(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１に記載の細菌。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
さらに、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】
前記細菌がパントエア属に属する細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項４に記載の細菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
【請求項７】
前記Ｌ−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
下記タンパク質をコードするＤＮＡ（但し、ゲノムＤＮＡを除く）。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜３０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項８に記載のＤＮＡ（但し、ゲノムＤＮＡを除く）。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、前記ストリンジェントな条件が、６８℃、０．１×SSC、０．１％SDSで洗浄する条件である、ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−システイン又はその関連物質の製造法に関し、詳しくはＬ−システイン又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いたＬ−システイン又はその関連物質の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。
【０００３】
Ｌ−システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。
【０００４】
また、Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献５）、Ｏ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特許文献６）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。
【０００５】
さらに、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている（非特許文献１）。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ−座、ｅｍｒ−座、ａｃｒ−座、ｃｍｒ−座、ｍｅｘ−遺伝子、ｂｍｒ−遺伝子、ｑａｃＡ−遺伝子（特許文献７）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒもしくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献８）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。
【０００６】
また、Ｌ−システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ （特許文献９）が知られている。
【０００７】
ｄ０１９１遺伝子は、本発明者により見出されたパントエア・アナナティスの新規遺伝子である。ホモロジーサーチにより種々の細菌から同遺伝子のホモログ遺伝子と推定される遺伝子が見出されるが、いずれも機能未知であり、Ｌ−システイン生産との関連は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２３３３８４
【特許文献２】特開平１１−１５５５７１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号
【特許文献４】米国特許第６２１８１６８号
【特許文献５】特開２００３−１６９６６８
【特許文献６】特開２００５−２４５３１１
【特許文献７】米国特許第５９７２６６３号
【特許文献８】特開２００５−２８７３３３
【特許文献９】国際公開パンフレット第０１／２７３０７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、パントエア・アナナティスからシステインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子を見出し、同タンパク質の活性が低下するように細菌を改変することによってＬ−システイン生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、下記タンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
（２）前記タンパク質をコードする遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下した、前記細菌。
（３）前記遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）さらに、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する前記細菌。
（５）パントエア属に属する細菌である、前記細菌。
（６）パントエア・アナナティスである、前記細菌。
（７）前記細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
（８）前記Ｌ−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、前記方法。
（９）下記タンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記ＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。
また、本発明により、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構造を示す図。
【図２】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築を示す図。
【図３】d0191遺伝子欠損のスキームを示す図。
【図４】プラスミド pMIV-5JSの構築を示す図。
【図５】pM12の構築を示す図。
【図６】プラスミドpM12-ter(thr)の構築を示す図。図中の配列は、配列番号２４及び配列番号２５に示した。
【図７】IntJSカセットの構築を示す図。
【図８】P. ananatisのd0191欠損株及びd0191強化株のＬ−システイン存在下での生育を示す図。
【図９】E. coliのd0191強化株及び非強化株のＬ−システイン存在下での生育を示す図。
【図１０】d0191産物のシステインデスルフヒドラーゼ活性染色の結果を示す図（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、d0191遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。d0191遺伝子については後述する。
【００１５】
Ｌ−システイン生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−システインを生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。また、Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、０．３ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．４ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができる微生物を意味する。
微生物が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換することがある。また、後述するように、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski
T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010参照）。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。したがって、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システインに加えて、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、例えばＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、もしくはヘミチオケタール、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力も含まれる。
【００１６】
Ｌ−システイン生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。尚、本発明においてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくは前記のような誘導体、またはこれらの混合物を指す。
【００１７】
本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属、エンテロバクター属、又はクレブシエラ属を用いることが望ましい。
【００１８】
エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１９】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２０】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
【００２１】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。
【００２２】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００２３】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。
パントエア・アナナティスとして具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17株、及びSC17(0)株が挙げられる。SC17株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株AJ13355（FERM BP-6614）から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17(0)株は、パントエア・アナナティスにおいて遺伝子破壊を行うために、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株として構築された株である（参考例１参照）。
【００２４】
パントエア・アナナティスAJ13355株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。SC17株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。また、SC17(0)株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【００２５】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。
【００２６】
以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法について述べる。
【００２７】
細菌にＬ−システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−システイン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−システイン生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２８】
Ｌ−システイン生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２９】
具体的には、Ｌ−システイン生産菌としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）をコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli
JM15(米国特許第6,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の細菌は、d0191遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された細菌である。後述するように、前記タンパク質は、システインデスルフヒドラーゼ活性を有する。E. coliでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有する公知のタンパク質として、シスタチオニン−β−リアーゼ（metC産物、特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、トリプトファナーゼ（tnaA産物、特開2003-169668、（Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218））、Ｏ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（cysM遺伝子産物、特開2005-245311）、及び、malY遺伝子産物（特開2005-245311）が知られている。d0191遺伝子がコードするタンパク質の活性に加えて、これらのタンパク質の活性を低下させてもよい。
【００３１】
本発明においては、Ｌ−システイン生産菌は、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持していることが好ましい。エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型SATとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型SAT（特開平11-155571）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型SAT（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型SAT（WO97/15673号国際公開パンフレット、米国特許第6218168号）、野生型SATの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列が１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型SAT（米国特許公開第20050112731(A1)）等が知られている。実施例に記載した変異型SATをコードするcysE5は、野生型SATの９５位及び９６位のVal残基及びAsp残基が、各々Arg残基及びPro残基に置換されている。
【００３２】
SAT遺伝子は、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、SAT活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。
細菌に変異型SATをコードする遺伝子を導入すれば、Ｌ−システイン生産能が付与される。細菌への変異型SAT遺伝子の導入は、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００３３】
SAT遺伝子を含む組換えベクターを細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方法（Methods
in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）、エレクトロポーレーションによる方法等、細菌の形質転換に通常用いられている方法を用いることができる。
【００３４】
また、SAT遺伝子のコピー数を高めることによっても、SAT活性を上昇させるこができる。SAT遺伝子のコピー数を高めることは、上記のようなベクターを用いてSAT遺伝子を細菌に導入することによって、又は、SAT遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによって達成できる。細菌の染色体DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、SAT遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００３５】
本発明の細菌は、上述したようなＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、d0191遺伝子を持つ細菌を、d0191遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、「D0191」と記載することがある）の活性が低下するように改変することによって得ることができる。ただし、D0191タンパク質の活性が低下するように改変を行った後に、Ｌ−システイン生産能を付与してもよい。
【００３６】
本発明者は、パントエア・アナナティスの染色体ＤＮＡから、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子を見出し、d0191遺伝子と命名した。同遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。
【００３７】
パントエア・アナナティスのd0191遺伝子の配列についてデータベース検索を行ったところ、下記の細菌からd0191遺伝子のホモログ遺伝子と考えられる機能未知の遺伝子が見出された。これらの遺伝子の塩基配列及びそれらの塩基配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号３４〜５２に示す。カッコ内はNCBI （National Center for Biotechnology Information）データベースのアクセション番号を示す（GenBank Identifier(gi) | RefSeq accession (ref)）。
【００３８】
シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）ATCC BAA-895（accession:gi|157146936|ref|YP_001454255.1|）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）subsp. pneumoniae MGH 78578（accession: gi|152968982|ref|YP_001334091.1|）
エンテロバクター（Enterobacter）sp. 638（accession: gi|146310575|ref|YP_001175649.1|）
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）LT2（accession: gi|16763839|ref|NP_459454.1|）
セラチア・プロテオアマキュランス（Serratia proteamaculans）568（accession: gi|157369348|ref|YP_001477337.1|）
エルビニア・カロトボラ（Erwinia carotovora）subsp. atroseptica SCRI1043（accession: gi|50120095|ref|YP_049262.1|）
ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）O1 biovar eltor str. N16961（accession: gi|15641074|ref|NP_230706.1|）
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）PfO-1（accession: gi|77457462|ref|YP_346967.1|）
ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）A3(2)（accession: g
i|21219544|ref|NP_625323.1|）
マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）104（accession: gi| 118467280|ref| YP_879726.1|）
【００３９】
本発明においては、パントエア・アナナティスのd0191遺伝子、及び他の細菌が持つ同遺伝子のホモログ遺伝子を、d0191遺伝子と呼ぶことがある。
【００４０】
「d0191遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下する」とは、d0191遺伝子によりコードされるD0191タンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることを意味し、活性が完全に消失していることを含む。
【００４１】
d0191遺伝子によりコードされるタンパク質、すなわちD0191タンパク質は、実施例に記載するように、活性染色によりシステインデスルフヒドラーゼ活性を有することが示された。したがって、D0191タンパク質の活性とは、具体的にはシステインデスルフヒドラーゼ活性を意味する。システインデスルフヒドラーゼ活性は、例えば特開２００２−２３３３８４公報に記載された方法で測定することができる。
【００４２】
D0191タンパク質の活性を低下させるような改変は、例えば、d0191遺伝子の発現を低下させることによって達成される。具体的には例えば、染色体上のd0191遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることによって、前記タンパク質の細胞内の活性を低下させることができる。また、D0191タンパク質の活性の低下は、同d0191遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによっても、発現を低下させることができる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上のd0191遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of
Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。アンチセンスRNAを発現させることでも達成できる。
【００４３】
パントエア・アナナティスSC17株のd0191遺伝子の上流には、同遺伝子の発現に関与する転写因子をコードする遺伝子が存在する。この遺伝子はc0263と命名され、そのORFはd0191遺伝子のORF上流約80bpから始まり、d0191と逆向きに伸びている。c0263遺伝子は、ドメイン検索などから、HTHモチーフを持つ転写因子をコードしていると考えられ、E.coliではybaO遺伝子がこのホモログである。実施例に記載されている通り、d0191の転写活性化にはc0263が関与してことが明らかとなった。したがって、D0191タンパク質の活性は、c0263遺伝子の不活化によっても低下させることができる。また、d0191遺伝子と併せてc0263遺伝子を欠損させてもよい。同じようにE.coliにおいてc0263のホモログであるybaO遺伝子を欠損させてもよい。パントエア・アナナティスのc0263遺伝子の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６６及び６７に示す。E.coliのybaO遺伝子の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８０及び８１に示す。このように活性調節に関与する因子（レギュレーター、sRNAなど）を操作することでも目的のタンパク質の活性を低下させることができる。
【００４４】
また、D0191タンパク質の活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
【００４５】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、D0191タンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００４６】
d0191遺伝子のコード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるD0191タンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−システイン生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００４７】
染色体上のd0191遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するD0191タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされるD0191タンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、または特開平05-007491号）。
【００４８】
d0191遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。
【００４９】
D0191タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。
【００５０】
さらに、D0191タンパク質の量が低下したことの確認は、細胞のシステインデスルフヒドラーゼ活性を測定することによっても行うことができる。
【００５１】
細菌が属する種又は菌株によって、d0191遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、改変するd0191遺伝子は、配列番号１の塩基配列のバリアントであってもよい。また、改変するd0191遺伝子は、前記d0191遺伝子ホモログ、例えば配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、又は５１に示す塩基配列を有する遺伝子のバリアントであってもよい。
【００５２】
d0191遺伝子のバリアントは、配列番号１、又は配列番号３３、３５、３７、３９、４
１、４３、４５、４７、４９、もしくは５１の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、d0191遺伝子のバリアントは、例えば腸内細菌科に属する細菌等の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１、又は配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、もしくは５１の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
【００５３】
また、d0191遺伝子は、D0191タンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号２、又は配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、もしくは５２において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００５４】
尚、本発明が提供する新規遺伝子としてのd0191遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００５５】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型D0191タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００５６】
また、d0191遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば前記遺伝子配列又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、D0191タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有
するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%
SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００５７】
プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００５８】
上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ等の酵素やそれらをコードする遺伝子にも同様に適用される。
【００５９】
＜２＞本発明のＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、もしくはそられの誘導体、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。Ｌ−システインの誘導体としては、前記したようなＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当するヘミチオケタール等が挙げられる。
【００６０】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
【００６１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００６２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００６３】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
【００６４】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００６５】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６６】
上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が含まれる。
【００６７】
また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。
また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。以下の実施例において、システインはＬ−システインである。
【００６９】
〔参考例１〕λ Red遺伝子産物に耐性なパントエア・アナナティス菌株の構築
パントエア・アナナティスにおいて遺伝子破壊を行うために、「Red-driven integration」あるいは「Red-mediated integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.  97. 6640-6645 (2000)）を高効率で行うための受容菌を構築した。
【００７０】
まず、λのgam、bet及びexoの各遺伝子（以下、「λ Red遺伝子」）を発現する新規なヘルパープラスミドRSF-Red-TERを構築した（図１）。詳細は、参考例２に記載する。
【００７１】
このプラスミドは、異なる遺伝子背景を持つ広い範囲の宿主に使用できる。その理由は、１）これは、多くのグラム陰性菌及びグラム陽性菌、並びに植物においてさえも安定に維持され得るRSF1010広宿主域プラスミドのレプリコンを有しており（Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987）、２）λ Red遺伝子、gam、bet及びexo遺伝子は、多くの細菌のRNAポリメラーゼによって認識される、PlacUV5プロモーターの調節化にあり（例えば、Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio,
M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)）、３）自己調節因子PlacUV5-lacI、及びエシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ非依存性転写ターミネーター（TrrnB）は、λ Red遺伝子の基底発現レベルを低くする（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）からである。さらに、RSF-Red-TERプラスミドは、レバンスクラーゼ（levansucrase）遺伝子（sacB）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを回収することができる。
【００７２】
エシェリヒア・コリでは、RSF-Red-TERプラスミドにより提供される短いフランキング領域と共に、PCRで生成したDNA断片がインテグレートする頻度は、pKD46ヘルパープラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を用いた場合と同程度に高い。しかし、λ Red遺伝子の発現は、パントエア・アナナティスにとって毒性を示す。RSF-Red-TERヘルパープラスミドで形質転換された細胞は、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド、1mM)及び適当な抗生物質（クロラムフェニコール25μg/ml又はカナマイシン40μg/ml）を含むLB培地で非常に低い生育速度を示し、λ Red介在組換え（λ Red-mediated recombination）の効率は、観察されたとしても極端に低い（10-8）。
【００７３】
λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべての発現に耐性なパントエア・アナナティスの変異株を選択した。そのために、パントエア・アナナティスSC17株（米国特許第6,596,517号）を、RSF-Red-TERプラスミドでエレクトロポレーションにより導入した。１８時間培養後、約106個の形質転換株が得られ、１０クローンまではコロニーが大きいサイズであり、残りはすべて非常に小さかった。１８時間培養後、大きいコロニーは約2mmであり、小さいコロニーは約0.2mmであった。培養を24時間まで延長しても、小さいコロニーはそれ以上生育しなかったが、大きいコロニーは生育を続けた。λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべて（gam、bet及びexo）の発現に耐性な、大きいコロニーのパントエア・アナナティス変異株の一つを、更なる解析に用いた。
【００７４】
RSF-Red-TERプラスミドDNAを、大きいコロニーのクローン１つ、及びいくつかの小さいコロニーのクローンから単離し、エシェリヒア・コリMG1655を再形質転換して、Red遺伝子の活性な産物を合成するプラスミドの能力を調べた。得られた形質転換体におけるRed依存的インテグレーションのコントロール実験により、大きいコロニーのクローンから単離されたプラスミドのみが、Red依存的インテグレーションに必要なλ Red遺伝子の発現をもたらすことが示された。選択された大きいコロニーのクローンにおいて、Red媒介インテグレーションが起るかを調べるために、KmRマーカー及びhisD遺伝子に相同な40bpのフランキング領域を含み、パントエア・アナナティスのhisD遺伝子のSmaI認識部位にインテグレートするようにデザインされた、PCRで生成した直鎖状のDNA断片を用いて、エレクトロポレーションを行った。２個の小さいコロニーのクローンをコントロールとして用いた。パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。PCRには、配列番号４及び５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、pMW118-(λatt-Kmr-λatt）プラスミドを鋳型として使用した。λ Red遺伝子に耐性ではない２個の小さなコロニーのクローンをコントロールとして使用した。pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築は、参考例３で詳述する。
【００７５】
RSF-Red-TERプラスミドは、同プラスミド上にあるlacI遺伝子によって、Red遺伝子の発現を誘導することができる。２つの誘導条件について調べた。第１のグループでは、IPTG(1mM)をエレクトロポレーションの１時間前に添加し、第２のグループでは、IPTGはエレクトロポレーション可能な細胞の調製のための培養開始時に添加した。大きいコロニーのクローンからのRSF-Red-TERを保持する細胞の後代の生育速度は、SC17プラスミドを持たない菌株よりも有意に低くはなかった。IPTGの添加により、これらの培養物の生育速度はわずかに低下しただけであった。一方、小さいコロニーのクローンの後代は、IPTG非添加で非常にゆっくり生育し、誘導すると生育は事実上停止した。大きいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクトロポレーションした後、たくさんのKmRクローン（短い誘導時間で１８クローン、誘導時間を延長すると約１００クローン）が生育した。調べた100クローンの全ては、His-表現型を有し、20クローンについてPCRで確認したところ、これらの細胞の染色体の構造が期待どおりであることが確認された。一方、小さいコロニーのクローンの後代の細胞をエレクトロポレーションしても、インテグレーションされた株は得られなかった。
【００７６】
得られた大きいコロニーのクローンを、7%スクロースを含むプレートで生育させてプラスミドを脱落させ、RSF-Red-TERで再形質転換した。プラスミドを持たない株をSC17(0)と命名した。同株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【００７７】
上記再形質転換の後に生育した全てのクローンは、親株クローンSC17(0)と同様に大きなコロニーサイズを有していた。RSF-Red-TERプラスミドで再形質転換したSC17(0)株におけるRed媒介インテグレーションの実験を行った。得られた３つの独立した形質転換株について、前の実験に用いたのと同じDNA断片を用いて調べた。短い誘導時間（エレクトロポレーション１時間前）を採用した。各々の実験で、１０個を超えるKmRクローンが生育した。試験した全てのクローンは、His-表現型を有していた。こうして、λ Red遺伝子の発現に耐性なSC17(0)と名付けた変異株が選択された。この菌株は、パントエア・アナナティス染色体へのRed依存的インテグレーションのための好適な受容菌として使用できる。
【００７８】
〔参考例２〕ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図２に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号６、７、８、９のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova, A.Yu et
al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代りにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。
【００７９】
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たRSF-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMWPlaclacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstI、及びSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号１０及び１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号１２及び１３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。
【００８０】
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号１４及び１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号１１及び１５のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSFsacBPlacMCSベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。
【００８１】
〔参考例３〕pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築
pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175)プラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の４つの断片を連結することによって得た。
【００８２】
１）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattLに相当する領域
から、プライマーP1（配列番号５３）及びP2（配列番号５４）を用いたPCR増幅により得たattL（配列番号５５）を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。
【００８３】
２）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattRに相当する領域から、プライマーP3（配列番号５６）及びP4（配列番号５７）を用いたPCR増幅により得たattR（配列番号５８）を持つPstI-HindIII断片(182bp)。これらのプライマーは、PstI及びHindIIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
【００８４】
３）pMW118-ter_rrnBのBglII-HindIII大断片(3916 bp)。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、次の３つのDNA断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性（ApR）の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6（配列番号５９及び６０）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8（配列番号６１及び６２）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。
【００８５】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及びter_thrL転写ターミネーターを持つpML-Tc-ter_thrLのEcoRI-PstI小断片(1388bp)（配列番号６３）。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは、次の２工程で得た。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al. 2001. Biotekhnologiya (in Russian) no.5,
3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10（配列番号６４及び６５）を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理した。
【００８６】
〔実施例１〕
（１）P. ananatis SC17株からのd0191遺伝子のクローニング
P. ananatis SC17株（米国特許第6,596,517号）のゲノミックDNAをテンプレートとして、プライマーd0191(Pa)-FW（CGCGGATCCAAGCTTTTCATTATCCAGCAGAGCG：配列番号１６）、d0191(Pa)-RV（CGCGGATCCTAATGCTGTAGGGCCTGAACCAG：配列番号１７）を用いたPCRによって、d0191遺伝子の上流約300bpから下流約200bpまでを含むd0191遺伝子断片を取得した。これらのプライマーの5’末端には制限酵素BamHIのサイトがデザインされている。PCRにはPyrobestポリメラーゼ（Takara社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応組成で、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分30秒からなるサイクルを30サイクル繰り返すことによって目的の約1.6KBの断片を増幅した。得られた断片をBamHIで処理し、pSTV29（Takara社）のBamHIサイトに挿入し（ベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入）、d0191がクローニングされたプラスミドpSTV-d0191F（クロラムフェニコール耐性マーカー）を取得した。また、同じPCR断片をpACYC177（NipponGene社）のBamHIサイトに挿入し（ベ
クター上のカナマイシン耐性遺伝子と同じ向きに挿入）、pACYC-d0191F（カナマイシン耐性マーカー）を作製した。シークエンシングによりPCRによるエラーがないことを確認した。こうして、同じd0191領域がクローニングされた、2種類の別の抗生物質耐性マーカーをもつプラスミド（いずれも同じp15A originを持つ）が準備された。また、ハイコピーベクターpHSG299（Takara社）のBamHIサイトに同じ約1.6KB DNA断片が挿入されたpHSG-d0191Fを作製した（カナマイシン耐性マーカー、ベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入）。
【００８７】
（２）P. ananatis SC17株からのd0191強化株の構築（SC17/ pSTV-d0191F、SC17/ pHSG-d0191F）
上記のように構築されたプラスミドpSTV-d0191FでP. ananatis SC17を形質転換し、d0191強化株SC17/pSTV-d0191F株を作製した。対照株として空のベクターを導入したSC17/pSTV29株も同時に作製した。また、ハイコピーのpHSG-d0191FをP. ananatis SC17に形質転換したd0191強化株SC17/pHSG-d0191F株を作製した。対照株として空のベクターを導入したSC17/ pHSG299株も同時に作製した。P. ananatisの形質転換はエレクトロポーレーションによる定法に従い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質（クロラムフェニコールの場合25mg/L、カナマイシンの場合20mg/L）を含むLB寒天培地（5g/L yeast extract, 10g/L Tryptone, 10g/L sodium chloride, 15g/L agar）にて行った。
【００８８】
（３）E. coli MG1655株からのd0191強化株の構築（MG1655/pSTV-d0191F）
上記のように構築されたプラスミドpSTV-d0191FでE. coli MG1655を形質転換し、d0191強化株MG1655/pSTV-d0191F株を作製した。また対照株として空のベクターを導入したMG1655/pSTV29株も同時に作製した。E. coliの形質転換はエレクトロポーレーションによる定法に従い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質（クロラムフェニコールの場合25mg/L、カナマイシンの場合20mg/L）を含むLB寒天培地（5g/L yeast extract, 10g/L Tryptone, 10g/L sodium chloride, 15g/L agar）にて行った。
【００８９】
（４）P. ananatis SC17株からのd0191欠損株の構築（SC17 d0191::Kmr株、SC17 Dd0191株）
d0191遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側に、それぞれデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。
【００９０】
d0191遺伝子の両端の相同配列に抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子）が挟まったDNA断片をPCRによって取得した。プライマーとしてDd0191-FW （CCGTGTCTGAAGCCTATTTTGCCCGCCTGCTGGGCTTGCCTTTTATTGCCTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA：配列番号１８）、Dd0191-RV （CTAGCCCAGTTCGCGCTGCCAGGGCGTAATATCGCCAATGTGCTCGGCAACGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA）を使用し、鋳型にpME118-(λattL-Kmr-λattR)（WO2006/093322A2：配列番号１９）を使用した。
【００９１】
PCRにはLA-Taqポリメラーゼ（Takara社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応組成で、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 2分30秒からなるサイクルを30サイクル繰り返すことによって目的のDNA断片を増幅した。得られたDNA断片（d0191の相同配列でカナマイシン耐性マーカーを挟んだDNA断片；図３）をP. ananatis SC17(0)/ RSF-Red-TER株にエレクトロポーレーションで導入し、カナマイシン耐性株を取得した。得られた
カナマイシン耐性株は、前記DNA断片の両端に存在するd0191遺伝子領域の相同配列により、カナマイシン耐性カセットが染色体上のd0191遺伝子に挿入された、d0191遺伝子破壊株であることが確認された（SC17(0) d0191::Kmr株；図３）。
【００９２】
次に、このSC17(0) d0191::Kmr株より調製した染色体DNAをエレクトロポーレーションでSC17株に導入することで、最終的にSC17株由来のd0191遺伝子破壊株であるSC17 d0191::Kmr株を取得した。
【００９３】
（５）阻害解除型SATセリンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子搭載プラスミドの構築（pMIV-CysE5）
プラスミドpMIV-CysE5にはフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードする遺伝子cysE5（米国特許公開第20050112731(A1)）が搭載されており、これを導入することでシステインを著量生産するシステイン生産菌を作製できることが知られている（米国特許公開第20050112731A1、米国特許第5972663など）。以下にpMIV-CysE5の構築方法を示す。
【００９４】
変異型アレルЕ. coli cysE遺伝子であるcysE5（米国特許公開第20050112731(A1)）は、プライマーcysEplF（5'-agc-tga-gtc-gac-atg-tcg-tgt-gaa-gaa-ctg-gaa-3'：配列番号２０）とプライマーcysER（5'-agc-tga-tct-aga-ata-gat-gat-tac-atc-gca-tcc-3'：配列番号２１）、鋳型pMW-PompC-cysE5 (EP1650296A1)を用いPCRによって取得した（94℃-0.5分、57℃-0.5分、72 ℃-1分を27サイクル繰返し、その後72℃-7分反応させた）。プライマーcysEplFは、Е. coli cysE遺伝子の開始コドンATG及びその下流の配列に結合するようにデザインされ、5'末端には6merのSalIサイトを有している。プライマーcysERは、Е.
coli cysE遺伝子の終止コドン及びその上流の配列に結合するようにデザインされ、5'末端には6merのXbaI サイトを有している。PCRによって得られた約0.7kbのDNA断片をSalIとXbaIで切断した後、同じくSalIとXbaIで切断したプラスミドpMIV-PompCに挿入し、pMIV-CysE5を構築した。
【００９５】
前記プラスミドpMIV-PompCは、以下の方法で構築した。E. coli MG1655株ゲノムDNAを鋳型とし、プライマーPrOMPCF（5'-agc-tga-gtc-gac-aac-cct-ctg-tta-tat-gcc-ttt-a-3'：配列番号２２）とプライマーPrOMPCR（5'-agc-tga-gca-tgc-gag-tga-agg-ttt-tgt-ttt-gac-3'：配列番号２３）を用いたPCRによりompC遺伝子のプロモーター領域約0.3kb を含むDNA 断片を取得し、この断片をプラスミドpMIV-5JSのPaeIとSalIサイトに挿入しpMIV-PompCを構築した。プラスミドpMIV-5JSは、プラスミドpM12-ter(thr)（後述）のBamHIとHindIIIサイトに、intJSカセット（後述）の両端にあらかじめデザインされていたBglIIとHindIIIを繋ぐことによって構築した（図４）。
【００９６】
プラスミドpM12-ter(thr)は、合成オリゴヌクレオチド（aagcttaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg cttttttttt cgaccactgc ag：配列番号２４）とその相補鎖である合成オリゴヌクレオチド（ttcgaattgt gtcttttttc gggcgtggac tgtcacgccc gaaaaaaaaa gctggtgacg tc：配列番号２５）のアニーリングにより作製された2本鎖DNAフラグメント（thrLターミネーター；両端にHindIIIとPstIサイトがデザインされている）を、Muファージ由来のインテグレーションカセットを持つプラスミドpM12（EP1486570(A1)）（図５）のHindIIIとMph1103Iサイトに挿入することで構築した（図６）。IntJSカセットは次の手順（ａ）〜（ｇ）によって構築した(図７)。
【００９７】
（ａ）上流プライマー(ccagatcttg aagcctgctt ttttatacta agttggc：配列番号２６) （BglIIサイトがデザインされている）と下流プライマー(gaaatcaaat aatgatttta ttttg：配列番号２７)（リン酸化されている）、及び、鋳型としてプラスミドpMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB（WO2005/010175）を用いたPCRにより、0.12 kbpのLattLフラグメントを取得した。
【００９８】
（ｂ）上流プライマー(ttacgccccg ccctgccact catcgc：配列番号２８) （リン酸化されている）と下流プライマー(gtcactgcag ctgatgtccg gcggtgcttt tgcc：配列番号２９)（PstIサイトがデザインされている）に鋳型としてプラスミドpACYC184（New England Biolabs）を用いたPCRにより1.03 kbpのCmRフラグメントを取得した。
【００９９】
（ｃ） 上流プライマー(cagctgcagt ctgttacagg tcactaatac c：配列番号３０) （PstIサイトがデザインされている）と下流プライマー(ccgagctccg ctcaagttag tataaaaaag ctgaacg：配列番号３１)（SacIサイトがデザインされている）、及び、鋳型としてプラスミドpMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB（WO2005/010175）を用いたPCRにより、0.16 kbpのLattRフラグメントを取得した。
【０１００】
（ｄ）LattLフラグメントとCmRフラグメントのライゲーションにより1.15 kbpのLattL-CmRフラグメントを取得した。
【０１０１】
（ｅ）LattL-CmRフラグメントとLattRフラグメントをPstIで切断後、両断片のライゲーションにより1.31 kbpのLattL-CmR-LattRフラグメントを取得した。
【０１０２】
（ｆ）合成オリゴヌクレオチド（cccgagctcg gtacctcgcg aatgcatcta gatgggcccg tcgactgcag aggcctgcat gcaagcttcc：配列番号３２）とその相補鎖である合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより、70bpのマルチクローニングサイト（MCS）を構成する2本鎖DNAフラグメントを取得した。
【０１０３】
（ｇ）LattL-CmR-LattRフラグメントと、マルチクローニングサイト（MCS）を構成する前記2本鎖DNAフラグメントをSacIで切断後、両断片のライゲーションにより1.38 kbpのIntJSフラグメントを取得した。
【０１０４】
（６）システイン生産能を有し、かつ、d0191が強化されたP. ananatisの菌株構築（SC17/pMIV-CysE5/pACYC-d0191F株）
上記のように構築されたd0191遺伝子を含むプラスミドpACYC-d0191F（カナマイシン耐性）をSC17株に導入し（SC17/pACYC-d0191F）、更に阻害解除型SAT遺伝子搭載プラスミドpMIV-CysE5（クロラムフェニコール耐性）を導入して、システイン生産能を有し、d0191が強化されたP. ananatis菌株を構築した（SC17/pMIV-CysE5/pACYC-d0191F株）。また、対照株としてpACYC-d0191Fのかわりに空のベクターpACYC177を導入したSC17/pMIV-CysE5/pACYC177株を作製した。
【０１０５】
（７）システイン生産能を有し、かつ、d0191欠損が欠損したP. ananatisの菌株構築（SC17 d0191::Kmr/pMIV-CysE5株）
上記のように構築されたd0191欠損株SC17 d0191::Kmr株を、プラスミドpMIV-CysE5で形質転換し、d0191を欠損したシステイン生産菌SC17 d0191::Kmr/ pMIV-CysE5株を作製した。一方、対照株としてSC17株にpMIV-CysE5を導入したSC17/ pMIV-CysE5株を作製した。
【０１０６】
（８）P. ananatis SC17株におけるd0191欠損及びd0191強化のシステイン耐性への効果
d0191遺伝子のシステイン耐性への影響を調べるため、d0191欠損株SC17 d0191::Kmr株と、d0191増幅株SC17/pSTV-d0191F株、及びそれぞれの対照株SC17株、SC17/pSTV29株を、異なる濃度のシステインを含むM9最少培地（Sambrook et al., Molecular cloning, 3rd edition, 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press）で培養し、その生育の立ち上がりの早さから判断してシステイン耐性の違いを評価した。この培養ではシステインへの耐性が高いほど培地のODの立ち上がりが早く、耐性が低いほど長いラグの後に立ち上がる。実験の手順は以下の通りである。各株を0.4%グルコースを含むM9最少培地（システインを含
まない）にて一晩前培養した後（3ml試験管、34℃、振とう培養）、本培養培地に接種した。その際、前培養のODを測定、本培養の開始時の各株の菌量がそろうように接種量を調整した。本培養開始時のODは約0.007であった。
【０１０７】
本培養は4mlの、各濃度（0mM、1mM、5mM）のシステインと、0.4%グルコースを含むM9最少培地にて、自動OD測定培養装置BIO-PHOTORECORDER TN-1506（ADVANTEC社）とその専用L字試験管を用いて行った。なおプラスミド保持株には25mg/Lクロラムフェニコールを添加した。培養経過（生育曲線）を図８に示す。システインの濃度が上がるにつれODの立ち上がりが遅くなる傾向が認められたが、d0191強化株SC/pSTV-d0191F株は対照のSC17/pSTV29株よりも早く生育し、システイン耐性が付与されていることがわかった。また、d0191欠損株SC17 d0191::Kmr株ではシステイン添加によって生育が完全に阻害されることから、システイン耐性が低下していることがわかった。
【０１０８】
（９）E. coli MG1655株におけるd0191強化のシステイン耐性への効果
d0191遺伝子のシステイン耐性への影響を調べるため、d0191の増幅株MG1655/pSTV-d0191F株、及びその対照株MG1655/pSTV29株を、異なる濃度のシステインを含むM9最少培地で培養し、その生育の立ち上がりの早さから判断してシステイン耐性の違いを評価した。基本的な培養の方法は（８）に記載の方法に従った。ただし、本培養開始時のODが約0.006であった点、培養温度が37℃であった点、各システイン濃度が0mM、0.1mM、0.2mMであった点は、（８）とは異なる。培養経過（生育曲線）を図９に示す。システインの濃度が上がるにつれ、ODの立ち上がりが遅くなる傾向が認められたが、d0191強化株MG1655/ pSTV-d0191F株は対照のMG1655/ pSTV29株よりも早く生育し、システイン耐性が付与されていることがわかった。以上の結果から、宿主がP. ananatisであるかE. coliであるかによらず、d0191を強化した場合にシステイン耐性が強化されることがわかった。
【０１０９】
（１０）d0191産物の活性染色によるシステインデスルフヒドラーゼ活性検出
システイン耐性に対する表現型から、d0191産物がシステイン分解に関与している可能性が考えられた。そこで、d0191遺伝子産物がシステイン分解活性として知られるシステインデスルフヒドラーゼ活性（以下「CD活性」と省略）を有しているかを検討するため、d0191欠損株と強化株、及びそれぞれの対照株を培養し、それぞれの細胞抽出液中のタンパク質をnative PAGEにより分離後、活性染色によってCD活性を検出した。一連のnative PAGE、活性染色の方法は、N. Awanoら（Effect of cysteine desulfhydrase gene disruption on L-cysteine overproduction in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Aug;62(2-3):239-43）に従った。
【０１１０】
まず、上記のように構築されたd0191欠損株SC17 d0191::Kmr株及びその対照株SC17株、d0191強化株であるSC17/pHSG-d0191F及びその対照株SC17/ pHSG299株の4株を、以下に記述の方法で培養し、各細胞抽出液を調製した。各株のLB培地（5g/L yeast extract, 10g/L Tryptone, 10g/L sodium chloride）でのオーバーナイト培養液を50mlのLB培地を入れた坂口フラスコに100倍希釈になるように植え、振とう培養をした。３時間後、対数増殖期の培養液（ODは0.5前後）から集菌し、洗浄バッファー（10mM Tris-HCl(pH8.6)、0.1mM
DTT（dithiothreitol）、0.01mM PLP（pyridoxal-5'-phosphate））で洗浄後に、1mlの洗浄バッファーに懸濁し、超音波によって破砕、遠心分離で上清（細胞抽出液）を得た。なお、培養は全て34℃で行い、プラスミドを保持している菌株に対しては20mg/Lカナマイシンを添加した。こうして調製された細胞抽出液のタンパク質濃度を定量し、各2.5mg/mlになるように洗浄バッファーで希釈し、5×ローディングバッファ（10mM Tris-HCl(pH8.6)、30% glycerol、0.005% BPB（Bromophenol Blue））を添加し最終濃度2mg/mlのサンプルとした。
【０１１１】
各サンプルを1μlずつ（2μgタンパク質）、10% native PAGEのゲル（TEFCO社）にロー
ドし、4℃で20mA、1.5時間、native PAGEを行った。このときのgel-runningバッファーの組成は、25mM Tris-HCl（pH8.3）、192mM Glycineであった。電気泳動後、ゲルを染色液（100mM Tris-HCl(pH8.6)、10mM EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）、 50mM システイン、0.02mM PLP、1.6mM 塩化ビスマス（III））に浸し、適度な発色が見られるまでゆっくり室温でゆすりながら活性染色を行った。図１０に、検出されたd0191産物のCD活性によるバンドを示す。d0191欠損株では見られないバンドが対照株では見られ、またこのバンドはd0191強化株では強度が強くなることからも、d0191産物がCD活性によって染色されたバンドと考えられる。以上の結果から、d0191は新規のシステインデスルフヒドラーゼをコードしており、システイン耐性に関与していることが明らかとなった。
【０１１２】
（１１）システイン生産菌におけるd0191強化のシステイン生産への効果
d0191遺伝子強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、d0191が強化されたシステイン生産菌P. ananatis SC17/pMIV-CysE5/pACYC-d0191F株と、その対照株SC17/pMIV-CysE5/pACYC177株のシステイン生産能を比較した。培養にはシステイン生産培地（組成：15g/L 硫酸アンモニウム, 1.5g/L リン酸二水素カリウム, 1g/L 硫酸マグネシウム七水和物, 0.1mg/L チアミン塩酸塩, 1.7mg/L 硫酸第一鉄七水和物, 0.15mg/L モリブデン酸ナトリウム二水和物, 0.7mg/L 塩化コバルト六水和物, 1.6mg/L 塩化マンガン四水和物, 0.3mg/L硫酸亜鉛七水和物, 0.25mg/L 硫酸銅五水和物, 0.6g/L トリプトン, 0.3g/L イーストエクストラクト, 0.6g/L 塩化ナトリウム, 20g/L 炭酸カルシウム, 135mg/L L-ヒスチジン塩酸塩一水和物, 4g/L チオ硫酸ナトリウム, 2mg/L ピリドキシン塩酸塩, 60g/L グルコース, 25mg/L クロラムフェニコール, 20mg/L カナマイシン）を使用した。
【０１１３】
培養は以下の手順で行った。SC17/pMIV-CysE5/pACYC-d0191F株、及びSC17/pMIV-CysE5/pACYC177株を、クロラムフェニコールとカナマイシンを含有するLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った。10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml入れたシステイン生産培地中に植菌した。植菌量は、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調整した。32℃にて振とう培養を行い、各株ともグルコースを完全に消費しきった時点で培養を終了し（約22〜25時間）、培地中に蓄積したシステインを定量した。システインの定量はGaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。各株とも4連で実験を行い、システイン蓄積量の平均値と標準偏差を表１に示した。表１に示したとおり、d0191の強化はシステイン蓄積量を減少させることが明らかとなった。
【０１１４】
【表１】
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【０１１５】
（１２）システイン生産菌におけるd0191欠損のシステイン生産能への効果
d0191はシステインの分解に関与し、遺伝子の強化によってシステイン生産を減ずることが明らかとなったため、次にd0191の活性抑制（具体的には遺伝子欠損）によってシステイン生産にポジティブな効果があるかどうか検討を行った。上記のように作製されたd0
191欠損をもつシステイン生産菌SC17 d0191::Kmr/pMIV-CysE5株が、d0191非破壊株SC17/pMIV-CysE5株に対して優れたシステイン生産能を有しているかどうかを調べるため、システイン生産培養を行いその能力を比較した。システインの生産培養及び定量の方法は（１１）に記述された方法と同じであるただし抗生物質はクロラムフェニコールのみ培地に添加した。対照株は4連で、d0191欠損株は8連で実験を行い、システイン蓄積量の平均値と標準偏差を表２に示した。表2に示すとおり、d0191の活性抑制はシステイン蓄積量を増加させる効果があることが明らかとなった。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
〔実施例２〕c0263欠損株によるシステインの生産
（１）d0191遺伝子の転写制御因子の同定
E. coliなどではシステイン存在下でシステインデスルフヒドラーゼ活性が誘導されることが知られている（Awano N et al. Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71(7):4149-52.）。そこでシステインデスルフヒドラーゼ活性を有することが明らかとなったd0191がシステインにより誘導されるかどうかを検討するため、システイン添加後のd0191のmRNAレベルを定量的RT-PCRを用いて調べた。
【０１１８】
0.4%グルコースを含む3mlのM9最少培地にてSC17株を一晩振とう培養した後（前培養）、同じM9最少培地25mlを張り込んだ坂口フラスコに100倍希釈となるように植え継ぎ、34℃にて振とう培養（本培養）を行った。5.5時間培養により、対数増殖期となった培養液（OD600=0.25前後）に最終濃度1mMとなるようにシステインを添加し、システイン添加前と添加2.5分後、5分後、10分後にサンプリングを行った。
【０１１９】
各サンプリングでは4mlの培養液を8mlのRNA Protect Bacteria Reagent(Qiagen社)と混ぜ合わせ、5分間室温に置いた後、遠心分離により菌体のみを取得し、素早く-80℃で冷凍保存した。こうして保存されたサンプルから、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用いてmRNAの調製を行った。RNAサンプルは全て0.5μg /μlに調製し、このうちの5μl（2.5μg）を用いてDNase処理を行った。このときTURBO DNA-free(Ambion社)を用い、同キット添付のプロトコールに従ってDNaseの反応及び不活化をした。こうして調製されたDNase処理済のRNAサンプル200ngを用いてTakara社のExScript RT reagent kit（同キット添付のプロトコールに従った）により逆転写を行いDNAに変換した。このときの反応組成は；4μl  バッファー（×5）、1μl dNTP Mix、0.5μl ExScript RTase、0.5μl RNase inhibitor、1μl random 6mer、11μl RNase free water、2μl RNAサンプル（100ng/μl）、反応条件は；42℃15分、95℃2分であった。
【０１２０】
こうして調製したDNAサンプルをまず20倍に希釈し、その後1倍、10倍、100倍、1000倍の系列に希釈した。このDNAサンプルを用いて定量的RT-PCRを行い、mRNAの定量を行った。定量的RT-PCRの試薬はPower SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)を用い、また定量的RT-PCR装置は7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を使用した。添
付のプロトコール、マニュアルに従い標準的な方法にて行った。このときの反応組成は；12.5μl Power SYBR Green Master Mix、0.5μl プライマー1（10pM）、0.5μl プライマー2（10pM）、2.5μl サンプルDNA、9μl 水であり、PCRサイクルは；50℃2分→95℃10分の後に95℃15秒→60℃60秒のサイクルを40回であった。
【０１２１】
各遺伝子（d0191及び16S RNA（後述））につき、システイン添加前のサンプルの検量線を作成し（先述の1〜1000倍の希釈系列より）、添加前に対する相対値としてシステイン添加後の各サンプルのmRNA量を定量した。d0191だけではなく16S RNAも各サンプルついて定量を行い、16S RNAの定量値を用いてRNA量による標準化を行った。この際用いたプライマーセットは、d0191；（d0191RT1-F：GCTCAGCGGACACACACTTAAT（配列番号６８）、d0191RT1-R：ACCTGATGCCCGGAAAATC（配列番号６９））、16S RNA；（16S1RT-1F：CGGTAATACGGAGGGTGCAA（配列番号７０）、16S1RT-1R：CCTGCGTGCGCTTTACG（配列番号７１））である。その結果を表３に示す。d0191はシステイン添加後すぐに数百倍のレベルでの誘導を受けることが明らかとなった。
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
d0191の上流には、わずか78bpを隔ててd0191と逆向きのORFであるc0263が存在し、相同性からc0263は何らかの転写因子をコードしていると考えられた。c0263がd0191のシステインでの誘導に関与しているかを検討するため、c0263欠損株を用いてシステイン添加5分後のd0191のmRNAの変化を定量的RT-PCRにより調べた。定量的RT-PCRは先述の方法と概ね同様である。ただし、ここではd0191のプライマーとしてd0191RT2-F：ACGCGTCGAGCCTTCCTT（配列番号７２）、d0191RT2-R：CCGGTACGCGAAGCATTT（配列番号７３）を用いた。また、菌株としてSC17 c0263::Kmr株にc0263遺伝子を搭載したプラスミドpSTV-c0263を導入した株とそれに対応する空のベクター（pSTV29、Takara社）を導入した株を用いた。pSTV-c0263の構築方法は後述する。定量的RT-PCRによる定量の結果を表４に示す。
c0263欠損株（SC17 c0263::Kmr/pSTV29）ではシステインによるd0191の誘導が見られなくなり、c0263をプラスミドで相補した株（SC17 c0263::Kmr/pSTV-c0263）では誘導が見られるようになったことから、d0191の転写の活性化にc0263が関与していることがわかった。
【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
以上の実験結果から、c0263を欠損させることは、d0191の発現を抑える効果があると考えられる。d0191の欠損によりシステイン生産を高めることが可能であったが、同じ効果はc0263を欠損することでも得られると考えられる。
【０１２６】
前記pSTV-c0263の構築方法は次の通りである。P. ananatis SC17株のゲノミックDNAをテンプレートとして、プライマーc0263(Pa)-FW（CGCGGATCCGGTGTATCTTGTTTGATCCAACCG（配列番号７４））、c0263(Pa)-RV（CGCGGATCCGGGCATCCATGTTTTGGTG（配列番号７５））を用いたPCRによって、c0263遺伝子の上流約300bpから下流約200bpまでを含むc0263遺伝子断片を取得した。これらのプライマーの5’末端には制限酵素BamHIのサイトがデザインされている。PCRにはPyrobestポリメラーゼ（Takara社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応組成で、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分30秒からなるサイクルを30サイクル繰り返すことによって目的の約1.0KBの断片を増幅した。得られた断片をBamHIで処理し、pSTV29（Takara社）のBamHIサイトに挿入しc0263がクローニングされたプラスミドpSTV-c0263（クロラムフェニコール耐性マーカー）を取得した。
【０１２７】
（２）P. ananatis SC17株からのc0263欠損株、及び、d0191-c0263二重欠損株の構築
c0263欠損株及びd0191-c0263の二重欠損株の構築は先述のd0191欠損株の構築と同じ方法によって行った。すなわち、SC17(0)/RSF_Red_TER株を用いた「Red-driven integration」により、カナマイシン耐性遺伝子でc0263遺伝子及びd0191-c0263遺伝子を欠損したSC17(0) c0263::Kmr株、及びSC17(0) d0191 c0263::Kmr株を構築し、各々の株の染色体DNAを用いてSC17株を形質転換して、最終的にSC17 c0263:: Kmr株（c0263のC末端約280bpを欠損）及びSC17 d0191-c0263::Kmr株（c0263とd0191の全長を含む領域を欠損）を構築した。このときの遺伝子欠損用DNAを調製するために用いたプライマーの組み合わせは次の通りである。
【０１２８】
c0263欠損用プライマー；
Dc0263-RV（TCAGGGGCCAACAGGCAGGGCTGTCGTGTATTTAATCTCTTCCATCGCGATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA）（配列番号７６）
Dc0263-attR2（ACGGCATTATTCGCGGACGGGTCGCTCTGCTGGATAATGAAAAGCTTGGCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA）（配列番号７７）
【０１２９】
c0263-d0191  二重欠損用プライマー；
Dc0263-RV（TCAGGGGCCAACAGGCAGGGCTGTCGTGTATTTAATCTCTTCCATCGCGATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA）（配列番号７８）
Dd0191-RV（CTAGCCCAGTTCGCGCTGCCAGGGCGTAATATCGCCAATGTGCTCGGCAACGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA）（配列番号７９）
【０１３０】
（３）c0263欠損によるシステイン生産への効果
c0263はd0191の転写活性化に関与する転写因子であることが明らかとなったため、次にc0263遺伝子欠損によってシステイン生産にポジティブな効果があるかどうか検討を行った。上記のように作製されたc0263欠損株及びd0191-c0263二重欠損株を先述のpMIV-CysE5で形質転換することでシステイン生産菌SC17 c0263::Kmr/pMIV-CysE5株及びSC17 d0191-c0263::Kmr/pMIV-CysE5株を構築した。
【０１３１】
これらの生産菌と対照株を用いてシステイン生産培養を行いその生産能力を比較した。システインの生産培養及び定量の方法は先述の方法と同じである。ただし抗生物質はクロラムフェニコールのみ培地に添加した。また、グルコース濃度を今回40g/Lで行った。システイン蓄積量を表５に示した。c0263の欠損及びd0191-c0263二重欠損は、d0191の欠損と同様にシステイン蓄積量を増加させる効果があることが明らかとなった。
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
〔配列表の説明〕
配列番号１：Pantoea ananatis d0191遺伝子の塩基配列
配列番号２：Pantoea ananatis D0191のアミノ酸配列
配列番号３：Pantoea ananatis hisD遺伝子の塩基配列
配列番号４〜３２:PCRプライマー
配列番号33：Citrobacter koseri d0191遺伝子の塩基配列
配列番号34：Citrobacter koseri D0191のアミノ酸配列
配列番号35：Klebsiella pneumoniae d0191遺伝子の塩基配列
配列番号36：Klebsiella pneumoniae D0191のアミノ酸配列
配列番号37：Enterobacter sp. 638 d0191遺伝子の塩基配列
配列番号38：Enterobacter sp. 638 D0191のアミノ酸配列
配列番号39：Salmonella typhimurium d0191遺伝子の塩基配列
配列番号40：Salmonella typhimurium  D0191のアミノ酸配列
配列番号41：Serratia proteamaculans d0191遺伝子の塩基配列
配列番号42：Serratia proteamaculans D0191のアミノ酸配列
配列番号43：Erwinia carotovora d0191遺伝子の塩基配列
配列番号44：Erwinia carotovora D0191のアミノ酸配列
配列番号45：Vibrio cholerae d0191遺伝子の塩基配列
配列番号46：Vibrio cholerae D0191のアミノ酸配列
配列番号47：Pseudomonas fluorescens d0191遺伝子の塩基配列
配列番号48：Pseudomonas fluorescens D0191のアミノ酸配列
配列番号49：Streptomyces coelicolor d0191遺伝子の塩基配列
配列番号50：Streptomyces coelicolor D0191のアミノ酸配列
配列番号51：Mycobacterium avium d0191遺伝子の塩基配列
配列番号52：Mycobacterium avium D0191のアミノ酸配列
配列番号53〜54：PCRプライマー
配列番号55：attLの塩基配列
配列番号56〜57：PCRプライマー
配列番号58：attRの塩基配列
配列番号59〜62：PCRプライマー
配列番号63：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号64〜65：PCRプライマー
配列番号66：Pantoea ananatis c0263遺伝子の塩基配列
配列番号67：Pantoea ananatis C0263のアミノ酸配列
配列番号68〜79：PCRプライマー
配列番号80：Escherichia coli ybaO遺伝子の塩基配列
配列番号81：Escherichia coli YbaOのアミノ酸配列
【図１】
0005396922.tif 000007
【図２】
0005396922.tif 000008
【図３】
0005396922.tif 000009
【図４】
0005396922.tif 000010
【図５】
0005396922.tif 000011
【図６】
0005396922.tif 000012
【図７】
0005396922.tif 000013
【図８】
0005396922.tif 000014
【図９】
0005396922.tif 000015
【図１０】
0005396922.tif 000016
【配列表】
0005396922000001.app