(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）項から（４）項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも１個の塩基配列を含んでなるハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１個の領域を含んでなる単離された純粋なＤＮＡであって、
前記ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドが、ポリケチド合成酵素、１８位水酸化酵素、１４，１５位エポキシ化酵素、１７位−Ｏ−メチル基転移酵素および転写調節因子から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、ＤＮＡ。
（１）  以下の（ａ）項から（ｈ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列
（ａ）  配列番号１の塩基６６８１から塩基７７０６までの連続した塩基配列
（ｂ）  配列番号１の塩基８９１９から塩基２８２９５までの連続した塩基配列
（ｃ）  配列番号１の塩基２８３２６から塩基４９８９２までの連続した塩基配列
（ｄ）  配列番号１の塩基４９８９２から塩基５５９８１までの連続した塩基配列
（ｅ）  配列番号１の塩基５６１１５から塩基５７５４５までの連続した塩基配列
（ｆ）  配列番号１の塩基５７５７５から塩基５８４３５までの連続した塩基配列
（ｇ）  配列番号１の塩基５８５３３から塩基５９７９８までの連続した塩基配列
（ｈ）  配列番号１の塩基１から塩基６５３６０までの連続した塩基配列
（２）  （１）項において定義されたいずれかの塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが有する塩基配列
（３）  （１）項において定義されたいずれかの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列
（４）  遺伝暗号の縮重のため、（１）項において定義された塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（１）項から（３）項までのいずれかの項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列
前記ストリンジェントな条件とは、０．５ＭのＮａＣｌおよび５０％ホルムアミドの存在下、６１〜６４℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６１〜６４℃で洗浄する条件である。
【請求項２】
以下の（ａ）項から（ｈ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも１個の塩基配列を含んでなるハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１個の領域を含んでなる単離された純粋なＤＮＡであって、
前記ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドが、ポリケチド合成酵素、１８位水酸化酵素、１４，１５位エポキシ化酵素、１７位−Ｏ−メチル基転移酵素および転写調節因子から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、ＤＮＡ。
（ａ）  配列番号１の塩基６６８１から塩基７７０６までの連続した塩基配列
（ｂ）  配列番号１の塩基８９１９から塩基２８２９５までの連続した塩基配列
（ｃ）  配列番号１の塩基２８３２６から塩基４９８９２までの連続した塩基配列
（ｄ）  配列番号１の塩基４９８９２から塩基５５９８１までの連続した塩基配列
（ｅ）  配列番号１の塩基５６１１５から塩基５７５４５までの連続した塩基配列
（ｆ）  配列番号１の塩基５７５７５から塩基５８４３５までの連続した塩基配列
（ｇ）  配列番号１の塩基５８５３３から塩基５９７９８までの連続した塩基配列
（ｈ）  配列番号１の塩基１から塩基６５３６０までの連続した塩基配列
【請求項３】
請求項１または２に記載されたＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
【請求項４】
ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２、３または４記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
１４，１５位エポキシ化酵素活性を有することを特徴とする、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号５記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
１７位−Ｏ−メチル基転移酵素活性を有することを特徴とする、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号６記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
１８位水酸化酵素活性を有することを特徴とする、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号７記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
転写調節因子活性を有することを特徴とする、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号８記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１または２に記載されたＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項１５】
請求項１または２に記載されたＤＮＡを保持する形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５記載の形質転換体を培地で培養し、その培養液からハーボキシジエンまたはその類縁体を採取することを特徴とする、ハーボキシジエンまたはその類縁体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡおよびそれらの改変体に関する。また、それらのＤＮＡおよびそれらの改変体の一部または全体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いたハーボキシジエンまたはその類縁体の製造方法に関する。さらに、ハーボキシジエン類縁体に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌の生産する様々な代謝産物のなかには生理活性物質として重要な物質が見出されている。とりわけ構造上ポリケチドを母核にもつ化合物（以下、ポリケチド化合物という）が多く見出されている。例えば、抗菌性物質として知られるエリスロマイシン、ジョサマイシン、タイロシン、ミデカマイシン、マイシナマイシン、抗真菌性物質として知られるナイスタチン、アンフォテリシン、殺虫性物質として知られるミルベマイシン、エバーメクチン、免疫抑制物質として知られるタクロリムス、ラパマイシンおよび抗腫瘍性物質として知られるダウノマイシン、アドリアマイシン、アクラシノマイシンなどのように種々の生物活性を有する化合物が知られている。【０００３】
そのような化合物の１つとしてハーボキシジエンと命名された優れた抗腫瘍活性を示す一群のポリケチド化合物がある。ハーボキシジエンは、当初放線菌ストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ）  Ａ７８４７株の培養物から見出された下記式（Ｉ）で示される化合物であり（非特許文献１参照）、その後、いくつかの放線菌株から、ハーボキシジエンをはじめとして５種以上の類縁体が見出されている（特許文献１および２参照）。【０００４】
【化１】
0005524053.tif 000002
【０００５】
一方、ポリケチド化合物の生合成機構についても多くのことが知られている。上記の多種多様なポリケチド化合物は共通な生合成機構を共有していると言われており、その機構は脂肪酸の生合成と極めて類似している。即ち、ポリケチド化合物の合成は酢酸やプロピオン酸などの低級脂肪酸が連続的に縮合し、次いで伸張したアシル基のβ位のカルボニル基を脂肪酸合成と同様な方法で様々にケトン還元、脱水あるいはエノイル還元する工程により生合成される。これら多くのポリケチド化合物の種々の反復的な合成工程はそれぞれの反応触媒活性に必要な別々の活性部位（ドメイン）を有する高分子の多機能酵素複合体によって調節されると言われている。ポリケチド生合成の一般的な反応様式は、例えば、非特許文献２および３に概説されている。【０００６】
ポリケチド合成酵素をコードしているＤＮＡ配列は一般にポリケチド骨格合成に必要なすべての活性をコードしており、縮合工程と縮合後の修飾工程を含む反復単位、即ちモジュールに構成されていることが明らかにされている。各々の触媒活性は、各縮合工程に含まれる特定のカルボン酸構成単位に対する特異性に関与するかあるいは達成される特定の縮合後の修飾機能を規定する異なる部位が関与している。例えば非特許文献４にはストレプトマイセス・ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＡＴＣＣ１５４３９のピクロマイシン生合成に関わるポリケチド合成酵素をコードする遺伝子について記載されている。また特許文献３にはサッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）のエリスロマイシンポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の構成が記載されている。この遺伝子は６つのモジュールから構成されており、各モジュールが１つの縮合工程を行う。即ち、アシル側鎖伸長の正確な配列と伸長している鎖の修飾は各モジュールに存在する遺伝子情報によって決定される。【０００７】
また、多種多様なポリケチド化合物は、ポリケチド合成酵素によりポリケチド骨格の合成が行われた後、水酸化、エポキシ化、メチル化などの修飾反応を触媒する酵素（以下、修飾酵素ということがある）により、しばしば修飾を受けて最終的な代謝産物に変換される。これらの生産に関与する遺伝子群、すなわち最終的な代謝産物を生合成するために必要な酵素のほか、生産調節に必要な調節因子などをコードする遺伝子（以下、これらの生合成に関与する遺伝子群を総称して単に「生合成遺伝子」と称することがある）は、一般に生産菌のゲノムまたはプラスミド上のＤＮＡ領域にクラスターを形成して配置されていることが明らかにされている。【０００８】
ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列情報が決定されれば、その情報を基にして、ドメインを改変することにより、炭素鎖の大きさ、縮合過程のβ位炭素の官能基を変化させることが可能となってくる。例えば非特許文献５には、エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子内の特定ドメインを選択的に不活化することにより、エリスロマイシンの新規誘導体を生じさせることができると記載されている。さらに、各モジュールのドメインを他のものと組み換えることにより、予測可能な新規の化合物を生産させることが可能となってくる。例えば非特許文献６には、エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子内のドメインをいくつか組み換えることで多種の新規化合物ができることが記載されている。【０００９】
また、修飾酵素をコードする遺伝子（以下、修飾酵素遺伝子ということがある）を含んだ生合成遺伝子クラスターの塩基配列が決定されれば、その情報を基にして、修飾酵素遺伝子を選択的に改変することにより、予測可能な新規の化合物を生産させることが可能となってくる。例えば、非特許文献７には、エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に存在する水酸化酵素遺伝子ｅｒｙＦを欠損させることで新たな誘導体６−デオキシエリスロノリドＢができることが記載されている。
【００１０】
さらに修飾酵素遺伝子の発現を活性化することで不要な副産物を減少させ、単一の目的成分を生産させることも可能となる場合がある。遺伝子発現の活性化には一般的にはプロモーターを置換することによる転写活性化、マルチコピーベクターを用いた遺伝子コピー数の増加、遺伝子への変異導入による酵素活性の向上などによる方法が知られている。また調節遺伝子を同様な方法で活性化させたり、逆に不活性化させたりすることで生産性を高めることが可能となる場合がある。【００１１】
さらに、これら生合成遺伝子クラスターをコードする遺伝子を取得し、適当な方法を用いて異種菌株に導入することで、異種菌株による目的ポリケチド化合物の生産ができる場合がある。この時用いる異種菌株は、微生物、特に短期間の培養が可能な大腸菌などを使うと有利である。例えば非特許文献８には、大腸菌にポリケチド合成酵素遺伝子を組み込むことにより、エリスロマイシン前駆体である目的の６−デオキシエリスロノリドＢを効率よく生産できることが記載されている。
【００１２】
また、特許文献４には、ポリケチド化合物の１種であるマクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡおよびそれらの改変体、並びにそれらＤＮＡおよびそれらの改変体の一部または全体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いたマクロライド系化合物プラジエノライドの製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平６−２２７７０号公報
【特許文献２】特開平９−２３５２８３号公報
【特許文献３】国際公開第１９９３／１３６６３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６／９２７６号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，  ４５  （１９９２）  ９１４−９２１
【非特許文献２】Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎ．，  ２４  （１９９０）  ３７−６６
【非特許文献３】Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４７  （１９９３）  ８７４−９１２
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  （１９９８）  １２１１１−１２１１６
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  （１９９３）  ７１１９−７１２３
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６  （１９９９）  １８４６−１８５１
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２  （１９９１）  １１４−１１６
【非特許文献８】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１  （２００１）  １７９０−１７９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡおよびそれらの改変体を提供することである。また、それらＤＮＡおよびそれらの改変体の一部または全体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いたハーボキシジエンまたはその類縁体の製造方法を提供することである。さらに、ハーボキシジエン類縁体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、コロニーハイブリダイゼーション法に従って、一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（ｋｅｔｏ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）において保存されていると言われている配列に基づいて調製したプローブを用い、ハーボキシジエンおよびその類縁体の生産菌であるストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１６２０８株（以下、Ｍｅｒ−１６２０８株ということがある）から目的のＤＮＡの取得を試みたが、多数のコスミドが選択され目的のＤＮＡを直ちに同定することはできなかった。【００１７】
そこで、ポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に修飾酵素遺伝子が存在する可能性が高いことに着目し、公知の放線菌ストレプトマイセス・プラテンシスＭｅｒ−１１１０７株が保有する類似のポリケチド生合成遺伝子の近傍にあるプラジエノライド１８，１９位エポキシ化酵素遺伝子ｐｌｄＤの配列を元にいくつかのプライマーを作成し、Ｍｅｒ−１６２０８株の染色体ＤＮＡからｐｌｄＤに同一性の高い遺伝子ｈｂｄＤを取得した。これをプローブとすることによりポリケチド合成酵素領域の配列に基づいて取得された多数のコスミドから目的のＤＮＡを含むいくつかのコスミドを選択し、最終的に、ハーボキシジエンの合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列（配列番号１）を決定した。【００１８】
配列番号１のＤＮＡを解析したところ、ｈｂｄＡＩ（塩基８９１９〜２８２９５）、ｈｂｄＡＩＩ（塩基２８３２６〜４９８９２）、ｈｂｄＡＩＩＩ（塩基４９８９２〜５５９８１）、ｈｂｄＤ（塩基５６１１５〜５７５４５）、ｈｂｄＦ（塩基５７５７５〜５８４３５）、ｈｂｄＥ（塩基５８５３３〜５９７９８）およびｈｂｄＲ（塩基６６８１〜７７０６）の７つのオープン・リーディング・フレームが含まれており、図１に示すハーボキシジエンの生合成経路に関与することが明らかとなった。すなわち、ｈｂｄＡＩ、ｈｂｄＡＩＩおよびｈｂｄＡＩＩＩはハーボキシジエンのポリケチド合成酵素遺伝子であり、ｈｂｄＤはハーボキシジエンの１４，１５位エポキシ化酵素遺伝子であり、ｈｂｄＦはハーボキシジエンの１７位−Ｏ−メチル基転位酵素遺伝子であり、ｈｂｄＥはハーボキシジエンの１８位水酸化酵素遺伝子であり、ｈｂｄＲはハーボキシジエンの転写調節因子遺伝子である。さらに、これらの遺伝子を破壊したＭｅｒ−１６２０８株を作製し、各株が産生したハーボキシジエンおよびその類縁体を解析することで、各遺伝子の機能を確認した。また、ハーボキシジエン類縁体の抗腫瘍活性を確認した。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２２］に関する。
［１］  ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１個の領域を含んでなる単離された純粋なＤＮＡ。
［２］  ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドをコードする全ての領域を含んでなることを特徴とする、［１］記載のＤＮＡ。
［３］  ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドが、ポリケチド合成酵素、１８位水酸化酵素、１４，１５位エポキシ化酵素、１７位−Ｏ−メチル基転移酵素および転写調節因子から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、［１］または［２］記載のＤＮＡ。
［４］  ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来することを特徴とする、［１］から［３］までのいずれかに記載のＤＮＡ。
［５］  以下の（１）項から（４）項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも１個の塩基配列を含んでなる、［１］記載のＤＮＡ。
（１）  以下の（ａ）項から（ｈ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列
（ａ）  配列番号１の塩基６６８１から塩基７７０６までの連続した塩基配列
（ｂ）  配列番号１の塩基８９１９から塩基２８２９５までの連続した塩基配列
（ｃ）  配列番号１の塩基２８３２６から塩基４９８９２までの連続した塩基配列
（ｄ）  配列番号１の塩基４９８９２から塩基５５９８１までの連続した塩基配列
（ｅ）  配列番号１の塩基５６１１５から塩基５７５４５までの連続した塩基配列
（ｆ）  配列番号１の塩基５７５７５から塩基５８４３５までの連続した塩基配列
（ｇ）  配列番号１の塩基５８５３３から塩基５９７９８までの連続した塩基配列
（ｈ）  配列番号１の塩基１から塩基６５３６０までの連続した塩基配列
（２）  （１）項において定義されたいずれかの塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが有する塩基配列
（３）  （１）項において定義されたいずれかの塩基配列との同一性が８５％以上である塩基配列
（４）  遺伝暗号の縮重のため、（１）項において定義された塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（１）項から（３）項までのいずれかの項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列
［６］  以下の（ａ）項から（ｈ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選択された少なくとも１個の塩基配列を含んでなる、［１］記載のＤＮＡ。
（ａ）  配列番号１の塩基６６８１から塩基７７０６までの連続した塩基配列
（ｂ）  配列番号１の塩基８９１９から塩基２８２９５までの連続した塩基配列
（ｃ）  配列番号１の塩基２８３２６から塩基４９８９２までの連続した塩基配列
（ｄ）  配列番号１の塩基４９８９２から塩基５５９８１までの連続した塩基配列
（ｅ）  配列番号１の塩基５６１１５から塩基５７５４５までの連続した塩基配列
（ｆ）  配列番号１の塩基５７５７５から塩基５８４３５までの連続した塩基配列
（ｇ）  配列番号１の塩基５８５３３から塩基５９７９８までの連続した塩基配列
（ｈ）  配列番号１の塩基１から塩基６５３６０までの連続した塩基配列
［７］  ［１］から［６］までのいずれかの項に記載されたＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
［８］  ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［９］  配列番号２、３または４記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［８］記載のポリペプチド。
［１０］  １４，１５位エポキシ化酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１１］  配列番号５記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１０］記載のポリペプチド。
［１２］  １７位−Ｏ−メチル基転移酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１３］  配列番号６記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１２］記載のポリペプチド。
［１４］  １８位水酸化酵素活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１５］  配列番号７記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１４］記載のポリペプチド。
［１６］  転写調節因子活性を有することを特徴とする、［７］記載のポリペプチド。
［１７］  配列番号８記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特徴とする、［１６］記載のポリペプチド。
［１８］  ［１］から［６］までのいずれかの請求項に記載されたＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［１９］  ［１］から［６］までのいずれかの請求項に記載されたＤＮＡを保持する形質転換体。
［２０］  ［１９］記載の形質転換体を培地で培養し、その培養液からハーボキシジエンまたはその類縁体を採取することを特徴とする、ハーボキシジエンまたはその類縁体の製造方法。
［２１］  下記式（１）で表される化合物。
【化２】
0005524053.tif 000003
［２２］  下記式（２）で表される化合物。
【化３】
0005524053.tif 000004
【００２０】
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、上記（ａ）項から（ｈ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（以下、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．と略す）の記載に従い、取得しようとするＤＮＡに合わせて適宜選定すればよい。例えば８５％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、０．５MのＮａＣｌおよび５０％ホルムアミドの存在下、５６〜５９℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、５６〜５９℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また９０％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、０．５MのＮａＣｌおよび５０％ホルムアミドの存在下、６１〜６４℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６１〜６４℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。【００２１】
「ＤＮＡの改変体」とは、構成塩基の削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたもの、あるいはその誘導体を意味する。「同一性」とは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３−４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。「類縁体」とは、化学構造を特徴づける主骨格が同じで、修飾の様式や側鎖の形状などが異なる化合物を意味する。【００２２】
「アミノ酸配列の部分配列」とは、所定の活性を発揮するために必須のドメインを有するアミノ酸配列であればよく、さらに、アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって所定の活性を発揮するアミノ酸配列も含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡを単離して、その塩基配列を決定することができる。さらにそのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて、ハーボキシジエンおよびその類縁体を効率よく生産することができる。さらに得られたＤＮＡの配列を修飾、変更することにより取り込まれるカルボン酸の種類、縮合後の修飾反応、骨格形成後の修飾反応、またそれらのあらゆる組み合わせを改変することにより新規または特定のハーボキシジエン類縁体の生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｍｅｒ−１６２０８株におけるハーボキシジエンの生合成経路を示した図である。
【図２】Ｍｅｒ−１６２０８株におけるハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡの各ＯＲＦとコスミドの対応関係を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２６】
本発明においては、ハーボキシジエンを生産する能力を有する微生物の培養菌体から、ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することができる。このような微生物としては、ハーボキシジエンを生産する能力を有するものであれば種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物として土壌から分離されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１６２０８株を挙げることができる。本菌株は、ＮＩＴＥ  ＢＰ−７１６として、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８在の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２００９年３月９日付けで国際寄託されている。
【００２７】
本発明者らはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されたコロニーハイブリダイゼーション法に従って、上記微生物から本発明のＤＮＡの取得を試みた。まずＭｅｒ−１６２０８株のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで部分分解したものを、大腸菌内で複製可能なコスミドベクターを制限酵素、例えばＢａｍＨＩで分解したものと連結して得た組換えＤＮＡを大腸菌に組込み形質導入株を得た。一方、Ｍｅｒ−１６２０８株から取得したＤＮＡを鋳型とし、一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（ｋｅｔｏ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）において保存されていると言われている配列情報と、ピクロマイシン生産菌のケト合成酵素領域の配列情報（非特許文献３参照）とを参考に設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅されたＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡをプローブとして先に調製した形質導入株をスクリーニングしたが、多数の陽性クローン（コスミド）が取得され、目的のＤＮＡをもつ形質導入株を直ちに同定することはできなかった。
【００２８】
そこで、ポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に修飾酵素遺伝子が存在する可能性が高いことに着目し、ハーボキシジエンとエポキシの部位の構造が類似した２次代謝物質であるプラジエノライドを生産する公知の放線菌ストレプトマイセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株（本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８１２として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に２００１年１１月２７日に国際寄託されている）が保有する類似のポリケチド生合成遺伝子の近傍にあるプラジエノライド１８，１９位エポキシ化酵素遺伝子ｐｌｄＤ（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＢ４３５５５３の中に登録されている）の配列を元にいくつかのプライマーを作成し、Ｍｅｒ−１６２０８株の染色体ＤＮＡからｐｌｄＤに同一性の高い遺伝子ｈｂｄＤを取得した。これをプローブとすることによりポリケチド合成酵素領域の配列に基づいて取得された多数のコスミドから目的のＤＮＡを含むいくつかのコスミドを選択した。
【００２９】
こうしてハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡの一部が判明したので、このハーボキシジエンの生合成に関与する１４，１５位エポキシ化酵素をコードするとみられる遺伝子ｈｂｄＤをプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、ｈｂｄＤに隣接するハーボキシジエン生合成遺伝子クラスターを含むコスミドを選択し整列化した。
【００３０】
次に各コスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。まず、各コスミドを単離後、約１ｋｂに剪断しサブクローン化した。次いで得られたサブクローンに対し、それぞれの断片の塩基配列を決定し、ハーボキシジエンの合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列を決定した（配列番号１参照）。
【００３１】
この配列番号１で示されるＤＮＡには、ｈｂｄＡＩ（塩基８９１９〜２８２９５）、ｈｂｄＡＩＩ（塩基２８３２６〜４９８９２）、ｈｂｄＡＩＩＩ（塩基４９８９２〜５５９８１）、ｈｂｄＤ（塩基５６１１５〜５７５４５）、ｈｂｄＦ（塩基５７５７５〜５８４３５）、ｈｂｄＥ（塩基５８５３３〜５９７９８）およびｈｂｄＲ（塩基６６８１〜７７０６）の７つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれていた。またこれらの配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２〜８に示すとおりである。
【００３２】
こうして得られたＭｅｒ−１６２０８株のハーボキシジエン生合成に関与するＤＮＡのうち、ｈｂｄＡＩ、ｈｂｄＡＩＩ、およびｈｂｄＡＩＩＩには、既に明らかにされている他のポリケチド生合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる１またはそれ以上の反復単位をそれぞれ含むいくつかの転写解読枠があった。そして各モジュールは後述するとおりポリケチド合成の縮合反応に関与するアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素（ＫＳ）、アシル転移酵素（ＡＴ）と、β位カルボニル基修飾反応に関与するケトアシル還元酵素（ＫＲ）、脱水酵素（ＤＨ）およびエノイル還元酵素（ＥＲ）から選択されるドメインの全てあるいはいくつかをコードしており最後のモジュールにはポリケチド鎖をポリケチド合成酵素から切り離すチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインが存在していた。
【００３３】
図１に、Ｍｅｒ−１６２０８株におけるハーボキシジエンの生合成経路を示した。開始モジュール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ；Ｍｏｄｕｌｅ  Ｌ）は他のモジュールと違って活性中心のシステインがグルタミンに置換されていることより、ＨｂｄＡＩは初発反応に関与していることがわかる。またモジュール８にはチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインがあることより、ＨｂｄＡＩＩＩはポリケチドの最後の反応に関与していることがわかる。こうしてポリケチドの基本骨格が形成された後、さらに、ｈｂｄＤ、ｈｂｄＦおよびｈｂｄＥがコードしている酵素群（ＨｂｄＤ、ＨｂｄＦおよびＨｂｄＥ）により修飾を受け、ハーボキシジエンが生合成されると思われる。なお、ｈｂｄＲは転写調節因子をコードする遺伝子ｌａｃＩとの同一性が高く、ハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡの転写調節因子をコードしていると思われる。
【００３４】
こうして明らかになったハーボキシジエン生合成に関与するＤＮＡのモジュールおよび対応するドメインは以下のとおりである。
ＯＲＦ  ｈｂｄＡＩ（配列番号１の塩基８９１９〜２８２９５）は、開始モジュール、モジュール１、モジュール２およびモジュール３をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２に記載したアミノ酸配列で示される。
【００３５】
開始モジュール（塩基８９１９〜１２０２３）
ＫＳ０：塩基８９５５〜１０２１７
ＡＴ０：塩基１０３０５〜１１３６０
ＡＣＰ０：塩基１１７９０〜１１９７２
【００３６】
モジュール１（塩基１２０２４〜１６４５１）
ＫＳ１：塩基１２０２４〜１３２６２
ＡＴ１：塩基１３３５６〜１４４４１
ＫＲ１：塩基１５３２４〜１６１９６
ＡＣＰ１：塩基１６２１８〜１６４００
【００３７】
モジュール２（塩基１６４５２〜２１７３４）
ＫＳ２：塩基１６４５２〜１７７１１
ＡＴ２：塩基１７７９６〜１８８６０
ＤＨ２：塩基１９０３８〜１９７３９
ＫＲ２：塩基２０６２２〜２１４６１
ＡＣＰ２：塩基２１４８３〜２１６６５
【００３８】
モジュール３（塩基２１７３５〜２８２９５）
ＫＳ３：塩基２１７３５〜２２９９１
ＡＴ３：塩基２３２５３〜２４３０５
ＤＨ３：塩基２４４７４〜２５１６９
ＥＲ３：塩基２６０１６〜２６９３６
ＫＲ３：塩基２６９６４〜２７８１２
ＡＣＰ３：塩基２７８３４〜２８０１６
【００３９】
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳ０：アミノ酸１３〜４３３
ＡＴ０：アミノ酸４６３〜８１４
ＡＣＰ０：アミノ酸９５８〜１０１８
【００４０】
ＫＳ１：アミノ酸１０３６〜２５１１
ＡＴ１：アミノ酸１４８０〜１８４１
ＫＲ１：アミノ酸２１３６〜２４２６
ＡＣＰ１：アミノ酸２４３４〜２４９４
【００４１】
ＫＳ２：アミノ酸２５１２〜２９３１
ＡＴ２：アミノ酸２９６０〜３３１４
ＤＨ２：アミノ酸３３７４〜３６０７
ＫＲ２：アミノ酸３９０２〜４１８１
ＡＣＰ２：アミノ酸４１８９〜４２４９
【００４２】
ＫＳ３：アミノ酸４２７３〜４６９１
ＡＴ３：アミノ酸４７７９〜５１２９
ＤＨ３：アミノ酸５１８６〜５４１７
ＥＲ３：アミノ酸５７００〜６００６
ＫＲ３：アミノ酸６０１６〜６２９８
ＡＣＰ３：アミノ酸６３０６〜６３６６
【００４３】
ＯＲＦ  ｈｂｄＡＩＩ（配列番号１の塩基２８３２６〜４９８９２）は、モジュール４、モジュール５、モジュール６およびモジュール７をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号３に記載したアミノ酸配列で示される。
【００４４】
モジュール４（塩基２８３２６〜３３６４４）
ＫＳ４：塩基２８４１９〜２９６８１
ＡＴ４：塩基２９７５１〜３０８５１
ＤＨ４：塩基３１０１７〜３１７１８  
ＫＲ４：塩基３２５２６〜３３３７１
ＡＣＰ４：塩基３３３９３〜３３５７５
【００４５】
モジュール５（塩基３３６４５〜３８８７３）
ＫＳ５：塩基３３６４５〜３４８９５
ＡＴ５：塩基３４９７４〜３６０４７
ＤＨ５：塩基３６２３１〜３６９３８
ＫＲ５：塩基３７７２２〜３８６０６
ＡＣＰ５：塩基３８６２８〜３８８１０
【００４６】
モジュール６（塩基３８８７４〜４３５３２）
ＫＳ６：塩基３８８７４〜４０１３３
ＡＴ６：塩基４０２０３〜４１２６７
ＫＲ６：塩基４２４０５〜４３２４７
ＡＣＰ６：塩基４３２６９〜４３４５１
【００４７】
モジュール７（塩基４３５３３〜４９８９２）
ＫＳ７：塩基４３５３３〜４４７９２
ＡＴ７：塩基４４８６５〜４５９６２
ＤＨ７：塩基４６１３７〜４６８４７
ＥＲ７：塩基４７７２４〜４８６４１
ＫＲ７：塩基４８６６９〜４９５２０
ＡＣＰ７：塩基４９５４２〜４９７２４
【００４８】
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳ４：アミノ酸３２〜４５２
ＡＴ４：アミノ酸４７６〜８４２
ＤＨ４：アミノ酸８９８〜１１３１
ＫＲ４：アミノ酸１４０１〜１６８２
ＡＣＰ４：アミノ酸１６９０〜１７５０
【００４９】
ＫＳ５：アミノ酸１７７４〜２１９０
ＡＴ５：アミノ酸２２１７〜２５７４
ＤＨ５：アミノ酸２６３６〜２８７１
ＫＲ５：アミノ酸３１３３〜３４２７
ＡＣＰ５：アミノ酸３４３５〜３４９５
【００５０】
ＫＳ６：アミノ酸３５１７〜３９３６
ＡＴ６：アミノ酸３９６０〜４３１４
ＫＲ６：アミノ酸４６９４〜４９７４
ＡＣＰ６：アミノ酸４９８２〜５０４２
【００５１】
ＫＳ７：アミノ酸５０７０〜５４８９
ＡＴ７：アミノ酸５５１４〜５８７９
ＤＨ７：アミノ酸５９３８〜６１７４
ＥＲ７：アミノ酸６４６７〜６７７２
ＫＲ７：アミノ酸６７８２〜７０６５
ＡＣＰ７：アミノ酸７０７３〜７１３３
【００５２】
ＯＲＦ  ｈｂｄＡＩＩＩ（配列番号１の塩基４９８９２〜５５９８１）は、モジュール８をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号４に記載したアミノ酸配列で示される。
【００５３】
モジュール８（塩基４９８９２〜５５９８１）
ＫＳ８：塩基４９８９２〜５１２７１
ＡＴ８：塩基５１３４１〜５２４２０
ＤＨ８：塩基５２５８９〜５３２７８
ＫＲ８：塩基５４０８３〜５４９４０
ＡＣＰ８：塩基５４９６２〜５５１４４
ＴＥ８：塩基５５１６３〜５５９８１
【００５４】
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＫＳ８：アミノ酸４１〜４６０
ＡＴ８：アミノ酸４８４〜８４３
ＤＨ８：アミノ酸９００〜１１２９
ＫＲ８：アミノ酸１３９８〜１６８３
ＡＣＰ８：アミノ酸１６９１〜１７５１
ＴＥ８：アミノ酸１７５８〜２０３０
【００５５】
ＯＲＦ  ｈｂｄＤ（配列番号１の塩基５６１１５〜５７５４５）は、ハーボキシジエンの生合成に関与する１４，１５位エポキシ化酵素をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号５に記載したアミノ酸配列で示される。ＯＲＦ  ｈｂｄＦ（配列番号１の塩基５７５７５〜５８４３５）は、ハーボキシジエンの生合成に関与する１７位−Ｏ−メチル基転移酵素をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号６に記載したアミノ酸配列で示される。ＯＲＦ  ｈｂｄＥ（配列番号１の塩基５８５３３〜５９７９８）は、ハーボキシジエンの生合成に関与する１８位水酸化酵素をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号７に記載したアミノ酸配列で示される。ＯＲＦ  ｈｂｄＲ（配列番号１の塩基６６８１〜７７０６）は、ハーボキシジエンの生合成における転写調節因子をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号８に記載したアミノ酸配列で示される。
【００５６】
こうして、一旦塩基配列を確定することができればその情報をもとに公知の方法によって本発明のハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡを取得することもできる。
【００５７】
例えば、配列番号１に示された塩基配列を有するＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．記載の方法により消化されたＤＮＡを分離回収し、プローブまたはプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを調製する。プローブとして用いる場合には、得られたＤＮＡ断片をジゴキシゲニン等で標識することが好ましい。ジゴキシゲニンによる標識にはＤＩＧラベリング＆デテクションキット（ロシュダイアノスティック社）等を用いることがこのましい。
【００５８】
次いでハーボキシジエンを生産する能力を有する微生物の菌体から、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．等に記載のゲノムクローニング法またはｃＤＮＡクローニング法を用いてライブラリーを作製する。得られたライブラリーから先に調製したプローブとハイブリダイゼーションするクローン（コロニー）を選抜し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載の方法に従い選抜されたクローンからプラスミドを抽出し、得られたプラスミドから目的のハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡを取得することができる。
【００５９】
この場合において、抽出されたプラスミドにハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡの部分断片しか存在しない場合には、抽出されたプラスミドを適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩで消化することにより、これらプラスミドの制限酵素地図を常法に従い作成する。次いでその制限酵素地図からいくつかのクローンに共通して存在する制限酵素断片を見出し、オーバーラップしている部分でクローン化断片をつなぎ合わせることでハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡ全体を含むＤＮＡを取得することができる。
【００６０】
あるいは、上記したライブラリーおよびプライマーを用いて、直接ＰＣＲ反応を行い、目的のＤＮＡを直接増幅することにより、ハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡを取得することもできる。
【００６１】
ハーボキシジエンの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７４，  ５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。具体的には、２本鎖プラスミドＤＮＡを種々の配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたサイクルシークエンス反応の鋳型として直接用いるか、あるいは、ＤＮＡ断片を細分化し、バクテリオファージＭ１３にランダムにそして各断片が一部重複したライブラリーまたはプラスミドベクターを用いＤＮＡ断片の末端部分から順次欠失を導入した重複ライブラリーを作製し、ついで個々の組み換えＤＮＡ断片をベクター配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡ配列を決定することができる。
【００６２】
また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、例えば８９０５型ＤＮＡ合成装置（パーセティブ・バイオシステムズ社製）等のＤＮＡ合成装置を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。得られた塩基配列データの整理、編集および解析は既存のソフトウェア、例えば株式会社ゼネティックス  製ＧｅｎｅｔｙｘＴＭを用いて行うことができる。
【００６３】
また本発明のポリペプチドは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．等に記載された方法を用い、本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて製造することができる。本発明のＤＮＡまたはそれらの改変体を組み込む部位は、宿主微生物のプラスミド上または染色体上のいずれでもよい。このようなプラスミドは、前記ＤＮＡまたはそれらの改変体以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含んでいてもよい。さらに、プラスミドは、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミドであってもよい。
【００６４】
このように本発明のＤＮＡでコードされるポリペプチドを発現させるための宿主、プラスミド−ベクター系は、これらのＤＮＡが安定に保持、発現される系であればどのような系でもよいが、例えば元々ハーボキシジエンを生産する能力を有する放線菌あるいはその類縁株を宿主とするならば、自律複製型ベクターｐＩＪ６０２１〔Ｇｅｎｅ  １６６，１３３−１３７（１９９５）〕や染色体組み込み型ベクターＫＣ５１５〔Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，  ｖｏｌ．９．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  （ｅｄ：  Ｑｕｅｅｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｄａｙ，Ｌ．Ｅ．）．ｐ．１１９−１５８．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｇｌａ．〕などが利用できる。
【００６５】
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、ホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。得られた無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００６６】
また、先に得られたポリペプチドのアミノ酸配列の情報を基に、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブトキシカルボニル法（ｔ−Ｂｏｃ法）等の化学合成法により本発明のポリペプチドを製造することもできる。
【００６７】
また先に取得したハーボキシジエン生合成遺伝子を含有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にハーボキシジエンまたはその類縁体を生成蓄積させ、該培養物からハーボキシジエンまたはその類縁体を採取することによりハーボキシジエンまたはその類縁体を製造することができる。培養条件は、特に制限はないが宿主の通常の培養条件に準ずる。
【００６８】
また、ハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡの塩基配列情報を基に、モジュールを修飾することにより、ポリケチド基本骨格の炭素鎖の大きさおよび縮合過程のβ位炭素の官能基を変化させることができる。さらにポリケチド形成後の修飾酵素を選択的に不活化することにより、予測可能なハーボキシジエン類縁体の特定成分を優先的に生産させることが可能である。例えば、主としてハーボキシジエンを生産する菌株であるＭｅｒ−１６２０８株のｈｂｄＥを欠損変異することにより、ハーボキシジエンの１８位デオキシ体を主に生産する菌株にすることが可能である。ｈｂｄＥを欠損変異する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．等に記載の常法により、相同組換えによる置換、あるいは変換を行う方法をあげることができる。
【００６９】
こうして取得された特定のハーボキシジエン類縁体を優先的に生産することが可能となった菌株を用い、ハーボキシジエンの製造法に準じて、特定のハーボキシジエン類縁体を製造することができる。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。また下記の説明中、特に記載がない限り表示濃度は重量％である。【００７１】
実施例１：ｈｂｄＤとその周辺領域の塩基配列の同定。
（１）：Ｍｅｒ−１６２０８株の培養およびゲノムＤＮＡの取得
Ｍｅｒ−１６２０８株の菌糸を５０ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（以下、ＴＳＢともいう）に接種し、２８℃、３日間振とう培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。【００７２】
（２）：  １４，１５位エポキシ化活性を有すると考えられるタンパク質（ＨｂｄＤ）をコードするＤＮＡの部分配列のクローニング
ハーボキシジエンとエポキシの部位の構造が類似した２次代謝物質であるプラジエノライドを生産する放線菌ストレプトマイセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株の保有するプラジエノライド１８，１９位エポキシ化酵素遺伝子ｐｌｄＤの配列を参考にして以下のようなプライマー（ＰＬＤＤＦおよびＰＬＤＤＲ）を設計し作成した（配列表の配列番号９および１０参照）。
ＰＬＤＤＦ：５’−ＣＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＣＧＣＴＧＧ−３’
ＰＬＤＤＲ：５’−ＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＧＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴＡ−３’
【００７３】
次に、この２種のプライマー（ＰＬＤＤＦおよびＰＬＤＤＲ）と前項（１）で得たＭｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、２分間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約２９０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ１という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ１はエポキシ化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ１を、反応液からＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって回収した。
【００７４】
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ１を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてＤＮＡ断片−Ａ１を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（Ｌａｂｏ  Ｐａｓｓ  Ｍｉｎｉ，北海道システムサイエンス社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ１を得た。【００７５】
（３）：クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（アプライドバイオシステムズ；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  ジェネティックアナライザー）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ１は電気泳動で約２９０ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には２８８ｂｐであることが明らかとなった（配列番号１の塩基５６８３２〜塩基５７１１９参照）。クローニングされた前記の２８８ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ１がこの２種類のプライマー（ＰＬＤＤＦおよびＰＬＤＤＲ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。【００７６】
（４）  ＤＮＡ断片−Ａ１の周辺領域の解析
前記のとおり、Ｍｅｒ−１６２０８株由来の１４，１５位エポキシ化活性を有すると考えられるタンパク質（ＨｂｄＤ）をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ｍｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡ（（１）参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中において制限酵素ＳａｌＩで消化した。得られた制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて自己環状化させた。【００７７】
他方、ＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列から、以下のようなプライマー（ＨｂｄＤｉｎ−１ＦおよびＨｂｄＤｉｎ−１Ｒ）を設計し作成した（配列表の配列番号１１および１２参照）。
ＨｂｄＤｉｎ−１Ｆ：５’−ＧＣＣＣＴＣＧＧＧＧＡＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣ−３’
ＨｂｄＤｉｎ−１Ｒ：５’−ＣＴＧＣＧＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣ−３’
次にこの２種のプライマー（ＨｂｄＤｉｎ−１ＦおよびＨｂｄＤｉｎ−１Ｒ）と前記の自己環状化させたＭｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、７分間行う２段階の反応３０回繰り返した。【００７８】
この結果、約２．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ１）が増幅したが、これらは、１４，１５位エポキシ化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。【００７９】
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ１について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前項（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（Ｌａｂｏ  Ｐａｓｓ  Ｍｉｎｉ，北海道システムサイエンス社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。【００８０】
（５）  ＤＮＡ断片−Ｂ１（約２．５ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（アプライドバイオシステムズ；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  ジェネティックアナライザー）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ１の２７１２ｂｐの塩基配列の情報を得た（配列番号１の塩基５６７０３〜塩基５９４１４参照）。【００８１】
この２７１２ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、３種類のタンパク質がコードされていることが判明した。タンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号１の塩基５６７０３〜塩基５７５４５にエポキシ化酵素と高い同一性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（ｈｂｄＤ）の部分配列が存在した。そしてｈｂｄＤがコードするタンパク質ＨｂｄＤは、ストレプトマイセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株のプラジエノライド１８，１９位エポキシ化酵素と高い同一性を有するタンパク質ＰｌｄＤのアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性５７％）。このことからｈｂｄＤはハーボキシジエンの生合成に関与する１４，１５位エポキシ化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。ここで、「アミノ酸配列の同一性」とは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したポリペプチドの百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３−４１０に記載されるPＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。
【００８２】
またｈｂｄＤのすぐ下流（配列番号１の塩基５７５７５〜塩基５８４３５）にはメチル基転移酵素に高い同一性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（ｈｂｄＦ）が存在した。ｈｂｄＦがコードするタンパク質ＨｂｄＦは２８７個のアミノ酸からなり、ストレプトマイセス・ラベンデュラエのメチル基転移酵素ＭｉｔＭのアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性６１％）。そのため、ｈｂｄＦはハーボキシジエンの生合成に関与する１７位−Ｏ−メチル基転移酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。【００８３】
またｈｂｄＦのすぐ下流（配列番号１の塩基５８５３３〜塩基５９４１４）にはシトクロムＰ４５０水酸化酵素に高い同一性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（ｈｂｄＥ）の部分配列が存在した。そしてｈｂｄＥがコードするタンパク質ＨｂｄＥは、ストレプトマイセス・ベネズエラエのシトクロムＰ４５０水酸化酵素ＰｉｋＣのアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性６０％）。そのため、ｈｂｄＥはハーボキシジエンの生合成に関与する１８位水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。【００８４】
実施例２：ｈｂｄＤ，Ｅ，Ｆに隣接する生合成遺伝子クラスター配列を含むコスミドクローンの取得。
（１）：Ｍｅｒ−１６２０８株のゲノムライブラリーの調製
滅菌精製水１６０μｌと、Ｍｅｒ−１６２０８株のゲノムＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）  ２００μｌと、１０倍濃度のＭ緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，５００ｍＭ  ＮａＣｌ］４０μｌと制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（１ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌとを混合し、３７℃で６分インキュベートした。その後、４００μｌのフェノール−クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，容量比）で抽出し、水相を回収し、さらに４００μｌのクロロホルムで抽出し、再び水相を回収した。この液に５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と１ｍｌのエタノールを加えて、−８０℃に３０分置き、遠心することで沈殿してくるＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌの滅菌精製水に溶解し、１０μｌの１０倍濃度ＢＡＰ緩衝液［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２］および２μｌ  ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｏｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （宝酒造社）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。この反応液を１００μｌのフェノール−クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，容量比）で抽出し、水相を回収し、さらに１００μｌのクロロホルムで抽出し、再び水相を回収した。この液に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と３００μｌのエタノールを加えて、−８０℃に３０分置き、遠心することで沈殿してくるＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、２０μｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に溶解した。【００８５】
一方でＳｕｐｅｒＣｏｓコスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）１０μｇをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従い制限酵素ＸｂａＩで消化後、ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｏｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社）によりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行い、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化、精製後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。【００８６】
このコスミドＤＮＡ溶液１μｌに、前述のＭｅｒ−１６２０８株ゲノムＤＮＡのＳａｕ３Ａ１部分分解物の溶液２．５μｌを加え、さらに滅菌精製水１．５μｌ、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを５μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを１０μｌ順次加えた後、２３℃で１４時間インキュベートした。この反応液４μｌをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてラムダファージにパッケージングした。得られたパッケージング液（全量５００μｌ）について形質導入試験を実施して、コロニー形成能を検定した結果、１９２ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／μｌであった。【００８７】
（２）：ｈｂｄＤ，Ｅ，Ｆを含むプローブの調製
実施例１（５）で得られた、ｈｂｄＤ，ｈｂｄＦ，ｈｂｄＥの部分配列を含む２７１２ｂｐの塩基配列の情報に基づいて以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ＨｂｄＤｉｎ−３ＦおよびｈｂｄＥｉｎ−１Ｒを合成した（配列表の配列番号１３および１４参照）。
ＨｂｄＤｉｎ−３Ｆ：５’−ＣＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＣＧＣＧＣＴ−３’
ＨｂｄＥｉｎ−１Ｒ：５’−ＧＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧ−３’【００８８】
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１μｌ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  ５０μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  １６μｌ
ＨｂｄＤｉｎ−３Ｆ  （１００ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ＨｂｄＥｉｎ−１Ｒ  （１００ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
Ｍｅｒ−１６２０８株ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μｌ，宝酒造社）  １μｌ【００８９】
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）    ３０サイクル
６８℃  ３分【００９０】
この反応の結果増幅された１．５ｋｂ  ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、分離した１．５ｋｂ  のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＤＮＡを回収精製し、得られた５０μｌのＴＥ溶液をｈｂｄＤ，Ｅ，Ｆを含むプローブ溶液とした。【００９１】
（３）：ｈｂｄＤ，Ｅ，Ｆを含むプローブを用いたスクリーニング
上記（１）で調製したＭｅｒ−１６２０８株のゲノムＤＮＡライブラリーのパッケージング液を使って大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を宿主とし、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従って形質導入した。形質導入操作後の菌液を１０枚のＬＢ−５０μｇ／ｍｌアンピシリン−１．５％寒天培地シャーレ（内径９０ｍｍ、高さ１５ｍｍ）に分注して広げ、３７℃で１８時間培養した。各シャーレに生育したコロニーをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋フィルター（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に転写し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋フィルターに添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、中和処理を行い、８０℃で２時間乾燥することでフィルター上にコロニー由来のＤＮＡを固定化した。【００９２】
上記（２）にて調製したｈｂｄＤ，Ｅ，Ｆを含む１．５ｋｂ  ＤＮＡ断片１００ｎｇをプローブにしてＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてゲノムＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは塩濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌで６８℃で１時間行った。プローブＤＮＡの標識、ハイブリダイゼーションおよび検出の条件についてはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍに添付されたマニュアルに記載された条件に従った。試験した約２，２００コロニーのうち、アルカリホスファターゼで標識したプローブと強くハイブリダイズした２コロニーを分離した。このコロニーから派生した大腸菌クローンからコスミド（ｐＨｂ６３５，ｐＨｂ１９７）を抽出精製した。【００９３】
（４）：ｐＨｂ６３５の末端配列を含むプローブの調製
上記（３）で得られたコスミドｐＨｂ６３５，ｐＨｂ１９７中に挿入されているＤＮＡ断片の末端配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（アプライドバイオシステムズ；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  ジェネティックアナライザー）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。この結果、ｐＨｂ６３５はポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の途中の領域（配列番号１の塩基２２５９５）から、ｈｂｄＥの途中の領域（配列番号１の塩基５８９５８）までを保有していることと、ｐＨｂ１９７はｈｂｄＤの途中の領域（配列番号１の塩基５７３５９）からｈｂｄＥの下流の領域を保有していることが分かった。そこで、ｐＨｂ６３５の末端配列より上流の配列を含むコスミドクローンを取得する為、ｐＨｂ６３５の末端配列を含むプローブを調製した。ｐＨｂ６３５の末端配列を含む５３７ｂｐ（配列番号１の塩基２２５９５〜２３１３１）の塩基配列の情報に基づいて以下に示すような配列からなる２種のプライマー、６３５−１Ｆおよび６３５−１Ｒを合成した（配列表の配列番号１５および１６参照）。
６３５−１Ｆ：５’−ＧＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＡＣＧＧＴＡＣＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＣＴ−３’
６３５−１Ｒ：５’−ＣＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＧＴ−３’【００９４】
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１μｌ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  ５０μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  １６μｌ
６３５−１Ｆ  （１００ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
６３５−１Ｒ  （１００ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ｐＨｂ６３５  コスミドＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μｌ，宝酒造社）  １μｌ【００９５】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６５℃  ３０秒，６８℃  １分）    ３０サイクル
６８℃  ２分【００９６】
この反応の結果増幅された４８６ｂｐのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、分離した４８６ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＤＮＡを回収精製し、得られた５０μｌのＴＥ溶液をｐＨｂ６３５の末端配列を含むプローブ溶液とした。【００９７】
（５）：ｐＨｂ６３５の末端配列を含むプローブを用いたスクリーニング
上記（１）で調製したＭｅｒ−１６２０８株のゲノムＤＮＡライブラリーのパッケージング液を使って大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を宿主とし、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従って形質導入した。形質導入操作後の菌液を１０枚のＬＢ−５０μｇ／ｍｌアンピシリン−１．５％寒天培地シャーレ（内径９０ｍｍ、高さ１５ｍｍ）に分注して広げ、３７℃で１８時間培養した。各シャーレに生育したコロニーをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋フィルター（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に転写し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋フィルターに添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、中和処理を行い、８０℃で２時間乾燥することでフィルター上にコロニー由来のＤＮＡを固定化した。上記（４）にて調製したｐＨｂ６３５の末端配列を含む４８６ｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇをプローブにしてＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてゲノムＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは塩濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌで７０℃で１時間行った。プローブＤＮＡの標識、ハイブリダイゼーションおよび検出の条件についてはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍに添付されたマニュアルに記載された条件に従った。試験した約１，９００コロニーのうち、アルカリホスファターゼで標識したプローブと強くハイブリダイズした１コロニーを分離した。このコロニーから派生した大腸菌クローンからコスミド（ｐＨｂ８２２１）を抽出精製した。【００９８】
実施例３：ハーボキシジエン生合成遺伝子クラスターの塩基配列の決定
実施例２（５）で得られたコスミドｐＨｂ８２２１中に挿入されているＤＮＡ断片の末端配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（アプライドバイオシステムズ；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  ジェネティックアナライザー）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。この結果、ｐＨｂ８２２１はポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の途中の領域（配列番号１の塩基３７９５５）から、ｐＨｂ６３５の末端配列を含む上流の領域を保有していることが分かった。以上のことから、ハーボキシジエン生合成遺伝子を含むコスミドとしてｐＨｂ１９７，ｐＨｂ６３５，ｐＨｂ８２２１を選出し、これらコスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。【００９９】
各コスミドを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｒｇｅ−Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて単離後、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いて約１ｋｂに剪断し、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて、サブクローン化した。【０１００】
得られたサブクローンに対し、ＤＮＡ塩基配列解析装置（アプライドバイオシステムズ；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  ジェネティックアナライザー）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析することにより、ハーボキシジエンの合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列を決定した（配列番号１参照）。【０１０１】
この配列番号１で示されるＤＮＡには、ｈｂｄＡＩ（塩基８９１９〜２８２９５）、ｈｂｄＡＩＩ（塩基２８３２６〜４９８９２）、ｈｂｄＡＩＩＩ（塩基４９８９２〜５５９８１）、ｈｂｄＤ（塩基５６１１５〜５７５４５）、ｈｂｄＦ（塩基５７５７５〜５８４３５）、ｈｂｄＥ（塩基５８５３３〜５９７９８）およびｈｂｄＲ（塩基６６８１〜７７０６）の７つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれていた。またこれらの配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２〜８に示すとおりである。こうして得られたＭｅｒ−１６２０８株のハーボキシジエン生合成に関与するＤＮＡのうち、ｈｂｄＡＩ、ｈｂｄＡＩＩ、およびｈｂｄＡＩＩＩについて、Ｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓの記載に基づき、それらの機能を解析したところ、既に明らかにされている他のポリケチド生合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる１またはそれ以上の反復単位をそれぞれ含む１１個の転写解読枠があった。そして各モジュールは後述するとおりポリケチド合成の縮合反応に関与するアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素（ＫＳ）、アシル転移酵素（ＡＴ）と、β位カルボニル基修飾反応に関与するケトアシル還元酵素（ＫＲ）、脱水酵素（ＤＨ）およびエノイル還元酵素（ＥＲ）から選択されるドメインの全てあるいはいくつかをコードしており最後のモジュールにはポリケチド鎖をポリケチド合成酵素から切り離すチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインが存在することが各々のドメインに保存されているアミノ酸配列から同定された（ＡＣＰドメインのパントテイン結合セリン残基を含むＧＦＤＳＬモチーフ、ＫＳドメインの保存的活性モチーフＴＶＤＴＧＣＳＳＳＬＶ、ＡＴドメインの活性に関与するモチーフＧＨＳＸＧとＡＸＨｓ、ＫＲドメインのＮＡＤＰ（Ｈ）結合部位モチーフのＧＸＧＸＸＡＸＸＸＡ、ＤＨドメインの活性部位モチーフのＨＸＸＸＧ（Ｄ）ＸＸＸＸＰ、ＥＲドメインのＮＡＤＰ（Ｈ）結合部位モチーフのＬＸＨＸＡＸＧＧＶＧ、ＴＥドメインのＧＸＳＸＧとＧＤＨモチーフ）。【０１０２】
開始モジュール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ；Ｍｏｄｕｌｅ  Ｌ）のＫＳドメインは他のモジュールのＫＳドメインと違って活性中心のシステインがグルタミンに置換されていることより、ＨｂｄＡＩは初発反応に関与していることがわかった。またモジュール８にはチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインがあることより、ＨｂｄＡＩＩＩはポリケチドの最後の反応に関与していることがわかった。こうしてポリケチドの基本骨格が形成された後、さらに、ｈｂｄＤ、ｈｂｄＦおよびｈｂｄＥがコードしている酵素群（ＨｂｄＤ、ＨｂｄＦおよびＨｂｄＥ）により修飾を受け、ハーボキシジエンが生合成されると思われた。なお、ｈｂｄＲは転写調節因子をコードする遺伝子ｌａｃＩとの同一性が高く、ハーボキシジエンの生合成に関与するＤＮＡの転写調節因子をコードしていると思われた。
こうして明らかになったハーボキシジエン生合成に関与するＤＮＡのモジュールおよび対応するドメインは以下のとおりであった。
ＯＲＦ  ｈｂｄＡＩ（配列番号１の塩基８９１９〜２８２９５）は、開始モジュール、モジュール１、モジュール２およびモジュール３をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２に記載したアミノ酸配列で示された。【０１０３】
開始モジュール（塩基８９１９〜１２０２３）
ＫＳ０：塩基８９５５〜１０２１７
ＡＴ０：塩基１０３０５〜１１３６０
ＡＣＰ０：塩基１１７９０〜１１９７２【０１０４】
モジュール１（塩基１２０２４〜１６４５１）
ＫＳ１：塩基１２０２４〜１３２６２
ＡＴ１：塩基１３３５６〜１４４４１
ＫＲ１：塩基１５３２４〜１６１９６
ＡＣＰ１：塩基１６２１８〜１６４００【０１０５】
モジュール２（塩基１６４５２〜２１７３４）
ＫＳ２：塩基１６４５２〜１７７１１
ＡＴ２：塩基１７７９６〜１８８６０
ＤＨ２：塩基１９０３８〜１９７３９
ＫＲ２：塩基２０６２２〜２１４６１
ＡＣＰ２：塩基２１４８３〜２１６６５【０１０６】
モジュール３（塩基２１７３５〜２８２９５）
ＫＳ３：塩基２１７３５〜２２９９１
ＡＴ３：塩基２３２５３〜２４３０５
ＤＨ３：塩基２４４７４〜２５１６９
ＥＲ３：塩基２６０１６〜２６９３６
ＫＲ３：塩基２６９６４〜２７８１２
ＡＣＰ３：塩基２７８３４〜２８０１６【０１０７】
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりであった。
ＫＳ０：アミノ酸１３〜４３３
ＡＴ０：アミノ酸４６３〜８１４
ＡＣＰ０：アミノ酸９５８〜１０１８【０１０８】
ＫＳ１：アミノ酸１０３６〜２５１１
ＡＴ１：アミノ酸１４８０〜１８４１
ＫＲ１：アミノ酸２１３６〜２４２６
ＡＣＰ１：アミノ酸２４３４〜２４９４【０１０９】
ＫＳ２：アミノ酸２５１２〜２９３１
ＡＴ２：アミノ酸２９６０〜３３１４
ＤＨ２：アミノ酸３３７４〜３６０７
ＫＲ２：アミノ酸３９０２〜４１８１
ＡＣＰ２：アミノ酸４１８９〜４２４９【０１１０】
ＫＳ３：アミノ酸４２７３〜４６９１
ＡＴ３：アミノ酸４７７９〜５１２９
ＤＨ３：アミノ酸５１８６〜５４１７
ＥＲ３：アミノ酸５７００〜６００６
ＫＲ３：アミノ酸６０１６〜６２９８
ＡＣＰ３：アミノ酸６３０６〜６３６６【０１１１】
ＯＲＦ  ｈｂｄＡＩＩ（配列番号１の塩基２８３２６〜４９８９２）は、モジュール４、モジュール５、モジュール６およびモジュール７をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号３に記載したアミノ酸配列で示された。【０１１２】
モジュール４（塩基２８３２６〜３３６４４）
ＫＳ４：塩基２８４１９〜２９６８１
ＡＴ４：塩基２９７５１〜３０８５１
ＤＨ４：塩基３１０１７〜３１７１８  
ＫＲ４：塩基３２５２６〜３３３７１
ＡＣＰ４：塩基３３３９３〜３３５７５【０１１３】
モジュール５（塩基３３６４５〜３８８７３）
ＫＳ５：塩基３３６４５〜３４８９５
ＡＴ５：塩基３４９７４〜３６０４７
ＤＨ５：塩基３６２３１〜３６９３８
ＫＲ５：塩基３７７２２〜３８６０６
ＡＣＰ５：塩基３８６２８〜３８８１０【０１１４】
モジュール６（塩基３８８７４〜４３５３２）
ＫＳ６：塩基３８８７４〜４０１３３
ＡＴ６：塩基４０２０３〜４１２６７
ＫＲ６：塩基４２４０５〜４３２４７
ＡＣＰ６：塩基４３２６９〜４３４５１【０１１５】
モジュール７（塩基４３５３３〜４９８９２）
ＫＳ７：塩基４３５３３〜４４７９２
ＡＴ７：塩基４４８６５〜４５９６２
ＤＨ７：塩基４６１３７〜４６８４７
ＥＲ７：塩基４７７２４〜４８６４１
ＫＲ７：塩基４８６６９〜４９５２０
ＡＣＰ７：塩基４９５４２〜４９７２４【０１１６】
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりであった。
ＫＳ４：アミノ酸３２〜４５２
ＡＴ４：アミノ酸４７６〜８４２
ＤＨ４：アミノ酸８９８〜１１３１
ＫＲ４：アミノ酸１４０１〜１６８２
ＡＣＰ４：アミノ酸１６９０〜１７５０【０１１７】
ＫＳ５：アミノ酸１７７４〜２１９０
ＡＴ５：アミノ酸２２１７〜２５７４
ＤＨ５：アミノ酸２６３６〜２８７１
ＫＲ５：アミノ酸３１３３〜３４２７
ＡＣＰ５：アミノ酸３４３５〜３４９５【０１１８】
ＫＳ６：アミノ酸３５１７〜３９３６
ＡＴ６：アミノ酸３９６０〜４３１４
ＫＲ６：アミノ酸４６９４〜４９７４
ＡＣＰ６：アミノ酸４９８２〜５０４２【０１１９】
ＫＳ７：アミノ酸５０７０〜５４８９
ＡＴ７：アミノ酸５５１４〜５８７９
ＤＨ７：アミノ酸５９３８〜６１７４
ＥＲ７：アミノ酸６４６７〜６７７２
ＫＲ７：アミノ酸６７８２〜７０６５
ＡＣＰ７：アミノ酸７０７３〜７１３３【０１２０】
ＯＲＦ  ｈｂｄＡＩＩＩ（配列番号１の塩基４９８９２〜５５９８１）は、モジュール８をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号４に記載したアミノ酸配列で示された。【０１２１】
モジュール８（塩基４９８９２〜５５９８１）
ＫＳ８：塩基４９８９２〜５１２７１
ＡＴ８：塩基５１３４１〜５２４２０
ＤＨ８：塩基５２５８９〜５３２７８
ＫＲ８：塩基５４０８３〜５４９４０
ＡＣＰ８：塩基５４９６２〜５５１４４
ＴＥ８：塩基５５１６３〜５５９８１【０１２２】
また対応するポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりであった。
ＫＳ８：アミノ酸４１〜４６０
ＡＴ８：アミノ酸４８４〜８４３
ＤＨ８：アミノ酸９００〜１１２９
ＫＲ８：アミノ酸１３９８〜１６８３
ＡＣＰ８：アミノ酸１６９１〜１７５１
ＴＥ８：アミノ酸１７５８〜２０３０【０１２３】
また、ＡＴ０、ＡＴ１、ＡＴ２、ＡＴ３、ＡＴ５、ＡＴ６はメチルマロン酸を取り込むＡＴドメインに特徴的なアミノ酸配列（活性に関与するモチーフのＧＨＳＱＧやＶＤＹＡＳＨなど）を持ち、ＡＴ４、ＡＴ７、ＡＴ８はマロン酸を取り込むＡＴドメインに特徴的なアミノ酸配列（活性に関与するモチーフのＧＨＳＶ（Ｉ）ＧやＨＡＦＨＳなど）を持つことから、各々のＡＴドメインが適切な基質特異性を持つことが明らかとなった。
【０１２４】
ＯＲＦ  ｈｂｄＤ（配列番号１の塩基５６１１５〜５７５４５）がコードするタンパク質ＨｂｄＤは、前述のとおり、ストレプトマイセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株のプラジエノライド１８，１９位エポキシ化酵素と高い同一性を有するタンパク質ＰｌｄＤのアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性５７％）。このことからｈｂｄＤはハーボキシジエンの生合成に関与する１４，１５位エポキシ化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。対応するポリペプチドＨｂｄＤは、配列番号５に記載したアミノ酸配列で示された。
【０１２５】
ＯＲＦ  ｈｂｄＦ（配列番号１の塩基５７５７５〜５８４３５）がコードするタンパク質ＨｂｄＦは、前述のとおり、ストレプトマイセス・ラベンデュラエのメチル基転移酵素ＭｉｔＭのアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性６１％）。そのため、ｈｂｄＦはハーボキシジエンの生合成に関与する１７位−Ｏ−メチル基転移酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。対応するポリペプチドＨｂｄＦは、配列番号６に記載したアミノ酸配列で示された。【０１２６】
ＯＲＦ  ｈｂｄＥ（配列番号１の塩基５８５３３〜５９７９８）がコードするタンパク質ＨｂｄＥは、前述のとおり、ストレプトマイセス・ベネズエラエのシトクロムＰ４５０水酸化酵素ＰｉｋＣのアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性６０％）。そのため、ｈｂｄＥはハーボキシジエンの生合成に関与する１８位水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。対応するポリペプチドＨｂｄＥは、配列番号７に記載したアミノ酸配列で示された。【０１２７】
ＯＲＦ  ｈｂｄＲ（配列番号１の塩基６６８１〜７７０６）がコードするタンパク質ＨｂｄＲはサッカロポリスポラ・エリスラエの転写調節因子ＳＡＣＥ＿４５３６のアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性５７％）ことからｈｂｄＲはハーボキシジエンの生合成遺伝子の転写調節因子をコードする遺伝子であると考えられた。対応するポリペプチドＨｂｄＲは、配列番号８に記載したアミノ酸配列で示された。図１に、Ｍｅｒ−１６２０８株におけるハーボキシジエンの生合成経路を示した。また、図２に各ＯＲＦとコスミドの対応関係をした。【０１２８】
実施例４：ハーボキシジエンの１８位水酸化酵素遺伝子（ｈｂｄＥ）破壊株の作製
実施例３で決定されたハーボキシジエンの生合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）から、図１に示された生合成経路でハーボキシジエンが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちのシトクロムＰ４５０遺伝子ｈｂｄＥのみを破壊することで、ハーボキシジエンの１８位デオキシ体のみを生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｈｂｄＥ破壊株を作製した。【０１２９】
（１）シャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲの調製
ハーボキシジエン生産株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｅｒ−１６２０８株と大腸菌で複製できるシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲを調製した。ＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる２種のプライマー、ＮＰ２−ＳＮ２Ｆ、およびＣＥ１−ＮＸＨＲ（配列表の配列番号１７および１８参照）を合成した。
ＮＰ２−ＳＮ２Ｆ：５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’
ＣＥ１−ＮＸＨＲ：５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴ−３’
大腸菌プラスミドＲＰ４由来接合遺伝子のｏｒｉＴ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５３２０−５３２３，１９８７）の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる２種のプライマー、ＯＴ−ＳＦ、およびＯＴ−ＳＲ（配列表の配列番号１９および２０参照）を合成した。
ＯＴ−ＳＦ：５’−ＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＴ−３’
ＯＴ−ＳＲ：５’−ＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＣＡＴＡＡＣ−３’
放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（ＮＢＲＣ１５１７３２）由来のプラスミドＳＣＰ２（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２６，４２７−４４２，１９８１）の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる２種のプライマー、ＳＣＰＲ−ＡＦ、およびＳＣＰＲ−ＳＲ（配列表の配列番号２１および２２参照）を合成した。
ＳＣＰＲ−ＡＦ：５’−ＧＧＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＴ−３’
ＳＣＰＲ−ＳＲ：５’−ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。【０１３０】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１．５μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ５μｌ
ＭｇＳＯ４溶液  ３μｌ
ジメチルスルホキシド  ２．５μｌ
ＮＰ２−ＳＮ２ＦまたはＯＴ−ＳＦまたはＳＣＰＲ−ＡＦ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ＣＥ１−ＮＸＨＲまたはＯＴ−ＳＲまたはＳＣＰＲ−ＳＲ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ＳｕｐｅｒＣｏｓ１またはＲＰ４またはＳＣＰ２  （１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕ／μｌ，東洋紡社）  １μｌ【０１３１】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６０℃  ３０秒，６８℃  ６分）    ３０サイクル
６８℃  ７分【０１３２】
この反応の結果、ＮＰ２−ＳＮ２ＦとＣＥ１−ＮＸＨＲとＳｕｐｅｒＣｏｓ１を用いた反応から、アミノグリコシド耐性遺伝子ａｐｈＩＩ（Ｇｅｎｅ，１９（３），３２７−３３６，１９８２）と大腸菌のプラスミド複製起点ＣｏｌＥ１（Ｇｅｎｅ，３３（１），１０３−１１９，１９８５）を含む３．２ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＡＣ１）が増幅され、ＯＴ−ＳＦとＯＴ−ＳＲとＲＰ４を用いた反応から、接合遺伝子のｏｒｉＴを含む０．８ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＯＴ１）が増幅され、ＳＣＰＲ−ＡＦとＳＣＰＲ−ＳＲとＳＣＰ２を用いた反応から、放線菌のプラスミドＳＣＰ２の複製領域を含む５．８ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＳＲ１）が増幅された。ＤＮＡ断片ＡＣ１、ＯＴ１およびＳＲ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で精製した。ＤＮＡ断片ＡＣ１について制限酵素ＮｄｅＩで消化し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で自己環状化した。得られた環状ＤＮＡ  ＡＣ１とＤＮＡ断片ＯＴ１についてそれぞれ制限酵素ＳｍａＩで消化し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてアミノグリコシド耐性遺伝子ａｐｈＩＩと接合遺伝子のｏｒｉＴをもつ大腸菌プラスミドｐＭＫＯ１を取得した。また、ＤＮＡ断片ＳＲ１を制限酵素ＳｐｅＩとＡｖｒＩＩで消化し、制限酵素ＳｐｅＩで消化したプラスミドｐＭＫＯ１とＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてｐＭＫＯ１に放線菌のプラスミドＳＣＰ２の複製領域が挿入されたシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲが構築された。
【０１３３】
（２）ｈｂｄＥ破壊用プラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤの調製。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｄＥＵ−ＡＨＥＦ、ｄＥＵ−ＮＸＲ、ｄＥＤ−ＸＦおよびｄＥＤ−ＥＨＲ（配列表の配列番号２３、２４、２５および２６参照）を合成した。
ｄＥＵ−ＡＨＥＦ：５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＧＧＧＡＡＣＧＧＧＴＣＣＴＣＡＴ−３’
ｄＥＵ−ＮＸＲ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＧＡＣＧ−３’
ｄＥＤ−ＸＦ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＴ−３’
ｄＥＤ−ＥＨＲ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＧＣＡＴ−３’
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ１２７４４由来  チオストレプトン耐性遺伝子のｔｓｒ（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，１９９（１），２６−３６，１９８５）の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる２種のプライマー、ＴＲ−ＡＦ、およびＴＲ−ＸＲ（配列表の配列番号２７および２８参照）を合成した。
ＴＲ−ＡＦ：５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＡＴＴ−３’
ＴＲ−ＸＲ：５’−ＣＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＧＧＴＴＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＴＴ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。【０１３４】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１．５μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ５μｌ
ＭｇＳＯ４溶液  ３μｌ
ジメチルスルホキシド  ２．５μｌ
ｄＥＵ−ＡＨＥＦまたはｄＥＤ−ＸＦまたはＴＲ−ＡＦ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ｄＥＵ−ＮＸＲまたはｄＥＤ−ＥＨＲまたはＴＲ−ＸＲ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
Ｍｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡまたはＳ．  ａｚｕｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ１２７４４株染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕ／μｌ，東洋紡社）  １μｌ【０１３５】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６０℃  ３０秒，６８℃  ３分）    ３０サイクル
６８℃  ４分【０１３６】
この反応の結果、ｄＥＵ−ＡＨＥＦとｄＥＵ−ＮＸＲとＭｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡを用いた反応から、配列番号１の塩基５６４７７から塩基５８５２９を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＥＵ１）が増幅され、ｄＥＤ−ＸＦとｄＥＤ−ＥＨＲとＭｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡを用いた反応から、配列番号１の塩基５９８０８から塩基６１８６３を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＥＤ１）が増幅され、ＴＲ−ＡＦとＴＲ−ＸＲとＳ．  ａｚｕｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ１２７４４株染色体ＤＮＡを用いた反応から、チオストレプトン耐性遺伝子ｔｓｒを含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＴＲ１）が増幅された。ＤＮＡ断片ＥＵ１、ＥＤ１、およびＴＲ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で精製した。【０１３７】
制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＥＵ１と、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＥＤ１と、制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで消化したＤＮＡ断片ＴＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲ、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片ＥＵ１とＥＤ１の間にチオストレプトン耐性遺伝子ｔｓｒが挿入された形の約５．３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＭＫＯＳＣＰＲに挿入された約１５．１ｋｂのプラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤが構築された。
【０１３８】
（３）ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤを用いたｈｂｄＥ破壊株の調製。
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤ株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１２ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地２ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。【０１３９】
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１６２０８株をＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布し、３０℃で１週間培養後、胞子を集菌し、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。【０１４０】
得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤ株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１６２０８株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、ＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：ベクトン・ディッキンソン社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤ形質転換株を得た。【０１４１】
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地２５ｍｌに植菌し、３０℃で２週間振盪培養した。なお、プラスミドベクターｐＭＫＯＳＣＰＲはＭｅｒ−１６２０８株中での複製効率が悪く、薬剤耐性マーカー（リボスタマイシン）を含まない培地で培養すると、Ｍｅｒ−１６２０８株はｐＭＫＯＳＣＰＲを保持できない。ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＥＵ−ｔｓｒ−ＥＤ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。チオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。【０１４２】
培養後、チオストレプトン耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｈｂｄＥ遺伝子内の１２７８ｂｐ（配列番号１の塩基５８５３０から塩基５９８０７）を欠失し、その間にチオストレプトン耐性遺伝子が挿入されたｈｂｄＥ破壊株であり、Ｍｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＥ：：ｔｓｒ株とした。【０１４３】
実施例５：ハーボキシジエンの１７位−Ｏ−メチル基転移酵素遺伝子（ｈｂｄＦ）破壊株の作製
実施例３で決定されたハーボキシジエンの生合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）から、図１に示された生合成経路でハーボキシジエンが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちのメチル基転移酵素遺伝子ｈｂｄＦのみを破壊することで、ハーボキシジエンの１７位デメチル体のみを生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｈｂｄＦ破壊株を作製した。【０１４４】
（１）ｈｂｄＦ破壊用プラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤの調製。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｄＦＵ−ＡＨＥＦ、ｄＦＵ−ＮＸＲ、ｄＦＤ−ＸＦおよびｄＦＤ−ＥＨＲ（配列表の配列番号２９、３０、３１および３２参照）を合成した。
ｄＦＵ−ＡＨＥＦ：５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＡＧＡＣＧＧＴＡ−３’
ｄＦＵ−ＮＸＲ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＧＣＣ−３’
ｄＦＤ−ＸＦ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＡ−３’
ｄＦＤ−ＥＨＲ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＴＣＧＣＧＴＴ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。【０１４５】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１．５μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ５μｌ
ＭｇＳＯ４溶液  ３μｌ
ジメチルスルホキシド  ２．５μｌ
ｄＦＵ−ＡＨＥＦまたはｄＦＤ−ＸＦ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ｄＦＵ−ＮＸＲまたはｄＦＤ−ＥＨＲ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
Ｍｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡ  （１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕ／μｌ，東洋紡社）  １μｌ【０１４６】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６０℃  ３０秒，６８℃  ３分）    ３０サイクル
６８℃  ４分【０１４７】
この反応の結果、ｄＦＵ−ＡＨＥＦとｄＦＵ−ＮＸＲを用いた反応から、配列番号１の塩基５５５１７から塩基５７５７１を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＦＵ１）が増幅され、ｄＦＤ−ＸＦとｄＦＤ−ＥＨＲを用いた反応から、配列番号１の塩基５８４４５から塩基６０５２３を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＦＤ１）が増幅された。ＤＮＡ断片ＦＵ１、およびＦＤ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で精製した。【０１４８】
制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＦＵ１と、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＦＤ１と、制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで消化した実施例４（２）取得のＤＮＡ断片ＴＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例４（１）取得のシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲ、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片ＦＵ１とＦＤ１の間にチオストレプトン耐性遺伝子ｔｓｒが挿入された形の約５．３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＭＫＯＳＣＰＲに挿入された約１５．１ｋｂのプラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤが構築された。【０１４９】
（２）ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤを用いたｈｂｄＦ破壊株の調製。
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤ株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１２ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地２ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。【０１５０】
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１６２０８株をＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布し、３０℃で１週間培養後、胞子を集菌し、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。【０１５１】
得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤ株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１６２０８株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、ＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：ベクトン・ディッキンソン社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤ形質転換株を得た。【０１５２】
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地２５ｍｌに植菌し、３０℃で２週間振盪培養した。ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＦＵ−ｔｓｒ−ＦＤ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。チオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。【０１５３】
培養後、チオストレプトン耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｈｂｄＦ遺伝子内の８７３ｂｐ（配列番号１の塩基５７５７２から塩基５８４４４）を欠失し、その間にチオストレプトン耐性遺伝子が挿入されたｈｂｄＦ破壊株であり、Ｍｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＦ：：ｔｓｒ株とした。【０１５４】
実施例６：ハーボキシジエンの１４，１５位エポキシ化酵素遺伝子（ｈｂｄＤ）破壊株の作製
実施例３で決定されたハーボキシジエンの生合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）から、図１に示された生合成経路でハーボキシジエンが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちの１４，１５位エポキシ化酵素遺伝子ｈｂｄＤのみを破壊することで、ハーボキシジエンの１４，１５位オレフィン体を生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｈｂｄＤ破壊株を作製した。
【０１５５】
（１）ｈｂｄＤ破壊用プラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤの調製。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｄＤＵ−ＡＨＥＦ、ｄＤＵ−ＮＸＲ、ｄＤＤ−ＸＦおよびｄＤＤ−ＥＨＲ（配列表の配列番号３３、３４、３５および３６参照）を合成した。
ｄＤＵ−ＡＨＥＦ：５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＣＣＡＣＧＧＡ−３’
ｄＤＵ−ＮＸＲ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧ−３’
ｄＤＤ−ＸＦ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＣＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧ−３’
ｄＤＤ−ＥＨＲ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＧＴＴＣＴＴ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。【０１５６】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１．５μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ５μｌ
ＭｇＳＯ４溶液  ３μｌ
ジメチルスルホキシド  ２．５μｌ
ｄＤＵ−ＡＨＥＦまたはｄＤＤ−ＸＦ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ｄＤＵ−ＮＸＲまたはｄＤＤ−ＥＨＲ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
Ｍｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡ  （１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕ／μｌ，東洋紡社）  １μｌ【０１５７】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６０℃  ３０秒，６８℃  ３分）    ３０サイクル
６８℃  ４分【０１５８】
この反応の結果、ｄＤＵ−ＡＨＥＦとｄＤＵ−ＮＸＲを用いた反応から、配列番号１の塩基５４０５８から塩基５６１１１を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＤＵ１）が増幅され、ｄＤＤ−ＸＦとｄＤＤ−ＥＨＲを用いた反応から、配列番号１の塩基５７５５５から塩基５９６０６を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＤＤ１）が増幅された。ＤＮＡ断片ＤＵ１、およびＤＤ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で精製した。【０１５９】
制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＤＵ１と、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＤＤ１と、制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで消化した実施例４（２）取得のＤＮＡ断片ＴＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例４（１）取得のシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲ、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片ＤＵ１とＤＤ１の間にチオストレプトン耐性遺伝子ｔｓｒが挿入された形の約５．３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＭＫＯＳＣＰＲに挿入された約１５．１ｋｂのプラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤが構築された。【０１６０】
（２）ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤを用いたｈｂｄＤ破壊株の調製。
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤ株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１２ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地２ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。【０１６１】
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１６２０８株をＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布し、３０℃で１週間培養後、胞子を集菌し、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。【０１６２】
得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤ株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１６２０８株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、ＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：ベクトン・ディッキンソン社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤ形質転換株を得た。【０１６３】
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地２５ｍｌに植菌し、３０℃で２週間振盪培養した。ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＤＵ−ｔｓｒ−ＤＤ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。チオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。【０１６４】
培養後、チオストレプトン耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｈｂｄＤ遺伝子内の１４４３ｂｐ（配列番号１の塩基５６１１２から塩基５７５５４）を欠失し、その間にチオストレプトン耐性遺伝子が挿入されたｈｂｄＤ破壊株であり、Ｍｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＤ：：ｔｓｒ株とした。【０１６５】
実施例７：ハーボキシジエンのポリケチド合成酵素遺伝子（ｈｂｄＡＩＩＩ）破壊株の作製
実施例３で決定されたハーボキシジエンの生合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）から、図１に示された生合成経路でハーボキシジエンが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちのｈｂｄＡＩＩＩがコードするタンパク質ＨｂｄＡＩＩＩはストレプトマイセス・アイズネンシスのポリケチド合成酵素Ｏｒｆ１７のアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性５４％）ことからｈｂｄＡＩＩＩはｈｂｄＡＩとｈｂｄＡＩＩと共にハーボキシジエンの基本骨格を構成するポリケチド合成酵素遺伝子であると考えられた。そこでｈｂｄＡＩＩＩを破壊することで、ハーボキシジエンを生産しない株が調製できることを確認する為、以下の方法でｈｂｄＡＩＩＩ破壊株を作製した。【０１６６】
（１）ｈｂｄＡＩＩＩ破壊用プラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄの調製。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｄＡ３Ｕ−ＡＨＥＦ、ｄＡ３Ｕ−ＮＸＲ、ｄＡ３Ｄ−ＸＦおよびｄＡ３Ｄ−ＥＨＲ（配列表の配列番号３７、３８、３９および４０参照）を合成した。
ｄＡ３Ｕ−ＡＨＥＦ：５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＧＣＧＡＴＧＴ−３’
ｄＡ３Ｕ−ＮＸＲ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧ−３’
ｄＡ３Ｄ−ＸＦ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＣＣＧＡＣＧＴＡＣＣＣＡＣＣＧＡ−３’
ｄＡ３Ｄ−ＥＨＲ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＴ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。【０１６７】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１．５μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ５μｌ
ＭｇＳＯ４溶液  ３μｌ
ジメチルスルホキシド  ２．５μｌ
ｄＡ３Ｕ−ＡＨＥＦまたはｄＡ３Ｄ−ＸＦ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ｄＡ３Ｕ−ＮＸＲまたはｄＡ３Ｄ−ＥＨＲ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
Ｍｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡ  （１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕ／μｌ，東洋紡社）  １μｌ【０１６８】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６０℃  ３０秒，６８℃  ３分）    ３０サイクル
６８℃  ４分【０１６９】
この反応の結果、ｄＡ３Ｕ−ＡＨＥＦとｄＡ３Ｕ−ＮＸＲを用いた反応から、配列番号１の塩基４７８１６から塩基４９８９７を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ａ３Ｕ１）が増幅され、ｄＡ３Ｄ−ＸＦとｄＡ３Ｄ−ＥＨＲを用いた反応から、配列番号１の塩基５５９９１から塩基５８０２２を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ａ３Ｄ１）が増幅された。ＤＮＡ断片Ａ３Ｕ１、およびＡ３Ｄ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で精製した。【０１７０】
制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片Ａ３Ｕ１と、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片Ａ３Ｄ１と、制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで消化した実施例４（２）取得のＤＮＡ断片ＴＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例４（１）取得のシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲ、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片Ａ３Ｕ１とＡ３Ｄ１の間にチオストレプトン耐性遺伝子ｔｓｒが挿入された形の約５．３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＭＫＯＳＣＰＲに挿入された約１５．１ｋｂのプラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄが構築された。【０１７１】
（２）ｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄを用いたｈｂｄＡＩＩＩ破壊株の調製。
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄ株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１２ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地２ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。【０１７２】
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１６２０８株をＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布し、３０℃で１週間培養後、胞子を集菌し、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。【０１７３】
得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄ株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１６２０８株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、ＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：ベクトン・ディッキンソン社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄ形質転換株を得た。【０１７４】
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地２５ｍｌに植菌し、３０℃で２週間振盪培養した。ｐＭＫＯＳＣＰＲ−Ａ３Ｕ−ｔｓｒ−Ａ３Ｄ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。チオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。【０１７５】
培養後、チオストレプトン耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｈｂｄＡＩＩＩ遺伝子内の６０９３ｂｐ（配列番号１の塩基４９８９８から塩基５５９９０）を欠失し、その間にチオストレプトン耐性遺伝子が挿入されたｈｂｄＡＩＩＩ破壊株であり、Ｍｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＡＩＩＩ：：ｔｓｒ株とした。【０１７６】
実施例８：ハーボキシジエンの転写調節因子遺伝子（ｈｂｄＲ）破壊株の作製
実施例３で決定されたハーボキシジエンの生合成に関連するＤＮＡを含む約６５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）より、図１に示された生合成経路でハーボキシジエンが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちのｈｂｄＲがコードするタンパク質ＨｂｄＲはサッカロポリスポラ・エリスラエの転写調節因子ＳＡＣＥ＿４５３６のアミノ酸配列に最も高い同一性を有していた（同一性５７％）ことからｈｂｄＲはハーボキシジエンの生合成遺伝子の転写調節因子をコードする遺伝子であると考えられた。そこでｈｂｄＲを破壊することで、ハーボキシジエンを生産性が変化する株が調製できることを確認する為、以下の方法でｈｂｄＲ破壊株を作製した。【０１７７】
（１）ｈｂｄＲ破壊用プラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤの調製。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｄＲＵ−ＡＨＥＦ、ｄＲＵ−ＮＸＲ、ｄＲＤ−ＸＦおよびｄＲＤ−ＥＨＲ（配列表の配列番号４１、４２、４３および４４参照）を合成した。
ｄＲＵ−ＡＨＥＦ：５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＧＡＴ−３’
ｄＲＵ−ＮＸＲ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＴＡＧＡＣＡ−３’
ｄＲＤ−ＸＦ：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＡ−３’
ｄＲＤ−ＥＨＲ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを下記の条件にて行った。【０１７８】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水  ３１．５μｌ
１０倍濃縮ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ５μｌ
ＭｇＳＯ４溶液  ３μｌ
ジメチルスルホキシド  ２．５μｌ
ｄＲＵ−ＡＨＥＦまたはｄＲＤ−ＸＦ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
ｄＲＵ−ＮＸＲまたはｄＲＤ−ＥＨＲ  （５０ｐｍｏｌ／μｌ）  ０．５μｌ
Ｍｅｒ−１６２０８株染色体ＤＮＡ  （１００ｎｇ／μｌ）  １μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕ／μｌ，東洋紡社）  １μｌ
【０１７９】
（反応温度条件）
９５℃  ６分
（９８℃  ２０秒，６０℃  ３０秒，６８℃  ３分）    ３０サイクル
６８℃  ４分【０１８０】
この反応の結果、ｄＲＵ−ＡＨＥＦとｄＲＵ−ＮＸＲを用いた反応から、配列番号１の塩基４６５８から塩基６６７７を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＲＵ１）が増幅され、ｄＲＤ−ＸＦとｄＲＤ−ＥＨＲを用いた反応から、配列番号１の塩基７７１６から塩基９７４０を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ＲＤ１）が増幅された。ＤＮＡ断片ＲＵ１、およびＲＤ１をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で精製した。【０１８１】
制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＲＵ１と、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片ＲＤ１と、制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで消化した実施例５（２）取得のＤＮＡ断片ＴＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例５（１）取得のシャトルベクターｐＭＫＯＳＣＰＲ、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片ＲＵ１とＲＤ１の間にチオストレプトン耐性遺伝子ｔｓｒが挿入された形の約５．３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＭＫＯＳＣＰＲに挿入された約１５．０ｋｂのプラスミドｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤが構築された。【０１８２】
（２）ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤを用いたｈｂｄＲ破壊株の調製。
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤを得た。得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤ株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１２ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍｌで２回洗浄後、ＬＢ培地２ｍｌに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。【０１８３】
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１６２０８株をＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布し、３０℃で１週間培養後、胞子を集菌し、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。【０１８４】
得られたＳ１７−１／ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤ株供与菌懸濁液５００μｌを、Ｍｅｒ−１６２０８株受容菌懸濁液１０μｌと混ぜ、ＩＳＰ４培地（ベクトン・ディッキンソン社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含む２．５ｍｌのＳＮＡ（０．８％栄養培地：ベクトン・ディッキンソン社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤ形質転換株を得た。【０１８５】
得られたｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地２５ｍｌに植菌し、３０℃で２週間振盪培養した。ｐＭＫＯＳＣＰＲ−ＲＵ−ｔｓｒ−ＲＤ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄後、滅菌水１０ｍｌに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。チオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍｌのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。【０１８６】
培養後、チオストレプトン耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｈｂｄＲ遺伝子内の１０３８ｂｐ（配列番号１の塩基６６７８から塩基７７１５）を欠失し、その間にチオストレプトン耐性遺伝子が挿入されたｈｂｄＲ破壊株であり、Ｍｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＲ：：ｔｓｒ株とした。【０１８７】
実施例９：ハーボキシジエン生合成遺伝子ｈｂｄＥ破壊株のハーボキシジエンならびにその類縁体の生産性試験
実施例４で得られたＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＥ：：ｔｓｒ株の凍結種母２５０μｌを、種母培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉（豊年ソイプロ（登録商標）：（株）Ｊ−オイルミルズ製）２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）２５ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１８８】
得られた種母培養液の４ｍｌを、本培養培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）４００ｍｌに植菌し、２８℃で７日間培養した。【０１８９】
培養終了後、得られた培養液６００μｌに等量のアセトニトリルを加えて抽出した。抽出液遠心上澄を下記の条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でハーボキシジエンおよびその類縁体の量を測定した。測定結果を表１に示す。【０１９０】
実施例１０：ハーボキシジエン生合成遺伝子ｈｂｄＦ破壊株のハーボキシジエンならびにその類縁体の生産性試験
実施例５で得られたＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＦ：：ｔｓｒ株の凍結種母２５０μｌを、種母培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）２５ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１９１】
得られた種母培養液の１ｍｌを、本培養培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）１００ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１９２】
培養終了後、得られた培養液６００μｌに等量のアセトニトリルを加えて抽出した。抽出液遠心上澄を下記の条件にてＨＰＬＣでハーボキシジエンおよびその類縁体の量を測定した。測定結果を表１に示す。【０１９３】
実施例１１：ハーボキシジエン生合成遺伝子ｈｂｄＤ破壊株のハーボキシジエンならびにその類縁体の生産性試験
実施例６で得られたＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＤ：：ｔｓｒ株の凍結種母２５０μｌを、種母培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）２５ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１９４】
得られた種母培養液の２ｍｌを、本培養培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、β−シクロデキストリン  ２％、ｐＨ７．４）２００ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１９５】
培養終了後、得られた培養液６００μｌに等量のアセトニトリルを加えて抽出した。抽出液遠心上澄を下記の条件にてＨＰＬＣでハーボキシジエンおよびその類縁体の量を測定した。測定結果を表１に示す。【０１９６】
実施例１２：ハーボキシジエン生合成遺伝子ｈｂｄＡＩＩＩ破壊株のハーボキシジエンならびにその類縁体の生産性試験
実施例７で得られたＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＡＩＩＩ：：ｔｓｒ株の凍結種母２５０μｌを、種母培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）２５ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１９７】
得られた種母培養液の６００μｌを、本培養培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）６０ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０１９８】
培養終了後、得られた培養液６００μｌに等量のアセトニトリルを加えて抽出した。抽出液遠心上澄を下記の条件にてＨＰＬＣでハーボキシジエンおよびその類縁体の量を測定した。測定結果を表１に示す。【０１９９】
実施例１３：ハーボキシジエン生合成遺伝子ｈｂｄＲ破壊株のハーボキシジエンならびにその類縁体の生産性試験
実施例８で得られたＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＲ：：ｔｓｒ株の凍結種母２５０μｌを、種母培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）２５ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０２００】
得られた種母培養液の６００μｌを、本培養培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ｐＨ７．４）６０ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０２０１】
培養終了後、得られた培養液６００μｌに等量のアセトニトリルを加えて抽出した。抽出液遠心上澄を下記の条件にてＨＰＬＣでハーボキシジエンおよびその類縁体の量を測定した。測定結果を表１に示す。【０２０２】
実施例１４：ハーボキシジエン生産株Ｍｅｒ−１６２０８株のハーボキシジエンならびにその類縁体の生産性試験
Ｍｅｒ−１６２０８株の凍結種母２５０μｌを、種母培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％，ｐＨ７．４）２５ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０２０３】
得られた種母培養液の６００μｌを、本培養培地（ポテトでんぷん２％、グルコース２％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３２％、ＣｕＳＯ４  ０．０００５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００５％、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００５％，ｐＨ７．４）６０ｍｌに植菌し、２８℃で３日間培養した。【０２０４】
培養終了後、それぞれ得られた培養液６００μｌに等量のアセトニトリルを加えて抽出した。その抽出液上澄を下記の条件にてＨＰＬＣでハーボキシジエンおよびその類縁体の量を測定した。測定結果を表１に示す。【０２０５】
実施例９〜１４におけるＨＰＬＣ条件
分析装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ
カラム：Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｃ１８（４．６ｍｍｘ５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相Ａ：水／アセトニトリル／ギ酸＝１０００／１０／１
移動相Ｂ：アセトニトリル／水／ギ酸＝１０００／１０／１
グラジエント：３０％〜７０％移動相Ｂ（０〜４分）
７０％〜１００％移動相Ｂ（４〜４．５分）
１００％移動相Ｂ（４．５〜６分）
１００％〜３０％移動相Ｂ（６〜６．０１分）
３０％移動相Ｂ（６．０１〜７分）
流速：２．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
インジェクション容量：１０μｌ
カラム温度：３０℃
分析時間：７分
保持時間：ハーボキシジエン；３．３３分、ＨＸ３５４；４．９４分、ＨＸ３５５；３．８３分、ＨＸ３５６；２．７８分、ＭＷ３９２；４．９１分【０２０６】
【表１】
0005524053.tif 000005
【０２０７】
ｈｂｄＡＩＩＩ破壊株であるＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＡＩＩＩ：：ｔｓｒ株はハーボキシジエンならびにその類縁体を生産しないことが確認された。またｈｂｄＲ破壊株であるＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＲ：：ｔｓｒ株はハーボキシジエンの生産量がＭｅｒ−１６２０８株と比較して著しく低下していることが確認された。
【０２０８】
実施例１５：ＨＸ３５４，３５５の単離精製と構造確認
実施例９で得られた菌液４００ｍｌの遠心上澄に食塩を８０ｇ加え２ｍｏｌ／Ｌ  塩酸でｐＨ２−３に調製した。そこに酢酸エチル４００ｍｌを加え激しく撹拌し抽出した。遠心を行い得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加え酢酸エチル層中から水を除去した。ろ過を行い適量の酢酸エチルで洗浄した後エバポレーターにかけ酢酸エチルを留去した。得られた乾固物をメタノール１．５ｍｌに溶解し分取ＨＰＬＣでＨＸ３５４，３５５のピークを分画した。これらの分画サンプルの溶媒を留去しＨＸ３５４を５ｍｇ，ＨＸ３５５を２ｍｇ得た。【０２０９】
（分取ＨＰＬＣ条件）
分取装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ  分取オートサンプラ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ１８（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ，５μｍ）
移動相Ａ：水
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：２０％移動相Ｂ（０〜１分）
２０％〜１００％移動相Ｂ（１〜８分）
１００％移動相Ｂ（８〜１４分）
１００％〜２０％移動相Ｂ（１４〜１５分）
２０％移動相Ｂ（１５〜１８分）
流速：３．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
インジェクション容量：５０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：１８分
保持時間：ＨＸ３５４；１１．６分、ＨＸ３５５；１０．３分【０２１０】
【化４】
0005524053.tif 000006
【０２１１】
ＨＸ３５４（１）の物性値
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ (ppm): 6.32(dd, 1H, J=15, 11Hz, H10), 5.94(d, 1H, J=11Hz, H9), 5.49(dd, 1H, J=15, 9Hz, H11), 3.79(m, 1H, H3), 3.39(s, 3H, H25), 3.37(d, 1H, J=10Hz, H7), 3.13(m, 1H, H17), 2.64(d, 1H, J=10Hz, H15), 2.48(dd, 1H, J=16, 8Hz, H2a), 2.47(overlap, 1H, H12), 2.41(dd, 1H, J=16, 6Hz, H2b), 1.91(dd, 1H, J=13, 4Hz, H13a), 1.88(m, 1H, H5a), 1.74(m, 1H, H4a), 1.71(s, 3H, H21), 1.62(m, 1H, H18a), 1.56(m, 1H, H18b), 1.56(m, 1H, H6), 1.44(m, 1H, H16), 1.36(m, 1H, H4b), 1.32(m, 1H, H5b), 1.29(s, 3H, H23), 1.19(dd, 1H, J=1３, 11Hz, H13b), 1.07(d, 3H, J=7, H22), 0.90(t, 3H, J=8, H19), 0.84(d, 3H, J=7, H24), 0.71(d, 3H, J=7, H20)【０２１２】
13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ (ppm): 175.19(C1), 140.76(C11), 136.17(C8), 129.66(C9), 126.54(C10), 92.19(C7), 85.72(C17), 75.48(C3), 67.78(C15), 61.85(C14), 58.45(C25), 48.13(C13), 42.28(C2), 37.52(C16), 36.56(C12), 33.50(C5), 33.40(C6), 32.81(C4), 24.90(C18), 22.71(C22), 18.09(C20), 16.84(C23), 12.07(C21), 11.80(C24), 10.13(C19)【０２１３】
ESI-MS: m/z = 421 [M-H]-【０２１４】
【化５】
0005524053.tif 000007
【０２１５】
ＨＸ３５５（２）の物性値
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ (ppm): 6.30(dd, 1H, J=15, 11Hz, H10), 5.91(d, 1H, J=11Hz, H9), 5.48(dd, 1H, J=15, 9Hz, H11), 3.76(m, 1H, H3), 3.44(m, 1H, H17), 3.34(d, 1H, J=10Hz, H7), 2.63(d, 1H, J=9Hz, H15), 2.46(dd, 1H, J=16, 7Hz, H2a), 2.46(overlap, 1H, H12), 2.38(dd, 1H, J=16, 6Hz, H2b), 1.90(dd, 1H, J=13, 5Hz, H13a), 1.86(m, 1H, H5a), 1.71(m, 1H, H4a), 1.69(s, 3H, H21), 1.53(m, 2H, H6 and H18a), 1.44(m, 1H, H18b), 1.33(m, 2H, H4b and H16), 1.27(s, 3H, H23), 1.27(m, 1H, H5b), 1.17(dd, 1H, J=13, 11Hz, H13b), 1.04(d, 3H, J=7, H22), 0.93(t, 3H, J=8, H19), 0.84(d, 3H, J=7, H24), 0.69(d, 3H, J=7, H20)【０２１６】
13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ (ppm): 175.19(C1), 140.73(C11), 136.16(C8), 129.67(C9), 126.51(C10), 92.20(C7), 75.80(C17), 75.52(C3), 68.05(C15), 61.74(C14), 48.12(C13), 42.33(C2), 39.79(C16), 36.49(C12), 33.48(C5), 33.42(C6), 32.82(C4), 28.83(C18), 22.65(C22), 18.11(C20), 16.83(C23), 12.11(C21), 11.57(C24), 10.80(C19)【０２１７】
ESI-MS: m/z = 407 [M-H]-【０２１８】
この結果、ｈｂｄＥ破壊株であるＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＥ：：ｔｓｒ株はハーボキシジエンを生産せずにハーボキシジエンの１８位デオキシ体であるＨＸ３５４、およびハーボキシジエンの１８位デオキシ、１７位Ｏ−デメチル体であるＨＸ３５５を生産していることが確認された。【０２１９】
実施例１６：ＨＸ３５６の単離精製と構造確認
実施例１０で得られた菌液１００ｍｌの遠心上澄に食塩を２０ｇ加え２ｍｏｌ／Ｌ  塩酸でｐＨ２−３に調製した。そこに酢酸エチル１００ｍｌを加え激しく撹拌し抽出した。遠心を行い得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加え酢酸エチル層中から水を除去した。ろ過を行い適量の酢酸エチルで洗浄した後エバポレーターにかけ酢酸エチルを留去した。得られた乾固物をメタノール１．５ｍｌに溶解し分取ＨＰＬＣでＨＸ３５６のピークを分画した。この分画サンプルの溶媒を留去しＨＸ３５６を４．５ｍｇ得た。【０２２０】
（分取ＨＰＬＣ条件）
分取装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ  分取オートサンプラ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ１８（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ，５μｍ）
移動相Ａ：水
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：２０％移動相Ｂ（０〜１分）
２０％〜１００％移動相Ｂ（１〜８分）
１００％移動相Ｂ（８〜１４分）
１００％〜２０％移動相Ｂ（１４〜１５分）
２０％移動相Ｂ（１５〜１８分）
流速：３．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
インジェクション容量：５０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：１８分
保持時間：ＨＸ３５６；９．０分【０２２１】
【化６】
0005524053.tif 000008
【０２２２】
ＨＸ３５６（３）の物性値
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ (ppm): 6.30(dd, 1H, J=15, 11Hz, H10), 5.91(d, 1H, J=11Hz, H9), 5.48(dd, 1H, J=15, 9Hz, H11), 3.77(m, 2H, H18 and H3), 3.34(d, 1H, J=10Hz, 1H, H7), 3.27(t, 1H, J=6Hz, H17), 2.66(d, 1H, J=5Hz, H15), 2.46(overlap, 1H, H12), 2.46(dd, 1H, J=15, 8Hz, H2a), 2.38(dd, 1H, J=15, 6Hz, H2b), 1.92(dd, 1H, J=14, 5Hz, H13a), 1.85(m, 1H, H5a), 1.71(m, 1H, H4a), 1.64(s, 3H, H21), 1.54(m, 1H, H6), 1.46(m, 1H, H16), 1.33(m, 1H, H4b), 1.30(s, 3H, H23), 1.25(m, 1H, H5b), 1.17(dd, 1H, J=14, 11Hz, H13b), 1.12(d, 3H, J=7, H19), 1.04(d, 3H, J=7, H22), 0.87(d, 3H, J=7, H24), 0.69(d, 3H, J=7, H20)【０２２３】
13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ (ppm): 175.36(C1), 140.70(C11), 136.19(C8), 129.66(C9), 126.54(C10), 92.19(C7), 78.24(C17), 75.55(C3), 69.59(C18), 67.83(C15), 62.23(C14), 48.09(C13), 42.42(C2), 37.12(C16), 36.50(C12), 33.48(C5), 33.43(C6), 32.82(C4), 22.66(C22), 19.63(C19), 18.11(C20), 16.80(C23), 12.12(C21), 11.90(C24)【０２２４】
ESI-MS: m/z = 423 [M-H]-【０２２５】
この結果、ｈｂｄＦ破壊株であるＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＦ：：ｔｓｒ株はハーボキシジエンを生産せずにハーボキシジエンの１７位Ｏ−デメチル体であるＨＸ３５６、およびハーボキシジエンの１８位デオキシ、１７位Ｏ−デメチル体であるＨＸ３５５を生産していることが確認された。【０２２６】
実施例１７：ＭＷ３９２の単離精製と構造確認
実施例１１で得られた菌液２００ｍｌの遠心上澄に食塩を４０ｇ加え２ｍｏｌ／Ｌ  塩酸でｐＨ２−３に調製した。そこに酢酸エチル２００ｍｌを加え激しく撹拌し抽出した。遠心を行い得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加え酢酸エチル層中から水を除去した。ろ過を行い適量の酢酸エチルで洗浄した後エバポレーターにかけ酢酸エチルを留去した。得られた乾固物をメタノール１．５ｍｌに溶解し分取ＨＰＬＣでＭＷ３９２のピークを分画した。この分画サンプルの溶媒を留去しＭＷ３９２を４．５ｍｇ得た。【０２２７】
（分取ＨＰＬＣ条件）
分取装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ  分取オートサンプラ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ１８（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ，５μｍ）
移動相Ａ：水
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：２０％移動相Ｂ（０〜１分）
２０％〜１００％移動相Ｂ（１〜８分）
１００％移動相Ｂ（８〜１４分）
１００％〜２０％移動相Ｂ（１４〜１５分）
２０％移動相Ｂ（１５〜１８分）
流速：３．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
インジェクション容量：５０μｌ
カラム温度：４０℃
分析時間：１８分
保持時間：ＭＷ３９２；１１．３分【０２２８】
【化７】
0005524053.tif 000009
【０２２９】
ＭＷ３９２（４）の物性値
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ (ppm): 6.20(dd, 1H, J=15, 11Hz, H10), 5.89(d, 1H, J=11Hz, H9), 5.33(dd, 1H, J=15, 8Hz, H11), 4.93(d, 1H, J=11Hz, H15), 3.76(m, 1H, H3), 3.31(overlap, 1H, H7), 3.12(td, 1H, J=9, 3Hz, H17), 2.46(dd, 1H, J=16, 8Hz, H2a), 2.38(overlap, 1H, H12), 2.38(dd, 1H, J=16, 6Hz, H2b), 2.30(m, 1H, H16), 1.97(dd, 2H, J=7, 4Hz, H13ab), 1.85(m, 1H, H5a), 1.68(m, 1H, H4a), 1.68(s, 3H, H21), 1.60(s, 3H, H23), 1.52(m, 2H, H6 and H18a), 1.26(m, 3H, H4b, H5b and H18b), 0.98(d, 3H, J=7, H22), 0.92(d, 3H, J=7, H24), 0.91(t, 3H, J=7, H19), 0.68(d, 3H, J=7, H20)
【０２３０】
13C-NMR (125MHz, CD3OD) δ (ppm): 175.21(C1), 141.67(C11), 135.26(C8), 133.94(C14), 131.44(C15), 129.82(C9), 125.31(C10), 92.18(C7), 78.57(C17), 75.51(C3), 49.88(C13), 42.29(C2), 40.02(C16), 36.72(C12), 33.50(C5), 33.46(C6), 32.84(C4), 28.94(C18), 20.84(C22), 18.04(C20), 17.70(C19), 16.71(C23), 12.20(C21), 10.65(C24)
ESI-MS: m/z = 391 [M-H]-【０２３１】
この結果、ｈｂｄＤ破壊株であるＭｅｒ−１６２０８  ｈｂｄＤ：：ｔｓｒ株はハーボキシジエンを生産せずにハーボキシジエンの１４，１５位オレフィン、１７位Ｏ−デメチル、１８位デオキシ体であるＭＷ３９２を生産していることが確認された。【０２３２】
［試験例］ＷｉＤｒヒト大腸癌細胞に対する増殖抑制作用
１０％  ウシ胎児血清、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）で培養したＷｉＤｒヒト大腸癌細胞を、２×１０３  ｃｅｌｌｓ／９０μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレートに播いた。ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した後、３倍希釈系列の実施例化合物ＨＸ３５４またはＨＸ３５５を含む１０μｌの上記培養液を添加して培養した。３日後５０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、２分間振とう後１５分間静置し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ発光を測定して、生細胞数の指標とした。
ＨＸ３５４およびＨＸ３５５について、ＷｉＤｒヒト大腸癌細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０値）を求めた結果を以下の表に示す。【０２３３】
【表２】
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【図１】
0005524053.tif 000011
【図２】
0005524053.tif 000012
【配列表】
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