図１０参照；この実験において、腫瘍細胞の入ったそれぞれのウェルにわずか０.０６２×１０６個のリンパ球を添加したことに留意されたい）。これらのデータは、５−アザ−ＣｄＲ処理されたＣＤ４が豊富なリンパ球によって誘導された腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍細胞との接触の結果としては損傷しないことを示している。これに対して、ＣＤ８＋免疫応答の記憶表現型を反映する、腫瘍特異的な細胞傷害性リンパ球の濃縮を導くこれらのリンパ球の選択的増殖が存在する。この解釈は、活性化ＣＤ８＋細胞の半分で中枢記憶マーカーＣＤ６２Ｌの存在を実証する実施例２における図６に従っており、このアプローチを養子免疫療法に使用することができることを示している。
【実施例４】
【００６２】
養子免疫療法のための細胞傷害性リンパ球産生のスケールアップ
養子免疫療法のためのex vivoで生成した腫瘍特異的な細胞傷害性リンパ球の使用には、大量のエフェクター細胞を安全に産生することができる培養系の確立が必要である。実施例３で記載した手法は、プロセス全体が非常に面倒を強いられ、且つ汚染の危険性が高い９６ウェルプレート及び２４ウェルプレートを利用する。この実施例では、２種類の大きい組織培養フラスコを利用する：樹状細胞の生成用の標準的なＴ２２５組織培養フラスコ（Nunc）、並びにリンパ球の活性化と増殖のための２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコ（Corning、カタログ番号４３１３４６）。
【００６３】
２３５ｃｍ２の拡大された面積のフラスコを使用するという考えは、一般的にリンパ球の増殖は、それらを密接に接触させると、良好になるという観察に基づいている。例えば、リンパ球は２４ウェル平底プレート又はＴ２２５組織培養フラスコよりもＵ底９６ウェルプレートではるかに良好に増殖する。このような密接な細胞結合の形成を支持し得る組織培養フラスコを探し求めて、本発明者らは、底が多くのＶ字型の溝で構成される２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコを見つけた。最初の実験で、本発明者らは、９６ウェルプレートと２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコとにおける活性化リンパ球の増殖を比較した。この結果によって、リンパ球が９６ウェルＵ底プレートと同じ効率で２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコで増殖できることが実証された。
【００６４】
プロセス全体をこれらの組織培養フラスコに適合する。このプロセスは、単離された末梢血単核細胞を利用し、５つの工程から成る：１）単球からの成熟樹状細胞の生成、２）ＣＤ４＋細胞の選択的増殖を導く成熟樹状細胞によるリンパ球の刺激、３）癌／精巣抗原の発現の誘導を導く脱メチル化剤による活性化リンパ球の処理、４）活性化リンパ球及び処理リンパ球によるリンパ球の共培養による細胞傷害性リンパ球の生成、及び５）フィーダー細胞としての自己樹状細胞の存在下での細胞傷害性リンパ球の増殖。
【００６５】
成熟樹状細胞の生成
実施例１で記載のように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離を行った。単離された細胞は凍結せずに、すぐに実験に使用した。５０００万個の単球を含有する細胞懸濁液を、５％のヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で４５分間前処理したＴ２２５組織培養フラスコ中でインキュベートした。非接着リンパ球を回収した後、接着単球を１回洗浄し、２％のヒトＡＢ血清を補充したＡＩＭ−Ｖ培地４０ｍｌをそれぞれのフラスコに加えた。回収したリンパ球を、７０％のＡＩＭ−Ｖ培地、２０％のヒトＡＢ血清及び１０％のＤＭＳＯから成る培地中で凍結した。一晩インキュベートした後及び２日後、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を添加した。４日目に、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）及びプロスタグランジンＥ２（０.１μｇ／ｍｌ）から成る成熟混合物をフラスコに加えた。２日後に、非接着細胞を採取し、それらの一部をリンパ球の活性化の迅速な開始に使用し、残りを増殖工程でのさらなる使用のために凍結した。
【００６６】
成熟樹状細胞によるリンパ球の刺激
培養の開始時に凍結した非接着リンパ球を解凍し、計数して、４０×１０６個の細胞を４×１０６個の樹状細胞と混合した。遠心分離後、この混合物を５％のヒトＡＢ血清を補充したＡＩＭ−Ｖ培地から成るリンパ球培養培地４０ｍｌ中に懸濁し、２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコに入れ、８日間培養した。２日目及び５日目に、インターロイキン２を補充した新鮮な培地（最終濃度１５Ｕ／ｍｌ）２０ｍｌをフラスコに加えた。
【００６７】
癌／精巣抗原の発現の誘導
８日目に、活性化リンパ球を採取し、計数して、２０×１０６個の細胞を遠心分離し、１０μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ）を補充したリンパ球培養培地４０ｍｌ中に懸濁して、２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコに入れた。３日後に、細胞を採取し、計数して、細胞傷害性リンパ球の生成のための刺激因子として使用した。
【００６８】
細胞傷害性リンパ球の生成
培養の開始時に凍結した非接着リンパ球を解凍し、計数して、２０×１０６個の細胞を２０×１０６個の５−アザ−ＣｄＲ処理細胞と混合した。
遠心分離後、この混合物を、５％のヒトＡＢ血清を補充したＡＩＭ−Ｖ培地から成るリンパ球培養培地４０ｍｌ中に懸濁し、２３５ｃｍ２の拡大表面フラスコに入れ、１１日間培養した。２日目、５日目及び８日目に、インターロイキン２で補充した新鮮な培地（最終濃度２５Ｕ／ｍｌ）２０ｍｌをフラスコに加えた。
【００６９】
細胞傷害性リンパ球の増殖
現在、活性化リンパ球の増殖に様々なプロトコルが利用されており、これらの多くはフィーダー細胞を利用している。フィーダー細胞の増殖を防ぐために、これらの細胞に放射線を照射する。これは、手法全体に面倒を強い、そして突然変異した変異体の副産物の危険性が出てくる。これらの問題を避けるために、成熟樹状細胞は増殖しないので、本発明者らは、フィーダー細胞として樹状細胞を使用することを決めた。また、自己樹状細胞は、活性化リンパ球の増殖を支持することができることが示されている（Langhoff and Steinman, 1989）。したがって、本発明者らは、反応６日目に生成し、細胞傷害性リンパ球の増殖を刺激するためにアリコートで凍結した樹状細胞を使用した。無傷リンパ球と５−アザ−ＣｄＲ処理された活性化リンパ球とのコインキュベーションの１１日目に、培養培地６０ｍｌを回収し、培養培地４０ｍｌ中で懸濁した４×１０６個の解凍樹状細胞を培養液に添加した。１３日目及び１５日目に、新鮮な培養培地４０ｍｌ及びＩＬ−２を添加しながら、培養液を１：１に分けた。１７日目又は１８日目に、培養液を回収し、フローサイトメトリ解析によって特徴付けた。
【００７０】
本発明者らは、６人のドナーの血液から単離したリンパ球から、この方法により細胞傷害性リンパ球の調製を行った（表１）。フローサイトメトリ法による生成したリンパ球の細胞表現型の特徴付けは、このリンパ球が、実施例３で示したものと同様の表現型を有することを示している。３つの主な集団が存在していた：ＣＤ８＋リンパ球、ＣＤ４＋リンパ球及びＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞。ＣＤ８＋細胞集団が通常優勢で、１７％〜５７％（平均４０.８％）の範囲である。一方、ＣＤ４＋細胞の割合は、これらの割合が３０％近くあった１人のドナーを除いて、２％〜１５％の範囲である。ＮＫ細胞の割合は３〜５４％（平均２５.５％）の範囲である。反応開始から３５日後に生成した総細胞数は、３×１０８〜７×１０８個の範囲であった。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
要約すると、記載の手法によって、安全で且つ比較的面倒なことがない方法で全反応を行うことを可能にする組織培養フラスコだけを用いて、多くの細胞傷害性リンパ球を生成することができる。
【００７３】
この手法は、ＧＭＰ条件下で腫瘍特異的な細胞傷害性リンパ球の産生に容易に適合することができる。
【００７４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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