(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親インシュリンと置換基を含むインシュリン誘導体であって、該置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基、又は親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基のいずれかに結合し、但しＢ３がＬｙｓである場合、Ｂ２９がＧｌｕではなく、
前記置換基が、４〜４０の炭素原子を有する親油性基であるインシュリン誘導体。
【請求項２】
前記置換基が、４≦ｎ≦３８のＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項３】
前記置換基が、４≦ｎ≦３８の(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項４】
前記置換基が、４≦ｎ≦３８のＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項５】
前記置換基が、５-αリトコール酸又は５-βリトコール酸である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項６】
前記置換基が、コール酸、ヒオコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸又はコラン酸の５-α又は５-β異性体である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項７】
前記置換基が、デヒドロリトコール酸の５-α又は５-β異性体である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項８】
前記置換基が、フシジン酸、フシジン酸誘導体又はグリシルレチン酸である請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【請求項９】
親インシュリンがインシュリン類似体である請求項１から８の何れか一項に記載のインシュリン誘導体。
【請求項１０】
インシュリン誘導体６分子当たり、２つの亜鉛イオン、３つの亜鉛イオン、４つの亜鉛イオン、５つの亜鉛イオン、６つの亜鉛イオン、７つの亜鉛イオン、８つの亜鉛イオン、９つの亜鉛イオン、１０の亜鉛イオン、１１の亜鉛イオン、又は１２の亜鉛イオンが結合している請求項１から９の何れか一項に記載のインシュリン誘導体の亜鉛錯体。
【請求項１１】
請求項１から９の何れか一項に記載のインシュリン誘導体又は請求項１０に記載のインシュリン誘導体の亜鉛錯体の治療的有効量と、場合により製薬的に許容可能な担体を共に含有する、治療が必要な患者における糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物又は請求項１０に記載のインシュリン誘導体の亜鉛錯体の製造方法であって、インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンを該医薬組成物に加える方法。
【請求項１３】
請求項１から９の何れか一項に記載のインシュリン誘導体又は請求項１０に記載のインシュリン誘導体の亜鉛錯体の治療的有効量を、場合により製薬的に許容可能な担体と共に、治療が必要な患者に投与することを含んでなる、患者における糖尿病を治療するための医薬として使用するためのインシュリン誘導体。
【請求項１４】
インシュリン誘導体が、
ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＢ３-ミリストイル ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＢ２２-ミリストイル ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ１５-ミリストイル ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ１８-ミリストイル ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ２２-ミリストイル ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンからなる群から選択される請求項１に記載のインシュリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、生理学的ｐＨ値で溶解し、長時間にわたる作用プロファイルを有する新規なヒトインシュリン誘導体に関する。また、本発明はそれらを含む医薬組成物、本発明のインシュリン誘導体を使用して糖尿病及び高血糖症を治療する方法、及び糖尿病及び高血糖症の治療におけるかかるインシュリン誘導体の使用に関する。
【０００２】
(発明の背景)
現在、１型糖尿病及び２型糖尿病の双方の糖尿病の治療は、いわゆる強化インシュリン療法に益々依存してきている。この療法によれば、患者は、基礎インシュリン必要量をカバーするための持続型インシュリンの１日１又は２回の注射を含む複数回の毎日のインシュリン注射に、食事に関連したインシュリン必要量をカバーするための速効型インシュリンのボーラス注射が補填された治療を受ける。
持続型インシュリン組成物は当該分野でよく知られている。例えば、持続型インシュリン組成物の主要な一タイプは、インシュリン結晶又は非晶質インシュリンの注入可能な水性懸濁液を含む。これらの組成物において、典型的に利用されるインシュリン化合物は、プロタミンインシュリン、亜鉛インシュリン、又はプロタミン亜鉛インシュリンである。
【０００３】
インシュリン懸濁液の使用には、ある欠点がある。よって、正確な投与を確実にするためには、定まった量の懸濁液がバイアルから抜き出されるか、又はカートリッジから放出される前に、穏やかに振盪して、インシュリン粒子を均質に懸濁させなければならない。また、インシュリン懸濁液の保存においては、凝集塊形成又は凝固を避けるために、温度を、インシュリン溶液よりも狭い範囲内に保持しなければならない。
【０００４】
持続型インシュリン組成物の他のタイプは、該溶液が注射される場合、ｐＨ値が上昇するためにインシュリンが沈殿してしまう生理学的ｐＨより低いｐＨ値の溶液である。これらの溶液の欠点は、注射時に組織内に形成される沈殿物の粒径分布、よって、医薬の放出プロファイルが、注射部位の血流と他のパラメータに些か予測不能な形で依存する。さらなる欠点は、インシュリンの固形粒子が局所的刺激として作用して、注射部位に組織の炎症を引き起こすおそれがあることである。
【０００５】
ヒトインシュリンは３つの第１級アミノ基を有している：Ａ-鎖とＢ-鎖のＮ末端基、ＬｙｓＢ２９のε-アミノ基である。これらの基の一又は複数において置換がなされたいくつかのインシュリン誘導体が従来から知られている。
【０００６】
ＷＯ９５／０７９３１(Novo Nordisk A/S)には、ＬｙｓＢ２９のε-アミノ基が親油性置換基を有しているヒトインシュリン誘導体が開示されている。これらのインシュリン誘導体は長時間にわたる作用プロファイルを有しており、生理学的ｐＨ値で可溶性である。
国際特許出願ＷＯ９６／２９３４４は、親油性側鎖が親インシュリン分子のＢ２６-Ｂ２９位のＬｙｓ残基又はＢ-鎖のＮ末端アミノ基に結合しているインシュリン誘導体に関する。
【０００７】
ＷＯ９７／３１０２２には、Ｂ-鎖のＮ末端のα-アミノ基及び／又はＢ２８、Ｂ２９又はＢ３０位のＬｙｓのε-アミノ基が、式-ＣＯ-Ｗ-ＣＯＯＨの置換基を有し、ここでＷが１２〜２２の炭素原子を有する長鎖炭化水素基であるインシュリン誘導体が開示されている。これらのインシュリン誘導体は長時間にわたる作用プロファイルを有しており、生理学的ｐＨ値で可溶性である。
他のインシュリン誘導体が国際特許出願に開示されている。特許出願ＷＯ２００５／０１２３４７には、親インシュリンのＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ酸又はＢ-鎖のＮ末端アミノ酸残基のα-アミノ基のいずれかに結合する側鎖を有するインシュリン誘導体が記載されている。
【０００８】
残念なことに、多くの糖尿病患者は、グルコースレベルの密なコントロールを維持するために必要な多くの注射に伴う不快感のために、強化療法を受けるのを嫌がっている。この種の治療は精神的及び肉体的痛みの双方を伴うおそれがある。経口投与では、インシュリンは胃腸管で急速に分解され、血流中に吸収されない。よって、多くの研究者が、インシュリンを投与するための代替経路、例えば経口、直腸、経皮、及び経鼻経路について研究している。しかしながら、今までのところ、これらの投与経路では、インシュリンの効果的な吸収には至っていない。
【０００９】
タンパク質の効果的な肺送達は、深部肺胞上皮にタンパク質を送達する能力に依存する。上部気道上皮に付着させられるタンパク質は、有意な程度では吸収されない。これは、上部を覆っている粘液が約３０〜４０μｍ厚であり、吸収に対する障壁として作用するためである。さらに、この上皮に付着されるタンパク質は、粘液線毛輸送により気道までに除去され、胃腸管を介して排除される。また、このメカニズムはいくつかのタンパク質粒子が低吸収であることの実質的一因となっている。タンパク質が吸収されずに、むしろこれらの経路により排除される程度は、それらの溶解度、それらのサイズ、並びに他のあまり理解されていない特徴に依存する。
【００１０】
今日までに知られているインシュリン誘導体よりもより長時間にわたる作用プロファイルを有し、同時に生理学的ｐＨ値で可溶性であり、ヒトインシュリンに匹敵する効力のあるインシュリンが、今だに必要とされている。さらに、肺投与によく適したさらなるインシュリン製剤も必要とされている。
本発明は、該従来技術の問題に取り組み、これを多少とも解決するものである。
【００１１】
(発明の概要)
本発明は、インシュリンのアシル化を、親インシュリンのＡ-鎖に存在するＬｙｓ残基又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基で実施することができるという認識に基づいている。
本発明によれば、親インシュリンと置換基を含み、ここで置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基、又は親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基のいずれかに結合し、但しＢ３がＬｙｓである場合、Ｂ２９はＧｌｕではないインシュリン誘導体が提供される。
【００１２】
Ｌｙｓ残基のε-アミノ基に結合する置換基は、親油性基、脂肪酸又は脂肪二酸、芳香族基、又はアミノ酸残基で、負に帯電可能な基を含んでいてもよいものを含みうる。
脂肪二酸は、典型的には炭素鎖中に４〜２２、６〜２２、８〜２０、８〜１８、４〜１８、６〜１８、８〜１６、８〜２２、８〜１７、又は８〜１５の炭素原子を有する。
脂肪二酸部分の非限定的な例は、式ＨＯＯＣ-(ＣＨ２)ｒ１-ＣＯＯＨを有する二酸であり、ここでｒ１は４〜２２である。脂肪二酸の例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、又はオクタデカン二酸である。
【００１３】
(定義)
「ｄｅｓＢ３０インシュリン」、「ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン」は、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インシュリン又はその類似体(アナログ)を意味する。同様に、「ｄｅｓＢ２９ｄｅｓＢ３０インシュリン」又は「ｄｅｓＢ２９ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン」は、Ｂ２９及びＢ３０アミノ酸残基を欠く天然インシュリン又はその類似体を意味する。
「Ｂ(１-２９)」及び「Ｂ-鎖」は、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インシュリンＢ-鎖又はその類似体を意味する。「Ａ(１−２１)」及び「Ａ-鎖」は、天然インシュリンＡ-鎖又はその類似体を意味する。「Ａ(１-２４)」は、Ａ-鎖のＣ末端が３つのコード可能アミノ酸で伸長されている修飾Ａ-鎖を意味する。
「Ｂ１」、「Ａ１」等は、インシュリンのＢ-鎖において１位(Ｎ末端から数えて)にあるアミノ酸残基、及びインシュリンのＡ-鎖において１位(Ｎ末端から数えて)にあるアミノ酸酸基をそれぞれ意味する。特定の位置にあるアミノ酸残基は、例えばＰｈｅＢ１として表され、これは、Ｂ１位にあるアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味している。
【００１４】
ここで使用される「インシュリン」とは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７の間と、ＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９の間にジスルフィド架橋を、またＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１の間に内部ジスルフィド架橋を有するヒトインシュリン、ブタインシュリン、及びウシインシュリンを意味する。
「ＰＯＴ」は、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
「リーダー」は、プレ-ペプチド(シグナルペプチド)及びプロ-ペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
【００１５】
「シグナルペプチド」なる用語は、タンパク質の前駆体においてＮ末端配列として存在するプレ-ペプチドを意味するものと理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質の小胞体への転位置を容易にすることである。シグナルペプチドはこのプロセスの過程で通常は切断される。シグナルペプチドはタンパク質を生産する酵母に対して異種性又は相同的であってもよい。本発明のＤＮＡ構築物で使用され得る多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド、又は任意の機能的類似体(Egel-Mitaniら、(1990) YEAST 6:127-137及びUS5726038)、ＭＦａ１遺伝子のα-因子シグナル(Thorner(1981)、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathernら編, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、及びUS487000)が含まれる。
【００１６】
「プロ-ペプチド」なる用語は、その機能が、発現されたポリペプチドを小胞体からゴルジ体へ、さらには培地中への分泌のために分泌小胞へ向けることを可能にすることであるポリペプチド配列を意味する(すなわち、ポリペプチドは、酵母細胞のペリプラズム空間中に細胞壁又は少なくとも細胞膜を通って出て行く)。プロ-ペプチドは酵母α-因子プロ-ペプチドであってよい。ＵＳ４５４６０８２及び４８７０００８を参照。またプロ-ペプチドは、合成プロ-ペプチド、つまり天然には見出されないプロ-ペプチドであってもよい。適切な合成プロ-ペプチドはＵＳ５３９５９２２；５７９５７４６；５１６２４９８及びＷＯ９８／３２８６７に開示されているものである。プロ−ペプチドは、Ｌｙｓ-Ａｒｇ配列又はその任意の機能的類似体等、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位を含みうる。
【００１７】
ここで使用される「インシュリン前駆体」とは、適切なプロテアーゼ、例えばトリプシンを用いて切断した後に、２本鎖インシュリン、インシュリン類似体、又はインシュリン誘導体を生じる単鎖ポリペプチドを意味する。このようなインシュリン前駆体の例は「Ｂ'Ａ」であり、これは、Ｂ-鎖のＣ末端アミノ酸残基が、Ａ-鎖中のＡ１アミノ酸残基に直接結合している単鎖インシュリン前駆体である。このようなＢ'Ａインシュリン前駆体の特定例は、ＡｒｇＢ２９がＧｌｙＡ１に直接結合しているＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ Ｂ'Ａである。
【００１８】
ここで使用される「インシュリン類似体」とは、天然インシュリン中に生じる少なくとも一のアミノ酸残基を欠失及び／又は置換することにより、及び／又は少なくとも一のアミノ酸残基を付加することにより、例えばヒトインシュリン等の自然に生じるインシュリンの構造から形式上誘導可能な分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能アミノ酸残基又は他の自然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成されたアミノ酸残基のいずれかとすることができる。
【００１９】
インシュリン類似体の例は、ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン類似体；Ｂ１及びＢ２の一方又は双方が欠失しているインシュリン類似体；Ａ-鎖及び／又はＢ-鎖がＮ末端伸長を有しているインシュリン類似体、及びＡ-鎖及び／又はＢ-鎖がＣ末端伸長を有しているインシュリン類似体である。よって、１又は２のＡｒｇがＢ１位に付加されてもよい。また、一又は複数のＢ２６-Ｂ３０が欠失されていてもよい。
【００２０】
「親インシュリン」とは、Ａ-鎖及び／又はＢ-鎖にＬｙｓ残基を一つのみ有するインシュリン類似体を意味し、ここでＬｙｓ残基はＢ２９位には存在しない。
親インシュリンの特定の例は、ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、及びＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである。
【００２１】
ここで使用される「インシュリン誘導体」とは、例えばインシュリン骨格の一又は複数の位置に置換基を導入することにより、又はインシュリンのアミノ酸残基の基を酸化又は還元することにより、又は遊離のカルボキシル基をエステル基に転換させることにより、又は遊離のアミノ基又はヒドロキシ基をアシル化することにより、化学的に修飾されたインシュリン類似体又は自然に生じるインシュリンを意味する。
本発明のインシュリン誘導体は、次の規則に従い命名される：配列は化学的修飾から出発し、Ａ-鎖が続き、Ｂ-鎖で終わる。アミノ酸残基はヒトインシュリンのそれぞれの対応物の名で命名され、変異及びアシル化が明示的に記載されるが、Ａ-鎖及びＢ-鎖中の不変のアミノ酸残基は記載されない。例えば、ヒトインシュリンと比較して次の変異ＬｙｓＡ９、ＡｒｇＢ２９、ｄｅｓＢ３０を有し、ＬｙｓＡ９のＮｅでミリストイルによりアシル化されているインシュリンは、ＮεＡ９-ミリストイルＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンと命名される。
本発明のインシュリン誘導体が「生理学的ｐＨ値で可溶性である」と述べられている場合、それは、インシュリン誘導体が、生理学的ｐＨ値で十分に溶解されたインシュリン組成物を調製するために使用可能であることを意味する。このような有益な溶解性は、ビヒクルに含まれる一又は複数の成分とインシュリン誘導体との間の好ましい相互作用の結果として、又はインシュリン誘導体単独の本来の特性によるものである。
【００２２】
アミノ酸の略語：
0005475836.tif 000002
【００２３】
「側鎖にカルボン酸基を有するアミノ酸残基」なる表現は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びｈＧｌｕ等のアミノ酸残基のことである。アミノ酸はＬ-又はＤ-立体配置のいずれかとすることができる。何も特定されない場合、アミノ酸残基はＬ-立体配置であると理解される。
「中性側鎖を有するアミノ酸残基」なる表現は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎ等のアミノ酸残基のことである。
【００２４】
実施例で使用される略語：
ＣＶ            カラム容量
ＥＤＴＡ        エチレンジアミン四酢酸
ＨＩ            ヒトインシュリン
ＨＰＬＣ        高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＡ          ヒト血清アルブミン
ＬＣ            液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩ      マトリックス支援レーザー脱離イオン化
ＭＳ            質量分析
ＮＭＰ          Ｎ-メチル-２-ピロリドン
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＭＳＦ        フッ化フェニルメチルスルホニル
ＲＴ            室温
ＳＥＣ          サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰＡ          シンチレーション近接アッセイ
Ｔｒｉｓ        トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
ｖｏｌ％        容量パーセント
Ｏ.Ｄ.          光学密度＝吸光度
Ｘ２モノマー    ＡｓｐＢ９ ＧｌｕＢ２７ヒトインシュリン
ｈＧｌｕ        ホモ-グルタミン酸
Ｓｕ            Ｎ-スクシンイミジル
ｈＧｌｕはホモグルタミン酸である。
ＴＦＡ：        トリフルオロ酢酸
ＤＭＦ：        Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
ＥｔＯＡｃ：    酢酸エチル
ＴＨＦ：        テトラヒドロフラン
ＴＳＴＵ：      Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート
ＤＩＰＥＡ：    ジイソプロピルエチルアミン
α-Ａｓｐは、-ＨＮＣＨ(ＣＯ-)ＣＨ２ＣＯＯＨのＬ型である。
β-Ａｓｐは、-ＨＮＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-のＬ型である。
α-Ｇｌｕは、-ＨＮＣＨ(ＣＯ-)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨのＬ型である。
γ-Ｇｌｕは、-ＨＮＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-のＬ型である。
α-ｈＧｌｕは、-ＨＮＣＨ(ＣＯ-)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨのＬ型である。
δ-ｈＧｌｕは、-ＨＮＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-のＬ型である。
β-Ａｌａは、-ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯＯＨのＬ型である。
Ｓａｒはサルコシン(Ｎ-メチルグリシン)である。
【００２５】
(発明の詳細な説明)
本発明は、親インシュリンと置換基を含むインシュリン誘導体に関し、ここで置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基、又は親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基のいずれかに結合し、但しＢ３がＬｙｓである場合、Ｂ２９はＧｌｕではない。
【００２６】
一態様では、本発明のインシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、インシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ９位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、インシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ１４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、インシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ１８位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、インシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２１位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、インシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、本発明のインシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２３位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
一態様では、本発明のインシュリン誘導体の置換基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
【００２７】
本発明のインシュリン誘導体のリジン残基の置換基は、６〜４０の炭素原子を含む親油性基を含みうる。置換基の例は、６〜４０、例えば１２〜３６の炭素原子を有するアシル基である。置換基の例は、１２〜３６の炭素原子を有するアシル基、又はアシル基の形態の親油性置換基が次のものである：ＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、ＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-、ここで４≦ｎ≦３８、例えば６≦ｎ≦３６、８≦ｎ≦３４、１２≦ｎ≦３２又は１２≦ｎ≦２８である。
本発明の一態様では、アシル基は、５-αリトコール酸又は５-βリトコール酸である。
【００２８】
一態様では、アシル基は、コール酸、ヒオコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸又はコラン酸の５-α又は５-β異性体である。
一態様では、アシル基は、デヒドロリトコール酸の５-α又は５-β異性体である。
一態様では、アシル基は、フシジン酸、フシジン酸誘導体、又はグリシルレチン酸である。
一態様では、アシル基は、アミノ酸リンカーを使用してリジン残基に結合している。この態様では、アシル基は、有利には、γ-又はα-グルタミルリンカーを介して、又はβ-又はα-アスパルチルリンカーを介して、又はα-アミド-γ-グルタミルリンカーを介して、又はα-アミド-β-アスパルチルリンカーを介して、リジン残基に結合している。
【００２９】
本発明の一態様では、インシュリン誘導体の置換基は、次の一般式：
0005475836.tif 000003
を有し、
ここで、Ｗは、
・側鎖にカルボン酸基を有するα-アミノ酸残基で、そのカルボン酸基の一つが、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基とアミド基を形成する残基；又は
・アミド結合を介して互いに結合した２、３又は４のα-アミノ酸残基からなる鎖で、アミド結合を介して、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する鎖であり、Ｗのアミノ酸残基は中性側鎖を有するアミノ酸残基、及びＷが側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一のアミノ酸残基を有するように側鎖にカルボン酸基を有するアミノ酸残基の群から選択されたもの；又は
・Ｘから親インシュリンのＡ-鎖又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基への共有結合であり；
Ｘは：
・-ＣＯ-；
・-ＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮＨＣＨ(ＣＯＯＨ)(ＣＨ２)４ＮＨＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；又は
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
であり、
但し：
ａ）Ｗがアミノ酸残基又はアミノ酸残基鎖である場合、Ｘ中の下線が付されたカルボニル炭素は、Ｗ中のアミノ基とアミド結合を形成し、又は
ｂ）Ｗが共有結合である場合、Ｘ中の下線が付されたカルボニル炭素は、親インシュリンのＡ-鎖又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基とアミド結合を形成し；
Ｙは、
・ｍが６〜３２の範囲の整数である-(ＣＨ２)ｍ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の総数が１０〜３２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の炭化水素鎖；
・ｖ及びｗの合計が６〜３０の範囲になるようにｖ及びｗが整数であるか又はそれらの一方が０である式-(ＣＨ２)ｖＣ６Ｈ４(ＣＨ２)Ｗ-の二価の炭化水素鎖
であり；
Ｚは：
・-ＣＯＯＨ；
・-ＣＯ-Ａｓｐ；
・-ＣＯ-Ｇｌｕ；
・-ＣＯ-Ｇｌｙ；
・-ＣＯ-Ｓｅｒ；
・-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２；
・-ＳＯ３Ｈ；又は
・-ＰＯ３Ｈ；
であり、またその任意のＺｎ２＋錯体である。
【００３０】
本発明の一態様では、側鎖-Ｗ-Ｘ-Ｙ-Ｚは、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。この態様のさらなる特定の一態様では、側鎖-Ｗ-Ｘ-Ｙ-Ｚは、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、又はＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１、又はＢ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する。
【００３１】
置換基-Ｗ-Ｘ-Ｙ-Ｚの基礎構造Ｗは、共有結合とすることができる。また、Ｗは側鎖にカルボン酸基を有するアミノ酸残基であってよく、該残基は、そのカルボン酸基の一つと、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基を有するアミド基を形成し、ここで該残基は全体で４〜１０の炭素原子を有する。特に、Ｗは例えばリンカーであってもよい。
【００３２】
一態様では、Ｗは、尿素リンカーを介して親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合可能である。
一態様では、リンカーは、アミド結合を介して共に結合する１-４のアミノ酸残基を有し、該アミド結合の少なくとも一は遊離のカルボン酸基又は中性ｐＨで負に帯電する基を有する。
一態様では、リンカーはアミノ酸残基、２-４のアミノ酸残基のペプチド鎖であるか、又はα-Ａｓｐ、β-Ａｓｐ、α-Ｇｌｕ、γ-Ｇｌｕ、α-ｈＧｌｕ及びδ-ｈＧｌｕ；-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-又は-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-であるモチーフを有する。
リンカーは、典型的には、アミノ酸残基又は４までのアミノ酸を含むアミノ酸残基の鎖である。特に、リンカーは、α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ；-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-、-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、又は-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-からなる群から選択されてよい。
【００３３】
さらなる態様では、リンカーは、一方が側鎖にカルボン酸基と４〜１０の炭素原子を有し、他方がカルボン酸基を有しないが２〜１１の炭素原子を有する、２つのアミノ酸残基からなる鎖とすることができる。カルボン酸基を有しないアミノ酸残基は、中性のα-アミノ酸残基とすることができる。このようなリンカーの具体例は：α-Ａｓｐ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-Ｇｌｙ；及びＧｌｙ-δ-ｈＧｌｕである。
【００３４】
さらなる態様では、リンカーは、独立して４〜１０の炭素原子を有し、双方が側鎖にカルボン酸基を有する、２つのアミノ酸残基からなる鎖である。これらのアミノ酸残基の一方又は双方は、α-アミノ酸残基とすることができる。これらのリンカーの具体例は：α-Ａｓｐ-α-Ａｓｐ；α-Ａｓｐ-α-Ｇｌｕ；α-Ａｓｐ-α-ｈＧｌｕ；α-Ａｓｐ-β-Ａｓｐ；α-Ａｓｐ-γ-Ｇｌｕ；α-Ａｓｐ-δ-ｈＧｌｕ；β-Ａｓｐ-α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-α-Ｇｌｕ；β-Ａｓｐ-α-ｈＧｌｕ；β-Ａｓｐ-β-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-γ-Ｇｌｕ；β-Ａｓｐ-δ-ｈＧｌｕ；α-Ｇｌｕ-α-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-α-Ｇｌｕ；α-Ｇｌｕ-α-ｈＧｌｕ；α-Ｇｌｕ-β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-γ-Ｇｌｕ；α-Ｇｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；γ-Ｇｌｕ-α-Ａｓｐ；γ-Ｇｌｕ-α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-α-ｈＧｌｕ；γ-Ｇｌｕ-β-Ａｓｐ；γ-Ｇｌｕ-γ-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；α-ｈＧｌｕ-α-Ａｓｐ；α-ｈＧｌｕ-α-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-α-ｈＧｌｕ；α-ｈＧｌｕ-β-Ａｓｐ；α-ｈＧｌｕ-γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-α-Ａｓｐ；δ-ｈＧｌｕ-α-Ｇｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-β-Ａｓｐ；δ-ｈＧｌｕ-γ-Ｇｌｕ；及びδ-ｈＧｌｕ-δ-ｈＧｌｕである。
【００３５】
さらなる態様では、リンカーは、独立して４〜１０の炭素原子を有する、３つのアミノ酸残基からなる鎖であり、鎖のアミノ酸残基は、中性側鎖を有する残基、及び鎖が側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一の残基を有するように、側鎖にカルボン酸基を有する残基からなる群から選択される。一態様では、アミノ酸残基はα-アミノ酸残基である。
さらなる態様では、リンカーは、独立して４〜１０の炭素原子を有する、４つのアミノ酸残基からなる鎖であり、鎖のアミノ酸残基は、中性側鎖を有する基、及び鎖が側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一の残基を有するように、側鎖にカルボン酸基を有する残基から選択される。一態様では、アミノ酸残基はα-アミノ酸残基である。
【００３６】
側鎖-Ｗ-Ｘ-Ｙ-Ｚの基礎構造Ｗは、式-ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
【００３７】
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
【００３８】
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
【００３９】
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
さらなる態様では、側鎖の基礎構造Ｘは、式-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-の基とすることができ、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗにおけるアミノ基とアミド基を形成し、又はＷが共有結合である場合は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と結合を形成する。
【００４０】
側鎖-Ｗ-Ｘ-Ｙ-Ｚの基礎構造Ｙは、式-(ＣＨ２)ｍ-の基とすることができ、ここでｍは６〜３２、８〜２０、又は１２〜２０の範囲の整数であるか、又はｍは１１、１２、１３、１４、１５又は１６である。
他の態様では、Ｙは、１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の全数が６〜３２、１０〜３２、又は１２〜２０の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の炭化水素鎖である。
一態様では、Ｙは、ｖ及びｗの合計が６〜３０又は１０〜２０の範囲になるように、ｖ及びｗが整数又はそれらのひとつが０である、式-(ＣＨ２)ｖＣ６Ｈ４(ＣＨ２)Ｗ-の二価の炭化水素鎖である。
【００４１】
一態様では、側鎖-Ｗ-Ｘ-Ｙ-Ｚの基礎構造Ｚは-ＣＯＯＨであり、但し、Ｗが共有結合であり、Ｘが-ＣＯ-である場合は、Ｚは-ＣＯＯＨとは異なる。
一態様では、Ｚは-ＣＯ-Ａｓｐである。
一態様では、Ｚは-ＣＯ-Ｇｌｕである。
一態様では、Ｚは-ＣＯ-Ｇｌｙである。
一態様では、Ｚは-ＣＯ-Ｓｅｒである。
一態様では、Ｚは-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２である。
一態様では、Ｚは-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２である。
一態様では、Ｚは-ＳＯ３Ｈである。
一態様では、Ｚは-ＰＯ３Ｈである。本発明の一態様では、インシュリン誘導体は、次の式：
0005475836.tif 000004
を有し、ここでＩｎｓは親インシュリン部分であり、-Ｃ(Ｏ)-Ｘ１-Ｗ-[ＣＨ２]ｍ-Ｘ-Ｙ-Ｑ-Ｚは置換基であり、ここでＩｎｓは、置換基において、Ｘ１、Ｗ、［ＣＨ２］ｍ、Ｙ又はＱに結合したＣＯ-基、及びＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基の間のアミド結合を介して置換基に結合しており、
Ｘ１は、
・ｎが１、２、３、４、５又は６である-(ＣＨ２)ｎ；
・Ｒが、水素又は-(ＣＨ２)ｐ-ＣＯＯＨ；-(ＣＨ２)ｐ-ＳＯ３Ｈ；-(ＣＨ２)ｐ-ＰＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＳＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＰＯ３Ｈ２；１又は２の-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＣＯＯＨ基で置換されたアリール基；-(ＣＨ２)ｐ-テトラゾール-５-イルで、ｐが１〜６の範囲の整数である、ＮＲ；
・Ｒ１及びＲ２がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑが１-６であり、Ｒが上述したものである、-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-；
・Ｒ３及びＲ４がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１が１-６であり、Ｒが上述したものである、-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-；又は
・結合；
であり、
Ｗは、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ３Ｈ、及び-ＰＯ３Ｈ２及びテトラゾール-５-イルからなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンであり、又はＷは結合であり；
ｍは０、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｘは、
・-Ｏ-；
・次の式
0005475836.tif 000005
のものであり；
ここでＲは上述したものであるか；又は
・結合；
であり；
Ｙは、
・Ｒ１及びＲ２がＨ、-ＣＯＯＨ、結合又はＯＨとすることができ、ｑが１-６であり、Ｒが上述したものである、-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-；
・Ｒが上述したものであるＮＲ；
・Ｒ３及びＲ４がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１が１-６であり、Ｒが上述したものである、-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-；又は
・結合；
であり；
Ｑは、
・ｒが４〜２２の整数である、-(ＣＨ２)ｒ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の全数が４〜２２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の炭化水素鎖；又は
・Ｑ１-Ｑ６が互いに独立して、Ｏ；Ｓ又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜２２の範囲となるように、ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立してゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ１、ｖ２及びｖ３が互いに独立して、ゼロ又は１とすることができ、但しＱ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５及びＱ６は互いに結合を形成していなくてもよく、ｓ、ｗ、ｔ及びｚがゼロ又は１である場合は、いずれの-ＣＨ２-も次の原子：Ｏ、Ｓの２つに結合していない、式-(ＣＨ２)ｓ-Ｑ１-(Ｃ６Ｈ４)ｖ１-Ｑ２-(ＣＨ２)Ｗ-Ｑ３-(Ｃ６Ｈ４)ｖ２-Ｑ４-(ＣＨ２)ｔ-Ｑ５-(Ｃ６Ｈ４)ｖ３-Ｑ６-(ＣＨ２)ｚ-の２価の鎖；
であり；また、
Ｚは：
-ＣＯＯＨ；
-ＣＯ-Ａｓｐ；
-ＣＯ-Ｇｌｕ；
-ＣＯ-Ｇｌｙ；
-ＣＯ-Ｓｅｒ；
-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２；
-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２；
-ＳＯ３Ｈ
-ＰＯ３Ｈ２；
Ｏ-ＳＯ３Ｈ；
Ｏ-ＰＯ３Ｈ２；
-テトラゾール-５-イル、又は
Ｗ１が、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ３Ｈ、及び-ＰＯ３Ｈ２及びテトラゾール-５-イルから選択される１又は２の基で置換されたアリーレン又はヘテロアリーレンである、-Ｏ-Ｗ１；
であり、またその任意のＺｎ２＋錯体である。
【００４２】
本発明の一態様では、Ｘ１は、ｎが１、２、３、４、５又は６である-(ＣＨ２)ｎとすることができる。
本発明の一態様では、Ｘ１は、Ｒが、水素又は-(ＣＨ２)ｐ-ＣＯＯＨ；-(ＣＨ２)ｐ-ＳＯ３Ｈ；-(ＣＨ２)ｐ-ＰＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＳＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＰＯ３Ｈ２；１又は２の-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＣＯＯＨ基で置換されたアリール基；-(ＣＨ２)ｐ-テトラゾール-５-イルで、ｐが１〜６の範囲の整数である、ＮＲとすることができる。
一態様では、Ｘ１は-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-とすることができる。例えばＸ１は、-(ＣＨ２)-(ＣＨＣＯＯＨ)-ＮＨ-ＣＯ-又は-(ＣＨ２)２-(ＣＨＣＯＯＨ)-ＮＨ-ＣＯ-とすることができる。
一態様では、Ｘ１は-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-とすることができ、又はＸ１は結合とすることができる。
【００４３】
一態様では、Ｗはフェニレンとすることができ、又はＷは窒素、酸素又は硫黄を有する５-７員の複素環系とすることができる。Ｗが５員の複素環である場合、それは少なくとも一の酸素を有することができる。
一態様では、Ｗは、-ＣＯＯＨで置換されていてもよいアリーレンである。一態様では、Ｗは結合である。
【００４４】
一態様では、Ｘは-Ｏ-、次の式
0005475836.tif 000006
のものであり、ここでＲは水素又は-(ＣＨ２)ｐ-ＣＯＯＨとすることができる。一態様では、ｐは１又は２である。
一態様では、Ｘは結合である。
【００４５】
一態様では、Ｙは-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-であり、ここで、ｑは１であり、Ｒ１及びＲ２は水素である。例えば、Ｙは、-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-又は-(ＣＨ２)３-(ＣＨＣＯＯＨ)-ＮＨ-ＣＯ-とすることができる。
一態様では、Ｙは(ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ-であり、ここで、Ｒ３及びＲ４はＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１は１-６であり、Ｒは上述したものである。
一態様では、Ｙは-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-であり、ここで、Ｒ３及びＲ４はＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１は１-６であり、Ｒは上述したものである。一態様では、Ｙは結合である。
【００４６】
一態様では、Ｑは-(ＣＨ２)ｒ-であり、ここでｒは４〜２２、８〜２０、又は１０〜１８の整数である。例えば、ｒは１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８とすることができる。
一態様では、Ｑは、１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の全数が４〜２２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の鎖である。
一態様では、Ｑは、式-(ＣＨ２)ｓ-Ｑ１-(Ｃ６Ｈ４)ｖ１-Ｑ２-(ＣＨ２)Ｗ-Ｑ３-(Ｃ６Ｈ４)ｖ２-Ｑ４-(ＣＨ２)ｔ-Ｑ５-(Ｃ６Ｈ４)ｖ３-Ｑ６-(ＣＨ２)ｚ-の２価の鎖であり、ここでＱ１-Ｑ６は互いに独立して、Ｏ；Ｓ又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜２２の範囲となるように、ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立してゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ１、ｖ２及びｖ３は互いに独立して、ゼロ又は１とすることができる。
一態様では、ｓは１又は２、９、１０又は１１である。一態様では、ｖ１は１又は２である。一態様では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ５及びＱ６は全て結合である。一態様では、Ｑ１はＳ又はＯである。一態様では、ｗは２である。一態様では、ｖ２は１であり、ｔは１である。
【００４７】
一態様では、Ｚは、-ＣＯＯＨ、-ＣＯ-Ａｓｐ、-ＣＯ-Ｇｌｕ、-ＣＯ-Ｇｌｙ、-ＣＯ-Ｓｅｒ、-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２、-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２、-ＳＯ３Ｈ、-ＰＯ３Ｈ２、-Ｏ-ＳＯ３Ｈ、-Ｏ-ＰＯ３Ｈ２、又は-テトラゾール-５-イルである。
一態様では、Ｚは-Ｏ-Ｗ１であり、ここでＷ１は、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ３Ｈ、及び-ＰＯ３Ｈ２、及びテトラゾール-５-イルから選択される１又は２の基で置換されたアリーレン又はヘテロアリーレンである。
【００４８】
本発明のインシュリン誘導体のインシュリン部分−本文中では親インシュリンとも称される−は、ただ一つのリジン残基を有していてもよく、インシュリン類似体のＢ-鎖のＢ２９位に存在しないインシュリン類似体とすることができる。このリジン残基は、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位の一つにあってもよいし、又は親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の、Ｂ-鎖のＬｙｓ残基のε-アミノ基に対していてもよい。
親インシュリンは、例えばヒトインシュリン又はブタインシュリンであってよく、ここでＢ２９位のＬｙｓ残基は置換されており、Ｌｙｓ残基はＡ-鎖又はＢ-鎖の位置に挿入されており、該位置はＢ-鎖のＢ２９ではない。
【００４９】
一態様では、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位の一つにあるアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
一態様では、親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つにあるアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００５０】
親インシュリン類似体の一群において、Ｂ２９位のアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｐｒｏ又はＴｈｒである。
親インシュリン類似体の一群において、Ｂ１及び／又はＢ３０位のアミノ酸残基は欠失している。
【００５１】
親インシュリン類似体の一群において、Ｂ２９位のアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｐｒｏ又はＴｈｒであり、Ａ又はＢ鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つにあるアミノ酸残基はＬｙｓである。この群の特定の例は、ＬｙｓＡ１７ ＡｒｇＢ２９ヒトインシュリンである。
親インシュリン類似体の一群において、Ｂ３０位のアミノ酸基は欠失しており、Ｂ２９位のアミノ酸残基はＬｙｓを除く任意のコード可能アミノ酸であってよく、Ａ-又はＢ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つにあるアミノ酸残基はＬｙｓであり、但し、ＬｙｓがＢ３位にある場合、Ｂ２９はＧｌｕではない。この群の親インシュリン類似体からの特定の例は、ＬｙｓＡ１２ ＨｉｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである。
【００５２】
親インシュリン類似体の一群において、Ｂ２９及びＢ３０位にあるアミノ酸残基は欠失しており、Ａ-又はＢ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つにあるアミノ酸残基はＬｙｓである。この群の親インシュリン類似体からの特定の例は、ＬｙｓＡ８ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである。
親インシュリン類似体の一群において、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３０位にあるアミノ酸残基は、Ｌｙｓを除く任意のコード可能アミノ酸であるか、又は欠失していてよく、Ａ-又はＢ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つにあるアミノ酸はＬｙｓであり、但し、Ｌｙｓが３位にある場合は、Ｂ２９はＧｌｕではない。この群の親インシュリン類似体からの特定の例は、ＬｙｓＢ４ ｄｅｓＢ２６ ｄｅｓＢ２７ ｄｅｓＢ２８ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである。
【００５３】
親インシュリン類似体の一群において、Ａ-鎖は、１、２又は３のアミノ酸残基でＣ末端が伸長しており、伸長したアミノ酸残基の位置はＡ２２、Ａ２３又はＡ２４位である。Ｌｙｓは、Ａ-鎖のＡ２２、Ａ２３又はＡ２４位のアミノ酸の一つを置換している。伸長部の任意の１又は２の残ったアミノ酸位置は、Ｌｙｓを除く、任意のコード可能アミノ酸残基であってよい。この群の親インシュリン類似体からの特定の例は、ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、又はＧｌｙＡ２２ ＬｙｓＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである。
【００５４】
本発明の一態様では、親インシュリンのＡ２１位にあるアミノ酸残基は、Ｇｌｙ又はＡｓｎである。親インシュリンのＡ２３又はＡ２４位にあるアミノ酸残基がＬｙｓである場合、親インシュリンのＡ２１位にあるアミノ酸残基はＧｌｙ、Ａｌａ又はＧｌｎであるべきである。
一態様では、親インシュリンのＢ３位にあるアミノ酸残基はＬｙｓであるか、又は親インシュリンのＢ２８位にあるアミノ酸残基はＡｓｐである。
親インシュリン類似体の具体例は、ＡｒｇＢ２９ヒトインシュリン又はＡｒｇＢ２９ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである。
【００５５】
さらなる態様では、インシュリン誘導体は、ＮεＡ８-ミリストイル ＬｙｓＡ８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１０-ミリストイル ＬｙｓＡ１０ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１２-ミリストイル ＬｙｓＡ１２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１４-ミリストイル ＬｙｓＡ１４ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１５-ミリストイル ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１７-ミリストイル ＬｙｓＡ１７ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１８-ミリストイル ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２１-ミリストイル ＬｙｓＡ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２２-ミリストイル ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ１-ミリストイル ＬｙｓＢ１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ２-ミリストイル ＬｙｓＢ２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ３-ミリストイル ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ４-ミリストイル ＬｙｓＢ４ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ２０-ミリストイル ＬｙｓＢ２０ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ２１-ミリストイル ＬｙｓＢ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン及びＮεＢ２２-ミリストイル ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンからなる群から選択される。
【００５６】
さらなる態様では、インシュリン誘導体は、ＮεＡ８-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ９-ω-カルボキシ−ペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１０-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１０ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１４-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１４ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１５-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１７-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１７ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ１８-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２１-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ１-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ４-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ４ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ２０-ω-カルボキシペンタ−デカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２０ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＢ２１-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン及びＮεＢ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンからなる群から選択される。
【００５７】
さらなる態様では、インシュリン誘導体は、ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＧｌｙＡ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｌａＡ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＧｌｎＡ２１ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＧｌｙＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＡｌａＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＧｌｎＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２４-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２４ ＧｌｙＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＧｌｙＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２４-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２４ ＡｌａＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＧｌｙＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２４-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２４ ＧｌｎＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＧｌｙＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２２-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＧｌｙＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＡｌａＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２３-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２３ ＧｌｎＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２４-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２４ ＧｌｙＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＧｌｙＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＮεＡ２４-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２４ ＡｌａＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＧｌｙＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン及びＮεＡ２４-ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２４ ＧｌｎＡ２１ ＧｌｙＡ２２ ＧｌｙＡ２３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンからなる群から選択される。
【００５８】
本発明のインシュリン誘導体は、本質的には亜鉛フリーの化合物の形態又は亜鉛錯体の形態で提供され得る。本発明のインシュリン誘導体の亜鉛錯体が提供される場合、約２の亜鉛イオン、約３の亜鉛イオン、又は約４の亜鉛イオン又は１２までの亜鉛イオンが、インシュリン誘導体の６つの分子(ヘキサマー)に結合可能である。インシュリン誘導体の亜鉛錯体の溶液は、このような種の混合物を含んでいるであろう。
医薬組成物の亜鉛含有量は、インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンであってよい。亜鉛含有量の上限は、インシュリンの沈殿を引き起こし、溶液を懸濁液に変える亜鉛の含有量である。
【００５９】
本発明の一態様では、医薬組成物は、インシュリン誘導体６分子当たり約４．３〜約１２の亜鉛イオン、又はインシュリン誘導体６分子当たり約４．５〜約１２の亜鉛イオンを含有している。本発明のさらなる態様では、医薬組成物は、インシュリン誘導体６分子当たり約５〜約１１．４の亜鉛イオン、又はインシュリン誘導体６分子当たり約５．５〜約１０の亜鉛イオンを含有する。
【００６０】
本発明は、インシュリン誘導体を含有する医薬組成物を製造するための方法を含み、ここでインシュリン誘導体６分子当たり約４の亜鉛イオンが組成物に加えられる。
本発明の一態様では、前記方法は、インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンを組成物に加えることを含む。
本発明の一態様では、前記方法は、インシュリン誘導体６分子当たり約４．３〜約１２の亜鉛イオンを組成物に加えることを含む。
【００６１】
本発明のさらなる態様では、インシュリン誘導体６分子当たり約４．５〜約１２の亜鉛イオンが組成物に加えられ、例えばインシュリン誘導体６分子当たり約５〜約１１．４の亜鉛イオンが組成物に加えられ、又はインシュリン誘導体６分子当たり約５．５〜約１０の亜鉛イオンが組成物に加えられる。
【００６２】
本発明の一態様は、医薬組成物を製造するための方法に関する。本方法は、保存料を添加する前に、組成物に亜鉛を加えることを含む。本発明の一態様では、インシュリン誘導体６分子当たり約４．５〜約１２の亜鉛イオンが、保存料の添加前に組成物に付加され、又は例えば、インシュリン誘導体６分子当たり約５〜約１１．４の亜鉛イオンが、保存料の添加前に組成物に付加され、例えばインシュリン誘導体６分子当たり約５．５〜約１０の亜鉛イオンが、保存料の添加前に組成物に付加される。
【００６３】
本発明の一態様では、本方法は、保存料の添加後に、約１２までの亜鉛イオンが組成物に付加されることを含む。
本発明の一態様では、インシュリン誘導体の６つ分子あたり少なくとも０．５の亜鉛イオンが、保存料の添加後に組成物に付加され、又はインシュリン誘導体の６つの分子あたり少なくとも１の亜鉛イオンが、保存料の添加後に組成物に付加される。
【００６４】
本発明のさらなる態様では、インシュリン誘導体６分子当たり約２、３、４、５又は６を越える亜鉛イオンが、保存料の添加後に組成物に付加される。
本発明のさらなる態様では、インシュリン誘導体６分子当たり約４．５〜約１２の亜鉛イオンが、保存料の添加後に組成物に付加され、又はインシュリン誘導体６分子当たり約５．５〜約１０の亜鉛イオンが、保存料の添加後に組成物に付加される。
【００６５】
本発明の一態様では、本方法は、保存料の添加前に亜鉛の一部、及び保存料の添加後に亜鉛の一部を加えることを含む。
一態様では、本方法は、インシュリン誘導体のの６つの分子当たり少なくとも１の亜鉛イオンを、保存料の添加前に付加し、インシュリン誘導体６分子当たり少なくとも１の亜鉛イオンを、保存料の添加後に加えることを含む。
【００６６】
本発明の他の態様では、本方法は、インシュリン誘導体６分子当たり少なくとも１、２、３、４、５又は６の亜鉛イオンを、保存料の添加前に付与し、インシュリン誘導体６分子当たり少なくとも２、３、４、５又は６の亜鉛イオンを、保存料の添加後に付与することを含む。
本発明の一態様では、保存料の添加前に付加される亜鉛イオンの数は、インシュリン誘導体６分子当たり少なくとも３の亜鉛イオンであり、保存料の添加後に付加される亜鉛イオンの数は、インシュリン誘導体６分子当たり少なくとも３の亜鉛イオンである。
【００６７】
本発明の一態様では、添加される保存料はフェノール及び／又はｍ-クレゾールである。
さらなる態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と共に、本発明のインシュリン誘導体又は本発明のインシュリンの亜鉛錯体の治療的有効量を含有し、１型糖尿病、２型糖尿病、及びこのような治療が必要な患者における高血糖症に起因する他の症状を治療するのに提供可能な医薬組成物に関する。
インシュリン誘導体、又は本発明のインシュリン誘導体又はインシュリン誘導体の亜鉛錯体を含有する医薬組成物は、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の症状を治療するのに使用される医薬組成物の製造に使用可能である。
【００６８】
本発明のさらなる態様は、１型糖尿病、２型糖尿病、及びこのような治療が必要な患者における高血糖症に起因する他の症状を治療するための、製薬的に許容可能な担体及び添加剤と、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体の混合物に、本発明のインシュリン誘導体又はインシュリン誘導体の亜鉛錯体を治療的有効量含有せしめてなる医薬組成物を提供することにある。
【００６９】
一態様では、本発明は、ＡｓｐＢ２８ヒトインシュリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインシュリン及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインシュリンからなる群から選択される、ヒトインシュリン又は速効型インシュリン類似体と、本発明のインシュリン誘導体又はインシュリン誘導体の亜鉛錯体の混合物である、医薬組成物を提供する。
【００７０】
さらなる態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体及び添加剤と、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体の混合物に、本発明のインシュリン誘導体又はインシュリンの亜鉛錯体を含有せしめてなる、１型糖尿病、２型糖尿病、及びこのような治療が必要な患者における高血糖症に起因する他の症状を治療するための、肺投与に関する。
本発明のインシュリン誘導体及び速効型インシュリン類似体は、約９０／１０％；約７０／３０％又は約５０／５０％の比率で混合することができる。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、製薬的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な添加剤と共に、本発明のインシュリン誘導体を治療的有効量患者に投与することを含む、１型糖尿病、２型糖尿病、及びこのような治療が必要な患者における高血糖症に起因する他の症状を治療するための方法を提供するものである。
本発明のさらなる態様は、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の症状を治療するのに使用される医薬組成物を製造するための方法を提供するものであり、該組成物は、製薬的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な添加剤と共に、本発明のインシュリン誘導体を含有している。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、製薬的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な添加剤と、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体の混合物に、治療的有効量の本発明のインシュリン誘導体が入ったものを患者に投与することを含む、１型糖尿病、２型糖尿病、及びこのような治療が必要な患者における高血糖症に起因する他の症状を治療するための方法を提供するものである。
本発明のさらなる態様は、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の症状を治療するのに使用される医薬組成物を製造するための方法を提供するものであり、該組成物は、製薬的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な添加剤と共に、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体の混合物に、本発明のインシュリン誘導体を含有せしめてなる。
【００７３】
他の態様では、本発明は、生理学的ｐＨ値で溶解する、本発明のインシュリン誘導体を含有する医薬組成物に関する。
他の態様において。本発明は、約６．５〜約８．５の間のｐＨ値で溶解する、本発明のインシュリン誘導体を含有する医薬組成物に関する。
他の態様では、本発明は、本発明のインシュリン誘導体を含有する、長時間にわたる作用プロファイルを有する医薬組成物に関する。
他の態様では、本発明は、約１２０ｎｍｏｌ／ｍｌ〜２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約６００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約６００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌの本発明のインシュリン誘導体、又は速効型インシュリン類似体と本発明のインシュリン誘導体との混合物を含有する溶液である医薬組成物に関する。
【００７４】
アシル化のための出発生成物、親インシュリン又はインシュリン類似体又はそれらの前駆体は、よく知られているペプチド合成、又は適切に形質転換された微生物におけるよく知られている組換え生成のいずれかにより生成させることができる。よって、インシュリン出発生成物は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、ペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地でポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培地から回収することを含む方法により生成可能である。
【００７５】
細胞を培養するのに使用される培地は、宿主細胞の増殖に適切な任意の従来からの培地、例えば適切な栄養補助剤を含有する複合培地又は最少培地であってよい。適切な培地は市販供給者から入手可能であり、また公開されている処方箋(例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。ついで、細胞により生成されるペプチドは、遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムにより上清又は濾液のタンパク質様成分を沈殿させ、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、当該ペプチドの種類に応じて様々なクロマトグラフィー手順により精製することを含む、従来からの手順により、培養培地から回収され得る。
【００７６】
親インシュリンをコードするＤＮＡ配列は、適切には、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによりポリペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ由来ものであってよい(例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF及びManiatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照)。また、親インシュリンをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されているホスホアミジト(phosphoamidite)法、又はMatthesら, EMBO Journal 3 (1984), 801-805に記載されている方法により、合成的に調製されてもよい。またＤＮＡ配列は、例えばUS4683202、又はSaikiら, Science 239 (1988),487-491に記載されているように、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製されてもよい。
【００７７】
ＤＮＡ配列は、便宜的に、組換えＤＮＡ手順にかけられている任意のベクターに挿入されてもよく、ベクターの選択は、多くの場合、挿入される宿主細胞に依存する。例えば、ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであってよく、その複製は染色体複製、例えばプラスミドとは無関係である。また、ベクターは、宿主細胞に挿入された場合に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた内部の染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００７８】
ベクターは、例えば、親インシュリンをコードするＤＮＡ配列が、プロモーター等、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している、発現ベクターである。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞に対して同族又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導されてもよい。種々の宿主細胞において親インシュリンをコードするＤＮＡの転写を方向付けるのに適切なプロモーターの例は、例えば上掲のSambrookら等、当該技術でよく知られている。
また、親インシュリンをコードするＤＮＡ配列は、必要であるならば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に結合していてよい。本発明の組換えベクターは、当該宿主細胞において、ベクターが確実に複製するＤＮＡ配列をさらに有している。
さらに、ベクターは選択可能なマーカー、例えば遺伝子、宿主細胞における欠失を補完し、薬剤、例えばアンピシリン、カイナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートに対する耐性を付与する生成物をさらに有していてもよい。
【００７９】
宿主細胞の分泌経路に本発明のペプチドを向かわせるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プロプレ配列又はプレ配列としても公知)が、組換えベクター中に提供されてもよい。分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレームにおいて、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し、５'に位置している。分泌シグナル配列は通常ペプチドに関連していてもよく、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【００８０】
親インシュリンをコードするＤＮＡ配列、プロモーター及び場合によってはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば上掲のSambrookら)。
【００８１】
ＤＮＡ配列又は組換えベクターが導入されている宿主細胞は、本ペプチドを生成可能な任意の細胞であってよく、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞を含む。よく知られており、当該技術で使用されている適切な宿主細胞の例は、限定されるものではないが、大腸菌、出芽酵母、又は哺乳類ＢＨＫ又はＣＨＯ細胞系である。
【００８２】
ついで、親インシュリン分子は、Ｂ-鎖のＢ１位又は選択されたＬｙｓ位のいずれかに、関連側鎖を導入することにより、本発明のインシュリン誘導体に転換される。側鎖は任意の簡便な方法により導入可能で、アミノ基をアシル化するための多くの方法が従来技術に開示されている。さらなる詳細は、以下の実施例により明らかになるであろう。
【００８３】
医薬組成物
請求項にある式の本発明のインシュリン誘導体は、例えば、皮下、経口又は肺に投与することができる。
皮下投与用には、式の化合物は、既知のインシュリンの処方と同じようにして処方される。さらに、皮下投与用には、式の化合物は、既知のインシュリンの投与と同じようにして投与され、医師はこの手順に通じている。
【００８４】
この発明のインシュリン誘導体は、血中インシュリン濃度を増加させ、及び／又は血中グルコース濃度を低下させるための用量効果的な方式で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖症などの疾患の治療に効果的である。インシュリンの効果的な投与を達成するには、この発明のインシュリン誘導体を約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇの吸入用量で投与することが必要である。治療的有効量は、インシュリンレベル、血中グルコースレベル、患者の健康状態、患者の肺の状態等を含む要因を考慮に入れて、知識のある医師により決定されるであろう。
【００８５】
本発明によれば、この発明のインシュリン誘導体は、吸入により送達されて、急速に吸収される。吸入による投与は、インシュリンの皮下投与に匹敵する程の薬物動態となる可能性がある。この発明のインシュリン誘導体を吸入することにより、血中インシュリン濃度が急速に上昇し、血中グルコース濃度が急速に低下する。同様の粒径及び同レベルの肺沈着で比較する場合、典型的には、様々な吸入装置で同様の薬学動態が得られる。
【００８６】
本発明によれば、この発明のインシュリン誘導体は、吸入による治療剤の投与に対して当該分野で知られている様々な吸入装置の任意のものによって送達されうる。これらの装置には、定量吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、スプレー等が含まれる。この発明のインシュリン誘導体は、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達せしめられる。この発明のインシュリン誘導体を投与するための吸入装置にはいくつかの好ましい特徴がある。例えば、吸入装置による送達は、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。吸入装置は、良好な呼吸のためには、例えば約１０μｍ未満、例えば約１−５μｍの小さな粒子を送達させるべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、Inhale Therapeuticsから市販されている装置、AERxTM(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
【００８７】
当業者であれば、この発明のインシュリン誘導体の処方、送達される処方物の量、及び単一用量の投与による持続時間が、使用される吸入装置の種類に依存することを認識しているであろう。いくつかのエアゾール送達システム、例えばネブライザーにおいて、投与頻度及びシステムが活性化する時間の長さは、主として、エアゾールにおけるインシュリンコンジュゲートの濃度に依存するであろう。例えば、より短い期間での投与では、噴霧溶液中、より高い濃度のインシュリンコンジュゲートを使用することができる。定量吸入器等の装置は、より高いエアゾール濃度を作り出すことができ、所望される量のインシュリンコンジュゲートを送達させるために、より短い期間で操作することができる。パウダー吸入器等の装置は、所定の負荷量の薬剤が装置から出されるまで、活性剤を送達する。この種の吸入器において、所定量のパウダーでのこの発明のインシュリン誘導体の量が、単一投与で投与される用量を定める。
【００８８】
吸入装置により送達される処方物におけるこの発明のインシュリン誘導体の粒子径は、肺中及び下気道又は肺胞中にインシュリンを送り込む能力の点で重要である。この発明のインシュリン誘導体は、送達されるインシュリンコンジュゲートの少なくとも約１０％、例えば約１０〜約２０％、又はそれ以上が肺に付着するように処方され得る。口呼吸するヒトにとって、肺沈着の最大効率は、約２μｍ〜約３μｍの粒子径で得られることが知られている。粒子径が約５μｍを越えると、肺沈着はかなり低減する。約１μｍ以下の粒子径では肺沈着は低減し、治療的に有効な十分な質量を有する粒子を送達することが困難になる。よって、吸入により送達されるインシュリン誘導体の粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子経を有する。インシュリン誘導体の処方は、選択される吸入装置において所望の粒子径を生じるように選択される。
【００８９】
有利には、乾燥パウダーとしての投与の場合は、この発明のインシュリン誘導体は、約１０μｍ未満、例えば約１〜約５μｍの粒子径を有する粒状形態に調製される。この粒子径により、患者の肺の肺胞への送達が効果的になされる。乾燥パウダーは、多くの粒子が所望の範囲のサイズを有するように製造された粒子から主としてなる。有利には、少なくとも約５０％の乾燥パウダーが、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。このような処方は、噴霧乾燥、製粉、又はインシュリンコンジュゲート及び他の所望する成分を含有する溶液の臨界点凝縮により達成可能である。また本発明に有用な粒子を製造するのに適した他の方法は従来から知られている。
【００９０】
粒子は、通常は、容器中において乾燥パウダー製剤から分離され、キャリア気流を介して、患者の肺に移送される。典型的には、現在の乾燥パウダー吸入器では、固形物を破壊する力は、単に患者の吸入により得られる。他の種類の吸入器では、患者の吸入により生じる気流が、粒子を崩壊させる推進モーターを駆動する。
【００９１】
乾燥パウダー吸入器から投与されるこの発明のインシュリン誘導体の製剤は、誘導体を含む微細に粉砕された乾燥パウダーを典型的には含んでいるが、パウダーは、増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をまた含有可能である。添加剤は、例えば、特定のパウダー吸入器からの送達に要求されるようにパウダーを希釈し、製剤のプロセシングを容易にし、製剤に有利なパウダー特性をもたらし、吸入装置からのパウダーの分散を容易にし、製剤を安定化させ(例えば酸化防止剤又はバッファー)、製剤に味を付与する等のために、インシュリンコンジュゲートの乾燥パウダー製剤中に含有せしめることができる。有利には、添加剤は、患者の気道に悪影響を与えないものである。インシュリン誘導体は分子レベルで添加剤と混合することもできるし、又は固形製剤は、添加剤の粒子と混合させるか、又は該粒子上にコートされるインシュリンコンジュゲートの粒子を含有可能である。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類及び多糖類；糖アルコール及び他のポリオール、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述した目的に対して有効な量、多くの場合は製剤の重量に対して約５０％から約９０％の量で存在している。インシュリン類似体タンパク質等のタンパク質の製剤について従来から知られている添加剤もまた本製剤に含めることができる。
【００９２】
この発明のインシュリン誘導体を収容するスプレーは、インシュリンコンジュゲートの懸濁液又は溶液を、加圧下でノズルを強制通過させることにより製造することができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給量は、所望する出量及び粒子径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続した電場により、電気スプレーを製造することができる。有利には、スプレーにより送達されるインシュリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍから約５μｍの範囲の粒子径を有する。
【００９３】
スプレーを用いて使用するのに適したこの発明のインシュリン誘導体の製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり、約１ｍｇから約２０ｍｇのインシュリンコンジュゲート濃度で、水溶液中にインシュリン誘導体を含有している。製剤は、賦形剤、バッファー、等張剤、保存料、界面活性剤、及び例えば亜鉛等の薬剤を含有することができる。また製剤は、賦形剤、又はインシュリン誘導体を安定化させるための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をさらに含有可能である。インシュリンコンジュゲートの処方に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。インシュリンコンジュゲートの処方に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等が含まれる。またインシュリン誘導体製剤は、エアゾールの形成において溶液の噴霧化により生じるインシュリンコンジュゲートの界面誘起凝集を低減し又は防止することができる界面活性剤をさらに含有することができる。様々な一般的界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを使用することができる。量は、一般的には、製剤の重量に対して約０．００１から約４％の範囲である。
【００９４】
本発明のインシュリン誘導体を含む医薬組成物は、また、かかる治療が必要な患者に非経口的に投与されうる。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射することにより実施されうる。または、非経口投与は、輸液ポンプにより実施されうる。さらなる選択肢は、例えば該目的に対して特に設計された組成物、パウダー又は液体としてインシュリンを鼻又は肺に投与することである。
【００９５】
本発明のインシュリン誘導体の注射用組成物は、所望する最終生成物が得られるように成分を溶解し混合することを含む製薬工業の常套的な技術を使用して調製することができる。よって、一手順によれば、本発明のインシュリン誘導体は、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、等張剤、保存料及びバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨが調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が得られるように、水で調節される。
【００９６】
本発明の他の態様では、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の態様を構成する。
【００９７】
本発明のさらなる態様では、製剤は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)、３-(４-クロロフェノキシ)プロパン-１,２-ジオール又はそれらの混合物からなる群から選択され得る製薬的に許容可能な保存料をさらに含有する。本発明のさらなる態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、保存料は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、保存料は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の保存料の各一が本発明の別の態様を構成する。医薬組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９８】
本発明のさらなる態様では、製剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤をさらに含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。糖又は糖アルコールが液状調製物に可溶性であり、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、使用量に決まった限界はない。一態様では、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明のさらなる態様では、等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、本発明のさらなる態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。医薬組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９９】
典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な保存料は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
【０１００】
本発明のインシュリン誘導体の経鼻投与用の組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号(Novo Nordisk A/S)に記載されているようにして調製されうる。
【０１０１】
この発明のインシュリン誘導体を含む組成物は、インシュリンに対して敏感な状態の治療に使用することができる。例えば、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症で、重症を負ったヒト及び大手術を受けたヒトに時折見られるようなものの治療に使用することができる。任意の患者に対する適量レベルは、使用される特定のインシュリン誘導体の有効性、年齢、体重、身体活動、患者の食習慣、他の薬剤との組合せの可能性、及び治療される状態の重篤度を含む種々の要因に依存する。この発明のインシュリン誘導体の毎日の投与量は、既知のインシュリン組成物と同様にして、当業者により個々の患者に対して決定されることが推奨される。
都合がよい場合は、この発明のインシュリン誘導体は、他のタイプのインシュリン、例えばさらに急速に作用を開始するインシュリン類似体と混合して使用してもよい。このようなインシュリン類似体の例は、例えば、公開番号ＥＰ２１４８２６(Novo Nordisk A/S)、ＥＰ３７５４３７(Novo Nordisk A/S)及びＥＰ３８３４７２(Eli Lilly & Co)を有する欧州特許出願に記載されている。
【０１０２】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解してはならない。
ここで提供される任意のかつ全ての例、又は例示的な言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をよりよく例証することを意図しており、別段の請求がなされない限りは、本発明の範囲を限定するものではない。明細書のいずれの言葉も、請求項に記載されていない構成を本発明の実施に必須であること示していると解されるべきではない。
ここでの特許文献の引用及び援用は、単に便宜的になされるものであって、このような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性の見解を反映するものではない。
この発明は、適用される法律が容認する場合、ここに添付される特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変更態様及び均等物を含む。
【０１０３】
本発明は、以下の項に要約されるであろう：
１．親インシュリンと置換基を含むインシュリン誘導体であって、該置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基、又は親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基のいずれかに結合し、但しＢ３がＬｙｓである場合、Ｂ２９はＧｌｕではないインシュリン誘導体。
【０１０４】
２．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ８位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
３．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ９位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
４．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ１４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
５．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ１８位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
６．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２１位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
７．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
８．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２３位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
９．前記置換基が、親インシュリンのＡ-鎖のＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する、第１項のインシュリン誘導体。
【０１０５】
１０．前記置換基が４〜４０の炭素原子を有する親油性基である、第１−９項のインシュリン誘導体。
１１．前記置換基が６〜４０の炭素原子を有するアシル基を含む、第１−１０項のインシュリン誘導体。
１２．前記置換基が１２〜３６の炭素原子を有するアシル基を含む、第１１項のインシュリン誘導体。
【０１０６】
１３．アシル基が、４≦ｎ≦３８のＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第１−１０項のインシュリン誘導体。
１４．アシル基が、４≦ｎ≦３８の(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第１−１０項のインシュリン誘導体。
１５．アシル基が、４≦ｎ≦３８の(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第１−１０項のインシュリン誘導体。
１６．アシル基が、４≦ｎ≦３８のＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第１−１０項のインシュリン誘導体。
【０１０７】
１７．６≦ｎ≦３６である、第１３−１６項のインシュリン誘導体。
１８．８≦ｎ≦３４である、第１３−１６項のインシュリン誘導体。
１９．１２≦ｎ≦３２である、第１３−１６項のインシュリン誘導体。
２０．１２≦ｎ≦２８である、第１３−１６項のインシュリン誘導体。
【０１０８】
２１．アシル基が、５-αリトコール酸又は５-βリトコール酸である、第１−１２項のインシュリン誘導体。
２２．アシル基が、コール酸、ヒオコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸又はコラン酸の５-α又は５-β異性体である、第１−１２項のインシュリン誘導体。
２３．アシル基が、デヒドロリトコール酸の５-α又は５-β異性体である、第１−１２項のインシュリン誘導体。
２４．アシル基が、フシジン酸、フシジン酸誘導体、又はグリシルレチン酸である、第１−１２項のインシュリン誘導体。
【０１０９】
２５．前記置換基が、次の一般式：
0005475836.tif 000007
のものであり、
ここで、Ｗは以下のものであり：
・側鎖にカルボン酸基を有するα-アミノ酸残基で、該残基は、そのカルボン酸基の一つと、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基を有するアミド基を形成し；又は
・アミド結合を介して共に結合した２、３又は４のα-アミノ酸残基からなる鎖で、アミド結合を介した該鎖は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合しており、Ｗのアミノ酸残基は中性側鎖を有するアミノ酸残基、及びＷが側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一のアミノ酸残基を有するように側鎖にカルボン酸基を有するアミノ酸残基の群から選択され；又は
・Ｘから親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基への共有結合；
Ｘは：
・-ＣＯ-；
・-ＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮＨＣＨ(ＣＯＯＨ)(ＣＨ２)４ＮＨＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；又は
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
であり、
但し：
ａ）Ｗがアミノ酸残基又はアミノ酸残基の鎖である場合、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素は、Ｗにおけるアミノ基とアミド結合を形成し、又は
ｂ）Ｗが共有結合である場合、Ｘにおいて下線が付されたカルボニル炭素は、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基を有するアミド結合を形成し；
Ｙは：
・ｍが６〜３２の範囲の整数である-(ＣＨ２)ｍ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の全数が１０〜３２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の炭化水素鎖；
・ｖ及びｗの合計が６〜３０の範囲になるように、ｖ及びｗが整数又はそれらのひとつが０である、式-(ＣＨ２)ｖＣ６Ｈ４(ＣＨ２)Ｗ-の二価の炭化水素鎖；
であり；
Ｚは：
・-ＣＯＯＨ；
・-ＣＯ-Ａｓｐ；
・-ＣＯ-Ｇｌｕ；
・-ＣＯ-Ｇｌｙ；
・-ＣＯ-Ｓａｒ；
・-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２；
・-ＳＯ３Ｈ；又は
・-ＰＯ３Ｈ；
である第１−９項のインシュリン誘導体、及びその任意のＺｎ２＋錯体。
【０１１０】
２６．Ｗが、側鎖にカルボン酸基を有するα-アミノ酸残基であり、該残基が、そのカルボン酸基の一つと、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基を有するアミド基を形成する、第２５項のインシュリン誘導体。
２７．Ｗが、４〜１０の炭素原子を有するα-アミノ酸残基である、第２６−２７項のいずれかのインシュリン誘導体。
２８．Ｗが、α-Ａｓｐ、β-Ａｓｐ、α-Ｇｌｕ、γ-Ｇｌｕ、α-ｈＧｌｕ及びδ-ｈＧｌｕからなる群から選択される、第２５−２７項のインシュリン誘導体。
２９．Ｗが２つのα-アミノ酸残基からなる鎖であり、一方が４〜１０の炭素原子と遊離のカルボン酸基を有し、他方が２〜１１の炭素原子を有するが、遊離のカルボン酸基を有さない、第２５項のインシュリン誘導体。
３０．Ｗが、α-Ａｓｐ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-Ｇｌｙ；及びＧｌｙ-δ-ｈＧｌｕからなる群から選択される、第２５及び２９項のインシュリン誘導体。
【０１１１】
３１．Ｗが、独立して４〜１０の炭素原子を有し、双方が遊離のカルボン酸基を有する、２つのα-アミノ酸残基からなる鎖である、第２５項のインシュリン誘導体。
３２．Ｗが、α-Ａｓｐ-α-Ａｓｐ；α-Ａｓｐ-α-Ｇｌｕ；α-Ａｓｐ-α-ｈＧｌｕ；α-Ａｓｐ-β-Ａｓｐ；α-Ａｓｐ-γ-Ｇｌｕ；α-Ａｓｐ-δ-ｈＧｌｕ；β-Ａｓｐ-α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-α-Ｇｌｕ；β-Ａｓｐ-α-ｈＧｌｕ；β-Ａｓｐ-β-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-γ-Ｇｌｕ；β-Ａｓｐ-δ-ｈＧｌｕ；α-Ｇｌｕ-α-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-α-Ｇｌｕ；α-Ｇｌｕ-α-ｈＧｌｕ；α-Ｇｌｕ-β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-γ-Ｇｌｕ；α-Ｇｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；γ-Ｇｌｕ-α-Ａｓｐ；γ-Ｇｌｕ-α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-α-ｈＧｌｕ；γ-Ｇｌｕ-β-Ａｓｐ；γ-Ｇｌｕ-γ-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；α-ｈＧｌｕ-α-Ａｓｐ；α-ｈＧｌｕ-α-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-α-ｈＧｌｕ；α-ｈＧｌｕ-β-Ａｓｐ；α-ｈＧｌｕ-γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-α-Ａｓｐ；δ-ｈＧｌｕ-α-Ｇｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-β-Ａｓｐ；δ-ｈＧｌｕ-γ-Ｇｌｕ；及びδ-ｈＧｌｕ-δ-ｈＧｌｕからなる群から選択される、第２５及び３１のインシュリン誘導体。
３３．Ｗが共有結合である、第２５項のインシュリン誘導体。
【０１１２】
３４．Ｘが、-ＣＯ-又は-ＣＯＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-である、第２５−３３項の何れかのインシュリン誘導体。
３５．Ｘが、
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；又は
・-ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
である、第２５−３３項のインシュリン誘導体。
【０１１３】
３６．Ｙが-(ＣＨ２)ｍ-であり、ｍが６〜３２の範囲の整数である、第２５−３５項の何れかのインシュリン誘導体。
３７．ｍが８-２０の範囲である、第３６項のインシュリン誘導体。
３８．ｍが１１、１２、１３、１４、１５又は１６である、第３６−３７項のインシュリン誘導体。
【０１１４】
３９．Ｚが-ＣＯＯＨである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４０．Ｚが-ＣＯ-Ａｓｐである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４１．Ｚが-ＣＯ-Ｇｌｕである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４２．Ｚが-ＣＯ-Ｇｌｙである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４３．Ｚが-ＣＯ-Ｓａｒである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４４．Ｚが-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２である、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４５．Ｚが-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２である、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４６．Ｚが-ＳＯ３Ｈである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
４７．Ｚが-ＰＯ３Ｈである、第２５−３８項の何れか一項のインシュリン誘導体。
【０１１５】
４８．次の式：
0005475836.tif 000008
を有し、ここでＩｎｓは親インシュリン部分であり、-Ｃ(Ｏ)-Ｘ１-Ｗ-[ＣＨ２]ｍ-Ｘ-Ｙ-Ｑ-Ｚは置換基であり、Ｉｎｓは、置換基において、Ｘ１、Ｗ、［ＣＨ２］ｍ、Ｙ又はＱに結合したＣＯ-基、及びＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基の間のアミド結合を介して置換基に結合しており、
Ｘ１は、
・ｎが１、２、３、４、５又は６である-(ＣＨ２)ｎ；
・Ｒが、水素又は-(ＣＨ２)ｐ-ＣＯＯＨ；-(ＣＨ２)ｐ-ＳＯ３Ｈ；-(ＣＨ２)ｐ-ＰＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＳＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＰＯ３Ｈ２；１又は２の-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＣＯＯＨ基で置換されたアリール基；-(ＣＨ２)ｐ-テトラゾール-５-イルで、ｐが１〜６の範囲の整数である、ＮＲ；
・Ｒ１及びＲ２がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑが１-６であり、Ｒが上述したものである、-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-；
・Ｒ３及びＲ４がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１が１-６であり、Ｒが上述したものである、-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-；又は
・結合；
であり、
Ｗは、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ３Ｈ、及び-ＰＯ３Ｈ２及びテトラゾール-５-イルからなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンであり、又はＷは結合であり；
ｍは０、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｘは、
・-Ｏ-；
・次の式
0005475836.tif 000009
のものであり；
ここでＲは上述したものであるか；又は
・結合；
であり；
Ｙは、
・Ｒ１及びＲ２がＨ、-ＣＯＯＨ、結合又はＯＨとすることができ、ｑが１-６であり、Ｒが上述したものである、-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-；
・Ｒが上述したものであるＮＲ；
・Ｒ３及びＲ４がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１が１-６であり、Ｒが上述したものである、-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-；又は
・結合；
であり；
Ｑは、
・ｒが４〜２２の整数である、-(ＣＨ２)ｒ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の全数が４〜２２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の炭化水素鎖；又は
・Ｑ１-Ｑ６が互いに独立して、Ｏ；Ｓ又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜２２の範囲となるように、ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立してゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ１、ｖ２及びｖ３は互いに独立して、ゼロ又は１とすることができ、但しＱ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５及びＱ６は互いに結合を形成していなくてもよく、ｓ、ｗ、ｔ及びｚがゼロ又は１である場合は、いずれの-ＣＨ２-も次の原子：Ｏ、Ｓの２つに結合していない、式-(ＣＨ２)ｓ-Ｑ１-(Ｃ６Ｈ４)ｖ１-Ｑ２-(ＣＨ２)Ｗ-Ｑ３-(Ｃ６Ｈ４)ｖ２-Ｑ４-(ＣＨ２)ｔ-Ｑ５-(Ｃ６Ｈ４)ｖ３-Ｑ６-(ＣＨ２)ｚ-の２価の鎖；
であり；また、
Ｚは：
-ＣＯＯＨ；
-ＣＯ-Ａｓｐ；
-ＣＯ-Ｇｌｕ；
-ＣＯ-Ｇｌｙ；
-ＣＯ-Ｓａｒ；
-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２；
-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２；
-ＳＯ３Ｈ
-ＰＯ３Ｈ２；
Ｏ-ＳＯ３Ｈ；
Ｏ-ＰＯ３Ｈ２；
-テトラゾール-５-イル、又は
Ｗ１が、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ３Ｈ、及び-ＰＯ３Ｈ２及びテトラゾール-５-イルから選択される１又は２の基で置換されたアリーレン又はヘテロアリーレンである、-Ｏ-Ｗ１；
である第１−９項のインシュリン誘導体、及びその任意のＺｎ２＋錯体。
【０１１６】
４９．Ｘ１が、ｎが１、２、３、４、５又は６である-(ＣＨ２)ｎである、第４８項のインシュリン誘導体。
５０．Ｘ１がＮＲであり、Ｒが、水素又は-(ＣＨ２)ｐ-ＣＯＯＨ；-(ＣＨ２)ｐ-ＳＯ３Ｈ；-(ＣＨ２)ｐ-ＰＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＳＯ３Ｈ２；-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＰＯ３Ｈ２；１又は２の-(ＣＨ２)ｐ-Ｏ-ＣＯＯＨ基で置換されたアリール基；-(ＣＨ２)ｐ-テトラゾール-５-イルで、ｐが１〜６の範囲の整数である、第４８項のインシュリン誘導体。
５１．Ｘ１が-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-である、第４８項のインシュリン誘導体。
５２．Ｘ１が-(ＣＨ２)-(ＣＨＣＯＯＨ)-ＮＨ-ＣＯ-である、第５１項のインシュリン誘導体。
５３．Ｘ１が-(ＣＨ２)２-(ＣＨＣＯＯＨ)-ＮＨ-ＣＯ-である、第５１項のインシュリン誘導体。
５４．Ｘ１が-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-である、第４８項のインシュリン誘導体。
５５．Ｘ１が結合である、第４８項のインシュリン誘導体。
【０１１７】
５６．Ｗがフェニレンである、第４８−５６項の何れかのインシュリン誘導体。
５７．Ｗが、窒素、酸素又は硫黄を有する５-７員の複素環系である、第４８−５６項のインシュリン誘導体。
５８．Ｗが、少なくとも一の酸素を有する５員の複素環系である、第５７項の何れかのインシュリン誘導体。
５９．Ｗがアリーレンである、第４８−５５項のインシュリン誘導体。
６０．Ｗが、-ＣＣＯＨで置換されていてもよいアリーレンである、第５９項のインシュリン誘導体。
６１．Ｗが結合である、第４８−５５項の何れかのインシュリン誘導体。
【０１１８】
６２．Ｘが-Ｏ-である、第４８−６１項の何れかのインシュリン誘導体。
６３．Ｘが、次の式
0005475836.tif 000010
である、第４８−６１項の何れかのインシュリン誘導体。
６４．Ｘが、次の式
0005475836.tif 000011
である、第４８−６１項の何れかのインシュリン誘導体。
【０１１９】
６５．Ｒが水素である、第６３−６４項のインシュリン誘導体。
６６．Ｒが-(ＣＨ２)ｐ-ＣＯＯＨである、第６３−６４項のインシュリン誘導体。
６７．ｐが１である、第６６項のインシュリン誘導体。
６８．ｐが２である、第６６項のインシュリン誘導体。
【０１２０】
６９．Ｘが結合である、第４８−６１項のインシュリン誘導体。
７０．Ｙが-(ＣＲ１Ｒ２)ｑ-ＮＲ-ＣＯ-である、第４８−６９項の何れかのインシュリン誘導体。
７１．Ｙが-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-である、第７０項のインシュリン誘導体。
７２．Ｙが-(ＣＨ２)３-(ＣＨＣＯＯＨ)-ＮＨ-ＣＯ-である、第７０項のインシュリン誘導体。
７３．Ｙが(ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ-であり、ここで、Ｒ３及びＲ４がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１が１-６であり、Ｒが上述したものである、第４８−６９項の何れかのインシュリン誘導体。
７４．Ｙが-((ＣＲ３Ｒ４)ｑ１-ＮＲ-ＣＯ)２−４-であり、ここで、Ｒ３及びＲ４がＨ、-ＣＯＯＨ、又はＯＨとすることができ、ｑ１が１-６であり、Ｒが上述したものである、第４８−６９項の何れかのインシュリン誘導体。
７５．Ｙが結合である、第４８−６９項の何れかのインシュリン誘導体。
【０１２１】
７６．Ｑが-(ＣＨ２)ｒ-であり、ｒが４〜２２の整数である、第４８−７５項の何れかのインシュリン誘導体。
７７．ｒが８〜２０の整数である、第７６項のインシュリン誘導体。
７８．ｒが１０〜１８の整数である、第７６−７７項のインシュリン誘導体。
７９．ｒが１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８である、第７６−７８項のインシュリン誘導体。
【０１２２】
８０．Ｑが、１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の全数が４〜２２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の鎖である、第４８−７５項の何れかのインシュリン誘導体。
８１．Ｑが、式-(ＣＨ２)ｓ-Ｑ１-(Ｃ６Ｈ４)ｖ１-Ｑ２-(ＣＨ２)Ｗ-Ｑ３-(Ｃ６Ｈ４)ｖ２-Ｑ４-(ＣＨ２)ｔ-Ｑ５-(Ｃ６Ｈ４)ｖ３-Ｑ６-(ＣＨ２)ｚ-の２価の鎖であり、ここでＱ１-Ｑ６は互いに独立して、Ｏ；Ｓ又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜２２の範囲となるように、ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立してゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ１、ｖ２及びｖ３は互いに独立して、ゼロ又は１とすることができる、第４８−７５項の何れかのインシュリン誘導体。
【０１２３】
８２．ｓが１又は２である、第８１項のインシュリン誘導体。
８３．ｓが９、１０又は１１である、第８１項のインシュリン誘導体。
８４．ｖ１が１又は２である、第８１−８３項の何れかのインシュリン誘導体。
８５．Ｑ１、Ｑ２、Ｑ５及びＱ６が全て結合である、第８１−８４項のインシュリン誘導体。
８６．Ｑ１がＳ又はＯである、第８１−８４項の何れかのインシュリン誘導体。
８７．ｗが２である、第８１−８６項の何れかのインシュリン誘導体。
８８．ｖ２が１であり、ｔが１である、第８７項のインシュリン誘導体。
【０１２４】
８９．Ｚが-ＣＯＯＨである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９０．Ｚが-ＣＯ-Ａｓｐである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９１．Ｚが-ＣＯ-Ｇｌｕである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９２．Ｚが-ＣＯ-Ｇｌｙである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９３．Ｚが-ＣＯ-Ｓａｒである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９４．Ｚが-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２である、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９５．Ｚが-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２である、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９６．Ｚが-ＳＯ３Ｈである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９７．Ｚが-ＰＯ３Ｈ２である、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９８．Ｚが-Ｏ-ＳＯ３Ｈである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
９９．Ｚが-Ｏ-ＰＯ３Ｈ２である、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
１００．Ｚが-テトラゾール-５-イルである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
１０１．Ｚが-Ｏ-Ｗ１であり、Ｗ１が、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ３Ｈ、及び-ＰＯ３Ｈ２、及びテトラゾール-５-イルから選択される１又は２の基で置換されたアリーレン又はヘテロアリーレンである、第４８−８８項の何れかのインシュリン誘導体。
【０１２５】
１０２．親インシュリンが、Ｂ-鎖のＢ２９位にＬｙｓ残基を有していないインシュリン類似体である、第１−１０１項の何れかのインシュリン誘導体。
１０３．親インシュリンがヒトインシュリン又はブタインシュリンであり、ここでＢ２９位のＬｙｓ残基が置換されており、Ｌｙｓ残基が、Ｂ２９位を除くＡ-鎖又はＢ-鎖の位置に挿入されている、第１−１０２項のインシュリン誘導体。
１０４．親インシュリンのＡ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位の一つにあるアミノ酸残基がＬｙｓ残基である、第１及び第１０２−１０３項のインシュリン誘導体。
１０５．親インシュリンのＢ-鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つにあるアミノ酸残基がＬｙｓ残基である、第１及び第１０２−１０３項のインシュリン誘導体。
【０１２６】
１０６．親インシュリンのＢ３０位のアミノ酸残基が欠失している、第１０２−１０５項のインシュリン誘導体。
１０７．親インシュリンのＢ１位のアミノ酸残基が欠失している、第１０２−１０５項のインシュリン誘導体。
１０８．親インシュリンのＡ２１位のアミノ酸残基がＧｌｙ又はＡｓｎである、第１０２−１０７項のインシュリン誘導体。
１０９．親インシュリンのＢ３位のアミノ酸残基がＬｙｓである、第１０２−１０８項のインシュリン誘導体。
１１０．親インシュリンのＢ２８位のアミノ酸残基がＡｓｐである、第１０２−１０９項のインシュリン誘導体。
１１１．親インシュリンのＢ２９位のアミノ酸残基がＰｒｏ又はＴｈｒである、第１０２−１１０項の何れかのインシュリン誘導体。
【０１２７】
１１２．インシュリン誘導体６分子当たり、２つの亜鉛イオン、３つの亜鉛イオン、４つの亜鉛イオン、５つの亜鉛イオン、６つの亜鉛イオン、７つの亜鉛イオン、８つの亜鉛イオン、９つの亜鉛イオン、１０の亜鉛イオン、１１の亜鉛イオン、又は１２の亜鉛イオンが結合している、上述の項の何れか一項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体。
【０１２８】
１１３．上述の項の何れかのインシュリン誘導体の治療的有効量を、場合によっては製薬的に許容可能な担体と共に含有する、このような治療が必要な患者における糖尿病を治療するための医薬組成物。
１１４．上述の項の何れかのインシュリン誘導体の治療的有効量を、場合によっては製薬的に許容可能な担体と共に、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体と混合して含有する、このような治療が必要な患者における糖尿病を治療するための医薬組成物。
【０１２９】
１１５．インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンが、医薬組成物に加えられる、第１１３−１１４項の医薬組成物又は第１１２項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体の製造方法。
１１６．インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンが、保存料の添加後に、医薬組成物に加えられる、第１１５項の方法。
【０１３０】
１１７．第１−１１１項の何れかのインシュリン誘導体の治療的有効量を、場合によっては製薬的に許容可能な担体と共に、患者に投与することを含む、このような治療が必要な患者における糖尿病の治療方法。
１１８．場合よっては製薬的に許容可能な担体と共に、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体と混合された第１−１１１項の何れかのインシュリン誘導体の治療的有効量を患者に投与することを含む、このような治療が必要な患者における糖尿病の治療方法。
１１９．糖尿病の肺治療用である第１１７−１１８項の方法。
【０１３１】
１２０．１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の症状を治療するのに使用される医薬組成物の製造における、第１−１１１項の何れかのインシュリン誘導体の使用。
１２１．１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症に起因する他の症状を治療するのに使用される医薬組成物の製造における、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体と混合されての第１−１１１項の何れかのインシュリン誘導体の使用。
【０１３２】
１２２．ＡｓｐＢ２８ヒトインシュリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインシュリン及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインシュリンからなる群から選択される速効型インシュリン類似体と、第１−１１１項の何れかのインシュリン誘導体と混合物。
１２３．インシュリン誘導体が、
ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＢ３-ミリストイル ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＢ２２-ミリストイル ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ１５-ミリストイル ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ１８-ミリストイル ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ２２-ミリストイル ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＢ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ１５-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ１８-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、
からなる群から選択される、第１項のインシュリン誘導体。
１２４．実施例に記載されているインシュリン誘導体。
【０１３３】
本発明は、次の項に、さらに要約されるであろう。
１ａ．Ａ-鎖のＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３又はＡ２４位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基、又はＢ-鎖の親インシュリンのＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２０、Ｂ２１又はＢ２２位に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基のいずれかに結合した側鎖を有するインシュリン誘導体で、但しＢ３がＬｙｓである場合、Ｂ２９はＧｌｕではないインシュリン誘導体。
２ａ．側鎖が６〜４０の炭素原子を有する親油性基である、第１ａ項のインシュリン誘導体。
【０１３４】
３ａ．側鎖が、６〜４０の炭素原子、好ましくは１２〜３６の炭素原子を有するアシル基を含む、第２ａ項のインシュリン誘導体。
４ａ．アシル基が、４≦ｎ≦３８のＣＨ３-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
５ａ．アシル基が、４≦ｎ≦３８の(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
６ａ．アシル基が、４≦ｎ≦３８の(ＮＨ２-ＣＯ)-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
７ａ．アシル基が、４≦ｎ≦３８のＨＯ-(ＣＨ２)ｎ-ＣＯ-である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
【０１３５】
８ａ．アシル基が、５-αリトコール酸又は５-βリトコール酸である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
９ａ．アシル基が、コール酸、ヒオコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸又はコラン酸の５-α又は５-β異性体である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
１０ａ．アシル基が、デヒドロリトコール酸の５-α又は５-β異性体である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
１１ａ．アシル基が、フシジン酸、フシジン酸誘導体、又はグリシルレチン酸である、第３ａ項のインシュリン誘導体。
【０１３６】
１２ａ．側鎖が、次の一般式：
0005475836.tif 000012
のものであり、
ここで、Ｗは、
・側鎖にカルボン酸基を有するα-アミノ酸残基で、そのカルボン酸基の一つが、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基とアミド基を形成する残基；又は
・アミド結合を介して互いに結合した２、３又は４のα-アミノ酸残基からなる鎖で、アミド結合を介して、親インシュリンのＡ-又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合する鎖であり、Ｗのアミノ酸残基は中性側鎖を有するアミノ酸残基、及びＷが側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一のアミノ酸残基を有するように側鎖にカルボン酸基を有するアミノ酸残基の群から選択されたもの；又は
・Ｘから親インシュリンのＡ-鎖又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基への共有結合であり；
Ｘは：
・-ＣＯ-；
・-ＣＨ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
・-ＮＨＣＨ(ＣＯＯＨ)(ＣＨ２)４ＮＨＣＯ-；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；又は
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；
で、
ａ）Ｗがアミノ酸残基又はアミノ酸残基鎖である場合、下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、Ｗ中のアミノ基とアミド結合を形成し、又は
ｂ）Ｗが共有結合である場合、下線が付されたカルボニル炭素からの結合を介して、親インシュリンのＡ-鎖又はＢ-鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基とアミド結合を形成し；
Ｙは、
・ｍが６〜３２の範囲の整数である-(ＣＨ２)ｍ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基、及び鎖中の炭素原子の総数が１０〜３２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ２-基を有する二価の炭化水素鎖；
・ｖ及びｗの合計が６〜３０の範囲になるようにｖ及びｗが整数であるか又はそれらの一方が０である式-(ＣＨ２)ｖＣ６Ｈ４(ＣＨ２)Ｗ-の二価の炭化水素鎖
であり；
Ｚは：
・-ＣＯＯＨ；
・-ＣＯ-Ａｓｐ；
・-ＣＯ-Ｇｌｕ；
・-ＣＯ-Ｇｌｙ；
・-ＣＯ-Ｓａｒ；
・-ＣＨ(ＣＯＯＨ)２；
・-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２；
・-ＳＯ３Ｈ；又は
・-ＰＯ３Ｈ；
である第１ａ項のインシュリン誘導体、及びその任意のＺｎ２＋錯体。
【０１３７】
１３ａ．アシル基が、リンカーとしてアミノ酸を使用し、リジン残基に結合している、第３ａ−１２ａ項のインシュリン誘導体。
１４ａ．アミノ酸リンカーが、α-グルタミル又はβ-グルタミル結合、又はβ-又はα-アルパルチル結合している、第１３ａ項のインシュリン誘導体。
１５ａ．アミノ酸リンカーが、γ-アミノブタノイル結合、β-アラニル結合、α-アミド-γ-グルタミル結合、又はα-アミド-β-アスパルチル結合している、第１３ａ項のインシュリン誘導体。
【０１３８】
１６ａ．側鎖が脂肪酸又は脂肪二酸を有している、第２ａ項のインシュリン誘導体。
１７ａ．親油性基が負に帯電可能である、第２ａ項のインシュリン誘導体。
１８ａ．側鎖が親油性アミノ酸残基を有している、第１７ａ項のインシュリン誘導体。
１９ａ．側鎖がアミノ酸残基を有している、第１７ａ項のインシュリン誘導体。
２０ａ．親インシュリンがｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン、ＡｒｇＢ２９ヒトインシュリン、又はＡｒｇＢ２９ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンである、先の項の何れかのインシュリン誘導体。
２１ａ．実施例に記載されているインシュリン誘導体。
【０１３９】
２２ａ．１２までの亜鉛原子が、６つのインシュリン誘導体当たりに結合している、先の項の何れか一項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体。
【０１４０】
２３ａ．第２２ａ項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体、又は第１ａ−２１ａ項の何れかのインシュリン誘導体の治療的有効量を製薬的に許容可能な担体と共に含有する、このような治療が必要な患者における糖尿病を治療するための医薬組成物。
２４ａ．第２２ａ項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体、又は第１ａ−２１ａ項の何れかのインシュリン誘導体の治療的有効量を、製薬的に許容可能な担体と共に、急速に作用を介するインシュリン又はインシュリン類似体と混合して含有する、このような治療が必要な患者における糖尿病を治療するための医薬組成物。
２５ａ．肺投与のためのものである、第２３ａ又は２４ａ項の医薬組成物。
【０１４１】
２６ａ．インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンを含有する、第２３ａ−２５ａ項の医薬組成物。
２７ａ．インシュリン誘導体６分子当たり約１２までの亜鉛イオンが、保存料の添加後に医薬組成物に加えられる、医薬組成物の製造方法。
２８ａ．第２２ａ項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体、又は第１ａ−２１ａ項のインシュリン誘導体の治療的有効量を、製薬的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な添加剤と共に、患者に投与することを含む、このような治療が必要な患者における糖尿病の治療方法。
２９ａ．製薬的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な添加剤と共に、急速に作用を開始するインシュリン又はインシュリン類似体と混合された、第２２ａ項のインシュリン誘導体の亜鉛錯体、又は第１ａ−２１ａ項のインシュリン誘導体の治療的有効量を、患者に投与することを含む、このような治療が必要な患者における糖尿病の治療方法。
【実施例】
【０１４２】
一般的手順：
発現ベクターの構築、酵母細胞の形質転換、及び本発明のインシュリン前駆体の発現
全ての発現プラスミドは、S. cerevisiaeにおけるプラスミドの選択及び安定化を目的としてサッカロミセス・ポンベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含むことを特徴とするＥＰ１７１１４２に記載のものと同様のＣ-ＰＯＴ型のものである。またプラスミドは、S. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーターをさらに含む。これらの配列は、インシュリン生成物及びリーダーの融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントの配列を除く全ての配列であり、プラスミドｐＫＦＮ１００３における対応配列に類似している(ＷＯ９０／１００７５に記載)。種々の融合タンパク質を発現させるために、ｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントが、関心あるリーダー-インシュリン融合体をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントで単に置き換えられる。このようなＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントは、標準的な手順に従い、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用して合成することができる。
【０１４３】
酵母形質転換体を、宿主株S. cerevisiae株ＭＴ６６３の形質転換により調製した(ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ ＨＩＳ４／ｈｉｓ４ ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Ｃｉｒ＋)。酵母株ＭＴ６６３を、ＷＯ９２／１１３７８の出願に関連してDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託し、寄託番号ＤＳＭ６２７８が得られた。
ＭＴ６６３を、６００ｎｍでの光学密度が０．６になるまで、ＹＰＧａＬ(１％のバクト酵母抽出物、２％のバクトペプトン、２％のガラクトース、１％のラクテート)において増殖させ、遠心分離により収集し、１０ｍＬの水で洗浄し、再度遠心分離し、１．２Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ=８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌのジチオトレイトール(dithiotreitol)を含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で１５分インキュベートし、遠心分離し、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、及び２ｍｇのNovozym(登録商標)２３４を含有する１０ｍｌの溶液に、細胞を再懸濁させた。懸濁液を３０℃で３０分インキュベートし、遠心分離により細胞を収集し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトール及び１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ＝７．５))で洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁させた。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ-懸濁細胞を、約０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１５分間放置した。１ｍｌの(２０％のポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５)を添加し、混合物をさらに３０分、室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレットを、０．１ｍｌのＳＯＳ(１．２Ｍのソルビトール、３３％ｖ／ｖのＹＰＤ、６．７ｍＭのＣａＣｌ２)に再懸濁させ、３０℃で２時間インキュベートした。ついで、懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁させた。ついで、６ｍｌの上層寒天(１．２Ｍのソルビトールと２．５％の寒天を含有する、ShermanらのSC medium. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)を５２℃で添加し、同様の寒天で凝固した、ソルビトール含有培地を収容するプレートの上に、懸濁液を注いだ。発現プラスミドで形質転換されたS. cerevisiae株ＭＴ６６３を、３０℃で７２時間、ＹＰＤ中で増殖させた。
【０１４４】
本発明のインシュリン誘導体の生産、精製及び特徴付け
上述したようにして多くのインシュリン前駆体を生成し、培地から単離して、精製した。インシュリン前駆体をアシル化させ、以下の実施例に記載したようにしてプロセシングし、最終的なインシュリン誘導体を生成した。これらのインシュリン誘導体を、以下に記載するようなヒトインシュリンと比較し、ヒトインシュリンレセプターに対する結合親和性により測定される生物学的インシュリン活性について試験した。
以下の実施例は、明細書及び実施例において同定された中間化合物及び最終生成物に言及する。本発明のインシュリン誘導体の調製は、以下の実施例を使用して詳細に記載されるが、記載された化学反応及び精製スキームは、本発明のインシュリン誘導体を調製するための一般的な適用性について開示している。時折、反応は、本発明の開示されている範囲内に含まれる各化合物に対して、記載されたようには適用されない場合もある。この場合の化合物は、当業者には直ぐに認識されるであろう。これらの場合では、反応は当業者に既知の一般的な修飾法により、すなわち干渉基を適切に保護することにより、他の常套的な試薬に変えることにより、又は反応条件の常套的な改変により、成功裏に実施することができる。あるいは、ここに開示されているか又は他に一般的な他の反応が、本発明の対応する化合物の調製に適用されるであろう。全ての調製方法において、全ての出発物質は既知であるか、又は既知の出発物質から直ぐに調製することができる。全ての温度は摂氏で記載されており、別の定義をしない限りは、全ての部及びパーセントは、収率に関しては重量であり、全ての部は、溶媒及び溶離液に関しては容量である。
【０１４５】
本発明のインシュリン誘導体は、当該分野で典型的な次の手順の一又は複数を使用することにより精製することができる。これらの手順は、必要ならば、勾配、ｐＨ、塩、濃度、流量、カラム等に関して変えることができる。当該問題の種々のインシュリンの不純物プロファイル、溶解度等の要因に応じて、これらの変更は容易に認識可能であり、また当業者によってなされるであろう。
【０１４６】
実施例１：
ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000013
工程１：ミリスチン酸-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
アシル化試薬ミリスチン酸-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成を、B. Faroux-Corlayら, J. Med. Chem. 2001, 44, 2188-2203に記載されたようにして実施した。
【０１４７】
工程２：インシュリン前駆体ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａの調製及び精製
インシュリン前駆体ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを、以下の精製工程ＡないしＣに記載されたようにして精製した。
精製工程Ａ：捕捉
工程Ａにおいて、１０．７５リットルの清浄な培地を、４．５リットルの９９％エタノールを添加することにより希釈し、３０ｖｏｌ％のエタノールを含む１５．２５リットルの全体容量とした(伝導率：２．７ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ＝３．４)。３００ｍのＳＰビッグ・ビーズセファロースカラム(１００-３００μｍ、Amersham Biosciences)を、朝まで、１５．２５リットルの調製された培養培地(約１０ｍｌ／分の流量)を充填する前に、１リットルの０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５(約２０ｍｌ／分の流量)で平衡にした。カラムに充填した後、再度、１リットルの０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５、続いて１リットルの４０ｖｏｌ％エタノール(約２０ｍｌ／分の流量)で洗浄した。ついで、結合していたインシュリン前駆体ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを、１．５リットルの０．２Ｍ酢酸ナトリウム、３５ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ  ５．７５で溶出させた(流量：１．５ｍｌ／分、溶出した前駆体容量：４００ｍｌ、前駆体の量：２２０ｍｇ)。
【０１４８】
精製工程Ｂ：逆相ＨＰＬＣ
工程Ｂにおいて、溶出液を蒸発乾固させ、ペレットを０．２５Ｍの酢酸に再溶解させた。Ｃ１８カラム(ＯＤＤＭＳ Ｃ１８、２０×２５０Ｍｍ、２００Å、１０μｍ、FeF Chemicals A/S)において逆相ＨＰＬＣにより精製する直前に、ｐＨをさらに１．５まで低下させた。カラムに適用する前に、前駆体溶液を滅菌濾過した(２２μｍ、Low Protein Binding Durapore(登録商標)(ＰＶＤＦ)、Millipore)。１５％Ｂから５０％Ｂの勾配をカラムに流した。ここで、バッファーＡ：０．２Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．０４Ｍのオルト-リン酸、１０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ  ２．５、及びバッファーＢ：７０ｖｏｌ％のエタノールである。５ｍｌ／分の流量、４０℃のカラム温度で、勾配を１２０分流した。インシュリン前駆体 ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを、約３５％のＢで溶出させ、プールした(全量量：７５ｍｌ)。
【０１４９】
精製工程Ｃ：ゲル濾過による脱塩
精製工程Ｃにおいて、逆相ＨＰＬＣからの溶出液におけるエタノール含有量を、ロータリーエバポレータを使用して、５ｖｏｌ％以下に低減させた(新規容量：〜５０ｍｌ)。１０００ｍｌのＧ２５セファデックスカラム(５ｘ５５ｃｍ、Amersham Biosciences)を、０．５Ｍの酢酸で洗浄し、ついでインシュリン前駆体ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａをカラムに適用し、０．５Ｍの酢酸中でのゲル濾過により脱塩した。ついで、インシュリン前駆体を２８０ｎｍでのＵＶ検出にかけ、さらに、塩を伝導率測定にかけた。脱塩直後に、インシュリン前駆体を凍結乾燥させた(重量で１６０ｍｇ、５７５９．８７ｍ／ｚ)。
【０１５０】
工程３：ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成
３０ｍｇの凍結乾燥インシュリン前駆体 ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを、５ｍｌの５０ｍＭホウ酸、ｐＨ２．６に溶解させた。ついで、１ＭのＮａＯＨを数滴使用し、ｐＨを１０．２に上昇させた。４ｍｇのアシル化試薬ミリスチン酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、約５０℃まで注意深く加熱しながら、３．４ｍｌのＣＨ３ＣＮに溶解させた。ついで、攪拌しつつ(これにより、アシル化試薬は１．７５倍過剰)、３．２ｍｌのアシル化試薬溶液をインシュリン前駆体溶液に添加した。室温で６０分攪拌しつつ、インキュベートした後、２．１ｍｌの０．２Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０を添加することにより、反応を停止させた。室温でのインキュベートの１０分後、ｐＨを６．４に調節し、それによって、アシル化されたインシュリン前駆体ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを沈殿させた。沈殿物を４℃で朝まで保存した(沈殿物の量：２３ｍｇ)。
【０１５１】
工程４：ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成
２３ｍｇのＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ沈殿物を、４．２ｍｌの５０ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ１０．０に溶解させた。３．６ｍｇの凍結乾燥されたブタトリプシン(Novo Nordisk A/S)を、３．５ｍｌの５０ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ  １０．０に溶解させた。ついで、このトリプシン溶液の０．５ｍｌを、インシュリン前駆体溶液に添加した(これにより、インシュリン前駆体は２００倍超)。ついで、ｐＨ＜３(０．５Ｍの酢酸を用いて、ｐＨ＝２．０８)に低下させることにより、トリプシン活性を停止させた後に、混合物を室温で１５分インキュベートした。
【０１５２】
ついで、アシル化されたインシュリン類似体ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを、逆相ＨＰＬＣにより精製した(トリプシン、及び任意の非-アシル化、二重-アシル化等、又は切断されていないインシュリン分子の除去)。４０％Ｂから１００％Ｂの勾配を、Ｃ４カラム(Jupiter C4、５μｍ、３００Å、１０×２５０ｍｍ、Phenomenex)に適用した。ここで、バッファーＡ：１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭの(ＮＨ４)ＨＣＯ３、１０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ８．５、及びバッファーＢ：７０ｖｏｌ％のエタノールである。２ｍｌ／分の流量、４０℃のカラム温度、１ｘ２５ｃｍのカラムサイズで、勾配を１２０分流した。ＮεＡ９-ミリストイル ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを７０％Ｂで溶出させた(溶出した類似体の容量：１５ｍｌ)。約６までｐＨを低下させることによって、類似体を沈殿させ、２ｍｌの０．５Ｍ酢酸に再溶解させ、凍結乾燥させた(類似体の重量：９．３ｍｇ重量、ＬＣＭＳ：５９８８．０４ｍ／ｚ)。
【０１５３】
実施例２：
ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
工程１：ω-カルボキシペンタデカノイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨの調製
アシル化試薬ω-カルボキシペンタデカノイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨを、本質的に、オクタデカン二酸の代わりにヘキサデカン二酸から出発して、WO-2005012347-A2にオクタデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨ(ω-カルボキシヘプタデカノイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨ)について記載しているようにして調製した。
0005475836.tif 000014
【０１５４】
工程２：インシュリン前駆体ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａの調製及び精製
インシュリン前駆体を、実施例１の工程２に記載しているようにして精製した。
工程３：ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成
４０ｍｇの凍結乾燥されたインシュリン前駆体 ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを、２ｍｌの１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．８に溶解させた。１３ｍｇのアシル化試薬ω-カルボキシペンタデカノイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨを、５００μｌのＣＨ３ＣＮに懸濁させた。ついで、７０μｌのＮＭＰを添加することにより、アシル化試薬を溶解させた。ついで、攪拌しつつ(これにより、アシル化試薬は２．５倍過剰)、５７０μｌのアシル化試薬溶液をインシュリン前駆体溶液にゆっくりと添加した。室温で６０分攪拌しつつ、インキュベートした後、ｐＨを約５に調節することにより反応を停止させ、それによって、アシル化されたインシュリン前駆体ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを沈殿させた。沈殿物を４℃で一晩保存した(ＬＣ-ＭＳ：６１５４．９３ｍ／ｚ)。
【０１５５】
工程４：ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成
ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ沈殿物を、３ｍｌの５０ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ１０．０に溶解させた。１ｍｇの凍結乾燥されたブタトリプシン(Novo Nordisk A/S)を、１．５ｍｌの５０ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ１０．０に溶解させ、ついで、インシュリン前駆体溶液に添加した(これにより、インシュリン前駆体は３００倍超)。ついで、ｐＨ＜３に低下させることにより、トリプシン活性を停止させた後に、反応体を室温で１５分インキュベートした。
【０１５６】
ついで、アシル化されたインシュリン類似体ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを、逆相ＨＰＬＣにより精製した(トリプシン、及び任意の非アシル化、二重アシル化等、又は非切断インシュリン分子の除去)。２５％Ｂ〜５５％Ｂの勾配を、フジ(Fuji)Ｃ４カラム(１５μｍ、２００Å、１０ｘ２５０ｍｍ、FeF Chemicals A/S)に適用した。ここで、バッファーＡ：１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭの(ＮＨ４)ＨＣＯ３、１０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ  ８．５、及びバッファーＢ：７０ｖｏｌ％のエタノールである。３ｍｌ／分の流量、室温で１００分以上、勾配を流した。ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを、約４８％Ｂで溶出させた(１７ｍｇの誘導体)。５以下にｐＨを低下させることによって、類似体を沈殿させ、２ｍｌの０．５Ｍ酢酸に再溶解させ、凍結乾燥させた(ＬＣ-ＭＳ：６１７３ｍ／ｚ)。
【０１５７】
実施例３：
ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
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工程１：ω-カルボキシペンタデカノイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨの調製
アシル化試薬ω-カルボキシペンタデカノイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨの調製を、実施例２に記載されているようにして実施した。
【０１５８】
工程２：インシュリン前駆体ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａの調製及び精製
インシュリン前駆体を、本質的に実施例１の工程２に記載されているようにして、すなわち捕捉工程、続いて逆相-ＨＰＬＣ、及び最終的に脱塩をして精製した。脱塩直後に、インシュリン前駆体を凍結乾燥した(ＬＣ-ＭＳ：５７３１．３４ｍ／ｚ)。
工程３：ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成
インシュリン前駆体ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタ-デカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａの合成を、本質的に実施例２の工程３に記載されているようにして実施した(ＬＣ-ＭＳ：６１２８．２ｍ／ｚ)。
【０１５９】
工程４：ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成
ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａを、本質的に、実施例２の工程４で、ＮεＡ９-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ９ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａについて記載したように、トリプシンにより切断した。
ついで、アシル化されたインシュリン類似体ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを、逆相ＨＰＬＣにより精製した。まず、トリプシン切断からの反応混合物を、１０％のエタノール(４．５ｍｌ)に水を添加することにより希釈し、１７５μｌのＰＭＳＦ(１ｍｇ／ｍｌ)を添加してトリプシンを阻害した。ｐＨを８に調節し、ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを溶解させた。２０％Ｂから５０％Ｂの勾配を、フジＣ４カラム(１５μｍ、２００Å、１０ｘ２５０ｍｍ、FeF Chemicals A/S)に適用した。ここで、バッファーＡ：１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭの(ＮＨ４)ＨＣＯ３、１０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ  ８．５、及びバッファーＢ：７０ｖｏｌ％のエタノールである。３ｍｌ／分の流量、室温で１６０分以上、勾配を流した。ＮεＢ３-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを、約３０％Ｂで溶出させた。
【０１６０】
分析用ジュピター(Jupiter)Ｃ４カラム(５μｍ、３００Å、４．６ｘ１５０ｍｍ、Phenomenex)を使用し、逆相ＨＰＬＣにより、誘導体をさらに精製した。２０％Ｂから５０％Ｂの勾配をカラムに適用した。ここで、バッファーＡ：１２．５ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭの(ＮＨ４)ＳＯ４、２０ｖｏｌ％のＣＨ３ＣＮ、ｐＨ７、及びバッファーＢ：８０ｖｏｌ％のＣＨ３ＣＮである。上述したように準備されたＨＰＬＣからのサンプルを、約１０のサブサンプルに分割し、各サブサンプルを分析用ＨＰＬＣスケールで精製した。精製後の全容量：２０ｍｌ、純度：９１％。
ｐＨを５．１２まで低下させることにより、類似体を沈殿させ、ペレットを凍結乾燥させた(１ｍｇ、ＬＣ-ＭＳ：６１４８．４ｍ／ｚ)。
【０１６１】
実施例４：
ＮεＢ３-ミリストイル ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
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ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製は、実施例３に記載されている。ＮεＢ３-ミリストイル ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＢ３-ミリストイル ＬｙｓＢ３ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に、実施例１に記載しているようにして実施した。ＬＣ-ＭＳ：無傷誘導体：５９５９．０ｍ／ｚ、還元誘導体のＢ-鎖：３５８１．３ｍ／ｚ。
【０１６２】
実施例５：
ＮεＢ２２-ミリストイル  ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000017
ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製を、本質的に実施例１及び３に記載しているようにして実施した。ＮεＢ２２-ミリストイル ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＢ２２-ミリストイル  ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に、実施例１に記載しているようにして実施した。ＬＣ-ＭＳ：無傷の誘導体：５９１７．２ｍ／ｚ、還元誘導体：２３８２．６０ｍ／ｚ(Ａ-鎖)、３５３７．７０ｍ／ｚ(Ｂ-鎖)。
【０１６３】
実施例６：
ＮεＢ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000018
ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製は、本質的に実施例１及び３に記載されているようにして実施した。ＮεＢ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＢ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＢ２２ ＡｒｇＢ２９ｚ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に実施例２及び３に記載されているようにして実施した。ＭＳ算出：６１０４．０６ｍ／ｚ。
【０１６４】
実施例７：
ＮεＡ１５-ミリストイル ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000019
ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製を、本質的に実施例１及び３に記載されているようにして実施した。ＮεＡ１５-ミリストイル ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＡ１５-ミリストイル ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に、実施例１に記載されているようにして実施した。ＭＡＬＤＩ-ＭＳ：無傷誘導体：５９４６．１４ｍ／ｚ、還元誘導体のＢ-鎖：３３５６．２３ｍ／ｚ。
【０１６５】
実施例８：
ＮεＡ１５-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000020
ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製は、本質的に実施例１及び３に記載されているようにして実施した。ＮεＡ１５-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＡ１５-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１５ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に、実施例２及び３に記載されているようにして実施した。ＭＳ算出値：６１３２．１２ｍ／ｚ。
【０１６６】
実施例９：
ＮεＡ１８-ミリストイル ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000021
ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９  ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製を、本質的に実施例１及び３に記載されているようにして実施した。ＮεＡ１８-ミリストイル ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＡ１８-ミリストイル-ＬｙｓＡ１８-ＡｒｇＢ２９-ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に実施例１に記載されているようにして実施した。ＬＣ-ＭＳ：無傷の誘導体：５９５９．５ｍ／ｚ、還元誘導体のＢ-鎖：３３５５．５０ｍ／ｚ。
【０１６７】
実施例１０：
ＮεＡ１８-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000022
ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製を、本質的に実施例１及び３に記載されているようにして実施した。ＮεＡ１８-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＡ１８-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ１８ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に実施例２及び３に記載されているようにして実施した。ＭＡＬＤＩ-ＭＳ：６１４６．９６ｍ／ｚ。
【０１６８】
実施例１１：
ＮεＡ２２-ミリストイル ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000023
ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製を、本質的に、実施例１及び３に記載しているようにして実施した。ＮεＡ２２-ミリストイル ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＡ２２-ミリストイル ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に実施例１に記載されているようにして実施した。ＬＣ-ＭＳ：６０７２．３ｍ／ｚ。
【０１６９】
実施例１２：
ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000024
ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の調製及び精製を、本質的に実施例１及び３に記載されているようにして実施した。ＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０Ｂ'Ａ前駆体の合成、続くトリプシンによる切断での最終生成物であるＮεＡ２２-ω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの生成を、本質的に実施例２及び３に記載されているようにして実施した。ＬＣ-ＭＳ：６２６０．ｍ／ｚ。
【０１７０】
実施例１３：
ＮεＡ２２-３-カルボキシ-５-ヘキサデカンジオイルアミノベンゾイルＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000025
０．１ＭのＮａ２ＣＯ３(２．２５ｍｌ)に溶解させたＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンに、アセトニトリル(１．１３ｍｌ)に溶解させた１．２当量の５-(１５-tert-ブトキシカルボニルペンタデカノイルアミノ)イソフタル酸-３-tert-ブチルエステル-１-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(ＷＯ２００６０８２２０４に記載されたようにして調製)を添加する。インシュリン誘導体を等電沈殿により単離させる。乾燥した生成物を、ＴＦＡで３０分処理する。蒸発により、ＴＦＡを除去する。ＳＰ２５０／２１ヌクレオシル(Nucleosil)３００-７ Ｃ４カラム、及び０．１％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリルの１０-８０％勾配を使用する、グリソン(Glison)２１５システムにおいて実施可能なＲＰ-ＨＰＬＣによる精製後に、表題化合物を単離する。
【０１７１】
実施例１４：
ＮεＡ２２-３-カルボキシ-５-オクタデカンジオイルアミノベンゾイルＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000026
４-(１７-tert-ブトキシカルボニル−ヘプタデカノイルアミノ)イソフタル酸-３-tert-ブチルエステル-１-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イル)エステルを、ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンと反応させ、続いてＴＦＡ処理をし、上述したようにして精製する。
【０１７２】
実施例１５：
ＮεＡ２２-１０-(３,５-ジカルボキシフェノキシ)デカノイル-γ-Ｇｌｕ ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000027
５-{９-[(Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)プロピルカルバモイル]ノニルオキシ}イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(上述したようにして調製)を、ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンと反応させ、続いてＴＦＡ処理をし、上述したようにして精製する。
【０１７３】
実施例１６：
ＮεＡ２２-４-[１０-(３,５-ジカルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブチリルＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンの合成
0005475836.tif 000028
５-{９-[３-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-プロピルカルバモイル]-ノニルオキシ}-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(上述したようにして調製)を、ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンと反応させ、続いてＴＦＡ処理をし、上述したようにして精製する。
【０１７４】
５-{９-[(Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-プロピルカルバモイル]-ノニルオキシ}-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステルの合成
工程１：３-ヒドロキシ-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
６０℃で、無水トルエン(２０ｍｌ)に５-ヒドロキシ-イソフタル酸(１．０６ｇ、５．８ｍｍｏｌ)が入った懸濁液に、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド-ジ-tert-ブチルアセタール(７．０ｍｌ、２９．２ｍｍｏｌ)を添加し、温度を１００℃まで上昇させた。無水ＤＭＦ(５ｍｌ)を添加した。窒素下で混合物を攪拌した。２時間後、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド-ジ-tert-ブチルアセタール(７．０ｍＬ、２９．２ｍｍｏｌ)をさらに添加した。３時間後、反応混合物を室温まで冷却し、濾過した。ヘプタン／ＥｔＯＡｃ／酢酸が４０：２０：３であるものを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより、固形物を精製した。表題化合物が分離され、トリ-tert-ブチルエステルで汚染されていた。
ＬＣ-ＭＳ：２３９，１３(Ｍ-ｔＢｕ)。
【０１７５】
工程２：５-(９-メトキシカルボニル-ノニルオキシ)-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
３-ヒドロキシ-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(９０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ)を、無水アセトン(５ｍｌ)、Ｋ２ＣＯ３(９０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ)に溶解させ、１０-ブロモデカン酸メチル(０．０７５ｍｌ、０．３ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を還流まで加熱した。加熱は、Ｋ２ＣＯ３の分解により生じる。しばらくすると、沈殿物が形成された。一晩、還流(５０℃)し続けた。さらなるＫ２ＣＯ３(３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ)及び１０-ブロモデカン酸メチル(０．０２５ｍｌ、０．１ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を５０℃で一晩還流した。乾燥反応混合物に、ＥｔＯＡｃ及び水を添加した。抽出後、水及びブラインで有機相を洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、透明な油として、表題粗化合物が得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：４２３．３４(Ｍ-ｔＢｕ)  。
【０１７６】
工程３：５-(９-カルボキシ-ノニルオキシ)-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
ＴＨＦ(２ｍｌ)に５-(９-メトキシカルボニル-ノニルオキシ)-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(１６２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ)が入った溶液に、１ＮのＮａＯＨ(０．３５ｍｌ)を添加した。混合物を７時間還流した。濃縮する前に、混合物を朝まで、室温で放置した。残ったＥｔＯＡｃ及び０．１ＮのＨＣｌに添加した。ＥｔＯＡｃを用いて２回、水相を抽出した。組合せた有機相をブラインで洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、透明なシロップが得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：４６５．３(Ｍ＋１)。
【０１７７】
工程４：５-[９-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
無水ＴＨＦ(２ｍｌ)に５-(９-カルボキシ-ノニルオキシ)-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(１５６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ)が入った溶液に、ＴＳＴＵ(１２５ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．０８ｍｌ)を添加した。混合物を窒素下で、朝まで攪拌した。混合物を濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに再溶解させ、濾過した。濾液を０．１ＮのＨＣｌ(２ｘ)、及びブライン(１ｘ)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、透明なシロップが得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：５６２．３(Ｍ＋１)。
【０１７８】
工程５：５-[９-((Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-カルボキシ-プロピルカルバモイル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
無水ＤＭＦ(１ｍｌ)に５-[９-(２，５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(６２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ)が入った溶液に、Ｈ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(０．０２７ｇ、０．１３ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(０．０５ｍｌ)を添加した。窒素下で４時間、混合物を朝まで攪拌した。混合物を濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに再溶解させ、０．１ＮのＨＣｌ(２ｘ)、ブライン(１ｘ)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、シロップが得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：６５０．４４(Ｍ＋１)。
【０１７９】
工程６：５-{９-[(Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-プロピルカルバモイル]-ノニルオキシ}-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
５-[９-((Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-カルボキシ-プロピルカルバモイル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ)を、無水ＴＨＦ(１ｍｌ)に溶解させた。ＴＳＴＵ(４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(０．０５ｍｌ)を添加した。窒素下で週末にかけて、混合物を室温で攪拌した。混合物を濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに再溶解させ、濾過した。濾液を０．１ＮのＨＣｌ(２ｘ)で洗浄し、ブライン(１ｘ)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、透明なシロップが得られた。まだ出発物質が残っており、ＴＳＴＵ-処理を繰り返し、続いて調べたところ、透明なシロップとして表題の化合物が得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：７４７(Ｍ＋１)。
【０１８０】
５-{９-[３-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-プロピルカルバモイル]-ノニルオキシ}-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステルの合成
工程１：５-[９-(３-カルボキシ-プロピルカルバモイル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
５-[９-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ)を、無水ＤＭＦ(２ｍｌ)に溶解させた。４-アミノ酪酸(ＧＡＢＡ、２３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(０．０５ｍｌ)を添加した。混合物を窒素下で２日間攪拌した。混合物を濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解させ、０．１ＮのＨＣｌ(２×)及びブライン(１×)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、透明なシロップが得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：５５０．３３(Ｍ＋１)。
【０１８１】
工程２：５-{９-[３-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)-プロピルカルバモイル]-ノニルオキシ}-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル
無水ＴＨＦ(２ｍｌ)に５-[９-(３-カルボキシ-プロピルカルバモイル)-ノニルオキシ]-イソフタル酸ジ-tert-ブチルエステル(６２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ)が入った溶液に、ＤＩＰＥＡ(０．０５ｍｌ)及びＴＳＴＵ(４１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ)を添加した。窒素下で朝まで、混合物を室温で攪拌した。混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃを残留物に添加した。濾過により沈殿物を除去した。濾液を０．１ＮのＨＣｌ(２×)及びブライン(１×)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮したところ、透明なシロップが得られた。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ：６４７．２９。
【０１８２】
実施例１７：
本発明のインシュリン誘導体の疎水性
インシュリン誘導体の疎水性は、等張条件下で逆相ＨＰＬＣを実施することにより見出される。インシュリン誘導体の溶出時間を、同じ条件下で既知の疎水性を有する他の誘導体、又はＨＩと比較する。疎水性度ｋ'ｒｅｌは：ｋ'ｒｅｌｄｅｒｉｖ＝((ｔｄｅｒｉｖ−ｔ０)／(ｔｒｅｆ−ｔ０))＊ｋ'ｒｅｌｒｅｆとして算出される。参照としてＨＩを使用：ｋ'ｒｅｌｒｅｆ＝ｋ'ｒｅｌＨＩ＝１。ＨＰＬＣシステムのボイド時間、ｔ０は、５μｌの０．１ｍＭ ＮａＮＯ３を注入することにより測定される。実施条件：
カラム： Lichrosorb RP-C18、５μｍ、４×２５０ｍｍ
バッファーＡ：０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３、１０ｖｏｌ％のＣＨ３ＣＮ
バッファーＢ：５０ｖｏｌ％のＣＨ３ＣＮ
注入容量：５μｌ
実施時間：最大で６０分
最初の勾配を流した後、誘導体及び参照を流す等張レベル(例えばＨＩ)を選択し、等張条件下にある誘導体及び参照の溶出時間を、上述した等式に使用し、ｋ'ｒｅｌｄｅｒｉｖを算出する。
【０１８３】
実施例１８：
本発明のインシュリン誘導体のインシュリンレセプター結合性
ヒトインシュリンレセプターに対する本発明のインシュリン誘導体の親和性は、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定される。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗-マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号 PRNQ0017)を、２５ｍｌの結合バッファー(１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％のトゥイーン(Tween)-２０)と混合した。単一のPackard Optiplate(Packard No.6005190)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：１５０００に希釈された精製組換えヒトインシュリンレセプター(エクソン１１を有する又は有さない)、１００μｌの試薬混合物当たり５００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-ヒトインシュリンの所定量の保存溶液、１２μｌの１：１０００に希釈されたＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ、全体を１２ｍｌにする結合バッファーからなる。ついで、全体で１００μｌの試薬混合物を、Packard Optiplateの各ウェルに添加し、インシュリン誘導体の希釈シリーズを、適切なサンプルからOptiplateにおいて作製する。ついで、ゆっくりと振盪させつつ、サンプルを１６時間インキュベートする。ついで、１分間遠心分離することにより相分離させ、プレートをトップカウンターで計測する。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego、CA)における非線状回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させた。
【０１８４】
実施例１９：
本発明のインシュリン誘導体のヒト血清アルブミン親和アッセイ
本発明のインシュリン誘導体のヒト血清アルブミンについての親和性を、Minileak粒子に固定化したヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に対するＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-誘導体の相対結合定数として与え、インシュリンデテミール(生理食塩水バッファーにおいて１に等しい)に対して比較し、２３℃で測定する：ＨＳＡａｆｆ＝Ｋｄ(デテミール)／Ｋｄ(誘導体)。
０．３ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．８において、ＨＳＡ(Sigma A-1887)及びＰＥＧ(Fluka 95172)を用い、室温で朝までインキュベートすることにより、ＨＳＡをMinileak粒子(KemEnTec 1011F)に固定する。インキュベート後、１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ９．０を添加することにより反応を停止させ、物質を、０．１ＭのＴｒｉｓ(ＨＣｌ)、ｐＨ７．４、０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．０、及び０．１Ｍのホスファート、ｐＨ３．０で数回洗浄する。ＨＳＡ-Minileak物質を、０．１ＭのＴｒｉｓ(ＨＣｌ)、ｐＨ７．４、０．０２％のアジドに保存する。物質に固定されたＨＳＡの量を、３Ｈ-ミリスチン酸(PerkinElmer NET-830)、及び０．１ＭのＴｒｉｓ(ＨＣｌ)、ｐＨ７．４に入った種々の量の遊離のＨＳＡ、０．０２５％のトリトン(Triton)-Ｘ-１００と共に、ＨＳＡ-Minileakを、室温で２時間インキュベートすることにより評価する。サンプルを遠心分離した後、シンチレーション-カウンターで上清を分析し、固定化されたＨＳＡの量を計測する。
ＨＳＡに対するインシュリン誘導体の親和性を測定する場合、種々の量のＨＳＡ-Minileakを、０．１ＭのＴｒｉｓ(ＨＣｌ)、ｐＨ７．４、０．０２５％のトリトン-Ｘ-１００において、室温で２時間、Ａ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-誘導体と共にインキュベートする。インキュベート後、サンプルを遠心分離し、上清の半分を新しいチューブに取り出す。上清の半分(１／２Ｓ)と残りの上清＋ペレット(１／２Ｓ＋Ｐ)の双方を、ガンマ-カウンターで分析し、Ａ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-誘導体についてのＫｄを算出するために、これらのデータを使用する。
【０１８５】
実施例２０：
本発明のインシュリン誘導体の自己会合性の分析
大きいが可溶性の錯体へ自己会合する本発明インシュリン誘導体の能力を、ＳＥＣ(サイズ排除クロマトグラフィー)を使用して分析する：
カラム：SuperoseＴＭ ６ ＰＣ ３．２／３０、ＣＶ＝２．４ｍｌ
(Amerham Biosciences)
温度：３７℃
ＳＥＣバッファー：１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．０１％のＮａＮ３、ｐＨ７．５
注入容量：２０μｌ
流量：０．０４ｍｌ／分
実施時間：８０分
【０１８６】
この分析のため、本発明のインシュリン誘導体は、０．６ｍＭの誘導体、２．１Ｚｎ２＋／ヘキサマー、１６ｍＭのフェノール、７ｍＭのホスファート、ｐＨ７．８からなる溶液中に入れる。ついで、誘導体の保持時間を、次の標準分子の保持時間と比較する：
標準体Ｉ：  ＨＳＡ＋ＨＳＡダイマー(６６．４ｋＤａ＋１３３ｋＤａ)
Ｃｏ(ＩＩＩ)ヘキサマー(３５．０ｋＤａ)
Ｘ２モノマー(５．９ｋＤａ) 
標準体ＩＩ：ブルーデキストラン(１．５ＭＤａ)
チログロブリン(６６９ｋＤａ)
フェリチン(４４０ｋＤａ)
アルドラーゼ(１５８ｋＤａ)
オボアルブミン(４４．５ｋＤａ)
リボヌクレアーゼ(１３．７ｋＤａ)
【０１８７】
次の式を使用し、誘導体についてのＫａｖを決定する：
Ｋａｖ＝(ｔ−ｔ０)／(Ｖｔ／(ｆ＋ｔｄ−ｔ０))
ここで、ｔは与えられたピークに対する保持時間であり、ｔ０はブルーデキストランに対する保持時間であり、Ｖｔは全カラム容量(ここでは２．４ｍｌ)であり、ｆは流量(ここでは０．０４ｍｌ／分)であり、及びｔｄは、システムにおいてカラムのないブルーデキストランの保持時間である。
【０１８８】
Ｋａｖ値は誘導体の自己会合の度合いを示す。すなわち、Ｃｏ(ＩＩＩ)ヘキサマー及びＸ２モノマーに対するＫａｖに類似して大きなＫａｖであることは、大きな自己会合性錯体を形成するための誘導体の傾向が小さいか又は無いことを示し、これに対し、Ｋａｖが０に近い程非常に小さいか又は負であるということは、大きな可溶性錯体に自己会合する誘導体の傾向が大きいことを示す。
0005475836.tif 000029
注意：
ヒトインシュリンに対する疎水性：ｋ'ｒｅｌ＜１：＋＋＋、１−１０：＋＋、＞１０：＋(ＨＩ＝１)
ヒトインシュリンに対するインシュリンレセプター親和性：＜５％：＋、５-５０％：＋＋、＞５０％：＋＋＋
自己会合性：Ｋａｖ＜０．５５：＋＋、及びＫａｖ≧０．５５：＋
(ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に対してＫａｖ＝０．５５、ヒトインシュリンＣｏ(ＩＩＩ)ヘキサマーに対してＫａｖ＝０．６３、及びインシュリン類似体Ｘ２モノマーに対してＫａｖ＝０．７２)。
【０１８９】
実施例２１：
本発明のインシュリン誘導体のラットへの静脈内ボーラス注射後の血中グルコース低下効果
ハイプノルム-ドルミカム(Hypnorm-Dormicum)皮下注射(１．２５ｍｇ／ｍｌのドルミカム、２．５ｍｇ／ｍｌのフルアニソン、０．０７９ｍｇ／ｍｌのクエン酸フェンタニル)を、プライミング用量(試験用物質の投与前−３０分の時点)として２ｍｌ／ｋｇ、及び付加的に２０分毎に１ｍｌ／ｋｇを使用し、１８時間絶食した２００〜３００ｇの雄ウィスターラットに麻酔をかけた。
動物に、１ｍｌ／ｋｇのコントロール及び被験化合物(通常の用量範囲：０．１２５-２０ｎｍｏｌ／ｋｇ)を静脈内注射(尾静脈)で投与する。全グルコース濃度を決定するための血液サンプルを、−２０分及び０分(投与前)、投与後１０、２０、３０、４０、６０、８０、１２０及び１８０分の時点で、尾端の毛細管の刺し傷より、ヘパリン処理された１０μｌのガラスチューブにて収集した。EBIO Plus自動分析器(Eppendorf, Germany)を使用する固定化グルコースオキシダーゼ法により、分析バッファーにおいて希釈した後、血中グルコース濃度を測定した。平均血漿グルコース濃度コース(平均±ＳＥＭ)を、各用量及び各化合物について作製する。
【０１９０】
実施例２２：
本発明のインシュリン類似体のＴ５０％のブタにおける定量
Ｔ５０％は、テストされたインシュリンのＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]標識された誘導体の注射量の５０％が、外部γ-計測器を用いて測定して、注射部位から消失した時間である。
実験用動物ケアの原則に従った。薬物動態及び薬力学的研究のために、特定の病原菌を持たないＬＹＹＤ、糖尿病ではない雌のブタ、デンマーク在来種、ヨークシャー及びデュロックの交雑種を使用した(Holmenlund, Haarloev, Denmark)。ブタは意識があり、４−５ヶ月の年齢、７０−９５ｋｇの体重であった。実験前に動物を８時間絶食させた。
１２５Ｉを有するＴｙｒＡ１４で標識されたインシュリン誘導体の処方された調製物を、先に記載したブタに皮下注射した(Ribel, U.,  Jorgensen, K, Brange, J、及びHenriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M and Lefebvre, P. J.  891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding))。
【０１９１】
実験の開始時に、本発明のインシュリン誘導体(被験化合物)６０ｎｍｏｌ用量とインシュリンデテミール６０ｎｍｏｌ用量(双方ともＴｙｒ Ａ１４において１２５Ｉ標識された)を、各ブタの頸部の２つの別々の部位に注射した。
皮下注射部位から放射性標識が消失するのを、伝統的な外部ガンマ-計測法の修正法を使用し、モニターした(Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. 及びGries, F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding))。この修正法を用いると、コードレスポータブル装置を使用して、数日間、皮下沈着物から放射活性が消失するのを、連続して測定することができる(Scancys Laboratorieteknik, Varlose, DK-3500, Denmark)。測定を１分間隔で実施し、計測された値をバックグラウンド活性に対して修正した。
【０１９２】
実施例２３：
ヒトインシュリンに対する本発明のインシュリン誘導体の有効性
実験日、２３８-３８３ｇでオスのスプラーグドーリーラットを、クランプ実験に使用した。制御された周囲条件下、ラットは餌に自由に接近し、クランプ実験の前には一晩(３ｐｍから)、絶食させた。
【０１９３】
実験プロトコル：
外科手順の少なくとも１週間前にラットを動物施設に慣れさせた。クランプ実験の約１週間前、ハロタン麻酔下で、頸静脈(注入のため)及び頸動脈(血液のサンプリングのため)にタイゴンカテーテルを挿入し、露出させ、頸部の後ろに固定した。外科手術後、ラットをStreptocilin vet.(Boehringer Ingelheim；０．１５ｍｌ／ラット、筋肉内)に付与し、回復期間中、動物ケアユニット(２５℃)内に配した。無痛覚とするために、麻酔中にアノルフィン(Anorphin)(０．０６ｍｇ／ラット、皮下)を投与し、麻酔から十分に回復した後、再度２日に１回、リマダイル(Rimadyl)(１．５ｍｇ／ｋｇ、皮下)を投与した。
使用したクランプ技術を、(１)実験日の７ａｍに一晩(前日の３ｐｍから)絶食させたラットを計量し、サンプリング用シリンジ及び注入システム(Harvard 22 Basic pumps, Harvard, 及びPerfectum Hypodermic glass syringe, Aldrich)につなぎ、ついで個々のクランプ用ゲージに配し、実験開始前の約４５分、そこで休ませた。全実験中、それらの通常の寝具上を、ラットは自由に動くことができ、飲み水に自由に接近することもできた。血漿グルコースレベルを１０分間隔で測定した３０分の基本期間後、試験されるインシュリン誘導体及びヒトインシュリン(ラット当たり１回の投与レベル、投与レベル当たりｎ＝６−７)を、３００分、一定の速度で注入した(静脈内)。１０分の間隔中、血漿グルコースレベルを測定し、正常血糖を維持するために、２０％水性グルコースの注入を調節した。再懸濁させた赤血球のサンプルを、各ラットからプールし、頸動脈カテーテルを介して、約１／２ｍｌ容量を戻した。
各実験日において、試験される個々のインシュリン誘導体溶液及びヒトインシュリン溶液のサンプルを、クリンプ実験の前及び終了時に取り出し、ペプチド濃度をＨＰＬＣにより確認した。ラットインシュリン及びＣ-ペプチド、並びに試験されるインシュリン誘導体及びヒトインシュリンの血漿濃度を、研究の前及び終了の時点で測定した。ペントバルビタール過剰投与を使用し、実験の終了時にラットを殺した。
【０１９４】
実施例２４：
ラットへのインシュリン誘導体の肺送達
被験物質は、滴下法により肺経路で投与されるであろう。簡単に述べると、雄ウィスターラット(約２５０ｇ)を、６．６ｍｌ／ｋｇの皮下プライミング用量として、続いて３０分の間隔を開けて３．３ｍｌ／ｋｇの保持用量を３回付与する約６０ｍｌのフェンタニル／デヒドロデンズペリドール／-ドルミカムで麻酔した。麻酔誘導の１０分後、基本サンプルを尾静脈(ｔ＝−２０分)から得、続いて被験物質の投与直前(ｔ＝０)、基本サンプルを得た。ｔ＝０において、被験物質を一方の肺に気管内的に投与した。丸くなった端部を有する特定のカニューレを、２００μｌの空気と被験物質(１ｍｇ／ｋｇ)を含有するシリンジに搭載する。オリフィスを介してカニューレを気管に導入し、二分枝部を丁度通過するように主気管支の一方に送る。挿入中、頸部を外側から触診し、気管内部の位置を確認する。シリンジの内容物を注射し、２秒中断する。その後、カニューレをゆっくりと引き抜く。試験中(４又は８時間までの血液サンプル)、ラットは麻酔がかかったままであり、実験後、安楽死させる。