(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
バラ科の植物であるバラ科バラ属のＲｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａに、遺伝子組み換え技術により、パンジー由来のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素遺伝子をアグロバクテリウム法により導入し；そして
該遺伝子を花弁内で発現させて、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
0005569822.tif 000008
｛式中、Ｒ1は、下記基：
【化２】
0005569822.tif 000009
であり、かつ、Ｒ２は−ＯＨであるか、又はＲ１とＲ２は一緒になって−Ｏ−を形成するか、又はＲ1は、下記基：
【化３】
0005569822.tif 000010
であり、かつ、Ｒ２は−ＯＨである。但し、Ｒ１中グルコースの１位の水酸基の配位（波線）はα体とβ体の互変異性であることを示す。｝で表される化合物を生成する、
を含む、前記化合物の製造方法。
【請求項２】
前記Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａは、品種ラバンデ又はＷＫＳ８２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物は、以下の式：
【化４】
0005569822.tif 000011
で表される化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物は、以下の式：
【化５】
0005569822.tif 000012
で表される化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、以下の式：
【化６】
0005569822.tif 000013
で表される化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物、特に遺伝子組換えによりデルフィニジンを生産する能力が付与されたバラの色素である新規化合物、並びに該色素を含むバラなどの植物及びその部分に関する。また、本発明は、当該化合物を用いて、植物の花色を改変する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
バラは切り花として重要な植物であり、その色素は詳細に調べられている。例えば、アントシアニン系色素としては、シアニジン３，５−ジグルコシド、ペラルゴニジン３，５−ジグルコシド、シアニジン３−グルコシド、ペラルゴニジン３−グルコシド、ペオニジン３，５−ジグルコシド、ペオニジン３−グルコシドなどが知られている。これらの色素を含むアントシアニンの生合成経路は知られている。
【０００３】
また、遺伝子組換えによりフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子を発現しているバラ（以下の特許文献１、特許文献２参照）は、デルフィン(以下、デルフィニジン３，５−ジグルコシドともいう。）を生産する。この場合、フラボノイドのB環の５’位の水酸化反応は、フラバノン又はジヒドロフラボノールの段階で起こると考えられる。この水酸化反応は、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素が小胞体に存在するチトクロームP450の一種であることから、小胞体上で起こると考えられている。アントシアニン類の生合成反応を触媒する酵素、例えば、アントシアニジン糖転移酵素は、シグナルペプチドなどの配列を持たない上、可溶性の蛋白質であるため、細胞の細胞質中に存在する。アントシアニン類は、糖が付加された後、ポンプにより液胞に運ばれる。
【０００４】
一方、少なくとも一部のバラには、化合物ロザシアニン類（図１参照）が存在することが報告され、ロザシアニンＡ1、ロザシアニンＢ及びロザシアニンＡ２などの構造も決定されている（例えば、以下の特許文献３又は非特許文献１参照）。
【０００５】
ロザシアニンは、その構造の一部にシアニジン骨格を有することから、シアニジン、又はシアニジンと共通する前駆体、又はシアニジンの類縁体をもとに合成される可能性が考えられる。しかし、これは推測の域を出ず、実際に、どのような物質を前駆体とし、そのような経路を経て合成されるかは明らかにはされていない。
一方、前述のように遺伝子組み換えにより、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子を発現させたバラにおいては、シアニジンの部分に代えてデルフィニジンが合成される。もし仮に、上記のようなロザシアニン合成経路についての仮説、すなわちシアニジンを前駆体としてロザシアニンが合成されるのではないかという仮説が正しいのであれば、前駆体となるシアニジンが殆ど存在しないこれら遺伝子組換えバラにおいては、ロザシアニン類は合成されないことになる。
発明者らは、ロザシアニン合成系についての知見を得るために、特許文献１又は特許文献２に記載されるシアニジンを殆ど含有しない、あるいは、宿主と比較してシアニジン含量が著しく低下した上記遺伝子組換えバラを用いて、解析を行ったところ、予想に反し、本来バラが有しているロザシアニン類とは明らかに化学構造の異なる新規化合物が存在することを見出した。さらに、この新規化合物は、遺伝子組換えによりフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子を発現させたバラに特異的に存在することが明らかになり、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０２０６３７公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０１７１４７公報
【特許文献３】特開２００２−２０１３７２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tetrahedron 62(2006)9661-9670
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、植物、特に遺伝子組換えによりデルフィニジンを生産する能力が付与されたバラの色素である新規化合物、並びに該色素を含むバラなどの植物及びその部分を提供することである。また、本発明が解決しようとする課題は、当該化合物を用いて、植物の花色を改変する方法を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の通りである。
［１］下記一般式（Ｉ）：
【化１】
0005569822.tif 000002
｛式中、Ｒ1は、下記基：
【化２】
0005569822.tif 000003
であり、かつ、Ｒ２は−ＯＨであるか、又はＲ１とＲ２は一緒になって−Ｏ−を形成するか、又はＲ1は、下記基：
【化３】
0005569822.tif 000004
であり、かつ、Ｒ２は−ＯＨである。但し、Ｒ１中グルコースの１位の水酸基の配位（波線）はα体とβ体の互変異性であることを示す。｝で表される化合物。
【００１０】
［２］以下の式：
【化４】
0005569822.tif 000005
で表される化合物。
【００１１】
［３］以下の式：
【化５】
0005569822.tif 000006
で表される化合物。
【００１２】
［４］以下の式：
【化６】
0005569822.tif 000007
で表される化合物。
【００１３】
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を含む植物。但し、該植物は天然には該化合物を含まない。
【００１４】
［６］バラ科の植物である、前記［５］に記載の植物。
【００１５】
［７］前記バラ科の植物が、バラ科バラ属の植物である、前記［６］に記載の植物。
【００１６】
［８］前記バラ科バラ属の植物が、バラ科バラ属バラである、前記［７］に記載の植物。
【００１７】
［９］前記［５］〜［８］のいずれかに記載の植物の部分。
【００１８】
［１０］切り花である、前記［９］に記載の植物の部分。
【００１９】
［１１］前記［１０］に記載の切り花を用いた、切り花加工品。
【００２０】
［１２］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物を用いて、植物の花の色を改変する方法。
【００２１】
［１３］前記植物が、バラ科の植物である、前記［１２］に記載の方法。
【００２２】
［１４］前記バラ科の植物が、バラ科バラ属の植物である、前記［１３］に記載の方法。
【００２３】
［１５］前記バラ科バラ属の植物が、バラ科バラ属バラである、前記［１４］に記載の方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、青いバラの花弁中の新規色素が抽出、単離、精製され、その化学構造が解明された。これは、バラの色を遺伝子工学的に改変して新規なバラ科植物を作出する研究の基礎となる。また、本発明に係る新規色素は、例えば、バラなどの切花に吸収させることにより切花の色を改良するために使用されうるし、植物性天然色素として、例えば飲食物の加色などにも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、シアニジン、デルフィニジン、ロザシアニンの化学構造式を示す。
【図２】図２は、藤色系バラ品種「ラバンデ」へ導入されたプラスミドｐＳＰＢ９１９の構造を示す。
【図３】図３は、青色色素（１）の３０％アセトニトリル、０．５％ＴＦＡ中での可視〜紫外吸収スペクトル図である。
【図４】図４は、青色色素（１）のＨＰＬＣにより分析した際のクロマトグラムであり、該化合物はグルコースの１位の水酸基がα体とβ体が互変異性を示すため２本のピークが認められる。
【図５】図５は、赤色色素（２）の３０％アセトニトリル、０．５％ＴＦＡ中での可視〜紫外吸収スペクトル図である。
【図６】図６は、赤色色素（２）のＨＰＬＣにより分析した際のクロマトグラムである。
【図７】図７は、青色色素（３）の３０％アセトニトリル、０．５％ＴＦＡ中での可視〜紫外吸収スペクトル図である。
【図８】図８は、青色色素（１）の化学構造式である。図中、グルコース水酸基の配位（波線）は、α体とβ体の互変異性体を示す。
【図９】図９は、赤色色素（２）の化学構造式である。
【図１０】図１０は、青色色素（３）の化学構造式である。
【図１１】図１１は、図８に示す青色色素（１）の1Ｈ  ＮＭＲのスペクトル図である。
【図１２】図１２は、図８に示す青色色素（１）の1３Ｃ  ＮＭＲのスペクトル図である。
【図１３】図１３は、図９に示す赤色色素（２）の1Ｈ  ＮＭＲのスペクトル図である。
【図１４】図１４は、藤色系バラ「ＷＫＳ８２」へ導入されたプラスミドｐＳＰＢ１３０の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に係る新規色素は、公知物質であるロザシアニンＡ1、ロザシアニンＢ及びロザシアニンＡ２（Ｂ環の水酸基の数は２個である）のＢ環に水酸基がさらに１個追加された構造を有する。換言すれば、本発明に係る新規青色色素は、青いバラ中に存在が確認されている公知物質である青色色素デルフィニジン部分構造（Ｂ環の水酸基の数は３個である）を有する新規化合物であるともいえる。
【００２７】
特許文献１又は２に記載されるように、青色遺伝子（フラボノイド３’，５’−水酸化酵素）を機能させることにより、青いバラには、従来のバラ品種植物中には存在しない青色色素（Ｂ環に水酸基を３個もつ）が存在することになる。今般、このような青色色素として、公知物質であるロザシアニンＡ1、ロザシアニンＢ及びロザシアニンＡ２（Ｂ環の水酸基の数は２個である）のＢ環に水酸基がさらに１個追加された構造を有する化合物を、単離・精製し、ＴＯＦ-ＭＳ及びＮＭＲで同定し、その構造を決定した。
本発明の３種類の化合物は、それぞれ、図３、図４、図１１、及び／又は図１２に示すデータを与える化合物であるか、図５、図６、図９、及び／又は図１３に示すデータを与える化合物であるか、あるいは図７に示すデータを与える化合物である。
【００２８】
アントシアニン類、例えばシアニジンに比較して、分子量が大きいロザシアニン類では、そのＢ環に水酸基がさらに１個追加されて３個の水酸基を有することによる溶解度向上効果がより高められる結果、花弁細胞の液胞に輸送されて青色を発揮する上でより有効な色素であると考えられる。また、ロザシアニン類は、一般的な色素に比べて、植物体内で合成される点において優れた特徴がある。また、本発明は、図８〜１０に示す化合物を含む植物を提供する。但し、該植物は天然には該化合物を含まないか又は該化合物は検知しうる量でその花弁中には存在しない。また、本発明は、図８〜図１０に示す化合物を用いて、植物の花色を改変する方法を提供する。例えば、本発明に係る化合物は、本発明にかかる化合物の合成に関与する酵素の遺伝子を、対象となる植物に遺伝子工学的手法によって導入し、検知しうる所定量の該化合物を植物の花弁内で合成させることによって初めて取得することができる。あるいは、本発明にかかる化合物を直接植物に吸収させるような物理的方法によることもできるが、対象となる植物が該化合物を含む態様は、これらに限定されるものではない。
本発明の植物体は、図８〜図１０に示す化合物を花弁内に含有する。植物体の花弁中のこれらの化合物の含有率は特に限定されないが、好ましくは花弁湿重量あたり、０．００００１mg／ｇ以上である。下限値は、より好ましくは０．０００１mg／ｇ以上、さらに好ましくは０．０００７mg／ｇ以上である。上限値は、好ましくは１mg／ｇ以下、より好ましくは０．５mg／ｇ以下、さらに好ましくは０．１３mg／ｇ以下である。
【００２９】
対象となる植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワーなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
そのなかでも好ましくは、バラ科の植物であり、より好ましくはバラ科バラ属の植物であり、更に好ましくはＲｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａに代表されるバラ科バラ属バラである。  本発明は、前記した植物の部分、特に切り花、該切り花を用いた、切り花加工品にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、プリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂封入品などを含むが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１：色素化合物の単離、精製
青いバラを抽出源として、本発明の色素化合物を単離精製した。
プラスミドｐSPB919を導入した品種ラバンデの作出
抽出源である青いバラを作出した。以下に示す方法により、プラスミドpSPB919を導入した品種ラバンデを作出した。
切花の青いアイリス花弁からＲＮＡを得、さらにこれからｐｏｌｙＡ+ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙＡ+ＲＮＡからλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製造者が推奨する方法で作製した。アイリスのＤＦＲ遺伝子断片は、リンドウのＤＦＲ遺伝子断片を取得した報告と同様に行った（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，７１１−７１６，１９９６）。
【００３１】
得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片をジーンクリーンにより製造者の推奨する方法で回収し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。その塩基配列を決定したところバラＤＦＲ遺伝子に相同な配列が見られた。このＤＮＡ断片を用いてアイリスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、全長のアミノ酸配列を含むアイリスＤＦＲｃＤＮＡを得た。そのうちｐＳＰＢ９０６としたクローンに含まれるｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（塩基配列とアミノ酸配列は、特許文献２の配列番号９と配列番号１０を参照のこと）。
次にｐＳＰＢ５８０をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＰＢ９０６をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し得られたプラスミドをｐＳＰＢ９０９とした。
【００３２】
植物中でバラＤＦＲｃＤＮＡの二本鎖ＲＮＡの転写は次のように行った。ｐＣＧＰ１３６４（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６ １０２３−１０３１）をＰｓｔＩで部分消化して得られる約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｍａｃ１プロモーター、バラＤＦＲｃＤＮＡ，ｍａｓターミネーターを含む）をｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９，１９８５）のＰｓｔＩ部位に挿入することによって得られるプラスミドのうちｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位がＭａｃＩプロモーターに近接しているものをｐＣＧＰ１３９４とした。
【００３３】
次に、ｐＣＧＰ１３９４をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩＩで消化して得られる約１．４ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＧＰ１３９４をＰｓｔＩで消化した後平滑末端化しさらにＳａｃＩＩで消化して得られる約１．９ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＢｉｎＰＬＵＳをＳａｃＩで消化した後平滑末端化しさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られるバイナリ−ベクター断片を連結しｐＳＰＢ１８５を得た。ｐＳＰＢ１８５をＸｂａＩで消化し、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカーとライゲーションすることにより、ｐＳＰＢ５２１を得た。ｐＵＥ６をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して得られる約７００ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＳＰＢ５２１をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化して得られるバイナリ−ベクターＤＮＡ断片とｐＥ２１１３をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られるＧＵＳ遺伝子ＤＮＡ断片を連結することによりｐＳＰＢ５２８を得た。
ｐＳＰＢ５２８はエンハンサーを有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターとマノピンシンターゼターミネーターの間に構造遺伝子を挿入し植物で発現させることができるバイナリ−ベクターである。また、ｐＣＧＰ６４５に含まれるバラＤＦＲｃＤＮＡの５’非翻訳領域配列を短くするためにｐＣＧＰ６４５をＳｍａＩとＰｖｕＩで消化した後平滑末端化し、ライゲーションして得られたｐＣＧＰ６４５ｓを得た。
【００３４】
バラＤＦＲｃＤＮＡの５’側配列を、ｐＣＧＰ６４５ｓを鋳型にリバースプライマーと合成プライマーＲＤＦ３１０（特許文献２の配列番号１９を参照のこと）をプライマーに用いてＰＣＲにより増幅することにより取得し、ｐＣＲＴＯＰＯにクローニングした。ＤＮＡの塩基配列を決定しＰＣＲによるエラーがないことを確認した。これをｐＳＰＢ５６９とした。また長さの異なるバラＤＦＲｃＤＮＡの５’側配列を、ｐＣＧＰ６４５ｓを鋳型にリバースプライマーと合成プライマーＲＤＦ８３０（特許文献２の配列番号２０を参照のこと）をプライマーに用いてＰＣＲにより増幅することにより取得し、ｐＣＲＴＯＰＯにクローニングした。ＤＮＡの塩基配列を決定しＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
【００３５】
これをｐＳＰＢ５７０とした。ｐＳＰＢ５２８をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られるバーナリーベクターのＤＮＡ断片と、ｐＳＰＢ５６９をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化して得られる０．３ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＰＢ５７０をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られるＤＮＡ断片を連結しｐＳＰＢ５７２を得た。本ベクターは植物中でバラＤＦＲｃＤＮＡの二本鎖ＲＮＡを転写するようにデザインされている。
【００３６】
ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化し、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカーを挿入しｐＵＥ８を得た。ｐＵＥ８をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片をｐＢｉｎＰＬＵＳのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＳＰＢ１８９とした。ｐＳＰＢ１８９をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られる約３．７ｋｂのＤＮＡ断片とｐＣＧＰ１９６１をＢａｍＨＩで完全消化しさらにＸｈｏＩで部分消化して得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結しｐＳＰＢ５６７を得た。ｐＳＰＢ５７２をＰａｃＩ消化し、脱リン酸化処理を行った後、ｐＳＰＢ５６７をＰａｃＩで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｎｐｔＩＩ遺伝子とパンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０が同じ向きに転写されるプラスミドを選択し、ｐＳＰＢ９０５とした。
【００３７】
ｐＳＰＢ９０５をＡｓｃＩで消化し、脱リン酸化処理を行った後、ｐＳＰＢ９０９をＡｓｃＩで消化して得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｎｐｔＩＩ遺伝子と同じ方向にアイリスＤＦＲ遺伝子が転写されるプラスミドを得、ｐＳＰＢ９１９（図２参照）とした。本プラスミドはバラにおいてはアイリス由来のＤＦＲ遺伝子とパンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子を転写し、バラのＤＦＲ遺伝子の発現を二本鎖ＲＮＡの転写により抑制することが期待される。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｇｌ０株に導入した。
当該アグロバクテリウムに感染させることで、藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＳＰＢ９１９（図２参照）を導入して、形質転換体を得た。形質転換細胞を再分化させ、組換え植物体である青いバラ（プラスミドpSPB919を導入した品種ラバンデ）を得て、それを開花させた。
【００３８】
色素化合物の抽出、単離、精製、同定
上記のようにして得られた青いバラ（プラスミドpSPB919を導入した品種ラバンデ）の花弁230ｇから以下の方法で色素化合物を精製した。
花弁230ｇを、ホモジナイザーを用いて液体窒素中で凍結粉砕し、1Lの0.5%TFAを含む50%アセトニトリルを加え一晩浸漬した。珪藻土ろ過したろ液をロータリーエバポレーターで約2/5の体積まで濃縮した。
この濃縮した抽出液を吸着樹脂HP-20（三菱化成（株））400mlに負荷した。800mlの水洗後、1Lの0.1%TFAを含む20%アセトニトリル、0.1%TFAを含む60%アセトニトリルでステップワイズに溶出した。60%画分に青色色素を含む画分が溶出した。
【００３９】
当該画分を、以下の分取HPLCで精製した。カラムはDevelosil-ODS-UG（野村化学社製）5cmφ＊50cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFAを用い、流速32ml/minで、B30%(30min保持）B30→B100%のリニアグラジエント（50min）、B100%を20分間保持した。検出はA260nmで行った。67-82minに溶出した青色色素を含む画分を集め凍結乾燥した。クロマトは2回繰り返した。
当該凍結乾燥品1.2ｇを50%アセトニトリルで平衡化したSephadexLH-20カラム（ファルマシア）(1.2L)に負荷した。50%アセトニトリル2.5L溶出後、さらに50%アセトニトリル2.5Lで溶出した青色色素を含む画分を集め、凍結乾燥した。
【００４０】
得られた凍結乾燥品を分取HPLCで再度クロマトグラムを行った。
カラムはYMC pack PolymerC18 (ワイエムシー株式会社、2cmφ＊30cm)、移動相はA: 0.5%TFA/水、B: 0.5%TFA/ 50%アセトニトリル、6ml/min、以下のグラジエントで行った。B65%(30min保持）B65→B90%のリニアグラジエント（20min）、B90%を30分間保持し、検出はA260nmで行った。50-52minに溶出した赤色色素（2）、及び60-65minに溶出した青色色素（１）、及び65-73minに溶出した青色色素（3）を集め凍結乾燥した。クロマトは計3回繰り返した。
【００４１】
このようにして得られた凍結乾燥品、青色色素（１）、赤色色素（２）及び青色色素（３）について目視で色調を観察した。その結果、それぞれ、濃い青、濃い赤、及び濃い青を呈していた。
このうち、青色色素（１）について、花弁中の含有量を測定したところ、その含有量は、花弁湿重量当り０．０００７mg／ｇ〜０．１３mg／ｇの範囲であった。
【００４２】
実施例２：色素化合物の機器分析による構造解析
青色色素（１）、赤色色素（２）、及び青色色素（３）について、必要により再度精製した試料を用いて各種機器分析を行った。
青色色素（１）、赤色色素（２）、及び青色色素（３）をHPLCで分析し、Photodiode array 検出器で、30％アセトニトリル、0.5％TFA中での650-250nmの吸収スペクトルを測定した（図３、図５、図７参照）。
HPLCはカラムにShodex-Asahipak-ODP50（昭和電工社製）4.6mmφ＊25cmを用い、移動相は0.6ml/minの30%アセトニトリル、0.5%TFAのアイソクラティック溶出を行った。検出はPhotodiode array 検出器（SPD-M10Avp、（株）島津製作所製）で650-250nmの吸収スペクトルを測定しA560nmのクロマトグラムをモニターした。
【００４３】
結果を以下に要約する（保持時間（Ｒ．Ｔ．）については、図４と６を参照のこと）。
青色色素（１）      λmax    593nm  R.T.  14.6分及び18.5分＊
赤色色素（２）      λmax    535nm  R.T.  8.9分
青色色素（３）      λmax    594nm  R.T.  21.6分
＊青色色素（１）はグルコースの１位の水酸基がα体とβ体が互変異性を示すため２本のピークを示す。
【００４４】
青色色素（１）、赤色色素（２）、及び青色色素（３）のＴＯＦ−ＭＳ測定を行った。
ＭＳは、Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、英国）でイオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ポジティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔ．：６０Ｖ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５６．２７７１［Ｍ+Ｈ］+）を用いた。
【００４５】
その結果、青色色素（１）は、ｍ／ｚ1221.1352［Ｍ］+の分子イオン、赤色色素（２）は、ｍ／ｚ435.0380［Ｍ］+の分子イオン、青色色素（２）は、ｍ／ｚ1373.1442［Ｍ］+の分子イオンを与え、それぞれ分子式Ｃ56Ｈ37Ｏ32（ｅｒｒ．：+6.9ｐｐｍ）、Ｃ22Ｈ11Ｏ10（ｅｒｒ．：+6.4ｐｐｍ）、Ｃ63Ｈ41Ｏ36（ｅｒｒ．：+4.6ｐｐｍ）とよく一致した。
【００４６】
青色色素（１）、赤色色素（２）、及び青色色素（３）の0.5％TFAを含む30%アセトニトリル中での吸収スペクトルを、それぞれ、図３、図５、及び図７に示す。
青色色素（１）及び青色色素（３）の可視部の吸収極大は593nmで、特許文献３の実施例１に記載された式（ＩＩ）の化合物の吸収極大よりもやや長波長にシフトしていた。
特許文献３に記載の式(ＩＩ)の化合物は、特許文献３に記載されているように青色を呈する。しかし、今回得られた青色色素（１）、青色色素（３）の吸収極大は、特許文献３に記載の式(ＩＩ)の化合物の吸収極大よりも更に長波長側であったことから、式(ＩＩ)の化合物よりも一段と青い色を呈する。よって、本発明で新たに見出した青色色素（１）、青色色素（３）は、植物の色を更に青くする効果があることが明らかとなった。青色色素（１）の分子量をTOF-MSで測定したところ、m/z 1221.13[M]+であり、これは、特許文献３の実施例１に記載された式（ＩＩ）の化合物の分子量１２０５よりも、１６マスユニット大きかった。これは、特許文献２に記載されたプラスミドｐSPB919を導入した品種ラバンデには、特許文献３から公知の前記色素化合物よりも分子量が１６大きい色素化合物が含まれていることを示す。フラボノイド３’，５’−水酸化酵素による水酸化反応による分子量の増加は、酸素原子1個の付加による１６の増加であることから、青色色素（１）は、特許文献３の実施例１に記載された式（ＩＩ）で表される化合物よりも酸素原子が１つだけ多いと考えられた。フラボノイド３’，５’−水酸化酵素はフラボノイドのB環を特異的に水酸化することから、今般、同定された化合物は、非特許文献１に記載されたロザシアニンＡ１配糖体ではなく、Ｂ環に水酸基を３個有するデルフィニジン部分構造を有する化合物であると判断された。すなわち、青色色素（１）、赤色色素（２）、及び青色色素（３）の構造は、それぞれ、図８、図９、及び図１０に示す構造であると判断した。
【００４７】
また、各化合物についてＮＭＲによる測定を行った。1% DCl（重塩酸）を含むDMSO-d6（（（CD3）2SO）ジメチルスルフォキサイド）に溶解し、1Hと13Cの残存ピークδ2.50、δ39.43を内部標準とした。測定項目は1H NMR、13C NMR、1H｛13C｝-HSQC、1H｛13C｝-HMBC、TOCSY、DQF-COSY及びROEをDMX-750 spectrometer (BRUKER BIOSPIN, Germany)で測定した。その結果、青色色素（１）、赤色色素（２）、及び青色色素（３）の構造は、それぞれ、図８、図９、及び図１０に示す構造であると決定した。
青色色素（１）の1H NMRの解析結果を図１１に、そして13C NMRの解析結果を、図１２に示す。
青色色素（１）は、1H NMRにおいてδ3.67 (1H, d12, Glc-6α)、δ4.48 (1H, dd2,9, Glc-5α)、δ4.84(1H, t9, Glc-4α)、δ4.94 (1H, dd2,9, Glc-2α)、δ4.99 (1H, dd2,12, Glc-6α)、δ5.30 (1H, d2, Glc-1α)、δ5.64 (1H, t9, Glc-3α)、δ6.22 (1H, s, HHDP) 、δ6.27 (1H, s, HHDP)、δ6.77 (2H, s, gallate-2,6)、δ6.79 (1H, s, D-3”)、δ6.83 (1H d2, A-6)、δ6.85(2H, s, gallate-2,6)、δ7.03 (1H, d2, A-8)、δ7.87 (2H, s, B-2’,6’)のシグナルが認められた。HHDPはhexahydroxy diphenoyl基の略号である。この他、糖の1位の水酸基がβタイプのグルコースのシグナルもマイナーシグナルとして観察された。
赤色色素（２）の1H NMRの解析結果を図１３に示す。
赤色色素（２）は、1H NMRにおいてδ7.32 (1H, d1.5, A-6)、δ7.40 (1H, d1.5, A-8)、δ7.68 (2H, s, B-2’,6’)、δ7.92 (1H, s, D-3”) のシグナルが認められた。
【００４８】
実施例３：別の品種の青いバラにおける色素化合物の確認
実施例１とは異なる品種の青いバラについて、本発明の化合物の存在を確認した。
プラスミドpSPB130を導入した品種「ＷＫＳ８２」の作出
以下の方法でプラスミドpSPB130を導入した品種「ＷＫＳ８２」を作出した。
アントシアニンを芳香族アシル基により修飾することによりアントシアニンを安定化させ、かつその色を青くすることができる（例えば、ＷＯ９６／２５５００）。アシル化したデルフィニジン型アントシアニンの生産を目指して以下の実験を行った。
トレニア品種サマーウェーブ花弁からＲＮＡを得、さらにこれからｐｏｌｙＡ+ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙＡ+ＲＮＡからλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーをｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製造者が推奨する方法で作製した。トレニアの主要アントシアニンはその５位のグルコースが芳香族アシル基により修飾されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２０００ ６，２３９−２４６）ので、トレニア花弁においてはアントシアニンアシル基転移酵素が発現している。
【００４９】
アントシアニンアシル基転移酵素は特定のアミノ酸配列が保存されており、これに対応する合成ＤＮＡをプライマーとして用いることによりアントシアニンアシル基転移酵素遺伝子を取得することができる（ＷＯ９６／２５５００）。具体的には、トレニアｃＤＮＡライブラリー作製の際に合成した１本鎖ｃＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、１００ｎｇのＡＴＣプライマー（特許文献２の配列番号１７参照）、１００ｎｇのオリゴｄＴプライマー（特許文献２の配列番号１８参照）をプライマーとし、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ、日本）を用いて製造者の推奨する条件でＰＣＲを行った。
【００５０】
ＰＣＲは、９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、及び７２℃にて１分間を１サイクルとする反応を２５サイクル行った。得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ（ＢＩＯ，１０１．Ｉｎｃ．）により製造者の推奨する方法で回収し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。その塩基配列を決定したところリンドウのアシル基転移酵素遺伝子（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６ ４２１−４３１）に相同な配列が見られた。なお塩基配列はダイプライマー法（アプライドバイオシステムズ社）を用い、シークエンサー３１０又は３７７（いずれもアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。
【００５１】
このＤＮＡ断片を、ＤＩＧ標識検出キット（日本ロッシュ）を用いてＤＩＧにより標識し、製造者が推奨する方法でトレニアのｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。得られたポジティブシグナルをもたらしたクローンを無作為に１２選択し、そこからプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。これらはアントシアニンアシル基転移酵素によい相同性を示した。これらのクローンのうちｐＴＡＴ７としたクローンに含まれるｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（塩基配列については、特許文献２の配列番号７を、そしてアミノ酸配列については、特許文献２の配列番号８を参照のこと）。
【００５２】
ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｖｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９ １９９６）をＳａｃＩで消化した後、平滑末端化し、８ｂｐのＸｈｏＩリンカー（タカラ）を挿入した。このプラスミドのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位にｐＴＡＴ７をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．７ｋｂのＤＮＡを挿入し、ｐＳＰＢ１２０を得た。ｐＳＰＢ１２０をＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した後平滑末端化しライゲーションすることによりｐＳＰＢ１２０’を得た。一方、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＧＰ１９６１をＢａｍＨＩで完全消化し、さらにＸｈｏＩで部分消化し得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これとＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＵＥ５Ｈとライゲーションし得られたプラスミドをｐＵＥＢＰ４０とした。
【００５３】
ｐＵＥＢＰ４０をＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した後平滑末端化しライゲーションすることによりｐＵＥＢＰ４０’を得た。ｐＵＥＢＰ４０’をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ｐＳＰＢ１２０’をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化したＤＮＡ断片と連結した。得られたプラスミドのうち、バイナリ−ベクター上でライトボーダー側から、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子、トレニア由来５ＡＴ遺伝子の順にそれぞれが同方向に連結されたバイナリ−ベクターをｐＳＰＢ１３０（図１４参照）とした。本プラスミドは植物においてはパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とトレニア由来５ＡＴ遺伝子構成的に発現し、遺伝子を花弁特異的に転写するように工夫されている。このプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇ１０株に導入した。当該アグロバクテリウムに感染させることで、藤色系バラ「ＷＫＳ８２」へｐＳＰＢ１３０（図１４）を導入して、形質転換体を得た。形質転換細胞を再分化させ、組換え植物体である青いバラ（プラスミドpSPB130を導入した品種「ＷＫＳ８２」）を得て、それを開花させた。
【００５４】
色素化合物の抽出、単離、精製、同定
上記のようにして得られた青いバラ（プラスミドpSPB130を導入した品種「ＷＫＳ８２」）の花弁230ｇから、実施例１と同様の方法で、抽出、単離、および精製を行い、青色色素（１）、赤色色素（２）及び青色色素（３）を得た。
得られた青色色素（１）、赤色色素（２）及び青色色素（３）について目視で色調を観察した。その結果、それぞれ、濃い青、濃い赤および濃い青を呈していた。
また、青色色素（１）、赤色色素（２）及び青色色素（３）について、ＬＣ-ＴＯＦ-ＭＳを用いて、実施例１で同定した色素成分とそれぞれ同一の化合物であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、青いバラの花弁中の新規色素が抽出、単離、精製され、その化学構造が解明された。本発明で新たに見出した化合物は、従来藤色系のバラに存在することが知られていたロザシアニン類と比べて、青い色を呈するものである。よって、本発明で見出した上記化合物を用いて、植物の花の色を改変することができる。あるいは、また、この化合物を植物性色素として用いることにより、例えば、飲食物の着色などにも利用することができる。
【図１】
0005569822.tif 000014
【図２】
0005569822.tif 000015
【図３】
0005569822.tif 000016
【図４】
0005569822.tif 000017
【図５】
0005569822.tif 000018
【図６】
0005569822.tif 000019
【図７】
0005569822.tif 000020
【図８】
0005569822.tif 000021
【図９】
0005569822.tif 000022
【図１０】
0005569822.tif 000023
【図１１】
0005569822.tif 000024
【図１２】
0005569822.tif 000025
【図１３】
0005569822.tif 000026
【図１４】
0005569822.tif 000027