(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）チオエステル基を含有するヒドロキシアルキルデンプン誘導体のチオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’とアルファ−Ｘベータアミノ基を含有する活性物質誘導体のアルファ−Ｘベータアミノ基：
【化１】
0005396019.tif 000036
とを反応させること、または
（ｉｉ）チオエステル基を含有する活性物質誘導体のチオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’とアルファ−Ｘベータアミノ基を含有するヒドロキシアルキルデンプン誘導体のアルファ−Ｘベータアミノ基：
【化２】
0005396019.tif 000037
とを反応させること
を特徴とする、活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンが式（Ｉ）：
【化３】
0005396019.tif 000038
（Ｉ）
［式中、ＹはＯおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子である］
で示される構造を有する化学残基により共有的に連結される（ここに、Ｒ’は水素、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキル基からなる群から選択され、ＸはＳＨおよび式：
【化４】
0005396019.tif 000039
で示される基からなる群から選択され、−（Ｃ＝Ｙ）基はチオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’に由来し、ＨＮ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｘ基はアルファ−Ｘベータアミノ基に由来し、ヒドロキシアルキルデンプンはその酸化された還元末端またはその酸化されていない還元末端により反応する）、活性物質とヒドロキシアルキルデンプンとのコンジュゲートを製造する方法。
【請求項２】
Ｒ’がベンジルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
チオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンが、アルファ−Ｘベータ−アミノ基が活性物質のシステインまたはヒスチジン残基に含まれる活性物質のアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応する、請求項１または２のいずれか記載の方法。
【請求項４】
ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端にて酸化し、
（ｉ）酸化された還元末端を活性カルボン酸誘導体に変換し、活性カルボン酸誘導体とＲ’−ＳＨ化合物とを反応させること；または
（ｉｉ）酸化された還元末端とカルボジイミドおよびチオールＲ’ＳＨとを反応させてチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンを得ること
を特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端にて酸化し、その酸化された還元末端と、二つのアミノ基を含有する少なくとも二官能性の化合物とを反応させてアミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得、該誘導体のアミノ基と、該誘導体のアミノ基と反応する少なくとも一つの官能基および少なくとも一つのチオエステル基を含有する少なくとも二官能性の化合物とを反応させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端にて酸化し、その酸化された還元末端と、Ｚに加えてアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物の官能基Ｚとを反応させ、該官能基Ｚが化学構造−ＮＨ−を含有することを特徴とする、チオエステル官能基化活性物質がヒドロキシアルキルデンプン誘導体のアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｚおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物が１，３−ジアミノ−２−チオプロパンまたは２，３−ジアミノ−１−チオプロパンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端にて酸化し、その酸化された還元末端と、Ｚに加えてさらに官能基Ｗを含有する化合物の官能基Ｚとを反応させて第一ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得、
そして第一ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の官能基Ｗと、Ｖに加えてアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物の官能基Ｖとを反応させてアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得、
該官能基Ｚが化学構造−ＮＨ−を含有し、
官能基Ｗが構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’−を有し（ここに、Ｒ’が水素、または適宜適切に置換されていてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール基であり、該シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール基がＮＨ基に直接連結するか、または酸素架橋によりＮＨ基に連結し、Ｒ’’が以下の式：
【化５】
0005396019.tif 000040
［式中、ＧはＯまたはＳであり、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳである］
で示される基からなる群から選択されるか、あるいは以下の式：
【化６】
0005396019.tif 000041
で示される基からなる群から選択される）、
官能基Ｖおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物がシステインもしくはその誘導体またはヒスチジンもしくはその誘導体であり、
Ｖがカルボキシ基または反応性カルボキシ基である（ここに、反応性カルボキシ基が反応性エステル、カルボン酸無水物、イソチオシアネートまたはイソシアネートである）
ことを特徴とする、チオエステル官能基化活性物質がヒドロキシアルキルデンプン誘導体のアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
官能基Ｚが以下の式：
【化７】
0005396019.tif 000042
［式中、ＧはＯまたはＳであり、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである］
で示される基からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ’が水素である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
官能基Ｗが以下の式：
【化８】
0005396019.tif 000043
［式中、ＧはＯまたはＳであり、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである］
で示される基からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ＺおよびＷを含有する化合物が
【化９】
0005396019.tif 000044
で示される化合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
ＺおよびＷを含有する化合物がジアミノ官能基化化合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
Ｖが反応性エステルまたはカルボン酸無水物である、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
反応性エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノールなどの適切に置換されたフェノール、２，４，６−トリクロロフェノールまたは２，４，５−トリクロロフェノールなどのトリクロロフェノール、２，４，６−トリフルオロフェノールまたは２，４，５−トリフルオロフェノールなどのトリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシベンゾトリアゾールなどのヒドロキシアゾールに由来する、請求項８または１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
反応性エステルがペンタフルオロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）アルキルチオ脱ハロゲン化を経由し、カルボキシ基を酸塩化物に変換し、該酸塩化物をＲ’−ＳＨ化合物と反応させること、または
（ｉｉ）カルボキシ基とカルボジイミドおよびチオールＲ’ＳＨとを反応させてチオエステル官能基化活性物質を得ること
を特徴とする、活性物質がカルボキシ基を含有する小分子薬剤である、請求項６〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
活性物質がチオエステル官能基化ペプチドを得ることができる合成樹脂を用いて製造されたペプチドである、請求項６〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
活性物質がチオエステル官能基化タンパク質につながる発現ベクターを用いて製造されたタンパク質である、請求項６〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか記載の方法により得られうる、活性物質とヒドロキシアルキルデンプンとのコンジュゲート。
【請求項２１】
活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンが式（ＩＶ）：
【化１０】
0005396019.tif 000045
（ＩＶ）
［式中、
ＹはＯおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子であり、
ＸはＳＨおよび式：
【化１１】
0005396019.tif 000046
で示される基からなる群から選択される］
で示される構造を有する化学的部分により連結される、活性物質とヒドロキシアルキルデンプンとのコンジュゲートであって、式（ＩＩ）：
【化１２】
0005396019.tif 000047
（ＩＩ）
［式中、
ＨＡＳ’はチオエステル基にその酸化された還元末端または酸化されていない還元末端により連結したヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体の残基であり、
ＡＳ’はアルファ−Ｘベータ−アミノ基に連結した活性物質またはその誘導体の残基である］
で示される構造、または式（Ｖ）：
【化１３】
0005396019.tif 000048
（Ｖ）
［式中、
ＨＡＳ’はアルファ−Ｘベータ−アミノ基にその酸化された還元末端または酸化されていない還元末端により連結したヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体の残基であり、
ＡＳ’はチオエステル基に連結した活性物質またはその誘導体の残基であり、
−（Ｃ＝Ｙ）基はチオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’に由来し、
ＨＮ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｘ基はアルファ−Ｘベータ−アミノ基に由来し、
Ｒ’は水素、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキル基からなる群から選択される］
で示される構造を有するコンジュゲート。
【請求項２２】
Ｒ’がベンジルである、請求項２１記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
式（ＶＩＩａ）：
【化１４】
0005396019.tif 000049
（ＶＩＩａ）
または式（ＶＩＩｃ）：
【化１５】
0005396019.tif 000050
（ＶＩＩｃ）
［式中、
ｎ＝０または１
Ｌは、それぞれのアルキル残基中に２〜１０の炭素原子を有する、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはヘテロアラルキル残基であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または２〜６の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基であり、
ＨＡＳ”は還元末端にて末端単糖類単位を有さないヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）分子を意味する］
で示される構造を有する、請求項２１または２２のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシエチルである、請求項２３記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素またはヒドロキシエチル基である、請求項２４記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
活性物質がタンパク質、ペプチドおよび小分子薬剤からなる群から選択される、請求項２１〜２５のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
ヒドロキシアルキルデンプンが１〜３００ｋＤの平均分子量を有し、０．１〜０．８の範囲における置換度を有するヒドロキシエチルデンプンである、請求項２１〜２６のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
ヒドロキシアルキルデンプンが２〜２００ｋＤまたは４〜１３０ｋＤの平均分子量を有するヒドロキシエチルデンプンである、請求項２７記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
式（ＶＩＩＩａ）：
【化１６】
0005396019.tif 000051
（ＶＩＩＩａ）
または式（ＶＩＩＩｃ）：
【化１７】
0005396019.tif 000052
（ＶＩＩＩｃ）
［式中、
Ｌはそれぞれのアルキル残基中に２〜１０の炭素原子を有する、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖の、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはヘテロアラルキル残基であり、
ＨＡＳ”は還元末端にて末端単糖類単位を有さないヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）分子を意味し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または２〜６の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基であり、
ＸはＳＨおよび式：
【化１８】
0005396019.tif 000053
で示される基からなる群から選択される］
で示される、アルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体。
【請求項３０】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシエチルである、請求項２９記載のアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３１】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素またはヒドロキシエチル基である、請求項３０記載のアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３２】
式（ＩＸ）：
【化１９】
0005396019.tif 000054
（ＩＸ）
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または２〜６の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基であり、
ＨＡＳ”は還元末端にて末端単糖類単位を有さないヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）分子を意味し、
Ｓ−Ｒ’は求電子性脱離基であり、
Ｒ’は水素、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキル基からなる群から選択される］
で示されるチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体。
【請求項３３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシエチルである、請求項３２記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３４】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素またはヒドロキシエチル基である、請求項３３記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３５】
求電子性基Ｓ−Ｒ’が置換または非置換のチオフェノール、チオピリジン、ベンジルメルカプタン、エタンチオール、メタンチオール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプト酢酸、２−メルカプト酢酸メチルエステルまたはエチルエステル、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸メチルエステルまたはエチルエステル、４−メルカプト酪酸、および４−メルカプト酪酸メチルエステルまたはエチルエステルからなる群から選択される、請求項３２記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３６】
式（Ｘ）：
【化２０】
0005396019.tif 000055
（Ｘ）
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または２〜６の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基であり、
ＨＡＳ”は還元末端にて末端単糖類単位を有さないヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）分子を意味し、
Ｓ−Ｒ’は求電子性脱離基であり、
Ｒ’は水素、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキル基からなる群から選択され、
Ｌ１およびＬ２は独立して、適宜少なくとも一つのヘテロ原子を含んでいてもよく、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキルおよび／またはヘテロアラルキル部分を含む、適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であり、該残基は１〜６０の炭素原子を有し、
ＤはＬ１に連結した適切な官能基Ｆ２およびＬ２に連結した適切な官能基Ｆ３により形成された共有連結基であり、
Ｆ２は−ＮＨ−またはアミノ基であり、Ｆ３は−（Ｃ＝Ｇ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｇ）−Ｇ−，−（Ｃ＝Ｏ）−Ｇまたは−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏであり、ＧはＯまたはＳである］
で示されるチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体。
【請求項３７】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシエチルである、請求項３６記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３８】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素またはヒドロキシエチル基である、請求項３７記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項３９】
求電子性基Ｓ−Ｒ’が置換または非置換のチオフェノール、チオピリジン、ベンジルメルカプタン、エタンチオール、メタンチオール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプト酢酸、２−メルカプト酢酸メチルエステルまたはエチルエステル、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸メチルエステルまたはエチルエステル、４−メルカプト酪酸、および４−メルカプト酪酸メチルエステルまたはエチルエステルからなる群から選択されるチオールに由来する、請求項３６記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項４０】
Ｌ１およびＬ２が独立して、１〜２０または１〜１０の炭素原子を有する、適宜置換されていてもよい直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基である、請求項３６記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項４１】
Ｌ１およびＬ２が独立して、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０である−（ＣＨ２）ｎ−である、請求項３６記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項４２】
ｎが２、３、４、５、６であるか、２、３、４であるか、または４である、請求項４１記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項４３】
Ｄがアミド結合である、請求項３６記載のチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項４４】
ヒトまたは動物体の治療のための方法における使用のための請求項２０〜２８のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
請求項２０〜２８のいずれか記載のコンジュゲートを含有する医薬組成物。
【請求項４６】
少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに含有する、請求項４５記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質とヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンとのコンジュゲート（ここに、コンジュゲートは、チオエステル基とアルファ−Ｘベータ−アミノ基（ここに、Ｘは−ＳＨおよび式：
【化１】
0005396019.tif 000002
で示される基からなる群から選択される）との反応により、ヒドロキシアルキルデンプンと活性物質との共有結合を経由したネイティブ化学ライゲーションにより製造される）に関する。本発明はまた、これらのコンジュゲートを製造する方法およびコンジュゲートの使用に関する。
【０００２】
ネイティブ化学ライゲーションは、ペプチドチオエステルがＮ−末端システイン残基を有するペプチドとカップリングしてライゲーション部位にてアミド結合を含む生成物を提供する、大分子ペプチドおよび小分子タンパク質を製造する高効率的方法である。
【背景技術】
【０００３】
国際公開番号WO 03/031581 A2は、Ｎ末端にシステインまたはヒスチジン残基を有するポリペプチドにポリマー誘導体をコンジュゲートさせる方法（ここに、該方法は、Ｎ末端にシステインまたはヒスチジン残基を有するポリペプチドの提供、チオエステル末端ポリマーの提供を含み、該ポリマーは、水溶性および非ペプチド性ポリマー骨格、好ましくはポリエチレングリコールポリマーを含み、ポリマー誘導体およびポリペプチドを反応させる）を開示する。ポリマーとして、ポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アルファヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、多糖類、ならびにその共重合体、三元重合体および混合物が挙げられる。すべての明示的に開示されているポリマーは、ポリエチレングリコールポリマーである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
単官能性ＰＥＧ分子のカップリング方法および使用の発展にもかかわらず、ＰＥＧ化剤の一般的不利は、非天然ポリマーとしてのＰＥＧの代謝経路が詳細に知られていないことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
それゆえ、活性物質と、化学ライゲーションにより形成されるポリマー（ここに、ポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールはポリマーとして使用されない）との新規コンジュゲートを提供することが本発明の目的であった。
【０００６】
それにより、これらのコンジュゲートを製造する方法を提供することは本発明の別の目的であった。
【０００７】
従って、本発明は、活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンが式（Ｉ）：
【化２】
0005396019.tif 000003
（Ｉ）
［式中、ＹはＯおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｘは−ＳＨおよび式：
【化３】
0005396019.tif 000004
で示される基からなる群から選択される］
で示される化学残基により連結される、活性物質とヒドロキシアルキルデンプンとのコンジュゲートに関する。
【０００８】
それにより、本発明は、チオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’と式：
【化４】
0005396019.tif 000005
［式中、Ｒ’は水素、適宜適切に置換されていてもよい、直鎖、環状および／または分枝鎖の、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキル基からなる群から選択され、好ましくはベンジルである］
で示されるアルファ−Ｘベータ−アミノ基とを反応させることを特徴とする、活性物質およびヒドロキシアルキルデンプンが式（Ｉ）：
【化５】
0005396019.tif 000006
（Ｉ）
［式中、ＹはＯおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子である］
で示される化学残基により連結される、活性物質とヒドロキシアルキルデンプンとの共有結合したコンジュゲートを製造する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
それゆえ本明細書において用語「アルファ−Ｘベータ−アミノ基」は、Ｘが炭素原子に結合し、第一級アミノ基が隣接する炭素原子に結合する、エチレン基を意味する。
【００１０】
上記式（Ｉ）で示される化学部分にて、−（Ｃ＝Ｙ）基はチオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’に由来し、ＨＮ−ＣＨ−ＣＨ2−Ｘ基はアルファ−Ｘベータ−アミノ基に由来する。
【００１１】
本明細書において用語「活性物質」は、ウィルス、バクテリア、菌類、植物体、動物体およびヒトを含むが、これらに限定されない、生物有機体のいずれかの物理的特性または生化学的特性に影響を及ぼすことができる物質に関する。特に本明細書において用語「活性物質」は、ヒトもしくは動物における疾患の診断、治療緩和、治療もしくは予防を対象とした物質、またはそうでなければヒトもしくは動物の肉体的もしくは精神的健康を増強するための物質に関する。生物学的に有効な分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬剤、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウィルス、リポソーム、微小粒子およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の例としては、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）などのエリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｇ−ＣＳＦ様組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＦＮアルファおよびＩＦＮベータ様組換えヒトＩＦＮアルファまたはＩＦＮベータ（ｒｈＩＦＮアルファまたはｒｈＩＦＮベータ）などのアルファ−インターフェロン（ＩＦＮアルファ）、ベータ−インターフェロン（ＩＦＮベータ）またはガンマ−インターフェロン（ＩＦＮガンマ）、インターロイキン、例えばＩＬ−２またはＩＬ−３様組換えヒトＩＬ−２またはＩＬ−３（ｒｈＩＬ−２またはｒｈＩＬ−３）などのＩＬ−１〜ＩＬ−１８、凝固因子ＩＩ−ＸＩＩＩ様因子ＶＩＩＩなどの血清タンパク質、アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈＴＰＡ）などの組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子、組換えヒトＡＴ  ＩＩＩ（ｒｈＡＴ  ＩＩＩ）などのＡＴ  ＩＩＩ、ミオグロビン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽増殖因子（ＦＧＦ）、脳由来増殖因子（ＢＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）、脳由来神経栄養増殖因子（ＢＤＮＦ）などの成長因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＧＦアルファまたはＴＧＦベータなどの形質転換成長因子、ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、ヒト成長ホルモンなどの成長ホルモン、ＴＮＦアルファまたはＴＮＦベータなどの腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、ヘモグロビン、インスリン、ゴナドトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン（アルファ−ＭＳＨ）、トリプトレリンなどのホルモンまたはプロホルモン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨおよびオキシトシン）ならびに放出ホルモンおよび放出阻害ホルモンなどの視床下部（hypthalamic）ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン、例えばチロキシン、チロトロピン、チロリベリン、プロラクチン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２など）、エキセンディン−４などのエキセンディン、レプチン、バソプレシン、ガストリン、セクレチン、インテグリン、糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ、ＦＳＨなど）、メラノシド（melanoside）刺激ホルモン、ａｐｏ−Ｂ、ａｐｏ−Ｅ、ａｐｏ−Ｌaなどのリポタ��パク質およびアポリポタンパク質、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのフラグメントなどのイムノグロブリン、ヒルジン、組織経路阻害剤、レクチンまたはリシンなどの植物性タンパク質、ハチ毒、ヘビ毒、抗毒素、抗原Ｅ、アルファ−プロテイナーゼ阻害剤、ブタクサ・アレルゲン、メラニン、オリゴリジンタンパク質、ＲＧＤタンパク質またはこれらのタンパク質のうちの一つについての適宜対応するレセプター；またはこれらいずれかのタンパク質もしくはレセプターの官能基性誘導体もしくはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。酵素の例としては、炭水化物特異的酵素、タンパク分解酵素、酸化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、キナーゼおよびリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な限定されない例は、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、グルタミナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニン、トリプトファナーゼ、チロシナーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）、エンドトキシナーゼ（endotoxinase）、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシン・ジホスファターゼ、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ、ビリルビン酸化酵素、グルコース酸化酵素、グルコダーゼ（glucodase）、グルコン酸酸化酵素、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、組織因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ＭＡＰ−キナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ラクトフェリンおよびその官能基性誘導体またはフラグメントである。
【００１２】
本発明のある別法によれば、活性物質は、小分子薬剤、ペプチドおよび／またはタンパク質である。
【００１３】
他のもののうち、次のタンパク質が明示的に示されている：  組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）などのエリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｇ−ＣＳＦ様組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、凝固因子ＩＩ−ＸＩＩＩ様因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸなどの血清タンパク質、アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈＴＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子、組換えヒトＡＴ  ＩＩＩ（ｒｈＡＴ  ＩＩＩ）などのＡＴ  ＩＩＩ。
【００１４】
本明細書において用語「ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）」は、少なくとも一つのヒドロキシアルキル基により置換されているデンプン誘導体を意味する。本発明の好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、式（ＩＩ）：
【化６】
0005396019.tif 000007
（ＩＩ）
［式中、デンプン分子の還元末端は、非酸化体にて示され、ＨＡＳの末端糖単位は、例えば溶媒に応じてアルデヒド体と平衡状態にあることができる、アセタール体にて示される］
で示される構造を有する。本明細書において略語ＨＡＳ”は、ＨＡＳ分子の還元末端における末端単糖類単位を有さないＨＡＳ分子を意味する。
【００１５】
本明細書において用語ヒドロキシアルキルデンプンは、末端炭水化物部分が簡潔のために式（ＩＩ）に示されるヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3を含有する化合物に限定されないが、少なくとも一つのヒドロキシアルキル基がどこかに存在し、末端炭水化物部分および／またはデンプン分子の残りの部分のいずれかにて、ＨＡＳ”がヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2またはＲ3で置換されている化合物をも意味する。
【００１６】
二以上の異なるヒドロキシアルキル基を含有するヒドロキシアルキルデンプンもまた可能である。
【００１７】
ＨＡＳに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基は、二以上のヒドロキシ基を含むことができる。好ましい具体的態様によれば、ＨＡＳに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基は、一つのヒドロキシ基を含む。
【００１８】
表現「ヒドロキシアルキルデンプン」はまた、アルキル基がモノ置換または多置換である誘導体を含む。本明細書において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素、またはアリール基で置換されていることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基のヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化することができる。
【００１９】
さらにアルキルの代わりに、直鎖または分枝鎖の置換または非置換アルケン基もまた使用することができる。
【００２０】
ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。該エーテル誘導体に加えて、他のデンプン誘導体もまた本明細書にて用いることができる。例えば、エステル化ヒドロキシ基を含有する誘導体が有用である。これらの誘導体は例えば、２〜１２の炭素原子を有する非置換のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸の誘導体またはその置換誘導体であることができる。特に有用なものは、２〜６の炭素原子を有する非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体である。本明細書において、アセチルデンプン、ブチリルデンプンおよびプロピオニルデンプンが好ましい。
【００２１】
さらに２〜６の炭素原子を有する非置換ジカルボン酸の誘導体が好ましい。
【００２２】
ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の第二カルボキシ基もまたエステル化されることが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体もまた、本明細書において適切である。
【００２３】
置換モノカルボン酸またはジカルボン酸について、好ましい置換基は、置換アルキル残基についての上記のものと同じであることができる。
【００２４】
デンプンのエステル化についての技術は、当分野において知られている（例えば文献（Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York）、特に4.4章セルロースのエステル化(ISBN 3-527-29489-9)を参照のこと）。
【００２５】
本発明の好ましい具体的態様によれば、上記式（ＩＩ）記載のヒドロキシアルキルデンプンを用いる。ＨＡＳ”に含まれる他の糖環構造は、糖環に明示的に記載のものと同一または異なることができる。
【００２６】
式（ＩＩ）記載の残基Ｒ1、Ｒ2およびＲ3に関しては、特別な限定はない。好ましい具体的態様によれば、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、独立して水素、またはアルキル残基にそれぞれ２〜１０の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基またはヒドロキシアルカリル基、または（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ基（ここに、ｎは整数、好ましくは１、２、３、４、５または６である）である。水素、および２〜１０を有するヒドロキシアルキル基が好ましい。より好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、２〜６の炭素原子、より好ましくは２〜４の炭素原子、およびさらにより好ましくは２〜４の炭素原子を有する。それゆえ好ましい「ヒドロキシアルキルデンプン」は、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンが最も好ましい。
【００２７】
アルキル、アリール、アラルキルおよび／またはアルカリル基は、直鎖または分枝鎖であり、適切に置換されていてもよい。
【００２８】
それゆえ本発明はまた、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が独立して水素、または２〜６の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖ヒドロキシアルキル基である、上記方法およびコンジュゲートに関する。
【００２９】
従って、好ましいＲ1、Ｒ2およびＲ3は、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピルなどのヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシイソプロピル、２−ヒドロキシエチルなどのヒドロキシエチル、水素であることができ、２−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。
【００３０】
それゆえ本発明はまた、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して水素または２−ヒドロキシエチル基である、上記の方法およびコンジュゲートに関し、少なくとも一つのＲ1、Ｒ2およびＲ3残基が２−ヒドロキシエチルである具体的態様が特に好ましい。
【００３１】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が、本発明のすべての具体的態様について最も好ましい。
【００３２】
それゆえ本発明は、ポリマーがヒドロキシエチルデンプンであり、ポリマー誘導体がヒドロキシエチルデンプン誘導体である、上記の方法およびコンジュゲートに関する。
【００３３】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然アミロペクチンの誘導体であり、体内にてアルファ−アミラーゼにより分解される。ＨＥＳは炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に９５重量％までの濃度にて存在する。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、臨床において血液量置換剤として用いられ、血液希釈治療に用いられる（文献（Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278、およびWeidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498））。
【００３４】
アミロペクチンは、主鎖においてアルファ−１，４−グリコシド結合が存在し、分枝鎖部位においてアルファ−１，６−グリコシド結合が見られるグルコース部分からなる。この分子の物理化学的特性は主に、グリコシド結合の型により測定される。ギザギザの（nicked）アルファ−１，４−グリコシド結合のために、１回転あたり約６つのグルコースモノマーを有するらせん構造が作られる。ポリマーの物理化学的特性ならびに生化学的特性は、置換により改変し得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化により達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコースモノマーにおけるそれぞれのヒドロキシ基の異なる反応性を活用することが可能である。この事実により、当業者は限定される程度まで置換パターンに影響を及ぼすことができる。
【００３５】
ＨＥＳは主に、分子量分布および置換度により特徴付けられる。置換度を記載する二つの可能性がある：
１．  置換度は、すべてのグルコース部分に関する置換グルコースモノマーの割合を相対的に記載することができる。
２．  置換度は、グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基の数が記載されるモル置換として記載することができる。
本明細書において、ＤＳとして示される置換度は、上記のモル置換に関する（文献（Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278、上記引用のように特にp. 273）もまた参照のこと）。
【００３６】
ＨＥＳ溶液は、各分子が重合度、分枝部位の数およびパターン、および置換パターンに関して他のものと異なる、多分散系組成物として存在する。それゆえＨＥＳは、異なる分子量を有する化合物の混合物である。その結果として、特定のＨＥＳ溶液は、統計的平均を用いた平均分子量により測定する。本明細書において、Ｍnは分子の数に応じて相加平均として計算する。あるいはＭw（またはＭＷ）、平均分子量はＨＥＳの質量に応じた単位を意味する。
【００３７】
本明細書において、好ましいヒドロキシエチルデンプンは、１〜３００ｋＤの平均分子量（平均分子量の重量）を有することができる。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、ヒドロキシエチル基に関して０．１〜０．８の好ましいモル置換度および２〜２０の範囲にてＣ2：Ｃ6置換の間の好ましい比を示すことができる。
【００３８】
本明細書において用語「平均分子量」は、文献（Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; and Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498）に記載されるＬＡＬＬＳ−（低アングルレーザー光散乱）−ＧＰＣ法により測定される重量に関する。さらに１０ｋＤ以下の平均分子量について、ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣにより先に定量される基準により計算した。
【００３９】
本発明の好ましい具体的態様によれば、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、１〜３００ｋＤ、より好ましくは２〜２００ｋＤ、より好ましくは４〜１３０ｋＤ、より好ましくは４〜１００ｋＤおよびさらにより好ましくは４〜７０ｋＤである。
【００４０】
それゆえ本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンが４〜７０ｋＤの平均分子量を有するヒドロキシエチルデンプンである、上記方法およびコンジュゲートに関する。
【００４１】
平均分子量の好ましい範囲は、例えば４〜７０ｋＤまたは１０〜７０ｋＤまたは１２〜７０ｋＤまたは１８〜７０ｋＤまたは５０〜７０ｋＤまたは４〜５０ｋＤまたは１０〜５０ｋＤまたは１２〜５０ｋＤまたは１８〜５０ｋＤまたは４〜１８ｋＤまたは１０〜１８ｋＤまたは１２〜１８ｋＤまたは４〜１２ｋＤまたは１０〜１２ｋＤまたは４〜１０ｋＤである。
【００４２】
本発明の特に好ましい具体的態様によれば、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、４ｋＤより大きく７０ｋＤ未満の範囲であり、例えば約１０ｋＤであるか、または９〜１０ｋＤまたは１０〜１１ｋＤまたは９〜１１ｋＤの範囲、または約１２ｋＤであるか、または１１〜１２ｋＤまたは１２〜１３ｋＤまたは１１〜１３ｋＤの範囲、または約１８ｋＤであるか、または１７〜１８ｋＤまたは１８〜１９ｋＤまたは１７〜１９ｋＤの範囲、または約５０ｋＤであるか、または４９〜５０ｋＤまたは５０〜５１ｋＤまたは４９〜５１ｋＤの範囲である。
【００４３】
モル置換度（ＤＳ）の上限について、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０などの２．０までの値もまた可能であり、２．０未満の値が好ましく、１．５未満の値がより好ましく、０．７、０．８または０．９などの１．０未満の値がさらにより好ましい。
【００４４】
それゆえモル置換度の好ましい範囲は、０．１〜２または０．１〜１．５または０．１〜１．０または０．１〜０．９または０．１〜０．８である。モル置換度のより好ましい範囲は、０．２〜２または０．２〜１．５または０．２〜１．０または０．２〜０．９または０．２〜０．８である。モル置換度のさらにより好ましい範囲は、０．３〜２または０．３〜１．５または０．３〜１．０または０．３〜０．９または０．３〜０．８である。モル置換度のさらにより好ましい範囲は、０．４〜２または０．４〜１．５または０．４〜１．０または０．４〜０．９または０．４〜０．８である。
【００４５】
置換度（ＤＳ）に関して、ＤＳは、好ましくは少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．３およびより好ましくは少なくとも０．４である。ＤＳの好ましい範囲は、０．１〜０．８、より好ましくは０．２〜０．８、より好ましくは０．３〜０．８およびさらにより好ましくは０．４〜０．８、さらにより好ましくは０．１〜０．７、より好ましくは０．２〜０．７、より好ましくは０．３〜０．７およびより好ましくは０．４〜０．７である。ＤＳの特に好ましい値は、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８であり、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８がより好ましく、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８がさらにより好ましく、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８がさらにより好ましく、例えば０．４および０．７が特に好ましい。
【００４６】
本明細書において０．８などの与えられた値のモル置換度は、正確な値であるか、または０．７５〜０．８４の範囲にあるものとして理解することができる。それゆえ例えば、０．１の与えられた値は、正確な値の０．１であるか、もしくは０．０５〜０．１４の範囲であることができ、０．４の与えられた値は、正確な値の０．４であるか、もしくは０．３５〜０．４４の範囲であることができ、または０．７の与えられた値は、正確な値の０．７であるか、もしくは０．６５〜０．７４の範囲であることができる。
【００４７】
ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの分子量およびその置換度ＤＳの特に好ましい組合せは、例えば１０ｋＤおよび０．４または１０ｋＤおよび０．７または１２ｋＤおよび０．４または１２ｋＤおよび０．７または１８ｋＤおよび０．４または１８ｋＤおよび０．７または５０ｋＤおよび０．４または５０ｋＤおよび０．７または１００ｋＤおよび０．７である。
【００４８】
約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳの例は、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８などの０．２〜０．８、好ましくは０．４、０．５、０．６または０．７などの０．４〜０．７の置換度を有するＨＥＳである。
【００４９】
約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳについての例は、FreseniusからのVoluven（登録商標）である。Voluven（登録商標）は、例えば血液量不足症の治療および予防のための治療指標に用いる容積置換に用いられる人工（artifical）コロイドである。Voluven（登録商標）の特徴は、130,000＋／−20,000Ｄの平均分子量、０．４のモル置換および約９：１のＣ2：Ｃ6比である。
【００５０】
Ｃ2：Ｃ6置換の比に関して、該置換は、好ましくは２〜２０の範囲、より好ましくは２〜１５の範囲、さらにより好ましくは３〜１２の範囲である。
【００５１】
本発明のさらなる具体的態様によれば、異なる平均分子量および／または異なる置換度および／またはＣ2：Ｃ6置換の異なる比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物もまた、用いることができる。それゆえ異なる平均分子量および異なる置換度およびＣ2：Ｃ6置換の異なる比を有するか、または異なる平均分子量および異なる置換度およびＣ2：Ｃ6置換の同じもしくはほぼ同じ比を有するか、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度およびＣ2：Ｃ6置換の異なる比を有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度およびＣ2：Ｃ6置換の異なる比を有するか、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度およびＣ2：Ｃ6置換の同じもしくはほぼ同じ比を有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度およびＣ2：Ｃ6置換の同じもしくはほぼ同じ比を有するか、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度およびＣ2：Ｃ6置換の異なる比を有するか、またはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ置換度およびほぼ同じＣ2：Ｃ6置換の比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物を用いることができる。
【００５２】
本発明による異なるコンジュゲートおよび／または異なる方法において、異なるヒドロキシアルキルデンプン、好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプンおよび／または異なるヒドロキシアルキルデンプン混合物、好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプン混合物を用いることができる。
【００５３】
本明細書において用語「反応性カルボキシ基」は、反応性エステルを意味し、無水カルボン酸、イソチオシアネートまたはイソシアネートを示すことができる。好ましい反応性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノールなどの適切に置換されたフェノール、２，４，６−トリクロロフェノールまたは２，４，５−トリクロロフェノールなどのトリクロロフェノール、２，４，６−トリフルオロフェノールまたは２，４，５−トリフルオロフェノールなどのトリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシベンゾトリアゾールなどのヒドロキシアゾールに由来する。特に好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが特に好ましい。すべてのアルコールはそれのみで、またはその二以上の適切な組合せとして用いることができる。反応性エステルとして、ペンタフルオロフェニルエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが特に好ましい。
【００５４】
チオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’、好ましくは−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−Ｒ’のＲ’基について、−Ｓ−Ｒ’基はアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応するときの置換に適切な求電子性脱離基を形成する場合に、非特異的限定が存在する。好ましいＳＲ’残基としては、置換または非置換のチオフェノール、チオピリジン、ベンジルメルカプタン、エタンチオール、メタンチオール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプト酢酸、２−メルカプト酢酸メチルエステルまたはエチルエステル、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸メチルエステルまたはエチルエステル、４−メルカプト酪酸、４−メルカプト酪酸メチルエステルまたはエチルエステルに由来する置換基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の最初の代替によれば、チオエステル基はヒドロキシアルキルデンプンに含まれ、アルファ−Ｘベータ−アミノ基は活性物質に含まれる。
【００５６】
それゆえ本発明はまた、チオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンが活性物質のアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応する、上記方法にも関する。
【００５７】
チオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンは、すべての適切な方法により提供することができる。
【００５８】
本発明のある具体的態様によれば、本発明の方法は、ヒドロキシアルキルデンプンをその還元末端にて選択的に酸化させて式（ＩＩＩａ）：
【化７】
0005396019.tif 000008
（ＩＩＩａ）
および／または式（ＩＩＩｂ）：
【化８】
0005396019.tif 000009
（ＩＩＩｂ）
で示されるヒドロキシアルキルデンプンを得、その還元末端にて選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプンと少なくとも一つの適切な化合物とを反応させてチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンを得ることを含む。
【００５９】
ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの酸化は、上記の構造（ＩＩＩａ）および／または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を生じる各方法または方法の組合せにより行うことができる。酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を生じるすべての適切な方法により行うことができるが、好ましくは、本明細書に引用される文献（例えばDE 196 28 705 A1）の各内容（実施例Ａ、９段落目、６〜２４行目）に記載されるアルカリ性ヨウ素溶液を用いて行う。
【００６０】
本発明の別法により、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくは還元末端にて選択的に酸化されたものは、官能基Ｍ（ここに、官能基Ｍはヒドロキシアルキルデンプンと、好ましくは酸化された還元末端にて反応する）、および官能基Ｑ（ここに、官能基Ｑはチオエステル基であるか、または改変されてチオエステル基を与えることができる官能基である）を含有する、少なくとも二官能性の化合物と反応する。
【００６１】
ヒドロキシアルキルデンプンと反応する少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍとして、特に基は、Ｒ’が、水素、またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基（ここに、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基はＮＨ基に直接連結することができるか、または別の具体的態様により酸素架橋によりＮＨ基に連結することができる）である、構造Ｒ’−ＮＨ−を有するものが示される。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は適切に置換することができる。好ましい置換基としては、Ｆ、ＣｌまたはＢｒなどのハロゲンを示すことができる。特に好ましいＲ’残基は、水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、さらに好ましくは、水素および非置換アルキルおよびアルコキシ基である。
【００６２】
アルキルおよびアルコキシ基のうち、１、２、３、４、５または６の炭素原子を有する基が好ましい。より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシ基である。特に好ましくは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、特に好ましくはメチルまたはメトキシである。
【００６３】
本発明の別の具体的態様により、官能基Ｍは、Ｒ”が、好ましくは構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ここに、ＧはＯまたはＳである）、および／または構造単位−ＳＯ2−を含有する、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−を有する。官能基Ｒ”についての具体的な例は、
【化９】
0005396019.tif 000010
［式中、Ｇが二つ存在する場合、独立してＯまたはＳである］
で示される基である。
【００６４】
それゆえ本発明はまた、官能基Ｍが以下の式：
【化１０】
0005396019.tif 000011
［式中、ＧはＯまたはＳであり、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである］
で示される基からなる群から選択される、上記の方法およびコンジュゲートに関する。
【００６５】
本発明の特に好ましい具体的態様により、官能基Ｍはアミノ基−ＮＨ2である。
【００６６】
チオエステル基であるか、または化学的に修飾されてチオエステル基を与えることができる官能基である、Ｑ基により、他の中で次の官能基が示される：
−  Ｃ−Ｃ−二重結合またはＣ−Ｃ−三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ−結合；
−  チオ基またはヒドロキシ基；
−  アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
−  １，２−ジオール；
−  １，２−アミノ−チオアルコール；
−  アジド；
−  １，２−アミノアルコール；
−  アミノ基−ＮＨ2、またはアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基もしくはアルカリルアミノ基などの構造単位−ＮＨ−を含有するアミノ基の誘導体；
−  ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2、またはヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、もしくはヒドロキサル（hydroxal）アルカリルアミノ基などの構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含有するヒドロキシルアミノ基の誘導体；
−  それぞれ構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含有する、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基またはアルカリルオキシアミノ基；
−  −Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ
［式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｍは例えば、
−−  −ＯＨまたは−ＳＨ；
−−  アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基またはアルカリルオキシ基；
−−  アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基またはアルカリルチオ基；
−−  アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基；
−−  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのイミド構造または構造単位Ｏ−Ｎ（ここに、Ｎはヘテロアリール化合物の一部である）を有するヒドロキシルアミンのエステルなどの活性化エステル、またはＧ＝Ｏであり、Ｑが存在しない場合、ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を有するアリールオキシ化合物など；
（ここに、Ｑは存在しないか、またはＮＨまたはＳもしくはＯなどのヘテロ原子である）；
である］
で示されるカルボニル基を有する残基；
−  −ＮＨ−ＮＨ2または−ＮＨ−ＮＨ−；
−  −ＮＯ2；
−  ニトリル基；
−  アルデヒド基またはケト基などのカルボニル基；
−  カルボキシ基；
−  −Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
−  ヨウ化ビニルもしくは臭化ビニル基などのハロゲン化ビニル基またはビニルトリフレート；
−  −Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
−  −（Ｃ＝ＮＨ2Ｃｌ）−Ｏアルキル
−  −（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｈａｌ基（ここに、ＨａｌはＣｌ、ＢｒまたはＩである）；
−  −ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ2−；
−  −Ｓ−Ｓ−構造を含有するジスルフィド基；
−  以下の式：
【化１１】
0005396019.tif 000012
で示される基；
−  以下の式：
【化１２】
0005396019.tif 000013
で示される基。
【００６７】
第一の別法により、官能基Ｑはチオエステル基である。
【００６８】
第二の別法により、官能基Ｑはさらに改変されてチオエステル基を与える基である。この具体的態様により、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくは還元末端にて選択的に酸化されたものと少なくとも二官能性の化合物との反応により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の官能基Ｑおよびチオエステル基と反応する官能基を含有する少なくとも二官能性の化合物とさらに反応する。
【００６９】
官能基Ｑと反応するさらなる化合物の官能基として、官能基Ｑについての上記の官能基のリストからのすべての適切な官能基がＱと反応しうるものとして示される。
【００７０】
本発明のある具体的態様により、官能基Ｑは化学構造−ＮＨ−を含有する。
【００７１】
本発明の好ましい具体的態様により、官能基Ｑは、Ｒ’が水素またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基（ここに、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接連結することができるか、または別の具体的態様により酸素架橋によりＮＨ基に連結することができる）である、Ｒ’−ＮＨ−構造を有する基である。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は適切に置換することができる。好ましい置換基として、Ｆ、ＣｌまたはＢｒなどのハロゲンを示すことができる。特に好ましいＲ’残基は、水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、さらにより好ましくは、水素および非置換アルキルおよびアルコキシ基である。
【００７２】
アルキルおよびアルコキシ基の中で、１、２、３、４、５または６の炭素原子を有する基が好ましい。より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシ基である。特に好ましくは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、特に好ましくは、メチルまたはメトキシである。
【００７３】
本発明の別の具体的態様により、官能基Ｑは、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−［式中、Ｒ”は好ましくは、構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ここに、ＧはＯまたはＳである）、および／または構造単位−ＳＯ2−を含有する］を有する。より好ましい具体的態様により、官能基Ｒ”は以下の式：
【化１３】
0005396019.tif 000014
［式中、Ｇが二つ存在する場合、Ｇは独立してＯまたはＳである］
で示される基からなる群から選択される。
【００７４】
それゆえ本発明はまた、官能基Ｑが以下の式：
【化１４】
0005396019.tif 000015
［式中、ＧはＯまたはＳであり、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである］
で示される基からなる群から選択される、上記の方法およびコンジュゲートに関する。
【００７５】
本発明の特に好ましい具体的態様により、官能基Ｑはアミノ基−ＮＨ2である。
【００７６】
本発明のある具体的態様により、ＭおよびＱの両方は、アミノ基−ＮＨ−を含有する。好ましい具体的態様により、ＭおよびＱの両方は、アミノ基−ＮＨ2である。
【００７７】
本発明の好ましい具体的態様により、ＭおよびＱを含有する化合物は、ホモ二官能性化合物、より好ましくは官能基としてＭおよびＱを、最も好ましくはアミノ基−ＮＨ2を、または他の具体的態様により、ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2または以下の式：
【化１５】
0005396019.tif 000016
［式中、Ｇは好ましくはＯである］
で示される基を含有する二官能性化合物である。これらのＭおよびＱを含有する化合物の具体的な例は、
【化１６】
0005396019.tif 000017
である。
【００７８】
好ましい場合、ＭおよびＱの両方は、アミノ基−ＮＨ2であり、ＭおよびＱはいずれかの適切なスペーサーにより分離されていることがある。他のもののうちで、スペーサーは適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であることができる。一般に炭化水素残基は、１〜６０、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６であり、特に好ましくは２〜４の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に、１〜２０、好ましくは１〜８、特に好ましくは１〜４のヘテロ原子を含有する。炭化水素残基は、例えば５〜７の炭素原子を有する適宜分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基、またはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であることができるアラルキル基、アルカリル基を含有することができる。さらにより好ましい具体的態様により、炭化水素残基は、１〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４の炭素原子のアルキル鎖である。
【００７９】
それゆえ本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンが１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパンまたは１，２−ジアミノエタンと反応してアミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を与える、上記方法およびコンジュゲートにも関する。
【００８０】
本発明の別法により、ヒドロキシアルキルデンプンは、酸化された還元末端にて行う。本発明の別法により、ヒドロキシアルキルデンプンは非酸化還元末端にて行う。本発明のさらなる別法により、ヒドロキシアルキルデンプンは選択的に酸化された還元末端により官能基Ｍと反応する。本発明のさらなる別法により、ヒドロキシアルキルデンプンは非酸化還元末端により官能基Ｍと反応する。本発明のさらなる別法により、ヒドロキシアルキルデンプンはＨＡＳ分子の適切な化学部分にて官能基Ｍと反応する。さらなる別法により、ヒドロキシアルキルデンプンは非酸化還元末端およびＨＡＳ分子の少なくとも一つのさらなる化学部分にて、または選択的に酸化された還元末端およびＨＡＳ分子の少なくとも一つのさらなる化学部分にて、官能基Ｍと反応することができる。
【００８１】
本明細書において用語「ヒドロキシアルキルデンプンは、還元末端により反応する」、または「ヒドロキシアルキルデンプンは、選択的に酸化された還元末端により反応する」は、ヒドロキシアルキルデンプンがその（選択的に酸化された）還元末端により主に反応するような工程に関する。
【００８２】
用語「主にその（選択的に酸化された）還元末端により」は、与えられた反応に用いられるヒドロキシアルキルデンプン分子の、統計的には５０％より多く、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など少なくとも９５％は、ヒドロキシアルキルデンプン分子あたり少なくとも一つの（選択的に酸化された）還元末端により反応する工程に関し、ここに、少なくとも一つの還元末端により反応する与えられたヒドロキシアルキルデンプン分子は、該ヒドロキシアルキルデンプン分子に含まれるが、還元末端ではない少なくとも一つのさらなる適切な官能基により同じ与えられた反応中に、反応することができる少なくとも一つの還元末端により反応することができる。一つ以上のヒドロキシアルキルデンプン分子は少なくとも一つの還元末端により反応し、そして同時にこのヒドロキシアルキルデンプン分子に含まれるが、還元末端ではない少なくとも一つのさらなる適切な官能基により反応する場合、このヒドロキシアルキルデンプン分子のすべての反応した官能基（ここに、該官能基は還元末端を含む）の、統計的に好ましくは５０％より多く、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など少なくとも９５％は、還元末端である。
【００８３】
本明細書において用語「還元末端」は、アルデヒド基および／または対応するアセタール体として存在することができるヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基に関する。還元末端が酸化される場合、アルデヒドまたはアセタール基はカルボキシ基および／または対応するラクトンの形態である。
【００８４】
上記のように、アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体は好ましくは、アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体のアミノ基、およびチオエステル基と反応する官能基を含有する少なくとも二官能性の化合物とさらに反応する。
【００８５】
アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体と反応しうる好ましい化合物としては、アミノ基と反応する反応性カルボキシ基、およびチオエステル基を含有するものが挙げられる。反応性カルボキシ基としては、反応性エステル、イソチオシアネートまたはイソシアネートを挙げることができる。好ましい反応性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノールなどの適切に置換されたフェノール、２，４，６−トリクロロフェノールもしくは２，４，５−トリクロロフェノールなどのトリクロロフェノール、２，４，６−トリフルオロフェノールもしくは２，４，５−トリフルオロフェノールなどのトリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはヒドロキシベンゾトリアゾールなどのヒドロキシアゾールに由来する。
【００８６】
反応性カルボキシ基およびチオエステルは、いずれかの適切なスペーサーにより分離することができる。他の中で、スペーサーは、適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であることができる。一般に炭化水素残基は、１〜６０、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に、１〜２０、好ましくは１〜８、特に好ましくは１〜４のヘテロ原子を含有する。炭化水素残基は、例えば５〜７の炭素原子を有する適宜分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基、またはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であることができるアラルキル基、アルカリル基を含有することができる。本発明のある具体的態様により、反応性カルボキシ基およびチオエステル基は、エチレン基、プロピレン基またはブチレン基などの２、３または４の炭素原子を有するアルキル残基により分離する。
【００８７】
例として、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンがその酸化された還元末端により１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパンまたは１，２−ジアミノエタンなどのジアミノアルカンと反応し、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体が、チオエステル基−Ｓ−Ｒ’および反応性カルボキシ基（ここに、チオエステル基および反応性カルボキシ基は、エチレン基、プロピレン基またはブチレン基により分離される）を含有する化合物とさらに反応する場合、式：
【化１７】
0005396019.tif 000018
［式中、ｎ、ｍは独立して２、３、４である］
で示されるチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンを得ることができる。
【００８８】
それゆえ本発明はまた、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを酸化し、酸化された還元末端と二つのアミノ基を含有する少なくとも二官能性の化合物とを反応させてアミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得、該誘導体のアミノ基と該誘導体のアミノ基と反応する少なくとも一つの官能基、好ましくは反応性カルボキシ基、および少なくとも一つのチオエステル基、好ましくは一つのチオエステル基−ＳＲ’を含有する少なくとも二官能性の化合物とを反応させることを特徴とする、上記の方法およびコンジュゲートに関する。
【００８９】
本発明の別の具体的態様により、チオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンは、上記のように、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを選択的に酸化させることにより製造し、
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を、例えば対応するカルボン酸と例えばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールとの反応により製造されるカルボン酸のイミダゾリドに、相対的に酸性のチオールを用いて変換することにより（文献（Masamune, S., et al., J. Am. Chem. Soc. 98 (1976) 7874））、または
−  ジスルフィドおよびトリフェニルホスフィンを用いてヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を対応するチオエステルに変換することにより（文献（Mukaiyama, T., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 43 (1970) 1271））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端とアリールチオイソシアネートとを反応させることにより（文献（Grieco, P., et al., Tetrahedron Lett. 43 (1979) 1283））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端とクロロギ酸チオピリジルとを反応させることにより（文献（Corey, E.J., et al., Tetrahedron Lett. (1979), 2875））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と２−フルオロ−Ｎ−メチルピリジニウムトシレートおよびチオールとを反応させることにより（文献（Watanabe, Y., et al., Chem. Lett. (1976) 741））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と、固体担体担持ＥＤＣ上のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド、およびチオールとを反応させることにより（文献（C.E-Lin et al. Tetrahedron Lett. 43 (2002) 4531-34; M. Adamczyk, Tetrahedron Lett. 37 (1996) 4305-8, J. Hovinen, Nucleosides Nucleotides 18 (1999) 1263-4））、製造する。
【００９０】
それゆえ本発明はまた、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを酸化し、酸化された還元末端とジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドおよびチオールとを反応させてチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンを得ることを特徴とする、上記の方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９１】
次いで上記チオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、活性物質のアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応する。
【００９２】
それゆえ本発明はまた、式（ＩＶ）：
【化１８】
0005396019.tif 000019
（ＩＶ）
［式中、チオエステル基に連結したＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体の残基であり、アルファ−Ｘベータ−アミノ基に連結したＡＳ’は、活性物質またはその誘導体の残基である］
で示される、上記コンジュゲートにも関する。
【００９３】
本発明の好ましい具体的態様により、アルファ−Ｘベータ−アミノ基は、活性物質、好ましくは小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基またはヒスチジン残基に含まれる。
【００９４】
それゆえ本発明はまた、アルファ−Ｘベータ−アミノ基が活性物質のシステイン残基またはヒスチジン残基に含まれる、上記方法およびコンジュゲートにも関する。
【００９５】
より好ましくは、活性物質のシステインまたはヒスチジン残基は、ペプチドまたはタンパク質のＮ−末端システインまたはヒスチジンである。Ｎ−末端システインまたはヒスチジン残基は、天然のＮ−末端システインもしくはヒスチジン残基であることができるか、またはペプチドもしくはタンパク質配列の適切な改変によりペプチドもしくはタンパク質にＮ−末端にて導入することができる。ペプチドにて、上記アミノ酸は合成中に導入することができる。ペプチド合成は当分野に知られている（文献（W. Chang, P. D. White ; Fmoc固相ペプチド合成、実践的アプローチ; Oxford University Press, Oxford, 2000, ISBN 0199637245））。
【００９６】
組換えポリペプチドは、例えば文献（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Eds. Sambrook et al., CSHL Press 2001）に記載の標準的分子生物学的技術により得られうる。簡潔に、ポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え発現ベクターから発現することができ、この核酸は所望のポリペプチドを発現させる少なくとも一つのレギュレーター配列に操作可能であるように連結する。例えば所望のポリペプチドをコードする核酸配列は、単離し、発現ベクターにクローン化することができ、次いで該ベクターは所望のポリペプチドの発現のために適切なホスト細胞に変換することができる。そのようなベクターはプラスミド、ファージミドまたはコスミドであることができる。例えば核酸分子は、原核生物または真核生物の発現ベクターに適切な形態でクローン化することができる（文献（Molecular Cloning、上記参照））。そのような発現ベクターは少なくとも一つのプロモーターを含み、翻訳の開始のためのシグナルを含むことができ、原核生物の発現ベクターの場合、翻訳の終了のためのシグナルをも含むことができる一方、真核生物の発現ベクターの場合、好ましくは転写終了およびポリアデニル化のための発現シグナルを含む。原核生物の発現ベクターのための例は、大腸菌における発現については例えば米国特許US 4,952,496に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターに基づく発現ベクター、サッカロマイセス・セレヴィシエにおける真核性発現については例えばG426/Met25またはP526/Gal1ベクター（文献（Mumberg et al., (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768））、昆虫細胞における発現については例えばEP-B1-0127839もしくはEP-B1-0549721またはCiccaroneらの文献（「バキュロ・ウィルス・シャトル・ベクターを用いた大腸菌における組換えバキュロ・ウィルスＤＮＡの生成」(1997) Volume 13, U. Reischt, ed. (Totowa, NJ: Humana Press Inc.)）に記載のバキュロ・ウィルス・ベクター、および哺乳類の細胞については例えばベクターＲｃ／ＣＭＷおよびＲｃ／ＡＳＷおよびＳＷ４０−ベクター（これらは一般に知られ、市販されている）、または実施例４記載のＥＢＮＡ系、シンドビス・レプリコンから作られたｐＣｙｔＴＳ（Boorsma et al. (2002) Biotechnol. Bioeng. 79(6): 602-609）、シンドビス・ウィルス発現系（Schlesinger (1993) Trends Biotechnol. 11(1):18-22）またはアデノ・ウィルス発現系（He et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514）である。これらの発現ベクターの製造のための分子生物学的方法ならびにホスト細胞をトランスフェクトし、そのトランスフェクトされたホスト細胞を培養する方法、ならびに本発明のポリペプチドを該トランスフェクトされたホスト細胞から製造し、得るための条件は、当業者によく知られている。
【００９７】
所望のＮ−末端ＣｙｓまたはＨｉｓ残基を有するポリペプチドは、上記のように、所望のＮ−末端ＣｙｓまたはＨｉｓ残基を有するポリペプチドを得るために除去できるＮ−末端リーダー配列の後ろに興味のポリペプチドをクローン化することにより、発現および精製されるポリペプチドから生成することができる。
【００９８】
これは例えば、上記のように発現および精製されたポリペプチドのタンパク分解性開裂により達成することができる。そのような場合、融合ポリペプチドは、クローン化され、発現され、精製された（ここに、ＣｙｓまたはＨｉｓ残基は、高選択的プロテアーゼ開裂部位に直接続き、例えば因子Ｘａ開裂部位：Ｉｌｅ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＧｌｙＡｒｇ｜（Ｃｙｓ／Ｈｉｓ）の直後のＨｉｓもしくはＣｙｓ残基、またはエンテロキナーゼ開裂部位：ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ｜（Ｃｙｓ／Ｈｉｓ）の直後のＨｉｓもしくはＣｙｓ残基である）（ここに、｜はプロテアーゼによる開裂部位を示す）。
【００９９】
これは、例えば発現中のポリペプチドの開裂、例えばシグナル・ペプチダーゼによりＥＲ転位の段階における開裂によりさらに達成することができる。そのような場合、ＣｙｓまたはＨｉｓ残基が組換えポリペプチドを分泌経路に向けさせるシグナルペプチドに直接続く、融合ポリペプチドをクローン化し、発現した（文献（Rapoport et al., Annu Rev Biochem. 1996;65:271-303）を参照のこと）。
【０１００】
所望の位置に所望のＣｙｓまたはＨｉｓ残基を有するポリペプチドについてのコード配列が生成するように組換えポリペプチドのコード配列を操作する分子生物学的方法は、当業者によく知られている（上記Sambrook）。
【０１０１】
本発明によるネイティブ化学ライゲーション反応によれば、チオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化活性物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質とシステインまたはヒスチジン残基、好ましくはＮ−末端システインまたはヒスチジン残基との反応の中間体生成物は、アミド結合により活性物質に連結するヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含有する本発明のコンジュゲートに、分子内トランスアセチル化により不可逆的に変換されるチオエステルである。
【０１０２】
別法により、本発明はまた、チオエステル官能基化活性物質がヒドロキシアルキルデンプン誘導体のアルファ−Ｘベータ−アミノ基と反応する、上記方法にも関する。
【０１０３】
従って、本発明はまた、式（Ｖ）：
【化１９】
0005396019.tif 000020
（Ｖ）
［式中、ＨＡＳ’はアルファ−Ｘベータ−アミノ基に連結したヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体の残基であり、ＡＳ’はチオエステル基に連結した活性物質またはその誘導体の残基である］
で示される構造を有する上記コンジュゲートにも関する。
【０１０４】
アルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプンは、いずれかの適切な方法により製造することができる。本発明のある具体的態様により、アルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプンは、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを選択的に酸化し、酸化された還元末端を適切に化学的に改変してアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることを特徴とする方法により製造する。
【０１０５】
それゆえ本発明のある具体的態様により、本発明の方法は、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを選択的に酸化し、式（ＩＩＩａ）：
【化２０】
0005396019.tif 000021
（ＩＩＩａ）
および／または式（ＩＩＩｂ）：
【化２１】
0005396019.tif 000022
（ＩＩＩｂ）
で示されるヒドロキシアルキルデンプンを得、その還元末端にて選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプンを適切に反応させてチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンを得ることを含む。
【０１０６】
ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの酸化は、上記構造（ＩＩＩａ）および／または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を生じる各方法または方法の組合せにより行うことができる。酸化は、ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を生じるすべての適切な方法により行うことができるが、好ましくは、例えば各内容（実施例Ａ、９段落目、６〜２４行目）が本明細書に引用されるDE 196 28 705 A1に記載のアルカリ性ヨウ素溶液を用いて行う。
【０１０７】
本発明のある具体的態様により、その還元末端にて選択的に酸化されるヒドロキシアルキルデンプンは、酸化された還元末端と反応する官能基Ｚ、およびＷと反応する官能基Ｖおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物とさらに反応する官能基Ｗを含有する、少なくとも二官能性の化合物と反応する。
【０１０８】
それゆえ、本発明はまた、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを酸化し、酸化された還元末端とＺに加えてさらに官能基Ｗを含有する化合物の官能基Ｚとを反応させて第一のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得、第一のヒドロキシアルキルデンプン誘導体の官能基ＷとＶに加えてアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物の官能基Ｖとを反応させてアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることを特徴とする上記方法にも関する。
【０１０９】
ある具体的態様により、ＺおよびＷの両方は化学構造−ＮＨ−を含有する。
【０１１０】
本発明の好ましい具体的態様により、官能基ＺおよびＷは、構造Ｒ’−ＮＨ−（ここに、Ｒ’は水素またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基（ここに、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接連結するか、または別の具体的態様により、酸素架橋によりＮＨ基に連結することができる）である）を有する基である。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は、適切に置換することができる。好ましい置換基としては、Ｆ、ＣｌまたはＢｒなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましいＲ’残基は、水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、さらにより好ましくは、水素および非置換アルキルおよびアルコキシ基である。
【０１１１】
アルキルおよびアルコキシ基の中で、１、２、３、４、５または６の炭素原子を有する基が好ましい。より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシ基である。特に好ましくは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、特に好ましくは、メチルまたはメトキシである。
【０１１２】
本発明の別の具体的態様により、官能基ＺおよびＷは、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−（ここに、Ｒ”は好ましくは、構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ここに、ＧはＯまたはＳである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含有する）を有する。より好ましい具体的態様により、官能基Ｒ”は以下の式：
【化２２】
0005396019.tif 000023
［式中、Ｇは、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳである］
で示される基からなる群から選択される。
【０１１３】
それゆえ本発明はまた、官能基ＺおよびＷは、独立して以下の式：
【化２３】
0005396019.tif 000024
［式中、ＧはＯまたはＳであり、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである］
で示される基からなる群から選択される、上記方法およびコンジュゲートに関する。
【０１１４】
ＺおよびＷを含有するこれらの化合物についての具体的な例は、以下の式：
【化２４】
0005396019.tif 000025
で示される化合物である。
【０１１５】
本発明の特に好ましい具体的態様により、官能基ＺおよびＷの両方は、アミノ基−ＮＨ2である。
【０１１６】
それゆえ本発明はまた、ＺおよびＷを含有する化合物がジアミノ官能基化化合物である、上記方法に関する。
【０１１７】
ＺおよびＷの両方がアミノ基−ＮＨ2である場合、ＺおよびＷはいずれかの適切なスペーサーにより分離していてもよい。他の中で、スペーサーは、適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であることができる。一般に炭化水素残基は、１〜６０、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に、１〜２０、好ましくは１〜８、特に好ましくは１〜４のヘテロ原子を含有する。炭化水素残基は、例えば５〜７の炭素原子を有する、適宜分岐していてもよい、アルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基、またはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であることができるアラルキル基、アルカリル基を含有することができる。さらにより好ましい具体的態様により、炭化水素残基は、１〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４の炭素原子のアルキル鎖である。
【０１１８】
それゆえ本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはその酸化された還元末端にて、１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパンまたは１，２−ジアミノエタンと反応してアミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得る、上記の方法およびコンジュゲートにも関する。
【０１１９】
従って、第一の別法により、アミノ基ＮＨ2である官能基Ｚは、ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と反応し、ヒドロキシアルキルデンプンを連結するアミド基を生じ、ＺおよびＷを含有する化合物を生じる。
【０１２０】
第二の別法により、アミノ基ＮＨ2である官能基Ｚは、次いで好ましくは水素化されてアミノ基を得るイミノ基を生じる還元的アミノ化によりヒドロキシアルキルデンプンの非酸化還元末端と反応し、イミノ基およびアミノ基はそれぞれ、ヒドロキシアルキルデンプン、およびＺおよびアミノ基Ｗを含有する化合物に連結している。この場合、ＺおよびＷを含有する化合物が−官能基として−一つのアミノ基のみを含む第一級アミンであることが好ましい。この具体的な場合において、化合物は一つの官能基のみを含むが、ＺおよびＷを含有する二官能性化合物（ここに、Ｚは、ポリマーの還元末端と還元的アミノ化する化合物に含まれるアミノ基であり、Ｗは、還元的アミノ化および続く水素化から生じる第二級アミノ基である）としてみなされる。
【０１２１】
第三の別法により、ポリマーの非酸化還元末端は、還元的アミノ化によりアンモニアと反応し、次いで好ましくは水素化されてポリマーの末端アミノ基、従って末端第一級アミノ基を与えるポリマーの末端イミノ基を生じる。この具体的な場合において、アンモニアは、ＺおよびＷを含有する二官能性化合物（ここに、Ｚは用いられるアンモニアに含まれるＮＨ2であり、Ｗは還元的アミノ化、続く水素化により生じる第一級アミノ基である）としてみなされる。
【０１２２】
本発明により、好ましいアミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、Ｗと反応する官能基Ｖおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物とさらに反応する。
【０１２３】
好ましい具体的態様により、Ｗと反応する官能基Ｖおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物は、システインまたはヒスチジン誘導体である。
【０１２４】
さらに好ましい具体的態様により、システイン誘導体またはヒスチジン誘導体は、適切な活性化剤により前活性化される。適切な活性化剤は、他の中で、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドであり、特にジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が好ましい。
【０１２５】
システイン誘導体のＳＨ基およびアミノ基は、システイン誘導体がヒドロキシアルキルデンプン誘導体のアミノ基と反応するとき、適切に保護すべきである。それぞれの保護基について、当分野に知られているすべての適切な化合物を用いることができる。従って以下の式：
【化２５】
0005396019.tif 000026
で示される基は適切に保護すべきである。
【０１２６】
ＳＨ基についての保護基として、アセトアミドメチル−（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ−（ＳｔＢｕ）、４−メトキシベンジル−（４−ＭｅＯＢｚｌ）、４−メトキシルトリチル−（Ｍｍｔ）、トリチル（Ｔｒｔ）−および４−メチルトリチル−（Ｍｔｔ）が好ましく、ＳｔＢｕが特に好ましい。
【０１２７】
アミノ基についての保護基として、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−（Ｂｏｃ）、フルオレニルオキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）、４−メトキシルトリチル−（Ｍｍｔ）、トリチル（Ｔｒｔ）−および４−メチルトリチル−（Ｍｔｔ）が好ましく、Ｆｍｏｃが特に好ましい。
【０１２８】
以下の式：
【化２６】
0005396019.tif 000027
で示される基についての保護基として、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ジニトロフェニル−（Ｄｎｐ）、４−メチルトリチル−（Ｍｔｔ）、トシル−（Ｔｏｓ）およびトリチル（Ｔｒｔ）−が好ましく、４−メチルトリチル−（Ｍｔｔ）およびトリチル（Ｔｒｔ）が特に好ましい。
【０１２９】
それゆえ本発明はまた、Ｖおよびアルファ−Ｘベータ−アミノを含有する化合物がシステインまたはヒスチジンまたはその誘導体（ここに、Ｖはカルボキシ基である）である、上記方法にも関する。
【０１３０】
それゆえ本発明はまた、式（ＶＩｃ）：
【化２７】
0005396019.tif 000028
（ＶＩｃ）
［式中、
Ｌは、適宜置換されていてもよい、それぞれのアルキル残基にて２〜１０の炭素原子を有する直鎖、環状および／または分枝鎖の、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキル残基であり、
ＨＡＳ”は、還元末端における末端単糖類単位なしでＨＡＳ分子を意味し、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、独立して水素またはヒドロキシアルキル基、好ましくはヒドロキシエチル基である］
で示されるアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０１３１】
別の具体的態様により、本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンが、好ましくは上記方法により、その還元末端にて選択的に酸化され、得られたヒドロキシアルキルデンプンがＺに加えてアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物の官能基Ｚと反応する、上記方法にも関する。
【０１３２】
それゆえ本発明はまた、その還元末端にてヒドロキシアルキルデンプンを酸化し、酸化された還元末端と、Ｚに加えてアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物の官能基Ｚとを反応させることを特徴とする、上記方法にも関する。
【０１３３】
好ましい具体的態様により、Ｚは化学構造−ＮＨ−を含有する。
【０１３４】
本発明の好ましい具体的態様により、官能基Ｚは、構造Ｒ’−ＮＨ−（ここに、Ｒ’は水素またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基（ここに、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接連結するか、または別の具体的態様により酸素架橋によりＮＨ基に連結することができる）である）を有する基である。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は適切に置換することができる。好ましい置換基として、Ｆ、ＣｌまたはＢｒなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましいＲ’残基は、水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、さらにより好ましくは、水素および非置換アルキルおよびアルコキシ基である。
【０１３５】
アルキルおよびアルコキシ基の中で、１、２、３、４、５または６の炭素原子を有する基が好ましい。より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシ基である。特に好ましくは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、特に好ましくは、メチルまたはメトキシである。
【０１３６】
本発明の別の具体的態様により、官能基Ｚは、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−（ここに、Ｒ”は好ましくは、構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ここに、ＧはＯまたはＳである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含有する）を有する。より好ましい具体的態様により、官能基Ｒ”は以下の式：
【化２８】
0005396019.tif 000029
［式中、Ｇは、二つ存在する場合、独立してＯまたはＳである］
で示される基からなる群から選択される。
【０１３７】
本発明の特に好ましい具体的態様により、官能基Ｚは、アミノ基−ＮＨ2である。
【０１３８】
アミノ基Ｚおよびアルファ−チオールベータ−アミノ基は、いずれかの適切なスペーサーにより分離されていてもよい。他の中で、スペーサーは、適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であることができる。一般に炭化水素残基は、１〜６０、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、特に好ましくは１〜４の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に、１〜２０、好ましくは１〜８、特に好ましくは１〜４のヘテロ原子を含有する。炭化水素残基は、例えば５〜７の炭素原子を有する、適宜分岐していてもよい、アルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基、またはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であるアラルキル基、アルカリル基を含有することができる。さらにより好ましい具体的態様により、炭化水素残基は、メチレン、エチレン、プロピレンまたはブチレン残基などの１〜４のアルキル鎖である。特に好ましくは、メチレン残基である。
【０１３９】
それゆえ本発明はまた、Ｚおよびアルファ−Ｘベータ−アミノ基を含有する化合物が１，３−ジアミノ−２−チオールプロパンまたは２，３−ジアミノ−１−チオールプロパン（ここに、チオール基は以下の式：
【化２９】
0005396019.tif 000030
で示される基により置換することができる）である、上記方法にも関する。
【０１４０】
従って、本発明はまた、式（ＶＩａ）：
【化３０】
0005396019.tif 000031
（ＶＩａ）
または式（ＶＩｂ）：
【化３１】
0005396019.tif 000032
（ＶＩｂ）
［式中、ＨＡＳ”は、還元末端にて末端単糖類単位を有さないＨＡＳ分子を意味し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、独立して水素またはヒドロキシアルキル基、好ましくはヒドロキシエチル基である］
で示されるアルファ−チオールベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
【０１４１】
次いでアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体をチオエステル官能基化活性物質と反応させる。
【０１４２】
本発明によるネイティブ化学ライゲーション反応によれば、チオエステル官能基化活性物質およびアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプンの反応の中間体生成物は、アミド結合によりヒドロキシアルキルデンプン誘導体に連結された活性物質を含有する本発明のコンジュゲートに、分子内トランスアセチル化により不可逆的に変換されるチオエステルである。
【０１４３】
チオエステル官能基化化合物、すなわちチオエステル官能基化活性物質またはチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体と、アルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化化合物、すなわちアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプンもしくはその誘導体またはアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化活性物質との反応は、少なくとも二つの溶媒のうちのいずれか適切な溶媒または混合物中にて、適切なｐＨおよび適切な反応温度にて行うことができる。
【０１４４】
反応温度は、好ましくは０〜４０℃、またはより好ましくは１０〜３０℃、例えば２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃などの約２０〜２５℃の範囲である。
【０１４５】
反応のｐＨは、好ましくは５〜９、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５の範囲にて行う。
【０１４６】
緩衝媒体として、例えば約０．１Ｍの濃度を有する酢酸ナトリウム緩衝液などの酢酸塩緩衝液、例えば約０．５Ｍの濃度を有する炭酸水素アンモニウム緩衝液などの炭酸水素塩緩衝液、および／または例えば約０．１Ｍの濃度を有するリン酸ナトリウム緩衝液などのリン酸塩緩衝液を挙げることができる。
【０１４７】
反応時間は、好ましくは４８時間まで、より好ましくは１〜４８時間、より好ましくは８〜３２時間、より好ましくは２０〜２４時間の範囲である。
【０１４８】
反応は、いずれか適切な溶媒中にて行うことができる。好ましい溶媒は水である。チオエステル官能基化化合物および／またはアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化化合物の溶液に、少なくとも一つの適切な触媒および／または少なくとも一つのアジュバントを加えることができる。
【０１４９】
他の中で好ましい触媒は、例えば２〜６％ｖ／ｖ、好ましくは３〜５％ｖ／ｖの濃度のチオフェノール、またはベンジルメルカプタン、または例えば約０．５Ｍなどの約０．４〜０．６Ｍの濃度のＭＥＳＮＡ、および／またはトリス（カルボキシエチル）ホスフィン、またはその二以上の混合物である。
【０１５０】
他の中で好ましいアジュバントは、約１〜８Ｍ、好ましくは１〜７Ｍ、より好ましくは１〜６Ｍ、より好ましくは１〜５Ｍ、より好ましくは１〜４Ｍ、より好ましくは１〜３Ｍ、例えば約２Ｍの濃度の尿素、または約４〜８Ｍ、好ましくは５〜７Ｍ、例えば約６Ｍの濃度のグアニジン塩酸塩、約２０〜４０％ｖ／ｖ、好ましくは約２５〜３５％ｖ／ｖの濃度のＤＭＦもしくはアセトニトリルなどの適切な有機溶媒、または約２〜８％ｖ／ｖ、好ましくは３〜７％ｖ／ｖ、より好ましくは４〜６％ｖ／ｖ、例えば約５％ｖ／ｖの濃度の３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、または約０．１〜０．５Ｍ、好ましくは０．２〜０．４Ｍ、例えば約０．３Ｍの濃度の塩化ナトリウムである。
【０１５１】
反応溶液中のチオエステル官能基化化合物およびアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化化合物の濃度は、それぞれ好ましくは０．００１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．０２〜０．４Ｍ、より好ましくは０．０５Ｍ〜０．３Ｍ、より好ましくは０．１〜０．２Ｍの範囲である。
【０１５２】
本発明のある具体的態様により、活性物質は、カルボキシ基を含有する小分子薬剤である。この場合、活性物質のカルボキシ基は、例えば、
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を酸塩化物に適切に変換し、該酸塩化物とメルカプタンＲ’−ＳＨとをアルキルチオ脱ハロゲン化により反応させること（文献（J. March, Advanced Organic Chemistry, 4th edition, John Wiley and Sons, New York (1992) 409）または該文献に引用される他の方法（段落０〜３７））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端をチオレートのタリウム（Ｉ）塩との反応により酸塩化物に変換すること（文献（Spessard, G., et al., Organic Synthesis Collection, vol. 7, 87））、または
−  酸とジアルキルまたはジフェニルホスホロクロリデートとの反応によりカルボン酸末端ヒドロキシアルキルデンプンを反応させ、次いで対応するチオエステルに変換することができる無水物を形成させること（文献（Masamune, S., et al., Can. J. Chem. 53 (1975) 3693））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を、例えば対応するカルボン酸（例えばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾール）と相対的に酸性のチオールとの反応により製造されるカルボン酸のイミダゾリドに変換すること（文献（Masamune, S., et al., J. Am. Chem. Soc. 98 (1976) 7874））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端をジスルフィドおよびトリフェニルホスフィンを用いて対応するチオエステルに変換すること（文献（Mukaiyama, T., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 43 (1970) 1271））、または
−  ヒドロキシアルキルの酸化された還元末端とアリールチオイソシアネートとを反応させること（文献（Grieco, P., et al., Tetrahedron Lett. 43 (1979) 1283））、または
−  ヒドロキシアルキルの酸化された還元末端とクロロギ酸チオピリジルとを反応させること（文献（Corey, E.J., et al., Tetrahedron Lett. (1979), 2875））、または
−  ヒドロキシアルキルの酸化された還元末端と２−フルオロ−Ｎ−メチルピリジニウムトシレートとを反応させること（文献（Watanabe, Y., et al., Chem. Lett. (1976) 741））、または
−  ヒドロキシアルキルの酸化された還元末端と１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとを反応させること（文献（Pelter, A., et al., J. Chem Soc., Perkin trans I (1977) 1672））
により、適切にチオエステル基−Ｓ−Ｒ’に変換する。
【０１５３】
活性物質のカルボキシ基を、
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端を酸塩化物に適切に変換し、該酸塩化物とメルカプタンＲ’−ＳＨとをアルキルチオ脱ハロゲン化により反応させること（文献（J. March, Advanced Organic Chemistry, 4th edition, John Wiley and Sons, New York (1992) 409）または該文献に引用される他の方法（段落０〜３７））、または
−  ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と、固体担体担持ＥＤＣ上のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドおよびチオールとを反応させること（文献（C.E-Lin et al. Tetrahedron Lett. 43 (2002) 4531-34; M. Adamczyk, Tetrahedron Lett. 37 (1996) 4305-8, J. Hovinen, Nucleosides Nucleotides 18 (1999) 1263-4））
によりチオエステル基−Ｓ−Ｒ’に変換することが好ましい。
【０１５４】
本発明の別の具体的態様により、活性物質は、人工ペプチドである。本発明のある好ましい別法により、チオエステル官能基化ペプチドは、チオエステル官能基化ペプチドを得ることができる適切な合成樹脂を用いて製造する。
【０１５５】
チオエステル官能基化ペプチドは、Ｂｏｃ化学ならびにＦｍｏｃ化学を用いて合成することができる。Tamらは、酸不安定Ｔｒｔ−メルカプト−プロピオニル−ＭＢＨＡ樹脂上にてＢｏｃ化学を用いたチオエステル官能基化ペプチドの合成を記載する（文献（Tam., J.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 12485））。特に好ましい具体的態様により、Ｔｒｔ基はＴＦＡ／ジクロロメタンにより除去する。ＤＩＰＥＡによる洗浄および中和の後、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ活性化を用いてペプチドのＣ−末端残基を樹脂に充填することができる。未反応チオール部位は次いで、ジクロロメタン中にて塩化アセチル／ＤＩＰＥＡでキャップすることが好ましい。標準的Ｂｏｃプロトコールを用いた鎖延長の後、ＨＦ開裂は、側鎖脱保護チオエステル官能基化ペプチドを提供する。
【０１５６】
Liらは、Ｆｍｏｃ化学を用いたチオエステル官能基化ペプチドの合成を記載する（文献（Li, X. et al., (1998) Tetrahedron Letters 39(47):8669-8672））。好ましい具体的態様により、１−メチルピロリジン、ヘキサメチレンイミンおよびＨＯＢｔの混合物を、Ｆｍｏｃの除去のための脱ブロック剤として、好ましくはＮＭＰおよびＤＭＳＯの混合物、より好ましくはＮＭＰおよびＤＭＳＯのモル比が１：１０〜１０：１、さらにより好ましくは１：５〜５：１、最も好ましくは１：２〜２：１である混合物中にて用いる。用いる樹脂は、例えばLiらの引用する樹脂または文献（Goldstein and Gelb (2000) Tetrahedron Letters 41(16):2797-2800）に引用される樹脂であることができる。
【０１５７】
チオエステル官能基化ペプチドを製造する別の可能性はまた、Ｆｍｏｃ化学にも基づき、チオール開裂を用いるスルファミルブチリル・セーフティー・キャッチリンカー（例えば４−スルファミルブチリルＮｏｖａＳｙｎＴＧ樹脂に由来（文献（Shin, Y., et al., J. Am. Chem. Soc. 121 (1999), 11684、Ingenito, R., et al., J. Am. Chem Soc. 121 (1999) 11369）））をも活用する。上記リンカーにより修飾された合成樹脂は、Ｂｏｃ化学およびＦｍｏｃ化学の両方用に市販されている（例えばNovabiochem、Merck Biosciences GmbH、Schwalbach、Germanyより）。
【０１５８】
それゆえ本発明はまた、側鎖脱保護後、固体担体を形成する最終開裂工程においてＣ−末端チオエステル形成を可能にする、合成樹脂上における化学的固相ペプチド合成によりペプチドを製造することを特徴とする、チオエステル官能基化ペプチドを製造する方法にも関する。
【０１５９】
本発明のさらなる具体的態様により、活性物質はタンパク質である。
【０１６０】
タンパク質は、化学的合成手順により製造することができるか、またはいずれかのヒトもしくは別の哺乳動物源であることができ、ヒトもしくは動物などの天然源からの精製により得ることができる。この場合、タンパク質の少なくとも一つの官能基と、タンパク質の官能基と反応する少なくとも一つの官能基、およびチオエステル基または化学修飾してチオエステル基を得ることができるＧ基である、他の少なくとも一つの官能基を含有する適切な化合物とを反応させることにより、タンパク質の誘導体を製造することが可能である。そのような化学修飾は、Ｇおよびチオエステル基−Ｓ−Ｒ’である別の官能基と反応する官能基を含有するさらなる化合物とこの官能基Ｇとの反応であることができる。
【０１６１】
タンパク質の官能基として、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、カルボキシ基、ケト基、アルデヒド基またはヘミアセタール基を挙げることができる。ケト基またはアルデヒド基またはヘミアセタール基は、グリコシル化タンパク質の炭水化物側鎖の単糖類単位などのタンパク質の単糖類単位を化学的または酵素的に酸化することにより、製造することができる。
【０１６２】
タンパク質の官能基の化学的性質に応じて、タンパク質の官能基と反応する適切な化合物の官能基は、例えば：
−  Ｃ−Ｃ−二重結合またはＣ−Ｃ−三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ−結合；
−  チオ基またはヒドロキシ基；
−  アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
−  １，２−ジオール；
−  １，２−アミノ−チオアルコール；
−  アジド；
−  １，２−アミノアルコール；
−  アミノ基−ＮＨ2、またはアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基もしくはアルカリルアミノ基などの構造単位−ＮＨ−を含有するアミノ基の誘導体；
−  ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2、またはヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基もしくはヒドロキサル（hydroxal）アルカリルアミノ基などの構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含有するヒドロキシルアミノ基の誘導体；
−  それぞれ構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含有する、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基またはアルカリルオキシアミノ基；
−  カルボニル基−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ（ここに、ＧはＯまたはＳであり、Ｍは例えば、
−−  −ＯＨまたは−ＳＨ；
−−  アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基またはアルカリルオキシ基；
−−  アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基またはアルカリルチオ基；
−−  アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基；
−−  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのイミド構造またはＮがヘテロアリール化合物の一部である構造単位Ｏ−Ｎを有するヒドロキシルアミンのエステルなどの活性化エステル、またはＧ＝Ｏであり、Ｑが存在しない場合、ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトリクロロフェニルなどの置換アリール残基を有するアリールオキシ化合物など；
であり、Ｑは存在しないか、またはＮＨまたはＳもしくはＯなどのヘテロ原子である）を有する残基；
−  −ＮＨ−ＮＨ2または−ＮＨ−ＮＨ−；
−  −ＮＯ2；
−  ニトリル基；
−  アルデヒド基またはケト基などのカルボニル基；
−  カルボキシ基；
−  −Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
−  ヨウ化ビニルもしくは臭化ビニル基などのハロゲン化ビニル基またはトリフレート；
−  −Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
−  −（Ｃ＝ＮＨ2Ｃｌ）−Ｏアルキル；
−  −（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｈａｌ基（ここに、ＨａｌはＣｌ、ＢｒまたはＩである）；
−  −ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ2−；
−  −Ｓ−Ｓ−構造を含有するジスルフィド基；
−  以下の式：
【化３２】
0005396019.tif 000033
で示される基；
−  以下の式：
【化３３】
0005396019.tif 000034
で示される基である。
【０１６３】
適切な化合物の官能基およびチオエステル基またはＧ基は、いずれかの適切なスペーサーにより分離されていてもよい。他の中で、スペーサーは適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であることができる。一般に炭化水素残基は、１〜６０、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に、１〜２０、好ましくは１〜８、特に好ましくは１〜４のヘテロ原子を含有する。炭化水素残基は、例えば５〜７の炭素原子を有する、適宜分岐していてもよい、アルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基、またはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であるアラルキル基、アルカリル基を含有することができる。
【０１６４】
Ｇ基が、Ｇおよびチオエステル基−Ｓ−Ｒ’である別の官能基と反応する官能基を含有するさらなる化合物で化学的に修飾されている場合、Ｇと反応する官能基は、Ｑに関して上記の官能基の群から適切に選択することができる。チオエステル基、およびＧと反応する基はいずれかの適切なスペーサーにより分離されていてもよい。他の中で、スペーサーは適宜置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であることができる。一般に炭化水素残基は、１〜６０、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は一般に、１〜２０、好ましくは１〜８であり、特に好ましくは１〜４のヘテロ原子を含有する。炭化水素残基は、例えば５〜７の炭素原子を有する、適宜分岐していてもよい、アルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基、またはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であるアラルキル基、アルカリル基を含有することができる。
【０１６５】
好ましくは、タンパク質は、組換え的に製造される。これは、遺伝子クローニングもしくはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成により得られる外因性ＤＮＡ配列の真核性または原核性ホスト発現を含む。タンパク質の組換え製造は当分野に知られている。一般にこれは、適当な発現ベクターを有するホスト細胞のトランスフェクション、タンパク質の製造およびホスト細胞からのタンパク質の精製を可能にする条件下における、ホスト細胞の培養を含む。
【０１６６】
さらに好ましい具体的態様により、チオエステル官能基化タンパク質、好ましくはＣ末端ポリペプチド−チオエステルを生じる発現ベクターを用いる。ある具体的態様にて、チオエステル官能基化タンパク質は、インテイン（intein）ポリペプチドに、好ましくはインテイン親和性タグ化融合ポリペプチドに結合したＣ末端チオエステルにより結合する。そのようなチオエステル官能基化タンパク質は例えば、例えば市販のｐＣＹＢまたはｐＴＹＢなどのＩＭＰＡＣＴ（ＴＭ）−ＣＮ系（New England Biolabs, Frankfurt/Main, Germany）のベクターの内容にて、好ましくは突然変異体のインテイン−ＣＢＤポリペプチドを有する骨格にて興味のタンパク質を融合することにより得ることができる。チオエステル結合によりインテインに結合したチオエステル官能基化タンパク質（ＴＦＰＩ）は好ましくは、インテインのＣ末端に融合した親和性タグを含有し、より好ましくは親和性タグは、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ポリヒスチジンタグ、連鎖球菌タグまたはＧＳＴであることができる。ある具体的態様にて、ＴＦＰＩはさらに、親和性タグにより対応する親和性樹脂に結合、例えばインテインに融合したＣＢＤによりキチン樹脂に結合する（例えば文献（Muir et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710）を参照のこと）。好ましい具体的態様にて、ＴＦＰＩは、チオエステル結合を無傷のままにする条件下、親和性樹脂上にて精製する（Muirらの上記文献を参照のこと）。次いで親和性樹脂に結合したＴＦＰＩは、アルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ＨＥＳ、好ましくは約１０ｋＤの平均分子量を有するアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ＨＥＳなどのアルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ＨＥＳと反応することができる。
【０１６７】
チオエステル結合によりアルキル−、アリール−またはアラルキル−残基（ＴＦＰＡ）に結合したチオエステル官能基化タンパク質は、例えばＴＦＰＩをアルキルチオール、アリールチオールまたはアラルキルチオールと反応させることにより生成することが好ましい。好ましい具体的態様にて、アルキルチオールは、ジチオールではなく、メチル−、エチル−、プロピル−またはブチルチオールから選択され；エチルチオールが特に好ましい。アルキルチオールはまた、メルカプトアルキル炭酸またはメルカプトアルキルスルホン酸であることができる。２−メルカプトエタンスルホン酸が特に好ましい。別の具体的態様にて、アリールチオールは、ジチオールではなく、例えばチオフェノール、１−チオ−２−ニトロフェノール、２−チオ安息香酸、２−チオピリジン、４−チオ−２−ピリジンカルボン酸または４−チオ−２−ニトロピリジンであることができる。ＴＦＰＡは、例えばUS 2002/0151006A1に記載のＡｂｌ−ＳＨ３ エチル−チオエステルについての実施例３のように単離することができ、アルファ−Ｘベータ−アミノ官能基化ＨＥＳとの反応について直接用いるか、またはさらに精製した後反応に用いるか、または保存した後、後の反応に用いることができる。ＴＦＰＡのさらなる実施例は文献（Iakovenko, A., et al., FEBS Letters 468 (2000) 155-158）に示され、ここに、チオエステル官能基化Ｒａｂ７ΔＣ６は、２．２項にて生成し（２−メルカプトエタンスルホン酸を有するチオエステル）、精製して保存した後、最終カップリング工程に用いられる。
【０１６８】
それゆえ本発明はまた、活性物質がチオエステル官能基化タンパク質を生じる発現ベクターを用いて製造したタンパク質である、上記方法にも関する。
【０１６９】
別の態様により、本発明はまた、上記方法により得られうるコンジュゲートにも関する。
【０１７０】
本発明に記載の方法は、化学選択的方法、すなわち上記の別法に応じたヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体、好ましくはヒドロキシエチルデンプンまたはその誘導体のカップリングが、上記のように活性物質がＮ末端システイン残基を有する場合、活性物質のＮ末端にて活性物質の特定部位にて選択的に起こるか、または活性物質がそれぞれチオエステル官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体およびアルファ−チオールベータ−アミノ官能基化ヒドロキシアルキルデンプン誘導体と反応する、上記のＣ末端チオエステル基を活性物質が有する場合、活性物質のＣ末端にて選択的に起こる方法であると考えられる。
【０１７１】
本明細書に用いられる用語「末端にて選択的に」は、統計的には５０％より多く、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など、少なくとも９５％の活性物質分子がそれぞれの末端により独占的に反応する工程に関する。
【０１７２】
本発明はまた、アルファ−チオールベータ−アミノ基のチオール基が式：
【化３４】
0005396019.tif 000035
で示される基により置換されている具体的態様も含む。
【０１７３】
それゆえシステインの代わりに、ヒスチジン、好ましくはＮ末端システインまたはヒスチジンを用いることができる。
【０１７４】
本発明のコンジュゲートを製造する方法において、上記方法の変換割合は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは、少なくとも９８％または９９％など９５％またはそれ以上であることができる。
【０１７５】
さらに別の態様により、本発明はまた、ヒトまたは動物体の治療のための方法における使用のための上記方法により得られうる、コンジュゲートまたは上記コンジュゲートに関する。
【０１７６】
本発明によるコンジュゲートは、少なくとも５０％純度、さらにより好ましくは少なくとも７０％純度、さらにより好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％または少なくとも９９％純度であることができる。最も好ましい具体的態様にて、コンジュゲートは、１００％純度、すなわち他に副生成物が存在しないものであることができる。
【０１７７】
それゆえ別の態様により、本発明はまた、コンジュゲートの量が少なくとも５０重量％、さらにより好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％、特に少なくとも９５重量％または少なくとも９９重量％であることができる、本発明のコンジュゲートを含有することができる組成物に関する。最も好ましい具体的態様にて、組成物はコンジュゲートからなる、すなわちコンジュゲートの量が１００重量％であることができる。
【０１７８】
従って本発明はまた、上記方法により得られうる、コンジュゲートまたは上記コンジュゲートを含有する医薬組成物にも関する。
【０１７９】
さらに本発明はまた、少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、アジュバントまたはキャリアをさらに含有する、上記方法により得られうるコンジュゲートまたは上記コンジュゲートを含有する医薬組成物にも関する。
【実施例】
【０１８０】
実施例１．官能基化ＨＥＳの合成：
実施例１．１  酸化ＨＥＳからのアミノ−ＨＥＳの合成
DE 196 28 705 A1に記載の、還元末端にて選択的に酸化されたＨＥＳ５．１２２ｇ（MW = 14,500 D, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D）を１５．５時間減圧下８０℃にて加熱し、窒素雰囲気下、乾燥ＤＭＳＯ（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）２５ｍＬに溶解させた。得られた溶液に、１，４−ジアミノブタン（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）５１．２２ｍｍｏｌを加えた。４０℃にて１７時間インキュベーションした後、反応混合物を氷冷エタノール（DAB, Sonnenberg, Braunschweig, D）とアセトン（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D）の１：１混合物（ｖ／ｖ）１５０ｍＬに加え、１時間−２０℃にてインキュベーションした。析出した生成物を４℃における遠心分離により集め、同じ混合物４０ｍｌで洗浄し、水８０ｍＬに再溶解させ、水に対して４０時間透析し（SnakeSkin透析チューブ、３．５ｋＤカットオフ、Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、凍結乾燥した。生成物を６７％収率で単離した。
【０１８１】
実施例１．２  実施例１．１のアミノ−ＨＥＳからのＨ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳの合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＯＨ（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）８６．３ｍｇおよび１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）４５．９ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）２ｍＬに溶解させ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）４０．７μＬを加えた。
【０１８２】
２１℃にて３０分間インキュベーションした後、実施例１．１に記載のように合成したアミノ−ＨＥＳ２０６ｍｇを加えた。２２℃にて１９時間撹拌した後、反応混合物を氷冷２−プロパノール（Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D）１４ｍＬに加えた。析出した生成物を４℃における遠心分離により集め、２−プロパノール８ｍｌに再懸濁させ、上記のように遠心分離した。析出物を水２０ｍＬに溶解させ、ジクロロメタン（Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D）２０ｍｌを加え、混合物をボルテックスした。遠心分離後、上層の水層を分離し、水に対して４３時間透析し（SnakeSkin透析チューブ、３．５ｋＤカットオフ、Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、凍結乾燥した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳを６７％収率で単離した。
【０１８３】
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳ１００．７ｍｇをＤＭＦ（ｖ／ｖ）中の２０％ピペリジン（Acros Organics, Geel, B）１ｍＬに溶解させた。２２℃にて１５分間撹拌した後、反応混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（Acros Organics, Geel, B）２０ｍＬに加えた。析出した生成物を４℃における遠心分離により集め、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍｌに再懸濁させ、遠心分離した。乾燥後、析出物を水１０ｍＬに溶解させ、水に対して３１時間透析し（SnakeSkin透析チューブ、３．５ｋＤカットオフ、Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、凍結乾燥した。Ｈ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳを８０％収率で単離した。
【０１８４】
実施例１．３  実施例１．１のアミノ−ＨＥＳからのチオエステル−ＨＥＳの合成
ペンタフルオロフェニルＳ−ベンジルチオスクシネート（Link technologies, Bellshill, UK）２９．３ｍｇおよび１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D）１０．１ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL）１．５ｍＬに溶解させ、実施例１．１に記載のように合成したアミノ−ＨＥＳ７５ｍｇを加えた。２２℃にて１５時間撹拌した後、反応混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（Acros Organics, Geel, B）１５ｍＬに加えた。析出した生成物を４℃における遠心分離により集め、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８ｍｌに再懸濁させ、遠心分離した。析出物を窒素雰囲気下、乾燥した。
【０１８５】
実施例２  化学ライゲーションによるタンパク質−ＨＥＳコンジュゲートの合成：
実施例２．１  Ｈ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳおよびペプチド−チオエステルＡからのペプチド−チオエステルＡ−ＨＥＳコンジュゲートの合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ペプチド合成グレード, Biosolve, Valkenswaard, NL）とｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液の１：１混合物（ｖ／ｖ）中のペプチドチオエステルペプチド−チオエステルＡ（GBF, Braunschweig, D, アミノ酸配列：
Ｈ−SPFGADTTVCCFNYSVRKLPQNHVKDYFYTSSK−チオプロピオン酸エチルエステル；MW = 3,920 g/mol）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液５μＬに、実施例１．２に記載のように合成したＨ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳのＤＭＦ中の２５５ｍｇ／ｍＬ溶液５μＬおよびＤＭＦ中の１．５Ｍ触媒溶液５μＬを２２℃にて加えた。触媒として、チオフェノール（図１、レーンＢ）またはベンジルメルカプタン（図１、レーンＣ）のいずれかを用いた。反応対照として、触媒溶液の代わりに緩衝液５μＬをＨＥＳ誘導体およびペプチドの混合物に加えた（図１、レーンＥ）。
【０１８６】
混合物を室温にて一晩インキュベーションし、ゲル電気泳動法により分析した（図１）。
【０１８７】
実施例２．２  チオエステル−ＨＥＳおよびＧＭ−ＣＳＦペプチド性インヒビターからのＧＭ−ＣＳＦペプチド性インヒビター−ＨＥＳコンジュゲートの合成
１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の、Ｎ末端Ｃｙｓ−ペプチドＧＭ−ＣＳＦペプチド性インヒビター（５４〜７８）（Bachem AG, Order-No. H-3438, Bubendorf, CH、アミノ酸配列：
Ｈ−Cys-Leu-Gln-Thr-Arg-Leu-Glu-Leu-Tyr-Lys-Gln-Gly-Leu-Arg-Gly-Ser-Leu-Thr-Lys-Leu-Lys-Gly-Pro-Leu-Thr−ＯＨ; MW = 2,816.4 g/mol）の２．８２ｍｇ／ｍＬ溶液１０μＬに、同じ緩衝液中の実施例１．３に記載のように合成したチオエステル−ＨＥＳの１５６ｍｇ／ｍＬ溶液３２μＬおよびチオフェノール１．７μＬ（図２、レーンＢ）を２２℃にて加えた。
【０１８８】
混合物を室温にて一晩インキュベーションし、ゲル電気泳動法により分析した（図２）。
【０１８９】
実施例２．３  反応対照−ＥＰＯのチオエステル−ＨＥＳによるインキュベーション
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の、ＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列および市販のErypo（登録商標、Ortho Biotech, Jansen-Cilag）またはNeoRocormon（登録商標、Roche）として本質的に同じ特性を有する組換え的に製造されたＥＰＯ（EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 411 678を参照のこと））の０．７８ｍｇ／ｍＬ溶液１９．２μＬに、チオフェノール１．７μＬおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび５０ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の、実施例１．３のように合成したチオエステル−ＨＥＳの１０または５０ｍｇ／ｍＬ溶液の５μＬ（図３、レーンＢおよびＣ）を２２℃にて加えた。反応対照として、チオエステル−ＨＥＳなしの同じ反応を行った（図３、レーンＤ）。
【０１９０】
混合物を室温にて一晩インキュベーションし、ゲル電気泳動法により分析した。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１は、実施例２．１記載の粗製のペプチド−チオエステルＣｙｓ−ＨＥＳコンジュゲートのゲル電気泳動法による分析を示す。  ゲル電気泳動法について、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Ｄ）およびConsort E143 power supply（CONSORTnv, Turnhout, Ｂ）を用いた。還元条件下、MES SDSランニング緩衝液と一緒に１２％ビス−トリスゲル（ともにInvitrogen GmbH, Karlsruhe, Ｄ）をメーカーの使用説明書に従って用いた：レーンＡ：  Roti（登録商標）−Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Ｄ）上から下までの分子量マーカー: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD；レーンＢ：  触媒としてチオフェノールを用いたペプチド−チオエステルＡのＨ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳ10/0.4へのコンジュゲーション；レーンＣ：  触媒としてベンジルメルカプタンを用いたペプチド−チオエステルＡのＨ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳ10/0.4へのコンジュゲーション；レーンＤ：  Roti（登録商標）−Mark STANDARD；レーンＥ：  触媒なしのペプチド−チオエステルＡのＨ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＨＥＳ10/0.4へのコンジュゲーション。
【０１９２】
【図２】図２は、実施例２．２記載の粗製のＣｙｓ−ペプチドチオエステル−ＨＥＳコンジュゲートのゲル電気泳動法による分析を示す。  ゲル電気泳動法について、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Ｄ）およびConsort E143 power supply（CONSORTnv, Turnhout, Ｂ）を用いた。還元条件下、MES SDSランニング緩衝液と一緒に１２％ビス−トリスゲル（ともにInvitrogen GmbH, Karlsruhe, Ｄ）をメーカーの使用説明書に従って用いた：レーンＡ：  Roti（登録商標）−Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Ｄ）上から下までの分子量マーカー: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD；レーンＢ：  触媒としてチオフェノールを用いたチオエステル−ＨＥＳ10/0.4のGM-CSF阻害剤ペプチド（５４〜７８）へのコンジュゲーション；レーンＣ：  GM-CSF阻害剤ペプチド（５４〜７８）。
【０１９３】
【図３】図３は、実施例２．３記載の粗製のＥＰＯチオエステル−ＨＥＳコンジュゲートのゲル電気泳動法による分析を示す。  ゲル電気泳動法について、XCell Sure Lock Mini Cell（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Ｄ）およびConsort E143 power supply（CONSORTnv, Turnhout, Ｂ）を用いた。還元条件下、MOPS SDSランニング緩衝液と一緒に１０％ビス−トリスゲル（ともにInvitrogen GmbH, Karlsruhe, Ｄ）をメーカーの使用説明書に従って用いた：レーンＡ：  Roti（登録商標）−Mark STANDARD（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Ｄ）上から下までの分子量マーカー: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD；レーンＢ：  触媒としてチオフェノールを用いた６．９当量のチオエステル−ＨＥＳのＥＰＯへのコンジュゲーション；レーンＣ：  触媒としてチオフェノールを用いた３４．５当量のチオエステル−ＨＥＳのＥＰＯへのコンジュゲーション；レーンＤ：  触媒としてチオフェノールを用いたチオエステル−ＨＥＳなしのＥＰＯ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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