(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）内耳および／または中耳における耳障害に関連したヒト標的遺伝子の発現を阻害する、治療に有効な量の少なくとも１個のオリゴヌクレオチド化合物と；
（ｂ）０．１％〜３０％（v/v）のグリセロールと；
（ｃ）少なくとも１個の薬学的に許容可能な賦形剤もしくは担体、またはそれらの混合物と、
を含む局所的非侵襲的投与用に製剤化された耳用医薬組成物。
【請求項２】
前記標的遺伝子がＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＩＤ３のうちの１つ又は複数から選択される、請求項１に記載の耳用医薬組成物。
【請求項３】
グリセロールを最終濃度で前記組成物の５体積％〜２５体積％含む、請求項１または２に記載の耳用医薬組成物。
【請求項４】
グリセロールを前記組成物の７体積％〜１３体積％の最終濃度で含む、請求項３に記載の耳用医薬組成物。
【請求項５】
グリセロールを前記組成物の１０％（v/v）の最終濃度で含む、請求項４に記載の耳用医薬組成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド化合物がアンチセンス、非修飾ｓｉＲＮＡ、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ｄｓＲＮＡまたはＤＮＡ化合物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の耳用医薬組成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチド化合物が化学的に修飾されたｓｉＲＮＡであって、以下に示される構造：
５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ            ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’  （センス鎖）
を有し、
ここで、前記ＮとＮ’が、それぞれ修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチドであるか、または非定型的部分であり；
前記（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
前記ＺとＺ’は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合している１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
前記ｚ”は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合しているキャッピング部分であり；
前記ｘとｙがそれぞれ独立して１８〜４０の整数であり；
前記（Ｎ’）ｙ配列が（Ｎ）ｘ配列に実質的に相補的であり；
前記（Ｎ）ｘが耳障害に関連する標的遺伝子のｍＲＮＡ中の１８〜４０個の連続するリボヌクレオチドに実質的に相補的であるアンチセンス配列を含む、
請求項６に記載の耳用医薬組成物。
【請求項８】
０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの少なくとも１個のオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項１に記載の耳用医薬組成物。
【請求項９】
前記組成物が外耳道への滴下、沈着または噴霧用に製剤化された請求項１に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が点耳剤として製剤化された請求項９に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、耳障害治療のためのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１２】
前記耳障害が中耳障害および／または内耳障害から選択される、請求項１１に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１３】
耳障害を患うまたは耳障害の危険性がある対象を治療するために、
前記組成物は、対象の外耳道へ局所投与され、それにより対象の内耳および／または中耳障害に関連したヒト標的遺伝子の発現を低減させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１４】
前記耳障害が、聴力損失を含む、請求項１３に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１５】
前記聴力損失が中毒性聴力損失、音響誘発性聴力損失、または加齢関連聴力損失から選択される、請求項１４に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１６】
前記耳毒性物質がシスプラチンまたはシスプラチン類似体である、請求項１５に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１７】
前記聴力損失が、対象の耳における耳有毛細胞再生の誘導により治療可能である、請求項１４に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１８】
前記耳有毛細胞が外有毛細胞および／または内有毛細胞である、請求項１７に記載の耳用医薬組成物。
【請求項１９】
前記点耳剤が対象の耳への投与前に３５℃〜３８℃に昇温される、
請求項１０に記載の耳用医薬組成物。
【請求項２０】
前記点耳剤が対象の片耳へ投与される、請求項１９に記載の耳用医薬組成物。
【請求項２１】
前記点耳剤が対象の耳に５分間〜６０分間浸透することを可能にする、請求項２０に記載の耳用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質誘発性耳毒性、音響外傷および老人性難聴に起因する聴力損失；腫瘍ならびに微生物感染などの耳障害の治療に有用なオリゴヌクレオチド化合物（ｓｉＲＮＡなど）の耳の組成物ならびにそれを中耳および内耳へ送達するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの耳
耳は３つの主要構成部分、すなわち外耳、中耳、および内耳からなり、これらは共同で機能し、音波を神経インパルスに変換して脳へ移動させ、神経インパルスはそこで音として認識される。内耳は平衡維持にも役立つ。
【０００３】
中耳と内耳の解剖学的構造は当業者に周知である（例えば、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｏｒｇａｎｓ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ａｎｄｒｓ  Ｃｓｉｌｌａｇ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２００５），  ｐａｇｅｓ  １−８２（本明細書に参照により組み込まれる）を参照されたい）。簡単に述べると、中耳は、鼓膜と、空気で満たされた小さな空間（鼓膜と内耳を結ぶ、小骨として知られている３本の小さな骨の連なりを含む）からなる。
【０００４】
内耳（迷路）は聴覚器官である蝸牛と、平衡器官である前庭系からなる複雑な構造を持つ。前庭系は位置感覚を決定する球形嚢および卵形嚢と、平衡維持に役立つ三半規管からなる。
【０００５】
蝸牛にはコルチ器があり、このコルチ器は部分的に約２０，０００個の特殊な感覚細胞（「内耳有毛細胞」または「有毛細胞」と呼ばれる）からなる。これらの細胞は、蝸牛内液中へ伸びている極細の小突起（繊毛）を有する。音の振動は中耳の小骨から内耳の卵円窓へ伝わり、これらの液体と繊毛を振動させる。蝸牛の各所にある有毛細胞は異なる音の周波数に反応して振動し、その振動を神経インパルスに変換し、神経インパルスは脳に送られて処理および解釈される。内耳有毛細胞は内耳支持細胞に囲まれている。支持細胞は基底にあり、内耳の感覚有毛細胞を少なくとも部分的に囲んで物理的に支えている。支持細胞の代表例としては、内柱（柱細胞）、外柱（柱細胞）、内指節細胞、外指節細胞（ダイテルス）、Ｈｅｌｄ細胞、ヘンセン細胞、クラウディウス細胞、ベッチャー細胞、歯間細胞および聴歯（フシュケ）が挙げられる。
【０００６】
らせん神経節は、蝸牛から脳へ音の表現を送る神経細胞集団である。らせん神経節ニューロンの細胞体は蝸牛のらせん構造に見られ、中枢神経系の一部である。それらの樹状突起は有毛細胞基底とシナプス接触させ、それらの軸索は一緒に束になって第８脳神経（前庭蝸牛耳神経）の聴覚部分を形成する。
【０００７】
聴力損失
聴覚反射による防御作用があってもなお、大騒音は有毛細胞を損傷および破壊し得る。不可逆的な有毛細胞死は、有毛細胞において活性酸素種（ＲＯＳ）に関与する代謝的または生化学的変化によって誘発される。とりわけ、特定の薬物への曝露および大騒音への持続的曝露は、進行性損傷を引き起こし、最終的には耳鳴り（ｒｉｎｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｓ）（耳鳴り（ｔｉｎｎｉｔｕｓ））およびまたは聴力損失に至る。
【０００８】
後天性聴力損失は、有害な騒音レベルへの曝露、耳毒性薬（シスプラチンおよびアミノグリコシド系抗生物質など）への曝露および加齢などのいくつもの要因に惹起され得る。
【０００９】
国際公開特許第２００８／０５０３２９号（本発明の譲受人に付与）は、プロアポトーシス遺伝子発現に関連する疾患および障害を治療するためのｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物を含む組成物、ならびにそれらの使用方法に関する。米国特許出願第１１／６５５，６１０号（本発明の譲受人に付与）は、プロアポトーシス遺伝子（全般的に、特にｐ５３）を阻害することにより聴覚障害を治療する方法に関する。国際公開特許第２００５／１１９２５１号は難聴を治療する方法に関する。国際公開特許第２００５／０５５９２１号は耳障害治療のための発泡性組成物に関する。米国特許第７，０８７，５８１号は内耳性の疾患および障害を治療する方法に関する。
【００１０】
とりわけ、耳保護、化学防御および聴力回復に有効で、使用し易く、コンプライアンスの高い薬物療法が依然として真に必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、耳障害（中耳および内耳障害など）を治療するのに有用な医薬組成物および方法を提供する。本発明は耳障害を非侵襲的に治療する方法（標的遺伝子へのオリゴヌクレオチドの局所投与を含み、ここで阻害性オリゴヌクレオチドは局所的、非侵襲的適用用に製剤化される）を提供することにより、先行技術における特定の制限を克服する。この方法は、驚くべきことに、オリゴヌクレオチドのサイズを考慮し、従来のオリゴヌクレオチド送達のための鼓膜内注射の使用を考慮する。この方法は、しばしば有害な全身系副作用を伴う経口療法の使用に関連した制限も克服する。
【００１２】
１つの態様によると、本発明は、耳障害を呈するまたは耳障害の危険性がある対象を治療する方法を提供し、この方法は対象の外耳道へ医薬組成物（オリゴヌクレオチド阻害剤、浸透エンハンサーおよび薬学的に許容可能な賦形剤またはそれらの混合物を含む）を、対象を治療するのに有効な量で局所投与し、それにより対象の耳障害に関連した遺伝子の発現を低減することを含む。
【００１３】
様々な実施形態では、この浸透エンハンサーはポリオールである。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドはポリオールとの混合物中にある。いくつかの実施形態では、このポリオールはグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、またはマルチトールから選択される。１つの実施形態によると、このポリオールはグリセロールである。様々な実施形態では、グリセロールは約０．１％〜約３５％；約１％〜約３０％；約５％〜約２５％、好ましくは約１０％〜約２０％の最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のグリセロールの最終濃度は約２．５％、５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２２．５％、２５％、２７．５％または約３０％である。１つの好ましい実施形態では、医薬組成物中のグリセロールの最終濃度は約１０％である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、耳への適用前に対象の体温（約３５℃〜３８℃）に昇温される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の頭を一方に傾け、治療する耳を上向きにして外耳道に適用される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点耳剤用の容器（例えば点滴器（例えば、１０〜１００ｍＬ／点滴））または芯を用いて耳に適用される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、耳障害は、化学物質誘発性聴力損失；例えばとりわけシスプラチンおよびその類似体；アミノグリコシド系抗生物質、キニーネおよびその類似体；サリチル酸塩およびその類似体；ホスホジエステラーゼタイプ５（ＰＤＥ５）阻害剤またはループ利尿薬により誘発された聴力損失に関する。いくつかの実施形態では、この耳障害は騒音性聴力損失を指す。他の実施形態では、この耳障害は加齢関連聴力損失である。
【００１６】
様々な実施形態では、医薬組成物は点耳剤、耳クリーム剤、耳軟膏、耳発泡剤またはムースとして製剤化される。特定の好ましい実施形態では、医薬組成物は点耳剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、方法はオリゴヌクレオチドの対象の片耳への投与を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ｄｓＲＮＡまたはＤＮＡ化合物からなる群から選択される阻害性核酸化合物である。様々な好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００１８】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子内に存在する核酸配列に十分相同な配列を有する連続するヌクレオチドの、対象の遺伝子の発現を低減または阻害するのに十分な数を含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学的に合成および化学的に修飾されている。この修飾は塩基修飾、糖修飾、ヌクレオチド間結合修飾またはそれらの組み合わせを含む。
【００１９】
１つの実施形態では、本発明の方法および組成物は次の構造を有するｓｉＲＮＡ化合物を用いる：
５’          （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチドか、または非定型的部分であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ次のＮもしくはＮ’と共有結合により連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立してそれが存在する鎖の３’末端で共有結合している１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
式中ｚ”は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合しているキャッピング部分であり；
式中ｘとｙはそれぞれ独立して１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘ配列に実質的に相補的であり；ならびに式中（Ｎ）ｘは、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含むアンチセンス配列（Ｎ）ｘを含む。
【００２０】
様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾および非修飾リボヌクレオチドを含み、式中（Ｎ）ｘの３’末端のＮは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、３’末端で開始する少なくとも５個の交互の２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドと少なくとも９個の２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを併せて含み、残りのＮはそれぞれ非修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙは少なくとも１個の鏡像体ヌクレオチド、または２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結するヌクレオチドを含む。
【００２１】
追加の実施形態では、（Ｎ）ｘは、修飾リボヌクレオチドを交互の位置に含み、ここで５’末端と３’末端のＮはそれぞれそれらの糖残基で修飾されており、中央リボヌクレオチドは修飾されていない（例えば１９ｍｅｒ鎖１０位のリボヌクレオチドなど）。様々な実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのヌクレオチドには２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にある。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘの中央部にあるリボヌクレオチドは修飾されておらず、（Ｎ’）ｙの中央部にあるリボヌクレオチドは修飾された２’ＯＭｅ糖である。
【００２２】
すべての構造において、いくつかの実施形態では、それぞれ連続するＮまたはＮ’を連結する共有結合はリン酸ジエステル結合である。様々な実施形態では、すべての共有結合がリン酸ジエステル結合である。
【００２３】
様々な実施形態では、ｘ＝ｙであり、ｘとｙはそれぞれ１９、２０、２１、２２または２３である。いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝２１である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
【００２４】
上の構造の１つの実施形態では、（Ｎ’）ｙは、一端もしくは両端または末端から２番目に少なくとも１個の鏡像体ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは３’末端から２番目に１個の鏡像体ヌクレオチドを含む。１つの好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは１８位にＬ−デオキシリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、対象の内耳障害に関連したウイルス遺伝子、細菌遺伝子および哺乳類遺伝子から選択される標的遺伝子の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、この標的遺伝子は、標的遺伝子ｍＲＮＡのｇｉ番号が表１に示される哺乳類遺伝子である。
【００２５】
特定の実施形態では、標的遺伝子は：ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４（ＲＥＤＤ１）、ＤＤＩＴ４Ｌ（ＲＥＤＤ２）、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、およびＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ＫＩＰ）からなる群の１つ以上から選択される。
【００２６】
理論に束縛されるものではないが、便宜上、標的遺伝子は次の２群に分類される：Ｉ群標的遺伝子は耳保護に関し、ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４（ＲＥＤＤ１）、ＤＤＩＴ４Ｌ（ＲＥＤＤ２）、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３が挙げられ、ＩＩ群標的遺伝子は細胞の再生および増殖に関し、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、およびＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ＫＩＰ）が挙げられる。
【００２７】
様々な実施形態によると、本発明は、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、１つ以上の耳障害に関連した複数の標的遺伝子を阻害するための方法を提供する。
【００２８】
したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、本明細書でＩ群標的遺伝子と指定された標的遺伝子を２つ以上阻害することにより耳障害を呈する対象を治療することに関する。非限定的な例として、それぞれ次の標的遺伝子：少なくとも１個のＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＣＡＳＰ２およびＨＴＲＡ２を、任意にＣＡＰＮＳ１（カルパイン）との組み合わせ、任意に少なくとも１個のＮＯＸ３、ＮＯＸ４およびＲＡＣ１との組み合わせ、任意に少なくとも１個のＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４ＬおよびＩＤ３との組み合わせ、および任意に少なくとも１個のＨＲＫおよびＢＮＩＰ３との組み合わせに対するｓｉＲＮＡ化合物を対象に投与する。理論に縛られることなく、少なくとも１個のこれらの標的遺伝子の阻害は、中毒性聴力損失に対する保護に関連する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書でＩＩ群（少なくとも１個のＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３、任意に少なくとも１個のＨＥＳ１およびＨＥＳ５と併用）と指定した２個以上の標的遺伝子を阻害することにより耳障害を呈する対象を治療することに関する。理論に縛られることなく、少なくとも１個のこれらの標的遺伝子の阻害は、蝸牛の支持細胞または外有毛細胞もしくは内有毛細胞の増殖促進に関連している。
【００３０】
好ましい実施形態では、方法は、少なくとも１個のＨＥＳ１およびＨＥＳ５に対するオリゴヌクレオチドを投与前に少なくとも１個のＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３に対するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。別の実施形態では、すべてのオリゴヌクレオチドが併用投与される。
【００３１】
さらなる実施形態では、ある群の標的遺伝子に対するオリゴヌクレオチドは他群の標的遺伝子に対するオリゴヌクレオチドと連続投与される。例えば、Ｉ群遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、ＩＩ群遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの投与前に対象に投与される。別の実施形態では、Ｉ群遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＩＩ群遺伝子に対するｓｉＲＮＡと共に対象に投与される。様々な実施形態では、標的遺伝子は哺乳類遺伝子である。特定の実施形態では、哺乳類遺伝子はヒト遺伝子であり、このヒト遺伝子ｍＲＮＡ中のｇｉ番号を表１に示す。
【００３２】
第２の態様では、本発明は：（ａ）内耳性または中耳性耳障害に関連したヒト標的遺伝子の発現を阻害する、治療的有効量の少なくとも１個のオリゴヌクレオチド分子化合物、（ｂ）浸透エンハンサー；ならびに（ｃ）少なくとも１個の薬学的に許容可能な賦形剤もしくは担体またはそれらの混合物、を含む耳の医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、浸透エンハンサーはグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、キシリトールおよびマルチトールからなる群から選択されるポリオールである。
【００３３】
好ましい実施形態では、このポリオールはグリセロールである。様々な実施形態では、グリセロールは約０．１％〜約３５％；約１％〜約３０％；約５％〜約２５％、約７％〜約１５％、好ましくは約１０％〜約２０％の最終濃度で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のグリセロールの最終濃度は約２．５％、５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２２．５％、２５％、２７．５％または約３０％である。１つの好ましい実施形態では、医薬組成物におけるグリセロールの最終濃度は約１０％である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、組成物はヒトの耳、好ましくは外耳道への非侵襲的適用用に製剤化される。様々な実施形態では、組成物はクリーム、発泡剤、ムース、泥膏、軟膏、エマルション、溶液、ゲル、スプレー、懸濁液、マイクロエマルション、ミクロ球体、マイクロカプセル、ナノ球体、ナノ粒子、脂質小胞、リポソーム、重合体小胞、パッチ、生体挿入剤として製剤化される。
【００３５】
様々な実施形態では、医薬組成物は液体点耳剤、耳クリーム剤、耳軟膏、耳発泡剤またはムースとして製剤化される。好ましい実施形態では、医薬組成物は液体点耳剤として製剤化される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス、非修飾ｓｉＲＮＡ、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ｄｓＲＮＡまたはＤＮＡ化合物からなる群から選択される阻害性核酸化合物である。様々な好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００３７】
様々な実施形態では、このｓｉＲＮＡは安定性を増大し、活性を増大し、オフターゲット効果を減らし、およびまたは自然免疫刺激を減らすために化学的に修飾されている。組成物中のｓｉＲＮＡ濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、およびより好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬである。
【００３８】
好ましい実施形態では、標的遺伝子は１つ以上の：ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３から選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは中耳障害または内耳障害に関連した遺伝子の発現を軽減または阻害する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、本明細書に開示の構造（Ａ）〜（Ｐ）の１つを含む化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】点耳剤適用から３日後の、コルチ器の頂回転のらせん神経節（コルチ神経節）におけるＣｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡである。
【図２】コルチ器の基底回転、第２回転、頂回転すべての外聴覚細胞、内聴覚細胞および支持細胞の３列におけるＣｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡを示す。
【図３】点耳剤（潅流および非潅流）投与から３日後の切開したラット蝸牛の聴覚上皮のすべての部分における蛍光を示す。
【図４】本発明の実践に有用な特定の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ化合物調製に有用なアンチセンスとセンス配列を示す表Ａ１〜Ａ７を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、概して、中耳および内耳障害の場合の治療に有用な組成物および方法に関する。
【００４３】
本発明の遺伝子を阻害する方法、分子および組成物は本明細書で詳細に論じられ、任意の前記分子および／または組成物を任意の前記病態を呈する対象の治療において有益に使用してよい。
【００４４】
本発明の阻害性核酸は、好ましくは非修飾化合物と比較して活性を増大し、安定性を増大し、および／または毒性を最小限に抑え得る修飾を保持するｓｉＲＮＡ化合物である。これらの化合物は、中耳および内耳へ核酸を送達する製薬学的ビヒクルと混合時、種々の耳障害を治療するのに有用であり、有効、安全で患者のコンプライアンスの高い治療化合物を提供する。化合物は耳障害に関連した標的遺伝子の発現を予防または軽減するために設計されている。特定の実施形態では、標的遺伝子は表１に示すｍＲＮＡポリヌクレオチドの任意の１つに転写される。好ましい実施形態では、標的遺伝子は１つ以上の：ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１Ｂから選択される。
【００４５】
理論に束縛されるものではないが、標的遺伝子は２つの群、すなわち耳保護に関連した遺伝子に関するＩ群（ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３を包含する）と、内耳細胞再生に関連したＩＩ群（ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１Ｂを包含する）に分類される。一部の遺伝子では、明確な群説明はなく、本分類は便宜上としてのみ提示する。
【００４６】
いくつかの標的遺伝子の詳細を下表１に提示する。この一覧は代表的かつ非限定的であることを意図している。
表１：聴力損失を治療するためのヒト標的遺伝子の非限定的な例
【表１】
0005524189.tif 000002
表１は、上に示す特定の標的遺伝子ｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列のｇｉ（ＧｅｎｅＩｎｆｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）番号および寄託番号を提示する。
【００４７】
耳障害
本発明は、様々な耳障害を呈するまたは耳障害の危険性がある患者を治療するのに有用な組成物および方法に関する。耳障害としては、例えば耳毒性物質、過度の騒音または加齢に誘発された聴力損失が挙げられる。中耳および内耳障害は多くの同一症状を生じ、中耳障害は内耳に影響を及ぼし得、逆も同様である。
【００４８】
聴力損失の他の耳障害としては、種々のウイルスおよび細菌により惹起される鼓膜炎、鼓膜感染；側頭骨折（例えば頭の殴打による）；聴覚神経腫瘍（聴神経腫、聴神経鞘腫、前庭神経鞘腫、第８神経腫瘍）が挙げられる。
【００４９】
様々な実施形態では、本発明の方法および組成物は聴力損失の様々な病態を治療するのに有用である。理論に縛られることなく、聴力損失はアポトーシス内耳有毛細胞の損傷または消失に起因し得（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３．  １２０：１９１−２０５；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３（（２４）：８５９６−８６０７）、この損傷または消失は感染、機械的損傷、大きな音（騒音）、加齢（老人性難聴）、または化学物質誘発性耳毒性により惹起される。
【００５０】
本発明に関して、「耳毒性物質」とは、その化学的作用を通じて、聴覚に関連する神経系の音受容器構成成分の活性を傷つけ、損なわせ、または阻害し、続いて聴覚（および／または平衡覚）を損なわせる物質を意味する。本発明に関して、耳毒性には、内耳有毛細胞に対する有害作用が包含される。耳毒性物質としては、治療薬（抗腫瘍薬、サリチル酸塩、ループ利尿薬、キニーネ、およびアミノグリコシド系抗生物質など）、食物もしくは薬剤中の汚染物質、および環境もしくは産業汚染物質が挙げられる。典型的に、治療は耳毒性（特に治療薬投与に起因したまたは起因したと予想される）を予防または軽減するために実施される。好ましくは本発明の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を治療的有効量含む組成物は、耳毒性作用を予防または軽減するために曝露直後に投与される。より好ましくは、耳毒性医薬品または耳毒性物質への曝露の前または同時のいずれかに本発明の医薬組成物を投与することにより予防的に治療が提供される。
【００５１】
聴覚および平衡障害の詳細および診断に関するｃｈａｐｔｅｒｓ  １９６，  １９７，  １９８  ａｎｄ  １９９  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （１９８２），  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎ．Ｊ．  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｃｈａｐｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｒｅｃｅｎｔ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２０７  ａｎｄ  ２１０）が本明細書に参照により組み込まれる。
【００５２】
したがって、本発明の１つの態様は、哺乳動物（好ましくはヒト）の聴覚の障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または不均衡、好ましくは中毒性聴覚病態を予防、軽減、または治療するため、かかる治療が必要な哺乳動物に本発明の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を投与することによる治療方法および医薬組成物を提供する。本発明の１つの実施形態は、治療的有効量の耳毒性医薬品投与に起因する耳毒性である聴覚の障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を治療するための方法である。典型的な耳毒性薬は化学療法薬、例えば抗腫瘍薬、および抗生物質である。他の可能な候補としては、ループ利尿薬、キニーネもしくはキニーネ様化合物、ＰＤＥ５阻害剤およびサリチル酸塩もしくはサリチル酸様化合物が挙げられる。
【００５３】
耳毒性は、抗生物質投与の用量制限副作用である。１日当たり１ｇを１週間を越えて投与された患者の４〜１５％が測定可能な聴力損失を発現し、治療を継続すると、この聴力損失は徐々に悪化して完全な永久難聴に至り得る。耳毒性アミノグリコシド系抗生物質としては、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、ジベカシン、フォルチマイシン、およびジヒドロストレンプトマイシン、またはそれらの配合が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗生物質としては、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、およびゲンタマイシンＣ２、などが重篤な毒性（特に耳毒性および腎毒性）を有し、かかる抗菌剤の実用性を低下させることが知られている（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ６ｔｈ  ｅｄ．，  Ａ．  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ；  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．１１６９−７１  （１９８０）を参照されたい）。
【００５４】
耳毒性は抗癌剤の重篤な用量制限副作用でもある。耳毒性を有する腫瘍薬としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物ならびにタキソールおよびタキソール様化合物が挙げられるが、これらに限定されない。シスプラチン様化合物としては、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（商標登録））、テトラプラチン、オキサリプラチン、アロプラチンおよびトランスプラチン、とりわけ、および白金ベースの化学療法薬が挙げられる。
【００５５】
耳毒性副作用が知られている利尿薬、特に「ループ」利尿薬としては、フロセミド、エタクリン酸、および水銀剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
耳毒性キニーネとしては、典型的にはマラリア治療に用いられるキニーネの合成置換が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、聴覚障害は、ホスホジエステラーゼタイプ５（ＰＤＥ５）阻害剤（シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ（商標登録））、バルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ（商標登録））およびタダラフィル（Ｃｉａｌｉｓ）など）の副作用である。
【００５７】
サリチル酸塩（アスピリンなど）は、それらの抗炎症、鎮痛、解熱および抗血栓効果のために最も一般的に使用されている治療薬である。残念ながら、サリチル酸塩も耳毒性副作用を有する。それらはしばしば耳鳴り（ｔｉｎｎｉｔｕｓ）（「耳鳴り（ｒｉｎｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｓ）」）および一過性の聴力損失に至る。さらに、薬物を高用量で長期間使用すると、この聴覚障害は永久的かつ不可逆的になり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、アミノグリコシド系抗生物質の投与による哺乳動物の感染治療のための方法が提供され、この改善には、治療的有効量の１つ以上の、標的遺伝子の発現を下方制御する化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を、かかる治療が必要な対象に投与して抗生物質に関連した中毒性聴覚障害を軽減または予防することが含まれる。
【００５９】
本発明の方法および医薬組成物は、音響外傷または機械的外傷、好ましくは内耳有毛細胞消失に至る音響外傷または機械的外傷の治療にも有効である。より重度の曝露を伴うと、損傷は、隣接する支持細胞の消失からコルチ器の完全な崩壊へと進行し得る。感覚細胞の死は、進行性ワーラー変性および主要な聴覚神経線維の消失をもたらし得る。本発明の方法は、非常に大きな音への単回曝露により惹起されるもしくは８５デシベル超の大きな音に連日長期間曝露後の音響外傷を治療するため、機械的内耳性外傷（例えば、電子機器の内耳への挿入に起因する）を治療するため、または手術に関連した内耳有毛細胞損傷を予防もしくは最小限に抑えるために有用である。
【００６０】
別の種類の聴力損失は老人性難聴であり、これは大部分の個人において加齢に伴い徐々に発現する聴力損失である。６５〜７５歳の成人の約３０〜３５％および７５歳以上の人の４０〜５０％が聴力損失を経験する。本発明の方法は、老人性難聴に関連した内耳障害および聴覚障害の発現および／または重症度を予防、低減または治療するのに有用である。
【００６１】
定義
便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲で使用される特定の用語についてここに記載する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数形を含むことに留意されたい。
【００６３】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の代替の群に関して記載されている場合、本発明は、それによりその群の任意の個々の要素または要素の亜群についても記載されることを当業者は認識するであろう。
【００６４】
「ポリペプチド」とは、上に掲載した任意の遺伝子（スプライシング変異、アイソフォーム、オルソログ、またはパラログなど）によりコードされるアミノ酸配列を指す。
【００６５】
「阻害剤」とは、遺伝子の発現またはかかる遺伝子の生成物の活性を所望の生物学的または生理的作用を成し遂げるのに十分な程度低減できる化合物である。「阻害剤」という用語は本明細書で使用されるとき、１個以上のオリゴヌクレオチドまたは核酸（アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイムを包含する）を指す。阻害とは下方制御も指し得、ＲＮＡｉの場合、サイレンシングも指し得る。
【００６６】
「阻害する」という用語は、本明細書で使用されるとき、遺伝子の発現またはかかる遺伝子の生成物の活性を所望の生物学的または生理的作用を成し遂げるのに十分な程度低減することを指す。阻害は完全であっても部分的であってもよい。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、同義的に使用してよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。この用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体からできているＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を包含することも理解されるべきである。本願全体でｍＲＮＡ配列は対応遺伝子を示すものとして表される。「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」とｍＲＮＡという用語は同義的に使用される。
【００６８】
「オリゴヌクレオチド」もしくは「オリゴマー」とは、約２〜約１００個のヌクレオチド、好ましくは約１５〜約６０個、もしくは１８〜約２３個の１本鎖もしくは２本鎖のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド配列またはそれらのキメラを指す。オリゴヌクレオチドを構成するＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチドは、それぞれ独立して天然であっても合成されていてもよく、およびまたは修飾されていても修飾されていなくてもよい。修飾としては、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分およびまたはヌクレオチド間結合の変化が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ならびにそれらの組み合わせを含む１本鎖もしくは２本鎖化合物である。
【００６９】
「ヌクレオチド」または「ヌクレオチドモノマー」とは、天然であっても合成されていてもよく、およびまたは修飾されていても修飾されていなくてもよいデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。修飾としては、糖部分、塩基部分ならびに／またはヌクレオチド間結合の変化および置換が挙げられる。
【００７０】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの類似体または修飾は、前記類似体または修飾がこのヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に有害作用を実質的に及ぼさない限り、本発明に好ましく使用される。いくつかの実施形態では、化学修飾により、活性もしくは安定性が増大するか、またはオフターゲット効果もしくは自然免疫反応の誘発が低下する。許容可能な修飾としては、糖部分修飾、塩基部分修飾、ヌクレオチド間結合部における修飾およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７１】
このヌクレオチドは天然または合成の修飾塩基から選択できる。天然塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。ヌクレオチドの修飾塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよびその他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６アザシトシンおよび６アザチミン、偽ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよびその他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよびその他の置換グアニン、他のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンが挙げられる。
【００７２】
加えて、ヌクレオチド類似体を含む化合物は、１つ以上のヌクレオチド構造が根本的に改変されて治療または実験試薬としてより適合するように調製される。ヌクレオチド類似体の一例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格がペプチドに見られるものに類似したポリアミド骨格と置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性であること、ならびにインビボおよびインビトロで生存が延長されることが示されている。
【００７３】
糖残基に可能な修飾は多様であり、２’−Ｏアルキル、固定化核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、アルトリトール（ＡＮＡ）およびその他の６員糖類（モルホリノ、およびシクロヘキシルなど）が挙げられる。
【００７４】
ＬＮＡ化合物は、国際公開特許第００／４７５９９号、国際公開特許第９９／１４２２６号、および国際公開特許第９８／３９３５２号に開示されている。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ＮＡＲ  ２００５．  ３３（１）：４３９−４４７）および国際公開特許第２００４／０８３４３０号に開示されている。
【００７５】
エチル（リン酸エチルトリエステルを生成）；プロピル（リン酸プロピルトリエステルを生成）；ならびにブチル（リン酸ブチルトリエステルを生成）などの骨格修飾も可能である。他の骨格修飾としては、ポリマー骨格、環式骨格、非環式骨格、チオリン酸−Ｄ−リボース骨格、アミデート、ホスホノアセテート誘導体が挙げられる。特定の構造としては、１つ以上の２’−５’ヌクレオチド間結合（架橋または骨格）を有するｓｉＲＮＡ化合物が挙げられる。
【００７６】
本発明の分子に存在し得る追加の修飾としては、人工核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよび固定化核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、ならびに鏡像体ヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシヌクレオシドに代わるβ−Ｌ−デオキシヌクレオシド）などのヌクレオシド修飾が挙げられる。さらに、前記分子は糖修飾（２’−アルキル、２’−フルオロ（２’−デオキシ−２’−フルオロ）、２’Ｏ−アリル、２’アミンおよび２’アルコキシなど）をさらに含有してよい。追加の糖修飾については本明細書で論じられている。
【００７７】
さらに、本発明の阻害性核酸分子は１つ以上のギャップおよび／または１つ以上のニックおよび／または１つ以上のミスマッチが入っていてよい。理論に束縛されるものではないが、ギャップ、ニックおよびミスマッチは内因性細胞機構（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡまたはＲＩＳＣなど）によってその阻害成分に容易に処理され得るように核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定にさせる利点を持つ。
【００７８】
本発明に関して、核酸中ギャップは、１本鎖中の１個以上の内部ヌクレオチドの欠如を指し、対して核酸中ニックは１本鎖中の２個の隣接するヌクレオチド間のヌクレオチド間結合の欠如を指す。本発明の分子のいずれも、１つ以上のギャップおよび／または１つ以上のニックが入っていてよい。
【００７９】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性の遺伝子特異的転写後サイレンシングが関与する現象である。当初、この現象について研究し、哺乳類細胞を実験的に操作する試みは、長いｄｓＲＮＡ分子に反応して活性化された活性非特異的抗ウイルス防御機構によって失敗した（Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ２０００．  ５：１０７−１１４）。その後、２１個のヌクレオチドＲＮＡの合成２本鎖が、一般の抗ウイルス防御機構を刺激せずに、哺乳類細胞において遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介できることが発見された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，  ４１１：４９４−４９８  ａｎｄ  Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００１，  ９８：９７４２−９７４７を参照されたい）。その結果、短い２本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子機能を理解する試みにおいて強力な手段となった。したがってＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８．  ３９１，  ８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）Ａｍｂｒｏｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００４  ４３１：７００６，３５０−５５；  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，  Ｃｅｌｌ．  ２００４．  １１６（２）：２８１−９７）によって媒介される哺乳類における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。植物における対応する過程は、一般に、特異的転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、菌類ではクエリングと呼ばれる。
【００８０】
ｓｉＲＮＡは、その内因性もしくは細胞の対応遺伝子／ｍＲＮＡ、または外来遺伝子（ウイルス核酸など）の発現を部分的または完全に阻害する２本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ干渉の機構は下に詳述する。
【００８１】
何件もの試験により、ｓｉＲＮＡ治療法がインビボで哺乳類とヒトの両方に有効であることが明らかになった。Ｂｉｔｋｏらは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドＮ遺伝子を対象とする特定のｓｉＲＮＡ分子が鼻腔内投与時にマウスの治療に有効であることを示している（Ｂｉｔｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２００５，  １１（１）：５０−５５）。近年、ｓｉＲＮＡは、霊長類における阻害のために成功的に使用されている（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｔｉｎａ  ２００４．  ２４（１）：１３２−１３８）。ｓｉＲＮＡの治療用途に関する概説については、例えばＢａｒｉｋ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２００５．  ８３：  ７６４−７７３）またはＤｙｋｘｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １３：５４１−５５２）を参照されたい。
【００８２】
ｓｉＲＮＡ構造
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成については、広く報告されている（例えばＵｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２００６；  ２００６：  ６５０５２；  Ｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＢＲＣ．  ２００４，  ３１９（１）：  ２６４−７４；  Ｓｉｏｕｄ  ＆  Ｌｅｉｒｄａｌ，  Ｍｅｔ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；  ２００４，  ２５２：４５７−６９；  Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．  ２００４，  ２０（３）：４３０−２；  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ．  ２００４，  ３２（３）：９３６−４８を参照されたい）。
【００８３】
例えば、修飾ｓｉＲＮＡの使用および産生については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００３，  ４２（２６）：７９６７−７５；  Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ，  ２００３，  ９（９）：１０３４−４８；ＰＣＴ国際公開特許第２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ  ＡＧ）および国際公開特許第０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ）を参照されたい。米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号は化学的に修飾されたオリゴマーについて教示している。米国特許第２００５／００８０２４６号および同第２００５／００４２６４７号は、それぞれモチーフを交互に有するオリゴマー化合物および化学的に修飾されたヌクレオシド間結合を有するｄｓＲＮＡ化合物に関する。
【００８４】
その他の修飾についても開示されている。５’−リン酸部分の含有物は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚のｓｉＲＮＡ活性を増強し（Ｂｏｕｔｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ２００１，  １１：１７７６−１７８０）、ヒトＨｅＬａ細胞においてｓｉＲＮＡ機能のために必要であることが示された（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ２００２，  １０：５３７−４８）。Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら（ＮＡＲ，  ２００３，  ３１（２）：５８９−９５）は、ｓｉＲＮＡ活性は２’−Ｏ−メチル修飾の位置付けに依存することを示した。Ｈｏｌｅｎら（ＮＡＲ．  ２００３，  ３１（９）：２４０１−０７）は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド数が少ないｓｉＲＮＡは野生型と比較して良好な活性を生じたが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド数が増すにつれ活性は低下したことを報告している。ＣｈｉｕおよびＲａｎａ（ＲＮＡ．  ２００３，  ９：１０３４−４８）は、センス鎖またはアンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド（完全修飾鎖）の取り込みは非修飾ｓｉＲＮＡと比較しｓｉＲＮＡ活性を大幅に低下させたことを教示している。アンチセンス鎖の５’末端の２’−Ｏ−メチル基の配置により活性が大幅に制限されたのに対し、アンチセンスの３’末端およびセンス鎖の両端の配置は許容されたことが報告されている（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ．  ２００３，  ３１（１１）：２７０５−１６；国際公開特許第２００４／０１５１０７号）。本発明の分子は非毒性であり、様々な疾患治療のための医薬組成物として製剤化してよい点で利点を供する。
【００８５】
国際公開特許第２００８／０５０３２９号（本発明の譲受人に付与されており、それらの全体が本明細書に組み込まれる）は、プロアポトーシス遺伝子発現に関連する疾患および障害を治療するためのｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物を含む組成物、ならびにそれらの使用方法に関する。米国特許出願第１１／６５５６１０号は、プロアポトーシス遺伝子（全般的に、特にｐ５３）を阻害することにより聴覚障害を治療する方法に関する。国際公開特許第２００５／１１９２５１号は、難聴を治療する方法に関する。国際公開特許第２００５／０５５９２１号は、耳障害治療のための発泡性組成物に関する。米国特許第７，０８７，５８１号は、内耳性の疾患および障害を治療する方法に関する。
【００８６】
１つの態様によると、本発明は、化学的に修飾された阻害性オリゴヌクレオチド化合物；浸透エンハンサーおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与することを含む、医薬組成物を投与する工程を含む耳障害の治療のための方法を提供する。化合物は、糖修飾、塩基修飾およびヌクレオチド間結合修飾からなる群から選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
【００８７】
本発明は、様々な遺伝子の発現を下方制御する化合物、特に新規の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にも関し、これらの新規ｓｉＲＮＡの聴力損失治療、内耳細胞再生および化学物質誘発性聴力損失の予防における使用にも関する。
【００８８】
本発明に有用なヒト標的遺伝子の非限定的な一覧を、配列番号１〜３６で表した表１に提示する。１つの好ましい実施形態では、標的遺伝子は１つ以上の：ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３から選択される。これらの遺伝子に関するｍＲＮＡの参照番号を表１に示す。それぞれの遺伝子に関して、１９ｍｅｒ、２１ｍｅｒおよび２３ｍｅｒ配列が生成され、それらは、ヒト遺伝子の発現を標的にする最良の配列として独自のアルゴリズムにおけるそれらの得点に基づき優先順位が付けられる。２１または２３ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ配列は本明細書に開示の１９ｍｅｒ配列の５’および／または３’の延長により生成することもできる。かかる延長は好ましくは対応するｍＲＮＡ配列に相補的である。特定の２３ｍｅｒオリゴマーを、優先順が対応１９ｍｅｒ順であるこの方法により考案した。本発明の実践に有用であるｓｉＲＮＡオリゴマーは米国特許出願第１１／９７８，０８９号（本発明の譲受人に譲与されており、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる）の表Ｂに開示されており、出願中で配列番号９７〜６８６５４として示されている。本発明の組成物および方法に有用である特定のｓｉＲＮＡオリゴマーは米国特許出願第１１／２０７１１９号、同第１１／８１１，１１２号、同第１１／６５５６３６号、およびＰＣＴ国際公開特許／イスラエル特許第２００８／０００７９７号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００８／０００８７４号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００９／００００５３号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００９／０００３０２号（本発明の譲受人に譲与されており、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている。様々な長さのｓｉＲＮＡ化合物の調製に有用である特定の１９ｍｅｒアンチセンスとセンスオリゴヌクレオチド配列を図４に示す。異種間配列の略記は次のとおりである：Ｃｈｐ：チンパンジー、Ｍｓ：マウス、Ｃｈｎ：チンチラ、ＧＰ：モルモット。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内で内因性細胞錯体（例えば上記のＤＲＯＳＨＡおよびＤＩＣＥＲ）により１つ以上の低分子２本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を産生するように処理されるステムおよびループ構造を含まないか、１つ以上含む長いオリゴヌクレオチド（典型的には、長さ約４１〜５００個のヌクレオチド）を含む組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、この長いオリゴヌクレオチドは、１つ以上のステムおよびループ構造を含む（ステム領域はそれぞれセンスおよび対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含む）１本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に開示の阻害性配列を含む（好適な核酸修飾を有する）任意の分子（例えば、アンチセンスＤＮＡ分子など）が特に望ましく、対応するＲＮＡ／ｓｉＲＮＡと同容量を本明細書に開示のすべての使用および方法に用いてよい。
【００９０】
オリゴヌクレオチド
本発明は、所望の遺伝子の発現を下方制御する２本鎖オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）を提供する。本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖が所望の遺伝子のｍＲＮＡ配列から引き出され、アンチセンス鎖がそのセンス鎖に相補的である２本鎖オリゴリボヌクレオチドである。一般に、標的ｍＲＮＡ配列との多少のずれは許容範囲であり、ｓｉＲＮＡ活性は損なわれない（例えばＣｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ．  ２００３，  ３１（１１）：２７０５−２７１６を参照されたい）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを破壊してまたは破壊せずに転写後レベルの遺伝子発現を阻害する。理論に縛られることなく、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡを特定の切断および分解の標的とし得、および／または標的メッセージ由来の翻訳を阻害し得る。
【００９１】
様々な実施形態では、このｓｉＲＮＡは第１鎖と第２鎖を含むＲＮＡ２本鎖を含み、ここで第１鎖は、標的遺伝子からｍＲＮＡ転写された標的核酸の約１８〜約４０個の連続するヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、第２鎖は、第１鎖と少なくとも部分的に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、前記第１鎖およびまたは前記第２鎖は、１個以上の化学的に修飾されたリボヌクレオチドおよびまたは非定型的部分を含む。
【００９２】
１つの実施形態では、このｓｉＲＮＡ化合物は、糖部分の２’修飾（「２’糖修飾」）を含む少なくとも１個のリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、化合物は、２’Ｏ−アルキルもしくは２’−フルオロもしくは２’Ｏ−アリルまたはその他の任意の２’修飾を、任意に交互の位置に含む。他の安定化修飾も可能である（例えば末端修飾）。いくつかの実施形態では、好ましい２’Ｏ−アルキルは２’Ｏ−メチル（メトキシ、２’ＯＭｅ）糖修飾である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド骨格は修飾されており、リン酸−Ｄ−リボース物質を含むが、チオリン酸−Ｄ−リボース物質、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも呼び得る）、ＰＡＣＥなどを含有してもよい。
【００９４】
本明細書で使用されるとき、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、非塩基対合部分（６デスアミノアデノシン（Ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣが挙げられるが、これらに限定されない）を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態では、非塩基対合ヌクレオチド類似体はリボヌクレオチドである。他の実施形態では、それはデオキシリボヌクレオチドである。加えて、ポリヌクレオチド類似体は、１つ以上のヌクレオチド構造が根本的に改変されて治療または実験試薬としてより適合するように調製し得る。ヌクレオチド類似体の一例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格がペプチドに見られるものに類似したポリアミド骨格と置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性であること、ならびにインビボおよびインビトロで安定性を増強することが示されている。他の有用な修飾としては、ポリマー骨格、環式骨格、非環式骨格、チオリン酸−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２’−５’架橋骨格、人工核酸、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、および鏡像体ヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドに代わるβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が挙げられる。本発明の化合物は、１つ以上の逆ヌクレオチド（例えば逆チミジンまたは逆アデニン）を用いて合成できる（例えば、Ｔａｋｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照されたい）。
【００９５】
追加の修飾としては、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分の末端修飾（キャッピング部分としても知られている）が挙げられる。かかる末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、糖および逆方向脱塩基部分から選択される。
【００９６】
本発明において「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド類似体」と時折呼ばれるものは、より好適には偽ヌクレオチドまたは非定型的部分と呼ばれる。ヌクレオチドは核酸のモノマー単位であり、リボースもしくはデオキシリボース糖、リン酸、ならびに塩基（ＤＮＡのアデニン、グアニン、チミン、またはシトシン；ＲＮＡのアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシン）からなる。修飾ヌクレオチドは１つ以上の糖、リン酸およびまたは塩基における修飾を含む。この脱塩基偽ヌクレオチドは塩基欠損であり、したがって厳密にはヌクレオチドではない。
【００９７】
「非定型的部分」という用語は、本明細書で使用されるとき、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド；架橋核酸（ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸など）を指す。本発明のいくつかの実施形態では、好ましい非定型的部分は脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドである。
【００９８】
脱塩基デオキシリボース部分としては、例えば脱塩基デオキシリボース−３’−リン酸；１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−リン酸；１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−リン酸が挙げられる。逆方向脱塩基デオキシリボース部分としては、逆デオキシリボ脱塩基；３’，５’逆デオキシ脱塩基５’−リン酸が挙げられる。
【００９９】
「鏡像体」ヌクレオチドは、天然または一般に使用されるヌクレオチドと逆の対掌性を有するヌクレオチド、すなわち、天然体（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）（鏡像体リボヌクレオチドの場合はＬ−ＲＮＡとも呼ばれる）、および「シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドでもあり得、さらに少なくとも１個の糖、塩基およびまたは骨格修飾を含む。米国特許第６，５８６，２３８号を参照されたい。また、米国特許第６，６０２，８５８号は核酸触媒（少なくとも１個のＬ−ヌクレオチド置換を含む）を開示している。鏡像体ヌクレオチドとしては、例えばＬ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＡ）；Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｄＣ）；Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＧ）；Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−リン酸（鏡像ｄＴ））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＡ）；Ｌ−リボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｒＣ）；Ｌ−リボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＧ）；Ｌ−リボウラシル−３’−リン酸（鏡像体ｄＵ）が挙げられる。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「キャッピング部分」という用語としては、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分（２’Ｏアルキル修飾など）；逆方向脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分およびそれらの修飾；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；鏡像体ヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡなど）；５’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド；ならびにヌクレオチド類似体（４’，５’−メチレンヌクレオチドなど）；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、カルボ環状ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；α−ヌクレオチド；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆方向脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；ならびに架橋もしくは非架橋メチルホスホン酸および５’−メルカプト部分が挙げられる。
【０１０１】
特定の好ましいキャッピング部分は、脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；逆方向脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；鏡像体ヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡなど）である。
【０１０２】
さらなる末端修飾はビオチン基である。かかるビオチン基は、好ましくは、第１および／または第２鎖の５’最末端もしくは３’最末端ヌクレオチドのいずれかまたは両端に結合されてよい。より好ましい実施形態では、ビオチン基はポリペプチドまたはタンパク質に結合される。ポリペプチドまたはタンパク質が他の上記末端修飾のいずれかを介して結合されることも本発明の範囲内である。
【０１０３】
本明細書に開示の様々な末端修飾は、好ましくは、本発明による核酸のヌクレオチドのリボース部分に位置する。より詳細には、末端修飾は、リボース部分の任意のＯＨ基（２’ＯＨ、３’ＯＨおよび５’ＯＨ位が挙げられるが、これらに限定されない）に結合するかまたは置換されてもよく、ただしこのように修飾されたヌクレオチドは末端ヌクレオチドである。逆方向脱塩基または脱塩基は、核酸塩基部分を有さないデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドである（例えばＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，  １２，  １３１−４３を参照されたい）。
【０１０４】
修飾デオキシリボヌクレオチドとしては、例えば５’末端位（１位）のヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテートが挙げられる。
【０１０５】
架橋核酸としては、ＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）；ならびにＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）が挙げられる。
【０１０６】
特定の実施形態では、前記第１鎖と標的核酸は完全に相補的である。いくつかの実施形態では、これらの鎖は実質的に相補的であり、すなわち前記第１鎖と標的核酸の間のミスマッチは１つ、２つまたは最大３つである。実質的に相補的とは、もう一方の配列に対して約８４％超の相補性を指す。例えば１９塩基対からなる２本鎖領域において、１つのミスマッチは９４．７％の相補性となり、２つのミスマッチは約８９．５％の相補性となり、３つのミスマッチは約８４．２％の相補性となり、２本鎖領域は実質的に相補的であることが示される。したがって、実質的に同一とは、もう一方の配列に対して約８４％超の同一性を指す。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、化合物の第１鎖と第２鎖はループ構造により結ばれており、非核酸ポリマー（とりわけ、ポリエチレングリコールなど）を含む。あるいは、このループ構造は核酸（修飾および非修飾リボヌクレオチドならびに修飾および非修飾デオキシリボヌクレオチドなど）を含む。
【０１０８】
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡの第１鎖の５’末端は第２鎖の３’末端に結ばれているか、第１鎖の３’末端は第２鎖の５’末端に結ばれており、前記結合は典型的には長さ２〜１００個の核塩基、好ましくは約２〜約３０個の核塩基を有する核酸リンカーを介する。
【０１０９】
本発明の化合物の好ましい実施形態では、化合物のアンチセンス鎖とセンス鎖の少なくとも一方で修飾されたリボヌクレオチドを交互に有し、１９ｍｅｒおよび２３ｍｅｒオリゴマーにおいて、アンチセンス鎖の５’末端と３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されており、センス鎖の５’末端と３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されていない。２１ｍｅｒオリゴマーにおいて、センス鎖の５’末端と３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されており、アンチセンス鎖の５’末端と３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されていないか、任意で３’末端に追加の修飾を有する。上述したように、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチドは修飾されていないことが好ましい。
【０１１０】
本発明の１つの好ましい実施形態によると、オリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の３’末端はリン酸化されており、５’末端はリン酸化されていない。本発明の別の好ましい実施形態によると、アンチセンス鎖とセンス鎖はリン酸化されていない。本発明のさらに別の好ましい実施形態によると、センス鎖の５’最末端のリボヌクレオチドはインビボ５’−リン酸化のいかなる可能性も排除するために修飾されている。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡ配列はいずれも本明細書に開示の任意の修飾／構造を有するように調製できる。配列と構造の組み合わせを含む化合物は本明細書に開示の病態治療に有用である。
【０１１２】
構造モチーフ
本発明によると、ｓｉＲＮＡ化合物は、構造（Ａ）〜（Ｐ）またはタンデムｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡスターとして表される次の修飾のうちの１つにより化学的およびまたは構造的に修飾されている。
【０１１３】
１つの態様では、本発明は構造（Ａ）として表される化合物を提供する：
（Ａ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが存在する鎖の３’末端で共有結合している１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明は、構造（Ｂ）を有する化合物を提供し、
（Ｂ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結している非修飾リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドであるオリゴマーであり；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが存在する鎖の３’末端で共有結合している１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
式中ｘとｙはそれぞれ１９、２１または２３であり、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙは完全に相補的であり、
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのそれぞれの交互のリボヌクレオチドはリボヌクレオチドの糖残基で２’−Ｏ−メチル修飾されており；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ独立して３’末端と５’末端でリン酸化されているかまたはリン酸化されていない。
【０１１６】
特定の実施形態では、式中ｘとｙはそれぞれ１９または２３であり、（Ｎ）ｘの５’末端と３’末端のＮはそれぞれ修飾されており；ならびに（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端のＮ’はそれぞれ修飾されていない。
【０１１７】
特定の実施形態では、式中ｘとｙはそれぞれ２１であり、（Ｎ）ｘの５’末端と３’末端のＮはそれぞれ修飾されておらず；ならびに（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端のＮ’はそれぞれ修飾されている。
【０１１８】
特定の実施形態では、ｘとｙが１９である場合、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘの１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）基が存在し、それにより、全く同一の修飾（すなわち２’−ＯＭｅ基）がセンス鎖（Ｎ’）ｙの２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８番目のヌクレオチドに存在する。様々な実施形態では、これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物の両端は平滑端である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、構造（Ｃ）を有する化合物を提供する：
（Ｃ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
式中ＮとＮ’はそれぞれ独立して非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するヌクレオチドがそれぞれ共有結合により次のヌクレオチドに連結しているオリゴマーであり、ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘのヌクレオチドは修飾されていないか、あるいは（Ｎ）ｘは、修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドを交互に含み；修飾リボヌクレオチドはその糖上にそれぞれ２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央部にあるリボヌクレオチドは修飾されているか修飾されていないが、好ましくは修飾されておらず；
式中（Ｎ’）ｙは、非修飾リボヌクレオチドを含み、さらに末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは、鏡像体ヌクレオチド、二環式ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、あるいは２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ’）ｙの１つ以上のヌクレオチドが修飾されている場合、この修飾ヌクレオチドは連続していてよく；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は、（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列を含み；ならびに式中（Ｎ）ｘは、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１２０】
特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘの修飾リボヌクレオチドはそれぞれその糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されていない。したがって、式中ｘ＝１９の化合物において、（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば６位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１４位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは１、２、３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、１、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば６位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、１、２、３、５、７、９、１１、１３、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、１、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１４位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、１、２、４、６、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１４、１６、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、１、２、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１５位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば７位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば８位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば９位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１０位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１１位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１２位）を含んでよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１１、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１個の脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分（例えば１３位）を含んでよい。
【０１２１】
さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、遺伝子の１つと比較し少なくとも１個のヌクレオチドのミスマッチを含む。特定の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは、単ヌクレオチドの５、６、または１４位にミスマッチを含む。構造（Ｃ）の１つの実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端の一端または両端の少なくとも２個のヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘのヌクレオチドに修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にあり、それぞれの修飾リボヌクレオチドはその糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されておらず；ならびに（Ｎ’）ｙの３’末端の３個のヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している（本明細書で構造Ｉと表す）。他の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり、（Ｎ）ｘのヌクレオチドに修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にあり、それぞれの修飾リボヌクレオチドがその糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されておらず；ならびに（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｙの中央部にある追加のヌクレオチドはその糖上で２’−Ｏ−メチル修飾されていてよい。別の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘのヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にあり、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２個もしくは３個の連続するヌクレオチドは３’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１２２】
構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙの少なくとも１つの位置に、脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分を含み、好ましくは５位に脱塩基または逆方向脱塩基の非定型的部分を含む。様々な実施形態では、次の位置：１位および１６〜１９位、１５〜１９位、１〜２位および１７〜１９位、１〜３位および１８〜１９位、１〜４位および１９位ならびに１〜５位に脱塩基または逆方向脱塩基を含む。（Ｎ’）ｙはさらに少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドを含んでよい。
【０１２３】
構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙのヌクレオチドの少なくとも１つの位置に、鏡像体ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドを含む。
【０１２４】
構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、鏡像体ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−ＤＮＡヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡはＬ−デオキシリボシチジンである。いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙは１８位にＬ−ＤＮＡを含む。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、１７位と１８位にＬ−ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、２位ならびに１７位と１８位の一方もしくは両方にＬ−ＤＮＡ置換を含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙはさらに、５’末端キャップヌクレオチド（５’−Ｏ−メチルＤＮＡまたは脱塩基など）または（オーバーハングとして）逆方向脱塩基部分を含む。
【０１２５】
さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは１５位にＤＮＡを含み、１７位と１８位の一方または両方にＬ−ＤＮＡを含む。その構造において、２位にさらにＬ−ＤＮＡまたは脱塩基の非定型的部分を含んでよい。
【０１２６】
構造Ｃの他の実施形態は、式中ｘ＝ｙ＝２１または式中ｘ＝ｙ＝２３であることが予想され；これらの実施形態では、上で論じた（Ｎ’）ｙ修飾が１５、１６、１７、１８位の代わりに２１ｍｅｒの１７、１８、１９、２０位および２３ｍｅｒの１９、２０、２１、２２位にあり；同様に１７位と１８位の一方もしくは両方の修飾は２１ｍｅｒの１９位もしくは２０位の一方もしくは両方、２３ｍｅｒの２１位と２２位の一方もしくは両方にある。１９ｍｅｒのすべての修飾は２１および２３ｍｅｒにおいて同様に調節される。
【０１２７】
構造（Ｃ）の様々な実施形態によると、（Ｎ’）ｙの３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている。１つの好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、ここで２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する１つ以上の２’−５’ヌクレオチドは、さらに、３’−Ｏ−メチル糖修飾を含む。好ましくは（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含む。構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙの１５、１６、１７、１８および１９位の２個以上の連続するヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成しているヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの１７位と１８位のヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により連結している。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙの１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８位のヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により連結している。
【０１２８】
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙの２位にＬ−ＤＮＡを含み、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８位に２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙの１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８位に２’−５’ヌクレオチド間結合を含み、５’末端にキャップヌクレオチドを含む。
【０１２９】
構造（Ｃ）の様々な実施形態によると、（Ｎ’）ｙのいずれかの末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチドまたは５’末端と３’末端のそれぞれの２〜８個の修飾ヌクレオチドは独立して鏡像体ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。鏡像体ヌクレオチドは糖もしくは塩基部分またはヌクレオチド間結合部でさらに修飾されてよい。
【０１３０】
構造（Ｃ）の１つの好ましい実施形態では、３’末端ヌクレオチドまたは（Ｎ’）ｙの３’末端の２もしくは３個の連続するヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１３１】
構造（Ｃ）の他の実施形態では、（Ｎ’）ｙのいずれかの末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドまたは５’末端と３’末端のそれぞれの２〜８個の修飾ヌクレオチドは独立して２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。一連の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３、４または５個の連続するヌクレオチドは２’−ＯＭｅ修飾を含む。別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１３２】
構造（Ｃ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端のいずれかの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、または５’末端と３’末端のそれぞれの２〜８個の修飾ヌクレオチドは独立して二環式ヌクレオチドである。様々な実施形態では、この二環式ヌクレオチドは固定化核酸（ＬＮＡ）である。２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）はＬＮＡ種である（下を参照されたい）。
【０１３３】
様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端または３’末端と５’末端の両端に修飾ヌクレオチドを含む。
【０１３４】
構造（Ｃ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端の一端または両端の少なくとも２個のヌクレオチドがＰ−エトキシ骨格修飾により連結している。特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘのヌクレオチドに修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にあり、それぞれの修飾リボヌクレオチドがその糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央部にあるリボヌクレオチドは修飾されておらず；ならびに（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の４個の連続するヌクレオチドは３つのＰ−エトキシ骨格修飾により連結している。別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つのＰ−エトキシ骨格修飾により連結している。
【０１３５】
構造（Ｃ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端のそれぞれの２、３、４、５、６、７または８個の連続するリボヌクレオチドは、独立して鏡像体ヌクレオチド、２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しているヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチドまたは二環式ヌクレオチドである。１つの実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端の修飾は同一である。１つの好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾は、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾と異なる。１つの具体的な実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。別の具体的な実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続するヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。（Ｎ）ｘのヌクレオチドに修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にあり、それぞれの修飾リボヌクレオチドがその糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されていないか、または（Ｎ）ｘのリボヌクレオチドは修飾されていない。
【０１３６】
構造（Ｃ）の別の実施形態では、本発明は、式中ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３である化合物を提供し；（Ｎ）ｘのヌクレオチドに修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドが交互にあり、それぞれの修飾リボヌクレオチドがその糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されておらず；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個のヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドはＬＮＡ（ＥＮＡなど）である。
【０１３７】
構造（Ｃ）の別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル糖修飾を含み、（Ｎ’）ｙの３’末端の２個の連続するヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
【０１３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、式中ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３である化合物を提供し；（Ｎ）ｘは非修飾リボヌクレオチドからなり；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続するヌクレオチドはＬＮＡ（ＥＮＡなど）である。
【０１３９】
構造（Ｃ）の他の実施形態によると、（Ｎ’）ｙの５’末端もしくは３’末端ヌクレオチド、またはいずれかの末端の２、３、４、５もしくは６個の連続するヌクレオチドまたは５’末端と３’末端のそれぞれの１〜４個の修飾ヌクレオチドは、独立してホスホノカルボキシレートまたはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、このＰＡＣＥヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。（Ｎ’）ｙのいくつかの好ましい実施形態では、５’末端と３’末端のそれぞれの１または２個の連続するヌクレオチドはＰＡＣＥヌクレオチドである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、構造（Ｄ）を有する化合物を提供する：
（Ｄ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するヌクレオチドがそれぞれ共有結合により次のヌクレオチドに連結しているオリゴマーであり、ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘは、３’末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ’）ｙは、５’末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのそれぞれにおいて、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドは交互ではなく；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘは、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１４１】
構造（Ｄ）の１つの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘは３’末端で２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている２個の連続するヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含み；ならびに（Ｎ’）ｙは５’末端に１つの２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている２個の連続するヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘは３’末端の３個の連続するヌクレオチドが２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している非修飾リボヌクレオチドを含み；ならびに（Ｎ’）ｙは５’末端で４個の連続するヌクレオチドが３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している非修飾リボヌクレオチドを含む（本明細書で構造ＩＩと表す）。
【０１４３】
構造（Ｄ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの５’最末端もしくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている。
【０１４４】
構造（Ｄ）の１つの好ましい実施形態によると、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、（Ｎ’）ｘの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｘの３’末端の２個のヌクレオチドは３’−Ｏ−メチル修飾を含んでもよい。
【０１４５】
構造（Ｄ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの５’最末端もしくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して鏡像体ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この鏡像体はＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１４６】
構造（Ｄ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの５’最末端もしくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾は、メトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。
【０１４７】
構造（Ｄ）の１つの好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含む。構造（Ｄ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１０個の連続するヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含む。構造（Ｄ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１３個の連続するヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１４８】
構造（Ｄ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの５’最末端もしくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して二環式ヌクレオチドである。様々な実施形態では、この二環式ヌクレオチドは固定化核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）など）である。
【０１４９】
構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１５０】
構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１５１】
同一鎖の３’末端と５’末端がそれぞれ修飾ヌクレオチドを含む実施形態では、５’末端と３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同一鎖の３’末端の修飾と異なる。１つの具体的な実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、同一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。
【０１５２】
構造（Ｄ）の１つの具体的な実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｙの３’末端の２個の連続するヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。加えて、化合物はさらに（Ｎ’）ｘの３’末端に５個の連続する２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドを含んでよい。
【０１５３】
構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドと異なる。例えば、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドである。
【０１５４】
追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｅ）を有する化合物を提供する：
（Ｅ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するヌクレオチドがそれぞれ共有結合により次のヌクレオチドに連結しているオリゴマーであり、ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘは、５’末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ’）ｙは３’末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのそれぞれにおいて、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドは交互ではなく；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１５５】
特定の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端の末端ヌクレオチドは修飾されていない。
【０１５６】
構造（Ｅ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘの５’最末端または５’末端から２番目で開始する、好ましくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている。
【０１５７】
構造（Ｅ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘの５’最末端または５’末端から２番目で開始する、好ましくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチドは独立して鏡像体ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この鏡像体はＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１５８】
構造（Ｅ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘの５’最末端または５’末端から２番目で開始する、好ましくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾は、メトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。
【０１５９】
構造（Ｅ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘの５’最末端または５’末端から２番目で開始する、好ましくは５’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、ならびに（Ｎ’）ｙの３’最末端もしくは３’末端から２番目で開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して二環式ヌクレオチドである。様々な実施形態では、この二環式ヌクレオチドは固定化核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）など）である。
【０１６０】
構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ骨格修飾により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド、または３’末端もしくは３’末端と５’末端のそれぞれで２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１６１】
構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または５’末端もしくは３’末端と５’末端のそれぞれで２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１６２】
同一鎖の３’末端と５’末端の両端に修飾ヌクレオチドを含む１つの実施形態では、５’末端と３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同一鎖の３’末端の修飾と異なる。１つの具体的な実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、同一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。
【０１６３】
構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドと異なる。例えば、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドである。
【０１６４】
追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｆ）を有する化合物を提供する：
（Ｆ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するヌクレオチドがそれぞれ共有結合により次のヌクレオチドに連結しているオリゴマーであり、ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙがそれぞれ独立して３’末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ骨格修飾により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのそれぞれにおいて、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドは交互ではなく；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１６５】
構造（Ｆ）のいくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ’）ｙは、３’末端の２個の連続するヌクレオチドが２個の連続する鏡像体デオキシリボヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含み；ならびに（Ｎ）ｘは、３’末端の１個のヌクレオチドが鏡像体デオキシリボヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含む（構造ＩＩＩと表す）。
【０１６６】
構造（Ｆ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの３’最末端または３’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている。
【０１６７】
構造（Ｆ）の１つの好ましい実施形態によると、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結しており、（Ｎ’）ｘの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。
【０１６８】
構造（Ｆ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの３’最末端または３’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するヌクレオチドは、独立して鏡像体ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１６９】
構造（Ｆ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの３’最末端または３’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾は、メトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。
【０１７０】
構造（Ｆ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの３’最末端または３’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して二環式ヌクレオチドである。様々な実施形態では、この二環式ヌクレオチドは固定化核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）など）である。
【０１７１】
構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または３’末端もしくは３’末端と５’末端の両端の２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１７２】
構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または３’末端もしくは３’末端と５’末端のそれぞれで２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１７３】
同一鎖の３’末端と５’末端がそれぞれ修飾ヌクレオチドを含む１つの実施形態では、５’末端と３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同一鎖の３’末端の修飾と異なる。１つの具体的な実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、同一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。
【０１７４】
構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドと異なる。例えば、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドである。
【０１７５】
追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｇ）を有する化合物を提供する：
（Ｇ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するヌクレオチドがそれぞれ共有結合により次のヌクレオチドに連結しているオリゴマーであり、ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙがそれぞれ独立して５’末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ骨格修飾により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは好ましくは５’末端から２番目にあり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのそれぞれにおいて、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドは交互ではなく；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１７６】
構造（Ｇ）のいくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３である。
【０１７７】
構造（Ｇ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの５’最末端または５’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれている。（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは好ましくは５’末端から２番目で開始する。
【０１７８】
構造（Ｇ）の様々な実施形態によると、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの５’最末端または５’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して鏡像体ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは好ましくは５’末端から２番目で開始する。
【０１７９】
構造（Ｇ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの５’最末端または５’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、この２’糖修飾は、メトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、この連続する修飾ヌクレオチドは好ましくは（Ｎ）ｘの５’末端から２番目で開始する。
【０１８０】
構造（Ｇ）の１つの好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するリボヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの５’末端から２番目の１個のリボヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含む。構造（Ｇ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するリボヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの５’末端位の２個の連続するリボヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
【０１８１】
構造（Ｇ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙの５’最末端または５’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続するリボヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドである。様々な実施形態では、この二環式ヌクレオチドは固定化核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）など）である。いくつかの好ましい実施形態では、連続する修飾ヌクレオチドは好ましくは（Ｎ）ｘの５’末端から２番目で開始する。
【０１８２】
構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または５’末端もしくは３’末端と５’末端のそれぞれで２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１８３】
構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または５’末端もしくは３’末端と５’末端のそれぞれで２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１８４】
同一鎖の３’末端と５’末端がそれぞれ修飾ヌクレオチドを含む１つの実施形態では、５’末端と３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同一鎖の３’末端の修飾と異なる。１つの具体的な実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、同一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドと異なる。例えば、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドである。
【０１８５】
追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｈ）を有する化合物を提供する：
（Ｈ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するヌクレオチドがそれぞれ共有結合により次のヌクレオチドに連結しているオリゴマーであり、ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘは、３’の末端もしくは末端から２番目または５’の末端もしくは末端から２番目に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ’）ｙは、さらに内部に１個の修飾ヌクレオチドを含む非修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは二環式ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドからなる群から選択され；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのそれぞれにおいて、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドは交互ではなく；
式中ＺとＺ’はそれぞれ存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０１８６】
構造（Ｈ）の１つの実施形態では、（Ｎ）ｘの３’末端もしくは５’末端もしくは両端の最末端もしくは末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチド、二環式ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチド、二環式ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾はアミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。
【０１８７】
構造（Ｈ）の別の実施形態では、３’末端もしくは５’最末端もしくは５’末端から２番目で独立して開始する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するリボヌクレオチド、または（Ｎ’）ｙの５’末端と３’末端のそれぞれの２〜８個の連続するヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチド、二環式ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続する内部リボヌクレオチドは、独立して２’糖修飾ヌクレオチド、二環式ヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドである。
【０１８８】
同一鎖の３’末端と５’末端がそれぞれ修飾ヌクレオチドを含む１つの実施形態では、５’末端と３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同一鎖の３’末端の修飾と異なる。１つの具体的な実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、同一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合により連結している。
【０１８９】
構造（Ｈ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドと異なる。例えば、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは２’−５’ヌクレオチド間結合により結ばれているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドである。
【０１９０】
構造（Ｈ）の１つの好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり；（Ｎ’）ｙの９〜１１位の３個の連続するリボヌクレオチドヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端位の５個の連続するリボヌクレオチドは２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
【０１９１】
上の構造（Ａ）〜（Ｈ）のすべてにおいて、様々な実施形態では、ｘ＝ｙであり、ｘとｙはそれぞれ１９、２０、２１、２２または２３である。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。さらに他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。追加の実施形態では、化合物は修飾リボヌクレオチドを交互の位置に含み、（Ｎ）ｘの５’末端と３’末端のＮはそれぞれそれらの糖残基にて修飾されており、中央リボヌクレオチドは修飾されていない（例えば１９ｍｅｒ鎖の１０位、２１ｍｅｒ鎖の１１位および２３ｍｅｒ鎖の１２位のリボヌクレオチドなど）。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３であり、１９ｍｅｒの修飾位置は２１および２３ｍｅｒのために調節される。ただし、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチドは好ましくは修飾されていない。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘも（Ｎ’）ｙも３’末端と５’末端はリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方の３’末端がリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方の３’末端が切断不能なリン酸基を用いてリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方の２’末端が切断可能または切断不能なリン酸基を用いてリン酸化されている。これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物は平滑端でもあり、末端はリン酸化されていないが、比較実験により、３’末端の一端または両端がリン酸化されているｓｉＲＮＡ化合物はリン酸化されていない化合物と比較して類似したインビボ活性を有することが示されている。
【０１９４】
特定の実施形態では、上記構造のすべてにおいて、化合物は平滑端（例えば式中ＺとＺ’はいずれも不在）である。１つの代替実施形態では、化合物は少なくとも１個の３’オーバーハングを含み、式中ＺまたはＺ’の少なくとも１つが存在する。ＺとＺ’は独立して、１つ以上の共有で結ばれた修飾または非修飾ヌクレオチド（例えば逆ｄＴまたはｄＡ；ｄＴ、ＬＮＡ、鏡像体ヌクレオチドなど）を含む。いくつかの実施形態では、ＺとＺ’はそれぞれ独立してｄＴおよびｄＴｄＴから選択される。Ｚおよび／またはＺ’が存在するｓｉＲＮＡは、ＺとＺ’が不在であるｓｉＲＮＡと類似した活性および安定性を有する。
【０１９５】
特定の実施形態では、上記構造のすべてにおいて、化合物は１つ以上のホスホノカルボキシレートおよび／またはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＣＥヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、ホスフィノカルボキシレートヌクレオチドはホスフィノアセテートヌクレオチドである。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は米国特許第６，６９３，１８７号および７，０６７，６４１号（いずれも本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている。
【０１９６】
特定の実施形態では、上記構造のすべてにおいて、化合物は１つ以上の固定化核酸（ＬＮＡ）（架橋核酸としても定義される）または二環式ヌクレオチドを含む。好ましい固定化核酸は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシド（ＥＮＡ）または２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンヌクレオシドである。ＬＮＡとＥＮＡヌクレオチドの他の例は国際公開特許第９８／３９３５２号、国際公開特許第００／４７５９９号および国際公開特許第９９／１４２２６号（すべて本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている。
【０１９７】
特定の実施形態では、上記構造のすべてにおいて、化合物は１つ以上のアルトリトールモノマー（ヌクレオチド）（１，５アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−アルトリトール−ヘキシトールとしても定義される）を含む（例えば、Ａｌｌａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １７：１５２３−１５２６；  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１３７１−１３７６；  Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＮＡＲ  ３５（４）：１０６４−１０７４（すべて本明細書に参照により組み込まれる）を参照されたい）。
【０１９８】
本発明は、Ｎおよび／またはＮ’のそれぞれがデオキシリボヌクレオチド（Ｄ−Ａ、Ｄ−Ｃ、Ｄ−Ｇ、Ｄ−Ｔ）である化合物を明確に除く。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９個または９個超のデオキシリボヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態では、本発明は、式中Ｎがそれぞれ非修飾リボヌクレオチドであり、３’末端ヌクレオチドまたは（Ｎ’）ｙの３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである化合物を提供する。さらに他の実施形態では、Ｎはそれぞれ非修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの５’末端の５’末端ヌクレオチドまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端の５’末端ヌクレオチドまたは２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個の連続するヌクレオチドならびに３’末端の１、２、３、４、５、もしくは６個の連続するヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’はそれぞれ非修飾リボヌクレオチドである。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｘは非修飾リボヌクレオチド、５’末端と３’末端のそれぞれ独立した１または２、３または４個の連続するデオキシリボヌクレオチド、内部の１または２、３、４、５または６個の連続するデオキシリボヌクレオチドを含み；ならびにＮ’はそれぞれ非修飾リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の３’末端ヌクレオチドまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチド、ならびに（Ｎ）ｘの５’末端の５’末端ヌクレオチドまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続するヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。本発明は、Ｎおよび／またはＮ’がそれぞれデオキシリボヌクレオチドである化合物を除く。いくつかの実施形態では、Ｎの５’末端ヌクレオチドまたは２もしくは３個の連続するＮおよび１、２、もしくは３個のＮ’はデオキシリボヌクレオチドである。活性ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｉＲＮＡキメラの特定の例は米国特許第２００５／０００４０６４号、およびＵｉ−Ｔｅｉ，  ２００８  （ＮＡＲ  ３６（７）：２１３６−２１５１）（それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている。
【０１９９】
特記しない限り、本明細書で論じられる構造の好ましい実施形態では、それぞれ連続するＮまたはＮ’間の共有結合はリン酸ジエステル結合である。
【０２００】
本発明に提供される追加の新規分子は、オリゴヌクレオチド（連続するヌクレオチドを含み、ここでかかるヌクレオチドの第１セグメントは第１の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、かかるヌクレオチドの第２セグメントは第２の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、およびかかるヌクレオチドの第３セグメントは第３の阻害性ＲＮＡ分子をコードする）である。第１、第２および第３セグメントはそれぞれ２本鎖ＲＮＡの１本鎖を含んでよく、第１、第２および第３セグメントはリンカーにより連結していてよい。さらに、オリゴヌクレオチドは１つ以上のリンカーにより連結している３つの２本鎖セグメントを含んでよい。
【０２０１】
したがって、本発明に提供される１分子は、オリゴヌクレオチド（３つの阻害性ＲＮＡ分子をコードする連続するヌクレオチドを含む）であり；前記オリゴヌクレオチドは、３つの２本鎖腕が１つ以上のリンカー（本明細書の上に提示した任意のリンカーなど）により結ばれるように３本鎖構造を保持してよい。この分子は「スター」様構造を形成し、本明細書でＲＮＡスターとも呼び得る。かかる構造はＰＣＴ国際公開特許第２００７／０９１２６９（本発明の譲受人に譲与されている）に開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０２０２】
共有結合とは、あるヌクレオチドモノマーを隣接ヌクレオチドモノマーと結ぶヌクレオチド間結合を指す。共有結合としては、例えば、リン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合、Ｐ−アルコキシ結合、Ｐ−カルボキシ結合などが挙げられる。ＲＮＡとＤＮＡの正常なヌクレオシド間結合は３’から５’方向のリン酸ジエステル結合である。特定の好ましい実施形態では、共有結合はリン酸ジエステル結合である。とりわけ、国際公開特許第２００４／０４１９２４号に開示されているもののように、共有結合はリンを含有しないヌクレオシド間結合を抱合する。特記しない限り、本明細書で論じられる構造の好ましい実施形態では、それぞれ連続するＮまたはＮ’間の共有結合はリン酸ジエステル結合である。
【０２０３】
上のすべての構造において、いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘのオリゴヌクレオチド配列は（Ｎ’）ｙのオリゴヌクレオチド配列に完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙは実質的に相補的である。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に対して実質的に相補的である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘも（Ｎ’）ｙも３’末端と５’末端はリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方の３’末端がリン酸化されている（３’Ｐｉ）。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方の３’末端が切断不能なリン酸基を用いてリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのいずれかまたは両方の２’末端が切断可能または切断不能なリン酸基を用いてリン酸化されている。さらに、本発明の阻害性核酸分子は、１つ以上のギャップおよび／または１つ以上のニックおよび／または１つ以上のミスマッチが入っていてよい。理論に束縛されるものではないが、ギャップ、ニックおよびミスマッチは、内因性細胞機構（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡまたはＲＩＳＣなど）によってその阻害成分に容易に処理され得るように核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定にさせる利点を持つ。
【０２０５】
本発明に関して、核酸中ギャップは、１本鎖中の１個以上の内部ヌクレオチドの欠如を指し、対して核酸中ニックは１本鎖中の２個の隣接するヌクレオチド間のヌクレオチド間結合の欠如を指す。本発明の分子のいずれも１つ以上のギャップおよび／または１つ以上のニックが入っていてよい。
【０２０６】
１つの態様では、本発明は構造（Ｉ）を有する化合物を提供する：
（Ｉ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ          ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチドか、または非定型的部分であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立してそれが存在する鎖の３’末端で共有結合している１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
式中ｚ”は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合しているキャッピング部分であり；
式中ｘ＝１８〜２７であり；
式中ｙ＝１８〜２７であり；
式中（Ｎ）ｘは修飾および非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾リボヌクレオチドはそれぞれその糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、式中（Ｎ）ｘの３’末端のＮは修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、３’末端で開始する少なくとも５個の交互の修飾リボヌクレオチドと少なくとも９個の修飾リボヌクレオチドを併せて含み、残りのＮはそれぞれ非修飾リボヌクレオチドであり；
式中（Ｎ’）ｙに少なくとも１個の非定型的部分が存在し、この非定型的部分は脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾もしくは非修飾デオキシリボヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドでよく；ならびに
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個の非定型的部分が（Ｎ’）ｙの１５、１６、１７、または１８位に存在する。いくつかの実施形態では、この非定型的部分は鏡像体ヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、非定型的部分は鏡像体ヌクレオチドであり、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分は１７位、１８位または１７位と１８位に存在する。
【０２０８】
他の実施形態では、この非定型的部分は脱塩基部分である。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも５個の脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分を含む。
【０２０９】
さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは少なくとも５個の脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分を含み、少なくとも１個のＮ’はＬＮＡである。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは９個の交互の修飾リボヌクレオチドを含む。構造（Ｉ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘは９個の修飾リボヌクレオチドを交互に含み、さらに２位の２’Ｏ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは奇数の１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘはさらに２位と１８位の一方または両方に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【０２１１】
様々な実施形態では、ｚ”は存在し、脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；逆方向脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；鏡像体ヌクレオチドから選択される。
【０２１２】
別の態様では、本発明は、次に表す構造（Ｊ）を有する化合物を提供する：
（Ｊ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ          ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチドか、または非定型的部分であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立してそれが存在する鎖の３’末端で共有結合する１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
式中ｚ”は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合するキャッピング部分であり；
式中ｘ＝１８〜２７であり；
式中ｙ＝１８〜２７であり；
式中（Ｎ）ｘは修飾もしくは非修飾リボヌクレオチドを含み、任意に少なくとも１個の非定型的部分を含み；
式中（Ｎ’）ｙには少なくとも１個の非定型的部分が存在し、この非定型的部分は脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾もしくは非修飾デオキシリボヌクレオチド、鏡像体ヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体または２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドでよく；ならびに
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。いくつかの好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは修飾および非修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１個の非定型的部分を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘの３’末端のＮは修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは少なくとも８個の修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、少なくとも８個の修飾リボヌクレオチドのうち少なくとも５個は３’末端で開始し、交互である。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５位の１つに脱塩基部分を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの少なくとも１個の非定型的部分は１５、１６、１７、または１８位に存在する。いくつかの実施形態では、非定型的部分は鏡像体ヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、非定型的部分は鏡像体ヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分は１７位、１８位または１７位と１８位に存在する。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙの少なくとも１個の非定型的部分は脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分である。
【０２１６】
さらに別の態様では、本発明は次に表す構造（Ｋ）を有する化合物を提供する：
（Ｋ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ          ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチドか、または非定型的部分であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立してそれが存在する鎖の３’末端で共有結合している１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
式中ｚ”は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合しているキャッピング部分であり；
式中ｘ＝１８〜２７であり；
式中ｙ＝１８〜２７であり；
式中（Ｎ）ｘは修飾もしくは非修飾リボヌクレオチドと非定型的部分の組み合わせ、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有する任意の修飾リボヌクレオチドを含み；
式中（Ｎ’）ｙは修飾もしくは非修飾リボヌクレオチドおよび任意に非定型的部分、その糖上に２’ＯＭｅを有する任意の修飾リボヌクレオチドを含み；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は耳障害に関連した標的遺伝子中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。いくつかの好ましい実施形態では、前記少なくとも１個の好ましい非定型的部分が（Ｎ）ｘに存在し、脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分である。他の実施形態では、少なくとも１個の非定型的部分が（Ｎ）ｘに存在し、非塩基対合ヌクレオチド類似体である。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは非修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは少なくとも５個の脱塩基リボース部分もしくは脱塩基デオキシリボース部分またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび／または（Ｎ’）ｙは（Ｎ’）ｙおよび／または（Ｎ）ｘ中の対応する修飾もしくは非修飾リボヌクレオチドと塩基対合していない修飾リボヌクレオチドを含む。
【０２１８】
様々な実施形態では、本発明は、構造（Ｌ）に表すｓｉＲＮＡを提供する：
（Ｌ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾
リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は不在であり；
式中ｘ＝ｙ＝１９であり；
式中（Ｎ’）ｙにおいて、１５、１６、１７、１８および１９位の少なくとも１つのヌクレオチドは、脱塩基の非定型的部分、鏡像体ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ならびに２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み；
式中（Ｎ）ｘは、（Ｎ）ｘの中央部に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを有するように２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと非修飾リボヌクレオチドを交互に含み；ならびに
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２１９】
構造（Ｌ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの１７位と１８位の一方または両方のヌクレオチドは、脱塩基の非定型的部分、鏡像体ヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに連結しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡから選択される。様々な実施形態では、この鏡像体ヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
【０２２０】
様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは１５位に修飾ヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから選択される。
【０２２１】
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙはさらに２位に修飾ヌクレオチドまたは偽ヌクレオチドを含み、この偽ヌクレオチドは脱塩基の非定型的部分でよく、修飾ヌクレオチドは任意に鏡像体ヌクレオチドである。
【０２２２】
様々な実施形態では、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは奇数位置（５’から３’方向；１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位）に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘはさらに２位と１８位の一方または両方に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【０２２３】
構造（Ｌ）の他の実施形態は、式中ｘ＝ｙ＝２１または式中ｘ＝ｙ＝２３であることが予想され；これらの実施形態では、上に論じた（Ｎ’）ｙの１７位と１８位に代わる修飾は２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドの１９位と２０位および２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの２１位と２２位であり；同様に１５、１６、１７、１８または１９位の修飾は２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドの１７、１８、１９、２０もしくは２１位、および２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの１９、２０、２１、２２、もしくは２３位である。アンチセンス鎖上の２’ＯＭｅ修飾は同様に調節される。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは奇数位置（５’から３’方向；２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドの１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０位［ヌクレオチド１１位は非修飾］および２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３位［ヌクレオチド１２位は非修飾］に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０位［２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドの１１位のヌクレオチドは修飾されておらず、２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの２、４、６、８、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３位［ヌクレオチド１２位は非修飾］に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙはさらに５’末端にキャップヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、末端キャップ部分は脱塩基の非定型的部分、逆方向脱塩基の非定型的部分、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、およびＣ６−イミンリン酸（末端にリン酸を有するＣ６アミノリンカー）から選択される。
【０２２５】
他の実施形態では、本発明は、次に表す構造（Ｍ）を有する化合物を提供する：
（Ｍ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ偽ヌクレオチドおよびヌクレオチドから選択され；
式中ヌクレオチドはそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択され；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は不在であり；
式中ｘ＝１８〜２７であり；
式中ｙ＝１８〜２７であり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２２６】
他の実施形態では、本発明は、次に表す構造（Ｎ）を有する２本鎖化合物を提供する：
（Ｎ）５’（Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は不在であり；
式中ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含み；
式中（Ｎ）ｘ、（Ｎ’）ｙ、または（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙは（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙが２本鎖化合物における１５塩基対未満を形成するように、非塩基対合修飾ヌクレオチドを含む。
【０２２７】
他の実施形態では、本発明は、次に表す構造（Ｏ）を有する化合物を提供する： 
（Ｏ）５’（Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中Ｎはそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中Ｎ’はそれぞれ六員糖ヌクレオチド、七員糖ヌクレオチド、モルホリノ部分、ペプチド核酸およびそれらの組み合わせから選択されるヌクレオチド類似体であり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は不在であり；
式中ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２２８】
他の実施形態では、本発明は、次に表す構造（Ｐ）を有する化合物を提供する：
（Ｐ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ    ３’  （アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  （センス鎖）
式中ＮとＮ’はそれぞれ、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
式中（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙはそれぞれ、連続するＮもしくはＮ’がそれぞれ共有結合により次のＮもしくはＮ’に連結しているオリゴヌクレオチドであり；
式中ＺとＺ’は不在であり；
式中ｘとｙはそれぞれ１８〜４０の整数であり；
式中（Ｎ）ｘもしくは（Ｎ’）ｙの内部にあるＮもしくはＮ’の１つ、または（Ｎ）ｘもしくは（Ｎ’）ｙの末端位にある１つ以上のＮまたはＮ’は、脱塩基部分もしくは２’修飾ヌクレオチドを含み；
式中（Ｎ’）ｙ配列は（Ｎ）ｘと実質的に相補的な配列であり；ならびに式中（Ｎ）ｘ配列は、耳障害に関連した標的遺伝子ｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドと実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【０２２９】
様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、１５位に修飾ヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから選択される。
【０２３０】
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙはさらに、２位に修飾ヌクレオチドを含み、この修飾ヌクレオチドは鏡像体ヌクレオチドおよび脱塩基の非定型的部分から選択される。
【０２３１】
様々な実施形態では、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは奇数位置（５’から３’方向；１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位）に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘはさらに２位と１８位の一方または両方に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【０２３２】
本発明に提供される追加の新規分子は、オリゴヌクレオチド（連続するヌクレオチドを含み、ここでかかるヌクレオチドの第１セグメントは第１の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、かかるヌクレオチドの第２セグメントは第２の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、およびかかるヌクレオチドの第３セグメントは第３の阻害性ＲＮＡ分子をコードする）である。第１、第２および第３セグメントはそれぞれ２本鎖ＲＮＡの１本鎖を含んでよく、第１、第２および第３セグメントはリンカーにより連結していてよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリンカーにより連結している３つの２本鎖セグメントを含んでよい。
【０２３３】
したがって、本発明に提供される１分子は、オリゴヌクレオチド（３個の阻害性ＲＮＡ分子をコードする連続するヌクレオチドを含む）であり；前記オリゴヌクレオチドは、３つの２本鎖腕が１個以上のリンカー（本明細書の上に提示した任意のリンカーなど）により結ばれるように３本鎖構造を保持してよい。この分子は「スター」様構造を形成し、本明細書でＲＮＡスターとも呼び得る。
【０２３４】
前記３本鎖オリゴヌクレオチドは一般構造：
５’    オリゴ１（センス）       リンカーＡ  オリゴ２（センス）       ３’
３’    オリゴ１（アンチセンス） リンカーＢ  オリゴ３（センス）       ５’
３’    オリゴ３（アンチセンス） リンカーＣ  オリゴ２（アンチセンス） ５’
または
５’    オリゴ１（センス） リンカーＡ  オリゴ２（アンチセンス） ３’
３’    オリゴ１（アンチセンス） リンカーＢ  オリゴ３（センス） ５’
３’    オリゴ３（アンチセンス） リンカーＣ  オリゴ２（センス） ５’
または
５’    オリゴ１（センス） リンカーＡ  オリゴ３（アンチセンス） ３’
３’    オリゴ１（アンチセンス） リンカーＢ  オリゴ２（センス） ５’
５’    オリゴ３（センス） リンカーＣ  オリゴ２（アンチセンス） ３’
を有するオリゴリボヌクレオチドでよく、
ここで１個以上のリンカーＡ、リンカーＢまたはリンカーＣが存在し；鎖の極性および分子の一般構造をとどめる限り、２個以上のオリゴヌクレオチドと１個以上のリンカーＡ〜Ｃの任意の組み合わせが可能である。さらに、２個以上のリンカーＡ〜Ｃが存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
【０２３５】
したがって、３本腕構造が形成され、ここでそれぞれの腕は、センス鎖と相補的アンチセンス鎖を含む（すなわちオリゴ１センスと塩基対合するオリゴ１アンチセンスなど）。この３本腕構造は、それによりそれぞれの腕が塩基対合を保持する３本鎖であり得る。
【０２３６】
さらに、上の３本鎖構造では１本以上の鎖にリンカーの代わりに１つのギャップが入っていてよい。１つのギャップが入っているかかる分子は厳密に言うと４本鎖であり、３本鎖ではない；さらなるギャップまたはニックを挿入すると、さらなる鎖を有する分子となる。本発明者らにより得られた予備結果により、前記ギャップ分子は特定の標的遺伝子の阻害において、類似するがギャップが入っていない分子よりも活性があることが示される。これは、ニック分子にも当てはまり得る。
【０２３７】
本発明の１つの好ましい実施形態によると、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖は３’末端のみリン酸化され、５’末端はリン酸化されていない。本発明の別の好ましい実施形態によると、アンチセンス鎖とセンス鎖はリン酸化されていない。本発明のさらに別の好ましい実施形態によると、センス鎖の５’最末端のリボヌクレオチドはインビボ５’−リン酸化のいかなる可能性も排除するために修飾されている。
【０２３８】
本発明は、さらに、細胞における非修飾形態の任意の上記オリゴリボヌクレオチドを発現可能なベクターであり、後で好適な修飾を行ない得るベクターを提供する。好ましい実施形態では、細胞は哺乳類細胞であり、好ましくはヒト細胞である。
【０２３９】
医薬組成物
本発明者らは、治療オリゴヌクレオチドの中耳および内耳への送達のための組成物の開発における多くの障害を克服した。したがって本発明は、１個以上の阻害性オリゴヌクレオチド化合物；浸透エンハンサーおよび薬学的に許容可能なビヒクルもしくは担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、２個以上の異なるオリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡ化合物の混合物を含む。
【０２４０】
「浸透（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）エンハンサー」または「浸透（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）エンハンサー」としては、ポリオール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール（グリセリン）、マルチトール、ソルビトールなど）；ジエチレングリコールモノエチルエーテル、アゾン、塩化ベンザルコニウム（ＡＤＢＡＣ）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルメチルアンモニウム、硫酸デキストラン、ラウリン酸、メントール、メトキシサリチル酸、オレイン酸、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン、ポリソルビン酸塩８０、グリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、スルホキシド、デオキシコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムおよび界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウレス−９、塩化セチルピリジニウムおよびポリオキシエチレンモノアルキルエーテルなど）、安息香酸（サリチル酸ナトリウムおよびサリチル酸メトキシなど）、脂肪酸（ラウリン酸、オレイン酸、ウンデカン酸およびオレイン酸メチルなど）、脂肪族アルコール（オクタノールおよびノナノールなど）、ラウロカプラム、シクロデキストリン、チモール、リモネン、尿素、キトサンならびに他の天然および合成ポリマーが挙げられる。
【０２４１】
本発明の溶液中の封入に好適なポリオールとしては、グリセロールおよび糖アルコール（ソルビトール、マンニトールまたはキシリトールなど）、ポリエチレングリコールおよびその誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、防腐剤を含む。本発明の組成物中に含まれる認められた防腐剤（塩化ベンザルコニウムおよびエデト酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）など）の有効な抗菌作用のために十分な濃度は、組成物の重量に基づき約０．０００１〜０．１％である。
【０２４２】
本発明はさらに、上に開示の１つ以上の遺伝子を阻害する有効量の１つ以上の本発明の化合物と共有または非共有結合している少なくとも１個の本発明の化合物；ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、内因性細胞錯体により細胞内で処理されて本発明の１つ以上のオリゴリボヌクレオチドを産生する。
【０２４３】
さらに、本発明は、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物を本発明の組成物と接触させることを含み、標的遺伝子の発現を対照と比較して少なくとも５０％阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性ｓｉＲＮＡ化合物は、遺伝子発現レベルを対照と比較して少なくとも５０％、６０％または７０％阻害する。特定の好ましい実施形態では、阻害レベルは対照と比較して少なくとも７５％、８０％または９０％である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は本明細書に開示のヒト遺伝子である。
【０２４４】
１つの実施形態では、オリゴリボヌクレオチドは本発明に開示の１つ以上の遺伝子を阻害し、この阻害は遺伝子機能の阻害、ポリペプチドの阻害およびｍＲＮＡ発現の阻害を含む群から選択される。特定の実施形態では、標的遺伝子はウイルス性、細菌性または哺乳類遺伝子である。様々な実施形態では、標的遺伝子は哺乳類遺伝子であり、好ましくはヒト遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜配列番号３６のいずれか１つから選択されるｍＲＮＡを有する。
【０２４５】
１つの実施形態では、化合物は、標的遺伝子にコードされたポリペプチド発現を阻害し、この阻害は、機能阻害（とりわけ、天然遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用子を用いた酵素アッセイまたは結合アッセイにより検査してよい）、タンパク質阻害（とりわけ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法または免疫沈降法により検査してよい）およびｍＲＮＡ発現阻害（とりわけ、ノーザンブロット法、定量ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュのハイブリッド形成またはマイクロアレイハイブリッド形成により検査してよい）を含む群から選択される。
【０２４６】
追加の実施形態では、本発明は、本発明の高値の遺伝子を伴う疾患を呈する対象を治療する方法を提供し、方法は治療有効量の本発明の化合物を対象に投与し、それにより対象を治療することを含む。
【０２４７】
送達
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、外耳へ医薬組成物を直接適用することにより耳へ送達される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は外耳道に適用される。耳（ｅａｒ）への送達は、ｓｉＲＮＡ；浸透エンハンサーおよび薬学的に許容可能なビヒクルを含む耳（ａｕｒａｌ）または耳（ｏｔｉｃ）への送達とも呼び得る。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子はリポソームまたはリポフェクチン剤形などの中で送達され、当業者に周知の方法により調製できる。かかる方法は例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号（本明細書に参照により組み込まれる）に記載されている。
【０２４９】
ｓｉＲＮＡの哺乳類細胞への増強かつ改善された送達を具体的に目的とした送達系が開発されている（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．  ２００３，  ５３９：１１１−１１４；  Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２００２，  ２０：１００６−１０１０；  Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｖｉｓｉｏｎ  ２００３，  ９：  ２１０−２１６；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００３．  ３２７：  ７６１−７６６；  Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎ．  ２００２，  ３２：  １０７−１０８  ａｎｄ  Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ  ２００３，  ３１，１１：  ２７１７−２７２４を参照されたい）。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類における遺伝子発現の阻害のために成功的に使用されている（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｔｉｎａ  ２４（４）：６６０を参照されたい。
【０２５０】
本明細書の目的のための「治療有効量」とはしたがって当該技術分野において知られている検討材料により決定される。この用量は、改善（改善された生存率またはより迅速な回復、または症状の改善もしくは除去ならびに当業者により好適な手段として選択される他の指標が挙げられるが、これらに限定されない）を成し遂げるために有効でなければならない。
【０２５１】
一般に、ヒトに対する化合物の活性用量は、１ｎｇ／ｋｇから約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから約２〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲（レジメン１回／日、または２回もしくは３回もしくは３回超／日、期間１〜４週間もしくは４週間超）である。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡは安定性を増大し、活性を増大し、オフターゲット効果を減らす、およびまたは自然免疫刺激を減らすために化学的に修飾されている。耳への投与量は、とりわけ、オリゴヌクレオチドの活性、適応、および障害の重症度により決定し、約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇ、約１ｎｇ〜約１ｍｇ、または約１０ｎｇ〜約１ｍｇの用量で薬学的に許容可能な薬剤中の総オリゴヌクレオチドを投与することを含む。組成物中のｓｉＲＮＡ濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬである。
【０２５２】
本発明の化合物は局所投与により投与される。この化合物は化合物として、または薬学的に許容可能な塩として投与でき、単独で、または薬学的に許容可能な担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびビヒクルの組み合わせにおける活性成分として投与できることに留意されたい。化合物は点耳剤、耳クリーム剤、耳軟膏、発泡剤、ムースまたは任意の上の組み合わせの送達デバイスとして投与される。化合物の移植も有用である。液体形態は点滴として調製される。液体組成物としては、水性溶液（有機共溶媒含有、もしくは非含有）、水性または油性懸濁液、食用油エマルション、ならびに類似した製薬学的ビヒクルが挙げられる。別の実施形態では、投与は、非侵襲的な局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）または局所（ｌｏｃａｌ）投与を含む。点耳剤（ｅａｒｄｒｏｐ）は点耳剤（ｏｔｉｃ  ｄｒｏｐ）または点耳剤（ａｕｒａｌ  ｄｒｏｐ）とも呼び得る。好ましい実施形態では、この点耳剤は、液滴が外耳道から漏出するのを防ぐために約３０分間外耳道にとどめる。したがってこの点滴を受ける対象は、液滴が外耳道から漏出するのを防ぐために、治療を受ける耳が上向きになる側に頭を保つことが好ましい。
【０２５３】
好ましい実施形態では、治療中の対象は温血動物であり、特に哺乳類（ヒトなど）である。
【０２５４】
治療方法
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の異常発現に関連した耳の疾患または障害の治療が必要な対象の治療方法に関し、医薬組成物（オリゴヌクレオチド、浸透エンハンサーおよび薬学的に許容可能な担体を含む）中において、耳障害に関連した標的遺伝子の発現を軽減または阻害する量のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子を表１に掲載する。好ましい実施形態では、標的遺伝子は１つ以上の：ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３から選択される。
【０２５５】
好ましい実施形態では、治療中の対象は温血動物であり、特に哺乳類（ヒトなど）である。
【０２５６】
本発明の方法は、耳障害に関連した遺伝子の発現を下方制御する１つ以上の阻害性化合物；ならびに薬学的に許容可能なビヒクルを含む医薬組成物を治療有効量で対象に投与し、それにより対象を治療することを含む。
【０２５７】
「処置」という用語は、治療的処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指し、ここで目的は耳障害を予防または遅延化（軽減）することである。処置が必要なものとしては、既に疾患もしくは病態を発現しているもの、疾患もしくは病態を呈する傾向があるもの、および疾患もしくは病態が予防されるべきものが挙げられる。本発明の化合物は、関連する疾患または病態または症状の発現前、発現中または発現後に投与してよい。処置が予防目的である場合、本発明は、疾患または障害の発達遅延化または発現回避方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、３５℃〜約３８℃に加温した点耳剤を対象の耳に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の組成物を片側に、例えば対象の片耳に投与することを含む。様々な実施形態では、組成物は対象の耳に約５分〜約６０分間浸透させることができる。
【０２５８】
本発明の１つの態様は、併用療法に関する。併用療法を構成する活性成分は、単投与量形態を介して併用投与してもよいし、それぞれの活性剤を別々に投与してもよい。いくつかの実施形態では、この併用療法は、本発明による組成物および耳毒性物質を、それらが必要な対象に投与することを含む。例えば、本発明は、哺乳動物に耳毒性物質および治療的有効量の１つ以上の本発明の化合物を併用投与することを含む、哺乳動物における聴力損失治療のための改善された方法に関する。耳毒性薬としては、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、アミノグリコシド、ループ利尿薬、ならびにヒドロキノンおよびそれらの類似体が挙げられる。
【０２５９】
併用投与とは、２種以上の薬剤を投与すること（それぞれの薬剤を製剤化して別々に投与）、または単剤形態で２種以上の薬剤を投与することを含む。２種以上の薬剤を同時投与できるが、必須ではない。例えば、第１薬剤（または併用薬）は第２薬剤（または併用薬）投与の数分、数時間、数日、または数週間前に投与できる。したがって、２種以上の薬剤は互いに数分以内に、または互いに任意の時間内に、または互いに任意の日数または週内に投与できる。いくつかの事例では、より長い間隔でも可能である。
【０２６０】
本発明の遺伝子を阻害する方法、分子および組成物は、本明細書で詳細に論じられ、前記分子および／または組成物のいずれも、任意の前記病態を呈する対象の治療において有益に使用し得る。
【０２６１】
本発明は医薬組成物の調製過程も提供し、これには：
１つ以上の本発明の化合物を提供すること；ならびに
前記化合物を薬学的に許容可能な担体と混合すること
が含まれる。
【０２６２】
本発明は、医薬組成物の調製過程も提供し、これには１つ以上の本発明の化合物を薬学的に許容可能な担体と混合することも含まれる。
【０２６３】
好ましい実施形態では、医薬組成物の調製に用いられる化合物は製薬的有効量の担体と混合される。特定の実施形態では、本発明の化合物はステロイドまたは脂質または別の好適な分子（例えばコレステロール）と共役している。
【０２６４】
オリゴヌクレオチド合成
本発明の化合物は、リボヌクレオチドの（またはデオキシリボヌクレオチドの）オリゴヌクレオチド合成について当該技術分野において周知である任意の方法によって合成できる。かかる合成は、特に、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２；  ４８：２２２３−２３１１；  Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９３；  ４９：  ６１２３−６１９４  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９８７；  １５４：  ２８７−３１３に記載されており；チオエート合成は、特に、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８５；  ５４：  ３６７−４０２に記載されており、ＲＮＡ分子合成はＳｐｒｏａｔ，  ｉｎ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．；  Ｋａｐ．  ２：  １７−３１に記載されており、それぞれの下流過程は、特に、Ｐｉｎｇｏｕｄ  ｅｔ．  ａｌ．，  ｉｎ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒ．Ｗ．Ａ．；  Ｋａｐ．  ７：  １８３−２０８に記載されている。
【０２６５】
他の合成手順は、例えばＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９８７，  １０９：７８４５；  Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ，  １９９０，  １８：５４３３；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ  １９９５，．  ２３：２６７７−２６８４；およびＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．，  １９９７，  ７４：５９に記載されている手順のように当該技術分野において既知であり、これらの手順は一般的な核酸保護基および結合基を使用してよい（５’末端のジメトキシトリチルなど、および３’末端のホスホラミジトなど）。この修飾（例えば２′−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドは所望により組み込まれる。
【０２６６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２，  ２５６：９９２３；国際公開特許第９３／２３５６９号；  Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ  １９９１，  １９：４２４７；  Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９７，  １６：９５１；  Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９９７，  ８：２０４）、または合成および／もしくは脱保護後のハイブリッド形成により別々に合成して合成後に、連結できる。
【０２６７】
市販の機器（とりわけ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能の機器）を使用できることに留意されたい；このオリゴヌクレオチドは本明細書に開示の配列により調製される。化学的に合成された断片の重複対は、当該技術分野において周知の方法（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照されたい）を用いてライゲーションできる。この鎖は別々に合成されて、次いで管内で互いにアニーリングされる。次いで、この２本鎖ｓｉＲＮＡは、ＨＰＬＣにより（例えばそれらの１つが過剰であったために）アニーリングされなかった１本鎖オリゴヌクレオチドから分離される。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ断片に関して、２つ以上のかかる配列を、本発明における使用のために、合成して結ぶことができる。
【０２６８】
本発明の化合物は、例えば米国特許第２００４／００１９００１号（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載されているように、タンデム合成方法を介して合成することもでき、この方法では、ハイブリッド形成してｓｉＲＮＡ２本鎖の精製を可能にする別々のｓｉＲＮＡ断片または鎖を得るために後に切断される、切断可能なリンカーによって分離された単一の隣接するオリゴヌクレオチド断片または鎖として両ｓｉＲＮＡ鎖が合成される。このリンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーとすることができる。
【０２６９】
本発明はさらに、本明細書で述べた任意の疾患および病態の治療のための２つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供し、前記２分子は医薬組成物内で同一でも有益な活性を生じる量で物理的に併せて混合してもよく、または共有結合していても非共有結合していてもよく、または長さ２〜１００個、好ましくは２〜５０個もしくは２〜３０個の範囲のヌクレオチドの核酸リンカーにより連結していてもよい。
【０２７０】
したがって、このｓｉＲＮＡ分子は共有結合していても非共有結合していてもよく、またはリンカーにより連結してタンデムｓｉＲＮＡ化合物を形成していてもよい。２つのｓｉＲＮＡ配列を含むかかるタンデムｓｉＲＮＡ化合物は、典型的には長さ約３８〜１５０個のヌクレオチド、より好ましくは長さ３８個または４０〜６０個のヌクレオチドであり、タンデム分子に２つより多くのｓｉＲＮＡ配列が含まれている場合はそれに応じてより長い。細胞内プロセシング（例えば、長いｄｓＲＮＡ）を介して産生されたｓｉＲＮＡをコードする２つ以上のより長い配列を含むより長いタンデム化合物は、２つ以上のｓｈＲＮＡをコードするタンデム分子として予想もされる。かかるタンデム分子も本発明の一部として考慮される。２つ以上の本発明のｓｉＲＮＡ配列を含むタンデム化合物が予想される。
【０２７１】
耳障害に関連した遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、医薬組成物中の主要活性成分であり得、または２つ以上のｓｉＲＮＡ（または２つ以上のｓｉＲＮＡをコードもしくは内生的に産生する分子、分子の混合物、または２つ以上のｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のタンデム分子）を含む医薬組成物の一活性成分であり得、前記医薬組成物はさらに１つ以上の追加の遺伝子を標的とする１つ以上の追加のｓｉＲＮＡ分子を含む。前記追加の遺伝子（１つ以上）の同時阻害は、本明細書に開示の疾患治療のための相加効果または相乗効果を有する可能性が高い。
【０２７２】
さらに、本明細書に開示のｓｉＲＮＡ、またはかかるｓｉＲＮＡを含有もしくはコードする核酸分子はいずれも、本明細書に開示の疾患治療用に増強した標的を成し遂げるために、標的細胞上で発現する細胞表面で内在化可能な分子に対する抗体（アプタマー分子など）と（共有または非共有で）結ばれるもしくは結合することができる。例えば、抗Ｆａｓ抗体（好ましくは中和抗体）は、任意の他のｓｉＲＮＡと（共有または非共有）結合できる。
【０２７３】
本発明の化合物は、例えば２本鎖化合物として、２本鎖ヘアピン化合物としてまたはタンデム化合物として送達できる。１つ以上のステムおよびループ構造を含み、ステム領域に本発明のオリゴヌクレオチド配列を含む長いオリゴヌクレオチド（典型的には長さ２５〜５００個のヌクレオチド）は、担体（好ましくは薬学的に許容可能な担体）中で送達し得、内因性細胞錯体により（例えば上記のようなＤＲＯＳＨＡおよびＤＩＣＥＲにより）細胞内で処理されて本発明のオリゴヌクレオチドである１つ以上の低分子２本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を産生し得ると予想もされる。このオリゴヌクレオチドはタンデムｓｈＲＮＡコンストラクトと称することができる。この長いオリゴヌクレオチドは１本鎖オリゴヌクレオチド（１つ以上のステムおよびループ構造を含み、ここでそれぞれのステム領域は、本発明の遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含む）であることが予想される。特に、このオリゴヌクレオチドは表１に示す群から選択される哺乳類遺伝子から転写されたｍＲＮＡに関連するアンチセンス配列（Ｎ）ｘを含むことが予想される。好ましい実施形態では、標的遺伝子は１つ以上の：ＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３から選択される。
【０２７４】
ＲＮＡｉ現象に関するいくつかのＰＣＴ出願が最近公開された。これらとしては：ＰＣＴ国際公開特許第００／４４８９５号；ＰＣＴ国際公開特許第００／４９０３５号；ＰＣＴ国際公開特許第００／６３３６４号；ＰＣＴ国際公開特許第０１／３６６４１号；ＰＣＴ国際公開特許第０１／３６６４６号；ＰＣＴ国際公開特許第９９／３２６１９号；ＰＣＴ国際公開特許第００／４４９１４号；ＰＣＴ国際公開特許第０１／２９０５８号；およびＰＣＴ国際公開特許第０１／７５１６４号が挙げられる。
【０２７５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡ種が細胞質タンパク質複合体に入る能力に基づき、次いで相補的細胞ＲＮＡに対する標的とされ、それを特異的に分解する。このＲＮＡ干渉反応は、ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、一般に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれ、ｓｉＲＮＡ２本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ２本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で生じ得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  ２００１，  １５（２）：１８８−２００）。より詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮアーゼにより、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片（短い阻害ＲＮＡ、「ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる）に消化される（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡなど；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００１，  ４０９（６８１８）：３６３−６；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００３，  ４２５（６９５６）：４１５−９）。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらの断片および相補的ｍＲＮＡを認識する。全体の過程は、最終的に、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断を生じる（ＭｃＭａｎｕｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，  ２００２，  ３（１０）：７３７−４７；  Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＆  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００３，  ５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提案される機構に関する追加情報については、例えばＢｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  ２００１，  ７（１１）：１５０９−２１；  Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，  Ｃｅｌｌ  ２００１，  １０７（４）：４１５−８およびＰＣＴ国際公開特許第０１／３６６４６号を参照されたい）。
【０２７６】
いくつもの集団が細胞内のｓｉＲＮＡを発生可能なＤＮＡベースのベクター開発について記載している。この方法は概して、細胞内ｓｉＲＮＡを形成するために効率よく処理される短いヘアピンＲＮＡ転写に関与する（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００２，  ９９：１４４３−１４４８；  Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆ Ｄｅｖ  ２００２，  １６：９４８−９５８；  Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００２，  ８：５５１５−５５２０；およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，  ２９６：５５０−５５３）。これらの報告は、幾多の体内外発現遺伝子を特異的に標的とできるｓｉＲＮＡの生成方法を述べている。
【０２７７】
本発明は例証的に記載されており、使用される用語は、述べられる言葉の本質を意図するものであって、制限するものではないことが理解されるべきである。
【０２７８】
明らかに、上の教示に照らして本発明の多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で本発明を明細記載したとおり以外にも実施できることが理解される。
【０２７９】
本願全体で、様々な刊行物（米国特許など）が、著者、年、および特許番号により参照される。これらの刊行物、特許および特許出願の開示は、本発明が関連する分野の状態をより詳細に述べるために、それらの全体が本願への本明細書に参照により組み込まれる。
【０２８０】
本発明は、実施例を参照しながら下に詳細に例証するが、それに限定されるものとは解釈されない。
【０２８１】
本明細書におけるいかなる文献の引用も、かかる文献が、好適な先行技術であること、または本願の特許請求の範囲の特許性に対して考慮される文献であることを承認することを意図しない。いかなる文献の内容または日付に関するいかなる記述も、出願の時点で出願人に入手可能な情報に基づいており、かかる記述の正確性に関する承認を構成するものではない。
【実施例】
【０２８２】
これ以上詳述しなくても、当業者は上記の本明細書を用いて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、下記の好ましい具体的な実施形態は、単に例証的に解釈されるべきであり、いかなる意味でも特許請求の範囲に規定された本発明を限定するものではない。
【０２８３】
材料および方法：概要
本明細書に特記していない当該技術分野において既知である標準分子生物学的プロトコールは概して基本的にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ  （１９８９，  １９９２）のとおり、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８８）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）のとおり、およびＰｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）のとおり、およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＢｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （ｅｄｓ）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌｓ．  １−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）のとおりに従い、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号；４，６８３，２０２号；４，８０１，５３１号；５，１９２，６５９号および５，２７２，０５７号に説明されている方法論に従い、これらは本明細書に参照により組み込まれる。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を概してＰＣＲプロトコール：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）のように行なった。フローサイトメトリーと併用したインサイチュ法（細胞内）ＰＣＲを細胞（特異的ＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含む）検出に使用できる（Ｔｅｓｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １９９６，  ８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲの実施方法も当該技術分野において周知である。
【０２８４】
細胞培養：
ＨｅＬａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）をＣｚａｕｄｅｒｎａ，  ｅｔ  ａｌ．  （ＮＡＲ，  ２００３．  ３１：６７０−８２）に記載されているように培養した。ヒトケラチノサイトを１０％ＦＣＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃で培養した。マウス細胞系、Ｂ１６Ｖ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を、１０％ＦＣＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃で培養した。培養条件は（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９９７  Ｍａｙ；  １９（４）：２３１−９）に記載されているとおりとした。
【０２８５】
それぞれの場合において、これらの細胞を約５０，０００細胞／ウェルの集密度で本明細書に記載されているように実験に供し、本発明による２本鎖核酸を２０ｎＭで添加し、それによりこの２本鎖核酸を独自の脂質１μｇ／ｍＬを用いて下記のとおり複合体化した。
【０２８６】
低酸素症様病態の誘発：
必要な場合、低酸素症様病態を誘発するために細胞をＣｏＣｌ２で次のとおり処置した：ｓｉＲＮＡトランスフェクションを１０ｃｍプレート（３０〜５０％密度）内でＣｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３によって記載されているように行なった。簡単に述べると、血清非含有培地中のＧＢと脂質の複合体（１０倍濃縮）を完全培地中の細胞に添加することによりｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行なった。総トランスフェクション容積は１０ｍＬであった。特に指示しない限り、脂質の最終濃度は１．０μｇ／ｍＬ；ｓｉＲＮＡの最終濃度は２０ｎＭであった。溶解の２４時間前に組織培養培地にＣｏＣｌ２（１００μＭ）を直接添加して低酸素反応の誘発を実行した。
【０２８７】
細胞抽出体の調製および免疫ブロット法
細胞抽出体の調製および免疫ブロット法分析を基本的に記載されているとおりに行なった（Ｋｌｉｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９８．  １８：５６９９−７１１；  Ｋｌｉｐｐｅｌ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９６．  １６：４１１７−２７）。
【実施例１】
【０２８８】
ｓｉＲＮＡ化合物のインビトロ試験
６ウェルプレートに、ウェル当たり約１．５〜２×１０５試験細胞（ヒト遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに対するＨｅＬａ細胞および／もしくは２９３Ｔ細胞、およびラット／マウス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに対するＮＲＫ５２細胞および／もしくはＮＭＵＭＧ細胞）を播種した（７０〜８０％集密）。
【０２８９】
２４時間後、５ｎＭまたは２０ｎＭの最終濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞をｓｉＲＮＡ化合物と共にトランスフェクションした。この細胞を、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で７２時間インキュベートした。
【０２９０】
トランスフェクションの陽性対照として、ＰＴＥＮ−Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡ化合物を使用した。使用した追加の陽性対照は平滑端１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ、すなわちｘ＝ｙ＝１９であり、式中ＺとＺ’はいずれも不在であった。このｓｉＲＮＡはリン酸化されておらず、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の糖残基２位で修飾されたリボヌクレオチドを交互に有し、この２位部分はメトキシ（２’ＯＭｅ）であり、このアンチセンス鎖の５’末端と３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されており、センス鎖の５’末端と３’末端のリボヌクレオチドの糖残基は修飾されていない。
【０２９１】
ｓｉＲＮＡ活性の陰性対照としてＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ化合物を使用した。
【０２９２】
トランスフェクションの７２時間後、細胞をハーベストし、細胞からＲＮＡを抽出した。蛍光顕微鏡法により、トランスフェクション効率を試験した。
【０２９３】
特異的な好ましいｓｉＲＮＡ構造を用いた遺伝子発現の阻害％を、内在性遺伝子を発現する細胞における標的遺伝子の定量ＰＣＲ分析を用いて測定する。概して、インビトロ試験用に選択された特異的配列を有するｓｉＲＮＡは、ヒトおよび２種目（ラットまたはウサギ遺伝子など）に対して特異的であった。いくつかの実施例では、これらのＲＮＡ配列を有するｓｉＲＮＡを用いて類似した結果が得られ、本明細書に記載されているように修正される。本明細書で試験したｓｉＲＮＡオリゴマーは図４、米国特許出願第第１１／９７８，０８９号（それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる）の表Ｂのオリゴヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物から選択され、配列番号９７〜６８６５４として表される。本明細書で試験したｓｉＲＮＡオリゴマーは、米国特許出願第またはＰＣＴ国際公開特許第１１／２０７１１９号、同第１１／８１１，１１２号、同第１１／６５５６３６号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００８／０００７９７号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００８／０００８７４号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００９／００００５３号、ＰＣＴ／イスラエル特許第２００９／０００３０２号（それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる）にも開示されている。
【実施例２】
【０２９４】
Ｃｙ３標識ＤＤＩＴ４＿１  ｓｉＲＮＡの中耳／内耳送達経路。
本試験の目的は次のとおりであった：治療オリゴヌクレオチドの中耳／内耳への局所的、非侵襲的送達手順を確立すること。
【０２９５】
医薬組成物をラット右外耳道（ＲＥＡＣ）へ滴下後の、ｓｉＲＮＡ  ＤＤＩＴ４−Ｃｙ３の蝸牛構造内分布の一時的パターンを推定すること。
【０２９６】
試験した物質はＲＴＰ８０１（ＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３）（センス鎖：ＧＵＧＣＣＡＡＣＣＵＧＡＵＧＣＡＧＣＵ；アンチセンス鎖：ＡＧＣＵＧＣＡＵＣＡＧＧＵＵＧＧＣＡＣ）に対するＣｙ３標識ｓｉＲＮＡであった。
【０２９７】
試験材料の詳細：２本鎖Ｃｙ３標識１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ、Ｃｙ３はアンチセンス鎖３’末端にｄＴヌクレオチドを介して結ばれる。センス鎖とアンチセンス鎖の両鎖において２’−ＯＭｅ修飾を交互に、アンチセンス鎖のすべての奇数ヌクレオチドとセンス鎖のすべての偶数ヌクレオチド上に組み込む。無菌条件下で、４２．４３ｍｇのＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３粉末剤（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ）を２．１ｍＬ無菌再蒸留水中に溶解し、透明な２０ｍｇ／ｍＬ（１．５ｍＭ）溶液を作製する。この溶液を使用時まで８０℃で保存した。製剤化（製剤化化合物）無菌１０ｍｇ／ｍＬ  Ｃｙ３ＤＤＩＴ４＿１のピロゲンを含まない２０％無菌グリセロール溶液。
対照物質（１つ以上）（陽性／陰性対照およびビヒクルなど）
ビヒクル−ピロゲンを含まない２０％無菌グリセロール溶液。
試験系：雄性ラット、１０〜１４週齢、体重２００〜２２０ｇ
【０２９８】
実験設計：本試験は、下表２に記載するように、５つの実験群を含んだ：実験群Ｉ〜ＩＶ群−（ｓｉＲＮＡ（ＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３）グリセロールベースの点耳剤／ラット３匹／時点で処置）およびＶ群（ａ；ｂおよびｃ）−ラット３匹／時点（２０％グリセロールで処置した対照群）。ラットを単ｓｉＲＮＡ（ＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３）グリセロールベースまたは２０％グリセロール単独の点耳剤（３７℃に加温；片耳のみ処置：ａ．ｄ．＝ａｕｒｉｏ  ｄｅｘｒｔａ＝右耳（右外耳道：ＲＥＡＣ）／ａ．ｓ．  ａｕｒｉｏ  ｓｉｎｉｓｔｅｒ＝左耳を非処置対照として使用）で次のように処置した。
【０２９９】
Ｉ〜ＩＶ群：用量レジーム：１００μｇ／１０μＬ／耳の２０％グリセロール／時点、投与経路：ＲＥＡＣ  ラット３匹／時点。
【０３００】
Ｖ群（ａ〜ｃ）：ＲＥＡＣ  １０μＬの２０％グリセロール単独処置対照。
表２：試験設計
【表２】
0005524189.tif 000003
【０３０１】
投与用の試験物質と対照物質の調製：１ｍＬの１００％グリセロールと４ｍＬピロゲン非含有水を３０分間以上反転して混合した。
【０３０２】
麻酔：ラットをエクイセシン４ｍＬ／ｋｇ体重で麻酔した。
【０３０３】
右外耳道（ＲＥＡＣ）送達：１０μＬ試料容積（加温したグリセロールベースの点耳剤、３７℃）をピペット鈍端を用いてゆっくりと外ＲＥＡＣに滴下した。この容積をそれぞれの右耳に送達した（試験設計によるＩ〜ＩＶ群）。ＲＥＡＣ滴下中および滴下後、ラットを観察し、意識回復後にケージに戻した。
【０３０４】
予定した安楽死：全群のラットを本試験設計により安楽死させた（表２、終了時点）。
【０３０５】
終了工程：心臓穿刺および採血により行なった；さらなるｓｉＲＮＡ血液検出分析（予備）用に血清／血漿を集めて保存した（−２０℃）。
【０３０６】
組織収集：ラットを屠殺した。左右の側頭骨（蝸牛など）を全動物から穏やかにハーベストし；ならびに下記のとおり骨性蝸牛を調製して凍結切片用に処理した。
【０３０７】
凍結切片のための組織包埋プロトコール
せん孔した骨性蝸牛：蝸牛膜の蝸牛頂を固定剤（４％ＰＦＡのＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２〜７．４）中に置き、ローター上で回転しながら、室温で１．５時間インキュベートした。この試料を回転しながらＰＢＳで３回、各５分間洗浄した。この骨性蝸牛を１０％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）中で一晩以上、４℃で回転しながら脱灰した。鉗子／シリンジ針により骨性蝸牛上で穏やかに押して脱灰を確定した。脱灰にさらに長い時間が必要とされる場合、脱灰溶液（新規の１０％ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液）を変更した。
【０３０８】
浸透工程：１０％および３０％ショ糖のＰＢＳストック溶液を調製した。この組織をＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）中で２回、各５分間リンス後、組織ローター上で回転しながら室温で１０％ショ糖中で３０分間洗浄した。この組織を室温で回転しながら１０：３０％ショ糖の２：１溶液中で３０分間洗浄後、室温で回転しながら１０：３０％ショ糖の１：１溶液中で３０分間洗浄し、次いで室温で回転しながら１０：３０％ショ糖の１：２溶液中で３０分間、および最後に４℃で３０％ショ糖中で回転しながら一晩洗浄した。
【０３０９】
この蝸牛をＯＣＴ脱気（デシケーター中で３０分）して管内に移し、バイアルを４℃で一晩回転しながら維持した。
【０３１０】
この蝸牛をＯＣＴ中に置き、包埋用鋳型の底と平行な蝸牛軸を介して仮想平面を並べることにより配向してから、凍結切片化のためにクリオスタットに配置した。
【０３１１】
検討：
ｓｉＲＮＡ送達を蛍光顕微鏡法とデジタル画像を用いて検討した。組織学的（顕微鏡的）評価により特定の蝸牛構造内の明確な蛍光シグナルが示された場合のみ、組織断片（蝸牛）を陽性（すなわち、移入したＣｙ３  ＤＤＩＴ４＿１  ｓｉＲＮＡの取り込みに成功した）とみなす。背景ＤＡＰＩ染色により、蝸牛組織（解剖学的または局所解剖学的）構造の同定を補助した。組織学的評価が群内で一貫性を示した場合（すなわち時点、経時変化など）、内耳送達を陽性とみなした。
【０３１２】
図１は、点耳剤（２０％グリセロール中で製剤化されたＣｙ３標識ｓｉＲＮＡを含む）適用後の、コルチ器頂回転中らせん神経節（コルチ神経節）へのＣｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの送達を示す。上パネルは４０倍のファロイジン標識細胞（左パネル）、明視野（ＢＦ、右パネル）およびそのマージ（中央パネル、Ｍ）である。下パネルは６０倍のファロイジン標識細胞（左パネル）、明視野（ＢＦ、右パネル）およびそのマージ（中央パネル、Ｍ）である。点耳剤適用（Ｃｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの２０％グリセロール溶液１０μＬの１００μｇ）から３日後、このラットを４％ＰＦＡで潅流した。側頭骨を除去し、骨性蝸牛を切開した。アクチンフィラメントに結合するＡｌｅｘａ４８８標識ファロイジンでコルチのホールマウントを調製した。ｓｉＲＮＡ送達を共焦点顕微鏡検査およびデジタル画像を用いて検討した。組織学的（顕微鏡的）評価により特定の細胞または構造内に明確な蛍光シグナルが示された場合のみ、組織断片を陽性（すなわち、移入したＣｙ３  ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みに成功した）とみなした。
【０３１３】
図２はコルチ器の基底回転、第２回転および頂回転中の外有毛細胞、内有毛細胞および支持細胞の３列におけるＣｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡ送達を示す。点耳剤適用（Ｃｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの２０％グリセロール溶液１０μＬの１００μｇ）から３日後、Ｃｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡ送達を決定した。
【０３１４】
図３はラット聴覚上皮へのＣｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡ送達を示す。上パネルは切開した（４％ＰＦＡ潅流）ラット骨性蝸牛である。下パネルは聴覚上皮の基底回転、第２回転および頂回転へのＣｙ３標識ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡ送達を示す。
【実施例３】
【０３１５】
ラット内耳の製剤化したＣｙ３−ＤＤＩＴ４＿１  ｓｉＲＮＡの非侵襲的送達評価
試験材料の詳細：２本鎖Ｃｙ３標識１９ｍｅｒ  ＤＤＩＴ４＿１  ｓｉＲＮＡ、Ｃｙ３は余分な‘ｄＴ’ヌクレオチドを介してアンチセンス鎖の３’末端に結ばれている。センス鎖とアンチセンス鎖の両方が、アンチセンス鎖のすべての奇数ヌクレオチド上およびセンス鎖のすべての偶数ヌクレオチド上の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを交互に組み込む。
【０３１６】
３つの異なる製剤を試験した：
製剤１：１００μｇ  Ｃｙ３  ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの１０μＬ  ３０％グリセロール溶液。
製剤２：１００μｇ  Ｃｙ３  ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの１０μＬ  ＰＢＳ溶液。
製剤３：１００μｇ  Ｃｙ３  ＤＤＩＴ４  ｓｉＲＮＡの１０μＬ  ２０％鉱油（ｖ／ｖ）、４０％プロピレングリコール（ｖ／ｖ）および１０％エタノール（ｖ／ｖ）溶液。
【０３１７】
右外耳道（ＲＥＡＣ）送達：１０μＬ試料容積（製剤化し加温した点耳剤、３７℃）をピペット鈍端を用いてゆっくりと外ＲＥＡＣに滴下した。この容積を右耳に送達した。ＲＥＡＣ滴下中および滴下後、ラットを反対側で４０分間保ち、回復後にラットのケージに戻した。
【０３１８】
組織収集：ラットを断頭した。全動物から両側の頭骨を穏やかにハーベスト後、１０％中性緩衝ホルマリンでさらに１時間固定した。その後、骨性蝸牛を切開してから、Ａｌｅｘａ４８８−ファロイジン免疫染色、コルチ器のホールマウント調製およびＤＡＰＩ染色を用いた反対側の染色を行なった。
【０３１９】
ｓｉＲＮＡ送達を蛍光顕微鏡法およびデジタル画像を用いて検討した。組織学的（顕微鏡的）評価により特定の蝸牛構造内で明確な蛍光シグナルが示された場合のみ、組織断片（コルチ器）を陽性（すなわち、Ｃｙ３  ＤＤＩＴ４＿１  ｓｉＲＮＡ送達に成功した）とみなした。背景ＤＡＰＩ染色を用いて蝸牛組織構造を同定した。組織学的評価がコルチ器の全回転部分（基底回転、第２回転、頂回転）で一貫性があった場合、内耳送達を陽性とみなした。
【０３２０】
結果：３０％グリセロール（製剤１）または２０％鉱油（ｖ／ｖ）、４０％プロピレングリコール（ｖ／ｖ）および１０％エタノール（ｖ／ｖ）（製剤３）を点耳剤を用いて適用後、内耳蝸牛構造内へのｓｉＲＮＡ送達陽性を検出した。コルチ器の全回転部分およびらせん神経節が１００μｇ量で標識されたが、鉱油製剤のシグナルはグリセロール製剤より弱かった。
【実施例４】
【０３２１】
シスプラチン投与後のラット内耳ｐ５３タンパク質発現レベルの誘発性ノックダウンの点耳剤によるＱＭ５  ｓｉＲＮＡ処置
この実験の目的は、ＱＭ５  ｓｉＲＮＡ（ラットｓｉＲＮＡ標的ラットｐ５３）含有点耳剤で処置したラット内耳（蝸牛）中のシスプラチン誘発性ｐ５３タンパク質のノックダウンを検討することであった。
【０３２２】
実験群Ｉ群：ＱＭ５  ｓｉＲＮＡ（センス鎖：ＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＡ；アンチセンス鎖：ＵＵＵＵＧＣＧＧＡＡＡＵＵＵＵＣＵＵＣ）で１回処置した：点耳剤（ＥｒＤ）により用量１００μｇ／３０％グリセロール／１０μＬを送達、経路：ＲＥＡＣ；１日目、シスプラチンの初回投与前にＱＭ５  ｓｉＲＮＡ処置を実施した。反対側の横向きの耳（左）を未処置対照とした。アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の糖残基２位で修飾された交互のリボヌクレオチド（この２位部分はメトキシ（２’ＯＭｅ糖修飾）である）としてＱＭ５  ｓｉＲＮＡを設計した。
【０３２３】
実験群ＩＩ群：未処置の正常な対照ラット
実験設計：
【表３】
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【０３２４】
測定変数：体重、血清クレアチニンおよびＥＬＩＳＡによるＰ５３タンパク質シグナル。
【０３２５】
Ｐ５３タンパク質シグナル
シスプラチン対照群（試料２）のＰ５３タンパク質シグナルレベルは未処置群（試料１）と比較して４９％上昇を示した。すなわち、シスプラチン処置ラットは、未処置ラットに対して蝸牛中ｐ５３レベル上昇を示した。ＱＭ５  ｓｉＲＮＡ処置によりｐ５３シグナルが２．６９に低下し、これは未処置群と比較して１２％高いのみであった。
表３：シスプラチン投与後のラット内耳ｐ５３タンパク質発現レベルの誘発性ノックダウンの点耳剤によるＱＭ５  ｓｉＲＮＡ処置
【表４】
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【実施例５】
【０３２６】
ラットにおけるＬ−ＤＮＡ構造における蛍光標識ｓｉＲＮＡの内耳送達。
試験材料の詳細：無菌１０ｍｇ／ｍＬ  Ｃｙ３−ＡＳ−ＣＡＳＰ２＿４−Ｓｔｒｕｃ−Ｌ−ＤＮＡ（アンチセンス鎖における交互の２−Ｏ−メチル化およびセンス鎖１８位におけるＬ−ＤＮＡヌクレオチド；センス：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵアンチセンス：ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣ）またはＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３．５（センス鎖およびアンチセンス鎖中の交互の２−Ｏ−メチル化）のピロゲンを含まない３０％無菌グリセロール溶液。Ｃｙ３はアンチセンス鎖の３’末端に結ばれている。
【０３２７】
概要：本試験は表４に記載するように実験群４群を含んだ：実験群Ｉ〜ＩＶ群（ｓｉＲＮＡ（ＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３．５またはＣｙ３−ＡＳ−ＣＡＳＰ２＿４−Ｓｔｒｕｃ−Ｌ−ＤＮＡ）グリセロールベースの点耳剤で処置）。ラットを次のとおり単回のｓｉＲＮＡの点耳剤（ＥｒＤ）で処置した。
【０３２８】
Ｉ〜ＩＶ群：用量レジーム：１００μｇ／１０μＬ／耳の３０％グリセロール投与経路：ＲＥＡＣ（右外耳道））／片耳（Ｉ群およびＩＩＩ群）およびＲＥＡＣ／ＬＥＡＣ（右／左外耳道）／両耳（ＩＩ群およびＩＶ群）。
表４：試験設計
【表５】
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【０３２９】
右外耳道（ＲＥＡＣ／片耳）送達：１０μＬ試料容積（加温したグリセロールベースの点耳剤、３７℃）をピペット鈍端を用いてゆっくりとＲＥＡＣに滴下した。この容積をそれぞれ右耳に送達した（試験設計によるＩ群およびＩＩＩ群）。ＲＥＡＣ滴下中および滴下後、反対側を下側にしてラットを横向きに寝かせ（左向き）、４０分間保ち、次いで回復後にラットのケージに戻した
【０３３０】
左右両耳の外耳道（ＲＥＡＣ／ＬＥＡＣ／両耳）送達：１０μＬ試料容積（加温したグリセロールベースの点耳剤、３７℃）をピペット鈍端を用いてゆっくりと外ＲＥＡＣに滴下した。この容積をそれぞれの右耳（試験設計によるＩＩ群およびＩＶ群）に送達した。ＲＥＡＣ滴下中および滴下後、反対側を下側にしてラットを横向きに寝かせ（左向き）、３０分間保った後、右向きに変えて、１０μＬ試料容積（加温したグリセロールベースの点耳剤、３７℃）をピペット鈍端を用いてＬＥＡＣ内にゆっくりと滴下してさらに３０分間保ち、回復後にラットのケージに戻した
【０３３１】
組織収集：ラットを断頭した。左右の側頭骨（蝸牛など）を集めて４％ＰＦＡ固定後、コルチのホールマウント染色を実施した。
【０３３２】
検討：ｓｉＲＮＡ送達を光学顕微鏡検査およびデジタル画像を用いて検討した。組織学的（顕微鏡的）評価が特異的な蝸牛構造内で明確な蛍光シグナルを示した場合のみ、組織断片（蝸牛）を陽性（すなわち、ｓｉＲＮＡ送達に成功した）とみなした。背景ＤＡＰＩ染色を用いて蝸牛組織構造の同定を補助した。
【０３３３】
結果：点耳剤によるｓｉＲＮＡ適用後の内耳蝸牛構造へのｓｉＲＮＡ送達陽性が両ｓｉＲＮＡ分子（交互の構造のＣｙ３．５標識ＤＤＩＴ４、およびＬ−ＤＮＡ構造のＣｙ３標識Ｃａｓｐ２＿４）において観察された。片耳適用（右耳）により送達されたｓｉＲＮＡは濃度１００μｇの３０％加温グリセロール溶液で、コルチ器の全回転部分およびらせん神経節において検出された。
【実施例６】
【０３３４】
ｓｉＲＮＡ定量化により決定した、点耳剤形態を用いたラット内耳組織へのｓｉＲＮＡ送達に対するグリセロール濃度の影響。
６−Ａ：ラットを点耳剤（２００μｇ  ｓｉＲＮＡ／１０μＬ  ＰＢＳ、５％、１０％、２０％または３０％グリセロール含有）の片耳適用に供した。ｓｉＲＮＡ濃度は１０ｍｇ／ｍＬであり、試験したｓｉＲＮＡ分子はＣＡＳＰ２＿ｍＲＮＡ（アンチセンス鎖中に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを交互に有し、センス鎖１８位にＬ−ＤＮＡヌクレオチドを有するＣＡＳＰ＿４  ｓｉＲＮＡ分子、センス配列：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵアンチセンス配列：ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣ）に特異的であった。点耳剤を適用してから４時間後に蝸牛組織を切開し、組織中ｓｉＲＮＡ量を定量ＰＣＲを用いて定量的に測定した。この実験で得られた定量結果を下表５に要約する。
【０３３５】
これらの結果により、点耳剤による蝸牛へのｓｉＲＮＡ送達は点耳剤形態が担体として５〜２０％グリセロールを含有時に有効であったことが示された。点耳剤による蝸牛へのｓｉＲＮＡ送達は点耳剤形態が担体として１０％グリセロールを含有時に最も有効であった。
表５：
【表６】
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【０３３６】
６−Ｂ：上の実験を、動物のシスプラチン処置を除いて同一形式で行なう。１０の実験群（各群ラット６匹）は次のとおりである：群を単回のｓｉＲＮＡ投与で処置する：用量１００ｍｇ／１０ｍＬのＰＢＳ、５％、１０％、２０％、２５％または３０％グリセロール溶液を点耳剤（ＥｒＤ）で経路：ＲＥＡＣにより送達した。１日目（試験開始）、シスプラチン初回投与（シスプラチン用量レジーム：４ｍｇ／ｋｇ連日；投与経路：腹腔内投与；注射容積：２５０ｇ体重ラットに対し１ｍＬ）の２４時間前にｓｉＲＮＡ処置を実施する。ラットを３回の連続したシスプラチン腹腔内注射（ストック濃度：５０ｍｇ／ｍＬ；ＬＤ５０腹腔内用量６．４ｍｇ／ｋｇ）に供する。試験開始後５日目、最終シスプラチン投与から２４時間後に終了工程を実施する。試験群と同一様式で、対照群をビヒクルＥｒＤ  １０μＬの単回適用で処置する。１つの実験群は未処置インタクト対照である。予定した安楽死を本試験設計により実施する。ＳｉＲＮＡはＴＰ５３ＢＰ２（ＡＳＰＰ２）、ＢＮＩＰ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＤＤＩＴ４、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＮＯＸ４、ＨＴＲＡ２、ＣＡＰＮＳ１（カルパイン）、ＩＤ３、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３遺伝子を標的とする。
【実施例７】
【０３３７】
聴力損失のチンチラモデル
（ｉ）カルボプラチン誘発性またはシスプラチン誘発性の、蝸牛の有毛細胞死のチンチラモデル
チンチラの左耳に、５％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％または３０％グリセロール溶液または他の浸透エンハンサー中で特異的ｓｉＲＮＡを直接投与することにより、各チンチラを前処置する。プラセボとして、各動物の右耳にグリセロールまたは他のビヒクル／薬剤（最終濃度は同一）を与える。本発明の特異的ｓｉＲＮＡ化合物の投与から２日後、動物を、カルボプラチン（７５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）またはシスプラチン（３０分にわたる１３ｍｇ／ｋｇの腹腔内注入）で処置する。
これらのチンチラを屠殺後（カルボプラチン処置の２週間後）、左耳（ｓｉＲＮＡ処置）および右耳（生理食塩水処置）の、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）の細胞死％を計数する。内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）の細胞死％は、右耳（ビヒクル対照）よりも、左耳（ｓｉＲＮＡ処置）の方が低いことが計数される。
【０３３８】
（ｉｉ）音響誘発性の蝸牛の有毛細胞死のチンチラモデル
音響外傷モデルにおける特異的ｓｉＲＮＡの活性を、チンチラにおいて研究する。動物を、２時間半１０５ｄＢで、４ｋＨｚを中心とした騒音のオクターブ帯域に曝露する。騒音に曝露させたチンチラの左耳を、１０μＬのグリセロール溶液中の３０μｇのｓｉＲＮＡで前処置し（音響外傷の４８時間前）、右耳は、ビヒクル（１０％グリセロール）で前処置する。複合活動電位（ＣＡＰ）は、蝸牛から伝達される神経活動を測定するための、便利かつ信頼性のある電気生理学的方法である。音刺激（クリック音またはトーンバーストなど）が突然作動するときに生成される局所電位を検出するために、電極を蝸牛の基底付近に設置して、ＣＡＰを記録する。音響外傷の２週間半後、それぞれの耳の機能状態を評価する。具体的には、ｓｉＲＮＡで処置した耳の閾値が、未処置（ビヒクル対照）耳よりも低い（優れている）かどうかを決定するために、正円窓から記録された複合活動電位の平均閾値を、音響外傷の２週間半後に測定する。加えて、内外有毛細胞消失量を、ｓｉＲＮＡで処置した耳および対照耳において測定する。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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