(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）で表される化合物。
ＡＡ1−ＡＡ2−ＡＡ1−Ｘ−Ｙ−Ｚ （ＩＩ）
ＡＡ1は陽イオン性アミノ酸であり；
ＡＡ2はトリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、またはＰｈｅ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））、Ｐｈｅ（４−（１−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））、Ｂｉｐ（４−ｎ−Ｂｕ）、Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）およびＢｉｐ（４−Ｔ−Ｂｕ）から選ばれるビフェニルアラニン誘導体から選ばれるアミノ酸であり；
ＸはＮ原子であり、該Ｎ原子は、Ｎ、ＯおよびＳから選ばれるヘテロ原子を最大２個まで含んでいてもよい、分岐もしくは非分岐のＣ1〜Ｃ10のアルキル基またはアリール基で置換されていてもよく；
Ｙは−Ｒa−Ｒb−であり、
ＲaはＣであり、
ＲbはＣであり；ＲaおよびＲbのそれぞれはＣ1〜Ｃ4のアルキル基で置換されているか、または非置換であり；
Ｚは、それぞれ５または６個の非水素原子からなる環状基を１個含む基であり、該環状基は置換されていてもよく；Ｚ部分は最大１５個の非水素原子を有し；
ＹＺ間の結合は、ＹのＲaまたはＲbと、Ｚの環状基に属する非水素原子との共有結合である。
【請求項２】
ペプチドである、請求項１に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項３】
前記陽イオン性アミノ酸がリシンおよび／またはアルギニンである、請求項１または２に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項４】
Ｘが非置換である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項５】
Ｙが−Ｒa−Ｒb−であって非置換である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項６】
Ｙが−ＣＨ2−ＣＨ2−である、請求項５に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項７】
Ｚがフェニル基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項８】
−Ｘ−Ｙ−Ｚが、合わせて−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｐｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）で表される化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載され、かつ、下記構造式を有する化合物。
0005524858.tif 000012
【請求項１０】
治療用である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
抗菌剤、抗真菌剤または抗腫瘍剤として用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の抗菌剤としての使用。
【請求項１３】
適切な希釈剤、担体または賦形剤と混合して、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物を含む製剤。
【請求項１４】
医薬製剤である、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
局所的投与に適している、請求項１４に記載の製剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性分子に関し、詳しくは抗菌活性を示すペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドおよびその誘導体は長い間治療上興味深い分子だと考えられてきた。さまざまな生物体が宿主防御機構の一因子としてペプチドを使用する。抗菌性ペプチドは細菌や哺乳類といった多様な種から単離されてきた。一般にこれらのペプチドは正味の正電荷を帯び、細菌の細胞膜の外側のリン脂質二重層と相互作用してα−へリックスまたはβ−シート構造を形成する傾向を有する。ほとんどの場合、抗菌活性の詳細なメカニズムはわかっていないが、クラスＬ（溶解性）に分類されるペプチドのいくつかは細菌の細胞膜と相互作用し、おそらくイオンチャンネルまたは細孔を形成すると考えられる。
【０００３】
既知の抗菌性ペプチドのほとんどは１０以上、主に２０以上のアミノ酸を含んでいるが、細菌の細胞膜に陥入し、細孔を形成するために、ペプチド、一般にα−へリックス構造に十分な長さを与えるには、これだけの数のアミノ酸が必要である。このようなメカニズムが、このようなペプチドの大多数が細胞毒性を発揮する一般に受け入れられた方法である。
【０００４】
従来技術での抗菌性ペプチドの合成は難しく、通常は、興味のあるペプチドを得るには培養し、採取することができる細菌またはその他の生物体によってペプチドを合成する必要があり、一般的には翻訳による直接生成物の単離後の追加の加工段階が必要である。もし、より短い活性ペプチドが確認されたならば、アミノ酸構成単位あるいは市販のジ−またはトリ−ペプチドからの合成を用いた経済的生産が可能になるだろう。さらに、ペプチドが短いということは、バイオデリバリーにとって強みになる。鼻腔の毛細血管からの吸入または吸収によって、注射の必要なしに投与することができる抗生物質の需要が高まっている。
【０００５】
新規抗生物質の探索は、既知で広く用いられている薬剤への耐性を示す菌種が増加しているため、特に緊急性を帯びてきている。農業、環境保護および食品安全以外に医薬の分野で作用する菌種には、絶えず新しい抗菌剤を必要とし、望ましくない菌に有効に対抗するために、一定の集団または部位をさまざまな異なる細菌で処理しなければならないかもしれない。
【０００６】
国際公開第０１／６６１４７号に開示されるように、実際、膜不安定化を通じて作用すると考えられる小さな抗菌分子、特にペプチドを作り出すことが可能であることが最近示された。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、優れた一連の特徴、特に抗菌活性、低毒性および安定性、すなわち酵素分解耐性を有効に併せ持つ少数の修飾ペプチドを特定した。
【０００８】
つまり式（Ｉ）で表される化合物、好ましくはペプチドがその一形態である。
【０００９】
ＡＡ−ＡＡ−ＡＡ−Ｘ−Ｙ−Ｚ      （Ｉ）
順不同に、上記ＡＡ（アミノ酸）の部分うち２つは陽イオン性アミノ酸、好ましくはリシンまたはアルギニンであるが、ヒスチジン、またはｐＨ７．０の時に正電荷を持つ、遺伝子によってコードされていない、すなわち遺伝子組み替えしていないアミノ酸であってもよく；上記ＡＡのうち１つは大きな親油性のＲ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は１４〜２７個の非水素原子を有し、かつ好ましくは縮合または結合していてもよい環状基を２個以上、例えば２または３個有し、これらの環状基は非水素原子を通常５または６個、好ましくは６個含み；
Ｘは、分岐もしくは非分岐のＣ1〜Ｃ10のアルキル基またはアリール基（例えば、メチル基、エチル基、フェニル基）で置換されていてもよいが、好ましくは置換されていないＮ原子であり、この基はＮ、ＯおよびＳから選ばれるヘテロ原子を最大２つまで含んでもよく；
Ｙは−Ｒa−Ｒb−、−Ｒa−Ｒb−Ｒb−および−Ｒb−Ｒb−Ｒa−から選ばれる基であり、
ＲaはＣ、Ｏ、ＳまたはＮ、好ましくはＣであり、
ＲbはＣであり、ＲaおよびＲbのそれぞれはＣ1〜Ｃ4のアルキル基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよく、
好ましくは、Ｙは−Ｒa−Ｒb−（ＲaはＣであることが好ましい）であり、この基は置換されていないことが好ましいが、Ｙが−Ｒa−Ｒb−Ｒc−または−Ｒb−Ｒb−Ｒa−であるときはＲaおよびＲbの１以上は置換されているのが好ましく；
Ｚは、それぞれ５または６個の非水素原子（好ましくはＣ原子）からなる環状基を１〜３個を含む基であり、該環状基のうち、２個以上は縮合していてもよく、該環状基のうち、１個以上は置換されていてもよく、これらの置換は、通常含まないだろうが極性基を含んでいてもよく、適当な置換基としてはハロゲン、好ましくは臭素またはフッ素、およびＣ1〜Ｃ4のアルキル基であり、Ｚ部分は最大１５個、好ましくは５〜１２の非水素原子を含み、より好ましくはフェニル基である。
【００１０】
ＹＺ間の結合は、ＹのＲaまたはＲbと、Ｚの環状基の１つに属する非水素原子との共有結合である。
【００１１】
遺伝子によってコードされていないアミノ酸および変性アミノ酸として、適切に陽イオン性アミノ酸を提供し得るものとしては、トリメチルリシンおよびトリメチルオルニチン以外に、ホモリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸およびホモアルギニンなどのリシン、アルギニンおよびヒスチジンの類似体；４−アミノピペリジン−４−カルボン酸；４−アミノ−１−カルバムイミドイルピペリジン−４−カルボン酸ならびに４−グアニジノフェニルアラニンが挙げられる。
【００１２】
大きな親油性のＲ基はＯ、ＮまたはＳのようなヘテロ原子を含んでもよいが、一般的にはへテロ原子が１個だけ含まれ、それが窒素であることが好ましい。このＲ基は極性基を２個以上含まないのが好ましく、含まないか１個だけ含むのがより好ましく、含まないのが最も好ましい。
【００１３】
本発明の化合物の好ましい態様は、式（ＩＩ）で表されるペプチドである。
【００１４】
ＡＡ1−ＡＡ2−ＡＡ1−Ｘ−Ｙ−Ｚ      （ＩＩ）
ＡＡ1は陽イオン性アミノ酸、好ましくはリシンまたはアルギニンであるが、ヒスチジン、またはｐＨ７．０の時に正電荷を持つ、遺伝子によってコードされていない、すなわち遺伝子組み替えしていないアミノ酸であってもよく；
ＡＡ2は大きな親油性のＲ基を有するアミノ酸であり、該Ｒ基は１４〜２７個の非水素原子を有し、かつ好ましくは縮合または結合していてもよい環状基を２個以上、例えば２または３個有し、これらの環状基は非水素原子を通常５または６個、好ましくは６個含み；
Ｘ、ＹおよびＺは上記のように定義される。
【００１５】
本発明の化合物にはさらに式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表される化合物が含まれる。
【００１６】
ＡＡ2−ＡＡ1−ＡＡ1−Ｘ−Ｙ−Ｚ      （ＩＩＩ）
ＡＡ1−ＡＡ1−ＡＡ2−Ｘ−Ｙ−Ｚ      （ＩＶ）
ＡＡ1、ＡＡ2、Ｘ、ＹおよびＺは上記のように定義される。しかし、式（ＩＩ）で表される分子が好ましい。
【００１７】
上記化合物の中では特定のものが好ましい。具体的には、大きな親油性のＲ基を有するアミノ酸（ここでは便宜上ＡＡ2という）としては、トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）あるいはＢｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））、Ｂｉｐ（４−（１−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））、Ｂｉｐ（４−ｎ−Ｂｕ）、Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）またはＢｉｐ（４−Ｔ−Ｂｕ）などのビフェニルアラニン誘導体が挙げられるが、Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））およびＴｂｔが最も好ましい。
【００１８】
上記したようにＹが−Ｒa−Ｒb−であるもの、好ましくはＲaおよびＲbが置換されていないもの、最も好ましくはＲaおよびＲbがいずれも炭素原子であるものが化合物のもう一つの好ましい基である。
【００１９】
−Ｘ−Ｙ−Ｚは、合わせて−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｐｈ基であるものが化合物のさらに好ましい基である。
【００２０】
化合物はすべてのエナンチオマー型、すなわち、Ｄ−およびＬ−アミノ酸、ならびにアミノ酸のＲ基、およびＹまたはＺの部分の中にあるキラル中心に起因するエナンチオマーを含む。
【００２１】
最も好ましい化合物を以下に挙げる。
【００２２】
【化１】
0005524858.tif 000002
【００２３】
さらなる態様は、治療用、特に抗菌薬（抗菌）剤だけではなく抗癌剤にも用いられる、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（Ｖ）で表される化合物である。本発明に係る分子は、抗真菌薬としての効果もあり、それ自体および真菌感染症の治療（予防も含む）方法における用途は本発明のさらなる形態を構成する。本発明に係る分子は爪甲真菌症（onchyomycosis）の治療に特に好適である。本発明に係る好ましい分子は、抗真菌薬および抗菌剤のいずれとしても活性である。
【００２４】
このような抗菌性分子には、例えば、農業あるいは家庭内または工業上の状況での微生物汚染を受けやすい物質への殺菌剤といった非治療的用途もある。したがって、本発明のさらなる側面によると、本発明に係る分子には抗菌薬剤、特に抗菌剤としての用途があることを提供するものである。
【００２５】
上記分子は抗菌活性を示し、特に膜に直接影響を与えるメカニズムを介して細胞毒性を示すので、膜作用性抗菌薬剤と呼ばれている。これらの分子は溶解し、細胞膜を不安定化し、穿孔することさえある。このことは、細胞表面受容体などの標的細胞のタンパク質成分に作用したり、相互作用する薬剤に対する明確な治療上の利点である。突然変異が抗生物質に対する耐性を引き起こす新しい型の標的タンパク質を形成しても、細胞毒性を回避するために脂質膜への急激な変化が起こる可能性は非常に低い。溶解効果は非常に急速な細胞死を引き起こすため、増殖する機会を得る前に細菌を殺すという利点がある。さらに、上記分子は、例えばタンパク質合成の抑制能といった標的微生物を殺すか損なうという他の有用な性質を持っているため、マルチターゲットである。
【００２６】
したがって、さらなる態様において、本発明は、微生物の細胞膜を不安定化および／または透過化するのに用いられる分子を提供するものである。「不安定化」というのは、膜の薄層化や、細菌の呼吸器系をも害する水、イオンまたは代謝物などに対する膜透過率の増大（主にチャンネル以外）を含んでいてもよい脂質二重層の通常の三次元配置の摂動を意味する。
【００２７】
Ｎ−置換グリシンがすべてＡＡ単位であると考えられるように、αアミノ酸以外に、βおよびγアミノ酸も「アミノ酸」という用語には含まれる。本発明に係る分子は、βペプチドおよびデプシペプチドを含む。
【００２８】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される化合物はペプチド擬似体および記載されたペプチドのペプチド擬似体であってもよいので、本発明の別の特徴としてここに記載する。ペプチド擬似体は一般的に、ペプチドと等価物であるがペプチド結合がしばしばより安定な連鎖によって置換されているものの極性、三次元的な大きさおよび機能性（生物活性）を保持することによって特徴付けられる。「安定な」は、加水分解性酵素の酵素分解に対し、より耐性があるという意味である。一般的にアミド結合に代わる結合（アミド結合の代用物）は、立体配座、立体的かさ高さ、静電的性質または水素結合形成能などのアミド結合の性質の多くを維持する。Krogsgaard、Larsen、LiljeforsおよびMadsen編、「Drug Design and Development」、Horwood Acad. Pub、1996年の第14章には、ペプチド擬似体の設計および合成のための技術の全般的な議論が開示されている。本発明のように分子が酵素の特定の活性部位ではなく膜と反応する場合、親和性および有効性の正確な模倣、または基質の機能について述べた問題のいくつかは関わりがなく、ペプチド擬似体は所定のペプチド構造または必須官能基のモチーフに基づいて容易に合成される。適切なアミド結合代用物は以下のように分類される：Ｎ−アルキル化（Schmidt, R.他、「Int. J. Peptide Protein Res.」、1995年、第46号、p. 47）；レトロインバース（retro-inverse）アミド（Chorev, MおよびGoodman, M、「Acc. Chem. Res.」、1993年、第26巻、p. 266）；チオアミド（Sherman D.B.およびSpatola, A.F.、「J. Am. Chem. Soc.」、1990年、第112巻、p. 433）；チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン（Hoffman, R.V.およびKim, H.O.、「J. Org. Chem.」、1995年、第60巻、p. 5107）；ヒドロキシメチレン、フルオロビニル（Allmendinger, T.他、「Tetrahydron Lett.」、1990年、第31巻、p. 7297）；ビニル、メチレンアミノ（Sasaki, YおよびAbe, J.、「Chem. Pharm. Bull.」、1997年、第45巻、p. 13）；メチレンチオ (Spatola, A.F.、「Methods Neurosci.」、1993年、第13号、p. 19)；アルカン（Lavielle, S.他、「Int. J. Peptide Protein Res.」、1993年、第42号、p. 270）；ならびにスルホンアミド（Luisi, G.他、「Tetrahedron Lett.」、1993年、第34巻、p. 2391）。
【００２９】
本発明に係るペプチド擬似化合物は、大きさおよび機能がアミノ酸（ＡＡユニット）と大体同じである３つの特定可能なサブユニットを有する。したがって、ここでは便宜上、「アミノ酸」の用語はペプチド擬似化合物と同等のサブユニットを指すのに用いられる。さらに、ペプチド擬似体はアミノ酸のＲ基に相当する基を有するので、適当なＲ基ならびにＮおよびＣ末端修飾基に関するここでの議論は、変更すべきところは変更すれば、ペプチド擬似化合物にあてはまる。
【００３０】
上述したテキストにおいて述べたように、ペプチド擬似体は、アミド結合の置換と同様により大きな構造部分をジ−またはトリ−ペプチド擬似構造で置換することにも関与しており、この場合、アゾールから誘導される擬似体のようなペプチド結合を含む擬似部分をジペプチド代替物として用いてもよい。しかしながら、ペプチド擬似体、そしてアミド結合が上述のように置換されたペプチド擬似骨格が好ましい。
【００３１】
適切なペプチド擬似体としては、アミド結合がボランや水素化アルミニウムリチウムのような水素化物試薬などの還元剤で処理することによりメチレンアミンまで還元された、還元ペプチドが挙げられる。このような還元は分子の分子全体の陽イオン性を増大できるという追加利点がある。
【００３２】
その他のペプチド擬似体としては、アミド官能化されたポリグリシンの段階的合成によって形成されたペプトイドが挙げられる。
【００３３】
ペプチド擬似骨格は、完全メチル化されたペプチドのような、そのペプチド前駆体から容易に得られる。なお、完全メチル化の適切な方法はOstresh, J.M.他、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」、1994年、第91巻、p.11138−11142に記載されている。Ｎ−メチル化はＯ−メチル化よりも強い塩基性条件を必要とし、ペプチド結合中の一部またはすべての窒素原子およびＮ−末端の窒素をメチル化する。
【００３４】
好ましいペプチド擬似骨格としては、置換アルカンおよび置換アルケンの他にポリエステル、ポリアミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。ペプチド擬似体は、本明細書で説明したように修飾されていてもよいＮおよびＣ末端を含んでいるのが好ましい。
【００３５】
本発明は、ここで説明した種々の分子を投与することによる細菌感染の治療方法を提供する。同様に、微生物の細胞膜を不安定化する方法が提供される。投与量は、標的微生物を全部または部分的に殺すのに有効であり、繁殖を止めるかまたは低下させるのに有効であり、あるいは逆に体への悪影響を少なくために有効な量でなければならない。臨床医や患者は、感染と関係がある１以上のパラメータや症状において改善が認められることに気付くべきだろう。投与は予防のために行ってもよい。
【００３６】
本発明に係るペプチドは任意の便利な方法で合成すればよい。一般に、存在する反応基（例えば、アミノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は全合成中、保護されていてもよい。したがって、合成の最終工程は、保護基の付いた誘導体の脱保護になるだろう。
【００３７】
ペプチドを構築するには、原則としてＮ末端かＣ末端のどちらかから始めるが、Ｃ末端から始める手順が好ましい。
【００３８】
ペプチドの合成方法は技術的には周知であるが、本発明では技術的に周知の固相担体を利用した合成を行うのが特に利便性が高い。
【００３９】
アミノ酸の保護基は幅広く選択できることが知られるが、適切なアミン保護基としては、カルボベンゾキシ（Ｚとも表す）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃとも表す）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃとも表す）が挙げられる。ペプチドがＣ末端側から構築されるとき、アミン保護基は付加されたそれぞれの新しい残基のα−アミノ基上に存在し、次のカップリング工程の前に選択的に除去する必要がある。
【００４０】
例えば、使用できるカルボキシル保護基としては、例えば、ポリスチレンに結合したメチル基のような固相担体上の結合基以外に、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｐ−ニトロべンジル（ＯＮｂ）、ペンタクロロフェニル（ＯＰＣｌＰ）、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）またはｔ−ブチル（ＯｔＢｕ）のような容易に開裂したエステル基が挙げられる。
【００４１】
チオール保護基としては、ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、トリチル（Ｔｒｔ）およびアセトアミドメチル（Ａｃｍ）が挙げられる。
【００４２】
アミン−およびカルボキシル−保護基を除去するにはさまざまな手法がある。しかしながらこれらは用いられる合成戦略と一致していなければならない。側鎖保護基は、次のカップリング工程の前にα−アミノ保護基による仮保護を除去するのに用いられる条件において安定でなければならない。
【００４３】
Ｂｏｃなどのアミン保護基およびｔＢｕなどのカルボキシル保護基は、例えば、トリフルオロ酢酸のような酸処理によって同時に除去することができる。Ｔｒｔなどのチオール保護基は、ヨウ素などの酸化剤を使って選択的に除去することができる。
【００４４】
本発明に係るペプチド擬似化合物および他の生物活性化合物を合成するための参照文献や方法は、以下に説明するように公知技術である。
【００４５】
適切な希釈剤、担体または賦形剤と混合に本発明の化合物を含む製剤は、本発明のさらなる態様を構成する。このような製剤は、製薬（動物用を含む）目的または農業目的あるいは食品産業などにおいて微生物汚染を受けやすい物質のための殺菌剤に特に好適である。適切な希釈剤、賦形剤および担体は当業者に知られたものである。
【００４６】
ここに定義するペプチドは広い抗菌活性を有するため、抗ウイルス薬および抗真菌薬として適しており、薬物および農業に応用できる。また、創傷治療や殺精子剤の促進剤として適している。これらの用途はすべて本発明のさらなる態様を構成する。
【００４７】
細菌、ウイルスまたは真菌による感染症を治療または予防する方法、あるいは人間または動物患者に、ここに定義するペプチドまたはペプチド擬似体の１種以上を投与して腫瘍を治療する方法は本発明のさらなる態様を構成する。
【００４８】
本発明に係る組成物は、例えば、口腔、鼻腔、非経口、静脈内、腫瘍内または直腸投与に適した形態で提供することができる。
【００４９】
ここで用いられるように、「製薬の」の用語は、本発明の動物への応用を含む。
【００５０】
ここに定義する活性化合物は、タブレット、コーティング錠、経鼻噴霧剤、液剤、乳剤、リポソーム、粉薬、カプセルまたは持続放出形態などの通常の薬理学的な投与形態で提供される。
【００５１】
ペプチドは糖尿病性潰瘍や爪甲真菌症などの真菌感染症の治療における局所的な投与に特に適している。局所的投与のための製剤としては、ジェル、クリーム、ローション、ペーストまたはその他の調合液であって、水より高い粘性を持つものであることが好ましい。局所的投与のためのさらなる製剤としては、本発明の化合物を含浸させた包帯剤やガーゼ剤などが挙げられる。こうした材料に含浸させれば、本発明の化合物を含む調合液は水より粘性を高くする必要がない。これらを調製するには、通常の方法で製造する以外に従来の医薬品賦形剤が用いられる。例えば、タブレットは、有効成分または成分と既知の賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはラクトースなどの希釈剤、コーンスターチまたはアルギン酸などの崩壊剤、デンプンまたはゼラチンなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウムまたはタルク粉などの滑剤、および／またはカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレートまたはポリ酢酸ビニルなどの徐放性を得るための剤とを混合することにより製造することができる。
【００５２】
タブレットは必要に応じて数層からなる。コーティング錠は芯をコーティングすることにより製造され、例えば、ポリビニルピロリドン、シェラック、アラビア・ゴム、タルク粉、二酸化チタンまたは砂糖などのタブレットコーティングに通常用いられる剤を使って、タブレットの製造と同様の方法で製造される。徐放性を得るため、また不適合を避けるため、芯も数層からなっていてもよい。コーティング錠は徐放性を得るために数層からなっていてもよく、その場合、タブレット化のための上記賦形剤を使用してもよい。
【００５３】
器官特異的なキャリアシステムも用いることができる。
【００５４】
例えば、注射液はｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの保存料やＥＤＴＡなどの安定剤を添加するなどの従来の方法で製造することができる。それから、液剤を注射剤のバイアルまたはアンプルに入れる。
【００５５】
投与の好ましい方法である経鼻噴霧剤は、水性液剤と同様に調合され、エアゾール噴射剤か、手で押す方法が備わった噴霧容器に充填する。1種または数種の有効成分の入ったカプセルは、有効成分と、ラクトースやソルビトールなどの不活性担体とを混合し、該混合物をゼラチンカプセルに入れることによって製造することができる。
【００５６】
適切な座薬は、例えば、有効成分または有効成分の組み合わせと、天然油脂、ポリエチレングリコールまたはこれらの誘導体など、この目的を想定した従来の担体とを混合することにより製造することができる。
【００５７】
上記活性分子を含む投薬単位には、抗菌剤が０．１〜１０ｍｇ、例えば１〜５ｍｇ含まれていることが好ましい。また、医薬組成物は他の抗微生物ペプチドなどの他の細胞毒性薬を含む、さらに効果のある成分を含んでもよい。他の有効成分は異なる種類の抗生物質、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＣＳＦおよび成長因子などのサイトカイン、免疫調整剤ならびにシスプラチンおよび抗体などの化学療法薬を含んでいてもよい。
【００５８】
生物活性分子は一般的に、局所用組成物に用いられるとき、少なくとも０．１重量％の量で存在する。ほとんど場合、１．０重量％を超える量でペプチドを用いる必要はない。
【００５９】
このような組成物を全身的に（筋肉内、静脈内、腹腔内）用いることによって、活性分子は生物活性分子の血中濃度が少なくとも約５μｇ／ｍｌに達するような量で存在する。一般に血中濃度は５００μｇ／ｍｌを超える必要はない。好ましい血中濃度は約１００μｇ／ｍｌである。そのような血中濃度は、生物活性分子を１〜約１０ｍｇ／ｋｇという量で全身的に投与されるよう組成物中に導入することによって達成される。一般に上記分子を１００ｍｇ／ｋｇを超える量で投与する必要はない。
【００６０】
食料および食料生産地のみならず、環境もしくは農業用地または生産物、あるいは例えば病院環境での表面または道具を、生菌数を減らし、細菌増殖や再生を示しまたは制限するために、本発明に係る分子の1種以上を用いて処理する方法は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００６１】
次の実施例および図は本発明をさらに説明するものであるが、本発明はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ネズミの皮膚感染モデルの黄色ブドウ球菌ＦＤＡ４８６に対し、化合物２を用いて１日局所治療を行った効果を示すグラフである。コロニー形成単位数（ＣＦＵ）はＹ軸に示し、マウスに適用した局所治療の種類はＸ軸に示す。
【図２】図２は、ネズミの皮膚感染モデルの化膿連鎖球菌に対し、化合物２を用いて１日局所治療を行った効果を示すグラフである。コロニー形成単位数（ＣＦＵ）はＹ軸に示し、マウスに適用した局所治療の種類はＸ軸に示す。
【図３】図３は、製剤により誘導されるクエンチ後のＡＴＰの回復の比較、およびそれらの既知濃度の標準との比較を示すグラフである（実施例５）。
【図４】図４は、異なる製剤を適用した後のＡＴＰ放出の比較を示すグラフである（実施例５）。
【実施例】
【００６３】
［実施例１］
［本発明の分子のインビトロ活性］
２．０  原料および方法
２．１  抗菌剤
予め秤量した化合物１および２のバイアルはＬｙｔｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  ＡＳにより提供された。
【００６４】
【表１】
0005524858.tif 000003
【００６５】
２．２  細菌分離株
この研究において使用する細菌分離株は、ＧＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｌｔｄ．が保管する世界各地の調達源から来ており、非希釈ウマ血清の高タンパク質基質中に存在する高密度懸濁液として、最小限の継代培養で−７０℃で冷凍保存されている。使用される種およびそれらの特徴を表１に示す。これらは５４のグラム陽性菌、３３のグラム陰性菌、１０の真菌を含んでいた。
【００６６】
２．３  最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
ＭＩＣはＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ、旧ＮＣＣＬＳ）によって発行された微量液体希釈法による抗菌薬感受性試験で求めた。
【００６７】
Ｍ７−Ａ６、第２３巻、第２号、２００３年１月、好気的に増殖する細菌の希釈法による抗菌薬感受性試験；承認された基準−第６版
Ｍ１００−Ｓ１５、第２５巻、第１号、２００５年１月、抗菌薬感受性試験実施基準；第１５の補足情報
Ｍ１１−Ａ６、第２４巻、第２号、嫌気性菌の抗菌薬感受性測定法；承認された基準−第６版
Ｍ２７−Ａ２、第２２巻、第１５号、液体希釈法による酵母の抗真菌薬感受性試験の標準法；承認された基準−第２版
Ｍ３８−Ａ、第２２巻、第１６号、液体希釈法による糸状菌の抗真菌薬感受性試験の標準法；承認された基準
ＭＩＣ測定はＧＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｌｔｄ．で調製された抗菌剤または抗真菌剤を含む湿板を用いて行われた。
【００６８】
陽イオン調整済みミューラー・ヒントンブロス（オキソイド社（ベイジングストーク、イギリス）製およびトレック・ディアグノスティック・システムズ社（イースト・グリンステッド、イギリス）製）（連鎖球菌属、コリネバクテリウム・ジャイカムおよびリステリア菌に５％ウマ溶解血を添加）を初回接種時のコロニー形成単位数（ＣＦＵ）／ｍＬが約１０5の状態で使用した。
【００６９】
ヘモフィルス試験培地（０．５％酵母抽出物、ならびにヘマチンおよびＮＡＤ（いずれもオキソイド社製、ベイジングストーク、イギリス）を１５ｍｇ／Ｌずつ含むヘモフィルス試験培地補充物を含むミューラー・ヒントンブロス）がインフルエンザ菌に対して用いられ、約１０5 ＣＦＵ／ｍＬの量で接種された。
【００７０】
添加ブルセラブロス（ＳＢＢ）を約１０6 ＣＦＵ／ｍＬの接種剤を用いて嫌気性菌体に対して使用された。ＳＢＢは１％ペプトン、０．５％ラブ‐レムコ、１％グルコースおよび０．５％塩化ナトリウムからなるブロスに、５μｇ／Ｌのヘミンおよび１μｇ／ＬのビタミンＫ（いずれもシグマアルドリッチ社製）を添加したものである。
【００７１】
酵母および糸状菌のＭＩＣ測定はＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０培地中で行った（ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒはシグマアルドリッチ社製、ＲＰＭＩ  １６４０はインヴィトロジェン社製、ペイズリー、スコットランド）。酵母接種は７．５ｘ１０2〜４ｘ１０3 ＣＦＵ／ｍＬであり、糸状菌接種は約８ｘ１０3〜１ｘ１０5 ＣＦＵ／ｍＬであった。
【００７２】
通常の慣行に従って、ミューラー・ヒントンブロスを含むすべてのプレートを予め用意し、調製日に−７０℃で凍結し、使用日に解凍した。真菌性、ヘモフィルス性および嫌気性の菌のＭＩＣはいずれも同日に調製したプレート上で測定した。
【００７３】
凍結がペプチドの活性に影響を与えるかどうかを評価するため、いくつかのＭＩＣは新たに調製したミューラー・ヒントンブロスを含んだプレートを使って繰り返し測定した。
【００７４】
２．４  対照菌株
以下の対照（標準）菌株を試験菌株のパネルに含有させた。
【００７５】
大腸菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ  ２５９２２）
黄色ブドウ球菌 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ  ２９２１３）
大便連鎖球菌 Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ２９２１２）
肺炎球菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ  ４９６１９）
緑濃菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  ２７８５３）
カンジダ・クルセイ Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ（ＡＴＣＣ  ６２５８）
以下の対照菌株は試験菌株のパネルに追加的に用いられ、必要に応じて、対照薬が範囲内であることを確認するために含有させた。
【００７６】
インフルエンザ菌 Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ＡＴＣＣ  ４９２４７）
カンジダ・パラシローシス Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（ＡＴＣＣ  ２２０１９）
バクテロイデス・フラギリス Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ２５２８５）
エッゲルセラ・レンタ Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ（ＡＴＣＣ  ４３０５５）
３．０  結果
結果をシングルライン表示で表１に示す。繰り返し対照菌株の結果を表２に示す。凍結保存した、あるいは新たに調製したミューラー・ヒントンブロスを含むプレートからの結果を含め、対照菌株の結果は高度に再現性のあるものであることがわかる。なお、プレートを凍結しても、他の細菌株に対するＭＩＣに影響はなかった。
【００７７】
得られたＭＩＣの結果は非常に有望なものであり、ペプチドがかなり広い活性スペクトルを持つことを示している。
【００７８】
【表２】
0005524858.tif 000004
【００７９】
0005524858.tif 000005
【００８０】
0005524858.tif 000006
【００８１】
【表３】
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【００８２】
［実施例２］ペプチド合成
［化学薬品］
保護アミノ酸Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｂｏｃ−４−ｐｈｅｎｙｌ−ＰｈｅおよびＡｃ−Ａｒｇ−ＯＨはバッケム社から購入し、Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン、Ｂｏｃ−３，３−ジフェニルアラニン、Ｂｏｃ−（９−アントリル）アラニンはアルドリッチ社から購入した。ペプチドのＣ末端を形成する、ベンジルアミン、２−フェニルエチルアミン、３−フェニルプロピルアミン、（Ｒ）−２−フェニルプロピルアミン、（Ｓ）−２−フェニルプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−メチルベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−エチルベンジルアミンおよびＮ，Ｎ−ジベンジルアミンは、Ｎ−エチルベンジルアミンをアクロス社から購入した以外は、フルカ社から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢｔ）、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌｏＰ）およびｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）は、フルカ社から購入した。４−ｎ−ブチルフェニルボロン酸、４−ｔ−ブチルフェニルボロン酸、４−ビフェニルボロン酸、２−ナフチルボロン酸、トリ‐ｏ−トリルホスフィン、ベンジルブロミドおよび酢酸パラジウムはアルドリッチ社から購入した。溶媒はメルク社、リーデルデハーン社またはアルドリッチ社から購入した。
【００８３】
［アミノ酸の調製］
Ｂｏｃ−２，５，７−トリ−ｔ−ブチルトリプトファン−ＯＨの調製：Ｈ2Ｎ−Ｔｒｐ−ＯＨ（１．８ｇ、８．８ｍｍｏｌ）およびｔ−ＢｕＯＨ（４．７ｇ、６３．４ｍｍｏｌ）の混合物をトリフルオロ酢酸（１９ｍＬ）中、７０℃で３時間撹拌する。得られたダークブラウンで半透明な溶液を室温で３０分間かけてロータリーエバポレーターで濃縮し、７重量％ ＮａＨＣＯ3を６０ｍＬ滴下することによって粉砕する。得られた灰白色の粒状固体を真空ろ過によって回収した後、室温で２４時間真空乾燥する。生成物は、沸点の近接する混合物である４０％エタノール水溶液から結晶化することにより分離される。その量は一般に粗生成物１ｇに対し、約２０ｍＬである。
【００８４】
粗生成物からの最初の結晶化によって、サンプルに含まれるその他のすべての物質に対し、８０〜８３％、既知のＴＢＴ類似体に対し約９４〜９５％の純度（ＨＰＬＣ）の生成物が分離される。この段階での収率は６０〜６５％である。
【００８５】
Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンのベンジル化：Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（１当量）を９０％メタノール水溶液に溶解させ、弱アルカリ性のｐＨになるまで（リトマス試験紙で確認）炭酸セシウムを添加することにより中和した。溶媒はロータリーエバポレーターで除去し、Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンのセシウム塩中に残存する水をトルエンでの共沸蒸留を繰り返すことによりさらに減少させた。得られた乾燥した塩をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、ベンジルブロミド（１．２当量）を添加した混合物を６〜８時間撹拌した。反応終了後、ＤＭＦを減圧除去すると、標題の化合物を含むオイルが生ずる。このオイルを酢酸エチルに溶解させ、等体積のクエン酸溶液（３回）、炭酸水素ナトリウム溶液および食塩水で洗浄する。標題の化合物は、ジクロロメタン：酢酸エチル（９５：５）を溶離液とするフラッシュクロマトグラフィーにより淡黄色のオイルとして収率８５％で単離された。結晶状のベンジル Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンがｎ−ヘプタンからの再結晶により得られた。
【００８６】
鈴木カップリングの一般的な手順： ジメトキシエタン（６ｍｌ／ｍｍｏｌベンジル Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン）および水（１ｍｌ／ｍｍｏｌベンジル Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン）の混合物を脱気後、ベンジル Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（１当量）、アリールボロン酸（１．５当量）、炭酸ナトリウム（２当量）、酢酸パラジウム（０．０５当量）およびトリ−ｏ−トリルホスフィン（０．１当量）を添加した。反応混合物をアルゴン下に保ち、８０℃に４〜６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物をシリカゲルおよび炭酸ナトリウムの短パッドを通してろ過する。フィルターケーキはさらに酢酸エチルで洗浄した。ろ液を合わせ、減圧下で溶媒を除去した。酢酸エチルおよびｎ−ヘキサンの混合物を溶離液とするフラッシュクロマトグラフィーにより、生成物が単離された。
【００８７】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（ｎ−Ｂｕ）−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの一般的な手順を用いて、４−ｎ−ブチルフェニルボロン酸から標題の化合物を収率５３％で調製した。Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（ｎ−Ｂｕ）−ＯＢｎは酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（８０：２０）溶離液を用いて単離された。
【００８８】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの一般的な手順を用いて、４−ｔ−ブチルフェニルボロン酸から標題の化合物を収率７９％で調製した。Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｎは酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（８０：２０）溶離液を用いて単離された。
【００８９】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの一般的な手順を用いて、４−ビフェニルボロン酸から標題の化合物を収率６１％で調製した。Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）−ＯＢｎは粗生成物をｎ−ヘプタンを用いて再結晶することにより単離された。
【００９０】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの一般的な手順を用いて、２−ナフチルボロン酸から標題の化合物を収率６８％で調製した。Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＢｎは粗生成物をｎ−ヘプタンを用いて再結晶することにより単離された。
【００９１】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（１−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＢｎの調製：鈴木カップリングの一般的な手順を用いて、２−ナフチルボロン酸から標題の化合物を調製した。Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（１−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＢｎは粗生成物をｎ−ヘプタンを用いて再結晶することにより単離された。
【００９２】
ベンジルエステルの脱エステル化の一般的な手法：ベンジルエステルをＤＭＦに溶解させ、パラジウム／炭素（Ｐｄ１０％）を触媒として用いて、大気圧下で２日間水素添加した。反応の終わりに、触媒をろ過により除去し、溶媒を減圧下で除去する。遊離酸はジエチルエーテルからの再結晶により分離する。
【００９３】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−ｎ−Ｂｕ）−ＯＨの調製：脱エステル化の一般的な手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（ｎ−Ｂｕ）−ＯＢｎから標題の化合物を収率６１％で調製した。
【００９４】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨの調製：脱エステル化の一般的な手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＢｎから標題の化合物を収率６５％で調製した。
【００９５】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）−ＯＨの調製：脱エステル化の一般的な手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）−ＯＢｎから標題の化合物を収率６１％で調製した。
【００９６】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＨの調製：脱エステル化の一般的な手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＢｎから標題の化合物を収率６８％で調製した。
【００９７】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＨの調製：脱エステル化の一般的な手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｂｉｐ（４−（２−Ｎａｐｈｔｈｙｌ））−ＯＢｎから標題の化合物を収率６８％で調製した。
【００９８】
ＨＢＴＵを用いた液相ペプチド合成の一般的な手順：以下の一般的な手法に従い、ペプチドはＢｏｃ保護法を用いたアミノ酸の段階的なカップリングにより液相中で合成された。遊離アミノ基（１当量）およびＢｏｃ保護したアミノ酸（１．０５当量）を有するＣ末端ペプチド部分ならびに１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢｔ）（１．８当量）を、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．８当量）を添加する前に、ＤＭＦ（アミノ成分が２〜４ｍｌ／ｍｍｏｌ）に溶解させた。混合物は氷上で冷却し、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．２当量）を添加した。反応混合物を１〜２時間、室温で振盪させた後、酢酸エチルで希釈し、クエン酸、炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄した。溶媒は減圧下で除去し、得られたペプチドのＢｏｃ保護基は無水メタノール中の９５％ＴＦＡまたは塩化アセチルを用いて暗所で脱保護した。
【００９９】
ＰｙＣｌｏＰを用いた液相アミド形成：Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｎ（ＣＨ2Ｐｈ）2の合成：Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ（１当量）、ＮＨ（ＣＨ2Ｐｈ）2（１．１当量）およびＰｙＣｌｏＰ（１当量）を乾燥ＤＣＭ（アルミナでろ過）（２ｍｌ）およびＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させた溶液：溶液を氷上で冷却し、ＤＩＰＥＡ（２当量）を撹拌しながら添加した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を蒸発させた後、酢酸エチルに再溶解させ、クエン酸、炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄した。溶媒は減圧下で除去し、得られたペプチドのＢｏｃ保護基は９５％ＴＦＡを用いて暗所で脱保護した。
【０１００】
ペプチドの精製および分析：水およびアセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡを含む）の混合物を溶離液とし、デルタパック（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ）（ウォーターズ社製、Ｃ18カラム、１００Å、１５μｍ、２５×１００ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。ペプチドは、分析用デルタパック（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ）（ウォーターズ社製、Ｃ18カラム、１００Å、５μｍ、３．９×１５０ｍｍ）のＲＰ−ＨＰＬＣおよびＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ四重極質量分析計（ＶＧインスツルメンツ社製、オルトリンガム、イギリス）による陽イオンエレクトロスプレー質量分析法により分析した。
【０１０１】
［実施例３］トリプシン分解に対する安定性
式ＡＡ1−ＡＡ2−ＡＡ1−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｐｈで表わされる化合物のトリプシン耐性および抗菌活性を調べた。
【０１０２】
［ペプチドの半減期の測定および計算］
それぞれのペプチドを０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させ、最終的なペプチド濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。トリプシン１ｍｇを０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．２）５０ｍｌに溶解させてトリプシン溶液を調製した。安定性の確認のため、新たに調製したトリプシン溶液２５０μｌ、およびペプチド溶液２５０μｌをロッキングテーブル上で３７℃下、０．１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．６）２ｍｌ中でインキュベートした。０．５ｍｌのアリコートを様々な時間間隔でサンプリングし、１％ＴＦＡを含む水：アセトニトリル（６０：４０ ｖ／ｖ）０．５ｍｌで希釈し、上述したＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。３７℃で０時間および２０時間後に採取したトリプシン非添加のサンプルは陰性対照とした。分析の最初の５時間中に採取したサンプルの２５４ｎｍにおけるピーク領域の積算はτ1/2を出すのに使用された。最初の２４時間中に分解しなかったペプチドは安定だと分類された。
【０１０３】
［抗菌性試験］
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２５９２３株、メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）ＡＴＣＣ  ３３５９１株およびメチシリン耐性 表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）ＡＴＣＣ  ２７６２６株）のＭＩＣは、標準法を用いてＴｏｓｌａｂ  ＡＳにより測定した；Ｄ．アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）著、「液状培地での抗菌剤の感受性試験」、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４版（Ｌｏｒｉａｎ，Ｖ．，Ｅｄ．）、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ社、ボルチモア、１９９６年、ｐ．７５−７８
【０１０４】
【表４】
0005524858.tif 000008
【０１０５】
［実施例４］化合物２のインビトロ活性
マウスの皮膚を黄色ブドウ球菌または化膿連鎖球菌に感染させ、３時間間隔で合計３回の処置を行った。最後の処置から３時間後、皮膚生検体を集め、皮膚サンプル中にあるコロニー形成単位数（ＣＦＵ）を計測した。
【０１０６】
結果をマウス１匹当たりのコロニー形成数として、図１および２に示す。
【０１０７】
実験１（図１）では、クリームまたはジェルに化合物２を２％（ｗ／ｗ）含有させたものとして、ネズミの皮膚に塗布した。化合物２を含まない同じクリームまたはジェルを陰性対照（プラセボ）として用いた。化合物２を含むクリームまたはジェルをネズミの皮膚に塗布したとき、陰性対照と比べ、ＣＦＵの数が減少することが明確に示され、化合物２が黄色ブドウ球菌に対して抗菌作用を発現したことを示している。担体、クリームまたはジェルの性質は重要な作用を発現しなかった。
【０１０８】
実験２（図２）では、化合物２を１％または２％のジェルとして２つの異なった濃度で投与した。プラセボジェルおよび既知の抗菌薬「バクトロバン」をコントロールとして使用した。化合物２を含むジェルは、プラセボジェルやバクトロバンよりもＣＦＵの数を減少させるのに効果的であったことがわかる。化合物２を２％含むジェルは、化合物２を１％しか含まないジェルよりも効果を示した。
【０１０９】
［実施例５］感染した爪のモデルにおける紅色白癬菌に対する化合物２のex vivo有効性
この試験の目的は、爪甲真菌症の治療のために、化合物２の抗菌効果（実施例１において説明）を調べることと、これを、ヒトの爪を使ってインビトロでＴＣＣＴＴＭ感染させた爪モデルであるメドファーム社で販売のロセリル（登録商標）と比較することであった。
【０１１０】
［材料］
試験項目１はＨＣｌ塩としての化合物２である。参照項目１はロセリル（登録商標）ネイルラッカーである。
【０１１１】
【表５】
0005524858.tif 000009
【０１１２】
［試験方式］
ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ
・ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍはメドファーム社によって作成された。
・ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍは、供給源の詳細が下記のとおりであるＴ．ｒｕｂｒｕｍを試験菌として用いて確立された。
・ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍはその周辺温度で設定された。ただし、最終細胞のインキュベーションの温度は２５±２℃である。
【０１１３】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍを接種したサブロー・デキストロース寒天（ＳＤＡ）斜面はカーディフ大学から入手した。培養物を最初に爪甲真菌症の患者から単離した。受け取り後直ちに新しいＳＤＡ斜面上２５℃で７日間、継代培養し、参照サンプルはグリセロール溶液中に入れ、極低温にして凍結させた。微生物は残存率を維持するために、３カ月ごとに継代培養した。培養物は、継代培養の後７日間２５℃で保存し、必要になるまで２〜８℃で保存した。
【０１１４】
［方法］
＜予備実験＞
化合物２の調製
化合物２の飽和溶液は、１０ｍｇの化合物２を脱イオン水１ｍｌに溶解させたものを用いて調製した。終夜撹拌した後、混合物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを除去した、２〜８℃で１４日間を超えない程度に保存した。
【０１１５】
プラセボは脱イオン水のみで調製した。
【０１１６】
＜微生物懸濁液の調製＞
サブロー・デキストロース寒天の調製
簡単に言えば、６５ｇの粉状のＳＤＡを１Ｌの脱イオン水に添加した。寒天が目に見えて溶解するまで混合物を加熱した。その後、オートクレーブ中、１２１℃で１５分間殺菌し、５６℃まで冷却してから、２５ｍｌを滅菌した９０ｍｍのペトリ皿に移した。ペトリ皿は使用前に、ラミナーフローキャビネット内で蓋をわずかに（１ｃｍ程度）開けて３０分間放置した。
【０１１７】
リンゲル液の調製
リンゲル液はＳＯＰ ３０８０に記載されているように調製した。この溶液をオートクレーブ中、１２１℃で１５分間殺菌した。
【０１１８】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの懸濁液の調製
（ｉ）９０ｍｍのＳＤＡプレートにＴ．ｒｕｂｒｕｍを添加し、斜面培養物から菌糸体や胞子を滅菌綿棒でそっと除去し、それを寒天表面に移した。
（ｉｉ）寒天プレートを２５℃で７日間インキュベートした。
（ｉｉｉ）リンゲル液（２０ｍｌ）で白色の胞子をプレート表面から洗い流した。
（ｉｖ）胞子懸濁液を滅菌ガーゼ（Ｓｍｉｔｈ+Ｎｅｐｈｅｗ，Ｐｒｏｐａｘ，７．５ｃｍ×７．５ｃｍ，８層織りガーゼスワブ，ＢＰ  Ｔｙｐｅ  １３）でろ過して菌糸体や寒天の細片を除去した。
（ｖ）胞子懸濁液の生菌数を計測し、胞子を適宜希釈または濃縮することにより、最終体積を２０ｍｌ中、胞子数が約１×１０7ｃｆｕ／ｍｌとなるように調節した。
【０１１９】
爪の準備
ヒトの爪先端を切って３ｍｍ×３ｍｍの切片とする前に、爪を冷凍庫から取り出し、ラミナーフローキャビネット内に３０分間置いて室温まで平衡化させた。その後、爪をそれぞれ以下のように軽く洗った：
（ｉ）爪を７０％エタノール水溶液に浸し、１分間ボルテックスした。
（ｉｉ）エタノール溶液をデカントし、新しい７０％エタノール溶液で置換し、さらに１分ボルテックスした。
（ｉｉｉ）エタノール溶液をデカントし、リンゲル液で置換し、１分間ボルテックスし、デカントし、新しいリンゲル液で置換した。このリンゲル液で洗浄するプロセスは３回行い、各段階で洗浄溶液を交換した。
（ｉｖ）洗浄プロセスが終わったら、爪を滅菌したペトリ皿に蓋をせずに置き、室温で３０分間、ラミナーフローキャビネット内で風乾させた。
【０１２０】
方法の説明：ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  ｃｅｌｌｓ
ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  ｃｅｌｌｓは以下のように用いた。
（ｉ）爪を準備したら、ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  ｃｅｌｌｓを組み立てる前に、それぞれの爪の厚みをノギスで測定した。
（ｉｉ）まず、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ（〜１×１０7ｃｆｕ／ｍｌを５μＬ）を爪の裏側に接種し、ラミナーフローキャビネット内で乾燥させ、ＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  ｃｅｌｌに背面を上にして載せた。ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ（４．４±０．２４ｃｍ3容）の半分まで滅菌したリンゲル液で満たした。
（ｉｉｉ）爪の微生物を十分に成長させるため、細胞を２５±３℃で１４日間、インキュベートした。
（ｉｖ）１４日でＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  ｃｅｌｌｓのインキュベーションを止め、化合物２を１０μＬとロセリル（登録商標）とを、微生物懸濁液を接種した側とは反対側の爪表面にそれぞれ別々に塗布した。化合物２およびロセリル（登録商標）を爪表面に塗布した後、細胞は２５±３℃で再びインキュベーションした。
（ｖ）５日間２４時間ごとに複数回に渡って細胞に投与する方法が採られた（表５）。投与前に、爪表面を滅菌したリンゲル液で洗浄し、前に投与した過剰の化合物２およびロセリル（登録商標）を除去した。これを行った後、表５に示す投与法に従って、新たに１０μＬ量の化合物２およびロセリル（登録商標）を適切な細胞に投与した。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
（ｖｉ）５日間投与した後、過剰の化合物２およびロセリル（登録商標）を爪表面からできるだけ除去し、爪をＣｈｕｂＴｕｒ（登録商標）  ｃｅｌｌｓのガスケットから取り外した。その後、爪について、生菌のＡＴＰの存在を分析した。
【０１２３】
［結果と考察］
阻害検査：製剤存在下における消去能
試験品の消去能試験は、既知濃度（ｎ＝３）のＡＴＰ標準品に、１０μＬの化合物２、ロセリル（登録商標）およびプラセボを添加し、それを（試験品を含まない）標準品のみと比較することにより行った。１０ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲において、ＡＴＰ標準品の蛍光強度に対する濃度を示す線形回帰曲線が得られた。種々のマトリックスの存在下でＡＴＰ標準品と比較した結果を図３に示す。２つの製剤の吸収強度は標準品のみと比較して著しい低下を示すため、グラフから、化合物２およびロセリルは、既知濃度のＡＴＰ標準溶液（７５０ｎｇ／ｍＬ）に添加すると消光効果を示すことがわかる。プラセボは標準品のみと著しい差異がないため、消光効果を示さなかった。
【０１２４】
薬品塗布後のＡＴＰの回復
図４は、試験品（ｎ＝３）を塗布した感染した爪サンプルからのＡＴＰ放出の変化ならびに感染対照および非感染対照である非処理の爪サンプルとの比較を示す（対照はｎ＝２で試験した）。回復したＡＴＰの量が少なくなると、試験微生物に対する試験品の効率が高くなることに注目すべきである。非処理の感染対照は予想通りの高いＡＴＰ回復をもたらし、非処理の非感染対照は非常にＡＴＰ回復レベルが低かったことがグラフからわかる。また、化合物２およびロセリル（登録商標）は感染対照およびプラゼボと比べてＡＴＰ回復が少ないことが観察され、試験微生物に対して効率がよいことを示した。プラゼボと非処理の感染対照との間には著しい差はなかった。
【０１２５】
〔実施例６〕
本発明に係る化合物をさらに調製し、さまざまな微生物に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。
【０１２６】
［Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＮＨ（ＣＨ2）2（２−Ｂｒ−ｐｈｅｎｙｌ）］
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅのケン化
ＢｏｃＡｒｇＴｂｔＡｒｇ−ＯＭｅ・２ＨＣｌ（２．５ｇ、２．９ｍｍｏｌ、国際公開第０１／６６１４７号に記載の方法で調製）をＨ2Ｏ（５ｍｌ）およびＴＨＦ（２０ｍｌ）の混合物に溶解させた無色の溶液中に、ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（３７３ｍｇ，８．９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌すると、急速に黄色に着色した：希ＨＣｌ（５２ｍｌ）と飽和食塩水（３５ｍｌ）を添加し、得られた混合物をＤＣＭで抽出した。ＤＣＭを蒸発させ、有機物質をＤＣＭに再び溶解させ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、ろ過および濃縮した。得られたＢｏｃＡｒｇＴｂｔＡｒｇ−ＯＨは２．４６ｇ，９３％であった。
【０１２７】
ＰｙＢＯＰ媒介カップリング
ＢｏｃＡｒｇＴｂｔＡｒｇＣＯ2Ｈ（３６５ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）のＴＦＡ塩を、２−ブロモフェニルエチルアミン（５３μｌ）のＤＭＦ（０．９ｍｌ）溶液と混合し、ＤＩＰＥＡ（１２０μｌ）を混合した。ＰｙＢＯＰ（１９４ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）を添加する前に、反応混合物を室温で５分間撹拌し、その後３時間置いた。ワークアップする前に混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で希釈し、５％クエン酸溶液３０ｍｌで２回、５％ＮａＨＣＯ3溶液３０ｍｌで２回、飽和食塩水３０ｍｌで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥、ろ過、濃縮した。カップリング試薬から生じた副生成物を含むオイル（４３２ｍｇ）として粗生成物が単離された。濃縮、および逆相クロマトグラフィーによる最終精製の前に、この粗生成物を４Ｍ ＨＣｌを１５ｍｌ含む１，４−ジオキサン溶液中に溶解させ、室温で３０分撹拌することによりＢｏｃ基を除去した。
【０１２８】
純度：＞９５％、エレクトロスプレー質量分析（ｍ／ｚ，プロトン化した分子イオン）：８６６．４８／８６８．５６（計算値）、８６６．５／８６８．５（実測値）。
【０１２９】
微生物学的データ
最小発育阻止濃度（ｍｇ／ｌ）、
Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ
【０１３０】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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