(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
着目する生物のアトラス；
着目する生物の画像を少なくとも一時的に保存するための保存デバイス；
着目する生物の画像のマップを自動的に作成し、そして画像のマップを、生物内の臓器の描写を含む生物のアトラスと自動的に比較する、操作デバイス；および
マップの作成に使用される着目する生物の１または複数の画像を、透過光画像撮影法を使用して複数のレベルの解像度で撮る画像デバイス、
を含む、着目する生物についての情報を抽出するシステムであって、
着目する生物が受精後約７２時間以内に胚形成を完了する小脊椎動物であり、
透過光画像撮影法がハイスループットシステムである、前記システム。
【請求項２】
生物が少なくとも部分的に透明であり、胚発生の間、可視化される、請求項１のシステム。
【請求項３】
操作デバイスが、生物の発生段階を自動的に決定する、請求項１または２のシステム。
【請求項４】
操作デバイスが、自動適合アルゴリズムを部分的に使用して、画像のマップを生物のアトラスと比較する、請求項１〜３のいずれか１項のシステム。
【請求項５】
アトラスが、操作デバイスを介して注釈を加えることができる、請求項１〜４のいずれか１項のシステム。
【請求項６】
操作デバイスが、１つまたはそれ以上の着目する生物の計測値を生じる、請求項１〜５のいずれか１項のシステム。
【請求項７】
１つまたはそれ以上の計測値が、着目する生物の１つまたはそれ以上の解剖学的特性または発生上の欠陥についての計測値を含む、請求項６のシステム。
【請求項８】
計測値が、同じ型の生物間において、５％より小さいかまたは５％に等しい分散を有する、請求項６または７のシステム。
【請求項９】
計測値が、長さ、面積、曲率、色、テクスチャ、形状、およびそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を含む、請求項６〜８のいずれか１項のシステム。
【請求項１０】
操作デバイスが、アトラスを使用して、着目する生物の画像の１つまたはそれ以上の画像特性を補正する、請求項１〜９のいずれか１項のシステム。
【請求項１１】
画像デバイスが、様々なレベルの解像度において、着目する生物の複数の画像を撮る、請求項１０のシステム。
【請求項１２】
画像の１つは生物全体のより低い解像度の画像であり、そして画像の１つは、着目する生物内の１つまたはそれ以上の臓器のより高い解像度の画像である、請求項１１のシステム。
【請求項１３】
画像デバイスが、着目する生物の画像の着目する生物のアトラスとの比較に少なくも部分的に基づいて、様々なレベルの解像度において、複数の画像を自動的に撮る、請求項１１または１２のシステム。
【請求項１４】
保存デバイスがさらに、１つまたはそれ以上の化学物質に関する情報を保存し、そして、操作デバイスが着目する生物内の１つまたはそれ以上の臓器に関連するデータを集め、そして１つまたはそれ以上の化学物質に関する情報とデータとを関連づける、請求項１〜１３のいずれか１項のシステム。
【請求項１５】
操作デバイスが、臓器データとプローブ情報との相関に基づいて、１つまたはそれ以上の毒性レベルを決定する、請求項１４のシステム。
【請求項１６】
操作デバイスが、着目する生物中で１つまたはそれ以上の毒物の存在を決定する、請求項１４または１５のシステム。
【請求項１７】
アトラスが適合性のある、請求項１〜１６のいずれか１項のシステム。
【請求項１８】
着目する生物のアトラスを提供する工程；
着目する生物の画像のマップを自動的に作成するために使用される、着目する生物の複数の画像を提供する工程、ここで画像は複数のレベルの解像度で透過光画像撮影法を使用する画像デバイスで撮られる；および
画像のマップを生物のアトラスと自動的に比較する工程；
を含む、胚発生の間、着目する生物についての情報を抽出する方法であって、
着目する生物が受精後約７２時間以内に胚形成を完了する、少なくとも部分的に透明な小脊椎動物である、前記方法。
【請求項１９】
着目する生物の１つまたはそれ以上の特性を計測する工程をさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
１つまたはそれ以上の計測値が、着目する生物の１つまたはそれ以上の解剖学的特徴の計測値を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
１つまたはそれ以上の計測値が、５％より小さいか、または５％と等しい分散を有する、請求項１９または２０の方法。
【請求項２２】
計測値が、長さ、面積、および曲率の１つまたはそれ以上を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、2008年11月7日に出願された米国特許出願番号12/267,019に対する優先権を主張し、その開示全体を、その全体において本明細書中で参照として援用する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  本発明は、一般に、生物全体から高含量の情報を抽出するための、自動的なシステムおよび方法に関連する。
[0003]  真骨類、線虫類、およびショウジョウバエなどの生物は、様々な研究応用のための、生物学的モデルとしての機能を果たす。例えば、ゼブラフィッシュは、発生生物学、分子遺伝学、および毒性学的研究における、よく知られた脊椎動物モデルである。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュの小さいサイズ、低い飼育費用、子宮外の透明な胚、初期の形態識別、交配当たりに産生される多数の胚、およびヒトのゲノムに対するそのゲノムの類似性を含む、マウスなどのその他の研究モデルよりも、多くの利点を提供する。ゼブラフィッシュは、一般に、細胞のアポトーシス、臓器発生（例えば、脳、肝臓、尾、耳）、並びに心臓系および神経系の機能に対する、様々な薬物の効果を研究するために使用される。
【０００３】
[0004]  ゼブラフィッシュをモデル生物として使用する研究は、ヒト疾患のモデル化、および、生物内の臓器における細胞集団の形成および機能の分析にまで、広がってきた。この研究は、新たなヒト疾患モデルを生み出し、そして疾患状態を改善する遺伝子や疾患から臓器を救う化学物質を含む、可能性のある治療を見出し始めている。
【０００４】
[0005]  遺伝生化学についてのモデルとしてのゼブラフィッシュの近年の、発展は、細胞株またはin vitroにおける、より古いスクリーニング技術に付加されるものとして、in vivoにおける化学スクリーニングを確立した。可溶性化学物質は、ゼブラフィッシュ胚の中に浸透し、そして、特異的効果を産生する。in vitro技術によるスクリーニングとは対照的に、ゼブラフィッシュは、化学物質の生物活性を研究するための、in vivoの脊椎動物モデルを提供する。それに加えて、多数のゼブラフィッシュ変異体が使用できることは、化学抑制剤のスクリーニングを迅速かつ容易にする。ゼブラフィッシュにおいて、疾患の表現型を防止または治癒させることが見出された化学物質の標的は、一般に、ヒトにおいても非常に近い性質のものを有するであろう。そのため、これらのスクリーニングは、新たな治療薬の開発への重要な入り口を提供する見込みがある。
【０００５】
[0006]  その他の脊椎動物モデルとは対照的に、ゼブラフィッシュは、受精後、最初の72時間で、胚形成を完了する。心臓血管系、消化管、肝臓、および腎臓を含む、内臓器官のほとんどは、最初の24時間から48時間に、急速に発生する。ゼブラフィッシュ胚はまた、透明でもあり、それは観察および分析を容易にする。脳、目、心臓、および筋肉組織のすべての前駆組織は、光学顕微鏡検査を用いて、簡単に可視化することができる。この動物モデルの別の重要な利点は、組織および臓器発生の形態的および分子的基礎が、一般に、ヒトを含むその他の脊椎動物と、同一かまたは類似しているかどちらかであることである。哺乳動物の代替動物モデルとしてのゼブラフィッシュの使用は、研究を加速させ、そして大型動物の試験よりも、費用がかからない。
【０００６】
[0007]  しかしながら、前臨床試験におけるゼブラフィッシュの使用は、限定するものではないが、肝臓のサイズ、尾の長さおよび曲率、斑点のサイズおよび頻度、および軸索が存在するかしないかなどの、様々な解剖学的計測値を研究者が行うことを必要とする。現在は、これらの計測値は、典型的に、手作業で、または、一般的な画像化ソフトウェアおよび画像特性を手でトレースすることを用いて得られる。前記方法は、これらの研究モデルのサイズが小さいことを考えれば、時間を要し、そして非効率的であり、そして人間のバイアスの影響を受ける。1つのアプローチは、各アッセイの観察可能な表現型に特異的な画像分析アルゴリズムを開発することである。後者の方法は機能的であってもよいが、各特異的なアッセイのために時間および労力をかけなければならない点で、非効率的である。
【０００７】
[0008]  様々な解剖学的特性のアトラスを使用して、前記の一般的な分割および登録ソフトウェアを導く、様々な方法が存在するが、前記方法は、不完全であるか、そうでなければ、実質的増加なしで、実際の生物にアトラスを登録することができない。細胞レベルにおいて線虫の研究モデルの小さな部分画像化することができる方法が存在するが、これらの方法は、研究モデル全体を自動的に画像化およびマッピングすることはできない。これらの方法はまた、自動スクリーニングにおける使用にも適応されない。
【０００８】
[0009]  現在のところ、ゼブラフィッシュなどの、小さいが生物の全体を定量的に計測および分析するための、自動化された、ミディアムスループットまたはハイスループットのシステムおよび方法は存在せず、これらは、マウスなどのより大きい研究モデルの実行可能な代替物にするために必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］着目する生物のアトラス；
着目する生物の画像を少なくとも一時的に保存するための保存デバイス；および
着目する生物の画像のマップを自動的に作成し、そして画像のマップを生物のアトラスと自動的に比較する、操作デバイス、
を含む、着目する生物についての情報を抽出するシステム。
［２］アトラスが、生物内の臓器の描写を含む、［１］のシステム。
［３］操作デバイスが、生物の発生段階を自動的に決定する、［１］のシステム。
［４］操作デバイスが、自動適合アルゴリズムを部分的に使用して、画像のマップを生物のアトラスと比較する、［１］のシステム。
［５］アトラスが、操作デバイスを介して注釈を加えることができる、［１］のシステム。
［６］操作デバイスが、１つまたはそれ以上の着目する生物の計測値を生じる、［１］のシステム。
［７］１つまたはそれ以上の計測値が、着目する生物の１つまたはそれ以上の解剖学的特性または発生上の欠陥についての計測値を含む、［６］のシステム。
［８］計測値が、同じ型の生物間において、５％より小さいかまたは５％に等しい分散を有する、［６］のシステム。
［９］計測値が、長さ、面積、曲率、色、テクスチャ、形状、およびそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を含む、［６］のシステム。
［１０］操作デバイスが、生物があらかじめ決められた生物の系統のものであるかを自動的に決定する、［１］のシステム。
［１１］操作デバイスが、着目する生物の発生段階を決定する、［１］のシステム。
［１２］操作デバイスが、着目する生物の特徴または特性の発生段階を決定する、［１］のシステム。
［１３］操作デバイスが、着目する生物内の１つまたはそれ以上の臓器を検出する、［１］のシステム。
［１４］操作デバイスが、アトラスを使用して、着目する生物の画像の１つまたはそれ以上の画像特性を補正する、［１］のシステム。
［１５］画像デバイスをさらに含む、［１］のシステム。
［１６］画像デバイスが、様々なレベルの解像度において、着目する生物の複数の画像を撮る、［１５］のシステム。
［１７］画像の１つは生物全体のより低い解像度の画像であり、そして画像の１つは、着目する生物内の１つまたはそれ以上の臓器のより高い解像度の画像である、［１６］のシステム。
［１８］画像デバイスが、着目する生物の画像の着目する生物のアトラスとの比較に少なくも部分的に基づいて、様々なレベルの解像度において、複数の画像を自動的に撮る、［１６］のシステム。
［１９］保存デバイスがさらに、１つまたはそれ以上の化学物質に関する情報を保存し、そして、操作デバイスが着目する生物内の１つまたはそれ以上の臓器に関連するデータを集め、そして１つまたはそれ以上の化学物質に関する情報とデータとを関連づける、［１］のシステム。
［２０］操作デバイスが、臓器データとプローブ情報との相関に基づいて、１つまたはそれ以上の毒性レベルを決定する、［１９］のシステム。
［２１］操作デバイスが、着目する生物中で１つまたはそれ以上の毒物の存在を決定する、［１９］のシステム。
［２２］着目する生物がゼブラフィッシュである、［１］のシステム。
［２３］アトラスが適合性のある、［１］のシステム。
［２４］着目する生物のアトラスを提供する工程；
着目する生物の画像を提供する工程；
着目する生物の画像のマップを自動的に作成する工程；および
画像のマップを生物のアトラスと自動的に比較する工程；
を含む、着目する生物についての情報を抽出する方法。
［２５］着目する生物の１つまたはそれ以上の特性を計測する工程をさらに含む、［２４］の方法。
［２６］１つまたはそれ以上の計測値が、着目する生物の１つまたはそれ以上の解剖学的特徴の計測値を含む、［２５］の方法。
［２７］１つまたはそれ以上の計測値が、５％より小さいか、または５％と等しい分散を有する、［２５］の方法。
［２８］計測値が、長さ、面積、および曲率の１つまたはそれ以上を含む、［２５］のシステム。
［２９］生物があらかじめ決められた生物の系統のものであるかを決定する工程をさらに含む、［２５］の方法。
［３０］着目する生物の発生段階を決定する工程をさらに含む、［２５］の方法。
［３１］着目する生物内の１つまたはそれ以上の臓器における１つまたはそれ以上の毒性レベルを決定する工程をさらに含む、［２５］の方法。
［３２］着目する生物中での１つまたはそれ以上の毒物の存在を決定する工程をさらに含む、［２５］の方法。
［３３］着目する生物がゼブラフィッシュである、［２５］の方法。
[0010] １つまたはそれ以上の態様におけるシステムおよび方法は、生物由来の研究に関連する特性および表現型の情報を、計測および分析するための、高含量でミディアムスループットの自動化システムおよび方法を提供することにより、限定するものではないが、生物、およびゼブラフィッシュなどの研究モデルにおける様々な研究を含む、研究およびスクリーニングの労力を軽くする。例えば、高含量システムの１つまたはそれ以上の態様は、空間的または時間的に分解される方法を使用して、統合分析を促すと同時に、複数の情報ベクトルを得る。これらのシステムおよび方法は、動物モデルの全体において、または動物モデルの複数の組織または臓器において同時にまたは時間をかけて、そして異なる用量にわたって、化合物および環境化学物質、さらにそれらの副作用の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価を可能にする。高含量の自動システムにおいて使用される場合、このシステムおよび方法は、化合物ライブラリーのスクリーニングなどの、迅速、自動化、そして広範囲の、化合物スクリーニングを可能にする。
【００１０】
[0011]  着目する生物についての情報を抽出するためのシステムの、1つの例となる態様は、着目する生物のアトラス；着目する生物の画像を少なくとも一時的に保存するための保存デバイス；着目する生物の画像のマップを自動的に作成し、そして画像のマップを生物のアトラスと自動的に比較する、操作デバイスを、一般的に含む。
【００１１】
[0012]  アトラスは、限定するものではないが、生物内の臓器、および臓器の部分などの、生物内の領域および／または下位領域の描写を含むことができる。1つまたはそれ以上の態様におけるデジタルアトラスは、特定の着目する生物と、自動的に、あるいは、使用者により開始される適合によって、適合可能であってもよい。
【００１２】
[0013]  操作デバイスは、生物の発生段階を、自動的に決定することができ、さらに自動適合アルゴリズムを部分的に使用して、画像のマップを生物のアトラスと比較することができる。アトラスは、操作デバイスを介して、注釈を加えることが可能であってよい。
【００１３】
[0014]  この方法およびシステムの1つまたはそれ以上の態様において、操作デバイスは、着目する生物の1つまたはそれ以上の計測値を生じ、1つまたはそれ以上の計測値は、着目する生物の1つまたはそれ以上の解剖学的特性および／または発生上の欠陥の計測値を含む。少なくとも1つの例となる態様において、計測値は5％よりも小さい分散を有する。1つまたはそれ以上の態様において、計測値は、1つまたはそれ以上の長さ、面積、および曲率を含む。1つまたはそれ以上の態様において、アトラスは、透過光画像撮影法（例えば、明視野の）によって得られる生物の画像に登録することができ、着目する領域を同定し、そしてさらに、蛍光画像撮影法によって得られる同視野の画像に登録することができる。この例となる態様において、計測値は、1つまたはそれ以上の、形態学に基づく測定（例えば、長さ、面積、および曲率）、または、強度に基づく（例えば、信号レベル、信号粒度）計測を含む。
【００１４】
[0015]  操作デバイスは、着目する生物の発生段階および／または着目する生物の特徴または特性の発生段階を、自動的に決定することができる。
[0016]  1つまたはそれ以上の態様において、操作デバイスは、アトラスを使用して、着目する生物の画像の1つまたはそれ以上の画像特性を補正することができる。システムの例はさらに、画像化デバイスが着目する生物の複数の画像を撮影し、そして様々なレベルの解像度において画像を撮影するように設定されることができる、画像化デバイスを含む。例えば、画像の1つは、生物全体のより低い解像度の画像であり、そして画像の1つは、着目する生物内の1つまたはそれ以上の臓器の、より高い解像度の画像である。1つまたはそれ以上の態様は、少なくとも部分的には、着目する生物の画像と着目する生物のアトラスとの比較に基づいて、様々なレベルの解像度において自動的に画像を撮影する、画像化デバイスを含む。1つの例となる態様はまた、より低い解像度で自動的にアトラスを使用して、着目する面積を測定し、そして生物の体の領域をより高い解像度において焦点を合わせ、さらに画像化するように設定される、画像化デバイスも含む。
【００１５】
[0017]  1つまたはそれ以上の態様において、保存デバイスはまた、1つまたはそれ以上の化学物質（agent）に関する情報を保存することもできる。前記態様において、操作デバイスは、着目する生物内の1つまたはそれ以上の臓器に関連するデータを集め、そして、1つまたはそれ以上の化学物質に関する情報とそのデータとを関連づけることもできる。測定値は、限定するものではないが、異なる色チャネル（波長帯）における透過光画像、および1つまたはそれ以上の波長チャネルにおける蛍光画像を含む、いくつかの画像撮影法により得られることができる。
【００１６】
[0018]  操作デバイスの例となる態様はまた、着目する生物中の1つまたはそれ以上の毒物の存在を決定することもでき、そしてさらに、臓器のデータとプローブ情報との相関に基づいて、1つまたはそれ以上の毒性レベルを測定することができる。
【００１７】
[0019]  着目する生物についての情報を抽出するための例となる方法は、着目する生物のアトラスを提供する工程；着目する生物の画像を提供する工程；着目する生物の画像のマップを自動的に作成する工程；および、画像のマップを生物のアトラスと自動的に比較する工程；を、一般的に含む。1つの例となる態様において、少なくとも画像の1つが、透過光撮影法において得られる。この方法の1つまたはそれ以上の態様は、着目する生物の1つまたはそれ以上の特性を計測し、ここで1つまたはそれ以上の計測値が、着目する生物の1つまたはそれ以上の解剖学的特性の計測を含み、そして計測値が、長さ、面積、および曲率を含むことができる、。1つまたはそれ以上の態様において、同様の計測値間の分散は、特定のシステムについてのぞましい正確性のレベルに応じて、5％より小さくなるように設定することができる。
【００１８】
[0020]  この方法の1つまたはそれ以上の態様は、生物が、あらかじめ決められた生物の系統のものであるかを決定し、そして着目する生物の発生段階を決定するように設定することができる。この方法の1つまたはそれ以上の態様は、使用者が、健康な未処理生物のいくつかの（例えば10より多い）試料の画像を使用して保存デバイスを操作し、そして既存のアトラスを調節して新しいアトラスを定義かつ生成することを可能にする。この例において、使用者のアトラスから元のアトラスを定義するために使用される、生物の組み合わせにおける小さい差異は、試料における誤った計測の結果をもたらさないであろう。前記差異は、元の生物が、異なる系統由来（例えば、遺伝的差異）、および／または異なる段階由来（例えば発生上の差異）であった可能性があるために、生じる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
[0021]  本発明の、これらおよびその他の特性、観点、および利点は、図を通して類似の特徴が類似の部分を表す添付される図を参照して、以下の詳細な説明が読まれる場合に、よりよく理解されるようになるであろう：
【図１】[0022]  図1は、本発明のシステムおよび方法の1つまたはそれ以上において有用である、アトラスの態様の図である。
【図２】[0023]  図2は、図1に示されるアトラスの下位区分の態様の図である。
【図３】[0024]  図3は、ゼブラフィッシュの長さおよび面積の計測値の組み合わせの態様の図である。
【図４】[0025]  図4は、本発明のシステムおよび方法の1つまたはそれ以上において有用である、アトラスに基づく計測過程の態様の流れ図である。
【図５】[0026]  図5は、着目する生物の下位領域の拡大図の態様である。
【図６】[0027]  図6は、試料ゼブラフィッシュの組み合わせの、面積計測値の例における、マトリックスプロットである。
【図７】[0028]  図7は、発明の自動システムの態様の図である。
【図８】[0029]  図8は、A）解剖学的に関連する計測値を決定するため、B）臓器を同定するため、および、C）特定の集団におけるアトラスを調節するための、方法およびシステムの態様の流れ図を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0030]   1つまたはそれ以上の態様におけるシステムおよび方法は、着目する特定の生物についての、様々な形態学的特徴およびその他の関連する生物学的および化学的情報の、ミディアムスループットの自動計測を可能にする。1つまたはそれ以上の態様は、計測値および／または研究に関連するその他の情報の組み合わせに基づくスコアを生じるように設定されることもできる。例えば、特定のアッセイについて、形態学的記述子およびテクスチャ記述子の組み合わせを、スクリーニングされるそれぞれのサカナから、およびサカナ内の特定の臓器および臓器の下位部分についても、抽出することができる。システムおよび方法の1つまたはそれ以上の態様において、モデル生物のアトラスは、スクリーニングされる生物がそれと比較される、標準またはモデルとして使用される。前記の形状記述子および外観記述子は、このシステムの態様のいくつかにおいて、メタデータとして保存されるか、そうでなければシステムの操作サブシステムにアクセス可能である。1つまたはそれ以上の例となる態様において、特定のサカナに関するクエリは、個々の毒性学的評価項目についての様々なスコアを結果としてもたらすであろう。1つまたはそれ以上の例となる態様において、特定の毒性学的評価項目に関するクエリは、評価項目に関する特定の特徴についての高スコアを有するサカナを提示するであろう。
【００２１】
[0031]  着目する生物についての情報を抽出するためのシステムの1つまたはそれ以上の態様は、着目する生物のアトラス；着目する生物の画像を少なくとも一時的に保存するための保存デバイス；および、着目する生物の画像のマップを自動的に作成し、そして画像のマップを、自動的に生物のアトラスと比較する、操作デバイス；を、一般的に含む。
【００２２】
[0031]  請求項に記載される発明の主題をより明確かつ正確に記述しそして指摘するために、以下の定義が特定の用語について提供され、それは以下の記載および添付の請求項において使用される。明細書を通して、特定の用語の例示は、限定しない例としてみなされるべきである。
【００２３】
[0032]  本明細書中で使用される場合、“アトラス”という用語は、生物の解剖学的オントロジーのグラフィック描写を言う。アトラスは、生物全体のグラフィック描写であるか、あるいは生物の部分または領域に分けることができる。描写は、単一の生物由来であるか、あるいは、個々の生物の群から合成され、そして平均化されてもよい。アトラスは、その上に描写の空間的広がりおよび座標が定義される、生物の1つまたはそれ以上の描写；用語のオントロジー；および、描写とオントロジー間のマッピングまたは解説；を含むことができる。オントロジーは、生物の発生の間（例えば、胚発生段階）に生じる構造的な変化を含むことができ、そしてさらに、発生段階を生物の内側または外側の形態的特徴によって特徴づけることができる各発生段階について、1つまたはそれ以上のヒエラルキーを含むことができる。
【００２４】
[0033]  本明細書中で使用される場合、“生物”という用語は、少なくとも研究目的で、ヒトの臓器の1つまたはそれ以上を模倣しまたは比較できる、生物内の1つまたはそれ以上の臓器を含む、生きているときにヒトの研究モデルとして扱うことができる生き物全体を言う。前記生物の例には、限定するものではないが、真骨類、線虫類、および節足動物が含まれる。本明細書中で使用される場合、“臓器”という用語は、特定の機能または機能の群を実行する、組織の群を言う（例えば、心臓、肺、脳、目、胃、脾臓、骨、膵臓、腎臓、肝臓、腸、皮膚、膀胱、および生殖器官）。
【００２５】
[0034]  本明細書中で使用される場合、“着目する生物の画像のマップ”という表現は、生物の1つまたはそれ以上の画像にアトラスを登録するために必要である、生物の1つまたはそれ以上の重要な特徴の同定を言い、前記特徴には、限定するものではないが、生物内の臓器が含まれる。
【００２６】
[0035]  本明細書中で使用される場合、“注釈”という用語は、付加、削除、修正、または置換することができる、単語、記号、文字、画像、数字、マーク、および表現を言う。注釈は、あらかじめ設定されたガイドラインまたはルールに基づくシステムによって、またはシステムに適応できるガイドラインまたはルールによって、あるいはシステムの使用者によって、入力することができる。注釈は、手動によって、自動によって、あるいはキーボード、スタイラス、タッチパッドを使用して、または言語認識ソフトウェアを使用して電子的に、入力することができる。入力の手段は、配線で接続されているか、または無線であってよい。注釈は、限定するものではないが、意味的な、テキストの、説明的な、解釈的な、例証的な、自動化された、絵で表した、聴覚による、または、言語による性質のものであってよい。注釈は、限定することなく、観察者が見ることができるスクリーン上の、組み込まれた、ハイパーテキストの、保存された、または回収可能なものであって良い。
【００２７】
[0036]  本明細書中で使用される場合、“化学物質”という用語は、限定するものではないが、例えば、薬剤的、治療的、薬理学的、環境的または農業的な汚染物質または化合物、毒物、水中汚染物質、薬用化粧品、薬物、毒物、天然産物、合成化合物、または化学化合物を含む、あらゆる要素、化合物、または存在物を言う。
【００２８】
[0037]  本明細書中で使用される場合、“発生上の欠陥”という用語は、生物の組織、臓器、またはその他の身体の構成要素の発生における、正常の発生と比較した、欠陥、不完全、または差異を言う。前記欠陥は、生物の組織、臓器、またはその他の身体の構成要素の発生における、完成または適切な働きにおいて必要であるかまたはのぞましい何らかの、変化、差異、または欠損として同定することができる。
【００２９】
[0038]  本明細書中で使用される場合、“毒物”という用語は、生物に害を及ぼす可能性を有する、あらゆる物質を言う。
[0039]  記述される実施例は、ゼブラフィッシュ（真骨類の1つの種）を態様としているが、これらの方法およびシステムは、限定するものではないが、その他の適切な真骨類の種（例えば、メダカ、Giant rerio、およびフグ）、線虫類、およびショウジョウバエなどの、あらゆる適切な発生段階における、その他のモデル生物全体での使用について、適用することができる。
【００３０】
[0040]  例となる方法およびシステムは、毒性学研究などの様々な研究およびスクリーニング研究についての、ゼブラフィッシュの分析を自動化する。限定するものではないが、サカナの長さ、頭および尾にある斑点の数、尾の曲率、および肝臓の縮小量などの、サカナの計測値は、サカナのモデルに基づいた、様々な形状記述子を自動的に使用して、実行される。画像は、透過光および蛍光画像化によって様々な撮影手段によって取得することができる、それぞれが様々なスペクトル帯によって、またはハイパースペクトル画像化を構成する組み合わせにおいてである。形状記述子は、システム内のハードウェアとして、またはそうでなければ、取り外し可能な記憶装置を介してまたはサーバーを通してシステムにアクセス可能であるなどの、記憶装置内のデータベースに保存されることができる。これらの形状記述子は、スクリーニングされる着目する生物に対する、サカナの表現型の検索および比較を容易にする。さらに、前記データベースは、その他のゼブラフィッシュデータベース（例えば、ZFINの遺伝子データベース）と統合することができる。臓器レベルにおける形状および外観的特徴の抽出は、毒物学者の現在のアプローチを模倣する。しかしながら、データベースは、発見ツールとして機能することもでき、その中においていくつかの特徴を組み合わせて表現型を取得することができる。
【００３１】
[0041]  この方法およびシステムの1つの観点は、生物の発生段階の検出および同定を可能にすることである。着目する生物に応じて、特定の生物の発生段階は、生物の生体構造を検出および同定する際に重要である。この方法およびシステムの少なくとも1つの例となる態様は、生物の発生段階を自動的に検出する。この方法およびシステムの別の観点は、化合物処理研究の開始前の、最初のスクリーニングにおける、小さい生物の生存能力の検出および同定を可能にする（死んでいるか、生きているか）。
【００３２】
[0042]  この方法およびシステムのいくつかの態様における別の特徴は、自動画像分析である。自動画像分析は、生物および臓器発生に対する薬物および毒物の効果をスクリーニングするために非常に重要である、標準化の過程を可能にする。例えば、ゼブラフィッシュの自動画像分析は、反復作業、希少事象の検出、異なるの染色の度合いの定量、多数の特徴の分類および計数、および手動の顕微鏡の性能を超える疑問に答えることを可能にする。モデル化の文脈において、生物学的で画像に基づく実験の定量データを有することは、不可欠である。ハイスループット画像分析は、前記作業を達成するための最も実用的な方法である。
【００３３】
[0043]  1つまたはそれ以上の態様における別の特徴は、生物の解剖学的構造を検出および同定することである。本明細書中で使用されるアトラスという用語は、モデル生物の生体構造の記述を言う。この方法およびシステムの少なくとも1つの態様は、生物の様々な発生段階を検出および同定するように、設計されることができる。アトラスは、様々な方法によって構築することができるが、アトラスの少なくとも1つの態様は、二次元可塑性メッシュを使用して構築される。計測値の特定の組み合わせは、メッシュの交点を使用して定義することができる。
【００３４】
[0044]  特定の生物に関するアトラスは、生物の関連するすべての領域をとらえるべきである。前記アトラスの限定しない例は、約5日齢（120時間）であるゼブラフィッシュについて、図1に示される。アトラス10は、12の生体構造領域を含む。この例において、示される領域は、目12、中脳14、耳16、顎18、肝臓20、腸22、後脳24、嚢（bladder）26、脊索28、筋肉30、ヒレ32、および心臓34である。この例において、下位区分表面36は、複数の解像度において、個々のサカナの形状および領域をモデル化するために取り込まれる。この方法を使用して、3次元（3D）におけるアトラスを構築することができる。アトラス生成および自動アトラス登録の両方は、データの次元に依存しない。例えば、アトラスは、サカナの画像が三次元（3D）であってよく、それにより矢状方向または軸方向に対して直交して撮られたZ-stack画像の組み合わせとして、あるいは立体的な2つの画像または2つの異なる軸における2つの画像として取得される。アトラスは、時間成分（2D+時間、または3D+時間）を取り込むこともでき、その場合、画像が時間をかけて繰り返し撮影される場合（例えば、心拍数の測定のため）。
【００３５】
[0045]  図2は、下位区分表面の2つのレベルを示すアトラスの例である。一番目のレベルは、各領域を大きい下位領域38に区分し、そして、二番目のレベルは、各領域をより小さい下位領域40に区分する。下位区分のサイズ、形状、および目的における多様性は、既定の適用において適応することができる。これらの例となるアトラスは、ゼブラフィッシュの主な解剖学的特性のすべてを含むが、これらの例は、限定するものではない。アトラスは、特定の生物について必要であるように、使用者によって改良および適応されることができる。例えば、使用者は、着目する領域としてのアトラスの特定の下位領域に、注釈をつけることができる。
【００３６】
[0046]  アトラスはまた、表現型の研究などの様々な使用について、作成されることもできる。例えば、アトラスは、変異系統などの下位集団について、または、ノックアウト研究において使用される下位集団について、作成することができる。
【００３７】
[0047]  この方法およびシステムの1つまたはそれ以上の態様において、自動適合アルゴリズムを使用して登録するか、またはそうでなければ、アトラスを個々のサカナの例と一致させるかまたは比較する。いったん登録されると、システムは、様々な計測を実行し、そして試験される試料のサカナを分析するように設定することができる。計測および分析の型は、例えば、生物の型、アッセイ、またはテストに基づくシステムによって、自動的に生成されることができる。使用者もまた、必要に応じて、選択をするか、または、システムに、カスタマイズされた指示を入力することができる。
【００３８】
[0048]  図5に示される通り、試験される生物の領域および下位領域は、自動的または選択的に、システムまたは使用者によって、拡大され、強調されるか、またはそうでなければ、分析されることができる。例えば、アッセイまたは毒性試験が、肝臓への効果を対象とする場合、このシステムは、自動的に肝臓領域を同定し、そして次に自動的に拡大するか、またはそうでなければ、デジタル的または光学的に肝臓領域を強調し、および／または分析することができる。続いて、下位領域が、肝臓領域内の着目する下位領域として同定される場合、次に、システムはさらに、着目する下位領域を、拡大、強調、および／または分析することができる。特定のアッセイまたは試験の対象である、生物のマップは、システムまたは使用者によって、自動的にまたは手動で、例えば、異常を示す下位領域にマークをつける、注釈が加えられることができる。
【００３９】
[0049]  別の例として、特定のアッセイが、ゼブラフィッシュ脊索の領域において、蛍光マーカーの取り込みを計測する必要がある場合、使用者は、アトラスにおいて、着目する領域として、その領域をマークすることができる。システムは、次に、着目する領域を計測しおよび／または分析することができ、そして領域または下位領域の1つまたはそれ以上の特性または特徴の報告または分析を生成することができる。
【００４０】
[0050]  1つまたはそれ以上の態様における特徴は、アトラスを使用する場合、アトラスの構造によって定義されるなどの解剖学的に関連する計測を自動的に実行する、システムの能力である。いったんアトラスが特定のサカナ試料に登録されると、いずれかまたは全ての計測を、自動的に算定することができる。可能性のある面積および長さ計測値の組み合わせの例が、5日齢のゼブラフィッシュについて、図3に示される。この例において、長さの計測値は、少なくとも部分的には、適合マップ上の点線に基づく。面積の計測値は、少なくとも部分的には、適合マップ上の実線に基づく。例示のみのために、図3に示す通り、ゼブラフィッシュについての面積および長さの計測値は、以下を含むことができる：
長さ計測
AB  体長
BC  脊索の長さ
BD  尾の長さ
EF  目のサイズ
面積計測
目
浮袋
心腔
胃腸管
肝臓。
【００４１】
[0051]  アトラスに基づく計測過程の例の、一般的な流れ図が、図4に示される。この例における過程は、好ましくは透過光画像撮影法によって取得される、ゼブラフィッシュのデジタル画像によって始まる。前処理段階において、サカナに属する表面領域を抽出しそして頭、目、および尾などの重要な特徴を検出し、そしてマッピングする。重要な特徴は、例えば、ゼブラフィッシュの目を検出するには、最適な半径において二分探索を用いる、多重解像度ハフサークル（Hough circle）適合アルゴリズムを含む、アルゴリズムを使用して、検出することができる。ゼブラフィッシュの体全体の分割は、限定するものではないが、領域分散に基づく画像の四分木分解、および類似するブロックの統合（merging）を含むアルゴリズムを使用して、達成することができる。
【００４２】
[0052]  前処理工程の後、そして計測が抽出される前において、その例が図1に示されるアトラスは、次に登録され、またはそうでなければ、試料生物のマップされた特徴と比較され、そして、分割境界が精緻化される。いったん登録されると、システムは次に、自動的にあらかじめ決められるか、同時に起こるように選択されるか、あるいは手動で入力されるガイドラインまたは指示に従って、試料の1つまたはそれ以上の領域、下位領域、解剖学的構造、特性、または特徴を、計測および／または分析する。
【００４３】
[0053]  自動アトラス登録を使用して、ゼブラフィッシュなどの生物の形状および重要な生体領域をそのデジタルアトラスと適合し、それにより特定の解剖学的計測値を、自動的に推定または決定することができる。前処理段階は、生物の着目する1つまたはそれ以上の領域を同定する。広範囲の登録を適用して、画像における生物の全体的な方向および位置を推測する。1つの試料生物を含む、結果として着目する領域が与えられる場合、生物の輪郭は、画像分割を使用して同定される。態様の1つにおいて、画像分割のための四分木法を適用して、試料の輪郭を同定する。
【００４４】
[0054]  動的形状モデル（ASM）アルゴリズムを使用して、試料にアトラスを登録することができる。ASMは、形状モデルおよび外観モデルを含む。形状は、あらかじめ指定される目印の組み合わせを使用して表される。ASMは、観察されたデータからの主成分分析（PCA）モデルを調節することにより、形状の多様性を捕らえる。それぞれの目印において、局所テクスチャモデルは、形状曲線の正常な方向に沿って観察される輪郭テクスチャを使用して、ガウスモデルを調節することにより得られる。生物の形状は、標準から大幅に変化する可能性があるため、位置特定方法を使用して、生物を登録し、それにより、ASMアルゴリズムをその大域的最適に非常に近い解において初期化することができる。
【００４５】
[0055]  図4に示される通り、サカナの輪郭に沿ったASM目印は、目印部分の長さ、曲率および画像テクスチャ観察の尤度を最適化することによって同定される。輪郭の点は、状態とみなすことができ、そして、輪郭に沿った連続する目印の割り当ては、最適化される軌跡とみなすことができる。ASM目印の広域最適化割り当ては、動的プログラミングアルゴリズムを使用して得ることができる。外側のASM目印の割り当ての後、内側のASM目印が、最尤推定によって初期化される。この例において、サカナの輪郭形状の統計は、サカナの内側の形状構造の統計と相関しているため、サカナの内側形状の最尤初期化は、グランドトルースに近い。次に、ASM適合アルゴリズムを使用して、サカナの内側のテクスチャ観察の尤度を最大にして、検出されたサカナの輪郭上にASM輪郭目印を固定する。さらに、ASM適合の精緻化がActive Contoursにより達成、それにより形状および配置をより高い正確性において適合することができる。最後に、ASM登録結果はアトラス構造に変換され、そして自動サカナ計測を実行することができる。
【００４６】
[0056]  試料生物の計測値を、あらかじめ決められた計測の範囲と比較して、例えば、特定の計測値が、計測値の正常範囲の外側に収まるかを決定することができる。ハイスループットスクリーニング計測もまた、例えば、特定の実行においてスクリーニングされるすべての生物に対して、比較することもできる。限定するものではないが、平均値および分散などのパラメータを使用して、正常、野生型、異常、および処理および未処理生物、ならびに、毒性および毒性レベルの間を識別するために使用されることができる。計測は、幾何学的な計測に限定されず、そして限定するものではないが、画像強度および色における変動を含むことができる。
【実施例】
【００４７】
計測値のデータセットは、正常ゼブラフィッシュ11匹、野生型ゼブラフィッシュ8匹、および処理されたゼブラフィッシュ1匹より生成された。次に、アトラスを一連のサカナに適合し、さらに、それぞれのゼブラフィッシュ内の様々な組織の面積の計測を行った。図6は、面積計測のマトリックスプロットである。
【００４８】
[0057]  この方法およびシステムは、生物の発生段階を同定するように、そして特定の臓器およびその臓器内の下位領域を同定するように、設定されることができる。いったん同定されると、臓器および下位領域についての情報をさらに使用して、アッセイおよび／または1つまたはそれ以上の蛍光に基づくチャネルの画像による情報と相関を調べることができる。生物のアトラスを、1つまたはそれ以上の態様において使用して、例えば、セ゛フ゛ラフィッシュ内の異なる臓器を自動的に位置づけ、そして次に、その情報を、あらかじめ決められた一連のルールおよびガイドラインと関連づける。
【００４９】
[0058]  図8は、この方法およびシステムの限定しない使用を説明する。例えば、この方法およびシステムを使用して、解剖学的に関連する計測値を測定し、生物内の臓器を同定し、そして特定の下位集団についてのアトラスを調節することができる。計測値には、限定するものではないが、長さ、面積、曲率、色、グレースケール、強度、テクスチャ、形状、蛍光、およびそれらの組み合わせにおける変動が含まれていてもよい。
【００５０】
[0059]  この方法およびシステムを使用して、3D分析について複数のさまざまな平面（例えば、直交する）において撮られた生物の画像を分析することもできる。例えば、この方法およびシステムを適用して、マイクロウェルアッセイおよびマイクロ流体素子に適する分化した発生段階（例えば、限定するものではないが、受精卵および幼生）を有する生物（例えば、Danio rerio、Drosophila melanogaster、Xenopus laevis）、および、フグ（puffer）、メダカ、Giant rerio、Paedocyprisなどのサカナなどを、画像化および分析することができる。
【００５１】
[0060]  この方法およびシステムの1つまたはそれ以上の態様は、試料生物の1つまたはそれ以上の画像を自動的に取得するための工程およびハードウェアを含むことができる。これらの自動画像取得工程、および生物の画像化に必要であるハードウェアは、GE Healthcareより入手可能であるIN Cellシステムなどの、自動ハイスループットスクリーニングシステムに組み込むことができる。
【００５２】
[0061]  最初の工程において、低解像度の試料生物の画像を撮り、生物の位置を特定し、そして生物内の1つまたはそれ以上の着目する臓器の特定の位置を検出する。次に、この情報を適用して、自動的にシステムの対象を変化させ、そして可動性ステージの位置を合わせて、着目する臓器の高解像度画像を撮る。アトラスを、1つまたはそれ以上の態様においても使用して、画像を補正するか、またはそうでなければ、例えば画像連結（image stitching）により自動的に画像を増感する。
【００５３】
[0062]  このシステムは、より低い解像度においてアトラスを自動的に使用して着目する領域を決定し、そしてより高い解像度において生物の体の領域に焦点を合わせそして画像化するように設定される、画像化デバイスを含むことができる。この方法において、画像化スループットを、有意に増加することができる。応用の例として、ゼブラフィッシュなどの生物が、96穴プレートのウェル内に、1ウェル当たり1匹の受精後5日のサカナである場合、そしてそれが心臓領域（約200マイクロメートル（um）のサイズ）の画像化に着目される場合、適切な解像度は、10×対物レンズ（objective）倍率を用いる画像化であることができる。この拡大の下で、自動高含量画像化システム、例えば、GE Healthcare由来のIN Cell 1000の、典型的な視野領域は、約0.6 mm2である。96穴プレートの円形ウェルは、直径約6.5 mm、または、面積33 mm2を有する。このことは、心臓領域が画像化されるまでに、10×対物レンズによって、各ウェルにおいて、少なくとも50の画像が得られなければならないことを意味する。
【００５４】
[0063]  操作デバイスを使用して、例えば、以下の工程を使用するシステムのスピードを増加させることができる：（1）1×倍率の下、ウェル全体の単一の画像の取得；（2）心臓領域の位置を正確な値付近に位置づける、アトラス分析のオンライン使用；（3）光軸上で、心臓領域を横方向に動かしそして中心に置く、電動XY-ステージ動作への自動コマンド；（4）10×対物レンズに交換させる、電動対物レンズ交換装置への自動コマンド；（5）対物レンズを軸方向に動かし、ウェルの底から上へ適切なレベル（例えば、よりよく焦点を合わせるために、300 um）にする、電動Z-ステージへの自動コマンド；および／または（6）心臓領域の透過光および／または蛍光画像の取得。いくつかの態様において、すべての操作を、部分的には、複数の画像が取得されるかに応じて、同時にまたはほとんど同時に行うことができる。本実施例の態様は、限定するものではないが、（a）高解像度画像スループットを、有意に増加させることができる（本実施例において少なくとも25倍）；（b）多数の高解像度画像の後処理を必要としない（例えば、分析、連結、平面化補正）；および（c）そのほとんどの領域が空である多数の不要画像の取得によって、システムメモリが妨害される必要がない；などの、利点を提供する。
【００５５】
[0064]  自動システム50（図7）は、一般に以下を含む：少なくとも一時的に生物のアトラスを保存し、そして試料生物の画像を保存するための、記憶保存デバイス52；および、方法の1つまたはそれ以上の段階を実行するための、プロセッサなどの操作デバイス54。記憶保存デバイスは、ROM（読み取り専用メモリ）、RAM（ランダムアクセスメモリ）、またはCPU（中央処理装置）のDRAM（ダイナミックランダムアクセスメモリ）、あるいは、DVDまたはCDなどのあらゆる適切なディスクドライブ記憶装置、あるいは、zipドライブ、あるいはメモリカードまたはメモリスティックなどの、プロセッサに付随するあらゆる適切なハードドライブメモリを含むことができる。記憶保存デバイスは、プロセッサまたは画像を表示するためのディスプレイデバイスから、離れて配置されることができ、そしてさらに配線で接続されているか無線かにかかわらず、限定するものではないが、ローカルエリアネットワーク、ケーブルネットワーク、衛星ネットワーク、およびインターネットを含む、あらゆる適切な接続デバイスまたは通信ネットワークを介してアクセスされることができる。プロセッサまたはCPUは、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、およびデジタルシグナルプロセッサ（DSP）を含むことができる。
【００５６】
[0065]  保存デバイス52および操作デバイス54は、1つのシステム内で画像化および分析をする、自動高速システムなどの分析デバイスの構成要素として、組み込むことができる。前記システムの例には、限定するものではないが、General Electric IN Cell Analyzerシステム（ニュージャージー州、Piscataway、General Electric Healthcare Bio-Sciences Group）が含まれる。記述される通り、システム50はさらに、試料生物の１つまたはそれ以上の画像、アトラス、試料生物の画像に適合されるアトラス、計測結果、および／またはシステム使用者が見るために有用である、その他のあらゆる型の画像、レポート、またはデータを表示するためのディスプレイデバイス56；相互ビューアー58；仮想顕微鏡60；および／または１つまたはそれ以上の画像、またはあらゆる関連データ、または分析情報を、通信ネットワーク64を介して、１つまたはそれ以上の遠隔地66に送信するデバイス62、を含むことができる。
【００５７】
[0066]  ディスプレイデバイス56は、限定するものではないが、LCDまたはCRTを内臓するデバイスなどの、デジタル画像を表示することができるあらゆる適切なデバイスを含むことができる。送信デバイス62は、限定するものではないが、配線で接続された、または無線の、デジタル通信システムを含む、通信ネットワークを介してデジタル情報を送信するための、あらゆる適切な手段を含むことができる。IN Cell Analyzerと同様に、このシステムはさらに、アッセイ、またはその他の適用される染色、マーカー、プローブまたはその他の同様の研究ツールを処理するための自動装置68；および、限定するものではないが、励振源72を含み、そして着目する試料生物のデジタル画像を取得することができる、蛍光画像化顕微鏡などの、デジタル画像化デバイス70を、含むことができる。前記画像化デバイスは、可動式ステージを有することができ、そして自動で焦点を合わせることができ、そして続いて、必要に応じて焦点特性を維持および追跡することができる。
【００５８】
[0067]   発明の特定の特性のみが、本明細書中で説明および記述されているが、多くの修正および変換が、当業者によって生じるであろう。そのため、添付の請求の範囲は、発明の真の精神の範囲内におさまる限り、前記修正および変換のすべてを含めることを意図することが、理解されるべきである。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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