(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 配列番号2、配列番号3又は配列番号4のいずれかで表される塩基配列、又は
(b) 配列番号2、配列番号3又は配列番号4のいずれかで表される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列、
からなるネコブセンチュウPOS-1タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子の転写産物と、
その転写産物と相補的な塩基配列を含むRNAと、
を含む二本鎖のRNA。
【請求項２】
請求項1に記載の二本鎖RNAであって、ネコブセンチュウPOS-1タンパク質の発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る二本鎖RNA。
【請求項３】
(c) 配列番号1で表される塩基配列、
(d) 配列番号1で表される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列、
のいずれかに記載のネコブセンチュウpos-1遺伝子をベクターに連結して発現可能に構成されているネコブセンチュウpos-1遺伝子発現ベクターであり、
(e) 数塩基以上のリンカー（スペーサー）配列の両端にIR（inverted  repeat:逆位反復）となるようにdsRNA形成部分に対応したDNA配列が配置され、植物体内で高発現するプロモーターによりヘアピン型dsRNAを転写するシステム、又は
(f) 2つのプロモーターからセンスRNAとアンチセンスRNAが転写され、細胞内でハイブリダイズしてsiRNAを産生するシステム、
を有する、ネコブセンチュウpos-1遺伝子発現ベクター。
【請求項４】
ネコブセンチュウに抵抗性を示す植物を生産する方法であって、請求項3に記載のネコブセンチュウpos-1遺伝子発現ベクターを用いて生産されるネコブセンチュウ抵抗性植物の製造方法。
【請求項５】
請求項4に記載の方法によって生産されたネコブセンチュウ抵抗性植物。
【請求項６】
請求項5に記載のネコブセンチュウ抵抗性植物をトラップ植物として利用する工程を含む、ネコブセンチュウの防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコブセンチュウの増殖に必須のｐｏｓ−１遺伝子に関するものである。さらに、本発明は、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉプラスミド（以下、ＲＮＡｉプラスミドという）、ＲＮＡｉプラスミドを導入したネコブセンチュウ抵抗性植物、及びネコブセンチュウの防除方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界的な線虫による農作物の被害は、約８兆円ともいわれ、このうちネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．）による被害は、約半分を占め、経済的に最も大きな損失をもたらす。ネコブセンチュウは約８０種が知られているが、ネコブセンチュウ害のうち９５％はサツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍ．  ａｒｅｎａｒｉａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍ．  ｈａｐｌａ）、ジャワネコブセンチュウ（Ｍ．  ｊａｖａｎｉｃａ）の４種によるもので、さらにこれらの被害の９０％以上はサツマイモネコブセンチュウによるものと推定されている（非特許文献１）。
【０００３】
それぞれの種が広い寄生範囲をもつが、例えば、サツマイモネコブセンチュウの寄生植物は７００種以上にもおよび、国内で被害となる作物はきわめて多く、キュウリ、トマト、ニンジン、メロン、サツマイモは普遍的に被害を受ける作物である。また、被害は鳥取県の県特産品であるスイカ・白ネギの栽培にも見受けられ、防除法の確立が切実に望まれている。
【０００４】
ネコブセンチュウは、土壌中に生息し、植物の根に寄生して根にコブを作り、養分を吸収しながら繁殖する寄生種である。メスの成虫は、あちこちの根の表面付近にゼリー状の大きな塊を尾端から出し、その中に産卵する（図１）。卵から孵化した幼虫は、土の中を移動し新しい根の組織内に侵入する。そして侵入したセンチュウの排泄する刺激物質により、寄生された植物の根の細胞が異常分裂を起こし、コブが形成される。寄生された植物は、このコブが形成されることによって根の組織が破壊され、水分や養分の吸収が悪くなり、寄生植物の種類や栽培法などによって被害状況は異なるものの、草丈の短小、葉色の減退・しおれ、枯れ上がりといった症状を示し、成長が遅くなったり、収穫量が減少したりする（図２）。
【０００５】
さらにまた、ネコブセンチュウの被害は、複合病害が大きいという問題も含んでいる。例えば、ネコブセンチュウとフザリウム菌との関連事例は多数報告されており、これは線虫が病原の媒介役を担うだけでなく、線虫寄生組織が病原体の誘引、侵入、感染、発育、及び発病を促進し、線虫または病原体が単体で働く場合よりはるかに被害が激化する。
【０００６】
現在、ネコブセンチュウの防除法としては、表１に示したように、土壌燻蒸剤を利用する防除法、非土壌燻蒸剤を投与する防除法、対抗植物を利用する防除法、及び緑肥作物等の有機物の施用による防除法などがある（非特許文献２）。
【表１】
0005614610.tif 000002
【０００７】
現在最も有効と考えられている防除法は、クロルピクリンなどの土壌燻蒸剤を利用する方法である。また、ネマトリンなど非土壌燻蒸剤を投与する防除法は、他の土壌微生物に影響がない点で優れている。
この他、栽培することによって積極的に線虫密度を減らす働きのある「対抗作物」を利用した防除方法もある。マリーゴールドなどの対抗植物は、一般的に殺線虫性の物質を含み、または分泌して根辺や植物組織内の線虫の発育を阻害したり死亡させる作用を持つ。土壌線虫は連作障害の主原因と考えられており、対抗作物を輪作したり、畑周辺に植えることで、有害線虫の密度を抑制することができる。
【０００８】
現在のところ、土壌中のセンチュウ密度が高い場合は主に土壌燻蒸剤を使用し、密度が下がった時に非土壌燻蒸剤で抑えるという方法や、対抗植物等を併用するのが効果的と考えられている。
【０００９】
その他、ネコブセンチュウに抵抗性を持った作物の育種も進められており、イチゴ、ラッカセイは線虫抵抗性の品種があり、輪作でも線虫害の軽減が期待できるといわれている。また、わが国ではサツマイモやトマトなどで試験研究が行われ、特にトマトでは一種の野生トマトの抵抗性因子（Ｍｉ因子）を導入して、既に幾つかの優れた経済品種が育成され実用に供されている（非特許文献３）。
【００１０】
また、ネコブセンチュウ抵抗性作物から耐性遺伝子を単離して、これを導入する遺伝子組換え作物の研究もされている。例えば、特許文献１、及び特許文献２ではネコブセンチュウに耐性を示すＭｉ耐性遺伝子を導入した作物について、また特許文献３でもネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を導入した作物について記載されている。
さらにまた、特許文献４では、線虫の食道腺細胞ポリペプチドの合成を阻害する遺伝子組換え作物に関して記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００１−５００００６号公報
【特許文献２】特開２００５−２３７３８０号公報
【特許文献３】再表０３／０８０８３８号公報
【特許文献４】特表２００８−５１５４５８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】線虫の生物学  石橋信義
【非特許文献２】農林水産研究文献解題Ｎｏ．２４
【非特許文献３】農林水産研究文献解題Ｎｏ．７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、土壌燻蒸剤を利用する防除法は、ネコブセンチュウに対して優れた効果を示す一方、眼、のど、鼻を刺激するなどの催涙性の刺激を有し、環境汚染・労働衛生上の観点から世界的に使用を削減・中止する方向に向かっている。また、拮抗する有益生物も減少させることから、農薬施用以前よりも病害虫が増加するという報告もある。
さらに、非土壌燻蒸剤を投与する防除法は、土壌燻蒸剤に比べ防除効果が弱く、また、対抗植物による防除効果も弱く不安定であり、緑肥作物等の有機物の施用による防除法も、効果は小さい。
【００１４】
また、抵抗性品種においても、たとえばラッカセイは、サツマイモネコブセンチュウに対して抵抗性を示しても、キタネコブセンチュウに対して抵抗性がないとの報告や、またトマトのネコブセンチュウ抵抗性の品種は、サツマイモネコブセンチュウやジャワネコブセンチュウにのみ有効で、キタネコブセンチュウには全く無効である（前田速雄：Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属３種のネコブセンチュウに対するトマト品種の抵抗性  関東病虫研報  １３１３２−１３３（１９６６））との報告がある。
さらにまた、Ｍｉ遺伝子は高温条件下では抵抗性が破られやすいとの報告（岡本好一・三井康：トマト抵抗性品種に寄生するサツマイモネコブセンチュウ  日線虫研誌，４，３２−３６（１９７１））や、抵抗性品種であっても連作をつづけることによって、その抵抗性を打破して寄生できる個体群が出現するとの報告（農林水産研究情報  平成１０年  農業研究センター・病害虫防除部・線虫害研究室「抵抗性トマトを加害するネコブセンチュウ系統の出現要因」）もあり、ネコブセンチュウの有効な防除法とはいえない。
【００１５】
さらにまた、ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子を導入した遺伝子組換え作物は、対象となる作物や害虫ごとに有効な害虫抵抗性遺伝子組換え作物を作製するのは、経済的、作業的負担が非常に大きく、さらに遺伝子組換え作物を嫌う風潮から、特に日本では、現実的に商品化が難しいという問題がある。また、特許文献４に記載される食道腺細胞分泌ポリペプチドは、植物の根の細胞壁を消化する酵素であるが、この酵素に対応するＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉという）の効果は、線虫がいったん根に侵入しなければ起こらないものであり、ＲＮＡｉの効果が疑問視される。
【００１６】
そこで、本発明において解決しようとする課題は、土壌燻蒸等に代わる、低コスト・軽労力ならびに安全かつ環境にやさしい持続的栽培が実現できる斬新かつ有効なネコブセンチュウの種特異的な防除法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明者は、ネコブセンチュウの増殖に必須のｐｏｓ−１遺伝子を発見し、ＲＮＡｉにより特異的にネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現を抑制し、ネコブセンチュウの増殖を阻害する方法を開発した。
さらに、ＲＮＡｉによりネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現が特異的に抑制されるようＲＮＡｉプラスミドが導入された遺伝子組換え作物にネコブセンチュウの幼虫を誘引し、この遺伝子組換え植物の根から侵入させ、幼虫が根の組織を摂食することによって幼虫の体内に二本鎖ＲＮＡが取り込まれ、この結果、幼虫の子孫の胚を死滅させるという新たな駆除法を開発した。
【００１８】
本発明は、特に、ネコブセンチュウの好む植物を「トラップ植物」として利用する防除方法に特徴を有する。すなわち、ネコブセンチュウの好む植物を、ＲＮＡｉによりネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現が特異的に抑制するよう作製された遺伝子組換え作物として用いて、ネコブセンチュウを故意に遺伝子組換え作物に侵入させるものである。侵入した線虫はＲＮＡｉ効果により不稔となる。このように「トラップ植物」自体は食用ではなく、「植物農薬」としての働きをする。
また、食用でないことから花芽も花粉も果実も全く必要としないので、花粉の飛散を避けるため、花芽を摘み取る、若しくは遺伝子操作にて花芽を形成させないなどの処理が可能であり、バイオハザードの観点からも問題がない。
【００１９】
すなわち、本発明によれば、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子であって、（ａ）配列番号１で表される塩基配列（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列のいずれかの塩基配列からなる遺伝子が提供される。本発明にかかる上記塩基配列からなる遺伝子は、ネコブセンチュウのＰＯＳ−１タンパク質をコードすることから、この遺伝子の発現を抑制すると、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の発現を制御することが出来る。
【００２０】
また、本発明によればネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子の転写産物であって、（ｄ）配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで表される塩基配列（ｅ）配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列（ｆ）配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで表される塩基配列からなるＲＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＲＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡが提供される。
【００２１】
また、本発明によれば上記のネコブセンチュウｐｏｓ−１ＲＮＡと、前記ネコブセンチュウｐｏｓ−１ＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖のＲＮＡが提供される。
【００２２】
また、本発明によれば上記の二本鎖ＲＮＡであって、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の発現量を低減させるためのＲＮＡｉ分子として作用し得る二本鎖ＲＮＡが提供される。この二本鎖ＲＮＡは、上記のネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の転写産物にＲＮＡｉ分子として作用し、該遺伝子の発現、すなわち転写又は翻訳を阻害する。前記ｐｏｓ−１遺伝子の転写又は翻訳を阻害すると、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の発現が抑制される。該タンパク質の発現を抑制すれば、ネコブセンチュウの細胞極性が制御される。
【００２３】
また、本発明によれば上記のネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子をベクターに連結して発現可能に構成されているネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子発現ベクター（ＲＮＡｉプラスミド）が提供される。このＲＮＡｉプラスミドは、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子が発現するように構成されており、このベクターが植物に導入されると、植物細胞内でネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の転写産物の発現が抑制され、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の発現が制御される。
【００２４】
また、本発明によればネコブセンチュウに抵抗性を示す植物を生産する方法であって、上記ＲＮＡｉプラスミドを用いて生産されるネコブセンチュウ抵抗性植物の製造方法が提供される。
【００２５】
また、本発明によれば上記の方法によって生産されたネコブセンチュウ抵抗性植物が提供される。このネコブセンチュウ抵抗性植物は、上記ＲＮＡｉプラスミドが導入された植物であり、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現を制御する二本鎖ＲＮＡが細胞内で合成される。このＲＮＡｉ作用により、ネコブセンチュウのＰＯＳ−１タンパク質の合成が制御される。よってこの構成により、ネコブセンチュウに対する抵抗性を示す植物を作製することができる。
【００２６】
また、本発明によれば上記のネコブセンチュウ抵抗性植物をトラップ植物として利用する工程を含む、ネコブセンチュウの防除方法が提供される。このネコブセンチュウ抵抗性植物はネコブセンチュウに抵抗性を示すことから、トラップ植物として他の作物といっしょに栽培することで、この植物にネコブセンチュウを積極的に寄生させ、土壌中のネコブセンチュウの数を減らすことができ、他の作物の被害を抑えることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、本発明にかかるネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質は、ネコブセンチュウの増殖に必須の細胞極性に寄与するタンパク質であるため、このタンパク質の発現を制御した組換え植物による防除方法は、有益な他の土壌線虫に影響を与えることなく、種特異的にネコブセンチュウの増殖を阻害することができ、大幅に農薬を減らすことが可能となり、低コスト・軽労働ならびに安全かつ環境にやさしい。
また、本発明にかかる組換え植物は「トラップ植物」として利用するため、多くの作物の栽培に利用でき、商品作物栽培中でも裁植が可能であり、花芽を摘み取るなどによりバイオハザードの面でも安心である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はサツマイモネコブセンチュウを示す図である。
【図２】図２はサツマイモネコブセンチュウによる被害を示した図である。矢印で示した部分は、寄生したサツマイモネコブセンチュウによって肥大した根である。
【図３】図３はＲＮＡｉ作用の説明図である。
【図４】図４はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＰＯＳ−１とＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ  ＰＯＳ−１のアミノ酸配列を比較した図である。
【図５】図５はＣ．ｅｌｅｇａｎｓに対するネコブセンチュウｐｏｓ−１  ＲＮＡｉ効果を示した図である。
【図６】図６はネコブセンチュウに対するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｐｏｓ−１  ＲＮＡｉ効果を示した図である。
【図７】図７はネコブセンチュウに対するネコブセンチュウｐｏｓ−１  ＲＮＡｉ効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
＜ＰＯＳ−１タンパク質の説明＞
本実施の形態は、ネコブセンチュウの増殖に必須のＰＯＳ−１タンパク質に関する。また、本実施の形態では、ＰＯＳ−１タンパク質の発現を制御することで、ネコブセンチュの増殖を阻害するものである。
【００３０】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）では、ＰＯＳ−１（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）タンパク質は、受精卵が第一分裂を行なう際に後方側（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）に分配され、細胞の極性（前後軸形成）に寄与することが知られている。ここで受精卵の後方とは、精子の侵入点であり、精子の侵入が引き金となって前後軸が決定されるといわれている。また、第一分裂は非対称的な不等分裂で、後方の小さい細胞が生殖系列細胞となる。
また、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは、胚発生初期に必要な遺伝子発現はほとんど母親（卵子）由来であることがわかっており、ＰＯＳ−１タンパク質の主要な機能は、生殖細胞系列（Ｐ細胞系列）に分配蓄積されるａｐｘ−１（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｐｈａｒｙｎｘ  ｅｘｃｅｓｓ）遺伝子などの母性ｍＲＮＡの翻訳制御だといわれている（Ｔａｂａｒａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｏｇｕｒａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。すなわち、ＰＯＳ−１タンパク質は標的ｍＲＮＡと結合することにより、翻訳を阻害すると考えられているが、詳細は分かっていない。
しかしながら胚発生は、細胞分裂を繰り返す細胞分裂期、細胞が分化する形態形成期を経て、孵化へと至ることから、細胞の極性に寄与するＰＯＳ−１タンパク質は卵の成熟に必須なタンパク質であり、これが欠損すると胚発生が停止し、重篤な胚性致死が誘起され、卵から幼虫に孵化することができない。
【００３１】
これに対して、これまでネコブセンチュウのＰＯＳ−１タンパク質については知られておらず、以下で詳細に説明するが、本実施の形態では、初めてネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の同定に成功し、次いで遺伝子配列の決定に成功したものである。
さらに、本実施の形態では、ＲＮＡｉによるネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現を抑制することで、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の制御に成功し、新たなネコブセンチュウの駆除法を開発したものである。
【００３２】
＜ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質及び遺伝子発見の経緯＞
図４に示すように、本発明では、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＰＯＳ−１タンパク質のアミノ酸配列を基に、ネコブセンチュウのデータベース（ＮｅｍａＢａｓｅ  ＥＳＴ）に存在するｃＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を検索し、相同タンパク質を調査した。ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）とは、ある組織において発現しているタンパク質のｍＲＮＡ配列に由来するｃＤＮＡ配列を部分的に決定したものをいい、イントロンが除去されたｃＤＮＡ配列であるという特徴をもつ。検討を重ねた結果、アミノ酸配列の相同性は２０％と低いものの、多数の候補の中から配列番号５で表されるタンパク質に注目した。
【００３３】
このタンパク質は、図４に示されるように、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＰＯＳ−１タンパク質のアミノ酸配列との相同性は２０％程度と低いものであるが、Ｃ−Ｘ８−Ｃ−Ｘ５−Ｃ−Ｘ３−Ｈで表される、ＲＮＡ結合モチーフといわれるジンクフィンガーモチーフを２箇所有していた。このジンクフィンガーモチーフは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＰＯＳ−１タンパク質にも含まれており、ＰＯＳ−１タンパク質に共通して保存されていることが分かった。
【００３４】
次に上記Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＰＯＳ−１タンパク質と相同性を示すタンパク質をコードするＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ  ｃＤＮＡの塩基配列を基にＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法を行った。
【００３５】
＜用語の説明＞
本明細書において、各種用語の意味は、下記の通り定義するものとする。
【００３６】
（１）線虫
線虫は非常に多様性に富み、１億種を超えるともいわれ、地中生活種、淡水生活種、海水生活種、寄生種などがあり、このうち寄生種は約８万種といわれている。
線虫の一種であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓは、後生動物でありながら体が小さく、細胞数が少なく、しかも培養がたやすいこと等からモデル生物として確立された。自由生活性で、実験室では寒天培地上に生やした大腸菌を餌として飼育される。１９９８年に多細胞生物として初めて ９７Ｍｂ の塩基配列読み取りが完了し、６本の染色体上に約 １９０００0 個の遺伝子の存在が予測され、受精卵から成虫に至る全細胞の発生、分化の過程が細胞系譜として明らかになっている。
またＲＮＡｉについて最初に報告されたのも、線虫を用いた研究である（Ａ．Ｆｉｒｅ，Ｓ．Ｘｕ，Ｍ．Ｋ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｓ．Ａ．Ｋｏｓｔａｓ，Ｓ．Ｅ．Ｄｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｃ．Ｍｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６（１９９８）。
【００３７】
（２）ネコブセンチュウ
これに対してネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．）（図１）は、寄生種である。詳細は前述したが、本発明においてネコブセンチュウとは、例えば、キタネコブセンチュウ、サツマイモネコプセンチュウ、ジャワネコブセンチュウ、及びアレナリアネコブセンチュウなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００３８】
（３）ＲＡＣＥ法
ＲＡＣＥ法は、得られたｃＤＮＡの情報を基にさらに上流や下流をクローニングする方法で、標的ｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行ない、得られたｃＤＮＡを基にＰＣＲにより全長ｃＤＮＡを合成することが出来る（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｄｕｓｈ，Ｍ．Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５，８９９８−９００２）。未知領域がｍＲＮＡの上流（５’側）にある場合を５’ＲＡＣＥ、下流（３’側）にある場合を３’ＲＡＣＥという。
【００３９】
３’ＲＡＣＥは、５’末端にアダプター配列の付いたオリゴ（ｄＴ）をプライマーにして逆転写反応を行いｃＤＮＡ（第１鎖）を合成する。できた第１鎖ｃＤＮＡはすべてアダプター配列が末端に付いた構造をしている。このためクローニングを目的とするｃＤＮＡは、未知領域が既知配列とアダプター配列に挟まれた形になる。そこで、既知配列の一部をセンスプライマー（ＧＳＰ１）としてアダプタープライマーとＰＣＲを行うことによって、両者に挟まれた未知領域を増幅することが可能になる。しかしこの第１段階のＰＣＲでは、用いた二つのプライマーのうち、一方のアダプタープライマーは逆転写反応によって生成された全ｃＤＮＡに共通に含まれる配列であり、ＰＣＲの特異性はＧＳＰ１のみに依存している。したがってこの段階で得られる生成物は、非特異的バックグラウンドが極めて多い。そこで、バックグラウンドを軽減する手段としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行う。ＧＳＰ１の下流の既知領域に、同じく目的のＤＮＡに特異的なセンスプライマーのＧＳＰ２をデザインし、ＧＳＰ２とアダプタープライマーでｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行いシークエンスして確認する。
【００４０】
５’ＲＡＣＥは、上流の未知領域を得るために、既知配列を基に遺伝子特異的なアンチセンスプライマー（ＧＳＰ１）を合成し、ＧＳＰ１をプライマーとした逆転写反応を行う。その後、ｃＤＮＡと２本鎖を作っているｍＲＮＡをＲＮａｓｅＨで分解すると、１本鎖のｃＤＮＡ（第１鎖）が得られる。このＤＮＡは５’末端にＧＳＰ１の配列を持ち、３’末端が未知の配列で終わっている。この未知配列をＰＣＲで増幅するには第１鎖ｃＤＮＡの３’末端にアンカー配列を付加する必要があるので、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）でヌクレオチドホモポリマーをアンカー配列として付加する。アンカー配列を付加した後で、アンカー配列に相補的なヌクレオチドポリマーを３’末端にもつアダプタープライマーと遺伝子特異的なアンチセンスプライマー（ＧＳＰ２）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行えば、５’上流の未知領域を含むｃＤＮＡが増幅される。
【００４１】
（４）遺伝子発現
遺伝子発現とは、遺伝子の情報が細胞における構造および機能に変換される過程をいう。具体的には、遺伝情報に基づいてタンパク質が合成されること、又はｍＲＮＡの合成をいう。
【００４２】
（５）ハイブリダイズ
ハイブリダイズするとは、あるヌクレオチドに対し、別のヌクレオチドが水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべきヌクレオチドには同条件では結合しない状態をいう。必ずしも、他の全てのヌクレオチドに対して特異的である必要は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。ハイブリダイズの条件は、そのヌクレオチドの使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとしてのヌクレオチドであれば、ＰＣＲでのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選択される。
【００４３】
（６）ストリンジェントな条件
ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼイション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。
【００４４】
（７）核酸増幅法
核酸増幅法としては、標的の核酸を増幅させる方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよいが、プライマー及びプライマーセットを用いる方法として、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法あるいは他の核酸の協奏的核酸増幅方法が用いられる。特にＲＮＡを増幅する際には、逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それと同時或いはそれに引き続いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の核酸産物を増幅させるＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  ＲＴ−ＰＣＲ法など）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法あるいは他の核酸の協奏的ＲＮＡ増幅方法が用いられる。
【００４５】
更に、ＲＮＡ増幅法としては、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、上記のＬＡＭＰ法に加え、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法等を用いることもできる。これらの方法の概略は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定核酸配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うというものである。
【００４６】
更に、他の核酸増幅法として、ＩＣＡＮ法を用いることもできる。これらの方法の概略は、標的となるＲＮＡに対して、逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それと同時或いはそれに引き続いて、ＲＮＡ−ＤＮＡからなるキメラプライマー、転写酵素により、ＲＮＡを含む２本鎖ＤＮＡを合成し、その２本鎖ＤＮＡにリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が切れ目を入れることで、標的ＲＮＡ由来の特定核酸配列を含むＤＮＡを生産する鎖置換連鎖反応を行うというものである。
【００４７】
（８）相同性
相同性とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合は間隙を導入した上で、目的の塩基と同一である候補配列中の核酸塩基数のパーセントとして定義される。この際に、同一の塩基（チミンとウラシンも同一とみなす）を有するＤＮＡとＲＮＡとは結合特性が非常に近いため、同一の核酸塩基として定義される。相同性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ又はＡＬＩＧＮのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能であるが、ｂｌａｓｔ２ｓｅｑにおいて標準的な初期パラメーターを用いて計算された値を用いることもできる。
【００４８】
（９）相補性
相補性とは、核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度等の試薬組成および温度）において、所定のＤＮＡまたはＲＮＡおよびそれと完全に相同な核酸に対して、高効率にハイブリダイゼイション可能であることを意味する。
【００４９】
以下、本発明の実施の形態について、説明する。
【００５０】
＜ＲＮＡｉ＞
本実施の形態は、ネコブセンチュウｐｏｓ−１ＲＮＡと、前記ネコブセンチュウｐｏｓ−１ＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖ＲＮＡであって、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の発現を低減させるためのＲＮＡｉ分子として作用し得る二本鎖ＲＮＡである。後述の実施例に示すように、本実施形態における前記二本鎖ＲＮＡは、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子の転写産物であって、（ｄ）配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで表される塩基配列（ｅ）配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列（ｆ）配列番号２、配列番号３又は配列番号４のいずれかで表される塩基配列からなるＲＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＲＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡと、前記ネコブセンチュウｐｏｓ−１ＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖ＲＮＡであるので、ＲＮＡｉ作用によりネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の転写または翻訳を阻害するため、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質の合成が制御され、ネコブセンチュウの増殖が阻害される。
【００５１】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）が引き金となり、そのアンチセンス鎖と相補的な配列を持つｍＲＮＡが切断される機構である。本実施形態においてＲＮＡｉは、転写後の遺伝子発現の抑制として知られる転写後遺伝子サイレンシング（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＰＴＧＳ）でもよく、遺伝子からｍＲＮＡへの転写そのものを抑制する転写時サイレンシングでもよい。
前者は、外から細胞内に導入されたｄｓＲＮＡによって、配列特異的に標的ｍＲＮＡが分解され、結果として標的遺伝子の発現が抑制されるという現象である。図３に示したように、細胞内に取り込まれたｄｓＲＮＡは、細胞内に導入されると、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるリボヌクレアーゼによって２塩基の３’突出末端をもった２１〜２３塩基程度の短いｄｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）に切断される。このｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、配列特異的に標的ＲＮＡを切断する際のガイド配列として働く。
後者は、遺伝子のプロモーター領域でＤＮＡのメチル化の誘発を介した遺伝子発現抑制システムである。
【００５２】
線虫にＲＮＡｉを起こすためのｄｓＲＮＡを導入する方法は、顕微注入法、浸漬法及び摂食法などである。顕微注入法はＲＮＡを線虫体内に注射する方法で、特別な装置及び技術を必要とし、煩雑かつコスト高である。浸漬法は、線虫類をＲＮＡ溶液に漬すだけで極めて簡便な方法である。摂食法は、線虫類が２本鎖ＲＮＡを合成する組換え微生物を摂取することによりＲＮＡｉを誘導する方法である。
本実施の形態においては、上記いずれの方法を用いても良いが、適宜目的に合った方法を選択できる。
【００５３】
＜ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子発現プラスミド（ＲＮＡｉプラスミド）＞
本実施の形態は、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子をベクターに連結して発現可能に構成されているＲＮＡｉプラスミドである。また、本実施の形態のＲＮＡｉプラスミドは、植物細胞に導入され二本鎖ＲＮＡを発現する。これを寄生したネコブセンチュウが摂食すると、ネコブセンチュウの体内に取り込まれ、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の転写又は翻訳を阻害する。あるいは、上記二本鎖ＲＮＡは、ネコブセンチュウの体表から直接取り込まれ、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の転写又は翻訳を阻害する。
【００５４】
本実施の形態において、ＲＮＡｉ用ベクターに連結する遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列の全部又はその一部からなるＤＮＡであって、作製されたＲＮＡｉプラスミドより産生される二本鎖ＲＮＡによりｐｏｓ−１タンパク質の発現量を低減させるためのＲＮＡｉ効果を有する遺伝子を用いることができる。また、このような遺伝子は、例えば対象となるＲＮＡ領域に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、Ｔベクターにサブクローニングすることによって得られる。
一般に、ＲＮＡｉプラスミドに連結する遺伝子は、発現抑制の対象となる遺伝子の開始コドンの下流５０〜１００ｂｐを用いることが好ましく、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）は避けることが好ましい。
【００５５】
植物形質転換に用いる組換えベクターは、上記の本実施形態の遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物細胞に目的遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられるがこれらに限定されるものではない。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物細胞に感染させると、ベクター上にあるＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれているＬＢ配列およびＲＢ配列ではさまれた部分のＤＮＡを植物の核ＤＮＡに組み込むことが可能である（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０（３），６９７−７０４（１９９１））。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００５６】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域内に、目的遺伝子を含む遺伝子カセットを挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌株Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等用いて導入し、該アグロバクテリウムを植物細胞の形質転換に用いる。
【００５７】
また、上記の方法以外にも、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４））によって、植物細胞形質転換用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド(例えば、ｐＲＫ２０１３等)を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリンおよびカナマイシンを含む培地上で培養することにより植物細胞形質転換用のアグロバクテリウムを得ることができる。
【００５８】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが採用される。詳しいベクターの作製方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．に記載されており、このような方法を用いて作製できる。
【００５９】
また、組換えベクターには、目的遺伝子以外にプロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ配列、選抜マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、必要に応じて、アグロバクテリウム細菌中で増幅するための複製開始点などを配置することができる。
【００６０】
本実施形態に用いられるベクターは、ＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現するベクターであって、ＲＮＡｉを引き起こすｄｓＲＮＡをヘアピン型として発現するベクターでもよく、タンデム型として発現するベクターでもよく、これに限定されるものではない。
ヘアピン型は、数塩基以上のリンカー（スペーサー）配列の両端にＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ：逆位反復）となるようにｄｓＲＮＡ形成部分に対応したＤＮＡ配列を配置し、植物体内で高発現するプロモーターによりヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写し、細胞内でｓｉＲＮＡを産生するシステムである。
タンデム型は、２つのプロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが転写され、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを産生するシステムである。
【００６１】
＜形質転換＞
形質転換とは、外因性のＤＮＡ配列（例えば、ベクター、組み換えＤＮＡ分子）を細胞またはプロトプラストに導入し、その細胞またはプロトプラストの遺伝的性質を変えることをいう。
本実施形態の形質転換植物は、上記の組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換することによって作出することができる。形質転換植物を作出する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられるが、アグロバクテリウム法が好ましい。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、培養細胞を用いる場合、組織を用いる場合がある。
【００６２】
本実施の形態では、宿主植物として、ネコブセンチュウの好む植物を用いることが好ましい。例えば、これに限定されないが、トマト、サツマイモ、ジャガイモ、キュウリ、ニンジン、スイカ、ネギなどの野菜、トウモロコシ、コムギなどの穀物、エンドウマメなどのマメ科の植物、および他の根、塊茎または種子作物、観賞用植物および針葉樹などである。
【００６３】
本実施形態では、これに限定されないが、例えばトマトを用いることがより好ましい。ネコブセンチュウは、トマトに対する嗜好性が高いことから、この作出したネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子組換えトマトを他の作物などと一緒に植えておくと、ネコブセンチュウが該遺伝子組換えトマトの根へ積極的に誘導されることとなり、その結果、他の作物への被害が低減されるからである。
【００６４】
また本実施の形態では、宿主細胞タイプは、例えば、胚形成組織、カルス組織Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、胚軸、成長点、根の組織、師部における発現のための組織における細胞などである
【００６５】
＜植物再生および繁殖＞
本実施の形態では、形質転換後、植物は、当該分野で標準的であるように、例えば、単一の細胞、カルス組織、または葉片から再生され得る。ほとんどすべての植物は、その植物の細胞、組織および器官から全体として再生され得る。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌら（１９８４）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ）；およびＷｅｉｓｓｂａｃｈら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に概説される。
【００６６】
懸濁培養の成長の間、小細胞凝集物（１０〜１００個の細胞）を、外見上より大きい細胞の塊から形成して、その培養物に分散した外見を与える。固体培地へのこれらの細胞をプレートする際、体細胞胚の発達が誘導され、そしてこれらの胚が成熟され、出芽され、そして繁殖力のある種子を保有する植物へと成長することができる。あるいは、固体培養培地上で成長しているカルス細胞は、体細胞胚を形成するように誘導され、それから繁殖性の種子保有植物が発達し得る。胚形成、再生および植物の繁殖性の特徴は、懸濁培養中で時間の関数として徐々に失われる。懸濁細胞の凍結保存によって、培養物の発育が停止され、そして凍結保存期間の間のこれらの特徴の喪失が妨げられる。
【００６７】
次いで、形質転換された植物を成長させて、同じ形質転換された株または異なる株で受粉させてもよく、そして所望の表現性の特徴の発現を有する得られた系統が同定される。所望の表現性の特徴の発現が安定に維持されかつ遺伝されることを確実にするために２つ以上の世代を成長させて、次いで種子を回収して所望の表現性の特徴の発現が達成されていることを確認してもよい。
【００６８】
＜ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子発現の抑制＞
ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子発現の抑制とは、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡの生成のレベルの減少を意味する。本実施の形態では、抑制の結果は、例えば上記二本鎖ＲＮＡを導入したセンチュウの孵化率を調べることによって、または上記二本鎖ＲＮＡを導入したセンチュウを植物の根に寄生させた後、根の変化を調べることによって、ＲＮＡｉ効果を直接的に確認できる。また例えば、ＲＮＡｉプラスミドで形質転換された遺伝子組換え作物にネコブセンチュウを寄生させた後、根の変化を調べることによって確認できる。
より詳細には、２本鎖ＲＮＡ溶液にネコブセンチュウを漬けて２本鎖ＲＮＡを取り込ませた後、次世代のネコブセンチュウの孵化率によって、またはこのネコブセンチュウをトマトの根に感染させ、培養した根の形状を観察することによって、ネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子の発現の制御を確認することができる。さらには、ネコブセンチュウの嗜好性の強い作物であるトマトを上記の方法によってＲＮＡｉプラスミドで形質転換させ、この遺伝子組換えトマトにネコブセンチュウを寄生させ、生じたネコブを観察することによりネコブ被害指数を算出することができる。ネコブ被害指数は、例えば、以下の表２に基づいて算出することができる。
【表２】
0005614610.tif 000003
このようなネコブセンチュウの増殖阻害効果は、ポット試験にて検証することができる。
【００６９】
＜圃場試験＞
圃場試験においては、遺伝子組換え作物をフィールドに持ち出す場合、バイオハザードを懸念した制約（安全性の確保）がある。最大の問題は花粉の飛散であると考えられるが、本トラップ植物は根にネコブセンチュウを感染させることが重要であるから、花芽を剪定することにより花粉の飛散を回避できる。この段階では、密閉した圃場試験が可能な研究施設の利用が必要になる。
【００７０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
（材料と方法）
（クローニング）
ＥＳＴ配列より取得した、ネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を基に、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法により全長のｃＤＮＡを取得した。具体的には、以下の手順で行った。
（１）ＥＳＴ配列よりネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を取得した。このＥＳＴの配列は開始メチオニンに対応するＡＵＧが含まれていたが、ストップコドンは含まれていなかったので、次に３’ＲＡＣＥを実施した。
【００７２】
（２）３’ＲＡＣＥ法
＜ｍＲＮＡの調整＞
ネコブセンチュウをトマトに感染させ、大量にネコブを作らせた。このコブを切り出して滅菌水に漬け線虫を放出させ、ベルマン法（濾過）により線虫を分離した。次に、回収した線虫をポッター式ホモジナイザーを用いて破砕し、線虫破砕液を回収した。線虫破砕液から、フェノールとチオシアン酸グアニジンを含むＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製  Ｎｏ.３１１−０２５０１）を用いた液相分離法により全ＲＮＡを回収し、その後Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ニッポンジーン社製  Ｎｏ.３１７−０５６４１）を用いて、ｍＲＮＡを調製した。
具体的には、試料にＩＳＯＧＥＮを加えて溶解またはホモジナイゼーションした後、クロロホルムを加えて遠心分離し、ＲＮＡが存在する水相を採取してイソプロパノールを加えて沈殿させｍＲＮＡを回収した。その後、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出するため、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡと反応性の高いＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞  を用いてＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを補足し、その後スピンカラムを用いて迅速に洗浄・溶出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを得た。
【００７３】
＜ｃＤＮＡの合成と増幅＞
ＴａＫａＲａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０（ＴａＫａＲａ社製  Ｎｏ．ＲＲ０１９Ａ）を用いて、逆転写反応による１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った後、これを鋳型としてＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲではＥＳＴ配列に基づいて設計したＭｉ−ｐｏｓ１−ＦＷ１配列（配列番号６）プライマーとＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（配列番号８）を、その後のＰＣＲではＭｉ−ｐｏｓ１−ＦＷ２（配列番号７）プライマーとＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（配列番号８）を用いた。
Ｍｉ−ｐｏｓ１−ＦＷ１  ５’−ＧＣＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣ−３’  （配列番号６）
Ｍｉ−ｐｏｓ１−ＦＷ２  ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＡＴＧＣ−３’  （配列番号７）
Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４    ５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号８）
逆転写反応は、４２℃で６０分の後、９５℃で５ 分、５℃で５ 分で反応させた。また、その後のＰＣＲは、９４℃で３０秒、５５℃で ３０秒、７２℃ で１分を３０サイクル反応させた。 遺伝子増幅装置は、ＡＢ社製のＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ２７２０を用いた。
【００７４】
（３）クローニング
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔを用いてＴＡ クローニング（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｅａｓｙ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）し、形質転換株よりプラスミドを調製し、塩基配列分析により全長のｃＤＮＡ配列が得られたことを確認した。このｃＤＮＡを鋳型として、全長ｃＤＮＡ（配列番号１），前半ｃＤＮＡ（配列番号９），後半ｃＤＮＡ（配列番号１０）の増幅を行い、同様にＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇを行った。
【実施例２】
【００７５】
（二本鎖ＲＮＡの調整）
ＲＮＡ溶液は以下のように調整した。
まず、ＲＮＡｉ用ベクターｐＰＤ１２９．３６（ｃＤＮＡを挿入するマルチクローニングサイトの両端にＴ７配列が付加したもの：＋鎖、−鎖を鋳型とした転写が可能：米国スタンフォード大学Ａｎｄｒｅｗ  Ｆｉｒｅ教授より分与）に、実施例１で作製したＴＡクローンの全長ｃＤＮＡ、前半ｃＤＮＡ、後半ｃＤＮＡの各々のｃＤＮＡを組み込んだ。具体的には、 個々のＴＡクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、挿入されたｃＤＮＡを取り出し、ＲＮＡｉ用ベクターｐＰＤ１２９．３６のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位に導入し、ＲＮＡｉプラスミドとした。このベクターによる大腸菌の形質転換体を作製し、プラスミド調製を行った。次に、このプラスミドを鋳型としてＴ７プロモーター配列よりｃＤＮＡを増幅（ＰＣＲ）し,  精製してＲＮＡ合成（転写反応）の鋳型とした。ＰＣＲの反応条件は、下記のプライマーを用いて、５０マイクロリットルスケールで行った。鋳型となるプラスミド０．０１ナノグラムを加え、９４℃で ３０秒、５０℃で３０秒、７２℃ で１分を２５サイクル反応させた。遺伝子増幅装置は、ＡＢ社製のＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ２７２０を用いた。
Ｔ７−ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ    ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号１１）
そして、ＭＥＧ  Ａｓｃｒｉｐｔ  ＲＮＡｉ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社  Ｎｏ．ＡＭ１６２６）を用いてＡｍｂｉｏｎ社のプロトコールに従って、上記合成ＤＮＡを鋳型に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより３７℃で４時間反応させ、２本鎖ＲＮＡを調製した。
【実施例３】
【００７６】
（ＲＮＡｉ  浸漬法）
１００μｌで１００匹になるように調製したセンチュウ １ｍｌを、Ｍ９溶液ごと１．５ｍｌ  Ｔｕｂｅに移した。１３，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを捨てた後、５×Ｓｏａｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（表３）２μｌ、１０％ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  １μｌ、ｄｓＲＮＡ溶液 ８μｌ(１μｇ／μｌ)加え、優しく混合した。室温で４時間ｓｏａｋｉｎｇ(振とう培養) した。  
【表３】
0005614610.tif 000004
【実施例４】
【００７７】
（トマトへの感染）
上記のｄｓＲＮＡ溶液に浸したセンチュウにＭ９溶液を適量加え、子葉が６枚以上のトマトへ寄生させ、２５．５℃に３ヵ月間、静置培養した。その後、丁寧に引き抜いてコブの形状により被害度を判断し、それによって増殖度を観察した。結果は、図６、及び７に示した。
【００７８】
（結果）
図５は、実施例３の方法でＣ．ｅｌｅｇａｎｓをｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液に浸し、その孵化率の結果を示した図である。図５中、コントロールとして、ｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液の代わりに、ＤＥＰＣ処理水、及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓをｐｏｓ−１遺伝子と全く相同性を示さないｖｉｒｕｓの二本鎖ＲＮＡ溶液を使用した。また、Ｃｅ−ｐｏｓ−１  ｄｓＲＮＡは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液を用いたことを示す。さらに、Ｍｉ−ｐｏｓ−１全長ｄｓＲＮＡ、Ｍｉ−ｐｏｓ−１前半ｄｓＲＮＡ、及びＭｉ−ｐｏｓ−１後半ｄｓＲＮＡは、それぞれサツマイモネコブセンチュウの全長ｐｏｓ−１遺伝子（配列番号１）、前半ｐｏｓ−１遺伝子（配列番号９）、及び後半ｐｏｓ−１遺伝子（配列番号１０）に対する二本鎖ＲＮＡ溶液を用いたことを示す。また、ｎは、実験に用いた個体数を示す。
この結果、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対しＣｅ−ｐｏｓ−１  ｄｓＲＮＡを用いた場合のみ孵化率が０％で、サツマイモネコブセンチュウのいずれの二本鎖ＲＮＡ溶液を用いた場合も１００％の孵化率を示すという非常に顕著なものであった。すなわち、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対しＲＮＡｉ効果があったのはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の二本鎖ＲＮＡだけで、サツマイモネコブセンチュウ由来のｄｓＲＮＡの影響は全くなく、このＲＮＡｉ効果は顕著で種特異的であることが示唆された。
【００７９】
図６、及び７は、上記の方法により作製されたネコブセンチュウに寄生されたトマトの根を示す。
図６は、上記同様コントロールとして、実施例３のｄｓＲＮＡ溶液の代わりにＤＥＰＣ処理水に浸したサツマイモネコブセンチュウに、実施例４の方法でトマトの根に寄生させた後の被害の様子である。このネコブ指数は４か３であると認められた。また、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液（Ｃｅ−ｐｏｓ−１）に浸したサツマイモネコブセンチュウに寄生されたトマトの根のネコブ指数も４か３であると認められた。
これらの結果から、Ｃｅ−ｐｏｓ−１溶液は、サツマイモネコブセンチュウに対して、ネコブ被害を抑える効果がないということがわかった。すなわち、サツマイモネコブセンチュウに対して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡｉ効果はなかったことが示唆された。
図７は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液（Ｃｅ−ｐｏｓ−１）と、サツマイモネコブセンチュウのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液（Ｍｉ−ｐｏｓ−１）に浸したサツマイモネコブセンチュウに寄生されたトマトの根を示す。Ｃｅ−ｐｏｓ−１  二本鎖ＲＮＡ溶液に浸したサツマイモネコブセンチュウに寄生されたトマトの根のネコブ指数は２から４であると認められた。一方、Ｍｉ−ｐｏｓ−１  二本鎖ＲＮＡ溶液に浸したサツマイモネコブセンチュウに寄生されたトマトの根のネコブ指数は１か０であると認められた。
これらの結果から、サツマイモネコブセンチュウに対して、Ｃｅ−ｐｏｓ−１  二本鎖ＲＮＡ溶液にはネコブ被害の抑制がみられないが、Ｍｉ−ｐｏｓ−１  二本鎖ＲＮＡ溶液にはネコブ被害を抑制する著しい効果がみられた。すなわち、サツマイモネコブセンチュウに対して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡｉの影響は認められないが、ネコブセンチュウのｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡｉ効果は顕著であり、種特異的にサツマイモネコブセンチュウの増殖が抑制されたことが示唆された。
【００８０】
以上より、ｐｏｓ−１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ溶液の種特異的なＲＮＡｉ効果は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｏｓ−１遺伝子配列とネコブセンチュウｐｏｓ−１遺伝子配列の相同性が２０％と低いことが原因と考えられる。そうであれば、他の土壌線虫への影響が少ない可能性が高く、実際農作物を育てる上で、非常に有益と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上のように、本発明にかかるネコブセンチュウＰＯＳ−１タンパク質は、ネコブセンチュウの増殖に必須の細胞極性に寄与するタンパク質であるため、ｐｏｓ−１遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉを利用した組換え植物による防除方法は、種特異的にネコブセンチュウの増殖を阻害することができ、大幅に農薬を減らすことが可能であり、低コスト・軽労働ならびに安全かつ環境にやさしい。
また、本発明にかかる組換え植物は「トラップ植物」として利用するため、多くの作物の栽培に利用でき、商品作物栽培中でも裁植が可能であり、花芽を摘み取るなどによりバイオハザ−ドの面でも安心である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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