(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド：
（Ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列において、１〜２０個の範囲内の個数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（Ｃ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個の範囲内の個数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項５】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチド。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド：
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個の範囲内の個数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：
【請求項６】
請求項３に記載の遺伝子によってコードされ、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリペプチドと、マーカーポリペプチド及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項５に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項９】
配列番号２におけるアミノ酸番号８３３〜１１０７に示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号１１１８〜１３９５に示されるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号１４０７〜１６９７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の抗体を用いた、魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法。
【請求項１１】
工程（ａ）：標識された請求項８又は９に記載の抗体と試料とを接触させる工程；及び
工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；
を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載の抗体を用いて、魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料から、魚類由来の未成熟生殖細胞を分離することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法。
【請求項１３】
工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された請求項８又は９に記載の抗体とを接触させる工程；及び
工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；
を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法。
【請求項１４】
魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料として、魚類の孵化胚の生殖隆起の細胞、魚類の生殖腺の細胞、及び、魚類の精巣の細胞から選択される細胞を含む試料を用いることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法。
【請求項１５】
ドナー魚類から、請求項１２〜１４の分離方法により、ドナー魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程、及び、分離されたドナー魚類由来の前記未成熟生殖細胞（分離未成熟生殖細胞）を、レシピエント魚類の初期胚に移植する工程を含むことを特徴とする分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法。
【請求項１６】
レシピエント魚類として、ドナー魚類と異種の魚類を用いることを特徴とする請求項１５に記載の分化誘導方法。
【請求項１７】
レシピエント魚類として、染色体が３倍体の魚類を用いることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の分化誘導方法。
【請求項１８】
レシピエント魚類の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にあるレシピエント魚類の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の分化誘導方法。
【請求項１９】
分離未成熟生殖細胞として、始原生殖細胞又は精原細胞を用いることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれかに記載の分化誘導方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれかに記載の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子を形成せしめることを特徴とする魚類の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代理親魚養殖技法による魚類の増殖方法に用いる魚類未成熟生殖細胞の分離に利用しうる抗体、及び該抗体を用いた魚類未成熟生殖細胞の分離方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の世界的な規模での健康意識の高まりを背景に、日本食、中でも、良質の脂質とタンパク質を含む魚類の消費は世界的に上昇している。その結果、特に需要の高いクロマグロをはじめとする大型高級魚は、生存数の減少が著しく、種類によっては絶滅が危惧される状況にまで至っている。クロマグロ等の大型高級魚資源を保護する手段の一つとして、人為的な管理の下で生産した人工種苗（稚魚）を天然海域に放流する、いわゆる栽培漁業が有効であるとされている。しかし、大型魚の放流用の人工種苗の生産に必要な卵や精子を入手するのは、技術的及びコスト的に大きな問題があった。すなわち、特定の疾患による全滅の弊害や、それらの人工種苗が成長した後に互いに交配を行った場合の弊害を避けるために、人工種苗の個体は遺伝的な多様性を保持している必要性があることを考慮すると、多数の親魚から卵や精子を採取することが望まれるが、クロマグロのように親魚が数百ｋｇにまで達する魚種や、チョウザメのように卵や精子の成熟に長い年月を要する魚種では、多数の親魚を人為的な管理の下で育成して卵や精子を採取することは技術的及びコスト的に極めて困難であった。【０００３】
卵や精子の採取に関する上記の問題を解決するため、本発明者らは世界に先駆けて、有用魚種の卵や精子を、成熟が早くかつ飼育が容易な近縁種に生産させる代理親魚養殖技術を確立した。具体的には、卵や精子などの生殖細胞系列の幹細胞である始原生殖細胞をニジマス（ドナー）の孵化稚魚から取り出し、免疫系が未熟で移植細胞の拒絶が生じない孵化前後のヤマメ稚魚（レシピエント）に前述の始原生殖細胞を移植し、得られた宿主ヤマメを育成して成熟させることによって、ヤマメが元々持っている生殖細胞に由来する卵や精子だけでなく、ドナーであるニジマスの移植細胞に由来する卵や精子を生産させる技術を確立した（例えば特許文献１参照）。この代理親魚養殖技法においては、商業的な量産化に十分な移植効率を確保するために、ドナー魚類の生殖腺や精巣から始原生殖細胞等の未成熟な生殖細胞のみを分離してそれを移植に用いる必要があるため、始原生殖細胞特異的にＧＦＰ遺伝子が発現するように、始原生殖細胞特異的に発現するｖａｓａ遺伝子の調節領域にＧＦＰ遺伝子を導入した遺伝子組換えニジマスをドナーとして用いた。しかし、この遺伝子組換えニジマス由来の始原生殖細胞を成熟させて得られる卵や精子はＧＦＰ遺伝子が導入されたものであり、それらの卵や精子を利用して生産される稚魚は、ＧＦＰ遺伝子導入組換え魚であるため、食用魚や放流用種苗として利用することはできず、実用上の利用性の点で不十分な点があった。【０００４】
一方、特許文献２には、ヒトの始原生殖細胞表面特異抗原に特異的な抗体、及び、この抗体を用いてヒト始原生殖細胞を同定することが記載されている。また、非特許文献１には、アフリカツメガエルの特定の発生段階の始原生殖細胞に特異的に発現するＶａｓａ遺伝子の遺伝子産物に反応するモノクローナル抗体を作製したことが記載されている。【０００５】
また、本発明者らは、代理親魚養殖技術における前述の遺伝子組換え魚の不十分な点を改善することを目的として、ＧＦＰ遺伝子等のマーカー遺伝子の導入を行わずに、ドナー魚類から始原生殖細胞や精原細胞等の未成熟な生殖細胞を分離する方法の探索を試みてきた。具体的には、ニジマスを用いて、その未成熟生殖細胞に特異的に発現する遺伝子の探索を行ってきた（非特許文献２参照）。【０００６】
本発明の課題は、魚類の未成熟生殖細胞に特異的に発現する遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供すること、及び、前記抗体を用いることによって、ＧＦＰ遺伝子等のマーカー遺伝子の導入を行わずにドナー魚類から未成熟生殖細胞を分離する方法や、魚類由来の未成熟生殖細胞を同定する方法を提供することにある。【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究し、ニジマスの精原細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を同定し、この抗原に対する抗体を作製した。具体的には、ニジマスの精原細胞で発現するｍＲＮＡを網羅的に解析（トランスクリプトーム解析）し、発現している遺伝子の中から細胞膜表面タンパク質をコードしている遺伝子の探索を行うことにより、ニジマスの精原細胞等の未成熟生殖細胞で特異的に発現し、かつ、in situ等でマーカーとして使用し得るクローンを得た。このクローンからｃＤＮＡを特定し、ホモロジー検索を行ったところ、１９９ｋＤａの完全膜貫通型糖タンパク質をコードするＣＤ２０５遺伝子であることが示唆された。ニジマス由来のＣＤ２０５遺伝子を、ニジマス以外の魚類（ゼブラフィッシュ、クロマグロ、ソウダガツオ、マサバ、ブリ、ヒラメ、マダイ、マハタ、ニベ）のＣＤ２０５遺伝子と比較し、各種の魚類で保存されている領域からペプチド抗原を作製し、次いで、そのペプチド抗原に対する抗体を作製した。この抗体を用いて、性分化直後のニジマスの未熟な精巣について免疫染色を行ったところ、未成熟な生殖細胞に特異的に結合することを見い出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２３５５５８号公報
【特許文献２】特表２００１−５２１３８０号公報
【非特許文献１】Develop. Growth & Differ., 34(2), 223-231(1992)
【非特許文献２】マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集Vol.9th, P148(2006.5.27）
【発明の開示】
【０００９】
すなわち本発明は、（１）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリヌクレオチド；（Ａ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド：（Ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列において、１〜２０個の範囲内の個数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：（Ｃ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：や、（２）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個の範囲内の個数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：や、（３）上記（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子や、（４）上記（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
【００１０】
また本発明は、（５）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチド；（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド：（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個の範囲内の個数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：や、（６）上記（３）に記載の遺伝子によってコードされ、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドや、（７）上記（５）又は（６）に記載のポリペプチドと、マーカーポリペプチド及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ポリペプチドに関する。
【００１１】
さらに本発明は、（８）上記（５）に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体や、（９）配列番号２におけるアミノ酸番号８３３〜１１０７に示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号１１１８〜１３９５に示されるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号１４０７〜１６９７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する上記（８）に記載の抗体に関する。
【００１２】
またさらに本発明は、（１０）上記（８）又は（９）に記載の抗体を用いた、魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法や、（１１）工程（ａ）：標識された上記（８）又は（９）に記載の抗体と試料とを接触させる工程；及び、工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法に関する。
【００１３】
さらにまた本発明は、（１２）上記（８）又は（９）に記載の抗体を用いて、魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料から、魚類由来の未成熟生殖細胞を分離することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法や、（１３）工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された上記（８）又は（９）に記載の抗体とを接触させる工程；及び、工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法や、（１４）魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料として、魚類の孵化胚の生殖隆起の細胞、魚類の生殖腺の細胞、及び、魚類の精巣の細胞から選択される細胞を含む試料を用いることを特徴とする上記（１２）又は（１３）に記載の魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（１５）ドナー魚類から、上記（１２）〜（１４）の分離方法により、ドナー魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程、及び、分離されたドナー魚類由来の前記未成熟生殖細胞（分離未成熟生殖細胞）を、レシピエント魚類の初期胚に移植する工程を含むことを特徴とする分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法や、（１６）レシピエント魚類として、ドナー魚類と異種の魚類を用いることを特徴とする上記（１５）に記載の分化誘導方法や、（１７）レシピエント魚類として、染色体が３倍体の魚類を用いることを特徴とする上記（１５）又は（１６）に記載の分化誘導方法や、（１８）レシピエント魚類の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にあるレシピエント魚類の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の分化誘導方法や、（１９）分離未成熟生殖細胞として、始原生殖細胞又は精原細胞を用いることを特徴とする上記（１５）〜（１８）のいずれかに記載の分化誘導方法や、（２０）上記（１５）〜（１９）のいずれかに記載の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子を形成せしめることを特徴とする魚類の増殖方法に関する。なお、本発明における「未成熟生殖細胞」とは、始原生殖細胞から精原細胞、精母細胞、精細胞、精子へ至る系列と、始原生殖細胞から卵原細胞、初期卵母細胞、卵母細胞、卵へと至る系列からなる生殖細胞系列のうち、始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞及び初期卵母細胞から選ばれる細胞を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】３ヶ月齢のｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプルに対するin situハイブリダイゼーションの結果を示す図である。なお、プローブとしては、ｖａｓａ遺伝子、クローン＃４０１７、クローン＃５２０６に対応するものをそれぞれ用いた。
【図２】受精後３５日後の始原生殖細胞を保持するｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス初期胚の精巣サンプルに対するinsituハイブリダイゼーションの結果を示す図である。なお、プローブとしては、クローン＃４０１７に対応するものを用いた。
【図３】未成熟な精巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１２ヶ月）の精巣サンプルに対するin situハイブリダイゼーションの結果を示す図である。なお、プローブとしては、クローン＃４０１７に対応するものを用いた。
【図４】成熟途上の精巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１８ヶ月）の精巣サンプルに対するin situハイブリダイゼーションの結果を示す図である。なお、プローブとしては、クローン＃４０１７に対応するものを用いた。
【図５】排精精巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプルに対するin situハイブリダイゼーションの結果を示す図である。なお、プローブとしては、クローン＃４０１７に対応するものを用いた。
【図６】未成熟な卵巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ導入ニジマスの卵巣サンプルに対するin situハイブリダイゼーションの結果を示す図である。なお、プローブとしては、クローン＃４０１７に対応するものを用いた。
【図７】ニジマス及び他魚種由来のＣＤ２０５ホモログの保存領域のアラインメント（アミノ酸配列）を示す図である。
【図８】Ａ：ニジマス及び他魚種由来のＣＤ２０５ホモログの保存領域のアラインメント（ヌクレオチド配列）を示す図である。Ｂ：別の領域におけるクロマグロ、ニジマス、ゼブラフィッシュのＣＤ２０５ホモログのアラインメント（アミノ酸）を示す図である。
【図９】ニジマスＣＤ２０５ ｃＤＮＡの各領域を示す図である。
【図１０】ニジマスＣＤ２０５についてリコンビナントを作製した６つの細胞外領域を示す図である。
【図１１】精製して得られた、ニジマスＣＤ２０５のリコンビナントポリペプチドについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１２】性分化直後のｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの未成熟な精巣に対して行ったホールマウント免疫染色の結果を示す図である。
【図１３】２ｎヤマメ、非移植３ｎヤマメ及び移植３ｎヤマメの精巣組織のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す図である。
【図１４】移植３ｎヤマメ（レシピエント）から採取した精液ＤＮＡ又は体細胞ＤＮＡからのＧＦＰ遺伝子断片のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図１５】移植３ｎヤマメから採取した精子を用いて作製された次世代個体のＤＮＡフィンガープリントの結果を示す図である。
【図１６】野生型２ｎヤマメ（２Ｎ）、非移植３ｎヤマメ（３Ｎヤマメ）、移植３ｎヤマメ（２Ｎ→３Ｎ）の雌個体の各生殖腺を示す図である。なお、最下段のパネルは、移植３ｎヤマメの卵母細胞がＧＦＰ陽性であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の遺伝子としては、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドや、本発明の遺伝子によってコードされ、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドであれば特に制限されず、本発明において、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドとは、いずれかの魚類に由来する未成熟生殖細胞に特異的に発現し、かつ、少なくとも一部が前記未成熟生殖細胞の細胞外又は細胞表面に位置するポリペプチドをいう。【００１７】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。【００１８】
例えば、これら１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（変異ポリヌクレオチド）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば配列番号１に示されるヌクレオチド配列）に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入することにより、変異ポリヌクレオチドを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（以後"モレキュラークローニング第３版" と略す）、Current Protocols in MolecularBiology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997) 等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを得ることができる。【００１９】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチド又はその断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００２０】
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。【００２１】
本発明のＤＮＡ等のポリヌクレオチドの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチド配列情報や、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて、魚類のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＣＤ２０５遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドの種類としてはＤＮＡを好適に例示することができる。【００２２】
本発明の遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子であるが、具体的には、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５３４９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７５７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好適に例示することができる。【００２３】
本発明における魚類としては、その未成熟生殖細胞が、本発明のポリペプチドを特異的に発現する魚類である限り特に制限されず、クロマグロ、マハタ、ブリ、ニベ、ヒラメ、マサバ、マダイ、ウナギ、シーラカンス等の海水魚や、ニジマス等の淡水魚を例示することができる。【００２４】
本発明のポリペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のポリペプチドでも、化学合成したポリペプチドでも、遺伝子組換え技術により作製した組換えポリペプチドの何れでもよい。天然由来のポリペプチドを取得する場合には、かかるポリペプチドを発現している細胞又は組織からポリペプチドの単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のポリペプチドを取得することができる。化学合成によりポリペプチドを調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のポリペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のポリペプチドを合成することもできる。遺伝子組換え技術によりポリペプチドを調製する場合には、該ポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ等のポリヌクレオチドを好適な発現系に導入することにより本発明のポリペプチドを調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。【００２５】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のポリペプチドを調製する場合、かかるポリペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとして、例えば、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のポリペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのポリペプチドの精製物を得ることができる。また、本発明のポリペプチドが細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。【００２６】
さらに、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド、又は、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドは、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜１７０５に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１におけるヌクレオチド番号７９〜５１９３に示されるヌクレオチド配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。【００２７】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドを魚類の生体内で発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のポリヌクレオチドを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、特に魚類細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましく、本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。【００２８】
本発明で用いることのできる制御配列としては、例えば、構成プロモーター、誘導性又は調節性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発現されている抗原の遺伝子由来のプロモーター等が挙げられるが、魚類の細胞内で発現可能である限り、特にそれらに限定されない。構成プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター配列、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ-４０）、筋βアクチンプロモーター、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの強力プロモーター等が挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等が挙げられる。誘導性又は調節性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、又は亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターを挙げることができる。前記転写調節配列は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、操作可能に（すなわち、前記ヌクレオチド配列の発現を調節することができるように）結合させることができる。【００２９】
前記制御配列は、プロモーター（例えば、前記誘導性又は構成性プロモーター）ＤＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことができ、所望により、更に、エンハンサー要素、転写又はポリアデニル化シグナル［例えば、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）又はウシ成長ホルモン由来］のスプライシングのためのイントロン配列、又はＣｐＧモチーフとして知られている免疫刺激ＤＮＡ配列のうち、１つ若しくはそれ以上のコピーを含むことができる。【００３０】
また、発現ベクターは、所望により、例えば、細菌複製起点配列、あるいは、選別させるための抗生物質耐性（例えば、カナマイシンなど）遺伝子又は非抗生物質耐性遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子など）等の選択性マーカーを含むことができる。【００３１】
本発明の融合ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと、マーカーポリペプチド及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ポリペプチドからなる。マーカーポリペプチドとしては例えばＧＦＰやルシフェラーゼタンパク質や、ＬａｃＺタンパク質等を例示することができ、ペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等を例示することができる。本発明の融合ペプチドは、本発明のポリペプチドやマーカーポリペプチドやペプチドタグを用い、公知の遺伝子工学を利用して作製することができる。【００３２】
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体としては、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体である限り特に制限されないが、配列番号２におけるアミノ酸番号８３３〜１１０７に示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号１１１８〜１３９５に示されるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号１４０７〜１６９７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体であることが好ましい。本発明の抗体の種類としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のポリペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの分離・定量や、本発明のポリペプチドの分子機構を明らかにする上で有用である。【００３３】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ポリペプチド若しくはそのエピトープを含む断片、又は該ポリペプチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。【００３４】
また上記本発明のモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、上記本発明の抗体にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合ポリペプチドを用いることによって、上記本発明のポリペプチドの機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。【００３５】
本発明の魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法としては、本発明の抗体を利用する方法である限り特に制限されないが、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を有する方法を好適に例示することができる。
工程（ａ）：標識された本発明の抗体と試料とを接触させる工程；
工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；【００３６】
上記工程（ａ）における抗体の標識としては、前述の蛍光物質や酵素を用いることができる。また、上記工程（ａ）における抗体と試料との接触は、適当な溶媒中で行うことができる。上記工程（ｂ）における前記抗体と試料とが特異的に結合しているかどうかは、ＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法等の公知の免疫学的測定法により確認することができる。【００３７】
上記工程（ｂ）の結果、前記抗体が特異的に結合した試料又は試料中の物質は、魚類由来の未成熟生殖細胞と同定することができ、一方、前記抗体が特異的に結合しなかった試料又は試料中の物質は、魚類由来の未成熟生殖細胞でないと同定することができる。【００３８】
本発明の魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法としては、本発明の抗体を用いて、魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料から、魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する方法である限り特に制限されないが、以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を有する方法を好適に例示することができる。
工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された本発明の抗体とを接触させる工程；
工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；【００３９】
上記工程（Ａ）に用いる試料としては、魚類の未成熟生殖細胞を含む試料である限り特に制限されないが、魚類の孵化胚の生殖隆起や、魚類の生殖腺や精巣の細胞を含む試料を好適に例示することができ、前述の生殖隆起や生殖腺や精巣をタンパク質分解酵素で細胞ごとにバラバラになるまで解離し、それを適当な溶媒に分散させた試料をより好適に例示することができる。
また、上記工程（Ａ）における抗体の標識には、前述の蛍光物質や酵素を用いることができる。さらに、上記工程（Ａ）における抗体と試料との接触は、適当な溶媒中で行うことができる。上記工程（Ｂ）における分離は、セルソーター等を利用する方法の他、本発明の抗体を認識する２次抗体を磁性ビーズで標識したもの（磁性ビーズ標識２次抗体）を利用する方法などにより、本発明の抗体が結合した未成熟生殖細胞のみを容易に分離することができる。磁性ビーズ標識２次抗体を用いると、磁石を利用することによって、上記工程（Ｂ）における分離を迅速簡便に行うことができる点で好ましい。【００４０】
本発明の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法は、上記の本発明の分離方法によって分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞（分離未成熟生殖細胞）を、レシピエント魚類の初期胚に移植することよりなる。分離未成熟生殖細胞のレシピエント魚類の初期胚への移植は、初期発生段階のレシピエント魚類の腹腔内腸管膜裏側への移植によって行うことができる。本発明の分化誘導方法により、分離未成熟生殖細胞を、例えばレシピエント魚類の孵化胚の腹腔内に、マイクロインジェクション法のような方法で移植すると、移植した未成熟生殖細胞は、自発的にレシピエント魚類の生殖腺内へと移動し、そこで卵母細胞或いは精母細胞への分化誘導、更には卵或いは精子への分化誘導を行うことができる。上記分離未成熟生殖細胞としては、孵化前後の胚から分離した未成熟生殖細胞、好ましくは始原生殖細胞や精原細胞を用いることができ、又、移植先となる上記レシピエント魚類の初期胚としては、孵化前後の発生段階にあるレシピエント魚類を用いることが好ましい。また、レシピエント魚類として、染色体が３倍体の魚類を用いると、レシピエント魚類由来の卵及び／又は精子がほとんど形成されることなく、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子、特に雌においてはほとんどドナー由来の卵が特異的に形成される点で好ましい。【００４１】
上記の染色体が３倍体のレシピエント魚類は、特開２００６−１０１８４５号公報に記載された方法により容易に作製することができる。具体的には、通常２倍体魚類の雌親からの卵と、通常２倍体魚類の雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、１０℃の流水下で発生を開始させ、受精後１５分経過した後に２８℃の温水に浸漬し、その後１０℃の流水で通常卵となると同様に発生させる方法の他、通常２倍体魚類の雌親からの卵と、通常２倍体魚類の雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、圧力処理によって第二極体の放出を阻止することにより卵の染色体を三倍体化した受精卵を経て、３倍体稚魚を作出する方法や、紫外線やγ線によって不活性化した精子を卵にかけ、発生させることで雌性発生を行わせ、第二極体放出阻止法（発生の過程で、圧力刺激や温度刺激によって第二極体の放出を阻止して２倍体にする方法）又は第一卵割阻止法（発生の段階で第二極体を放出して雌性前核のみで発生を開始したところに、物理化学的な刺激を与え、第１回の卵割を阻止して２倍体とする方法）により染色体を倍加する方法や、雌魚を雄性ホルモン（テストステロン）で処理して、性転換を起こさせ雄化させ、この偽雄と普通の雌を交配する方法等を挙げることができる。３倍体のレシピエント魚類としては、殆どドナー由来の卵が特異的に形成される雌が好ましい。【００４２】
また、本発明の分化誘導方法におけるレシピエント魚類とドナー魚類の種類は、同種であってもよいが、異種の魚類を用いることもできる。上記異種の魚類としては同属異種の魚類や異属の魚類を挙げることができ、例えば、ドナー魚類がニジマスの場合、同属異種のレシピエント魚類としてヤマメを、異属のレシピエント魚類としてブラウントラウト、イワナを具体的に例示することができ、ドナー魚類がクロマグロの場合、同属異種のレシピエント魚類として、メバチマグロ、ビンナガマグロ、キハダマグロ、メバチマグロ等を、異属のレシピエント魚類としてマサバを具体的に例示することができ、ドナー魚類がブリやカンパチの場合、異属のレシピエント魚類として、マアジやニベを例示することができる。また、ドナー魚類がハタ、ウナギの場合は、近縁の飼育が容易な異種の魚類を用いることができる。異種の魚類を用いる場合、例えばドナー魚類由来の未成熟生殖細胞として、成魚までの育成が比較的高コスト、高労力である魚類（例えばレシピエント魚類より大型の魚類）の未成熟生殖細胞を用い、レシピエント魚類として、成魚までの育成が比較的低コスト、低労力である魚類（例えばドナー魚類より小型の魚類）を用いると、移植後のレシピエント魚類を育成することによって、ドナー魚類の卵や精子を、例えば比較的小型の水槽を用いて、比較的低コスト、低労力で分化誘導することが可能となる。このメリットを享受するために好ましいドナー魚類とレシピエント魚類の組み合わせとしては、クロマグロ（ドナー）とマサバ（レシピエント）の組み合わせや、ニジマス（ドナー）とヤマメ（レシピエント）の組み合わせを例示することができる。【００４３】
本発明の魚類の増殖方法は、本発明の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法によって、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子を形成せしめることよりなる。より具体的には、例えば、移植後のレシピエント魚類から、ドナー由来の卵や精子を採取し、この卵や精子を用いて受精卵を作製し、これを孵化させてドナーの稚魚を得、これを育成してドナー魚類の新規個体を作成し、ドナー魚類を大量に増殖させることができる。【００４４】
また、本発明の分化誘導方法の、魚類の増殖方法への利用のその他の具体例としては、次のようなものがある。
（１）魚類の遺伝子資源の保存への利用：希少種、絶滅危惧種の未成熟生殖細胞を凍結保存し、必要な時に飼育が容易な近縁種のレシピエントに移植すれば、これらのレシピエントは希少種、あるいは絶滅危惧種（場合によっては既に絶滅した種）に由来する卵や精子を作出することが可能となる。また、今後遺伝子導入等の技術により様々な有用系統・品種が作出された場合、個体の経代飼育を行わなくてもこれらの維持が可能であり、必要なときにレシピエント胚への移植により個体へ改変することが可能となる。
（２）分離した未成熟生殖細胞の分子生物学的・生化学的解析への利用：分離した未成熟生殖細胞からタンパク質、核酸を抽出し解析することで、この細胞で発現している遺伝子・タンパク質の同定が可能になる。特に再生医療等で注目されている幹細胞の解析系として有用である。
（３）魚類の育種（品種改良）への利用：分離した未成熟生殖細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的改変を施した後、レシピエント個体内に移植し、卵・精子に分化させ、受精することで、効率よく、目的の遺伝的改変を行った個体を作製することができる。未成熟生殖細胞の遺伝的改変を行うには、前記したように、魚類で、既に用いられている公知の遺伝子の導入方法及び遺伝子の改変方法を用いることができる。該方法としては、例えば、魚類の遺伝子導入方法として汎用されている、マイクロインジェクション法及びエレクトロポーレーション法を挙げることができる。
（４）魚類の遺伝子機能解析への利用：未成熟生殖細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することが可能になれば、この細胞に対して遺伝子ターゲティングを行った後、上記の方法で未成熟生殖細胞を個体に変換することで、例えば、当該遺伝子の機能が破壊されたノックアウト魚や、さらには当該遺伝子の配列を改変したノックイン魚を作出することが可能となる。すなわち、マウスで利用されている胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の代用として利用することが可能であり、これにより機能が未知の新規遺伝子の役割を明らかにすることが可能となる。【００４５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
［魚類未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドの探索］
特開２００３−２３５５５８号公報（［００４０］）において本発明者らが作出した、ｖａｓａ遺伝子の転写調節領域により制御されるＧＦＰ遺伝子を導入したニジマス（以下、「ｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス」という。）から、ＧＦＰ蛍光を指標としたフローサイトメトリーにより、Ａ型精原細胞を１×１０７個単離した。単離したＡ型精原細胞からｍＲＮＡを抽出し、常法にしたがってｃＤＮＡライブラリーを作製した。続いて、本ライブラリーに含まれるｃＤＮＡのうち、５２０６クローンをランダムに選択し、その５’末端側の塩基配列を決定した。さらに、in silicoにて膜タンパク質予想プログラムを用いて、これら５２０６個のクローンの中から、膜タンパク質としての特徴を有している８２個のクローンを同定した。これら８２個のクローンは、Ａ型精原細胞で発現していることは明らかであるものの、その発現がＡ型精原細胞（未成熟生殖細胞）に特異的であるのか、あるいは生殖細胞ではない生殖腺体細胞においても発現しているのかは不明であった。そこで、得られた８２クローンのうち、未成熟生殖細胞で特異的に発現するクローンを同定するため、各クローンに対するプライマーをデザインし、常法にしたがってＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。なお、このＲＴ−ＰＣＲにおける鋳型ｃＤＮＡとしては、フローサイトメトリーで単離した上記Ａ型精原細胞由来のｃＤＮＡや、生殖腺の体細胞由来のｃＤＮＡを用いた。その結果、８２クローンのうち、２０クローンが、未成熟生殖細胞で特異的、あるいは特に高レベルで発現していることが判明した。
魚類未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドの発現量は、該ポリペプチドをターゲットとして抗体によって魚類未成熟生殖細胞の分取等に利用する場合に有利であることから、より高いことが望まれる。ここで、上記ＲＴ−ＰＣＲは感度が極めて高いため、この２０クローンの中からより発現量が高いものをスクリーニングするためには最適とはいえない。そこで、これら２０クローンの各クローンをプローブとして用いて、３ヶ月齢のｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプルに対して常法にしたがってin situハイブリダイゼーションを行い、そのシグナル強度の解析を試みることとした。その結果、２０クローンのうち、２クローン（クローン＃４０１７と＃５２０６）において、３ヶ月齢精巣のＡ型精原細胞に特異的で、かつ、より強いシグナルが認められた（図１）。そこで、これら２クローンのうち、シグナルがより強かったクローン＃４０１７を用いてさらなる詳細な発現解析を行うこととした。
【実施例２】
【００４７】
［クローン＃４０１７の発現解析］
未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製した場合に、その抗体の汎用性を高めるためには、そのポリペプチドが上記in situハイブリダイゼーション等に用いた３ヶ月齢のＡ型精原細胞のみならず、あらゆるステージの生殖腺において、始原生殖細胞や精原細胞等の未成熟生殖細胞を特異的に認識することが要求される。そこで、上記のin situハイブリダイゼーションで用いたサンプルに代えて、受精後３５日後の始原生殖細胞を保持するｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス初期胚の精巣サンプル（図２）、未成熟な精巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１２ヶ月）の精巣サンプル（図３）、成熟途上の精巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１８ヶ月）の精巣サンプル（図４）、排精精巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプル（図５）、又は、未成熟な卵巣を持つｖａｓａ−ＧＦＰ導入ニジマスの卵巣サンプル（図６）を用いて、同様のin situハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブとしては、上記実施例１で用いた、クローン＃４０１７に対するアンチセンスプローブ（配列番号３）を用いた。その結果を図２〜図６に示す。その結果、すべてのサンプルにおいて、クローン＃４０１７は始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞や初期卵母細胞で特異的に発現していることが明らかとなった。
以上の実験により、クローン＃４０１７が始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞や初期卵母細胞等の未成熟生殖細胞のマーカー分子として適していることが示された。
【実施例３】
【００４８】
［クローン＃４０１７のポリヌクレオチド配列の決定］
上記実施例２の実験により、クローン＃４０１７が、未成熟生殖細胞特異的に発現し、そのマーカー分子として適していることが示された。そこで、クローン＃４０１７の全長を常法であるＲＡＣＥ−ＰＣＲ法により単離し、その全塩基配列を決定した。その結果、本クローンは１９９ｋＤのポリペプチド（配列番号２）をコードする５２７４ｂｐのオープンコード領域を含む全長６５４１ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号１）であることが明らかとなった。本クローンのポリペプチドについてホモロジー解析を行ったところ、本クローンはＣＤ２０５のホモログである可能性が示唆された。そこで、ニジマス以外の魚にも、ＣＤ２０５ホモログが存在するかを確認するために、ゼブラフィッシュ、クロマグロ、ソウダガツオ、マサバ、ブリ、ヒラメ、マダイ、マハタ、ニベについて調べたところ、すべての魚からＣＤ２０５ホモログが単離された。これらのＣＤ２０５ホモログを解析し、その演繹アミノ酸配列から各魚種間で保存されている領域を探索したところ、図７（配列番号２におけるアミノ酸番号１２２２〜１２６０に示されるアミノ酸配列と、ＣＤ２０５ホモログにおいてそれに相当するアミノ酸配列との比較）及び図８Ａ（配列番号１におけるヌクレオチド番号３７４２〜３８５８に示されるヌクレオチド配列と、ＣＤ２０５ホモログにおいてそれに相当するヌクレオチド配列との比較）に示される領域において、ニジマスのＣＤ２０５と極めて相同性が高いことが判明した。また、図８Ｂに示される別の領域においても、クロマグロ、ニジマス、ゼブラフィッシュのＣＤ２０５ホモログのアミノ酸配列はかなり相同性が高いことが判明した。
【実施例４】
【００４９】
［クローン＃４０１７のポリペプチドに対する抗体の作製］
実施例３において見出されたＣＤ２０５の保存領域内（配列番号２におけるアミノ酸番号１２２２〜１２６０に示されるアミノ酸配列）においてさらに抗原性が高いと予想される配列にしたがって、ニジマスＣＤ２０５由来の２種類のペプチド抗原を合成し、それぞれの抗原を２羽ずつ（計４羽）のウサギに免疫して４種類の抗血清を作製した。しかし、この４種類の抗血清を用いてウエスタンブロット法や免疫組織化学染色を行ったところ、これらの抗血清の中には、ＣＤ２０５を特異的に認識するものは含まれていなかった。そこで、次に、配列番号２のポリペプチド（ニジマスのＣＤ２０５）（図９）の細胞外領域を６つの領域に分断し（図１０）、それぞれに対応するｃＤＮＡ配列を発現ベクターpCold I（TaKaRa社製）に乗せ、得られたベクターを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒに形質転換し、この形質転換体を培養することによって、前述の６つの領域のポリペプチドを生産した。これら６領域のポリペプチドについてＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製を試み、得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、６領域中、４領域（領域２、領域４、領域５、領域６）のポリペプチドのみを精製することができた（図１１）。これら４領域のポリペプチドをそれぞれ別のウサギに免疫し、各ウサギから抗血清を採取した。得られた４種類のそれぞれの抗血清を用い、性分化直後のｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの未成熟な精巣に対してホールマウント免疫染色を行った。得られた４種類の抗血清のうち、１種類の抗血清（以下、「＃４０１７抗体」ともいう。）のホールマウント免疫染色の結果を図１２に示す。上段が、＃４０１７抗体で検出したイメージであり、中段が、生殖細胞が生産しているＧＦＰを検出したイメージであり、下段が、上段と中段のイメージを重ね合わせたものである。この結果から、＃４０１７抗体が未成熟生殖細胞（精原細胞）を特異的に認識することが示された。なお、他の３種類の抗血清を用いた場合も、同様のイメージが得られた。【００５０】
［参考例］ニジマス未成熟生殖細胞を移植したヤマメにおけるドナーニジマス生殖細胞の分化誘導、及び、前記ヤマメを利用したドナーニジマスの増殖
ドナー魚類からＧＦＰを指標として分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞をレシピエント魚類の初期胚に移植し、得られた移植レシピエント魚類を育成することによって、ドナー由来の生殖細胞が得られるか、また、移植レシピエント魚類から得られた、ドナー魚類由来生殖細胞を利用して、ドナー魚類の稚魚が得られるかを確認するために、以下の実験を行った。【００５１】
まず、レシピエント魚類として、特開２００６−１０１８４５号公報記載の方法にしたがって、染色体が３倍体のヤマメ（以下、「３倍体ヤマメ」又は「３ｎヤマメ」ともいう。）の孵化稚魚を作製した。この方法は、ヤマメ等のサケ科魚類では受精後１５分経過した受精卵を２７℃の温水に１５分間浸漬すると、第２極体の放出を容易かつ確実に阻止できることを利用したものである。３倍体個体は、不妊になるため、ドナーの未成熟生殖細胞を移植した場合に、レシピエント自身の卵や精子と混ざることなく、ドナー由来の卵や精子のみを作製し得る点でレシピエント魚類として好ましい。【００５２】
上記方法により得られた３倍体ヤマメの孵化稚魚（レシピエント）の腹腔内に、妊性を有している２倍体のｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（ドナー）のＡ型精原細胞を移植した。移植後のレシピエント個体をその後、継続飼育し、産卵期直前の雄個体（移植３ｎヤマメ）から精巣を採取した。採取した精巣の組織を切片化し、ヘマトキシリン・エオシン染色によって組織形態を観察した。また、コントロールとして、ドナー細胞を移植しなかった３倍体ヤマメの産卵期直前の雄個体（非移植３ｎヤマメ）の精巣組織や、野生型の２倍体ヤマメの産卵期直前の雄個体（２ｎヤマメ）の精巣組織も観察した。これらの観察結果を図１３に示す。この図１３の結果から分かるように、非移植３ｎヤマメは、体細胞分裂期の精原細胞しか有していなかったのに対し、２倍体のドナーニジマスの未成熟生殖細胞（Ａ型精原細胞）を移植した移植３ｎヤマメでは、野生型の２ｎヤマメと同様に、成熟精子で充満した精巣組織を確認することができた。【００５３】
上述の移植３ｎヤマメをさらに継続して飼育したところ、移植から満１年で雄個体の一部が成熟したため、そのうち１０個体の精液からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡと、ドナーニジマスの細胞に特異的なＧＦＰプライマーとを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（＃１〜＃１０の「精」）をアガロースゲルで電気泳動した結果、これら１０個体（＃１〜＃１０）のすべてでＧＦＰ遺伝子断片の増幅が認められた（図１４）。また、これら１０個体の精液由来のＤＮＡに代えて、体細胞由来のＤＮＡを用いて同様のＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物（＃１〜＃１０の「体」）を同様に電気泳動した場合は、ＧＦＰ遺伝子断片の増幅は認められなかった。さらに、ドナーニジマス（ｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス）（陽性対照個体）や野生型ヤマメ（陰性対照個体）や野生型ニジマス（陰性対照個体）について、それぞれ精液及び体細胞から抽出したＤＮＡを用いて同様のＰＣＲ解析を行ったところ、ドナーニジマスの精液及び体細胞においてもＧＦＰ遺伝子の発現が確認されたのに対し、野生型ヤマメや野生型ニジマスの場合は精液からも体細胞からもＧＦＰ遺伝子の発現は確認されなかった。また、内部標準として、β−アクチンを用いた。【００５４】
次に、成熟した移植３ｎヤマメから得られる精液が、ドナー由来の精液として実際に機能するかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
上記の成熟した移植３ｎヤマメから採取した精液を、野生型ニジマスから採取した未受精卵に媒精したところ、得られた卵からニジマスの稚魚（以下、「ニジマスＦ１稚魚」という。）が孵化した。また、この孵化のタイミングは、野生型ニジマス由来の受精卵の場合と全く同じタイミング（受精後３２−３３日）であった。なお、ニジマスの卵とヤマメの精子の受精により生じた雑種の受精卵は、大幅に孵化が遅れ、孵化後の稚魚は接餌開始期までに全滅することを確認している。
上記のニジマスＦ１稚魚は、ドナーニジマスのマーカーであるＧＦＰ遺伝子を保持しており、生殖細胞が緑色蛍光で標識されていることが確認された。さらに、公知のＲＡＰＤ（Random Amplification DNA Fingerprinting）法によるＤＮＡ鑑定を行った結果、調査したニジマスＦ１稚魚５０個体の全てが完全にニジマス型のＤＮＡパターンを示し、ヤマメ特有のＤＮＡ断片は全く認められなかった。ニジマスＦ１稚魚５０個体のうち、２０個体についてのＲＡＰＤ法の結果を図１５に示す。また、対照として、ニジマス、ヤマメ、及び、ニジマスとヤマメの雑種（ニジヤマ）の結果も併せて示す。
以上の結果から、成熟した移植３ｎヤマメから得られる精液が、ドナーであるニジマスの精液として実際に機能することが示された。【００５５】
次に、移植３ｎヤマメの雌から得られる卵が、ドナーであるニジマスの卵として実際に機能するかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
移植後９ヶ月目の移植３ｎヤマメ（２Ｎ→３Ｎ）の雌個体を解剖して観察を行ったところ、非移植３ｎヤマメ（３Ｎ）の雌に典型的な小型卵母細胞しか保持しない糸状の卵巣の中央部に、野生型の２ｎヤマメ（２Ｎ）ヤマメが保持するような大型の卵母細胞から構成されるコロニーを観察することができた。さらに、これらの大型卵母細胞はドナーニジマスのマーカーである明瞭なＧＦＰ蛍光を発していた（図１６）。そこで、これらの雌個体を継続飼育した結果、５０尾の雌親魚のうち５尾で排卵が認められた。そこで、この５尾の雌個体から得られた卵を、前述の移植３ｎヤマメの雄個体から得られた精液で媒精した。その結果、図１６に示すように、受精した全ての卵が正常に発生し、通常のニジマスと全く同じタイミングで孵化を完了した。孵化した各稚魚の染色体のゲノムや、母性遺伝することが知られているミトコンドリアゲノムについてＤＮＡ解析を行ったところ、全ての稚魚個体が完全にニジマスであることが証明された。また、これらの稚魚はその後も正常に成育した。
以上より、移植３ｎヤマメの雄個体と雌個体を用いることにより、ドナーであるニジマスのみの稚魚を生産することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドや遺伝子やポリペプチドを指標とすることによって、魚類由来の未成熟生殖細胞を容易に分離又は同定することが可能となる。
また、本発明を利用すれば、ＧＦＰ等の遺伝子組換え技術を利用することなく、ドナー魚類から未成熟生殖細胞のみを単離することができるため、食用魚や放流用種苗としても利用可能な代理親魚養殖技法が高効率で実現可能となる。
また、この代理親魚養殖技法において、成魚までの育成が比較的高コスト、高労力である魚類をドナー魚類とし、成魚までの育成が比較的低コスト、低労力である魚類をレシピエント魚類とすると、ドナー魚類由来の未成熟生殖細胞をレシピエント魚類に移植し、それを成魚まで育成することによって、比較的低コスト、低労力でドナー魚類の生殖細胞へと分化誘導することができ、その生殖細胞を用いることによって、ドナー魚類を比較的低コスト、低労力で増殖させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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