(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に由来する血液試料であって、ＢＮＰ１−３２分子（配列番号１）、ＢＮＰ３−３２分子（配列番号２）、ＢＮＰ４−３２分子（配列番号３）、ＢＮＰ５−３２分子（配列番号４）、及びＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも２種を含むＢ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各ＢＮＰ分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記ＢＮＰ分子群を検出し、
前記ＢＮＰ分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を評価する方法であって、
前記分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比は、
前記ＢＮＰ１−３２分子の検出強度及び前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度の和と、前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比
である、心筋虚血状態を評価する方法。
【請求項２】
被験者に由来する血液試料であって、ＢＮＰ１−３２分子（配列番号１）、ＢＮＰ３−３２分子（配列番号２）、ＢＮＰ４−３２分子（配列番号３）、ＢＮＰ５−３２分子（配列番号４）、及びＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも２種を含むＢ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各ＢＮＰ分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記ＢＮＰ分子群を検出し、
前記ＢＮＰ分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を評価する方法であって、
前記分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比は、
前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度と、前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比
である、心筋虚血状態を評価する方法。
【請求項３】
被験者に由来する血液試料であって、ＢＮＰ１−３２分子（配列番号１）、ＢＮＰ３−３２分子（配列番号２）、ＢＮＰ４−３２分子（配列番号３）、ＢＮＰ５−３２分子（配列番号４）、及びＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも２種を含むＢ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各ＢＮＰ分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記ＢＮＰ分子群を検出し、
前記ＢＮＰ分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を評価する方法であって、
前記分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比は、
前記ＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子の検出強度と、前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比
である、心筋虚血状態を評価する方法。
【請求項４】
前記血液試料は、ＢＮＰ測定値が１８〜１５０ｐｇ／ｍｌである被験者の血液検体そのもの又は血液検体から調製されたものである、請求項１〜３のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記心筋虚血状態が、虚血性心疾患によるもの、又は冠動脈インターベンション後の再狭窄によるものである、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記血液試料が、前記被験者の血液検体を、前記Ｂ型ナトリウム利尿ホルモン分子群に対する抗体を用いた免疫学的濃縮に供することによって調製されるものである、請求項１〜５のうちのいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断医学、診断検査機器、循環器内科学、人間ドック、質量分析学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法（Method for Assessing Myocardial Ischemia using a Blood Sample）に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床現場における心不全の診断には、主に心筋から分泌されるホルモンであるＢ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）の血液中存在量を測定することが、日本をはじめ世界中の臨床現場で広く行われている。ＢＮＰは、これまで世界中において、その血液中の存在量と慢性心不全の重篤度との相関が極めて高いことが検証されてきたものであり、現在、心不全の重篤度を知る唯一のバイオマーカーとして用いられているものである。【０００３】
具体的な心不全診断においては、ＢＮＰの存在量をＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法などの免疫化学的方法によって測定し、特にＢＮＰ値が１００ｐｇ／ｍＬ以上或いは１５０ｐｇ／ｍＬ以上であれば、「心不全の疑い有り」と診断することが一般臨床の現場ではほぼ確立されている。またＢＮＰ値が基準値上限の１８．４ｐｇ／ｍＬ以下であると一般的には「異常なし」との診断がなされている。一方、閾値範囲である１８．４〜１００ｐｇ／ｍＬ或いは１８．４〜１５０ｐｇ／ｍＬにおいては、一般臨床上何がしかの心血管疾患の疑いがありということで、「要経過観察、場合によって検査」と判断される。【０００４】
心血管疾患のうち、虚血性心疾患の診断法として臨床現場で行われているものには、心電図、負荷心電図、心エコーといった外来で行われる検査が挙げられる。しかしながら虚血性心疾患をこれらの検査で完全にとらえることは因難であるため、正確な診断をするためには通常、入院を要する心臓カテーテル検査が必要となる。【０００５】
虚血性心疾患の非薬物治療としては、冠動脈の狭窄を広げる手術が一般的に行われている。そのような手術として汎用されるものとして、経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）が挙げられる。従来、ＰＣＩ施術後の患者においては、術後３〜６ヶ月後に２０〜４０％程度の頻度で拡張した血管に再狭窄を起こすことがわかっている。近年、当該手術に薬剤溶出ステント（ＤＥＳ）が用いられるようになったことにより、再狭窄の頻度は１０％以下にまで低減されている。【０００６】
一方、最近の例として、米国特許第７３４１８３８号明細書、特表２００６−５２７１９０号公報に、試験試料における、BNP79〜108、BNP77〜106、BNP39〜86、BNP53〜85、BNP66〜98、BNP30〜106、BNP11〜107、BNP9〜106、BNP69〜100、BNP76〜107、BNP69〜108、BNP80〜108、BNP81〜108、BNP83〜108、BNP30〜103、BNP3〜108、およびBNP79〜106からなる群より選択される少なくとも１つのＢＮＰポリペプチド（ここでは、１０８アミノ酸からなるＢＮＰ前駆体すなわちBNP1〜108を基準として、これらのＢＮＰポリペプチドを表示している）の量を特異的に測定することによって、試験試料の病態を分類する方法が記載されている。具体的には、ＢＮＰ値３５３．５ｐｇ／ｍＬの患者及びＢＮＰ値９０５．５ｐｇ／ｍＬの患者についての測定結果から、BNP3〜108が、鬱血性心不全から不安定な狭心症または心筋梗塞を区別するであろうということが記載されている。【０００７】
また、最近の他の例として、特開２００７−３２２１８７号公報に、ＰＣＩ後の再狭窄の発症リスクを判定する方法として、血液中の変性低比重リポ蛋白（変性ＬＤＬ）の存在量を測定する方法が記載されている。【０００８】
【特許文献１】米国特許第７３４１８３８号明細書
【特許文献２】特表２００６−５２７１９０号公報
【特許文献３】特開２００７−３２２１８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
血液中のＢＮＰ値を測定することによる心不全の診断は臨床上有効である。しかしながら、血液中のＢＮＰ値を測定することによる虚血の診断法は確立されていないのが現状である。また、心不全疑いの有無の判断の閾値範囲である１８．４〜１００ｐｇ／ｍＬ或いは１８．４〜１５０ｐｇ／ｍＬにおいては、何がしかの心血管疾患の疑いがあるとされるのみであり、その実態は不明である。すなわち、ＢＮＰ値が当該閾値範囲を示す場合に、心血管疾患についての評価が不可能であるのが現状である。【００１０】
現在、心血管疾患の中でも虚血性心疾患の診断のために行われる検査のひとつとして負荷心電図検査が挙げられるが、その感度・特異度は７０％前後であり、診断の信頼性としてはそれほど高いものではない。また、この検査は、被検査者に運動を課さなければならならず、患者への負担が大きい。また、下肢の弱い又は下肢関節に障害のある高齢者においては実施不可能である。診断時には常に医師による観察が必要であるが、運動負荷による心事故を引き起こす危険性がある。加えて、不安定狭心症等の疑いがある者の場合は禁忌となっている。【００１１】
また、ＰＣＩ後に起こる再狭窄は、その頻度が少なくなったとはいえ、確実に一定の頻度で起こることには変わりない。そのため、再狭窄の有無の診断のための検査は依然として必須である。具体的には心臓カテーテル検査が汎用されている。しかしながら、心臓カテーテル検査は侵襲的検査であるため、患者への負担が大きい。そのため、頻繁に検査を行うことは事実上不可能である。さらに造影剤を用いるため、特に腎機能障害を有する患者においては、造影剤の腎毒性も問題となる。【００１２】
一方、上述の米国特許第７３４１８３８明細書、特表２００６−５２７１９０号公報には、BNP3〜108が、鬱血性心不全から不安定な狭心症または心筋梗塞を区別するであろうということが記載されているが、これはＢＮＰ値３５３．５ｐｇ／ｍＬの患者及びＢＮＰ値９０５．５ｐｇ／ｍＬの患者についての測定結果に依拠している。さらに、当該公報には、特定のＢＮＰペプチドが、評価対象となる心血管疾患を有する検体と対照検体との間で有意差をもって検出されることは全く示されていない。従って、心血管疾患を評価するための有用な指標は全く記載されていない。
また、当該公報においては、上記の測定とともに、ＢＮＰ値が低い（具体的には３９．６ｐｇ／ｍＬ）患者についても同様の測定を行っているが、このようなＢＮＰ値が低い患者については、特定のＢＮＰペプチドの検出に至っていないため、全く情報は得られていない。【００１３】
そこで本発明は、心筋虚血状態（例えば虚血性心疾患や再狭窄など）を低侵襲的に評価することを可能にする方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、従前の方法では心不全を含む心血管疾患の有無を判断することができないＢＮＰ値（すなわち心不全疑いの有無の判断の閾値範囲１８．４〜１５０ｐｇ／ｍＬ）を示す血液試料からであっても、心不全以外の心血管疾患、特に心筋虚血状態の有無を判断することを可能にする指標を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、心臓カテーテル検査を受検する患者であって、ＢＮＰ値が当該閾値範囲を含む患者の血液試料を質的観点から測定した場合に、質量数の異なるＢＮＰ分子群から選ばれる特定のＢＮＰ分子の検出量と、特定の他のＢＮＰ分子の検出量との比の値が、当該患者のうち心臓カテーテル検査で有意な狭窄が見られた患者と、有意な狭窄が見られなかった患者との間で有意に異なることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
被験者に由来する血液試料であって、ＢＮＰ１−３２分子（配列番号１）、ＢＮＰ３−３２分子（配列番号２）、ＢＮＰ４−３２分子（配列番号３）、ＢＮＰ５−３２分子（配列番号４）、及びＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも２種を含むＢ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各ＢＮＰ分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記ＢＮＰ分子群を検出し、
前記ＢＮＰ分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を評価する方法。【００１６】
心筋虚血状態を評価することは、すなわち冠動脈の狭窄の有無を調べることでもある。具体的には、虚血性心疾患の有無を判断すること、ＰＣＩ後の再狭窄の有無を判断することが含まれる。【００１７】
本発明において、ＢＮＰ１−３２分子は、３２アミノ酸からなる成熟Ｂ型ナトリウム利尿ホルモンであり、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。（或いは、１０８アミノ酸からなるＢ型ナトリウム利尿ホルモン前駆体をBNP1〜108と表記した場合、BNP77-108が本発明における成熟Ｂ型ナトリウム利尿ホルモンＢＮＰ１−３２に相当する。）
ＢＮＰ３−３２分子は、ＢＮＰ１−３２分子のＮ末端の２アミノ酸ＳＰ（アミノ酸一文字略号により表示、以下において同様）がプロセスされて生じる断片であり、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。ＢＮＰ４−３２分子は、ＢＮＰ１−３２分子のＮ末端の３アミノ酸ＳＰＫがプロセスされて生じる断片であり、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。ＢＮＰ５−３２分子は、ＢＮＰ１−３２分子のＮ末端の４アミノ酸ＳＰＫＭがプロセスされて生じる断片であり、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。【００１８】
本発明において、Ｂ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）分子群は、成熟Ｂ型ナトリウム利尿ホルモン分子（すなわちＢＮＰ１−３２分子）、ＢＮＰ３−３２分子、ＢＮＰ４−３２分子、ＢＮＰ５−３２分子、及びＢＮＰ５−３２より質量数が１６Ｄａ大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも２種も含み、それら以外の、ＢＮＰ１−３２からプロセシングを受けて生じた断片及びそれを基本とする誘導体をさらに含んでよい。【００１９】
（２）
前記分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比は、
前記ＢＮＰ１−３２分子の検出強度及び前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度の和と、前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比
である、（１）に記載の方法。【００２０】
すなわち、（２）に記載の比は、下記式：
{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)            （式１）
（式中、I(BNP 1-32)は前記ＢＮＰ１−３２分子の検出強度であり、
I(BNP 3-32)は前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度であり、
I(BNP 5-32)は前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度である。）
及びその逆比のいずれかで表される。【００２１】
（３）
前記分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比は、
前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度と、前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比
である、（１）又は（２）に記載の方法。【００２２】
すなわち、（３）に記載の比は、下記式：
I(BNP 3-32)／I(BNP 5-32)            （式２）
（式中、I(BNP 3-32)は前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度であり、I(BNP 5-32)は前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度である。）
及びその逆比のいずれかで表される。【００２３】
上記（２）及び（３）において、好ましくは、血液検体のＢＮＰ測定値が１８ｐｇ／ｍＬ以上、又は２１．９ｐｇ／ｍＬ以上である。
上記（２）及び（３）において、好ましくは、前記心筋虚血状態が、虚血性心疾患によるもの、又はＰＣＩ後の再狭窄によるものである、【００２４】
（４）
前記分子群から選択される少なくとも１種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも１種の他の分子の検出強度との比は、
前記ＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子の検出強度と、前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比
である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。【００２５】
すなわち、（４）に記載の比は、下記式：
I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)            （式３）
（式中、I(BNP 5-32)は前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度であり、
I(BNP 5-32+)は前記ＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子の検出強度である。）
及びその逆比のいずれかで表される。【００２６】
（５）
前記血液試料は、ＢＮＰ測定値が１８〜１５０ｐｇ／ｍＬである被験者の血液検体そのもの又は血液検体から調製されたものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。【００２７】
（６）
前記心筋虚血状態が、虚血性心疾患によるもの、又はＰＣＩ後の再狭窄によるものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００２８】
前記（１）〜（６）において、前記血液試料が、少なくともアプロチニンを含む採血管を用いて前記被験者から採血して得た血液検体から調製されたものであってよい。【００２９】
前記（１）〜（６）において、好ましくは、前記血液検体は血漿検体である。【００３０】
（７）
前記血液試料が、前記被験者の血液検体を、前記Ｂ型ナトリウム利尿ホルモン分子群に対する抗体を用いた免疫学的濃縮に供することによって調製されるものである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。【００３１】
前記（１）〜（７）において、前記質量数の異なる各ＢＮＰ分子の区別及び定量が可能な方法は、生体特異的親和性に基づく方法又は質量分析法とすることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によると、心筋虚血状態が引き起こす病態（例えば虚血性心疾患や再狭窄など）を低侵襲的に評価することが可能になる。
また、本発明によると、従前の方法では何らかの心血管疾患の疑いがあるとあいまいに判断されるのみで、心血管疾患の有無を判断することができないＢＮＰ値（すなわち心不全疑いの有無の判断の閾値範囲１８．４〜１５０ｐｇ／ｍＬ）を示す血液試料からであっても、心血管疾患の有無を判断することが可能になる。【００３３】
より具体的に、本発明の効果を以下に示す。
本発明は、従来用いられていたＢＮＰについての量的観点に基づいた指標（すなわちＢＮＰ値）とは異なり、ＢＮＰについての質的観点に基づいた指標を用いる方法であるため、量的観点のみでは得られない情報を血液試料から得ることを可能にした。すなわち、本発明は、心筋虚血状態の検査を、血液検査のみによって行うことを初めて可能にした。【００３４】
本発明では新しい指標が用いられるため、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であった１８．４〜１５０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ値を示す血液試料から、そのような病態の評価が可能になった。また、本発明で用いられる新しい指標の有用性は、虚血状態において特異的に示されるものであるため、高いＢＮＰ値を示す疾患（例えば慢性心不全）においても、心筋虚血状態の有無の判断を行うことが可能になった。【００３５】
また、本発明は血液検査で用いられるため、従来の侵襲的な検査法（心臓カテーテル検査など）と比較して非常に容易且つ低侵襲である。このため、あらかじめ行った血液検査で狭窄の疑いが有ると判断された患者のみに、より確実性を期すための侵襲的な検査法を適用することが可能になる。すなわち、不必要な心臓カテーテル検査などを回避できるため、患者の体への負担、及び検査費用を大幅に削減することが可能となる。また、従来約半年ごとに行っていた心臓カテーテル検査では処置の必要な再狭窄が半年より早くに生じていても処置ができず、的確な処置が不可能であったが、低侵襲な血液検査では簡便に繰り返し検査ができるため、より早期に的確な処置が可能となる。【００３６】
このように、本発明の方法は、従前の検査法とは異なり、容易、低侵襲的、且つ経済的な血液検査のみで、虚血の信頼性高い評価及び早期発見が可能となる。ひいては動脈硬化の判定にも応用可能である。さらに、上述のように、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であったＢＮＰ値を示す血液試料におけるＢＮＰの意義が明らかになったため、ＢＮＰのフラグメント及びその修飾フラグメントが創薬へとつながる可能性が見出される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実験例１において、採血にＥＤＴＡ採血管を用いた場合とＥＤＴＡ−アプロチニン採血管を用いた場合とにおける、ＢＮＰのプロセシングの違いを示したＭＳスペクトルである。
【図２】実験例２において、抗体ＫＹＢＮＰIIがＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２、及びＢＮＰ５−３２を特異的に認識する抗体であることを示したＭＳスペクトルである。
【図３】実験例３において検討された本発明の方法の検出限界を示すＭＳスペクトルである。
【図４】実験例４において、臨床検体から、ＢＮＰ１−３２とともに、ＢＮＰ１−３２からＮ末端がプロセスされたＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２及びＢＮＰ５−３２が検出されたことを示すＭＳスペクトルである。
【図５】実施例１において、従来のＥＩＡ法によるＢＮＰ測定値が約９０ｐｇ／ｍＬと同等である２つの臨床検体の血漿が、本発明の方法によって質的に異なるものとして検出されたことを示すＭＳスペクトルである。
【図６】実施例２において、ＢＮＰ値が４０．８ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬの２４臨床検体について、指標としてI(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)を用い、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。
【図７】実施例３において、ＢＮＰ値が２１．４ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬの４１臨床検体について、指標としてI(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)を用い、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。
【図８】実施例４において、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)と有意狭窄の有無との相関の調査を、ＲＯＣ曲線を用いて解析した結果である。
【図９】実施例５において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)を用い、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。
【図１０】実施例６において、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)と有意狭窄の有無との相関の調査を、ＲＯＣ曲線を用いて解析した結果である。
【図１１】比較例１において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)を用い、その指標と高血圧の有無との相関の調査を行った結果である。
【図１２】比較例２において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)を用い、その指標と高脂血症の有無との相関の調査を行った結果である。
【図１３】比較例３において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)を用い、その指標と糖尿病の有無との相関の調査を行った結果である。
【図１４】比較例４において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)を用い、その指標と性別との相関の調査を行った結果である。
【図１５】実施例７において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標としてI(BNP 4-32)／I(BNP 5-32)を用い、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。
【図１６】実施例８において、ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 4-32)を用い、ＭＳシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
［１．血液検体］
［１−１．被験者］
本発明の方法において被験者となりうる者は、主訴の有無を問わずどのような者でも許容される。具体的には、人間ドック患者、虚血性心疾患患者、ＰＣＩを受けた患者、心不全患者などが挙げられる。特に、従前の検査法で心臓カテーテル検査が必要とされる患者が挙げられる。また、高血圧、高脂血症、糖尿病などの疾患に罹患している者又はその疑いがある者であっても良い。【００３９】
本発明は、被験者の心筋虚血状態を調べる方法である。心筋虚血状態とは、動脈硬化性変化などがもたらす冠動脈の狭窄によって、心臓の酸素供給が十分に行われていない状態をいう。従って、本発明は、被験者の冠動脈の狭窄の有無を調べる方法ということもできる。本発明において、心筋虚血状態が引き起こす具体的な病態としては、特に限定されず、虚血性心疾患、ＰＣＩ後に起こる再狭窄が含まれる。【００４０】
虚血性心疾患の具体例としては、通常狭心症と心筋梗塞とが挙げられるが、本発明は、これまで血液検査では診断できなかった心筋虚血状態の診断を可能にするものであるため、従前では血液検査による診断が不可能であった狭心症に適用できる点で有用である。【００４１】
特に本発明は、ＰＣＩ後に起こり得る再狭窄の有無を診断する場合に、心臓カテーテル検査の前段階の診断時に適用できるという点で非常に有用である。ＰＣＩは具体的には、ステント留置術、バルーンを用いる冠動脈形成術、カッティングバルーンカテーテル、アテレクトミーなどが挙げられる。【００４２】
なお、本発明において、狭窄が有る、或いは有意な狭窄が有るとする場合、その狭窄の度合いは冠動脈造影所見で７５％以上（左冠動脈主幹部は５０％以上）である。【００４３】
［１−２．血液検体の形態］
本発明で用いられる血液検体の形態としては、全血、血漿、血清が挙げられるが、中でも血漿の形態であることが好ましい。血漿の形態の血液検体を用いることによって、後述の検出工程での検出対象となるＢＮＰの不必要な断片化（例えばＣ末端からの切断）を防ぐことができ、より正確な評価を行うことが可能になる。【００４４】
［１−３．血液検体に加えられうる成分］
血液検体には、血液安定剤が適宜含まれてよい。
血液安定剤としては、プロテアーゼ阻害剤や抗凝固剤などが挙げられる。このような血液安定剤としては、例えば、アプロチニン、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、クエン酸、フッ化ナトリウムが含まれる。これらの血液安定剤は、当業者が適宜選択して用いることができる。本発明では、特にアプロチニンを少なくとも用いることが好ましい。具体的には、採血管にアプロチニン、ＥＤＴＡを含むものを用いることが好ましい。アプロチニン、ＥＤＴＡを含む採血管を用いることによって、後述の検出工程での検出対象となるＢＮＰの不必要な断片化を防ぐことができ、より正確な評価を行うことが可能になる。【００４５】
［１−４．血液検体のＢＮＰ値］
本発明において、ＢＮＰ測定値又はＢＮＰ値とは、心不全などのマーカーとして広く臨床応用されている指標をいう。ＢＮＰ値は、公知の方法、例えばＥＩＡ法（酵素免疫測定法）によって測定される。本発明における質的観点からみれば、ＢＮＰ値とは、後述の検出工程での検出対象となるＢＮＰ分子群を含む、異なる分子量を有するＢＮＰ分子混合物全体の濃度である。【００４６】
本発明は、虚血状態の診断に有用であり、対象となる血液検体のＢＮＰ値は特に限定されるものではなく、あらゆるＢＮＰ値の血液検体を対象としてよい。【００４７】
例えば、本発明は血液検体のＢＮＰ値が１８〜１５０ｐｇ／ｍＬである場合にも有用である。この範囲のＢＮＰ値は、これまで血液検査では異常の有無が曖昧であったため、心不全の診断を行うための重要な情報ではなかった。しかしながら、本発明の方法では、この範囲のＢＮＰ値において、後述する指標の値が、冠動脈狭窄の有無の間で有意な差を示すことを利用して異常の有無の判断を行うことが可能である。
このようなＢＮＰ値を示す血液検体に対して好ましい指標としては、後述の４−１−１、４−１−２、４−１−３に記載する指標が挙げられる。【００４８】
上記範囲のＢＮＰ値を有する血液検体の中でも、２０〜１５０ｐｇ／ｍＬ、３０〜１５０ｐｇ／ｍＬ、或いは４０〜１５０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ値を示す血液検体においては、上記１８〜１５０ｐｇ／ｍＬの範囲を示す血液検体に比べて異常の有無の判断をより信頼性高く行うことが可能となる場合がある。このような傾向を示す指標としては、後述４−１−３に記載する指標が挙げられる。【００４９】
さらに、本発明は血液検体のＢＮＰ値が１５０ｐｇ／ｍＬを上回る範囲の場合にも有用である。この範囲においては、これまでの血液検査では心不全の疑い有りという診断のみが可能であったが、本発明の方法では、この範囲のＢＮＰ値において、すなわち、心不全疑いの濃厚な患者においても冠動脈狭窄の有無を判断することが可能である。なお、この範囲のＢＮＰ値の上限値としては特に限定されず、臨床的に生じうる１５０ｐｇ／ｍＬを上回るＢＮＰ値のいかなるものも含まれる。例えば、６５０ｐｇ／ｍＬ程度のＢＮＰ値が臨床で生じることがあるが、これを上回るＢＮＰが生じることももちろんある。【００５０】
このように本発明は血液検体のＢＮＰ値が１５０ｐｇ／ｍＬを上回る範囲の場合にも有用であるため、上述の１８〜１５０ｐｇ／ｍＬの範囲をあわせた１８ｐｇ／ｍＬ以上の範囲において、本発明を有用に用いることができる。この場合、さらに２０ｐｇ／ｍＬ以上の範囲であることも好ましい。
このようなＢＮＰ値を示す血液検体に対して好ましい指標としては、後述４−１−１、４−１−２に記載する指標が挙げられる。【００５１】
一方、本発明はＢＮＰ値が１８ｐｇ／ｍＬを下回る範囲の場合にも用いることができる。この範囲においては、これまでの血液検査で異常なしと評価されてきたが、本発明の方法で、質的観点からさらに詳細に分析することも可能である。検体使用量が５００μＬ程度の場合には、例えば質量分析による検出法を用いた場合には検出限界を下回ることがあるが、検体使用量を適宜増やす（例えば１ｍＬや２ｍＬに増やすなどによって、同様な分析は可能である。【００５２】
［２．血液試料］
本発明において、血液試料とは、検出工程に供される試料をいう。従って、血液試料は、上記の血液検体を適当な処理に供して調製したものであっても良いし、上記の血液検体そのものであっても良い。【００５３】
［２−１．血液試料に含まれる検出対象分子］
本発明で検出対象となる分子は、血液試料中に存在するＢ型ナトリウム利尿ホルモン（ＢＮＰ）分子群である。ＢＮＰ分子群を構成する分子には、ＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ１−３２からプロセシングを受けて生じた断片、及び／又はそれらを基本とする誘導体が含まれうる。ＢＮＰ分子群を構成するこれら分子には、被験者の生体内で生じたものが含まれなければならない。【００５４】
ＢＮＰ分子群を構成する分子には、被験者の生体内で生じた分子が採血時や試料調製時に変化（例えば生体内で起こり得ないプロセシングや化学変化）したものも含まれうるが、できるだけそのような分子が含まれないように血液試料を調製することが好ましい。例えば、血液検体として血漿の形態のものを用いる、アプロチニン、ＥＤＴＡを含む採血管を用いることなどによって、ＢＮＰのＣ末端の切断やＮ末端の非特異的な切断を抑制した血液試料を調製することが好ましい。【００５５】
より具体的には、ＢＮＰ１−３２は、３２アミノ酸からなる成熟Ｂ型ナトリウム利尿ホルモンであり、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。或いは、１０８アミノ酸からなるＢ型ナトリウム利尿ホルモン前駆体をBNP1〜108と表記した場合、BNP77-108が本発明における成熟Ｂ型ナトリウム利尿ホルモンＢＮＰ１−３２に相当する。【００５６】
ＢＮＰからプロセシングを受けて生じた断片としては、被験者の体内状態をより良く反映させる観点から、ＢＮＰ３−３２分子、ＢＮＰ４−３２分子、ＢＮＰ５−３２分子などが少なくとも挙げられる。ＢＮＰ３−３２分子は、ＢＮＰ１−３２分子のＮ末端の２アミノ酸ＳＰ（アミノ酸一文字略号により表示、以下において同様）がプロセスされて生じる断片であり、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。ＢＮＰ４−３２分子は、ＢＮＰ１−３２分子のＮ末端の３アミノ酸ＳＰＫがプロセスされて生じる断片であり、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。ＢＮＰ５−３２分子は、ＢＮＰ１−３２分子のＮ末端の４アミノ酸ＳＰＫＭがプロセスされて生じる断片であり、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。【００５７】
ＢＮＰ１−３２又はそれからプロセシングを受けて生じた断片を基本とする誘導体としては、具体的には、当該基本となる分子が化学変化して生じたものが挙げられる。より具体的には、当該化学変化として酸化が挙げられる。主に、メチオニンが酸化を受けうる。【００５８】
本発明においては、ＢＮＰ分子群を構成する分子のひとつとして、ＢＮＰ５−３２より質量数が１６Ｄａ大きい分子を含む。この分子は、ＢＮＰ５−３２との質量数の差が１６Ｄａであること、後述のように、１つの抗体によって他のＢＮＰ断片とともに免疫学的濃縮が可能であること、及び、脱酸化試薬を作用させることにより消失することが本発明者らによって確認されていることから、ＢＮＰ５−３２の酸化物とも考えられる。本発明では、この分子の表記としては、構造の観点から特定することなく、質量数の観点のみから、「ＢＮＰ５−３２より質量数が１６Ｄａ大きい分子」とし、便宜上の観点から、この分子を上記「誘導体」に含めている。【００５９】
すなわち、本発明において、ＢＮＰ分子群は、ＢＮＰ１−３２分子、ＢＮＰ３−３２分子、ＢＮＰ４−３２分子、ＢＮＰ５−３２分子、及びＢＮＰ５−３２より質量数が１６Ｄａ大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも２種を含むものであり、さらに、それら以外の、ＢＮＰ１−３２からプロセシングを受けて生じた断片及びそれを基本とする誘導体を含むことも許容する。【００６０】
［２−２．免疫学的濃縮］
本発明においては、血液検体中に含まれるＢＮＰ分子群を免疫学的に濃縮することが好ましい。免疫学的濃縮法としては、免疫複合体が形成しうる条件下で、血液試料中のＢＮＰ分子群と、ＢＮＰ分子群に対する抗体とを接触させることにより、ＢＮＰ分子群を特異的に濃縮することができる方法であればどのような方法であっても良く、当業者によって適宜選択されうる。また、具体的なプロトコルも当業者によって容易に選択されうる。【００６１】
免疫学的濃縮法の具体例としては、免疫沈降法、親和的カラムクロマトグラフィ法などが挙げられる。これらの方法は、当業者に良く知られた方法であり、そのプロトコルは当業者によって適宜決定されるものである。
本発明においては、免疫沈降法を用いることが好ましい。この方法においては、免疫複合体が形成しうる条件下で、血液試料と、対象となるＢＮＰ分子群に対する抗体と、沈降用の担体とを共存させ、免疫沈降物を得る。この方法は、操作が簡便でコスト性が良く、非常に汎用性が高い点で好ましい。【００６２】
免疫学的濃縮において用いられる抗体の例としては、濃縮対象とするＢＮＰ分子群に含まれるＢＮＰを同時に認識することができる抗体が挙げられる。この抗体は、濃縮対象となるＢＮＰ分子群に含まれるＢＮＰ分子に共通する領域を使用し、その共通領域を有するペプチド断片を認識することができる抗体として、当業者によって適宜調製されうる。
免疫学的濃縮において用いられる抗体の他の例としては、濃縮対象とするＢＮＰ分子群に含まれるＢＮＰ分子の各々を別々に認識する複数種の抗体の混合物が挙げられる。この抗体は、濃縮対象とするＢＮＰ分子群に含まれる特定のＢＮＰ分子における特徴的な領域を使用し、その領域を有するペプチド断片を認識することができる抗体として、当業者によって適宜調製されうる。【００６３】
より具体的な抗体の例として、ＫＹＢＮＰII（塩野義製薬）が挙げられる。ＫＹＢＮＰIIは、少なくともＢＮＰ１−３２分子、ＢＮＰ３−３２分子、ＢＮＰ４−３２分子、ＢＮＰ５−３２分子、及びＢＮＰ５−３２より質量数が１６Ｄａ大きい分子を同時に認識することができる。【００６４】
［３．検出工程］
上記の血液試料は検出工程に供される。検出工程においては、質量数の異なるＢＮＰ分子の区別及び定量が可能な方法を用いる。すなわち、ＢＮＰ分子群に含まれるそれぞれの分子の区別及び定量が可能な方法を用いる。ここでいう定量とは、それぞれのＢＮＰ分子の絶対量ではなく、相対量の測定が可能であれば足りる。検出工程で用いられる方法は、上記のような方法であればどのような方法であっても良く、当業者によって適宜選択されうる。具体的には、生体特異的親和性に基づく方法や、質量分析法が挙げられる。【００６５】
［３−１．生体特異的親和性に基づく方法］
生体特異的親和性に基づく方法を用いる場合は、血液検体を上記の免疫学的濃縮に供し、得られた血液試料を検出工程に供しても良いし、上記の免疫学的濃縮を行うことなく、血液検体（例えば血漿検体）そのものを血液試料として検出工程に供しても良い。【００６６】
生体特異的親和性に基づく方法は当業者に良く知られた方法であり、生体特異的親和力による複合体を形成しうる条件のもと、血液試料を生体特異的親和性物質に接触させ、得られるシグナルの量を測定することによって行われる方法であればどのような方法であっても良く、当業者によって適宜選択されうる。また、具体的なプロトコルも当業者によって容易に選択されうる。【００６７】
具体的には、当該方法としてはイムノアッセイが好ましい。すなわち、免疫複合体を形成しうる条件のもと、血液試料を抗体に接触させ、得られるシグナルの量を測定することによって行われる。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集測定、補体結合分析検定、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。より具体的なプロトコルは、当業者であれば容易に選択することができる。【００６８】
上記イムノアッセイにおいては、ＢＮＰ分子群に含まれるＢＮＰ分子の各々を別々に認識する複数種の抗体が用いられる。この抗体は、濃縮対象とするＢＮＰ分子群に含まれる特定のＢＮＰ分子における特徴的な領域を使用し、その領域を有するペプチド断片を認識することができる抗体として、当業者によって適宜調製されうる。【００６９】
［３−２．質量分析法］
質量分析法を用いる場合は、血液検体を上記の免疫学的濃縮に供し、得られた血液試料を検出工程に供することが好ましい。
質量分析法は、当業者に周知の方法であり、タンパク質・ペプチド分子の検出が可能なイオン化手段及び検出手段を特に限定することなく、当業者が適宜選択することができる。例えば、イオン化法として、電子イオン化法（EI）、化学イオン化法（CI）、高速原子衝撃法（FAB）、エレクトロスプレーイオン化法（ESI）、大気圧化学イオン化法（APCI）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）、表面増強レーザー脱離イオン化法（SELDI）などを用いることができる。好ましくは、MALDI-TOF型質量分析装置を用いることができる。SELDI法を用いる場合は、上記免疫学的濃縮において用いられる抗体を用いることができる。【００７０】
［４．評価工程］
［４−１．指標］
本発明においては、上記の方法によって検出されたＢＮＰ分子群から選択される少なくとも１つの分子の検出強度と、当該ＢＮＰ分子群から選択される少なくとも１つの他の分子の検出強度との比を評価のための指標とする。この指標は、これまでのＢＮＰについての量的観点に基づいた指標（すなわちＢＮＰ値）とは異なり、ＢＮＰについての質的観点に基づいた指標である。このため、従来の方法と異なり、量的観点のみでは得られない情報を血液試料から得ることが可能になる。すなわち、当該指標によって、血液試料から心筋虚血の有無すなわち冠動脈の有意な狭窄（具体的には冠動脈造影所見で７５％以上、左冠動脈主幹部においては５０％以上）の有無を判断することが可能になる。【００７１】
［４−１−１．指標例１］
本発明において用いられる指標の一例として、ＢＮＰ１−３２分子の検出強度及びＢＮＰ３−３２分子の検出強度の和と、ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比が挙げられる。具体的には、
下記式：
{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)            （式１）
（式中、(BNP 1-32)は前記ＢＮＰ１−３２分子の検出強度であり、
I(BNP 3-32)は前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度であり、
I(BNP 5-32)は前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度である。）
で表される比及びその逆比が挙げられる。【００７２】
式１で示される比の値は、狭窄が有る患者群において、狭窄が無い患者群に比べて有意に低い値となる。この傾向は、検体のＢＮＰ値が例えば１８ｐｇ／ｍＬ以上、或いは２１．９ｐｇ／ｍＬ以上の場合により強く見られる。【００７３】
［４−１−２．指標例２］
ここで、ＢＮＰ１−３２分子は、分解を受けやすく、血液採取後速やかにＢＮＰ３−３２へ変化することが、本発明者らによって確認されている。そのため、臨床検体その他の条件によってはＢＮＰ１−３２分子が観測されない、或いはほとんど観測されない場合もある。そのような場合においては、上記の指標において考慮されたＢＮＰ１−３２分子を無視した指標を用いることもできる。【００７４】
すなわち、本発明において用いられる指標の他の一例として、ＢＮＰ３−３２分子の検出強度と、ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比が挙げられる。具体的には、下記式：
I(BNP 3-32)／I(BNP 5-32)            （式２）
（式中、I(BNP 3-32)は前記ＢＮＰ３−３２分子の検出強度であり、I(BNP 5-32)は前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度である。）
で表される比及びその逆比が挙げられる。【００７５】
式２で示される比の値は、狭窄が有る患者群において、狭窄が無い患者群に比べて有意に低い値となる。この傾向は、検体のＢＮＰ値が例えば１８ｐｇ／ｍＬ以上、或いは２１ｐｇ／ｍＬ以上の場合により強く見られる。特に、血液検体中の、ＢＮＰ１−３２分子のシグナルが観測されない場合或いはシグナル強度が無視できる程度である場合にこの傾向が強い。【００７６】
［４−１−３．指標例３］
本発明において用いられる指標のさらなる他の一例として、ＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子の検出強度と、ＢＮＰ５−３２分子の検出強度との比が挙げられる。具体的には、下記式：
I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)            （式３）
（式中、I(BNP 5-32)は前記ＢＮＰ５−３２分子の検出強度であり、I(BNP 5-32+)は前記ＢＮＰ５−３２分子より質量数が１６Ｄａ大きい分子の検出強度である。）
で表される比及びその逆比が挙げられる。【００７７】
式３で示される比の値は、狭窄が有る患者群において、狭窄が無い患者群に比べて有意に高い値となる。この傾向は、検体のＢＮＰ値が例えば１８〜１５０ｐｇ／ｍＬの場合により強く見られる。また、２１ｐｇ／ｍＬ〜１５０ｐｇ／ｍＬ、３０〜１５０ｐｇ／ｍＬ或いは４０〜１５０ｐｇ／ｍＬの場合にはさらに強く見られる。【００７８】
［４−２．評価手段］
このような指標を利用して狭窄の有無を判断する場合、患者に由来する血液試料についての当該比の値を、あらかじめ定めた基準値と比較すると良い。基準値は、例えば、予め上記の比の値を確認した複数の被験者について、心臓カテーテル検査による狭窄があったか否かの結果を、統計学的解析手法を用いて解析することにより設定することができる。【００７９】
統計学的解析手法の例としては、Receiver-operating characteristics（ＲＯＣ）曲線を用いた解析が挙げられる。ＲＯＣ曲線を用いた解析においては、狭窄群を識別する感度と特異度との差が最小値を示す値を基準値とすることができる。或いは、当該基準値は、予測精度、予防効果等の臨床現場における要望や事情を勘案して、それぞれの要望や事情に最適な値を当業者が適宜調整することができる。【００８０】
さらに、本発明の方法は、他のいかなる方法と組み合わせられても良い。例えば、他の心血管疾患検査法と組み合わせることによって、より信頼性の高い検査を行うことができる。
【実施例】
【００８１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、質量分析による解析においては、同一臨床検体を同時に２サンプルを分析したそれぞれのサンプルをＭＳで２回分析した。合計４つの分析データを解析し、ＣＶ値が１５％以内の結果のみ採用した。【００８２】
［実験例１：採血管等の検討］
１）血漿調製
被験者：インフォームドコンセントの得られた健常者から採血を行った。
採血：肘静脈より一般的な方法で採血した。採血管としては、ＥＤＴＡ−アプロチニン採血管及びＥＤＴＡ採血管を検討した。血清調製のためには血清分離剤を含む一般的な採血管を使用した。
採血後の処理：採血後直ちに外部からＢＮＰ１−３２（最終濃度２００ｆｍｏｌ／ｍＬ）をスパイクし、採血後ただちに血漿分離を行った（実際に調製のために要した時間は１５〜３０分である）。また、時間変化を検討した結果、ただちに血漿分離が不可能な場合は、４度もしくは氷上にて保管後６時間以内に血漿分離を行った。その血漿は直ちに液体窒素で凍らせ、マイナス８０度にて保存した。【００８３】
融解した血漿サンプルを、後述の実験例２に詳述するＢＮＰ濃縮及び濃縮ＢＮＰの質量分析を行った。
その結果を図１に示す。図１（i）〜（iii）が示すように、いずれもＮ末端のＳＰの２アミノ酸（アミノ酸一文字略号で表記、以下において同様）がプロセスされたフラグメント（ＢＮＰ３−３２）が生じていることがわかった。Ｎ末端のＳＰの２アミノ酸がプロセスされることは、従来から報告のあるとおりである。【００８４】
しかしながら、図１（i）が示すように、ＥＤＴＡ採血管を使用した場合、さらにＮ末端のＳＰＫがプロセスされたフラグメントや、Ｃ末端のＲＨ、或いはＲＲＨがプロセスされたフラグメントも検出された。なお、Ｃ末端の切断は、氷上において時間とともに生じやすくなることも確認された（Ｎ末端の切断も、時間とともに生じやすくなることを確認した。いずれもデータ示さず）。
一方、図１（ii）及び（iii）が示すように、ＥＤＴＡ−アプロチニン採血管を使用した場合、Ｎ末端のＳＰＫがプロセスされたフラグメントが極微量検出されたものの、Ｃ末端がプロセスされたフラグメントはほとんど検出されなかった。【００８５】
従って、ＥＤＴＡ採血管を使用した場合はＢＮＰ１−３２のＮ末端やＣ末端からの切断が生じやすく、ＥＤＴＡ−アプロチニン採血管を使用した場合、ＢＮＰ１−３２のＣ末端からの切断が抑制されることが確認された。すなわち、ＥＤＴＡ−アプロチニン採血管を使用すると、ＥＤＴＡ採血管を使用した場合より、生体内のＢＮＰの存在状態をよく反映していると考えられる。
なお、採血から血漿調製までの時間変化についても検討した。すなわち、採血後ただちに血漿分離を行った場合、４度で６時間保管後に血漿分離を行った場合のそれぞれについて分析した。その結果、この両者で変化のないことを確認した（データ示さず）。【００８６】
一方、血漿分離の代わりに血清分離を行った以外は上記と同様の実験を行ったところ、血清中ではＢＮＰ１−３２はＮ末端、Ｃ末端ともにすみやかに切断されることが確認された（データ示さず）。【００８７】
［実験例２：抗体の特異性の確認］
１）血漿調製
被験者：インフォームドコンセントの得られた健常者から採血を行った。
採血：肘静脈よりＥＤＴＡ−アプロチニン採血管を使用して採血した。
採血後の処理：採血後はすみやかに氷上、もしくは４度にて保存した。採血後６時間以内に血漿分離を行い、その血漿はただちに液体窒素で凍らせ、マイナス８０度にて保存した。この血漿を融解し、ＢＮＰ混合物（Mixed BNP）として、ＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２及びＢＮＰ５−３２（各々５ｆｍｏｌずつ）を添加した。このようなＢＮＰ添加検体（５００μＬ）を２個調製した。
また別途、ＢＮＰ添加を行わずに血漿分離を行った検体も調製し、上記と同様に凍結保存した。このようなＢＮＰ非添加検体（５００μＬ）も２個調製した。【００８８】
２）ＢＮＰの濃縮
１次抗体にＫＹＢＮＰII（（株）塩野義製薬より供与を受けたもの）を、２次抗体に抗マウスＩｇＧ結合ビーズ（Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG、ベリタス社、カタログNo.112.03）を用いて、血漿中のＢＮＰを免疫沈降した。
具体的には、上記ＢＮＰ添加検体のうち１個と、上記ＢＮＰ非添加検体のうち１個とのそれぞれについて、以下の方法により免疫沈降を行った。【００８９】
抗マウスＩｇＧ結合ビーズ２０μＬをＰＢＳで３回洗浄した。
次に、ＫＹＢＮＰII ２μＬを加え、室温で１時間インキュベートすることにより、ＫＹＢＮＰIIをビーズに結合させた。
対照としては、ＫＹＢＮＰIIを加えずに、ビーズを室温で１時間インキュベートした。
これらのビーズをＰＢＳで５回洗浄した後、ＫＹＢＮＰIIを結合させたビーズを２０μＬのＰＢＳに懸濁し、氷上においた。
マイナス８０度にて保存しておいた検体を、３７度の温浴槽にてすみやかに融解し、氷上においた。
融解した検体（５００μＬ）に、ＰＢＳ（１０×）５０μＬ、ＤＤＷ  ４４０μＬ、１０％（ｗ／ｖ） Zwittergent （Calbiochem社）を加え１ｍＬとした。
上記のＫＹＢＮＰIIを結合させたビーズを２０μＬ加えた。
対照として、上記でKYBNPIIを加えずに１時間インキュベートしたビーズを２０μＬ加えた。
室温にて１時間インキュベートし、血漿中のＢＮＰをビーズに結合させた。
このビーズをＰＢＳで４回洗浄した。
さらに、２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１回洗浄した。
このビーズからのＢＮＰの溶出は、５μＬの０．５％(v/v) ＴＦＡを用いて行った。【００９０】
３）濃縮ＢＮＰの質量分析
以下の（ａ）〜（ｄ）の検体について、質量分析を行った。
（ａ）：ＢＮＰ濃縮操作を行ったＢＮＰ添加検体
（ｂ）：ＢＮＰ濃縮操作を行わなかったＢＮＰ添加検体
（ｃ）：ＢＮＰ濃縮操作を行ったＢＮＰ非添加検体
（ｄ）：ＢＮＰ濃縮操作を行わなかったＢＮＰ非添加検体【００９１】
ＢＮＰ濃縮操作を行った検体（ａ）及び（ｃ）についてはビーズから溶出した全量をＭＡＬＤＩターゲットプレートに滴下した。一方、ＢＮＰ濃縮操作を行わなかった検体（ｂ）及び（ｄ）についてもビーズから溶出した全量をＭＡＬＤＩターゲットプレートに滴下した。
マトリックスには５ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢと２．５ｍｇ／ｍＬ のＣＨＣＡの混合マトリックスを用いた。
風乾後、すみやかにAXIMA-CFR plusにて分析を行った。
AXIMA-CFR plusでの分析はリニアモードで行い、ｍ／ｚの較正にはACTH (18-39) fragment、Insulin oxidized B-chainを用いた。【００９２】
検体（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）についての質量分析結果を図２に示す。図２が示すように、ＢＮＰ濃縮操作を行ったＢＮＰ添加検体（ａ）のみにおいて、ＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２、及びＢＮＰ５−３２の特異的なシグナルを得た。従って、ＫＹＢＮＰII抗体は、ＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２、及びＢＮＰ５−３２を特異的に認識する抗体であることが確認された。【００９３】
［実験例３：検出限界（Limit of detection;ＬＯＤ）の検討］
ヒト市販血清０．５ｍＬに、下記濃度のＢＮＰ１−３２を加えて調製した血清サンプル（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）を、実験例２と同様のＢＮＰ濃縮及び質量分析に供した。
（ｅ）：２０ｆｍｏｌ（７０ｐｇ）／０．５ｍＬ血清
（ｆ）：１０ｆｍｏｌ（３５ｐｇ）／０．５ｍＬ血清
（ｇ）：５ｆｍｏｌ（１７．５ｐｇ）／０．５ｍＬ血清
（ｈ）：２．５ｆｍｏｌ（８．７５ｐｇ）／０．５ｍＬ血清
（ｉ）：１ｆｍｏｌ（３．５ｐｇ）／０．５ｍＬ血清
（ｊ）：０ｆｍｏｌ（０ｐｇ）／０．５ｍＬ血清【００９４】
得られたＭＳスペクトルを図３に示す。図３が示すとおり、サンプル（ｉ）１ｆｍｏｌ（３．５ｐｇ）／０．５ｍＬ血清のＢＮＰを検出することが可能であった。すなわち検出限界は２ｆｍｏｌ（７ｐｇ）／ｍＬである。一方、臨床現場におけるＢＮＰ値の基準値上限は１８．４ｐｇ／ｍＬである。従って、この基準値上限付近のＢＮＰ値も原理的には測定可能な検出感度を有することが確認された。【００９５】
［実験例４：臨床検体におけるＢＮＰ検出例］
１）血漿調製
被験者：心臓カテーテル検査を行う患者のうち、インフォームドコンセントの得られた患者（♯１０３７）から採血を行った。
採血：カテーテル導入前にカテーテルシースより血液を採取し、その血液をＥＤＴＡ−アプロチニン採血管に分注した。この患者のＢＮＰ値は、１１７．１ｐｇ（〜３３ｆｍｏｌ）／ｍＬであった。
採血後の処理：採血後４度で保管し、６時間以内に血漿分離を行った。その血漿は直ちに液体窒素で凍らせ、分析に供するまでマイナス８０度にて保存した。【００９６】
２）上記の♯１０３７検体について、実験例２と同様にＢＮＰ濃縮を行った。
３）以下のサンプル（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）について、実施例２と同様に質量分析に供した。
（ｋ）：ＢＮＰ濃縮を行った♯１０３７検体
（ｌ）：ＢＮＰ濃縮を行わなかった♯１０３７検体
（ｍ）:健常者由来血漿にＢＮＰ混合物（ＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２及びＢＮＰ５−３２；各々５ｆｍｏｌずつ）を添加したサンプル【００９７】
得られたＭＳスペクトルを図４に示す。図４（ｋ）より、ＢＮＰ１−３２以外に３つの特異的なシグナルを検出した。図４（ｌ）及び（ｍ）より、この特異的なシグナルは、それぞれ、Ｎ末端がプロセスされたＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２及びＢＮＰ５−３２と考えられる。【００９８】
［実施例１：臨床検体の血漿分析］
本実施例では、インフォームドコンセントが得られた患者♯１０８６（ＢＮＰ値：８９．０ｐｇ／ｍＬ）及び患者♯１０６７（ＢＮＰ値：９２．６ｐｇ／ｍＬ）から採血した血液を、実験例４と同様に血漿分離、ＢＮＰ濃縮及び質量分析に供した。【００９９】
得られたＭＳスペクトルを図５に示す。図５が示すように、ＢＮＰ１−３２、ＢＮＰ３−３２、ＢＮＰ４−３２及びＢＮＰ５−３２の４つのシグナルの相対強度比のパターンが両者において異なっていることがわかった。また、ＢＮＰ５−３２のシグナルと、それより１６Ｄａ質量数が大きいシグナルとに着目すると、♯１０８６の場合はＢＮＰ５−３２より１６Ｄａ質量数が大きいシグナルがより高い強度で検出されていることに対し、♯１０６７の場合はＢＮＰ５−３２のシグナルがより高い強度で検出されていることがわかった。【０１００】
このように、これらの検体はいずれも、従来のＥＩＡ法によるＢＮＰ測定値は約９０ｐｇ／ｍＬであまり変わらないが、本発明の方法に供することによって従来のＥＩＡ法では検出できない質的な違いを検出することが可能である。【０１０１】
［実施例２：ＭＳシグナルのパターン解析及び有意狭窄の有無との相関調査１−１］
本実施例では、インフォームドコンセントが得られた２４患者から採血した血液（ＢＮＰ値：４０．８ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬ）を、実験例４と同様に血漿分離、ＢＮＰ濃縮及び質量分析に供した。【０１０２】
得られたＭＳスペクトルにおいて、ＢＮＰ５−３２のシグナル（ｍ／ｚ＝３，０２２）のシグナルの相対強度に対する、ＢＮＰ５−３２より１６Ｄａ質量数が大きいシグナルの相対強度の比（以下、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)と表記する）を計算した。
心臓カテーテルの診断結果情報から、狭窄があった患者と、有意な狭窄がなかった患者とについて、当該比の値との相関を調べた。なお、有意な狭窄の有無という２群判別にはStudentのt検定（両側）および、後述の実施例４でＲＯＣ曲線を用いた検討を行った。【０１０３】
ＢＮＰ値が４０．８ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬの２４患者について、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)の値と、有意な狭窄の有無との関係を表した図を、図６に示す。
図６が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者では、有意な狭窄が無いと診断された患者と比較して、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)の値が有意に（ｐ＝０．００２）大きいという結果が得られた。すなわち、ＢＮＰ値が４０．８ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬである場合に、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者とでは、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)の値に顕著な相関が見られた。【０１０４】
［実施例３：ＭＳシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査１−２］
本実施例では、インフォームドコンセントが得られた４１患者から採血した血液（ＢＮＰ値：２１．４ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬ）について、実施例２と同様にＭＳシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。【０１０５】
ＢＮＰ値が２１．４ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬの４１患者について、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)の値と、有意な狭窄の有無との関係を表した図を、図７に示す。
図７が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者では、有意な狭窄が無いと診断された患者と比較して、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)の値が有意に（ｐ＝０．００２６）大きいという結果が得られた。すなわち、ＢＮＰ値が２１．４ｐｇ／ｍＬ〜１４７．８ｐｇ／ｍＬである場合にも、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者とでは、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)の値に顕著な相関が見られた。【０１０６】
［実施例４：ＭＳシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査１−３］
本実施例では、有意な狭窄の有無という２群判別にＲＯＣ曲線を用いた解析を行った。ＢＮＰ値ｘ（ｐｇ／ｍＬ）の範囲が、１０＜ｘ＜１５０、４０＜ｘ＜１５０、及び１０＜ｘ＜４０の場合について、得られたＲＯＣ曲線を図８に示す。図８が示すように、ＢＮＰ値の範囲が４０＜ｘ＜１５０の場合に特に精度が良く、この場合のＡＵＣは０．９４、I(BNP 5-32+)／I(BNP 5-32)＝０．７５としたときの感度は９１％、特異度は８５％であった。【０１０７】
［実施例５：ＭＳシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査２−１］
本実施例では、インフォームドコンセントが得られた３３患者から採血した血液（ＢＮＰ値：２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬ）について、実施例２と同様にＭＳシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。なお、２群判別にはWilcoxon検定を用いた。【０１０８】
ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３患者について、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値と、有意な狭窄の有無との関係を表した図を、図９に示す。
図９が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者では、有意な狭窄が無いと診断された患者と比較して、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値が有意に（ｐ＝０．０００７）小さいという結果が得られた。すなわち、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者とでは、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値に顕著な相関が見られた。【０１０９】
［実施例６：ＭＳシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査２−２］
本実施例では、有意な狭窄の有無という２群判別にＲＯＣ曲線を用いた解析を行った。ＢＮＰ値が２１．９ｐｇ／ｍＬ〜６４５．８ｐｇ／ｍＬの３３患者について、得られたＲＯＣ曲線を図１０に示す。図１０が示すように、ＡＵＣは０．８５、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32)＝０．７９としたときの感度は７９％、特異度は９３％であった。【０１１０】
［比較例１：ＭＳシグナルのパターン解析と高血圧の有無との相関調査］
実施例５における３３患者について、実施例５と同様に当該パターンと高血圧の有無との相関の調査を行った。【０１１１】
これらの３３患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値と、高血圧の有無との関係を示した図を、図１１に示す。
図１１が示すように、高血圧と判断される患者（HTN+）と判断されない患者（HTN-）との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値に有意な差はない（ｐ＝０．８４１１）という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例５で得られた結果と異なり、高血圧の有無と当該指標の値とでは相関がないことが示された。【０１１２】
［比較例２：ＭＳシグナルのパターン解析と高脂血症の罹患の有無との相関調査］
実施例５における３３患者について、実施例５と同様に当該パターンと高脂血症の有無との相関の調査を行った。【０１１３】
これらの３３患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値と、高脂血症の有無との関係を示した図を、図１２に示す。
図１２が示すように、高脂血症と判断される患者（HL+）と判断されない患者（HL-）との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値に有意な差はない（ｐ＝０．７６８０）という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例５で得られた結果と異なり、高脂血症の有無と当該指標の値とでは相関がないことが示された。【０１１４】
［比較例３：ＭＳシグナルのパターン解析と糖尿病の罹患の有無との相関調査］
実施例５における３３患者について、実施例５と同様に当該パターンと糖尿病の有無との相関の調査を行った。【０１１５】
これらの３３患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値と、糖尿病の有無との関係を示した図を、図１３に示す。
図１３が示すように、糖尿病と判断される患者（DM+）と判断されない患者（DM-）との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値に有意な差はない（ｐ＝０．５７１２）という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例５で得られた結果と異なり、糖尿病の有無と当該指標の値とでは相関がないことが示された。【０１１６】
［比較例４：ＭＳシグナルのパターン解析と性別との相関調査］
実施例５における３３患者について、実施例５と同様に当該パターンと性別との相関の調査を行った。【０１１７】
これらの３３患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値と、性別との関係を示した図を、図１４に示す。
図１４が示すように、男性（M）と女性（F）との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}／I(BNP 5-32) の値に有意な差はない（ｐ＝０．５３８３）という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例５で得られた結果と異なり、性別と当該指標の値とでは相関がないことが示された。【０１１８】
上記比較例１〜４と、実施例５との結果からわかるように、本発明で用いられる指標が、狭窄の有無において特異的に相関関係を示し、高血圧、高脂血症、糖尿病の有無や性別には相関関係を示さない。【０１１９】
［実施例７：ＭＳシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査３］
指標として、I(BNP 4-32)／I(BNP 5-32)を用いた以外は、実施例５と同様にＭＳシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。その結果を図１５に示す。図１５が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者との間において、当該指標のｐ値は、０．０７７１であった。【０１２０】
［実施例８：ＭＳシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査４］
指標として、{I(BNP 1-32)+I(BNP  3-32)}／I(BNP 4-32)を用いた以外は、実施例５と同様にＭＳシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。その結果を図１６に示す。図１６が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者との間において、当該指標のｐ値は、０．３８２０であった。【０１２１】
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他の色々な形態で実施することができる。例えば、上記実施例において、検出法として質量分析法を用いて本発明の指標の有効性が示されたことから、検出法として生体特異的親和性に基づく方法を用いた場合も同様の効果が示されることは明らかである。このような点も含め、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明によると、虚血性心疾患や再狭窄などの、心筋虚血状態が引き起こす病態を低侵襲的に評価することが可能になる。
また、本発明によると、従前の方法では何らかの心血管疾患の疑いがあるとあいまいに判断されるのみで、心血管疾患の有無を判断することができないＢＮＰ値（すなわち心不全疑いの有無の判断の閾値範囲１８．４〜１５０ｐｇ／ｍｌ）を示す血液試料からであっても、心血管疾患の有無を判断することが可能になる。【０１２３】
より具体的には、本発明は、従来用いられていたＢＮＰについての量的観点に基づいた指標（すなわちＢＮＰ値）とは異なり、ＢＮＰについての質的観点に基づいた指標を用いる方法であるため、量的観点のみでは得られない情報を血液試料から得ることを可能にした。すなわち、本発明は、心筋虚血状態の検査を、血液検査のみによって行うことを初めて可能にした。【０１２４】
本発明では新しい指標が用いられるため、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であった１８．４〜１５０ｐｇ／ｍｌのＢＮＰ値を示す血液試料から、そのような病態の評価が可能になった。また、本発明で用いられる新しい指標の有用性は、虚血状態において特異的に示されるものであるため、高いＢＮＰ値を示す疾患（例えば慢性心不全）においても、心筋虚血状態の有無の判断を行うことが可能になった。【０１２５】
また、本発明は血液検査で用いられるため、従来の侵襲的な検査法（心臓カテーテル検査など）と比較して非常に容易且つ低侵襲である。このため、あらかじめ行った血液検査で狭窄の疑いが有ると判断された患者のみに、より確実性を期すための侵襲的な検査法を適用することが可能になる。すなわち、不必要な心臓カテーテル検査などを回避できるため、患者の体への負担、及び検査費用を大幅に削減することが可能となる。また、従来約半年ごとに行っていた心臓カテーテル検査では処置の必要な再狭窄が半年より早くに生じていても処置ができず、的確な処置が不可能であったが、低侵襲な血液検査では簡便に繰り返し検査ができるため、より早期に的確な処置が可能となる。【０１２６】
このように、本発明の方法は、従前の検査法とは異なり、容易、低侵襲的、且つ経済的な血液検査のみで、虚血の信頼性高い評価及び早期発見が可能となる。ひいては動脈硬化の判定にも応用可能である。さらに、上述のように、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であったＢＮＰ値を示す血液試料におけるＢＮＰの意義が明らかになったため、ＢＮＰのフラグメント及びその修飾フラグメントが創薬へとつながる可能性が見出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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