(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）合成ポリマー基材ならびに（ｉｉ）前記基材に連結された糖基およびＲＧＤペプチド基を含む表面であって、前記糖基が３Ｄ肝細胞単層を形成するのに十分な密度でガラクトース、ガラクトース部分またはこれらの組合せを含み、前記ＲＧＤペプチド基が前記ガラクトース、ガラクトース部分またはこれらの組合せと共結合されて、前記３Ｄ肝細胞単層を安定化する、表面。
【請求項２】
前記ポリマー基材が熱可塑性ポリマーを含む、請求項１に記載の表面。
【請求項３】
前記熱可塑性ポリマーがポリエステルを含む、請求項２に記載の表面。
【請求項４】
前記ポリエステルがポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を含む、請求項３に記載の表面。
【請求項５】
前記ポリマー基材が第１のポリマー、および前記第１のポリマーにグラフト化された第２のポリマーを含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の表面。
【請求項６】
前記糖基およびペプチド基が前記第２のポリマーに連結されている、請求項５に記載の表面。
【請求項７】
前記第２のポリマーがポリアクリル酸を含む、請求項６に記載の表面。
【請求項８】
前記ガラクトース部分が乳糖である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の表面。
【請求項９】
さらに、ＹＩＧＳＲペプチド、ＧＦＯＧＥＲペプチドまたはこれらの組合せを含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の表面。
【請求項１０】
前記ＲＧＤペプチドがアミノ酸配列ＧＲＧＤＳを含む、請求項９に記載の表面。
【請求項１１】
前記ＲＧＤペプチド基がアミノ酸配列ＧＲＧＤＳからなる、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の表面。
【請求項１２】
前記表面が多孔性である、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の表面。
【請求項１３】
前記表面が非多孔性である、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の表面。
【請求項１４】
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の表面を含む、装置。
【請求項１５】
肝細胞を増殖させるための装置であって、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の表面を含む、装置。
【請求項１６】
前記装置がバイオ人工肝臓補助装置（ＢＬＡＤ）である、請求項１４または請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＢＬＡＤがバイオリアクターである、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
安定化された３Ｄ肝細胞単層を提供するためのプロセスであって、
（ｉ）糖基およびペプチド基が連結された合成ポリマー基材を含む表面を準備するステップと、
（ｉｉ）前記肝細胞が前記表面に接着するのに好適な時間および条件の下で、肝細胞の存在下で生体外で前記表面をインキュベーションするステップと、
（ｉｉｉ）前記表面に接着している前記肝細胞を培養して安定化された３Ｄ肝細胞単層を生成するステップと、
を含むプロセス。
【請求項１９】
糖基およびＲＧＤペプチド基をポリマー基材に連結するステップを含む、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載のポリマー表面を作製するためのプロセス。
【請求項２０】
さらに、第２のポリマーを第１のポリマー上にグラフト化して、前記連結するステップに先立って前記ポリマー基材を形成するステップを含む、請求項１８または請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第２のポリマーを前記第１のポリマー上にグラフト化するステップが、プラズマ処理および／またはＵＶ誘導グラフト重合を含む、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記第１のポリマーがプラズマ処理またはＵＶ方法によってグラフト化できる、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記プラズマ処理がアルゴンプラズマ処理である、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記連結するステップが、
ａ）前記ポリマー基材を活性化して活性化されたポリマー基材を形成するステップと、
ｂ）前記活性化されたポリマー基材を、前記糖基を含む第１の試薬および前記ペプチド基を含む第２の試薬と反応させて前記表面を形成するステップと
を含む、請求項１９から請求項２３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記活性化するステップが、前記ポリマー基材を活性化剤と反応させて、活性化する基を前記ポリマー基材の前記表面に結合するステップを含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記連結するステップが、さらに、前記ポリマー基材をクエンチ剤でクエンチし、これにより未反応の活性化する基をクエンチするステップを含む、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記活性化剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を含み、前記第１の試薬および前記第２の試薬がともに少なくとも１つのアミン基を含む、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記クエンチ剤がアミン基を含む、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記糖基がガラクトースおよび／もしくは乳糖またはこれらの組合せを含む、請求項１８から請求項２８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３０】
さらに、ＹＩＧＳＲペプチド、ＧＦＯＧＥＲペプチドまたはこれらの組合せを含む、請求項１８から請求項２９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３１】
肝細胞を培養するためのバイオリアクターであって、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の表面を備えるバイオリアクター。
【請求項３２】
前記バイオリアクターが、膜、管、マイクロタイターウェル、カラム、中空糸、ローラーボトル、組織培養プレートまたはマイクロキャリアの形態である、請求項３１に記載のバイオリアクター。
【請求項３３】
バイオ人工肝臓補助装置（ＢＬＡＤ）における、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の表面の使用。
【請求項３４】
前記ＢＬＡＤがバイオリアクターである、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の表面の使用であって、前記使用が、ミクロプレートベースのプラットフォームでの高スループット薬物試験、高含有量スクリーニング、肝毒性試験、代謝試験、平板バイオ人工補助装置、および／または膜ベースのバイオリアクターからなる群から選択される、表面の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性基層を介する肝細胞単層培養物の安定化に関する。さらに本発明は肝細胞ベースの応用のための肝細胞単層培養物の使用に関する。
【０００２】
（関連出願）
本願は、２００６年５月２４日出願の米国仮出願番号第６０／８０２，７６８号の利益を主張する。この特許仮出願の開示は、参照によりその全体が本願明細書に引用されたものとする。
【背景技術】
【０００３】
乳腺、膵島、肺または肝臓などの種々の組織から解離した細胞は、適切な実験条件下で、そのもとの組織に似た組織体（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）および構造を有する多細胞凝集体へと自己組織化することができることが実証されている。これらの三次元組織様構造の形態形成を理解し制御することができることは、細胞生物学および発生生物学および組織工学研究の基本的な目的である。
【０００４】
肝組織工学の分野では、単離した一次肝細胞の自己集合したスフェロイド状凝集体は、懸濁培養物として、または天然もしくは人工の細胞外マトリックス（ラミニン、フィブロネクチンまたはＩ型コラーゲンなど）の中程度に接着性の基層を利用することにより、得られている。この細胞外マトリックスタンパク質は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）およびＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）などの細胞接着性ペプチドと結合されていてもよい。しかしながら、肝細胞はこれらの基層にしっかりと接着し、これにより拡張され広がった細胞モルホロジーがもたらされ、そして肝細胞の脱分化の結果である可能性がある肝臓特異的な活性のレベルの低下が引き起こされる。
【０００５】
対照的に、肝細胞が基層にあまりに緩やかに繋がれる場合には、肝細胞は、生体内でのような３Ｄ構造を形成し、かつ組織様の細胞−細胞および細胞−マトリックス接合性および高められた肝臓特異的な活性、細胞膜極性および肝臓の超微細構造（例えば、毛細胆管、密着結合およびギャップ結合）を呈するスフェロイドへと凝集する。肝細胞スフェロイドの特徴は、バイオ人工肝臓補助装置（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｉｖｅｒ  ａｉｄｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ、ＢＬＡＤ）および薬物代謝／肝毒性研究における肝細胞スフェロイドの潜在的な応用を示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、３Ｄ肝細胞スフェロイドの有用性は、これらの大きい細胞凝集体へのまたは細胞凝集体からの栄養素、酸素、生体異物および代謝産物の物質移動の乏しさに起因して、限定的なものとなっている。細胞消失も、基層上でのスフェロイドの接着性の低さに起因して、これらのスフェロイドを形成し維持する上で非常に重要な問題である。従って、スフェロイドの有利な特性のいくつかを提供するがスフェロイドの欠点のいくつかを回避する、肝細胞スフェロイドを生成することに代わるものが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様によれば、（ｉ）ポリマー基材ならびに（ｉｉ）前記基材に連結された糖基およびペプチド基を含む、表面が提供される。
【０００８】
別の態様によれば、第１の態様に係る表面を有する装置が提供される。
【０００９】
別の局面によれば、肝細胞の安定化された培養物を提供するためのプロセスであって、糖基およびペプチド基が連結されたポリマー基材を含む表面を準備するステップと、前記肝細胞が前記表面に接着するのに好適な時間および条件の下で、肝細胞の存在下で生体外で前記表面をインキュベーションするステップと、前記表面に接着している前記肝細胞を培養して肝細胞の安定化された培養物を生成するステップと、を含むプロセスが提供される。
【００１０】
別の局面によれば、糖基およびペプチド基をポリマー基材に連結するステップを含む、ポリマー表面を作製するためのプロセスが提供される。
【００１１】
前記プロセスは、さらに、第２のポリマーを第１のポリマー上にグラフト化して、前記連結するステップに先立って前記ポリマー基材を形成するステップを含むことができる。前記第２のポリマーを前記第１のポリマー上にグラフト化するステップは、プラズマ処理および／またはＵＶ誘導グラフト重合を含むことができる。前記プラズマ処理はアルゴンプラズマ処理であってもよい。
【００１２】
前記連結するステップは、
ａ）前記ポリマー基材を活性化して活性化されたポリマー基材を形成するステップと、
ｂ）前記活性化されたポリマー基材を、前記糖基を含む第１の試薬および前記ペプチド基を含む第２の試薬と反応させて前記表面を形成するステップと
を含むことができる。
【００１３】
前記活性化するステップは、前記ポリマー基材を活性化剤と反応させて、活性化する基を前記ポリマー基材の前記表面に結合するステップを含むことができる。
【００１４】
前記連結するステップは、さらに、前記ポリマー基材をクエンチ剤でクエンチし、これにより未反応の活性化する基をクエンチするステップを含むことができる。
【００１５】
前記活性化剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を含むことができ、前記第１の試薬および前記第２の試薬はともに、各々、少なくとも１つのアミン基を含むことができる。
【００１６】
前記クエンチ剤はアミン基を含むことができる。
【００１７】
さらなる態様によれば、肝細胞を培養するためのバイオリアクターであって、（ｉ）ポリマー基材、ならびに（ｉｉ）前記基材に連結された糖基およびペプチド基、を含む表面を備えるバイオリアクターが提供される。前記バイオリアクターは、膜、管、マイクロタイターウェル、カラム、中空糸、ローラーボトル、組織培養プレートまたはマイクロキャリアの形態であってもよい。
【００１８】
別の態様によれば、バイオ人工肝臓補助装置（ＢＬＡＤ）における、（ｉ）少なくとも１つのポリマー基材ならびに（ｉｉ）前記基材に連結された糖基およびペプチド基を含む、表面の使用が提供される。前記ＢＬＡＤはバイオリアクターであってもよい。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、肝細胞を増殖させるための装置であって、（ｉ）少なくとも１つのポリマー基材、ならびに（ｉｉ）前記基材に連結された糖基およびペプチド基、を含む表面を備える装置が提供される。前記装置はＢＬＡＤであってもよい。前記ＢＬＡＤはバイオリアクターであってもよい。
【００２０】
上記の態様のいずれかによれば、前記ポリマー基材は熱可塑性ポリマー（ポリエステルなど）を含むことができる。前記ポリマー基材は、プラズマ方法またはＵＶ方法によってグラフト化できるポリマーを含むことができる。一実施形態では、前記ポリエステルはポリエチレンテレフタレートである。前記ポリマー基材は第１のポリマー、および前記第１のポリマーにグラフトされた第２のポリマーを含むことができる。前記糖基およびペプチド基は前記第２のポリマーに連結されていてもよい。前記第２のポリマーがポリアクリル酸であってもよい。
【００２１】
前記糖基は少なくとも１つの単糖基を含むことができる。一実施形態では、前記単糖基はヘキソース（ガラクトースなど）である。さらに別の実施形態では、前記ガラクトースは乳糖であってもよい。
【００２２】
上記の態様のいずれかのうちの一実施形態によれば、前記ペプチド基は３アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基の長さであるペプチドを含む。これらのペプチド基は天然由来のものであっても合成的に誘導したものであってもよい。前記ペプチド基は、ＲＧＤペプチド、および／またはＹＩＧＳＲペプチド、および／またはＧＦＯＧＥＲペプチドであってもよい。前記ペプチド基は、ＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳなど）であってもよい。一実施形態では、前記ペプチド基はＧＲＧＤＳである。別の実施形態では、前記ペプチド基はＹＩＧＳＲである。さらに別の実施形態では、前記ペプチド基はＧＦＯＧＥＲである。
【００２３】
上記の態様のいずれかのうちのある実施形態によれば、前記表面は、水、塩またはブドウ糖の通過にとっては多孔性であってもよい。他の実施形態では、前記表面は不透過性であってもよい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態が、具体例のみとしての添付の図面を参照して、これより説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】２ステップ反応スキーム（実線の矢印）によるＰＥＴ−ｐＡＡ（ポリアクリル酸）フィルムへのリガンド結合、および逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ；点線の矢印）による結合されたリガンドの定量分析の模式図である。
【図２】成功裏のアクリル酸のグラフト化および引き続くそのＰＥＴフィルムへのＲＧＤおよびＧａｌリガンドの結合を示すＰＥＴ、ＰＥＴ−ｇ−ＡＡ、ＰＥＴ−ｇａｌおよびＰＥＴ−ＲＧＤのＸＰＳ広角走査スペクトルである。
【図３Ａ】ＲＰ−ＦＩＰＬＣによる結合されたＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳ）およびＧａｌリガンド（１−Ｏ−（６’−アミノへキシル）−Ｄ−ガラクトピラノシド；ＡＨＧ）の定量分析を示すグラフである。アルギニン（ａ）、可溶性ＲＧＤペプチドの加水分解生成物（ｂ）、Ｇａｌリガンド（ｃ）およびＰＥＴ−ハイブリッドの加水分解生成物（ｄ）の代表的なＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図３Ｂ】ＲＰ−ＦＩＰＬＣによる結合されたＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳ）およびＧａｌリガンド（１−Ｏ−（６’−アミノへキシル）−Ｄ−ガラクトピラノシド；ＡＨＧ）の定量分析を示すグラフである。ＰＥＴｐＡＡｃ上へのＲＧＤペプチドの結合効率曲線。
【図３Ｃ】ＲＰ−ＦＩＰＬＣによる結合されたＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳ）およびＧａｌリガンド（１−Ｏ−（６’−アミノへキシル）−Ｄ−ガラクトピラノシド；ＡＨＧ）の定量分析を示すグラフである。ｐＡＡｃ−ＰＥＴ基層へのガラクトースリガンドの結合効率曲線。
【図４Ａ】肝細胞スフェロイド形成の間の異なる段階における、ガラクトシル化された基層上で培養された肝細胞のモルホロジーを示す顕微鏡写真である。位相コントラスト写真および基層被覆率。
【図４Ｂ】肝細胞スフェロイド形成の間の異なる段階における、ガラクトシル化された基層上で培養された肝細胞のモルホロジーを示す顕微鏡写真である。走査型電子顕微鏡写真。
【図５】ガラクトシル化された基層上での肝細胞３Ｄスフェロイド形成（上段）およびコラーゲンコーティングされた基層上での従来の２Ｄ単層形成（下段）の間の種々の時間点におけるＦ−アクチン再組織化の図である。
【図６Ａ】肝細胞３Ｄスフェロイド形成の間のｐ−ＦＡＫおよびＥ−カドヘリン発現ならびに分布を示す図である。３ｄスフェロイドおよび２Ｄ単層形成の間にＥＬＩＳＡによって定量されたｐ−ＦＡＫ発現の動的変化の図である。
【図６Ｂ】肝細胞３Ｄスフェロイド形成の間のｐ−ＦＡＫおよびＥ−カドヘリン発現ならびに分布を示す図である。Ｅ−カドヘリンおよびβ−アクチン発現のウエスタンブロット分析の図である。ＧＡＰＤＨを装填量対照として使用した。
【図６Ｃ】肝細胞３Ｄスフェロイド形成の間のｐ−ＦＡＫおよびＥ−カドヘリン発現ならびに分布を示す図である。従来の２Ｄ単層、プレスフェロイド（ｐｒｅ−ｓｐｈｅｒｏｉｄ）３Ｄ単層、３Ｄスフェロイドのｐ−ＦＡＫ／Ｅ−カドヘリン二重染色法の図である。
【図７Ａ】従来の２Ｄ単層、プレスフェロイド３Ｄ単層、３Ｄスフェロイドにおける肝細胞の極性および密着結合形成の図である。毛細胆管トランスポーターＭＲＰ２および側底マーカーＣＤ１４３の二重染色法。この写真は加工されており、各加工された写真の隅の数字は、材料および方法において説明するアルゴリズムによる、極性マーカーとしての細胞境界に沿ったＭｒｐ２局在化の定量的測定値である。
【図７Ｂ】従来の２Ｄ単層、プレスフェロイド３Ｄ単層、３Ｄスフェロイドにおける肝細胞の極性および密着結合形成の図である。密着結合タンパク質ＺＯ−１および側底マーカーＣＤ１４３の二重染色法。この写真は加工されており、各加工された写真の隅の数字は、材料および方法において説明するアルゴリズムによる、極性マーカーとしての細胞境界に沿ったＺＯ−１局在化の定量的測定値である。
【図８】従来の２Ｄ単層、プレスフェロイド３Ｄ単層、３Ｄスフェロイドにおける肝細胞の肝臓特異的な機能の図である。（Ａ）アルブミン分泌；（Ｂ）尿素産生；（Ｃ）７−エトキシレゾルフィン  Ｏ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）シトクロムＰ４５０活性。
【図９】２Ｄ単層およびプレスフェロイド単層において（Ａ）アセトアミノフェンおよび（Ｂ）肝細胞のアフラトキシンＢ１によって誘発される肝毒性感度の図である。
【図１０Ａ】播種から２時間後の様々な基材上での肝細胞の付着性を示す図である。データは平均値±標準偏差である。ｎ１０。（＊）：Ｐ＜０．０５、（＊＊）：Ｐ＜０．０１、（Ｎ．Ｓ）：有意ではない。
【図１０Ｂ】様々な基層に付着した肝細胞を示すための、７日間の培養の間の種々の時間点における、様々な基層上で培養された肝細胞の全ＤＮＡ含有量の図である。
【図１１】７日間の培養の間の種々の時間点における様々な基材上で培養された一次肝細胞の位相コントラスト写真である（スケールバー＝５μｍ）。
【図１２】３Ｄスフェロイド、３Ｄ単層および２Ｄ単層としての３日間培養後の肝細胞のＦ−アクチン、ｐ−ＦＡＫおよびＥ−カドヘリンの共焦点Ｚ−スタック投影図（スケールバー：２０μｍ）である。Ｅ−カドヘリン分布を明瞭に示すために、Ｚ−スタック図からの単一のスライスの一部が対応する投影図の隅に置かれている。
【図１３Ａ】可溶性ＧＲＧＤＳペプチドにより不安定化することができた、ハイブリッドＧＲＧＤＳ／ガラクトース−ＰＥＴ基層（ＰＥＴ−ハイブリッド）上のプレスフェロイド３Ｄ単層の安定化の図である。６日間にわたる培養の間のＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞のｐ−ＦＡＫ発現は、ＰＥＴ−ハイブリッド上の安定化された３Ｄ単層の高められた細胞−基層相互作用を示した。
【図１３Ｂ】可溶性ＧＲＧＤＳペプチドにより不安定化することができた、ハイブリッドＧＲＧＤＳ／ガラクトース−ＰＥＴ基層（ＰＥＴ−ハイブリッド）上のプレスフェロイド３Ｄ単層の安定化の図である。可溶性ＧＲＧＤＳペプチドを含む培地および対照としての通常の培地中でのＰＥＴ−Ｇａｌ、ＰＥＴ−ハイブリッドおよびコラーゲン基層の、４日目の肝細胞の位相コントラスト写真である。
【図１４Ａ】７日間の培養の間の種々の時間点における様々な基層上の肝細胞のアルブミン分泌レベルを示す図である。機能データは１サンプルあたりのＤＮＡの総量に対して規格化された。データは平均値±標準偏差である。ｎ＝６。（＊）：Ｐ＜０．０５、（＊＊）：Ｐ＜０．０１、（Ｎ．Ｓ）：有意ではない。
【図１４Ｂ】７日間の培養の間の種々の時間点における様々な基層上の肝細胞の尿素合成を示す図である。機能データは１サンプルあたりのＤＮＡの総量に対して規格化された。データは平均値±標準偏差である。ｎ＝６。（＊）：Ｐ＜０．０５、（＊＊）：Ｐ＜０．０１、（Ｎ．Ｓ）：有意ではない。
【図１４Ｃ】７日間の培養の間の種々の時間点における様々な基層上の肝細胞の３ＭＣ誘発性ＥＲＯＤ活性を示す図である。機能データは１サンプルあたりのＤＮＡの総量に対して規格化された。データは平均値±標準偏差である。ｎ＝６。（＊）：Ｐ＜０．０５、（＊＊）：Ｐ＜０．０１、（Ｎ．Ｓ）：有意ではない。
【図１５Ａ】様々な基層上で培養された肝細胞のアセトアミノフェン誘発性肝毒性に対する反応の図である。異なる濃度のＡＰＡＰおよび３ＭＣと同時投与されたＡＰＡＰの２４時間投与量の下での培養された肝細胞の細胞毒性を示すためのＭＴＳ検定。データは平均値±標準偏差である。ｎ＝１０。（＊）：Ｐ＜０．０５、（＊＊）：Ｐ＜０．０１、（Ｎ．Ｓ）：有意ではない。
【図１５Ｂ】様々な基層上で培養された肝細胞のアセトアミノフェン誘発性肝毒性に対する反応の図である。異なる濃度のＡＰＡＰおよび３ＭＣと同時投与されたＡＰＡＰの４８時間投与量の下での培養された肝細胞の細胞毒性を示すためのＭＴＳ検定。データは平均値±標準偏差である。ｎ＝１０。（＊）：Ｐ＜０．０５、（＊＊）：Ｐ＜０．０１、（Ｎ．Ｓ）：有意ではない。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（定義）
本願明細書全体を通して、文脈が別段の定義を必要としていないかぎり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」との用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられたステップもしくは要素もしくは整数またはステップもしくは要素もしくは整数の郡の包含を含み、いかなる１つのステップもしくは要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を含まないと理解される。
【００２７】
本願明細書中で使用する場合の用語「に由来する」は、特定された整数が特定の供給源から入手することができるが、必ずしもその供給源から直接に入手できる必要はないことを示すと解釈されるものとする。
【００２８】
本願明細書中で使用する場合の用語「ＲＧＤペプチド」は、アミノ酸残基Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含むペプチドを意味すると解釈されるものとする。ＲＧＤを含有するペプチドは、ＲＧＤ認識部位を介して細胞の表面に発現されたインテグリンに特異的に結合することができる（Ｐｌｏｗら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０００）。ＲＧＤペプチドはＲＧＤモチーフのそばにある１つ以上のアミノ酸を含有していてもよい。
【００２９】
本願明細書中で使用する場合の「３Ｄスフェロイド」との用語は、以下の特徴の少なくとも１つが存在する、３Ｄ構造における（通常は丸まった凝集体の形態にある）培養された肝細胞の形成を意味すると解釈されるものとする：（ｉ）Ｅ−カドヘリンの極性ある発現などの確立した細胞−細胞／細胞−マトリックス相互作用、（ｉｉ）肝臓に特異的な活性を有する、（ｉｉｉ）細胞膜極性を呈する、および（ｉｖ）コラーゲン基材上で培養された肝細胞よりも高い程度で、生体内で肝細胞により示される超微細構造を有する。
【００３０】
「３Ｄ肝細胞単層」との用語は、本願明細書において糖基（ガラクトースなど）およびペプチド基（ＲＧＤペプチドなど）を含む表面上で肝細胞が培養されたときに生成する培養物における肝細胞の単層を意味するために使用されることが理解されるであろう。３Ｄ肝細胞単層中の肝細胞は、細胞の広がりを呈するだけでなく、上で説明したような３Ｄスフェロイド中に存在する肝細胞の特徴の多くをも呈する。
【００３１】
本願明細書中で使用する場合の、用語「安定化する（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）」または「安定な（ｓｔａｂｌｅ）」または「安定化された（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）」は、細胞集合相の２サイクルの間に起こる一過性の細胞が広がった相（ｃｅｌｌ−ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）がより一過性でない細胞が広がった相となるような、上で説明したような３Ｄ肝細胞単層の長期間にわたる存在を意味すると解釈されるものとする。肝細胞の安定化された培養物は、少なくとも約２４時間で発生する細胞が広がった相を含む単層である。
【００３２】
本願明細書中で使用する場合の、用語「インテグリン」は、ＲＧＤリガンドに結合することにより細胞接着を媒介する原形質膜受容体を表す。
【００３３】
本願明細書中で使用する場合の、用語「ガラクトース」または「ガラクトースリガンド」は、糖基の例である。糖基およびペプチド基は、ポリマー基材上に連結することができる。
【００３４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本願明細書に記載されるとおり、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのポリマー基材（ポリエチレンテレフタレートフィルムなど）、ならびに（ｉｉ）このポリマー基材に結合される（連結される）糖基（ガラクトースなど）およびペプチド基（ＲＧＤペプチドなど）を含む表面を提供する。ポリマー基材上のＲＧＤペプチドおよびガラクトースは、本願明細書に記載されるような、基材への細胞接着および肝臓特異的な活性を高める。
【００３５】
（ポリマー基材の前処理）
ポリマー基材は、それに糖基およびペプチド基を連結するのに先立って活性化することができる。この活性化は、基材が糖基（ガラクトースなど）およびペプチド基（ＲＧＤペプチドなど）と反応できるようにし上記表面を形成できるようにする前処理ステップを実行することにより行うことができる。基材は、活性化剤の付加である化学反応により活性化することができる。好適な活性化剤は、ポリマー基材に連結することができる官能基ならびにそれぞれ糖基およびペプチド基を含有する第１の試薬および第２の試薬と反応することができる別の官能基を有することができる。あるいは、その活性化剤は、第１の試薬および第２の試薬のポリマー基材との反応を活性化することができるものであってもよい。一実施形態では、第１の試薬および第２の試薬は少なくとも１つのアミン基を含み、ポリマー基材は表面カルボキシル基を有する。この実施形態において、好適な活性化剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミドである。この試薬は、第１の試薬および第２の試薬をアミド基を介してポリマー基材に連結するために、ポリマー上の表面カルボキシル基と反応することができ、引き続いて第１の試薬および第２の試薬上のアミン基によって置換され得る。別の好適な試薬はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。他の類似の活性化剤は当業者には明らかであろう。
【００３６】
（ポリマー基材）
本発明で準備されるポリマー基材は、熱可塑性ポリマーとして公知のポリマーの群に属するものであってよい。一実施形態では、熱可塑性ポリマーはポリエステルであってよい。別の実施形態では、ポリエステルはポリエチレンテレフタレートであってよい。ポリマー基材は、第２のポリマーがグラフトされた第１のポリマーを含んでいてよい。第２のポリマーは付加ポリマーであってよい。それはポリアクリル酸またはポリメタクリル酸などのポリ酸であってもよい。一実施形態では、第１のポリマー（ＰＥＴなど）は、ポリアクリル酸またはポリメチルアクリル酸（必要に応じてメチル基上で置換されている）でグラフト化することにより官能化され、カルボン酸基が導入されてもよい。第２のポリマーは、グラフト重合により第１のポリマーに結合されていてもよい。しかしながら、結合するための他の好適な技法は、当業者が想起するとおり、使用することができる。グラフト化は、例えば、プラズマ処理（アルゴンプラズマ処理など）および／またはＵＶ誘導共重合を使用して実施することができる。
【００３７】
（糖基）
本願明細書において、糖基は単糖であってよいことが想起される。単糖は、ヘキソースまたはその誘導体であってよい。このヘキソースはガラクトースであってよい。糖基は、ガラクトース部分を含む任意の糖（乳糖など）であってよい。
【００３８】
（ペプチド基）
本発明ではペプチド基を準備する。これらのペプチド基は、インテグリンに結合できるものとすることができる。これらのペプチド基の例はトリペプチドまたはＹＩＧＳＲペプチドである。トリペプチドは、ＲＧＤペプチドであってよい。（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）［Ｃａｒｌｉｓｌｅら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ２０００］、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（ＧＦＯＧＥＲ）［Ｒｅｙｅｓら  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００３］。
【００３９】
（表面）
本発明では、多孔性であってもよくまたは不透過性であってもよい表面を準備する。この表面は単層であってもよく、多層であってもよい。この表面は、膜、管、マイクロタイターウェル、カラム、中空糸、ローラーボトル、プレートおよびマイクキャリアの形態であってもよい。
【００４０】
（結合）
本願明細書に記載される場合、結合は、糖基（ガラクトースなど）およびペプチド基（ＲＧＤペプチドなど）を結合するために使用される任意の化学であり得る。これらの基は本発明を実施するのに好適な表面を生成するために互いに、および／または基層へと結合することができる。本願明細書に記載されるとおり、連結（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）は結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）であってもよい。
【００４１】
本願明細書に記載される特定の具体例に限定されないが、以下の例は、糖基およびペプチド基を基材に連結するために使用することができる化学を説明するということが理解されるであろう。
基層上のカルボン酸基は、アミン基を含有するガラクトースリガンドおよびＲＧＤペプチド（またはその誘導体）に連結され、アミド基を形成することができる。
基層上のカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、アミン基を含有するガラクトースリガンドおよびＲＧＤペプチド（またはその誘導体）に連結され、アミド基を形成することができる。
基層上のアミン基は、酸クロリドを有するガラクトースリガンドおよびＲＧＤペプチド（またはその誘導体）に連結され、アミド基を形成することができる。
基層上のアジド基は、アセチレン基を有するガラクトースリガンドおよびＲＧＤペプチド（またはその誘導体）に連結され、トリアゾール基を形成することができる。
基層上のマレイミド基は、Ｍｉｃｈａｅｌ型の付加によってチオール基を有するガラクトースリガンドおよびＲＧＤペプチド（またはその誘導体）に連結され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドチオエーテル基を生成することができる。
【００４２】
しかしながら、生体分子をポリマー表面に特異的に固定化するために当該技術分野で一般に用いられる多くの他の官能基および活性化戦略もまた用いることができることは理解されるであろう。当該技術分野で周知の他の連結反応もまた使用することができる。これらは、化学基を分子または機能化された固体の上に導入する周知の方法のいずれを含んでいてもよい。これらとしては、ベンジルハライド（例えば、クロリドまたはブロミド）基の求核置換反応、「クリック」化学などが挙げられる。好適なクリック化学としては、例えば環化付加反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ  １，３−双極子環化付加反応、Ｃｕ（Ｉ）触媒によるアジド−アセチレン環化付加反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、ひずみがかかった小環（例えば、エポキシ環およびアジリジン環）への求核置換反応、尿素およびアミドの形成ならびに二重結合への付加反応（例えば、エポキシ化、ジヒドロキシ化）を挙げることができる。
【００４３】
本発明は、ガラクトース結合された生物活性基層上で培養された肝細胞が２サイクルの細胞集合および広がりを経て大きいスフェロイドを形成するという驚くべき発見に基づく。肝細胞が単層として基層に付着するが、３Ｄスフェロイドの上述の制限（乏しい物質移動および様々な特徴をもつ細胞の不均一な空間分布など）なしに３Ｄスフェロイドの多くの特徴（確立した細胞−細胞／細胞−マトリックス相互作用、高レベルの代謝機能、合成機能、解毒機能および排泄機能など）を呈する、細胞が広がった相が第１の細胞集合相と第２の細胞集合相との間に存在する。この細胞が広がった相（「３Ｄ肝細胞単層」と名付ける）は、２つの細胞集合相の間に一過性に発生するに過ぎず、１日間〜３日間発生し、約２４時間しか存続しない。
【００４４】
ポリマー表面ならびに糖基（ガラクトースなど）およびペプチド基（ＲＧＤペプチドなど）を含む表面を用いる際に、その表面が、約１週間までの期間にわたって細胞が広がった相の中で３Ｄ肝細胞単層を約１週間までの期間にわたって安定化することが見出され、このためこの３Ｄ肝細胞単層の有用な応用が可能になる。
【００４５】
肝細胞ベースの応用のためにこの３Ｄ肝細胞単層の安定化を実現するために、本発明者らは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上に結合されたガラクトースを含む生物活性のガラクトシル化された基層（米国特許出願公開第２００５−００５８６８５（Ａ１）号明細書。これは、参照により本願明細書に引用されたものとする）を、ＲＧＤペプチドおよびガラクトースをＰＥＴフィルム上へと同時結合することにより改変した。
【００４６】
提案されたメカニズムに何ら束縛されることはないが、培養された肝細胞の表面にあるＲＧＤペプチドおよびインテグリンによって媒介されるより強固な細胞−基層相互作用が、細胞が広がる３Ｄ単層相を選択的に安定化すると考えられる。この３Ｄ単層構造は１週間までこのハイブリッド基層上で安定であり、これは、薬物代謝、肝毒性の研究またはＢＬＡＤにおけるような効果的な物質移動、および細胞支持の両方を必要とする種々の肝細胞ベースの応用／肝臓工学的応用に有用であろう。例示的な肝毒性研究において、ＰＥＴ−ハイブリッド基層上で培養された３Ｄ肝細胞単層は、モデル薬物アセトアミノフェンによって誘発された肝毒性に対して高レベルの感度を呈した。この感度は３Ｄスフェロイドと同程度であるが、コラーゲンコーティングされた基層上で培養された２Ｄ肝細胞単層よりも高い。
【００４７】
スフェロイド形成の間のＥ−カドヘリンの動態、リン酸化された接着斑キナーゼ（ｐ−ＦＡＫ）およびＦ−アクチンの分布および発現を研究することにより、ガラクトシル化された基層上での肝細胞形態形成が、主に、細胞骨格の再組織化を介した細胞−細胞相互作用と細胞−基層相互作用との間の均衡によって調節されることが見出された。肝細胞スフェロイド形成の異なる段階において、プレスフェロイド（ｐｒｅ−ｓｐｈｅｒｏｉｄ）単層段階の肝細胞は、コラーゲンコーティングされた基層上で培養された従来の肝細胞２Ｄ単層と比べて強固な細胞−基層相互作用および細胞−細胞相互作用を保有した。この一過性のプレスフェロイド単層段階の肝細胞は、改善された細胞組織および細胞極性、高められた細胞−細胞相互作用およびより良好な分化した活性を呈した。これらは、［発明が解決しようとする課題］の項において述べた物質移動の問題がない場合の３Ｄスフェロイド中の肝細胞に匹敵する。
【００４８】
プレスフェロイド単層構造をより長期間の適用の間（例えば約１日から５−１０日間まで、例えば約７日間）安定化するために、ＲＧＤペプチドは、ガラクトシル化された基層上へ同時結合され、ＲＧＤ−インテグリン結合により媒介される細胞−基層相互作用が高められる。一次肝細胞は、バイオ人工肝臓補助装置（ＢＬＡＤ）、薬理学的研究、毒物学研究および代謝研究において広く使用されている。これらの応用における肝細胞は、通常、最適の細胞付着性および機能維持を実現するための適切な基層上で増殖される［Ａｌｌｅｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００１；Ｓｅｐ；３４（３）：４４７−４５５；ＬｅＣｌｕｙｓｅら，Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６；８：１２１−１５９；Ｌｕら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３  Ｄｅｃ；４（２７）４８９３−４９０３］。種々の天然または合成物のポリマー基層が肝細胞培養物のために用いられてきた（例えば、細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど）でコーティングされているか、または細胞接着ペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）［Ｔａｓｈｉｒｏら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９１，Ｍａｒ；１４６（３）４５１−４５９］およびＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）［Ｃａｒｌｉｓｌｅら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２０００，Ｆｅｂ；６（１）：４５−５２］など）と結合されたプラスチック表面または膜）。肝細胞はこれらの基層にしっかりと繋がり、拡張され広がった細胞モルホロジーを呈する。低レベルの肝臓特異的機能は肝細胞の脱分化によるようである［Ｙｉｎｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）：１５７−１６５］。これらの基層はミクロプレートでの薬物スクリーニングのために［Ｇｅｂｈａｒｄｔら，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  ２００３，Ｍａｙ−Ａｕｇ；３５（２−３）：１４５−２１３；Ｃｏｅｃｋｅら，ＡＴＬＡ  １９９９；２７：５７９−６３８；Ｋｉｋｋａｗａら，Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２００５，Ｆｅｂ；３０（１）：６１−７２］、およびＢＬＡＤバイオリアクター［Ｐａｒｋら，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２００５，Ａｐｒ；９９（４）３１１−３１９］のために広範に使用されてきた。ガラクトース結合された基層は、ガラクトース−アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）相互作用を介する肝細胞付着性についての魅力的な代替物である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、３Ｄ肝細胞スフェロイドにおいて通常観察される肝細胞が広がっていない（ｎｏｎ−ｓｐｒｅａｄ）細胞モルホロジー、密接な細胞−細胞相互作用および高レベルの肝臓特異的な活性を維持しつつ、基層上に単層として安定的に繋がることができるように、ＲＧＤペプチド基およびガラクトースの両方をポリマーに結合することによる生物活性基層に関する。
【００５０】
一実施形態では、ＰＥＴフィルムは、ポリアクリル酸（ｐＡＡ）で表面改質され（実施例１Ａ参照）、次いで「２ステップ」「ＥＤＣ」化学を使用して結合され（実施例１Ｂ参照）、そしてＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）および逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって特性解析された。ＲＧＤペプチドおよびガラクトースの両方と結合されたこのＰＥＴフィルム（ＰＥＴ−ハイブリッド）は、対照としてのＲＧＤペプチドのみと結合されたＰＥＴフィルム（ＰＥＴ−ＲＧＤ）、ガラクトシル化されたＰＥＴ（ＰＥＴ−Ｇａｌ）およびコラーゲンコーティングされたミクロプレートとともに、肝細胞培養のために９６ウェルミクロプレートに挿入された。鍵となるマーカー（Ｆ−アクチン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−ＦＡＫ）の発現の分析により、ＰＥＴ−ハイブリッド膜上の細胞は、２Ｄ基層に接着しているにもかかわらず、３Ｄスフェロイド状の細胞のような挙動をすることが示された。このＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された３Ｄ肝細胞単層は、アセトアミノフェンが誘発した肝細胞毒性に対して、２Ｄの対照よりはむしろ３Ｄ肝細胞スフェロイドと同様の感度を呈した。このハイブリッドＲＧＤ／ガラクトース生物活性基層は、単層上でスフェロイド様肝細胞の挙動を支持し、通常の３Ｄスフェロイドの細胞消失および物質移動の制限を回避し、そして種々の応用のためのミクロプレートまたは他の普及している２Ｄ培養装置またはバイオリアクターに直ちに適合させることができる。
【００５１】
本発明の一態様は、付着促進のためのペプチド基（ＲＧＤペプチドなど）およびモルホロジー改善および機能改善のための糖基（ガラクトースなど）の両方を含有する肝細胞培養のためのハイブリッド生物活性基層の開発である。一次肝細胞がＲＧＤおよびガラクトースの両方を含むハイブリッド基層上で培養された場合、これらの２つのリガンド−受容体相互作用間の戦略的相互作用が観察された。
【００５２】
肝細胞が密接な細胞−細胞相互作用を持って、同時に基層への効果的な接着を伴って互いに接する、広がった単層と３Ｄ単層との間の中間のモルホロジー状態が観察された。肝細胞「３Ｄ単層」の分化した活性、解毒能力および肝毒性に対する応答感度は３Ｄスフェロイドと同様であった。興味深いことに、ＰＥＴ−Ｇａｌ上での動的なスフェロイド形成の肝臓画像化研究に基づくと、細胞播種後１日以内のプレスフェロイド段階と細胞播種から３日後に発生するコンパクトな３Ｄスフェロイド段階との間に「単層」段階も存在（ｅｘｉｔ）する。小さいプレスフェロイドが徐々に広がり、互いに合体して一時的に単層を形成し、これが後でより大きくかつよりコンパクトな成熟したスフェロイドをもたらすときに、３Ｄスフェロイドが形成される。
【００５３】
肝臓組織工学の分野におけるバイオリアクターのための細胞培養表面も、本発明において想定されている。それは、３Ｄ肝細胞単層（より良好な細胞付着性および機能を備えた培養物の構成である）を得るために表面を改善する方法を提供する可能性がある。
【００５４】
（組織形態形成のメカニズムを研究するためのモデル系）
３Ｄ組織様構造の形態形成を理解し制御することができることは、細胞生物学および発生生物学および組織工学研究の基本的な目的である。肝細胞スフェロイド形成には、組織形成のプロセスに似た細胞の移送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）および細胞形状の変化が関与する。ハイブリッドポリマー基層中の生物活性リガンドによって肝細胞スフェロイド形成を調節することができれば、スフェロイド形成のメカニズム研究が可能になる。
【００５５】
（バイオ人工肝臓バイオリアクターのための「支持表面」）
バイオ人工肝臓装置のためのバイオリアクターは、膜、管、ミクロタイターウェル、カラム、中空糸、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅｒ）、プレート、およびマイクロキャリアなどの任意の好適な形態であってよい。バイオリアクターの「支持表面」は、細胞と物理的に接して細胞の付着を支持することが意図されている。好適な支持体材料は、剛直性、表面積、調製および使用の容易さ、ならびにコストなどの特性の最適の組合せを示す表面を提供する。
【００５６】
本発明は、より適切な生物活性生体材料の設計につながる可能性があるガラクトシル化された生物活性基層上のスフェロイド自己集合のメカニズムを明らかにするための商業的推進力を提供する。加えて、プレスフェロイド単層の同定および安定化は、ＢＬＡＤおよび薬物代謝／肝毒性研究などの肝臓組織工学的応用のための有用な構成を提供する。
【００５７】
プレスフェロイド３Ｄ肝細胞単層の同定およびＲＧＤ／ガラクトースハイブリッド基層を使用することによるこの構成の安定化は、現在の２Ｄ系および３Ｄ系に対して以下の利点の１つ以上を提供する。
コラーゲンコーティングされた基層上で培養された従来の２Ｄ肝細胞単層と比べて、ＲＧＤ／ガラクトースハイブリッド基層上で培養された３Ｄ肝細胞単層は、生体内での肝細胞と同様の細胞構造および細胞極性、細胞−細胞相互作用ならびに分化機能を呈した。
３Ｄ肝細胞単層は３Ｄスフェロイドよりも良好な付着性および物質移動を呈した。
３Ｄ肝細胞単層は、Ｐｒｉｍａｒａ皿上の肝細胞スフェロイドおよび肝細胞単層の混合物［Ｔｚａｎａｋａｋｉｓ  ＥＳら  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００１；１０：３２９−４２．１］に比べて、より均一な単層モルホロジーを呈した。
３Ｄ肝細胞単層は、「コラーゲンを欠く」生物活性サンドイッチ培養物構成よりもより効果的な物質移動を呈した。
３Ｄ肝細胞単層を生成するために必要とされる表面は、未同定の成分を有しバッチ毎に変動する天然の細胞外マトリックスに比べて、単純で定量的な制御可能な生物活性の手掛かりを含有する。
合成ポリマー表面は、長期保存および低温保存のために化学的にかつ力学的に安定である。
合成ポリマー表面で増殖した肝細胞は、高濃度のＤＥＸにより維持されるＰｒｉｍａｒａ皿で培養された光度に官能化された単層と比べて、高レベルのホルモンに曝露することなく通常の培養培地で培養することができる。
合成ポリマー表面は、生体適合性でありかつ光学的に透明である。このため、その表面はミクロプレートベースのＡＤＭＥ／ＴＯＸスクリーニングプラットフォームまたは膜ベースのバイオリアクターに直ちに適合させることができる。
複数のリガンドをＰＥＴフィルム上へと結合するという同一の技術を使用して、肝細胞ベースの応用のための基底膜組成物をよりよく模倣するために、他の生物活性リガンドを結合することができる。
【００５８】
（応用）
本願明細書に記載されるとおり、プレスフェロイド３Ｄ単層段階は、応用への大きな潜在能力を示す従来の２Ｄ単層よりも、相対的に強固な細胞−基層相互作用、高められた細胞−細胞相互作用、改善された極性および肝臓特異的な機能を特徴とした。ガラクトース／ＲＧＤハイブリッド基層を使用してこの構成を安定化することにより、本発明者らは、この３Ｄ単層段階を１週間まで維持することができた。その化学的かつ力学的安定性および定量的に制御可能な生物活性の手掛かりをもとに、透明なハイブリッドポリマー基層は、コラーゲンコーティングされた基層の代替物として、高スループット薬物代謝／肝毒性スクリーニングのための現在のミクロプレートベースの自動化プラットフォームに簡単にかつ直ちに組込まれる。例示的な薬物肝毒性研究が示すとおり、提供された３Ｄ肝細胞単層構成は、生体内での生物反応をよりよく要約する、生体異物の薬物動態／動態学データの生体外予測を改善した。このハイブリッド基層は、より良好な細胞付着性および機能を備えた３Ｄ肝細胞単層を得るためのバイオ人工肝臓装置用のバイオリアクターの細胞培養表面としても有用である可能性がある。
【００５９】
基層への一次肝細胞の効果的な接着および３Ｄ細胞の特徴をもとに、ＲＧＤ／ガラクトースハイブリッド基層上で安定化されたプレスフェロイド３Ｄ肝細胞単層は、以下の代表的な応用において（これらに限定されない）有用であり得る。その応用とは、肝細胞ベースの高スループットの（ｉ）生体異物の代謝または肝毒性スクリーニング、（ｉｉ）薬物研究、（ｉｉｉ）高含有量スクリーニング、ならびに（ｉｖ）ミクロプレートベースの代謝および毒性の研究である。
【００６０】
（ｉ）肝細胞ベースの高スループットの生体異物の代謝または肝毒性スクリーニング
３Ｄ肝細胞単層は、例えば［ＡＰ．Ｌｉ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２００５；２：１７９−１８５；Ｗｈｉｔｅ  ＲＥ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０００；４０：１３３−５７；Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ＢＪ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：１６７−７３］に記載されているような肝細胞ベースの高スループットの生体異物の代謝または肝毒性スクリーニングのために使用することができる。
【００６１】
（ｉｉ）薬物研究
ＡＤＭＥ／ＴＯＸ薬物特性、つまり吸収、体内動態、代謝、排泄および毒性、は臨床における成功に関連しかつそれにとって重大な、重要な薬物特性である。薬物ＡＤＭＥ／Ｔの正確な予測は、製薬業界にとっては依然として主要な課題のままである。予想されなかった副作用に起因する市販されている薬物の毎年の使用中止または厳しい使用制限から明らかなように、臨床前および臨床時の薬物ＡＤＭＥ／Ｔ評価の日常的な実施では、明らかに不十分である。肝臓は生物変換および生体異物（薬物を含む）の解毒の主たる臓器であるので、肝臓の実質細胞として、肝細胞ベースの薬物スクリーニングは、薬物候補の代謝および毒性を評価するために広く使用されてきた。生体異物の現在の肝細胞ベースの高スループット代謝／肝毒性スクリーニングのほとんどは、基材調製の容易さおよび一貫性に起因して、Ｉ型コラーゲンがコーティングされた９６ウェルまたは３８４ウェルのミクロプレート上で培養された肝細胞を使用して行われている。いくつかの他の生体外培養物構成は、肝細胞ベースの系の機能性および生体模倣性を改善しようとしており、それらとしては、３Ｄミクロカプセル、サンドイッチ培養物、３Ｄスフェロイド培養物マイクロキャリア培養物、バイオリアクター内部での潅流培養物および非実質細胞との共培養が挙げられる。しかしながら、それらの複雑な系は、プレート取扱いロボット、色素ベースの分析のための高密度ミクロプレートおよびプレート走査型リーダーなどの平行プロセスを支持する自動化および機器分析をもたらしている標準的な高スループットスクリーニングプラットフォームに容易には適合できない技術的複雑さという問題を抱えている。
【００６２】
その化学的かつ力学的安定性および定量的に制御可能な生物活性の手掛かりをもとに、３Ｄ肝細胞単層を生成するために本願明細書において提供される透明なハイブリッドポリマー基層は、コラーゲンコーティングされた基層の代替物として、高スループットの薬物代謝／肝毒性スクリーニングのための現在のミクロプレートベースの自動化プラットフォームに簡単にかつ直ちに組込まれる。３Ｄ肝細胞単層構成は、生体内での生物反応をよりよく要約する、生体異物の薬物動態／動態学データの改善された生体外予測を提供することが予想される。
【００６３】
一次肝細胞は、３Ｄスフェロイドの細胞を想起させる高レベルの肝細胞活性、細胞モルホロジーおよび細胞−細胞相互作用を呈しつつ、９６ウェルプレートにおいて透明なハイブリッド基層の上に単層として効果的に接着する。ハイブリッド基層上で培養された肝細胞はまた、ガラクトシル化された基層上で発現している肝細胞スフェロイドと同様の、アセトアミノフェンに対する高感度を呈する。この平坦なハイブリッド基層上で３Ｄ細胞の挙動を呈する肝細胞の単層は、高スループットの生体異物スクリーニングまたは他の応用について確立されている任意の既存の２Ｄ細胞培養プラットフォームと適合性である。
【００６４】
（ｉｉｉ）高含有量スクリーニング
高含有量スクリーニングは、自動化された画像ベースの技術を使用する細胞検定の解析を指す、細胞ベースの系に適用できる高スループットアプローチである。これによって、複数の検定パラメータをモニタリングすること、および細胞情報（細胞形状および生存能力、標的の動きおよびその化合物と他の生体分子との相互作用を含む）をワンステップで捕捉することが可能になる。差は、２Ｄ撮像装置を使用すると１ウェルあたり数１０００であるのに対して、通常の観察時間測定を使用して１ウェルあたり数データポイントである。このように、高含有量アプローチは、多くの細胞の特徴が一度に追跡できるため、細胞ベースのスクリーニングのコストを下げることができる。
【００６５】
光学的に透明なハイブリッド生物活性ＲＧＤ／ガラクトース基層上に維持される３Ｄ肝細胞単層の均一性に起因して、この系はまた、肝細胞ベースの高含有量スクリーニングにおけるコラーゲンコーティングされた基層のための代替物として使用することもできる。これによって、肝臓における肝細胞を示す３Ｄ肝細胞単層における細胞事象および細胞応答を評価しつつ、複数の検定パラメータ（ミトコンドリア膜電位、細胞内の遊離のカルシウム、原形質膜の完全性など）をワンステップでモニタリングすることが可能になる。
【００６６】
（ｉｖ）ミクロプレートベースの代謝および毒性の研究
ハイブリッド基層上で培養された肝細胞３Ｄ単層のスフェロイドを模倣する特性、単層構造、および効果的な付着のために、本願明細書に記載されるハイブリッド基層は、肝細胞ベースの応用（ミクロプレートベースの代謝および肝毒性試験ならびに平坦プレートバイオ人工補助装置など）のための従来のコラーゲンコーティングされた２Ｄ基層についての優れた代替物となる。ＡＰＡＰの例示的な肝毒性研究に示されるように、ハイブリッド基層上で培養された肝細胞は、ＡＰＡＰに対して、コラーゲン上で培養された肝細胞よりもより高い感度を示した。
【００６７】
アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）により誘発された肝毒性に対する、ＰＥＴ−ハイブリッド上およびＰＥＴ−Ｇａｌ上で培養された肝細胞のより高い感度は、より高いシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５Ｏ）酵素活性によって引き起こされているのかも知れない。同時投与した誘導因子（３ＭＣ）の「肝毒性の増幅効果」は、ＰＥＴ−ハイブリッドおよびＰＥＴ−Ｇａｌ上で培養された肝細胞のＣＹＰ４５０酵素のより高い誘発性に起因するかも知れないと考えられる。
【実施例】
【００６８】
（実施例１：ガラクトシル化された基層上のプレスフェロイド３Ｄ肝細胞単層段階の同定および特性解析）
【００６９】
（実施例１Ａ：アクリル酸をグラフトしたＰＥＴフィルムの製作）
厚みが約１００μｍの二軸配向させたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムを英国、ケンブリッジのＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  Ｉｎｃ．から購入した。ガラクトースリガンド、１−Ｏ−（６’−アミノへキシル）−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＡＨＧ、Ｍ．Ｗ．２７９）を以前に開発された方法［Ｙｉｎｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）：１５７−１６５；Ｆｉｎｄｅｉｓ  ＭＡ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ，１９９４，Ｍａｙ；４３（５）：４７７−４８５；Ｗｅｉｇｅｌら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ，１９７９；７０：８３−９１］に従って合成し、ＮＭＲスペクトルにより確認した。ＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳ）をＰｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。別段の記載がないかぎり、すべての他の化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから購入した。
【００７０】
生物活性リガンドを結合するための改変した手順［Ｙｉｎｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）１５７−１６５；Ｇｕｐｔａら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００２，Ｆｅｂ；２３（３）：８６３−８７１］を用いて、ポリアクリル酸（ｐＡＡ）をＰＥＴフィルム表面にグラフトした（図１）。手短に言えば、ＰＥＴフィルムを２ｃｍ×８ｃｍのストリップに切り、エタノール中で洗浄した。風乾したＰＥＴストリップを、１３．６ＭＨｚの無線周波数（ＲＦ）で動作するＳＡＭＣＯ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（Ｓａｍｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）で実施したアルゴンプラズマ処理にかけた。アルゴンを、５０ｍｌ／分の流量でＳＡＭＣＯキットのチャンバの中へ導入し、チャンバ圧力を２０Ｐａに維持した。プラズマを、４０Ｗの電力で１分間発生させた。プラズマ処理の後、ＰＥＴストリップを１０分間大気に曝して表面の過酸化物およびヒドロペルオキシドの形成を促し、これを引き続くｐＡＡのＵＶ誘導グラフト化に使用した。ＵＶ処理のために、長さ１２ｃｍ、直径２．５ｃｍの石英管を使用した。プラズマ処理したＰＥＴストリップを石英管中のアクリル酸を含む３０ｍｌの水溶液に浸漬した。アルゴンを溶液に吹き込んで徹底的に酸素を除き、アルゴン下でふたをした。この石英管を２８℃の一定温度の水槽に置き、ＵＶ−Ｆ  ４００ユニット（Ｐａｎａｃｏｌ−Ｅｌｏｓｏｌ  ＧｍｂＨ）の４００Ｗ投光機を使用してこれを３０分間ＵＶ照射した。グラフト化後、ＰＥＴストリップを管から取り出し、脱イオン水で２４時間徹底的に洗浄して表面に吸収された残留するホモポリマーを除いた。
【００７１】
（実施例１Ｂ：生物活性基層の製作および特性解析）
ｐＡＡ−ｇ−ＰＥＴ（すなわちｐＡＡをグラフトしたＰＥＴ）ストリップを、９６ウェルのミクロプレートにフィットさせるために直径６．４ｍｍの円形のディスクに切った。ＲＧＤペプチドおよびガラクトースリガンド（ＡＨＧ）を、「２ステップ」ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）化学を使用して、別々にまたは同時にアミド結合を介してｐＡＡｃ−ｇ−ＰＥＴ基層に結合した（図１）。手短に言えば、第１のステップで、１．５ｍｇ  ＥＤＣおよび０．３ｍｇスルホ−ＮＨＳを含有する１００μｌのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）をｐＡＡ−ｇ−ＰＥＴディスクを含む各９６ウェルに加え、ＮＨＳエステルを形成することにより表面カルボキシル基を活性化した。室温での２時間の活性化後、ＭＥＳ溶液を完全に除去し、リガンドを含む１００μｌ  リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で再び満たし、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で４℃で４８時間、３００ｒｐｍで振盪することにより活性化された基層と反応させた。
【００７２】
ＰＥＴ−ＲＧＤまたはＰＥＴ−Ｇａｌを、それぞれ、ＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳ）またはガラクトースリガンド（１−Ｏ−（６’−アミノへキシル）−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＡＨＧ）との反応により製作した。ＰＥＴ−ハイブリッドを、様々な比のＧＲＧＤＳおよびＡＨＧの均一な混合物との反応により製作した。
【００７３】
生物活性リガンドの結合後、各サンプルを０．５％エタノールアミン溶液で１〜５分間クエンチし、未反応のカルボキシル基と肝細胞との非特異的相互作用をブロックした。様々な基層を含むミクロプレートを、７０％エタノールに３時間浸すことにより滅菌し、ＰＢＳで３回リンスした。コラーゲンコーティングされた基層を、９６ウェルミクロプレートの各ウェルにて１００μｌの１．５ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を４℃で一晩インキュベーションすることにより調製した。過剰のコラーゲン溶液を吸引し、各ウェルをＰＢＳで３回リンスした。
【００７４】
ＰＥＴフィルム上のカルボキシル基のグラフト密度を、以前に報告されたトルイジンブルー染色［Ｙｉｎｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）１５７−１６５；Ｕｃｈｉｄａら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９３；９：１２２１−１１２４］を使用して、比色法により決定した。
【００７５】
ＸＰＳを、ＰＥＴ上へのｐＡＡグラフト化およびリガンド結合を定量的に確認するために使用した。測定は、Ｍｇ  Ｋα  Ｘ線源（１２５３．６ｅＶ  光子）を備えたＶＧ  ＥＳＣＡＬＡＢ  Ｍｋ  ＩＩ分光計で４０の一定の遅延比で行った。
【００７６】
最初のＰＥＴフィルムのＸＰＳ広角走査スペクトルは、Ｃ  １ｓ（結合エネルギー、２８５ｅＶ）およびＯ  １ｓ（結合エネルギー、５３２ｅＶ）に対応するピークを示し、これは炭素および酸素のシグナルの存在を明らかにした。ＰＥＴ−ｐＡＡｃフィルムのスペクトル（図２上段、左の図）は、最初のＰＥＴフィルムと同一のピークを示した。しかしながら、炭素ピークに対する酸素ピークの相対強度比は、最初のＰＥＴフィルムにおける比よりもＰＥＴ−ｐＡＡフィルムにおいてのほうが高い。ｐＡＡｃグラフト化密度を、ＴＢＯ比色分析［Ｙｉｎｇら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）１５７−１６５；Ｕｃｈｉｄａら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９３；９：１２２１−１１２４］により定量した。８．２±２．３から２５８．２±２４．２ｎｍｏｌ／ｃｍ２までのカルボキシル基密度を有するＰＥＴ−ｐＡＡ基層を、アクリル酸モノマー溶液の初期濃度を１％−５％で変えることにより得ることができた。
【００７７】
カルボキシル基および結合されるガラクトースリガンドの密度の差は、密度がある値を超えれば、肝細胞３Ｄスフェロイド形成および機能維持においては有意な差につながらないと予想された［Ｙｉｎｇら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３を参照］。比較的非効率的な２ステップの「ΕＤＣ化学」［Ｈｅｒｓｅｌら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３，Ｎｏｖ；２４（２４）：４３８５−４４１５］を使用して適度に高いリガンド結合密度を実現するために、３．７５％アクリル酸モノマー溶液を選択して、以下のリガンド結合および細胞培養研究のための７８．５±１０．２ｎｍｏｌ／ｃｍ２のカルボキシル基密度のＰＥＴ−ｐＡＡを製作した。
【００７８】
ＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳ）および／またはＧａｌリガンド（ＡＨＧ）をＰＥＴ−ｐＡＡフィルム上に結合し（図１）、リガンドの結合が成功したことをＸＰＳ（図２）により確認した。最初のＰＥＴおよびＰＥＴ−ｐＡＡとは対照的に、Ｎ  １ｓ（結合エネルギー、４００ｅＶ）に対応する新しいピークがＰＥＴ−ＲＧＤ、ＰＥＴ−ＧａｌおよびＰＥＴ−ハイブリッドフィルムのスペクトルに現れた。フィルム上に結合されたＧＲＧＤＳおよび／またはＡＨＧの量を測定するために、結合されたＧＲＧＤＳおよび／またはＡＨＧを酸加水分解によってフィルムから取り除き、加水分解したＧＲＧＤＳおよびＡＨＧ上のα−アミンを蛍光物質に誘導体化した後に、この加水分解したＧＲＧＤＳおよびＡＨＧを蛍光検出器を備えたＲＰ−ＨＰＬＣで定量した。様々なサンプルの代表的なクロマトグラムを図３Ａに図示する。ＰＥＴ−ハイブリッド中のＧＲＧＤＳおよびＡＨＧの比を、フィルム上のＧＲＧＤＳおよびＡＨＧの結合効率をモニタリングすることにより制御した。
【００７９】
ＰＥＴ上のＲＧＤおよび／またはＧａｌリガンドを、Ａｃｉｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｃ．Ａ．Ｔ．ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．）を使用して、真空下、６Ｎ  ＨＣｌ中で１１０℃で２４時間、基層から加水分解した。冷却した加水分解した溶液を新しいバイアルへ濾過し、窒素下でエバポレーションした。ＰＥＴから加水分解したリガンドを５０μｌ脱イオン水に再懸濁し、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の逆相Ｃ−１８カラム上での分離後の蛍光検出のためのＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ  Ａｍｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して誘導体化した。最適化された動作条件：移動相：Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ；勾配：Ａ／Ｂ（９８：２）から４５分後（７０：３０）；流量：１ｍｌ／分；蛍光検出：４５０ｎｍでの励起、５５０ｎｍでの発光。標準曲線を、可溶性ＲＧＤペプチドおよびＧａｌリガンドに対して作成した。ＲＧＤペプチドの加水分解生成物の中で、アルギニンに対応するピークを、その鋭さおよびクロマトグラフにおける早い溶出時間に起因して、ＲＧＤペプチドを表し定量するために選択した。
【００８０】
ＧＲＧＤＳはＡＨＧよりも高い結合効率を呈した（図３Ｂ）。３ｍｇ／ｍｌ（９６ウェルあたり０．３ｍｇ）のＡＨＧに対して、０．６ｍｇ／ｍｌ（９６ウェルあたり０．０６ｍｇ）のＧＲＧＤＳが活性化されたＰＥＴ−ｐＡＡｃフィルムと反応し、約１：１の結合比を達成した。フィルム上に結合されたＧＲＧＤＳおよびＡＨＧの最終密度は、それぞれ、５．６３±０．８６ｎｍｏｌ／ｃｍ２および６．９４±０．７４ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。ＰＥＴ−ｐＡＡｃフィルム上で利用可能な７８．５±１０．２ｎｍｏｌ／ｃｍ２のカルボキシル基に対して、約１６％がリガンドに結合された。１：５および５：１の比の結合されたＧＲＧＤＳおよびＡＨＧを実現するために、それぞれ０．１２ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌのＧＲＧＤＳを使用して、ＰＥＴ−ｐＡＡフィルム上で３ｍｇ／ｍｌ  ＡＨＧと結合させた。ＧＲＧＤＳ／ＡＨＧの最終密度は、１９．４０±３．１９／４．３６＋０．４５ｎｍｏｌｌ／ｃｍ２および１．３１±０．４９／５．３８±０．８９ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。ＰＥＴ−ＧａｌおよびＰＥＴ−ＲＧＤフィルムについて、それぞれ３ｍｇ／ｍｌ  ＡＨＧおよび０．６ｍｇ／ｍｌ  ＧＲＧＤＳがＰＥＴ−ｐＡＡフィルムに結合された。ＰＥＴ−ＧａｌのＡＨＧの最終密度は、５．９２±０．７４ｎｍｏｌ／ｃｍ２であり、ＰＥＴ−ＲＧＤのＧＲＧＤＳは７．０４±０．９６ｎｍｏｌ／ｃｍ２である。
【００８１】
（実施例１Ｃ：ガラクトシル化された基層上での肝細胞自己集合の動的プロセス）
ガラクトシル化された基層上での肝細胞自己集合のプロセスを、以下の方法を使用して調べた。
【００８２】
「底がガラクトシル化された」培養皿を、ＷｉｌｌＣｏ−ｄｉｓｈ  Ｋｉｔ（ＷｉｌｌＣｏ  Ｗｅｌｌｓ  Ｂ．Ｖ．、オランダ）を使用し、（実施例１Ｂに示した）ガラクトシル化されたＰＥＴフィルムを底の中央領域が空の特別の皿に貼って組立てた。使用したこの特別の皿は３５ｍｍ皿であった。肝細胞を、ガラクトシル化されたフィルム上に１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種し、温度およびＣＯ２を制御したライブ画像化チャンバ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）中で培養した。肝細胞モルホロジーの透過画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ｍｅｔａ  ５１０共焦点顕微鏡の１０×対物レンズを使用して、３日目まで５分毎に捉えた。広がりの傾向に関する細胞モルホロジーの動的変化を画像加工（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｐｒｏｂｅ）により、細胞が覆う基層の総面積として定量し、０時間における播種後細胞の面積で規格化することによって計算した基層被覆率として表現した。
【００８３】
３．７％パラホルムアルデヒドで固定したサンプルをＰＢＳでリンスし、酸化オスミウム（ＶＩＩＩ）で１時間、後固定した。脱水は、段階系列（ｇｒａｄｅｄ  ｓｅｒｉｅｓ）のエタノール（２５％、５０％、７５％、９５％、および１００％）を使用して行った。サンプルを、無水アルコール中で２時間、臨界点乾燥し、真鍮の台上にマウントし、白金でスパッターコーティングし（ＪＦＣ−１６００、ＪＥＯＬ）、その後、電界放射型走査電子顕微鏡（ＪＳＭ−７４００Ｆ、ＪＥＯＬ）で観察した。
【００８４】
共焦点透過画像（図４Ａ）およびＳＥＭ写真（図４Ｂ）が示すとおり、肝細胞自己集合の間、細胞モルホロジーおよび基層被覆率に劇的な変化が起こった。ガラクトシル化された基層上の肝細胞は２サイクルの細胞集合を経て、成熟したスフェロイドを形成した。このガラクトシル化された基層上に播種された単一の肝細胞が、１２時間以内にいくつかの肝細胞を含む小さい凝集体をまず形成し、基層の被覆率の面積が小さくなった。細胞の移行が、細胞−細胞の接触の確立および小さい凝集体間の収縮を促し、１日後、これが徐々に、より大きい「島様の」クラスターへと合体した。この「島様の」クラスターはさらに広がり、２日間以内に最大基層被覆率を有する単層を形成する。強固な細胞−細胞収縮に起因して、プレスフェロイド単層の端縁の細胞は、引き伸ばされて多層へと折り畳まれ、成熟したより大きい３Ｄスフェロイドへと密集し、３日後には最終的には基層から剥がれる。
【００８５】
（実施例１Ｄ：肝細胞スフェロイド自己集合の間の細胞骨格再組織化）
細胞骨格は細胞の広がり、移行および組織形成を媒介する主要な動力源（ｆｏｒｃｅ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）であるため、ガラクトシル化された基層上での肝細胞３Ｄスフェロイド自己集合の間、および比較としてのコラーゲンコーティングされた基層の上での従来の２Ｄ単層形成の間、主要な骨格タンパク質の１つであるアクチンフィラメントの動的再組織化を調べた。
【００８６】
Ｆ−アクチン染色については、細胞を３．７％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で室温で１時間ブロックし、１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で５分間透過化し、ＴＲＩＴＣ−ファロイジン（１μｇ／ｍｌ）とともに２０分間インキュベーションし、３回リンスした後、画像化した。ｐ−ＦＡＫ、およびＥ−カドヘリンの染色ならびにＭＲＰ２／ＣＤ１４７およびＺＯ−１／ＣＤ１４７の二重染色法については、３．７％パラホルムアルデヒドで固定した細胞を１０％  ＦＣＳ中で室温で１時間ブロックした。サンプルを一次抗体（ＺＯ−１／ＣＤ１４７およびＭＲＰ２／ＣＤ１４７二重染色法については１：１０；Ｅ−カドヘリンおよびｐ−ＦＡＫ染色については１：２０；一次ウサギ抗ｐ−ＦＡＫ抗体はＵｐｓｔａｔｅ（米国、シャーロッツビル）から購入し、一次ウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（米国、カリフォルニア州）から購入した）とともに４℃で一晩インキュベーションし、その後ＰＢＳで３回リンスした。次いでサンプルを、二次抗体とともにインキュベーションした。二次のＴＲＩＴＣ結合したヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合したヤギ抗マウスＩｇＧをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、シンガポール）から購入し、室温で１時間、ＰＢＳで３回リンスし、その後ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（商標）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、サンディエゴ）でマウントした。サンプルを、６３×水レンズを使用して共焦点顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ３００、オリンパス）で観察した。
【００８７】
アクチンフィラメントは多段階の３Ｄスフェロイド形成の間に顕著な再配置を経た。播種から１２時間後の小さい凝集体中の肝細胞について、アクチンフィラメントはすでに細胞−細胞接触領域に局在しており（図５）、これは細胞−細胞相互作用の確立を示す。小さい肝細胞凝集体が、１日後に「島様の」クラスターに合体するとき、アクチンストレスファイバーが細胞−基層接触領域全体に観察された。これらは徐々に、クラスターとして細胞周辺に再局在化し、このクラスターは、観察されたアクチンストレスファイバーが有意に小さくなり単層の端縁の細胞だけに見られるようになるまで、広がってプレスフェロイド単層を形成する。プレスフェロイド単層の細胞−細胞接触領域におけるアクチンフィラメントの皮層分布は、成熟した３Ｄスフェロイドにおいても観察され、これはプレスフェロイド単層の３Ｄ細胞的な特徴を示す。対照的に、アクチンフィラメントは徐々にストレスファイバーを形成し、それは、コラーゲンコーティングされた基層中の従来の２Ｄ単層形成の間、細胞−基層接触領域全体で強度を増した（図５）。
【００８８】
（実施例１Ｅ：細胞−細胞相互作用および細胞−基層相互作用の均衡による肝細胞自己集合の調節）
アクチン細胞骨格はアダプタータンパク質（α−アクチニン、タリン、フィラミン）を介して細胞−基層相互作用を媒介するための接着斑（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）およびカテニンを介して細胞−細胞相互作用を媒介するためのカドヘリンの両方に連結されているため、様々なアクチン構成の存在は、細胞−細胞相互作用によりもたらされる力と細胞−基層相互作用によりもたらされる力との間の競合を示す。この競合を、肝細胞３Ｄ単層および従来の２Ｄ単層の形成の間のリン酸化された接着斑キナーゼ（ｐ−ＦＡＫ）およびＥ−カドヘリン（ＥＬＩＳＡによる）の発現レベルの変化を（ＥＬＩＳＡにより）定量することにより調べた（図６Ａ）。接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）は、インテグリンを介した基層への付着の際に細胞骨格によってもたらされる力に反応して接着斑の集合を調節することに関与する、鍵となるタンパク質である。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への細胞のインテグリン媒介性接着は、ＦＡＫのＴｙｒ−３９７残基での自己リン酸化を開始させる。ｐ−ＦＡＫの発現を、細胞−基層相互作用のインジケータとして定量した。細胞−細胞相互作用を媒介するための主要な細胞接着タンパク質として、Ｅ−カドヘリンを細胞−細胞相互作用のインジケータとして選択した。
【００８９】
ｐ−ＦＡＫのＥＬＩＳＡを、ＦＡＣＥ（商標）ｐ−ＦＡＫ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｉｎｃ．，米国）の手順に従って実施した。手短に言えば、９６ウェルプレートで様々な基層上で培養された肝細胞を、ｐ−ＦＡＫのＥＬＩＳＡのために３．７％  パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、またはメタノール／アセトン（１：１）溶液で１５分間固定した。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００でリンスして１％  ＢＳＡで室温で１時間ブロックした後に、細胞を、１：２００希釈した抗ｐ−ＦＡＫ一次抗体とともに４℃で一晩インキュベーションした。この細胞を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で３回洗浄し、１：２５００希釈した抗ＩｇＭ−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）二次抗体とともに室温で１時間、インキュベーションした。０．１％  Ｔｒｉｔｉｏｎ−Ｘ  １００で３回、ＰＢＳで２回リンスした後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン、ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）基質溶液で発色させることによりＨＲＰ活性を比色測定した。吸収を４５０ｎｍで測定した。
【００９０】
ウエスタンブロッティング研究のために、培養された肝細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、シンガポール）を補ったＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ）で、４℃で３０分間溶解させた。溶解液を、１０，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離することにより清澄にした。１サンプルあたりのタンパク質濃度を、サンプル装填緩衝液（２％  ＳＤＳ、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％  グルセロール、０．１％  ブロモフェノールブルー、５％  ２−メルカプトエタノール）中に希釈して９５℃で５分間加熱したＤｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｕ．Ｓ）によって定量した。１レーンあたり１０μｇのタンパク質サンプルを装填し、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分画し、半乾式エレクトロブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に移した。この膜をＴＢＳ−Ｔ中の５％  無脂肪乳を用いて室温で１時間ブロックし、一次ウサギ抗Ｅ−カドヘリンまたは抗β−アクチンもしくは抗ＧＡＰＤＨ（ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中に１：１０００希釈した）とともに４℃で一晩インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した後、この膜を、２．５％無脂肪乳に１：１０，０００希釈した二次の、ロバペルオキシダーゼ（ｄｏｎｋｅｙ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）に結合された抗ウサギＩｇＧとともに室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄した後、この膜をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＬＣ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）で処理し、この膜をＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）に露出することにより発光を検出した。フィルムをＫＯＤＡＫ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｘ−ｒａｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＫＯＤＡＫ、米国）を使用して現像し、ＫＯＤＡＫ  ＩＭＡＧＥ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ２０００ＭＭ（ＫＯＤＡＫ、米国）を使用して画像化した。
【００９１】
肝細胞スフェロイド自己集合のプロセスの間、ｐ−ＦＡＫ発現のレベルは初期にはプレスフェロイド単層の形成とともに高まったが、３Ｄ成熟したスフェロイドの形成とともに低下した。対照的に、ｐ−ＦＡＫ発現の一定の増加が従来の２Ｄ単層形成の間観察された。
【００９２】
Ｅ−カドヘリンはＰＥＴ−ｇａｌフィルム上で培養されたすべての４段階での肝細胞において高度に発現し、プレスフェロイド単層および３Ｄスフェロイドに由来する細胞においてはわずかのアップレギュレーションを伴った（図６Ｂ）。これは強固な細胞−細胞相互作用を示す。コラーゲン基層上で培養された肝細胞におけるＥ−カドヘリンの発現は、初期には稀であったが、後に２Ｄ肝細胞単層形成の間、有意にアップレギュレーションされた（図６Ｂ）。これは徐々に細胞−細胞相互作用が高まったことを示す。
【００９３】
細胞骨格組織化およびｐ−ＦＡＫ／Ｅ−カドヘリン発現を観察したことにより、肝細胞スフェロイド形成の４段階の中で、プレスフェロイド単層が３Ｄスフェロイドに類似のアクチン分布およびＥ−カドヘリン発現レベルを呈するが、それは３Ｄスフェロイドよりもより強いｐ−ＦＡＫ発現であることが示された。プレスフェロイド単層、３Ｄスフェロイドおよび従来の２Ｄ単層のＥ−カドヘリン／ｐ−ＦＡＫのダブルイムノアッセイ（ｄｏｕｂｌｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｉｎｇ）により、ＥＬＩＳＡの結果が確認された（図６Ｃ）。Ｅ−カドヘリンは、プレスフェロイド３Ｄ単層の側方境界および３Ｄスフェロイドに局在し、これは２Ｄ単層におけるよりもはるかに少なかった。ｐ−ＦＡＫクラスターは、２Ｄ単層では観察し、プレスフェロイド３Ｄ単層ではより低いレベルで観察したが、３Ｄスフェロイドでは観察されなかった。すべての上記の知見は、プレスフェロイド単層が肝細胞ベースの応用のための優れた構成であることを示す。
【００９４】
（実施例１Ｆ：プレスフェロイド３Ｄ単層、３Ｄスフェロイドおよび従来の単層における肝細胞極性および密着結合形成）
様々な培養構成の間の機能的構造の特徴を、極性および密着結合形成によって評価した。これらは、それらが生体内での状況を予想するものであれば、生体外構成についての貴重な基準である。細胞極性の形成の研究は、多剤耐性関連タンパク質（Ｍｒｐ２）および側底ＣＤ１４７をそれぞれ頂端（ａｐｉｃａｌ）マーカーおよび側底（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）マーカーとして、毛細胆管トランスポーターを調べることにより行った。共焦点画像を、これらの２マーカーの共局在化を定量するために加工した。一次抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体をＳｅｒｏｔｅｃ（ノースカロライナ州、ローリー）から購入した。一次ウサギ抗ＺＯ−１抗体をＺｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国、サンフランシスコ）から購入した。
【００９５】
蛍光二重染色法に加えて、細胞境界（側底ＣＤ１４７）に沿ったＭｒｐ２またはＺＯ−１局在化の定量を、Ｖｉｓｕａｌ  Ｃ＋＋  ６．０で開発された画像加工アルゴリズムを実行することにより実施した。ＣＤ１４７染色からの各画像の緑色ピクセルを、まずセグメント化に閾値を設けることにより２値化して１ピクセルの厚みを有する細胞境界を得て、Ｍｒｐ２またはＺＯ−１染色からの同一の画像における赤色ピクセルを２値化してそれぞれのマーカーの有意な濃度を含む領域を得、そして画像における赤色ピクセルの総数をＩ全量として算出した。各赤色ピクセルについて、最近接の細胞境界ピクセルまでの距離を距離マップから得た（Ｌｉｎｇら，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１，１９９４）。毛細胆管様構造に存在する細胞外の赤色ピクセルを同定し、「領域成長」アルゴリズム（Ｂｉｓｃｈｏｆら，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  １９９４）を使用することにより、細胞内の赤色ピクセルから判別した。最近接の境界ピクセルからの２ピクセルの距離内にある細胞内の赤色ピクセルおよび細胞外赤色ピクセルをＩ局在化としてカウントした。Ｉ局在化とＩ全量との間の比を使用して、細胞境界に沿ったＭｒｐ２またはＺＯ−１の局在化を記述した。
【００９６】
細胞本体内部のＭｒｐ２のランダム分布をコラーゲン上の従来の２Ｄ単層において観察したが、他方、プレスフェロイド３Ｄ単層において、Ｍｒｐ２は細胞−細胞接触領域に局在した（これは極性の確立のプロセスにおいて後の事象の１つである）。３Ｄスフェロイドにおいて、極性構造が完全に構築され、より多くのＭｒｐ２がいくつかの接触した細胞の間に確立された毛細胆管様構造を満たした。密着結合タンパク質ＺＯ−１および側底マーカーＣＤ１４７を使用する密着結合染色は、同一の傾向を示した。プレスフェロイド３Ｄ単層において、密着結合タンパク質ＺＯ−１は細胞−細胞接触に沿って局在化した領域に濃縮されたが、従来の２Ｄ単層においては、ＺＯ−１はより拡散している（図７Ａおよび図７Ｂ）。
【００９７】
（実施例１Ｇ：プレスフェロイド３Ｄ単層、３Ｄスフェロイドおよび従来の単層の分化機能）
プレスフェロイド３Ｄ単層構成の潜在的な応用の可能性を評価するために、２日目で培養されたこの一過性の段階における肝細胞の肝臓特異的な機能（合成、解毒および代謝活性など）を２日目の従来の２Ｄ単層、および３日目の３Ｄスフェロイドと比較した。
【００９８】
すべての機能データを１０６細胞に対して規格化した。細胞数を、Ｐｉｃｏ−ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ定量キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＤＮＡの全量に基づき算出した。毎日のアルブミン産生を、Ｒａｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、テキサス州、モンゴメリー）を使用して測定した。２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌとともに培養培地中で９０分間インキュベーションした肝細胞培養物の尿素産生を、Ｕｒｅａ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、テキサス州、Ｂｏｅｒｎｅ）を使用して測定した。シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）１Ａと会合したモノオキシゲナーゼ酵素の脱エチル化活性の尺度である７−エトキシレゾルフィン  Ｏ−脱エチル化（ＥＲＯＤ）検定を、測定の前より１日早く３−ＭＣによる誘発がある場合およびない場合ともに、培養物を３９．２μＭの７−エトキシレゾルフィンとともに培養培地の中で３７℃で４時間インキュベーションすることにより、開始した。酵素が変換したレゾルフィンの量を、ミクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ、スイス）を使用して、レゾルフィン標品に対するインキュベーション培地におけるレゾルフィン蛍光を５４３ｎｍの励起／５７０ｎｍの発光で測定することにより算出した。
【００９９】
図８は、プレスフェロイド３Ｄ単層としての肝細胞の、アルブミン分泌および３ＭＣにより誘発される７−エトキシレゾルフィン  Ｏ−脱エチル化シトクロムＰ４５０活性は従来の２Ｄ単層のそれよりも有意により高く、３Ｄスフェロイドのそれに匹敵することを示す。尿素合成は、これらの３つの構成の間で有意な差を示さなかった。
【０１００】
（実施例１Ｈ：アセトアミノフェンに誘発される肝毒性に対するプレスフェロイド３Ｄ単層および従来の単層の感度）
一般に使用される鎮痛剤であるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）は、動物およびヒトにおいて大量に摂取した場合、特に慢性的なエタノール消費後に投与した場合に、肝毒性を引き起こすことが知られている。肝毒性は、組織高分子に結合し、それにより細胞壊死を開始することができる毒性のある中間体へと、アセトアミノフェンがシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）酵素によって生物変換されることに由来する。ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２ＥおよびＣＹＰ３Ａは、アセトアミノフェンを代謝することができることが示されているもっとも活性なアイソフォームである。ＣＹＰ活性の誘発は、ＡＰＡＰ毒性の高まりをもたらすことが示された。アフラトキシンＢ１は、ヒトおよび実験動物において急性肝毒性および肝臓癌を引き起こす。アフラトキシンは、通常、ＣＹＰ２Ｃ１１および３Ａ２によって酸化され、中間体の反応性エポキシドを生成し、このエポキシドは、細胞高分子に結合し肝臓の門脈周辺領域に損傷を与える。プレスフェロイド単層および２Ｄ単層に対してアセトアミノフェンまたはアフラトキシンＢ１が引き起こす肝毒性に対する反応を調べた。
【０１０１】
肝毒性試験では、培地中のＤＭＳＯの最終濃度が各薬物濃度において０．２％未満であるようにアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）をＤＭＳＯに溶解した。ＰＥＴ−Ｇａｌフィルム上で培養された２日目のプレスフェロイド３Ｄ肝細胞単層およびコラーゲン上で培養された２日目の従来の肝細胞を種々の濃度で２４時間ＡＰＡＰに曝露し、このとき細胞の生存能力を測定した。
【０１０２】
水溶性テトラゾリウム塩ＭＴＳ（３−［４，５，ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カルボキシメトキシ−フェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈテトラゾリウム、内部塩）の還元を細胞生存能力を測定するために使用し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。試験毒素での処理後、細胞を、フェノールレッドを欠くＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培養培地中の５×希釈したＭＴＳ試薬の１００μｌ／ウェルに曝露し、３７℃で３時間インキュベーションした。ＭＴＳの吸収を、ミクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２）を使用して４５０ｎｍで測定した。様々な基層上で培養された肝細胞のＡＰＡＰに誘発された肝毒性の反応を、ＡＰＡＰに誘発された肝細胞でのＭＴＳ値をＡＰＡＰに曝露していない肝細胞でのＭＴＳデータに対して規格化することにより算出した「生存率」として表現した。
【０１０３】
薬物を欠く条件下で、すべての培養物構成における肝細胞は同様のベースとなるレベルの生存能力を示した。すべての薬物投与量において、プレスフェロイド単層は、２Ｄ単層よりも高い、（低生存率によって決定したとおり）アセトアミノフェンまたはアフラトキシンＢ１に誘発された肝毒性に対する感度を呈した（図９）。２Ｄ単層と比べて、アセトアミノフェンまたはアフラトキシンに誘発された肝毒性に対するより高い感度は、３Ｄスフェロイドにおいても観察された（データは示さず）。このことは、プレスフェロイド単層の薬物反応は３Ｄスフェロイドの反応に似ていることを示す。
【０１０４】
（実施例２：ハイブリッドＲＧＤ／ガラクトース基層上の３Ｄ肝細胞単層の安定化）
実施例１で同定したプレスフェロイド３Ｄ単層は肝細胞自己集合の動的プロセスの間の一過性の段階にすぎないため、本発明者らは、それらが長期の応用で使用できるように、ＧＲＧＤＳペプチドおよびガラクトースリガンドをＰＥＴ基層上へ結合すること（ＲＧＤ／ガラクトースＰＥＴ−ハイブリッド）によるプレスフェロイド３Ｄ単層の安定化の実行可能性を調べた。様々な生物活性基層（ＰＥＴ−Ｇａｌ、ＰＥＴ−ＲＧＤ、ＰＥＴ−ハイブリッド）を製作するための方法は実施例１Ｂで説明した。
【０１０５】
（実施例２Ａ：生物活性基層上の肝細胞の付着性）
様々な生物活性基層（ＰＥＴ−Ｇａｌ、ＰＥＴ−ＲＧＤ、ＰＥＴ−ハイブリッド）上の肝細胞付着性を調べた。
【０１０６】
最初に、肝細胞を、２ステップのｉｎ  ｓｉｔｕコラゲナーゼ潅流法［Ｓｅｇｌｅｎら，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９７６；１３：２９−８３］により、体重が２５０−３００ｇの雄性Ｗｉｓｔａｒラットから採取した。肝細胞の生存能力をトリパンブルー排斥法（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）により９０％超と、収量を＞１０８細胞／ラットと決定した。
【０１０７】
新たに単離したラット肝細胞（３．２×１０４）を９６ウェルミクロプレート内に１×１０５細胞／ｃｍ２で様々な基層の上に播種し、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）、０．５μｇ／ｍｌのインスリン、５ｎＭ  デキサメタゾン、５０ｎｇ／ｍｌ  リノール酸、１００単位／ｍｌ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補った１００μｌのＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培養培地中で培養した。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２および９５％の湿度でインキュベーションした。２時間のインキュベーション後、付着しなかった細胞を含む培養培地を除去し、ウェルをＰＢＳでリンスし、新しい培養培地で満たした。肝細胞の初期の培養物を２時間インキュベーションし、付着しなかった細胞を除去した。
【０１０８】
２時間後の様々な基層上の肝細胞付着性（未付着の細胞を除去した後のものである）を、ＤＮＡ分析方法［Ｂｒｕｎｋら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７９，Ｊａｎ  １５；９２（２）：４９７−５００に基づき算出した。付着した細胞を、ＤＮＡを欠く脱イオン水中で−８０℃で一晩凍結し、３７℃で融解させることによる凍結−融解サイクルによって基層上で溶解させた。ＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用して測定した。付着した細胞数を、既知数の細胞のＤＮＡ濃度から生成した標準曲線を使用して決定した。様々な基層上の肝細胞付着性を播種効率（付着した細胞数を最初に播種した全細胞数で割ったもの）として表現した。
【０１０９】
図１０Ａに示すように、リガンド結合によって、播種の２時間後の生物活性基層上への肝細胞付着性は有意に増加した。肝細胞は、ＰＥＴ−Ｇａｌ、ＰＥＴ−ハイブリッドおよびコラーゲンに付着し、適度にＰＥＴ−ＲＧＤに付着したが、ｐＡＡｃ−ＰＥＴおよび組織培養プレート（ＴＣＰ）にはほんのわずかしか付着しなかった。同様の数の肝細胞が、１：５、５：１または１：１のＲＧＤ：Ｇａｌ比のＰＥＴ−ハイブリッドに対して付着した。
【０１１０】
培養した肝細胞は、全ＤＮＡ含有量の変化（図１０Ｂ）が示すように、７日間の培養の間に種々の基層上への異なる付着性を示した。全ＤＮＡ含有量を、基層に付着した生存できる細胞の見積もりとして使用した［Ｄｕｎｎら，Ｆａｓｅｂ  Ｊ，１９８９，Ｆｅｂ；３（２）：１７４−１７７；Ｈａｓｉｒｃｉら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ，２００１，Ａｕｇ；７（４）３８５−３９４］。全ＤＮＡ含有量が徐々に低下したことは、主に、毎日の培地の変更の間の細胞消失に起因していると考えた。３Ｄスフェロイドが３日後に基層から剥がれ始めたのにつれて、ＰＥＴ−ｇａｌ上で培養された肝細胞のＤＮＡ含有量の急激な低下が３日目以降に観察された。他方、他の基層では、ＤＮＡ含有量の滑らかな低下が観察された。ＰＥＴ−ＲＧＤ上で培養された肝細胞の全ＤＮＡ含有量が低いことは、最初に播種した細胞数が少なかったことによる。コラーゲン基層およびＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞は、１週間の培養の間、５日目以降からＰＥＴ−Ｇａｌ上よりも有意により良好な付着性（Ｐ＜０．０１）を示した。これらの結果は、生物活性リガンド（ＲＧＤペプチド、ガラクトースリガンド、またはＲＧＤ／ガラクトースハイブリッド）の存在に起因して、播種後の細胞付着性が高まったことを示す。
【０１１１】
（実施例２Ｂ：生物活性基層上の肝細胞の経時的なモルホロジー変化）
肝細胞モルホロジーに対する基層特徴（結合される生物活性リガンドの存在など）の重大な影響が観察された。
【０１１２】
図１１は、細胞播種から１日目、３日目および６日目の培養された肝細胞の位相コントラスト画像を提示する。播種後１日以内では、肝細胞は、ＰＥＴ−Ｇａｌ上に小さいプレスフェロイドを形成し、ＰＥＴ−ハイブリッド（ＲＧＤ：Ｇａｌ＝１：１）上には広がっていない凝集体を形成したが、肝細胞は、ＰＥＴ−ＲＧＤおよびコラーゲン基層上には広がり始めた。
【０１１３】
３日間の培養後、あまりコンパクトでない３ＤスフェロイドがＰＥＴ−Ｇａｌ上に生成し、そのうちのいくつかは基層から剥がれた。ＰＥＴ−ハイブリッド上の肝細胞は、明確な細胞−細胞境界を有するあまり広がっていない２Ｄ単層を生成した。ＰＥＴ−ＲＧＤおよびコラーゲン基層上では、肝細胞は完全に広がって平らになりコンフルエントな単層を生成した。
【０１１４】
６日後、ほとんどが基層から剥がれた成熟したスフェロイドをＰＥＴ−Ｇａｌ上に観察した。ＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞単層は、ＰＥＴ−ＲＧＤおよびコラーゲン上で培養された肝細胞の完全に広がった２Ｄ単層とは明らかに異なる「島様の」単層へと引き伸ばされた。ＰＥＴ−ハイブリッド上の引き伸ばされた［島様の」単層は、細胞が基層から剥がれるまで少なくとも１週間維持することができた。ＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞の動的モルホロジーを「３Ｄ単層」と名付ける。これは、ＰＥＴ−ＲＧＤおよびコラーゲン基層上で見られる広がった２Ｄ単層とは明らかに異なっていた。様々なＲＧＤペプチドを備えたＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞では有意なモルホロジーの差は観察されなかった。それゆえ、ＲＧＤ：Ｇａｌ  １：１比を有するハイブリッド基層のみを、本願明細書に記載する研究において肝細胞培養物のために使用した。これらの結果は、３Ｄ肝細胞単層をＰＥＴ−ハイブリッド上で安定化できることを示した。
【０１１５】
（実施例２Ｃ：生物活性基層上で培養された肝細胞のＦ−アクチン、ｐ−ＦＡＫおよびＥ−カドヘリン分布および発現）
いかなる提案された作用メカニズムにも拘束されることはないが、ＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞は、２Ｄ単層より強固な細胞−細胞相互作用およびより弱い細胞−基層相互作用を経験し、このためにＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞は３Ｄ細胞モルホロジーを維持することができると考えられる。ＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された３Ｄ単層は、上で観察したように、培養基層により良好に接着するので、ＰＥＴ−Ｇａｌ上の３Ｄスフェロイドよりも強固な細胞−基層相互作用をも有するはずである。コラーゲン基層上で培養された肝細胞の２Ｄ単層は、細胞全体にわたって強いアクチンストレスファイバーを示し、これは強固な細胞−基層相互作用を示す（図１２）。３Ｄ単層としてＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞は、コラーゲン基層上の２Ｄ単層よりも少ないアクチンストレスファイバーを有したが、３Ｄスフェロイドより多くのストレスファイバーを有しており、これは細胞−基層相互作用の中間の強さを示す。ＰＥＴ−ハイブリッド上の３Ｄ単層は、ＰＥＴ−Ｇａｌ上で培養された３Ｄスフェロイドと同様の皮質Ｆ−アクチン分布を呈し、これは、生体内の肝細胞の強固な細胞−細胞相互作用の特徴を示す。細胞内のクラスターとしてのｐ−ＦＡＫ分布は、細胞−基層相互作用の特異的なインジケータである。点状のｐ−ＦＡＫクラスターのシグナルは、２Ｄ単層および３Ｄ単層では強く、３Ｄスフェロイドでは非常に弱い（図１２）。これは、３Ｄ単層は３Ｄスフェロイドより強固な細胞−基層相互作用を経験し、基層により良好に接着することができたことを確認させる。細胞−細胞相互作用の特異的インジケータとしてのＥ−カドヘリン発現を調べた。Ｅ−カドヘリンは、３Ｄ単層およびスフェロイドでは細胞−細胞境界に局在化するが、２Ｄ単層では肝細胞の細胞質全体にわたって細胞内に存在することが見出された。これは、３Ｄ単層およびスフェロイドにおける２Ｄ単層よりも強固な細胞−細胞相互作用を確認する。
【０１１６】
（実施例２Ｄ：プレスフェロイド３Ｄ単層の安定化および不安定化）
いかなる提案された作用メカニズムに拘束されることはないが、このハイブリッド基層におけるＧＲＧＤＳペプチドの役割は、インテグリン膜受容体と結合することを通して「単層」段階を安定化すること、および「単層」が３Ｄスフェロイドへと開くのを防ぐことと考えられる。
【０１１７】
実施例２Ｂに示すように、肝細胞は、基層から剥がれるまでの１週間までスフェロイド形成なしに単層構成を維持した。本願明細書に記載されるＰＥＴ−ハイブリッドにおけるＧＲＧＤＳペプチドの役割は、肝細胞のインテグリン膜受容体に結合することを通して細胞−基層相互作用を高め、そして、プレスフェロイド肝細胞単層が３Ｄスフェロイドを形成するのを防ぐことであるのかも知れない。
【０１１８】
まず、ＰＥＴ−ハイブリッド上で１週間培養された肝細胞についてＥＬＩＳＡ（方法の説明についての実施例１Ｅを参照）を使用してｐ−ＦＡＫ発現を定量することにより、これを検討した。肝細胞のｐ−ＦＡＫ発現は、ＰＥＴ−ハイブリッドでの最初の３日間（すなわちＤ３）培養の間徐々に上昇し、６日間（すなわちＤ６；図１３Ａ）にわたって持続した。３日目のＰＥＴ−Ｇａｌ上の３Ｄスフェロイド形成につれてのｐ−ＦＡＫ発現の減少（図６Ａ）とは対照的に、ＰＥＴ−ハイブリッド上の肝細胞の持続したｐ−ＦＡＫ発現は、ＧＲＧＤＳペプチドの導入を許容する高められた細胞−基層相互作用を示唆した。
【０１１９】
ＧＲＧＤＳがプレスフェロイド単層の安定化を担うのかどうかを知るために、可溶性ＧＲＧＤＳペプチドを培養培地に加え、ＰＥＴ−ハイブリッドの結合されたＧＲＧＤＳペプチドと潜在的に競合させた（図１３Ｂ）。
【０１２０】
１００μＭ濃度で、可溶性ＧＲＧＤＳペプチドはＰＥＴ−ハイブリッド上に維持された肝細胞単層を不安定化し、コンパクトな３Ｄスフェロイドの形成を可能にする。可溶性ＧＲＧＤＳペプチドは、恐らく肝細胞の細胞表面の結合部位を求めて結合されたＧＲＧＤＳペプチドと競合したためである。可溶性ＧＲＧＤＳペプチドはまた、ＰＥＴ−Ｇａｌ上で培養された３Ｄスフェロイドが基層から剥がれるのを促した。可溶性ＧＲＧＤＳで２４時間処理すると、肝細胞に対してわずかな毒性をも引き起こした。なぜなら、対照におけるよりも処理したサンプルにおいてより単一な死細胞が観察されたからである。対照的に、可溶性ガラクトースリガンドは、ガラクトシル化された基層上の３Ｄスフェロイド、またはハイブリッド基層上のプレスフェロイド単層またはコラーゲン基層上の２Ｄ肝細胞単層のモルホロジー変化をまったく引き起こさなかった。
【０１２１】
（実施例２Ｅ：生物活性基層に反応した肝細胞機能）
ＰＥＴ−ハイブリッド上の安定化した３Ｄ肝細胞単層の肝臓特異的な機能を調べた。
【０１２２】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ＤＮＡ分析によって測定した１サンプルあたりの全ＤＮＡ含有量を使用して、７日間の培養全体にわたる様々な基層からの細胞消失を説明するために機能データを規格化した。［Ｄｕｎｎら，Ｆａｓｅｂ  Ｊ，１９８９，Ｆｅｂ；３（２）：１７４−１７７；Ｊｉａｎｇら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ，２００４，Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１０（９−１０）：１５７７−１５８６］。
【０１２３】
図１４Ａおよび図１４Ｂに示すように、ＰＥＴ−ＧａｌおよびＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞のアルブミンおよび尿素分泌は、７日間の培養にわたってコラーゲン基層上で培養されたものよりも高かった。コラーゲン上で培養された肝細胞のアルブミンおよび尿素分泌が劇的に低下した３日目から７日目までｍ有意な差が存在した。シトクロムＰ４５０は、多くの内在性基質ならびに多数の生体異物および治療薬（以下の肝毒性研究のモデル薬物であるアセトアミノフェン［Ｂｌａｃｋ  ＳＤ，Ｆａｓｅｂ  Ｊ，１９９２］を含む）を代謝する構成型（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）および誘導型（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）ヘムタンパク質酵素のクラスに属する。ＣＹＰ１Ａは、７−エトキシレゾルフィン  Ｏ−脱エチル化（ＥＲＯＤ）の代謝を担う一次酵素であり、この酵素の活性は３−ＭＣによって誘発されることが公知である。図１４Ｃに示すように、すべての基層上で培養された肝細胞は、誘発されたＥＲＯＤ活性を７日間の培養にわたって維持することができた。誘発されたＥＲＯＤレベルは、コラーゲン基層上よりもＰＥＴ−ＧａｌおよびＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞についてのほうが有意に高い。
【０１２４】
（実施例２Ｆ：種々の基層上で培養された肝細胞による、アセトアミノフェンに誘発された肝毒性への反応）
ＰＥＴ−Ｇａｌ上で培養された３Ｄスフェロイドおよびコラーゲン基層上の２Ｄ肝細胞単層と比較した、ＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された３Ｄ肝細胞単層に対する、ＡＰＡＰのみおよび３ＭＣと同時投与により引き起こされる肝毒性の効果を調べた。ＣＹＰ１Ａの誘導物質である３−ＭＣとの同時投与を、より高い毒性につながる薬物−薬物相互作用の評価として実施した。アセトアミノフェンの肝毒性試験を、実施例１Ｈに記載した方法に従って実施した。
【０１２５】
図１５は、ＭＴＳ生存能力検定を実施するまで、ＡＰＡＰまたは３ＭＣを同時投与したＡＰＡＰに２４時間（図１５Ａ）または４８時間（図１５Ｂ）曝露した後の様々な基層上で培養された肝細胞の生存率を示す。薬物を欠く条件では、すべての基層上で培養された肝細胞は、ＭＴＳ生存能力検定において同様の読取り値を示し、ベースとなるレベルの生存能力が同程度であることを示した。本願明細書に記載されるすべての薬物投与量条件において、ＰＥＴ−ハイブリッド上で培養された肝細胞３Ｄ単層は、肝毒性に対してＰＥＴ−Ｇａｌ上で培養された分化中の肝細胞スフェロイドと同様の反応を示した。これらの培養物はともに、コラーゲン基層上で培養された２Ｄ単層よりもより「肝毒性に敏感」であった。低濃度のＡＰＡＰ（２ｍＭ）に２４時間曝露した場合は、コラーゲン基層上で培養された肝細胞に対してはほとんど無毒（生存率９８％）であったが、ＰＥＴ−ｇａｌ（生存率８４％）およびＰＥＴ−ハイブリッド（生存率８９％）上の細胞に対してはわずかに毒性があった。２ｍＭ  ＡＰＡＰに４８時間曝露すると、コラーゲン上で培養された肝細胞に対してかなりの肝毒性を引き起こし（生存率６４％）、ＰＥＴ−ｇａｌ（生存率５７％）およびＰＥＴ−ハイブリッド（生存率５９％）上で培養された肝細胞に対してはより重篤な毒性を引き起こした。高濃度のＡＰＡＰ（１０ｍＭ）に２４時間曝露すると、ＰＥＴ−Ｇａｌ（生存率４４％）およびＰＥＴ−ハイブリッド（生存率３８％）上で培養された肝細胞は、コラーゲン基層（生存率８０％）上で培養された肝細胞よりも約２倍の肝毒性に対する感度を示した。１０ｍＭ  ＡＰＡＰへ４８時間曝露すると、様々な基層上の細胞のほとんどは死滅した。
【０１２６】
ＡＰＡＰと同時投与した場合の３ＭＣの肝毒性の増幅効果は、２４時間では明瞭には示されなかったが、４８時間後には顕著であった。様々な基層上で、３ＭＣを加えた１０ｍＭ  ＡＰＡＰに曝露すると、ほとんどすべての細胞は死滅した。３ＭＣを加えた２ｍＭ  ＡＰＡＰに４８時間曝露したとき、ＰＥＴ−Ｇａｌ（生存率１９％）およびＰＥＴ−ハイブリッド（生存率２８％）上で培養された肝細胞は、コラーゲン基層（生存率４８％）上で培養された肝細胞よりも、それぞれ、ほぼ３倍および２倍肝毒性に対して鋭敏であった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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