(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程と、
末梢血単核球の培養を行う工程と、
を含むことを特徴とする疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
【請求項２】
前記疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程は、培養開始初日に行われることを特徴とする請求項１に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
【請求項３】
前記アミノビスホスホネートが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
【請求項４】
前記疾病抗原が、がん抗原であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
【請求項５】
前記疾病抗原と前記アミノビスホスホネートを同時に添加することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療に有効な抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を同時に効率よく培養する技術に関する。更には、当該培養技術を用いて培養した細胞の医薬としての利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんをはじめとする難治性疾患の新たな治療法として、近年免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者本人の免疫細胞、特に白血球を取り出して活性化した上で再度患者本人に戻し、人工的に免疫力を強化するという治療方法である。患者本人の細胞を用いるため、従来の抗癌剤治療などと比べて格段に副作用が少ないという利点がある。【０００３】
現在、免疫細胞療法としては、体外でリンパ球をリンフォカインにより抗原非特異的に活性化し、体内に戻す活性化自己リンパ球療法がすでに普及しつつあるが、さらに強力な細胞傷害活性を持ち、病変を特異的に認識・傷害する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下ＣＴＬと記す）を利用した治療法の普及が望まれている。【０００４】
ここで、現在試みられているＣＴＬを利用した治療法としては、例えばがん抗原ペプチド等を直接患者に投与するという方法がとられているが、この場合、患者の免疫能が低下していることが多いため、そのＣＴＬ誘導能には改善の余地がある。そこで、抗原提示細胞、例えば樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ、以下ＤＣとも記す）等と抗原を接触させて、強力に抗原提示を行わせ、そのＤＣにより体内で疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導する樹状細胞ワクチン療法等がある【０００５】
以下、現在の疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導方法について、代表的なものをいくつか例示する。
例えば、非特許文献１及び２においては、特定疾病抗原のエピトープ等の９ｍｅｒペプチドを末梢血単核球に加えることにより、そこからＣＴＬの誘導を試みている。また、非特許文献３及び４では、末梢血単核球よりＤＣを得、そこに抗原ペプチドを添加させることで抗原提示機能を付与し、そのＤＣとともに末梢血リンパ球より分離したＣＤ８陽性Ｔ細胞を培養することで、該疾病抗原特異的なＣＴＬを誘導している。
更に、非特許文献５では、造血前駆細胞より得たＤＣと抗原ペプチドによるＤＣワクチンを行い、次いで単球由来のＤＣに抗原を加えたものと末梢血単核球より分離したＣＤ８陽性Ｔ細胞とを共培養することにより抗原特異的なＣＴＬを誘導している。【０００６】
上述した例において用いられていることでもわかる通り、樹状細胞は抗原提示細胞の中でもその抗原提示能力が高く、疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導能力が高いため、その技術開発が進められている。【０００７】
しかし、通常樹状細胞ワクチンのための樹状細胞を得るためには、ヒトの末梢血を採取し、そこから単球とよばれる細胞を分離し、ＩＬ−４やＧＭ−ＣＳＦなどを添加し、培養する必要がある。また、その工程は煩雑で、現在のところはその培養技術者の技術如何で培養細胞数やその機能も変わってしまうという問題がある。【０００８】
一方、非ペプチド抗原により活性化されるγδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞であるが、最近ではがん細胞に対してＭＨＣ非拘束性に細胞傷害活性（非特異的活性）を有することがわかり、このγδＴ細胞の有する強い抗腫瘍活性を利用した免疫療法の研究が行われている。【０００９】
γδＴ細胞は非ペプチド抗原を認識して活性化するため、非ペプチド抗原として例えば、アルキルアミンやビスホスホネートでγδＴ細胞を刺激し、活性化及び／又は増殖させることが可能であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで末梢血から分離したγδＴ細胞に非ペプチド抗原を認識させ活性化及び／又は増殖に関する研究がなされている（例えば、非特許文献６）。【００１０】
しかしながら、γδＴ細胞は通常、末梢血中に１〜５％しか存在しないので、少量の血液を採取してγδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させても治療に十分な純度及び細胞数を確保することができないといった問題がある。また、治療に十分な純度及び細胞数を確保するために患者からの採血量を多くすると、患者に多大な負担がかかるといった問題もある。【００１１】
また、特許文献１では、末梢血単核球にビスホスホネートを添加することで、γδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させる方法が開示されている。
このように、免疫細胞療法においては、より効果の高い細胞を培養・利用することが非常に重要であり、現在も多種多様な手法・技術の開発が行われている。【００１２】
更に、免疫細胞療法においては、現状一種類の細胞を主に培養し、それを治療に用いているが、上記のように、例えば疾病抗原特異的ＣＴＬはＭＨＣ拘束性に、例えばＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉに提示されたある抗原に対して特異的に目標とする細胞・組織を攻撃し、γδＴ細胞はＭＨＣ非拘束性に細胞や組織に攻撃を行うといった特性を考えれば、様々な細胞を混合して治療に用いれば良いと考えられる。【００１３】
しかしながら、実際には、複数種類の免疫細胞を培養して治療するには、その種類の数だけ培養工程を同時並行で行わなければならない。それぞれの細胞にとって適切な培養条件は異なっており、仮に一種類の細胞に合わせた従来の培養方法では、例えば疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を同時にしかも治療効果を有するだけの細胞数を効率よく培養することは非常に困難であり、そのような効果的な培養方法や誘導方法はいまだ完成されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００６／００６７２０
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２００２  Ｄｅｃ；５１(１１−１２)：６１４−２０．Ｅｐｕｂ２００２  Ｏｃｔ １８．
【非特許文献２】Ａｐｐｅｌｌａ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９５  Ｍａｒ  １；１５４(５)：２２５７−６５．
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｔａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０００  Ｊａｎ  １；９５(１)：２８６−９３．
【非特許文献４】Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２  Ａｕｇ；８(８)：２６２６−３１．
【非特許文献５】Ｐａｌｕｃｋａ  ＡＫ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００４Ｊｕｎ  ７；１９９(１１)：１５０３−１１．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｊｕｎ  １．
【非特許文献６】Ｆｕｍｉ  Ｍｉｙａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１；１６６（９）：５５０８−５５１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を一つの培養で同時に効率よく治療に効果があるだけの細胞数を誘導・培養することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、これらの課題を解決するべく様々な研究を行い、本発明を創出するに至った。本発明は以下の通りである。【００１８】
（１）末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程と、末梢血の培養を行う工程と、を含むことを特徴とする疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（２）前記疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程は、培養開始初日に行われることを特徴とする（１）に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（３）前記アミノビスホスホネートが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（１）または（２）に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（４）前記疾病抗原が、がん抗原であることを特徴とする（１）から（３）のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（５）前記疾病抗原と前記アミノビスホスホネートを同時に添加することを特徴とする（１）から（４）のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（６）（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬；（７）（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法。【００１９】
本発明者らは、研究により、アミノビスホスホネートにより活性化された末梢血中のγδＴ細胞が増殖し、これら活性化し増殖したγδＴ細胞がＡＰＣ（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ：抗原提示細胞）機能を発揮することにより疾病抗原を提示し、疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導をも促すということを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、従来の方法であれば、様々な工程を経て所望の細胞を得た後に培養を開始していた疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞の培養・誘導方法について、末梢血から細胞を分離することなく、一つの培養で疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞を同時に効率よく、しかも治療効果が優れた細胞数の多い細胞集団を得ることが可能となる。この誘導方法により得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の混合細胞集団は、医薬として従来の単一の免疫細胞を投与することによる治療よりも効果の高い治療を提供することが可能となる。【００２１】
特に、これまでＣＴＬを誘導するためには、（１）血液から単核球を分取し、（２）サイトカインを添加して樹状細胞を誘導し、（３）樹状細胞に抗原をパルスし、（４）抗原をパルスした樹状細胞とリンパ球を共培養し、ＣＴＬを誘導する、という工程が必要であった。しかし、本方法を用いれば樹状細胞を誘導する工程を省略することができるため、作業量を減らすことができ、また、コンタミネーションのリスクを低減することができ、更には、樹状細胞を誘導する期間（およそ７日間）を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について説明する。
＜第一の実施形態：本発明の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法＞
本発明の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法（以下、単に「本発明の誘導方法」とも言う）は、末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程と、末梢血の培養を行う工程とを含むことを特徴とする。【００２３】
従来であれば、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を、それぞれ治療に有効な程度の量を同一培養工程で得ることは非常に困難であったが、本発明の誘導方法では、上記工程を経ることで簡便かつ高効率に得ることが可能である。【００２４】
本発明の誘導方法では、末梢血中のγδＴ細胞がアミノビスホスホネートにより活性化され、増殖し、これら活性化し増殖したγδＴ細胞がＡＰＣ機能をも発揮して疾病抗原を提示し、疾病抗原特異的ＣＴＬが誘導される。さらに、ＡＰＣ機能を有したγδＴ細胞が単にＡＰＣとして活動するだけでなく、疾病抗原特異的ＣＴＬが増殖してもなお、γδＴ細胞自身も増殖を続け、どちらの細胞も治療に効果を有するだけの細胞数を得ることが可能となる。【００２５】
以下、本発明の誘導方法につき、具体的な手順を説明する。
１）採血により末梢血を得る。量としては１５〜２５ｍＬを必要とする。これだけの量を得られれば、好適に培養することが可能である。ただし、培養開始時に十分な末梢血量であればこの範囲に限らず、また、採血するドナーの負担が少ないようであれば、採血量が多くなるほど疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の回収細胞数は増加するので、より多くの採血量が好ましい。
２）例えば密度勾配遠心法により、末梢血単核球を得る。個数としては１５〜２５ｍＬの末梢血からはおおむね１〜２×１０７個の末梢血単核球を得ることができる。【００２６】
３）２）で得られたおよそ末梢血単核球を培養液ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下ＤＭＥＭという）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下ＩＭＥＭという）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。【００２７】
４）３）で得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。
５）フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が０．０５〜１００μＭ、好ましくは０．１〜３０μＭとなるようにアミノビスホスホネートを添加する。【００２８】
ここで、ビスホスホネートとはピロリン酸のアナログであり、ピロリン酸骨格のＰ−Ｏ−ＰのＯ（酸素原子）をＣ（炭素原子）で置換した化合物（Ｐ−Ｃ−Ｐ）である。一般的に骨粗鬆症の治療薬として用いられている。アミノビスホスホネートはビスホスホネートのうちＮ（窒素原子）を有する化合物をいう。例えば、本発明で用いられるアミノビスホスホネートとしては特に制限されないが、ＷＯ２００６／００６７２０及びＷＯ２００７／０２９６８９に開示されたアミノビスホスホネート等を用いることができる。具体的には、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物等が挙げられる。ここで、更に、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物では０．１〜１０μＭにすることが好ましい。ここでは例としてゾレドロン酸を５μＭ添加する。【００２９】
６）５）でアミノビスホスホネートを添加するときに、合わせて疾病抗原を添加する。ここで「疾病」とは、例えば、がんや感染症等である。がんとしては、特に制限されず、あらゆるがんを含み、例えば、治療困難であるがん等が挙げられる。感染症としては、例えば、エイズ、Ｂ型・Ｃ型肝炎等のウイルス感染症や、細胞感染、細菌感染、真菌感染、又は原虫による感染症が上げられる。
抗原の形態としては、ペプチドや、タンパクなど適宜用いることができる。また、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及びそれらの熱処理物等を使用することができる。
抗原としては、患者由来のもの（例えば、患者から外科手術によって摘出された腫瘍組織等）でも、合成したものでも良い。合成ペプチドを利用すれば、自己のがん組織等から採取したがん抗原を使用する場合と比べ、患者の負担を少なくすることができる。
添加する量は、ペプチドであれば０．０２〜２μｇ／ｍｌ程度添加すれば良い。例えば２μｇ／ｍｌを添加する。【００３０】
アミノビスホスホネートと疾病抗原を添加する順序は、特に制限はされず、同時に添加することも、どちらかを先に添加することも可能であるが、同時に添加することが好ましい。【００３１】
６）更に、上記培養液にＩＬ−２を濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加する。
７）ＩＬ−２を添加した後３４〜３８℃、より好ましくは３７℃で、２〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２存在下で培養する。この際、培養する細胞数に応じ、培養液を適宜添加する。更に、培養液の増加に伴い、ＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。【００３２】
８）更に、上記培養液に血清を０．１〜２０％添加する。血清として、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳという）、ＡＢ血清又は自己血漿等を使用してもよい。【００３３】
以上、培養期間としては７日間以上であれば高純度で疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞を含む細胞群が得られるが、更に細胞数を増やすには、１４日間程度培養することが好ましい。【００３４】
また、上記培養工程中、培養液に血漿を添加することが好ましい。添加時期としては、おおむね培養開始０〜１００時間の範囲内であれば良好に培養することが可能である。【００３５】
＜第二の実施形態：疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬＞
本発明の医薬は疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬であって、末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを培養開始時に添加して培養することにより得られる医薬である。【００３６】
従来の免疫細胞療法に用いられる細胞はその種類で単体、もしくは個別に培養したものを投与時に混合後もしくは同時に添加することにより複数種類の細胞を用いるものであった。【００３７】
しかし、本発明の医薬は本発明の誘導方法により同時に疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞とを培養することで得られるものであり、非常に簡便にかつ多くの細胞数を得ることができる。そのような医薬を用いた場合、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞との相乗効果により、従来の単一の免疫細胞を用いた場合よりも更に治療効果が高くなるという利点を有する。【００３８】
以下、具体的に本発明の医薬の説明を行う。
１）本発明の培養方法によって得られた細胞を遠心分離法等により回収する。
２）回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。【００３９】
３）洗浄後に得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団を遠心分離法等により回収し、医薬品として可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の医薬を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。
本発明の医薬に用いる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団の数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
４）ついで生理食塩水に懸濁して本発明の医薬を得る。本発明の医薬はがんや感染症を対象とした治療・予防剤として用いることができる。【００４０】
ここで、がんの治療・予防剤として使用する場合には、ＩＬ−２及びＩＬ−１２等のサイトカインと本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。【００４１】
更に、ウイルス感染症の治療・予防剤として使用する場合には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等と本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。【００４２】
５）投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、病変部に直接注入しても、また点滴として全身投与してもよい。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよい。【００４３】
＜第三の実施形態：疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法＞
本発明の治療・予防方法は末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを培養開始時に添加して培養することにより得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法である。【００４４】
以下、具体的に本発明の治療・予防の説明を行う。
１）本発明の培養方法によって得られた細胞を遠心分離法等により回収する。
２）回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。【００４５】
３）洗浄後に得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団を遠心分離法等により回収し、医薬品として可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の治療・予防方法に用いる細胞懸濁液を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。
本発明の治療・予防方法に用いる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団の数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
４）ついで生理食塩水に懸濁して細胞懸濁液を得る。【００４６】
ここで、がんの治療・予防を行う場合には、ＩＬ−２及びＩＬ−１２等のサイトカインと本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。【００４７】
更に、ウイルス感染症の治療・予防を行う場合には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等と本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。【００４８】
５）投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、病変部に直接注入しても、また点滴として全身投与してもよい。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよい。【００４９】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００５０】
本発明の培養・誘導方法
１）健常人ドナーから末梢血を４２ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
２）得られた末梢血単核球を、ＡＩＭ−Ｖに懸濁した。
３）６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、８×１０６／４ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ−２を１０００Ｕ／ｍＬ加え、更に、ゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））を５μＭ、ペプチドとしてＭａｒｔ−１（Ａ２７Ｌ、配列；ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を２μｇ／ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
４）更に培養開始後にＡＢ血清を１０％添加した。
５）細胞の増殖に応じて、ＩＬ−２を１０００Ｕ／ｍｌ含有するＡＩＭ−Ｖ、及び、ＡＢ血清を添加し１４日間培養した。
６）上述のとおり、７日間もしくは１４日間培養した後に得られた細胞群中の疾病抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合、またＴＣＲＶγ９を発現している細胞の割合を抗ＣＤ８抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  Ｍａｒｔ−１  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＢＬ）、抗ＴＣＲＶγ９抗体（ベックマン・コールター）、抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、を用いて、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（以下ＦＡＣＳという、Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ  ＡＤＣ，ベックマン・コールター）により測定した。測定により得られた値を以下に示す。【００５１】
【表１】
0005524056.tif 000002
【００５２】
【表２】
0005524056.tif 000003
【００５３】
【表３】
0005524056.tif 000004
【００５４】
【表４】
0005524056.tif 000005
【００５５】
以上の結果により、疾病抗原とアミノビスホスホネートを同時に添加し、培養することによって、疾病抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団を得られることが確認された。
【実施例２】
【００５６】
＜疾病抗原の添加がγδＴ細胞上のＣＤ５６発現率に及ぼす影響についての検討＞
以下の手順により疾病抗原の添加がγδＴ細胞上のＣＤ５６発現率に影響を与えないかを調べた。ＣＤ５６は神経系細胞接着分子（Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｎ−ＣＡＭ）のアイソフォームで、ＮＫ細胞のマーカーとして知られる接着因子である。γδＴ細胞の有する細胞傷害活性の指標となるマーカーの一つである。【００５７】
１）健常人ドナーから末梢血を８ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
２）得られた末梢血単核球を、ＡＩＭ−Ｖに懸濁した。
３）１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１．８×１０６／２．５ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ−２を１０００Ｕ／ｍＬ加え、更に、ゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ）を５μＭ、ペプチドとしてＭａｒｔ−１（Ａ２７Ｌ）を２μｇ／ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
４）更に培養開始後にＡＢ血清を１０％添加した。
５）細胞の増殖に応じて、ＩＬ−２を１０００Ｕ／ｍｌ含有するＡＩＭ−Ｖ、及び、ＡＢ血清を添加し最大１４日間培養した。
６）上述のとおり、最大１４日間培養した後に得られた細胞群中のＴＣＲＶγ９を発現している細胞の割合、またはＣＤ５６を発現している細胞の割合を抗ＴＣＲＶγ９抗体（ベックマン・コールター）、抗ＣＤ５６抗体（ベックマン・コールター）、抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、を用いて、ＦＡＣＳ（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ  ＡＤＣ、ベックマン・コールター）により測定した。測定により得られた値を表５に示す。【００５８】
【表５】
0005524056.tif 000006
【００５９】
表５に示した通り、疾病抗原を添加しなかった場合（−）と添加した場合（＋）とでγδＴ細胞の表面抗原の発現率に差は見られず、疾病抗原の添加は、γδＴ細胞のＣＤ５６発現率に大きな影響を及ぼさないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上説明したように、本発明の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法は、従来であれば疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の培養を別々に行っていたところ、一度の採血により、両方をそれぞれが治療効果を有する細胞数まで増殖・誘導させることを可能にするものである。これにより、疾病特異的・非特異的双方免疫細胞を同時かつ簡便に治療に用いることが可能となり、治療効果も向上するし、患者への負担も軽減することが可能となる。更に、培養工程を一つに集約することが可能となるため、培養コストなど経済的な面においても、その効果を享受することができる。