(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の数の接着した細胞に達するためのバイオリアクター内の生体外で接着した細胞を拡張させる方法であって、
ａ）赤血球、血小板および間葉系幹細胞を含む接着した細胞を含有する未浄化細胞の集団をバイオリアクター内の中空繊維基板に直接播種し、その結果、５〜５０間葉系幹細胞／ｃｍ2の低密度の前記間葉系幹細胞がバイオリアクター内の前記中空繊維基板に接着することであって、バイオリアクターは、前記間葉系幹細胞の成長のための閉鎖した無菌システムを提供し、前記未浄化細胞の集団は、前記未浄化細胞の集団の直接播種前に浄化手順を受けない細胞から成り、前記直接播種は汚染細胞を除去することなく未浄化細胞の集団をバイオリアクターに直接播種することを含み、汚染細胞は、血小板と赤血球を含み、
ｂ）前記接着した間葉系幹細胞を前記中空繊維基板上で拡張させることと、
ｃ）前記膨張した間葉系幹細胞が密集度に達する前に前記拡張した間葉系幹細胞を中空繊維基板から除去すること、
ｄ）前記中空繊維基板上で除去された拡張した間葉系幹細胞を再播種することと、
ｅ）所望の数の間葉系幹細胞に達するまで、ステップｂ）〜ｄ）を繰り返すこと、
の各ステップを備える方法。
【請求項２】
前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化骨髄を播種することをさらに備える請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化末梢血液細胞を播種することをさらに備える請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化臍帯細胞を播種することをさらに備える請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化胎芽細胞を播種することをさらに備える請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記中空繊維基板は、合成膜である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記合成膜は、ポリアミド、ポリアリールエーテルスルホンおよびポリビニルピロリドンの混合物を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記合成膜は、０．５％の熱可塑性ポリウレタンを含む請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本願は、２００６年６月２６日に出願された米国予備特許出願第６０／８０５，８０１号の優先権を主張する。
【０００２】
ヒト幹細胞（huhan stem cells）は、培養液中で少量のドナー細胞から膨張しており、損傷した組織または欠陥のある組織を修復するかまたは取り替えるために使用することができ、広い範囲の疾病の治療のために広い臨床用途を有する。再生医療の分野における最近の進歩は、幹細胞が、独特の特性、たとえば、自己再生能力、未分化状態を維持する能力、および、特定の状態下で分化状態に分化する能力を有することを例証する。
【背景技術】
【０００３】
再生医の重要な構成要素として、細胞が生長し膨張するための最適な環境を提供する際に、バイオリアクタまたは細胞膨張システムが、重要な役割を演じる。バイオリアクタは、細胞に栄養を与え、代謝産物を除去し、さらに、閉鎖した無菌システムにおける細胞生長を助ける生化学的環境を提供する。
【０００４】
多くのタイプのバイオリアクタが、現在利用可能である。もっとも一般的なものの２つが、フラットプレートバイオリアクタおよび中空繊維(hollow fibera)バイオリアクタを含む。フラットプレートバイオリアクタは、大きな平らな表面に細胞が生長するのを可能にし、一方、中空繊維バイオリアクタは、中空繊維の内側または外側のいずれかに細胞が生長するのを可能にする。
【０００５】
幹細胞生長および複製の分野における従来の知恵は、バイオリアクタまたは他の生体外細胞膨張システムにおいて、接着細胞たとえば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）(mesenchymal stem cells)が、他のＭＳＣによって密接に囲繞されているときにより速く複製し、したがって、大きい数のＭＳＣを細胞膨張システムに初期装填すべきであると考えている。従来の知恵はまた、バイオリアクタで膨張する最良のＭＳＣは、バイオリアクタで膨張する前に高度に浄化されているかまたは他の汚染細胞タイプから分離されている細胞であると考えている。本発明の方法は、驚くべきことに、これが、そうではないことを教示している。
【特許文献１】米国予備特許出願第６０／８０５，８０１号
【発明の開示】
【０００６】
(発明の概要)
本発明は、生体外で間葉系幹細胞を膨張させる方法に関し、間葉系幹細胞を含有する細胞の集団を基板に播種し、そのため、低密度の間葉系幹細胞が基板に接着することと、接着した間葉系幹細胞を基板上で膨張させることと、膨張した間葉系幹細胞を基板から除去することと、間葉系幹細胞を同一の基板または異なる基板に再播種することと、の各ステップを含む。
【０００７】
(詳細な説明)
本発明は、細胞培養システムにＭＳＣを播種し膨張させる方法に関する。
【０００８】
上記に検討されたように、足場依存性細胞たとえばＭＳＣ等を培養するための多数のバイオリアクタ構成が存在し、本発明は、いずれの特定の構成に依存しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
しかし、限定することは意味せず、単に１つの例として、中空繊維バイオリアクタが、図１に示されている。本発明に使用されてもよい細胞膨張モジュールまたはバイオリアクタ１０は、ハウジング１４内に入れられた中空繊維膜１２のバンドルから作られている。中空繊維膜のバンドルはまとめて膜と称される。ハウジングまたはモジュール１４は、形状が円筒形であってもよく、いずれのタイプの生体適合性ポリマー材料から作られてもよい。
【００１０】
モジュール１４の各端は、端キャップまたはヘッダー１６、１８で閉じられている。端キャップ１６、１８は、材料がバイオリアクタ内で生長すべき細胞と生体適合性がある限り、いずれの適切な材料たとえばポリカーボネートから作られてもよい。
【００１１】
モジュール内に且つモジュールから、少なくとも４つのポートがあってもよい。２つのポートは中空糸外空間（ＥＣ空間）(extracapillaary soace)に流体的に接続され、１つのポート３４は、新たな中空糸外媒体が、中空繊維を囲繞する空間内に進入するためのものであり、１つのポート４４は、使用済みの中空糸外媒体がモジュールから出るためのものである。２つのポートはまた、中空糸内空間（ＩＣ空間）(intracapillary space)にも流体的に接続され、１つのポート２６は、新たな中空糸内媒体が中空繊維のルーメン内に進入し且つ膨張されるべき細胞を導入するためのものであり、１つのポート４２は、使用済みの中空糸内媒体がバイオリアクタから出て膨張した細胞を除去するためのものである。
【００１２】
バイオリアクタ内で膨張されるべき細胞は、ＩＣ空間内にまたはＥＣ空間内に流れてもよい。バイオリアクタには、シリンジを使用して細胞が装填されてもよく、または、細胞は、細胞セパレータから直接、ＩＣ空間またはＥＣ空間内に分配されてもよい。細胞はまた、バイオリアクタに無菌結合されてもよい細胞投入バッグまたはフラスコ（要素５として示されている）から生長モジュールまたはバイオリアクタ内に導入されてもよい。
【００１３】
上記に検討されたように、細胞膨張システムに初期播種された細胞の数は、いかに速やかに細胞が膨張し上述のもの等の細胞膨張システムで密集度に到達するかにおいて重要な要因であると思われる。しかし、下記実施例１は、実際には、最適な生長および膨張を達成するためにＭＳＣが他のＭＳＣによって密接に囲繞される必要はないことを示す。
【００１４】
実施例１
ＭＳＣは、当初、５、５０、５００および５０００細胞／ｃｍ2の濃度でフラスコに播種された。細胞が２倍になるのにかかる時間（時）が測定された。下記表１に示されるように、５細胞／ｃｍ2の初期濃度で細胞が２倍になる平均時間は、およそ３５時間である。１０００倍高い濃度の細胞は、２倍になるのにおよそ１２３時間かかった。このデータは、低密度で初期播種された細胞は、より高い密度で初期播種された細胞よりも速く２倍になることを示唆する。より低い密度は、基板上でおよそ１〜１００細胞／ｃｍ2の間と規定され、基板上のおよそ５〜５０細胞／ｃｍ2の間を含む。
【表１】
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【００１５】
間葉細胞膨張に重要であると思われる別の要因は、細胞膨張システムに初期装填されたか播種された細胞の純度である。
【００１６】
実施例２
ＭＳＣの最大膨張を確実にするためにＭＳＣを他の汚染細胞から浄化しなければならないという理論を検証するために、４アーム実験が行われた。この実施例および他の実施例の目的のために、浄化手順は、ＭＳＣを含有する細胞の集団から実質的にすべての汚染細胞を除去するために行われるいずれの追加手順を意味する。細胞の集団は、骨髄、末梢血液、臍帯、胎芽細胞またはＭＳＣが存在する他の細胞集団からの細胞でありうる。未浄化細胞は、浄化手順を受けていない上記細胞のいずれを意味する。
【００１７】
各アーム用に、浄化および分画ステップ（もし実行されるならば）後に、細胞が数えられた。各アームから同一数の浄化された（またはされなかった）細胞が培養された。細胞は、およそ１×１０6細胞が得られるまで（この実施例の目的用の密集度）、生長した。密集度は、細胞が生長している基板の利用可能な表面全体を覆うように膨張した状態として定義される。
【００１８】
各アーム用に、２セットの実験が行われ、一方のセットは、７日ごとに細胞を培養するかまたは再播種することを伴い、他方のセットは、１４日ごとに細胞を培養するかまたは再播種することを伴った。細胞が密集度に達したときに、実験は停止された。
【００１９】
アーム１では、およそ５０ｍＬの骨髄穿刺液がドナーから取り出され、１ｍＬが直接、２５ｃｍ2Ｔフラスコ内で培養された（図２および３ではＢＭとして示されている）。浄化または分画ステップは行われなかった。２５ｃｍ2Ｔフラスコの表面積は、１．６ｍ2の中空繊維バイオリアクタの表面積に近い。
【００２０】
アーム２では、アーム１から収集された５０ｍＬ骨髄穿刺液の１０ｍＬが浄化され、標準フィコールグラディエント（ficoll gradient）浄化を使用して、単核球（ＭＮＣ）画分（幹細胞がみつかった場合）を収集した（図２および３ではフィコールとして示されている）。画分は、２５ｃｍ2Ｔフラスコで培養された。
【００２１】
アーム３は、アーム１で収集された残りの４０ｍＬ骨髄穿刺液からＭＳＣを溶離することを伴った。ＭＳＣは、エルトラ（Elutra）システム（米国コロラド州レイクウッドのガンブロ（Gambro）ＢＣＴ社が販売）を使用して、汚染赤血球からデバルクされ溶離された（図２および３ではＲｏ４０デバルクとして示されている）。
【００２２】
アーム４では、アーム３からの残っている培養されなかった画分が、溶解手順を受け、いずれの残っている汚染赤血球を除去した（図２および３ではＲｏ４０溶解として示されている）。
【００２３】
代表的なグラフが、図２および３に示されている。見ることができるように、７日ごとに再播種された間葉系幹細胞（図２）は、１４日ごとに再播種された間葉系幹細胞（図３）よりも速い速度で密集度に達した。驚くべきことに、最小量の操作を受けた細胞（汚染細胞を含有する、直接培養された骨髄）が、もっとも速く生長した。最大の操作を受けた細胞、したがって、最大の純度を有すると思われた細胞（溶解した汚染赤血球を備えた溶離されたＭＳＣ）は、もっとも遅く生長した。
【００２４】
これらの発見はまた、密集度に達する前に再播種されたＭＳＣが、少なくとも、収集後初期に播種されたＭＳＣと同じほど速く生長することを示唆する。この発見は、再播種手順がバイオリアクタ内のＭＳＣの生長に有害事象を与えないこと、および、細胞が初期に播種された同一表面を再使用（再播種）することが、細胞の生長に有害事象を与えないと思われること、を暗示することがある。しかし、細胞はまた、異なる基板に再播種されることができる。
【００２５】
したがって、ＭＳＣを密集度へ生長させないことが望ましい。細胞は、密集状態に達するよりかなり前に、採取されるべきである。ＭＳＣの十分な治療的投与量を提供するのに十分な細胞の生長が、速やかに達せられる。
【００２６】
実施例３
別の実施例では、標準エルトリエーションプロトコルたとえば米国特許出願第１１／１３１０６３号に記載されたもの等を使用して、骨髄からの幹細胞のサブセットを濃縮し、より浄化された細胞が、汚染細胞から浄化されなかった細胞と比較して、どのように生長するかを決定した。
【００２７】
実質的に浄化されたＭＳＣを含有する骨髄の６つのエルトリエーション画分が密集度へ生長した。実質的に浄化されたＭＳＣは、特定のエルトリエーション画分の細胞の大半が同一細胞タイプであることを意味する。これらのエルトリエーション画分は、図４のＦ１〜Ｆ６に示されている。骨髄の５０ｍＬサンプルもまた、比較のためフィコールグラディエントの共通に使用された浄化手順を使用して、浄化された（図４ではフィコールとして示されている）。４０ロータオフ（図４ではＲｏ４０として示されている）は、血漿、血小板および赤血球が初期５０ｍＬ骨髄サンプルから除去された後に、ロータがオフにされ、４０ｍＬエルトリエーションチャンバに残っているすべての細胞が収集されたことを意味する。この手順は、細胞の個別の画分またはサブセットを溶離しない。
【００２８】
図４は、個別エルトリエーション画分からの細胞、および、フィコール浄化細胞、および、ロータオフで収集された細胞が、１×１０8細胞へ膨張する日数を比較する。見ることができるように、大半の実質的に浄化された細胞を含有する画分Ｆ１〜Ｆ６はもっとも遅く生長し、一方、もっとも少なく浄化された細胞（ロータオフまたはＲｏ４０）は、もっとも速く生長した。これは、上記実施例２の発見、すなわち、もっとも少なく浄化される細胞がもっとも速く生長するということを裏付ける。
【００２９】
実施例４
上記に検討されたように、膨張すべきＭＳＣの純度は、培養液中で細胞がいかに速く膨張するかに影響を与えると思われる。
【００３０】
実施例４は、アルファ（α）、または、中空繊維バイオリアクタ内に直接播種された５０ｍＬ骨髄の未浄化ＭＳＣの細胞が２倍になるのにかかる日数を比較し、そのＭＳＣは、バイオリアクタ内に播種される前に予め選択された。直接播種は、患者から取られた骨髄が、いずれの汚染細胞たとえば血小板および赤血球を除去することなく、バイオリアクタ内に直接置かれることを意味する。骨片（bone chip）および他の非細胞物質が除去されてもよい。予め選択されたは、５０ｍＬの骨髄が初期にＴ−７５フラスコで培養され、中に含まれたＭＳＣがフラスコに接着し且つ中空繊維バイオリアクタに再播種される前に密集度に生長するのを可能にしたことを意味する。予選択は、バイオリアクタで膨張すべき細胞のすべてが浄化ＭＳＣであるのを確実にする。２タイプの中空繊維膜、すなわち、登録商標デスモパン（Ｄｅｓｍｏｐａｎ）（ドイツ、バイエルマテリアルサイエンス社（Bayer MaterialScience AG）が販売）の商標名で販売されている０．５％熱可塑性ポリウレタンおよび登録商標ポリフラックス（Ｐｏｌｙｆｌｕｘ）（ポリアミド、ポリアリールエーテルスルホンおよびポリビニルピロリドンの混合物）（ドイツ、ヘッヒンゲンのガンブロダイアリサトレン社（Gambro Dialysatoren, GmBH）が販売）がテストされた。デスモパンおよびポリフラックスの両方は、合成膜である。
【表２】
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【００３１】
上記表２に見られるように、バイオリアクタ内に直接播種され骨髄に他の汚染細胞を備えたＭＳＣは、バイオリアクタで膨張する前にまず浄化されたＭＳＣよりも速く２倍になった（２倍になるのにかかる日数が少なかった）。これは、両方の種類の合成膜で、そうであった。
【００３２】
上記実施例に示されるように、細胞膨張システムでより速いＭＳＣの膨張を達成するために、細胞は、他の汚染細胞から浄化される必要はない。ＭＳＣはまた、頻繁に再播種すべきであり、再播種される前に密集度に達するのを可能にするべきではない。
以下に、本発明の実施態様を示す。
１．  生体外で間葉系幹細胞を膨張させる方法であって、
ａ）間葉系幹細胞を含有する細胞の集団を基板に播種し、そのため、低密度の間葉系幹細胞が前記基板に接着することと、
ｂ）前記接着した間葉系幹細胞を前記基板上で膨張させることと、
ｃ）前記膨張した間葉系幹細胞を前記基板から除去することと、
ｄ）前記除去した間葉系幹細胞を同一の基板または異なる基板に再播種することと、
ｅ）所望の数の膨張した間葉系幹細胞に達するまで、ステップｂ）〜ｄ）を繰り返すことと、
の各ステップを備える方法。
２．  前記低密度の間葉系幹細胞は、およそ１〜１００間葉系幹細胞／ｃｍ2の間である１記載の方法。
３．  前記低密度の間葉系幹細胞は、およそ５〜５０間葉系幹細胞／ｃｍ2の間である１記載の方法。
４．  前記低密度の間葉系幹細胞は、およそ５間葉系幹細胞／ｃｍ2の密度をさらに備える３記載の方法。
５．  前記低密度の間葉系幹細胞は、およそ５０間葉系幹細胞／ｃｍ2の密度をさらに備える３記載の方法。
６．  前記間葉系幹細胞を再播種するステップは、密集度に達する前に前記間葉系幹細胞を再播種することをさらに含む１記載の方法。
７．  前記播種ステップは、浄化手順を実行する前に、前記間葉系幹細胞を含有する集団を播種することをさらに備える１記載の方法。
８．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する骨髄細胞を播種することをさらに備える１記載の方法。
９．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する末梢血液細胞を播種することをさらに備える１記載の方法。
１０．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する臍帯細胞を播種することをさらに備える１記載の方法。
１１．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する胎芽細胞を播種することをさらに備える１記載の方法。
１２．  前記播種ステップは、合成膜上に播種することをさらに備える１記載の方法。
１３．  前記合成膜は、ポリフラックス膜である１２記載の方法。
１４．  前記合成膜は、デスモパン膜である１２記載の方法。
１５．  合成膜上に播種する前記方法は、中空繊維に播種することをさらに備える１２記載の方法。
１６．    生体外で間葉系幹細胞を膨張させる方法であって、
ａ）間葉系幹細胞を含有する未浄化細胞の集団を基板に播種し、そのため、前記間葉系幹細胞が前記基板に接着することと、
ｂ）前記接着した間葉系幹細胞を前記基板上で膨張させることと、
の各ステップを備える方法。
１７．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化骨髄を播種することをさらに備える１６記載の方法。
１８．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化末梢血液細胞を播種することをさらに備える１６記載の方法。
１９．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化臍帯細胞を播種することをさらに備える１６記載の方法。
２０．  前記播種ステップは、前記間葉系幹細胞を含有する未浄化胎芽細胞を播種することをさらに備える１６記載の方法。
２１．  前記播種ステップは、合成膜上に播種することをさらに備える１６記載の方法。
２２．  前記合成膜は、ポリフラックス膜である２１記載の方法。
２３．  前記合成膜は、デスモパン膜である２１記載の方法。
２４．  合成膜上に播種する前記方法は、中空繊維に播種することをさらに備える２１記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に使用されてもよいバイオリアクタの概略図である。
【図２】再播種後７日の異なるレベルの純度を有する間葉系幹細胞の生長を比較するグラフである。
【図３】再播種後１４日の異なるレベルの純度を有する間葉系幹細胞の生長を比較するグラフである。
【図４】異なるレベルの純度を有する間葉系幹細胞の生長を比較する別のグラフである。
【図１】
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【図２】
0005550902.tif 000005
【図３】
0005550902.tif 000006
【図４】
0005550902.tif 000007