(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のＣ末端キャッピング基をペプチドまたはペプチドミメティックに組み込むことを含む、ペプチドまたはペプチドミメティックのトリプシンによる分解に対する耐性を向上させる方法：
Ｘ−Ｙ−Ｚ                （Ｉ）
式中、
ＸはＮ原子であり、Ｎ、ＯおよびＳから選択される２個までのヘテロ原子が組み込まれていてもよい、分岐したまたは分岐していないＣ1〜Ｃ10アルキルまたはアリール基により置換されていてもよい；
Ｙは、−Ｒa−Ｒb−、−Ｒa−Ｒb−Ｒb−および−Ｒb−Ｒb−Ｒa−から選ばれる基を表し、
ＲaはＣであり、
ＲbはＣである；ＲaおよびＲbの各々は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル基により置換されていても、非置換であってもよい；
Ｚは、各々５個もしくは６個の非水素原子の環状基を１〜３個含み、２個以上の環状基は融合していてもよく、１個以上の環状基は置換されていてもよい基である；Ｚ部分には最高１５個の非水素原子が組み込まれていてもよい；そして、
ＹとＺとの間の結合は、ＹのＲaもしくはＲbとＺの環状基のうちの一つの非水素原子との間の共有結合である。
【請求項２】
Ｘが非置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｙが−Ｒa−Ｒb−であり非置換である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｙが−ＣＨ2−ＣＨ2である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｚがフェニル基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
−Ｘ−Ｙ−Ｚがまとめて−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｐｈである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記キャッピングされたペプチドまたはペプチドミメティックのトリプシンによる分解に対する感受性を測定するステップを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドがそのＣ末端にカチオン性アミノ酸を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｃ末端アミノ酸に隣接したアミノ酸が少なくとも９個の非水素原子を有するものである親油性Ｒ基を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
親油性Ｒ基が９〜２０個の非水素原子を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
親油性Ｒ基が２個以上の環状基を有する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドが、長さが３〜１８個のアミノ酸である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一つで定義した式（Ｉ）の化学部分を含むまたはそれからなる化合物の、Ｃ末端キャッピング基として式（Ｉ）のその部分が組み込まれていない同じ分子と比較して、トリプシン分解に対する耐性が増加したペプチドまたはペプチドミメティックの調製における使用。
【請求項１４】
以下を含むペプチド生産の方法：
（ａ）興味があるペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること、
（ｂ）請求項１〜６のいずれか一つで定義した式（Ｉ）のＣ末端キャッピング基の前記ペプチドへの組み込みにより、前記ペプチドを修飾すること、および任意で
（ｃ）前記修飾されたペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素分解に対する耐性を向上させるためにペプチドを修飾する方法、特に酵素分解に対する耐性を向上させるためのペプチドのＣ末端修飾を伴う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドおよびタンパク質は、細胞における主要なエフェクター分子（酵素）として、ならびに代謝経路の制御および調節において、どちらも中心的な役割を演ずる。さらに、ペプチドは相当な種類の化学的性質を有するモノマーから容易に入手できるポリマーであるので、ペプチドは医薬の化学者が入手できる、化学的多様性の広大で魅力的なプールとなる。製薬会社は始め、治療的な使用のためのペプチドの市場の潜在性に興奮していた。しかしながら、ペプチドホルモンの最初の化学合成から数十年後、たいていは投与されたときのペプチドの安定性が、少なくとも一部の原因となって、薬物として承認されたペプチドは極めて少ない。
【０００３】
タンパク質分解に対する安定性は薬物にとって極めて重要である。作用部位が代謝が活発な病変部（例えば損傷部）であれば、病変部における分解に対する安定性は最大の重要性をもつ。さらに、薬物を経口で有効なものとするのであれば、胃腸管内での分解に対する安定性が必要とされる。ペプチドは通常、アミノ酸を一緒に連結しているアミド結合の酵素的な加水分解により、体内で代謝される。この分解を担っている酵素は二つの大きなクラス、末端のアミノ酸を切断するエキソペプチダーゼと、ペプチド配列内の多少特異的な部位で切断するエンドペプチダーゼに分類される。
【０００４】
医薬の化学者は、タンパク分解性の酵素によって触媒される酵素分解を回避するためのいくつかのツールを持っている。エキソペプチダーゼの作用は通常、いわゆるエンドキャッピング、すなわちＮ末端およびＣ末端アミノ酸の化学修飾により妨げることができる。典型的なエンドキャッピングとしては、Ｃ末端のアミド化と、Ｎ末端のアセチル化または脱アミノ化が挙げられる。エンドペプチダーゼのペプチドへの作用に関して、分解を阻害する通常の方法は、アミド窒素原子のメチル化か、切断部位の近くのアミノ酸の立体化学性を逆にすることである。これらの方法を用いることの利点は、ペプチドがその構造の大部分を改変されないまま保持することであり、これらの変化によって生理活性が変化し、しばしば落ちる例は十分なほどあるが、そのことが生理活性が影響を受けないことにつながっている。
【０００５】
酵素分解の課題を解決するためのより根本的な方法は、構造中にペプチドミメティック〈peptidemimetic：ペプチド疑似体〉の要素を導入することにより、加水分解されうる結合を完全に避けることである。ペプチドミメティックのアプローチの不利な面は、一般的に合成が遙かに複雑なことであり、しばしば伴われる元のペプチド構造の遙かに大きな改変もまた、生理活性の予測により大きな不確実性を引き起こすことである。それゆえ、分解酵素に対する安定性を得るための万能薬はないこと、しかしながら、各々独自の長所と欠点を有する利用可能な様々な方法の道具箱を医薬の化学者が持っていることは明白なはずである。
【０００６】
ヒト胃腸管内で最も重要なエンドペプチダーゼは、胃で見つかるペプシンと、腸の上部で見つかるトリプシンおよびキモトリプシンである。トリプシンおよびキモトリプシンはどちらも機構的にセリンプロテアーゼに分類されるが、それらは三次元構造および基質特異性のどちらも異なる。キモトリプシンは大きな親油性アミノ酸（典型的にはＰｈｅ）に隣接するＣ末端側でペプチド結合を切断するが、これに対してトリプシンはカチオン性残基であるリジンおよびアルギニンのＣ末端側で切断する。
【０００７】
いくつかの治療上有用なペプチドはカチオン性アミノ酸を含んでいる。デスモプレシン、１−デアミノ−８−Ｄ−アルギニン−バソプレシン（Ｍｐａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）はその例となり得る。デスモプレシンは、尿崩症、夜尿および尿失禁と関連した利尿の治療に用いられる、経口で効力のあるバソプレシン（抗利尿ホルモン）の類似体である。胃腸管内での酵素分解に対する耐性は経口的な生体利用性の前提条件であるので、カチオン性アミノ酸を含んでいるペプチドにとってトリプシンは胃腸管内での大きな障害物となる。デスモプレシンの経口的な生体利用性が成功した主因は、８位にあるカチオン性のアルギニン残基をＤ−エナンチオマーに転換したことであって、トリプシンによって当該Ｄ−エナンチオマーは認識されず、それゆえ分解されないのである。デスモプレシンに用いられているトリプシン活性を回避するための解決策は確かに一般的ではなく、立体異性体のペプチドの生体利用性は通常、天然の立体異性体のそれと非常に異なる（そして極めて頻繁に劣る）。
【０００８】
潜在的に臨床的に有用なカチオン性ペプチドのもう一つの重要な種類は、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。ＡＭＰは、抵抗性微生物によって起きる感染症の治療における大きな可能性を有する、構造的に多様な種類のカチオン性ペプチドである。ＡＭＰは一様にカチオン性なので、それらもトリプシンにとっての潜在的な標的である。トリプシンは、最低でもおよそ６個のアミノ酸がペプチド基質中にあることを必要とするエンドペプチダーゼなので、非常に短いＡＭＰはエンドペプチダーゼ酵素に対して安定的であるはずだとみなされてきた。発明者にとって大変思いがけないことに、相当の数の短いＡＭＰがトリプシンによって分解されることがわかった。
【発明の開示】
【０００９】
ペプチドの安定性を改善するための、特にトリプシンによる切断を低減するための研究において、本発明者は、驚くべきことに、ある特定の種類のＣ末端キャッピング基がトリプシンによる切断に対するペプチドの耐性を顕著に増強し、そのためペプチドを経口的に投与したときのインビボでの安定性を向上させることを見出した。
【００１０】
したがって、一つの側面により、本発明は、
式（Ｉ）のＣ末端キャッピング基をペプチドに組み込むことを含む、ペプチドのトリプシンによる分解に対する耐性を向上させる方法を提供する：
Ｘ−Ｙ−Ｚ                （Ｉ）
式中、
ＸはＮ原子であり、置換されていないことが好ましいが、分岐したまたは分岐していないＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはアリール基、例えばメチル、エチルまたはフェニル基により置換されていてもよく、この基はＮ、ＯおよびＳから選択される２個までのヘテロ原子が組み込まれていてもよい；
Ｙは、−Ｒａ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｒｂ−Ｒｂ−および−Ｒｂ−Ｒｂ−Ｒａ−から選ばれる基を表し、
ＲａはＣ、Ｏ、ＳまたはＮ、好ましくはＣであり、
ＲｂはＣである；
ＲａおよびＲｂの各々は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基により置換されていても、非置換であってもよく、好ましくはＹは−Ｒａ−Ｒｂ−（ここでＲａ−は好ましくはＣである）であり、好ましくはこの基は非置換であり、Ｙが−Ｒａ−Ｒｂ−Ｒｂ−または−Ｒｂ−Ｒｂ−Ｒａ−である場合は一以上のＲａおよびＲｂは置換されている；
Ｚは、各々５個もしくは６個の非水素原子（好ましくはＣ原子）の環状基を１〜３個含み、２個以上の環状基が融合していてもよい基である；１個以上の環は置換されていてもよく、これらの置換は、典型的には含まないが、極性基を含んでいてもよく、適切な置換基としてはハロゲン、好ましくはフッ素もしくは臭素およびＣ１〜Ｃ４アルキル基が挙げられる；
Ｚ部分には最高１５個、好ましくは５〜１２個の非水素原子が組み込まれていてもよく、最も好ましくはその部分はフェニル基であるかそれを含む；
ＹとＺとの間の結合は、ＹのＲａもしくはＲｂとＺの環状基のうちの一つの非水素原子との間の共有結合である。
【００１１】
好ましくは、Ｃ末端キャッピング基は２−フェニルエチルアミンであるかそれを含み、そのエチル基部分およびアミンの窒素は、上述のように置換されていてもよいが置換されていないことが好ましい。また、そのフェニル基は、特にＣ１〜Ｃ４アルキル基によって上記のように置換されていてもよいが、置換されていないことが好ましい。
【００１２】
特に好ましいのは、式（Ｉ）のＣ末端キャッピング基である：
Ｘ−Ｙ−Ｚ                （Ｉ）
式中、
ＸはＮＨ基である；
Ｙは、−Ｒａ−Ｒｂであり、ここで、
ＲａはＣ、Ｏ、ＳまたはＮ、好ましくはＣであり、
ＲｂはＣである；
ＲａおよびＲｂの各々は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基により置換されていてもよく、非置換であってもよい；
Ｚは、上で定義した通りである。
【００１３】
理論に束縛されることは望まないが、Ｃ末端キャッピング基の親油的な特性だけでなくＣ末端キャッピング基の三次元形状およびサイズが全て、トリプシンによる分解に対する感受性の低下をもたらすことに寄与すると考えられる。
【００１４】
一つの態様において、前記方法はさらに、前記修飾された、すなわちキャッピングされたペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定するステップを含む。また、この方法は、同じペプチドではあるが本発明によるＣ末端キャッピング基を欠いているもののトリプシンによる分解に対する感受性を測定するステップ、および任意でそれらの結果を比較するステップを含んでいてもよい。
【００１５】
「前記ペプチドへの組み込み」に言及する場合、ペプチドが初めからＣ末端キャッピング基を組み込むように合成してもよいことが理解されよう。その代わりとして、必須ではないが、最初にペプチドを合成し、それからＣ末端キャッピング基を組み込むように修飾することも可能である。Ｃ末端キャッピング基は、ＸがＣ末端アミノ酸に共有結合するような方法で、ペプチドに組み込まれる。好ましくは、共有結合はＣ末端アミノ酸のカルボニル炭素とＸの窒素の間に形成される。Ｃ末端キャッピング基は、トリプシンによる分解に対するペプチドの耐性を（Ｃ末端キャッピング基のない同じペプチドと比較して）「向上させる」目的で、ペプチドに組み込まれる。「分解」とはトリプシンによる単一または複数の切断反応をいう。
【００１６】
別の見方をすれば、本発明は、上で定義した式（Ｉ）の化学部分を含むまたはそれからなる化合物の、Ｃ末端キャッピング基として式（Ｉ）の部分が組み込まれていない同じペプチドと比較して、トリプシン分解に対する耐性が増加したペプチドペプチドミメティックの調製における使用を提供する。
【００１７】
更なる側面において、本発明は、以下を含むペプチド生産の方法を提供する：
（ａ）興味があるペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること、
（ｂ）上で定義した式（Ｉ）のＣ末端キャッピング基の前記ペプチドへの組み込みにより、前記ペプチドを修飾すること、および任意で
（ｃ）前記修飾されたペプチドのトリプシンによる分解に対する感受性を測定すること。
【００１８】
任意で、前記方法はステップ（ａ）の前にペプチドのデノボ合成を伴う。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、治療における使用のための、特に疾患または感染の経口治療のための、例えば抗菌物質としての、本発明の方法に従って調製されたペプチド、および疾患または感染の経口治療の方法を含む。
【００２０】
本発明に従って修飾されたペプチドは、標準的なＬ型の立体配置を有するカチオン性アミノ酸をＣ末端残基（本明細書において位置（Ｃ）と呼ぶ）として有する。当該カチオン性アミノ酸は、好ましくはリジンまたはアルギニンだが、ヒスチジンまたはｐＨ７．０で正電荷を有する非遺伝的コードアミノ酸もまたカバーされる。カチオン性アミノ酸を供する適切な非遺伝的コードアミノ酸または修飾アミノ酸としては、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸およびホモアルギニン、またトリメチルリジンおよびトリメチルオルニチンといった、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの類似体が挙げられる。
【００２１】
位置（Ｃ−１）において、ペプチドは典型的には大きな親油性Ｒ基のあるアミノ酸を有する。Ｒ基は、好ましくは少なくとも９個、より好ましくは少なくとも１０個または１１個の非水素原子、例えば、９〜２０個、好ましくは９〜１７個の非水素原子を有する。典型的には、Ｒ基は融合またはつながっていてもよい２個以上の環状基を含んでおり、これらの環状基は典型的には５または６個の非水素原子、好ましくは５または６個の炭素を含む。
【００２２】
さらなるカチオン性残基が、典型的には位置（Ｃ−２）に存在していてもよい。
【００２３】
ペプチドは、３個のアミノ酸およびそれより上の任意の長さのもの、典型的には長さが３〜２５個、例えば３〜１８個、好ましくは３〜１２個、より好ましくは３〜９個のアミノ酸であるものとすることができる。
【００２４】
好適な種類のペプチドは、微生物の細胞膜に対する溶解効果を有する抗菌ペプチドである。そのような分子は、例えばＷＯ０１／６６１４７に開示されている。これらのペプチドおよび他のより大きな抗菌ペプチドはしばしば「カチオン性」と言われ、典型的にはｐＨ７で正電荷を有する３個以上の基を備えている。
【００２５】
本発明のペプチドは、いかなる好都合な方法で合成してもよい。一般的に、存在する反応基（例えばアミノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は、合成全体の間、保護されることになる。そのため、合成の最終ステップは、保護された本発明の誘導体を脱保護することになる。
【００２６】
ペプチドの構築にあたって、Ｃ末端から開始する手順が好適であるが、原則としてＣ末端から開始してもＮ末端から開始してもよい。
【００２７】
ペプチド合成の方法は周知の技術であるが、本発明にとって、固相担体上で合成を行うことが特に好都合となり得、そのような支持体は周知の技術である。
【００２８】
アミノ酸のために幅広い選択のできる保護基が知られており、適切なアミンの保護基としては、カルボベンゾキシ（Ｚと記すこともある）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃと記すこともある）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃと記すこともある）を挙げることができる。ペプチドがＣ末端の先端から構築される場合、アミン保護基は、付加される新たな残基各々のα−アミノ基に存在することになり、次の結合ステップの前に選択的に除去される必要があることが認識されよう。
【００２９】
例えば、採用することのできるカルボキシル保護基としては、固体担体に結合する基、例えばポリスチレンに連結したメチル基とともに、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｐ−ニトロベンジル（ＯＮｂ）、ペンタクロロフェニル（ＯＰＣｌＰ）、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）またはｔ−ブチル（ＯｔＢｕ）基のような容易に切断されるエステル基が挙げられる。
【００３０】
チオール保護基としては、ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、トリチル（Ｔｒｔ）およびアセトアミドメチル（Ａｃｍ）が挙げられる。
【００３１】
アミンおよびカルボキシル保護基を除去するための広範囲にわたる手順が存在する。しかしながら、これらは採用される合成戦略に適合したものでなければならない。側鎖保護基は、一時的なα−アミノ保護基を次の結合ステップの前に除去するために用いられる条件に対して、安定でなければならない。
【００３２】
Ｂｏｃのようなアミン保護基およびｔＢｕのようなカルボキシル保護基は、例えばトリフルオロ酢酸を用いる、酸処理によって同時に除去することができる。Ｔｒｔのようなチオール保護基は、ヨウ素のような酸化剤を用いて選択的に除去することができる。
【００３３】
ペプチドに加えて、本明細書に記載したＣ末端キャッピング基は、ペプチドミメティック化合物の安定性を向上させるために用いることもできる。したがって、さらなる側面において、本発明は、上で定義した式（Ｉ）のＣ末端キャッピング基をペプチドミメティックに組み込むことを含む、ペプチドミメティック化合物のトリプシンによる分解に対する耐性を向上させる方法を提供する。
【００３４】
ペプチドミメティックは、典型的には、そのペプチド等価物の極性、三次元サイズおよび官能性（生理活性）を保持していること、しかしそこでは、たいていはより安定的な結合によって、ペプチド結合が置換されていることにより特徴付けられる。「安定的な」によって、加水分解酵素による酵素分解に対する耐性がより高いことが意味される。一般的に、アミド結合を置換する結合（アミド結合代用物）は、アミド結合の性質（例えばコンホメ−ション、立体的な大きさ、静電気的特性、水素結合の可能性など）の多くを保存する。"Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad. Pubの第14章は、ペプチドミメティックの設計および合成のための技術に関する一般的な議論を提供している。適切なアミド結合代用物としては、以下の群が挙げられる：Ｎ−アルキル化（Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47）、レトロ逆アミド〈retro−inverse amide〉（Chorev, M and Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266）、チオアミド（Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433）、チオエステル、ホスホナート、ケトメチレン（Hoffman, R.V. and Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107）、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル（Allmendinger, T. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297）、ビニル、メチレンアミノ（Sasaki, Y and Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13）、メチレンチオ（Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19）、アルカン（Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270）およびスルホンアミド（Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391）。
【００３５】
上で引用した教科書中で議論されているように、アミド結合の置換だけでなく、ジないしトリペプチドミメティック構造によるより大きな構造部分の置換をペプチドミメティックは伴っていてもよい。そして、この場合、アゾール由来のミメティックのようなペプチド結合を伴うミメティック部分は、ジペプチド置換として用いることができる。しかしながらアミド結合が上述のように置換されているペプチドミメティックすなわちペプチドミメティックのバックボーンは好適である。
【００３６】
適切なペプチドミメティックとしては、還元剤、例えばボランやリチウム・アルミニウム水素化物のような水素化物試薬を用いた処理によりアミド結合がメチレンアミンに還元されている、還元ペプチドが挙げられる。そのような還元には、分子の全体的なカチオン性を向上させるという追加の利点がある。
【００３７】
他のペプチドミメティックとしては、例えばアミド官能化ポリグリジンの段階的合成によって形成される、ペプトイド〈peptoid〉挙げられる。いくつかのペプチドミメティックのバックボーンは、過メチル化されている〈permethylated〉ペプチドのような、それらのペプチド前駆体から容易に入手できるものとなる。適切な方法はOstresh, J.M. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91, 11138−11142に記載されている。強塩基性の条件は、Ｏ−メチル化よりもＮ−メチル化を促進することになり、ペプチド結合中の窒素原子およびＮ末端窒素の一部または全部がメチル化される結果になる。
【００３８】
好適なペプチドミメティックのバックボーンとしては、置換されたアルカンおよびアルケンと共に、ポリエステル、ポリアミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。ペプチドミメティックは、好ましくは、本明細書で述べたように修飾されていてもよいＮおよびＣ末端を有することになる。
本発明のＣ末端キャッピング基は親油性部分を含んでいるが、このことは、修飾されるペプチドの親油的な特性を保持するないし向上させることが望まれている場合に有利である。例えば、抗菌ペプチドは、典型的には親油基を組み込んでいることが有利である。
【００３９】
すべての場合において、分子の安定性は、トリプシンによる分解に対する耐性のインビトロでのアッセイにより評価することが可能である。適切な方法としては逆相ＨＰＬＣが挙げられ、これは本明細書の実施例に記載されている。このアッセイを用いることにより、二つの分子、例えば本明細書に記載したＣ末端キャッピング基のあるペプチドとないペプチドの耐性を比較することが可能である。好ましくは、安定性は少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３、４または５倍、最も好ましくは少なくとも６倍に向上する。
【００４０】
安定性は、生物学的半減期、すなわちペプチドの総量の半分が破壊されるのにかかる時間によって表現できる。半減期がインビトロでアッセイされる場合、それはアッセイにおいて存在するペプチドの初期濃度に依存する。そのため、同一か少なくとも比較可能なアッセイ条件下でペプチドの半減期を比較することが重要である。このように、生物学的半減期は、特定の分子の絶対的な特質ではなく、相対的な特質である。
【００４１】
これより、以下の非限定的な図および実施例を参照することにより、本発明をさらに詳しく説明することにする。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本明細書に記載のペプチドに組み込むことのできるアミノ酸誘導体を調製するための一般的なスキームを示す。
【図２】図２は、トリプシンが小さいペプチドを切断しうる、２つの考えられる様式を示す。
【図３】図３は、トリプシンで処理した結果の、ペプチドおよび代謝産物濃度の対時間の変動を示す。コーネル大学からのＭｅｄｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて、分解の始めの５時間の間に集められたデータに基づいて半減期を算出した。
【実施例】
【００４３】
［実施例１］ペプチドの調製およびトリプシンによる分解の測定
化学薬品
ウシ膵臓由来の基本的に無塩のトリプシン（Ｔ８８０２、１００００〜１５０００ＢＡＥＥユニット／ｍｇタンパク質）はSigma−Aldrichから供給された。保護アミノ酸はBachem AGまたはAldrichから購入した。化学薬品はFluka Acros. Merck, Riedel−de HaenまたはAldrichから購入した。
【００４４】
アミノ酸の調製
非市販のアミノ酸誘導体を、図１（スキーム１）に概説した一般的なスキームに従って調製した。
【００４５】
Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（２）のベンジル化
Ｂｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（１、１当量）を９０％メタノール水溶液に溶解し、それが弱アルカリ性になるまで（リトマス試験紙により判定した）炭酸セシウムを添加して中和した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、トルエンとの共沸蒸留を繰り返すことでＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンのセシウム塩に残存している水をさらに減少させた。できた乾燥塩をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。臭化ベンジル（１．２当量）を添加し、できた混合液を６〜８時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、油状物を生じさせ、それは標記化合物（２）を含んでいた。油状物を酢酸エチルと酢酸（１５％ｖ／ｖ）の間で分離し、有機相を同量のクエン酸溶液（５％ｖ／ｖ、２回）、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液および塩水で洗浄した。溶出剤としてＣＨ２Ｃｌ２：酢酸エチル（９５：５ｖ／ｖ）を用いたフラッシュクロマトグラフィによる精製後、標記化合物を淡黄色の油状物として８５％の収率で単離した。結晶のベンジルＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニンは、再結晶によってｎ−ヘプタンから得ることが可能だった。
【００４６】
鈴木・宮浦カップリングのための一般的な手順
ベンジルＢｏｃ−４−ヨードフェニルアラニン（１当量）、アリールボロン酸（１．５当量）、炭酸ナトリウム（２当量）、パラジウム酢酸塩（０．０５当量）およびトリオルト−トリルホスフィン（０．１当量）を、ジメトキシエタン（６ｍｌ／ｍｍｏｌアミノ酸）および水（１ｍｌ／ｍｍｏｌアミノ酸）の脱気した混合液に添加した。反応混合液をアルゴン下に保持し、４〜６時間、８０度℃に加熱した。室温に冷却後、混合液をシリカゲルおよび炭酸ナトリウムの短いパッドでろ過した。フィルターケークを酢酸エチルでさらに洗浄し、他の画分とあわせてから減圧下で溶媒を除去した。生成物を、溶出剤として酢酸エチルおよびｎ−ヘキサンの混合液を用いたフラッシュクロマトグラフィにより精製した。
【００４７】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ(ｔ−Ｂｕ)−ＯＢｎ（３ａ）の調製
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、４−ｔ−ブチルフェニルボロン酸から標記化合物を７９％の収率で調製した。溶出剤として酢酸エチル：ｎ−ヘキサン溶出剤（８０：２０ｖ／ｖ）を採用したフラッシュクロマトグラフィの後に、３ａを単離した。
【００４８】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ(４−Ｐｈ)−ＯＢｎ（３ｂ）の調製
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、４−ビフェニルボロン酸から標記化合物を６１％の収率で調製した。粗生成物の再結晶によりｎ−ヘプタンから３ｂを単離した。
【００４９】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ(ｎ−Ｂｕ)−ＯＢｎ（３ｃ）の調製
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、４−ｎ−ブチルフェニルボロン酸から標記化合物を５３％の収率で調製した。８０：２０の酢酸エチル：ｎ−ヘキサンを溶出剤として用いて３ｃを精製した。
【００５０】
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ(４−(２−ナフチル))−ＯＢｎ（３ｄ）の調製
鈴木カップリングのための一般的な手順を用いて、２−ナフチルボロン酸から標記化合物を６８％の収率で調製した。粗生成物の再結晶によりｎ−ヘプタンから３ｄを単離した。
【００５１】
ベンジルエステルのエステル分解の一般的な手順
ベンジルエステルをＤＭＦに溶解し、雰囲気圧および雰囲気温度で２日間、触媒として１０％パラジウム−炭素を用いて水素化した。反応終了時に濾過により触媒を除去し、減圧下で溶媒を除去した。再結晶によりジエチルエーテルから遊離酸を単離した。
【００５２】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ(４−ｔ−Ｂｕ)−ＯＨ（４ａ）の調製
エステル分解のための一般的な手順を用いて、３ａから標記化合物を６５％の収率で調製した。
【００５３】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ(４−Ｐｈ)−ＯＨ（４ｂ）の調製
エステル分解のための一般的な手順を用いて、３ｂから標記化合物を６１％の収率で調製した。
【００５４】
Ｂｏｃ−Ｂｉｐ(４−ｎ−Ｂｕ)−ＯＨ（４ｃ）の調製
エステル分解のための一般的な手順を用いて、３ｃから標記化合物を６１％の収率で調製した。
【００５５】
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ(４−(２−ナフチル))−ＯＨ（４ｄ）の調製
エステル分解のための一般的な手順を用いて、３ｄから標記化合物を６８％の収率で調製した。
【００５６】
カップリング試薬としてＨＢＴＵを用いる溶液相ペプチド合成の一般的な手順
以下の一般的な手順に従って、Ｂｏｃ保護戦略を用いた段階的アミノ酸カップリングにより、ペプチドを溶液中で調製した。遊離アミノ基のあるＣ末端ペプチド部（１当量）、Ｂｏｃ保護アミノ酸（１．０５当量）および１−ＨＯＢｔ（１．８当量）をＤＭＦ（アミノ成分２〜４ｍｌ／ｍｍｏｌ）に溶解してから、ＤＩＰＥＡ（４．８当量）を添加した。反応混合液を氷冷してからＨＢＴＵ（１．２当量）を添加し、１〜２時間周囲温度で反応混合液を撹拌した。反応混合液を酢酸エチルで希釈し、クエン酸溶液（５％ｖ／ｖ）、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液および塩水で洗浄した。真空下で溶媒を除去し、できたペプチドのＢｏｃ保護基を、無水メタノール中の９５％ＴＦＡまたは塩化アセチルを用いて暗所で脱保護した。
【００５７】
ＮＨ２−Ａｒｇ−Ｎ(ＣＨ２Ｐｈ)２のＰｙＣｌｏｐ合成を用いた溶液相アミド形成
詳細は、Coste, J., Frerot, E., and Jouin, P. (1994) Coupling N-Methylated Amino-Acids Using Pybrop and Pyclop Halogenophosphonium Salts - Mechanism and Fields of Application. J. Org. Chem. 59, 2437−2446)を参照のこと。乾燥したＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）およびＤＭＦ（１ｍｌ）にＢｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ（１当量）、ＮＨ(ＣＨ２Ｐｈ)２（１．１当量）およびＰｙＣｌｏＰ（１当量）が溶解した溶液。その溶液を氷冷し、撹拌しながらＤＩＰＥＡ（２当量）を添加した。室温で１時間溶液を撹拌した。反応混合液を蒸発させ、酢酸エチルに再溶解し、クエン酸溶液（５％ｖ／ｖ）、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液および塩水で洗浄した。真空下で溶媒を除去し、できたアミノ酸誘導体のＢｏｃ保護基を９５％ＴＦＡを用いて暗所で脱保護した。
【００５８】
ペプチド精製および分析−ＲＰ−ＨＰＬＣ
水およびアセトニトリル（どちらも０．１％のＴＦＡを含んでいる）の混合液を溶出剤とする、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）Ｃ１８カラム（１００Å、１５μｍ、２５×１００ｍｍ）での逆相ＨＰＬＣを用いて、ペプチドを精製した。さらに、分析用Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ社）Ｃ１８カラム（１００Å、５μｍ、３．９×１５０ｍｍ）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ四重極質量分析計（ＶＧ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アルトリンガム、英国）での正イオン・エレクトロスプレー・マススペクトル分析により、ペプチドの純度を分析した。
【００５９】
ペプチド半減期の測定および算出
最終的なペプチド濃度が１ｍｇ／ｍｌになるよう、各ペプチドを０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．２）５０ｍｌにトリプシン１ｍｇを溶解して、トリプシン溶液を調製した。安定性の定量のため、できて間もないトリプシン溶液２５０μｌおよびペプチド溶液２５０μｌを、浸透台上、３７℃で、０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）２ｍｌ中でインキュベートした。０．５ｍｌのアリコートを異なる時間間隔でサンプリングし、１％のＴＦＡを含む、水：アセトニトリル（６０：４０ｖ／ｖ）０．５ｍｌで希釈し、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。３７℃で０時間および２０時間後に採られたトリプシン無添加のサンプルをネガティブコントロールとして用いた。アッセイの始めの５時間の間に採られたサンプルの、２５４ｎｍのピーク面積の積分値を、コーネル大学からのＭｅｄｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いてｔ１／２を生成するために用いた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ｃで動態学的プロファイルのプロットを作成した。
【００６０】
トリプシン分解からの代謝産物の同一性は、ペプチドの予備的なトリプシン分解、精製およびＥＳＭＳによる構造決定よって、または標品試料の化学合成によってのどちらかで判定した。
【００６１】
トリプシンは、正に荷電した残基、アルギニン、リジンおよびヒスチジンのＣ末端側でペプチドを切断する。試験されたすべてのペプチドは二つのアルギニン残基を、一つはＣ末端に、一つはＮ末端に含んでいる。それゆえ、ペプチドは容易に切断されると考えられる二つの別々の結合を含んでいる。当該結合は、図２の切断様式Ｉに対応するＣ末端アルギニンとＸ−Ｙ−Ｚ−基間、あるいはまた、切断様式ＩＩに対応するＮ末端アルギニンとＣ−１−残基間のどちらかである。したがって、発明者はＨＰＬＣを用いることによってペプチド切断の速度を監視することに決めたが、それは、この方法が速度を測定することが可能であるのみならず、同時に切断産物の構造を特徴付けることにより切断の様式を判定することも可能だからである。
【００６２】
Ｃ末端キャッピング部分のトリプシンに対する安定性への影響を探索するために、ペプチドのライブラリを設計した。結果を表１に示す。本発明によるＣ末端キャッピング基がさまざまなペプチドの安定性を少なくとも２倍で、しかしたいていは７倍ないしさらに大きな桁で向上させたことを、表１は示す。
【００６３】
図３は、本発明によるＣ末端キャッピング基を備えていない化合物Ａ、およびそのようなＣ末端キャッピング基を備えている化合物Ｄについて、ペプチドおよび代謝産物（Ｈ−Ａｒｇ−親油性アミノ酸−Ａｒｇ−ＯＨ）の相対量の、時間に対するプロットを示す。
【００６４】
【表１】
0005433586.tif 000002
【００６５】
［実施例２］本明細書に記載したキャッピング基が組み込まれたさらなるペプチドの調製
更なる化合物を本発明の方法に従って調製し、さまざまな細菌に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）値を得た。
【００６６】
Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＮＨ(ＣＨ２)２（２−Ｂｒ−フェニル基）
Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＯＭｅの鹸化
ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（３７３ｍｇ、８．９ｍｍｏｌ）を、ＢｏｃＡｒｇＴｂｔＡｒｇ−ＯＭｅ・２ＨＣｌ（２．９ｍｍｏｌ、２．５ｇ、ＷＯ０１／６６１４７に記載されたようにして調製）がＨ２Ｏ（５ｍｌ）ＴＨＦ（２０ｍｌ）混合液に溶解した無色の溶液に添加し、室温で３０分間撹拌して反応させたところ、その間にそれは急速に黄色を発色した。希釈したＨＣｌ（５２ｍｌ）および飽和塩水（３５ｍｌ）を添加し、できた混合液をＤＣＭで抽出した。ＤＣＭを蒸発させ、有機物質をＤＣＭに再溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して濃縮した。得られたＢｏｃＡｒｇＴｂｔＡｒｇ−ＯＨのかたまり：２．４５ｇ、９３％。
【００６７】
ＰｙＢＯＰ媒介カップリング
ＢｏｃＡｒｇＴｂｔＡｒｇＣＯ２ＨのＴＦＡ塩（３６５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．９ｍｌ）に溶解した２−ブロモフェニルエチルアミン（５３μｌ）と混合し、ＤＩＰＥＡ（１２０μｌ）を添加した。反応混合液を５分間室温で撹拌してからＰｙＢＯＰ（１９４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を添加し、それから３時間放置した。精密検査の前に混合液をＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で希釈し、２×３０ｍｌの５％クエン酸溶液、２×３０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３溶液、３０ｍｌの飽和塩水で洗浄し、その後Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して濃縮した。カップリング試薬由来の副産物を含んでいる油状物（４３２ｍｇ）として粗生成物を単離した。粗精製物を１，４−ジオキサンに溶解した４ＭのＨＣｌ１５ｍｌに溶解し、濃縮および逆相クロマトグラフィによる最終的な精製の前に、それを室温で３０分間撹拌することにより、Ｂｏｃ基を除去した。
純度：＞９５％、エレクトロスプレー・マススペクトル分析（ｍ／ｚ、プロトン化された分子イオン）：８６６．４８／８６８．５６（計算値）、８６６．５／８６８，５（観測値）。
【００６８】
微生物学的データ
最小阻止濃度（ｍｇ／ｌ）、Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｂｔ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ
【００６９】
【表２】
0005433586.tif 000003
【図１】
0005433586.tif 000004
【図２】
0005433586.tif 000005
【図３】
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