(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄道虫由来赤色発光ルシフェラーゼであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼに比べて発光強度が少なくとも５倍以上上昇することを特徴とする変異型ルシフェラーゼであって、鉄道虫由来赤色発光ルシフェラーゼがPhrixothrix属由来のルシフェラーゼであり、当該変異型ルシフェラーゼが
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において２１２位のイソロイシンが、ロイシン及びバリンからなる群より選択されてなるアミノ酸に置換されたものであるか、
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において２１２位のイソロイシンが、ロイシン及びバリンからなる群より選択されてなるアミノ酸に置換され、かつ４６３位のセリンがアルギニン、リシン、ヒスチジン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、システイン及びフェニルアラニンからなる群より選択されてなるアミノ酸に置換されたものであるか又は、
（Ｃ）前記（Ａ）及び（Ｂ）で示されるアミノ酸配列において、２１２位及び４６３位以外の位置に１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するものである、
変異型ルシフェラーゼ。
【請求項２】
３２〜４０℃で保持された １０分または２０分後のルシフェラーゼの相対残存活性が、野生型ルシフェラーゼの相対残存活性の４倍以上であることを特徴とする、請求項1に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【請求項３】
２１２位のイソロイシンが置換される他のアミノ酸が、ロイシンであることを特徴とする請求項２に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【請求項４】
４６３位のセリンが置換される他のアミノ酸が、アルギニン、リシン及びヒスチジンからなる群より選択されてなる請求項１〜３のいずれか１つに記載の変異型ルシフェラーゼ。
【請求項５】
４６３位のセリンが置換される他のアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする請求項４に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【請求項６】
配列番号３及び７のいずれか１つに記載の遺伝子配列によってコードされる、請求項１または２に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載した変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の遺伝子を用いた変異型ルシフェラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素標品とし発光量が増幅され、安定性が増した変異型赤色発光ルシフェラーゼの遺伝子構築体、及びその酵素標品に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲虫発光酵素ルシフェラーゼはレポーター遺伝子として、細胞に与える外来因子の影響の評価、細胞内情報伝達の伝播、或は個々のタンパク質群の発現解析等に用いられている。ホタルルシフェラーゼ遺伝子に転写活性領域を連結、細胞内に遺伝子構築体を導入、レポーター遺伝子を導入した培養細胞を一定時間、薬剤等で処理した後、細胞を集め、発光基質を加えることで、細胞内で合成されたルシフェラーゼ量を測定、転写活性を評価するシステムが挙げられる。ルシフェラーゼの発光量から転写活性を評価することから定量性に優れており、既に多くの会社から本システム関連製品が開発、市販化されている。
【０００３】
甲虫ルシフェラーゼにはｐHに連動して発光色を変えるホタルルシフェラーゼ群と発光色を変えないヒカリコメツキムシや鉄道虫由来ルシフェラーゼ群の２種類がある。このルシフェラーゼ群には緑色から赤色の光を発する酵素群が存在し、これらの発光色の多様性に目を向けたマルチ遺伝子発現（マルチ遺伝子転写活性測定システム：近江谷克裕、中島芳浩；非特許文献１）及び特許文献１のように発光色の識別を前提としたレポーターアッセイが市販化されている。
【０００４】
マルチ遺伝子転写活性の測定では、色識別可能なルシフェラーゼを基本に、個々のルシフェラーゼの発現量の違いを、混在する異なる色の光をフィルターで分離する必要があり、光識別する装置では、個々の発光色のルシフェラーゼ標品により検出系を校正する必要がある。しかしながら、赤色発光ルシフェラーゼでは酵素のタンパク質として安定性がなく、発光色が変わらない安定した酵素の供給が重要なテーマである。
【０００５】
化学物質等の外的な因子が生体に与える影響を評価する際に、マルチ遺伝子転写活性測定により複数の遺伝子発現で、細胞の変化を評価することからより生体に及ぼす影響を精度よく評価できるが、たくさんのサンプルを測定する必要がありハイスループットの解析と複数の装置での大規模解析が重要である。測定装置間には検出器のロット差や劣化の差異を埋めるためには標品による校正が必須である。しかしながら、甲虫ルシフェラーゼのうち、特に赤色発光ルシフェラーゼの安定性が低いことが問題となっている。
【０００６】
これまでに種々のホタルルシフェラーゼの変異体の発光特性の解析から発光色の制御に重要なアミノ酸残基、ルシフェラーゼの構造安定性に寄与するアミノ酸残基が論文上で指摘されている（非特許文献２−８）。しかし構造の相関性の異なるルシフェラーゼで一律に同じアミノ酸残基が有効であるとは予想できない。よって種々のアミノ酸残基が酵素の安定化に寄与することが知られている。また甲虫ルシフェラーゼ２種の３次元構造は明らかになっているが、発光の分子メカニズムには不明な点が多く、発光色や反応性の異なるアミノ酸一次配列レベルで構造の相同性の異なる甲虫ルシフェラーゼにおいてどのアミノ酸を変異させると、例えば熱安定性や発光色変化するかなどは明確ではない。
【０００７】
特に鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼではシャペロンタンパク質を共発現させることで酵素を安定に大腸菌の中で生産させ、併せてグリセロールを加えることで長期間にわたり保存する方法は見出されているが、酵素それ自体を安定化する構造の解明には至っていない（特許文献２）。赤色ルシフェラーゼはマルチ遺伝子発現解析法では必須のルシフェラーゼにも関わらず、安定化には成功していない。また、発光活性を標準化する酵素標品を提供できないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2007-159567
【特許文献２】特開2006-055082
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nakajima Y, Ikeda M, Kimura T, Honma S, Ohmiya Y, Honma K: Role of orphan nuclear receptor ROR・ in clock gene transcriptions demonstrated by a novel reporter assay system. FEBS Lett 565, 122-126, 2004
【非特許文献２】White PJ, Squirrell DJ, Arnaud P, Lowe CR, Murray JAH (1996) Improved thermostability of the North American firefly luciferase: saturation mutagenesis at position 354. Biochem J 319: 343-350.
【非特許文献３】Tisi LC, White PJ, Squirrell DJ, Murphy MJ, Lowe CR, Murray JAH (2002) Development of a thermostable firefly luciferase. Analytica Chimica Acta 457: 115-123.
【非特許文献４】Law GHE, Gandelamn OA, Tisi LC, Lowe CR, Murray JAH (2006) Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance. Biochem J 397: 305-312.
【非特許文献５】Kajiyama N, Nakano E (1993) Thermostabilization of firefly luciferase by a single amino acid substitution at position 217. Biochemstry 32: 13795-13799.
【非特許文献６】Kajiyama N, Nakano E (1994) Enhancement of thermostability of firefly luciferase from Luciola lateralis by a single amino acid substitution. Biosci Biotech Biochem 58: 1170-1171.
【非特許文献７】Kitayama A, Yoshizaki H, Ohmiya Y, Ueda H, Nagamune T (2003) Creation of a thermostable firefly luciferase with pH-insensitive luminescent color. Photochem Photobiol 77: 333-338.
【非特許文献８】Kyte J, Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 157: 105-32.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、マルチ遺伝子発現検出系で用いる赤色発光ルシフェラーゼの高強度、及び高い安定性を保持する酵素標品を提供することを目的とする。 
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、赤色の光を発する変異型鉄道虫由来ルシフェラーゼを取得すべく種々検討した結果、野生型ルシフェラーゼ遺伝子を変異処理して変異型ルシフェラーゼ遺伝子を取得、野生型ルシフェラーゼの波長とほぼ同じ程度の赤色の発光波長を有する変異型ルシフェラーゼを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の変異型ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子、それらの遺伝子を含む遺伝子構築体、及び該遺伝子構築体を含む形質転換細胞を用いた変異型ルシフェラーゼの製造方法を提供するものである。 
【００１３】
項１  鉄道虫由来赤色発光ルシフェラーゼであって、野生型ルシフェラーゼに比べて発光強度が少なくとも５倍以上上昇することを特徴とする変異型ルシフェラーゼ。
【００１４】
項２  32〜40℃で保持された １０分または２０分後のルシフェラーゼの相対残存活性が、野生型ルシフェラーゼの相対残存活性の４倍以上であることを特徴とする、項1に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００１５】
項３  鉄道虫由来赤色発光ルシフェラーゼがPhrixothrix属由来のルシフェラーゼである、項１または２に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００１６】
項４  ２１２位のイソロイシン及び／又は４６３位のセリンが他のアミノ酸に置換された、項３に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００１７】
項５  ２１２位のイソロイシンが置換される他のアミノ酸が、ロイシン、アスパラギン、スレオニン、セリン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、システイン、およびフェニルアラニンからなる群より選択されてなる項４に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００１８】
項６  ２１２位のイソロイシンが置換される他のアミノ酸が、ロイシンであることを特徴とする項５に記載の変異型ルシフェラーゼ。 
【００１９】
項７  4６３位のセリンが置換される他のアミノ酸が、アルギニン、リシン、イソロイシン、スレオニン、セリン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、システイン、およびフェニルアラニンからなる群より選択されてなる項４〜６のいずれかに記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００２０】
項８  ４６３位のセリンが置換される他のアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする項４〜７のいずれかに記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００２１】
項９  配列番号３〜７ のいずれか１つに記載の遺伝子配列によってコードされる、項１または２に記載の変異型ルシフェラーゼ。
【００２２】
項１０  項１〜９のいずれか１つに記載した変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子。
【００２３】
項１１  項１０に記載の遺伝子を含むベクター。
【００２４】
項１２  項１０に記載の遺伝子を用いた変異型ルシフェラーゼの製造法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、野生型鉄道虫由来赤色ルシフェラーゼとほぼ同じ 発光スペクトルを示すが室温下でも安定に発光する酵素の供給が可能となった。これによってマルチ遺伝子発現解析行う際、測定装置の校正などを容易に進める標準化が行うことができ、精度の高い遺伝子発現解析が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ウエスタンブロット法による細胞溶解液中の変異体量の比較（A）、及び発光活性の比較（B）
【図２】３７℃における各種変異体の発光活性の時間経過
【図３】野生型及び変異型赤色ルシフェラーゼの発光スペクトル
【発明を実施するための形態】
【００２７】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis，” Molecular Cloning A Laboratory Manual ”， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York， 2001; Ausubel, F. M. et al. ” Current Protocols in Molecular Biology ”, John Wiley & Sons, New   York, N. Y, 2007等に記載されている。
【００２８】
本発明における変異型ルシフェラーゼの活性とは、ルシフェリンを基質とした酵素反応の活性を表し、基質のルシフェリンが酵素反応によって励起状態になった後、基底状態に戻る際に発する光を検出することによって測定される。
【００２９】
本発明における相対残存活性とは、ある環境で一定時間おかれた後のルシフェラーゼ活性が、どの程度ルシフェラーゼ活性を残存しているかを意味するものとする。その算出方法としては、一定温度で保持しない０分におけるルシフェラーゼ活性を基準値とし、各々一定時間経過後のルシフェラーゼ活性を求めた値を用いたの比の値で表され、これが野生型ルシフェラーゼの相対残存活性の4倍以上高ければ良いものとする。より好ましくは６倍以上、最も好ましくは１０倍以上高ければよいものとする。
【００３０】
本発明におけるルシフェラーゼ活性の保持が確認できる温度は、３２〜４０℃である。より好ましくは３４〜３９℃である。最も好ましくは３６〜３８℃である。
【００３１】
本発明の変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較してほぼ同程度のルシフェリン存在下における最大発光波長の光を発光し得る。このような性質は、本発明の変異型赤色発光ルシフェラーゼを野生型赤色発光ルシフェラーゼに対する酵素表品として用いる際には重要な性質となる。両者のルシフェラーゼがルシフェリン存在下で発光し得る光の最大発光波長の差は、２0ｎｍ以下の範囲である。より好ましくは1５ｎｍ以下、更に好ましくは１０ｎｍ以下である。すなわち、上記の野生型ルシフェラーゼがルシフェリン存在下に発光させ得る赤色の範囲を逸脱しない範囲であればよいものとする。
【００３２】
本発明における赤色発光ルシフェラーゼとはルシフェリン存在下に６００〜６３５ｎｍの最大波長の発光をし得る酵素である。より好ましくは６２０〜６３０ｎｍの最大波長である。
【００３３】
本発明における鉄道虫由来赤色発光ルシフェラーゼとは、鉄道虫に由来する赤色発光ルシフェラーゼであって、具体例としては配列番号１に示すアミノ酸配列が挙げられる。また、これをコードする遺伝子配列の例として配列番号２に示すポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【００３４】
本発明における２１２位のイソロイシンとは、上記の鉄道虫由来ルシフェラーゼの遺伝子配列において、配列番号８に記載の遺伝子配列とストリンジェントな条件下にてハイブリダイゼーションする部位に含まれ、配列番号８に記載の遺伝子配列中のcＴＣ（太字部分）に対応する遺伝子がコードするアミノ酸であることを示す。具体例としては配列番号１に記載のアミノ酸配列中の２１２番目にあるイソロイシンが挙げられる。
【００３５】
本発明における２１２位のイソロイシンへの変異導入は、赤色発光ルシフェラーゼの安定性を向上させる目的を達成できるように、置換されるアミノ酸を選択すればよいものとする。具体的には、２１２位のイソロイシンが置換されるアミノ酸としてロイシン、アスパラギン、スレオニン、セリン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、システイン、およびフェニルアラニンなどが挙げられる。好ましくは、疎水性を調節する目的でバリン、ロイシンを選択することができる。更に好ましくはロイシンである。
【００３６】
本発明における「４６３位のセリン」とは、上記の鉄道虫由来ルシフェラーゼの遺伝子配列において、配列番号１２に記載の遺伝子配列とストリンジェントな条件下にてハイブリダイゼーションする部位に含まれ、配列番号１２に記載の遺伝子配列中のcｇＴ（太字部分）に対応する遺伝子がコードするアミノ酸であることを示す。具体例としては配列番号１に記載のアミノ酸配列中の４６３番目にあるアスパラギンが挙げられる。
【００３７】
本発明における４６３位のセリンへの変異導入は、安定性を向上させる目的を達成できるように置換されるアミノ酸を選択すればよいものとする。具体的には、４６３位のセリンが置換されるアミノ酸として、アルギニン、リシン、ヒスチジン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、システイン、またはフェニルアラニンなどが挙げらる。好ましくは、正の電荷に調節する目的でアルギニン、リシン、ヒスチジンを選択することができる。更に好ましくは、アルギニンである。
【００３８】
本発明の変異型ルシフェラーゼは、鉄道虫由来赤色ルシフェラーゼで、野生型に比べて標品として強度を増した変異型ルシフェラーゼである。鉄道虫由来赤色変異型ルシフェラーゼの遺伝子としては、配列番号３〜７のいずれか１つの遺伝子が例示される。従って、配列番号２の遺伝子によってコードされる野生型ルシフェラーゼにおける２１２位のイソロイシン及び／又は４６３位のセリンが他のアミノ酸残基に置換された変異体が例示される。
【００３９】
本発明における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「１×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中の４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する」条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。 
【００４０】
本発明の変異型ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターには、必要に応じて変異型ルシフェラーゼ遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイト、プロモータ配列、エンハンサー配列、ポリアデニレーション配列、インスレータ配列、選択マーカー遺伝子配列、複製起点を有していても良いものとする。ここで、哺乳類細胞を宿主細胞として本発明の変異型ルシフェラーゼを組換え体として発現させる場合は、さらに転写開始サイトとしてのＫｏｚａｋ配列や、CMVプロモータのような強力なプロモータを有していることが望ましい。
【００４１】
本発明の変異型ルシフェラーゼ遺伝子や遺伝子を含む上記ベクターを細胞内に導入する方法は、公知の方法を用いて実施することができる。具体的には、リポフェクション法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、スフェロブラスト法などが挙げられる。
【００４２】
本発明の変異型ルシフェラーゼの活性は、上記ベクターが導入された宿主細胞の細胞溶解液に含まれた状態で測定することが出来る。宿主細胞の溶解方法は、公知の方法を用いて行うことが出来る。具体的には、界面活性剤を含む生理的緩衝液によってホモジェナイズまたは超音波破砕することによって宿主細胞を溶解させる方法が挙げられる。上記緩衝液には、タンパク質分解酵素の阻害剤が含まれていてもよいものとする。また、酵母細胞のような細胞壁を有する細胞であれば、細胞壁を分解する酵素（例えばザイモリエースなど）が含まれていることが望ましい。このような方法によって得られた変異型ルシフェラーゼを含む細胞溶解液を用いることで、ルシフェラーゼの活性を測定することが出来る。
【００４３】
本発明における変異型ルシフェラーゼの基質となるルシフェリンは、公知のものを用いることが出来る。具体的にはＤ−ホタルルシフェリン、Ｌ−ホタルルシフェリン、Ｄ−ホタルルシフェリン6’ベンジルエーテル（luciferin-6’-benzyl ether、Ｄ−ホタルルシフェリン6’メチルエーテル（luciferin-6’-methyl etherなどが挙げられる。
【００４４】
本発明の変異型ルシフェラーゼ活性測定は、宿主細胞内で組替え体として合成された変異型ルシフェラーゼを含む細胞溶解液と混合させた後、フォトンカウンティング方式などによるルミノメータを用いた公知の方法にて測定することが出来る。また、発光スペクトルも同様に公知の方法にて測定することが可能である。ここで、基質となるルシフェリンは宿主細胞の溶解に用いる生理的緩衝液に含まれた形で存在し、細胞溶解操作と同時に変異型ルシフェラーゼと反応させても良いものとする。
【００４５】
本発明におけるルシフェラーゼ活性は、野生型および変異型の各種ルシフェラーゼとルシフェリン溶液を接触させた後即座にあるいは一定時間放置して発光強度を安定化した後に、一定時間の積算測定を行って相対発光強度（RLU）値を算出するのが望ましい。また、積算測定にかかる時間としては０．１〜６０秒があげられ、好ましくは１〜３０秒間である。測定時の温度としては１５〜４０℃があげられ、好ましくは２０〜３０℃である。
【００４６】
本発明における変異型ルシフェラーゼの製造法は、細胞内において組換え体として合成した後に、精製することによって得られる。具体的な例として、特許文献２（特開２００６−５５０８２）に記載された野生型ルシフェラーゼの製造法と同様の方法を参照して実施することが出来る。
【００４７】
本発明の変異型ルシフェラーゼの製造法において採用される宿主細胞は、一般的にタンパク質の製造に用いられる宿主細胞であれば特に限定されることは無いが、原核細胞を用いることが望ましい。より好ましくは大腸菌である。
【００４８】
変異型ルシフェラーゼの製造方法に使用するベクターとしては、宿主細胞において発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。大腸菌を宿主細胞として用いる際の具体的なベクターの例としては、pBluescript、pET21d、pTrc99A、pCA24N、pUC18、pUC19、pBR322などが挙げられ、好ましくはサプレッサーlacIqを含み、IPTGによって誘導可能なPT5-lacプロモーターを持つベクター群である。
【００４９】
変異型ルシフェラーゼの製造方法に使用する発現ベクターの大腸菌への導入は、公知の方法を用いて実施することが可能であり、塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００５０】
該発現ベクターで形質転換された大腸菌の培養は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスターチ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明の、変異型ルシフェラーゼが大量に生産されるように適宜選択される。
【００５１】
特に培養温度は、比較的低温であるのが好ましく、例えば5〜25℃、好ましくは10〜25℃、より好ましくは15〜20℃である。
【００５２】
本発明の、変異型ルシフェラーゼは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の精製、単離に供することができる。
【００５３】
本発明の、変異型ルシフェラーゼは、Hisタグやマルトース結合タンパク質と融合体として、NiやCoなどの金属イオンやアミロースなどをリガンドとしたアフィニティカラムを利用して精製を行うことができる。アフィニティカラムとしては、例えば、Niセファロース、アミロース結合ゲル等を使用できる。
【００５４】
アフィニティカラムからの溶出は、イミダゾールを使用するのが好ましい。イミダゾールの濃度は、通常１００〜１０００ｍＭ程度、好ましくは２００〜３００ｍＭ程度である。イミダゾールは、溶出液を濃縮ないし凍結乾燥等して保存する場合にも、変異型ルシフェラーゼの安定剤として機能するため好ましい。
【００５５】
なお、本発明のルシフェラーゼ変異体に対して、上述のそれぞれ機能の期待を減殺しない範囲であれば、変異、置換、欠失、挿入、付加、タンデム化などの改変を加えることは当業者が容易に実施できるものである。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼ（Phrixothrix Red：PhRED） の野性型アミノ酸配列を保持し、コドンユーセージが哺乳類型に変更されたcDNA（配列番号２）をpCMVプロモータの下流に挿入したベクターを基本とした。本プラスミドを鋳型にルシフェラーゼの３つのアミノ酸残基を他の残基にすべくインバースPCR法による部位特的変異部位の導入を行った。変異導入は、部位特異的変異導入キットKOD - Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績）をキット付属の取扱説明書に従い実施し、得られたプラスミドを用いて、大腸菌コンピテントセルDH5α（東洋紡績）の形質転換を行った。すなわち、212番目のIleに対応するコドンの位置をCTCにして（表１の太字部位）、これをPrimer#1(配列番号８)とした。また、背中合わせの逆方向の相補鎖をPrimer#2(配列番号９)とした。これによって、212番目のIleがLeuに変更された変異体SLR-I212Lを構築した。351番目のAsnに対応するコドンの位置をAAGにして（表１の太字部位）、これをPrimer#3(配列番号１０)とした。また、背中合わせの逆方向の相補鎖をPrimer#4(配列番号１１)とした。これによって、３５１番目のAsnがLysに変更された変異体SLR-N351Kを構築した。463番目のSerに対応するコドンの位置をCGTにして（表１の太字部位）、これをPrimer#5(配列番号１２)とした。また、背中合わせの逆方向の相補鎖をPrimer#6(配列番号１３)とした。これによって、463番目のSerがArgに変更された変異体SLR-S463Rを構築した。変異の配列の確認はシークエンサー(ABI3100; Applied Biosystems)で行った。１つのアミノ酸残基を変異させた部位特異的変異体を基本にさらに変異を加え、最終的に5種（SLR-I212L；配列番号３、SLR-N351K；配列番号４、SLR-S463R；配列番号５、SLR-I212L/N351K；配列番号６、SLR-I212L/S463R；配列番号７ ）作成した。
【００５７】
【表１】
0005644993.tif 000002
【００５８】
実施例２
作成された変異が導入されたベクターはマウス由来のNIH3T3細胞に遺伝子導入した。細胞はDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma-Aldrich) 10% FBS培地にて5% CO2の37℃の条件で培養した。遺伝子導入する前日に35 mmディッシュあたりの細胞数を3×105 cellsとした。遺伝子のプラスミド量を1000 ng/dishとしLipofectamine PLUS (インビトロジェン社)にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、４８時間後に細胞を回収、細胞をＰＢＳで洗浄後、タカラバイオ製の細胞溶解剤（M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent）150μｌで溶かし、その一部の25μｌに対してルシフェリン溶液(LAR II；Promega)を50μl加え、AB-2500(ATTO社)を用いて、直ちに２０秒間積算測定を実施した。一方、細胞溶解液のタンパク質量をバイオラッド社のProtein Assay kitで測定、２μｇのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、膜に転写、ウエスタンブロットを行った。一次抗体として精製赤色ルシフェラーゼをウサギに免疫して調製された抗血清を２５００倍希釈して使用し、２次抗体としてhorseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch)を用いた。ECL Western Blotting Detection Reagents (GEヘルスケアバイオサイエンス)で発光させ、LAS-4000miniPR（富士フィルム）で発光量をイメージング化した。図１Aは、ウエスタンブロットした結果であり、タンパク質の発現は若干の差があるものの同程度であった。図１Bは個々の発光量をタンパク質の発現量でノーマライズしたものである。これによると野生型に比べて、SLR-I212L、SLR-I212L/N351K、SLR-I212L/S463Rの３種で発光量が８倍前後に増加した。
【００５９】
実施例３
実施例２で用いた細胞溶解液中の赤色発光ルシフェラーゼ及びその変異体３７℃のインキュベータに静置し、１０，２０、３０、４０、５０、６０分後に取り出し、25μｌのサンプルに対してルシフェリン溶液(LARII; Promega)25μｌを加え、直ちに発光活性を測定した。測定にはAB-2250（アトー社）を使用した。図２は相対残存活性の時間経過を調べたものである。１０分後の発光活性を比較した場合、野生型では0分時に比べて５％程度しか活性が保持されていなかったが、SLR-I212L/S463Rでは、50%もの活性が保持されており、この時点で１０倍程度の活性の向上がみられた。また、野生型では２０分時程度で１-2％程度しか保持されていないが、SLR-I212L/S463Rでは２０％以上の活性が保持され、１０倍以上の安定性が向上していることが明らかとなった。それ以外にもSLR-I212Lが高い活性を保持していた。ただ、単独のSLR-S463Rでは37℃での安定性の向上は見られなかった。
【００６０】
実施例４
各種変異体の発光スペクトルを測定した。測定はアトー社製AB-1850Sを使用、細胞溶解液15μｌにルシフェリン溶液（(LARII; Promega)15μｌを加え測定した。変異体5種のうち、SLR-I212L、SLR-S463R、SLR-I212L/S463Rは野生型とほぼ同じ、最大発光波長は６３０nm前後であったが、SLR-N351K、SLR-I212L/N351Kは10nmほど青色にシフトした620nmの最大発光波長を示し全体に発光スペクトルがブルーシフトした（図３）。
【００６１】
これらの結果、野生型の赤色ルシフェラーゼが最も赤色の波長を含むルシフェラーゼであるが、赤色ルシフェラーゼとして最も安定且つ野生型の標品となりうるものはSLR-I212L/S463R変異体であった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、野生型鉄道虫由来赤色ルシフェラーゼとほぼ同じ発光スペクトルを持ち、且つ活性が向上、37℃における安定性を増した変異型ルシフェラーゼを提供する。これによって、従来不安定であった赤色ルシフェラーゼの取り扱いが容易になり、例えば、複数の遺伝子の転写活性を同時に測定するマルチ遺伝子発現解析などにおける測定装置の品質管理等に活用可能な酵素標品の供給が可能になる等に利用することができ、創薬・医療・食品検査などの産業界に寄与することが大いに期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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