(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル、または医薬的に許容されるその塩。
【請求項２】
治療上有効な量の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル、および医薬的に許容されるアジュバント、担体もしくは希釈剤を含有する、CRFに関連した精神もしくは神経疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
該疾患がうつ病である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該疾患が不安症または不安関連障害である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該疾患が過敏性腸症候群である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該疾患が断薬およびアルコール離脱の依存または負の側面である、請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2008年7月31日に出願された米国仮特許出願第61/085,230号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、化合物(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル、該化合物の医薬組成物、ならびに該化合物を用いた精神障害および神経疾患（うつ病、不安関連障害、過敏性腸症候群、断薬およびアルコール離脱の依存および負の側面、ならびにCRFに関連する他の症状を含む）の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)（41アミノ酸ペプチド）は、脳下垂体前葉からのプロオピオメラノコルチン(POMC)由来ペプチド分泌の主要な生理調節因子である[非特許文献１;非特許文献２]。脳下垂体における内分泌の役割に加えて、該ホルモンは中枢神経系において視床下部外に広く分布しており、脳内における神経伝達物質もしくは神経調節物質の役割と一致した幅広い自律神経性効果、電気生理学的効果および行動性効果をもたらすことが、CRFの免疫組織化学的局在によって実証されている[非特許文献３;非特許文献４;非特許文献５]。生理学的、心理学的および免疫学的ストレス要因に対する免疫系の応答を統合することにおいてCRFが重要な役割を担っていることが証明されている[非特許文献６;非特許文献７]。
【０００４】
CRFの過剰発現または過小発現は、いくつかの医学的障害の根本的な原因と考えられている。そのような治療可能な障害としては、感情障害、不安症、うつ病、頭痛、過敏性腸症候群、外傷後ストレス障害、核上性麻痺、免疫抑制、アルツハイマー病、胃腸疾患、神経性食欲不振症もしくは他の摂食障害、薬物依存、薬物もしくはアルコール離脱症状、炎症性疾患、心血管疾患もしくは心臓関連疾患、受精能問題（fertility problem）、ヒト免疫不全ウイルス感染症、出血性ストレス、肥満症、不妊症、頭部および脊髄外傷、てんかん、脳卒中、潰瘍、筋萎縮性側索硬化症、低血糖、高血圧、頻脈およびうっ血性心不全、脳卒中、骨粗鬆症、早産、心理社会的小人症、ストレス性の発熱、潰瘍、下痢、術後イレウス、ならびに精神病理学的障害およびストレスに関連する腸過敏症が挙げられる[概説として、非特許文献８;非特許文献９、非特許文献１０;非特許文献１１;非特許文献１２;非特許文献１３;非特許文献１４;非特許文献１５を参照]。
【０００５】
CRFは、うつ病(例えば、大うつ病、単一エピソードうつ病、反復性うつ病、小児虐待誘発性（child abuse induced）うつ病、および産後うつ病)、気分変調症（dysthemia）、双極性障害、および気分循環症を含む感情障害に関与することが証明されている。大うつ病に罹患している個体の中で、薬剤を使用していない個体の脳脊髄液(CSF)のCRF濃度は顕著に増大している[非特許文献１６;非特許文献１７;非特許文献１８;非特許文献１９]。さらに、自殺者の前頭皮質においてCRF受容体の密度は、CRFの過分泌と一致して顕著に低下している[非特許文献２０]。加えて、抑うつ患者において、CRF(静脈内投与した)に対する副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)応答の鈍麻が観察されている[非特許文献２１;非特許文献２２;非特許文献２３]。CRFの過分泌はヒトのうつ病で見られる症状に関与しうるという仮説が、ラットおよび非ヒト霊長類における前臨床試験によってさらに支持されている[非特許文献２４]。三環系抗うつ薬はCRF濃度を変化させることができ、それにより脳内のCRF受容体の数を調節することができるという予備的な証拠がある[非特許文献２５]。
【０００６】
CRFは不安症および関連障害（合併うつ病性疾病（co-morbid depressive illness）を伴う不安症、パニック障害、恐怖症性障害、社会不安障害、強迫性障害、外傷後ストレス障害、および非定型不安障害を含む）の原因に関与することが証明されている[非特許文献２６]。不安障害ならびにストレスに対する応答を低下させる薬物療法が一般的に効果を有する障害においては、多くの場合、情緒的ストレスが誘発因子である。過剰な濃度のCRFは、動物モデルにおいて不安惹起作用をもたらすことが知られている[非特許文献２７;非特許文献２８;非特許文献２９を参照]。CRFは動物において不安惹起作用をもたらし、ベンゾジアゼピン/非ベンゾジアゼピン抗不安薬とCRFとの間の相互作用が様々な行動不安モデルにおいて証明されている[非特許文献３０;非特許文献２８]。様々な行動パラダイムにおける、推定CRF受容体アンタゴニスト α-らせんヒツジCRF(9-41)を用いた予備的研究によって、該アンタゴニストは、ベンゾジアゼピンと定性的に類似している「抗不安薬様」効果をもたらすことが示されている[非特許文献２９、非特許文献３０]。
【０００７】
神経化学的研究、内分泌研究、および受容体結合研究のすべてによって、CRFとベンゾジアゼピン抗不安薬との間の相互作用が示されており、さらに、これらの障害にCRFが関与していることも証明されている。クロルジアゼポキシドは、ラットにおけるコンフリクト試験[非特許文献３１; 非特許文献３２]および聴覚試験（acoustic startle test）の両方において、CRFの「不安惹起」作用を減衰させる[非特許文献３３]。コンフリクト試験において単独では行動活性のなかったベンゾジアゼピン受容体アンタゴニスト(Ro15-1788)は、CRFの作用を用量依存的に回復させたが、一方ベンゾジアゼピンインバースアゴニスト(FG7142)はCRFの作用を増大させた[非特許文献３３]。とりわけ興味深いことは、様々な行動パラダイムにおけるCRF受容体アンタゴニスト(α-らせんCRF9-41)の効果を調べる予備的研究によって、CRFアンタゴニストがベンゾジアゼピンに定性的に類似した「抗不安薬様」効果をもたらすことが示されていることである[概説として、非特許文献３４を参照]。
【０００８】
HPAアクシスの調節に加えて、CRFは腸-脳相関（gut-brain axis）の調節の重要なモジュレーターであると考えられている。CRFは、過敏性腸症候群(IBS)、術後イレウス、および精神病理学的障害とストレスに関連する腸過敏症などのストレス関連胃腸障害[非特許文献３５]を媒介する役割を果たしうることを示す証拠が存在する[概説として、非特許文献３６および非特許文献３７;非特許文献３８; 非特許文献３９を参照]。ラットにおいて、CRF1アンタゴニストJTC-017の腹腔内投与は慢性結腸直腸膨張への曝露による便排泄の増大を阻止することが示されている[非特許文献４０]。加えて、JTC-017は急性結腸直腸膨張への曝露後に見られる不安関連行動を減衰させた。ラットにおけるCRF-刺激結腸運動はまた、CRF1/2ペプチドアンタゴニスト アストレシンの中枢投与によって減衰された[非特許文献４１]。健常なヒトにおいて、CRFの静脈内投与は、直腸過敏症に影響を与え、IBS患者特有のストレス誘発性内臓反応に類似した症状を呈することが示された[非特許文献４２]。これらのデータにより、CRFアンタゴニストはIBSの治療に有用でありうることが示唆される。
【０００９】
CRF1のアンタゴニストは、断薬の依存および負の側面の治療としての使用について検討されている[非特許文献４３]。ニコチン、コカイン、オピエート、およびアルコールからの離脱は、しばしば、負の情動状態および不安度の上昇をもたらす。これらの望ましくない作用はときおり、中毒状態を再発（relapse）させる物質の自己投与の増大により相殺され得る。外的ストレス要因も、同様に、しばしば中毒を再発させ得る。
【００１０】
CRF受容体アンタゴニストは、ニコチンからの離脱の負の情動的側面の治療に有用でありうる。CRF1/2ペプチドアンタゴニスト D-Phe CRF(12-41)によるニコチン依存ラットの前処置は、ニコチン離脱に関連した脳の報酬閾値の上昇を防ぐことが示された[非特許文献４４]。D-Phe CRF(12-41)はまた、ラットにおいて、ニコチン-探索行動のストレス誘発性復活（reinstatement）を減少させる[非特許文献４５]。加えて、自制（abstinence）期間後のニコチン摂取の増大（しばしばニコチン依存症とともに見られる）は、ラットにおいては、CRF1アンタゴニストMPZPを用いた前処置によって阻止され得る[非特許文献４６;非特許文献４７]。
【００１１】
動物実験からの証拠もまた、CRF受容体の拮抗作用によってコカインおよびモルヒネの離脱および再発が減衰されうることを示唆する。CRF1アンタゴニスト CP-154,526は、リスザルにおけるコカイン探索行動のスピラドリン-誘発性復活[非特許文献４８]、ならびにラットにおけるメタンフェタミン-探索行動のキュー-誘発性復活[非特許文献４９]を減衰させることが示された。離脱の誘発（precipitation of withdrawal）前にCRF1アンタゴニスト R121919[非特許文献５０]で前処置されたロラゼパム依存ラットは、防御的離脱モデルにおいて、HPAアクシス活性化の減少および不安行動の減少を示した[非特許文献５１]。R121919は、同様に、誘発モルヒネ離脱の重症度および離脱-誘発性HPAアクシス活性化を減衰させることができた[非特許文献５２]。自己投与中のオピエート曝露量および自制期間は、再発に影響を与え得る。コカインをより長時間(毎日6時間)自己投与させたラットは、より短い時間(毎日2時間)自己投与させたラットよりも、コカイン、電気的足ショック、またはCRF投与によって復活しやすかった[非特許文献５３]。別の研究において、CRF1アンタゴニスト MPZPおよびアンタラルミンは、毎日のコカインアクセス（access）を延長させたラットにおいて、コカイン自己投与を減少させることが示された[非特許文献４６]。
【００１２】
CRF1アンタゴニストは、エタノール依存症で見られる負の情動的側面、過剰な飲酒、およびストレス誘発性再発を阻止する助けとなりうることが証明されている[非特許文献５４]。エタノール依存野生型マウスは、離脱期間中にエタノール自己投与の増大を示すが、ただし自制（abstinence）期間後のみである[非特許文献５５]。CRF1アンタゴニスト アンタラルミンの投与により、この作用は逆転される。CRF1ノックアウト(KO)マウスは自己投与が増大するこの傾向を示さない。CRF1アンタゴニスト R121919もしくはアンタラルミンで処置された場合、エタノール依存ラットでは、急性離脱の間における過剰なエタノール自己投与の減少が示された[非特許文献５６]。しかしながら、これらのCRF1アンタゴニストで処置した非依存ラットでは、エタノール自己投与への効果が示されなかった。同様に、依存ラットでは、CRF1アンタゴニスト MPZPは急性離脱の間における過剰なエタノール自己投与を選択的に減少させた[非特許文献５７]。別の研究において、依存ラットにおいて、新規CRF1アンタゴニストはストレスにより誘発される過剰なエタノール自己投与を選択的に減少させた[非特許文献５８]。これらの研究により、CRF1受容体の拮抗作用は、基礎自己投与レベルに影響を与えることなく、過剰なエタノール自己投与を選択的に阻止することができることが示されている。このことは、CRF1アンタゴニストはアルコール依存症の治療に有用であり得ることを示唆している。
【００１３】
さらに、CRFはストレスから生じる心血管もしくは心臓関連疾患、例えば高血圧、頻脈およびうっ血性心不全、脳卒中に関与すると考えられている(CRF1アンタゴニストを用いたうっ血性心不全の治療方法が、1999年2月10日に出願された特許文献１、特許文献２(2000年3月28日)に記載されている）。
【００１４】
また、CRF1アンタゴニストは関節炎および炎症性障害の治療に有用であることも示唆されている[非特許文献５９;非特許文献６０]。
【００１５】
また、CRF1アンタゴニストは皮膚障害に有用であることも示唆されている[非特許文献６１]。動物モデルにおいて、ストレスによる慢性接触皮膚炎の悪化は選択的CRF1アンタゴニストにより阻止され、このことは、CRF1がストレスによる慢性接触皮膚炎の悪化に関与していること、ならびにCRF1アンタゴニストがこの障害の治療に有用でありうることを示唆する[非特許文献６２]。
【００１６】
CRF1アンタゴニストは毛髪成長刺激因子として有用でありうることが、研究により示されている(特許文献３はKBM-2細胞産生の刺激におけるCRFアンタゴニストの使用に関する細胞培養アッセイを開示している)。従って、CRFアンタゴニストは脱毛症の治療において有用でありうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許出願第09/248,073号
【特許文献２】現米国特許第6,043,260号
【特許文献３】WO2002/19975
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Rivier, J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 80: 4851 (1983)
【非特許文献２】Vale, W. et al., Science 213: 1394 (1981)
【非特許文献３】Vale, W. et al., Rec. Prog. Horm. Res. 39: 245 (1983)
【非特許文献４】Koob, G. F. Persp. Behav. Med. 2: 39 (1985)
【非特許文献５】De Souza, E. B. et al., J. Neurosci. 5: 3189 (1985)
【非特許文献６】Blalock, J. E. Physiological Reviews 69: 1 (1989)
【非特許文献７】Morley, J. E. Life Sci. 41: 527 (1987)
【非特許文献８】McCarthy, J. R.; Heinrichs, S. C.; Grigoriadis, D. E. Cur. Pharm. Res. 5: 289-315 (1999)
【非特許文献９】Gilligan, P. J.; Robertson, D. W.; Zaczek, R. J. Med. Chem. 43: 1641-1660 (2000)
【非特許文献１０】Chrousos, G. P. Int. J. Obesity, 24, Suppl. 2, S50-S55 (2000)
【非特許文献１１】Webster, E.; Torpy, D. J.; Elenkov, I. J.; Chrousos, G. P. Ann. N.Y. Acad. Sci. 840: 21-32 (1998)
【非特許文献１２】Newport, D. J.; Nemeroff, C. B. Curr. Opin. Neurobiology, 10: 211-218 (2000)
【非特許文献１３】Mastorakos, G.; Ilias, I. Ann. N.Y. Acad. Sci. 900: 95-106 (2000)
【非特許文献１４】Owens, M. J.; Nemeroff, C. B. Expert Opin. Invest. Drugs 8: 1849-1858 (1999)
【非特許文献１５】Koob, G. F. Ann. N.Y. Acad. Sci., 909: 170-185 (2000)
【非特許文献１６】Nemeroff, C. B. et al., Science 226: 1342 (1984)
【非特許文献１７】Banki, C. M. et al., Am. J. Psychiatry 144: 873 (1987)
【非特許文献１８】France, R. D. et al., Biol. Psychiatry 28: 86 (1988)
【非特許文献１９】Arato, M. et al., Biol Psychiatry 25: 355 (1989)
【非特許文献２０】Nemeroff, C. B. et al., Arch. Gen. Psychiatry 45: 577 (1988)
【非特許文献２１】Gold, P. W. et al., Am J. Psychiatry 141: 619 (1984)
【非特許文献２２】Holsboer, F. et al., Psychoneuroendocrinology 9: 147 (1984)
【非特許文献２３】Gold, P. W. et al., New Eng. J. Med. 314: 1129 (1986)
【非特許文献２４】Sapolsky, R. M. Arch. Gen. Psychiatry 46: 1047 (1989)
【非特許文献２５】Grigoriadis et al., Neuropsychopharmacology 2: 53 (1989)
【非特許文献２６】The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16th edition (1992)
【非特許文献２７】Britton, D. R. et al., Life Sci. 31: 363 (1982)
【非特許文献２８】Berridge, C. W., Dunn, A. J. Regul. Peptides 16: 83 (1986)
【非特許文献２９】Berridge, C. W.; Dunn, A. J. Horm. Behav. 21: 393 (1987)
【非特許文献３０】Dunn, A. J.; Berridge, C. W. Brain Research Reviews 15: 71 (1990)
【非特許文献３１】Britton, K. T. et al. Psychopharmacology 86: 170 (1985)
【非特許文献３２】Britton, K. T. et al. Psychopharmacology 94: 306 (1988)
【非特許文献３３】Swerdlow, N. R. et al. Psychopharmacology 88: 147 (1986)
【非特許文献３４】G.F. Koob and K.T. Britton, In: Corticotropin-Releasing Factor: Basic and Clinical Studies of a Neuropeptide, E.B. De Souza and C.B. Nemeroff eds., CRC Press p 221 (1990)
【非特許文献３５】Gabry, K. E. et al. Molecular Psychiatry 7(5): 474-483 (2002)
【非特許文献３６】E.D. DeSouza, C.B. Nemeroff, Editors; Corticotropin-Releasing Factor: Basic and Clinical Studies of a Neuropeptide, E.B. De Souza and C.B. Nemeroff eds., CRC Press p 221 (1990)
【非特許文献３７】Maillot, C. et al. Gastroenterology, 119: 1569-1579 (2000)
【非特許文献３８】Fukudo, S. J. Gastroenterol. 42(Suppl XVII): 48 (2007)
【非特許文献３９】Tache, Y.; Bonaz, B. J. Clin. Invest. 117: 33 (2007)
【非特許文献４０】Saito, K. et al. Gastroenterol., 129: 1533 (2005)
【非特許文献４１】Tsukamoto, K. et al. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 290: R1537 (2006)
【非特許文献４２】Nozu, T.; Kudaira, M. J. Gastroenterol. 41: 740 (2006)
【非特許文献４３】Steckler, T.; Dautzenberg, F. M. CNS Neurol. Disord. Drug Targets 5: 147 (2006)
【非特許文献４４】Bruijnzeel, A. W. et al. Neuropsychopharmacol. 32: 955 (2007)
【非特許文献４５】Zislis, G. et al. Neuropharmacol. 53: 958 (2007)
【非特許文献４６】Specio, S. E. et al. Psychopharmacol. 196: 473 (2008)
【非特許文献４７】George, O. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 17198 (2007)
【非特許文献４８】Valdez, G. R. et al. J. Pharm. Exp. Ther. 323: 525 (2007)
【非特許文献４９】Moffett, M. C. et al. Psychopharmacol. 190: 171 (2007)
【非特許文献５０】Holsboer, F. et al. Eur. J. Pharmacol. 583: 350 (2008)
【非特許文献５１】Skelton, K. H. et al. Psychopharmacol. 192: 385 (2007)
【非特許文献５２】Skelton, K. H. et al. Eur. J. Pharmacol. 571: 17 (2007)
【非特許文献５３】Mantsch, J. R. et al. Psychopharmacol. 195: 591 (2008)
【非特許文献５４】Heilig, M. et al. Trends Neurosci. 30: 399 (2007)
【非特許文献５５】Chu, K. G. F. Pharmacol. Biochem. Behav. 86: 813 (2007)
【非特許文献５６】Funk, C. K. et al. Biol. Psychiatry 61: 78 (2007)
【非特許文献５７】Richardson, H. N. et al. Pharmacol. Biochem. Behav. 88: 497 (2008)
【非特許文献５８】Gehlert, D. R. et al. J. Neurosci. 27: 2718 (2007)
【非特許文献５９】Webster, E. L. et al. J. Rheumatol. 29(6): 1252-61 (2002)
【非特許文献６０】Murphy, E. P. et al. Arthritis Rheum. 44(4): 782-93 (2001)
【非特許文献６１】Zouboulis, C. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7148-7153 (2002)
【非特許文献６２】Kaneko, K. et al. Exp. Dermatol, 12(1): 47-52 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、化合物(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル、該化合物の医薬組成物、ならびに該化合物を用いた精神障害および神経疾患（うつ病、不安関連障害、過敏性腸症候群、断薬およびアルコール離脱の依存および負の側面、さらにCRFに関連する他の症状を含む）の治療方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(化合物I)および医薬組成物ならびに異常なCRFレベルに関連した病状を有する患者におけるCRFの調節方法を包含する。
【化１】
0005396474.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明には、該化合物の全ての医薬的に許容される塩形態が含まれる。医薬的に許容される塩は、対イオンが化合物の生理活性または毒性に有意に寄付せず、したがって薬理学的同等物として機能するものである。これらの塩は、市販の試薬を用いて通常の有機技術によって製造することができる。いくつかのアニオン塩形態には、酢酸塩、アシストレート、ベシル酸塩、臭化物塩、塩化物塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グルコウロン酸塩（glucouronate）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヨウ化物塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシレート、およびキシノホエート（xinofoate）が含まれる。いくつかのカチオン塩形態には、アンモニウム塩、アルミニウム塩、ベンザチン塩、ビスマス塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、リチウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、４−フェニルシクロヘキシルアミン塩、ピペラジン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩、および亜鉛塩が含まれる。
【００２２】
化合物Iは不斉炭素原子を有するので、本発明は本明細書に記載される、化合物Iのラセミ体ならびに個々のエナンチオマー形態、ならびにキラルおよびラセミ中間体を含む。単一の記号表示（例えば(R)もしくは(S)）の使用は、主に１つの立体異性体を含むことを意図する。異性体の混合物は、当分野で公知の方法に従って、個々の異性体に分離することができる。
【００２３】
「治療」、「療法」、「レジメン」および関連する用語は、当分野の医師によって理解される通りに使用する。
【００２４】
「治療上有効な」とは、当分野の医師によって理解される通りに、患者にとって有意義な利益をもたらすのに必要な薬剤の量を意味する。単独で投与された個々の活性成分に適用する場合、該用語は該成分単独を指す。組み合わせに適用する場合、組み合わせてか、連続してか、もしくは同時に投与されるかにかかわらず、該用語は治療効果をもたらす活性成分を合計した量を指す。
【００２５】
「患者」は、当分野の医師によって理解される通りに療法に適した人を意味する。
【００２６】
（合成方法）
化合物Iは、スキーム1-8に記載の方法を含む当分野で公知の方法によって製造することができる。記載された方法の妥当な改変法、ならびに当業者に明白である合成方法が、本発明の範囲内であると意図される。
【００２７】
スキームにおいて用いられる略語は通常、当分野で用いられる慣習に従う。本明細書および実施例で用いられる化学的略語は以下の通り定義される:「NaHMDS」はナトリウムビス(トリメチルシリル)アミド;「DMF」はN,N-ジメチルホルムアミド;「MeOH」はメタノール;「NBS」はN-ブロモスクシンイミド;「Ar」はアリール;「TFA」はトリフルオロ酢酸;「LAH」は水素化アルミニウムリチウム;「BOC」、「DMSO」はジメチルスルホキシド;「h」は時間;「rt」は室温もしくは保持時間(状況により決定する);「min」は分;「EtOAc」は酢酸エチル;「THF」はテトラヒドロフラン;「EDTA」はエチレンジアミン四酢酸;「Et2O」はジエチルエーテル;「DMAP」は4-ジメチルアミノピリジン;「DCE」は1,2-ジクロロエタン;「ACN」はアセトニトリル;「DME」は1,2-ジメトキシエタン;「HOBt」は1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物;「DIEA」はジイソプロピルエチルアミン、「Nf」はCF3(CF2)3SO2-;および、「TMOF」はオルトギ酸トリメチル。
【００２８】
(S)-アミン(9)の合成の２つの経路をスキーム1および2に示す。経路A(スキーム1)において、アミンの(S)-キラル中心は、キラルイミン4にシアン化物をジアステレオ選択的に加えることを含むStrecker合成によって構築することができる(Bayston, D.J.; Griffin, J.L.W.; Gruman, A.; Polywka, M.E.C.; Scott, R.M. US patent No. 6191306)。同様に、イミン4は市販のキラルアミン3から導くことができる。経路Bにおいて、該キラルアミンは、キラルクロマトグラフ分離によってラセミ中間体13から得ることができる。
【００２９】
経路Aは、市販のシクロプロパンカルボキシアルデヒド2と(S)-1-フェネチルアミン3との縮合によって開始され、キラルイミン4を得ることができる。そのままシアン化カリウムで処理し、次いで、酸性条件下において中間体α-アミノニトリル5を加水分解することにより、酸6を得ることができる。6のボラン還元により、アルコール7を得ることができ、それを水素化ナトリウムおよびヨウ化メチルで処理することによってメチル化し、エーテル8を76％の収率で得ることができる。ベンジル基の還元的開裂によって、重要なキラルアミン9を得ることができる。
スキーム1
【化２】
0005396474.tif 000003
【００３０】
(S)-アミン9への経路Bは、市販のα-メトキシ酸10からアミド11への変換により開始され、次いでシクロプロピルグリニャール（Grignard）を加えて、ケトン12を得ることができる。還元的アミノ化の後、(ベンジルオキシ)カルバメートとしてアミンを保護することにより、ラセミ中間体13を得ることができる。クロマトグラフィーによってエナンチオマーを分離して、単一のエナンチオマー14を得ることができる。酸性条件下で脱保護して、(S)-アミン9を得ることができる。
スキーム2
【化３】
0005396474.tif 000004
【００３１】
ジブロモピラジノン16およびジクロロピラジノン17の合成をスキーム3に概説する。クロロアセトニトリルを用いてアミン9をアルキル化することにより、α-アミノニトリル15を得ることができる。過剰量のオキサリルブロミドでニトリルを処理することによってジブロモピラジノン環の形成を達成し、16を得ることができる。別法として、オキサリルクロリドでニトリル15を処理することによってジクロロピラジノン17を得ることができる[Vekemans, J.; Pollers-Wieers, C.; Hoornaert, G. J. Heterocycl. Chem. 20: 919-923 (1983)]。
スキーム3
【化４】
0005396474.tif 000005
【００３２】
ピリジルアミンフラグメント26の合成をスキーム4および5に示す。市販の2-アミノ-3-メチルピリジン18を、HawkinsおよびRoeのワンポット法[Hawkins, G. F.; Roe, A. J. Org. Chem. 14: 328-332 (1949)]で、２工程の改変を用いて硝酸および硫酸で処理することによりニトロ化して、ピリドン19を得ることができる。POCl3を用いた19の処理によって開始し、続いてメタノリシスを行う２工程の方法において、高い収率で、メトキシピリジン20へ変換することができる。6-メチル置換基の組み込みは２つの異なる方法によって達成することができ、その両方とも、ニトロピリジン20の6位における代償求核性芳香族置換を含む。方法Aでは、t-ブチルクロロアセテートのアニオンを生成させた後、生じたエステル21を加水分解することによって酸22が得られる。DMF中で塩基性条件下において加熱することによって脱カルボキシルさせて、6-メチルピリジン23を得ることができる。別法として方法Bでは、トリメチルスルホキソニウムヨージドで20を処理することによって、6-メチル基を直接組み込むことができる。
スキーム4
【化５】
0005396474.tif 000006
【００３３】
23を酸性条件下において1-2時間加熱してピリドン24を得ることによって開始し、ピリジルアミン26の合成を完了させることができる。ジフルオロカルベン（difluorocarbene）で、例えば、シリルエステルである2-フルオロスルホニルジフルオロアセテート(Dolbier, W. R.; Tian, F.; Duan, J. X.; Chen, Q. Y. Org. Synth. 2003, 80, 172-176; Dolbier, W. R.; Tian, F.; Duan, J. X.; Li, A.; Ait-Mohand, S.; Bautista, O.; Buathong, S.; Baker, J. M.; Crawford, J.; Anselme, P.; Cai, X. H.; Modzelewska, A.; Koroniak, H.; Battiste, M. A.; Chen, Q. Y. J. Fluorine Chem. 2004, 125, 459-469; Cai, X.; Zhai, Y.; Ghiviriga, I.; Abboud, K. A.; Dolbier, W. R. J. Org. Chem. 2004, 69, 4210-4215)もしくは2-フルオロスルホニルジフルオロ酢酸(Chen, Q. Y.; Wu, S. W. J. Fluorine Chem. 1989, 44, 433-440)を用いて、24を選択的O-アルキル化することによって、ジフルオロメチルエーテル25を製造することができる。水素化によって、ピリジルアミン26へと最終的に変換することができる。
スキーム5
【化６】
0005396474.tif 000007
【００３４】
1の合成の完了をスキーム6に示す。NaHMDSの存在下においてジブロモピラジノン16とピリジルアミン26とのカップリングが達成されて、化合物26を得ることができる。DMF中において、27とシアン化亜鉛とをパラジウム媒介カップリングさせることによって、シアノピラジノン1を得ることができる[Maligres, P. E.; Waters, M. S.; Fleitz, F.; Askin, D. Tetrahedron Lett. 40: 8193-8195 (1999)]。
スキーム6
【化７】
0005396474.tif 000008
【００３５】
クロロピラジノン28からシアノピラジノン1の合成もまた、シアン化亜鉛およびパラジウム触媒を用いて達成することができる。
スキーム7
【化８】
0005396474.tif 000009
【００３６】
別法として、クロロピラジノン29を、パラジウム触媒下においてシアン化亜鉛を用いて5-シアノピラジノン30を得て、シアノピラジノン1へと変換することができる。酢酸中においてヨウ化カリウムを用いて処理することにより、メトキシピリジン部分を脱メチル化することができる。続いて、トリメチルシリルエステルである2フルオロスルホニルジフルオロ酢酸を用いてピリジノンを選択的O-アルキル化することによって、シアノピラジノン1を得ることができる。
スキーム8
【化９】
0005396474.tif 000010
【００３７】
（生物学的方法）
CRF1結合アッセイ
凍結ラット前頭皮質を、アッセイバッファー（50 mM Hepes(23℃でpH 7.0)、10 mM MgCl2、2 mM EGTA、1 μg/ml アプロチニン、1 μg/ml ロイペプチン、1 μg/ml ペプスタチンA、0.005％ Triton X-100、10U/ml バシトラシンおよび0.1％ オボアルブミンを含有する）中で急速に解凍し、ホモジナイズした。該懸濁液を32000xgで30分間遠心分離した。得られた上清を捨て、ペレットをホモジナイズによってアッセイバッファー中に再懸濁させ、再度遠心分離した。上清を捨て、ペレットをホモジナイズによってアッセイバッファー中に再懸濁させ、-70℃にて凍結させた。実験の当日、ホモジネートのアリコートを迅速に解凍し、25 μg/ウェルを、総量100 μlのアッセイバッファー中の150 pM 125I-ヒツジ-CRF(125I-o-CRF)および薬物に加えた。該アッセイ混合液を21℃で2時間インキュベートした。次いで、結合および遊離放射性リガンドを、Brandel Cell Harvesterにおいて、グラスファイバーフィルター(Whatman GF/B、0.3％ PEI (ポリエチレンイミン)で予め処理)を用いた急速濾過により分離した。その後、フィルターを氷冷洗浄バッファー(Ca2+およびMg2+を含有しないPBS、0.01％ Triton X-100;23℃でpH 7.0)で複数回洗浄した。1 μM DMP696（CRF1選択的アンタゴニスト）を用いて非特異的結合を決定した[Li, Y-W. et al., CNS Drug Reviews 11: 21-52, (2005)]。その後、フィルターをWallac Wizardガンマカウンターにおいて計測した。IC50値は、５点(５つの薬物濃度)または１０点(１０の薬物濃度)の競合アッセイにおいて、Microsoft Excel-fitによる非直線回帰を用いて決定した。
【００３８】
CRF2結合アッセイ
凍結ブタ脈絡叢を、アッセイバッファー（50 mM Hepes (23℃でpH 7.0)、10 mM MgCl2、2 mM EGTA、1 μg/ml アプロチニン、1 μg/ml ロイペプチン、1 μg/ml ペプスタチンA、0.005％ Triton X-100、10U/ml バシトラシンおよび0.1％ オボアルブミンを含有する）中で急速に解凍し、ホモジナイズした。該懸濁液を、32000xgで30分間遠心分離した。得られた上清を捨て、ペレットを、ホモジナイズによってアッセイバッファー中で再懸濁し、再度遠心分離した。上清を捨て、ホモジナイズによってアッセイバッファー中で再懸濁し、-70℃で凍結させた。実験の当日、ホモジネートのアリコートを迅速に解凍し、10 μg/ウェルを、総量100 μlのアッセイバッファー中の100 pMの125I-サウバギンおよび薬物に加えた。該アッセイ混合液を21℃で2時間インキュベートした。次いで、結合および遊離放射性リガンドを、Brandel Cell Harvesterにおいて、グラスファイバーフィルター(Whatman GF/B, 0.3％ PEIで予め処理)を用いた急速濾過により分離した。その後、フィルターを、氷冷洗浄バッファー(Ca2+およびMg2+を含有しないPBS、0.01％ Triton X-100(23℃でpH 7.0))で複数回洗浄した。1 μM α-らせんCRF(9-41)を用いて非特異的結合を決定した。その後、フィルターをWallac Wizard ガンマカウンターにおいて計測した。IC50値は、５点(５つの薬物濃度)の競合アッセイにおいて、Microsoft Excel-fitによる非直線回帰を用いて決定した。
【００３９】
hCRF1結合アッセイ
Y79細胞（ヒトCRF1受容体を天然に発現するヒト網膜芽細胞腫細胞株（line））を用いて、結合用の膜を調製した[Hauger, R., et al., Journal of Neurochemistry 68: 2308-2316, (1997)]。簡単に述べると、細胞を増殖させ、回収し、次いでペレットを、アッセイバッファー（50 mM Hepes(23℃でpH 7.0)、10 mM MgCl2、2 mM EGTA、1 μg/ml アプロチニン、1 μg/ml ロイペプチン、1 μg/ml ペプスタチンA、0.005％ Triton X-100、10U/ml バシトラシンおよび0.1％ オボアルブミンを含有する）中でホモジナイズした。該懸濁液を32000xgで30分間遠心分離した。得られた上清を捨て、ペレットをアッセイバッファー中でホモジナイズによって再懸濁し、再度遠心分離した。上清を捨て、ペレットをアッセイバッファー中でホモジナイズによって再懸濁し、アリコートを-70℃で凍結させた。実験の当日、アリコートを迅速に解凍し、25 μg/ウェルを、総量100 μlのアッセイバッファー中の150 pMの125I-ヒツジ-CRFおよび薬物に加えた。該アッセイ混合液を、21℃で2時間インキュベートした。次いで、結合および遊離放射性リガンドを、Brandel Cell Harvesterにて、グラスファイバーフィルター(Whatman GF/B、0.3％ PEIで予め処理)を用いた急速濾過により分離した。その後、フィルターを氷冷洗浄バッファー(Ca2+およびMg2+を含有しないPBS、0.01％ Triton X-100(23℃でpH 7.0))で複数回洗浄した。1 μM DMP696を用いて非特異的結合を決定した。その後、フィルターをWallac Wizardガンマカウンターにおいて計測した。IC50値は、５点(５つの薬物濃度)競合アッセイにおいて、Microsoft Excel-fitによる非直線回帰を用いて決定した
【００４０】
結合結果
CRF1受容体における(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルの結合能力(IC50値)を決定するための一次スクリーニングは、標識ペプチドリガンドとして125I-o-CRFおよび受容体源としてラット前頭皮質膜を用いた競合結合実験であった。(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは、ラット前頭皮質膜への125I-o-CRFの結合を強くかつ完全に阻害し、0.86 ± 0.04 nM (n=10)のIC50および0.94 ± 0.03 (n=10)のHill Slopeを示した。これらの結果は、5点および10点の競合結合アッセイを含む。比較のため、DMP696（よく特徴づけられた小分子選択的CRF1アンタゴニスト）もまた試験し、1.39 ± 0.09 nM (n=10)のIC50および1.00 ± 0.02 (n=10)のHill Slopeが示された。(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルはまた、ヒト網膜芽細胞腫細胞株Y79に存在する天然のCRF1受容体に、高親和性で結合する。(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは、Y79膜への125I-o-CRFの結合を強くかつ完全に阻害し、1.81 ± 0.46 nM (n=3)のIC50を示した。比較のため、DMP696もまた試験し、1.71 ± 0.53 nM (n=3)のIC50が示された。CRF1受容体に対する高い親和性とは対照的に、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは、ブタ脈絡叢膜で発現するCRF2受容体としてほとんどもしくは全く親和性を示さなかった。α-らせんCRF(CRF1およびCRF2受容体の切断型高親和性アンタゴニスト)はブタ脈絡叢膜で内因的に発現されるCRF2受容体に対して高親和性で結合(IC50 = 25.7 ± 2.9 nM, n=3)するが、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルはIC50 ＞ 10,000 nM (n=3)を示した。
【００４１】
ラットにおける状況不安行動研究
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルを、状況不安モデルにおいて審査し、その抗不安能を評価した。このモデルにおいて、ラットは、不慣れなオープンフィールドにある、小さく、暗いチャンバーに入れられる。ビヒクル処置ラットは、不安が高められた状態に合っている該部屋内でほとんどの時間を過ごす[Takahashi L. K. et al, Behav. Neurosci.  103: 648-654, (1989)]。このモデルは、抗不安薬（クロルジアゼポキシドなどのベンゾジアゼピンを含む）に対して感受性である[Yang X-M. et al, J. Pharmacol. Exp. Ther.  255: 1064-1070, (1990)]。加えて、前述のCRF1アンタゴニスト（例えばDMP696およびDMP904）[McElroy J. F. et al., Psychopharmacology 165: 86-92, (2002); Lelas S. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 309: 293-302, (2004)]はこのモデルに効果を有していた。このモデルにおいて、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルの効果を、抗不安薬の標準物質であるクロルジアゼポキシド(Librium（登録商標）)およびジアゼパム(Valium（登録商標）)の効果と比較した。体重180-300 gの雄のスプラーグドーリーラットを、Charles River Laboratories(Wilmington, Mass.)から購入した。該ラットを、一定の温度(21 ± 2℃)および湿度(50 ± 10％)にて維持されたコロニー室（colony room）中の吊式ワイヤーケージに個別に収容した。該室は、１日あたり12時間照明した。該ラットには、研究の間、餌および水を自由に摂取させた。行動研究は、6時から13時の間、実施した。動物は、Bristol-Myers Squibb Companyの動物実験委員会のガイドライン「Guide for Care and Use of Laboratory Animals」(Institute of Animal Laboratory Resources, 1996)、および国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に公開されているガイドラインに従って維持した。研究プロトコールは、Bristol-Myers Squibb Companyの動物実験委員会により承認された。全ての化合物は、0.25％ メチルセルロース中に調製して、経口投与した。クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、およびデシプラミンは、Sigma Chemical Companyから購入した。(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは2 ml/kgの容量で投与した。全ての標準を、2 ml/kgの容量で投与した。全ての試験において、データは、分散分析の後、個々の対照についてのダネット検定により解析した。有意水準（significance value）は0.05に設定した。該データは、平均 ± 標準誤差(SEM)として、テキストおよび図で示す。雄のスプラーグドーリーラットを、試験の前日に、ハンドリングおよび投与に慣れさせた。試験の当日、全ての化合物を、行動試験の60分前に経管により経口投与した。各動物を、照明されたオープンフィールドの壁の一面(長さ106 cm x 幅92 cm x 高さ50 cm)に対して縦方向に設置された小さな亜鉛めっき銅円筒(長さ14 cm, 直径10 cm)に入れ、試験を開始した。該オープンフィールドを、60-W白熱電球によって照射し、変圧器によって30-ルクス（円筒の入り口で測定）まで照射を漸増させた。処置の割当てを知らない訓練された観察者によって、15分間、行動を評価した。動物が円筒を退出するまでの潜時（全ての��をオープンフィールドに置き、オープンフィールドを探索することと定義される）を記録した(秒で)。15分経っても動物が円筒を退出しなかった場合、該試験を終了し、900秒のスコアを記録した。嗅覚キューが連続して試験した動物の行動に影響するのを防ぐため、プレキシグラスチャンバーおよび円筒を、動物間で、1.0％ 氷酢酸を用いて清浄した。行動試験の後、動物を屠殺し、血漿曝露および中枢受容体占有率を解析するために、血漿サンプルおよび脳を採取した。
【００４２】
状況不安行動研究結果
ビヒクル処置動物は、暗いチャンバーを退出してオープンフィールドを探索するまで、長い潜時を示した。平均退出潜時は、クロルジアゼポキシドおよびジアゼパム研究において、各々、792 ± 108および794 ± 106秒であった(両研究における総試験持続期間900秒の88％)。ベンゾジアゼピン抗不安薬であるクロルジアゼポキシドおよびジアゼパムは、両者とも、用量依存的に退出潜時を減少させた[クロルジアゼポキシド F(5,47)=7.62, p＜0.0001;ジアゼパム F(4,38)=15.17, p＜0.0001]。最小有効用量のクロルジアゼポキシド(3.0 mg/kg, 経口)は、ビヒクル処置対照と比べて、58％まで退出潜時を減少させた。試験したさらに高い用量のクロルジアゼポキシド(10、30、および100 mg/kg, 経口)もまた、ビヒクル処置動物と比べて各々、97％、72％、および54％、退出潜時を顕著に減少させた。クロルジアゼポキシドのこれらの効果についてのU字曲線は、この薬剤の鎮静特性に起因するものと考えられる。最小有効用量のジアゼパム(1.0 mg/kg, 経口)は、対照と比べて62％まで退出潜時を減少させ、試験したさらに高い用量(3.0および10 mg/kg, 経口)は、ビヒクル処置対照と比べて各々、69％および91％、退出潜時をさらに減少させた。
【００４３】
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルを、単一用量(1.0、1.8、および3.0 mg/kg, 経口)で、３つの別個の研究において試験した後、完全用量反応（complete dose-response）(0.56-3.0 mg/kg, 経口)研究で試験した。全ての単一用量研究において、ビヒクル処置動物は、暗いチャンバーを退出してオープンフィールドを探索するまで、長い潜時を示した。平均退出潜時は、３つの研究において各々、780 ± 81、748 ± 77、および824 ± 76秒であった(総試験持続期間900秒の、各々、87％、83％、および92％)。ポジティブ対照 DMP696(10 mg/kg)（別のCRF1受容体アンタゴニスト）は、３つの研究の各々において、退出潜時を顕著に減少させた(各々、57％、74％、および81％の減少)。1.0 mg/kgではなく、1.8および3.0 mg/kgの用量の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは、退出潜時を顕著に減少させた。1.8 mg/kgの用量は退出潜時を53％[F(2,23)=7.52, p=0.003]減少させ、3.0 mg/kgの用量は51％[F(2,23)=14.05, p=0.0001]減少させた。
【００４４】
用量依存的研究において、ビヒクル処置動物は、747 ± 78秒(総試験持続期間900秒の83％)の退出潜時を示した。ポジティブ対照であるDMP696は、10 mg/kgにて、退出潜時を顕著に減少させた(62％減少)。単一用量研究において示された効果と一致して、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは、経口的に投与された場合、状況不安モデルにおいて退出潜時を用量依存的に減少させた[F(5,47)=3.69, p=0.007)。最小有効用量の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは1.8 mg/kgであり、ビヒクル処置対照と比べて60％、退出潜時を減少させた。より高い用量の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(3.0 mg/kg)もまた、退出潜時を、56％、顕著に減少させた。より低い用量の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(0.56および1.0 mg/kg)は退出潜時を有意に変化させなかった。要約すると、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルは、ラット状況不安モデルにおける抗不安薬-様効果の産生において、ベンゾジアゼピン（ジアゼパムおよびクロルジアゼポキシド）と同等の効力を示した。
【００４５】
（医薬組成物および使用方法）
化合物IはCRFの阻害を示す。CRFの阻害は、精神障害および神経疾患（うつ病、不安関連障害、過敏性腸症候群、断薬およびアルコール離脱の依存および負の側面、ならびにCRFに関連した他の症状を含む）に対する効果と関連している。このように、化合物Iはこれらの障害の治療に有用であり得て、そのことから、本発明の他の態様はこれらの症状およびCRFの異常濃度に関連した他の症状を治療するための組成物および化合物Iの使用方法である。
【００４６】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルを患者に投与することを含む、CRFに関連した精神もしくは神経疾患の治療方法である。
【００４７】
本発明の別の態様は、うつ病の治療方法である。
【００４８】
本発明の別の態様は、不安症または不安関連障害の治療方法である。
【００４９】
本発明の別の態様は、過敏性腸症候群の治療方法である。
【００５０】
本発明の別の態様は、断薬およびアルコール離脱の依存および負の側面の治療方法である。
【００５１】
化合物Iは、通常、治療上有効な量の化合物I、もしくは医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物として提供され、通常の賦形剤を含んでもよい。治療上有効な量は、当分野の実務者によって決定されるような、患者にとって有意義な利益をもたらすのに必要な量である。医薬的に許容される担体は、許容される安全性プロファイルを有する一般的に公知の担体である。組成物は、カプセル剤、錠剤、ロゼンジ剤、および散剤、ならびに液体懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、および液剤を含めた、全ての一般的な固体および液体形態を包含する。組成物は、一般的な製剤技術ならびに通常の賦形剤(例えば結合材および湿潤剤)およびビヒクル(例えば水およびアルコール)を用いて製造される。
【００５２】
固体組成物は通常、用量あたり約1から約1000 mgの活性成分をもたらす用量単位で製剤化される。固体の用量単位のいくつかの例は、1 mg、10 mg、100 mg、250 mg、500 mg、および1000 mgである。液体組成物は一般的に1-100 mg/mLの単位用量範囲である。液体用量単位のいくつかの例は、1 mg/mL、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、および100 mg/mLである。
【００５３】
本発明は、全ての通常の投与様式を包含し;経口および非経口様式が好ましい。典型的には、１日用量は、１日あたり0.01-100 mg/kg体重でありうる。一般的に、経口ではより多くの化合物が、非経口ではより少ない化合物が必要である。しかしながら、具体的な投与レジメンは、妥当な医学的判断を用いて医師により決定されるべきである。
【００５４】
（具体的実施態様の説明）
以下の実施例において、全ての温度は摂氏度で示される。融点は、Meltemp 3.0（Laboratory Devices, Inc.社製）またはThomas Scientific Unimelt capillary融点測定装置で記録し、補正はしていない。プロトン磁気共鳴(1H NMR)スペクトルは、Bruker 400またはBruker 500 MHz分光計で記録した。全てのスペクトルは示した溶媒中で測定され、化学シフトを内部標準テトラメチルシラン(TMS)を基準としてδ単位の低磁場として報告し、そして、プロトン間結合定数をヘルツ(Hz)で報告する。多重パターンは以下の通り示される:s, １重線;d, ２重線;t, ３重線;q, ４重線;m, 多重線;br, ブロードピーク;dd, ２重の２重線;br d, ブロードの２重線;dt, ２重の３重線;br s, ブロードの１重線;dq, ２重の４重線。旋光度[α]Dは、示した溶媒中において、Rudolph Scientific Autopol IV旋光計で測定した;濃度はmg/mLで示される。低分解能質量分析(MS)および見かけ分子（apparent molecular）(M+H+)もしくは(M-H)+は、Finnegan SSQ7000で測定した。高分解能質量分析はFinnegan MAT900で測定した。液体クロマトグラフィー(LC)/質量分析を、Water Micromass ZQに連結した島津LCで実施した。
【００５５】
略語は通常、当分野で用いられる従来の用語に従う:「1 x」は１回、「2 x」は２回、「3 x」は３回、「℃」は摂氏度、「eq」は当量、「g」はグラム、「mg」はミリグラム、「L」はリットル、「mL」はミリリットル、「μL」はマイクロリットル、「N」は規定濃度、「M」モル、「mmol」はミリモル、「min」は分、「h」は時間、「rt」は室温、「RT」は保持時間、「atm」は気圧、「psi」ポンド／平方インチ、「conc.」は濃縮物、「sat」もしくは「sat'd」は飽和、「MW」は分子量、「mp」は融点、「ee」はエナンチオマー過剰率、「MS」もしくは「Mass Spec」は質量分析、「ESI」はエレクトロスプレーイオン化質量分析、「HR」は高分解能、「HRMS」は高分解能質量分析、「LCMS」は液体クロマトグラフィー質量分析、「HPLC」は高圧液体クロマトグラフィー、「RP HPLC」は逆相HPLC、「TLC」もしくは「tlc」薄層クロマトグラフィー、「NMR」は核磁気共鳴分光法、「1H」はプロトン、「δ」はデルタ、「s」は１重線、「d」は２重線、「t」は３重線、「q」は４重線、「m」は多重線、「br」はブロード、「Hz」はヘルツ、ならびに「α」、「β」、「R」、「S」、「E」、および「Z」は当業者によく知られた立体化学的命名である。
【実施例】
【００５６】
【化１０】
0005396474.tif 000011
(S)-2-シクロプロピル-2-[(S)-1-フェニルエチルアミノ]酢酸
3つ口の5 L丸底フラスコ中において、メタノール(2.0 L)中のシクロプロパンカルボキシアルデヒド(200.0 g, 1.42 mol)およびS-(-)-1-フェニルエチルアミン(172.9 g, 1.42 mol)の撹拌した溶液を、75℃で2時間加熱した。次いで、該反応混合液を室温に冷却し、シアン化カリウム(185.0 g, 1.42 mol)を少しずつ加えた。該反応混合液を、室温で終夜撹拌した。水(600 mL)を加えた後、該反応混合液がpH 9-10に達するまで濃HCl(250 mL)を滴下した。その後、該混合液を酢酸エチル(4 x 1 L)で抽出し、有機層を合わせて、減圧下において濃縮し、黄色の油状物を得た。濃HCl(3.5 L)をこの残渣に加え、該混合液を95℃で終夜加熱した。室温に冷却した後、pHがほぼ中性(pH 7-8)になるまで、冷却および撹拌しながら10％水酸化カリウム溶液を滴下した。0℃でさらに45分間、撹拌を続けた。内容物を濾過し、冷メタノール(5 L)で十分に洗浄した。この段階での含水率は約8-10％であると認められた。該固形物を、乾燥アセトン(7 L)に再懸濁させ、濾過して、(S)-2-シクロプロピル-2-[(S)-1-フェニルエチルアミノ]酢酸(330 g, 52％収率)を、＜1％の水分の固形物として得た:  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.44-7.26 (m, 5H), 3.91-3.86 (m, 1H), 2.28-2.22 (m, 1H), 1.34 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 0.93-0.89 (m, 1H), 0.41-0.37 (m, 2H), 0.31-0.27 (m, 1H), 0.11-0.07 (m, 1H)。
【００５７】
【化１１】
0005396474.tif 000012
(S)-2-シクロプロピル-2-[(S)-1-フェニルエチルアミノ]エタノール
0℃にて、(S)-2-シクロプロピル-2-[(S)-1-フェニルエチルアミノ]酢酸(400 g, 1.82 mol)／乾燥THF(5.2 L)溶液にジメチルスルフィドボラン(ニート)(485 g, 6.39 mol)を、激しく撹拌しながら加えた。該反応混合液を、室温で終夜撹拌した。反応の進行をHPLCによりモニターした。酸が完全に消費されるまで撹拌を続けた(18-20時間)。完了後、該反応混合液を0℃に冷却し、メタノール(6 L)を滴下した。該混合液を減圧下で濃縮し、残渣をクロロホルム(5 L)に溶解させた。有機層を、10％NaHCO3水溶液(2 X 1 L)、続いて食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、黄褐色-黄色の油状物を得た。該油状物を減圧下において蒸留して、(S)-2-シクロプロピル-2-[(S)-1-フェニルエチルアミノ]エタノール(166 g, 44％収率)を無色の油状物として得た:  bp 175-184℃, 0.1 mm Hg; [α]25D -52.1 (c 1.0, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33-7.20 (m, 5H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.67 (dd, JAB = 10.6, JAX = 3.8 Hz, 1H), 3.39 (dd, JBA = 10.6, JBX = 4.3 Hz, 1H), 2.40 (s br, 2H), 1.70-1.65 (m, 1H), 1.35 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88-0.82 (m, 1H), 0.47-0.37 (m, 2H), 0.05- -0.06 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 146.8, 127.6, 126.2, 125.9, 63.0, 60.5, 54.4, 24.4, 13.3, 3.0, 1.5; LRMS (ESI) m/e 206.3 [(M+H)+, C13H20NOとして計算;計算値: 206.2]。
【００５８】
【化１２】
0005396474.tif 000013
(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシ-N-[(S)-1-フェニルエチル]エタンアミン
0℃にて、(S)-2-シクロプロピル-2-[(S)-1-フェニルエチルアミノ]エタノール(29.2 g, 0.143 mol)／THF(700 mL)溶液に、NaH(6.29 g, 0.157 mol, 60％分散／鉱物油)を加えた。冷却浴を取り外し、該反応混合液を室温に昇温させ、室温で30分間撹拌した。シリンジを介してヨウ化メチル(20.30 g, 0.143 mol)を滴下した。添加の完了の直後に、温度がいくらか上昇した。少量の氷を含む水浴を用いて、該反応混合液の温度を〜25℃に制御した。該反応混合液を室温で4時間撹拌した。次いで、該反応混合液を飽和NaHCO3水溶液でゆっくりとクエンチし、飽和NaHCO3水溶液(400 mL)を含む分液漏斗に移した。水層を酢酸エチル(3 x 300 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(5％ MeOH／1:1 酢酸エチル/ヘキサン)により精製して、(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシ-N-[(S)-1-フェニルエチル]-エタンアミン(26.52 g, 85％収率)を薄茶色の油状物として得た:  [α]25D -61.5 (c 0.72, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.25 (m, 4H), 7.20-7.16 (m, 1H), 3.98-3.93 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.50 (dd, JAB = 9.5, JAX = 3.5 Hz, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.34 (dd, JBA = 9.5, JBX = 5.8 Hz, 1H), 1.79-1.74 (m, 2H), 1.33 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.73-0.67 (m, 1H), 0.36-0.34 (m, 2H), 0.03- -0.06 (m, 2H); GC/MS (ESI) m/e 220.2 [(M+H)+, C14H22NOとして計算;計算値: 220.2]。
【００５９】
【化１３】
0005396474.tif 000014
(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミン塩酸塩
(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシ-N-[(S)-1-フェニルエチル]エタンアミン(100 g, 458 mmol)を、Pd(OH)2/C(50 g, 炭素上に20％)およびエタノール(1.2 L)とパールボトル（Parr bottle）中で合わせた。該反応混合液をH2雰囲気(15 psi)下に設置し、18時間振盪させた。次いで該反応混合液を、撹拌中の2 N HCl／Et2O(360 mL)を含むフラスコ中に、セライトのパッドを通して濾過した。得られた濾液を濃縮して、黄色の固形物を得た後、それをEt2O(500 mL)とともに共エバポレートした。得られた固形物を終夜、減圧乾燥させて、(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミン塩酸塩(69 g, 99％収率)を白色の固形物として得た:  mp 190-192℃; [α]25D +16.3 (c 0.446, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (s br, 3H), 3.68 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (s, 3H), 2.64-2.60 (m, 1H), 1.20-1.13 (m, 1H), 0.71-0.58 (m, 3H), 0.32-0.28 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 72.1, 59.2, 57.5, 10.7, 4.2, 4.1; LRMS (ESI) m/e 231.2 [(2M+H)+, C12H27N2O2として計算;計算値: 231.2]。
【００６０】
【化１４】
0005396474.tif 000015
N,2-ジメトキシ-N-メチルアセトアミド
トリエチルアミン(115 mL)を、メトキシ酢酸(35.0 g, 389 mmol)／CH2Cl2(1200 mL)溶液に、室温にて加えた。N,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(45.5 g, 467 mmol)を加え、5分間撹拌した後、該懸濁液を0℃に冷却した。次いで、ジアゾカルボン酸エチル(EDC)(81.7 g, 428 mmol)を加え、該反応混合液を、室温に昇温させながら、終夜撹拌した。該混合液を分液漏斗に注ぎ入れ、CH2Cl2(500 mL)で希釈した。有機層を、1 N HCl(2 x 300 mL)、飽和NaHCO3水溶液(2 x 300 mL)、および食塩水(300 mL)で洗浄した。得られた溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。生成物をシリカゲルのショートカラムでのカラムクロマトグラフィー(5％ メタノール／CH2Cl2)により精製して、N,2-ジメトキシ-N-メチルアセトアミド(33.2 g, 64％収率)を無色の油状物として得た:  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.20 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.45 (s, 3H), 3.17 (s, 3H);  13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 173.0, 69.7, 69.4, 61.4, 59.4; LRMS (ESI) m/e 134.1 [(M+H)+, C5H12NO3として計算;計算値: 134.1]。
【００６１】
【化１５】
0005396474.tif 000016
1-シクロプロピル-2-メトキシエタノン
削り状マグネシウム(15.2 g, 632 mmol)を、滴下漏斗を備えた5-Lの3つ口フラスコに加えた。該フラスコ、漏斗、および削り状物を炎で乾燥させた後、還流コンデンサーを該フラスコにセットした。フラスコおよび内容物を室温に冷却した後、ジエチルエーテル(100 mL)を該フラスコに加え、続いてシクロプロピルブロミドの一部(5.0 mL, 7.55 g, 62.4 mmol)およびいくらかのヨウ素の結晶を加えた。反応の開始後、ジエチルエーテル(400 mL)を反応フラスコに加えた。次いで、該反応混合液を氷水浴で断続的に冷却しながら、残りのシクロプロピルブロミド(87.3 g, 721 mmol)をゆっくりと30分かけて加えた。添加が完了してマグネシウムが消費された後、さらなるジエチルエーテル(700 mL)を加え、該反応混合液を0℃に冷却した。マグネチックスターラーをメカニカルスターラーで置き換え、ジエチルエーテル(500 mL)に溶解させたN,2-ジメトキシ-N-メチルアセトアミド(42.07 g, 316 mmol)の溶液を、滴下漏斗を介して30分かけてゆっくりと加えた。この間に白色の固形物が形成された。添加の完了後、該冷却浴を取り外し、該混合液を室温で1時間撹拌した。その後、該混合液を0℃に冷却し、該反応液を、1 N HCl(700 mL, 最初はゆっくりと加えた)を加えることによってクエンチした。さらに15分撹拌した後、該混合液を分液漏斗に移し入れ、水層をエーテル(3 x 500 mL)で抽出した。有機層を合わせて、飽和NaHCO3水溶液(400 mL)、食塩水(400 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、最小の減圧(500 mbar)で濃縮した。収集フラスコ（collection flask）をドライアイス/イソプロパノール浴中に浸しながら、生成物を減圧下において濾過により精製して、1-シクロプロピル-2-メトキシエタノン(29.2 g, 81％収率)を無色の油状物として得た:  bp 35-38℃, 5 mm Hg; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.13 (s, 2H), 3.43 (s, 3H), 2.11-2.07 (m, 1H), 1.10-1.06 (m, 2H), 0.94-0.89 (m, 2H); GC/MS (CI) m/e 115.1 [(M+H)+, C6H11O2として計算;計算値: 115.1]。
【００６２】
【化１６】
0005396474.tif 000017
ベンジル 1-シクロプロピル-2-メトキシエチルカルバメート
THF(1000 mL)中の1-シクロプロピル-2-メトキシエタノン(10.0 g, 88.0 mmol)をトリフルオロ酢酸アンモニウム(115 g, 880 mmol)で処理し、該混合液を0℃に冷却した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(27.9 g, 133 mmol)を加え、冷却浴を取り外し、該反応混合液を、温水浴を用いて40℃にて2時間、徐々に加温した。該混合液を室温に冷却し、濃縮して、1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミンを得て、それをそのまま次の工程で用いた。
【００６３】
前工程からのクルードな1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミンをCH2Cl2/H2O(300 mL/300 mL)中に溶解させ、Na2CO3(111.9 g, 1.06 mol)を加えた。該反応混合液を氷浴中に設置し、シリンジを介してCbzCl(16.46 g, 96.78 mmol)を加えた。添加の間、反応混合液の内部温度を15-20℃にて維持した。添加の完了後、該反応混合液を室温で2時間撹拌した。該混合液を分液漏斗に注ぎ入れ、H2O(300 mL)で希釈し、CH2Cl2(3 x 300 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水(300 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(30％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製し、ベンジル 1-シクロプロピル-2-メトキシエチルカルバメート(17.2 g, 78％ 2工程についての収率)を油状物として得て、それを静置して結晶化させた:  mp 190.5-192℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.39-7.29 (m, 5H), 7.17 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 3.36-3.34 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.19-3.14 (m, 1H), 0.85-0.79 (m, 1H), 0.43-0.37 (m, 1H), 0.35-0.22 (m, 2H), 0.20-0.16 (m, 1H); LRMS (ESI) m/e 250.3 [(M+H)+, C14H20NO3として計算;計算値: 250.1]。
【００６４】
【化１７】
0005396474.tif 000018
(S)-ベンジル 1-シクロプロピル-2-メトキシエチルカルバメート
ラセミの1-シクロプロピル-2-メトキシエチルカルバメートを、HPLC（Chiralpak ADカラム(10 cm x 50 cm), 94％ ヘプタン/6％ エタノール, 300 mL/分, λ = 210 nm, 1グラム／注入, 30分メソッド, ピーク1(S), ピーク2(R)）によってそのエナンチオマーに分離し、分析HPLC(Chiralpak ADカラム, 4.6 x 250 mm, 95％ ヘプタン/5％ エタノール, 0.8 mL/分, λ = 212 nm, 保持時間 = 15.79分)によって、光学純度＞99％ eeを有すると決定された:  mp 190.5-192℃; [α]25D -18.2 (c 0.500, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.39-7.29 (m, 5H), 7.17 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 3.36-3.34 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.19-3.14 (m, 1H), 0.85-0.79 (m, 1H), 0.43-0.37 (m, 1H), 0.35-0.22 (m, 2H), 0.20-0.16 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 155.6, 136.9, 128.0, 127.38, 127.34, 74.0, 64.8, 57.8, 53.5, 12.6, 2.2, 1.5; LRMS (ES+) m/e 272.3 [(M+Na)+, C14H19NO3Naとして計算;計算値: 272.1]。
【００６５】
【化１８】
0005396474.tif 000019
(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミン塩酸塩
パールボトル中の、EtOH(80 mL)およびCHCl3(3 mL)中の(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシエチルカルバメート(4.36 g, 17.5 mmol)の溶液に、4 N HCl／ジオキサン(5 mL)およびPd/C(476 mg, 10％, 湿, Degussa type)を加えた。該混合液を、45 psiの気圧のH2下において16時間、パールシェイカー（Parr shaker）上に設置した。該反応混合液を、セライトのパッドを通して濾過し、該濾液を濃縮した後、ヘキサン(2 x)から再濃縮して、(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミン塩酸塩(2.65 g, 100％収率)を白色の固形物として得た:  mp 190-192℃; [α]25D +14.3 (c 0.446, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (s br, 3H), 3.68 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (s, 3H), 2.64-2.60 (m, 1H), 1.20-1.13 (m, 1H), 0.71-0.58 (m, 3H), 0.32-0.28 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 72.1, 59.2, 57.5, 10.7, 4.2, 4.1; LRMS (ESI) m/e 231.2 [(2M+H)+, C12H27N2O2として計算;計算値: 231.2]。
【００６６】
【化１９】
0005396474.tif 000020
(S)-2-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチルアミノ)アセトニトリル塩酸塩
クロロアセトニトリル(8.40 mL, 133 mmol)を、アセトニトリル(300 mL)中の(S)-1-シクロプロピル-2-メトキシエタンアミン塩酸塩(20.0 g, 133 mmol)、K2CO3(52.0 g, 376 mmol)およびKI(24.2 g, 145 mmol)の撹拌した懸濁液に、室温で加えた。該混合液を48℃で17時間撹拌した。次いで、該反応混合液を室温に冷却した後、セライトのパッドを通して濾過した。得られた濾液を暗褐色の半固形物まで濃縮した。該固形物をCH2Cl2中に懸濁し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2 → 3％ メタノール／CH2Cl2)により精製して、茶色の油状物(18.8 g)を得た。該油状物をEt2O(150 mL)中に溶解させ、該溶液を2 N HCl／Et2O(100 mL)で酸性化して、(S)-2-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチルアミノ)-アセトニトリル塩酸塩(23.6 g, 93％収率)をオフホワイト色の固形物として得た:  [α]25D +22.9 (c 0.714, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.51 (s br, 2H), 4.39 (ABq, JAB = 16.7, Δν = 24.4 Hz, 2H), 3.94 (dd, JAB = 10.6, JAX = 7.8 Hz, 1H), 3.79 (dd, JBA = 10.8, JBX = 2.2 Hz, 1H), 3.42 (s, 3H), 2.79-2.75 (m, 1H), 1.25-1.17 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 1H), 0.78-0.70 (m, 2H), 0.39-0.34 (m, 1H); LRMS (ES+) m/e 155.2 [(M+H)+, C8H15N2Oとして計算;計算値: 155.1]。
【００６７】
【化２０】
0005396474.tif 000021
(S)-3,5-ジブロモ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン
滴下漏斗を備えた1 Lの3つ口丸底フラスコ中において、(S)-2-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチルアミノ)アセトニトリル塩酸塩(15.0 g, 78.7 mmol)を無水ジクロロメタン(300 mL)中に懸濁させた。該混合液を-60℃に冷却し、オキサリルブロミド(41.3 mL, 440 mmol)を15分かけて滴下した。添加の完了後、冷却浴を取り外し、該反応混合液を室温に昇温させ、次いで40℃で3時間加熱した。該混合液を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。該固形物を、シリカゲルカラムの先端に直接添加することにより精製し、残ったオキサリルブロミドとシリカゲルとの反応が停止した後、溶出して(5％ → 20％ 酢酸エチル／ヘキサン)、(S)-3,5-ジブロモ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン(15.5 g, 56％収率)をオフホワイト色の固形物として得た:  mp 98.5-100.5℃; [α]25D -71.8 (c 1.19, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.61 (s, 1H), 4.08-4.04 (m, 1H), 3.72 (dd, JAB = 10.5, JAX = 4.5 Hz, 1H), 3.61 (dd, JBA = 10.3, JBX = 3.0 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H), 1.41-1.36 (m, 1H), 0.82-0.76 (m, 1H), 0.65-0.59 (m, 1H), 0.54-0.48 (m, 1H), 0.32-0.27 (m, 1H); LRMS (APCI)  m/e 351.1 [(M+H)+, C10H13N2O2Br2として計算;計算値: 350.9]。
【００６８】
【化２１】
0005396474.tif 000022
(S)-3,5-ジクロロ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン
オキサリルクロリド(54.5 mL, 624 mmol)を、1,4 ジオキサン(300 mL)および塩化メチレン(200 mL)中の(S)-2-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチルアミノ)アセトニトリル塩酸塩(23.6 g, 124 mmol)の冷たい(＜8℃)溶液に滴下した。次いで、該反応混合液を53℃で19時間加熱した。該反応混合液を室温に冷却し、半固形物まで濃縮した後、CH2Cl2(50 mL)とともに３回共エバポレートした。得られた茶色の固形物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(0 → 10％ → 20％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製して、(S)-3,5-ジクロロ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン(22.4 g, 69％収率)を白色の固形物として得た:  mp 109.8-110.8℃; [α]25D -88.8 (c 0.513, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 (s, 1H), 4.12-4.08 (m, 1H), 3.73 (dd, JAB = 10.3, JAX = 4.5 Hz, 1H), 3.62 (dd, JBA = 10.3, JBX = 3.0 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H), 1.43-1.37 (m, 1H), 0.82-0.76 (m, 1H), 0.65-0.61 (m, 1H), 0.55-0.50 (m, 1H), 0.33-0.27 (m, 1H); LRMS (ESI) m/e 206.3 [(M+H)+, C10H13N2O2Cl2として計算;計算値: 263.0]。  C10H12N2O2Cl2として計算;計算値: C, 45.64, H, 4.59, N, 10.64. 実測値: C, 45.74, H, 4.62, N, 10.61.
【００６９】
いくつかのバッチからの(S)-3,5-ジクロロ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン[160 g, 90-95％の(S)-エナンチオマー]を、Thar SFCにより処理して、＞99％エナンチオマー純度で(S)-エナンチオマーを単離した。3バッチにおいて計133gの(S)-3,5-ジクロロ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オンを単離した。11.8 gの目的でない異性体もまた得られた。得られた化合物のエナンチオマー過剰率(ee)は＞99％であった。Thar 350 SFCでのプレパラティブ条件（Preparative condition）は以下の通りであった: ラセミ体の量(g):65, 58, 37; カラム:Chiralpak AD-H, 5x25 cm ; 移動相:10％ EtOH／CO2 ; 圧力(bar):100 ; 流速(ml/分):200 ; 溶液濃度(mg/ml):50 ; 注入量(ml):6 ; サイクル時間(分/注入):3.5 ; 温度:35 ; 処理量(g/時間):5.1 ; 検出λ:220。
【００７０】
【化２２】
0005396474.tif 000023
3-メチル-5-ニトロピリジン-2-オール
メカニカルスターラー、滴下漏斗および温度計を備えた3つ口の2-L丸底フラスコを、氷水浴中に設置した。該フラスコに濃H2SO4(150 mL)を加えた。2-アミノ-3-メチルピリジン(50.0 g, 0.463 mol, Lancaster, CAS 1603-40-3, mp. 29℃, 温水浴中で予め温めて融解させた)を125 mLのエルレンマイヤーフラスコ中に量り取り、続いて、予め温めた細い先端が切断されたパスツールピペットを介して少量ずつ加えた。添加の間、該エルレンマイヤーフラスコを温水浴中で維持して、出発物質が固化するのを防いだ。添加している間に温度を約45℃に上げ、フラスコ内に白色の煙/霧が生じた。濃H2SO4(100 mL)を残った出発物質に加え、該混合液を反応フラスコに加えた。得られた混合液は乳白色の懸濁液であった。濃H2SO4(35 mL)および70％硝酸(35 mL)の溶液を、氷水浴で冷却しながら予め混合し、滴下漏斗に移し入れた。反応混合液の内部温度が10-15℃(しかし10℃以下でない)まで冷却された後、予め混合したH2SO4/HNO3酸混合液を、内部の反応液温度を20-25℃に上げるような速度(添加時間 5-10分)で滴下した。添加の完了後、氷水浴を水道水浴で置き換えた。該反応温度を約30℃の域までゆっくりと上げ、その後室温に冷却した。この間は、該反応をモニターして、温度が高く上昇し過ぎないことを確実にすべきである。次いで、該反応混合液を終夜撹拌した後、該暗赤褐色の混合液に、70％硝酸(35 mL)を、温度が35℃を超えないような添加速度で、滴下漏斗を介して滴下した。この間、該反応フラスコを室温の水を含む水浴中に入れていた。その後、該反応フラスコに、滴下漏斗を介して少しずつ水(500 mL)を加えた。内部温度をゆっくりと50-60℃に上げながら、第１の約150 mLの水を滴下した。生じたいずれの起泡も消すように、撹拌速度を増大させた。最初の約150 mLの水の添加の間に茶色の気体が発生した。気体の発生が停止した後に、残りの約350 mLの水をより速い速度で加え、温度上昇はもはや観察されなかった。該反応液は、暗く濁った茶色から澄明なオレンジ色の溶液に変化した。反応液を50℃以下に冷却するにつれて、黄色の沈殿物がいくらか形成されうる。次いで、水浴を取り外し、加熱マントルで置き換え、滴下漏斗をコンデンサーで置き換えた。その後、該反応混合液(薄いオレンジ色の溶液もしくは明るい黄色の溶液)を115-118℃で1.75-2時間加熱した。この間、約115℃でさらなる気体の発生が生じた。次いで、氷水浴を用いて該反応混合液を室温に冷却した後、該反応混合液に氷を直接加えることによってさらに0℃に冷却した。生じた固形物をブフナー漏斗に集め、冷水、続いて最小量の冷エタノール、続いて最小量の冷エーテルで洗浄した。その後、該固形物を減圧下で乾燥させて、3-メチル-5-ニトロピリジン-2-オール(53.5 g, 75％収率)を淡黄色の固形物として得た:  mp 228-229℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.55 (s, br, 1H), 8.54 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.04 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 162.2, 135.4, 130.0, 129.5, 128.1, 15.8; LRMS, (ESI) m/e 152.96 [(M-H)-, C6H5N2O3として計算;計算値: 153.03].  C6H6N2O3として計算;計算値: C, 46.75, H, 3.92, N, 18.17. 実測値: C, 46.80, H, 3.79, N, 18.14。
【００７１】
【化２３】
0005396474.tif 000024
2-メトキシ-3-メチル-5-ニトロピリジン
3-メチル-5-ニトロピリジン-2-オール(134 g, 0.872 mol)(J. Org. Chem. 1949, 14, 328-332)を３部に分け、３つの1L丸底フラスコに入れた。POCl3(200 mL)を各フラスコに加え、該混合液を2時間還流加熱した。該溶液を冷却し、過剰なPOCl3を減圧除去した。残渣を撹拌しながら氷水(1 L)に注ぎ入れ、沈殿物を濾過により集め、20分間風乾させた。生成物を合わせて、10％酢酸エチル／ヘキサン(300 mL)から再結晶化させ、風乾させて2-クロロ-3-メチル-5-ニトロピリジン(139 g, 92％収率)を白色の固形物として得て、それをさらなる精製は行わずに次の工程で用いた: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.04 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.50 (s, 3H)。
【００７２】
上記の方法からの2-クロロ-3-メチル-5-ニトロピリジン(139 g, 0.806 mol)を２部に分け、メタノール(500 mL)とともに２つの2L丸底フラスコに入れた。該溶液を、温度が20℃以下で維持されるように、固体のナトリウムメトキシド(26.5 g, 0.467 mol)を各フラスコに少しずつ加えながら、ドライアイス/イソプロパノール浴において冷却した。添加の完了後、得られた混合液を1時間還流加熱した。該混合液を冷却し、氷水(500 mL)で希釈し、白色の沈殿物を得て、それを濾過により集めた。濾過物を合わせて、水で洗浄し、風乾させて、2-メトキシ-3-メチル-5-ニトロピリジン(127 g, 97％収率)を白色の固形物として得た:  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.91 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 4.06 (s, 3H), 2.25 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 165.83, 141.91, 139.37, 132.92, 121.77, 54.83, 15.84。分析試料をヘキサンから再結晶化させて、白色の針状物質を得た, mp 95-96.5℃. C7H8N2O3として計算;計算値: C, 50.00, H, 4.79, N, 16.66. 実測値: C, 49.73, H, 5.02, N, 16.48。
【００７３】
【化２４】
0005396474.tif 000025
tert-ブチル 2-(6-メトキシ-5-メチル-3-ニトロピリジン-2-イル)アセテート
THF(1 L)中の2-メトキシ-3-メチル-5-ニトロピリジン(68.8 g, 409 mmol)およびtert-ブチル 2-クロロアセテート(77.0 g, 511 mmol)の黄色の溶液を撹拌し、ドライアイス/イソプロパノール浴中において-20℃に冷却した。カリウムtert-ブトキシド(115 g, 1.02 mol)を、反応液温度が-10℃未満であるような速度で加えた。該反応混合液が暗紫色に変化した。添加の完了後、冷却浴を取り外し、該反応液を30分間撹拌した。撹拌した反応混合液をHCl(500 mL, 2.4 N)でクエンチした。紫色の溶液は淡黄色に変化し、該混合液を２つの層に分離した。有機層を分離し、食塩水で３回洗浄し、減圧濃縮した。ヘキサンを、琥珀色の残渣に加えた。該混合液を減圧濃縮した後、高真空下において1時間乾燥させて、tert-ブチル 2-(6-メトキシ-5-メチル-3-ニトロピリジン-2-イル)アセテート(83.4 g, 72％収率)を黄褐色の固形物として得た: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.16 (s, 1H), 4.09 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 2.21 (s, 3H), 1.44 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 168.81, 163.63, 147.88, 139.41, 135.19, 120.82, 81.66, 54.69, 44.48, 28.03, 15.27。分析試料をヘキサンから再結晶化させ、白色の針状物質を得た, mp 71-72.5℃.  C13H18N2O5として計算;計算値: C, 55.31, H, 6.42, N, 9.92. 実測値: C, 55.52, H, 6.40, N, 9.84。
【００７４】
【化２５】
0005396474.tif 000026
2-(6-メトキシ-5-メチル-3-ニトロピリジン-2-イル)酢酸
tert-ブチル 2-(6-メトキシ-5-メチル-3-ニトロピリジン-2-イル)アセテート(83.0 g, 294 mmol)／TFA(200 mL)溶液を熱水浴中で1時間加熱した。該溶液を減圧濃縮して、茶色の油状物を得た。該油状物をヘキサンで希釈して撹拌した。生じた固形物を濾過により集め、風乾させて、2-(6-メトキシ-5-メチル-3-ニトロピリジン-2-イル)酢酸(62.8 g, 94％収率)を黄褐色の固形物として得た:  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s br, 1H), 8.20 (s, 1H), 4.25 (s, 2H), 4.03 (s, 3H), 2.24 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 175.59, 163.80, 146.52, 139.16, 135.30, 121.53, 54.86, 42.88, 15.32。分析試料をヘキサンから再結晶化させた:  mp 135-137℃. C9H10N2O5として計算;計算値: C, 47.79, H, 4.46, N, 12.39. 実測値: C, 47.65, H, 4.14, N, 12.30。
【００７５】
【化２６】
0005396474.tif 000027
2-メトキシ-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン
tert-ブチル 2-(6-メトキシ-5-メチル-3-ニトロピリジン-2-イル)アセテート(62.5 g, 276 mmol)、K2CO3(20.0 g, 145 mmol)、およびDMF(100 mL)の混合液を、撹拌しながら、熱水浴中において90℃に1時間加熱した。加熱の間に気体の発生が見られ、1時間後に停止した。該混合液を、撹拌した氷水(600 mL)に注ぎ入れ、反応フラスコを少量のアセトンで洗浄した。得られた沈殿物を濾過により集め、風乾させて2-メトキシ-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(48.5 g, 96％収率)を黄褐色の固形物として得た:  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 2.76 (d, 3H), 2.19 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 163.37, 151.63, 139.44, 135.02, 119.39, 54.45, 24.18, 15.16。分析試料をヘキサンから再結晶化させて、黄褐色の針状物質を得た: mp 85.9-90.5℃. C8H10N2O3として計算;計算値: C, 52.74, H, 5.53, N, 15.37. 実測値: C, 52.82, H, 5.28, N, 15.45。
【００７６】
【化２７】
0005396474.tif 000028
2-メトキシ-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン
ジメチルスルホキシド(35 mL)を、NaH(1.82 g, 45.5 mmol, 60％／鉱物油)を含む乾いた丸底フラスコに加えた。得られた懸濁液を70℃で35分間加熱し、その間に該懸濁液は溶液となった。該反応混合液を室温に冷却し、トリメチルスルホキソニウムヨージド(10.0 g, 45.5 mmol)を加え、該混合液を室温で30分間撹拌した。2-メトキシ-3-メチル-5-ニトロピリジン(4.50 g, 26.80 mmol)を加え、得られた暗赤色の溶液を室温で30分間撹拌した後、TLCによって出発物質の消費が示された。該反応混合液を、水(30 mL)を含む分液漏斗に移し、水層をEtOAc(3 x 100 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させて、濾過し、濃縮した。残渣を、MPLC(シリカゲル, 20％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製して、2-メトキシ-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(2.00 g, 41％収率)を、前述の方法により製造させたものと同一の、無色の固形物として得た:  mp 85.5-86.2℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 2.20 (s, 3H)。
【００７７】
【化２８】
0005396474.tif 000029
3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン-2-オール
2-メトキシ-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(32.3 g, 182 mmol)／12 N 塩酸(300 mL)溶液を、100℃で1時間加熱した。TLCでの分析によって、いくらかの出発物質が残っていることが示されたため、該反応液を110℃でさらに45分間加熱した。該反応混合液を室温に冷却し、氷(400 g)に注ぎ入れた。氷が融解し、得られた濃い茶色の懸濁液の濃度がまだ0℃未満である時に、該混合液を濾過した。固体のケーキを水(100 mL)で洗浄し、フィルター上で30分間乾燥させた。次いで、該固形物を冷(-10℃)エタノール(150 mL)中に再懸濁し、濾過し、冷エタノール(50 mL)で洗浄し、フィルター上で1時間風乾して、3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン-2-オール(28.0 g, 94％収率)を黄褐色の粉末として得た:  mp 263℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.42 (s br, 1 H), 8.03 (s, 1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.01 (s, 3 H); LRMS (ESI) m/e 169.3 [(M+H)+, C7H9N2O3として計算;計算値: 169.1].  C7H8N2O3として計算;計算値: C, 50.00, H, 4.79, N, 16.66. 実測値: C, 50.01, H, 4.59, N, 16.75。
【００７８】
【化２９】
0005396474.tif 000030
2-(ジフルオロメトキシ)-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン
水素化ナトリウム(6.63 g, 166 mmol, 60％／鉱物油)をヘキサン(100 mL)で洗浄して鉱物油を除去し、次いで室温にて乾燥アセトニトリル(1500 mL)に懸濁させた。3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン-2-オール(27.9 g, 166 mmol)を30分かけて少しずつ加え、黄色の懸濁液を得た。添加の間に、いくらか泡立ちが見られたが、温度変化は無視できるものであった。次いで、フッ化セシウム(2.50 g, 16.6 mmol)を加え、続いてトリメチルシリル2-(フルオロスルホニル)ジフルオロアセテート(36.0 mL, 182 mmol)を30分かけてゆっくりと加えた。添加の間に、いくらかの泡立ちが見られ、温度が23℃から30℃に上昇し、該懸濁液は濁りが著しく減少した。15分間撹拌した後、TLCによって出発物質がまだ残っていることが示されたため、さらなるトリメチルシリル2-(フルオロスルホニル)ジフルオロアセテート(6.5 mL, 33 mmol)を10分かけて加えた。さらなる15分の後、TLCによって出発物質の消費が示された。該反応液を、泡立ちが激しくなりすぎない速度で水(20 mL)を滴下することによってクエンチした。泡立ちが停止した後、さらなる水(200 mL)を加えた。大部分の溶媒を減圧除去し、水性残渣を酢酸エチル(3x200mL)で抽出した。有機層を合わせて、Na2SO4で乾燥させ、エバポレートして、茶色のシロップ状物を得て、それを静置して固化させた。この残渣をエタノール(400 mL)中に溶解させて、脱色炭(15 g)を加えた。該懸濁液を70℃で20分間加熱し、次いでセライトのパッドおよび砂（sand）を通して濾過した。濾液を集め、該溶媒をエバポレートした。残渣を塩化メチレン中に溶解させ、該溶液をエバポレートして、2-(ジフルオロメトキシ)-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(33.4 g, 92％収率)を淡黄色の固形物として得た:  mp 51-52℃;  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.21 (s, 1 H), 7.55 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 2.76 (s, 3 H), 2.30 (s, 3 H).  C8H8N2O3F2として計算;計算値: C, 44.04, H, 3.69, N, 12.84. 実測値: C, 43.78, H, 3.55, N, 12.58。
【００７９】
別の経路
3,6-メチル-5-ニトロピリジン-2-オール(700 mg, 4.17 mmol)／アセトニトリル(70 mL)懸濁液に、NaH(450 mg, 11.3 mmol, 60％／鉱物油)を加えた。室温で15分間撹拌した後、2,2-ジフルオロ-2-(フルオロスルホニル)酢酸(0.73 mL, 7.09 mmol)を数分かけて滴下した。添加の間にいくらかの泡立ちが生じた。該反応混合液を室温で15分間撹拌した後、該反応液を、水(10 mL)をゆっくりと添加することによってクエンチした。アセトニトリルを減圧除去し、残渣を、水(50 mL)を含む分液漏斗に移した。水層をEtOAc(3 x 50 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルでのMPLC(10％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製して、2-(ジフルオロメトキシ)-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(870 mg, 96％収率)を、方法Aにより製造されたものと同一の、無色の固形物として得た: mp 48-49℃;  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (s, 1 H), 7.54 (t, J = 72.4 Hz, 1 H), 2.76 (s, 3 H), 2.30 (s, 3 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 158.1, 151.0, 142.0, 137.0, 120.0, 113.9 (t, J = 255.8 Hz), 23.5, 14.7。
【００８０】
【化３０】
0005396474.tif 000031
6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-アミン
塩化メチレン(100 mL)およびエタノール(600 mL)中の2-(ジフルオロメトキシ)-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(33.4 g, 153 mmol)の溶液に、10％パラジウム炭素（palladium on charcoal）(3.3 g)を加えた。得られた懸濁液を、パール装置において、40 psiのH2にて1時間、水素化した。TLCを用いて該反応をモニターした。さらなる3.3 gのパラジウム炭素を、出発物質の残留がなくなるまで、1時間ごとに加えた。計13.2 gのPd/Cを加えた。該反応混合液を、最後の触媒添加の後、H2雰囲気下において2時間維持した。該反応混合液を、セライトおよび砂を通して濾過し、固形物を集めて、酢酸エチル(2x100 mL)で洗浄した。濾液を減圧濃縮し、灰色の油状物を得て、それをシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(35％ → 50％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製して、6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-アミン(25.7 g, 89％収率)を淡黄色の油状物として得て、それを冷蔵庫で冷却して固化させた。生成物を、0℃以下にて、ヘキサンから再結晶化させ、白色の針状物質を得た:  mp 40-42℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 (t, J = 74.0 Hz, 1 H), 6.84 (s, 1 H), 2.27 (s, 3 H), 2.15 (s, 3 H); LRMS (ESI) m/e 189.2 [(M+H)+, C8H11N2OF2として計算;計算値: 189.1]. C8H10N2OF2として計算;計算値: C, 51.12, H, 5.38, N, 14.86. 実測値: C, 51.17, H, 5.29, N, 14.87。
【００８１】
別の経路
EtOH(40 mL)および酢酸(4 mL)中の2-(ジフルオロメトキシ)-3,6-ジメチル-5-ニトロピリジン(1.00 g, 4.58 mmol)の溶液に、鉄粉(1.26 g, 22.9 mmol)を加えた。該反応混合液を、フラスコ中において撹拌子なしで、加熱マントルを用いて激しい還流で加熱した。1.75時間後、該反応混合液を室温に冷却し、該鉄粉をセライトのパッドを通して濾過により除去した。濾液を濃縮し、残渣を、飽和NaHCO3水溶液(50 mL)を含む分液漏斗に移した。水層をEtOAc(3 x 100 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルでのMPLC(20％ → 50％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製して、6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-アミン(774 mg, 90％収率)を、方法Aにより精製されたものと同一の、淡黄色の固形物として得た: mp 38.4-39.4℃;  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 (t, J = 74.5 Hz, 1 H), 6.82 (s, 1 H), 2.26 (s, 3 H), 2.14 (s, 3 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 149.6, 137.4, 137.1, 127.4, 119.0, 115.0 (J = 251.3 Hz), 19.3, 14.8; LRMS (ESI) m/e 189.0 [(M+H)+, C8H11N2OF2として計算;計算値: 189.1]。
【００８２】
【化３１】
0005396474.tif 000032
(S)-5-ブロモ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチル-ピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン
(S)-3,5-ジブロモ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン(18.1 g, 51.7 mmol)および6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-アミン(9.70 mg, 51.7 mmol)を、温度計および滴下漏斗を備えた2 Lの3つ口丸底フラスコ中において合わせ、N2下に設置した。THF(360 mL)を加え、該混合液を0℃に冷却した。NaHMDS(109 mL, 109 mmol, 1 M／THF)を、滴下漏斗を介して15分かけて滴下した(内部温度を5℃以下に維持した)。添加の完了後、該反応混合液を0℃でさらに30分間撹拌した。該反応液を、飽和NH4Cl水溶液(120 mL)の添加によってクエンチした。該混合液を、水(100 mL)を含む分液漏斗に移し、水層を酢酸エチル(3 x 250 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過して、濃縮し、(S)-5-ブロモ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン(22.4 g, 95％収率)を茶色の固形物として得て、それをさらなる精製は行わずに次の工程で用いた:  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.40 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.46 (t, J = 73.7 Hz, 1H), 4.16-4.12 (m, 1H), 3.74 (dd, JAB = 10.5, JAX = 5.2 Hz, 1H), 3.66 (dd, JBA = 10.3, JBX = 3.3 Hz, 1H), 3.35 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 1.39-1.34 (m, 1H), 0.85-0.79 (m, 1H), 0.66-0.62 (m, 1H), 0.56-0.51 (m, 1H), 0.34-0.29 (m, 1H); HRMS (ESI) m/e 459.0864 [(M+H)+, C18H22N4O3BrF2として計算;計算値: 459.0843]。
【００８３】
【化３２】
0005396474.tif 000033
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル
(S)-5-ブロモ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチル-ピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン(22.4 g, 48.8 mmol)を、無水ジメチルホルムアミド(480 mL)および水(24 mL)中に、室温にて、マグネチックスターラーで撹拌して溶解させた。該反応混合液に、窒素を15分間バブリングした。シアン化亜鉛(6.00 g, 51.0 mmol)、Pd2(dba)3(2.23 g, 2.40 mmol)およびdppf(3.24 g, 5.85 mmol)を加え、該反応混合液を120℃で3時間加熱した。該反応液を冷却し、セライトのパッドを通して濾過した。該DMF濾液を減圧エバポレート(浴温度＜40℃)し、残渣を、飽和NH4Cl水溶液(200 mL)を含む分液漏斗に移した。水層をEtOAc(3 x 400 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水(300 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(70％ → 100％ CH2Cl2／ヘキサン、次いで、2％ → 5％ 酢酸エチル／CH2Cl2)により精製して、(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(14.2 g, 72％収率)を淡黄色の固形物として得た。EtOH:2-BuOH(10:1)の混合液から再結晶化して、淡黄色の針状物質を得た:  mp 146.8-147.7℃; [α]25D -63.7 (c 0.486, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.40 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.46 (t, J = 73.5 Hz, 1H), 4.16-4.12 (m, 1H), 3.74 (dd, JAB = 10.3, JAX = 5.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, JBA = 10.4, JBX = 3.0 Hz, 1H), 3.35 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 1.39-1.33 (m, 1H), 0.85-0.79 (m, 1H), 0.67-0.61 (m, 1H), 0.56-0.50 (m, 1H), 0.34-0.29 (m, 1H); HRMS (ESI) m/e 406.1704 [(M+H)+, C19H22N5O3F2として計算;計算値: 406.1691].  C19H21N5O3F2として計算;計算値: C, 56.29; H, 5.22; N, 17.27.  実測値: C, 56.38; H, 5.31; N, 17.34。
【００８４】
第１溶出異性体中に高められた(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(複数の処理から97 g)(〜97％エナンチオマー純度)を合わせて、キラル担体での超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)によって、目的でない第２溶出異性体を除去した:Chiralpak OD-Hカラム(5 x 25 cm), 移動相=CO2中の15％イソプロパノール/アセトニトリル(1:1);流速=200 mL/分, 圧力=100 bar, 温度=35℃,λ=254 nm, 注入/6分あたり91 mg/mL（イソプロパノール/アセトニトリル(1:1)中）を5 mL。精製された物質は、分析SFCによって、光学純度＞99％ eeであると決定された:Chiralcel OD-Hカラム(4.6 x 250 mm, 5 μm); 移動相=CO2中の8％エタノール;流速=2 mL/分 @ 150 bar; λ=215 nm; 保持時間=6.5分。
【００８５】
該分離によって、85 gのエナンチオマー的に純粋な化合物(ee ＞99％)を得た。この物質を、各々〜28グラムの3部に分けた。各部を、無水2-ブタノール(280 mL)から再結晶化させた。固形物を合わせて、高真空下において72時間乾燥させて、81.7グラムの(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリルを得た。
【００８６】
【化３３】
0005396474.tif 000034
(S)-5-クロロ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチル-ピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン
(S)-3,5-ジクロロ-1-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)ピラジン-2(1H)-オン(15.0 g, 57.0 mmol)および6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-アミン(10.7 g, 57.0 mmol)を、温度計および滴下漏斗を備えた2 Lの3つ口丸底フラスコ中で、N2下において合わせた。THF(570 mL)を加え、該混合液を0℃に冷却した。NaHMDS(119.7 mL, 119.7 mmol, 1 M／THF)を、内部温度が5℃以下に維持される速度で、滴下漏斗を介して20分かけて滴下した。添加の完了後、該反応混合液を0℃でさらに15分間撹拌した。該反応液を、飽和NH4Cl水溶液(60 mL)の添加によりクエンチした。該混合液を、水(400 mL)を含む分液漏斗に移し、水層をエーテル(3 x 300 mL)で抽出した。有機層を合わせて、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(30％ 酢酸エチル／ヘキサン)により精製して、(S)-5-クロロ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン(22.1 g, 94％収率)を淡黄色の固形物として得て、続いてそれをヘプタンから再結晶化させて、無色の針状物質を得た:  mp 103.4-104.4℃; [α]25D -41.9 (c 0.807, CHCl3);  1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.46 (t, J = 74.0 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 4.19-4.14 (m, 1H), 3.75 (dd, JAB = 10.3, JAX = 6.3 Hz, 1H), 3.67 (dd, JBA = 10.3, JBX = 3.5 Hz, 1H), 3.34 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 1.32-1.26 (m, 1H), 0.81-0.74 (m, 1H), 0.63-0.54 (m, 1H), 0.52-0.47 (m, 1H), 0.36-0.29 (m, 1H); HRMS (ESI) m/e 415.1360 [(M+H)+, C18H22N4O3ClF2として計算;計算値: 415.1349].  C18H21N4O3ClF2として計算;計算値: C, 52.11; H, 5.10; N, 13.50.  実測値: C, 52.05; H, 4.99; N, 13.48。
【００８７】
【化３４】
0005396474.tif 000035
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ]-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル
(S)-5-クロロ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチル-ピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン(99.3 mg, 0.24 mmol)を無水NMP(3 mL)中に溶解させた。この溶液に、Pd(dppf)Cl2・CH2Cl2(78.4 mg, 0.096 mmol)、Zn(CN)2(60 mg, 0.51 mmol)およびZn粉末(24 mg, 0.37 mmol)を加えた。該反応混合液に、N2を15分間バブリングし、溶存O2を排出し、該反応混合液を、アルゴン下において1時間、120℃にて維持した。LC-MS分析によって、所要の生成物への92.5％の変換が示された。 LRMS (ESI) m/e 406.3 [(M+H)+, C19H22N5O3F2として計算;計算値: 406.2].
【００８８】
【化３５】
0005396474.tif 000036
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-メトキシ-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル
(S)-5-クロロ-1-(シクロプロピル-2-メトキシエチル)-3-[6-(メトキシ)-2,5-ジメチル-ピリジン-3-イルアミノ]ピラジン-2(1H)-オン(3.00 g, 7.93 mmol)を、63 mLのN-メチルピロリジノン中に溶解させた。Pd(dppf)Cl2・CH2Cl2(648 mg, 0.793 mmol)、Zn(CN)2(1.86 g, 15.9 mmol)およびZn粉末(619 mg, 9.52 mmol)を該溶液に加えた。該溶液にN2を15分間バブリングした後、該暗色混合液を、アルゴン下において23時間120℃で維持した。該反応混合液のLC-MS分析によって、98.6％の変換が示された。該反応混合液を周囲温度に冷却し、短い吸着床のセライトを通して濾過し、セライトケーキをNMPで洗浄した。濾液を減圧エバポレートした(浴温度 〜60℃)。暗色残渣を、EtOAc(350 mL)およびH2O(60 mL)間に分配した。有機層を水(2 x 50 mL)および食塩水(50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、次いで減圧エバポレートした。その後、暗褐色（dark brown）の残渣を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(30％ 酢酸エチル／ヘキサン, Rf = 0.3)により精製して、純粋な(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-メトキシ-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(2.83 g, 96.5％)を淡黄色の固形物として得た: 1H NMR (CDCl3) δ 7.86 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 4.16-4.13 (m, 1H), 3.94 (s, 1H), 3.74 (dd, 1H, JAB = 10.4 Hz, JAX = 5.2 Hz), 3.66 (dd, JBX = 3.2 Hz), 3.35 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.39-1.32 (m, 1H), 0.85-0.79 (m, 1H), 0.67-0.61 (m, 1H), 0.55-0.50 (m, 1H), 0.34-0.29 (m, 1H);  13C NMR (CDCl3):  158.7, 151.4, 148.1, 144.1, 133.1, 125.7, 124.7, 118.4, 117.3, 107.8, 77.4, 77.1, 76.9, 72.7, 62.3, 59.5, 53.6, 20.0, 15.8, 11.2, 6.2, 4.1; LRMS (ESI) m/e 370 [(M+H)+, C19H24N5O3として計算;計算値: 370];  保持時間 = 2.0分(溶媒A:MeOH:H2O:TFA=10:90:0.1; 溶媒B:MeOH:H2O:TFA=90:10:0.1; 3分のランで40％B／A〜100％B／A 直線グラジエント、および最後に1分のホールド時間, λ = 280 nm)。
【００８９】
【化３６】
0005396474.tif 000037
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-ヒドロキシ-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル
氷酢酸(80 mL)中の(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-メトキシ-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(3.00 g, 8.12 mmol)およびKI(6.2 g, 37.3 mmol)を、撹拌しながら、100℃で1時間加熱した。LC-MS分析によって、所要の生成物への＞98％の変換が示された。該反応混合液を周囲温度に冷却し、酢酸を減圧エバポレートした。残渣を、酢酸エチル(3 x 150 mL)およびH2O(〜100 mL)間に分配した。有機層を食塩水(100 mL)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させた。有機層を減圧エバポレートし、暗褐色の残渣をBiotage SiO2カラムクロマトグラフィー(5％ MeOH/CH2Cl2, Rf = 0.16)により精製して、純粋な(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-ヒドロキシ-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(2.33 g, 81％)を淡黄色の固形物として得た: 1H NMR (CDCl3) δ 7.85-7.55 (br. s, 1H), 7.48 (s, 1H), 4.16-4.12 (m, 1H), 3.73 (dd, 1H, JAB = 10.3 Hz, JAX = 4.9 Hz), 3.66 (dd, JBX = 2.2 Hz), 3.35 (s, 3H), 2.40-2.20 (br s, 6H), 1.39-1.32 (m, 1H), 0.85-0.79 (m, 1H), 0.67-0.61 (m, 1H), 0.55-0.51 (m, 1H), 0.34-0.29 (m, 1H); LRMS (ESI) m/e 356 [(M+H)+, C18H21N5O3として計算;計算値: 356];  保持時間 = 1.8分 (溶媒A:MeOH:H2O:TFA=10:90:0.1; 溶媒B:MeOH:H2O:TFA=90:10:0.1; 3分のランで0％B／A〜100％B／Aの直線グラジエント、および最後に1分のホールド時間,  λ = 280 nm)。
【００９０】
【化３７】
0005396474.tif 000038
(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル
純粋な(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-ヒドロキシ-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(2.3 g, 6.5 mmol)およびCsF(395 mg, 2.6 mmol)の混合液を、アセトニトリル(65 mL)に加えた。得られた懸濁液に、トリメチルシリル2,2-ジフルオロ-2-(フルオロスルホニル)アセテート(3.82 mL, 19.4 mmol)をゆっくりと加えた(細心の注意を払うこと!該試薬は皮膚障害をもたらし得るため、常にフード内で取り扱うべきである)。1時間後、LC-MS分析によって反応の完了が示された(所要の生成物への89％の変換)。揮発性物質を減圧エバポレートし、残渣をEtOAc(3 x 120 mL)およびH2O(〜100 mL)間に分配した。有機層を水(2 x 50 mL)および食塩水(50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。酢酸エチルを減圧エバポレートし、残渣をDMF(10 mL)中に溶解させた。該溶液を、MeCN:H2O(1:2)で平衡化したC18シリカゲルカラム(14 cm x 5 cm)にアプライした。該カラムを、33％ MeCN/H2O(500 mL)、45％ MeCN/H2O(500 mL)、60％ MeCN/H2O(1000 mL)、70％ MeCN/H2O(500 mL)で溶出した。個々の画分をLC-MSによって分析した(生成物は60％-70％ MeCN/H2Oの間に溶出する)。純粋な生成物を含む画分を合わせて、減圧濃縮し、純粋な(S)-4-(1-シクロプロピル-2-メトキシエチル)-6-(6-(ジフルオロメトキシ)-2,5-ジメチルピリジン-3-イルアミノ)-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-カルボニトリル(2.28 g, 87％収率)を淡黄色の固形物として得た: 1H NMR (CDCl3) δ 8.43 (s, 1 H); 8.01 (s, 1 H); 7.56 (s, 1 H); 7.49 (t, JH-F = 73.8 Hz, 1 H); 4.15 - 4.18 (m, 1 H); 3.76 (dd, JAB = 10.4, JAX = 5.2 Hz, 1 H); 3.68 (dd, JBA = 10.4, JBX = 3.1 Hz, 1 H); 3.37 (s, 3 H); 2.46 (s, 3 H); 2.30 (s, 3 H); 1.35-1.42 (m, 1 H); 0.82-0.88 (m, 1 H); 0.64-0.69 (m, 1 H); 0.53-0.58 (m, 1 H); 0.31-0.36 (m, 1 H);  13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 153.0, 151.5, 147.8, 143.8, 133.3, 129.4, 125.6, 119.1, 117.2, 114.8 (t, J = 256.1 Hz, 1 C), 107.6, 72.7, 62.6,  59.6, 20.0, 15.5, 11.4, 6.4, 4.2;  19F NMR (CDCl3) δ -88.73 (d); LRMS (ESI) m/e 406 [(M+H)+, C19H22N5O3F2として計算;計算値: 406]; 保持時間 = 2.7分(溶媒A:MeOH:H2O:TFA=10:90:0.1; 溶媒B:MeOH:H2O:TFA=90:10:0.1; 3分のランで40％B／A〜100％B／Aの直線グラジエント、および最後に1分のホールド時間, λ = 280 nm)。
【００９１】
本発明は上記の例示的な実施例に限定されず、そしてその本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態において具体化することができることが当業者には明白であろう。従って、実施例はあらゆる点で、制限するものではなく例示的なものとしてみなされ、上記の実施例に対してよりはむしろ添付の特許請求の範囲を参照すべきであり、従って、特許請求の範囲と同等の意味および範囲内となる全ての変更を包含することが望ましい。