(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞及び／又は組織を含む培養物の培養方法であって、
弾性材料で形成されて湾曲可能なベッドに前記培養物を設置し、該培養物の両端を前記ベッドに固定するとともに、前記ベッドに形成された押え部で前記培養物の上面部を覆うステップと、
前記培養物が設置された前記ベッドを培養液で包囲するステップと、
前記培養液からの前記培養物に対する圧力を一定に保ちながら前記ベッドに対して力を付加することによって、前記ベッドを湾曲させるとともに前記ベッドの湾曲に合わせて前記培養物を湾曲させ、前記ベッドに対する前記力が解除されて弾性によって前記ベッドが原形状に戻ると、前記ベッドの原状復帰に合わせて前記培養物が前記押え部によって押さえつけられることにより原形状に戻されて、前記培養物に曲げ運動を負荷するステップと、
を含むことを特徴とする培養方法。
【請求項２】
請求項１記載の培養方法において、
前記曲げ運動は、前記ベッドを媒介にして行うことを特徴とする培養方法。
【請求項３】
請求項２記載の培養方法において、
前記ベッドは、その両端を移動可能に支持し、中央部に荷重を負荷することにより、湾曲させることを特徴とする培養方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の培養方法において、
前記曲げ運動は、周期的又は断続的に行うことを特徴とする培養方法。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載の培養方法であって、
前記培養物は、半透膜で密封されていることを特徴とする培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療分野、ティッシュエンジニアリング（Tissue Engineering）の分野における細胞又は組織の培養に関し、三次元組織又は器官再生のための三次元組織培養方法、具体的には、細胞構成体（Cell construct）として、細胞、細胞担体（Scaffold）、細胞が産出する細胞外マトリクス（Extracellar Matrix：ＥＣＭ）の何れかを含み、場合により、培養液や、その他の添加物や、グロスファクター或いは薬品等を添加して行う培養方法に関する。
【０００２】
要するに、本発明の培養方法は、従来における静置培養と異なり、物理作用併用の三次元培養に関する方法であり、細胞構成体の細胞に積極的に刺激を与え、細胞構成体に変位を与え、増殖、細胞移動、物質移動を促して細胞の生存力を高めるとともに、分化の誘導あるいは脱分化の抑止により、目的とする再生組織の実現を企図するものである。
【背景技術】
【０００３】
細胞や組織の培養には、培養しようとする細胞や組織に圧力や張力等の物理刺激を与える方法が検討され、各種のバイオリアクタ等が提案されている。二次元培養（平面培養）は、平底培養基材を用いる培養方法であり、一般的には、インキュベータ内での静置培養法である。浮遊培養は、非接着性の細胞を浮遊培養する方法である。これもインキュベータ内での静置培養法である。三次元培養は、細胞を播種した細胞担体をインキュベータ内で静置し、培養するのが一般的方法である。三次元培養（バイオリアクタ使用）は、細胞担体に細胞を接着又は包含させ、培養液の攪拌等の処理を行うのが一般的であるが、細胞担体の三次元培養で細胞に加圧、圧縮、張力、せん断等の物理的作用を付加する培養方法も考えられている。物理的作用を与えるための培養装置は、「バイオリアクタ」、「 ティッシュエンジニアリングプロセッサ」 等と称され、ティッシュエンジニアリングの培養実験や再生医療のための体外（in vitro）における細胞・組織培養装置として実用化されつつある。
【０００４】
このような細胞や組織の培養、その培養に用いられる物理的な変位や応力、刺激を与える機能を有するバイオリアクタに関し、圧力、振動（超音波）を用いる例として、特許文献１には、細胞又は組織の培養方法及びその装置が開示され、圧力を用いる例として、特許文献２には、生体内、生体外及び試験管内での軟骨及びコラーゲンの修復及び再生並びに骨再形成方法が開示され、せん断力を用いる例として、特許文献３には、細胞・組織培養装置が開示され、引っ張り力を用いる例として、特許文献４には、細胞・組織培養装置が開示され、圧縮力を用いる例として、特許文献５には、細胞・組織培養装置が開示され、せん断力を用いる例として、特許文献６には、細胞培養装置が開示され、引っ張り力を用いる例として、特許文献７には、シリコンベルトを使った培養細胞用伸縮刺激負荷装置が開示され、引っ張りとせん断とを併用する例として、特許文献８には、組織、 合成又は天然血管移植片の滅菌、接種、培養、保存、輸送、並びに検査を行う装置及び方法が開示されている。また、特許文献９には、膜体上に保持された細胞に膜体によって歪みを生じさせる培養方法等が開示されている。また、特許文献１０及び特許文献１１には、培養に半透膜を利用することが開示されている。様々な物理的作用及び刺激の付与や、半透膜の利用による細胞等の培養についての試みがなされている。
【特許文献１】特開２００１−２３８６６３号公報（要約等）
【特許文献２】特表２００４−５１２０３１号公報（要約等）
【特許文献３】特開２００２−３１５５６６号公報（要約等）
【特許文献４】特開２００３−０６１６４２号公報（要約等）
【特許文献５】特開２００３−１８０３３１号公報（要約等）
【特許文献６】特開平０９−３１３１６６号公報（要約等）
【特許文献７】特開平１０−１５５４７５号公報（要約等）
【特許文献８】特表平１１−５０４２１６号公報（要約等）
【特許文献９】特開２００５−１４３３４３号公報（要約等）
【特許文献１０】ＷＯ２００６／０１５３０４Ａ２（要約等）
【特許文献１１】特表２０００−５１３２１４号公報（要約等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、人体には、種々の応力を受けている部位が存在し、これらの部位の修復に用いる組織はその部位毎に異なるものである。例えば、椎間板、半月板、骨、繊維軟骨、心臓の弁では体内で曲げ力を受けている。この曲げ応力は、単純な圧力、圧縮、引っ張り、せん断等とは異なるものである。斯かる曲げ力を受けている部位に対し、単純な圧力、圧縮、引っ張り、せん断等の刺激ファクタを以て培養された組織を適用させることは不十分である。
【０００６】
本発明者は、培養する細胞や組織に付与する刺激又は負荷として、曲げが細胞や組織の増殖等に極めて有益であることに気づいた。本発明は、斯かる知見に基づくものであり、このような曲げに関し、特許文献１ないし特許文献１１には開示されておらず、その示唆もない。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、細胞及び／又は組織を含む培養物の培養方法に関し、人等の体の部位に適正な細胞及び／又は組織の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、細胞及び／又は組織を含む培養物の培養方法に関し、細胞及び／又は組織を含む培養物に曲げ力を作用させて培養物を曲げることにより、具体的には、湾曲させることにより、その凹の部分から凸の部分の厚み方向に連続的な圧縮と伸長とを生じさせ、従前の加圧、せん断、引っ張りでは得られない物理的な刺激や変形を培養物に負荷することにより、曲げを伴う部位の組織の修復に適合する培養物を実現するものである。
【０００９】
そこで、上記目的を達成するための本発明の第１の側面は、細胞及び／又は組織を含む培養物の培養方法であって、弾性材料で形成されて湾曲可能なベッドに前記培養物を設置し、該培養物の両端を前記ベッドに固定するとともに、前記ベッドに形成された押え部で前記培養物の上面部を覆うステップと、前記培養物が設置された前記ベッドを培養液で包囲するステップと、前記培養液からの前記培養物に対する圧力を一定に保ちながら前記ベッドに対して力を付加することによって、前記ベッドを湾曲させるとともに前記ベッドの湾曲に合わせて前記培養物を湾曲させ、前記ベッドに対する前記力が解除されて弾性によって前記ベッドが原形状に戻ると、前記ベッドの原状復帰に合わせて前記培養物が前記押え部によって押さえつけられることにより原形状に戻されて、前記培養物に曲げ運動を負荷するステップとを含む構成である。
【００１０】
上記目的を達成するためには、上記培養方法において、好ましくは、前記曲げ運動は、周期的又は断続的に行う構成としてもよい。
【００１１】
上記目的を達成するためには、上記培養方法において、好ましくは、前記曲げ運動は、前記ベッドを媒介にして行う構成としてもよい。
【００１２】
上記目的を達成するためには、上記培養方法において、好ましくは、前記ベッドは、その両端を移動可能に支持し、中央部に荷重を負荷することにより、湾曲させる構成としてもよい。
【００１３】
上記目的を達成するためには、上記培養方法において、好ましくは、前記培養物は、半透膜で密封されている構成としてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、次の効果が得られる。
【００１５】
(1)   培養中に培養物を曲げる等の変位（応力) を加えるので、培養物の培養を促進でき、例えば、椎間板等の体内で曲げ力を受ける組織の再生に使用することができる。
【００１６】
(2)   幹細胞は分化を、組織細胞は脱分化を防ぐことが期待できる。
【００１７】
(3)   組織構造等に方向性がある場合、その配列方向を一様にでき、体内の組織と同等のものが得られる。
【００１８】
(4)   圧力等、他の物理作用を排除し、又は最小にして曲げ作用で必要な組織の培養ができる。
【００１９】
(5)   細胞移動をし易くすることができる。
【００２０】
(6)   栄養物、酸素を三次元細胞構成体の内部まで浸透させることができる。
【００２１】
(7)   老廃物の排出がし易くなる。
【００２２】
(8)   半透膜で細胞の存在部分と培養液の部分を分離すれば、培養液の流れによるせん断力が排除され、曲げや圧力に限定した作用で培養できる。
【００２３】
(9)   半透膜で細胞の存在部分と培養液の部分を分離すれば、スキャフォールドが無くても、スフェロイド化し、三次元組織化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
〔第１の実施の形態〕
【００２５】
本発明の第１の実施の形態に係る細胞又は組織の培養方法について説明する。
【００２６】
この細胞又は組織の培養方法には、培養物の一例として細胞構成体２（図３）が用いられる。この細胞構成体２は、細胞、細胞担体（Scaffold）、前記細胞が産出する細胞外マトリクス（Extracellar Matrix）の何れかを含み、場合により、培養液や、その他の添加物や、グロスファクター或いは薬品等を添加してもよい。例えば、細胞を浮遊させた培養液、細胞が播種された三次元スキャフォールドとゲル状物質や他の担体を複合させたもの、また、これらを半透膜（Semi-permeable membrane ）製の袋やチューブに封入した構成であってもよい。三次元スキャフォールド及びゲル状物質は、例えば、生体吸収性材料等で構成される。
【００２７】
上記の細胞構成体２を封入する半透膜は、通過できる分子の大きさに応じて作られている。例えば、透過分子量が１００〔Ｄａ〕（ダルトン）から１０００〔ｋＤａ〕の半透膜の中から選択して使用される。即ち、培養液中の栄養分、必要な酸素等のガスや細胞が出した老廃物等の低分子の物質等は通過し、細胞や高分子の細胞外マトリクスを通過させないような半透膜を選択し、細胞を閉じ込めれば、細胞や細胞外マトリクスの流失を防ぎながら、栄養分と酸素の供給が可能となり、効率的な培養が実現する。
【００２８】
この細胞構成体２の培養には、培養ベッド４が用いられる。図１は、この培養ベッドの構成例を示す図である。
【００２９】
この培養ベッド４は、細胞構成体２を支持するとともに、細胞構成体２に対する運動の付与のための手段であって、保持した細胞構成体２に変位動作を伝達し、培養ベッド４が持つ弾性により、細胞構成体２を変位動作前の状態に戻す機能部を構成する。
【００３０】
そこで、この培養ベッド４には、２つの細胞構成体２が平行に載置可能な載置部６が備えられ、この載置部６は、各細胞構成体２を平行に載置する面積及び形状を持ち、各細胞構成体２に曲げ運動を付与するために弾性材料で形成された板状部である。弾性材料として例えば、ばね用ステンレス鋼板やその他のばね性の高い材料が用いられる。この場合、培養ベッド４の全体を弾性材料で形成してもよく、曲げ運動を可能にする載置部６又はその一部を弾性材料で形成してもよい。載置部６は、フラットな板状部に限定されるものではなく、ネット状であってもよい。また、載置部６は、単一の細胞構成体２を載置する構成でもよく、３以上の細胞構成体２を載置可能な構成としてもよい。
【００３１】
この載置部６は長方形状であって、その長手方向の端部には長方形状の立壁部８、１０が形成され、各立壁部８、１０は載置部６に対して直角をなすとともに、各細胞構成体２に対応する楕円形の透孔部１２が形成されている。これらの透孔部１２は、細胞構成体２の両端を固定する。また、各立壁部８、１０は、各細胞構成体２の大きさに応じて所定の高さｈに設定されている。
【００３２】
各立壁部８、１０の頂部には、載置部６と平行して一定幅を持つ支持面部１４、１６が形成され、各支持面部１４、１６には、その一部を折り返して各立壁部８、１０と平行に折返し部１８が形成されている。各折返し部１８により、各支持面部１４、１６及び各立壁部８、１０が補強されている。即ち、薄い板状部からなる載置部６と同一の板材で各支持面部１４、１６及び各立壁部８、１０を形成しても十分な強度が得られるとともに、培養ベッド４の軽量化が図られる。この実施の形態の培養ベッド４では、支持面部１４側を固定するため、図示しない固定ピンに対応するＵ字形の切欠部２０が形成されている。
【００３３】
また、載置部６の中間縁部には、載置される細胞構成体２の側面部を支える支持壁部２２、２４が形成され、各支持壁部２２、２４の頂部には、細胞構成体２の上面部を覆う押え部２６、２８が形成されている。各支持壁部２２、２４は載置部６と直交する壁部であって、その高さは既述の立壁部８、１０と同様である。また、各押え部２６、２８は載置部６と平行面を構成している。細胞構成体２は載置部６と各押え部２６、２８との間隔内に配置される。各押え部２６、２８の終端部は曲面部を構成し、両者間には細胞構成体２の着脱のための間隔３０が設定されている。
【００３４】
次に、細胞構成体２の培養方法について、図２、図３、図４及び図５を参照して説明する。図２は、培養の処理手順を示すフローチャート、図３は、培養処理される細胞構成体の形態を示す図、図４は、細胞構成体の培養ベッドへの設置を示す図、図５は、細胞構成体に対する曲げ運動の付与及びその解除を示す図である。
【００３５】
図２に示すように、細胞構成体２の培養処理は、前処理（ステップＳ１）、培養処理（ステップＳ２）及び後処理（ステップＳ３）を含んでいる。前処理には、細胞構成体２の形成、半透膜への封入処理等が含まれる。培養処理には、曲げ運動処理を含み、湾曲処理（ステップＳ２１）、湾曲解除（ステップＳ２２）、湾曲処理（ステップＳ２３）・・・湾曲解除（ステップＳ２Ｎ）の繰り返しが実行される。そして、後処理では、培養を終了した細胞構成体２の培養ベッド４からの取り出し等が含まれる。
【００３６】
(1) 前処理（ステップＳ１）
【００３７】
細胞構成体２の形成では、体内から組織や細胞を取り出し、また、取り出した組織を酵素等で分解し、必要とする細胞の選別を行う。また、選別した細胞数を増やす必要がある場合には、前処理の段階で単層培養等によって、細胞の数を増やす処理を行ってもよい。そして、得られた細胞について、培養液、ハイドロゲル、ゲル状スキャフォールドを組み合わせて細胞構成体２を作成する。その他、不定形構成体として、培養液やハイドロゲルに細胞を浮遊させたり、ゲル状担体に細胞を混ぜるようにしてもよい。また、定形構成体として、培養液に細胞を浮遊させ、これをコラーゲンスポンジ、キトサンスポンジ等の細胞担体に入れ、細胞を付着させたり、ゾルの状態で担体に細胞を混入させ、これをコラーゲンスポンジ、キトサンスポンジ等の細胞担体に入れ、細胞を付着させるとともに、ゲル化させるようにしてもよい。また、必要に応じて成長因子や薬剤等を添加してもよい。
【００３８】
そして、図３に示すように、培養物である細胞構成体２を筒状の半透膜製のチューブ３２に封入して培養を行う。半透膜製のチューブ３２の一端に、例えば半透膜からなる封止栓３４を設置し、他端から上記の細胞構成体２を入れ、同様に封止栓３４で封止することにより、細胞構成体２を密封する。なお、細胞構成体２を封入するチューブ３２の大きさについては、培養するものの目的、及び細胞構成体２の種類等に応じて変えるようにしてもよい。
【００３９】
そして、図４のＡ及びＢに示すように、チューブ３２に密封された細胞構成体２を、培養ベッド４の載置部６に載置させる。培養ベッド４への載置処理は、細胞構成体２を封入したチューブ３２を押え部２６、２８の間に設けた間隔３０を通して、各立壁部８、１０に設けた透孔部１２にチューブ３２の両端を通すとともに、チューブ３２の中間部が載置部６と押え部２６又は２８の間に位置するように配置させる。この実施の形態においては、チューブ３２を２本並べて載置するようにしているが、本数については、これに限定されるものではない。また、この実施の形態では、透孔部１２にチューブ３２の両端を挿通させて固定しているが、チューブの大きさに応じて、例えば、専用クリップ等で培養ベッド４に支持させるようにしてもよい。
【００４０】
このように載置することで、後述する培養処理において、例えば、培養ベッド４の底部側に加える力による培養ベッド４の湾曲及びその解除に対し、各透孔部１２及び押え部２６、２８によりチューブ３２が支持されて、培養ベッド４とともに湾曲及び戻り動作をさせることができ、曲げ運動が可能となる。
【００４１】
(2) 培養処理（ステップＳ２）
【００４２】
培養処理では、図５のＡに示すように、チューブ３２に封入された細胞構成体２を、培養ベッド４とともに培養空間である培養チャンバ３６に移送し、その培養チャンバ３６内に培養液３８の供給をする。培養チャンバ３６にセットしたら、培養液３８等が流出したり、外部からの雑菌混入を防止するため、例えば、カバー等により培養チャンバ３６を密封状態にする。また、培養チャンバ３６に設置された培養ベッド４は、その支持面１４、１６が支持部材４０によって支持されている。これにより、後述する背面側からの力Ｆの付加によっても、培養ベッド４に上下のずれを生じさせず、培養ベッド４及びチューブ３２を湾曲させることができる。なお、培養チャンバ３６について、密封状態を維持しつつ、培養処理中に培養液３８を循環供給させるような構成にしてもよい。この場合、培養液３８は、培養チャンバ３６に連続的に循環させてもよく、定期的に交換する構成であってもよい。
【００４３】
培養ベッド４の背面側から、例えば、図示しないレバー等により、力Ｆを負荷させると、図５のＢに示すように、培養ベッド４の載置部６が力Ｆによって上方に湾曲し、この湾曲により、載置部６上のチューブ３２も湾曲する。即ち、細胞構成体２には曲げが生じる。この曲げ状態から力Ｆを解除すると、培養ベッド４の載置部６は弾性により、原形状に復帰し、平坦になるため、載置部６上の細胞構成体２も平坦状態に移行し、再び図５のＡに示す状態となる。この場合、チューブ３２の上面部には、培養ベッド４の押え部２６、２８が存在しており、上方に凸に変形したチューブ３２は、載置部６の復帰に応じて、チューブ３２の両端を通過させている透孔部１２や押え部２６、２８に押さえつけられ、載置部６の原状復帰に応じて平坦化する。以上のように、透孔部１２及び押え部２６、２８によって、チューブ３２に封入された細胞構成体２には、培養ベッド４の湾曲及び平坦化の変位量と同程度の変位量が与えられるため、付加する力Ｆによる移動量を制御することで、細胞構成体２に与える曲げ運動量も制御することが可能となる。
【００４４】
そして、このような曲げ運動が繰り返され（ステップＳ２１〜ステップＳ２Ｎ）、必要な培養時間の経過により、チューブ３２内に細胞が増殖するとともに、細胞外マトリクス等が産出され、不定形な、あるいは定形な新生組織が再生される。なお、曲げ動作の周期や大きさ、動作スケジュール、培養チャンバ３６内の温度設定等は、培養処理開始前に最適なパターン等により予め設定する他、細胞又は組織の培養状態に応じて、任意に設定するようにしてもよい。また、必要に応じて培養チャンバ３６内に圧力をかけて培養する構成としてもよい。
【００４５】
このように、培養に半透膜製のチューブ３２を用いた場合、培養液と培養物との間に生じるせん断力の発生を防ぐとともに、細胞や細胞外マトリクスの流失を防ぎながら、栄養分と酸素の供給が可能となり、効率的な培養が実現するが、栄養物の通過の抵抗になるため、栄養物の供給に障害が生じるおそれがある。しかし、 上記のように、曲げ動作を付加することにより、内部の変位が能動的に上昇し、圧力の差が生じ、栄養分の移動がし易くなるとともに、細胞に物理的刺激が与えられる。これにより、血管のない段階の細胞構成体２や、血管のない組織においては、曲げ動作が血管や心臓の働きを代行して培養を行うことができる。
【００４６】
(3) 後処理（ステップＳ３）
【００４７】
培養を完了した細胞構成体２は、培養ベッド４とともに培養チャンバ３６（図５）から取り出される。そして、培養ベッド４から細胞構成体２を封入したチューブ３２を取り外し、その内部で増殖した細胞や、産出した細胞外マトリクス等の新生組織を取り出す。取り出された新生組織は品質検査等を行い、人体等の治療に用いられるまで保存される。
【００４８】
培養された新生組織は、例えば、定形組織であれば、縫合等の手段により、そのまま人体に移植され、また、不定形組織であれば、欠損部に注入したり、組織の形状に合わせて塗布、又は成形して固定させる等の処理をすることにより、体内で周囲の組織と融合し、組織化させることが可能となる。
【００４９】
次に、細胞構成体２の培養方法における、曲げ運動と培養について、図６を参照して説明する。図６は、曲げ状態において円柱状の細胞構成体が受ける力及び変位に関する解析に用いる図である。
【００５０】
培養ベッド４は、上記したように、培養チャンバ３６内で上下等にずれないように所定の位置で支持されており、また、細胞構成体２も培養ベッド４に固定されていることから、図５に示すように、培養ベッド４の背面側から力Ｆが付加されると、培養ベッド４の載置部６が上方に湾曲し、細胞構成体２も培養ベッド４に沿って一緒に変形する。
【００５１】
物体を曲げようとすると、曲げ応力（Bending stress）が発生する。そして、物体が曲がることにより、曲げひずみ（Bending strain）が生ずる。曲げられた物体の内部では様々なひずみが生ずる。即ち、図６に示すように、曲げの外周側（図６のＢの上側）では引っ張り力が作用して伸び、内周側（図６のＢの下側）では逆に圧縮力が作用して縮む。物体内部の微小部分を考えてみると、微小部分同士が隣り合った位置では、伸びや縮みの変位に差異が生じ、そこには、せん断応力（Shearing stress ）が生じており、それによって、ひずみ（Shearing strain ）が生ずる。なお、図６のＡに太線で示すように、物体の一部分に伸縮の変位が無い（０）面として、いわゆる中立面があるが、その中立面も含み、全ての位置でせん断ひずみが生じる。そして、それは一定の方向に生じる。
【００５２】
また、曲げにより断面積が変化し、内部の圧力が変化する。断面形状が変化することにより、物体内部には、圧力の上昇する部分と低下する部分が生ずる。さらに、外周が引っ張り、内周が圧縮されるので、内周部分では、圧力が高く、外周付近では圧力が低くなっている。
【００５３】
即ち、曲げには、内部で引っ張り、圧縮、せん断、圧力が様々に作用していることになる。細胞構成体２に曲げ運動を作用させると、引っ張り、圧縮、せん断、圧力により、細胞構成体２の内部は微妙に変形する。ここで、圧力による液体の収縮率は無視できるほど微量であることから、曲げ運動によるひずみは、細胞構成体２に繰り返し圧力をかける方法に比べて、はるかに大きなひずみを生じさせることができる。これにより、曲げの作用は、細胞や栄養、酸素、老廃物等の移動、供給というような効果を更に大きくすることが可能となるとともに、曲げる方向に対して、ある特定な方向で引張りや圧縮のせん断力が発生するので、形成される組織配列を一様にすることができる。
【００５４】
従って、曲げ運動に適した細胞であれば、増殖が促進されるとともに、組織配列まで生体内の組織を模倣したものが培養できる。さらに、曲げと並行して、圧力の付加を併用することにより、効果を拡大できる。
【００５５】
そこで、細胞構成体２のモデルとして、ゲル円柱を曲げた場合に生じる伸び等を、図６を参照して、解析する。
【００５６】
図６のＡに斜線で示すように、曲げる前の直径がｄであるゲル円柱の長手方向の断面を示した図６のＢについて考える。変形前の横の長さをＬとし、また、ゲル円柱の中心線について、曲率半径がｒとなるように曲げたとする。曲げる前のゲル円柱の高さはｄ（＝直径）であり、そのｄを曲げの内側から外側まで、ｍ個に区切る。ゲル円柱の中心線を０とし、内側に向かって−ｎ番、外側に向かって＋ｎ番の Sectionとする。なお、図６のＢでは、一例として、ゲル円柱を１０の Sectionに分割し、このゲル円柱を分割している各線とゲル円柱の側面との接点を変位の算定位置として、曲げの内側から外側に向かって１から１１までの Section位置を示している。
【００５７】
長さ方向への伸びをΔＬｎ、厚み方向の変位をΔＲｎ、トータルの変位をＤｎとする。曲げによる長さ方向（円周方向）の変位について解析を行う。長さＬのゲルが曲げの内周では、収縮し、外周では伸びる。曲げる前の円柱の中心線を中立面とすると、圧縮応力と引張り応力が等しい。ｎ番目の Sectionでの曲率半径ｒn は、
【００５８】
【数１】
0005433129.tif 000002
となり、ｎ番目の Sectionの弦長は、
【００５９】
【数２】
0005433129.tif 000003
である。そこで、長さ方向への伸びΔＬｎは、
【００６０】
【数３】
0005433129.tif 000004
となる。式(1) を式(3) に代入すると、
【００６１】
【数４】
0005433129.tif 000005
となる。
【００６２】
次に、厚み方向（曲率半径方向）の変位ΔＲｎについて解析を行う。曲げたときに最も内側になる部分からｎ個分の Sectionが曲げられると、変形前は長方形だったその部分が、面積を保ちながら扇形となる。ゲル円柱を曲げると、上記のように、長さ方向が変化するので、その分だけ厚みが変化する。この考え方から厚み方向の変位を算出する。曲げたとき、最も内側となる面までの中心からの距離ｒO は、
【００６３】
【数５】
0005433129.tif 000006
である。最内側からｎ番目の Sectionまでの長方形の面積Ｓｎｓは、
【００６４】
【数６】
0005433129.tif 000007
であり、最内側からｎ番目の Sectionまでの扇形の面積Ｓｎは、
【００６５】
【数７】
0005433129.tif 000008
となる。ＳｎｓとＳｎは同面積（Ｓｎｓ＝Ｓｎ）を維持すると、式 (6)、式(7) より、
【００６６】
【数８】
0005433129.tif 000009
となる。ここで、式(8) に式(5) を代入すると、
【００６７】
【数９】
0005433129.tif 000010
となる。
【００６８】
曲げる前のｎ番目の Sectionについて、曲率中心からの距離ｒn は、
【００６９】
【数１０】
0005433129.tif 000011
であり、これから曲げられたときの変位ΔＲｎは、
【００７０】
【数１１】
0005433129.tif 000012
となる。従って、総合変位Ｄｎは、
【００７１】
【数１２】
0005433129.tif 000013
から求めることができる。
【００７２】
以上の解析を利用して、ゲル円柱内部の変位を図７、図８、図９に示す。図７は、高さが１０（＝直径ｄ、 Section数＝１０）の位置中央部におけるゲル円柱内部の変位に関する解析図であり、図８は、高さが８（ Section数＝８）の位置（中央からずれた位置）におけるゲル円柱内部の変位に関する解析図であり、図９は、高さが４（ Section数＝４）の位置（中央からさらにずれた位置）におけるゲル円柱内部の変位に関する解析図である。
【００７３】
詳細には、直径１０（ｄ＝１０）のゲル円柱を曲率半径５０（ｒ＝５０）で曲げた場合の変化を解析しており、円柱をタテ、ヨコ１０の Sectionに区切り、長さの変位は１０（Ｌ＝１０）に対する値とする。これを円柱の円形面側から見て、高さが１０（円の中心を区切る Section、図７のＡ）の場合と、高さが８（図８のＡ）の場合と、高さが４（図９のＡ）の場合とに分けてグラフ化している。各図は、共に横軸に変位の算出位置を表すSection 位置を取り、縦軸に総変位（Ｄｎ）、厚み方向への変位（ΔＲｎ）、長さ方向への伸び（ΔＬｎ）を取り、高さに変位量を取っている。
【００７４】
上記の解析結果から、円柱を曲げると、その円形断面上のある点と、隣接する点との間では、必ず変位の大きさや方向に差異が生ずることが判る。この差異によって、円柱のあらゆる部分にせん断応力が生ずる。但し、ある点の長さ方向の線上では、同等の変位と応力が生じている。
【００７５】
〔第２の実施の形態〕
【００７６】
次に、本発明の第２の実施の形態に係る細胞又は組織の培養方法について、図１０及び図１１を参照して説明する。図１０は、第２の実施の形態における細胞構成体２の形態を示す図であり、図１１は、その細胞構成体２を培養ベッド４に載置した状態を示す図である。図１０、図１１、において、第１の実施の形態と同一部分及び同一構成には同一符号を付してある。
【００７７】
この実施の形態では、第１の実施の形態に係る培養方法において、不定形な細胞構成体２を半透膜製のチューブ４２に封入して培養を行う。例えば、培養液やハイドロゲルに細胞を浮遊させたり、もしくは、ゲル状担体に細胞を混ぜた不定形な細胞構成体２に対し、半透膜製のチューブ４２が型枠とならないことにより、培養後においても不定形組織となり、生体組織間に注入する等の用途に応じた組織を培養することが可能となる。なお、上記のゲル状の物質は、例えば、生体吸収材料で構成される。
【００７８】
このような細胞構成体２（図１０）においても、既述の培養方法（図２）を用いて同様に培養することができるが、この場合、前処理では、柔軟性の高いチューブ４２を用いるため、その開口断面形状が不定形であり、チューブ４２の両端開口の封止には封止栓３４（図３）に代え、チューブ４２の持つ柔軟性を利用するとともに、専用のクリップ４４で封止する。即ち、チューブ４２から細胞構成体２が流出するのを防止するため、チューブ４２の両端を折り返し、重なり部分をクリップ４４で封止する等の処理を施す。また、曲げ運動によるチューブ４２の破裂防止やチューブ４２内での細胞構成体２の移動スペースを作る等により、チューブ４２への細胞構成体２の封入は、満杯状態とならないような適当な量を封入する必要がある。培養する目的の量にもよるが、例えば半透膜製のチューブ４２の断面が楕円形状となるように封入する。
【００７９】
以上のようにチューブ４２に封入された細胞構成体２は、図１１に示すように、培養ベッド４に取り付けられる。培養ベッド４への載置処理については、第１の実施の形態と同様に、細胞構成体２を封入したチューブ４２を押え部２６、２８の間に設けた間隔３０を通して、各立壁部８、１０に設けた透孔部１２にチューブ４２の両端を通すとともに、チューブ４２の中間部が載置部６と押え部２６又は２８の間に位置するように配置させる。このように載置することで、既述の培養処理における曲げ運動により、培養ベッド４の載置部６の湾曲及びその解除に応じて、細胞構成体２への曲げ運動が可能となる。
【００８０】
このような構成において、第１の実施の形態と同様に培養処理を施すことで、上記したように、不定形な細胞構成体２の培養が可能となる。
【００８１】
なお、細胞構成体２と培養ベッド４の固定については、上記の他、例えば、クリップ４４でチューブ４２と培養ベッド４とを共に挟み込むようにする構成や、クリップ４４に培養ベッド４との固定用のクリップを併設したような構成であってもよい。
【００８２】
〔第３の実施の形態〕
【００８３】
次に、本発明の第３の実施の形態に係る細胞又は組織の培養方法について、図１２を参照して説明する。図１２は、第３の実施の形態に係る細胞構成体２の形態を示す図である。図１２において、第１の実施の形態と同一部分及び同一構成には同一符号を付してある。
【００８４】
この実施の形態では、第１の実施の形態に係る培養方法に対して、細胞を定形の細胞担体（三次元スキャフォールド）４８に播種し、定形の細胞構成体２を作成し、半透膜製のチューブ３２に封入して培養を行う構成である。具体的には、培養液やハイドロゲルに細胞を浮遊させたり、ゲル状担体に細胞を混ぜるようにしてもよい。また、定形構成体として、培養液に細胞を浮遊させ、これをコラーゲンスポンジ、キトサンスポンジ等の細胞担体に入れ、細胞を付着させたり、ゾルの状態で担体に細胞を混入させ、これをコラーゲンスポンジ、キトサンスポンジ等の細胞担体に入れ、細胞を付着させるとともに、ゲル化させるようにしてもよい。なお、三次元スキャフォールド及びゲル状物質は、例えば、生体吸収材料等で構成される。培養方法に関しては、上記第１の実施の形態と同様であるので、説明を省略する。
【００８５】
上記構成により、予め定形の細胞構成体２を用いることで、所望の形状、又は大きさの新生組織を培養することが可能となる。
【００８６】
〔第４の実施の形態〕
【００８７】
次に、本発明の第４の実施の形態に係る細胞又は組織の培養システムについて、図１３を参照して説明する。図１３は、細胞又は組織の培養システムを示す図である。図１３において、第１の実施の形態と同一部分及び同一構成には同一符号を付し説明を省略する。
【００８８】
この実施の形態では、第１の実施の形態から第３の実施の形態に係る細胞又は組織の培養方法において、培養液の循環や、随時、新鮮な培養液を供給させるとともに、培養室の温度や圧力、供給する混合ガスＧの濃度等を制御して培養する培養システム５０を構成している。
【００８９】
培養システム５０には、培養装置であるインキュベータ５２が用いられる。このインキュベータ５２の培養室５３には、培養ユニット５４、培養回路５６、アクチュエータ５８、温度調節器６０、ガス濃度調節器６２、加圧装置６４が設置され、これらはインキュベータ５２の外部にある制御装置６６で制御される。
【００９０】
培養ユニット５４は細胞構成体２に圧力や前記のように力Ｆ等を付与して培養する培養手段であって、その内部には既述の培養空間である培養チャンバ３６が形成されている。加圧装置６４は、制御装置６６で制御され、培養チャンバ３６内の培養ベッド４の下面側に圧力Ｐを作用させる。
【００９１】
培養回路５６は、培養手段への培養液３８等の供給及び循環する手段であって、培養液３８を溜める培養液溜７０と、培養液３８や培養室５３に混合ガスＧ（窒素、酸素、二酸化炭素等）を供給するガス交換部７２と、ポンプ７４と、逆止弁７６と、培養ユニット５４と、培養室５３や培養チャンバ３６内の圧力を調節する圧力調節弁７８とを連結する循環チューブ８０により構成されている。
【００９２】
ポンプ７４は、例えばピストン式ポンプ、シリンジポンプ、ペリスタルティックポンプが使用できる。ポンプ７４の駆動、圧力調節弁７８の開閉、その開度等が制御装置６６によって調整される。アクチュエータ５８は、培養ユニット５４が細胞構成体２に力Ｆを付加するための駆動源である。温度調節器６０は、培養室５３及び培養チャンバ３６内の温度を調節する。ガス濃度調節器６２は、培養液溜７０や培養液３８に供給する混合ガスＧ（窒素、酸素、二酸化炭素等）の濃度調節を行う。そして、制御装置６６は、これら各機能部の制御を行い、具体的には、温度調節やガス濃度の調節等をまとめて制御する他、培養液溜７０の循環やポンプ７４の動作、アクチュエータ５８の動作等の制御を行う。
【００９３】
このような培養システム５０により既述の培養処理を行えば、曲げ運動を負荷した培養処理が行えるとともに、培養回路５６による、培養チャンバ３６への培養液３８の供給及び老廃物等の排除が可能となる。また、加圧装置６４により、培養ユニット５４への加圧を連続的、断続的、又は、周期的等に制御でき、温度や圧力を所望の状態に保ちながら培養を行うことができる。この結果、効率的且つ信頼性の高い培養が行える。
【００９４】
この培養システム５０では、培養液溜７０、アクチュエータ５８、ポンプ７４をインキュベータ５２の内部に設置しているが、これに限定されるものではなく、これらの全部又は一部をインキュベータ５２の外部に構成するようにしてもよい。また、アクチュエーター５８の動作は、加圧装置６４で培養チャンバ３６への加圧と、培養液３８を供給するポンプ７４等の動作とを連動させるようにしてもよく、また、培養処理の途中で中断するようにして、曲げ運動を周期的又は断続的に負荷すれば、細胞に効果的な刺激を与えることができる。
【００９５】
〔他の実施の形態〕
【００９６】
上記実施の形態では、培養物である細胞構成体２に対し、培養ベッド４の背面側から力Ｆを付加し、培養ベッド４を上方に湾曲させることにより細胞構成体２を曲げているが、培養ベッド４もしくは、細胞構成体２自体に所定の曲げ変位を付与するようにしてもよい。また、この処理では、連続的又は断続的に付与したり、連続又は断続する張力を周期的に付与するようにしてもよい。このような構成においても、細胞構成体２に所定の曲げを施すことができる。
【００９７】
〔実施の形態から抽出される特徴事項〕
【００９８】
次に、以上述べた各実施の形態から抽出される特徴事項に関し、特許請求の範囲に記載した事項以外の特徴事項を以下に列挙する。列挙した特徴事項に本発明が限定されるものではない。
【００９９】
(1) 上記培養方法において、
前記曲げ運動は、周期的又は断続的に行うことを特徴とする培養方法。
【０１００】
(2) 上記培養方法において、
前記培養物には、細胞、細胞担体、前記細胞が産出する細胞外マトリクス、培養液の何れかを含むことを特徴とする培養方法。
【０１０１】
(3) 上記培養方法において、
前記培養物は、細胞が播種された三次元培養担体であることを特徴とする培養方法。
【０１０２】
(4) 上記培養方法において、
前記培養物は、ゲル状物質を含むことを特徴とする培養方法。
【０１０３】
(5) 上記培養方法において、
前記三次元培養担体は、生体吸収性材料であることを特徴とする培養方法。
【０１０４】
(6) 上記培養方法において、
前記ゲル状物質は、生体吸収性材料であることを特徴とする培養方法。
【０１０５】
(7) 上記培養方法において、
前記培養物に連続する張力を付与する処理、断続する張力を付与する処理、連続又は断続する張力を周期的に付与する処理の何れかを含むことを特徴とする培養方法。
【０１０６】
(8) 上記培養方法において、
前記培養物を加圧する処理を含み、前記加圧は、連続し、又は断続し、又は周期的に変化し、不規則に変化することを特徴とする培養方法。
【０１０７】
〔実験結果〕
【０１０８】
次に、本発明の培養方法を用いた実験結果について、図１４ないし図１８を参照して説明する。
【０１０９】
図１４は、細胞構成体を示し、この細胞構成体は、培養液中に浮遊させた細胞を半透膜のチューブに入れて構成されている。図１５に示すように、細胞構成体は培養ベッドに固定され、培養チャンバに収容される。この場合、駆動部は培養チャンバから分離されている。
【０１１０】
培養ユニットにはアクチュエータからの加圧が作用し、細胞構成体に曲げ動作が付加される。アクチュエータは、培養室の外に置かれ、ケーブルは培養室のドアを貫通させ、駆動部に接続されている。アクチュエータの動作状態は表示装置により確認できる。
【０１１１】
アクチュエータは、モータの回転運動をクランクで直線運動に変換しており、クランクアームの長さ選択により、ワイヤの進退幅が調節でき、これに応じて細胞構成体に付与される曲げの大きさが調節される。
【０１１２】
この実験では、加圧動作に関し、大気圧を維持し、曲げ動作だけに限定し、培養液循環を行った。圧力と、アクチュエータによる曲げ動作は個々に無関係に単独で付加した。この実験では、例えば、０．５〔ＭＰａ〕以上の加圧を付与することも考えられる。
【０１１３】
また、図１６ないし図１８は、脊椎器官の培養実験（Vertebrae organ culture of 2 days old mouse ）を示している。実験は、生後２日のマウスから取り出した脊椎を培養ベッドに設置し（図１６）、０．１〔Ｈｚ〕の周波数で曲げ動作を付加し、１０日間の培養を実施した。この実験では加圧はしていない。
【０１１４】
比較例として、静置培養を行った。図１７及び図１８は、１０日間の静置培養（Static 10 days）を示している。１０日後に、器官の断面をトルイジンブルー染色し、細胞の生存状況を観測した。図中、着色部分は明示できないが、明度の低下している部分（染色部分）が生きた細胞の存在を表している。静置培養では、椎間板内部の細胞密度が上がらず、マトリクスの変性が見られた（図１７のａ）。
【０１１５】
これに対し、曲げ動作、Displacement（変位）を付加した脊椎には、椎間板内部の細胞の増生並びに新生マトリクスの蓄積が認められた（図１８のｂ）。
【０１１６】
この実験結果から、曲げ動作を付与した培養は、静置培養と比較し、細胞の増生並びに新生マトリクスの堆積が見られることから、その曲げ動作が細胞構成体に刺激を与えるとともに、物質移動を促進させていることを推察することができる。
【０１１７】
以上の通り、本発明の最も好ましい実施の形態等について説明したが、本発明は、上記記載に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載され、又は明細書に開示された発明の要旨に基づき、当業者において様々な変形や変更が可能であることは勿論であり、斯かる変形や変更が、本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、細胞又は組織の培養方法に関し、細胞構成体に曲げ運動による刺激を与えたり、血管のない新生組織内の物質移動を促すことで、細胞の増殖を促進する他、生体内の組織を模倣した状態の培養をすることができ、有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】第１の実施の形態に係る培養ベッドの構成例を示す図である。
【図２】培養の処理手順を示すフローチャートである。
【図３】培養処理される細胞構成体の形態を示す図である。
【図４】細胞構成体を培養ベッドに載置した状態を示す図である。
【図５】細胞構成体に対する曲げ運動の付与及びその解除を示す図である。
【図６】曲げ状態における細胞構成体が受ける力及び変位に関する解析に関する図である。
【図７】高さ位置におけるゲル円柱内部の変位に関する解析図である。
【図８】高さ位置におけるゲル円柱内部の変位に関する解析図である。
【図９】高さ位置におけるゲル円柱内部の変位に関する解析図である
【図１０】第２の実施の形態に係る細胞構成体の形態を示す図である。
【図１１】細胞構成体を培養ベッドに載置した状態を示す図である。
【図１２】第３の実施の形態に係る細胞構成体の形態を示す図である。
【図１３】第４の実施の形態に係る細胞又は組織の培養システムを示す図である。
【図１４】実験例を示す図である。
【図１５】実験例を示す図である。
【図１６】実験例を示す図である。
【図１７】実験例を示す図である。
【図１８】実験例を示す図である。
【符号の説明】
【０１２０】
２  細胞構成体
４  培養ベッド
６  載置部
１４、１６  支持面
２６、２８  押え部
３２  チューブ
３６  培養チャンバ
３８  培養液
４０  支持部材
【図１】
0005433129.tif 000014
【図２】
0005433129.tif 000015
【図３】
0005433129.tif 000016
【図４】
0005433129.tif 000017
【図５】
0005433129.tif 000018
【図６】
0005433129.tif 000019
【図７】
0005433129.tif 000020
【図８】
0005433129.tif 000021
【図９】
0005433129.tif 000022
【図１０】
0005433129.tif 000023
【図１１】
0005433129.tif 000024
【図１２】
0005433129.tif 000025
【図１３】
0005433129.tif 000026
【図１４】
0005433129.tif 000027
【図１５】
0005433129.tif 000028
【図１６】
0005433129.tif 000029
【図１７】
0005433129.tif 000030
【図１８】
0005433129.tif 000031