(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の：
(ａ)I-CreIの最終Ｃ-末端ループの、配列番号32で表されるI-CreIアミノ酸配列の番号付けを参照にして138位及び142位の残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させ、
(ｂ)親のI-CreIのものとは異なる切断DNA標的のパターンを有する変異型を、工程(ａ)から選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む、新規な基質特異性を有するI-CreI変異型を工学的に作製する方法。
【請求項２】
前記I-CreI変異型が、I-CreIアミノ酸配列の番号付けを参照にして、139位及び／又は143位に少なくとも１つの更なる変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
138位及び／又は139位の残基が、疎水性アミノ酸で置換され、及び／又は142位及び／又は143位の残基が、小さいアミノ酸で置換されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
138位の残基がアラニンで置換され、139位の残基がメチオニンで置換され、及び／又は142位及び／又は143位の残基が、グリシンで置換されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程(ａ)が、２つの残基の変異を含み、それぞれが、138位と139位の残基及び142位と143位の残基から選択される異なる対からである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記I-CreI変異型が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に変異を有し、パリンドロームDNA配列を切断し、該DNA配列の１つの半分の少なくとも＋３位〜＋５位及び＋８位〜＋10位又は−10位〜−８位及び−５位〜−３位のヌクレオチドが、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的の１つの半分の＋３位〜＋５位及び＋８位〜＋10位又は−10位〜−８位及び−５位〜−３位のヌクレオチドに相当する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程(ａ)が、同時又は逐次的に、DNA標的の±８〜10位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の26位〜40位に位置するものに相当する第１機能的サブドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異、及び／又は少なくとも、DNA標的の±３〜５位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の44位〜77位に位置するものに相当する第２機能的サブドメイン内のアミノ酸残基の変異を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程(ａ)が、同時又は逐次的に、前記I-CreI変異型アミノ酸配列の全体又はＣ-末端半分のランダム変異を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程(ｂ)が、前記親のI-CreIにより切断されない少なくとも１つのDNA標的配列を切断できる工程(ａ)からの変異型の選択及び／又はスクリーニングを含み、前記DNA標的配列が、親のI-CreIの切断部位から、該切断部位の１つの半分の少なくとも１つのヌクレオチドの、異なるヌクレオチドへの置換により導かれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記DNA標的配列が、配列番号１の配列を有するI-CreIパリンドローム部位に由来する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記DNA標的が、±１〜２位、±６〜７位、±８〜10位及び／又は11位〜12位のヌクレオチドに変異を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記DNA標的配列が、興味対象の遺伝子内に存在するゲノム配列である請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により得ることができ、138位及び/又は142位に少なくとも１つの変異を含み、且つ親のI-CreIのものとは異なる切断DNA標的のパターンを有するホモ二量体又はヘテロ二量体I-CreI変異型(ただし、配列番号３及び４のホモ二量体変異型並びに配列番号５の単量体を含むホモ二量体及びヘテロ二量体変異型を除く)。
【請求項１４】
前記方法により得ることができる２つの異なる変異型の単量体を含むヘテロ二量体である請求項１３に記載の変異型。
【請求項１５】
それぞれがS138A及びK139Mの対、並びにK142G及びT143Gの対からなる群より選択される変異の異なる対からである１つ又は２つの変異を有するI-CreI変異型である請求項１３又は１４に記載の変異型。
【請求項１６】
配列番号６〜９の配列のものである請求項１５に記載の変異型。
【請求項１７】
２つの単量体からなるヘテロ二量体I-CreI変異型であり、前記単量体のそれぞれが、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異をさらに含み、前記変異型が、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できる、請求項１５又は１６に記載の変異型。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の１つ若しくは２つの変異型の２つの単量体又はコアドメイン、或いはそれらの組み合わせを含む単鎖キメラメガヌクレアーゼ。
【請求項１９】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の変異型の１つの単量体、又は請求項１８に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドフラグメントを少なくとも１つ含む組換えベクター。
【請求項２１】
２つのポリヌクレオチドフラグメントを含み、そのそれぞれが、請求項1３〜１７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体変異型の２つの単量体のうちの１つをコードし、前記フラグメントが、２つの単量体の産生を可能にする調節配列に機能的に連結されている発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１８に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含み、前記フラグメントが、前記単鎖メガヌクレアーゼの産生を可能にする調節配列に機能的に連結されている発現ベクター。
【請求項２３】
請求項６、１２及び１７のいずれか１項で定義されるゲノムDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む、請求項２１又は２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ターゲティングDNA構築物が、ａ)請求項６、１２及び１７のいずれか１項で定義されるゲノムDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を有する配列と、ｂ) ａ)の配列と接する、導入される配列とを含む請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１９又は２１で定義される１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメント、或いは請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１９又は２１で定義される１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２７】
請求項１９又は２１で定義される１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項２８】
少なくとも、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の変異型、請求項１８に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９又は２１に記載の１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクター、請求項２５に記載の宿主細胞、請求項２７に記載のトランスジェニック植物、又は請求項２６に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の、非治療目的での、分子生物学、インビボ若しくはインビトロの遺伝子工学、又はインビボ若しくはインビトロでのゲノム工学のための使用。
【請求項２９】
少なくとも、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の変異型、請求項１８に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９又は２１に記載の１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの、必要とする個体に任意の手段により投与することを意図する、前記個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬品を製造するための使用。
【請求項３０】
少なくとも、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の変異型、請求項１８に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９又は２１に記載の１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの、必要とする個体に任意の手段により投与することを意図する、前記個体におけるDNA媒介物を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項３１】
少なくとも、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の変異型、請求項１８に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９又は２１に記載の１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの、生物由来生成物、又は生物学的使用を意図する生成物における、DNA媒介物を示す感染性因子の増殖を阻害し、不活性化し、又は欠失させるため、或いは物体を消毒するためのインビトロでの使用。
【請求項３２】
前記感染性因子がウイルスである請求項３０又は３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、請求項２３又は２４で定義されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
請求項１〜５のいずれか１項で定義されるとおりに、親のI-CreIの最終Ｃ-末端ループの少なくとも１つのアミノ酸を変異させることを含む、親のI-CreIの毒性を減少させる方法。
【請求項３５】
変異が、K139M及び／又はT143Gである請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な基質特異性を有するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を工学的に作製する(engineering)方法に関する。本発明は、該方法により得ることができる変異型、該変異型をコードするベクター、該ベクターにより改変された細胞、動物又は植物、並びに該ホーミングエンドヌクレアーゼ変異型及びその派生生成物の、遺伝子工学、ゲノム療法及び抗ウイルス療法のための使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
メガヌクレアーゼは、定義としては、生細胞内の特定の遺伝子座にてDNA二本鎖破断(DSB; double strand break)をもたらし得る大きい(12〜45 bp)切断部位を有する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Thierry及びDujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625〜5631)。メガヌクレアーゼは、培養細胞及び植物においてそれらの標的配列の近傍における相同組換えを刺激するために用いられ(Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106; Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973; Donohoら, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070〜4078; Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101; Sargentら, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267〜277; Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055〜5060; Chiurazziら, Plant Cell, 1996, 8, 2057〜2066)、このことにより、メガヌクレアーゼにより誘発される組換えは、ゲノム工学についての効率的で強固な方法になる。
【０００３】
メガヌクレアーゼにより誘発される組換えの使用は、長い間、天然メガヌクレアーゼのレパートリーにより制限されており、現在の技術の主要な制限は、興味対象の遺伝子座にメガヌクレアーゼの切断部位を予め導入する必要があることである。つまり、選択された標的を切断する、再設計されたメガヌクレアーゼの工学的な作製に対する強い興味がある。
【０００４】
このようなタンパク質は、真の染色体配列を切断するために用いることができ、広い応用範囲においてゲノム工学についての新たな展望を開くだろう。例えば、メガヌクレアーゼは、内因性遺伝子をノックアウトするか、又は外因性配列を染色体にノックインするために用いることができる。これは、また、単一遺伝子疾患に関連する変異の精密なインサイチュー修正に用いることもでき、それにより現在の遺伝子療法アプローチを用いて遭遇する無作為に挿入された導入遺伝子による危険性を回避することができる(Hacein-Bey-Abinaら, Science, 2003, 302, 415〜419)。
【０００５】
最近、Cys2-His2タイプのジンク(亜鉛)フィンガータンパク質(ZFP)のジンクフィンガーDNA結合ドメインを、FokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させて、種々の細胞のタイプ：ヒトリンパ球様細胞を含む哺乳動物培養細胞、植物及び昆虫において組換えが誘導された(Smithら, Nucleic Acids Res, 1999, 27, 674〜81; Paboら, Annu. Rev. Biochem, 2001, 70, 313〜40; Porteus M.H.及びBaltimore D., Science, 2003, 300, 763; Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764; Duraiら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, 5978〜5990; Porteus M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446)。ZFPの結合特異性は、操作が比較的簡単であり、多くの(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn配列に結合できる新規な人工ZFPのレパートリーが、現在、利用可能である(Paboら, 上記; Segal及びBarbas, Curr. Opin. Biotechnol., 2001, 12, 632〜637; Isalanら, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)。しかし、非常に狭い特異性の保存は、ゲノム工学への応用のための主要な問題点であり、現在のところ、ZFPが治療への応用のための非常に厳密な要件を満たすかどうか不明である。さらに、これらの融合タンパク質は、ショウジョウバエ属(Drosophila) (Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175)及び哺乳動物NIHT3細胞(Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Porteus M.H.及びBaltimore D., Science, 2003, 300,763; Porteus M.H.及びCarroll D., Nat. Biotechnol., 2005, 967〜973)における非常に高い毒性、おそらく頻繁なオフサイト切断によるであろう遺伝毒性の影響(Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446)を示している。
【０００６】
天然においては、メガヌクレアーゼは、可動性の遺伝的要素によりコードされるエンドヌクレアーゼのファミリーであるホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)により本質的に代表され、その機能は、ホーミングとよばれるプロセスにおいて、DNA二本鎖破断(DSB)により誘発される組換え事象を開始することである(Chevalier, B.S.及びStoddard, B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774; Kostrikenら, Cell; 1983, 35, 167〜74; Jacquier A.及びDujon, B., Cell, 1985, 41, 383〜394)。数百のHEが、細菌、真核生物及び始原菌で同定されている(Chevalier B.S.及びStoddard, B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。しかし、選択された遺伝子内でHE切断部位を見出す可能性は、非常に低い。
【０００７】
それらの生物学的機能並びに効率及び特異性の点での珍しい切断特性に鑑みて、HEは、ゲノム工学のための新規なエンドヌクレアーゼを導く理想的な足場を提供する。さらに、それらの精巧な特異性に加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼは、おそらくはよりよい特異性のために、ZFPよりも毒性が低いことが示されており(Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Porteus, M.H.及びBaltimore, D., Science, 2003, 300, 763; Porteus, M.H.及びCarroll, D., Nat. Biotechnol., 2005, 23, 967〜973)、これらの2つの特徴は、治療用途に用いるときに必須になる。
【０００８】
4つのHEファミリーのうちで最大のLAGLIDADGファミリーの比較的良好な特徴決定を可能にするデータが、過去10年の間に蓄積されている(Chevalier B.S.及びStoddard, B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜74)。LAGLIDADGは、ファミリーの間で実際に保存されている唯一の配列のことであり、タンパク質中に1つ又は(よりしばしば)2つのコピーで見出される。I-CreI (Wangら, Nucleic Acids Res., 1997, 25, 3767〜3776)のような単一モチーフのタンパク質は、ホモ二量体を形成し、パリンドローム又は偽パリンドローム(pseudo-palindromic) DNA配列を切断するが、I-SceI (Jacquier, A.及びDujon, B., Cell., 1985, 41, 383〜394)又はI-DmoI (Dalgaardら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5417〜5417)のようなより大きい二重モチーフのタンパク質は、単量体であり、非パリンドローム標的を切断する。9つの異なるLAGLIDADGタンパク質は、結合したDNAとともに、又はDNAなしで結晶化されており、1次配列のレベルでの類似性の欠如とは対照的な、非常に顕著なコア構造の保存を示す(Heathら, Nature Struct. Biol., 1997, 4, 468〜476; Duanら, Cell., 1997, 89, 555〜564; Silvaら, J. Mol. Biol., 2003, 286, 1123〜1136; Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269; Moureら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 685〜695; Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜770; Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901; Gimbleら, J. Biol. Chem., 1998, 273, 30524〜30529; Bolducら, Genes Dev. 2003, 17, 2875〜2888; Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜1136; Nakayamaら, J. Mol. Biol., Epub 2006年9月26日, Spiegelら, Structure, 2006, 14, 869〜880)。そのDNAに結合した結晶構造とは対照的に(Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316 ; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、DNAに結合していないI-CreIの構造は(Heathら, Nature Struct. Biol., 1997, 4, 468〜476)、非対称ユニット内に、1つのI-CreI単量体のみを示した。
【０００９】
構造の比較は、LAGLIDADGタンパク質が、類似の活性コンホメーションを採用し、それらの自己会合は、2つの単量体又は明らかなドメインを分ける2つのパックされたα-ヘリックスを形成することを示す。このコア構造において(図1)、2つの単量体又は二重LAGLIDADGタンパク質中の2つのドメインが貢献する2つの特徴的なαββαββα折り畳みが、2回転対称で互いに面している。両側のLAGLIDADGα-ヘリックスにおいて、DNAヘリックス主溝上のサドルを形成する4つのβシート鎖は、タンパク質と標的DNA配列のハーフサイトとの相互作用を駆動するDNA結合界面を提供する(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜476)。触媒部位は中央にあり、両方の単量体のヘリックスの寄与により形成されている。触媒部位のすぐ上には、2つのLAGLIDADG α-ヘリックスが、二量体形成界面における必須の役割を演じている。このコア構造に加えて、他のドメインを見出すことができ、例えばインテインであるPI-SceIは、タンパク質スプライシングドメインと、さらなるDNA結合ドメインとを有する(Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜770; Pingoudら, Biochemistry, 1998, 37, 8233〜8243)。
【００１０】
DNA結合タンパク質の基質特異性を、突然変異誘発及びスクリーニング/選択により改変することは、困難な仕事である(Lanioら, Protein Eng., 2000, 13, 275〜281; Voziyanovら, J. Mol. Biol., 2003, 326, 65〜76; Santoroら, P.N.A.S., 2002, 99, 4185〜4190; Buchholz, F.及びStewart, A.F., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 1047〜1052)。これは、その主要な特徴がそれらの大きいDNA認識部位であるHEの場合は、さらに困難である。
【００１１】
I-CreI/DNA結晶構造の解析は、各単量体において、9つの残基(S32, Y33, Q38, N30, K28, Q26, Q44, R68及びR70)が、ホーミング部位の±3、4、5、6、7、9、10及び11位にて8つの塩基と直接の相互作用を確立することを示し(Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜76; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、その無作為化は、今日のいずれのスクリーニング能力をも超える数である209の組み合わせをもたらす。さらに、合計で28個(左の単量体)又は24個(右の単量体)の水分子は、タンパク質/DNA界面におけるヌクレオチドとタンパク質側鎖とのさらなる接触を媒介する(Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。
【００１２】
よって、いくつかの研究室は、半合理的アプローチ(Chicaら, Curr. Opin. Biotechnol., 2005, 16, 378〜384)を用いて、構造データに従って、関係するアミノ酸残基の小さい組を選択して、取り扱う変異体ライブラリーの多様性を制限することに頼っている。この組は、通常、HE/DNA複合体構造において、ホーミング部位のヌクレオチド塩基との直接又は水分子が媒介する接触を形成する4つのβシート鎖のアミノ酸残基で構成される。
【００１３】
この半合理的なアプローチを用いて、I-CreI (Seligmanら, Genetics, 1997, 147, 1653〜64; Seligmanら, Nucleic Acids Res., 2002, 30, 3870〜3879; Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31〜41; Rosenら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 4791〜4800; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及び国際PCT出願WO 2006/097853及びWO 2006/097784; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)、I-SceI (Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484)、PI-SceI (Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008)及びI-MsoI (Ashworthら, Nature, 2006, 441, 656〜659)のタンパク質の特異性を局所的に変更している。
【００１４】
半合理的アプローチとハイスループットスクリーニングとを組み合わせることにより(HTS; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097853及びWO 2006/097784; Smithら, Nucleic Acids Res., Epub 2006年11月27日)、種々の標的を認識するI-CreIメガヌクレアーゼの局所的に変更された多数の変異型を得て、それらをコンビナトリアルプロセスにより組み立てて、選択された特異性を有する完全に再設計された変異体を得ることができた。
【００１５】
しかし、このアプローチは、簡単ではない。なぜなら、HE DNA結合界面は非常に密であり、実質的に全ての塩基特異的相互作用の原因である2つの異なるββヘアピンが、単一折り畳みの一部分であるからである。よって、いくつかの位置で変異された標的に結合するために必要とされる、近傍に位置するいくつかのアミノ酸の変異は、結合界面の構造を破壊し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
よって、多数の配列に到達するために、新規な基質特異性を生じるために工学的に改変できるLAGLIDAGエンドヌクレアーゼの他の領域を同定できることは、非常に価値があるだろう。
さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼは、非常に高い用量では、時々有害であり得るので(Goubleら, J. Gene Med., 2006, 8, 616〜622)、毒性が少ないLAGLIDADGエンドヌクレアーゼを工学的に作製することは、非常に価値があるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、DNAなしのI-CreI二量体の構造を解明した。これを、DNAに結合した結晶構造(PDBコード1gz9; Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316)と比較すると、C-末端ループ及び最終のヘリックスα6の異なるコンホメーションが示され、このことは、それがDNA結合に関わることを示唆する。この領域における部位特異的突然変異誘発の研究は、C-末端ヘリックスがDNA結合について無視できないが、LAGLIDADGファミリーからのホモ二量体タンパク質の間でよく保存され(図2)、DNAリン酸主鎖といくつかの非特異的接触を形成する(Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜76; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)最終のC-末端ループが、結合及び切断のみならず、標的特異性にも重要な役割を演じることを示す。さらに、C-末端ループ内のいくつかの変異体は、野生型I-CreIよりも著しく毒性が低かった。
【００１８】
この領域は、新規な基質特異性を有する新しいホーミングエンドヌクレアーゼを工学的に作製する新しい可能性を開き、そのことにより、メガヌクレアーゼにより標的にされるDNA配列の数を増加させる。よって、興味対象の遺伝子からの選択されたゲノム標的を切断する、再設計されたメガヌクレアーゼを、上記で定義される、以前に同定された変異(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097853、WO 2006/097854及びWO 2006/097784; Smithら, Nucleic Acids Res., Epub 2006年11月27日)を、最終のC-末端ループの変異と組み合わせることにより、工学的に作製できる。
【００１９】
さらに、この領域は、毒性がより低いホーミングエンドヌクレアーゼを工学的に作製することも可能にする。
可能性のある応用は、遺伝子工学、ゲノム工学、遺伝子治療及び抗ウイルス療法を含む。
本発明は、少なくとも以下の：
(a) I-CreIのスレオニン140 (T140)を除く、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの最終C-末端ループの少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させ、
(b) 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断DNA標的のパターンを有する変異型を、工程(a)から選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む、新規な基質特異性を有するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を工学的に作製する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】I-CreI及びI-CreI-DNA構造のCαリボン図の重ねあわせを示す。
【図２】I-CreIファミリーのメンバーからのC-末端領域の配列アラインメントを示す。
【図３】S138、K139、K142及びT143の、DNA主鎖との接触の詳細図(a)、並びに結合及び非結合DNA構造間のS138、K139、K142及びT143の位置の比較(b)を表す。
【図４】I-CreI C-末端領域変異体の生物物理学的特徴を示す。
【図５】分析用超遠心分離により測定した、I-CreI C-末端領域変異体による二量体の形成を示す。
【図６】Mg2+及びCa2+の存在下での、C-末端短縮型二重及び単一変異体の電気泳動移動度シフトアッセイを表す。
【図７】C-末端短縮型二重及び単一変異体のゲルインビトロ切断アッセイのまとめである。
【図８】単一変異体のプロファイリング及び単一変異体の10NNN_P DNA標的切断プロファイルのために用いたインビボ切断アッセイを示す。
【図９】単一変異体の5NNN_P DNA標的切断プロファイルを示す。
【図１０】単一変異体の2NN DNA標的切断プロファイルを示す。
【図１１】単一変異体の12NN_P DNA標的(A)及び7NN_P DNA標的(B)切断プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- 疎水性アミノ酸とは、ロイシン(L)、バリン(V)、イソロイシン(I)、アラニン(A)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)及びチロシン(Y)のことである。
【００２２】
- ヌクレオチドは、次のように表す：1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
【００２３】
- 「メガヌクレアーゼ」により、12〜45 bpの2本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。
- 「親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ」は、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、又はその機能的変異型を意図する。この親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、単量体、22〜24 bpの二本鎖DNA標的を切断できる機能的エンドヌクレアーゼに会合した2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを含む二量体(ホモ二量体又はヘテロ二量体)であってよい。
【００２４】
- 「ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ」により、単一のLAGLIDADGモチーフを有し、パリンドロームDNA標的配列を切断する野生型ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばI-CreI若しくはI-MsoI、又はそれらの機能的な変異型を意図する。
- 「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ配列の少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置き換えることにより得られるタンパク質を意図する。
【００２５】
- 「機能的変異型」により、DNA標的、好ましくは、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより切断されない新しいDNA標的を切断できるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか、又は直接若しくは間接的に該DNA標的と相互作用する位置にてアミノ酸変動を有する。
- 「新規な特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼ変異型」により、親のホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断標的のパターン(切断プロファイル)を有する変異型を意図する。該変異型は、親のホーミングエンドヌクレアーゼよりも少ない標的(制限されたプロファイル)又はより多い標的を切断してよい。好ましくは、該変異型は、親のホーミングエンドヌクレアーゼにより切断されない少なくとも1つの標的を切断できる。
等価で、同様に用いられる用語「新規な特異性」「改変された特異性」「新規な切断特異性」「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異型の特異性のことである。
【００２６】
- 「I-CreI」により、配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yを有する野生型I-CreIを意図する。
- 「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれる4つのベータ鎖(β1、β2、β3、β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。単量体ホーミングエンドヌクレアーゼの場合、2つのこのようなドメインは、エンドヌクレアーゼの配列内で見出される。例えば、I-DmoI (194アミノ酸)において、第1ドメイン(残基7〜99)及び第2ドメイン(残基104〜194)は、短いリンカー(残基100〜103)で分けられている。
【００２７】
- 「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの独特の(distinct)部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。2つの異なるサブドメインは、独立して挙動し、一方のサブドメイン内の変異は、他方のサブドメインの結合及び切断特性を変更しない。よって、2つのサブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの別々の部分に結合する。
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
【００２８】
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより認識されかつ切断される20〜24 bpの2本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでエンドヌクレアーゼにより2本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNAの位置、好ましくはゲノムの位置のことをいう。DNA標的は、2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'の配列により定義される。例えば、図8に示される野生型I-CreIにより切断されるパリンドロームDNA標的配列は、5'- t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12 (配列番号1)の配列により定義される。DNA標的の切断は、センス及びアンチセンス鎖についてそれぞれ、+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型によるDNA標的の切断が起こる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
【００２９】
- 「DNA標的ハーフサイト」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフサイト」により、それぞれのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の部分を意図する。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
【００３０】
- 「ベクター」により、それが連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を意図する。
- 「変異」により、核酸/アミノ酸配列内の1つ又は複数のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を意図する。
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得るそれぞれの配列中の位置の比較により決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、その分子同士は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算することができ、例えば、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む。
【００３１】
- 「個体」は、哺乳動物、及びその他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」及び「哺乳類」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)、並びに反芻動物(例えばウシ、ブタ、ウマ)を含む。
【００３２】
- 「遺伝病」は、部分的又は完全に、そして直接的又は間接的に1又は複数の遺伝子における異常による任意の疾患のことをいう。該異常は、変異、挿入又は欠失であり得る。該変異は、点突然変異であり得る。上記の異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。該異常は、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造若しくは安定性に影響し得る。該遺伝病は、劣性又は優性であり得る。このような遺伝病は、限定されないが、嚢胞性繊維症, ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症(LDL受容体欠損)、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン病、肝臓代謝の遺伝性障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、色素性網膜炎、毛細管拡張性運動失調、ブルーム症候群、網膜芽腫、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、及びテイ-サックス病であり得る。
【００３３】
本発明によると、最終C-末端ループのアミノ酸は、I-CreIのアミノ酸配列である配列番号2又はSwissprot P05725の137〜143位に相当する。I-CreI中の最終C-末端ループの位置がわかれば、当業者は、Pymolのような公知のタンパク質構造解析ソフトウェアを用いて、別のホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにおける対応する位置を容易に導き出すことができる。例えば、I-MsoIについて、最終C-末端ループは、143位〜149位に相当する。上記の方法の有利な実施形態によると、工程(a)は、親のLAGLIDADGエンドヌクレアーゼDNA切断部位(野生型LAGLIDAGエンドヌクレアーゼホーミング部位)のリン酸主鎖と接触する最終C-末端ループのアミノ酸残基を変異させることを含む。好ましくは、該残基は、該DNA切断部位の結合及び切断に関わる。より好ましくは、上記の残基は、I-CreIアミノ酸配列(配列番号2；図2)の番号付けを参照にして、138位、139位、142位又は143位にある。各変異が、138位及び139位の残基の対、並びに142位及び143位の残基の対から選択される残基の異なる対にあることを条件として、2つの残基を、1つの変異型内で変異させることができる。
【００３４】
本発明の方法において、導入される変異は、最終C-末端ループのアミノ酸の、親のLAGLIDADGエンドヌクレアーゼDNA切断部位のリン酸主鎖との相互作用を改変する。
【００３５】
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程(a)における変異は、最終C-末端ループの少なくとも１つのアミノ酸の、異なるアミノ酸への置換である。
好ましくは、138位又は139位の残基が、疎水性アミノ酸に置換されて、DNA切断部位のリン酸主鎖との水素結合の形成が妨げられる。例えば、138位の残基をアラニンに置換するか、又は139位の残基を、メチオニンに置換する。
142位又は143位の残基を、小さいアミノ酸、例えばグリシンに置換して、これらのアミノ酸残基の側鎖のサイズを減少させることが有利である。
【００３６】
本発明の方法によると、工程(a)の変異は、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型のいずれかに導入される。
野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、有利には、ホモ二量体である。野生型ホモ二量体LAGLIDAGホーミングエンドヌクレアーゼの例は、Lucasら, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 960〜969の表１に示されている。野生型ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、有利には、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI及びI-CpaIからなる群より選択でき、好ましくはI-CreIであり得る。
【００３７】
機能的変異型は、最終C-末端ループの外側、好ましくはDNA標的ハーフサイトと相互作用するアミノ酸残基の位置のさらなる変異を含む。LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼDNA相互作用残基は、当該技術において公知である。変異される残基は、DNA主鎖又はヌクレオチド塩基と、直接又は水分子を介して相互作用できる。好ましくは、上記の変異は、メガヌクレアーゼの切断特異性を改変し、興味対象の遺伝子からのDNA標的を切断できる、新規な特異性を有するメガヌクレアーゼをもたらす。より好ましくは、上記の変異は、以前に記載されたような(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006)、DNA標的の±8〜10位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の26位〜40位に位置するものに対応する第1機能的サブドメイン内の1つ又は複数のアミノ酸の置換、及び／又はDNA標的の±3〜5位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の44位〜77位に位置するものに対応する第2機能的サブドメイン内の置換である。置換は、I-CreIアミノ酸配列の26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に相当することが有利である。n-4がtであるか又はn+4がaであるDNA標的を切断するために、該変異型は、44位にグルタミン(Q)を有するのが有利である。n-4がaであるか又はn+4がtであるDNA標的を切断するために、上記の変異型は、44位にアラニン(A)又はアスパラギンを有し、n-9がgであるか又はn+9がcであるDNA標的を切断するために、上記の変異型は、38位にアルギニン(R)又はリジン(K)を有するのが有利である。
【００３８】
上記の方法の最も好ましい実施形態によると、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に変異を有し、DNA配列の1つの半分の少なくとも+3位〜+5位及び+8位〜+10位又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、興味対象の遺伝子からのDNA標的の1つの半分の+3位〜+5位及び+8位〜+10位又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドに相当するパリンドロームDNA配列を切断するI-CreI変異型である。
【００３９】
工程(a)における変異は、当該技術において公知であり、商業的に利用可能な標準的な突然変異誘発法に従って導入される。これらは、上記で定義される変異される位置を含むオーバーラップフラグメントを、公知のオーバーラップPCR法に従って増幅することにより、有利に作製できる。最終C-末端ループにアミノ酸の変動を有する変異型のライブラリーは、標準的な方法に従って作製できる。
【００４０】
工程(a)は、上記で定義されるDNA標的配列に接触するか、又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置でのさらなる変異の導入を含み得る。この工程は、国際PCT出願WO 2004/067736、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及びSmithら, Nucleic Acids Res., Epub 2006年11月27日に記載されるようなコンビナトリアルライブラリーを作製し、そして、公知のオーバーラップPCR法に従って、それぞれの変異を含むオーバーラップフラグメントを増幅して、該変異を分子内で組み合わせることにより行うことができる。
さらに、ランダム変異は、興味対象の遺伝子からのDNA標的に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改善するために、変異型全体又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端半分(I-CreIアミノ酸配列である配列番号2の80位〜163位)にも導入できる。
【００４１】
さらなる変異(ランダム又は部位特異的)及び最終C-末端ループ内の変異は、同時又は逐次的に導入し得る。
さらに、1つ又は複数の残基を、変異型単量体／ドメインのNH2末端及び／又はCOOH末端に挿入できる。例えば、メチオニン残基を、NH2末端に導入し、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)をNH2末端及び／又はCOOH末端に導入する。上記のタグは、メガヌクレアーゼの検出及び／又は精製に有用である。
【００４２】
工程(b)における選択／スクリーニングは、国際PCT出願WO 2004/067736に記載されるようなインビトロ又はインビボでの切断アッセイを用いて行うことができる。
【００４３】
本発明の方法の別の有利な実施形態によると、工程(b)は、変異型により作製される変異DNA 標的配列内の2本鎖破断が、陽性選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又は陰性選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化が、該DNA 2本鎖破断の組換えにより媒介される修復により導かれる条件下で、インビボにて行われる。
【００４４】
例えば、本発明の変異型の切断活性は、酵母又は哺乳動物の細胞において、PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178,及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるようなレポーターベクター用いる直列反復組換えアッセイ(direct repeat recombination assay)により測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクターにクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮された(truncated)非機能的コピー(直列反復)と、介在配列内のキメラDNA標的とを含む。DNA標的配列は、異なるヌクレオチドによる少なくとも1つのヌクレオチドの置換により、親のホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位から導かれる。好ましくは、DNA切断部位の1つ又は複数の位置での4つの塩基(g, a, c, t)の異なる組み合わせを示すパリンドローム又は非パリンドロームDNA標的のパネルが試験される(n個の変異された位置について4n個のパリンドローム標的)。変異型の発現は、DNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼをもたらす。この切断は、直列反復間の相同組換えを誘導し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現は、適切なアッセイによりモニターできる。
【００４５】
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程(b)は、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより切断されない少なくとも1つのDNA標的を切断できる、工程(a)からの変異型の選択及び／又はスクリーニングを含み、該DNA標的配列は、該切断部位の1つの半分の少なくとも1つのヌクレオチドの、異なるヌクレオチドでの置換により、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位から導かれる。
【００４６】
本発明の方法によると、親のDNA標的は、パリンドローム、非パリンドローム又は偽パリンドロームであり得る。好ましくは、上記のDNA標的配列は、配列番号1の配列を有するI-CreIパリンドローム部位に由来する。より好ましくは、上記のDNA標的は、±1〜2位、±6〜7位、±8〜10位及び／又は±11〜12位、さらにより好ましくは±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位にヌクレオチド変異を有する。
【００４７】
上記の方法の別の有利な実施形態によると、これは、工程(b)で得られた1つの変異型を発現させる、さらなる工程(c)を含んで、ホモ二量体の形成を可能にする。該ホモ二量体は、パリンドローム又は偽パリンドローム標的配列を切断できる。
【００４８】
上記の方法の別の有利な実施形態によると、これは、工程(b)で得られた1つの変異型と、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型とを同時発現させる、さらなる工程(c')を含んで、ヘテロ二量体の形成を可能にする。2つの異なるLAGLIDADGエンドヌクレアーゼ単量体の同時発現による機能的ヘテロ二量体の組み立ては、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097853、WO 2006/097854及びWO 2006/097784; Smithら, Nucleic Acids Res., Epub 2006年11月27日において以前に記載されている。好ましくは、工程(b)で得られた2つの異なる変異型を同時発現させる。該ヘテロ二量体は、非パリンドロームキメラ標的を切断できる。
例えば、宿主細胞は、該変異型をコードする1つ又は2つの組換え発現ベクターにより改変できる。細胞は、次いで、変異型の発現を可能にする条件下で培養され、次いで、形成されるホモ二量体/ヘテロ二量体が、細胞培養物から回収される。
【００４９】
本発明の方法によると、単鎖キメラメガヌクレアーゼを、工程(b)で得られる1つの変異型とホーミングエンドヌクレアーゼドメイン/単量体との融合により構築できる。上記のドメイン/単量体は、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型からであり得る。好ましくは、2つのドメイン/単量体は、ペプチドリンカーにより連結される。より好ましくは、単鎖メガヌクレアーゼは、工程(b)で得られる2つの異なる変異型を含む。上記の単鎖メガヌクレアーゼは、それぞれの変異型DNA標的の1つの異なる半分を含む非パリンドロームキメラ標的を切断できる。
【００５０】
ホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼを構築する方法は、当該技術において公知である(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法のいずれも、本発明において定義される変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼを構築するために用いることができる。
【００５１】
本発明は、上記で定義される方法により得ることができるホモ二量体又はヘテロ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型(ただし、配列番号3及び4のホモ二量体変異型、並びに配列番号5の単量体を含むホモ二量体又はヘテロ二量体変異型を除く)にも関する。本発明のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型は、変異型、メガヌクレアーゼ変異型又はメガヌクレアーゼともよばれる。
上記の変異型の有利な実施形態において、これは、上記で定義される方法により得ることができる2つの異なる変異型からの単量体を含むヘテロ二量体である。
【００５２】
上記の変異型の別の有利な実施形態によると、これは、それぞれがS138AとK139Mの対及びK142GとT143Gの対からなる群より選択される変異の異なる対からである1つ又は2つの変異を有するI-CreI変異型である。このような変異型の例は、配列番号6〜9を含む。
より好ましくは、上記のI-CreI変異型は、それぞれが、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異をさらに含み、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できる2つの単量体を含むヘテロ二量体である。
【００５３】
本発明の主題は、上記で定義される変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼでもある。本発明の単鎖キメラメガヌクレアーゼは、単鎖誘導体、単鎖メガヌクレアーゼ、単鎖メガヌクレアーゼ誘導体又はメガヌクレアーゼともよばれる。
本発明のメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ変異型及び単鎖メガヌクレアーゼ誘導体の両方を含む。
【００５４】
本発明の主題は、上記で定義される変異型又は単鎖誘導体をコードするポリヌクレオチドフラグメントでもある。上記のポリヌクレオチドは、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体変異型の1つの単量体、又は単鎖誘導体の2つのドメイン/単量体をコードし得る。
【００５５】
本発明の主題は、本発明による変異型又は単鎖誘導体の発現のための組換えベクターでもある。組換えベクターは、上記で定義される変異型又は単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む。好ましい実施形態において、上記のベクターは、それぞれがヘテロ二量体変異型の1つの単量体をコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む。
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自律複製できるもの(エピソームベクター)及び／又は連結された核酸の発現を可能にするもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
【００５６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
【００５７】
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてTRP1；E. coliにおいてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
【００５８】
好ましくは、上記のベクターは、本発明の変異型／単鎖誘導体をコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該メガヌクレアーゼの産生又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結するプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、変異型がヘテロ二量体である場合、各単量体をコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動し得る1つのベクターに含まれる。適切なプロモーターは、組織特異的及び／又は誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加により誘導される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度の増加により誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-抗トリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)タンパク質A及びB、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
【００５９】
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、上記で定義されるゲノムDNA標的切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。
或いは、メガヌクレアーゼをコードするベクターと、ターゲティングDNA構築物を含むベクターとは、異なるベクターである。
【００６０】
より好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は：
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)に記載の配列で挟まれた、導入される配列と
を含む。
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpを超える、より好ましくは200 bpを超える相同配列を用いる。実際に、共有されるDNA相同性は、破断の部位の上流及び下流に接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、2つの腕の間に位置すべきである。導入される配列は、好ましくは、ゲノム療法の目的のための、興味対象の遺伝子内の変異を修復する配列(遺伝子修正又は機能的遺伝子の回復)である。或いは、特定の配列を改変するため、興味対象の内因性遺伝子を減弱若しくは活性化させるため、興味対象の内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させるため、興味対象部位に変異を導入するため、又は外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するために用いられる配列を含む、いくつかの特定の様式で用いて染色体DNAを改変する任意のその他の配列であり得る。
【００６１】
本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変された、原核又は真核の宿主細胞にも関する。
本発明は、細胞の全て又は一部が、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物又は酵母細胞のことである。
【００６２】
本発明の主題は、さらに、配列番号5を除くメガヌクレアーゼ、好ましくは発現ベクターに含まれる1つ又は2つの派生ポリヌクレオチド、上記で定義される細胞、トランスジェニック植物、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の、非治療目的での分子生物学、インビボ若しくはインビトロの遺伝子工学、及びインビボ若しくはインビトロのゲノム工学のための使用である。
非治療目的は、例えば、(i) タンパク質生産のための細胞パッケージング系統における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(ii) 株の改良及び代謝工学のための農作植物の特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(iii) 遺伝子改変された農作植物におけるマーカーの除去のための標的された組換え、(iv) (例えば抗生物質生産のために)遺伝子改変された微生物株におけるマーカーの除去のための標的された組換えを含む。
【００６３】
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、DNA標的配列を含む興味対象の部位において2本鎖破断を誘導することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘導するためである。
本発明によると、上記の2本鎖破断は、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、興味対象の内因性遺伝子を減弱若しくは活性化させるため、興味対象部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は検出するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないままにして分解させるためである。
【００６４】
本発明の主題は、上記で定義されるDNA標的を含むベクター上に位置する興味対象の部位中で、該ベクターを上記で定義されるメガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)と接触させることにより2本鎖核酸を破断させ、そのことにより、該メガヌクレアーゼの切断部位を取り囲む配列と相同性を示す別のベクターとの相同組換えを誘導する工程を含むことを特徴とする遺伝子工学の方法でもある。
【００６５】
本発明の主題は、1) 上記で定義されるメガヌクレアーゼの少なくとも1つのDNA標的を含むゲノム遺伝子座の2本鎖を、該標的を該メガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)と接触させることにより破断させる工程と、2) 該破断したゲノム遺伝子座を、標的にされた遺伝子座との相同性を有する配列で挟まれた、該遺伝子座に導入される配列を含むターゲティングDNA構築物との相同組換えに適する条件下に維持する工程とを含むことを特徴とするゲノム工学の方法でもある。
【００６６】
本発明の主題は、1) 上記で定義されるメガヌクレアーゼの少なくとも1つのDNA標的を含むゲノム遺伝子座の2本鎖を、該切断部位を該メガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)と接触させることにより破断させる工程と、2) 該破断したゲノム遺伝子座を、切断部位を取り囲む領域との相同性を有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に維持する工程とを含むことを特徴とするゲノム工学の方法でもある。
【００６７】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)、1つ又は2つの派生ポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものの、必要とする個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための、該個体に任意の手段により投与される医薬品の製造のための使用でもある。
【００６８】
本発明の主題は、必要とする個体に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを少なくとも含む組成物を、任意の手段により投与する工程を含む、該個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための方法でもある。
この場合、上記で定義されるメガヌクレアーゼの使用は、(a) 個体の体組織に、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含む遺伝子の興味対象部位にて2本鎖切断を誘発する工程と、(b) 個体にターゲティングDNAを導入する工程とを少なくとも含み、該ターゲティングDNAは、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含む。ターゲティングDNAは、個体に、興味対象部位にターゲティングDNAを導入するのに適する条件下で導入される。
【００６９】
本発明によると、上記の2本鎖切断は、該メガヌクレアーゼを個体に投与することにより全体として(in toto)、又は個体から回収して、改変の後に個体に戻す体細胞に該メガヌクレアーゼを導入することによりエクスビボで誘導される。
上記の使用の好ましい実施形態において、上記のメガヌクレアーゼは、上記で定義されるような、該メガヌクレアーゼのゲノムDNA切断部位を取り囲む遺伝子の領域と相同性を有する配列で挟まれた、遺伝子中の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わせる。変異を修復する配列は、正しい配列を有する遺伝子のフラグメント又はエキソンノックイン構築物のいずれかである。
【００７０】
遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる。ターゲティング構築物は、切断を修復するためのゲノムDNA切断部位に接する相同配列の少なくとも200 bpを有する遺伝子フラグメント(最小修復マトリクス)を含み、変異を修復するための遺伝子の正しい配列を含む。その結果、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含むか又はそれからなり、これは、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。
【００７１】
機能的遺伝子を回復させるために、遺伝子の切断は、変異の上流で生じる。好ましくは、上記の変異は、遺伝子の配列内で最初のわかっている変異であり、そのことにより、遺伝子の全ての下流の変異が、同時に修正できる。ターゲティング構築物は、(cDNAとして)フレーム内(in frame)で融合され、3'における転写を停止するためのポリアデニル化部位を含む、ゲノムDNA切断部位の下流のエキソンを含む。導入される配列(エキソンノックイン構築物)は、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソンの配列で挟まれており、そのことにより、工学的な遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)を、機能的タンパク質をコードできるmRNAに転写することが可能になる。例えば、エキソンノックイン構築物は、上流及び下流の配列で挟まれる。
【００７２】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)、1つ又は2つの派生ポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものの、必要とする個体において、DNA媒介物(intermediate)を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための、任意の手段により個体に投与される医薬品の製造のための使用でもある。
【００７３】
本発明の主題は、必要とする個体に、上記で定義される組成物を、任意の手段により投与する工程を少なくとも含む、該個体における、DNA媒介物を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒する方法でもある。
【００７４】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、1つ又は2つのポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものの、生物由来生成物又は生物学的使用を意図する生成物において、インビトロにおいて、DNA媒介物を示す感染性因子の増殖を阻害するか、不活性化するか若しくは欠失させるため、或いは物体を消毒するための使用でもある。
【００７５】
本発明の主題は、生物由来製品、生物学的使用を意図する製品又は物体を、上記で定義される組成物と、感染性因子の増殖の阻害、不活性化又は欠失に充分な時間接触させる工程を少なくとも含む、DNA媒介物を示す感染性因子から、製品又は物質を除染する方法でもある。
具体的な実施形態において、上記の感染性因子は、ウイルスである。例えば、該ウイルスは、アデノウイルス(Ad11、Ad21)、ヘルペスウイルス(HSV、VZV、EBV、CMV、ヘルペスウイルス6、7又は8)、ヘパドナウイルス(HBV)、パポバウイルス(HPV)、ポックスウイルス又はレトロウイルス(HTLV、HIV)である。
【００７６】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)、1つ若しくは2つの派生ポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義される標的された遺伝子座と相同性を有する配列に挟まれた興味対象部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。好ましくは、該ターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれているか、又は本発明で定義されるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれるかのいずれかである。
【００７７】
本発明の主題は、メガヌクレアーゼ(配列番号5を除く)又は該メガヌクレアーゼをコードする1つ若しくは2つの発現ベクターと、上記で定義されるターゲティング構築物を含むベクターとを少なくとも含む、遺伝病の予防又は治療における同時、別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製剤としての製品でもある。
治療の目的のために、メガヌクレアーゼと、医薬的に許容される賦形剤とは、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が、生理的に効果をもたらす場合に「治療有効量」で投与されるという。ある因子は、その存在が、受容者の生理機能における検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に効果をもたらす。この関係において、ある因子は、その存在が、標的にされた疾患の1つ又は複数の症状の重篤さの減少と、損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に効果をもたらす。
【００７８】
本発明による使用のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち、有害な免疫学的応答をほとんど又は全く生じない。この種の有害な免疫学的反応を緩和又は排除する種々の方法を、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、N-ホルミルメチオニンを実質的に有さない。望まない免疫学的反応を回避する別の方法は、メガヌクレアーゼを、ポリエチレングルコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」) (好ましくは、500〜20,000ダルトンの平均分子量(MW)のもの)とコンジュゲートさせることである。例えばDavisら(US 4,179,337)により記載されるPEG又はPPGとのコンジュゲート形成は、抗ウイルス活性を有する、非免疫原性で、生理活性で、水溶性のエンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供できる。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる同様の方法は、Saiferら(US 5,006,333)に記載されている。
【００７９】
メガヌクレアーゼは、ポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物/ベクターとして用い得る。これは、細胞に、インビトロ、エクスビボ又はインビボで、具体的な種類の細胞に適する当該技術において公知の任意の簡便な手段により、単独で、又は少なくとも適切なビヒクル若しくは担体、及び／又はターゲティングDNAと会合して、導入される。細胞内に一旦入ると、メガヌクレアーゼと、存在するならばターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、細胞質から、核の作用部位へと、細胞により移入されるか又は輸送される。
【００８０】
メガヌクレアーゼ(ポリペプチド)は、リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI)及び／又は膜輸送ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52〜56)と会合しているのが有利であり得る。後者の場合、メガヌクレアーゼの配列は、膜輸送ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
ターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、細胞に、種々の方法により導入できる(例えば、注入、直接摂取、発射衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞内で安定的又は一過的に発現させ得る。真核細胞における発現の方法は、当該技術において公知である(Current Protocols in Human Genetics: 12章 「Vectors For Gene Therapy」及び13章「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照)。所望により、組換えタンパク質中に、核局在化シグナルを組み込んで、核内でそれが発現されることを確実にすることが好ましい。
【００８１】
本発明によるメガヌクレアーゼの使用、及び該メガヌクレアーゼを用いる方法は、上記で定義される、上記のメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用も含む。
本発明の使用及び方法の別の有利な実施形態によると、上記のメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、上記のターゲティングDNA構築物と会合する。好ましくは、メガヌクレアーゼの単量体をコードする該ベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
【００８２】
本発明は、以下の工程を少なくとも含む、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製する第1の方法を提供する。
(a1) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有する変異型の第1シリーズを構築し、
(b1) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c1) 工程(a1)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d1) 工程(b1)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００８３】
(e1) 工程(a1)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f1) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００８４】
(g1) 工程(c1)及び工程(d1)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(h1) 工程(e1)及び工程(f1) からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
【００８５】
(i1) 工程(g1)及び／又は(h1)からの変異型に、最終C-末端ループ中の少なくとも1つの変異、好ましくは、上記で定義される、I-CreI の138位、139位、142位又は143位の置換を導入し、
(j1) 工程(g1)、(h1)及び／又は(i1)で得られた変異型を組み合わせてヘテロ二量体を形成し、
(k1) 興味対象の遺伝子内に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(j1)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
【００８６】
或いは、本発明によるI-CreI変異型は、少なくとも以下の工程を含む、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製する第2の方法により得ることができる：
(a2) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換と、最終C-末端ループ内の1つの変異、好ましくは上記で定義されるI-CreIの138位、139位、142位又は143位の置換とを有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b2) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換と、最終C-末端ループ内の1つの変異、好ましくは上記で定義されるI-CreIの138位、139位、142位又は143位の置換とを有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、但し、I-CreI変異型の2つのシリーズの少なくとも一方は、最終C-末端ループ内に少なくとも1つの変異を含み、
(c2) 工程(a2)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットと、-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレット及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドダブレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットと、+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００８７】
(d2) 工程(b2)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットと、-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドダブレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットと、+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、但し、工程(c)及び(d)の2つの変異I-CreI部位の少なくとも一方は、I-CreI部位の-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つ、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位の対応するヌクレオチドダブレットの少なくとも1つに変異を有する変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００８８】
(e2) 工程(a2)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットと、+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つとが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットと、-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットとが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００８９】
(f2) 工程(b2)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットと、+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットとが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットと、-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットとが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、但し、工程(e)及び(f)の2つの変異I-CreI部位の少なくとも一方は、I-CreI部位の+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットの少なくとも1つ、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位の対応するヌクレオチドダブレットの少なくとも1つに変異を有する変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００９０】
(g2) 工程(c2)及び工程(d2)からの2つの変異型の26位〜40位、44位〜77位の変異及び最終C-末端ループの変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、それぞれ、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットの逆相補配列とそれぞれ同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
【００９１】
(h2) 工程(e2)及び工程(f2)からの2つの変異型の26位〜40位、44位〜77位の変異と、最終C-末端ループの変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、それぞれ、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレット、及び-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、それぞれ、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレット、及び+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
【００９２】
(i2) 工程(g2)及び(h2)で得られた変異型を組み合わせてヘテロ二量体を形成し、
(j2) 興味対象の遺伝子に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(i2)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
【００９３】
さらに別の変形によると、本発明のI-CreI変異型は、以下の工程を少なくとも含む、興味対象の遺伝子からのゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製する第3の方法により得ることができる：
(a3) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換を有する変異型の第1シリーズを構築し、
(b3) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c3) 最終C-末端ループ内の少なくとも1つの変異、好ましくは上記で定義されるI-CreIの138位、139位、142位又は143位の置換を有する変異型の第3シリーズを構築し、
【００９４】
(d3) 工程(a3)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e3) 工程(b3)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００９５】
(f3) 工程(c3)の第3シリーズから、(i) I-CreI部位の-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドトリプレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) +1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-2位〜-1位、-7位〜-6位、及び／又は-12位〜-11位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g3) 工程(a3)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(h3) 工程(b3)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【００９６】
(i3) 工程(c3)の第3シリーズから、(i) I-CreI部位の+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の+1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットでそれぞれ置き換えられ、(ii) -12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の+11位〜+12位、+6位〜+7位及び／又は+1位〜+2位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(j3) 工程(d3)、(e3)及び(f3)からの3つの変異型の26位〜40位、44位〜77位の変異及び最終C-末端ループの変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(v) -12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位に存在するヌクレオチドトリプレットとそれぞれ同一であり、(vi) +1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の-2位〜-1位、-7位〜-6位及び／又は-12位〜-11位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列とそれぞれ同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
【００９７】
(k3) 工程(g3)、(h3)及び(i3)からの3つの変異型の26位〜40位、44位〜77位の変異及び最終C-末端ループの変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(v) +1位〜+2位、+6位〜+7位、及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットとそれぞれ同一であり、(vi) -12位〜-11位、-7位〜-6位及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の+11位〜+12位、+6位〜+7位及び／又は+1位〜+2位に存在するヌクレオチドダブレットの逆相補配列とそれぞれ同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
【００９８】
(l3) 工程(j3)及び(k3)で得られた変異型を組み合わせてヘテロ二量体を形成し、
(m1) 興味対象の遺伝子に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(l3)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
【００９９】
工程(a1)、(a2)、(b1)、(b2)、(a3)、(b3)、(c3)、(g1)、(g2)、(h1)、(h2)、(i1)、(j3)及び(k3)は、変異体の結合及び／又は切断特性を向上させるために、特に、DNA標的配列と接触するか、又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置でのさらなる変異の導入を含み得る。これらの工程は、国際PCT出願WO 2004/067736、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及びSmithら, Nucleic Acids Research, Epub 2006年11月27日に記載されるコンビナトリアルライブラリーを作製することにより行うことができる。
【０１００】
工程(g1)、(g2)、(h1)、(h2)、(i1)、(j3)及び(k3)は、変異型全体、又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端半分(80位〜163位)に対するランダム変異の導入をさらに含み得る。これは、当該技術において公知であり、商業的に利用可能な標準的な突然変異誘発法に従って、変異型のプールに対してランダム突然変異誘発ライブラリーを作製することにより行うことができる。
【０１０１】
工程(i1)は、+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の+1位〜+2位、+6位〜+7位及び／又は+11位〜+12位に存在するヌクレオチドダブレットとそれぞれ同一であり、-12位〜-11位、-7位〜-6位、及び／又は-2位〜-1位のヌクレオチドダブレットが、上記のゲノム標的の+11位〜+12位、+6位〜+7位及び／又は+1位〜+2位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列とそれぞれ同一である配列を切断できるホモ二量体の選択及び／又はスクリーニングも含み得る。
【０１０２】
工程(g1)、(g2)、(h1)、(h2)、(j3)及び(k3)における変異の(分子内)組み合わせは、2つのサブドメインのそれぞれを含むオーバーラップフラグメントを、例えばSmithら, Nucleic Acids Res., Epub 2006年11月27日に記載されるような、公知のオーバーラップPCR法に従って増幅することにより行うことができる。
【０１０３】
工程(j1)、(i2)及び(l3)における変異型の(分子間)組み合わせは、工程(g1)、(g2)又は(i1)、(j3)からの1つの変異型を、それぞれ工程(h1)、(h2)又は(i1)、(k3)からの1つの変異型と同時発現させて、ヘテロ二量体の形成を可能にすることにより行われる。例えば、宿主細胞を、上記の変異型をコードする1つ又は2つの組換え発現ベクターにより改変できる。次いで、細胞を、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097853、WO 2006/097854及びWO 2006/097784; Smithら, Nucleic Acids Res., Epub 2006年11月27日に以前に記載されたようにして、変異型の発現を可能にする条件下で培養して、宿主細胞内でヘテロ二量体が形成される。
【０１０４】
選択及び／又はスクリーニングの工程は、上記で定義されるようなインビトロ又はインビボの切断アッセイを用いて行うことができる。好ましくは、これは、上記の変異型により作製された変異DNA標的配列内の2本鎖破断が、上記で定義されるような、該DNA 2本鎖破断の組換えにより媒介される修復により、陽性選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又は陰性選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を導く条件下で、インビボで行われる。
【０１０５】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、他のメガヌクレアーゼを作製するための足場としての使用でもある。例えば、さらなる回の突然変異誘発及び選択/スクリーニングを、新規なホーミングエンドヌクレアーゼを作製する目的で、変異型に対して行うことができる。
【０１０６】
本発明の主題は、上記の親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの最終C-末端ループの少なくとも1つのアミノ酸を変異させることを含む、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの毒性を減少させる方法でもある。
上記の方法の有利な実施形態によると、親のエンドヌクレアーゼは、I-CreI又はその機能的変異型である。好ましくは、K139及び／又はT143残基が変異される。より好ましくは、K139が、メチオニン(K139M)のような疎水性アミノ酸に変異され、及び／又はT143が、グリシン(T143G)のような小さいアミノ酸に変異される。
【０１０７】
ターゲティングDNA構築物の配列又は本発明において定義されるメガヌクレアーゼ変異型若しくは単鎖メガヌクレアーゼ誘導体をコードする配列を有するポリヌクレオチドフラグメントは、当業者に知られる任意の方法により調製できる。例えば、これらは、DNA鋳型から、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。好ましくは、メガヌクレアーゼ変異型又は単鎖メガヌクレアーゼ誘導体をコードするcDNAのコドンは、所望の発現系での該タンパク質の発現に好ましいように選択される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の手法により、作製して、宿主細胞に導入できる。
【０１０８】
本発明で定義されるメガヌクレアーゼ変異型又は単鎖メガヌクレアーゼ誘導体は、上記で定義されるポリペプチドを発現させることにより作製される。好ましくは、上記のポリペプチドは、1つの発現ベクター又は2つの発現ベクター(変異型のみの場合)により改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物/植物内で、該ポリペプチドの発現又は同時発現に適する条件下で、発現又は同時発現させ(変異型のみの場合)、メガヌクレアーゼ変異型又は単鎖メガヌクレアーゼ誘導体を、宿主細胞培養又はトランスジェニック動物/植物から回収する。
【０１０９】
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は、文献に充分に説明されている。例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)：Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版(Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson及びM. Simon編, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ、特に154巻及び155巻(Wuら編)及び185巻「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編, 1986)；並びにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【０１１０】
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型及びその使用を説明する実施例及び添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴も含む。添付の図面において；
- 図1は、I-CreI及びI-CreI-DNA構造のCαリボン図の重ねあわせを示す。明確性のために、DNAを省略している。
-図2は、I-CreIファミリーのメンバーからのC-末端領域の配列アラインメントを示す(Lucasら, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 960〜969)。SKTRKTTモチーフ内の変異された残基の位置を、灰色の三角で示す(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)。
- 図3は、S138、K139、K142及びT143の、DNA主鎖との接触の詳細図(a)、並びに結合及び非結合DNA構造間のS138、K139、K142及びT143の位置の比較(b)を表す。
【０１１１】
- 図4は、I-CreI C-末端領域変異体の生物物理学的特徴を示す。a) 円偏光二色性熱変性。b) 1次元H-H NMRスペクトル。
- 図5は、分析用超遠心分離により測定した、I-CreI C-末端領域変異体による二量体の形成を示す。I-CreIタンパク質(PBSバッファー中に1 mg/ml)の、42,000 rpm及び20℃での沈降速度分布。挿入図、I-CreIタンパク質(PBSバッファー中に4 mg/ml)の、11,000 rpm及び20℃での沈降平衡勾配。白抜きの丸は実験データを表し、2本の実線は、I-CreI単量体(20,045)及び二量体(41,000)の理論的勾配を表す。
- 図6は、Mg2+及びCa2+の存在下での、C-末端短縮型二重及び単一変異体の電気泳動移動度シフトアッセイを表す。
- 図7は、C-末端短縮型二重及び単一変異体のゲルインビトロ切断アッセイのまとめである。
【０１１２】
- 図8は、単一変異体のプロファイリング及び単一変異体の10NNN_P DNA標的切断プロファイルのために用いたインビボ切断アッセイを示す。a) 酵母スクリーニングアッセイの原理。単一変異体をコードする発現ベクターを有する株を、レポータープラスミドを有する株と交配させる。レポータープラスミド内では、LacZレポーター遺伝子内に、2つの直列反復に挟まれた、興味対象の標的部位の1つを有する挿入断片が介在する。交配により、メガヌクレアーゼ(灰色の卵形)は、興味対象部位にて2本鎖破断を生じ、2つの挟んでいる直列反復間の1本鎖アニーリング(SSA)により、機能的LacZ遺伝子の復帰を可能にする。機能的LacZ遺伝子は、青色の着色により視覚化される。b) DNA標的。C1221標的(上)は、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的である。この研究において用いた全ての標的は、±8、±9及び±10の6つのヌクレオチドの置換によりC1221から導かれるパリンドローム標的(配列番号1及び10〜16)である。いくつかの例を示す(下)。10GGG_P標的は、C1221標的とは、-10、-9、-8のGGGトリプレット、並びに+8、+9及び+10のCCCが異なる。c) 変異標的プロファイル。それぞれの変異体は、一連の64個のパリンドローム標的(10NNN_P)に対して、酵母内でプロファイリングされた。I-CreI D75Nに比較した、単一変異体(K139M)についての酵母での切断活性の例を示す。青色の着色が切断を示す。さらに、I-CreI D75N及びI-CreIに比較した、全ての単一変異体の10NNN_P切断プロファイルを示す。灰色のレベルは、シグナルの強度を反映する。I-CreIは酵母において毒性であり、プロファイルは、37℃の代わりに30℃にて確立された。全ての他の変異体は、37℃で研究した。
【０１１３】
- 図9は、単一変異体の5NNN_P DNA標的切断プロファイルを示す。標的(64)は、±3〜5位に変動を有するパリンドローム標的である。
- 図10は、単一変異体の2NN DNA標的切断プロファイルを示す。標的(16×16)は、±1〜2位に変動を有する非パリンドローム標的である。
- 図11は、単一変異体の12NN_P DNA標的(A)及び7NN_P DNA標的(B)切断プロファイルを示す。A (16)及びB (16)における標的は、それぞれ、±11〜12位及び±6〜7位に変動を有するパリンドローム標的である。
【実施例】
【０１１４】
実施例1：結合及び非結合のI-CreI DNA構造間の構造の違い
1) 材料及び方法
a) タンパク質の発現、精製及び結晶化
タンパク質発現及び精製は、(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)に記載されるようにして行った。I-CreI結晶化条件の最初のスクリーニングは、1μlのタンパク質溶液(20 mM HEPES, pH 7.5中に7 mg/ml)及び50μlの貯蔵溶液に対して20℃にて平衡化された1μlの沈殿溶液を含有する小滴を用いるHampton結晶スクリーニングを用いる蒸気拡散法(vapour-diffusion method)により、96ウェルプレートで行った。結晶を、いくつかの条件下で得た(結晶スクリーン1条件10、22、33、40、41及び結晶スクリーン2条件32)。結晶は、VDXプレートを用いて、懸滴(hanging-drop)蒸気拡散法により行った。最適化実験により、結晶化について以下の条件が導かれた：20 mM HEPES pH 7.5中に7 mg/mlでの1μlタンパク質、及び500μl沈殿バッファーに対して20℃にて平衡化された、20% PEG 4000、0.1 M HEPES pH 7.5、10%イソプロパノール、10%エチレングリコール及び0.01M酢酸マグネシウムを含有する1μl沈殿バッファー。桿形状の結晶が4〜8日で成長し、これらを直ちに回収して液体窒素中で凍結させた。
【０１１５】
b) データ収集、構造解明、モデル作製及び精密化
全てのデータは、100Kでのシンクロトロン放射を用いて低温で収集した。I-CreI結晶を載せ、低温保護した。データセットを、ID14-4ビームラインにて、ESRF (Grenoble)で、及びPXビームラインにて、SLS (Villigen)で、シンクロトロン放射を用いて収集した。回折データを、ビームラインに応じて、ADSC-Q4又はMar225 CCD検出器で記録した。処理及びスケーリングは、HKL2000を用いて行った(Otwinowski, Z.及びMinor, W.: Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode, Methods in Enzymology, 1997, Academic Press, New York)。構造は、プログラムMOLREP (Vagin, A.及びTeplyakov, A. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2000, 56 Pt 12, 1622〜1624)により実行される分子置換法を用いて解明した。
【０１１６】
2) 結果
I-CreIの構造は、分子置換及び2.0Åの解像度までの精密化により解明した。最良のデータセット(表I)は、Δφ=1°及び0.97Åの波長を用いて収集した。結晶学的データについての統計を、表Iにまとめる。探索モデルは、プロテインデータバンク(Protein Data Bank)で見出されるPDB 1gz9に由来するポリアラニン主鎖に基づいた。DNAからの配位(coordinates)は、探索モデルで削除した。精密化された2Fo-Fcマップは、タンパク質主鎖及び多くの側鎖について、明確で隣接する(contiguous)電子密度を示した。ARP/wARP及びREFMAC5を、自動モデル構築及び2.0Åまでの精密化にあてはめた(表I)。
【０１１７】
【表１】
0005524627.tif 000002
【０１１８】
DNAなしの二量体は、タンパク質-DNA複合体(PDBコード1gz9) (図1)との比較の後に、DNA結合の際のタンパク質コンホメーションの変化の観察を可能にした。最も顕著な違いは、C-末端領域のコンホメーションにある。DNAが結合した構造内において、C-ヘリックス及びC-ループがDNAと整列しているが、非結合構造では両方の要素が、DNAが結合する空洞の上部に位置しており、このことは、ループとC-ヘリックスが、DNA結合溝を開閉する錠として働きうることを示唆する。この領域は、非対称ユニット内に1つの単量体しか有さないI-CreIの以前の構造では観察されなかった(Heathら, Nat Struct Biol, 1997, 4, 468〜476)。さらに、I-CreIのC-末端ドメインは、LAGLIDADGファミリーからのホモ二量体タンパク質の間でよく保存されており(Lucasら, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 960〜969)、このことは、このメガヌクレアーゼ群の作用機構におけるその重要な役割を示す(図2)。C-末端領域でのタンパク質-DNA相互作用の詳細な図は、SKTRKTTモチーフのSer138、Lys139、Lys142及びThr143が、DNA主鎖との水素結合に含まれることを示す(図3a)。これらの残基の位置は、非結合DNA状態とは完全に異なり(図3b)、このことは、コンホメーションの変化が、核酸の結合に必要であることを示す。これらの相互作用は以前に記載されており(Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、アミノ酸は保存されているが、メガヌクレアーゼ作用の間のそれらの役割についての情報はない。
【０１１９】
実施例2：生物物理学的解析
1) 材料及び方法
a) I-CreI変異体の構築
I-CreI欠損変異体(Δ1及びΔ2)を、PCRにより、野生型I-CreI (I-CreI D75) cDNA鋳型に対して、両方の変異体についてフォワードプライマー5' gatataccatggccaataccaaatataac 3' (配列番号18)、及びΔ1変異体についてリバースプライマーICreI deltaCter-R: 5' ttatcagtcggccgcatcgttcagagctgcaatctgatccacccagg 3' (配列番号19)、又はΔ2変異体についてCreh2: 5' gagtgcggccgcagtggttttacgcgtcttagaatcg 3' (配列番号20)を用いて増幅した。
I-CreI単一及び二重変異体を、ラウンドザワールドPCRにより、Quickchange (登録商標)キット(STRATAGENE # 200518)、適切な突然変異誘発オリゴ及び鋳型としての野生型I-CreI (I-CreI D75) cDNAを用いて増幅した。
【０１２０】
b) 円偏光二色性熱解析
データは、d-10-カンファースルホン酸で予め校正され、Jasco Peltier熱電温度調節器CDF-426Sモデルを備えるJasco 810モデル円二色計を用いて取得した。実験は、PBS中で、1℃/分の間隔で行った。タンパク質濃度は10μMであった。222 nmでの楕円率を、5から95℃まで、2 mm Hellma 110-QSセル内で追跡した。
【０１２１】
c) 分析用超遠心分離
沈降平衡実験を、20℃にて、UV-可視光学構成要素を備えたOptima XL-A (Beckman-Coulter)分析用超遠心分離機で、Epon炭の3 mmダブルセクターセンターピースのAn50Tiローターを用いて行った。タンパク質濃度は、PBSバッファー中に200μMであった。短いカラム(23μl)の低速沈降平衡を、3つの連続する速度(11,000、13,000及び15,000 rpm)で行い、系は、連続するスキャンが重なり合い、平衡スキャンが280 nmの波長で得られたときに、平衡であるとみなした。ベースラインシグナルは、高速遠心分離の後に測定した(42,000 rpmで5時間)。タンパク質のセル全体の見かけの分子量を、プログラム EQASSOCを用いて得た(Minton, A.P., Modern Analytical Ultracentrifugation, 1994, Birkhauser Boston, Inc., Cambridge, MA)。I-CreIの部分比体積は、プログラムSEDNTERP (RASMBサーバーから得た; Laue, T.M.S., B.D.,  Ridgeway, T.M., Pelletier, S.L., In: Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins, 1992, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)を用いてアミノ酸組成から算出して、20℃にて0.7436 ml/gであった。沈降速度実験は、XL-A分析用超遠心分離器(Beckman-Coulter Inc.)で、42,000 rpm及び20℃にて、An50Tiローター及び1.2mmダブルセクターセンターピースを用いて行った。吸光度のスキャンを、280 nmで行った。タンパク質濃度は、PBS中に50μMであった。沈降係数を、SEDFITプログラムで実行される連続分布c(s) Lamm等式モデル(Schuck, P., Biophys. J., 2000, 78, 1606〜1619)により算出した。これらの実験的沈降値は、SEDNTERPプログラム(Laue, T.M.S., B.D.,  Ridgeway, T.M., Pelletier, S.L., Computer-aided interpretation of analytical sedimentation data for proteins, 1992, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)を用いて、標準条件に校正して、対応するs20,w値を得た。さらに、流体力学的解析(すなわち、摩擦係数比の算出)を、SEDFITプログラムを用いて行って、de c(M)分布を得た(Schuck, P., Biophys. J., 2000, 78, 1606〜1619)。
【０１２２】
d) NMRデータ取得
NMRスペクトルは、25℃にて、クリオプローブを備えたBruker AVANCE 600分光光度計で記録した。タンパク質試料は、5% 2H2Oを加えたPBSバッファー(137 mM NaCl、10 mM Na2HPO4-2H2O、2.7 mM KCl、2 mM KH2PO4、pH 7.4)中に500μMであった。DSS (2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸ナトリウム塩)を、内部プロトンケミカルシフト参照として用いた。
【０１２３】
2) 結果
I-CreIのC-末端ドメインの役割を解明するために、一連の整えた(trimmed)二重及び単一変異体を、結合及び非結合のDNA構造間の構造の違いに基づいて設計した。2つの短縮変異体を設計して、C-末端領域の役割を明らかにした。I-CreIΔ1 (アミノ酸番号1〜137)は、C-ループ及びC-ヘリックスの両方を欠くが、I-CreIΔ2 (アミノ酸番号1〜144)は、C-ループを含んでいた。SKTRKTTモチーフ内のDNA主鎖との接触に基づいて、二重変異体I-CreI AM (S138A、K139M)及びI-CreI GG (K142G、T143G)、並びにそれらの単一変異型I-CreI S138A、I-CreI K139M、I-CreI K142G、I-CreI T143Gを作製した。メガヌクレアーゼ活性における効果が変異によるものであることを示すために、タンパク質の安定性、構造及びオリゴマー形成状態におけるそれらの影響を研究した。熱変性円偏光二色性分光分析を行って、全ての変異体が折り畳まれていることを確認した。実際に、全ての変異体は、変異に応じて異なるTmを有する、野生型と同様のシグモイド曲線を示した(図4a)。さらに、1次元H-H NMRにより、熱変性実験が確かめられ、アミド領域内のよく定義された分散したピークにより、全ての変異体が折り畳まれていることが確認された(図4b)。メガヌクレアーゼのI-CreIファミリーが、ホモ二量体としてDNAに結合することが知られているので、変異体のオリゴマー形成状態を分析するために、これらを分析用超遠心分離に供した。実験により、全ての変異体が、変異とは独立して二量体として挙動し、それらの分子量に対応するわずかな変動があることが示された(図5)。
これらの実験は全て、変異体が折り畳まれ、メガヌクレアーゼ活性に関わるI-CreI足場が保存されていることを示す。
【０１２４】
実施例3：C-末端変異体のDNA結合活性
1) 材料及び方法
バンドシフトアッセイ条件
バンドシフトアッセイを、10 mM Tris-HCl pH 8、50 mM NaCl、10 mM CaCl2又はMgCl2、1 mM DTT中で、5μM (0.0793μg/μl) 6-FAM二重(配列番号21；図6を参照)及び20μM (0.463μg/μl)タンパク質を用いて室温にて1時間インキュベートし、15 %アクリルアミド-TBEゲル中で電気泳動して行った。
【０１２５】
2) 結果
Mg2+及びCa2+の存在下での電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用いて、DNA結合におけるC-末端変異体の挙動を分析した(図6)。Ca2+の存在はDNA結合を可能にするが、Mg2+は、結合及びDNA切断に不可欠である(Chevalierら, Biochemistry, 2004, 43, 14015〜14026)。I-CreIの結合能力はΔ1変異体で失われたが、Δ2は、標識されたDNAプローブに結合でき、C-ループがDNA結合に必須であることが示された。さらに、結合は、野生型I-CreIと同様に両方のカチオンの存在下で検出された。
【０１２６】
一方、I-CreI AM及びI-CreI GG二重変異体はともに、カチオンの存在とは独立してそのDNA結合特性に著しい影響を受け、このことは、DNA主鎖とのSer138、Lys139、Lys142及びThr143の接触が、核酸への結合に重要であることを示す。よって、SKTRKTTモチーフ中のこれらの残基は、I-CreI DNA結合に必須の2つの新しい活発な部位を構成する。
【０１２７】
C-ループ内のそれぞれの部位の別個の特性を明確にするために、単一変異体を、同じ条件下でEMSAによりアッセイした。二重変異体とは対照的に、全ての単一変異体は、標識プローブに結合可能であった。しかし、これらは、アッセイに存在するカチオンに応じて、違いを示した。Ser138-Lys139部位において、Mgの明確な依存性が観察できたが、Lys142-Thr143部位の単一変異体は、移動度アッセイに存在するカチオンに関わらず、DNAに結合できた。
つまり、それぞれの部位における両方の残基の変異は、DNA結合の喪失に必要であり、このことは、それぞれの活発な部位における2つの残基間の共同作用が、DNA結合に必須であることを示す。
【０１２８】
実施例4：C-末端変異体のインビトロでのDNA切断活性
1) 材料及び方法
インビトロ切断アッセイ条件
切断アッセイを、37℃にて、10 mM Tris-HCl (pH 8)、50 mM NaCl、10 mM MgCl2 (又はCaCl2)及び1 mM DTT中で行った。濃度は、25μlの最終容量の反応物中で、XmnIで線状にした標的基質(pGEM-T Easy C1221 GTC)について100 ng、及びI-CreI及びヘリックス変異タンパク質について40〜0.25ngの希釈であった。線状にした標的プラスミドは3 kbであり、切断後に、2 kb及び1 kbのより小さいバンドを生じる。反応を、1時間後に、5μlの45%グリセロール、95 mM EDTA (pH 8)、1.5% (w/v) SDS、1.5 mg/mlプロテイナーゼK及び0.048 % (w/v)ブロモフェノールブルー(6×停止バッファー)の添加により停止し、37℃にて30分間インキュベートし、1%アガロースゲル中で電気泳動した。フラグメントを、SYBR Safe DNAゲル染色(IN VITROGEN)を用いて定量した。ゲルを、ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて解析し、式：(2kb+1kb)/(3kb+2kb+1kb)*100に従って切断のパーセンテージを算出した。
【０１２９】
2) 結果
DNA結合アッセイにおける別個の変異体の分析は、DNA切断活性について明確に関連し、よって、野生型DNA配列に対するそれらの切断特性を調べた。図7は、HEの量に対する切断パーセンテージを示すグラフである(生データを示すゲルは、サポート情報として利用可能である)。野生型HEに対するそれらの切断特性の比較に基づいて、変異体は、2つの群に分けることができる。第1の群は、短縮変異体I-CreIΔ1及びI-CreIΔ2並びに二重変異体I-CreI AM及びI-CreI GGであり、一方、単一変異体I-CreI S138A、I-CreI K139M、I-CreI K142G、I-CreI T143Gは、第2の群を形成する。第1群のメンバーは、野生型I-CreIと比較すると、切断活性が減少していた。I-CreIΔ1及びI-CreI GG切断特性は完全に失われたが、I-CreIΔ2及びI-CreI AMは、活性の減少を示し、これは、より多量のHEを用いたときに増加する。しかし、第2群を構成する単一変異体の切断特性は、野生型に似ているだけでなく、増強される場合もある(図7)。
【０１３０】
これらの結果は、DNA結合が失われるか、又は著しく影響を受けた、整えられた二重変異体が、DNAを切断しないか、又はプラスミドを切断するためにより多量のHEを必要とすることを示す。I-CreΔ2の場合は注目に値し、この変異体は、C-ループ内の野生型アミノ酸を保存するが、α6ヘリックスを欠き、その切断活性は影響されるが、活性プロファイルは、I-CreI野生型により類似する。
【０１３１】
一方、単一変異体は、そのすべてにおいて、野生型に比較して活性がわずかに増進された。活性アッセイは、DNA結合研究を確かにし、二重変異体が関係する様式で作用することを示すが、これらの変異体の影響は、核酸だけでなく、ここで示したようにDNA切断にも関係する。
【０１３２】
実施例5：C-末端変異体のインビボでのDNA切断活性
1) 材料及び方法
インビボ切断アッセイ(図8a)は、PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178、及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に以前に記載された。
【０１３３】
a) 標的クローンの構築
C1221の24 bpの標的配列(5'-tcaaaacgtcgtacgacgttttga-3': 配列番号1)は、天然のI-CreI標的(5'-tcaaaacgtcgtgagacagtttgg-3': 配列番号17)のハーフサイトのパリンドロームである。C1221は、I-CreI天然標的と同様に効率的に、インビトロ及びエクスビボで、酵母及び哺乳動物細胞の両方において切断される。C1221に由来するパリンドローム標的を、Gatewayプロトコル(Invitrogen)を用いて、ともに以前に記載され(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962)、I-SceI標的部位を対照として有する酵母pFL39-ADH-LACURAZ及び哺乳動物ベクターpcDNA3.1-LACURAZ-ΔURAのレポーターベクター中に以前に記載されたようにしてクローニングした(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。酵母レポーターベクターで、S. cerevisiae FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
【０１３４】
b) 酵母のスクリーニング
ホモ二量体変異体をスクリーニングするプロトコルは、以前に記載されている(PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。
【０１３５】
c) 酵母でのメガヌクレアーゼ発現クローンの交配及びスクリーニング
交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、高格子密度(約20スポット/cm2)を用いて、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上にグリッドした。2回目のグリッド手順を、同じフィルタ上に、それぞれの変異型について、64又は75の異なるレポーター含有酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて1晩インキュベートして交配を可能にした。次に、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース(2%)を炭素源として含む合成培地に移し、37℃(I-CreIについて30℃)にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果は、スキャンにより分析し、定量は、適切なソフトウェアを用いて行った。
【０１３６】
2) 結果
結果を確かめるために、インビボ切断アッセイを、以前に記載された(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)I-CreI及びI-CreI D75Nタンパク質とともに全ての変異体を用いて行った。
インビトロでは変異により結合及び切断活性に影響を受けた二重変異体又は短縮変異体のいずれも、いずれの標的に対しても活性を示さなかった。例として、I-CreI AM及びI-CreI GGを示す(図8cの上のパネル)。対照的に、全ての単一変異体は、野生型標的(C1221)に対してより高い活性を示した。
【０１３７】
- 10NNN_P標的プロファイリング(図8c)
全ての単一変異体は、野生型標的(C1221)、10AAG_P及び10AAT_Pに対して高い活性を示した。より低いレベルの切断が、これらの4つの変異体を用いて、10TCG_P及び10AAC_Pについて観察できた。さらに、I-CreI K139M変異体は、図8cで観察できるように、7つのさらなる標的(10AGT_P、10GAG_P、10GAA_P、10GAT_P、10CAG_P、10CAA_P、10CAT_P)を切断することもできた。I-CreI K139M変異体のプロファイルは、I-CreI (その毒性なし)に非常に類似するが、3つのその他の変異体は、I-CreI D75Nにより近い。
【０１３８】
- 5NNN_Pプロファイリング(図9)
S138A及びK139Mのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルに似ているが、K142G及びT143Gのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルよりも制限されている。
【０１３９】
- 2NN_Pプロファイリング(図10) 
K142G及びS138Aのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルよりも制限されている。D75Nに比較すると、T143G及びK139Mは、それぞれ6個及び10個のさらなる標的を切断し、それらのうち6個は共通である。さらに、少なくとも8個の標的は、D75NよりもK139Mによって、より効率的に切断される。5つの標的(2TT_2TG、2TG_2TT、2TA_2CT、2TC_2TC、2CT_2CT)は、K139Mにより切断されない。これらの標的は、D75Nにより切断されるが、I-CreIによるよりも効率は低い。
【０１４０】
- 12NN_Pプロファイリング(図11A)
K142G及びS138Aのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルよりも制限され、S138Aのプロファイルは、K142Gのプロファイルよりも制限されている。
T143Gのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルに似ている。
K139Mのプロファイルは、I-CreIのプロファイルに似ているが、その毒性がない。D75Nに比較して、7つのさらなる標的が、K139Mにより切断される。
【０１４１】
- 7NN_Pプロファイリング(図11B)
K142G及びS138Aのプロファイルは、I-CreI D75Nのプロファイルに似ている。
K139M及びT143Gは、D75Nに比較して、2つのさらなる標的(7CG_P及び7TT_P)を切断する。しかし、K139M及びT143Gの切断プロファイルは、I-CreIのプロファイルよりも制限されている。
【０１４２】
これらの結果は、I-CreIのC-末端領域が、HE活性に必須であることを示す。さらに、SKTRKTT領域に接する残基における変異は、それらが、核酸結合だけでなく、標的特異性も制御することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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