(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ  Ｐ−１３０１であって、アルコール含有培地にて培養され、ＩＬ−１２の産生誘導能、ＩＦＮ−γの産生誘導能、およびＴＮＦ−αの産生誘導能を有することを特徴とする乳酸菌。
【請求項２】
請求項１記載の乳酸菌を含有することを特徴とする免疫増強作用を有する組成物。
【請求項３】
食品であることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項４】
医薬品であることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項５】
飼料であることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項６】
アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ  Ｐ−１３０１を、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地にて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能、ＩＦＮ−γの産生誘導能およびＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することを特徴とする乳酸菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、乳酸菌を含有する組成物および乳酸菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、各種の乳酸菌は免疫を向上させる効果を有することが明らかとなっている。この中で、アルコールを含む食品の中でワイン醪、漬け物、日本酒の生もとから分離された乳酸菌は免疫調整作用を有していることが知られている。特許文献１には、アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌が免疫増強作用を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２１１５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、アルコール耐性を有する乳酸菌は免疫増強作用を有することが知られている。発明者は、さらに優れた免疫増強作用を有する乳酸菌が得られないか鋭意検討した結果、アルコール耐性を有する乳酸菌を、アルコールを含有する培地で培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌が得られることに想到した。
【０００５】
すなわち、本発明は、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌、その組成物および乳酸菌の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ  Ｐ−１３０１であって、アルコール含有培地にて培養され、ＩＬ−１２の産生誘導能、ＩＦＮ−γの産生誘導能、およびＴＮＦ−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
この構成によれば、アルコール耐性を有する乳酸菌をアルコール含有培地で培養して得られた、ＩＬ−１２の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌である。
【０００８】
本発明の組成物は、前記アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を含有し、免疫増強作用を有する。これによれば、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌を利用した組成物である。
【０００９】
また、本発明の組成物は食品であることが好ましい。これによれば、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌を食品に含有させることができ、摂取して免疫を増強させることができる。
また、本発明の組成物は医薬品であることが好ましい。これによれば、乳酸菌の優れた免疫増強作用を利用した医薬品である。
また、本発明の組成物は飼料であることが好ましい。これによれば、飼育動物の餌に利用して、飼育動物の免疫を増強させることができる。
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌の培養方法は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ  Ｐ−１３０１を、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地にて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能、ＩＦＮ−γの産生誘導能およびＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌、その組成物、およびその乳酸菌の培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株を各アルコール濃度の培地で培養して菌体の増殖を測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３０１株を各アルコール濃度の培地で培養して菌体の増殖を測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施形態に係るみりん醪由来乳酸菌７株の各々について、脾臓細胞を用いたＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株について、脾臓細胞を用いたＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株について、脾臓細胞を用いたＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株について、脾臓細胞を用いたＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株を経口摂取したマウスのＩＬ−１２産生細胞割合を測定した結果を示すグラフである。
【図８】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株を経口摂取したマウスのＩＦＮ−γ産生細胞割合を測定した結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株を経口摂取したマウスのＴＮＦ−α産生細胞割合を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施形態に係る乳酸菌ＡＰ−１３００株を経口摂取したマウスのＮＫ活性を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。
本実施形態に係る乳酸菌は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であって、アルコール含有培地にて培養され、ＩＬ−１２の産生誘導能を有することを特徴とする。さらに、ＩＦＮ−γの産生誘導能、ＴＮＦ−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
また、本実施形態に係る乳酸菌の培養方法は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地にて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらに、ＩＦＮ−γの産生誘導能、ＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。
【００１５】
アルコール耐性を有する乳酸菌としては、酒類の製造や漬け物製造等のアルコールを含む食品の製造に関連する乳酸菌が挙げられる。
【００１６】
本実施形態で用いるアルコール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であり、アルコールを含む食品から分離されたものである。本実施形態の乳酸菌は、アルコールを含む食品から分離された乳酸菌を、アルコールを含む培地を用いて培養して免疫増強作用を向上させたものである。
【００１７】
培養ではアルコール濃度５〜１０ｖｏｌ％の培地を用いて菌を増殖させることが好ましい。培地のアルコール濃度が５ｖｏｌ％より高くなると、アルコールを添加しないで単に培養したものと比べてＩＬ−１２の産生誘導能は向上して、免疫増強作用は高まる。また、培地のアルコール濃度が１０ｖｏｌ％よりも高いと、乳酸菌の増殖速度が低下し始めて得られる菌体量が少なくなる。さらに、培地のアルコール濃度が１５ｖｏｌ％よりも高いと乳酸菌が増殖し難くなり、効率的に菌体を得ることが困難となる。
【００１８】
培養用の培地は特に限定されないが、後記するみりん粕抽出液を用いて調製した培地を好適に用いることができる。培養温度は２５〜３０℃程度が好ましく、培養時間は、菌株や培地のアルコール濃度によっても相違するが、６０〜１００時間程度が好ましい。
【００１９】
これら乳酸菌を、上記のように、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地を用いて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらにＩＬ−１２に加えて、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。
【００２０】
特に発明者等は、みりん製造時の醪中から次の乳酸菌を分離し、この乳酸菌をアルコール含有培地にて培養した結果、優れた免疫増強作用を有することがわかった。すなわち、この乳酸菌は、真性火落菌であるラクトバチルス・フルクチボランスに属するＮＩＴＥ  Ｐ−１３００、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３０１であり、ＩＬ−１２の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を有する。
これらみりん醪中から分離されたアルコール耐性を有する乳酸菌は、酒類製造時に常在する乳酸菌で、これら乳酸菌の増殖によって酒類としては風味を損なうことから、「火入れ」と呼ばれる低温殺菌工程を経て流通されることが多い。しかし、「火入れ」法が用いられる以前は、これら乳酸菌およびその代謝物を含有した酒類を飲用していたと考えられることから、人に対して安全性は問題ない。
【００２１】
また、これら乳酸菌の少なくとも１種類を食品、飼料、医薬品、医薬部外品等に混入させることによって、免疫増強作用を有する組成物を提供することができる。例えば、ヨーグルト、パンなどの食品や乳酸菌飲料、アルコール飲料などの飲料、飼料には、乳酸菌をそのまま、あるいはカプセルなどに封入して所要量混入させるようにすればよい。また、医薬品、医薬部外品に用いる場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、コーティング剤等の製剤に用いる公知の補助剤を用いて製剤する。剤形としては、錠剤、カプセル剤、加硫剤等、任意である。さらに、食品製造過程で積極的に本件乳酸菌を培養してそのまま利用する方法もある。免疫増強作用を有する組成物を提供するためにこれら乳酸菌の少なくとも１種類を混入させる場合、これら乳酸菌は生菌、死菌、さらには磨砕や破砕等により処理物としてもかまわない。
【実施例】
【００２２】
［実施例１］
みりん醪中に生息する乳酸菌を分離し、アルコール含有培地で培養して得られた乳酸菌の免疫増強作用を調査した。
【００２３】
１．分離方法
みりん醪の希釈懸濁液を火落菌検出培地（日本醸造協会製、ＳＩ培地、アルコール濃度５〜１０ｖｏｌ％、ｐＨ５．０）に添加して２５〜３０℃で混釈培養し、生育してきたコロニーを釣菌した。さらにこれを寒天平板培地で培養を繰り返して純粋分離を行い、アルコール耐性を有する乳酸菌２２４株を得た。
【００２４】
２．同定試験
得られた菌株は生理的手法と分子生物学的手法によって火落性乳酸菌と真性火落菌の２タイプに類別した。さらに、同じ性状を持つ株が複数分離されていたことから、それぞれのタイプに特徴的な菌株を選定した。すなわち、真性火落菌の中から２株（ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株）、火落性乳酸菌の中から５株（ＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株）を選定し、同定試験を行った。
【００２５】
（１）生理的諸性質
乳酸菌実験マニュアルに従って、生理的諸性質を調べた結果を表１、表２に示す。ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株ついて、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陽性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産が認められ、ヘテロ発酵型であることが確認された。
ＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株について、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陰性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産は認められず、ホモ発酵型であることが確認された。
【００２６】
【表１】
0005413760.tif 000002
【００２７】
【表２】
0005413760.tif 000003
【００２８】
（２）１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列の解析
アルコール耐性を有する上記の菌株のうち、真性火落菌であるＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、基準株のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７４７株と相同率９９．８％であった。これらのことから、２菌株はラクトバチルス・フルクチボランスと同定された。この２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託し、受託番号はそれぞれＮＩＴＥ  Ｐ−１３００、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３０１である。
さらに、上記菌株のうち、火落性乳酸菌であるＹＭ−２０１株など５株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、基準株のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＮＢＲＣ１５８８９株と相同率９９．９％であった。このことから、ＹＭ−２０１株など５株は、ラクトバチルス・パラカゼイと同定された。
【００２９】
３．菌体の調製方法
（１）菌
みりん醪から分離・同定した上記菌株を用いた。
（２）乳酸菌の調製
［培地］
みりん粕４ｋｇに５倍量の水を加え、６０℃で１時間加熱・溶解した後に放冷し、濾過してみりん粕抽出液１５Ｌを得た。このみりん粕抽出液８５０ｍＬに、酵母エキス２０ｇ（オリエンタル酵母工業製）、メバロン酸０．００５ｇ（シグマ製）を加え、６Ｎ塩酸を用いてｐＨ５．０に調製した後、オートクレーブ殺菌した。アルコールとしてエタノールを用いた。オートクレーブ殺菌後のみりん粕抽出液に、培地中の最終エタノール濃度が０（エタノール無添加）、５、１０ｖｏｌ％、加えてＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株用については７、１５ｖｏｌ％となるようにエタノールを加えて１Ｌとしたものを培地（以下ＭＫＹ培地と記す）として用いた。
［培養］
各菌株をエタノール濃度０、５、７、１０、１５ｖｏｌ％の火落菌検出培地（日本醸造協会製、ＳＩ培地）に植菌し、３０℃で５〜７日間前培養を行った。次いで各エタノール濃度の火落菌検出培地で前培養した菌株の培養液を、火落菌検出培地と同じエタノール濃度となるエタノール濃度０、５、７、１０、１５ｖｏｌ％の各ＭＫＹ培地１Ｌに、ＯＤ６６０ｎｍ＝０．０１となるように添加した。３０℃で培養し、定常期初期の増殖段階まで培養した。なお、ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株の各条件での増殖状況は図１、図２に示した通りである。
［集菌、洗浄、殺菌、凍結乾燥］
ＭＫＹ培地で培養後の各培養液を４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を捨て集菌した。さらに、蒸留水を用いて２回洗浄し、最後に１０ｍＬの蒸留水に菌体を懸濁した後、常法通りオートクレーブ殺菌し、室温まで放冷後、凍結乾燥した。なお、得られた乾燥菌体重量は表３、表４に示した通りである。
【００３０】
【表３】
0005413760.tif 000004
【００３１】
【表４】
0005413760.tif 000005
【００３２】
表３より、火落性乳酸菌のラクトバチルス・パラカゼイであるＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株については、アルコール濃度０ｖｏｌ％で培養した方が５ｖｏｌ％で培養したものよりも乾燥菌体重量は多かった。また、アルコール濃度１０ｖｏｌ％では十分な菌体量を得ることができなかった。
火落性乳酸菌よりもアルコール耐性の強い真性火落菌のラクトバチルス・フルクチボランスであるＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株は、アルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養して得られた菌体量が他のアルコール濃度で得られたものよりも多かった。また、図１、図２から明らかなように、培地のアルコール濃度が１５ｖｏｌ％では増殖し難いため、培養時間をアルコール濃度１０ｖｏｌ％の２〜３倍（２００〜３００時間）に延長して試験に供するための菌体を確保した。
【００３３】
なお、ＭＫＹ培地はｐＨなどの影響により多少の沈殿物が生じる。この培地成分由来沈殿物の免疫活性への影響を確認するため、菌体を接種しない培地を同条件に置いて生じる沈殿物を、同様に洗浄して培地成分由来沈殿物（以下ＭＰと記す）として調製した。
【００３４】
４．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験方法
（１）マウス脾臓細胞による各種サイトカイン遺伝子発現に及ぼす影響
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６週齢、メス）より無菌的に脾臓を採取した。採取した脾臓は、常法に従い脾臓細胞浮遊液とした。この脾臓細胞浮遊液に上記の凍結乾燥した乳酸菌を終濃度１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で６時間培養した。ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量はリアルタイムＰＣＲ法により測定し、コントロールを１とした場合の相対発現量として活性の比較を行った。ここで、コントロールとは、凍結乾燥した乳酸菌を添加しないで、乳酸菌を添加した場合と同様に、脾臓細胞浮遊液を３７℃、６時間で処理したもののｍＲＮＡ発現量である。
【００３５】
［ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量］
図３より、ラクトバチルス・フルクチボランスに属するＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株に関して、アルコール濃度０ｖｏｌ％、５ｖｏｌ％の培地よりアルコール濃度１０ｖｏｌ％の培地で培養して得られた菌体の方が、ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量は増大した。さらに、ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株のＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量は、いずれのアルコール濃度に対するラクトバチルス・パラカゼイに属するＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株の発現量より多かった。
なお、培地成分由来沈殿物では、ｍＲＮＡ発現量の増大は認められなかった。
図４から明らかなように、ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株については、ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量はアルコール濃度による違いが認められた。アルコール濃度５〜１０ｖｏｌ％で培養して得られた菌体によるＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量はコントロールに対して１．７倍〜３．０倍と有意に増加した。しかし、アルコール濃度０ｖｏｌ％および１５ｖｏｌ％で培養して得られたものはコントロールとの違いは認められなかった。
【００３６】
［ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量］
図５、図６より、アルコール濃度０〜１５ｖｏｌ％で培養して得られた菌体によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量を検討した結果、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量はアルコール濃度による違いは認められず、コントロールに対して４０倍〜１４０倍と著しく増加した。同様にＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量も１０倍〜２０倍と著しく増加した。
【００３７】
この結果、ラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌（ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株）は、アルコール含有培地にて培養されることによって、免疫作用が増強された乳酸菌となった。
【００３８】
５．Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験方法
（１）動物試験方法
Ｂａｌｂ／ｃ  マウス（５週令，オス）を粉末飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業製）で
１週間の予備飼育後、ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与える群、粉末飼料にアルコール濃度０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群、および粉末飼料にアルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群の３群に分け、それぞれ２週間飼育した。なお、ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える２群については、菌体摂取量が１．０×１０９ｃｆｕ／マウス／日となるようにそれぞれ菌体を配合した。各群のマウスは５匹とし、飼料と飲料水は自由摂取とした。また、飼育環境の条件は、室温２３℃、１２時間の明暗周期とした。
【００３９】
（２）ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体の経口摂取が脾臓細胞に及ぼす影響
ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物およびＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与えた動物よりそれぞれ無菌的に脾臓細胞を採取した。採取した脾臓細胞は、ビオチン標識抗マウスＣＤ４９ｂモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＤＸ５，Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）、ビオチン標識抗マウスＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｍ１／７０，Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）、およびストレプトアビジン−ＰＥ／Ｃｙ５  （Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）を用いて標識した。細胞をビオチン標識した後、ＰＥ標識抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｃ１５．６、Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＸＭＧ１．２，Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＭＰ６−ＸＴ２２，Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）を用いて脾臓細胞内に産生されたサイトカインを標識した。ビオチン標識された細胞数およびＰＥ標識されたサイトカインを含む細胞数は、フローサイトメーターＧｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定し、脾臓細胞に占めるサイトカイン生産細胞割合を算出した。
【００４０】
（３）Ｙａｃ−１細胞に対する傷害試験（ＮＫ活性試験）
東北大学加齢医学研究所より譲渡されたＹａｃ−１細胞（２×１０７ｃｅｌｌ）を、ＰＫＨ−２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）用いて標識した。遠心分離により標識されたＹａｃ−１細胞を回収し、標識したＹａｃ−１浮遊液（５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ）と脾臓細胞浮遊液を、脾臓細胞：Ｙａｃ−１細胞＝２：１になるよう２４穴プレートに入れ、６時間培養した。細胞を回収し、７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ溶液を加えて死細胞を標識した。標識されたＹａｃ−１細胞数および二重染色されたＹａｃ−１死細胞数を、フローサイトメーターＧｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定し、標的細胞に占める死細胞の割合を算出した。
【００４１】
（４）Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験結果
（ａ）脾臓細胞に占めるサイトカイン産生細胞割合
図７、８、９より、アルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を投与した動物より採取したＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＬ−１２産生細胞割合は、ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物より採取したＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＬ−１２産生細胞割合よりも有意に増加した。同様にＣＤ４９ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生細胞割合は増加傾向を示し、ＴＮＦ−α産生細胞割合は有意に増加した。
【００４２】
（ｂ）ＮＫ細胞活性
Ｙａｃ−１死細胞割合は、マウス脾臓細胞のＹａｃ−１に対する細胞傷害性を表している。図１０より、アルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を投与した動物より採取した脾臓細胞のＮＫ活性は有意に上昇した。
【００４３】
（５）まとめ
動物試験に於けるサイトカイン産生細胞割合とＮＫ活性の結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で認められた結果を裏付けるように、アルコール含有培地で培養したラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌において優れた免疫増強作用が認められた。
【００４４】
［実施例２］乳酸菌含有組成物の製造
以下に示す製造例に基づいて乳酸菌含有組成物を製造した。
【００４５】
製造例１：乳酸菌を含有する医薬品
錠剤：
以下に示す方法により、乳酸菌を含有する医薬品（錠剤）を製造した。
ＡＰ−１３００株菌体末１００ｇを、乳糖２００ｇおよびステアリン酸マグネシウム２ｇと共に混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。
顆粒剤：
ＡＰ−１３００株菌体末１００ｇに、ステアリン酸マグネシウム２ｇを加え、圧縮、粉砕、製粒し、篩分して２０〜５０メッシュの顆粒剤を得た。
【００４６】
製造例２：乳酸菌を含有する各種飲食物
表５に示す組成にて、乳酸菌入りの、各種飲食品を製造した。なお、乾燥菌体を配合するものについては、「乳酸菌菌体末」と表記した。
【００４７】
【表５】
0005413760.tif 000006
【００４８】
製造例３：乳酸菌を含有する飲食物
表６に示す組成で蒸米に米麹、温水を加え、６０℃で５時間保温して甘酒を造り、これに１５容量％エタノールを加え、さらに、酸にてｐＨ５．５に調整した後、ＡＰ−１３００株をアルコール濃度１０ｖｏｌ％のＭＫＹ培地で３０℃、５日間培養した乳酸菌培養物を加え、他の微生物汚染を受けないように５日間熟成することにより、すっきりとした酸味を有するマッコリ風アルコール飲料を製造した。
【００４９】
【表６】
0005413760.tif 000007
【００５０】
製造例４：乳酸菌を含有する飼料
表７に示す組成にて、乳酸菌入りの飼料を製造した。
【００５１】
【表７】
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【００５２】
なお、いずれの製造例においても、ＡＰ−１３００株の代わりにＡＰ−１３０１株を用いてもよく、乳酸菌含有組成物の製造が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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