(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｌ３５７Ｐ、Ａ３６２Ｔ、Ｆ４１Ｌ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ｔ２３４Ａ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ及びＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号：３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質であるチトクロームＰ４５０を用いて、以下の式：
【化１】
0005550041.tif 000025
（式中、Ｒは−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＳＯ３Ｈ、―ＳＯ３Ｈ及び−ＯＰＯ３Ｈ２から選択される親水性基である）
で示されるＮ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体を水酸化することを特徴とする、以下の式：
【化２】
0005550041.tif 000026
（式中、Ｒは前記と同意義）で示されるＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の製造方法。
【請求項２】
配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｌ３５７Ｐ、Ｉ７７Ｗ、Ｆ２３２Ｉ及びＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１又は数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項３】
配列番号：３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１又は数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チトクロームＰ４５０を用いた、アダマンタン水酸化体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アダマンタン水酸化体は、フォトリソグラフィー分野における感光性樹脂等の機能性樹脂のモノマー（特許文献１）や、医薬品の分野における１１ベータ−ヒドロキシステロイド  デヒドロゲナーゼI型酵素（１１βＨＳＤ１）の阻害剤（特許文献２、２７ページ）として知られている。また、ＤＰＰＩＶ阻害剤としても、アダマンチル基を有する化合物が知られている。そしてこれらの化合物を合成する場合、アダマンタン水酸化体の一部の置換基を保護した化合物は、その反応性から合成中間体として有用である。【０００３】
微生物を用いたアダマンタン誘導体の水酸化体の生産方法は以前から知られている。例えば、ボーベリア・スルフレッセンス（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｕｌｆｕｒｅｓｃｅｎｓ）の生体内変換を用いて、ベンズアミドで保護されたアダマンタミン誘導体の水酸化体を生産できる（非特許文献１）。他にも、フタルイミドで保護されたアダマンタン誘導体について、スポロトリカム・スルフレッセンス（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｕｌｆｕｒｅｓｃｅｎｓ）の生体内変換により、ジヒドロキシ体を生産できることが報告されている（非特許文献２）。【０００４】
チトクロームＰ４５０（以下、Ｐ４５０ともいう）は、還元して一酸化炭素を結合させた時に４５０ｎｍ付近に特異的な吸収帯（ソーレー帯）を示すプロトヘム含有タンパク質の総称である。Ｐ４５０は多くの動植物組織、カビ、酵母のミクロソーム、一部の動物組織のミトコンドリアの内膜に結合しているほか、ある種の細菌、カビでは可溶性の形で存在している。【０００５】
Ｐ４５０は様々な基質特異性を有し、多種多様な有機化合物を基質とし得る非常に広い基質特異性を示す酵素がある一方で、比較的限られた種類の有機化合物としか反応しない基質特異性のかなり厳密な酵素も存在する。Ｐ４５０は、生理活性脂質であるコレステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸、活性型ビタミンＤの生合成、ヘム、脂肪酸やエイコサノイドの代謝、そして薬物を含む外来化学物質の代謝等に関与している。Ｐ４５０の具体的な機能としては、該Ｐ４５０を発現する細胞の生体内異物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ）の水酸化反応、エポキシ化反応、脱アルキル化反応、脱窒素反応等の様々な反応を触媒することが知られている。【０００６】
微生物由来の、例えば、カビ又は細菌においては工業的に有用な物質の生産に役立つＰ４５０の例が知られており、一部は実際に有用薬物の工業生産に利用されている。代表的な例は、放線菌ストレプトミセス カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）によりコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）の６β位を水酸化し、生成物として高脂血症の治療薬であるプラバスタチンを得るものである（非特許文献３、特許文献３）。放線菌シュードノカルジア オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）を利用してビタミンＤ３の１α位と２５位を水酸化して活性型ビタミンＤ３を生産する方法も実用化されている。【０００７】
アダマンタンの水酸化に関しては、非特許文献４に、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のＰ４５０である、Ｐ４５０cam によってアダマンタンが水酸化されることが記載されている。また、非特許文献５には、４７０の微生物からアダマンタンを水酸化する５つの微生物をスクリーニングしたこと、その一つであるストレプトミセス  グリセオプラナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ）におけるアダマンタンの水酸化にはＰ４５０が関与していることが示唆されている。【０００８】
しかし、いずれの文献にも、Ｐ４５０を用いたアダマンタン骨格を有する化合物の水酸化、例えば、Ｐ４５０を用いたＮ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体の水酸化について、記載も示唆もされていない。
【特許文献１】特開２００６−６３０６１号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０４／０５６７４４号パンフレット
【特許文献３】特開平６−７０７８０号公報
【非特許文献１】ジャーナル オブ  オーガニック ケミストリー （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９２年、５７巻、ｐ.７２０９‐７２１２
【非特許文献２】ザ  ジャーナル オブ  オーガニック  ケミストリー(Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)、１９６８年、３３巻、ｐ.３２０１−３２０７
【非特許文献３】ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９９５年、１６３巻、ｐ．８１−８５
【非特許文献４】アーカイブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、１９８４年、２２８巻、ｐ．４９３−５０２
【非特許文献５】アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００６年、７１巻、ｐ.５０２‐５０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、機能性樹脂や医薬品の中間体として有用であるモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンの原料となるアダマンタン骨格を有する化合物の水酸化体（例えば、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体）のＰ４５０を用いた高収率かつ安定な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｐ４５０の一つである、ＣＹＰ１０９Ｂ１を用いて、アダマンタン骨格を有する化合物のアダマンタン部分を水酸化する方法を見出した。詳しくは、Ｎ−（２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体から、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を生産することができることを初めて見出した。またＣＹＰ１０９Ｂ１を改変することにより得られた、ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体、１０９ＦＫ、１０９ＦＫ変異体を用いることにより、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の生産効率を上げることができることを見出した。また、得られるＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体が、医薬品の中間体として好ましいＡｎｔｉ体１００％であることを見出した。
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）チトクロームＰ４５０を用いて、Ｎ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体を水酸化することを特徴とする、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の製造方法。
（２）チトクロームＰ４５０が、配列番号：１若しくは３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ水酸化活性を有するタンパク質である、（１）記載の製造方法。
（３）チトクロームＰ４５０が、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｌ３５７Ｐ、Ａ３６２Ｔ、Ｆ４１Ｌ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ｔ２３４Ａ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ及びＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号：３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質である、（１）記載の製造方法。
（４）Ｎ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体が、
式：
【化１】
0005550041.tif 000002
（式中、Ｒは水素又は親水性基である）
で示される化合物である、（１）記載の製造方法。
（５）Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体が、
式：
【化２】
0005550041.tif 000003
（式中、Ｒは水素又は親水性基である）
で示される化合物である、（１）記載の製造方法。
（６）（１）〜（５）いずれかに記載の製造方法によりＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を得、
脱保護することを特徴とする、
式：
【化３】
0005550041.tif 000004
で示される化合物の製造方法。
（７）Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を単離しないことを特徴とする、（６）記載の製造方法。
（８）（６）又は（７）いずれかに記載の製造方法により（Ｉ）で示される化合物を得、
式（ＩＩ）：Ａ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｘ
（式中、Ａは置換されていてもよい環式炭化水素基又は置換されていてもよい複素環式基であり、Ｒ１は単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−又はＮＲ４−であり、Ｒ２は単結合又は置換されていてもよいアルキレンであり、Ｒ３は単結合又はＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘは水酸基、ハロゲン又は水酸基から導かれる脱離基であり、Ｒ４は水素又は置換されていてもよいアルキルである）で示される化合物と反応させることを特徴とする、式（ＩＩＩ）：
【化４】
0005550041.tif 000005
で示される化合物の製造方法。
（９）配列番号：１若しくは３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ水酸化活性を有するタンパク質を用いて、アダマンタン骨格を有する化合物のアダマンタン部分を水酸化する方法。
（１０）配列番号：１記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタンパク質。
（１１）配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｌ３５７Ｐ、Ａ３６２Ｔ、Ｆ４１Ｌ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ｔ２３４Ａ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ及びＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１又は数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１２）配列番号：３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタンパク質。
（１３）配列番号：３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１又は数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１４）式：
【化５】
0005550041.tif 000006
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
（１５）式：
【化６】
0005550041.tif 000007
（式中、Ｒは水素又は親水性基である）
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のアダマンタン骨格を有する化合物のアダマンタン部分の水酸化方法は、安定した生産及び供給を実現するものであり、アダマンタン骨格を有する化合物の水酸化体を効率よく、安全で安価に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。【００１３】
本発明において、「チトクロームＰ４５０」は、アダマンタン骨格を有する化合物の水酸化の触媒として利用される。例えば、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を水酸化することによりＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を製造する方法において触媒として利用される。Ｐ４５０であるタンパク質がアダマンタン骨格を有する化合物の水酸化の触媒として利用可能か否かは、例えば、基質であるＮ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体に、該タンパク質、又は該タンパク質及び該タンパク質に電子を供給するフェレドキシンと還元酵素からなる還元系を作用させることによって、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体が得られるか否かで判断することができる。より詳しくは、Ｐ４５０を発現可能な微生物を、好適な培地で培養し、培地中に蓄積されたＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の有無を検出する方法を用いることができる。必要であればＰ４５０に電子を供給するフェレドキシンと還元酵素からなる還元系を微生物内に導入することにより、より効率的に検出することができる。Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の検出は、例えば、本発明により得られるＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を標準品として用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、行うことができる。具体的には後述の実施例に記載の方法を用いることができる。本発明に有用なＰ４５０としては、例えば、ＣＹＰ１０９Ｂ１、ＣＹＰ１０１、ＣＹＰ１０５Ｄ等、及びこれらの誘導体等が挙げられる。【００１４】
Ｐ４５０の「誘導体」とは、実質的にＰ４５０と同じ生物学的機能又は活性、すなわち本発明においては、水酸化活性を有するポリペプチドを意味する。該ポリペプチドのＣ末端はカルボキシル基、カルボキシレート、アミド又はエステルのいずれであってもよい。例えば、他のタンパク質との融合タンパク質、修飾基を付加して得られた修飾体、アミノ酸残基を欠失、置換若しくは付加することにより得られた変異体等が挙げられる。
融合タンパク質に用いられる「他のタンパク質」としては、融合することによって、該融合タンパク質が、実質的にＰ４５０と同じあるいはそれ以上の水酸化活性を示すことになるものが好ましい。例えば、Ｒ４５０Ｒｈｆ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ、Ｐ４５０ＢＭ３  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ等が挙げられる。
修飾体の修飾基としては、蛍光性を呈する官能基、ポリペプチドの立体構造の形成には関与しない官能基等が挙げられる。また、天然由来のＰ４５０を構成するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基（例えば、β−アラニン等）であってもよい。蛍光性を呈する官能基としては、エオシンやフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等が挙げられる。ポリペプチドの立体構造の形成には関与しない官能基としては、β−アラニン残基等に代表されるスペーサー基等が挙げられる。かかる官能基は末端に存在することが好ましい。
変異体としては、Ｐ４５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＰ４５０の機能を有するタンパク質等が含まれる。【００１５】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、（Ａ）Ｐ４５０のアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（Ｂ）Ｐ４５０のアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（Ｃ）Ｐ４５０のアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、又は（Ｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が欠失、置換又は付加されている場合、その欠失、置換又は付加の位置としては、特に限定されない。但し、本発明に使用されるＰ４５０の変異体は、欠失、置換又は付加によっても、アダマンタン骨格を有する化合物の水酸化の触媒作用を有するポリペプチドである。Ｐ４５０のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリペプチドが挙げられる。【００１６】
本明細書において、「ＣＹＰ１０９Ｂ１」とは、配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を意味する。
「ＣＹＰ１０９Ｂ１の変異体」とは、配列番号：１記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタンパク質を意味する。具体的には、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｌ３５７Ｐ、Ａ３６２Ｔ、Ｆ４１Ｌ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ｔ２３４Ａ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ及びＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。「１若しくは数個の変異」とは、１〜５個程度、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個の変異を意味する。特に、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７ＦとＬ３５７Ｐ、Ｉ７７ＦとＭ１０５ＩとＴ２３４Ａ、Ｉ７７ＦとＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１〜５個、好ましくは１〜３個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。【００１７】
「ＣＹＰ１０９ＦＫ」とは、配列番号：３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を意味する。
「ＣＹＰ１０９ＦＫ変異体」とは、配列番号：３記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタンパク質を意味する。具体的には、配列番号：３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。「１若しくは数個の変異」とは、１〜５個程度、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個の変異を意味する。特に、配列番号：３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１〜５個、好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。【００１８】
「アダマンタン骨格を有する化合物」とは、アダマンタン骨格を有する化合物であれば、いずれの化合物も包含される。好ましくは、保護された２−アミノアダマンタンが挙げられる。
「保護された２−アミノアダマンタン」とは、アダマンタナミンのアミノ基が保護された化合物であれば、いずれの化合物も包含される。なお、アダマンタン部分の水酸化される以外の部分が置換基を有していてもよい。該置換基は特に限定されないが、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン、置換されていてもよいアルキル（例えば、非置換アルキル、カルバモイルアルキル）、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アリール、アリールアルキル、カルボキシ、エステル（例えば、アルコキシカルボニル等）、カルバモイル、アルケニル、アルキニル、カルバモイルオキシ、保護されたヒドロキシ（例えば、アルキルヒドロキシ等）等が置換基として挙げられる。好ましくは、Ｎ−（２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体、Ｎ−（２−アダマンチル）−ベンズアミド、Ｎ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸、Ｎ−（２−アダマンチル）−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルアミン等が挙げられる。【００１９】
「Ｎ−（２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体」とは、Ｎ−（２−アダマンチル）−ベンズアミド又はその誘導体を意味する。誘導体としては、例えば、ベンゼン環部分が、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アリール、アリールアルキル、カルボキシ、エステル、カルバモイル等で置換された化合物、アダマンチル基の水酸化される以外の部分がハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アリール、アリールアルキル、カルボキシ、エステル、カルバモイル等で置換された化合物、また、ベンゼン環部分及びアダマンタン部分が上記の置換基で置換された化合物も含まれる。好ましくは、
【化７】
0005550041.tif 000008
（式中、Ｒは水素又は親水性基である）
で示される化合物が挙げられる。【００２０】
「親水性基」とは、水との親和性が強い基である。すなわち、静電気的相互作用や水素結合等により水分子と弱い結合を形成しうる原子団を指す。例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＳＯ３Ｈ、―ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２等が挙げられる。特に、−ＣＯＯＨが好ましい。【００２１】
「Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体」とは、Ｎ−（モノヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド又はその誘導体を意味する。誘導体としては、例えば、ベンゼン環が、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アリール、アリールアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル等で置換された化合物も含まれる。好ましくは、
【化８】
0005550041.tif 000009
（式中、Ｒは水素又は親水性基である）
で示される化合物が挙げられる。さらに好ましくは、
【化９】
0005550041.tif 000010
（式中、Ｒは水素又は親水性基である）
で示される化合物が挙げられる。【００２２】
本発明により得られた、アダマンタン骨格を有する化合物の、例えば、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体は、保護基をはずすことにより、容易にモノヒドロキシ−２−アダマンタナミン、つまり、
式：
【化１０】
0005550041.tif 000011
で表される化合物に変換することができる。【００２３】
また、本発明において、Ｎ−（２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体からＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を製造し、脱保護によりモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンを得る工程の中で、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を単離してもよいし、単離しなくてもよい。Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を製造した際に、一度精製して脱保護を行うこともできる。また、実施例８に記載のように、滅菌をしながら脱保護を行うことによってＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を単離せずにモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンを得ることもできる。【００２４】
さらに上記で得られたモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンを、
式（ＩＩ）：Ａ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｘ
（式中、Ａは置換されていてもよい環式炭化水素基又は置換されていてもよい複素環式基であり、Ｒ１は単結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−又はＮＲ４−であり、Ｒ２は単結合又は置換されていてもよいアルキレンであり、Ｒ３は単結合又はＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘは水酸基、ハロゲン又は水酸基から導かれる脱離基であり、Ｒ４は水素又は置換されていてもよいアルキルである）で示される化合物と反応させることによって、式（ＩＩＩ）：
【化１１】
0005550041.tif 000012
で示される化合物を製造することができる。【００２５】
【化１２】
0005550041.tif 000013
式（Ｉ）で示される化合物と式（ＩＩ）で示される化合物を反応させ、式（ＩＩＩ）で示される化合物を製造する工程である。
溶媒としては、N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、芳香族炭化水素類（例、トルエン、ベンゼン、キシレン等）、飽和炭化水素類（例、シクロヘキサン、ヘキサン等）、ハロゲン化炭化水素類（例、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等）、エステル類（例、酢酸メチル、酢酸エチル等）、ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトン等）、ニトリル類（例、アセトニトリル等）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等）、水及びそれらの混合溶媒等が挙げられる。好ましくは、ハロゲン化炭化水素類（例、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等）、ニトリル類（例、アセトニトリル等）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等）及び水等である。
限定されないが、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、トルエン、テトラヒドロフラン及び水である。
さらに好ましくは、ジクロロメタン、メタノール、エタノールである。
Ｒ５が−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｘが水酸基の場合は、該工程において縮合剤及び塩基を用いることができる。縮合剤としては、例えば１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）等が使用できる。塩基としては、例えば金属水素化物（例、水素化ナトリウム等）、金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウム等）、金属炭酸塩（例、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸セシウム等）、金属アルコキシド（例、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等）、炭酸水素ナトリウム、金属ナトリウム、有機アミン（例、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、DBU、２，６−ルチジン等）等が挙げられる。
Ｒ５が−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｘがハロゲンである場合は、該工程において上記記載の塩基を用いることができる。
Ｒ３が−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｒ４が置換されていてもよいアルキレンであり、Ｒ５が単結合であり、Ｘがハロゲン又は水酸基から導かれる脱離基である場合は、該工程において上記の塩基を用いることができる。
反応条件は、特に制限されないが、約−２０〜１００℃、好ましくは約−１０〜８０℃で通常１時間〜３６時間、好ましくは１時間〜２４時間攪拌すればよい。
こうして得られた化合物（ＩＩＩ）は１１β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素阻害剤及びＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ＰｅｐｔｉｄａｓｅＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）阻害剤、Ｊａｋ３阻害剤等として有用である。【００２６】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を包含する。
「アルキル」とは、炭素数１〜１０個の直鎖状又は分枝状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、n-ヘキシル、イソヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシル等が挙げられる。好ましくは、炭素数１〜６又は１〜４個のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、n-ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。
「アルコキシ」、「アルコキシカルボニル」のアルキル部分は、上記のアルキルと同意義である。
「アリール」とは、単環芳香族炭化水素基（例：フェニル）及び多環芳香族炭化水素基（例：１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等）が挙げられる。
「アリールアルキル」は、上記のアリールで置換された上記アルキルを意味する。
「環式炭化水素基」とは、「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「アリール」を包含する。
「シクロアルキル」とは、炭素数３〜１５の環状飽和炭化水素基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等が挙げられる。
「橋かけ環式炭化水素基」とは、２つ以上の環が２個又はそれ以上の原子を共有している炭素数５〜８の脂肪族環から水素を１つ除いてできる基を包含する。具体的にはビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル及びビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル等が挙げられる。
「スピロ炭化水素基」とは、２つの炭化水素環が１個の炭素原子を共有して構成されている環から水素を１つ除いてできる基を包含する。具体的にはスピロ［３．４］オクチル等が挙げられる。
「シクロアルケニル」とは、炭素数３〜７個の環状の不飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルが挙げられ、好ましくはシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルである。シクロアルケニルには、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基及びスピロ炭化水素基も含む。
「複素環式基」とは、「ヘテロアリール、ヘテロサイクル」を包含する。
「ヘテロアリール」とは、単環芳香族複素環式基及び縮合芳香族複素環式基を意味する。単環芳香族複素環式基は、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子を環内に１〜４個含んでいてもよい５〜８員の芳香環から誘導される、置換可能な任意の位置に結合手を有していてもよい基を意味する。縮合芳香族複素環式基は、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子を環内に１〜４個含んでいてもよい５〜８員の芳香環が、１〜４個の５〜８員の芳香族炭素環若しくは他の５〜８員の芳香族ヘテロ環と縮合している、置換可能な任意の位置に結合手を有していてもよい基を意味する。例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、３−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、ファナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）又はフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等が挙げられる。
「ヘテロサイクル」とは、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子を環内に１〜４個含んでいてもよく、置換可能な任意の位置に結合手を有していてもよい非芳香族複素環式基を意味する。また、そのような非芳香族複素環式基がさらに炭素数１〜４のアルキル鎖で架橋されていてもよく、シクロアルカン（５〜６員環が好ましい）やベンゼン環が縮合していてもよい。非芳香族であれば、飽和でも不飽和でもよい。例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル等があげられる。
「アルキレン」とは、メチレンが１〜６個連続した２価の基を包含し、具体的にはメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン及びヘキサメチレン等が挙げられる。
「水酸基から導かれる脱離基」とは、−ＯＭｓ、−ＯＴｓ、−ＯＴｆ、−ＯＮｓ等があげられる。ここで、「Ｍｓ」はメタンスルホニル基、「Ｔｓ」はパラトルエンスルホニル基、「Ｔｆ」はトリフルオロメタンスルホニル基、「Ｎｓ」はオルトニトロベンゼンスルホニル基を表す。【００２７】
式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）中のＡとしては、好ましくは、置換されていてもよい複素環式基である。さらに好ましくは、置換されていてもよいヘテロアリール又は置換されていてもよいヘテロサイクルが挙げられる。より好ましくは、フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール、トリアゾール、オキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、テトラヒドロチオフェン、ベンゾオキサジン、ベンゾフラン、ピロロピリジンが挙げられる。限定されないが、特に、イソキサゾール及びピラゾールが好ましい。また、Ａとして、置換されていてもよい環式炭化水素基が挙げられる。好ましくは、フェニルである。
置換基としては、−ＯＲ５、−ＳＲ５、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロサイクル、式：−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｒｃ−Ｒｄで示される基又は式：−（ＣＲｅＲｆ）ｍ−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｒｃ−Ｒｄで示される基等が挙げられる。
Ｒａ及びＲｂは各々独立して水素、置換されていてもよいアルキル又はハロゲンであり、
又はＲａとＲｂは隣接する炭素原子と一緒になって置換されていてもよい環を形成していてもよく、
Ｒｃは−（ＣＨ２）ｎ−（ここでｎは０〜３の整数である。）であり、
Ｒｄは水素、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロサイクル、式：−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｇＲｈで示される基又は式：−ＮＲｉＲｊで示される基であり、
Ｒｅ及びＲｆは各々独立して水素、ハロゲン又は置換されていてもよいアルキルであり、
Ｒｇ及びＲｈは各々独立して水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロサイクル、置換されていてもよいアルキルスルホニル、置換されていてもよいシクロアルキルスルホニル、置換されていてもよいアリールスルホニル、置換されていてもよいヘテロアリールスルホニル、置換されていてもよいヘテロサイクルスルホニル、置換されていてもよいアルキルオキシ、置換されていてもよいカルバモイル若しくはＲｇとＲｈは隣接する窒素原子と一緒になって置換されていてもよい環を形成していてもよく、
Ｒｉ及びＲｊは各々独立して水素、カルボキシ、ヒドロキシ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロサイクル、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいカルバモイル、置換されていてもよいチオカルバモイル、置換されていてもよいアルキルスルホニル、置換されていてもよいシクロアルキルスルホニル、置換されていてもよいアリールスルホニル、置換されていてもよいヘテロアリールスルホニル、置換されていてもよいヘテロサイクルスルホニル、置換されていてもよいアルキルオキシカルボニル、置換されていてもよいシクロアルキルオキシカルボニル、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル、置換されていてもよいヘテロアリールオキシカルボニル、置換されていてもよいヘテロサイクルオキシカルボニル、置換されていてもよいアルキルカルボニル、置換されていてもよいシクロアルキルカルボニル、置換されていてもよいアリールカルボニル、置換されていてもよいヘテロアリールカルボニル、置換されていてもよいヘテロサイクルカルボニル、置換されていてもよいスルファモイル、若しくはＲｉとＲｊは隣接する窒素原子と一緒になって置換されていてもよい環を形成していてもよく、
Ｒ５は置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール又は置換されていてもよいヘテロサイクルであり、
ｍは各々独立して１〜３の整数である。
Ｒ１は、好ましくは、単結合である。
Ｒ２は、好ましくは、単結合である。
Ｒ３は、好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）−である。
Ｘは、好ましくは、水酸基である。
式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）で表される化合物及びそれらの調製方法の詳細は、国際公開第２００６／１３２１９７号パンフレット、国際公開第２００７／０５８３４６号パンフレット、ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５６５３８、特願２００７−１３２２５９に集合的に記載されている。【００２８】
本発明のアダマンタン骨格を有する化合物を水酸化する方法、例えば、Ｎ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体を水酸化することによって、Ｎ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−ベンズアミド誘導体を製造する方法（以下、「本発明の製造方法」と称することもある。）は、水酸化活性を持つＰ４５０（以下、「本発明のタンパク質」と称することもある。）を触媒として使用することを特徴とする。具体的には、本発明の製造方法は、基質であるＮ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体に、
（ａ）本発明のタンパク質、又は該タンパク質及び該タンパク質に電子を供給するフェレドキシンと還元酵素からなる還元系、又は
（ｂ）本発明のタンパク質を発現可能な微生物
の少なくとも１つを作用させ、アダマンタン部分を選択的に水酸化させる工程を含む。【００２９】
（ａ）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の遺伝子」と称することもある。）を取得し、利用することによって作成することができる。以下に、本発明の遺伝子の取得方法、本発明のタンパク質の作製方法（発現ベクターの作成方法、形質転換体の作成方法等）を具体的に記載する。【００３０】
（１）本発明の遺伝子の取得方法
バチルス  サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製することによって、本発明の遺伝子を取得することができる。【００３１】
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ストラタジーン社製）等を用いる方法が挙げられる。【００３２】
該方法により取得されるｃＤＮＡとして、例えば、配列番号：１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ等を挙げることができ、具体的には、配列番号：２記載の塩基配列からなるＤＮＡ等を挙げることができる。該ｃＤＮＡは、本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに組み込んだ発現用プラスミドの作製に使用することができる。発現ベクター、発現用プラスミドの使用方法等については「本発明のタンパク質の作製方法」に後述する。【００３３】
また、アミノ酸配列に基づいて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを化学合成することによってもＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。【００３４】
さらに、アミノ酸配列に基づいて、オリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。【００３５】
（２）本発明のタンパク質の作製方法  
本発明のタンパク質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、本発明のタンパク質の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００３６】
（ｉ）原核生物を宿主として用いる場合
本発明のタンパク質の発現ベクターは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００３７】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（ロシュダイアグノスティックス社製）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、ｐＫＫ２３３-２（ＧＥヘルスケア社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ-１（プロメガ社製）、ｐＱＥ-８（キアゲン社製）、ｐＧＥＸ（ＧＥヘルスケア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＡＬ-ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８-１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）．）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９）．）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）．）、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）．）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０７）、ｐＴｒｓ３２(ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０８)、ｐＧＨＡ２(ＦＥＲＭ  ＢＰ-４００)、ｐＧＫＡ２(ＦＥＲＭ  Ｂ-６７９８)、ｐＰＡ１（特開昭６３-２３３７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３-２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）等を例示することができる。【００３８】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００３９】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば、６〜１８塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００４０】
宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株等が、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株等が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株等が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株等が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株等が、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株等が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｐ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株等が例示される。【００４１】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）．やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）．に記載の方法等があげられる。【００４２】
（ｉｉ）酵母を宿主として用いる場合
宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ：３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ：３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ：３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＨＯ５（酸性フォスファターゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１（ガラキトースキナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１０（ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ）プロモーター、ＭＦα１（αフェロモン）プロモーター、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモーター等が挙げられる。
宿主としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｐｏｍｂｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ種及びＰｉｃｈｉａ属、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種等が挙げられる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）．）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）．）、酢酸リチウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）．及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）．）記載の方法等が挙げられる。【００４３】
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）等を用いることができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００４４】
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。【００４５】
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）。【００４６】
（ｉｖ）植物細胞を宿主として用いる場合
宿主として植物細胞又は植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養，２０（１９９４）．、組織培養，２１（１９９５）．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５、４５（１９９７）．）に準じてポリペプチドを生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。【００４７】
宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。【００４８】
（ｖ）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファーベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）等が、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ等が挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）．等に記載の方法が用いられる。【００４９】
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクター及び昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりポリペプチドを発現することができる。
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞等が挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）等が、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）等が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．）等を挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）等も用いることができる。【００５０】
（ｖｉ）培養方法
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、本発明の遺伝子を保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のタンパク質を該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のタンパク質を該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のタンパク質を培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保有する形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００５１】
形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。【００５２】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【００５３】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００５４】
本発明のタンパク質製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下等の条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）．）等を用いることができる。【００５５】
（ｖｉｉ）製造方法
本発明のタンパク質は、形質転換体を培養し、培養液から本発明のタンパク質を単離・精製することにより製造することができる。本発明のタンパク質の単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。
本発明のタンパク質が溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離等の方法で細胞又は菌体と培地に分離する。本発明のタンパク質が宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞又は菌体をＳＴＥ溶液等の適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンゴーリンホモジナイザー、ダイノミル等で細胞又は菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。
本発明のタンパク質の分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等を含んでいてもよい。
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組み合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロース等の疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法等の各種電気泳動等が例示される。【００５６】
本発明のタンパク質が不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞又は菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等の界面活性剤等の可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈又は透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。【００５７】
また、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）．）。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧ等が例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）．、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）．、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、本発明のタンパク質とプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、本発明のタンパク質とＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。【００５８】
本発明のタンパク質は、公知の方法に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．）。
本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）等のペプチド合成機器をにより化学合成することができる。
本発明のタンパク質の構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のタンパク質の水酸化活性は、アダマンタン骨格を有する化合物、例えば、基質であるＮ−（２−アダマンチル）―ベンズアミド誘導体に、本発明のタンパク質を作用させ、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の生産量で検出することができる。より詳しくは、本発明のタンパク質を発現可能な微生物を、好適な培地で培養し、培地中に蓄積されたＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の蓄積量を検出する方法を用いることができる。Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の検出は、例えば、本発明により得られるＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体を標準品として用いたＨＰＬＣにより、行うことができる。具体的には後述の実施例に記載の方法を用いることができる。【００５９】
（ｖｉｉ）変異型ポリペプチドの作製方法
本発明のタンパク質のアミノ酸の欠失又は置換は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。１若しくは数個のアミノ酸が欠失又は置換は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）．、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、ＷＯ  ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）．等に記載の方法に準じて調製することができる。【００６０】
（ｂ）本発明のタンパク質を発現可能な微生物
本発明の製造方法において用いることのできる微生物は、基質と作用させる際に、基質と作用可能な状態で本発明のタンパク質を発現可能な微生物である限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明の遺伝子を導入した形質転換体、本発明のタンパク質を発現することが知られている天然の微生物、例えば、バシルス属に属する微生物、好ましくはバシルス・サチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ)、シュードモナス属に属する微生物、ストレプトマイセス属に属する微生物等が挙げられる。微生物中に含まれる本発明のタンパク質の量を人為的に増加させることができる点で、形質転換体であることが好ましい。【００６１】
本発明の製造方法に用いることのできる各種形質転換体を作成するために使用することのできる宿主細胞は、基質と作用可能な状態で本発明のタンパク質を発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞を挙げることができる。増殖速度が速く、取り扱いが容易な点で、大腸菌が好ましい。また、該形質転換体を作成するために使用することのできる発現ベクターは、基質と作用可能な状態で本発明のタンパク質を発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
宿主細胞、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の培養方法等については上記「（２）本発明のタンパク質の作製方法」に詳述されている。【００６２】
本発明の製造方法において、基質と本発明のタンパク質を発現可能な微生物を作用させる際には、休止菌体反応を用いてもよいし、生育菌体反応を用いてもよい。それぞれ公知の方法を利用することができる。休止菌体反応とは、本発明のタンパク質を発現可能な微生物を培養後、菌体の増殖を止めて、基質を添加する方法である。例えば、後述の実施例１〜６に記載の方法を利用することができる。生育菌体反応とは、本発明のタンパク質を発現可能な微生物を培養しながら基質を添加する方法である。例えば、後述の実施例７又は８に記載の方法を利用することができる。【００６３】
本発明の製造方法において、基質と
（ａ）本発明のタンパク質、又は該タンパク質及び該タンパク質に電子を供給するフェレドキシンと還元酵素からなる還元系、又は
（ｂ）本発明のタンパク質を発現可能な微生物
の少なくとも１つを作用させる際の反応条件は以下が好ましい。
反応温度は、本発明のタンパク質の至適温度、並びに、基質及び生成物の安定温度等を考慮して適宜決定することができ、例えば、１０〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、更に好ましくは２０〜４０℃、特に好ましくは２５〜３５℃で実施することができる。
反応ｐＨも、本発明のタンパク質の至適ｐＨ、並びに、基質及び生成物の安定ｐＨ等を考慮して適宜決定することができ、例えば、４〜１０、好ましくは５〜９、更に好ましくは６〜９、特に好ましくは７〜８で実施することができる。
反応時間は、前記各種条件（すなわち、使用する溶媒、反応温度、又は反応ｐＨ）、あるいは、使用する基質及び本発明のタンパク質又は微生物の種類等に応じて適宜決定することができ、例えば、１〜１００時間、好ましくは５〜４８時間、より好ましくは１２〜３６時間である。
使用する本発明のタンパク質の量は、特に限定されるものではないが、例えば、０．５〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で実施することができる。【００６４】
また、本発明の製造方法では、基質と本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を発現可能な微生物を作用させる際に、所望により、包接剤を添加してもよい。基質の化学的安定性や水への溶解性を増大させたり、酵素や微生物に対する基質阻害を低減させたりすることができる。該包接剤としては、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン（Ｍｅ−β−ＣＤ）が挙げられる。【００６５】
本発明の製造方法では、基質と本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を発現可能な微生物を作用させる際に、所望により、補酵素（例えば、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ、好ましくはＮＡＤＰＨ）を共存させることができ、更に、前記補酵素の再生系を共存させることができる。本発明の製造方法では、使用する本発明のタンパク質の種類に応じて、適当な補酵素を共存させることにより、その反応性を向上させることができる。【００６６】
また、反応の進行に伴って、補酵素が消費される（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが消費され、ＮＡＤ（Ｐ）＋に変換される）ため、更に、前記補酵素の再生系を共存させることにより、その反応性を向上させることができる。補酵素再生系としては、各補酵素に種々の再生系が公知であり、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生系としては、例えば、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼとの組み合わせ、ギ酸とギ酸デヒドロゲナーゼとの組み合わせ、又はプロパノールとアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせ等を挙げることができる。【００６７】
本発明の製造方法において共存させることのできるこれらの補酵素、又は補酵素再生系の添加量は、使用する基質及び本発明のタンパク質又は微生物の種類等に応じて適宜決定することができる。【００６８】
反応を停止し、その反応物から発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて、アダマンタン骨格を有する化合物の水酸化体、例えば、Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の分離を行うのがよい。具体的には、例えば、溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離等により、アダマンタン骨格を有する化合物の水酸化体を培地から単離することができる。【００６９】
本発明は、上記反応を行うために利用される酵素群も含有する。具体的には、以下のタンパク質が挙げられる。
−配列番号：１記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタンパク質。
−配列番号：１記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｌ３５７Ｐ、Ａ３６２Ｔ、Ｆ４１Ｌ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ｔ２３４Ａ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ及びＦ２３２Ｍからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質。
−配列番号：３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタンパク質。
−例えば、配列番号３記載のアミノ酸配列において、Ｉ７７Ｆ、Ｉ７７Ｗ、Ｍ１０５Ｉ、Ａ１９６Ｄ、Ｆ２３２Ｉ、Ｆ２３２Ｌ、Ｆ２３２Ｍ、Ｔ２３４Ａ、Ｔ２４４Ａ、Ｖ３９９Ｅ及びＫ７０２Ｅからなる群より選ばれる１若しくは数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質。
これらのタンパク質は上記「本発明のタンパク質の作製方法」に記載の方法により、得ることができる。【００７０】
また、本発明は以下の化合物も含有する。これらの化合物は、機能性樹脂や医薬品の中間体として有用であるモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンの原料となるＮ−（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）−ベンズアミド誘導体の製造に有用である。
式：
【化１３】
0005550041.tif 000014
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。【００７１】
また、本発明は以下の化合物も含有する。これらの化合物は、機能性樹脂や医薬品の中間体として有用であるモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンの製造に有用である。
式：
【化１４】
0005550041.tif 000015
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。【００７２】
「塩」としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸又はリン酸等の無機酸の塩；パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸又はクエン酸等の有機酸の塩；アンモニウム、トリメチルアンモニウム又はトリエチルアンモニウム等の有機塩基の塩；ナトリウム又はカリウム等のアルカリ金属の塩；及びカルシウム又はマグネシウム等のアルカリ土類金属の塩等を挙げることができる。【００７３】
「溶媒和物」とは、上記化合物に対し、任意の数の溶媒分子と配位していてもよい。好ましくは水和物である。【００７４】
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
遺伝子操作的手法として、特に断らない限りＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｐｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）．に記載されている方法を用いた。
【実施例１】
【００７５】
ＣＹＰ１０９Ｂ１を用いた休止菌体反応によるアダマンタンの水酸化
[種培養]
ＣＹＰ１０９Ｂ１遺伝子（配列番号：２）が挿入された発現ベクター（ｐＥＴ−１０９Ｂ１−ＣａｍＡ−ＣａｍＢ）を大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し形質転換体を得た。該形質転換体をＬＢ培地２ｍｌに植菌し、３００ｒｐｍの往復しんとう機で３７℃、２４時間培養し、種母とした。
[本培養]
Ｍ９ｍｉｘ培地（６．７８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４（無水），３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４  ，０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ，４ｇ／Ｌ  カザミノ酸，１００μＭ  ＣａＣｌ２）１００ｍｌを滅菌し、これに１００ｍＭ  ＦｅＳＯ４を１００μｌ、２ｍｇ／ｍｌ  チミンを１ｍｌ、添加した。これにメルク社製のＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ａｕｔｏ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ  ２ｍｌ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ  ５ｍｌ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ  １００μｌ）を加え、さらに５０ｍｇ／ｍｌ  カルベニシリンを１００μｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  ５−アミノレブリン酸を１００μｌ添加して本培養培地とした。５０ｍｌの本培養培地が入った５００ｍｌ広口三角フラスコに種母を５００μｌ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで２４時間培養した。
[生体触媒反応]
培養液を遠心分離して上清を除き、菌体を得た。菌体濃度が培養液換算で１倍、２．５倍、５倍になるように菌体を２５ｍｌリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４），１０％グリセロール，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  Ｄ−グルコース）でそれぞれ希釈し、縦ひだつき５００ｍｌ三角フラスコに入れ、反応液とした。この反応液にＮ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸を終濃度５０００μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４になるように添加して反応を開始した。２８℃、１８０ｒｐｍで３１時間反応し、等量アセトンを添加し、逆相ＨＰＬＣで分析した。その結果、表１に記載の変換率で基質がＮ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸にそれぞれ変換した。
【表１】
0005550041.tif 000016
【実施例２】
【００７６】
ＣＹＰ１０９ＦＫを用いた休止菌体反応によるアダマンタンの水酸化
[ベクターの作成]
アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００６年、７１巻、ｐ.４５５‐４６２を参考にＣＹＰ１０９Ｂ１とＰ４５０Ｒｈｆ還元ドメインの融合蛋白（１０９ＦＫ）の発現ベクターを作製した。具体的には１０９ＦＫ遺伝子（配列番号：４）の構築にはＯｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いた。ｐＥＴ−１０９Ｂ１−ＣａｍＡ−ＣａｍＢを鋳型としてプライマー１（配列番号：７）とプライマー２（配列番号：８）を用いてＰＣＲを実施し、またロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属ＮＣＩＭＢ９７８４株のゲノムを鋳型としてプライマー３（配列番号：９）とプライマー４（配列番号：１０）を用いてＰＣＲをおこなった。次に各々のＰＣＲ産物を鋳型としてプライマー１と４を用いてＰＣＲを実施しクローニングベクター（ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ）へ挿入した（ｐＣＲ−１０９ＦＫ）。ｐＣＲ−１０９ＦＫベクターからＸｂａＩ、ＢａｍＨＩで１０９ＦＫ遺伝子を含む断片を切り出し、発現ベクターｐＥＴ２１ａに挿入し１０９ＦＫの発現ベクターを作製した（ｐＥＴ−１０９ＦＫ）。
[種培養]
ｐＥＴ−１０９ＦＫを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し、形質転換体を得た。該形質転換体を１穴あたり５００μｌのＬＢ培地が入った９６穴ディープウェルプレートに植菌し、９００ｒｐｍで３７℃、２４時間培養し、種母とした。
[本培養]
実施例１記載の本培養培地を用い、１穴あたり５００μｌの本培養培地が入った９６穴ディープウェルプレートに種母を１穴あたり５μｌ植菌し、２５℃、９００ｒｐｍで２４時間培養した。
[生体触媒反応]
９６穴ディープウェルプレートの培養液を遠心分離して上清を除き、菌体を得た。この菌体を１ｍｇ／ｍｌの  Ｎ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸が入った１００μｌリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４），１０％グリセロール，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  Ｄ−グルコース）で希釈し反応を開始した。２８℃、９００ｒｐｍで２４時間反応した。等量アセトンを添加し、逆相ＨＰＬＣで分析した結果、１８％の基質がＮ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸に変換された。
【実施例３】
【００７７】
ＣＹＰ１０９ＦＫ変異体を用いた休止菌体反応によるアダマンタンの水酸化
[ランダム変異の導入]
１０９ＦＫ遺伝子へのランダム変異導入にはＥｒｒｏｒ  Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法を用いた。具体的にはストラタジーン社のＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてプロトコールに従い、ｐＥＴ−１０９ＦＫを鋳型としてプライマー１と４を用い変異頻度が０−４．５／ｋｂになるようにＥｒｒｏｒ  Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理をしてｐＥＴ２１ａに挿入し、発現ベクターを作製した（ｐＥＴ−１０９ＦＫｍ）。
[スクリーニング]
ｐＥＴ−１０９ＦＫｍを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し、形質転換体を得た。該形質転換体として２２９６コロニーを採取し、各々のコロニーを１穴あたり５００μｌのＬＢ培地が入った９６穴ディープウェルプレートに植菌し、９００ｒｐｍで３７℃、２４時間培養し、種母とした。
実施例１記載の本培養培地を用い、１穴あたり５００μｌの本培養培地が入った９６穴ディープウェルプレートに種母を１穴あたり５μｌ植菌し、２５℃、９００ｒｐｍで２４時間培養した。
９６穴ディープウェルプレートの培養液を遠心分離して上清を除き、菌体を得た。この菌体を１ｍｇ／ｍｌの  Ｎ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸が入った１ｍｌリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４），１０％グリセロール，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  Ｄ−グルコース）で希釈し反応を開始した。２８℃、９００ｒｐｍで２４時間反応後、等量アセトンを添加し、逆相ＨＰＬＣで分析した。その結果、９１コロニーがｐＥＴ−１０９ＦＫを導入した形質転換体より活性が１．５０倍以上向上していた。コロニーからプラスミドを抽出しシークエンスにより変異箇所を同定した。得られた変異の中でＩ７７とＦ２３２については、ストラタジーン社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いた部位特異的変異により他のアミノ酸への置換を実施した。スクリーニングと同様の方法で各々の変異体の活性を確認した結果、表２に記載の変異が、他の変異（例えば、表３に記載の変異）と比べ、活性を向上させることが判明した。
【表２】
0005550041.tif 000017
【表３】
0005550041.tif 000018
【実施例４】
【００７８】
ランダム変異によるＣＹＰ１０９Ｂ１変異体を用いた休止菌体反応によるアダマンタンの水酸化
[ランダム変異の導入]
ＣＹＰ１０９Ｂ１遺伝子へのランダム変異導入にはＥｒｒｏｒ  Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法を用いた。具体的にはストラタジーン社のＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてプロトコールに従い、ｐＥＴ−１０９Ｂ１−ＣａｍＡ−ＣａｍＢを鋳型としてプライマー１とプライマー５（配列番号：１１）を用い変異頻度が０−４．５／ｋｂになるようにＥｒｒｏｒ  Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＫｐｎＩで制限酵素処理をおこない、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで制限酵素処理をしたｐＥＴ−１０９Ｂ１−ＣａｍＡ−ＣａｍＢの７ｋｂの断片に挿入し、発現ベクターを作成した（ｐＥＴ−１０９Ｂ１ｍ−ＣａｍＡ−ＣａｍＢ）。
[スクリーニング]
ｐＥＴ−１０９Ｂ１ｍ−ＣａｍＡ−ＣａｍＢを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し、形質転換体を得た。該形質転換体として８８０コロニーを採取し、各々のコロニーを１穴あたり５００μｌのＬＢ培地が入った９６穴ディープウェルプレートに植菌し、９００ｒｐｍで３７℃、２４時間培養し、種母とした。
実施例１記載の本培養培地を用い、１穴あたり５００μｌの本培養培地が入った９６穴ディープウェルプレートに種母を１穴あたり５μｌ植菌し、２５℃、９００ｒｐｍで２４時間培養した。
９６穴ディープウェルプレートの培養液を遠心分離して上清を除き、菌体を得た。この菌体を１ｍｇ／ｍｌの  Ｎ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸が入った５００μｌリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４），１０％グリセロール，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  Ｄ−グルコース）で希釈し反応を開始した。２８℃、９００ｒｐｍで２時間反応後、等量アセトンを添加し、逆相ＨＰＬＣで分析した。その結果、１６コロニーがｐＥＴ−１０９ＦＫを導入した形質転換体より活性が１．２３倍以上向上していた。コロニーからプラスミドを抽出しシークエンシングにより変異箇所を同定した。スクリーニングと同様の方法で各変異の活性を再確認した結果、表４に記載の変異が、他の変異（例えば、表５に記載の変異）と比べ、活性を向上させることが判明した。
【表４】
0005550041.tif 000019
【表５】
0005550041.tif 000020
【実施例５】
【００７９】
ＣＹＰ１０９ＦＫ変異体の変異を導入したＣＹＰ１０９Ｂ１変異体を用いた休止菌体反応によるアダマンタンの水酸化
実施例３で判明した１０９ＦＫ遺伝子の変異の一部をＣＹＰ１０９Ｂ１遺伝子に導入し、実施例４のスクリーニングの方法で活性の検討をおこなった。ただし、菌体は３ｍｇ／ｍｌのＮ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸が入った１ｍｌリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４），１０％グリセロール，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  Ｄ−グルコース）で希釈し、反応時間を１６時間に変更した。その結果、表６に記載の変異が活性を向上させることが判明した。
【表６】
0005550041.tif 000021
一方でＦ２３２に変異を導入したＣＹＰ１０９Ｂ１遺伝子の活性の確認は、実施例４のスクリーニングの方法で実施した。その結果、表７に記載の変異が活性を向上させることが判明した。
【表７】
0005550041.tif 000022
【実施例６】
【００８０】
ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体（Ｉ７７Ｆ）を用いた休止菌体反応によるアダマンタンの水酸化
[種培養]
ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体（Ｉ７７Ｆ）遺伝子（配列番号：５）が挿入された発現ベクター（ｐＥＴ−１０９Ｂ１（Ｉ７７Ｆ）−ＣａｍＡ−ＣａｍＢ）を大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し形質転換体を得た。該形質転換体をＬＢ培地２ｍｌに植菌し、３００ｒｐｍの往復しんとう機で３７℃、２４時間培養し、種母とした。
[本培養]
実施例１と同様に本培養を実施した。
[生体触媒反応]
実施例１と同様に生態触媒反応を実施した。反応後、等量アセトンを添加し、逆相ＨＰＬＣで分析した結果、表８のような変換率で基質がＮ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸にそれぞれ変換した。
【表８】
0005550041.tif 000023
[精製]
上記反応液をまとめて遠心分離後、上清１１３ｍｌを取得した。上清４０ｍｌを５ｍｌのＨＰ２０ＳＳに吸着させ、０．１％ギ酸水溶液で２ＣＶ洗浄後、０．１％ギ酸、５０％アセトン水溶液で溶出し、活性画分を得た。活性画分を濃縮、凍結乾燥してＮ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸の粉末１２５ｍｇを得た。ＮＭＲにより構造解析した結果、３．９２のＨと１．７１及び１．６２のＨとの間にＮＯＥが観測されたことから、Ａｎｔｉ体１００％であることが判明した。
１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-d６) δ : ８.４０(１Ｈ、ｂｒ．ｓ)、７.７４(１Ｈ、ｂｒ．ｓ)、７.５２２(１Ｈ、ｔｄ、J＝７．５、１．１Ｈz)、７.４６１(１Ｈ、ｔｄ、J＝７．５、１．１Ｈz)、７.４０(１Ｈ、ｂｒ．ｄ、J＝〜８Ｈz)、 ４.４０(１Ｈ、 ｂｒ．ｓ)、 ３．９２(１Ｈ、 ｍ)、 ２．０５(２Ｈ、 ｂｒ．ｓ)、 １．９７(２Ｈ、 ｍ)、 １．９６(１Ｈ、 ｍ)、１．７１(２Ｈ、ｂｒ．ｄ)、 １.６２(２Ｈ、 ｂｒ．ｄ、 J＝〜１２Ｈz)、 １.６１(１Ｈ、 ｂｒ．ｓ)、 １.２８(２Ｈ、 ｂｒ．ｄ、 J＝〜１２Ｈz)
【実施例７】
【００８１】
ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体（Ｉ７７Ｆ）を用いた生育菌体反応によるアダマンタンの水酸化
[種培養]
ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体（Ｉ７７Ｆ）遺伝子（配列番号：５）が挿入された発現ベクター（ｐＥＴ−１０９Ｂ１（Ｉ７７Ｆ）−ＣａｍＡ−ＣａｍＢ）を大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し形質転換体を得た。
該形質転換体を一白金耳、５０ｍｌのＬＢ培地が入った５００ｍｌ広口三角フラスコに植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで、５．５時間培養し、種母とした。
[本培養]
１ＬのＬ培地（１０ｇ／Ｌ  トリプトン，５ｇ／Ｌ  酵母エキス，５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）を滅菌し、これに１００ｍＭ  ＦｅＳＯ４を１ｍｌ、グリセロール  ２０ｇ、ヒドロキシプロピル-β−シクロデキストリン  ３０ｇ、５０ｍｇ／ｍｌ  カルベニシリンを１０ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  ５−アミノレブリン酸を１０ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ  チミンを１０ｍｌ、ＭｇＣｌ２  ０．１ｇ、Ａｄｅｃａｎｏｌ  ＬＧ１２１  ０．１ｍｌを添加し、基質であるＮ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸を終濃度５０００μｇ／ｍｌになるように添加して本培養培地とした。１Ｌの本培養培地が入った３Ｌ−ミニジャーに種母を４０ｍｌ植菌し、２８℃、６００ｒｐｍ、ｐＨ６．５に制御して培養を開始した。培養開始６時間後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加した。培養中、カザミノ酸、グリセロール、基質を適宜添加し、最終的に添加した基質量は３０ｇ／Ｌに達した。反応開始７２時間後に逆相ＨＰＬＣで分析した結果、６７％の基質がＮ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸に変換された。
【実施例８】
【００８２】
ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体（Ｉ７７Ｆ）を用いた生育菌体反応によるアダマンタンの水酸化及びモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンの製造
[ベクターの作成]
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号：６）をｐＣＤＦＤｕｅｔに挿入し、発現ベクターを構築した（ｐＣＤＦＤ−ＧＬＤ）。
[種培養]
ｐＣＤＦＤ−ＧＬＤ及び実施例７記載のｐＥＴ−１０９Ｂ１（Ｉ７７Ｆ）−ＣａｍＡ−ＣａｍＢを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入し形質転換体を得た。該形質転換体を一白金耳、５０ｍｌのＬＢ培地が入った５００ｍｌ広口三角フラスコに植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで、７時間培養し、種母とした。
[本培養]
１ＬのＬ培地／Ｍ９（１０ｇ／Ｌ  トリプトン，５ｇ／Ｌ  酵母エキス，６．７８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４（無水），３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４  ，５．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，１ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ）を滅菌し、これに１００ｍＭ  ＦｅＳＯ４を１ｍｌ、グリセロールを２０ｇ、ヒドロキシプロピル-β−シクロデキストリンを３０ｇ、５０ｍｇ／ｍｌ  カルベニシリンを１ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを１ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ  ５−アミノレブリン酸を１ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ  チミンを１０ｍｌ添加した。さらにメルク社製のＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ａｕｔｏ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ  ２０ｍｌ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ  ５０ｍｌ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ  １ｍｌ）を加え、基質であるＮ−（アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸を終濃度５０００μｇ／ｍｌになるように添加して本培養培地とした。１Ｌの本培養培地が入った３Ｌ−ミニジャーに種母を４０ｍｌ植菌し、２８℃、５００ｒｐｍ、ｐＨ６．５に制御して培養を開始した。培養中、カザミノ酸、グリセロール、基質を適宜添加し、最終的に添加した基質量は３０ｇ／Ｌに達した。反応開始７２時間後に逆相ＨＰＬＣで分析した結果、９０％の基質がＮ−（５−ヒドロキシ−アダマンタン−２−イル）−フタルアミド酸に変換された。
[精製]
培養液を塩酸でｐＨ４に調整後、１２０℃、１５分間、滅菌し保護基を脱保護した。水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整後、遠心分離により、上清１．６５Ｌを得た。上清１Ｌをアンモニウムイオン型のダイヤイオンＰＫ２０８、３００ｍｌに吸着させ、２規定アンモニア水で溶出することにより活性画分を得た。活性画分を濃縮、凍結乾燥後、１００ｍｌの水に溶解し、水酸化物イオン型のアンバーライトＩＲＡ４１０、１２０ｍｌに吸着させた。水で溶出して活性画分を取得後、濃縮、凍結乾燥してモノヒドロキシ−２−アダマンタナミンの粉末９．６４ｇを得た。ＦＤＬＡ法により純度を測定した結果、モノヒドロキシ−２−アダマンタナミンの純度は９６．６％であった。
【実施例９】
【００８３】
【化１５】
0005550041.tif 000024
化合物３(150mg)のジメチルホルムアミド溶液（ＤＭＦ）(5ml)に、窒素雰囲気下、モノヒドロキシ−２−アダマンタナミン(140mg)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）(31mg)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）(174mg)、トリエチルアミン（ＴＥＡ）(180μl)を加え、室温で14時間攪拌した。反応終了後、2N塩酸水溶液(30ml)を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物４(226mg)を得た。
NMR:(CDCl3);1.06(d,J=6.6Hz,6H),1.53-2.20(m,14H),3.72(s,3H),3.98(d,J=6.6Hz,2H),6.25-6.30(m,1H),7.71(s,1H)
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の方法は、機能性樹脂や医薬品の中間体として有用であるアダマンタン骨格を有する化合物の水酸体の安価で高収率の製造方法として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号：１は、ＣＹＰ１０９Ｂ１のアミノ酸配列を示す。【００８６】
配列番号：２は、実施例１で用いたＣＹＰ１０９Ｂ１をコードする遺伝子の塩基配列を示す。【００８７】
配列番号：３は、ＣＹＰ１０９ＦＫのアミノ酸配列を示す。【００８８】
配列番号：４は、ＣＹＰ１０９ＦＫをコードする遺伝子の塩基配列を示す。【００８９】
配列番号：５は、ＣＹＰ１０９Ｂ１変異体（Ｉ７７Ｆ）をコードする遺伝子の塩基配列を示す。【００９０】
配列番号：６は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を示す。
【配列表】
0005550041000001.app