(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の腎症のリスクを測定する方法であって、
腎症を有する疑いのある被検者から尿サンプルを取得すること、
（ｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント、及び（ｉｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントと、α１酸性糖タンパク質、または、α１酸性糖タンパク質のフラグメントとの組合せよりなる群から選択されるバイオマーカーの前記尿サンプル中におけるレベルを測定すること、及び
前記バイオマーカーのレベルに基づき、前記被検者が腎症のリスクを有するかどうかを判定することを含み、
前記バイオマーカーのレベルが腎症のない被検者のレベルに比べて高い場合、前記被検者は腎症のリスクを有していることを示している、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントがＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）であり、前記α１酸性糖タンパク質のフラグメントがＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマーカーのレベルが質量分析または免疫分析によって測定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、及び液体クロマトグラフ−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫分析が、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、放射免疫測定（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、及び発光免疫測定（ＬＩＡ）よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記被検者がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被検者が実験動物である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーが前記白血球関連Ｉｇ様受容体２である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーが白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記被検者がタンパク尿のない被検者である請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーの組合せが白血球関連Ｉｇ様受容体２とα１酸性糖タンパク質との組合せである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオマーカーの組合せが白血球関連Ｉｇ様受容体２とα１酸性糖タンパク質のフラグメントとの組合せである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーの組合せが白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントとα１酸性糖タンパク質との組合せである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーの組合せが白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントとα１酸性糖タンパク質のフラグメントとの組合せである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記被検者がタンパク尿のない被検者である請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
被検者の腎症進行をモニターする方法であって、
腎症を患っている被検者から第１の尿サンプルを取得すること、
（ｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント、及び（ｉｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントと、α１酸性糖タンパク質、または、α１酸性糖タンパク質のフラグメントとの組合せよりなる群から選択されるバイオマーカーの前記第１の尿サンプル中におけるレベルを測定すること、
前記第１の尿サンプルを取得してから２週間〜１２ヶ月後に前記被検者から第２の尿サンプルを取得すること、
前記第２の尿サンプル中における前記バイオマーカーのレベルを測定すること、及び
前記被検者の腎症進行を判定することを含み、
前記第２の尿サンプル中における前記バイオマーカーのレベルが前記第１の尿サンプル中におけるレベルに比べて高い場合、腎症が前記被検者内で悪化していることを示している、ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントがＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）であり、前記α１酸性糖タンパク質のフラグメントがＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被検者が初期腎症のヒトであり、前記第２の尿サンプルが前記第１の尿サンプルを取得してから６〜１２ヶ月後に取得される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被検者が後期腎症のヒトであり、前記第２の尿サンプルが前記第１の尿サンプルを取得してから３〜６ヵ月後に取得される請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記被検者が実験動物であり、前記第２の尿サンプルが前記第１の尿サンプルを取得してから２〜２４週間後に取得される請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
腎症患者の腎症治療の有効性をモニターする方法であって、
（ｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント、及び（ｉｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントと、α１酸性糖タンパク質、または、α１酸性糖タンパク質のフラグメントとの組合せよりなる群から選択される、前記治療前の前記患者からの尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルを測定すること、
前記治療後、前記被検者からの尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
前記治療後の前記バイオマーカーのレベルの変化に基づき、前記治療の有効性を判定することを含み、
前記治療後の前記バイオマーカーのレベルが前記治療前のバイオマーカーのレベルと比較して、同じままであるか、あるいは、低下している場合、前記治療は有効である、ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントがＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）であり、前記α１酸性糖タンパク質のフラグメントがＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤の腎毒性を判定する方法であって、
治療中のさまざまな時点で、薬剤治療された被検者から複数の尿サンプルを取得すること、
（ｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント、及び（ｉｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントと、α１酸性糖タンパク質、または、α１酸性糖タンパク質のフラグメントとの組合せよりなる群から選択されるバイオマーカーの前記尿サンプルのそれぞれにおけるレベルを測定すること、及び
前記治療中の前記バイオマーカーのレベルの変化に基づき、前記薬剤の腎毒性を判定することを含み、
前記治療の過程における前記バイオマーカーのレベルの上昇は、前記薬剤が腎毒性であることを示している、ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、化合物、ハーブ製品、及び食品よりなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントがＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）であり、前記α１酸性糖タンパク質のフラグメントがＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
白血球関連Ｉｇ様受容体２と特異的に結合する第１抗体及びα１酸性糖タンパク質と特異的に結合する第２抗体を含むことを特徴とする腎症診断キット。
【請求項２７】
前記第１及び第２抗体が完全免疫グロブリン分子である請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記第１抗体が白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントと特異的に結合し、且つ、当該白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントがＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）である請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記第２抗体がα１酸性糖タンパク質のフラグメントと特異的に結合し、且つ、当該α１酸性糖タンパク質のフラグメントがＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
白血球関連Ｉｇ様受容体２と特異的に結合する第１抗体及びα１酸性糖タンパク質と特異的に結合する第２抗体で実質的に構成されることを特徴とする腎症診断キット。
【請求項３１】
前記第１抗体が白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントと特異的に結合し、且つ、当該白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントがＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）である請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記第２抗体がα１酸性糖タンパク質のフラグメントと特異的に結合し、且つ、当該α１酸性糖タンパク質のフラグメントがＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎症と関連するバイオマーカーに関するものである。
【０００２】
本出願は、２００９年１月２８日に出願された米国特許仮出願番号第６１／１４７，７８５号についての優先権を主張するものであり、その内容は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
腎症は、通常、糖尿病、高血圧、薬物毒性、及び炎症に起因する腎障害として知られている。
【０００４】
通常、腎症は、タンパク尿のレベル（例えば、尿中アルブミンのレベル）を測定することによって、あるいは、腎機能の指標である糸球体濾過量（ＧＦＲ）を検査することによって診断される。この両方の方法は、一般的に症状を示さない初期腎症を検出するのに適さない。腎症は、腎生検によっても検出することができるが、この侵襲的方法は、理想的な診断方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，３７６，１１０号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ），（１９８８）抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）
【非特許文献２】コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、（１９７５）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６巻，４９５頁
【非特許文献３】コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、（１９７６）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）６巻，５１１頁
【非特許文献４】コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、（１９７６）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）６巻，２９２頁
【非特許文献５】ハンマーリング（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ）ら（１９８１）モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），エルシビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）
【非特許文献６】コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、（１９７５）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６巻，４９５頁
【非特許文献７】コスボア（Ｋｏｓｂｏｒ）ら、（１９８３）イムノロジー・トュデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ）４巻，７２頁
【非特許文献８】コール（Ｃｏｌｅ）ら、（１９８３）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０巻，２０２６頁）
【非特許文献９】コール（Ｃｏｌｅ）ら、（１９８３）モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ），アラン・アール・リス・インク（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），７７−９６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
初期腎症を検出する方法を開発することが非常に重要である。この目標を達成する鍵は、初期腎症と関連する信頼できるバイオマーカーを特定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、白血球関連Ｉｇ様受容体２、α１酸性糖タンパク質、及びこれらの２つのタンパク質のフラグメントの尿レベルが腎症のない患者よりも腎症患者に高いといった、予期せぬ発見に基づくものである。それゆえ、これらのタンパク質分子は、初期腎症の診断用バイオマーカーとして信頼性の高いものである。
【０００９】
従って、本発明のある態様は、腎症の診断方法を特徴とする。この方法は、少なくとも以下のステップを含む：（ａ）腎症を有する疑いのある被検者から尿サンプルを取得するステップ、（ｂ）尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルを測定するステップ、及び（ｃ）バイオマーカーのレベルに基づき、被検者が腎症を有するかどうかを判定するステップ。上述の方法に用いられるバイオマーカーは、以下のうちの１つである：（ｉ）白血球関連Ｉｇ様受容体２、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を有する、ＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）などの白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント、（ｉｉ）少なくとも１０個のアミノ酸残基を有する、ＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）などのα１酸性糖タンパク質のフラグメント、（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せ、または（ｉｖ）（ｉ）及びα１酸性糖タンパク質の組合せ。４つのバイオマーカーのうちの１つのレベルが腎症のない被検者のレベルに比べて高い場合、被検者は腎症を有していることを示している。ある実施例において、バイオマーカーのレベルは、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、及び液体クロマトグラフ−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ））によって測定される。別の実施例では、免疫分析（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、放射免疫測定（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、及び発光免疫測定（ＬＩＡ））によって測定される。
【００１０】
上述の腎症診断方法は、例えば、タンパク尿のないヒト及び実験動物の両方に適用することができる。ここに用いられる「実験動物」という用語は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、猫、犬、豚、及び非ヒト霊長類などの動物試験に一般的に用いられる脊椎動物を意味する。
【００１１】
本発明の別の態様は、被検者の腎症進行をモニターする方法を特徴とする。この方法は、（ａ）腎症を患っている被検者（例えば、ヒトまたは実験動物）から第１の尿サンプルを取得すること、（ｂ）第１の尿サンプル中における上記４つのバイオマーカーのうちの１つのレベルを測定すること、（ｃ）第１の尿サンプルを取得してから２週間〜１２ヶ月後に被検者から第２の尿サンプルを取得すること、（ｄ）第２の尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルを測定すること、及び（ｅ）被検者の腎症進行を判定することを含む。第２の尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルが第１の尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルに比べて高い場合、腎症が被検者内で悪化していることを示している。被検者が初期腎症のヒトである場合、第２の尿サンプルは、第１の尿サンプルを取得してから６〜１２ヶ月後に取得される。後期腎症のヒトの被検者では、第２の尿サンプルは、第１の尿サンプルを取得してから３〜６ヵ月後に取得することができる。この方法が実験動物に用いられる場合、第２の尿サンプルは、第１の尿サンプルを所得してから２〜２４週間後に取得される。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、腎症患者の腎症治療の有効性をモニターする方法を提供する。この方法は、（ａ）治療前の腎症患者からの尿サンプル中における上記のバイオマーカーのうちの１つのレベルを測定すること、（ｂ）治療後の患者からの尿サンプル中におけるバイオマーカーのレベルを測定すること、及び（ｃ）治療後のバイオマーカーのレベルの変化に基づき、治療の有効性を判定することを含む。治療後のバイオマーカーのレベルが治療前のバイオマーカーのレベルと比較して、同じままであるか、あるいは、低下している場合、治療は有効であることがわかる。
【００１３】
本発明は、薬剤の腎毒性を判定する方法も提供する。この方法は、（ａ）治療中のさまざまな時点で、薬剤治療された被検者から複数の尿サンプルを取得すること、（ｂ）各尿サンプルの上記のバイオマーカーのうちの１つのレベルを測定すること、及び（ｃ）治療中のバイオマーカーのレベルの変化に基づき、薬剤の腎毒性を判定することを含む。治療の過程におけるバイオマーカーのレベルの上昇は、薬剤が腎毒性であることを示している。薬剤としては、化合物（例えば、薬物または薬剤候補）、ハーブ製品、及び食品が挙げられる。
【００１４】
本発明は、上記の方法のいずれかに有用なキットを更に提供する。このキットは、白血球関連Ｉｇ様受容体２と特異的に結合する第１抗体、及びα１酸性糖タンパク質と特異的に結合する第２抗体を含む。両方の抗体は、完全免疫グロブリン分子であり得る。ある実施例では、このキットは、ここに記載された方法のうちの１つを実施するために検出される抗原（例えば、腎症関連のバイオマーカー）に特異的な抗体だけを含む。即ち、このキットは、このような抗体で実質的に構成される。
【００１５】
また、本発明の範囲内には、ＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）またはＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）に特異的に結合する単離抗体を有する。ここに用いられる「抗体」という用語は、自然に結合された分子を実質的に有しない抗体を意味する。より具体的に言えば、製剤中の自然に結合された分子が多くて２０％の乾燥重量を構成する場合、抗体を含有する製剤は、「単離抗体」としてみなされる。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び高速液体クロマトグラフィーなどの好適な方法によって測定することができる。
【００１６】
上記のどの抗体も、本発明の方法のいずれかを実施するのに有用なキットを製造するのに用いることができる。
【００１７】
本発明の１つまたはそれ以上の実施の形態の詳細を以下に説明する。本発明の他の特徴または利点は、以下の複数の実施例の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
まず、図面について説明する。
【図１】健常対照及び様々なタイプの腎症を有する患者における、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント及びα１酸性糖タンパク質のフラグメントを組み合わせたレベルのボックスプロットを示す図である。ＤＮ、ＩｇＡＮ、ＣＨＮ、及びＭＧＮは、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、漢方薬腎症、及び膜性糸球体腎炎腎症を意味する。ボックスの上限及び下限は、２５％値及び７５％値を示し、ボックスを横切る線は、中央値を示している。上ひげは、７５％値プラス１．５の四分位範囲である、上フェンス以下の最大値を示し、下ひげは、２５％値マイナス１．５の四分位範囲である、下フェンス以上の最小値を示している。
【図２】健常対照及びＣＨＮを有する患者における、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント及びα１酸性糖タンパク質のフラグメントを組み合わせたレベルのボックスプロットを示す図である。ボックスの上限及び下限は、２５％値及び７５％値を示し、ボックスを横切る線は、中央値を示している。上ひげは、７５％値プラス１．５の四分位範囲である、上フェンス以下の最大値を示し、下ひげは、２５％値マイナス１．５の四分位範囲である、下フェンス以上の最小値を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ある態様において、本発明は、尿中バイオマーカーのレベルに基づいて、腎症を診断する方法に関し、尿中バイオマーカーとしては、白血球関連Ｉｇ様受容体２（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＣＡＱ０８９６２；２０１０年１月１０日）、α１酸性糖タンパク質（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＥＡＷ８７４１６；２０１０年１月１０日）、どちらかのタンパク質のフラグメント、またはこれらの組合せが挙げられる。どちらかのタンパク質のフラグメントは、１０個のアミノ酸からなる最小の長さを有し、好ましくは、１２０〜２００個のアミノ酸からなる最大の長さを有する。例えば、白血球関連Ｉｇ様受容体２及びα１酸性糖タンパク質のフラグメントは、１２５個及び１９１個までのアミノ酸残基をそれぞれ含むことができる。ある実施例では、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントは、ＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）であり、α１酸性糖タンパク質のフラグメントは、ＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）である。
【００２０】
上記の各尿中バイオマーカーは、糖尿病に関連する腎症（即ち、糖尿病性腎症）、腎臓組織内のＩｇＡ沈着に起因する糸球体腎炎（即ち、ＩｇＡ腎症）、炎症（例えば、膜性糸球体腎炎）、漢方薬誘発性の腎線維化（即ち、漢方薬腎症）、腎不全を招く慢性腎尿細管間質障害（即ち、慢性間質性腎炎）、及び巣状分節状糸球体硬化症を含む、任意のタイプの腎症を診断するのに用いることができる。
【００２１】
本発明の診断方法を実施するには、腎症を有する疑いのある被検者から尿サンプルを取得し、次いで、上記のバイオマーカーのいずれかのレベルを従来の方法、例えば、酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）及びウェスタンブロットによって測定する。バイオマーカーがペプチドまたはペプチドの組合せである場合、そのレベルは、質量分析によって測定することができる。次いで、尿バイオマーカーのレベルを、腎症を有しない被検者の同様の尿バイオマーカーのレベルを表している基準点と比較する。基準点は、腎症患者のグループと腎症を有しない被検者のグループの尿バイオマーカーの代表的なレベルに基づいて、所定の実施によって測定され得る。例えば、それは、これらの２つのグループの平均レベル間の中間点とすることができる。被検者の尿バイオマーカーのレベルが基準点より大きい場合、被検者が腎症を有することを示している。
【００２２】
必要な時には、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）または微小変化型疾患（ＭＣＤ）を有する患者は、上記の基準点を測定する対照グループとして用いることができる。一般的に、ＭＣＮ及びＭＣＤの患者は、顕著なタンパク尿を示すが、腎機能は正常である。
【００２３】
白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメント、またはα１酸性糖タンパク質のフラグメントを用いる場合、本発明の診断方法は、尿中のタンパク質（例えば、アルブミン）の存在が検出できないときに、即ち、タンパク尿を示さないときに、初期腎症を検出するのに用いることができる。
【００２４】
別の態様において、本発明は、上記の尿バイオマーカーのいずれかに基づいて、被検者の腎症進行をモニターする方法に関する。この方法を実施するためには、被検者から２つの尿サンプルを適当な期間（例えば、２週間〜１２ヶ月）で取得し、上記の尿バイオマーカーのうちの１つのレベルを測定するように検査すればよい。後に得られた尿サンプル中における尿バイオマーカーのレベルが先に得られた尿サンプル中における尿バイオマーカーより大きい場合、被検者内に腎症進行があることを示す。
【００２５】
モニター方法は、腎症を患っているか、あるいは、腎症のリスクがあるヒト被検者に用いることができる。ヒト被検者が腎症のリスクがあるか、あるいは、初期腎症である場合、尿バイオマーカーのレベルは、６〜１２ヵ月毎に１回測定して、腎症進行をモニターすることができる。ヒト被検者が既に腎症の後期にある場合、尿バイオマーカーのレベルは、３〜６ヵ月毎に１回測定することが好ましい。腎障害を患っていても、初期腎症である患者は、一般的に無症状であり、正常な肝機能を示す。これらの患者は、腎症進行のリスクがある。後期腎症は、ＧＦＲ（例えば、＜１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２）のかなりの低下により特徴付けられる。
【００２６】
上記のモニター方法は、腎症を研究するために所定の手順に従って実験動物に用いることもできる。好ましくは、実験動物は、２〜２４週間毎に１回検査され、上記の尿バイオマーカーのうちの１つのレベルを測定する。時間と共にバイオマーカーのレベルが増加するのは、動物の疾病が進行していることを示している。
【００２７】
更に別の態様において、本発明は、腎症治療を必要としている被検者（即ち、ヒト腎症患者または腎障害を有する実験動物）の治療の有効性を判定する方法を提供する。この方法では、上記の尿バイオマーカーのうちの１つのレベルを、治療前、治療中及び／または治療後に測定する。尿バイオマーカーのレベルが治療の過程を通して同じままであるか、あるいは、低下している場合、治療は有効であることを示している。
【００２８】
上記の尿バイオマーカーは、いずれも、標的薬剤の腎毒性、即ち、薬剤が腎障害を誘発するかどうかをモニターするのに用いることもできる。標的薬剤は、ヒトに投与するためのいかなる化合物または組成物とすることができる。その例としては、薬物（例えば、非ステロイド系抗炎症薬）または薬剤候補、食品またはサプリメント、およびハーブサプリメントであり得る化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。標的薬剤の腎毒性は、時間と共に尿中バイオマーカーのレベルを上昇させるその能力によって示される。
【００２９】
また、ここに述べられるのは、上記の方法のいずれかを実施するのに有用なキットである。このキットは、少なくとも２つの抗体を含み、その１つは、Ｉｇ様受容体２に特異的な抗体、例えば、そのフラグメントＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）またはその中に含まれる任意のエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、もう１つは、α１酸性糖タンパク質に特異的な抗体、例えば、そのフラグメントＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）またはその中に含まれる任意のエピトープと特異的に結合可能な抗体である。ある実施例では、このキットは、同じバイオマーカーと結合する２つの異なる抗体（即ち、コーティング抗体及び検出抗体）を含む。通常、検出抗体は、それ自身によって、または他の薬剤と結合することによって検出可能な信号を発する分子と連結される。ここに用いられる「抗体」という用語は、例えば、完全免疫グロブリン、または抗原結合活性を保持するそのフラグメント、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２など意味する。これは、天然に存在するか、あるいは、遺伝子工学的に得ることができる（例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体）。
【００３０】
本発明のキットに含まれる抗体は、市販品のメーカーから入手することができる。あるいは、それらは、従来の方法によって製造することができる。例えば、非特許文献１を参照されたい。上記のある特定のバイオマーカーに対する抗体を製造するには、このマーカーを、必要に応じてキャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）に結合させ、アジュバントと混合し、宿主動物に注入すればよい。次いで、動物内で産生された抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。一般的に用いられる宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、及びラットが挙げられる。免疫応答を増強させるのに用いることができる種々のアジュバントは、宿主動物種に依存し、例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ＣｐＧ、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールが挙げられる。有用なヒトアジュバントとしては、カルメット−ゲラン杆菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。ポリクローナル抗体、即ち、抗体分子の不均質な集団は、免疫動物の血清中に存在する。
【００３１】
モノクローナル抗体、即ち、抗体分子の均質な集団は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；及び非特許文献５を参照されたい）。特に、モノクローナル抗体は、非特許文献６及び特許文献１に記載されるような培養液中での連続細胞株による抗体分子の産生を提供するいずれかの技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（非特許文献７；非特許文献８）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（非特許文献９）によって得られる。これらの抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む、いずれの免疫グロブリンクラス、及びこれらのいずれのサブクラスであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、生体外または生体内で培養すればよい。生体内で高力価のモノクローナル抗体を産生できることが、特に有用な製造方法である。
【００３２】
更に、抗体フラグメントは、公知の方法によって製造することができる。例えば、これらのフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって製造することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって製造することができるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
これ以上詳述しなくても、当業者は上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の実施の形態は、代表的なものに過ぎず、いかなる意味でも開示内容の残部を限定するものではない。ここに引用したすべての刊行物は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３４】
実施例１：尿白血球関連Ｉｇ様受容体２またはα１酸性糖タンパク質をバイオマーカーとして用いて腎症を診断すること
材料及び方法
（ｉ）被検者
以下のヒト被検者のグループが本研究に参加した。
（ａ）健常ドナー：糖尿病を有さず、正常な腎機能を有する
（ｂ）ＤＭ患者：２型糖尿病を有するが、腎症を有しない
（ｃ）ＤＮ患者：糖尿病性腎症を有する
（ｄ）ＤＮ尿毒症患者：尿毒症を伴うＤＮを有する
（ｅ）ＩｇＡＮ患者：ＩｇＡ腎症を有する
（ｆ）ＭＧＮ患者：膜様糸球体腎炎を有する
（ｇ）ＣＨＮ患者：漢方薬誘発性の腎症を有する、及び
（ｈ）ＣＩＮ患者：慢性間質性腎炎を有する
健常ドナーと患者の臨床的特徴を下記の表１に要約する：
【００３５】
【表１】
0005524241.tif 000002
【００３６】
（ｉｉ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）分析
中間尿サンプルは、早朝に上記のヒト被検者のグループから収集された。健常ドナー及び患者の両方からの、システインプロテアーゼ阻害剤と混合された、これらの尿サンプルは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって分析された。健常ドナーのグループと様々な患者のグループに異なって表れたペプチド候補は、各患者グループと健常ドナーグループとの間のポリペプチドパターンを比較し、人口統計学及びサンプルパラメータの統計的評価を考慮に入れることで、特定された。これらのペプチドは、精製され、それらのアミノ酸配列が所定の技術によって決定された。
【００３７】
（ｉｉｉ）ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析は、所定の技術に従って、白血球関連Ｉｇ様受容体２のフラグメントＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）及びα１酸性糖タンパク質のフラグメントＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）に特異的な抗体を用いて実施された。この結果は、同じサンプルのクレアチニンまたはタンパク質のレベルに対して正規化された。
【００３８】
（ｉｖ）ＥＬＩＳＡ
尿サンプルは、プロテアーゼ阻害剤と混合され、希釈バッファーと１：１００で希釈され、血清サンプルは、１：１０で希釈された。希釈されたサンプルは、トリプリケートでＥＬＩＳＡプレートに入れられた。白血球関連Ｉｇ様受容体２及びα１酸性糖タンパク質の濃度は、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定され、同じサンプルのクレアチニンまたはタンパク質のレベルに対して正規化された。
【００３９】
結果
上述のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって、ペプチドＤＦＬＥＬＬＶＫＧＴＶＰＧＴＥＡＳＧＦＤＡＰ（配列番号１）及びＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲＤＴＫＴＹＭＬＡＦＤＶＮＤＥＫＮＷＧＬＳ（配列番号２）は、健常対照からの尿サンプルに比較して大幅に高いレベルで、腎症患者からの尿サンプルに検出された。配列番号１及び２は、それぞれ白血球関連Ｉｇ様受容体２及びα１酸性糖タンパク質のフラグメントである。健常ドナーのグループと様々な患者のグループのこれらの２つのペプチドの陽性率を下記の表２に示す：
【００４０】
【表２】
0005524241.tif 000003
【００４１】
この結果は、腎症患者のこれらの２つのペプチドの尿レベルがタンパク尿と相関していなかったことも示しており、それらが尿中にタンパク質、特にアルブミンが現れる前に、腎臓障害を検出するのに用いることができることを示している。
【００４２】
また、腎症患者のこれらの２つのペプチドの尿レベルは、糸球体濾過量（ＧＦＲ）と逆相関を示すことが見出されており、腎機能の変化及び腎症進行をモニターするマーカーとなり得ることを示している。
【００４３】
上記のＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析によって、白血球関連Ｉｇ様受容体２及びα１酸性糖タンパク質は、腎症患者（例えば、漢方薬誘発性の腎症を有する患者）からの尿サンプルと健常対照からの尿サンプルとで異なって表れることが見出された。下記の表３を参照されたい。さらに詳しくは、健常対照からの尿サンプル中にいずれのタンパク質の存在もほぼ検出できないが、より高いレベルのタンパク質が腎症患者からの尿サンプルで見出された。この結果は、いずれのタンパク質も、腎症を診断するマーカーとして用いることができることを示している。
【００４４】
【表３】
0005524241.tif 000004
【００４５】
実施例２：白血球関連Ｉｇ様受容体２とα１酸性糖タンパク質との組合せをバイオマーカーとして用いて腎症を診断すること
健常対照及び腎症患者（糖尿病性腎症、尿毒症、ＩｇＡ腎症、漢方薬誘発性の腎症、及び膜様糸球体腎炎腎症を有する患者を含む）の両方からの尿白血球関連Ｉｇ様受容体２及びα１酸性糖タンパク質のレベルを、上記の実施例１で述べたように測定した。
【００４６】
図１に示されるように、上記の２つのタンパク質マーカーの組み合わせたレベルは、健常対照に比べて、全てのタイプの腎症患者で大幅に高かった（ＡＵＲＯＣ＝０．９３）。このことは、白血球関連Ｉｇ様受容体２とα１酸性糖タンパク質とを組み合わせれば、腎症を診断する高感度で特異性の高い信頼できるバイオマーカーとして用いることできることを示している。
【００４７】
尿白血球関連Ｉｇ様受容体２とα１酸性糖タンパク質との組合せは、漢方薬によって誘発された腎症を検出するのに特に信頼できることが見出された。図２を参照されたい。本研究から得られたＡＵＲＯＣが１．０に達するということは、このバイオマーカーを用いて漢方薬誘発性の腎症を有する患者を診断する場合に診断精度が１００％であることを示している。
【００４８】
他の実施の形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組合せで結合してもよい。本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、同じ、等価の、または同様の目的を提供する代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、明示的に特に断らない限り、それぞれの特徴は、等価または同様の特徴の一般的な系列の一例に過ぎない。
【００４９】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確かめることができ、また、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更や修飾を行って、本発明を様々な用途や条件に適用することができる。従って、他の実施の形態も特許請求の範囲内にある。
【図１】
0005524241.tif 000005
【図２】
0005524241.tif 000006
【配列表】
0005524241000001.xml