(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式[Ａ]、[Ｂ]又は[Ｃ]
0005614281.tif 000016
0005614281.tif 000017

0005614281.tif 000018
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤの基質となる新規物質、及びこれを用いたホスホリパーゼＤの測定方法及びカルシウムイオンの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＤは、ホスホリルコリン構造に酵素親和性の高い酵素であり、また、その酵素反応において２価陽イオンを要求することが一般に知られている。この性質を利用して、近年では市販のパラニトロフェニルホスホリルコリンを発色性の基質として用いた、ホスホリパーゼＤの酵素活性測定方法や、ホスホリパーゼＤを用いた２価陽イオンの測定方法が検討されている。【０００３】
パラニトロフェニルホスホリルコリン等のホスホリルコリン化合物を基質として用い、ホスホリパーゼＤを用いた２価陽イオンの測定方法としては、カルシウム測定方法に応用した例（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５等）が知られている。しかしながら、特にパラニトロフェニルホスホリルコリンを基質として用いる測定系では、酵素反応により遊離する色素のｐKaがその測定系の中で至適な状態にないため、色素が完全発色の状態に無い、発色安定性が悪い、十分な感度が得られない等の問題点を抱えていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−１９５２９７号公報
【特許文献２】特開平４−１８７０９８号公報
【特許文献３】特開平４−２３９９９号公報
【特許文献４】特開平７−１７０９９９号公報
【特許文献５】特開２００２−２３８５９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、良好なホスホリパーゼＤの基質を提供すると共に、酵素活性や２価陽イオンの測定において、基質安定性を保持しながらも、遊離する色素がホスホリパーゼＤの至適pH付近で高発色し、発色安定性に優れ、十分な測定感度を有する発色基質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。【０００７】
（１）下記式[１] 
0005614281.tif 000002
[式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体。【０００８】
（２）下記式[１] 
0005614281.tif 000003
[式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体を含む、ホスホリパーゼＤ測定用試薬。【０００９】
（３）被検試料と、下記式[１] 
0005614281.tif 000004
[式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体と、ホスホリパーゼＤとを、リン酸モノエステラーゼの存在下に混合して反応を開始させた後、吸光度増加速度を測定し、当該吸光度増加速度に基づいて行うことを特徴とする、カルシウムイオンの定量方法。【００１０】
（４）下記式[１] 
0005614281.tif 000005
[式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体を含む、カルシウムイオン定量用試薬。【００１１】
（５）下記式[１] 
0005614281.tif 000006
[式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示されるフェニルホスホリルコリン誘導体、ホスホリパーゼＤ及びリン酸モノエステラーゼを構成成分として含む、カルシウムイオン定量用キット。【００１２】
本発明者等は、上記した如き課題を解決すべく鋭意検討の結果、パラニトロフェニルホスホリルコリンに電子吸引基が少なくとも一つ導入された本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を合成し、該誘導体は、遊離する色素のｐKaがパラニトロフェニルホスホリルコリンから遊離する色素よりも低下していることを見出した。そして更に鋭意研究の結果、本発明のフェニルホスホリスコリンから遊離する色素は、ホスホリパーゼＤの至適pＨである中性付近で、また自動分析機の固定測定波長405nm付近で高発色することを見出し、該誘導体をホスホリパーゼＤの基質として用い、カルシウムイオン濃度の測定を行えば、十分な測定感度で測定が行えることを見出し、本発明を完成するに到った。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の、色素骨格に電子吸引基が置換された新規なフェニルホスホリルコリン誘導体は、ホスホリパーゼＤの良好な基質となり得ると共に、酵素活性測定や、カルシウムイオンの測定における、発色安定性に優れ、十分な測定感度を有する発色基質となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例７で得られた、各基質の基質濃度（mM）と吸光度増加速度（ΔE/mim）との関係を示すグラフである。  図１において、（ａ）はホスホリパーゼＤの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）及び（ｃ）はホスホリパーゼＤの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物８ａ又は化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
【図２】実施例８で得られた、各基質を用いてカルシウムイオン濃度を測定した場合の反応タイムコースを示し、各測光ポイント（sec.）における吸光度（OD×10000）をプロットしたグラフである。図２において、（ａ）はホスホリパーゼＤの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）〜（ｅ）はホスホリパーゼＤの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物５ｂ、化合物８ａ、化合物８ｂ、化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
【図３】実施例８で得られた、カルシウム溶液のカルシウム濃度（検体Ca量）と、検量線から求めた該カルシウム溶液のカルシウム濃度（測定値）との関係を示す検量線である。図３において、（ａ）はホスホリパーゼＤの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）〜（ｅ）はホスホリパーゼＤの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物５ｂ、化合物８ａ、化合物８ｂ、化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
【図４】実施例９において得られた各基質の、溶液状態での経時安定性を試験した結果を示し、各保存期間保存後の各基質溶液を用いて得られた、405nmにおける絶対吸光度をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体は、パラニトロフェニルホスホリルコリンに電子吸引基が少なくとも一つは導入されたものであり、具体的には下記式[1]
0005614281.tif 000007
[式中、Ｒ１〜Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、若しくはカルボキシル基を表す。]
で示される構造を有する。
【００１６】
式［１］に於いて、Ｒ１〜Ｒ４は各々独立して水素原子又は電子吸引基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つは電子吸引基である。電子吸引基としては、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基若しくはカルボキシル基が挙げられ、好ましくはハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基である。
【００１７】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられ、好ましくはフッ素、塩素、臭素、より好ましくはフッ素、塩素である。
【００１８】
ハロゲン化アルキル基のアルキル基としては、直鎖状でも分枝状でも或いは環状でも何れにても良く、主鎖長が６炭素までの低級アルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル 基、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、tert-ペンチル基、１-メチルペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、等が挙げられる。好ましくは４炭素以下、より好ましくは２炭素以下の主鎖長のものが挙げられる。
【００１９】
ハロゲン化アルキル基のハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられ、好ましくはフッ素、塩素、臭素、より好ましくはフッ素、塩素である。
【００２０】
式［１］で表されるフェニルホスホリルコリン誘導体の具体例としては、例えば
O-(2-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、 
O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、 
O-(3-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、 
O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、 
O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、 
O-(2-Carboxy-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Carboxy-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
等が挙げられる。
【００２１】
本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体の合成方法は、特に限定されず、例えばホスホリルコリンをパラニトロフェノールで脱水縮合によりエステル化して合成する方法（S. Kurioka, Journal of Biochemistry, 63(5), 678(1998)、パラニトロフェノール誘導体と各種リン酸化試薬を用いてフェニルホスホジクロリデートを合成し、それとコリン化合物と縮合する方法（B. Chesebro and H. Metzger, Biochemistry 11,1766(1972)、 S. Kurioka and M. Matsuda, Analytical Biochemistry 75, 281-289(1976)、E. Barbar et.al., Biochemistry 35(9), 2959(1996)）等の方法に準じて合成することができる。
【００２２】
以下に、一般式[２]
0005614281.tif 000008
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は前記と同じ。）
で示されるパラニトロフェノール誘導体（以下、「本発明に係るパラニトロフェノール誘導体」と略記する場合がある。）とリン酸化試薬を用いてフェニルホスホジクロリデートを合成し、コリン化合物と縮合する方法に準じて本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を合成する例を記載する。
【００２３】
本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体の合成は、(１)コリン化合物の合成、(２)本発明に係るパラニトロフェノール誘導体をホスホジクロリデート化したもの（以下、「本発明に係るフェニルホスホジクロリデート」と略記する場合がある。）の合成、及び(３)本発明に係るフェニルホスホジクロリデートとコリン化合物との縮合から成される。
【００２４】
（１）コリン化合物の合成
ジメチルアミノエタノールに対して、ヨードメタン1.0〜2.0倍モルを、溶媒（例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、1,4-ブタンジオール等のアルコール類）中で、-20〜100℃（好ましくは0〜50℃）で0.1〜24時間（好ましくは1〜12時間）反応させることにより、コリン化合物が得られる。
【００２５】
（２）本発明に係るフェニルホスホジクロリデートの合成
本発明に係るパラニトロフェノール誘導体に対して、オキシ塩化リン1.0〜1.5倍モルを、溶媒（例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類）中で、-80〜0℃、好ましくは-78〜-50℃で0.1〜24時間、好ましくは1〜16時間反応させることにより、本発明に係るフェニルホスホジクロリデートが得られる。
【００２６】
本発明に係るパラニトロフェノール誘導体は常法により合成してもよいが、市販品があれば、それをそのまま用いればよい。
【００２７】
（３）本発明に係るフェニルホスホジクロリデートとコリン化合物との縮合
上記(2)で得られた本発明に係るフェニルホスホジクロリデートに対して、上記(1)で得られたコリン化合物0.5〜5.0モル（好ましくは1.0〜2.0モル）を、塩基触媒（例えばピリジン、キノリン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類）の存在下、必要ならば溶媒（例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、n-ブチロニトリル等のニトリル類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、N,N-ジメチルアセトアミド（DMA）、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類）中で-20〜100℃（好ましくは0〜50℃）で0.1〜24時間（好ましくは0.5〜12時間、より好ましくは1〜8時間）で反応させることにより、目的とする本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体が得られる。
【００２８】
本発明のホスホリパーゼＤ測定用試薬としては、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を含むものが挙げられる。
【００２９】
本発明のホスホリパーゼＤ測定用試薬を用いてホスホリパーゼＤを測定するには、被検試料と本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体とを、リン酸モノエステラーゼや二価金属イオンの存在下に混合し反応を開始させた後、吸光度増加速度を測定し、その結果を、例えば予め作成された、濃度既知のホスホリパーゼＤを含有する試料を用いて得られるホスホリパーゼＤ活性と吸光度増加速度との関係を示す検量線に当てはめることにより、実施すればよい。
【００３０】
上記方法に於いて用いられるリン酸モノエステラーゼとしては、アルカリホスファターゼ、中性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼが挙げられる。
【００３１】
本発明に係るカルシウムイオンの定量方法を実施するには、ホスホリパーゼＤの基質として本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を用いる以外は、例えば特開２００２−２３８５９８号公報、特開平７−１７０９９９号公報、特開平４−１８７０９８号公報、特開平４−２３９９９号公報、特開昭６２−１９５２９７号公報等に記載された、ホスホリパーゼＤを用いる自体公知のカルシウム測定方法に準じて測定を行い、生成した本発明に係るパラニトロフェノール誘導体の発色（吸光度変化）を測定すればよい。
【００３２】
すなわち、被検試料と本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体とホスホリパーゼＤとを、リン酸モノエステラーゼの存在下に混合し、吸光度増加速度を測定し、その結果を、例えば予め作成された、濃度既知のカルシウムイオンを含有する試料を用いて得られたカルシウムイオン濃度と吸光度増加速度との関係を示す検量線に当てはめることにより定量する方法が挙げられる。
【００３３】
例えば、（１）被検試料と、ホスホリパーゼＤとリン酸モノエステラーゼを含有する試液とを反応させ、次いで本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を反応させた後、吸光度増加速度を測定する方法、（２）被検試料とホスホリパーゼＤを含有する試液を反応させ、次いでリン酸モノエステラーゼと本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を含有する試液を反応させた後、吸光度増加速度を測定する方法、等が挙げられる。
【００３４】
本発明に係るカルシウムイオンの定量方法に用いられる本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体及びその好ましい具体例は上記した通りである。
【００３５】
中でも好ましいものとして、
O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、 
O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、
が挙げられる。
【００３６】
特に好ましいものとしては、
O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、
O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、及び
O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、
が挙げられる。
【００３７】
本発明の定量方法に於ける本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体の使用濃度は、試液中の濃度としては、通常２〜２００ｍＭ、好ましくは４〜４０ｍＭであり、最終の反応液中の濃度としては、通常０．５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭである。
【００３８】
本発明に係るカルシウムイオンの定量方法に用いられるホスホリパーゼＤとしては、酵素反応にカルシウムイオンを要求するものが挙げられる。例えば、キャベツ、ニンジン、ピーナッツ、ブタ膵臓等の動植物由来のもの、ストレプトマイセスｓｐ（特開000-270857号公報）、ノカルディア属（特開昭60-164483号公報）等の微生物由来のもの等が挙げられる。安定供給、酵素の安定性等を考慮すると、ストレプトマイセス・クロモフスカス（Streptomyces chromofuscus）等の微生物由来の酵素が好ましい。
【００３９】
ホスホリパーゼＤの使用濃度は、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。試液中の濃度としては、通常０．０７５〜１５Ｕ／ｍｌ、好ましくは３〜７．５Ｕ／ｍｌであり、最終の反応液中の濃度としては、通常０．０５〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜５Ｕ／ｍｌである。
【００４０】
本発明に係るカルシウムイオンの定量方法に用いられるリン酸モノエステラーゼとしては、微生物、動物起源の各種酵素でアルカリホスファターゼ、中性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼが使用できる。酵素の安定性、入手し易さ等を考慮すると、アルカリホスファターゼが好ましく、中でも安定性に優れている大腸菌由来のアルカリホスファターゼが好ましい。
【００４１】
リン酸モノエステラーゼの使用濃度は、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。試液中の濃度としては、通常０．４〜８０Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜２０Ｕ／ｍｌであり、最終の反応液中の濃度としては、通常は０．１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５Ｕ／ｍｌである。
【００４２】
尚、ホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオンの測定を行う場合、カルシウムイオン以外に作用するキレート剤の共存下で測定を行うと、カルシウムイオンに対する特異性が高まることが知られている（例えば特開平７−１７０９９９号公報、特開２００２−２３８５９８号公報等）。
【００４３】
このために用いられるキレート剤としては、カルシウムイオン以外の二価金属イオンの影響を排除し得るものであれば、用いることが出来る。例えば、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸等や、クエン酸，シュウ酸等のカルボン酸化合物が挙げられる。これらのキレート剤を一種又は二種以上用いるのは、任意であるが、グリコールエーテルジアミン四酢酸とジエチレントリアミン五酢酸を併用するのが好ましい。
【００４４】
キレート剤の使用濃度は、試液中の濃度としては４μＭ〜１.２ｍＭ、好ましくは４０〜４００μＭであり、最終の反応液中の濃度としては、１μＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１０〜１００μＭである。
【００４５】
また、グリコールエーテルジアミン四酢酸とジエチレントリアミン五酢酸を併用する場合、最終の反応液中の濃度として、グリコールエーテルジアミン四酢酸が５〜２００μＭ、好ましくは１０〜８０μＭ、ジエチレントリアミン五酢酸が１〜５０μＭ、好ましくは５〜２０μＭである。
【００４６】
また、本発明の定量方法に用いられるホスホリパーゼＤは、キレート剤が存在すると不安定化してしまうので、キレート剤を用いる場合には、安定化剤としてマグネシウムイオンを使用することが望ましい。また、マグネシウムイオンはリン酸モノエステラーゼの活性化剤ともなるので、この点からも、マグネシウムイオンを使用することが望ましい。
【００４７】
マグネシウムイオンを本発明の測定系に共存させる方法としては、通常これの塩の形で用いる方法が最も簡便であるが、特にこの方法に限定されるものではない。この際に使用する塩の種類は、該溶液中に共存する試薬等の安定性を阻害したりしないものであれば特に限定されないが、例えば硫酸、硝酸等の無機酸との塩、例えば塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子との塩（ハロゲン化物）、例えば酢酸、クエン酸、グルコン酸、プロピオン酸、パントテン酸等の有機酸との塩等が挙げられる。
【００４８】
また、その濃度は、試液中の濃度として１．５〜４５０ｍＭ、好ましくは１５〜１５０ｍＭ、最終の反応液中の濃度として、１〜３００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭである。
【００４９】
本発明に係るカルシウムイオンの定量方法は、使用する酵素の至適ｐＨ範囲内で行うことが望ましいため、各試薬類を溶解する溶媒は、緩衝液が好ましい。
【００５０】
本発明の定量方法における測定時の好ましいｐＨは、ｐＨ５〜９、更に好ましくはｐＨ６〜７．５である。ｐＨを上記した如き範囲とするために用いられる緩衝液としては、酵素活性を安定に保ち、試薬類を溶解し、所定のｐＨが得られるものであれば使用できるが、各種グッド緩衝液、トリス緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液等が挙げられる。また、その濃度は、試液中の濃度として７．５ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは３０〜４００ｍＭであり、最終の反応液中の濃度として５〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭである。
【００５１】
更に、これらの試薬の他に、界面活性剤、各種防腐剤、安定化剤、賦活剤、共存物質の影響回避剤及び通常臨床検査薬に使用している物質を共存させてもかまわないことは言うまでもない。これら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知のホスホリパーゼＤを用いるカルシウムイオンの定量方法に於て通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いることで足りるが、本発明に係るカルシウムイオンの定量方法に於いて用いられる酵素類の至適ｐＨ範囲内で、安定性が高く、また酵素反応により生成するパラニトロフェノール誘導体の発色を阻害しないものを選択することが望ましい。
【００５２】
吸光度の測定時に使用する分光光度計等は、通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
【００５３】
また、測定は用手法によって行っても良いことはもちろんであるが、臨床検査室でよく用いられている自動分析機を用いた連続測定にも適応できる。
【００５４】
用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類の組み合わせについては、特に限定はされず、適用する自動分析装置の環境、その他の要因等に合わせて適宜行えば良い。
【００５５】
吸光度変化は、単波長又は主波長と副波長を使用する２波長測光により求めてもよい。
【００５６】
吸光度測定のための測定波長は、使用するフェニルホスホリルコリン誘導体の種類によって適宜選択すればよい。単波長で測定する場合は、３８０〜４５０ｎｍの任意の波長における吸光度の増加速度を測定すればよい。２波長で測定する場合には、主波長４０５ｎｍ付近、副波長６６０ｎｍ付近で測定すればよい。
【００５７】
本発明の定量方法に適用される被検試料としては、血液、例えば血漿、血清もしくは尿などの生体液等や排水、微生物培養液、動植物培養液、生体材料抽出液等が挙げられる。
【００５８】
本発明の基質を用いた場合のカルシウム測定例を下記に示す。
反応式：
・ホスホリパーゼＤ、カルシウムイオン＋本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体＋水
→ 本発明に係るパラニトロフェニルリン酸誘導体＋コリン
・リン酸モノエステラーゼ、本発明に係るパラニトロフェニルリン酸誘導体＋水 
→ 本発明に係るパラニトロフェノール誘導体（黄色）＋リン酸
【００５９】
本発明に係るカルシウムイオンの定量方法の一例を示すと、例えば、被検試料と、ホスホリパーゼＤとリン酸モノエステラーゼとを含有する試薬溶液と、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を含む試薬溶液を、要すればキレート剤及びマグネシウムイオンの存在下に順次混合し、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、通常２〜１０分間、好ましくは５分間程度反応させる。生成される本発明に係るパラニトロフェノール誘導体由来の発色を経時的に測定し、吸光度増加速度を得る。得られた値を、例えば予め濃度既知のカルシウムイオン標準液を試料として用いて同様に測定を行い、作成されたカルシウムイオン濃度と吸光度増加速度との関係を示す検量線に当てはめることにより、被検試料中のカルシウムイオン濃度が求められる。
【００６０】
また、当該定量方法の他の一例を示すと、例えば、被検試料と、ホスホリパーゼＤを含有する試薬溶液と、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体とリン酸モノエステラーゼとを含む試薬溶液を、要すればキレート剤及びマグネシウムイオンの存在下に順次混合し、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、通常２〜１０分間、好ましくは５分間程度反応させる。生成される本発明に係るパラニトロフェノール誘導体由来の発色を経時的に測定し、吸光度増加速度を得る。得られた値を、例えば予め濃度既知のカルシウムイオン標準液を試料として用いて同様に測定を行い、作成されたカルシウムイオン濃度と吸光度増加速度との関係を示す検量線に当てはめることにより、被検試料中のカルシウムイオン濃度が求められる。
【００６１】
本発明のカルシウムイオン測定用試薬は、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を含んで成るものであり、その好ましい態様、具体例及び使用濃度等は先に述べた通りである。
【００６２】
本発明のカルシウムイオン測定用キットは、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体、ホスホリパーゼＤ、及びリン酸モノエステラーゼ、要すれば更にキレート剤及びマグネシウムイオンを構成成分として含んでなるものであればよい。夫々の構成要素の好ましい態様、具体例及び使用濃度等については先に述べた通りである。
【００６３】
本発明のキットの具体的な実施態様としては、例えば以下の如き二液から成る構成が挙げられる。
【００６４】
（１）ホスホリパーゼＤとリン酸モノエステラーゼを含有する第一試液と、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を含有する第二試液からなるもの、
（２）ホスホリパーゼＤを含有する第一試液と、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体とリン酸モノエステラーゼを含有する第二試液からなるもの。
【００６５】
また、要すれば前記したキレート剤及び／又はマグネシウムイオンが、前記第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれていてもよい。
【００６６】
また、当該キットの各試薬中には、この分野で通常用いられる、例えば緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、安定化剤等を通常この分野で使用される範囲含有していてもよい。更に、当該キットには、必要に応じて、カルシウムイオン標準品が組み合わされていてもよい。
【００６７】
また、当該キットが複数の試液で構成される場合、各試液中には、測定対象成分を測定する為に必要な試薬類も含有させるが、これら試薬類は、各試液を混合した時点で目的の成分測定の反応が開始されるように各試液の何れかに適宜分散させて含有させればよい。これら試液を構成する試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
【００６８】
以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
実験例１．遊離色素の選択
下記方法により、各種パラニトロフェノール誘導体のpKa及び発色率を測定し、本発明に係るカルシウムイオンの定量方法に使用可能と思われる、パラニトロフェノール誘導体（遊離色素）を選択した。尚、下記説明文中の３ａ、３ｂ等の記載は、下記表１に記載の化合物名に対応する。
まず、パラニトロフェノールは、和光純薬工業(株)製を用いた。化合物３ａは、2-Chloro phenol（和光純薬工業(株)製）をSynthetic Communication, 1996, 26(20), 3783-3790  に記載の方法に従いニトロ化して合成した。
パラニトロフェノールと、表１に記載のパラニトロフェノール誘導体５種、すなわち上記で合成した化合物３ａと、化合物3b（和光純薬工業(株)製）、化合物6a（和光純薬工業(株)製）、化合物6b（和光純薬工業(株)製）、化合物6c（東京化成工業(株)製）それぞれの水溶液（濃度：1.55mM）を調製した。次いで、水溶液各100μlを、それぞれ下記pH緩衝液3mLに溶解した（各パラニトロフェノール誘導体の終濃度：５０μＭ）。
緩衝液：50mMグリシン-HCl緩衝液（pH2〜5, 30℃）
50mM MES緩衝液（pH5〜8, 30℃）
50mM CHES緩衝液（pH8〜11, 30℃）
得られた溶解液について、分光光度計（日立Ｕ−３０００型）で吸収曲線を取り、405nm及びλmaxのOD値とpHをプロットしｐKaを求めた。また、405nm及びλmaxでの発色率（pH7緩衝液中におけるパラニトロフェノール誘導体の吸光度/1N NaOH溶液中におけるパラニトロフェノール誘導体の吸光度）も併せて求めた。
結果を表１に示す。【００７０】
【表１】
0005614281.tif 000009
【００７１】
参考：既知pKa
4-nitrophenol:7.1、2-fluoro-4-nitrophenol:7.1、3-4-nitrophenol:5.3、
2,3-difluoro-4-nitrophenol:4.7、2,5-difluoro-4-nitrophenol:4.7、
3,5-difluoro-4-nitrophenol:4.4、4-nitro-2,3,6-trifluorophenol:3.5、
4-nitro-2,3,5,6-tetrafluorophenol:2.9、2-chloro-4-nitrophenol:5.5。【００７２】
カルシウムイオンの定量に用いるホスホリパーゼＤの至適pHは中性付近である。よって通常、ホスホリパーゼＤを用いてカルシウムイオンを定量する際には、反応を効率良く進行させるために、反応液のpHを中性付近に設定する。また、従来の測定系の最終生成物であるパラニトロフェノールの測定を自動分析装置で行う場合、用いられる固定波長は405nm付近であることが多い。しかし、上記表１から明らかなように、従来のパラニトロフェノールは、中性付近では405nm付近の発色率が低い。
更に表１から明らかな如く、本発明に係るパラニトロフェノール誘導体は、従来のパラニトロフェノールよりもpKaが低下しており、中性付近で高発色していること、すなわち、発色率が増加し、発色安定性が向上することが判る。
以上の結果から、これらのパラニトロフェノール誘導体を遊離するフェニルホスホリルコリン誘導体が、ホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオンの定量に、より適していることがわかった。
そこで、次にこれらのパラニトロフェノール誘導体を遊離するフェニルホスホリルコリン誘導体を、下記の反応スキームに従って、合成した。【００７３】
[反応スキームＡ]
0005614281.tif 000010
【００７４】
[反応スキームＢ]
0005614281.tif 000011
【００７５】
[反応スキームＣ]
0005614281.tif 000012
【００７６】
[反応スキームＤ]
0005614281.tif 000013
【００７７】
[反応スキームＥ]
0005614281.tif 000014
【００７８】
実験例２．コリン化合物（化合物（2））の合成）
ジエチルエーテル（500ml）に、ジメチルアミノエタノール（25ml、0.249mmol）とヨードメタン（50g、0.352mmol）を添加し、0℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩をジエチルエーテル（300ml）で洗浄し、目的とするコリン化合物（反応スキームＡの化合物２）を得た（56.7g、収率99%）。【００７９】
実験例３．本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物4a）の合成  ジエチルエーテル（200ml）に、オキシ塩化リン（10g、65.2mmol）、実験例１で合成した化合物3a（反応スキームＢの化合物３において、Ｒ＝Clの化合物）（11.3g、65.2mmol）及びトリエチルアミン（6.6g、65.2mmol）を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物4a、反応スキームＢの化合物４において、Ｒ＝Clの化合物）を得た（15.0g、収率79%）。【００８０】
実施例１．本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物5a）の合成
実験例３で得られた化合物4a （15g、51.7mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶解し、それに実験例２で得られた化合物２（11.9g、51.7mmol）とキノリン（6.7g、51.7mmol）を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水（5ml）とピリジン（23ml）を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和重曹水（400ml）で中和し、Sephadex G-10（溶出液：水）で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（O-(2-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物5a、反応スキームＢの化合物５において、Ｒ＝Clの化合物）を得た（5.2g、収率30%）。
Mass（posi=339）
NMR (D2O,400MHz)  δ:8.38(d, 1H, J=2.8), 8.13-8.16(dd, 1H, J=2.8,9.2), 7.48(d, 1H, J=9.2)、4.42(t, 2H, J=4.4)、3.65(t, 2H, J=4.4)、3.13(s,9H)。【００８１】
実験例４．本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物4b）の合成
ジエチルエーテル（200ml）に、オキシ塩化リン（10g、65.2mmol）、化合物3b（反応スキームＢの化合物３において、Ｒ＝Fの化合物、和光純薬工業(株)製）（10.2g、65.2mmol）及びトリエチルアミン（6.6g、65.2mmol）を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物4b、（反応スキームＢの化合物４において、Ｒ＝Fの化合物）を得た（14.4g、収率81%）。【００８２】
実施例２．本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物5b）の合成
実験例４で得られた化合物4b （14.4g、52.6mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶解し、それに実験例２で得られた化合物２（12.2g、52.6mmol）とキノリン（6.8g、52.6mmol）を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水（5ml）とピリジン（25ml）を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）及び再結晶（溶媒：メタノール、アセトン）で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（O-(2-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物5b、反応スキームＢの化合物５において、Ｒ＝Fの化合物）を得た（6.5g、収率38%）。
Mass（posi=323）
NMR(D2O,400MHz)δ:8.02-8.10(m, 2H)、7.41-7.45(dd, 1H, J=8.0,16.8)、4.39(t, 2H, J=4.4)、3.63(t, 2H, J=4.4),3.13(s, 9H)。【００８３】
実験例５．本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物7a）の合成  ジエチルエーテル（200ml）に、オキシ塩化リン（6.8g、44.4mmol）、化合物6a（反応スキームＣの化合物６において、Ｒ＝Clの化合物、和光純薬工業(株)製）（7.7g、44.4mmol）及びトリエチルアミン（4.5g、44.4mmol）を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物7a、反応スキームＣの化合物７において、Ｒ＝Clの化合物）を得た（12.1g、収率95%）。【００８４】
実施例３．本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物8a）の合成
実験例５で得られた化合物7a （12.1g、41.7mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶解し、実験例２で得られた化合物２（9.6g、41.7mmol）とキノリン（5.4g、41.7mmol）を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水（5ml）とピリジン（25ml）を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）及び再結晶（溶媒：メタノール、アセトン）で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（O-(3-Chloro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物8a、反応スキームＣの化合物８において、Ｒ＝Clの化合物）を得た（5.1g、収率36%）。
Mass（posi=339）
NMR(D2O,400MHz)δ:8.01(dd, 1H, J=0.8,8.8)、7.38(dd, 1H, J=1.2,2.4)、7.19-7.22(m, 1H)、4.35(t, 2H, J=4.4),3.61(t, 2H, J=4.4)、3.12(s, 9H)。【００８５】
実験例６．本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物7b）の合成
ジエチルエーテル（200ml）に、オキシ塩化リン（10g、65.2mmol）、化合物6b（反応スキームＣの化合物６において、Ｒ＝Fの化合物、和光純薬工業(株)製）（10.2g、65.2mmol）及びトリエチルアミン（6.6g、65.2mmol）を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物7b、反応スキームＣの化合物７において、Ｒ＝Fの化合物）を得た（14.4g、収率81%）。【００８６】
実施例４．本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物8b）の合成
実験例６で得られた化合物7b （14.4g、52.6mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶解し、実験例２で得られた化合物２（12.2g、52.6mmol）とキノリン（6.8g、52.6mmol）を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水（5ml）とピリジン（25ml）を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）及び再結晶（溶媒：メタノール、アセトン）で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（O-(3-Fluoro-4-Nitrophenylphosphoryl)choline、化合物8b、反応スキームＣの化合物８において、Ｒ＝Fの化合物）を得た（6.6g、収率39%）。
Mass（posi=323）
NMR(D2O,400MHz)δ:8.11(dd, 1H, J=,8.8,18.0)、7.07-7.15(m, 2H)、4.35(t, 2H, J=4.4)、3.61(t, 2H, J=4.4)、3.12(s,9H)。【００８７】
実験例７．本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物7c）の合成
ジエチルエーテル（200ml）に、オキシ塩化リン（7.0g、45.6mmol）、化合物(6c)（反応スキームＣの化合物６において、Ｒ＝CF3の化合物、東京化成工業(株)製）（9.5g、45.6mmol）、トリエチルアミン（4.6g、45.6mmol）を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物7c、反応スキームＣの化合物７において、Ｒ＝CF3の化合物）を得た（12.5g、収率85%）。【００８８】
実施例５．本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物8c）の合成
実験例７で得られた化合物7c （12.5g、38.6mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶解し、実験例２で得られた化合物２（8.9g、38.6mmol）とキノリン（5.0g、38.6mmol）を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水（5ml）とピリジン（25ml）を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）及び再結晶（溶媒：メタノール、アセトン）で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（O-(4-Nitro-3-Trifluoromethylphenylphosphoryl)choline、化合物8c、反応スキームＣの化合物８において、Ｒ＝CF3の化合物）を得た（3.3g、収率23%）。
Mass（posi=373）
NMR(D2O,400MHz)δ:8.05(d, 1H, J=,8.8)、7.63(d, 1H, J=1.6)、7.51(dd, 1H, J=2.0,9.2)、4.36(t, 2H, J=4.4)、3.61(t, 2H, J=4.4)、3.12(s, 9H)。【００８９】
実験例８．３、５−ジフルオロ−４−ニトロフェノールの合成
ジクロロメタン（500ml）に３，５−ジフルオロフェノール（反応スキームＤの化合物９、和光純薬工業(株)製）（25.0g、0.19mol）を溶解し、0℃で70%濃硝酸（13.5ml、0.19mol）をゆっくり添加し、3時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水に投入し、抽出（CH2Cl2）、乾燥（MgSO4）を実施し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；酢酸エチル：ヘキサン＝１：９）で精製して、目的とする３、５−ジフルオロ−４−ニトロフェノール（反応スキームＤの化合物10）を得た（12.8g、収率38%）。【００９０】
実験例９．本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（化合物１０）の成
ジエチルエーテル（250ml）に、オキシ塩化リン（10.7g、69.7mmol）、実験例８で得られた化合物１０（12.2g、69.7mmol）、トリエチルアミン（7.1g、69.7mmol）を添加し、-78℃で終夜撹拌した。反応終了後、析出した塩を濾過し、溶媒を減圧留去して、目的とする本発明に係るフェニルホスホジクロリデート（反応スキームＤの化合物11）を得た（14.3g、収率70%）。【００９１】
実施例６．本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物12）の合成
実験例９で得られた化合物11 （14.2g、48.6mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶解し、実験例２で得られた化合物２（11.2g、48.6mmol）とキノリン（6.3g、48.6mmol）を添加し、0℃で6時間撹拌した。その後、精製水（6ml）とピリジン（21ml）を添加し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）及び再結晶（溶媒：メタノール、アセトン）で精製を行い、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（反応スキームＤの化合物12）を得た（3.2g、収率20%）。
Mass（posi=339）
NMR(D2O,400MHz)δ: 6.99 (d, 2H, J=10.8)、4.36 (t, 2H, J=4.0), 3.62 (t, 2H, J=4.0)、3.14 (s,9H)。【００９２】
実施例７．基質特異性試験
（１）試液の調製
下記の組成の各試液を調製した。
試液１：４Ｕ／ｍｌホスホリパーゼＤ（旭化成株式会社製Ｔ−０７、Streptomyces chromofuscus由来）、５３．３μＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１３．３μＭジエチレントリアミン五酢酸、３３．３ｍＭ塩化マグネシウム、０．１３％トリトンＸ−１００を含有する１．１ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）。
試液２：０〜１００ｍＭのパラニトロフェニルホスホリルコリン、もしくは上記実施例３及び４で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（反応スキームＣの化合物８ａ又は化合物８ｃ）、５Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼを含有する５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）。
カルシウムイオン溶液：塩化カルシウム（和光純薬工業(株)製、特級）を精製水で希釈して、カルシウムイオンとして100mg/dLの水溶液を調製し、カルシウムイオン溶液とした。【００９３】
（２）反応速度の測定
日立自動分析機（７１７０型）を用い、試液１を180μL、試液２を60μL、及びカルシウム溶液4μLを混合し、３７℃で反応を行い、主波長４０５ｎｍ、副波長６６０ｎｍの吸光度を経時的に測定し、反応タイムコースを得た。得られた反応タイムコースから、吸光度増加速度を計算した。
次いで、用いた各基質（パラニトロフェニルホスホリルコリン又は本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体）の濃度に対する吸光度増加速度をプロットし、逆数グラフを得た。【００９４】
（３）結果
得られた基質濃度（mM）と吸光度増加速度（ΔE/min）との関係を、図１に示す。
図１において、（ａ）はホスホリパーゼＤの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）〜（ｃ）はホスホリパーゼＤの基質として本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物８ａ又は化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
また、図１をもとに得られた各逆数グラフの近似式からＫｍを求めた。
結果を表２に示す。【００９５】
【表２】
0005614281.tif 000015
【００９６】
表２の結果から明らかな如く、化合物8a，化合物8cは、パラニトロフェニルホスホリルコリンよりもＫｍが大幅に低下し、ホスホリパーゼＤの基質特異性が著しく向上していることがわかった。【００９７】
実施例８．カルシウムイオンの定量
上記各実施例で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を用いて、カルシウムイオンの定量を行った。【００９８】
（１）試液の調製
下記の組成の各試液を調製した。
試液１：４Ｕ／ｍｌホスホリパーゼＤ（旭化成株式会社製Ｔ−０７、Streptomyces chromofuscus由来）、５３．３μＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１３．３μＭジエチレントリアミン五酢酸、３３．３ｍＭ塩化マグネシウム、０．１３％トリトンＸ−１００を含有する６１．１ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）。
試液２：１６ｍＭのパラニトロフェニルホスホリルコリン、もしくは上記実施例２，３，４，５で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（反応スキームＢの化合物5b、反応スキームＣの化合物8a、化合物8b、化合物8c）、５Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼを含有する５ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）。
カルシウムイオン標準液：マルチキャリブレーターA（和光純薬工業（株）製）  10 mg/dL。
カルシウムイオン溶液：〔和光純薬工業(株)製  塩化カルシウム、特級〕を用いてCa:20 mg/dL溶液を調製し、本品を精製水で希釈して、各濃度の水溶液（1mg/dL、2mg/dL、4mg/dL、10mg/dL、20mg/dL）を調製した。【００９９】
（２）カルシウムイオン濃度の測定
日立自動分析機（７１７０型）を用い、試液１を180μL、試液２を60μL、及び各濃度のカルシウムイオン溶液 4μLを混合し、３７℃で反応を行い、主波長４０５ｎｍ、副波長６６０ｎｍの吸光度を、各測光ポイントで経時的に測定し、反応タイムコースを得た。
結果を図２（ａ）〜（ｅ）に示す。
図２において、（ａ）はホスホリパーゼＤの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）〜（ｅ）はホスホリパーゼＤの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物５ｂ、化合物８ａ、化合物８ｂ、化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
尚、各試薬の最終反応液中の濃度は、それぞれ本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体は約４ｍＭ、ホスホリパーゼＤは約３Ｕ／ｍＬ、アルカリホスファターゼは約１．２５Ｕ／ｍＬである。
また、得られた反応タイムコースから吸光度増加速度を計算した。
別に、カルシウムイオン溶液の代わりに精製水又はカルシウムイオン標準液（10mg/dL）を用いる以外は上記と同様に反応を行い、吸光度を経時的に測定し、得られた反応タイムコースから吸光度増加速度を計算し、カルシウムイオン濃度と吸光度増加速度との関係を示す検量線を作成した。
次いで、上記で得られた、各濃度のカルシウム溶液毎に測定を行って得られた吸光度増加速度を、検量線に当てはめ、各カルシウム溶液の濃度を求めた。【０１００】
（３）結果
各カルシウム溶液のカルシウムイオン濃度（検体Ca量）と、検量線から求めた当該カルシウム溶液のカルシウムイオン濃度（測定値）との関係を図３（ａ）〜（ｅ）に示す。
図３において、（ａ）はホスホリパーゼＤの基質として従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）〜（ｅ）はホスホリパーゼＤの基質として、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物５ｂ、化合物８ａ、化合物８ｂ、化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
図３（ｂ）〜（ｅ）から明らかな如く、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を用いてカルシウムイオンの定量を行った場合、従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを用いた場合（図３(a)）と同様に、カルシウムイオン濃度に比例した、良好な検量線が得られ、ホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオンの定量に用いることが出来ることが判る。
また、測定に用いたカルシウム溶液の実際のカルシウム濃度と、検量線より求めた同じカルシウム溶液のカルシウム濃度とは良く相関しており、この測定系により得られた測定値の信頼度が高いことがわかる。【０１０１】
尚、本実施例では、従来の基質であるパラニトロフェニルホスホリルコリンの最適条件で本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体を用いたカルシウム濃度の測定を行っている。しかし、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体の最適な測定、組成条件は、パラニトロフェニルホスホリルコリンの最適条件とは異なる。これは、本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体は、パラニトロフェニルホスホリルコリンとはＫｍ値が大きく異なる（実施例７）ことからも容易に推察される。化合物８ａ及び８ｃにおいて、カルシウムイオンの濃度が高い範囲で、測定値が検量線から少しずれている（図３(ｃ)及び(ｅ)）のは、化合物８ａ及び８ｃそれぞれの最適な測定・組成条件で測定を行わなかったためと推察される。もし、化合物８Ａ、８ｃそれぞれの最適な測定・組成条件で測定を行えば、高濃度域のカルシウム濃度でも、測定結果は検量線に乗ってくると推察される。【０１０２】
実施例９．基質の経時安定性
（１）試液の調製
下記の組成の試液１及び試液２を調製した。
試液１：実施例８と同じ。
試液２：１６ｍＭのパラニトロフェニルホスホリルコリン、もしくは上記実施例４及び実施例５で合成した本発明のフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物8b又は化合物8c）、５Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼを含有する５ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）。【０１０３】
（２）溶解保存時の吸光度の測定
日立自動分析機（７１７０型）を用い、試液１を180μL、試液２を60μL、及び生理食塩水を混合し、３７℃で反応を行い、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
その後、試液２を冷蔵（７℃）と過酷（２５℃）条件にて保存し、２週間後、４週間後に、生理食塩水を試料として、同様の測定を行った。【０１０４】
（３）結果
結果を図４（ａ）〜（ｃ）に示す。
図４において、（ａ）は従来のパラニトロフェニルホスホリルコリンを、（ｂ）及び（ｃ）は本発明のニトロフェニルホスホリルコリン誘導体を、すなわち化合物８ｂ又は化合物８ｃをそれぞれ用いた場合の結果を示す。
また、図４(ａ)〜(ｃ)において、―□―は冷蔵(７℃)で保存した場合、―■―は過酷(２５℃)条件で保存した場合の結果をそれぞれ示す。
図４（ｂ）〜（ｃ）より明らかな如く、本発明に係るフェニルホスホリルコリン誘導体（化合物8b,8c）は、４週間、７℃又は２５℃で保存しても絶対吸光度の変化がほとんどなく、従来のパラニトロフェニルホスホリルコリン（図４(a)）と同程度の安定性があることが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の、色素骨格に電子吸引基が置換された新規なフェニルホスホリルコリン誘導体は、ホスホリパーゼＤの良好な基質となり得ると共に、酵素活性測定や、カルシウムイオンの測定における、発色安定性に優れ、十分な測定感度を有する発色基質となる。
【符号の説明】
【０１０６】
図４(ａ)〜(ｃ)において、―□―は冷蔵(７℃)で保存した場合、―■―は過酷(２５℃)条件で保存した場合の結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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