(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（エチレングリコール）が共有結合されたＥＰＯペプチドであって、前記ポリ（エチレングリコール）は、前記ＥＰＯペプチドのグリコシル基においてシアル酸残基を介して共有結合で結合されており、
前記共有結合を調整する方法は；
前記ＥＰＯペプチドを少なくとも一つのシアル酸トランスフェラーゼおよび少なくとも一つの修飾された糖のドナーとを、シアル酸トランスフェラーゼが前記少なくとも一つの修飾された糖のドナーの糖部を前記ＥＰＯペプチドへと転移させるのに適した状態において接触させ、また少なくとも一つの前記修飾された糖のドナーはCMP-SA-PEGであり、
それによって前記ＥＰＯペプチドとの共有結合を形成することを特徴とする、ポリ（エチレングリコール）が共有結合されたＥＰＯペプチド。
【請求項２】
前記ポリ（エチレングリコール）の分子量が本質的に単一分散性の分布である請求項１に記載のポリ（エチレングリコール）が共有結合されたＥＰＯペプチド。
【請求項３】
ＥＰＯペプチドとポリ（エチレングリコール）との間の共有結合を形成する細胞を用いないin vitroの方法であって、前記共有結合を形成後のＥＰＯペプチドが次のメンバーから選択される化学式によって示されるグリコシル残基をもち；
0005413548.tif 000099
および
0005413548.tif 000100
ここで、
a,b,c,d,i,n,o,pがそれぞれ独立に０または１から選択され；
e,f,g,hがそれぞれ独立に整数０から４の間で選択され；
j,k,l,mがそれぞれ独立に整数０から２０の間で選択され；
q,r,s,t,u,v,w,x,y,zがそれぞれ独立に０または１から選択され；
Ｒがポリ（エチレングリコール）であり；
前記方法は；
（ａ）前記ＥＰＯペプチドを少なくとも一つのシアル酸トランスフェラーゼおよび少なくとも一つの修飾された糖ドナーとを、少なくとも一つのシアル酸トランスフェラーゼが前記少なくとも一つの修飾された糖ドナーの糖部を前記ＥＰＯペプチドへと転移させるのに適した状態において接触させ、また少なくとも一つの前記修飾された糖ドナーはCMP-SA-PEGであり；
それによって前記ＥＰＯペプチドの前記共有結合を形成することを特徴とする、EPOペプチドとポリ（エチレングリコール）との間の共有結合を形成する細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項４】
更に；
（ｂ）ステップ（ａ）よりも先に、前記ＥＰＯペプチドを、シアル酸を前記ＥＰＯペプチドから取り除くのに適切な状況においてシアリダーゼと接触させる
手順を含むことを特徴とする請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項５】
更に；
（ｃ）ステップ（ａ）の産物と、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナーとを、シアル酸を前記産物に転移させるのに適した状態において接触させる
手順を含む請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項６】
更に；
（ｄ）ステップ（ａ）よりも先に、前記ＥＰＯペプチドと、ガラクトシダーゼとを、前記ＥＰＯペプチドへガラクトースを転移させるのに適した状況で合成させるように接触させる
手順を含む請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項７】
更に；
（ｅ）ステップ（ａ）よりも先に、前記ＥＰＯペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトースドナーと、前記ＥＰＯペプチドにガラクトースを転移させるのに適した状況で接触させる
手順を含む請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項８】
更に；
（ｆ）ステップ（ｅ）の産物を、ＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸ドナーとを、前記産物へシアル酸を転移させるのに適した状況で接触させる
手順を含む請求項７に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項９】
更に；
（ｇ）ステップ（ａ）の産物を、ポリ（エチレングリコール）と反応する部分と接触させ、それによって前記シアル酸残基と前記部分との間の共有結合を形成させる
手順を含む請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１０】
更に；
（ｈ）ステップ（ａ）よりも先に、前記ＥＰＯペプチドを、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびＧｌｃＮＡｃドナーと、前記ＥＰＯペプチドへＧｌｃＮＡｃを転移させるのに適した状況で接触させる
手順を含む請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１１】
以下のような化学式であるグリコシル残基を含む
0005413548.tif 000101
請求項３に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１２】
更にステップ（ａ）よりも先に；
（ｂ）前記ＥＰＯペプチドがＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびＧｌｃＮＡｃドナーと、前記ＥＰＯペプチドのグリコシル残基へＧｌｃＮＡｃを転移させるのに適した状況で接触させられる
手順を含む請求項１１に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１３】
更に；
（ｃ）ステップ（ｂ）の産物をガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトースドナーと、前記ＥＰＯペプチドへ前記ガラクトースを転移させるのに適した状況で接触させる
手順を含む請求項１２に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１４】
更にステップ（ｄ）を含む；
（ｄ）ステップ（ｂ）の産物をガラクトシダーゼと、前記ＥＰＯペプチドにガラクトースを付加するのに適した状況で合成させるように接触させる
手順を含む請求項１２に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の産物が次のような化学式のグリコシル残部を持つ；
0005413548.tif 000102
0005413548.tif 000103
請求項１３もしくは１４に記載の細胞を用いないin vitroの方法。
【請求項１６】
前記ポリ（エチレングリコール）が、直鎖状ポリ（エチレングリコール）また分岐したポリ（エチレングリコール）のメンバーから選択される請求項１に記載のＥＰＯペプチド。
【請求項１７】
前記ポリ（エチレングリコール）がモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である請求項１に記載のＥＰＯペプチド。
【請求項１８】
前記シアル酸トランスフェラーゼがＣＳＴ−ＩＩである請求項１に記載のポリ（エチレングリコール）が共有結合されたＥＰＯペプチド。
【請求項１９】
前記共有結合の前記形成に続いて、前記ＥＰＯペプチドがシアル酸ドナーおよびシアリルトランスフェラーゼと、前記ＥＰＯペプチドにシアル酸残基を転移させるのに適した状況で、接触させる請求項１に記載のPEGが共有的に結合したポリ（エチレングリコール）が共有結合されたＥＰＯペプチド。
【請求項２０】
前記ポリ（エチレングリコール）が、直鎖状ポリ（エチレングリコール）また分岐したポリ（エチレングリコール）のメンバーから選択されることを特徴とした請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリ（エチレングリコール）がモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリ（エチレングリコール）の分子量が本質的に単分散性の分布を持つ請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記シアル酸トランスフェラーゼがＣＳＴ−ＩＩである請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
ポリ（エチレングリコール）が共有的に結合した前記ＥＰＯペプチドの前記形成に続いて、前記ＥＰＯペプチドがシアル酸ドナーおよびシアリルトランスフェラーゼと、前記ＥＰＯペプチドにシアル酸残基を転移させるのに適した状況で接触させられる、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチドに結合した特別なグルカン構造を有するペプチド、その改造方法及び複合糖質化に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するほとんどのペプチドは、主ペプチド鎖長に沿って選択された数のアミノ酸へ特異的な連結を介してペプチドに結合している炭水化物部分を含む。このように多くの天然に存在するペプチドは「糖ペプチド（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）」と呼ばれている。任意の上記ペプチドに関するグリコシル化パターンの可変性は、そのペプチドの機能について膨大な意味を有する。例えばペプチド上のＮ−グリカン構造は、細胞または生物中のペプチドのプロテアーゼ感受性、細胞内トラフィッキング、分泌、組織ターゲッティング、生物学的半減期および抗原性を含むペプチドの様々な特性に影響を及ぼすことができる。これら１つ以上の特性の改変は、ペプチドの天然の状況でその効力に大きく影響し、そしてまたペプチドが治療薬の目的に生成された状況では、治療薬としてのペプチドの効力にも影響する。
【０００３】
ペプチド鎖に結合した炭水化物の構造は、「グリカン（ｇｌｙｃａｎ）」分子として知られている。ペプチド上の特別なグリカン構造はペプチドの可溶性および凝集特性、１次ペプチド鎖のホールディング、したがってその機能的または酵素的活性、タンパク質分解的攻撃に対するペプチドの耐性およびペプチドの不活性形から活性形への転換を導くタンパク質分解の制御に影響を及ぼす。重要なことはグリカン分子上に存在する末端シアル酸残基が哺乳動物の循環系でペプチドの半減期の長さに影響することである。末端シアル酸残基を含まないペプチドは肝臓により循環から急速に除去され、この出来事がペプチドの潜在的な治療的利益を無効にする。
【０００４】
天然に存在する糖ペプチドに見いだされるグリカン構造は典型的には２種類、Ｎ−およびＯ−グリカンに分けられる。
【０００５】
真核細胞で発現されるペプチドは、典型的には配列アスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン（ここでＸはプロリンおよびアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であることができる）を含むペプチドの１次構造中のアスパラギン残基上でＮ−グリコシル化されている。そのようなペプチドの炭水化物部分はＮ−グリカンとして知られている。Ｎ−グリコシル化の初期の反応（ｅｖｅｎｔ）は小胞体（ＥＲ）中で起こり、そして哺乳類、植物、昆虫および他の高等真核生物で同一である。最初に１４個の糖残基を含んでなるオリゴ糖が脂質担体分子上に構築される。新生ペプチドはＥＲへ翻訳およびトランスロケーションされるので、全オリゴ糖鎖は膜結合グリコシルトランスフェラーゼ酵素により触媒される反応でアスパラギン残基のアミド基に転移する。Ｎ−グリカンはさらにＥＲおよびゴルジ装置内の両方でプロセッシングされる。さらなるプロセッシングは一般に除去および付加される糖残基について特異的なグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼにより触媒される反応で、幾つかの糖残基の除去および他の糖残基の付加を伴う。
【０００６】
典型的にはＮ−グリカンの最終的構造はペプチドが生産される生物に依存する。例えば一般に、細菌中で生産されるペプチドは完全に非グリコシル化である。昆虫細胞中で発現されるペプチドは中でも高マンノース、およびポンチ（ｐａｕｎｃｉ）−マンノースＮ−オリゴ糖鎖を含む。哺乳動物の細胞培養で生産されるペプチドは通常、例えば種および細胞培養条件に依存して様々にグリコシル化される。同じ種および同じ条件下でも、時々、グリコシル鎖における特定量の異質性に遭遇する。さらに植物細胞中で生産されるペプチドは、動物細胞中で生産されるものとは有意に異なるグリカン構造を含んでなる。組換えペプチドの生産分野、特にペプチドが治療薬として使用される時のジレンマは、正しくグリコシル化されたペプチドを生成できることであり、すなわち天然に存在するペプチドの形態上に存在するものに似ているか、または同一のグリカン構造を有するペプチドを生成できることである。組換え手段により生産されるほとんどのペプチドが、天然に存在するグリカンとは異なるグリカン構造を含んでなる。
【０００７】
当該技術分野において様々な方法がペプチドのグリコシル化パターンをカスタマイズするために提案された（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４）。  
本質的にはペプチドの生体外グリコシル化に必要な多くの酵素がクローン化され、そして配列決定された。中にはこれらの酵素が生体外で使用され、そして特異的な糖がペプチド上の不完全なグリカン分子に加えられた場合もある。他の例では、発現したペプチド上へ所望の糖部分の付加が細胞内で起こるように、細胞を遺伝的に操作して酵素および所望のペプチドの組み合わせを発現させた。
【０００８】
ペプチドはＯ−グリカンの付加によっても修飾することができ、これはそれらのムチン様糖ペプチド上での広がり（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）によりムチン−型グリカンとも呼ばれている。アスパラギン残基に結合し、そして脂質−結合中間体からのオリゴ糖のｅｎｂｌｏｃ転移により形成されるＮ−グリカンとは異なり、Ｏ−グリカンは主にセリンおよびトレオニン残基に結合し、そしてヌクレオチド糖から糖の段階的付加により形成される（非特許文献１、非特許文献２）。ペプチドの機能はそれに存在するＯ−グリカン構造により影響され得る。例えばＰ−セレクチンリガンドの活性は、それに存在するＯ−グリカン構造により影響を受ける。Ｏ−グリカン構造の総説については、非特許文献３を参照にされたい。他のグリコシル化パターンはグリコシルホスファチジルイノシトールをタンパク質のカルボキシル−末端カルボキシル基に連結することにより形成される（非特許文献４および非特許文献５）。
【０００９】
現在、ペプチドのＮ−グリカンを修飾するために様々な技術が存在するが、当該技術分野には所望する、すなわちカスタマイズされたグリコシル化パターンを有するペプチドの一般的に応用できる生産法の必要性が存在する。当該技術分野では生成するペプチドを工業的規模で生産することができる、ペプチドのカスタマイズされた生体外グリコシル化について特別な必要性が存在する。この、および他の必要性が本発明により満たされる。
【００１０】
特定の生理学的応答を生じるためにグリコシル化および非−グリコシル化ペプチドを投与することは医学分野では周知である。中でもこの目的に使用されている最も知られているペプチドは、糖尿病を処置するために使用されているインスリンである。酵素もそれらの治療的利益のために使用されてきた。治療用ペプチドの使用を制限する主な要因は、ほとんどのペプチドの免疫原性である。患者では投与されたペプチドに対する免疫原性応答がペプチドを中和し、かつ／または患者にアレルギー応答の発生を導き得る。治療用ペプチドの他の欠点には最適状態には及ばない効力および急速な排除速度（ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｒａｔｅ）を含む。ペプチド治療薬に固有の問題が当該技術分野では認識されており、そしてこの問題の様々な排除法が調査された。可溶性ペプチド治療薬を提供するために、合成ポリマーがペプチド骨格に付けられた。
【００１１】
ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）はペプチドに結合されたポリマーの１例である。ペプチド治療薬を誘導化するためのＰＥＧの使用はペプチドの免疫原性を下げ、そして循環からの排除時間を長くすることが示された。例えば特許文献５（Ｄａｖｉｓら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールにカップリングした酵素およびペプチドホルモンのような非−免疫原性ペプチドに関する。１モルのペプチドあたり１０から１００モルの間のポリマーが使用され、そして少なくとも１５％の生理学的活性が維持される。
【００１２】
特許文献６（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら）は、ポリエチレングリコール−修飾化タンパク質分解酵素の活性を、タンパク質分解酵素を高分子化インヒビターに連結することにより維持する方法に関する。結合物は医学的応用を意図している。
【００１３】
ペプチドへのＰＥＧ結合の主な様式およびその誘導体は、ペプチドのアミノ酸残基を介する非特異的結合である。例えば特許文献７は、ＰＥＧに共有結合した酵素の酵素的に活性なポリマー−酵素結合物を開示する。同様に特許文献８は、α−１プロテアーゼインヒビターと、ＰＥＧまたはメトキシポリ（エチレングリコール）（“ｍＰＥＧ”）のようなポリマーの共有結合複合体を開示する。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（非特許文献６）は、ｍＰＥＧのウシ血清アルブミンのアミン基への共有結合を開示する。特許文献９はインターフェロンをポリ（エチレン無水琥珀酸）のようなジカルボン酸の無水物に結合することにより、インターフェロンをより低い疎水性にする方法を開示する。特許文献１０はＰＥＧおよびポリ（オキシエチル化）ポリオールの、インターフェロン−β、インターロイキン−２およびイムノトキシンのようなタンパク質への結合を開示する。特許文献１１は、リンホカインの少なくとも１つの１級アミノ基に直接結合したＰＥＧを含有するＩＬ−２のような化学的に修飾したリンホカインを開示し、そして特許請求する。特許文献１２は、多糖のようなポリマー性基質に共有結合したタンパク質分解酵素の水溶性複合体の製薬学的組成物を開示する。
【００１４】
ＰＥＧをペプチドに結合する別の様式は、ペプチド上のグリコシル残基の非特異的な酸化を介する。酸化された糖はＰＥＧ部分をペプチドに結合させるための部位として利用する。例えばＭ’Ｔｉｍｋｕｌｕ（特許文献１３）は、ＰＥＧを糖タンパク質へ付加するためにヒドラジン−またはアミノ−ＰＥＧの使用を開示する。グリコシル部分は対応するアルデヒドに無作為に酸化され、これは続いてアミノ−ＰＥＧにカップリングされる。
また、Ｂｏｎａら（特許文献１４）にもみられ、ここでは酵素的に免疫グロブリンのグリカンを酸化し、それからグリカンをアミノ−ＰＥＧ分子と接触することにより、ＰＥＧが免疫グロブリン分子に加えられる。
【００１５】
上記に開示した各方法では、ポリ（エチレングリコール）が無作為な非特異的様式でペプチド骨格の反応性残基に付加される。治療用ペプチドを生産するために、特異的に標識され、容易に特性決定可能な、本質的に均一な生成物をもたらす誘導化法を利用することが望ましいのは明らかである。
【００１６】
主要な２種類の酵素、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）およびグリコシダーゼが炭水化物の合成に使用されている。グリコシダーゼはさらにエキソグリコシダーゼ（例えばβ−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）およびエンドグリコシダーゼ（例えばエンド−Ａ、エンド−Ｍ）に分類される。これらの種類の各酵素は、炭水化物を調製するために成功裏に合成的に使用されてきた。一般的な総説については、非特許文献７を参照されたい。
【００１７】
グリコシルトランスフェラーゼはペプチド上のオリゴ糖構造を修飾する。グリコシルトランスフェラーゼは良好な立体化学的および位置化学的制御で特異的生成物を生産するために効果的である。グリコシルトランスフェラーゼはオリゴ糖を調製し、そして末端Ｎ−およびＯ−結合炭水化物構造、特に哺乳動物細胞で生産されたペプチドを修飾するために使用されてきた。例えば糖ペプチドの末端オリゴ糖は完全にシアル化および／またはフコシル化されてより一貫した糖構造を提供し、これは糖ペプチドの薬物動態学および種々の他の生物学的特性を改善する。例えばβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してラクトサミンを合成し、これは炭水化物の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの用途の具体例である（例えば非特許文献８を参照にされたい）。さらに多くの合成手順がシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からシアル酸をガラクトースの３−ＯＨまたは６−ＯＨへ転移するために、α−シアリルトランスフェラーゼを使用した（非特許文献９を参照にされたい）。フコシルトランスフェラーゼはグアノシン−５’−ジホスホフコースからフコース単位をサッカリド受容体の特異的なヒドロキシルへ転移させるための合計経路で使用される。例えばＩｃｈｉｋａｗａは、クローン化されたフコシルトランスフェラーゼを用いてシアリル化ラクトサミンのフコシル化が関与する方法により、シアリルルイス−Ｘを調製した（非特許文献１０）。治療的使用について複合糖質合成における最近の進歩についての考察は、非特許文献１１を参照にされたい。また特許文献１５；１６；１７；１８；および１９も参照されたい。
【００１８】
グリコシダーゼはまた、サッカリドを調製するためにも使用することができる。グリコシダーゼは通常はグリコシド結合の加水分解を触媒する。しかし適切な条件下でそれらはこの結合を形成するために使用することができる。炭水化物合成に使用するほとんどのグリコシダーゼはエキソグリコシダーゼであり；グリコシル転移は基質の非還元末端で起こる。グリコシダーゼはグリコシル−酵素中間体中のグリコシル供与体に結合し、これは水に遮断されて加水分解物を生じるか、または受容体により遮断されて新たなグリコシドまたはオリゴ糖を生じるいずれかである。エキソグリコシダーゼを使用した経路の例は、β−マンノシダーゼの作用により形成されるβ−マンノシド結合を含むすべてのＮ−糖ペプチドのコア（ｃｏｒｅ）となる三糖の合成である（非特許文献１２）。
【００１９】
グリコシド結合を形成するためのグリコシダーゼの使用の別の応用例では、突然変異グリコシダーゼが調製され、ここで活性部位内の標準的な求核性アミノ酸が非求核性アミノ酸に変えられる。突然変異酵素はグリコシド結合を加水分解しないが、それらを形成することはできる。そのような突然変異グリコシダーゼは、α−グリコシルフルオリド供与体およびグリコシド受容体分子を使用してオリゴ糖を調製するために使用される（Ｗｉｔｈｅｒｓら，特許文献２０）。
【００２０】
エンドグリコシダーゼの使用はエキソグリコシダーゼよりも一般的ではないが、エンドグリコシダーゼも炭水化物を調製するために使用されている。エンドグリコシダーゼの使用に基づく方法は、単糖よりもオリゴ糖を転移する利点を有する。オリゴ糖フラグメントは、エンド−Ｆ、エンド−Ｍのようなエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミンを使用して基質に加えられた（非特許文献１３；および非特許文献１４）。
【００２１】
上記酵素の炭水化物の調製における使用に加えて、それらは糖ペプチドの合成にも応用される。リボヌクレアーゼＢの均一なグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の合成が報告された（非特許文献１５）。リボヌクレアーゼＢの高いマンノースコア（ｃｏｒｅ）は、糖ペプチドをエンドグリコシダーゼＨで処理することにより開裂された。この開裂は２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基間で特異的に起こる。次に四糖のシアリルルイスＸが、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＶの順次使用により、今、均一なタンパク質に残るＧｌｃＮＡｃアンカー部位で酵素的に再構築された。しかし各々の酵素的に触媒される工程は優れた収量で進行するものの、そのような手順は工業的規模での糖ペプチドの生成に適合しなかった。
【００２２】
化学的および酵素的合成要素を組み合わせる方法が当該技術分野では知られている。例えばＹａｍａｍｏｔｏおよび共同研究者（非特許文献１６）は、エンドグリコシダーゼを使用した糖ペプチド、グリコシル化ペプチドＴの化学酵素的合成を報告した。Ｎ−アセチルグルコサミニルペプチドは純粋に化学的な手段で合成された。このペプチドは続いてヒトトランスフェリンペプチドのオリゴ糖を用いて酵素的に仕上げられた（ｅｌａｂｏｒａｔｅｄ）。サッカリド部分はエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理することによりペプチドに付加された。生成したグリコシル化ペプチドは、ペプチドＴおよびＮ−アセチルグルコサミニルペプチドＴと比べた時、高度に安定であり、しかもタンパク質分解に耐性であった。
【００２３】
レポーター基を用いてペプチド構造を修飾するために、グリコシルトランスフェラーゼの使用が調査された。例えばＢｒｏｓｓｍｅｒら．（特許文献２１）は、シアル酸の蛍光−標識シチジンモノリン酸（“ＣＭＰ”）誘導体の形成、およびシアリルトランスフェラーゼ活性のアッセイ、および細胞表面、糖タンパク質およびペプチドの蛍光−標識のアッセイに蛍光グリコシドの使用を開示する。Ｇｒｏｓｓら，（非特許文献１７）は、同様のアッセイを記載する。Ｂｅａｎら，（特許文献２２）は、不十分に（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｌｙ）グリコシル化されたタンパク質の再グリコシ
ル化を利用した、グリコシル化欠損疾患のためのアッセイを開示する。欠損タンパク質は蛍光−標識ＣＭＰグリコシドにより再グリコシル化される。各蛍光シアル酸誘導体は、９−位またはシアル酸内で通常はアセチル化されているアミンのいずれかで蛍光部分に置き換えられる。蛍光シアル酸誘導体を使用するこの方法は、グリコシルトランスフェラーゼの存在または非グリコシル化またはグリコシル化されていないまたは不適切にグリコシル化された糖タンパク質に関するアッセイである。このアッセイは生物起源のサンプル中の少量の酵素または糖タンパク質について行われる。修飾したシアル酸を使用して調製用または工業的規模でグリコシル化または非グリコシル化ペプチドを酵素的に誘導化することは、従来技術では開示も示唆もされなかった。
【００２４】
細胞表面を、それらの表面に提示されるグリコシル残基を改変させることにより修飾することに対してかなりの努力が向けられた。例えばＦｕｋｕｄａおよび共同研究者は、定めた構造のグリコシドを細胞表面に結合する方法を開発した。この方法は、多様なグリコシル基質を有する、フコースおよびフコース類似体を転移することができるフコシルトランスフェラーゼの弛緩した基質特異性を活用する（非特許文献１８）。
【００２５】
酵素的方法は続いて化学的合成（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）に向けて、糖ペプチド上のグリコシル残基を活性化するためにも使用されてきた。グリコシル残基は典型的には、末端のガラクトース残基を対応するアルデヒドに転換するガラクトースオキシダーゼを使用して活性化される。アルデヒドは続いてアミンを含む修飾基にカップリングされる。例えばＣａｓａｒｅら，（非特許文献１９）は、ドキソルビシンを組換えＭＨＣＩＩ−ペプチドキメラの酸化されたガラクトース残基に結合させた。
【００２６】
グリコシル残基はケトン基を含むようにも修飾された。例えばＭａｈａｌおよび共同研究者（非特許文献２０）は、天然な基質ではアセチル基により通常は占められている位置にケトン官能基を有するＮ−レブリノイルマンノサミン（“ＭａｎＬｅｖ”）を調製した。細胞はＭａｎＬｅｖで処理され、これによりケトン基を細胞表面に包含した。また非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；および非特許文献２４も参照にされたい。
【００２７】
細胞表面の修飾法は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドを修飾するために細胞の不存在下では適用されなかった。さらに細胞表面の修飾法は、修飾されたグリコシル供与体部分をペプチドへ移す酵素的包含には利用されていない。さらにいずれの細胞表面修飾法も、工業的規模でグリコシル−修飾ペプチドを生産するために現実的ではない。
【００２８】
サッカリド構造の酵素的合成（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）に向けられた努力にもかかわらず、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子等のような修飾基を用いて、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドを修飾するための工業的に現実的な方法の必要性がいまだに存在する。特に興味深いのは、修飾ペプチドが治療薬または診断薬としての使用を強化する改善された特性を有する方法である。本発明はこれらの、および他の必要性を満たす。
【特許文献１】国際公開第９９／２２７６４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／５８９６４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／５４３４２号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５，０４７，３３５号明細書
【特許文献５】米国特許第４，１７９，３３７号明細書
【特許文献６】国際公開第９３／１５１８９号パンフレット
【特許文献７】米国特許第４，０８８，５３８号明細書
【特許文献８】米国特許第４，４９６，６８９号明細書
【特許文献９】米国特許第４，４１４，１４７号明細書
【特許文献１０】国際公開第８７／０００５６号パンフレット
【特許文献１１】欧州特許第１５４，３１６号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，０５５，６３５号明細書
【特許文献１３】国際公開第９４／０５３３２号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第９４／４０７３１号パンフレット
【特許文献１５】米国特許第５，８７６，９８０号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，０３０，８１５号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，７２８，５５４号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，９２２，５７７号明細書
【特許文献１９】国際公開第９８／３１８２６号パンフレット
【特許文献２０】米国特許第５，７１６，８１２号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，４０５，７５３号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，４３２，０５９号明細書
【非特許文献１】Ｔａｎｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１−９１（１９８７）
【非特許文献２】Ｈｏｕｎｓｅｌｌら．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１３：１９−２６（１９９６）
【非特許文献３】Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ、分岐Ｏ−グリカンの生合成（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｒａｎｃｈｅｄ  Ｏ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｇｌｙｃａｎｓ）、１９８９、実験生物学学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１〜２６頁（英国）
【非特許文献４】Ｔａｋｅｄａら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３６７−３７１（１９９５）
【非特許文献５】Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５９３−５９１（１９９５）
【非特許文献６】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５７８（１９７７）
【非特許文献７】Ｃｒｏｕｔら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：９８−１１１（１９９８）
【非特許文献８】Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：５４１６−５４１８（１９８２）
【非特許文献９】Ｋｅｖｉｎら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２：１３５９−１３６２（１９９６）
【非特許文献１０】Ｉｃｈｉｋａｗａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３−９２９８（１９９２）
【非特許文献１１】Ｋｏｅｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：８３５−８４１（２０００）
【非特許文献１２】Ｓｉｎｇｈら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．９９３−９９４（１９９６）
【非特許文献１３】Ｗａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：１９７５−１９７８
【非特許文献１４】Ｈａｎｅｄａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９２：６１−７０（１９９６）
【非特許文献１５】Ｗｉｔｔｅ  Ｋら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８（１９９７）
【非特許文献１６】Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  ｃｏｗｏｒｋｅｒ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５−４２２（１９９８）
【非特許文献１７】Ｇｒｏｓｓら，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６：１２７（１９９０）
【非特許文献１８】Ｔｓｕｂｏｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７２１３（１９９６）
【非特許文献１９】Ｃａｓａｒｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：１４２（２００１）
【非特許文献２０】Ｍａｈａｌ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：１１２５（１９９７）
【非特許文献２１】Ｓａｘｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：２００７（２０００）
【非特許文献２２】Ｈａｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１２４２（２００１）
【非特許文献２３】Ｙａｒｅｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３１１６８（１９９８）
【非特許文献２４】Ｃｈａｒｔｅｒら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４９（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明の目的は、サッカリド構造の酵素的合成（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）により、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子等のような修飾基を用いて、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドを修飾するための工業的に現実的な方法を提供することである。
本発明の別の目的は、これを用いて治療薬または診断薬として使用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、１つ以上のグリカンからなり、共役的に結合したグリココンジュゲート分子を持つＥＰＯペプチド；ＥＰＯペプチドと少なくとも１つのグリカンとグリカンに共役的に付いた少なくとも１つのポリエチレングリコール分子からなっているグリコＰＥＧ化ＥＰＯペプチド及びその製造方法；これらを用いて哺乳類を治療する方法である。
【００３１】
本発明はペプチドに結合した特別なグルカン構造を有するペプチドの多数の改造方法を含む。特別なグリカン構造を本明細書に記載するが、本発明は任意の１つの特定のグリカン構造に限定されると解釈されるべきではない。加えて本明細書には特別なペプチドを記載するが、本発明は記載するペプチドの性質に限定されるべきではなく、むしろ任意のすべての適当なペプチドおよびその変形物を包含するべきである。
【００３２】
以下に記載する説明は本発明の好適な態様を開示し、そして本発明に添付する請求の範囲の文章による説明を提供する。本発明は明らかな、または本明細書を読んだ後に明らかになるこのような態様の任意の、そしてすべての変形態様を包含する。
【００３３】
本発明は、ペプチドがもつ式：
【００３４】
【化１】
0005413548.tif 000002
【００３５】
式中、ＡＡはペプチドの末端または内部アミノ酸残基であり；
Ｘ１−Ｘ２は該ＡＡに共有結合したサッカリドであり、ここで
Ｘ１は第１グリコシル残基であり；そして
Ｘ２はＸ１に共有結合した第２グリコシル残基であり、ここでＸ１およびＸ２は単糖およびオリゴ糖残基から選択される、
を有するＥＰＯペプチドの無細胞の生体外（インビトロ）改造方法；
（ａ）Ｘ２またはその糖サブユニットを該ペプチドから除去し、これにより短縮化グリカンを形成し；そして
（ｂ）短縮化グリカンを、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのグリコシル供与体と、少なくとも１つのグリコシル供与体を短縮化グリカンへ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ＥＰＯペプチドを改造する、
ことからなる方法、を含んでなる。
【００３６】
この方法はさらに
（ｃ）Ｘ１を除去し、これによりＡＡを露出し；そして
（ｄ）ＡＡを、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのグリコシル供与体と、少なくとも１つのグリコシル供与体をＡＡへ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ＥＰＯペプチドを改造する、ことを含んでなる。
【００３７】
付け加えて、本方法は：
（ｅ）工程（ｂ）の前に、翻訳後修飾中にサッカリドに付加した基を除去する、ことを含んでなる。
１つの観点では、基がホスフェート、スルフェート、カルボキシレートおよびそれらのエステルから選択される員である。
【００３８】
この方法の一つの観点では、ペプチドは式：
【００３９】
【化２】
0005413548.tif 000003
【００４０】
式中、ＺはＯ、Ｓ、ＮＨおよび架橋剤から選択される員である、
を有する。
【００４１】
一つの態様において、少なくとも１つのグリコシル供与体は修飾基を含んでなる。
これと他の態様において、修飾基はポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性連結基、標的部分およびペプチドからなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマー、好ましくはポリ（エチレングリコール）であり、ここで、好ましくはポリ（エチレングリコール）は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
【００４２】
また、ペプチドがもつ式：
【００４３】
【化３】
0005413548.tif 000004
【００４４】
式中、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ１７は、単糖またはオリゴ糖残基から独立して選択され；そして、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅとｘは、整数０、１および２から独立して選択されるが、但し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｘから選択される少なくとも１つの員は１または２である、を有するＥＰＯペプチドの無細胞の生体外改造方法；
（ａ）少なくとも１つのＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７またはＸ１７、またはその糖サブユニットをペプチドから除去し、これにより短縮化グリカンを形成し；そして
（ｂ）短縮化グリカンを、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのグリコシル供与体と、少なくとも１つのグリコシル供与体を該短縮化グリカンヘ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、ことからなる方法、を含んでなる。
【００４５】
１つの態様において、工程（ａ）の除去は、ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｘがそれぞれ０である短縮化グリカンを生成する。
【００４６】
別の態様において、Ｘ３、Ｘ５およびＸ７は（マンノース）ｚおよび（マンノース）ｚ−（Ｘ８）ｙ、
式中、Ｘ８は単−およびオリゴ−糖から選択されるグリコシル部分であり；
ｙは０および１から選択される整数であり；そして
ｚは１から２０の間の整数であり、ここでＺは３以上である時、（マンノース）ｚは直鎖および分岐構造から選択される、
から成る群から選択される。
【００４７】
さらなる態様において、Ｘ４はＧｌｃＮＡｃおよびキシロースからなる群から選択される。別の観点ではＸ３、Ｘ５およびＸ７が（マンノース）ｕであり、ここでｕは１から２０の間の整数から選択され、そしてｕが３以上である時、（マンノース）ｕは直鎖および分岐構造から選択される。
【００４８】
一つの観点では、少なくとも１つの該グリコシル供与体は修飾基を含んでなる。
【００４９】
式：
【００５０】
【化４】
0005413548.tif 000005
【００５１】
式中、ｒ、ｓおよびｔは、０および１から独立して選択される整数である、を有するグリカンを含んでなるＥＰＯペプチドの無細胞の生体外改造方法：
（ａ）ペプチドを、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのグリコシル供与体と、少なくとも１つのグリコシル供与体をグリカンへ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ＥＰＯペプチドを改造する、ことからなる方法、がさらに提供される。
【００５２】
一つの観点では、少なくとも１つのグリコシル供与体は修飾基を含んでなる。
別の観点では、ペプチドは式：
【００５３】
【化５】
0005413548.tif 000006
【００５４】
式中、Ｘ９およびＸ１０は、単糖またはオリゴ糖残基から独立して選択され；そしてｍ、ｎおよびｆは０および１から選択される整数である、
を有する。
【００５５】
さらに、ペプチドは式：
【００５６】
【化６】
0005413548.tif 000007
【００５７】
式中、Ｘ１１およびＸ１２は、独立して選択されるグリコシル部分であり；そしてｒおよびｘは０および１から独立して選択される整数である、
を有する。
【００５８】
別の観点では、Ｘ１１およびＸ１２が（マンノース）ｑであり、ここでｑは１から２０の間の整数から選択され、そしてｑが３以上である時、（マンノース）ｑは直鎖および分岐構造から選択される。
【００５９】
付け加えるに、ペプチドは式：
【００６０】
【化７】
0005413548.tif 000008
【００６１】
式中、Ｘ１３、Ｘ１４およびＸ１５は、独立して選択されるグリコシル残基であり；そしてｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｐは整数０および１から独立して選択されるが、但し、少なくとも１つのｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｐは１である、
を有する。
【００６２】
この方法はまた、Ｘ１４およびＸ１５がＧｌｃＮＡｃおよびＳｉａから独立して選択される員であり；そしてｉおよびｋが整数０および１から独立して選択されるが、但し、少なくとも１つのｉおよびｋは１であり、そしてｋが１ならばｇ、ｈおよびｊは０である、を含む。
【００６３】
付加的な観点では、ペプチドは式：
【００６４】
【化８】
0005413548.tif 000009
【００６５】
式中、Ｘ１６は
【００６６】
【化９】
0005413548.tif 000010
【００６７】
ここでｓおよびｉは０および１から独立して選択される、
から選択される員である、を有する請求項１に記載の方法。
【００６８】
１つの態様では除去がグリコシダーゼを利用する。
【００６９】
また含まれるのは式：
【００７０】
【化１０】
0005413548.tif 000011
【００７１】
式中、ＡＡはペプチドの末端または内部アミノ酸残基であり；
Ｘ１は、単糖およびオリゴ糖残基から選択される、ＡＡに共有結合したグリコシル残基であり；そして
ｕは０および１から選択される整数である、を有するＥＰＯペプチドの無細胞のインビトロ改造方法：
【００７２】
ペプチドを、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのグリコシル供与体と、少なくとも１つのグリコシル供与体を該短縮化グリカンへ転移させるために適する条件下で接触させ、ここで該グリコシル供与体は修飾基を含んでなり、これにより該ＥＰＯペプチドを改造する、ことからなる方法である。  
【００７３】
一つの態様では、少なくとも１つのグリコシル供与体が修飾基が修飾基を含んでなり、そして修飾基がポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性連結基、標的部分およびペプチドからなる。
【００７４】
別の観点では、修飾基および完全なグリコシル連結基前駆体が、酵素の作用を介して共有結合した単位としてペプチドに結合し、酵素が該前駆体を完全なグリコシル連結基に転換し、これにより該結合物を形成する。
【００７５】
さらに別の観点では、共有結合物は一つの第１の完全なグリコシル連結基を介してペプチドの第１残基に共有結合した第１修飾基、および第２の完全なグリコシル連結基を介してペプチドの第２残基に結合した第２グリコシル連結基を含んでなる。
【００７６】
１つの態様では、第１残基および第２残基が構造的に同一である。別の態様では、第１残基および第２残基が異なる構造を有する。さらなる態様では、第１残基および第２残基がグリコシル残基である。さらに、第１残基および第２残基はアミノ酸残基である。
【００７７】
ペプチドはまた結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成する前に改造されうる。別の観点では、改造されたペプチドは完全なグリコシル連結基の受容部分を導入するために改造されうる。まださらなる観点では、修飾基は水溶性ポリマーである。一つの観点では、完全なグリコシル連結基はシアル酸残基、Ｇａｌ残基、ＧｌｃＮＡｃ残基、及びＧａｌＮＡｃ残基からなるグループから選ばれる一つの員である。
【００７８】
また本発明で提供されるのは、ポリマーとグリコシル化または非−グリコシル化ペプチドとの間に共有結合物を形成する方法であって、ここでポリマーは、間に挿入され、そしてペプチドとポリマーの両方に共有結合した完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合している。この方法はペプチドを、ポリマーに共有的に連結したヌクレオチド糖および該ヌクレオチド糖が基質であるグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる混合物と、結合物を形成するために十分な条件下で接触させることを含んでなる。ここでペプチドはＥＰＯである。
【００７９】
一つの観点では、グリコシル連結基が、ペプチドに共有結合したグリコシル残基に共有結合し、そしてさらなる観点ではグリコシル連結基がペプチドのアミノ酸残基に共有結合する。
【００８０】
付加的な観点では、ポリマーはポリアルキレンオキシドおよびポリペプチドからなる群から選択される員を含んでなる。別の観点ではポリアルキレンオキシドはポリ（エチレングリコール）である。
【００８１】
まださらなる観点では、グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、およびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからなる群から選択される。付け加えるとグルコシルトランスフェラーゼは組換え的に生産され、組換え原核、または組換え真核酵素であろう。
【００８２】
一つの態様では、ヌクレオチド糖がＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシドおよびＧＤＰ−グリコシドからなる群から選択される。さらに、ヌクレオチド糖はＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからなる群から選択される。
【００８３】
付け加えると、グリコシル化ペプチドが接触前に部分的に脱グリコシル化されている。
【００８４】
さらに、完全なグリコシル連結基がシアル酸残基である。
【００８５】
付け加えるとこの方法は無細胞環境で行われる。
【００８６】
またでは、共有結合物は単離され、そして好ましくは物が膜濾過により単離される。
【００８７】
発明はさらにペプチドと修飾された糖の間の共有結合を形成するための組成物、修飾された糖、グリコシルトランスフェラーゼ及びペプチド受容体基質の混合物からなる組成物、ここで、修飾された糖はポリマー、治療部分、生体分子から選択される員に共有結合で結合しており、ペプチドはＥＰＯである、を提供する
【００８８】
付け加えると、本発明の方法によって改造されたＥＰＯペプチドとそのようなＥＰＯペプチドからなる製薬学的組成物が提供される。
【００８９】
また、生体外の、無細胞環境下での下式を有するペプチドを改造する方法が提供される。
式：
【００９０】
【化１１】
0005413548.tif 000012
【００９１】
式中、ＡＡは、少なくとも一つのグリコシル受容体をアミノ酸残基に転移するに適当な条件下で、ペプチドを少なくとも一つのグリコシルタランスフェラーゼと少なくとも一つのグリコシル受容体と接触させることからなる方法の末端又は内部のアミノ酸残基であり、ここでグリコシル受容体は修飾基がＥＰＯペプチドであるペプチドを改造することからなる。
【００９２】
付け加えて、ＥＰＯペプチドと修飾基との間の共有結合を形成するための方法が提供される。ここで修飾基は完全な連結基を通してＥＰＯペプチドに共有結合で連結しており、ＥＰＯペプチドは選ばれた形の員である下式をもつグリコシル残基からなる。
【００９３】
【化１２】
0005413548.tif 000013
0005413548.tif 000014
【００９４】
式中、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｉ，ｎ，ｏ，ｐ，ｑ，ｒ，ｓ，ｔ及びｕは０と１から独立して選択される員であり；  ｅ，ｆ，ｇ及びｈは０から４の間の整数から独立して選択される員であり；ｊ，ｋ，ｌ及びｍは０から２０の間の整数から独立して選択される員であり；ｖ，ｗ，ｘ，ｙ及びｚは０であり；そしてＲはマンノースもしくはオリゴマンノースの修飾基であり；
【００９５】
方法は、（ａ）ＥＰＯペプチドをグリコシルトランスフェラーゼ及び、修飾基と共有結合的に連結したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分からなる修飾されたグリコシル受容体とを、完全なグリコシル連結基の形成に適当な条件下で接触させる工程、
（ｂ）さらに工程（ａ）の前にＥＰＯペプチドからシアル酸を除くのに適当な条件下でＥＰＯペプチドとシアルダーゼを接触する工程、を含んでなる。
【００９６】
この方法は、工程（ａ）の生成物を、シアル酸を生成物に転移させるのに適当な条件下でシアリルトランスフェラーゼとシアル酸受容体とを接触させる工程（ｃ）を含んでなる。
【００９７】
この方法は、工程（ａ）の前に、ＥＰＯペプチドを、合成的に作用するガラクトシダーゼと、ＥＰＯペプチドにガラクトースを付加するのに適当な条件下で接触させる工程（ｄ）を含んでなる。
【００９８】
付け加えるに、この方法は：工程（ａ）の前に、ＥＰＯペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをＥＰＯペプチドへ転移させるのに適当な条件下で接触させる工程（ｅ）を含んでなる。
【００９９】
この方法はまた、工程（ｅ）からの生成物を、ＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるのに適当な条件下で接触させる工程（ｆ）を含んでなる。
【０１００】
この方法はまた、工程（ａ）からの生成物を、修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成する工程（ｇ）を含んでなる。
【０１０１】
付け加えるに、この方法は、工程（ａ）の前にＥＰＯペプチドを、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびＧｌｃＮＡｃ供与体と、ＧｌｃＮＡｃをＥＰＯペプチドへ転移させるのに適当な条件下で接触させる工程（ｈ）を含んでなる。
【０１０２】
一つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
【０１０３】
別の観点では、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｎおよびｑが１であり；ｈが１から３の間の整数から選択される員であり；ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｏ、ｐ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕが０および１から独立して選択される員であり、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚが０である。
【０１０４】
さらに別の観点では、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｑ、ｓ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚが０であり；そしてｅ、ｇ、ｉ、ｒおよびｔが０および１から独立して選択される員である。
【０１０５】
付加的な観点では、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕが０および１から独立して選択される員あり；そしてｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚが０である。
【０１０６】
さらなる観点では、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｎおよびｑが１であり；ｈが１から３の間の整数から選択される員であり；ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｏ、ｐ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕが、０および１から独立して選択される員であり；そしてｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚが０である。
【０１０７】
別の観点では、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｏ、ｐ、ｓ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚが０であり；そしてｅ、ｇ、ｉ、ｎ、ｑ、ｒおよびｔが０および１から独立して選択される。
【０１０８】
付け加えて、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｏ、ｐ、ｓ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚが０であり；そしてｅ、ｇ、ｉ、ｑ、ｒおよびｔが０および１から独立して選択される員である。
【０１０９】
さらに、ｑが１であり；ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｎ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕが０および１から独立して選択される員であり；そしてｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｏ、ｐ、ｖ、ｗ、ｘおよびｚが０である。
【０１１０】
また、下記の本発明の方法により形成されたＥＰＯペプチド結合物も提供される。
【０１１１】
さらに、ペプチドに共有結合しているグリコ結合分子をもつ一つまたはそれ以上のグリカンを含むＥＰＯペプチドが提供される。ひとつの観点では、一つまたはそれ以上のグリカンは１分岐グリカンである。別の観点では、一つまたはそれ以上のグリカンは２分岐グリカンである。さらに別の観点では、一つまたはそれ以上のグリカンは３分岐グリカンである。さらにいっそうもう一つの観点では、少なくとも一つまたはそれ以上のグリカンは３分岐グリカンである。一つの更なる観点では、一つまたはそれ以上のグリカンは一つあるいは多分岐グリカンを含む少なくとも2つのグリカンからなっている。さらに別の観点では、一つまたはそれ以上のグリカンはＮに結びついたグリカンとＯに結びついたグリカンから選ばれる。さらに別の観点では、一つまたはそれ以上のグリカンはＮに結びついたグリカンとＯに結びついたグリカンから選ばれた2つのグリカンである。その上に、ペプチドは、原核細胞と真核細胞からなるグループから選ばれた細胞で表現される。そして真核細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞そしてイースト細胞から成るグループから選ばれる。
【０１１２】
この発明において、１つのＥＰＯペプチドと共有結合でグリカンに付いた少なくとも１つのグリカンと少なくとも1つのポリ(エチレングリコール)分子を含むグリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドについても提供される。そしてそこではポリ(エチレングリコール)分子はグリコシルトランスフェラーゼを用いてＥＰＯに付加される。1つの観点では、グリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドは少なくとも単一分岐のグリカンからなる。別の観点では、総てのグリカンはＮに結びついている単一分岐である。更なる観点では、総てのグリカンはＮに結びついており、少なくとも1つのグリカンはポリ(エチレングリコール)を含んでいる。更なる観点では、1つ以上のグリカンがポリ(エチレングリコール)を含んでいる。更なる観点では、総てのグリカンはＮに結びついており、総てのグリカンはポリ(エチレングリコール)を含んでいる。さらに、グリコＰＥＧ化されたペプチドは、それに共有結合で結び付けられたポリ(エチレングリコール)を持った少なくとも3つの単一分岐グリカンを含んでいる。
【０１１３】
更に、ＥＰＯペプチドが3つあるいはそれ以上のグリカンを含むグリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドが提供される。1つの観点では、少なくとも１つのグリカンはそれに共有的に付けられたポリ(エチレングリコール)を含んでいる。
【０１１４】
他の観点では、1つ以上のグリカンはそれに共有的に付けられたポリ(エチレングリコール)を含んでいる。更なる観点では、総てのグリカンは、それに共有的に付けられたポリ(エチレングリコール)を含んでいる。加えて、ポリ(エチレングリコール)は、フコース(Ｆｕｃ)、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、 ガラクトース(Ｇal)およびシアル酸(ＳＡ)からなる群から選ばれる１つの糖の部分に結び付けられている。加えて、シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸である。更に、そのＥＰＯペプチドはＯにリンクしたグリカンを含まない。加えて、そのＥＰＯペプチドは少なくとも1つのＯにリンクしたグリカンを含んでいる。更に、Ｏにリンクしたプチドはそれに共有的に付けられたポリ(エチレングリコール)を含んでいる。加えて、そのＥＰＯペプチドは、細胞の中で組み替え的に表される。更に、その細胞は昆虫細胞、イースト細胞、そして哺乳動物細胞からなる群から選ばれる。望むらくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。１つの観点では、ポリ(エチレングリコール)は約 1 ｋＤａ (キロダルトン)、 2 ｋＤａ、 5 ｋＤａ、10 ｋＤａ、20 ｋＤａ、30 ｋＤａおよび  40 ｋＤａ からなる群から選ばれる分子量を持つ。他の観点では、ＥＰＯペプチドは天然に存在するＥＰＯペプチドと突然変異したＥＰＯペプチドからなる群から選ばれる。他の観点では、突然変異したＥＰＯペプチドは、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸系列を含む。それは Ａｌａ139 に対して Ａｒｇ139、 Ａｌａ143 に対して Ａｒｇ143 そして Ａｌａ154 に対して Ｌｙｓ154 からなる群から選ばれる1つの突然変異を持っている。
【０１１５】
グリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドを作る方法も提供される。その方法は、（ａ）ＥＰＯペプチドを、ポリ(エチレングリコール)をＥＰＯペプチドに転移するのに十分な条件下で、ポリ(エチレングリコール)に共有結合で連結したヌクレオチド糖とグリコシルトランスフェラーゼとの混合物に接触させる工程を含む。
【０１１６】
一つの実施形態では、ヌクレオチド糖の糖はフコース(Ｆｕｃ)、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、 ガラクトース(Ｇal)およびシアル酸(ＳＡ)からなる群から選ばれる。更なる実施形態では、ポリ(エチレングリコール)は、約 1 ｋＤａ（キロダルトン）、2 ｋＤａ、 5 ｋＤａ、10 ｋＤａ、20 ｋＤａ、30 ｋＤａおよび  40 からなる群から選ばれる分子量を持つ。更なる実施形態では、ＥＰＯペプチドは細胞の中で組み替え的に表される。ここで、細胞は昆虫細胞、イースト細胞そして哺乳動物細胞からなる群から選ばれる。１つの観点では、ＥＰＯペプチドは、天然に存在するＥＰＯペプチドと突然変異したＥＰＯペプチドからなる群から選ばれる。もう一つの観点では、成熟したＥＰＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３の系列を持つ。更なる観点では、突然変異したＥＰＯペプチドは、Ａｌａ139 に対して Ａｒｇ139、 Ａｌａ143 に対して Ａｒｇ143 そして Ａｌａ154 に対して Ｌｙｓ154 からなる群から選ばれる少なくとも1つの突然変異を持つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３の系列を持つ。
【０１１７】
発明のもう一つの観点では、工程(a)の前に次の方法が含まれる。
(b) ＥＰＯペプチドを、ヌクレオチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）分子とＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Ｇｎｔ）から成る混合物と接触させること、ヌクレオチド−ＧｌｃＮＡｃはＧｌｃＮＡｃとＥＰＯの間で結合を形成するのに十分な条件下での基質である。そしてここではＧｎｔはＧｎｔＩ、ＧｎｔII、Ｇｎｔ III、Ｇｎｔ ＩＶ、Ｇｎｔ V 及びＧｎｔ VI からなる群から選ばれる。
【０１１８】
１つの観点では、その混合物は、ＧｎｔＩ、ＧｎｔII、Ｇｎｔ III、Ｇｎｔ ＩＶ、Ｇｎｔ V 及びＧｎｔ VI からなるグループから選ばれる１つのＧｎｔを含む。もう一つの観点では、グリコＰＥＧ化されたＲＰＯペプチドは、少なくとも1つの単一分岐グルカンを含む。更なる観点では、ヌクレオチド糖の糖は、ガラクトースであり、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼ I(ＧａｌＴ I)である。
【０１１９】
方法の更なる観点では、工程（ａ）の前で工程(ｂ)の後に、
(c) ＥＰＯペプチドを、ヌクレオチド ガラクトース（Ｇａｌ） とガラクトシルトランスフェラーゼ I（ＧａｌＴ I）からなる混合物にガラクトースがＥＰＯペプチドに転移するのに十分な条件下で接触させること。
【０１２０】
一つの実施形態では、工程（ａ）において、ヌクレオチド糖の糖はシアル酸で、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである。もう1つの実施形態では、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮ）である。更なる実施形態では、シアリルトランスフェラーゼはα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ、α（２，６）シアリルトランスフェラーゼそしてα（２，８）シアリルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる。
【０１２１】
グリコＰＥＧ化されたＥＰＯについても提供する。ここでＲＰＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３の系列からなっている。1つの局面では、ＥＰＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３の系列から成り、そして更にその系列の突然変異から成る。
【０１２２】
更に発明の中で、グリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドを作る方法を提供する。その方法は次の工程から成る：
（ａ）ＥＰＯペプチドを、ポリ(エチレングリコール)に共有結合的に連結したヌクレオチド糖とグリコシルトランスフェラーゼからなる混合物とを、ポリ(エチレングリコール)をＥＰＯペプチドへ転移するのに十分な条件下で接触させること。ここでグリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。
【０１２３】
1つの局面では、フコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼ I, フコシルトランスフェラーゼ III, フコシルトランスフェラーゼ IV, フコシルトランスフェラーゼ V, フコシルトランスフェラーゼ VI, フコシルトランスフェラーゼ VII からなる群から選ばれる。そして別の局面では、ＥＰＯはＣＨＯ細胞中で発現する。
【０１２４】
更に貧血を持つ哺乳動物を取り扱う方法を提供する。この方法は、ペプチドに付けられたグリコ共役分子を持った１つあるいはそれ以上のグリカンを含むＥＰＯペプチドを哺乳動物に対して投与することからなる。ここでＥＰＯはその哺乳動物のヘマトクリットレベルを増加させるのに有効な量が投与される。これおよびその他の実施形態では、哺乳動物は人間である。
【０１２５】
同様にまた、哺乳動物にエリスロポエチン治療を施す方法を提供する。その方法は、ＥＰＯペプチドと少なくとも１つのグリカンとグリカンに共有結合的に付けられた少なくとも１つのポリ(エチレングリコール)分子からなるグリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドについて有効量を哺乳動物に投与することからなる。ここでポリ(エチレングリコール)分子はグリコシルトランスフェラーゼを使ってＥＰＯに付加される。さらにここでＥＰＯは哺乳動物のヘマトクリットレベルを増加させるのに有効な量が投与される。
【０１２６】
加えて、貧血を持つ哺乳動物を取り扱う方法を提供する。この方法は、ＥＰＯペプチドと少なくとも１つのグリカンとグリカンに共有結合的に付けられた少なくとも１つのポリ(エチレングリコール)分子からなるグリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドについて有効量を哺乳動物に投与することから成る。ここでポリ(エチレングリコール)分子はグリコシルトランスフェラーゼを使ってＥＰＯに付加される。
【０１２７】
ここで、ＥＰＯは哺乳動物のヘマトクリットレベルを増加させるのに有効な量が投与される。１つの観点では、貧血は化学療法を関連している。
【０１２８】
更に腎臓透析患者を取り扱う方法を提供する。この方法は、ＥＰＯペプチドと少なくとも１つのグリカンとグリカンに共有結合的に連結した少なくとも１つのポリ(エチレングリコール)分子からなるグリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドについて有効量を患者に投与することからなる。ここでポリ(エチレングリコール)分子はグリコシルトランスフェラーゼを使ってＥＰＯに付加される。さらにここでＥＰＯは患者のヘマトクリットレベルを増加させるのに有効な量が投与される。
【発明の効果】
【０１２９】
本明細書に提供する方法および組成物を使用することにより、ペプチドを改造して好ましくはペプチドに結合した修飾された糖を有する望ましいグリカン構造をペプチドに付与することが可能である。また本発明の方法および組成物を使用することにより、工業的規模で所望する、かつまたは修飾されたグリカン構造を有するペプチド分子を生成することも可能であり、これにより初めて当該技術分野に改善された治療用ペプチドを効率的に生産するための現実的解決を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３０】
本発明は、特別にカスタマイズされた、または所望のグリコシル化パターンを有する糖ペプチド分子を提供する様式で、ペプチド分子に、またはペプチド分子から糖を無細胞で生体外付加および／または削除するための方法および組成物を含み、ここで糖ペプチドは工業的規模で生産される。本発明の好適な態様では、そのように生産された糖ペプチドは酵素反応を介してペプチドに付加された修飾糖が糖ペプチドに結合している。本発明の重要な特徴は、任意の細胞型により生産されるペプチドを取り、そしてペプチド上にコアグリカン構造を生成し、その後にグリカン構造を生体外で改造して、哺乳動物の治療的使用に適するグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成するように改造することである。より具体的には、結合分子がペプチドに有利な特性を付与するように、本発明に従い修飾された糖分子またはそれに結合した他の化合物を有する糖ペプチド分子を調製することが可能である。本発明により、結合分子のペプチドへの酵素に基づく付加は位置
選択性および立体選択性の利点を有するので、結合分子はペプチドに酵素的に付加される。グリコ共役は、グリコシル化が完結する前あるいは後でペプチド上に付加される。言い換えると、グリココンジュゲーションに対するグリコシル化の順序は、別のところに記すように、変えられる。
従って、本明細書に提供する方法および組成物を使用することにより、ペプチドを改造して好ましくはペプチドに結合した修飾された糖を有する望ましいグリカン構造をペプチドに付与することが可能である。また本発明の方法および組成物を使用することにより、工業的規模で所望する、かつまたは修飾されたグリカン構造を有するペプチド分子を生成することも可能であり、これにより初めて当該技術分野に改善された治療用ペプチドを効率的に生産するための現実的解決を提供する。
【０１３１】
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術でおよび科学的用語は、一般に本発明が属する分野で当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。一般に細胞培養、分子遺伝学、有機化学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションで本明細書で使用する命名法および研究手順は、当該技術分野において周知なものであり、そして普通に使用されている。核酸およびペプチド合成については標準的な技術を使用する。これらの技法および手順は当該技術分野の常法および様々な一般的参考書（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州）に従い一般に行われ、これらはこの文献全体にわたって提供されている。本明細書で使用する命名法および以下に記載する分析化学および有機合成で使用する研究手順は周知で、しかも当該技術分野では普通に使用されているものである。標準技法およびそれらの変法を、化学合成および化学分析に使用する。
【０１３２】
本明細書で使用する冠詞“ａ”および“ａｎ”は１以上（すなわち少なくとも１）の物体の文法的対象を指す。例として“要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）”は１または１より多くの要素を指す。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を称する。抗体は天然な供給源または組換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には四量体の免疫グロブリン分子である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在することができる（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、抗体を使用して：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；Ｈｏｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６）。
【０１３４】
本明細書で使用する用語「合成抗体」は、例えば本明細書に記載するバクテリオファージにより発現される抗体のような組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語は抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により生成された抗体を意味するとも解釈すべきであり、そしてこのＤＮＡ分子は抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能であり、しかも周知な合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技法を使用して既に得られている。
【０１３５】
本明細書で使用する「機能的な」生物学的分子は、特徴とする特性を現す形態の生物学的分子である。例えば機能的酵素は、その酵素の特徴とする特徴的な触媒活性を示すものである。
【０１３６】
本明細書で使用する構造
【０１３７】
【化３９】
0005413548.tif 000015
【０１３８】
は、ペプチド中のアミノ酸あるいはアミノ酸側鎖とグリカン構造との間の連結点である。
【０１３９】
「Ｎ−結合」オリゴ糖は、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によりアスパラギンを介してペプチド骨格に連結しているオリゴ糖である。Ｎ−結合オリゴ糖は「Ｎ−グリカン」とも呼ぶ。すべてのＮ−結合オリゴ糖は共通するＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の五糖コアを有する。それらはＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアル酸のような周辺糖の存在および分岐（アンテナとも呼ぶ）の数が異なる。場合によりこの構造はコアのフコース分子および／またはキシロース分子を含んでもよい。
【０１４０】
「基本的なトリマンノシルコア構造」とは、さらなる糖は結合していないトリマンノシルコア構造のみから構成されるグリカン部分を称する。用語「基本的な」が「トリマンノシルコア構造」の記載に含まれない時、グリカンはグリカンはそれに結合したさらなる糖を持つトリマンノシルコア構造を構成する。場合によりこの構造はコアフコース分子および／またはキシロース分子を含んでもよい。
【０１４１】
用語「基本的なトリマンノシルコア糖ペプチド」は、本明細書では主に基本的なトリマンノシルコア構造から構成されるグリカン構造を有する糖ペプチドを指すために使用する。場合によりこの構造はコアフコース分子および／またはキシロース分子を含んでもよい。
【０１４２】
「Ｏ−結合」オリゴ糖は、トレオニンまたはセリンまたはヒドロキシプロリンまたはチロシンまたはヒドロキシを含有するアミノ酸を介してペプチド骨格に結合したオリゴ糖である。
【０１４３】
本明細書に記載するすべてのオリゴ糖は、非還元サッカリド（すなわちＧａｌ）に関する名前および記号で記載し、次にグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与する還元サッカリドの環の位置（２、３、４、６または８）、そして次に還元サッカリドの名前または記号（すなわちＧｌｃＮＡｃ）を記載する。各サッカリドは好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学命名法に関する総説は、例えば糖生物学の本質（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖａｒｋｉら，編集、１９９９、ＣＳＨＬ出版を参照にされたい。
【０１４４】
用語「シアル酸」は、９−炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意の員を指す。シアル酸ファミリーの最も普通の員は、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノソ−１−ン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略記される）。このファミリーの第２の員は、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｕｅ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーの員は、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら，（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））。また含まれるのは９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ様の９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−置換シアル酸である。シアル酸ファミリーの総説については、例えばＶａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：２５−４０（１９９２）；シアル酸：化学、代謝および機能（Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ、編集（スプリンガーファーラーグ、ニューヨーク（１９９２））を参照にされたい。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年、１０月１日に公開された国際公開第９２／１６６４０号パンフレットに開示されている。
【０１４５】
本明細書で使用する「所望のグリコシル化」を有するペプチドは、ペプチドの効率的な生物学的活性に必要な１以上のオリゴ糖分子を含んでなるペプチドである。
【０１４７】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、そして疾患が改善されなければ、動物の健康状態は悪化し続ける動物の健康状態である。
【０１４８】
患者にペプチド薬剤を投与する内容において、本明細書で使用する「曲線下の面積」または「ＡＵＣ」は、ゼロから無限大の時間の関数として患者の全身循環における薬剤濃度を記載する曲線下の総面積と定義する。
【０１４９】
患者にペプチド薬剤を投与する内容において、本明細書で使用する「半減期」または「ｔ１／２」は、患者の血漿薬剤濃度が半分に減少するために必要な時間と定める。多くの排除（ｃｌｅａｒｅｎｃｅ）メカニズム、再分布および当該技術分野で周知な他のメカニズムに依存して、ペプチド薬剤に関連する１より多くの半減期が存在するかもしれない。通常、アルファ期が再分布に関連し、そしてベータ期が排除に関連するような、アルファおよびベータ半減期が定義されている。しかしタンパク質薬剤については、ほとんどの部分が血流に限定され、少なくとも２つの排除半減期が存在し得る。幾つかのグリコシル化ペプチドに関しては、急速なベータ期排除はマクロファージ上のレセプター、あるいは末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースまたはフコースを認識する内皮細胞を介して媒介される。より遅いベータ期排除は有効半径（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒａｄｉｕｓ）＜２ｎｍ（約６８ｋＤ）の分子については腎臓
の糸球体濾過を介して、および／または組織中の特異的もしくは非特異的取り込みおよび代謝を介して起こり得る。糖ＰＥＧ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は末端糖（例えばガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）をキャップすることができ、そしてこれによりこれらの糖を認識するレセプターを介する急速なアルファ期排除を遮断する。より大きな有効半径を与え、そしてこれにより分布の容量および組織の取り込みを下げ、これにより後期ベータ期を延長することもできる。このようにアルファ期およびベータ期半減期に及ぼす糖ＰＥＧ化の明確な影響は、サイズ、グリコシル化の状態および当該技術分野で周知な他のパラメーターに依存して変動するだろう。「半減期」のさらなる説明は、製薬学的バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、（１９９７，ＤＦＡ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ  ａｎｄ  ＲＤ  Ｓｉｎｄｅｌａｒ、編集、ハウウッド出版、アムステルダム、第１０１−１２０頁）に見いだすことができる。
【０１５０】
患者にペプチド薬剤を投与する内容において、本明細書で使用する用語「滞留時間」とは、薬剤が投薬後に患者の身体に留まる平均時間と定義する。
【０１５１】
「単離された核酸」とは天然に存在する状態でそれを挟む配列、例えばフラグメントに通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメント、例えば天然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントを称する。この用語は、核酸に天然に付随する他の成分、例えば通常は細胞中で付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用する。従って、この用語には、例えばベクターに、自律複製プラスミドまたはウイルスに、または原核または真核生物のゲノムＤＮＡに包含されるか、または他の配列から独立して別個の分子として存在する（ｃＤＮＡまたはゲノムもしくはＰＣＲまたは制限酵素消化により生成されるｃＤＮＡフラグメントのような）組換えＤＮＡを含む。またさらなるペプチド配列をコードするハイブリッド核酸の一部である組換えＤＮＡも含む。
【０１５２】
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖またはパラレルおよび抗−パラレル鎖を意味する。すなわちポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖核酸のいずれかでよい。
【０１５３】
用語「核酸」は典型的には大きなポリヌクレオチドを称する。用語「オリゴヌクレオチド」は典型的には短いポリヌクレオチド、一般には約５０ヌクレオチド未満を指す。
【０１５４】
本明細書では従来の表記法を使用してポリヌクレオチド配列を記載する：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’−末端である；２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’−方向を指す。新生ＲＮＡ転写物に対してヌクレオチドの５’から３’付加の方向は転写方向と称する。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖を「コード鎖」と称し；ＤＮＡ上の参照点に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と称し；ＤＮＡ上の参照点に対して３’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と称する。
【０１５５】
「コードする」とは、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定めた配列、またはアミノ酸の定めた配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として役立つ遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特別な配列に固有の特性を称する。すなわち核酸配列は、その核酸に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系であるタンパク質を生産する場合、そのタンパク質をコードする。両コード鎖は、そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、そして通常は配列表に提供され、そして遺伝子またはｃＤＮＡの転写に鋳型として使用される非コード鎖は、その核酸またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。
【０１５６】
他に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は互いの縮重形物であり、そして同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
【０１５６】
本明細書で使用する「相同的」とは２つの重合性分子の間、例えば２つの核酸分子の間、例えば２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子の間、または２つのペプチド分子の間のサブユニット配列類似性を称する。２つの両分子中のサブユニット位置が同じモノマー性サブユニットに占有されている時、例えば２つの各ＤＮＡ分子の１つの位置がアデニンで占められているならば、それらはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は対合するか、または相同的な位置の数の直接的関数であり、例えば２つの化合物の配列で位置の半分（例えば１０個のサブユニット長のポリマー中の５箇所）が相同的ならば、２つの配列は５０％相同的であり、９０％の位置、例えば１０のうちの９が対合または相同的ならば、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【０１５７】
本明細書で使用するように、「相同性」は「同一性」と同義的に使用する。
【０１５８】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。例えば２つの配列を比較するために有用な数学的アルゴリズムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）におけるように改良されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８）のアルゴリズムである。このアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに包含され、そして例えばホームページのＵＲＬ“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／”を有するナショナル  センター  フォー  バイオテクノロジー  インフォメーション（ＮＣＢＩ）の世界的なウェッブサイトからアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド調査は、以下のパラメーターを使用してＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて行うことができる（ＮＣＢＩウェッブサイトで“ｂｌａｓｔｎ”と命名）：本明細書に記載する核酸に対して相同的なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティー＝５；ギャップエクステンションペナルティー＝２；ミスマッチペナルティー＝３；マッチリワード＝１；期待値＝１０．０；およびワードサイズ＝１１。ＢＬＡＳＴのタンパク質調査は、以下のパラメーターを使用してＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェッブサイトで“ｂｌａｓｔｎ”と命名）またはＮＣＢＩ“ｂｌａｓｔｐ”プログラムを用いて行うことができる：本明細書に記載するタンパク質分子に対して相同的なアミノ酸配列を得るために、期待値＝１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス。比較目的のギャップ
化アライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記載されているように利用することができる。あるいはＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係（Ｉｄ．）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復調査を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ化ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する時、各プログラムのデフォルトパラメーター（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照にされたい。
【０１５９】
２つの配列間の同一性の割合は、ギャップを割り当てるか、または割り当てずに上記の技術に類似する技術を使用して決定することができる。同一性の割合の計算では、多くの場合、正確な対合をカウントする。
【０１６０】
ペプチドをコードする「ヘテロロガスな核酸発現単位」は、プロモーターおよび／また
はリプレッサー配列（ここで少なくとも１つの配列はヘテロロガス、すなわち宿主細胞中
に通常は見いだされない）のような１以上の発現制御配列に操作可能に連結された、問題
のペプチドのコード配列を有する核酸と定義する。
【０１６１】
２つのポリヌクレオチドが「操作可能に連結された」と記載することは、一本鎖または
二本鎖核酸部分が、２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つがその特徴とする生理学的
効果をもう一方に及ぼすことができる様式で、核酸部分内に配列されている２つのポリヌ
クレオチドを含んでなることを意味する。例として核酸のコード領域と操作可能に連結さ
れたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
【０１６２】
本明細書で使用する用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に操
作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある場合ではこの配
列はコアプロモーター配列でよく、そして他の場合ではこの配列は遺伝子産物の発現に必
要なエンハンサー配列および他の調節要素を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、
例えば組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０１６３】
「構成的プロモーターは、それが操作可能に連結された遺伝子の発現を細胞中で一定の
様式で駆動するプロモーターである。例として、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を
駆動するプロモーターは構成的プロモーターである。
【０１６４】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌクレオ
チドに操作可能に連結された時、プロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在す
る時にのみ生きている細胞中で遺伝子産物の生産を実質的に引き起こすヌクレオチド配列
である。
【０１６５】
「組織−特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌ
クレオチドに操作可能に連結された時、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞であ
る時にのみ生きている細胞中で遺伝子産物の生産を実質的に引き起こすヌクレオチド配列
である。
【０１６６】
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなり、そして単離された核酸を細胞の内部へ
送達するために使用することができる物質の組成物である。当該技術分野では数々のベク
ターが知られており、それらには限定するわけではないが線状ポリヌクレオチド、イオン
性または両イオン性化合物を付随するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含
む。このように用語「ベクター」には自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用
語は、例えばポリリシン化合物、リポソーム等のような核酸の細胞への転移を促進する非
−プラスミドおよび非−ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクタ
ーの例には、限定するわけではないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
ター、レトロウイルスベクター等を含む。
【０１６７】
「発現ベクター」は発現されるべきヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御
配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを称する。発現ベクター
は発現に十分なシス−作用要素を含んでなり；発現のための他の要素は宿主細胞またはイ
ンビトロ発現系により供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを包含
するコスミド、プラスミド（例えば裸の、またはリポソームに含まれた）およびウイルス
のような、当該技術分野で既知のこれらすべてを含む。
【０１６８】
「遺伝的に操作された」または「組換え」細胞は、細胞の遺伝的物質に対して１以上の
修飾を有する細胞である。そのような修飾には限定するわけではないが、遺伝的物質の挿
入、遺伝的物質の削除、およびそのような物質が安定に維持さるか、またはされなくても
染色体外の遺伝的物質の挿入に見られる。
【０１６９】
「ペプチド」はオリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質または糖タンパ
ク質である。本明細書における用語「ペプチド」の使用は、糖部分がペプチドに結合して
いる時、ペプチドに結合した糖部分を有するペプチドを含む。
【０１７０】
本明細書で使用する「天然の形態」は、天然に見いだされる、細胞および／または生物
により生産される時のペプチドの形態を意味する。ペプチドが複数の細胞および／または
生物により生産される時、ペプチドは種々の天然な形態を有することができる。
【０１７１】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、そしてアミド結合を介して一緒に連結さ
れているポリマーを称するか、あるいはペプチドと呼ぶ。さらに天然には存在しないアミ
ノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含む。核酸がコー
ドしないアミノ酸も本発明で使用することができる。さらに反応性基、グリコシル化部位
、ポリマー、治療部分、生体分子等を含むように修飾されたアミノ酸も本発明に有用とな
り得る。本発明で使用するすべてのアミノ酸は、そのＤ−またはＬ−同位体のいずれかで
あり得る。Ｌ−同位体が一般に好ましい。さらに他のペプチド模造物も本発明に有用であ
る。本明細書で使用するように、「ペプチド」はグリコシル化および非グリコシル化ペプ
チドの両方を指す。またペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されたペプチ
ドも含む。一般的な総説については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、アミノ酸、ペプチドお
よびタンパク質の化学および生化学（ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ
）、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、
ニューヨーク、第２６７（１９８３）頁を参照にされたい。
【０１７２】
「ペプチド結合物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、ペプチドが本明細書
で説明する修飾された糖を用いて結合されている本発明の種を称する。
【０１７３】
用語「アミノ酸」は、天然に存在する、および合成アミノ酸、ならびに天然に存在する
アミノ酸と同様な様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模造物を称する。天然に
存在するアミノ酸は遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミ
ノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリン
である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学的構造、すなわち
水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホ
モセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを称
する。そのような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペ
プチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミ
ノ酸模造物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するア
ミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。  本明細書で使用するアミノ酸は、以
下の表１に示すように、その完全名により、それらに対応する３文字コードにより、また
はそれらに対応する１文字コードにより表す：
【０１７４】
【表１】
0005413548.tif 000016
【０１７５】
本発明はまた、上で確認されたようなタンパク質を含んでなるタンパク質またはペプチ
ドの類似体も提供する。類似体は保存的アミノ酸配列の差異により、または配列に影響し
ない修飾により、あるいはその両方により天然に存在するタンパク質またはペプチドとは
異なることができる。例えばタンパク質またはペプチドの１次配列は変えるが、通常はそ
の機能を変えない保存的アミノ酸の変化を作成することができる。保存的アミノ酸置換に
は典型的には以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１７６】
修飾（通常は１次配列を変えない）には、  生体外または生体内の、ペプチドの化学的誘導化、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。またグリコシル化の修飾、例えばペプチドの合成およびプロセッシング中、またはさらなるプロセッシング段階でのペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより；例えばペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素に暴露することにより作られるものを含む。またリン酸化アミノ酸残基を有する配列、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンも含む。
【０１７７】
もちろんペプチドは活性に影響を及ぼさずに修飾されるアミノ酸残基を含むことができ
ると考える。例えば末端を誘導化してブロッキング基、すなわち「望ましくない分解」（
この用語は化合物の機能に影響を及ぼすと思われる化合物の末端で任意の種類の酵素的、
化学的または生化学的分解、すなわちその末端での化合物の順次分解を意味する）からＮ
−末端およびＣ−末端を保護し、かつ／または安定化するために適する化学置換基を含む
ことができる。
【０１７８】
ブロッキング基にはペプチドの生体内活性に悪い影響を及ぼさないペプチド化学の分野で従来から使用されている保護基を含む。例えば適当なＮ−末端ブロッキング基は、Ｎ−末端のアルキル化またはアシル化により導入することができる。適当なＮ−末端ブロッキング基の例には、Ｃ１−Ｃ５分岐もしくは非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル基のようなアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ基のようなそれらの置換形を含む。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なＮ−末端ブロッキング基であり、そしてペプチドのＮ−末端にカップリングされるか、またはＮ−末端残基の代わりに使用されるかのいずれかであり得る。適当なＣ−末端ブロッキング基（ここでＣ−末端のカルボキシル基が含まれるか、または含まれない）には、エステル、ケトンまたはアミドを含む。エステルまたはケトン−形成アルキル基、特にメチル、エチルおよびプロピルのような低級アルキル基、および１級アミン（−ＮＨ２）のようなアミド形成アミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基は、Ｃ−末端ブロッキング基の例である。アグマチンのようなデスカルボキシル化アミノ酸類似体も有用なＣ−末端ブロッキング基であり、そしてペプチドのＣ−末端残基にカップリングされるか、またはそれに変えて使用することができる。さらに末端の遊離アミノおよびカルボキシル基はペプチドから一緒に取り出して、ペプチドの活性に影響を及ぼすことなくそれらのデスアミノ
およびデスカルボキシル化形を生じることができると考えられる。
【０１７９】
他の修飾も活性に悪影響を及ぼさずに包含することができ、そしてこのような修飾には
限定するわけではないが天然のＬ−異性体における１以上のアミノ酸をＤ−異性体中のア
ミノ酸に置換することを含む。このようにペプチドは１以上のＤ−アミノ酸残基を含んで
もよく、あるいはすべてがＤ−形のアミノ酸から構成されてもよい。本発明に従いペプチ
ドのレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）形、例えばすべてのアミノ酸が
Ｄ−アミノ酸形に置換されている転化（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ペプチドも企図する。
【０１８０】
本発明の酸付加塩も機能的均等物として企図する。すなわちペプチドの水溶性塩を提供
するために、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸で、あるいは酢酸、プロ
ピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン
酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シンナミン酸、マンデル酸、メタンスルホ
ン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸で処理
した本発明のペプチドは、本発明での使用に適している。
【０１８１】
タンパク質分解的分解に対するペプチドの耐性を改善し、または溶解特性の至適化し、
またはペプチドを治療薬としてより適するようにするために、通常の分子生物学的技術を
使用して修飾されたペプチドも含む。そのようなペプチドの類似体には、天然に存在する
Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または天然には存在しない合成アミノ酸を
含有するものを含む。本発明のペプチドは本明細書に掲載する具体的な例示法の生成物に
限定されない。
【０１８２】
本明細書で使用する用語「ＭＡＬＤＩ」はマトリックス支援レーザー脱離イオン化の略
である。イオン化中、ＳＡ−ＰＥＧ（シアル酸−ポリ（エチレングリコール））は糖タン
パク質のＮ−グリカン構造から部分的に排除され得る。
【０１８３】
本明細書で使用する用語「グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ）」とは、供与体の糖を受容部分（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｉｅｔｙ）に
転移する能力を有する任意の酵素／タンパク質を称する。
【０１８４】
本明細書で使用する用語「修飾された糖（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｕｇｅｒ）」は、本発
明の方法でペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に付加された天然に存在す
る、または天然には存在しない炭水化物を称する。修飾された糖は限定するわけではない
が糖ヌクレオチド（モノ−、ジ−およびトリ−ホスフェート）、活性化糖（例えばグリコ
シルハライド、グリコシルメシラート）および活性化もされず、ヌクレオチドでもない糖
を含む多数の酵素基質から選択される。
【０１８５】
「修飾された糖」は「修飾基（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」を用いて共有的に
官能化される。有用な修飾基には限定するわけではないが、水溶性ポリマー、治療部分、
診断部分、生体分子等を含む。修飾基での官能化の位置は、「修飾された糖」がペプチド
に酵素的に加えられることを妨げないように選択される。
【０１８６】
用語「水溶性（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」とは水中で幾らかの検出可能な溶解度
を有する部分を称する。水溶性を検出し、かつ／または定量するための方法は当該技術分
野では周知である。例として水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカリド、ポリ（エーテ
ル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）等を含む。ペプチドは混合配列を有するか、
または単一アミノ酸からなる（例えばポリ（リシン））ことができる。同様にサッカリド
は混合配列であるか、または単一サッカリドサブユニット（例えばデキストラン、アミロ
ース、キトサンおよびポリ（シアル酸））からなることができる。ポリ（エーテル）の例
はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）はポリアミンの例であり
、そしてポリ（アスパラギン）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。
【０１８７】
「ポリ（アルキレンオキサイド）」は、ポリエーテル主鎖を持つ化合物類である。この発明で使用するポリ（アルキレンオキサイド）は、例えば、直鎖のものおよび枝分かれしたものが含まれている。更に、代表的なポリ（アルキレンオキサイド）は、1個あるいはそれより多くの反応性の基または活性化可能な基または不活性な基が端になり得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）は、エチレンオキサイドが繰り返しのサブユニットとなるポリ（アルキレンオキサイド）である。これはいずれかの端で、付加的な反応性の基または活性化可能な基または不活性な基を含むかもしれないし、含まないかもしれない有効なポリ（アルキレンオキサイド）は、１つの端が不活性基で“覆われている”ものが含まれている。例えば、モノメトキシ−ポリ（アルキレンオキサイド）である。分子が枝分かれしたものであれば、アルキレンオキサイドの端で、複数の反応性の基または活性化可能な基または不活性な基をもつ可能性がある。その反応性の基は同じであるかもしれないし、異なるかもしれない。ヘテロ２官能性である直鎖条ポリ（アルキレンオキサイド）の誘導体は、技術的にも知られている
【０１８８】
本明細書で使用する用語「グリコシル連結基（ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇ
ｒｏｕｐ）」とは、作用物質（例えば水溶性ポリマー、治療部分、生体分子）が共有結合
するグリコシル残基を指す。本発明の方法において「グリコシル連結基」は、グリコシル
化または非グリコシル化ペプチドに共有結合するようになり、これにより作用物質をペプ
チド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に連結する。「グリコシル連結基」は、
一般に「修飾された糖」をペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に酵素的
に結合することにより、「修飾された糖」に由来する。もっと厳密に言うと、ここで使われている「グリコシル連結基」とは、ここで議論されるように「修飾基」とペプチドのアミノ酸残基とを共有結合的に結ぶ部分である。グリコシル連結基−修飾基付加体は、酵素に対する基質の構造を持つ。グリコシル連結基−修飾基付加体が基質である酵素は一般に、サッカリル（ｓａｃｃｈａｒｙｌ）の部分をペプチドのアミノ酸残基へと変換できるものである。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、アミダ−ゼ、グリコシダ−ゼ、トランスーシアリダーゼなど。グリコシル連結基は、修飾基とペプチドのアミノ酸残基との間に入っていて共有結合的に両者を結んでいる。
【０１８９】
「完全なグリコシル連結基」はグリコシル部分に由来する連結基を称し、ここで結合物を連結する個々のサッカリドモノマーは分解、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化されない。本発明の「完全なグリコシル連結基」はグリコシル単位（１つまたは複数）の付加により、または元のサッカリド構造から１以上のグリコシル単位の除去により天然に存在するオリゴ糖に由来することができる。
【０１９０】
模範的な「完全なグリコシル連結基」は、少なくとも1つの完全な、例えば、分解していない、ペプチド上のアミノ酸残基に共有的に付いているサッカリル部分を含んでいる。「連結基」の残りの部分は、実質的にどのような構造をも持つことが出来る。例えば、修飾基は、状況によっては、完全なサッカリル部分に直接結び付いている。また別の状況では、修飾基は、連結アーム（リンカーアーム：ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍ）を経由して完全なサッカリル部分に結ばれている。連結アームは、実質的に、選択された実施例において有効であるように決められた如何なる構造をも持ち得る。模範的な実施例では、連結アームは、１つまたはそれ以上の完全サッカリル部分である。すなわち、「完全なグリコシル連結基」は、オリゴ糖に似ている。もう一つの模範的な完全グリコシル連結基は、直接的にあるいは間接的に、完全サッカリル部分に付いたサッカリル部分が分解されたり、誘導体化されたものである。（例えば、還元的アミノ化に引き続いて起こる過ヨウ素酸塩 酸化）。なお更なる連結アームとしては、この明細書に記したものあるいはそれらの類似のもののような、架橋剤を経由して、直接あるいは間接的に、完全サッカリル部分に付けられた修飾基が含まれる。
【０１９１】
ここで使われる“分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）”は、１つまたはそれより多くの炭素原子がサッカリル部分から外れることである。
【０１９２】
本明細書で使用する用語「標的部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）」および「
標的剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、身体の特定の組織または領域に選択的
に局在化する種を称する。局在化は分子決定基の特異的認識、標的剤または結合物の分子
サイズ、イオン的相互作用、疎水的相互作用等により媒介される。作用物質を特定の組織
または領域に標的化する他のメカニズムは、当業者により知られている。
【０１９３】
本明細書で使用する「治療部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）」は、治療
に有用な任意の作用物質を意味し、それらには限定するわけではないが抗生物質、抗−炎
症剤、抗−腫瘍剤、サイトトキシンおよび放射性剤を含む。「治療部分」には生物活性剤
（１より多くの治療部分が担体に結合連結している構築物、例えば多機能剤（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｇｅｎｔ））のプロドラッグを含む。治療部分はペプチドおよびペプチドを含む構築物も含む。例示ペプチドには図１２８および本明細書中の表５６および表６７に開示されているものを含む。
【０１９４】
“治療部分”とは、従って、含まれる治療に有効な如何なる医薬品を意味するもので、抗生物質、抗炎症薬、抗癌剤、細胞毒素、放射性薬品に限るものではない。“治療部分”は、生物活性医薬品のプロドラッグを含み、１つより多くの 治療部分がキャリヤーに結び付けられているものである（例えば、多価の医薬品）。
【０１９５】
本明細書で使用する「抗−腫瘍剤」とはガンを克服するために有用な任意の作用物質を
意味し、限定するわけではないがサイトトキシンおよび代謝拮抗物質、アルキル化剤、ア
ンスラサイクリン、抗生物質、抗有糸分裂剤、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アス
パラギナーゼ、コルチコステロイド、インターフェロンおよび放射性剤のような作用物質
を含む。また用語「抗腫瘍剤」の範囲内に包含されるのは、ペプチドと−腫瘍活性、例え
ばＴＮＦ−αとの結合物である。結合物は限定するわけではないが、治療用タンパク質と
本発明の糖タンパク質との間で形成されるものを含む。代表的な結合物は、ＰＳＧＬ−１
とＴＮＦ−αとの間で形成される結合物である。
【０１９６】
本明細書で使用する「サイトトキシンまたは細胞傷害剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅ
ｎｔ）」は、細胞に有害な任意の作用物質を意味する。例にはタキソール、サイトカラシ
ンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノル
ビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチ
ノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラ
カイン、リドカイン、プロプラノルオールおよびピューロマイシンおよびそれらの類似体
または相同体を含む。他のトキシンには例えばリシン、ＣＣ−１０６５および類似体、ヅ
オカルマイシンを含む。さらに別のトキシンにはジフテリアトキシンおよび蛇毒（例えば
コブラ毒）を含む。
【０１９７】
本明細書で使用するように、「放射性剤」には腫瘍を診断し、または破壊するために効
果的な任意の放射性同位体を含む。例には限定するわけではないが、インジウム−１１１
、コバルト−６０およびテクネチウムを含む。さらにウラン、ラジウムおよびトリウムの
ような天然に存在する放射性同位体元素（これらは典型的には放射性同位体の混合物を表
す）は、放射性剤の適切な例である。金属イオンは典型的には有機錯化部分で錯化される
。
【０１９８】
多くの有用な錯化基、クラウンエーテル、クリプタンド等が当該技術分野では知られて
おり、そして本発明の化合物に包含することができる（例えばＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯ
ＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等、およびＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ等のようなそ
れらのホスホネート類似体）。例えばＰｉｔｔら、「鉄過剰負荷の処置のための錯化剤の設計（Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｒｏｎ  Ｏｖｅｒｌｏａｄ）」、生物学および医学における無機化学（ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ）で；Ｍａｒｔｅｌｌ編集；アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９８０、第２７９〜３１２頁；Ｌｉｎｄｏｙ、大環リガンド錯体の化学（ＴＨＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ  ＬＩＧＡＮＤ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）；ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、１９８９；Ｄｕｇａｓ、生物有機化学（ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）；スプリンガー−ファーラーク、ニューヨーク、１９８９、およびそれらの中に含まれている参考文献を参照にされたい。
【０１９９】
さらに錯化剤、クラウンエーテルおよびシクロデキストリンを他の分子に付ける多数の
経路を当業者は利用することができる。例えばＭｅａｒｅｓら「生体内のキレート−標識タンパク質およびポリペプチドの性質（Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、タンパク質の修飾：食品、栄養および薬理学的観点（ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ）」で、Ｆｅｅｎｅｙら、アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９８２、第３７０〜３８７頁；Ｋａｓｉｎａら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９：１０８−１１７（１９８８）；Ｓｏｎｇら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８：２４９−２５５（１９９７）を参照にされたい。
【０２００】
本明細書で使用するところの「製薬学的に許容され得る担体」には、結合物と合わせた
時に結合物活性の活性を保持し、そして個体の免疫系とは非反応性の任意の物質を含む。
例には限定するわけではないが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水型乳液のような乳
液、および様々な種類の湿潤剤のような標準的な製薬学的担体を含む。他の担体には、滅
菌溶液、コート錠剤を含む錠剤およびカプセルを含んでもよい。典型的にはそのような担
体は澱粉、ミルク、糖、ある種のクレー、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステア
リン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物油脂または油、ガム、グリコールの
ような賦形剤、または他の既知の賦形剤を含む。そのような担体はまた、香料および着色
用添加剤もしくは他の材料を含んでもよい。そのような担体を含んでなる組成物は、周知な常法により配合される。
【０２０１】
本明細書で使用するように、「投与する」とは個体への経口投与、座薬としての投与、
局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）、鼻内もしくは皮下投与、鞘内投与、または緩効性デバイス（例えばミニ−浸透圧ポンプ）の移植を意味する。
【０２０２】
用語「単離された」とは、物質を生産するために使用する成分を実質的または本質的に
含まない物質を称する。本発明のペプチド結合物について、用語「単離された」とはペプ
チド結合物を調製するために使用する混合物中の物質を通常付随する成分を実質的または
本質的に含まない物質を称する。「単離された」および「純粋な」とは互換的に使用する
。典型的には本発明の単離されたペプチド結合物は好ましくは範囲として表される純度の
レベルを有する。ペプチド結合物に関する純度範囲の下限は約６０％、約７０％または約
８０％であり、そして純度範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％よ
り高い。
【０２０３】
ペプチド結合物が約９０％より高い純度である時、それらの純度も好ましくは範囲で表
される。純度範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％であ
る。純度範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％である
。
【０２０４】
純度は技術的に認識されている分析法（例えば銀染色ゲル上のバンドの強度、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣまたは類似の手段）により決定される。
【０２０５】
この明細書で使われる“市販のスケール”というのは、その方法で作られる約１ｇ以上の最終生成物を意味する。
【０２０６】
本明細書で使用する「群の本質的な各員」とは、ペプチドに付加される選択された割合
の修飾された糖が、ペプチド上の多数の同一な受容体部位（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｔｅ
）に付加されている、本発明のペプチド結合物群の特徴を説明する。「群の本質的な各員
」は、修飾された糖に対するペプチド結合物上の部位の「均一性」にも言及しており、そ
して少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なく
とも約９５％均一である本発明の結合物を称する。
【０２０７】
「均一性」とは、修飾された糖が結合する受容体部分の群全域の構造的一貫性を称する
。すなわち各修飾された糖が、それぞれ他の修飾された糖が結合する受容体部位と同じ構
造を有する受容体部位に結合している本発明のペプチド結合物では、ペプチド結合物は約
１００％均一であると言える。均一性は典型的には範囲で表される。ペプチド結合物につ
いて均一性の範囲の下限は約６０％、約７０％または約８０％であり、そして純度範囲の
上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％より高い。
【０２０８】
ペプチド結合物が約９０％以上均一である時、それらの均一性も好ましくは範囲で表さ
れる。均一性の範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４、約９６％または約９８％であ
る。純度範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均一
性である。ペプチド結合物の純度は典型的には当業者に既知の１以上の方法、例えば液体
クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、飛行スペクトロメトリーのマトリックス
支援レーザー脱離飛行時間質量時間分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動等により決定される。
【０２０９】
糖ペプチド種に関して言う時、「実質的に単一なグリコフォーム（ｓｕｂｓｔａｎｔｉ
ａｌｌｙ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」または「実質的に単一なグリコシル
化パターン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）」とは、問題のグリコシル
トランスフェラーゼ（例えばフコシルトランスフェラーゼ）によりグリコシル化される受
容体部分の割合を指す。例えばα１，２−フコシルトランスフェラーゼの場合では、実質
的にすべての（以下に定義するように）Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシ
アリル化類似体が本発明のペプチド結合物中でフコシル化される場合、実質的に単一なフ
コシル化パターンが存在する。当業者は出発原料がグリコシル化受容体部分（例えばフコ
シル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含んでもよいと理解するだろう。すな
わち計算されるグリコシル化の割合は、本発明の方法によりグリコシル化される受容体部
分、ならびに出発原料中ですでにフコシル化された受容体部分を含む。
【０２１０】
「実質的に単一」の上記定義において用語「実質的に」とは、一般に特定のグリコシル
トランスフェラーゼについて少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８
０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらに好ましくは少なくとも約９５％
の受容体部分がグリコシル化されることを意味する。
【０２１１】
Ｉ．グリカン鎖の改造するための方法
本発明は、好ましくは修飾された糖をペプチドに付加することを含む特別にカスタマイ
ズされた、または所望のグリコシル化パターンを有するペプチド分子を提供するような様
式で、糖ペプチド分子へ、またはそれから糖を生体外で付加および／または削除するための方法および組成物を含む。したがって本発明の重要な特徴は、任意の細胞型により生産されるペプチドを取り、そしてペプチド上にコアグリカン構造を生成し、その後にグリカン構造を生体外で改造して哺乳動物における治療的使用に適するグリコシル化パターンを有するペプチドを生成することである。
【０２１２】
ペプチドのグリコシル化パターンの重要性は、正しくグリコシル化されたペプチドを生
産するための現在の生体内法の、特にこれらのペプチドが組換えＤＮＡの方法論を使用して生産される時の限界から当該技術分野では周知である。さらに本発明まで、ペプチドは工業的規模で生産できるが、ペプチド上に所望のグリカン構造を有する糖ペプチドを生成することは可能でなかった。
【０２１３】
本発明では、本明細書のいたるところで記載するような「所望のグリコシル化」を有す
る糖ペプチドを提供する様式で、ペプチド上に存在すべきではない糖部分が除去され、そ
してペプチドに付加されるべき、場合により修飾された糖を含む糖部分が付加されるよう
に、細胞により生産されるペプチドが適当な酵素およびその基質の体系的付加により生体外で酵素的に処理される。
【０２１４】
Ａ．Ｎ−連結グリカンを改造する方法
１つの観点では、本発明は商業的または製薬学的に興味深いほとんどのペプチドが本明
細書でトリマンノシルコア（ｔｒｉｍａｎｎｏｓｙｌ  ｃｏｒｅ）と呼ぶ共通する５個の
糖構造を含んでなり、これはペプチド鎖上の配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒでアスパラ
ギンにＮ−結合しているという事実を利用する。基本的なトリマンノシルコアは本質的に
ペプチドに結合した２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基および３個の
マンノース（Ｍａｎ）残基からなり、すなわちこれは場合によりフコース残基を含むこと
ができる場合を除き、このような５個の糖残基を含んでなり、そしてさらなる糖は含まな
い。第１ＧｌｃＮＡｃはアスパラギンのアミド基に結合し、そして第２のＧｌｃＮＡｃは
β１，４−結合を介して第１に結合している。マンノース残基はβ１，４−結合を介して
第２のＧｌｃＮＡｃに結合し、そして２個のマンノース残基がそれぞれα１，３およびα
１，６結合を介してこのマンノースに結合している。トリマンノシルコア構造の図解的説
明は図２１、左側に示す。ほとんどのペプチド上のグリカン構造はトリマンノシルコアに加えて他の糖を含んでなるのが通例であるが、トリマンノシルコア構造は哺乳動物のペプチド上のＮ−結合グリカンの本質的特徴を表す。
【０２１５】
本発明は、ペプチド上にグリカン分子の構造の基本的要素としてトリマンノシルコア構
造を有するペプチドの生成を含む。系がそれ自体天然に存在するものであるか、あるいは
それらは組換えＤＮＡ法を含むかどうかにかかわらず、ペプチドを生産するために使用す
る種々の細胞系を考慮して、本発明は任意の細胞型で生産されるペプチド上のグリカン分
子が基本的なトリマンノシルコア構造に減少できる方法を提供する。いったん基本的なト
リマンノシルコア構造を生成したら、次いで本明細書に記載する方法を使用して、ペプチ
ドにペプチドの治療的効果を強化する１以上の特性を付与するペプチド上の所望するグリ
カン構造をインビトロでペプチドに生成することが可能である。
【０２１６】
本明細書に記載する考察から、用語「トリマンノシルコア」は図２１、左側に示すグリカン構造を記載するために使用することは明らかなはずである。トリマンノシルコア構造
有する糖ペプチドは、それらに加えられたさらなる糖を有してもよく、そしてほとんどの
部分について、糖が所望するグリカン構造を有するペプチドを生じるかどうかには無関係
に、それに加えられたさらなる構造を有する。用語「基本的なトリマンノシルコア構造」
は、本明細書中のいたるところで定義している。用語「要素」が「トリマンノシルコア構
造」の記載には含まれない時、グリカンはさらにそれにマンノース糖に付いた糖を含むトリマンノシルコア構造を含んでなる。
【０２１７】
用語「基本的なトリマンノシルコア糖ペプチド」は、本明細書では主に基本的なトリマ
ンノシルコア構造を含んでなるグリカン構造を有する糖ペプチドを指すために使用する。
しかし場合によりそれに結合したフコース残基を含んでもよい。本明細書に記載するよう
に、基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドは１つの最適例であり、したがって本発明の
グリカン改造方法の好適な出発原料である。
【０２１８】
本発明のグリカン改造方法の別の最適な出発原料は、１または２個のさらなるＧｌｃＮ
Ａｃ残基が各α１，３およびα１，６−マンノース残基に加えられたトリマンノシルコア
を有するグリカン構造である（例えば図３２の第２行の、図の左から２番目の構造を参照にされたい）。この構造は本明細書では「Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４」と呼ぶ。単一アンテナである時、ここでの構造は、“Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３”である。場合により、この構造はコアフコース分子を含んでもよい。いったんＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３あるいはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造が生成したら、本明細書に記載する方法を使用してペプチドの治療的効果を強化する１以上の特性を糖ペプチド上に付与する所望のグリカン構造を糖ペプチド上に生体外で生成することが可能である。
【０２１９】
それらの天然の形態では、本発明のＮ−連結糖ペプチド、そして特に本発明に有用な哺
乳動物およびヒトの糖ペプチドは、トリマンノシルコア構造およびそれに結合した１以上
の糖を用いてＮ−連結グリコシル化される。
【０２２０】
用語「糖ペプチド」および「糖ポリペプチド」は本明細書では同義的に使用し、そして
ペプチドに結合した糖部分を有するペプチド鎖を指す。本明細書では小さい糖ポリペプチ
ドまたは糖ペプチドを、大きな糖ポリペプチドまたは糖ペプチドから区別する識別は行わ
ない。すなわち大変わずかなアミノ酸をそれらのペプチド鎖中に有するホルモン分子（例
えばしばしばわずか３アミノ酸）および他の大変大きなペプチドも、それらが結合した糖
部分を有するならば総称用語「糖ポリペプチド」および「糖ペプチド」に含める。しかし
用語「ペプチド」の使用はペプチドが糖ペプチドであることを除外しない。
【０２２１】
所望のグリコシル化を有するＮ−連結糖ペプチドの例は、それに結合した少なくとも１
つのＧｌｃＮＡｃ残基を含むトリマンノシルコアを有するＮ−連結グリカンを有するペプ
チドである。この残基はＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ−Ｉ
）を使用してトリマンノシルコアに加えられる。第２のＧｌｃＮＡｃ残基を加える場合、
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）を使用する。場合
によりさらなるＧｌｃＮＡｃ残基をＧｎＴ−ＩＶおよび／またはＧｎＴ−Ｖを用いて加え
てもよく、そして第３のバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃ残基をＮ
−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を使用してトリ
マンノシルコアのβ１，４マンノースに結合することができる。場合により、この構造は
、ガラクトース残基を各非−バイセクティングＧｌｃＮＡｃに加えるためにβ１，４ガラ
クトシルトランスフェラーゼを用いて処理することにより延長してもよく、そしてさらに
場合により、α２，３またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼ酵素を使用して、シ
アル酸残基を各ガラクトース残基に加えてもよい。バイセクティングＧｌｃＮＡｃをグリ
カンに付加することは、引き続きガラクトースおよびシアル酸残基の付加に必要ではない
；しかしラットおよびヒトＧｎＴ−ＩＩＩ酵素の基質親和性に関して、グリカン上の１以
上のガラクトース残基の存在は、ガラクトースを含むグリカンがこれらＧｎＴ−ＩＩＩ形
の基質ではないのでバイセクティングＧｌｃＮＡｃの付加を防止する。このようにバイセ
クティングＧｌｃＮＡｃの存在が望まれ、そしてこのような形のＧｎＴ−ＩＩＩを使用す
る場合、グリカンはバイセクティングＧｌｃＮＡｃの付加前に除去されるさらなるガラク
トースおよび／またはシアル酸残基を含べきであることが重要である。他のＧｎＴ−ＩＩ
Ｉ形はそれらの活性にこの特異的な基質の順序を必要としない。より好ましい反応では、ＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩとＧｎＴ−ＩＩＩの混合物を反応混合物に加えるので、ＧｌｃＮＡｃ残基は任意の順序で付加され得る。
【０２２２】
「所望のグリコシル化」を有するペプチドの種々の観点を表すグリカン構造の例は、本
明細書に提供する図面に示す。「所望のグリコシル化」を有するペプチドの生体外生成に関する正確な手順は、本明細書のいたるところに記載する。しかし本発明は本明細書に開示する任意の１つのグリカン構造のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ本発明は本明細書に提供する方法論を使用して作成され得るありとあらゆるグリカン構造を含むと解釈すべきである。
【０２２３】
場合により、基本的なトリマンノシルコア構造のみがペプチドの所望するグリコシル化
を構成するかもしれない。例えば唯一のトリマンノシルコアを有するペプチドは、ゴーシェ病に関与するゴーシェ病を治療するために使われる酵素の有効な成分であることが示された（Ｍｉｓｔｒｙら，１９６６，Ｌａｎｃｅｔ３４８：１５５５−１５５９；Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈら，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：３４４−３４９）。
【０２２４】
本発明に従い、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成するために以下の手順が明
らかとなる。
ａ）共通する特徴としてトリマンノシルコア構造およびそれに結合した１以上の糖の少な
くとも１以上の異種または均一な混合物を有する１以上のグリカン分子を有する糖ペプチ
ドから始めて、唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコア構造を有するか、
または唯一のグリカン構造としてＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４を有する糖ペプチドの比率を上げることが可能である。これはグリカン構造の糖の異種または均一混合物が基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造に減少するまで、それを開裂する適当数の酵素を適当な順序で糖ペプチドに体系的に加えることにより生体外で達成される。どのようにこれがなされるかの具体例は、ペプチドが生産される細胞型、それゆえに細胞により最初に生産されたペプチド上に存在するグリカン構造（１つまたは複数）の複雑さの程度を含む種々の因子に大部分が依存する。どのように複雑なグリカン構造が基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造に減少できるかを図３２に提示し、そして本明細書のいたるところで詳細に記載する。
【０２２５】
ｂ）細胞のグリコシル化機構が唯一のグリカン構造としてペプチド上に基本的なトリマン
ノシルコア構造を有するペプチドを生産する、天然に存在する細胞を単離することにより
、そのようなペプチドを生成することが可能である。次に選択したペプチドが唯一のグリ
カン構造としてペプチド上に基本的なトリマンノシルコア構造を有するように、選択する
ペプチドをコードするＤＮＡを、ＤＮＡが転写、翻訳、そしてグリコシル化される細胞に
トランスフェクトする。例えば機能的ＧｎＴ−Ｉ酵素を欠く細胞は数種の糖ペプチドを生
産するだろう。場合によってはこれらはトリマンノシルコアに結合したさらなる糖を伴わ
ない糖ペプチドとなることもある。しかし別の場合では、生産されるペプチドはトリマン
ノシルコアに結合した２つのさらなるマンノース残基を有することができ、Ｍａｎ５グリ
カンを生じる。これも本発明の改造方法に望ましい出発原料である。そのようなグリカン
構造の生成の具体例を本明細書に記載する。
【０２２６】
ｃ）あるいはペプチド上に唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコアまたは
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するペプチドが生産されるように、特異的なグリコシル化機構を付与するために細胞を遺伝的に工作することが可能である。選択したペプチドが基本的なトリマンノシルコア構造のみを含んでなる増加した数のグリカンを有するように、選択したペプチドをコードするＤＮＡを、ＤＮＡが転写、翻訳、そしてグリコシル化される細胞にトランスフェクトする。例えばＧｎＴ−Ｉを欠くように遺伝的に工作されたある種の細胞は、基本的なトリマンノシルコア構造を有するグリカンを生産するか、あるいは細胞に依存して、結合した２つのさらなるマンノース残基が加えられたトリマンノシルコアを有するグリカン（Ｍａｎ５）を生産することができる。細胞がＭａｎ５グリカン構造を生産する時、細胞は２つのさらなるマンノース残基を開裂してトリマンノシルコアを生成するマンノシダーゼ３を発現するようにさらに遺伝的に工作されることができる。あるいはこのＭａｎ５グリカンは生体外でマンノシダーゼ３とインキューベーションして同じ効果を有することが可能である。
【０２２７】
ｄ）ペプチドが昆虫細胞で発現される時、ペプチド上のグリカンは部分的に複合鎖を形成する。昆虫細胞はまた、細胞中でヘキソサミニダーゼを発現する。そしてそれは、部分的複合鎖を、ここで記述するような改造が出来るトりマンノシルコアまで切り整える。
ｅ）ｂ）および，ｃ）およびｄ）での考察から、細胞は基本的なトリマンノシルコアまたはそれに結合したＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するペプチドのみを生産する必要はないことが容易に明らかである。むしろｂ）およびｃ）で記載した細胞が１００％の基本的なトリマンノシルコア構造（すなわち、それに結合したさらなる糖を持たない）、あるいは１００％のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するペプチドを生産しなければ、細胞は実際には唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコア構造、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を、それに結合したさらなる糖を有するこれらの構造に加えて組み合わせて有するペプチドの異種の混合物を生産する。結合したさらなる糖を有するトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するペプチドの比率は、１つの構造を有するペプチドの比率とは反対に、それらを生産する細胞に依存して変動するだろう。グリカンの複雑さ（すなわちトリマンノシルコアにどの糖がどれくらい結合しているか）も、それらを生産する細胞に依存して変動するだろう。
【０２２８】
ｆ）いったん基本的なトリマンノシルコアまたは１または２個のＧｌｃＮＡｃ残基がそれ
に結合したトリマンノシルコアを有する糖ペプチドが上記のａ）、ｂ）またはｃ）に従い
生産されれば、本発明に従い、さらなる糖分子をインビトロでトリマンノシルコア構造に
加えて、所望のグリコシル化を有するペプチド（すなわち、生体外でカスタマイズされたグリカン構造を有するペプチド）を生成する。
【０２２９】
ｇ）しかしすべてではないが幾らかの所望する糖を結合して含む基本的なトリマンノシル
コアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するペプチドが生産される場合の時は、グリ
カン構造を基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造に減少するこ
となく、残りの所望の糖を付加することのみが必要である。したがって場合により、さら
なる糖を結合したトリマンノシルコア構造を有するグリカン構造を有するペプチドは、改
造の適当な出発原料である。
【０２３０】
基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドの単離
本発明の基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４糖ペプチドは、必要ならばペプチド精製の分野で周知な技術を使用して単離し、そして精製することができる。適当な技術にはクロマトグラフィー技法、等電点電気泳動技法、超遠心技法等を含む。そのような任意の技法を使用して、本発明の組成物を調製することができ、ここで本発明の糖ペプチドは通常、細胞培養基内に見いだされる他のペプチドおよび他の成分から単離されている。精製の程度は例えば他のペプチドに関して９０％または９５％、あるいは一層高い、例えば９８％となり得る。例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（編集、１９９０、ペプチド精製に対する手引き（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、サンディエゴ）を参照にされたい。
【０２３１】
従来技術の方法により生産された糖ペプチド中に存在するＮ−連結グリカンの異質性は
通常、所望の糖ペプチドを生産するために修飾することができる少ない割合の標的糖ペプ
チドを単離することを可能にするだけである。本発明では、大量の基本的なトリマンノシ
ルコア糖ペプチドおよびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４グリカンを含む他の所望する糖ペプチドを生産することができ、次いでこれらはさらに修飾されて所望するグリコシル化を有する大量のペプチドを生成することができる。
【０２３２】
ペプチドに結合連結した特定の型のグリカンの特異的濃縮は、所望のグリカンに親和性を有するレクチンを使用して達成することができる。そのような技術は糖生物学の分野では周知である。
【０２３３】
以下により詳細に記載する本発明の重要な特徴は、いったんペプチド上にコアグリカン
構造が生成されれば、次いでこのグリカン構造は哺乳動物において改善された治療的使用
を有する望ましいグリコシル化を有するペプチドを生成するために生体外で改造されることである。哺乳動物は任意の適当な種でよく、そして好ましくはヒトである。
【０２３４】
所望のグリコシル化を持つペプチドを調製するのための種々のシナリオおよび正確な方
法および組成物が、以下の開示から明らかになるだろう。
【０２３５】
哺乳動物で治療に使用するためのペプチド生産の最終的な目的は、ペプチドがペプチド
の治療的利益を無効にするというよりは促進するグリカン構造を含んでなるべきであると
いうことである。本明細書を通して開示するように、細胞中で生産されるペプチドは、所
望のグリコシル化を有し、こうして哺乳動物での治療的使用に適するペプチドが生成する
ように、グリカン上に存在すべきではない糖の開裂およびグリカン上に存在すべき糖の付
加を触媒する種々の酵素を用いて、生体外で処理されることができる。細胞中でペプチドの種々のグリコ形の生成は、上に記載する。所望するグリコシル化を有するペプチド生成の様々なメカニズムをこれから記載し、ここで出発原料、すなわち細胞により生産されるペプチドは細胞型毎に異なってもよい。本開示から明らかになるように、出発原料はそのグリカン組成に関して単一である必要はない。しかし出発原料は、大量の最終産物、すなわち正しくグリコシル化されたペプチドが生産されるために、ある一定のグリコ形について豊富にすることが好ましい。
【０２３６】
本発明に従い好適な態様では、所望のグリコシル化を有するペプチドをもたらす分解お
よび合成反応（ｅｖｅｎｔ）には、ある点で基本的なトリマンノシルコア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造をペプチド上に生成することを含む。
【０２３７】
本発明はペプチドに１以上の選択したグリコシル残基を加える手段も提供し、その後に
修飾した糖をペプチドの少なくとも１つの選択したグリコシル残基に結合させる。本態様
は例えば、修飾された糖を、ペプチド上には存在しないか、または望ましい量で存在しな
いいずれかの選択したグリコシル残基に結合させることが望ましい時に有用である。この
ように修飾された糖をペプチドにカップリングさせる前に、選択したグリコシル残基を酵
素または化学的カップリングによりペプチドに結合させる。別の態様ではペプチドのグリ
コシル化パターンは、ペプチドから炭水化物残基を除去することにより修飾された糖の結
合前に改変させる。例えば国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照にされたい
。
【０２３８】
ペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の付加または除去は、化学的にまたは酵素的
に行う。化学的な脱グリコシル化は好ましくはペプチド変異体を化合物であるトリフルオ
ロメタンスルホン酸または均等な化合物に暴露することにより行われる。この処理は連結
糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどすべ
ての糖の開裂をもたらすと同時に、ペプチドは完全なままである。化学的な脱グリコシル
化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら／．１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１に記載されている。ペプチド変異体上の炭水化物部分の酵素的開裂は、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載されているように行うことができる。
【０２３９】
グリコシル部分の化学的付加は、任意の技術的に認識されている方法により行う。糖部
分の酵素的付加は好ましくは本明細書に説明する方法の変法を使用して行い、天然のグリ
コシル単位を本発明で使用する修飾された糖に置換する。糖部分を付加する他の方法は、
米国特許第５，８７６，９８０号、同第６，０３０，８１５号、同第５．７２８，５５４
号および同第５，９２２，５７７号明細書に開示されている。
【０２４０】
選択されたグリコシル残基の結合点の例には、限定するわけではないが：（ａ）Ｎ−お
よびＯ−結合グリコシル化の部位；（ｂ）グリコシルスランスフェラーゼの受容体である
末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離カ
ルボキシル基；（ｅ）システインのもののような遊離スルフヒドリル基；（ｆ）セリン、
トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基；（ｇ）フェニ
ルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもののような芳香族残基；あるいは（ｈ）
グルタミンのアミド基を含む。本発明での使用法の例は、１９８７年９月１１日に公開さ
れた国際公開第８７／０５３３０号パンフレットおよびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔ
ｏｎ  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０２４１】
本明細書で提供する幾つかの図面に示す例を特に扱って、ペプチド上に所望のグリカン
を生産するための生体外酵素反応の順序に関する説明をこれから与える。以下に開示する各酵素転換の正確な反応条件は糖生物学の当業者には周知であり、故にここでは繰り返さない。このような種類の反応に関する反応条件の総説は、Ｓａｄｌｅｒら，１９８２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ８３：４５８−５１４およびそれに引用されている文献を参照にされたい。
【０２４２】
図１では、左側に基本的なトリマンノシルコアグリカンの構造を示す。この構造は、基本的なトリマンノシルコア構造をＧｎＴ−Ｉ、続いてＧｎＴ−ＩＩ、そしてさらにＧｎＴ−ＩＩＩ、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含んでなる糖供与体の存在下でインキューベーションすることにより、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する完全なグリカン構造に転
換することが可能であり、ここでＧｌｃＮＡｃは順次、基本的なトリマンノシルコア構造
に付加されてバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するトリマンノシルコアを生成する。例えば、ここに記述するＦｃグリカンを改造する幾つかの例では、ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、ＧｎＴ−ＩＩＩを加える順序は、文献に報告されたものと反しているかも知れない。
バイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造は、ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、ＧｎＴ−ＩＩＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの混合物を反応混合物に加えることによって作り出される。
【０２４３】
図３では、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを含むトリマンノシルコアグリカンの、ガラ
クトースおよびＮ−アセチルノイラミン酸を含んでなる複雑なグリカン構造への転換を示
す。バイセクティングＧｌｃＮＡｃを含むトリマンノシルコアグリカンを最初にガラクト
シルトランスフェラーゼおよび供与体分子としてＵＤＰ−Ｇａｌとインキューベーション
し、ここで２個のガラクトース残基が分子上の周辺ＧｌｃＮＡｃ残基に加えられる。次い
で酵素ＮｅｕＡｃ−トランスフェラーゼを使用して２個のＮｅｕＡｃ残基を１から各ガラ
クトース残基に加える。
【０２４４】
図４では、高マンノースグリカン構造の基本的なトリマンノシルコアグリカンへの転換
を示す。高マンノースグリカン（Ｍａｎ９）はマンノシダーゼ１の存在下で順次インキュ
ーベーションされて、Ｍａｎ５構造を生成し、そして次にマンノシダーゼ３の存在下でイ
ンキューベーションされて、すべて、しかし３個のマンノース残基を残してグリカンから
除去される。あるいはＭａｎ９構造のインキューベーションは、単にマンノシダーゼ３の
存在下でのインキューベーションによりトリマンノシルコア構造のみに戻し改作されても
よい。上記図１および３に提示するスキームに従い、次にこの基本的なトリマンノシルコ
アグリカンの複雑なグリカン分子への転換が可能である。
【０２４５】
図５では、植物細胞により生産される典型的な複雑なＮ−結合グリカン構造を示す。植
物細胞がＧｎＴ−Ｉ酵素活性を欠く時、キシロースおよびフコースはグリカンに付加され
ることはできないことに注目することが重要である。すなわちＧｎＴ−Ｉノック−アウト
細胞の使用は、これらの細胞がどのような「戻し改作」反応を行うことなくさらなる糖を
付加することができる基本的なトリマンノシルコアを有するペプチドを生産する点で本発
明に特定の利点を提供する。同様に、植物細胞中で生産される構造がグリカンのＭａｎ５
変形物であり、ＧｎＴ−Ｉがこれらの細胞に存在しなければ、キシロースおよびフコース
はこの構造に付加されることができない。この場合、マンノシダーゼ３を使用してＭａｎ
５構造を基本的なトリマンノシルコア（Ｍａｎ３）に戻し改作することができる。本明細
書に提供する方法に従い、今、所望する糖部分をトリマンノシルコアに付加して所望する
グリカン構造を生成することが可能である。
【０２４６】
図６では、昆虫細胞で生産される典型的な複雑なＮ−連結グリカン構造を示す。明らか
に、例えばフコースのようなさらなる糖も存在する。さらにここでは示さないが、昆虫細
胞は９個ものマンノース残基を有する高マンノースグリカンを生産することができ、そし
てそれに結合したさらなる糖を含むかもしれない。昆虫細胞ではＧｎＴ−Ｉノックアウト
細胞がフコース残基をグリカンに付加することを妨げる場合もある。このように昆虫細胞
中でのペプチドの生産は、好ましくはＧｎＴ−Ｉノックアウト細胞で達成されるかもしれない。このようにして生産されたグリカンは、次いで必要ならば本明細書に記載する任意の方法およびスキームを使用して生体外で戻し改作されることができ、そしてさらなる糖を本明細書に提供する方法およびスキームを使用して生体外でそれらに加えてもよい。
【０２４７】
図２では、様々な完成段階のグリカン構造を示す。特にバイセクティングＧｌｃＮＡｃ
残基を含まない複雑な炭水化物グリカン構造から基本的なトリマンノシルコア構造のイン
ビトロの酵素的生成を示す。またそれらからのバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含むグリ
カン構造の生成を示す。生産することができる幾つかの中間体グリカン構造を示す。これ
らの構造は細胞により生産されることができ、あるいは本明細書に記載する生体外戻し改作反応で生産されることができる。糖部分は生体外で基本的なトリマンノシルコア構造に、または所望するグリカンを生産するために任意の適当な中間体構造に付加することができる。
【０２４８】
図７では、高マンノース構造から始まるグリカンを戻し改作またはそれに付加するため
に行うことができる一連の可能な生体外反応を示す。例えばＭａｎ９グリカンはマンノシダーゼ１を使用して改作してＭａｎ５グリカンを生成するか、あるいはこれはマンノシダーゼ３または１以上の微生物マンノシダーゼを使用してトリマンノシルコアに改作してもよい。次いでＧｎＴ−Ｉおよび／またはＧｎＴ−ＩＩを使用してさらなるＧｌｃＮＡｃ残基をグリカンに転移することができる。さらにグリカン分子がＧｎＴ−Ｉを持たない細胞中で生産される時には起こらない状況を示す（影を付けた箱を参照にされたい）。例えばフコースおよびキシロースは、ＧｎＴ−Ｉが活性であり、そしてＧｌｃＮＡｃの分子への転移を促進する時にのみグリカンに付加され得る。
【０２４９】
図８はトリマンノシルコア構造から始まり、２分岐、３分岐そしてさらには４分岐グリカン構造を合成するための周知法を表す。本発明の方法に従い、これらの各構造は糖生物学の分野で周知の適切な酵素および反応条件を使用して、生体外で合成することが可能である。
【０２５０】
図９は、高マンノース（６から９のマンノース部分）グリカン構造から始めての、単一分岐グリカン構造の合成に対する２つの方法を表す。端のシアル酸−ＰＥＧ部分を、この明細書の中で記したグリコＰＥＧ化の方法論にしたがって、シアル酸の代わりに付加させることもありうる。第一の方法は、ペプチド上のグリカン構造を開裂させて最初のＧｌｃＮＡｃ残基へ戻すために、内部の（ｅｎｄｏ―）Ｈが使われる。そこで、ガラクトシルトランスフェラーゼを使って、ガラクト−スが付加され、そしてこの明細書の他の所で記したようにシアル化ＰＥＧが付加される。第二の方法は、ペプチド中のグリカン構造からマンノーズ残基を開裂させるために、マンノシダ−ゼ  Ｉを使う。Ｊａｃｋ  Ｂｅａｎ  α−マンノーシダーゼを使ってグリカンに開裂させられた残りのマンノース残基の１つのアームにガラクト−ス残基を付加する。そこでシアル化ＰＥＧは、指示どおりにこの構造に付加される。
【０２５１】
図１０は、高マンノース（６から９のマンノース部分）グリカン構造から始めての、単一分岐グリカン構造の合成に対する更なる２つの方法を表す。図９のように、端のシアル酸−ＰＥＧ部分を、この明細書の中で記したグリコＰＥＧ化の方法論にしたがって、シアル酸の代わりに付加させることもありうる。ここで記述される状況では、シアル化ＰＥＧが付加されていないアームからのいくつかのマンノース残基は取り除かれる。
【０２５２】
図１１では、トリマンノシルコア構造から始まり、さらにより一層複雑な炭水化物構造
を合成するためのスキームを示す。例えばシアリル化されていてもいなくてもよいルイス
ｘおよびルイスａ抗原構造を生体外で生産するためのスキームを示す。そのような構造はペプチド上に存在する時、免疫応答をアップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）またはダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）するために免疫学的な利点をペプチドに付与することができる。さらにそのような構造は、これらの構造の型が細胞接着ペプチド等への結合に関与するので、ペプチドを特異的な細胞に標的化するためにも有用である。
【０２５３】
図１２はセリンまたはトレオニンから始まる多くのＯ−連結ペプチドを調製するための
例示スキームである。
【０２５４】
図１３はコア１から４と名付けられた４種類のＯ−連結グリカン構造を表す一連の図解
である。コア構造は点線で囲む。この構造に含むことができる糖には、ガラクトース残基
に加えられたシアル酸残基およびＧｌｃＮＡｃ残基に加えられたフコース残基を含む。
【０２５５】
このように好適な態様では、本発明は基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３Ｇｌ
ｃＮＡｃ４構造が結合する単離および精製された糖ペプチドを提供し、この糖ペプチドを
グリコシルトランスフェラーゼ酵素およびグリコシル部分を有する供与体分子と、グリコ
シル部分を糖ペプチドに転移させるために適する条件下で接触させることにより、Ｎ−連結グリコシル化糖ペプチドを作成する方法を提供する。次に所望のグリコシル化パターン
を有するペプチドを生産するためのトリマンノシルコア糖ペプチドまたはＭａｎ３Ｇｌｃ
ＮＡｃ４糖ペプチドのカスタマイズ化が、当該技術分野で周知の技術を使用して所望の糖
部分の順次付加により達成される。
【０２５６】
グリカン１次構造の決定
Ｎ−結合糖ペプチドが細胞により生産される時、本明細書のいたるところで記載するよ
うに、これは他の糖部分をそれに付加する前に共通の、一般的には基本的なトリマンノシ
ルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造に減少されなければならないグリカン構造の異
種の混合物を含んでなるかもしれない。どの糖を特定のグリカン構造から除去するべきで
あるかを正確に決定するために、１次グリカン構造を同定することが必要となる場合があ
る。グリカンの１次構造を決定するための技術は当該技術分野では周知であり、そして例
えばＭｏｎｔｒｅｕｉｌ、「糖ペプチドの構造および生合成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎ
ｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、医学的応用に
おける多糖（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ）、第２７３〜３２７頁、１９９６、Ｓｅｖｅｒｉａｎ  Ｄａｍｉｔｒｉ
ｕ編集、マルセルデッカー、ニューヨーク州、に詳細に記載されている。したがって糖生
物学の分野の当業者には、細胞により生産されたペプチド群を単離し、そしてそれに結合
しているグリカンの構造（１つまたは複数）を決定することは単純な事柄である。例えば
（ｉ）加水分解、アセトリシス、ヒドラジン分解のような化学的開裂により、または亜硝
酸のデアミネーションによりいずれかでグリコシド結合を分解し（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）
；（ｉｉ）メチル化を完成し、続いて加水分解またはメタノリシスを行い、そして部分的
にメチル化された単糖のガス−液体クロマトグラフィーおよび質量分析を行い；そして（
ｉｉｉ）エキソグリコシダーゼを使用して単糖間のアノマー結合を決定し、これはまた順
次分解により１次グリカン構造の洞察も提供するための効率的な方法を利用することがで
きる。特に質量分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法の技術、特に高磁場ＮＭＲはグリ
カン１次構造を決定するために成功裏に使用されてきた。
【０２５７】
炭水化物分析用のキットおよび装置も市販されている。フルオロフォア支援炭水化物電
気泳動（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＦＡＣＥ（商標））は、グリコ（Ｇｌｙｋｏ）社（ノバト
、カリフォルニア州）から販売されている。ＦＡＣＥ分析では、Ｎ−連結グリカンに関し
ては内部の（ｅｎｄｏ−）ＨまたはＮ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）のいずれかを用いて、あるいはＳｅｒ／Ｔｈｒ結合グリカンに関してはヒドラジンを用いて、ペプチドから複合糖質が放出される。次いでグリカンは還元末端でフルオロフォアにより非−構造識別様式で標識される。フルオロフォアで標識したグリカンは次いでポリアクリルアミドゲルでサッカリドの荷電／質量比ならびに流体力学的容量に基づき分離される。像をＵＶ光の下で取り、そしてグリカンの組成は標準と比較した移動距離により決定される。オリゴ糖はエキソグリコシダーゼ消化によりサッカリドの順次除去による移動シフトを分析することにより、この様式で配列決定することができる。
【０２５８】
例示態様
Ｎ−連結グリコシル化の改造は、式１：
【０２５９】
【化４０】
0005413548.tif 000017
【０２６０】
式中、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ１７は、（独立して選択された）単糖ま
たはオリゴ糖残基であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｘは（独立して選択された）０、１または２であるが、ただ
しａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｘから選択される少なくとも１つの員は１または２である、
を参照にして最もよく説明される。
【０２６１】
式１はトリマンノシルコアを含んでなる、好ましくはペプチド骨格のアスパラギン残基
に共有結合しているグリカン構造を記載する。好適な発現系は、トリ−マンノシルコアを
含んでなるＮ−結合グリカンを含む外因性のペプチドを発現し、そして分泌する。本発明
の改造方法を使用して、これらペプチド上のグリカン構造は所望する任意のグリカン構造
に都合よく改造することができる。例示的な反応条件は、実施例および参考文献全体に見
いだされる。
【０２６２】
好適な態様では、式１に記載するグリカンは構造が特異的な決定基を有するように改造
される。グリカンの構造は中でもペプチドの生物学的活性を強化し、ペプチドに新しい生
物活性を与え、ペプチドの生物学的活性を除去し、またはとりわけ天然のペプチドのグリ
コシル化パターンにより良く近づけるために選択することができる。
【０２６３】
第１の好適な態様では、ペプチドＮ−連結グリカンを改造して天然のヒトのタンパク質
のグリコシル化パターンにより良く近づける。この態様では、式１に記載するグリカン構
造は以下の部分：
Ｘ３およびＸ５＝｜−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ；
ａおよびｃ＝１；
ｄ＝０または１；
ｂ、ｅおよびｘ＝０
を有するように改造される。
【０２６４】
この態様は異質な細胞発現系で発現するヒトペプチドに特に有利である。Ｎ−連結グリ
カン構造をこの立体配置に改造することにより、ペプチドはとりわけヒト患者中での免疫
原性が低くなり、かつ／またはより安定となる。
【０２６５】
第２の好適な態様では、ペプチドＮ−連結グリカンがトリ−マンノシルコア上にバイセ
クティングＧｌｃＮＡｃ残基を有するように改造される。この態様では、式１に記載する
グリカン構造は以下の部分：
Ｘ３およびＸ５は｜−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ；
ａおよびｃ＝１；
Ｘ４がＧｌｃＮＡｃであり；
ｂ＝１；
ｄ＝０または１；
ｅおよびｘ＝０
を有するように改造される。
【０２６６】
この態様は異質な細胞系で発現する組換え抗体分子に特に有利である。抗体分子がＦｃ
−媒介型細胞傷害性を含む時、Ｆｃドメインに結合したバイセクティングオリゴ糖の存在
が抗体−依存性の細胞傷害性を著しく増すことが知られている。
【０２６７】
第３の好適態様では、ペプチドＮ−連結グリカンがシアリル化ルイスＸ部分を有するよ
うに改造される。この態様では、式１に記載するグリカン構造は以下の部分：
Ｘ３およびＸ５は
【０２６８】
【化４１】
0005413548.tif 000018
【０２６９】
であり；
ａ、ｃ、ｄ＝１；
ｂ、ｅおよびｘ＝０；
Ｘ６＝フコース
を有するように改造される。
【０２７０】
この態様は改造されるペプチドがセレクチン分子およびそれを発現する細胞を標的にす
ることを意図する時に特に有利である。
【０２７１】
第４の好適な態様では、ペプチドＮ−連結グリカンが結合部分を有するように改造する
。この結合部分は、とりわけＰＥＧ分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい。こ
の態様では、式１に記載するグリカン構造は以下の部分：
Ｘ３およびＸ５は｜−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−Ｒ；
ａおよびｃ＝１または２；
ｄ＝０または１；
ｂ、ｄ、ｅおよびｘ＝０；
ここでＲ＝結合基
を有するように改造される。
【０２７２】
結合部分は、とりわけＰＥＧ分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい。したが
ってこの態様はペプチドを、患者の血流からペプチドの排除を遅らせるＰＥＧ分子に、両
ペプチドを特異的組織または細胞を標的とさせるペプチドに、あるいは相補的な治療的使
用の別のペプチドに結合させるために有用である。
【０２７３】
当業者には本発明が上記の好適なグリカン分子に限定されないことは明らかであろう。
好適態様は本発明の改造方法により作成することができる多くの有用なグリカン分子のわ
ずか２〜３である。当業者は他の有用なグリカンをどのように設計するかを知っているだ
ろう。
【０２７４】
第１の例示態様では、ペプチドを当該技術分野で周知の方法に従いＣＨＯ（チャイニー
ズハムスター卵母細胞系）で発現させる。Ｎ−連結グリカンの共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
）部位を持つペプチドがＣＨＯ細胞から発現され、そして分泌される時、Ｎ−結合グリカ
ンは図２の上段に表す構造を有するばかりでなく、コア  フコースからなっている。これらすべての構造が存在することができるが、断然最も多くの構造は右側の２つである。式１の用語において、
Ｘ３およびＸ５は｜−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−（ＳＡ）であり；
ａおよびｃ＝１；
ｂ、ｅおよびｘ＝０および  ｄ＝０  または  １
である。
【０２７５】
従って、１つの例示態様では、ＣＨＯ細胞で発現するペプチドのＮ−結合グリカンは
、ペプチドをガラクトース受容体分子およびシアル酸供与体分子に特異的であるグリコシ
ルトランスフェラーゼと接触させることにより、好適なヒト化グリカンに改造する。この
工程を図２および実施例１７で具体的に説明する。別の例示態様では、ＣＨＯ細胞から発現され、そして分泌されるペプチドのＮ−連結グリカンを、好適なＰＥＧ化構造に改造する。ペプチドを最初にシアル酸に特異的なグリコシダーゼと接触させて末端ＳＡ部分を除去し、そして次いでガラクトース受容体部分およびシアル酸受容体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼとＰＥＧ−シアル酸−ヌクレオチド供与体分子の存在下で接触させる。場合によりペプチドは次いでガラクトース受容体部分およびシアル酸受容体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと、シアル酸−ヌクレオチド供与体分子の存在下で接触させて、すべてのグリカン分子の完全なＳＡキャッピングを確実とする。
【０２７６】
他の例示態様では、ペプチドを当該技術分野で周知の方法に従いｓｆ９細胞系のよう
な昆虫細胞中で発現させる。Ｎ−連結グリカンと共通部位を持つペプチドがｓｆ９細胞
から発現され、そして分泌される時、Ｎ−連結グリカンは図６の上段に表す構造を有する
。式１の用語において：
Ｘ３およびＸ５は｜−ＧｌｃＮＡｃであり；
ａおよびｃ＝０または１；
ｂ＝０；
Ｘ６はフコースであり；
ｄ＝０、１または２；そして
ｅおよびｘ＝０
である。
【０２７７】
トリマンノースコアは昆虫細胞により作られるＮ−連結グリカンのほとんどすべてに存
在し、そして時折、アンテナＧｌｃＮＡｃおよび／またはフコース残基（１つまたは複数
）も存在する。グリカンは、コア  フコース  を持たないかもしれないこと、または、いずれかの連結を持つ単一のコア  フコースを持つかもしれないこと、または、単一連結の“Ｐｅｒｐｏｎｄｅｒａｎｃｅ”を持つ単一のコア  フコースを持つかもしれないことに注意されたい。１つの例示態様では、昆虫細胞から発現され、そして分泌されるペプチド
のＮ−結合グリカンは、最初にグリカンをフコース分子に特異的なグリコシダーゼと接触
させ、次いでグリカンをトリマンノースコアの各アンテナ上のマンノース受容体分子、Ｇ
ｌｃＮＡｃ供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Ｇｌ
ｃＮＡｃ分子の存在下で接触させ；次いでグリカンをＧｌｃＮＡｃ受容体分子、Ｇａｌ供
与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Ｇａｌ分子の存在
下で接触させ；そして次にグリカンをガラクトース受容体分子、シアル酸供与体分子に特
異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−ＳＡ分子の存在下で接触させる
ことにより好適なヒト化グリカンに改造される。当業者は存在するならばフコース分子は
この方法の任意の時点で除去できると考えるだろう。そしてもし、コア  フコースが、ヒト  グリカンで見出されるようにと同じアルファ  １，６連結を持つならば、それは原型のまま残っているかもしれない。別の例示態様では、前例のヒト化グリカンはグリカンをＧｌｃＮＡｃ受容体分子、フコース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼとヌクレオチド−フコース分子の存在下で接触させることにより、シアリル化ルイスＸグリカンにさらに改造する。この工程は図１１および実施例３９で具体的に説明する。
【０２７８】
さらに他の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従いサッカロミセス
セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母で発
現させる。Ｎ−連結グリカンの共通部位を持つペプチドがＳ．セルビシエ（ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）細胞から発現され、そして分泌される時、Ｎ−結合グリカンは図４の左に表す
構造を有するだろう。Ｎ−連結グリカンは常にトリマンノシルコアを有し、これはしばし
ばマンノースまたは関連する多糖を用いて１０００残基まで合成される。式１の用語にお
いて、
Ｘ３およびＸ５＝｜−Ｍａｎ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ）０−１０００；
ａおよびｃ＝１または２；
ｂ、ｄ、ｅおよびｘ＝０
である。
【０２７９】
１つの例示態様では、酵母細胞から発現され、そして分泌されるペプチドのＮ−連結グ
リカンは、最初にグリカンをα２マンノース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させ、
次にグリカンをα６マンノース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させることにより、
基本的なトリマンノースコアに改造される。この工程を図４および実施例３８で具体的に説明する。
【０２８０】
別の例示態様では、Ｎ−連結グリカンは、基本的なトリマンノースコアグリカンをトリマンノースコアの各分岐上のマンノース受容体分子、ＧｌｃＮＡｃ供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼおよびＧｌｃＮＡｃ供与体分子とを、ヌクレオチド−ＧｌｃＮＡｃ分子の存在下で接触させることによって、Ｆｃ介在の細胞毒性機能を持つ組み換え抗体に適したグリカンを作るために改造される。；
次いでグリカンをトリマンノースコアの真ん中のマンノース受容体マンノース分子、Ｇ
ｌｃＮＡｃ供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Ｇｌ
ｃＮＡｃ分子の存在下で接触させ、；次いでそして更に、グリカンをＧｌｃＮＡｃ受容体分子、Ｇａｌ供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Ｇａｌ分子の存在下で接触させ；そして次に状況に応じて、グリカンをガラクトース受容体分子、シアル酸供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、更に状況によっては、シアル酸供与体分子と、ヌクレオチド−ＳＡ分子の存在下で接触させる。
ことにより、Ｆｃ媒介型の細胞毒性機能を持つ組換え抗体に適するグリカンを作成するた
めにさらに改造される。
この工程は図１，２および３で具体的に説明する。
【０２８１】
別の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従い細菌細胞、特に大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で発現させる。Ｎ−連結グリカンの共通部位を持つペプチドが（Ｅ
．ｃｏｌｉ）細胞で発現する時、Ｎ−連結共通部位はグリコシル化されない。例示態様で
は、ヒト化グリカン分子はペプチドをＮ−連結共通部位およびＧｌｃＮＡｃ供与体分子に
特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチドＧｌｃＮＡｃの存在下で接触さ
せ；そしてさらに成長しているグリカンを受容体および供与体部分に特異的なグリコシル
トランスフェラーゼと、必要な供与体部分の存在下で所望のグリカン構造が完成するまで
順次接触させることにより、ペプチド骨格から構築される。Ｎ−連結グリカンを持つペプ
チドが真核細胞で発現するが、新生ペプチドをゴルジ装置に向ける正しいリーダー配列が
無い時、成熟ペプチドはグリコシル化されないらしい。この場合もペプチドは前述のペプ
チドＮ−連結共通部位から構築することにより、Ｎ−結合グリコシル化を与えることがで
きる。タンパク質が糖部分を用いて化学的に修飾される時、タンパク質を前述のように構
築することができる。
【０２８２】
これらの例は本発明を具体的に説明するものであり、そして本発明を限定するものでは
ないことを意味している。当業者は各例で取られる工程が状況によっては異なる順序で行
われ、同じ結果を得ることができると考えるだろう。また当業者は、異なる工程の組が同
じ生成グリカンを生産することもできると理解するだろう。好適な改造されたグリカンは
ペプチドが発現される発現系に対して全く特異的では無いと理解するだろう。改造された
グリカンは単に具体的説明であり、そして当業者は本明細書に具体的には記載していない
グリカンを作成するために、これらの例からどのように原理を取り出し、そしてそれらを
種々の発現系で生産されるペプチドに応用するかを知っている。
【０２８３】
Ｂ．Ｏ−連結グリカンの改造方法
Ｏ−グリコシル化は種々の単糖がＯ−グリコシド結合でヒドロキシアミノ酸へ結合して
いることが特徴である。Ｏ−グリコシル化は動物および植物界で広く行き渡った翻訳後修
飾である。タンパク質にＯ−結合したグリカンの構造的複雑さは、Ｎ−連結グリカンのそ
れをはるかに越える。新たに翻訳されたペプチドのセリンまたはトレオニン残基は、ペプ
チドのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼによりゴルジのシスからトランス区画で修飾され
るようになる。Ｏ−グリコシル化の部位はグリコシルトランスフェラーゼの配列特異性に
より決定されだけでなく、異なる基質部位間の競合およびグリカンを形成する原因となる
他のグリコシルトランスフェラーゼとの競合により媒介される後成的調節によっても決定
される。
【０２８４】
Ｏ−連結グリカンは任意に３つの領域：コア、骨格領域および周辺領域を有すると任意
に定義された。Ｏ−結合グリカンの「コア」領域はペプチドに近いグリカン鎖の最も内側
の２または３つの糖である。骨格領域は単一な延長により形成されたグリカン鎖の長さに
主に貢献している。周辺領域は高度な構造の複雑性を現す。Ｏ−連結グリカンの構造的複
雑さはコア構造から始まる。多くの場合で、Ｏ−連結グリカン共通部位に加えた第１の糖
残基はＧａｌＮＡｃであり；しかし糖は中でもＧｌｃＮＡｃ、グルコース、マンノース、
ガラクトースまたはフコースでもよい。図１２は既知のＯ−結合グリカンコア構造および
それらの生体内合成の原因となる酵素の図解である。
【０２８５】
哺乳動物細胞では、少なくとも８つの異なるＯ−連結コア構造が見いだされ、すべてコ
ア−α−ＧａｌＮＡｃ残基に基づく。図１３に表す４つのコア構造が最も一般的である。
コア１およびコア２は哺乳動物細胞で最も豊富な構造であり、そしてコア３およびコア４
はより限定された、器管−特徴的発現系で見いだされる。Ｏ−連結グリカンはＭｏｎｔｒ
ｅｕｉｌ、糖ペプチドの構造および合成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、医学的応用における多糖（Ｐｏｌｙｓａｃ
ｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）で、第２７
３−３２７頁、１９９６、Ｓｅｖｅｒｉａｎ  Ｄａｍｉｔｒｉｕ編集、マルセルデッカー
、ニューヨーク州、およびＳｃｈａｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ、分岐
Ｏ−結合グリカンの生合成（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｒａｎｃｈｅ
ｄ  Ｏ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｇｌｙｃａｎｓ）、１９８９、実験生物学会、第１〜２６頁（英
国）で総説されている。
【０２８６】
本開示からＯ−グリコシル化ペプチドのグリカン構造は、Ｎ−連結グリカンについて記
載したものに類似の技術を使用して改造できることは明らかであろう。Ｏ−グリカンはア
スパラギン残基ではなくセリンまたはトレオニン残基に結合している点でＮ−グリカンと
は異なる。Ｎ−グリカンの改造に関して本明細書に記載するように、加水分解酵素を使用
してＯ−結合グリカン中の望ましくない糖部分を開裂し、そして次にさらに望ましい糖を
それらに付加して、カスタマイズされたＯ−グリカン構造をペプチド上に構築することが
できる（図１２および１３を参照にされたい）。
【０２８７】
哺乳動物細胞におけるＯ−グリコシル化の最初の段階は、各々が限定された受容体ペプ
チド特異性を有する少なくとも１１種の既知のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトラン
スフェラーゼの任意のファミリーを使用したＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ
）の結合である。一般に各酵素により認識される受容体ペプチドは少なくとも１０個のア
ミノ酸の配列を構成する。１つの特定のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼにより認識さ
れるアミノ酸配列を含むペプチドは、それらがこの酵素を発現している細胞中で発現し、
そしてそれらがＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃも存在するゴルジ装置に適切に局在するならば、こ
の受容体部位でＯ−グリコシル化されるようになる。
【０２８８】
しかし組換えタンパク質の場合、最初のＧａｌｃＮＡｃの結合は起こらないかもしれな
い。発現している細胞に天然なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ酵
素は、組換えペプチドが発現している細胞とは異なる共通配列特異性を有するかもしれな
い。
【０２８９】
所望の組換えペプチドは、グリカン鎖を合成しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細
菌細胞できる発現させることができる。これらの場合、最初のＧａｌＮＡｃ部分を生体外で付加することが有利である。ＧａｌＮＡｃ部分は、いったん組換えペプチドが可溶性の状態で回収されれば、ペプチドを適切なＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下で接触させることにより生体外でペプチドに導入することができる。
【０２９０】
１つの態様では、Ｏ−連結糖を転移されるために効果的な受容体を構成するアミノ酸の
さらなる配列が存在し得る。そのようなアミノ酸配列はペプチドのコード配列に対する枠
内で融合したＤＮＡ配列によりコードされるか、または化学的手段により導入してもよい
。あるいはペプチドはグリカン鎖を欠いているかもしれない。場合によりペプチドはＮ−
および／またはＯ−連結グリカン鎖を有することができるが、例えばさらなるグリカン置
換を望む時、さらなるグリコシル化部位が必要である。
【０２９１】
例示態様では、アミノ酸配列ＰＴＴＴＫ−ＣＯＯＨ（これはヒトのムチンＭＵＣ−１中
の天然なＧａｌＮＡｃ受容体配列である）を融合タグとして加える。次いで融合タンパク
質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現し、そして精製される。次いでペプチドを組換えヒ
トＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼＴ３またはＴ６と、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下
で接触させてＧａｌＮＡｃ残基をペプチドに生体外で転移させる。
【０２９２】
このペプチド上のグリカン鎖は、次いでＮ−連結またはＯ−連結グリカンに関して本明
細書に記載した方法を使用してさらに延長することができる。あるいはＧａｌＮＡｃトラ
ンスフェラーゼ反応は、Ｏ−３、４または６位あるいはＮ−２位でＰＥＧに共有的に置換
されるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下で行うことができる。複合糖質化（Ｇｌｙｃｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は本明細書のいたるところで詳細に記載する。新たなペプチド配列
によりペプチドに導入される抗原性は、結合するグリカンのＰＥＧ化により都合よく遮蔽
することができる。受容体部位融合技術はＰＥＧ部分を導入するだけでなく、限定するわ
けではないがトキシン、抗−感染剤、細胞傷害剤、放射性核種のキレーターおよび組織タ
ーゲッティングのような他の官能性を有するグリカンを含む他のグリカンおよび非−グリ
カン部分を導入するためにも使用することができる。
【０２９３】
例示態様
Ｏ−連結グリコシル化の改造は、式２を参照にして最もよく具体的に説明される：
【０２９４】
【化４２】
0005413548.tif 000019
【０２９５】
式２は、好ましくはペプチド骨格上のセリンまたはトレオニン残基に共有結合している
ＧａｌＮＡｃを含んでなるグリカン構造を記載する。この構造はＯ−連結グリカンの最も
普通の形態を具体的に説明するために使用するが、本発明はこれらＯ−連結グリカンに単
に限定されると解釈されるべきではない。Ｏ−連結グリカンの他の形態は図１２に具体的
に説明する。本発明に有用な好適な発現系は、ＧａｌＮＡｃ残基を含んでなるＯ−連結グ
リカンを有する外因性ペプチドを発現し、そして分泌する。本発明の改造方法を使用して
、これらペプチド上のグリカン構造は所望する任意のグリカン構造を生成するために都合
よく改造することができる。当業者はいったん本開示から着手すれば、当該技術分野で利
用可能なものと同じ原理、酵素および反応条件を使用してＯ−連結グリカンを改造できる
と考えるだろう。例示的な反応条件は、実施例中に見いだされる。
【０２９６】
好適な態様では、グリカン構造は式２に記載する構造が特異的な部分を有するように改
造される。グリカンの構造は中でもペプチドの生物学的活性を強化し、ペプチドに新しい
生物活性を与え、ペプチドの生物学的活性を除去または改変させ、または天然のペプチド
のグリコシル化パターンにより良く近づけるために選択することができる。
【０２９７】
第１の好適な態様では、ペプチドＯ−連結グリカンを改造して天然のヒトのタンパク質
のグリコシル化パターンにより良く近づける。この態様では、式２に記載するグリカン構
造が以下の部分：
Ｘ２は｜−ＳＡ；または｜−ＳＡ−ＳＡであり；
ｆおよびｎ＝０または１；
Ｘ１０はＳＡであり；
ｍ＝０
を有するように改造される。
【０２９８】
この態様は異質な細胞発現系で発現するヒトペプチドに特に有利である。Ｏ−連結グリ
カン構造をこの立体配置を有するように改造することにより、ペプチドはヒト患者中での
免疫原性が低くなり、かつ／またはより安定となる。
【０２９９】
別の好適な態様では、ペプチドＯ−連結グリカンはシアリル化ルイスＸ抗原を表すよう
に改造される。この態様では、式２に記載するグリカン構造が以下の部分：
Ｘ２は｜−ＳＡであり；
Ｘ１０はＦｕｃまたは｜−ＧａｌＮＡｃ（Ｆｕｃ）−Ｇａｌ−ＳＡであり；
ｆおよびｎ＝１；
ｍ＝０
を有するように改造される。
【０３００】
この態様は改造されるペプチドがセレクチン分子を標的とし、そして細胞がそれを発現
している時に最も効果的である時、特に有利である。
【０３０１】
さらに別の好適な態様では、ペプチドＯ−連結グリカンは結合部分を含むように改造さ
れる。この結合部分は、とりわけＰＥＧ分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい
。この態様では、式２に記載するグリカン構造が下の部分：
Ｘ２は｜−ＳＡ−Ｒであり；
ｆ＝１；
ｎおよびｍ＝０
ここでＲは結合基である
を有するように改造される。
【０３０２】
この態様はペプチドを、患者の血流からペプチドの排除を遅らせるＰＥＧ分子に、両ペ
プチドを特異的組織または細胞を標的とさせるペプチドに、あるいは相補的な治療的使用
の別のペプチドに結合させるために有用である。
【０３０３】
当業者には本発明が上記の好適なグリカン分子に限定されないことは明らかであろう。
好適態様は本発明の改造方法を使用して作成することができる多くの有用なグリカン分子
のわずか２〜３である。当業者はいったん本発明から着手すれば他の有用なグリカンをど
のように設計するかを知るだろう。
【０３０４】
第１の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従いＣＨＯ（チャイニー
ズハムスター細胞系）で発現させる。Ｏ−連結グリカンの共通部位を持つペプチドがＣＨ
Ｏ細胞から発現され、そして分泌される時、Ｏ−連結グリカンの大部分が式２の用語にお
いて、
Ｘ２＝｜−ＳＡ；
ｆ＝１；
ｍおよびｎ＝０
である構造を有することが多い。
【０３０５】
従って、ＣＨＯ細胞中のほとんどのグリカンは、ヒト患者での使用に許容され得るた
めに改造を必要としない。別の例示態様では、ＣＨＯ細胞から発現され、そして分泌され
るペプチドのＯ−結合グリカンは、グリカンをＧａｌＮＡｃ受容体部分およびフコース供
与体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−フコースの存
在下で接触させることにより、シアリル化ルイスＸ構造を含むように改造される。この工
程は図１１および実施例３９でＮ−連結グリカンに関して具体的に説明している。
【０３０６】
他の例示態様では、ペプチドを当該技術分野で周知の方法に従いｓｆ９のような昆虫細
胞中で発現させる。Ｏ−連結グリカンの共通部位を持つペプチドがほとんどのｓｆ９細胞
から発現され、そして分泌される時、Ｏ−連結グリカンの大部分は式２の用語において、
Ｘ２＝Ｈ；
ｆ＝０または１；
ｎおよびｍ＝０
である構造を有する。
【０３０７】
例えばＭａｒｃｈａｌら，（２００１，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２：１５１−１５９）を参照にされたい。１つの例示態様では、昆虫細胞で発現されるペプチド上のＯ−連結グリカンは、グリカンをＧａｌＮＡｃ受容体分子およびガラクトース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Ｇａｌの存在下で接触させ；そして次にグリカンをＧａｌ受容体分子およびＳＡ供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼとヌクレオチド−ＳＡの存在下で接触させることにより、ヒト化グリカンに改造される。別の例示態様では、Ｏ−連結グリカンをさらにヒト化形態から、グリカンをさらにＧａｌＮＡｃ受容体分子およびフコース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−フコースの存在下で接触させることにより、シアリル化ルイスＸ形態に改造する。
【０３０８】
さらに他の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従い真菌細胞、特に
Ｓ．セルビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞で発現させる。Ｏ−連結グリカンの共通部
位を持つペプチドがＳ．セルビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞から発現され、そして
分泌される時、ほとんどのＯ−連結グリカンは構造：
｜−ＡＡ−Ｍａｎ−Ｍａｎ１−２
を有する。Ｇｅｍｍｉｌｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｍｂｌｅ（１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４２６：２２７−２３７）を参照にされたい。このようなＯ−
結合グリカンをヒトでの使用に改造するために、グリカンをアミノ酸レベルで開裂し、そ
してここから再構築することが好ましい。
【０３０９】
１つの例示態様では、グリカンは真菌細胞で発現されるペプチド上のＯ−連結グリカン
であり、そしてグリカンをアミノ酸−ＧａｌＮＡｃ結合に特異的なエンドグリコシダーゼ
と接触させ；そして次いでグリカンをＯ−連結共通部位およびＧａｌＮＡｃ供与体分子に
特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−ＧａｌＮＡｃの存在下で接触
させ；グリカンをＧａｌＮＡｃ受容体分子およびガラクトース供与体分子に特異的なグリ
コシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Ｇａｌの存在下で接触させ；そして次にグ
リカンをＧａｌ受容体分子およびＳＡ供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラー
ゼと、ヌクレオチド−ＳＡの存在下で接触させることにより、ヒト化グリカンに改造する
。
【０３１０】
あるいは別の例では、グリカンは真菌細胞で発現されるペプチド上のＯ−連結グリカン
であり、そしてグリカンをタンパク質Ｏ−マンノースβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ（ＰＯＭＧｎＴＩ）と、ＧｌｃＮＡｃ−ヌクレオチドの存在下
で接触させ；次いでグリカンをヌクレオチド−Ｇａｌの存在下でガラクトシルトランスフ
ェラーゼと接触させ；そして次にグリカンをヌクレオチド−ＳＡの存在下でシアリルトラ
ンスフェラーゼと接触させることによりヒト化グリカンに改造する。
【０３１１】
別の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従い細菌細胞、特に大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で発現させる。Ｏ−連結グリカンの共通部位を持つペプチドが（Ｅ
．ｃｏｌｉ）細胞で発現する時、Ｏ−連結共通部位はグリコシル化されない。この場合、
所望するグリカン分子は上記のＳ．セルビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について記載し
た様式に準じて、ペプチド骨格から構築しなければならない。さらにＯ−結合グリカンを
有するペプチドが新生ペプチドをゴルジ装置に向けるための正しいリーダー配列無しで真
核細胞で発現する時、成熟ペプチドはグリコシル化されないらしい。この場合もＯ−連結
グリコシル構造は、グリカンをペプチドＯ−連結共通部位から直接構築することによりペ
プチドに加えることができる。さらにタンパク質が糖部分を用いて化学的に修飾される時
、タンパク質は前述のように改造される。
【０３１２】
これらの例は本発明を具体的に説明するものであり、そして本発明を限定するものでは
ないことを意味している。当業者は同じ結果を得るために各例で取られる工程を状況によ
っては異なる順序で行うことができると考えるだろう。また当業者は異なる工程の組が同
じ生成グリカンを生産することもできると理解するだろう。さらに好適な改造されたグリ
カンはペプチドが発現する発現系に対して全く特異的では無いと理解するだろう。改造さ
れたグリカンは単に具体的説明であり、そして当業者は本明細書に具体的には記載してい
ないグリカンを作成するために、これらの例からどのように原理を取り出し、そしてそれ
らを異なる発現系で生産されるペプチドに応用するかを知っている。
【０３１３】
Ｃ．複合糖質化（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、総論
本発明はグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの結合物の調製法を提供する。本
発明の結合物はペプチドと水溶性ポリマー、治療部分、診断部分、標的部分等のような多
様な種との間で形成される。また提供されるのは連結アーム（ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍ）を介して一緒に連結された２以上のペプチドを含む結合物、すなわち多機能性結合物（
ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である。本発明の多機能性結合
物は、同じペプチドの２以上のコピー、または異なる構造および／または特性を持つ多様
なペプチドの集合を含むことができる。
【０３１４】
本発明の結合物は、修飾された糖のグリコシル化または非グリコシル化ペプチドへの酵
素的結合により形成される。修飾された糖はペプチドと糖上の修飾基との間に挿入された
時、本明細書でのいわゆる「完全なグリコシル連結基」となる。グリコシルトランスフェ
ラーゼのような酵素の優れた選択性を使用して、本方法は１以上の特異的な位置に所望す
る基を持つペプチドを提供する。すなわち本発明に従い、修飾された糖はペプチド鎖上の
選択された位置に直接結合させられるか（ａｔｔａｃｈｅｄ）、あるいは修飾された糖は
ペプチドの炭水化物部分につけられる（ａｐｐｅｎｄｅｄ）。修飾された糖がペプチド炭
水化物に、およびペプチド骨格のアミノ酸残基に直接、両方で結合連結したペプチドも本発明の範囲内である。
【０３１５】
既知の化学的および酵素的なペプチドの合成（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）法とは対照的
に、本発明の方法はペプチドおよび実質的に均一な誘導化パターンを有する糖ペプチドを
集成させることが可能であり；本発明で使用する酵素は、一般にペプチドの特定のアミノ
酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせまたは特定のグリカン構造に選択的である。この方法はまた修飾されたペプチドおよび糖ペプチドの大規模生産にも現実的である。このように本発明の方法は前以て選択された実質的に単一な誘導化パターンを有するペプチドの大規模調製のための現実的手段を提供する。この方法は限定するわけではないが、細胞培養細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、酵母細胞または原核細胞）またはトランスジェニック植物または動物中での生産中に不完全にグリコシル化されたペプチドを含め、治療用ペプチドの修飾にも特によく適している。
【０３１６】
本発明の方法は、例えば排除速度の低下または免疫もしくは細網内皮系（ＲＥＳ）によ
る取り込み率の低下により、上昇した治療的半減期を有するグリコシル化および非グリコ
シル化ペプチドの結合物も提供する。さらに本発明の方法はペプチド上の抗原決定基を遮
蔽するための手段を提供し、これがペプチドに対する宿主免疫応答を下げるか、または排
除する。標的剤の選択的結合を使用して、ペプチドを特定の標的剤に特異的な特定の組織
または細胞表面レセプターを標的とするためにも使用できる。さらに治療部分を用いて特
異的に修飾された種類のペプチドを提供する。
【０３１７】
１．結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
第１の観点では、本発明はペプチドと選択部分との間に結合物を提供する。ペプチドと
選択部分との間の連結には、ペプチドと選択部分の間に挿入された完全なグリコシル連結
基を含む。本明細書で検討するように、選択部分は、サッカリド単位に結合することがで
きる本質的には任意の種であり、ペプチドに修飾された糖を付ける適切なトランスフェラ
ーゼ酵素により認識される「修飾された糖」を生じる。修飾された糖のサッカリド成分は
、ペプチドと選択部分との間に挿入された時、「完全なグリコシル連結基」となる。この
グリコシル連結基は、選択部分を用いた修飾後に適切なトランスフェラーゼの基質となる
単−またはオリゴ糖から形成される。
【０３１８】
本発明の結合物は典型的には一般構造：
【０３１９】
【化４３】
0005413548.tif 000020
【０３２０】
ここで、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは正のゼロではない整数を表し；そしてｔは０
または正の整数である、に相当する。「作用物質（ａｇｅｎｔ）」は治療薬、生物活性剤、検出可能な標識、水溶性部分等である。この「作用物質」はペプチド、例えば酵素、抗体、抗原等であることができる。連結剤（リンカー）は任意の広い配列の上記連結基であることができる。あるいは連結剤は単結合または「ゼロ次連結剤（ｚｅｒｏ  ｏｒｄｅｒ  ｌｉｎｋｅｒ）」でもよい。ペプチドの同一性には限界がない。ペプチドの例を図２８に提供する。
【０３２１】
例示態様では、選択部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーは完全なグリコシル
連結基を介してペプチドに共有結合する。グリコシル連結基はペプチド上のアミノ酸残基
またはグリコシル残基のどちらかに共有結合する。あるいはグリコシル連結基は糖ペプチ
ドの１以上のグリコシル単位に結合する。本発明はグリコシル連結基がアミノ酸残基およ
びグリコシル残基の両方に結合した結合物も提供する。
【０３２２】
酵素的に付加される完全なグリコシル連結基を介して形成される結合物を提供すること
に加えて、本発明はそれらの置換パターンが高度に均一な結合物を提供する。本発明の方
法を使用して、本発明の結合物群の全域で本質的にすべての修飾された糖部分が、構造的
に同一のアミノ酸またはグリコシル残基の複数のコピーに結合しているペプチド結合物を
形成することが可能である。すなわち第２の観点では、本発明は完全なグリコシル連結基
を介してペプチドに共有結合する水溶性ポリマー部分の群を有するペプチド結合物を提供
する。本発明の好適な結合物では、本質的に群の各員がグリコシル連結基を介してペプチ
ドのグリコシル残基に結合連結し、そしてグリコシル連結基が結合する付いているペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有する。
【０３２３】
また完全なグリコシル連結基を介してペプチド結合物に共有結合した水溶性ポリマー部
分の群を有するペプチド結合物も提供する。好適な態様では、本質的に水溶性ポリマー部
分群の各員が完全なグリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸残基に結合連結し、そして完全なグリコシル連結基を結合して有する各アミノ酸残基は同じ構造を有する。
【０３２４】
また本発明は、ペプチドが完全なグリコシル連結基を介して治療部分、診断部分、標的
部分、トキシン部分等に結合した上記のものに類似する結合物を提供する。上に引用した
各部分は、低分子、天然ポリマー（例えばペプチド）または合成ポリマーであることがで
きる。
【０３２５】
例示態様ではインターロイキン−２（ＩＬ−２）が、ＰＥＧ部分の各末端で完全なグリ
コシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合させられる（スキ
ーム１）。例えばＰＥＧリンカーの１末端をトランスフェリンに結合する完全なシアル酸
リンカーで官能化し、そしてもう１端をＩＬ−２に結合する完全なＧａｌＮＡｃリンカー
で官能化する。
【０３２６】
別の例示態様ではＥＰＯをトランスフェリンに結合する。別の例示態様ではＥＰＯをグ
リア由来神経栄養増殖因子（ＧＤＮＦ）に結合する。これらの態様では、各結合は上記の
ようにＰＥＧ部分の各末端に完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してな
される。トランスフェリンはタンパク質を血液脳関門をわたって移動させる。
【０３２７】
本明細書に添付する図面で説明するように、本発明の結合物は単−または多−価である
（例えば分岐構造）完全なグリコシル連結基を含むことができ、図１４〜２２を参照にされたい。本発明の結合物はセリンまたはトレオニンから始まるＯ−連結グリカンであるグリコシル連結基も含む（図１１）。このように本発明の結合物は、選択部分が単価のグリコシル連結基を介してペプチドに結合している両方の種を含む。また本発明の範囲内に含まれるのは、１より多くの選択部分が多価連結基を介してペプチドに結合している結合物も含む。１以上のタンパク質を一緒に結合して、それらの生物物理的および生物学的特性を利用することができる。
【０３２８】
さらなる態様では、本発明は結合物の成分として標的剤の存在により、特定の組織中に
選択的に局在する結合物を提供する。例示態様では、標的剤はタンパク質である。タンパ
ク質の例にはトランスフェリン（脳、血液プール）、ヒト血清（ＨＳ）−糖タンパク質（
骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体−特異的抗原を含む組織、血液プール）、凝固第
Ｖ−ＸＩＩ因子（損傷組織、凝血、ガン、血液プール）、血清タンパク質、例えばα−酸
性糖タンパク質、フェチュイン、α−胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２−糖タン
パク質（肝臓、アテローム硬化症斑、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ
−ＣＳＦおよびＥＰＯ（免疫刺激、ガン、血液プール、赤血球過剰生産、神経保護）、お
よびアルブミン（半減期の上昇）。
【０３２９】
上記で検討した結合物に加えて、本発明はこれらのおよび他の結合物を調製する方法を
提供する。すなわちさらなる観点では、本発明は選択部分とペプチドとの間の共有結合物
を形成する方法を提供する。したがって本発明は本発明の結合物を身体の特定の組織また
は領域を標的とさせるための方法を提供する。
【０３３０】
例示態様では、結合物は水溶性ポリマー、治療部分、標的化部分または生体分子と、グ
リコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間に形成される。ポリマー、治療部分また
は生体分子は、間に挿入され、そしてペプチドおよび修飾基（例えば水溶性ポリマー）の
両方を共有結合する完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合させる。この方法は
ペプチドを、修飾された糖および修飾された糖が基質であるグリコシルトランスフェラー
ゼを含む混合物と接触させることを含む。反応は修飾された糖とペプチドとの間に共有結
合を形成するために十分な条件下で行う。修飾された糖の糖部分は、好ましくはヌクレオ
チド糖、活性化糖およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない糖から選択される。
【０３３１】
１つの態様では、本発明は２以上のペプチドを連結基を介して連結するための方法を提
供する。連結基は任意の有用な構造であり、そして直−鎖および分岐構造から選択することができる。好ましくはペプチドに結合する連結剤（リンカー）の各末端には、修飾された糖（すなわち新生の完全なグリコシル連結基）を含む。
【０３３２】
本発明の方法の例では、２つのペプチドがＰＥＧ連結剤を含む連結基部分を介して一緒に連結される。この構築物は上記の絵で説明する一般構造と同じである。本明細書で記載するように、本発明の構築物は２つの完全なグリコシル連結基（すなわちｓ＋ｔ＝１）を含む。２つのグリコシル基を含むＰＥＧ連結剤に焦点をあてているのは明瞭さを目的とするものであり、そして本発明のこの態様での連結アームの使用の同一性に限定すると解釈されるべきではない。
【０３３３】
このようにＰＥＧ部分を第１末端で第１のグリコシル単位を用いて、そして第２末端で
第２のグリコシル単位を用いて官能化する。第１および第２のグリコシル単位は好ましく
は異なるトランスフェラーゼの基質であり、第１および第２ペプチドのそれぞれ第１およ
び第２グリコシル単位への直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）結合を可能とする。実際には（
グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２連結剤を、第１ペプチドおよび第１グリコシル単位が基質である第１トランスフェラーゼと接触させ、これにより（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２を形成する。次いで第１トランスフェラーゼおよび／または未反応ペプチドを場合により反応混合物から除去する。第２ペプチドおよび第２グリコシル単位が基質である第２トランスフェラーゼを、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２結合物に加え、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２−（ペプチド）２を形成する。当業者は上記に概説した方法が２より多くのペプチド間の結合物を、例えば分岐ＰＥＧ、樹状物、ポリ（アミノ酸）、多糖等の使用により形成するためにも応用できると考えるだろう。
【０３３４】
すでに記載したように例示態様では、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ＰＥＧ部
分の各末端で完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリン
に結合される（スキーム１）。ＩＬ−２結合物は結合物のより大きな分子量サイズにより
、ＩＬ−２単独よりも上昇した生体内半減期を有する。さらにＩＬ−２のトランスフェリンへの結合は、結合物が脳を選択的に標的とするために役立つ。例えば、ＰＥＧ連結剤の１つの末端をＣＭＰ−シアル酸を用いて官能化し、そしてもう１端をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用いて官能化する。連結剤はＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの存在下でＩＬ−２と合わせられ、連結アームのＧａｌＮＡｃの、ＩＬ−２上のセリンおよび／またはトレオニン残基への結合を生じる。
【０３３５】
別の例示態様では、トランスフェリンを遺伝子治療に使用するために核酸に結合する。
【０３３６】
【化４４】
0005413548.tif 000021
【０３３７】
上記の工程は望みの数のサイクルを通して行うことができ、そして２つのペプチドと１
つのリンカーとの間に結合物を形成することに限定されない。さらに当業者はペプチドを
含むＰＥＧ（または他の）連結剤の末端で完全なグリコシル連結基を官能化する反応が、同じ反応槽中で同時に起こることができるか、あるいはそれらの反応は段階的様式で行うことができると考えるだろう。反応を段階的様式で行う時、各段階で生成される結合物は任意に１以上の反応成分（例えば酵素、ペプチド）から精製される。
【０３３８】
さらなる例示態様をスキーム２に説明する。スキーム２は選択したタンパク質、例えば
ＥＰＯが骨を標的とし、そして選択したタンパク質の循環半減期を上昇させる結合物の調
製法を示す。
【０３３９】
【化４５】
0005413548.tif 000022
【０３４０】
１以上のペプチド部分を連結剤に結合するために、ＰＥＧ（または他の）連結剤の反応性誘導体の使用は、本発明の範囲内である。本発明は反応性ＰＥＧ類似体の同一性に限定されない。ポリ（エチレングリコール）の多くの活性化誘導体が市販されており、そして文献で利用可能である。本発明に有用な基質を調製するために用いる適当な活性化ＰＥＧ誘導体を選択し、そして必要ならば合成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，７：１７５−１８６（１９８４）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：３５８２−３５８６（１９７７）；Ｊａｃｋｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６５：１１４−１２７（１９８７）；Ｋｏｉｄｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１１：６５９−６６７（１９８３））、トレシレート（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１０４：５６−６９（１９８４）；Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２：１１９−１２８（１９９０））；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導化活性エステル（Ｂｕｃｋｍ
ａｎｎら，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８２：１３７９−１３８４（１９８１）；Ｊｏｐｐｉｃｈら，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，１８０：１３８１−１３８４（１９７９）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，７：１７５−１８６（１９８４）；Ｋａｔｒｅｅｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８４：１４８７−１４９１（１９８７）；Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：４３１０−４３１５（１９９１）；Ｂｏｃｃｕら，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ，３８Ｃ：９４−９９（１９８３）；カーボネート（Ｚａｌｉｐｓｋｙら，ポリ（エチレングリコール）化学：生物工学的および生物医学的応用（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）、Ｈａｒｒｉｓ編集、プレナム出版、ニューヨーク、１９９２、第３４７−３７０頁；Ｚａｌｉｐｓｋｙら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１５：１００−１１４（１９９２）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１１：１４１−１５２（１９８５））；イミダゾリルホルメート（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３１：２５−３３（１９８３）；Ｂｅｒｇｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，７１：１６４１−１６４７（１９８８））；４−ジチオピリジン（Ｗｏｇｈｉｒｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，４：３１４−３１８（１９９３））；イソシアネート（Ｂｙｕｎら，ＡＳＡＩＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｍ６４９−Ｍ−６５３（１９９２））およびエポキシド（Ｎｏｉｓｈｉｋｉら．へ発効された米国特許第４，８０６，５９５号明細書（１９８９）を参照にされたい。他の連結基にはアミノ基と活性化ＰＥＧとの間のウレタン結合を含む。Ｖｅｒｏｎｅｓｅら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：１４１−１５２（１９８５）を参照にされたい。  
【０３４１】
反応性ＰＥＧ誘導体を利用する別の例示態様では、本発明はペプチドを糸球体によるタ
ンパク質の濾過を遅らせるためにペプチドを、十分なサイズの合成もしくは天然のポリマ
ーに結合させることにより、本質的に血液プールにペプチドを標的させて、選択したペプ
チドの血液循環半減期を伸ばす方法を提供する（例えばアルブミン）。本発明のこの態様
はスキーム３で具体的に説明するが、ここでエリスロポエチン（ＥＰＯ）を化学的および
酵素的修飾の組み合わせを使用してＰＥＧ連結剤を介してアルブミンに結合する。
【０３４２】
【化４６】
0005413548.tif 000023
【０３４３】
このようにスキーム３で示すように、アルブミンのアミノ酸残基はＸ−ＰＥＧ−（ＣＭＰ−シアル酸）（ここでＸは反応性基：例えば活性エステル、イソチオシアネート等）であるような反応性ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。ＰＥＧ誘導体およびＥＰＯは合わせられ、そしてＣＭＰ−シアル酸が基質であるトランスフェラーゼと接触させる。別の具体的説明の態様では、リシンのε−アミンをＰＥＧ−リンカーのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させてアルブミン結合物を形成する。連結剤（リンカー）のＣＭＰ−シアル酸はＥＰＯ上の適切な残基、例えばＧａｌに酵素的に結合し、これにより結合物が形成する。
当業者は上記の方法で説明した反応パートナーに限定されないと考えるだろう。さらにこの方法は、例えば２以上の末端を有する分岐連結剤を利用することにより２より多くのタンパク質部分を含む結合物を形成するために実施できる。
【０３４４】
２．修飾された糖
修飾されたグリコシル供与体種（「修飾された糖」）は好ましくは、修飾された糖ヌクレオチド、活性化された修飾された糖およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない単なるサッカリドである修飾された糖から選択される。任意の所望する炭水化物構造が本発明の方法を使用してペプチドに加えられる。典型的には構造は単糖であるが、本発明は修飾された単糖の糖の使用に限定されず；オリゴ糖および多糖も有用である。
【０３４５】
修飾された基は酵素的手段、化学的手段またはそれらの組み合わせにより糖部分に結合させ、これにより修飾された糖を生成する。糖は修飾部分の結合を可能とする任意の位置で置換されるが、それでもこれは糖を、修飾された糖がペプチドに連結するために使用する酵素の基質として機能することを可能とする。好適な態様ではシアル酸が糖である時、シアル酸はピルビル側の鎖上の９−位または通常はシアル酸中でアセチル化されるアミン部分上の５−位のいずれかで修飾基に置換される。
【０３４６】
本発明の特定の態様では、修飾された糖ヌクレオチドが修飾された糖をペプチドに加えるために利用される。本発明の方法において修飾された状態で使用される糖ヌクレオチドの例には、ヌクレオチドモノ−、ジ−またはトリ−ホスフェートまたはそれらの類似体を含む。好適な態様では修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシドまたはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより一層好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。糖ヌクレオチドのＮ−アセチルアミン誘導体も本発明の方法で使用される。
【０３４７】
本発明は、修飾された糖、例えば修飾された−ガラクトース、−フコースおよび−シアル酸を使用して修飾された糖ペプチドの合成法も提供する。修飾されたシアル酸を使用する時、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ（α２，３−結合シアル酸のみ）をこれらの方法に使用することができる。
【０３４８】
別の態様では、修飾された糖は活性化された糖である。本発明に有用な活性化された修飾された糖は、典型的には活性化された脱離基を含むように合成的に改変させたグリコシドである。本明細書で使用する用語「活性化された脱離基」は、酵素が調節する求核性置換反応で容易に置き換わる部分を称する。多くの活性化された糖が当該技術分野では知られている。例えばＶｏｃａｄｌｏら，炭水化物の化学および生物学（ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、第２巻、Ｅｒｎｓｔ編集、ウィリー−ＶＣＨファーラーグ；ヴァインハイム、ドイツ；Ｋｏｄａｍａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）；Ｌｏｕｇｈｅｅｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９））を参照にされたい。
【０３４９】
活性基（脱離基）の例にはフルオロ、クロロ、ブロモ、トシラートエステル、メシラートエステル、トリフラートエステル等を含む。本発明での使用に好適な活性化された脱離基は、グリコシドの受容体への酵素的転移を有意に立体的に妨害しないものである。従って、活性化されたグリコシド誘導体の好適態様には、グリコシルフルオリドおよびグリコシルメシラートを含み、グリコシルフルオリドが特に好適である。グリコシルフルオリドの中でもα−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グリコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアルフルオリド、α−Ｎ−アセチルグリコサミニルフルオリド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グリコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリドが最も好適である。
【０３５０】
具体的説明として、グリコシルフルオリドは最初に糖をアセチル化し、そして次にそれをＨＦ／ピリジンで処理することにより遊離糖から調製することができる。これは保護された（アセチル化）グリコシルフルオリドの熱力学的に最も安定なアノマーを生じる（すなわちα−グリコシルフルオリド）。より安定性が低いアノマー（すなわちβ−グリコシルフルオリド）を所望するならば、これはアノマー性ブロミドまたはクロライドを生成するために前アセチル化糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣｌを用いて転換することにより調製することができる。この中間体を臭化銀のような臭化物塩と反応させて、グリコシルフルオリドを生成する。アセチル化グリコシルフルオリドは、メタノール中の穏やか（触媒的）な塩基（例えばＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応により脱保護される。さらに、多くのグリコシルフルオリドが市販されている。
【０３５１】
他の活性化されたグリコシル誘導体は、当該技術分野で既知の常法を使用して調製することができる。例えば、グリコシルメシラートは完全にベンジル化されたヘミアセタール状態の糖をメシルクロライドで処理し、続いてベンジル基を除去するための触媒的水素添加により調製することができる。
【０３５２】
さらなる例示態様では、修飾された糖は分岐構造を有するオリゴ糖である。好適な態様では１以上の分岐の末端が修飾部分を持つ。１つの修飾部分が分岐構造を有
するオリゴ糖に結合する時、オリゴ糖は修飾基を「増幅」するために有用であり；ペプチドに結合した各オリゴ糖単位は、修飾基の多数のコピーをペプチドに結合する。上記の図に説明する本発明の典型的なはさみ状（ｃｈｅｌａｔｅ）の一般構造は、分岐構造を利用して本発明の結合物を調製することから生じる多価種を包含する。多くの分岐状サッカリド構造が当該技術分野では知られており、そして本発明は限定することなくそれらを用いて実施することができる。
【０３５３】
修飾基の例を以下で検討する。修飾基は１以上の望ましい特性のために選択することができる。特性の例には限定するわけではないが、強化された薬物動態学、強化された薬力学、改善された生体分布、多価種を提供すること、改善された水溶性、強化または縮小した親油性および組織ターゲッティングを含む。
【０３５４】
Ｄ．ペプチド結合物
ａ）水溶性ポリマー
選択したペプチドの親水性は、アミン−、エステル−、ヒドロキシル−およびポリヒドロキシル−含有分子のような極性分子との結合により強化される。代表例には限定するわけではないがポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）を含む。好適な水溶性ポリマーは本質的に非−蛍光性であるか、あるいはアッセイで蛍光マーカーとして使用するためには不適当であるような最少量の蛍光を発する。天然に存在しない糖であるポリマーを使用してもよい。さらに他の物質（例えばポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレン  グリコール）、ポリ（アスパルテート）、生体分子、治療部分、診断部分等）の共有結合により修飾されている外は天然に存在する糖の使用も意図している。別の例示態様では、治療用の糖部分を連結アームに結合し、そして糖−連結アームを続いて本発明の方法を介してペプチドに結合する。
【０３５５】
水溶性ポリマーおよび糖を活性化するための方法および化学、ならびにサッカリドおよびポリマーを種々の種に結合する方法は、技術文献に記載されている。ポリマーを活性化するために共通して使用する方法には、官能基の臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、スルホニルハライド、トリクロロトリアジン等での活性化を含む（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１）、タンパク質の固定化．基礎および応用（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）、マルセルデッカー、ニューヨーク；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２）、タンパク質結合および架橋化の化学（ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ）、ＣＲＣ出版、ボカラトン；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，（１９９３）、固定化アフィニティーリガンド技術（ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＬＩＧＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）、アカデミック出版、ニューヨーク；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌら，編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳシンポジウムシリーズ、第４６９巻、アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１）を参照にされたい。
【０３５６】
反応性ＰＥＧ分子を調製し、そして反応性分子を使用して結合物を形成する経路は、当該技術分野では既知である。例えば米国特許第５，６７２，６６２号明細書は、直鎖もしくは分岐ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー性酸の活性エステルの水溶性および単離可能な結合物を開示し、ここでポリマーは約４４個以上の反復単位を有する。
【０３５７】
米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、ポリマーの末端ヒドロキシルをジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートと有機溶媒中で反応させることにより、水溶性および非ペプチド性ポリマーの水溶性の１−ベンゾトリアゾリルカルボン酸エステルの調製法を説明する。活性エステルを使用してタンパク質またはペプチドのような生物学的な活性剤との結合物を形成する。
【０３５８】
国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、生物学的な活性剤および活性化された水溶性ポリマー（安定な連結を介してポリマー骨格に連結された少なくとも１つの末端を有するポリマー骨格を含んでなり、ここで少なくとも１つの末端は、分岐部分に連結された近接反応基を有する分岐部分を含んでなり、ここで生物学的な活性剤が少なくとも１つの近接反応基に連結している）を含んでなる結合物を記載する。他の分岐ポリ（エチレングリコール）は、国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載され、そして米国特許第５，９３２，４６２号明細書は、反応性官能基を含む分岐末端を含む分岐ＰＥＧ分子を用いて形成された結合物を記載する。遊離反応基はタンパク質またはペプチドのような生物学的な活性剤と反応することが可能であり、ポリ（エチレン  グリコール）と生物学的な活性種との間に結合物を形成する。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は二官能性ＰＥＧリンカーおよび各ＰＥＧリンカー末端にペプチドを有する結合物の形成におけるその使用を記載する。
【０３５９】
分解性ＰＥＧ結合を含む結合物は国際公開第９９／３４８３３号：および同第９９／１４２５９号パンフレットならびに米国特許第６，３４８，５５８号明細書に記載されている。そのような分解性結合は本発明に応用することができる。
【０３６０】
反応性ＰＥＧ誘導体およびこの誘導体を使用して形成した結合物の両方が当該技術分野で知られているが、本発明まで結合物がＰＥＧ（または他のポリマー）とペプチドまたは糖ペプチドのような別の種との間に完全なグリコシル連結基を介して形成され得ることは認識されなかった。
【０３６１】
多くの水溶性ポリマーが当業者により知られ、そして本発明を実施するするために有用である。水溶性ポリマーという用語は、サッカリド（例えばデキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）例えば、ポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えばポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えばポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質等のような種を包含する。本発明は任意の水溶性ポリマーを用いて実施することができ、唯一の限定はポリマーが結合物の残部（ｒｅｍａｉｎｄｅｒ）を結合することができる点を含まなければならないということだけである。
【０３６２】
ポリマーの活性化法は国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号、同第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号、同第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、そしてさらに国際公開第９３／１５１８９号パンフレットにも見いだすことができ、そして活性化ポリマーとペプチドとの間の結合物に関しては例えば、凝固第ＶＩＩＩ因子（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５（１９８５））に見いだすことができる。
【０３６３】
好適な水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプル中の実質的な割合のポリマー分子がおよそ同じ分子量であるものであり；そのようなポリマーは「単分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）」である。
【０３６４】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）結合物を参照にすることによりさらに具体的に説明される。ＰＥＧの官能化および結合について、幾つかの総説および小論が入手可能である。例えばＨａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）；およびＢｈａｄｒａら，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５−２９（２００２）を参照にされたい。
【０３６５】
本発明の使用に適するポリ（エチレン  グリコール）分子には限定するわけではないが、以下の式３により記載されるものを含む：
【０３６６】
【化４７】
0005413548.tif 000024
【０３６７】
Ｒ＝Ｈ、アルキル、ベンジル、アリール、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−、ＨＳ−ＣＨ２−ＣＨ２−、
【０３６８】
【化４８】
0005413548.tif 000025
【０３６９】
−糖−ヌクレオチド、タンパク質、メチル、エチル：  Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｕ（独立して選択される）＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−Ｒ’；
Ｒ’、Ｒ”’（独立して選択される）＝アルキル、ベンジル、アリール、アルキルアリール、ピリジル、置換アリール、アリールアルキル、アシルアリール；
ｎ＝１〜２０００；
ｍ、ｑ、ｐ（独立して選択される）＝０〜２０
ｏ＝０〜２０
Ｚ＝ＨＯ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ”’、活性化エステル、
【０３７０】
【化４９】
0005413548.tif 000026
【０３７１】
−糖−ヌクレオチド、タンパク質、イミダゾール、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド；そして  Ｖ＝ＨＯ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ”’、活性化エステル、活性化アミド、−糖−ヌクレオチド、タンパク質。
【０３７２】
好適な態様では、ポリ（エチレングリコール）分子は以下から選択される：
【０３７３】
【化５０】
0005413548.tif 000027
【０３７４】
本発明の結合物を形成するために有用なポリ（エチレングリコール）は、直鎖もしくは分岐している。本発明の使用に適する分岐ポリ（エチレングリコール）分子には、限定するわけではないが以下の式により記載されるものを含む：
【０３７５】
【化５１】
0005413548.tif 000028
【０３７６】
Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’（独立して選択される）＝Ｈ、アルキル、ベンジル、アリール、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−、ＨＳ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｑＣＹ−Ｚ、−糖−ヌクレオチド、タンパク質、メチル、エチル、ヘテロアリール、アシルアルキル、アシルアリール、アシルアルキルアリール：
Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｂ（独立して選択される）＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−Ｒ’（ＣＨ２）ｌ；
ｎ、ｐ（独立して選択される）＝１〜２０００；
ｍ、ｑ、ｏ（独立して選択される）＝０〜２０
Ｚ＝ＨＯ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ”’、活性化エステル、
【０３７７】
【化５２】
0005413548.tif 000029
【０３７８】
−糖−ヌクレオチド、タンパク質；
Ｖ＝ＨＯ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ”’、活性化エステル、活性化アミド、−糖−ヌクレオチド、タンパク質。
【０３７９】
治療用ペプチドの生体内半減期、曲線下面積および／または滞留時間も、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような水溶性ポリマーを用いて強化することができる。例えばＰＰＧを用いたタンパク質の化学的修飾（ＰＥＧ化：ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）はそれらの分子量サイズを上げ、そしてそれらの表面−および官能基−接近性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を下げるが、それぞれがタンパク質に結合したＰＰＧのサイズに依存する。これは血漿半減期およびタンパク質溶解的−安定性に改善をもたらし、そして免疫原性および肝臓の取り込みを下げる（Ｃｈａｆｆｅｅら．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３−１６５１（１９９２）；Ｐｙａｔａｋら，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３−１２７（１９８０））。インターロイキン−２のＰＥＧ化は、生体内で抗腫瘍効力を上昇させることが報告され（Ｋａｔｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７−１４９１（１９８７））、そしてモノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、その腫瘍への局在化を向上させた（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７−１３９４（１９９０））。
【０３８０】
１つの好適な態様では、本発明の方法により水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドの生体内半減期は、非−誘導化ペプチドの生体内半減期に比べて上昇する。別の好適な態様では、本発明の方法を使用して水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドの曲線下の面積は、非−誘導化ペプチドの曲線下面積に比べて上昇する。別の好適な態様では、本発明の方法を使用して水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドの滞留時間は、非−誘導化ペプチドの滞留時間に比べて上昇する。生体内半減期、曲線下面積および滞留時間を決定する技法は、当該技術分野では周知である。そのような技法の説明は、Ｊ．Ｇ．Ｗａｇｎｅｒ、１９９３、製薬科学者のための薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）、テクノミック出版社（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．）、ランカスター、ペンシルベニア州）に見出すことができる。
【０３８１】
ペプチドの生体内半減期の上昇は、この量における上昇の割合の範囲で最も良く表される。上昇の割合の範囲の下限は約４０％、約６０％、約８０、約１００％、約１５０％または約２００％である。この範囲の上限は約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％または約２５０％以上である。
【０３８２】
例示態様では、本発明はＰＥＧ化された濾胞刺激ホルモンを提供する（実施例９２３および１０２４）。さらなる例示態様では、本発明はＰＥＧ化トランスフェリンを提供する（実施例１３４２）。
【０３８３】
本発明で使用する他の水溶性ポリマーの例には、限定するわけではないが直鎖もしくは分枝ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）およびポリ（アクリロモルホリン）、デキストラン、澱粉、ポリ（アミノ酸）等を含む。
【０３８４】
ｂ）水−不溶性ポリマー
本発明の結合物は１以上の水−不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの態様は、治療用ペプチドを制御された様式で送達する賦形剤としての結合物の使用により具体的に説明される。ポリマー性の薬剤送達系は当該技術分野では既知である。例えばＤｕｎｎら、ポリマー性薬剤および薬剤送達系（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳシンポジウムシリーズ、第４６９巻、アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１を参照にされたい。当業者は実質的に任意の既知の薬剤送達系を本発明の結合物に応用できると考えるだろう。
【０３８５】
代表的な水−不溶性ポリマーには限定するわけではないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシル  アクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルクロライド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールおよびそれらのコポリマーを含む。
【０３８６】
本発明の結合物で使用する合成的に修飾された天然ポリマーには、限定するわけではないがアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステルおよびニトロセルロースを含む。広い種類の合成的に修飾された天然ポリマーの特に好適な員には、限定するわけではないがメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩およびアクリル酸およびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーを含む。
【０３８７】
本明細書で検討するこれらのおよび他のポリマーは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（セントルイス、モンタナ州）、ポリサインエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）、ウァレントン、ペンシルベニア州）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、フルカ（ロンコンコーマ、ニューヨーク州）およびバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（リッチモンド、カリフォルニア州）のような市販の供給源から容易に得ることができ、あるいはこれらの供給元から得たモノマーから標準技術を使用して合成することができる。
【０３８８】
本発明の結合物に使用する代表的な生分解性ポリマーには、限定するわけではないがポリラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらのブレンドおよびコポリマーを含む。特別な使用は、コラーゲン、プルロニック等を含むもののようなゲルを形成する組成物である。
【０３８９】
本発明におけるポリマーの使用には、それらの構造の少なくとも一部の中に生物再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）分子を有する水不溶性材料を含む「ハイブリッド」ポリマーを含む。そのようなポリマーの例は、ポリマー鎖あたり生物再吸収性領域、親水性領域および複数の架橋結合可能な官能基を有する水−不溶性コポリマーを含むものである。
【０３９０】
本発明の目的のために、「水−不溶性材料」には水または水を含有する環境中で実質的に不溶性である材料を含む。すなわちコポリマーの特定領域またはセグメントは親水性または水溶性でもよく、全体としてポリマー分子は任意の実質的な限界まで水に溶解しない。
【０３９１】
本発明の目的のために、用語「生物再吸収性分子」には代謝または分解され、そして再吸収および／または身体による正常な排出経路を介して排除され得る領域を含む。そのような代謝産物または分解産物は、好ましくは身体に対して実質的に非毒性である。
【０３９２】
生物再吸収性領域は、コポリマー組成物を全体として水溶性にしない限り、疎水性または親水性のいずれかでよい。すなわち生物再吸収性領域はポリマーが全体として水−不溶性を保持することの優先性に基づき選択される。したがって関連する特性、すなわち含まれる官能基の種類、および生物再吸収性領域の相対的割合、および親水性領域は、有用な生物再吸収性組成物が水−不溶性を保持することを確実にするように選択される。
【０３９３】
再吸収性ポリマーの例には、例えばポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に生成される再吸収性ブロックコポリマーを含む（Ｃｏｈｎら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照にされたい）。これらのコポリマーは架橋結合されず、そして水溶性であるので身体は分解したブロックコポリマー組成物を排出することができる。Ｙｏｕｎｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１−１３１６（１９８７）；およびＣｏｈｎら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３−１００９（１９８８）を参照にされたい。
【０３９４】
現在好適な生物再吸収性ポリマーには、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖およびそれらの混合物から選択される１以上の成分を含む。より好ましくはさらに生物再吸収性ポリマーにはポリ（ヒドロキシ）酸成分を含む。ポリ（ヒドロキシ）酸の中で、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカルプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸およびそれらのコポリマーおよび混合物が好ましい。
【０３９５】
生体内で吸収される（「生物に吸収される」）フラグメントを形成することに加えて、本発明の方法での使用に好適なポリマー性コーティングも、排出可能かつ／または代謝可能なフラグメントを生成することができる。
【０３９６】
高次コポリマーも本発明に使用することができる。例えば１９８４年、３月２０日に発効されたＣａｓｅｙら、米国特許第４，４３８，２５３号明細書は、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル−末端化ポリ（アルキレングリコール）のエステル交換反応から生産されるトリ−ブロックコポリマーを開示する。そのような組成物は再吸収性モノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。そのような組成物の柔軟性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートのような芳香族オルトカーボネートをコポリマー構造に包含させることにより制御される。
【０３９７】
乳酸および／またはグリコール酸に基づく他のコーティングも利用することができる。例えば１９９３年４月１３日に発効されたＳｐｉｎｕ、米国特許第５，２０２，４１３号明細書は、ラクチドおよび／またはグリコリドのオリゴジオールまたはジアミン残基への開環重合、続いてジイソシアネート、ジアシルクロライドまたはジクロロシランのような二官能性化合物を用いた鎖延長により生産されたポリラクチドおよび／またはポリグリコリドを順次に配置した（ｏｒｄｅｒｅｄ）ブロックを有する生分解性マルチ−ブロックコポリマーを開示する。
【０３９８】
本発明に有用なコーティングの生物再吸収性領域は、加水分解的かつ／または酵素的に開裂できるように設計することができる。本発明の目的のために、「加水分解的に開裂可能な」とは、水中または水を含む環境下で加水分解に対するコポリマー、特に生物再吸収性領域の感受性を指す。同様に本明細書で使用する「酵素的に開裂可能な」とは、内因性または外因性酵素による開裂に対するコポリマー、特に生物再吸収性領域の感受性を指す。
【０３９９】
身体内に置かれた時、親水性領域は排出可能かつ／または代謝可能なフラグメントに処理され得る。すなわち親水性領域には例えばポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキル  オキサゾリン）、多糖、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびそれらのコポリマーおよび混合物を含むことができる。さらに親水性領域は例えばポリ（アルキレン）オキシドであることもできる。そのようなポリ（アルキレン）オキシドには、例えばポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドおよびそれらの混合物およびコポリマーを含むことができる。
【０４００】
ヒドロゲルの成分であるポリマーも本発明に有用である。ヒドロゲルは比較的大量の水を吸収することができるポリマー性材料である。ヒドロゲル形成化合物の例には限定するわけではないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カラゲーナンおよび他の多糖、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）ならびにそれらの誘導体等を含む。安定で、生分解性の、そして生物再吸収性であるヒドロゲルを生成することができる。さらにヒドロゲル組成物は１以上のこれらの特性を現すサブユニットを含むことができる。
【０４０１】
完全性が架橋結合を介して制御され得る生物適合性（ｂｉｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ヒドロゲル組成物が知られており、そして現在、本発明の方法で使用するために好適である。例えば１９９５年４月２５日に発効されたＨｕｂｂｅｌｌら、米国特許第５，４１０，０１６号明細書および１９９６年６月２５日に発効された米国特許第５，５２９，９１４号明細書は、２つの加水分解的に不安定な延長物の間に挟まれた水溶性の中央ブロックセグメントを有する架橋結合したブロックコポリマーである水溶性の系を開示する。そのようなコポリマーは光重合性アクリレート官能基を用いてさらにエンド−キャップ化されている。架橋結合する時、これらの系はヒドロゲルになる。そのようなコポリマーの水溶性の中央ブロックには、ポリ（エチレングリコール）を含むことができ；一方加水分解的に不安定な延長物はポリグリコール酸またはポリ乳酸のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）であることができる。Ｓａｗｈｎｅｙら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１−５８７（１９９３）を参照にされたい。
【０４０２】
別の好適な態様では、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびそれらの組み合わせのような成分を含む熱可逆性ゲルが現在好適である。
【０４０３】
さらに別の例示態様では、本発明の結合物はリポソームの成分を含む。リポソームは例えば１９８５年、６月１１日に発効されたＥｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているように、当該技術分野で既知の方法に従い調製することができる。例えばリポソーム配合物は適当な脂質（１つまたは複数）（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイル  ホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリンおよびコレステロールのような）を無機溶媒に溶解し、これを次いで蒸発させ、容器の表面上の乾燥脂質の薄いフィルムを残しておくことにより調製することができる。次いで活性化合物またはその製薬学的に許容され得る塩の水溶液を容器に注ぐ。次いで容器を手で旋回して、容器の側面から脂質材料を解放し（ｆｒｅｅ）、そして脂質凝集物を分配し、これによりリポソーム懸濁液を形成する。
【０４０４】
上記に引用した微粒子および微粒子の調製法は例として提供され、そしてそれらは本発明で使用する微粒子の範囲を定めることを意図しない。当業者は異なる方法により作成される多くの微粒子を本発明に使用できると考えるだろう。
【０４０５】
ｃ）生体分子
別の好適な態様では、修飾された糖は生体分子を持つ。さらに好適な態様では、生体分子は機能的タンパク質、酵素、抗原、抗体、核酸（例えばシングルヌクレオチドまたはヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび１−およびより多い鎖の核酸）、レクチン、レセプターまたはそれらの組み合わせである。
【０４０６】
幾つかの好適な生体分子は本質的に非−蛍光性であり、またはアッセイで蛍光マーカーとして使用するには不適切な最少量の蛍光を発する。他の生体分子は蛍光でもよい。別の物体（例えばＰＥＧ、生体分子、治療部分、診断部分等）の共有結合により修飾されている外は天然に存在する糖の使用が適当である。例示態様では、生体分子である糖部分を連結アームに結合し、そして糖−連結アームカセットを続いて本発明の方法を介してペプチドに結合する。
【０４０７】
本発明の実施に有用な生体分子は、任意の供給源に由来することができる。生体分子は天然な供給源から単離することができ、またはそれらは合成法により生成することができる。ペプチドは天然なペプチドまたは突然変異したペプチドであることができる。突然変異は化学的な突然変異誘発法、部位−特異的突然変異誘発法または当業者に既知の突然変異を導入する他の手段により行うことができる。本発明の実施で有用なペプチドには例えば、酵素、抗原、抗体およびレセプターを含む。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでよく；完全またはフラグメントのいずれかであることができる。ペプチドは任意に方向付けされた進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）のプログラムの産物である。
【０４０８】
天然に由来する、および合成ペプチドの両方および核酸も本発明と共に使用される；これらの分子は糖残基成分または架橋結合剤に利用可能な反応基により結合することができる。例えばペプチドは反応性アミン、カルボキシル、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基を介して結合することができる。反応基はペプチド末端またはペプチド鎖に対して内部に存在することができる。核酸は塩基（例えばエキソ環式アミン）上の反応基または糖部分の利用可能なヒドロキシル基（例えば３’−または５’−ヒドロキシル）を介して結合することができる。ペプチドおよび核酸鎖はさらに１以上の部位で誘導化されて、適切な反応基を鎖に付けることが可能となる。例えばＣｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３０３１−３０３９（１９９６）を参照にされたい。
【０４０９】
さらに好適な態様では、生体分子を選択して本発明の方法により修飾したペプチドを特異的組織に向け、これによりその組織に送達される非誘導化ペプチドの量に比べてペプチドのその組織への送達を強化する。さらなに好適な態様では、選択した時間内に特異的な組織へ送達される誘導化ペプチドの量は、誘導化により少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、そしてより好ましくは少なくともさらに約１００％まで強化する。現在、標的化に応用するために好適な生体分子には抗体、ホルモンおよび細胞表面レセプターのリガンドを含む。模範的に標的となる生物分子には、限ったことではないが、脳へ分子を供給するトランスフェリン  レセプターに特有の抗体（Penichetら, 1999, J. Immunol. 163: 4421-4426; Pardridge, 2002, Adv. Exp. Med. Biol. 513: 397-430）や前立腺の血管系を認識するペプチド（Arapら, 2002, PNAS 99: 1527-1531）や肺のカベオラに特有の抗体（McIntoshら, 2002, PNAS 99: 1996-2001）が含まれる。
【０４１０】
現在好適な態様では、修飾基はタンパク質である。例示態様では、タンパク質はインターフェロンである。ヒトではインターフェロンは、ウイルスまたは二本鎖ＲＮＡで誘導した後にヒトの１次繊維芽細胞により分泌される抗ウイルス糖タンパク質である。インターフェロンは治療薬として、例えば抗ウイルス剤および多発性硬化症の処置に興味深い。インターフェロン−βを考察した参考文献については、例えばYuら, J. Neuroimmunol., 64(1):91-100(1996); Schmidt, J., J. Neurosci. Res., 65(1): 59-67(2001); Wenderら, Folia Neuropathol., 39(2):91-93 (2001); Martinら. Springer  Semin.Immunopathol.,18(1):1-24(1996); Takaneら, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294(2):746-752 (2000); Sburlatiら, Biotechnol . Prog., 14:189-192 (1998); Doddら, Biochimica et Biophysica Acta, 787:183-187(1984); Edelbaumら., J. Interferon Res., 12:449-453 (1992); Conradtら, J. Biol. Chem., 262(30):14600-14605(1987); Civasら, Eur. J. Biochem., 173:311-316(1988); Demolderら, J. Biotechnol., 32:179-189(1994); Sedmakら, Interferon Res., 9(Suppl 1): S61-S65 (1989); Kagawaら, J. Biol. Chem., 263(33): 17508-17515 (1988); Hershensonら, U.S. Patent No. 4,894,330; Jayaramら, J. Interferon Res., 3(2): 177-180(1983); Mengeら, Develop. Biol. Standard., 66: 391-4
01 (1987); Vonkら, J. Interferon Res., 3(2): 169-175 (1983); and Adolfら, J. Interferon Res., 10:255-267 (1990). For references relevant to interfer
on-, see, Asanoら, Eur. J. Cancer, 27(Suppl 4): S21-S25 (1991); Nagyら, Anticancer Research, 8(3): 467-470 (1988); Dronら, J. Biol. Regul. Hom
eost. Agents, 3(1): 13-19(1989); Habibら, Am. Surg., 67(3): 257-260 (3/200
1); および Sugyiamaら, Eur. J. Biochem., 217: 921-927 (1993)を参照にされたい。
【０４１１】
インターフェロン結合物の例では、インターフェロンβは連結アームを介して第２ペプチドに結合する。連結アームには完全なグリコシル連結基を含み、これを通して本発明の方法を介して第２ペプチドに連結する。連結アームも場合により第２の完全なグリコシル連結基も含み、これを通してインターフェロンに結合する。
【０４１２】
別の例示態様では、本発明は濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の結合物を提供する。ＦＳＨは糖タンパク質ホルモンである。例えばSaneyoshiら, Biol. Reprod., 65: 1686-1690 (2001); Hakolaら, J. Endocrinol., 158: 441-448 (1998); Stantonら, Mol. Cell. Endocrinol., 125:133-141 (1996); Waltonら, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86(8): 3675-3685 (08/2001); Ulloa-Aguirreら, Endocrine, 11(3): 205-215 (12/1999); Castro-Fernadezら, J. Clin. Endocrinol. Matab., 85(12): 4603-4610 (2000); Prevost, Rebecca  R.,Pharmacotherapy, 18(5): 1001-1010 (1998); Linskensら, The FASEB Journal, 13: 639-645 (04/1999); Butnevら, Biol. Reprod., 58:458-469 (1998); Muyanら, Mol. Endo., 12(5): 766-772 (1998); Min, ら, Endo. J., 43(5): 585-593 (1996); Boimeら, Recent Progress in Hormone Research, 34: 271-289 (1999); および Raffertyら, J. Endo., 145: 527-533 (1995)を参照にされたい。ＦＳＨ結合物はインターフェロンについて上に記載した様式に準じて形成することができる。
【０４１３】
さらに別の例示態様では、結合物はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む。ＥＰＯは低酸素に対する反応を媒介し、そして赤血球の生産を刺激することが知られている。関連する参考文献については、Ｃｅｒａｍｉら，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２８（２）（Ｓｕｐｐｌ８）：６６−７０（０４／２００１）を参照にされたい。例示のＥＰＯ結合物は、インターフェロンの結合物に準じて形成される。
【０４１４】
さらなる例示態様では、本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の結合物を提供する。Ｇ−ＣＳＦはニュートロポイエティック（ｎｅｕｔｒｏｐｏｉｅｔｉｃ）前駆細胞の機能的に成熟した好中球への増殖、分化および活性化を刺激する糖タンパク質である。注入されたＧ−ＣＳＦは身体から急速に排除されることが知られている。例えばＮｏｈｙｎｅｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３９：２５９−２６６（１９９７）；Ｌｏｒｄら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７（７）：２０８５−２０９０（０７／２００１）；Ｒｏｔｏｎｄａｒｏら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１（２）：１１７−１２８（１９９９）；およびＢｏｅｎｉｇら，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２８：２５９−２６４（２００１）を参照にされたい。Ｇ−ＣＳＦの例示結合物は、インターフェロンの結合物について上に記載したように調製される。当業者は多くの他のタンパク質が、限定するわけではないが表７と８（本明細書のいたるところに記載する）および図２８、および個々の修飾スキームが提示されている図２９〜５７に掲げるペプチドを含む本発明の方法および組成物を使用して、インターフェロンに結合することができると考えるだろう。
【０４１５】
さらなる例示態様では、ビオチンとの結合物が提供される。すなわち例えば選択的にビオチン化されたペプチドは、１以上の修飾基を持つアビジンまたはストレプトアビジン部分の結合により仕上げられる。
【０４１６】
さらに好適な態様では、生体分子は本発明の方法により修飾したペプチドを特異的な細胞内コンパートメントへ向けるために選択され、これにより組織に送達される非誘導化ペプチドの量に比べて細胞内コンパートメントへのペプチドの送達を強化する。さらに好適な態様では、選択した時間内に特異的な細胞区画へ送達される誘導化ペプチドの量を誘導化により、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１００％まで強化する。別の特に好適な態様では生体分子は、いったん内面化されると加水分解することができる開裂可能な連結剤（リンカー）によりペプチドに連結される。細胞内ターゲッティングの応用に現在好適な生体分子には、トランスフェリン、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）、メラノトランスフェリン（ｐ９７）、セルロプラスミンおよび二価のカチオン輸送体、そしてまた特異的に血管を標的とした抗体が含まれる。を含む。意図する連結には限定するわけではないが、タンパク質−糖−連結剤−糖−タンパク質、タンパク質−糖−連結剤−タンパク質およびそれらの多価形態、および薬剤がとりわけ低分子、ペプチド、脂質を含むタンパク質−糖−連結剤−薬剤を含む。
【０４１７】
治療薬の部位特異的および標的−指向的送達は、種々の悪性疾患および特定の神経障害のようなヒトの広い種々の疾患を処置する目的に望ましい。そのような手順は薬剤のより少ない副作用およびより高い効率で達成される。これらの送達系の設計は様々な原理に頼るものであった。総説については、Ｇａｒｎｅｔｔ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５３：１７１−２１６（２００１）を参照にされたい。
【０４１８】
組織を特異的に標的するために、薬剤送達系の設計における１つの重要な考察。腫瘍表面抗原の発見により、定めることができる表面抗原を提示している腫瘍細胞を特異的に標的とし、そして殺す治療的取り組みを開発することが可能となった。悪性疾患の処置においてヒトの臨床試験で効果が証明された３つの主要のクラスの治療用モノクローナル抗体（抗体）がある：（１）非結合ＭＡｂ、これは成長阻害および／またはアポトーシスを直接誘導するか、あるいは抗腫瘍細胞傷害性を媒介するために宿主の防御メカニズムを間接的に活性化する；（２）薬剤を結合したＭＡｂ、これは有力な細胞傷害性トキシンを腫瘍細胞に優先的に送達し、したがって従来の化学療法に普通は付随する全身性の細胞傷害性を最少とする；および（３）放射性同位体を結合したＭＡｂ、これは腫瘍に殺菌用量の放射線を送達する。Ｒｅｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ９：１５２−１６６（２００２）による総説を参照にされたい。
【０４１９】
悪性細胞を殺す力を持つＭＡｂを準備するために、ＭＡｂを植物、細菌または菌類の供給源から得たトキシンに結合して、イムノトキシンと呼ばれるキメラタンパク質を形成することができる。頻繁に使用される植物トキシンは２種類に分類される：（１）リシン、アブリン、アメリカヤドリギ  レクチン、およびモデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）のようなホロトキシン（またはクラスＩＩリボソーム不活性化タンパク質）、および（２）アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、Ｂｒｙｏｄｉｎ１、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）およびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）のようなヘミトキシン（クラスＩリボソーム不活性化タンパク質）。よく使用される細菌トキシンには、ジフテリアトキシン（ＤＴ）およびシュードモナスのエキソトキシン（ＰＥ）を含む。Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：３１３−３２５（２００１）。本発明との使用に検討された他のトキシンが含まれるが、しかし表２におけるものに限定されない
【０４２０】
【表２-１】
0005413548.tif 000030
【表２−２】
0005413548.tif 000031
【表２−３】
0005413548.tif 000032
【表２−４】
0005413548.tif 000033
【表２−５】
0005413548.tif 000034
【表２−６】
0005413548.tif 000035
【表２−７】
0005413548.tif 000036
【表２−８】
0005413548.tif 000037
【表２−９】
0005413548.tif 000038
【表２−１０】
0005413548.tif 000039
【表２−１１】
0005413548.tif 000040
【表２−１２】
0005413548.tif 000041
【表２−１３】
0005413548.tif 000042
【表２−１４】
0005413548.tif 000043
【表２−１５】
0005413548.tif 000044
【表２−１６】
0005413548.tif 000045
【表２−１７】
0005413548.tif 000046
【表２−１８】
0005413548.tif 000047
【表２−１９】
0005413548.tif 000048
【表２−２０】
0005413548.tif 000049
【表２−２１】
0005413548.tif 000050
【表２−２２】
0005413548.tif 000051
【表２−２３】
0005413548.tif 000052
【表２−２４】
0005413548.tif 000053
【表２−２５】
0005413548.tif 000054
【表２−２６】
0005413548.tif 000055
【表２−２７】
0005413548.tif 000056
【表２−２８】
0005413548.tif 000057
【０４２１】
通例のイムノトキシンは、正常細胞への結合を最少にするために突然変異または化学的に修飾したトキシンに化学的に結合したＭＡｂを含む。例にはＣＤ５を標的とする抗−Ｂ４−ブロック化リシン；およびＣＤ２２を標的とするＲＦＢ４−脱グリコシル化リシンＡ鎖を含む。より最近開発された組換えイムノトキシンは、組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質トキシンに融合させた腫瘍抗原に対して向けられた抗体の可変領域からなるキメラタンパク質である。トキシンはまた、正常組織結合部位は除去するが、その細胞傷害性を保持するために、頻繁に遺伝的に修飾される。造血性ガン、グリオーマおよび胸部、結腸、卵巣、膀胱および胃腸管のガンを含む種々の悪性疾患を処置するために、イムノトキシンの標的として多数の分化抗原、過剰発現したレセプターまたはガン−特異的抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）、ＣＤ３３、ＩＬ−４レセプター、ＥＧＦレセプターおよびその突然変異体、ＥｒＢ２、ルイス炭水化物、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、トランスフェリンレセプター、ＧＭ−ＣＳＦレセ
プター、Ｒａｓ、Ｂｃｒ−Ａｂ１およびｃ−Ｋｉｔが同定された。例えばＢｒｉｎｋｍａｎｎら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：６９３−７０２（２００１）；Ｐｅｒｅｎｔｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｅｉｃａ  １５：６７７−７０１（２００１）を参照にされたい。
【０４２２】
放射性同位体に結合したＭＡｂは、ヒトの悪性疾患、特に造血性の悪性疾患を高レベルの特異性および効力で処置する別の手段として使用される。最もよく使用される治療用の同位体は、１３１Ｉおよび９０Ｙのような高エネルギー−エミッターである。最近、２１３Ｂｉ−標識抗−ＣＤ３３ヒト化ＭＡｂも、フェイズＩのヒト臨床試験で試験された。Ｒｅｆｆら，同上。
【０４２３】
多数のＭＡｂが治療目的に使用されてきた。例えば特定の造血性悪性疾患を処置するために、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））、組換えキメラ抗−ＣＤ２０ＭＡｂの使用が１９９７年にＦＤＡにより認可された。それからヒトのガンの処置に治療的使用が認められた他のＭＡｂには：アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（商標））、ＣＤ５２に対するヒト化ラット抗体；およびジェンツズマブ  オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ：Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標））、カリーチマイシン（ｃａｌｉｃｈｅｍｉｃｉｎ）−結合ヒト化マウス抗ＣＤ３３ＭＡｂを含む。現在、ＦＤＡはまた細胞傷害剤または照射、例えば放射標識Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）およびＢｅｘｘａｒ（商標）の部位特異的送達を目的にするための数種の他のＭＡｂの安全性および効力も調査している。Ｒｅｆｆら，同上。
【０４２４】
薬剤送達系の設計において２番目に重要な考察は、標的とする組織の治療薬への接近性である。これは血液脳関門が高分子の拡散を妨害する中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患を処置する場合に特に関心のある事柄である。治療薬のＣＮＳへの効率的送達のために、血液脳関門をバイパスするための幾つかの取り組みが開発された。
【０４２５】
血漿から脳への鉄輸送メカニズムを解明することは、血液脳関門（ＢＢＢ）のバイパスに有用な道具を提供した。トランスフェリンにより血漿中で輸送される鉄は、ほとんどすべての種類の細胞に必須な成分である。脳は代謝プロセスに鉄を必要とし、そして脳の毛細管内皮細胞に位置するトランスフェリンレセプターを通して、レセプターが媒介するトランスサイトーシスおよびエンドサイトーシスを介して鉄を受容する。Ｍｏｏｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：７７−９５（２０００）。トランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作用に基づく送達系が、ペプチド、タンパク質およびリポソームを脳に効率的に送達するために確立された。例えばペプチドは脳によるより多い取り込みを達成するために、トランスフェリンレセプターに対して向けられたＭａｂにカップリングすることができる、Ｍｏｏｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ、同上。同様に、トランスフェリンレセプターに向けられたＭＡｂにカップリングした時、血液脳関門全域の塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ
ＦＧＦ）の輸送が強化される。Ｓｏｎｇら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３０１：６０５−６１０（２００２）；Ｗｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １０：２３９−２４５（２００２）。さらに化学療法剤、ドキソルビシンのＣ６グリオーマへの効果的輸送のためのリポソーム送達系が報告され、ここでトランスフェリンはリポソームＰＥＧ鎖の遠位末端に結合された。Ｅａｖａｒｏｎｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５１：１０−１４（２０００）。多数の米国特許もトランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作用に基づき血液−脳関門をバイパスする送達法に関する。例えば米国特許第５，１５４，９２４号；同第５，１８２，１０７号；同第５，５２７，５２７号；同第５，８３３，９８８号；同第６，０１５，５５５号明細書を参照にされたい。
【０４２６】
血液脳関門をバイパスするための製剤用に適する他の結合パートナーがある。例えば米国特許第５，６７２，６８３号、同第５，９７７，３０７号明細書および国際公開第９５／０２４２１号パンフレットは、血液脳関門をわたる神経製剤を送達する方法に関し、ここで薬剤は脳の毛細管内皮細胞レセプターと反応性のリガンドとの融合タンパク質の状態で投与される；国際公開第９９／００１５０号パンフレットは、血液脳関門をわたる薬剤の輸送が、ヒトのインスリンレセプターに対して向けられたＭＡｂとの結合により促進される薬剤送達系を記載する；国際公開第８９／１０１３４号パンフレットは、脳へ親水性の神経ペプチドを導入する手段として、比較的高速で血液脳関門をわたることができるペプチドおよびトランスサイトーシスできない親水性の神経ペプチドを含むキメラペプチドを開示する；国際公開第０１／６０４１１  Ａ１号パンフレットは、製薬学的な有効成分を脳に容易に輸送することができる製薬学的組成物を提供する。有効成分は結合物として使用されるヒバーネーション（ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ）−特異的タンパク質に結合させ、そして甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンの生産を促進する物質と共に投与さる。さらに血液脳関門をバイパスするために、別の薬剤送達経路が調査された。例えば結合を必要としない治療薬の鼻内送達は別の送達法の可能性を示した（Ｆｒｅｙ，２００２，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（５）：４６−４９）。
【０４２７】
血液脳関門をわたる薬剤の輸送を促進することに加えて、トランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作用は、多くの腫瘍細胞がそれらの表面上にトランスフェリンレセプターを過剰発現するので、特定の腫瘍細胞の特異的標的化にも有用である。この方法はトランスフェリン結合物を介してＫ５６２細胞に生物活性高分子を送達するために（Ｗｅｌｌｈｏｎｅｒら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６：４３０９−４３１４（１９９１））、そしてトランスフェリン結合物を介して腸細胞−様Ｃａｃｏ−２細胞にインスリンを送達するために（Ｓｈａｈ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８５：１３０６−１３１１（１９９６））使用されてきた。
【０４２８】
さらにラクトトランスフェリンレセプター、メラノトランスフェリン、セルロプラスミンのような種々の鉄輸送タンパク質の機能、および二価のカチオン輸送体およびそれらの発現パターンについてより知られるようになったので、鉄輸送メカニズムに関与する幾つかのタンパク質（例えばメラノトランスフェリン）またはそれらのフラグメントは、血液脳関門をわたる治療薬の輸送、または特異的組織のターゲッティングを支援するために同様に効果的であることが分かった（国際公開第０２／１３８４３Ａ２号、同第０２／１３８７３Ａ２号パンフレット）。薬剤送達において、結合物としての鉄の取り込みが関与するトランスフェリンおよび関連タンパク質の使用に関する総説は、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｑｉａｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２２：２２５−２５０（２００２）を参照にされたい。
【０４２９】
治療薬の組織−特異的送達の概念は、トランスフェリンとトランスフェリンレセプターまたはそれらの関連タンパク質との間の相互作用を越える。例えば石化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ）した組織へのタンパク質の送達を改善するために、タンパク質が骨を探す（ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ）アミノビホスフェートと結合した骨−特異的送達系が記載された。Ｕｌｕｄａｇ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：６０４−６１１（２００２）。この話題に関する総説は、Ｖｙａｓら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  １８：１−７６（２００１）を参照にされたい。  
【０４３０】
種々のリンカーを、治療薬の特異的送達の目的で生物結合物の生成法に使用することができる。適当な連結剤には、例えば酸−触媒型の解離により開裂され得る、あるいは非−開裂性のホモ−およびヘテロ二官能性架橋結合試薬を含む（例えば、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｃｈａｒ  ａｎｄ  Ｎｅｖｉｌｌｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：２５０１−２５０９（１９８９）；Ｗｅｌｌｈｏｎｅｒら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６：４３０９−４３１４（１９９１）を参照にされたい）。ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビシンのような多くの既知の結合パートナー間の相互作用も、治療薬と治療薬の特異的かつ効果的送達を確実とする結合パートナーとを連結する手段として使用することができる。本発明の方法を使用して、タンパク質は分子を結合物として細胞内コンパートメントへ送達するために使用することができる。リガンド結合後に内面化される、特異的な細胞表面レセプターに結合するタンパク質、ペプチド、ホルモン、サイトカイン、低分子等は、結合した治療用化合物の細胞内ターゲッティングに使用することができる。典型的にはレセプター−リガンド複合体は、特異的な細胞コンパートメントへ送達される細胞内小胞中に内面化され、これらのコンパートメントには限定するわけではないがレセプターにより標的化される細胞内の位置に依存して核、ミトコンドリア、ゴルジ、ＥＲ、リソソームおよびエンドソームを含む。レセプターリガンドを所望する分子に結合することにより、薬剤はレセプター−リガンド複合体で運ばれ、そしてレセプターにより通常は標的とされる細胞内の位置へ送達される。したがって薬剤は疾患の処置が必要とされている細胞の特異的な細胞内の位置へと送達され得る。
【０４３１】
多くのタンパク質が治療薬を特異的な組織および器官を標的とするために使用することができる。標的化タンパク質には限定するわけではないが増殖因子（とりわけＥＰＯ、ＨＧＨ、ＥＧＦ、神経成長因子、ＦＧＦ）、サイトカイン（とりわけＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンファミリー、インターロイキン）、ホルモン（とりわけＦＳＨ、ＬＨ、ステロイドファミリー、エストロゲン、コルチコステロイド、インスリン）、血清タンパク質（とりわけアルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、ヒト血清タンパク質、抗体および抗体のフラグメント）、およびビタミン（とりわけ葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＡ）を含む。ほとんどの細胞型上のレセプターに特異的な標的化剤も利用可能である。
【０４３２】
企図する連結の立体配置には、限定するわけではないがタンパク質−糖−連結剤−糖−タンパク質およびそれらの多価の形態、タンパク質−糖−連結剤−タンパク質およびそれらの多価の形態、タンパク質−糖−連結剤−治療薬（ここで治療薬には限定するわけではないが低分子、ペプチドおよび脂質を含む）を含む。幾つかの態様では、いったん内面化されれば加水分解され得る加水分解可能な連結剤を使用する。酸性ｐＨを有するエンドソームまたはリソソーム中にタンパク質結合物が内面化される場合、酸に不安定な連結剤を使用することは有利となり得る。いったんエンドソームまたはリソソーム中に内面化されれば、連結剤は加水分解され、そして治療薬が標的剤から放出される。
【０４３３】
例示態様では、トランスフェリンは、患者中でトランスフェリンレセプターを提示する細胞を標的することが望まれる酵素または酵素をコード化した核酸ベクトルに連結剤を介して連結される。患者は例えばその特定の酵素について酵素代替療法を必要とすることができる。特に好適な態様では、酵素はリソソーム蓄積疾患の患者に欠けているものである（表５を参照にされたい）。いったん循環に入れば、トランスフェリン−酵素結合物はトランスフェリンレセプターに結合連結し、そして早期にエンドソームにより内面化される（Ｘｉｎｇ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３６：６６７；Ｌｉら．，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：２０６；Ｓｕｈａｉｌａら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４３５５）。トランスフェリンに関する他の企図する標的剤には、限定するわけではないがラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）、メラノトランスフェリン（ｐ９７）、セルロプラスミンおよび二価カチオン輸送体を含む。
【０４３４】
別の例示態様では、トランスフェリン−ジストロフィン結合物がトランスフェリン経路によりエンドソームに入る。いったん入れば、ジストロフィンが加水分解可能な連結剤により放出され、これは次いで必要とされる細胞内コンパートメントに取り込まれることができる。この態様は、トランスフェリンに結合された機能的ジストロフィンペプチドを用いて、遺伝的に欠損性のジストロフィン遺伝子および／またはタンパク質を補充することにより筋ジストロフィーの患者を処置するために使用することができる。
【０４３４】
Ｅ．治療部分
別の好適な態様では、修飾された糖は治療部分を含む。当業者は治療部分と生体分子の範疇の間で重複する部分があると考えるだろう；多くの生体分子が治療特性または潜在性を有する。
【０４３５】
治療部分は臨床的使用がすでに許容された作用物質であることができ、あるいはそれらはその使用が実験的であるか、またはその活性もしくは作用メカニズムが調査中の薬剤であることができる。治療部分は所定の疾患状態で証明された作用を有することができ、あるいは所定の疾患状態で望まれる作用を示すと仮定されるだけであることができる。好適な態様では、治療部分は選択した組織と相互作用するそれらの能力についてスクリーニングされている化合物である。本発明の方法を実施するために有用な治療部分は、種々の薬理学的活性を有する薬剤の広範な種類からの薬剤を含む。幾つかの態様では、糖ではない治療部分を使用することが好ましい。この好適例の例外は、ＰＥＧ、生体分子、治療部分、診断分子等のような別の物体と共有結合することにより修飾された糖である。模範的な実施例では、アンチセンス核酸部分は、標的部分に付いた連結アームと共役している。別の例示態様では、治療用の糖部分を連結アームと結合させ、そして続いて糖−連結アームカセットを本発明の方法を介してペプチドに結合させる。
【０４３６】
治療および診断薬を様々な他の種に結合する方法は、当業者には周知である。例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，バイオコンジュゲート技術（ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）、アカデミック出版、サンディエゴ、１９９６；およびＤｕｎｎら，編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳシンポジウムシリーズ、第４６９巻、アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１を参照にされたい。
【０４３７】
例示態様では、治療部分は選択した条件下で開裂する連結を介して修飾された糖に結合させる。条件の例には、限定するわけではないが、選択されたｐＨ（例えば胃、腸、エンドサイトーシスの液胞）、活性な酵素の存在（例えばエステラーゼ、プロテアーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）、光、熱等を含む。多くの開裂可能な基が当該技術分野では知られている。例えばJungら., Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Joshiら, J. Biol. Chem., 265: 14518-14525 (1990); Zarlingら, J. Immunol.,124: 913-920 (1980); Bouizarら, Eur. J. Biochem., 155: 141-147 (1986); Parkら, J. Biol. Chem., 261: 205-210 (1986); Browningら, J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989)を参照にされたい。
【０４３８】
有用な治療部分の種類には、限定するわけではないが非−ステロイド性抗−炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）を含む。ＮＳＡＩＤＳは例えば以下の範疇から選択することができる：（例えばプロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体およびオキシカム（ｏｘｉｃａｍｓ））；ヒドロコルチゾン等を含むステロイド性抗−炎症剤；アジュバント：抗−ヒスタミン剤（例えばクロロフェニラミン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、トリプロリジン（ｔｒｉｐｒｏｌｉｄｉｎｅ））；鎮咳剤（例えばデキストロメトルファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ）、コデイン（ｃｏｄｅｉｎ）、カラミフェン（ｃａｒａｍｉｐｈｅｎ）、およびカルベタペンタン（ｃａｒｂｅｔａｐｅｎｔａｎｅ）；止痒剤（例えばメトジラジン（ｍｅｔｈｄｉｌａｚｉｎｅ）およびトリメプラジン（ｔｒｉｍｅｐｒａｚｉｎｅ）；抗コリン作用剤（例えばスコポラミン（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）、ホマトロピン（ｈｏｍａｔｒｏｐｉｎｅ）、レボドパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）；嘔吐抑制剤および抗めまい剤（例え
ばシクリジン（ｃｙｃｌｉｚｉｎｅ）、メクリジン（ｍｅｃｌｉｚｉｎｅ）、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、ブクリジン（ｂｕｃｌｉｚｉｎｅ）；食欲減退剤（例えばベンズフェタミン（ｂｅｎｚｐｈｅｔａｍｉｎｅ）、フェンテルミン（ｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）、クロルフェンテルミン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）およびフェンフルラミン（ｆｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ）；中枢刺激剤（例えばアンフェタミン（ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）、メタンフェタミン（ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）、デクストロアンフェタミン（ｄｅｘｔｒｏａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）およびメチルフェニデート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｉｄａｔｅ））；抗不整脈剤（例えばプロパノルオール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）、プロカインアミド（ｐｒｏｃａｉｎａｍｉｄｅ）、ジソピラミド（ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ）、キニジン（ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）、エンカイニド（ｅｎｃａｉｎｉｄｅ）；β−アドレナリン遮断薬（例えばメトプロロール（ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ）、アセブトロール（ａｃｅｂｕｔｏｌｏｌ）、ベタキソロール（ｂｅｔａｘｏｌｏｌ）、ラベタロール（ｌａｂｅｔａｌｏｌ）およびチモロール（ｔｉｍｏｌｏｌ）；
強心剤（例えばミルリノン（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）、アムリノン（ａｍｒｉｎｏｎｅ）およびドブタミン（ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ）；降圧剤（例えばエナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、クロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、ヒドララジン（ｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、グアナドレル（ｇｕａｎａｄｒｅｌ）、グアネチジン（ｇｕａｎｅｔｈｉｄｉｎｅ）；利尿剤（例えばアミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）およびヒドロクロロチアジド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）；冠血管拡張薬（例えばジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、イソクスプリン（ｉｓｏｘｓｐｕｒｉｎｅ）、ナイリドリン（ｎｙｌｉｄｒｉｎ）、トラゾリン（ｔｏｌａｚｏｌｉｎｅ）およびベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）；血管収縮薬（例えばジヒドロエルゴタミン（ｄｉｈｙｄｒｏｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、エルゴタミン（ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）およびメチルセルギド（ｍｅｔｈｙｌｓｅｒｇｉｄｅ）；抗潰瘍剤（例えばラニチジン（ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ）およびシメチジン（ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ）；麻酔薬（例えばリドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ），ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）、クロロプロカイン（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｃａｉｎｅ）、ジブカイン（ｄｉｂｕｃａｉｎｅ）；抗鬱剤（例えばイミプラミン（ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ）、デシプラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｙｐｔｉｌｉｎｅ）、ノルトリプチリン（ｎｏｒｔｒｙｐｔｉｌｉｎｅ）；精神安定剤および鎮静剤（例えばクロルジアゼポキシド（ｃｈｌｏｒｄｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）、ベナシチジン（ｂｅｎａｃｙｔｙｚｉｎｅ）、ベンズキナミド（ｂｅｎｚｑｕｉｎａｍｉｄｅ）、フルラゼパム（ｆｌｕｒａｚｅｐａｍ）、ヒドロキシジン（ｈｙｄｒｏｘｙｚｉｎｅ）、ロキサピン（ｌｏｘａｐｉｎｅ）およびプロマジン（ｐｒｏｍａｚｉｎｅ））；抗精神病薬（例えばクロルプロチキセン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）、フルフェナジン（ｆｌｕｐｈｅｎａｚｉｎｅ）、ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）、モリンドン（ｍｏｌｉｎｄｏｎｅ）、チオリダジン（ｔｈｉｏｒｉｄａｚｉｎｅ）およびトリフルオペラジン（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ）；抗微生物剤（抗バクテリア、抗菌・カビ、抗原生生物および抗ウイルス剤）。
【０４３９】
有用な治療部分の種類にはアジュバントを含む。アジュバントは例えば、とりわけ当該技術分野で周知のキーホールリンペットヘモシアニン結合物、モノホスホリル脂質Ａ、マイコプラズマ−由来リポペプチドＭＡＬＰ−２、コレラトキシンＢサブユニット、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）熱不安定性トキシン、破傷風トキソイドに由来するユニバーサルＴヘルパーエピトープ、インターロイキン−１２、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、シクロデキストリン、スクワレン、アルミニウム塩、髄膜炎菌の外膜小胞（ＯＭＶ）、モンタニド（ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）（モンタナ州、セントルイスのシグマから入手可能）、ニトロセルロース吸着、ＱｕｉｌＡのような免疫−刺激複合体、Ｇｅｒｂｕ（商標）アジュバント（ゲルブ  バイオテクニーク（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）、キルヒバルド、ドイツ）、トレオニルムラミルジペプチド、チモシン  アルファ、ブピバカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、不完全フロインドアジュバント、ＭＴＰ−ＰＥ／ＭＦ５９（チバ／ガイギー（Ｃｉｂａ／Ｇｅｉｇｙ）、バーゼル、スイス）、ポリホスファゼン、セッケンボクの木（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）に由来するサポニンおよびＳｙｎ
ｔｅｘアジュバント製剤（バイオカイン（Ｂｉｏｃｉｎｅ）、エミリーヴァレ、カリフォルニア州）から選択することができる。
【０４４０】
本発明の組成物に包含するために好適な抗微生物剤には、例えばβ−ラクタム剤、キノロン剤、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタムブトール、ヘキサミジンイソチオネート、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メタンアミド、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾールおよびアマンタジンの製薬学的に許容され得る塩を含む。
【０４４１】
本発明の実施に使用する他の薬剤部分には、抗癌剤（例えばアンチアンドロゲン（例えばロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）またはフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ））、殺細胞剤（例えばアドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β−２−インターフェロン）抗−エストロゲン剤（例えばタモキシフェン）、代謝拮抗物（例えばフルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン）を含む。またこの分類に含まれるのは、診断および治療の両方のための放射性同位体に基づく作用物質およびリシンのような結合トキシン、ゲルダナマイシン、ミタンシン（ｍｙｔａｎｓｉｎ）、ＣＣ−１０６５、Ｃ−１０２７、デュオカルマイシン、カリーチマイシンおよび関連する構造およびそれらの類似体、そして表２に掲載した毒素である。
【０４４２】
治療部分はホルモン（例えばメドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲステロール、オクトレチドまたはソマトスタチン）；筋弛緩剤（例えばシンナメドリン（ｃｉｎｎａｍｅｄｒｉｎｅ）、シクロベンザプリン（ｃｙｃｌｏｂｅｎｚａｐｒｉｎｅ）、フラボキセート（ｆｌａｖｏｘａｔｅ）、オルフェナドリン（ｏｒｐｈｅｎａｄｒｉｎｅ）、パパヴェリン（ｐａｐａｖｅｒｉｎｅ）、メベヴェリン（ｍｅｂｅｖｅｒｉｎｅ）、イダヴェリン（ｉｄａｖｅｒｉｎｅ）、リトドリン（ｒｉｔｏｄｒｉｎｅ）、ジフェノキシレート（ｄｉｐｈｅｎｏｘｙｌａｔｅ）、ダントロレン（ｄａｎｔｒｏｌｅｎｅ）およびアズモレン（ａｚｕｍｏｌｅｎ））；抗痙剤；骨−活性剤（例えばジホスホネートおよびホスホノアルキルホスフィネート剤化合物）；内分泌調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）物質（例えば、避妊薬（例えばエチノジオール（ｅｔｈｉｎｏｄｉｏｌ）、エチニルエストラジオール、ノレチンドロン（ｎｏｒｅｔｈｉｎｄｒｏｎｅ）、メストラノール（ｍｅｓｔｒａｎｏｌ）、デソゲステレル（ｄｅｓｏｇｅｓｔｒｅｌ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ））、糖尿病の調節物質（例
えばグリブリド（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）またはクロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、テストラクトンまたはスタノゾロールのような同化産物、アンドロゲン類（例えばメチルテストステロン、テストステロンまたはフルオキシメステロン）、抗利尿物（例えばデスモプレッシン（ｄｅｓｍｏｐｒｅｓｓｉｎ）およびカルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ））であることができる。
【０４４３】
また本発明に使用するのはエストロゲン（例えばジエチルシチルベステロール）、グルココルチコイド（例えばトリアムシノロン、ベタメサゾン等）、およびノレチンドロン、エチノジオール、ノレエチンドロン、レボノルゲストレルのようなプロゲステロン；甲状腺剤（例えばリオチロニン（ｌｉｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）またはレボチロキシン（ｌｅｖｏｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）または抗−甲状腺剤（例えばメチマゾール（ｍｅｔｈｉｍａｚｏｌｅ））；抗過プロラクチン血症剤（例えばカベルゴリン（ｃａｂｅｒｇｏｌｉｎｅ）；ホルモンサプレッサー（例えばダナゾール（ｄａｎａｚｏｌ）またはゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ））、子宮収縮剤（例えばメチルエルゴノビン（ｍｅｔｈｙｌｅｒｇｏｎｏｖｉｎｅ）またはオキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）およびミオプロストール（ｍｉｏｐｒｏｓｔｏｌ）、アルプロスタジル（ａｌｐｒｏｓｔａｄｉｌ）またはジノプロストーン（ｄｉｎｏｐｒｏｓｔｏｎｅ）のようなプロスタグランジンである。
【０４４４】
他の有用な修飾基には免疫調節剤（例えば抗ヒスタミン剤、ロドキサミド（ｌｏｄｏｘａｍｉｄｅ）および／またはクロモリン（ｃｒｏｍｏｌｙｎ）のようなマスト細胞安定化剤、ステロイド（例えばトリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔｈａｚｏｎｅ）、コルチゾン（ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）またはクロベタゾル（ｃｌｏｂｅｔａｓｏｌ））、ヒスタミンＨ２アンタゴニスト（例えばファモチジン（ｆａｍｏｔｉｄｉｎｅ）、シメチジン（ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ）、ラニチジン（ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ））、免疫抑制剤（例えばアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ））等を含む。
【０４４５】
スリンダク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）、エトドラク（ｅｔｏｄｏｌａｃ）、ケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）およびケトロラク（ｋｅｔｏｒｏｌａｃ）のような抗炎症活性を有する群も使用する。本発明と一緒に使用する他の薬剤は、当業者には明らかである。
【０４４６】
有効な治療部分のクラスには、例えば、アンチセンス薬や裸のＤＮＡが含まれる。アンチセンス薬は、例えば、アフィニタック(ＩＳＩＳ，Ｃａｒｌｓｂａｄ,ＣＡ)やジーナセンスＴＭ（Ｇｅｎｔａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ,  ＮＪ  からの）から選択することが可能である。裸のＤＮＡは、血友病の処置のため、例えば、ファクターＶＩＩＩとＩＸをコード化したＤＮＡでの遺伝子治療の治療法として供給され得る。
【０４４７】
Ｆ．修飾された糖の調製法
本発明の結合物を形成するために有用な修飾された糖を本明細書で検討する。この検討は説明の簡明さのために水溶性ポリマーで修飾された糖の調製に焦点をあてる。特にこの検討はポリ（エチレングリコール）部分を含む修飾された糖の調製に焦点をあてる。当業者は本明細書に記載する方法が修飾された糖の調製に広く応用可能であり、したがってこの検討は本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないと考えるだろう。
【０４４８】
一般に糖部分および修飾基は、典型的には連結法により新規な有機官能基または非反応性種に転移される反応基の使用を介して一緒に連結される。糖の反応性官能基（１つまたは複数）は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明の実質に有用な反性基および反応の種類は、一般にバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）化学の分野で周知なものである。反応性糖部分を用いて利用可能な現在好適な種類の反応は、比較的穏和な条件下で進行するものである。これらには限定するわけではないが、求核性置換（例えばアミンおよびアルコールとアシルハライド、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えばエナミン反応）、および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加）を含む。これらのおよび他の有用な反応は、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ、進歩した有機化学（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、第５版、ジョン  ウィリー＆サンズ、ニューヨーク、２００１；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、バイオコンジュゲート技術（ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  
ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）、アカデミック出版、サンディエゴ、１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら，タンパク質の修飾：化学シリーズの進歩（ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯ
Ｎ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第１９８巻、アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９８２で検討されている。
【０４４９】
糖核または修飾基から下がる（ｐｅｎｄａｎｔ）有用な反応性官能基には、限定するわけではないが以下を含む：
（ａ）カルボキシル基およびそれらの種々の誘導体、限定するわけではないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含む；
（ｂ）例えばエステル、エーテル、アルデヒド等に転換できるヒドロキシル基；
（ｃ）ハロアルキル基、ここでハライドは例えばアミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンのような求核性基に後で置き換わることができ、これによりハロゲン原子の官能基で新たな基の共有結合をもたらす；
（ｄ）ディールス−アルダー反応に参加することができるジエノフィル基、例えばマレイミド基；
（ｅ）後の誘導化が例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムのようなカルボニル誘導体の形成を介して、あるいはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加のようなメカニズムを介して可能となるようなアルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するために、アミンとの後の反応のためのスルホニルハライド基；
（ｇ）例えばジスルフィドに転換されるか、またはアルキルおよびアシルハライドと反応することができるチオール基；
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化または酸化され得るアミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば付加環化、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン；および
（ｊ）例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。
【０４５０】
反応性官能基は、それらが反応性糖の核（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｇｅｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）または修飾基の集成に必要な反応に参加せず、または妨害しないように選択することができる。あるいは反応性官能基は保護基の存在により反応へ参加することから保護することができる。当業者は選択した組の反応条件を妨害しないように、どのように特定の官能基を保護するかを理解している。例えば有用な保護基は、Ｇｒｅｅｎｅら、有機合成における保護基（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、ジョン  ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９１を参照にされたい。
【０４５１】
以下に続く検討では、本発明の実施に有用な多数の修飾された糖の具体例を説明する。
例示態様ではシアル酸誘導体を糖の核として利用して、これに修飾基を結合する。シアル酸誘導体についての検討に焦点をあてるのは、具体的説明の明瞭性のみのためであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は例としてシアル酸を使用して説明した様式に準じて、種々の他の糖部分を活性化し、そして誘導化することができると考えるだろう。例えばガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾して、当該技術分野で認識されている方法により容易に修飾される幾つかの糖基質を挙げるために多数の方法を利用することができる。例えばＥｌｈａｌａｂｉら，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９）：およびＳｃｈａｆｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００）を参照にされたい。
【０４５２】
例示態様では、本発明の方法により修飾するペプチドは哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）またはトランスジェニック動物で生産されるペプチドであり、すなわちＮ−および／またはＯ−結合オリゴ糖鎖を含み、これらは不完全にシアル化されている。シアル酸を欠き、そして末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化またはそうではなく修飾されたシアル酸を用いて修飾することができる。
【０４５３】
スキーム４では、マンノサミングリコシド１を保護されたアミノ酸（例えばグリシン）誘導体の活性化エステルを用いて処理し、糖のアミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に転換する。付加物をアルドラーゼを用いて処理してシアル酸２を形成する。化合物２をＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの作用により対応するＣＭＰ誘導体へ転換し、続いてＣＭＰ誘導体の触媒的水素付加により化合物３を生成する。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンは、化合物３を活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体と反応させることによりＰＥＧまたはＰＰＧ結合の位置として利用して（例えばＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＰＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ）、それぞれ４または５を生成する。
【０４５４】
【化５３】
0005413548.tif 000058
【０４５５】
表３はＰＥＧまたはＰＰＧ部分により誘導化される糖モノホスフェートの代表例を説明する。表３の相当の化合物がスキーム１の方法により調製される。他の誘導体は技術的に認識されている方法により調製される。例えばＫｅｐｐｌｅｒら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：１１Ｒ（２００１）；およびＣｈａｒｔｅｒら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４９（２０００）を参照にされたい。他のアミン反応性ＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は市販されているか、または当業者が容易に入手できる方法により調製することができる。
【０４５６】
【表３】
0005413548.tif 000059
0005413548.tif 000060
【０４５７】
本発明の実施に使用する修飾された糖ホスフェートは、上記に説明したものと同じく他の位置でも置換され得る。“ｉ”は、Ｎａ又はその他の塩であってもよいし、“ｉ”は、Ｎａの代わりでもよい。現在好適なシアル酸の置換を式５に説明する。
【０４５８】
【化５４】
0005413548.tif 000061
【０４５９】
式中、Ｘは好ましくは−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ２−およびＮ（Ｒ）２から選択される連結基であり、ここで各ＲはＲ１〜Ｒ５から独立して選択される員である。記号Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは、各々がＸの同一性について上に説明した基から選択される基を表す。“ｉ”は、Ｎａあるいはその他の塩であってもよいし、Ｎａは、“ｉ”と代わってもよい。Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢはそれぞれ独立して選択され、したがってそれらは同じか又は異なることができる。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨ、ポリマー、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子または他の部分を表す。記号Ｒ６はＨ、ＯＨまたはポリマーを表す。あるいはこれらの記号はポリマー、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子または他の部分に連結したリンカーを表す。
【０４６０】
別の例示態様では、スキーム５に説明するように無水クロロ酢酸の使用による求核置換のためにマンノサミンが同時にアシル化そして活性化される。この節に示した各スキームで、ｉ＋またはＮａ＋は代わり得るものであり、塩はナトリウムまたはその他適当な塩で有り得る。
【０４６１】
【化５５】
0005413548.tif 000062
【０４６２】
生成したクロロ−誘導化グリカンをピルベートとアルドラーゼの存在下で接触させ、クロロ−誘導化シアル酸を形成する。対応するヌクレオチド糖はシアル酸誘導体を適当なヌクレオチドトリホスフェートおよびシンテターゼと接触させることにより調製する。シアル酸部分のクロロ基をチオ−ＰＥＧのような求核性ＰＥＧ誘導体に置き換える。
【０４６３】
さらなる例示態様では、スキーム６に示すように、マンノサミンをビス−ＨＯＢＴジカルボキシレートを用いてアシル化し、対応するアミド−アルキル−カルボン酸を生成し、これを続いてシアル酸誘導体に転換する。このシアル酸誘導体をヌクレオチド糖に転換し、そしてカルボン酸を活性化し、そしてアミノ−ＰＥＧのような求核性ＰＥＧ誘導体と反応させる。
【０４６４】
【化５６】
0005413548.tif 000063
【０４６５】
スキーム７に説明する別の例示態様では、アミン−およびカルボキシル−保護ノイラミン酸を、１級ヒドロキシル基を対応するｐ−トルエンスルホン酸エステルに転換することにより活性化し、そしてメチルエステルを開裂する。活性化されたノイラミン酸は対応するヌクレオチド糖に転換され、そして活性基はチオ−ＰＥＧのような求核性ＰＥＧ種に置き換える。
【０４６６】
【化５７】
0005413548.tif 000064
【０４６７】
スキーム８に説明するようなさらなる例示態様では、アミン−およびカルボキシル−保護ノイラミン酸誘導体の１級ヒドロキシル部分を、クロロ−ＰＥＧのような求電子性ＰＥＧを使用してアルキル化する。続いてメチルエステルを開裂し、そしてＰＥＧ−糖をヌクレオチド糖に転換する。
【０４６８】
【化５８】
0005413548.tif 000065
【０４６９】
シアル酸以外のグリカンは、本明細書に説明する方法を使用してＰＥＧで誘導化することができる。誘導化されたグリカンそれ自体が本発明の範囲内である。すなわちスキーム９はＰＥＧ化ガラクトースヌクレオチド糖への例示合成経路を提供する。ガラクトースの１級ヒドロキシル基は対応するトルエンスルホン酸エステルのように活性化され、これは続いてヌクレオチド糖に転換される。
【０４７０】
【化５９】
0005413548.tif 000066
【０４７１】
スキーム１０は、ガラクトース−６−アミン部分に基づくガラクトース−ＰＥＧ誘導体を調製する例示経路を説明する。すなわちガラクトサミンをヌクレオチド糖に転換し、そしてガラクトサミンのアミン部分を活性なＰＥＧ誘導体で官能化する。
【０４７２】
【化６０】
0005413548.tif 000067
【０４７３】
スキーム１１はガラクトース誘導体の別の例示経路を提供する。スキーム１１の出発点はガラクトース−２−アミンであり、これをヌクレオチド糖に転換する。ヌクレオチド糖のアミン部分は、メトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）カルボン酸のようなＰＥＧ誘導体を結合するための位置である。
【０４７４】
【化６１】
0005413548.tif 000068
【０４７５】
本明細書で開示する結合物に結合する部分の例には、限定する訳ではないがＰＥＧ誘導体（例えばアシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ、アルキル−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えばアシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、ポリアスパラギン酸、ポリグルタメート、ポリリシン、治療部分、診断部分、マンノース−６−ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−ホスフェート、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質（例えばトランスフェリン）、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、デキストラン、修飾されたデキストラン、アミロース、ビスホスフェート、ポリ−ＳＡ、ヒアルロン酸、ケリタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ状オリゴ糖、ペプチド等を含む。種々の修飾基をサッカリド部分に結合する方法は、当業者が容易に入手できるものである（ポリ（エチレングリコールの化学：生物工学的および生物医学的応用（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹ
ＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編集、プレナム出版社、１９９２；ポリ（エチレングリコール）の化学および生物学的応用（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編集、ＡＣＳシンポジウムシリーズ、Ｎｏ．６８０、アメリカ化学学会、１９９７；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、バイオコンジュゲート技術（ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＥＳ）、アカデミック出版、サンディエゴ、１９９６；およびＤｕｎｎら．編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系（ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＡＣＳシンポジウムシリーズ、Ｎｏ．４６９、アメリカ化学学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１）。
【０４７６】
糖、ヌクレオチド糖および誘導体の精製
上記の方法により生成されたヌクレオチド糖および誘導体は、精製せずに使用することができる。しかし通常、生成物を回収することが好ましい。薄または厚層（ｔｈｉｃｋ  ｌａｙｅｒ）クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過のような標準的な周知技法を使用することができる。膜濾過を使用すること、より好ましくは逆浸透膜を使用することが好ましく、または回収のためにはこれから、そして本明細書に引用する技術文献で検討するように１以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好適である。例えば膜濾過（ここで膜は約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する）を使用して、１０，０００Ｄａ未満の分子量を有する試薬についてタンパク質を取り出すために使用することができる。次に膜濾過または逆浸透を使用して塩を除去し、かつ／または生成物サッカリドを精製するために使用することができる（例えば国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照にされたい）。ナノフィルター（ｎａｎｏｆｉｌｔｅｒ）膜は１種の逆浸透膜であり、これは使用する
膜に依存して１価の塩を通すが、多価の塩および約１００から約２，０００ダルトンより大きい非電荷溶質は保持する。このように典型的な応用では、本発明の方法により調製されるサッカリドは膜内に保持され、そして混入する塩は通過する。
【０４７７】
Ｇ．架橋基
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製には、修飾基の糖残基への結合、そしてグリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物の形成を含む。このように修飾基を糖へ結合するために架橋剤を使用することが好ましいことが多い。修飾基を炭水化物部分に結合するために使用することができる二官能性化合物の例には、限定するわけではないが二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステル等を含む。炭水化物を他の分子に連結するための一般的取り組みは、技術文献にて知られている。例えば、Ｌｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１８５６（１９８９）；Ｂｈａｔｉａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９）；Ｊａｎｄａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６（１９９０）およびＢｅｄｎａｒｓｋｉら、国際公開第９２／１８１３５号パンフレットを参照にされたい。以下の考察は反応基が新生の修飾された糖の糖部分上で良性（ｂｅｎｉｇｎ）として処置される。この考察に焦点をあてるのは具体的説明の明瞭性のためである。当業者はこの考察が修飾基上の反応基にも関連すると考えるだろう。
【０４７８】
例示の方法には、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を使用して、保護されたスルフヒドリルの糖への包含、そして次に修飾基上の別のスルフヒドリルとジスルフィド結合を形成するためにスルフヒドリルの脱保護が関与する。
【０４７９】
ＳＰＤＰがグリコシルトランスフェラーゼの基質として作用する修飾された糖の能力に悪影響を及ぼす場合、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）のような多数の架橋剤の１つを使用して、ジスルフィド結合を形成する。２−イミノチオランは１級アミンと反応し、即座に非保護スルフヒドリルをアミノ−含有分子に包含する。ＳＡＴＡも１級アミンと反応するが保護されたスルフヒドリルを包含し、これは後にヒドロキシルアミンを使用して脱アセチル化されて遊離のスルフヒドリルを生成する。各々の場合で、包含されたスルフヒドリルは他のスルフヒドリルまたは保護されたスルフヒドリルとＳＰＤＰのように自由に反応し、必要なジスルフィド結合を形成する。
【０４８０】
上記の方法は例であり、そして本発明で使用する架橋剤を限定するものではない。修飾基をペプチドに架橋するための様々な方法に使用できる他の架橋剤を入手することができる。例えばＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジドおよびＴＰＭＰＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）は、穏和な過ヨウ素酸塩処理により前以て酸化された炭水化物部分と反応し、このように架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩が生成したアルデヒドとの間にヒドラゾン結合を形成する。ＴＰＣＨおよびＴＰＭＰＨは２−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を糖に導入し、これはＤＴＴで脱保護することができ、そして次いで成分間にジスルフィド結合を形成するように結合物に使用される。
【０４８１】
ジスルフィド結合が安定な修飾された糖を生成するには適さないことが分かった場合、成分間により安定な結合を包含する他の架橋剤を使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）およびＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は１級アミンと反応し、これがマレイミド基を成分上に導入する。続いてマレイミド基は前に挙げた架橋剤により導入することができる他の成分上のスルフヒドリルと反応し、このようにして成分間に安定なチオエーテル結合を形成する。成分間の立体障害がいずれかの成分の活性または修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼの基質として作用する能力を妨害する場合、成分間に長いスペーサーアームを導入し、そして前に挙げた幾つかの架橋剤（例えばＳＰＤＰ）の誘導体を含む架橋剤を使用することができる。このように有用な適当な架橋剤が豊富に存在し：その各々が最適なペプチド結合物および修飾された糖の生成に及ぼす効果に依存して選択される。
【０４８２】
さまざまな試薬が、分子内の化学的架橋で修飾糖の成分を修飾するために使用される（架橋試薬および架橋結合手順の総説に関しては：Ｗｏｌｄ，Ｆ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３−６５１，１９７２；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．：薬剤としての酵素（ＥＮＺＹＭＥ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ）で、（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ編集）、第３９５〜４４２頁、ウィリー、ニューヨーク、１９８１；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０−６０９，１９８３：Ｍａｔｔｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７−１８３，１９９３を参照にされたい（これらすべては引用により本明細書に編入する））。
【０４８３】
好適な架橋剤は種々のゼロ−長（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）、ホモ−二官能性およびヘテロ−二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ−長架橋試薬には、外因性の物質の導入が無い、２つの必須の化学基の直接的結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する試薬は、この範疇に属する。別の例はカルボキシルと１級アミノ基の縮合を導入してアミド結合を形成する、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ’ｓ）試薬Ｋ−（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホネート）およびカルボニルイミダゾールのような試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トラスングルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）をゼロ−長の架橋試薬として使用することができる。この酵素は通常、基質として１級アミノ基を用いて、タンパク質−結合連結グルタミン残基のカルボキサミド基でアシル転移反応を触媒する。好適なホモ−およびヘテロ−二官能性試薬はそれぞれ２つ
の同一または２つの似ていない部位を含み、これらはアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドールまたは非特異的基と反応性となり得る。
【０４８４】
２．架橋試薬中の好適な特異的部位 
ａ．アミノ−反応基
１つの好適な態様では、架橋剤上のこの部位はアミノ−反応基である。アミノ−反応基の有用な非限定的例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアネート、アシルハライド、アリールアジド、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルデヒドおよびスルホニルクロライドを含む。
【０４８５】
ＮＨＳエステルは修飾された糖成分の１級（芳香族を含む）アミノ基と優先的に反応する。ヒスチジンのイミダゾール基は１級アミンと反応を競合するが、反応生成物は不安定であり、そして容易に加水分解される。この反応にはＮＨＳエステルの酸カルボキシル上でアミンの求核的攻撃が関与し、アミドを形成してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する。このようにして元のアミノ基の正電荷が失われる。
【０４８６】
イミドエステルは修飾された糖成分のアミン基との反応のための最も特異的なアシル化試薬である。７から１０の間のｐＨで、イミドエステルは１級アミンとのみ反応する。１級アミンは求核的にイミデートを攻撃し、高ｐＨでアミジンに、または低ｐＨで新しいイミデートに分解する中間体を生成する。この新たな中間体は別の１級アミンと反応させることができ、これにより単官能性イミデートが二官能的に反応すると仮定する場合、２つのアミノ基を架橋する。１級アミノとの反応の主な生成物は、元のアミンよりも強力な塩基であるアミジンである。したがって元のアミノ基の正電荷が保持される。
【０４８７】
イソシアネート（およびイソチオシアネート）は修飾された糖成分の１級アミンと反応して、安定な結合を形成する。スルフヒドリル、イミダゾールおよびチロシル基とそれらの反応は、比較的不安定な生成物を生じる。
【０４８８】
アシルアジドもアミノ−特異的試薬として使用され、ここで親和性成分の求核性アミンがわずかにアルカリ性の条件下、例えばｐＨ８．５で酸性カルボキシル基を攻撃する。
【０４８９】
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのようなアリールハライドは、修飾された糖成分のアミノ基およびチロシンのフェノール性基と優先的に反応するが、スルフヒドリルおよびイミダゾール基とも反応する。
【０４９０】
モノ−およびジカルボン酸のｐ−ニトロフェニルエステルも有用なアミノ−反応基である。試薬の特異性はそれほど高くないが、α−およびε−アミノ基は最も急速に反応するようである。
【０４９１】
グルタルアルデヒドのようなアルデヒドは、修飾された糖の１級アミンと反応する。不安定なシッフ塩基がアミノ基とアルデヒドのアルデヒドとの反応で形成されるが、グルタルアルデヒドは安定な架橋により修飾糖を修飾することができる。ｐＨ６〜８で（このｐＨは典型的な架橋条件である）、環式ポリマーは脱水を受けてα−β不飽和アルデヒドポリマーを形成する。しかしシッフ塩基は別の二重結合と結合した時に安定である。両二重結合の共鳴的相互作用は、シッフ結合の加水分解を防止する。さらに高い局所的濃度でアミンはエチレン二重結合を攻撃して安定なマイケル付加生成物を形成することができる。
【０４９２】
芳香族スルホニルクロライドは、修飾された糖成分の種々の部位と反応するが、安定なスルホンアミド結合を生じるアミノ基との反応が最も重要である。
【０４９３】
ｂ．スルフヒドリル−反応基
別の好適な態様では、部位はスルフヒドリル−反応性基である。スルフヒドリル−反応基の有用な非限定的例には、マレイミド、アルキルハライド、ピリジルジスルフィドおよびチオフタルイミドを含む。
【０４９４】
マレイミドは修飾された糖成分のスルフヒドリル基と優先的に反応して安定なチオエーテル結合を形成する。それらはまた、より一層遅い反応速度でヒスチジンの１級アミノ基およびイミダゾール基とも反応する。しかしｐＨ７では、このｐＨで単純なチオールの反応速度は対応するアミンの反応速度よりも１０００倍大きいので、マレイミド基はスルフヒドリルに特異的な基と考えられる。
【０４９５】
アルキルハライドはスルフヒドリル基、スルフィド、イミダゾールおよびアミノ基と反応する。しかし中性からわずかにアルカリ性のｐＨで、アルキルハライドは主にスルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。より高ｐＨではアミノ基との反応が有利である。
【０４９６】
ピリジルジスルフィドはジスルフィド交換を介して遊離のスルフヒドリルと反応して、混合ジスルフィドを与える。結果としてピリジルジスルフィドは最も特異的なスルフヒドリル−反応基である。
【０４９７】
チオフタルイミドは遊離のスルフヒドリル基と反応してジスルフィドを形成する。
【０４９８】
ｃ．カルボキシル−反応性残基
別の態様では、水および有機溶媒に可溶性のカルボジイミドをカルボキシル−反応試薬として使用する。これらの化合物は遊離のカルボキシル基と反応してプソイドウレアを形成し、次にこれは利用可能なアミンにカップリングしてアミド結合を形成することができる。カルボジイミドを用いてカルボキシル基を修飾する手順は、当該技術分野では周知である（Ｙａｍａｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：４８３６−４８４２，１９８１を参照にされたい）。
【０４９９】
３．架橋試薬中の好適な非特異的部位
部位−特異的な反応性部分に加えて、本発明は糖を修飾基に連結するための非特異的な反応性基も企図する。
【０５００】
非特異的な架橋剤の例には、暗中では完全に不活性な光活性化可能な（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）基を含み、これは適切なエネルギーの光子を吸収すると反応性種に変換される。好適な態様では、光活性化可能な基は、アジドの加熱または光分解で生成するニトレンの前駆体から選択される。電子−欠損ニトレンは極めて反応性であり、そしてＮ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−ＨおよびＣ＝Ｃを含む種々の化学結合と反応することができる。３種類のアジド（アリール、アルキルおよびアシル誘導体）を使用することができるが、アリールアジドが現在好適である。光分解でのアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりもＮ−ＨおよびＯＨでより良い。電子−欠損アリールニトレンは急速に環が拡大してデヒドロアゼピンを形成し、これはＣ−Ｈ挿入生成物を形成するよりは求核性物質と反応する傾向がある。アリールアジドの反応性は環中のニトロまたはヒドロキシル基のような電子−吸引置換基の存在により上げることができる。そのような置換はより長い波長にアリールアジドの最大吸収を支援する（ｐｕｓｈ）。非置換アリールアジドは２６０〜２８０ｎｍに範囲の最大吸収を有し、一方、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは３０５ｎｍを越えて有意な光を吸収する。したがってヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、非置換アリールアジドよりも親和性成分に関してより害が少ない光分解条件を使用するので最も好ましい。
【０５０１】
別の好適な態様では、光活性化可能な基はフッ素添加されたアリールアジドから選択される。フッ素添加されたアリールアジドの光分解産物はアリールニトレンであり、そのすべてが高い効率でのＣ−Ｈ結合の挿入を含むこの基に特徴的な反応を受ける（Ｋｅａｎａら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：３６４０−３６４７，１９９０）。
【０５０２】
別の態様では、光活性化可能な基はベンゾフェノン残基から選択される。ベンゾフェノン試薬は一般にアリールアジド試薬よりも高い架橋結合収量を与える。
【０５０３】
別の態様では、光活性化可能な基はジアゾ化合物から選択され、これが光分解で電子−欠損カルベンを形成する。これらのカルベンはＣ−Ｈ結合への挿入、二重結合への付加（芳香族系を含む）、水素誘引および求核中心への配位を含む種々の反応を受け、炭素イオンを与える。
【０５０４】
さらに別の態様では、光活性化可能な基はジアゾピルベートから選択される。例えばｐ−ニトロフェニルジアゾピルベートのｐ−ニトロフォニルエステルは脂肪族アミンと反応してジアゾピルビン酸アミドを与え、これは紫外線の光分解を受けてアルデヒドを形成する。光分解したジアゾピルベートで修飾された親和性成分はホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドのように反応して架橋を形成する。
【０５０５】
４．ホモ二官能性試薬
ａ．第一アミンと反応性のホモ二官能性架橋剤
アミン−反応性架橋剤の合成、特性および応用は、技術文献で工業的使用のために記載されている（架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい）。多くの試薬が利用可能である（例えば、ピアスケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、ロックフォード、イリノイ州；シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州；モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州）。
【０５０６】
ホモ二官能性ＮＨＳエステルの好適な非限定的例には、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホ−ＤＳＴ）、ビス−２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス−２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）およびジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（スルホ−ＤＳＰ）を含む。ホモ二官能性イミドエステルの好適な非−限定的例には、ジメチルマロンイミデート（ＤＭＭ）、ジメチルスクシンイミデート（ＤＭＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−オキシジプロピオンイミデート（ＤＯＤＰ）、ジ
メチル−３，３’−（メチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＭＤＰ）、ジメチル−３’−（ジメチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＤＤＰ）、ジメチル−３，３’−（テトラメチレンジオキシ）−ジプロピオンイミデート（ＤＴＤＰ）およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）を含む。
【０５０７】
ホモ二官能性イソチオシアネートの好適な非限定的例には：ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）、および４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）を含む。
【０５０８】
ホモ二官能性イソシアネートの好適な非限定的例には、キシレン−ジイソシアネート、トルエン−２，４−ジイソシアネート、トルエン−２−イソシアネート−４−イソチオシアネート、３−メトキシジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−アゾフェニルジイソシアネートおよびヘキサメチレンジイソシア
ネートを含む。
【０５０９】
ホモ二官能性アリールハライドの好適な非限定的例には、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、および４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニル−スルホンを含む。
【０５１０】
ホモ二官能性脂肪族アルデヒド試薬の好適な非限定的例には、グリオキサール、マロンジアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む。
【０５１１】
ホモ二官能性アシル化試薬の好適な非限定的例には、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルを含む。
【０５１２】
ホモ二官能性芳香族スルホニルクロライドの好適な非限定的例には、フェノール−２，４−ジスルホニルクロライドおよびα−ナフトール−２，４−ジスルホニルクロライドを含む。  
【０５１３】
さらなるアミノ−反応性ホモ二官能性試薬の好適な非限定的例には、アミンと反応してビスカルバメートを与えるエリトリトールビスカルボネートを含む。
【０５１４】
ｂ．遊離スルフヒドリル基と反応性のホモ二官能性架橋剤
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている（架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい）。多くの試薬が市販されている（例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州；シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州；モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州）。  
【０５１５】
ホモ二官能性マレイミドの好適な非限定的例には、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミドおよびビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルを含む。
【０５１６】
ホモ二官能性ピリジルジスルフィドの好適な非限定的例には、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）を含む。
【０５１７】
ホモ二官能性アルキルハライドの好適な非限定的例には、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α，α’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、α，α’−ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｂ−ブロモメチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ（ブロモアセチル）フェニルヒドラジンおよび１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルプロパンを含む。
【０５１８】
ｃ．ホモ二官能性の光活性化可能な架橋剤
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている（架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい）。数種の試薬が市販されている（例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州；シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州；モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州）。
【０５１９】
ホモ二官能性の光活性化可能な架橋剤の好適な非限定的例には、ビス−β−（
４−アジドサリチルアミド）エチルジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ジ−Ｎ−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）−シスタミン−Ｓ，Ｓ−ジオキシド（ＤＮＣＯ）および４，４’−ジチオビスフェニルアジドを含む。
【０５２０】
５．ヘテロ二官能性試薬
ａ．ピリジルジスルフィド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている（架橋結合の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい）。多くの試薬が市販されている（例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州；シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州；モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州）。
【０５２１】
ピリジルジスルフィド部分およびアミノ−反応性ＮＨＳエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（スルホ−ＬＣＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）およびスルホスクシンイミジル６−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミドヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）を含む。
【０５２２】
ｂ．マレイミド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている。マレイミド部分およびアミノ−反応性ＮＨＳエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、スクシンイミジルマレイミジルアセテート（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルプロピオネート（ＢＭＰＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）スクシンイミジル６−マレイミジルヘキサノエート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルベンゾエート（ＳＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレ
ート（ＳＭＰＢ）およびスルホスクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）を含む。
【０５２３】
ｃ．アルキルハライド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている。アルキルハライド部分およびアミノ−反応性ＮＨＳエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−６−（ヨードアセチル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル−６−（６−（（ヨードアセチル）−アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−６−（（（４−ヨードアセチル）−アミノ）−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＣＸ）およびスクシンイミジル−４（（ヨードアセチル）−アミノ）−メチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＩＡＣ）を含む。
【０５２４】
アミノ−反応性ＮＨＳエステルおよびアルキルジハライド部分を持つヘテロ二官能性試薬の好適な例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ２，３−ジブロモプロピオネート（ＳＤＢＰ）を含む。ＳＤＢＰは、クロスリンカーをアミノ基に結合することにより親和性成分に分子内架橋剤を導入する。１級アミン基に対するジブロモプロピオニル部分の反応性は、反応温度により制御される（ＭｃＫｅｎｚｉｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．７：５８１−５９２（１９８８））。
【０５２５】
アルキルハライド部分およびアミノ−反応性ｐ−ニトロフェニルエステル部分を持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）を含む。
【０５２６】
他の架橋剤も当業者に知られている。例えばＰｏｍａｔｏら、米国特許第５，９６５，１０６号明細書を参照にされたい。特定の応用のための適切な架橋剤を選択する能力は、当業者の能力の範囲内である。
【０５２７】
ｄ．開裂性リンカー基
さらなる態様では、リンカー基には開裂して糖残基から修飾基を放出することができる基が提供される。多くの開裂性基が当該技術分野では知られている。例えばJungら, Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshiら, J. Biol. Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarlingら, J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizarら, Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Parkら, J. Biol. Chem. 261: 205-2
10 (1986); Browningら, Immunol. 143: 1859-1867 (1989)を参照にされたい。さらに広範な開裂性の二官能性（ホモ−およびヘテロ−二官能性の両方）結合基がピアスのような供給元から市販されている。
【０５２８】
例示する開裂性部分は、光、熱またはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩等のような試薬を使用して開裂することができる。さらに特定の好適な基はエンドサイトーシスされる反応で生体内で開裂される（例えばシス−アコニチル；Ｓｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８（１９９１）を参照にされたい）。好適な開裂性基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基からなる群から選択される員である開裂性部分を含んでなる。
【０５２９】
ｅ．修飾された糖のペプチドへの結合
修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素を使用してグリコシル化または非グリコシル化ペプチドに結合される。好ましくは修飾された供与体の糖（１つまたは複数）、酵素（１つまたは複数）および受容体ペプチド（１つまたは複数）の濃度は、受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下に検討する考察は、シアリルトランスルフェラーゼの内容について説明すると同時に、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に応用することできる。
【０５３０】
グリコシルトランスフェラーゼを使用して所望のオリゴ糖構造を合成する多数の方法が知られており、そして一般に本発明に応用することができる。例示方法は例えば、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、Ｉｔｏら，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号および同第５，５４５，５５３明細書に記載されている。
【０５３１】
本発明は単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用して実施される。例えばシアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用することができる。１以上の酵素を使用するそれらの態様では、酵素および基質は好ましくは最初の反応混合物で合わせられるか、または第２の酵素反応用の酵素および試薬はいったん第１酵素反応が完了したら、またはほぼ完了したら反応媒質に加えられる。２つの酵素反応を１つの反応槽で順次行うことにより、中間体種が単離される手順よりも全体的な収量が改善する。さらに過剰な溶媒および副産物の洗浄および廃棄が減少する。
【０５３２】
好適な態様では、各第１および第２酵素がグリコシルトランスフェラーゼである。別の好適な態様では、１つの酵素がエンドグリコシダーゼである。別の好適な態様では、１つの酵素がエキソグリコシダーゼである。さらに好適な態様では、２より多くの酵素を使用して本発明の修飾された糖タンパク質を集成する。酵素は、修飾された糖をペプチドに加える前または後の任意の時点で、ペプチド上のサッカリド構造を改変させるために使用する。
【０５３３】
別の好適な態様では、少なくとも２つの酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、そしてペプチドのサッカリド構造に加えられる最後の糖は修飾されていない糖である。代わりに修飾された糖がグリカン構造の内部にあり、したがってグリカン上に最終的な糖は必要ない。例示態様では、ガラクトシルトランスフェラーゼはＧａｌ−ＰＥＧのＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧからグリカンへの転移を触媒することができ、続いてＳＴ３Ｇａｌ３およびＣＭＰ−ＳＡ（これは「キャッピング」する非修飾シアル酸をグリカンに加えるために役立つ）の存在下でインキューベーションする（図２３Ａ）。
【０５３４】
別の態様では、使用する少なくとも２つの酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、そして少なくとも２つの修飾された糖がペプチド上のグリカン構造に加えられる。この様式で、２以上の異なる複合糖質をペプチド上の１以上のグリカンに加えることができる。この方法は、２以上の機能的に異なる修飾された糖を有するグリカン構造を生成する。例示態様では、ペプチドとＧｎＴ−Ｉ、ＩＩとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧとのインキューベーションは、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ分子をグリカンに付加するために役立ち；次いでガラクトシルトランスフェラーゼとＵＤＰ−Ｇａｌのインキューベーションは、Ｇａｌ残基をそれに付加するために役立ち；そしてＳＴ３Ｇａｌ３とＣＭＰ−ＳＡ−Ｍａｎ−６−ホスフェートのインキューベーションは、ＳＡ−マンノース−６−ホスフェート分子のグリカンへの付加に役立つ。この反応順序で、ＰＥＧ化グリカンの機能的特徴ならびにマンノース−６−ホスフェート標的化活性を有するグリカン鎖をもたらす（図２３Ｂ）。
【０５３５】
別の態様では、反応に使用する少なくとも２つの酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、そしてここでも異なる修飾された糖がペプチド上のＮ−連結およびＯ−連結グリカンに加えられる。この態様は２つの異なる修飾された糖がペプチドのグリカンに加えられるようになる時、しかしペプチド上の修飾された糖を互いに空間的に離すことが重要である時に特に有用である。例えば修飾された糖が、限定するわけではないがＰＥＧおよび結合分子のような他の分子を含む嵩高の分子を含んでなる時、この方法が好ましいかもしれない。修飾された糖はペプチド上のグリカン構造に同時に加えるか、またはそれらを順次加えてもよい。例示態様では、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧとのインキューベーションは、シアル酸−ＰＥＧをＮ−連結グリカンに加えるために役立つが、ＳＴ３Ｇａｌ１およびＣＭＰ−ＳＡ−ビスホスホネートとのインキューベーションはシアル酸−ビスホスホネートをＯ−連結グリカンへ加えるために役立つ（図２３Ｃ）。
【０５３６】
別の態様では、この方法は１以上のエキソ−またはエンド−グリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは典型的には突然変異体であり、これはグリコシル結合を破壊というよりは形成するように工作されている。突然変異体のグリカナーゼは時折、グリコシンターゼと呼ばれるが、典型的には活性部位の酸性アミノ酸残基にアミノ酸残基の置換を含む。例えばエンドグリカナーゼが内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈである時、置換される活性部位の残基は典型的には１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕ、またはそれらの組み合わせである。アミノ酸は一般にセリン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンに置換される。トランスシアリリダーゼのようなエキソグリコシダーゼも有用である。
【０５３７】
突然変異酵素は通常、エンドグリカナーゼの加水分解工程の逆反応に準じる合成工程により反応を触媒する。これらの態様では、グリコシル供与体分子（例えば所望するオリゴ−またはモノ−サッカリド構造）が脱離基を有し、そして反応は供与体分子をタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基へ加えることにより進行する。例えば脱離基はフルオリドのようなハロゲンであることができる。別の態様では脱離基はＡｓｎまたはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらなる態様では、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えばＧｌｃＮＡｃ残基は１，２オキサゾリン部分を含んでなることができる。
【０５３８】
好適な態様では、本発明の結合物を生成するために使用する各酵素は触媒量で存在する。特定酵素の触媒量は、その酵素基質の濃度ならびに温度、時間、ｐＨ値のような反応条件に従い変動する。予め選択した基質濃度および反応条件下での所定の酵素の触媒量を決定する手段を、当業者は周知である。
【０５３９】
上記方法が行なわれる温度は、ちょうど凍結より上から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲で変動することができる。好適な温度範囲は約０℃から約５５℃、そしてより好ましくは約２０℃から約３７℃である。別の例示態様では、本方法の１以上の成分が好熱性酵素を使用して高温で行われる。
【０５４０】
反応混合物は受容体がグリコシル化されるために十分な時間、維持され、これにより所望の結合物を形成する。結合物の中にはしばしば数時間後に検出できるものもあり、回収可能な量は通常、２４時間以内に得られる。当業者は反応速度は多数の可変性因子（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒容量）に依存し、これは選択する系に至適化されると理解している。
【０５４１】
本発明は修飾されたペプチドの工業的規模の生産も提供する。本明細書で使用するように、工業的規模では一般に少なくとも１グラムの完成され、精製された結合物が生産される。
【０５４２】
以下の検討では、本発明は修飾されたシアル酸分子のグリコシル化ペプチドへの結合により例示される。例示する修飾されたシアル酸はＰＥＧで標識される。以下の検討をＰＥＧ−修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に焦点をあてるのは具体的説明の明瞭さのためであり、本発明がこれら２つのパートナーの結合に限定されることを意味するものではない。当業者はこの検討が一般にシアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付加に応用できることを理解している。さらにこの検討は他の水溶性ポリマー、治療部分および生体分子を含むＰＥＧ以外の作用物質を含むグリコシル単位の修飾にも等しく応用できる。
【０５４３】
酵素的取り組みは、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化炭水化物のペプチドまたは糖ペプチドへの選択的導入に使用することができる。この方法はＰＥＧ、ＰＰＧ、または遮蔽された反応性官能基を含む修飾された糖を利用し、そして適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせる。所望する炭水化物結合を作るグリコシルトランスフェラーゼを選択し、そして供与体基質として修飾された糖を利用することにより、ＰＥＧまたはＰＰＧをペプチド骨格に、糖ペプチドに既存の糖残基に、またはペプチドに加えられた糖残基に直接導入することができる。
【０５４４】
シアリルトランスフェラーゼの受容体は本発明の方法により修飾されるペプチド上に、天然に存在する構造として、または組換え的に、酵素的にまたは化学的にそこに配置されたものとして存在する。適当な受容体には例えばＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）のようなガラクトシル受容体、および当業者に知られている他の受容体を含む（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４（１９７８）を参照にされたい）。
【０５４５】
１つの態様では、シアリルトランスフェラーゼの受容体は修飾されるペプチド上にペプチドの生体内合成で存在する。そのようなペプチドは、ペプチドのグリコシル化パターンの前修飾無しで特許請求する方法を使用してシアリル化することができる。あるいは本発明の方法を使用して、適切な受容体を含まないペプチドをシアリル化することができ；最初にペプチドを当該技術分野で既知の方法により受容体を含むように修飾する。例示態様では、ＧａｌＮＡｃ残基をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により加える。
【０５４６】
例示態様では、ガラクトシル受容体はガラクトース残基をペプチドに連結された適切な受容体（例えばＧｌｃＮＡｃ）に結合することにより集成する。この方法には修飾されるペプチドを適当量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）および適当なガラクトシル供与体（例えばＵＤＰ−ガラクトース）を含む反応混合物とインキューベーションすることを含む。反応は実質的に完了するまで進行するように行うか、あるいは反応は前以て選択した量のガラクトース残基が加えられた時に終了する。選択したサッカリド受容体を集成する他の方法は、当業者には明らかである。
【０５４７】
さらに別の態様では、ペプチド−連結オリゴ糖は最初に全体的または部分的「改作（ｔｒｉｍｍｅｄ」されて、シアリルトランスフェラーゼの受容体または適当な受容体を得るために１以上の適切な残基を加えることができる部分のいずれかを露出する。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素（例えば米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照にされたい）は、付加および改作反応に有用である。「改作」およびＮ−連結およびＯ−連結グリカンの改造に関する詳細な検討は、本文献のいたるところに提供されている。
【０５４８】
以下の検討では、本発明の方法が水溶性ポリマーを結合した修飾された糖の使用により例示される。これに焦点をあてるのは具体的説明の明瞭さのためである。当業者はこの検討は修飾される糖が治療部分、生体分子等を持つ態様にも等しく関連すると考えるだろう。
【０５４９】
修飾される糖を加える前に炭水化物残基が「改作」される本発明の例示態様を図１４に説明し、これは高マンノースが第１世代の２アンテナ構造に戻し改作されるスキームを説明する。水溶性ポリマーを持つ修飾された糖は、「戻し改作（ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｂａｃｋ」により露出した１以上の糖残基に結合される。１つの態様では水溶性ポリマーは水溶性ポリマーに結合したＧｌｃＮＡｃ部分を介して加えられる。修飾されるＧｌｃＮＡｃは２アンテナ構造の１または両末端マンノース残基に付けられる。あるいは非修飾ＧｌｃＮＡｃを分岐種の１または両末端に加えることができる。
【０５５０】
別の例示態様では、水溶性ポリマーが、末端マンノース残基上に加えられるＧｌｃＮＡｃ残基に結合するガラクトース残基を有する修飾された糖を介して、２分岐構造の１または両方の末端マンノース残基に加えられる。あるいは非修飾Ｇａｌを１または両方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に加えることができる。
【０５５１】
さらなる態様では、水溶性ポリマーが修飾されたシアル酸を使用してＧａｌ残基に加えられる。
【０５５２】
別の例示態様を図１５で説明し、これは図１４に示すスキームと同様であり、ここで高マンノース構造がマンノースに「戻し改作」され、それから２分岐構造が分岐する。１例では、水溶性ポリマーがポリマーで修飾されたＧｌｃＮＡｃを介して加えられる。あるいは非修飾ＧｌｃＮＡｃをマンノースに加え、続いて結合した水溶性ポリマーを持つＧａｌを加える。さらに別の態様では、非修飾ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基を順次マンノースに加え、続いて水溶性ポリマーで修飾したシアル酸部分を加える。
【０５５３】
図１６は図１４に類似したスキームを使用してさらなる例示態様を説明し、ここで高マンノースをＧｌｃＮＡｃに「戻し改作」し、これに第１マンノースを結合させる。ＧｌｃＮＡｃは水溶性ポリマーを持つＧａｌ残基に結合する。あるいは非修飾ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに加え、続いて水溶性糖で修飾したシアル酸を加える。さらなる例では、末端Ｇｌｃ
ＮＡｃをＧａｌに結合し、そして続いてＧｌｃＮＡｃを水溶性ポリマーを持つ修飾されたフコースでフコシル化する。
【０５５４】
図１７は図１４に示したものに類似するスキームであり、ここで高マンノースはペプチドのＡｓｎに結合した第１ＧｌｃＮＡｃに戻し改作される。１例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃを、水溶性ポリマー持つＧｌｃＮＡｃに結合させる。別の例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃを、水溶性ポリマーを持つＧａｌで修飾する。さらに別の態様では、ＧｌｃＮＡｃをＧａｌで修飾し、続いて水溶性ポリマーで修飾したシアル酸をＧａｌに結合する。
【０５５５】
別の例示態様を図１８〜２２に説明する。本発明を実施することができる反応型の順序の説明は、前述の各図面に提供されている。
【０５５６】
上記に説明された例は、ここで説明される方法の出力の説明を提供する。本発明の方法を用いて、実質的にあらゆる望まれる構造の糖質残基を“縮小”するか形成するかが可能である。上に説明した様に、修飾された糖は糖質部分の末端に付加されうるか、ペプチドコアと糖質の末端との間の中間体ともなりうる。
【０５５７】
一つの実施例においては、存在するシアル酸はシアルダーゼを用いてグリコペプチドから除かれるが、そこでは下線部のガラクトシル残基のすべてかほとんどをマスクしない。択一的に、ペプチドもしくはグリコペプチドはガラクトース残基か、もしくはガラクトース単位において終結するオリゴ糖残基でラベルされる。ガラクトース残基の露出か付加に続いて、適当なシアリルトランスフェラーゼが修飾されたシアル酸を付加するために用いられる。アプローチがスキーム１２に総括される。
【０５５８】
【化６２】
0005413548.tif 000069
【０５５９】
スキーム１３にまとめるさらなる取り組みでは、マスクされた反応性官能基がシアル酸上に存在する。マスクされた反応基は好ましくは、修飾されたシアル酸をペプチドに結合するために使用する条件に影響を受けない。修飾されたシアル酸のペプチドへの共有結合後、マスクを除き、そしてペプチドをＰＥＧ、ＰＰＧ、治療部分、生体分子または他の作用物質と結合させる。作用物質は、修飾された糖残基上の露出した反応基との反応により特異的様式でペプチドに結合する。
【０５６０】
【化６３】
0005413548.tif 000070
【０５６１】
任意の修飾された糖は、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に依存して、それに適切なグリコシルトランスフェラーゼと使用することができる（表４）。上で検討したように、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化構造の導入に必要な糖ペプチドの末端糖は、発現中に天然に導入できるか、あるいは適切なグリコシダーゼ（１つまたは複数）、グリコシルトランスフェラーゼ（１つまたは複数）またはグリコシダーゼ（１つまたは複数）およびグリコシルトランスフェラーゼ（１つまたは複数）の混合を使用して発現後に生成することができる。
【０５６２】
【表４】
0005413548.tif 000071
※表４．隣の訳，修飾糖
【０５６３】
さらなる例示態様では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧを牛乳のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させ、これにより修飾されたガラクトースを適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造に転移させる。糖ペプチドの末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳動物、昆虫、植物または真菌のような発現系で起こるように発現中に生成され得るが、糖ペプチドを必要に応じてシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することにより生成することもできる。
【０５６４】
別の例示態様では、ＧｎＴ−Ｉ−ＩＶのようなＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをＰＥＧ化−ＧｌｃＮＡｃを糖ペプチドのマンノース残基に転移するために利用する。さらなる例示態様では、Ｎ−および／またはＯ−連結グリカン構造を糖ペプチドから酵素的に除去してアミノ酸または末端グリコシル残基を露出し、次いでこれを修飾された糖に結合する。例えばエンドグリカナーゼを使用して糖ペプチドのＮ−連結構造を除去して、末端ＧｌｃＮＡｃを糖ペプチド上のＧｌｃＮＡｃ−連結剤−Ａｓｎとして露出する。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ−またはＰＰＧ−ガラクトース官能基を露出したＧｌｃＮＡｃ上に導入する。
【０５６５】
別の態様では、修飾された糖は糖残基をペプチド骨格に転移することが知られているグリコシルトランスフェラーゼを使用してペプチド骨格に直接加える。この例示態様はスキーム１４で説明する。本発明を実施するために有用なグリコシルトランスフェラーゼの例には、限定するわけではないがＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ１−１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ等を含む。この取り組みの使用は、炭水化物を欠くペプチド上へ、あるいは既存の糖ペプチド上への修飾された糖の直接的付加を可能とする。両方の場合で、修飾された糖の付加はグルコシルトランスフェラーゼの基質特異性により定められるペプチド骨格上の特異的な位置で起こり、そして化学的な方法を使用したタンパク質のペプチド骨格の修飾中に起こる様式のような無作為の様式では起こらない。適当なアミノ酸配列をペプチド鎖に工作することにより、多くの作用物質がグルコシルトランスフェラーゼの基質ペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチドに導入され得る。
【０５６６】
【化６４】
0005413548.tif 000072
【０５６７】
上に説明した各例示態様では、１以上のさらなる化学的または酵素的修飾工程を、修飾
された糖がペプチドに結合した後に利用することができる。例示態様では、酵素（例えば
フコシルトランスフェラーゼ）を使用してグルコシル単位（例えばフコース）をペプチド
に結合した末端修飾糖に付加（ａｐｐｅｎｄ）する。別の例では酵素反応を利用して修飾
された糖が結合できなかった部位を「キャップ」する。あるいは化学反応を利用して結合
した修飾糖の構造を改変させる。例えば結合した修飾糖を、修飾糖が結合しているペプチ
ド成分との結合を安定化または不安定化する作用物質と反応させる。別の例では、修飾さ
れた糖の成分をそのペプチドへの結合後に脱保護する。当業者は修飾された糖がペプチド
に結合した後の段階で本発明の方法に有用な多数の酵素的または化学的手順があると考え
るだろう。修飾された糖−ペプチド結合物のさらなる仕上げ（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）
は、本発明の範囲内である。
【０５６８】
マンノース−６−ホスフェートでのペプチドの標的化
例示態様では、ペプチドを少なくとも１つのマンノース−６−ホスフェート部分で誘導
化する。マンノース−６−ホスフェート部分はペプチドを細胞のリソソームに標的し、そ
して例えばリソソーム蓄積疾患（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ
）の治療に治療用タンパク質をリソソームに標的するために有用である。
【０５６９】
リソソーム蓄積疾患は、細胞のリソソーム内の糖脂質または多糖廃棄産物を分解する酵
素をコードする遺伝子の欠損の結果である４０を越える疾患群である。次いで酵素産物、
例えば糖および脂質は新たな生成物に再使用される。これら各疾患はリソソーム中の酵素
レベルに影響を及ぼす遺伝する常染色体またはＸ−結合劣性形質から生じる。一般に影響
を受けている個体の細胞および組織中には、影響を受けた酵素の生物学的または機能的活
性が無い。表５は代表的蓄積疾患および疾患に関連する酵素的欠失の一覧を提供する。そ
のような疾患では、酵素機能の欠乏が身体の細胞中のリソソームに脂質または炭水化物基
質の進行的な全身性の沈積を生じ、最終的には器官の機能損失および死を引き起こす。遺
伝的病因論、臨床的発現、分子生物学およびリソソーム蓄積疾患の可能性は、Ｓｃｒｉｖ
ｅｒら．編集、遺伝疾患の代謝および分子的基礎（ＴＨＥ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＩＮＨＥＲＩＴＥＤ  ＤＩＳＥＡＳＥ）、７．ｓｕｐ．ｔｈ．Ｅｄ、Ｖｏｌ．ＩＩ、マグローヒル（１９９５）に詳細に記載されている。
【０５７０】
【表５】
0005413548.tif 000073
※表５．隣の訳，リソソーム蓄積症と関連した酵素欠陥
【０５７１】
Ｄｅ  Ｄｕｖｅは損失しているリソソーム酵素を外因性の生物学的に活性な酵素で代用
することがリソソーム蓄積疾患を処置する貴重な取り組みであると最初に提案した（Ｄｅ
Ｄｕｖｅ，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．２３：１０４５（１９６４））。その時から、酵素代替
治療が様々なリソソーム蓄積疾患を処置するために有益になり得るという種々の研究が提
案された。最高の成功は、胎盤から（Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商標））またはより最近では組
換え的（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））に調製した外因性酵素（β−グルコセレブロシダー
ゼ）で処置したＩ型ゴーシェ病を持つ個体で示された。酵素代替はファブリー病ならびに
他のリソソーム蓄積疾患を処置するためにも有益であることが示唆された。例えばＤａｗ
ｓｏｎら，Ｐｅｄ．Ｒｅｓ．７（８）：６８４−６９０（１９７３）（生体外）およびＭａｐｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６９：９８７（１９７０）（生体内）を参照にされたい。酵素代替治療の臨床試験は、正常血漿（Ｍａｐｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６９：９８７−９８９（１９７０））、胎盤から精製したα−ガラクトシダーゼＡ（Ｂｒａｄｙら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２７９：１１６３（１９７３））；または脾臓または血漿から精製したα−ガラクトシダーゼＡ（Ｄｅｓｎｉｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：５３２６−５３３０（１９７９））の潅流を使用したファブリー患者について報告
され、そしてファブリー病の直接的酵素代替の生物化学的効力が証明された。これらの研
究は反復した酵素代替により病理学的な糖脂質蓄積を排除し、または有意に減少するため
の可能性を示す。例えば１つの実験では（Ｄｅｓｎｉｃｋら，同上）、精製された酵素の静脈内注入で、蓄積される脂質物質、グロボトリアシルセラミドの血漿レベルに一過性の減少がもたらされた。
【０５７２】
従って、当該技術分野には、ヒトα−ガラクトシダーゼＡのような十分な量の生物学的に活性なリソソーム酵素を、欠乏細胞に提供するための方法の必要性が存在する。最近、組換え的な方法でこれらの必要性に取り組んだ、例えば米国特許第５，６５８，５６７号、同第５，５８０，７５７明細書；Ｂｉｓｈｏｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：４８５９−４８６３（１９８６）；Ｍｅｄｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７９１７−７９２２（１９９６）；Ｎｏｖｏ，Ｆ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．４：４８８−４９２（１９９７）；Ｏｈｓｈｉｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２５４０−２５４４（１９９７）；およびＳｕｇｉｍｏｔｏら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９０５−９１６（１９９５）を参照にされたい。マンノース−６−ホスフェートは治療用ペプチドがリソソームを標的とすることを媒介し、本発明は十分量の生物学的に活性なリソソームペプチドを欠損細胞に送達するための組成物および方法を提供する。
【０５７３】
このように例示態様では、本発明はマンノース−６−ホスフェートで誘導化した表７によるペプチドを提供する（図２４および図２５）。ペプチドは組換え的または化学的に調製することができる。さらにペプチドは完全に天然な配列であるか、または例えば短縮化、延長により修飾することができ、あるいは置換または欠失を含んでもよい。本発明の方法を使用して改造されるタンパク質の例は、グルコセレブロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性−α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）を含む。臨床的に使用する代表的な修飾されたペプチドには、限定するわけではないがＣｅｒｅｄａｓｅ（商標）、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）およびＦａｂｒｙｚｙｍｅ（商標）を含む。修飾され、そして臨床的に関連するペプチド上のグリコシル基も、本発明の方法を利用して改変させることができる。マンノース−６−ホスフェートはグリコシル連結基を介してペプチドに結合させる。例示態様では、グリコシル連結基はシアル酸に由来する。シアル酸−由来グリコシル連結基の例は表３に説明し、ここで１以上の“Ｒ”部分がマンノース−６−ホスフェートまたは結合した１以上のマンノース−６−ホスフェート部分を有するスペーサー基である。修飾されたシアル酸部分は好ましくはペプチドの表面に連結したオリゴ糖の末端残基である（図２６）。
【０５７４】
マンノース−６−ホスフェートに加えて、本発明のペプチドは水溶性ポリマー、治療部
分、またはさらなる標的部分のような部分を用いて誘導化することができる。これらのお
よび他の基を結合する方法は本明細書で説明する。例示態様では、マンノース−６−ホス
フェート以外の基を、表３に従い誘導化されたシアル酸誘導体を介してペプチドに結合さ
せ、ここで１以上の“Ｒ”部分がマンノース−６−ホスフェート以外の基である。
【０５７５】
例示態様では、Ｃｂｚ−保護グリシンに基づくリンカーアームで修飾されたシアル酸部分を調製する。対応するヌクレオチド糖を調製し、そしてＣｂｚ基は触媒的水素添加により除去する。生成するヌクレオチド糖は、利用可能な反応性アミンを有し、これを活性化マンノース−６−ホスフェート誘導体と接触させて、本発明の方法の実施に有用であるマンノース−６−ホスフェート誘導化ヌクレオチド糖を提供する。
【０５７６】
以下のスキーム（スキーム１５）に示すように、活性化マンノース−６−ホスフェート誘導体の例は、２−ブロモ−ベンジル−保護ホスホトリエステルを対応するトリフラートにその場で転換し、そしてトリフラートと反応性酸素を含有する部分を有するリンカーとを反応させ、糖とリンカーとの間にエーテル結合を形成することにより形成される。ベンジル保護基は触媒的水素添加により除去され、そしてリンカーのメチルエステルは加水分解され、対応するカルボン酸を提供する。カルボン酸は当該技術分野で既知の方法により活性化される。活性化手順の例は、カルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの転換に依る。
【０５７７】
【化６５】
0005413548.tif 000074
【０５７８】
別の例示態様では、以下のスキーム（スキーム１６）に示すように、Ｎ−アセチル化シ
アル酸をピルビル部分の操作によりアミンに転換する。このように１級ヒドロキシルをス
ルホン酸エステルに転換し、そしてアジ化ナトリウムと反応させる。アジドを対応するア
ミンに触媒的に還元する。続いて糖はヌクレオチド類似体に転換し、そしてアミン基を介
して上記のように調製した連結アーム−誘導化マンノース−６−ホスフェートにカップリングする。
【０５７９】
【化６６】
0005413548.tif 000075
【０５８０】
リソソーム蓄積疾患を処置するために有用なペプチドは、限定するわけではないがトラ
ンスフェリン、（血液脳関門をわたり、そしてエンドソームにペプチドを送達するために
）、カルニチン（ペプチドを筋肉細胞に送達するために）、およびホスホネート、例えば
ビスホスホネート（ペプチドを骨および他の炭酸カルシウムを含む組織を標的とさせるた
めに）を含む他の標的部分で誘導化することができる。標的部分および治療用ペプチドは
本明細書に記載する任意の方法または当該技術分野で既知の方法により結合される。
【０５８１】
例示態様では、標的剤および治療用ペプチドはリンカー部分を介してカップリングされる。この態様では、少なくとも１つの治療用ペプチドまたは標的剤が本発明の方法に従い、結合基部分に完全なグリコシル連結基を介してカップリングされる。例示態様では、結合基部分にはポリ（エチレングリコール）のようなポリ（エーテル）を含む。別の例示態様では結合基部分は、結合物を身体中の標的とする組織または領域に送達した後、生体内で分解されて標的剤から治療用ペプチドを放出する少なくとも１つの結合を含む。
【０５８２】
さらに別の例示態様では、治療用ペプチドを標的部分に結合することなく治療部分のグリコホームの改変を介して治療部分の生体内分布が改変される。例えば治療用ペプチドはシアル酸（またはその誘導体）でグリコシル基の末端ガラクトース部分をキャッピングすることにより、網内系による取り込みからそらすことができる（図２４および２７）。末端Ｇａｌを覆うシアリル化は、肝臓のアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ）レセプターによるペプチドの取り込みを回避し、そしてシアリル化が無い複雑なグリカン鎖のみを有するペプチドに比べてペプチドの半減期を伸ばすことができる。
【０５８３】
ＩＩ．本発明のペプチド／糖ペプチド 
１つの態様では、本発明は基本的なトリマンノシルコアを主要なグリカン構造としてペプチドに結合して有する１つのペプチドの多数のコピーを含んでなる組成物を提供する。好適な態様では、ペプチドは治療用分子である。ペプチドの天然な形態は複雑なＮ−連結グリカンを含んでなることができ、あるいは高マンノースグリカンでよい。ペプチドは哺乳動物のペプチドでよく、そして好ましくはヒトのペプチドである。幾つかの態様では、ペプチドは免疫グロブリン、エリスロポエチン、組織型アクチベーターペプチドおよびその他からなる群から選択される（図２８を参照にされたい）。
【０５８４】
グリカンが本発明の方法を使用して改造できるペプチドの例を図２８に説明する。
【０５８５】
【表６】
0005413548.tif 000076
※表６．隣の訳，グリカンの改造に好ましいペプチド
【０５８６】
【表７】
0005413548.tif 000077
0005413548.tif 000078
※表７．隣の訳，グリカンの改造に最も好ましいペプチド
【０５８７】
本発明に有用なペプチドのより詳細な一覧およびそれらの供給源を図２８に提供する。
【０５８８】
本発明の方法により修飾されるペプチドの他の例には、免疫グロブリンファミリーの員（例えば抗体、ＭＨＣ分子、Ｔ細胞レセプター等）、細胞間レセプター（例えばインテグリン、ホルモンまたは増殖因子のレセプター等）レクチン、およびサイトカイン（例えばインターロイキン）を含む。さらなる例にはとりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、レニン、第ＶＩＩＩ因子およびＩＸ因子のような凝固因子、ボンベシン、トロンビン、造血増殖因子、コロニー刺激因子、ウイルス抗原、補体ペプチド、α１−アンチトリプシン、エリトロポエチン、Ｐ−セレクチン糖ペプチドリガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、抗−トロンビンＩＩＩ、インターロイキン、インターフェロン、ペプチドＡおよびＣ、フィブリノーゲン、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、レプチン、グリコシダーゼを含む。ペプチドの一覧は例であり、排他的であると考えるべきではない。むしろ本明細書に提供する開示から明らかなように、本発明の方法は所望するグリカン構造を形成することができる任意のペプチドに応用可能である。
【０５８９】
本発明の方法は、限定するわけではないがＩｇＧのような免疫グロブリンに由来する部分を含むキメラペプチドを含むキメラペプチドの修飾にも有用である。
【０５９０】
本発明の方法により修飾されるペプチドは合成または野生型ペプチドであることができ、あるいはそれらは部位指向的突然変異誘発法のような当該技術分野で既知の方法により生成される突然変異したペプチドであることができる。ペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ−結合またはＯ−結合である。Ｎ−結合の例は、修飾された糖のアスパラギン残基の側鎖への結合である。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。このようにペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在が潜在的なグリコシル化部位を作成する。本明細書のいたるところで開示するように、Ｏ−結合グリコシル化は、１つの糖（例えばＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）の、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはトレオニンのヒドロキシ側鎖への結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用することができる。
【０５９１】
本発明の数種の例示態様を、以下で検討する。これらの態様の幾つかは商用名を持つ名前を有するペプチド、および例示ペプチドとして他の具体的なペプチドを使用するが、これらの例は具体的ペプチドに限定するものではない。以下の例示態様はすべてのペプチド均等物および任意のペプチドの変異体を含むことを意図している。そのような変異体には限定するわけではないが、Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の付加または削除、および加えたグリコシル化部位との融合タンパク質を含む。当業者は以下の態様およびそこに開示されている基本的方法が多くのペプチドに応用でき、等しく成功すると考えるだろう。
【０５９２】
１つの例示態様では、本発明は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を修飾するための方法を提供する。図２９Ａ〜２９Ｇは、本明細書に開示する方法論を使用してこれがどのようになされるかの幾つかの例を説明する。図２９Ｂでは、哺乳動物細胞系で発現したＧ−ＣＳＦペプチドをシアリダーゼを使用して戻し改作する。このように露出した残基は、それに適切な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１を使用してシアル酸−ポリ（エチレングリコール）部分（ＰＥＧ部分）の付加により修飾される。図２９Ｃは昆虫細胞で発現したＧ−ＣＳＦペプチドを修飾するための例示スキームを説明する。このペプチドは、それに適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトース部分を加えることにより修飾する。ガラクトース残基は、シアル酸−ＰＥＧ誘導体を介してＳＴ３Ｇａｌ１の作用を通してＰＥＧで官能化される。図２９Ｄでは、細菌が発現したＧ−ＣＳＦをＮ−アセチルガラクトサミン供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼと接触させる。このペプチドはＰＥＧ化シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧで官能化する。図２９Ｅでは、哺乳動物細胞が発現したＧ−ＣＳＦをレブリン酸で修飾したシアル酸供与体と接触させ、反応性ケトンをシアル酸供与体に加える。ペプチド上のグリカン上のグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図２９Ｆでは細菌が発現したＧ−ＣＳＦを、ペプチドをエンド−ＧａｌＮＡｃ酵素と、これが加水分解的様式ではなく合成的に機能する条件下で接触させ、これによりＰＥＧ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ分子をそれらの活性化誘導体から加える。図２９Ｇは細菌が発現したＧ−ＣＳＦの別の改造経路を提供する。ポリペプチドはＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を用いて、ポリペプチドをＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび適切なＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させることにより誘導化する。
【０５９４】
別の例示態様では、本発明は図３０Ａ〜３０Ｎに示すようにインターフェロンα−１４Ｃ（ＩＦＮα１４Ｃ）を修飾する方法を提供する。様々なＩＦＮα形態を本明細書のいたるところに開示する。図３０Ｂでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮα１４Ｃを最初にシアリダーゼで処理してそれらの上のシアル酸単位を戻し改作し、そして次いでこの分子をＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｃでは最初にＮ−アセチルグルコサミンを昆虫もしくは真菌細胞で発現したＩＦＮα１４Ｃに加え、ここで反応はＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩの作用を介してＮ−アセチルグルコサミン供与体を使用して行う。次いでポリペプチドはガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ化−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化される。図３０Ｄでは酵母で発現したＩＦＮα１４Ｃを最初にエンド−Ｈで処理してその上のグリコシル単位を戻し改作する。この分子はガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し、そして次にこれをＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｆでは哺乳動物細胞により生産されたＩＦＮα１４Ｃが、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化−シアル酸の供与体を使用して修飾されてＰＥＧ部分が少しづつ動かれされる（ｉｎｃｈｅｄ）。図３０Ｇでは昆虫または真菌細胞で発現したＩＦＮα１４Ｃは、最初に１以上のＧｎＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶ、およびＮ−アセチルグルコサミン供与体を使用してＮ−アセチルグルコサミンが加えられる。このタンパク質は次いで適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでＩＦＮα１４ＣはＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図３０Ｈでは酵母が生産したＩＦＮα１４Ｃを最初にマンノシダーゼで処理してマンノシル基を戻し改作する。次いでＮ−アセチルグルコサミンが、Ｎ−アセチルグルコサミンの供与体および１以上のＧｎＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用して加えられる。さらにＩＦＮα１４Ｃは適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図３０ＩではＮＳＯ細胞が発現したＩＦＮα１４Ｃを、適切な末端残基をレブリン酸で修飾したシアル酸供与体でキャッピングすることにより修飾し、これにより反応性ケトンをシアル酸供与体に付加する。ペプチドのグリコシル残基へ加えた後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３０Ｊでは哺乳動物細胞により発現されたＩＦＮα１４Ｃが、ＰＥＧ−シアル酸の供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化される。図３０Ｋでは哺乳動物細胞により生産されたＩＦＮα１４Ｃが最初にシアリダーゼを用いて末端シアル酸残基を戻し改作され、そして次に分子はトランス−シアリダーゼおよびＰＥＧ化シアル酸−ラクトース複合体を使用してＰＥＧ化される。図３０Ｌでは哺乳動物系で発現したＩＦＮα１４Ｃがシアル酸の供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル化される。図���０Ｍでは昆虫または真菌細胞で発現したＩＦＮα１４Ｃに、最初に適切な供与体およびＧｎＴＩおよび／またはＩＩを使用してＮ−アセチルグルコサミンが加えられる。次いで分子をガラクトシルトランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化したガラクトース供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびガラクトース残基を介して反応性シアル酸に結合させる。ついでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。図３０Ｎでは昆虫または酵母細胞のいずれかで発現したＩＦＮα１４Ｃを、最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化されたガラクトース供与体と接触させて、ポリペプチドにリンカーおよびガラクトース残基を介して反応性シアル酸を結合させる。ついで分子をＳＴ３Ｇａｌ３およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。
【０５９５】
別の例示態様では、本発明は図３０Ｏ〜３０ＥＥに示すようにインターフェロンα−２ａまたは２ｂ（ＩＦＮα）を修飾する方法を提供する。図３０Ｐでは哺乳動物細胞で生産されたＩＦＮαを最初にシアリダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｑでは昆虫細胞で発現したＩＦＮαを最初に適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ１およびＰＥＧ化シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｒは細菌中で発現したＩＦＮαの別の改造方法を提供する：ＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンは、適切な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してタンパク質に加える。図３０Ｓでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮαを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体を用いて適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基に加えた後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３０Ｔでは細菌で発現したＩＦＮαを、加水分解的様式の代わりに合成的に機能する修飾された酵素であるエンド−Ｎ−アセチルガラクトサミダーゼを使用して、およびＰＥＧ部分で誘導化したＮ−アセチルガラクトサミン供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０ＰではＮ−アセチルガラクトサミンを最初に、適当な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してＩＦＮαに加え、そして次いでシアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ化シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｖでは哺乳動物系で発現したＩＦＮαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次に適当な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１および／またはＳＴ３Ｇａｌ
３を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｗでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでこのポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ１およびリンカーで連結された２つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび２番目のシアル酸残基を介して１つの反応性シアル酸に結合させる。続いてポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてトランスフェリンがシアル酸残基を介して結合するようになる。図３０Ｙでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ１およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０Ｚでは昆虫細胞により生産されたＩＦＮαを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ化ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化する。図３０ＡＡでは細菌が発現したＩＦＮαに、最初に適切な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してアセチルガラクトサミンを加える。このタンパク質は次いで、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図３０ＣＣＣでは細菌で発現したＩＦＮαが別の手順で修飾される；ＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンを、Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼによりＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンの供与体を使用してタンパク質に加える。図３０ＤＤでは細菌で発現したＩＦＮαを別のスキームで改造する。ポリペプチドを最初にＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸を用いて誘導化されたＮ−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、ＩＦＮαをリンカーおよびＮ−アセチルガラクトサミンを介して反応性のシアル酸に結合させる。次いでＩＦＮαをＳＴ３Ｇａｌ３およびアシアロトランスフェリンと反応させて、これがシアル酸残基を介してトランスフェリンに連結するようになる。次いでＩＦＮαはＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングされる。細菌が発現したＩＦＮαを修飾するさらなる方法を図３０ＥＥに開示し、ここでＩＦＮαは最初にＮＨＳ−ＣＯ−リンカー−ＳＡ−ＣＭＰに暴露され、そして次いでリンカーを介して反応性シアル酸に連結される。これは続いてＳＴ３Ｇａｌ３およびトランスフェリンを使用してトランスフェリンに結合する。
【０５９６】
ＩＮＮオメガを改造する方法は、ＩＮＦオメガペプチドに対するグリカンの付着がＳＥＧＩＤ  Ｎｏ：７５のアミノ酸残基１０１で起こることを除いて、ＩＦＮアルファに対してここで示したものと本質的に同一である。ＩＦＮオメガに対するヌクレオチドとアミノ酸配列は、ＳＥＧ  ＩＤ  Ｎｏ：７４と７５としてこの中に示してある。ＩＦＮオメガの作り方と使用法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４９１７８８７と５３１７０８９およびＥＰ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０１７０２０４−Ａに見出される。
【０５９７】
別の例示態様では、本発明は図３１Ａ〜３１Ｓで示すようにインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）の修飾法を提供する。図３１Ｂでは哺乳動物系で発現したＩＦＮ−βを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでタンパク質はＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図３１Ｃは昆虫細胞により生産されたＩＦＮ−βを修飾するためのスキームである。最初にＮ−アセチルグルコサミンを、適切な供与体およびＧｎＴ−ｉおよび／または−ＩＩを使用してＩＦＮ−βに加える。次いでタンパク質はガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。最後にＩＦＮ−βはＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧされる。図３１Ｄでは酵母で発現したＩＦＮ−βを最初にエンド−Ｈで処理してそのグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３１Ｅでは哺乳動物細胞で生産されたＩＦＮ−βを、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ部分ですでに誘導化したシアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化することにより修飾する。図３１Ｆでは昆虫細胞で発現したＩＦＮ−βは最初に、Ｎ−アセチルグルコサミン供与体を使用して１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶによりＮ−アセチルグルコサミンが加えられ、そして次にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化され、そして次にＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図３１Ｇでは酵母で発現したＩＦＮ−βを最初にマンノシダーゼで処理してマンノシル単位を戻し改作し、次いでＮ−アセチルグルコサミン供与体および１以上のＧｎＴ−  Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用してＮ−アセチルグルコサミンが加えられる。このタンパク質はさらにガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化され、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化される。図３１Ｈでは哺乳動物細胞が発現したＩＦＮ−βを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基でキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３１Ｉでは哺乳動物系で発現したＩＦＮ−βを、ＰＥＧ−シアル酸の供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化する。図３１Ｊでは哺乳動物細胞により発現されたＩＦＮ−βを最初にシアリダーゼで処理してその末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでトランスシアリダーゼおよびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３１Ｋでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮ−βを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図３１Ｌでは哺乳動物細胞で発現し���ＩＦＮ−βを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３またはシアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３１Ｍでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮ−βを最初にシアリダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作する。これを次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図３１Ｎでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮ−βを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３１Ｏでは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮ−βを、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図３１Ｑでは昆虫細胞により発現されたＩＦＮ−βに、最初にＮ−アセチルグルコサミンの供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用してＮ−アセチルグルコサミンを加え、そしてさらにＰＥＧ−ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してさらにＰＥＧ化する。図３１Ｒでは酵母で発現したＩＦＮ−βを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３１Ｓでは哺乳動物系で発現したＩＦＮ−βを最初にＳＴ３Ｇａｌ３および連結剤（リンカー）を介して連結された２つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドを連結剤および第２のシアル酸残基を介して１つの反応性シアル酸と連結する。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３および脱シアリル化トランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが結合するようになる。次いでＩＦＮ−βはシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してさらにシアリル化される。
【０５９８】
別の例示態様では、本発明は図３２Ａ〜３２Ｄに示す第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因
子を修飾するための方法を提供する。図３２Ｂでは哺乳動物系により生産された第ＶＩＩ
またはＶＩＩａ因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そ
して次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図
３２Ｃでは哺乳動物細胞により発現された第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子を最初にシアリダ
ーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥ
Ｇ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。さらにポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３お
よびシアル酸供与体でシアリル化する。図３２Ｄは哺乳動物細胞により生産される第ＶＩ
ＩまたはＶＩＩａ因子の別の修飾スキームを提供する：ポリペプチドを最初にシアリダー
ゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作し
、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクト
シル化し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ
化する。
【０５９９】
別の例示態様では、本発明は第ＩＸ因子の修飾法を提供し、その幾つかの例が図３３Ａ〜３３Ｇに含まれる。図３１Ｂでは哺乳動物細胞により生産された第ＩＸ因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＳＴ３Ｇａｌ３でＰＥＧ化する。図３３Ｃでは哺乳動物細胞により発現された第ＩＸ因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、これを次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化−シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化し、そしてさらにＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。哺乳動物細胞が生産した第ＩＸ因子の改造の別のスキームは、図３３Ｄに見いだすことができる。ポリペプチドを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、さらにシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアリル化し、そして次いでＰＥＧ化シアル酸の供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１を使用してＰＥＧ化する。図３３Ｅでは哺乳動物系で発現した第ＩＸ因子が、ＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＳＴ３Ｇａｌ３により触媒されるシアリル化の方法を通してＰＥＧ化される。図３３Ｆでは哺乳動物細胞で発現した第ＩＸ因子を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンはヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化される。図３３Ｇは第ＩＸ因子のさらなる修飾法を提供する。哺乳動物細胞で生産されたポリペプチドは、ＰＥＧ−シアル酸の供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化される。
【０６００】
別の例示態様では、本発明は濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の修飾法を提供する。図Ｊ３４Ａ〜３４Ｊは幾つかの例を提示する。図３２Ｂ３４Ｂでは、ＦＳＨが哺乳動物系で発現し、そしてシアリダーゼで処理されて末端シアル酸残基が戻し改作され、続いてＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化されることにより修飾される。図３４Ｃでは哺乳動物細胞で発現したＦＳＨを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図３４Ｄは哺乳動物系で発現したＦＳＨを修飾するスキームを提供する。ポリペプチドをシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３４Ｅでは哺乳動物系で発現したＦＳＨを以下の手順で修飾する：ＦＳＨを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図３４Ｆは哺乳動物細胞により生産されたＦＳＨの別の修飾例を提供する：ポリペプチドを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３４Ｇでは哺乳動物系で発現したＦＳＨを別の手順で修飾する：ポリペプチドは、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加を用いて改造される。図３４ＨではＦＳＨを昆虫細胞で発現させ、そして以下の手順で修飾する：Ｎ−アセチルグルコサミンを適切なＮ−アセチルグルコサミン供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用して最初にＦＳＨに加え；次いでＦＳＨはＰＥＧ−ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化される。図３４Ｉは酵母により生産されたＦＳＨの修飾スキームを表す。このスキームに従い、ＦＳＨを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体でＰＥＧ化する。図３４Ｊでは哺乳動物細胞により発現されたＦＳＨを最初に、ＳＴ３Ｇａｌ３および結合剤を介した２つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドを結合剤および２番目のシアル酸残基を介して１つの反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ１およびＣＨＯで生産された脱シアリル化絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）と接触させ、そしてこのようにしてＣＧが第２シアル酸残基を介して連結するようになる。ついでＦＳＨはシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３および／またはＳＴ３Ｇ���ｌ１を使用してシアリル化される。
【０６０１】
別の例示態様では、本発明はエリスロポエチン（ＥＰＯ）の修飾法を提供し、図３５Ａ〜３５ＡＡは、野生型および突然変異ＥＰＯペプチドの両方の改造に関する幾つかの例を説
明する。図３５Ｂでは、種々の哺乳動物系で発現したＥＰＯが、発現したタンパク質をシ
アリダーゼと接触させて末端シアル酸残基を除去することにより改造される。生成したペ
プチドを、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導化したＣＭＰ−シアル酸
と接触させる。図３５Ｃでは昆虫細胞で発現したＥＰＯが、ＧｎＴ−Ｉおよび／またはＧ
ｎＴ−ＩＩを使用してＮ−アセチルグルコサミンを用いて改造される。次いでガラクトー
スがガラクトシルトランスフェラーゼを使用してペプチドに加えられる。ＰＥＧ基は、改
造されたペプチドをシアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導化されたＣＭＰ
−シアル酸と接触させることにより改造されたペプチドに加えられる。図３５Ｄでは哺乳
動物細胞系で発現したＥＰＯが、シアリダーゼの作用を介して末端シアル酸を除去するこ
とにより改造される。Ｎ−結合グリコシル単位の末端ガラクトース残基は、ＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアル酸で「キャップ化」される。Ｏ−結合グリカン上の末端ガラクトース残基は、適切なシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１を使用してＰＥＧ部分を持つシアル酸で官能化される。図３５Ｅでは哺乳動物細胞系で発現したＥＰＯを、ＰＥＧ−誘導化シアル酸部分でＮ−結合グリコシル残基を官能化することにより改造する。ペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３および適切な修飾されたシアル酸供与体と接触させる。図３５Ｆでは昆虫細胞系もしくは酵母もしくはきのこで発現したＥＰＯが、ペプチドをＮ−アセチルグルコサミン供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩおよびＧｎＴ−Ｖと接触させることにより、少なくとも1つのＮ−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造される。次いでペプチドはＰＥＧ化ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることによりＰＥＧ化される。図３５Ｇでは昆虫細胞系で発現したＥＰＯを、適切なＮ−アセチルグルコサミン供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩおよびＧｎＴ−Ｖを使用して、少なくとも1つのＮ−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造する。加水分解的様式ではなく合成的に作用するように作り変えられたガラクトシダーゼを利用して、活性化ＰＥＧ化ガラクトース供与体をＮ−アセチルグルコサミン残基に加える。
【０６０２】
図３５Ｈでは、昆虫細胞系もしくは酵母もしくはきのこで発現するＥＰＯは、少なくとも1つの末端Ｎ−アセチルグルコサミン−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、ＧｎＴ−ＩおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なＮ−アセチルグルコサミンと接触される。ペプチドはそこで、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で修飾される適当なガラクト−ス供与体と接触される。図３５Ｊでは、昆虫細胞系もしくは酵母もしくはきのこで発現するＥＰＯは、1つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体およびＧｎＴ−Ｉと接触される。ペプチドはさらに、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクト−ス供与体と接触される。ペプチドはそこで、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ部分で誘導される適当なガラクト−ス供与体と接触される。図３５Ｋでは、昆虫細胞系もしくは酵母もしくはきのこで発現するＥＰＯは、末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体および１つ以上のＧｎＴ−ＩやＧｎＴ−ＩＩやＧｎＴ−Ｖと接触される。ペプチドはそこで、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクト−ス供与体と接触される。ペプチドはさらに、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ部分で誘導される適当なガラクト−ス供与体と接触される。図３５Ｌでは、昆虫細胞系もしくは酵母もしくはきのこで発現するＥＰＯは、１つ以上の末端α２，６-シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体および１つ以上のＧｎＴ−ＩやＧｎＴ−ＩＩやＧｎＴ−Ｖと接触される。ペプチドはさらに、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクト−ス供与体と接触される。ペプチドはそこで、α２，６-シアリルトランスフェラーゼおよび適当に修飾されたシアル酸供与体と接触される。図３５Ｍでは、哺乳動物細胞細胞系で発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、末端シアル酸残基を取り除くためにシアリダーゼと接触させる。ペプチドはさらに、シアリルトランスフェラーゼおよび適当なシアル酸供与体と接触される。ペプチドはさらに、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアル酸供与体と接触される。図３５Ｎでは、哺乳動物細胞細胞系で発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアル酸供与体と接触される。図３５Ｏでは、哺乳動物細胞細胞系で発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端α２,８-シアル酸−ＰＥＧ残基を主としてＯ−結合のグリカンに付加することにより改造される。ペプチドは、α２,８-シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアル酸供与体と接触される。図３５Ｐでは、哺乳動物細胞細胞系で発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端α２,８-シアル酸−ＰＥＧ残基をＯ−結合とＮ−結合のグリカンに付加することにより改造される。ペプチドは、α２,８-シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアル酸供与体と接触される。図３５Ｑでは、酵母もしくはきのこで発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、末端マンノース残基を取り除くためにマンノシダ-ゼと接触させる。次に、ペプチドは、ＧｎＴ−Ｉおよび適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体と接触させる。ペプチドはさらに、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクト−ス供与体と接触される。ペプチドはそこで、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアル酸供与体と接触される。図３５Ｒでは、酵母またはきのこで発現されるＥＰＯは、少なくとも１つの末端Ｎ−アセチルグルコサミン−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、末端マンノース残基を取り除くためにマンノシダ-ゼと接触させる。ペプチドはそこで、ＧｎＴ−ＩおよびＰＥＧ部分で誘導される適当Ｎ−アセチルグルコサミン供与体と接触される。図３５Ｓでは、酵母もしくはきのこで発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、α２マンノース残基を取り除くためにマンノシダ-ゼと接触させる。ペプチドはさらに、ＧｎＴ−Ｉおよび適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体と接触させる。ペプチドはそこで、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクト−ス供与体と接触される。ペプチドはそこで、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアル酸供与体と接触される。図３５Ｕでは、酵母もしくはきのこで発現されるＥＰＯは、１つ以上のガラクト-ス−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、グリコシル基を切断縮小させるために内部のＨと接触させる。ペプチドはそこで、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なガラクト−ス供与体と接触される。図３５Ｖでは、酵母もしくはきのこで発現されるＥＰＯは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、グリコシル基を切断縮小させるために内部のＨと接触させる。ペプチドはさらに、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクト−ス供与体と接触される。ペプチドはそこで、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なシアリル酸供与体と接触される。図３５Ｗでは、昆虫細胞系で発現されるＥＰＯは、末端ガラクト-ス−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ペプチドは、末端マンノース残基を取り除くためにマンノシダ-ゼと接触させる。ペプチドはそこで、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導される適当なガラクト-ス供与体と接触される。図３５Ｙでは、ＮＳＯ  マウス骨髄腫細胞中で発現される“ｎｏｖｅｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ”、即ちＮＥＳＰと呼ばれる突然変異ＥＰＯは、シアル酸供与体に反応性ケトンを加えて、レブリン酸で修飾されるシアル酸供与体で適当な末端残基を覆うことによって改造される。ペプチドのグリコシル残基への付加の後、ケトンはヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分と共に誘導される。図３５Ｚでは、哺乳動物細胞系で発現される突然変異ＥＰＯ、即ちＮＥＳＰは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ残基を付加することにより改造される。ＰＥＧは、ＰＥＧ修飾シアル酸とα２，８-シアリルトランスフェラーゼを使ってグリカン上のグリコシル残基へ付加される。図３５ＡＡでは、哺乳動物細胞系で発現されるＮＥＳＰは、末端シアル酸残基を付加することにより改造される。シアル酸はシアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使ってグリコシル残基に加えられる。
【０６０３】
別の例示態様では、本発明は図３６Ａ〜３６Ｋに示すように顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の修飾法を提供する。図３６Ｂでは哺乳動物細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３６Ｃでは哺乳動物細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次いでシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１および／またはＳＴ３Ｇａｌ３を使用してさらにシアリル化する。図３６ＤではＮＳＯ細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアリル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ１およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３６Ｅでは、哺乳動物細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化する。図３６Ｆは哺乳動物細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３６Ｇでは哺乳動物細胞で発現しＧＭ−ＣＳＦを、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図３６Ｉでは昆虫細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦが、適当な供与体および１以上のＧｎ−ＴＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用したＮ−アセチルグルコサミンの付加、続いて適当な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したＰＥＧ化ガラクトースの付加により修飾される。図３６Ｊでは酵母が発現したＧＭ−ＣＳＦを最初にエンドグリカナーゼおよび／またはマンノシダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、そして続いてガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化する。図３６Ｋでは哺乳動物細胞で発現したＧＭ−ＣＳＦを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ１およびリンカーを介して連結された２つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第２のシアル酸残基を介して１つの反応性シアル酸に結合させる。ポリペプチドはさらにＳＴ３Ｇａｌ３およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてトランスフェリンと連結するようになる。
【０６０４】
別の例示態様では、本発明はインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の修飾法を提供する。図３７Ａ〜３７Ｎは幾つかの例を含む。図３７Ｂでは、種々の哺乳動物細胞で発現したＩＦＮγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして続いてＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３７Ｃでは哺乳動物系で発現したＩＦＮγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そしてさらにＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸の供与体を使用してシアリル化する。図３７Ｄでは哺乳動物細胞が発現したＩＦＮγを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理してシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでＩＦＮγはＰＥＧ−シアル酸の供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してＰＥＧ化される。図３７Ｅでは哺乳動物系で発現したＩＦＮγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化され、そしてさらにＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図３７Ｆは哺乳動物系で発現したＩＦＮγを修飾するための別の方法を記載する。タンパク質はレブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３７Ｇは哺乳動物細胞で発現したＩＦＮγは、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加により改造される。図３７Ｉでは昆虫または真菌細胞で発現したＩＦＮγが、適切な供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用してＮ−アセチルグルコサミンを付加することにより修飾される。このタンパク質はさらに、ＰＥＧ化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したＰＥＧ部分の付加により修飾される。図３７Ｊは酵母で発現したＩＦＮγを修飾するための方法を提供する。ポリペプチドを最初にエンドグリカナーゼで処理してサッカリド鎖を戻し改作し、そして次にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。次にＩＦＮγはＰＥＧ化シアル酸の供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してＰＥＧ化される。図３７Ｋでは哺乳動物細胞により生産されたＩＦＮγが以下のように修飾される：ポリペプチドを最初にＳＴ３Ｇａｌ３およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘導化されたシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応性ガラクトースに結合させる。ついでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびエンドグリカナーゼで前処理したトランスフェリンと接触させ、そしてこれによりトランスフェリンがガラクトース残基を介して連結するようになる。図３７Ｌに具体的に説明するス��ームでは、哺乳動物系で発現したＩＦＮγがＳＴ３Ｇａｌ３の作用を介して修飾され：ＰＥＧ化シアル酸が適当な供与体からＩＦＮγに転移する。図３７Ｍは昆虫または真菌細胞で発現したＩＦＮγを修飾する例であり、ここでポリペプチドのＰＥＧ化はＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用してＰＥＧ化Ｎ−アセチルグルコサミンを供与体からＩＦＮγに転移することにより達成される。図３７Ｎでは哺乳動物系で発現したＩＦＮγが、適当な供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用したＰＥＧ化シアル酸の付加により改造される。
【０６０５】
別の例示態様では、本発明はα１アンチ−トリプシン（α１−プロテアーゼインヒビター）の修飾法を提供する。そのような例の幾つかは図３８Ａ〜３８Ｎに見いだすことができる。図３８Ｂでは、種々の哺乳動物細胞で発現したα１アンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでＰＥＧ化シアル酸残基がＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのような適当な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３のようなシアリルトランスフェラーゼを使用して加えられる。図３８Ｃではα１アンチ−トリプシン修飾の別のスキームを示す。哺乳動物系で発現したα１アンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでＰＥＧで誘導化されたシアル酸残基が、適当な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３のようなシアリルトランスフェラーゼを使用して加えられる。続いて分子はシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用したシアル酸残基の付加によりさらに修飾される。任意的に哺乳動物細胞が発現したα１アンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理して末端シアル酸およびα−結合ガラクトース残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクトース供与体を使用してガラクトシル化される。さらにＰＥＧで誘導化したシアル酸が、ＰＥＧ化シアル酸供与体を使用してＳＴ３Ｇａｌ３の作用により加えられる。図３８Ｄでは哺乳動物系で発現したα１アンチ−トリプシンは最初に、シアリダーゼを使用して末端シアル酸残基が戻し改作される。次いでＰＥＧが、ＰＥＧ化シアル酸をＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのような供与体からα１アンチ−トリプシンへ転移することを媒介するＳＴ３Ｇａｌ３の作用を介してＮ−結合グリコシル残基に加えられる。引き続きより多くのシアル酸残基を、シアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用して結合させる。図３８Ｅはα１アンチ−トリプシンを改造する別の方法を具体的に説明する。哺乳動物細胞で発現したα１アンチ−トリプシンを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図３８Ｆはα１アンチ−トリプシン修飾の別の方法を開示する。哺乳動物発現系から得たα１アンチ−トリプシンは、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル酸の付加により改造する。図３８Ｈではα１アンチ−トリプシンが昆虫または酵母細胞で発現し、そしてポリペプチドをＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンおよび１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶまたはＶと接触させることにより、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造される。ついでこのポリペプチドは、ＰＥＧ化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ部分を用いて修飾される。図３８Ｉは酵母細胞で発現したα１アンチ−トリプシンを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作する。これを次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化する。次にポリペプ��ドはＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図３８Ｊではα１アンチ−トリプシンが哺乳動物系で発現する。ポリペプチドを最初にＳＴ３Ｇａｌ３および連結剤を介して反応性ガラクトースで誘導化されたシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応性ガラクトースに結合させる。ついでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびエンドグリカナーゼで前処理したトランスフェリンと接触させ、そしてこれによりトランスフェリンがガラクトース残基を介して連結するようになる。図３８Ｌでは酵母で発現したα１アンチ−トリプシンを最初にエンドグリカナーゼで処理してそのグリコシル基を戻し改作する。次いでタンパク質はガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分を持つガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化する。図３８Ｍでは植物細胞で発現したα１アンチ−トリプシンをヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼおよびキシロシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして続いてＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用して、ＰＥＧ部分で誘導化されたＮ−アセチルグルコサミンで修飾する。図３８Ｎでは哺乳動物細胞で発現したα１アンチ−トリプシンを、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧで誘導化したシアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化シアル酸残基を加えることにより修飾する。
【０６０６】
別の例示態様では、本発明は図３９Ａ〜３９Ｋに示すグルコセレブロシダーゼ（β−グルコシダーゼＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）またはＣｅｒｅｄａｓｅ（商標））の修飾法を提供する。図３９Ｂでは、哺乳動物系で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３９Ｃでは哺乳動物細胞で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびマンノース−６−ホスフェートで誘導化した反応性シアル酸を使用してマンノース−６−ホスフェート基を結合させ、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。任意的にＮＳＯ細胞が発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、そして次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。次いでマンノース−６−ホスフェート部分がＳＴ３Ｇａｌ３およびマンノース−６−ホスフェートで誘導化した反応性シアル酸を使用して分子に加えられる。図３９Ｄでは、哺乳動物細胞で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、これを次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図３９Ｅでは、哺乳動物細胞で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンを１以上のマンノース−６−ホスフェート基のような部分で誘導化する。図３９Ｆは哺乳動物細胞で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図３９Ｈでは昆虫細胞で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）は、最初に適当な供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用してＮ−アセチルグルコサミンが加えられ、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化される。図３９Ｉでは酵母で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図３９ＪＫでは哺乳動物細胞で発現したＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）を、最初にＳＴ３Ｇａｌ３および連結剤を介して連結した２つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドを連結剤および第２のシアル酸残基を介して１つの反応性シアル酸に結合させる。ついでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３および脱シアリル化トランスフェリンと接触させ、そしてこれによりトランスフェリンが連結するようになる。次いでこのポリペプチドはシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアリル化される。
【０６０７】
別の例示態様では、本発明は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）およびその突然変異体の修飾法を提供する。幾つかの具体的修飾スキームを図４０Ａ〜４０Ｗに提示する。図４０Ｂは１つの修飾手順を具体的に説明する：ＴＰＡが哺乳動物細胞により発現された後、これを１以上のマンノシダーゼ（１つまたは複数）およびシアリダーゼで処理してマンノシルおよび／またはシアル酸残基を戻し改作する。次いで末端Ｎ−アセチルグルコサミンを、ポリペプチドと適切なＮ−アセチルグルコサミンおよび１以上のＧｎＴ−  Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶとを接触させることにより加える。ＴＰＡはさらにガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでＰＥＧは、ＳＴ３Ｇａｌ３により触媒されるシアル化により、そしてＰＥＧ部分で誘導化されたシアル酸の供与体を使用して分子に結合させる。図４０Ｃでは、ＴＰＡが昆虫または真菌細胞で発現する。修飾には、適切なＮ−アセチルグルコサミンの供与体およびＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用したＮ−アセチルグルコサミンの付加：ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したガラクトシル化：およびＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧで誘導化されたシアル酸の供与体を使用したシアリル化によるＰＥＧの結合工程を含む。図４０Ｄでは、ＴＰＡが酵母で発現し、そして続いてエンドグリカナーゼで処理されてサッカリド鎖を戻し改作する。ポリペプチドは、供与体からＴＰＡへのＰＥＧ−ガラクトースの転移を触媒するガラクトシルトランスフェラーゼの作用を介してさらにＰＥＧ化される。図４０Ｅでは、ＴＰＡが昆虫または酵母細胞で発現する。ついでポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作する。さらにＰＥＧ部分は、ガラクトシルトランスフェラーゼにより媒介される適当な供与体からＴＰＡへのＰＥＧ−ガラクトースの転移を介して分子へ結合させる。図４０Ｆは昆虫もしくは酵母系から得たＴＰＡの異なる修飾法を提供する：ポリペプチドは、Ｎ−アセチルグルコサミンの供与体およびＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用したＮ−アセチルグルコサミンの付加、続いてガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ化ガラクトースの供与体を使用したガラクトシル化により改造される。図４０Ｇは昆虫または酵母細胞で発現したＴＰＡの別の改造スキームを提供する。末端Ｎ−アセチルグルコサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミンの供与体およびＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用して加える。加水分解的様式というよりむしろ合成的に作用するように修飾されたガラクトシダーゼを利用して、適切な供与体からＮ−アセチルグルコサミン残基へＰＥＧ化ガラクトースを加える。図４０Ｉでは、哺乳動物系で発現したＴＰＡを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。ポリペプチドはさらに、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４０Ｊでは、哺乳動物系で発現したＴＰＡをこのスキームに従い改造する：最初にポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作する：次いでシアル酸残基をシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用して末端ガラクトシル残基に結合させる：さらにＴＰＡは、ガラクトシルトランスフェラーゼにより触媒される供与体からＮ−アセチルグルコサミニル残基へのＰＥＧ化ガラクトースの転移を介してＰＥＧ化される。図４０ＫではＴＰＡが植物細胞で発現する。この例の修飾手順は以下の通りである：ＴＰＡを最初にヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼおよびキシロシダーゼで処理してそのグリコシル基を戻し改作する；次いでＰＥＧ化Ｎ−アセチルグルコサミンを
、適当な供与体およびＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを使用してＴＰＡに
加える。図４０Ｍでは、哺乳動物細胞で発現したＴＰＡ突然変異体（ＴＮＫ  ＴＰＡ）を改造する。末端シアル酸残基を最初にシアリダーゼを使用して戻し改作する；次いでポリペプチドがＰＥＧ化されるようにＳＴ３Ｇａｌ３を使用してＰＥＧ化シアル酸を供与体からＴＮＫ  ＴＰＡへ転移する。図４０Ｎでは、哺乳動物系で発現したＴＮＫ  ＴＰＡを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでタンパク質を、供与体としてＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧおよびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してＰＥＧ化し、そしてさらにシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアリル化する。図４０Ｏでは、ＮＳＯ細胞が発現したＴＮＫ  ＴＰＡを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理して末端シアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。ついでＴＮＫ  ＴＰＡは、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。この改造スキームの最終工程は、ＰＥＧ部分で誘導化されたシアル酸を、シアリルトランスフェラーゼまたはＳＴ３Ｇａｌ３を使用して供与体からＴＮＫ  ＴＰＡへ転移することである。図４０ＱではＴＮＫ  ＴＰＡが哺乳動物系で発現し、そして最初にシアリダーゼで処理されて末端シアル酸残基が戻し改作される。次いでタンパク質はＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してシアリル化される。次いでタンパク質はシアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアリル化される。図４０Ｒでは哺乳動物系で発現したＴＮＫ  ＴＰＡを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４０Ｓでは哺乳動物細胞で発現したＴＮＫ  ＴＰＡを異なる方法を介して修飾する：ポリペプチドは、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加により改造する。図４０Ｕでは、昆虫細胞で発現したＴＮＫ  ＴＰＡを、適当な供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用してＮ−アセチルグルコサミンの付加により改造する。このタンパク質はさらに、ＰＥＧ化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したＰＥＧ部分の付加により修飾される。図４０Ｖでは、ＴＮＫ  ＴＰＡは酵母で発現する。ポリペプチドを最初にエンドグリカナーゼで処理してそのグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでＰＥＧで誘導化したガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化する。図４０ＷではＴＮＫ  ＴＰＡが哺乳動物系で生産される。ポリペプチドを最初に、ＳＴ３Ｇａｌ３およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘導化したシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応性ガラクトースに結合させる。次いでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびＣＨＯで生産された抗−ＴＮＦ  ＩＧキメラと接触させて、これによりキメラはガラクトース残基を介して連結するようになる。
【０６０８】
別の例示態様では、本発明はインターロイキン−２（ＩＬ−２）を修飾する方法を提供する。図４１Ａ〜４１Ｇは幾つかの例を提供する。図４１Ｂは２段階の修飾スキームを提供する：哺乳動物細胞により生産されたＩＬ−２を最初にシアリダーゼで処理してその末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４１Ｃでは、昆虫細胞が発現したＩＬ−２を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。続いてＩＬ−２を、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４１Ｄでは細菌で発現したＩＬ−２を、適切な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してＮ−アセチルガラクトサミンで、続いてＰＥＧ−シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼを用いたＰＥＧ化工程で修飾する。図４１Ｅでは、哺乳動物系により生産されたＩＬ−２を修飾する別のスキームを提供する。ポリペプチドを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４１Ｆは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現したＩＬ−２の改造例を具体的に説明する。ポリペプチドは、ＰＥＧ基で誘導化した反応性Ｎ−アセチルガラクトサミン複合体および加水分解的酵素というよりはむしろ合成的酵素として機能するように修飾された酵素を使用してＰＥＧ化する。図４１Ｇでは、細菌が発現したＩＬ−２を適切な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンの付加により修飾する。
【０６０９】
別の例示態様では、本発明は図４２Ａ〜４２Ｎに示すように第ＶＩＩＩ因子の修飾法を提供する。図４２Ｂでは哺乳動物細胞で発現した第ＶＩＩＩ因子を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル
酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４２Ｃでは、哺乳動物細胞で発現した第ＶＩＩＩ
因子を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３
および適切な供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ１およびシアル酸供
与体を使用してさらにシアリル化する。
【０６１０】
図４２Ｅでは、哺乳動物細胞が生産した第ＶＩＩＩ因子を、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化の１工程により修飾する。図４２Ｆは哺乳動物細胞により発現された第ＶＩＩＩ因子の別の修飾例を提供する。タンパク質は、ＳＴ３Ｇａｌ１およびＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図４２Ｇでは哺乳動物細胞が発現した第ＶＩＩＩ因子を別のスキームに従い改造する：これはα２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図４２Ｉでは哺乳動物細胞により生産された第ＶＩＩＩ因子を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。
【０６１１】
ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４２Ｊでは、最初に哺乳動物細胞で発現されるＦａｃｔｏｒＶＩＩＩが内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈで処理されてグリコシル基となる。次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化される。図４２Ｋでは最初に、哺乳動物系で発現されるＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩが、ＳＴ３Ｇａｌ３とシアル酸供与体を使って、シアル化される。次に、内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈで処理してグリコシル基として、そりて次に、ガラクトシルトランスフェラーゼとＰＥＧ  ガラクト−スの供与体でＰＥＧ化される。図４２Ｌでは、哺乳動物系で発現されるＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩは、最初にマンノシダーゼで処理され末端マンノシル残基となり、次いで適当な供与体とＧｎＴ−Ｉおよび／または  ＩＩを使って、Ｎ−アセチルグルコサミン基が付加され、次いでガラクトシルトランスフェラーゼとＰＥＧ−ガラクト−スの供与体を使って、ＰＥＧ化される。図４２Ｍでは、哺乳動物細胞で発現されるＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩは、最初にマンノシダーゼで処理され末端マンノシル単位となり、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミン  トランスフェラーゼと適当な供与体を使って、Ｎ−アセチルグルコサミン基が付加される。さらに、ガラクトシルトランスフェラーゼとガラクト−ス供与体を使って、ガラクトシル化され、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３とシアル酸供与体を使って、シアル化される。図４２Ｎでは、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩは哺乳動物細胞で作り出され、次のように修飾される；  最初にマンノシダーゼで処理され末端マンノシル基となる。次いで、ＧｎＴ−ＩとＰＥＧ化されたＮ−アセチルグルコサミンの適当な供与体を使って、ＰＥＧ化されたＮ−アセチルグルコサミン基が付加される。
【０６１２】
もう一つの模範的な実施例では、図４３Ａから４３Ｍに示すように、この発明はウロキナ−ゼを修飾する方法を提供する。図４３Ｂでは、哺乳動物細胞で発現されるウロキナ−ゼは、最初にシアリダーゼで処理されシアル酸残基となり、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３とＰＥＧ化されたシアル酸の供与体を使って、シアル化される。状況によっては、哺乳動物系で発現されるウロキナ−ゼは、最初にシアリダーゼとガラクトシダーゼで処理されグリコシル鎖となり、次いで、ガラクト−ス供与体とα−ガラクトシルトランスフェラーゼをつかって、ガラクトシル化され、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３またはシアリルトランスフェラーゼとＰＥＧ−シアル酸の供与体を使って、ＰＥＧ化される。図４３Ｄでは、哺乳動物細胞で発現されるウロキナ−ゼは、最初にシアリダーゼで処理されシアル酸残基となり、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３とＰＥＧ−シアル酸の供与体を使って、ＰＥＧ化され、さらに次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３とシアル酸供与体を使って、シアル化される。図４３Ｅでは、哺乳動物細胞で発現されるウロキナ−ゼは、レブリン酸で修飾されるシアル酸供与体で適当な末端残基を覆うことによって、最初に修飾される。シアル酸供与体には反応性ケトンが付加される。ペプチドのグリコシル残基への付加の後、ケトンはヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導される。図４３Ｆでは、哺乳動物細胞で発現されるウロキナ−ゼは、シアル酸供与体とα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使って、シアル化される。 図４３Ｈでは、昆虫細胞で発現されるウロキナ−ゼは、次のようなステップで修飾される：最初に、Ｎ−アセチルグルコサミンの適当な供与体と1つ以上のＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、ＧｎＴ−ＩＩＩを使って、Ｎ−アセチルグルコサミンがポリペプチドに付加される。次に、ガラクトシルトランスフェラーゼとＰＥＧ−ガラクト−スの供与体を使って、ＰＥＧ化ガラクト−スが付加される。図４３Ｈでは、酵母で発現されるウロキナ−ゼは、最初に、エンドグリカナ−ゼで処理されグリコシル基となり、次いで、ガラクト−スの供与体とガラクトシルトランスフェラーゼを使って、ガラクトシル化され、次いで、ＳＴ３Ｇａｌ３とＰＥＧ−シアル酸の供与体を使って、ＰＥＧ化される。図４３Ｊでは、哺乳動物細胞で発現されるウロキナ−ゼは、最初に、ＳＴ３Ｇａｌ３とリンカーを経て結び付いている２つの反応性シアル酸残基と接触される。その結果、ポリペプチドは、連結剤を経て１つの反応性シアル酸と第２のシアル酸残基に付けられる。次にポリペプチドは、ＳＴ３Ｇａｌ１と哺乳動物細胞で作り出される脱シアル化ウロキナ−ゼに接触される。従って、第二のウロキナ−ゼ分子と結ばれることとなる。次いで、全分子はさらに、ＳＴ３Ｇａｌ１および／あるいはＳＴ３Ｇａｌ３を使ってシアル化される。図４３Ｋでは、単離されたウロキナ−ゼは最初に、硫酸基を取り除くためにスルフォヒドラ−ゼで処理される。次に、シアリルトランスフェラーゼとＰＥＧ−シアル酸の供与体を使って、ＰＥＧ化される。図４３ＬＭでは単離したウロキナーゼを最初にスルホヒドロラーゼおよびヘキソサミニダーゼで処理してスルフェート基およびヘキソサミン基を除去し、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化する。
【０６１３】
別の例示態様では、本発明は図４４Ａ〜４４Ｊに示すようにＤＮａｓｅＩを修飾する方法を提供する。図４４Ｂでは哺乳動物系で発現したＤＮａｓｅＩを以下の工程で修飾する：最初にタンパク質をシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する；次いでタンパク質をＳＴ３Ｇａｌ３でＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４４Ｃでは、哺乳動物細胞で発現したＤＮａｓｅＩを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３でＰＥＧ−シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。任意的に、哺乳動物系で発現したＤＮａｓｅＩを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼに暴露してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３またはシアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４４Ｄでは哺乳動物細胞で発現したＤＮａｓｅＩを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化し、そして次にＳＴ３Ｇａｌ３でシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図４４Ｅでは哺乳動物細胞で発現したＤＮａｓｅＩを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４４Ｆでは哺乳動物細胞で発現したＤＮａｓｅＩを、シアル酸供与体およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図４４Ｈでは昆虫細胞で発現したＤＮａｓｅＩには、最初に適当な供与体および１以上のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩ、ＩＶおよびＶを使用してＮ−アセチルグルコサミンが加えられる。次いでタンパク質は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化される。図４４Ｉでは酵母で発現したＤＮａｓｅＩを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４４ＪＫでは哺乳動物細胞で発現したＤＮａｓｅＩを、最初にＳＴ３Ｇａｌ３および連結剤を介して連結された２つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドを連結剤および第２シアル酸残基を介して１つの反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ１および脱シアリル化α１−プロテアーゼインヒビターと接触させ、そしてこれによりシアル酸残基を介してインヒビターと連結するようになる。次いでポリペプチドはさらに適当な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１および／またはＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアリル化される。
【０６１４】
別の例示態様では、本発明は図４５Ａ〜４５Ｌに示すようにＮ−グリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンを修飾する方法を提供する。図４５Ｂでは哺乳動物系で発現したインスリンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を使用してＰＥＧ化する。図４５Ｃでは昆虫細胞で発現したインスリンを、適当な供与体およびＧｎＴ  Ｉおよび／またはＩＩを使用してＰＥＧ化Ｎ−アセチルグルコサミンの付加により修飾する。図４５Ｄでは酵母で発現したインスリンを最初に内部のＨで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化する。図４５Ｆでは哺乳動物細胞で発現したインスリンを、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ１およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４５Ｇでは昆虫細胞で発現したインスリンを、適当な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化ガラクトースの付加により修飾する。図４５Ｈでは細菌で発現したインスリンに最初に、適当な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してＮ−アセチルガラクトサミンを加える。次いでポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４５Ｊでは細菌で発現したインスリンが異なる方法を通して修飾される：ＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンを、適当な供与体およびＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してタンパク質に加える。図４５Ｋでは細菌で発現したインスリンを以下の別のスキームに従い修飾する：ポリペプチドを最初にＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび連結剤を介した反応性シアル酸で誘導化した反応性Ｎ−アセチルガラクトサミンと接触させて、ポリペプチドを連結剤およびＮ−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、それゆえにトランスフェリンに連結するようになる。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図４５Ｌでは細菌で発現したインスリンをさらに別の方法を使用して修飾する：ポリペプチドは最初にＮＨＳ−ＣＯ−連結基−ＳＡ−ＣＭＰに暴露されて、連結剤を介して反応性シアル酸残基に連結するようになる。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびアシアロトランスフェリンを使用してトランスフェリンに連結される。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化される。
【０６１５】
別の例示態様では、本発明は図４６Ａ〜４６Ｋに示すようにＢ型肝炎抗原（Ｍ抗原−ｐｒｅＳ２およびＳ）を修飾する方法を提供する。図４６ＢではＭ−抗原が哺乳動物系で発現され、そして最初にシアリダーゼで処理されてシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてＳＴ３Ｇａｌ３および連結剤を介して脂質Ａに連結した反応性シアル酸を使用して脂質Ａに結合することにより修飾される。図４６Ｃでは哺乳動物細胞で発現したＭ−抗原を、シアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ１および連結剤を介しトキシンに連結した反応性シアル酸を使用して連結剤を介して破傷風トキシンに結合し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図４６Ｄでは哺乳動物系で発現したＭ−抗原を最初にガラクトシダーゼで処理してガラクトシル残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。次いでポリペプチドは、ＳＴ３Ｇａｌ１および適当な供与体を使用して加えたＫＬＨでシアル酸を誘導化する。図４６Ｅでは酵母で発現したＭ−抗原を最初にマンノダーゼで処理してマンノシル残基を戻し改作し、そして次いでＧｎＴ−Ｉおよびジフテリアトキシンに連結したＮ−アセチルグルコサミンの供与体を使用してジフテリアトキシンに結合させる。図４６Ｆでは哺乳動物細胞が発現したＭ−抗原を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４６Ｇでは哺乳動物系から得たＭ−抗原が、シアル酸供与体およびポリα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアリル化により改造される。図４６Ｉでは昆虫細胞で発現したＭ−抗原を、ＧｎＴ−ＩＩおよびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に連結したＮ−アセチルグルコサミンの適当な供与体を使用することによりナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に結合させる。図４６Ｊでは酵母が発現したＭ−抗原を、最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に連結されたガラクトースの適切な供与体を使用してナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に結合する。図４６Ｋは酵母で発現したＭ−抗原の修飾の別の例である。ポリペプチドを最初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作し、そして次いでＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用してＮ−アセチルグルコサミンを加える。続いてポリペプチドを、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングする。
【０６１６】
別の例示態様では、本発明は図４６Ａ〜４６Ｋに示すようにＢ型肝炎抗原（Ｍ抗原−ｐｒｅＳ２およびＳ）を修飾する方法を提供する。図４６ＢではＭ−抗原が哺乳動物系で発現され、そして最初にシアリダーゼで処理されてシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてＳＴ３Ｇａｌ３および連結剤を介して脂質Ａに連結した反応性シアル酸を使用して脂質Ａに結合することにより修飾される。図４６Ｃでは哺乳動物細胞で発現したＭ−抗原を、シアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでＳＴ３Ｇａｌ１および連結剤を介しトキシンに連結した反応性シアル酸を使用して連結剤を介して破傷風トキシンに結合し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図４６Ｄでは哺乳動物系で発現したＭ−抗原を最初にガラクトシダーゼで処理してガラクトシル残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。次いでポリペプチドは、ＳＴ３Ｇａｌ１および適当な供与体を使用して加えたＫＬＨでシアル酸を誘導化する。図４６Ｅでは酵母で発現したＭ−抗原を最初にマンノダーゼで処理してマンノシル残基を戻し改作し、そして次いでＧｎＴ−Ｉおよびジフテリアトキシンに連結したＮ−アセチルグルコサミンの供与体を使用してジフテリアトキシンに結合させる。図４６Ｆでは哺乳動物細胞が発現したＭ−抗原を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４６Ｇでは哺乳動物系から得たＭ−抗原が、シアル酸供与体およびポリα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアリル化により改造される。図４６Ｉでは昆虫細胞で発現したＭ−抗原を、ＧｎＴ−ＩＩおよびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に連結したＮ−アセチルグルコサミンの適当な供与体を使用することによりナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に結合させる。図４６Ｊでは酵母が発現したＭ−抗原を、最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に連結されたガラクトースの適切な供与体を使用してナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質に結合する。図４６Ｋは酵母で発現したＭ−抗原の修飾の別の例である。ポリペプチドを最初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作し、そして次いでＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用してＮ−アセチルグルコサミンを加える。続いてポリペプチドを、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングする。
【０６１７】
別の例示態様では、本発明は図４７Ａ〜４７Ｋに示すようにヒト成長ホルモン（Ｎ、Ｖおよびそれらの変異体）を修飾する方法を提供する。図４７ＢではＮ−連結部位を含むように突然変異させたか、または哺乳動物により生産されたＮ−連結部位を有する天然に存在するアイソフォーム（すなわち胎盤の酵素）のいずれかのヒト成長ホルモンを、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてＳＴ３Ｇａｌ３を用いて、そしてＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図４７Ｃでは昆虫細胞で発現したヒト成長ホルモンが、ＧｎＴ  Ｉおよび／またはＩＩおよびＰＥＧ化Ｎ−アセチルグルコサミンの適切な供与体を使用してＰＥＧ化Ｎ−アセチルグルコサミンの付加により修飾される。図４７Ｄでは、ヒト成長ホルモンを酵母で発現させ、内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈで処理してグリコシル基を戻し改作し、そしてさらにＰＥＧ化ガラクトースの供与体を使用してガラクトシルトランスフェラーゼを用いてＰＥＧ化する。図４７Ｆでは哺乳動物系で発現したヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質を、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてＰＥＧ−シアル酸の供与体およびＳＴ３Ｇａｌ１を使用したＰＥＧ化により修飾する。図４７Ｇでは昆虫細胞で発現したヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質を、ガラクトシルトランスフェラーゼでＰＥＧ化ガラクトースの供与体を使用したＰＥＧ化により改造する。図４７Ｈではヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質が細菌で生産される。Ｎ−アセチルガラクトサミンが最初にＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用によりＮ−アセチルガラクトサミンの供与体を使用して融合タンパク質に加えられ、続いてＰＥＧ−シアル酸の供与体およびシアリルトランスフェラーゼを使用して融合タンパク質をＰＥＧ化する。図４７Ｉでは細菌が発現したヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質の別の修飾スキームを記載する：融合タンパク質は、ＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンの供与体を使用してＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用を介してＰＥＧ化される。図４７Ｊはヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質のさらなる改造スキームを提供する。融合タンパク質を最初にＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび連結剤を介して反応性シアル酸で誘導化したＮ−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、融合タンパク質を連結剤およびＮ−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いで融合タンパク質をシアリルトランスフェラーゼおよびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、このようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。次いで融合タンパク質は、ＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングする。図４７Ｋでは、細菌で生産されたヒト成長ホルモン（Ｎ）の修飾についてさらに別のスキームを与える。ポリペプチドを最初にＮＨＳ−ＣＯ−連結基−ＳＡ−ＣＭＰと接触させ、そして連結剤を介して反応性シアル酸とカップリングされるようになる。次いでポリペプチドをＳＴ３Ｇａｌ３およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、そしてシアル酸残���を介してトランスフェリンと連結するようになる。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。
【０６１８】
別の例示態様では、本発明は図４８Ａ〜４８Ｇに示すようにＴＮＦレセプターＩｇＧ融合タンパク質（ＴＮＦＲ−ＩｇＧ、またはＥｎｂｒｅｌ（商標））を改造する方法を提供する。図４８Ｂは哺乳動物系で発現したＴＮＦＲ−ＩｇＧが最初にシアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ３Ｇａｌ１でシアリル化され；次いで融合タンパク質がガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化され；次いで融合タンパク質がＳＴ３Ｇａｌ３の作用およびＰＥＧで誘導化されたシアル酸の供与体を介してＰＥＧ化される修飾手順を具体的に説明する。図４８Ｃでは哺乳動物細胞で発現したＴＮＦＲ−ＩｇＧを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。続いてＰＥＧ部分は、ＳＴ３Ｇａｌ１により触媒される反応で供与体から融合タンパク質へＰＥＧ化シアル酸を転移することによりＴＮＦＲ−ＩｇＧに結合させる。図４８ＤではＴＮＦＲ−ＩｇＧが哺乳動物系で発現され、そしてＰＥＧ−ガラクトース供与体を使用したガラクトシルトランスフェラーゼにより媒介されるガラクトシル化法を介したＰＥＧの付加により修飾される。図４８ＥではＴＮＦＲ−ＩｇＧが哺乳動物系で発現される。融合タンパク質の改造における第１工程は、シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ３Ｇａｌ１を使用したＯ−結合シアル酸残基の付加である。続いてＰＥＧ化ガラクトースを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分を有するガラクトースの適当な供与体を使用して融合タンパク質に加える。図４８Ｆでは哺乳動物細胞で発現したＴＮＦＲ−ＩｇＧを最初に、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。融合タンパク質のグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−ＰＥＧのような部分で誘導化する。図４８Ｇでは哺乳動物細胞で発現したＴＮＦＲ−ＩｇＧは、ＰＥＧ化シアル酸をＰＥＧ部分を持つシアル酸の供与体から融合タンパク質へ転移する反応を触媒する２，８−シアリルトランスフェラーゼにより改造する。
【０６１９】
別の例示態様では、本発明は図４９Ａ〜４９Ｄに示すようにＨｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（商標）結合物の生成法を提供する。図４９ＢではＨｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（商標）を哺乳動物系で発現させ、そして最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。次いでＨｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（商標）は、反応性シアル酸−トキシン複合体を使用してＳＴ３Ｇａｌ３の作用を通してシアル酸を介してトキシンに結合させる。図４９Ｃでは哺乳動物細胞または真菌のいずれかで生産されたＨｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（商標）は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび反応性ガラクトース−トキシン複合体を使用してガラクトシル化の工程を通してトキシンに結合させる。図４９ＤはＨｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（商標）結合物の別の作成スキームを含む：真菌で生産されたＨｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（商標）を最初にエンド−Ｈで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３および反応性シアル酸−放射性同位体複合体を使用することによるシアリル化により放射性同位体と結合させる。またあるいは、キレート部分がそれに続くステージで放射性同位体を取り込むことが出来る場合に限って、反応性シアル酸部分が付く可能性がある。、
【０６２０】
別の例示態様では、本発明は図５０Ａ〜５０Ｄに示すようにＳｙｎａｇｉｓ（商標）結合物の生成法を提供する。図５０Ｂでは哺乳動物細胞で発現したＳｙｎａｇｉｓ（商標）を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化される。図５０Ｃでは哺乳動物または真菌細胞で発現したＳｙｎａｇｉｓ（商標）は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化する。図５０Ｄは発現したＳｙｎａｇｉｓ（商標）を最初にエンド−Ｈで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。
【０６２２】
別の例示態様では、本発明は図５１Ａ〜５１Ｄに示すようにＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）結合物の生成法を提供する。図５１Ｂでは哺乳動物系で発現したＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図５１Ｃでは哺乳動物系で発現したＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）は、適当な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＰＥＧ化ガラクトースの付加により修飾する。図５１Ｄは真菌で発現したＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）を最初に内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ３および放射性同位体で誘導化した反応性シアル酸を使用して放射性同位体に結合する。
【０６２３】
別の例示態様では、本発明はＮグリコシル化部位を含むように突然変異させたＲｅｏｐｒｏを修飾する方法を提供する。図５２Ａ〜５２Ｌはそのような例を含む。図５２Ｂでは哺乳動物系で発現したＲｅｏｐｒｏを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そしてＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図５２Ｃでは昆虫細胞で発現したＲｅｏｐｒｏを、適当な供与体およびＧｎＴ−Ｉおよび／またはＩＩを使用したＰＥＧ化Ｎ−アセチルグルコサミンの付加により修飾する。図５２Ｄでは酵母で発現したＲｅｏｐｒｏを最初に内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈで処理してグリコシル基を戻し改作する。続いてタンパク質はガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧする。図５２Ｆでは哺乳動物細胞で発現したＲｅｏｐｒｏを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでＳＴ３Ｇａｌ１で、ＰＥＧ化シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図５２Ｇでは昆虫細胞で発現したＲｅｏｐｒｏを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−ガラクトースの供与体を使用してＰＥＧ化により修飾する。図５２Ｈでは細菌で発現したＲｅｏｐｒｏは最初に、Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用してＮ−アセチルグルコサミンが加えられる。次いでタンパク質はシアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ−シアル酸の供与体を使用してＰＥＧ化する。図５２Ｊでは細菌で発現したＲｅｏｐｒｏが異なるスキームで修飾される：これはＰＥＧ化Ｎ−アセチルガラクトサミンの供与体を使用して、Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用を介したＰＥＧ化である。図５２Ｋでは細菌で発現したＲｅｏｐｒｏを別の方法で修飾する：最初にポリペプチドをＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび連結剤を介して反応性シアル酸で誘導化したＮ−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、ポリペプチドを連結剤およびＮ−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、これによりシアル酸残基を介してトランスフェリンに連結するようになる。次いでポリペプチドは適当な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアル酸残基でキャッピングする。図５２Ｌでは細菌で発現したＲｅｏｐｒｏのさらなる修飾スキームを提供する。ポリペプチドを最初にＮＨＳ−ＣＯ−連結基（リンカー）−ＳＡ−ＣＭＰに暴露して、連結剤を介して反応性シアル酸に連結するようにする。次いでポリペプチドはＳＴ３Ｇａｌ３およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンと連結するようにする。次いでポリペプチドは適切な供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してシアル酸残基でキャッピングする。
【０６２４】
別の例示態様では、本発明はＲｉｔｕｘａｎ（商標）結合物を生産する方法を提供する。図５３Ａ〜６３Ｇはその幾つかの例を提示する。図５３Ｂでは種々の哺乳動物系で発現したＲｉｔｕｘａｎ（商標）は、最初に適切なガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでペプチドは、シアル酸供与体およびＳＴ３Ｇａｌ３を使用してトキシン部分で誘導化したシアル酸で官能化される。図５３Ｃでは哺乳動物細胞または真菌細胞で発現したＲｉｔｕｘａｎ（商標）を、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し、これは薬剤部分を含有するペプチドガラクトースを提供する。図５３Ｄでは真菌系で発現したＲｉｔｕｘａｎ（商標）を改造する別の例を提供する。ポリペプチドのグリコシル基を最初に内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈを使用して戻し改作する。次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトースを加える。続いて放射性同位体を、放射同位体−複合化シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ３Ｇａｌ３を介して分子に結合させる。図５３ＦではＲｉｔｕｘａｎ（商標）を哺乳動物系で発現させ、そして最初にガラクトシルトランスフェラーゼおよび適切なガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し；ＰＥＧ部分を持つシアル酸を、次いでＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ化シアル酸供与体を使用して分子に結合させる。図５３Ｇに示すように、真菌、酵母または哺乳動物細胞で発現したＲｉｔｕｘａｎ（商標）は以下の方法で修飾することもできる：最初にポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を除去する；次いでＧｌｃＮＡｃを、ＧｎＴ−Ｉ、ＩＩおよびＧｌｃＮＡｃ供与体を使用して分子に結合させ、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよび放射性同位体を結合することができる錯化部分にカップリングしたガラクトースの供与体を使用したガラクトシル化により放射性同位体を結合する。
【０６２５】
もう一つの模範的な実施例では、この発明はアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ） を修飾する方法を提供する。図５４Ａから５４Ｏは幾つかの例を示す。図５４Ｂでは、種々の哺乳類系で発現されるアンチトロンビンＩＩＩは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ部分の付加によって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は最初、末端シアル酸部分を取り除くためにシアリダーゼと接触させる。次にその分子は、シアリルトランスフェラーゼとＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体と接触される。図５４Ｃでは、種々の哺乳類系で発現されるＡＴＩＩＩは、シアル酸−ＰＥＧ部分の付加によって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、末端シアル酸部分を取り除くためにシアリダーゼと接触させる。次いでその分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と１．２当量モルのＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体と接触される。次いでその分子は、残りの末端ガラクト−ス部分を覆うために、ＳＴ３Ｇａｌ３と適当なシアル酸供与体と接触される。図５４Ｄでは、ＮＳＯマウス骨髄腫で発現されるＡＴＩＩＩは、末端シアル酸−ＰＥＧ部分と共に複合グリカン分子を持つように改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、末端シアル酸とガラクト−ス部分を取り除くために、シアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼと接触させる。次にその分子は、ガラクトシルトランスフェラーゼと適当なガラクト−ス供与体と接触される。次にその分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。図５４Ｅでは、種々の哺乳類系で発現されるＡＴＩＩＩは、ほぼ完全な末端シアル酸−ＰＥＧ部分を持つように改造される。末端シアル酸部分を取り除くために、ＡＴ  ＩＩＩ分子はシアリダーゼと接触させる。次いでその分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３および１６当量モルのＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体と接触される。次いでその分子は、残りの末端ガラクト−ス部分を覆うために、ＳＴ３Ｇａｌ３と適当なシアル酸供与体と接触される。図５４Ｆでは、種々の哺乳類系で発現されるＡＴＩＩＩは、１つ以上の末端シアル酸ＰＥＧ部分の付加によって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、レブリン酸部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。次いでその分子は、ヒドラジン−ＰＥＧと接触される。図５４Ｇでは、種々の哺乳類系で発現されるＡＴＩＩＩは、１つ以上の末端ポリ−α２,８−結合シアル酸部分の付加によって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、ポリ−α２,８−シアリルトランスフェラーゼと適当なシアル酸供与体とに接触される。図５４Ｉでは、昆虫、酵母、菌類の細胞で発現されるＡＴＩＩＩは、Ｎ−Ｎ−アセチルグルコサミン−ＰＥＧ部分に側鎖を付加することによって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、ＧｎＴ−Ｉと、ＰＥＧで誘導された適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体とに接触される。図５４Ｊでは、酵母で発現されるＡＴＩＩＩは、高マンノースグリカン構造を取り除き、末端シアル酸−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、グリコシル基を切るためにエンドグリカナ−ゼと接触させる。次いでその分子は、ガラクトシルトランスフェラーゼと適当なガラクト−ス供与体と接触される。次にその分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。図５４Ｋでは、種々の哺乳類系で発現されるＡＴＩＩＩは、グリコ共役トランスフェリン の付加によって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、連結剤−ガラクト−ス供与体部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。次にその分子は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびエンドグリカナ−ゼ処理のトランスフェリン に接触される。図５４Ｍでは、酵母で発現されるＡＴＩＩＩは、マンノースグリカン構造を取り除き、末端ガラクト−ス−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。その分子は、グリコシル基を切るためにエンドグリカナ−ゼと接触される。さらにその分子は、ガラクトシルトランスフェラーゼとＰＥＧ部分で誘導された適当なガラクト−ス供与体と接触される。図５４Ｎでは、植物細胞で発現されるＡＴＩＩＩは、グリカン構造を哺乳類タイプの複合グリカンへ変換し、１つ以上の末端ガラクト−ス−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、キシロース残基を取り除くためにキシリダーゼと接触させる。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼと、ＰＥＧ部分で誘導された適当なガラクト−ス供与体とに接触される。図５４Ｏでは、種々の哺乳類系で発現されるＡＴＩＩＩは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ部分を末端ガラクト−ス部分へ付加することによって改造される。ＡＴ  ＩＩＩ分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸ＰＥＧ供与体とに接触される。
【０６２６】
もう１つの模範的な実施例では、この発明はヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のαおよびβサブユニットを修飾する方法を提供する。図５５Ａから５５Ｊは、幾つかの例を示す。図５５Ｂでは、種々の哺乳類系や昆虫系で発現されるｈＣＧは、末端シアル酸−ＰＥＧ部分の付加によって改造される。ｈＣＧ分子は、末端シアル酸部分を取り除くために、シアリダーゼと接触させる。その分子は次に、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体分子とに接触される。図５５Ｃでは、昆虫細胞、酵母、菌類系で発現されるｈＣＧは、Ｎ−結合グリカンを増築し、末端シアル酸−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、ＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩそして適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体と接触させる。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼと、適当なガラクト−ス供与体とに接触される。その分子はさらに、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸ＰＥＧ供与体とに接触される。図５５Ｄでは、種々の哺乳類と昆虫系で発現されるｈＣＧは、Ｏ−リンクのグリカン構造上に１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、末端シアル酸部分を取り除くために、シアリダーゼと接触させる。その分子は次に、シアル酸部分でグリカン構造を覆うために、ＳＴ３Ｇａｌ３と、適当なシアル酸供与体とに接触される。その分子は次に、ＳＴ３Ｇａｌ１と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸ＰＥＧ供与体とに接触される。図５５Ｅでは、種々の哺乳類と昆虫系で発現されるｈＣＧは、シアル酸−ＰＥＧ部分をＮ−連結グリカン構造へ付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸ＰＥＧ供与体とに接触される。図５５Ｆでは、昆虫細胞、酵母、菌類で発現されるｈＣＧは、末端Ｎ−アセチルグルコサミン−ＰＥＧ分子の付加によって改造される。ｈＣＧ分子は、ＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩおよびＰＥＧ部分で誘導された適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体と接触される。図５５Ｇでは、昆虫細胞、酵母、菌類で発現されるｈＣＧは、Ｎ−連結グリカン構造当たり１つ以上のＮ−アセチルグルコサミン−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、ＧｎＴ−Ｉと、ＰＥＧ部分で誘導された適当なＮ−アセチルグルコサミン供与体と接触される。図５５Ｈでは、種々の哺乳類系で発現されるｈＣＧは、Ｏ−連結グリカン構造上に１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、ＳＴ３Ｇａｌ３と、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸ＰＥＧ供与体とに接触される。図５５Ｈでは、種々の哺乳類系で発現されるｈＣＧは、末端シアル酸−ＰＥＧ部分を付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、α２,８−ＳＡと、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。図５５Ｊでは、種々の哺乳類系で発現されるｈＣＧは、末端シアル酸部分を付加することによって改造される。ｈＣＧ分子は、α２,８−ＳＴと、ＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。
【０６２７】
もう１つの模範的な実施例では、この発明はアルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＦａｂｒａｚｙｍｅＴＭ）を修飾する方法を提供する。図５６Ａから５６Ｊは、幾つかの例を示す。図５６Ｂでは、種々の哺乳類系や昆虫系で発現されたり排出されたりするアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端ガラクト−ス−ＰＥＧ−トランスフェリン部分の付加によって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡは、グリコシル基を切るために内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈと接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼと、ＰＥＧおよびトランスフェリンで誘導かされた適当なガラクト−ス供与体とに接触される。図５６Ｃでは、種々の哺乳類系や昆虫系で発現されたり排出されたりするアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端シアル酸−連結剤−マンノース-６-フォスフェ−ト部分の付加によって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、末端シアル酸部分を取り除くために、シアリダーゼと接触させる。その分子はさらに、ＳＴ３Ｇａｌ３と、連結剤を経てマンノース-６-フォスフェ−トに対して共役した適当なシアル酸供与体とに接触される。図５６Ｄでは、ＮＳＯマウス骨髄腫で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、末端シアル酸−連結剤−マンノース-６-フォスフェ−ト部分の付加によって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、末端シアル酸とガラクト−ス部分を取り除くために、シアリダーゼとαガラクトシダーゼとに接触させる。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼと、適当なガラクト−ス供与体とに接触される。その分子は次に、シアリルトランスフェラーゼおよび連結剤を経てマンノース-６-フォスフェ−トに対して共役した適当なシアル酸供与体に接触される。図５６Ｅでは、種々の哺乳類系や昆虫細胞系で発現されたり排出されたりするアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ部分の付加によって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、末端シアル酸部分を取り除くために、シアリダーゼに接触させる。その分子は次に、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。図５６Ｆでは、哺乳動物、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端マンノース−連結剤−ＡｐｏＥ部分の付加によって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、マンノシルトランスフェラーゼおよび連結剤を経てＡｐｏＥに対して共役した適当なシアル酸供与体に接触される。図５６Ｇでは、哺乳動物、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、ガラクト−ス−連結剤−アルファ２−マクログロブリン部分の付加によって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、グリコシル基へ切断するために内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈと接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび、連結剤を経てアルファ２−マクログロブリンと共役された適当なガラクト-ス供与体と接触される。図５６Ｈでは、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上のＮ−アセチルグルコサミン-ＰＥＧ-マンノース-６-フォスフェート部分を付加することによって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼ分子は、ＧｎＴ−Ｉおよび、ＰＥＧとマンノース-６-フォスフェートとで誘導された適当なＮ−アセチル-グルコサミン供与体と接触される。図５６Ｉでは、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端ガラクトース-ＰＥＧ-トランスフェリン部分を付加することによって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、ＧｎＴ−Ｉおよび適当なＮ−アセチル-グルコサミン供与体と接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび、ＰＥＧとトランスフェリンとで誘導された適当なガラクトース供与体と接触される。図５６Ｊでは、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端シアル酸-ＰＥＧ-メラノトランスフェリン部分を付加することによって改造される。アルファ−ガラクトシダーゼＡ分子は、ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩおよび適当なＮ−アセチル-グルコサミン供与体と接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクトース供与体と接触される。その分子はさらに、シアリルトランスフェラーゼおよび、ＰＥＧとメラノトランスフェリンで誘導された適当なシアル酸供与体に接触される。
【０６２８】
もう１つの模範的な実施例では、この発明はアルファ−イズロニダーゼ（ＡｌｄｕｒａｚｙｍｅＴＭ）を修飾する方法を提供する。図５７Ａから５７Ｊは、幾つかの例を示す。図５７Ｂでは、種々の哺乳類系や昆虫系で発現されたり排出されたりするアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上の末端ガラクト−ス−ＰＥＧ−トランスフェリン部分の付加によって改造される。アルファ−イズロニダーゼは、グリコシル基を切るために内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈと接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼ及び、ＰＥＧおよびトランスフェリンで誘導かされた適当なガラクト−ス供与体とに接触される。図５７Ｃでは、種々の哺乳類細胞系や昆虫細胞系で発現されたり排出されたりするアルファ−イズロニダーゼは、末端シアル酸-リンカー-マンノース-６-リン酸部分の付加によって改造される。アルファ−イズロニダーゼは、末端シアル酸部分を取り除くためにシアリダーゼと接触させる。その分子は次に、ＳＴ３Ｇａｌ３と接触され、マンノース-６-リン酸に連結剤を経て接合された適当なシアル酸供与体と接触させる。図５７Ｄでは、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞で発現されるアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上の末端シアル酸−連結剤−マンノース-６-フォスフェ−ト部分の付加によって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子は、末端シアル酸とガラクト−ス部分を取り除くために、シアリダーゼとαガラクトシダーゼとに接触させる。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼ及び、適当なガラクト−ス供与体とに接触される。その分子は更に、シアリルトランスフェラーゼおよび連結剤を経てマンノース-６-フォスフェ−トに対して連結された適当なシアル酸供与体に接触される。図５７Ｅでは、種々の哺乳類系や昆虫細胞系で発現されたり排出されたりするアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上の末端シアル酸−ＰＥＧ部分の付加によって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子は、末端シアル酸部分を取り除くために、シアリダーゼに接触させる。その分子は更に、シアリルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ部分で誘導された適当なシアル酸供与体とに接触される。図５７Ｆでは、哺乳動物、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上の末端マンノース−連結剤−ＡｐｏＥ部分の付加によって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子は、マンノシルトランスフェラーゼおよびリンカーを経てＡｐｏＥに対して連結した適当なシアル酸供与体に接触される。図５７Ｇでは、哺乳動物、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上のガラクト−ス−連結剤−アルファ２−マクログロブリン部分の付加によって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子は、グリコシル基を切断するために内部の（ｅｎｄｏ−）Ｈと接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび、連結剤を経てアルファ２−マクログロブリンと連結された適当なガラクト-ス供与体と接触される。図５７Ｈでは、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上のＮ−アセチルグルコサミン-ＰＥＧ-マンノース-６-フォスフェート部分を付加することによって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子���、ＧｎＴ−Ｉおよび、ＰＥＧとマンノース-６-フォスフェートとで誘導された適当なＮ−アセチル-グルコサミン供与体と接触される。図５７Ｉでは、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−ガラクトシダーゼＡは、１つ以上の末端ガラクトース-ＰＥＧ-トランスフェリン部分を付加することによって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子は、ＧｎＴ−Ｉおよび適当なＮ−アセチル-グルコサミン供与体と接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび、ＰＥＧとトランスフェリンとで誘導された適当なガラクトース供与体と接触される。図５７Ｊでは、昆虫、酵母、菌類の系で発現されるアルファ−イズロニダーゼは、１つ以上の末端シアル酸-ＰＥＧ-メラノトランスフェリン部分を付加することによって改造される。アルファ−イズロニダーゼ分子は、ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩおよび適当なＮ−アセチル-グルコサミン供与体と接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクトース供与体と接触される。その分子は次に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクトース供与体と接触される。その分子はさらに、シアリルトランスフェラーゼおよび、ＰＥＧとメラノトランスフェリンで誘導された適当なシアル酸供与体に接触される。
【０６２９】
Ａ．Ｎ−結合グルコシル化部位の作成または排除
本発明は、ペプチド上のグリカン鎖（１つまたは複数）の部位が天然なペプチドグリカン鎖から改変されたペプチドの使用を意図する。典型的にはＮ−連結グリカン鎖はアスパラギン残基で１次ペプチド構造に連結され、ここでアスパラギン残基は小胞体（ＥＲ）内の膜−結合グリコシルトランスフェラーゼにより認識されるアミノ酸配列内にある。典型的には１次ペプチド構造上の認識部位は配列アスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニンであり、ここでＸはプロリンおよびアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸であることができる。この認識部位は典型的なものであるが、本発明はさらに、Ｎ−結合鎖が天然なまたは組換えグリコシルトランスフェラーゼを使用して加えられた他の認識部位にＮ−連結グリカン鎖を有するペプチドを包含する。
【０６３０】
ペプチドのＮ−連結グリコシル化の認識部位は知られているので、天然のＮ−連結グリコシル化認識部位が除去されるか、あるいはさらに１以上のさらなるＮ−グリコシル化認識部位が作成される突然変異した１次ペプチド配列を作成することは十分に当業者の技術範囲内である。最も単純な場合では、アスパラギン残基をペプチドの１次配列から除去し、これによりグリカンの結合部位を除去し、このようにして成熟ペプチドから１つのグリカンを除去することができる。例えばアスパラギン−セリン−セリンの配列をもつ天然の認識部位は、配列ロイシン−セリン−セリンを有するように遺伝的に操作して、この位置でのＮ−連結グリコシル化部位を排除することができる。
【０６３１】
さらにＮ−連結グリコシル化部位は、たとえアスパラギン残基が存在しても１以上のさらなる認識残基が存在しないように、認識部位中の残基を改変することにより除去することができる。例えばアスパラギン−セリン−セリンの天然の配列をアスパラギン−セリン−リシンに突然変異させて、これによりその位置でのＮ−グリコシル化部位を排除することができる。上記の典型的な認識部位以外の残基を含んでなるＮ−連結グリコシル化部位の場合では、当業者は適切なグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるために必要な配列および残基を決定し、そして次に適切なグリコシルトランスフェラーゼがもはやその部位を認識しないように少なくとも１つの残基を突然変異させることができる。換言すると、グリコシル化部位の作成または除去、あるいは両方を行い、これにより改変されたグリコシルパターンを有するペプチドを生成するために、ペプチドの１次配列を操作することは十分に当業者の技術範囲内である。したがって本発明はグリカン改造の唯一の配列として本明細書に提供する１次ペプチド配列に限定されると解釈するべきではなく、むしろグリカン改造に適する任意かつすべてのペプチド配列を含むと解釈するべきである。
【０６３２】
突然変異ペプチドを作成するために、天然のアミノ酸残基をコードする天然のコドンを突然変異させて別のアミノ酸残基をコードするコドンを生成するように、ペプチドの１次配列をコードする核酸配列を改変させる。核酸配列を改変させる技術は当該技術分野で一般的であり、そして例えば任意の周知な分子生物学マニュアルに記載されている。
【０６３３】
さらに１次ペプチド構造をコードする核酸は、標準的な技術を使用して生体外で合成することができる。例えば核酸分子はホスホロアミダイト法のようなプロトコールを使用する「遺伝子機械」で合成することができる。化学的に合成した二本鎖ＤＮＡが核酸またはそのフラグメントの合成のような応用に必要な場合、各相補鎖を別個に合成する。短い核酸（６０〜８０塩基対）の生成は技術的には単純であり、そして相補鎖を合成し、そして続いてそれらをアニーリングすることにより行うことができる。長い核酸（＞３００塩基対）の生成については、化学的なＤＮＡ合成中の各サイクルのカップリング効率がめったに１００％とはならないので特別な方法が必要かもしれない。この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）を、２０〜１００ヌクレオチド長の一本鎖であるフラグメントからの組み立て形態で集成する。ポリヌクレオチド合成に関する総説は、例えばＧｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ（モレキュラーバイオテクノロジー、組換えＤＮＡの原理および応用：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、１９９４、ＡＳＭ出版）、Ｉｔａｋｕｒａら，（１９８４，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３）、およびＣｌｉｍｉｅら，（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３３）を参照にされたい。
【０６３４】
さらにペプチドをコードする核酸配列中の変化は部位指向的突然変異誘発法により作成することができる。明らかであるように、この技術は典型的には一本鎖および二本鎖状態の両方で存在するファージベクターを使用する。部位指向的突然変異誘発法に有用な典型的なベクターには、Ｍ１３ファージのようなベクターを含む。これらのファージは容易に入手可能であり、そしてそれらの使用は当業者にとって周知である。二本鎖プラスミドも部位指向的突然変異誘発法に日常的に使用され、これは問題の核酸をプラスミドからファージへ移す工程を排除する。
【０６３５】
一般に部位指向的突然変異誘発法は最初に、その配列内に所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの二本鎖を融解することにより行なわれる。所望の突然変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーを一般には合成的に調製する。このプライマーを次いで一本鎖ベクターとアニーリングし、そして突然変異を持つ鎖の合成を完成するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩクレノーフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素に供する。これによりヘテロ二本鎖が形成され、ここで１つの鎖がもとの非突然変異配列をコードし、そして２番目の鎖が所望の突然変異を持つ。このヘテロ二本鎖ベクターを次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような適切な細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用し、そして突然変異した配列の配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択する。突然変異したオリゴヌクレオチドを包含するクローンを濃縮するための遺伝子選択スキームは、Ｋｕｎｋｅｌら．（１９８７，Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２）により考案された。あるいはＰＣＲ（商標）と市販されているＴａｑポリメラーゼのような熱安定性酵素との使用を、増幅したＤＮＡフラグメントに突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマーを包含させるために使用し、これは次いで適切なクローニングまたは発現ベクターにクローン化することができる。Ｔｏｍｉｃら．（１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：１６５６）およびＵｐｅｎｄｅｒら．（１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８：２９−３１）のＰＣＲ（商標）媒介突然変異誘発法の手順は、そのようなプロトコールの２例を提供する。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するＰＣＲ（商標）を使用して、リン酸化された突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを増幅したＤＮＡフラグメントに包含させることもでき、これは次いで適当なクローニングまたは発現ベクターにクローン化することができる。Ｍｉｃｈａｅｌ（１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：４１０−４１２）により記載された突然変異誘発法の手順は、そのようなプロトコールの１
例を提供する。
【０６３６】
すべてのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列がＮ−グリコシル化されていないことは、提示されているモチーフの内容が重要であることを示唆している。別の取り組みでは、生体内でグリコシル化され、そして活性、安定性またはペプチドの他の特性に対して有利である新規なＮ−連結部位を同定するために、新規Ｎ−連結共通部位を有する突然変異ペプチドのライブラリーを作成する。
【０６３７】
前に記載したように、糖タンパク質中にＮ−連結グリカン鎖を付加するための共通配列はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸは任意のアミノ酸であることができる）である。Ａｓｎのカルボキシル末端側から２つの目のアミノ酸位をコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られている標準的な手順を使用してＳｅｒおよび／またはＴｈｒ残基をコードするように突然変異させることができる。上記のように、すべてのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位がグリカンの付加により修飾されるわけではない。したがって各組換え突然変異糖タンパク質は真菌、酵母または動物または哺乳動物発現系で発現され、そしてＮ−連結グリカン鎖の付加に関して分析されなければならない。グリコシル化部位を特性決定するための技術は当業者には周知である。さらに突然変異した組換え糖タンパク質の生物学的機能は、調査する特定のタンパク質に関して標準的なアッセイを使用して決定することができる。このようにペプチドの１次配列を操作し、そしてそれに含まれる新規なグリコシル化部位を同定し、そしてさらにペプチドの生物学的活性に及ぼす新規部位の効果を決定することは簡単な問題となる。
【０６３８】
別の態様では、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基のアミノ末端側から２つ目のアミノ酸位をコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られている標準的な手順を使用してＡｓｎをコードするように突然変異させることができる。新規なグリコシル化部位が作成されたかどうか、およびこの部位がペプチドの生物学的活性に及ぼす効果を決定する手順は上に記載している。
【０６３９】
Ｂ．Ｏ−連結グリコシル化部位の作成または排除
ペプチドにＯ−連結グリコシル化部位を付加することは、ペプチドの始めの１次アミノ酸配列に比べてペプチドの１次アミノ酸配列が１以上のさらなるＯ−連結グリコシル化部位を含むように、ペプチドの１次アミノ酸配列を改変させることにより都合よく行う。ペプチドにＯ−連結グリコシル化部位を加えることは、ＯＨ基が接近可能となり、そしてＯ−連結グリコシル化に利用できるようになるように、ペプチドの配列内に−ＯＨ基、好ましくはセリンまたはトレオニン残基を含んでなる１以上のアミノ酸種をペプチドに包含させることにより行うこともできる。ペプチド内のＮ−連結グリコシル化部位の改変の検討と同様に、ペプチドの１次アミノ酸配列は好ましくはヌクレオチドレベルで改変する。ペプチドをコードするＤＮＡ配列中の特別なヌクレオチドは、所望のアミノ酸が配列にコードされるように改変することができる。ＤＮＡ中の突然変異（１つまたは複数）は好ましくは、上記のホスホロアミダイト法のＤＮＡ合成および部位指向的突然変異誘発法の技術のような当該技術分野で既知の方法を使用して作成される。
【０６４０】
あるいはＯ−連結グリカンを付加する推定部位をコードするヌクレオチド配列はＤＮＡ分子に、１または幾つかのコピーで分子の５’または３’末端に加えることができる。次いで改変されたＤＮＡ配列を真菌、酵母もしくは動物もしくは哺乳動物発現系の任意の１つで発現させ、そしてペプチドへの配列の付加およびこの配列が機能的なＯ−連結グリコシル化部位であるか否かが分析される。簡単に説明すると合成ペプチドの受容体配列をヌクレオチド分子の５’または３’末端に導入する。原理的には、この型の配列の付加は適当な発現系で発現した時に生じる糖タンパク質に対して破壊性が低い。次いで改変したＤＮＡはＣＨＯ細胞または他の適切な発現系で発現させ、そしてこれにより発現したタンパク質をＯ−結合グリコシル化部位の存在について調査する。さらにグリカン鎖の存在または不存在を決定することができる。
【０６４１】
別の取り組みでは、新規なＯ−連結部位に有利な部位を、様々な新規Ｏ−連結部位を含むペプチドのライブラリーを作成することによりペプチド中に見いだすことができる。例えばＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼによるＮ−アセチルガラクトサミン付加のための共通アミノ酸配列は、使用する特異的なトランスフェラーゼに依存する。ペプチドのアミノ酸配列を走査して、Ｏ−連結グリカン鎖の付加の可能性部位を生じるように突然変異させることができるアミノ酸の連続する基を同定することができる。これらの突然変異はすでに記載したような当業者には知られている標準的手順を使用して生成することができる。見いだされたグリコシル化部位が実際にグリコシル化されるかどうかを決定するために、次に各組換え突然変異ペプチドを適当な発現系で発現させ、そして続いてＯ−連結グリカン鎖の部位および／または存在の付加について分析する。
【０６４２】
Ｃ．ペプチドの化学合成
本発明に有用なペプチドの１次構造は細胞に基づく発現系で最も効率的に生成され得るが、ペプチドが合成的に生成できることも本発明の範囲内である。ペプチドの化学合成は当該技術分野では周知であり、そして限定するわけてはないが段階的な固相合成、および溶液中または固相上でのフラグメント縮合を含む。古典的な段階的固相合成には、所望のペプチド鎖のカルボキシ−末端アミノ酸に対応するアミノ酸を固体支持体に共有結合し、そしてペプチド鎖を、活性化カルボキシル基を有する活性化アミノ酸誘導体の段階的カップリングにより、アミノ末端に向けて延長することを含む。完全に保護された固相結合ペプチド鎖の集成体が完成した後、ペプチド−固相の共有結合を適当な化学により開裂し、そして保護基を除去して生成物であるペプチドを得る。Ｒ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、固相ペプチド合成：テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照にされたい。より長いペプチド鎖ほど、高純度の十分に規定された生成物を得ることが難しくなる。複雑な混合物の生産のために、段階的な固相合成法にはサイズに限界がある。一般に１００の連続するアミノ酸残基またはそれ以上の十分に規定されたペプチドが、段階的な固相合成を介して日常的に調製されることはない。
【０６４３】
セグメント縮合法は、固相の段階的方法による数種のペプチドセグメントの調製、続いて固相からの開裂、そしてこれら最大に保護されたセグメントの精製を含む。保護されたセグメントは固相に結合した最初のセグメントまで１つずつ縮合される。
【０６４４】
本発明に有用なペプチドは、排他的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合または古典的な溶液合成により合成することができる。これらの合成法は当業者には周知である（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）、Ｓｔｅｗａｒｔら．、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（第２版）、（ピアスケミカル社、１９８４）、Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｐｐ，Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３：３（１９８６）、Ａｔｈｅｒｔｏｎら，固相ペプチド合成：実践的とりくみ（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ出版、１９８９）、Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第２８９巻（アカデミック出版１９９７）、およびＬｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、ペプチド合成の化学的取り組みおよびペプチド（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（ＣＲＣ出版社、１９９７）を参照にされたい）。「天然の化学的連結」および「発現したペプチドの連結」のような全化学合成法における変更も標準的である（例えばDawsonら., Science 266: 776 (1994), Hackengら, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muirら, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95: 6705 (1998), and Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998))を参照にされたい）。また有用であるのは、カリフォルニア州、サウスサンフシンシスコのグリフォン  サイエンス（Ｇｒｙｐｈｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により開発された固相ペプチド合成法である。米国特許第６，３２６，４６８号、同第６，２１７，８７３号、同第６，１７４，５３０号および同第６，００１，３６４号明細書を参照にされたい（これらすべては全部、引用により本明細書に編入する）。
【０６４５】
Ｄ．翻訳後修飾 
当業者はペプチドがＮ−連結および／またはＯ−連結グリカンを付加される上に、翻訳後修飾も受け得ると考えるだろう。グリコシル化以外の翻訳後修飾を有するペプチドは、ペプチドの所望する生物学的活性または機能を保持または改善するかぎり、本発明でペプチドとして使用できることを意図している。そのような翻訳後修飾は通常、生体内で起こる天然の修飾、またはペプチドに生体外で行われる操作された修飾であることができる。意図する既知の修飾には限定するわけではないがアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫黄化、アルギニレーションのようなトランスファー−ＲＮＡが媒介するアミノ酸のペプチドへの付加、およびユビキチン化を含む。多くのこれらの修飾を行うために使用され得る酵素は当該技術分野では周知であり、そして中でもベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（インディアナポリス、イリノイ州）およびシグマケミカル社（セントルイス、モンタナ州）のような会社から市販されている。
【０６４６】
そのような修飾は当業者には周知であり、そして科学技術文献で大変詳細に記載されてきた。幾つかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質結合、硫黄化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、ペプチド−構造および分子的特性（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）のようなほとんどの基本的な教科書に記載されている。この主題については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、ペプチドの翻訳後の共有的修飾（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、アカデミック出版、ニューヨーク、１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｅｒら，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０））およびＲａｔｔａｎら．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２））によるような多くの詳細な総説が入手可能である。
【０６４７】
ペプチドの共有的修飾も、選択した側鎖または末端アミノ酸残基と反応することができる有機誘導化剤を用いてペプチドの標的とするアミノ酸残基と反応させることにより、生体外で分子に導入することもできる。最も一般的に誘導化される残基はシステイン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、チロシン、グルタミン、アスパラギンおよびアミノ末端残基である。プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンおよびトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、ヒスチジンのアルファ−アミノ基およびヒスチジン側鎖のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル化およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化。そのような誘導化された部分は溶解性、吸収、生物学的半減期等を改善する。この部分はまた、ペプチド等の望ましくない副作用も排除または弱めることができる。
【０６４８】
さらに二官能性試薬での誘導化もペプチドを水不溶性支持体マトリックスまたは他の高分子担体に架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤にはグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、１，１−ビス（−ジアゾロアセチル）−２−フェニルエタンおよび二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［９ｐ−アジドフェニル）］ジチオプロピオイミデートのような誘導化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。あるいは臭化シアンで活性化した炭水化物および米国特許第３，９６９，２８７号および同第３，６９１，０１６号明細書に記載されている反応性物質のような反応性の水不溶性マトリックスをペプチドの固定化に使用してもよい。
【０６４９】
Ｅ．融合ペプチド／ペプチド
本発明に有用なペプチドは融合ペプチドを含んでなることができる。融合ペプチドは２つのペプチドの生物学的および／または機能的特性が１つのペプチド分子内に組み合わされることが望まれる場合、特に有利である。そのような融合ペプチドは、治療用および工業的応用の新規かつ有用な分子を作成するために、天然には見いだされない生物学的活性および機能の組み合わせを提示することができる。問題の生物学的活性には限定するわけではないが酵素活性、レセプターおよび／またはリガンド活性、免疫原性モチーフおよび構造的ドメインを含む。
【０６５０】
そのような融合ペプチドは当該技術分野では周知であり、そして作成法は当業者には周知である。例えばヒトα−インターフェロン−ヒト融合ペプチドがすでに作成され、ここで生成したペプチドはアルブミンの長期循環寿命と組合わされたα−インターフェロンの治療的利益を有し、これにより減少した投与頻度、および患者に副作用の可能性が低下した治療用組成物が作られる。ヒトゲノムサイエンス（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）社からのＡｌｂｕｆｅｒｏｎ（商標）および米国特許第５，７６６，８８３号明細書を参照にされたい。他の融合ペプチドには、本明細書のいたるところに記載する抗体分子を含む。
【０６５０】
Ｆ．より小さな「生物学的に活性な」分子の生成 
本発明で使用するペプチドは天然なペプチドの変異体でよく、ここで天然のペプチドのフラグメントが完全長の天然なペプチドの代わりに使用される。さらにプレ−プロ−およびプレ−ペプチドを企図する。変異体ペプチドは天然なペプチドよりもサイズが小さくてもよく、そしてより大きなペプチドの１以上のドメインを含んでなってもよい。特別なペプチドドメインの選択は、ペプチド中の特定のドメインの生物学的活性が望まれるが、ペプチドの他のドメインの生物学的活性は望まない時に有利となり得る。またペプチドの所望する治療的効果を強化することができるペプチドの短縮化および内部削除も含む。そのような任意な形のペプチドは、ペプチドの所望する活性が保存される限り、本発明に有用となることを意図している。
【０６５２】
ペプチドのより短い変形物は天然のペプチドには見いだされない独自の利点を有することができる。ヒトのアルブミンの場合、天然なアルブミンペプチドのわずか６３％を含んでなる短縮化形態が、血漿容量増量剤として有利であることが分かった。短縮化アルブミンペプチドは、天然のヒト血清アルブミンあるいは組換えヒト血清アルブミンの２分の１から３分の２の個々のペプチド用量が均等なコロイド浸透効果（ｃｏｌｌｏｉｄ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）に必要とされるだけなので、治療目的のために天然なペプチドよりも良いと考えられている。米国特許第５，３８０，７１２号明細書（この内容は全部、引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。
【０６５３】
より小さい「生物学的に活性な」ペプチドも、天然なペプチドに比べて強化された治療的活性を有することが見いだされた。ＩＬ−２の治療的効力は、血管漏出症候群により支配される種々の副作用により制限される。全α−ヘリックスに対応する残基１〜３０から成るより短く化学的に合成したペプチドの変形物は正しく折り畳まれ、そして天然なＩＬ−２の生物学的的活性を副作用を伴うこと無しに含むことが分かった。
【０６５４】
Ｇ．新規ペプチドの生成
本発明のペプチドは天然なペプチドの１次配列に由来するものでよく、または当業者に知られている多くの手段を使用して工作することができる。そのように工作したペプチドは、天然のペプチドに比べて強化された、または新規な特性から設計され、及び／または選択されることができる。例えばペプチドは、上昇した酵素反応速度、上昇したまたは低下した基質もしくはリガンドへの結合親和性、上昇または低下したレセプターへの結合親和性、基質、リガンド、レセプターまたは他の結合パートナーに対する改変された特異性、上昇または低下した生体外および／または生体内の安定性、あるいは動物において上昇または低下した免疫原性を有するように工作することができる。
【０６５５】
Ｈ．突然変異
１．合理的な設計の突然変異
本発明の方法に有用なペプチドは、所望する生物学的活性または機能を強化し、ペプチドの望ましくない特性を縮小し、かつ／またはペプチドに新規活性または機能を加えるために突然変異させることができる。「合理的なペプチド設計」はそのような改変されたペプチドを生成するために使用することができる。いったんペプチドのアミノ酸配列および構造を知り、そして所望する突然変異を計画すれば、突然変異は突然変異させることを望むアミノ酸残基をコードする対応する核酸コドンに対して最も都合良く作成することができる。当業者は一般的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）な遺伝子コード、および選択した発現系でのコドン優先性の知識に基づき、どのように核酸配列を改変すべきかを容易に決定することができる。コドン中の突然変異は翻訳中にペプチドに重合化されるアミノ酸残基を変化させるために作ることができる。あるいはコドンは対応するコードされるアミノ酸残基は同じであるが、コドンの選択が所望のペプチド発現系により適するように突然変異させることができる。例えばシス−残基を別のアミノ酸に置き換えて成熟ペプチドからジスルフィド結合を除去してもよく、触媒ドメインを突然変異させて生物学的活性を改変してもよく、そして一般にペプチドのアイソフォームを工作することができる。そのような突然変異はとりわけ点突然変異、削除、挿入および短縮であることができる。
【０６５６】
ペプチド中の特別なアミノ酸を突然変異させる技術は当該技術分野において周知である。上で検討した部位指向的突然変異誘発法はコドンの指向的突然変異によく適している。オリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発法もＳａｍｂｒｏｏｋら，（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、１５．５１頁から始まる）により詳細に検討されている。体系的な削除、挿入および短縮化は、当該技術分野で周知な他の方法の中でも連結剤挿入突然変異誘発法、ヌクレアーゼＢａｌ３１での消化、および連結剤走査（ｌｉｎｋｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発法を使用して作成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク）。
【０６５７】
合理的なペプチドの設計は、熱不活性化および酸化に対する酵素の安定性を上げるために成功裏に使用されてきた。例えば酵素の安定性はα−アミラーゼ中のアスパラギン残基の除去（Ｄｅｃｌｅｒｃｋら，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１：１０４１−１０５７）、プロリンのようなより硬い構造的要素のα−アミラーゼ（Ｉｇａｒａｓｈｉら，１９９９，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：１５３５−１５４０）およびＤ−キシロースイソメラーゼ（Ｚｈｕら，１９９９，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｇ．１２：６３５−６３８）への導入により向上した。さらに疎水的接触の導入が３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（Ａｋａｎｕｍａら．，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６０：４９９−５０４）およびシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種から得たギ酸デヒドロゲナーゼ（Ｒｏｊｋｏｖａら．，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４５：１８
３−１８８）を安定化した。これら突然変異の安定化効果の背後にあるメカニズムは、一般に多くのペプチドに応用することができる。これらのおよび同様の突然変異は、本発明の方法で改造されるペプチドに関して有用になると予想する。
【０６５８】
２．ランダム変異導入（Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）技術
本発明の方法に有用な新規ペプチドは、核酸のコード配列にランダムな突然変異を導入する技術を使用して生成することができる。次いで核酸は望ましい発現系で発現され、そして生成したペプチドを問題の特性について評価する。ランダムな突然変異をＤＮＡ配列に導入するための技術は当該技術分野では周知であり、そしてＰＣＲ突然変異誘発法、飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）突然変異誘発法および縮重オリゴヌクレオチド法を含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、モレキュラークローニング、ア  ラボラトリーアプローチ、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）およびＡｕｓｕｂｅｌら．（２００２、分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン  ウィリー＆サンズ、ニューヨーク州）を参照にされたい。
【０６５９】
ＰＣＲ突然変異誘発法では、低下したＴａｑポリメラーゼの忠実度を使用してランダムな突然変異をＤＮＡのクローン化したフラグメントに導入する（Ｌｅｕｎｇら．，１９８９，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５）。これはランダムの突然変異をＤＮＡ配列に導入する大変有力で、しかも比較的迅速な方法である。突然変異させるＤＮＡ領域は、例えば改変したｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ比を使用することにより、およびＭｎ２＋をＰＣＲ反応に加えることにより、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実度が下がる条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させる。増幅したＤＮＡフラグメントのプールは適切なクローニングベクターに挿入してランダムな突然変異ライブラリーを提供する。
【０６６０】
飽和突然変異誘発法は、多数の１塩基置換をクローン化したＤＮＡフラグメントに迅速に導入することを可能とする（Ｍａｙｅｒｓら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：２４２）。この技術には例えば生体外での化学的処理または一本鎖ＤＮＡの照射による突然変異の作成、そして相補的ＤＮＡ鎖の合成を含む。突然変異の頻度は処理の厳しさを調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）することにより調節することができ、そして本質的にすべての可能な塩基置換を得ることができる。この手順には突然変異フラグメントに関する遺伝子選択が関与しないので、中性の置換ならびに機能を改変する置換の両方が得られる。点突然変異の分布は保存された配列要素に片寄らない。
【０６６１】
核酸相同体のライブラリーは、１組の縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することもできる。縮重オリゴヌクレオチド配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成器で行うことができ、そして合成遺伝子は次に適切な発現ベクターに連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野では知られている（例えばＮａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら．（１９８１）組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）、Ｐｒｏｃ  ３ｒｄ、クリーブランド  シンポ。高分子（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）編集、ＡＧ  ヴァルトン、アムステルダム：エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）２７３−２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅら．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照にされたい。そのような技術は他のペプチドの方向性のある進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）にも使用された（例えばＳｃｏｔｔら．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら．（１９９２）ＰＮＡＳ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら．（１９９０）ＰＮＡＳ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号明細書を参照にされたい）。
【０６６２】
ａ．方向付けされる進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
本発明の方法で有用なペプチドは、「方向付けされる進化」の技術を使用して生成することもできる。ペプチドの構造の知識を必要とする部位指向的突然変異誘発技術とは対照的に、今ではペプチドの構造的特徴の知識無しで改善された特性を持つペプチドが得られる突然変異のライブラリーを作成する方法が存在する。これらの方法は一般に「方向付けされる進化」の技術として知られ、そして問題のペプチドをコードする核酸配列を循環的（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｒｏｕｎｄ）な突然変異、スクリーニングそして増幅に供する点でこれまでのランダムな変異誘導手順とは異なる。
【０６６３】
幾つかの「方向付けされる進化」技術では、得られた核酸の多様性は核酸配列に点突然変異をランダムに作成する突然変異法により生成される。点突然変異技術には限定するわけではないが、「誤−傾向（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ（商標）」（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，１９９４：ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８−３３；およびＫｅ  ａｎｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２：３３７１−３３７２）、反復オリゴヌクレオチド−指向的突然変異誘発法（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０８：５６４−５８６）、および前記の任意なランダム変異導入法を含む。
【０６６４】
方向付けされる進化が作用し得る多様性を作成する別の方法は、突然変異誘発遺伝子の使用である。問題の核酸を、ゲノムが典型的には欠損性ＤＮＡ修復遺伝子をコードする突然変異誘発細胞株の中で培養する（米国特許第６，３６５，４１０号明細書、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３６４５−３６４９；Ｌｏｎｇ−ＭｃＧｉｅら，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：１２１−１２５；ジェネンコール  インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、パロアルト、カリフォルニア州を参照にされたい）。
【０６６５】
方向付けされる進化の技術を使用して多様性を達成することは、縮重プライマーと一緒に飽和突然変異誘発法を使用しても行うことができる（Ｇｅｎｅ  Ｓｉｔｅ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（商標）、ディバーサ社（Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）。この種の飽和突然変異誘発法では、多様化されるべき核酸配列長を覆うように設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲ反応でポリメラーゼをプライムする。この様式では、アミノ酸のコード配列の各コドンを突然変異させて、残りは一般的な各１９個のアミノ酸をコードするようにする。この技術は核酸コード配列の特別な領域に突然変異、削除および挿入を導入するためにも使用できると同時に、残りの核酸分子を手付かずにしておく。遺伝子飽和技術に関する手順は当該技術分野では周知であり、そして米国特許第６，１７１，８２０号明細書に見いだすことができる。
【０６６６】
ｂ．ＤＮＡシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）
本発明の方法に有用な新規ペプチドは、遺伝子−シャフリング、モチーフ−シャフリング、エキソン−シャフリングおよび／またはコドン−シャフリング（集合的に「ＤＮＡシャフリング」と呼ぶ）を使用して生成することもできる。ＤＮＡシャフリング技術は本発明に有用なペプチドの活性をモジュレートするために使用することができ、そして改変した活性を有するペプチドを生成するために使用することができる。一般に米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号明細書、およびStemmerらl. (1994, Nature  370(6488):389-391); Crameriら. (1998, Nature 391 (6664): 288-291);Zhang ら (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(9): 4504-4509); Stemmer ら.(1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (22): 10747-10751), Pattenら. (1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33); Harayama, (1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82); Hanssonら., (1999, J. Mol. Biol. 287:265-76); and Lorenzo and Blasco (1998, Biotec hniques 24(2): 308-13)を参照にされたい（これら各々は、引用により本明細書に編入する）。
【０６６７】
ＤＮＡシャフリングにはポリヌクレオチド配列に変化を生じるために、２以上のＤＮＡセグメントの相同的または部位特異的組換えを集合することが関与する。ＤＮＡシャフリングはヒト免疫不全ウイルス１型タンパク質（Ｐｅｋｒｕｎら．２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（６）：２９２４−３５）、トリアジンヒドロラーゼ（Ｒａｉｌｌａｒｄら．２００１，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ８（９）：８９１−８９８）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）タンパク質（Ｐｏｗｅｌｌら．２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８（１２）：１２７９−１２８２）、およびインドールグリセロールホスフェートシンターゼ（Ｍｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（５）：８８０−８８９）の新規変化を生成するために使用されて来た。
【０６６８】
ＤＮＡシャフリングの技術は、ＤＮＡの生体外相同的組換えを可能にすることにより天然な組換えを模することによる生体分子の多様性を作成するために開発された（Ｓｔｅｍｍｌｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；およびＳｔｅｍｍｌｅｒ，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：１０７４７−１０７５１）。一般にこの方法では関連する遺伝子群  を断片化し、そして変性の循環サイクル、再ハイブリダイゼーション、そして続いてＴａｑポリメラーゼによる５’突出部の延長に供する。各サイクルでフラグメントの長さが増し、そしてＤＮＡ組換えは異なる遺伝子に由来するフラグメントが互いにハイブリダイズする時に起こる。ＤＮＡの最初の断片化は通常、ヌクレアーゼ消化、典型的にはＤＮａｓｅを使用して達成されるが（Ｓｔｅｍｍｌｅｒの参考文献、同上を参照にされたい）、切断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ＰＣＲ合成により行うこともできる（米国特許第５．９６５，４０８号明細書、引用により全部、本明細書に編入する；ディバース社、サンディエゴ、カリフォルニア州を参照にされたい）。ＤＮＡシャフリング法は各回のシャフリングにより、生成される有利な突然変異の指向的な組換えが達成され、したがってペプチドの改善された表現型について自己選択がある点で、ランダムな点突然変異法よりも有利である。
【０６６９】
ＤＮＡシャフリングの技術は当該技術分野では周知である。そのような技術の詳細な説明は、Ｓｔｅｍｍｌｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１およびＳｔｅｍｍｌｅｒ，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：１０７４７−１０７５１に見いだされる。ＤＮＡシャフリング技術は米国特許第６，１８０，４０６号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１１７，６７９号、同第６，０９６，５４８号、同第５，８３７，４５８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８１１，２３８号および同第５，６０５，７９３号明細書にも記載されている（これらはすべて引用により全部、本明細書に編入する）。
【０６７０】
この技術はまた、さらに最近ではＤＮＡシャフリングの基本的技術の変法も提供する。１例では、エキソンシャフリングでペプチドの特別なドメインをコードするエキソンまたはエキソンの組み合わせがキメラオリゴヌクレオチドを使用して増幅される。増幅された分子は次いで自己−プライミングアッセンブリー（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ＰＣＲ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）により組換えられる（Ｋｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｌｅｒ，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：４２３−４２８）。別の例では一過性の鋳型ライブラリー構築に関するランダムなキメラ誘発法（ｒａｎｄｏｍ  ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ：ＲＡＣＨＩＴＴ）の技術を使用して、１本鎖の元のＤＮＡフラグメントを完全長の１本鎖の鋳型にアニーリングする（Ｃｏｃｏら．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３５４−３５９）。さらに別の例では、付着伸長法（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ：ＳｔＥＰ）、大変省略されたアニーリング／延長サイクルでの熱サイクリングを使用して、フランキングプライマーからＤＮＡ重合を反復して切断する（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１）。ＣＬＥＲＹとして知られている技術では、酵母を対象として生体外のファミリーシャフリングを生体内の相同的組換えと組み合わせる（Ａｂｅｃａｓｓｉｓら．，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：Ｅ８８；）。遺伝子間組換えを最大にするために、各核酸の相補鎖からの１本鎖ＤＮＡをＤＮａｓｅで消化し、そしてアニーリングする（Ｋｉｋｕｃｈｉら，２０００，Ｇｅｎｅ  ２４３：１３３−１３７）。次いで開裂可能な配列により連結されている可変長の２つの短縮化核酸の平滑末端を連結して、相同的組換え無しに遺伝子融合を生成する（Ｓｉｅｂｅｒら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４５６−４６０；Ｌｕｔｚら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ１６；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１２０５−１２０９；Ｌｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：３１９−３２４）。小さい配列相同性を持つ核酸間の組換えは一般に、ＤＮＡフラグメントのエキソヌクレアーゼが媒介する平滑末端化、そしてフラグメントを一緒に連結してそれらを組換えることによっても強化された（米国特許第６，３６１，９７４号明細書、引用により全部、本明細書に編入する）。本発明は本発明の方法に有用なペプチドおよび／または酵素の生物学的特性を強化する手段として、上記の各々、およびすべての変異の使用を意図する。
【０６７１】
方向性のある進化および遺伝子シャフリング技術を詳細に記載する公開されたプロトコールに加えて、今では選択したペプチドの遺伝子シャフリングおよび選択手順を請け負う商業的サービスも利用することができる。マキシジェン（Ｍａｘｙｇｅｎ：レッドウッドシティ、カリフォルニア州）は、カスタムＤＮＡシャフリングライブラリーを作成するための商業的サービスを提供する。さらにこの会社は、遺伝子シャフリングおよび選択するペプチドファミリーの選択を含むカスタマイズされた方向付けされる進化の手順も行う。
【０６７２】
オプティジェニックス社（Ｏｐｔｉｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．、ニューアーク、デラウエア州）、プラスミドシャフリングに関連したサービスを提供する。オプティジェニックスは新たな特性を有する突然変異をその中に得るために、遺伝子ファミリーを使用する。問題の核酸をアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現系中のプラスミドにクローン化する。次いで関連するファミリーのＤＮＡを発現系に導入し、そしてファミリーの保存された領域中の組換えが宿主中で起こる。次いで生成した突然変異ＤＮＡが発現し、そしてそれらから生産されたペプチドを、所望の特性の存在および望ましくない特性の不存在についてスクリーニングする。
【０６７３】
ｃ．スクリーニング手順
「進化」の各循環後、突然変異した遺伝子により発現された所望のペプチドを問題の特性についてスクリーニングする。次いで「候補」遺伝子を増幅し、そして次回のＤＮＡシャフリング用にプールする。使用するスクリーニング手順は、「進化」したペプチドおよび問題の特性に高度に依存する。中でもとりわけペプチド安定性、生物学的活性、抗原性のような特性は、当該技術分野で周知な手順を使用して選択することができる。本発明の方法に有用な好適ペプチドの生物学的活性に関する個々のアッセイは、本明細書のいたるところに記載する。
【０６７４】
ｄ．技術の組み合わせ
当業者には突然変異および選択の上記技術は、本発明の方法に有用な最高に可能なペプチド分子を生成するために、互いに、そしてさらなる手順と組み合わせることができると考えるだろう。すなわち本発明はペプチドの生成に関して任意の１つの方法に限定されることはなく、そして本明細書に記載するありとあらゆる方法論を包含すると解釈すべきである。例えば点突然変異を核酸配列に導入する手順を最初に行い、続いて循環的ＤＮＡシャフリング、選択および増幅を行うことができる。初期の点突然変異の導入を使用して、それを欠く遺伝子群に多様性を導入し、次回のＤＮＡのシャフリングおよびスクリーニングにより有利な点突然変異を選択し、そして組み合わせることができる。
【０６７５】
ＩＩＩ．グリコシダーゼおよびグリコトランスフェラーゼ
Ａ．グリコシダーゼ
グリコシダーゼは受容体分子として水を使用し、そしてそのままで典型的なグリコシド−加水分解酵素であるグリコシルトランスフェラーゼである。グリコシダーゼは、反応混合物の熱力学または動力学を制御することにより生体外でグリコシド結合を形成するために使用することができる。変更された反応条件でも、グリコシダーゼ反応はうまく作用することが難しく、そしてグリコシダーゼは可逆的なトランスグリコシラーゼ反応および競合する加水分解反応の結果、低い合成収量を与える傾向がある。
【０６７６】
グリコシダーゼは加水分解中に破壊される結合で立体化学を維持することにより、あるいは加水分解中に破壊される結合で立体化学を逆転することにより機能することができ、それぞれ「維持（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）」グリコシダーゼまたは「逆転（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）」グリコシダーゼのいずれかに分類される。維持グリコシダーゼは活性部位に存在する２つの重要なカルボン酸部分を有し、１つのカルボキシレートは酸／塩基触媒として作用し、そしてもう１つは求核性として作用するが、逆転グリコシダーゼは１つのカルボン酸が酸として、そしてもう１つが塩基として作用する。
【０６７７】
任意のグリコシダーゼの活性および結合特性を決定する方法は当該技術分野では周知であり、それらには簡略化ＨＰＬＣプロトコール（Ｊａｃｏｂ  ａｎｄ  Ｓｃｕｄｄｅｒ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３０：２８０−３００）を含む。グリコシダーゼおよびグリコシダーゼ処理の一般的考察は、糖生物学、実践的取り組み（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、（１９９３，Ｆｕｋｕｄａ  ａｎｄ  Ｋｏｂａｔａ編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク）に見いだせる。
【０６７８】
本発明に有用なグリコシダーゼには限定するわけではないが、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、エンドグリカナ−ゼ、マンノシダーゼ（すなわちαおよびβ、ＭａｎＩ、ＭａｎＩＩおよびＭａｎＩＩＩ）、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、アグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）のβ−グリコシダーゼ、セルロモナス  フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）のマンノシダーゼ２Ａ、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のグリコシダーゼ、スルホロブス  ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のグリコシダーゼおよびバチルス  リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のグリコシダーゼを含む。
【０６７９】
本発明で使用するフコシダーゼの選択はフコースの他の分子に対する結合に依存する。本発明の方法に有用な多くのα−フコシダーゼの特異性は当該技術分野では周知であり、そしてまた多種のフコシダーゼが市販されている（とりわけグリコ（Ｇｌｙｋｏ）、ノバト、カリフォルニア州；プロザイム（ＰＲＯｚｙｍｅ）、サンレアンドロ、カリフォルニア州；カルビオケム−ノババイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）社、サンディエゴ、カリフォルニア州）。興味深いα−フコシダーゼには限定するわけではないが、タルボ  コルナタス（Ｔｕｒｂｏ  ｃｏｒｎｕｔｕｓ）、カロニア  ランパス（Ｃｈａｒｏｎｉａ  ｌａｍｐａｓ）、バチルス  フルミナンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｌｍｉｎａｎｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、クロストリジウム  パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウシ腎臓（グリコ）、ニワトリ肝臓（Ｔｙａｇａｒａｊａｎら，１９９６，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：８３−９３）に由来するα−フコシダーゼ、およびザントモナス  マニホティス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）（グリコ、プロザイム）由来のα−フコシダーゼＩＩを含む。ニワトリ肝臓のフコシダーゼはＮ−結合グリカンからコアフコースの除去に特に有用である。
【０６８０】
Ｂ．グリコシルトランスフェラーゼ 
グリコシルトランスフェラーゼは活性化糖（供与体ＮＤＰ−糖）のタンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質への、あるいは成長しているオリゴ糖の非還元末端への付加を段階的様式で触媒する。Ｎ−結合糖ペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質−結合オリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９をｅｎブロック転移で、続いてコアの改作を介して合成される。この場合、「コア」サッカリドの性質は後の結合とは幾分異なる。大変多数のグリコシルトランスフェラーゼが当該技術分野で知られている。
【０６８１】
本発明で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、それが糖供与体として修飾された糖を利用できる限り任意のものでよい。そのような酵素の例はガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼ等のようなルロアール経路のグリコシルトランスフェラーゼを含む。
【０６８２】
グリコシルトランスフェラーゼ反応に関与する酵素的サッカリド合成については、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化することができ、あるいは任意の供給源から単離することができる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼ、およびそれらのポリヌクレオチド配列も知られている。例えばＴａｎｉｇｕｃｈｉら，２００２，グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ）、スプリンガー、東京、を参照にされたい。
【０６８３】
グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列を推定することが
できるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列も、ＧｅｎＢａｎｋ
、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬおよびその他を含む様々な公開されているデーターベ
ースに見いだすことができる。
【０６８４】
本発明の方法で採用できるグリコシルトランスフェラーゼには、限定するわけではないがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼおよびオリゴ糖トランスフェラーゼを含む。適当なグリコシルトランスフェラーゼには真核生物ならびに原核生物から得られるものを含む。
【０６８５】
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは化学合成により、適切な細胞または細胞系カルチャーに由来するｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることにより、適切な細胞に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、あるいはこれらの手法の組み合わせにより得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列から生成したオリゴヌクレオチドプローブを使用して行うことができる。プローブは限定するわけではないが蛍光基、放射性原子または化学発光基のような検出可能な標識で既知の手順に従い標識し、そして通例のハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。あるいはグリコシルトランスフェラーゼの核酸配列から生成されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法を使用して得ることができる。Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第４，６８３，１９５号明細書およびＭｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照にされたい。
【０６８６】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換した宿主細胞で合成することができる。ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅し、かつ／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現させるいずれかのために使用する。発現ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物であり、ここでグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列が、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を行うことができる適切な制御配列に操作可能に連結されている。そのような制御配列の必要性は選択した宿主および選択した形質転換法に依存して変動する。一般に制御配列には転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。必要なすべてのものは、通常は複製起点により付与される宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にするための遺伝子の選択である。
【０６８７】
１．フコシルトランスフェラーゼ
幾つかの態様では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは当業者に知られている。フコシルトランスフェラーゼの例には、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容体の糖のヒドロキシ部位へ転移する酵素を含む。非−ヌクレオチド糖から受容体へ転移するフコシルトランスフェラーゼも本発明で使用される。
【０６８８】
幾つかの態様では、受容体の糖が例えばオリゴ糖のグリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−基のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適当なフコシルトランスフェラーゼには、最初にヒトの乳から特性決定されたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、（Ｐａｌｃｉｃら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照にされたい）、およびヒトの血清で見いだされたＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）を含む。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも特性決定された。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形も特性決定された（Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照にされたい）。他のフコシルトランスフェラーゼの例には例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）を含む。酵素的フコシル化はＭｏｌｌｉｃｏｎｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号明細書に記載されている方法により行うことができる。
【０６８９】
２．ガラクトシルトランスフェラーゼ
別の態様群では、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼの例にはα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９−２３３（１９９０）を参照にされたい）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７（１９８９））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１（１９８９）、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１−１０５（１９９５）を含む。別の適当なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液のＢ抗原群の合成に関与するものである（Ｅ．Ｃ．２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１（１９９０）（ヒト））。
【０６９０】
また本発明の方法での使用に適するのはβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには例えばＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）、ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７（１９８９））、ヒト（Ｍａｓｒｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３（１９８８））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８（１９８８））、ならびにＥＣ．２．４．１．３８およびセラミド  ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２（１９９４））を含む。他の適当なガラクトシルトランスフェラーゼには例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばシゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）に由来、Ｃｈａｐｅｌｌら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９−５２８（１９９４）を参照にされたい）を含む。さらに適当なグリコシルトランスフェラーゼについては、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら．（２００２、グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、プリンガー、東京）、Ｇｕｏら．（２００１，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１（１０）：８１３−８２０）およびＢｒｅｔｏｎら．（１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３：１０００−１００９）を参照にされたい。
【０６９１】
遺伝子操作によりクローン化した遺伝子に由来する酵素ＧａｌＮＡｃ  ＴＩ−ＸＩＶのようなタンパク質の生産も周知である。例えば米国特許第４，７６１，３７１号明細書を参照にされたい。１つの方法は十分なサンプルの収集、次いで酵素のアミノ酸配列をＮ−末端シークエンシングにより決定することを含む。次いでこの情報を使用して完全長の（膜に結合した）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離し、これは昆虫細胞系Ｓｆ９中で発現して完全に活性な酵素の合成をもたらす。次いで酵素の受容体特異性を、１６種のタンパク質における既知のグリコシル化部位の周辺のアミノ酸の半定量的分析、続いて合成ペプチドのインビトロのグリコシル化の実験により決定する。この作業では特定のアミノ酸残基がグリコシル化ペプチドセグメント中で過剰に提示され（ｏｖｅｒｒｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）、そしてグリコシル化されたセリンおよびトレオニン残基周辺の特異的位置の残基が、受容体効率に他のアミノ酸部分よりも顕著な効果を有し得ることが示された。
【０６９２】
３．シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物に有用な別の種類のグリコシルトランスフェラーゼである。本発明の使用に適するシアリルトランスフェラーゼの例には、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（例えばラットまたはヒトＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩを含む（本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６）に記載されている）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と呼ぶα（２，３）シアリルトランスフェラーゼの例は、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元末端のＧａｌへ転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）を参照にされたい。別の例のα２，３シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖またはグリコシドの非還元末端のＧａｌへ転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２）を参照にされたい。さらなる酵素の例にはＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを含む（Ｋｕｒｏｓａｗａら．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照にされたい）。
【０６９３】
好ましくは糖ペプチドの炭水化物のグリコシル化について、シアリルトランスフェラーゼは完全にシアリル化された炭水化物構造上の末端シアル酸の下にある最も多くの終わりから２番目の配列である配列Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−またはＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−にシアル酸を転移させることができる（表８を参照にされたい）。α２，８−シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を本発明の方法に有用なα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃに転移させることができる。
【０６９４】
【表８】
0005413548.tif 000079
【０６９５】
特許請求する方法に有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩであり、これはα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれる。この酵素はシアル酸をＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへ転移させることを触媒し（例えばＷｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１）を参照にされたい）、そして糖ペプチド中のアスパラギン−結合オリゴ糖のシアリル化の原因である。シアル酸はＧａｌと結合して２つのサッカリド間にα−結合を形成する。サッカリド間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２−位とＧａｌの３−位との間である。この特別な酵素はラットの肝臓（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２））；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７；Ｋｉｔａｇａｗａ  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１）、およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８）から単離することができる。ＤＮＡ配列も既知であり、組換え発現によるこの酵素の生産を促進する。好適な態様では、特許請求するシアリル化法はラットのＳＴ３ＧａｌＩＩＩを使用する。
【０６９６】
特許請求方法で有効なシアリルトランスフェラーゼの例は、カンピロバクターからのＣＳＴ−Ｉである。（例えば、米国特許  ６５０３７４４、６０９６５２９、６２１０９３３および国際公開９９／４９０５１、刊行された米国特許出願  ２００２／２０４２３６９を参照）この酵素は、シアル酸をＧａｌβ１，４ＧｌｃまたはＧａｌβ１，３ＧｌＮＡｃのＧａｌへの変換の触媒である。本発明に使用する他のシアリルトランスフェラーゼの例には、α（２，３）を含むカンピロバクター  ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）から単離されるものを含む。例えば国際公開第９９／４９０５１号パンフレットを参照にされたい。
【０６９７】
表８に掲げるものも含む他のシアリルトランスフェラーゼも、工業的に重要な糖ペプチドの経済的かつ効率的な大規模シアリル化法に有用である。このような他の酵素の有用性を見いだすための単純な試験として、様々な量の酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）をアシアロ−α１ＡＧＰ（１〜１０ｍｇ／ｍｌで）と反応させて、糖ペプチドをシアリル化する問題のシアリルトランスフェラーゼの能力を、ウシのＳＴ６Ｇａｌ、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩまたは両シアリルトランスフェラーゼのいずれかと比較する。あるいは他の糖ペプチドまたは糖ペプチド、またはペプチド骨格から酵素的に放出されるＮ−結合オリゴ糖を、この評価のためにアシアロ−α１ＡＧＰの代わりに使用することができる。ＳＴ６ＧａｌＩよりも効率的に糖ペプチドのＮ−結合オリゴ糖をシアリル化する能力を持つシアリルトランスフェラーゼは、ペプチドをシアリル化するための現実的な大規模法に有用である（本開示においてＳＴ３ＧａｌＩＩＩについて具体的に説明するように）。
【０６９８】
４．他のグリコシルトランスフェラーゼ 
当業者は他のグリコシルトランスフェラーゼを、シアリルトランスフェラーゼについて詳細に記載したように同様なトランスフェラーゼサイクルで置き換え得ることができると理解するだろう。特にグリコシルトランスフェラーゼは例えばグルコシルトランスフェラーゼ、例えばＡｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４））であることもできる。
【０６９９】
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼも本発明の実施に使用する。適当なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼには限定するわけではないが、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））を含む。適当なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにはＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら，ＢＢＲＣ１７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら
，Ｊ．ＢｉｏＣｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））およびＧｎＴＶＩ、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２））およびヒアルロナン  シンターゼを含む。
【０７００】
マンノシルトランスフェラーゼは、修飾されたマンノース部分を転移するために使用する。適当なマンノシルトランスフェラーゼにはα（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，６）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１およびＰｍｔ１を含む（Ｋｏｒｎｆｅｌｄｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４（１９８５）を参照にされたい）。
【０７０１】
キシロシルトランスフェラーゼも本発明に有用である。例えばＲｏｄｇｅｒｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８８：８１７−８２２（１９９２）；およびＥｌｂａｉｎら、米国特許第６，１６８，９３７号明細書を参照にされたい。
【０７０２】
他の適当なグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａら，ＪＡＣＳ１１４：９２８３（１９９２）、Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３（１９９２）およびＩｃｈｉｋａｗａら、炭水化物および炭水化物ポリマー（ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＰＯＬＹＭＥＲＳ）、Ｙａｌｔａｍｉ編集（ＡＴＬ出版、１９９３）に記載されている。
【０７０３】
原核生物のグリコシルトランスフェラーゼも本発明の実施に有用である。そのようなグリコシルトランスフェラーゼには多くのグラム陰性細菌により生産されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素を含む。ＬＯＳは典型的には、ヒト上皮細胞の表面または宿主の分泌に見いだされる複合糖質を模する末端グリカン配列を有する（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２３（３）：１３９−１８０（１９９６））。そのような酵素には限定するわけではないが、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような種のｒｆａオペロンのタンパク質（例えばＥＭＢＬ寄託番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））；ＥＭＢＬ寄託番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を参照にされたい）、グルコシルトランスフェラーゼ（スイス−プロット寄託番号Ｐ２５７４０（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（スイス−プロット寄託番号Ｐ２７１２９（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））およびスイス−プロット寄託番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、およびβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬ寄託番号Ｕ０００３９（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を含む。アミノ酸配列が既知の他のグリコシルトランスフェラーゼには、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ  エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、マイコバクテリウム  レプロサム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍ）のような微生物で特徴付けられたｒｆａＢのようなオペロン、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｒｈ１オペロンにコードされるものを含む。
【０７０４】
また本発明での使用に適するのは、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰｋ血液型の三糖配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含む構造の生産に関与するグリコシルトランスフェラーゼであり、これらは粘膜病原菌である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬＯＳで同定された（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６−２４３（１９９４））。グリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来の遺伝子は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のイムノタイプＬ３およびＬ１（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９−７４０（１９９５））、および淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）突然変異体のＦ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１−２１９０（１９９４））から同定されたこれらの構造の生合成に関与した。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）では、３つの遺伝子、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢおよびｌｇＥからなる位置がラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖に最後の３つの糖を付加するために必要であるグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６−７３（１９９６））。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が証明され、それらの提案されたグリコシルトランスフェラーゼ機能について直接的な証拠が提供された（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６（１９９６））。淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）では２つのさらなる遺伝子、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃをラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位に加えるｌｇｔＤ、および短縮化ＬＯＳのラクトース要素に末端α−Ｇａｌを加えるｌｇｔＣがあり、これによりＰｋ血液型抗原構造を作成する（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４）、同上）。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）では、別のイムノタイプＬ１もＰｋ血液型抗原を発現し、そしてｌｇｔＣ遺伝子を持つことが示された（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら，（１９９５）、同上）。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）のグリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子も、米国特許第５，５４５，５５３号明細書（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）に記載されている。ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に由来するα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼに関する遺伝子も特性決定された（Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９−２１３５６（１９９７））。また本発明で使用するのはカンピロバクター  ジェジュニ（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシルトランスフェラーゼである（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，２００２、グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンド��ック、スプリンガー、東京を参照にされたい）。
【０７０５】
Ｂ．スルホトランスフェラーゼ 
本発明は、例えばヘパリン、硫酸ヘパラン、カラゲニン（ｃａｒｒａｇｅｎｅｎ）のような硫黄化多糖および関連化合物を含む硫黄化した分子を含むペプチドの生産法を提供する。適当なスルホトランスフェラーゼには例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（Ｆｕｋｕｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５−１８５８０（１９９５）により記載されたニワトリｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ４９９１５）、グルコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｄｉｘｏｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２３９−２４１（１９９５）；ＵＬ１８９１８）、およびグルコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（Ｏｒｅｌｌａｎａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０−２２７６（１９９４）およびＥｒｉｋｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８−１０４４３（１９９４）に記載されたマウスｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ２３０４に記載されたヒトｃＤＮＡ）を含む。
【０７０６】
Ｃ．細胞−結合グリコシルトランスフェラーゼ
別の態様では、本発明の方法で採用する酵素は細胞−結合グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られているが（例えば米国特許第５，０３２，５１９号明細書を参照にされたい）、グリコシルトランスフェラーゼは
細胞に付随する時は一般に膜に結合している状態である。これまでに研究された多くの膜
に結合酵素は内在性のタンパク質であると考えられ；すなわちそれらは超音波により膜か
ら放出されず、そして可溶化に界面活性剤を要する。表面のグリコシルトランスフェラー
ゼは脊椎動物および無脊椎動物の細胞上の表面で同定され、そしてこれら表面のトランス
フェラーゼが生理学的条件下で触媒活性を維持していることも認識された。しかし細胞表
面のグリコシルトランスフェラーゼのより認識されている機能は細胞間の認識である（Ｒ
ｏｔｈ，１９９０，超細胞現象に対する分子的取り組み（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒ
ｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｕｐｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）。
【０７０７】
細胞により発現されるグリコシルトランスフェラーゼを改変させるための方法が開発さ
れた。例えばＬａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２２７−８２３１（１９８９）は、細胞表面のオリゴ糖構造およびそれらのコグネイトグルコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化ｃＤＮＡ配列を単離する遺伝的取り組みを報告する。ＵＤＰ−ガラクトース；β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをを発現することが知られているマウスの細胞系から単離したｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。次いでトランスフェクトした細胞を培養し、そしてα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。
【０７０８】
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：２７１３−２７１７（１９９２）は、β−ラクタマーゼを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の外面に足掛けする（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）方法を開示する。（ｉ）外膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外膜タンパク質の膜−拡張区分（ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｓｅｃｔｉｏｎ）、および（ｉｉｉ）完全な成熟β−ラクタマーゼ配列からなる三者（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）融合が生産され、活性な表面結合β−ラクタマーゼ分子を生じる。しかしＦｒａｎｃｉｓｃｏの方法は原核細胞系にのみ限定され、著者により認識されているように、正しく機能するには完全な三者融合を必要とする。
【０７０９】
Ｄ．融合酵素
別の例示態様では、本発明の方法は所望の糖ペプチド結合物の合成に関与する１より多
くの酵素活性を有する融合ペプチドを利用する。融合ペプチドは例えば、アクセサリー酵
素の触媒的に活性なドメインに連結されたグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性
なドメインからなることができる。アクセサリー酵素の触媒ドメインは、例えばグリコシ
ルトランスフェラーゼの供与体であるヌクレオチド糖の形成における工程を触媒するか、
あるいはグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応を触媒することができる
。例えばグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドはフレイム内で、
ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに結合され得る。生成
した融合ペプチドは次いでヌクレオチド糖合成を触媒するだけでなく、アクセプター分子
への糖部分の転移も触媒する。融合ペプチドは１つの発現可能なヌクレオチド配列に連結
された２以上のサイクル酵素であることができる。別の態様では融合ペプチドは２以上の
グリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインを含む。例えば米国特許５，６
４１，６６８第号明細書を参照にされたい。本発明の修飾された糖ペプチドは、様々な適
切な融合ペプチドを利用して容易に設計し、そして製造することができる（例えば国際公
開第９９／３１２２４号パンフレットとして１９９９年６月２４日に公開されたＰＣＴ特
許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０を参照にされたい）。
【０７１０】
Ｅ．固定化酵素
細胞に結合した酵素に加えて、本発明は固体および／または可溶性支持体上に固定化さ
れた酵素の使用も提供する。例示態様では、本発明の方法に従い完全なグリコシル連結基を介してＰＥＧに結合されたグリコシルトランスフェラーゼを提供する。ＰＥＧ−連結基−酵素結合物は、場合により固体支持体に結合される。本発明の方法において固体に支持された酵素の使用は、反応混合物の処理および反応生成物の精製を簡単にし、そしてまた酵素の容易な回収を可能とする。このグリコシルトランスフェラーゼ結合物は本発明の方法に利用する。他の酵素および支持体の組み合わせも当業者には明らかであろう。
【０７１１】
Ｆ．グリコシルトランスフェラーゼの突然変異誘発法
本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ
、スルホトランスフェラーゼおよび任意の他の酵素の新規形態は、これまでに記載した任
意の方法ならびに当該技術分野で周知の他の方法を使用して作成することができる。特に
興味深いのは、改変された受容体特異性および／または供与体特異性を持つトランスフェ
ラーゼである。また興味深いのは、中でもより高い転換速度およびより高い安定性を持つ
酵素である。
【０７１２】
合理的な設計の突然変異誘発技術は、ペプチドの配列が知られている時に使用すること
ができる。本発明で使用するトランスフェラーゼおよびグルコシダーゼ配列ならびに３次
構造の多くは知られているので、これらの酵素は突然変異の合理的な設計に理想的である
。例えば酵素の触媒部位を突然変異させて酵素の供与体および／または受容体特異性を改
変することができる。
【０７１３】
グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼヒドロラーゼに関する膨大な３次
構造に関するデータにより、これらの酵素はドメイン交換が関与する突然変異にも理想的
なものとなる。グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼヒドロラーゼはモジ
ュラー酵素（ｍｏｄｕｌａｒ  ｅｎｚｙｍｅ）である（Ｂｏｕｒｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒ
ｉｓｓａｔ，２００１，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：５９３−６００）。グリコシルトランスフェラーゼはそれらの
構造に基づき２つのファミリーに分類される：ＧＴ−ＡおよびＧＴ−Ｂ。ＧＴ−Ａファミ
リーのグリコシルトランスフェラーゼは２つの似ていないドメインを含んでなり、１つは
ヌクレオチド結合に関与し、そしてもう１つは受容体結合に関与する。このように１つの
遺伝子に由来するドメインをコードするＤＮＡ配列を、第２の遺伝子に由来するドメイン
とフレイム内で都合よく融合して、新たな受容体／供与体特異性を持つタンパク質をコー
ドする新たな遺伝子を作成することができる。そのようなドメインの交換にはさらに炭水
化物モジュールおよび他のアクセサリードメインを含むことができる。
【０７１４】
上記のようなランダム変異導入および／または方向性のある進化の技術は、本発明で使
用するグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼの新規な形態を作成するため
にも使用することができる。
【０７１５】
ＩＶ．生体外および生体内の発現系
Ａ．糖ペプチドを生産するための細胞
グリコシルトランスフェラーゼの作用はペプチドのグリコシル化に重要であり、すなわ
ち所定の細胞型での１組のグリコシルトランスフェラーゼの発現における差異は、その細
胞で生産される所定のペプチドのグリコシル化パターンに影響を及ぼす。宿主細胞に依存
的なペプチドのグリコシル化の総説に関しては、Ｋａｂａｔａ  ａｎｄ  Ｔａｋａｓａｋ
ｉ、「細胞表面の炭水化物の構造および生合成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）」
、細胞表面の炭水化物および細胞生育（Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）で、１９９１、第１〜２４頁、
編集．Ｍｉｎｏｒｕ  Ｆｕｋｕｄａ、ＣＲＣ出版、ボカ  ラトン、フロリダ州を参照にさ
れたい。
【０７１６】
本開示に従いペプチドが生産される細胞の型は、所望のグリコシル化を有するペプチド
を生成するために必要な改造の程度に対してのみ関係がある。例えば所望のグリコシル化
を有するペプチドを生成するために、生体外で必要な酵素的消化反応の回数および順序および酵素的合成反応の回数および順序は、特定の細胞型により生産されるペプチド上のグリカンの構造に依存して変動する。本発明は本明細書に開示する任意の細胞型を含む任意の１つの特定の細胞型に由来するペプチドの生産に限定されるとは全く解釈されるべきではなく、本発明の威力およびペプチドが生成される細胞系の独立性を確立する幾つかの細胞系の検討をこれから提示する。
【０７１７】
一般に、そしてペプチドをコードする核酸からペプチドを発現させるために、核酸はプ
ロモーター要素、ターミネーター要素およびこの２つの間に操作可能に連結されたペプチ
ドのコード配列を含んでなる発現カセットに包含されなければならない。次いで発現カセ
ットをベクターに操作可能に連結する。この末端に向けてアダプターまたは連結剤（リンカー）を使用してヌクレオチドフラグメントを連結することができ、あるいは便利な制限部位、余分なヌクレオチドの除去、制限部位の除去等を提供するために他の操作が関与してもよい。このために、生体外の突然変異誘発法、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジッションおよびトランスバージョンを含むことができる。シャトルベクターは細胞中で複製に必要な遺伝子要素を有する。ベクターの中には原核細胞中でのみ複製できるもの、あるいは原核および真核細胞の両方で複製できるものがある。そのようなプラスミド発現ベクターは１以上の複製系、好ましくは発現の目的で酵母宿主細胞内で、そしてクローニングの目的で原核宿主内で安定に維持されることができる２つの複製系で維持される。今では多様な特性を持つ多くのベクターが市販されている。ベクターは通常、プラスミドまたはファージであるが、コスミドまたはミニ−染色体でもよい。都合が良いことに、多くの市販されているベクターはすでに存在する発現カセットにプロモーターおよびターミネーター、および問題のペプチド用のコード配列を挿入できるマルチ−連結基部位を有する。次いで発現カセットを含むシャトルベクターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で形質転換され、ここでベクターは細胞分裂中に複製して選択した発現系の宿主細胞を形質転換するのに十分なベクターの調製物を生成する。上記の方法は当業者には周知であり、そして行なわれるプロトコールはＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１，モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク）に見いだすことができる。
【０７１８】
ベクターはいったん増幅された細胞から精製されれば、次に発現系の細胞に形質転換さ
れる。形質転換のプルトコールは細胞の種類およびベクターの性質に依存する。形質転換
体を適当な栄養培地中で成長させ、そして適当な場合には内因性ＤＮＡの維持を選択圧下
で維持する。発現が誘導性である場合、成長により酵母宿主が高密度の細胞を生じること
ができるようになり、次いで発現が誘導される。分泌した成熟したヘテロロガスなペプチ
ドは通常の手段により回収することができ、そしてクロマトグラフィー、電気泳動、透析
、溶媒−溶媒抽出等により精製され得る。
【０７１９】
分子クローニングの技術は当該技術分野では周知である。さらに分子クローニングの手
順に関する技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）；Ｇｌｏｖｅｒら（１９８５、ＤＮＡクローニング：実践的取り組み（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第ＩおよびＩＩ巻）；Ｇａｉｔら（１９８５、オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ））；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５、核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８４、転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ））；Ｆｒｅｓｈｎｅｙら（１９８６、動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ））；Ｐｅｒｂｅｌ、（１９８６、固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＩＲＬ出版）；Ｐｅｒｂｅｌ、（１９８４、分子クローニングに関する実践的指針（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ））；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２、分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン  ウィリー＆サンズ社）に見いだすことができる。
【０７２０】
Ｂ．真菌および酵母
酵母で生産されたペプチドはグリコシル化されており、そしてそこに存在するグリカン
構造は主に高マンノース構造である。Ｎ−グリカンの場合では、酵母で生産されたグリカ
ン構造は、９以上ものマンノース残基を含むことができ、この残基はそれに結合したさら
なる糖を含んでも、含まなくてもよい。酵母細胞により生産されるペプチド上のこの型の
グリカンの例を、図４の左側に示す。マンノース残基の番号およびそれに結合したさらな
る糖の型および複雑さに関係なく、酵母細胞で生産されたペプチドの成分としてＮ−グリ
カンは、図４に示すトリマンノシルコア構造を含んでなる。酵母細胞で生産されたペプチ
ド上のグリカン構造が高マンノース構造である時、当業者が利用可能なマンノシダーゼ酵
素を使用してグリカンのトリマンノシルコアを含んでなる残基を除き、分子からすべての
マンノース残基をインビトロで除去することは単純なことであり、これにより結合した基
本的なトリマンノシルコア構造を有するペプチドを生成する。ここで今、当該技術分野で
利用可能な技術を使用し、そして本開示から着手すれば、生体外で酵素的にさらなる糖部分を基本的なトリマンノシルコア構造に加え、所望のグリカン構造をトリマンノシルコアに結合して有するペプチドを生成することは簡単である。同様に酵母細胞により生産されたペプチドが、結合した他の複雑な糖に加えて高マンノース構造を含んでなる時、余分なマンノース残基を含めさらなる糖のすべてを酵素的に開裂して基本的なトリマンノシルコア構造に到達することは簡単な事柄である。いったん基本的なトリマンノシルコアが生成されれば、所望のグリコシル化を有するペプチドの生成は本明細書に提供する指針に従い可能となる。
【０７２１】
「酵母」は無胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子胞子酵母（ｂａｓｉｄｉ
ｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）、および不完全菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属す
る酵母を意図している。無胞子酵母は２つのファミリー、スペルモフィトラ科（Ｓｐｅｒ
ｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）およびサッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａ
ｃｅａｅ）に分類される。後者は４つのサブファミリー、シゾサッカロミセス科（Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えばシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属）、ナドゾニア科（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、
リポミセス科（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）およびサッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えばピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属）から
なる。担子胞子酵母にはロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドス
ポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリディオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏ
ｂｏｌｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）およびフィロバシジーラ
（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属を含む。不完全菌類に属する酵母は２つのファミリ
ー、スポロボロミセス科（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えば、スポロ
ボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属）およびク
リプトコッカス科（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属）に分類される。本発明で特に興味深いのは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ）属、特にＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）およびＫ．ドロソフィラム（ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセニューラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）
、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａ
ｒｒｏｗｉａ）およびクリソポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）属内の種である。酵
母の分類は将来、変わるかもしれないので、本発明の目的のための酵母は、Ｓｋｉｎｎｅ
ｒら．編集、１９８０）、酵母の生物学および活性（Ｂｉｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ）（Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９）に記載されてように定義されるものである。
【０７２２】
先の記述に加えて、当業者は恐らく酵母の生物学および酵母遺伝子の操作に関して精通
している。例えばＢａｃｉｌａら．編集（１９７８、酵母の生化学および遺伝学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ）、アカデミック出版、ニューヨーク）；およびＲｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ．（１９８７、酵母（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ）（第２版）、アカデミック出版、ロンドン）を参照にされたい。外因性のＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野で周知である。酵母の形質転換のためには広範な種々の方法がある。スフェロプラスト形質転換はＨｉｎｎｅｎら（１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９１９−１９３３）；Ｂｅｇｇｓ，（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ２７５（５６７６）：１０４−１０９）；およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，（欧州特許出願公開第４５，５７３号明細書；引用により本明細書に編入する）により教示され、電気穿孔はＢｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｕｒａｎｔｅ，（１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−１８７）により教示され、酢酸リチウムはＧｉｅｔｚら．（２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５０：８７−９６）およびＭｏｕｎｔら．（１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５３：１３９−１４５）により教示されている。非サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換系の総説に関しては、Ｗａｎｇら．（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１；２１（３）：１７７−２１８）を参照にされたい。酵母の遺伝子操作に関する一般的手順については、Ｂａｒｒら，（１９８９、酵母の遺伝子操作（Ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ）、バターワース、ボストン）を参照にされたい。
【０７２３】
野生型酵母および真菌細胞に加えて、外因性遺伝子の発現レベル、純度、生成したペプ
チドの翻訳後修飾プロセッシングおよび成熟ペプチドの回収および純度を強化するように
突然変異および／または選択された酵母および真菌の株が存在する。外因性ペプチドの発
現は、インスリンの発現により具体的に説明されるように細胞の分泌経路に向けることも
できる（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，２０００，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．５４：２７７−２８６、およびその中の参考文献を参照にされたい）。一般に酵
母細胞から外因性ペプチドの分泌を引き起こすためには、キラートキシン（Ｓｔａｒｋ  
ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５−２００２）、またはアルファフ
ェロモン（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２，Ｃｅｌｌ  ３０：
９３３；Ｂｒａｋｅら，１９８８，Ｙｅａｓｔ  ４：Ｓ４３６）の遺伝子のもののような酵母遺伝子に由来する分泌シグナルを使用することができる。
【０７２４】
一般に糸状菌に関して、遺伝子操作法はＫｉｎｇｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ（１
９９２，糸状菌の応用分子遺伝学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ）、ブラッキー  アカデミック  アン
ド  プロフェッショナル（Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓ
ｉｏｎａｌ）、ニューヨーク）に見いだすことができる。適切なベクターに関するガイダ
ンスは、Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｈｏｒｎ（１９９４，アルペルギルス
：５０年（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０  ｙｅａｒｓ）、エルセビア、アムステルダム
）に見いだすことができる。
【０７２５】
１．サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）では、ペプチドを生産するために使用
する適当な酵母ベクターにはＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：１０３５−１０３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら，Ｇｅｎｅ  ８：１２１−１３３，１９７９）、ＰＯＴベクター（Ｋａｗａｓａｋｉら，米国特許第４，９３１，３７３号明細書、これは引用により本明細書に編入する）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４−１０８，１９７８）およびそれらの誘導体を含む。酵母での使用に好適なプロモーターは、酵母の解糖遺伝子の発現に関するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０，１９８０；Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−４３４，１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号明細書）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、化学品のための微生物の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら，（編集）、第３５５頁、プレナム出版、ニューヨーク、１９８２；Ａｍ
ｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１，１９８３）、および
ＡＤＨ２−４ｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：６５２−６５４，１９８３；Ｉｒａｎｉ  ａｎｄ  Ｋｉｌｇｏｒｅ，米国特許出願第０７／７８４，６５３号明細書、カナダ国特許第１，３０４，０２０号明細書および欧州特許第２８４  ０４４号明細書、これらは引用により本明細書に編入する）を含む。発現単位は転写ターミネーターも含むことができる。好適な転写ターミネーターはＴＰＩ１ターミネーター（Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓａｋｉ，同上）である。
【０７２６】
そのような酵母−細菌シャトルベクターの例には、Ｙｅｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７−２４；ｐＣ１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：４６４２−４６４６）、およびＹｒｐ１７（Ｓｔｎｉｃｈｏｍｂら．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）を含む。さらにプラスミド発現ベクターは高または低コピー数プラスミドでよく、コピー数は一般に約１〜約２００の範囲である。高コピー数酵母ベクターの場合、一般に１つの宿主中に少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、そして通常は約１５０コピーを越えない。選択したヘテロロガスなペプチドに依存して、高または低コピー数ベクターのいずれかが、ベクターおよび組換えペプチドが宿主に及ぼす効果に依存して望ましい。例えばＢｒａｋｅら．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６を参照にされたい。本発明のＤＮＡ構築物はベクターに組み込むことにより酵母ゲノムに組み込んでもよい。そのようなベクターの例は当該技術分野で知られている。例えばＢｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７−２４を参照にされたい。
【０７２７】
本発明を実施するために適当な酵母および他の微生物宿主に関する選択は、当該技術分
野の技術内である。特に興味深いのは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
のＳ．セルビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂ
ｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ジアスタティカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ドウグラ
シー（ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス
（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）およびＳ．オビホルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）種である。所望
のペプチドを発現させるために酵母宿主細胞を選択する時、適当な宿主細胞は、中でも良
好な分泌能力、低いタンパク質分解活性、および全体的な成長力（ｖｉｇｏｒ）を有する
ことが示されたものを含むことができる。酵母および他の微生物は一般に様々な供給源か
ら入手可能であり、それらにはカリフォルニア州、バークレーのカリフォルニア大学、生
物物理学および医学物理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａ
ｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）、酵母遺伝子ストックセンター（Ｙｅａｓｔ  
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）；およびバージニア州、マナッサスのアメ
リカンタイプカルチャーコレクションを含む。総説に関しては、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅ
ｔ  ａｌ．編集．（１９８１、酵母、サッカロミセスの分子生物学（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク州）をに参照にされたい。外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野では周知である。
【０７２８】
２．ピヒア
組換えペプチドの生産のための宿主としてピヒア  メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔ
ｈａｎｏｌｉｃａ）の使用は、ＰＣＴ出願、国際公開第９７／１７４５０号、同第９７／
１７４５１号、同第９８／０２５３６号および同第９８／０２５６５号パンフレットに開
示されている。Ｐ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換に使用するＤＮＡ
分子は一般に、形質転換前に好ましくは直線化される二本鎖の環状プラスミドとして調製
される。Ｐ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）でのペプチド生産には、プラスミド
中のプロモーターおよびターミネーターは、Ｐ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）
のアルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）のようなＰ．メタノリカ（ｍｅｔｈ
ａｎｏｌｉｃａ）遺伝子のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターにはジヒ
ドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）およびカタ
ラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のもの、ならびに米国特許第５，２５２，７２６号明細書に開示
されているものを含む。ＤＮＡの宿主染色体への組み込みを容易にするために、宿主ＤＮ
Ａ配列により両末端を挟まれたプラスミドの全発現セグメントを有することが好ましい。
ピヒア  メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）での使用に好適な選択マ
ーカーは、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ；ＥＣ
４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＡＤＥ２遺
伝子であり、これはａｄｅ２宿主細胞がアデニンの不存在下で成長することを可能とする
。メタノールの使用を最少にすることが望まれる大規模な工業的方法には、両方のメタノ
ール利用遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が削除されている宿主細胞が好ましい。分泌
するペプチドの生産には、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）を欠く宿
主細胞が好適である。目的のペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドを、Ｐ．メタ
ノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞に導入することを容易にするために、電気穿孔を
使用する。指数的に減少する、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約３．７５ｋＶ／
ｃｍの場の強さを有するパルス電場、および１〜４０ミリ秒、最も好ましくは約２０ミリ
秒の時間定数（ｔ）を使用して、電気穿孔によりＰ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ
ａ）細胞を形質転換することが好ましい。抗体フラグメントの大規模生産のためのピヒア
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の使用に関する総説は、Ｆｉｓｃｈｅ
ｒら（１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（Ｐｔ２）：１１７−１２０）を参照にされたい。
【０７２９】
３．アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種でペプチドを発現させる方法は当該技術
分野では周知であり、それらには限定するわけではないが引用により全部、本明細書に編
入するCarrezら, 1990, Gene 94: 147-154; Contreras, 1991, Bio/Technology 9:378-381; Yeltonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474; Tilburnら, 1983, Gene 26: 205-221; Kelly and. Hynes, 1985, EMBO J. 4:475-479; Ballanceら, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112: 284-289; Buxtonら, 1985, Gene 37: 207-214, and U.S. Pat. No. 4,935,349に記載されているものを含む。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）で有用なプロモーターの例は、米国特許第５，２５２，７２６号明細書に見いだされる。ペプチドの発現に有用なアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株は、米国特許第４，９３５，３４９号明細書に見いだされる。外因性ペプチドの工業的生産は、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）およびアスペルギルス  オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）についてノボエンザイム（Ｎｏｖｏｅｎｚｙｍｅｓ）から入手可能である。
【０７３０】
４．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）は所望のペプチドを発現させるために、他の
種の組換え宿主細胞に優るある一定の利点を有する。この微生物は大量に成長させること
が容易であり、そしてグリコシル化する能力を有し、そして組換え哺乳動物ペプチドを培
地に高い収量で効率よく分泌し、ペプチドの単離を比較的容易とする。さらに発現したペ
プチド上のグリコシル化パターンは、多くの他の系で発現されるものよりもヒトペプチドに類似している。しかしこれらの細胞から発現したペプチド上のグリカン構造にも差異が存在する。例えば末端シアル酸残基は、グリカン構造の末端のこれらの部分の存在が哺乳動物の血流からペプチドの排除を遅らせるので、哺乳動物系におけるペプチドの治療的機能に対して重要である。シアリル化分子が生物学的半減期を上昇させる背後にあるメカニズムは、レクチンによるそれらの認識の低下にあると考えられる（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９５５７−９５６０）。しかし一般に真菌細胞は末端シアル酸残基をペプチド上のグリカンに加えず、故に真菌細胞で合成されたペプチドはシアル酸が除かれている。本発明に従い、この欠如は本明細書のいたるところに詳細に記載する本発明の生体外グリカン改造方法を使用して補修する（ｒｅｍｅｄｉｅｄ）
ことができる。
【０７３１】
改造するペプチドの生産のために宿主として有用なトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａ）種には、ＱＭ６ａ、ＡＬＫＯ２４４２またはＣＢＳ３８３．７８（セントラールビ
ュロー、フォーア  シンメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓ
ｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、オースターストラート  １、私書箱２７３、３７４
０  バールン社（ＡＧ  Ｂａａｒｎ）、オランダ）、またはＡＴＣＣ１３６３１（アメリ
カンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州、１０８５２、米国、型
）のようなＴ．レーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ）；Ｔ．ビリデ（ｖｉｒｉｄｅ）（ＣＢＳ１８９
．７９のような（ｄｅｔ．Ｗ．Ｇａｍｓ）；ＣＢＳ８１６．６８のようなＴ．ロンギブラ
キアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）（型）；Ｔ．シュードコニンギー（ｐｓｅ
ｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）（ＭＵＣＬ１９３５８のような；Ｍｙｃｏｔｈｅｑｕｅ  ｄｅ
ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ  ｄｅ  Ｌｏｕｖａｉｎ）；Ｔ．サ
チュルニスポラム（ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）ＣＢＳ３３０．７０（型）；Ｔ．ハル
ジアナム（ｈａｒｚｉａｎｕｍ）  ＣＢＳ３１６．３１（ｄｅｔ．Ｗ．Ｇａｍｓ）；Ｔ．
ビルガタム（ｖｉｒｇａｔｕｍ）（Ｔ．シュードコニンギー（ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇ
ｉｉ））ＡＴＣＣ２４９６１を含む。最も好ましくは宿主はＴ．レーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ
）であり、そしてより好ましくはこれはＴ．レーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ）のＱＭ９４１４（
ＡＴＣＣ２６９２１）、ＲＵＴ−Ｃ−３０（ＡＴＣＣ５６７６５）およびＱＭ９４１４に
由来するＶＴＴ−Ｄ−７９１２５株のような高度に生産的な突然変異体（Ｎｅｖａｌａｉ
ｎｅｎ、テクニカル  リサーチ  センター  オブ  フィンランド（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｆｉｎｌａｎｄ）公報２６、（１９８５）、エ
スポー、フィンランド）である。
【０７３２】
ＤＮＡでのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換は、欧州特許第０２４
４２３４号明細書、Ｈａｒｋｋｉ（１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：５９
６−６０１）およびＵｕｓｉｔａｌｏ（１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：３５−５
０）に教示されている技術を含め当該技術分野で既知の技術を使用して行う。トリコデル
マ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の培養は、工業的規模の発酵技術でのこれまでの豊富な経
験により支持されている；例えばＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，１９９２，糸状菌のバイオテ
クノロジー：技術および産物（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏ
ｕｓ  Ｆｕｎｇｉ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、バターワース
−ヘイネマン出版、ストーンハム、マサチューセッツ州を参照にされたい。
【０７３３】
５．クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）
クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母は、組換えペプチド
の生産に宿主微生物として使用されてきた。この属の酵母により生産されるペプチドは特
にキモシン（欧州特許第９６４３０号明細書）、タウマチン（欧州特許第９６９１０号明
細書）、アルブミン、インターロイキン−１β、ＴＰＡ、ＴＰＡ、ＴＩＭＰ（欧州特許第
３６１９９１号明細書）および治療的機能を有するアルブミン誘導体（欧州特許第４１３
６２２号明細書）である。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の中で特
に興味深い種にはＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）を含む。
【０７３４】
クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種での組換えペプチドの発現法は、
当該技術分野で周知である。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）でのヒト
組換えペプチドの発現および分泌のためのベクターは、組換えペプチドの形質転換および
発現のための生産体として当該技術分野（Ｙｅｈ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕ
ｐｐｌ．１４Ｃ：６８，Ａｂｓｔ．Ｈ４０２；Ｆｌｅｅｒ，１９９０，Ｙｅａｓｔ６（特
集）：Ｓ４４９）で既知である（Ｉｔｏら，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３−１６８；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５−１３９；米国特許第５，６３３，１４６号明細書、国際公開第８３０４０５０Ａ１号パンフレット、欧州特許第００９６９１０号、同第０２４１４３５号、同第０３０１６７０号、同第０３６１９９１号明細書、すべて引用により全部、本明細書に編入する）。遺伝子ターゲッティングおよびプラスミドシャフルによるクルイベロミセス  ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）の線状ＤＮＡプラスミドの遺伝子操作の総説に関しては、Ｓｃｈａｆｆｒａｔｈら（１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７８（２）：２０１−２１０）を参照にされたい。
【０７３５】
６．クリソポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）
真菌の属であるクリソポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）は最近、外来組換えペプ
チドの発現に使用された。外来ペプチドを発現するために当業者がクリソポリウム（Ｃｈ
ｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）を使用することができる手順の記載は、国際公開第００／２０５
５５号明細書に見いだされる（これは引用により全部、本明細書に編入する）。発現系に
特に適する種は限定するわけではないが、Ｃ．ボトリオイデス（ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）
、Ｃ．カルミカエリー（ｃａｒｍｉｃｈａｅｌｉｉ）、Ｃ．クラッシツニカタム（ｃｒａ
ｓｓｉｔｕｎｉｃａｔｕｍ）、Ｃ．ヨーローパ（ｅｕｒｏｐａｅ）、Ｃ．エボルセアンヌ
イ（ｅｖｏｌｃｅａｎｎｕｉ）、Ｆ．ファスチジウム（ｆａｓｔｉｄｉｕｍ）、Ｃ．フィ
リホルメ（ｆｉｌｉｆｏｒｍｅ）、Ｃ．ゲロギエ（ｇｅｒｏｇｉａｅ）、Ｃ．グロビフェ
ラム（ｇｌｏｂｉｆｅｒｕｍ）、Ｃ．グロビフェラム  変種  アーチクラタム（ｇｌｏｂ
ｉｆｅｒｕｍ  ｖａｒ．ａｒｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、Ｃ．グロビフェラム  変種  ニベウ
ム（ｇｌｏｂｉｆｅｒｕｍ  ｖａｒ．ｎｉｖｅｕｍ）、Ｃ．ヒルンド（ｈｉｒｕｎｄｏ）
、Ｃ．ヒスパニカム（ｈｉｓｐａｎｉｃｕｍ）、Ｃ．ホルミー（ｈｏｌｍｉｉ）、Ｃ．イ
ンジカム（ｉｎｄｉｃｕｍ）、Ｃ．イノプス（ｉｎｏｐｓ）、Ｃ．ケラチノフィラム（ｋ
ｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｃ．クレイセリー（ｋｒｅｉｓｅｌｉｉ）、Ｃ．クズロ
ビアナム（ｋｕｚｕｒｏｖｉａｎｕｍ）、Ｃ．リグノラム（ｌｉｇｎｏｒｕｍ）、Ｃ．ロ
バタム（ｌｏｂａｔｕｍ）、Ｃ．ラックノヴェンセ（ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、Ｃ．ラ
ックノヴェンセ（ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）Ｇａｒｇ２７Ｋ、Ｃ．メディウム（ｍｅｄｉ
ｕｍ）、Ｃ．メディウム  変種  スピッセスセンス（ｍｅｄｉｕｍ  ｖａｒ．ｓｐｉｓｓ
ｅｓｃｅｎｓ）、Ｃ．メフィチカム（ｍｅｐｈｉｔｉｃｕｍ）、Ｃ．メルダリウム（ｍｅ
ｒｄａｒｉｕｍ）、Ｃ．メルダリウム  変種  ロゼウム（ｍｅｒｄａｒｉｕｍ  ｖａｒ．
ｒｏｓｅｕｍ）、Ｃ．マイナー（ｍｉｎｏｒ）、Ｃ．パンニコーラ（ｐａｎｎｉｃｏｌａ
）、Ｃ．パルバム（ｐａｒｖｕｍ）、Ｃ．パルバム  変種  クレセンス（ｐａｒｖｕｍ  
ｖａｒ．ｃｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｃ．ピロサム（ｐｉｌｏｓｕｍ）、Ｃ．ペオドメルデリウ
ム（ｐｅｏｄｏｍｅｒｄｅｒｉｕｍ）、Ｃ．ピリホルミス（ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｃ
．クィーンズランディカム（ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、Ｃ．シグレリ（ｓｉｇｌ
ｅｒｉ）、Ｃ．スルフレウム（ｓｕｌｆｕｒｅｕｍ）、Ｃ．シンクロナム（ｓｙｎｃｈｒ
ｏｎｕｍ）、Ｃ．トロピカム（ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、Ｃ．ウンダラタム（ｕｎｄｕｌａｔ
ｕｍ）、Ｃ．バレレナレンス（ｖａｌｌｅｎａｒｅｎｓｅ）、Ｃ．ベスペルチリウム（ｖ
ｅｓｐｅｒｔｉｌｉｕｍ）およびＣ．ゾナタム（ｚｏｎａｔｕｍ）を含む。
【０７３６】
７．その他
シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）を形質転換する方法は欧州特許
第３９４５３８号明細書に開示されている。アクレモニウム  クリソゲナム（Ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換する方法は、米国特許第５，１６２，
２２８号明細書に開示されている。ニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転
換する方法は、米国特許第４，４８６，５３３号明細書に開示されている。またシゾサッ
カロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）に特異的
な発現系も知られている（欧州特許第３８５３９１号明細書）。分裂酵母シゾサッカロミ
セス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）でペプチドを発
現させるための一般的方法は、Ｇｉｇａ−Ｈａｍａ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｇａｉ（１９９７
、分裂酵母：シゾサッカロミセス  ポンベでの外来遺伝子発現（Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎ
ｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、スプリンガー、ベルリン）に見いだすことができる
。
【０７３７】
Ｃ．哺乳動物系
上記のように、哺乳動物細胞は典型的にはトリマンノシルコアに結合したさらなる糖の
数および配列について変動するＮ−グリカン構造のヘテロロガスな混合物を生産する。典
型的には哺乳動物細胞は図３右側に示すような複雑なグリカン構造を有するペプチドを生
産する。本発明の方法を使用して、最初に１次グリカン構造を同定し、次にグリカン構造
を改造するためにはどの糖が除去されるなけれければならないかを決定することにより、
哺乳動物細胞で生産されたペプチドを生体外で改造して、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成することができる。本明細書で検討するように、除去される糖によりどの開裂酵素が使用されるかが決定され、すなわ改造方法の正確な工程は最初の基質として使用される１次グリカン構造に依存して変動するだろう。哺乳動物細胞で一般に生産されるグリカン構造を改造するための実例スキームは図２に示す。哺乳動物細胞でのＮ−グリカン生合成経路は十分に特徴付けられた（Ｍｏｒｅｍｅｎ，１９９４，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ４：１１３−１２５を参照にされたい）。グリカン合成に必要な酵素の多くが同定され、そしてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系Ｌｅｃ２３（アルファ−グルコシダーゼＩ欠損）およびＬｅｃ１８（新規ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶＩＩＩ）を含め、この酵素的経路を欠く突然変異体細胞系が単離された。これらの突然変異体細胞により生産されるペプチドのグリコシル化パターンは、正常ＣＨＯ細胞に対して改変されている。本明細書で検討するように、これらおよび他の突然変異体細胞におけるグリコシル化の欠損は、複雑なグリカン構造を欠くペプチドを生産する目的に活かすことができる。例えばＬｅｃ２３細胞により生産されたペプチドはシアル酸残基を欠き、すなわち基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮａｃ４にグリカン構造を減少させるために必要な酵素的操作が少ない。このようにこれらの細胞で生産されるペプチドはグリカン改造用の好適な基質として役立つ。当業者は既知の方法、例えばＳｔａｎｌｅｙら，１９９０，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：２１１−２２３に記載されている方法に基づき、他のグリコシル化−欠損細胞系を単離し、そして同定することができる。同定された、または未だ同定されていないグリコシル化−欠損細胞系の使用は、本明細書に記載する改造方法のための好適なペプチド基質を生成する目的で本発明に含まれる。
【０９３０】
哺乳動物細胞中で外因性ペプチドを発現させるための発現ベクターは膨大にあり、そし
て当該技術分野では周知である。現在、多くの哺乳動物発現ベクターがとりわけノバジェ
ン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社（マジソン、ウィスコンシン州）、ジーンセラピーシステム（Ｇ
ｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）、プロメ
ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マジソン、ウィスコンシン州）、クローンテック（ＣｌｏｎＴｅ
ｃｈ）社（パロ  アルト、カリフォルニア州）およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）（ラ  ジョラ、カリフォルニア）を含む会社から市販されている。
【０７３８】
外因性ペプチドの発現に特に適合した数種の哺乳動物細胞系がある。典型的には哺乳動
物細胞系は不死化した哺乳動物から抽出した腫瘍細胞（すなわちそれらは培養中、本質的
に無限に複製できる）に由来する。これらの細胞系には限定するわけではないがＣＨＯ（
チャイニーズハムスター卵巣、例えばＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）およ
びそれらの変異体、ＮＳ０（マウス  骨髄腫）、ＢＮＫ、ＢＮＫ５７０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ
．ＣＲＬ１０３１４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６３２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（商
標）（不死化ヒト細胞、Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｎ．Ｖ．，ライデン、オランダ）、ＣＯＳ−１
（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）
、ＨＥＫ２９３、マウスＬ細胞、Ｔリンパ球細胞系、ＢＷ５１４７細胞およびＭＤＣＫ（
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  イヌ腎臓）、ＨｅＬａ（ヒト）、Ａ５４９（ヒト肺癌腫）、２
９３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｈａｍら，１９７７，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）、ＢＧＭＫ（バッファローグリーンモンキーの腎臓）、Ｈｅｐ−２（ヒト類表皮咽頭癌腫）、ＬＬＣ−ＭＫ２（アフリカグリーンモンキーの腎臓）、ＭｃＣｏｙ、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト肺粘膜類表皮癌腫管）、ＲＤ（横紋筋肉腫）、Ｖｅｒｏ（アフリカグリーンモンキーの腎臓）、ＨＥＬ（ヒト胚性肺）、ヒト胎児Ｌｕｎｇ−Ｃｈａｎｇ、ＭＲＣ５（ヒト胚性肺）、ＭＲＨＦ（ヒト包皮）、およびＷＩ−３８（ヒト胚性肺）を含む。幾つかの場合では、治療用ペプチドが発現される細胞は処置する患者のものでよく、あるいはそれらは別の関連または非関連哺乳動物に由来するものでもよい。例えば繊維芽細胞は哺乳動物の皮膚組織から単離し、そして培養し、そして生体外で形質転換させることができる。この技術はトランスカリオティック  セラピー（Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から市販されている。ほとんどすべての現在使用されている細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）およびバイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）（ウォーカーズヴィル、メリーランド州）から入手可能である。
【０７３９】
哺乳動物細胞は、当該技術分野で周知な幾つかの技術の１つを使用してＤＮＡを用いて
形質転換させることができる。そのような技術には限定するわけではないが、とりわけリ
ン酸カルシウム形質転換(Chen and Okayama, 1988; Graham and van der Eb, 1973; Cors
aro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603), ジエチルアミノエチル (DEAE)
-デキストラン  トランスフェクション (Fujitaら, 1986; Lopataら, 1984; Seldenら, 1986,), 電気窄孔 (Neumannら, 1982,; Potter, 1988,;Potterら, 1984,; Wong and Neuman, 1982), カチオン性脂質試薬のトランスフェクション (Elroy-Stein and Moss, 1990; Feignerら, 1987; Roseら, 1991; Whittら, 1990; Hawley-Nelsonら, 1993, Focus 15:73; Ciccaroneら, 1993, Focus 15:80), レトロウイルス (Cepkoら, 1984; Miller and  Baltimore, 1986; Pearら, 1993; Austin and Cepko, 1990; Bodineら, 1991; Fekete and Cepko, 1993; Lemischkaら, 1986; Turnerら, 1990; Williamsら, 1984; Miller and Rosm
an, 1989, BioTechniques 7:980-90; Wang and Finer , 1996, Nature Med. 2:714-6), ポリブレン (Chaney ら, 1986; Kawai and Nishizawa, 1984), マイクロインジェクション (Capecchi, 1980), およびプロトプラスト融合 (Rassoulzadegan et al., 1982; Sandri-Goldinら, 1981; Schaffer, 1980)を含む。一般に形質転換技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（２００２、分子生物学の現在のプロトコール、ジョン  ウィリー＆サンズ、ニューヨーク）を参照にされたい。
【０７４０】
最近、昆虫細胞の形質転換で広く知られているバキュロウイルス系が哺乳動物細胞の安
定な形質転換に適合させられた（総説に関しては、Ｋｏａｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｒｅａｙ
，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１７３−１８０、およびそこ
に引用されている参考文献を参照にされたい）。培養した哺乳動物細胞中の組換えペプチ
ドの生産が、例えば米国特許第４，７１３，３３９号、同；第４，７８４，９５０号；同
第４，５７９，８２１号；および同第４，６５６，１３４号明細書に開示されている。セ
ルトレンド（Ｃｅｌｌ  Ｔｒｅｎｄｓ）（ミドルタウン、メリーランド州）を含む数社が
、哺乳動物細胞の形質転換および培養のサービスを提供している。哺乳動物細胞を培養す
る技術は当該技術分野で周知であり、そしてさらにＨａｕｓｅｒら（１９９７，哺乳動物細胞のバイオテクノロジー（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウォルター  デ  グルイャー（Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｅｒ）社、ホーソーン、ニューヨーク州）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーおよびそこに引用されている参考文献）に見いだされる。
【０７４１】
Ｄ．昆虫
昆虫細胞、そして特に培養した昆虫細胞は、シアリル化されることが稀で、そして通常
は結合したさらなるフコース残基を持つかまたは持たないかもしれないマンノース残基を
含んでなるＮ−結合グリカン構造を有するペプチドを発現する。培養した昆虫細胞で生産
されるペプチド上に存在するグリカン構造の型の例は、図６およびそれらのマンノースグリカンに示す。この様な状況では、コアフコースが存在するかもしれないし存在しないかもしれない。もし存在するならば、数個の異なる結合を経てグリカンにリンクしている。
【０７４２】
昆虫細胞中でバキュロウイルスが媒介する発現は、組換えペプチドの生産について特に
よく樹立されるようになった（Ａｌｔｍａｎｎら，１９９９，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１６：１０９−１２３）。ペプチドのホールディングおよび翻訳後プロセッシングに関して、昆虫細胞は唯一、哺乳動物細胞に次ぐ。しかし上記のように昆虫細胞中でのペプチドのＮ−グリコシル化は、多くの観点で哺乳動物細胞でのＮ−グリコシル化とは異なり、特に昆虫細胞は３個だけ、または時にわずか２個のマンノース残基を含むオリゴ糖を含んでなる短縮化されたグリカン構造を頻繁に生成する点で異なる。これらの構造はさらにフコース残基で置換されているかもしれない。
【０７４３】
本発明に従い昆虫細胞で生産されるペプチドは最初に、場合により任意の置換フコース
残基を適切なフコシダーゼ酵素を使用して除去することにより、生体外で改造されて所望のグリコシル化を持つペプチドを生成することができる。ペプチドがフコース残基の除去後に基本的なトリマンノシルコア構造を含んでなる場合、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成するために必要なすべてのことは、適切な糖をトリマンノシルコア構造に生体外で付加することである。ペプチドがフコース残基の除去後のグリカン構造に２個のマンノース残基のみを含む場合、第３のマンノース残基をマンノシルトランスフェラーゼ酵素およびＧＤＰ−マンノースのような適切な供与体分子を使用して加え、そしてその後に適切な残基を加えて所望するグリコシル化を有するペプチドを生成する。場合によっては、単一分岐グリカンもこれらの分子種から生成され得る。
【０７４４】
昆虫細胞を形質転換するためのバキュロウイルスの使用に関するプロトコールは当業者
には周知である。昆虫細胞中でペプチドを発現させるためのバキュロウイルス系の使用に
対する手順を提供する数冊の本が出版された。これらの本には限定するわけではないが、
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（バキュロウイルス発現プロトコール（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３９巻、ヒュマナ出版）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  
ａｌ．（１９９４、バキュロウイルス発現ベクター：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、オックスフォード大学出版）、およびＫｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅ
ｅ（１９９２、バキュロウイルス発現系：ア  ラボラトリーガイド（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ）
、チャップマン＆ホール（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ））を含む。さらにＬｕｃｋｌｏｗ
（１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−５７２）および
Ｍｉｌｌｅｒ（１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：９７−１０１
）のような報告もある。
【０７４５】
外来タンパク質のバキュロウイルス発現用の系に関する多くの特許も発効された。これ
らの特許には限定するわけではないが、米国特許第６，２１０，９６６号明細書（グルタ
ミンを欠き、そしてアンモニウム塩を含む昆虫細胞に関する培養基）、米国特許第６，０
９０，５８４号明細書（組換えペプチドを生産するためのＢＶＡＣｓ（バキュロウイルス
人工染色体）の使用）、米国特許第５，８７１，９８６号明細書（哺乳動物細胞中で組換
え核酸を発現させるためのバキュロウイルスの使用）、米国特許第５，７５９，８０９号
明細書（昆虫細胞中でのペプチドの発現法および昆虫を殺す方法）、米国特許第５，７５
３，２２０号明細書（システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルス、その生産法
、およびそれを使用することによる経済的なペプチドの生産法）、米国特許第５，７５０
，３８３号明細書（バキュロウイルスクローニングシステム）、米国特許第５，７３１，
１８２号明細書（哺乳動物細胞中で組換え核酸を発現させるための非−哺乳動物ＤＮＡウ
イルス）、米国特許第５，７２８，５８０号明細書（昆虫細胞系で単一細胞懸濁液を誘導
する方法および培養基）、米国特許第５，５８３，０２３号明細書（修飾されたバキュロ
ウイルス、その調製法および遺伝子発現ベクターとしてのその応用）、米国特許第５，５
７１，７０９号明細書（修飾されたバキュロウイルスおよびバキュロウイルス発現ベクタ
ー）、米国特許第５，５２１，２９９号明細書（バキュロウイルス感染を検出するための
オリゴヌクレオチド）、米国特許第５，５１６，６５７号明細書（分泌および膜−結合ペ
プチドを発現させるためのバキュロウイルスベクター）、米国特許第５，４７５，０９０
号明細書（宿主昆虫のウイルス感染を強化するペプチドをコードする遺伝子）、米国特許
第５，４７２，８５８号明細書（昆虫の幼虫での組換えペプチドの生産）、米国特許第５
，３４８，８８６号明細書（細菌での組換え真核ウイルスの生産法）、米国特許第５，３
２２，７７４号明細書（組換えバキュロウイルス発現系での原核リーダー配列）、米国特
許第５，２７８，０５０号明細書（昆虫系での組換え遺伝子のプロセッシングおよび分泌
の効率を改善するための方法）、米国特許第５，２４４，８０５号明細書（バキュロウイ
ルス発現ベクター）、米国特許第５，２２９，２９３号明細書（組換えバキュロウイルス
）、米国特許第５，１９４，３７６号明細書（組換えペプチドを高レベルで生産すること
ができるバキュロウイルス発現系）、米国特許第５，１７９，００７号明細書（組換えペ
プチド精製のための方法およびベクター）、米国特許第５，１６９，７８４号明細書（バ
キュロウイルス二重プロモーター発現ベクター）、米国特許第５，１６２，２２２号明細
書（安定に形質転換された昆虫細胞または組換えバキュロウイルスでの組換え核酸の発現
のためのバキュロウイルス初期プロモーターの使用）、米国特許第５，１５５，０３７号
明細書（昆虫系での組換え核酸のプロセッシングおよび分泌の効率を改善するために有用
な昆虫シグナル配列）、米国特許第５，１４７，７８８号明細書（バキュロウイルスベク
ターおよび使用法）、米国特許第５，１１０，７２９号明細書（培養した細胞中でバキュ
ロウイルスベクターを使用してペプチドを生産する方法）、米国特許第５，０７７，２１
４号明細書（安定に形質転換された昆虫細胞で組換え遺伝子を発現するためのバキュロウ
イルス初期プロモーターの使用）、米国特許第５，０２３，３２８号明細書（鱗翅目ＡＫ
Ｈシグナル配列）および米国特許第４，８７９，２３６号および同第４，７４５，０５１
明細書（組換えバキュロウイルス発現ベクターを生産する方法）を含む。前述のすべての
特許は引用により全部、本明細書に編入する。
【０７４６】
現在、幾つかの異なる種起源の昆虫細胞系がペプチド発現に使用され、そしてこれらの
系は当業者には周知である。問題の昆虫細胞系は限定するわけではないが、中でも一般に
双翅目および鱗翅目の昆虫細胞、Ｓｆ９およびそれらの変異体（ヤガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、アメリカヒトリガ（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ  ａｃｒｅａ）
、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  
ｍｏｒｉ）、マラコソマ  ジシットリ（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｄｉｓｓｔｒｉ）、キイ
ロショウジョウバエ属のＫｃ１およびＳＬ２系および蚊を含む。
【０７４７】
Ｅ．植物
ペプチド生産体としての植物細胞は、別口の話題を提示する。植物により生産されるＮ
−結合グリカンはトリマンノシルコア構造を含んでなり、この五糖骨格は図５に示すよう
に数個の異なるさらなる糖を含んでなることができる。例えば例として、トリマンノシル
コア構造はβ１，２結合キシロース残基およびα１，３結合フコース残基に置き換えられ
る。さらに植物細胞はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造も生産することができる。植物細胞中
で生産されたペプチドはしばしば、グリカン構造上のコアα１，３フコースおよびキシロ
ースの存在の結果として高度に抗原性であり、そして末端シアル酸残基の不存在から哺乳
動物に導入された時、血流から迅速に排除される。したがってこれらのペプチドは本明細
書で提供する方法を使用して改造されない限り、それらは一般には哺乳動物の治療薬とし
ては適さないと考えられる。植物細胞中で発現した幾つかのモノクローナル抗体がマウス
で非−免疫原性であることが判明したが、これはグリカン鎖がこれらの抗体中のＦｃ領域
に埋め込まれたので免疫原性ではなかったらしい（Ｃｈａｒｇｅｌｅｇｕｅら，２０００，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．９（３）：１８７−１９４）。
【０７４８】
本明細書で提供する指示に従い、今、植物細胞で生産されたペプチドを生成することが
可能であり、ここでペプチド上に存在する増加した数のグリカン構造が基本的なトリマン
ノシルコア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を含んでなる。これはフコシダーゼを
含む適切なグリコシダーゼの組み合わせを使用して、基本的なトリマンノシルコア構造ま
たはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造に到達するまで生体外でさらなる糖を開裂することにより達成される。これらの開裂反応には、哺乳動物に導入した時に最終的なペプチドの抗原性を縮小させるために、構造からフコースまたはキシロース残基の除去も含むべきである。フコースおよびキシロース残基をトリマンノシルコア構造に付加することを阻害する突然変異を有する植物細胞は、当該技術分野では知られている（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｅｗｅｎら，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １０２：１１０９−１１１８）。フコースおよびキシロースを欠いたグリカンを有するペプチドを生産するためのこれらの細胞の使用は本発明の意図するところである。基本的なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造の生産で、さらなる糖がそれらに結合されて、哺乳動物での治療薬的使用に適する所望のグリコシル化を有するペプチドに達することができる。
【０７４９】
多くの人がトランスジェニック植物は製薬学的ペプチドの発現系として選択されると考
えている。潜在的に植物は組換えペプチドのより廉価な供給源を提供することができる。
植物での組換えペプチドの生産コストは、同じペプチドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産
するコストよりも１０から５０倍低くできると予想された。動物と較べて植物でのコドン
利用頻度にわずかな差異があるものの、これらは組換えＤＮＡ配列を調整することにより
相補できる（Ｋｕｓｎａｄｉら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５６：４７３−４８４；Ｋｈｏｕｄｉら，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１３５−１４３；Ｈｏｏｄら，１９９９，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７を参照されたい）。さらにペプチド合成、分泌および翻訳後修飾は植物のグリコシル化にわずかな差異があるだけで、植物と動物で大変似ている（Ｆｉｓｃｈｅｒら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ  １４：８３−９２を参照にされたい）。次いでトランスジェニック植物からの産物は動物病原体、微生物トキシンおよび発癌性配列の混入も少ないと思われる。
【０７５０】
植物細胞中での組換えペプチドの発現は当該技術分野では周知である。トランスジェニ
ック植物に加えて、ペプチドはトランスジェニック植物細胞培養（Ｌｅｅら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：７８３−７８７）、および組換え植物ウイルスを接種した非−トランスジェニック植物でも生産され得る。植物細胞の遺伝子形質転換に関するプロトコールを記載する数冊の本が出版された：Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９９５、植物への遺伝子転移（Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｐｌａｎｔｓ）、スプリンガー、ニューヨーク）、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ（１９９５、植物細胞の電気穿孔および電気融合プロトコール（Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ヒューマナ出版、トトワ、ニューヨーク）およびＤｒａｐｅｒ（１９８８、植物遺伝子形質転換（Ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、オックスフォード出版、ボストン）。
【０７５１】
現在、組換え遺伝子材料を用いて植物細胞を安定に形質転換させるために、幾つかの方
法が使用されている。これらの方法は限定するわけではないがアグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換(Bechtold and Pelletier, 1998; Escudero and Hohn
, 1997; Hansen and Chilton, 1999; Touraevら, 1997), バイオリスティックス（ミクロプロジェクティル(microprojectiles)） (Finer et al., 1999; Hansen and Chilton, 1999; Shilito, 1999), プロトプラストの電気窄孔 (Frommら, 1985, Ou-Leeら, 1986; Rhodesら, 1988; Saundersら, 1989; Trickら, 1997), ポリエチレン  グリコール処理 (Shiltio, 1999; Trickら, 1997), 植物内  マイクロインジェクション (Leducら, 1996; Zhouら, 1983), 種子  インビビッション (Trickら, 1997), レーザー  ビーム (1996), およびシリコン  カーバイド  ウイスカ (Thompsonら, 1995；米国特許出願第２００２０１０００７７号明細書、引用により全部、本明細書に編入する）を含む。
【０７５２】
多くの種類の植物は、形質転換され、そして外因性ペプチドを発現し易い。本発明の改
造方法で使用されるペプチドを発現するために特に興味深い植物には、限定するわけでは
ないが、Arabidopsis thalliana, ナタネ (Brassica spp.; Ruiz and Blumwald, 2002, P
lanta 214:965-969)), ダイズ (Glycine max), ヒマワリ (Helianthus unnuus), ギニア
アブラヤシ (Elaeis guineeis), アメリカホドイモ (ラッカセイ, Arachis hypogaea; 
Deng et al., 2001, Cell. Res. 11:156-160), ココヤシ (Cocus nucifera), キャスター
(Ricinus communis), ベニバナ (Carthamus tinctorius), カラシナ (Brassica spp. an
d Sinapis alba), コリアンダー, (Coriandrum sativum), カボチャ (Cucurbita maxima;
Spencer and Snow, 2001, Heredity 86(Pt 6): 694-702), 亜麻子／亜麻 (Linum usitat
issimum; Lamblinら, 2001, Physiol Plant 112:223-232), ブラジル  ナッツ (Bertholletia excelsa), ホホバ (Simmondsia chinensis), トウモロコシ (Zea mays; Hoodら, 1999, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147; Hoodら, 1997, Mol. Breed. 3:291-306; Petolinoら, 2000, Transgenic Research 9:1-9), アルファルファ (Khoudiら,1999,Biotechnol. Bioeng. 64:135-143), タバコ (Nicotiana tabacum; Wrightら, Transgenic Res. 10:177-181; Frigerioら, 2000, Plant Physiol. 123:1483-1493; Cramer ら, 1996, Ann. New York Acad. Sci. 792:62-8-71; Cabanes-Macheteauら, 1999,Glycobiology 9:365-372; Ruggieroら, 2000, FEBS Lett. 469:132-1 36), キャノーラ (Baiら, 2001, Biotechnol. Prog. 17:168- 174; Zhangら, 2000, J. Anim. Sci. 78: 2868-2878)), ジャガイモ (Tacketら, 1998, J. Infect. Dis. 182:302-305; Richterら, 2000, Nat. Biotechnol. 18:1167-1171; Chongら, 2000, Transgenic Res. 9:71-78), アルファルファ (Wingdorovitzら, 1999, Virology 255:347-353), エンドウ (Pisum sativum; Perrinら, 2000, Mol. Breed. 6:345-352), コメ (Oryza sativa; Stogerら, 2000, Plant Mol. Biol. 42:583-590), ワタ (Gossypium hirsutum; Kornyeyevら, 2001, Physiol Plant 113:323-331), オオムギ (Hordeum vulgare; Petersenら, 2002, Plant Mol Biol
49:45-58); コムギ (Triticum spp.; Pellegrineschi et al., 2002, Genome 45:421-43
0) およびインゲン (Vicia spp.; Saalbachら, 1994, Mol Gen Genet 242: 226-236)を含む。
【０７５３】
組換え核酸の発現が培養した細胞中ではなく植物全体であることを望む場合、植物細胞
は最初にペプチドをコードするＤＮＡで形質転換され、その後、植物を再生させる。これ
には典型的には各植物種に至適化された組織培養手順が関与する。植物を再生するプロト
コールはすでに多くの種について当該技術分野で周知である。さら他の種に関するプロト
コールは、日常的な実験を使用して当業者により開発され得る。植物の再生に関する手順
を記載する多数の研究用マニュアルが利用可能であり、それらには限定するわけではない
がＳｍｉｔｈ（２０００、植物組織培養：技法および実験（Ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  
ｃｕｌｔｕｒｅ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）、アカデミ
ック出版、サンディエゴ）、Ｂｈｏｊｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｒａｚｄａｎ（１９９６、植物
組織培養：理論および実践（Ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｔｈｅｏｒｙ
ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）、エルセビア  サイエンス出版、アムステルダム）、Ｉｓ
ｌａｍ（１９９６、植物組織培養（Ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、オッ
クスフォード＆ＩＢＨ出版社、ニューデリー、インド）、Ｄｏｄｄｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ（１９９５、植物組織培養における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｌａ
ｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、ニューヨーク；ケンブリッジ大学出版、ケンブ
リッジ、イギリス）、Ｂｈｏｊｗａｎｉ（植物組織培養：応用および限界（Ｐｌａｎｔ  
ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉ
ｏｎｓ）、エルセビア、アムステルダム、１９９０）、Ｔｒｉｇｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｇｒ
ａｙ（２０００、植物組織培養の概念および実験実習（Ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕ
ｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｘｅｒｃｉｓｅｓ）
、ＣＲＣ出版、ボカ  ラトン、フロリダ州）およびＬｉｎｄｓｅｙ（１９９１、植物組織
培養マニュアル：基礎および応用（Ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍａｎ
ｕａｌ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、クルヴァー
アカデミック（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ボストン）を含む。
【０７５４】
植物から組換えペプチドを精製することは潜在的に経費がかさみ、これらの経費を最少
にするために幾つかの系が開発された。１つの方法は合成されるペプチドを種子の内胚乳
に向け、ここからペプチドを容易に抽出することができる（Ｗｒｉｇｈｔら．，２００１，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１０：１７７−１８１，Ｇｕｄａら，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９：２５７−２６２；および米国特許第５．７６７，３７９号明細書、これらは引用により全部、本明細書に編入する）。別の取り組みは組換えペプチドと澱粉、粉または油のような従来の植物産物とを同時抽出することである。油−種子のナタネでは、植物中で発現させた時にオレオシン−ヒュルディン（ｈｕｒｕｄｉｎ）の融合ペプチドは種子の油体に結合し、そして油と一緒に植物の種子から抽出することができる（Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１１６７−１１８０；米国特許第５，６５０，５５４号、同第５，７９２，９２２号、同第５，９４８，６８２号および同第６，２８８，３０４号明細書、ならびに米国特許出願第２００２／００３７３０３号明細書、これらすべてが引用により全部、本明細書に編入される）。この取り組みに関する変更では、オレオシンを外因性の問題の同時発現ペプチドに親和性を有するペプチドに融合させる（米国特許第５，８５６，４５２号明細書、引用により全部、本明細書に編入する）。
【０７５５】
クロロプラストのような植物プラスチド中での組換えペプチドの発現は、原核細胞での
状況と同様、それに結合したグリカン構造を持たないペプチドを生じる。しかしそのよう
なペプチドの収量はこれらの植物細胞オルガネラで発現させた時に格段に大きく、すなわ
ちこの種の発現系は他の系に優る利点を有することができる。外因性ペプチドの高等植物
中のプラスチド発現に関する技術の一般的総説については、Ｈａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｃ
ｋ（２０００，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５４：３０２−
３１０およびそれに引用されている文献）を参照にされたい。プラスチド発現はタバコ（
例えばＳｔａｕｂら，２０００，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３３−３３８を参照にされたい）で特に成功した。
【０７５６】
Ｆ．トランスジェニック動物
動物（例えば哺乳動物）の受精卵への組換えＤＮＡの導入は、トランスジェニック動物
技術で標準的な多数の技術を使用して行うことができる。例えばＨｏｇａｎら，マウス胚の操作；ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８６；および米国特許第５，８１１，６３４号明細書（これは引用により全部、本明細書に編入する）を参照にされたい。最も普通には組換えＤＮＡは前核マイクロインジェクションにより胚に導入されるGordonら, 1980, PNAS 77: 7380-7384; Gordon and Ruddle, 1981, Science 214:1244-1246; Brinsterら, 1981, Cell 27:223-231; Costantini and Lacy, 1981, Nature 294:92-94）。マイクロインジェクションは広範な様々な種に応用可能な利点を有する。着床前の胚もレトロウイルスで形質転換することができる（Jaenisch and Mintz, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 71:1250-1254; Jaenischら, 1976, Hamatol Bluttransfus. 19:341-356; Stuhlmannら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:7151-7155）。レトロウイルスが媒介する形質転換は１コピーの組換え核酸を細胞へ加える利点があるが、高度なモザイク現象を生じる。最も最近では、胚性幹細胞が媒介する技法が使用され（Ｇｏｓｓｌｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３：９０６５−９０６９）、全染色体セグメントの転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３）および生体外受精と組み合わせた配偶子トランスフェクション（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３）も使
用された。これらの技法を開示した研究手順に関する数冊の本が出版された：Ｃｉｄ−Ａ
ｒｒｅｇｕｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｃａａｒａｎｃａ（１９９８，マイクロインジェ
クションおよびトランスジェネシス：方法およびプロトコール（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔ
ｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ）、スプリンガー、ベルリン）、Ｃｌａｒｋｅ（２００２、トランスジェネシ
ス技法：原理およびプロトコール（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ヒューマナ出版、トトワ、ニュ
ージャージー州）およびＰｉｎｋｅｒｔ（１９９４、トランスジェニック動物技法：ア  
ラボラトリーハンドブック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、アカデミック出版、サンディエゴ
）。
【０７５７】
いったん組換えＤＮＡが卵に導入されれば、卵を短時間インキューベーションし、そし
て次いで卵を得た同じ種の偽妊娠動物に移す（Ｈｏｇａｎら，同上）。哺乳動物の場合、１回の実験あたり典型的には１２５個の卵を注入し、そのおよそ３分の２がこの手順で生き残る。２０個の生きている卵を偽妊娠哺乳動物に移し、その４〜１０個が生きている子孫に生育する。典型的には１０〜３０％の子孫（マウスの場合）が組換えＤＮＡを持つ。
【０７５８】
全動物体を本発明のペプチドの発現系として使用することができるが、好適な態様では
外因性ペプチドは動物の産物中に蓄積し、そこから動物を傷つけずに回収できる。好適な
態様では、外因性ペプチドは乳、卵、毛髪、血液および尿に蓄積する。
【０７５９】
組換えペプチドが動物の乳に蓄積する場合、適当な哺乳動物は反芻動物、有蹄動物、家
畜および酪農動物である。特に好適な動物はヤギ、ヒツジ、ラクダ、雌ウシ、ブタ、ウマ
、牡ウシおよびラマである。乳の中に組換えペプチドを蓄積するトランスジェニック雌ウ
シを作出する方法は周知である：Ｎｅｗｔｏｎ（１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ２３１：１５９−１６７）、Ｅｂｅｒｔら（１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８３５−８３８）および米国特許第６，２１０，７３６号、同第５，８４９，９９２号、同第５，８４３，７０５号、同第５，８２７，６９０号、同第６，２２２，０９４号明細書（これらすべては引用により全部、本明細書に編入する）を参照にされたい。所望する組換えペプチドを生産するトランスジェニック哺乳動物の子孫（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、マサチューセッツ州、フラミンガムのＧＴＣバイオセラピューティックス（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）から販売されている。
【０７６０】
組換えペプチドが卵に蓄積される場合、適当な鳥には限定するわけではないがニワトリ
、アヒルおよび七面鳥を含む。他の興味深い動物には限定するわけではないが、鳥類の他
の種、魚、爬虫類および両生類を含む。レトロウイルス形質転換による組換えＤＮＡのニ
ワトリへの導入は、当該技術分野では周知である：Thoravalら. (1995, Transgenic 
Research 4:369-376), Bosselmanら, (1989, Science 243: 533-535), Petropoulosら， (1992, J. Virol. 66: 3391-3397)、米国特許第５，１６２，２１５号明細書（引用により全部、本明細書に編入する）。組換えＤＮＡを用いたニワトリの成功裏の形質転換も達成され、ここでＤＮＡは胚盤葉細胞に導入され、そしてそのようにしてトランスフェクトされた胚盤葉細胞が胚に導入された：Brazolotら. (1991, Mol. Reprod. Dev. 30:304-312), Fraserら. (1993, Int. J. Dev. Biol. 37:381-385), and Petitteら. (1990, Development 108: 185-189)。トランスジェニックニワトリが所望のペプチドを発現するかどうかを評価するために、高処理技法が開発された（Ｈａｒｖｅｙら，２００２，Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８１：２０２−２１２、米国特許第６，４２３，４８８号明細書、引用により全部、本明細書に編入する）。組換えＤＮＡを用いたニワトリのレトロウイルス形質転換を使用して、外因性ベータ−ラクタマーゼがニワトリの卵白中に蓄積した（Ｈａｒｖｅｙら，２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．２０（４）：３９６−３９９）。ニワトリが生産する卵中の外因性ペプチドの生産物は、ジョージア州、アテネのアビジェニックス（ＡｖｉＧｅｎｉｃｓ）から販売されている。
【０７６１】
Ｇ．細菌
細菌で組換え的に発現したペプチドは一般にグリコシル化されていない。しかしペプチ
ドをグリコシル化することができる細菌系は明らかになりつつあり、したがって将来はグ
リコシル化された組換えペプチドを細菌で生産することができるかもしれない。
【０７６２】
多数の細菌発現系が当該技術分野では知られている。好適な細菌種には限定するわけで
はないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含む。
【０７６３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での組換えペプチドの発現は当該技術分野では周知である。大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく発現系に関するプロトコールは、とりわけ米国特許出願第
２００２００６４８３５号明細書、米国特許第６，２４５，５３９号、同第５，６０６，
０３１号、同第５，４２０，０２７号、同第５，１５１，５１１号明細書およびＲＥ３３
，６５３号明細書に見いだされる。細菌を形質転換するための方法には限定するわけでは
ないが、塩化カルシウム（Ｃｏｈｅｎら，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，６９：２１１０−２１１４；Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０；Ｍａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｈｉｇａ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９−１６２）および電気穿孔（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，２００１（同上）に記載されているものを含む。微生物の形質転換および発現系に関する実験室用のプロトコールの総説は、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９８７、バイオテクノロジーに応用される微生物遺伝学：遺伝子転移および操作の原理および技法（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）、クルーム  ヘルム、ロンドン）、Ｐｕａｈｌｅｒ（１９９３、微生物の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、ヴァインヘイム、ニューヨーク）、Ｌｅｅら（１９９９、代謝工学（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、マルセルデッカー、ニューヨーク）、Ａｄｏｌｐｈ（１９９６、微生物のゲノム法（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、ＣＲＣ出版、ボカ  ラトン）、およびＢｉｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｉ（１９９６、非哺乳動物ゲノム分析：実践的指針（Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ）、アカデミック出版、サンディエゴ）を参照にされたい。
【０７６４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのペプチドの発現に関する技術文献の一般的総説については
、Ｂａｌｂａｓ（２００１，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２５１−２６７）を
参照にされたい。今では数社が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｏｓｅｔｔａ（商標）株のよ
うな哺乳動物ペプチドの発現系のために選択された細菌株を提供している（ノバジェン社
、マジソン、ウィスコンシン州；細菌細胞で通常使用されていない真核コドンの強化され
た発現、および強化されたジスルフィド結合の形成を含む）。
【０７６５】
Ｈ．細胞工学
本開示から、細胞により生産される出発原料が均一なほど、より効率的に所望のグリコ
シル化を有する大量のペプチドが生体外で生成されることは明白である。すなわち本明細書で開示する生体外の酵素的反応の出発原料として、均一にグリコシル化されたペプチドを生産するための宿主細胞の遺伝子工学は、ヘテロロガスな組のグリカン構造を結合して有するペプチド出発原料を使用することよりも有意な利点を提供する。本発明で使用するために好適な１つのペプチド出発原料は、基本的なトリマンノシルコア構造のみからなる１次グリカン分子を有するペプチドである。別の好適な出発原料はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４である。改造方法の後、好適なペプチドは所望のグリコシル化、すなわち改善された臨床的効力を有する最大量のペプチドを生じるようになる。しかし他のグリカン出発原料も、例えば高マンノースグリカンは一連のマンノシダーゼを使用して生体外で基本的なトリマンノシルコア構造に容易に減少されるので、本明細書に記載する方法での使用に適する。本明細書のいたるところに記載するように、基本的なトリマンノシルコア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４が生成されるようにすべての過剰な糖部分が開裂可能であるならば、他のグリカン出発原料も使用することができる。このように本発明のペプチドを生産するために、遺伝的に工作した細胞を使用する目的は、出来る限り均一なグリカン構造を結合して有するペプチドを生成することであり、ここでグリカン構造は生体外で改造されて所望のグリコシル化を有するペプチドを生成することができる。これによりこのようなペプチドの生産コストに劇的な減少をもたらす。この方法を使用して生産された糖ペプチドは、大部分が同じＮ−結合グリカン構造を有するので、生産後修飾プロトコールはバッチ毎の一貫性がより高い最終産物を生成するために標準化し、そして至適化することができる。結果として、最終的に完成された−鎖（ｃｈａｉｎ）生成物は、現在入手可能なものよりも異質性が低くなり得る。この生成物は従来技術の生成物よりも改善された生物学的半減期および生物学活性を有する。あるいは所望により本発明は、例えば異なる糖部分の付加をもたらす反応条件を選択することにより、限定され、そして特異的な異質性を導入するために使用することができる。
【０７６６】
好ましくは厳しい要件ではないが、遺伝的に工作した細胞は主に基本的なトリマンノシ
ルコア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４からなるグリカン構造を有するペプチドを生産
する細胞である。最少限、遺伝的に工作された細胞により生産されるこれらの好適な構造
の比率は、改造プロトコールの後に望ましいグリコシル化を有するペプチドを生じるため
に十分でなければならない。
【０７６７】
一般に任意の真核細胞型を修飾して本発明の宿主細胞とすることができる。基本的なト
リマンノシルコア糖ペプチドまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４糖ペプチドの生産をもたらす
酵素活性の適切な付加／削除を同定するために、最初に微生物により生産される内因性お
よび組換え糖ペプチドの両方のグリコシル化パターンを決定する。これは典型的にはグリ
コシルトランスフェラーゼ反応の基質としてトリマンノシル糖ペプチドを使用する酵素活
性の削除、およびより短い鎖を生成するためにより複雑なＮ−結合グリカンを分解する酵
素活性の挿入を伴う。さらに遺伝的に工作された細胞は高マンノースグリカンを生成する
ことができ、これはマンノシダーゼにより開裂されて所望の出発グリカン構造を生成する
ことができる。マンノシダーゼは細胞中、生体内で活性であることができ（すなわち、細胞はそれらを生産するように遺伝的に工作することができる）、あるいはそれらは生産後の反応に生体外で使用することができる。
【０７６８】
発現したペプチドのグリコシル化プロフィールを改変するために、遺伝的に修飾した宿
主細胞に関する技法は周知である。例えばAltmannら. (1999, Glycoconjugate J. 16
:109-123), Ailorら. (2000, Glycobiology 10(8): 837-847), Jarvisら, (In vitrogen Conference, March, 1999, abstract), Hollister and Jarvis, (2001, Glycobiology 11(1): 1-9), and Palacpacら, (1999, PNAS USA 96: 4697), Jarvisら, (1998. Curr. Opin. Biotechnol. 9:528-533), Gerngross（米国特許出願２００２０１３７１３４第号明細書）を参照にされたい、これらすべてが昆虫または植物細胞をグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションすることにより、昆虫または植物発現系を「哺乳動物化する（ｍａｍｍａｌｉａｎｉｚｅ）」ための技術を開示する。
【０７６９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現したペプチドのグリコシル化プロフィールを遺伝的に改
変する技法も存在する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、生体内でオリゴ糖を生産するように、細菌である髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびアゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に由来する種々のグリコシルトランスフェラーゼで工作された（Ｂｅｔｔｌｅｒら，１９９９，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１６：２０５−２１２）。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のβ１，３ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼｌｇｔＡ遺伝子を過剰に発現するように遺伝的に工作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、外因性ラクトースを効率的にグリコシル化する（Ｐｒｉｅｍら，２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：２３５−２４０）。
【０７７０】
真菌細胞も遺伝的に修飾されて外因性のグリコシルトランスフェラーゼを生産した（Ｙ
ｏｓｈｉｄａら，１９９９，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９（１）；５３−５８；Ｋａｌｓｎｅｒら，１９９５，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２：３６０−３７０；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ａｎｄ  Ｅｒｎｓｔ，１９９４，Ｇｅｎｅ  １４５（２）：２９９−３０３；Ｃｈｉｂａら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３０８：４０５−４０９）。
【０７７１】
このように１つの観点では、本発明は細胞により生産される糖ペプチドの比率が基本的
なトリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するように、糖ペプチド群
をグリコシル化する細胞を提供する。好ましくは細胞は基本的なトリマンノシルコアのみ
からなるグリカン構造を有するペプチドを生産する。最少限、基本的なトリマンノシルコ
アまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を有するペプチドの比率は、改造方法後に所望のグ
リコシル化を有するペプチドを生じるために十分である。細胞は１以上のヘテロロガスな
核酸発現単位を導入され、その各々は１以上の問題のペプチドをコードする１以上の核酸
配列を含んでなることができる。問題の糖ペプチドの天然な形態は、１以上の複雑なＮ−
結合グリカンを含んでなることができ、あるいは単に高マンノースグリカンであり得る。
【０７７２】
細胞は任意の型の細胞でよく、そして好ましくは真核細胞である。この細胞はヒト、マ
ウス、ラット、ウサギ、ハムスターのような哺乳動物細胞または他の型の哺乳動物細胞で
よい。細胞が哺乳動物細胞である時、哺乳動物細胞は非−ヒトトランスジェニック哺乳動
物に由来するか、またはその中に含まれ、ここで哺乳動物中の細胞は、所望の糖ペプチド
分子の生産に必要な所望の糖ペプチドおよび種々のグリコシル化およびグリコシダーゼ酵
素をコードする。加えて細胞は真菌細胞、好ましくは酵母細胞でよく、あるいは細胞は昆
虫または植物細胞でよい。同様に細胞が植物細胞である時、植物細胞はトランスジェニッ
ク植物に由来するか、またはその中に含まれ、ここで植物は所望の糖ペプチド分子の生産
に必要な所望の糖ペプチドおよび種々のグリコシル化およびグリコシダーゼ酵素をコード
する。
【０７７３】
いくつかの態様では、宿主細胞は１以上のヘテロロガスなグリコシルトランスフェラー
ゼ酵素および／または１以上のヘテロロガスなグリコシダーゼ酵素を発現する真核細胞で
よく、ここで宿主細胞中での組換え糖ペプチドの発現は、１次グリカン構造としてペプチ
ドに結合した基本的なトリマンノシルコアを有する組換え糖ペプチドの生産をもたらす。
【０７７４】
いくつかの態様では、細胞中で有用なヘテロロガスなグリコシルトランスフェラーゼ酵
素は、例えばＴａｎｉｇｕｃｈｉら．（２００２，グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、スプリンガー、ニューヨーク）で利用可能なグリコシルトランスフェラーゼのリストに含まれる既知のグリコシルトランスフェラーゼ酵素からなる群から選択することができる。
【０７７５】
別の態様では、ヘテロロガスなグリコシラーゼ酵素はマンノシダーゼ１、マンノシダー
ゼ２、マンノシダーゼ３および限定するわけではないが微生物のマンノシダーゼを含む他
のマンノシダーゼからなる群から選択することができる。本発明の方法に有用な酵素に関
するさらなる開示は、本明細書のいたるところに提供している。
【０７７６】
さらに別の態様では、宿主細胞は真核細胞でよく、ここで１以上の内因性グリコシルト
ランスフェラーゼ酵素および／または１以上の内因性グリコシダーゼ酵素は、宿主細胞で
の組換え糖ペプチドの発現が１次グリカン構造として結合した基本的なトリマンノシルコ
アを有する組換え糖ペプチドの生産をもたらすように不活性化されている。
【０７７７】
さらなる態様では、宿主細胞はヘテロロガスなグリコシルトランスフェラーゼ酵素およ
び／またはグリコシダーゼ酵素を発現することができると同時に、１以上の内因性グリコ
シルトランスフェラーゼ酵素および／またはグリコシダーゼ酵素が不活性化されている。
内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはグリコシダーゼ酵素は、限定す
るわけではないがアンチセンス技法および核酸を宿主細胞のゲノムに挿入することが関与
する技法を含む当業者に既知の技法を使用して不活性化することができる。幾つかの態様
では、内因性酵素はＧｎＴ−Ｉからなる群から選択することができ、マンノシダーゼ、キ
シロシルトランスフェラーゼ、コアα１，３フコシルトランスフェラーゼ、セリン／トレ
オニンＯ−マンノシルトランスフェラーゼ等の選択であることができる。
【０７７８】
あるいは、Ｎ−連結グリカンが主にトリマンノシルコア型またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ
４型となるように、天然にペプチドをグリコシル化する発現系を利用することができる。
トリマンノシルコアを生産する細胞型の例は、Ｓｆ９細胞である。他のそのような発現系
は、天然にまたは組換え的に細胞で発現した糖ペプチドを分析し、所望のグリコシル化特
性を現す糖ペプチドを選択することにより同定することができる。本発明は、本発明のペ
プチドを生産するためにありとあらゆるそのような細胞を含むと解釈すべきである。
【０７７９】
Ｖ．改造されたグリカンおよび／または複合糖質化ペプチドの精製
修飾された糖タンパク質が細胞内で生産され、または分泌される場合、第１工程として
特定の屑、宿主細胞、分解したフラグメントを、例えば遠心または超遠心により除去し；
場合によりタンパク質は市販されているタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮すること
ができ、続いてペプチド変異体はイムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換
カラム分画（例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチルもしくは
スルホプロピル基を含むマトリックス）、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ  Ｂｌｕ
ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ、ＷＧＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｔｈｅｒ  
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌまたはプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのカラムクロマトグラフィー、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ−クロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ゲル濾過（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ分子篩またはサイ
ズ−排除クロマトグラフィー）、ペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフ
ィー、およびエタノール、ｐＨまたは硫酸アンモニウム沈殿、膜濾過および種々の技法か
ら選択される１以上の工程により他の不純物から分離することができる。
【０７８０】
培養で生産された修飾ペプチドは通常、細胞、酵素等からの初期の抽出、続いて１以上
の濃縮、塩析、水性イオン−交換またはサイズ−排除クロマトグラフィー工程により単離
される。さらに修飾糖タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより精製するこ
とができる。次いで最終精製工程にＨＰＬＣを使用することができる。
【０７８１】
タンパク質分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビター、例えばフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を前述の任意工程に含めることができ、そして偶発的な
混入物の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。
【０７８２】
別の態様では、本発明の修飾ペプチドを生産する系からの上清を、最初に市販されてい
るタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）超遠心ユニットを使用して濃縮する。濃縮工
程後、濃縮物を適当な精製マトリックスに乗せる。例えば適当なアフィニティーマトリッ
クスは適当な支持体に結合したペプチド用のリガンド、レクチンまたは抗体分子を含んで
なることができる。あるいはアニオン−交換樹脂、例えばペンダントＤＥＡＥ基を有する
マトリックスまたは支持体を使用することができる。適当なマトリックスにはアクリルア
ミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に使用され
ている他の種類のものを含む。あるいはカチオン−交換工程を使用してもよい。適当なカ
チオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでなる種々の不溶性
マトリックスを含む。スルホプロピル基が特に好適である。
【０７８３】
次いで疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有
するシリカゲルを使用した１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用してさらにペプチド変異体
組成物を精製することができる。前述の精製工程の幾つかまたは全ては、種々に組み合わ
せて使用して均一な修飾糖タンパク質を提供することもできる。
【０７８４】
大規模な発酵から得られた本発明の修飾ペプチドは、Ｕｒｄａｌら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４）により開示された方法に類似する方法により精製することができる。この参考文献は調製用ＨＰＬＣカラムで組換えヒトＩＬ−２を精製するために、２つの順次のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を記載する。あるいはアフィニティークロマトグラフィーのような技法を使用して修飾糖タンパク質を精製することができる。
【０７８５】
ＶＩ．好適なペプチドおよび好適なペプチドをコードする核酸
本発明は種々のペプチドおよびタンパク質、および同様な分子またはそれらのフラグメ
ントをコードする単離された核酸を含む。この発明は、発明の方法におけるこれらのペプチドの利用だけに限られるものではなくて、現在得られるあるいは技術的に得られるようになる如何なる総てのペプチドを含むと見なされるべきである。加えて、この発明は、この中に表示したペプチドに対するただ１つの核酸系列やアミノ酸系列を含むものではなくて、それぞれのペプチドの如何なる総ての変異体、同族体、突然変異体等を含むと見なされるべきである。特定のペプチドが、そのペプチド系列において、突然変異またはその他の変性を持つとして同定されたとき、変性や突然変異を同定するアミノ酸の番号付けは、特に述べなければ、成熟したペプチド系列における最初のアミノ酸がアミノ酸  Ｎｏ.１と決められていることに注意しておく。
【０７８６】
好適なペプチドには限定するわけではないが、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−アルファ）、ヒトインターフェロンベータ（ＩＦＮ−ベータ）、ヒト第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩ因子）、ヒト第ＩＸ因子（第ＩＸ因子）、ヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヒト顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、ヒト−アルファ−１プロテアーゼインヒビター（アルファ−１アンチトリプシンまたはアルファ−１−トリプシンインヒビター、Ａ−１−Ｐ１としても知られている）、グルコセレブロシダーゼ、ヒト組織型アクチベーター（ＴＰＡ）、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ヒト第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩ因子）、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ部分に融合した７５ｋＤａ腫瘍壊死因子レセプター（ＥＮＢＲＥＬ（商標）またはＥＴＡＮＥＲＣＥＰＴ（商標）（キメラＴＮＦＲ）として商業的に知られている）、ヒトウロキナーゼ（ウロキナーゼ）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａおよびビトロネクチンアルファｖベータ３レセプターに特異的に結合するヒト／マウスキメラモノクローナル抗体のＦａｂフラグメント（ＲＥＯＰＲＯ（商標）またはＡＢＣＩＸＩＭＡＢ（キメラ抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）として商業的に知られている）、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合するマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（キメラ抗−ＨＥＲ２）として商業的に知られている）、呼吸合胞体ウイルスのＡ抗原部位またはＦタンパク質に特異的に結合するヒト／マウスキメラ抗体（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標）またはＰＡＬＩＶＩＺＵＭＡＢ（キメラ抗−ＲＳＶ）として商業的に知られている）、ヒトＢ−細胞上のＣＤ２０に特異的に結合するキメラヒト／マウスモノクローナル抗体（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）またはＲＩＴＵＸＡＭＡＢ（商標）（キメラ抗−ＣＤ２０）として商業的に知られている）、ヒト組換えＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ）、ヒト腫瘍壊死因子に特異的に結合するキメラヒト／マウスモノクローナル抗体（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）またはＩＮＦＬＩＸＩＭＡＢ（キメラ抗−ＴＮＦ）として商業的に知られている）、ヒトインスリン、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ａｄｗサブタイプ；ＨＢｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、アルファ-ガラクトシダーゼＡ  （ＦａｂｒｙｚｙｍｅＴＭ）、α-イヅロニダーゼ（ＡｌｄｕｒａｚｙｍｅＴＭ），アンチスロンビン（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ，  ＡＴ-ＩＩＩ），ヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン  オメガ等を含む。
【０７８７】
本発明の単離された核酸は、本発明で上に確認した任意のペプチド、およびそれらの任
意の修飾された形態（ヌクレオチド配列が無細胞である時、または細胞に付随する時、ヌ
クレオチド配列をより安定にするＤＮＡまたはＲＮＡの化学的修飾を含む）をコードする
ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含むと解釈するべきである。非限定的な例として、少なくとも
１つのホスホロチオエート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌク
レアーゼに対して強化された耐性を付与することが知られている。修飾オリゴヌクレオチ
ドの具体例には、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖
アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖
間（「骨格」）結合を含むものを含む。さらにモルホリノ骨格構造（米国特許第５，０３
４，５０６号明細書）またはポリアミド骨格構造（Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７）を有するオリゴヌクレオチドも使用することができる。
【０７８８】
ヌクレオチドの化学修飾を使用して、細胞によるヌクレオチド配列の取り込み効率、ま
たは細胞でヌクレオチド配列が発現される効率を強化することもできる。ヌクレオチド配
列の修飾のありとあらゆる組み合わせが本発明では企図されている。
【０７８９】
本発明は本明細書に開示する核酸およびアミノ酸配列のみに限定されると解釈されるべ
きではない。本明細書のいたるところにより詳細に記載するように、いったん本発明を着
手すれば、当業者には本発明のペプチドをコードする他の核酸が本明細書に記載する手順
（例えば部位指向的突然変異誘発法、フレイムシフト突然変異等）、および当該技術分野
で周知の手順に従うことにより得られるのは明らかである
またペプチドのフラグメントをコードする単離された核酸も含み、ここでペプチドのフ
ラグメントはペプチドの所望する生物学的活性を保持している。さらに好適なペプチドを
コードする核酸の例を具体的な配列番号と関連して本明細書に開示するが、本発明は本明
細書に開示する具体的な核酸には限定されることは全くないと解釈すべきである。むしろ
本発明は核酸が本明細書に開示する所望の生物学的活性を有するペプチドをコードするよ
うに、本明細書に開示する配列と十分な同一性の割合を有するありとあらゆる核酸分子を
含むと解釈するべきである。また完全長よりも短い単離された核酸も意図し、ここでそれ
によりコードされるペプチドの生物学的活性は保持されている。１つの核酸ともう１つの
核酸との間の同一性の割合を決定する方法は、任意の特に好適なペプチドの生物学的活性
を決定するためのアッセイとして本明細書のいたるところに開示する。
【０７９０】
また本明細書のいたるところに開示するように、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン＆ウィリー、ニューヨーク）のような当該技術分野で周知な組換えＤＮＡ法を使用して、本発明のペプチドの誘導体、突然変異体または変異体を生成するための多数の他の手順を使用することができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することによりペプチドまたはポリペプチド中にアミノ酸の変化を導入するための手順は当該技術分野では周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、同上）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７、同上）にも記載されている。
【０７９１】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因
子、ＦＳＨ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、Ａ−１−Ｐ１、グルコセレブロシ
ダーゼ、ＴＰＡ、ＩＬ−２、第ＶＩＩＩ因子、キメラＴＮＦＲ、ウロキナーゼ、キメラ抗
−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩａ、キメラ−抗−ＨＥＲ２、キメラ抗−ＲＳＶ、キメラ抗−
ＣＤ２０、ＤＮａｓｅ、キメラ抗−ＴＮＦ、ヒトインスリン、ＨＢｓＡｇおよびＨＧＨを
コードする核酸を含み、ここで標識ペプチドをコードする核酸はそれに共有結合している
。すなわち本発明は、標識ペプチドをコードする核酸配列が本発明のペプチドをコードす
る核酸に共有結合しているキメラ核酸を包含する。そのような標識ペプチドは当該技術分
野では周知であり、そして例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−
ピルベートキナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）
、インフルエンザウイルス赤血球凝集素標識ポリペプチド、フラッグ標識ポリペプチド（
ＦＬＡＧ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ポリペプチド
を含む。しかし本発明は上記に掲載した標識ペプチドをコードする核酸に限定すべきもの
とは全く解釈されない。むしろこれらの標識ペプチドに実質的に類似する様式で機能する
ことができるペプチドをコードする任意の核酸配列を、本発明に含むと解釈すべきである
。
【０７９２】
標識ペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸は、本発明のペプチドを細胞、組織内
に、および／または生物全体（例えば哺乳動物の胚）に局在させ、細胞から分泌された本
発明のペプチドを検出し、そして細胞中でのペプチドの役割（１つまたは複数）を研究す
るために使用することができる。さらに標識ペプチドの付加により「標識」されたペプチ
ドの単離および精製が容易になるので、本発明のペプチドが生産され、そして容易に精製
され得る。
【０７９３】
本発明は以下の好適な単離ペプチドを含む：Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−
ベータ、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＦＳＨ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、
Ａ−１−Ｐ１、グルコセレブロシダーゼ、ＴＰＡ、ＩＬ−２、第ＶＩＩＩ因子、キメラＴ
ＮＦＲ、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、キメラ−抗−ＨＥＲ
２、キメラ抗−ＲＳＶ、キメラ抗−ＣＤ２０、ＤＮａｓｅ、キメラ抗−ＴＮＦ、ヒトイン
スリン、ＨＢｓＡｇ、ＨＧＨ、アルファ-ガラクトシダーゼＡ、α-イヅロニダーゼ，アンチスロンビン  ＩＩＩ，ｈＣＧ、インターフェロン  オメガ等。              。
【０７９４】
本発明は本発明のペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ）の「誘導体」、「突然変
異体」および「変異体」を包含すると解釈され、この誘導体、突然変異体および変異体は
１以上のアミノ酸が改変されている（またはそれをコードするヌクレオチド配列を指す時
は、１以上の塩基対が改変されている）ので、生成するペプチド（またはＤＮＡ）は本明
細書に引用する配列とは同一ではないが、そのペプチドがＧ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−アルファ
、ＩＦＮ−ベータ、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＦＳＨ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ
−ガンマ、Ａ−１−Ｐ１、グルコセレブロシダーゼ、ＴＰＡ、ＩＬ−２、第ＶＩＩＩ因子
、キメラＴＮＦＲ、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、キメラ−
抗−ＨＥＲ２、キメラ抗−ＲＳＶ、キメラ抗−ＣＤ２０、ＤＮａｓｅ、キメラ抗−ＴＮＦ
、ヒトインスリン、ＨＢｓＡｇおよびＨＧＨの生物学的／生化学的特性を有するという点
で本明細書に開示するペプチドと同じ生物学的特性を有する。
【０７９５】
さらにペプチドの長さに関係なく、望ましいペプチドの生物学的活性を保持するペプチ
ドのフラグメントを含む。本発明に有用な任意のペプチドの完全長形態よりも小さいもの
を単離し、そして本明細書に提供するアッセイを使用して単離したどのフラグメントが所
望の生物学的活性を保持するか、したがって本発明に有用なペプチドであるかを決定する
ことは当業者の技術範囲内である。
【０７９６】
本発明のタンパク質の生物学的特性は、炎症の減少、免疫応答の顕在化、血液凝固、造
血産出力の上昇、プロテアーゼ阻害、免疫系の調節、抗原の結合、成長、疾患の処置の軽
減、ＤＮＡ開裂等のような、限定するわけではなく含む本明細書に記載する生物学的アッ
セイおよび環境においてペプチドが機能する能力を含むと解釈されるべきである。
【０７９７】
Ａ．Ｇ−ＣＳＦ
本発明はＧ−ＣＳＦ上のグリカン構造を修飾する方法を包含する。Ｇ−ＣＳＦは活性化
Ｔ−細胞、マクロファージ、内皮細胞およびストロマの繊維芽細胞により生産されるサイ
トカインとして当該技術分野では周知である。Ｇ−ＣＳＦは主に骨髄に作用して炎症性白
血球の生産を増加し、そしてさらに内分泌ホルモンとして機能して炎症機能中に消費され
る好中球の補充を開始する。またＧ−ＣＳＦは化学療法後の骨髄代用に臨床的応用を有す
る。
【０７９８】
改造されたＧ−ＳＣＦペプチドは、骨髄抑制化学療法を受ける非ー脊髄ガン患者のグループから選ばれた患者、導入化学療法や地固め療法を受ける急性骨髄（性）白血病（ＡＭＬ）患者、骨髄移植を受ける非ー脊髄ガン患者、抹消血液前駆細胞の採取を受ける患者、激しい慢性の好中球減少症の患者、そして頑固な好中球減少症および進んだＨＩＶ感染症の患者に対して投与される可能性がある。好ましくは人間の患者である。
【０７９９】
Ｇ−ＣＳＦは哺乳動物、特にヒトにおける治療的応用に重要でしかも有用な化合物であ
ると示されてきたが、組換え細胞からＧ−ＣＳＦを生産するための現在の方法は、比較的
短い生物学的寿命、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能の
損失を有する生成物、及び同じ効果を達成するためにより大量及びより頻繁な投与の両方の必要性の増加をもたらす。
【０８００】
Ｇ−ＣＳＦは単離そしてクローン化され、その核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ配列
番号１および配列番号２（それぞれ図５８Ａおよび５８Ｂ）に示す。本発明はＧ−ＣＳＦ
を、特に有力かつ機能的な生物学的分子として機能するＧ−ＣＳＦの能力に関係するよう
に飾する方法を包含する。当業者は本開示および本明細書の教示をもってすれば、本発明
がＧ−ＣＳＦを修飾するための組成物および方法を提供することを容易に理解するだろう
。
【０８０１】
本発明はさらに当該技術分野で周知なＧ−ＣＳＦ変異体を包含する。例として、しかし
本発明を限定することは全く意味せずに、Ｇ−ＣＳＦ変異体はすでに米国特許第６，１６
６，１８３号明細書に記載され、ここでＧ−ＣＳＦはリシン残基の天然な補体を含んでな
り、そしてさらに１または２個のポリエチレングリコール分子に連結したものが記載され
ている。さらに米国特許第６，００４，５４８号、同第５，５８０，７５５号、同第５，
５８２，８２３号および同第５，６７６，９４１号明細書は、１以上のシステイン残基が
１７、３６、４２、６４および７４位でアラニンあるいはセリンに置き換えられたＧ−Ｃ
ＳＦ変異体を記載する。米国特許第５，４１６，１９５号明細書は、１７位のシステイン
、２７位のアスパラギン酸、および６５および６６位のセリンがそれぞれセリン、セリン
、プロリンおよびプロリンに置き換えられたＧ−ＣＳＦ分子を記載する。別の変異体は当
該技術分野で周知であり、そして例えば米国特許第５，３９９，３４５号明細書に記載さ
れている。
【０８０２】
本発明の修飾されたＧ−ＣＳＦ分子の発現および活性は、当該技術分野で周知な、そし
て例えば米国特許第４，８１０，６４３号明細書に記載されているような方法を使用して
アッセイすることができる。例として活性は放射能−標識チミジンの取り込みアッセイを
使用して測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーに由来するヒトの骨髄
をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅでの密度カットに供し（１．０７７ｇ／ｍｌ、ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、そして低密度細
胞を、１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を含むＩｓｃｏｖｅの培地（ギブ
コ（ＧＩＢＣＯ）、ラジョラ、カリフォルニア州）に懸濁する。約２Ｘ１０４個のヒト骨
髄細胞を対照培地またはＧ−ＣＳＦまたは本発明のいずれかと、９６−ウェル平底プレー
ト中で約３７℃で空気中５％ＣＯ２で約２日間、インキューベーションする。次いでカル
チャーは約４時間、０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（ニューイングランドヌクレ
アー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）で
パルスをかけ、そして取り込みを例えばＶｅｎｔｕａら（１９８３，Ｂｌｏｏｄ  ６１：７８１）に記載されているように測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比べて、３Ｈ−チミジンのヒト骨髄細胞への包含の上昇は、活性なそして能力のあるＧ−ＣＳＦ化合物の指標である。
【０８０３】
Ｂ．ＩＦＮアルファ、ＩＮＦベータおよびＩＦＮオメガ
本発明はさらに、ＩＦＮアルファ、ＩＮＦベータおよびＩＦＮオメガの改造および修飾法を包含する。ＩＦＮアルファは重量が約１８ｋＤａの約２０個のペプチドのファミリーの一部である。ＩＮＦオメガは、構造と機能においてＩＦＮアルファに非常に良く似ている。その処置を効果のないホストにおいてＩＦＮアルファに対する免疫がある時、ＩＮＦオメガは、Ｃ型肝炎ウィルス感染の治療に有効である。ＩＮＦアルファに対する抗体はＩＮＦオメガと交差反応をしない。従って、ＩＮＦアルファの治療がもはや不可能な時Ｃ型肝炎の処置は、ＩＮＦオメガを使って続けられる可能性がある。
【０８０４】
ＩＮＦアルファ、オメガおよびＩＦＮベータは集合的にＩ型インターフェロンとして知られるが、同じ細胞レセプターに結合し、そして類似の応答を誘導する。Ｉ型ＩＦＮは中でも、ウイルス複製を阻害し、ＮＫ細胞の溶解能力を上げ、ＭＨＣ分子の発現を調節し、そして細胞増殖を阻害する。Ｉ型ＩＦＮはウイルス感染、特に肝炎ウイルスの治療として、および多発性硬化症の治療として使用されてきた。
【０８０５】
Ｉ型ＩＦＮの現在の組成物は上記のように、異型の免疫学的応答の調節、および種々の
疾患の治療の両方に有用な化合物である。しかしそれらは天然なグリコシル化の補体を含
んでなる天然なサイトカインと比べて、体内での能力および機能の低下、および限定され
た半減期により阻まれている。
【０８０６】
改造されたインターフェロン-アルファ  ペプチドは、ヘアリー細胞白血病の患者、悪性黒色腫の患者、濾胞性リンパ腫の患者、尖圭コンジローム の患者、エイズ関連のカポジ肉腫の患者、Ｃ型肝炎の患者、Ｂ型肝炎の患者、ヒト乳頭腫ウイルス感染症の患者、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者、慢性期のフィラデルフィア染色体陽性の慢性骨髄性白血病の患者、非ホジキンリンパ腫の患者（ＮＨＬ）、リンパ腫の患者、膀胱癌の患者、及び腎臓癌の患者のグループから選択された患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８０７】
改造されたインターフェロン-ベータ  ペプチドは、多発性硬化症の患者（ＭＳ）、Ｂ型肝炎の患者、Ｃ型肝炎の患者、ヒト乳頭腫ウイルス感染症の患者、乳癌の患者、脳腫瘍の患者、結腸直腸癌の患者、肺線維症の患者、及び関節リウマチの患者のグループから選択された患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８０８】
改造されたインターフェロン-オメガ  ペプチドは、ヘアリー細胞白血病の患者、悪性黒色腫の患者、濾胞性リンパ腫の患者、尖圭コンジローム の患者、エイズ関連のカポジ肉腫の患者、Ｃ型肝炎の患者、Ｂ型肝炎の患者、ヒト乳頭腫ウイルス感染症の患者、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者、慢性期のフィラデルフィア染色体陽性の慢性骨髄性白血病の患者、非ホジキンリンパ腫の患者（ＮＨＬ）、リンパ腫の患者、膀胱癌の患者、及び腎臓癌の患者のグループから選択された患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８０９】
ＩＦＮアルファの原型ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列
番号３および配列番号４（それぞれ図５９Ａおよび５９Ｂ）として説明する。ＩＦＮオメガの原型ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号７４および配列番号７５（それぞれ図５９Ｃおよび５９Ｄ）として説明する。ＩＦＮベータは約２０ｋＤａの単一の遺伝子産物を含んでなり、その核酸およびアミノ酸配列は、本明細書では配列番号５および配列番号６（それぞれ図６０Ａおよび６０Ｂ）として表す。本発明は本明細書のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に限定されない。当業者はＩＦＮアルファの多くの変異体が天然な、および工作された誘導体として両方が存在すると容易に考えるだろう。同様に、ＩＦＮベータはより有利な治療的プロフィールを達成することを試みるために修飾された。修飾されたＩ型ＩＦＮの例は当該技術分野では周知であり（表９を参照にされたい）、そして例えば米国特許第６，３２３，００６号明細書（ここでシステイン−６０がチロンシに置換されている）、米国特許第４，７３７，４６２号、同第４、５８８，５８５号、同第５，５４５，７２３号および同第６，１２７，３３２号明細書（ここで種々のアミノ酸の置換を持つＩＦＮベータが記載されている）に記載されている。さらに米国特許第４，９６６，８４３号、同第５，３７６，５６７号、同第５，７９５，７７９号明細書は、ＩＦＮアルファ−６１およびＩＦＮ−アルファ−７６を記載する。米国特許第４，７４８，２３３号および同第４，６９５，５４３号明細書は、ＩＦＮアルファｇｘ−１を記載し、一方米国特許第４，９７５，２７６号明細書はＩＦＮアルファ５４を記載する。米国特許第４，６９５，６２３号、同第４，８９７，４７１号、同第５，６６１，００９号および同第５，５４１，２９３号明細書はすべて共通ＩＦＮアルファ配列を記載し、提出日までに知られているすべての変異体を表す。このＩ型ＩＦＮおよびその変異体のリストは網羅的であること全く意味せず、当業者は本発明が既知の、または将来見いだされるＩＦＮベータおよびＩＦＮアルファ分子、誘導体および変異体を包含すると容易に理解するだろう。
【０８１０】
【表９】
0005413548.tif 000080
【０８１１】
組換え細胞中のＩＦＮの発現法は周知であり、そして例えば米国特許第４，９６６，８
４３号明細書およびＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン＆ウィリー、ニューヨーク）に記載されている技法を使用して容易に行われる。
【０８１２】
本発明の方法により修飾されたＩ型ＩＦＮの生物学的活性を測定するアッセイは、当業
者には周知である。例えばＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎら（１９８１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７：７５５−７５８）に記載されているアッセイは、細胞群に及ぼすウイルス感染の細胞病理学効果を測定することにより、Ｉ型ＩＦＮの効果を決定するために一般的に使用されている。この方法はＩＦＮ型の生物学的機能をアッセイするために当該技術分野で知られている多くの１つにすぎない。
【０８１３】
Ｃ．第ＶＩＩａ因子
さらに本発明は第ＶＩＩ因子の改造および修飾法を包含する。血液凝固経路は、多くの
出来事（ｅｖｅｎｔ）を含んでなる複雑な反応である。この経路の中間の出来事が第ＶＩ
Ｉ因子であり、これは組織因子およびカルシウムイオンの存在下で第Ｘ因子をＸａ因子に
転換することにより（第ＶＩＩａ因子への活性化で）、血液凝固の外因系経路に参加する
プロ酵素である。次に第Ｘａ因子は、第Ｖａ因子、カルシウムイオンおよびリン脂質の存
在下でプロトロンビンをトロンビンに転換する。第Ｘ因子から第Ｘａ因子への活性化は、
内因系および外因系の血液凝固経路の両方により分けられる（ｓｈａｒｅｄ）出来事であ
り、したがって第ＶＩＩａ因子は第ＶＩＩＩ因子の欠損またはインヒビターを有する患者
の処置に使用することができる。また第ＶＩＩａ因子が内因系の経路にも参加できること
を示唆する証拠もあるので、血液凝固における第ＶＩＩ因子の役割の突出および重要性が
増している。
【０８１４】
第ＶＩＩ因子は約５０ｋＤａの分子量を持つ一本鎖の糖タンパク質である。この状態で
、この因子は血液中を不活性なプロ酵素として循環する。第ＶＩＩ因子のＶＩＩａへの活
性化は、第ＸＩＩａ因子のような数種の血漿プロテアーゼにより触媒され得る。第ＶＩＩ
因子の活性化は、少なくとも１つのジスルフィド結合により一緒に保たれる重鎖および軽
鎖の形成をもたらす。さらに第ＶＩＩａ因子に転換されることができない修飾された第Ｖ
ＩＩ因子分子が記載され、そしてこれらは血液凝固、血栓症等のような場合に抗−凝固薬
として有用である。血液凝固経路における第ＶＩＩ因子の重要性、および上昇または減少
した凝固レベルの両方の処置としての使用を仮定すると、より長い生物学的半減期、上昇
した能力および一般に野生型の第ＶＩＩ因子により似ている治療プロフィールを有する分
子が、健康なヒトで合成され、そして分泌されれば、血液凝固障害の処置に有益でしかも
有用となるだろう。
【０８１５】
改造された第ＶＩＩ因子ペプチドは、出血症状の血友病患者、Ａ型血友病の患者、B 型血友病の患者、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体も持っているＡ型血友病の患者、第ＩＸ因子に対する抗体も持っているＢ型血友病の患者、肝硬変の患者、同所性肝移植の肝硬変患者、上部消化管出血の肝硬変患者、骨髄移植の患者、及び肝臓切除の患者グループから選択された患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８１６】
第ＶＩＩ因子はクローン化そして配列決定され、そして核酸およびアミノ酸配列が本明
細書に配列番号７および配列番号８（それぞ図６１Ａおよび６１Ｂ）として提示されてい
る。本発明は本明細書で説明する第ＶＩＩ因子の核酸およびアミノ酸配列に全く限定され
ないと解釈されるべきである。第ＶＩＩ因子の変異体も例えば米国特許第４，７８４，９
５０号および同第５，５８０，５６０号明細書に記載され、ここでリシン−３８、リシン
−３２、アルギニン−２９０、アルギニン−３４１、イソロイシン−４２、チロシン−２
７８およびチロシン３３２が種々のアミノ酸に置き換えられている。さらに米国特許第５
，８６１，３７４号、同第６，０３９，９４４号、同第５、８３３，９８２号、同第５，
７８８，９６５号、同第６，１８３，７４３号、同第５，９９７，８６４号および同第５
，８１７，７８８号明細書は、第ＶＩＩａ因子の形態に開裂されない第ＶＩＩ因子変異体
を記載する。当業者は、血液凝固経路およびその中での第ＶＩＩ因子の役割については周
知であり、したがって天然に存在するか、または上記のように工作された多くの変異体が
本発明に含まれることを認識するだろう。
【０８１７】
第ＶＩＩ因子の発現および活性の測定法は当該技術分野では周知であり、そして例えば
米国特許第４，７８４，９５０号明細書に記載されている。簡単に説明すると、第ＶＩＩ
因子、またはその変異体の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、
昆虫細胞を含む様々な原核および真核系で、バキュロウイルス発現系を使用して行うこと
ができ、そのすべてが当該技術分野では周知である。
【０８１８】
本発明の方法に従い調製された修飾第ＶＩＩ因子の活性のアッセイは、当該技術分野で
周知な方法を使用して行うことができる。非限定的な例として、Ｑｕｉｃｋら（出血性疾患および血栓症（Ｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、第２版、リート  フェビガー（Ｌｅａｔ  Ｆｅｂｉｇｅｒ）、フィラデルフィア、１９６６）は、本発明の方法に従い調製した第ＶＩＩ因子分子の生物学的活性を測定するために有用な１段階凝固アッセイを記載している。
【０８１９】
Ｄ．第ＩＸ因子
本発明はさらに第ＩＸ因子を改造および／または修飾するための方法を包含する。上記
のように第ＩＸ因子は血液凝固カスケードで活性で（ｖｉｔａｌ）ある。体内での第ＩＸ
因子の欠損は、血友病（Ｂ型）の型の特徴である。この疾患の処置は通常、ヒト血漿タン
パク質の第ＩＸ因子濃縮物の静脈内輸血に限られている。しかし時間および経費の現実的
な欠点に加えて、血液濃縮物の輸血にはウイルス性肝炎、後天的免疫不全症候群の伝播、
または受容者に対する血栓塞栓性疾患の危険性を含む。
【０８２０】
第ＩＸ因子はそれ自体が治療的応用に重要かつ有用な化合物であることが示されたが、
組換え細胞から第ＩＸ因子を生産する現在の方法（米国特許第４，７７０，９９９号明細
書）は、生成物にやや短い生物学的半減期、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコ
シル化パターン、機能損失、同じ効果等を達成するためにより大量かつ頻繁な投与の必要
性の増加をもたらす。
【０８２１】
改造された第ＩＸ因子ペプチドは、出血症状およびＢ型血友病の血友病患者、Ｂ型血友病の患者、Ｂ型血友病で第ＩＸ因子に対する抗体を持つ患者、肝硬変の患者、同所性肝移植の肝硬変患者、上部消化管出血の肝硬変患者、骨髄移植の患者、及び肝臓切除の患者グループから選択された患者に投与される可能性がある。改造された第ＩＸ因子ペプチドはまた同様に、B 型血友病または、先天的な第ＩＸ因子欠損症あるいはクリスマス病の患者の出血症状を制御したり防いだりするのに投与される可能性がある。改造された第ＩＸ因子ペプチドはまた同様に、手術中の患者の出血症状を制御したり防いだりするのに投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。  
【０８２２】
第ＩＸ因子の核酸およびアミノ酸配列は、本明細書では配列番号９および配列番号１０（それぞれ図６２Ａおよび６２Ｂ）に説明する。本発明は本明細書に説明する配列に全く限定されない。第ＩＸ因子の変異体は例えば米国特許第４，７７０，９９９号、同第５，５２１，０７０号明細書（ここでチロシンが第一位でアラニンに置換されている）、米国特許第６，０３７，４５２号（ここで第ＸＩ因子はアルキレンオキシド基に連結している）、および米国特許第６，０４６，３８０号明細書（ここで第ＩＸ因子をコードするＤＮＡが少なくとも１つのスプライス部位で修飾されている）に記載されているように、当該技術分野で周知である。本明細書で示すように第ＩＸ因子の変異体も当該技術分野では周知であり、そして本開示はこれらの既知のまたは将来開発もしくは見いだされる変異体を包含する。
【０８２３】
本発明の方法に従い調製された修飾第ＩＸ因子を活性を測定する方法は、上記の方法を
使用して、またはさらに例えばＢｉｇｇｓ（１９７２，ヒト血液凝固止血および血栓症（
第１版）（Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ
ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、オックスフォード、ブラックウェル、サイエンティ
フィック、第６１４頁）に記載されているような１段階の活性化部分トロンボプラスチン
時間アッセイのような周知方法を使用して行うことができる。簡単に説明すると、本発明
の方法により開発された第ＩＸ分子の生物学的活性をアッセイするために、このアッセイ
は等容量の活性化部分トロンボプラスチン試薬、Ｂ型血友病患者から単離した第ＩＸ因子
欠損血漿を用いて、当該技術分野で周知の滅菌瀉血技法、および標準として正常プール血
清またはサンプルを使用して行うことができる。このアッセイでは１単位の活性を、１ミ
リリットルの正常プール血清に存在する量と定める。さらに正常に対して第ＩＸ因子欠損
患者に由来する血漿の凝固時間を下げる第ＩＸ因子の能力に基づく生物学的活性に関する
アッセイが、例えばＰｒｏｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｒａｐａｐｏｒｔ（１９６１，Ａｍｅｒ．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．３６：２１２）に記載されているように行うことができる。
【０８２４】
Ｅ．ＦＳＨ
本発明はさらＦＳＨを改造および／または修飾する方法を含む。ヒトの生殖機能は部分
的には、共通する９２アミノ酸糖タンパク質アルファサブユニットを有するが、ホルモン
−特異的ベータサブユニットが異なるヘテロ二量体のヒト糖タンパク質ホルモンのファミ
リーにより制御されている。このファミリーには濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成
ホルモン（ＬＨ）、チロトロピンまたは甲状腺−刺激ホルモン（ＴＳＨ）およびヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含む。ヒトＦＳＨおよびＬＨは治療的に使用されて、ヒ
ト女性において生殖に関する様々な代謝的な観点を調節する。例えば尿から部分精製され
たＦＳＨは、無排卵症候群または黄体期欠損の無排卵女性の小胞成熟を刺激するために臨
床的に使用されている。黄体形成ホルモン（ＬＨ）およびＦＳＨは、生体外の受精のために卵胞の生育の刺激に組み合わせて使用されている。生殖サイクルにおけるＦＳＨの役割は十分によく知られているので治療的使用が可能であるが、部分的には天然な供給源からの調製物の異質性および不純さから困難に遭遇した。
【０８２５】
ＦＳＨは生体外の受精および生体内での受精の刺激の両方に価値ある道具であるが、上述のようにその臨床的効力はタンパク質のグリコシル化の一貫性の無さから妨げられている。したがってＦＳＨを改造する方法が生殖科学に大変有益となるのは明らかと思われる。
【０８２６】
改造されたＦＳＨペプチドは、子宮腔内授精（ＩＵＩ）を受ける患者、体外受精（ＩＶＦ）を受ける患者、および不妊症の患者から成るグループから選択された患者に投与される可能性がある。改造されたＦＳＨペプチドはまた同様に、患者の排卵を誘発したり増加させたりすること、患者の卵胞の発達を刺激すること、患者の配偶子形成の卵胞成長を誘発すること、患者の卵胞の発達とそれに続く排卵を刺激したり、誘発したり、増加させること、あるいは患者の不妊症を処置することに投与される可能性がある。好ましくは患者はヒト女性である。改造されたＦＳＨペプチドはまた同様に、下垂体欠陥の患者あるいは思春期の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒト男性である。
【０８２７】
ＦＳＨはクローン化そして配列決定され、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は本明
細書でそれぞれ配列番号１１および配列番号１２（アルファサブユニット）およびそれぞ
れ配列番号１３および配列番号１４（ベータサブユニット）として表す（それぞれ図６３Ａ，６３Ｂ，６３Ｃ）。当業者には本発明が、当該技術分野で周知であるＦＳＨの変異体のように本明細書に表す配列に限定されないと容易に考えるだろう。非限定的例として、米国特許第５，６３９，６４０号明細書は２つの異なるアミノ酸配列を含んでなるベータサブユニットを記載し、そして米国特許第５，３３８，８３５号明細書はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニットに由来する約２７個のアミノ酸のさらなるアミノ酸配列を含んでなるベータサブユニットを記載する。したがって本発明は天然のまたは人の手により工作されたＦＳＨ変異体（すべて当該技術分野では周知である）を含んでなる。
【０８２８】
原核および真核の両方の細胞中でＦＳＨを発現するための方法は当該技術分野では周知
であり、そして技術文献に豊富に記載されている（米国特許第４，８４０，８９６号、同
第４，９２３，８０５号、同第５，１５６，９５７号明細書）。さらに本発明の改造され
たＦＳＨ分子の生物学的活性を評価する方法は当該技術分野では周知であり、そして例え
ば米国特許第４，５８９，４０２号明細書（ここでＦＳＨが受精、卵の生産および妊娠率
に及ぼす効果を測定する方法が、非ヒト霊長類およびヒト個体の両方について記載されて
いる）に記載されている。
【０８２９】
Ｆ．ＥＰＯ
本発明はさらＥＰＯを改造および／または修飾する方法を含んでなる。ＥＰＯは約３４ｋＤａの酸性糖タンパク質であり、そして３つの天然な形態で存在することができる：ア
ルファ、ベータおよびアシアロ。アルファおよびベータ形は炭水化物成分がわずかに異な
るが、同じ能力、生物学的活性および分子量を有する。アシアロ形はアルファまたはベー
タ形であり、末端シアル酸が除去されている。ＥＰＯは身体が健康な状態である時は血漿
中に大変低濃度で存在し、ここで組織は既存の数の赤血球から十分な酸素を受容する。こ
の正常濃度は通常は加齢を通して失われる赤血球細胞の代替を刺激するために十分である
。循環中のエリスロポエチンの量は、循環中の血液細胞による酸素輸送が低下する時の低
酸素の条件下で増加する。低酸素は出血による大量の血液損失、照射に過剰暴露された赤
血球細胞の破壊、高山病または長期の意識不明による酸素取り込みの低下、または様々な
状態の貧血によるより引き起こされ得る。したがってＥＰＯは、照射療法後の赤血球細胞
の補充、貧血および他の生命を脅かす状態に有用な化合物である。
【０８３０】
改造されたＥＰＯペプチドは、貧血症の患者、慢性腎不全(insufficiency)の貧血患者、末期の腎臓病の貧血患者、透析を受ける貧血患者、慢性腎不全(failure)の貧血患者、ジドブジン処置したHIV に感染した貧血患者、非骨髄性癌で化学療法を受ける貧血患者、および心臓以外の血管外の手術を受けることになっている貧血患者、から成る群から選ばれる患者に投与される可能性がある。改造されたＥＰＯペプチドはまた同様に、手術を受ける患者に対して異質遺伝子型輸血の必要性を低減するのに投与される可能性がある。改造されたＥＰＯペプチドはまた同様に、予期された著しい血液の損失で術前の輸血の危険性が高い患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８３１】
種々の疾患および障害から回復することを目的とするＥＰＯの重要性に鑑みて、本発明
は天然な、したがってより効果的なサッカリド成分を持つＥＰＯの生産に有用である。現
在合成されているようにＥＰＯは完全なグリコシル化補体を欠くので、したがって体内で
のその短い半減期により、より頻繁に、そしてより高用量で投与されなければならない。この発明はまた同様に、好ましいグリコ形を最大にすることによって達せられるものに比べて、大きく改善された半減期を持ったＰＥＧ化されたＥＰＯの生成を提供する。
【０８３２】
ＥＰＯはクローン化そして配列決定され、そしてヌクレオチドおよびアミノ酸配列は本
明細書でそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に表す（それぞれ図６４Ａおよび６４Ｂ）。当業者には本明細書で説明する配列がＥＰＯをコードし、そして含んでなる配列の
単なる一例であると容易に理解するだろう。例として、米国特許第６，１８７，５６４号
明細書は２以上のＥＰＯペプチドのアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質を記載し、
米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号明細書は、１０１、１
０３、１０４および１０８位でアミノ酸置換を有する突然変異体ＥＰＯ分子を記載する。
米国特許第５，１０６，９５４号明細書は短縮化されたＥＰＯ分子を記載し、そして米国
特許第５，８８８，７７２号明細書は３３、１３９および１６６位に置換を持つＥＰＯ類
似体を記載する。したがって当業者は本発明が技術文献および当該技術分野で十分に記載
されたＥＰＯおよびＥＰＯ誘導体および変異体を全部、包含すると認識するだろう。
【０８３３】
さらに細胞中でＥＰＯを発現する方法は当該技術分野で周知である。とりわけ米国特許
第４，７０３，００８号、同第５，６８８，６７９号および同第６，３７６，２１８号明
細書に例示されるように、ＥＰＯは原核および真核発現系で発現することができる。ＥＰ
Ｏの生物学的活性を測定する方法も、等しく当該技術分野では周知である。例としてＫｒ
ｙｓｔａｌアッセイ（Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８３，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：６４
９−６６０）を使用して、本発明の方法に従い調製したＥＰＯの活性を測定することがで
きる。簡単に説明すると、アッセイはエリスロポエチンが完全なマウス脾臓細胞に及ぼす
効果を測定する。マウスはエリスロポエチン−反応性赤血球細胞の子孫細胞の生産を刺激
するために、フェニルヒドラジンで処置される。処置後、脾臓を摘出し、完全な脾臓細胞
を単離し、そして様々な量の野生型エリスロポエチンまたは本明細書に記載するエリスロ
ポエチンタンパク質とインキューベーションする。一晩インキューベーションした後、３
Ｈ−チミジンを加え、そして細胞内ＤＮＡの取り込みを測定する。３Ｈ−チミジンの取り込み量は、エリスロポエチンと細胞レセプターとの間の相互作用を介してエリトスポエチンが刺激する血液細胞生産の指標である。本発明のエリスロポエチンのタンパク質濃度ならびに野生型エリスロポエチンの濃度は、当該技術分野で周知の競合的ラジオイムノアッセイ法により定量される。比活性は、ラジオイムノアッセイにより免疫沈降可能なタンパク質として測定された時、ミリグラムで除算されたＫｒｙｓｔａｌアッセイで測定した国際単位として算出する。
【０８３４】
異なるグリコシル化パターンを持つ幾つかの異なる突然変異ＥＰＯが報告された。多くのものは、動物の血流におけるペプチドの半減期に影響することなしに、網状赤血球増加の活性の刺激を改善した。この中に記載されたグリカン改造、グリコＰＥＧ化、そして／あるいはグリコ共役の実施例のいずれにおいても、天然のＥＰＯペプチドの代わりに突然変異ＥＰＯペプチドを使うことが出来ると考えられる。望ましいＥＰＯの突然変異を次の表に掲げるが、表にしたものに限られるものではない（例えば、Ｃｈｅｒｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.２０２：２２５−２２９；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８：５９７−６０１；Ｂｕｒｎｓら，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：４４００−４４０５；米国特許第５６１４１８４号；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＡＮ７６９９３；ＯＣｏｎｎｅｌｌら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５０１０−２５０１８；Ｅｌｌｉｏｔら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：２７０８−２７１２；Ｂｉｏｓｓｅｌら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５９８３−１５９９３  を参照）。  最も好ましいＥＰＯの突然変異は、Ａｒｇ１３９からＡｌａ１３９へ、Ａｒｇ１４３からＡｌａ１４３へ、そしてＬｙｓ１５４からＡｌａ１５４へである。これらの突然変異体を作るのに好ましい天然のＥＰＯは１６５ａａ形であり、図６５に示す。しかしながら、ＥＰＯの他の天然形も同様に使える可能性がある。最終的に、表１０に記した突然変異は、本発明に有効なＥＰＯペプチドを作るために、お互いにあるいは他の突然変異と組み合わすことのできる可能性もある。
【０８３５】
【表１０】
0005413548.tif 000081
【０８３６】
Ｇ．ＧＭ−ＣＳＦ
本発明はＧＭ−ＣＳＦを修飾する方法を包含する。ＧＭ−ＣＳＦは活性化Ｔ−細胞、マ
クロファージ、内皮細胞およびストロマの繊維芽細胞により生産されるサイトカインとし
て当該技術分野では周知である。ＧＭ−ＣＳＦは主に骨髄に作用して炎症性白血球の生産
を増加し、そしてさらに内分泌ホルモンとして機能して炎症機能中に消費される好中球の
補充を開始する。さらにＧＭ−ＣＳＦはマクロファージ活性化因子であり、そしてランゲ
ルハンス細胞の樹状細胞への分化を促進する。Ｇ−ＣＳＦと同様に、ＧＭ−ＣＳＦは化学
療法後の骨髄代用にも臨床的応用を有する。
【０８３７】
Ｇ−ＣＳＦはそれ自体が治療的応用に重要でしかも有用な化合物であると示されてきた
が、組換え細胞からのＧ−ＣＳＦを生産するための現在の方法は比較的短い生物学的寿命
、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能の損失を有する生成
物、および同じ効果等を達成するためにより大量およびより頻繁な投与の両方の必要性の
増加をもたらす。
【０８３８】
改造されたＧ−ＣＳＦペプチドは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）あるいは急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）の患者、末梢血から造血前駆細胞を集めるために“ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ”を受ける患者、自己末梢血液前駆細胞の移植を受ける患者、自己骨髄移植を受ける非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の患者、自己骨髄移植を受けるホジキン病の患者、そして自己骨髄移植を受ける急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者からなるグループから選ばれた患者に投与される可能性がある。改造されたＧ−ＣＳＦペプチドはまた同様に、脊髄の移植を加速する患者、化学療法に続く好中球の回復時間を短くする患者、”leukapheresis” による収集のため末梢血への造血前駆細胞を結集させる患者、あるいは自家骨髄移植や同種骨髄移植（ＢＭＴ）後の骨髄の再構成を促進する患者に投与される可能性がある。改造されたＧ−ＣＳＦペプチドはまた同様に、骨髄移植が失敗したり、骨髄移植が遅れている患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８３９】
ＧＭ−ＣＳＦは単離そしてクローン化され、その核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ配
列番号１７および配列番号１８（それぞれ図６６Ａおよび６６Ｂ）に示す。本発明はＧＭ−ＣＳＦ、特に有力かつ機能的な生物学的分子として機能するＧＭ−ＣＳＦの能力に関係するように修飾する方法を包含する。当業者は本開示および本明細書の技術をもってすれば、本発明がＧＭ−ＣＳＦを修飾するための組成物および方法を提供することを容易に理解するだろう。
【０８４０】
本発明はさらに当該技術分野で周知なＧＭ−ＣＳＦ変異体を包含する。例として、しか
し本発明を限定することは全く意味せずにＧＭ−ＣＳＦ変異体はすでに国際公開第８６／
０６３５８号パンフレットに記載され、ここでタンパク質は選択的な（ａｌｔｅｒｎａｔ
ｉｖｅ）４次構造に修飾されている。さらに米国特許第６，２８７，５５７号明細書は、
遺伝子治療の応用のためにヘルペスウイルスのゲノムに連結されたＧＭ−ＣＳＦの核酸配
列を記載する。さらに欧州特許出願公開第０２８８８０９号明細書（国際公開第８７／０
２０６０号パンフレットに対応する）は、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦを含んでなる融合
タンパク質を報告する。ＩＬ−２配列は、融合タンパク質の酸開裂後に、Ｎ−またはＣ−
末端配列修飾のいずれかを有するＧＭ−ＣＳＦが生成できるように、ＧＭ−ＣＳＦのＮ−
またはＣ−末端配列であることができる。したがってＧＭ−ＣＳＦ誘導体、突然変異体お
よび変異体は当該技術分野では周知であり、そして本発明の方法の中に包含される。
【０８４１】
本発明の修飾されたＧＭ−ＣＳＦ分子の発現および活性は、当該技術分野で周知な、そ
して例えば米国特許第４，８１０，６４３号明細書に記載されているような方法を使用し
てアッセイすることができる。例として活性は放射能−標識チミジン取り込みアッセイを
使用して測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーに由来するヒトの骨髄
をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅでの密度カットに供し（１．０７７ｇ／ｍｌ、ファルマ
シア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、そして低密度細胞を、１０％ウシ胎児血
清、グルタミンおよび抗生物質を含むＩｓｃｏｖｅの培地（ギブコ、ラジョラ、カリフォ
ルニア州）に懸濁する。約２Ｘ１０４個のヒト骨髄細胞を対照培地またはＧＭ−ＣＳＦま
たは本発明のいずれかと、９６−ウェル平底プレート中で約３７℃で空気中５％ＣＯ２で
約２日間、インキューベーションする。次いでカルチャーは約４時間、０．５μＣｉ／ウ
ェルの３Ｈ−チミジン（ニューイングランドヌクレアー、ボストン、マサチューセッツ州
）でパルスをかけ、そして取り込みを例えばＶｅｎｔｕａら（１９８３，Ｂｌｏｏｄ  ６１：７８１）に記載されているように測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比べて、３Ｈ−チミジンのヒト骨髄細胞への包含の上昇は、活性な、そして活力のあるＧＭ−ＣＳＦ化合物の指標である。
【０８４２】
Ｈ．ＩＦＮ−ガンマ
ＩＦＮ−ガンマを修飾および／または改造する方法を包含することは、本発明の目的で
ある。ＩＦＮ−ガンマはＩＩ型インターフェロンとしても知られているが、ＩＦＮアルフ
ァおよびＩＦＮベータとは対照的に、約２１〜２４ｋＤａの２つのサブユニットを含んで
なるホモ二量体糖タンパク質である。サイズの変動は、当該技術分野で知られている種々
の発現系で組換え的に再生した時、通常は複製しない可変性のグリコシル化パターンによ
るものである。ＩＦＮ−ガンマはマクロファージの有力なアクチベーターであり、ＭＨＣ
クラスＩ分子の発現、そして程度は低いがＭＨＣクラスＩＩ分子刺激物を上昇させる。さ
らにＩＦＮ−ガンマはＴ−細胞の分化およびＢ−細胞中でのアイソタイプスイッチを促進
する。ＩＦＮ−ガンマはまた好中球、ＮＫ細胞、および食細胞が媒介する排除を導く抗体
応答の刺激物としてもよく知られている。ＩＦＮ−ガンマは、結核症およびリーシュマニ
アのような細胞内病原体による感染と関連して使用される処置として、および種々の癌お
よび他の新形成のような、顕著な特徴として異常な細胞増殖を伴う状態に有用な抗−増殖
性治療剤としても提案された。
【０８４３】
ＩＦＮ−ガンマは有力な免疫学的活性が証明されたが、ＩＦＮ−ガンマを発現するため
に現在使用されている系に由来するグリコシル化の変動により、治療薬の能力、効力、生
物学的半減期、および他の重要な因子は最善の状態では可変的である。本発明はこの重要
な欠点を正す方法を包含する。
【０８４４】
改造されたインターフェロン-ガンマ  ペプチドは、慢性肉芽腫症の患者、悪性の大理石骨病の患者、肺線維症の患者、結核の患者、クリプトコックス髄膜炎の患者、および肺のトリ型結核菌複合体（ＭＡＣ）感染症の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８４５】
ＩＦＮ−ガンマのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号
１９および配列番号２０に示す（それぞれ図６７Ａおよび６７Ｂ）。本明細書で説明する配列は、本発明を限定するものでは全くないことは容易に理解される。対照的にＩＦＮ−ガンマの変異体、誘導体および突然変異体は当業者には周知である。例として米国特許第６，０８３，７２４号明細書は、組換えトリＩＦＮ−ガンマを記載し、そして米国特許第５，７７０，１９１号明細書は、ヒトＩＦＮ−ガンマのＣ−末端変異体を記載する。さらに米国特許第４，７５８，６５６号明細書は新規ＩＦＮ−ガンマ誘導体および種々の発現
系でそれらを合成する方法を記載する。したがって本発明は本明細書のいたるところに開
示するＩＦＮ−ガンマの配列に限定されず、当該技術分野で周知なすべての誘導体、変異
体、突然変異体等を包含する。
【０８４６】
ＩＦＮ−ガンマの発現系も等しく当該技術分野では周知であり、そして原核および真核
系、ならびに植物および昆虫細胞調製物を含み、その方法は当業者に知られている。例と
して米国特許第４，７５８，６５６号明細書は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でＩＦＮ−ガンマ
誘導体を発現させる系を記載し、一方米国特許第４，８８９，８０３号明細書はチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞およびＳＶ４０プロモーターを使用する発現系を記載する。
【０８４７】
本明細書に開示された方法に従い調製されたＩＦＮ−ガンマの生物学的活性のアッセイ
は、当業者には周知である。ＩＦＮ−ガンマ発現の生物学的アッセイは、例えば米国特許
第５，８０７，７７４号明細書に見いだすことができる。簡単に説明すると、ＩＦＮ−ガ
ンマを、ＩＬ−３，ｃ−ｋｉｔリガンドおよびＩＬ−１、ＩＬ−６またはＧ−ＣＳＦのい
ずれかのようなサイトカインの組み合わせにより刺激したＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞（ウェルあたり１００個の細胞）のカルチャーに加えて、ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の増殖を誘導する。細胞増殖および２次コロニー形成細胞の生成は用量依存的様式で大いに阻害され、５０００Ｕ／ミリリットルのＩＦＮ−ガンマでほぼ完全な阻害が起こる。ＩＦＮ−ガンマの阻害効果に対する確認試験として、対照としてＩＦＮ−ガンマ抗体の添加を行うことができる。
【０８４８】
Ｉ．アルファ−プロテアーゼインヒビター（α−アンチトリプシン）
本発明はさらに、アルファ−アンチトリプシンとしても知られているアルファ−プロテ
アーゼインヒビター（Ａ−Ｉ−ＰＩ、α−１−アンチトリプシンまたはα−１−トリプシ
ンインヒビター）の改造方法を含む。Ａ−Ｉ−ＰＩは５３ｋＤａの分子量を有する糖タン
パク質である。Ａ−Ｉ−ＰＩは内因性のセリンプロテアーゼによる組織破壊の制御に役割
を有し、そして血漿中で最も有名なセリンプロテアーゼインヒビターである。特にＡ−Ｉ
−ＰＩは好中球エラスターゼを含む種々のエラスターゼを阻害する。エラスターゼは組織
を破壊するプロテアーゼであり、そしてその活性が肺組織で調節されない時、特に問題を
生じる。このプロテアーゼは外来タンパク質を分解することにより機能する。しかしＡＰ
Ｉがエラスターゼ活性を調節するために十分な量で存在しない時、エラスターゼは肺組織
を分解する。早晩、この平衡失調が慢性の肺組織傷害および気腫をもたらす。実際に、Ａ
−１−ＰＩの遺伝的欠損は、肺気腫の未成熟な発生を伴うことが示された。Ａ−１−ＰＩ
の補充はこの状態の気腫の治療に成功裏に使用された。さらにＡ−１−ＰＩの欠損は嚢胞
性繊維症および関節炎のような他の疾患の悪化にも関与し、この場合、白血球は感染と戦
うために肺または関節に移動する。
【０８４９】
したがってＡ−１−ＰＩは恐らく、インヒビターとプロテアーゼ（１つまたは複数）、特に好中球エラスターゼとの間の平衡失調が疾患状態の進行を引き起こす疾患を処置する
ために使用できるだろう。抗ウイルス活性もＡ−１−ＰＩに起因した。この観点で本発明
は論理上、肺の空気の永久的な交換に、安全で、効果的で、しかも有力であるＡ−１−Ｐ
Ｉの生産に有用となる。
【０８５０】
改造されたＡ−１−Ｐ１ペプチドは、先天的なアルファ-１-アンチトリプシン欠乏症や気腫の患者、嚢胞性線維症の患者、および悪性の線維症患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８５１】
Ａ−１−ＰＩはクローン化そして配列決定され、そして配列番号２１および配列番号２
２に説明する（それぞれ図６８Ａおよび６８Ｂ）。当業者に理解されるように、Ａ−１−
ＰＩの天然な、および工作された変異体が存在し、そして本発明に包含される。例として
米国特許第５，７２３，３１６号明細書は、３５６〜３６１位にアミノ酸置換を有し、そ
してさらに約３個のアミノ酸のＮ−末端延長を含んでなるＡ−１−ＰＩ誘導体を記載する
。米国特許第５，６７４，７０８号明細書は、１次アミノ酸配列の３５８位にアミノ酸置
換を持つＡ−１−ＰＩ類似体を記載する。当業者は本発明が既知の、または今後見いださ
れるＡ−１−ＰＩ変異体、誘導体および突然変異体を包含すると容易に認識するだろう。
【０８５２】
本発明の方法に従い生産された改造Ａ−１−ＰＩ活性の発現および測定法は当該技術分
野では周知であり、そして例えば米国特許第５，６７４，７０８号および同第５，７２３
，３１６号明細書に記載されている。簡単に説明すると生物学的活性は、例えばＤｅｌＭ
ａｒら，（１９７９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６）に記載されているように、基質Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−−Ａｌａ−−Ｐｒｏ−−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（９０％ＤＭＳＯ中、０．１ｍｌの１０ｍＭ溶液）のキモトリプシンが触媒する加水分解の阻害を測定することにより、アンチキモトリプシン活性に関するアッセイを使用して測定することができる。典型的なキモトリプシンアッセイは、１．０ミリリットル中に：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー、ｐＨ８．３、０．００５（容量／容量）％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ウシ膵臓キモトリプシン（１８キロモル）および本発明のＡ−１−ＰＩを含む。アッセイ混合物を室温で５分間、プレ−インキューベーションし、基質（９０％ＤＭＳＯ中、０．０１ｍｌの１０ｍＭ溶液）を加え、そして残りのキモトリプシン活性を、ｐ−ニトロアニリンの放出により生じる４１０ｎｍでの吸収の変化の割合により決定する。光学的吸収の測定は、温度制御サンプル区画を備えた分光光度計を使用して２５℃で行う。
【０８５３】
Ｊ．グルコセレブロシダーゼ
本明細書に記載する本発明はさらに、グルコセレブロシダーゼを修飾する方法を含む。
グルコセレブロシダーゼは糖脂質であるグルコセレブロシドをグルコースおよびセラミド
へ加水分解することを触媒するリソソームの糖タンパク質酵素である。グルコセレブロシ
ダーゼの変異体は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）およびＣｅｒｅｄａｓｅ（商標）として市
販されており、ゴーシェ病の処置に治療薬として認可されている。Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商
標）は完全なＮ−結合構造を有するグルコセレブロシダーゼの胎盤に由来する形態である
。Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）は４９７アミノ酸長で、ＣＨＯ細胞で発現されたグルコセレ
ブロシダーゼの組換え変異体である。Ｃｅｒｅｚｙｍｅの４Ｎ−結合グリカンはトリマン
ノースコアで終結するように修飾された。
【０８５４】
グルコセレブロシダーゼは現在、組換え哺乳動物細胞培養で生産され、したがってこれ
らの細胞、通常、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはベビーハムスター腎臓細胞のよ
うな齧歯類の細胞のグリコシル化パターンを反映し、これはヒトのグリコシル化パターン
とは劇的に異なり、中でも免疫原性および能力の欠如を導く。
【０８５５】
改造されたグルコセレブロシダーゼは、リソソーム蓄積症の患者、グルコセレブロシダーゼ欠損症の患者、ゴーシェ病 の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８５６】
グルコセレブロシダーゼの核酸およびアミノ酸配列は本明細書で配列番号２３および２
４に説明する（それぞれ図６９Ａおよび６９Ｂ）。しかし当業者には明らかであるように
、本明細書で提示する配列は原型配列であり、そして本発明を限定するものではない。実
際にグルコセレブロシダーゼの変異体は周知であり、そして例えば米国特許第６，０１５
，７０３号明細書に記され、これはグルコセレブロシダーゼ同族体およびその変異体の強
化された生産を記載する。さらに米国特許第６，０８７，１３１号明細書は、別のグルコ
セレブロシダーゼ変異体のクローニングおよびシークエンシングを記載する。既知の、ま
たは将来見いだされるこれらおよび他の誘導体、変異体および突然変異体を包含すること
は本発明の意図するところである。
【０８５７】
標準的な技法を使用したグルコセレブロシダーゼの発現法は周知であり、そして例えば
米国特許第６，０１５，７０３号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調
製されたグルコセレブロシダーゼ分子の生物学的効力のアッセイも同様に当該技術分野で
は周知であり、そして評価のためのマウスのゴーシェ病モデルおよびグルコセレブロシダ
ーゼ治療薬の使用は、例えばＭａｒｓｈａｌｌら，（２００２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１７９）に記載されている。
【０８５８】
Ｋ．ＴＰＡ
本発明はさらに組織−型アクチベーター（ＴＰＡ）の改造方法も包含する。ＴＰＡはプ
ラスミノーゲンを活性化して、フィブリン（血栓のタンパク質物質の主成分）を溶解する
プラスミンを形成する。ＴＰＡ調製物は、心筋梗塞および脳梗塞を引き起こす血栓症の血
栓溶解処置において血栓に対して大変高い選択性を有する血栓溶解剤として開発された。
【０８５９】
さらにフィブリンに対する高い親和性および天然なＴＰＡよりも長い血液中の半減期を
得る目的で、様々な修飾されたＴＰＡが遺伝子工学により生産されてきた。ＴＰＡは、一般に水に溶解することが極端に難しいタンパク質である。特に修飾されたＴＰＡは天然なＴＰＡよりも水に溶解することが難しく、修飾されたＴＰＡの調製を大変難しくしている。このように修飾されたＴＰＡは患者に投与する時に水に溶解することが難しい。しかし修飾されたＴＰＡはフィブリンに対して上昇した親和性および血液中でのより長い半減期のような種々の利点を有する。本発明の目的は修飾されたＴＰＡの可溶性を上昇させることである。
【０８６０】
改造されたＴＰＡペプチドは、急性心筋梗塞の患者や急性虚血性脳卒中の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。改造されたＴＰＡペプチドはまた同様に、急性心筋梗塞に続く心室機能の改善するため、急性心筋梗塞に続く鬱血性の心臓疾患の発生を減らすため、あるいは急性心筋梗塞に関連した死亡率を減らすため、患者に投与される可能性がある。改造されたＴＰＡペプチドはまた同様に、急性虚血性脳卒中に続く神経的な回復を改善するため、あるいは急性虚血性脳卒中に続く無力症や麻痺状態の発生を軽減するため患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８６１】
ＴＰＡの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５および配列番号２６として
本明細書に説明する（それぞれ図７０Ａおよび７０Ｂ）。上記のようにＴＰＡの変異体は
治療的応用に構築され、そして使用されてきた。例えば米国特許第５，７７０，４２５号
明細書はフィブリンドメインの幾つか、またはすべてが削除されたＴＰＡ変異体を記載す
る。さらに米国特許第５，７３６，１３４号明細書は、２７６位のアミノ酸に対する修飾
が開示されているＴＰＡを記載する。当業者は本開示および本明細書の教示をもってすれ
ば、本発明が本明細書に説明するＴＰＡ配列ならびに技術文献に精通した人に周知なそれ
ら変異体を含んでなることを容易に認識するだろう。
【０８６２】
ＴＰＡをコードする核酸配列からのＴＰＡの発現は当該技術分野では周知であり、そし
て例えば米国特許第５，７５３，４８６号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法
に従い調製したＴＰＡ分子の生物学的特性を測定するアッセイも、当該技術分野では同様
に周知である。簡単に説明すると、本明細書のいたるところに開示するように合成したＴ
ＰＡ分子は、Ｃａｒｌｓｅｎら（１９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８：４２８）の方法に従い、飽和濃度のプラスミノーゲンの存在下でフィブリンを溶解するそれらの能力についてアッセイすることができる。生体外の血塊溶解アッセイは、微遠心（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ）分析機を使用した比濁法により組織−型アクチベーターの活性を測定する。トロンビンおよびＴＰＡの混合物をフィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンの混合物中で遠心して血塊形成を開始し、そして引き続き血塊を溶解する。生成した吸収  対  時間のプロフィールを分析してアッセイの終点を決定する。ＴＰＡ変異体の活性はＴＰＡの標準曲線と比較する。アッセイを通じて使用するバッファーは、０．０１（容量／容量）％ＴＷＥＥＮ８０および０．０１（重量／容量）％のアジ化ナトリウムを含有する０．０６Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４である。ヒト  トロンビンは約３３単位／ｍｌの濃度である。フィブリノーゲン（２．０ｍｇ／ｍｌの血塊性タンパク質）を湿った氷上で冷却してフィブロネクチンを沈殿させ、そして次いで重力により濾過する。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは１ｍｇ／ｍｌの濃度である。分析機のチャンバーの温度は３７℃に設定する。ローダーは、標準曲線用のサンプルとして２０マイクロリットルのＴＰＡ（約５００ナノグラム／ミリリットル〜約１．５マイクログラム／ミリリットル）を、または標準曲線の範囲内で溶解を引き起こす濃度で２０マイクロリットルの変異体ＴＰＡを分配するように設定する。第２試薬として２０マイクロリットルのトロンビン、および１次試薬として２００マイクロリットルの５０：１（容量／容量）のフィブリノーゲン：プラスミノーゲン混合物。吸収／時間プログラムは５分間のインキュベーション時間、３４０−ナノメーターのフィルターおよび９０秒間隔の読み取りで使用する。
【０８６３】
Ｌ．ＩＬ−２
本発明はさらにＩＬ−２を改造および修飾する方法を包含する。ＩＬ−２はＴリンパ球
の主要な増殖因子であり、そして細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞およびＮＫ細胞を刺激すること
により液性および細胞性免疫応答を上昇させる。したがってＩＬ−２は腫瘍およびウイル
ス感染に対する防御メカニズムにおいて重要である。ＩＬ−２は転移性メラノーマおよび
腎腺癌に対する治療にも使用され、そして臨床試験で多くの形態の癌に使用されてきた。
さらにＩＬ−２は、ＣＤ４カウントの有意な上昇を導くＨＩＶに感染した患者にも使用さ
れてきた。
【０８６４】
ＩＬ−２が様々な癌およびＡＩＤＳのような生命を脅かす疾患の管理および処置におい
て証明した成功を考慮すれば、本発明の方法はより長い生物学的半減期、上昇した能力、
そして一般に健康なヒトで合成分泌されるような野生型のＩＬ−２に似た治療プロフィー
ルを有するＩＬ−２分子を開発するために有用ということになるだろう。
【０８６５】
改造されたＩＬ−２ペプチドは、転移性腎細胞癌の患者、転移性悪性黒色腫の患者、卵巣癌の患者、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者、非ホジキンリンパ腫 （ＮＨＬ）の患者、ＨＩＶに感染した患者、及びC 型肝炎に感染した患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。改造されたＩＬ−２ペプチドはまた同様に、癌ワクチン補助として患者に投与することが有効であるかもしれない。好ましくは患者はヒトである。
【０８６７】
ＩＬ−２はクローン化そして配列決定され、そして核酸およびアミノ酸配列を本明細書
で配列番号２７および配列番号２８に示す（それぞれ図７１Ａおよび７１Ｂ）。本発明は本明細書に説明するＩＬ−２の核酸およびアミノ酸配列に限定されると全く解釈されるべきではない。ＩＬ−２の変異体は例えば米国特許第６，３４８，１９３号明細書に記載され、ここで８８位のアスパラギンがアルギニンに置換され、そして米国特許第５，２０６，３４４号明細書では、種々のアミノ酸置換を持つＩＬ−２変異体を含んでなるポリマー
が記載されている。本発明はこれらのＩＬ−２変異体および当該技術分野で周知なその他
を包含する。
【０８６８】
ＩＬ−２の発現および活性の測定法は当該技術分野で周知であり、そして例えば米国特
許第５，４１７，９７０号明細書に記載されている。簡単に説明すると、ＩＬ−２または
その変異体の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞を含
む種々の原核および真核系の両方で、バキュロウイルス発現系を使用して行うことができ
、それらすべてが当該技術分野では周知である。
【０８６９】
本発明の方法に従い調製された修飾ＩＬ−２の活性についてのアッセイは以下のように
進めることができる。末梢血リンパ球は、例えばＡ．Ｂｏｙｕｍら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８４，Ｖｏｌ．１０８，ｐａｇｅ８８、アカデミック出版社）に記載された方法により、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージージー州）勾配での遠心により、赤血球および顆粒球から分離することができる。続いてリンパ球は、ＲＲＭＩ１６４０（ギブコ−ＢＲＬ、ラジョラ、カリフォルニア州）に熱（５６℃で１時間）不活性化した１０％ＡＢヒト血清（ＣＴＳパーパン（Ｐｕｒｐａｎ）、トゥールーズ、フランス）、２ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンを加えてなる培養基（完全培地）で約３回洗浄する。
【１０２５】
接着細胞（単核およびマクロファージ）はプラスティックに接着させることにより排除
し、そして残りの細胞を完全培地にミリリットル当たり約５〜１０Ｘ１０５細胞の濃度で
懸濁し、そして平方センチメートルあたり約１〜２Ｘ１０５細胞の密度で培養フラスコに
播種した。次いでフラスコを３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気中で約１時間インキューベーシ
ョンし、その後、非−接着リンパ球は培養フラスコをゆるやかに撹拌した後、吸引により
回収する。
【０８７０】
非−接着リンパ球を１回洗浄し、そしてミリリットルあたり約１０５細胞の濃度で本発
明のＩＬ−２の存在下、完全培地中で約４８時間、上記のインキューベーター中で培養す
る。次いで細胞を１回洗浄する。
【０８７１】
細胞の細胞傷害活性は、Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎら（１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２９：５１−６４；１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ：２２３，７０３−７０７）により記載されているように、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対して耐性のヒトＴリンパ系Ｃ８１６６−４５／Ｃ６３（ＨＴ１細胞）の標的細胞と約４時間接触させた後に評価する。６Ｘ１０５ＨＴ１細胞を約２００μＣｉの５１Ｃｒ（クロム酸ナトリウム、アマーシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州）で、３７℃で約１時間、血清を含まない完全培地中で放射−標識し、次いで数回洗浄する。標的細胞およびエフェクティブ細胞は丸底マイクロタイタープレートに、エフェクティブ細胞  対  標的細胞の比率を変動させながら分配する（５０：１、１０：１、１：１）。マイクロタイタープレートを遠心し、そして上記のようにインキューベーションした後、各ウェルからの上清を回収し、そして放射性をガンマカウンターを使用して測定する。細胞傷害性は死んだ標的細胞により放出された５１Ｃｒの量から決定する。非−特異的細胞傷害性は、エフェクティブ細胞の不存在下で、標的細胞から天然に放出された放射性の量から決定する。
【０８７２】
本方法はエフェクター細胞の細胞傷害性を測定するために当該技術分野で周知な多くの
方法のうちの１つであり、そして本発明を限定するとは解釈すべきではない。
【０８７３】
Ｍ．第ＶＩＩＩ因子
本発明はさらに第ＶＩＩＩ因子の改造および修飾法を包含する。第ＶＩＩおよび第ＩＸ
因子について前に記載したように、第ＶＩＩＩ因子は血液凝固経路の重要な成分である。
ヒト第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子；ＦＶＩＩＩ：Ｃ）は２つのペプチド（８０ｋＤａの
軽鎖分子量、およびグリコシル化状態に依存して９０から２２０ｋＤａまで可変の重鎖分
子量）からなるヒト血漿タンパク質である。これは凝固経路の必須なコファクターであり
、そして第Ｘ因子がその活性状態（第Ｘａ）因子に転換するために必要である。第ＶＩＩ
Ｉ因子は、２０５０ａａペプチドの二量体であるフォン  ビルブラント（ｖｏｎ  Ｗｉｌ
ｌｉｂｒａｎｄ）因子（ａｋａ  ＦＶＩＩＩ：ＲＰ）との非共有複合体として血漿中を循
環する（米国特許第６，３０７，０３２号明細書を参照にされたい）。正常の２０％未満
の第ＶＩＩＩ因子の血液濃度は、血友病Ａと呼ばれる出血性障害を引き起こす。１％未満
の第ＶＩＩＩ因子の血液レべルは、重篤な出血障害を生じ、最も共通する症状である天然
な関節出血を伴う。
【０８７４】
他の血液凝固因子と同様に、第ＶＩＩＩ因子は血友病Ａおよび血友病Ｂのような様々な
出血性障害の処置に相当有力な治療薬である。重鎖のグリコシル化により、組換え細胞か
ら第ＶＩＩＩ因子を調製する現在の方法は、天然な第ＶＩＩＩ因子ほど効果的な生成物を
もたらさない。ヒト血漿からの精製法は効果が低く、そして組換え第ＶＩＩＩ因子を調製
するよりも難しい粗組成物をもたらす。本発明はこの状況の改善を求める。
【０８７５】
改造された第ＶＩＩＩ因子ペプチドは、フォン・ヴィレブランド病の患者、血友病Aの患者、第ＶＩＩＩ因子欠損症の患者、フィブリノゲン欠損症の患者、第ＸＩＩＩ因子欠損症の患者、後天的な 第ＶＩＩＩ因子阻害物質（後天的血友病）を持つ患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。改造された第ＶＩＩＩ因子ペプチドはまた同様に、出血症状を防ぐために患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８７６】
第ＶＩＩＩ因子の核酸およびアミノ酸配列は、本明細書で配列番号２９および配列番号
３０にそれぞれ表す（それぞれ図７２Ａおよび７２Ｂ）。当該技術分野では例えば米国特
許第５，６６８，１０８号明細書に記載されているように（ここで１２４１位のアスパラ
ギン酸がグルタミン酸に置き換えられ、関連する核酸も変わる）、第ＶＩＩＩ因子のおび
ただしい数の変異体が存在する。米国特許第５，１４９，６３７号明細書はグリコシル化
されているか、または非グリコシル化のＣ−末端画分を含んでなる第ＶＩＩＩ因子変異体
を記載し、そして米国特許第５，６６１，００８号明細書はアミノ酸１６４９〜２３３２
に少なくとも３個のアミノ酸残基で連結したアミノ酸１〜７４０を含んでなる第ＶＩＩＩ
因子変異体を記載する。したがって第ＶＩＩＩ因子の変異体、誘導体、修飾および複合体
は当該技術分野では周知であり、そして本発明に包含される。
【０８７７】
第ＶＩＩＩ因子を生産するための発現系は当該技術分野では周知であり、そして米国特
許第５，６３３，１５０号、同第５，８０４，４２０号および同第５，４２２，２５０号
明細書に例示されるように原核および真核細胞を含む。
【０８７８】
本発明の方法に従い合成された第ＶＩＩＩ因子分子の生物学的活性を測定するために、
当業者は第ＶＩＩ因子および第ＩＸ因子を評価するために本明細書に記載したアッセイが
第ＶＩＩＩ因子にも応用可能であることを認識するだろう。
【０８７９】
Ｎ．ウロキナーゼ
本発明はウロキナーゼを改造および／または修飾する方法も含む。ウロキナーゼはプラ
スミノーゲンをプラスミンに活性化するセリンプロテアーゼである。このタンパク質は内
皮および腎臓を含む種々の組織中で合成され、そして尿中に微量分泌される。精製された
ウロキナーゼは２つの活性形態、高分子量形（ＨＵＫ：約５０ｋＤａ）および低分子量形
（ＬＵＫ：約３０ｋＤａ）で存在する。ＬＵＫはＨＵＫから最初の１３５アミノ酸を放出
するリシン３５以降のタンパク質分解により、ＨＵＫから誘導されることが示された。Ｈ
ＵＫまたはＬＵＫは、プロウロキナーゼと呼ばれる１本鎖前駆体の、リシン１５８とイソ
ロイシン１５９との間のタンパク質分解的加水分解によりタンパク質分解的に活性な形に
転換されて、二本鎖の活性化形（これはＨＵＫまたはＬＵＫをいずれかに対応し続ける）を生じるはずであるという従来の見識が維持された。この加水分解的切断から生じるタンパク質分解的に活性なウロキナーゼ種は、１つのジスルフィド結合により一緒に保持される２つのアミノ酸鎖を含む。活性化切断により形成された２つの鎖をＡまたはＡ１鎖（それぞれＨＵＫまたはＬＵＫ）と呼び、そしてＢ鎖は分子のプロテアーゼドメインを含んでなる。
【０８８０】
ウロキナーゼは効果的な血栓溶解剤であることが示されてきた。しかしこれは天然には微量でしか生産されないので、効果的な投薬用量のための酵素のコストは高い。ウロキナーゼは組換え細胞培養で生産され、そしてウロキナーゼをコードするＤＮＡは適当なベクターおよび宿主微生物と一緒に知られている。ウロキナーゼを含んでなる現在の組成物およびウロキナーゼを組換え的に生産する方法はグリコシル化パターンが欠如した産物により阻まれ、そしてウロキナーゼの活性化を取り巻く複雑なタンパク質分解的開裂を考慮すると、この異型のグリコシル化は効果が低く、そして能力が低い生成物を導く。
【０８８１】
改造されたウロキナーゼペプチドは、塞栓症の患者、急性広範肺塞栓症の患者、冠状動脈血栓症の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。改造されたウロキナーゼペプチドはまた同様に、血餅やフィブリンによって妨害される中心静脈カテーテル を含めて、静脈内カテーテル に対する開通性を復旧させるため使われる可能性がある。
【０８８２】
ウロキナーゼの１次アミノ酸鎖をコードするヌクレオチドの配列を、配列番号３３およ
び配列番号３４に表す（それぞれ図７３Ａおよび７３Ｂ）。ウロキナーゼの変異体は当該
技術分野では周知であり、したがって本発明は本明細書に説明する配列に限定されない。
実際に当業者は例えば米国特許第５，２１９，５６９号、同第５，６４８，２５３号およ
び同第４，８９２，８２６号明細書に記載されているウロキナーゼ変異体が機能的部分と
して存在し、したがって本明細書に包含されることを容易に認識するだろう。              
【０８８３】
本発明の方法に従い調製されたウロキナーゼ分子の発現および評価は、同様に当該技術
分野では周知である。非限定的な例として、様々な系でのウロキナーゼの発現が米国特許
第５，２１９，５６９号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調製された
ウロキナーゼの活性および機能性を測定するためアッセイは本明細書で説明され、そして
技術文献を通して記載され、そしていたるところにあまねく記載されている他のプラスミ
ノーゲンのアッセイおよびフィブリン関連アッセイに類似している。本明細書に記載する
ように合成したウロキナーゼ分子の活性を測定するためのアッセイの１例は、例えば１．
２５％アガロース、４．１ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノーゲン、０．３単位／ｍｌのトロン
ビンおよび０．５μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含んでなるフィブリンプ
レートを使用するＰｌｏｕｇら（１９５７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２４：２７８−２８２）に記載されているアッセイであることができる。
【０８８４】
Ｏ．ヒトＤＮａｓｅ
本発明はさらに組換えヒトＤＮａｓｅを改造および／または修飾する方法を包含する。
ヒトＤＮａｓｅＩは治療薬として試験され、そして生体外で嚢胞性線維症の粘液の粘度を低下させることが示された。化膿した粘液は約１０〜１３ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含むと測定され、イオン性ポリマーが気道流体の流動学的特性に影響を及ぼすと予想された。したがってウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡを分解する酵素）が粘液溶解剤として何年も前に試験されたが、抗原性および／または混入プロテアーゼにより誘導される副作用から臨床的実施には入らなかった。組換えヒトＤＮａｓｅは現在、嚢胞性線維症のような疾患の症状を緩和するために治療薬として使用されている。
【０８８５】
改造されたｒＤＮａｓｅペプチドは、嚢胞性線維症の患者に投与される可能性がある。改造されたｒＤＮａｓｅペプチドはまた同様に、肺機能を改善するために嚢胞性線維症の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８８６】
ウシ起源のＤＮａｓｅと同様に、組換えヒトＤＮａｓｅには幾つかの困った問題をかか
え、ほとんどが現在使用されている哺乳動物発現系により伝えられた不適切なグリコシル
化により低下した効力による。本発明はＤＮａｓｅを改造する方法を記載し、上昇した効
力およびより良い治療的結果を導く。
【０８８７】
ヒトＤＮａｓｅのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３９およ
び配列番号４０に提示する（それぞれ図７４Ａおよび図７４Ｂ）。ＤＮａｓｅを含んでな
るペプチドの変異体は当該技術分野では周知である。例として米国特許第６，３４８，３
４３号明細書は１次構造全体にわたり多数のアミノ酸置換を持つヒトＤＮａｓｅを記載す
る。さらに米国特許第６，３９１，６０７号明細書は９、１４、７４、７５および２０５
位に多数のアミノ酸置換を持つＤＮａｓｅの超活性変異体を記載する。この例および当該
技術分野で他の周知の変異体、または将来見いだされる変異体は本発明に包含する。
【０８８８】
ＤＮａｓｅペプチドを生産するための発現系は当業者には周知であり、そして原核およ
び真核系で記載された。例えばＰＣＴ特許出願、国際公開第９０／０７５７２号パンフレ
ットはかなり詳細にこれらの方法を記載する。
【０８８９】
本発明の方法に従い開発したＤＮａｓｅ分子の生物学的活性を測定するアッセイは、当
該技術分野で周知である。例として、しかし本発明を限定するとは全く意味せずに、ヒト
ＤＮａｓｅＩのＤＮＡ−加水分解活性を測定するアッセイを本明細書に提示する。簡単に
説明すると、２種類のプラスミド消化アッセイを使用する。第１アッセイ（「スーパーコ
イル化ＤＮＡ消化アッセイ」）は、スーパーコイル化二本鎖プラスミドＤＮＡの、弛緩し
た（ニック入り）、線状および分解形への転換を測定する。第２アッセイ（「線状ＤＮＡ
消化アッセイ」）は、線状の二本鎖プラスミドＤＮＡの分解形への転換を測定した。具体
的には、本発明の方法に従い調製したＤＮａｓｅを、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１
、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２
、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に、２５マイクログラム／ミリリットルのスーパーコイル化プ
ラスミドＤＮＡまたはＥｃｏＲ  −消化線状化プラスミドＤＮＡのいずれかを含んでなる
１６０マイクロリットルの溶液に加え、そしてサンプルを室温でインキューベーションす
る。様々な時間で、反応混合物のアリコートを取り出し、そして２５ｍＭ  ＥＤＴＡをキ
シレンシアノール、ブロモフェノールブルーおよびグリセロールと一緒に加えることによ
り止める。止めたサンプル中のプラスミドＤＮＡの完全性はアガロースゲルでのサンプル
の電気泳動により分析する。電気泳動後、ゲルはエチジウムブロミドの溶液で染色し、そ
してゲル中のＤＮＡを紫外線光により視覚化する。スーパーコイル形、弛緩形および線形
のプラスミドＤＮＡの相対的量は、ゲルを蛍光造影機で走査し（モレキュラーダイナミッ
クス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）モデル５７５ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ）
、そしてゲルのバンド中の異なる状態に対応するＤＮＡ量を定量することにより決定する
。
【０８９０】
Ｐ．インスリン
本発明はさらにインスリンの改造方法を含む。インスリンは、血中グルコースレベルを
調節するために膵臓のベータ小島細胞がインスリンを生産しないＩ型糖尿病に最も効果的
な処置であることは周知である。糖尿病の系統および非制御血中グルコースには、循環器
系および足の問題、および失明、挙げることはしないが糖尿病の悪化からもたらされるか
、または悪化のいずれかである他の様々な合併症を含む。
【０８９１】
ヒトインスリンのクローニングおよびシークエンシング以前は、ブタのインスリンが糖
尿病の処置に使用された。インスリンは今では組換え的に生産されているが、成熟分子の
短い、５１アミノ酸配列は多数のスルフィド結合を含んでなる複雑な構造である。インス
リンを組換え的に生産する現在の方法は、健康な非−糖尿病個体で生産されるような天然
なタンパク質との類似性を欠く生成物を生じる。本発明はこの弱点を修復することを試み
る。
【０８９２】
改造されたインスリンペプチドは、タイプ１の糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ）の患者、高血糖のコントロールのため基礎的な（長時間作用の）インスリンをひつようとするタイプ２の糖尿病患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。改造されたインスリンペプチドはまた同様に、高血糖のコントロールのために糖尿病患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８９３】
ヒトインスリンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３および配
列番号４４に描かれている（それぞれ図７５Ａおよび７５Ｂ）。インスリンの変異体は当
該技術分野を通して豊富に存在する。米国特許第６，３３７，１９４号明細書はインスリ
ン融合タンパク質同族体を記載し、米国特許第６，３２３，３１１号明細書はジカルボン
酸の環式無水物を含んでなるインスリン誘導体を記載し、そして米国特許第６，２５１，
８５６号明細書は多数のアミノ酸置換および親油性基を含んでなるインスリン誘導体を記
載する。当業者はインスリン誘導体の以下の例が網羅的では全くなく、単に当該技術分野
で周知な誘導体の小さい実例を表すだけであると認識するだろう。したがって本発明は既
知のおよびこれから見いだされるインスリン誘導体を含んでなる。
【０８９４】
インスリンを生産するための発現系は当該技術分野では周知であり、そして例えばＳａ
ｍｂｒｏｏｋら（１９８９、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク）に記載されているような分子生物学的技法を使用して行うことができる。
【０８９５】
本発明の方法に従い調製されたインスリン分子の機能性を測定するアッセイも、当該技
術分野では周知である。例えばグルコース抑制のインビボモデルは、本発明の方法を使用
して合成されたインスリンの生物学的活性を評価するために使用することができる。この
目的に有用であるのはラットモデルである。動物は実験前に一晩絶食させ（１６時間）、
次いでペントバルビタールナトリウムまたはケタミンのような他の適当な麻酔剤を腹腔内
投与することにより麻酔をかける。各動物は特定のインスリン誘導体（２０μｇ／ｍｌ／
ｋｇ）のｉ．ｖ．注射（尾の静脈）を受ける。血液サンプルは頸静脈から注射の１５およ
び５分前、および注射から１５、３０、６０、９０、１２０、１８０および２４０分後に
採血する。血中グルコースレベルは、種々の商業的提供源から入手可能な血液グルコース
モニターで測定する。
【０８９６】
Ｑ．Ｂ型肝炎ワクチン（ＨＢｓＡｇ）
本発明はさらにＢ型肝炎ワクチン（ＨｂｓＡｇまたはＢ型肝炎ｓＡｇ）で使用する抗原
を改造する方法を含んでなる。ＨＢｓＡｇはＢ型肝炎Ｓ−タンパク質の組換え的に生産さ
れる表面抗原であり、そしてＢ型肝炎ウイルス（とりわけ肝硬変および癌腫を含む肝臓疾
患を引き起こす危険なウイルスを増やし、そして世界中で年間に百万人以上の死をもたら
す）に対する免疫応答を誘導するために使用される。現在ＨＢｓＡｇワクチンは防御およ
び中和免疫応答を誘導するために、６カ月間の間隔で３回投与される。
【０８９７】
現在、ＨＢｓＡｇは酵母株で生産され、したがって真菌に天然なグリコシル化パターン
を反映する。本発明はＨＢｓＡｇを改造するための方法を提供し、とりわけ改善された免
疫原性、ウイルスに対して改善された親和性を有する抗体等をもたらす。
【０８９８】
改造されたＨＢｓＡｇペプチドは、Ｂ型肝炎ウィールスによって引き起こされる病気に対する免疫性を与えるために患者に投与される可能性がある。改造されたＨＢｓＡｇペプチドはまた同様に、Ｂ型肝炎ウィールスによって引き起こされる病気に対する免疫性を与えるために透析前の患者や透析患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０８９９】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）に由来するＳ−タンパク質の核酸および１次アミノ酸
鎖配列は、本明細書中に配列番号４５および配列番号４６として説明する（それぞれ図７６Ａおよび７６Ｂ）。ヌクレオチドは１２０３塩基長である。アミノ酸は４００残基長で
ある。最後の２２６アミノ酸残基は小さいＳ−抗原であり、これはグラクソスミスクライ
ン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）のワクチンおよびメルク（Ｍｅｒｃｋ）のワクチ
ンに使用されている。小さいＳ−抗原から上流の５５個のアミノ酸はプレ−Ｓ出発コドン
である。プレＳ＋Ｓ領域は中央Ｓ抗原であり、これはアベンティス  パスツール（Ａｖｅ
ｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ）のワクチンに使用されている。第１出発コドンからプレ−Ｓ
出発コドンまでは残りのＳ−タンパク質を含んでなり、そして大きいＳ−タンパク質と呼
ばれている。これはワクチンに使用されているＨＢｓＡｇの１例であるが、ＧｅｎＢａｎ
ｋ  Ａｃｃ  Ｎｏ．に例示されているように他のサブタイプも周知である：ＡＦ４１５２
２２、ＡＦ４１５２２１、ＡＦ４１５２２０およびＡＦ４１５２１９。本明細書に提示さ
れた配列は単に当該技術分野で知られているＨＢｓＡｇの例である。同様な抗原がＢ型肝
炎ウイルスの他の株から単離され、そしてワクチン候補として抗原性および能力を評価さ
れたかもしれないし、またはされなかったかもしれない。したがって本発明は既知の、ま
たは今後見いだされるＢ型肝炎ワクチンＳ−タンパク質表面抗原を包含する。
【０９００】
発現系でのＨＢｓＡｇの発現は当業者には日常的な手順であり、そして例えば米国特許
第５，８５１，８２３号明細書に記載されている。ワクチンの免疫原性に関するアッセイ
は当該技術分野では周知であり、そして中和抗体を生産するための種々の試験を含んでな
り、そしてＥＬＩＳＡ、中和アッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降等のような技法を
使用する。簡単に説明すると、効果的な抗−ＨＢｓＡｇ抗体を検出するためのサンドイッ
チＥＬＩＳＡが記載されている。Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ  ＨＢｓＡｇアッセイ（アベンティ
ス  ベーリング（Ｂｅｈｒｉｎｇ）、キングオブプルシア、ペンシルバニア州）をそのよ
うな方法に使用する。ウェルは抗−ＨＢｓでコートされる。血清血漿または精製したタン
パク質および適切な対照をウェルに加え、そしてインキューベーションする。洗浄後、Ｈ
ＢｓＡｇに対するペルオキシダーゼ−標識抗体を残りの抗原決定基と反応させる。非結合
酵素−結合抗体を洗浄により除き、そして固体相上の酵素活性を当該技術分野で周知な方
法により測定する。過酸化水素および発色源の酵素的に触媒される反応は、希釈した硫酸
を加えることにより止める。色の強度はサンプルのＨＢｓＡｇ濃度に比例し、そして未知
のサンプルの色の強度は、付随する負および正の対照血清の色の強度と分光的に比較する
ことにより得られる。
【０９０１】
Ｒ．ヒト成長ホルモン
本発明はさらにヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の改造方法を包含する。ヒト下垂体で分泌
されるＨＧＨのアイソフォームは、１９１個のアミノ酸からなり、そして約２１，５００
の分子量を有する。胎盤で作られるＨＧＨのアイソフォームはグリコシル化形である。Ｈ
ＧＨは、とりわけ一次成長（ｌｉｎｅａｒ  ｇｒｏｗｔｈ）（体細胞発生）、哺乳期、マ
クロファージの活性化およびインスリン様および糖尿病原性効果を含む正常なヒトの成長および発生の調節に大いに関与している。
【０９０２】
ＨＧＨは複雑なホルモンであり、そしてその効果は種々の細胞レセプターとの相互作用
の結果として変動する。ＨＧＨを含んでなる組成物は臨床的な状況、特に萎縮発育症で使
用されてきたが、効力は組換え的に生産されるＨＧＨのグリコシル化をしないことによって制限されている。
【０９０３】
改造されたＨＧＨペプチドは、成長ホルモン欠乏症の患者、ターナー症候群の患者、十分な “endogenouse” 成長ホルモン分泌不足による成長障害の患者、プラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）による成長障害の患者、慢性腎不全に関連した成長障害の患者、及びＡＩＤＳ関連の消耗や悪液質の患者に投与される可能性がある。改造されたＨＧＨペプチドはまた同様に、小人症の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９０４】
ＨＧＨの核酸およびアミノ酸配列は、本明細書で配列番号４７および配列番号４８とし
ていたるところに説明する（それぞれ図７７Ａおよび７７Ｂ）。当業者はＨＧＨの変異体
、誘導体および突然変異体が周知であることを認識している。例は１０、１４、１８、２
１、１６７、１７１、１７４、１７６および１７９位のアミノ酸残基が置換されている米
国特許第６，１４３，５２３号明細書に見いだすことができ、そして米国特許第５，９６
２，４１１号明細書はＨＧＨのスプライス変異体を記載する。本発明は、当該技術分野で
知られている、またはこれから見いだされるこのようなＨＧＨ変異体を包含する。
【０９０５】
組換え細胞中でのＨＧＨの発現法は、例えば米国特許第５，７９５，７４５号明細書に
記載されている。とりわけ原核、真核、昆虫細胞系、植物、および生体外翻訳系でのＨＧＨの発現法は、当該技術分野では周知である。
【０９０６】
本発明の方法を使用して生産したＨＧＨ分子は、活性について当業者に知られてる様々
な方法を使用してアッセイすることができる。例えば米国特許第５，７３４  ０２４号明
細書は、発現したＨＧＨの生物学的機能を測定する方法を記載する。
【０９０７】
Ｓ．アンチトロンビン  ＩＩＩ
アンチトロンビン  （ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ，ＡＴＩＩＩ）は、血液中の凝固カスケイドの強力な抑制剤である。トロンビンおよびその他の凝血促進因子（例えば、Ｘａ因子）の作用を抑制するのは、非ビタミンＫ−依存プロテアーゼである。先天的なアンチトロンビンＩＩＩ欠乏症は、個々が１コピーの欠陥遺伝子を受け継ぐ常染色体優性疾患である。この病気は、典型的に若年成人期に臨床症状に発症するが、静脈血栓症や動脈血栓症の危険性が高くなる。激しい先天的なアンチトロンビンＩＩＩ欠乏症は、個々が２つの欠陥遺伝子を受け継ぐのであるが、典型的に幼児期に知られる血栓症発生の増加と関連した常染色体劣性形態である。後天的なアンチトロンビンＩＩＩ欠乏症は、凝固系の不適当な活性化が存在する状況で最も普通に見られる。後天的なアンチトロンビンＩＩＩ欠乏症を結果として生じる普通の病気には、播種性血管内凝固症候群、内皮の損傷による微小血管症性溶血性貧血（すなわち、溶血性尿毒症症候群）および骨髄移植を受ける患者に見られる肝内性肝静脈閉塞症（ＶＯＤ）が含まれる。ＡＴＩＩＩ欠乏症は、ＡＴＩＩＩ濃縮物 の注入によって急激に直される可能性がある。
【０９０７】
改造されたＡＴ−ＩＩＩペプチドは、外科手術あるいは産科手術に関連した遺伝性のＡＴＩＩＩ欠乏症の患者、血栓塞栓症のＡＴＩＩＩ欠乏症患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９０８】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ-ＩＩＩ）は、分子量５８，０００のα２−グリコタンパクである。それはＴｈｒｏｍｂａｔｅ  ＩＩＩＴＭ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．，ＷｅｓｔＨａｖｅｎ，ＣＴ）として市販されている。ヒト  アンチトロンビンＩＩＩの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ図７８Ａ（配列番号６３）と７８Ｂ（配列番号６４）に示す。
【０９０９】
アンチトロンビンＩＩＩの作り方は、当業者に良く知られている。例えば、刊行された核酸およびアミノ酸配列は、ヒト  アンチトロンビンＩＩＩ（米国特許第４，５１７，２９４号  参照）とヒト  アンチトロンビンＩＩＩ（米国特許第５，４２０，２５２号；５，６１８，７１３号；５，７００，６６３号参照）の突然変異体に対して得られる。本発明の方法は、コード化したいずれのアミノ酸配列およびいずれの核酸配列にも使用される可能性があるが、これらの配列に限られるものではない。組み換え型アンチトロンビンＩＩＩを生産する模範的な方法は、当業者に良く知られており、幾つかのものは米国特許第５，４２０，２５２号；５，８４３，７０５号；６，４４１，１４５号；５，９９４，６２８号に記されている。組み換え型アンチトロンビンＩＩＩを精製する模範的な方法は、米国特許第５，９８９，５９３号；６，２６８，４８７号；６，３９５，８８８号；６，３９５８８１号；６，４５１，９７８号；および第６，５１８，４０６号に記されている。
【０９１０】
組み換え型アンチトロンビンＩＩＩの多くの用途がある。アンチトロンビンＩＩＩは、外科手術中の抗凝血剤として（米国特許第５，２５２，５５７号；５，１８２，２５９号）、血栓症を抑制する薬学的準備の一環として（米国特許第５，５６５，４７１号；６，００１，８２０号）、そして細胞移植の副作用を軽減するために（米国特許第６，３８７，３６６号）使うことができる。さらに、アンチトロンビンＩＩＩの準備は、胎盤の血流を増加させるため（米国特許第５，８８８，９６４号）、受精を抑制するため（米国特許第５，５４５，６１５号）、ぜんそくの治療のため（米国特許第６，３５５，６２６号）、そして関節炎（ 米国特許第５，２５２，５５７号）やその他の炎症過程（米国特許第６，３９９，５７２号）の治療のために役立つ可能性がある。アンチトロンビンＩＩＩはまた同様に、医薬品として（米国特許第５，０８４，２７３号；５，８６６，１２２号；６，３９９，５７２号；６，１５６，７３１号；６，５１４，９４０号）あるいは遺伝子治療の方法論を使って（米国特許第６，４１０，０１５号）投与される可能性がある。アンチトロンビンＩＩＩを構成する組成は、組織接着剤（米国特許第６，５００，４２７号）あるいは患者に挿入される医療機器の潤滑剤（米国特許第６，３９１，８３２号）として役立つ。アンチトロンビンＩＩＩはまた同様に、末梢血管のステント を覆うため（米国特許第６，３５５，０５５号；第６，２４０，６１６号；第５，９８５，３０７号；第５，６８５，８４７号；第５，２２２，９７１号）、眼球移植（米国特許第５，９４４，７５３号）および一般的に人工器官を（米国特許第６，５０３，５５６号；第６，４９１，９６５号；第６，４５１，３７３号）を  コートするために利用できる。アンチトロンビンＩＩＩはまた同様に、患者の内出血の場所を決める方法（米国特許第６，３１４，３１４号）および患者の止血機能障害を決定する方法（米国特許第６，４２９，０１７号）に利用できる。
【０９１１】
Ｔ．ヒト絨毛膜ゴナドトロピン
ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、アルファ  サブユニットとベータ  サブユニットから成るグリコタンパクである。ＨＣＧは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）と卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）という2つのその他のゴナドトロピン、そして甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に密接に関連している。これら3つのホルモンは総てグリコタンパクホルモンである。これらの種々のグリコタンパクホルモンのアルファ  サブユニットは、構造的に非常に良く似ているが、ベータ  サブユニットはアミノ酸配列が異なっている。
【０９１２】
ヒト絨毛膜ゴナドトロピンα-サブユニットの核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれ図７９Ａ（配列番号６９）と７９Ｂ（配列番号７０）に示す。ヒト絨毛膜ゴナドトロピンβ-サブユニットの核酸配列とアミノ酸配列を、それぞれ図７９Ｃ（配列番号７１）と７９Ｄ（配列番号７２）に示す。
【０９１３】
ヒト絨毛膜ゴナドトロピンは、排卵を促進するための不妊症治療あるいは自分自身で排卵しない女性の卵巣から卵を放出させる不妊症治療に使われる。ヒト絨毛膜ゴナドトロピンはまた同様に、停留睾丸あるいは未発育睾丸の治療に若い男性に与えられる。それは男性のテストステロンの生成を刺激するのに役に立つ。何人かの医師はまた同様に、ヒト絨毛膜ゴナドトロピンは睾丸機能不全あるいは性欲の欠乏の男性に、そして男性「更年期障害」の治療に処方している。
【０９１４】
改造されたｈＣＧペプチドは、生殖介助術（ＡＲＴ）の患者、体外受精（ＩＶＦ）の患者、胚移植の患者、不妊患者、解剖学的障害によらない思春期前の”cryptoorchidism”の患者、そして低ゴナドトロピン性性機能低下症の男性患者のグループから選択された患者に投与される可能性がある。改造されたｈＣＧペプチドはまた同様に、最終的な卵胞の成熟を誘起するためや不妊女性患者の初期の黄体形成を誘起するために投与される可能性がある。ここで、不妊女性患者は下垂体の脱感作や卵胞刺激ホルモンでの治療前の患者である。改造されたｈＣＧペプチドはまた同様に、無排卵性不妊患者の排卵や妊娠を誘起するために投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９１５】
ヒト絨毛膜ゴナドトロピンの生成法は、技術的に良く知られている。ヘテロ二量体ｈＣＧは、組み換えタンパクの工業生産で最近使われる多くの発現系の1つの中で、組み換え技術によって作られることが可能である。組換え型ｈＣＧを作る１つの方法は、米国特許第５，６３９，６３９号に記されている。同じ細胞中に両方のサブユニットを発現することによって組換え型ヘテロ二量体タンパクを作る方法は、一般に技術的に良く知られていて、幾つかの方法は米国特許第５，６４３，７４５号（糸状菌での発現）、５，９８５，６１１号そして６，０８７，１２９号（分泌細胞での発現）に記述されている。もう1つの方法として、各サブユニットは、細胞中で別個に発現させることができて、２つのサブユニットは後に生体外で組立ててヘテロ二量体にする。
【０９１６】
ヒト絨毛膜ゴナドトロピンを使う方法は数多く、技術的に良く知られている。普通、ｈＣＧは、哺乳動物における排卵を誘発させたり同期させたりするのに使われる（米国特許第６，４８９，２８８号、５，５８９，４５７号、５，５３２，１５５号、４，１９６，１２３号、４，０６２，９４２号、４，８４５，０７７号参照）。さらにｈＣＧは、妊娠テストや特定の免疫テストに使うことができる（米国特許第３，９９１，１７５号、４，００３，９８８号、４，０７１，３１４号、４，０８８，７４９号参照）。ｈＣＧはまた同様に、避妊用のワクチンに使うことができる（米国特許第４，１６１，５１９号、第４，０８８，７４９号参照）。さらにｈＣＧは、高齢者の前立腺肥大症（米国特許第５，６１０，１３６号参照）や中枢神経系疾患（米国特許第４，７９１，０９９号参照）のような高齢化で変化したホルモンバランスに関係した病状を治療するのに使われ得る。
【０９１７】
もう1つの方法として、ｈＣＧは、ｈＣＧあるいはそのサブユニットの１つを発現する癌を発見したり治療したりするのに使われ得る。ｈＣＧ発現腫瘍は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌やカルポジ肉腫のような神経芽細胞腫が含まれるが、これらに限られるものではない。
【０９１８】
抗体は、腫瘍発現ｈＣＧで見出されたものに類似したグリカン構造を持つようにグリコ改造されたｈＣＧに発展させることができる。そしてこれらの抗体は、技術的に良く知られた方法によって、患者のｈＣＧ発現腫瘍を検出するのに使われる可能性がある（米国特許第４，３１１，６８８号、第４，４７８，８１５号、第４，３２３，５４６号参照）。さらに、改造ｈＣＧは、ｈＣＧを発現する腫瘍に対応した免疫を高めるのに使われ得る（米国特許第５，６７７，２７５号、第５，７６２，９３１号、第５，８７７，１４８号、第４，９７０，０７１号、第４，９６６，７５３号参照）。
【０９１９】
ｈＣＧは、米国特許第５，５５４，５９５号、第５，８５１，９９７号、第５，７００，７８１号に記されているように、一般に動物を免疫修飾する方法に使われ得る。さらに、ｈＣＧは、慢性炎症性疾患病や多発性硬化症や血管形成に依存する病気のような（米国特許第６，４４４，６３９号、治療に恩恵をうける病気のマトリクスメタロプロテアーゼの抑制剤として使われ得る。
【０９２０】
Ｕ．α-ウロキナ-ゼ
α-イズリオナ-ゼは、ＡｌｄｕｒａｚｙｍｅＴＭ（ＢｉｏＭａｒｉｎａｎｄＧｅｎｚｙｍｅ）として市販されている。ＭＰＳ  Ｉ  リソソーム蓄積症治療の代償療法として有用である。MPS  Ｉは（ハーラー病としても知られているが）、通常、グリコサミングリカン（ＧＡＧｓ）として知られている、ある複合カーボハイドレートを壊すのに必要な酵素であるアルファ-L-イズリオナ-ゼの欠乏によって引き起こされる遺伝病である。ＧＡＧｓの通常の破壊は、酵素が十分な量存在しなければ不完全であったりブロックされたりする。細胞は、カーボハイドレート残基を排せつすることができなく、細胞のリソソーム に蓄積し、MPS  Ｉを引き起こす。
【０９２１】
改造されたアルファ-イズリオナ-ゼ  ペプチドは、リソソーム 蓄積病の患者、アルファ-L-イズリオナ-ゼ欠乏症の患者、ムコポリサッカリドシス（mucopolysaccaridosis）（ＭＰＳ  Ｉ）の患者、Ｈｕｒｌｅｒ病の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９２２】
α-イズリオナ-ゼを作り出し、精製する方法は、α-L-イズリオナ-ゼ欠乏症やムコポリサッカリドシス（mucopolysaccaridosis）（ＭＰＳ  Ｉ）を含めた一定の遺伝病を治療する方法と同様に、米国特許第６，４２６，２０８号に記述されている。ヒトα-イズリオナ-ゼの核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ図８０A（配列番号６５）と８０B（配列番号６６）に見出される。
【０９２３】
V.  α-ガラクトシダーゼ  A
α-ガラクトシダーゼ  Aは（アガルシダーゼ  ベータとしても知られているが）、ＦａｂｒａｚｙｍｅＴＭ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）として市販されている。α-ガラクトシダーゼ  Aは、ファブリー病の治療に有効である。ファブリー病は、稀な病気で、本質的な酵素α-ガラクトシダーゼの欠乏によって引き起こされる遺伝病である。この酵素が無ければ、ファブリー病患者は、グロボトリアシルセラミド（ＧＬ−３）と呼ばれる脂肪酸を体内で分解できない。それは、心臓や腎臓や脳やその他の重要な臓器の血管の細胞に蓄積する。この物質の漸進的な蓄積は、患者を脳梗塞、心臓麻痺、腎臓病、衰弱性疾患の危険にさらす。大抵の患者は、成人の間に腎不全となり、激しい臓器合併症で、４０歳までに死亡する。
【０９２４】
改造されたアルファ-ガラクトシダーゼ  Aペプチドは、リソソーム 蓄積病の患者、アルファ-ガラクトシダーゼ  A欠乏症の患者、およびファブリー病の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９２５】
α-ガラクトシダーゼ  A酵素は、グロボトリアオシルセラミドを加水分解するリソソーム酵素と末端α‐ガラクトシダ‐ゼ結合を持った関連グリコリピッドである。それは、X−クロモソームの長い腕上でコード化された４５ｋＤａのN-グリコシル化タンパクである。ヒトの繊維細胞あるいはＣｈａｎｇ肝細胞における初期のグリコシル化形（Ｍｒ＝５５，０００から５８，０００）は、成熟したグリコシル化形（Ｍｒ＝５０，０００）へ加工処理される。ヒトの細胞組織や血漿から精製される成熟した活性酵素はホモ２量体である（Ｂｉｓｈｏｐら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４８５９−４８６３）。α-ガラクトシダーゼ  Aの核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれ、図８１Ａ（配列番号６７）と８１Ｂ（配列番号６８）に見出される。アルファ-ガラクトシダーゼ  Aのその他の有益な核酸配列とアミノ酸配列は、米国特許第６，３２９，１９１号に見出される。
【０９２６】
アルファ-ガラクトシダーゼ  Aの作り方を教示する文献は、米国特許第５，１７９，０２３号と第５，６５８，５６７号（昆虫細胞における発現）、米国特許第５，３５６，８０４号（ＣＨＯ細胞を含めた哺乳動物細胞からの発現と分泌）、米国特許第５，５８０，７５７号（融合タンパク質としての哺乳動物細胞における発現）、米国特許第５，９２９，３０４号（植物細胞における発現）に見出される。組換え型アルファ-ガラクトシダーゼ  Aの精製法は、米国特許第６，３９５，８８４号に見出される。
【０９２７】
患者を治療するためのアルファ-ガラクトシダーゼ  Aの使い方を教示する文献は、米国特許第６，０６６，６２６号（遺伝子治療）と米国特許第６，４６１，６０９号（タンパク質での治療）であるが、これらに限られない。発明方法において役に立つアルファ-ガラクトシダーゼ  Aの突然変異形は、米国特許第６，２１０，６６６号に記述されているものを含むが、これらに限られるものではない。
【０９２８】
Ｗ．抗体
本発明はさらに、キメラＴＮＦＲ、キメラ抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、キメラ
抗−ＨＥＲ２、キメラ抗−ＲＳＶ、キメラ抗−ＣＤ２０およびキメラ抗−ＴＮＦを含む種
々のキメラ抗体調製物を含めた種々の調製についての改造する方法を含んでなる。キメラ抗体調製物は、ＩｇＧ抗体に由来するヒトのＦｃ部分および抗原に特異的なモノクローナル抗体に由来する可変領域を含んでなる。他の調製物はレセプター、例えばヒトＩｇＧＦｃ部分に融合した７５ｋＤａのＴＮＦレセプターを含んでなる。これらの分子はさらに、ヒトおよびマウスに由来する軽および重鎖を含んでなるＦａｂフラグメントを含む。キメラＴＮＦＲは、慢性関節リウマチのような炎症性疾患の処置に有用である。キメラ抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａは、心臓異常、血液凝固および血小板機能障害の処置に有用である。キメラ抗−ＨＥＲ２は胸部癌の処理として有用であり、キメラ抗−ＲＳＶは呼吸合胞体ウイルスの処理に有用であり、キメラ抗−ＣＤ２０は非−ホジキンリンパ腫の処置に有用であり、そしてキメラ抗−ＴＮＦはクローン病の処置に有用である。
【０９２９】
これらのキメラ抗体は変動する疾患の管理に有用であることが示されたが、齧歯類細胞
で生産された組換えタンパク質の比較的短い半減期により、投与はかなり頻繁で、しかも
かなり高用量でなければならない。キメラ抗体のほとんどがヒトであり、したがって免疫
系により「自己」とみなされると同時に、それらは天然ではないグリコシル化パターン故
に分解、そして破壊される。本発明はこの問題を修復し、これら新規薬剤の効力を大いに
上昇させることを提案する。
【０９３０】
抗体およびそれらの作成法
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的なエピトープに特異的な結合する
ことができる免疫グロブリン分子を称する。抗体は天然な供給源に由来するか、または組
換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリン
の免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体で
ある。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ
およびＦ（ａｂ）２を含む種々の形態、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体で存在する
ことができる（Ｈａｒｌｏｗら，１９９９，抗体を使用して（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州；Ｈａｒｌｏｗら，１９８９，抗体：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；Ｈｏｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６）。
【０９３１】
本明細書で使用する用語「合成抗体」とは、例えば本明細書に記載するバクテリオファ
ージにより発現された抗体のような組換えＤＮＡ技法を使用して作成された抗体を意味す
る。この用語は抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により作成された抗体を意味すると解
釈され、そしてこのＤＮＡ分子が抗体ペプチドまたは抗体を特定するアミノ酸配列を発現
し、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能で、しかも周知な合成Ｄ
ＮＡまたはアミノ酸配列技法を使用して得られた。
【０９３２】
ペプチドの完全長またはペプチドフラグメントまたはペプチドに対するモノクローナル
抗体は、例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８，抗体：ア  ラボラトリーマニュアルで、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）、およびＴｕｓｚｙｎｋｉら（１９８８，Ｂｌｏｏｄ，７２：１０９−１１５）に記載されているような周知のモノクローナル抗体調製手順を使用して調製することができる。望ましいペプチドの量は、化学的合成技法を使用しても合成することができる。あるいは所望するペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、そして大量のペプチドを作成するために適する細胞中で適当なプロモーター配列から発現させることができる。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書で参照にしたような標準的な手順を使用して、ペプチドで免疫感作したマウスから作成する。
【０９３３】
本明細書に記載した手順を使用して得たモノクローナル抗体コードする核酸は、当該技
術分野で利用可能であり、そして例えばＷｒｉｇｈｔら（１９９２，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３，４）：１２５−１６８およびそこに引用されている参考文献に記載されている技術を使用してクローン化し、そして配列決定することができる。さらに本発明の抗体はＷｒｉｇｈｔら（同上）およびそこに引用されている参考文献、およびＧｕら（１９９７，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５−７５９）に記載されている技術を使用して「ヒト化」することができる。
【０９３４】
ファージ抗体ライブラリーを作成するために、ｃＤＮＡライブラリーを最初に細胞、例
えば発現すべき所望のペプチドを、例えば所望の抗体をファージ表面に発現するハイブリ
ドーマから単離したｍＲＮＡから得る。ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを逆転写酵素により生
産する。免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡはＰＣＲにより得、そして生成
したＤＮＡを適当なバクテリオファージベクターにクローン化して、免疫グロブリン遺伝
子を特定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージのＤＮＡライブラリーを作成する。
ヘテロロガスなＤＮＡを含んでなるバクテリオファージのライブラリーを作成する手順は
当該技術分野では周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ
（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリ
ングハーバー、ニューヨーク州）に記載されている。
【０９３５】
所望する抗体をコードするバクテリオファージは、その対応する結合ペプチド、例えば
抗体が向けられる抗原に結合できる様式で、ペプチドがその表面上で表示されるように工
作することができる。このように特異的な抗体を発現するバクテリオファージが対応する
抗原を発現する細胞の存在下でインキューベーションされる時、バクテリオファージは細
胞に結合するだろう。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。そのよ
うな難しい（ｐａｎｎｉｎｇ）技術は当該技術分野では周知であり、そして例えばＷｒｉ
ｇｈｔら（同上）に記載されている。
【０９３６】
上記のような方法はＭ１３バクテリオファージ表示を使用してヒト抗体を生産するため
に開発された（Ｂｕｒｔｏｎら，１９９４，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）。本質的に、ｃＤＮＡライブラリーは抗体−生産細胞の１群から得たｍＲＮＡから作成する。ｍＲＮＡは再配列した免疫グロブリン遺伝子をコードし、そしてすなわちｃＤＮＡはそれをコードする。増幅したｃＤＮＡをＭ１３発現ベクターにクローン化して、表面上にヒト抗体フラグメントを発現するファージのライブラリーを作成する。問題の抗体を表示するファージは抗原の結合により選択し、そして細菌中で増殖させて可溶性のヒト免疫グロブリンを生産させる。このように従来のモノクローナル抗体合成とは対照的に、この手順はヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不滅化する。
【０９３７】
抗体分子のグリカンの改造
ペプチドの１クラス、すなわち免疫グロブリンの特異的なグリコシル化は、これらペプ
チドの生物学的活性に特に重要な効果を有する。本発明はＩｇＧクラスの免疫グロブリン
のみに限定されると解釈すべきではなく、抗体のＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭクラスの免
疫グロブリンも含むと解釈すべきである。
【０９３８】
さらに本発明は任意の型の伝統的な抗体構造のみに限定されると解釈すべきではない。
むしろ本発明は例えば抗体のフラグメント、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体等を含む
すべての型の抗体分子を含むと解釈すべきである。
【０９３９】
典型的な免疫グロブリン分子は、エフェクタータンパク質および抗原結合部分を含んで
なる。免疫グロブリンの総説に関しては、；Ｈａｒｌｏｗら，１９８８，抗体：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、およびＨａｒｌｏｗら，１９９９，抗体を使用して：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州を参照にされたい。免疫グロブリン分子のエフェクター部分は分子のＦｃ部分に存在し、そして免疫グロブリンのそのコグネイト細胞レセプターへの効率的結合に一部、寄与している。免疫グロブリン分子、特に分子のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン中の不適切なグリコシル化は、免疫グロブリンの生物学的活性に影響を及ぼす。
【０９４０】
免疫グロブリンＩｇＧに関してさらに具体的には、ＩｇＧエフェクター機能は大部分、ＩｇＧがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメイン中のアスパラギン（Ａｓｎ）２９７でＮ−グルカンのトリマンノシルコアの分岐マンノースの４−Ｏ位に結合したＮ−アセルチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むか否かに支配されている。この残基は「バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃ」として知られている。バイセクティングＧｌｃＮＡｃを天然なまたは組換えＩｇＧ分子もしくはＩｇＧ−Ｆｃ含有キメラ構築物のＮ−グリカン鎖に加える目的は、分子のＦｃ部分のＦｃ免疫エフェクター機能を至適化することにある。そのようなエフェクター機能には、抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）およびＦｃγＲレセプターへの効率的結合を必要とする他の生物学的効果、および補体のＣ１成分への結合を含むことができる。ＩｇＧ分子の最大の免疫エフェクター機能を達成するために、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの重要性が記載された（Ｌｉｆｅｌｙら，１９９５，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（８）：８１３−８２２；Ｊｅｆｆｒｉｓら，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８（３）：５２９−５３７）。
【０９４１】
ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７のＮ−グリコシル化部位に見いだされるグ
リカンは、ヒトおよび動物血漿中で循環中していることが分かったＩｇＧ分子、骨髄腫細
胞、ハイブリドーマ細胞および種々のトランスフェクトされた不死化哺乳動物および昆虫
細胞系により生産されるＩｇＧについて構造的に特性が決定された。すべての場合でＮ−
グリカンは高マンノース鎖または完全（Ｍａｎ３、ＧｌｃＮＡｃ４、Ｇａｌ２、ＮｅｕＡ
ｃ２、Ｆｕｃｌ）またはバイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つか持たない可変性の不完全
な２アンテナ鎖のいずれかである（Ｒａｊｕら，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０（５）：４７７−４８６；Ｊｅｆｆｒｉｓら，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｒｅｖ．１６３Ｌ５９−７６；Ｌｅｒｏｕｇｅら，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：３１−４８；Ｊａｍｅｓら，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５９２−５９６）。
【０９４２】
本発明は生体外でカスタマイズされたグリコシル化免疫グロブリン分子を提供する。免疫グロブリン分子は限定するわけではないが、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等を含む任意の免疫グロブリン分子でよい。抗体分子を生成し、そしてそれらを特徴付けるための具体的方法は、本明細書のいたるところに記載する。好ましくは免疫グロブリンはＩｇＧであり、そしてより好ましくはＩｇＧはヒト化またはヒトＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１である。
【０９４３】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をＩｇＧ分子のＣＨ２ドメイン
のＡｓｎ２９７でＮ−グリカンのトリマンノシルコアの分岐マンノースの４−Ｏ位にグリ
コシド結合で連結するために、生体外の試薬としてβ１，４−マンノシル−糖ペプチドβ１，４−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＧｎＴ−ＩＩＩ：ＥＣ２．４．１．１４４を使用することを具体的に意図している。しかし本明細書に提供される開示から、本発明がバイセクティングＧｌｃＮＡｃを免疫グロブリン分子に提供するためにこの酵素の使用だけを含むと解釈すべきではないことは明らかである。むしろ抗体分子のグリコシル化パターンは、抗体分子が強化された生物学的活性、すなわち他の特性、例えば安定性等の強化の可能性に加えて、エフェクター機能を有するように調節することが可能であることが見いだされた。
【０９４４】
本発明では、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩＡへの結合を強化し、そして強化された抗体−依存
性細胞傷害性を目的として、Ａｓｎ（２９７）Ｎ−連結グリカンからフコース分子を除去
する一般的方法を提供する（Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照にされたい）。この方法は抗体分子を、抗体グリカン（１つまたは複数）上のフコース分子（１つまたは複数）の結合に適当なフコシダーゼと接触させることを必要とする。あるいは組換え抗体を、ＣＨＯ細胞のＬｅｃ１３変異体のようなフコシルトランスフェラーゼを発現する細胞で発現させることができる。抗体のグリカン（１つまたは複数）からのフコースの除去は単独で、あるいはバイセクティングＧｌｃＮＡｃを付加するような他のグリカン改造方法と組み合わせて行うことができる。ＧｎＴ−Ｉを欠く細胞中での抗体の発現もコアフコースを欠いたＦｃグリカンを生成し、これは本発明によりさらに修飾することができる。
【０９４５】
本発明では、ＣＨ２ドメイン中、多くはＡｓｎ２９７でＮ−結合オリゴ糖を含むＩｇＧ
分子の調製物において、Ｆｃ免疫エフェクター機能を強化する目的で、バイセクティング
ＧｌｃＮＡｃの一般的導入法を提供する。この方法ではＩｇＧ分子の群は、グリカン鎖が
ＧｎＴ−ＩＩＩの受容体となるようなグリコシル化の状態になることが必要である。これ
は３つの方法の任意の１つにより達成される：１）ＧｎＴ−ＩＩＩの基質であるＮ−グリ
カン鎖を持つＩｇＧを分泌する宿主発現系の選択または遺伝子操作による；２）エキソグ
リコシダーゼ処理後に残るグリカン構造（１つまたは複数）がＧｎＴ−ＩＩＩの受容体と
なるような、ＩｇＧグリコフォーム群をエキソグリコシダーゼで処理することによる；３
）上記１）および２）におけるような宿主選択およびエキソグリコシダーゼ処理の幾つか
の組み合わせに加えて、ＧｎＴ−ＩＩＩの受容体を作成するためにＧｎＴ−ＩおよびＧｎ
Ｔ−ＩＩによる連続的なＧｌｃＮＡｃの付加。
【０９４６】
例えばニワトリの血漿から得たＩｇＧは主に高マンノース鎖を含有し、そしてＧｌｃＮ
Ａｃをトリマンノシルコアのα１，３マンノース枝にＧｎＴ−Ｉにより付加するための基
質を作成するためには、１以上のα−マンノシダーゼで消化する必要がある。この基質は
基本的なトリマンノシルコア、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であることができる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として使用して、ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩそしてＧｎＴ−ＩＩＩを結び付けたこのコア構造を処理することにより、図１に示すようなＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ５を生成する。これらのグリコシルトランスフェラーゼを作用させる順序は、望む生成物の生成を最適化するように変えても良い。場合によりこの構造はβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼを用いた処理により延長することができる。必要ならばガラクトシル化オリゴ糖は、α２，３−またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いてさらに延長して、完全な２アンテナ状構造を達成することができる。この方法を使用して、２アンテナ状グリカン鎖は、開発中の任意の治療用ＩｇＧの最適なＦｃ免疫エフェクター機能に必要性であるように改造することができる（図３）。
【０９４７】
あるいはほとんどの動物の血漿中に見いだされるＩｇＧ分子、またはほとんどの動物細
胞によるもしくはトランスジェニック動物による組換え産物として分泌されるＩｇＧは、
多くは完全な（ＮｅｕＡｃ２、Ｇａｌ２、ＧｌｃＮＡｃ４、Ｍａｎ３、±Ｆｕｃｌ）（図
３）およびバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含むかまたは含まない変動性の不完全な形態
を含む２アンテナ状グリコフォームのスペクトルを含む（Ｒａｊｕら，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０（５）：４７７−４８６；Ｊｅｆｆｒｉｓら，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。バイセクティングＧｌｃＮＡｃがそのように生産された免疫グロブリン分子の群全体に存在することを確実とするために、分子の混合物を以下のエキソグリコシダーゼと連続的に、または混合物で処理することができる：ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−へキソサミニダーゼ、α−フコシダーゼ。生成したトリマンノシルコアは次いで上記のようにグリコシルトランスフェラーゼを使用して改造することができる。
【０９４８】
ある場合では、存在する抗体からのエフェクター機能を止めることが望まれるかもしれない。本発明はまた同様に、エフェクター機能を排除するために、適当なグリコシダーゼやグリコシルトランスフェラーゼでＦｃグリカンを修飾することが含まれている。同様に、Ｆｃレセプターや補体の抗体に対する結合を妨害したり止めたりするのに役立つＰＥＧやその他のポリマーで修飾した糖を加えることも期待される。
【０９４９】
さらにトランスジェニック動物により分泌されるか、またはトランスジェニック植物に
より「植物体」として貯蔵されるＩｇＧを特性決定した。β１，２結合キシロースおよび
／またはα１，３結合フコースを含むＮ−グリカンを有するトランスジェニック植物中で
生産されるＩｇＧ分子は、トリマンノシルコアまたはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ４構造を作成
するために上記エキソグリコシダーゼに加えて、エキソグリコシダーゼで処理してそれら
残基を除去することができ、次いでそれらをグリコシルトランスフェラーゼで処理して上
記のようにＮ−グリカンを改造する。
【０９５０】
本発明の主な新規観点は、事前のエキソグリコシダーゼ処理を含むか、または含まずに
、抗体のエフェクター機能を至適化するために正しい順序で適用される、適切なグリコシ
ルトランスフェラーゼの適用である。１つの例示態様では、バイセクティングＧｌｃＮＡ
ｃは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃが必要なＩｇＧ分子または他のＩｇＧ−Ｆｃ−キメ
ラ構築物のグリカンに導入される。別の例示態様では、コアフコースがＩｇＧ分子または
他のＩｇＧ−Ｆｃ−キメラ構築物のグリカンから除去される。
【０９５１】
Ｘ.ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質
７５ｋＤａのヒトＴＮＦレセプターのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、本明細書で
それぞれ配列番号３１および配列番号３２として説明する（それぞれ図８２Ａおよび８２Ｂ）。キメラ抗−ＨＥＲ２の軽および重可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３５および配列番号３６として説明する（それぞれ図８３Ａおよび８３Ｂ）。キメラ抗−ＲＳＶの軽および重可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３８および配列番号３７として説明する（それぞれ図８４Ａおよび８４Ｂ）。抗−ＴＮＦの非−ヒト可変領域のアミノ酸配列を、本明細書中でそれぞれ配列番号４１および配列番号４２として説明する（それぞれ図８５Ａおよび８５Ｂ）。ヒトＩｇＧのＦｃ部分のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号４９および配列番号５０として説明する（それぞれ図８６Ａおよび８６Ｂ）。
【０９５２】
改造されたキメラＥＮＢＲＥＬＴＭは、関節リウマチの患者、多関節若年関節炎の患者のグループから選択される患者に投与される可能性がある。改造されたキメラＥＮＢＲＥＬＴＭはまた同様に、患者の兆候や症状や構造的な損傷を減らすために、関節炎の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９５３】
改造されたキメラＳｙｎａｇｉｓＴＭは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染に対する免疫性を与えるために患者に投与される可能性がある。改造されたキメラＳｙｎａｇｉｓＴＭはまた同様に、ＲＳＶによって引き起こされる下部呼吸器疾患の重症度を抑えたり、減じたりするために患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９５４】
Ｙ．  ＭＡｂ抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ
マウス抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の可変領域のアミノ酸配列を、配列番号
５２（マウス成熟可変軽鎖、図８７）および配列番号５４（マウス成熟可変重鎖、図８８）で説明する。これらのマウス配列は、米国特許第５，７７７．０８５号明細書に見いだされる手順に従い、ヒトＩｇＧアミノ酸配列の配列番号５１（ヒト成熟可変軽鎖、図８９）、配列番号５３（ヒト成熟可変重鎖、図９０）、配列番号５５（ヒト軽鎖、図９１）および配列番号５６（ヒト重鎖、図９２）と組み合わせて、キメラヒト化マウス抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体を作成することができる。他の抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａヒト化抗体は、米国特許第５，８７７，００６号明細書に見いだされる。抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ＭＡｂ  ７Ｅ３を発現する細胞系は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州）から寄託番号ＨＢ−８８３２で商業的に得ることができる。
【０９５５】
選択された抗体の適応
改造されたＲｅｏｐｒｏＴＭは、２４時間以内に経皮冠動脈インターベンションが予定されている経皮冠動脈インターベンションの患者や不安定狭心症の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。改造されたＲｅｏｐｒｏＴＭはまた同様に、心臓の虚血性の合併症を減じたり、抑制したりするために経皮冠動脈インターベンションの患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９５６】
改造されたＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭは、ＨＥＲ２を過剰発現する転移性の乳癌の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９５７】
改造されたＲｅｍｉｃａｄｅＴＭは、関節リュウマチの患者、クローン病の患者、そして瘻管が生じるクローン病の患者からなる群から選択される患者に投与される可能性がある。改造されたＲｅｍｉｃａｄｅＴＭはまた同様に、関節リュウマチの兆候や症状を減じるために関節リュウマチの患者に投与される可能性がある。改造されたＲｅｍｉｃａｄｅＴＭはまた同様に、クローン病の兆候や症状を減じるためにクローン病の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９５８】
Ｚ．ＭＡｂ抗−ＣＤ２０
キメラ抗−ＣＤ２０抗体の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号５９（マウス可変領域
軽鎖の核酸配列、図９３Ａ）、配列番号６０（マウス可変領域軽鎖のアミノ酸配列、図９３Ｂ）、配列番号６１（マウス可変領域重鎖の核酸配列、図９４Ａ）および配列番号６２（マウス可変領域重鎖のアミノ酸配列、図９４Ｂ）に説明する。マウス抗体をヒト化するために、ヒトＩｇＧ重および軽定常ドメインを含むＴＣＡＥ８（配列番号５７、図９５Ａ−９５Ｅ）を都合よく使用することができる。上記マウス可変領域コードＤＮＡを、米国特許第５，７３６，１３７号明細書に与えられた使用説明に従いＴＣＡＥ８ベクターにクローニングすることにより、哺乳動物細胞系で形質転換した時、キメラ抗−ＣＤ２０抗体を発現するベクターが作成される（配列番号５８、図９６Ａ−９６Ｅ）。他のヒト化抗−ＣＤ２０抗体は、米国特許第６，１２０，７６７号明細書に見いだされる。抗−ＣＤ２０ＭＡｂ  Ｃ２７３を発現する細胞系は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州）から寄託番号ＨＢ−９３０３で商業的に得ることができる。
【０９５９】
当業者は本明細書中で説明する配列が網羅的ではなく、むしろ可変領域、レセプターお
よび他のキメラ抗体の結合部分の例であると直ちに考えるだろう。さらにキメラまたは「
ヒト化」抗体を構築するための方法は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特
許第６，３２９，５１１号および同第６，２１０，６７１号明細書に記載されている。本
開示および当該技術分野を通して周知な方法と組み合わせて、当業者は本発明が本明細書
に開示した配列に限定されないことを認識するだろう。
【０９６０】
キメラ抗体の発現は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第６，３２９
，５１１号明細書に詳細に記載されている。発現系は原核、真核等であることができる。
さらにバキュロウイルス発現系を使用した昆虫細胞でのキメラ抗体の発現が、Ｐｕｔｌｉ
ｔｚら（１９９０．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６５１−６５４）に記載されている。従って、融合またはキメラタンパク質をコードする核酸の発現法は当該技術分野では周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン＆ウィリー、ニューヨーク）に記載されている。
【０９６１】
本発明の方法に従い生産されたキメラ抗体の機能および生物学的活性の測定は、当業者
には同様に基本的操作である。競合アッセイによる抗体の親和性を決定する方法は、Ｂｅ
ｒｚｏｆｓｋｙ（Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ａｎｄ  Ｉ．Ｊ．Ｂｅｒｋｏｗｅｒ、１
９８４、基本的免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、（Ｗ．Ｅ．
Ｐａｕｌ編集）、ラベン（Ｒａｖｅｎ）出版（ニューヨーク）、５９５）に詳細に記載さ
れている。簡単に説明すると、キメラ抗体の親和性はそれが由来するモノクローナル抗体
の親和性と、放射−ヨード化モノクローナル抗体を使用して比較する。
【０９６２】
改造された  ａｎｔｉ−ＣＤ２０は、置換のまたは低度難治性または濾胞性の、ＣＤ２０陽性の、Ｂ−細胞非ホジキンリンパ腫の患者に投与される可能性がある。好ましくは患者はヒトである。
【０９６３】
ＶＩＩ．製薬学的組成物 
別の観点では、本発明は製薬学的組成物を提供する。製薬学的組成物には、製薬学的に
許容され得る希釈剤および天然には存在しない、水溶性ポリマー、治療部分または生体分
子とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間の共有結合物を含む。ポリマー、
治療部分または生体分子は、ペプチドとポリマー、治療部分または生体分子との間に挿入
され、そして両方を共有結合する完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合される
。
【０９６４】
本発明の製薬学的組成物は様々な薬剤送達系での使用に適している。本発明での使用に
適する製剤は、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、メース（Ｍａｃｅ）出版社、フィラデルフィア、ペンシ
ルバニア州、第１７版、（１９８５）に見いだせる。薬剤送達に関する方法の簡単な総説
については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を
参照にされたい。
【０９６５】
製薬学的組成物は、例えば局所、経口、鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉
内を含む任意の適切な投与様式に配合することができる。皮下注射のような非経口投与に
は、担体は好ましくは水、塩水、アルコール、脂肪、蝋またはバッファーを含んでなる。
経口投与には任意の上記の担体またはマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ
グネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロースお
よび炭酸マグネシウムのような固体担体を使用することができる。生分解性微小球（例え
ばポリラクテートポリグリコレート）を本発明の製薬学的組成物に担体として使用するこ
ともできる。適当な生分解性微小球は、例えば米国特許第４，８９７，２６８号および同
第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。
【０９６６】
一般に製薬学的組成物は非経口的、例えば静脈内に投与される。すなわち本発明は許容
されうる担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝化水、塩水、ＰＢＳ等に溶解または
懸濁された化合物を含んでなる非経口投与用の組成物を提供する。組成物はｐＨ調整およ
び緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤等のような生理学的状態に近づけるため必
要な製薬学的に許容され得る補助物質を含むことができる。
【０９６７】
これらの組成物は通例の滅菌技術により滅菌することができ、または滅菌濾過してもよ
い。生成した水溶液はそのまま使用するために包装されることができ、または凍結乾燥さ
れ、凍結乾燥された調製物は滅菌水性担体と投与前に合わせられる。調製物のｐＨは典型
的には３から１１の間、より好ましくは５から９、そして最も好ましくは７から８である
。
【０９６８】
幾つかの態様では、本発明のペプチドは標準的な小胞−形成脂質から形成されたリポソ
ームに包含することができる。様々な方法が、例えばＳｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号および同第４，８３７，０２８号明細書に記載されているようにリポソームを調製するために利用可能である。様々な標的化剤（例えば本発明のシアリルガラクトシド）を使用したリポソームの標的化は当該技術分野で周知である（例えば米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号明細書を参照にされたい）。
【０９６９】
標的化剤をリポソームにカップリングする標準的な方法を使用することができる。これ
らの方法は一般に、標的化剤の結合を活性化することができるホスファチジルエタノール
アミンのような脂質成分、または本発明の脂質−誘導化ペプチドのような誘導化された親
油性化合物のリポソームへの包含が関与する。
【０９７０】
標的化メカニズムは一般に、標的部分が標的、例えば細胞表面レセプターとの相互作用
に利用できるような様式で、標的化剤をリポソームの表面上に配置することが必要である
。本発明の炭水化物は当業者に既知の方法（例えば炭水化物上に存在するヒドロキシル基
の、長鎖アルキルハライドまたは脂肪酸を用いたそれぞれアルキル化またはアシル化）を
使用して、リポソームが形成される前に脂質分子に結合することができる。あるいはリポ
ソームはコネクター部分を最初に、膜を形成する時点で膜に包含させるような様式に工夫
することができる。コネクター部分は親油性部分を持たなければならず、コネクター部分
は膜中に堅く包埋され、そしてしっかり固定される。これはまた反応性部分を持たなけれ
ばならず、反応性部分はリポソームの水性表面上で化学的に利用可能である。反応性部分
はこれが安定な化学結合を後に加える標的化剤または炭水化物と形成するために、化学的
に適するように選択される。場合により標的剤をコネクター分子に直接付けることも可能
であるが、ほとんどの場合で化学的ブリッジとして作用するための第３分子を使用するこ
とが適当であり、すなわち膜中にあるコネクター分子を、３次元的に小胞表面から離れて
伸びる標的剤または炭水化物に連結する。本発明のペプチドの投与の投薬範囲は、免疫応
答の症状がある程度の抑制を示す、所望する効果を生じるために十分に多い量である。投
薬用量は副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に投薬用量は動物の年齢、状態
、性別および疾患の程度で変動し、そして当業者により決定され得る。投薬用量は反対の
徴候の出来事で、個々の医師により調整されることができる。
【０９７１】
さらなる製薬学的方法を使用して、作用期間を制御することができる。放出制御調製物
は、結合物に対するポリマーの使用、複合体、またはペプチドの吸収により達成すること
ができる。制御された送達は、適当な高分子（例えばポリエステル、ポリアミノカルボキ
シメチルセルロースおよび硫酸プロタミン）および高分子の濃度ならびに放出を制御する
ための包含法を選択することにより果たすことができる。放出制御調製物により作用期間
を制御するための別の可能な方法は、ペプチドをポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲ
ル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニル酢酸コポリマーのようなポリマー性材料の粒子に
包含させることである。
【０９７２】
ペプチドを血漿タンパク質の結合から保護するために、ペプチドはコアセルベーション
法により、または界面重合法により調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキ
シメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチメタクリレート
）マイクロカプセルに、あるいはコロイド状薬剤送達系、例えばリポソーム、アルブミン
微小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルに、またはマクロエマルジョ
ンに封入することが好適である。そのような教示は、レミングトンの製薬科学（第１６版
、Ａ．Ｏｓｌｏ編集、マック、イーストン、ペンシルバニア州、１９８０）に開示されて
いる。
【０９７３】
本発明のペプチドは、高分子量複合体、ナノカプセル、微小球またはビーズ状の合成ま
たは天然のポリマー、および水中油型のエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム
および再封入赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）を含む脂質に基づく
系、のような標的可能な薬剤送達系での使用によく適している。これらの系は集合的にコ
ロイド状薬剤送達系として知られている。典型的にはそのような分散したペプチドを含有
するコロイド状粒子は、直径約５０ｎｍ〜２μｍである。コロイド状粒子のサイズは、そ
れらが注射によるように静脈内に、またはエーロゾルとして投与できるようにする。コロ
イド系の調製物に使用する材料は典型的には、濾過滅菌を介して滅菌可能な、非毒性の、
生分解可能な、例えばアルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、
リン脂質およびダイズ油である。ポリマー性のコロイド系はマイクロカプセル化のコアセ
ルベーションに類似する方法により調製される。
【０９７４】
例示態様では、ペプチドは標的化送達系として使用するリポソームの成分である。リン
脂質が水性媒質にゆるやかに分散した時、それらは膨潤し、水和し、そして脂質二重層を
分ける水性媒質の層を含むマルチラメラ同心二重層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  
ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を天然に形成する。そのよう
な系は通常、多重層リポソームまたは多重層小胞（ＭＬＶ）と呼ばれ、そして約１００ｎ
ｍから約４μｍの範囲の直径を有する。ＭＬＶが超音波処理される時、直径が約２０〜約
５０ｎｍの範囲の小１枚膜リポソーム（ＳＵＶＳ）が形成され、これはＳＵＶのコアに水
溶液を含む。
【０９７５】
リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル
コリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンのようなホスファ
チジル化合物を含む。特に有用であるのは、ジアシルホスファチジルグリセロールであり
、ここで脂質部分は１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、そし
て飽和されている。具体的例のリン脂質には卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイル
ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【０９７６】
本発明のペプチドを含有するリポソームの調製では、ペプチドのカプセル化効率、ペプ
チドの不安定性（ｌａｂｉｌｉｔｙ）、生成されるリポソーム群の均一性およびサイズ、
ペプチド−対−脂質比、調製物の浸透不安定性、および製剤の製薬学的な許容性のような
変数を考慮すべきである。Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９：４６７（１９８０）；Ｄｅａｍｅｒら，リポソーム（ＬＩＰＯＳＯＭＥ）で、マルセルデッカー、ニューヨーク、１９８３、２７：Ｈｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，４０：８９（１９８６）。  
【０９７７】
本発明のペプチドを含有する標的化送達系は、宿主、特に哺乳動物宿主に、静脈内、筋
肉内、皮下、腹腔内、血管内、局所的、空隙内、経皮的、鼻内、および吸入のような種々
の方法で投与することができる。ペプチドの濃度は特定の応用、疾患の性質、投与頻度等
により変動するだろう。標的化送達系−カプセル化ペプチドは、適当な他の化合物および
水性の生理学的に許容され得る媒体、例えば塩水、リン酸緩衝化生理食塩水等を含んでな
る製剤で提供され得る。
【０９７８】
本発明の方法により調製された化合物は、診断試薬としても使用を見いだすことができ
る。例えば標識した化合物は炎症を有することが疑われる患者の炎症または腫瘍の転移の
領域を決めるために使用することができる。この使用のために、化合物は１２５Ｉ、１４
Ｃまたはトリチウムで標識することができる。
【実施例】
【０９７９】
本発明をこれから以下の実施例を参照にして記載する。これらの実施例は具体的説明の
目的のみに提供し、そして本発明がこれらの実施例に限定されるべきでは全くなく、むし
ろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包含すると解
釈すべきである。
【０９８０】
この実施例で提示するこの実験に使用する材料および方法をこれから記載する。
【０９８１】
Ａ．  一般的な操作
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
この実施例はＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの調製を説明する。
【０９８２】
２−（ベンジルオキシカルボキサミド）−グリシルアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノースの調製。Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３．１２５ｇ、１０．２ミリモル）を、Ｄ−マンノサミン−ＨＣｌ（２ｇ、９．３ミリモル）およびトリエチルアミン（１．４２ｍＬ、１０．２ミリモル）を含む溶液（１０ｍＬのＭｅＯＨおよび６ｍＬのＨ２Ｏに溶解）に加えた。反応物を室温で１６時間撹拌し、そしてロト蒸発（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して濃縮した。クロマトグラフィー（シリカ、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）は１．７１ｇ（５０％収率）の生成物を白色固体として得た：Rf=0.62 (シリカ；CHCl3:MeOH:H2O,6/4/1); 1HNMR(CD3OD, 500 MHz)3.24- 3.27(m, 2H), 3.44(t, 1H), 3.55(t, 1H), 3.63-3.66 (m, 1H), 3.76-3.90 (m, 6H), 3.91 (s, 2H), 4.0 (dd, 2H), 4,28(d, 1H, J=4.4), 4.41 (d, 1H, J=3.2), 5.03 (s, 1H), 5.10 (ｍ, 3H), 7.29-7.38 (m, 10H)。
【０９８３】
５−（Ｎ−ベンジルオキシカルボキサミド）グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネートの調製。２−（Ｎ−ベンジルオキシカルボキサミド）グリシルアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノース（１．５９ｇ、４．３ミリモル）を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（１２ｍＬ、ｐＨ７．５）およびピルビン酸ナトリウム（４．７３ｇ、４３ミリモル）の溶液に溶解した。ノイラミン酸アルドラーゼ（０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する４５ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝化溶液、ｐＨ６．９中、５４０Ｕの酵素）、および反応物混合物を３７℃で２４時間加熱した。次いで反応混合物を遠心し、そして上清をクロマトグラフィーにかけた（Ｃ１８シリカ、Ｈ２Ｏ（１００％）から３０％  ＭｅＯＨ／水への勾配）。適切な画分をプールし、濃縮し、そして残渣をクロマトグラフィーにかけた（シリカ、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２からＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ６／４／１への勾配）。適切な画分を集め、濃縮し、そして残渣を水に再懸濁した。凍結乾燥後、生成物（１．６７ｇ、８７％収率）を白色固体として得た：Rf=0.26 (シリカ, CHCl3/MeOH/H2O 6/4/1); 1HNMR (D2O, 500MHz) 1.82 (t, 1H), 2.20 (m, 1H), 3.49 (d, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.67-3.86 (m, 2H), 3.87 (s, 2H), 8.89-4.05 (m, 3H), 5.16 (s, 2H), 7.45 (m, 5H)。
【０９８４】
５−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネートの調製。５−（Ｎ−ベンジルオキシカルボキサミド）グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート（１．６６ｇ、３．６ミリモル）を、２０ｍＬの５０％水／メタノールに溶解した。フラスコを繰り返し真空とし、そしてアルゴン下に置き、次いで１０％Ｐｄ／Ｃ（０．２２５ｇ）を加えた。繰り返し真空にした後、次いで水素（約１気圧）をフラスコに加え、そして反応混合物を１８時間撹拌した。反応混合物はセライトを通して濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、そして凍結乾燥させて１．２４ｇ（１００％収率）の生成物を白色固体として得た：Rf=0.25 (シリカ, IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) 1.83 (t, 1H, J=9.9), 2.23 (dd, 1H, J=12.9, 4.69), 3.51-3.70 (m, 2H), 3.61 (s, 2H), 3.75-3.84 (m, 2H), 3.95-4.06 (m, 3H)。
【０９８５】
シチジン−５’−モノホスホリル−［５−（Ｎ−フルオレニルメトキシ−カルボキサミド）グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］の調製。２０ｍＬのＨ２Ｏに溶解した５−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート（０．５５ｇ、１．７０ミリモル）の溶液を、Ｔｒｉｓ（１．３８ｇ、１１．４ミリモル）、１Ｍ  ＭｇＣｌ２（１．１ｍＬ）およびＢＳＡ（５５ｍｇ）の溶液に加えた。溶液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ（２ｍＬ）で８．８に調整し、そしてＣＴＰ−２Ｎａ＋（２．２３ｇ、４．２ミリモル）を加えた。反応混合物のｐＨは、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨを送るｐＨコントローラーで制御してｐＨ８．８を維持した。融合タンパク質（シアリルトランスフェラーゼ／ＣＭＰ−ノイラミン酸シンテターゼ）を溶液に加え、そして反応混合物を室温で撹拌した。２日後、さらなる量の融合タンパク質を加え、そして反応物をさらに４０時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＨ中で沈殿させ、そして沈殿物を冷ＥｔＯＨで５回洗浄して、２．３グラムの白色固体を得た。約１．０ｇの粗生成物を１，４−ジオキサン（４ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（４ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（３ｍＬ）に溶解し、そして２ｍｌのジオキサンに溶解したＦＭＯＣ−Ｃｌ（３０８ｍｇ、１．２ミリモル）の溶液を滴下した。室温で１６時間撹拌した後、反応混合物はロータリーエバポレーションにより約６ｍＬに濃縮し、そしてクロマトグラフィー（Ｃ１８シリカ、１００％Ｈ２Ｏから３０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏへの勾配）を使用して精製した。適切な画分を合わせ、そして濃縮した。残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して２５３ｍｇの白色固体を得た：Rf=0.50 (シリカ, IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) 1.64 (dt, 1H, J=12.0, 6.0), 2.50 (dd, 1H, J=13.2, 4.9), 3.38 (d, J=9.67, 1H), 3.60 (dd, J=11.65, 6.64, 1H), 3.79 (d, J=4.11, 1H), 3.87 (dd, J=12.24, 1.0, 1H), 3.97 (m, 2H), 4.07 (td, J=10.75, 4.84, 1H), 4.17 (dd, J=10.68, 1.0, 1H), 4.25 (s, 2H), 4.32 (t, J=4.4, 1H), 4.37(t, J=5.8 1H),
4.6-4.7 (m,溶媒ピークにより不明瞭), 5.95 (d, J=4, 1H), 6.03 (d, J=7.4, 1H), 7.4
3-7.53 (m, 3H), 7.74 (m, 2H), 7.94 (q, J=7, 3H). MS (ES); 理論値 C35H42N5O18P ([M-H]-), 851.7; 測定値 850.0。
【０９８６】
シチジン−５’−モノホスホリル−（５−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネートの調製）。ジイソプロピルアミン（８３μＬ、０．５８７マイクロモル）を、水（３ｍＬ）およびメタノール（１ｍＬ）に溶解したシチジン−５’−モノホスホリル−［５−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボキサミド）グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］（１００ｍｇ、０．１１７ミリモル）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、そして反応メタノールを反応混合物からロータリーエバポレーションにより除去した。粗反応混合物は水を使用してＣ１８シリカゲルカラムを通して濾過し、そして溶出液を集め、そして凍結乾燥して（８７ｍｇ、１００％）の生成物を白色固体として得た：Rf=0.21 (シリカ，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) 1.66 (td, 1H, J=5.3), 2.50 (dd, 1H, J=13.2, 4.6), 3.43 (d, J=9.58, 1H), 3.63 (dd, J=11.9, 6.44, 1H), 3.88 (dd, J=11.8, 1.0, 1H), 3.95 (td, J=9.0, 2.3, 1H), 4.10 (t, J=10.42, 1H), 4.12 (td, J=10.34, 4.66, 1H), 4.18 (d, J=10.36, 1H), 4.24 (m, 2H), 4.31 (t, J=4.64, 1H), 4.35 (t, 1H), 6.00 (d, J=4.37, 1H), 6.13 (d, J=7.71, 1H), 7.98 (d, J=7.64, 1H). MS (ES); 理論値 C21 H32 N5O11P ([M-H]-), 629.47; 測定値 627.9。
【０９８７】
シチジン−５’−モノホスホリル−［５−（Ｎ−メトキシ−ポリオキシエチレン−（１ｋＤａ）−３−オキシプロピオンアミド）−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］の調製。ベンジルトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフテェート（ＢＯＰ、２１ｍｇ、４８マイクロモル）を、無水ＤＭＦ（７００μＬ）およびトリエチルアミン（１３μＬ、９５マイクロモル）に溶解したメトキシポリオキシエチレン−（１ＫＤａの平均分子量）−３−オキシプロピオン酸（４８ｍｇ、４８マイクロモル）溶液に加えた。３０分後、シチジン−５’−モノホスホリル−（５−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）（３０ｍｇ、４８マイクロモル）、水（４００μＬ）およびトリエチルアミン（１３μＬ、９５マイクロモル）を含む溶液を加えた。この溶液を２０分間、室温で撹拌し、そして次いでクロマトグラフィーにかけた（Ｃ１８シリカ、メタノール／水の勾配）。適切な画分を集め、濃縮し、残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して白色固体として４０ｍｇ（５０％収率）を得た：Rf=0.36 (シリカ, IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500MHz) 1.66 (td, 1H, J=5.3), 2.50 (dd, 1H, J=13.2, 4.6), 2.6(t, J=5.99, 3H) 3.43 (d, J=9.58, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.71 (s, 70H), 3.79 (m, 3.71 ピークにより不明瞭)、3.82 (t, J=6.19, 1H) 3.88 (dd, J=11.8, 1.0, 1H), 3.95 (td, J=9.0, 2.3, 1H), 3.98 (t, J=5.06, 1H), 4.12 (td, J=10.34, 4.66, 1H), 4.18 (d, J=10.36, 1H), 4.23 (d, J=4.85, 2H), 4.31 (t, J=4.64, 1H), 4.35 (t, 1H), 6.00 (d, J=4.55, 1H), 6.13 (d, J=7.56, 1H), 7.98 (d, J=7.54, 1H). MS (MALDI), 観測値 [M-H]; 1594.5, 1638.5, 1682.4, 1726.4, 1770.3, 1814.4, 1858.2, 1881.5, 1903.5, 1947.3。
【０９８８】
シチジン−５’−モノホスホリル−［５−（Ｎ−メトキシ−ポリオキシエチレン−（１０ｋＤａ）−オキシカルボキサミド）−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］の調製。シチジン−５’−モノホスホリル−（５−グリシルアミド−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）（２．５ｍｇ、４マイクロモル）および水（１８０μＬ）を、トリエチルアミン（１．１μＬ、８マイクロモル）を含有する無水ＤＭＦ（８００μＬ）中の（メトキシポリオキシエチレン−（１０ｋＤａ、平均分子量）−オキシカルボニル−（Ｎ−オキシベンゾトリアゾール）エステル（４０ｍｇ、４マイクロモル）の溶液に加え、そして反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水（８ｍＬ）で希釈し、そして逆層フラッシュクロマトグラフィーにより精製した（Ｃ１８シリカ、メタノール／水の勾配）。適切な画分を合わせ、濃縮し、残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して白色固体として２０ｍｇの生成物（４６％収率）を得た：Rf=0.35 (シリカ, IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz)δ1.66(td, 1H), 2.50(dd, 1H), 2.64 (t, 3H) 3.55-3.7 (m, 3.71ピークのより不明瞭)、3.71(s, 488H), 3.72-4.0 (m, 3.71ピークのより不明瞭), 4.23 (m, 3H), 4.31 (t, 1H), 4.35 (t, 1H), 6.00 (d, J=4.77, 1H), 6.12 (d, J=7.52, 1H), 7.98 (d, J=7.89, 1H). MS (MALDI), 観測値 [MCMP+Na]; 10780。
【０９８９】
２．ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ  ＩＩの調製
この例は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ  を作るための一般的な操作とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を作るための個別の操作を説明する。
シチジン−５’−モノスフォリル−（５−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）の調製の一般的な操作。シチジン−５’−モノスフォリル−（５−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）（８７０ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの水に溶解し、４０ｗｔ％のジメチルアミン水溶液５．５ｍＬを加えた。反応は１時間攪拌し、次に、過剰のアミンはロータリー・エバポレータによって取り除いた。 水溶液は、Ｃ−１８シリカゲルカラムで濾過し、カラムは水で洗浄した。溶離液は、一緒にして、凍結乾燥するし、６３８ｍｇ（９３％）の白色固体が得られる。Ｒｆ＝０．１０（シリカ，ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ；７／２／１）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ１．６６（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３），２．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２，４．６），３．４３（ｄ，Ｊ＝９．５８，１Ｈ），３．６３（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，６．４４，１Ｈ），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，１．０，１Ｈ），３．９５（ｔｄ，Ｊ＝９．０，２．３，１Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝１０．４２，１Ｈ），４．１２（ｔｄ，Ｊ＝１０．３４，４．６６，１Ｈ），４．１８（ｄ，Ｊ＝１０．３６，１Ｈ），４．２４（ｍ，２Ｈ），４．３１（ｔ，Ｊ＝４．６４，１Ｈ），４．３５（ｔ，１Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝４．３７，１Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝７．７１，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．６４，１Ｈ）。ＭＳ（ＥＳ）；Ｃ１２Ｈ３２Ｎ５Ｏ１１Ｐ（［Ｍ−Ｈ］−）の計算値，６２９．４７；見出された値，６２７．９。
【０９９０】
ｍＰＥＧ−（ｐ−ニトロフェノル）カーボネートを使ってＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを調製する一般的な操作。シチジン−５’−モノスフォリル−（５−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）（１７５ｍｇ，０．２５９ｍＭｏｌ）を２５ｍＬの水ｐＨ８．５，とＤＭＦあるいはＴＨＦ（１：２の比の）混合物に溶かした。ｍＰＥＧ−ニトロフェノル）カーボネート（ｍＰＥＧの値で２から２０ｋＤａ）（０．５１９ｍＭｏｌ）を室温で８時間、数回の割合で加えた。反応混合物は室温で３日間攪拌した。反応が完了した時、水（４０ｍｌ）とＮＨ４ＯＨ（２９％水溶液）を加えた。黄色の反応混合物は更に２時間攪拌して、次にロータリー・エバポレータで濃縮した。次に、反応混合物は水（ｐＨ８．５）で容積約５００ｍｌまで希釈し、メタノール／水のグラジエントでの逆相フラッシュクロマトグラフ（Ｂｉｏｔａｇｅ４０Ｍ，Ｃ１８シリカカラム）によって精製した。適当な部分分けしたものを合わせて、白色固体として生成物が得られるまで濃縮した。Ｒｆ（シリカ；１−プロパノール／水／２９％ＮＨ４ＯＨ；７／２／１）；（２ｋＤａ  ＰＥＧ）＝０．３１；（５ｋＤａ  ＰＥＧ）＝０．３３；（１０ｋＤａ  ＰＥＧ）＝０．３６；（２０ｋＤａ  ＰＥＧ）＝０．３８（ＴＬＣシリカ，ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ７／２／１）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）、観測値［Ｍ−ＣＭＰ＋Ｎａ］；（２ｋＤａ）＝２４６０；（５ｋＤａ）＝５２５０；（１０ｋＤａ）＝１０７００；（２０ｋＤａ）＝２２５００。
【０９９１】
シチジン−５’−モノスフォリル−［５−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボオキサミド）−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］の調製。ピルビン酸ナトリウム（２．４ｇ，２１８ｍｍｏｌ）とＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２５Ｍ，ｐＨ７．３４）と１．０ｇ（２２ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−グリシルマンノスアミドを１５０ｍＬのポリカーボネート瓶で混合した。次に、ノイラミン酸アルドラ−ゼ溶液（１９ｍＬ，〜６００Ｕ）加え、反応混合物は３０℃でオービタル攪拌器上で培養した。２３時間後、薄相クロマトグラフ（ＴＬＣ）は、およそ７５％の生成物への変換が起こったことを示した。次に、ＣＴＰ（１．７２ｇ，３３ｍｍｏｌ）と０．１ＭのＭｎＣｌ２（６ｍＬ）を反応混合物に加えた。ｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨ（５．５ｍＬ）で７．５に調節し、ＣＭＰ−ノイラミン酸シンセターゼ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）を含む溶液を加えた（２５ｍＬ，３８６Ｕ）。反応は２４時間で完了し、反応混合物はクロマトグラフ（Ｃ−１８シリカ，Ｈ２Ｏ（１００％）から１０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏまでのグラヂエント）にかけた。適当に分けた部分は合わせて、濃縮し、白色固体を得るまで凍結乾燥した。Ｒｆ（ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ７／２／１）＝０．５２．１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ１．６４（ｄｔ，１Ｈ１２．０，６．０），２．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２，４．９），３．３８（ｄ，Ｊ＝９．６７，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝１１．６５，６．６４，１Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝４．１１，１Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝１２．２４，１．０，１Ｈ），３．６７（ｍ，２Ｈ），１．０４（ｔｄ，Ｊ＝１０．７５，４．８４，１Ｈ），４．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．６８，１．０，１Ｈ），４．２５(ｓ，２Ｈ)，４．３２(Ｔ，Ｊ＝４．４，１Ｈ)，４．３７(Ｔ，Ｊ＝５．８１Ｈ)，４．６−４．７（ｍ，溶媒ピークで不鮮明），５．９５（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），７．４３−７．５３（ｍ，３Ｈ），７．７４（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｑ，Ｊ＝７，３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳ）；Ｃ３５Ｈ４２Ｎ５Ｏ１８Ｐ（［Ｍ−Ｈ］−）に対する計算値，８５０．７；見出された値，８５０．８。
【０９９２】
シチジン−５’−モノスフォリル−［５−（Ｎ−メトキシポリオキシエチレン−（１ｋＤａ）−３−オキシプロピオンアミド）−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］の調製。メトキシポリオキシエチレン−（平均分子量１ｋＤａ）−３−オキシプロピオネート−Ｎ−サクシニミジル  エステル（５２ｍｇ，５２μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４５０μＬ）とトリエチルアミン（３３μＬ，２３８μｍｏｌ）に溶かした。シチジン−５’−モノスフォリル−（５−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）（３０ｍｇ，４８μｍｏｌ）を固体で加えた。水、ｐＨ８（３３０μＬ）を加えて、３０分後、更にＮＨＳ−活性化されたＰＥＧを２８ｍｇ加えた。更に５分後、反応混合物はクロマトグラフ（Ｃ−１８シリカ，メタノール／水のグラヂエント）にかけた。濃縮して白色固体３２ｍｇ（収量４０％）を得た。Ｒｆ＝０．３１（シリカ，ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ；７／２／１）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ１．６６（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３），２．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．２，４．６），２．６４（ｔ，Ｊ＝５．９９，３Ｈ）３．４３（ｄ，Ｊ＝９．５８，１Ｈ），３．６３（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，７０Ｈ），３．７９（ｍ，３．７１のピークで不鮮明）３．８２（ｔ、Ｊ＝６．１９，１Ｈ）３．８８（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，１．０，１Ｈ），３．９５（ｔｄ，Ｊ＝９．０、２．３、１Ｈ），３．９８（ｔ，Ｊ＝５．０６、１Ｈ），４．１２（ｔｄ，Ｊ＝１０．３４，４．６６，１Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝４．８５，２Ｈ），４．３１（ｔ，Ｊ＝４．６４，１Ｈ），４．３５（ｔ，１Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝４．５５，１Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝７．５６，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．５４，１Ｈ）。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ），［Ｍ−ＣＭＰ］-Ｈ］の観測値；１５０６．４，１５５０．４，１５９４．５，１６３８．５，１６８２．４，１７２６．４，１７７０．３，１８１４．４，１８５８．２。
【０９９３】
シチジン−５’−モノスフォリル−｛５−［Ｎ−（２，６−ジメトキシポリオキシエチレン−（２０ｋＤａ）−３−オキシプロピオンアミヂル−リシルアミド）−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート］の調製。２，６−ジ−［メトキシポリオキシエチレン−（平均分子量２０ｋＤａ）−３−オキシプロピオンアミヂル］−リシルアミド−Ｎ−サクシニミジル  エステル（３６７ｍｇ，９μｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（７ｍＬ）とトリエチルアミン（５μＬ，３６μｍｏｌ）に溶かした。シチジン−５’−モノスフォリル−（５−グリシルアミド−３，５−ヂデオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）（３０ｍｇ，４８μｍｏｌ）１．０ｍＬの水に溶かし、反応混合物に加えた。反応は室温で４時間攪拌し、次にクラマトグラフ（ＨＰＬＣ，ＷａｔｅｒｓＸｔｅｒｒａＲＰ８，水／ＮＨ４ＯＨ，１００％から２０％メタノール／水／ＮＨ４ＯＨの１ｍＬ／ｍｉｎのグラヂエント）にかけて、Ｒｆ＝２２．８で白色固体を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ），［（Ｍ−ＣＭＰ）−Ｈ］の観測値；４３０２７．０１（４０，０００−４５，５００）。
【０９９４】
３．ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧの調製
この例はＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧを作るための一般的な操作を説明する。
メトキシポリオキシエチレンプロピオネート  Ｎ−ハイドロオキシサクシンイミド  エステル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，ＭＷ１、０００）（ＴＨＦ中に３４８ｍｇ含む）を１ｍｌ水の中に２５ｍｇのガラクトサミン−１−フォスフェートの溶液に加え、続けて６７μＬのトリエチルアミンを加えた。生じた混合物は室温で１７時間攪拌した。減圧濃縮で粗製の反応混合物が得られ、乾燥濃縮した後、クロマトグラフ（Ｃ−１８シリカ，１０％，２０％，３０％，４０％のＭｅＯＨ水溶液の段階的なグラヂエントを使って）によって精製して、９０ｍｇ（７４％）の生成物が得られた。Ｒｆ＝０．５（シリカ，プロパノール／／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ  ３０／２０／２）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ），観測値１３５６，１４００，１４４４，１４８８，１５３２，１５７６，１６２０。
【０９９５】
［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−２−デオキシ−２−（メトキシポリオキシエチレン−プロピオノイルアミド−１ｋＤａ）−α―Ｄガラクトサミン。２−デオキシ−２−（メトキシポリオキシエチレン−プロピオノイルアミド−１ｋＤａ）−α−１−モノフォスフェート−Ｄ−ガラクトサミン（５８ｍｇ）を６ｍＬのＤＭＦと１．２ｍＬのピリジンに溶かした。次に、ＵＭＰ−モノフォスフォリデート（６０ｍｇ）を加え、生じた混合物は７０℃で４８時間攪拌した。濃縮後、残留物はクロマトグラフ（Ｃ−１８シリカ，１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，８０％のＭｅＯＨ水溶液の段階的なグラヂエントを使って）にかけて、適当な部分部分の濃縮後、５０ｍｇの生成物が得られた。Ｒｆ＝０．５４（シリカ，プロパノール／／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ  ３０／２０／２）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ），観測値  １４８５，１５２９，１６１８，１７０６。
【０９９６】
［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−デオキシ−６−（メトキシポリオキシエチレン−アミノ−２ｋＤａ）−α―Ｄ−ガラクトース。  ［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−カルボキシアルハイド−α―Ｄ−ガラクトース（１０ｍｇ）を２５ｍＭのリン酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ６．０）の２ｍＬに溶かし、メトキシポリエチレングリコールアミン（ＭＷ  ２,０００，７０ｍｇ）を施し、次に０℃で１ＭのＮａＢＨ３ＣＮ溶液を２５μＬ施す。生じた混合物は、−２０℃で3日間凍らせる。反応混合物は、溶離液として流動層Ａには０．０１５ＭのＮＨ４ＯＨ、流動層ＢにはＭｅＯＨを使って、１．０ｍＬ／ｍｉｎの速さでクロマトグラフ（ＨＰＬＣ，Ｗａｔｅｒ  Ｘｔｅｒｒａ  Ｐ８）にかけた。生成物は集められ、濃縮され、固体；Ｒｔ＝９．４分を生成した。Ｒｆ＝０．２７（シリカ，ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ  ７／３）。
【０９９７】
［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−アミノ−６−デオキシ−α―Ｄ−ガラクトース。  酢酸アンモニウム２５ｍｇをリン酸ナトリウム 緩衝（ｐＨ６．０）中の［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−カルボキシアルハイド−α―Ｄ−ガラクトピラノシド（１０ｍｇ）溶液に加えた。次に、１ＭのＮａＢＨ３ＣＮ溶液（２５μＬ）を加え、混合物は24時間攪拌された。溶液は濃縮され、残留物はクロマトグラフ（ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０）にかけられ、固体；Ｒｔ＝９．４分を生成した。Ｒｆ＝０．６２（シリカ，ＥｔＯＨ／０．１  Ｍ  ＮＨ４Ａｃ）。
【０９９８】
［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−デオキシ−６−（メトキシポリオキシエチレンプロピオニルアミド〜２ｋＤａ）−α―Ｄ−ガラクトピラノシド。  ［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−アミノ−６−デオキシ−α―Ｄ−ガラクトピラノシド（５ｍｇ）を１ｍＬのＨ２Ｏに溶かした。次に、メトキシポリエチレングリコピラノシル−ＮＨＳエステル（ＭＷ〜２,０００、６６ｍｇ）を加えた。続いてトリエチルアミン４．６μＬを加えた。生じた混合物は、一晩室温で攪拌し、ＨＰＬＣ（Ｃ−８）で精製し、生成物,Ｒｔ＝９．０分を得た。
【０９９９】
［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−デオキシ−６−（メトキシポリオキシエチレンカルボキサアミド,〜２ｋＤａ）−α―Ｄ−ガラクトピラノシド。  ［α−１−（ウリジン−５’−ジフォスフォリル）］−６−アミノ−６−デオキシ−α―Ｄ−ガラクトピラノシド（１０ｍｇ）をメトキシポリエチレングリコカルボキシ−ＨＯＢＴ（ＭＷ  ２０００、６７ｍｇ）と１ｍＬのＨ２Ｏ中で混合し、続いてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  ハイドロクロライド  ６．４ｍｇとリエチルアミン４．６μＬを加えた。生じた混合物は、室温で24時間攪拌した。混合物はクロマトグラフ（Ｃ−８  シリカ）にかけられ、生成物を得た。
【１０００】
４．ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧの調製
この例はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧを作るための一般的な操作を説明する。スキーム１７の左側で、保護されたアミノ糖ジフォスフォ−ヌクレオチドは酸化され、糖の６位でアルデヒドを形成する。アルデヒドは、シッフ塩基の形成と還元によって対応した１級アミンに変わる。生じた付加体は、ｍ−ＰＥＧのｐ−ニトロフェノール  カーボネートと接触される。それはアミンと反応し、アミド結合を経てｍ−ＰＥＧをサッカライド核に結びつける。スキーム１７の右側最上部で、保護されたアミノ糖ジフォスフォ−ヌクレオチドは、化学酸化剤で処理され、糖核の６位でカルボキシル基を形成する。カルボキシル基は活性化され、ｍ−ＰＥＧ  アミンと反応して、アミド結合を経てｍ−ＰＥＧをサッカライド核に結びつける。スキーム１７の右側下部での反応は、、出発の糖ヌクレオチドが化学酸化剤でなくてデヒドロゲナ−ゼのような酸化酵素と接触される以外は、上右側のものと実質的に同じである。
【１００１】
【図５７】
0005413548.tif 000082
【１００２】
５．ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧの調製
この例（スキーム１８）は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧを作るための一般的な操作を説明する。上に説明する反応は、糖ジフォスフォ−ヌクレオチドに始まる。ここでＲは、水酸基１かまたは保護されたアミン２である。ステップａでは、出発の糖はオキシダ−ゼとカタラ−ゼの混合物で処理し、糖の６位をアルデヒドに変える（３と４）。ステップｃでは、アルデヒドはシッフ塩基の形成と還元によって対応するアミンに変えられる（７と８）。ステップｅでは、アミンは場合によっては活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体で処理され、それによってアミンはアシル化され、対応したｍ−ＰＥＧアミドを生成する（１１と１３）。もう一つ、ステップｆでは、アミンはｍ−ＰＥＧ活性エステルのような活性化ｍ−ＰＥＧ種と接触され、それによって対応したｍ−ＰＥＧアミドを形成する（１２と１４）。ステップｂでは、出発ぶっしつは同様に、カタラ−ゼとオキシダ−ゼで処理し、ハイドロオキシメチル部分を完全に酸化し、６位にカルボキシル基を形成させる。ステップｄでは、カルボキシル部分は活性化され、その後ｍ−ＰＥＧアミン中間体との反応によってｍ−ＰＥＧ付加体（９と１０）へ変換される。これをスキーム１８に示す。
【１００３】
【図５８】
0005413548.tif 000083
【１００４】
アミノ糖フォスフェートは、ｍ−ＰＥＧ  Ｎ−ハイドロオキシ  サクシンイミド活性エステルと接触される。それによって対応した糖−ＰＥＧ−アミドが形成される。アミドは、ＵＭＰ−モルフォリデイトと接触され、対応した活性糖ジフォスフォ−ヌクレオチドとなる。
【１００５】
【図５９】
0005413548.tif 000084
【１００６】
６．ＣＭＰ−ＳＡ−レブリネートの合成
この実施例はＣＭＰ−ＳＡ−レブリネートの合成手順を説明する。
【１００７】
２−レブリンアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノースの調製。イソブチルクロロ
ホルメート（１００μＬ、０．７７ミリモル）を、レブリン酸（８６μＬ、０．８４ミリ
モル）、無水ＴＨＦ（３ｍＬ）およびトリエチルアミン（１２７μＬ、０．９１ミリモル
）の溶液に滴下した。この溶液を３時間、室温で撹拌し、次いでＤ−マンノサミンヒドロ
クロライド（１５１ｍｇ、０．７ミリモル）、トリエチルアミン（１２７μＬ、０．９１
ミリモル）、ＴＨＦ（２ｍＬ）および水（２ｍＬ）を含む溶液に滴下した。反応混合物を
１５時間撹拌し、次いでロータリーエバポレーションにより濃縮乾固した。クロマトグラ
フィー（シリカ、５〜１５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２の段階勾配）を使用して生成物を
単離し、０．１５６ｇ（７３％収率）の白色固体を得た：Rf= 0.41 (シリカ, CHCl3/MeOH
/ 水 6/4/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) 2.23 (s, 3H), 2.24 (s, 3H), 2.57 (td, J=6.54,
3.68, 2H) 2.63 (t, J=6.71, 2H), 2.86-2.90 (m, 4H),3.42 (m, 1H), 3.53 (t, J=9.76
, 1H), 3.64 (t, J=9.43, 1H), 3.80-3.91 (m, 4H), 4.04 (dd, J=9.79, 4.71, 1H), 4.3
1 (dd, J=4.63, 1.14, 1H), 4.45 (dd, J=4.16, 1.13, 1H), 5.02 (d, J=1.29, 1H), 5.1
1 (s, J=1.30, 1H), MS (ES); 理論値 C11H19NO7, 277.27; 測定値 [M+1] 277.9。
【１００８】
５−レブリンアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネートの調製。ピルビン酸ナトリウム（０．６１６ｇ、５．６ミリモル）およびＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（５０Ｕ）を、２−レブリンアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノース（０．１５６ｇ、０．５６ミリモル）の溶液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中）に加えた。反応混合物を３７℃に２０時間加熱し、その後、凍結した。次いで反応混合物はＣ１８シリカを通して濾過し、凍結し、そして凍結乾燥させた。粗固体はフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、最初に１０〜４０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ６／４／０．５を使用する）を使用して精製した。適切な画分を合わせ、そして濃縮して４５ｍｇ（８０％収率）の白色固体を得た：Rf=0.15 (シリカ, CHCl3/MeOH/水 6/4/1); 1H NMR (D2O, 500MHz)81.82 (t, J=11.9, 1H), 2.21 (dd, J=13.76, 4.84, 1H), 2.23 (s, 3H), 2.57 (app q, J=6.6, 2H), 2.86-2.95 (m, 2H), 3.15-3.18 (m, 1H), 3.28-3.61 (複合, 1H), 3.60 (dd, J=11.91, 6.66, 1H), 3.75 (td, J=6.65, 2.62, 1H), 3.84 (dd, J=11.89, 2.65, 1H), 3.88-4.01 (複合, 2H), 4.04 (td, J=11.8, 4.67, 1H), MS (ES); 理論値 C14H23NO10, 365.33; 測定値 ([M-1]-), 363.97。
【１００９】
シチジン−５’−モノホスホリル−（５−レブリンアミド−３，５−ジデオキシ−β−
Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート）の調製。５−レブリンアミ
ド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノスロネート（
５０ｍｇ、１３７マイクロモル）を２ｍＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５バッフ
ァーに溶解し、そして１ＭのＭｎＣｌ２（３００μＬ、３００マイクロモル）を加えた。
ＣＴＰ−２Ｎａ＋（７９ｍｇ、１．５マイクロモル）を５ｍＬのＨＥＰＥＳバッファーに
溶解し、そして糖に加えた。シアリルトランスフェラーゼ／ＣＭＰ−ノイラミン酸シンテ
ターゼ融合酵素（１１Ｕ）を加え、そして反応混合物を室温で４５時間撹拌した。反応混
合物を１０，０００ＭＷＣＯフィルターに通して濾過し、そして濾液（これは反応の生成
物を含む）をさらに精製せずに直接使用した：Ｒｆ＝０．３５（シリカ、ＩＰＡ／水／Ｎ
Ｈ４ＯＨ  ７／２／１）。
【１０１０】
Ｂ．ペプチドのグリココンジュゲーションとグリコＰＥＧ化
α−プロテアーゼ  インヒビター（α―アンチトリプシン）
７．組み換えグリコタンパクアンチトロンビン  ＩＩＩ，フェツインそしてα１−アンチトリプシンのシアル化
この例は幾つかの組換えペプチドのシアル化形の調製を説明する。
【１０１１】
ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使った組み換えグリコタンパクのシアル化。幾つかのグリコタンパクは、組み換え型ネズミＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩによるシアル化の可能性に対して調べられた。これらのグリコタンパクそれぞれに対して、シアル化は、商業用の生産物として個別のリコタンパクの発展において重要な工程段階であろう。
【１０１２】
反応条件。反応条件は、表１１にまとめた。シアリルトランスフェラーゼ反応は室温と３７°の間で２４時間行われた。シアリル化の程度は、グリコタンパクにリンクしたオリゴ糖に挿入された１４Ｃ−ＮｅｕＡｃの量を決めることによって定めた。各タンパク質の反応条件は表１１を参照。
【１０１３】
【表１１】
0005413548.tif 000085
【１０１４】
表１２に提示した結果は、使った酵素は低レベルにもかかわらず、著しい程度のシアル化が達成されたことを実証している。本質的に、入手できる末端ガラクト−スの見積もりに基づいて、完全なシアル化されたものが得られた。表１２は、シアル化反応の結果を示す。種々の研究の比較の基礎として、酵素量はタンパク質ｍｇ当たり（ｍＵ／ｍｇ）を使った。示した幾つかの例で、２４時間後の実質上完全なシアル化を得るために、ｍｇタンパク質当たりの７−１３ｍＵ  ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩだけが必要とされた。
【１０１５】
【表１２】
0005413548.tif 000086
表１２            分析結果
【１０１６】
これらの結果は、ウシＳＴ６Ｇａｌ  Ｉでの詳細な研究で報告された結果と著しく違っている。そこでは５０ｍＵ／ｍｇタンパク質が５０％以下のシアル化を与え、そして２４時間で１０７０ｍＵ／ｍｇタンパク質が８５−９０％のシアル化を与えた。Ｐａｕｌｓｏｎら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２３６３−２３７１；Ｐａｕｌｓｏｎら（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４．他のグループによるネズミα２，３とα２，６シアリルトランスフェラーゼの研究は、アジアロ−ＡＧＰの完全なシアル化は１５０−２５０ｍＵ／ｍｇタンパク質の酵素濃度が必要であることを明らかにした（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５−１３８５３）。これらの初期の研究はひとまとめにして、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉシアリルトランスフェラーゼは、５０ｍＵ／ｍｇ以上を必要とし、完全なシアル化を達成するには１５０ｍＵ／ｍｇまで必要であることを提案した。
【１０１７】
この例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼを使う組み換えグリコタンパクのシアル化は期待されるより少ない酵素で良いことを実証する。１ｋｇ規模の反応に対して、初期の研究で示された１００，０００−１５０，０００単位ではなくて、約７，０００単位のＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼが必要であろう。天然の原料からの酵素の精製は、１−２ヶ月の作業の後大規模な調整でわずか１−１０単位しか得られなく、高額なものとなる。ＳＴ６Ｇａｌ  ＩとＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼは両方とも、組換え型シアリルトランスフェラーゼとして生産され、２つの酵素の発現が同レベルであると仮定すると、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼに比較して、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉに１４−２１倍以上の醗酵規模が必要とされるであろう。ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼに対して、イーストで０．３Ｕ／ｌの発現レベルが報告されている（Ｂｏｒｓｉｇら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１０：１４−２０）。ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼの１０００Ｕ／リットルの発現レベルは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（黒色アスペルギルス）で達成されている。ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉシアリルトランスフェラーゼを使って１ｋｇのグリコタンパクをシアル化するのに十分な酵素を作るためには、現在の発現レベルで、イースト醗酵の３００−４５０，０００リットルが必要とされるであろう。それに対して、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼを使った１ｋｇのグリコタンパクのシアル化には Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの１０リットル以下の醗酵が必要となるであろう。したがって、大規模シアル化反応のためのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩシアリルトランスフェラーゼ生産に要求される醗酵容量は、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉの生産に対して要求されるより１０−１００倍小さいであろう。シアリルトランスフェラーゼ生産の価格は比例して小さくなるであろう。
【１０１８】
Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体
８．Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体のグリコ−改造
この例は、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体の生体外改造の仕方を説明する。
【１０１９】
モノクローナル抗体のＦｃドメインにおけるＡｓｎ２９７で、１つの保存サイトでのＮ−グリコシル化は、その薬動力学的挙動やエフェクター機能を変えることができる。（Ｄｗｅｋら，１９９５，Ｊ．Ａｎａｔ．１８７：２７９−２９２；Ｂｏｙｄら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１２１１−１３１８；Ｌｕｎｄら，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５，９：１１５−１１９；Ｌｕｎｄら，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−４９６９；Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３９３−３４０２；Ｆｌｙｎｎ  ＆  Ｂｙｒｄ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：５７４−５８１）。細胞培養醗酵の間または病的状態において、このサイトでグリコシル化のパターンに著しい不均質が生じる。Ｆｃドメインのグリコシル化の種々のパターンは、０，１，２個の末端ガラクト−ス残基（それぞれＧ０，Ｇ１，Ｇ２、表１３参照）を持つ複合２触角構造が特徴である。
【１０２０】
末端ガラクトシル化や先端を切り取ったＮ−グリコ形や二等分修飾の変化形のような、観測されたグリコ形の変化形は、抗体の治療特性、特に補体結合や補体活性化を通して目標とした細胞殺滅を仲立ちする能力に影響することが示された（Ｂｏｙｄら，１９９５，ｓｕｐｒａ；Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９８，ｓｕｐｒａ，Ｍｉｍｕｒａら，２０００，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：６９７−７０６；Ｄａｖｉｅｓら，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−２９４）。
【１０２１】
表１３に示すように、種々のＣｒｉ−ＩｇＧ１  抗体のグリコ形を得それらのＦｃエフェクター機能をテストするために、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体は、エキソグリコシダ−ゼを使って、シアル酸を欠いたグリコ形（Ｇ２，Ｇ１）、シアル酸とガラクト−スを欠いたグリコ形（Ｇ０）そしてシアル酸とガラクト−スとＮ−アセチルグルコサミンを欠いたグリコ形（Ｍ３Ｎ２Ｆ）へと段階的に切り戻された。これらの分子は、種々のグリコシルトランスフェラーゼや適当な糖を使って著しく変えられた。修飾条件は、元の抗体グリカン構造を次のような種々のグリコ形へ変換させた。即ち、Ｍ３Ｎ２、Ｇｎ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２（ＧｎＴ−Ｉを使って付加されたＧｌｃＮＡｃ部分を持つＭ３Ｎ２グリコ形）、Ｇ０、分割−Ｇ０（ＧｎＴ−ＩＩＩを使って付加された分割されたＧｌｃＮＡｃを持つＧ０部分）、ガラクトシル化分割−Ｇ０（付加した末端ガラクト−ス部分を持つ分割−Ｇ０グリコ形）、Ｇ２、１個シアル化されたＳ１（α２，６）−Ｇ２（α２，６−シアリルトランスフェラーゼを使って付加された１つの末端シアル酸部分を持つＧ２グリコ形）、Ｓ１（α２，３）−Ｇ２（α２，３−シアリルトランスフェラーゼを使って付加された１つの末端シアル酸部分を持つＧ２グリコ形）、ジシアル化Ｓ２（α２，３）−Ｇ２（Ｇ２グリコ形）。総てのグリコ改造ステップの後、グリカン構造は抗体タンパクから酵素的に放出され、キャピラリー電気泳動分析、２ＡＡ  ＨＰＬＣプロファイリング分析やＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分離など、種々の方法によって分析された。
【１０２２】
【表１３】
0005413548.tif 000087
＊表１３．隣の訳：  グリコ形の略語
【１０２３】
今これらの３つの実験で使われた物質と方法を記述する。
【１０２４】
Ｃｒｉ−ＩｇＧ１モノクロナ−ル抗体。  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ，ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒＩｍｍｕｎｅ  Ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ  から得た。抗体は非組み換え型抗体であり、ヒト骨髄腫から単離した。抗体は３つの方法を使って準備した。最初の方法、“ＤＥＡＥ”と呼ぶことにするが、抗体はＤＥＡＥイオン交換カラムを使った比較的穏やかな条件で単離した。第二の方法、“ＳＰＡ”と呼ぶことにするが、抗体は、低ｐＨ溶出ステップでタンパクＡカラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｅｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）上で精製した。第３の方法、“Ｆｃ”と呼ぶことにするが、抗体は、抗体のＦｃ部分だけが残るようにプロテアーゼで処理され、抗原結合ドメインが取り除かれた。抗体の精製に対するこれらの方法は、技術のある業者には良く知られており、ここで詳細は繰り返さない。
【１０２５】
改造された抗体の親和性精製。エキソグリコシダーゼあるいはグリコシルトランスフェラーゼによって修飾された抗体は、ＰｒｏＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４−高流速カラムで親和性精製した。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．７で抽出し、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液，ｐＨ９．５で中和した。抽出物は、ＮＡＰ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）を使って、１００ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．５あるいは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２のような、グリコシル化の次のステップのために適当な緩衝液へとバッファー交換をした。  改造最終生成物は、８ｋＤａのＭＷＣＯでＴｕｂｅ−Ｏ−ＤｉａｌｙｚｅｒｓＴＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）中、４℃で  大々的に透析した。
【１０２６】
Ｃｒｉ−抗体の生体外グリコシダ−ゼ処理。  抗体は、ＮＡＰ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）を使って、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ／クエン酸Ｎａ，ｐＨ６．０へバッファー交換した。糖部分のインビトロでの切り戻しは、（末端シアル酸部分を取り除くために）１晩３７℃で抗体（５ｍｇ／ｍＬ）を２０Ｕ／ｍｇのタンパク質ノイラミニダーゼと接触させることによって、（末端ガラクト−ス部分を取り除いてＧ０グリコ形を得るために）１晩３７℃で２０Ｕ／ｍｇのタンパク質β−ガラクトシダーゼと接触させることによって、そして／あるいは（末端Ｎ−アセチルグルコサミンを取り除いてＭ３Ｎ２グリコ形を得るために）１晩３７℃で２Ｕ／ｍｇのタンパク質β−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｊａｃｋ  Ｂｅａｎ，Ｓｅｋａｇａｋｕ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎｎ  からの）と接触させることによって、段階的に行われた。試料は上に記したように、親和性精製を行った。
【１０２７】
Ｃｒｉ−抗体の生体外グリコシル化。  生体外のＧｎＴ１修飾は、基質として１ｍｇ／ｍｌのＭ３Ｎ２グリコ形抗体を使い、２５ｍＵ／ｍｇの組換え型ヒトβ１，２−マンノシル−ＵＤＰ−Ｎ−グルコサミノシルトランスフェラーゼを使って、１００ｍＭのＭＥＳ,ｐＨ６．５と５ｍＭのＭｎＣｌ２と５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと０．０２％のＮａＮ３の緩衝液中で、３２℃で２４時間行われた。１つのアリコートをグリカン分析のために取り除き、生成物は、上に記したように、親和性精製を行った。
【１０２８】
等分したグリコ形の生体外修飾は、基質として１ｍｇ／ｍｌのＭ３Ｎ２グリコ形抗体を使い、２５ｍＵ／ｍｇのβ１，２−組み換え型ヒトマンノシル−ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミノシルトランスフェラーゼＩと２５ｍＵ／ｍｇのβ１，２−組み換え型ヒトマンノシル−ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミノシルトランスフェラーゼＩＩと３．５ｍＵ／ｍｇのβ１，４−組み換え型マウスマンノシル−ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミノシルトランスフェラーゼＩＩＩを使って、１００ｍＭのＭＥＳ,ｐＨ６．５と１０ｍＭのＭｎＣｌ２と５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと０．０２％のＮａＮ３の緩衝液中で、３２℃で２４時間行われた。１つのアリコートをグリカン分析のために取り除き、生成物は、上に記したように、親和性精製を行った。
【１０２９】
生体外のガラクトシル化は、Ｇ０グリコ抗体を使うかまたは０．６Ｕ／ｍｇの組み換え型牛乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させてグリコ形抗体を等分して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクト−ス，５ｍＭ  ＭｎＣｌ２  の緩衝液中で、３２℃で２４時間行われた。１つのアリコートをグリカン分析のために取り除き、生成物は、上に記したように、親和性精製を行った。
【１０３０】
生体外のシアル化は、Ｇ２グリコ形抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を使って、それを０．１Ｕ／ｍｇのＳＴ３Ｇａｌ３または０．１Ｕ／ｍｇのＳＴ６Ｇａｌ１，５ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸と接触させることにより、３２℃で２４時間行われた。１つのアリコートをグリカン分析のために取り除き、生成物は、上に記したように、親和性精製を行った。
【１０３１】
グリカン分析
レーザー誘起蛍光検出でのキャピラリー電気泳動。  バッファー成分と糖ヌクレオチドは、希釈し、そして、ＭｉｃｒｏｃｏｎＴＭ  ＹＭ−３０  マイクロコンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中での濃縮することによって、グリコ改造した抗体のアリコートから取り除かれた。Ｎ−リンクのオリゴ糖は、製造業者によって提供される方法を使って、それをＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，  Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と接触させることによって、タンパク質から切り離した。短的に、試料は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５，０．１％  ＳＤＳと５０ｍＭ  β−メルカプトエタノールの緩衝液中で、１０時間１００℃で変性させた。次に、０．７５％（Ｖ／Ｖ）および１０Ｕ  ＰＮＧａｓｅＦ／２００μｇタンパク質となるように、ＴＸ１００を加えた。３７℃で３時間の培養の後、タンパク質はエタノール沈殿され、上澄を乾燥した。解放されたフリーのオリゴ糖は次に、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルフォン酸でラベルして、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）からのカーボハイドレートのラベルと分析のキットで、製造業者によって示されているように、キャピラリー電気泳動による分析を行った（Ｍａ  ａｎｄ  Ｎａｓｈａｂｅｈ，１９９９，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：５１８５−５１９２  も参照）。
【１０３２】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、ｅＣＡＰＴＭＮ−ＣＨＯでコートされたキャピラリー（内径５０μｍ，検出長さ４０ｃｍ；Ｂｅｃｋａｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）中で、Ｐ／ＡＣＥＴＭＭＤＱグリコタンパク系（Ｂｅｃｋａｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使って、レーザー誘起蛍光検出器（Ｂｅｃｋａｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で行われた。試料は、１０秒間、２０ｐｓｉの圧力でカートリッジへ挿入され、２０分間逆極性２５ｋＶで分離した。カートリッジ温度は２０℃に保った。電気泳動像は、励起波長４８８ｎｍと発光波長５２０ｎｍでのレーザー誘起蛍光検出によって、もたらされた。
【１０３３】
Ｇ０（コアフコースを持つオリゴ糖、アジアロ、アガラクト、２触角）、Ｇ２（コアフコースを持つオリゴ糖、アジアロ、アガラクト、２触角）そしてフコース無しのＧ２を含めて、カーボハイドレート標準（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ(R)，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）は、Ｍ３Ｎ２（コアフコースの無いＮ−リンクのトリマンノシルコア）、Ｓ１−Ｇ２（コアフコース無しのモノシアル化，ガラクトシル化２触角オリゴ糖）、Ｓ２−Ｇ２（コアフコース無しのジシアル化，ガラクトシル化２触角オリゴ糖）（Ｇｌｙｋｙｏから、ＰｏｌｙＺｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）、Ｍ３Ｎ２Ｆ（コアフコースを持つＮ−リンクのトリマンノシルコア）およびＮＧＡ２Ｆ（コアフコースと等分されたＧｌｃＮＡｃを持つＮ−リンクのオリゴ糖  アジアロ、アガラクト、２触角）は、１−アミノピレンー３，６，８−トリスルフォネート（ＡＰＴＳ，Ｂｅｃｋａｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）でラベルされ、抗体から解放されたグリカンの分布を同定するために使われた。
【１０３４】
２−ＡＡ  ＨＰＬＣ。グリカンから解放されたＰＮＧａｓｅＦは、若干修正したＡｎｕｍｕｌａとＤｈｕｍｅによって記述された方法にしたがって、２−ＡＡ（２−アントラニル酸 ）でラベルされた（１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６８５−６９４）。還元的にアミノ化されたＮ−グリカンは、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  アミノカラム（４．６ｍｍＸ１５０ｍｍ）Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使って分析した。分離のために使った2つの溶媒は、Ａ）２％酢酸と１％テトラハイドロフランを含むアセとニトリルと、Ｂ）５％酢酸と３％トリエチルアミンと１％テトラハイドロフランを含む水である。
【１０３５】
中性の２ＡＡ−ラベルしたグリカンを分離するために、カラムは７０％のＡで５分間定組成的に溶離し、続いて、７０％から５０％Ｂの線形勾配で６０分、５０％から５％Ｂの急勾配で５分、そして５％のＢで１０分最終的な定組成溶離を行った。溶離ピークは、励起波長２３０ｎｍ、検出波長４２０ｎｍでの蛍光検出法を使って検出した。この勾配条件で、Ｇ０グリコ形は約３０．５分で溶離し、Ｇ１グリコ形は約３４．０分で溶離し、Ｇ２グリコ形は約３７．０分で溶離する。これらの条件では、フコースの存在は溶離時間を変化させない。
アニオン性の２ＡＡ−ラベルしたグリカンを分離するために、カラムは７０％のＡで２．５分間定組成的に溶離し、続いて、７０％から５％Ａの線形勾配で９７．５分、そして５％のＡで１５分最終的な定組成溶離を行った。溶離ピークは、励起波長２３０ｎｍ、検出波長４２０ｎｍでの蛍光検出法を使って検出した。この勾配で、中性グリカンは１８．００−２９．００分の間で溶離すると期待され、１価のグリカンは３０．００−４０．００分で溶離し、２価のグリカンは４３．００−５２．００分で溶離し、３価のグリカンは５４．００−６３．００分で溶離し、４価のグリカンは６５．００−７４．００分で溶離する。
【１０３６】
還元的にアミノ化されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ分析。２−アントラニル酸（２ＡＡ）でラベルされた ＰＮＧａｓｅ解放Ｎ−グリカンの小アリコートは次に、水に浮かせたＭＦ−ミリポア膜フィルター（０．０２５μｍ、直径４７ｍｍ）で 45分間透析した。透析したアリコートは、ＳｐｅｅｄｖａｃＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）で乾燥し、少量の水に溶かし、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（10ｇ／Ｌ）の水／アセとニトリル（５０：５０）溶液と混合した。
【１０３７】
混合物は、ＭＡＬＤＩターゲット上で乾燥され、線形／負イオンモードで働かせたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＥ−Ｐｒｏ  質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使って分析した。オリゴ糖構造は、観測された質量・電荷比と文献の手続きに基づいて決定した。定圧構造を完全に明らかにする試みはなされなかった。
【１０３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。グリコ改造された抗体の安定性を決めるために、総ての試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。しりょうの最終的な生成は、８−１６％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って非還元条件で行われた。ウシ血清アルブミンは、定量条件として還元条件で行われた。ゲルは視覚化するためにＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染めた。
【１０３９】
今、実験結果を記述する。
【１０４０】
ヒト骨髄腫細胞で発現されたＣｒｉの天然のグリコ形。多発性骨髄腫の患者の血清から精製したＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、種々のグリコ形を含んでいる。図９７Ａ−９７Ｃは、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から酵素的に解放されたグリカンのＨＰＬＣプロファイルを示す。図９８Ａ−９８Ｃは、ヒト骨髄腫細胞で発現されたＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体から酵素的に解放されたグリカンのＭＡＬＤＩプロファイルを示す。主要な形は、アンダーガラクトシル化されたＧ０、Ｇ１で、Ｇ２およびシアル化された構造は相対的に主要なものではない（表１４と図９７Ｃ）。モノクロナ−る抗体の治療特性に関する修飾グリカンの効果をテストするために、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、この抗体の異なるグリコ形を発生させるために、生体外のエクソグリコシダ−ゼ切断と生体外のグリコシル化改造によって修飾された。
【１０４１】
【表１４】
0005413548.tif 000088
＊表１４．の隣の訳：ＨＰＬＣによって分離されたヒト骨髄腫細胞発現Ｃｒｉ−ＩｇＧ１の種々のグリコ形の相対量は個々のピークの面積から計算された。
【１０４２】
最初、エクソグリコシダ−ゼ切断とグリコシル化の各ステップの最適化は小規模（各１００μｇ）で行われた。
【１０４３】
Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体のトリマンノシルコアのグリコ形（Ｍ３Ｎ２）。Ｍ３Ｎ２は、ノイラミニダーゼ、β１，４−ガラクトシダ−ゼ、β１−２，３，４，６Ｎ−アセチルへキソサミニダーゼを含めたグリコシダ−ゼの段階的な処理によって作られた。グリコ改造されたＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体試料上の末端ガラクト−スとＧｌｃＮＡｃの除去を算定するために、定量的なキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法が使われた。グリカンは、ＰＮＧａｓｅＦでグリコ改造された抗体から酵素的に解放され、還元末端で８−アミノピレン−１，３，６−トリスルフォン酸（ＡＰＴＳ）で誘導体化された。生じた生成物は、カラム上のレーザー誘起蛍光検出（ＬＩＦ）でのＣＥにより分析された（Ｍａ  ＆  Ｎａｓｈａｂｅｈ，１９９９，ｓｕｐｒａ）。グリカンの分離は流体力学的なサイズに基づいているので、ＡＰＴＳラベルのグリカンは、サイズが増える順に移動する（Ｍ３Ｎ２＜Ｍ３Ｎ２Ｆ＜Ｇ０＜Ｇ１＜Ｇ２）。
【１０４４】
図９９Ａ−９９Ｄは、ＡＰＴＳで誘導体化されたグリカン標準と共に、グリコ改造されたＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンを示す電気泳動像を示す（図９９Ａ）。グリコ形は、電気泳動の移動度を標準値と比較することによって同定した。各グリカン種の相対量は、各同定ピークの相対面積割合から計算された。結果は表１５に示されている。Ｍ３Ｎ２Ｆグリコ形は、ＤＥＡＥ−Ｃｒｉのグリカンが９１％、ＳＰＡ−Ｃｒｉのグリカンが８０％、Ｆｃ−Ｃｒｉのグリカンが１００％であることを示す。ＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２Ｆグリコ形で生じたＧｌｃＮＡｃの不完全な除去（表１５参照）は、ＤＥＡＥ−Ｃｒｉ（８．６％）とＳＰＡ−Ｃｒｉ（〜２０％）からのグリカン構造で観測された。グリコ形ＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２Ｆは、ＧｎＴ−Ｉによって付加されるような、１個のＧｌｃＮＡｃを持つＭ３Ｎ２Ｆグリコ形である。
【１０４５】
【表１５】
0005413548.tif 000089
＊表１５．の隣の訳：図９９でのＣＥプロファイルの個々のピークの面積が計算され、Ｍ３Ｎ２Ｆグリコ形とＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２Ｆグリコ形の相対量が決定された。
【１０４６】
脱ガラクトシル化されたグリコ形（Ｇ０）。Ｇ０グリコ形を持つＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体をノイラミニダーゼとβ１，４−ガラクトシダーゼで各反応を２４時間段階的に処理することによって得られた。グリコ改造された抗体から解放されたグリカンはＣＥとＨＰＬＣとＭＡＬＤＩとによって分析された。図１００Ａは、解放されたグリカンのＣＥプロファイルを示す。３つの試料総てで、標準との比較に基づいてＧ０グリコ形と指定された１つのピークしか観測されなかった。
【１０４７】
【表１６】
0005413548.tif 000090
＊表１６．の隣の訳：ＣＥとＨＰＬＣによって決定されたＣｒｉ−ＩｇＧ１のＧ０グリコ形の相対量
【１０４８】
ＣＥによるグリカン分析に加えて、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体の改造グリカンによって表されるＧ０グリコ形の割合を決めるために、定量的なＨＰＬＣ法が同様に使われた。グリコ改造された抗体上のグリカンの分布は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆでグリカンを酵素的に解放し、還元末端で、解放された生成物をアントラニル酸（２−ＡＡ）で誘導体化することによって、観測された。誘導体化された混合物は、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄカラムによって、蛍光検出法で分離された。図１０１Ａ−１０１Ｃは、解放グリカンから得られたクロマトグラフを示す。ＨＰＬＣの結果は、３つの試料総てで１つのピークしか観測されなかったのと同じように、ＣＥ分析結果が確認された。ＣＥとＨＰＬＣのデータと一致して、ＭＡＬＤＩ分析も同様に、Ｇ０グリコ形に対する殆ど完全なグリコ改造を示した（図１０２Ａ−１０２Ｃ）。
【１０４９】
完全にガラクトシル化されたＧ２グリコ形（Ｇ２）。Ｃｒｉ−ＩｇＧ抗体は、ノイラミニダーゼで処理され、同様にガラクトシル化されたアジアロ−グリコ形を生じた。これらのアジアロ−グリコ形は次に、Ｇ２グリコ形を持つように抗体をグリコ改造するために、０．６Ｕ／ｍｌのウシβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼとガラクト−スドナー分子で処理された。
【１０５０】
末端ガラクトシル化の程度はグリカン分析によって決定された。ＣＥおよびＨＰＬＣ両方のプロファイルで、１つの主要ピークしか観測されなかった（図１０３Ａ−１０３Ｃと図１０４Ａ−１０４Ｃ）。このピークは各ケースにおいてＧ２グリコ形に対応する。全ピーク面積割合の計算は、元の試料のガラクトシル化グリコ形からＧ２への殆ど完全な（〜９０％）変換を示した（表１４参照）。これらの結果は表１７にまとめた。更に、グリカンのＭＡＬＤＩ分析は、３つの試料総てでＧ２グリコ形への殆ど完全なグリコ改造であることを支持した（図１０５Ａ−１０５Ｃ）。
【１０５１】
【表１７】
0005413548.tif 000091
＊表１７．の隣の訳：ＣＥとＨＰＬＣ分析の全ピーク面積パーセントで決めた改造Ｃｒｉ−ＩｇＩ１抗体のＧ２グリコ形の相対量
【１０５２】
Ｇｎ−Ｉ−グリコ形（ＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２）．  Ｍ３Ｎ２グリコ形Ｃｒｉ−ＩｇＧ抗体は、分子に１つのＧｌｃＮＡｃ部分を付加することによってＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２グリコ形へグリコ改造した。分子は、２５ｍＵ  ＧｎＴ−Ｉ／ｍｇ抗体と適当なＧｌｃＮＡｃドナー分子とに接触させた。解放されたグリカンのＣＥ、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ分析（それぞれ図１０６Ａ−１０６Ｄ、１０７Ａ−１０７Ｃ、１０８Ａ−１０８Ｃ）は、もとのＭ３Ｎ２Ｆグリコ形は完全に改造されることを示した。しかしながら、修飾構造の４０−６０％しかＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２構造でなく、約３０％がＧ０グリコ形であった。Ｇ０グリコ形の存在」はもとのＭ３Ｎ２形を作る時の不完全なＧｌｃＮＡｃ切断の結果である可能性がある。
【１０５３】
等分グリコ形（ＮＧＡ２Ｆ）．  Ｍ３Ｎ２グリコ形Ｃｒｉ−ＩｇＧ抗体は、３つのトランスフェラーゼ，（ＧｎＴ−Ｉ，ＧｎＴ−ＩＩ，ＧｎＴ−ＩＩＩ）と適当なＮ−アセチルグルコサミンとの組み合わせに接触させることによって、ＮＧＡ２Ｆグリコ形へグリコ改造された。反応は２４時間後に完了した。等分―ＧｌｃＮＡｃ部分がグリカンに加えられた程度を決めるために、ＣＥ分析を使って、グリコ改造された抗体上に存在するグリコ形の割合を決めた。
【１０５４】
図１０９Ａ−１０９Ｄは、グリコ改造されたＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンのＣＥ分析から得られた電気泳動像を示す。改造後は４つのピークが現れた。主ピークはＮＧＡ２Ｆ標準グリコ形と同じ保持時間で移動した。他の３つの主ピークは不完全な改造グリカンであると思われる。比較のために、定量ＨＰＬＣ法も同様に利用された。そこでは２−ＡＡラベルのグリカンはサイズの大きくなる順に溶離した（Ｇｎ１＜Ｇ０＜ＮＧＡ２Ｆ）。図１１０Ａ−１１０Ｃに示すように、グリカンのＣＥ分析からも同様の結果が得られた。ＣＥ分析、ＨＰＬＣ分析、いずれを使ってもＭ３Ｎ２Ｆは見出されなかった。ＮＧＡ２Ｆは、ＣＥ分析とＨＰＬＣ分析の両方で、主ピークであった。試料中になお残っているＧｎ１とＧ０グリカンは、不完全な修飾の結果であると思われる。大抵のもとのＭ３Ｎ２Ｆグリコ形は、３つのＧｌｃＮＡｃ部分によってＮＧＡ２Ｆグリコ形へ改造された（６０〜７０％）。約１５〜１８％は、2つのＧｌｃＮＡｃ部分の付加によってＧ０グリコ形へ改造された。そしてごく少量（〜７％）は、ただ１つのＧｌｃＮＡｃ部分の付加によって改造された。解放されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析（図１１１Ａ−１１１Ｃ）は、ＣＥ分析やＨＰＬＣ分析（図１０９と１１０）と一致して、１つ、２つ、３つの末端ＧｌｃＮＡｃ部分を持つグリコ形のピークを示す。各グリカン種の相対量は、それぞれ示されたピークの相対面積割合から計算された。それを表１８にまとめた。
【１０５５】
【表１８】
0005413548.tif 000092
＊表１８．の隣の訳：ＣＥとＨＰＬＣによって決められたＧｎＴ−Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ改造Ｃｒｉ−ＩｇＧ１からの種々のグリコ形の相対量
【１０５６】
ガラクトシル化された等分（Ｇａｌ−ＮＧＡ２Ｆ）グリコ形。  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体のＮＧＡ２Ｆグリコ形は、ウシβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと適当なガラクトースドナーでグリコ改造された。末端ガラクト-ス部分は、０．６Ｕ／ｍｌのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを使って、付加された。図１１２Ａ−１１２Ｄは、２−ＡＡ  ＨＰＬＣをつかって得られた電気泳動像を示す。短的に、ＧａｌＮＡｃが末端となるグリコ形は約１００％ガラクトシル化された。ＤＥＡＥ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１について図１１２Ａと１１２Ｂを比較すると、そしてＦｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１について図１１２Ｃと１１２Ｄを比較すると、ＧｎＴ−Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ改造グリカンの２−ＡＡ  ＨＰＬＣプロファイル（図１１２Ａと１１２Ｃ）は、ＧａｌＴ１によって修飾されるので、総てのグリカンピークは、付加したガラクト−ス部分からのサイズの増加のために、遅れて溶離される（図１１２Ｂと１１２Ｄ）。これらの結果はさらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって確認された。
【１０５７】
Ｃｒｉ−ＩｇＧ１のシアル化された（Ｓ２Ｇ２）グリコ形。  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体のグリコ改造Ｇ２グリコ形はさらに、ＳＴ３Ｇａｌ３とＳＴ６Ｇａｌ１の両方を使って改造された。図１１３Ａ−１１３Ｃは、ＳＴ３Ｇａｌ３で改造されたＧ２グリコ形のＨＰＬＣプロファイルを示す。大抵のＧ２グリコ形はＳ２Ｇ２グリコ形（２つの付加末端シアル酸部分を持つＧ２グリコ形；〜７０％，表１９参照）へ変換された。ごく少量はＳ１Ｇ２グリコ形（１つの付加末端シアル酸部分を持つＧ２グリコ形；＜２５％，表１９参照）である。これらの結果はさらに、図１１４Ａ−１１４Ｃに示すＭＡＬＤＩ分析で確認された。ＭＡＬＤＩデータはまた同様に、総てのグリコ形は、Ｓ２Ｇ２グリコ形かＳ１Ｇ２グリコ形のいずれかへシアル化された。
【１０５８】
【表１９】
0005413548.tif 000093
＊表１９．の隣の訳：ＨＰＬＣによって決めたＳＴ３Ｇａｌ３改造Ｃｒｉ−ＩｇＧ１からの種々のグリコ形の相対量
【１０５９】
比較すると、Ｇ０グリコ形のＳＴ６Ｇａｌ１改造は、ＳＴ３Ｇａｌ３改造の完結のレベルに達しなかった。図１１５Ａ−１１５Ｄと図１１６Ａ−１１６Ｃはそれぞれ、ＣＥ分析とＨＰＬＣ分析から得られた結果を示す。どのグリコ改造試料でも、Ｓ２Ｇ２グリコ形は見られ名かった。しかしながら、総てのＧ２グリコ形はＳ１−Ｇ２へ変換された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は同様に、これらのデータを支持する（図１１７Ａ−１１７Ｃ）。
【１０６０】
Ｃｒｉ−ＩｇＧ１の改造グリカンの安定性。最後に、エキソグリコシダーゼ処理とグリコシル化によって改造されたＣｒｉ−ＩｇＧ１グリカンの安定性を調べた。各グリコ改造されたＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、４℃で保存され、改造後２週間での分解について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。図１１８Ａ−１１８Ｅに示すように、改造ＤＥＡＥ抗体とＳＰＡ抗体は両方とも約１５０ｋＤａの分子量を保った。このことは、行われたグリコ改造の性質に関係なく、少しから全く、分解が起こっていないことを示している。Ｆｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、約３８ｋＤａの分子量を保った。このことはまた同様に、行われたグリコ改造の性質に関係なく、少しから全く、分解が起こっていないことを示している。
【１０６１】
改造Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体のエフェクター機能の生物学的検定。  エフェクター機能の生物学的検定は、Ｍｉｍｕｒａらの操作（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３７：６９７−７０６）から導かれた。Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体のグリコ形のＩＣ５０は、天然ａｎｔｉ−ＮＩＰ抗体で増感の赤血球によって誘発されたＵ９３７細胞の超酸化物応答の抑制によって決定された。
【１０６２】
単球Ｕ９３７細胞は、細胞の区別を引き出すためと超酸化物を生じる容量を引き出すために  １００単位／ｍＬのインターフェロンガンマの存在下で2日間培養された。次に細胞は、洗浄され、フェノールレッド無しで２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４と０．１５ｍＭ  ＢＳＡを含むハンクス平衡塩類溶液中、２Ｘ１０６細胞／ｍＬで再けん濁させた。赤血球は、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体の種々のグリコ形の無い状態あるいは存在する状態で、３７℃３０分間培養してａｎｔｉ−ＮＩＰ（５−ｉｏｄｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）で増感された。赤血球は次に、ＰＢＳで３度洗浄され、ＨＢＳＳ−ＢＳＡ中に２．５Ｘ１０７細胞／ｍＬで再けん濁させた。Ｕ９３７細胞（１００μｌ，２Ｘ１０６細胞／ｍＬ）がプラスチック・試験管に加えられ、そしてルシゲニン（２０μｌ，２．５ｍＭ）が加えられた。次に増感赤血球（８０μｌ，２．５Ｘ１０７／ｍＬ）がその試験管に加えられた。超酸化物アニオン生成は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＶ５９３照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，  Ｂｕｎｄｏｏｒａ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使ったルシゲニン増感化学発光によって３７℃、３０分測定された。
【１０６３】
Ｇ０とＭ３Ｎ２グリコ形Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体はそれぞれ、天然抗体と比べて９２％と８５％の相対抑制値を持った。しかしながら、天然Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体は、コアフコースを欠いていた。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ら（２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０）は、コアフコースを欠いていることは抑制値を１０倍改善するであろうと暗示している。これらの結果に基づくと、ガラクトシル化等分Ｇ０グリコ形の抑制値は等分グリコ形より大きいこと、そして順に、Ｇ０グリコ形はＧ２グリコ形よりずっと大きく、Ｇ２グリコ形はジシアル化Ｇ２グリコ形やモノシアル化Ｇ２グリコ形にほぼ等しく、これらは天然抗体グリコ形より大きく、天然抗体グリコ形はＧ０グリコ形より大きく、Ｇ０グリコ形はＭ３Ｎ２グリコ形より大きいということが期待される。
【１０６４】
補体レセプター−１
９．ＴＰ１０のシアル化とフコシル化
この例は、シアリル  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ部分を持つＴＰ１０の調製と増進生物化学的活性の分析を説明する。
【１０６５】
脳への血流の妨げは、短時間でも、脳組織の損傷を悪化させ得る脳微小血管系内の炎症性事象の引き金となる。生じる組織損傷は、炎症と凝固カスケードの活性化によって増幅される。脳梗塞のマウスモデルにおいて、Ｐ−セクションの増加した発現とＩＣＡＭ−１の増加した発現は白血球動員を促進する。ｓＣＲ１は、補体レセプター−１（ＣＲ−１）の細胞外ドメインの組み換え形である。ｓＣＲ１は、補体活性化の強力なインヒビターである。ｓＣＲ１ｓＬｅＸ（ＣＤ２０）は、シアル化ＬｅｗｉｓＸ抗体を示すように交互にグリコシル化されるｓＣＲ１の交互にグリコシル化された形である。前に、人工の  Ｌｅｃ１１  ＣＨＯ細胞中インビボで発現しグリコシル化されたｓＣＲ−１ｓＬｅＸが、虚血性脳微小血管とＣ１ｑ−発現神経細胞に正しく位置していること、したがって、好中球や血小板の蓄積を禁制し、脳梗塞のボリュームを小さくすることが見出された（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：５９５−５９９）。今の例において、インビボでグリカンの改造によって調整されたｓＣＲ１ｓＬｅＸは、生体内でグリコシル化されたｓＣＲｓＬｅＸと類似した増進生物化学的活性を示した。
【１０６６】
ＴＰ１０ペプチドは、ＤＵＫ  Ｂ１１  ＣＨＯ細胞で発現された。このＣＨＯ細胞株は、典型的なＣＨＯ細胞グリコシル化で、そして多いが総てではないシアル酸で覆われたグリカンで、ＴＰ１０ペプチドを生産した。
【１０６７】
６６ｍｇのＴＰ１０のシアル化。  ＴＰ１０（２．５ｍｇ／ｍＬ）、ＣＭＰＳＡ（５ｍＭ）とＳＴ３Ｇａｌ３）０．１Ｕ／ｍＬ）は、３２℃で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％アジ化ナトリウム ，ｐＨ７．２中で４８時間培養した。放射性同位体でラベルしたＣＭＰシアル酸が、結合をモニターするために小アリコートに加えられた。ＴＰ１０は、ＳＥＣ  ＨＰＬＣによってヌクレオ糖から分離された。２４時間と４８時間で分析された試料は、反応が２４時間後に完了していることを実証した。反応混合物は次に凍結された。反応生成物は、蛍光補助カーボハイドレート電気泳動（ＦＡＣＥ(R)；Ｇｌｙｋｏ、Ｉｎｃ．Ｎｏｖａｔｏ  ＣＡ）分析にかけられた（図１１９）。
【１０６８】
薬動力学的研究。  ネズミは頸部静脈カニューレと共に購入された。シアル化前あるいはシアル化後のＴＰ１０ペプチド１０ｍｇ／ｋｇを、尾静脈注射によって各処理のため３匹のネズミ（ｎ＝３）に投与された。１４の血液試料０から５０時間で採られた。シアル化後のＴＰ１０ペプチドの血液濃度は、０時間後のすべての時間点で、シアル化後のＴＰ１０の濃度より高い（図１２０）。シアル酸付加では、出発物質に比べて、薬動力学的カーブのプラズマ濃度・時間カーブ（ＡＵＣ）の面積は２倍であった（図１２１）。
【１０６９】
シアル化ＴＰ１０のフコシル化。  １０ｍＬ（２５ｍｇ  ＴＰ１０）の上述のシアル化混合が解凍され、ＧＤＰ−フコースを５ｍＭ、ＭｎＣｌ２を５ｍＭ、ＦＴＶＩ（フコシルトランスフェラーゼ）を０．０５Ｕ／ｍＬ加えられた。反応は３２℃、４８時間培養された。反応性生物は、蛍光補助カーボハイドレート電気泳動（ＦＡＣＥ(R)；Ｇｌｙｋｏ、Ｉｎｃ．Ｎｏｖａｔｏ  ＣＡ）分析にかけられた（図１２２）。小アリコートに、結合をモニターするために、放射性同位体でラベルしたＧＤＰ−フコースが加えられた。ＴＰ１０は、ＳＥＣ  ＨＰＬＣによってヌクレオ糖から分離された。２４時間と４８時間で分析された試料は、反応が２４時間後に完了していることを実証した。Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎに対する結合を測定するインビボ試験は、フコース付加が生物学的活性Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリガンドを生成することができることを示す（図１２３）。
【１０７０】
ＥｎｂｒｅｌＴＭ
１０．抗体ＥｎｂｒｅｌＴＭのグリコＰＥＧ化
この例は、抗体分子のＯリンクのグリカンをＰＥＧ化するための操作を説明する。ここで、ＥｎｂｒｅｌＴＭは、１つの例として使われるが、当業者はこの操作は多くの抗体分子で使用できることを有り難く思うであろう。
【１０７１】
ＥｎｂｒｅｌＴＭ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）の調製。  ＥｎｂｒｅｌＴＭ（ＴＮＦ−レセプター−ＩｇＧ１−キメラ）は、ＰＥＧ化の前にシアル化されたＯリンクのグリカンを持つものであれ、あるいは持たないものであれ、２．５ｍｇ／ｍＬで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．０５％ＮａＮ３，ｐＨ７．２中に溶かされた。溶液は、５ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクト−スと０．１Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼで３２℃２日間、ガラクト−スで下ガラクトシル化されたグリカンを覆うために、培養した。結合をモニターするために、反応の小アリコートは１４Ｃ−ＵＤＰリガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、メタノールと水中、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ２０００ＳＷ分析カラムのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。放射性同位元素ラベルのペプチドへの結合は、インライン放射能検出器を使って定量された。
【１０７２】
反応が完了した時、溶液は１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−連結剤−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）と０．１Ｕ／ｍＬのＳＴＧａｌ３で３２℃２日間培養される。シアル酸−連結剤−ＰＥＧの結合をモニターするために、ペプチドは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ２０００ＳＷ分析カラムのゲルろ過によって、分離される。反応が完了した時、反応混合物は、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００実験カラムを使い、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使って、ＵＶ吸収に基づき一部分を集めて精製される。生成物を含む部分部分は一緒にされ、濃縮され、バッファー交換され、凍結乾燥される。反応生成物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供される操作と試薬によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１０７３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）
１１．ＥＰＯに対するＧｌｃＮＡｃの付加
この例はトリマンノシルコアに対するＧｌｃＮＡｃの付加について説明する。
【１０７４】
ＥＰＯに対するＧｌｃＮＡｃの付加．  ＥＰＯはＳＦ−９昆虫細胞で発現され、精製された（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）。ＥＰＯのトリマンノシルグリコ形から“トリマンノシルコア＋２ＧｌｃＮＡｃ”への１００％変換（ピーク１，図１２４のＰ１）は、２４時間３２℃で、１００ｍＵ／ｍｌのＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉと１００ｍＵ／ｍｌのＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩで、次のような反応最終濃度での培養で、達成された。
１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５，あるいは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５
５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２
１００ｍＵ／ｍｌ  ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ
１００ｍＵ／ｍｌ  ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ
１ｍｇ  ＥＰＯ（精製された、Ｓｆ９細胞中で発現された、Ｐｒｏｔｅｉｎ  
Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入された）
【１０７５】
グリコ形の分析。  この分析は、Ｋ−ＲＡｎｕｍｕｌａとＳＴＤｈｕｍｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ８（１９９８）６８５−６９の僅かな修飾である。Ｎ−グリカナ−ゼ（ＰＮＧａｓｅ）解放Ｎ−グリカンはアントラニル酸で還元的にラベルされた。還元的にアミノ化されたＮ−グリカンは、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄアミノカラム（４．６ｍｍＸ１５０ｍｍ）上に注入された。分離のために２つの溶媒が使われた：Ａ）水中５％（ｖ／ｖ）酢酸，１％テトラハイドロフラン，３％トリエチルアミン、そしてＢ）アセトニトリル中２％酢酸，１％テトラハイドロフラン。カラムは次に、２．５分間７０％Ｂで定組成的に溶離され、９７．５分７０から５％Ｂへの線形勾配によって続けられ、５％Ｂで１５分最終的にな定組成溶離が行われた。溶離ピークは励起波長２３０ｎｍ、発光波長４２０ｎｍでの蛍光検出法を使って検出された。
【１０７６】
これらの条件下で、トリマンノシルコアは、２２．３分の保持時間であり、ＧｎＴの反応生成物は３０分の保持時間であった。出発物質は、もっぱらコアＧｌｃＮＡｃを持つトリマンノシルコアであった（図１２４）。
【１０７７】
１２．多分岐（触角）複合グリカンを持つＥＰＯの調製
この例は、昆虫細胞発現ＥＰＯからのＰＥＧ化２分岐ＥＰＯと３分岐シアル化ＥＰＯの調製を説明する。
【１０７８】
バキュロ・ウイルス/Ｓｆ９発現系からの組換え型ヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｒｉｄｅｎ,  ＣＴ）がグリカン分析にかけられ、生成したグリカンはコアフコースを持つ１級トリマンノシルコアであること、そして少しの割合のグリカンはまた、単一のＧｌｃＮＡｃを持つことが示された。
【１０７９】
ＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩでのＮ−アセチルグルコサミンの付加。  ２つのロットのｒｈＥＰＯ（１ｍｇ/ｍＬ）は、３２℃、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５中で  ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、そして０．０２％  アジ化ナトリウムで２４時間培養した。ロットＡには、２０ｍｇのＥＰＯ、１００ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−Ｉそして６０ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−ＩＩが含まれていた。ロットＢには、４１ｍｇのＥＰＯ、４１ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−Ｉ＋５０ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−ＩＩが含まれていた。反応後、試料はゲルろ過によって脱塩された（ＰＤ１０カラム、Ｐｈａｒｍａｔｉｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【１０８０】
２−ＡＡ  ＨＰＬＣプロファイルによる分析ＥＰＯグリカン分析。この分析は、ＡｎｕｍｕｌａとＤｈｕｍｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ８（１９９８）６８５−６９の僅かな修飾である。還元的にアミノ化されたＮ−グリカンは、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄアミノカラム（４．６ｍｍＸ１５０ｍｍ）上に注入された。分離のために２つの溶媒が使われた：Ａ）水中５％（ｖ／ｖ）酢酸，１％テトラハイドロフラン，３％トリエチルアミン、そしてＢ）アセトニトリル中２％酢酸，１％テトラハイドロフラン。カラムは次に、２．５分間７０％Ｂで定組成的に溶離され、１００分７０から５％Ｂへの線形勾配によって続けられ、５％Ｂで２０分最終的にな定組成溶離が行われた。溶離ピークは励起波長２３０ｎｍ、発光波長４２０ｎｍでの蛍光検出法を使って検出された。非シアル化Ｎリンクグリカンは、２３−３４分のＬＣ範囲で、モノシアル化グリカンは３４−４２分、ジシアル化グリカンは４２−５２分、トリシアル化グリカンは５５−６５分、テトラシアル化グリカンは６８−７８分であった。
【１０８１】
２−ＡＡ  ＨＰＬＣによるグリカンプロファイルは、ロットＡが９２％、２つのＧｌｃＮＡｃを持つ（残りは単一ＧｌｃＮＡｃを持つ）２分岐構造へ変換したことのを明らかにした。ロットＢは、望みの生成物へ９７％変換していることを示した（図１２５Ａと１２５Ｂ）。
【１０８２】
ＧｎＴ−Ｖでの第３分岐枝の挿入。ＰＤ１０カラムでの脱塩と続く濃縮の後、ＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩ反応の生成物からのＥＰＯ（ロットＢ  １ｍｇ/ｍＬ）は、３２℃、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２と０．０２％  アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５中で  １０ｍＵ／ｍＬのＧｎＴ−Ｖと  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃで２４時間培養された。２−ＡＡ  ＨＰＬＣ分析は、変換が９２％の効率で起こることを実証した（図１２６）。
【１０８３】
脱塩（ＰＤ−１０）と濃縮の後、ｒＧａｌＴＩと共にガラクト−スが加えられ、ＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）は、０．１Ｕ／ｍＬ  ＧａｌＴ１,５ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクト−ス,５ｍＭ  ＭｎＣｌ２と共に３２℃で２４時間培養した。
【１０８４】
ＥＰＯからの還元的アミノ化Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ分析。アントラニル酸 で還元的にラベルされたＥＰＯからのＰＮＧａｓｅの小アリコートは、水に浮かんでいるが、４５分間ＭＦ−ミリポア膜フィルター（０．０２５μｍポア、直径４７ｍｍ）で透析された。透析されたアリコートは、急速真空で乾燥され、少量の水に再溶解させ、２，５−ジハイドロオキシ安息香酸（１０ｇ／Ｌ）を溶かした水／アセとニトリル（５０：５０）溶液と混合する。混合物は、ターゲット上で乾燥され、線形／負イオンモードでのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＥ−Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器を使って分析された。オリゴ糖は、観測された質量・電荷比と文献値との比較に基づいて決められた。
【１０８５】
ＭＡＬＤＩによる解放グリカンの分析は、ガラクト−スが定量的に総ての可能なサイトに付加していることを示した（図１２７）。上で得られたガラクトシル化ＥＰＯは次に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ,０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ６中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  １．６／６０カラムでゲルろ過によって精製された。
【１０８６】
シアル化。  濃縮と脱塩（ＰＤ−１０）の後、１０ｍｇのガラクトシル化ＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）は、ＳＴ３Ｇａｌ３（０．０５Ｕ／ｍＬ）および０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２中のＣＭＰ−ＳＡ（３ｍＭ）と共に培養した。分離されたアリコートは、放射能ラベルされたＣＭＰ−ＳＡを含んでいる。結果てきに挿入されたラベルとフリーのラベルは、４５％メタノール,０．１％ＴＦＡ中、０．５ｍＬ／分で、定組成サイズ排除クロマトグラフィー／ＨＰＬＣ（７．８ｍｍＸ３０ｃｍカラム、粒子サイズ５μｍ、ＴＳＫ  Ｇ２０００ＷＸＬ、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ,  ＡｎｓｙｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,  Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ,  ＣＡ）によって分離された。この操作を使って、総数の１２％が挿入された（３６０マイクロモル、３３マイクロモルのＥＰＯで約１０．９モル／モルとなる）。理論的な値（３Ｎリンクサイト、３触角）は約９モル／モルの挿入である。これらの値はこの方法の限界内である。ＳＴ３Ｇａｌ３でなくてＳＴ６Ｇあｌ１での同じ反応では、５．７％の放射能ラベルがガラクトシル化ＥＰＯに挿入された。すなわち、ＳＴ３Ｇａｌ３と比べて、約４８％である。
【１０８７】
１３．昆虫細胞で作られたＥＰＯのグリコＰＥＧ化
この例は、昆虫細胞発現ＥＰＯからのＰＥＧ化２分岐ＥＰＯの調整を説明する。
【１０８８】
バキュロ・ウイルス/Ｓｆ９発現系からの組換え型ヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｒｉｄｅｎ,  ＣＴ）がグリカン分析にかけられ、生成したグリカンはコアフコースを持つ１級トリマンノシルコアであること、そして少しの割合のグリカンはまた、単一のＧｌｃＮＡｃを持つことが示された（図１２８）。
【１０８９】
ＧｎＴ−ＩとＧｎＴ−ＩＩでのＮ−アセチルグルコサミンの付加。  ２つのロットのｒｈＥＰＯ（１ｍｇ/ｍＬ）は、３２℃、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５中で  ＧｎＴ−Ｉ、ＧｎＴ−ＩＩ、５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、そして０．０２％  アジ化ナトリウムで２４時間培養した。ロットＡには、２０ｍｇのＥＰＯ、１００ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−Ｉそして６０ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−ＩＩが含まれていた。ロットＢには、４１ｍｇのＥＰＯ、４１ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−Ｉ＋５０ｍＵ/ｍＬ  ＧｎＴ−ＩＩが含まれていた。反応後、試料はゲルろ過によって脱塩された（ＰＤ１０カラム、Ｐｈａｒｍａｔｉｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【１０９０】
２−ＡＡ  ＨＰＬＣによるグリカンプロファイルは、ロットＡが９２％、２つのＧｌｃＮＡｃを持つ（残りは単一ＧｌｃＮＡｃを持つ）２分岐（触角）構造へ変換したことのを明らかにした。ロットＢは、望みの生成物へ９７％変換していることを示した（図１２５Ａと１２５Ｂ）。
【１０９１】
ＥＰＯロットＡのガラクトシル化。  ＥＰＯ（ロットＡの〜１６ｍｇ）は、ＧｌｃＮＡｃの付加が完結するまでＧｎＴ−ＩＩで処理された。反応は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ,ＥＰＯｍｇ／ｍｌ,１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ,５ｍＭ  ＭｎＣｌ２,および０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，，ｐＨ７．２中、３２℃で２４時間行われた。次に、ＥＰＯのガラクトシル化は、３ｍＭまでＵＤＰ−ガラクト−スと０．５Ｕ／ｍｌまでＧａｌＴ１を加えることによってなされ、培養は３２℃で４８時間続けた。
【１０９２】
ガラクトシル化ＥＰＯは次に、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ,  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ,ｐＨ６中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  １．６／６０カラムでのゲルろ過によって精製された。ＥＰＯを含むピークは次に、２ＡＡ  ＨＰＬＣによって分析された。ＨＰＬＣデータに基づくと、ガラクトシル化反応後、〜８５％のグリカンは２つのガラクト−スを含み、〜１５％のグリカンは全くガラクト−スを含まなかった。
【１０９３】
ガラクトシル化ＥＰＯのシアル化。  ガラクトシル化ＥＰＯのシアル化は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ,０．５ｍｇ／ｍｌＥＰＯ,２００ｍＵ／ｍｌのＳＴ３Ｇａｌ３および０．５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡあるいはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＲＧ（１ｋＤａ）あるいはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＲＧ（１０ｋＤａ）のいずれかを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  中で４８時間、３２℃で行われた。２つのガラクト−ス残基を持った殆ど総てのグリカンは、ＣＭＰ−ＳＡでのシアル化反応の後、完全にシアル化された（２シアル酸／グリカン）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析はＨＰＬＣデータを確認した。
【１０９４】
ガラクトシル化ＥＰＯのＰＥＧ化。  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＲＧ（１ｋＤａ）とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＲＧ（１０ｋＤａ）を使ったＰＥＧ化反応に対して、反応混合物のアリコートはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された（図１２９）。ＥＰＯペプチドの分子量は、各糖の付加と共に増加し、ＰＥＧ化反応の後、分子量は一層劇的に増加した。
【１０９５】
ＥＰＯの生体内分析。  生体内ＥＰＯ分析（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら１９９６,Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１４：１４５５−１４６９から採用した）は、ＥＰＯの多レベルに対するＴＦ−１細胞株の反応性に基づいている。ＴＦ−１細胞は、汎血球減少症の３５歳日本人男性からのヘパリン化された骨髄穿刺から１９８７年１０月Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａらによってはっきりさせられた。これらの細胞は、完全にインターロイキン３あるいはグラヌロサイト−マクロファージ  コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に依存している。
【１０９６】
ＴＦ−１細胞株（ＡＴＣＣ,Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２００３）は、ＲＰＭＩ＋ＦＢＳ１０％＋ＧＭ−ＣＳＦ（１２ｍｇ／ｍｌ）中で成長され、３７℃、５％ＣＯ２で培養された。細胞は、５０００細胞／（ｍｌ媒体）の濃度で浮遊状態にあり、２００μｌは、９６ウェルプレートに分注された。細胞は４８時間、種々のＥＰＯ濃度（０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ）で培養された。次に、ＭＴＴ能力検査が、５ｍｇ／ｍｌで２５μｌのＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ  Ｍ５６５５）を加えることによって行われ、３７℃で２０分から４時間そのプレートは培養され、１００μｌのイソプロパノール／ＨＣｌ溶液（１００ｍｌイソプロパノール＋３３３μｌ  ＨＣｌ  ６Ｎ）を加え、５７０ｎｍと６３０ｎｍあるいは６９０ｎｍでＯＤを読み、５７０ｎｍでの読みから６３０ｎｍあるいは６９０ｎｍでの読みを差し引いた。
【１０９７】
図１３０は、シアル化ＥＰＯと１ｋＤａあるいは１０ｋＤａでグリコＰＥＧ化されたＥＰＯが生体内生物活性テストにかけられた時の結果を含む。１ｋＤａＰＥＧでグリコＰＥＧ化されたＥＰＯは、両者が約５μｇ／ｍｌの濃度の時、グリコＰＥＧ化されていないＥＰＯと殆ど同じ活性を持つ。１０ｋＤａＰＥＧでグリコＰＥＧ化されたＥＰＯは、両者が約５μｇ／ｍｌの濃度の時、グリコＰＥＧ化されていないＥＰＯのほぼ半分の活性を持つ。
【１０９８】
１４．ＣＨＯ細胞で作られたＥＰＯのＯ−連結グリカンのグリコＰＥＧ化
Ｏ−連結ＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）の調製。アジアロ−ＥＰＯは、もともとＣＨＯ細胞中で作られるのであるが、５０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,０．１５Ｍ  ＮａＣｌ,０．０５％  ＮａＮ３,ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬ溶解される。溶液は、５ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡと０．１  Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３と３２℃で２日培養する。Ｎ−連結グリカンへのシアル酸の挿入をモニターするために、反応物の小アリコートにＣＭＰ−ＳＡ−１４Ｃを加えた。ペプチドはメタノール水を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ２０００ＳＷ分析カラムのゲルろ過によって分離され、生成物は放射能検出器で観測された。反応が完結したら、溶液はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−２０フィルターを使って濃縮される。残りの溶液は、もはやＣＭＰ−ＳＡが観測されなくなるまで、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）,０．１５Ｍ  ＮａＣｌ,０．０５％  ＮａＮ３で、最終容量７．２ｍＬまでバッファー交換される。次に、溶液は０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）,０．１５Ｍ  ＮａＣｌ,０．０５％  ＮａＮ３中に２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で再びけん濁させる。溶液は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とＳＴ３Ｇａｌ１で、３２℃２日間グリコシル化するまで培養される。酸―ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応物の小エリコートは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−ゲル−３０００分析カラムのゲルろ過によって分離され、ＰＢＳ  ｐＨ７．０で溶離し、ＵＶ検出で分析した。反応が完結したら、反応混合物は、ＰＢＳ緩衝（ｐＨ７．０）を使うＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−ゲル−３０００実験カラムを使ってＵＶ吸収に基づいて部分部分を集めて精製した。反応生成物は、インビトロゲンによって提供された操作と試薬によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析法を使って分析された。
【１０９９】
１５．ＥＰＯ−トランスフェリン
この実施例はタンパク質のＯ−連結グリカンへの複合糖質化、そして特にトランスフェリンをＥＰＯに複合糖質化する手順について説明する。シアル酸残基はＥＰＯのＯ−連結グリカンから除去し、そしてＥＰＯ−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＣＭＰを調製する。ＥＰＯ−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＣＭＰをアシアロトランスフェリンにＳＴ３Ｇａｌ３で複合糖質化する。
【１１００】
Ｏ−連結アシアロ−ＥＰＯの調製。ＣＨＯ細胞で生産されたＥＰＯ（エリスロポエチン
）を２．５ｍｇ／ｍＬで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４
、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解し、これを３００ｍＵのシアリダーゼ（ビブリオ  コレラ
：Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）−アガロース結合体と１６時間、３２℃でインキュー
ベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈
し、そしてインビトロゲンの手順に従いＩＥＦゲルを行う。混合物を１０，０００ｒｐｍ
で遠心し、そして上清を集める。上清は約２．５ｍｇ／ｍＬのＥＯＰ濃度に５０ｍＭ  Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中で濃縮する
。この溶液を５ｍＭのＣＭＰ−シアル酸および０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３と３２℃
で２日間インキューベーションする。シアル酸の取り込みを監視するために、反応の小ア
リコートにＣＭＰ−ＳＡ−蛍光リガンドを加え；ペプチドへ取り込まれた標識は、ＰＢＳ
バッファー（ｐＨ７．１）を使用してトーソー  ハースＧ３０００ＳＷ分析カラムでのゲ
ル濾過により遊離標識から分離する。反応が完了した時、反応混合物はＰＢＳバッファー
（ｐＨ７．１）を使用したトーソー  ハース  Ｇ３０００ＳＷ調製カラムを使用して精製
し、そしてＵＶ吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給
される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用して分析する。サ
ンプルを水に対して透析し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析する。
【１１０１】
ＥＰＯ−ＳＡ−連結基−ＳＡ−ＣＭＰの調製。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中のＯ−結合アシアロ−ＥＰＯ２．５ｍｇ／ｍＬ。この溶液を１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−連結基−ＳＡ−ＣＭＰおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３と３２℃で２日間インキューベーションする。シアル酸−連結基−ＳＡ−ＣＭＰの取り込みを監視するために、ペプチドはＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使用してトーソー  ハースＧ３０００ＳＷ分析カラムでのゲル濾過により分離する。
【１１０２】
２日後、反応混合物はＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使用したトーソー  ハース  Ｇ３０００ＳＷ調製カラムを使用して精製し、そしてＵＶ吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析する。
【１１０３】
トランスフェリン−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＥＰＯの調製。上からのＥＰＯ−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＣＭＰは２．５ｍｇ／ｍＬで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２に溶解する。この溶液を２．５ｍｇ／ｍＬのアシアロ−トランスフェリンおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３と３２℃で２日間インキューベーションする。トランスフェリンの取り込みを監視するために、ペプチドはＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使用してトーソー  ハースＧ３０００ＳＷ分析カラムでのゲル濾過により分離し、そして生成物をＵＶ吸収により検出する。反応が完了した時、溶液を５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３（未反応のトランスフェリングリカンをキャップするために）と３２℃で２日間インキューベーションする。反応混合物はＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使用してトーソー  ハースＧ３０００ＳＷ調製カラムを使用して精製し、そして画分をＵＶ吸収に基づき集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析する。
【１１０４】
１６．ＥＰＯ−ＧＤＮＦ
この実施例はペプチドの複合糖質化の手順、そして特にＥＰＯ−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＧＤＮＦの調製について説明する。
【１１０５】
ＥＰＯ−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＧＤＮＦの調製。上からのＥＰＯ−ＳＡ−連結剤−ＳＡ−ＣＭＰは２．５ｍｇ／ｍＬで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２に溶解する。この溶液を２．５ｍｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（ＮＳＯで生産）および０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３と３２℃で２日間インキューベーションする。ＧＤＮＦの取り込みを監視するために、ペプチドはＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使用してトーソー  ハースＧ３０００ＳＷ分析カラムでのゲル濾過により分離し、そして生成物をＵＶ吸収により検出する。反応が完了した時、溶液を５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３（未反応のＧＤＮＦグリカンをキャップするために）と３２℃で２日間インキューベーションする。反応混合物はＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使用したトーソー  ハースＧ３０００ＳＷ調製カラムを使用して精製し、そして画分をＵＶ吸収に基づき集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析する。
【１１０６】
１７．ＥＰＯの単一分岐（触角）グリコＰＥＧ化
この例は、グリコＰＥＧ化単一分岐エリスロポエチン（ＥＰＯ）の調製と生体外と生体内での生物活性を説明する。
ＥＰＯ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ０１５８８）がＣＨＯ細胞で発現されると、Ｎ−連結グリカンがアミノ酸残基２４、３８、８３で形成され、Ｏ−連結グリカンがアミノ酸残基１２６で形成される（図１３１；Ｌａｉら，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３１１６−３１２１）．このグリコタンパク質の生物活性は、直接ＮｅｕＡｃの含有レベルと相関している。シアル酸が増加すると、レセプターに対する生体内でのＥＰＯの結合が減少する。しかしながら、シアル酸が増加すると、生体内でのＥＰＯの生物活性は増加する。Ｏ−連結グリカンは、ＥＰＯの生体外あるいは生体内の活性、あるいはまた分子の薬動力学に影響を及ぼさない（Ｗａｓｌｅｙら，１９９１，Ｂｌｏｏｄ７７：２６２４−２６３２）。
【１１０７】
バキュロ・ウイルス/Ｓｆ９発現系を使って達成されるように（Ｗｏｊｃｈｏｗｓｈｉら，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９１０：２２４−２３２；Ｑｕｅｌｌｅら，１９８９，Ｂｌｏｏｄ７４：６５２−６５７）、昆虫細胞でＥＰＯが発現されると、Ｎ−連結グリカンがアミノ酸残基２４、３８、８３で形成されるが、Ｏ−連結グリカンがアミノ酸残基１２６で形成されない（図１３２）。これは、昆虫細胞が、ＥＰＯのアミノ酸残基１２６周辺のアミノ酸配列を認識するグリコシルトランスフェラーゼを持たないためである。大抵のＮ−連結グリカンはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｆｕｃから成っている。今の例で、昆虫細胞で発現されたＥＰＯは、高い効率で改造され、タンパク質を適当なドナー分子の存在下で、一連のＧｎＴ１,２、ＧａｌＴ−１およびＳＴと接触させることによって、複合グリカンＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＦｕｃＧｌｃＮＡｃ２を得る。これらの酵素反応は、ここで明らかにした反応条件を使って、昆虫細胞発現ＥＰＯで行われ、全効率９２％で複合グリカンを生成した（表２１）。任意選択的に、Ｏ−連結グリカンも加えられた（ＯＣｏｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔａｂａｋ，１９９３，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７２：１５５４−１５５８；Ｗａｎｇら，１９９３，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２９７９−２２９８３）。
【１１０８】
【表２１】
0005413548.tif 000094
＊表２１．の隣の訳：昆虫細胞発現ＥＰＯ（“出発物質”）と各酵素的改造ステップのグリカン構造分布における各グリカン種構造の割合
【１１０９】
この例はまた同様に、昆虫細胞で発現されたＥＰＯは改造されて、１分岐（触角）、２分岐、３分岐グリカンを形成し、それらは続いて他の所も記述した操作を使って、１ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａＰＥＧ分子でグリコＰＥＧ化された。これらのＥＰＯ形の分子量が決定され、３Ｎ−連結グリカンを持つＥｐｏｅｔｉｎＴＭそして５Ｎ−連結グリカンを持つＮＥＳＰ（ＡｒａｎｅｓｐＴＭ）と比較された。１分岐、２分岐グリカン構造の調製例は、本文例７に与えられている。
【１１１０】
１分岐ＰＥＧ化グリカン構造を持つＥＰＯは、昆虫細胞中でＥＰＯを発現させ、次にＥＰＯペプチドをＧｌｃＮＡｃドナーの存在下でＧｎＴＩ（あるいはＧｎＴＩＩだけと）接触させることによって行われた。ＥＰＯペプチドは次に、ガラクト−スドナーの存在下で、ＧａｌＴ−Ｉと接触させる。ＥＰＯペプチドは次に、３つのＮ−連結１分岐ＰＥＧ化グリカン構造を発生させるために、ＳＡ−ＰＥＧドナー分子の存在下で、ＳＴと接触させる（図１３４Ｂ）。
【１１１１】
昆虫細胞発現ＥＰＯから発生したＥＰＯ−ＳＡとＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧの生体外の生物活性は、ＴＦ−１赤白血病細胞の増殖を刺激するための分子の能力を測定することによって得られた。３分岐ＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ１ｋＤａは、３分岐ＥＰＯ−ＳＡの殆ど総ての生物活性を示した。２分岐ＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ１０ｋＤａは、ＥＰＯの濃度範囲で、２分岐ＥＰＯ−ＳＡの殆ど総ての生物活性を示した（図１３５）。昆虫細胞中で発生された改造グリコＰＥＧ化ＥＰＯは、さらなるグリカン改造やＰＥＧ化なしでＣＨＯ細胞中で発現されるＥｐｏｇｅｎＴＭの生体外生物活性の９４％になることを示した（表２２）。
【１１１２】
【表２２】
0005413548.tif 000095
表２２．の隣の訳：２μｇ／ｍｌタンパク質、４８時間でＥｐｏｇｅｎＴＭと比較したＥＰＯ構築物の生体外活性
【１１１３】
グリコＰＥＧ化されたＥＰＯとグリコＰＥＧ化されていないＥＰＯの生体内薬動力学が決められた。グリコＰＥＧ化されたものとグリコＰＥＧ化されていない［Ｉ１２５］ラベルのＥＰＯは、ネズミへ静脈注射され、分子の薬動力学が決定された。２分岐ＥＰＯと比べて、２分岐ＥＰＯ−ＰＥＧ１ｋＤａのＡＵＣは１．８倍大きく、２分岐ＥＰＯ−ＰＥＧ１０ｋＤａのＡＵＣは１１倍大きい（図１３６）。２分岐ＥＰＯと比べて、２分岐ＥＰＯ−ＰＥＧ１ｋＤａのＡＵＣは１．６倍大きく、２分岐ＥＰＯ−ＰＥＧ１０ｋＤａのＡＵＣは４６倍大きい（図１３６）。したがって、ＥＰＯの薬動力学はグリコＰＲＧ化によって大きく改善された。
グリコＰＥＧ化されたＥＰＯとグリコＰＥＧ化されていないＥＰＯの生体内生物活性も同様に、ＥＰＯ構造が網状赤血球増加を刺激する度合を測定することによって決定された。網状赤血球増加は、赤血球前駆体の成熟赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ：赤血球）への成熟速度の尺度である。処理グループ当たり８マウスが、１０μｇタンパク質／Ｋｇの皮下注射が行われた。網状赤血球増加の割合は９６時間測定された。３分岐と２分岐ＰＥＧ化ＥＰＯは、ＥｐｏｇｅｎＴＭを含めて、グリコＰＥＧ化されていないＥＰＯより大きな生体内生物活性を示した。
【１１１４】
さらに、ＥＰＯ構築物の生体内生物活性の決定は、ＥＰＯ構築物２．５μｇペプチド／ｋｇ体重  を週３回腹腔内投与後１５日ＣＤ−１メスマウスのヘマトクリット値（全血液の赤血球の割合）を測定することによって行われた。ヘマトクリット値は、ＥＰＯ形のサイズと共に増加した。８２．７ｋＤａの１触角ＥＰＯ−ＰＥＧ２０ｋＤａは、３５．６ｋＤａのＮＥＳＰ（ＡｒａｎｅｓｐＴＭ）より僅かに大きな活性を持ち、２８．５ｋＤａＥｐｏｇｅｎＴＭの約２倍の活性を持つ。
【１１１５】
この例は、長く作用するグリコＰＥＧ化ＥＰＯの発生は、実現できることを示す。グリコＰＥＧ化ＥＰＯの薬動力学的プロファイルは、グリコＰＥＧ化サイトの数と血流中のペプチドの半減期を変えるために加えられたＰＥＧ分子のサイズを変化させることによって作ることが出来る。最後に、グリコＰＥＧ化ＥＰＯは、生体外および生体内両方の生物活性を保持する。
【１１１６】
１８．シアル化およびＰＥＧ化された１−、２−、３−分岐ＥＰＯの調製と生物活性
この例は、グリコＰＥＧ化ＥＰＯの生成、特にそれにリンクしたＰＥＧでＰＥＧグリコ化した１分岐と２分岐グリカンのＥＰＯ生成を説明する。次のようなＥＰＯ変種が生成された：１分岐ＰＥＧ（１ｋＤａ）、ＰＥＧ（１０ｋＤａ）、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）；２分岐２，３−シアル酸（ＳＡ）、２分岐ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）、２分岐ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）；３分岐２，３−ＳＡ、そして２，３−ＳＡでキャップされた３分岐２，６−ＳＡ。
昆虫細胞で発現された組み換えエリスロポエチン（ｒＥＰＯ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｏｔ＃０６０３０２）から得られた。このバッチのＥＰＯのグリカン組成は、約９８％のトリマンノシルコア構造を持っていた。図１３９Ａは、このＥＰＯから解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析結果を示し、“Ｐ２”ピークはトリマンノシルコアグリカンを表す。図１３９Ｂは、それらが示すピークの傍のような解放されたグリカンの構造を持つ解放されたグリカンのＭＡＬＤＩ分析結果を示す。
【１１１７】
１触角分枝
１触角枝分かれ構造をつくるのに幾つかのステップが遂行された。要するに、第一ステップは、ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応で、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフを使って精製した。この反応は、トリマンノシルコアの１つの分枝にＧｌｃＮＡｃ部分を付加し、そのＧｌｃＮＡｃ部分にガラクトシル部分を付加する。分岐は、ＳＴ３Ｇａｌ３反応で伸ばされた、末端ガラクト-ス部分にＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）部分あるいはＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）部分を付加された。最終的な精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００クロマトグラフを使って為された（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）。
【１１１８】
ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応
ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応は、組み合わされ、３２℃で３６時間培養された。反応は、１ｍｇ/ｍＬ  ＥＰＯ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＮａＮ３、３ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０ｍＵ／ｍｇ  ＧｎＴ−Ｉ、３ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ、そして２００ｍＵ／ｍｇ  ＧａｌＴ−１を含むものであった。図１４０は、ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応後にＥＰＯから解放されたグリカンのＭＡＬＤＩ分析を示す。グリカン分析は、ほぼ９０％のグリカンが希望した末端ガラクト-ス部分の１触角分岐構造であることを示した。
【１１１９】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５での精製。  ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応後、ＥＰＯは、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、（１．６ｃｍＸ６０ｃｍＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲルフィルタークロマトグラフ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）を使って、酵素タンパク質やヌクレオチド糖の汚れを精製された。
【１１２０】
ＳＴ３Ｇａｌ３反応。  ＳＴ３Ｇａｌ３  ＰＥＧ化反応は、３２℃、２４時間培養された。反応は、１ｍｇ/ｍＬ  ＥＰＯ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＮａＮ３、２００ｍＵ／ｍｇ  ＳＴ３Ｇａｌ３、そして０．５ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）あるいは０．５ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を含むものであった。図１４１は、この反応後のＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。タンパク質帯の対応した分子量は、ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応によって形成されたＥＰＯグリカンはＰＥＧ誘導体で完全にシアル化されたことを示す。
【１１２２】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００での精製。ＥＰＯは次に、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で、（１．６ｃｍＸ６０ｃｍＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲルフィルタークロマトグラフ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）によって、ＳＴ３Ｇａｌ３反応の汚れが精製された。
【１１２３】
１触角ＰＥＧ化ＥＰＯのＴＦ−１細胞生体内生物試験。  ＥＰＯ生体内活性を評価するために、ＴＦ−１細胞株が使われる。ＴＦ−１細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（カタログ番号  ＣＲＬ-２００３，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手される骨髄性前駆細胞である。細胞株は生存に対して、インターロイキン−３あるいは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に完全に依存している。ＴＦ−１細胞は、増殖と分化に対するＥＰＯの効果を調べるための良い系となる。
【１１２４】
ＴＦ−１細胞は、１０％  ＦＢＳと１２ｎｇ/ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦのＲＰＭＩ中３７℃で５％  ＣＯ２中で成長された。細胞は、１０，０００細胞/ｍｌ溶媒の濃度でけん濁された。２００μｌアリコートの細胞は、９６−ウェルプレートへ分けられた。細胞は、０．１から１０μｇ/ＥＰＯで、４８時間培養された。
【１１２５】
次に、５μｇ/ｍｌＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，すなわちチアゾリルブルー；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．，カタログ番号Ｍ５６５５）の２５μｌを最初に加えることによって、生存試験が行われた。プレートは、４時間３７℃で培養された。１００μｌのイソプロパノール/ＨＣｌ溶液（１００ｍｌのイソプロパノールと３３３μｌのＨＣｌ６Ｎ）が加えられた。プレートの吸光度は、５７０ｎｍと６３０ｎｍあるいは６９０ｎｍで読まれ、６３０ｎｍあるいは６９０ｎｍで読みは５７０ｎｍでの読みから差し引かれた。
【１１２６】
図１４２は、１分岐グリカンのＰＥＧ化後のＥＰＯ活性試験結果を示す。この生物試験で、１分岐ＰＥＧ化ＥＰＯは、非ＰＥＧ化ＥＰＯよりずっと活性度が低い。
【１１２７】
１分岐ＰＥＧ化ＥＰＯの生体内生物試験  −  血液パラメーターの試験。
雄Sprague-Dawley ラットの血液パラメーターに対するＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）、（これらの化合物の調製については上に詳しく記述されているが）の効果が調べられた。Sprague-Dawley ラットは、良く研究された実験モデルであり、そのような動物の使用や世話の技術は当業者には良く知られている。したがって、Sprague-Dawley ラットは、本発明にしたがってＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）の臨床的および生理学的効果を調べるための良い系となる。
【１１２８】
試験被験体の調整、世話、取り扱い。  本発明の方法と構成にしたがった生体内試験は、ＴｈｅｒＩｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＮＤ）で行われた。生体内研究の試験被験体は、１７０の雄Sprague-Dawley ラットが含まれていて、Ｈａｒｌａｎ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。試験被験体は総て、少なくとも重さ３００グラム であり、発送時に少なくとも年齢７０日のものであった。被験体は、ＴｈｅｒＩｍｍｕｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  にしたがって、そしてｔｈｅ  ＵＳＤＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ，  ｔｈｅ  ＰＨＳ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．  Ｉｎｔｅｇｒａｎｃｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌｓの規定にしたがって世話された。研究は、ｔｈｅ  ＦＤＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，２１  ＣＦＲ  Ｐａｒｔ５８にしたがって行われた。被験体は、ポリカーボネートの籠のなかで、コントロールされた環境下で個別的に飼育され、毎週適宜新鮮な餌を与えられ、自動的水供給システムあるいは水ボトルから適宜水道水が試験被験体に与えられるようにされた。被験体はランダムにテストのためのグループが決められ、生物学的に意味のあるデータを与えるのに必要十分な数が使われた。被験体は、皮下注射で投薬され、投与のの頻度と量は表２５に示されている。投与前そして少なくとも日に２回、毒性、瀕死、死亡について観測した。体重が測定され、研究前後、同じく研究中週間隔での健康検査が行われた。
【１１２９】
血液学研究のため、０．２５ｍｌ（±１５％）の血液試料が、生存被験体の頸部静脈から、研究第一日目の投与前と、研究第３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、２６、２９日目に、集められた。試験被験体の血液分析は、細胞形態学、赤血球数、ヘマトクリット値、ヘモグロビン、白血球、白血球分化、平均赤血球、平均赤血球濃度、平均細胞体積、平均血小板体積、血小板数、そして網状赤血球の検査が含まれている。
【１１３０】
【表２５】
0005413548.tif 000096
＊表２５．の隣の訳：被験体のグループと投与量のまとめ
【１１３１】
研究第２９日目、臨床病理学血液採集の後、総ての生存被験体は、二酸化炭素吸入で安楽死させた。血液は、腹大動脈から採取した。前に安楽死させた瀕死被験体と研究中に死んだ被験体は、完全な検死が行われた。
【１１３２】
結果の分析とデータの説明。定量的な結果は、関連当業者に知られた技術を使って分析された。特に、正常性に対してコルモゴルフ・スミルノフ検定、等分散に対してリーベン・メヂアン検査、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使って、結果は分析された。正常性あるいは等分散テストが出来なかった場合、ランクを変えたデータでノンパラメトリックなクラスカル・ワリスＡＮＯＶＡ検定を使って続けられた。パラメトリックなデータは、コントロールからはずれたグループを線引きするためにダネットｔ検定を使って分析された。ノンパラメトリックなデータに対しては、コントロールからはずれたグループを線引きするためにダンズ検定が使われた。０．０５以下の確率値（両側）が、総てのテストの意味付けの臨界値として使われた。
【１１３３】
研究１５日目のデータの１つの分析に基づくと、本発明にしたがって、グリコＰＥＧ化１触角ＥＰＯであるＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）あるいはＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）の５０μｇ／ｋｇを１回投与することによって、同じ投与でのＮＥＳＰ効果に比較して、ネズミの血液ヘモグロビンは広範な上昇を示す（図１９２）。特定の理論に縛られたくないが、図１９２はＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とＥＰＯ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）は予想外に増大した生物学的特性を持つことを示す。
【１１３４】
２触角分岐。
ＥＰＯの２触角分岐を達成するために、幾つかの反応が遂行された。短的に言うと、最初の反応は、２つのトリマンノシルコア枝にＧｌｃＮＡｃ部分を付加するためにＧｎＴ−Ｉ反応とＧｎＴ−ＩＩ反応を組み合わされた。第二の反応、  Ｇａｌ−１反応は、各ＧｌｃＮＡｃ部分にガラクト−ス部分を加える。ＳＴ３Ｇａｌ反応の前に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５クロマトグラフィー（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）が行われた。２触角分岐はさらに、ＳＴ３Ｇａｌ反応で伸ばされ、２，３−ＳＡまたはＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）、ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）を付加された。最終的な精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００クロマトグラフ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）によって為された。
【１１３５】
ＧｎＴ−Ｉ／ＧｎＴ−ＩＩ反応。  ＧｎＴ−Ｉ／ＧｎＴ−ＩＩ反応が組み合わされ、３２℃４８時間培養された。反応は、１ｍｇ/ｍＬ  ＥＰＯ、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＮａＮ３、５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１００ｍＵ／ｍｇ  ＧｎＴ−Ｉ、そして６０ｍＵ／ｍｇ  ＧｎＴ−ＩＩ  を含むものであった。反応は、２分岐ＧｌｃＮＡｃ部分の付加は９２％完了が達成され、１分岐ＧｌｃＮＡｃ部分の付加は８％であった。図１４３Ａは、解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析を示す。ここで、ピーク“Ｐ３”は、２分岐ＧｌｃＮＡｃグリカンを表す。図１４３Ｂは、それらが示すピークの傍に示したグリカン構造を持った解放されたグリカンのＭＡＬＤＩ分析を示す。
【１１３６】
更なる反応のため、さらに２０ｍＵ／ｍｇのＧｎＴ−ＩＩが、１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＮａＮ３と共に加えられ、混合物は３２℃で４時間培養された。２触角ＧｌｃＮＡｃグリカンの反応は、９９％以上が達成された。
【１１３７】
ＧａｌＴ−１  反応。  ＧａｌＴ−１  反応は、第二のＧｎＴ−ＩＩ反応の完了後直ちに始められた。酵素とヌクレオチド糖は、０．５Ｕ／ｍｇ  ＧａｌＴ−１と３ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌの濃度で完了したＧｎＴ−ＩＩ反応に加えられた。
【１１３８】
ＧａｌＴ−１  反応は、反応当たり約１００μｇＥＰＯ、２分岐末端ガラクト−ス部分を持つ反応生成物の約９５％の小スケールで行われた。図１４４Ａは、解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析を示す。ここで、ピーク“Ｐ２”は末端ガラクト−ス部分を持つ２分岐グリカン（８５％のグリカン）であり、ピーク“Ｐ１”は末端ガラクト−ス部分を持たない２分岐グリカン（１５％のグリカン）である。
【１１３９】
ＧａｌＴ−１  反応はまた同様に、反応当たり１６ｍｇのＥＰＯでの大きなスケールでも行われた。図１４４Ｂは、大スケールＧａｌＴ−１  反応からの解放グリカンのＨＰＬＣ分析を示す。ここで、ピーク“Ｐ２”は末端ガラクト−ス部分を持つ２分岐グリカンであり、ピーク“Ｐ１”は末端ガラクト−ス部分を持たない２分岐グリカンである。
【１１４０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５での精製。  ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応後、ＥＰＯは、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で、（１．６ｃｍＸ６０ｃｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲルフィルタークロマトグラフィー（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）を使って、酵素タンパク質やヌクレオチド糖の汚れを精製された。図１４５は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲルフィルタークロマトグラフを示す。ここで、ピーク２は、末端ガラクト−ス部分を持ち２分岐グリカンを持ったＥＰＯである。図１４６は、各改造ステップでの分子量増加を表す各改造ステップの生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【１１４１】
ＳＴ３Ｇａｌ３反応。  ＳＴ３Ｇａｌ３  反応は、３２℃、２４時間培養された。反応は、０．５ｍｇ/ｍＬ  ＥＰＯ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＮａＮ３、１００ｍＵ／ｍｇ  ＳＴ３Ｇａｌ３、そして０．５ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡ、０．５ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）あるいは０．５ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）を含むものであった。図１４７は、ＳＴ３Ｇａｌ３  反応前後のＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。このＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと、末端Ｇａｌを含む２分岐ＥＰＯは、各ＳＴ３Ｇａｌ３  反応後もはや視覚的に検出できなかった。総てのシアル化ＥＰＯ変種は反応開始時の非シアル化ＥＰＯと比較してサイズの増加を示す。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００での精製。ＥＰＯは、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲルフィルタークロマトグラフィー（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）によって、ＳＴ３Ｇａｌ３反応の汚れが精製された。表２３は、各改造ステップでのグリカン構造の分布をまとめたものである。
【１１４２】
【表２３】
0005413548.tif 000097
＊表２３．の隣の訳：各改造ステップ後のＥＰＯのグリカン構造のまとめ
【１１４３】
３触角分岐。
ＥＰＯの３触角分岐を達成するために、幾つかの反応が遂行された。短的に言うと、最初の反応は、グリカンの２つの外側のトリマンノシルコア枝にＧｌｃＮＡｃ部分を付加するためにＧｎＴ−Ｉ反応とＧｎＴ−ＩＩ反応を組み合わされた。第二の反応、  ＧｎＴ−Ｖ反応は、第二のＧｌｃＮＡｃ部分を２つの外側のトリマンノシルコア枝に加える。したがって、３つのＧｌｃＮＡｃ部分が存在することとなる。第３の反応は、各末端ＧｌｃＮＡｃ部分へガラクト−ス部分を加える。次に、ＥＰＯ生成物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５クロマトグラフィーで分離された。３触角分岐はさらに、ＳＴ３Ｇａｌ３反応で伸ばされ、２，３−ＳＡ部分あるいは２，６−ＳＡ部分が加えられ、２，３−ＳＡ部分で覆われた。精製はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５クロマトグラフィーで行われた。
【１１４４】
ＧｎＴ−Ｉ／ＧｎＴ−ＩＩ反応。  ＧｎＴ−Ｉ／ＧｎＴ−ＩＩ反応が組み合わされ、３２℃４８時間培養された。反応は、１ｍｇ/ｍＬ  ＥＰＯ、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＮａＮ３、５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０ｍＵ／ｍｇ  ＧｎＴ−Ｉ、そして４１ｍＵ／ｍｇ  ＧｎＴ−ＩＩ  を含むものであった。反応は、２分岐ＧｌｃＮＡｃ部分の付加の９７％完了が達成され、３％が残りのトリマンノシルコアであった。図１４８は、ＧｎＴ−Ｉ／ＧｎＴ−ＩＩ反応後ＥＰＯから
解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析を示す。
【１１４５】
ＧｎＴ−Ｖ反応。１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、５ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＮａＮ３、１０ｍＵ／ｍｇ  ＧｎＴ−Ｖ、そして１ｍｇのＥＰＯを含むＧｎＴ−Ｖ反応は、３２℃４８時間培養された。この反応は、すでにＧｌｃＮＡｃ部分を含む外側のマンノース部分へＧｌｃＮＡｃ部分を加える。図１４９は、ＧｎＴ−Ｖ反応後ＥＰＯから解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析を示す。グリカン分析とＭＡＬＤＩ分析に基づくと、ＥＰＯから解放された約９２％のグリカンが望んだ生成物である末端ＧｌｃＮＡｃ部分を持つ３分岐ＥＰＯであった。残り８％のグリカンは、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む２分岐構造であった。
【１１４６】
Ｇａｌ−１反応。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＵＤＰ  Ｇａｌ、１００ｍＵ／ｍｇ  ＧａｌＴ−１、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０２％  ＮａＮ３、そして１ｍｇ／ｍＬ  ＥＰＯを含むＧａｌ−１反応は、３２℃で２４時間培養された。図１５０は、この反応後、ＥＰＯから解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析を示す。グリカン分析とＭＡＬＤＩ分析は、９７％の解放グリカンが３分岐構造上に末端ガラクト−ス部分を持っていたことを示す。残りの３％は、末端ガラクト−スを含む２分岐構造であった。
【１１４７】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５での精製。  ＧｎＴ−Ｉ/ＧａｌＴ−１反応後、ＥＰＯは、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で、１．６ｃｍＸ６０ｃｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲルフィルタークロマトグラフィー（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）を使って、酵素タンパク質やヌクレオチド糖の汚れが精製された。精製物質は、２つのバッチへ分離され、末端２，６−ＳＡ部分を持つ３分岐グリカンと２，６−ＳＡでキャップされた末端２，６−ＳＡ部分を持つ３分岐グリカンが生成された。
【１１４８】
ＳＴ３Ｇａｌ３反応。  ＳＴ３Ｇａｌ３  反応は、３２℃、２４時間培養された。反応は、１ｍｇ/ｍＬ  ガラクトシル化ＥＰＯ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＮａＮ３、５０ｍＵ／ｍｇ  ＳＴ３Ｇａｌ３、そして３ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡを含むものであった。図１５１は、このステップ後ＥＰＯから解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析を示す。グリカンとＭＡＬＤＩ分析に基づくと、約８０％の解放グリカンが、末端２，３−ＳＡ部分を持つ３分岐構造であった。残り２％の解放グリカンが、末端２，３−ＳＡ部分を持つ２分岐構造であった。
【１１４９】
ＳＴ３Ｇａｌ３反応に続くＳＴ６Ｇａｌ１シアル化反応。  ＳＴ６Ｇａｌ１化反応は、３２℃、２４時間培養された。反応は、１ｍｇ/ｍＬ  ガラクトシル化ＥＰＯ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＮａＮ３、５０ｍＵ／ｍｇ  ＳＴ６Ｇａｌ１、そして３ｍＭ  ＣＭＰ−ＳＡを含むものであった。図１５２は、ＳＴ６Ｇａｌ１化反応後ＥＰＯから解放されたグリカンのＨＰＬＣ分析結果を示す。グリカンとＭＡＬＤＩ分析に基づくと、約８０％の３分岐グリカンが末端２，３−ＳＡ部分を含んでいた。残り２％のグリカンが、末端２，３−ＳＡ部分を持つ２分岐であった。
【１１５０】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５での精製。  ＥＰＯは、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で、１．６ｃｍＸ６０ｃｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲルフィルタークロマトグラフィー（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）によって、ＳＴ３Ｇａｌ３  反応の汚れが精製された。
【１１５１】
３分岐と２分岐のシアル化あるいはＰＥＧ化ＥＰＯの生物学的検定。３分岐と２分岐のシアル化ＥＰＯグリコ形およびＰＥＧ１０ｋＤａと１ｋＤａグリコ形の活性は、上述のように、ＴＦ−１細胞株とＭＴＴ生存テストを使って調べられた。図１５３は、ＭＴＴ細胞増殖分析の結果を示す。ＥＤＰ２μｇ/ｍｌで、２分岐のシアル化ＥＰＯは殆ど対照のＥｐｏｇｅｎの活性を持った。それに対して３分岐のシアル化ＥＰＯは、著しくより小さな活性であった。
【１１５２】
ファクターＸ
１９．ＣＨＯ細胞で作られたファクターＩＸのグリコＰＥＧ化
この例は、ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧを持つアジアロ  ファクターＩＸの調製とそのシアル化を説明する。
【１１５３】
ファクターＩＸの脱シアル化。凝固ファクターＩＸ（ｒＦａｃｔｏｒ  ＩＸ）の組み換え形は、ＣＨＯ細胞で作られた。６０００ＩＵのｒファクターＩＸが、１２ｍｌ  ＵＳＰ  Ｈ２Ｏ全体に溶かされた。この溶液は、さらに別の６ｍＬ  ＵＳＰ  Ｈ２Ｏで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０，ＰＬ−１０遠心ろ過器へ移された。溶液は２ｍＬに濃縮され、次に、１５ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３で希釈し、再濃縮した。希釈／濃縮は、効果的にバッファーが３．０ｍＬの最終体積になるように、４回繰り返した。この溶液２．９ｍＬ（ｒファクター約２９ｍｇ）は、小さなプラスチック試験管へ移され、それに５３０ｍＵのα２−３，６，８−ノイラミニダーゼ−アガロース抱合体（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ，  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，４５０μＬ）が加えられた。反応混合物は、３２℃で２６．５時間緩やかに攪拌された。混合物は、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離され、上澄が集められた。アガロース  ビーズ（ノイラミニダーゼを含む）は、０．５ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．１２、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３で洗浄された。プールされた洗浄液と上澄は、再度１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離され、残留アガロース樹脂が取り除かれた。プールされた脱シアル化タンパク質溶液は、同じバッファー液で１９ｍＬに希釈され、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０，ＰＬ−１０遠心ろ過器で〜２ｍＬまで濃縮された。溶液は、１５ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．１２、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３で２倍に希釈され、２ｍＬに再濃縮された。最終的な脱シアル化ｒファクターＩＸ溶液は、Ｔｒｉｓバッファーで、最終体積３ｍＬ（〜１０ｍｇ／ｍＬ）まで希釈された。天然と脱シアル化のｒファクターＩＸ試料はＩＥＦ−電気泳動によって分析された。まず１０μＬのＴｒｉｓバッファーで希釈され、１２μＬの試料を含むバッファーと混合された１．５μＬ（１５μｇ）の試料を使って、ゲル等電点電気泳動（ｐＨ３−７）が行われた。標準的な操作を使って、ゲルは装着され、動かされ、固定された。ゲルは、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色され（図１５４）、脱シアル化ファクターＩＸのバンドを示した。
【１１５４】
ＰＥＧ（１ｋＤａと１０ｋＤａ）−ＳＡ−ファクターＩＸの調製。  脱シアル化ファクターＩＸ（２９ｍｇ，３ｍＬ）は、２つの１５ｍＬの遠心分離試験管中２つの１．５ｍＬ（１４．５ｍｇ）の試料へ分けられた。各溶液は、１２．６７ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ｋあるいは１０ｋ（７．２５μｍｏｌ）が加えられた。試験管は緩やかに逆さにされ、混合され、２．９Ｕ  ＳＴ３Ｇａｌ３（３２６μＬ）が加えられた（全体積１４．５ｍＬ）。試験管は再度逆転され、３２℃で６５時間緩やかに攪拌された。反応は、−２０℃で凍結して終わらせた。反応の１０μｇの試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。ＰＥＧ化タンパク質は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．１（Ｇｉｂｃｏ），６ｍＬ／分で、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｂｉｓｅｐ  Ｇ３０００ＳＷ（２１．５Ｘ３０ｃｍ，１３ｕｍ）ＨＰＬＣカラムで精製された。反応と精製は、ＳＤＳ  ＰａｇｅとＩＥＦゲルを使ってモニターされた。Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−グリシン４−２０％  １ｍｍゲルは、２μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３バッファーで希釈され、１２μＬの試料含有バッファーと１μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴとを混合され、８５℃で６分加熱された後、１０μＬ（１０μｇ）の試料と共に装着された。ゲルは、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色され（図１５５）、ＰＥＧ（１ｋＤａと１０ｋＤａ）−ＳＡ−ファクターＩＸのバンドを示した。
【１１５５】
２０．ファクターＩＸの直接シアリル−グリコＰＥＧ化
この例は、前もってシアリダーゼ処理無しでの、ファクターＩＸのシアリル−ＰＥＧ化を説明する。
【１１５６】
ＣＭＰ−ＰＥＧ−（１０ｋＤａ）でのファクターＩＸのシアリル−ＰＥＧ化。  ＣＨＯ細胞で発現され、完全にシアル化されたファクターＩＸ（１１００ＩＵ）は、５ｍＬの２０ｍＭ  ヒスチジン、５２０ｍＭ  グリシン、２％蔗糖、０．０５％  ＮａＮ３そして０．０１％  ポリソルベート８０，ｐＨ５．０に溶解された。次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（１０ｋＤａ）（２７ｍｇ，２．５μｍｏｌ）が溶液に溶かされ、１ＵのＳＴ３Ｇａｌ３が加えられた。反応は、３２℃で２８時間緩やかな混合の後、完了した。反応は、インビトロゲンによって記されたように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。生成タンパク質は、リン酸バッファー生理食塩，ｐＨ７．０（ＰＢＳ）、１ｍＬ／分、Ｒｆ＝９．５分で、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０Ｘ３００ｍｍ，１３μｍ）ＨＰＬＣカラムで精製された。
【１１５７】
ＣＭＰ−ＰＥＧ−（２０ｋＤａ）でのファクターＩＸのシアリル−ＰＥＧ化。ＣＨＯ細胞で発現され、完全にシアル化されたファクターＩＸ（１１００ＩＵ）は、５ｍＬの２０ｍＭ  ヒスチジン、５２０ｍＭ  グリシン、２％蔗糖、０．０５％  ＮａＮ３そして０．０１％  ポリソルベート８０，ｐＨ５．０に溶解された。次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（２０ｋＤａ）（５０ｍｇ，２．３μｍｏｌ）が溶液に溶かされ、ＣＳＴ−ＩＩが加えられた。反応は、３２℃で４２時間緩やかな混合の後、完了した。反応は、インビトロゲンによって記されたように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【１１５８】
生成タンパク質は、リン酸バッファー生理食塩，ｐＨ７．０（ＰＢＳ）、１ｍＬ／分、Ｒｆ＝９．５分で、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１０Ｘ３００ｍｍ，１３μｍ）ＨＰＬＣカラムで精製された。
【１１５９】
２１．グリコＰＥＧ化ファクターＩＸのシアル酸キャッピング
この例は、シアリル−グリコＰＥＧ化ペプチドのシアル酸キャッピングの操作を説明する。ここで、ファクターＩＸは典型的なペプチドである。
【１１６０】
ファクターＩＸ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）のＮ−連結とＯ−連結のグリカンのシアル酸キャッピング。精製されたｒファクターＩＸ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）（２．４ｍｇ）は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ(R)Ｐｌｕｓ  ２０，ＰＬ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）遠心ろ過器で濃縮され、バッファーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３へ変えられ最終体積１．８５ｍＬとされた。タンパク質溶液は、同じＴｒｉｓバッファー３７２μＬで希釈され、７．４ｍｇのＣＭＰ−ＳＡ（１２μｍｏｌ）が固体として加えられた。溶液は、混合のため逆にされ、０．１Ｕ  ＳＴ３Ｇａｌ１と０．１Ｕ  ＳＴ３Ｇａｌ３が加えられた。反応混合物は、３２℃で４２時間緩やかに攪拌された。
【１１６１】
１０μｇの反応試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−グリシン４−１２％  １ｍｍゲルについて行われ、インビトロゲンによって記されたように、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色された。短く言うと、試料１０μＬ（１０μｇ）は、１２μＬの試料の入ったバッファーおよび１μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴと混合され、８５℃で６分間加熱された（図１５６、６レーン）。
【１１６２】
ファクターＶＩＩａ
２２．ＢＨＫ細胞で作られた組み換えファクターＶＩＩａのグリコＰＥＧ化
この例は、ＢＨＫ細胞で作られた組み換えファクターＶＩＩａのグリコＰＥＧ化を説明する。
【１１６３】
アジアロ−ファクターＶＩＩａの調製。組み換えファクターＶＩＩａは、ＢＨＫ細胞（ハムスター赤ん坊の腎細胞）で作られた。ファクターＶＩＩａは、バッファー溶液（ｐＨ７．４、０．０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）中に１ｍｇ溶かされ、３００ｍＵのシアリダーゼ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）−アガロース抱合体で、３２℃で３日間培養された。反応をモニターするために、反応の小アリコートは、適当なバッファーで希釈され、インビトロゲン操作にしたがってＩＥＦゲルが行われた（図１５７）混合物は３，５００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。樹脂は、上のバッファー溶液（ｐＨ７．４、０．０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）で３回（３Ｘ２ｍＬ）洗浄され、組み合わせ洗浄された溶液はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ−２０中で濃縮された。残りの溶液は、０．０５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３で、最終体積１４．４ｍＬまでバッファー交換された。
【１１６４】
ファクターＶＩＩａ−ＳＡＰＥＧ（１ｋＤａと１０ｋＤａ）の調製。  脱シアル化ｒファクターＶＩＩａ溶液は、２つの等量７．２ｍｌの試料に分離された。各資料にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）（７．４ｍｇ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）（７．４ｍｇ）が加えられた。両方の試験管にＳＴ３Ｇａｌ３（１．５８Ｕ）が加えられ、反応混合物は３２℃で９６時間培養された。反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって記述された試薬と条件を使ってモニターされた。反応が完了した時、反応混合物は、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００予備カラムを使い、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションを集めた。生成物を含む一緒に合わせたフラクションは、４℃でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ−２０遠心ろ過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で濃縮され、濃縮溶液は改質化され、ファクターＶＩＩａ−ＰＥＧ（ビシンコニン酸 タンパク質検査、ＢＣＡ検査、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を９．１７ｍｇ生成する。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とＩＥＦ分析を使って分析された。試料は水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析された。図１５８は、天然ファクターＶＩＩａのＭＡＬＤＩ結果を示す。図１５９は、１ｋＤａＰＥＧでＰＥＧ化されたファクターＶＩＩａのＭＡＬＤＩ結果を示す。ここで、１ｋＤａＰＥＧでＰＥＧ化されたファクターＶＩＩａのピークは明白である。図１６０は、１０ｋＤａＰＥＧでＰＥＧ化されたファクターＶＩＩａのＭＡＬＤＩ結果を含む。ここで、１０ｋＤａＰＥＧでＰＥＧ化されたファクターＶＩＩａのピークは明白である。図１６１は、総ての反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ここで、ファクターＶＩＩａ―ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）のバンドは明白である。
【１１６５】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）
２３．ヒト下垂体誘導ＦＳＨのグリコＰＥＧ化
この例は、発明における接合体の集合を説明する。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、脱シアル化され、次にＣＭＰ−（シアル酸）−ＰＥＧと接合された。
【１１６６】
卵胞刺激ホルモンの脱シアル化。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（Ｈｕｍａｎ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ，  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  カタログ番号８６９００１）１ｍｇは、５００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解させた。この溶液３７５μＬは、小さなプラスチック試験管へ移され、２６３ｍＵのノイラミダーゼ  ＩＩ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が加えられた。反応混合物は３２℃で１５時間緩やかに振られた。反応混合物は、あらかじめ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３と平衡にしておいたＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロース抱合体６００μＬへ加えられ、４℃で６．５時間緩やかに回転攪拌された。験濁液は１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離され上澄が集められた。ビーズは０．５ｍＬのバッファーで５回洗浄され、すべての上澄はプールされた。酵素溶液は２Ｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３を含む溶液で４℃で１５時間透析（７０００ＭＷＣＯ）され、次に４℃で４時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３へ２回透析された。溶液は、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃで２μｇ／μＬまで濃縮され、−２０℃で保存された。反応試料はＩＥＦゲル（ｐＨ３−７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ）によって分析された（図１６２）。
【１１６７】
ヒト下垂体誘導ＳＡ−ＦＳＨとＰＥＧ−ＳＡ−卵胞刺激ホルモンの調製。脱シアル化ＦＳＨ（１００μｇ，５０μＬ）とＣＭＰ−シアル酸あるいはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａまたは１０ｋＤａ）（０．０５ｕｍｏｌ）は、１３．５μＬのＨ２Ｏ（ＮａＯＨでｐＨ８に調製）中に、０．５ｍＬプラスチック試験管中で溶解させた。試験管は、簡単に渦を発生させ、４０ｍＵのＳＴ３Ｇａｌ３（３６．５μＬ）が加えられた（全体積１００μＬ）。試験管は再度渦を発生させ、３２℃で２４時間緩やかに振った。反応は−８０℃で凍結させることによって終わらせた。１５μｇの反応試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１６３）、ＩＥＦゲル（図１６４）、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析された。天然のＦＳＨはまた同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された（図１６５）。
【１１６８】
反応生成物のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析とＩＥＦゲル分析。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析のためのＮｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−グリシン  ８−１６％  １ｍｍゲルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入された。７．５μL（１５μｇ）のFSH反応試料は、５μLの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３バッファーで希釈され、１５μLの試料挿入バッファーと１μのメルカプタノールと混合され、８５℃で６分間加熱された。ゲルはインビトロゲンによって指示されたように実験され、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色された。
【１１６９】
ＦＳＨ試料（１５μｇ）は、５μLの  Ｔｒｉｓバッファーで希釈され、１５μLの試料挿入バッファーと混合された（図１６２）。試料は次に、ゲル等電点電気泳動（ｐH３−７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が適用された（図１６５）。ゲルはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって指示されたように実験され、調整され、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色された。
【１１７０】
２４．ＣＨＯ細胞で組み換え的に作られた組み換えＦＳＨのグリコＰＥＧ化
この例は、発明の接合体の集合を説明する。脱シアル化ＦＳＨは、ＣＭＰ−（シアル酸）−ＰＥＧと接合された。
【１１７１】
組み換えアジアロ卵胞刺激ホルモンの調製。ＣＨＯから作られた組み換え卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）が、これらの研究で使われた。７，５００ＩＵのｒＦＳＨが、８ｍＬの水に溶解された。FSH溶液は、５０ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  中で透析され、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０遠心ろ過器で５００μＬまで濃縮された。この溶液の一部（４００μL）（〜０．８ｍｇ  ＦＳＨ）は小さなプラスチック試験管へ移され、それに２７５ｍＵのノイラミダーゼ  ＩＩ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が加えられた。反応混合物は、３２℃で１６時間混合された。反応混合物は、予め洗浄されたＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロース抱合体６００μＬへ加えられ、４℃で２４時間緩やかに回転攪拌された。混合物は、１０，０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。ビーズは０．６ｍＬの  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで３度、０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで１度、０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで１度洗浄され、上澄はプールされた。上澄は４℃で、２Ｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析され、さらにもう２度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析された。透析された溶液は次に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０遠心ろ過器で４２０μＬまで濃縮され、−２０℃で保存された。
【１１７２】
天然および脱シアル化されたｒＦＳＨ試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦによって分析された（図１６６）。Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−グリシン  ８−１６％はインビトロゲンから購入された。試料（７．５μL，１５μｇ）は、５μLの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３バッファーで希釈され、１５μLの試料挿入バッファーと１μLの９Ｍβ−メルカプトエタノールと混合され、８５℃で６分加熱された。ゲルはインビトロゲンの指示のように実験され、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ（インビトロベン）で着色された。ゲル等電点電気泳動（ｐH３−７）は、インビトロゲンから購入された。試料（７．５μL，１５μｇ）は、５μLのＴｒｉｓ  バッファーで希釈され、１５μLの試料挿入バッファーと混合された。ゲルはロードされ、インビトロゲンの指示のように調整された。ゲルは、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色された。天然と脱シアル化されたＦＳＨはまた同様に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析された。
【１１７３】
組み換え卵胞刺激ホルモンのシアリルＰＥＧ化。脱シアル化ＦＳＨ（１００μｇ，５４μL）とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａあるいは１０ｋＤａ）が、２８μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に、０．５ｍＬプラスチック試験管中で溶解された。試験管は、渦を発生させられ、２０ｍＵのＳＴ３Ｇａｌ３が加えられた（全体積１００μＬ）。試験管は、再度渦を発生させられ、３２℃で２４時間緩やかに混合され、反応は−８０℃で凍らせることによって終わらせた。この反応の試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１６７）、ＩＥＦゲル（図１６８）そしてＭＡＪＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって上述のように分析された。ＭＡＬＤＩはまた同様に、ＰＥＧ化ｒＦＳＨについても行われた。イオン化の間に、ＳＡ−ＰＥＧは、グリコタンパクのＮ−グリカン構造から取り除かれる。天然のＦＳＨは、１３９２８にピークを与え；ＡＳ−ｒＦＳＨ（１３２８２）；再シアル化ｒＦＳＨ（１３３３２）；ＰＥＧ１０００−ｒＦＳＨ（１３５１５；１４９６０（１）；１６４５５（２）；１７７９６（３）；１９３２１（４）；そしてＰＥＧ１００００（２３５６０（１）；３４７９０（２）；４５６７０（３）；５６７６０（４））にそれぞれピークを生じる。
【１１７４】
２５．グリコＰＥＧ化ＦＳＨの薬動力学研究
この例は、発明の方法にしたがって準備されたグリコＰＥＧ化卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の薬動力学的特性の生体内検査について、  非ＰＥＧ化ＦＳＨと比較して説明する。
【１１７５】
ＦＳＨ、ＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）とＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）は、標準的な条件を使って、放射性ヨウ素化され（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）、０．１％ＢＳＡを含むリン酸バッファー生理食塩水中で実施された。リン酸バッファー中適当な濃度に希釈の後、それぞれの検査ＦＳＨタンパク質（それぞれ０．４μｇ）は、メスSprague-Dawley ラット（体重２５０−３００ｇ）に 静脈注射され、０から80時間の間の時点で採決された。血液試料の放射能はガンマカウンターを使って分析され、薬動力学は標準方法を使って分析された（図１６９）。ＦＳＨは、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）よりずっと早く血液から取り除かれた。そして順に、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）は、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）より幾分早く取り除かれた。
【１１７６】
２６．グリコＰＥＧ化ＦＳＨの生体外活性セルトリ細胞の生体試験
この例は、培養セルトリ細胞に基づく卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）活性の生体試験について説明する。この試験は、グリコ接合を含めてグリコ改造後のＦＳＨの生物活性を決定するために有効である。
【１１７７】
この生体試験は、黄体形成ホルモンではなくてＦＳＨが、未成熟の老化したネズミから得られた培養セルトリ細胞に加えられた時に作られるエストラジオールの量の間に存在する線量反応関係に基づいている。外因性のテストステロンは、ＦＳＨの存在下で１７β―エストラジオールに変えられる。
【１１７８】
セルトリ細胞を得るために、７から１０日のSprague-Dawley ラットが使われた。生贄の後、睾丸が取り離され、組織はコラゲナーゼ（1ｍｇ/ｍｌ）、トリプシン（1ｍｇ/ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（1ｍｇ/ｍｌ）、そしてＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ ）（５μｇ/ｍｌ）中での５から１０分の培養によって分散された。細管のフラグメントはフラスコの底に置かれ、ＰＢＳ（１ｘ）中で洗浄された。 細管のフラグメントは、同じ酵素：コラゲナーゼ（1ｍｇ/ｍｌ）、トリプシン（1ｍｇ/ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（1ｍｇ/ｍｌ）、そしてＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ ）（５μｇ/ｍｌ）を含む媒体で２０分再培養された。
【１１７９】
細管のフラグメントは、均一化され、無血清媒体中で２４このプレートへ移した。１つのプレート当たり５Ｘ１０５個の細胞が分散された。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した後、新鮮な媒体が細胞に加えられた。無血清媒体の組成：ＤＭＥＭ（１ｖｏｌ）、ＨａｍのＦ１０栄養混合物（１ｖｏｌ）、インシュリン１μｇ/ｍｌ、ＥＧＦ１０ｎｇ/ｍｌ、Ｔ４  ２０ｐｇ/ｍｌ、ハイドロコルチゾン１０−８Ｍ、レチノイン酸１０−６Ｍ。
【１１８０】
刺激実験は、３７℃、５％ＣＯ２で、標準ＦＳＨあるいは試料を２４時間培養することから成っている。変化についての平均検査内係数は９％で、平均検査間係数は１１％である。
１７Ｂ−エストラジオール  Ｅｌｉｓａ  Ｋｉｔ  ＤＥ２０００（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）が、ＦＳＨ,  ＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）,ＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）での培養後のエストラジオールのレベルを定量化するために使われた。
【１１８１】
操作は次のようである：１００μｌのエストラジオール標準（キットで提供され、キットの指示どおりに準備した）あるいは試料は、１７Ｂ−エストラジオール  Ｅｌｉｓａのプレートへピペットで取った；５０μｌの１７Ｂ−エストラジオール  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅキットで提供され、キットの指示どおりに準備した）が、それぞれのプレートに加えられ；５０μｌの１７Ｂ−エストラジオール抗体溶液（キットで提供され、キットの指示どおりに準備した）が、各プレートに加えられ；プレートは２時間室温２００ｒｐｍで培養され；液体は各プレートから吸引され；プレートは洗浄溶液を使って４回洗浄され；総ての液体は取り除かれ；２００μｌのｐＮＰＰ基質（キットで提供され、キットの指示どおりに準備した）が総てのプレートへ加えられ４５分培養され；５０μｌの停止液（キットで提供され、キットの指示どおりに準備した）が加えられプレートは４０５ｎｍで読み取られた（図１７０）。
ＦＳＨ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）は１μｇ／ｍｌで、中位のセルトリ細胞刺激を示したのに対して、ＦＳＨ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）は、非ＰＥＧ化ＦＳＨより５０％も大きくセルトリ細胞を刺激した。
【１１８２】
２７．グリコＰＥＧ化ＦＳＨの生体内活性のＳｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ生体試験
この例では、グリコＰＥＧ化ＦＳＨの生体内活性を決めるために、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ生体試験（Ｓｔｅｅｌｍａｎ  ａｎｄＰｏｈｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ５３：６０４−６１５）が使われた。Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ試験は、ヒト絨毛膜ゴナドトロピンで接合したＦＳＨの生体内活性を測定するために卵巣重量を利用する。
【１１８３】
Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ試験は、Ｃｈｒｉｓｔｉｎ−Ｍａｉｔｒｅら（２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ２１：５１−５７）にきされた手続にしたがって遂行された。７匹のメスSprague-Dawley ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）生後２１から２２日、試験操作を始める少なくとも５日前に、試験施設に収容する。操作の間中、動物の部屋は１８から２６℃、相対湿度３０から７０％、１２時間人工光、１２時間暗闇にコントロールされた。総ての動物は、Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）または同等品そして水が無制限に与えられた。動物操作は、Ｃａｌｖｅｒｔ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｏｌｙｐｈａｎｔ，ＰＡ）で行われた。
【１１８４】
組み換えＦＳＨは、ＣＨＯ細胞で発現され、標準的な技術によって精製され、ＰＥＧ（１ｋＤａ）でＰＥＧ化された。ラットは、グループ当たり１０匹の、７つのテストグループに分けられた。−１と０の日に、総てのグループの動物は、０．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌ中の２０Ｉ．Ｕ．のヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＧＧ）を皮下注射された。１，２，３日に、対照動物は、０．９％ＮａＣｌ中の２０Ｉ．Ｕ．のＨＧＧを含んだ１回投与量の０．５ｍｌが皮下注射された。それに対して他のグループの動物は、ｒＦＳＨあるいはｒＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）で、１回投与量当たり０．１４μｇまたは０．４μｇまたは１．２μｇと増やされた。４日目に動物は、ＣＯ２吸入により安楽死させた。卵巣は取り出され、切断され、秤量された。平均卵巣重量が各ループについて決められた。
【１１８５】
図１７１は、４日目のテスト  グループの平均卵巣重量である。ＨＣＧだけを与えたグループ（対照）あるいは低投与量（０．１４μｇ）  のｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）大雑把に言って等しい卵巣重量であった。中投与量（０．４μｇ）あるいは高投与量（１．２μｇ）  のｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａ）を与えたグループは、大雑把に言って対照グループの２倍の卵巣重量であった。中投与量（０．４μｇ）で、グリコＰＥＧ化ｒＦＳＨは、大雑把に言って、非ＰＥＧ化ｒＦＳＨと同じ生体内活性（卵巣重量で決定された）であった。高投与量（１．２μｇ）で、グリコＰＥＧ化ｒＦＳＨは、非ＰＥＧ化ｒＦＳＨより幾分高い生体内活性であった。
【１１８６】
Ｇ−ＣＳＦ
２８．ＣＨＯ細胞で作られたＧ−ＣＳＦのグリコＰＥＧ化
【１１８７】
アジアロ顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調整。ＣＨＯ細胞で作られたＧ−ＣＳＦは、５０ｍM  Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  中で２．５ｍｇ／ｍＬで溶解され、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過で５００μＬまで濃縮された。溶液は、３００ｍＵのノイラミダーゼ  ＩＩ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）で３２℃１６時間培養される。反応をモニターするために、反応の小アリコートは適当なバッファーで希釈され、ＩＥＦゲルが行われた。次に反応混合物は、予め洗浄されたＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸 −アガロース抱合体（反応体積８００μＬ／ｍＬ）へ加えられ、洗浄されたビーズは２４時間４℃で緩やかに回転攪拌された。混合物は１０,０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。ビーズは３回Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄され、１度０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで、そして１度０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄され、総ての上澄はプールされる。上澄は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析され、次に２回さらに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析される。透析された溶液は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過を使って濃縮され、−２０℃で保存される。ＩＥＦゲルの条件は、インビトロゲンによって提供された操作と試薬にしたがった。天然と脱シアル化のＧ−ＣＳＦは、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析された。
【１１８８】
Ｇ−ＣＳＦ−（アルファ２,３）−シアリルＰＥＧの調整。脱シアル化のＧ−ＣＳＦは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解された。溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧと０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ１で３２℃２日間培養される。シアル酸−ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ実験カラムを使って精製され、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。天然とＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦは、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析される。
【１１８９】
Ｇ−ＣＳＦ−（アルファ２,８）−シアリルＰＥＧの調整。ＣＨＯ細胞で作られたＧ−ＣＳＦは、アルファ２,３−シアリル化Ｏリンクグリカンを含むが、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧと０．１Ｕ／ｍＬのＣＳＴ−ＩＩで３２℃２日間培養される。シアル酸−ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ実験カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。天然とＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦは、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析される。
【１１９０】
Ｇ−ＣＳＦ−（アルファ２,６）−シアリルＰＥＧの調整。ＯリンクのＧａｌＮＡｃだけを含むＧ−ＣＳＦは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧと０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩまたはＩＩで３２℃２日間培養される。シアル酸−ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ実験カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。天然とＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦは、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析される。
ＣＨＯ細胞で作られたＧ−ＣＳＦは、アルスロバクター  シアリダーゼで処理され、次にＳｕｐｅｒｄｅｘ７５でのサイズ抽出によって精製され、ＳＴ３Ｇａｌ１またはＳＴ３Ｇａｌ２で処理され、次にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ  ２０ｋＤａで処理された。その結果生じた分子は、イオン交換とゲルろ過によって精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、ＰＥＧ化は完全であることを実証した。これはＯ−連結グリカンのＰＥＧ化の最初の実証である。
【１１９１】
グルコセレブロシダ−ゼ
２９．ＣＨＯ細胞で作られたグルコセレブロシダ−ゼ−マンノース−６−リン酸
この例は、マンノース−６−リン酸をグルコセレブロシダ−ゼのようにＣＨＯ細胞で作られるペプチドへグリコ接合させる手続きを説明する。
【１１９２】
アジアログルコセラミダーゼの調整。ＣＨＯ細胞で作られるグルコセレブロシダ−ゼは、２．５ｍｇ／ｍＬで５０ｍM  Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ中に溶解され、３００ｍＵ／ｍＬのシアリダーゼ−アガロース抱接体と３２℃で１６時間培養される。反応をモニターするために、反応の小アリコートは適当なバッファーで希釈され、ＩＥＦゲルとＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ操作にしたがって行われた。混合物は１０,０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。ビーズは３回Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄され、１度０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで、そして１度０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄される。総ての上澄はプールされる。上澄は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析され、次に２回さらに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析される。透析された溶液は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過を使って濃縮される。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１１９３】
グルコセレブロシダ−ゼ−ＳＡ−連結剤−マンノース−６−リン酸（操作１）。上述のアジアログルコセレブロシダ−ゼは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−連結剤−Ｍａｎ−６−リン酸と０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３ＧａＬ３と３２℃で２日間培養される。シアル酸−連結剤−Ｍａｎ−６−リン酸の挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。反応が完了した時、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１１９４】
グルコセレブロシダ−ゼ−ＳＡ−連結剤−マンノース−６−リン酸（操作２）。グルコセレブロシダ−ゼは、ＣＨＯ細胞で作られるが不完全にシアル化されているが、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−連結剤−Ｍａｎ−６−リン酸と０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ３と３２℃で２日間培養される。シアル酸−連結剤−Ｍａｎ−６−リン酸の挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。反応が完了した時、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１１９５】
３０．グルコセレブロシダ−ゼ−トランスフェリン
この例は、タンパク質のグリコ接合の操作を説明する。特にトランスフェリンがグルコセレブロシダ−ゼにグリコ接合される。グルコセラミダーゼ上にＧｌｃＮＡｃ−ＡＳＮ構造が作られ、トランスフェリン−ＳＡ−連結剤−Ｇａｌ−ＵＤＰがガラクトシルトランスフェラーゼを使ってＧＮＤＦ  ＧｌｃＮＡｃ−ＡＳＮ構造に接合される。
【１１９６】
ＧｌｃＮＡｃ−グルコセレブロシダ−ゼ（ＣｅｒｅｚｙｍｅＴＭ）の調整。ＣＨＯ細胞で作られるＣｅｒｅｚｙｍｅＴＭ（グルコセレブロシダ−ゼ）は、２．５ｍｇ／ｍＬで５０ｍM  Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３  中に溶解され、３００ｍＵ／ｍＬの  Ｅｎｄｏ‐Ｈ−アガロース抱合体と３２℃で１６時間培養される。反応をモニターするために、反応の小アリコートに、反応の小アリコートは適当なバッファーで希釈され、ＩＥＦゲルとＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ操作にしたがって行われた。混合物は１０,０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。ビーズは３回Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄され、１度０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで、そして１度０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄される。総ての上澄はプールされる。上澄は、４℃で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析され、次に２回さらに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析される。透析された溶液は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過を使って濃縮される。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１１９７】
トランスフェリン−ＳＡ−連結剤−Ｇａｌ−グルコセレブロシダ−ゼの調整。上述のトランスフェリン−ＳＡ−連結剤−Ｇａｌ−ＵＤＰは、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｃＮＡｃ−グルコセレブロシダ−ゼと０．１Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼと３２℃で２日間培養される。グルコセレブロシダ−ゼの挿入をモニターするために、ペプチドは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によって分離され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１１９８】
ＧＭ−ＣＳＦ
３１．  サッカロマイセスで作られたＧｌｃＮＡｃ−ＡＳＮ構造：ＧＭ−ＣＳＦ  
の発生とＰＥＧ化
この例は、ＰＥＧ化ＧｌｃＮＡｃ−ＡＳＮでの組織型活性化因子の調整を説明する。
イーストで発現される組み換えＧＭ−ＣＳＦは、２Ｎ−連結と２Ｏ−連結のグリカンを含むことが期待される。Ｎ−連結グリカンは、分岐マンナン  タイプである筈である。この組み換えグリコタンパクは、ペプチド／タンパク質のバックボーン上、アスパラギン（Ａｓｎ）残基上にＧｌｃＮＡｃ結節を発生させるために、エンドグリコシダ−ゼＨ、エンドグリコシダ−ゼ−Ｆ１、エンドグリコシダ−ゼ−Ｆ２、エンドグリコシダ−ゼ−Ｆ３、エンドグリコシダ−ゼ−Ｍ、だけ、あるいはマンノシダ−ゼＩ，ＩＩ，ＩＩＩとの組み合わせから成るエンドグリコシダ−ゼ−で処理される。ペプチド／タンパク質のバックボーン上のＧｌｃＮＡｃ構造は次に、それぞれＵＤＰ−ガラクト−スあるいはＵＤＰ−ガラクト−ス−６−ＰＥＧとＧａｌＴ１のようなガラクトシルトランスフェラーゼを使って、ガラクト−スやガラクト−ス−ＰＥＧで修飾される。第一のケースでは、ガラクト−ス−ＰＥＧは、末端残基である。第二のケースでは、ガラクト−スは更にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧドナーとＳＴ３ＧａｌＩＩＩのようなシアリルトランスフェラーゼを使ってＳＡ−ＰＥＧで修飾される。別の実施例では、ペプチド／タンパク質のバックボーン上のＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ構造は、上述のようにガラクトシル化とシアリル化することが出来て、次に更に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧとカンピロバクター・ジェジュニ  ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子でコード化された酵素のようなα２,８シアリルトランスフェラーゼを使ってシアル化することが出来る。
【１１９９】
ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ
３２．ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭに対するミトラマイシンのグリココンジュゲーション
この例は、哺乳類細胞で作られた抗体分子のＦｃ領域のグリカンにミトラマイシンのような小さな分子をグリココンジュゲートさせるための操作を説明する。ここでは、抗体ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭが使われるが、当業者は、この方法が多くの他の抗体で使用できることを有り難く思うであろう。
【１２００】
ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ−Ｇａｌ−連結剤−ミトラマイシンの調整。ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭは、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、Ｆｃ領域グリカンにミトラマイシンを導入するために、１ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクト−ス−連結剤−ミトラマイシンと０．１Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼで３２℃で２日間培養される。ガラクト−スの挿入をモニターするために、反応の小アリコートは、１４Ｃ−ガラクト−ス−ＵＤＰリガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。  放射性ラベルの挿入は、インラインの放射能検出器を使って定量化される。
【１２０１】
反応が完了した時、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。生成物を含むフラクションは、合わされて、濃縮され、バッファー交換され、凍結乾燥される。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２０２】
インターフェロンαとインターフェロンβ
３３．哺乳類系あるいは昆虫系で発現されるタンパク質：ＥＰＯ、インターフェロンα
そしてインターフェロンβ  のグリコＰＥＧ化
この例は、哺乳類系あるいは昆虫系で発現されるＰＥＧ化ペプチドの調整を説明する。
【１２０３】
哺乳類発現系からの受容体（アクセプター）の調整。ＣＭＰ−シアル酸ＰＥＧを使ってグリコＰＥＧ化されるペプチドは、ガラクト−スが末端となるグリカンを持つひ必要がある。哺乳類発現系からの大抵のペプチドは、最初に取り除くことを要する末端シアル酸を持つであろう。
【１２０４】
シアリダーゼ消化。ペプチドはシアリダーゼを使って、脱シアル化される。典型的な操作は、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えたＴｒｉｓバッファー生理食塩水、ｐＨ７．２中のペプチド溶液を０．２Ｕ／ｍｌのコレラ菌からの固定化シアリダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で、３２℃２４時間培養することである。微生物増殖は、除菌または０．０２％アジ化ナトリウムを加えることによって抑制できる。次に樹脂は、遠心分離あるいはろ過によって取り除かれ、洗浄され捕獲されたペプチドが回収される。この時点で、樹脂からろ過されたシアリダーゼを抑制するために、溶液にＥＤＴＡを加えて良い。
【１２０５】
昆虫発現系からの調整。ＥＰＯ、インターフェロン−アルファそしてインターフェロン−ベータはまた同様に、イーストや植物や昆虫細胞のような非哺乳類系で発現される可能性がある。ＣＭＰ−シアル酸ＰＥＧを使ってグリコＰＥＧ化されるペプチドは、ガラクト−スが末端となるグリカンを持つひ必要がある。例えば、昆虫細胞で発現されるペプチドの多くのＮ−グリカンは、トリマンノシルコアである。これらのグリカンは最初に、シアリルトランスフェラーゼの受容体となる前に、ガラクト−スが末端となるグリカンに増築される。
【１２０６】
トリマンノシルコアから受容体グリカンの構築。ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）は、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＵＤＰ−ｇｌｃＮＡｃ、０．０５Ｕ/ｍＬ  ＧｌｃＮＡｃＴ  Ｉ、０．０５Ｕ／ｍＬ  ＧｌｃＮＡｃＴ  ＩＩを含むＴｒｉｓバッファー生理食塩水、ｐＨ７．２中で、３２℃２４時間あるいは実質上反応が完了するまで培養される。微生物増殖は、除菌または０．０２％アジ化ナトリウムを加えることによって抑制できる。ＵＤＰとその他の小分子を取り除くためのバッファー交換の後、ＵＤＰ−ガラクト−スとＭｎＣｌ２が各５ｍＭまで加えられ、ガラクトシルトランスフェラーゼが０．０５Ｕ／ｍＬまで加えられ、３２℃２４時間あるいは実質上反応が完了するまで培養される。微生物増殖は、除菌または０．０２％アジ化ナトリウムを加えることによって抑制できる。ペプチドは、グリコＰＥＧ化される状態にある。
【１２０７】
Ｏ−連結グリカンの構築。望みのＯ−連結Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃを酵素的に作るために、インターフェロンアルファに対して、同様の戦略が採られる可能性がある。必要なら、セリンあるいはトレオニンにリンクしたＧａｌＮＡｃは、適当なＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＮＡｃ  Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ  Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４など）とＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使って、ペプチドに付加され得る。また必要なら、ガラクトシルトランスフェラーゼとＵＤＰ−ガラクト−スを使って、ガラクト−スを付加することが出来る。
【１２０８】
シアリルトランスフェラーゼを使うグリコＰＥＧ化。  末端ガラクト−スを持つグリコペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）は、Ｔｒｉｓバッファー生理食塩水＋０．０２％アジ化ナトリウム中で、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（０．７５ｍＭ）と０．４Ｕ／ｍＬ  シアリルトランスフェラーゼ（ＥＰＯとインターフェロン  ベータのＮ−グリカンに対してはＳＴ３Ｇａｌ３またはＳＴ３Ｇａｌ４；インターフェロン  アルファのＯ−グリカンに対してはＳＴ３Ｇａｌ４またはＳＴ３Ｇａｌ１）で、３２℃２４時間培養される。役に立つかもしれない他のトランスフェラーゼには、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌｌａ  からの２,６−シアリルトランスフェラーゼがある。受容体ペプチド濃度は、最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬからペプチドの溶解度限界の範囲である。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの濃度は、可能なサイトを超過するのに十分であるべきであるが、ＰＥＧによるペプチドの溶解問題を引き起こすほど高くあるべきではなく、５０μＭから５ｍＭまでの範囲となり、温度は２℃から４０℃の範囲であると良い。反応完了に要する時間は、温度、受容体基質に対する酵素の相対量、供与体基質濃度、そしてｐＨに依存する。
【１２０９】
３４．ＣＨＯ細胞で作られたインターフェロンαのグリコＰＲＧ化
アジアロ−インターフェロンαの調整。ＣＨＯ細胞で作られたインターフェロンアルファは、５０ｍM  Ｔｒｉｓ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  中に溶解され、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ  ２０遠心ろ過器で５００μＬまで濃縮される。この溶液は、３００ｍＵ／ｍＬのノイラミダーゼ  ＩＩ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）と、３２℃で１６時間培養された。反応をモニターするために、反応の小アリコートは適当なバッファーで希釈され、ＩＥＦゲルが行われた。次に反応混合物は、予め洗浄されたＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸 −アガロース抱合体（反応体積８００μＬ／ｍＬ）へ加えられ、洗浄されたビーズは２４時間４℃で緩やかに回転攪拌された。混合物は１０,０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。ビーズは３回Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄され、１度０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで、そして１度０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで洗浄され、総ての上澄はプールされる。上澄は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析され、次に２回さらに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析される。透析された溶液は次に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過を使って濃縮され、−２０℃で保存される。  ＩＥＦゲルの条件は、インビトロゲンによって提供された操作と試薬にしたがった。天然と脱シアル化のＧ−ＣＳＦは、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析された。
【１２１０】
インターフェロン−アルファ−（アルファ２,３）−シアリル−ＰＥＧの調整。脱シアル化インターフェロン−アルファは、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧと０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ１で、３２℃で２日間培養される。  シアル酸−ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。天然と脱シアル化のインターフェロン  アルファの試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２１１】
インターフェロン−アルファ−（アルファ２,８）−シアリル−ＰＥＧの調整。ＣＨＯで作られたインターフェロン  アルファは、２,３−シアル化  Ｏ−連結グリカンを含むのであるが、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧと０．１Ｕ／ｍＬのＣＳＴ−ＩＩで、３２℃で２日間培養される。シアル酸−ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。天然と脱シアル化のインターフェロン  アルファの試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２１２】
インターフェロン−アルファ−（アルファ２,６）−シアリル−ＰＥＧの調整。ＯリンクＧａｌＮＡｃだけを含むインターフェロン  アルファは、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧと０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩあるいはＩＩで、３２℃で２日間培養される。シアル酸−ＰＥＧの挿入をモニターするために、反応の小アリコートに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの蛍光ラベルの挿入は、インラインの蛍光検出器を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。天然と脱シアル化のインターフェロン  アルファの試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２１３】
３５．ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とＰＥＧ（２０ｋＤａ）でのインターフェロン−β−１ａのグリコＰＥＧ化
この例は、ＰＥＧ（１０ｋＤａ）またはＰＥＧ（２０ｋＤａ）でのインターフェロン−βのグリコＰＥＧ化の操作を説明する。
【１２１４】
短的に、インターフェロン−β−１ａ（ＩＮＦ−β）は、Ｂｉｏｇｅｎ（ＡｖｏｎｅｘＴＭ）から得られた。ＩＮＦ−βはまず、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフィーによって精製された。次にＩＮＦ−βは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  シアリダーゼで脱シアル化された。次にＩＮＦ−βは、ＰＥＧ（１０ｋＤａ）またはＰＥＧ（２０ｋＤａ）でＰＥＧ化され、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００クロマトグラフィーによって精製された。
【１２１５】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフィー精製。ＩＮＦ−β（１５０μｇ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）にかけられ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  ヒスチジン、そして１０％グリセロールのＰＢＳで溶出された。溶出物は、２８０ｎｍでの吸光度でモニターされ（図１７２Ａと１７２Ｂ）、フラクションが集められた。ピーク４と５は、プールされ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５スピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濃縮され、バッファーは、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  ツイーン−２０、２０ｍＭ  ヒスチジンそして１０％グリセロールでＴＢＳへ交換された。
【１２１６】
シアリダーゼ反応。ＩＮＦ−βは次に、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  ツイーン−２０、２０ｍＭ  ヒスチジンそして１０％グリセロールのＴＢＳ中のアラゴナ−ゼ上で、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  シアリダーゼ（７０ｍＵ／ｍｌ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ(R)，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で脱シアル化された。反応は、３２℃１２時間行われた。ＩＮＦ−βは、０．２２μｍのＳｐｉｎ−ＸＴＭフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）でアラゴナ−ゼから取り除かれた。図１７３Ａは、天然のＩＮＦ−βから解放されたグリカンのＭＡＬＤＩ分析を示す。天然のＩＮＦ−βは、末端シアル酸部分を含む多くのグリコ形を持つ。図１７３Ｂは、脱シアル化ＩＮＦ−βから解放されたグリカンのＭＡＬＤＩ分析を示す。脱シアル化ＩＮＦ−βは、一義的に、末端ガラクト−ス部分の２分岐の１つのグリコ形を持つ。
【１２１７】
シアリル化のレクチン  ドット−ブロット分析。脱シアリダーゼ反応からのＩＮＦ−β試料は、ニトロセルロースにドット−ブロットされ、次にＴｒｉｓバッファー生理食塩水（ＴＢＳ：０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）とＤＩＧキット（Ｒｏｃｈｅ  ＃２１０２３８で得られるグリカン分別化キット）ブロッキング  バッファーでブロックされた。幾つかのブロットは、ＩＮＦ−βのα２,３−シアル化を検出するために、ジゴキソゲニン（ＤＩＧ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ,  ＩＬ）でラベルされたＭａａｃｋｉａ  Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ）で培養された。これらのブロットは、ＴＢＳで洗浄され、アルカリ  ホスファターゼ  でラベルされたアンチ・ジギトニン 抗体で培養され、再度 ＴＢＳで洗浄され、ＮＢＴ／Ｘ−フォスファターゼ溶液で展開された。ここで、ＮＢＴは４−ニトロブルー  テトラゾリウムクロライドでＸ−フォスファターゼは、５−ブロモ−４−クロロ−３インドイル  フォスフェートである。図１７４の左側は、脱シアリル化反応後のＩＮＦ−βのＭＡＡブロットの結果を示す。ＩＮＦ−βは、脱シアル化試料の天然のＩＮＦ−βと比較してドット発展の減少で示されるように、部分的にジシアル化されている。
【１２１８】
他のブロットは、ＩＮＦ−β上に展開されたガラクト−ス残基を検出するためにビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でラベルされたＥｒｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ  レクチン（ＥＣＬ）で培養された。２．５μｇ／ｍｌ  ＥＣＬでの培養の後、ブロットはＴＢＳで洗浄され、アルカリ  フォスフェートでラベルされたストレップタビジンで培養された。ブロットは次に、再度洗浄され、展開された。図１７４の右側は、展開後のＥＣＬブロットを示す。天然のＩＮＦ−βと比較して、脱シアル化ＩＮＦ−βのドット強度の増大は、より多くさらされたガラクト−ス部分を示し、したがって広範な脱シアル化を示す。
【１２１９】  
ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）での脱シアル化ＩＮＦ−βのＰＥＧ化。脱シアル化ＩＮＦ−β（０．０５ｍｇ／ｍｌ）は、ＳＴ３Ｇａｌ３（５０ｍＵ／ｍｌ）とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）で、ＴＢＳ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  ヒスチジン、１０％グリセロール  の適当なバッファー中で、３２℃５０時間でＰＥＧ化された。図１７５Ａは、反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表し、ＰＥＧ化ＩＮＦ−βは約９８ｋＤａであることを示した。
【１２２０】  
ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）での脱シアル化ＩＮＦ−βのＰＥＧ化。脱シアル化ＩＮＦ−β（０．５ｍｇ／ｍｌ）は、ＳＴ３Ｇａｌ３（１７０ｍＵ／ｍｌ）とＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）で、ＴＢＳ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  ヒスチジン、１０％グリセロール  の適当なバッファー中で、３２℃５０時間でＰＥＧ化された。図１７６は、ＰＥＧ化反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す。ＰＥＧ化ＩＮＦ−βは、広範なＰＥＧ化を示す非修飾ＩＮＦ−βで見られるよりずっと高い分子量を持つ。
【１２２１】  
ＰＥＧ（１０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００精製。ＰＥＧ反応の生成物は、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２  ツイーン−２０、２０ｍＭ  ヒスチジン、そして１０％グリセロールのＰＢＳ中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で、１ｍｌ／分、３０ｃｍ／時間の流速で分離された。溶出物は２８０ｎｍの吸光度でモニターされ（図１７７）、フラクションは集められた。ピーク３と４は、プールされ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５スピンフィルターで濃縮された。
【１２２２】  
ＰＥＧ（１０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βの生体検査。
この検査は、肺癌細胞株、Ａ５４９の増殖の抑制である。Ａ５４９細胞株は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、３７℃、５％  ＣＯ２で成長された肺癌接着細胞である。それらは、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５から得ることが出来る。ＰＢＳ１０ｍｌで細胞を洗浄し、ＰＢＳを取り除く。トリプシン  ５ｍｌを加え、室温で２０分あるいは３７℃で２分培養する。細胞が分離された時、２５ｍｌの溶媒に再浮揚させ、細胞を数える。１００００細胞／ｍｌの細胞濃度に希釈し、２００ｕｌ／プレートウェル（９６ｗｅｌｌｓ  ｐｌａｔｅ）を加える。３７℃、５％  ＣＯ２で４時間培養する。０．１  ｕｇ／ｍｌの濃度でＩＦＮ  Ｂを１ｍｌ準備する。プレート当たり１００ｕｌ（８レプリカ＝１レーン）を加える。溶媒２００ｕｌ（プレート当たり１００ｕｌだけ残る）取り除く。ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）（０．２２μｍで濾過された５ｍｇ／ｍｌ）を加える。３７℃、５％  ＣＯ２で４時間培養する。緩やかに溶媒を吸引ろ過し、イソプロパノール  １００ｍｌと６Ｎ  ＨＣｌ  の混合物を１００μｌ加える。クリスタル・バイオレットを均一化するために、上下で吸引ろ過する。ＯＤ５７０ｎｍを読み取る（６３０あるいは６９０ｎｍでのバックグラウンドを除去する）。
【１２２３】  
図１７８は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから溶出された、ＰＥＧ（１０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βを含むピークの生体検査の結果を示す。
【１２２４】  
ＰＥＧ（２０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００精製。ＰＥＧ（２０ｋＤａ）のＰＥＧ化反応の生成物は、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  ヒスチジン、そして１０％グリセロールのＰＢＳ中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で、１ｍｌ／分の流速で分離された。溶出物は２８０ｎｍの吸光度でモニターされ（図１７９）、フラクションは集められた。ピーク３は、多くのＰＥＧ（２０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βを含んでいた。
【１２２５】  
ＰＥＧ（２０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βのエンドトキシン検査。
Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ｌｙｓａｔｅ検査、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＃５０−６４Ｕが行われた。
【１２２６】
【表２４】
0005413548.tif 000098
＊表２４．の訳：ＰＥＧ（２０ｋＤａ）でＰＥＧ化されたＩＮＦ−βのエンドトキシン検査の結果
【１２２７】  
ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ
３６．ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ抗体のグリコＰＥＧ化
この例は、ＰＥＧ分子をＦｃ領域グリカンに導入することによる、組み換え抗体分子をＰＥＧ化するための操作を説明する。ここで、ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ、ＴＮＦ−Ｒ：ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、が模範的なペプチドである。
【１２２８】  
ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ−Ｇａｌ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）の調整。ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭは、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、Ｆｃ領域グリカンにＰＥＧを導入するために、１ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクト−ス−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）と０．１Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼで、３２℃で２日間培養される。ガラクト−スの挿入をモニターするために、反応の小アリコートは、１４Ｃ−ガラクト−ス−ＵＤＰリガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。放射性ラベルの挿入は、インラインの放射能検出器を使って定量化される。
【１２２９】  
反応が完了した時、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。生成物を含むフラクションは、合わされて、濃縮され、バッファー交換され、凍結乾燥される。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２３０】  
ＲｉｔｕｘａｎＴＭ
３７．ＲｉｔｕｘａｎＴＭに対するゲルダナマイシンのグリココンジュゲーション
この例は、ＲｉｔｕｘａｎＴＭのような、ＣＨＯ細胞で作られる抗体のＦｃ領域グリカンに対する、ゲルダナマイシンのような小さな分子のグリココンジュゲーションを説明する。ここでは、ＲｉｔｕｘａｎＴＭが使われるが、当業者は、この方法が多くの他の抗体で使用できることを有り難く思うであろう。
【１２３１】  
ＲｉｔｕｘａｎＴＭ−Ｇａｌ−連結剤−ゲルダナマイシンの調整。ＲｉｔｕｘａｎＴＭは、５０ｍＭ  のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解される。溶液は、Ｆｃ領域グリカンにゲルダナマイシンを導入するために、１ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクト−ス−連結剤−ゲルダナマイシンと０．１Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼで、３２℃で２日間培養される。ガラクト−スの挿入をモニターするために、反応の小アリコートは、１４Ｃ−ガラクト−ス−ＵＤＰリガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。  放射性ラベルの挿入は、インラインの放射能検出器を使って定量化される。
【１２３２】
反応が完了した時、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。生成物を含むフラクションは、合わされて、濃縮され、バッファー交換され、凍結乾燥される。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２３３】  
Ｒｎａｓｅ
３７．ハイブリッドおよび複合のＮ−グリカンへのハイマンノースＮ−グリカンの改造：
ウシ膵臓Ｒｎａｓｅ
【１２３４】
この例は、ハイブリッドあるいは複合のＮ−グリカンでの、ウシ膵臓Ｒｎａｓｅの調整を説明する。Ｒｎａｓｅのハイマンノース  Ｎ−連結グリカンは酵素的に消化され、ハイブリッド  Ｎ−連結グリカンが合成される。加えて、Ｒｎａｓｅのハイマンノース  Ｎ−連結グリカンは、酵素的に消化され、複合Ｎ−連結グリカンが合成される。
【１２３５】
グリコペプチドにおけるＮ−連結オリゴ糖のハイマンノース構造は、α−マンノシダーゼやグリコトランスフェラーゼの組み合わせを利用して、ハイブリッド形あるいは複合形へ修飾され得る。この例は、モデル基質のような単純なＮ−グリカンを使ってそのような努力をした結果である。
【１２３６】
ウシ膵臓から精製したリボヌクレア−ゼＢ（ＲＮａｓｅＢ）（Ｓｉｇｍａ）は、１２４のアミノ酸残基から成るグリコペプチドである。それはハイマンノース構造で修飾される単一の潜在的Ｎ−グリコシル化のサイトを持っている。その単純性と低分子量（１３．７ｋＤａから１５．５ｋＤａ）のために、リボヌクレア−ゼＢは、ハイマンノース構造からハイブリッドあるいは複合のＮ−連結オリゴ糖へのＮ−グリカン改造の実現可能性を実証するための良い候補である。
【１２３７】
ＲＮａｓｅＢのＭＡＬＤＩスペクトル（図１８０Ａ）とＮ−グリカナ−ゼによって開裂されたオリゴ糖のＨＰＬＣプロファイル（図１８０Ｂ）は、小部分の非修飾ペプチド以外に、ペプチドの多くのＮグリコシル化のサイトが、５から９のマンノース残基から成るハイマンノースオリゴ糖で修飾されることを示した。
【１２３８】
ハイマンノース  ＮグリカンのハイブリッドＮ−グリカンへの変換。ハイマンノース  Ｎグリカンは、図１８１に示すように、α1,２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ（β−1,２−アセチル  グルコサミル  トランスフェラーゼ）、ＧａｌＴ−Ｉ（β1,４−ガラクトシルトランスフェラーゼ）およびα２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６−シアリルトランスフェラーゼの組み合わせを使って、ハイブリッドＮ−グリカンへ変換された。
【１２３９】
例のように、ＲＮａｓｅＢのハイマンノース構造は、ハイブリッド構造への変換は成功した。
【１２４０】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからクローン化された単一のα1,２−マンノシダーゼを触媒として、Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒから得られ          た（図１８２）。ＲＮａｓｅＢ（１ｇ，約６７μｍｏｌ）は、ＭＥＳバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）中、全体積１０ｍＬで、１５ｍＵの組み換えＴ．ｒｅｅｓｅｉ  α1,２−マンノシダーゼで、３０℃、４５時間培養された。Ｍａｎ６−９ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質構造は、組み換えマンノシダ−ゼによって高い効率でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質へ変換することに成功した。
【１２４１】
また、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉから精製された単一のα1,２−マンノシダーゼを触媒として、Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒから得られた（図１８３）。ＲＮａｓｅＢ（４０μｇ，約２．７μｍｏｌ）は、ＮａＯＡＣバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）中、全体積２０μＬで、１５ｍＵの組み換えＡ．ｓａｉｔｏｉ  α1,２−マンノシダーゼ（ＧｌｙｋｏまたはＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）で、３０℃、４５時間培養された。Ｍａｎ６−９ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質構造は、市販で得られるマンノシダ−ゼによって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質へ変換することに成功した。しかしながら、ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質に対応する新しいピークが、スペクトルに現れた。これは調整中におけるエンドグリコシダ−ゼＨによる汚染の可能性を示している。幾つかの哺乳類アルファマンノシダ−ゼがこのステップを達成するのに必要であったが、α1,２−マンノシダーゼが、総てのα1,２リンクのマンノース残基を取り除くのに非常に有効であった。
【１２４２】
次に、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉによって、ＧｌｃＮＡｃ残基がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒへ付加された（図１８４）。ＲＮａｓｅＢを含む（６００μｇ，約４０ｎｍｏｌ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  α1,２−マンノシダーゼ反応後、反応混合物は、ＭｎＣｌ２（２０ｍＭ）とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（５ｍＭ）を含むＭＥＳバッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．５）中で、未精製の組み換えＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ（３４ｍＵ）で、全体積４００μｌで、３７℃４２時間培養された。ＧｌｃＮＡｃ残基は、組み換えＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉによって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質へ定量的に付加された。
【１２４３】
次に、ＧａｌＴ１を使って、Ｇａｌ残基が付加された（図１８５）。ＲＮａｓｅＢを含む（１２０μｇ，約８ｎｍｏｌ）ＧａｌＴ−Ｉ反応の後、反応混合物は、ＵＤＰ−Ｇａｌ（７．５ｍＭ）とＭｎＣｌ２（２０ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．３）中で、組み換えＧａｌＴ−Ｉ３．３ｍＵで、全体積１００μｌで、３７℃２０時間培養された。Ｇａｌ残基は、組み換えＧａｌＴ−１によって、ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質へ約９８％付加された。
【１２４４】
次のステップは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６−シアリルトランスフェラーゼを使ったシアル酸の付加である（図１８６）。一例として、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ、α２，３−シアリルトランスフェラーゼが使われた。ＲＮａｓｅＢを含むＧａｌＴ−１反応の後、反応混合物（１３μｇ，約０．８７ｎｍｏｌ）は、ＣＭＰ−シアル酸（５ｍＭ）とＭｎＣｌ２（２０ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．３）中で、組み換えＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ  ８．９ｍＵで、全体積２０μｌで、３７℃１６時間培養された。シアル酸残基は、ＣＭＰ−ＳＡをドナーとして使い組み換えＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩによって、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質へ約９０％付加された。収量は、反応条件を調整することによって、さらに改善することができる。
【１２４５】
便宜上、上述のそれぞれの反応後、精製や透析は必要なかった。さらに興味深いことに、ＧａｌＴ−１とＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩは、ワンポット反応として組合すことが出来る。
別々の反応と比較して、同じくらいの収量が得られた。ＲＮａｓｅＢ（６０μｇ，約４ｎｍｏｌ）を含むＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ反応の後、反応混合物は、ＵＤＰ−Ｇａｌ（７．５ｍＭ）、ＣＭＰ−シアル酸（５ｍＭ）とＭｎＣｌ２（２０ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７．３）中で、組み換えＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ  ９．８ｍＵで、全体積６０μｌで、３７℃２０時間培養された。
【１２４６】
図１８７に示すように、ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）のＲＮａｓｅＢへの付加は成功した。ＲＮａｓｅＢ（６．７μｇ，約０．４５ｎｍｏｌ）を含むＧａｌＴ−１反応の後、反応混合物は、室温で１時間、水に対して透析され、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）（０．２５ｍＭ）とＭｎＣｌ２（２０ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ，ｐＨ７．３）中で、組み換えＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ  ５５ｍＵで、全体積２０μｌで、３７℃１５．５時間培養された。ＰＥＧ修飾シアル酸残基は、組み換えＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩによるＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドへの付加は成功した。収量は、反応条件を調整することによって、さらに改善することができる。
【１２４８】
ハイマンノース  Ｎグリカンの複合Ｎ−グリカンへの変換。この変換を達成させるためには、ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドの中間体が得ることである。図１８８に示すように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドからこの中間体への反応を行うのに４つの可能なルートがある。すなわち、
【１２４９】
ルートＩ：真菌α1,２−マンノシダーゼによって作られるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドは、１つのＧｌｃＮＡｃを付加するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ  Ｉ（ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ，酵素２）の基質である。ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドの末端α1,３−およびα1,６−連結マンノース残基は、Ｇｏｌｇｉ  α−マンノシダ−ゼＩＩ（ＭａｎＩＩ，酵素５）によって取り除かれる。このルートは、高等生物で行われるＮリンクオリゴ糖の処理の自然の経路の一部である。
【１２５０】
ルートＩＩ：２つのマンノース残基はまず、α−マンノシダ−ゼ（酵素６）によって取り除かれ、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ（酵素２）によってＧｌｃＮＡｃが付加される。自然の受容体Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒ以外に、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉは同様に、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−Ｒを基質として認識することが出来て、マンノースコア構造に１つのＧｌｃＮＡｃを付加することが出来て、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドを形成する。
【１２５１】
ルートＩＩＩ：α１，６−マンノシダ−ゼによってα1,６−連結マンノースが取り除かれ、続いてＧｌｃＮＡｃＴ−ＩによってＧｌｃＮＡｃが付加され、α１，３−マンノシダ−ゼによって末端α1,３−結合マンノースが取り除かれる。得られた実験データから、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉは、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドを受容体として認識することが出来て、１つのＧｌｃＮＡｃ残基を付加することが出来て、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドを形成する。
【１２５２】
ルートＩＶ：ルートＩＩＩと類似しているが、α１，３−マンノシダ−ゼによってα1,３−連結マンノースが取り除かれ、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ反応が続く。次に、α１，６−マンノシダ−ゼによって末端α1,６−連結マンノースが取り除かれる。
【１２５３】
ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｉ（マンノースコア上、ＧｌｃＮＡｃβ１，２リンクのα１，３−マンノースへの付加に対応する）とＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ（マンノースコア上、第二のＧｌｃＮＡｃβ１，２連結のα１，６−マンノースへの付加に対応する）を作用させた後、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドは、ＧａｌＴ  １とシアリルトランスフェラーゼによって処理され、２分岐複合Ｎ−グリカンが形成される。ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＶやＧｌｃＮＡｃＴ−ＶやＧｌｃＮＡｃＴ−ＶＩのような他のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（図１８８と図１８９）もまた同様に、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ペプチドをグリコシル化することが出来る。ＧａｌＴ  １とシアリルトランスフェラーゼによる更なるグリコシル化は、多分岐複合Ｎ−グリカンを形成するであろう。酵素ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩＩは、等分ＧｌｃＮＡｃの挿入の触媒となる。したがって、ＭａｎＩＩの作用とそれに続くＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＩ、ＧｌｃＮＡｃＴ−ＩＶ、ＧｌｃＮＡｃＴ−Ｖの作用を妨げる。
【１２５４】
ティシュータイプのプラズミノゲン活性剤
３９．シアリル  ルイスＸ形成するためのＴＰＡのフコシル化
この例は、Ｎ−リンクのシアリルルイスＸでのティシュータイプのプラズミノゲン活性剤（ＴＰＡ）の調製を説明する。
【１２５５】
シアリル化。哺乳類細胞で発現されるＴＰＡは、しばしば、シアル酸を末端とする多くのグリカンを含んでいるが、完全なシアル化を確保するためには、まず生体内のシアル化を行うことが有益であろう。ＴＰＡは、適当なバッファー（最も好ましくはｐＨ５．５と９の間で、例えば、Ｔｒｉｓバッファー生理食塩、ｐＨ７．２）中で、ＣＭＰシアル酸とシアリルトランスフェラーゼで、シアル酸なしのグリカンをシアル化種に変換するのに十分な時間、培養された。典型的な条件は、１ｍｇ／ｍＬ  ＴＰＡ、３ｍＭ  ＣＭＰシアル酸、０．０２Ｕ／ｍＬ  ＳＴ３Ｇａｌ３で、３２℃、２４時間であろう。微生物増殖は、除菌または０．０２％アジ化ナトリウムの添加によって抑制できる。ＴＰＡ濃度は最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬからペプチドの溶解度限界までの範囲である。ＣＭＰ−ＳＡの濃度は、可能なサイトを超過するのに十分であるべきで、５０μＭから５０ｍＭまでの範囲であろう。温度は２℃から４０℃までであろう。完全反応に要する時間は、温度、受容体基質に対する酵素の相対量、供与体基質濃度、そしてｐＨに依存するであろう。ＳＴ３Ｇａｌ４を含めて２，３連結にシアル酸を付加することのできる他のシアリルトランスフェラーゼもまた同様に使うことが出来るであろう。
【１２５６】
フコシル化。フコシル化の典型的な条件は、１ｍｇ／ｍＬ  ＴＰＡ、３ｍＭ  ＧＤＰ−フコース、０．０２Ｕ／ｍＬ  ＦＴＶＩ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３２℃で、２４時間Ｔｒｉｓバッファー食塩水中であろう。微生物増殖は、除菌または０．０２％アジ化ナトリウムの添加によって抑制できる。ＴＰＡ濃度は最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬからペプチドの溶解度限界までの範囲である。ＧＤＰ−フコースの濃度は、可能なサイトを超過するのに十分であるべきで、５０μＭから５０ｍＭまでの範囲であろう。温度は２℃から４０℃までであろう。完全反応に要する時間は、温度、受容体基質に対する酵素の相対量、供与体基質濃度、そしてｐＨに依存するであろう。シアリル  ルイスＸを作ることが出来る他のフコシルトランスフェラーゼには、ＦＴＶＩＩ、ＦＴＶ、ＦＴＩＩＩが含まれ、微生物トランスフェラーゼも同じく使えるであろう。
【１２５７】
４０．ハイマンノースのトリマンノースコア構造への切断：
ＣＨＯで作られるティシュータイプのプラズミノゲン活性剤
この例は、ハイマンノースグリカンからの切り戻しによるトリマンノースコアでのティシュータイプのプラズミノゲン活性剤の調製を説明する。
【１２５９】
ティシュータイプのプラズミノゲン活性剤（ＴＰＡ）は現在、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で作られ、低量のハイマンノースＮ連結オリゴ糖を含んでいる。マンノースは、種々の特定のマンノシダーゼを使って、切断することが出来る。最初のステップは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）の生成することである。これはマンノシダ−ゼＩを使って為され得る。次に、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）を作るために、ＧｌｃＮＡｃ１（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ）が使われるかまたは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）を作るために、マンノシダ−ゼＩＩＩが使われる。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）から、ＧｌｃＮＡｃＴ１を使って、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）が作られ得る。またはＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）から、マンノシダ−ゼＩＩを使って、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）が作られ得る。次に、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＴＩＩ）を使って、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ０−１）へ変換される。２つの末端ＧｌｃＮＡｃ残基は次に、ＧａｌＴＩを使ってガラクトシル化され、ＳＴ３ＧａｌＴＩＩＩを使って、ＳＡ−ＯＥＧでシアル化される。
逆に、ＴＰＡはイーストや真菌系で作られ得る。類似の処理は真菌誘導物質に対しても必要であろう。
【１２６０】
４１．ＧｌｃＮＡｃ構造の生成とＰＥＧ化：イーストで作られるＴＰＡ
この例は、イーストで発現されるＴＰＡのようなペプチド上のＰＥＧ化ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎの調製を説明する。
【１２６１】
イースト発現は、Ｎ一連結のマンナン  タイプの構造を含むＴＰＡで生じることが期待される。この組み換えグリコタンパクはまず、ペプチドのアスパラギン（Ａｓｎ）残基にＧｌｃＮＡｃ構造を作るために、エンドグリコシダ−ゼで処理する。
【１２６２】
ペプチド／タンパク質  バックボーン上のＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎは次に、それぞれＵＤＰ−ガラクト−スまたはＵＤＰ−ガラクト−ス−６−ＰＥＧとＧａｌＴＩのようなガラクトシルトランスフェラーゼを使って、ガラクト−スまたはガラクト−ス−ＰＥＧで修飾される。第一の場合、ガラクト−ス−ＰＥＧは末端残基である。第二の場合、ガラクト−スは更に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ供与体とＳＴ３ＧａｌＩＩＩのようなシアリルトランスフェラーゼを使って、ＳＡ−ＰＥＧで修飾される。もう１つの実施例では、ペプチド／タンパク質  バックボーン上のＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ構造は、上に記したようにガラクトシル化され、シアリル化される可能性があり、更にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧとＣａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子でコード化された酵素のようなα２，８−シアリルトランスフェラーゼを使ってシアリル化される可能性がある。
【１２６３】
トランスフェリン
４２．トランスフェリンのグリコＰＥＧ化
この例は、アジアロトランスフェリンの調製とＰＥＧ−ＣＭＰ−シアル酸を使ったそのシアル化を説明する。
【１２６４】
アジアロトランスフェリンの調製。ヒトのホロトランスフェリン（１０ｍｇ）は、５００μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．５に溶解された。この溶液に、５００ｍＵのノイラミニダーゼＩＩ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）              が加えられた。反応混合物は３７℃で２０．５時間緩やかに振られた。反応混合物は、あらかじめ洗浄されたＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロース抱合体（６００μＬ）へ加えられ、洗浄されたビーズは４℃で２４時間緩やかに回転攪拌された。混合物は１０，０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。反応混合物は、洗浄されたビーズに３０ｍＭＥＤＴＡを１００μＬ加えることによって５ｍＭ  ＥＤＴＡに調整された。そしてそれは４℃で２０時間緩やかに回転攪拌された。けん濁液は１０，０００ｒｐｍで２分遠心分離され、上澄が集められた。ビーズは、０．３５ｍＬの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．５で５度洗浄し、総ての上澄はプールされた。酵素溶液は、４℃で、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４へ２度透析された。トランスフェリン溶液（全体積３．３ｍＬ）０．３ｍＬが取り除かれ、水に２度透析された。残りは更に２度リン酸バッファー生理食塩に対して４℃で透析された。透析された溶液は、−２０℃で保存された。タンパク質試料はＩＥＦ電気泳動で分析された。試料（９μＬ，２５μｇ）は、１６μLの  Ｔｒｉｓバッファーで希釈され、１５μLの試料挿入バッファーと混合され、ゲル等電点電気泳動（ｐH３−７）（インビトロゲン）が適用された。ゲルは標準的な操作で実験され、調整された。ゲルはＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色された。
【１２６５】
アジアロトランスフェリンのシアリルＰＥＧ化。脱シアル化トランスフェリン（２５０μｇ）とＣＭＰ−シアル酸あるいはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（１ｋＤａあるいは１０ｋＤａ）は、６９μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２を１．５ｍＬのプラスチック試験管中に溶解させる。試験管は、短時間渦流攪拌し、１００ｍＵのＳＴＧａｌ３（９０μＬ）が加えられた（全体積２５０μＬ）。試験管は、再び短時間渦流攪拌し、３２℃で２４時間緩やかに混合された。反応は、−８０℃で凍結させることによって終わらせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−Ｇｒｉｓｉｎｅ  ８−１６％  １ｍｍゲルが使われた（図１９０）。試料（２５μＬ，２５μｇ）は、試料の入ったバッファー２５μＬとβメルカプトエタノール０．４μＬとで混合され、８５℃で６分間加熱された。ゲルは標準的な条件で実験され、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで着色された。ＩＥＦゲルはまた、上記のように行われた（図１９１）。試料はまた、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析される。
【１２６６】
結果。ＭＡＬＤＩも行われた。天然のトランスフェリン（７８７２９）；アジアロトランスフェリン（７８１９７）；再シアリル化トランスフェリン（７８６２６／８０７０３）；そして  ＳＡ−ＰＥＧ  １ｋ（７９０３７（１）；８０９６１（２）；８２５３５（３）；８４７７８（４））；ＳＡ−ＰＥＧ  ５ｋ（９０００３（２）；９６１１７（３）；９６１１７（４））；ＳＡ−ＰＥＧ  １０ｋ（１００３３６（２）；１１１４２１（３）；１２２５１０（４））であった。
【１２６７】
４３．トランスフェリン−ＧＤＮＦ
この例は、タンパク質のグリココンジュゲーションの操作を説明する。特に、トランスフェリンは、ＧＤＮＦにグリココンジュゲートされる。トランスフェリン−ＳＡ−連結剤ーＧａｌ−ＵＤＰは、トランスフェリンから調製される。ガラクト−ス残基は、ＧＤＮＦグリカンから取り除かれ、トランスフェリン−ＳＡ−連結剤ーＧａｌ−ＵＤＰは、ガラクトシルトランスフェラーゼを使って、ＧＤＮＦグリカンにコンジュゲートされる。
【１２６８】
アガラクト−ＧＤＮＦの調製。ＮＳＯ細胞でつくられるＧＤＮＦ（ＮＳＯマウス骨髄腫細胞）は、５０ｍM  Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解され、ベータ−ガラクトシダ−ゼ−アガロース  コンジュゲート３００ｍＵ／ｍＬで１６時間３２℃で培養される。反応をモニターするために、反応の小アリコートは適当なバッファーで希釈され、インビトロゲン操作にしたがって、ＩＥＦゲルが行われた。混合物は１０,０００ｒｐｍで遠心分離され、上澄が集められた。上澄は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して４℃で透析され、次に２回さらに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３に対して透析される。透析された溶液は次に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過器を使って濃縮され、−２０℃で保存される。ＩＥＦゲルの条件は、インビトロゲンによって提供された操作と試薬にしたがった。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析された。
【１２６９】
トランスフェリン−ＳＡ−連結剤ーＧａｌ−ＵＤＰの調製。アジアロトランスフェリンは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解さる。溶液は、ＣＭＰ−シアル酸−連結剤ーＧａｌ−ＵＤＰ（加えるモル量はトランスフェリンに対して１モル当量のヌクレオチド糖）とＳＴＧａｌ３  ０．１Ｕ／ｍＬで３２℃２日培養される。シアル酸の挿入をモニターするために、反応の小アリコートは、１４Ｃ−ＳＡ−ＵＤＰリガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの放射性ラベルの挿入は、インラインの放射能検出器を使って定量化される。
【１２７０】
溶液は、５ｍＭのＣＭＰ−シアル酸と０．１Ｕ／ｍＬのＳＴＧａｌ３（未反応トランスフェリン  グリカンをキャップするため）とで３２℃２日培養される。ペプチドへの挿入は、インラインのＵＶ検出を使って定量化される。２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２７１】
トランスフェリン−ＳＡ−連結剤ーＧａｌ−ＧＤＮＦの調製。上記のようにして調製れたトランスフェリン−ＳＡ−リンカーＧａｌ−ＵＤＰは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３  ｐＨ７．２に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解さる。溶液は、２．５ｍｇ／ｍＬのアガラクト−ＧＤＮＦと０．１Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼで、３２℃２日培養される。ガラクト−スの挿入をモニターするために、反応の小アリコートは、１４Ｃ−ガラクト−ス−ＵＤＰリガンドが加えられた；ペプチドに挿入されたラベルは、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ったＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでのゲルろ過によってフリーのラベルから分離される。ペプチドへの放射性ラベルの挿入は、インラインの放射能検出器を使って定量化される。
反応が完了した時、溶液は、５ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌと０．１  Ｕ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼ（未反応トランスフェリン  グリカンをキャップするため）とで３２℃２日培養され、続いて５ｍＭのＣＭＰ−ＳＡと０．１  Ｕ／ｍＬのＳＴＧａｌ３を加える。更に２日後、反応混合物は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１）を使ってＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷ予備カラムを使って精製され、ＵＶ吸収に基づいてフラクションは集められる。反応生成物は、インビトロゲンによって供給された操作と試薬にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩＥＦ分析を使って分析される。試料は、水に対して透析され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。
【１２７２】
本明細書に引用するすべての特許、特許出願、および公報の開示は、引用により全部、
本明細書に編入する。
【１２７３】
本発明は具体的な態様に関して開示してきたが、本発明の他の態様および変更は本発明
の精神および範囲から逸脱することなく当業者により考案され得ることは明らかである。
添付する特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および均等な変更物を含むと解釈さ
れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【１２７４】
本発明のエリスロポエチンは治療薬または診断薬として、特に貧血症、腎臓透析患者の治療薬として有用であり、また本発明のその改造方法は工業的に現実的な製造方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【１２７５】
発明を説明するために、発明についての確かな実施例を図に示す。しかしながら、発明は図で示した実施例のぴったりそのままの配列処理や手段に限られるものではない。
【１２７６】
図１は、トリマンノシル核のグリシン（左側）と分岐ＧｌｃＮＡｃを持つグリカンの発生の酵素過程（右側）を示すスキームである。
【１２７７】
図２は、素トリマンノシル核構造と完了までの種々の程度での複合鎖を示すスキームである。分岐したＧｌｃＮＡｃ残渣を含まない複合カーボハイドレート  グリカン  構造から素トリマンノシル核構造の生体外での酵素発生を示す。それは分岐ＧｌｃＮＡｃを含むグリカン構造の発生である。  記号：四角：ＧｌｃＮＡｃ；  白円：Ｍａｎ；黒円：Ｇａｌ；三角：ＮｅｕＡｃ。
【１２７８】
図３は、トリマンノシル核を持つグリカンに始まるシアリル化したグリカン構造（右側）と分岐ＧｌｃＮＡｃ（左側）の酵素発生に対するスキームである。
【１２７９】
図４は、グリカン構造を含む典型的な高マンノーズ（左側）と素トリマンノシル核構造に対してこの構造の削減の酵素過程のスキームである。このスキームで、Ｘはモノサッカライド、オリゴ糖あるいはポリサッカライドとしてのマンノーズである。
【１２８０】
図５は、植物細胞中で典型的に産み出されるＮに結合したグリカン構造を含むフコーズとキシローズのダイアグラムである。
【１２８１】
図６は、典型的に昆虫細胞中で生み出されるＮに連結したグリカン構造を含むフコーズのダイアグラムである。グリカンは核（コア）の無いフコーズであっても良いし、いずれかの結合を持つ単一核フコーズであっても良いし、あるいは優位な１つの結合を持つ単一核フコーズであっても良いことに注意されたい。
【１２８２】
図７は、高マンノーズ構造の切断とそれから複合糖鎖を合成するための種々の経路を示すスキームである。記号：四角：ＧｌｃＮＡｃ;  円：Ｍａｎ；ダイアモンド印：フコーズ；五角形：キシローズ。
【１２８３】
図８は、素トリマンノシル核構造から複合構造を合成するための生体外の戦術を示すスキームである。記号：四角：ＧｌｃＮＡｃ;  白抜き円：Ｍａｎ；黒円：Ｇａｌ;黒三角：ＮｅｕＡｃ;ＧｎＴ:Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；ＧａｌＴ:ガラクトシルトランスフェラーゼ；ＳＴ: シアリルトランスフェラーゼ
【１２８４】
図９は、単一分岐グリカンの合成とオプションとしてのそれのグリコＰＥＧ化に対するニつの生体外戦術を示すスキームである。黒四角：ＧｌｃＮＡｃ;  黒円：Ｍａｎ；白抜き円：Ｇａｌ; 黒三角：シアル酸
【１２８５】
図１０は、単一分岐グリカンの合成とオプションとしてのそれのグリコＰＥＧ化に対する二つの生体外戦術を示すスキームである。黒四角：ＧｌｃＮＡｃ;  黒円：Ｍａｎ；白抜き円：Ｇａｌ; 黒三角：シアル酸
【１２８６】
図１１は、種々のコンプレックス構造を表すスキームである。それは素トリマンノシル核構造から合成してもよい。記号：四角：ＧｌｃＭＡｃ;白抜き円：Ｍａｎ；黒円：Ｇａｌ;三角：ＮｅｕＡｃ；ダイアモンド印：フコーズ；ＦＴ とＦｕｃＴ:フコシルトランスフェラーゼ；ＧａｌＴ:ガラクトシルトランスフェラーゼ；ＳＴ:シアリルトランスフェラーゼ；Ｌｅ:ルイス抗原；Ｓｌｅ:シアリル化ルイス抗原
【１２８７】
図１２は、セリントスレオニンを起源としてのＯにリンクしたグリコペプチドの作り方の模範的なスキームである。オプションとして、ポリ(エチレングリコール)のような水溶性ポリマー（ＷＳＰ）が最終のグリカン構造に付け加えられる。
【１２８８】
図１３は、核１から４と名付けた四つのタイプのＯ−グリカン構造を表す一連のダイアグラムである。その核構造は点線で描かれている。
【１２８９】
図１４は、図１４Ａと図１４Ｂからなっているが、発明の模範的な実施例を示す一連のスキームである。ここで、複合カーボハイドレート構造及び/又は高マンノーズ構造を含むカーボハイドレート残渣はもとの第一発生の２分岐構造まで切断される。オプションとして、フコーズはＧｎＴＩとの反応後だけ付加される。従って、水溶性ポリマー（ＷＳＰ）を有している修飾された糖はその切断もどり過程によって露呈された１つあるいはそれ以上の糖残基と共役している。
【１２９０】
図１５は、図４に示したものと同様のスキームである。ここでは高マンノーズ即ち複合構造はマンノーズのベータ結合核へと“戻り切断”される。従って、水溶性ポリマーを有している修飾された糖はその切断もどり過程によって露呈された１つあるいはそれ以上の糖残基と共役している。糖は順次連続してグリコシルトランスフェラーゼを用いて付加される。
【１２９１】
図１６は、図４に示したものと同様のスキームである。ここでは高マンノーズ即ち複合構造は最初のマンノーズが付いているＧｌｃＮＡｃへと戻り切断される。従って、水溶性ポリマーを有している修飾された糖はその切断もどり過程によって露呈された１つあるいはそれ以上の糖残基と共役している。糖は順次連続してグリコシルトランスフェラーゼを用いて付加される。
【１２９２】
図１７は、図４に示したものと同様のスキームである。ここでは高マンノーズ即ち複合構造はペプチドのＡｓｎに付いている最初のＧｌｃＮＡｃへと戻り切断される。それに続いて、水溶性ポリマーは順次加えられら１つまたはそれ以上の糖残基へ共役される。糖は順次連続してグリコシルトランスフェラーゼを用いて付加される。
【１２９３】
図１８は、図１８Ａと図１８Ｂからなっているが、Ｎに結合した糖質が、１つのオプションとして高マンノーズ即ち複合構造から戻り切断され、続いて水溶性ポリマーを持つ修飾糖部分（ＧａｌあるいはＧｌＮＡｃ）と共に誘導されるスキームである。
【１２９４】
図１９は、図１９Ａと図１９Ｂからなっているが、Ｎに結合した糖質は、高マンノーズ即ち複合構造から戻り切断され、順次、水溶性ポリマーを有するシアル酸部分と共に誘導されるスキームである。糖は順次連続してグリコシルトランスフェラーゼを用いて付加される。
【１２９５】
図２０は、Ｎに結合した糖質が、１つのオプションとして高マンノーズ即ち複合構造から戻り切断され、順次、１つあるいはそれ以上のシアル酸部分と共に誘導され、水溶性ポリマーと共に誘導されたシアル酸に終結するスキームである。糖は順次連続してグリコシルトランスフェラーゼを用いて付加される
【１２９６】
図２１は、Ｏに結合したサッカライドが“戻り切断”され、順次、水溶性ポリマーを持つ修飾糖へ変化されるスキームである。模範的なスキームでは、カーボハイドレート部分は、２分岐構造の最初の発生まで“戻り切断”される。
【１２９７】
図２２は、Ｏに結合したグリコペプチドの糖質部分を戻り切断して、それに付着した水溶性ポリマーを持つ修飾糖との共役で得られるマンノーズを作り出すための模範的なスキームである。
【１２９８】
図２３は、図２３Ａから図２３Ｃまでからなっているが、一連の模範的なスキームである。図２３Ａは、非修飾糖の付加に続いて行われるＰＥＧ化された糖の付加を表すスキームである。図２３Ｂは、１個のグリカンへの1種類以上の修飾糖の付加を表すスキームである。図２３Ｃは、Ｏに結合したグリカンとＮに結合したグリカンへの異なる修飾糖の付加を表すスキームである。
【１２９９】
図２４は、共役を含めて、グリカンの改造によってペプチドの治療機能を改善する種々の方法のダイアグラムである。
【１３００】
図２５は、ゴーチャ−病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｅｓｅａｓｅ）を扱う治療ペプチドを改造するグリカンに対する一連のスキームである。
【１３０１】
図２６は、末端にマンノーズ−６−フォスフェ−ト部分を持つグリカンを生成するグリカン改造のスキームである。
【１３０２】
図２７は、シアル化後のＣＨＯ−生成のグルコセレブロシダーゼ（ＣｅｒｅｚｙｍｅＴＭ）で見出されるグリカン構造の配列を表すダイアグラムである。
【１３０３】
図２８は、図２８Ａから図２８Ｚまでおよび図２８ＡＡから図２８ＣＣまでからなっており、発明の方法に有用なペプチドの表である。
【１３０４】
図２９は、図２９Ａから図２９Ｇまでから成っているが、グラニュロサイト  コロニー  刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に関してグリカン構造を改造する模範的なスキームを提供する。図２９Ａは、グリカンが結合しているアミノ酸残基を示すＧ−ＣＳＦ  ペプチドとそれに連結している模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図２９Ｂから図２９Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図２９Ａにおいて考えられるグリカンの改造ステップのダイアグラムおよび望ましく改造されたグリカン構造である。
【１３０５】
図３０は、図３０Ａから３０ＥＥまでからなっているが、インターフェロンーアルファに関してグリカン構造を改造するための模範的なスキームを説明している。図３０Ａは、グリカンが結合しているアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ  イソ型１４ｃペプチドを表すダイアグラムおよびそれに結合している典型的なグリカン構造式を表す。図３０Ｂから図３０Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３０Ａにおいて考えられたペプチド中のグリカンの改造ステップのダイアグラムと望ましく改造されたグリカン構造である。図３０Ｅは、グリカンが結合しているアミノ酸残基を示すインターフェロンーアルファ  イソ型１４ｃペプチドを表すダイアグラム及びそれに結合している典型的なグリカン構造式を表す。図３０Ｆから図３０Ｎまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３０Ｅにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップのダイアグラムおよび望ましく改造されたグリカン構造である。
図３０Ｏは、グリカンが結合しているアミノ酸残基を示すインターフェロン-アルファ  イソ型  ２ａあるいは２ｂペプチドを表すダイアグラム及びそれに結合している典型的なグリカン構造式を表す。図３０Ｐから図３０Ｗまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３０Ｏにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップのダイアグラム及び望ましく改造されたグリカン構造である。図３０Ｘは、改造に対して考えられたグリカンに結合している残基を示すインターフェロン-アルファ-ムチン融解ペプチド及びそれに結合している典型的なグリカン構造式を表す。図３０Ｙから図３０ＡＡまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３０Ｘにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップのダイアグラム及び望ましく改造されたグリカン構造である。図３０ＢＢは、改造に対して考えられた、グリカンに結合している残基を示すインターフェロン-アルファ-ムチン融解ペプチドとインターフェロン-アルファ  ペプチドを表すダイアグラムおよびグリカンの構造式を表す。図３０ＣＣから図３０ＥＥまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３０ＢＢにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップのダイアグラム及び望ましく改造されたグリカン構造である。
【１３０６】
図３１は、図３１Ａから３１Ｓまでからなっているが、インターフェロン-ベータに関するグリカン構造の改造に対する典型的なスキームを説明する。図３１Ａは、グリカンが結合している残基を示すインターフェロン-ベータ  ペプチドを表すダイアグラム及びそれに結合している望ましく改造されたグリカン構造である。図３１Ｂから３１Ｏまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３１Ａにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップのダイアグラムおよび望ましく改造されたグリカン構造である。図３１Ｐは、グリカンが結合している残基を示すインターフェロン-ベータ  ペプチドを表すダイアグラム及びそれに結合している典型的なグリカン構造式である。図３１Ｑから３１Ｓまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３１Ｐにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップのダイアグラム及び望ましく改造されたグリカン構造である。
【１３０７】
図３２は、図３２Ａから３２Ｄまでからなっているが、ＦａｃｔｏｒＶＩＩとＦａｃｔｏｒＶＩＩａに関して、グリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３２Ａは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＦａｃｔｏｒ-ＶＩＩとＦａｃｔｏｒ-ＶＩＩａペプチドＡ（実線）及びＢ（点線）、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３２Ｂから３２Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３２Ａにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３０８】
図３３は、図３３Ａから３３Ｇまでからなっているが、ＦａｃｔｏｒＩＸに関して、グリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３３Ａは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＦａｃｔｏｒ-ＩＸペプチド及びグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３３Ｂから３３Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３３Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３０９】
図３４は、図３４Ａから３４Ｊまでからなっているが、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、それはαおよびβのサブユニットからなっているが、に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３４Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示す卵胞刺激ホルモンペプチド  ＦＳＨαとＦＳＨβそしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３４Ｂから３４Ｊまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３４Ａにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１０】
図３５は、図３５Ａから３５ＡＡまでからなっているが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３５Ａは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＥＰＯペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３５Ｂから３５Ｓは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３５Ａにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図３５Ｔは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＥＰＯペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３５Ｕから３５Ｗは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３５Ｔにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図３５Ｘは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＥＰＯペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３５Ｙから３５ＡＡまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３５Ｘにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１１】
図３６は、図３６Ａから３６Ｋまでからなっているが、グラヌロサイト‐マクロファージ  コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３６Ａは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＧＭ−ＣＳＦペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３６Ｂから３６Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３６Ａにおいて考えられたペプチドのグリカンの改造ステップおよび望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図３６Ｈは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＧＭ−ＣＳＦペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３６Ｉから３６Ｋまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３６Ｈにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１２】
図３７は、図３７Ａから３７Ｎまでからなっているが、インターフェロン-ガンマに関して、グリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３７Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すインターフェロン-ガンマペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３７Ｂから３７Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３７Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図３７Ｈは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すインターフェロン-ガンマペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３７Ｉから３７Ｎまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３７Ｈにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１３】
図３８は、図３８Ａから３８Ｎまでからなっているが、α１-アンチトリプシン（ＡＴＴ、すなわちα-１プロテアーゼ阻害物質）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３８Ａは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＡＡＴペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３８Ｂから３８Ｆまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３８Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図３８Ｇは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＡＡＴペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３８Ｈから３８Ｊは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３８Ｇにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されるグリカン構造のダイアグラムである。図３８Ｋは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＡＡＴペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３８Ｌから３８Ｎまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３８Ｋにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１４】
図３９は、図３９Ａから３９Ｊまでからなっているが、グルコセレブロシダーゼに関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３９Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すグルコセレブロシダーゼ  ペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３９Ｂから３９Ｆまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３９Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図３９Ｇは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すグルコセレブロシダーゼ  ペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図３９Ｈから３９Ｋまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図３９Ｇにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１５】
図４０は、図４０Ａから４０Ｗまでからなっているが、薄織物状のプラズミノゲン活性化剤（アクティベーター）（ＴＰＡ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４０Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＴＰＡペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４０Ｂから４０Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４０Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４０Ｈは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＴＰＡペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４０Ｌは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＴＰＡペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４０Ｍから４０Ｏまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４０Ｌにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４０Ｐは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＴＰＡペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４０Ｑから４０Ｓは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４０Ｐにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４０Ｔは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＴＰＡペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４０Ｕから４０Ｗまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４０Ｔにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１６】
図４１は、図４１Ａから４１Ｇまでから成っているが、インターロイキン‐２（ＩＬ-２）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図３１Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すインターロイキン‐２  ペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４１Ｂから４１Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４１Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１７】
図４２は、図４２Ａから４２Ｍまでからなっているが、ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩに関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４２Ａは、ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩペプチドのＮ連結グリコシラン  サイト（ＡとＡ‘）及びＯ連結グリコシラン  サイト（Ｂ）に結合したグリカンの構造式である。図４２Ｂから４２Ｆまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４２Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４２Ｇは、ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩペプチドのＮ連結グリコシラン  サイト（ＡとＡ’）及びＯ連結グリコシラン  サイト（Ｂ）に結合したグリカンの構造式である。図４２Ｈから４２Ｍまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４２Ｇにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１８】
図４３は、図４３Ａから４３Ｌまでからなっているが、ウロキナーゼに関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４３Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すウロキナーゼペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４３Ｂから４３Ｆまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４３Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４３Ｇは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すウロキナーゼペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４３Ｈから４３Ｌまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４３Ｇにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３１９】
図４４は、図４４Ａから４４Ｊまでからなっているが、ヒトＤＮａｓｅ（ｈＤＮａｓｅ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４４Ａは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すヒトＤＮａｓｅペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４４Ｂから４４Ｆまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４４Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４３Ｇは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すヒトＤＮａｓｅペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４４Ｈから４４Ｊまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４４Ｇにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２０】
図４５は、図４５Ａから４５Ｌまでからなっているが、インシュリンに関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４４Ａは、Ｎ  グリコシレーション  サイト  を含むまで突然変異されたインシュリンペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４５Ｂから４５Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４５Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４５Ｅは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すインシュリン-ムチン融解ペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４５Ｆから４５Ｈまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４５Ｅにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４５Ｉは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すインシュリン-ムチン融解ペプチドとインシュリンペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４５Ｊから４５Ｌまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４５Ｉにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２１】
図４６は、図４６Ａから４６Ｋまでからなっているが、へパティティスＢ表面蛋白質（ＨｂｓＡｇ）のＭ-抗原（ｐｒｅＳとＳ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４６Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＭ-抗原ペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４６Ｂから４６Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４６Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４６Ｈは、改造のために考えられたグリカンに結合した残基を示すＭ-抗原ペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４６Ｉから４６Ｋまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４６Ｈにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２２】
図４７は、図４７Ａから４７Ｋまでからなっているが、Ｎ，Ｖ及びその変異体を含めたヒト成長ホルモンに関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４７Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すヒト成長ホルモンペプチド、そしてそれに結合した典型的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４７Ｂから４７Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４７Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図４７Ｅは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すヒト成長ホルモンペプチドとムチンペプチドの部分あるいは総てからなる３つの融解ペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４７Ｆから４７Ｋまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４７Ｅにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２３】
図４８は、図４８Ａから４８Ｇまでからなっているが、ＴＮＦ  レセプター-ＩｇＧ  Ｆｃ領域融解蛋白質（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４８Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示す付加的なＮ-グリコシレーションサイトを含むまで変位されるＴＮＦ  レセプター-ＩｇＧ  Ｆｃ領域融解ペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。ＴＮＦ  レセプターペプチドは太線、そしてＩｇＧ  Ｆｃ領域融は通常の線で示す。図４８Ｂから４８Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４８Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２４】
図４９は、図４９Ａから４９Ｄまでからなっているが、ａｎｔｉ-ＨＥＲ２  モノクローナル抗体（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図４８Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗原の重い分子鎖上の残基を示すＮ-グリコシレーションサイトを含むまで変位されたａｎｔｉ-ＨＥＲ２  モノクローナル抗体、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図４９Ｂから４９Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図４９Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２５】
図５０は、図５０Ａから５０Ｄまでからなっているが、呼吸器合胞体ウィルスのプロテンＦ（ＳｙｎａｇｉｓＴＭ）に対するモノクローナル抗体に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５０Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した残基を示すＮ-グリコシレーションサイトを含むまで変位されるプロテンＦに対するモノクローナル抗体、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５０Ｂから５０Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５０Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２６】
図５１は、図５１Ａから５１Ｄまでからなっているが、ＴＮＦ-α（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）に対するモノクローナル抗体に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５１Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗残基を示すＮ-グリコシレーションサイトを持つＴＮＦ-αに対するモノクローナル抗体、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５１Ｂから５１Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５１Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２７】
図５２は、図５２Ａから５２Ｌまでからなっているが、グリコプロテンＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＲｅｏｐｒｏＴＭ）に対するモノクローナル抗体に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５２Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗残基を示すＮ-グリコシレーションサイトを持つまで変異されたグリコプロテンＩＩｂ／ＩＩＩａに対する変異体モノクローナル抗体、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５２Ｂから５２Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて考えられる改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図５２Ｅは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗残基を示すグリコプロテンＩＩｂ／ＩＩＩａ-ムチン融解ペプチドに対するモノクローナル抗体、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５２Ｆから５２Ｈまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて考えられる改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図５２Ｉは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗残基を示すグリコプロテンＩＩｂ／ＩＩＩａ-ムチン融解ペプチドとグリコプロテンＩＩｂ／ＩＩＩａペプチドに対するモノクローナル抗体、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５２Ｊから５２Ｌまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて考えられる改造ステップ、及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２８】
図５３は、図５３Ａから５３Ｇまでからなっているが、ＣＤ２０（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）に対するモノクローナル抗体に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５３Ａは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗残基を示すＮ-グリコシレーションサイトを持つまで変異されたＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５３Ｂから５３Ｄまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５３Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図５３Ｅは、改造のために考えられるグリカンに結合した抗残基を示すＮ-グリコシレーションサイトを持つまで変異されたＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。  図５３Ｆから５３Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５３Ｅにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３２９】
図５４は、図５４Ａから５４Ｏまでからなっているが、アンチトロンビンＩＩＩ(ＡＴＩＩＩ)に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５４Ａは、Ｎ-リンクのグリカンが結合しているアミノ酸残基を示すアンチトロンビンＩＩＩペプチド、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５４Ｂから５４Ｇまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５４Ａにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図５４Ｈは、Ｎ連結グリカンが結合しているアミノ酸残基を示すアンチトロンビンＩＩＩペプチド、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５４Ｉから５４Ｋまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５４Ｈにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。図５４Ｌは、Ｎ連結グリカンが結合しているアミノ酸残基を示すアンチトロンビンＩＩＩペプチド、そしてそれに結合する模範的なグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５４Ｍから５４Ｏまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて、図５４Ｌにおいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３３０】
図５５は、図５５Ａから５５Ｊまでからなっているが、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のサブユニットαとβに関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５５Ａは、改造のために考えられるＮ連結グリカン（Ａ）とＯ連結グリカン（Ｂ）が結合している残基を示すｈＣＧαとｈＣＧβペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５５Ｂから５５Ｊまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３３１】
図５６は、図５６Ａから５６Ｊまでからなっているが、アルファ-ガラクトシダーゼ（ＦａｂｒａｚｙｍｅＴＭ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５６Ａは、改造のために考えられるＮ連結グリカン（Ａ）に結合しているアミノ酸残基を示すアルファ-ガラクトシダーゼＡペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５６Ｂから５６Ｊまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３３２】
図５７は、図５７Ａから５７Ｊまでからなっているが、アルファ-イヅロニナーゼ（ＡｌｄｒａｚｙｍｅＴＭ）に関してグリカン構造を改造するための典型的なスキームを説明する。図５７Ａは、改造のために考えられるＮ連結グリカン（Ａ）に結合しているアミノ酸残基を示すアルファ-イヅロニナーゼペプチド、そしてグリカンの構造式を表すダイアグラムである。図５７Ｂから５７Ｊまでは、ペプチドが表されている細胞のタイプに基づいて考えられるペプチドのグリカンの改造ステップ及び望ましく改造されたグリカン構造のダイアグラムである。
【１３３３】
図５８は、図５８Ａと５８Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と２）のアミノ酸配列である。
【１３３４】
図５９は、図５９Ａから５９Ｄまでからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した  インターフェロン  アルファ（ＩＦＮ−α）（図５９Ａと５９Ｂは、それぞれＳＥＱＩＤＮＯＳ：３と４）のアミノ酸配列である。そして模範的なヌクレオチド及びそれに対応したインターフェロン  オメガ（ＩＦＮ−オメガ）（図５９Ｃと５９Ｄは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と７５）のアミノ酸配列である。
【１３３５】
図６０は、図６０Ａと６０Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したインターフェロン  ベータ（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と６）のアミノ酸配列である。
【１３３６】
図６１は、図６１Ａと６１Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したＦａｃｔｏｒＶＩＩａ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と８）のアミノ酸配列である。
【１３３７】
図６２は、図６２Ａと６２Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したＦａｃｔｏｒＩＸ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と１０）のアミノ酸配列である。
【１３３８】
図６３は、図６３Ａから６３Ｄまでからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と１１から１４）のα鎖とβ鎖それぞれのアミノ酸配列である。
【１３３９】
図６４は、図６４Ａと６４Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したエリスロポエチン（ＥＰＯ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５と１６）のアミノ酸配列である。
【１３４０】
図６５は、成熟したＥＰＯ、すなわち１６５のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）のアミノ酸配列である。
【１３４１】
図６６は、図６６Ａと６６Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したグラヌロサイト−マクロファーゼコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７と１８）のアミノ酸配列である。
【１３４２】
図６７は、図６７Ａと６７Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ガンマ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９と２０）のアミノ酸配列である。
【１３４３】
図６８は、図６８Ａと６８Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したα−１−プロテアーゼ  インヒビター（Ａ−１−ＰＩ，あるいはα―アンチトリプシン）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１と２２）のアミノ酸配列である。
【１３４４】
図６９は、図６９Ａ−１、６９Ａ−２及び６９Ｂから成っているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したグルコセレブロシダーゼ（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と２４）のアミノ酸配列である。
【１３４５】
図７０は、図７０Ａと７０Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したティッシュウ−タイプのプラズミノゲン  アクティベータ−（ＴＰＡ）（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５と２６）のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と２８）
【１３４６】
図７１は、図７１Ａと７１Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したインターロイキン−２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列である。
【１３４７】
図７２は、図７２Ａ−１から７２Ａ−４までと、図７２Ｂ−１から７２Ｂ−４までとからからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したＦａｃｔｏｒＶＩＩＩのアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と３０）
【１３４８】
図７３は、図７３Ａと７３Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したウロキナーゼのアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３と３４）
【１３４９】
図７４は、図７４Ａと７４Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した組み換え型ＤＮａｓｅ（ｈｒＤＮａｓｅ）のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９と４０）
【１３５０】
図７５は、図７５Ａと７５Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したインスリン分子のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３と４４）
【１３５１】
図７６は、図７６Ａと７６Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した肝炎ＢウィルスからのＳ−プロテン（ＨｂｓＡｇ）のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５と４６）
【１３５２】
図７７は、図７７Ａと７７Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５と４６）
【１３５３】
図７８は、図７８Ａと７８Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したアンチトロンビンＩＩＩのアミノ酸配列である。図７８Ａと７８Ｂは、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した“ＷＴ”アンチトロンビンＩＩＩのアミノ酸配列である。
（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３と６４）
【１３５４】
図７９は、図７９Ａから７９Ｄまでからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）αとβサブユニット のアミノ酸配列である。図７９Ａと７９Ｂは、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのα−サブユニットのアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９と７０）  図７９Ｃと７９Ｄは、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ−サブユニットのアミノ酸配列である。
（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１と７２）
【１３５５】
図８０は、図８０Ａと８０Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したα−イヅロにナーゼのアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５と６６）
【１３５６】
図８１は、図８１Ａと８１Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したα−ガラクトシダーゼＡのアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７と６８）
【１３５７】
図８２は、図８２Ａと８２Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した、ＥｎｂｒｅｌＴＭ（腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）／ＩｇＧ融解）の一部から成っている、７５  ｋＤａの腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１と３２）
【１３５８】
図８３は、図８３Ａと８３Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した  ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（Ｈｅｒ２に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、上皮細胞増殖因子レセプター）のそれぞれ軽鎖と重鎖のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５と３６）
【１３５９】
図８４は、図８４Ａと８４Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した  ＳｙｎａｇｉｓＴＭ（呼吸器合胞体ウイルスのＦペプチドに対するＭＡｂ）のそれぞれ軽鎖と重鎖のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７と３８）
【１３６０】
図８５は、図８５Ａと８５Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ（ＴＮＦαに対するＭＡｂ）の非人間可変領域のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１と４２）
【１３６１】
図８６は、図８６Ａと８６Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応した人のＩｇＧ  のアミノ酸配列である。（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９と５０）
【１３６２】
図８７は、アンチ−グリコプロテン  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  マウス抗体の成熟可変領域の軽鎖の模範的なアミノ酸配列である。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）
【１３６３】
図８８は、アンチ−グリコプロテン  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  マウス抗体の成熟可変領域の重鎖の模範的なアミノ酸配列である。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）
【１３６４】
図８９は、ヒトＩｇＧの可変領域の軽鎖の模範的なアミノ酸配列である。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）
【１３６５】
図９０は、ヒトＩｇＧの可変領域の重鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）の模範的なアミノ酸配列である。
【１３６６】
図９１は、ヒトＩｇＧの軽鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）の模範的なアミノ酸配列である。
【１３６７】
図９２は、ヒトＩｇＧの可変領域の重鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）の模範的なアミノ酸配列である。
【１３６８】
図９３は、図９３Ａと９３Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したアンチ−ＣＤ２０マウス抗体軽鎖の成熟可変領域（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９と６０）のアミノ酸配列である。
【１３６９】
図９４は、図９４Ａと９４Ｂからなっているが、模範的なヌクレオチド及びそれに対応したアンチ−ＣＤ２０マウス抗体重鎖の成熟可変領域（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１と６２）のアミノ酸配列である。
【１３７０】
図９５は、図９５Ａから９５Ｅまでからなっているが、タンデム型キメラ抗体表現ベクトルＴＣＡＥ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）のヌクレオチド配列である。
【１３７１】
図９６は、図９６Ａから９６Ｅまでからなっているが、アンチ−ＣＤ２０マウス抗体の軽鎖と重鎖を含むアンチタンデム型キメラ抗体表現ベクトルＴＣＡＥ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）のヌクレオチド配列である。
【１３７２】
図９７は、図９７Ａから９７Ｃまでからなっているが、骨髄腫発現の  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体からＰＮＧａｓｅＦによって解放されたグリカンの ２−ＡＡ ＨＰＬＣ  解析を示すグラフである。グリカンの構造は、保持時間によって決められる。すなわち、Ｇ０グリコフォームは３０分で溶出する。Ｇ１グリコフォームは〜３３分で溶出する。Ｇ２グリコフォームは約３７分で溶出する。そしてＳ１−Ｇ１グリコフォームは〜７０分で溶出する。図９７Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図９７Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図９７Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１４にまとめた。
【１３７３】
図９８は、図９８Ａから９８Ｃまでからなっているが、骨髄腫発現の  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体からＰＮＧａｓｅＦによって解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ  解析を示すグラフである。グリカンは２ＡＡで誘導され、ＭＡＬＤＩで解析された。図９８Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図９８Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図９７Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３７４】
図９９は、図９９Ａから９９Ｄまでからなっているが、Ｍ３Ｎ２  グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 毛管電気泳動  解析を示すグラフである。ＡＰＴＳで誘導されたグリカン基準の 毛管電気泳動  解析を表すグラフを図９９Ａに示す。図９９Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図９９Ｃは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図９８Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１５にまとめた。
【１３７５】
図１００は、図１００Ａから１００Ｄまでからなっているが、Ｇ０グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 毛管電気泳動  解析を示すグラフである。ＡＰＴＳで誘導されたグリカン基準の 毛管電気泳動  解析を表すグラフを図１００Ａに示す。図１００Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１００Ｃは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１００Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１６にまとめた。
【１３７６】
図１０１は、図１０１Ａから１０１Ｃまでからなっているが、Ｇ０グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ２ＡＡＨＰＬＣ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。図１０１Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０１Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０１Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１６にまとめた。
【１３７７】
図１０２は、図１０２Ａから１０２Ｃまでからなっているが、Ｇ０グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡで誘導され、ＭＡＬＤＩによって解析された。図１０２Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０２Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０２Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３７８】
図１０３は、図１０３Ａから１０３Ｄまでからなっているが、Ｇ２グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 毛管電気泳動  解析を示すグラフである。ＡＰＴＳで誘導されたグリカン基準の 毛管電気泳動  解析を表すグラフを図１０３Ａに示す。図１０３Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０３Ｃは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０３Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１７にまとめた。
【１３７９】
図１０４は、図１０４Ａから１０４Ｃまでからなっているが、Ｇ２グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ２ＡＡＨＰＬＣ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。図１０４Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０４Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０４Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１７にまとめた。
【１３８０】
図１０５は、図１０５Ａから１０５Ｃまでからなっているが、Ｇ２グリコ形を含むようにグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡで誘導され、ＭＡＬＤＩによって解析された。図１０５Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０５Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０５Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３８１】
図１０６は、図１０６Ａから１０６Ｄまでからなっているが、Ｍ３Ｎ２グリコ形のＧｎＴ−Ｉ処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 毛管電気泳動  解析を示すグラフである。ＡＰＴＳで誘導されたグリカン基準の 毛管電気泳動  解析を表すグラフを図１０６Ａに示す。図１０６Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０６Ｃは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０６Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３８２】
図１０７は、図１０７Ａから１０７Ｃまでからなっているが、Ｍ３Ｎ２グリコ形のＧｎＴ−Ｉ処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ２ＡＡＨＰＬＣ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。図１０７Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０７Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０７Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３８３】
図１０８は、図１０８Ａから１０８Ｃまでからなっているが、Ｍ３Ｎ２グリコ形のＧｎＴ−Ｉ処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＭＡＬＤＩによって解析された。図１０８Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０８Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０８Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３８４】
図１０９は、図１０９Ａから１０９Ｄまでからなっているが、Ｍ３Ｎ２グリコ形のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 毛管電気泳動  解析を示すグラフである。ＡＰＴＳで誘導されたグリカン基準の 毛管電気泳動  解析を表すグラフを図１０９Ａに示す。図１０９Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１０９Ｃは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１０９Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１８にまとめた。
【１３８５】
図１１０は、図１１０Ａから１１０Ｃまでからなっているが、Ｍ３Ｎ２グリコ形のＧｎＴ−Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 2-ＡＡＨＰＬＣ解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。図１１０Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１０Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１０Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１８にまとめた。
【１３８６】
図１１１は、図１１１Ａから１１１Ｃまでからなっているが、ＮＧＡ２Ｆグリコ形のガラクトシルトランスフェラーゼ処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＭＡＬＤＩによって解析された。図１１１Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１１Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１１Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３８７】
図１１２は、図１１２Ａから１１２Ｄまでからなっているが、ＧａｌＴ１処理前（図１１２Ａと１１２Ｃ）およびＧａｌＴ１処理後（図１１２Ｂと１１２Ｄ）のＮＧＡ２Ｆイソ型を含むＣｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ２−ＡＡＨＰＬＣ解析を示すグラフである。図１１２Ａと１１２Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１２Ｃと１１２Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。解放されたグリカンは、２ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。
【１３８８】
図１１３は、図１１３Ａから１１３Ｃまでからなっているが、Ｇ２グリコ形のＳＴ3Ｇaｌ３処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 2-ＡＡ  ＨＰＬＣ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２−ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。図１１３Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１３Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１３Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。これらのグラフについてのピーク面積のパーセント割合を表１９にまとめた。
【１３８９】
図１１４は、図１１４Ａから１１４Ｃまでからなっているが、Ｇ２グリコ形のＳＴ3Ｇaｌ３処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２−ＡＡとラベルされ、ＭＡＬＤＩによって解析された。図１１４Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１４Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１４Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３９０】
図１１５は、図１１５Ａから１１５Ｄまでからなっているが、Ｇ２グリコ形のＳＴ６Ｇaｌ１処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 毛管電気泳動  解析を示すグラフである。ＡＰＴＳで誘導されたグリカン基準の 毛管電気泳動  解析を表すグラフを図１１５Ａに示す。図１１５Ｂは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１５Ｃは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１５Ｄは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３９１】
図１１６は、図１１６Ａから１１６Ｃまでからなっているが、Ｇ２グリコ形のＳＴ６Ｇaｌ１処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの 2−ＡＡ  ＨＰＬＣ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２−ＡＡとラベルされ、ＨＰＬＣによってＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｄ  アミノ  カラム  上で分離された。              図１１６Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１６Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１６Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３９２】
図１１７は、図１１７Ａから１１７Ｃまでからなっているが、Ｇ２グリコ形のＳＴ６Ｇaｌ１処理によってグリコ改造された  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体から解放されたグリカンの ＭＡＬＤＩ  解析を示すグラフである。解放されたグリカンは、２−ＡＡとラベルされ、ＭＡＬＤＩによって解析された。図１１７Ａは、ＤＥＡＥ抗体試料の解析を示す。図１１７Ｂは、ＳＰＡ抗体試料の解析を示す。図１１７Ｃは、Ｆｃ抗体試料の解析を示す。
【１３９３】
図１１８は、図１１８Ａから１１８Ｅまでからなっているが、非還元条件下で種々のグリコ形で、Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体の改造されたもののＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の描像を表す。定量的な基準として、還元条件下でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をおこなった。蛋白質の分子量を示した。それらの大きさは、ｋＤａ単位で示す。図１１８Ａは、Ｇ０とＧ２グリコ形を含むようにグリコ改造されたＤＥＡＥ，ＳＰＡ  そしてＦｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。図１１８Ｂは、ＮＧＡ２Ｆ（２分するもの）とＧｎＴ−Ｉ−Ｍ３Ｎ２（ＧｎＴ１）グリコ形を含むようにグリコ改造されたＤＥＡＥ，ＳＰＡそしてＦｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。図１１８Ｃは、Ｓ２Ｇ２（ＳＴ６Ｇａｌ１）グリコ形を含むようにグリコ改造されたＤＥＡＥ，ＳＰＡ  そしてＦｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。図１１８Ｄは、Ｍ３Ｎ２グリコ形を含むようにグリコ改造されたＤＥＡＥ，ＳＰＡ  そしてＦｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１  抗体及びＢＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。図１１８Ｅは、Ｇａｌ−ＮＧＡ２Ｆ（Ｇａｌ−２分）グリコ形を含むようにグリコ改造されたＤＥＡＥ，ＳＰＡ  そしてＦｃ  Ｃｒｉ−ＩｇＧ１抗体及びＢＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。
【１３９４】
図１１９は、ＴＰ１０のシアリル化前及びシアリル化後のＦＡＣＥ解析結果を表臣ꊂ苣ꪃ菣ꊂ菣覃苣ꮃ臣辏菥芀볯覽볯ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢꣧꾁胣랂苣ꮃ藩议鿥銂賦龁臣蒁胣ꊼ뷯꺼볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲑猯扵꺨臣膀볯ꒁ臣랂苣ꮃ藩议鿥銂賦ꒁ胣ꊼ뷯꺼볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꺨臣膀볯ꒁ臣랂苣ꮃ藩议鿥銂賦ꒁ胣ꊼ뷯鶼볯ꊂ菣蚃菣鮼볯ꆼ볯躃苣ꦃ菣뎃藩㲸牢ਾ胣醼볯馼볯醀戼㹲 뎛볯銼볯꾁胣趃苣龃臣ꢳ냥閁苣龁볯낼볯邼臣랂苣ꪃ菣隌觥誏臣랂苣ꪃ菣隌뻥꺁菣ꦃ苣麃뿦ꚺ苣芙雩ꮁ꿥鞁臣캦枼洯⁬跥趽臣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀戼㹲邀볯鎼볯隼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯醼臣膀苣ꊂ菣ꮃ賥趉迥뎁苣ꊂ菣ꮃ賥貾臣뒼볯醼볯ꮁ꿥鞁臣膀菣ꦃ苣麃뿦ꚺ芙雩늛럧꺁鷩趩볯ꆼ볯ꎼ볯銂볎⽧牨洯⁬跥趽臣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀戼㹲邀볯鎼볯鞼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯銼臣膀볯낼볯邼臣閃苣랂菣隌觥貾臣ꒁ臣ꚁ臣ꚼ볯ꎼ볯낂菣ꮂ菣꺁꟨邞뗧鲞迥뎁볯ꢼ볯내菨龔裦뒼볯銼볯꺁볯ꆼ볯ꖼ苣ꪃ苣뎃臣ꎧ黦邵黦銂ꇨ馁苣꾂菣ꮃ苣龃菣늂菣꺁迦较臣芁苣芀볯覽볯ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯㲦畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꺨臣膀볯ꒁ臣躃苣ꦃ菣뎃藩袼볯ꆼ볯议鿥銂賦ꆁ胣銼臣꺁菣뎂菣몂볯ꚼ볯议鿥銂賦ꒁ胣㲂牢ਾ†鯥醼볯鎼臣膀볯薽뷯醼볯ₑꎼ볯꾼†듧麃룤ꞁ铧鎽蛥袼菣ꒂ苣낍볯誏臣龔뷤隤鮛꟨⦒臣낂菣뎂苣ꮃ賥閁苣龁볯낼볯邼볯鎽볯늼볯鎽볯薽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뢼⼼畳㹰볯꺁铧鎽ꓥ邵郥銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯馼볯醀戼㹲 뎛볯銼볯꾁胣ꖼ볯꾼臣Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯隌臣覂臣낂菣뎂뷥꺁볯ⶒ볯ꆼ†볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀戼㹲邀볯鎼볯馼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯閼臣膀鯥醼볯閼볯ꢁ볯銼볯ꊼ臣覂臣ꎁ臣蒁苣貁胣꺼裢ꊂ苣膃菣낂菣뎂苣龃菣銂諥袁臣銼臣꺁菣莃菣꺁볯낼볯꺁볯銈볯ꆼ†볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀鯥醼볯閼볯꾁胣궃菣袃볯꺁꟨邞苣ꢡ臣膀鯥醼볯閼볯꾁胣궃菣袃볯꺁꟨邞苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯邼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯隼臣膀볯躽볯銈볯ꞁ볯낼볯ꮁ곧鎼臣낂菣ꮂ菣鶞苣躰藥馁苣趏뿥Ꞁ臣龔觧꺁볯ⶒ볯ꆼ†볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀볯躽볯銈볯膀볯躽볯銈볯ꦼ胣Ꞽ뷯뒼裢ꦼ볯ꦼ볯Ꞽ뷯뒼裢뚼迥뎁볯膽뷯뒼볯ꞁ臣ꚇ郧貾臣膀臩鎽臣鮾룤몟苣膌臣ꖼ볯꾼ꫨ뒕鏥꺁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ裢뒼볯ꚼ苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯邼볯醀戼㹲 뎛볯銼볯꾁胣ꦤ蓧꺁볯낼볯꺁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯邼볯醀戼㹲 뎛볯銼볯꾁胣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯銂铧蒁臣낼볯Ꞽ賥趏뿥龔裦ꦉ臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯늂菣꺁迦较臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯钼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯邼臣膀볯ꖼ볯隌臣貂臣ꖼ볯꾼臣龔뷤隤臣꺁铧ꦉ귥蒚ꓦ骮뗧鲞苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀菣ꒂ苣낍臣膀볯ꖼ볯蚈귥銂賦龁臣蒁苣ꊂ菣ꮃ賥閁苣龁볯낼볯讁苣꺁菣벃苣銂ꇨ馁胣鮛꟨꾁볯ꖼ볯袼볯ₑ讽볯膽볯銂賦ꒁ볯낼볯銂뷤ꎁ臣鞾苣貂臣螃菣뾂苣ꢡ臣芀룤銧臣膀볯ꖼ볯袼볯邼†뷯꒼뷯覼苣膌臣ꖼ볯꾼苣뾽臣ꚁ뻥覂苣龁菣벃苣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯邼볯醀戼㹲 뎛볯鎼볯꾁胣ꎼ볯꾼駧뺏볯낼볯꺁菣ꒂ苣낂菣ꂃ臣讂胣ꖼ볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣醼볯閼臣ꊂ菣躃藩꺁闩閁臣芁苣膀苣ꪃ苣랂菣隌臣鞁臣醼볯ₘ讽볯膽臣蚈귥辇苣膌臣芀볯ꢼ볯내菨ꞁ铧邈臣貂臣ꖼ볯꾼臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꊽ臣膀듧鎼볯讽볯膽臣覂볯馼뷯꒼뷯꺁裥邭蟩銂賦ꒁ胣낂菣ꮂ菣階룤꺁돧銂ꇨ馁뷥꾁鯥꺁룤꾫臣놮臣궸臣몤臣芀戼㹲邀볯钼볯隼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯銼臣膀飦ꮙ듧麃ꇨ뺏臣ꖼ볯꾼臣肃苣ꊂ苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣낂菣ꮂ菣階룤꺁돧銂ꇨ馁뷥꾁鯥醼볯醼臣许ꯧ꺁껧꺁룤ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯邼볯醀戼㹲 뎛볯鎼볯꾁胣蚘駨내菨궸臣몙迧閁苣龁볯낼볯骃菣膃菣꺁裥邭蟩銂ꇨ馁ꏦ낂菣閃臣芁苣芀臣貂苣꾁胣醼†뷯꒼뷯膀볯邼†뷯꒼뷯芁苣蒁臣銼볯ₐ讽볯膽†臣낼볯Ꞽ臣꺁믤辄臣낂菣뎂볯ꖼ볯隌臣膀껥ꢅ臣醼臣膀볯ꒁ胣誁苣뎁볯ꒁ臣蚈닥낂菣ꮂ菣銂뷥邈臣讂苣蚁臣릔胩閁苣龁苣꺁臣芁苣芀볯邽뷯薽뷯覽뷯㲎畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯궼⼼畳㹰臣膀鯦ꪁ苣낂菣ꮂ菣꺿ꏩ鞁臣蒁臣芁苣蒁臣낼볯Ꞽ賥鞁臣蒁臣몓매麡듧麃룤ꞁ駧뺏臣貂臣ꖼ볯꾼臣芁苣芀볯ꖼ볯낼볯ꆼ뷯膽뷯薽뷯邽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뒼볯㲭猯灵貼볯趽뷯薽뷯貼볯袽뷯閽뷯膽뷯蒽†볯膽뷯鎽볯ꎼ볯覼臣膀郥颧臣膀鯦ꪁ苣낂菣ꮂ菣꺿ꏩ鞁臣蒁臣芁苣蒁臣낼볯Ꞽ賥鞁臣蒁臣몓매麡듧麃룤ꞁ駧뺏臣貂臣膀볯꺼裢ꎀ뗧낂菣ꮂ菣떂苣袃苣膌臣ꖼ볯꾼臣ꊽ臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯颼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯钼臣膀鯥醼볯钼볯ꢁ볯鎼볯ꊼ臣覂臣ꎁ臣蒁苣貁胣蚘駨내菨몙迧꺁볯낼볯꺁铦ꂀ臣낂菣뎂볯ꖼ볯隌臣뺯臣讂볯ꒁ臣릂苣벃菣銂ꇨ馁胣뎛볯鎼볯ꆼ臣膀飦ꮙ駧뺏苣ꪃ苣뎃苣颍룤蚈닥낂菣뎂볯ꖼ볯隌苣ꪃ苣뎃臣릔胩ꢁ苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥꺁苣蚃菣鞃苣ꢡ臣芀鯥醼볯钼볯꾁胣鶃菣骃菣膃菣꺁郥꺼裢ꎀ뗧낂菣ꮂ菣떂苣袃臣貮裦閁苣龁苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥颍룤蚈닥낂菣ꮂ菣銂賦ꎁ臣蒁苣릔胩ꖼ볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꢡ臣芀苣ꪃ苣뎃軩궸臣隳苣ꢡ臣ꊽ臣膀룤銧臣랂苣ꮃ藩銂ꇨ馁臣ꢁ믤隤臣膀鯥醼볯醼臣许ꯧ꺁껧꺁룤ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯邼볯醀戼㹲 뎛볯鎼볯꾁胣ꖼ볯꾼裢뎼볯ꢁ볯낼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ꟦覯觧꺁铧鎽ꓥ꺁铧ꦉ듦Ꞁ苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀铧鎽ꓥ꺁裥邞臣膀볯낼볯讧꿧ꦉ苣醼볯躼볯貼볯躼볯貼볯躼볯貼볯躼볯貼볯⺐볯貼迥뎁볯캐螽볯趽뷯₌ꂊ臣龁뻥膀볯ꊼ볯ꦼꚼ볯뎼볯邼볯讼볯궼裢ꎼ볯ꚼ볯醼볯躽뷯込뷯貽볯궸臣膀볯颼뷯銽뿤膌臣龁볯ꚼ裢醼뗨붙ꇨ薗듧麃臣鞢껦銂룦骮臣龁胣뒼뷯覽裢뎼볯꾁胣낂菣ꮂ菣貁볯蚈닥ꞁ볯ꆼ苣膌臣龁볯낼볯讧꿧ꦉ苣ꢡ臣芀볯銽뷯銈볯ꆼ†볯ꮼ†볯ꖼ볯꾁胣낂菣ꮂ菣貁볯蚈닥ꞁ볯膽뷯銂賦ꆁ胣醼뷯꒼뷯꺁볯ꆼ裢낼볯Ꞽ臣낂菣뎂볯ꖼ볯隌臣貂臣蒁苣ꖼ볯꾼꟦覯觧銂ꇨ馁胣꒼뷯ⶉ볯ꆼ볯邼볯₫낼볯Ꞽ†臣膀苣ꪃ苣뎃臣銼裥邲臣醼볯讽볯膽臣뎼볯銈볯ꖼ볯ꞁ苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥閁苣ꚁ臣讂볯낼볯讧꿧ꦉ苣ꢡ臣芀볯覽뎼볯醼볯₫낼볯Ꞽ†臣膀苣ꪃ苣뎃臣銼裥邲臣Ꞽ뷯貽苣膌臣膀볯讽볯膽臣뎼볯銈볯ꖼ볯ꞁ苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥閁苣ꚁ臣讂볯낼볯讧꿧ꦉ苣ꢡ臣芀볯覽뎼볯醼볯ꮼ†볯ꖼ볯₧꾁胣낂菣ꮂ菣꾁볯蚈닥ꞁ볯邼뷯꒼뷯꺁볯ꆼ裢낼볯Ꞽ臣낂菣뎂볯ꖼ볯隌臣貂臣蒁苣ꖼ볯꾼꟦覯觧銂ꇨ馁胣꒼뷯ⶉ볯ꆼ†臣膀苣ꪃ苣뎃臣銼裥邲臣뎼볯뺁臣鞢꿧閁苣讂볯낼볯讧꿧ꦉ苣ꢡ臣芀볯邽뷯螽뷯躽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뒼볯㲭猯灵꾁胣뒛臣讂苣ꪃ苣뎃뿤뺣苣鞁臣蒁臣ꎼ볯꾼듧麃룤ꞁ駧뺏臣貂臣ꖼ볯꾼臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯邼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯隼臣膀菣몂菣꺁볯낼볯讧꿧ꦉ臣겖该鮊귥銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣趃苣龃臣膀볯ꦼ볯銼볯붼臣ꦃ菣ꮃ臣龁胣낂菣뎂볯ꖼ볯隌臣늼볯꾼臣낂菣뎂볯늼볯隌臣ꪁ臣ꖼ볯꾼臣鲃菣ꦃ苣ꢳ냥ꞁ臣讂胣낂菣閃臣膀돦蒰뻥邼臣覂볯銼裥ꞁ臣趃苣龃臣股뗦궸臣꺁铦蒰菨ꦃ菣ꮃ臣龁볯낼볯꺁뿦ꚺ苣몤臣芀胢ꊼ뷯膽뷯钽裢醼볯ꮼ胢꾁胣꾫臣醼볯ₐ讽볯膽†볯ꖼ볯₧ꢃ裥銂賦ꒁ볯蚈닥낂菣ꮂ菣讧胩꺁볯낼볯銂ꓧ馁胣鲀볯辽뷯辽裢銼볯ꮼ胢꾁胣꾫臣銼볯ₐ讽볯膽†볯ꖼ볯₧ꢃ裥銂賦ꒁ跥肸裥邲苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀볯ꖼ볯낼臣膀룥ꦲ臣貂臣蒁苣ꆼ뷯膽뷯薽뷯邽臣芁苣芀胢ꊼ뷯膽뷯钽裢醼볯鶀臣膀ꯧꮁ볯ₑ讽볯膽†볯ꖼ볯₧ꢃ裥銂賦ꒁ跥肸裥邲苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀胢ꊼ뷯膽뷯钽裢뎼볯鶀臣膀ꯧꮁ볯ₑ讽볯膽†菩蚈苣膌臣銼裥邲苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀볯銼뷯銽臣꺁ꇨ膵룤꺁볯낼볯讧꿧ꦉ臣莿뫥꾁곦꺁胩誂볯ꊼ뷯膽뷯钽裢醼볯ꮼ볯閼볯醼뷯邽뷯込뷯貽볯ₛ궼뷯躽뷯銈볯邼볯貼볯躼볯莽뷯趽볯趽뷯鮼볯ꖼ볯낼볯醼뷯邽뷯込뷯貽볯ₛꊼ뷯膽뷯钽裢醼볯貼볯躼볯莽뷯趽볯趽뷯鮼볯覽뷯躽뷯銈볯ꆼ볯邼볯醼뷯邽뷯込뷯貽胣ꖼ볯꾼꟦覯觧꺁鯦骷臣뢛꿥ꊝꧧꆬ臣骀苣骼볯覽뷯躽뷯銈볯邼볯貼볯躼볯鮼†볯辽뷯辽裢銼볯ꮼ볯銼볯醼볯꺼볯뎼볯貼볯鮼†볯覽뷯躽뷯銈볯ꮼ볯邼볯閼볯ꊼ뷯膽뷯钽裢뎼볯貼볯躼볯芀†††戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀铧鎽蛥ꞁ臣늶諧꒵ꇨ莐ꋥꂊ苣몈뿦馁苣ꖼ볯꾼꟦覯觧꺁菨鮊苣芁苣辂臣낂菣閃臣芁苣芀郥ꚇ郧낂菣벃菣꾁볯릌臣麃苣릂臣覂裦ꎁ臣蒁苣芀菣Ꚃ苣꾁胣讽뷯鎽蟩鎽臣誂볯邼볎뷯鞃菣蚃菣꺁볯麛臣꺚룤ꢳ냥貁臣貂臣芀뛧뚊뗨股郧鞢諥꺁菣벃苣뎃菣꾁볯隼뷯銽臣겸껥鞁臣芀볯蚈닥銈볯ꆼ볯貼볯袼볯覼꟦覯觧꾁胣銼볯鎼臣讂臣꾁볯貼볯邵郥ꞁ뗧낁苣龁볯ꆼ裥邭苣膌臣芀볯芏藧骼ꫨ붣臣ꒁ臣ꚁ胣设볯颼臣궸臣覼臣鎁臣꾁볯낼볯誸臣낂菣ꮂ菣꾁볯ꆼ裢낼볯Ꞽ†볯邼볯貁믤蒁臣蒁苣鎼裥邲볯銈苣ꪃ苣뎃臣芁苣芀郥颧臣膀볯蚈닥門볯邼볯₫낼볯Ꞽ臣膀볯邼볯₫낼볯Ꞽ臣颻臣ꚁ臣讂볯ꆼ裢낼볯Ꞽ臣膀볯蚈닥꺼낂菣ꮂ菣銂賦ꎁ臣ꖼ볯꾼臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯銼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯颼臣膀볯낼볯讧꿧ꦉ臣ꒁ臣ꚁ胣龔뷤薆臣麃苣릂臣股뛦꺁菣麃菣꾂菣莃菣ꒀ苣鞢諥閁臣讂菨鮊臣芁苣芀볯꒼裢醼鯩麃苣릂臣膀뷯螽뷤趇뷥龁苣銼볯閼볎뷯꺁菣궃菣뎃臣릅藨薆돦蒰苣鞁臣芀菣Ꚃ苣꺁菣麃菣꾂菣莃菣ꒀ臣膀볯낼볯ꢳ냥貾볯閼韦ꞁ룦骮臣龁胣ꊼ뷯銈볯ꮼ臣膀苣ꪃ苣뎃臣銼裥邲臣膀볯膽뷯뺁臣鞢꿧閁苣뎼볯銈볯ꖼ볯₧醼뷯꒼뷯ꞁ苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥閁苣ꚁ臣讂볯낼볯讧꿧ꦉ苣몤臣芀볯辽뷯辽裢銼볯ꮼ臣膀苣ꪃ苣뎃臣颍룤蚈닥ꞁ胣Ꞽ뷯貽臣ꞁꋥ覯臣貂볯ꆼ裢낼볯Ꞽ†볯邼뷯꒼뷯ꞁ苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥閁苣ꚁ臣讂볯낼볯讧꿧ꦉ苣몤臣芀戼㹲邀볯钼볯鎼胣㲑牢ਾ††鯥醼볯馼臣膀鯥醼볯馼볯ꢁ볯鎼볯ꊼ臣覂臣ꎁ臣蒁苣貁胣蚘駨내菨궸臣몙迧閁苣龁볯낼볯讁苣떅듧蒚臣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣ꎧ黦銂ꇨ馁볯낼뷯辽뷯薽뷯躽†볯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯겼뷯钽볯邼볯邼볯邼볯覼胣뎛볯鎼볯ꆼ臣膀꟨뺔臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣芀鯥醼볯馼볯꾁胣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ꟨邞苣ꢡ臣芀菣ꒂ苣낍臣閃苣벃苣銂ꇨ鞁胣鮛꟨꾁볯貽뷯꺼볯莽苣ꢡ臣膀蛥꾁菣뎃菣벃苣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯醼볯醀戼㹲 뎛볯钼볯꾁胣Ꞽ뷯뒼裢ꦼ볯Ꞽ뷯貽볯銈볯ₑ趏뿥貾볯낼볯讁苣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ꟨邞苣ꢡ臣芀苣ꪃ苣뎃臣讧胩꾁胣钃菣꾂苣骃苣袃菣銂꣦隺臣낂菣ꮂ菣꺁苣꺁臣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣몱껥鞁臣芀苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣膀菣벃苣꺁若覂臣辏臣龁胣肃苣ꊂ菣뎃菣꾁菣뎂菣몂苣ꢡ臣膀鯥銧臣Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯銂ꇨ鞁胣蚆臣麃菣躃菣릂苣ꢡ臣膀飦꾁苣ꦃ苣袃菣릂苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯閼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯醼臣膀볯躽볯銈볯込볯膽뷯뒼裢醼†迥鲿뻥膀볯閽뷯薽뷯蒽뷯颽볯閼닧붣뻥膀臣鞁臣뎼볯ⶡ볯ꖼ볯⢧볯邼뷯꒼뷯⦁臣袂臣뎼볯ⶡ볯ꖼ볯⢧볯邼뷯꒼뷯⦁臣뎼볯鎼볯膽뷯鎼臣꺁迥鲿뻥ꖼ볯꾼臣覂꟨뺔臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ꟨邞苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯隼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯銼臣膀볯ꖼ볯隌臣貂臣颍룤蚈닥ꖼ볯꾼臣ꒁ臣ꚁ볯ꚼ裢醼듧麃臣龔뷤隤臣龔觧ꚭ髧鲤껥邵黦銂ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯醼볯醀戼㹲 뎛볯钼볯꾁胣뎛볯钼볯ꆼ臣醼볯鎼볯讁苣ꪁ臣ꚁ臣讂臣膀볯躽볯銈볯込볯躽볯銈볯ꦼ†迥鲿뻥ꖼ볯꾼臣覂꟨뺔臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁꟨邞苣ꢡ臣芀鯥醼볯鎼볯꾁胣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣ꢼ볯겼볯ꎧ黦銂ꇨ馁胣鎁臣ꞁ胣钃菣꾂볯꾁胣銼裥邲볯貽뷯꺼볯莽苣ꪃ苣뎃苣ꢡ臣芀鯥醼볯鎼볯꾁胣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ꟨邞苣ꢡ臣芀苣ꪃ苣뎃臣讧胩꾁胣钃菣꾂苣骃苣袃菣銂꣦隺臣낂菣ꮂ菣꺁苣꺁臣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣몱껥鞁臣芀苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣膀菣벃苣꺁若覂臣辏臣龁胣肃苣ꊂ跥꾁菣뎂菣몂苣ꢡ臣膀鯥銧臣Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯銂ꇨ鞁胣蚆臣麃菣躃菣릂苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯醼볯醼볯醀戼㹲 †뎛볯钼볯꾁胣뎛볯钼볯ꆼ臣醼볯钼볯讁苣ꪁ臣ꚁ臣讂臣膀볯膽뷯뒼裢醼†迥鲿뻥ꖼ볯꾼臣覂꟨뺔臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣芀鯥醼볯钼볯꾁胣辰ꛨꆨ臣꺁볯膽뷯뒼裢醼†迥鲿뻥ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃苣ꢡ臣芀鯥醼볯钼볯꾁胣Ꞥꛨꆨ臣꺁볯膽뷯뒼裢醼†迥鲿뻥ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃苣ꢡ臣芀룤릖臣뎛臣膀菣벃苣醼臣膀ꯧ꺁苣ꦃ苣袃릂菩蚈苣膌臣龁蚈닥낂菣ꮂ菣ꞁ臣誂胣钃菣꾂볯꾁胣꾫臣겂菣꾂菣ⶈ苣ꢃ裥銂賦龁臣蒁蚈닥낂菣ꮂ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯醼볯醀戼㹲 뎛볯钼볯꾁胣Ꞽ뷯貽볯銈볯ₑ趏뿥貾胣ꖼ볯꾼꣧꺁볯閽뷯薽뷯蒽뷯颽볯閼†苣궃菣袃苣ꦃ菣蚈鯩銂ꇨ馁胣钃菣꾂볯꾁胣꾫臣겂菣꾂菣ⶈ苣ꢃ裥銂賦ꆁ胣㊁裥邲苣ꪃ苣뎃苣膌臣龁볯낼볯銂郥肂胣㲂牢ਾ胣醼볯銼볯醀戼㹲 뎛볯钼볯꾁胣꾫臣겂菣꾂菣ⶈ苣ꢃ裥銂賦ꎁ臣㊟裥邲苣ꪃ苣뎃臣膂臣낂菣뎂铦ꂀ臩讨臣蒐铧邈觧꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ꟨邞苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀볯뒼볯Ꞽ뷯貽볯랂苣ꪃ菣隌뻥芁苣蒁臣뎼볯ⶡ볯ꖼ볯⢧볯邼뷯꒼뷯⦁臣龁臣뎼볯ⶡ볯ꖼ볯⢧볯邼뷯꒼뷯⦁臣꺁볯ꖼ볯隌뻥꺁볯낼볯ꮁ臣蒁臣꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ꟨邞苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯銼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯颼臣膀볯躽볯銈볯込볯躽볯銈볯ꦼ†迥鲿뻥ꖼ볯꾼臣覂꟨뺔臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣芀苣ꪃ苣뎃臣讧胩꾁胣钃菣꾂뿤膌駦鎖苣馨뫦꺁苣ꪃ苣뎃臣节臣ꢁ꿦莼臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뇦骮臣龁胣낂菣ꮂ菣讧胩꾁胣钃菣꾂臣趂苣ꮁ迦蒁臣芀菣ꒂ苣낍臣閃苣벃苣銂ꇨ鞁胣鮛꟨꾁볯貽뷯꺼볯莽苣ꢡ臣膀蛥꾁菣뎃菣벃苣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯銼볯醀戼㹲 뎛볯钼볯꾁胣Ꞽ뷯뒼裢뚼迥鲿뻥ꖼ볯꾼臣覂꟨뺔臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁볯낼볯ꎼ꟨邞苣ꢡ臣芀苣ꪃ苣뎃臣讧胩꾁胣钃菣꾂뿤膌駦鎖苣馨뫦꺁苣ꪃ苣뎃臣节臣ꢁ꿦莼臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뇦骮臣龁胣낂菣ꮂ菣讧胩꾁胣钃菣꾂臣趂苣ꮁ迦蒁臣芀菣ꒂ苣낍臣閃苣벃苣銂ꇨ鞁胣鮛꟨꾁볯貽뷯꺼볯莽苣ꢡ臣膀蛥꾁菣뎃菣벃苣銂ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯銼볯醀戼㹲 뎛볯閼볯꾁胣Ꞽ뷯貽볯銈볯趏뿥貾볯낼볯讁苣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣ꢼ볯겼볯ꎧ黦銂ꇨ馁胣낂菣ꮂ菣꺁꟦ꂀ臣膀菣벃苣鶿賦芙雩銂꣦隺臣낂菣ꮂ菣꺁苣꺁臣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣몱껥鞁臣芀苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣膀菣벃苣꺁若覂臣辏臣龁胣肃苣ꊂ跥꾁菣뎂菣몂苣ꢡ臣膀鯥銧臣Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯銂ꇨ鞁胣蚆臣麃菣躃菣릂苣ꢡ臣膀룤鲊臣蚆臣겂菣꾂菣ⶈ苣銂ꇨ鞁胣覸꟨꾁苣ꊂ菣뢅苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯閼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯醼臣膀볯뒼볯Ꞽ뷯貽볯趏뿥貾볯낼볯讁苣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣ꢼ볯겼볯ꎧ黦銂ꇨ馁胣낂菣ꮂ菣꺁꟦ꂀ臣膀菣벃苣鶿賦芙雩銂꣦隺臣낂菣ꮂ菣꺁苣꺁臣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣몱껥鞁臣芀苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣膀菣벃苣꺁若覂臣辏臣龁胣肃苣ꊂ跥꾁菣뎂菣몂苣ꢡ臣膀鯥銧臣Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯銂ꇨ鞁胣蚆臣麃菣躃菣릂苣ꢡ臣膀룤鲊臣蚆臣겂菣꾂菣ⶈ苣銂ꇨ鞁胣覸꟨꾁苣ꊂ菣뢅苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯隼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯銼臣膀볯뒼볯Ꞽ뷯貽볯趏뿥貾볯낼볯讁苣ꎧ铦閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣ꢼ볯겼볯ꎧ黦銂ꇨ馁胣낂菣ꮂ菣꺁꟦ꂀ臣膀菣벃苣鶿賦芙雩銂꣦隺臣낂菣ꮂ菣꺁苣꺁臣钯볨馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣몱껥鞁臣芀苣ꪃ苣뎃꟦ꂀ臣膀菣벃苣꺁若覂臣辏臣龁胣㲂牢ਾ胣醼볯銼볯醀戼㹲 뎛볯閼볯꾁胣낼볯Ꞽ賥閁苣龁볯蚈닥ꢁ볯蚈닥낂菣ꮂ菣銂賦ꒁ볯낼볯ꮁ臣蒁臣뒼볯銈볯내菨꺁铧鎽ꓥ꺁铧ꦉ귥蒚ꓦ骮뗧鲞苣ꢡ臣芀胢꒼뷯銈볯ꆼ胢꾁胣랂苣ꮃ藩貁뗧꾫菩ꢁ臣讂볯蚈닥낂菣ꮂ菣銂賦ꎁ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀胢꒼뷯銈볯ꆼ†볯邼볯₫낼볯Ꞽ胢꾁胣낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯ꞁꫨ躰臣貂胣랂苣ꮃ藩貁뗧꾫菩ꢁ臣讂볯蚈닥낂菣ꮂ菣銂賦ꎁ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀胢꒼뷯銈볯ꆼ†볯ꮼ†볯ꖼ볯鶀臣膀볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꞁꫨ躰臣貂胣랂苣ꮃ藩貁뗧꾫菩ꢁ臣讂볯蚈닥낂菣ꮂ菣銂賦ꎁ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀胢뒼뷯覽裢뎼볯₡뎼볯隼볯뎼볯鎼胢꾁胣銼볯鎼裢뎼볯ꞁꛨ辂苣膀볯貼볯銈볯ꆼ臣芵ꯧꢁ臣讂볯ꊂ菣蚃菣낂菣ꮂ菣銂賦ꎁ臣ꖼ볯꾼苣몤臣芀戼㹲邀볯钼볯颼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯钼臣膀蓨랂苣ꮃ賥躁꣧꺁铧邈觧꺁뷯ꦼ苣ꢡ臣ꦼ볯ꚼ苣ꮃ臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁胣ꦼ볯ꚼ꣦隺臣芁苣芀菣벃菣銼臣膀볯膽뷯钽뷯銽볯뢼菣궃菣뎃臣芁苣芀菣벃菣鎼臣膀뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯ꦼ볯鞃菣蚃菣ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣銼볯袽뷯ꞁ뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯ꦼ볯鞃菣蚃菣꺁蓨랂苣ꮃ賥趏뿥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯銼볯醀戼㹲 뎛볯閼볯꾁胣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯Ꞽ臣꺁迥鲿뻥膀볯ꆼ낼볯Ꞽ醼뷯꒼뷯⦁臣讂臣꾁볯ꆼ낼볯Ꞽ醼볯讽볯膽꺁臣骁苣讁臣놅뷥邵郥鞁臣ꚼ뷯莽뷯辽뷯ꦼ볯꺁裥邭蟩銂ꇨ馁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ†苣ꮃ臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁胣뎼뷯薽볯貽뷯薽볯銼裥邭蟩馨뫦ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯ꚼ裢ꦼ볯ꞁ臣蚁胣것菣뎃볯꾁蓨랂苣ꮃ賥閁苣龁뷯ꚼ裢ꦼ볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣뎼볯ⶡ볯ꖼ볯⢧볯讽볯膽ꮁ藥覜뗧袐臣龁뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯ꦼ볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣뎼볯ⶡ볯ꖼ볯⢧볯邼뷯꒼뷯⦁臣놅鳦邵郥鞁臣銽볯膽뷯钽뷯銽볯뢼臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯邼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯隼臣膀볯膽뷯钽뷯銽裢ꦼ볯ꢁ볯膽뷯钽뷯銽裢ꦼ볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ苣蚦臣ꚁ臣讂苣ꊂ菣뢅臣뒛軦꺁苣ꊂ菣隌迥鲿铧邈觧銂ꇨ馁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ†苣ꮃ臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁菣궃菣뎃꣦隺臣芁苣芀菣벃菣銼臣목臣芁苣芀菣벃菣鎼臣銽볯膽뷯钽뷯銽裢ꦼ볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯銈볯뢼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼臣蚦苣貂臣뎼볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯銈볯뢼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼臣芁苣芀菣벃菣隼臣뎼볯鎼볯膽뷯醼臣芁苣芀菣벃菣鞼臣뎼볯鎼볯膽뷯鎼臣芁苣芀菣벃菣颼볯馼볯醼볯꾁觥节臣ꚁ苣ꊂ菣肃菣벂蟥蚐苣鞁臣蒁뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯銈볯뢼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀뷯鎽뷯膽뷯辽裢ꚼ뷯莽뷯辽뷯ₒ뚼볯ꦼ뷯꺁苣ꮃ귧뮛苧뮛냦뎳该袼뷯ꢼ볯銈볯覼臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯ꚼ뷯莽뷯辽뷯뚼볯ꦼ臣ꞁ臣讂胣것菣뎃볯銈볯꾁뷯鎽뷯膽뷯辽裢ꚼ뷯莽뷯辽뷯뚼볯ꦼ뷯ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鎼볯醀戼㹲 뎛볯閼볯꾁胣ꚼ뷯莽뷯辽뷯뚼볯ꦼ뷯꺁볯ꆼ볯꒼볯릂菣꾂菣ꮃ臣낂菣閃臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯鎼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯馼臣膀볯膽뷯钽뷯銽볯ꦼ볯膽裢낼볯Ꞽ볯醼뷯꒼뷯覼臣궼볯겼볯ꦼ苣骃苣袃菣꺁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鎼볯醀戼㹲 뎛볯隼볯꾁胣ꚼ뷯莽뷯辽뷯뚼볯ꦼ뷯銈볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼臣궼볯겼볯ꦼ苣骃苣袃菣꺁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鎼볯醀戼㹲 뎛볯隼볯꾁胣낼볯Ꞽ賥閁苣龁볯膽뷯钽뷯銽볯ꦼ볯膽臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯늂菣꺁迦较臣芁苣芀菣벃菣醼臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯膽뷯钽뷯銽볯ꦼ볯膽臣芁苣芀菣벃菣銼臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯膽뷯钽뷯銽볯ꦼ볯膽臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꢁ볯뒼볯Ꞽ뷯貽볯ꢁ臣钼볯袽뷯貾臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣鎼臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯膽뷯钽뷯銽볯ꦼ볯膽迥뎁볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼뷯꒼뷯覼臣뎼볯鎼볯膽뷯鎼臣꺁볯颼뷯銽뻥꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯鎽뷯膽뷯辽裢ꚼ뷯莽뷯辽뷯뚼볯ꦼ뷯誁苣뎁볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯꺁볯뒼볯Ꞽ뷯貽볯ꢁ臣馼볯袽뷯貾臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯隼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯銼臣膀菣袃룤芞뷤ꚼ볯ꢼ臣놄苣ꊂ菣隌迥鲿铧邈觧꺁苣ꮃ귧뮛苧뮛냦뎳该袼볯ꖼ볯覼臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁胣覭鯩릂鯩鞰돦開볯ꦼ볯ꚼ볯馨뫦ꞁ臣讂胣것菣뎃꾁ꓥ뚄臣ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀菣벃菣鎼臣놄苣랂菣隌臣龁볯뎼볯ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鎼볯醀戼㹲 뎛볯隼볯꾁胣銽볯뎼볯꺁볯ꖼ볯銈苣ꊂ菣隌苣馁苣龁苣꺁迥鲿铧邈觧꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ苣ꮃ臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁胣뎼뷯薽볯貽뷯薽볯銼裥邭蟩馨뫦ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣醼볯캕螽臣ꦤ蓧ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀菣벃菣鎼臣膀볯閼볎뷯꺁뷯鎽뷯膽뷯辽裢ꚼ볯ꢼ볯ꆼ볯銈볯뎼볯覼臣芁苣芀菣벃菣钼胣꾁볯閼볎뷯꺁볯뎼裢ꚼ볯ꢼ臣ꎼ볯낼裢뎼볯ꢁ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣閼胣꾁볯閼볎뷯꺁볯뎼裢ꚼ볯ꢼ臣ꎼ볯낼裢뎼볯門볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꢁ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣閼臣膀볯閼볎뷯꺁볯뎼裢ꚼ볯ꢼ臣ꎼ볯낼裢뎼볯門볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꢁ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣隼臣膀볯閼볎뷯꺁볯뎼裢ꚼ볯ꢼ臣ꎼ볯낼裢뎼볯門볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꢁ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣鞼臣膀볯閼볎뷯꺁볯뎼裢ꚼ볯ꢼ臣ꎼ볯낼裢뎼볯門볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼臣꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣₂㰠牢ਾ胣醼볯鎼볯醀戼㹲 뎛볯隼볯꾁胣ꚼ볯ꢼ臣낼볯Ꞽ裢랂苣ꮃ賥銂臣讂臣膂臣趏뿥龔裦ꦉ臣늂菣覭鯩릂鯩鞰돦開†臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁胣ꦼ볯ꚼ꣦隺臣芁苣芀菣벃菣銼臣膀볯閼볎뷯꺁ꓥ뚄볯뎼볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣醼볯캕螽臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯뎼볯袼볯뎼裢ꚼ볯ꢼ볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯膀臣醼볯캕螽臣ꆼ볯銈볯뎼볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ胢낼볯Ꞽ볯醼뷯꒼뷯覼臣꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣醼볯캕螽臣ꆼ볯銈볯뎼볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ胢낼볯Ꞽ볯醼뷯꒼뷯覼臣꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣醼볯캕螽臣ꆼ볯銈볯뎼볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ胢낼볯Ꞽ볯閼뷯꒼뷯覼臣꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣醼볯캕螽臣ꆼ볯銈볯뎼볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ胢낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯ꢁ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯馼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯閼臣膀菣袃룤芞뷤내菨궸臣龔裦閁苣龁ꓥ뚄臣麝뗧鮏臣ꚼ볯ꢼ臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯꺁迦较臣芁苣芀菣벃菣醼볯銼볯閼臣膀볯薽뷯ꊼ뷯閽뷯㲅畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯궼⼼畳㹰볯銼裥邭蟩馨뫦ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁臣貂臣貂볯캕螽臣銼볯캕螽臣ꦤ蓧ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯邼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯隼臣膀뷯ꚼ볯ꢼ臣랂苣ꮃ賥꺁铧邈觧銂ꇨ馁귧뮛苧뮛냦뎳该袼뷯ꢼ볯銈볯覼臣辏菥ꞁ臣讂胣것菣뎃볯ꢁ볯꾁볯ꖼ볯馨뫦ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁ꓥ뚄뷯ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀菣벃菣鎼臣膽뷯覽뷯貽뷯銈뷯ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀뷯鎽뷯膽뷯辽裢銽볯뎼볯꺁볯ꖼ볯랂苣ꮃ賥꺁뗧鲞苣ꢡ臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯꺁迦较臣芁苣芀菣벃菣醼臣ꦤ蓧銽볯뎼볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯鎽뷯膽뷯辽裢ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀菣벃菣鎼臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯뎼볯ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣钼裢鞼臣膀臣貂臣貂볯袽뷯貼볯袽뷯貼볯钼뷯銽볯钼볯袽뷯ꞁ臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯뎼볯ꢁ볯躼볯趽볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣钼볯袽뷯ꞁ臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯뎼볯ꢁ볯躼볯趽볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁胣钼볯袽뷯ꞁ臣膽뷯覽뷯貽뷯銈볯뎼볯ꢁ볯躼볯趽볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼뷯꒼뷯覼臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯銼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯颼臣膀뷯鎽뷯膽뷯辽裢銽볯뎼볯꺁볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼뷯꒼뷯覼臣꺁볯ꖼ볯랂苣ꮃ賥꺁铧邈觧銂ꇨ馁苣ꮃ귧뮛苧뮛냦뎳该꺁迦较臣芁苣芀菣벃菣醼臣ꦤ蓧銽볯뎼볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯鎽뷯膽뷯辽裢銽볯뎼볯ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁뷯鎽뷯膽뷯辽裢銽볯뎼볯ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ臣銼볯袽뷯ꞁ臣趏뿥龔裦ꦉ臣芁苣芀菣벃菣钼裢鞼臣膀臣貂臣貂볯袽뷯貼볯袽뷯貼볯钼뷯銽볯钼볯袽뷯ꞁ臣膽뷯覽뷯貽뷯銈뷯ꚼ볯ꢼ臣邼볯閼뷯궼臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣것菣뎃볯꾁ꧧ붙臣芁苣芀菣벃菣馼臣醼볯꾁胣钼볯袽뷯ꞁ臣膽뷯覽뷯貽뷯銈뷯ꚼ볯ꢼ臣鶁苣麁苣邼볯閼뷯궼臣醼볯邼뷯궼臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼臣꺁迥鲿铧邈觧ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯钼볯醀戼㹲 뎛볯隼볯꾁胣銽볯뎼볯ꢁ뷯ꚼ볯ꢼ裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯讽볯膽臣醼볯讽볯膽볯꺁雨開諥ꚭ臣낂菣閃臣芁苣芀臣꺁苣ꦃ菣꾁胣銽볯뎼볯隌郥ꦉ臣趃苣龃臣股뗦궸臣芁苣芙雩ꢁ苣ꪃ苣傳䝅賥閁苣龁뷯ꚼ볯ꢼ臣ꒁ臣ꚁ胣傁䝅賥閁苣ꚁ臣ꪁ臣銽볯뎼볯ꢁ꿦莼臣ꚁ胣股뗦궸臣銽볯뎼볯꺁맥螝뿦ꚺ臣꺁雩꺁雩芿苣뎛ꓧ鞁臣节臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯钼볯醀戼㹲 뎛볯鞼볯꾁胣뮂菣袃菣내菨銂뷤ꎁ臣꺁볯뎼볯龔觧ꚭ髧ꚩ꣩邵黦꺁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣鎁臣낂菣閃臣膀苣ꮃ菣ꪃ듧麃鿥誤ꫥ鎽룤꺁볯뎼볯莿뫥ꢁ苣ꮃ菣ꪃ듧麃臣覂铦몇臣貂臣醼볯銈닎苣릂菣ꦃ苣ꪂ菣ꮃ臣辇臣꺁雩꺁雩芿苣뎛ꓧ鞁臣节臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯钼볯醀戼㹲 뎛볯鞼볯꾁胣낂菣뎂볯ꖼ볯隌迥뎁鷩낂菣뎂볯ꖼ볯隌볯뎼볯꺁볯钽뷯薽뷯趽뷯躽裢낼뷯袽뷯薽뷯龔觧ꚭ髧ꚩ꣩邵黦銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣趃苣龃臣膀菣袃뗧鮯胦뒂菣覃菣궃菣뎃臣꺨胣꺁蟩꺁볯뎼볯銂볯ꖗ雩꺚룤ꢳ냥閁苣龁胣ꚇ郧낂菣벃菣꺁跥ꎷ臣趇蟩꾁볯ꖗ鯧ꮁ뇦骮臣龁胣銽볯뎼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ臣膀볯ꖼ볯袼볯讽볯膽볯ꞁ苣ꪃ苣낼볯Ꞽ賥閁苣龁뗧뾁迦袁黥ꚼ볯ꢼ臣芁苣芀뷯ꚼ볯ꢼ臣膀鷩낂菣뎂볯ꖼ볯隌볯뎼볯ꞁ臣讂胣鶁苣麁苣꺁蟥蚐苣ꮃ菣鞃臣醼볯꺁菣몂菣銂郥鎂臣蒁苣芀戼㹲邀볯钼볯隼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯銼臣膀鯥醼볯銼볯ꢁ볯鞼볯ꊼ臣覂裦ꎁ臣蒁苣貁胣뎼뷯邽뷯銽뷯薽뷯銈볯閼苣ꦃ菣讁苣ꦼ볯ꚼ諦몇臣꾂菣麃菣낂菣閃苣ꢡ臣芀鯥醼볯銼볯꾁胣꾂菣麃菣낂菣閃藥鎽苣ꢡ臣芀볯鞼볯ꊼ臣膀菣벃苣钼臣閼苣ꮐ苣醼볯銼볯꺁껧꺁ꃩ龟苣肸뇥뎩臣辁ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯钼볯醀戼㹲 뎛볯鞼볯꾁胣뎛볯鞼볯ꆼ臣醼볯鎼볯讁苣邈臣ꚁ臣讂臣膀볯꺼볯銈닎臣覂藩ꂴ髧ꮁ铦몇臣貂臣낂菣ꮂ菣꺁볯ꆼ볯꒼볯ꎧ黦銂ꇨ馁胣뎛볯鞼볯ꆼ臣膀ꓥ뚄臣ꦼ볯ꚼ裢캒讁苣떅듧蒚臣뺔蟥閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ꟨邞苣ꢡ臣芀볯鞼볯ꊼ臣膀蓨랂苣ꮃ賥ꦼ볯ꚼ裢캒讁苣떅듧蒚臣뺔蟥閁苣龁苣ꪃ苣뎃臣궼볯겼볯ꦼ꟨邞苣ꢡ臣芀苣ꪃ苣뎃臣讧胩꾁胣钃菣꾂苣骃苣袃菣銂꣦隺臣낂菣ꮂ菣ꢁ꿦莼臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뇦骮臣貂臣芀苣ꪃ苣뎃臣讧胩꾁菣벃苣꺁若ꮁꇨ閁苣ꚁ臣讂胣鮛꟨꾁볯貽뷯꺼볯莽苣ꢡ臣膀룤銧臣閃苣벃苣銂ꇨ鞁胣蚆臣麃菣躃菣릂苣ꢡ臣膀菣ꒂ苣ꊃ菣覃臣겂菣꾂菣銈苣銂ꇨ鞁胣龘臣랂苣ꮃ藩銂ꇨ馁胣㲂牢ਾ胣醼볯钼볯醀戼㹲 뎛볯鞼볯꾁胣놄苣ꊂ菣隌볯꺼볯銈닎臣랂苣ꮃ賥꺁菣꾂菣뎃菣궃菣袃裥邞苣ꢡ臣芀迥뒁臣隃菣莃菣꾁胣캁銼볯鎼裢랂苣ꮃ賥貁ꓦ몇臣貂苣袂臣ꮁ胣뢂苣궂苣늂菣뎃볯꒼볯Ꞽ볯袼볯辽뷯袽뷯₅ꆼ뷯邽뷯覽뷯蒽†볯莽뷯薽뷯莽뷯貼볯躽뷯覽뷯躽뷯邽뷯貽뷯鎽ꦼ볯覼臣ꦃ菣ꮃ臣龁볯膽뷯莽뷯覽뷯₁膽뷯閽뷯薽뷯鎽뷯鎽蟥蚛듧袼볯ꆼ볯覼臣鲤蟥閁苣讂胣ꚷ臥꺁菣궃菣袃臣膀††鳩몇臣龁苣ꦃ苣袃裢릂껦몟臣鲤蟥閁苣讂苣蚁臣膀菣ꪂ菣뎃볯뚼뷯莽뷯辽뷯ₒ겼뷯芽뷯銽뷯钽뷯銽뷯薽뷯ⲓ†볯閽뷯貽뷯躽뷯膽뷯薽‬ꎼ볯覼臣ꦃ菣ꮃ臣龁†볯銽뷯袽뷯覽뷯膽†뷯銽뷯鎽뷯膽뷯膽뷯貽뷯₉것苣膃菣袼볯ꎼ볯覼臣鲤蟥閁苣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯钼볯醀戼㹲 뎛볯鞼볯꾁胣ꦼ볯ꚼ裢캒꺁볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼볯ꖼ볯隌迥鲿铧邈觧꺁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ꟨邞苣ꢡ臣芀胢銈볯ꖼ볯鶀臣膀볯ꖼ볯隌迥鲿觥꺁볯꺼볯銈닎臣芁苣芀胢讼볯ꖼ볯鶀臣膀볯ꖼ볯隌迥鲿뻥꺁볯꺼볯銈닎臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯邼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯隼臣膀볯꺼볯銈닎臣낼볯Ꞽ볯銼볯讽볯膽볯낼볯Ꞽ賥趏뿥龔裦ꦉ臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꎧ黦銂ꇨ馁胣鲀볯躽뷯辽뷯覽뷯覽뷯蒽胢꾁胣낼볯Ꞽ賥趏뿥趉臣ꦼ볯ꚼ裢캒ꞁ臣讂胣鲀볯薽뷯馽뷯膽뷯薽뷯鶀臣膀볯ꖼ볯隌迥鲿뻥꺁볯꺼볯銈닎臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀볯閽뷯薽뷯蒽뷯颽裢㊒볯꾼苣ꦃ菣讁苣꺁볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼볯ꖼ볯隌볯꺼볯銈닎諦몇臣꾂菣麃菣낂菣閃苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯銼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯颼臣膀苣궃菣袃苣ꦃ菣꺁鯥ꞁꓧ鞁臣낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯낼볯Ꞽ賥ꦼ볯ꚼ裢캒꺁菣벃苣閃菣꾂苣ꞃ菣ꮁ臣蒁臣꺁铧ꦉ귥蒚ꧨ鎨뗧鲞苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯鎼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯馼臣膀볯閽뷯薽뷯蒽뷯颽裢㊒볯꾼苣ꦃ菣讁苣꺁볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼볯ꖼ볯隌볯꺼볯銈닎諦몇臣꾂菣麃菣낂菣閃苣ꢡ臣芀戼㹲邀볯钼볯钼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯邼臣膀鯥醼볯邼볯ꢁ볯颼볯ꊼ臣覂臣ꎁ臣蒁苣貁胣늼볯膽뷯薽볯꺁볯ꆼ볯꒼볯銈볯꾼볯릂菣꾂菣ꮃ볯뎛볯颼볯ꆼ볯ꢁ볯銈苣ꪃ苣誃裢벂臣袂臣ꚁ볯꺼뷯鎽뷯ꊼ臣覂裥궖臣貂臣ꪂ菣뒂돧꺁볯낼볯ꎼ菣궃菣ꆂ苣ꮃ볯뎛볯颼볯ꊼ볯ꢁ苣ꢡ臣銼臣꺁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣骃菣膃菣꺁ꓥ認臣꺼裢낂菣뎂苣ꮃ賥꺁苣ꒂ菣꾁볯讁苣醼볯꺁菣뎃菣벃苣议鿥讁苣ꪁ苣颫菣뎃菣벃苣꺁苣ꪃ苣隳臣꺿ꏩ閁苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣颫菣뎃菣벃苣꺼裢낂菣ꮂ菣꺁菣ꒂ菣ꪃ菣覃볯銈苣ꪃ苣뎃臣꺁ꓥ鮏苣ꢡ臣릂苣벃菣ꞁ臣讂胣떅듧醼臣膀볯銽뷯莽뷯辽뷯辽뷯膽†뷯薽뷯鎽뷯覽臣讂臣꾁볯鎽뷯薽뷯螽뷯貽뷯閽뷯ₓ鎽뷯覽뷯辽뷯₉讁苣꺁뇎볯貼볯銈菣뎃菣랂菣銈苣ꞁ臣讂胣떅듧銼臣膀볯躽볯銈볯袼닎裢㆒㈬裢꺼裢ꊂ苣膃菣₫낂菣뎂苣龃菣ꮃ†菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣₼ꦼ볯ꞁ臣讂胣떅듧鎼臣膀볯膽뷯뒼裢ꦼ볯캈醼볯钼裢겂菣꾂菣랂菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂†볯覼臣芁苣芀藩ꂴ볯꾁胣캁銼볯鎼裢랂苣ꪃ菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂†臣讂臣꾁뇎볯貼볯銈苣ꊂ菣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣뎛볯颼볯ꆼ臣醼볯銼볯讁苣ꪁ臣ꚁ臣讂臣膀뗧뾁迦袁黥뒼‮銽뷯薽뷯薽뷯₉츠醼볯銼裢麃菣躃苣肃裢벂臣ꚇ郧鞁臣늼볯膽뷯薽볯꺁볯ꆼ볯꒼볯銈볯꾼볯릂菣꾂菣ꮃ볯뎛볯颼볯ꆼ볯ꢁ볯銈苣ꪃ苣誃裢벂臣袂臣ꚁ뿤뺣볯꺼뷯鎽뷯ꊼ臣覂裥궖臣龁苣ꪃ苣隳臣ꢼ볯겼볯鞃菣閃苣ꒂ菣袼鯥醼볯銼볯覼苣ꢡ臣銼臣꺁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣ꆼ鎽뷯覽뷯辽뷯讁苣뺲ꏨ鞁臣芸단ꞁ뻥覂苣讂뇎볯貼볯銈菣뎃菣랂菣銈苣ꞁ蟥蚐臣龁볯꺼뷯鎽뷯ꊼ볯Ꞽ뷯馽뷯辽†볯₆ꎼ뷯貽볯覽뷯ꎼ뷯薽뷯覼臣궼볯겼볯ꦼ裢뒼볯ꚼ苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣뎛볯颼볯ꮁꓧ鞁臣龔裦ꦉ苣蒵迦袁黥Ꞽ뷯뒼裢ꦼ볯Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯₃袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂裢ꦼ볯ꞁ蟥蚐臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뿤뺣臣龁볯꺼뷯鎽뷯ꊼ臣궼볯겼볯ꦼ裢뒼볯ꚼ苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣뎛볯颼볯ꮁꓧ鞁臣龔裦ꦉ苣蒵迦袁黥Ꞽ뷯貽볯銈볯袼苣ꦃ苣袃苣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣₼醼볯ꞁ蟥蚐臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뿤뺣臣龁볯꺼뷯鎽뷯ꊼ臣궼볯겼볯ꦼ裢뒼볯ꚼ苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯隼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣뎛볯颼볯ꮁꓧ鞁臣龔裦ꦉ苣膀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣ꮁ꿥馁苣覃菣벃臣鞁臣ꎼ볯낼裢뎼볯銂뷤ꎁ臣蒵迦袁黥뎼볯鎼볯膽뷯ꦼ볯ꦼ볯캈銼볯鎼裢랂苣ꪃ菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂†볯ꦼ볯覼臣ꚇ郧馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣꺿ꏩ鞁臣늼볯膽뷯薽볯꺁볯ꆼ볯꒼볯銈볯꾼볯릂菣꾂菣ꮃ苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀戼㹲邀볯钼볯醼胣㲑牢ਾ†鯥醼볯鞼臣膀鯥醼볯鞼볯ꢁ볯颼볯ꊼ臣覂臣ꎁ臣蒁苣貁胣뎛볯颼볯ꮁꓧ鞁臣龔裦ꦉ苣膀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣ꮁ꿥馁苣覃菣벃臣鞁臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯袼볯邼뷯꒼뷯覼苣뾽臣龁뗧鮏臣讞볯뒼볯Ꞽ뷯貽볯ꦼ볯袼뇎볯貼볯銈苣ꊂ菣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣₼ꦼ볯ꦼ볯ꞁ蟥蚐臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뿤뺣臣龁볯꺼뷯鎽뷯ꊼ臣궼볯겼볯ꦼ裢뒼볯ꚼ苣骃苣袃菣銂ꇨ馁苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯隼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣颫菣뎃菣벃苣₹꺼裢낂菣ꮂ菣꺁ꓨ袐볯門苣ꪃ苣뎃臣꺁ꓥ鮏苣ꢡ臣肸胩꺁苣궂菣ꂃ臣芁苣芀藩ꂴ볯꾁胣뒼뷯覽뷯袽뷯蒽뷯趽뷯₁銽뷯薽뷯薽뷯芁苣蒁臣ꆼ뷯邽뷯銽뷯覽뷯貽뷯鎽†뷯膽뷯钽뷯覽†臣覂臣캮醼볯銼裢麃菣躃苣肃裢벂臣芁苣芀藩ꂴ볯꾁胣Ꞽ뷯뒼裢ꦼ臣芁苣芀藩ꂴ볯꾁胣Ꞽ뷯貽볯銈볯ꞁ臣讂胣떅듧钼臣膀뇎볯貼볯銈苣ꊂ菣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣₼芁苣蒁臣캯銼볯隼裢랂苣ꪃ菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂臣芁苣芀藩ꂴ볯꾁胣캁銈菣뎃菣랂菣銈苣ꦼ볯ꞁ臣讂胣떅듧隼臣膀뇎裢麃菣躃苣肃裢벂臣芁苣芀藩ꂴ볯꾁胣Ꞽ뷯뒼裢ꦼ볯ꞁ臣讂胣떅듧颼臣膀뇎볯貼볯銈菣뎃菣랂菣銈苣ꞁ臣讂胣떅듧馼臣膀뇎볯貼볯銈菣뎃菣랂菣銈苣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯颼볯꾁胣꺼裢ꊂ苣膃菣낂菣뎂苣龃菣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣ꦼ臣覂볯ꦼꞼ뷯뒼†볯銈볯ꦼ銂꟨銪臣閁苣龁뗧袐臣肃苣ꊂ苣ꦃ菣ꞁ臣讂胣늼볯Ꞽ뷯莽볯ꆼ뷯캃醼볯钼볯貽뷯꺼볯莽裢ꆼ뷯躽裢뢼볯㲎牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯馼볯꾁胣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯꺁苣ꆃ菣뢂臣芁苣芀꣦隺볯것菣뎃볯覼볯ꦤ蓧袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣袼菣벃菣銼볯鮼苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃볯것菣뎃볯覼볯ꊂ苣ꊂ菣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ볯것菣뎃볯覼볯것菣뎃볯ꢁ볯꾁臣貂臣貂볯躼볯趽볯誁苣뎁볯趽볯ꞁ臣ꊂ苣ꊂ菣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽㄨ뷯꒼뷯⦁볯것菣뎃볯ꢁ볯꾁臣貂臣貂볯躼볯趽볯誏臣閼뷯궼臣꺁苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯⢧볯讽볯膽鮼菣벃菣馼臣醼볯꾁臣貂臣貂볯躼볯趽볯誏臣閼뷯궼臣꺁苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯⢧邼뷯꒼뷯⦁胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯馼볯꾁胣ꦼ볯ꚼ苣ꮃ臣ꒂ菣벃苣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣袼菣벃菣醼볯鮼苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃볯것菣뎃볯覼볯ꊂ苣ꊂ菣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ胣銼볯袽뷯袼菣벃菣鎼볯鮼苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃臣ꎼ볯낼裢뎼볯膀볯隼뷯銽볯것菣뎃볯覼볯것菣뎃볯ꢁ볯꾁臣貂臣貂볯钼뷯銽臣袂臣馼볯袽뷯ꞁ臣ꊂ苣ꊂ菣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣ꢁ볯궼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽㄨ뷯꒼뷯⦁볯것菣뎃볯ꢁ볯꾁臣貂臣貂볯钼뷯銽迥뎁볯隼뷯銽臣꺁苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯⢧볯讽볯膽鮼菣벃菣馼臣醼볯꾁臣貂臣貂볯钼뷯銽迥뎁볯隼뷯銽臣꺁苣뢂苣궃菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃臣ꎼ볯낼裢뎼볯銈볯ꖼ볯⢧邼뷯꒼뷯⦁胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲 뎛볯馼볯꾁胣厁牰条敵䐭睡敬⁹菣莃菣₈臣誁臣讂菣ꊃ苣궃菣뎃뿥钭臣뺯臣讂볯낼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯醼볯讽볯膽볯膀볯낼볯銈볯ꆼ裢낼볯Ꞽ볯銼볯讽볯膽볯誏臣꺼볯뎼볯꺁諥鲞苣ꢡ臣낂菣閃臣芁苣芀菣莃菣꾁胣讽뷯鎽蟩鎽臣誂볯邼볎뷯꺁髧许돦蒰臣貂臣袼鿧낍臣몤臣覼胣鞃菣莃菣鞁臣ꒀ臣膀ꫥ鎽볯뚺ꫥ覼臣醁苣ꢳ냥鞁臣뎂菣袃菣벃菣開觧ꞁ뻥覂苣龁胥ꮁ꿥鞁臣鲣귦閁苣龁菣벃苣ꦃ苣뎃臣膀藥股뛦颃菣낂菣鎃菣꺁맥螝ꋥꂊ蟩袼苣ꮃ菣鞃뷥龁苣躽볯閼볯ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〱㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〱㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㤰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꚼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㌱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꢼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㐱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꦼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꮼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㜱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯겼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯궼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㤱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯꺼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯꾼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯낼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯놼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㌲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯늼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㐲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯뎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯뒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯떼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㜲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯뚼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯랼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㤲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯뢼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯림胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯몼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㐳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㌴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐱㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㜴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㌵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㜶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘱㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㤶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꊼ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜱㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꎼ볯銈볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㌷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜱㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㔷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꢼ裢ꦼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯겼裢궼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯꾼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯늼裢뎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㐸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠱㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯뚼裢랼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯림裢몼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰〹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㈹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꪼ裢ꮼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㐹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤱㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯꺼裢꾼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㘹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯놼裢늼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㄰㠹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄲ㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄲ㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄲ㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄲ㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄲ㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꦼ裢ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꢼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꮼ裢겼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꢼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꮼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯궼裢꺼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꢼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꮼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꦼ裢ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯겼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯꾼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯놼裢늼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯뒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯랼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꢼ裢ꦼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯겼裢궼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꦼ裢ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯궼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰〹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤲㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꦼ裢ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㈹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㐹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㘹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㈰㠹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꦼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯겼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꦼ裢ꪼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄳ㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄳ㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄳ㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꪼ裢ꮼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄳ㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄳ㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꦼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯겼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯꒼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꚼ裢Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꦼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯겼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꊼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꢼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꮼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯궼裢꺼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꢼ裢ꦼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꢼ裢ꦼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯꒼裢ꖼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꢼ裢ꦼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꆼ裢ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꊼ裢꒼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㠸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰〹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㈹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ裢ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ裢ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㌰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꆼ裢醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ裢ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ裢銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄴ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ裢钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄴ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꊼ裢銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄴ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꊼ裢钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄴ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰ㄴ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꆼ裢ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯ꎼ裢꒼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㈴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼볯ꆼ裢ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㌴㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㌴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㘴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㐴㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔴㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔴㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥馼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㔴㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㤵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㘴㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㜴㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㜸⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㠴㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰㤴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㐰㤹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〵㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㔰㄰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㔰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㔰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩㸢〰㔰ㄴ㔳㠴琮晩ꃂ〰㔰㜰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㐵㌱㐵⸸楴≦〾〰㐵㌱㐵⸸楴쉦゠〰〵㰸愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀藩鞈ꇨ醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦⸢〯〰㐵㌱㐵⼸〰㔰ㄴ㔳㠴〰〰㄰〯〰㐵㌱㐵〸〰〰⸱浸≬〾〰㐵㌱㐵〸〰〰⸱浸㱬愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊戯摯㹹㰊栯浴㹬