(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）を人参及びふすまで構成された培地に接種するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の菌を培養するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の培養物をカットオフ（cutoff）１００ＫＤａの限外濾過膜（ultrafilteration）で精製するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）の精製物から酵素を分離するステップと、
（ｅ）人参、紅参、人参抽出物、または紅参抽出物に、前記ステップ（ｄ）の酵素を添加するステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）の添加物を発酵するステップと、
（ｇ）前記ステップ（ｆ）の発酵物を分離するステップと、
（ｈ）前記ステップ（ｇ）の上澄液を濃縮するステップと、
（ｉ）前記ステップ（ｈ）濃縮物をアセト酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、及び酒石酸からなる群から選択された一種以上の有機酸で反応するステップと、
（ｊ）前記ステップ（ｉ）反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥するステップと、を有し
ジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量を増加させた
ことを特徴とする加工人参または加工人参抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記（ａ）ステップのアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）接種が、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）胞子懸濁液の胞子数を培地重さｇ当たり５×１０５胞子になるようにする接種であり、初期水分含有量を５０〜８０％に維持する
請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記（ｃ）、（ｄ）ステップの酵素が、ベータ−グルコシダーゼとアルファラムノシダーゼが３：１から８：１重量比で生成される酵素である
請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記（ｅ）ステップの酵素添加が、前記ステップ（ｄ）の酵素を人参、紅参、人参抽出物または紅参抽出物の重さの５〜２０％添加である
請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記（ｉ）ステップで、前記有機酸濃度は前記ステップ（ｈ）の濃縮物に精製水を添加して１０％の濃縮物溶液に製造した後、前記濃縮物溶液を１〜５０％（ｗ／ｗ）にし、反応時間は２〜１８時間であり、反応温度は４０〜８０℃である
請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記（ｆ）ステップの発酵が、発酵温度２５〜６０℃で６〜２４時間の培養である
請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の製造方法により製造され、ジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量を増加させた
ことを特徴とする加工人参または加工人参抽出物。
【請求項８】
請求項７に記載のジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物を、有効性分として含有する
ことを特徴とする抗癌補助剤組成物。
【請求項９】
前記抗癌補助剤組成物が抗癌剤と併用されるものである
請求項８に記載の薬学組成物。
【請求項１０】
前記抗癌剤が、シスプラチン、カルボプラチン、パラプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ドキソルビシン、タキソール、タムオキシフェン、カムトベル、アドルシル、グリベック、エトフォシド、ゾメタ、オンコビン、ルプロン、ゲムザ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカンからなる群から選択された一種以上のものである
請求項９に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて、微量のジンセノサイド成分が増加した新規な加工人参または加工人参抽出物の製造方法、及び、これから製造された加工人参抽出物を含む抗癌補助剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人参は植物分類学上、五加皮科人参属に属する多年生宿根草であって、約１１種があり、高麗人参（Panax Ginseng C. A. Meyer）が代表的に薬効が優れるものと知られている。人参は、水蔘、白蔘、紅参、山蔘、長腦蔘、尾蔘、元蔘などを全て含む最も広い概念である。人参は、中国などの漢方医学で非常に価値の高い医薬品として用いられてきた天産物素材であって、数多い医書に人参の薬効が収録されている。
しかしながら、実際に長い利用の歴史にもかかわらず臨床研究を通じた科学的な糾明は足りない状態である。それにもかかわらず、現代医学が紹介された今でも人参の人気が落ちることなく、健康機能食品のうちの不動の一位を占めていることは、長い間の臨床歴史が認める薬効を表し、副作用が少なく、安全度の高い生薬という理由であろう。
人参の主な機能性成分は植物界のさまざまなサポニンのうち、人参サポニンのみを特別に区分して命名したジンセノサイドと呼ばれる人参サポニンである。人参成分のうち、サポニンは、抗癌、抗アレルギー、抗炎症の他に、中枢抑制及び精神安定、鎮痛、記憶力改善、肝傷害保護、蛋白質及び脂質合成促進、抗糖尿、抗ストレス、抗酸化活性物質生成促進、免疫調節、血小板凝集抑制、抗老化作用などの薬理効能がある。
【０００３】
サポニンは置換基に結合された糖（glucose、arabinose、rhamnose）の種類と数によって多様なジンセノサイドに区分されるが、経口摂取後、生体消化酵素によりほとんど分解されず（非特許文献１）腸内細菌によって２０（Ｓ）−Ｏ−β−プロトパナキサジオール２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、及び２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオールに分解された後、吸収される（非特許文献２）。
しかしながら、腸内微生物の構成は個人差が大きいので、サポニンの吸収は個人差によって変わることがある。
【０００４】
一方、現在知られたところによれば、人参の薬理効能を表す主成分であるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、及びＲｃなどのサポニンが知られている。
しかしながら、実質的に抗癌作用または癌細胞の転移を抑制、または抗アレルギー作用に関する成分は、人参が極少量含まれていているコンパウンドＫ（ｃｏｍｐ  Ｋ）、ジンセノサイドＲｈ１、Ｒｈ２、Ｒｇ３のサポニンであることと知られている。置換基にグルコースが一分子結合されたジンセノサイドＲｈ２、コンパウンドＫは、抗癌、抗アレルギー、抗炎症効果に優れると共に、糖鎖の結合が多くないで親水性が低いので腸内吸着及び吸収率に優れる。したがって、人参の抗癌作用、抗アレルギー作用及び免疫増強作用などのための使用のためには、上記人参に全く含まれていないとか、極少量含まれていているコンパウンドＫ、ジンセノサイドＲｈ２、Ｒｈ１、Ｒｇ３などのサポニン成分の含有量を増加させて使用することが好ましい。
【０００５】
最近、人参に全く含まれていていないとか、極少量含まれていている人参有効性分（ジンセノサイド）の含有量の増加と体内吸収の容易性のために、微生物を用いて人参を発酵する方法、人参に酵素を処理する方法、または人参を酸加水分解する方法などが試みられている。
例えば、硫酸または塩酸を用いて吸収されやすい酸糖化人参を作る方法（特許文献１）、超高圧を用いた人参の有効性分を増大させ、紅参の特異的なジンセノサイドを含有する人参加工方法（特許文献２）、人参または紅参にキムチ乳酸菌を接種し、有機酸を処理する段階を含む発酵人参または発酵紅参の製造方法（特許文献３）、人参をアスペルギルスで発酵した後、澱粉分解酵素及び蛋白質分解酵素に分解することを特徴とする機能性及び官能性に優れる人参発酵液の製造方法（特許文献４）、ラクトバチラスカゼイハセガワ菌株で人参の内の配糖体成分を分解して得た分解物を含む発酵人参（特許文献５）、多様なラクトバチラス菌株で人参を発酵してサポニン分解物を含む発酵人参（特許文献６）などが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許出願第２０００−５８９９７号
【特許文献２】韓国特許公開第２００３−８７２５０号
【特許文献３】韓国特許公開第２００６−１８３４号
【特許文献４】韓国特許公開第２００３−６１７５６号
【特許文献５】韓国特許公開第２００６−７４９７０号
【特許文献６】韓国特許公開第１９９８−４０２２４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hasegawa, H. et al., Microbial Ecololgy in Health and Disease、12、85-91、2000
【非特許文献２】Hasegawa, H. et al., Planta Medica, 62, 453-457, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように人参に全く含まれていないとか、極少量含まれていている人参ジンセノサイドの含有量の増加と体内吸収の容易性のために微生物を用いて人参を発酵する方法、人参に酵素を処理する方法、または人参を酸加水分解する方法などが試みられているが、今まで高付加価値の人参製品を開発生産できない惜しみがある。これは、特定成分を強化するために高エネルギーを使用して量産するに当たって、効率性の問題、さまざまな微生物で発酵する場合、標準有効性分の含有量が一定に生産できないという問題点などがある。
【０００９】
本発明の目的は、人参のジンセノサイド組成を変化させることにある。
【００１０】
本発明の更に他の目的は、人参のジンセノサイドのうち、Ｒｇ３及びＲｈ２の含有量を高めることにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、人参内の有効成分を効果的に抽出し出す方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、ジンセノサイド含有量、好ましくはＲｇ３及びＲｈ２成分の高い人参抽出物及びこれを含む抗癌補助剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造方法は、（ａ）アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）を人参及びふすまで構成された培地に接種するステップ、（ｂ）上記ステップ（ａ）の菌を培養するステップ、（ｃ）上記ステップ（ｂ）の培養物を精製するステップ、（ｄ）上記ステップ（ｃ）の精製物から酵素を分離するステップ、（ｅ）人参または紅参に上記ステップ（ｄ）の酵素を添加するステップ、（ｆ）上記ステップ（ｅ）の添加物を発酵するステップ、（ｇ）上記ステップ（ｆ）の発酵物を分離するステップ、（ｈ）上記ステップ（ｇ）の上澄液を濃縮するステップ;（ｉ）上記ステップ（ｈ）の濃縮物を有機酸で反応するステップ、及び（ｊ）上記ステップ（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥するステップを含む加工人参または加工人参抽出物の製造方法である。
【００１４】
本発明の更に他の態様によれば、（ａ）アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）を人参及びふすまで構成された培地に接種するステップ、（ｂ）上記ステップ（ａ）の菌を培養するステップ、（ｃ）上記ステップ（ｂ）の培養物を精製するステップ、（ｄ）上記ステップ（ｃ）の精製物から酵素を分離するステップ、（ｅ）人参または紅参に上記ステップ（ｄ）の酵素を添加するステップ、（ｆ）上記ステップ（ｅ）の添加物を発酵するステップ、（ｇ）上記ステップ（ｆ）の発酵物を分離するステップ、（ｈ）上記ステップ（ｇ）の上澄液を濃縮するステップ、（ｉ）上記ステップ（ｈ）の濃縮物を有機酸反応するステップ、及び（ｊ）上記ステップ（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥するステップを含むジンセノサイドの含有量、より好ましくはＲｇ３及びＲｈ２含有量を増加させることを特徴とする。
【００１５】
本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造に使われる人参の原産地は特別に限定されず、例えば、国内産、米国産、日本、ヒマラヤ、ベトナム、及び中国産を全て使用することができ、紅参の場合、紅尾参と紅参根を使用することができる。
【００１６】
また、本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造に使われる人参の形態は、人参または紅参、人参または紅参の抽出粉末、及びエキス形態でありうる。上記抽出物は、熱水抽出法、酒精抽出法、及び混合抽出法により製造できる。上記において、人参または紅参の粉末化程度は特別に限定されず、例えば、人参または紅参抽出粉末の粉末化程度は粒子サイズが３０〜１５０ｍｅｓｈ位になるようにすることができる。上記エキスは減圧蒸留法や薄膜蒸留法により製造することができる。
【００１７】
本発明で使われる上記人参は、人参の根、葉、及び幹のうちから選択されたものであることがあり、紅参は紅尾参及び紅参根のうちから選択されたものを使用することができる。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
上記（ａ）ステップで使われた菌はアスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）であって、生物資源センターから分譲されたＡＣＴＣ６９８５である。上記（ａ）ステップの培地は人参粉末とふすまが１：１〜１：５重量比（ｇ／ｇ）、好ましくは１：３割合が維持できるように培地割合を合せた後、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）を接種する。アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）接種は、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）胞子懸濁液の胞子数が培地ｇ当たり５×１０５胞子数になるように接種し、初期水分含有量を５０〜８０％に維持し、好ましくは６５％を維持する。
【００２０】
上記（ｂ）ステップで、培養温度は２５〜４０℃に、好ましくは３０℃に維持し、培養時間は３〜７日間培養する時、サポニン分解酵素の生産量が最高潮に達した。
【００２１】
上記（ｃ）と（ｄ）ステップは、菌株の培養が終われば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加した後、培地をワットマンガラスマイクロファイバーフィルタ（Watman  glass  microfiber  filter）で濾過した後、胞子を完全に除去するために、酵素が含まれた０．２２μｍボトルトップフィルタ（bottle  top  filter）でまた一度濾過してくれた。集められた濾過液は限外濾過膜（ultrafilteration）を実施して混合酵素液を精製し、この時に使われた濾過膜のカットオフ（cutoff）は１００ＫＤａであった。このように得られた濃縮された精製サポニン分解酵素液で人参または紅参を発酵することもでき、または精製された酵素液に酒精などを添加してサポニン分解酵素を分離することができる。即ち、精製されたサポニン分解酵素液に酒精を添加して蛋白質を沈殿させてサポニン分解酵素を塊りにて得ることができ、または酵素液をそのまま凍結乾燥して粉末でも得ることができる。
【００２２】
上記（ｅ）と（ｆ）ステップで使われた人参または紅参は前述した人参または紅参粉末、人参または紅参抽出エキス、または濃縮粉末に上記サポニン分解酵素を人参または紅参粉末、人参または紅参抽出エキスまたは濃縮粉末重量の５〜２０％を添加した後、適当な発酵温度２５〜６０℃、好ましくは３０〜３５℃で６〜２４時間の間培養し、好ましくは人参または紅参エキス１ｋｇを３０Ｌの水を入れて懸濁した後、５０ｇの酵素を添加する。
【００２３】
上記（ｇ）ステップで、人参または紅参の発酵物に酒精を添加してサポニン分解酵素を沈殿して濾過（濾過紙０．８μｍ）または遠心分離してサポニン分解酵素を分離し、上澄液のみ集めて５０℃で濃縮する。
【００２４】
上記（ｉ）ステップで発酵された人参または紅参に有機酸を添加し、４０〜８０℃で２〜１８時間の間反応させる。上記の有機酸には特別に限定されるものではないが、アセト酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、及び酒石酸など、またはこれらの混合物を使用することができ、有機酸はステップ（ｈ）濃縮物に精製水を添加して１０％濃度の濃縮物溶液に製造した後、製造された濃縮物溶液の１〜５０％（ｗ/ｗ）濃度で、好ましくは５〜２５％（ｗ/ｗ）濃度で有機酸を添加する。
【００２５】
上記（ｈ）と（ｊ）ステップで、有機酸反応物の中和時、水または食品添加物である酸中和剤の使用が可能である。そして、有機酸反応物の濃縮は５０℃で進行し、水または酒精を添加した後に濾過して濃縮することができ、有機酸反応物を一般的な精製過程であるレジン（resin）及び溶媒分画、即ちブタノールやエチルアセテートなどを使用して精製した後、濃縮を進行することもできる。
【００２６】
また、本発明の製造方法により製造されたジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物は、従来の臨床で使用している抗癌剤と併用して使用時、上昇的な抗癌効果と共に抗癌剤により引き起こされる骨髄、血球細胞、肝または腎臓に対する毒性予防及び治療用薬学組成物及び抗癌補助剤を提供する。上記抗癌剤には、シスプラチン、カルボプラチン、パラプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ドキソルビシン、タキソール、タムオキシフェン、カムトベル、アドルシル、グリベック、エトフォシド、ゾメタ、オンコビン、ルプロン、ゲムザ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカンなどが該当する。
【００２７】
上記本発明の製造方法により製造されたジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物は、既存の抗癌剤１重量部に対して０．１ないし１０００重量部に併用して使用することが好ましい。その含有量が上記範囲内の場合には、既存の抗癌剤の上昇的抗癌効果と共に抗癌剤により引き起こされる毒性を効果的に減少させることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造方法を利用すれば、ジンセノサイドの含有量が格段に増加した人参または人参抽出物が得られる。
【００２９】
本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造方法を利用すれば、ジンセノサイドのうち、特にＲｇ３とＲｈ２が同時に含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物が得られる。
【００３０】
本発明では、サポニン分解酵素のみで発酵された人参と有機酸工程のみ実施した加工人参と本発明の方法により実施した加工人参のジンセノサイドＲｇ３とＲｈ２の含有量を比較した結果、サポニン分解酵素と有機酸工程のみ進行した加工人参よりサポニン分解酵素工程と有機酸工程とが共になされた加工人参がジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２含有量が格段に高いことを確認することができる（表１）。
【００３１】
一方、上記サポニン分解酵素はアスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）を人参とふすま培地で培養して得た酵素であって、上記技術は酵素で人参サポニン糖基を変化させて稀少な人参サポニンを製造する方法（韓国特許公開１０−１９９９−４５１８０号）などに既に公知された技術である。また、黴はβ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）、α−アラビノシダーゼ（α-arabinosidase）、α−ラムノシダーゼ（α-rhamnosidase）の活性が高く、その他にプロテアーゼ（protease）、セルロース（cellulose）等、人参または紅参のような参を発酵させることに助けになる酵素を分泌することと知られている。
しかしながら、従来の技術は人参または紅参を発酵する場合、ジンセノサイド成分が一定に変化されないで発酵されたジンセノサイド成分が一定に生産されないという短所がある。
【００３２】
ここに、本発明ではアスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）で培養後、限外濾過膜（ultrafilteration）を実施した酵素からベータ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）、アルファ−ラムノシダーゼ（α-rhamnosidase）があることを確認し、またベータ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）、アルファ−ラムノシダーゼ（α-rhamnosidase）が重量費比（ｇ／ｇ）で３：１から８：１で混合された酵素であり、酵素活性度（activity）が限外濾過膜の実施前より２倍以上向上したことを確認した。限外濾過膜の透過酵素２と透過しない酵素１の活性をＴＬＣで確認した結果、限外濾過膜の透過酵素の場合、Ｆ２を生成して有機酸反応によりＲｈ２に転換されたが、限外濾過膜が透過しない酵素は化合物Ｋ（ｃｏｍ  Ｋ）をより多く生成してＲｈ２に転換される量が少ないことを確認した後、本発明を完成させた（図４）。
【００３３】
即ち、本発明はアスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）から発現された混合酵素物でジンセノサイドＲｈ２がより多く発現できる酵素を精製する方法により酵素の活性度が高まり、ベータ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）とアルファ−ラムノシダーゼ（α-rhamnosidase）の割合が一定のサポニン分解酵素を生産することによって、ジンセノサイド成分の変化調節が可能であるので、標準化した加工人参または加工人参抽出物の生産が可能になった。これによって、本発明はジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２が同時に増加し、一定の量のＲｇ３とＲｈ２が含まれた加工人参または加工人参抽出物を製造できる標準製造方法を提供して、従来の技術の問題点である発酵に従うジンセノサイドの変化率を予測できなかった問題点を解決しながらＲｇ３とＲｈ２が同時に増加した加工人参または紅参を製造することができる。
【００３４】
また、それぞれのサポニン分解酵素を精製して使用する場合、酵素精製時間及び費用がたくさん発生する問題点があるが、本発明はサポニン分解酵素の一定の割合生産が可能であり、精製段階が簡便であるので量産が容易で、かつ精製歩留まりが高いので生産コストも低めることができる効果がある。また、さまざまな微生物で混合して発酵する場合、他の微生物との交差汚染の問題点があるが、本発明は単一黴菌であるアスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）を使用して交差汚染を防ぐことができる。
【００３５】
また、本発明は人参または紅参を発酵させるためにサポニン分解酵素を生産し、これを使用して人参または紅参を発酵させた後、有機酸を添加して加水分解する過程を経て発明を完成するようになった。これと関連した従来技術には、キムチ乳酸菌を用いた発酵人参または発酵紅参の製造方法（韓国特許出願１０−２００５−９４３１１号）により人参または紅参をキムチ乳酸菌で発酵し、有機酸処理して発酵人参または紅参を製造する方法を開示しているが、上記従来技術により製造された発酵人参または紅参にはＲｈ２がほとんど含まれていず、Ｒｇ３やはり少量含まれることを確認することができる（図５、６）。
【００３６】
ここに、本発明ではこのような問題点を解決してサポニン転換酵素を限外濾過膜で精製した後、人参または紅参を発酵するようにし、有機酸の添加によりＲｇ３とＲｈ２が同時に増加する加工人参または加工紅参製造方法を完成することができた。
【００３７】
本発明に従う加工人参または加工紅参抽出物は、好ましくは、加工人参にはジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２を０．０５％〜１％含有していて、加工人参抽出物のうち、人参濃縮液または紅参濃縮液を使用して製造された加工人参抽出物にはジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量が０．５〜５％、人参濃縮液粉末または紅参濃縮液粉末を使用して製造された加工人参抽出物にはジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量が０．５％〜３０％、その他、人参サポニンまたは紅参サポニン成分を精製して製造した人参加工抽出物にはジンセノサイドＲｇ３及びジンセノサイドＲｈ２の含有量が３０〜５０％の量で含有していることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明の製造方法により製造されたジンセノサイドＲｇ３及びＲｈ２の含有量が増加した加工人参または加工紅参抽出物は、従来の臨床で使用している抗癌剤と併用して使用時、上昇的な抗癌効果と共に、抗癌剤により引き起こされる骨髄、血球細胞、肝または腎臓に対する毒性予防効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】人参エキスの酵素反応物と有機酸反応物に従うサポニン成分変化スペクトル
【図２】標準品Ｒｅを本発明酵素で反応させた時、Ｒｇ１が生成されることが確認を通じてアルファ−ラムノシダーゼ（α-rhamnosidase）があることを確認することができるスペクトル
【図３】標準品Ｒｇ３を本発明酵素で反応させた時、Ｒｈ２が生成されることを確認を通じてベータ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）があることを確認することができるスペクトル
【図４】本発明（ｃ）、（ｄ）ステップの限外濾過膜の透過酵素２と透過しない酵素１の活性をＴＬＣで確認した結果、限外濾過膜の透過酵素の場合、Ｆ２を生成して有機酸反応によりＲｈ２に転換されたが、限外濾過膜を透過しない酵素は化合物Ｋ（Ｃｏｍ  Ｋ）をより多い生成してＲｈ２に転換される量が少ないことを確認する薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）
【図５】本発明と従来技術とのＲｇ３生成比較スペクトル
【図６】本発明と従来技術とのＲｈ２生成比較スペクトル
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の権利範囲はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１：人参を用いた加工人参の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。人参２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水を加えた後、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％の酒精を添加し濾過、濃縮して２００ｇの加工人参を得た。
【００４２】
（実施例２：人参濃縮液を用いた加工人参濃縮液の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種し、２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加し混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。人参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水の添加後、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％酒精を添加し濾過、濃縮して１９０ｇの加工人参濃縮液を得た。
【００４３】
（実施例３：人参濃縮液粉末を用いた加工人参濃縮液粉末の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種し、２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。人参濃縮液粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを添加し、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％酒精を添加し濾過、濃縮、乾燥して１９５ｇの加工人参濃縮液粉末を得た。
【００４４】
（実施例４：紅参を用いた加工紅参の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種し、２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。紅参２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加えて、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％酒精を添加し濾過、濃縮、乾燥して１９５ｇの加工紅参を得た。
【００４５】
（実施例５：紅参濃縮液を用いた加工紅参濃縮液の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種し、２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。紅参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加えて、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％酒精を添加し濾過、濃縮して１９０ｇの加工紅参濃縮液を得た。
【００４６】
（実施例６：紅参濃縮液粉末を用いた加工紅参濃縮液粉末の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種し、２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。紅参濃縮液粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加えて、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％酒精を添加し、濾過、濃縮、乾燥して１９５ｇの加工紅参濃縮液粉末を得た。
【００４７】
（実施例７：人参濃縮液粉末を用いた精製した加工人参抽出物の製造）
人参粉末２５０ｇ、ふすま７５０ｇを入れて、１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Aspergillus  niger）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種し、２８℃で７日間培養する。培養が完了すれば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜（１００ＫＤａ以上）を使用して濾過濃縮して酵素液６０ｇを得る。人参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水を加えて、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％酒精を添加し、濾過、濃縮、乾燥して１９５ｇの加工人参濃縮液粉末を得て、レジンを使用して精製して１０ｇの加工人参抽出物を得た。
【００４８】
（比較例１：サポニン分解酵素のみで発酵した加工人参濃縮液粉末の製造）
実施例３のように実験し、かつ酢酸溶液をいれる有機酸反応を除外して加工人参濃縮液粉末を得た。
【００４９】
（比較例２：有機酸のみで反応した加工人参濃縮液粉末の製造）
実施例３のように実験し、かつ酵素処理を除外して加工人参濃縮液粉末を得た。人参濃縮液粉末２００ｇに２Ｌの精製水を加えて、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間の間攪拌した。反応が完了すれば、７０％の酒精を添加し、濾過、濃縮、乾燥して１９５ｇの加工人参濃縮液粉末を得た。
【００５０】
（比較例３：精製しないサポニン分解酵素で反応した加工人参濃縮液粉末の製造）
実施例３のように実験し、かつ限外濾過膜透過工程で精製しないサポニン分解酵素と有機酸反応により加工人参濃縮液粉末を得た。
【００５１】
本発明に従う加工人参または加工人参抽出物のサポニン含有量の変化は、以下の表１に示した。
【００５２】
【表１】
0005614864.tif 000002
【００５３】
（実験例１：サポニン分解酵素の確認）
５００ｍｇの標準品Ｒｇ３と５０ｍｇの標準品Ｒｅ試料を各々２０ｍＭアセト酸ナトリウム緩衝溶液に入れて、本発明のサポニン分解酵素を２５ｍｇ添加した後、３２℃で２２時間恒温攪拌する。それぞれの酵素反応物にブタノールを入れて層分離した後、ブタノール層を濃縮した後、ＨＰＬＣで確認した。ＨＰＬＣ分析条件は、以下の通りである。
１）  機器：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ｎａｎｏｓｐａｃｅ  ＳＩ−２
２）  コラム：Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＵＧ８０  ４．６×１５０ｍｍ（５μｍ）
３）  流速：１．００ｍＬ／ｍｉｎ
４）  ＵＶ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２０３ｎｍ
５）  コラム温度：４０℃
６）  注入量：２０μＬ
７）  移動相：（1）Ｒｅ分析：２０％アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）
（2）Ｒｇ３分析：４０％アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と６０％アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を４０分間濃度勾配した。
【００５４】
実験の結果、標準品Ｒｅを本発明の酵素で反応させた時、Ｒｇ１が生成されることを確認することができ、これは本発明のサポニン分解酵素にアルファ−ラムノシダーゼ（α-rhamnosidase）があることを確認することができた。また、同一な実験として、Ｒｇ３の標準品で本発明の酵素と反応した時、Ｒｈ２が生成されることを確認することができ、これは本発明のサポニン分解酵素にベータグルコシダーゼが存在することを確認することができた（図２、３）。
【００５５】
（実験例２：サポニン分解酵素のＴＬＣ確認）
サポニン分解酵素を培養して限外濾過膜を通過した酵素２と通過しない酵素１を各々２５ｍｇを取って５０ｍｇの標準品Ｒｂ１と各々反応した後、ＴＬＣ結果を確認した。展開溶媒は、CHCl3：MeOH：H2O=７：２．５：０．５であり、発色試薬は５％硫酸−アニスアルデヒド（Anisaldehyde）溶液を製造して確認した（図４）。
【００５６】
（実験例３：サポニン分解酵素の割合決定）
本発明のサポニン分解酵素を重量対体積比で５０％となる硫酸アンモニウムを４℃で徐々に添加しながらよく攪拌してくれた。上記酵素液を１２０００ｘＧで３０分間遠心分離して沈殿物のみを集めて上記沈殿物を０．０１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶かし、同一緩衝溶液で透析した。この透析された酵素液をＤＥＡＥ−セルロース（cellulose）コラムを通過させて酵素がコラムに吸着されるようにし、０．０１ｍｏｌの塩化カリウムを入れて分離した。分離されたそれぞれの酵素分画のうち、酵素活性がある分画のみを確認して比較的精製されたベータ−グルコシダーゼとアルファ−ラムノシダーゼのみを収得して割合を定めた（表２）。
【００５７】
【表２】
0005614864.tif 000003
【００５８】
（実験例４：急性毒性試験）
実施例２で得た加工人参濃縮液を精製水に溶解させて各々１００、３００、５００ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにしてマウス投与用試料溶液とした。６週齢の健康な雌雄マウス（ＩＣＲ系）を使用して試料溶液投与前５時間絶食させた後、雄雌各々５頭ずつを１つの群にして試料投与量が各々０．５ｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ、及び２ｇ／ｋｇになるように試料溶液を１０ｍＬ／ｋｇずつ経口投与した。一方、対照群には同量の精製水のみを投与した。また、試験期間中には実験動物が飼料及び水を自由に摂取できるようにした。全ての実験動物に対して試料溶液に対して溶液投与直後、３０分間は継続的に、試験期間中には１日１回ずつ臨床症状を観察し、体重は投与直前と投与後１、３、７、及び１４日目に特定した。体重変化に対して対照群と投与群との差はstudents  t-testを使用して分析した。
【００５９】
試験期間の間、全体動物のうち、斃死した動物は１件も発生しなくて、白ねずみに対する加工人参抽出液の５０％致死量（ＬＤ５０）は２ｇ／ｋｇより大きいことと表れた。また、試料投与群は対照群と比較して試料投与により引き起こされたものと思われる症状が全く観察できなかったし、体重の差も全く表れなかった。さらに、観察期間の終了後、剖検時にも肉眼で臓器の異常は全く観察できなかった。以上の結果を総合して見ると、本発明による加工人参または加工紅参は非常に安全性に優れることか分かる。
【００６０】
（実験例５：抗癌補助剤組成物の製造及び効果）
実験動物は体重２０±２ｇの６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスをオリエント株式会社から供給を受けて、温度２３±１℃、相対湿度５５±１５％、及び１２時間間隔で明暗が調節される動物飼育室で飼育させ、一週間の間、飼料（株式会社オリエント）を自由に摂取させ順化させた後、肉眼的な症状を観察した。一週間の間順化させたＢａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスにＨＴ−２９（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）細胞を１００μlずつ横腹皮下に移植させた後、肉眼で観察した。腫瘍のサイズが２００mm3に到達したマウスをランダムにグループを分けた後、薬物投与を始めた。体重及び腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）は週２回測定し、腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）の測定はバーニヤカリパス（ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒｓ）を使用して長径（ｌｅｎｇｔｈ）と短径（ｗｉｄｔｈ）を測定した。測定した腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）は次のような数式により算出し、これを試験終了日まで一定に実施した。
＊Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ（mm3）＝ｌｘｗ２ｘ０．５
（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ＝腫瘍サイズ、ｌ＝長径、ｗ＝短径）
【００６１】
全ての実施例、比較例、及びさまざまな人参関連濃縮液は、１００ｍｇ／ｋｇＢＷの容量で蒸溜水（ＤＷ）に希釈して調製した後、経口投与針（sonde）を使用して経口に強制投与した。投与容量は投与当日に測定した体重に従って２００μｌ／２０ｇ投与するように算出し、試験物質の投与時間は１日１回、午前１０時頃に一括的に投与した。ＦＯＬＦＯＸ療法は5-fluorouracil(5-FU)/leucovorin(LV)+Oxaliplatin(Ox)＝１６：５：１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの濃度で０．９％のＮａＣｌ溶液３ｍｇに溶かした後、測定した体重に従って１回／日で初期週５回腹腔投与した（以下の表３はＦＯＬＦＯＸ及び比較例投与方法及び投与容量を表した）。
【００６２】
【表３】
0005614864.tif 000004
【００６３】
マウスの犠牲前、内靜脈叢でヘパリン処理したキャピラリ（heparinized  capillary）（Chase  instruments  Co.）により採血してＥＤＴＡ（Ｋ３）が入っている試験管（Sherwood  medical  Co.）に取って、roll
mixerで混化した後、ＷＢＣ（white  blood  cell）、ＲＢＣ（red  blood  cell）、ＰＬＴ（platelet）をコールターカウンター（Coulter  counter）で測定した。コールターカウンター（Coulter  counter）は使用前に４Ｃplus液でＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＬＴ値を標準溶液に合うように補正した後、血液を分析した。また、心臓で分取した血液は直ちに３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して血清を得た。採取した血清を用いて直ちにＡＳＴ（aspartate  aminotransferase）、ＡＬＴ（alanine
aminotransferase）、血中尿素窒素（blood  urea  nitroden）、そしてクレアチニン（creatinine）は２４時間以内に定量した。以下の表４に、ＨＴ−２９大腸癌細胞株を異種移植したBalb/C  nude  miceでＦＯＬＦＯＸと本発明の加工人参抽出物の併用時、上昇的な抗癌効果を表した。
表４からわかるように、ＨＴ−２９大腸癌細胞株に異種移植したBalb/C  nude  miceでのＦＯＬＦＯＸと本発明の実施例などを投与した時の上昇的な併用効果を確認した。ＦＯＬＦＯＸ（５−Ｆｕ／ＬＶ＋Ｏｘ＝１６：５：１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）処理方法は、細胞を移植した後、腫瘍（tumor）のサイズ（volume）が２００mm3に到達した時、マウスをランダムにグループを分けて、初期５日間連続して腹腔投与した。薬物群は、一括的に１００ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの濃度で毎日口腔投与した。４週間投与した結果、ＦＯＬＦＯＸグループはコントロール（control）グループに比べて４２．７％の癌成長抑制率を表した。
これに反して、ＦＯＬＦＯＸと本発明の実施例を併用投与したグループである実施例２は、７４．６％、実施例３は８０．２％、実施例６は７７％に癌成長抑制率が上昇的に格段に増加したが、これは本発明の製造方法により製造されていない通常の人参濃縮液や人参濃縮液粉末、紅参濃縮液粉末を処理したグループ及び比較例２（５８．７％抑制）の条件に比べて格段に優れる抗癌効果を表した。
【００６４】
【表４】
0005614864.tif 000005
【００６５】
以下の表５は、ＨＴ−２９大腸癌細胞株を異種移植したBalb/C  nude  miceでＦＯＬＦＯＸと加工人参抽出物の併用時、血液生化学的分析結果を表したものであって、本実験では薬物などを４週間投与した後、血液生化学的分析を実施した。その結果、ＦＯＬＦＯＸ投与グループは、ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＬＴ全てコントロール（control）グループに比べて格段に劣ったことを確認することができた。それに反して、ＦＯＬＦＯＸと本発明の実施例を併用投与したグループでは、ＦＯＬＦＯＸにより劣った血液学的数値が回復する傾向を確認することができ、これは本発明の製造方法により製造されていない通常の人参濃縮液や人参濃縮液粉末、紅参濃縮液粉末を処理したグループと比較例２の回復率に比べて優れる血液生化学的数値の回復結果を表した。
【００６６】
【表５】
0005614864.tif 000006
【００６７】
以下の表６は、ＨＴ−２９大腸癌細胞株を異種移植したBalb/C  nude  miceでＦＯＬＦＯＸと加工人参抽出物の併用時、腎臓毒性及び肝毒性変化分析結果を表したものであって、本実験では薬物などを４週間投与した後、腎臓機能を評価する指標となるＢＵＮ（血中尿素窒素）、クレアチニン及び肝毒性指標であるＡＳＴとＡＬＴ分析を実施した。その結果、ＦＯＬＦＯＸグループはＢＵＮ、クレアチニン（Creatinine）、ＡＳＴ、及びＡＬＴ全てコントロール（control）グループに比べて留意的に増加して腎臓毒性及び肝の毒性が格段に増加したことを確認することができ、これに反して、ＦＯＬＦＯＸと実施例とを併用投与したグループでは、ＦＯＬＦＯＸにより高まった腎臓毒性及び肝毒性の数値がだいぶ回復する傾向を確認することができ、これは本発明の製造方法により製造されていない通常の人参濃縮液や人参濃縮液粉末、紅参濃縮液粉末を処理したグループと比較例２の回復率に比べて優れるに腎臓毒性及び肝毒性が回復する結果を確認することができた。
【００６８】
【表６】
0005614864.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００６９】
人参の薬理効能は多い研究を通じて明らかになっていて、製品開発も単純抽出あるいは加工方法から外れて人参を発酵と接続させた技術の以外に２０００年以後、多様な人参加工技術が続出した。しかしながら、このような多様な技術開発の努力にもかかわらず、高付加価値の人参製品は生産されていない。これは、量産するに当たって効率性の問題、標準化した生産方法確立の不足などを挙げることができる。人参の代表的な製品として、ドイツのベーリンガーインゲルハイムのファーマトンは人参の単純抽出工程により生産された製品であるにもかかわらず、年５００億ドル以上の売上げを上げているが、ファーマトンの場合、標準化した生産工程によりジンセノサイド成分が一定に含まれた製品を生産しているためである。
このように製品の標準化した生産方法は非常に重要であるが、本発明ではジンセノサイドＲｇ３とＲｈ２が同時に強化された加工人参または加工人参抽出物を標準化した生産工程により製造する方法を完成し、また、これから製造された加工人参または加工人参抽出物を含む抗癌補助剤組成物を提供して高付加価値の人参製品開発に応用できるようにしたため、産業上有用である。
【図１】
0005614864.tif 000008
【図２】
0005614864.tif 000009
【図３】
0005614864.tif 000010
【図４】
0005614864.tif 000011
【図５】
0005614864.tif 000012
【図６】
0005614864.tif 000013