(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のペプチドを含む肺小細胞癌治療剤。
(III) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn Glu Pro Leu Lys Thr His Arg Glu
【請求項２】
ペプチドが、Ｔ細胞性白血病転座関連遺伝子タンパク由来である請求項１記載の肺小細胞癌治療剤。
【請求項３】
肺小細胞癌が、転移性肺小細胞癌である請求項１又は２記載の肺小細胞癌治療剤。
【請求項４】
肺小細胞癌治療剤を製造するための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項５】
以下のペプチドを含む肺小細胞癌細胞増殖抑制剤。
(III) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn Glu Pro Leu Lys Thr His Arg Glu
【請求項６】
ペプチドが、Ｔ細胞性白血病転座関連遺伝子タンパク由来である請求項５記載の肺小細胞癌細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
肺小細胞癌細胞増殖抑制剤を製造するための請求項５に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のペプチドを含有する肺小細胞癌治療剤及び肺小細胞癌細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、従前、関節リウマチ滑膜からヒト破骨細胞分化を促進あるいは抑制する新規因子の同定を目的として実験を行い、T cell leukemia translocation-associated gene (Ｔ細胞性白血病転座関連遺伝子、TCTA) タンパク由来の新規ペプチドがヒト破骨細胞分化を抑制することを見出した（特許文献１、非特許文献１）。
このTCTA遺伝子は肺小細胞癌で一部欠損が報告されているが(非特許文献２)、TCTA蛋白の機能は本発明者らが見いだした上記機能以外不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１４８５６６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kotake S et al., Bone.  2009; 45: 627-639.
【非特許文献２】Aplan PD et al., Cancer Res. 1995; 55:1917-21.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、TCTA蛋白由来のペプチドの更なる機能を解明し、前記ペプチドの新規用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、TCTA蛋白の29merペプチドがヒト肺小細胞癌の増殖を抑制することを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、以下の(I) 〜 (VI)からなる群から選ばれるペプチドを含む肺小細胞癌治療剤を提供する。
(I) Gly Gln Asn 
(II) Gly Gln Asn Gly Ser Thr
(III) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn Glu Pro Leu Lys Thr His Arg Glu
(IV) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn
(V) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe  及び
(VI) Pro Gly Leu Gly Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe
【０００７】
本発明はまた、肺小細胞癌治療剤を製造するための上記ペプチドの使用を提供する。
本発明はまた、以下の(I) 〜 (VI)からなる群から選ばれるペプチドを含む肺小細胞癌細胞増殖抑制剤を提供する。
(I) Gly Gln Asn 
(II) Gly Gln Asn Gly Ser Thr
(III) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn Glu Pro Leu Lys Thr His Arg Glu
(IV) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn
(V) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe  及び
(VI) Pro Gly Leu Gly Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe
本発明はまた、肺小細胞癌細胞増殖抑制剤を製造するための上記ペプチドの使用を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
上記ペプチドは、ヒト肺小細胞癌細胞の増殖を抑制することができることから、本発明により、優れた肺小細胞癌治療剤及び肺小細胞癌細胞増殖抑制剤を提供することができる。特に、肺癌の骨転移の治療において癌細胞の増殖抑制及び破骨細胞による骨吸収抑制の両者に有効な点から、転移性肺小細胞癌の治療剤として有用である。更に特にTCTA由来蛋白ペプチドを含有する場合、生物学的製剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ペプチドＡのヒト肺小細胞癌細胞の増殖抑制活性を示す。
【図２】scrambled ペプチドのヒト肺小細胞癌細胞の増殖抑制活性を示す。
【図３】ペプチドＡ及びscrambled ペプチド濃度が、それぞれ0μg/mL及び10μg/mLであるか、又は10μg/mL及び0μg/mLである場合のヒト肺小細胞癌細胞の増殖抑制活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で用いるペプチドは、以下のいずれかの配列：
(I) Gly Gln Asn 
(II) Gly Gln Asn Gly Ser Thr（配列番号１）
(III) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn Glu Pro Leu Lys Thr His Arg Glu（配列番号２）
(IV) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe Pro Ser Trp Glu Met Ala Ala Asn（配列番号３）
(V) Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe（配列番号４）  及び
(VI) Pro Gly Leu Gly Gly Gln Asn Gly Ser Thr Pro Asp Gly Ser Thr His Phe
Gly Gln Asn （配列番号５）
で示されるペプチドである。以降、配列番号２〜５のペプチドをそれぞれペプチドＡ、Ａ２、Ｂ及びＣと称することもある。このうち、ペプチドＡ、Ａ２及びＢが好ましく、ペプチドＡ及びＡ２がより好ましく、ペプチドＡが最も好ましい。配列番号１〜５のペプチドをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号６〜１０に示した。
【００１１】
本発明で用いるペプチドは、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びマススペクトル等を用いる公知の方法により、関節リウマチ患者の滑膜組織から単離及び精製することにより得ることができる。本発明で用いるペプチドはまた、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏｃ法により合成することもできるし、市販のアミノ酸合成装置を使用して合成することもできる。
本発明で用いるペプチドは、TCTA蛋白由来であるのが好ましい。本発明で用いるペプチドがTCTA蛋白由来である場合、生物学的製剤（biologics）とすることができる。生物学的製剤は、これまでに抗がん剤を含め、抗体製剤、受容体製剤、ホルモン製剤など臨床現場で多く使用されている。しかし、TCTA蛋白関連の生物学的製剤は知られていないことから、本発明に基づく新規生物学的製剤を利用できることが期待される。
【００１２】
本発明が治療対象とする肺小細胞癌は、肺癌の20%を占める。喫煙との関連性が大きく中枢側の気管支から生ずることが多い。悪性度が高く急速に進展し、またリンパ行性にも血行性にも早期から骨、脳などの他臓器に転移しやすいため発見時にはすでに進行癌であることが多い癌である。肺癌の骨転移の治療において癌細胞の増殖抑制及び破骨細胞による骨吸収抑制の両者に有効な点から、本発明は、転移性肺小細胞癌の治療剤として特に有用である。
【００１３】
上記ペプチドは、そのままあるいは各種の医薬組成物として投与される。このような医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、糖衣剤、デボー剤、またはシロップ剤にしてよく、普通の製剤助剤を用いて常法に従って製造することができる。
例えば錠剤は、本発明の有効成分である上記ペプチドを既知の補助物質、例えば乳糖、炭酸カルシウムまたは燐酸カルシウム等の不活性希釈剤、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤、アルギン酸、コーンスターチまたは前ゼラチン化デンプン等の膨化剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはカルボキシメチルセルロース等の滑湿剤、脂肪、ワックス、半固形及び液体のポリオール、天然油または硬化油等のソフトゼラチンカプセル及び坐薬用の賦形剤、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース、植物油等の溶液用賦形剤と混合することによって得られる。
本発明の治療剤又は抑制剤は、例えば錠剤の場合、錠剤あたり、配列番号１〜５のいずれかのペプチド100 mgと、ラクトース900 mgとから処方することができる。
本発明の治療剤又は抑制剤の投与量は、投与ルート、治療期間、患者の年齢及び体重などにより決定される。例えば、気管支鏡による局所的投与又は全身投与により、成人一日あたりの投与量として経口投与の場合で通常300 mg〜1ｇ、非経口投与の場合で通常300μｇ〜300 mｇを用いる。
【実施例１】
【００１４】
〔癌細胞の増殖抑制〕
１．ペプチド
ペプチドとしては、TCTA蛋白の細胞外ドメインのGQNを含む29merのペプチドＡ（配列番号２）を用いた。
コントロールとして、ペプチドＡのscrambled ペプチド（Ser Pro Phe Thr Gly Thr Lys Gly Ser Trp Asn Glu Thr Ala His Pro Asp His Gly Asn Glu Glu Arg Gln Ala Pro Met Ser Leu    配列番号１１）を使用した。
なお、ペプチドＡ及びペプチドＡのscrambled ペプチドは、東レリサーチセンター（鎌倉市）に合成を委託した。
２．対象と方法
癌細胞としては、ヒト肺小細胞癌細胞株RERF-LC-MA、ヒト前立腺癌細胞株PC-3及びヒト乳癌細胞株MCF-7を用いた。
これらを、0.6〜1.0×103/wellとなるように96wellプレートに接種した。次いで37℃において3日間培養した。その後、Cell proliferation kit (XTT based)を用い細胞増殖を定量化した。
次に、上記ペプチドを、0μg/mL、1μg/mL、5μg/mL又は10μg/mLとなるようにこれら培養系に添加し、37℃において3日間培養した。培養終了後、上記癌細胞の細胞数を測定した。
３．結果
ペプチドＡを、5μg/mL又は10μg/mL濃度で添加したところ、コントロールのscrambled ペプチドと比べると、RERF-LC-MA細胞は約85％に増殖が統計学的に有意に抑制された（p=0.031）(図１〜３)。しかし、PC-3細胞及びMCF-7細胞に対しては殆ど抑制効果を示さなかった（図示せず）。
【実施例２】
【００１５】
癌細胞株及び破骨細胞ペプチドを添加し、癌細胞株及び破骨細胞との相互作用に関わる分子群の発現の変化について、ｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲで測定した。
１．ペプチド
実施例１に記載のペプチドＡ及びscrambled ペプチドを用いた。
２．分子群とその発現細胞
癌細胞及び／又は破骨細胞が発現していると報告（森岡洋子ら、癌の進展におけるMMP ファミリーとRECKの役割  細胞工学  vol.28 No.7 659-679,2009）されている分子群として以下のものを用いた：
0005569886.tif 000002
なお、癌細胞としては、実施例１に示したものを用いた。【００１６】
３．方法
癌細胞及び破骨細胞を、それぞれ1〜2×105/wellとなるように別の6wellプレートに接種し、24時間後にD-MEM（1％FCS, 2mM  L-glu）に培地交換、さらに24時間後に培地交換と同時にペプチドＡ又はコントロールを添加し、さらに24時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。
４．結果
破骨細胞におけるＶＥＧＦＲ１、ＲＥＣＫ、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１４のｍＲＮＡの発現に、ペプチドＡとscrambled ペプチドとの間に有意差は無かった。この結果から、癌細胞株及び破骨細胞に対するペプチドAの作用において上記分子群の発現量は関与していないと推測される。
他方、癌細胞では、RERF-LC-MA細胞のみでペプチドＡによりＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現が減少した。この結果から、ペプチドＡはいわゆるhouse-keeping geneであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制することにより、RERF-LC-MA細胞の増殖を抑制すると推測される。【００１７】
以上、実施例から明らかなように、上記ペプチドはヒト肺小細胞癌細胞株の増殖を抑制した。これらのペプチドは低濃度でヒト破骨細胞分化を抑制する。今後ヒト組織由来である上記ペプチドは肺癌の骨転移の治療において癌細胞の増殖抑制および破骨細胞による骨吸収抑制の両者に有効な点から転移性肺小細胞癌の治療への応用が期待される。
【図１】
0005569886.tif 000003
【図２】
0005569886.tif 000004
【図３】
0005569886.tif 000005
【配列表】
0005569886000001.app