(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を含むトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリであって、ここで、前記ガラクトシルトランスフェラーゼはトランスジェニックトリの卵管の管状腺細胞において発現し、さらにここで、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、管状腺細胞において発現する他のトランス遺伝子によってコードされる外因性タンパク質のオリゴ糖へ少なくとも１つのガラクトースを、前記管状腺細胞において付加し、ここで前記オリゴ糖はガラクトシルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子の不在下であれば前記少なくとも１つのガラクトースを含まない、トランスジェニックトリ。
【請求項２】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼタイプ１である、請求項１に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項３】
前記オリゴ糖が１〜５個のガラクトースを含む、請求項１に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項４】
ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子が、卵管に特異的なプロモーターを含む、請求項１に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項５】
トリにおいて単離されたタンパク質を生成する方法であって、ここで前記タンパク質はトリに対して外因性であり、該方法は以下を含む方法：
(a) 卵管に特異的なプロモーターと作動可能に結合されたガラクトシルトランスフェラーゼをコードするトランス遺伝子を含むトランスジェニックトリを生成するステップであって、ここで、前記ガラクトシルトランスフェラーゼはトランスジェニックトリの卵管の管状腺細胞において発現し、さらにここで、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、前記トリの管状腺細胞において発現する他のトランス遺伝子によってコードされる外因性タンパク質のオリゴ糖へ少なくとも１つのガラクトースを、前記管状腺細胞において付加し、ここで前記オリゴ糖はガラクトシルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子の不在下であれば前記ガラクトースを含まない、ステップ、および
(b)前記トランスジェニックトリによって産卵される卵の卵白から、修飾されたオリゴ糖を有する前記外因性タンパク質を単離するステップ。
【請求項６】
前記卵管に特異的なプロモーターがオバルブミンプロモーターである、請求項５に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項７】
前記タンパク質が治療タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記トリがニワトリである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
シアリルトランスフェラーゼコード配列を含むトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリであって、ここで、前記シアリルトランスフェラーゼはトランスジェニックトリの卵管の管状腺細胞において発現し、さらにここで、前記シアリルトランスフェラーゼは、前記トリの管状腺細胞において発現する他のトランス遺伝子によってコードされる外因性タンパク質のオリゴ糖へ少なくとも１つのシアル酸を付加し、ここで前記オリゴ糖はシアリルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子の不在下であれば前記少なくとも１つのシアル酸を含まない、トランスジェニックトリ。
【請求項１０】
前記シアリルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼタイプ１、２、３、４、５、または６である、請求項９に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項１１】
前記オリゴ糖が１〜５個のシアル酸を含む、請求項９に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項１２】
シアリルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子が卵管に特異的なプロモーターを含む、請求項９に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項１３】
前記タンパク質が治療タンパク質である、請求項９に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項１４】
前記トリがニワトリである、請求項９に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項１５】
トリにおいてタンパク質を生成する方法であって、ここで前記タンパク質は前記トリに対して外因性であり、前記方法は以下を含む方法：
シアリルトランスフェラーゼをコードするトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリを生成するステップであって、ここで前記シアリルトランスフェラーゼはトランスジェニックトリの卵管の管状腺細胞において発現し、さらにここで、前記シアリルトランスフェラーゼは、トリの管状腺細胞において発現する他のトランス遺伝子によってコードされる外因性タンパク質のオリゴ糖へ少なくとも１つのシアル酸を付加し、ここで前記オリゴ糖は、シアリルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子の不在下であれば前記少なくとも１つのシアル酸を含まない、ステップ、および
前記トランスジェニックトリによって産卵される卵の卵白から、修飾されたオリゴ糖を有する前記外因性タンパク質を単離するステップ。
【請求項１６】
前記シアリルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼタイプ１、２、３、４、５、または６である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シアリルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子が卵管に特異的なプロモーターを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が治療タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記トリがニワトリである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本願は、２００８年１月７日に出願されたUS provisional application No. 61/010,207の優先権を主張するものであり、その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
潜在的な商業的用途を有する特定のタンパク質は、哺乳類細胞によって効率的にもたらされる翻訳後修飾を必要としうる。しかし、哺乳類細胞、例えば業界標準のチャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）はＧＭＰ条件下で成長するのが困難であり、商用目的で必要とされる規模で増殖するための限りない資源を必要としうる。動物に基づくバイオリアクターシステムは、低コスト、低メンテナンスおよび拡張性の容易さを含むことが理由で、ＣＨＯおよび他の哺乳類細胞に基づくシステムに対して興味深い代替物である。しかし、治療タンパク質の翻訳後修飾、特にグリコシル化は、特定の動物および植物では、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞に対して異なる形でなされる。トランスジェニックトリは、部分的にはその多産卵およびタンパク質生成能が理由で、治療タンパク質バイオリアクターとして巧妙に使用されている。いくつかの例では、ニワトリなどのトリの卵管内に生成されかつ卵内に貯蔵されるタンパク質に結合される糖分子（すなわちオリゴ糖またはグリコシル化構造）は、ＣＨＯおよびヒトタンパク質に類似の基本的構造を有することが見出されている。しかし、ヒト患者における生物活性およびバイオアベイラビリティにとって重要でありうる、卵管内で生成される特定のタンパク質上に存在しないいくつかの構造性炭水化物要素が存在する。
【０００３】
卵白は、卵管（トリでは哺乳類ファローピウス管に相当する）を横切る際に卵黄の周囲に形成される。卵白形成が生じる卵管の領域はマグナムと称され、専ら卵白タンパク質の合成および分泌を行う管状腺細胞（ｔｕｂｕｌａｒ  ｇｌａｎｄ  ｃｅｌｌ）（ＴＧＣ）と称される細胞が集中する。
【０００４】
タンパク質上に見出されるグリコシル化構造の２つの主なクラスであるＮ−およびＯ−結合オリゴ糖が異なる酵素セットによって合成される。産卵鶏のマグナム内で生成されかつ卵白内に貯蔵されるＯ−結合オリゴ糖（Ｏ−グリカンとも称される）においては、ヒトとトリ卵管の双方において生成されるオリゴ糖構造内に本質的に同じ糖および結合が存在することから、オリゴ糖を生成するための酵素的機構がヒトでのＯ−グリカンの生成におけるそれに類似するように見られる。
【０００５】
ニワトリ卵白Ｎ−結合オリゴ糖（Ｎ−グリカンとも称される）は、ヒトにおいて見出されるものにやや類似した構造を有するが、典型的には末端のガラクトースおよびシアル酸糖が欠如している。特定の治療タンパク質においては、末端のガラクトースおよびシアル酸を有することは、患者におけるバイオアベイラビリティ、ひいては有効性にとって重要でありうる。
【０００６】
ニワトリ卵管内に生成されるＮ−グリカン構造上でほとんど存在しないかまたは全く存在しない末端シアル酸残基は、Ｎ−グリカンを様々なレクチン（糖分子を認識する受容体）による認識から保護する。末端Ｇａｌを有するタンパク質は、患者において肝臓内で発現されかつ血液循環から除去されるレクチンによって結合されうる（非特許文献１）。末端ＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを有するタンパク質（典型的にはニワトリ卵管内で生成されるタンパク質の場合）またはマンノースはマクロファージ上に発現されるレクチンによって結合され、さらに除去されることになる（非特許文献２）。これらの結果は、有効性を低減することが多い短い半減期を有するタンパク質をもたらしうる。
【０００７】
興味深いことに、ニワトリにおける他の器官内で生成され、例えば血中に見出されるＮ−グリカンは、典型的にはＧａｌおよび／またはシアル酸で終結される（非特許文献３；非特許文献４）。したがって、ニワトリゲノムが完全にシアリル化されたＮ−グリカンの合成に必要とされる酵素のすべてをコードする遺伝子を有することは明白である。
【０００８】
ニワトリ卵白に由来するＮ−グリカンにおいては、低い割合（％）の分岐がＧａｌによって占有され、かつ低い割合（％）のそれらのＧａｌがシアル酸によってキャッピングされる。卵白Ｏ−グリカンにおいては、高い割合（％）の分岐がシアル酸によってキャッピングされる。卵白タンパク質内には、主にＯ−グリカン修飾卵白タンパク質が豊富であることから、大量のガラクトースおよびシアル酸が存在する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。Ｎ−およびＯ−グリカン合成経路はＧａｌおよびシアル酸の同じプールを共有する（非特許文献８）。したがって、ＴＧＣにおけるグリカン合成において使用可能なＧａｌおよびシアル酸のレベルは高く、制限要因であるはずがない。
【０００９】
哺乳類における関連酵素について知られることに加え、卵白Ｎ−グリカンの構造は、卵白Ｎ−グリカン構造を生じさせる細胞機構に関する手掛かりを与える。哺乳類においては、Ｎ−グリカンの合成は、２個のＧｌｃＮＡｃ残基および多数のマンノースおよびグルコース残基を含むドリコールオリゴ糖前駆体の合成により、小胞体において開始する。この複合体は標的タンパク質のアスパラギンに結合される。前駆体は、様々なグリコシダーゼ（コア五糖とも称される）により、３個のマンノースおよび２個のＧｌｃＮａｃ残基に削られる。次いで、ＧｌｃＮａｃ、Ｇａｌおよびシアル酸残基は、グリコシルトランスフェラーゼによって連続的に付加される。おそらく様々なグリコシルトランスフェラーゼの細胞内レベルおよび成長するＮ−グリカン分岐上の遊離アクセプタ部位におけるグリコシルトランスフェラーゼ間の競合に起因し、Ｎ−グリカン構造の多様性が優勢になるのはこの段階である（非特許文献８）。
【００１０】
ＧｌｃＮａｃを始め、Ｎ−グリカンのトリマンノシルコア（ｔｒｉｍａｎｎｏｓｙｌ  ｃｏｒｅ）へのＧｌｃＮＡｃの付加に関与する少なくとも６つのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）が存在する。卵白Ｎ−グリカンの高レベルの分岐は、６つ全てのＧｎＴがニワトリの卵管細胞内である程度まで発現されうることを示す。
【００１１】
本明細書中でＧａｌＴと称されるガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ）は、Ｎ−およびＯ−グリカンの形成において異なるとともに重複する役割を有する少なくとも７つのメンバーのファミリーである。ＧａｌＴ１（タイプ１）は、主にＮ−グリカン上のすべての結合のＧｌｃＮａｃ残基へのＧａｌの付加に関与すると考えられる（非特許文献９）。他のファミリーのメンバー、特にタイプ２および３は、Ｎ−グリカン合成におけるそれらの実際の役割は小さいように見られるが、この転移を触媒可能であると考えられる。ＧａｌＴ１は、レベルは変化しうるが、典型的には全細胞種内でよく見られる様式で発現される。
【００１２】
シアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａｌＴ）ファミリーは、シアル酸のＧａｌまたはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）（Ｏ−結合グリカンの場合）および他のアクセプタへの付加を触媒する。Ｎ−およびＯ−グリカンに関しては、シアル酸の付加は、関連する特定のＳｉａｌＴに依存し、α２，３またはα２，６のいずれかの結合によってもたらされる。ヒトＮ−グリカンは、α２，３およびα２，６結合の一方または双方を有しうる。ＣＨＯで生成されるＮ−グリカンは、α２，６  ＳｉａｌＴの発現の欠如に起因し、α２，３結合のみを有する（非特許文献１０）。卵白Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカンはまた、α２，３結合を介してのみ結合されるように見られる。
【００１３】
α２，３  ＳｉａｌＴファミリーには６つのメンバーが存在する。タイプ１および２は、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ鎖をアクセプタとして使用する際、Ｏ−グリカンの合成に関与しうる。タイプ３、４および６は、明らかにシアル酸をＧａｌ−ＧｌｃＮａｃで終結する鎖に付加可能であり、かつＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの合成に関与しうる。タイプ５は、Ｏ−グリカンまたはＮ−グリカンの合成に関与しないように見られるが、そうではなくセラミドを有する化合物へのシアル酸の付加に関与しうる（非特許文献１１）。ニワトリ胚におけるタイプ１（ＳｉａｌＴ１）の発現分析以外で、トリα２，３  ＳｉａｌＴファミリーについて知られていることは極めて少ない（非特許文献１２）。
【００１４】
現在、卵白グリカン内での最後（すなわち末端）または末端から２番目（すなわち最後から２番目）の位置でのＧａｌのレベルが約１０％未満であり、かつ末端シアル酸におけるレベルが約２％未満であることが推定されている。必要とされるのは、より多量のガラクトースおよび／またはシアル酸がＮ−結合オリゴ糖に付加される場合に、卵管組織内、例えばマグナム組織内でグリコシル化タンパク質を生成するトリである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ashwell and Morell. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 41: 99-128, 1974
【非特許文献２】Schlesinger, et al. Biochem J 192: 597-606, 1980
【非特許文献３】Ito, et al. Rapid Commun Mass Spectrom 20: 3557-65, 2006
【非特許文献４】Raju, et al. Glycobiology 10: 477-86., 2000
【非特許文献５】Feeney, et al. J Biol Chem 235: 2633-7, 1960
【非特許文献６】Feeney, et al. J Biol Chem 235: 2307-11, 1960
【非特許文献７】Robinson and Monsey．Biochem J 147: 55-62,1975
【非特許文献８】Varki, et al. Essentials of Glycobiology. Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999
【非特許文献９】Lee, et al. J Biol Chem 276: 13924-34, 2001
【非特許文献１０】Lee, et al. J Biol Chem 264: 13848-55, 1989
【非特許文献１１】Harduin-Lepers, et al. Biochimie 83: 727-37, 2001
【非特許文献１２】Kurosawa, et al. Biochim Biophys Acta 1244: 216-22, 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＧａｌからＮ−グリカンへの転移に関与する鍵酵素がＴＧＣにおいて発現されないことが発見されている。これは、シアル酸がＧａｌ残基を介して専らＮ−グリカンに結合されることから、特に重要である。また、Ｎ−グリカン上でシアル酸をＧａｌに転移させる酵素が発現されるが、それは効率的なシアリル化を阻害するように見られるレベルであることが発見されている。これらの発見により、部分的には、末端のシアル酸残基およびＧａｌ（例えば末端から２番目のＧａｌ）残基のより完全な相補体とともにオリゴ糖構造（例えばＮ−結合オリゴ糖構造）を有する治療タンパク質（例えばヒト治療タンパク質）を生成する本発明のトランスジェニックトリが得られている。これらのトリは、本明細書中で「トランス遺伝子が増強されたグリコシル化」トリと称されることが多い。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、発現されるグリコシルトランスフェラーゼコード配列を有するゲノム内にトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリ（例えばトランスジェニックニワトリ）を含む。本発明はまた、トランスジェニックトリを作製する方法を含む。トランスジェニックトリの卵管組織、例えばマグナム組織（例えば管状腺細胞）は、トランス遺伝子の不在下であれば存在しないことになる少なくとも１つの糖を有するＮ−結合オリゴ糖を有するタンパク質（例えば外因性タンパク質、例えば治療タンパク質）を生成しうる。また、本発明においては、本明細書中で開示されるように生成される修飾オリゴ糖パターンを有するタンパク質も含まれる。
【００１８】
一実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３であり、かつ糖はＮ−アセチルグルコサミンである。
【００１９】
別の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばガラクトシルトランスフェラーゼタイプ１）であり、かつ糖はガラクトースである。一実施形態では、トランス遺伝子が増強されたガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばガラクトシルトランスフェラーゼタイプ１）トリの卵管内で生成される外因性タンパク質（例えば治療タンパク質）は、シアル酸を付加するための基質として使用されうる。例えば、周知のインビトロ方法を用い、シアル酸は、卵管内の組換えまたは外因性ガラクトシルトランスフェラーゼによりオリゴ糖構造に付加されているＧａｌに結合される。
【００２０】
別の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼタイプ３）であり、かつ糖はシアル酸である。
【００２１】
一実施形態では、本発明のトランスジェニックトリの卵管組織の細胞は卵白の存在下でタンパク質を分泌する。
【００２２】
一実施形態では、本発明のトランス遺伝子は、卵管に特異的なプロモーターの少なくとも１つおよびＬＴＲなどのレトロウイルスの少なくとも一部を含む。
【００２３】
本発明の一態様は、改変されたオリゴ糖パターンを有するタンパク質の単離または精製に関する。
【００２４】
１つの特定の実施形態では、本発明は、トリにおけるタンパク質を生成する方法に関し、ここでタンパク質はトリに対して外因性である。方法は、グリコシルトランスフェラーゼをコードするトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリを生成するステップを含み、ここでトリの卵管組織は、第２のトランス遺伝子によってコードされかつＮ−結合オリゴ糖を有する外因性タンパク質を生成し得る。Ｎ−結合オリゴ糖は、ガラクトースおよびそれに結合されたシアル酸の中の少なくとも１つを有することになり、ここでオリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼをコードするトランス遺伝子の不在下であれば結合されたガラクトースおよび／またはシアル酸を有しないことになる。
【００２５】
本発明は、マグナム（例えば管状腺細胞）などのニワトリ卵管組織内に比較的少量で存在することが見出された、オリゴ糖構造の合成に関与する酵素におけるコード配列を有するトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリを含む。例えば、酵素は、卵管組織内に、トリにおける他の組織内に見出される場合より少ない量で存在しうる。例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約９０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約８０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約７０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約６０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約５０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約３０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約２０％未満の量で存在しうるか、または例えば酵素は卵管組織内に、肝組織および腎組織などのトリにおける他の組織内で平均的に見出される場合に対して約１０％未満の量で存在しうる。
【００２６】
本発明はまた、本発明のトランス遺伝子を有するベクターを含む。本発明によって使用されるベクターは、本発明のトランス遺伝子をニワトリゲノムに組み込み、卵白タンパク質を作る卵管の細胞内で酵素を発現するように設計される。任意の有用なベクターを使用し、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリ（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｖｉａｎ）などの本発明のトリを生成可能である。一部の有用なベクターは、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターなどのウイルスベクター、プラスミド、ならびにトリゲノムの一部になりうる（すなわちゲノムに組み込まれる）他のヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
非感染性核酸ベクターなどの他の有用なベクターが本明細書中での使用として考えられる。例えば、部位特異的ＤＮＡ組込み、インテグラーゼ媒介性組込みおよび人工染色体もまた本発明による使用が考えられる。
【００２８】
本発明による使用が考えられるトリレトロウイルスの例として、限定はされないが、トリ白血病／白血症ウイルス（ＡＬＶ）、例えばまた限定はされないが、ＲＡＶ−０、ＲＡＶ−１、ＲＡＶ−２；トリ肉腫ウイルス（ＡＳＶ）；トリ肉腫／急性白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）が挙げられ、ここでは限定はされないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）；藤浪肉腫ウイルス（ＦＳＶ）；トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）；トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）；トリ骨髄球腫症ウイルス（ＭＣＶ）、例えばまた限定はされないが、ＭＣ２９；細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、例えばまた限定はされないが、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）が挙げられる。本発明ではまた、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）；モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）；モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）；およびレンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびこれらのレトロウイルスの複製欠損型）の使用が考えられる。典型的には、本発明に従って使用されるレトロウイルスベクターは複製欠損性である。
【００２９】
また、感染性ＤＮＡが生殖細胞系伝達、例えばde Lavoir et al, June 8, 2006, Nature vol 441, p 766-769（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）において報告されているものをもたらすのに必要とされない場合、他の方法を用い、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリが生成されうる。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、ＧａｌＴ１、ＧａｌＴ２、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ５、ＧａｌＴ６および／またはＧａｌＴ７をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有し、かつ末端位置で完全にまたは実質的にガラクトースによって占有されるＮ−グリカンを有する組換えタンパク質、例えば治療タンパク質を卵管組織内、例えばマグナム組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリに関する。例えば、本発明に従って生成される外因性タンパク質（例えば治療タンパク質）は、末端位置で約３０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約４０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約５０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約６０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約７０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約８０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約９０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約９５％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で１００％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうる。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のＧａｌＴ１、ＧａｌＴ２、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ５、ＧａｌＴ６およびＧａｌＴ７をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有し、かつ末端から２番目の位置で完全にまたは実質的にガラクトースによって占有されるＮ−グリカンを有する組換えタンパク質、例えば治療タンパク質を卵管組織内、例えばマグナム組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリに関する。例えば、本発明に従って生成される外因性タンパク質（例えば治療タンパク質）は末端から２番目の位置で約３０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約４０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約５０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約６０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約７０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約８０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約９０％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で約９５％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端から２番目の位置で１００％がガラクトースによって占有されるＮ−グリカン構造を有しうる。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のＧａｌＴ１、ＧａｌＴ２、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ５、ＧａｌＴ６およびＧａｌＴ７をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有し、かつ末端位置で完全にまたは実質的にシアル酸によって占有されるＮ−グリカンを有する組換えタンパク質、例えば治療タンパク質を卵管組織内、例えばマグナム組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリに関する。例えば、外因性タンパク質は、末端位置で約３０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約４０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約５０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約６０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約７０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約８０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約９０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約９５％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で約１００％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうる。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のＧａｌＴ１、ＧａｌＴ２、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ５、ＧａｌＴ６およびＧａｌＴ７をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有し、かつ組換えタンパク質、例えば治療タンパク質を卵管組織内、例えばマグナム組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリに関し、ここではオリゴ糖の３つのＧｌｃＮａｃ残基のうち１つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのＧｌｃＮａｃ残基のうち２つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのＧｌｃＮａｃ残基のうち３つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのＧｌｃＮａｃ残基のうち１つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖のＧｌｃＮａｃ残基の４つのうち２つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのＧｌｃＮａｃ残基のうち３つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのＧｌｃＮａｃ残基のうち４つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのＧｌｃＮａｃ残基のうち１つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのＧｌｃＮａｃ残基のうち２つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのＧｌｃＮａｃ残基のうち３つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのＧｌｃＮａｃ残基のうち４つが、結合されたガラクトース残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのＧｌｃＮａｃ残基のうち５つが、結合されたガラクトース残基を有する。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のＳｉａｌＴ１、ＳｉａｌＴ２、ＳｉａｌＴ３、ＳｉａｌＴ４、ＳｉａｌＴ５およびＳｉａｌＴ６をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有し、かつ組換えタンパク質、例えば治療タンパク質を卵管組織内、例えばマグナム組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリに関し、ここではオリゴ糖の１つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の２つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の２つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち４つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち４つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち５つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち４つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち５つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち６つが、結合された末端シアル酸残基を有する。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、非トランスジェニックトリに対してシアル酸で終結する分岐の百分率が増加したＮ−グリカンをマグナム組織などのその卵管組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、１つ以上のＳｉａｌＴ１、ＳｉａｌＴ２、ＳｉａｌＴ３、ＳｉａｌＴ４、ＳｉａｌＴ５およびＳｉａｌＴ６をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有するトランスジェニックニワトリを提供する。例えば外因性タンパク質は、末端位置で３０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で４０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で５０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で６０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で７０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で８０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で９０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で９５％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で１００％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうる。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のＧａｌＴ１、ＧａｌＴ２、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ５、ＧａｌＴ６、ＧａｌＴ７、ＳｉａｌＴ１、ＳｉａｌＴ２、ＳｉａｌＴ３、ＳｉａｌＴ４、ＳｉａｌＴ５およびＳｉａｌＴ６をコードするトランス遺伝子、例えばＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有し、かつ組換えタンパク質、例えば治療タンパク質を卵管組織内、例えばマグナム組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリに関し、ここではオリゴ糖の１つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の２つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の２つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の３つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の４つのガラクトース残基のうち４つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち４つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の５つのガラクトース残基のうち５つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち１つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち２つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち３つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち４つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち５つが、結合された末端シアル酸残基を有し、または例えばここではオリゴ糖の６つのガラクトース残基のうち６つが、結合された末端シアル酸残基を有する。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、非トランスジェニックトリに対してシアル酸で終結する分岐の百分率が増大した外因性タンパク質をマグナム組織などのその卵管組織内（例えば管状腺細胞内）に生成する、ＧａｌＴ１、ＧａｌＴ２、ＧａｌＴ３、ＧａｌＴ４、ＧａｌＴ５、ＧａｌＴ６、ＧａｌＴ７、ＳｉａｌＴ１、ＳｉａｌＴ２、ＳｉａｌＴ３、ＳｉａｌＴ４、ＳｉａｌＴ５およびＳｉａｌＴ６をコードするトランス遺伝子のうちの２つ以上、例えばＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３をコードするトランス遺伝子をゲノム内に有するトランスジェニックニワトリを提供する。例えば外因性タンパク質は、末端位置で２０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で３０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で４０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で５０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で６０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で７０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で８０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で９０％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で９５％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうるか、または例えば外因性タンパク質は、末端位置で１００％がシアル酸によって占有されるＮ−グリカン構造を有しうる。
【００３８】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、１〜５個のシアル酸（例えば１〜４個のシアル酸）を有するオリゴ糖を有する。
【００３９】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、１〜５個のガラクトース（例えば１〜４個のガラクトース）を有するオリゴ糖を有する。
【００４０】
外因性タンパク質を生成するトランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリを生成するため、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリは卵管内での治療タンパク質の生成を目的としてトランスジェニックである既存のトリと交配可能であり、ここで治療タンパク質の有効性は、治療タンパク質に付加されるオリゴ糖でガラクトースおよび／またはシアル酸を有することによって高まりうる。また、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリを使用し、卵または胚ドナーが生成されうる。治療タンパク質などのタンパク質をコードするトランス遺伝子を、例えば当該技術分野で既知の方法によって胚に導入することで、卵管内においてトランス遺伝子でコードされるタンパク質を生成することになるトリの系列が生成可能であり、ここで、グリコシル化トランス遺伝子でコードされるタンパク質はオリゴ糖構造に対してガラクトースおよびシアル酸などの追加的な糖を有しうる。別の実施形態では、治療タンパク質の生成を目的としてトランスジェニックである既存のトリを使用することで卵または胚ドナーが生成され、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばＧａｌＴ、ＳｉａｌＴ）トランス遺伝子をコードするベクターが卵または胚ドナーに導入される。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、哺乳類タンパク質、特にヒトタンパク質上に天然に存在するオリゴ糖構造により酷似する、卵白由来の治療タンパク質内でのオリゴ糖構造の生成を目的としたチキンなどのニワトリの生成に関する。
【００４２】
本発明に従って生成される第一世代のトランスジェニックトリは、典型的にはＧ０世代と称され、通常は各挿入トランス遺伝子に対して半接合である。Ｇ０世代を非トランスジェニックトリと交配させ、完全トランスジェニックＧ１子孫（これもトランス遺伝子に対して半接合である）が生成されうる。Ｇ１半接合子孫を非トランスジェニックトリと交配させ、Ｇ２半接合子孫が生成されうるか、または互いに交配させ、トランス遺伝子に対してホモ接合であるＧ２子孫が生成されうる。トランス遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるＧ０トリの子孫を別のトランス遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるＧ０トリの子孫と交配させ、両トランス遺伝子に対して半接合である子孫が生成されうる。二重の半接合トリを異種交配させ、一方または両方のトランス遺伝子に対してホモ接合であるトリが生成されうる。これらは単に特定の有用な交配スキームの例である。本発明では、例えば当業者に既知の任意の有用な交配スキームの使用が考えられる。
【００４３】
本明細書中に記載の特徴の任意の組み合わせが本発明の範囲内に含まれる。ただし、任意のかかる組み合わせに含まれる特徴は互いに矛盾しない。かかる組み合わせは、本明細書および当業者の知見に基づくことで明白であろう。
[1]  グリコシルトランスフェラーゼコード配列を含むトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリであって、ここで前記トランスジェニックトリの卵管組織は、少なくとも1つの糖を含むＮ−結合オリゴ糖を有するタンパク質を生成し、ここで前記オリゴ糖は前記トランス遺伝子の不在下であれば前記糖を含まない、トランスジェニックトリ。
[2]  前記グリコシルトランスフェラーゼがＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである、[1]のトランスジェニックトリ。
[3]  前記グリコシルトランスフェラーゼがＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ3である、[1]のトランスジェニックトリ。
[4]  前記卵管組織がマグナム組織である、[1]のトランスジェニックトリ。
[5]  前記卵管組織が管状腺細胞を含む、[1]のトランスジェニックトリ。
[6]  前記卵管組織の細胞が卵白の存在下で前記タンパク質を分泌する、[1]のトランスジェニックトリ。
[7]  前記トランス遺伝子がＬＴＲを含む、[1]のトランスジェニックトリ。
[8]  前記トランス遺伝子が卵管に特異的なプロモーターを含む、[1]のトランスジェニックトリ。
[9]  [1]のトランスジェニックトリによって生成される前記タンパク質を単離するステップを含む方法。
[10]  前記タンパク質が前記トリに対して外因性である、[1]のトランスジェニックトリ。
[11]  [10]のトランスジェニックトリによって生成される前記外因性タンパク質を単離するステップを含む方法。
[12]  前記タンパク質が治療タンパク質である、[1]のトランスジェニックトリ。
[13]  前記トリがニワトリである、[1]の方法。
[14]  ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を含むトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリであって、ここで前記トランスジェニックトリの卵管組織は、少なくとも1つのガラクトースを含むＮ−結合オリゴ糖を有するタンパク質を生成し、ここで前記オリゴ糖は前記トランス遺伝子の不在下であれば前記ガラクトースを含まない、トランスジェニックトリ。
[15]  前記グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼタイプ1である、[14]のトランスジェニックトリ。
[16]  前記タンパク質が管状腺細胞内で生成される、[14]のトランスジェニックトリ。
[17]  前記卵管組織の細胞は卵白の存在下で前記タンパク質を分泌する、[14]のトランスジェニックトリ。
[18]  前記オリゴ糖が1〜5個のガラクトースを含む、[14]のトランスジェニックトリ。
[19]  前記トランス遺伝子が、卵管に特異的なプロモーターを含む、[14]のトランスジェニックトリ。
[20]  [14]のトランスジェニックトリによって生成される前記タンパク質を単離するステップを含む方法。
[21]  前記タンパク質が外因性タンパク質である、[14]のトランスジェニックトリ。
[22]  [21]のトランスジェニックトリによって生成される前記外因性タンパク質を単離するステップを含む方法。
[23]  前記タンパク質が治療タンパク質である、[22]の方法。
[24]  前記トリがニワトリである、[22]の方法。
[25]  シアリルトランスフェラーゼコード配列を含むトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリであって、ここで前記トランスジェニックトリの卵管組織は、少なくとも1つのシアル酸を含むＮ−結合オリゴ糖を有するタンパク質を生成し、ここで前記オリゴ糖は前記トランス遺伝子の不在下であれば前記シアル酸を含まない、トランスジェニックトリ。
[26]  前記グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼタイプ1である、[25]のトランスジェニックトリ。
[27]  前記タンパク質は管状腺細胞内で生成される、[25]のトランスジェニックトリ。
[28]  前記卵管組織の細胞が卵白の存在下で前記タンパク質を分泌する、[25]のトランスジェニックトリ。
[29]  前記オリゴ糖が1〜5個のシアル酸を含む、[25]のトランスジェニックトリ。
[30]  前記トランス遺伝子が卵管に特異的なプロモーターを含む、[25]のトランスジェニックトリ。
[31]  [25]のトランスジェニックトリによって生成される前記タンパク質を単離するステップを含む方法。
[32]  前記タンパク質が外因性タンパク質である、[25]のトランスジェニックトリ。
[33]  [32]のトランスジェニックトリによって生成される前記外因性タンパク質を単離するステップを含む方法。
[34]  前記タンパク質が治療タンパク質である、[33]の方法。
[35]  前記トリがニワトリである、[33]の方法。
[36]  トリにおいてタンパク質を生成する方法であって、ここで前記タンパク質は前記トリに対して外因性であり、グリコシルトランスフェラーゼをコードするトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリを生成するステップを含み、ここで前記トリの卵管組織は、第2のトランス遺伝子によってコードされかつガラクトースおよびシアル酸の少なくとも1つを含むＮ−結合オリゴ糖を有する外因性タンパク質を生成し、ここで前記オリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする前記トランス遺伝子の不在下であれば前記ガラクトースおよび／またはシアル酸を含まない、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】天然の卵白タンパク質に結合されるＮ−グリカンの典型的な構造を示す。図１Ａに示されるように、Ｇａｌは場合により末端ＧｌｃＮａｃ残基を占有することが見出され、またβ１，４−結合であるように見られる。天然卵白タンパク質については、Ｇａｌは分岐ＧｌｃＮａｃ上に存在することが検出されていない。さらに、ＧａｌがＮ−結合オリゴ糖上に存在する場合、場合により、まれではあるがシアル酸化されるように見られる。本発明に記載の末端ＧｌｃＮａｃ残基へのＧａｌの付加とともに、他にトランス遺伝子が増強されたグリコシル化の不在下でシアル酸化される場合より多数の末端ＧｌｃＮａｃ残基がシアル酸化される。
【図１Ｂ】本発明による卵白タンパク質に結合されるＮ−グリカンの典型的な構造を示す。本発明によるトリ卵管内に生成されるタンパク質上に存在する典型的なＮ−結合オリゴ糖構造を示す。この典型的な図の非限定的な構造においては、末端ＧｌｃＮａｃ残基のすべて（分岐ＧｌｃＮａｃ以外）がシアル酸化された結合Ｇａｌを有する。
【図２】ニワトリガラクトシルトランスフェラーゼの発現解析を示す。ｍＲＮＡが産卵鶏の培養された線維芽細胞（Ｆ）、マグナム（Ｍ）、肝（Ｌ）および腎（Ｋ）組織から単離され、ノーザンブロット法によって分析された。ブロットがニワトリβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼタイプ１、２および３に相補的な配列でプローブされた。ＲＮＡ分子量マーカーの大体の位置が左側に示される。タイプ１  ｍＲＮＡにおける想定されるサイズは２．２ｋｂである。タイプ１のブロットにおける約４．３ｋｂのバンド、は部分的にプロセシングされたＲＮＡを示しうる。データは、マグナム内でタイプ１の生成がないことを示す。
【図３】ニワトリシアリルトランスフェラーゼ１、３、４および６の発現解析を示す。ｍＲＮＡが産卵鶏の培養された線維芽細胞（Ｆ）、マグナム（Ｍ）、肝（Ｌ）および腎（Ｋ）組織から単離され、ノーザンブロット法によって分析された。ブロットがニワトリ１、３、４および６シアリルトランスフェラーゼに相補的な配列でプローブされた。ＲＮＡ分子量マーカーの大体の位置が左側に示される。データは、マグナム内でタイプ３の発現が低く、場合によりタイプ４の発現が低いことを示す。
【図４】典型的な２つのベクターによる方法の流れ図を示す。ＧａｌＴ１群（ＧａｌＴ１  ｆｌｏｃｋ）は、図６Ａに示されるｐＡＬＶ−ＳＩＮ−１．８−ＯＭ−ＧａｌＴ１トランス遺伝子で生成されうる。ＳｉａｌＴ３群は、図６Ｂに示されるｐＡＬＶ−ＳＩＮ−１．８−ＯＭ−ＳｉａｌＴ３トランス遺伝子で生成されうる。ＥＷは卵白を意味する。Ｓｉａｌはシアル酸を意味する。Ｇａｌはガラクトースを意味する。ＧＳトリは、ＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３の双方におけるトランス遺伝子を有するトリである。Ｇａｌ／ＳｉａｌはＧａｌおよびシアル酸を意味する。ＧＧＳＳトリは、ＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３トランス遺伝子の双方に対してホモ接合であるトリである。「タンパク質生成群」は、治療タンパク質などのオリゴ糖構造が結合されたタンパク質を生成する群であり、その有効性はＧａｌおよび／またはシアル酸のオリゴ糖構造への付加によって高められうる。
【図５】典型的な１つのベクターによる方法の流れ図を示す。群は、図６Ｃに示されるｐＡＬＶ−ＳＩＮ−１．８−ＯＭ−ＧａｌＴ１−ＩＲＥＳ−ＳｉａｌＴ３ベクターで生成される。ＥＷは卵白を意味する。
【図６】図６Ａは、ｐＡＬＶ−ＳＩＮ−１．８−ＯＭ−ＧａｌＴ１ベクターのマップを示す。ベクターのレトロウイルストランス遺伝子部分が示される。簡略化のため、ベクター骨格は示されていない。ニワトリ胚細胞内へのベクターの組込み時、３’ＳＩＮ  ＬＴＲは、トランス遺伝子が不活性化ＬＴＲによって隣接されるように５’ＬＴＲ全体に複製される。図６Ａは、ニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼタイプ１コード配列に作動可能に結合された１．８ｋｂのオボムコイドプロモーターを示す。図６Ｂは、ｐＡＬＶ−ＳＩＮ−１．８−ＯＭ−ＳｉａｌＴ３ベクターのマップを示す。ベクターのレトロウイルストランス遺伝子部分が示される。簡略化のため、ベクター骨格は示されていない。ニワトリ胚細胞内へのベクターの組込み時、３’ＳＩＮ  ＬＴＲは、トランス遺伝子が不活性化ＬＴＲによって隣接されるように５’ＬＴＲ全体に複製される。図６Ｂは、ニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼタイプ３に作動可能に結合された１．８ｋｂのオボムコイドプロモーターを示す。図Ｃは、ｐＡＬＶ−ＳＩＮ−１．８−ＯＭ−ＧａｌＴ１−ＩＲＥＳ−ＳｉａｌＴ３ベクターのマップを示す。ベクターのレトロウイルストランス遺伝子部分が示される。簡略化のため、ベクター骨格は示されていない。ニワトリ胚細胞内へのベクターの組込み時、３’ＳＩＮ  ＬＴＲは、トランス遺伝子が不活性化ＬＴＲによって隣接されるように５’ＬＴＲ全体に複製される。図６Ｃは、１９９０年６月２６日に交付されたUS patent No. 4,937,190に開示された（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）、翻訳エンハンサーなどの２つのコード配列間のＩＲＥＳで、ニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼタイプ１コード配列およびニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３コード配列に作動可能に結合された１．８ｋｂのオボムコイドプロモーターを示す。
【図７】トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリを生成するための一般的方法および時系列を示す。
【図８Ａ】図６Ａ（図９）に示されるベクターを使用してゲノム内に組み込まれたＧａｌＴ１トランス遺伝子を有するトランス遺伝子が増強されたグリコシル化ニワトリにおいて生成される卵白タンパク質のオリゴ糖構造のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を示す。１３の別々の分析を行い、図は実行の１つの典型的な結果を示す。データは、Ｇａｌおよび一部のシアル酸がトランス遺伝子が増強されたグリコシル化の結果として卵白タンパク質上に存在するオリゴ糖構造に付加されたことを示す。記号：●＝マンノース；▲＝フコース；○＝ガラクトース；■＝Ｎ−アセチルグルコサミン；◆＝シアル酸。
【図８Ｂ】他の１２の分析（質量／ｍｚはそれぞれに対して特有である）の１つ以上においても同定された、Ｇａｌおよび／またはシアル酸が付加されたさらなるオリゴ糖構造を示す。データは、Ｇａｌおよび一部のシアル酸がトランス遺伝子が増強されたグリコシル化の結果として卵白タンパク質上に存在するオリゴ糖構造に付加されたことを示す。記号：●＝マンノース；▲＝フコース；○＝ガラクトース；■＝Ｎ−アセチルグルコサミン；◆＝シアル酸。
【図８Ｃ】他の１２の分析（質量／ｍｚはそれぞれに対して特有である）の１つ以上においても同定された、Ｇａｌおよび／またはシアル酸が付加されたさらなるオリゴ糖構造を示す。データは、Ｇａｌおよび一部のシアル酸がトランス遺伝子が増強されたグリコシル化の結果として卵白タンパク質上に存在するオリゴ糖構造に付加されたことを示す。記号：●＝マンノース；▲＝フコース；○＝ガラクトース；■＝Ｎ−アセチルグルコサミン；◆＝シアル酸。
【図８Ｄ】対照試料である。データは、Ｇａｌおよび一部のシアル酸が、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化の結果として卵白タンパク質上に存在するオリゴ糖構造に付加されたことを示す。記号：●＝マンノース；▲＝フコース；○＝ガラクトース；■＝Ｎ−アセチルグルコサミン；◆＝シアル酸。  本発明は、新規オリゴ糖構造を有する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリの卵管内で発現されうるＮ−結合オリゴ糖を有するタンパク質、例えば本願中に開示される場合を含むヒトタンパク質（例えばヒトタンパク質）を含む。
【図９Ａ】（配列番号１）は７４３４ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＧａｌＴ１を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３７０．．５４２；ＬＴＲ−３６４５．．３９９０；ＣＤＳ−２６８．．７３５６；プロモーター４４４１．．６２１４。
【図９Ｂ】（配列番号１）は７４３４ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＧａｌＴ１を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３７０．．５４２；ＬＴＲ−３６４５．．３９９０；ＣＤＳ−２６８．．７３５６；プロモーター４４４１．．６２１４。
【図９Ｃ】（配列番号１）は７４３４ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＧａｌＴ１を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３７０．．５４２；ＬＴＲ−３６４５．．３９９０；ＣＤＳ−２６８．．７３５６；プロモーター４４４１．．６２１４。
【図１０Ａ】（配列番号２）は７５４５ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＳｉａｌＴ３を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３７０．．５４２；ＬＴＲ−３６４５．．３９９０；ＣＤＳ−６３６２．．７５４０；プロモーター４４３１．．６３０９。
【図１０Ｂ】（配列番号２）は７５４５ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＳｉａｌＴ３を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３７０．．５４２；ＬＴＲ−３６４５．．３９９０；ＣＤＳ−６３６２．．７５４０；プロモーター４４３１．．６３０９。
【図１０Ｃ】（配列番号２）は７５４５ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＳｉａｌＴ３を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３７０．．５４２；ＬＴＲ−３６４５．．３９９０；ＣＤＳ−６３６２．．７５４０；プロモーター４４３１．．６３０９。
【図１１Ａ】（配列番号３）は９１１９ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＧａｌＴ１−ＩＲＥＳ−ＳｉａｌＴ３を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３６５３．．３９９８；ＬＴＲ−ヌクレオチド３７８．．５５０；ＣＤＳ−ヌクレオチド７９３０．．９１０８；ＣＤＳ−ヌクレオチド６２７６．．７３６１；プロモーターヌクレオチド４４４９．．６２２２；ＩＲＥＳ７３６２．．．７９２９。次のヌクレオチド置換、すなわち、ｎｔ７９２０  ＴからＧ；ｎｔ７９１８  ＣからＡ；ｎｔ７９１７  ＧからＴ；ｎｔ７８３６  ＧからＡ；ｎｔ７３６６〜７３６８（ＣＣＣ）がＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣ（配列番号３９）で置換のうちの１つ以上がＩＲＥＳによって生成される翻訳産物の量を増加させることになると考えられる。
【図１１Ｂ】（配列番号３）は９１１９ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＧａｌＴ１−ＩＲＥＳ−ＳｉａｌＴ３を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３６５３．．３９９８；ＬＴＲ−ヌクレオチド３７８．．５５０；ＣＤＳ−ヌクレオチド７９３０．．９１０８；ＣＤＳ−ヌクレオチド６２７６．．７３６１；プロモーターヌクレオチド４４４９．．６２２２；ＩＲＥＳ７３６２．．．７９２９。次のヌクレオチド置換、すなわち、ｎｔ７９２０  ＴからＧ；ｎｔ７９１８  ＣからＡ；ｎｔ７９１７  ＧからＴ；ｎｔ７８３６  ＧからＡ；ｎｔ７３６６〜７３６８（ＣＣＣ）がＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣ（配列番号３９）で置換のうちの１つ以上がＩＲＥＳによって生成される翻訳産物の量を増加させることになると考えられる。
【図１１Ｃ】（配列番号３）は９１１９ｂｐ長のｐＳＩＮ−ＯＭ−１．８−ＧａｌＴ１−ＩＲＥＳ−ＳｉａｌＴ３を示す。配列の一部の特徴は次のとおりである。ＬＴＲ−ヌクレオチド３６５３．．３９９８；ＬＴＲ−ヌクレオチド３７８．．５５０；ＣＤＳ−ヌクレオチド７９３０．．９１０８；ＣＤＳ−ヌクレオチド６２７６．．７３６１；プロモーターヌクレオチド４４４９．．６２２２；ＩＲＥＳ７３６２．．．７９２９。次のヌクレオチド置換、すなわち、ｎｔ７９２０  ＴからＧ；ｎｔ７９１８  ＣからＡ；ｎｔ７９１７  ＧからＴ；ｎｔ７８３６  ＧからＡ；ｎｔ７３６６〜７３６８（ＣＣＣ）がＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣ（配列番号３９）で置換のうちの１つ以上がＩＲＥＳによって生成される翻訳産物の量を増加させることになると考えられる。
【図１２Ａ】（配列番号４）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＫＩ）ｍＲＮＡタイプ１−登録番号Ｕ１９８９０を示す。特徴の一部は、５’ＵＴＲ−ヌクレオチド１．．５７；ＣＤＳ−ヌクレオチド５８．．１１４６；３’ＵＴＲ−ヌクレオチド１１４７．．２２７９；ポリＡ＿シグナル−ヌクレオチド２２６０．．２２６５である。
【図１２Ｂ】（配列番号５）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにおけるアミノ酸配列を示す。
【図１３Ａ】（配列番号６）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＫＩＩ）ｍＲＮＡタイプ２−登録番号Ｕ１９８８９を示す。ＣＤＳはヌクレオチド２０２．．１３２３によって示される。
【図１３Ｂ】（配列番号７）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにおけるアミノ酸配列を示す。
【図１４Ａ】（配列番号８）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ３ｍＲＮＡ−登録番号：ＸＭ＿４１６５６４を示す。ＣＤＳはヌクレオチド１．．１０２９によって示される。
【図１４Ｂ】（配列番号９）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ３におけるアミノ酸配列を示す。
【図１５Ａ】（配列番号１０）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ４  ｍＲＮＡ−登録番号ＸＭ＿４１６５６３を示す。ＣＤＳはヌクレオチド２２１．．１２８８によって示される。
【図１５Ｂ】（配列番号１１）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ４におけるアミノ酸配列を示す。
【図１６Ａ】（配列番号１２）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ５  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド１．．１７７３によって示される。
【図１６Ｂ】（配列番号１３）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ５におけるアミノ酸配列を示す。
【図１７Ａ】（配列番号１４）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ６  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド２９４．．１４００によって示される。
【図１７Ｂ】（配列番号１４）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ６  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド２９４．．１４００によって示される。
【図１７Ｃ】（配列番号１５）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ６におけるアミノ酸配列を示す。
【図１８Ａ】（配列番号１６）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ７  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド５７．．１０１６によって示される。
【図１８Ｂ】（配列番号１７）はニワトリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、タイプ７におけるアミノ酸配列を示す。
【図１９Ａ】（配列番号１８）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド１３２．．１１６０によって示される。
【図１９Ｂ】（配列番号１９）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１におけるアミノ酸配列を示す。
【図２０Ａ】（配列番号２０）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド２９０．．１３３９によって示される。
【図２０Ｂ】（配列番号２１）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２におけるアミノ酸配列を示す。
【図２１Ａ】（配列番号２２）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド１．．１１７９によって示される。
【図２１Ｂ】（配列番号２３）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３におけるアミノ酸配列を示す。
【図２１Ｃ】（配列番号２４）は欠失されたアミノ酸配列セグメント（すなわち対応するヌクレオチド配列セグメントが図２１ａに示されるヌクレオチド配列内で欠失された）を有する他のアイソフォームを示す。
【図２２Ａ】（配列番号２５）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド３２５．．１３３２によって示される。
【図２２Ｂ】（配列番号２６）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４におけるアミノ酸配列を示す。
【図２３Ａ】（配列番号２７）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド１２８．．１２３４によって示される。
【図２３Ｂ】（配列番号２８）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５におけるアミノ酸配列を示す。
【図２４Ａ】（配列番号２９）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ６  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド７４０．．１７９８によって示される。
【図２４Ｂ】（配列番号３０）はニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ６におけるアミノ酸配列を示す。
【図２５Ａ】（配列番号３１）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド３５９．．１６００によって示される。
【図２５Ｂ】（配列番号３２）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１におけるアミノ酸配列を示す。
【図２６Ａ】（配列番号３３）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ２  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド１．．１５９０によって示される。
【図２６Ｂ】（配列番号３４）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ２におけるアミノ酸配列を示す。
【図２７Ａ】（配列番号３５）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ４  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチドによって示される。ＣＤＳはヌクレオチド６２．．９３１によって示される。
【図２７Ｂ】（配列番号３６）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ４におけるアミノ酸配列を示す。
【図２８Ａ】（配列番号３７）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ５  ｍＲＮＡを示す。ＣＤＳはヌクレオチド５１．．１１００によって示される。
【図２８Ｂ】（配列番号３８）はニワトリα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ５におけるアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書で使用される定義および略語の一部は次のもの、すなわち、ａａ、アミノ酸；ｂｐ、塩基対；ＣＤＳ、コード配列；ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ＧａｌＮａｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｇａｌ、ガラクトース；ＧｌｃＮａｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；ＩＲＥＳ、内部リボソーム進入部位；ｎｔ、ヌクレオチド；ｋｂ、１０００塩基対；μｇ、マイクログラム；ｍｌ、ミリリットル；ｎｇ、ナノグラム；ｎｔ、ヌクレオチドを含む。
【００４６】
特定の定義は、本明細書中で本発明を説明するのに使用される様々な用語の意味および範囲を例示し、定義するように本明細書中に示される。
【００４７】
本明細書で使用される用語「トリ」は、分類学的クラスａｖａの生物の任意の種、亜種または株を示し、例として限定はされないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、ワシ、カラス、ならびにダチョウ、エミューおよびヒクイドリを含む走鳥類などの生物が挙げられる。同用語は、ガッルス・ガッルス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）またはニワトリ（例えば、ホワイトレグホン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、ブラウンレグホン（Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、バードロック（Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、オーストラロープ（Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ）、ミノルカ（Ｍｉｎｏｒｃａ）、アムロックス（Ａｍｒｏｘ）、カリフォルニアグレイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｇｒａｙ）、イタリアンパートリッジカラード（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ））の様々な既知の株、ならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび一般に商業的量で飼育される他の家禽の株を含む。
【００４８】
語句「に基づく」および「に由来する」は、典型的には全体的または部分的に得られることを意味する。例えば、特定のレトロウイルスに基づくかまたはそれに由来するかあるいは特定のレトロウイルスのヌクレオチド配列に基づくレトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのゲノムが特定のレトロウイルスのゲノムのヌクレオチド配列の実質的部分を有することを意味する。当業者の知識として本明細書の文脈から明らかなように、実質的部分は、ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列などの特定の遺伝子またはヌクレオチド配列あるいはＬＴＲをコードする配列などのウイルスゲノムの他の構造的または機能的ヌクレオチド配列でありうるか、あるいは実質的に完全なレトロウイルスゲノム、例えば、レトロウイルスゲノムの大部分（例えば、６０％超もしくは７０％超もしくは８０％超もしくは９０％超）または全部でありうる。レトロウイルスに基づくかまたはそれに由来するレトロウイルスベクターの例が、Cosset et al, Journal of Virology (1991) vol 65, p 3388-3394に開示される、ＡＬＶレトロウイルスに基づくＮＬレトロウイルスベクター（例えばＮＬＢ）である。
【００４９】
本明細書で使用される用語「コード配列」および「コード領域」は、ＲＮＡ、タンパク質、あるいはＲＮＡまたはタンパク質の任意の部分の合成における遺伝的情報をコードする、ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含むヌクレオチド配列および核酸配列を示す。
【００５０】
本来的に特定の生物のゲノムの一部でないかまたは生物ゲノム内の非天然部位に導入されるヌクレオチド配列は、「外来」ヌクレオチド配列、「異種」ヌクレオチド配列、「組換え」ヌクレオチド配列または「外因性」ヌクレオチド配列と称される。さらに、単離され、次いで生物の同じタイプ（例えば同じ種）に再導入されているヌクレオチド配列は、特定の生物のゲノムの天然部分であるとは考えられず、故に外因性または異種であると考えられる。「異種タンパク質」または「外因性タンパク質」は、外来、異種または外因性ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質でありえ、故に生物の細胞内で天然に発現されない場合が多い。
【００５１】
核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡに関して本明細書で使用される用語「外因性」、「異種」および「外来」は交換可能に使用され、それが存在する染色体、ゲノムまたは細胞の一部として天然に発生しないか、あるいはそれが天然に発生する位置および／または量と異なる位置および／または量で見出される核酸を示す。それは、ゲノム、染色体または細胞に対して内因性でなく、かつ体外からゲノム、染色体または細胞に導入されている核酸でありうる。異種ＤＮＡの例として、限定はされないが、例えばコードされたタンパク質の生成を目的とした目的の遺伝子産物をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡの例として、限定はされないが、追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、治療タンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。用語「異種」および「外因性」は、通常は特定の細胞、組織または生物によって生成される物質において見出されることはないか、あるいは通常は特定の細胞、組織または生物によって生成される物質において、天然に生じることが見出される場合と同じ量または位置で見出されない核酸またはタンパク質などの生体分子を示しうる。例えば、卵に対して異種または外因性であるタンパク質は、通常は卵内に見出されないタンパク質である。
【００５２】
本明細書で使用される用語「コンストラクト」は、天然供給源から単離されているかまたは化学的に合成されているか、あるいはそれらが組み合わされた、ヌクレオチド配列の２つ以上のセグメントから構築されているＤＮＡなどの線状または環状ヌクレオチド配列を示す。
【００５３】
本明細書で使用される用語「相補的」は、互いに特異的相互作用を形成しうる２つの核酸分子を示す。特異的相互作用においては、２つの核酸鎖が反対の極性である場合、核酸の一方の鎖内部のアデニン塩基は、第２の核酸鎖内のチミンと２つの水素結合を形成しうる。また特異的相互作用においては、２つの核酸鎖が反対の極性である場合、核酸の一方の鎖内のグアニン塩基は、第２の核酸鎖内のシトシンと３つの水素結合を形成しうる。本明細書中で参照される相補的核酸は修飾塩基をさらに含む可能性があり、修飾アデニンはチミンまたは修飾チミンと水素結合を形成し、かつ修飾シトシンはグアニンまたは修飾グアニンと水素結合を形成しうる。
【００５４】
本明細書で使用される用語「サイトカイン」は、細胞の機能に作用し、免疫、炎症または造血応答において細胞間の相互作用を調節する分子である任意の分泌アミノ酸配列を示す。サイトカインは、限定はされないが、モノカインおよびリンホカインを、いずれの細胞がそれらを生成するかに無関係に含む。例えば、モノカインは、一般に、単核球、例えばマクロファージおよび／または単球によって生成され、分泌されるものとして参照される。しかし、多数の他の細胞、例えばナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳星状細胞、骨髄間質細胞、表皮角化細胞およびＢリンパ球もまたモノカインを生成する。リンホカインは、一般に、リンパ球細胞によって生成されるものとして参照される。サイトカインの例として、限定はされないが、インターフェロン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「発現される」または「発現」は、コード配列の２本の核酸鎖の一方の領域に対して少なくとも部分的に相補的なＲＮＡ核酸分子を得るためのコード配列の転写を示す。本明細書で使用される用語「発現される」または「発現」はまた、タンパク質またはペプチドを生成するためのＲＮＡの翻訳を示しうる。
【００５６】
本明細書で使用される用語「発現ベクター」は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合される遺伝子発現制御領域、例えばプロモーターまたはプロモーター成分を含む核酸ベクターを示す。
【００５７】
本明細書で使用される用語「断片」は、（例えば化学合成により）人工的に、または、制限エンドヌクレアーゼもしくは機械的せん断を使用して天然産物を複数の断片に切断することにより、または酵素的に、例えばＰＣＲまたは当該技術分野で既知の任意の他の重合技術により、作成されているか、あるいは当業者に既知の組換え核酸技術によって宿主細胞内で発現されている核酸の、例えば少なくとも約１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、５０００、６，０００、８，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００もしくは６０，０００ヌクレオチド長の部分を示しうる。本明細書で使用される用語「断片」はまた、アミノ酸配列の、例えば少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２０００、５０００、６，０００、８，０００もしくは１０，０００個のアミノ酸部分を示す場合があり、ここで同部分は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断により天然アミノ酸配列から切断されるか、あるいは化学的方法または当業者に既知の組換えＤＮＡ技術の使用によって合成される天然アミノ酸配列の一部である（例えば天然アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部から発現される）。「断片」はまた、特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の、例えば約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９９％の部分を示しうる。
【００５８】
「機能的部分」および「機能的断片」は、交換可能に使用可能であり、本明細書中で使用されると、全体の機能を全体的または部分的に実行可能な全体の一部または断片を意味する。例えば、分子の生物学的に機能的な部分は、全体または無傷分子の生物学的機能を実行する分子の一部を意味する。機能的部分は任意の有用なサイズでありうる。例えば、機能的断片はサイズが約２０塩基長〜特定の配列の全長−１ヌクレオチドに等しい長さの範囲でありうる。別の例では、機能的断片はサイズが約５０塩基長〜特定の配列の全長−１ヌクレオチドに等しい長さの範囲でありうる。別の例では、機能的断片はサイズが約５０塩基長〜約２０ｋｂ長の範囲でありうる。別の例では、機能的断片はサイズが約５００塩基長〜約２０ｋｂ長の範囲でありうる。別の例では、機能的断片はサイズが約１ｋｂ長〜約２０ｋｂ長の範囲でありうる。別の例では、機能的断片はサイズが約０．１ｋｂ長〜約１０ｋｂ長の範囲でありうる。別の例では、機能的断片はサイズが約２０ｋｂ塩基長〜約１０ｋｂ長の範囲でありうる。
【００５９】
用語「完全トランスジェニック」は、本質的にすべてのその体細胞内にトランス遺伝子の少なくとも１つのコピーを有するトリなどの動物を示す。
【００６０】
本明細書で使用される用語「遺伝子発現制御領域」は、コード配列に関連し、かつコード配列の発現を全体的または部分的に調節する、例えばコード配列の転写を全体的または部分的に調節するヌクレオチド配列を示す。遺伝子発現制御領域は、天然供給源から単離されうるかまたは化学的に合成可能であり、かつ核酸ベクターに組み込み可能であり、それにより適切な細胞内での転写の調節が可能になる。「遺伝子発現制御領域」は、限定はされないが、ｍＲＮＡに転写されうるコード配列の末端の５’領域内に存在する核酸配列の領域に先行しうる。
【００６１】
本明細書で使用される用語「単離核酸」は、例えば、（ａ）天然ゲノム分子の一部の配列を有するが、それが天然に生じる種のゲノム内の分子のその部分に隣接する配列の少なくとも１つによって隣接されないＤＮＡ；（ｂ）得られるベクターまたはゲノムＤＮＡが、核酸が得られる元となる天然ＤＮＡと同一とはならないような様式で、ベクター、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）もしくは化学合成によって生成される断片、または制限断片などの別々の分子；（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、および（ｅ）天然でないハイブリッド配列の一部である組換えヌクレオチド配列を網羅する。本発明の単離核酸分子は、例えば、天然対立遺伝子変異体、ならびにヌクレオチドの欠失、挿入、逆位、または置換によって修飾される核酸分子を含みうる。
【００６２】
本明細書で使用される用語「核酸」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの任意の線状または連続アレイ、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよびそれらの誘導体を示す。考察を容易にするため、非天然核酸は本明細書中でコンストラクトと称されうる。核酸は、発現、クローニング、コスミドおよび形質転換ベクターを含む細菌プラスミドベクター、例えば動物ウイルスベクター、例えば限定はされないが、修飾アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、例えばトリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなどとそれらの断片を含みうる。さらに、核酸は、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターとそれらの断片のＬＴＲでありうる。核酸はまた、ＮＬＢ、ＮＬＤおよびＮＬＡなどのＮＬベクターとそれらの断片、および化学合成されたＤＮＡまたはＲＮＡなどの合成オリゴヌクレオチドを含みうる。核酸は、修飾または誘導体化ヌクレオチドおよびヌクレオシド、例えば限定はされないがハロゲン化ヌクレオチド、例えば限定はされないが５−ブロモウラシル、ならびにビオチン標識ヌクレオチドなどの誘導体化ヌクレオチドを含みうる。
【００６３】
本明細書で使用される用語「ベクター」および「核酸ベクター」は、細胞に形質移入または形質転換され、宿主細胞ゲノムとは無関係にまたはその内部で複製しうる天然または合成の一本鎖または二本鎖のプラスミドまたはウイルス核酸分子を示す。環状二本鎖ベクターは、ベクターのヌクレオチド配列に基づく適切な制限酵素による処理によって線形化されうる。核酸は、当該技術分野で理解されるように、ベクターを制限酵素で切断し、所望される断片を互いにライゲートすることによってベクターに挿入されうる。
【００６４】
用語「作動可能に結合される」は、そのように記載される成分が、その通常の機能を発揮するように構成される要素の配列を示す。コード配列に作動可能に結合される遺伝子発現制御領域またはプロモーター（例えばプロモーター成分）は、コード配列の発現を達成しうる。制御配列は、コード配列の発現を誘導するように機能する限り、それと隣接する必要はない。したがって、例えば、未翻訳であるが転写された配列への介在がプロモーター配列とコード配列の間に存在し、かつプロモーター配列はやはりコード配列に「作動可能に結合される」と考えられうる。
【００６５】
用語「卵管」または「卵管組織」は、トリ卵管の組織、例えばマグナム、例えば管状腺細胞を示し、ここでは、肝組織または腎組織などのトリの他の組織内で生成されるタンパク質の量に対して実質的に量が減少したＧａｌおよび／またはシアル酸を有するＮ−結合オリゴ糖を有するタンパク質が生成される。
【００６６】
本明細書で使用される用語「卵管に特異的なプロモーター」は、機能的である、すなわちトリの卵管細胞内で大幅に、例えば第一に（すなわち動物において特定のプロモータータイプによって生成される転写産物の５０％超が卵管細胞内で生成されている）または排他的にコード配列の転写をもたらすプロモーターおよびプロモーター成分を示す。卵管に特異的なプロモーターの例として、オバルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボインヒビタープロモーター、リゾチームプロモーターおよびオボトランスフェリンプロモーターおよびこれらのプロモーターの機能的部分、例えばプロモーター成分が挙げられる。ＧａｌＴ（例えばＧａｌＴ１）およびＳｉａｌＴ（例えばＳｉａｌＴ３）などのグリコシル化酵素は、通常はＥＲ／ゴルジオルガネラに特異的であり、Ｎ−グリカン合成経路に関与する。卵管に特異的なプロモーターを使用したマグナムに対するこれらの酵素の発現の制限により、トリの他の組織内でのこれらの酵素の発現の結果としてのトリに対する有害な生理的効果は最小化される。
【００６７】
用語「パーセント配列同一性」、「パーセント同一性」、「％同一性」、「パーセント配列相同性」、「パーセント相同性」、「％相同性」および「パーセント配列類似性」はそれぞれ、２つの核酸配列の間または２つのアミノ酸配列の間での配列マッチングの程度を示しうる。かかる配列マッチングは、Karlin & Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264-2268のアルゴリズム（Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-5877などで改良）を使用して判定されうる。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) T. Mol. Biol. Q15: 403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行することで、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することで、参照アミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が得られる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が使用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用される。限定はされないが、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列比較のためのプログラムを含むＵ．Ｋ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＣｅｎｔｒｅのＧＣＧ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅなどの他のアルゴリズム、プログラムおよびデフォルト設定もまた適切でありうる。
【００６８】
用語「家禽に由来する」は、家禽によって生成されるかまたはそれから得られる組成物または物質を示す。「家禽」は、限定はされないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラおよび走鳥類を含む、家畜として飼われうるトリを示す。例えば、「家禽に由来する」は、ニワトリに由来する、シチメンチョウに由来するおよび／またはウズラに由来することを示しうる。用語「トリに由来する」は、トリによって生成されるかまたはそれから得られる組成物または物質を示す。
【００６９】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」は本明細書中で交換可能に使用可能であり、限定はされないがコード配列、すなわちポリヌクレオチドまたは核酸配列を含み、それらは、適切な調節または制御配列；制御配列、例えば翻訳開始および停止コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサー、転写因子が結合し、遺伝子のプロモーターの活性を正に（誘発）または負に（抑制）改変するＤＮＡ配列などの制御下に置かれる場合、インビトロまたはインビボで転写され、ポリペプチドに翻訳される。本明細書中に記載の用語から、長さまたは合成起点に関して全く制限がないことが示唆される。
【００７０】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合を介して連続アレイで結合されるアミノ酸のポリマー、例えば３個以上のアミノ酸を示す。用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどを含む。用語「ポリペプチド」は、核酸によってコードされるか、組換え技術によって生成される（例えばトランスジェニックトリから単離される）か、または合成される、上で定義されたポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」では、化学修飾アミノ酸または標識リガンドに共有結合または非共有結合されたアミノ酸を含む、上で定義されたポリペプチドがさらに考えられる。
【００７１】
本明細書で使用される用語「プロモーター」は、トリ細胞内でＲＮＡポリメラーゼによって転写を開始するのに有用なＤＮＡ配列を示す。「プロモーター成分」は、単独でかまたは他のＤＮＡ配列と相まって転写を有効にするかまたは促進しうるＤＮＡ配列である。プロモーター成分はプロモーターの機能的断片でありうる。例えば、オボムコイドプロモーター成分は、限定はされないが、２００７年５月１７日に公開されたUS application No. 11/649,543（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に開示される、約１．８ｋｂ、約３．９ｋｂおよび約１０ｋｂのオボムコイドプロモーターを含む。「プロモーター成分」はまた、ＲＮＡ転写を開始するように機能する再配列された遺伝子発現制御領域、ならびにＲＮＡ転写を開始するように機能する天然ＤＮＡ配列および／または合成ＤＮＡ配列からなるハイブリッドＤＮＡ分子を包含しうる。
【００７２】
本明細書で使用される用語「組換え核酸」および「組換えＤＮＡ」は、真核または原核細胞内に天然に見出されない少なくとも２つの核酸配列の組み合わせを示す。核酸配列は、限定はされないが、核酸ベクター、遺伝子発現調節因子、複製の起点、発現される場合に抗生物質耐性を付与する適切な遺伝子配列、タンパク質コード配列などを含みうる。用語「組換えポリペプチド」は、その位置、純度または構造のいずれかにおいて天然ポリペプチドと異なるように組換えＤＮＡ技術によって生成されるポリペプチドを含むように意味する。一般に、かかる組換えポリペプチドは、天然に通常観察される量とは異なる量で細胞内に存在することになる。
【００７３】
本明細書で使用される用語「調節」配列または因子は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、停止コドン、および遺伝子発現を制御可能な他の因子を含む。
【００７４】
「レトロウイルス」、「レトロウイルス粒子」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）粒子」、または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）粒子」は、非ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に形質導入可能な複製欠損または複製コンピテント（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルスを示す。
【００７５】
「ＳＩＮベクター」は自己不活性化ベクターである。特に、ＳＩＮベクターは、標的細胞（例えばトリ胚細胞）のゲノムＤＮＡへの組込み時、組込みレトロウイルスベクターの５’ＬＴＲがプロモーターとして機能しないように改変されたゲノムを有するレトロウイルスベクターである。例えば、レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲのＵ３領域をもたらすレトロウイルスベクターのヌクレオチド配列の一部または全部は、一旦組み込まれると、５’ＬＴＲのプロモーター活性を低減または除去するように欠失または改変されうる。特定の例では、当該技術分野で理解されているように、５’ＬＴＲのＵ３からのＣＡＡＴボックスおよび／またはＴＡＡＴＡボックスの欠失はＳＩＮベクターをもたらしうる。
【００７６】
本明細書で使用される用語「センス鎖」は、ＲＮＡに転写されかつ遺伝子の天然ポリペプチド産物に翻訳されうるゲノムＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡ分子を示す。本明細書で使用される用語「アンチセンス鎖」は、遺伝子のセンス鎖に相補的なゲノムＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ分子を示す。
【００７７】
「治療タンパク質」または「医薬タンパク質」は全体的または部分的に薬剤を構成する物質である。特に、「治療タンパク質」および「医薬タンパク質」は、全体的または部分的に薬剤を構成するアミノ酸配列を含む。
【００７８】
本明細書で使用される用語「転写調節配列」および「プロモーター成分」は、コード配列の転写発現を調節するヌクレオチドを示す。典型的な転写調節配列は、エンハンサー因子、ホルモン応答因子、ステロイド応答因子、負の調節因子などを含む。「転写調節配列」を単離し、ベクターに組み込むことで、ベクターＤＮＡの一部の適切な細胞内での転写の調節が可能になりうる。「転写調節配列」は、限定はされないが、ｍＲＮＡに転写されるタンパク質コード配列の末端の５’領域内にある核酸配列の領域に先行しうる。転写調節配列はまた、タンパク質コード領域内部、例えば「イントロン」領域として同定される遺伝子の領域内に位置しうる。
【００７９】
本明細書で使用される用語「形質転換」および「形質移入」は、核酸を宿主に挿入するプロセスを示す。核酸の原核生物または真核生物への形質転換または形質移入を促進するための多数の技術が当業者に周知である。これらの方法は、例えば、細胞を特定の濃度の塩、例えば限定はされないがカルシウム塩またはマグネシウム塩で処理するか、または細胞を電場、デタージェント、またはリポソーム材料に暴露し、宿主細胞に核酸分子の取込み能を付与するといった種々の技術を含む。
【００８０】
本明細書で使用される「トランスジェニック動物」は任意の非ヒト動物、例えばニワトリを含むトリ種であり、そこでは動物の１つ以上の細胞が、ヒトの介入により、例えば、本明細書で開示される場合を含む当該技術分野で既知のトランスジェニック技術（例えば２００７年１０月１８日に公開されたUS patent publication No. 2007/0243165（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）を参照）により導入される異種核酸を有する。核酸は、意図的な遺伝子操作による、例えばマイクロインジェクションまたは組換えウイルスでの感染による細胞（例えば卵または胚細胞）への導入により、直接的または間接的に動物に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な交配、または体外受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を対象とする。この分子は染色体内部に組み込まれうるか、またはそれは染色体外複製ＤＮＡでありうる。典型的なトランスジェニック動物では、トランス遺伝子は、細胞における組換え形態の標的タンパク質またはポリペプチドの発現を引き起こしうる。用語「キメラ動物」または「モザイク動物」は、本明細書中で、動物の一部であって全部でない細胞内で、トランス遺伝子が見出されるかまたは組換えヌクレオチド配列が発現される動物を示すように使用される。生殖系列キメラ動物は、その胚細胞内にトランス遺伝子を有し、子孫の大部分またはすべての細胞がトランス遺伝子を有する子孫トランスジェニック動物を発生させうる。
【００８１】
本明細書で使用される用語「トランス遺伝子」は、それが導入される動物または細胞に対し、部分的または全体的に異種すなわち外来であるか、あるいは、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子に対し、部分的または全体的に相同である（例えばヒトタンパク質をコードする）核酸配列を示すが、動物または細胞ゲノムに、それが導入される生物のゲノムを改変するような方法で挿入されるように設計されるかまたは挿入される（例えば、それは天然遺伝子の位置と異なる位置に挿入されるかまたはその挿入はノックアウトをもたらす）。
【００８２】
本発明の核酸およびタンパク質を単離し、特徴づけるのに有用な技術は当業者に周知であり、標準の分子生物学および生化学マニュアルで調べることで必要以上の実験と伴わない使用のための適切なプロトコルを選択できる。例えば、 Sambrook et al, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harborを参照のこと（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
【００８３】
卵管内で発現され、分泌される外因性治療タンパク質および内因性卵白タンパク質の双方は、Ｇａｌおよびシアル酸が欠落したＮ−グリカン構造を有する。これが卵白タンパク質の糖修飾に関与するグリコシル化酵素経路の結果であることが発見されている。
【００８４】
今日まで、エリスロポエチン、インターフェロンαおよびＧ−ＣＳＦを含む、トランスジェニックニワトリの卵白内に貯蔵される複数のタンパク質が生成されている。トリに由来するＧ−ＣＳＦおよびトリに由来するインターフェロンαはいずれも、Ｏ−グリカンのみを有し、Ｎ−グリカンを有しないタンパク質である。これら２つのタンパク質のＯ−グリカン構造の一部は、高い割合で完全に合成された同構造を有するヒトＯ−グリカンに類似する（Rapp, et al. Transgenic Res 12: 569-75., 2003）。さらに、これらのタンパク質は、患者において高い安定性とともに高い有効性および低い免疫応答を有することが示されており、それらのすべては適切なＯ−結合グリコシル化を有するタンパク質であることが想定される（Patel, et al. Int J Clin Pharmacol Ther 45: 161-8, 2007）。
【００８５】
ヒトエリスロポエチンなどのＮ−グリカンで修飾される、ニワトリ卵管内で発現されるタンパク質のグリコシル化は分析されている。例えば、２００７年１０月１０日に出願されたUS patent application No. 11/973,853を参照のこと（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）。基本的Ｎ−結合構造は、ヒトの構造に対してある程度の類似性を有するが、いくつかの相違点も存在する。例えば、ヒトＮ−グリカンのほとんどの場合、フコースがアスパラギンに結合されたＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）残基に結合される。卵管内で生成される卵白タンパク質および組換えタンパク質においては、このフコースは典型的には大量に存在しない。ヒトＮ−グリカンは、典型的には、全部もしくは大部分の末端位置でシアル酸において終結し、それはＧｌｃＮａｃに結合されたガラクトース（Ｇａｌ）に結合されている。卵管、すなわちマグナム（例えば管状腺細胞）内で生成されるニワトリ卵白タンパク質および外因性タンパク質の場合、Ｎ−グリカンにおいてシアル酸はほとんど存在しないかまたは全く存在しない。さらに、典型的には、トランスジェニックトリに由来する外因性タンパク質において特徴づけられているＮ−グリカン構造内の末端糖にはＧａｌ残基がほとんど存在しない（図８Ａ）。したがって、ニワトリ卵管によって生成され、分泌される卵白タンパク質および外因性タンパク質のＮ−グリカンにおける末端位置の大部分はＧｌｃＮａｃによって占有される。
【００８６】
本発明者はまた、ヒトにおける特定の組織または細胞種内で見出される構造であるβ１，４−結合マンノースに分岐ＧｌｃＮａｃを認めている。分岐ＧｌｃＮａｃは抗体のＡＤＣＣ活性を高めると考えられる。一実施形態では、本発明のトランスジェニックトリは、卵管に特異的なプロモーターに結合され、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３におけるコード配列を有するトランス遺伝子を有することで、卵管内で生成されるタンパク質（例えば抗体などの外因性タンパク質）のＮ−結合オリゴ糖構造に追加的な分岐ＧｌｃＮａｃがもたらされる。
【００８７】
卵管内で生成され、分泌される外因性および内因性（例えば、オバルブミン、オボムコイド）タンパク質上に存在するＮ−グリカンは、本質的に図１Ａに示される基本的構造を有し、（Yamashita, et al. J Biol Chem 257: 12809-14, 1982; Harvey, et al. J Am Soc Mass Spectrom 11: 564-71, 2000; Lattova, et al. J Am Soc Mass Spectrom 15: 725-35, 2004）および２００７年１０月１０日に出願されたUS patent application No. 11/973,853を参照のこと。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、グリコシル化の欠如を、グリコシルトランスフェラーゼ（その発現はマグナム、例えばＴＧＣ（管状腺細胞）内で欠如している）を発現することになるトリゲノムトランス遺伝子への導入によって訂正することに関する。Ｎ−グリカンを有する内因性卵白タンパク質、例えばオバルブミンおよびオボムコイドは、トランスジェニックニワトリの卵から収穫され、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化群をもたらす末端シアル酸および／または末端Ｇａｌおよび／または末端から２番目のＧａｌの存在について評価されうる。
【００８９】
トランス遺伝子が増強されたグリコシル化群は、複数の用途を有することになる。例えば、ある群を、治療タンパク質を生成する既存の群に交配可能であり、その有効性は、シアリル化Ｎ−グリカン構造の数の増加によって高められうる。別の用途では、トランスジェニック群を使用し、卵管内、例えば、マグナム組織内で発現される外因性タンパク質におけるコード配列を有するトランス遺伝子を有する全体的に新しい生成群が生成されうる。すなわち、外因性（例えば治療）タンパク質のトランス遺伝子は、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化群に導入される。
【００９０】
ニワトリβ１，４  ＧａｌＴタイプ１および２は、過去にニワトリ肝腫瘍ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって同定された（Shaper, N. L., J. A. Meurer, et al. (1997) J Biol Chem 272(50): 31389-99）。公表されたニワトリゲノム配列の分析を通じ、本発明者は、ヒト、マウス、およびハムスターを含む他の種において特徴づけられているβ１，４  ＧａｌＴファミリーの５つのメンバーに対応する、ニワトリゲノムにおける５つのさらなるＧａｌＴ（例えばβ  １，４  ＧａｌＴタイプ３〜７）を同定している。
【００９１】
マグナム組織を含む数種の組織内での７つのニワトリＧａｌＴの発現は、ノーザン分析によって分析されている。図２に示されるように、ＧａｌＴ１の発現はマグナム内でほとんど検出不能であることが見出された一方、それは培養されたニワトリ線維芽細胞内ならびに肝組織および腎組織内で検出可能なレベルで発現された。タイプ６の発現もまたマグナム組織内で検出できなかった。タイプ２〜５および７はすべて、マグナム組織内で発現されることが見出された。
【００９２】
ＧａｌＴ１が種々の組織内で偏在的に発現されると考えられていることから、ＧａｌＴ１の発現の欠如は驚くべき結果である（Hennet. Cell Mol Life Sci 59: 1081-95, 2002）。他の試験ではＧａｌＴ１が多数のニワトリ組織内で発現されることが示されたが、それら試験においてマグナム組織での発現は評価されなかった（Shaper, Meurer, Joziasse, Chou, Smith, Schnaar and Shaper. J Biol Chem 272: 31389-99, 1997）。
【００９３】
本発明者は、マグナム内でのＧａｌＴ１の発現の欠如がＮ−結合Ｇａｌの欠如に関与することを見出している。ＧａｌＴ６の発現もまた、ニワトリのマグナム内に不在である。しかし、ＧａｌＴ６は、主として糖脂質ラクトシルセラミドの合成におけるステップであるＧａｌのグルコース−セラミドへの付加に関与するが（Guo, et al. Glycobiology 11: 813-20, 2001）、典型的にはニワトリにおいて生成される他のタンパク質へのＧａｌの付加に関与しないと考えられる。
【００９４】
したがって、これらの発見を考慮すると、実施例に開示のように、卵管組織内で生成されるタンパク質のＮ−結合オリゴ糖へのＧａｌの付加をもたらす卵管内で機能しうるプロモーターに作動可能に結合されたＧａｌＴ１におけるコード配列を有するトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリを生成することが本発明の目的である。さらに、想定されるとおり、これらのＧａｌＴ１トリはまた、タンパク質のＮ−結合オリゴ糖への一部のシアル酸の付加をもたらす。
【００９５】
ＧａｌＴ１の発現は、シアル酸に対する結合点として作用しうるマグナム内で生成されるＮ−結合オリゴ糖へのＧａｌの付加をもたらす。図８で明らかなように、さらなるシアル酸が、通常のトリに対してＧａｌＴ１トリのマグナム内で生成されるタンパク質のＮ−結合オリゴ糖構造に付加される。
【００９６】
また、本発明によると、ＳｉａｌＴファミリーのメンバーの発現の欠如が、ＧａｌＴ１トリの場合より多いＮ−結合オリゴ糖のシアル酸化を可能にする、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリを提供するように補われうると考えられる。
【００９７】
本発明者は、最近配列決定されたニワトリゲノムについて分析し、α２，３  ＳｉａｌＴファミリーには全部で６つのメンバーが存在することを見出している。ノーザンブロット法によるＳｉａｌＴの発現の分析についても実施されている。マグナム内でのＳｉａｌＴ１の発現（図３）は極めて高い一方、ＳｉａｌＴ２の発現は低く、これは、卵白タンパク質中に見出されるＯ−グリカン中のＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ鎖が大部分シアリル化される（一方で、Ｎ−グリカン上にほとんど存在しないＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ鎖は結合されたシアル酸をほとんど有しない）ことから、ＳｉａｌＴ１が卵白Ｏ−グリカン合成において大きな役割を有することを示唆している。マグナム内でのＳｉａｌＴ３の発現は検出可能であるが、ニワトリ線維芽細胞、腎臓および肝臓の場合に対してかなり低い（図３）。ＳｉａｌＴ３の合成が腎臓および肝臓においてかなり盛んであり、かつこれらの器官から生じるＮ−グリカンが高頻度にシアリル化されるという事実（Ito, Takegawa, Deguchi, Nagai, Nakagawa, Shinohara and Nishimura. Rapid Commun Mass Spectrom 20: 3557-65, 2006; Deguchi, et al. Rapid Commun Mass Spectrom 20: 741-6, 2006; Sasaki, et al. J Biol Chem 262: 12059-76, 1987）は、ＳｉａｌＴ３がニワトリにおけるＮ−グリカンのシアリル化において有意な役割を有しうることを示す。ＳｉａｌＴ４についてはニワトリ線維芽細胞内では弱いシグナル、またマグナムおよび腎臓内ではさらに弱いシグナルが検出された。試験された組織内でのＳｉａｌＴ４の低い発現は、ＳｉａｌＴ４が有しうるニワトリＮ−グリカンのシアリル化における役割がより小さいことを示唆する。マグナムおよび腎臓におけるＳｉａｌＴ６の発現は比較的高く、ニワトリ線維芽細胞および肝臓において検出不能である。
【００９８】
したがって、本発明によると、卵管組織内、例えばマグナム組織内で１つ以上の組換えまたは外因性ＳｉａｌＴコード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。一実施形態では、マグナム組織内（例えば管状腺細胞内）で外因性ＳｉａｌＴコード配列を発現するトランスジェニックトリ、例えばトランスジェニックニワトリ、すなわち組換えトリ、例えばニワトリのＳｉａｌＴをコードするヌクレオチド配列が考えられる。一実施形態では、外因性ＳｉａｌＴ１コード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。一実施形態では、外因性ＳｉａｌＴ２コード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。一実施形態では、外因性ＳｉａｌＴ３コード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。一実施形態では、外因性ＳｉａｌＴ４コード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。一実施形態では、外因性ＳｉａｌＴ５コード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。一実施形態では、外因性ＳｉａｌＴ６コード配列を発現するトランスジェニックトリが考えられる。
【００９９】
特に有用な一実施形態では、マグナム組織内（例えば管状腺細胞内）でＳｉａｌＴ３コード配列を発現するニワトリなどのトランスジェニックトリが生成される。
【０１００】
一実施形態では、卵管内で１種以上のＧａｌＴの発現をもたらす１種以上のトランス遺伝子、および卵管内で１種以上のＳｉａｌＴの発現をもたらす１種以上のトランス遺伝子を有する、トランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリが本発明に従って生成される。特に有用であるが非限定的な例では、卵管内でＧａｌＴ１の発現をもたらすトランス遺伝子および卵管内でＳｉａｌＴ３の発現をもたらすトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリが本発明に従って生成される。別の非限定例では、卵管内でＧａｌＴ１の発現をもたらすトランス遺伝子および卵管内でＳｉａｌＴ３の発現をもたらすトランス遺伝子および卵管内でＳｉａｌＴ４の発現をもたらすトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリが本発明に従って生成される。別の非限定例では、卵管内でＧａｌＴ１の発現をもたらすトランス遺伝子および卵管内でＧａｌＴ６の発現をもたらすトランス遺伝子および卵管内でＳｉａｌＴ３の発現をもたらすトランス遺伝子および卵管内でＳｉａｌＴ４の発現をもたらすトランス遺伝子を有するトランスジェニックトリが本発明に従って生成される。
【０１０１】
トリゲノムにおける２つ以上（例えば、２つ、３つまたは４つもしくはそれ以上）の外因性ヌクレオチド配列の発現に有用な多数の方法は当業者にとって明らかである。例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する単一の転写産物を使用する１つのかかる方法が実施例６に記載される。別の例では、第１の所望されるトランス遺伝子を有する完全トランスジェニックトリ（すなわちＧ１トランスジェニックまたはＧ１トランスジェニックの子孫）は、標準的方法を用いてそのゲノム内に導入される第２のトランス遺伝子を有しうる。すなわち、トランス遺伝子は、第１のトランス遺伝子の場合と本質的に同じ方法で完全トランスジェニックトリに導入されうる。別の例では、当該技術分野で理解されるように、完全トランスジェニックトリは、所望されるトランス遺伝子を有する第２の完全トランスジェニックトリに交配されうる。これらのプロセスを繰り返すことで、所望される数のトランス遺伝子がゲノムに導入されうる。
【０１０２】
本発明による使用において、本明細書中に開示されるＩＲＥＳを含む任意の有用なＩＲＥＳおよび任意の他の有用なＩＲＥＳ（例えば口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、例えばBelsham and Brangwyn (1990) J of Virology, vol 64, p 5389-5395）が考えられる。
【０１０３】
例えば２００７年８月２日に公開されたUS patent publication No. 2007/0180546；２００７年４月５日に公開されたUS patent publication No. 2007/0077650、および２００８年３月１３日に公開されたUS patent publication No. 2008/0064862（これら３つの特許出願の各々の開示はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）において開示される方法を含む任意の有用な方法を用い、本発明のトランス遺伝子がトリゲノムに導入されうる。１つの検討事項が、これらの引用される文書中に開示される方法に従って生成されるタンパク質が、卵白に分泌されるようにシグナル配列によって生成された一方、本発明に従って生成されるグリコシルトランスフェラーゼが細胞から分泌されることがなく、それ故に典型的にはシグナル配列を含むことがないという点である。
【０１０４】
本発明によって有用になりうる任意の遺伝子発現制御領域（例えばプロモーター）が本発明による使用として考えられる。例えば、トリ卵管内で機能することが示されているＣＭＶおよびβ−アクチンなどの構成プロモーターが使用されうる。例えば、２００６年１月１９日に公開されたUS patent publication No. 2006/0015960および２００６年６月２９日に公開された2006/0143725を参照のこと。これら２つの特許出願の各々の開示はその全体が参照により本明細書中に援用される。特に有用な一実施形態では、プロモーターは、オボムコイドプロモーター、オバルブミンプロモーター、およびリゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムシンプロモーター、オボトランスフェリンプロモーターなどの卵管内で第一にまたは排他的に発現されるプロモーターである。例えば、２００５年８月１１日に公開されたUS patent publication No. 2005/0176047；２００７年２月１３日に交付されたUS Patent No. 7,176,300；２００７年５月３１日に公開されたUS patent publication No. 2007/0124829；および２００６年６月１５日に公開されたUS patent publication No. 2006/0130170を参照のこと。これら３つの特許出願および１つの交付済み特許の各々の開示はその全体が参照により本明細書中に援用される。かかるプロモーターは、トランスジェニックトリの健康または生存に対して問題でありうるトリの卵管組織以外の組織内でのグリコシルトランスフェラーゼの過剰発現を回避するのに有用でありうる。本発明において有用な他のプロモーターとして、例えば限定はされないが、ＭＤＯＴプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターおよびＳＶ４０プロモーター、ならびにこれらのプロモーターの各々の機能的部分が挙げられる。本発明において有用でありうる他のプロモーターとして、限定はされないが、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、タイプ１、タイプ２およびタイプ３  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、例えばＨ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、リボヌクレアーゼＭＰＲプロモーターおよびこれらのプロモーターの各々の機能的部分が挙げられる。典型的には、当該技術分野で理解されるように、機能的ターミネーター配列が、使用されるプロモーターに応じて本発明での使用において選択される。
【０１０５】
有用な一実施形態では、本質的に２００７年５月１７日に公開されたUS patent publication No. 2007/0113299（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）中に開示される１．８ｋｂのオボムコイドプロモーターが使用される。１．８ｋｂのＯＭプロモーターは、実施例３に見られるマグナム細胞内でのＧａｌＴコード配列の有用な発現をもたらしている。１．８ｋｂのオボムコイドプロモーターの制御下での卵管内での生成については、他のグリコシル化酵素が考えられる。
【０１０６】
本発明のトランス遺伝子が増強されたグリコシル化トリにおける生成について考えられるタンパク質は、具体的には、限定はされないが１つ以上のＮ−結合オリゴ糖構造を有するヒトタンパク質を含む治療タンパク質を含む。かかるタンパク質は、限定はされないが、次のタンパク質、例えば、適用可能な場合、そのヒトタンパク質相当物、すなわち、融合タンパク質、生長ホルモン、サイトカイン、構造タンパク質および酵素、例えば、ヒト生長ホルモン、インターフェロン、リゾチーム、およびβ−カゼイン、アルブミン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、因子ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ（など）、フィブリノーゲン、インスリン、ラクトフェリン、プロテインＣ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ソマトトロピン、およびキモトリプシン、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、βガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）；アガルシダーゼα（Ｒｅｐｌａｇａｌ）、アガルシダーゼβ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）またはαガラクトシダーゼＡ；α−グルコシダーゼ；酸スフィンゴミエリナーゼ（ｒｈＡＳＭ）；ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）；修飾免疫グロブリンおよび抗体、例えばヒト腫瘍細胞上の表面抗原に結合しうる免疫毒素、ｂ−ドメイン欠損因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、抗凝固剤；ヒルジン、アルテプラーゼ、ｔｐａ、レテプラーゼ、ｔｐａ、ｔｐａ（５つのうち３つのドメインが欠損）、インスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、長期作用型インスリンアナログ、ｈｇｈ、グルカゴン、ｔｓｈ、ホリトロピン−β、ｆｓｈ、ｇｍ−ｃｓｆ、ｐｄｇｈ、ｉｆｎα２、ｉｆｎα２ａ、ｉｆｎα２ｂ、ｉｎｆ−α、ｉｎｆ−β１ｂ、ｉｆｎ−β１ａ、ｉｆｎ−γ１ｂ、ｉｌ−２、ｉｌ−１１、ｈｂｓａｇ、ｏｓｐａ、ｔ−リンパ球抗原に特異的なｍａｂ、ｔａｇ−７２に特異的なｍａｂ、腫瘍関連糖タンパク質、血小板表面受容体ｇｐＩＩ（ｂ）／ＩＩＩ（ａ）に特異的なキメラｍａｂに由来するｆａｂ断片、腫瘍関連抗原ｃａ１２５に特異的なｍａｂもしくはｍａｂ断片、ヒト癌胎児抗原ｃｅａに特異的なｍａｂもしくはｍａｂ断片、ヒト心筋ミオシンに特異的なｍａｂもしくはｍａｂ断片、腫瘍表面抗原ｐｓｍａに特異的なｍａｂもしくはｍａｂ断片、ｈｍｗ−ｍａａに特異的なｍａｂ断片（ｆａｂ／ｆａｂ２ミックス）、癌関連抗原に特異的なｍａｂもしくはｍａｂ断片（ｆａｂ）、表面顆粒球非特異的交差反応抗原ｎｃａ  ９０に特異的なｍａｂ断片（ｆａｂ）、Ｂリンパ球の表面上に見出されるｃｄ２０抗原に特異的なキメラｍａｂ、ｉｌ２受容体のα鎖に特異的なヒト化ｍａｂ、ｉｌ２受容体のα鎖に特異的なキメラｍａｂ、ＴＮＦ−αに特異的なキメラｍａｂ、呼吸器多核体ウイルスの表面上のエピトープに特異的なヒト化ｍａｂ、ｈｅｒ  ２（ヒト表皮成長因子受容体２）に特異的なヒト化ｍａｂ、サイトケラチン腫瘍関連抗原抗−ｃｔｌａ４に特異的なヒトｍａｂ、Ｂリンパ球ドルナーゼ−α  ｄｎａｓｅのｃｄ２０表面抗原に特異的なキ���ラｍａｂ、βグルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ−α、ｉｌ−２−ジフテリア毒素融合タンパク質、ｔｎｆｒ−ｌｇｇ断片融合タンパク質ラロニダーゼ、ＤＮＡアーゼ、ｍａｂ、アレファセプト、トシツモマブ、アレムツズマブ、ラスブリカーゼ、アガルシダーゼβ、テリパラチド、副甲状腺ホルモン誘導体、アダリムマブ（ｌｇｇ１）、アナキンラ、生物学的修飾因子、ネシリチド、ヒトｂ−型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｂｎｐ）、コロニー刺激因子、ペグビソマント、ヒト生長ホルモン受容体アンタゴニスト、組換え型活性化プロテインｃ、オマリズマブ、免疫グロブリンｅ（ｌｇｅ）ブロッカー、イブリツモマブチウキセタン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、エタネルセプト、制尿ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、免疫グロブリンを含む多量体タンパク質、例えば抗体、およびその抗原結合断片、可変領域もしくはその変異体を含む免疫グロブリン重鎖ポリペプチド（Ｄ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、もしくはそれらの組み合わせを含みうる）；可変領域もしくはその変異体を含む免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド（Ｊ領域およびＣ領域を含みうる）；免疫グロブリン重鎖可変領域、免疫グロブリン軽鎖可変領域、およびリンカーペプチドを含むことで、抗原に選択的に結合可能な単鎖抗体を形成する、少なくとも１つの発現ベクターによってコードされる免疫グロブリンポリペプチド；転移性乳癌を有する患者の治療のためのヒト化抗−ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＣＡ）；血餅形成の予防のための血小板上の抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体であるＲＥＯＰＲＯ（商標）（アブシキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；急性腎同種移植片拒絶の予防のための免疫抑制性ヒト化抗−ＣＤ２５モノクローナル抗体であるＺＥＮＡＰＡＸ（商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；抗−ｌ７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体であるＰＡＮＯＲＥＸ（商標）（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；マウス抗−イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体であるＢＥＣ２（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；キメラ抗−ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体であるＩＭＣ−Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；ヒト化抗−αＶβ３インテグリン抗体であるＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；Ｃａｍｐａｔｈ；ヒト化抗ＣＤ５２  ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ−０３（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）；ヒト化抗−ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ  Ｍ１９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／カネボウ）；キメラ抗−ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｒｏｃｈｅ／Ｚｅｔｔｙａｋｕ）；ヒト化抗−ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体であるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ヒト化抗−ＩＣＡＭ３抗体であるＩＣ���３（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ）；霊長類抗−ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／三菱）；放射性標識マウス抗−ＣＤ２０抗体であるＺＥＶＡＬＩＮ（商標）（ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）；ヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ−１３ｌ（ＩＤＥＣ／エーザイ）；プリマタイズした（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗−ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ＩＤＥＣ）；プリマタイズした抗−ＣＤ２３抗体であるＩＤＥＣ−１５２（ＩＤＥＣ／生化学工業）；ヒト化抗−ＣＤ３  ＩｇＧであるＳＭＡＲＴ抗−ＣＤ３（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）；ヒト化抗補体因子５（ＣＳ）抗体である５Ｇ１．１（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ）；ヒト化抗−ＴＮＦ−α抗体であるＤ２Ｅ７（ＣＡＴＩＢＡＳＦ）；ヒト化抗−ＴＮＦ−α  Ｆａｂ断片であるＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；プリマタイズした抗−ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ヒト抗−ＣＤ４  ＩｇＧ抗体であるＭＤＸ−ＣＤ４（Ｍｅｄａｒｅｘ／エーザイ／Ｇｅｎｍａｂ）；ヒト化抗−ＴＮＦ−α  ＩｇＧ４抗体であるＣＤＰ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ヒト化抗−α４β７抗体であるＬＤＰ−０２（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗−ＣＤ４  ＩｇＧ抗体であるＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ  ＯＫＴ４Ａ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体であるＡＮＴＯＶＡ（商標）（Ｂｉｏｇｅｎ）；ヒト化抗−ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体であるＡＮＴＥＧＲＥＮ（商標）（Ｅｌａｎ）；ヒト抗−ＴＧＦ−β２抗体であるＣＡＴ−１５２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｂ  Ｔｅｃｈ）；モノクローナル抗−ＥＧＦ受容体（ＥＧＦｒ）抗体であるセツキシマブ （ＢＭＳ）；抗−ＶＥＧＦヒトモノクローナル抗体であるベバシズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；自己免疫疾患の治療に使用されるキメラ（マウスおよびヒト）モノクローナル抗体であるインフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ，ＪＪ）；化学療法に使用されるモノクローナル抗体であるゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｗｙｅｔｈ）；黄斑変性の治療に使用されるキメラ（マウスおよびヒト）モノクローナル抗体であるラニビズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンβ、融合タンパク質、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質、生長ホルモン、サイトカイン、ストラクチュラル（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）、インターフェロン、リゾチーム、β−カゼイン、アルブミン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、因子ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ（など）、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、プロテインＣ、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ソマトトロピン、およびキモトリプシン、免疫グロブリン、抗体、免疫毒素、因子ＶＩＩＩ、ｂ−ドメイン欠損因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＩＸ、抗凝固剤；ヒルジン、アルテプラーゼ、ｔｐａ、レテプラーゼ、ｔｐａ、ｔｐａ（５つのうち３つのドメインが欠損）、インスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、長期作用型インスリンアナログ、グルカゴン、ｔｓｈ、ホリトロピン−β、ｆｓｈ、ｐｄｇｈ、ｉｎｆ−β、ｉｆｎ−��１、ｉｆｎ−β２、ｉｆｎ−α、ｉｆｎ−α１、ｉｆｎ−α２、ｉｆｎ−γ、ｉｌ−２、ｉｌ−１１、ｈｂｓａｇ、ｏｓｐａ、ドルナーゼ−α  ｄｎａｓｅ、βグルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ−α、ｉｌ−２−ジフテリア毒素融合タンパク質、ｔｎｆｒ−ｌｇｇ断片融合タンパク質ラロニダーゼ、ＤＮＡアーゼ、アレファセプト、トシツモマブ、マウスｍａｂ、アレムツズマブ、ラスブリカーゼ、アガルシダーゼβ、テリパラチド、副甲状腺ホルモン誘導体、アダリムマブ（ｌｇｇ１）、アナキンラ、生物学的修飾因子、ネシリチド、ヒトｂ−型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｂｎｐ）、コロニー刺激因子、ペグビソマント、ヒト生長ホルモン受容体アンタゴニスト、組換え型活性化プロテインｃ、オマリズマブ、免疫グロブリンｅ（ｌｇｅ）ブロッカー、イブリツモマブ・チウキセタン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、黄体ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、エタネルセプト、制尿ホルモン、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモン、免疫グロブリンポリペプチド、免疫グロブリンポリペプチドＤ領域、免疫グロブリンポリペプチドＪ領域、免疫グロブリンポリペプチドＣ領域、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン重鎖可変領域、免疫グロブリン軽鎖可変領域およびリンカーペプチドを含む。
【０１０７】
通常はＮ−グリコシル化されない本明細書中で開示されるようなタンパク質は、当業者によって理解されるように、トリ系においてグリコシル化されたグリコシル化部位（すなわちＮ−結合グリコシル化部位）を有するように改変されうる。さらに、本明細書中で開示されるようなタンパク質は、１つ以上の追加的なＮ−結合グリコシル化部位を有するように改変されうる。一実施形態では、グリコシル化部位が付加されたタンパク質は、本明細書で開示のように生成される末端修飾基で１つ以上のＮ−結合オリゴ糖構造に結合している。
【０１０８】
特に、本明細書で開示されるように生成されるタンパク質が当業者に周知の方法を用いて単離または精製されうると考えられる。
【０１０９】
一実施形態では、本発明に従って生成されるトリによって産まれる卵は、本明細書で開示されるように卵管内で生成される改変グリコシル化パターンを有する外因性または異種タンパク質（治療タンパク質など）を約０．０１μｇ／ハードシェル卵（ｈａｒｄ−ｓｈｅｌｌ  ｅｇｇ）を超える量で含有する。例えば、卵は異種タンパク質を約０．０１μｇ／ハードシェル卵〜約２ｇ／ハードシェル卵の範囲内の量で含有しうる。一実施形態では、卵は約０．１μｇ／ハードシェル卵〜約１ｇ／ハードシェル卵で含有する。例えば、卵は約１μｇ／ハードシェル卵〜約１ｇ／ハードシェル卵で含有しうる。一実施形態では、卵は約１０μｇ／ハードシェル卵〜約１ｇ／ハードシェル卵で含有する。例えば、卵は約１００μｇ／ハードシェル卵〜約１ｇ／ハードシェル卵で含有しうる（例えば、卵は約１００μｇ／ハードシェル卵および約１００ｍｇ／ハードシェル卵で含有しうる）。
【０１１０】
典型的には、本明細書で開示される改変グリコシル化パターンを有する異種タンパク質（例えば治療タンパク質）は卵の卵白内に存在する。一実施形態では、異種タンパク質は卵白内に卵の約０．０１μｇ／ｍｌを超える量で存在する。別の実施形態では、異種タンパク質は卵白の約０．０１μｇ／ｍｌ〜卵白の約０．２ｇ／ｍｌの範囲内の量で卵白内に存在する。例えば、異種タンパク質は、卵白の約０．１μｇ／ｍｌ〜卵白の約０．５ｇ／ｍｌの範囲内の量で卵白内に存在しうる。一実施形態では、異種タンパク質は卵白の約１μｇ／ｍｌ〜卵白の約０．２ｇ／ｍｌの範囲内の量で卵白内に存在する。例えば、異種タンパク質は卵白の約１０μｇ／ｍｌ〜卵白の約０．１ｇ／ｍｌの範囲内の量で卵白内に存在しうる（例えば、異種タンパク質は卵白の約１０μｇ／ｍｌ〜卵白の約５ｇ／ｍｌの範囲内の量で卵白内に存在しうる）。
【０１１１】
本発明ではまた、例えば２００６年１０月２３日に出願されたUS patent application No. 11/584,832（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）で考察のように、本明細書で開示されるように生成されるタンパク質のペグ化が有利でありうると考えられる。
【０１１２】
本発明に従って生成される治療タンパク質は生の形態で投与可能であると考えられる一方、治療タンパク質を薬学的製剤の一部として投与することが好ましい。
【０１１３】
したがって、本発明は、本発明に従って生成される治療タンパク質または薬学的に許容可能なその誘導体とともに、１つ以上の薬学的的に許容可能なその担体と場合により他の治療的および／または予防的成分を含む薬学的製剤、ならびにかかる薬学的製剤を投与する方法をさらに提供する。担体は、製剤の他の成分と適合しかつそのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。本発明の薬学的組成物を使用して患者を治療する方法（例えば、投与される医薬タンパク質の量、投与の頻度および治療期間の持続）は、当該技術分野の医師に既知の標準的方法を用いて決定されうる。
【０１１４】
薬学的製剤は、経口、直腸、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、経膣投与に適切なものを含む。薬学的製剤は、筋肉内、皮下および静脈内投与を含む注射による投与に適切なものを含む。薬学的製剤はまた、吸入または吸送による投与に適切なものを含む。製剤は、必要に応じ、便宜的に個別の用量単位で存在する場合があり、薬学の技術分野で周知の方法のいずれかによって調製されうる。薬学的製剤を生成する方法は、典型的には、治療タンパク質を液体担体または微粉化した固体担体またはその両方と会合状態にするステップと、次いで必要があれば生成物を所望される製剤に成形するステップを含む。
【０１１５】
経口投与に適切な薬学的製剤は、便宜的にカプセル、カシェまたはタブレット（それぞれは予め定められた量の活性成分を粉末もしくは顆粒として、溶液として、懸濁液として、またはエマルジョンとして含有する）などの個別の単位として存在する場合がある。活性成分は、はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして存在しうる。経口投与用のタブレットおよびカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または浸潤剤などの従来の賦形剤を含有しうる。タブレットは、当該技術分野で周知の方法に従ってコーティングされうる。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁剤、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態で存在しうるか、または使用前、水または他の適切な媒体との組成のために乾燥生成物として存在しうる。かかる液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、食用油を含みうる非水性媒体、または保護剤などの従来の添加剤を含有しうる。
【０１１６】
非経口的投与（例えば、注射、例えばボーラス注射または連続注入による）のために調合される本発明の治療タンパク質は、アンプル、既充填シリンジ、小容量注入における単位用量形態、または保護剤が添加された複数回投与容器において提供されうる。治療タンパク質は、例えば、皮下注射、筋肉内注射、および静脈内注入または注射によって注射されうる。
【０１１７】
治療タンパク質は、油性または水性媒体中で懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態をとる場合があり、かつ懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有しうる。また、治療タンパク質は、使用前、適切な媒体、例えば無菌のピロゲン−フリー水（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）との組成のため、無菌固体の無菌単離または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態で存在しうると考えられる。
【０１１８】
表皮への局所投与においては、本発明に従って生成される治療タンパク質は、軟膏、クリームまたはローションとしてまたは経皮パッチとして調合されうる。軟膏およびクリームは、例えば適切な増粘剤および／またはゲル化剤が添加された水性または油性基剤と調合されうる。ローションは水性または油性基剤と調合される場合があり、かつ一般に１種以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤または着色剤も含有することになる。
【０１１９】
口腔における局所投与に適切な製剤は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの風味のある基剤中に活性成分を含有するロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含有するトローチ；ならびに適切な液体担体中に活性成分を含有するマウスウォッシュを含む。
【０１２０】
担体が固体である、直腸投与に適切な薬学的製剤は、最も好ましくは単位用量座剤として表される。適切な担体はココアバターおよび当該技術分野で一般に使用される他の材料を含み、かつ座剤は便宜的に活性化合物と軟化または溶融担体との混合、その後の冷却および成型によって形成されうる。
【０１２１】
膣内投与に適切な製剤は、活性成分に加え、当該技術分野で適切であることが知られているような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡またはスプレーとして示されうる。
【０１２２】
鼻内投与においては、本発明の治療タンパク質は、液体スプレーまたは分散性粉末としてかまたはドロップの形態で使用されうる。
【０１２３】
ドロップは、１つ以上の分散剤、可溶化剤または懸濁剤も含有する水性または非水性基剤と調合されうる。液体スプレーは便宜的に加圧パックから送達される。
【０１２４】
吸入による投与においては、本発明に記載の治療タンパク質は、便宜的に吸入器、噴霧器または加圧パックまたはエアロゾルスプレーを送達する他の便利な手段から送達されうる。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体などの適切な推進剤を含有しうる。加圧されたエアロゾルの場合、用量単位は定量（ｍｅｔｅｒｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）を送達するための弁を提供することによって決定されうる。
【０１２５】
吸入または吹送による投与においては、本発明に記載の治療タンパク質は、乾燥粉末組成物、例えば同化合物と乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物の形態をとりうる。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセルまたはカートリッジ、あるいは例えばゼラチンまたはブリスターパックで提供可能であり、そこから粉末が吸入器または吹送器の補助で投与されうる。
【０１２６】
所望される場合、上記の製剤は、活性成分の徐放をもたらすように適合させて使用してもよい。
【０１２７】
本発明に記載の薬学的組成物はまた、抗菌剤または保護剤などの他の活性成分を含有しうる。さらに、本発明の治療タンパク質が他の治療剤と併用されうると考えられる。
【０１２８】
本発明の組成物または化合物を使用し、種々の症状が治療されうる。例えば、細胞培養物（例えばＣＨＯ細胞）から得られる治療タンパク質が使用される、治療法が当該技術分野の医師に既知である症状は多い。本発明では、本発明に従って生成される治療タンパク質を使用し、かかる症状が治療されうると考えられる。すなわち、本発明では、本発明に従って生成される治療タンパク質の使用による、従来式に生成された治療タンパク質によって治療可能であることが知られた症状の治療について検討される。例えば、本発明に従って生成されるエリスロポエチンを使用し、貧血および腎疾患、例えば慢性腎不全などのヒトの症状（または本発明のＥＰＯの投与によって治療可能でありうる他の症状）が治療されうる。
【０１２９】
一般に、投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、併用療法のタイプ、治療の頻度などの既知の要素に応じて変化しうる。通常、活性成分の用量は約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重でありうる。正確な用量、投与の頻度および治療の期間は、各治療タンパク質の投与の当該技術分野の医師によって決定されうる。
【０１３０】
図６に少なくとも部分的に示されるベクターのヌクレオチド配列は本明細書中、例えば図９〜１１に開示される。また、典型的なグリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列およびグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が示され、それらは本発明による使用が考えられるものの例である。例えば図１２〜２８に開示される、本明細書で開示されるアミノ酸配列の各々に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一または相同であるアミノ酸配列もまた、本発明による使用が考えられる。例えば図９〜２８に開示される、本明細書で開示されるヌクレオチド配列の各々に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一または相同であるヌクレオチド配列もまた、本発明による使用が考えられる。
【０１３１】
コード配列は、本明細書で開示されるグリコシルトランスフェラーゼに使用され、当該技術分野の医師はこれらの特定のコード配列からアミノ酸配列を決定できる。したがって、本発明は、本明細書で開示されるグリコシルトランスフェラーゼコード配列の各々によってコードされるアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一である、グリコシルトランスフェラーゼとして機能するアミノ酸配列をコードすることになるヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
また、本明細書で開示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々の本発明の機能的断片に従う使用は本発明の範囲内に含まれる。
【０１３３】
糖（例えばシアル酸、ガラクトース）をタンパク質のＮ−結合オリゴ糖構造に付加するための本明細書で開示される概念および方法はまた、他の動物および植物などの他の生物における使用が考えられる。
【０１３４】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、それは例示目的で提供され、限定するものとして解釈されるべきではない。すべての参考文献、公開された特許出願および本願全体を通じて引用される特許の内容は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１３５】
実施例１
トリ卵管内でＧａｌＴ１を発現するためのベクターの設計および作成
ＧａｌＴ１コード配列は、ニワトリマグナム内での発現のために最適化されたコドンの使用を伴う組込みＤＮＡ技術（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、下記に示される（配列番号４０）。
【化１】
0005571576.tif 000002
【０１３６】
合成コード配列を、図６Ａに示される（配列は図９に示される）オボムコイド（ＯＭ）プロモーター下流のＡＬＶベクター（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が欠失）に挿入した。
【０１３７】
ＡＬＶベクターのＬＴＲが自己不活性化（ＳＩＮ）していることから、ベクターはｐＡＬＶ−ＳＩＮと称され、２００８年３月１３日に公開されたUS patent publication No. 2008/0064862（その開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）中に開示されている。使用されるベクターはまた、US patent publication No. 2008/0064862中に開示されるＳＣ−陰性ベクターである。すなわち、力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）に使用される遺伝子（すなわちネオマイシン耐性遺伝子）に関連した因子はｐＡＬＶ−ＳＩＮから除去されている。
【０１３８】
図６Ａ（図９）に示されるｐＡＬＶ−ＳＩＮベクターでは、ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列のマグナムに特異的な発現の駆動に使用される１．８ｋｂのオボムコイド（ＯＭ）プロモーターを使用する。ＯＭタンパク質は主要な卵白タンパク質の中の１つであり、またＯＭ遺伝子の発現は本質的にマグナムに限定される。ベクターはｐＡＬＶ−ＳＩＮ−ＧａｌＴ１と称される。
【０１３９】
実施例２
ＧａｌＴ１トランス遺伝子が増強されたトリの生成
実施例１に記載のように生成されたｐＡＬＶ−ＳＩＮ−ＧａｌＴ１ベクターを、２００７年４月５日に公開されたUS patent publication No. 2007/0077650中に開示された一時的形質移入法によってウイルス粒子にパッケージングした。
【０１４０】
ウイルスを有する培地を形質移入の４８時間後に回収し、遠心分離によって濃縮した直後、ウインドウが設けられた（ｗｉｎｄｏｗｅｄ）卵のステージＸ胚（ステージＸは典型的には新たに産生された卵内に見出される約５０，０００個の細胞胚）に注射した。
【０１４１】
約１５０個の胚に注射した。卵をホットグロープラグ（ｈｏｔ  ｇｌｕｅ  ｐｌｕｇ）で密封し、インキュベートした（Andacht, et al. Mol Reprod Dev 69: 31-4, 2004）。ニワトリ４２匹が約２１日後に孵化し、１週間後、血液ＤＮＡにおけるトランス遺伝子の存在について評価した。孵化したニワトリは世代０に対してＧ０と称される。
【０１４２】
遺伝子組換え手順の奏功を評価するため、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）定量ＰＣＲシステムを使用し、孵化したＧ０ニワトリの血液ＤＮＡ中でのトランス遺伝子含量を測定した（Harvey, et al. Poultry Science 81: 202-12, 2002）。プライマー、および蛍光標識で標識したプローブをグリコシルトランスフェラーゼＣＤＳの配列に基づいて設計した。血液ＤＮＡを精製し、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）キットによって定量し、Ｔａｑｍａｎアッセイで分析した。ニワトリの約８０％がそれらの血液ＤＮＡ中に検出可能なレベルのトランス遺伝子を有した。
【０１４３】
さらなる分析を行い、組み込まれたトランス遺伝子が無傷であることを確認した。ＰＣＲプライマーを使用し、陽性ニワトリの血液ＤＮＡ由来のトランス遺伝子の様々な部分（ＯＭプロモーター、ＣＤＳおよび３’未翻訳領域）を増幅し、ＰＣＲ産物のサイズをアガロースゲル電気泳動によって測定した。試験したすべてのＧａｌＴ１陽性Ｇ０トリは、無傷のトランス遺伝子のコピーを有することが見出された。
【０１４４】
実施例３
完全トランスジェニックＧａｌＴ１トリの生成、およびトランス遺伝子が増強されたグリコシル化の評価
精液を実施例２のＧ０雄鳥から採取し、精液ＤＮＡにおけるトランス遺伝子含量について、Ｔａｑｍａｎアッセイによって分析した（Harvey, Speksnijder, Baugh, Morris and Ivarie. Poultry Science 81: 202-12, 2002）。最高のトランス遺伝子含量を有する雄鳥を野生型ニワトリと交配させ、子孫をＴａｑｍａｎによって分析し、完全トランスジェニックＧ１を同定した。
【０１４５】
卵をＧ１ニワトリ１３匹から収集した。卵白タンパク質を、タンパク質からＮ−結合オリゴ糖（Ｎ−グリカン）を特異的に放出するＰＮＧａｓｅで処理した。Ｎ−グリカンを精製し、構造をＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって判定し、その結果を図８に示す。図から明らかなように、結果は、多量のガラクトースが多数のオリゴ糖構造に付加されている状態での本発明の有効性を示している。さらに、図８Ａ〜８Ｃは、野生型（図８Ｄ）ニワトリ由来のタンパク質のオリゴ糖構造の場合より多量のシアル酸がＧａｌＴ１トリのタンパク質のオリゴ糖構造に付加されていることを示す。
【０１４６】
実施例４
ＳｉａｌＴ３トランス遺伝子が増強されたトリを発現するためのベクターの設計および作成
ＳｉａｌＴ３コード配列は、ニワトリマグナム内での合成ニワトリα−２，３−シアリルトランスフェラーゼタイプ３における発現のために最適化されたコドンを使用して合成されており、下記に示される（配列番号４１）。
【化２】
0005571576.tif 000003
【０１４７】
合成コード配列を、図６Ｂに示されるオボムコイド（ＯＭ）プロモーターの下流のｐＡＬＶ−ＳＩＮベクターに挿入し、図１０に示される配列ｐＡＬＶ−ＳＩＮ−ＳｉａｌＴ３を生成した。コンストラクトを作成し、次いでＧ０トリを生成し、本質的に実施例１および２でＧａｌＴ１  Ｇ０トリについて記載のように分析し、Ｇ１トリを本質的に実施例３でＧａｌＴ１トリについて記載のように生成する。
【０１４８】
実施例５
ＳｉａｌＴ３陽性トリとＧａｌＴ１陽性トリの交配によるＳｉａｌＴ３／ＧａｌＴ１トランス遺伝子が増強されたトリの生成
当該技術分野で理解されるように、実施例３のＧａｌＴ１  Ｇ１トリ（または２つのＧａｌＴ１  Ｇ１トリの交配から得られるホモ接合Ｇ２  ＧａｌＴ１トリ）の１つ以上を、実施例４のＳｉａｌＴ３  Ｇ１トリと交配させる（または２つのＳｉａｌＴ３  Ｇ１トリの交配から得られるホモ接合Ｇ２  ＳｉａｌＴ３トリと交配させる）ことで、得られた子孫トリはＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３トランス遺伝子の双方を有する。当該技術分野で理解されるように、これらのトリを互いに２回交配させることで、両方のトランス遺伝子に対してホモ接合であるトリが生成されうる。
【０１４９】
実施例６
単一の発現ベクターを使用する、ＳｉａｌＴ３およびＧａｌＴ１トランス遺伝子が増強されたトリを生成するためのベクターの設計および作成
ＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３コード配列を、実施例１および実施例４などのようにニワトリマグナム内での発現のために最適化されたコドンを使用して合成する。コード配列を、単一の１．８ｋｂのオボムコイドプロモーターの下流の単一のレトロウイルスベクターに挿入する。２番目または下流ＣＤＳの翻訳をもたらす配列（例えばＩＲＥＳ）をＧａｌＴ１〜ＳｉａｌＴ３  ＣＤＳの間に挿入することで、図６Ｃおよび図１１に示される、バイシストロニックメッセージを有するベクターを生成する。
【０１５０】
ＧａｌＴ１の翻訳を上流翻訳開始部位によって開始し、ＳｉａｌＴ３の翻訳を内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって開始することで、ＧａｌＴ１およびＳｉａｌＴ３  ＣＤＳの双方が同じｍＲＮＡから発現される。図６ＣにおけるＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する（Jang, et al. J Virol 62: 2636-43., 1988; Ghattas, et al. Mol Cell Biol 11: 5848-59, 1991）。
【０１５１】
ベクターをトリ（例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ）胚に挿入することで、本質的にｐＡＬＶ−ＳＩＮ−ＧａｌＴ１についての上記実施例における記載のようにＧ０  Ｇ１が得られる。当該技術分野で理解されるように、ホモ接合体が得られうる。
【０１５２】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、各々の個別の出版物、特許または特許出願があらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用されることが具体的かつ個別に示唆されるのと同程度に、それら全体があらゆる目的で参照により本明細書中に援用される。
【０１５３】
いずれの出版物の引用も、出願日前におけるその開示を目的とし、かつ、本発明が先行発明によってかかる出版物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１５４】
本発明が様々な特定の実施例および実施形態に関連して説明されている一方、本発明はそれらに限定されることなく、以下の特許請求の範囲の範囲で様々に実行されうると理解されるべきである。
【図１Ａ】
0005571576.tif 000004
【図１Ｂ】
0005571576.tif 000005
【図２】
0005571576.tif 000006
【図３】
0005571576.tif 000007
【図４】
0005571576.tif 000008
【図５】
0005571576.tif 000009
【図６】
0005571576.tif 000010
【図７】
0005571576.tif 000011
【図８Ａ】
0005571576.tif 000012
【図８Ｂ】
0005571576.tif 000013
【図８Ｃ】
0005571576.tif 000014
【図８Ｄ】
0005571576.tif 000015
【図９Ａ】
0005571576.tif 000016
【図９Ｂ】
0005571576.tif 000017
【図９Ｃ】
0005571576.tif 000018
【図１０Ａ】
0005571576.tif 000019
【図１０Ｂ】
0005571576.tif 000020
【図１０Ｃ】
0005571576.tif 000021
【図１１Ａ】
0005571576.tif 000022
【図１１Ｂ】
0005571576.tif 000023
【図１１Ｃ】
0005571576.tif 000024
【図１２Ａ】
0005571576.tif 000025
【図１２Ｂ】
0005571576.tif 000026
【図１３Ａ】
0005571576.tif 000027
【図１３Ｂ】
0005571576.tif 000028
【図１４Ａ】
0005571576.tif 000029
【図１４Ｂ】
0005571576.tif 000030
【図１５Ａ】
0005571576.tif 000031
【図１５Ｂ】
0005571576.tif 000032
【図１６Ａ】
0005571576.tif 000033
【図１６Ｂ】
0005571576.tif 000034
【図１７Ａ】
0005571576.tif 000035
【図１７Ｂ】
0005571576.tif 000036
【図１７Ｃ】
0005571576.tif 000037
【図１８Ａ】
0005571576.tif 000038
【図１８Ｂ】
0005571576.tif 000039
【図１９Ａ】
0005571576.tif 000040
【図１９Ｂ】
0005571576.tif 000041
【図２０Ａ】
0005571576.tif 000042
【図２０Ｂ】
0005571576.tif 000043
【図２１Ａ】
0005571576.tif 000044
【図２１Ｂ】
0005571576.tif 000045
【図２１Ｃ】
0005571576.tif 000046
【図２２Ａ】
0005571576.tif 000047
【図２２Ｂ】
0005571576.tif 000048
【図２３Ａ】
0005571576.tif 000049
【図２３Ｂ】
0005571576.tif 000050
【図２４Ａ】
0005571576.tif 000051
【図２４Ｂ】
0005571576.tif 000052
【図２５Ａ】
0005571576.tif 000053
【図２５Ｂ】
0005571576.tif 000054
【図２６Ａ】
0005571576.tif 000055
【図２６Ｂ】
0005571576.tif 000056
【図２７Ａ】
0005571576.tif 000057
【図２７Ｂ】
0005571576.tif 000058
【図２８Ａ】
0005571576.tif 000059
【図２８Ｂ】
0005571576.tif 000060
【配列表】
0005571576000001.app