(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）で表される遺伝子。（ａ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡ（ｂ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質において、さらに、１８４位および５７２位以外において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ｄ）または（ｅ）で表される遺伝子。（ｄ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列から、シグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ（ｅ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列から、シグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質において、さらに、１８４位および５７２位以外において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターにより形質転換された、形質転換体。
【請求項５】
宿主がアスペルギルス・オリゼである、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換体を、栄養培地を用いて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により製造された、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質を含む、グルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項７に記載のタンパク質を含む、グルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項７に記載のタンパク質を用いる、グルコース測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼに関するものである。また、本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、該グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、及び、該グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーに関するものである。【０００２】
本明細書で用いている略号について以下に解説する。
本明細書では、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨと記載する。また、フラビンアデニンジヌクレオチドをＦＡＤと記載する。また、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨと記載する。
本明細書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱと記載する。また、ＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨと記載する。また、ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨと記載する。
【背景技術】
【０００３】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。
グルコースオキシダーゼは、血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。その理由は、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有しているからである。
グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいて、グルコースの測定は、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることによってなされる。しかし、該測定において、溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。その理由は、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいためである。【０００４】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ（ＥＣ  １．１．１．４７）あるいはＰＱＱＧＤＨ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは、溶存酸素の影響を受けない点で優位である。
しかし、前者のＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨには、安定性が乏しい、あるいは、補酵素の添加が必要であり煩雑である、という欠点がある。一方、後者のＰＱＱＧＤＨには、基質特異性に乏しい、あるいは、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまう、という欠点がある。【０００５】
そこで、ＦＡＤＧＤＨが注目されてきている。その理由は、ＦＡＤＧＤＨが、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているからである。【０００６】
非特許文献１〜４、特許文献１〜３には、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨについて報告されている。【０００７】
特許文献４には、アスペルギルス属由来ＦＡＤＧＤＨが開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。該ＦＡＤＧＤＨの熱安定性については、該ＦＡＤＧＤＨの活性残存率は５０℃、１５分処理後で８９％程度である。該ＦＡＤＧＤＨは、安定性についても優れているとされている。
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８
【特許文献２】ＷＯ２００７／１３９０１３
【特許文献３】ＷＯ２００８／００１９０３
【特許文献４】ＷＯ２００４／０５８９５８
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な、血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、該酵素を遺伝子組み換えにより生産することを視野において、酵素の安定供給という観点から先行技術を再検討した。
その結果、意外にも、大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体は、熱安定性が野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて大きく劣ることが判明した。
例えば、発明者らが後述の方法によりアスペルギルス・オリゼから取得したＦＡＤＧＤＨは、５０℃・１５分処理後、約７７％の活性を維持していたが、大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体の熱安定性は、５０℃・１５分処理後、約１３％しか維持できない程度であった。【００１０】
発明者らは、熱安定性が低下した理由を、大腸菌を宿主として遺伝子組み換えにより生産された酵素には、表面に多糖が付加されていないからであると考えた。
酵素を用いる血糖センサ用チップの作製工程においては、作製者が酵素に加熱乾燥処理を施す場合がある。加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が２０％以上存在する状態であり、好ましくは４０％以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは、６０％以上の残存活性が存在する状態である。
そのような工程において、大腸菌を遺伝子組換え宿主として利用して製造した酵素を用いる場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があるため、発明者らは、該酵素の熱安定性を向上させる必要があると考えた。【００１１】
そこで発明者らは、例えば大腸菌を遺伝子組換え宿主として用いてＦＡＤＧＤＨを製造した場合のように表面に多糖が付加されていなくても、十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な、血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的に、さらに検討を重ねた。
その結果、発明者らは、アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。【００１２】
さらに、アスペルギルス・オリゼ株を宿主として、該遺伝子を発現させた場合には、改変前にくらべてさらに安定性の高い酵素を提供することができることを見出した。【００１３】
すなわち本発明は以下の通りである。
［項１］以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表される遺伝子。
（ａ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｂ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質において、さらに、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｃ）「（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
［項２］以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかで表される遺伝子。
（ｄ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列から、シグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｅ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列から、シグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質において、さらに、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［項３］項１または２に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
［項４］項３に記載の組換えベクターにより形質転換された、形質転換体。
［項５］宿主がアスペルギルス・オリゼである、項４に記載の形質転換体。
［項６］宿主がアスペルギルス・オリゼＮＳ４株である、項５に記載の形質転換体。
［項７］項４〜６のいずれかに記載の形質転換体を、栄養培地を用いて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
［項８］項７に記載の方法により製造された、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［項９］項８に記載のタンパク質を含む、グルコースアッセイキット。
［項１０］項８に記載のタンパク質を含む、グルコースセンサー。
［項１１］項８に記載のタンパク質を用いる、グルコース測定法。【００１４】
なお、これまでＰＱＱＧＤＨの安定性を向上する方策に関する報告としては、ＷＯ０２／０７２８３９があり、その中では遺伝子レベルでの改変手段を用いた検討が報告されているが、ＦＡＤＧＤＨについては、遺伝子レベルでの改変が行われたとの報告はなかった。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の遺伝子
本発明の実施形態の１つは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表される遺伝子である。
（ａ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｂ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質において、さらに、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｃ）「（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ【００１７】
配列番号４５は、「野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナル配列を含む。
シグナル配列は、アスペルギルス等の真核生物によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。
シグナル配列部分は、例えば配列番号４５のような「シグナル配列を含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えたのち切除される。【００１８】
以下、本発明の遺伝子に関連して、次の順序で説明する。
（１）配列番号４５で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、およびそれをコードする遺伝子の入手
（２）野生型アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を改変した改変型のＦＡＤＧＤＨの獲得（配列番号４５で示されるＦＡＤＧＤＨにおいて１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質等の獲得）、およびそれらをコードする遺伝子の入手【００１９】
（１）配列番号４５で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、および、それをコードする遺伝子の入手
配列番号４５で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、およびそれらをコードする遺伝子は、以下の方法により入手した。
本発明者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下ＮＣＢＩと表記）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用いた遺伝子組換え体よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。【００２０】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、自社保有のアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、我々はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。ついで、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。最終的に、この塩基配列を元に、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定、取得した。
その概要を以下の＜実験例１＞＜実験例２＞に示す。【００２１】
＜実験例１＞、
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の推定］
本明細書では、アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼをＡＯＧＤＨと記載する。
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得ることはできなかった。【００２２】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
［ｃＤＮＡの作製］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ  Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
［ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定］
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（１．４％グリシン、０．３％トリス、２０％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号３７）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号３８）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
［ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定］
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．  ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ  ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。【００２３】
＜実験例２＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入］
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３９、４０に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ）を構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号４１）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４５）からなることが明らかとなった。ＲＩＢ４０株から予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸でありＴＩ株  ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。また、ＰＣＲ法を用いて、ＲＩＢ４０株に基づくＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、ＲＩＢ４０株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。【００２４】
（２）野生型アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を改変した改変型のＦＡＤＧＤＨの獲得、およびそれらをコードする遺伝子の入手
次に、野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを、以下の方法により改変した。
その概要を以下の＜実験例３＞に示す。【００２５】
＜実験例３＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の大腸菌への導入］
［１］シグナルペプチドの削除
シグナルペプチド切断後のＦＡＤＧＤＨをｍＦＡＤＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。ここで、Ｓ２は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
Ｓ２では、配列番号４３のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号４４のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配
列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。
なお、この改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
この形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が増大した。【００２６】
［２］ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の改変
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを取得する方法は、特に限定されるものではないが、上記［１］で得た、配列番号２（「配列番号４５においてシグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」の一例）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを用いて、後述のいずれかの位置においてアミノ酸置換を行う方法が例示される。【００２７】
ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。【００２８】
発明者らは、このようにして、「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質」を含む種々の改変型ＦＡＤＧＤＨを獲得した。【００２９】
［３］改変型ＦＡＤＧＤＨを製造する方法
本願発明の別の実施形態は、上記で得られた改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換体、該形質転換体を栄養培地を用いて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法である。【００３０】
アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。【００３１】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主微生物に移入される。
宿主細胞には、大腸菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な細胞が用いられる。本発明の遺伝子はアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするものであるから、それを発現させるための宿主としては、アスペルギルス・オリゼが好ましく、中でもアスペルギルス・オリゼＮＳ４株が好ましい。あるいは、製造が容易であるとの観点から、大腸菌（エシェリヒア・コリー）の宿主−ベクター系を用いることも好ましい選択である。
宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。糸状菌の場合にはプロトプラスト化された細胞等が用いられる。【００３２】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。アスペルギルス・オリゼ株の場合は、好ましくは２０〜４０℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜７２時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変体タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度である。【００３３】
培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従ってＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。【００３４】
このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。【００３５】
本発明の遺伝子の、別の形態
なお、本発明は、請求項１および／または請求項２における「配列番号４５において変異を含むアミノ酸配列」に関し、請求項に記載されたアミノ酸配列以外に、次の（１）〜（３）のいずれかの形態をとりうる。
また、本発明は、請求項１および／または請求項２における「配列番号４５において変異を含むアミノ酸配列」に関し、請求項に記載されたアミノ酸配列にさらに次の（１）〜（３）のいずれかの変異を加えた形態をとりうる。【００３６】
（１）配列番号４５に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＧＤＨにおいて少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する。【００３７】
（２）配列番号４５において、以下に示す群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する。
１４１位、１８１位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、２０１位、３５０位、３５２位、３９０位、４９２位及び５７２位【００３８】
（３）配列番号４５において、アミノ酸置換が以下に示す群のうちいずれかである。
Ｋ１４１Ｅ、Ｇ１８１Ｅ、Ｇ１８１Ｉ、Ｇ１８１Ｐ、Ｇ１８１Ｓ、Ｇ１８１Ｑ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｃ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｌ、Ｓ１８３Ｐ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｌ、Ｇ１８４Ｒ、Ｓ１８５Ｆ、Ｓ１８５Ｔ、Ｓ１８５Ｙ、Ｌ１８６Ａ、Ｌ１８６Ｉ、Ｌ１８６Ｎ、Ｌ１８６Ｐ、Ｌ１８６Ｖ、Ａ１８７Ｃ、Ａ１８７Ｉ、Ａ１８７Ｋ、Ａ１８７Ｌ、Ａ１８７Ｍ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｓ、Ｓ１８８Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｖ、Ｎ１９０Ｋ、Ｎ１９０Ｐ、Ｎ１９０Ｙ、Ｎ１９０Ｗ、Ｌ１９１Ｃ、Ｌ１９１Ｆ、Ｓ１９２Ｉ、Ｓ１９２Ｋ、Ｓ１９２Ｍ、Ｓ１９２Ｑ、Ｓ１９２Ｖ、Ｖ１９３Ａ、Ｖ１９３Ｃ、Ｖ１９３Ｅ、Ｖ１９３Ｉ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ１９３Ｓ、Ｖ１９３Ｗ、Ｖ１９３Ｙ、Ａ２０１Ｇ、Ｖ３５０Ｑ、Ａ３５２Ｃ、Ａ３５２Ｄ、Ａ３５２Ｉ、Ａ３５２Ｋ、Ａ３５２Ｌ、Ａ３５２Ｍ、Ｑ３５２Ｖ、Ｋ３９０Ｒ、Ｋ４９２Ｒ、Ｖ５７２Ａ、Ｖ５７２Ｃ、Ｖ５７２Ｔ、Ｖ５７２Ｑ、Ｖ５７２Ｓ、Ｖ５７２Ｙ、（Ｇ１８１Ｅ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８１Ｉ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８１Ｓ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８１Ｑ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ａ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｃ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｄ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｄ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｅ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｆ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｈ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８３Ｌ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｇ１８４Ｄ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８５Ｆ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８５Ｔ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８５Ｙ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｌ１８６Ａ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｌ１８６Ｉ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｌ１８６Ｐ＋Ｓ１９２Ｋ）、（Ｌ１８６Ｐ＋Ｖ５７２Ｃ）、（Ｌ１８６Ｖ＋Ｖ５７２Ｃ）、（Ａ１８７Ｃ＋Ｓ１８８Ｐ）、（  Ａ１８７Ｉ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｋ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｋ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｍ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｐ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ａ１８７Ｓ＋Ｓ１８８Ｐ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｐ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｙ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｗ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９１Ｃ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｌ１９１Ｆ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｍ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｑ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｓ１９２Ｖ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ａ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｃ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｅ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｍ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｓ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｔ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｗ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ１９３Ｙ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ｖ３５０Ｑ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｃ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｄ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｉ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｋ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｌ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｍ）、（Ｓ１８８Ｐ＋Ａ３５２Ｖ）、（Ｇ１８４Ｋ＋Ｖ５７２Ｃ）および（Ｇ１８４Ｒ＋Ｖ５７２Ｃ）【００３９】
なお、上記のアミノ酸置換の表現方法に関して、「Ｋ１４１Ｅ」は、１４１位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換した改変型であることを意味する。また、置換箇所が複数ある場合は「＋」でつないで併記する。たとえば「Ｋ１４１Ｅ＋Ｓ１８８Ｐ」は、１４１位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に、１８８位のＳ（Ｓｅｒ）をＰ（Ｐｒｏ）にそれぞれ置換した改変型であることを意味する。【００４０】
本発明の遺伝子の、さらに別の形態
また、本発明の別の実施形態は、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかで表される遺伝子である。
（ｄ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列から、シグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｅ）「配列番号４５において１８４位および／または５７２位の変異を含むアミノ酸配列から、シグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質において、さらに、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００４１】
「配列番号４５においてシグナル配列部分の一部または全部が欠失したアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質」の一例を、配列番号２に示す。
配列番号４５と配列番号２の違いは、配列番号４５がＮ末端側にシグナル配列を含むが、配列番号２ではシグナル配列部分の一部または全部が欠失している点であり、配列番号４５のほうが２１アミノ酸分長くなっているが、それ以外は同じである。【００４２】
配列番号２においても、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする部分の変異箇所は、上記に配列番号４５で示したものと同様の形態をとりうる。配列番号２において、これらの変異は、変異箇所の位置をそれぞれ２１ずつ減じた表記により示される。【００４３】
特に、配列番号２における、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。【００４４】
なお、本願発明は、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有するものを含む。
例えば、具体的に「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２のアミノ酸配列と、配列番号２と高い相同性（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列を有する他の種由来のＦＡＤＧＤＨとを、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。より好ましくはアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨとを、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
相同性分析は、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）（ゼネティクス社）を用いて行うことができる。【００４５】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーおよびグルコース測定法
本発明の別の実施形態は、上記の方法により製造されたグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を含むグルコースアッセイキット、該タンパク質を含むグルコースセンサー、および／または、該タンパク質を用いるグルコース測定法である。【００４６】
本発明のグルコースアッセイキットは、上記の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のキットは、該ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のキットにおいて、該ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。【００４７】
本発明のグルコースセンサーは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。【００４８】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。【００４９】
ＦＡＤＧＤＨの活性測定法
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ  ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。【００５０】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。【００５１】
実施例１〜６に、大腸菌を宿主に用いて種々の改変型ＦＡＤＧＤＨを作製し、その熱安定性を評価した結果を示す。また、実施例７〜１０、にアスペルギルス・オリゼを宿主に用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製し、その熱安定性を評価した結果を示す。
【実施例１】
【００５２】
実施例１：グルコース測定系を用いた改変型ＦＡＤＧＤＨ熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、改変型ＦＡＤＧＤＨを約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々の改変型ＦＡＤＧＤＨ（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【実施例２】
【００５３】
実施例２：ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入  
シグナルペプチド切断型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を接種し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調製した。該プラスミドを鋳型として用いＤｉｖｅｒｓｉｆｙＴＭ  ＰＣＲ  Ｒａｍｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた変異処理をそのプロトコールに従って実施し、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【実施例３】
【００５４】
実施例３：改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製
実施例２で調製したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【実施例４】
【００５５】
実施例４：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、３種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら３種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４と命名した。【００５６】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の１６２番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２では１６７番目のセリンがプロリンに４７１番目のリジンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３では１８０番目のアラニンがグリシンに５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４では１２０番目のリジンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリンに３６９番目のリジンがアルギニンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。【００５７】
【表１】
0005408125.tif 000002
【００５８】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１８の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、  グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。【００５９】
上記プラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。【００６０】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、１６種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら１６種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９と命名した。【００６１】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６  、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６では１６３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７では１６３番目のグリシンがロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８では１６３番目のグリシンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９では１６７番目のセリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０では１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１では１６７番目のセリンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２では１６７番目のセリンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３では１７１番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４では５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５では５５１番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６では５５１番目のバリンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７では５５１番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８では５５１番目のバリンがセリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９では５５１番目のバリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表２に示す。【００６２】
【表２】
0005408125.tif 000003
【実施例５】
【００６３】
実施例５；多重変異体の作製と熱安定性
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３４の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。【００６４】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５のプラスミドを鋳型として、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。【００６５】
上記プラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。【００６６】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、５７種の熱安定性の向上した変異体を取得した。
これら５７種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９  ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６と命名した。【００６７】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９  ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ；
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１では１６０番目のグリシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２では１６０番目のグリシンがセリングルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３では１６０番目のグリシンがグルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４では１６２番目のセリンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５では１６２番目のセリンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６では１６２番目のセリンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７では１６２番目のセリンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８では１６２番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９では１６２番目のセリンがヒスチジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０では１６２番目のセリンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１では１６３番目のグリシンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２では１６４番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３では１６４番目のセリンがスレオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４では１６４番目のセリンがチロシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５では１６５番目のロイシンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６では１６５番目のロイシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７では１６５番目のロイシンがアスパラギンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８では１６５番目のロイシンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９では１６５番目のロイシンがバリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０では１６６番目のアラニンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１では１６６番目のアラニンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２では１６６番目のアラニンがリジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３
では１６６番目のアラニンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４では１６６番目のアラニンがメチオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５では１６６番目のアラニンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６では１６６番目のアラニンがセリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがフェニルアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがイソロイシンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステインに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがにチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７では１６７番目のセリンがプロリンに３２９番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがアスパラギン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがリジンｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがロイシン、ＡＯＧＤＨ−Ｍ７３では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表３に示す。【００６８】
【表３】
0005408125.tif 000004
【実施例６】
【００６９】
実施例６：改変型ＦＡＤＧＤＨの取得
改変型ＦＡＤＧＤＨ生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨサンプルとした。表４に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。【００７０】
【表４】
0005408125.tif 000005
【実施例７】
【００７１】
実施例７：アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアスペルギルス・オリゼ株への導入
前出のＡＯＧＤＨ組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ）をＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ処理し、ＡＯＧＤＨ遺伝子断片を切り出した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて、該ＤＮＡ断片の末端平滑化を行った。
一方、ＡｍｙＢプロモーター、ＡｍｙＢターミネーター、アスペルギルスニドランス由来ｓＣ遺伝子を含むｐＵＳＡプラスミド（７．２５ｋｂｐ）をＳｍａＩ処理し、ＡｍｙＢプロモーター直下流を一箇所切断したのち、脱リン酸化処理を実施した。該プラスミドに平滑化した上記ＡＯＧＤＨ遺伝子断片を連結し、組換えプラスミドを構築した（ｐＵＳＡＲ）。
組換えホストにはアスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、非特許文献５に記載されているもので、ｐＵＳＡプラスミドとともに（独）酒類総合研究所より分譲いただいたものである。
形質転換も、非特許文献５に記載の方法を参考に実施した。形質転換で得られた形質転換体については、純化を繰り返し、最終株を選抜した。取得した形質転換体を試験管スケールで、５ｍｌ液体培地（１．５％  大豆ペプトン、１％  マルトエキス、０．１％  ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２０、２％  グルコース、２％  マルトース）で３０℃、２４時間培養したところ培養液１ｍｌ当たり５．０ＵのＧＤＨ活性を確認した。
【非特許文献５】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７
【実施例８】
【００７２】
実施例８：アスペルギルス・オリゼ由来改変型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のアスペルギルスオリゼへの導入
上記組換えプラスミドｐＵＳＡＲを鋳型として、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用い、Ｇ１８４Ｒ＋Ｖ５７２Ｃの変異導入を実施し、改変型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組換えプラスミドｐＵＳＡＲＭを作製した。該組換えプラスミドを用いて同様にアスペルギルスＮＳ４株の組換え体を取得し、ＧＤＨ活性を確認したところ培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性を確認した。
【実施例９】
【００７３】
実施例９：ｒａＡＯＧＤＨ、ｒａｒｍＡＯＧＤＨの取得
実施例７で作製した組換えプラスミドｐＵＳＡＲで形質転換された形質転換体、および、実施例８で作製した組換えプラスミドｐＵＳＡＲＭで形質転換された形質転換体を、それぞれ、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、（１．５％  大豆ペプトン、１％  マルトエキス、０．１％  ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２０、２％  グルコース、２％  マルトース（ｐＨ６．５））培地にて、培養温度３０℃で５０時間培養した。培養菌体をろ過した後、硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて狭雑タンパク質を沈殿させ、遠心分離で上清を回収した。
上清を濃縮・バッファー置換（５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を行い、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを実施し酵素精製標品（順にｒａＡＯＧＤＨ、ｒａｒｍＡＯＧＤＨ）を取得した。【００７４】
また、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃの変異を含む変異酵素をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドにより形質転換した大腸菌についても、１０Ｌ−Ｊａｒ容ジャーファーメンターを用いてｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈを用いて  ３０℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。
これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、イオン交換クロマト、疎水クロマト、脱塩を実施し、酵素精製標品（ｒｍＡＯＧＬＤ）を取得した。【００７５】
ここで、ｒａＡＯＧＤＨは、配列番号４５のアミノ酸配列を有する酵素をアスペルギルス・オリゼで発現させたものである。
また、ｒａｒｍＡＯＧＤＨは、配列番号４６のアミノ酸配列を有する酵素をアスペルギルス・オリゼで発現させたもの（配列番号４５においてＧ１８４Ｒ＋Ｖ５７２Ｃの変異を含む変異酵素をセルフクローニングによりアスペルギルス・オリゼで発現させたもの）である。
また、ｒｍＡＯＧＤＨは、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃの変異を含む変異酵素を大腸菌で発現させたものである。
【実施例１０】
【００７６】
実施例１０：熱安定性、ｐＨ安定性
実施例９で得た精製標品を用いて５０℃で０、１５、３０、６０および１８０分間加熱処理したものについても残存しているグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
また、２０、４０、４５、５０、５５、６０および６５℃の各温度で１５ｍｉｎ保存したものについても同様に活性を測定した。
さらに、種々のｐＨにおける酵素の安定性を調べるために、各精製酵素を含む種々のｐＨ溶液（ｐＨ３．５〜９．０）を調製し、２５℃で１６ｈｒ保存した後、残存しているグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。【００７７】
図１〜３にその結果を示す。いずれも、処理前の活性に対する残存活性の比率をグラフ化して示した。
図１は、本発明の酵素標品の５０℃処理における安定性を示したものである。
図１には図示されていないが、配列番号２のアミノ酸配列を有するに酵素を大腸菌で発現させたものについても同様の評価を行ったところ、１５分処理時における活性残存率は１５％であり、３０分処理時には活性がほぼ消失した。
図２は、本発明の酵素標品の各温度で１５分処理した後の残存酵素活性を示したものである。
図３は、本発明の酵素標品のｐＨ安定性を示したものである。【００７８】
これらの結果より、アスペルス・オリゼを宿主として生産した変異体酵素は、大腸菌をホストに用いて生産した変異体酵素、及びアスペルギルス・オリゼをホストとして生産した非変異体酵素よりも大幅に安定性、ｐＨ安定性が向上していることが確認された。
つまり、変異導入により酵素タンパク質自体を安定化させ、さらに該酵素を大腸菌ではなく、アスペルギルス・オリゼを宿主として生産させることでさらに安定性の高い酵素が取得できることを示したことになる。【００７９】
上記で得られた精製酵素標品について、さらに理化学的特性（至適温度、至適ｐＨ、基質特異性）を検討した結果を、それぞれ図４、図５および表５に示す。
表および図中、ｒｍ、ｒａ、ｒａ−ｒｍはそれぞれｒｍＡＯＧＤＨ、ｒａＡＯＧＤＨ、ｒａｒｍＡＯＧＤＨを示す。
至適温度は、温度の設定以外は［試験例］の活性測定条件に合わせて行い、相対活性を比較した。
至適ｐＨは、ｐＨ７．５以上を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５以下を５０ｍＭのＰＩＰＥＳを用いた以外は［試験例］の活性測定条件に合わせて行い、相対活性を比較した。
基質特異性は、各基質の濃度が終濃度４ｍＭになるよう［試験例］の活性測定条件をモディファイして測定した反応性をグルコースと比較した。【００８０】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上及びｐＨ安定域の増大は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の失活低減に直接結びつくものであり、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の酵素標品の５０℃処理における安定性を示したものである。
【図２】本発明の酵素標品の各温度処理における安定性を示したものである。
【図３】本発明の酵素標品のｐＨ安定性を示したものである。
【図４】本発明の酵素標品の至適温度を示したものである。
【図５】本発明の酵素標品の至適ｐＨを示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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