(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法であって、
ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、Ｆａｓを介した刺激を付与しながら、前記特定抗原と共に培養して前記特定抗原に特異的な抗原特異的Ｂ細胞を選別し、前記特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を得ること
を含む当該製造方法。
【請求項２】
前記ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体及びＦａｓを介した刺激は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬにより付与される請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下で培養する一次培養及びＩＬ−２１の存在下で培養する二次培養により培養することによって得られる請求項１又は請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原を提示した担体が使用される請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原を提示したフィーダー細胞が使用される請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の製造方法により得られた抗原特異的Ｂ細胞集団を用いてモノクローナル抗体を製造するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原を表面に有する抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対して高い選択性を示すため、有効な医薬として近年大きな注目を集めており、特に、癌細胞を標的とする抗体医薬には大きな期待が寄せられている。モノクローナル抗体を有効な医薬としてヒトの治療に適用するには、異種抗原の量が少ないヒトの抗体を投与することが、拒絶反応回避の観点から最も理想的である。このため多くのキメラ抗体やヒト化抗体が開発されている。
【０００３】
一般にヒト治療用のキメラ抗体やヒト化抗体は、抗原をマウス等に複数回免疫した後に、脾臓やリンパ節の細胞をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマが産生するマウスＩｇＧ抗体を基に、組換え技術を用いて作製している。
しかしながら、動物個体を用いることや、高い親和性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することには時間がかかり、組換え技術により得られた抗体の活性を確認する必要がある。このため、この方法では、目的とする抗体の作製に時間がかかる上に、その効果はヒトに投与するまで確定できない。
また、免疫抗原が個体毒性を示す場合には個体への免疫は困難である。さらに、動物種間で保存性の高いタンパク抗原を抗原とする場合、免疫学的寛容のために抗体が産生されにくい。
【０００４】
その一方で、抗原に対する高い親和性を示すＢ細胞は胚中心で選択されることが知られているが、この選択の機構については、充分に解明されていない。特定の抗原に対して高い親和性を示すＢ細胞を人為的に増殖させて濃縮できれば、特定の抗原に対して高い親和性を示すモノクローナル抗体をより短時間で作製できる。
【０００５】
Ｂ細胞を増殖させる方法として、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とインターロイキン（ＩＬ）−４等のサイトカインの存在下でＢ細胞を培養する方法が知られている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。
【０００６】
また、胚中心は、抗原未接触のナイーブＢ細胞が抗原と接触して増殖した結果形成される組織学的構造であり、胚中心のＢ細胞にはクラススイッチや体細胞超突然変異が起こることが知られている。例えば、非特許文献２では、ＢＡＦＦとＣＤ４０Ｌを同時発現させた線維芽細胞の存在下で、ＩＬ−４及び抗μＨｃ抗体と共に脾臓Ｂ細胞を培養すると、殆どのＢ細胞が胚中心様の表現型を示すようになり、その約半数はＩｇＧ１へクラススイッチすること、及びその後にＩＬ−４をＩＬ−２１に切り替えると、ＩｇＥ陽性細胞が増加することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平９−５１２４４１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J Exp Med. 1992 Vol.176(6): pp.1543-1550
【非特許文献２】日本免疫学会学術集会記録、２００７年、第３７巻、第２５９頁、３−Ｆ−Ｗ４１−１６−Ｏ／Ｐ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ナイーブＢ細胞、抗原接触後のＢ細胞に関わらず、特定の抗原に対して高い親和性を示すＩｇＧ抗体を産生可能なＢ細胞のみを高い選択性で且つ短時間に得ることには、未だに至っていない。
従って、本発明の目的は、特定抗原に対して特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を簡便に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］  特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法であって、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体及びＦａｓを介した刺激を付与しながら、前記特定抗原と共に培養して前記特定抗原に特異的な抗原特異的Ｂ細胞を選別し、前記特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含む当該製造方法。
［２］  前記ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体及びＦａｓを介した刺激は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬにより付与される［１］に記載の製造方法。
［３］  前記ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下で培養する一次培養及びＩＬ−２１の存在下で培養する二次培養により培養することによって得られる［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］  前記ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原を提示した担体が使用される［１］〜［３］のいずれかにに記載の製造方法。
［５］  前記ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び抗原を提示したフィーダー細胞が使用される［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法により得られた抗原特異的Ｂ細胞集団を用いてモノクローナル抗体を製造するモノクローナル抗体の製造方法。
［７］  ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原を表面に有する抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、特定抗原に対して特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を簡便に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明によるＩｇＧ陽性Ｂ細胞の選別を、フィーダー細胞を使用した一実施形態に基づいて説明する概念図である。
【図２】本発明の実施例１にかかるＢ細胞増殖曲線のグラフである。
【図３】本発明の実施例１にかかる一次および二次培養中の細胞集団に対する抗ＩｇＥ抗体及び抗ＩｇＧ１抗体を用いた二次元染色の結果を説明する図である。
【図４】本発明の実施例２にかかる細胞集団中の抗ＮＰＩｇＧ１産生細胞の割合を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例３にかかる選別工程後の細胞集団のＮＰ共役ＢＳＡビオチン及び抗ＩｇＧ１抗体を用いた二次元染色の結果を説明する図である。
【図６】本発明の実施例４にかかるＡＩＤ誘導体細胞における抗体遺伝子の超突然変異の部位を説明する図である。
【図７】本発明の実施例５にかかるヒト末梢血Ｂ細胞増殖曲線のグラフである。
【図８】本発明の実施例５にかかるヒト末梢血細胞の二次培養後の細胞集団に対する抗ＩｇＧ抗体又は抗IｇＧ１抗体と抗Ｃ１９抗体とを用いた二次元染色の結果を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法は、特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法であって、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、Ｆａｓを介した刺激を付与しながら、前記特定抗原と共に培養して前記特定抗原に特異的な抗原特異的Ｂ細胞を選別し、前記特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を得ること（以下、「選別工程」という）を含む製造方法である。
【００１４】
この方法によれば、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、Ｆａｓを介した刺激を付与しながら、目的とする特定抗原と共に培養するので、他の抗原に対して親和性を有するＢ細胞ではなく、用いられた特定抗原に対して親和性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞が生存し、その他のＢ細胞は排除される。特定の理論に拘束されないが、この段階のＩｇＧ陽性Ｂ細胞の表面には、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）の他に、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）及びＦａｓが存在しており、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ−Ｒを介した刺激を受けたＩｇＧ陽性Ｂ細胞のうち、用いられた抗原に対する受容体を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞（特定抗原に対して特異性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞）以外は、Ｆａｓを介した刺激によりアポトーシスが誘導されて死滅するためと推測される（図１参照）。この結果、選別の後に得られた細胞集団は、特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞で主として構成された抗原特異的Ｂ細胞集団となる。
従って、複数回の免疫を経ることなく、特定抗原に対して特異性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団が効率よく得られる。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
本発明に用いられるＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、表面にＩｇＧを有するＢ細胞である。このＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、Ｂ細胞を含有する細胞集団からＩｇＧ抗体の有無に基づいて得ることができる。
【００１６】
本発明に用いられるＢ細胞を含有する細胞集団は、一般には末梢血細胞、骨髄細胞又はリンパ系臓器、例えば脾臓細胞などに由来する細胞集団であればよく、特に限定されない。またＩｇＧ陽性Ｂ細胞としては、抗原未反応のナイーブＢ細胞であっても、抗原接触後のＢ細胞であってもよい。ここで本明細書における「ナイーブＢ細胞」とは、抗原と未反応の成熟Ｂ細胞を一般に指し、ＣＸＣＲ５陽性且つＣＤ４０陽性の表面抗原を示す細胞が該当する。
また、本発明に用いられる細胞集団は、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）及びＦａｓを有し且つ抗原を認識可能なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含むものであればよく、本発明の目的を妨げない範囲で分化段階における他のステージのＢ細胞や多種の細胞が含まれていてもよい。培養による選択の効率の観点から、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞以外のＢ細胞、例えば、ＩｇＥ陽性細胞、ＣＤ１３８陽性（プラズマ）細胞や、Ｂ細胞以外の細胞、例えば、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞を除去することが好ましい。
【００１７】
本発明において用いられる細胞集団は、免疫系が確立された生物由来の細胞集団であればよく、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えばブタ、ウシ、ウマなど、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなど、鳥類、例えはニワトリ、ウズラなどが含まれる。本細胞集団の由来としては、齧歯類及び霊長類であることが好ましく、マウス、ヒトを例示することができる。脾臓等の生体組織から細胞集団を調製する方法は、通常のＢ細胞集団を調製する条件をそのまま適用すればよい。また、生体由来の細胞集団に限定されず、確立されたＢ細胞株であってもよい。
【００１８】
ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団の培養は、通常、Ｂ細胞の培養に用いられる培地による通常の培養条件であればよい。このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培地に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
培養温度などの培養条件は、一般的なＢ細胞に対して用いられる培養条件をそのまま適用することができ、例えば、３７℃５％ＣＯ２の条件が挙げられる。
細胞集団の培地への播種密度は、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０２個〜１×１０７個／ｃｍ２、好ましくは１×１０３個〜１×１０７個／ｃｍ２とすればよく、特にヒトＢ細胞は高密度で培養を開始した方が増殖率が良いことから、好ましくは１×１０４個〜１×１０７個／ｃｍ２とすればよい。この範囲内であれば、４日間程度の培養後に、過増殖状態になることを予防できる。
【００１９】
本発明に用いられるＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、Ｆａｓを介した刺激により細胞内シグナルを生じさせるためには、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）及びＦａｓを有することを要する。これらの分子に対する刺激は、これらの分子を外部から認識してＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体及びＦａｓを有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞の内部に細胞内シグナルを生じさせるものであれば制限はなく、これらの分子の全部又は一部を認識する抗体又は抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＢＡＦＦ及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）を挙げることができる。なお、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体及びＦａｓを介した刺激は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＢＡＦＦ及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）のうちの１つ以上を、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）又はＦａｓに対する抗体又は抗体断片に代えて、与える形態も本発明に包含される。
【００２０】
ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０に対するリガンドであり、ＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Nature, Vol.357, pp.80-82 (1992)及び、EMBO J., Vol.11, pp.4313-4321 (1992)参照）。本発明では、ＣＤ４０Ｌの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＣＤ４０Ｌは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＣＤ４０Ｌは、培養系中のＢ細胞に対してＣＤ４０Ｌの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型であっても、膜結合型であってもよい。
遊離型ＣＤ４０Ｌは、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団を形成するためには、Ｂ細胞が増殖を維持可能な濃度で培養系に存在すればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌだが、Ｂ細胞の増殖に伴う相対的な減少を考慮して、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌとすることができる。
【００２１】
ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子：B cell activation factor belonging to the tumor necrosis factor family）は、ＴＮＦ類縁分子であって抗原と反応したＢ細胞の増殖、分化等に関与していることが知られている分子であり、ＢＡＦＦのアミノ酸配列は既に公知となっている（例えば、J Exp Med, Vol.189, pp.1747-1756 (1999)及び、Science, Vol. 285, pp.260-263 (1999)及び、J Bio Chem, Vol.274, pp.15978-15981, (1999)）。本発明では、ＢＡＦＦの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＢＡＦＦは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＢＡＦＦは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＢＡＦＦの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型（即ち、分泌型）であっても、膜結合型であってもよい。
【００２２】
遊離型ＢＡＦＦは、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団を形成するためには、Ｂ細胞が増殖を維持可能な濃度で培養系に存在すればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、高濃度であればより生存支持活性が期待できるとの観点から好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ濃度とすることができる。
【００２３】
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、ＴＮＦファミリーに属するデス因子、即ちアポトーシス誘導活性を示すサイトカインであり、そのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Cell, Vol.75, pp.1169-1178 (1993)）参照。本発明では、ＦａｓＬの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＦａｓＬは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＦａｓＬは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＦａｓの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、細胞内シグナルを生じさせることができれば遊離型であっても、膜結合型であってもよい。
ＦａｓＬは、一般的にＢ細胞に対してアポトーシスを誘導可能な濃度で培養系に存在していればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、また抗原刺激による細胞死の抑制を誘導する観点から、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの濃度とすることができる。
【００２４】
なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬの由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、ヒト、マウスを例示することができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来するものであってもよく、異なる種に由来するものであってもよい。
【００２５】
ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）又はＦａｓに対する抗体又は抗体断片は、当業界で既知の方法に従って得ることができる。ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）又はＦａｓに対して結合能を有する抗体であれば、特に制限はない。
これらの抗体又は抗体断片は、担体の表面に提示された形態であっても、抗体表面に固定化されていない遊離型又は可溶化形態であってもよい。
【００２６】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ又はＦａｓＬは、培養系中のＢ細胞に対して確実に細胞内シグナルを与える観点から、担体の表面に提示された形態であることが好ましい。
各分子を表面に提示するために用いられる担体としては、細胞、人工脂質二重膜、ポリスチレン若しくはポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、コラーゲン、ナイロン、ニトロセルロース、寒天、アガロース、セファロースなどの多糖、紙、ガラスなどを、上記分子を表面に提示するために通常用いられるものであれば、特に制限されることなく挙げることができる。担体の形状には特に限定はなく、シート状、平板状、球状、スポンジ状、繊維状などのいずれの形状としてもよい。担体としては、細胞の確実な選択性の観点から、細胞であることが好ましい。担体として使用可能な細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞（例えばＨｅＬａ細胞）、胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３など）、濾胞樹状細胞などを挙げることができる。なかでも、増殖速度が速く、細胞表面積が大きい、フィーダー細胞の除去が簡便であるとの観点から、線維芽細胞が好ましい。
【００２７】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを細胞表面に提示されたフィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬの既知の配列に基づいて、当業者であれば遺伝子組み換え技術等を用いて作製することができる。
フィーダー細胞の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。また、フィーダー細胞は、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する細胞であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００２８】
選別工程においてＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対して提示される特定抗原は、本発明において目的とする抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞が親和性を示す抗原を意味し、目的に応じて適宜選択される。抗原の種類としては、抗原性を示すものであれば特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、糖鎖、脂質、アミノ酸、ペプチド、タンパク、ハプテン、低分子化合物などを挙げることができる。これらの物質は、Ｂ細胞が認識できる形態で提示されていればよく、遊離型であっても担体固定型であってもよい。Ｂ細胞への確実な提示の観点から、抗原は、担体に固定された形態であることが好ましい。
【００２９】
ＩｇＧ陽性Ｂ細胞による抗原認識性を高めるために、用いられる抗原には、抗原単独で用いられる形態の他に、既知の補助分子を付加した形態、抗体分子との結合形態など、当業界で既知の抗原性を高める形態を適用してもよい。
【００３０】
抗原の提示に抗体分子との結合形態を適用した場合あるいはタンパク抗原と抗体Ｆｃ領域との融合タンパクを適用した場合には、担体表面に抗原を展示させるための足場、例えばＦｃレセプター分子又は、プロテインＡまたはプロテインＧなどを更に用いればよい。また担体の構成成分に対して結合するタンパク質と、抗原蛋白の融合タンパク質を用いてもよい。また、抗原として膜型タンパク質を提示する場合はその遺伝子を発現ベクターの形で担体としての細胞に導入して発現させてもよい。それ以外のタンパクの場合は適当なシグナルペプチド（分泌タンパクの場合は不要）と適当な膜貫通領域（例えばＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩのもの）との融合タンパクとして発現させることのできる発現ベクターを担体としての細胞に導入して発現させてもよい。
【００３１】
目的とする抗原特異的Ｂ細胞の選択効率の観点から、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ又はＦａｓＬと、抗原とは、フィーダー細胞に提示されていることが更に好ましい。なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び抗原は、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対して細胞内シグナルを生じさせることができれば、必ずしも同一のフィーダー細胞上に存在していなくてもよい。
【００３２】
選別工程で用いられるＩＬ−２１は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ−２１の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、例えばマウス、ヒトなどを挙げることができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００３３】
選別工程の培養系に含まれるＩＬ−２１の量は、特定抗原に対して親和性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖可能な量であればよく、一般に、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌとすることが好ましく、１００ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌとすることが更に好ましい。なお、選別工程では、得られる細胞集団におけるＩｇＧ陽性Ｂ細胞の割合の観点から、培養系にはＩＬ−４が含まれていないことが好ましい。
【００３４】
選別工程は、播種密度及び細胞種などの条件によって異なる場合もあるが、確実な選別の観点から一般に選別工程開始後半日以上とし、確実な選別の観点から１日〜３日としてもよく、１日〜２日とすることが好ましいが、細胞の生存能が維持されれば、より長期であってもよく、より長期に培養することによって、より高い親和性を有する抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を得ることができる。
【００３５】
また、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、選別工程はフィーダー細胞を更新しながら、繰り返し行ってもよい。その場合、各選別工程の後にＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖させるために、後述する二次培養を行うことが好ましい。
Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、工程を繰り返す毎に抗原の濃度や価数を変化（減少）させてもよい。さらに、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、直前の工程の培養上澄、または培養上澄中に産生された抗体を次の工程を行う際に培養系へ加えてもよい。これにより、Ｂ細胞受容体と抗体との競合が生じて、より高い親和性のＢ細胞受容体をもつＢ細胞が選別され得る。
【００３６】
本発明におけるＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）及びＦａｓを有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、これらの分子の存在を、例えば抗体等を用いたときの反応性等に基づいて得てもよいが、調製時間及び目的とするＩｇＧ陽性Ｂ細胞の細胞密度の観点から、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下で培養する一次培養工程及びＩＬ−２１の存在下で培養する二次培養工程により培養すること（培養工程）を含む方法によって得たものであることが好ましい。
このような異なるサイトカインを用いた二段階の培養を行うことによって、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞が大量に増殖する。培養工程の開始時の播種密度及び細胞種によって異なるが、本培養工程を行うことにより、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、培養開始時の１０３倍〜１０５倍まで増やすことが可能となる。
【００３７】
上記培養工程では、一次培養及び二次培養とも、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら行う。ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激としては、選別工程と同様に、これらの分子に対する抗体を用いて行ってもよく、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを用いてもよい。またこれらの抗体及び分子からの刺激を確実に培養対象となる細胞集団に対して付与する観点から、これらの抗体またはＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを有する担体、例えばフィーダー細胞等を用いてもよい。ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦと、担体等については、選別工程において記載した事項をそのまま適用することができる。培養工程で用いられる担体又はフィーダー細胞については、それぞれ培養用担体または培養用フィーダー細胞とよぶことがある。
【００３８】
一次培養に用いられるＩＬ−４は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ−４の濃度は、Ｂ細胞の効果的な増殖の観点から１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが好ましく、ＩｇＥ細胞の抑制の観点から１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌとすることが更に好ましい。
【００３９】
また一次培養では、培養対象となるＢ細胞集団の種類や由来に応じて、ＩＬ−４とともに他のサイトカインも使用してもよい。例えばＩＬ−２をＩＬ−４と併用する場合には、ＩＬ−２の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４０】
一次培養を開始するときの細胞の播種密度は、特に制限はないが、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０２個〜１×１０６個／ｃｍ２、好ましくは１×１０３個〜１×１０６個／ｃｍ２とすればよい。
また一次培養は、播種密度によって異なる場合もあるが、Ｂ細胞集団の増殖速度の観点から一般に培養開始後２日〜８日としてもよく、細胞集団中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞の密度の観点から３日〜６日とすることが好ましく、３日〜５日とすることがより好ましい。
【００４１】
上記培養工程における二次培養は、ＩＬ−２１の存在下で行われる。ＩＬ−２１は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ−２１の濃度は、効果的なＢ細胞の増殖の関連から１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが更に好ましい。
二次培養は、播種密度によって異なる場合もあるが、Ｂ細胞集団の増殖速度の観点から一般に二次培養開始後２日〜１０日としてもよく、細胞集団中でのプラズマ芽細胞の数の抑制とＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数の増加の観点から２日〜７日とすることが好ましく、２日〜５日とすることがより好ましいが、細胞の生存能が維持されれば、より長期であってもよい。
【００４２】
二次培養を開始する際には、一次培養後の培養系に所定量のＩＬ−２１を添加してもよく、一次培養後の培養系から細胞を回収して、ＩＬ−４を含まないＩＬ−２１含有培地に移して開始してもよい。二次培養におけるＩｇＧ陽性Ｂ細胞の増殖速度及び得られた細胞集団中におけるＩｇＥ陽性Ｂ細胞の混入を抑制する観点から、ＩＬ−２１を含有し且つＩＬ−４を含まない培地により二次培養を行うことが最も好ましい。
【００４３】
なお、本発明で用いられるＩＬ−４及びＩＬ−２１の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００４４】
二次培養終了後には、目的とするＢ細胞の濃度を確実に高めるために、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞以外の細胞を除去することが好ましい。除去対象となる細胞としては、ＩｇＥ陽性Ｂ細胞、ＣＤ１３８陽性の形質細胞、フィーダー細胞（存在する場合）などを挙げることができる。これらの細胞は、表面に存在する固有の表面抗原に対する抗体等を用いた既知の技術で除去することができる。
【００４５】
また二次培養では、培養対象となるＢ細胞集団の種類や由来に応じて、ＩＬ−２１とともに他のサイトカインも使用してもよい。例えば、ＩＬ−２をＩＬ−２１と併用する場合には、ＩＬ−２の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４６】
本発明の抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法では、目的とする抗原特異的ＩｇＧ陽性細胞を選別するために必要な期間行えばよく、選別工程を開始するときのＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数、用いられる抗原の種類又はフィーダー細胞の状態などによって適宜変更することができる。例えば、効率よく目的とする細胞集団を得るために、選別工程を１日〜２日間としてもよく、培養工程を含む場合には、一次培養を３日〜５日間、二次培養を２日〜５日間とし、選別工程を１日〜２日間としてもよい。
【００４７】
本発明の製造方法では、選別工程の後に、選別された抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を更に増殖させるための増殖工程を含んでもよい。この増殖工程は、選別工程で選別された特定抗原に対して抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖させることができる培養条件で行えばよいが、選別されたＩｇＧ陽性Ｂ細胞の効率よい増殖の観点から、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦと共に培養するものであることが好ましい。
増殖工程で好ましく用いられるＩＬ−２１については、前述した二次培養又は選別工程で適用した条件をそのまま適用することができる。また、増殖工程に好ましく用いられるＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦについても、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００４８】
増殖工程は、得られた細胞集団中の目的とするＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数に応じた期間継続すればよく、一般に１日以上、好ましくは３日以上とすることができるが、培養系に含まれる細胞集団の増殖速度及び密度に応じて適宜調整すればよい。
【００４９】
なお、本発明では、上述した選別工程後に得られた細胞に対して用いられる「抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団」との用語は、得られた細胞を総括する意味で用いられ、細胞の数に限定されない。即ち、複数個の細胞を指す場合に用いられる他、１個の細胞のみが存在する場合にも同様に用いられる。
【００５０】
本発明の抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団は、上述した製造方法により得られた細胞集団である。この細胞集団では、用いられた特定抗原に対して特異性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞で主として構成されており、例えば、同様の抗原と一次接触した生体由来の脾臓組織に由来する細胞集団よりも、抗原に対して特異性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞の密度が高い。
従って、本抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団であれば、特定抗原に対して親和性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞を大量に必要とするモノクローナル抗体の製造や、細胞治療等に好適に用いることができる。
【００５１】
なお、本発明の製造方法により得られたＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団を構成するＢ細胞に対しては、抗体分子に変異を導入して、更に多様な抗原特異性を有するＢ細胞を得てもよい。このような変異の導入としては、例えば、Ｖ領域に対する変異の導入が挙げられる。これにより、抗原に対する親和性を更に改良することができる。
Ｖ領域に対して変異を導入する方法としては、公知の方法を適用することができるが、変異導入の確実性の観点から、抗体遺伝子の体細胞突然変異（ＳＨＭ）と抗体定常部領域遺伝子のクラススイッチ組み換え（ＣＳＲ）の双方に寄与するＡＩＤ(activation induced cytidine deaminase)の利用が挙げられる。あるいは、ＡＩＤの発現を増強するサイトカインなどを用いてもよい。
【００５２】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、上述した抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法により得られた細胞集団を用いてモノクローナル抗体を製造することを含む。
これにより、特定抗原に対するモノクローナル抗体を簡便に且つ迅速に得ることができる。
【００５３】
本モノクローナル抗体の製造方法では、周知のハイブリドーマ作製方法を、上記の抗原特異的Ｂ細胞集団に対して適用すればよい。具体的には、本発明により得られたＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団に対して、ミエローマ細胞等を周知の方法による細胞融合法を用いてハイブリドーマを得て、このハイブリドーマの中から、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等を用いて単離し、単離されたハイブリドーマが産生する抗体を回収すればよい。あるいは、上記の抗原特異的Ｂ細胞集団から抗体遺伝子を単離して、遺伝子組み換えによりモノクローナル抗体を作製する方法でもよい。
【００５４】
本発明の抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原を表面に有する細胞である。
本フィーダー細胞を用いることによって、本発明の抗原特異的Ｂ細胞集団を効率よく得ることができる。
【００５５】
本抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞では、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬ及び特定抗原が、提示対象となるＢ細胞に認識可能に細胞表面に提示されていればよい。これらの分子を細胞表面に提示する手段としては、例えば、膜型の天然由来分子としてそのまま発現するように、又は、膜に結合するアンカー分子との融合タンパク質として発現するように、遺伝子組み換え技術などを用いて標的フィーダー細胞へ導入することなどが挙げられる。
【００５６】
フィーダー細胞の種類としては、この目的に一般的に用いられるものであれば特に制限はなく、線維芽細胞、上皮細胞（例えばＨｅＬａ細胞）、胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３など）、濾胞樹状細胞などを挙げることができる。なかでも、増殖速度が速く、細胞表面積が大きい、フィーダー細胞の除去が簡便であるとの観点から、線維芽細胞が好ましい。
【００５７】
なお、本発明で用いられるフィーダー細胞の由来としては、上述した細胞集団等と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。また、フィーダー細胞は、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する細胞であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００５８】
なお、上記抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞を得るために、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ＦａｓＬのみを有する抗原提示用フィーダー細胞を用いてもよい。この抗原提示用フィーダー細胞を用いて抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞を得るには、特定抗原を細胞表面に提示するための手段、例えば特定抗原発現ベクター等を用いて、特定抗原を後から抗原提示用フィーダー細胞へ提示させればよい。このような抗原提示用フィーダー細胞を用いることにより、全ての分子を同時期に導入するよりも効率よく、目的に応じた特定抗原を有する抗原特異的Ｂ細胞選別用フィーダー細胞を得ることができる。
【実施例】
【００５９】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００６０】
［実施例１］
［Ａ］ＩｇＧ陽性Ｂ細胞の増殖
（１）細胞の培養
Ｂ細胞調製物及び他の細胞の培養は、特に断らない限り、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％(v/v) ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ ２−ＭＥ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム添加）をＢ細胞培養培地として用いて、５％（v/v）ＣＯ２、３７℃の条件下で行った。
【００６１】
（２）ナイーブＢ細胞の調製
マウス（C57BL/6、メス8週齢）から脾臓細胞を得て、常法により、ビオチン−抗マウスＣＤ４３抗体(BD Pharmingen社製)、ビオチン−抗マウスＣＤ４抗体(Biolegend社製）、ビオチン−抗マウスＴｅｒ−１１９抗体(eBioscience社製)、ビオチン−抗マウスＣＤ１１ｃ抗体(eBioscience社製）を反応させ、ＣＤ４３、ＣＤ４、Ｔｅｒ−１１９及びＣＤ１１ｃ陰性のＢ細胞を、Streptavidin-Particle Plus-DM、BD IMagnet(BD Bioscience Pharmingen社製）を用いて回収し、上記培養培地に懸濁してＢ細胞調製物を得た。
【００６２】
ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを細胞表面に提示するフィーダー細胞、４０ＬＢ細胞は、以下のようにして得た。即ち、マウスＣＤ４０リガンド（例えば、Nature, Vol.357, pp.80-82 (1992)及び、EMBO J., Vol.11, pp.4313-4321 (1992)参照）を、ｐＡｐｕｒｏ(EMBO J. 13:1341-1349, 1994)に組み込んでＣＤ４０Ｌ発現ベクターを構築した。またＢＡＦＦ（例えば、J Exp Med, Vol.189, pp.1747-1756 (1999)及び、Science, Vol. 285, pp.260-263 (1999)及び、J Bio Chem, Vol.274, pp.15978-15981, (1999)）を、ｐＣＡＧＧＳ（Gene 108: 193-199, 1991）のプロモーター部分（SnaBIからEcoRIまで）とｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）（BamHIからSnaBIまでのネオマイシン耐性遺伝子を含む部分）とから構成されるベクターに組み込んでＢＡＦＦ発現ベクターを構築した。これらの発現ベクターを、Balb/c 3T3細胞に、常法により導入し、恒常的に発現させてクローンを作製した。
実験には、直径１０ｃｍ細胞培養プレート（BD Falcon社製）に、４０ＬＢ細胞を３×１０６個播種し、２４時間培養して単一層を形成させた後、１２０Ｇｙのγ線を照射してから使用した。
【００６３】
（３）ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団の調製（培養工程）
４０ＬＢ上に、上記で得られたマウスＢ細胞を、マウスＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地に１．２５×１０４個／ｍｌの細胞密度で懸濁して、ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った（一次培養）。
培養４日目に全細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いてフィーダーごと剥がし、ピペットでフラッシュして回収した。新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種されたプレートに、ＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地に、回収された細胞集団を、２．５×１０３個／ｍｌ以下の細胞密度で播種して、培養を行った（二次培養）。
【００６４】
培養開始から４、６、８、１０日目に、トリパンブルーで染色して生細胞数を計測し、初期細胞数からの増加率を表した。結果を図２に示す。図２において、実線は一次培養期間で確認された細胞数、破線は二次培養期間で確認された細胞数を示す。その結果、培養開始から１０日で約１０万倍に増殖したことが確認された（図２参照）。
【００６５】
また、培養開始から４、６、８、１０日目のＢ細胞を、ＩｇＥおよびＩｇＧ１に対する抗体（ビオチン−抗マウスＩｇＥ抗体（BD Pharmingen社製）、ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ１抗体（Southern biotec社製））で２０分間、室温にて染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Calibur BectonDickinson社製）で解析した。結果を図３に示す。図中の囲み線に付された数値はそれぞれの囲み線内の含まれる細胞の割合（％）を示す。
図３に示されるように、培養４日目ではＩｇＧ１及びＩｇＥ型抗原受容体を発現したＢ細胞が存在しているが、培養１０日目にはほぼ全てのＢ細胞はＩｇＧ１型のみとなったことが確認できた。また、一部がＣＤ１３８陽性(形質細胞系)となることを除けば、ほぼ全ての細胞が胚中心Ｂ細胞の表現型を示していた（ＧＬ７＋、Ｆａｓ＋、ＣＤ３８ｌｏｗ、ＰＮＡ結合性＋）（データは示さず）。
【００６６】
［実施例２］
［Ｂ］Ｂ１−Ｈ８ノックインマウス由来Ｂ細胞集団の抗体産生能
（１）細胞の調製
ＮＰ抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団を調製するために、Ｂ１−８重鎖ノックインマウスのＢ細胞集団を用いた。
Ｂ１−８重鎖ノックインマウス（Lam KP et al., 1997: Cell 90:1073）の脾臓より、実施例１（１）と同様にして、ナイーブＢ細胞を調製した。Ｂ１−８重鎖ノックインマウスのＢ細胞は、４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル（ＮＰ）抗原に対して親和性を示すＢ細胞（λＬ鎖陽性）が約５％存在していることが知られている。
【００６７】
（２）ＮＰ抗原認識産生Ｂ細胞のＥＬＩＳＰＯＴ法による確認
Ｂ１−８重鎖ノックインマウス由来脾臓Ｂ細胞を、実施例１と同様にして、回収した後、κ軽鎖陰性且つＮＰ結合性Ｂ細胞を、ＦＩＴＣ−抗マウスκ軽鎖抗体（BD Pharmingen社製）、抗FITC-microbeads（Miltenyi Biotec社製)、ＮＰ−ＢＳＡ−ビオチン(Biosearch Technologies社製)、及びアビジン-microbeads(Miltenyi Biotec社製)を使用し、さらにMACS Separation Columns （Miltenyi Biotec社製）を用いて回収した。このＮＰ特異的Ｂ細胞を、実施例１と同様にして培養開始から４日目に回収して、二次培養を開始した。二次培養開始から２日目と４日目における全Ｂ細胞中の抗ＮＰＩｇＧ１産生細胞数を、ＥＬＩＳＰＯＴ法により測定した。また、実施例１と同様にしてフローサイトメトリーを用いて、ＩｇＧ１陽性細胞の数を算出した。フローサイトメトリーの結果から算定したＩｇＧ１陽性細胞数を基に、抗ＮＰ−ＩｇＧ１抗体産生細胞の割合（％）を算出した。具体的には、ＮＰ−ＣＧＧをコーティングしたMultiScreen（MILLIPORE社製）に、回収された細胞を２００個／ｗｅｌｌで播種し、５時間培養後、細胞を洗浄除去し、抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ抗体（SouthernBiotech社製）を反応後、AEC substrate（ＤＡＫＯ社製）を用いて発色させ、ＮＰ特異的ＩｇＧ１産生細胞数を測定した。結果を図４示す。
【００６８】
図４に示されるように、二次培養開始後２日目では４１％±６、４日後には６７％±４と、約半数がＩｇＧ抗体産生細胞として存在することが確認された。このように、二次培養工程を経たＩｇＧ陽性Ｂ細胞の半数は、形質芽細胞であることが示された。
【００６９】
［実施例３］
［Ｃ］Ｂ１−Ｈ８ノックインマウス由来のＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団の調製
（１）細胞の調製
抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団が選択できることを確認するため、Ｂ１−８重鎖ノックインマウスのＢ細胞集団及び４０ＬＢ−ＦｃＹ−ＦＬ細胞を用いた。
Ｂ１−８重鎖ノックインマウス（Lam KP et al., 1997: Cell 90:1073）の脾臓より、実施例１（１）と同様にして、ナイーブＢ細胞を調製した。
４０ＬＢ−ＦｃＹ−ＦＬ細胞は、４０ＬＢ細胞にマウスＦａｓ−ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）（Cell, Vol.75, pp.1169-1178 (1993))とニワトリＩｇＹ（ＩｇＧ）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A, Vol.104, pp.11718-11723 (2007))を、常法に従ってレトロウィルスベクターにより導入し(Int J Hematol, Vo.67, pp.351-359 (1998))、恒常的に発現させてクローン作製した。
４０ＬＢ−ＦｃＹ−ＦＬ細胞に提示する抗原としては、ＮＰ４２−チキン−グロブリン（ＣＧＧ）抗原（定法によりＮＰとＣＧＧを共役させた）を用いた。実施例１と同様に、１０ｃｍプレートに４０ＬＢ−ＦｃＹ−ＦＬ細胞を播種した後、ＮＰ４２−ＣＧＧを１０ｕｇ／ｍｌで１時間、室温で反応させ結合させた。
【００７０】
（２）抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団の調製
Ｂ１−８重鎖ノックインマウス由来脾臓Ｂ細胞を、実施例１と同様にして、３日間一次培養した後、２日間二次培養した。
次にＮＰ抗原特異的Ｂ細胞の選択培養を行うため、回収した培養Ｂ細胞から、ビオチン−抗マウスＩｇＥ抗体（BD Pharmingen社製）及びビオチン−抗マウスＣＤ１３８抗体（BD Pharmingen社製）とStreptavidin-Particle Plus-DM（BD Pharmingen社製）とを用いてＩｇＥ陽性細胞及び抗体産生細胞を除いた後、ＮＰ４２−ＣＧＧを結合させた４０ＬＢ−ＦｃＹ−ＦＬ細胞でＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）と共に培養した。３６時間後、全細胞を回収し、ここからビオチン−抗マウスＨ−２Ｋｄ抗体とStreptavidin-Particle Plus-DM（BD Pharmingen社製）を用いて４０ＬＢ−ＦｃＹＲ−ＦＬ細胞を除き、得られたＢ細胞を新たな４０ＬＢ細胞上でＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を加えて３日間、培養した。
【００７１】
培養後に細胞を回収して、ＮＰ特異的Ｂ細胞を、ＮＰ−ＢＳＡ−ビオチン(Biosearch Technologies社製)とａｖｉｄｉｎ−ＰＥ (eBioscience社製)と抗ＩｇＧ１抗体（Southern biotec社製）を用いて、フローサイトメーターで検出した。結果を図５に示す。図５左欄は選択培養前、図５右欄はＮＰ４２−ＣＧＧを結合させた４０ＬＢ−ＦｃＹＲ−ＦＬ上で３６時間選択培養した後、生存Ｂ細胞を回収して４０ＬＢとＩＬ−２１でさらに３日間培養したもの、図５中央は選択培養を行わず、４０ＬＢ上で培養を続けて図５右欄と同時に解析したものを示した。図５中の右上領域及び右下領域に付された数値はそれぞれの領域内の含まれる細胞の割合（％）を示す。
【００７２】
図５に示されるように、ｄ５からｄ６．５までの３６時間、４０ＬＢ−ＦｃＹＲ−ＦＬ上で培養した結果（図５右欄）、ＮＰに結合しないＢ細胞はほとんど死滅し、ＮＰ結合性Ｂ細胞が選択された。Ｆａｓ受容体刺激によるアポトーシスが抗原受容体刺激により回避された結果、抗原特異的Ｂ細胞が選別されることを示している。従って、得られた細胞集団は、ＮＰに特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含むＮＰ特異的Ｂ細胞集団であることが確認された。
【００７３】
［実施例４］
［Ｄ］ＡＩＤ強制発現によるＧＣＬ−Ｂ細胞における体細胞超突然変異の誘導
Ｂ１−８重鎖ノックインマウス由来脾臓Ｂ細胞を用いて、実施例１と同様に一次培養を開始し、培養２日目にＡＩＤを、レトロウィルスベクターを用いて強制発現させた。具体的には、pMX-IRES-GFPレトロウィルスベクター（Proc Natl Acad Sci U S A, Vol.97, pp.3062-3066 (2000)）のＧＦＰ遺伝子をヒトＣＤ８（ｈＣＤ８）に組み換えたpMX-IRES-hCD8レトロウィルスベクターを作成し、これにマウスＡＩＤ（J Biol Chem, Vol.274, pp.18470-18476 (1999)）を常法に従ってサブクローニングして作成したpMX-AID-IRES-hCD8レトロウィルスベクターを用いて、培養２日目のＢ細胞に感染させて培養４日目で２次培養に移行した。培養開始後２日ごとに抗軽鎖抗体を用いて抗原受容体刺激を行い、培養９日目に、ビオチン−抗ヒトＣＤ８抗体（Biolegend社製）とアビジン-APC (eBioscience社製）を用いて染色し、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（BectonDickinson社製）を用いてｈＣＤ８陽性細胞をソーティングした。この細胞のゲノムに対し、鋳型として以下のプライマー（５’−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣ−３’：配列番号１）及び（５’−ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣ−３’：配列番号２）を用いてノックイン重鎖をＰＣＲ法により増幅し、増幅した断片をプラスミドベクターにクローニングした後、シークエンス解析を行った。
【００７４】
図６は、Ｂ１−８重鎖Ｖ領域の塩基配列（配列番号３、図６下段）と、この領域に変異を有する変異体の配列を示したものである（図６上段及び中段。下線部の塩基がその上方の塩基に置換されていたことを示し、（−）は塩基の欠失を示す）。２４クローン解析した結果、合計で１４塩基の置換もしくは欠失が生じていたことから、変異頻度は１重鎖あたり０．５８塩基であった。細胞数よりＡＩＤ導入から約１０回の細胞分裂が起こったと考えられるので、変異率は約１／１００００／generationと算定できる。
従って、実施例１及び実施例２で示される一次培養及び二次培養では、ＡＩＤを発現させることによって、重鎖Ｖ領域に高頻度の変異を導入可能であることが示された。この重鎖Ｖ領域に高頻度に変異が導入されたＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、実施例３と同様に抗原を用いて選別することによって、この抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団が得られることが示唆される。
【００７５】
［実施例５］
［Ｅ］ヒトＢ由来細胞を用いたＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団の調製
健常人のヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ（GE Healthcare Bio-Sciences社製）を用いて単核球を分離し、さらにＣＤ２陰性且つＣＤ１９陽性のＢ細胞を、ビオチン−抗ヒトＣＤ２抗体、ＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ１９抗体、Streptavidin-Particle Plus-DM（BD Pharmingen社製）及び抗FITC microbeads（Miltenyi Biotec社製）を使用し、更にMACS Separation Columns （Miltenyi Biotec社製）を用いて回収した。回収されたＢ細胞を、実施例１と同様に準備した４０ＬＢ上で、ヒトＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）、ヒトＩＬ−２（２５unit／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を加えて４日間一次培養した。一次培養後の全細胞を実施例１と同様に回収し、新たに準備した４０ＬＢ上に一次培養Ｂ細胞を撒き、ヒトＩＬ−２（２５unit／ｍｌ、PEPRO TECH社製）とヒトＩＬ−２１（1０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を加え二次培養した。３日後に全細胞を回収し、二次培養と同条件でさらに３日間培養を続けた。
【００７６】
培養後の細胞の生細胞数を、実施例１と同様に計測し、初期細胞数からの増加率を表した。結果を図７に示す。図７において、実線は一次培養期間で確認された細胞数、破線は二次培養期間で確認された細胞数を示す。その結果、培養開始から１０日で約１００倍に増殖したことが確認された（図７参照）。
【００７７】
また、培養開始時点及び１０日目のＢ細胞をＦＩＴＣ−抗ＣＤ１９抗体（eBioscience社製）およびビオチン−抗ＩｇＧ（BD Pharmingen社製）もしくはビオチン抗ＩｇＧ１抗体（BD Pharmingen社製）で染色し、フローサイトメーターで解析した。結果を図８に示す。図８中の右上領域及び右下領域に付された数値はそれぞれの領域内の含まれる細胞の割合（％）を示す。
【００７８】
図８に示されるように、培養開始時に全Ｂ細胞中１８％であったＩｇＧ１陽性細胞は１６％に、また培養開始時に２２％であったＩｇＧ陽性細胞は４８％となったことが確認された。従って、ヒト由来細胞でも、本実施例１による培養方法で、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を効果的に増やすことができた。従って、得られたＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、実施例３と同様に抗原を用いて選別することによって、この抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることができる。
【００７９】
このように本発明の製造方法によれば、目的とする種々の特定抗原に対して特異性を示し、且つ特定抗原に対する抗体を産生可能なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を多く含むＢ細胞集団を、簡便に得ることができる。また、このＩｇＧ陽性Ｂ細胞のＶ領域には高頻度の変異を導入することができる。これらのことから、動物への免疫を実施する必要なく特定抗原に対して特異性を示す抗体産生細胞の細胞集団を簡便に製造できることは明らかである。動物への免疫を実施する必要がないので個体毒性のある物質や種間で相同性の高いタンパクを抗原として抗体を作ることに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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