(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性より少なくとも１０倍大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有するモノクローナル抗体であって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸残基２４〜３９、５５〜６１及び９４〜１０２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９７〜１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸残基２４〜３９、５５〜６１及び９４〜１０２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５及び９８〜１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸残基２４〜３９、５５〜６１及び９４〜１０２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２及び９５〜１０３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｅ）配列番号１９のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸残基２４〜３９、５５〜６１及び９４〜１０２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｆ）配列番号２３のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸残基２４〜３９、５５〜６１及び９４〜１０２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｇ）配列番号２７のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５及び９８〜１０１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸残基２４〜３９、５５〜６１及び９４〜１０２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｈ）配列番号３１のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２及び９５〜１０３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３６のアミノ酸残基２４〜４０、５６〜６２及び９５〜１０３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、及び
（ｊ）配列番号３８のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６６、９８〜１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８５１によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体３Ｂ１０の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体
からなる群から選択される、抗体。
【請求項２】
抗体がヒト化されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒト定常領域を含む請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトグリコシル化パターンを有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２４１によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（５Ｆ７）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２３９によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（１０Ｆ１１）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２４０によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（７Ｃ６）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２４２によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（４Ｂ７）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０８によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（２Ｆ２）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０９によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（６Ａ２）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０５によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（４Ｄ１０）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０９によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（７Ｅ５）；
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８１０によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（１０Ｃ１）；および
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８５１によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（３Ｂ１０）、
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｇ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｈ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、及び
（ｊ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８５１によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（３Ｂ１０）の軽鎖可変領域とを含む抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合部分。
【請求項８】
抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片又は一本鎖Ｆｖ断片である、請求項７に記載の抗原結合部分。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体のアミノ酸配列又は請求項７又は８に記載の抗原結合部分のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
抗体の作製に適した条件下で、請求項１１に記載の宿主細胞を培地中において培養することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、又は、請求項７若しくは８に記載の抗原結合部分の作成方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって取得可能な請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、又は、請求項７若しくは８に記載の抗原結合部分。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、又は、請求項７若しくは８に記載の抗原結合部分と、医薬的に許容される担体とを含む、アミロイドーシスを治療、予防又は診断するための医薬組成物。
【請求項１５】
アミロイドーシスが、アルツハイマー病またはダウン症候群である請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ａβグロブロマー抗体、その抗原結合部分、前記抗体を産生するハイブリドーマ、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、前記抗体を作製する方法、前記抗体を含む組成物、前記抗体の治療的及び診断的使用並びにアルツハイマー病及び他のアミロイドーシスに関連する対応する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９０７年に、医師Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒが、後にその名誉を称えて彼の名が付けられた認知症の一形態の神経病理学的な特徴を最初に記載した（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ１９０７）。アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者に最も頻繁に見られる認知症の原因であり、６５歳を超える集団の約１０％に発生する。年齢が上昇するとともに、疾病の確率も上昇する。全世界で、約１，５００万人が罹患しており、平均寿命のさらなる増加が、今後１０年にわたって、罹患者の数を約３倍まで増加させると予測されている。
【０００３】
分子的な観点から、アルツハイマー病（ＡＤ）は、異常に凝集されたタンパク質の沈着によって特徴付けられる。細胞外アミロイドプラークの場合には、これらの沈着の多くは、アミロイド−β−ペプチド繊維からなり、τタンパク質の細胞内神経線維のもつれ（ＮＦＴ）の場合には。アミロイドβ（Ａβ）ペプチドは、タンパク質分解切断によって、β−アミロイド前駆体タンパク質から生じる。この切断は、α、β及びγ−セクレターゼと名付けられた幾つかのプロテアーゼの協働的活性によって行われる。切断は、異なる長さの多数の特異的断片をもたらす。アミロイドプラークの多くは、４０又は４２アミノ酸の長さを有するペプチド（Ａβ４０、Ａβ４２）からなる。主要な切断産物はＡβ４０であるが、Ａβ４２は、ずっと強い毒性効果を有する。
【０００４】
アルツハイマー病で観察されるものと極めて類似する脳アミロイド沈着及び認知障害は、８００の出生に約１件の頻度で発症するダウン症候群（トリソミー２１）の特徴でもある。
【０００５】
Ｈａｒｄｙ及びＨｉｇｇｉｎｓのアミロイドカスケード仮説は、Ａβ（１−４２）の増加した産生が、Ａβプラークの主成分である前フィブリル及びフィブリルの形成をもたらし、これらのフィブリルがアルツハイマー病の症候の原因であると仮定した。認知症の重度及び沈着したＡβプラークの負荷との間の相関が乏しいにも関わらず、この仮説は、最近まで支持されてきた。プラークの負荷より、ＡＤの症候との相関が優れている、ＡＤ脳内における可溶性Ａβ形態の発見は、修正されたアミロイドカスケード仮説をもたらした。
【０００６】
Ａβペプチドでの能動免疫は、形成の減少及び既存のプラークの部分的な溶解を引き起こす。同時に、Ａβペプチドでの能動免疫は、ＡＰＰトランスジェニックマウスモデルにおいて認知障害の緩和をもたらす。
【０００７】
Ａβペプチドに対して誘導された抗体を用いた受動免疫の場合には、Ａβプラークの負荷の減少も認められた。
【０００８】
ＡＮ−１７９２（凝集の繊維性状態のＡβ（１−４２）ペプチド）での能動免疫の第ＩＩａ相試験の結果（ＥＬＡＮ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｌｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ  ａｎｄ  Ｄｕｂｌｉｎ，ＵＫ）は、Ａβペプチドに対して誘導された免疫療法が奏功することを示唆している。３０人の患者の亜群において、疾病の進行は、ＭＭＳＥ及びＤＡＤ指標によって測定された陽性抗Ａβ抗体力価を有する患者で著しく減少していた。しかしながら、髄膜脳炎の形態の重い副作用のために、本研究は停止された（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，２００５，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４，１０−１２）。
【０００９】
髄膜脳炎は、神経炎症及び脳内へのＴ細胞の浸潤によって特徴付けられた。おそらく、これは、抗原としてＡβ（１−４２）を注射することによって誘導されたＴ細胞免疫応答によるものであった。このような免疫応答は、受動免疫後には予想されない。現在まで、これに関して入手できる臨床データは存在しない。しかしながら、５ヶ月にわたって週に１回、Ａβ（１−４２）のＮ末端エピトープに対して誘導された抗体を与えた極めて老齢のＡＰＰ２３マウスでの前臨床研究のために、免疫化のためのこのような受動的アプローチに関して、副作用特性についての懸念が表明された。これらのマウスは、生理的食塩水で処理された対照動物に比べて、微小出血の数及び重度の増大を示した（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９８，１３７９）。極めて老齢の（＞２４月齢）Ｔｇ２５７６及びＰＤＡＰＰマウスにおいても、同様の微小出血の増加が記載された（Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５，６２９−６３６；Ｗｉｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１（１）：２４；Ｄｅ  Ｍａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ２５（Ｓ２）：５７７）。マウスの両系統において、抗体注射は、微小出血の著しい増加をもたらした。これに対して、Ａβ（１−４２）ペプチドの中央領域に対して誘導された抗体は、微小出血を誘導した（ｄｅ  Ｍａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。ＣＡＡの形態の凝集したＡβペプチドに結合しない抗体処理には、微小出血の誘導の欠如が伴った（Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５，６２９−６３６）。しかし、ＡＰＰが遺伝子導入されたマウス中に微小出血をもたらす正確な機序は、理解されていない。おそらく、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）は、脳出血を誘導し、又は少なくとも悪化させる。ＣＡＡは、ほぼ全てのアルツハイマー病の脳内に存在し、症例の約２０％は、「重度ＣＡＡ」と認められる。従って、受動免疫は、Ａβペプチドの中央又はカルボキシ末端領域を認識する抗体を選択することによって微小出血を回避することを目指すべきである。
【００１０】
ＷＯ２００４／０６７５６１は、安定なＡβ（１−４２）オリゴマー（Ａβ（１−４２）グロブロマー）及び該グロブロマーに対して特異的に誘導された抗体を記載している。非特異的なプロテアーゼによる消化は、Ａβグロブロマーは、球状のコア構造から突出する親水性Ｎ末端から開始して消化され得ることを示す（Ｂａｒｇｈｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９５，８３４−８４７）。このようなＮ末端切断されたＡβグロブロマー（Ａβ（１２−４２）及びＡβ（２０−４２）グロブロマー）は、このオリゴマーＡβの基本構造単位に相当する。これらは、ウサギ及びマウスの能動免疫のための極めて強力な抗原であり、高い抗体力価をもたらす（ＷＯ２００４／０６７５６１）。Ｎ末端切断されたＡβ形態のインビボでの推定される病理的な役割が、ＡＤ脳内におけるそれらの存在についての幾つかの最近の報告によって示唆されている（Ｓｅｒｇｅａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，８５，１５８１−１５９１  ；Ｔｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，５８，２１０−２１６）。インビボ消化の間に、脳内に見出されるある種のプロテアーゼ、例えば、ネプリリシン（ＮＥＰ２４．１１）又はインシュリン分解酵素（ＩＤＥ）が関与し得る（Ｓｅｌｋｏｅ，２００１，Ｎｅｕｒｏｎ，３２，１７７−１８０）。
【発明の開示】
【００１１】
免疫療法における患者の認知能力を向上させ、同時に、脳内のＡβペプチドの全体量の僅かな一部のみと反応するＡβグロブロマーに対して誘導された抗体を提供することが本発明の目的であった。これは、脳のＡβバランスの大幅な妨害を抑制し、より少ない副作用をもたらすと予想される。（例えば、治療的に問題のある脳容積の低下が、凝集の繊維性状態におけるＡβペプチドでの能動免疫の研究において観察されている（ＡＮ１７９２を用いたＥＬＡＮ試験）。さらに、この試験では、髄膜脳炎の形態の重い副作用が観察された。
【００１２】
本発明は、Ａβグロブロマーの末端切断された形態に対して高い親和性を有するグロブロマー特異的抗体を提供することによってこの問題を解決する。これらの抗体は、Ａβペプチド、特にモノマー及びフィブリルの他の形態のみならず、Ａβグロブロマーの末端切断されていない形態も識別可能である。
【００１３】
従って、本発明は、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する本抗体の結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、Ａβ（１２−４２）グロブロマーに対する本抗体の結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００１５】
特定の実施形態によれば、従って、本発明は、Ａβ（１−４２）グロブロマー及びＡβ（１２−４２）グロブロマーの両方に対するその結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００１６】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、ＸおよびＹの両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡＴ（アミノ酸１から４３に相当）またはそれの天然変異体のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙのアミノ酸配列、特には位置Ｘおよび位置Ｙの両方あるいはいずれもグロブロマー形成を妨害し得ない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸１２またはＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４２またはＹ（いずれか数値の低い方）の部分に別のアミノ酸置換がなく、より好ましくはアミノ酸２０またはＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４２またはＹ（いずれか数値の低い方）の部分に追加のアミノ酸置換がなく、最も好ましくはアミノ酸２０またはＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４０またはＹ（いずれか数値の低い方）の部分に追加のアミノ酸置換がない配列（ここで、「追加の」アミノ酸置換とは、自然には認められない、標準的な配列からの誘導である）を含むＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数値は、Ａβペプチドの開始に関係するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものを指す。
【００１７】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（１−４２）」という用語は、１および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡまたはそれの天然変異体、特にはＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数字は１および４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２の部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。同様に、本明細書における「Ａβ（１−４０）」という用語は、１および４０の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４０のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶまたはそれの天然変異体、特にはＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）およびＤ２３Ｎ（「アイオア」）（数字は１および４０の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４０の部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【００１８】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（１２−４２）」という用語は、１２および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１２からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡまたはそれの天然変異体、特にはＡ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数値は、１２および４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２までの部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【００１９】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（２０−４２）」という用語は、２０および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置２０からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列Ｆ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡまたはそれの天然変異体、特にはＡ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数値は２０および４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくは別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【００２０】
本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」（Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー）という用語は、均質性および明瞭な物理特性を有する上記で定義のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド可溶性で球形の非共有結合的会合を指す。１態様によれば、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、アニオン系界面活性剤とともに温置することで得ることができるＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの安定な非フィブリル性のオリゴマー集合体である。モノマーおよびフィブリルとは対照的に、これらのグロブロマーは、指定の集合体数のサブユニット（例えば、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載の初期集合体型、ｎ＝４から６、「オリゴマーＡ」および後期集合体型、ｎ＝１２から１４、「オリゴマーＢ」）を特徴とする。グロブロマーは、３次元球状型構造（「モルテン・グロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９５，８３４−８４参照）を有する。それらは、下記の特徴のうちの１以上によってさらに特徴付けることができる。
【００２１】
−乱交雑プロテアーゼ（サーモリシンまたはエンドプロテアーゼＧｌｕＣなど）によってＮ末端アミノ酸Ｘ−２３を開裂して、切断型のグロブロマーを生じることができる。
【００２２】
−乱交雑プロテアーゼおよび抗体ではＣ末端アミノ酸２４−Ｙはアクセスできない。
【００２３】
−切断型のこれらグロブロマーは、グロブロマー配座において核エピトープＡβ（２０−Ｙ）のアクセス性がより良好な前記グロブロマーの３次元核構造を維持している。
【００２４】
本発明によれば、特には本発明の抗体の結合親和性の評価に関して、本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、ＷＯ２００４／０６７５６１（参照によって本明細書に組み込まれるものとする）の方法によって得ることができる製造物を指す。
【００２５】
前記方法は、天然、組換えもしくは合成Ａβ（Ｘ−ｙ）ペプチドまたはその誘導体を開く段階；少なくとも部分的に開かれたＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を界面活性剤に曝露する段階；製剤の作用を低減する段階；ならびに温置を続ける段階を有する。
【００２６】
ペプチドの折り畳み解除に関しては、例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合切断剤を、タンパク質に作用させることができる。作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合、数分間、例えば約１０から６０分間の作用時間で十分である。次に、蒸発乾固させた残留物、好ましくは濃縮された状態のものを、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水系緩衝液と混和性の好適な有機溶媒に溶解させることで、少なくとも部分的に折り畳み解除されたペプチドまたはその誘導体の懸濁液が得られ、それを次に用いることができる。必要に応じて、ストック懸濁液を、低温、例えば約−２０℃で長期間にわたって保管することができる。
【００２７】
あるいは、ペプチドまたはその誘導体を、若干酸性の、好ましくは水系の溶液、例えば約１０ｍＭのＨＣｌ水溶液に取ることができる。通常数分間の温置時間後、不溶成分を遠心によって除去する。１００００ｇで数分間が都合が良い。これらの方法段階は好ましくは、室温、すなわち２０から３０℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を含み、低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存することができる。
【００２８】
その後の界面活性剤への曝露は、ペプチドまたはその誘導体のオリゴマー化による中間体型オリゴマーの形成に関係するものである（ＷＯ２００４／０６７５６１では、オリゴマーＡと称されている）。これに関しては、界面活性剤は十分な中間体オリゴマーが製造されるまで、少なくとも部分的に折り畳み解除されたペプチドまたはその誘導体に作用させることができる。
【００２９】
イオン系の界面活性剤、特にはアニオン系界面活性剤を用いることが好ましい。
【００３０】
特定の実施形態によれば、下記式（Ｉ）の界面活性剤が用いられる。
【００３１】
Ｒ−Ｘ
式中、基Ｒは、６から２０個、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する未分岐もしくは分岐アルキルまたは６から２０個、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する未分岐または分岐アルケニルであり、基Ｘは酸性基もしくはそれの塩であり、Ｘは好ましくは下記のもの：
−ＣＯＯ−Ｍ＋、ＳＯ３Ｍ＋、特には
−ＯＳＯ３Ｍ＋から選択され、Ｍ＋は水素カチオンまたは好ましくはアルカリ金属およびアルカリ土類金属カチオンおよびアンモニウムカチオンから選択される無機もしくは有機カチオンである。
【００３２】
有利なものは、Ｒが未分岐アルキル（その中で、特に言及すべきものはアルク−１−イル基である）である式（Ｉ）の界面活性剤である。特に好ましいものは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ラウリン酸およびオレイン酸も有利に使用可能である。界面活性剤であるラウロイルサルコシン（サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）ＮＬ−３０またはガルドール（Ｇａｒｄｏｌ；登録商標）とも称される）のナトリウム塩も特に有利である。
【００３３】
界面活性剤作用の時間は特に、オリゴマー化を受けるペプチドまたはその誘導体が折り畳み解除されたか否か、そしてそうであればどの程度折り畳み解除されたかによって決まる。折り畳み解除段階によれば、ペプチドまたはその誘導体が水素結合切断剤で、すなわち、特にはヘキサフルオロイソプロパノールで処理されている場合は、作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合には、数時間、有利には約１から２０時間、特には約２から１０時間の範囲の作用時間で十分である。折り畳み解除が少ないか実質的に折り畳み解除されていないペプチドまたはその誘導体が出発点である場合、それに相当して長い作用時間が良い。そのペプチドまたはその誘導体が、例えばＨＦＩＰ処理に対する代替法として上記で示した手順に従って前処理されている場合、または前記ペプチドまたはその誘導体に対して直接オリゴマー化を行う場合、作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合には、約５から３０時間、特には約１０から２０時間の範囲の作用時間で十分である。温置後、有利には遠心によって不溶成分を除去する。１００００ｇで数分間が良い。
【００３４】
選択される界面活性剤濃度は、使用される界面活性剤によって決まる。ＳＤＳを用いる場合、０．０１から１重量％、好ましくは０．０５から０．５重量％の範囲の濃度、例えば、約０．２重量％が良いことがわかっている。ラウリン酸またはオレイン酸を用いる場合、例えば０．０５から２重量％、好ましくは０．１から０．５重量％の範囲、例えば約０．５重量％という若干高い濃度が良い。
【００３５】
界面活性剤作用は、ほぼ生理的範囲での塩濃度で起こるべきである。従って特には、５０から５００ｍＭ、好ましくは１００から２００ｍＭの範囲、特には約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が良い。
【００３６】
界面活性剤のその後の低減および温置の継続は、さらなるオリゴマー化による本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーの取得に関連するものである（ＷＯ２００４／０６７５６１では、オリゴマーＢと称されている）。以前の段階から得られた組成物は常に界面活性剤および生理的範囲での塩濃度を含むことから、界面活性剤作用、好ましくはさらには塩濃度を低減することが良い。これは、界面活性剤および塩の濃度を低減することで、例えば好都合には水または相対的に低い塩濃度の緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）で希釈することで行うことができる。約２から１０の範囲、有利には約３から８の範囲、特には約４の希釈係数が好適であることがわかっている。界面活性剤作用の低減は、前記界面活性剤作用を中和し得る物質を加えることによっても達成できる。これらの例には、精製および抽出手段の途中で細胞を安定化させることができる物質のような界面活性剤を錯化させることができる物質、例えば特定のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、特にはピウロニック（Ｐｉｕｒｏｎｉｃ；登録商標）Ｆ６８という商品名でのブロックコポリマーなどがある。特定の臨界ミセル濃度付近もしくはそれより高い濃度範囲でのアルコキシル化、特にはエトキシル化アルキルフェノール類（例えば、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ；登録商標）Ｘシリーズのエトキシル化ｔ−オクチルフェノール類、特にはトリトン（登録商標）Ｘ１００、３−（３−クロラミドプロピルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ（登録商標））またはアルコキシル化、特にはエトキシル化ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）シリーズ、特にはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）を、同等に用いることができる。
【００３７】
次に、本発明の十分なＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーが産生されるまで、溶液を温置する。作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合は、数時間の範囲、好ましくは約１０から３０時間の範囲、特には約１５から２５時間の範囲の作用時間で十分である。次に、溶液を濃縮し、残留物があれば遠心によってそれを除去することができる。この場合もやはり、１００００ｇ数分間が良いことがわかっている。遠心後に得られた上清は、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーを含む。
【００３８】
本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、自体が公知の方法で、例えば限外濾過、透析、沈殿または遠心によって最終的に回収することができる。
【００３９】
例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、変性条件下でのＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーの電気泳動分離によって二重帯域が生じることがさらに好ましく（例えば、Ａβ（１−４２）の場合には見かけの分子量が３８／４８ｋＤａ）、分離前のグロブロマーのグルタルジアルデヒド処理時に、これら２つの帯域が一つにまとまることが特に好ましい。グロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーによって単一ピーク（例えば、それぞれ、Ａβ（１−４２）の場合には約６０ｋＤａの分子量に相当）となることも好ましい。
【００４０】
Ａβ（１−４２）ペプチド、Ａβ（１２−４２）ペプチドおよびＡβ（２０−４２）ペプチドから出発すると、前記プロセスは、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーを得る上で特に好適である。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、Ａβ（Ｘ−Ｙ）（Ｘは、数字２．．２４からなる群から選択され、及びＹは上記定義のとおりである。）は、Ａβ（１−Ｙ）グロブロマー（Ｘは、数字２．．２４からなる群から選択され、Ｘは、好ましくは２０又は１２であり、及びＹは上記定義のとおりである。）をより短い形態へ末端切断することによって取得されるものであり、これは、適切なプロテアーゼでの処理によって達成することが可能である。例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマーをサーモリシンタンパク質分解へ供することによって取得することが可能であり、Ａβ（１２−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマーをエンドプロテイナーゼＧｌｕＣタンパク質分解へ供することによって取得することが可能である。タンパク質分解の所望される程度に達した時点で、プロテアーゼは、一般的に知られている様式で不活化される。次いで、本明細書に既に記載されている操作に従って、得られたグロブロマーを単離し、必要であれば、さらなる作業及び精製工程によって、さらに加工し得る。前記プロセスの詳しい記述は、参照により、本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０６７５６１に開示されている。
【００４２】
本発明の方法において、Ａβ（１−４２）グロブロマーは、特に、本明細書の実施例１ａに記載されているＡβ（１−４２）グロブロマーであり、Ａβ（２０−４２）グロブロマーは、特に、本明細書の実施例１ｃに記載されているＡβ（２０−４２）グロブロマーであり、及びＡβ（１２−４２）グロブロマーは、特に、本明細書の実施例１ｄに記載されているＡβ（１２−４２）グロブロマーである。
【００４３】
好ましくは、グロブロマーは、神経細胞に対して親和性を示す。好ましくは、グロブロマーは、神経調節効果も示す。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、グロブロマーは、１１から１６、最も好ましくは、１２から１４のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドからなる。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから実質的になるグロブロマーを表し、１２のサブユニットのうち、平均、少なくとも１１のサブユニットが、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、グロブロマーの１０％未満がいずれかの非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含めば、より好ましく、最も好ましくは、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回っている。
【００４６】
より具体的には、本明細書において「Ａβ（１−４２）グロブロマー」という用語は、上記定義のＡβ（１−４２）単位から実質的になるグロブロマーを表し、本明細書において「Ａβ（１２−４２）グロブロマー」という用語は、上記定義のＡβ（１２−４２）単位から実質的になるグロブロマーを表し、本明細書において「Ａβ（２０−４２）グロブロマー」という用語は、上記定義のＡβ（２０−４２）単位から実質的になるグロブロマーを表す。
【００４７】
本明細書において、「架橋されたＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、グロブロマーの構成単位の架橋によって、好ましくは化学的な架橋によって、より好ましくはアルデヒド架橋によって、最も好ましくは、グルタルジアルデヒド架橋によって、上述のようなＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーから取得可能な分子を表す。本発明の別の態様において、架橋されたグロブロマーは、実質的に、前記単位が非共有的相互作用のみによって互いに固定されるのではなく、少なくとも部分的に共有結合によって連結されているグロブロマーである。本発明において、架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマーは、特に、本明細書の実施例１ｂに記載されている架橋されたＡβ（１−４２）オリゴマーである。
【００４８】
本明細書において、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー誘導体」という用語は、特に、検出を容易にする基、好ましくは、蛍光色素分子、例えば、フルオレセイン・イソチオシアナート、フィコエリトリン、エコーレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、ディクチオソーマ（Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ）蛍光タンパク質又はこれらのあらゆる組み合わせ又は蛍光活性誘導体；発色団；化学発色団、例えば、ルシフェラーゼ、好ましくは、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼ又はこれらのあらゆる組み合わせ若しくは化学発光活性誘導体；酵素的に活性な基、例えば、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は酵素的に活性なこれらのいずれかの誘導体；電子密度が高い基、例えば、重金属含有基、例えば、金含有基；ハプテン、例えば、フェノールに由来するハプテン；強く抗原性の構造、例えば、抗原性であると予測されるペプチド配列、例えば、Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムによって、抗原性であると予測されるペプチド配列；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；更なる特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する天然の又は天然由来のタンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎ対の要素；磁性基、例えば、強磁性基；又は放射性基、例えば、１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ若しくは１２５Ｉ若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む基；又は共有結合によって、若しくは非共有高親和性相互作用によってフラッグ標識されているグロブロマー、好ましくは、不活化、隔離、分解及び／又は沈殿を促進する基に共有結合されているグロブロマー、好ましくは、インビボ分解を促進する基、より好ましくはユビキチンでフラッグ標識されているグロブロマー（この場合、このフラッグ標識されたオリゴマーがインビボで組み立てられるのであれば、特に好ましい。）、又は上記のあらゆる組み合わせによって修飾されたグロブロマーを表す。このような標識及びフラッグ標識基並びにタンパク質にこれらを付着させるための方法は、本分野において公知である。標識及び／又はフラッグ標識は、グロブロマー化の前、間又は後に実施し得る。本発明の別の態様において、グロブロマー誘導体は、標識及び／又はフラッグ標識反応によって、グロブロマーから取得可能な分子である。
【００４９】
対応して、本明細書において、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー誘導体」という用語は、特に、グロブロマーに対して記載されているように標識又はフラッグ標識されているＡβモノマーを表す。
【００５０】
都合よく、本発明の抗体は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍの範囲のＫＤで、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに結合する。好ましくは、抗体は、高い親和性で、例えば、１×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、１×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−９ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、１×１０−９ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−１０ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、１×１０−１０ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−１１ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、又は１×１０−１１ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに結合する。
【００５１】
本明細書において「より大きい親和性」という用語は、一方で結合していない抗体及び結合していないグロブロマーと他方で抗体−グロブロマー複合体との間の平衡が、さらに、抗体−グロブロマー複合体の方に傾く相互作用の程度を表す。同様に、本明細書において「より小さい親和性」という用語は、一方で結合していない抗体及び結合していないグロブロマーと他方で抗体−グロブロマー複合体との間の平衡が、さらに、結合していない抗体及び結合していないグロブロマーの方に傾く相互作用の程度を表す。「より大きい親和性」という用語は、「より高い親和性」という用語と同義であり、「より小さい親和性」という用語は「より低い親和性」という用語と同義である。
【００５２】
特定の実施形態によれば、本発明は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍの範囲のＫＤでＡβ（２０−４２）グロブロマーに、１０−１２Ｍ又はそれより小さい親和性のＫＤでＡβ（１−４２）グロブロマーに結合し、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性がＡβ（１−４２）グロブロマーに対する結合親和性より大きい抗体に関する。
【００５３】
Ａβ（２０−４２）グロブロマーへの本発明の抗体の結合親和性は、Ａβ（１−４２）グロブロマーへの抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが好ましい。
【００５４】
特定の実施形態によれば、本発明は、１０−１２Ｍ又はそれより小さい親和性のＫＤでＡβ（１２−４２）グロブロマーに結合し、Ａβ（２０−４２）グロブロマーへの結合親和性がＡβ（１２−４２）グロブロマーへの結合親和性より大きい抗体に関する。
【００５５】
また、Ａβ（２０−４２）グロブロマーへの本発明の抗体の結合親和性は、Ａβ（１２−４２）グロブロマーへの抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが好ましい。
【００５６】
好ましくは、本発明の抗体は、上記定義のように、少なくとも１つのＡβグロブロマーに結合し、Ａβの少なくとも１つの非グロブロマー形態に対して比較的より小さい親和性を有する。
【００５７】
少なくとも１つのＡβグロブロマーに対するよりＡβの少なくとも１つの非グロブロマー形態に対して比較的より小さい親和性を有する本発明の抗体には、Ａβ（１−４２）モノマーに対する結合親和性より大きいＡβ（２０−４２）グロブロマーへの結合親和性を有する抗体が含まれる。さらに、これに代えて又はこれに加えて、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性が、Ａβ（１−４０）モノマーに対する抗体の結合親和性より大きいことが好ましい。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体の親和性は、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）モノマーの両方に対する抗体の親和性より大きい。
【００５９】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー」という用語は、単離型のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド、好ましくは本質的に非共有結合的相互作用で他のＡβペプチドと関わっていないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの一形態を指す。実際には、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマーは通常、水溶液の形態で提供される。本発明の特に好ましい実施形態において、水系モノマー溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮＨ４ＯＨを含む。本発明の別の特に好ましい実施形態において、水系モノマー溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮａＯＨを含む。使用される場合（例えば、本発明の抗体の結合親和性を測定するため）、前記溶液を適切な方法で希釈することが良い可能性がある。さらに通常は、前記溶液は、それの調製から２時間以内、特には１時間以内、特別には３０分以内に使用することが良い。
【００６０】
より具体的には、本明細書において「Ａβ（１−４０）モノマー」という用語は、本明細書の実施例２に記載されているＡβ（１−４０）モノマー調製物を表し、本明細書において「Ａβ（１−４２）モノマー」という用語は、本明細書の実施例２に記載されているＡβ（１−４２）モノマー調製物を表す。
【００６１】
都合よく、本発明の抗体は、低い親和性で、最も好ましくは１×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、１×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−６ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、一方の、又はより好ましくは両方のモノマーに結合する。
【００６２】
Ａβ（２０−４２）グロブロマーへの本発明の抗体の結合親和性は、一方、又は、より好ましくは両方のモノマーへの抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが特に好ましい。
【００６３】
少なくとも１つのＡβグロブロマーに対する親和性よりＡβの少なくとも１つの非グロブロマー形態に対して比較的より小さい親和性を有する本発明の抗体には、Ａβ（１−４２）フィブリルに対する結合親和性より大きいＡβ（２０−４２）グロブロマーへの結合親和性を有する抗体がさらに含まれる。さらに、これに代えて又はこれに加えて、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性が、Ａβ（１−４０）フィブリルに対する抗体の結合親和性より大きいことが好ましい。
【００６４】
本明細書において、「フィブリル」という用語は、電子顕微鏡中で繊維性構造を示し、コンゴーレッドを結合し、次いで、偏光下で複屈折を示し、そのＸ線回折パターンがクロス−β構造である非共有的に会合された各Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合物を含む分子構造を表す。
【００６５】
本発明の別の態様において、フィブリルは、界面活性剤の不存在下で、例えば、０．１ＭＨＣｌ中で、適切なＡβペプチドの自己誘導された重合体凝集物を含む方法によって取得可能な分子構造であり、２４超、好ましくは１００単位超の凝集物の形成が得られる。この方法は、本分野において周知である。都合よく、Ａβ（Ｘ−Ｙ）フィブリルは、水溶液の形態で使用される。本発明の特に好ましい実施形態において、水性フィブリル溶液は、０．１％ＮＨ４ＯＨ中にＡβペプチドを溶解し、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０  ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４にこれを希釈した後に、ｐＨを７．４に再調整し、３７℃で２０時間溶液を温置した後、１００００ｇでの１０分間の遠心及び２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に再懸濁することによって作製される。
【００６６】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）フィブリル」という用語は、本明細書において、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから実質的になるフィブリルを表し、サブユニットの少なくとも９０％が、平均、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、サブユニットの少なくとも９８％が、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であればより好ましく、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回っていれば、最も好ましい。
【００６７】
より具体的には、「Ａβ（１−４２）フィブリル」という用語は、本明細書において、本明細書中の実施例３に記載されているようにＡβ（１−４２）フィブリル調製物を表す。
【００６８】
都合よく、本発明の抗体は、低い親和性で、最も好ましくは、１×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、１×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−６ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、一方の、又はより好ましくは両方のフィブリルに結合する。
【００６９】
Ａβ（２０−４２）グロブロマーへの本発明の抗体の結合親和性は、一方、又は、より好ましくは両方のフィブリルへの抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが特に好ましい。
【００７０】
１つの特定の実施形態によれば、本発明は、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）フィブリルの両方に対するその結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００７１】
特定の好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのＡβグロブロマー、特にＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する親和性より、Ａβのモノマー及び繊維性形態の両方に対して比較的より小さな親和性を有する抗体に関する。以下、これらの抗体は、グロブロマー特異的抗体と称される。
【００７２】
本発明の抗体には、さ架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマー、特に、本明細書の実施例１ｂに記載されているものなど、グルタルジアルデヒド架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマーより、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対してより大きな結合親和性を有する抗体がさらに含まれる。
【００７３】
本発明の特に好ましい実施形態において、Ａβ（２０−４２）グロブロマーへの抗体の結合親和性は、架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマーへの抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが好ましい。
【００７４】
本発明の抗体は、好ましくは、単離されており、特に、モノクローナルであり、さらに具体的には、組み換えである。
【００７５】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２４１によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（５Ｆ７）にも関する。
【００７６】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２３９によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（１０Ｆ１１）にも関する。
【００７７】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２４０によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（７Ｃ６）にも関する。
【００７８】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７２４２によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（４Ｂ７）にも関する。
【００７９】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０９によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（６Ａ２）にも関する。
【００８０】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０８によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（２Ｆ２）にも関する。
【００８１】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０５によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（４Ｄ１０）にも関する。
【００８２】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０９によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（７Ｅ５）にも関する。
【００８３】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８１０によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（１０Ｃ１）にも関する。
【００８４】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８５１によって表記されるハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体（３Ｂ１０）にも関する。
【００８５】
本発明のこれらの抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０は、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性より高い、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有することによって特徴付けられる。
【００８６】
本発明は、前記モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０のいずれか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体にも関する。前記モノクローナル抗体のいずれか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体は、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性より大きな、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体に限定されるものではないことを理解すべきである。
【００８７】
前記モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０のいずれか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体には、モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０と同一のエピトープに結合する抗体が含まれる。
【００８８】
５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０からなる群から得られる全てのモノクローナル抗体は、２０及び４２Ａβ配列範囲内に、特に、２０から３０Ａβ配列範囲内に含有されるエピトープに結合する。理論に拘泥するものではないが、前記エピトープは、アミノ酸２０と４２の領域中のサブユニット間、特に、アミノ酸２０と３０の領域中のサブユニット間中に存在する構造的な非直鎖エピトープであると考えられる。
【００８９】
本発明は、５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは全ての抗体と競合することができる抗体にも関する。
【００９０】
本明細書において、「競合する抗体」という用語は、同一の分子実体又は安定的に、但し、非共有結合的に連結された超分子実体、好ましくは同一分子を標的とする抗体のあらゆる数を表し、少なくとも１つは、好ましくは、その標的エピトープへの他の抗体のアクセスを立体的に妨害することによって、又は他の抗体に対する標的の親和性を低下させる標的実体中の立体構造を誘導及び／又は安定化させることによって、より好ましくは、標的実体のエピトープの十分近くに存在するエピトープに結合し、標的実体と重複し、又は標的実体と同一であり、最も好ましくは、重複又は同一であり、特に同一であることによって他の抗体の標的エピトープへの接近を直接的に遮断することによって、別の抗体の測定可能な結合を特異的に低下させることが可能である。本明細書において、２つのエピトープが、それらの化学構造、好ましくはそれらのアミノ酸配列の一部を共有すれば、２つのエピトープは、「重複する」と称され、それらの化学構造、好ましくはそれらのアミノ酸配列が同一であれば、「同一」であると称される。
【００９１】
従って、本発明は、その標的エピトープが、５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０からなる群から選択される抗体の少なくとも１つの標的エピトープと重複し、好ましくは同一である抗体にも関する。
【００９２】
従って、前記モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０のいずれか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体には、さらに、前記モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０のいずれか１つの抗原結合部分の少なくとも一部を含む抗体が含まれる。好ましくは、前記部分は、前記モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０のいずれか１つの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００９３】
従って、さらなる特定の実施形態によれば、本発明は、モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列及び／又は軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体に関する。このような抗体の具体例には、それぞれ、モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及び／又は軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列も含む抗体が含まれる。さらに具体的には、このような抗体には、それぞれモノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１又は３Ｂ１０の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列及び／又は軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列も含む抗体が含まれる。
【００９４】
一態様において、従って、本発明は、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１ドメインが、モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１又は３Ｂ１０の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体に関する。
【００９５】
さらなる態様において、従って、本発明は、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１ドメインが、それぞれ、モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１又は３Ｂ１０の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００９６】
好ましくは、抗体は、配列番号３のアミノ酸残基３１−３５、配列番号３のアミノ酸残基５０−６６、配列番号３のアミノ酸残基９９−１０９、配列番号４のアミノ酸残基２４−３９、配列番号４のアミノ酸残基５５−６１、配列番号４のアミノ酸残基９４−１０２、配列番号７のアミノ酸残基３１−３５、配列番号７のアミノ酸残基５０−６６、配列番号７のアミノ酸残基９７−１０９、配列番号８のアミノ酸残基２４−３９、配列番号８のアミノ酸残基５５−６１、配列番号８のアミノ酸残基９４−１０２、配列番号１１のアミノ酸残基３１−３５、配列番号１１のアミノ酸残基５０−６５、配列番号１１のアミノ酸残基９８−１０７、配列番号１２のアミノ酸残基２４−３９、配列番号１２のアミノ酸残基５５−６１、配列番号１２のアミノ酸残基９４−１０２、配列番号１５のアミノ酸残基３１−３５、配列番号１５のアミノ酸残基５０−６６、配列番号１５のアミノ酸残基９９−１０７、配列番号１６のアミノ酸残基２４−４０、配列番号１６のアミノ酸残基５６−６２、配列番号１６のアミノ酸残基９５−１０３、配列番号１９のアミノ酸残基３１−３５、配列番号１９のアミノ酸残基５０−６６、配列番号１９のアミノ酸残基９９−１０９、配列番号２０のアミノ酸残基２４−３９、配列番号２０のアミノ酸残基５５−６１、配列番号２０のアミノ酸残基９４−１０２、配列番号２３のアミノ酸残基３１−３５、配列番号２３のアミノ酸残基５０−６６、配列番号２３のアミノ酸残基９９−１０９、配列番号２４のアミノ酸残基２４−３９、配列番号２４のアミノ酸残基５５−６１、配列番号２４のアミノ酸残基９４−１０２、配列番号２７のアミノ酸残基３１−３５、配列番号２７のアミノ酸残基５０−６５、配列番号２４のアミノ酸残基９８−１０１、配列番号２８のアミノ酸残基２４−３９、配列番号２８のアミノ酸残基５５−６１、配列番号２８のアミノ酸残基９４−１０２、配列番号３１のアミノ酸残基３１−３５、配列番号３１のアミノ酸残基５０−６６、配列番号３１のアミノ酸残基９９−１０７、配列番号３２のアミノ酸残基２４−４０、配列番号３２のアミノ酸残基５６−６２、配列番号３２のアミノ酸残基９５−１０３、配列番号３５のアミノ酸残基３１−３５、配列番号３５のアミノ酸残基５０−６６、配列番号３５のアミノ酸残基９９−１０７、配列番号３６のアミノ酸残基２４−４０、配列番号３６のアミノ酸残基５６−６２、配列番号３６のアミノ酸残基９５−１０３、配列番号３８のアミノ酸残基３１−３５、配列番号３８のアミノ酸残基５０−６６及び配列番号３８のアミノ酸残基９８−１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００９７】
好ましい実施形態において、抗体は、上に開示されている配列からなる群から選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む。より好ましくは、選択される３つのＣＤＲは、以下からなる群から選択される可変ドメインＣＤＲのセットから得られる。
【００９８】
【表２】
0005475994.tif 000002
0005475994.tif 000003
0005475994.tif 000004
0005475994.tif 000005
【００９９】
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットを含む。より好ましくは、２つの可変ドメインＣＤＲセットは、ＶＨ５Ｆ７ＣＤＲセット及びＶＬ５Ｆ７ＣＤＲセット；ＶＨ１０Ｆ１１ＣＤＲセット及びＶＬ１０Ｆ１１ＣＤＲセット；ＶＨ７Ｃ６ＣＤＲセット及びＶＬ７Ｃ６ＣＤＲセット；ＶＨ４Ｂ７ＣＤＲセット及びＶＬ４Ｂ７ＣＤＲセット；ＶＨ２Ｆ２ＣＤＲセット及びＶＬ２Ｆ２ＣＤＲセット；ＶＨ６Ａ２ＣＤＲセット及びＶＬ６Ａ２ＣＤＲセット；ＶＨ４Ｄ１０ＣＤＲセット及びＶＬ４Ｄ１０ＣＤＲセット；ＶＨ７Ｅ５ＣＤＲセット及びＶＬ７Ｅ５ＣＤＲセット；並びにＶＨ１０Ｃ１ＣＤＲセット及びＶＬ１０Ｃ１ＣＤＲセットからなる群から選択される。
【０１００】
別の実施形態において、上に開示されている抗体は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。
【０１０１】
好ましい実施形態において、抗体はＣＤＲ移植された抗体である。好ましくは、ＣＤＲ移植された抗体は、上に開示されているＣＤＲの１つ又はそれ以上を含む。
【０１０２】
好ましくは、ＣＤＲ移植された抗体は、ヒトアクセプターフレームワークを含む。
【０１０３】
好ましい実施形態において、抗体はヒト化された抗体である。好ましくは、ヒト化された抗体は、上に開示されているＣＤＲの１つ又はそれ以上を含む。より好ましくは、ヒト化された抗体は、上に開示されているＣＤＲの３つ又はそれ以上を含む。最も好ましくは、ヒト化された抗体は、上に開示されている６つのＣＤＲを含む。特定の実施形態において、ＣＤＲは、ヒトアクセプターフレームワークのヒト抗体可変ドメイン中に取り込まれる。好ましくは、ヒト抗体可変ドメインは、コンセンサスヒト可変ドメインである。より好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、中心的残基に、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、中心的残基は、ＣＤＲに隣接する残基；グリコシル化部位残基；稀な残基；Ａβ（２０−４２）グロブロマーと相互作用することが可能な残基；ＣＤＲと相互作用することが可能な残基；標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基；ベルニエ（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン内の残基；並びにＣｈｏｔｈｉａ定義された可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義された第一の重鎖フレームワーク間の重複する領域内の残基からなる群から選択される。好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークヒトアクセプターフレームワークは、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列は、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、及び前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０のアミノ酸残基を含む。
【０１０４】
さらなる態様において、本発明は、上記重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体に関する。
【０１０５】
好ましくは、抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。より好ましくは、抗体は、２つの可変ドメインを含み、前記２つの可変ドメインは、配列番号３及び配列番号４、配列番号７及び配列番号８及び配列番号１１及び配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２４、配列番号２７及び配列番号２８、配列番号３１及び配列番号３２、並びに配列番号３５及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
別の態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びヒトＩｇＧ１Ａｌａ２３４、Ａｌａ２３５変異定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。特に、抗体は、ヒト定常領域を含む。より好ましくは、抗体は、配列番号３９から４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体が好ましい。
【０１０７】
別の実施形態において、抗体はグリコシル化されている。好ましくは、グリコシル化パターンは、ヒトグリコシル化パターンであり、又は本明細書に開示されている真核細胞のいずれか１つ、特に、ＣＨＯ細胞によって産生されるグリコシル化パターンである。
【０１０８】
本発明は、本発明の抗体の抗原結合部分にも関する。このような抗原結合部分には、抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及び一本鎖Ｆｖ断片が含まれるが、これらに限定されない。さらなる抗原結合部分は、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片及びジスルフィド結合されたＦｖ断片である。
【０１０９】
本発明は、本明細書に開示されている抗体のいずれか１つをコードする単離された核酸も提供する。さらなる実施形態は、本明細書に開示されている単離された核酸を含むベクターを提供する。前記ベクターは、特に、ｐｃＤＮＡ；ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，  Ｖｏｌ３０，Ｎｏ．２）；ｐＴＴ３（さらなる多重クローニング部位を有するｐＴＴ；ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，  Ｓ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ１８，Ｎｏ．１７）；ｐＢＶ；ｐＪＶ；及びｐＢＪからなる群から選択され得る。
【０１１０】
別の態様において、宿主細胞は、本明細書に開示されたベクターで形質転換されている。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。より好ましくは、宿主細胞はイー・コリである。関連する実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。好ましくは、真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞）、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ及びＣＯＳを含む（但し、これらに限定されない。）哺乳動物細胞；又は真菌細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシアエなどの酵母細胞；又はＳｆ９などの昆虫細胞である。
【０１１１】
本発明の別の態様は、本発明の抗体を生産するのに十分な条件下で、本明細書に開示されている宿主細胞又はハイブリドーマのいずれか１つを培地中において培養することを含む、本発明の抗体を生産する方法を提供する。別の実施形態は、本明細書に開示されている方法によって取得可能である抗体を提供する。
【０１１２】
本発明の抗体は、それ自体公知の様式で取得することが可能である。
【０１１３】
全体として、異なる抗体特異性の数千億から構成される抗体レパートリーを含有するＢリンパ球は、哺乳動物の免疫系の一部である。特定の抗原に対する正常な免疫応答とは、前記抗原に対して特異的に結合する前記レパートリーの１つ又はそれ以上の抗体を選択することを意味し、免疫応答の成功は、少なくとも部分的には、前記抗体が刺激抗原を特異的に認識し（最終的には、除去する）、前記抗体の環境中の他の分子を無視する能力に基づいている。
【０１１４】
１つの特定の標的抗原を特異的に認識する抗体の有用性は、モノクローナル抗体技術の開発をもたらした。現在では、標準化されたハイブリドーマ技術によって、目的の抗原に対して単一の特異性を有する抗体を作製することが可能である。より最近では、抗体ライブラリーのインビトロスクリーニングなどの組み換え抗体技術が開発されている。これらの技術は、同様に目的の抗原に対して単一の特異性を有する抗体の産生を可能とする。
【０１１５】
本発明の方法において、インビボ又はインビトロのいずれかで、抗体レパートリーに対して、目的の抗原を作用させ得る。
【０１１６】
一実施形態によれば、インビボにおいて動物を抗原で免疫化することによって、抗原をレパートリーに作用させる。このインビボアプローチは、さらに、動物のリンパ球から多数のハイブリドーマを確立すること、及び前記抗原へ特異的に結合する抗体を分泌する特定のハイブリドーマを選択することを含み得る。免疫化すべき動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物若しくはヒツジであり得、又は、抗原刺激後にヒト抗体を産生する、上に挙げられている動物のいずれかのトランスジェニック様式、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスであり得る。免疫化され得る動物の他の種類には、ヒト末梢血単核球で（キメラｈｕ−ＰＢＭＣＳＣＩＤマウス）又はリンパ球系細胞若しくはその前駆体で再構成されている重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有するマウス、及び致死的な全身照射を施された後に、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有するマウスから得られた骨髄細胞によって照射に対して保護され、続いて、機能的ヒトリンパ球が移植されたマウス（「トリメラ」系）が含まれる。免疫化すべき動物の別の種類は、抗原での免疫化後に、前記動物が前記抗原を外来として認識するように、そのゲノム内において、目的の抗原をコードする内在性遺伝子のスイッチが、例えば、相同的組み換えによって停止されている（ノックアウトされている）動物（例えば、マウス）である。本方法によって作製されたポリクローナル又はモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ及びドットブロット技術を含む（但し、これらに限定されない。）公知のスクリーニング方法を用いることによって性質決定及び選択されることが当業者に自明である。
【０１１７】
別の実施形態によれば、インビトロにおいて、抗原で組み換え抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、抗原を抗体レパートリーに作用させる。組み換え抗体ライブラリーは、例えば、バクテリオファージの表面上又は酵母細胞の表面上又は細菌細胞の表面上に発現され得る。様々な実施形態において、組み換え抗体ライブラリーは、例えば、ｓｃＦｖライブラリー又はＦａｂライブラリーである。別の実施形態によれば、抗体ライブラリーは、ＲＮＡ−タンパク質融合物として発現される。
【０１１８】
本発明の抗体を作製する別のアプローチは、インビボ及びインビトロアプローチの組み合わせを含む。例えば、インビボにおいて、動物を抗原で免疫化した後、前記動物のリンパ球系細胞から調製された組み換え抗体ライブラリー又は（例えば、重鎖及び／又は軽鎖を含有する）単一ドメイン抗体ライブラリーを、前記抗原を用いてインビトロでスクリーニングすることによって、抗体レパートリーに対して抗原を作用させ得る。別のアプローチによれば、インビボにおいて、動物を抗原で免疫化した後、前記動物のリンパ球系細胞から作製された組み換え抗体ライブラリー又は単一ドメインライブラリーをアフィニティー成熟に供することによって、抗体レパートリーに対して抗原を作用させる。別のアプローチによれば、インビボで動物を抗原で免疫化した後、目的の抗体を分泌する各抗体産生細胞を選択し、（例えば、ＰＣＲを用いて）重鎖及び軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを、前記選択された細胞から取得し、インビトロにおいて、哺乳動物宿主細胞中で重鎖及び軽鎖の前記可変領域を発現させることにより（これは、選択されたリンパ球抗体法又はＳＬＡＭと称される。）、選択された抗体遺伝子配列をさらに選択及び操作できるようにすることによって、抗原を抗体レパートリーに作用させる。さらに、モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖に対する抗体遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させ、所望の結合親和性を有する抗体を分泌する哺乳動物細胞を選択することによる発現クローニングによって選択され得る。
【０１１９】
本発明は、スクリーニング及びカウンタースクリーニングのための所定の抗原を提供する。従って、本発明によれば、上に定義されている結合親和性で、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を選択することが可能である。
【０１２０】
抗体を作製するための本発明の方法は、抗体の様々な種類を生産するために使用することが可能である。これらには、モノクローナル、特に組み換え抗体、特に実質的にヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びＣＤＲ移植抗体並びにこれらの抗原結合部分も含まれる。
【０１２１】
本発明は、さらに、本発明のモノクローナル抗体を産生（分泌）することができるハイブリドーマに関する。本発明のハイブリドーマには、ＰＴＡ−７２４１、ＰＴＡ−７２３９、ＰＴＡ−７２４０、ＰＴＡ−７２４２、ＰＴＡ−７４０８、ＰＴＡ−７４０９、ＰＴＡ７４０５、ＰＴＡ−７８０９、ＰＴＡ−７８１０及びＰＴＡ−７８５１からなる群から選択されるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号によって表記されるハイブリドーマが含まれる。
【０１２２】
本発明の抗体は、本明細書に記載されているＡβグロブロマー以外のＡβ形態とも反応し得る、すなわち結合し得ることが注目される。これらの抗原は、オリゴマー若しくはグロブロマーであってもよく、又はオリゴマー若しくはグロブロマーでなくてもよい。従って、本発明の抗体が結合する抗原には、本発明の抗体が反応性を有するグロブロマーエピトープを含むあらゆるＡβ形態が含まれる。このようなＡβ形態には、Ａβ（２０−４２）、Ａβ（２０−４０）、Ａβ（１２−４２）、Ａβ（１２−４０）、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）形態などの末端切断された及び末端切断されていないＡβ（ＸＹ）形態（Ｘ及びＹは、上に定義されている。）が含まれるが、但し、前記形態は、グロブロマーエピトープを含む。
【０１２３】
本発明は、上に定義されているように、本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む組成物にも関する。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、前記組成物は、本発明の抗体又は抗原結合部分及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物である。
【０１２５】
上に定義されている本発明の抗体又は抗原結合部分は、インビトロ及びインビボの両方において、本発明の抗体又は抗原結合部分が結合するＡβグロブロマー又はその誘導体の活性を好ましくは中和することができる。従って、前記抗体又は抗原結合部分は、例えば、前記グロブロマー若しくはその誘導体を含有する調製物中で、又は前記グロブロマー若しくはその誘導体がその中に存在するヒト個体若しくは他の哺乳動物中で、前記グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害するために使用され得る。
【０１２６】
一実施形態によれば、本発明は、前記グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害する方法であり、前記グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害するために、本発明の抗体又はその抗原結合部分をグロブロマー又はその誘導体に対して作用させることを含む、前記方法に関する。前記活性は、例えば、インビトロで阻害され得る。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、試料中で、グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害するために、前記グロブロマー又はその誘導体を含有し、又は含有すると疑われている対象又は細胞培養から得られた試料などの調製物に添加され得る。あるいは、グロブロマー又はその誘導体の活性は、インビボで、個体中において阻害され得る。
【０１２７】
従って、本発明は、さらに、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病及びダウン症候群のアミロイドーシスからなる群から選択されるアミロイドーシスを治療又は予防するための医薬組成物を調製するための、上記抗体又は抗原結合部分の使用に関する。従って、本発明の前記使用の一態様は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスの治療又は予防を必要としている対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療又は予防する方法であり、前記対象に上記抗体又は抗原結合部分を投与することを含む、前記方法である。アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療し、及び特に予防するために、前記抗体又は抗原結合部分を使用することは、特に、受動免疫のためである。従って、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療又は予防することを必要とする対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療又は予防する方法では、前記対象へ抗体又は抗原結合部分を投与する１つの目的は、アミロイドーシス、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスに対して前記対象を受動的に免疫することである。
【０１２８】
上に定義されている本発明の抗体又は抗原結合部分は、インビトロ及びインビボの両方において、本発明の抗体又は抗原結合部分が結合するＡβグロブロマー又はその誘導体を好ましくは検出することができる。従って、前記抗体又は抗原結合部分は、例えば、前記グロブロマー若しくはその誘導体を含有する調製物中で、又は前記グロブロマー若しくはその誘導体がその中に存在するヒト個体若しくは他の哺乳動物中で、前記グロブロマー又はその誘導体を検出するために使用され得る。
【０１２９】
一実施形態によれば、本発明は、前記グロブロマー又はその誘導体を検出する方法であり、前記グロブロマー又はその誘導体に結合させるために、本発明の抗体又はその抗原結合部分をグロブロマー又はその誘導体に対して作用させること（これにより、好ましくは、抗体又はその抗原結合部分及びグロブロマー又はその誘導体を含む複合体を形成する。）を含む、前記方法に関する。前記グロブロマーは、例えば、インビトロで検出され得る。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、調製物中のグロブロマー又はその誘導体を検出するために、調製物、例えば、前記グロブロマー又はその誘導体を含有し、又は含有すると疑われている対象又は細胞培養から得られた試料に添加され得る。あるいは、グロブロマー又はその誘導体の活性は、インビボで、個体中において検出され得る。
【０１３０】
従って、本発明は、さらに、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを診断するための組成物を調製するための、上記抗体又は抗原結合部分の使用に関する。本発明の前記使用の一態様は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを有することが疑われている対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを診断する方法であり、上記抗体又は抗原結合部分を前記対象に投与すること、及び前記抗体又は抗原結合部分を前記抗原とともに含む複合体の形成を検出することを含み、前記複合体の存在が、前記対象におけるアミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスの存在を示唆する、前記方法である。本発明の前記使用の第二の態様は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを有することが疑われている対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを診断する方法であり、前記対象から試料を準備すること、前記試料を上記抗体又は抗原結合部分と接触させること、及び前記抗体又は抗原結合部分を前記抗原とともに含む複合体の形成を検出することを含み、前記複合体の存在が、前記対象におけるアミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを示唆する、前記方法である。
【０１３１】
（発明の詳細）
本発明の抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット又はＢＩＡｃｏｒｅ分析（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）などの標準化されたインビトロイムノアッセイを使用することによって評価され得る。さらなる記載については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  ５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：２６８−２７７を参照されたい。
【０１３２】
特定の実施形態によれば、本明細書において定義されている親和性は、実施例８に記載されているドットブロットを実施し、これを濃度測定によって評価することによって得られる値を表す。本発明の特定の実施形態によれば、ドットブロットによって結合親和性を測定することは、以下のことを含む。抗原（例えば、上に定義されているような、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー又はＡβ（Ｘ−Ｙ）フィブリル）又は、好適には、例えば、１００ｐｍｏｌ／μＬ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ、０．１ｐｍｏｌ／μｌ及び０．０１ｐｍｏｌ／μｌの抗原濃度になるように、例えば、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ中へ抗原の適切な希釈物の一定量を、ニトロセルロース膜上にドット状に滴加し、次いで、非特異的な結合を防止するために、膜をミルクでブロックし、洗浄し、次いで、目的の抗体と接触させた後、酵素連結された二次抗体及び呈色反応を用いて酵素を検出し、所定の酵素濃度で、結合した抗体の量が親和性の測定を可能とする。従って、１つの標的への２つの異なる抗体の相対親和性又は２つの異なる標的への１つの抗体の相対親和性は、本明細書において、その他は同一のドットブロット条件下で、２つの抗体−標的組み合わせを用いて観察された標的結合された抗体のそれぞれの量の関係として定義される。ウェスタンブロッティングに基づく類似のアプローチとは異なり、ドットブロットアプローチは、天然の立体構造を採る所定の標的への抗体の親和性を測定する。ＥＬＩＳＡアプローチとは異なり、ドットブロットアプローチは、異なる標的とマトリックス間の親和性の差という問題がなく、これにより、異なる標的間でのより正確な比較が可能となる。
【０１３３】
本明細書において使用される「Ｋｄ」という用語は、本分野において公知であるように、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を表すものとする。
【０１３４】
本発明の抗体は、好ましくは、単離された抗体である。「単離された抗体」とは、上述の結合親和性を有し、及び異なる結合親和性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する。本明細書において、「実質的に含まない」という用語は、抗体の少なくとも９５％、好ましくは抗体の少なくとも９８％、より好ましくは抗体の少なくとも９９％が所望の結合親和性を有する抗体調製物を表す。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことができる。
【０１３５】
本発明の単離された抗体には、モノクローナル抗体が含まれる。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」は、異なるアミノ酸配列の抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物とは異なり、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子、抗体の調製物を表すものとする。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイのような幾つかの新しい技術及びハイブリドーマから得られた抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７などのハイブリドーマ技術によって調製されたハイブリドーマによって分泌された抗体）が例である古典的な方法によって作製することが可能である。従って、ハイブリドーマに由来しない均一な配列を有する抗体は、本明細書において、なお、モノクローナル抗体と称されるが、これは、非古典的な方法によって取得され得、「モノクローナル」という用語は、ハイブリドーマに由来する抗体に限定されず、１つの核酸クローンに由来する全ての抗体を表すために使用される。
【０１３６】
従って、本発明のモノクローナル抗体には、組み換え抗体が含まれる。本明細書において「組み換え」という用語は、例えば、化学合成によって、又は遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作によって、本来隔てられている配列の２つのセグメントを人工的に組み合わせることを表す。特に、「組み換え抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体；組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子のためにトランスジュニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい。）など、組み換え手段によって産生され、発現され、作製され若しくは単離された抗体又は、特定の免疫グロブリン遺伝子配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など）が他のＤＮＡ配列と組み合わされている、他のいずれかの方法で産生され、発現され、作製され若しくは単離された抗体を表す。組み換え抗体には、例えば、キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体が含まれる。当業者は、異種の系内での、ハイブリドーマに由来する慣用のモノクローナル抗体の発現は、得られた抗体タンパク質のアミノ酸配列が変化されておらず、又は変化されることが意図される場合でさえ、組み換え抗体の作製を必要とすることに気づく。
【０１３７】
本発明の特定の実施形態において、抗体は、ヒト化された抗体である。
【０１３８】
複数の実施形態によれば、抗体は、ヒト抗体又はマウス抗体など、専ら単一の種に由来するアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態によれば、抗体は、キメラ抗体又はＣＤＲ移植抗体又はヒト化された抗体の別の形態であり得る。
【０１３９】
「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子を表すものとする。鎖は、通常、ジスルフィド結合を介して、互いに連結されている。各重鎖は、前記重鎖の可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲ又はＶＨと略称される。）及び前記重鎖の定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、前記軽鎖の可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲ又はＶＬと略称される。）及び前記軽鎖の定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、保存された領域が散在された超可変領域へさらに分割され得る。従って、各ＶＨ及びＶＬ領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、Ｎ末端からＣ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。この構造は、当業者に周知である。
【０１４０】
抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、本発明の抗体の断片の１つ又はそれ以上の断片を表し、前記断片は、上記結合親和性をなお有する。完全な抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を実施可能であることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に従えば、結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（すなわち、ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋を介して互いに連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＦＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメイン又はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＤＨ３若しくはＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照。）を形成している単一のタンパク質鎖として、これらの調製を可能とする合成リンカー（例えば、ポリ−Ｇ４Ｓアミノ酸配列）、及び組み換え法を用いてさらに互いに連結され得る。抗体の「抗原結合部分」という用語は、このような一本鎖抗体も含むものとする。「ダイアボディ」などの一本鎖抗体の他の形態も、同様にここに包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが一本鎖ポリペプチド鎖上に発現されているが、２つのドメインが同じ鎖上で対合するには短すぎるリンカーを使用することにより、前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成するように強制し、２つの抗原結合部位を形成する二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３を参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを表す。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、本分野において公知であり、表１に示されている。
【０１４１】
【表３】
0005475994.tif 000006
【０１４２】
さらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、前記抗体又は抗体部分の、１つ又はそれ以上のさらなるタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有的会合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子に対して適しているのは、四量体ｓｃＦｖ分子を調製するためにストレプトアビジンコア領域を使用すること（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）、並びに二価及びビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するために、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジニル、例えば、ヘキサヒスチジニルタグを使用する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：１０４７−１０５８）ことである。
【０１４３】
「ヒト抗体」という用語は、その可変及び定常領域が、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照。）によって記載されているように、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に対応し、又はヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する抗体を表す。しかしながら、本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＥ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな突然変異導入若しくは部位特異的突然変異導入によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含有し得る。本発明の組み換えヒト抗体は可変領域を有し、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する定常領域も含有し得る（Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照。）。しかしながら、特定の実施形態によれば、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列のＶＨ及びＶＬ配列に関連し、又はこれらの配列に由来するにも関わらず、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には、天然に存在しない配列であるように、インビトロ突然変異導入（又は、ヒトＩｇ配列のためにトランスジェニックである動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異導入）に供される。特定の実施形態によれば、この種の組み換え抗体は、選択的な突然変異導入又は逆突然変異又は両者の結果である。好ましくは、突然変異導入は、親抗体の親和性より大きい、標的に対する親和性をもたらし、及び／又は親抗体の親和性より小さい、非標的構造に対する親和性をもたらす。
【０１４４】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖の可変領域に対する配列並びに別の種に由来する定常領域配列を含有する抗体を表す。
【０１４５】
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、マウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）の１つ又はそれ以上がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置換されている抗体を表す。
【０１４６】
「ヒト化された抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ又はヤギ）由来の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を含有するが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒト類似に」、すなわち、ヒト生殖系列の可変配列により類似するように改変された抗体を表す。ヒト化抗体の１つの種類は、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列がヒト以外のＶＨ及びＶＬ配列中に挿入されているＣＤＲ移植抗体である。
【０１４７】
「Ｋａｂａｔ番号」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。本分野において認められているこれらの用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基に比べて、より可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に付番するシステムを表す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＮＯ．９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超過片領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５及びＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０２にわたる。軽鎖可変領域の場合、超過片領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６及びＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７にわたる。
【０１４８】
本明細書において使用される「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードする抗体又は核酸配列を表す。幾つかの実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域を提供し、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の１つ又はそれ以上を提供し、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。具体的な実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。本実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１つ又はそれ以上の特定の位置に存在しない少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも１０のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、本分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）に由来し、又はこれらから取得され得る。
【０１４９】
本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を表す。重鎖及び軽鎖の各可変領域中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、各可変領域に対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と表記される。本明細書において使用される「ＣＤＲセット」という用語は、抗原を結合することが可能な単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を表す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによって記載された系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１））は、抗体の何れの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを画する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）ａｎｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、ＫａｂａｔＣＤＲ内のある種の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３（「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を表記する。）と表記された。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称される場合があり、これは、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを画する他の境界は、Ｐａｄｌａｎによって記載されている（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１３３−１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  ＭｏｌＢｉｏｌ  ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））。さらに別のＣＤＲ境界定義は、上記系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、ＫａｂａｔＣＤＲと重複するが、それらは、特定の残基又は残基の群又はＣＤＲ全体さえ、抗原結合に著しい影響を与えないという予測又は実験的な発見に照らして、短縮又は延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａ定義されたＣＤＲを使用する。
【０１５０】
本明細書において使用される「標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２）、何れも、参照により、本明細書中に組み込まれる。）によって定義される所定の標準的なＣＤＲ構造を規定するＣＤＲ又はフレームワーク中の残基を表す。Ｃｈｏｔｈｉａらによれば、多くの抗体のＣＤＲの重大な一部は、アミノ酸配列のレベルでの大きな多様性に関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を有する。各標準的な構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続するセグメントに対して、ペプチド骨格ねじれ角の群を主に指定する。
【０１５１】
本明細書で使用される「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する抗体を表す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域がそこから取得され、又は由来する抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体という文脈において、「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を表す。
【０１５２】
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残りの配列を表す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なる系を用いて決定され得るので、フレームワーク配列の意義は、これに対応して、異なる解釈に供せられる。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）は、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域も、各鎖上の４つの亜領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者によって表記されるように、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定の亜領域を特定せずに、フレームワーク領域は、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書において使用される１つのＦＲは、４つの亜領域の１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの亜領域の２つ又はそれ以上を表す。
【０１５３】
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、本分野において公知である。
【０１５４】
本明細書において使用される「生殖系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝的再編成及び変異をもたらす変異プロセスを経ていない非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を表す。（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０（２００１）参照）。本発明の様々な実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子は、成熟した抗体遺伝子より、種内の個体に特徴的な必須のアミノ酸配列構造を保存する傾向がより大きく、このため、その種において使用された場合に、非自己と認識される可能性がより低いという知見から生じる。
【０１５５】
本明細書において使用される「中心的な」残基という用語は、抗体、特に、ヒト化された抗体の結合特異性及び／又は親和性に対してより大きな影響を有する可変領域内のある種の残基を表す。中心的な残基には、以下の１つ又はそれ以上、ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ又はＯグリコシル化部位のいずれかであり得る。）、稀な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準的な残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基並びに可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義及び第一の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義の間で重複する領域中の残基が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、特に、目的の抗原に免疫特異的に結合し、並びにヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はそのバリアント、誘導体、類縁体若しくは断片を表す。ＣＤＲに関して、本明細書において使用される「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを表す。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の全てを実質的に含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに対応し、及びフレームワーク領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの一部も含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
【０１５７】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥなどの免疫グロブリンのあらゆるクラス、並びにＩｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４など（但し、これらに限定されない。）の免疫グロブリンのあらゆる亜クラスから選択することが可能である。
【０１５８】
ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、当該部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれかに正確に対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって変異され得る。好ましい実施形態において、このような変異は、しかしながら、大規模なものではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％は、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに対応する。本明細書で使用される「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を表す。本明細書において使用される「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリー中の最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を表す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７を参照されたい。）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリー内で当該位置において最も頻繁に存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しい頻度で存在する場合には、何れも、コンセンサス配列中に含まれ得る。
【０１５９】
本明細書において使用される「Ｖｅｒｎｉｅｒ」ゾーンとは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって記載されているように、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への適合性を微調整し得るフレームワーク残基のサブセットを表す。Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン残基は、ＣＤＲの下に存在する層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に対して影響を及ぼし得る。
【０１６０】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンに特異的な結合をすることができるあらゆるポリペプチド決定基が含まれる。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホリルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある種の実施形態において、特異的な三次元構造的特徴及び／又は特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープとは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある種の実施形態において、抗体が、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原を優先的に認識する場合に、抗体は抗原を特異的に結合すると称される。
【０１６１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語は、２つ又はそれ以上のヌクレオチド（リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態）のポリマー形態を意味する。本用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含むが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１６２】
本明細書において使用される「単離されたポリペプチド」という用語は、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成起源又はこれらのいずれかの組み合わせの）ポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、「単離されたポリヌクレオチド」が本来一緒に見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部と会合していないか、本来連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されている、又はより大きな配列の一部として本来存在しない。
【０１６３】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を表すものとする。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡ表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここにおいて、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクターなどの（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）発現ベクターのこのような他の形態を含むものとする。
【０１６４】
「作用可能に連結された」という用語は、記載された成分がそれらを所期の様式で機能させることができる関係にある併置を表す。コード配列に対して「作用可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるように接続されている。「作用可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現調節配列及び目的の遺伝子を調節するように、トランスで又は離れて作用する発現調節配列の両方を含む。本明細書において使用される「発現制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現及びプロセッシングを実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を表す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び所望であれば、タンパク質分泌を増強させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセッシングに不可欠である成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合対配列も含むことが可能である。
【０１６５】
本明細書において記載される「形質転換」とは、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る全てのプロセスを表す。形質転換は、本分野で周知の様々な方法を用いて、自然の条件又は人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞中へ外来核酸配列を挿入するためのいずれかの公知の方法に依拠し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェション及び粒子照射を含み得るが、これらに限定されない。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとして、又は宿主染色体の一部として、その中で複製することできる安定に形質転換された細胞が含まれる。それらには、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、限られた時間、一過性に発現する細胞も含まれる。
【０１６６】
本明細書において使用される「組換え宿主細胞」（又は単に、「宿主細胞」）という用語は、外来ＤＮＡがその中に導入されている細胞を表すものとする。このような単語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表すことを理解すべきである。突然変異又は環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲に、なお含まれる。好ましくは、宿主細胞には、生物の界のいずれかから選択される原核及び真核細胞が含まれる。好ましい真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が含まれる。最も好ましくは、宿主細胞には、原核細胞株イー・コリ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９及び真菌細胞サッカロミセス・セレビシアエが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６７】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に対しては標準的な技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の説明書に従って、又は本分野で一般的に遂行されているように、又は本明細書に記載されているように、実施され得る。一般に、先述の技術及び手順は、本分野で周知の慣用的な方法に従い、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的参考文献及びより具体的な参考文献中に記載されているように実施され得る。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．（１９８９））」（参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０１６８】
本分野において公知であり、本明細書において使用される「トランスジェニック生物」は、導入遺伝子を含有する細胞を有する生物を表し、生物（又は生物の先祖）中に導入された導入遺伝子は、当該生物中で天然には発現されていないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」とは、トランスジェニック生物がそこから発達する細胞のゲノム中に安定に及び作用可能に組み込まれており、トランスジェニック生物の１つ又はそれ以上の細胞種又は組織中で、コードされた遺伝子産物の発現を誘導するＤＮＡ構築物である。
【０１６９】
本発明の抗体を作製する方法は、以下に記載されている。本明細書では、インビボアプローチ、インビトロアプローチ又は両方の組み合わせの間で、区別が為される。
【０１７０】
本発明の抗体を作製する幾つかの方法が、以下に記載されている。本明細書では、インビボアプローチ、インビトロアプローチ又は両方の組み合わせの間で、区別が為される。
【０１７１】
インビボアプローチ
所望される抗体の種類に応じて、インビボ免疫化のために様々な宿主動物を使用し得る。それ自体、目的の抗原の内在性様式を発現している宿主が使用され得る。あるいは、目的の抗原の内在性様式が欠乏された宿主を使用することが可能である。例えば、対応する内在遺伝子における相同的組み換えを介して、特定の内在性タンパク質が欠乏されたマウス（すなわち、ノックアウトマウス）は、マウスを免疫化した当該タンパク質に対して液性応答を生成し、従って、該タンパク質に対する高親和性モノクローナル抗体の作製のために使用できることが示されている（例えば、Ｒｏｅｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：２３１−２３７；Ｌｕｎｎ，  ＭＰ．  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：４０４−４１２を参照されたい）。
【０１７２】
本発明の非ヒト抗体を作製するために、複数のヒト以外の哺乳動物が、抗体産生のための適切な宿主である。これらには、マウス、ラット、ニワトリ、ラクダ科の動物、ウサギ、ヒツジ及びヤギ（及びこれらのノックアウト様式）が含まれるが、ハイブリドーマの作製のためには、マウスが好ましい。さらに、ヒト抗体レパートリーを発現している非ヒト宿主動物は、二重特異性を有するヒト抗原に対してヒト抗体を実質的に作製するために使用され得る。この種の非ヒト動物には、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）（キメラｈｕ−ＰＢＭＣＳＣＩＤマウス）及び、以下でより詳しく記載されているヒト／マウス照射キメラが含まれる。
【０１７３】
一実施形態によれば、ヒト以外の哺乳動物が抗原刺激時にヒト抗体を作製するように、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体で免疫化された動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のためにトランスジェニックとなっているヒト以外の哺乳動物、好ましくはマウスである。典型的には、ヒト生殖系列配置を有する重鎖及び軽鎖のための免疫グロブリン導入遺伝子は、それらの内在性重鎖及び軽鎖遺伝子坐が不活性であるように改変されたこのような動物中に導入される。このような動物が抗原で（例えば、ヒト抗原で）刺激されると、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体（ヒト抗体）が産生される。標準化されたハイブリドーマ技術を用いて、このような動物ヒトモノクローナル抗体のリンパ球から作製することが可能である。ヒト免疫グロブリンを有するトランスジェニックマウス及びヒト抗体の作製におけるそれらの使用のさらなる記載については、例えば、ＵＳ５，９３９，５９８、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３及びＷＯ９９／５３０４９（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）、及びＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＵＳ５，８１４，３１８、ＵＳ５，８７７，３９７及びＷＯ９９／４５９６２（Ｇｅｎｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）を参照されたい。「ＭａｃＱｕｉｔｔｙ，Ｊ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１８８；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｆ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ、Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ、Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．（１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５；Ｇｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：４０１−４１０；Ｇａｌｌｏ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５３４−５４０も参照されたい。
【０１７４】
別の実施形態によれば、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体で免疫されている動物は、ヒト末梢血単核球若しくはリンパ球系細胞又はこれらの前駆体で再構築された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスであり得る。証明されているように、キメラｈｕ−ＰＢＭＣＳＣＩＤマウスと称されるこのようなマウスは、抗原刺激をすると、ヒト免疫グロブリン応答を産生する。これらのマウス及び抗体を作製するためのそれらの使用のさらなる記述については、例えば、Ｌｅａｄｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７６：２２９−２３４；Ｂｏｍｂｉｌ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９５：３６０−３７５；Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３３−２４１；Ｈｅｒｚ，Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．１１３：１５０−１５２；Ａｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３９３−１４０３；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７；Ａｒａｉ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１７：７９−８５；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ａｒａｉ，  Ｋ．（１９９８）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：４１−４５；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｗ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １８：１２１−１２９；Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：２２−２７；Ｓｍｉｔｈｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１１３−１２４；Ｃｈａｍａｔ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ１８０：２６８−２７７；ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．５：３５−４５を参照されたい。
【０１７５】
別の実施形態によれば、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体で免疫されている動物は、全身照射の致死線量で処理された後、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスから得られた骨髄細胞で照射から保護され、続いて、機能的ヒトリンパ球で移植されたマウスである。目的の抗原で前記マウスを免疫化し、次いで、標準化されたハイブリドーマ技術を使用することによってモノクローナル抗体を作製することによって、ヒトモノクローナル抗体を作製するために、Ｔｒｉｍｅｒａ系と称されるキメラのこの種類が使用される。これらのマウス及び抗体を作製するためのそれらの使用のさらなる記載については、例えば、Ｅｒｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：１５４−１６１；Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ  ａｎｄ  Ｄａｇａｎ，Ｓ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２−２４６；Ｎａｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：５５３−５６２；ａｎｄ  Ｂｏｃｈｅｒ，  Ｗ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９６：６３４−６４１を参照されたい。
【０１７６】
インビボ生成された抗体産生細胞から開始して、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されたハイブリドーマ技術などの標準化された技術を用いて、モノクローナル抗体を作製し得る（１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）ＰＮＡＳ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照されたい。）。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は、十分に公知である（Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，  ３：２３１−３６）。要約すれば、不死化された細胞株（典型的には、骨髄腫）は、本発明のＡβグロブロマー又はその誘導体で免疫された哺乳動物のリンパ球（典型的には、脾細胞又はリンパ節細胞又は末梢血リンパ球）と融合され、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングする。この目的のために、リンパ球及び不死化された細胞株を融合するための多くの周知のプロトコールのうち何れをも使用することが可能である（Ｇ．  Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，  上で引用；Ｌｅｒｎｅｒ，  Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，上で引用；Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，上で引用）。さらに、当業者は、同様に有用であるこのような方法の多様な変形が存在することを理解する。典型的には、不死化された細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種から得られる。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウスから得られたリンパ球を、不死化されたマウス細胞株と融合することによって確立され得る。好ましい不死化された細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含有する培地に対して感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。骨髄腫細胞株の多数のいずれか、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株を、融合対として、当初から使用し得る。これらの骨髄腫細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手することができる。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、マウス脾細胞に融合される。次いで、ＨＡＴ培地を使用し、これにより、融合されていない骨髄腫細胞及び非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させることによって（融合されていない脾細胞は形質転換されていないので、数日後に死亡する。）、融合から得られたハイブリドーマ細胞株を選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、上に定義されているように結合親和性を有する抗体を選択するために、上に及び実施例８に記載されているドットブロットアッセイを用いることによって、このような抗体に対してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって同定される。
【０１７７】
モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１及び３Ｂ１０の全ては、上記インビボアプローチを用いて作製され、本明細書に記載されているハイブリドーマから取得することができる。
【０１７８】
同様に、前記ハイブリドーマは、以下でさらに詳しく記載されているように、本発明の抗体を組み換え的に産生するために、軽鎖及び／又は重鎖をコードする核酸の源として使用することができる。
【０１７９】
インビトロアプローチ
免疫化及び選択によって本発明の抗体を作製する別の方法として、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体で、組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングし、これにより、必要とされる結合親和性を有する免疫グロブリンライブラリーの要素を単離することによって、本発明の抗体を同定及び単離し得る。ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（Ｒ）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。多くの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリー又はＦａｂライブラリーである。組み換え抗体ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ技術は、十分に記載されている。抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするために特に有利に使用することができる方法及び化合物の例は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＷＯ９２／０１０４７、ＵＳ５，９６９，１０８及びＥＰ  ５８９  ８７７（特に、ｓｃＦｖディスプレイを記載する。）、ＬａｄｎｅｒらＵＳ５，２２３，４０９、ＵＳ５，４０３，４８４、ＵＳ５，５７１，６９８、ＵＳ５，８３７，５００及びＥＰ４３６５９７（例えば、ｐＩＩＩ融合を記載する。）；ＤｏｗｅｒらＷＯ９１／１７２７１、ＵＳ５，４２７，９０８、ＵＳ５，５８０，７１７及びＥＰ５２７８３９（特に、Ｆａｂディスプレイを記載する。）；ＷｉｎｔｅｒらＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ９２／２０７９１及びＥＰ３６８，６８４（特に、可変免疫グロブリンドメインに対する配列のクローニングを記載する。）；ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらのＵＳ５，８８５，７９３及びＥＰ５８９８７７（特に、組み換えライブラリーを使用することによる、ヒト抗原に対するヒト抗体の単離を記載する。）；ＧａｒｒａｒｄらＷＯ９２／０９６９０（特に、ファージ発現技術を記載する。）；ＫｎａｐｐｉｋらＷＯ９７／０８３２０（ヒト組み換え抗体ライブラリーＨｕＣａＩを記載する。）；ＳａｌｆｅｌｄらＷＯ９７／２９１３１（ヒト抗原（ヒト腫瘍壊死因子α）に対する組み換えヒト抗体の産生及び組み換え抗体のインビトロ親和性成熟を記載する。）及びＳａｌｆｅｌｄらのＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．６０／１２６，６０３及びこれらを基礎とする特許出願（同様に、ヒト抗原（ヒトインターロイキン−１２に対する組み換えヒト抗体の作製及び組み換え抗体のインビトロ親和性成熟を記載する。）に見出すことができる。
【０１８０】
組み換え抗体ライブラリーのスクリーニングのさらなる記述は、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６などの科学的な刊行物中に見出される。
【０１８１】
バクテリオファージディスプレイ系の使用に代えて、組み換え抗体ライブラリーは、酵母細胞又は細菌細胞の表面上に発現され得る。ＷＯ９９／３６５６９は、酵母細胞の表面上に発現されたライブラリーを調製し、スクリーニングする方法について記載する。ＷＯ９８／４９２８６は、細菌細胞の表面上に発現されたライブラリーを調製し、スクリーニングする方法についてさらに詳しく記載する。
【０１８２】
全てのインビトロアプローチにおいて、所望の特性を有する組み換え抗体を濃縮するための選択方法は、該方法の不可欠な部分を形成し、これは、一般的に、「パニング」と呼ばれ、しばしば、そのマトリックスに標的構造が付着されたカラム上のアフィニティークロマトグラフィーの形態を採る。次いで、好ましくは、上に及び実施例８に記載されているように、標準化されたドットブロットアッセイを用いて、有望な候補分子を、それらの絶対的及び／又は相対的親和性の個別的測定に供する。
【０１８３】
コンビナトリアルライブラリーの目的の抗体が一旦同定され、十分に性質決定されたら、前記抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ配列は、標準化された分子生物学的技術を用いて、例えば、ライブラリースクリーニングの間に単離されたディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）からのＤＮＡのＰＣＲ増幅を用いて単離される。ＰＣＲプライマーを調製するために使用し得る軽及び重抗体鎖に対する遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者に公知である。このような配列の複数が、例えば、「Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２」及びヒト生殖系列ＶＢＡＳＥの配列のデータベースに記載されている。
【０１８４】
本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞中で、軽及び重免疫グロブリン鎖に対する遺伝子を組み換え的に発現することによって作製され得る。抗体を組換え的に発現させるために、前記抗体の軽及び重免疫グロブリン鎖をコードすることにより、宿主細胞中の軽鎖及び重鎖を発現し、好ましくは前記宿主細胞がその中で培養されている培地中にそれらを分泌するＤＮＡ断片を担持する１つ又はそれ以上の組換え発現ベクターで、宿主細胞が形質移入される。抗体は、この培地から単離することが可能である。重及び軽抗体鎖に対する遺伝子を取得し、前記遺伝子を組み換え発現ベクター中に挿入し、前記ベクターを宿主細胞中に導入するために、標準化された組み換えＤＮＡ法が使用される。この種の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，（１９８９），  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓらのＵＳ４，８１６，３９７号に記載されている。
【０１８５】
目的の抗体のＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が取得されたら、該ＤＮＡ断片は、例えば、可変領域に対する遺伝子を完全長抗体鎖に対する遺伝子に、Ｆａｂ断片に対する遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準化された組み換えＤＮＡ技術を用いてさらに操作され得る。これらの操作は、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片を、別のタンパク質、例えば、定常抗体領域又は柔軟なリンカーをコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結することを含む。本明細書において、「作用可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列が翻訳領域内部に保たれるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味することを理解すべきである。
【０１８６】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨ領域をコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）に作用可能に連結することによって、完全長重鎖に対する遺伝子へと変換し得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、及び前記領域を包含するＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅を用いて取得し得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤから得られる定常領域であり得、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来の定常領域が好ましい。重鎖Ｆａｂ断片に対する遺伝子を得るために、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖定常領域ＣＨ１のみをコードする別のＤＮＡ分子へ作用可能に連結され得る。
【０１８７】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって、完全長軽鎖に対する遺伝子（及びＦａｂ軽鎖に対する遺伝子）へと変換され得る。ヒト軽鎖の定常領域の遺伝子の配列は、周知であり（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、前記領域を包含するＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅を用いて取得し得る。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得るが、κ定常領域が好ましい。
【０１８８】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現され、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーを介して互いに連結されるように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟なリンカー（例えば、アミノ酸（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３）をコードする別の断片へ、作用可能に連結され得る（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４参照）。
【０１８９】
上記結合親和性を有する単一のドメインＶＨ及びＶＬは、上記方法によって、単一ドメインライブラリーから単離され得る。所望の結合活性を有する２つのＶＨ単一ドメイン鎖（ＣＨ１あり又はなし）又は２つのＶＬ鎖又は１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖の対は、本発明の抗体に対して本明細書に記載されているように有用であり得る。
【０１９０】
本発明の組換え抗体又は抗体部分を発現させるために、遺伝子が適切な転写調節配列及び翻訳調節配列へ作用可能に連結されるように、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは発現ベクター中に挿入され得る。この文脈において、「作用可能に連結された」という用語は、ベクター内の転写調節配列及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するという所期の機能を充足するように、抗体遺伝子がベクター中に連結されていることを意味するものと理解すべきである。
【０１９１】
都合よく、発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合的であるように選択される。抗体軽鎖に対する遺伝子及び抗体重鎖に対する遺伝子は、別個のベクター中に挿入され得、又は両遺伝子は同一の発現ベクター中に挿入され、これが通常の事例である。抗体遺伝子は、標準化された方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限切断部位の連結によって、又は制限切断部位が存在しなければ、平滑末端連結の連結によって）を用いて発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは、軽鎖及び重鎖に対する配列の挿入の前に、抗体定常領域に対する配列を既に担持し得る。例えば、１つのアプローチは、ＶＨ及びＶＬ配列を、それぞれ、重鎖及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクター中に挿入し、これにより、ベクター内において、ＶＨセグメントをＣＨセグメントに作用可能に連結し、また、ベクター内において、ＶＬセグメントをＣＬセグメントへ作用可能に連結することによって、ＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子に変換することである。
【０１９２】
これに加えて又はこれに代えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。前記抗体鎖に対する遺伝子をベクター中にクローニングし、これにより、抗体鎖に対する遺伝子のＮ末端へ、翻訳領域内にシグナルペプチドを連結し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。抗体鎖に対する遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖に対する遺伝子の発現を調節する制御配列を有し得る。
【０１９３】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖に対する遺伝子の転写又は翻訳を調節するさらなる発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。この種の制御配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）」に記載されている。当業者は、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現強度などの要因に依存し得ることを理解する。哺乳動物宿主細胞中での発現のための好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及びエンハンサーなど、哺乳動物細胞中で強く、恒常的タンパク質発現をもたらすウイルス要素が含まれる。ウイルス制御要素及びその配列のさらなる記述については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉに対するＵＳ５，１６８，０６２、Ｂｅｌｌらに対するＵＳ４，５１０，２４５及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらに対するＵＳ４，９６８，６１５を参照されたい。
【０１９４】
抗体鎖に対する遺伝子及び制御配列以外に、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子など、さらなる配列を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらに対するＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ  ４，３９９，２１６、４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７を参照されたい。）。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが挿入される宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの細胞毒性薬に対する耐性を付与するのが一般的である。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に対する遺伝子及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０１９５】
軽鎖及び重鎖を発現させるために、前記重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準化された技術を用いて、宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多数の技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞の何れの中でも、本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞、特に、哺乳動物細胞中では、原核細胞中に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を集合及び分泌する確率がより高いので、真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞中で抗体を発現させることが好ましい。抗体遺伝子の原核発現は、活性な抗体の高い収率の産生には有効でないことが報告されている（Ｂｏｓｓ，  Ｍ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，  Ｃ．  Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０１９６】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されており、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ−選択可能マーカーとともに使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入すると、抗体が前記宿主細胞中で発現されるまで、又は、好ましくは、宿主細胞がその中で増殖している培地中に抗体が分泌されるまで、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。次いで、抗体は、標準化されたタンパク質精製方法を用いることによって、培地から単離され得る。
【０１９７】
同様に、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子など、完全な状態の抗体の部分を作製するために、宿主細胞を使用することが可能である。上記操作の変形は、もちろん、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両鎖ではない。）をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質移入することが望ましい場合があり得る。目的の抗原の結合のために必要とされない軽鎖又は重鎖が存在する場合には、このような軽鎖又はこのような重鎖又は両鎖をコードするＤＮＡは、組み換えＤＮＡ技術を用いて、部分的に又は完全に除去され得る。このような末端切断されたＤＮＡ分子によって発現された分子は、同様に、本発明の抗体に含まれる。さらに、標準化された化学法を用いて本発明の抗体を第二の抗体に架橋することによって、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、並びに他の重鎖及び他の軽鎖が、目的の抗原とは異なる抗原に対して特異性を有する二機能性抗体を作製することが可能である。
【０１９８】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現用の好ましい系では、リン酸カルシウムによって媒介された形質移入を用いて、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び抗体軽鎖に対する遺伝子は、各事例において、前記遺伝子の強い転写を実施するために、制御ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター要素へ作用可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を使用することによって、ベクターで形質移入されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を選択するために使用可能なＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された被形質転換宿主細胞は、重及び軽抗体鎖が発現され、完全な状態の抗体が培地から単離されるように培養される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、前記宿主細胞を培養し、培地から抗体を得るために、標準化された分子生物学的技術が使用される。従って、本発明は、本発明の組み換え抗体が合成されるまで、適切な培地中で、本発明の宿主細胞を培養することによって、本発明の組み換えタンパク質を合成する方法に関する。本方法は、前記培地から前記組み換えタンパク質を単離することをさらに含み得る。
【０１９９】
ファージディスプレイによって、組み換え抗体ライブラリーをスクリーニングする代わりに、巨大なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして本発明の抗体を同定するために、当業者に公知の他の方法を使用し得る。基本的には、核酸と該核酸によってコードされる抗体との間の密接な物理的連結が確立され、及び核酸配列がコードする抗体の特性によって適切な核酸配列を選択するために使用され得る全ての発現系を使用し得る。
【０２００】
別の発現系の１つの種類において、組み換え抗体ライブラリーは、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓに対するＷＯ９８／３１７００並びに「Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｒ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２」に記載されているように、ＲＮＡ−タンパク質融合物の形態で発現される。この系では、３’末端上にピューロマイシン（ペプチジルアクセプター抗生物質）を担持する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、ｍＲＮＡ及びこれによってコードされるペプチド又はタンパク質の共有的融合をもたらす。従って、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）の特定のｍＲＮＡは、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体への前記抗体又は前記その部分の結合など、コードされるペプチド又はタンパク質の（例えば、抗体又はその部分の）特性に基づいて濃縮され得る。抗体又はその部分をコードし、このようなライブラリーのスクリーニングによって得られる核酸配列は、上述のように（例えば、哺乳動物宿主細胞中で）組み換え手段によって発現され得、さらに、さらなるラウンドにおいてｍＲＮＡ−ペプチド融合をスクリーニングし、最初に選択された配列中に変異を導入することによって、又は上述のように組み換え抗体のインビトロ親和性成熟の他の方法を用いることによって、さらなる親和性成熟に供され得る。
【０２０１】
インビボとインビトロアプローチの組み合わせ
同様に、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体を、まず、インビボで、宿主動物中の抗体レパートリーに対して作用させて、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又は誘導体結合抗体の産生を刺激した後、１つ又はそれ以上のインビトロ技術の補助を得て、さらなる抗体選択及び／又は抗体成熟（すなわち、最適化）が達成される方法など、インビボとインビトロアプローチの組み合わせを使用することによって、本発明の抗体を作製し得る。一実施形態によれば、この種の組み合わされた方法は、まず、抗原に対する抗体応答を刺激するために、前記Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体でヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ若しくはヤギ又はそのトランスジェニック様式又はキメラマウス）を免疫化し、次いで、前記Ａβ（２０−４２）グロブロマー又は誘導体の作用によってインビボで刺激されたリンパ球の免疫グロブリン配列を使用することによって、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを調製及びスクリーニングすることを含み得る。この組み合わされた操作の第一の工程は、インビボアプローチと組み合わせて上記の様式で実施し得るのに対して、この操作の第二の工程は、インビトロアプローチと組み合わせて上記の様式で実施し得る。前記刺激されたリンパ球から調製されたファージディスプレイライブラリーのその後のインビトロスクリーニングによって非ヒト動物を過免疫化する好ましい方法には、ＢｉｏＳｉｔｅ  Ｉｎｃによって記載される方法が含まれ、例えば、ＢｉｏＳｉｔｅＩｎｃ．，ＷＯ９８／４７３４３、ＷＯ９１／１７２７１、ＵＳ５，４２７，９０８及びＵＳ５，５８０，７１７を参照されたい。
【０２０２】
別の実施形態によれば、組み合わされた方法は、まず、本発明のＡβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体に対する抗体応答を刺激するために、本発明のＡβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体でヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ、ヤギ又はそのノックアウト及び／又はトランスジェニック様式又はキメラマウス）を免疫化し、（例えば、免疫化された動物から調製された）ハイブリドーマをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体を作製するリンパ球を選択することを含む。抗体又は単一ドメイン抗体に対する遺伝子は、（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応などの標準化されたクローニング方法を用いて）選択されたクローンから単離され、選択された１つ又は複数の抗体の結合特性を改善するために、インビトロアフィニティー成熟に供される。この操作の第一の工程は、インビボアプローチに関連する上記様式で実施され得るのに対して、この操作の第二の工程は、特に、ＷＯ９７／２９１３１及びＷＯ００／５６７７２に記載されているものなど、インビトロアフィニティー成熟の方法を用いることによって、インビトロアプローチに関連して上述されている様式で実施され得る。
【０２０３】
さらなる組み合わされた方法において、組み換え抗体は、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ；ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）として当業者に公知であり、Ｕ．Ｓ．５，６２７，０５２、ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ，  Ｊ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載されている操作を使用することによって、個別の単離されたリンパ球から作製される。この方法において、まず、オリゴマー又は誘導体への免疫応答を刺激するために、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はその誘導体で、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ、ヤギ又はそのトランスジェニック様式、又はキメラマウス）をインビボで免疫化し、次いで、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いることによって、目的の抗体を分泌する個別の細胞を選択する。この目的のために、グロブロマー又はその誘導体又は構造的に関連する目的の分子は、ビオチンなどのリンカーを用いて、ヒツジ赤血球に結合され、これにより、溶血プラークアッセイを使用することによって、適切な特異性を有する抗体を分泌する個別の細胞を同定することを可能とし得る。目的の抗体を分泌する細胞の同定に続き、逆転写酵素ＰＣＲによって、軽鎖及び重鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを細胞から取得し、次いで、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞中で、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）に付随して、前記可変領域を発現し得る。インビボで選択されたリンパ球に由来する増幅された免疫グロブリン配列で形質移入された宿主細胞は、次いで、例えば、結合親和性を有する抗体を発現する細胞を単離するために、形質移入された細胞を伝播されることによって、さらなるインビトロ分析及びインビボ選択に供され得る。増幅された免疫グロブリン配列は、さらに、インビトロで操作され得る。
【０２０４】
本明細書に定義されている必要とされる親和性を有する抗体は、実質的に上述されているドットブロットを実施することによって選択することができる。簡潔に述べると、系列希釈して、抗原を固体マトリックスに付着させ、好ましくはニトロセルロース膜上にドット状に添加する。次いで、固定化された抗原を目的の抗体と接触させた後、酵素連結された二次抗体を用いて抗体の検出及び比色反応を行う。所定の抗体及び抗原濃度で、結合された抗体の量が、アフィニティー測定を可能とする。従って、１つの標的への２つの異なる抗体の相対親和性又は２つの異なる標的への１つの抗体の相対親和性は、本明細書において、その他は同一のドットブロット条件下で、２つの抗体−標的組み合わせを用いて観察された標的結合された抗体のそれぞれの量の関係として定義される。
【０２０５】
モノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１、７Ｃ６、４Ｂ７、６Ａ２、２Ｆ２、４Ｄ１０、７Ｅ５、１０Ｃ１又は３Ｂ１０と同一のエピトープに結合する抗体は、それ自体公知の様式で取得することが可能である。
【０２０６】
上記抗体が競合され得るのと同様に、本明細書において、これらの構造の少なくとも１つが、好ましくは、重複するエピトープ又は同一のエピトープ、より好ましくは、同一のエピトープを提供することによって、別の構造の測定可能な結合を特異的に低下させることができれば、本明細書において、異なる標的構造は、特定の抗体に対して「競合する」と称される。
【０２０７】
標的実体との競合は、このような標的構造に対するそれらの相対親和性によって抗体を直接的に選択するのに有用である。従って、競合実体、例えば、異なって標識された競合構造の区別可能な形態を目的の抗体と接触させ、抗体によって結合されるこれらの実体の相対的量から、これらの実体の各々に対する抗体の相対親和性を推定する競合アッセイを使用することによって、相対的親和性を直接測定し得る。
【０２０８】
より大きな親和性が望まれる実体を固体マトリックス支持体に付着させ、培地に対してより小さな親和性が望まれる競合実体の適切な量、好ましくは、モル過剰を添加することによって、標的実体に対する所望の相対親和性を有する抗体を直接濃縮するために、このような競合を使用し得る。従って、所望の相対親和性を示す抗体は、他の抗体より強くマトリックスに結合する傾向があり、例えば、低い塩濃度で洗浄した後、高い塩濃度を使用することにより、結合した抗体をその標的から可逆的に剥離させることによって、結合した抗体を採集することによって、より望ましくない形態を洗浄した後に取得され得る。所望であれば、濃縮を数回繰り返して実施し得る。例えば、ハイブリドーマ又は抗原を提示するファージ又は酵母細胞のプール中で、抗体の基礎を成す遺伝子型がこの抗体に物理的に関連付けられている本発明の特定の実施形態では、対応する表現型が救出され得る。
【０２０９】
本発明の別の実施形態において、抗体の相対的親和性が固定化された抗原に結合されたパーセントから推測できるように、抗体結合に関して、固定化された抗原が溶解された実体と競合する修飾されたドットブロットが使用される。
【０２１０】
パパイン又はペプシンでの消化など慣用技術を使用することによって、完全な抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を作製し得る。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、標準化された組み換えＤＮＡ技術を使用することによって取得し得る。
【０２１１】
本発明は、本発明の抗体を含み、医薬として適切な担体を場合によって含む薬剤（組成物）にも関する。本発明の医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、その緩和のために本発明の抗体が有用である疾病の治療のための１つ又はそれ以上のさらなる治療剤を含有し得る。例えば、本発明の抗体が本発明のグロブロマーに結合する場合には、医薬組成物は、さらに、前記グロブロマーの活性が重要である疾患の治療に有用である１つ又はそれ以上の追加の治療剤を含有し得る。
【０２１２】
医薬として適切な担体には、生理的に適合性がある限り、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬として許容される担体には、例えば、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの及びこれらの組み合わせが含まれる。多くの場合、さらに、等張剤、例えば、糖、マニトール若しくはソルビトールなどの多価アルコール又は塩化ナトリウムを使用することが好ましい。医薬として適切な担体は、抗体の半減期又は効力を増強する、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの補助物質の比較的少量をさらに含有し得る。
【０２１３】
医薬組成物は、例えば、非経口投与に適切であり得る。ここで、抗体は、好ましくは、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体含量を有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、液体又は凍結乾燥された形態で調製され得、剤形は、フリントガラス又はバイアル、アンプル又は予め充填されたシリンジである。緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（１から５０ｍＭ、好ましくは、５から１０ｍＭ）を含有し得、５．０から７．０、好ましくは６．０のｐＨを有し得る。さらに、適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。０から３００ｍＭの濃度に（好ましくは、液体剤形に対して１５０ｍＭ）の溶液の毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を修飾するために、塩化ナトリウムを使用し得る。凍結乾燥された剤形に対して、凍結保護剤、例えば、スクロース（例えば、好ましくは、０から１０％、好ましくは０．５から１．０％）も含め得る。他の適切な凍結保護剤は、トレハロース及びラクトースである。凍結乾燥された剤形に対して、充填剤、例えば、マニトール（例えば、１から１０％、好ましくは、２から４％）も含め得る。液体及び凍結乾燥された剤形の両方に、安定化剤、例えば、Ｌ−メチオニン（例えば、５１から５０ｍＭ、好ましくは５から１０ｍＭ）を使用し得る。さらなる適切な充填剤は、グリシン及びアルギニンである。界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（例えば、０から０．０５％、好ましくは、０．００５から０．０１％）も使用し得る。さらなる界面活性剤は、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤である。
【０２１４】
本発明の組成物は、多様な形態を有し得る。これらには、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。好ましい形態は、予定される投与の種類及び治療用途に依存する。典型的には、注射可能溶液又は注入可能溶液の形態の組成物、例えば、ヒトの受動免疫のための他の抗体と類似する組成物が好ましい。投与の好ましい経路は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内）である。好ましい実施形態によれば、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態によれば、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０２１５】
治療組成物は、典型的には、調製及び保存条件下で、無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム又は活性物質の高濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化され得る。無菌注射可能溶液は、適宜、必要であれば、上記成分の１つ又は組み合わせとともに、必要な量で、適切な溶媒中に活性化合物（すなわち、抗体）を導入し、次いで、前記溶液を滅菌ろ過することによって調製され得る。通常、分散液は、塩基性分散媒、及び、適宜、その他の必要とされる成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を導入することによって調製される。無菌注射可能溶液を調製するための凍結乾燥された無菌粉末の場合には、予め滅菌ろ過された溶液から、活性成分の粉末、及び、適宜、さらなる所望の成分の粉末を産生する真空乾燥及び粉末乾燥が好ましい調製方法である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には、必要な粒径を維持することによって、又は界面活性剤を使用することによって維持し得る。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中にさらに導入することによって実現され得る。
【０２１６】
本発明の抗体は、当業者に公知の多数の方法によって投与され得るが、多くの治療用途に対して好ましい投与の種類は、皮下注射、静脈内注射又は注入である。当業者は、投与の経路及び／又は種類は、所望される結果に依存することを理解する。特定の実施形態によれば、活性化合物は、例えば、インプラント、経皮膏薬及び微小封入された放出系を含む持続的な放出又は調節された放出を有する製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生物分解可能な生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を調製する方法は、当業者に周知であり、例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８」を参照されたい。
【０２１７】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、例えば、不活性希釈剤又は代謝可能な食用担体中に入れて、経口投与され得る。また、抗体（及び、所望であれば、さらなる成分）を、硬若しくは軟ゼラチンカプセル中に封入し、錠剤へと圧縮し、又は食物に直接添加し得る。経口治療的投与の場合、抗体は、賦形剤と混合され得、経口錠剤、口腔錠、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップなどの形態で使用され得る。非経口経路以外の経路を介して本発明の抗体を投与することが予定される場合には、その不活化を妨げる材料からコーティングを選択することが必要であり得る。
【０２１８】
本発明は、アミロイドβタンパク質が関与しており、及び、特に、本発明のグロブロマーの活性が重要である疾患に罹患している個体中の本発明のグロブロマーの活性を阻害する方法にも関する。抗体が結合するグロブロマーの活性を阻害する目的で、前記方法は、本発明の少なくとも１つの抗体を個体に投与することを含む。前記個体は、好ましくは、ヒトである。本発明の抗体は、治療目的のために、ヒト個体に投与され得る。さらに、本発明の抗体は、獣医目的のためにヒト以外の哺乳動物に投与され得、又は、特定の疾患に対する動物モデルの枠組み内に投与され得る。このような動物モデルは、（例えば、投与の用量及び時間を検査するために）本発明の抗体の治療的効力を評価するのに有用であり得る。
【０２１９】
本発明のグロブロマーが役割を果たしている疾患には、特に、その発達及び／又は進行に、本発明のグロブロマーが関与している疾患が含まれる。これらは、特に、本発明のグロブロマーが、明らかに又はおそらく、疾患の病態生理の原因であり、又は前記疾患の発達及び／又は進行に寄与している因子である疾患である。従って、本発明のグロブロマーの活性の阻害が疾患の症候及び／又は進行を緩和させることができるこれらの疾患が本明細書に含まれる。このような疾患は、例えば、特定の疾患に罹患している個体の生物学的液体中の本発明のグロブロマーの増加された濃度（例えば、血清、血漿、ＣＳＦ、尿中などの増加された濃度）によって確認することができる。これは、例えば、本発明の抗体を使用することによって検出され得る。本発明のグロブロマーは、神経変性要素、認知不全、神経毒性要素及び炎症性要素が関与する疾患の複数と関連する病理において重要な役割を果たす。
【０２２０】
本発明の別の態様において、治療又は予防可能な疾患には、アミロイドーシスを伴う疾患が含まれる。本明細書において、「アミロイドーシス」という用語は、身体の様々な組織中の特定のタンパク質（アミロイド、繊維性タンパク質及びこれらの前駆体）の異常な折り畳み、凝集塊形成、凝集及び／又は蓄積を特徴とする多数の疾患を表す。アルツハイマー病及びダウン症候群では、神経組織が冒され、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）では、血管が冒される。
【０２２１】
本発明の医薬組成物には、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」が含まれ得る。「治療的有効量」は、所望の治療的結果を達成するために必要な投薬量で、及び所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者によって決定され得、病状、年齢、性別及び個体の体重並びに抗体又は抗体部分が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、抗体又は抗体部分のあらゆる毒性効果又は有害効果が、治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、及び所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。疾病のより初期段階の前に又は疾病のより初期段階において、予防的投薬が患者に使用されるので、通例、予防的有効量は、治療的有効量を下回る。
【０２２２】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療する方法をさらに含む。この方法は、予防又は治療を実施するのに十分な量で、上記ワクチンを患者に投与する工程を含む。
【０２２３】
さらに、本発明は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を発症すると予測されている患者の能動免疫に適した化合物を同定する方法を包含する。本方法は、１）１つ又はそれ以上の化合物が１つ又は複数の抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で、上記抗体の１つ又はそれ以上に、目的の１つ又はそれ以上の化合物を曝露すること、２）前記１つ又は複数の抗体に結合する化合物を同定することを含み、同定された化合物は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を発症すると予測されている患者での能動免疫において使用される。
【０２２４】
抗体の診断的使用の枠内において、定性又は定量特異的グロブロマー測定は、特に、疾病に関連するアミロイドβ形態を診断する役割を果たす。この文脈において、特異性は、十分な感受性で、特定のグロブロマー若しくはその誘導体又はその混合物を検出できる可能性を意味する。本発明の抗体は、有利には、１０ｎｇ／ｍＬ試料未満、好ましくは、１ｎｇ／ｍＬ試料未満、及び特に好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ試料未満の検出閾値濃度を有し、少なくとも各事例に示されているｍＬ試料当りのグロブロマーの濃度、有利には、より低い濃度が、本発明の抗体によって検出可能であることを意味する。
【０２２５】
検出は、免疫学的に実施される。これは、原則として、凝集及び沈殿技術、イムノアッセイ、免疫組織学的方法並びにイムノブロット技術、例えば、ウェスタンブロッティング又は、好ましくは、ドットブロット法など、抗体が使用されるあらゆる分析又は診断アッセイ方法を使用することによって実施され得る。インビボ法では、例えば、画像化法も本発明に含まれる。
【０２２６】
イムノアッセイにおける使用が有利である。競合的イムノアッセイ（すなわち、抗原及び標識された抗原（追跡物質）が抗体結合を競合するアッセイ）及びサンドイッチイムノアッセイ（すなわち、抗原への特異的抗体の結合が、第二の、通常は標識された抗体によって検出されるアッセイ）が、ともに適切である。これらのアッセイは、均一（すなわち、固相及び液相への分離がない。）又は不均一（すなわち、結合された標識が、例えば、固相に結合された抗体を介して、結合されていない抗体から分離されている。）のいずれかであり得る。標識化及び測定の方法に応じて、様々な不均一及び均一イムノアッセイフォーマットは、特定のクラスに、例えば、ＲＩＡｓ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、ＬＩＡ（発光イムノアッセイ）、ＴＲＦＩＡ（時間分解ＦＩＡ）、ＩＭＡＣ（免疫活性化（ｉｍｍｕｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ））、ＥＭＩＴ（酵素増倍免疫検査）、ＴＩＡ（比濁イムノアッセイ）、Ｉ−ＰＣＲ（イムノ−ＰＣＲ）に分類することができる。
【０２２７】
発明のグロブロマー定量の場合、追跡物質としての役割を果たす標識されたグロブロマー誘導体の所定量が、使用されている抗体への結合について定量されるべき試料（標識されていないグロブロマーの未知の量を含有する。）のグロブロマーと競合する競合的イムノアッセイが好ましい。試料中の抗原の量、すなわち、グロブロマーの量は、標準曲線の補助を得て、置換された追跡物質の量から測定することが可能である。
【０２２８】
これらの目的のために利用可能な標識のうち、酵素は、有利であることが判明している。例えば、ペルオキシダーゼ、特に、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−Ｄガラクトシダーゼに基づく系が使用され得る。例えば、その転化が分光学的にモニターできる特異的な基質をこれらの酵素に対して利用することが可能である。適切な基質系は、アルカリホスファターゼについては、ｐ−ニトロフェニルホスファート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＰＴ）、ファーストレッド／ナフトールーＡＳ−ＴＳホスファート；ペルオキシダーゼについては、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリンー６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＴ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）；β−ガラクトシダーゼについては、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド（ｏ−ＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド及び４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）に基づく。多くの事例で、これらの基質系は、即時使用形態で、例えば、適切な緩衝液などのさらなる試薬も含有し得る錠剤の形態で市販されている。
【０２２９】
使用される追跡物質は、標識されたグロブロマーであり得る。この意味で、特定のグロブロマーは、測定されるべきグロブロマーを標識し、これを追跡物質として使用することによって測定することが可能である。
【０２３０】
追跡物質を調製するための、グロブロマーへの標識の結合は、それ自体公知の様式で実施され得る。本発明のグロブロマーの誘導体化に関する上記コメントは、類推によって表記されている。さらに、タンパク質への連結のために適切に修飾された多数の標識、例えば、ビオチン、アビジン、エクストラビジン又はストレプトアビジン連結された酵素、マレイミドで活性化された酵素などが利用可能である。これらの標識は、オリゴマーと直接、又は、必要であれば、追跡物質を与えるために適切に誘導体化されたグロブロマーと反応され得る。例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体が使用される場合には、これは、まず、グロブロマーのビオチン化を必要とする。これは、逆の順序に対しても準用される。この目的のための適切な方法は、当業者にも公知である。
【０２３１】
異種のイムノアッセイフォーマットが選択されるのであれば、例えば、支持体に結合された抗イディオタイプ抗体、例えば、ウサギＩｇＧに対して誘導された抗体を介して、抗原抗体複合体を支持体に結合することによって抗原抗体複合体を分離し得る。適切な支持体、特に、適切な抗体で被覆されたマイクロタイタープレートが公知であり、一部は市販されている。
【０２３２】
本発明は、さらに、少なくとも１つの上記抗体及びさらなる成分を有するイムノアッセイセットに関する。前記セットは、通常、本発明のグロブロマー測定を実施するための手段の組み合わせであるパッケージング単位の形態である。取り扱いを可能な限り容易にするために、前記手段は、好ましくは、実質的に即時使用形態で提供される。有利な配置は、キットの形態のイムノアッセイを与える。キットは、通常、成分を分離して配置するための複数の容器を含む。全ての成分は、即時使用希釈液中に、希釈するための濃縮物として、又は溶解若しくは懸濁するための乾燥物質若しくは凍結乾燥物として与えることができ、個々の又は全ての成分は、凍結され、又は使用まで室温に保存され得る。これらの事例において、イムノアッセイは、好ましくは、使用前に、凍結温度以下の温度に保たなければならないので、血清は、好ましくは、例えば、−２０℃で、ショック凍結される。
【０２３３】
イムノアッセイとともに供給されるさらなる成分は、前記イムノアッセイの種類に依存する。通常、標準的なタンパク質、必要とされ得る又は必要とされ得ない追跡物質及び対照血清が、抗血清とともに供給される。さらに、マイクロタイタープレート（好ましくは、抗体で被覆されている。）、例えば、検査用、洗浄用又は基質の転化用緩衝液及び酵素基質自体も含まれ得る。
【０２３４】
イムノアッセイの一般的な原理並びに研究室及び病院での補助具としての抗体の作製及び使用は、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．，Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８８）中に見出すことができる。
【０２３５】
従って、本発明は、アミロイドーシスを有することが疑われている患者において、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を診断する方法も含む。本方法は、１）患者から生物学的試料を単離する工程；２）抗原／抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、上記抗体の少なくとも１つと生物学的試料を接触させる工程；及び３）前記試料中の抗原／抗体複合体の存在を検出する工程を含み、複合体の存在が、患者中のアミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病の診断を示唆する。抗原は、例えば、グロブロマー又は完全なグロブロマーと同じ機能的特性（例えば、結合活性）を有するその一部若しくは断片であり得る。
【０２３６】
さらに、本発明は、アミロイドーシスを有することが疑われている患者において、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を診断する別の方法を含む。本方法は、１）生物学的試料を患者から単離する工程；２）抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、生物学的試料を抗原と接触させる工程；３）結合された抗体に抱合体を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体／抗原複合体に抱合体を添加する工程；４）シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによって、生物学的試料中に存在し得る抗体の存在を検出する工程を含み、前記シグナルは、患者中のアミロイドーシス、例えばアルツハイマー病の診断を示す。抗原は、グロブロマー又は完全なグロブロマーと同じ機能的特性（例えば、結合活性）を有するその一部若しくは断片であり得る。
【０２３７】
本発明は、アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病を有することが疑われている患者において、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を診断するさらなる方法を含む。本方法は、１）生物学的試料を患者から単離する工程；２）抗抗体／抗体複合体（該複合体は、生物学的試料中に存在する抗体を含有する。）の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で、生物学的試料を抗抗体（抗抗体は、上記抗体の１つに対して特異的である）と接触させる工程；２）結合された抗体に抱合体を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗抗体／抗体複合体に抱合体を添加する工程（前記抱合体は、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル発生化合物に結合する抗原を含む。）；並びに３）シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出する工程を含み、シグナルは、前記患者中のアミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病の診断を示す。
【０２３８】
また、本発明には、キットであって、ａ）上記抗体の少なくとも１つ、及びｂ）シグナル発生化合物に付着された抗体を含む抱合体を含み、前記抱合体の前記抗体が単離された抗体とは異なる、前記キットが含まれる。
【０２３９】
本発明は、ａ）上記抗体の１つに対する抗抗体及びｂ）シグナル発生化合物に付着された抗原を含む抱合体を含むキットも包含する。抗原は、グロブロマー又はグロブロマーと同じ機能的な特徴（例えば、結合活性）を有するその断片若しくは一部であり得る。
【０２４０】
本発明の１つの診断的実施形態において、本発明の抗体又はその一部は、固相上にコートされている（又は液相中に存在する。）。次いで、検査又は生物試料（例えば、全血、脳脊髄液、血清など）を固相と接触させる。抗原（例えば、グロブロマー）が試料中に存在する場合には、このような抗原は、固相上の抗体に結合し、次いで、直接法又は間接法のいずれかによって検出される。直接法は、単に、複合体そのものの存在を検出し、これにより抗原の存在を検出することを含む。間接法では、抱合体が、結合された抗原に添加される。抱合体は、シグナル発生化合物又は標識に付着された第二の抗体を含み、第二の抗体は、結合された抗原に結合する。第二の抗体が結合された抗原に結合すると、シグナル発生化合物は、測定可能なシグナルを発生する。次いで、このようなシグナルは、検査試料中の抗原の存在を示す。
【０２４１】
診断用イムノアッセイにおいて使用される固相の例は、多孔性及び非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７０５，３３０を参照。）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチックチューブである。固相材料の選択及び抱合体中に存在する抗原又は抗体を標識する方法は、所望であれば、所望のアッセイフォーマット性能特性に基づいて決定される。
【０２４２】
上述のように、抱合体（又は指標試薬）は、シグナル発生化合物又は標識に付着された抗体（又は、おそらく、アッセイによっては、抗抗体）を含む。このシグナル発生化合物又は「標識」は、それ自体検出可能であり、又は検出可能な生成物を生成させるための１つ又はそれ以上の追加の化合物と反応させ得る。シグナル発生化合物の例には、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視又は蛍光）、核酸、錯化剤又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）などの触媒が含まれる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用する場合には、色素産生性、蛍光性又は発光性（ｌｕｍｏｇｅｎｉｃ）基質の添加が、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法などの他の検出系も有用である。
【０２４３】
上記イムノアッセイによって検査され得る生物学的液体の例には、血漿、全血、乾燥された全血、血清、脳脊髄液又は組織及び細胞の水性又は有機水性抽出物が含まれる。
【０２４４】
本発明は、検査試料中の抗体の存在を検出するための方法も包含する。本方法は、（ａ）抗抗体／抗体複合体の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で、患者試料中の抗体に対して特異的な抗抗体（抗抗体は、患者試料中の抗体に結合する本発明の抗体である。）と、抗体を含有することが疑われる検査試料を接触させる工程、（ｂ）得られた抗抗体／抗体複合体に抱合体を添加する工程（前記抱合体は、検出可能なシグナルを検出することができるシグナル発生化合物に付着された抗原（抗抗体に結合する。）を含む。）、及び（ｄ）シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによって、検査試料中に存在し得る抗体の存在を検出する工程を含む。抗抗体に対する抗体を含む対照又は標準物質を使用し得る。
【０２４５】
キットも、本発明の範囲に含まれる。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病又は認知障害を特徴とする別の症状を有すると疑われる患者中の抗原（例えば、グロブロマー）の存在を測定するためのキットを含む。特に、検査試料中の抗原の存在を測定するためのキットは、ａ）本明細書に記載されている抗体又はその部分、及びｂ）検出可能なシグナルを発声することができるシグナル発生化合物に付着された第二の抗体（抗原に対する特異性を有する。）を含む抱合体を含む。キットは、抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質も含有し得る。
【０２４６】
本発明は、検査試料中の抗体を検出するためのキットも含む。キットは、ａ）目的の抗体に対して特異的な抗抗体（例えば、本発明の１つ）、及びｂ）上記抗原又はその一部を含み得る。抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質も含まれ得る。より具体的には、前記キットは、ａ）抗体に対して特異的な抗抗体（本発明の１つなど）及びｂ）検出可能なシグナルを発生することが可能なシグナル発生化合物に付着された抗原（例えば、グロブロマー）を含む抱合体を含み得る。同じく、キットは、抗原に結合する試薬を含む標準物質の対照も含み得る。
【０２４７】
キットは、バイアル、瓶又は細片などの１つの容器も含み得、各容器は予め設置された固相を有し、他の容器はそれぞれの抱合体を含有する。これらのキットは、洗浄、加工及び指示試薬など、アッセイを実施するために必要とされる他の試薬のバイアル又は容器も含有し得る。
【０２４８】
本発明は、上記完全長抗体を含むのみならず、その部分又は断片、例えば、そのＦａｂ部分も含むことに留意すべきである。さらに、本発明は、例えば、結合特異性、構造などの点で、本発明の抗体と同一の特性を有するあらゆる抗体を包含する。
【０２４９】
本発明の利点
Ａβ（２０−４２）グロブロマーでの免疫化によって、上述されている比較ドットブロッティングによって測定されるように、異なるＡβ（１−４２）オリゴマー及びＡβ（Ｘ−４２）オリゴマーとは寛容性又は認識が異なる、別のモノクローナル抗体が取得され得る。これによって、認識増強効果の間の最適な関係、他のＡβ形態に比べて所望される特異性及び最小の副作用特性を有するＮ末端切断されたＡβオリゴマーに対して誘導された抗体の開発が可能となる。驚くべきことに、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１２−４２）グロブロマーは、構造的要素を含有するにも関わらず、末端切断されたさらなるＡβ（２０−４２）グロブロマーを抗原として使用することによって得られる抗体によって、部分的に認識されるに過ぎない。
【０２５０】
特異的なオリゴマー性Ａβ形態を基本的な構造原理（すなわち、Ｎ末端切断されたＡβグロブロマーの使用）に限定することによって、オリゴマーＡβ形態に対して高度に特異的である能動免疫において、抗体特性が生成される。同じことが、受動免疫において使用するためのモノクローナル抗体に対しても当てはまる。（能動及び受動）免疫化のためのこのような特定の戦略の利点は、Ａβモノマーに対する免疫応答、凝集の繊維性状態にあるＡβペプチド又はｓＡＰＰαを誘導しないことである。これは、幾つかの点で有利である。
【０２５１】
１）不溶性Ａβプラークの形態において、凝集の繊維状状態のＡβペプチドは、ＡＤ脳内の全体のＡβペプチドプールの主要な部分を占める。これらのプラークとの抗Ａβ抗体の反応によって誘導されたＡβプラークの溶解によるＡβの大規模な放出は、有害であると認められる。Ａβのこの大規模な放出は、次いで、血液脳関門を横切り、血流に入り、微小出血のリスクを増大させ得る。さらに、ＥＬＡＮ試験において、繊維性Ａβペプチド形態を用いた免疫化のこの戦略は、髄膜脳炎を発症する症例の６％のために、試験を中止する必要があった。
【０２５２】
２）モノマーＡβペプチド形態は認知増強効果を発揮し得ることを示すことが可能であったので、モノマーＡβペプチド形態に対して誘導される免疫応答は望ましくない。
【０２５３】
３）ｓＡＰＰαに対して誘導された免疫応答は、生理的に存在する前駆体タンパク質ＡＰＰとの反応をもたらし、従って、自己免疫反応をもたらし得るので、ｓＡＰＰαに対して誘導された免疫応答は、同様に望ましくない。さらに、ｓＡＰＰαは、認知増強効果を発揮することも示された。
【０２５４】
４）微小出血の望ましくない副作用を回避するために、ＣＡＡの形態の血管Ａβペプチドに対して誘導された応答は避けるべきである（Ａβの中央部分に対する抗体、及び、さらに、ＣＡＡの形態で凝集されたＡβペプチドに結合しない抗体は、Ｎ末端に対するこのような抗体と比べて、より少ない微小出血を誘導する。上記参照。）。
【０２５５】
５）Ａβオリゴマーと特異的に反応する抗体は、例えば、繊維性Ａβに結合されず、従って、治療的効果のために利用可能でないので、病態生理学的な関連するＡβ種に関してより高い生物学的利用性を有する。
【０２５６】
寄託情報：モノクローナル抗体５Ｆ７を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００５年１２月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７２４１が与えられた。さらに、モノクローナル抗体１０Ｆ１１を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００５年１２月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７２３９が与えられた。さらに、モノクローナル抗体４Ｂ７を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００５年１２月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７２４２が与えられ、モノクローナル抗体７Ｃ６を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００５年１２月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７２４０が与えられた。さらに、モノクローナル抗体６Ａ２を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年２月２８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７４０９が与えられ、モノクローナル抗体２Ｆ２を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年２月２８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７４０８が与えられた。モノクローナル抗体４Ｄ１０を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年２月２８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７４０５が与えられた。モノクローナル抗体７Ｅ５を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年８月１６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７８０９が与えられた。モノクローナル抗体１０Ｃ１を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年８月１６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７８１０が与えられた。モノクローナル抗体３Ｂ１０を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年９月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  １０８０１に寄託され、受託番号ＰＴＡ−７８５１が与えられた。全ての寄託は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  １００  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６００６４（ＵＳ）を代理して行われた。
【０２５７】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０２５８】
グロブロマーの調製
ａ）Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を６ｍｇ／ｍＬで１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に懸濁し、完全な可溶化のために、３７℃で１．５時間、振盪下で温置した。ＨＦＩＰは、水素結合破壊剤として作用し、Ａβペプチド中にあらかじめ存在する構造的な不均質性を排除するために使用する。ＳｐｅｅｄＶａｃ中での蒸発によりＨＦＩＰを除去し、ジメチルスルホキシド中で５ｍＭ濃度で再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰで前処理されたＡβ（１−４２）をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で４００μＭに希釈し、（Ｈ２Ｏ中の）１／１０容積の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した（０．２％ＳＤＳの終濃度）。３７℃で６時間温置すると、１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー（球状オリゴマーのための短い形態）の中間体が得られた。Ｈ２Ｏの３容積でさらに希釈し、３７℃で１８時間温置することによって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを生じた。３０００ｇで２０分間遠心分離した後、試料を限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）により濃縮し、５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、１００００ｇで１０分間遠心分離し、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを含む上清を回収した。透析に対する代替例として、氷冷メタノール／酢酸溶液（３３％メタノール、４％酢酸）の９倍過剰量（ｖ／ｖ）によって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを４℃で１時間沈殿させることも可能である。次に、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーをペレットにし（１６２００ｇで１０分間）、５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で再懸濁し、ｐＨを７．４に調整した。
【０２５９】
ｂ）架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を６ｍｇ／ｍＬで１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に懸濁し、完全な可溶化のために、３７℃で１．５時間、振盪下で温置した。ＨＦＩＰは、水素結合破壊剤として作用し、Ａβペプチド中にあらかじめ存在する構造的な不均質性を排除するために使用した。ＳｐｅｅｄＶａｃ中での蒸発によりＨＦＩＰを除去し、ジメチルスルホキシド中で５ｍＭ濃度で再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰで前処理されたＡβ（１−４２）をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で４００μＭに希釈し、（Ｈ２Ｏ中の）１／１０容積の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した（０．２％ＳＤＳの終濃度）。３７℃で６時間温置すると、１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー（球状オリゴマーのための短い形態）の中間体が得られた。Ｈ２Ｏの３容積でさらに希釈し、３７℃で１８時間温置することによって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを生じた。１ｍＭグルタルアルデヒドとともに２１℃の室温（ＲＴ）で２時間温置した後、ＲＴで３０分間エタノールアミン（５ｍＭ）処理することによって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーの架橋をここで実施した。
【０２６０】
ｃ）Ａβ（２０−４２）グロブロマー
実施例１ａに従って調製されたＡβ（１−４２）グロブロマー調製物１．５９ｍＬを、緩衝液（５０ｍＭＭＥＳ／ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）３８ｍＬ及び水中の１ｍｇ／ｍＬサーモリシン溶液（Ｒｏｃｈｅ）２００μＬと混合した。反応混合物をＲＴで２０時間撹拌した。次に、水中の１００ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）８０μＬを添加し、１％強度のＳＤＳ溶液４００μＬで０．１％のＳＤＳ含有量へと混合物をさらに調整した。１５ｍＬの３０ｋＤａ遠心沈殿チューブを介して、反応混合物を約１ｍＬに濃縮した。濃縮物を緩衝液（５０ｍＭＭＥＳ／ＮａＯＨ、０．０２％ＳＤＳ、ｐＨ７．４）９ｍＬと混合し、１ｍＬに再度濃縮した。透析チューブ中で緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭＮａＣｌ）１Ｌに対して、濃縮物を６℃で１６時間透析した。水中の２％強度のＳＤＳ溶液で、透析物を０．１％のＳＤＳ含有量に調整した。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離し、Ａβ（２０−４２）グロブロマー上清を回収した。
【０２６１】
ｄ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー
実施例１ａに従って調製されたＡβ（１−４２）グロブロマー調製物２ｍＬを、３８ｍＬの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）及び水中の１ｍｇ／ｍＬ  ＧｌｕＣエンドプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１５０μＬと混合した。反応混合物をＲＴで６時間撹拌し、その後、水中の１ｍｇ／ｍＬ  ＧｌｕＣエンドプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１５０μＬをさらに添加した。反応混合物をＲＴでさらに１６時間撹拌した後、５Ｍ  ＤＩＦＰ溶液８μＬを添加した。１５ｍＬの３０ｋＤａ遠心沈殿チューブを介して、反応混合物を約１ｍＬに濃縮した。濃縮物を緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）９ｍＬと混合し、１ｍＬに再度濃縮した。透析チューブ中で緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭＮａＣｌ）１Ｌに対して、濃縮物を６℃で１６時間透析した。水中の１％強度のＳＤＳ溶液で、透析物を０．１％のＳＤＳ含有量に調整した。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離し、Ａβ（１２−４２）グロブロマー上清を回収した。
【実施例２】
【０２６２】
異なるＡβ（１−４２）モノマー及びＡβ（１−４０）モノマー調製物の分子ふるいクロマトグラフィー
Ａβ（１−４２）、０．１％ＮＨ４ＯＨ：
Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ−１３６８）１ｍＬをＨ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ５００μＬ中に溶解し、大気温で１分間撹拌した。試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収した。上清中のＡβ（１−４２）濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に従って決定した。
【０２６３】
５分間試料：
上清を含有する０．１％ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）２０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で、０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４２）濃度に希釈した。試料を大気温で５分間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、１００μＬを分析した。
【０２６４】
１時間試料：
上清を含有する０．１％ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）２０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で、０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４２）濃度に希釈した。試料を大気温で１時間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、１００μＬを分析した。
【０２６５】
Ａβ（１−４２）、７０％ＨＣＯＯＨ：
Ａβ（１−４２）１ｍｇをＨ２Ｏ中の５０μＬの７０％ＨＣＯＯＨ中に溶解し、大気温で１分間撹拌した。試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収した。上清中のＡβ（１−４２）濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に従って決定した。
【０２６６】
５分間試料：
７０％ＨＣＯＯＨ中のＡβ（１−４２）２μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４２）の濃度に希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。試料を大気温で５分間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィーによって、１００μＬを分析した。
【０２６７】
１時間試料：
７０％ＨＣＯＯＨ中のＡβ（１−４２）２μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４２）の濃度に希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。試料を大気温で１時間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィーによって、１００μＬを分析した。
【０２６８】
Ａβ（１−４２）、０．１％ＮａＯＨ：
Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ−１３６８）１ｍＬをＨ２Ｏ中の０．１％ＮａＯＨの５００μＬ中に溶解し、大気温で１分間撹拌した。試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収した。上清中のＡβ（１−４２）濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に従って決定した。
【０２６９】
５分間試料：
０．１％ＮａＯＨ中のＡβ（１−４２）２０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４２）の濃度に希釈した。試料を大気温で５分間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィーによって、１００μＬを分析した。
【０２７０】
１時間試料：
０．１％ＮａＯＨ中のＡβ（１−４２）２０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４２）の濃度に希釈した。試料を大気温で１時間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィーによって、１００μＬを分析した。
【０２７１】
Ａβ（１−４２）、０．１％ＮａＯＨ：
Ａβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ−１１９４）１ｍｇをＨ２Ｏ中の０．１％ＮａＯＨの５００μＬ中に溶解し、大気温で１分間撹拌した。試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収した。上清中のＡβ（１−４２）濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に従って決定した。
【０２７２】
５分間試料：
０．１％ＮａＯＨ中のＡβ（１−４０）２０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４０）の濃度に希釈した。試料を大気温で５分間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィーによって、１００μＬを分析した。
【０２７３】
１時間試料：
０．１％ＮａＯＨ中のＡβ（１−４０）２０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬのＡβ（１−４０）の濃度に希釈した。試料を大気温で１時間温置した。次に、分子ふるいクロマトグラフィーによって、１００μＬを分析した。
【０２７４】
分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）のための条件：
ＳＥＣカラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２ＨＲ  １０／３００ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７−５１７３−０１）
流速：０．５ｍＬ／分
紙送り：０．２ｃｍ／分
２１４ｎｍでの吸光度：０ないし０．２吸収単位
移動相：２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４
【０２７５】
結果を図１に示す。
Ａβペプチド、特にＡβ（１−４２）モノマーがフィブリルへ凝集する傾向が強いので、純粋にモノマーのＡβ溶液の調製は、困難な課題である。それにもかかわらず、Ａβ（１−４２）モノマー及びＡβ（１−４０）モノマーを識別する抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーのスクリーニング及び性質決定のために、最もよく技術的に達成可能なＡβモノマー調製物が使用されるべきである。本発明において、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中へさらに希釈した後の凝集効果に及ぼすＡβペプチドの初期溶媒の効果を検査した。Ａβペプチド供給元（Ｂａｃｈｅｍ）は、その技術情報において、Ａβ（１−４２）が０．１％ＮＨ４ＯＨ中で可溶化されるべきであると述べている。ＮＨ４ＯＨ中にＡβ（１−４２）を可溶化してすぐに２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に１：１０にさらに希釈した後に、室温（ＲＴ）で５分間、分子ふるいクロマトグラフィーを行うと、７４ｋＤに小さなピークを有する繊維状前駆体に対するＡβ（１−４２）凝集の最初の兆候を示す。モノマーＡβ（１−４２）は、１１ｋＤで主要ピーク及び６ｋＤでの肩部で流れる。室温（ＲＴ）で１時間の温置の後、ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）ペプチドは、既に、Ａβ（１−４２）フィブリルへとかなりの程度まで凝集し、分子ふるいクロマトグラフィーカラムに入らなかった検出可能な材料を喪失するに至る。Ａβ（１−４２）ペプチドのための初期溶媒として７０％ギ酸を使用する場合、ＲＴで１時間後の凝集のかなりの程度が生じるとともに、わずかな画分のＡβ（１−４２）モノマーが残る（ギ酸自体は、タンパク質検出波長において背景吸収が高くなることに留意されたい。）。凝集を防止するためのＡβ（１−４２）のための最良の初期溶媒は、０．１％ＮａＯＨであり、これは、可溶化の１時間の温置及びさらなる希釈後でさえ、凝集したＡβ（１−４２）のわずかな画分のみを示し、Ａβ（１−４２）の大部分はなおモノマーである。０．１％ＮａＯＨ中に最初に可溶化されるＡβ（１−４０）は、ＲＴ温置の１時間後でさえ、凝集の全てにおいて兆候を示さない。
【実施例３】
【０２７６】
Ａβ（１−４２）フィブリルのためのＡβ（２０−４２）グロブロマー選択的抗体の識別のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化された半定量的分析
Ａβ（１−４２）フィブリル調製物：
Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ−１３６８）１ｍｇをＨ２Ｏ中の５００μＬの０．１％ＮＨ４ＯＨ中に溶解し、大気温で１分間撹拌した。試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収した。上清中のＡβ（１−４２）濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に従って決定した。
【０２７７】
０．１％ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）１００μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の３００μＬと混合し、２％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。次に、試料を３７℃で２０時間温置した。その後、試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬと混合し、１分間激しく撹拌する（「渦巻き撹拌する」）ことによって再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬと混合し、１分間激しく撹拌する（「渦巻き撹拌する」）ことによって再懸濁し、１００００ｇで１０分間さらにもう１回遠心分離した。上清を廃棄した。残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の３８０μＬ中で再懸濁し、激しい撹拌（「渦巻き撹拌」）によって促進した。
【０２７８】
Ａβ（１−４２）フィブリルに対する抗Ａβ抗体の結合：
Ａβ（１−４２）フィブリル調製物４０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の１６０μＬで希釈した後、試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の９５μＬ中に再懸濁した。再懸濁は、激しい撹拌（「渦巻き撹拌」）によって促進された。
【０２７９】
フィブリル調製物１０μＬの一定分量を
ａ）１０μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４
ｂ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の５Ｆ７の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｃ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ  ９３２０番）の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
と各々混合した。
【０２８０】
試料を３７℃で２０時間温置した後、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μＬと混合した。残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の５０μＬと混合し、「渦巻き撹拌」によって再懸濁した後、試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の２０μＬと混合した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μＬと混合した。電気泳動用４ないし２０％トリス／グリシンゲルへ試料を適用した。
【０２８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのパラメータ：
ＳＤＳ試料緩衝液：０．３ｇ  ＳＤＳ
４ｍＬの１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）
８ｍＬグリセリン
エタノール中の１％ブロモフェノールブルー１ｍＬ
Ｈ２Ｏで適宜５０ｍＬに充填
４ないし２０％トリス／グリシンゲル：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＥＣ６０２５ＢＯＸ）
電気泳動緩衝液：７．５ｇトリス
３６ｇグリシン
２．５ｇ  ＳＤＳ
Ｈ２Ｏで適宜２．５Ｌに充填
２０ｍＡの定常電流でゲルを泳動する。
【０２８２】
ゲルの染色：クーマシーブルーＲ２５０
結果を図２に示す。
【０２８３】
異なる抗Ａβ抗体の半定量的分析及び前記抗体によるＡβ（１−４２）フィブリルの識別Ａβ（１−４２）フィブリル及びＡβ（１−４２）モノマーの抗体の位置をゲルの縁に標識する。それらの大きさにより、Ａβ（１−４２）フィブリルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルへ進入することが不可能であり、ゲルの水中に観察されることが可能である。
【０２８４】
１．マーカー
２．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；対照
３．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；＋ｍＡｂ５Ｆ７；３７℃、２０時間；上清
４．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；＋ｍＡｂ５Ｆ７；３７℃、２０時間；ペレット
５．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；＋ｍＡｂ６Ｅ１０；３７℃、２０時間；上清
６．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；＋ｍＡｂ６Ｅ１０；３７℃、２０時間；ペレット
遠心分離後の繊維に結合した画分（ペレット画分）及び上清画分中の抗体の重鎖から光学密度（ＯＤ）値を測定することによって、Ａβ型繊維に対する相対的な結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥから評価した。Ａβフィブリルへ結合した抗体は、Ａβフィブリルとともにペレットになり、従って、ペレット画分中に見出されるべきであるのに対し、Ａβフィブリルへ結合していない（遊離の）抗体は、上清中に見出される。Ａβフィブリルへ結合した抗体の割合を次式に従って算出した：
Ａβフィブリルに結合した抗体の割合＝ＯＤフィブリル画分×１００％／（ＯＤフィブリル画分＋ＯＤ上清画分）
【０２８５】
ｍＡｂ６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ、カタログ番号９３２０）、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１に関して、この手法を実施した。
【０２８６】
アルツハイマー病患者の脳において、Ａβフィブリルは、Ａβペプチドプール全体の主要成分である。抗Ａβ抗体によってこれらのフィブリルを攻撃することによって、負の副作用の危険性は、Ａβの多量の遊離により上昇し、これがその後、微小出血の危険性を増大し得る。微小出血に関する危険性の増大は、Ａβペプチドの繊維状凝集体による能動免疫のアプローチにおいて観察された（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，２００５，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４，  １０−１２；Ｏｒｇｏｇｏｚｏ  Ｊ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００３，  ６１，  ４６−５４；Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，  ５９９−６０６）。
【０２８７】
ＡＡ１−１７間で線形Ａβエピトープを認識する市販の抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ  ９３２０）とは対照的に、（Ａβ（２０−４２）に対して最小限の選択性を実際に有する）Ａβ（２０−４２）グロブロマー選択的抗体５Ｆ７は、同時ペレット化実験においてＡβ（１−４２）フィブリルに結合しない。これは、Ａβ（１−４２）フィブリルとの温置後の５Ｆ７抗体が、ペレット化工程後に上清中に残留し、Ａβ（１−４２）フィブリルに結合しているために同時ペレット化しないという事実によって示される。
【実施例４】
【０２８８】
野生型と比較したＡβ（１−４２）モノマー（０．１％ＮＨ４ＯＨ）、Ａβ（１−４２）グロブロマー又はＡβ（２０−４２）グロブロマーによる能動免疫後の対象認識検査によるマウスにおける認知成績の分析
これらの実験において、点変異を有するヒトＡＰＰを過剰発現するマウスを使用した。点変異とは、アミノ酸７１７（イソロイシンのバリンとの置換）を指し、寿命が６０歳になる前にＡＤの開始に至るロンドンのある一家で発見されている（Ｍｕｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（１９９２）３４０−３４２）。本明細書でＡＰＰ／Ｌと呼ばれる遺伝子導入マウスは、ルーバン（Ｌｅｕｖｅｎ）（Ｍｏｅｃｈａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）６４８３−６４９２）によって作出され、ルーバンにおいて最初に記載された。６週齢で、雌ＡＰＰ／Ｌマウスを能動免疫へ供した。
【０２８９】
マウスは、フロイント完全アジュバントの等しい量と混合されたリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中のＡβ（１−４２）モノマー（０．１％ＮＨ４ＯＨ）、Ａβ（１−４２）グロブロマー又はＡβ（２０−４２）グロブロマーのいずれかの１００μｇを腹腔内に受容した後、フロイント不完全アジュバント中のアンチジーンの同一量による追加免疫注射を３週間ごとに３ヶ月間受容した。実験の時間経過を通じて、逆転した昼／夜周期（午後７時に開始する明期１４時間／暗期１０時間）中の標準的な条件下で動物を維持した。実験を通じて経時的に体重が増加したことは、予想通りであり、ＰＢＳ／アジュバント単独を受容した対照群と差はなく、抗原処理が十分許容されることを示唆した。
【０２９０】
４．５ヶ月齢で、マウスの認知能を先行技術（Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２（２００２）３４４５−３４５３）に記載されている対象認識検査によって検査した。この目的のため、マウスを活動領域へ慣れさせた後、２つの同一要素（同様の大きさ約４ｃｍの青色の錐体、緑色の立方体、黄色の円柱）を含有する活動領域中に個々に配置される獲得相へ１０分間曝露した。マウスが対象を探索する時間及び頻度を記録した。２．５時間後の保持相の間、既知の対象に加え、他の対象から無作為に選択された未知の対象を含有している活動領域へマウスを戻した。時間全体（旧い及び新しい対象の探索）に対するマウスが古い対象を探索している時間として、新たな対象の認識を記録した。「認識指数」は、この関係を表す（新たな対象のための時間／時間全体）。既知の対象を思い出さないマウスは、既知の対象を新たな対象と等しく興味があるものと考え、既知の対象を探索する時間の等しい量を過ごし、言い換えれば、５０％の認識指数を示す。既知の対象を思い出すマウスは、既知の対象を興味のないものと考え、それゆえ、有意により高い認識指数を示す。ＡＰＰ／Ｌマウスは、４．５ヶ月齢で認知の欠乏が生じることが公知であり、無作為なレベル、すなわち５０％の次元における認識指数を呈する。
【０２９１】
結果を図３に示す。
【０２９２】
マウスにおける対象認識検査。前記検査は、１０分間の検査相の間の探索行動に関して測定された、未知の対象と比較した既知の対象の認識を報告する。認識指数は、マウスが、両対象を探索するのにかかる時間に対する未知の対象を探索するのにかかる時間の割合として定義される。検査相の３時間前の１０分間の獲得相の間、マウスが、既知の対象を探索した。マウスの５群（数ｎが、列の下に付与される。）を比較した。正常なＣ５７Ｂｌ／６マウス（野生型）は、無作為なレベル（５０％、すなわち既知及び未知の両対象にかかる探索の等しい時間）とは有意に異なる高いＲＩを示す（＊＊＊＝ｐ＜０．００１；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。３ヶ月前に、ＡＰＰ遺伝子導入マウスの他の４群を能動免疫へ供した。使用される免疫原は、Ａβ（１−４２）モノマー、Ａβ（１−４２）グロブロマー及びＡβ（２０−４２）グロブロマーであった。リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を対照として使用した。ＰＢＳと他の群との間の有意差を円で示す：○＝ｐ＜０．０５；○○＝ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡにおけるｐ＜０．０５後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定）。
【０２９３】
ＡＰＰ／マウスは、非遺伝子導入マウスとは対照的に、４．５ヶ月齢で認知欠乏を示すことが公知であり、スコア化の結果は無作為レベル（すなわち、５０％認識指数）に近い。実際、ＰＢＳ処理したマウスは、非遺伝子導入マウス（野生型）とは対照的に無作為な行動を示した。天然Ａβ（１−４２）グロブロマー及びＡβ（２０−４２）グロブロマーによる免疫化の結果、ＡＰＰ／Ｌマウスにおける対象認識が有意に改良された。
【０２９４】
両グロブロマー調製物（天然型及び切断型）によってＡＰＰ遺伝子導入動物における記憶の改良及びＡβ（２０−４２）で処理した動物におけるさらに優れた認識が得られたため、切断型Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体の誘導が、最良の結果を生じ、この種と特異的に反応する抗体による受動免疫が処理の最適な戦略に該当することを想定することは妥当である。
【実施例５】
【０２９５】
Ａβ（２０−４２）グロブロマーによるＡＰＰ／Ｌ  Ｔｇマウスの能動免疫後の異なるＡβ形態に関する抗体特性のドットブロット分析
Ａβの異なる形態によるＡＰＰ／Ｌマウス（Ｍｏｅｃｈａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６４８３−６４９２）のマウスの免疫化（実施例４と比較）の後、抗Ａβ抗体に関して血漿試料を評価した。この目的のため、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを補充されたＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬまでの範囲の個々のＡβ（１−４２）形態を連続的に希釈した。各試料１μＬをニトロセルロースメンブレン上へブロットした。検出のため、（１：４００に希釈された）対応するマウス血漿試料を使用した。アルカリホスファターゼ抱合型抗マウスＩｇＧ及び染色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して、免疫染色を実施した。
【０２９６】
ドットブロットのためのＡβ標準物質：
１．Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）グロブロマーの調製を実施例１ａに記載している。
【０２９７】
２．ＨＦＩＰで前処理されたＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー
Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｈ−１３６８）３ｍｇを１．７ｍＬのエッペンドルフチューブ中の０．５ｍＬ  ＨＦＩＰ（６ｍｇ／ｍＬ懸濁液）中に溶解し、透明な溶液が得られるまで、３７℃で１．５時間振盪した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー、１４００ｒｐｍ）、試料をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中で乾燥させ（１．５時間）、１３．２μＬのＤＭＳＯ中に再懸濁し、１０秒間振盪した後、超音波処理し（２０秒間）、（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー中で、１４００ｒｐｍ）１０分間振盪した。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８；ｐＨ７．４の６ｍＬを添加し、室温で１時間撹拌した。試料を３０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を０．６ｍＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、ｐＨ７．４中に溶解した。Ｈ２Ｏ３．４ｍＬを添加し、室温で１時間撹拌した後、３０００ｇで２０分間遠心分離した。さらなる使用のため、上清各０．５ｍＬの８個の一定分量を−２０℃で保存した。
【０２９８】
３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
Ａβ（２０−４２）グロブロマーの調製を実施例１ｃに記載している。
【０２９９】
４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
Ａβ（１２−４２）グロブロマーの調製を実施例１ｄに記載している。
【０３００】
５．ＨＦＩＰで前処理された、ＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー
１ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ、カタログ番号Ｈ−１１９４）をエッペンドルフチューブ中の０．２５ｍＬのＨＦＩＰ（４ｍｇ／ｍＬ懸濁液）中に懸濁した。（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー中で、１４００ｒｐｍ）チューブを３７℃で１．５時間振盪して透明な溶液を得た後、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ濃縮器中で乾燥させた（１．５時間）。試料を４６μＬのＤＭＳＯ中で再度溶解し（２１．７ｍｇ／ｍＬ溶液＝５ｍＭ）、１０秒間振盪した後、２０秒間超音波処理した。（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー中で、１４００ｒｐｍ）１０分間の振盪後、さらなる使用のために試料を−２０℃で保存する。
【０３０１】
６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０３０２】
７．Ａβ（１−４２）フィブリル
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．カタログ番号Ｈ−１３６８）を５００μＬの０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（エッペンドルフチューブ）中に溶解し、試料を室温で１分間撹拌した。この新鮮に調製されたＡβ（１−４２）溶液１００μＬを３００μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。ｐＨを１％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。試料を３７℃で２４時間温置し、（１００００ｇで１０分間）遠心分離した。上清を廃棄し、フィブリルのペレットを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬで、１分間の渦巻き撹拌により再懸濁した。
【０３０３】
８．ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａから供給された（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４中の２５μｇ）。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡでｓＡＰＰαを０．１ｍｇ／ｍＬ（＝１ｐｍｏｌ／μＬ）に希釈した。
【０３０４】
ドットブロットの材料
Ａβ標準物質：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中のＡβ抗原の連続希釈物
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ
ニトロセルロース：
トランスブロットトランスファー媒体、ピュアニトロセルロースメンブレン（０．４５μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウスＡＰ：
ＡＱ３３０Ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）
検出試薬：
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ錠剤（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：
Ａ−７８８８（ＳＩＧＭＡ）
ブロッキング試薬：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳
緩衝溶液：
ＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
ＴＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）
＋１４０ｍＭＮａＣｌ
＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：
Ａβ（２０−４２）グロブロマーによる能動免疫研究由来のマウス血漿試料（ＴＢＳ中の１％低脂肪乳２０ｍＬ中で１：４００に希釈）
抗体溶液ＩＩ：
１：５０００希釈
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳中の抗マウスＡＰ
【０３０５】
ドットブロット手法：
１）（５個の連続希釈物中の）異なるＡβ標準物質各１μＬを、互いに約１ｃｍの距離で、ニトロセルロースメンブレン上へ滴下した。
２）Ａβ標準物質のドットをニトロセルロースメンブレン上で、室温（ＲＴ）で少なくとも１０分間空気乾燥させた（＝ドットブロット）。
３）ブロッキング：
ドットブロットをＴＢＳ中の５％低脂肪乳３０ｍＬとともに、ＲＴで１．５時間温置した。
４）洗浄：
ブロッキング溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄緩衝液を廃棄し、抗体溶液ＩとともにＲＴで一晩温置した。
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄緩衝液を廃棄し、抗体溶液ＩＩとともにドットブロットをＲＴで１時間温置した。
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。
９）発色：
洗浄溶液を廃棄した。１個のＮＢＴ／ＢＣＩＰ錠剤を２０ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解し、この溶液とともにドットブロットを５分間温置した。Ｈ２Ｏによる集中洗浄により、発色を停止させた。
【０３０６】
結果を図４に示す。
【０３０７】
抗Ａβ抗体のドットブロット分析は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーによるマウスの能動免疫後に、Ａβの異なる形態に対する前記抗体の特異性を評価するために実施された。Ａβの個々の形態を連続希釈物中でブロットし、免疫反応中に産生された抗Ａβ抗体を含有する対応するマウス血漿とともに温置した。個々のドットブロットは、免疫化されたマウスの異なる個体に対応する。
【０３０８】
１．Ａβ（１−４２）グロブロマー
２．ＨＦＩＰで前処理された０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８中のＡβ（１−４２）モノマー
３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
５．ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中の５ｍＭＡβ（１−４０）モノマー
６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
７．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物
８．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【０３０９】
ＡＰＰ／Ｌ  Ｔｇマウスの能動免疫研究において、Ａβ（２０−４２）グロブロマーによる免疫化は、ＰＢＳ処理と比較して、これらのマウスにおいて認知機能障害を緩和する最良の結果に至ることが示された。Ａβ（２０−４２）グロブロマーで能動免疫された後のＡＰＰ／Ｌ  Ｔｇマウス由来の血漿試料は、本明細書で主張されるＡβ（２０−４２）グロブロマーｍＡｂのものと類似する抗体特性（Ａβ（２０−４２）グロブロマー及びＡβ（１２−４２）グロブロマーの顕著な認識）を呈する。
【実施例６】
【０３１０】
Ａβ（１−４２）モノマー、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又は対照としての媒体のいずれかで能動免疫されたＡＰＰ／ＰＳ１  Ｔｇマウスの脳抽出物中の可溶性及び不溶性Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）ペプチドの濃度
４ヶ月齢でＦＶＢｘＣ５７ＢＩ／６Ｊの背景にあるアルツハイマー病の二重遺伝子導入マウスモデル（ＡＰＰ／ＰＳ１  Ｔｇマウス）の４０匹の雌マウスを本研究に使用した。ＡＰＰ／ＰＳ１  Ｔｇマウスは、Ｖ７１７Ｉ変異（最長のＡＰＰ分子種と呼ぶ位置）を有するヒトＡＰＰの６９５個アミノ酸形態、及び、加えて、Ａ２６４Ｅ変異を有するヒトプレセニリン１遺伝子を含有する。両遺伝子は、Ｔｈｙ１プロモーターの調節下にある。ｒｅＭＹＮＤ，ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｃａｍｐｕｓ  Ｇａｓｔｈｕｉｓｂｅｒｇ，Ｃａｔｈｏｌｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｅｕｖｅｎの創立研究室のうちの１つにおいて、Ｆｒｅｄ  Ｖａｎ  Ｌｅｕｖｅｎ教授らによって、マウスを作出し、特徴付けた。
【０３１１】
全てのマウスを３週齢でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子型で分類し、ＰＣＲ結果が一度わかると、固有の識別番号を受容した。
【０３１２】
マウスは、あらかじめ充填し滅菌した水（紫外線光）及び標準的なマウス餌へ自由にアクセスした。十分に換気された貯蔵室中で、乾燥及び冷却条件下で食餌を保存した。水及び食餌の量は、毎日チェックされ、必要な場合に供給され、初期設定によって１週間に２回補給した。
【０３１３】
標準的な金属ケージＲＶＳ  Ｔ２型（５４０ｃｍ２の面積）中で、午後７時に開始する１４時間の明期／１０時間の暗期の逆転した昼夜リズムのもとでマウスを飼育した。ケージに固体の床及び木屑床敷き層を装備した。ケージ当たりのマウスの数を、動物保護法に従って制限した。行動検査開始５日前に、マウスをマクロロン２型ケージ中で再度収容し、行動検査に備えて研究室環境に適応させるために、研究室へ移送した。
【０３１４】
マウスは、フロイント完全アジュバントの等しい量と混合されたリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中のＡβ（１−４２）モノマー（０．１％ＮＨ４ＯＨ）、Ａβ（１−４２）グロブロマー又はＡβ（２０−４２）グロブロマーのいずれかの１００μｇを腹腔内に受容した後、フロイント不完全アジュバント中のアンチジーンの同一量による追加免疫注射を３週間ごとに４ヶ月間受容した。
【０３１５】
生化学
一半球の可溶性画分中のＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）をＥＬＩＳＡによって測定した。さらに、一半球の不溶性膜画分中のＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３１６】
ケタラール（ケタミン）、ロンパン（２％キシラジン）及びアトロピンの２：１：１の混合物でマウスを麻酔し、生理学的血清を使用して４℃で経心的に流した。これを実施して脳血管から血液を除去し、これは、臓器の完全性に何ら影響を及ぼさない手法である。
【０３１７】
頭蓋骨と第一頸椎との間の頸筋中の切開部を介して、脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収した。大槽中への穿刺を２６ゲージ針で付与し、ＣＳＦ１０ないし２０μＬを細いガラスピペットで回収した。
【０３１８】
心臓穿刺及びヘパリンコーティングされたエッペンドルフチューブ中への１ｍＬシリンジを介して血液を回収した。４℃、１４０００ｒｐｍで５分間、血液を遠心分離した。血清を−７０℃に保存した。
【０３１９】
マウスを４℃の生理学的血清で経心的に流した。
【０３２０】
脳を頭蓋から摘出し、冠状／前額平面における切断により、後脳及び前脳を分離した。小脳を除去した。正中線矢状切断を使用することによって、前脳を左右の半球へと均等に分割した。
【０３２１】
一半球を液体窒素中に即時浸漬し、生化学的分析まで−７０℃で保存した。
【０３２２】
一脳半球の均質化及び分画
ポッター、ガラスチューブ（界面活性剤非含有、２ｃｍ３）及び機械的ホモジナイザーを使用して脳を均質化した（６５０ｒｐｍ）。プロテアーゼ阻害剤（５０ｍＬトリス／ＨＣｌ緩衝液当たり１錠剤、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する新鮮に調製された２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）の６．５×１／２脳重量の容積を、均質化緩衝液として使用した。
【０３２３】
−７０℃から液体窒素を有する試料ホルダー中へ、試料を転移させ、ベンチ上での温置により各個々の試料を数秒間あらかじめ加温した後、均質化した。均質化液をベックマン遠心チューブＴＬＸ中に回収し、氷上で回収した後、遠心分離した。２つの試料間で、界面活性剤を有しない蒸留水（ＡＤ）でポッター及びガラスチューブを注意深くすすぎ、吸水紙で乾燥させた。
【０３２４】
あらかじめ冷却しておいた超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で試料を４℃、４８０００ｒｐｍ（１３５０００×ｇ）で１時間２０分遠心分離した。遠心分離ホルダー（Ｎ＝８）の数が限定されていることにより、（遠心分離を平衡化するために）試料を脳重量により分別し、異なる遠心分離セッションにわたって異なる処理群を分けるために無作為化した。
【０３２５】
上清（分泌されたＡＰＰ及びアミロイドペプチドを含有する可溶性画分）をペレット（膜に結合したＡＰＰ断片を含有する膜画分及び、老齢マウスの場合、プラーク結合型アミロイドペプチド）から分離した。上清を２本のチューブに分け、そのうちの１つをバックアップとして−２０℃で保存し、その他をカラムクロマトグラフィーでさらに処理して、アミロイドペプチドを濃縮した。
【０３２６】
脳重量、使用されるトリス／ＨＣｌ緩衝液の容積、（色により標識される）遠心分離セッション及びカラムクロマトグラフィーのために使用される可溶性画分の容積は、次の表中に典型的に付与されている。
【０３２７】
【表４】
0005475994.tif 000007
【０３２８】
小さな逆相カラム（Ｃ１８−Ｓｅｐ−Ｐａｃｋ  Ｖａｃ  ３ｃｃカートリッジ、Ｗａｌｔｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＭＡ）を真空システムへ装着し、０．１％トリフルオロ酢酸（Ａ−ＴＦＡ）中の８０％アセトニトリルで洗浄した後、０．１％ＴＦＡで２回洗浄した。次に、試料を適用し、カラムを５％及び２５％Ａ−ＴＦＡで連続洗浄した。アミロイドペプチドを７５％Ａ−ＴＦＡで溶出し、溶出物を氷上で２ｍＬチューブ中に回収した。溶出物をＳｐｅｅｄ／Ｖａｃ濃縮機（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）中で一晩凍結乾燥させ、ＥＬＩＳＡキットに備えられた試料希釈剤３３０μＬ中に溶解した。
【０３２９】
ペレットを異なる膜画分、すなわち膜画分Ａ（ＭＦＡ）、全長のＡＰＰを含有する膜画分Ｂ（ＭＦＢ）及びプラーク結合型アミロイドを含有する膜画分Ｃ（ＭＦＣ）へとさらに分画した。それゆえ、プロテアーゼ阻害剤（５０ｍＬＴＢＳ緩衝液当たり１錠剤、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を有するＴＢＳ緩衝液中にペレットを溶解し、ＭＦＡを２つのチューブに分け、そのうちの１つをバックアップとして−２０℃で保存した。プロテアーゼ阻害剤を有するＴＢＳ中にＮＰ４０（最終容積の２％）及びトリトンＸ−１００（最終容積の２％）を添加して、ＭＦＡの６０％をさらに処理し、４℃でスウィングアウトローター（ＳＷ６０）を使用するベックマン遠心分離装置において、２７０００ｒｐｍ（９８０００×ｇ）で１時間遠心分離した。上清（ＭＦＢ）をペレット（ＭＦＣ）から分離し、両者を−２０℃で保存した。
【０３３０】
脳重量、脳重量の６０％、使用されるＴＢＳ＋ＰＩ＋ＮＰ４０＋トリトンＸ−１００緩衝液の容積及び（色により標識される）遠心分離セッションを、次の表中に典型的に付与する。
【０３３１】
【表５】
0005475994.tif 000008
【０３３２】
一半球の可溶性画分中のヒトＡβのＥＬＩＳＡ
脳均質液の可溶性画分及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中のヒトＡβ（１−４０）及びヒトＡβ（１−４２）の量を定量化するために、市販の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用した（ヒトアミロイドβ４０又はβ４２ＥＬＩＳＡ高感度、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。製造元のプロトコールに従って、ＥＬＩＳＡを実施した。簡潔には、標準物質（合成Ａβ（１−４０）又はＡβ（１−４２）の希釈物）及び試料を、タンパク質結合能を有さない９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に調製した。１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３及び１５．６ｐｇ／ｍＬの終濃度を有する標準物質希釈物及び試料を、ＥＬＩＳＡキットとともに備えられた試料希釈剤中で６０μＬの最終容積に調製した。アミロイドレベルがマウスの加齢とともに増大するので、及び実際の評価では、試料の読み取りが標準物質の曲線の直線部分内にあることが必要であるので、Ａβ（１−４０）分析のための試料を１：３に希釈し、Ａβ（１−４２）分析のための試料を１：６に希釈した。
【０３３３】
選択的抗Ａβ抗体抱合体（ビオチン化検出抗体）とともに、試料、標準物質及びブランク（５０μＬ）を、抗Ａβコーティングされたポリスチロールプレート（捕捉抗体が、抗原のＣ末端を選択的に認識する。）へ添加し、４℃で一晩温置して、抗体−アミロイド−抗体−複合体を形成させた。翌日、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体を添加した３０分後に、ＴＭＢ／過酸化物混合物を添加し、それにより基質が、着色された生成物へと変換された。硫酸（１Ｍ）の添加により、この反応を停止し、４５０ｎｍフィルターを有するＥＬＩＳＡリーダーを備えた測光法によって、色の強度を測定した。吸光度を合成Ａβ（１−４０）又はＡβ（１−４２）で作成された標準物質曲線と比較することによって、試料のＡβ含有量の定量化を得た。
【０３３４】
一半球の不溶性画分中のヒトＡβのＥＬＩＳＡ
脳均質液の不溶性膜画分中のヒトＡβ（１−４０）及びヒトＡβ（１−４２）の量を定量化するため、ＭＦＣ試料をさらに処理し、８０ｍＭトリス／ＨＣｌ中の８Ｍグアニジン中に溶解した。その後、２５℃でサーモミキサー中で試料を３時間温置し、毎時間１００μＬピペットで上下にピペッティングし、グアニジン緩衝液中へＭＦＣペレットを溶解した。最後に、試料を４０００ｒｐｍで１分間だけ遠心分離し、細片を除去した。
【０３３５】
脳重量、ＭＦＣペレットの重量及び８Ｍグアニジン緩衝液の容積を、次の表に典型的に付与する。
【０３３６】
【表６】
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【０３３７】
最終的な試料中のヒトＡβ（１−４０）及びヒトＡβ（１−４２）の量を定量化するため、市販の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用した（ヒトアミロイドβ４０又はβ４２ＥＬＩＳＡ高感度、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。製造元のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡを実施したが、例外は標準物質（合成Ａβ（１−４０）又はＡβ（１−４２）の希釈物）の調製であった。ＥＬＩＳＡキットとともに備えられた試料希釈剤中で、６０μＬの最終容積へ試料を調製した。グアニジンは、標準物質曲線のＯＤ値に影響するため、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３及び１５．６ｐｇ／ｍＬの終濃度を有する標準物質希釈物を、試料に関するものと同一濃度のグアニジンを有する試料希釈剤中で調製した。タンパク質結合能を有さない９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でこれを実施した。
【０３３８】
アミロイドレベルがマウスの加齢とともに亢進するため、及び試料の読み取りが標準物質の曲線の直線部分内にあることを実際の評価が必要とするため、不溶性Ａβ（１−４０）及び不溶性Ａβ（１−４２）分析のための試料を１：５００に希釈した。
【０３３９】
選択的抗Ａβ抗体抱合体（ビオチン化検出抗体）とともに、試料、標準物質及びブランク（５０μＬ）を、抗Ａβコーティングされたポリスチロールプレート（捕捉抗体が、抗原のＣ末端を選択的に認識する。）へ添加し、４℃で一晩温置して、抗体−アミロイド−抗体−複合体を形成させた。翌日、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体を添加した３０分後に、ＴＭＢ／過酸化物混合物を添加し、それにより基質が、着色された生成物へと変換された。硫酸（１Ｍ）の添加により、この反応を停止し、４５０ｎｍフィルターを有するＥＬＩＳＡリーダーを備えた測定光法によって、色の強度を測定した。吸光度を合成Ａβ（１−４０）又はＡβ（１−４２）で作成された標準物質曲線と比較することによって、試料のＡβ含有量の定量化を得た。
【０３４０】
結果を図５に示す。
【０３４１】
Ａβ（１−４２）モノマー（０．１％ＮＨ４ＯＨ）、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又は対照としての媒体のいずれかで能動免疫されたＡＰＰ／ＰＳ１  Ｔｇマウスの脳抽出物中の可溶性及び不溶性Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）ペプチドの濃度
Ａβ（２０−４２）グロブロマーで能動免疫されたＡＰＰ／ＰＳ１Ｔｇマウスの脳抽出物の可溶性及び不溶性画分中で、Ａβ（１−４０）ペプチド及びＡβ（１−４２）ペプチドのレベルは、媒体対照に対して有意に異ならない。対照的に、Ａβ（１−４２）グロブロマー及びＡβ（１−４２）モノマーによる免疫化によって、脳のＡβ（１−４０）レベル及びＡβ（１−４２）レベルが低下する。これは、Ａβ（２０−４２）グロブロマー配向型免疫化アプローチが、Ａβ脳中レベル全体を有意には変化させないが、それにもかかわらず、Ａβペプチドと関連した認知障害を緩和する上で効果的であることを示す（実施例４参照）。
【実施例７】
【０３４２】
抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体による受動免疫後のＡＰＰ／Ｌ遺伝子導入マウスにおける対象認識検査による認知成績の分析
これらの実験において、点変異を有するヒトＡＰＰを過剰発現するマウスを使用した。点変異とは、アミノ酸７１７（イソロイシンのバリンとの置換）を指し、寿命が６０歳になる前にＡＤの開始に至るロンドンのある一家で発見されている（Ｍｕｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（１９９２）３４０−３４２）。本明細書でＡＰＰ／Ｌと呼ばれる遺伝子導入マウスは、ルーバン（Ｌｅｕｖｅｎ）（Ｍｏｅｃｈａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）６４８３−６４９２）によって作出され、ルーバンにおいて最初に記載された。３ヶ月齢で、雌ＡＰＰ／Ｌマウスを受動免疫へ供した。マウスは、リン酸塩類緩衝液（ＰＢＳ）１００μＬ中のマウスモノクローナル抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１又は７Ｃ６のいずれか２５０μｇを受容した。実験の時間経過を通じて、逆転した昼／夜周期（午後７時に開始する明期１４時間／暗期１０時間）中の標準的な条件下で動物を維持した。前記マウスは、受動免疫に十分耐容し、副作用の何れの徴候も有さなかった。
【０３４３】
３回目の注射の後（実験１５日目）、先行技術（Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２（２００２）３４４５−３４５３）に記載されている対象認識検査によって、マウスの認知能を検査した。この目的のため、マウスを活動領域へ慣れさせた後、２つの同一要素（同様の大きさ約４ｃｍの緑色の立方体又はオレンジ色の円柱）を含有する活動領域中に個々に配置される獲得相へ１０分間曝露した。マウスが対象を探索する時間及び頻度を記録した。２．５時間後の保持相の間、既知の対象に加え、その他の対象を含有している活動領域へマウスを戻した。時間全体（旧い及び新しい対象の探索）に対するマウスが旧い対象を探索している時間として、新たな対象の認識を記録した。「認識指数」は、この関係を表す（新たな対象のための時間／時間全体）。既知の対象を思い出さないマウスは、既知の対象を新たな対象と等しく興味があるものと考え、既知の対象を探索する時間の等しい量を過ごし、言い換えれば、５０％の認識指数を示す。既知の対象を思い出すマウスは、既知の対象を興味のないものと考え、それゆえ、有意により高い認識指数を示す。ＡＰＰ／Ｌマウスは、４．５ヶ月齢で認知の欠乏が生じることが公知であり、無作為なレベル、すなわち５０％の次元における認識指数を呈する。
【０３４４】
結果を図６に示す。
【０３４５】
マウスにおける対象認識検査。前記検査は、１０分間の検査相の間の探索行動に関して測定された、未知の対象と比較した既知の対象の認識を報告する。認識指数は、マウスが、両対象を探索するのにかかる時間に対する未知の対象を探索するのにかかる時間の割合として定義される。検査相の２．５時間前の１０分間の獲得相の間、マウスが、既知の対象を探索した。
【０３４６】
ａ）５Ｆ７抗体（ｎ＝９）、１０Ｆ１１抗体（ｎ＝１１）又は７Ｃ６抗体（ｎ＝１１）２５０μｇの腹腔内注射によって、ＡＰＰ遺伝子導入マウスを週１回、３週間免疫化し；対照動物はＰＢＳを受容した（ｎ＝６）。
無作為レベル（５０％、すなわち既知の対象及び未知の対象に関してかかる等しい探索時間）との有意差を星印で示す。＊＝ｐ＜０．０５（ｔ検定）
ｂ）抗体（５Ｆ７、１０Ｆ１１及び７Ｃ６）で処理したマウス全部（ｎ＝３１）及びリン酸塩類緩衝溶液（ＰＢＳ）で処理したマウス（ｎ＝６）。無作為レベルとは有意に異なる抗体処理群のＲＩ（＊＊＝Ｐ＜０．０１；ｔ検定）
【０３４７】
ＡＰＰ／Ｌマウスは、４．５ヶ月齢で認知の欠乏が生じることが公知であり、無作為なレベル、すなわち５０％の次元における認識指数を呈する。
【０３４８】
実際、ＰＢＳ処理したマウスは、無作為な行動を示した。３つの抗体全て（５Ｆ７、１０Ｆ１１及び７Ｃ６）による受動免疫は、認識指数が顕著に増大する結果となった。プールされた群を対照群に対して比較すると、認識指数は有意に増大する。３つの抗体全ての投与後のＡＰＰ／Ｌマウスの記憶成績に及ぼすこの利益のある効果は、切断型Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体が、認知の改良を達成するのに十分であることを示唆する。
【実施例８】
【０３４９】
抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体の選択性に関するドットブロット特性
モノクローナル抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体の選択性を特徴付けるために、異なるＡβ形態で認識するためのプローブを前記抗体につけた。この目的のため、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを補充されたＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬまでの範囲の個々のＡβ（１−４２）形態の連続希釈を使用した。各試料１μＬをニトロセルロースメンブレン上へブロットした。検出のため、対応する抗体を使用した（０．２μｇ／ｍＬ）。ペルオキシダーゼ抱合型抗マウスＩｇＧ及び染色試薬ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、免疫染色を実施した。
【０３５０】
ドットブロットのためのＡβ標準物質：
１．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０３５１】
２．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
１ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０３５２】
３．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮａＯＨ
２．５ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝５ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０３５３】
４．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮａＯＨ
２．５ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝５ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０３５４】
５．Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）グロブロマーの調製を実施例１ａに記載している。
【０３５５】
６．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
Ａβ（１２−４２）グロブロマーの調製を実施例１ｄに記載している。
【０３５６】
７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  Ａβ（２０−４２）グロブロマーの調製を実施例１ｃに記載している。
【０３５７】
８．Ａβ（１−４２）フィブリル
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．カタログ番号Ｈ−１３６８）を５００μＬの０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（エッペンドルフチューブ）中に溶解し、試料を室温で１分間撹拌した。この新鮮に調製されたＡβ（１−４２）溶液１００μＬを３００μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。ｐＨを１％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。試料を３７℃で２４時間温置し、（１００００ｇで１０分間）遠心分離した。上清を廃棄し、フィブリルのペレットを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬで、１分間の渦巻き撹拌により再懸濁した。
【０３５８】
９．ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａによって供給された（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４中の２５μｇ）。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡでｓＡＰＰαを０．１ｍｇ／ｍＬ（＝１ｐｍｏｌ／μＬ）に希釈した。
【０３５９】
ドットブロットのための材料：
Ａβ標準物質：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中のＡβ抗原の連続希釈物
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ
ニトロセルロース：
Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ媒体、Ｐｕｒｅ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．４５μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウスＰＯＤ：
カタログ番号７１５−０３５−１５０（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
検出試薬：
ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質、沈殿物（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：
カタログ番号Ａ−７８８８（ＳＩＧＭＡ）
ブロッキング試薬：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳
緩衝溶液：
ＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
ＴＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）
＋１４０ｍＭＮａＣｌ
＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳２０ｍＬ中に希釈された０．２μｇ／ｍＬ抗体
抗体溶液ＩＩ：
１：５０００希釈
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳中の抗マウスＰＯＤ
【０３６０】
ドットブロット手法：
１）（５個の連続希釈物中の）異なるＡβ標準物質各１μＬを、互いに約１ｃｍの距離で、ニトロセルロースメンブレン上へ滴下した。
【０３６１】
２）Ａβ標準物質のドットをニトロセルロースメンブレン上で、室温（ＲＴ）で少なくとも１０分間空気乾燥させた（＝ドットブロット）。
【０３６２】
３）ブロッキング：
ドットブロットをＴＢＳ中の５％低脂肪乳３０ｍＬとともに、ＲＴで１．５時間温置した。
【０３６３】
４）洗浄：
ブロッキング溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。
【０３６４】
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄緩衝液を廃棄し、抗体溶液ＩとともにドットブロットをＲＴで２時間温置した。
【０３６５】
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。
【０３６６】
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄緩衝液を廃棄し、ドットブロットを抗体溶液ＩＩとともにＲＴで一晩温置した。
【０３６７】
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置した。
【０３６８】
９）発色：
洗浄溶液を廃棄した。ドットプロットを１０ｍＬのＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質で１０分間発色させた。Ｈ２Ｏによるドットブロットの集中洗浄によって発色を停止させた。ドットの強度に関する濃度計分析（ＧＳ８００濃度計（ＢｉｏＲａｄ）及びソフトウェアパッケージであるＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ、第４．５．０版（ＢｉｏＲａｄ））を使用して、定量的評価を実施した。Ａβ（２０−４２）グロブロマーの最後の光学的に明確に同定されたドットの相対密度の２０％を超える相対密度を有するドットのみを評価した。ドットブロットごとに独立して、この閾値を決定した。算出された値は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーの認識と付与された抗体に関する個々のＡβ形態との間の関係を示す。
【０３６９】
結果を図７に示す。
【０３７０】
Ａβの異なる形態に対する異なる抗Ａβ抗体（６Ｅ１０、５Ｆ７、４Ｂ７、１０Ｆ１１、６Ａ２、４Ｄ１０、２Ｆ２；３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５、１０Ｃ１）の特異性に関するドットブロット分析Ａβ（２０−４２）グロブロマーによるマウスの能動免疫後の融合されたハイブリドーマ細胞の選択によって、検査されたモノクローナル抗体を得た（６Ｅ１０以外）。個々のＡβ形態を連続希釈物中に適用し、免疫反応のため、個々の抗体とともに温置した。
【０３７１】
１．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
２．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
３．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮａＯＨ  
４．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮａＯＨ
５．Ａβ（１−４２）グロブロマー
６．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
８．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物
９．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【０３７２】
Ａβ（１−４２）グロブロマー及びＡβ（１２−４２）グロブロマーの識別に関して、抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー選択的ｍＡｂを、３つのクラスに分割することが可能である。抗体６Ａ２、５Ｆ７及び２Ｆ２を含む第一のクラスは、Ａβ（２０−４２）グロブロマーを優先的に認識し、ある程度Ａβ（１−４２）グロブロマーを（及びＡβ（１２−４２）グロブロマーも）認識する。抗体１０Ｆ１１、４Ｄ１０及び３Ｂ１０を含む第二のクラスは、Ａβ（２０−４２）グロブロマーを優先的に認識し、Ａβ（１２−４２）グロブロマーも認識するが、その程度はより低く、Ａβ（１−４２）グロブロマーを有意には認識しない。抗体７Ｃ６、４Ｂ７、７Ｅ５及び１０Ｃ１を含む第三のクラスは、Ａβ（２０−４２）グロブロマーを認識するが、その他の有意な認識を示さない。３つのクラスは全て、モノマーＡβ（１−４２）、モノマーＡβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）フィブリル又はｓＡＰＰαを有意には認識しない。
【０３７３】
抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体の選択性特性は、（図６中の）受動免疫において有意に上昇した認識指数が、切断型Ａβ（２０−４２）グロブロマー及びＡβ（１２−４２）グロブロマーの選択的認識に主としてよるものでなければならず、それより非常に低い程度でＡβ（１−４２）グロブロマーが認識され、モノマーＡβ（１−４２）、モノマーＡβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）フィブリル又はｓＡＰＰαは認識されないことを示す。
【実施例９】
【０３７４】
老齢ＴＧ２５７６マウスにおけるＡβプラークの形態の繊維状Ａβペプチド及び髄膜血管中のＡβアミロイドに対するＡβ（２０−４２）選択的抗体の特異的反応に関する生体内原位置での分析
これらの実験のため、１９ヶ月齢のＴＧ２５７６マウス（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７４（５２８４），９９−１０２）若しくは９ヶ月齢のＡＰＰ／ＬｘＰＳ１マウス（上述の記載；ＲｅＭＹＮＤ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の脳材料又は２名のアルツハイマー病患者の剖検材料（ＲＺ１６及びＲＺ５５；ＢｒａｉｎＮｅｔ，Ｍｕｎｉｃｈから入手）を使用した。マウスは、Ａ２６４Ｅ変異を有するヒト１型プレセニリン遺伝子（ＡＰＰ／ＬｘＰＳ１）に加えて、いわゆるスウェーデン変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ；Ｔｇ２５７６）又はいわゆるロンドン変異（Ｖ７１７Ｉ）を有するヒトＡＰＰを過剰発現し、形成されるβアミロイドは、約７ないし１１ヶ月齢で脳実質中に沈着し、βアミロイドは、約１８ヶ月齢でより大きな脳血管中に沈着する（Ｔｇ２５７６）。動物を深麻酔し、０．１Ｍリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で経心的に灌流して血液を流した。次に、脳を頭蓋から摘出し、長軸方向に分割した。脳の一半球をショック凍結させ、もう半分を４％パラホルムアルデヒド中への浸漬により固定した。浸漬により固定された半球を、ＰＢＳ中の３０％ショ糖中に浸漬することによって凍結保護し、凍結しているミクロトーム上に載せた。前脳全体を４０μｍ切片に切り、ＰＢＳ中に回収して、その後の染色手法のために使用した。ヒト脳材料は、新皮質の深さ約１ｃｍ３の凍結ブロックであった。ブロックのわずかな部分を４％パラホルムアルデヒド中に浸漬固定し、マウス脳材料と同様さらに処理した。
【０３７５】
次のプロトコールを使用して、個々の切片をコンゴーレッドで染色した。
【０３７６】
材料：
ＮａＣｌアルコール溶液、ＮａＯＨ溶液及びコンゴーレッド溶液からなるアミロイド色素コンゴーレッドキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ＨＴ−６０）
染色キュベット
ＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓ顕微鏡スライド及びカバーガラス
エタノール、キシロール、包埋媒体
【０３７７】
試薬：
ＮａＣｌ溶液で１：１００に希釈されたＮａＯＨは、アルカリ塩類溶液を生じる。
コンゴーレッド溶液で１：１００に希釈されたアルカリ塩類溶液は、アルカリ性コンゴーレッド溶液を生じる。（使用前１５分以内に調製、濾過）
スライド上に切片を載せ、乾燥させる。
【０３７８】
染色キュベット中でスライドを、最初の３０ないし４０分間はアルカリ塩類溶液中で、次の３０ないし４０分間はアルカリ性コンゴーレッド溶液中で温置する。
【０３７９】
新鮮なエタノールで３回すすぎ、キシロール上で包埋する。
【０３８０】
Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を使用して染色物をまず写真撮影し、定性的に評価した。赤色は、プラークの形態及びより大きな髄膜血管の両者中のアミロイド沈着物を示した。これらの結果を図８Ａに示す。後に、これらの構造に焦点を絞って抗体染色を評価した。
【０３８１】
次のプロトコールに従って、個々の抗体０．０７ないし７．０μｇ／ｍＬを含有する溶液と切片を温置することによって、抗体染色を実施した。
【０３８２】
材料：
ＴＢＳＴ洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝塩類溶液；１０倍濃縮物；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｓ３３０６  Ａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ中の１：１０）
メタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２
ＴＢＳＴ中の５％ロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ）
ＴＢＳＴ中に希釈されたモノクローナルマウス抗グロブロマー抗体
二次抗体：ビオチン化ロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ；７１５−０６５−１５０；ＴＢＳＴ中に１：５００で希釈）
ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｋ０３７７）
ペルオキシダーゼ基質キットジアミノベンジジン（＝ＤＡＢ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＳＫ−４１００）
ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド及びカバーガラス
キシロール非含有包埋媒体（Ｍｅｄｉｔｅ；Ｘ−ｔｒａ  Ｋｉｔｔ）
【０３８３】
手法：
氷冷０．３％Ｈ２Ｏ２中へ浮遊切片を転移させ、３０分間温置する。
ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する。
ロバ血清／ＴＢＳＴとともに２０分間温置する。
一次抗体とともに室温で２４時間温置する。
ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する。
Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣペルオキシダーゼキットからのブロッキング血清とともに２０分間温置する。
ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する。
二次抗体とともに大気温で６０分間温置する。
ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する。
ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘとともに大気温で６０分間温置する。
ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する。
Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣペルオキシダーゼキットからのＤＡＢとともに２０分間温置する。
スライド上に切片を載せ、空気乾燥させ、アルコールで脱水し、包埋した。
【０３８４】
染色の視覚的検査のほかに、ＩｍａｇｅＰｒｏ５．０画像分析システムを使用して組織学的画像から１０個の無作為に選択されたプラークをグラフで切り取り、それらの平均グレースケール値を測定することによって、プラーク染色をさらに定量化した。アミロイドプラークの密度から染色された材料の平均背景密度を差し引くことによって、グレースケール値から光学密度値を算出し（０％−取り囲んでいる背景上にプラーク染色なし、１００％−透過なし／最大染色）、対照と抗体との間の差異及び６Ｇ１とＡβ（２０−４２）選択的抗体との間の差異を、ＡＮＯＶＡによる統計的有意性に関して検査した。
【０３８５】
Ｔｇ２５７６及びＡＰＰ／ＬｘＰＳ１マウスにおける染色の結果を図８ＢないしＤ及びＨに示す。
【０３８６】
１９ヶ月齢の遺伝子導入ＴＧ２５７６マウスの新皮質の横断切片中の０．７μｇ／ｍＬの濃度での異なる抗体の結合：
Ｃ）実質性Ａβ沈着物（アミロイドプラーク）は、６Ｇ１及び６Ｅ１０によってのみ染色されたが、グロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）によっては染色されなかった。
【０３８７】
Ｄ）全てのグロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）は、市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８と比較して有意に弱い実質性プラーク染色を示した。
１１ヶ月齢の遺伝子導入ＴＧ２５７６マウスの新皮質の横断切片中の０．７μｇ／ｍＬの濃度での異なる抗体の結合：
【０３８８】
Ｅ）実質性Ａβ沈着物（アミロイドプラーク）は、グロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）よりも低い濃度で６Ｇ１、６Ｅ１０及び４Ｇ８により有意により強く染色した。
【０３８９】
全てのアミロイド沈着物は、以前、コンゴーレッド親和性染色によって確認されている（コンゴーレッド；図８Ａ参照）。バー＝１００μｍ
【０３９０】
褐色のＤＡＢ沈着物の評価は、Ａβ非選択的６Ｇ１及び６Ｅ１０抗体がプラーク及び髄膜血管を染色するのに対し、Ａβ（２０−４２）グロブロマー選択的抗体５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１は染色しないことを示した。この発見は、インビボではアミロイド構造中に存在するＡβフィブリル又は他のＡβ種に対するこれらの抗体の結合が全くないか又は著しく低いことを示している。この結合の低下は、プラークのあまりにも迅速な溶解及びその後の可溶性Ａβ中の増大、又はミクログリアとのプラーク結合抗体の相互作用による神経炎症によって誘導される副作用の危険性を低下させると推定される。
【０３９１】
ヒトアルツハイマー病患者の脳における染色結果を図８Ｂ、ＦないしＨに示す。
【０３９２】
患者ＲＺ５５の新皮質の横断切片中の０．７μｇ／ｍＬの濃度での異なる抗体の結合：
Ｂ）実質性Ａβ沈着物（アミロイドプラーク）は、６Ｇ１及び６Ｅ１０によってのみ染色されたが、グロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）によっては染色されなかった。
【０３９３】
Ｆ）全てのグロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）は、市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８と比較して有意に弱い実質性プラーク染色を示した。
【０３９４】
Ｈ）血管Ａβ沈着物（矢印）は、６Ｇ１及び６Ｅ１０によってのみ染色されたが、グロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）によっては染色されなかった。
【０３９５】
１１ヶ月齢の遺伝子導入ＡＰＰ／ＬｘＰＳ１マウスの新皮質の横断切片中の０．０７ないし７．０μｇ／ｍＬの濃度での異なる抗体の結合：
Ｇ）実質性Ａβ沈着物（アミロイドプラーク）は、グロブロマー選択的抗体（すなわち、５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１）よりも低い濃度で６Ｇ１、６Ｅ１０及び４Ｇ８により有意により強く染色した。
【０３９６】
全てのアミロイド沈着物は、以前、コンゴーレッド親和性染色によって確認されている（コンゴーレッド；図８Ａ参照）。
【０３９７】
褐色のＤＡＢ沈着物の評価は、Ａβ非選択的６Ｇ１及び６Ｅ１０抗体がプラーク及び髄膜血管を染色するのに対し、Ａβ（２０−４２）グロブロマー選択的抗体５Ｆ７、２Ｆ２、６Ａ２、４Ｄ１０、１０Ｆ１１、３Ｂ１０、７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１は染色しないことを示した。市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８は、グロブロマー選択的抗体と比較してより強い染色を示したが、６Ｇ１に比べて弱い染色を示した。この発見は、インビボではアミロイド構造中に存在するＡβフィブリル又は他のＡβ種に対するグロブロマー選択的抗体の結合が全くないか又は著しく低いＡＰＰ遺伝子導入マウスにおける染色パターンを確認している。この結合の低下は、プラークのあまりにも迅速な溶解及びその後の可溶性Ａβ中の増大、又はミクログリアとのプラーク結合抗体の相互作用による神経炎症によって誘導される副作用の危険性を低下させると推定される。
【実施例１０】
【０３９８】
能動免疫の約１年後のＴＧ２５７６マウスの血漿における抗Ａβ抗体力価及びドットブロット選択性特性
（実施例９からの）Ｔｇ２５７６マウスの（Ａβ（２０−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４２）モノマー及び媒体による）最後の免疫化の約１年後、産生され、なおも存在する抗Ａβ抗体に関して血漿試料を評価した。この目的のため、ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中の１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬまでの範囲の濃度におけるＡβ（１−４２）の異なる形態を連続的に希釈した。各試料の１μＬをニトロセルロースメンブレンへ適用した。（１：４００に希釈された）適切なマウス血漿試料で検出を実施した。抗マウスＩｇＧ抱合型アルカリホスファターゼ及び染色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によって、染色を実施した。
【０３９９】
ドットブロットのためのＡβ標準物質：
１．Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）グロブロマーの調製を実施例１ａに記載している。
【０４００】
２．ＨＦＩＰで前処理したＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー
３ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｈ−１３６８）を１．７ｍＬのエッペンドルフチューブ中の０．５ｍＬ  ＨＦＩＰ（６ｍｇ／ｍＬ懸濁液）中に溶解し、透明な溶液が得られるまで、３７℃で１．５時間振盪した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー、１４００ｒｐｍ）、試料をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中で乾燥させ（１．５時間）、１３．２μＬのＤＭＳＯ中に再懸濁し、１０秒間振盪した後、超音波処理し（２０秒間）、（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー中で、１４００ｒｐｍ）１０分間振盪した。６ｍＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８；ｐＨ７．４を添加し、室温で１時間撹拌した。試料を３０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を０．６ｍＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、ｐＨ７．４中に溶解した。３．４ｍＬのＨ２Ｏを添加し、室温で１時間撹拌した後、３０００ｇで２０分間遠心分離した。さらなる使用のため、上清各０．５ｍＬの８個の一定分量を−２０℃で保存した。
【０４０１】
３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
Ａβ（２０−４２）グロブロマーの調製を実施例１ｄに記載している。
【０４０２】
４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）グロブロマーの調製を実施例１ｄに記載している。
【０４０３】
５．ＨＦＩＰで前処理された、ＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー
１ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ、カタログ番号Ｈ−１１９４）をエッペンドルフチューブ中の０．２５ｍＬのＨＦＩＰ（４ｍｇ／ｍＬ懸濁液）中に懸濁した。（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー中で、１４００ｒｐｍ）チューブを３７℃で１．５時間振盪して透明な溶液を得た後、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中で（１．５時間）乾燥させた。試料を４６μＬのＤＭＳＯ中に再度溶解し（２１．７ｍｇ／ｍＬ溶液＝５ｍＭ）、１０秒間振盪した後、２０秒間超音波処理した。（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  Ｔｈｅｒｍｏミキサー中で、１４００ｒｐｍ）１０分間振盪した後、さらなる使用のために、試料を−２０℃で保存する。
【０４０４】
６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ０．５ｍＬ中に溶解し（＝２ｍｇ／ｍＬ）、即時、室温で３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０４０５】
７．Ａβ（１−４２）フィブリル
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．カタログ番号Ｈ−１３６８）を５００μＬの０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（エッペンドルフチューブ）中に溶解し、試料を室温で１分間撹拌した。この新鮮に調製されたＡβ（１−４２）溶液１００μＬを３００μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。ｐＨを１％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。試料を３７℃で２４時間温置し、（１００００ｇで１０分間）遠心分離した。上清を廃棄し、フィブリルのペレットを４００μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で、１分間の渦巻き撹拌により再懸濁した。
【０４０６】
８．ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａから供給された（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４中の２５μｇ）。ｓＡＰＰαを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡで０．１ｍｇ／ｍＬ（＝１ｐｍｏｌ／μＬ）に希釈した。
【０４０７】
ドットブロットのための材料：
Ａβ標準物質：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中のＡβ抗原の連続希釈物
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ  
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ
ニトロセルロース：
Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ媒体、Ｐｕｒｅ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．４５μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウスＡＰ：
ＡＱ３３０Ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）
検出試薬：
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ錠剤（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：
Ａ−７８８８（Ｆａ．ＳＩＧＭＡ）
ブロッキング試薬：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳
緩衝溶液：
ＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
ＴＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）
＋１４０ｍＭＮａＣｌ
＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：
ＴＢＳ中の２０ｍＬの１％低脂肪乳中に１：４００で希釈された、能動免疫されたＴＧ２５７６マウスの血漿
抗体溶液ＩＩ：
１：５０００希釈
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳中の抗マウスＡＰ
【０４０８】
ドットブロット手法：
１）（５個の連続希釈物中の）異なるＡβ標準物質各１μＬを、互いに約１ｃｍの距離で、ニトロセルロースメンブレン上へ滴下した。
【０４０９】
２）Ａβ標準物質のドットをニトロセルロースメンブレン上で、室温（ＲＴ）で少なくとも１０分間空気乾燥させた（＝ドットブロット）。
【０４１０】
３）ブロッキング：
ドットブロットをＴＢＳ中の５％低脂肪乳３０ｍＬとともに、ＲＴで１．５時間温置する。
【０４１１】
４）洗浄：
ブロッキング溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。
【０４１２】
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄緩衝液を廃棄し、ドットブロットを抗体溶液ＩとともにＲＴで一晩温置する。
【０４１３】
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。
【０４１４】
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄緩衝液を廃棄し、ドットブロットを抗体溶液ＩＩとともにＲＴで１時間温置する。
【０４１５】
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットをＲＴで１０分間振盪しながら温置する。
【０４１６】
９）発色：
洗浄溶液を廃棄する。１個のＮＢＴ／ＢＣＩＰ錠剤を２０ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解し、この溶液とともにドットブロットを５分間温置する。Ｈ２Ｏによる集中洗浄により、発色を停止させる。
【０４１７】
結果を図９に示す。
【０４１８】
異なる免疫化群の血漿：ａ）Ａβ（２０−４２）グロブロマー；ｂ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー；ｃ）Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ；ｄ）媒体対照を、異なる抗体特性に関してドットブロット中の異なるＡβ形態に対して検査した。
【０４１９】
１．Ａβ（１−４２）グロブロマー
２．ＨＦＩＰで前処理された０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー
３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
５．ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー
６．０．１％ＮＨ４ＯＨ中に溶解されたＡβ（１−４２）モノマー
７．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物
８．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【０４２０】
対照としての媒体又はＡβ（１−４２）モノマーのいずれかによる能動免疫とは対照的に、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又はＡβ（１２−４２）グロブロマーによる免疫化は、最後の免疫化の約１年後でさえ、抗体の高い力価を呈する。これらの抗体は、Ａβ（２０−４２）グロブロマー免疫化の場合、Ａβ（２０−４２）グロブロマー選択的であり、Ａβ（１２−４２）グロブロマー免疫化の場合、Ａβ（２０−４２）グロブロマー及びＡβ（１２−４２）グロブロマー選択的である。これは、切断型Ａβ（２０−４２）グロブロマー及びＡβ（１２−４２）グロブロマーが、非常に良好な抗原を表し、前記グロブロマーに対する抗体がインビボで非常に長く持続することを示す。
【０４２１】
（幾つかのドットブロットに関して、おそらく、Ａβペプチドの連続希釈において使用されるＢＳＡに対するネズミ抗体の交差反応である、非特異的染色シグナルが観察されることに留意されたい。）
【実施例１１】
【０４２２】
アルツハイマー病患者におけるＡβ（２０−４２）グロブロマーエピトープの脳レベル
ＳＤＳ−ＤＴＴ脳抽出物：
アルツハイマー病患者の脳試料：ＲＺ１６；ＲＺ５２及びＲＺ５５（Ｂｒａｉｎ  Ｎｅｔ，Ｍｕｎｉｃｈから入手した。）
対照試料：ＲＺ９２（Ｂｒａｉｎ  Ｎｅｔ，Ｍｕｎｉｃｈから入手した。）
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６９７４９８）１錠剤を１ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解する（＝プロテアーゼ阻害剤溶液）。アルツハイマー病患者の脳試料１００ｍｇを２．５ｍＬの（２５μＬのプロテアーゼ阻害剤溶液で補充された）ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＢＳＡ中で、ガラスポッター中で２０ストロークで均質化する。懸濁液を氷上で３０秒間超音波処理した後、３７℃で１６時間温置する。懸濁液を１０００００ｇ、８℃で１時間遠心分離した後、上清を回収する。残留物を５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に溶解し、ガラスポッター中で１０ストロークで均質化する。１０％ＳＤＳ７５μＬ及び０．１６ｍｇ／ｍＬ  ＤＴＴ１２５μＬを添加し、大気温で２０分間撹拌する。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を−２０℃で一晩保存する。使用前に、上清を解凍し、１００００ｇでさらに１０分間遠心分離する。上清（＝ＳＤＳ／ＤＴＴ脳抽出物）をＥＬＩＳＡに使用する。
【０４２３】
ａ）Ａβ（２０−４２）グロブロマーエピトープのためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
試薬リスト：
１．Ｆ９６  Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（カタログ番号４３９４５４）
２．結合抗体：５Ｆ７、７Ｃ６、１０Ｆ１１
３．共役緩衝液：
１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．６
４．ＥＬＩＳＡのためのブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨカタログ番号１１１２５８９）
５．ＰＢＳＴ緩衝液：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４
６．Ａβ（２０−４２）較正標準物質
７．一次抗体：
抗ＡβｐＲＡｂ  ＢＡ１９９；（Ａβ（１−４２）グロブロマー−セファロースにより）アフィニティ精製されたＰＢＳ中のＩｇＧ溶液；Ｋｏｎｚ．：０．２２ｍｇ／ｍＬ
８．二次抗体：
抗ウサギＰＯＤ抱合体；（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１−０３６−０４５）
９．発色：
ＴＭＢ；（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨカタログ番号９２８１７０６０）ＤＭＳＯ中の４２ｍＭ
Ｈ２Ｏ中の３％Ｈ２Ｏ２
１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９
停止溶液：２Ｍ硫酸
【０４２４】
試薬の調製：
１．結合抗体：
個々の結合抗体５Ｆ７、７Ｃ６及び１０Ｆ１１を共役緩衝液中で０．７μｇ／ｍＬの終濃度に希釈する。
【０４２５】
２．ブロッキング試薬：
ブロッキングストック溶液の調製に関し、ブロッキング試薬を１００ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解し、各１０ｍＬの一定分量で−２０℃で保存する。
【０４２６】
１枚のＥＬＩＳＡプレートをブロッキングするために、ブロッキングストック溶液３ｍＬを２７ｍＬのＨ２Ｏで希釈する。
【０４２７】
３．Ａβ（２０−４２）較正標準物質（ＣＳ１）
【０４２８】
Ａβ（１−４２）グロブロマーの調製を実施例１ａに記載している。Ａβ（２０−４２）グロブロマータンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）後に測定した（６．８１ｍｇ／ｍＬ）。１０ｍＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ中に１４．６８μＬのＡβ（２０−４２）グロブロマー（６．８１ｍｇ／ｍＬ）を希釈する（＝１０μｇ／ｍＬ）。１０ｍＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ中に１０μｇ／ｍＬ溶液１０μＬをさらに希釈する（＝１０ｎｇ／ｍＬ＝ＣＳ１）。
【０４２９】
Ａβ（２０−４２）のための較正標準物質：
【０４３０】
【表７】
0005475994.tif 000010
【０４３１】
ＳＤＳ−ＤＴＴ脳抽出物：
ＳＤＳ−ＤＴＴ脳抽出物＝Ｅ＃
（＃は、４つのヒト脳試料（１）ＲＺ１６；（２）ＲＺ５２；（３）ＲＺ５５；（４）ＲＺ９２を表す。）
【０４３２】
【表８】
0005475994.tif 000011
【０４３３】
４．一次抗体：
抗ＡβｐＲＡｂストック溶液をＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ中で０．０５μｇ／ｍＬに希釈する。抗体溶液を即時使用する。
【０４３４】
５．二次抗体：
凍結乾燥した抗ウサギＰＯＤ抱合体を０．５ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解し、５００μＬのグリセロールと混合する。次に、抗体濃縮物を１００μＬの一定分量で−２０℃で保存する。濃縮物をＰＢＳＴ緩衝液中で１：１００００に希釈する。抗体溶液を即時使用する。
【０４３５】
６．ＴＭＢ溶液：
１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９の２０ｍＬを２００μＬのＴＭＢ溶液及び３％過酸化水素２９．５μＬと混合する。この溶液を即時使用する。
【０４３６】
Ａβ（２０−４２）のためのＥＬＩＳＡプレート：
較正標準物質（ＣＳ１．１ないしＣＳ１．８）及び４つのヒト脳試料のＳＤＳ／ＤＴＴ脳抽出物（１）ＲＺ１６；（２）ＲＺ５２；（３）ＲＺ５５；（４）ＲＺ９２（４つの連続希釈物Ｅ＃．１ないしＥ＃．４中のＥ１ないしＥ４）を二重に測定する。
【０４３７】
【表９】
0005475994.tif 000012
【０４３８】
結合モノクローナル抗体５Ｆ７、７Ｃ６、１０Ｆ１１の各々を使用して、このＥＬＩＳＡを実施した。
【０４３９】
手法：
１．ウェルあたり１００μＬのモノクローナル抗体溶液を添加する。＋６℃（冷蔵庫）で一晩ＥＬＩＳＡプレートを温置する。
【０４４０】
２．抗体溶液を廃棄し、各２５０μＬのＰＢＳＴ緩衝液でウェルを３回洗浄する。
【０４４１】
３．ブロッキング溶液２５０μＬ／ウェルを添加する。大気温で２時間温置する。
【０４４２】
４．ブロッキング溶液を廃棄し、各２５０μＬのＰＢＳＴ緩衝液でウェルを３回洗浄する。
【０４４３】
５．較正標準物質及びＳＤＳ／ＤＴＴ脳抽出物各１００μＬ／ウェルを添加する。プレートを大気温で２時間温置した後、６℃で一晩温置する。
【０４４４】
６．較正標準物質及びＳＤＳ／ＤＴＴ脳抽出物溶液を廃棄し、各２５０μＬのＰＢＳＴ緩衝液でウェルを３回洗浄する。
【０４４５】
７．一次抗体溶液２００μＬ／ウェルを添加し、大気温で１時間温置する。
【０４４６】
８．一次抗体溶液を廃棄し、各２５０μＬのＰＢＳＴ緩衝液でウェルを３回洗浄する。
【０４４７】
９．二次抗体溶液２００μＬ／ウェルを添加し、大気温で１時間温置する。
【０４４８】
１０．二次抗体溶液を廃棄し、各２５０μＬのＰＢＳＴ緩衝液でウェルを３回洗浄する。
【０４４９】
１１．ＴＭＢ溶液１００μＬ／ウェルを添加する。
【０４５０】
１２．発色中のプレートの色をモニターし（大気温で５ないし１５分間）、適切な色が発色したとき、停止溶液５０μＬ／ウェルを添加することによって反応を終結させる。
【０４５１】
１３．４５０ｎｍでの励起を測定する。
【０４５２】
１４．較正物質を使用して結果を算出する。
【０４５３】
１５．評価：試料の励起が、較正物質の直線的な範囲を超過する場合、試料を再度希釈し、反復する。
【０４５４】
結果を図１０に示す。
【０４５５】
アルツハイマー病患者及び対照対象者由来の脳抽出物中のＡβ（２０−４２）グロブロマーエピトープの脳レベル
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、脳抽出物を、切断型Ａβ（２０−４２）グロブロマーエピトープ含有量に関して評価した。Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する個々の抗体を使用するＥＬＩＳＡを較正のために使用した。
【０４５６】
アルツハイマー病患者の脳組織の抽出物は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーエピトープ含有量が、対照患者と比較して有意に上昇することを示す。これは、Ａβ（２０−４２）グロブロマーエピトープが実際に、ヒトアルツハイマー病患者の脳中の関連するＡβ種であり、アルツハイマー病動物モデルに関連しているだけではないことを示す。それゆえ、Ａβ（２０−４２）グロブロマーエピトープに対する抗体は、アルツハイマー病の治療のために非常に望ましい。
【実施例１２】
【０４５７】
抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーハイブリドーマ細胞系の発達
ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む本分野で周知の広範な技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、本分野で周知であり、例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（該参考文献は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。）において教示されるものを含むハイブリドーマ技術を使用して産生されることが可能である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生された抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」という語は、真核クローン、原核クローン又はファージクローンのいずれかを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、産生される方法を指すものではない。
【０４５８】
本明細書に記載される抗体を産生するために使用される具体的なプロトコールは、次のとおりである。
【０４５９】
マウスの免疫化：Ｂａｌｂ／ｃ及びＡ／Ｊマウス（６ないし８週齢）をＣＦＡ中の抗原５０μｇで皮下的に免疫化した。Ｉｍｍｕｎｅａｓｙ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）中の抗原５０μｇで３週ごとに動物を追加免疫し、合計３回の追加免疫を実施した。融合の４日前に、抗原１０μｇでマウスを静脈内で追加免疫した。
【０４６０】
細胞融合及びハイブリドーマスクリーニング：標準的な技術を使用して、免疫化された動物由来の脾臓細胞を５：１の割合でＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合した。融合の７ないし１０日後、肉眼でコロニーを観察すると、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体に関して、ＥＬＩＳＡによりＳＮを検査した。ＥＬＩＳＡ陽性ウェル由来の細胞を増大させ、希釈を制限することによってクローニングした。
【０４６１】
抗体のアイソタイプの決定：Ｚｙｍｅｄ  ＥＩＡアイソタイプ分類キットを使用して、抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。
【０４６２】
モノクローナル抗体の規模拡大及び精製：５％低ＩｇＧウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する培地中へハイブリドーマを拡大した。上清を回収し濃縮した。タンパク質Ａクロマトグラフィーを使用してモノクローナル抗体を精製し、ＰＢＳ中へ透析した。
【０４６３】
血清力価：１０匹のマウスをＡβ（２０−４２）グロブロマーで免疫化した。全てのマウスは、１：５０００ないし１０，０００のＥＬＩＳＡ力価（１／２最大ＯＤ４５０ｎｍ）で血清転換した。
【０４６４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの設計
委託のために使用されるＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの内部設計
寄託された細胞系：
１）（本明細書では、「７Ｃ６」とも呼ばれる）ＭＬ１３−７Ｃ６．１Ｄ４．４Ａ９．５Ｇ８
２）（本明細書では、「５Ｆ７」とも呼ばれる）ＭＬ１５−５Ｆ７．５Ｂ１０
３）（本明細書では、「１０Ｆ１１」とも呼ばれる）ＭＬ１５−１０Ｆ１１．３Ｄ９
４）（本明細書では、「４Ｂ７」とも呼ばれる）ＭＬ１５−４Ｂ７．３Ａ６
５）（本明細書では、「２Ｆ２」とも呼ばれる）ＭＬ１５−２Ｆ２．３Ｅ１２
６）（本明細書では、「６Ａ２」とも呼ばれる）ＭＬ１５−６Ａ２．４Ｂ１０
７）（本明細書では、「４Ｄ１０」とも呼ばれる）ＭＬ１３−４Ｄ１０．３Ｆ３
８）（本明細書では、「７Ｅ５」とも呼ばれる）ＭＬ１５−７Ｅ５．５Ｅ１２
９）（本明細書では、「１０Ｃ１」とも呼ばれる）ＭＬ１５−１０Ｃ１．５Ｃ６．３Ｈ４
１０）（本明細書で「３Ｂ１０」とも呼ばれる）ＭＬ１５−３Ｂ１０．２Ｄ５．３Ｆ１
【図面の簡単な説明】
【０４６５】
【図１Ａ】図１は、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）の分子ふるいクロマトグラムを示す。Ａ）０．１％ＮＨ４ＯＨ、Ｂ）７０％ギ酸、Ｃ）０．１％ＮａＯＨ中にＡβ（１−４２）モノマーを溶解し、Ｄ）においてＡβ（１−４０）を０．１％ＮａＯＨ中に溶解した。その後、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で試料を１：１０にさらに希釈した。これらの試料を大気温で溶解した後、５分間（左の列）又は１時間（右の列）温置した後、分子ふるいカラムへ適用した。
【図１Ｂ】図１は、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）の分子ふるいクロマトグラムを示す。Ａ）０．１％ＮＨ４ＯＨ、Ｂ）７０％ギ酸、Ｃ）０．１％ＮａＯＨ中にＡβ（１−４２）モノマーを溶解し、Ｄ）においてＡβ（１−４０）を０．１％ＮａＯＨ中に溶解した。その後、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で試料を１：１０にさらに希釈した。これらの試料を大気温で溶解した後、５分間（左の列）又は１時間（右の列）温置した後、分子ふるいカラムへ適用した。
【図１Ｃ】図１は、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）の分子ふるいクロマトグラムを示す。Ａ）０．１％ＮＨ４ＯＨ、Ｂ）７０％ギ酸、Ｃ）０．１％ＮａＯＨ中にＡβ（１−４２）モノマーを溶解し、Ｄ）においてＡβ（１−４０）を０．１％ＮａＯＨ中に溶解した。その後、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で試料を１：１０にさらに希釈した。これらの試料を大気温で溶解した後、５分間（左の列）又は１時間（右の列）温置した後、分子ふるいカラムへ適用した。
【図１Ｄ】図１は、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）の分子ふるいクロマトグラムを示す。Ａ）０．１％ＮＨ４ＯＨ、Ｂ）７０％ギ酸、Ｃ）０．１％ＮａＯＨ中にＡβ（１−４２）モノマーを溶解し、Ｄ）においてＡβ（１−４０）を０．１％ＮａＯＨ中に溶解した。その後、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で試料を１：１０にさらに希釈した。これらの試料を大気温で溶解した後、５分間（左の列）又は１時間（右の列）温置した後、分子ふるいカラムへ適用した。
【図２Ａ】図２のＡ）は、標準タンパク質（分子マーカータンパク質、レーン１）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；対照（レーン２）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物＋モノクローナル抗体５Ｆ７、３７℃、２０時間、上清（レーン３）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物＋モノクローナル５Ｆ７、３７℃、２０時間、ペレット（レーン４）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物＋モノクローナル６Ｅ１０、３７℃、２０時間、上清（レーン５）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物＋モノクローナル６Ｅ１０、３７℃、２０時間、ペレット（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し；
【図２Ｂ】Ｂ）は、抗体全体の割合におけるＡβフィブリルへ結合したモノクローナル抗体の定量分析の結果を示す。
【図３】図３は、野生型マウス（ポジティブ対照）及びＰＢＳ処理したＡＰＰ／Ｌマウス（ネガティブ対照）と比較した、０．１％ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）モノマー、Ａβ（１−４２）グロブロマー（ｇｌｏｂｕｌｏｍｅｒ）及びＡβ（２０−４２）グロブロマーによる能動免疫後のＡＰＰ／Ｌ遺伝子導入マウスを使用する、対象認識検査の結果を示す棒グラフであり、円は、ＰＢＳ処理したＡＰＰ／Ｌマウスに対する有意差を示し、星印は、群間の差異に関するＡＮＯＶＡにおけるＰ＜０．０５後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定に従った見込みレベル（５０％）に対する高度に有意な差を示す。
【図４】図４は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーによるＡＰＰ／Ｌ  Ｔｇマウスの能動免疫後に得られた多様な抗血清による、Ａβ（１−４２）グロブロマー（１列）；ＨＦＩＰで前処理されたＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー（２列）；Ａβ（２０−４２）グロブロマー（３列）；Ａβ（１２−４２）グロブロマー（４列）；ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中のＡβ（１−４０）（５列）；Ａβ（１−４２）モノマー、ＮＨ４ＯＨ（６列）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物（７列）；Ｓｉｇｍａ製ｓＡＰＰα（８列）の１００ｐｍｏｌ／μＬ（Ａ行）；１０ｐｍｏｌ／μＬ（Ｂ行）；１ｐｍｏｌ／μＬ（Ｃ行）；０．１ｐｍｏｌ／μＬ（Ｄ行）及び０．０１ｐｍｏｌ／μＬ（Ｅ行）の反応性のドットブロットを示す。
【図５】図５は、Ａβ（１−４２）モノマー（０．１％ＮＨ４ＯＨ）、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（２０−４２）グロブロマー又は対照としての媒体のいずれかで能動免疫されたＡＰＰ／ＰＳ１  Ｔｇマウスの脳抽出物中の可溶性及び不溶性Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）ペプチドの濃度を示す棒グラフである。
【図６Ａ】図６は、Ａ）別個に各抗体に関する、及びＢ）全ての抗体を総合したものに関する対照マウスと比較した抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１及び７Ｃ６による受動免疫後のＡＰＰ／Ｌ遺伝子導入マウスによる、対象認識検査の結果を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】図６は、Ａ）別個に各抗体に関する、及びＢ）全ての抗体を総合したものに関する対照マウスと比較した抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体５Ｆ７、１０Ｆ１１及び７Ｃ６による受動免疫後のＡＰＰ／Ｌ遺伝子導入マウスによる、対象認識検査の結果を示す棒グラフである。
【図７Ａ】図７のＡ）は、異なる抗Ａβ抗体（６Ｅ１０、５Ｆ７、４Ｂ７、１０Ｆ１１、６Ａ２、４Ｄ１０、３Ｂ１０、２Ｆ２、７Ｃ６、７Ｅ５、１０Ｃ１）の特異性のドットブロット分析を示す。Ａβ（２０−４２）グロブロマーによるマウスの能動免疫後に融合されたハイブリドーマ細胞（市販の６Ｅ１０、Ｓｉｇｎｅｔ９３２０番以外）の選択によって、本発明で検査されるモノクローナル抗体を得た。個々のＡβ形態を連続希釈物中に適用し、免疫反応のため、個々のモノクローナル抗体とともに温置した。  １．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ２．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ３．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮａＯＨ  ４．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮａＯＨ  ５．Ａβ（１−４２）グロブロマー  ６．Ａβ（１２−４２）グロブロマー  ７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  ８．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物  ９．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【図７Ｂ】Ｂ）の定量的評価は、強度の濃度測定分析を使用して実施した。各Ａβ形態に関し、最低の抗原濃度に相当するドットのみを評価し、ただし、前記濃度は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーの光学的に明確に同定された最後のドットの相対密度（閾値）の２０％を超える相対密度を有した。ドットブロットごとに独立して、この閾値を決定した。前記値は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーの認識と付与された抗体に関する個々のＡβ形態との間の関係を示す。
【図８Ａ】図８は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰ遺伝子導入マウスの新皮質の横断切片に対する異なる濃度での抗体の結合を示す。  Ａ）ＡＰＰ遺伝子導入マウスＴｇ２５７６系及びＡＤ患者（ＲＺ５５）における脳組織中のプラークとしての、及び脳血管中の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）としてのコンゴーレッド染色によるアミロイド沈着物の立証。
【図８Ｂ】Ｂ）ＡＤ患者（ＲＺ１６）におけるＡβ（アミロイドプラーク）の実質性沈着物の強い染色は、６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０でのみ生じる（左の列）のに対し、抗体５Ｆ７、２Ｆ２及び６Ａ２（第二列）、４Ｄ１０、１０Ｆ１１及び３Ｂ１０（第三列）並びに７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１（右の列）は、無染色を示す。０．７μｇ／ｍＬの濃度で全ての抗体を使用した。
【図８Ｃ】Ｃ）１９ヶ月齢のＴｇ２９７６におけるＡβ（アミロイドプラーク）の実質性沈着物の強い染色は、６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０でのみ生じる（左の列）のに対し、抗体５Ｆ７、２Ｆ２及び６Ａ２（第二列）、４Ｄ１０、１０Ｆ１１及び３Ｂ１０（第三列）並びに７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１（右の列）は、無染色を示す。０．７μｇ／ｍＬの濃度で全ての抗体を使用した。
【図８Ｄ】Ｄ）ないしＧ）画像分析を使用した組織学的画像におけるＡβプラーク染色の分析の定量化。背景組織のグレースケール値によって差し引かれるプラークのグレースケール値から、光学密度値（０％＝無染色）を算出した。Ｄ）老齢Ｔｇ２５７６マウスにおける０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、Ｅ）ＡＰＰ／Ｌマウスにおける抗体の３つの異なる濃度での染色、Ｆ）ＡＤ患者（ＲＺ５５）における０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、及びＧ）ＡＤ患者（ＲＺ１６）における抗体の３つの異なる濃度での染色。市販の抗体６Ｅ１０（星印）及び４Ｇ８（円）及びその他の全ての抗体の染色間の差（３つの星印／円：対照に対するｐ＜０．００１；ｐ＜０．００１でのＡＮＯＶＡ後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）を統計的に評価した（Ｄ、Ｆ）。Ｅ）及びＧ）において、６Ｇ１以外の全ての抗体は、市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８よりも有意に弱い染色を常に示した（ＡＮＯＶＡにおけるｐ＜０．００１後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定におけるｐ＜０．００１）。
【図８Ｅ】Ｄ）ないしＧ）画像分析を使用した組織学的画像におけるＡβプラーク染色の分析の定量化。背景組織のグレースケール値によって差し引かれるプラークのグレースケール値から、光学密度値（０％＝無染色）を算出した。Ｄ）老齢Ｔｇ２５７６マウスにおける０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、Ｅ）ＡＰＰ／Ｌマウスにおける抗体の３つの異なる濃度での染色、Ｆ）ＡＤ患者（ＲＺ５５）における０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、及びＧ）ＡＤ患者（ＲＺ１６）における抗体の３つの異なる濃度での染色。市販の抗体６Ｅ１０（星印）及び４Ｇ８（円）及びその他の全ての抗体の染色間の差（３つの星印／円：対照に対するｐ＜０．００１；ｐ＜０．００１でのＡＮＯＶＡ後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）を統計的に評価した（Ｄ、Ｆ）。Ｅ）及びＧ）において、６Ｇ１以外の全ての抗体は、市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８よりも有意に弱い染色を常に示した（ＡＮＯＶＡにおけるｐ＜０．００１後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定におけるｐ＜０．００１）。
【図８Ｆ】Ｄ）ないしＧ）画像分析を使用した組織学的画像におけるＡβプラーク染色の分析の定量化。背景組織のグレースケール値によって差し引かれるプラークのグレースケール値から、光学密度値（０％＝無染色）を算出した。Ｄ）老齢Ｔｇ２５７６マウスにおける０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、Ｅ）ＡＰＰ／Ｌマウスにおける抗体の３つの異なる濃度での染色、Ｆ）ＡＤ患者（ＲＺ５５）における０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、及びＧ）ＡＤ患者（ＲＺ１６）における抗体の３つの異なる濃度での染色。市販の抗体６Ｅ１０（星印）及び４Ｇ８（円）及びその他の全ての抗体の染色間の差（３つの星印／円：対照に対するｐ＜０．００１；ｐ＜０．００１でのＡＮＯＶＡ後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）を統計的に評価した（Ｄ、Ｆ）。Ｅ）及びＧ）において、６Ｇ１以外の全ての抗体は、市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８よりも有意に弱い染色を常に示した（ＡＮＯＶＡにおけるｐ＜０．００１後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定におけるｐ＜０．００１）。
【図８Ｇ】Ｄ）ないしＧ）画像分析を使用した組織学的画像におけるＡβプラーク染色の分析の定量化。背景組織のグレースケール値によって差し引かれるプラークのグレースケール値から、光学密度値（０％＝無染色）を算出した。Ｄ）老齢Ｔｇ２５７６マウスにおける０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、Ｅ）ＡＰＰ／Ｌマウスにおける抗体の３つの異なる濃度での染色、Ｆ）ＡＤ患者（ＲＺ５５）における０．７μｇ／ｍＬ抗体での染色、及びＧ）ＡＤ患者（ＲＺ１６）における抗体の３つの異なる濃度での染色。市販の抗体６Ｅ１０（星印）及び４Ｇ８（円）及びその他の全ての抗体の染色間の差（３つの星印／円：対照に対するｐ＜０．００１；ｐ＜０．００１でのＡＮＯＶＡ後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）を統計的に評価した（Ｄ、Ｆ）。Ｅ）及びＧ）において、６Ｇ１以外の全ての抗体は、市販の抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８よりも有意に弱い染色を常に示した（ＡＮＯＶＡにおけるｐ＜０．００１後のｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定におけるｐ＜０．００１）。
【図８Ｈ】Ｈ）Ａβの血管沈着物の強い染色（矢印）は、６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０（左の列）でのみ生じるのに対し、抗体５Ｆ７、２Ｆ２及び６Ａ２（第二列）、４Ｄ１０、１０Ｆ１１及び３Ｂ１０（第三列）並びに７Ｃ６、７Ｅ５及び１０Ｃ１（右の列）は、無染色を示す。０．７μｇ／ｍＬの濃度で全ての抗体を使用した。定量的に同様の状況は、Ｔｇ２５７６マウスにおいて見出された（ここでは示されていない。）。
【図９Ａ】図９は、能動免疫の約１年後のＴＧ２５７６マウスの血漿における抗Ａβ抗体力価及びドットブロット選択性特性を示す。Ａβ（２０−４２）グロブロマー、Ｂ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー、Ｃ）Ａβ（１−４２）モノマー及びＤ）媒体による最後の免疫化の約１年後のＴｇ２５７６マウスの血漿試料を、産生された抗Ａβ抗体に関して評価し、ドットブロットによってなおも存在した。  １．Ａβ（１−４２）グロブロマー  ２．ＨＦＩＰで前処理された０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー  ３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  ４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー  ５．ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー  ６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ７．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物  ８．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【図９Ｂ】図９は、能動免疫の約１年後のＴＧ２５７６マウスの血漿における抗Ａβ抗体力価及びドットブロット選択性特性を示す。Ａβ（２０−４２）グロブロマー、Ｂ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー、Ｃ）Ａβ（１−４２）モノマー及びＤ）媒体による最後の免疫化の約１年後のＴｇ２５７６マウスの血漿試料を、産生された抗Ａβ抗体に関して評価し、ドットブロットによってなおも存在した。  １．Ａβ（１−４２）グロブロマー  ２．ＨＦＩＰで前処理された０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー  ３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  ４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー  ５．ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー  ６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ７．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物  ８．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【図９Ｃ】図９は、能動免疫の約１年後のＴＧ２５７６マウスの血漿における抗Ａβ抗体力価及びドットブロット選択性特性を示す。Ａβ（２０−４２）グロブロマー、Ｂ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー、Ｃ）Ａβ（１−４２）モノマー及びＤ）媒体による最後の免疫化の約１年後のＴｇ２５７６マウスの血漿試料を、産生された抗Ａβ抗体に関して評価し、ドットブロットによってなおも存在した。  １．Ａβ（１−４２）グロブロマー  ２．ＨＦＩＰで前処理された０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー  ３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  ４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー  ５．ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー  ６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ７．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物  ８．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【図９Ｄ】図９は、能動免疫の約１年後のＴＧ２５７６マウスの血漿における抗Ａβ抗体力価及びドットブロット選択性特性を示す。Ａβ（２０−４２）グロブロマー、Ｂ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー、Ｃ）Ａβ（１−４２）モノマー及びＤ）媒体による最後の免疫化の約１年後のＴｇ２５７６マウスの血漿試料を、産生された抗Ａβ抗体に関して評価し、ドットブロットによってなおも存在した。  １．Ａβ（１−４２）グロブロマー  ２．ＨＦＩＰで前処理された０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８中のＡβ（１−４２）モノマー  ３．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  ４．Ａβ（１２−４２）グロブロマー  ５．ＨＦＩＰで前処理されたＤＭＳＯ中の５ｍＭのＡβ（１−４０）モノマー  ６．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ７．Ａβ（１−４２）フィブリル調製物  ８．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
【図１０】図１０は、アルツハイマー病を有するヒト及び痴呆になっていない対照の脳組織中のＡβ（２０−４２）グロブロマーのレベルを要約する表を示す。
【図１１Ａ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｂ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｃ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｄ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｅ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｆ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｇ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｈ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｉ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【図１１Ｊ】図１１は、次表のとおりのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す（各アミノ酸配列において相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。）。
【０４６６】
【表１０】
0005475994.tif 000013
0005475994.tif 000014
【図１Ａ】
0005475994.tif 000015
【図１Ｂ】
0005475994.tif 000016
【図１Ｃ】
0005475994.tif 000017
【図１Ｄ】
0005475994.tif 000018
【図２Ａ】
0005475994.tif 000019
【図２Ｂ】
0005475994.tif 000020
【図３】
0005475994.tif 000021
【図４】
0005475994.tif 000022
【図５】
0005475994.tif 000023
【図６Ａ】
0005475994.tif 000024
【図６Ｂ】
0005475994.tif 000025
【図７Ａ】
0005475994.tif 000026
【図７Ｂ】
0005475994.tif 000027
【図８Ａ】
0005475994.tif 000028
【図８Ｂ】
0005475994.tif 000029
【図８Ｃ】
0005475994.tif 000030
【図８Ｄ】
0005475994.tif 000031
【図８Ｅ】
0005475994.tif 000032
【図８Ｆ】
0005475994.tif 000033
【図８Ｇ】
0005475994.tif 000034
【図８Ｈ】
0005475994.tif 000035
【図９Ａ】
0005475994.tif 000036
【図９Ｂ】
0005475994.tif 000037
【図９Ｃ】
0005475994.tif 000038
【図９Ｄ】
0005475994.tif 000039
【図１０】
0005475994.tif 000040
【図１１Ａ】
0005475994.tif 000041
【図１１Ｂ】
0005475994.tif 000042
【図１１Ｃ】
0005475994.tif 000043
【図１１Ｄ】
0005475994.tif 000044
【図１１Ｅ】
0005475994.tif 000045
【図１１Ｆ】
0005475994.tif 000046
【図１１Ｇ】
0005475994.tif 000047
【図１１Ｈ】
0005475994.tif 000048
【図１１Ｉ】
0005475994.tif 000049
【図１１Ｊ】
0005475994.tif 000050
【配列表】
0005475994000001.app