(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
- RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの触媒ドメイン、
- グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの触媒ドメイン、
- N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの触媒ドメインおよび
- DNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの触媒ドメイン
を含む、キメラ酵素。
【請求項２】
細胞質キメラ酵素であることを特徴とする、請求項1に記載のキメラ酵素。
【請求項３】
RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインが単量体に含まれる、請求項1または2に記載のキメラ酵素。
【請求項４】
DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインが単量体に含まれる、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラ酵素。
【請求項５】
DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインならびに
- RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、
- グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよび
- N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン
からなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つが単量体に含まれる、請求項1から4のいずれか一項に記載のキメラ酵素。
【請求項６】
DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインがバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである、請求項1から5のいずれか一項に記載のキメラ酵素。
【請求項７】
- RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、
- グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよび
- N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン
からなる群の中で選択される前記触媒ドメインの少なくとも1つがウイルスキャッピング酵素の触媒ドメインである、請求項1から6のいずれか一項に記載のキメラ酵素。
【請求項８】
単量体酵素であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載のキメラ酵素。
【請求項９】
- RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、
- グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、
- N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび
- DNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン
からなる群の中で選択される前記触媒ドメインの少なくとも2つが連結性ペプチドによって結合される、請求項1から8のいずれか一項に記載のキメラ酵素。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素をコードする、単離核酸分子または単離核酸分子群。
【請求項１１】
- RNAポリメラーゼIIに対するプロモーターおよび
- DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーター
からなる群から選択される少なくとも1つのプロモーターと作動可能に連結された、請求項10に記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項10または11に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項10もしくは11に記載の核酸分子もしくは単離核酸分子群または請求項12に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素を発現する、遺伝子改変したヒト以外の真核生物。
【請求項１５】
5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を産生するための、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素のin vitroまたはex vivoでの使用。
【請求項１６】
DNA配列にコードされた、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を宿主細胞で産生するためのin vitroまたはex vivoの方法であって、前記方法が請求項10または11に記載の核酸分子または単離核酸分子群を宿主細胞で発現させる工程を含み、前記DNA配列がDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結される方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよび/または内因性のキャッピング酵素のサブユニットの少なくとも1つの発現を阻害する工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのキメラ酵素ならびに/または請求項10または11に記載の単離核酸分子および/もしくは単離核酸分子群ならびに/または請求項12に記載のベクターを備える、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を産生するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え分野、特に真核細胞の遺伝子組換え分野に関する。
【０００２】
特に本発明は、5'末端にm7GpppNのキャップ構造を有するRNA分子を産生するのに有用なキメラ酵素に関する。
【背景技術】
【０００３】
真核性の発現は、生命科学、バイオテクノロジーおよび医学において非常に広範に使用されている。したがって、真核細胞における効率的な遺伝子組換えに関する多くの方法が開発されている。一般的なDNAソースおよび送達機構は、ウイルス(例えばバキュロウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス)またはプラスミドおよび人工染色体を含めた非ウイルスベクターである。
【０００４】
その容易さから、in vitroおよびin vivoの両適用において、非ウイルス性プラスミドが真核細胞への遺伝子導入用の発現ベクターとして一般に使用されている。しかし、非ウイルス性の方法によって達成される導入遺伝子の発現レベルは通常あまり高くなく、急速に低下する。約40,000ダルトンを超えるDNA分子は大きすぎるため、それらが核のRNAポリメラーゼIIによって転写される場所である核に核膜孔を通過して入ることができないという事実が、この有効性があまり高くないことに対する一般的な解釈である(Lang、Scholzら1986年;Zabner、Fasbenderら1995年)。実際、巨大なDNA分子のごく少量(<0.1〜0.001%)のみが真核細胞の細胞質から核へ能動的に移行される。発現が急速に低下する機構もおそらく核特異的であり、様々なエピジェネティックな機構による導入遺伝子発現のサイレンシングと関係がある(Loser、Jenningsら1998年;Gill、Smythら2001年;Miao、Thompsonら2001年;Nicol、Wongら2002年;Miao、Yeら2003年)。
【０００５】
真核細胞の内因性RNA転写系を使用した遺伝子組換え方法の他の欠点によっても、その使用が制限される。第一に、核の真核性RNAポリメラーゼの処理能力が弱いこと(例えば、RNAポリメラーゼIIに関しては10〜20ヌクレオチド/秒)である(Fire、Samuelsら1984年;UckerおよびYamamoto1984年;Bengal、Floresら1991年;IzbanおよびLuse1992年)。第二に、内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との競合である。第三に、いくつかのサブユニット、例えば、RNAポリメラーゼIIに関しては12のサブユニットからなり、複数の転写因子に制御されている真核性RNAポリメラーゼが極度に複雑であることである(Lodish、Berkら2008年)。
【０００６】
これらの不利な点を考慮して、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼに基づいた遺伝子組換え方法がいくつか開発されている。これらの方法は、真核細胞の内因性RNA転写系ではなく、真核性RNAポリメラーゼよりも処理能力が高いあるバクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼを使用するという利点も有する。
【０００７】
原核生物では、pET発現系は一般的な遺伝子発現法である(Studier、Rosenbergら1990年)。pET発現系は、T7遺伝子1の産物であるバクテリオファージの単一サブユニットのDNA依存性T7RNAポリメラーゼ(T7RNAポリメラーゼ、T7RNAP)の発現に依存して、T7プロモーターの制御化で発現するように設計された目的の遺伝子を発現する。このpET発現系は真核細胞向けに適合させられており、通常ハイブリッドRNAポリメラーゼと称される。しかし、真核生物の環境では、DNA依存性T7RNAポリメラーゼの高い酵素活性は、T7転写産物の翻訳収量が非常に乏しいことと著しい対照を成す(Fuerst、Nilesら1986年)。この矛盾は、転写産物の5'末端にキャップ構造を付加することによる修飾(Benton、Engら1990年;DowerおよびRosbashら2002年)も転写産物の3'末端のしっかりとしたポリアデニル化(Mifflinおよびellems1991年;DowerおよびRosbash2002年)もどちらもないという、真核細胞における転写産物の成熟化が欠如していることによって説明される。
【０００８】
したがって、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系のようなこのハイブリッド系によって産生されるキャッピングされていない転写産物の翻訳能力を改善させる方法が開発されている。この真核性の発現系は、バクテリオファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼを感染哺乳動物細胞の細胞質で合成する組換えワクシニアウイルスに基づく(Fuerst、Nilesら1986年;Fuerst、Earlら1987年;Elroy-Stein、Fuerstら1989年;Fuerst、Fernandezら1989年;FuerstおよびMoss1989年;Elroy-SteinおよびMoss1990年)。組換えプラスミドのトランスフェクションまたは第二の組換えワクシニアウイルスの感染のいずれかによって、T7プロモーターおよび終結配列に隣接するバクテリオファージRNAポリメラーゼの標的遺伝子を感染細胞へ導入する(Fuerst、Nilesら1986年;Elroy-Stein、Fuerstら1989;Elroy-SteinおよびMoss1990年)。ワクシニアウイルスにコードされたmRNAのキャッピングに関する細胞質の酵素は、T7転写産物に作用してその翻訳能力を改善するだろうと期待された。しかし、T7転写産物のキャッピングは、最適化されていない(infra-optimal)ままである。(FuerstおよびMoss1989年)。例えばこの発現系を使用して、T7転写産物は、総細胞質RNAの30%までを24時間後に構成することができるが、T7転写産物のわずか5%〜10%しか5'末端キャップ構造を含まないことが発見された(FuerstおよびMoss1989年)。ある程度効果的ではあるが、ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系の技術的欠点によって、その一般化および大規模な使用が明らかに制限される。第一に、この系はヒトに感染する組換えワクシニアウイルスに基づく。したがって、これらの組換えウイルスの取り扱いには、特別な実験室施設および熟練を要する。ヒト細胞において、パッケージング段階の後期でその複製サイクルが失敗に終わる、トリ弱毒化宿主域制限系統、すなわち改変ワクシニアアンカラ(vaccinia Ankara)(MVA)を、この危険性をより良く制御するのに使用することができる(Wyatt、Mossら1995年;Engleka、Lewisら1998年)。第二に、組換えワクシニアまたはMVAウイルスは細胞毒性である。したがって、ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系は一過性の遺伝子組換え場合のみ使用することができる(Elroy-Stein、Fuerstら1989年;Elroy-SteinおよびMoss1990年)。第三に、ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系は、ワクシニア感染に対して許容的ないくつかの細胞モデル(例えばBSC-1)で容易に使用することができるが、使用することができないものもある(例えばCHO)。組換えワクシニアウイルスゲノムへ牛痘ウイルスの(cowpox virus)CP77遺伝子を挿入することによってワクシニアウイルスがCHO細胞に増殖的に感染することが可能になり、ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の宿主域制限を打開することができる(Spehner、Gillardら1988年;Ramsey-EwingおよびMoss1996年)。第四に、この系の複雑さ故、同一の細胞モデルにおいてさえその有効性が著しく変動することを予想することができる。第五に、ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系は費用および手間のかかる技術であるので、この技術は大規模なアッセイおよびタンパク質産生にはあまり適切ではない。
【０００９】
キャッピングを転写に連動させ、それによって、T7RNAポリメラーゼによって産生されるキャッピングされていない転写産物の翻訳能力を改善するために、この酵素は、RNAポリメラーゼII(POLR2A)最大サブユニットのカルボキシル末端ドメイン(CTD)に連結されてきた(Natalizio、Robson-Dixonら2009年)。このCTDは、進化を通じて高度に保存されており、転写サイクルの間に可逆的なリン酸化を受けるコンセンサス配列が1YSPTSPS7である、25〜52のヘプタペプチドリピートを含む(PalancadeおよびBensaude2003年)。酵母(Cho、Takagiら1997年、McCracken、Fongら1997年)および哺乳動物(McCracken、Fongら1997年;Yue、Maldonadoら1997年)において、リン酸化された際には、CTDはmRNAキャッピング酵素の1つまたは複数のサブユニットと結合することによって新生転写産物の転写とキャッピングの連動を媒介すると考えられている。注目すべきことは、Ser5リン酸化CTDリピートを有するRNAポリメラーゼIIは、新生転写産物の共転写キャッピングと同時発生的なプロモーター近位停止を起こす(Komarnitsky、Choら2000年;Schroeder、Schwerら2000年)。しかし直感的に予想できることとは対照的に、in vivoにおいて、CTDと単一ユニットのT7RNAポリメラーゼとの融合は、構成的および選択的にスプライシングされた両方の基質のキャッピングを増強するには不十分である(Natalizio、Robson-Dixonら2009年)。
【００１０】
キャッピングは、ほぼ全ての真核性メッセンジャーRNAの5'末端に見られる特殊な構造である。最も単純なキャップ構造、すなわちcap0は、一次RNAの末端に結合した5'-5'三リン酸によって連結された、N7でメチル化されたグアニンヌクレオシドの付加の結果として生じる(すなわち、Nが任意の塩基、pがリン酸を意味し、mがメチル基を意味するm7GpppN)。cap0の形成は、連続した3つの酵素反応、すなわちRNAトリホスファターゼ(RTPase)が新生mRNA前駆体の5'三リン酸末端のγリン酸残基を除去し二リン酸とし、RNAグアニリルトランスフェラーゼ(GTase)がGTPから二リン酸新生RNA末端にGMPを移し、RNA N7-グアニンメチルトランスフェラーゼ(N7-MTase)がグアニンの7位の窒素にメチル残基を加えてGpppNキャップとする反応を必要とする(FuruichiおよびShatkin2000年)。高等真核生物およびいくつかのウイルスでは、第一(すなわちcap1構造、m7GpppNm2'-OpN)および第二の(すなわちcap2構造、m7GpppNm2'-OpNm2'-O)転写ヌクレオチドのリボースの2'-水酸基は、cap1およびcap2特異的MTaseと名付けられた2つの別のリボース-2'-O MTaseによってそれぞれメチル化され得る(LangbergおよびMoss1981年)。しかし、細胞のN7-MTase活性が核のみであるのと対照的に、cap1リボース-2'-O MTase活性はHeLa細胞の細胞質および核の両方で検出されており、一方cap2MTase活性はその細胞質でのみ見られる(LangbergおよびMoss1981年)。
【００１１】
5'末端のm7GpppNキャップ形成は、mRNA前駆体のプロセシングの第一段階である。m7GpppNキャップは、mRNAの安定性およびmRNAの核から細胞質への輸送において重要な役割を担う(HuangおよびSteitz2005年;KohlerおよびHurt2007年)。加えて、5'末端のm7GpppNキャップは、リボソーム小サブユニットの16S部分をmRNAへの動員を媒介する真核性の翻訳開始因子4F(eIF4F)複合体を固定するため、mRNAのタンパク質への翻訳にとって重要である(Furuichi、LaFiandraら1977年;Gingras、Raughtら1999年;Rhoads1999年)。したがって、5'末端のm7GpppNキャップは、in vitro(Lo、Huangら1998年)およびin vivo(Malone、Felgnerら1989年;Gallie1991年;Lo、Huangら1998年;Kozak2005年)の両方においてmRNAの翻訳を大幅に増強する。その一方、mRNAの翻訳における2'-O-メチル化の効果は、細胞の種類および実験条件に依存すると思われる(Epicentre Biotechnologiesのウェブサイト;Drummond、Armstrongら1985年;Kuge、Brownleeら1998年)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Epicentre Biotechnologiesのウェブサイト
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、細胞毒性または誘発性細胞毒性を伴わない遺伝子治療および大規模なタンパク質産生に適切な、真核細胞における効率的な遺伝子組換えについての新規で改善された系に関するかなりの必要性が当技術分野に依然として存在する。本発明者は、本明細書に開示される本発明を用いて著しい前進を遂げた。
【００１４】
本発明の目的は、上記の問題の全てまたは一部を解決することを可能にする新規なキメラ酵素を提供することによって、この必要を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
期せずして本発明者は、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインを含むキメラ酵素は、細胞毒性がなくアポトーシスを誘導せずに、真核性の翻訳機構によって高度に翻訳可能な5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができることを実証した。
【００１６】
ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系では、T7転写産物のキャッピングは最適化されていないままであり、融合酵素のCTD-T7RNAポリメラーゼでは達成することができないので、これらの結果は驚くべきものである。
【００１７】
したがって、一態様では、本発明は、
-  RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよび
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン
を含むキメラ酵素に関する。特に、本発明によるキメラ酵素は、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができる。
【００１８】
本発明によるキメラ酵素は、特に以下の利点を有する。
-  内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との間に競合がない。
-  高価でなく、実施するのに迅速容易であるので、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に適切である。
-  ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系と対照的に、明らかな細胞毒性またはアポトーシス促進活性がない。
-  任意の真核生物種(例えば酵母、植物、齧歯類、酪農の反芻動物、霊長類およびヒト)においてRNA転写産物の産生を可能にする。
【００１９】
別段定義されない限りは、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を持つ。
【００２０】
便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲で特定の用語およびフレーズの意味が用いられる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「キメラ酵素」という用語は、自然界に見られる天然の酵素ではない酵素を指す。したがって、キメラ酵素は、異なる供給源(例えば異なる酵素)に由来する触媒ドメインまたは同じ供給源(例えば同じ酵素)に由来するが自然界に見つかるものと異なる様式で配置されている触媒ドメインを含むことができる。
【００２２】
「キメラ酵素」という用語は、単量体(すなわち単一ユニット)酵素を含み、さらにはオリゴマー(すなわち多ユニット)酵素、特にヘテロオリゴマー酵素も含む。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「単量体酵素」という用語は、ポリペプチド鎖のみで構成される単一ユニット酵素に関する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「オリゴマー酵素」という用語は、共有結合または非共有結合によって互いに連結された、少なくとも2つのポリペプチド鎖から構成される多ユニット酵素を指す。「オリゴマー酵素」という用語は多ユニット酵素を含み、前記酵素の少なくとも2つのユニットは、共有結合または非共有結合によって互いに連結される。「オリゴマー酵素」という用語は、1種の単量体(サブユニット)のみから構成される多ユニット酵素であるホモオリゴマー酵素および異なる種類の単量体(サブユニット)から構成されるヘテロオリゴマー酵素を含む。
【００２５】
特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、共有結合および/または非共有結合によって互いに連結される。
【００２６】
特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成するように作動可能に互いに連結される。
【００２７】
特に、本発明によるキメラ酵素は、
-  RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよび
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン
を含み、前記触媒ドメインの少なくとも2つは、好ましくはそれらの末端(NまたはC末端)で共有結合または非共有結合によって互いに連結され、より特定すると、
-  RNAトリホスファターゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよび
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン
からなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つが、好ましくはその末端(NまたはC末端)で共有結合または非共有結合によって、
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインと好ましくはその末端(NまたはC末端)で連結される。
【００２８】
特に、本発明は、
-  RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインならびに
-  核の真核性DNA依存性RNAポリメラーゼI、IIおよび/またはIIIの触媒ドメインのみ、より詳細には、DNA依存性RNAポリメラーゼIIの触媒ドメインのみ
を含むキメラ酵素を除外して、
-  RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよび
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン
を含む、本発明によるキメラ酵素に関する。
【００２９】
特に、本発明は、
-  RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび
-  核の真核性DNA依存性RNAポリメラーゼI、IIおよび/またはIIIの触媒ドメイン、より特定すると、少なくともDNA依存性RNAポリメラーゼIIの触媒ドメインを含むキメラ酵素を除外して、
-  RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよび
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン
を含む、本発明によるキメラ酵素に関する。
【００３０】
特に、真核性宿主細胞における発現に関して、本発明による前記キメラ酵素は、好ましくは真核性の翻訳機構によって翻訳可能である5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができる。
【００３１】
特に、真核性宿主細胞における発現に関して、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインによって合成されるRNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができ、好ましくは5'末端にm7GpppNキャップを有する前記RNA分子は、真核性の翻訳機構によって翻訳可能である。
【００３２】
特に、真核性宿主細胞における発現に関して、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインがバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際には、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、グアノシンリボヌクレオチドを5'末端に有するRNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができる。
【００３３】
特に、真核性宿主細胞における発現に関して、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインが細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際には、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、グアノシンリボヌクレオチドまたはアデノシンリボヌクレオチドを5'末端に有するRNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができる。
【００３４】
特に、真核性宿主細胞における発現に関して、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインがヒトまたはマウスのミトコンドリアのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際には、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、アデノシンリボヌクレオチドまたはチミジンリボヌクレオチドを5'末端に有するRNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができる。
【００３５】
本明細書で使用される酵素の「触媒ドメイン」という用語は、特にその三次元構造において酵素機能を保証するのに必要十分なドメインに関する。例えば、RNAトリホスファターゼの触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの機能を保証するのに必要十分なドメインである。「触媒ドメイン」という用語は、野生型または変異酵素の触媒ドメインを含む。
【００３６】
本発明によるキメラ酵素は、少なくとも前記触媒ドメインを含むが前記触媒ドメインを含有する酵素の全部または一部をさらに含むことができる。実際、本発明によるキメラ酵素の一実施形態によれば、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、DNA依存性RNAポリメラーゼの、好ましくは単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼの全部または一部に含まれてよい。RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインも、キャッピング酵素、好ましくは単量体のキャッピング酵素の全部または一部に含まれてよい。
【００３７】
本発明によるキメラ酵素は、核の酵素、細胞内区画の酵素または細胞質の酵素であってもよい。したがって、本発明によるキメラ酵素は、当業者に周知の、細胞において酵素の輸送を導くシグナルペプチドまたはマーカーシグナルを含むことができる。例えば、本発明によるキメラ酵素は酵素を核に導く核移行シグナル(NLS)を含むことができる。このようなNLSは、塩基性で正電荷の5つのアミノ酸からなるユニットであることが多い。NLSはペプチド鎖のどこにでも配置することができる。
【００３８】
好ましくは、本発明によるキメラ酵素は細胞質キメラ酵素である。特に、キメラ酵素は、細胞質を除いた、酵素の輸送を導くシグナルペプチドまたはマーカーシグナルを含まない。
【００３９】
本発明によるキメラ酵素の細胞質局在は、真核細胞の細胞質から核への巨大なDNA分子(すなわち導入遺伝子)の能動的な移行および核から細胞質へのRNA分子の運び出しを回避させることによって、導入遺伝子の発現レベルを最適化するという利点を有する。
【００４０】
したがって、本発明によるこのような細胞質キメラ酵素は、核と比較して有意に高い量のトランスフェクトされたDNAが通常見られる細胞質で機能することができる、宿主非依存的な真核性の遺伝子発現系を作出するのに有用であり得る。
【００４１】
本発明によるこれらの細胞質キメラ酵素は、細胞毒性がなくアポトーシスを誘導せずに、真核性の細胞質内翻訳機構によって高度に翻訳可能な5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができる。
【００４２】
細胞質で起こる導入遺伝子の転写と対照的に、内因性遺伝子の転写は真核細胞の核で起こるので、内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との間に競合もない。
【００４３】
したがって、本発明による細胞質キメラ酵素は、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に特に適する。
【００４４】
本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、単量体、すなわち1つのポリペプチドに含まれる。例えば、前記単量体は、本発明による単量体のキャッピング酵素または単量体のキメラ酵素であってもよい。
【００４５】
特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、単量体のキャッピング酵素に含まれる。この場合、本発明によるキメラ酵素は、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインを含む単量体のキャッピング酵素を含む。前記単量体のキャッピング酵素は、単量体のウイルスのキャッピング酵素でよく、特に、RNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができる野生型のブルータングウイルス(bluetongue virus)キャッピング酵素、野生型のタケモザイクウイルス(bamboo mosaic virus)キャッピング酵素、野生型のアフリカブタコレラウイルス(African swine fever virus)キャッピング酵素、野生型の多食アメーバミミウイルス(acanthamoeba polyphaga mimivirus)キャッピング酵素ならびにそれらの変異体および誘導体からなる群の中で選択される単量体のウイルスキャッピング酵素でよく、より詳細には、RNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができる野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素ならびにその変異体および誘導体からなる群の中で選択される単量体のウイルスキャッピング酵素でよく、さらにより詳細には、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素であってもよい。
【００４６】
特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは単量体、すなわち1つのポリペプチドに含めることができる。例えば、前記単量体は、単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼまたは本発明による単量体のキメラ酵素であってもよい。
【００４７】
特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼに含まれる。この場合、本発明によるキメラ酵素はDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインを含む単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼを含む。前記単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼは、単量体のファージのDNA依存性RNAポリメラーゼでよく、特に、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きで合成することができるT7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼおよびSP6RNAポリメラーゼならびにそれらの変異体または誘導体からなる群の中で選択される単量体のファージのDNA依存性RNAポリメラーゼでよく、より詳細には、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きで合成することができるT7RNAポリメラーゼおよびその変異体または誘導体からなる群の中で選択される単量体のファージのDNA依存性RNAポリメラーゼであってもよい。
【００４８】
DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインならびに、
-  RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよび
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン
からなる群の中で選択される少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つ以上の、より好ましくは全ての触媒ドメインは、単量体に含むことができる。
【００４９】
本発明によるキメラ酵素は、単量体またはオリゴマーであってもよい。実際、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかのポリペプチドに含むことができる。
【００５０】
好ましくは、本発明によるキメラ酵素は単量体である。
【００５１】
実際、本発明者は、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインを含む単量体のキメラ酵素が、細胞毒性がなくアポトーシスを誘導せずに、真核性の翻訳機構によって高度に翻訳可能な5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができることを実証した。
【００５２】
その天然の高次構造を保たなければならない立体障害および構成要素および酵素が原因で、転写産物のキャッピングが単量体酵素を用いて十分に起こるか明らかでなかった。実際、新生RNA分子の5'末端のm7GppNキャッピングを引き起こすと思われるが、T7転写産物のキャッピングは、融合酵素CTD-T7RNAポリメラーゼでは達成できなかった。
【００５３】
本発明による単量体のキメラ酵素は、特に、高価でなく、実施するのに迅速容易であるので、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に特に適切であるという利点を有する。実際、単量体酵素の産生は、オリゴマー酵素の産生よりも容易である。単一ユニットしかないので、ユニット構築の問題もない。単量体酵素はまた、多量体酵素よりも扱いが簡単である。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「DNA依存性RNAポリメラーゼ」(RNAP)という用語は、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きで合成するヌクレオチジルトランスフェラーゼに関する。
【００５５】
好ましくは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、比較的簡単な構造を有する酵素の触媒ドメインであり、より好ましくは、特徴付されたゲノムの酵素制御エレメント(すなわちプロモーター、転写終結シグナルおよびコンカテマー結合)を有する酵素の触媒ドメインである。したがって、特にDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインまたは様々な真核性オルガネラ(例えばミトコンドリア、葉緑体および原色素体)のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインであってもよい。
【００５６】
一実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインはバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。
【００５７】
バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼは、特に真核性RNAポリメラーゼよりも高い処理能力を有することで導入遺伝子の発現レベルを最適化するという利点を特に有する。バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼはまた、複数のサブユニットを持つ複合体構造を有する多くの核の真核性ポリメラーゼ(例えばRNAポリメラーゼII)よりもより単純な構造を有する(ChenおよびSchneider2005年)。今までに特徴付けられたバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの大部分は単一サブユニット酵素であり、それらは転写の開始、伸長または終結に関して補助蛋白質を必要としない(ChenおよびSchneider2005年)。クローニングの由来となったバクテリオファージにちなんで名付けられたこれらの酵素のいくつかは、よく特徴付けられた、遺伝子組換えにとって重要なゲノム制御エレメント(すなわちプロモーター、終結シグナル、転写中断配列)も有する。
【００５８】
内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との間に競合もない。バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼ部分を含む本発明によるキメラ酵素は、任意の真核生物種(例えば酵母、齧歯類、およびヒト)においてRNA転写産物の産生を可能にする。それらは、高価でなく、実施するのに迅速容易であるので、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に適切であり、RNAポリメラーゼIIなどの真核性RNAポリメラーゼと対照的にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの大部分は転写の開始、伸長または終結に関して補助因子を必要としないので、任意の生物系(例えば無細胞反応混合物、培養細胞および生体)においてRNA転写産物の産生を可能にする。
【００５９】
バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、特に、野生型のT7RNAポリメラーゼ、野生型のT3RNAポリメラーゼ(NCBIゲノム配列ID#NC_003298;遺伝子ID#927437;UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q778M8)、野生型のK11RNAポリメラーゼ(NCBI K11RNAPゲノム配列ID#NC_004665;遺伝子ID#1258850;UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q859H5)、野生型のφA1122RNAポリメラーゼ(NCBIゲノム配列ID#NC_004777;遺伝子ID#1733944;UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID#Q858N4)、野生型のφYeo3-12RNAポリメラーゼ(NCBIゲノム配列ID#NC_001271;遺伝子ID#1262422;UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q9T145)および野生型のgh-1RNAポリメラーゼ(NCBIゲノム配列ID#NC_004665;遺伝子ID#1258850;UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID#Q859H5)、野生型のK1-5RNAP RNAポリメラーゼ(NCBIゲノム配列ID#NC_008152;遺伝子ID#5075932;UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID#Q8SCG8)および野生型のSP6RNAポリメラーゼ(NCBIゲノム配列ID#NC_004831;遺伝子ID#1481778;UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID#Q7Y5R1)の触媒ドメインならびに二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きで合成することができるそれらの変異体または誘導体からなる群の中で選択される触媒ドメイン、より詳細には、野生型のT7RNAポリメラーゼの触媒ドメインであってもよい。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「T7RNAポリメラーゼ」という用語はバクテリオファージのT7DNA依存性RNAポリメラーゼに関する。好ましくは、T7RNAポリメラーゼは、SEQ ID N°1(NCBIゲノム配列ID#NC_001604;遺伝子ID#1261050;UniProtKB/Swiss-Prot ID#P00573)のアミノ酸配列を有し、分子量が98.8kDaである883アミノ酸のタンパク質である(Davanloo、Rosenbergら1984年;Moffatt、Dunnら1984年)。
【００６１】
T7RNAポリメラーゼは、in vitroで極めて伸長性があり、37℃で5'→3'の向きに240〜250ヌクレオチド/秒伸長する(GolombおよびChamberlin1974年;Lyakhov、Heら1997年;ZhangおよびStudier1997年;Finn、MacLachlanら2005年)という利点を特に有する。そのうえ、真核細胞で発現させた際に、T7RNAポリメラーゼは細胞質に大部分が留まり(Elroy-SteinおよびMoss1990年;GaoおよびHuang1993年;Brisson、Heら1999年)、そのことによって真核細胞の細胞質から核への巨大なDNA分子(すなわち導入遺伝子)の能動的な移行および核から細胞質へのRNA分子の運び出しが回避されることによって、導入遺伝子の発現レベルが最適化される。
【００６２】
DNA依存性RNAポリメラーゼ触媒ドメインは、T7RNAポリメラーゼの野生型の触媒ドメインであってもよいが、処理能力が低下しても、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きに合成することができるT7RNAポリメラーゼの変異体の触媒ドメインでもよい。例えば、前記変異体は、R551S、F644A、Q649S、G645A、R627S、I810SおよびD812E(Makarova、Makarovら1995年)ならびにK631M(Osumi-Davis、de Aguileraら1992年;Osumi-Davis、Sreeramaら1994年)を含む群の中で選択することができる。
【００６３】
本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインに対してC末端に位置する。
【００６４】
実際、DNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインがバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際は、前記触媒ドメインはその天然のカルボキシル末端を好ましくは保存する。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのC末端、特にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼC末端は、前記キメラ酵素のC末端と一致する。特に、キメラ酵素がバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの全体、特にT7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの全体を含む際は、前記ポリメラーゼは、その天然のカルボキシル末端を好ましくは保存する。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのC末端、特にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼのC末端は、前記キメラ酵素のC末端に一致する。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特に、T7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの全部または一部に含まれ、ここでは、前記バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼのC末端は、前記キメラ酵素のC末端に一致する。
【００６５】
本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインに対してC末端に位置する。
【００６６】
別の実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。
【００６７】
好ましくは、前記細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼは、構造の複雑さが中程度である。
【００６８】
例えば、前記細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼは大腸菌(E.coli)のDNA依存性RNAポリメラーゼ(NCBI K-12亜株DH10Bのゲノム配列ID#NC_010473)でよく、このポリメラーゼは4つの異なるサブユニット(αサブユニット:rpoA遺伝子ID#6060938、UniProtKB/Swiss-Prot ID#B1X6E7;βサブユニット:rpoB遺伝子ID#6058462、UniProtKB/Swiss-Prot ID#B1XBY9;β'サブユニット:rpoC遺伝子ID#6058956、UniProtKB/Swiss-Prot ID#B1XBZ0;σサブユニット:rpoE遺伝子ID#6060683、UniProtKB/Swiss-Prot ID#B1XBQ0)で構成され、これらのサブユニットは5つのααββ'σサブユニット複合体に会合する(Lodish、Berkら2008年)。大腸菌のRNAポリメラーゼのプロモーター(LisserおよびMargalit1993年)、rho依存的および非依存的ターミネーターを含めた終結シグナル(Platt1986年;UptainおよびChamberlin1997年)ならびに転写中断配列(Lee、Phungら1990年)を含めて、この酵素の活性制御に関わるゲノムエレメントはよく特徴付けられている。
【００６９】
別の実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、ミトコンドリア、葉緑体および原色素体のような真核性オルガネラのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。実際、これらのポリメラーゼも比較的簡単な構造を有し得る。
【００７０】
特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、ミトコンドリアのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。
【００７１】
特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、哺乳動物のマウスのミトコンドリアのRNAポリメラーゼの触媒ドメインでよく、このポリメラーゼは、単一ユニットの120kDaのタンパク質(遺伝子ID#216151、UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q8BKF1)であり、バクテリオファージのRNAポリメラーゼと相同性を持つ(Tiranti、Savoiaら1997年)。いくつかの転写因子、すなわちTFB1M(ミトコンドリア転写因子B1;マウス遺伝子ID#224481、UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q8JZM0)またはTFB2M(ミトコンドリア転写因子B2;マウス遺伝子ID#15278、UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q3TL26)、TFAM(ミトコンドリア転写因子A、マウス遺伝子ID#21780、UniProtKB/Swiss-Prot ID#P40630)および転写終結に関するmTERF(ミトコンドリア転写終結因子;マウス遺伝子ID#545725、UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q8CHZ9)(FisherおよびClayton 1985年;Fisher、Topperら1987年;FisherおよびClayton 1988年;TopperおよびClayton 1989年;Fernandez-Silva、Martinez-Azorinら1997年、Prieto-Martin、Montoyaら2001年;McCulloch、Seidel-Rogolら2002年)が転写の開始、伸長または終結に必要とされる。ミトコンドリアゲノムの軽鎖および重鎖にある2つのプロモーター(Ojala、Montoyaら1981年;Clayton1991年)ならびに転写終結シグナル(Kruse、Narasimhanら1989年)を含めて、ミトコンドリアRNAポリメラーゼの酵素活性制御に関わるゲノムエレメントはよく特徴付けられている。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「RNAトリホスファターゼ」(RTPase)という用語は、新生mRNA前駆体の5'三リン酸末端γリン酸残基を除去し二リン酸にする酵素(FuruichiおよびShatkin2000年)に関する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「RNAグアニリルトランスフェラーゼ」(GTase)という用語は、GTPから二リン酸新生RNA末端にGMPを移す酵素(FuruichiおよびShatkin2000年)を指す。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「N7-グアニンメチルトランスフェラーゼ」(N7-MTase)という用語は、グアニンの7位の窒素にメチル残基を加えてGpppNキャップとする酵素(FuruichiおよびShatkin2000年)に関する。
【００７５】
RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、同じまたは異なったキャッピング酵素の触媒ドメインであってもよい。前記触媒ドメインが同じ酵素の触媒ドメインである場合、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは異なる酵素の触媒ドメインである。
【００７６】
好ましくは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかの細胞質の酵素由来であり、それらは比較的簡単な構造およびよく特徴付けられた酵素活性を好都合なことに有する。したがって、特にRNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかのウイルスキャッピング酵素の触媒ドメインまたは細胞質エピゾームのキャッピング酵素の触媒ドメインであってもよい。
【００７７】
一実施形態では、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかのウイルスキャッピング酵素に由来し、特に、新生mRNA前駆体5'三リン酸末端のγリン酸残基を除去して二リン酸にすること、またはGTPからGMPを二リン酸新生RNA末端に移すこと、またはグアニンの7位の窒素にメチル残基を加えてGpppNキャップとすることがそれぞれできる、野生型のブルータングウイルスキャッピング酵素、野生型のタケモザイクウイルスキャッピング酵素、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素、野生型の多食アメーバミミウイルスキャッピング酵素およびそれらの変異体または誘導体からなる群の中で選択されるキャッピング酵素に由来し、より詳細には、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素に由来する。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「ブルータングウイルスキャッピング酵素」という用語は、ブルータングウイルス(BTV)の単一ユニットのVP4キャッピング酵素に関する。この酵素は、76kDaタンパク質(644アミノ酸;配列に関しては、例えばNCBI BTV血清型10のゲノム配列ID#Y00421;遺伝子ID#2943157;UniProtKB/Swiss-Prot ID#P07132、D0UZ45、Q5J7C0、Q65751、Q8BA65、P33428、P33429、P33427、C3TUP7、Q8BAD5、C5IWW0、B4E551、Q3VQ2、Q3KVQ1、Q65732、Q3VP8、Q3KVP9、Q3VQ0を参照されたい)である。このキャッピング酵素は、そのカルボキシル末端近傍に位置するロイシンジッパーを介してホモ二量体化する可能性が高い(Ramadevi、Rodriguezら1998年)。VP4は、mRNAのm7GpppNキャッピング合成に必要とされる3つ全ての酵素、すなわちRTPase(Martinez-Costas、Suttonら1998年)、GTase(Martinez-Costas、Suttonら1998年;Ramadevi、Burroughsら1998年)およびN7-MTase(Ramadevi、Burroughsら1998年)の段階を触媒する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「タケモザイクウイルスキャッピング酵素」という用語は、ORF1、すなわちタケモザイクウイルス(BMV)のmRNAキャッピング酵素に関する。この酵素は単一ユニットの155-kDaタンパク質(1365アミノ酸、NCBI BMV分離株BaMV-Oのゲノム配列ID#NC_001642、遺伝子ID#1497253、UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q65005)である。ORF1タンパク質は、m7GpppNのmRNAキャッピングを生じるのに必要な全ての酵素活性、すなわちRTPase(Li、Shihら2001年;Han、Tsaiら2007年)、GTaseおよびN7-MTase(Li、Chenら2001年;Li、Shihら2001年)を有する。加えて、ORF1はRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を有し、この活性は本発明によるキメラ酵素活性には必須ではなく、このmRNAキャッピング酵素のAsp1229Asp1230残基を欠損させることにより無効にすることができる(Li、Chengら1998年)。本明細書で使用する場合、「アフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素」という用語はNP868Rキャッピング酵素(G4R)、(ASFV)に関する。この酵素は、単一ユニットの100kDaタンパク質(868アミノ酸;NCBI BA71V系統のASFVのゲノム配列ID#NC_001659;遺伝子ID#1488865;UniProtKB/Swiss-Prot ID#P32094)である。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「多食アメーバミミウイルスキャッピング酵素」という用語はR382、(APMV)に関する。これは、別の単一のユニット136.5kDaタンパク質(1170アミノ酸;NCBI APMVのゲノム配列ID#NC_006450;遺伝子ID#3162607;UniProtKB/Swiss-Prot ID#Q5UQX1)である。
【００８１】
一実施形態では、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、pGKL2のような、細胞質のエピゾームの1つまたはいくつかのキャッピング酵素に由来する。特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、酵母の染色体外直線状エピゾームpGKL2のキャッピング酵素全部または一部に含まれる。
【００８２】
細胞質の直線状エピゾームは二本鎖DNA構造であり、様々な酵母系統の細胞質で安定して複製する(Cong、Yarrowら1994年)。酵母の染色体外直線状エピゾームの一プロトタイプ、pGKL2(13,457bp;pGK12とも命名される)は、クルイベロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)CB2359および出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)F102-2(Tommasino、Ricciら1988年)を含めた様々な酵母系統で全配列が決定されている。クルイベロミセスラクチスpGKL2のORF3遺伝子(NCBI  クルイベロミセスラクチスCB2359 pGKL2のゲノム配列ID#NC_010187;UniProtKB/Swiss-Prot ID#P05469)にコードされているキャッピング酵素は、594アミノ酸のタンパク質(70.6kDaタンパク質)である。
【００８３】
本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、少なくとも2つの、特に少なくとも3つの、より特定すると全ての触媒ドメインを直接的に、または連結性ペプチド(linking peptide)によって間接的に会合、融合または結合することができる。
【００８４】
特に、
-  RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび
-DNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン
からなる群の中で選択される、少なくとも2つ、特に少なくとも3つ、より特定すると全ての触媒ドメインが直接的に、または連結性ペプチドによって結合する。
【００８５】
連結性ペプチドは、立体障害を最小限にし、融合タンパク質の構成要素に十分なスペースを提供してその天然の高次構造を保つ融合タンパク質を産生するという利点を有する。
【００８６】
好ましくは、少なくともDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、
-  RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよび
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン
からなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つと連結性ペプチドによって結合する。
【００８７】
特に、連結性ペプチドは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対してN末端に、ならびにRNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインに対してC末端に位置することできる。
【００８８】
特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのN末端、特にT7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのN末端は、
-  RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよび
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン
からなる群の中で選択される触媒ドメイン1つのC末端に、共有結合、特に連結性ペプチドによって連結する。
前記連結性ペプチドは、
-  式(GlymSerp)nのペプチド(ここでは、
・  mは0から12、特に1から8、より特定すると3から6、さらに特定すると4の整数を表し、
・  pは0から6、特に0から5、より特定すると0から3、より特定すると1の整数を表し、
・  nは0から30、特に0から12、より特定すると0から8、さらに特定すると1から6までの整数を表す)
-  配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド
からなる群から選択することができる。
【００８９】
式(GlymSerp)nのフレキシブルなリンカーペプチドは、グリシン残基がペプチドに柔軟性を与え、一方セリンが多少の溶解性をもたらすという利点を有する(Huston、Levinsonら1988年)。さらに、(GlymSerp)nリンカー配列にキモトリプシンI、第Xa因子、パパイン、プラスミン、トロンビンおよびトリプシンに対する感受性部位がないことによって、得られる融合タンパク質の全体的な安定性が増すはずである(CrastoおよびFeng2000年)。
【００９０】
可変長の(GlymSerp)nリンカーが単鎖Fv断片(sFv)抗体を作成するのに一般に使用される(Huston、Levinsonら1988年)。加えて、(GlymSerp)nリンカーが、融合タンパク質の各構成要素の生物活性を高頻度で保持する様々な融合タンパク質を作出するのに使用されている(Newton、Xueら1996年;Lieschke、Raoら1997年;Shao、Zhangら2000年;Hu、Liら2004年)。
【００９１】
GGGGIAPSMVGGGGS(配列番号2)(Turner、Ritterら1997年)、SPNGASNSGSAPDTSSAPGSQ(配列番号3)(Hennecke、Krebberら1998年)、EGKSSGSGSESKSTE(配列番号4)(Bird、Hardmanら1988年)、EGKSSGSGSESKEF(配列番号5)(Newton、Xueら1996年)、GGGSGGGSGGGTGGGSGGG(配列番号6)(RobinsonおよびSauer1998年)、GSTSGSGKSSEGKG(配列番号7)(Bedzyk、Weidnerら1990年)、YPRSIYIRRRHPSPSLTT(配列番号8)(Tang、Jiangら1996年)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号9)(Whitlow、Bellら1993年)、GSTSGSGKPGSGEGS(配列番号10)(Ting、Kainら2001年)、SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDA(配列番号11)(Pantoliano、Birdら1991年)、GSADDAXXDAAXKDDAKKDDAKKDGS(配列番号12)(Gregoire、Linら1996年)、LSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDL(配列番号13)(Pavlinkova、Beresfordら1999年)、AEAAAKEAAAKEAAAKA(配列番号14)(Wickham、Carrionら1995年)、GSHSGSGKP(配列番号15)(Ting、Kainら2001年)、GSTSGSGKPGSGEGSTGAGGAGSTSGSGKPSGEG(配列番号16)(Ting2003年)、LSLEVAEEIARLEAEV(配列番号17)(Liu、Jian-Boら2005年)およびGTPTPTPTPTGEF(配列番号18)(Gustavsson、Lehtioら2001年)など、他のタイプのペプチドリンカーも本発明によるキメラ酵素を作出するのに検討可能である。
【００９２】
他のタイプの共有結合には、これらに限定されないが、ジスルフィド結合(Mantile、Fuchsら2000年)、トランスグルタミネーション(PaguiriganおよびBeebe2007年)ならびに化学薬品および/または物理的要因、例えばトリス(ビピリジン)ルテニウム(II)-ジクロリドおよび紫外線照射(FancyおよびKodadek1999年)による架橋結合によるタンパク質のトランス結合(trans-linking)が含まれる。
【００９３】
RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒はドメイン、ロイシンジッパー、触媒ドメインの一方に対するビオチニル化ドメイン(例えばAvi-tagII(Cronan1990年)またはPFB-tag(Wu、Yeungら2002年))および他方の触媒ドメインの1つに対するビオチン結合ドメイン(例えばStrep-tagII(SchmidtおよびSkerra1993年)またはNano-tag(LamlaおよびErdmann2004年))のような、本発明によるキメラ酵素中の特定のタンパク質エレメントによっても会合可能である。
【００９４】
本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、前記触媒ドメインの少なくとも2つは非共有結合、特にロイシンジッパーによって会合することができる。
【００９５】
好ましくは、少なくともDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、
-  RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、
-  グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよび
-  N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン
からなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つに、非共有結合、特にロイシンジッパーによって会合する。
【００９６】
互いに相互作用する両親媒性の2つのαヘリックスからなる、二量体のコイルドコイルタンパク質構造であるロイシンジッパーは、ホモまたはヘテロ二量体化タンパク質に一般に使用される(O'Shea、Klemmら1991年)。各へリックスは7アミノ酸リピートから構成され、この7アミノ酸の最初のアミノ酸(残基a)は疎水性であり、4番目(残基d)は通常ロイシンであるが、他の残基は極性である。平行なヘテロ二量体の2本鎖コイルドコイル構造を形成するロイシンジッパーのVELCROのACID-p1およびBASE-p1は、平行なタンパク質ヘテロ二量体を形成する傾向が高い(O'Shea、Lumbら1993年)。これらは、膜タンパク質(Chang、Baoら1994年;Pashine、Buschら2003年)ならびにいくつかの可溶性タンパク質(Busch、Reichら1998年;Busch、Pashineら2002年)をヘテロ二量体化するのに使用されている。
【００９７】
他のタイプのオリゴマー形成ペプチドドメイン、特にACID-a1/BASE-a1(OakleyおよびKim1998年)、ACID-Kg/BASE-Eg(McClain、Woodsら2001年)、NZ/CZ(Ghosh、Hamiltonら2000年)、ACID-pLL/BASE-pLL(LumbおよびKim1995年)ならびにEE1234LおよびRR1234L(Moll、Ruvinovら2001年)ロイシンジッパーなどの逆平行のヘテロマー構造を形成するロイシンジッパーも、本発明によるキメラ酵素を作出するのに、本発明によるキメラ酵素の前記触媒ドメインの少なくとも2つを会合するのに検討可能である。ジスルフィド結合バージョンのロイシンジッパーも本発明によるジスルフィドコイルドコイル結合ヘテロ二量体のキメラ酵素(O'Shea、Lumbら1993年)ならびに酸化条件下でのシステイン残基間の鎖間ジスルフィド架橋(WellsおよびPowers1986年)を作出するのに使用することができる。
【００９８】
したがって、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインの少なくとも2つは、ロイシンジッパー、特にACID-a1/BASE-a1(OakleyおよびKim1998年)、ACID-Kg/BASE-Eg(McClain、Woodsら2001年)、NZ/CZ(Ghosh、Hamiltonら2000年)およびACID-pLL/BASE-pLLロイシンジッパーのような逆平行のヘテロマー構造を形成するロイシンジッパー、ジスルフィドコイルドコイル結合(O'Shea、Lumbら1993年)ならびにシステイン残基間のジスルフィド架橋(WellsおよびPowers1986年)によって会合することができる。
【００９９】
一実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、特にリンカーを介して、より詳細には(Gly3Ser)4リンカーを介して、
-  RNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素と、それと融合された
-  二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'向きで合成することができる野生型のT7RNAポリメラーゼまたはその変異体もしくは誘導体のアミノ末端、特に野生型のT7RNAポリメラーゼのアミノ末端
を含む。
【０１００】
別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、特にリンカーを介して、より詳細には、(Gly3Ser)4リンカーを介して、
-  RNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素と、それと融合された
-  二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きで合成することができる野生型のT3RNAポリメラーゼまたはその変異体もしくは誘導体のアミノ末端、特に野生型のT3RNAポリメラーゼアミノ末端
を含む。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、特にリンカーを介して、より詳細には(Gly3Ser)4リンカーを介して、
-  RNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素と、それと融合された
-  二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きに合成することができる野生型のSP6RNAポリメラーゼまたはその変異体または誘導体のアミノ末端、特に野生型のSP6RNAポリメラーゼのアミノ末端
を含む。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、ロイシンジッパーによって会合する
-  RNA分子の5'末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素および
-  二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5'→3'の向きで合成することができる野生型のT7RNAポリメラーゼまたはその変異体ならびに誘導体のアミノ末端、特に野生型のT7RNAポリメラーゼのアミノ末端
を含む。
【０１０３】
本発明によるキメラ酵素は、本発明のキメラ酵素の少なくとも1つの触媒ドメインの活性、特にRNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインからなる群の中で選択される少なくとも1つの触媒ドメインの活性を増強するドメインをさらに含むこともできる。
【０１０４】
例えば、本発明のキメラ酵素の少なくとも1つの触媒ドメインの活性を増強する前記ドメインは、ワクシニアウイルスD12L遺伝子(ゲノム配列ID#NC_006998.1;遺伝子ID#3707515;UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232999.1)にコードされる31-kDaサブユニットでよく、このサブユニットは固有の酵素活性は持たないが、ワクシニアのmRNAキャッピング酵素のD1RサブユニットのRNA N7-グアニンメチルトランスフェラーゼ活性を強烈に増強する(Higman、Bourgeoisら1992年;Higman、Christenら1994年;MaoおよびShuman1994年)。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のキメラ酵素は、
-  ワクシニアmRNAキャッピング酵素の少なくとも1つの触媒ドメイン、特に、RNAトリホスファターゼ、RNAグアニリルトランスフェラーゼおよびRNA N7-グアニンメチルトランスフェラーゼの酵素活性を有し(CongおよびShuman1993年;NilesおよびChristen1993年;HigmanおよびNiles1994年;MaoおよびShuman1994年;GongおよびShuman2003年)、ワクシニアウイルスD1R遺伝子(ゲノム配列ID#NC006998.1;遺伝子ID#3707562;UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232988.1)にコードされる95kDaサブユニット
-  少なくとも1つのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6-RNAポリメラーゼからなる群の中で選択される触媒ドメイン、より詳細にはT7RNAポリメラーゼの触媒ドメインおよび
-  ワクシニアウイルスのD12L遺伝子によってコードされる31kDaサブユニット
を含み、
特にリンカーを介して、より詳細には(Gly3Ser)4リンカーを介して、および/またはロイシンジッパーによって全部または一部が会合する。
【０１０６】
本発明は、単離核酸分子または単離核酸分子群にも関する。前記核酸分子は、本発明によるキメラ酵素をコードする。
【０１０７】
本発明によるキメラ酵素をコードする前記単離核酸分子群は、その発現によって本発明によるキメラ酵素を得るのに必要かつ十分な全ての核酸分子を含むまたはそのような核酸分子から構成される。
【０１０８】
一実施形態では、本発明によるキメラ酵素をコードする前記単離核酸分子群は、
-  少なくとも1つのRNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、少なくとも1つのグアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび少なくとも1つのN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子ならびに
-  少なくとも1つのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子
を含むまたはそれらから構成される。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素をコードする前記単離核酸分子群は、
-  少なくとも1つのRNAトリホスファターゼの触媒ドメインをコードする核酸分子、
-  少なくとも1つのグアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子、
-  少なくとも1つのN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子および
-  少なくとも1つのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子
を含むまたはそれらから構成される。
【０１１０】
特に、本発明による核酸分子は、
-  真核性DNA依存性RNAポリメラーゼ、好ましくはRNAポリメラーゼIIに対するプロモーターおよび
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーター
からなる群から選択される少なくとも1つの、好ましくは全てのプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０１１１】
真核性DNA依存性RNAポリメラーゼ、好ましくはRNAポリメラーゼIIに対するプロモーターと核酸の連結は、真核性宿主細胞で本発明のキメラ酵素を発現させる際に、キメラ酵素の発現が真核性RNAポリメラーゼ、好ましくはRNAポリメラーゼIIによって駆動するという利点を特に有する。次に、これらのキメラ酵素は導入遺伝子の転写を開始することができる。組織特異的RNAポリメラーゼIIプロモーターを使用する場合、本発明のキメラ酵素を標的組織/細胞で選択的に発現させることができる。
【０１１２】
前記プロモーターは、当業者に周知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。このプロモーターは、発達的制御性、誘導性または組織特異的であってもよい。
【０１１３】
本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターにも関する。前記ベクターは、半安定的または安定的発現に供してよい。
【０１１４】
本発明は、本発明による前記単離核酸分子群を含むベクター群にも関する。
【０１１５】
特に、本発明による前記ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターである。
【０１１６】
ベクターは、バクテリオファージなどのウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどの非ウイルスベクターであってもよい。
【０１１７】
一実施形態では、本発明による前記ベクターはバイシストロニックなベクターであり、特に、本発明による核酸分子およびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインおよび/または少なくとも1つの目的DNA配列に対するプロモーターを含み、ここでは、前記DNA配列は、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのプロモーターに作動可能に連結される。
【０１１８】
本発明による前記ベクターは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターを含んでもよい。
【０１１９】
本発明は、本発明による単離核酸分子もしくは本発明による単離核酸分子群または本発明によるベクターもしくは本発明によるベクター群を含む宿主細胞にも関する。
【０１２０】
本発明による宿主細胞は、大規模なタンパク質産生に有用であり得る。
【０１２１】
好ましくは、本発明によるDNA-ポリメラーゼRNAポリメラーゼキメラ酵素の前記触媒ドメインは、内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との競合を防ぐために、宿主細胞のものとは異なる酵素由来である。
【０１２２】
本発明は、発明によるキメラ酵素を発現させた遺伝子改変したヒト以外の真核生物にも関する。前記ヒト以外の真核生物は、ヒト以外の任意の動物、植物であってもよい。
【０１２３】
本発明は、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を産生するための、本発明によるキメラ酵素または本発明による単離核酸分子もしくは本発明による単離核酸分子群の、特にin vitroまたはex vivoでの使用にも関する。
【０１２４】
本発明は、タンパク質、特に抗体のような治療上有益なタンパク質を、特にin vitro合成タンパク質アッセイまたは培養細胞などの真核生物系で産生するための、本発明によるキメラ酵素または本発明による単離核酸分子もしくは本発明による単離核酸分子群のin vitroまたはex vivoでの使用にも関する。
【０１２５】
本発明は、特にin vitroまたはex vivoにおいて、5'末端にm7GpppNキャップを有する、DNA配列にコードされたRNA分子を宿主細胞で産生する方法にも関し、前記方法は、本発明による核酸分子または核酸分子群を宿主細胞で発現させる工程を含み、前記DNA配列はDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーター、特に前記宿主細胞で有効な前記プロモーターに作動可能に連結される。
【０１２６】
好ましくは、本発明によるキメラ酵素のDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、内因性遺伝子の転写と前記DNA配列の転写との競合を防ぐために、宿主細胞のものと異なる酵素に由来する。
【０１２７】
特に、本発明による前記方法は、リン酸カルシウムを用いるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは陽イオン脂質とDNAを混合してリポソームを産生することによるような当業者に周知の方法で、前記DNA配列および/または本発明による核酸を宿主細胞へ導入する工程をさらに含むことができる。
【０１２８】
一実施形態では、本発明による前記方法は、前記宿主細胞の細胞内転写および転写後機構を抑制する工程、特に(好ましくはsiRNAによる)サイレンシングをさらに含む。
【０１２９】
一実施形態では、本発明による前記方法は、前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼのサブユニットおよび/または内因性のキャッピング酵素のサブユニットの少なくとも1つの発現を抑制する工程をさらに含む。
【０１３０】
前記追加工程(すなわち、前記宿主細胞の細胞内転写および転写後機構を抑制、特に(好ましくはsiRNAまたはshRNAによって)サイレンシングすること、ならびに/あるいは前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼの1つもしくはいくつかのサブユニットおよび/または内因性のキャッピング酵素の1つまたはいくつかのサブユニットの発現を抑制すること)によって、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子合成の最適化が可能になる。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼ」という用語は、前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼに関する。宿主細胞が真核細胞の際は、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼはRNAポリメラーゼIIである。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「内因性のキャッピング酵素」という用語は、前記宿主細胞の内因性のキャッピング酵素を指す。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「タンパク質の発現抑制」という用語は、前記タンパク質の発現が少なくとも20%、特に少なくとも35%、少なくとも50%、より特定すると少なくとも65%、少なくとも80%、少なくとも90%減少することに関する。タンパク質の発現抑制は、これらに限定されないが、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、RT-PCRを含めた当業者に周知の技術によって決定することができる。
【０１３４】
前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよび/または内因性のキャッピング酵素の発現抑制の工程は、これらに限定されないが、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよび/または内因性のキャッピング酵素を標的にするsiRNA(低分子干渉RNA)技術、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよび/または内因性のキャッピング酵素を標的にするアンチセンスRNA技術、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよび/または内因性のキャッピング酵素を標的にするshRNA(低分子ヘアピン型RNA)技術を含めた、任意の当業者に周知の技術によって実施することができる。
【０１３５】
同じ目的で、siRNA(またはshRNA;低分子ヘアピン型RNA)に加えて、DNAまたはRNAアンチセンス(LiuおよびCarmichael1994年;DiasおよびStein2002年)、ハンマーヘッドリボザイム(Salehi-AshtianiおよびSzostak2001年)、ヘアピンリボザイム(Lian、De Youngら1999年)またはキメラsnRNA U1-アンチセンス標的配列(Fortes、Cuevasら2003年)を含めた他の抑制配列も検討可能であろう。加えて、細胞の転写(例えばRNAポリメラーゼIIの他のサブユニットまたは転写因子)、転写後プロセシング(例えばキャッピング酵素の他のサブユニットならびにポリアデニル化因子またはスプライソソーム因子)およびmRNAの核外移行経路に含まれる他の遺伝子を含めた、他の細胞の標的遺伝子が抑制に関して検討可能であろう。
【０１３６】
一実施形態では、本発明による方法は、前記RNA分子が治療上有益なポリペプチドをコードすることができる。
【０１３７】
別の実施形態では、前記RNA分子は、siRNA、リボザイム、shRNAおよびアンチセンスRNAを含む群から選択されるノンコーディングRNA分子であってもよい。特に、前記DNA配列は、mRNA、ノンコーディングRNA、特にsiRNA、リボザイム、shRNAおよびアンチセンスRNAからなる群の中で選択されるRNA分子をコードすることができる。
【０１３８】
本発明は、キャッピング酵素およびDNA依存性RNAポリメラーゼとしての本発明によるキメラ酵素の使用にも関する。
【０１３９】
本発明は、5'末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子の産生のためのキットにも関する。このキットは、少なくとも1つの本発明によるキメラ酵素、ならびに/または本発明による単離核酸分子および/もしくは核酸分子群、ならびに/または本発明によるベクターおよび/もしくは本発明によるベクター群を備える。
【０１４０】
一実施形態では、本発明のキットは、本発明によるベクターおよび/または本発明によるベクター群を備え、前記ベクターは、
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターおよび/または
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列
を備える。
【０１４１】
本発明によるキットは、
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターを含むベクターおよび/または
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列
をさらに備えることができる。
【０１４２】
本発明は、特に、好ましくは遺伝子治療による、ヒトまたは動物の病状の予防および/または治療のための医薬として使用するための、本発明によるキメラ酵素、本発明による単離核酸分子、本発明による核酸分子群または本発明によるベクターにも関する。
【０１４３】
本発明は、本発明によるキメラ酵素、ならびに/または本発明による単離核酸分子および/もしくは本発明による核酸分子群、ならびに/または本発明によるベクターを含む医薬組成物にも関する。好ましくは、本発明による前記医薬組成物は薬学的に許容可能な担体で製剤化される。
【０１４４】
薬学的に許容可能な担体は当業者に周知である。
【０１４５】
本発明による医薬組成物は、
-  DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのプロモーターに対して作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列
をさらに含むことができる。
【０１４６】
(特に、本発明によるキメラ酵素、本発明による単離核酸分子、本発明による単離核酸分子群、本発明によるベクター、本発明によるベクター群および少なくとも1つの目的DNA配列からなる群の中で選択される)そのような構成要素は、本発明による医薬組成物または医薬に治療量(有効量および非毒性量)で存在してよい。
【０１４７】
そのような治療量は、本発明による前記医薬組成物または医薬の投与によって予防および/または治療されることが検討される病状および/または障害に対して前記構成要素の投与が与える影響の評価を含めたルーチン試験により当業者によって決定することができる。
【０１４８】
例えば、そのような試験は、異なる量の(特に、本発明によるキメラ酵素、本発明による単離核酸分子、本発明による単離分子群、本発明によるベクター、本発明によるベクター群および少なくとも1つの目的DNA配列からなる群の中で選択される)前記構成要素の投与が前記病状および/または前記障害に特有の(生物学的および/または臨床的な)マーカー一式に対して与える量的および質的の両影響を、被験者の生物学的試料から分析することによって実施することができる。
【０１４９】
本発明は、本発明によるキメラ酵素、ならびに/または本発明による単離核酸分子および/もしくは本発明による核酸分子群、ならびに/または本発明によるベクターおよび/もしくは本発明によるベクター群を、それを必要とする患者に治療量で投与することを含む治療方法にも関する。本発明による治療方法は、少なくとも1つの目的DNA配列(ここでは、前記DNA配列は、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結される)を治療量でそれを必要とする被験者に投与することをさらに含むことができる。
【０１５０】
前記キメラ酵素、核酸分子および/または本発明による前記ベクターは、前記目的DNA配列と同時に、別々にまたは連続して、特に前記目的DNA配列の前に投与することができる。
【０１５１】
本発明は、特に遺伝子治療による、ヒトまたは動物の病状の予防および/または治療に使用するための本発明による医薬組成物にも関する。
【０１５２】
前記病状は、前記の少なくとも1つの目的DNA配列の投与によって改善され得る病状からなる群から選択することができる。
【０１５３】
本発明は、特に遺伝子治療によるヒトまたは動物の病状の予防および/または治療のために、本発明によるキメラ酵素、ならびに/または本発明による単離核酸分子および/もしくは本発明による核酸分子群、ならびに/または本発明によるベクターおよび/もしくは本発明によるベクター群を医薬製造へ使用することにも関する。
【０１５４】
本発明は、
-  少なくとも1つの本発明による酵素、ならびに/または少なくとも1つの本発明による核酸分子および/もしくは本発明による核酸分子群、ならびに/または本発明による核酸分子および/もしくは本発明による核酸分子群を含むかつ/または発現させる少なくとも1つの本発明によるベクターおよび
-  少なくとも1つの目的DNA配列(ここでは、前記DNA配列はDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結される)
を含む、同時、分離または連続投与のための併用製品にも関する。
【０１５５】
前記目的DNA配列は、抗癌遺伝子(腫瘍抑制遺伝子)であってもよい。
【０１５６】
前記目的DNA配列は、治療上有益なポリペプチドまたはsiRNA、リボザイム、shRNAおよびアンチセンスRNAを含む群の中で選択されるノンコーディングRNAをコードすることができる。
【０１５７】
前記治療上有益なポリペプチドは、サイトカイン、細胞のまたは核の受容体、リガンド、凝固因子、CFTRタンパク質、インスリン、ジストロフィン、成長ホルモン、酵素、酵素阻害剤、抗悪性腫瘍効果を有するポリペプチド、細菌性、寄生虫性またはウイルス性感染、特にHIV感染を抑制することができるポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、RNAポリメラーゼIIのサブユニット(特にRNAポリメラーゼIIのRpb1サブユニットであり、これはαアマニチン毒素で阻害することができる)およびマーカーから選択することができる。
【０１５８】
好ましくは、本発明による併用製品は、薬学的に許容可能な担体で製剤化することができる。
【０１５９】
本発明による併用製品の一実施形態では、前記ベクターは前記目的DNA配列の前に投与される。
【０１６０】
本発明は、特に遺伝子治療によるヒトまたは動物の病状の予防および/または治療に使用するための本発明による併用製品にも関する。
【０１６１】
前記病状は、上で述べたような、少なくとも1つの目的DNA配列の投与によって改善され得る病状からなる群から選択することができる。
【０１６２】
例えば、前記病状ならびにその臨床的、生物学的または遺伝的サブタイプは、癌およびその素因(特に乳癌および結腸直腸癌、メラノーマ)、悪性血液障害(特に白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、骨髄腫)、血液凝固障害および1次止血障害、異常血色素症(特に鎌状赤血球性貧血およびサラセミア)、(全身性エリテマトーデスおよび強皮症を含めた)自己免疫障害、心血管系症状(特に心律動障害および心伝導障害、ならびに肥大型心筋症)、代謝異常(特にI型およびII型糖尿病ならびにその合併症、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症およびその合併症、ムコ多糖症、糖原病、フェニルケトン尿症)、(エイズ、ウイルス性B型肝炎、ウイルス性C型肝炎、インフルエンザおよび他のウイルス病;ボツリヌス中毒、破傷風および他の細菌性疾患;マラリアおよび他の寄生虫性疾患を含めた)感染性疾患、(デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびスタイナート筋緊張性筋ジストロフィーを含めた)筋障害、呼吸器疾患(特に嚢胞性線維症およびα1-アンチトリプシン欠損症)、腎臟疾患(特に腎嚢胞)、(肝硬変、ウィルソン病、αアマニチンによる肝毒性、薬物関連肝毒性を含めた)肝疾患、(クローン病および潰瘍性大腸炎を含めた)結腸直腸障害、眼障害特に網膜疾患(特にレーバー黒内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症)、中枢神経系障害(特にアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンチントン病、神経線維腫症、副腎白質ジストロトフィー、双極性疾患、統合失調症および自閉症)ならびに皮膚障害および結合組織障害(特にマルファン症候群および乾癬)を含む群から選択することができる。
【０１６３】
一実施形態では、本発明の併用製品は、
-  本発明による核酸分子および/または本発明による核酸分子群を含むかつ発現させる少なくとも1つのベクター(ここでは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼ、特にT7バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである)および
-  少なくとも1つの目的DNA配列(ここでは、前記DNA配列は、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼ、特にT7バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結され、ここでは、前記目的DNA配列は、アマニチン毒素によって阻害することができるRNAポリメラーゼIIのRpb1サブユニットをコードする)
を含む。
【０１６４】
本発明は、ヒトまたは動物のαアマニチンによる肝毒性の、遺伝子治療による予防および/または治療に使用するための、この併用製品にも関する。
【０１６５】
本発明は、本発明のキメラ酵素をコードする前記核酸分子または前記核酸分子群を、少なくとも1つの宿主細胞で、前記核酸分子の発現を前記宿主細胞で可能にする条件で発現させる工程を含む、本発明によるキメラ酵素の製造方法にも関する。
【０１６６】
本発明は、
-  本発明のキメラ酵素をコードする前記核酸分子群の一部を第一の宿主細胞で前記核酸分子の発現を前記宿主細胞で可能にする条件で発現させ、本発明のキメラ酵素の第一部分を得る工程と、
-  本発明のキメラ酵素をコードする前記核酸分子群の他の部分を第二の宿主細胞で前記核酸分子の発現を前記宿主細胞で可能にする条件で発現させ、本発明のキメラ酵素の第二部分を得る工程と、
-  前記第一部分および前記第二部分を会合させて、本発明のキメラ酵素を得る工程と
を含む、本発明によるキメラ酵素を製造する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】本発明によるキメラ酵素NP868R-T7RNAPによって引き起こされる翻訳産生量をモニターするために使用したホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現アッセイを表す図である。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミドは、pT7p-ルシフェラーゼプラスミドと共にヒトHEK-293培養細胞へ同時にトランスフェクションした。NP868R-T7RNAPおよびT7RNAP酵素の発現は、対応するプラスミドのRNAポリメラーゼII-依存性CMVプロモーターで駆動する。次に、NP868R-T7RNAPおよびT7RNAP酵素は、pT7p-ルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドのT7プロモーターによって転写が開始させられることが期待される。NP868R-T7RNAP酵素のmRNAキャッピングおよびDNA依存性RNAP酵素の両活性が保持されている場合は、ホタルルシフェラーゼタンパク質に翻訳することができ、細胞発光アッセイで検出することが可能な、m7GpppGmキャップ構造を有するルシフェラーゼmRNAが合成されることになる。これに対して、T7RNAP酵素は、5'末端にm7GpppNキャップを有さず、それによって翻訳されにくいRNA分子を合成することが期待される。
【図２Ａ】pT7RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。野生型のファージDNA依存性T7RNAポリメラーゼをコードするpT7RNAPプラスミドの物理地図。pT7RNAPプラスミドおよびpNP868R-T7RNAPは同じ設計である:CMVプロモーター、コザック配列に続いてT7RNAPの翻訳領域(ORF)、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナル。
【図２Ｂ】pNP868R-T7RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。NP868R mRNAキャッピング酵素(アフリカブタコレラウイルス)と野生型のファージDNA依存性T7RNAポリメラーゼ(バクテリオファージT7)とのフレキシブルな(Gly3Ser)4リンカーを介した融合物をコードするpNP868R-T7RNAPプラスミドの物理地図。pNP868R-T7RNAPおよびpT7RNAPプラスミドは同じ設計である:CMVプロモーター、コザック配列に続いてNP868R-T7RNAPの翻訳領域(ORF)、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナル。
【図３Ａ】ホタルルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドの物理地図を表す図であり、NP868R-T7RNAPおよびT7RNAPの酵素活性アッセイ用に設計された、pT7p-ルシフェラーゼである。これはpET-22b(+)骨格中において、一連のRNAポリメラーゼプロモーター(T7、T3およびSP6ファージRNAPプロモーター、続いて大腸菌リボゾームrrnD1プロモーター)、Lacオペレーター配列、ホタルルシフェラーゼの全ORF、ポリ[A]領域、RNA自己切断配列をコードするD型肝炎リボザイムおよびΤΦターミネーターから構成される。
【図３Ｂ】ホタルルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドの物理地図を表す図である。ルシフェラーゼORFとプロモーターの配列間の物理的接続が制限酵素消化によって切断される、BamHI消化pT7p-ルシフェラーゼである。このプラスミドは陰性対照として使用される。矢印は消化部位を示す。
【図３Ｃ】ホタルルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドの物理地図を表す図である。ホタルルシフェラーゼの全ORFがCMVプロモーターの制御化にある、pCMV-ルシフェラーゼである。このプラスミドは陽性対照として使用される。
【図４Ａ】HEK-293細胞へプラスミドをトランスフェクションした後のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示すグラフであり、pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼ、pT7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼおよびpCMV-ルシフェラーゼをトランスフェクションした細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示す。HEK-293細胞は、上記のように培養およびトランスフェクションした。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミド(0.4μgDNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)、および/またはpT7p-ルシフェラーゼ、BamHI消化pT7p-ルシフェラーゼもしくはpCMV-T7RNAP(0.4μgDNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)あるいは何もなしのいずれかで細胞をトランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ発光を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、Madison WI USA)を使用して選択した時点でアッセイした。トランスフェクション効率を標準化するために、pORF-eSEAPプラスミドでも細胞をトランスフェクションした。このプラスミドは、Quanti-Blue比色酵素アッセイキット(InvivoGen、San Diego、CA)を使用して細胞培養培地中でアッセイされる、胎盤分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)をコードする。遺伝子レポーター発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を2回独立して反復した。エラーバーは、平均値の標準誤差(SEM)を表す。スチューデントの両側t検定を用いて統計解析を実施した。pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼおよびpCMV-ルシフェラーゼプラスミドをトランスフェクションした細胞は、pT7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼを同時にトランスフェクションした細胞より、それぞれ23倍および33倍高いシグナル(*p<0.05)を示す。
【図４Ｂ】HEK-293細胞へプラスミドをトランスフェクションした後のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示すグラフであり、pT7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼ、pT7RNAP/BamHI消化pT7p-ルシフェラーゼ(*p<0.05)および他のコントロール条件(pT7RNAP単独、消化もしくは未消化pT7p-ルシフェラーゼ単独またはトランスフェクション試薬のみ)でトランスフェクションした細胞のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示す。HEK-293細胞は、上記のように培養およびトランスフェクションした。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミド(0.4μgDNA/ウェルおよび1μL/ウェルリポフェクタミン2000)、および/またはpT7p-ルシフェラーゼ、BamHI消化pT7p-ルシフェラーゼもしくはpCMV-T7RNAP(0.4μgDNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)あるいは何もなしのいずれかで細胞をトランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ発光を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、Madison WI USA)を使用して選択した時点でアッセイした。トランスフェクション効率を標準化するために、pORF-eSEAPプラスミドでも細胞をトランスフェクションした。このプラスミドは、Quanti-Blue比色酵素アッセイキット(InvivoGen、San Diego、CA)を使用して細胞培養培地中でアッセイされる、胎盤分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)をコードする。遺伝子レポーター発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を2回独立して反復した。エラーバーは、平均値の標準誤差(SEM)を表す。スチューデントの両側t検定を用いて統計解析を実施した。
【図４Ｃ】HEK-293細胞へプラスミドをトランスフェクションした後のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示すグラフであり、pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼ、pNP868R-T7RNAP/BamHI消化pT7p-ルシフェラーゼ(*p<0.05)および他のコントロール条件(pNP868R-T7RNAP単独、消化もしくは未消化pT7p-ルシフェラーゼ単独またはトランスフェクション試薬のみ)に対するホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示す。HEK-293細胞は、上記のように培養およびトランスフェクションした。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミド(0.4μgDNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)、および/またはpT7p-ルシフェラーゼ、BamHI消化pT7p-ルシフェラーゼもしくはpCMV-T7RNAP(0.4μgDNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)あるいは何もなしのいずれかで細胞をトランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ発光を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、Madison WI USA)を使用して選択した時点でアッセイした。トランスフェクション効率を標準化するために、pORF-eSEAPプラスミドでも細胞をトランスフェクションした。このプラスミドは、Quanti-Blue比色酵素アッセイキット(InvivoGen、San Diego、CA)を使用して細胞培養培地中でアッセイされる、胎盤分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)をコードする。遺伝子レポーター発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を2回独立して反復した。エラーバーは、平均値の標準誤差(SEM)を表す。スチューデントの両側t検定を用いて統計解析を実施した。
【図５Ａ】αアマニチンで処理した、HEK-293をトランスフェクションした細胞のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を表す図であり、本アッセイの概略図を表す図である。pCMV-ルシフェラーゼプラスミド(ルシフェラーゼの発現はRNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーターで駆動する)に関しては、αアマニチン(0または20μg/ml)を細胞のトランスフェクションと同時に細胞培地に添加した。pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼプラスミドに関しては、pNP868R-T7RNAPプラスミド(NP868R-T7RNAPの発現はRNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーターで駆動する)を用いた第一のトランスフェクションを実施し、その24時間後に(0から20μg/mlの濃度幅で)αアマニチンを細胞培地に添加し、pT7p-ルシフェラーゼプラスミドを用いて第二のトランスフェクションを行った。これらの試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。上記のように統計解析を実施した。
【図５Ｂ】αアマニチンで処理した、HEK-293をトランスフェクションした細胞のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を表す図である。αアマニチンは、pCMV-ルシフェラーゼプラスミドでトランスフェクションした細胞のルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現をほぼ完全に無効にした(*p<0.05)。
【図５Ｃ】αアマニチンで処理した、HEK-293をトランスフェクションした細胞のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を表す図である。αアマニチンは、pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼプラスミドでトランスフェクションした細胞のルシフェラーゼ発現シグナルを軽く減少させたのみであった(*p<0.05)。したがって、このことから、NP868R-T7RNAP酵素による転写はそのファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼ部分に依存することが示唆される。
【図６Ａ】トランスフェクションした細胞HEK-293の細胞生存率のアッセイを表す図である。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミドで上記のように細胞を培養し、トランスフェクションした。細胞生存率をApoTox-Glo Triplex Assayを使用して選択した時点で評価した。この試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。細胞生存率レベルは、無処理の細胞の発光/蛍光を差し引いた、試験細胞の発光/蛍光シグナルとして表す。上記のように統計解析を実施した。プラスミドDNAが存在してもしなくてもトランスフェクション試薬(すなわちリポフェクタミン2000)は、細胞生存率を害する。しかし、1日目を除く全ての時点での細胞生存率レベルに関して、pNP868R-T7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞とpT7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞との間に統計学的有意差は観察されなかった(スチューデントの両側t検定、*p<0.05)。
【図６Ｂ】トランスフェクションした細胞HEK-293の細胞毒性のアッセイを表す図である。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミドで上記のように細胞を培養し、トランスフェクションした。細胞毒性をApoTox-Glo Triplex Assayを使用して選択した時点で評価した。この試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。細胞毒性レベルは、無処理の細胞の発光/蛍光を差し引いた、試験細胞の発光/蛍光シグナルとして表す。上記のように統計解析を実施した。プラスミドDNAが存在してもしなくてもトランスフェクション試薬(すなわちリポフェクタミン2000)は、細胞毒性を害する。しかし、全ての時点での細胞毒性レベルに関して、pNP868R-T7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞とpT7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞との間に統計学的有意差は観察されなかった。
【図６Ｃ】トランスフェクションした細胞HEK-293のアポトーシスのアッセイを表す図である。pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミドで上記のように細胞を培養およびトランスフェクションした。アポトーシスをApoTox-Glo Triplex Assayを使用して選択した時点で評価した。この試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。アポトーシスのレベルは、無処理の細胞の発光/蛍光を差し引いた、試験細胞の発光/蛍光シグナルとして表す。上記のように統計解析を実施した。プラスミドDNAが存在してもしなくてもトランスフェクション試薬(すなわちリポフェクタミン2000)は、アポトーシスを害する。しかし、全ての時点でのアポトーシスレベルに関して、pNP868R-T7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞とpT7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞との間に統計学的有意差は観察されなかった。
【図７Ａ】単量体のNP868R-T3RNAPキメラ酵素用に使用される、ファージのDNA依存性T3RNAポリメラーゼをコードするpT3RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。図7AからDの4つのプラスミドは、同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図７Ｂ】単量体のNP868R-SP6RNAPキメラ酵素用に使用される、ファージのDNA依存性SP6RNAポリメラーゼをコードするpSP6RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。図7AからDの4つのプラスミドは、同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図７Ｃ】(A-D)単量体のNP868R-T3RNAPキメラ酵素用に使用される、NP868RアフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素とファージのDNA依存性T3RNAポリメラーゼとのフレキシブルな(Gly3Ser)4リンカーを介した融合物をコードするpNP868R-T3RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。図7AからDの4つのプラスミドは、同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図７Ｄ】単量体のNP868R-SP6RNAPキメラ酵素用に使用される、NP868RアフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素とファージのDNA依存性SP6RNAポリメラーゼとのフレキシブルな(Gly3Ser)4リンカーを介した融合物をコードするpNP868R-SP6RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。図7AからDの4つのプラスミドは、同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図８】単量体のNP868R-T3RNAPおよびNP868R-SP6RNAPキメラ酵素のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を表すグラフである。トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを上記のように実施した。レポーター遺伝子の発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光として(RLU、相対的な光単位)表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を4回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。
【図９】図９Ａは、ヘテロ二量体キメラ酵素であるヘテロ二量体RR1234L-NP868R/EE1234L-T7RNAP酵素の構造の概略を表す図である。相互作用してヘテロ二量体を形成するロイシンジッパーのEE1234L(酸性)およびRR1234L(塩基性)をNP868RおよびT7RNAポリメラーゼのアミノ末端にそれぞれ付加した。白矢印は逆平行の配向のロイシンジッパーの結合を示す。図９Ｂは、ヘテロ二量体キメラ酵素であるヘテロ二量体D12L/D1R-T7RNAP CCPP酵素の構造の概略を表す図である。ワクシニアウイルスのmRNAキャッピング酵素のD1Rサブユニットを単一ユニットのT7RNAポリメラーゼのアミノ末端に融合させた。mRNAキャッピング酵素のD12Lサブユニットと共発現させた際は、D1R-T7RNAPは、D12L/D1R-T7RNAPと称されるヘテロ二量体が形成される。単純化するために、もう1つの構造、すなわちD1R/D12L-T7RNAPキメラ酵素は示さない。黒矢印は他のタイプのタンパク質相互作用を示す。図９Ｃは、ヘテロ三量体のキメラ酵素であるヘテロ三量体D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素の構造の概略を表す図である。ロイシンジッパーのEE1234L(酸性)およびRR1234L(塩基性)をD1RおよびT7RNAポリメラーゼのアミノ末端にそれぞれ付加した。RR1234L-D1RをEE1234L-T7RNAPおよびワクシニアウイルスのmRNAキャッピング酵素のD12Lサブユニットと一緒に共発現すると、ヘテロ三量体が形成される。単純化するために、もう1つの構造、すなわちD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素は示さない。白矢印は逆平行の配向のロイシンジッパーの結合を示す。黒矢印は他のタイプのタンパク質相互作用を示す。
【図１０Ａ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、D1R、すなわちワクシニアのmRNAキャッピング酵素の大サブユニットをコードする、pD1Rプラスミドの物理地図を表す。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｂ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、D12L、すなわちワクシニアのmRNAキャッピング酵素の小サブユニットをコードする、pD12Lプラスミドの物理地図を表す。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｃ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、アフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素であるNP868Rのアミノ末端に融合したRR1234Lロイシンジッパーをコードする、pRR1234L-NP868Rプラスミドの物理地図を表す図である。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｄ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、D1R、すなわちワクシニアのmRNAキャッピング酵素の大サブユニットのアミノ末端に融合したRR1234Lロイシンジッパーをコードする、pRR1234L-D1Rプラスミドの物理地図を表す図である。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｅ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、D12L、すなわちワクシニアのmRNAキャッピング酵素の小サブユニットのアミノ末端に融合したRR1234Lロイシンジッパーをコードする、pRR1234L-D12Lプラスミドの物理地図を表す図である。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｆ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、ファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼに融合したpEE1234Lロイシンジッパーをコードする、pEE1234L-T7RNAプラスミドの物理地図を表す図である。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｇ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、ワクシニアのmRNAキャッピング酵素の大サブユニットとファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼとのフレキシブルな(Gly3Ser)4リンカーを介した融合物をコードする、pD1R-T7RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１０Ｈ】ヘテロ二量体およびヘテロ三量体のキメラ酵素に使用した、ワクシニアのmRNAキャッピング酵素の小サブユニットとファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼとのフレキシブルな(Gly3Ser)4リンカーを介した融合物をコードする、pD12L-T7RNAPプラスミドの物理地図を表す図である。図10AからHの全てのプラスミドは同じ設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージのRNAポリメラーゼ転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有する。
【図１１】ヘテロ二量体のRR1234L-NP868R/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を表すグラフである。上記のようにHEK-293細胞を培養し、トランスフェクションした。対応するプラスミド(0.4μg DNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)およびpT7p-ルシフェラーゼまたはpCMV-T7RNAP(0.4μg DNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)を細胞へトランスフェクションした。レポーター遺伝子の発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を4回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。
【図１２】ヘテロ二量体のD1R/D12L-T7RNAPおよびD12L/D1R-T7RNAPキメラ酵素によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を表すグラフである。上記のようにトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを実施した。レポーター遺伝子の発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。
【図１３】ヘテロ三量体のD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPおよびD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を表すグラフである。上記のようにトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを実施した。レポーター遺伝子の発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。
【図１４】RNAポリメラーゼIIの大サブユニット(POL2AR)またはヒトのキャッピング酵素(RNGTT)を標的にするsiRNAの存在下における、単量体のNP868R-SP6RNAPキメラ酵素によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を表すグラフである。トランスフェクション試薬に25nMの終濃度でsiRNAを添加したことを除いて、上記のようにトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを実施した。siRNAのSI04364381、SI04369344、SI04250162およびSI04354420はPOLR2A遺伝子を標的にし、一方siRNAのSI00055986、SI03021508、SI00055972およびSI00055979はRNGTTを標的にする。レポーター遺伝子の発現を、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を2回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。
【図１５】RNAポリメラーゼIIの大サブユニット(POL2AR)およびヒトのキャッピング酵素(RNGTT)を標的にするsiRNAの用量効果活性を表すグラフである。トランスフェクション試薬に0から100nMの濃度範囲でsiRNAを添加したことを除いて、上記のようにトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを実施した。siRNAのSI04369344およびSI00055972は、POLR2AおよびRNGTT遺伝子をそれぞれ標的にする。レポーター遺伝子の発現をトランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。この試験を3回反復した。エラーバーは平均値の標準誤差(SEM)を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１６８】
本発明について以下の実施例を用いて詳細に説明することにするが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１６９】
(実施例)
(実施例1)
活性な単量体キメラ酵素NP868R-T7RNAPの実施例
I.プラスミド
NP868R、すなわちアフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素とバクテリオファージT7の野生型のファージDNA依存性RNAポリメラーゼとの融合物をコードする1つのプラスミドを合成した。このキャッピング酵素は、(Gly3Ser)4リンカーを介してT7RNAポリメラーゼのアミノ末端に融合した。
【０１７０】
このpNP868R-T7RNAPプラスミドを使用して、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現アッセイ(図1)でコードされる酵素の活性を評価した。手短に言えば、pNP868R-T7RNAPおよびpT7p-ルシフェラーゼプラスミドをヒトHEK-293培養細胞へ同時にトランスフェクションした。NP868R-T7RNAP酵素の発現は、対応するプラスミドのRNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーターで駆動する。次に、NP868R-T7RNAP酵素は、T7プロモーターからpT7p-ルシフェラーゼプラスミドの転写を開始することが期待される。NP868R-T7RNAP酵素のmRNAキャッピングおよびDNA依存性RNAPの両酵素活性が保持されている際は、m7GpppGmキャップ構造を有するルシフェラーゼmRNAが合成されることになり、次にホタルルシフェラーゼタンパク質に翻訳され得、細胞発光アッセイで検出することができる。加えて、pNP868R-T7RNAPプラスミドを使用して、HEK-293細胞における酵素の細胞分布ならびに酵素の発現に関連する細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスを調べた。
【０１７１】
NP868R-T7RNAPおよびT7RNAP(T7RNAポリメラーゼ)酵素をコードするプラスミドを、GeneArt AG(Regensburg、Germany)によって四工程で合成した。pT7RNAプラスミドによってコードされるタンパク質配列は、配列番号19に対応する。pNP868R-T7RNAPプラスミドによってコードされるタンパク質配列は、配列番号20に対応する。第一に、T7RNAポリメラーゼプロモーターおよびマルチプルクローニングサイト(MCS)を含むDNA断片をpCMV-Scriptプラスミド(Stratagene、La Jolla、CA USA)から除去した。第二に、カセットをpCMV-ScriptのプラスミドのCMVプロモーターとSV40ポリアデニリル化シグナルとの間に導入した。このカセットは、Lacオペレーターのステムループ(GilbertおよびMaxam1973年)、MCS、ポリ[A]領域およびΤΦクラスIヘアピンターミネーターシグナル(Lyakhov、Heら1997年)から構成されていた。第三に、翻訳開始のコザックコンセンサス配列(Kozak1987年)、それに続くNP868R-T7RNAPまたはT7RNAP酵素の全翻訳領域(ORF)をPCRに基づく方法を使用して合成オリゴヌクレオチドから構築し、クローニングし、全配列を確認した。NP868R-T7RNAPのORF(配列番号21)およびT7RNAPのORF(配列番号22)を、好ましいコドン使用頻度への変更、潜在的なスプライス部位およびポリ(A)シグナルなどのシスエレメントの除去ならびに直列反復配列および二次構造要素の除去によるmRNA安定性の改善によって最適化した。第四に、NP868R-T7RNAPまたはT7RNAPのそれぞれの全ORFをカセット中のMCSにサブクローニングして、pNP868R-T7RNAPプラスミドおよびpT7RNAPプラスミドを得た。構築方法の結果として、2つの余分なアミノ酸(Glu、Phe)がコザック配列のATGの直ぐ下流に付加され、他の2つ(Gly、Pro)が(Gly3Ser)4リンカーの直ぐ上流に付加され、2つ(Leu、Glu)がNP868R-T7RNAP酵素のこのリンカーの直ぐ下流に付加された。最後に、pNP868R-T7RNAPおよびpT7RNAPプラスミドは、以下の設計(図2Aおよび2B)、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてNP868R-T7RNAPまたはT7RNAPのORF、ポリ[A]領域、ファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有していた。
【０１７２】
ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする2種のプラスミドをEurofins/MWG/Operon(Ebersberg、Germany)によって合成した。pET-22b(+)RNAPp-ルシフェラーゼプラスミド(以後pT7p-ルシフェラーゼと名付ける)を本発明によるキメラ酵素の活性のアッセイ用に設計した。試験用の配列を、一連のRNAポリメラーゼプロモーター(T7、T3およびSP6ファージRNAPプロモーターに続いて大腸菌リボゾームrrnD1プロモーター)、Lacオペレーターステムループ配列、ホタルルシフェラーゼの全ORF、ポリ[A]領域、RNA自己切断配列をコードするD型肝炎リボザイム(ConzelmannおよびSchnell1994年;Garcin、Peletら1995年;BridgenおよびElliott1996年;Schurer、Langら2002年;Walker、Avisら2003年)およびファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーター(図3A)から構成されるpET-22b(+)骨格(Novagen、San Diego、CA USA)に導入した。ルシフェラーゼORFとT7プロモーターとの間の物理的接続を切断したBamHI消化バージョンのpT7p-ルシフェラーゼプラスミドも陰性対照として使用した(図3B)。さらに、活性対照(active comparator)として使用したpCMV-ルシフェラーゼプラスミドは、pCMV-ScriptプラスミドのRNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーター下流にホタルルシフェラーゼを含む(図3C)。
【０１７３】
II.細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胚性腎臓293細胞(HEK-293、ATCC CRL 1573)を5%C02、37℃で生育させた。細胞は、3.97mMのL-アラニル-L-グルタミン(モル当量基準でL-グルタミンで代替した)、10%のウシ胎仔血清(FBS)、1%の非必須アミノ酸、1%のペニシリンおよびストレプトマイシンならびに0.2%のファンギゾンを追加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で維持した。
【０１７４】
トランスフェクションの前日に、ウェルあたり約8×104細胞密度で24ウェルプレート中にHEK-293細胞を蒔いた。トランスフェクションの一時間前に、抗生物質なしの新鮮な完全培地に培地を交換した。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000(Invitrogen、Carlsbad、CA USA)を使用して製造者の推奨に従って実施した。手短に言えば、Opti-MEM I血清使用量低減培地(Invitrogen、Carlsbad、CA USA)に希釈しリポフェクタミン2000と混合したプラスミドDNAを細胞培地に添加した。トランスフェクションに引き続き、細胞を120時間までインキュベートし、その後ルシフェラーゼおよびSEAP遺伝子のレポーター発現を試験した。
【０１７５】
pT7p-ルシフェラーゼレポータープラスミド(0.4μg DNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)と共にpT7RNAPまたはpNP868R-T7RNAP(0.4μg DNA/ウェルおよび1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)で細胞を同時にトランスフェクションした。一連の他のトランスフェクション条件を陰性対照として使用し、これらには、(a)ルシフェラーゼORFとT7プロモーターとの間の物理的接続を切断するBamHI制限酵素でpT7p-ルシフェラーゼが消化されていることを除いて、上記と同じ同時トランスフェクション、(b)pNP868R-T7RNAPまたはpT7RNAPプラスミド単独、(c)消化または未消化pT7p-ルシフェラーゼレポータープラスミド単独、(d)トランスフェクション試薬単独(すなわちリポフェクタミン2000)が含まれる。pORF-eSEAPプラスミド(InvivoGen、San Diego、CA、トランスフェクション効率の標準化に使用される)およびpCMV-T7RNAPプラスミド(活性な対照として使用される)でも細胞をトランスフェクションした。
【０１７６】
III.ホタルルシフェラーゼ発光アッセイおよびSEAP比色アッセイ
ホタルルシフェラーゼ発光は、ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して製造者の推奨(Promega、Madison WI USA)に従ってアッセイした。手短に言えば、細胞培養溶解試薬(CCLR)溶解バッファー中でHEK-293細胞を溶解し、12,000×gで2分間4℃で遠心分離し、ルシフェラーゼアッセイ発光試薬(Promega、100μl/ウェル)を上清(20μl/ウェル)に添加した。発光をルミノメーターリーダー(Fluostar、BMG Labtech、Offenburg Germany)で製造者の説明に従って読み取った。
【０１７７】
pORF-eSEAPプラスミドの発現を使用して、トランスフェクション効率を標準化した。このプラスミドは、胎盤分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)をコードし、SEAPは、Quanti-Blue比色酵素アッセイキット(InvivoGen、San Diego、CA)を使用して、選択した時点で細胞培養培地中で酵素活性をアッセイする。レポーター遺伝子の発現をトランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度で割ってトランスフェクション効率(OD、光学濃度)比を標準化した。
【０１７８】
IV.統計解析
全ての統計解析は、必要に応じて多重検定に関してホルム-ボンフェローニの補正によって調整した、スチューデントの両側t検定で実施した。0.05未満のP値を有意であるとみなした。
【０１７９】
V.レポーター遺伝子発現アッセイ
ホタルルシフェラーゼレポーター発光アッセイを使用して、本発明によるキメラ酵素またはT7RNAP酵素によって作り出されたmRNAの翻訳能力を評価した。pT7RNAPとpT7p-ルシフェラーゼプラスミドとの同時トランスフェクションによって、pT7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼプラスミドのBamHI消化バージョンを同時にトランスフェクションした細胞と比較して、低いけれども検出可能なルシフェラーゼ発現シグナルが引き起こされた(したがって、このことはルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現がファージT7プロモーターで駆動することを実証するものである、図4Aおよび4B)。これは、真核細胞で発現させたT7RNAPは、5'キャッピングの欠如のために翻訳されにくいRNA分子を合成することができることを示した以前の公表報告(Fuerst、Nilesら1986年;Chen、Liら1994年)と一致する。pT7RNAPプラスミドなし(これはルシフェラーゼ発現はT7RNAPの存在を必要とすることを確証する)またはpT7p-ルシフェラーゼプラスミドなし(これは発光シグナルの特異性を確証する)または両方なしでトランスフェクションを実施した際も、ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現シグナルの強烈な減少が観察された。
【０１８０】
pNP868R-T7RNAPプラスミドをpT7p-ルシフェラーゼプラスミドと同時にトランスフェクションし、上記と同じ条件下で試験した。最高時において、pT7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼプラスミドの使用よりも約23倍高いルシフェラーゼ発現シグナルが、pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼの使用で観察された(図4A)。上記の発見の特異性は、ルシフェラーゼ発現シグナルの強烈な減少をもたらしたpT7p-ルシフェラーゼプラスミドのBamHI消化バージョンの同時トランスフェクション、ならびに消化されたpNP868R-T7RNAPもしくはpT7p-ルシフェラーゼプラスミドまたは両方によるトランスフェクションによって確証された(図4C)。最高時において、pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼプラスミドの同時トランスフェクションは、pCMV-T7RNAPプラスミドのシグナルに対して72%のルシフェラーゼ発現シグナルをもたらした(図4A)。
【０１８１】
要約すると、pNP868R-T7RNAPプラスミドによってコードされる本発明によるキメラNP868R-T7RNAP酵素の活性をホタルルシフェラーゼレポーター発光アッセイを使用し実証した。本発見の特異性は一連のコントロールによって支持され、このことは、HEK-293細胞で発現させた際に、NP868R-T7RNAP酵素のmRNAキャッピングおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの両酵素活性が保持されることを示唆するものである。
【０１８２】
VI.αアマニチン処理細胞における遺伝子レポーター発現アッセイ
pNP868R-T7RNAPによる転写がファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼ部分に依存していることをさらに実証するために、αアマニチン処理細胞での遺伝子トランスフェクションアッセイも実施した。αアマニチンは核のRNAポリメラーゼIIの特異的阻害剤であり(Jacob、Sajdelら1970年、Kedinger、Gniazdowskiら1970年、Lindell、Weinbergら1970年)、核のRNAポリメラーゼIIのRpb1サブユニットに結合する(Bushnell、Cramerら2002年)。対照的に、αアマニチンは、本発明によるキメラ酵素NP868R-T7RNAPを設計するのに使用したファージT7RNAポリメラーゼによる転写には作用しない(Kupper、McAllisterら1973年;Engleka、Lewisら1998年)。
【０１８３】
RNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーターで駆動するNP868R-T7RNAP酵素の発現を惹起するために、αアマニチン(0から20μg/mlの濃度幅)の細胞培地への添加およびpT7p-ルシフェラーゼプラスミドを用いた第二のトランスフェクションの24時間前に、pNP868R-T7RNAPを細胞へトランスフェクションした(図5A)。pCMV-ルシフェラーゼプラスミドについては、細胞を同時にトランスフェクションし、αアマニチン(0または20μg/ml、図5A)で処理した。レポーター遺伝子の発現をトランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度で割ってトランスフェクション効率(OD、光学濃度)比を標準化した。
【０１８４】
期待通りに、αアマニチンは、pCMV-ルシフェラーゼでトランスフェクションした細胞のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現をほぼ完全に無効にした(図5B)。対照的に、pNP868R-T7RNAP/pT7p-ルシフェラーゼをトランスフェクションした細胞では、全ての濃度のαアマニチンは、ルシフェラーゼ発現を軽く減少させたのみであった(図5C)。
【０１８５】
したがって、本発見は、NP868R-T7RNAP酵素による転写は、そのファージDNA依存性T7RNAポリメラーゼ部分の酵素活性に依存していることを確証するものである。
【０１８６】
VII.免疫蛍光法
間接免疫蛍光法によって、NP868R-T7RNAP酵素の細胞内分布を調べた。ポリ-L-リジンでコーティングしたカバーガラス(BD BioCoat;Bioscience、Mississauga、ON USA)上の24ウェルプレートに8×104細胞/ウェルでHEK-293細胞を蒔き、次に上記のようにトランスフェクションした。トランスフェクション後6時間および24時間目に、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で細胞を洗浄し、次に4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。固定後PBSで細胞を洗浄し、次に5%ヤギ血清(Invitrogen)、0.1%トリトンX100および0.02%アジ化ナトリウムを含むPBS中で30分間透過処理した。T7RNAポリメラーゼに対するマウスモノクローナル抗体(1:200、Novagen)と共に細胞を4℃で一晩インキュベートした。PBSで十分に洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート結合(FITC)ヤギ抗マウスIgG(Sigma-Aldrich)と共に室温で3時間細胞をインキュベートした。4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で5分間細胞核を染色した。次に細胞を洗浄し、蛍光退色防止培地Mowiol4-88(Calbiochem、Gibbstown、NJ USA)にマウントした。適切なフィルターを使用した落射蛍光顕微鏡で細胞を解析した。
【０１８７】
期待通りに、弱いけれども検出可能なFITCシグナルがpNP868R-T7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞の細胞質で6時間および24時間目の両方で観察され、一方その細胞の核はDAPIで染色された。
【０１８８】
VIII.細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスアッセイ
ApoTox-Glo Triplex Assay(Promega、Madison WI)を使用して、NP868R-T7RNAP酵素の発現が生存率を害するか、またはトランスフェクションした細胞の毒性もしくはアポトーシスを誘導するかを調べた。2種のプロテアーゼ活性、すなわち1つは細胞生存率マーカー(すなわちペプチド基質GF-AFC)であり、もう1つは細胞毒性マーカー(すなわちペプチド基質ビス-AAF-R110)を蛍光によってアッセイした。アポトーシスは、テトラペプチド配列DEVDを含む発光性カスパーゼ-3/7基質で、カスパーゼ活性に最適化した試薬中でアッセイした。
【０１８９】
ウェルあたり1.2×104細胞の密度範囲で96-ウェルプレートにHEK-293細胞を蒔いたことを除いて、細胞培養およびトランスフェクションを上記のように実施した。pNP868R-T7RNAPプラスミド、pT7RNAPプラスミドまたはトランスフェクション試薬のみで細胞にトランスフェクションした。製造者の推奨に従ってApoTox-Glo Triplex Assayを実施した。手短に言えば、GF-AFC基質およびビス-AAF-R110基質の両方を含む生存率/細胞毒性試薬を選択した時点でウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートした後、生存率および細胞毒性用の2つの異なる波長セットで蛍光評価を行った。その後、カスパーゼ試薬を全てのウェルに添加して、室温で30分インキュベートした後に発光を測定した。上記のように統計解析を実施した。細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスレベルは、無処理の細胞の発光/蛍光を差し引いた、試験細胞の発光/蛍光シグナルとして表した。
【０１９０】
以前に報告されているように(Patil、Rhodesら2004年)、細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスは、無処理の細胞(図6A、6Bおよび6C)と比較して、トランスフェクション試薬(すなわちリポフェクタミン2000)で処理した細胞において有意に害された。また期待通りに、プラスミドDNAをトランスフェクション混合物に添加した際に、細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスは、概してさらに害された(図6A、6Bおよび6C)。しかし、pNP868R-T7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞の細胞生存率、細胞毒性またはアポトーシスのマーカーは、細胞生存率のトランスフェクション後24時間目のみ(これは、おそらくハザードだけに起因する)を除いて、試験した全ての時点で、pT7RNAPプラスミドの各マーカーと統計的に違いはなかった(図6A、6Bおよび6C、各時点に対するスチューデントの両側t検定、P値<0.05)。
【０１９１】
結論として、キャッピング酵素活性が認められないT7RNAPと比較して、NP868R-T7RNAP酵素の細胞毒性、細胞生存率およびアポトーシスに明らかな違いがないことを実証することができる。
【０１９２】
(実施例2)
活性な単量体キメラ酵素NP868R-T3RNAPおよびNP868R-SP6RNAPの実施例
野生型の単量体T3またはSP6バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼのアミノ末端にフレキシブルなリンカー(Gly3Ser)4を介して融合したNP868R、すなわち単量体のアフリカブタコレラウイルスmRNAキャッピング酵素から構成される、本発明による単量体のキメラ酵素の2つの他のタイプを作出した。
【０１９３】
I.方法
前記単量体のキメラ酵素を作出するのに使用する配列は、PCRに基づく方法を使用して合成オリゴヌクレオチドから構築し、クローニングし、全配列を確認した。これらの配列を先に述べたサブクローニングカセットを含むpCMV-Scriptプラスミドにサブクローニングした。最後に、発現に使用する全てのプラスミドは、類似の設計、すなわちCMV IE1プロモーター/エンハンサープロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリ[A]領域、ファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有していた(図7(A〜D))。
【０１９４】
サブクローニング方法の結果として、プラスミドでコードされるコザック配列のATGの直ぐ下流にアミノ酸(pT3RNAPおよびpSP6RNAPに関してGlu-Phe-Leu-Glu、pNP868R-T3RNAPおよびpNP868R-SP6RNAPに関してGlu-Phe)が付加された。加えて、2つのアミノ酸が(Gly3Ser)4リンカーの直ぐ上流(pNP868R-T3RNAPおよびpNP868R-SP6RNAPに関してGly-Pro)または下流(pNP868R-T3RNAPおよびpNP868R-SP6RNAPに関してLeu-Glu)に付加された。
【０１９５】
上記のようにHEK-293細胞を24ウェルプレートで生育させ、リポフェクタミン2000試薬および適切なプラスミド(トランスフェクションするプラスミドあたり0.4μg DNA/ウェルと1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)でトランスフェクションした。pT7p-ルシフェラーゼ(これはT3およびSP6プロモーターの両方も含む)およびルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、上記のようにホタルルシフェラーゼ発光をアッセイした。上記のように、pORF-eSEAPプラスミドの発現を使用してトランスフェクション効率を標準化した。必要に応じて多重検定に関してホルム-ボンフェローニの補正によって調整した、スチューデントの両側t検定を使用して統計解析を実施した。0.05未満のP値を統計的に有意であるとみなした。
【０１９６】
II.結果
図8に示すように、レポーターpT7p-ルシフェラーゼプラスミドと共にトランスフェクションした際は、pNP868R-T3RNAPおよびNP868R-SP6RNAPの両方が強いルシフェラーゼ遺伝子のレポーターシグナルを示し、そのシグナルは、それぞれpT3RNAPまたはpSP6RNAPよりも14倍および56倍高かった(各比較についてp<0.001、スチューデントのt検定)。NP868R-T3RNAP酵素は、pCMV-T7RNAPプラスミドの活性に対して36%の活性であるが(p<0.001、スチューデントのt検定)、一方NP868R-SP6RNAPヘテロ二量体酵素は、pCMV-T7RNAPプラスミドの発現に対して1.1倍のルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示す(非統計学的有意差、スチューデントのt検定)。
【０１９７】
これらの結果は、本発明による異なるタイプの単量体のキメラ酵素の活性を実証するものである。
【０１９８】
(実施例3)
活性な二量体および三量体キメラ酵素の実施例
本発明による異なるタイプの活性なオリゴマーキメラ酵素を図9に示すように作出した。
-  EE1234LおよびRR1234Lロイシンジッパーを介する、単量体のアフリカブタコレラウイルスmRNAキャッピング酵素NP868Rと単量体のT7RNAポリメラーゼとの非共有結合の結果得られる、1つのヘテロ二量体キメラ酵素。これは、ヘテロ二量体のRR1234L-pNP868R/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素を形成する。
-  ワクシニアウイルスのmRNAキャッピング酵素の2つの各サブユニット(すなわちD1RまたはD12L)と単量体のT7RNAポリメラーゼとのフレキシブルな(Gly3Ser)4リンカーを介する融合によって得られる、2つのヘテロ二量体のキメラ酵素。各融合タンパク質をワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素の他のサブユニットと共発現させ、ヘテロ二量体のD12L/D1-T7RNAPおよびD1R/D12L-T7RNAPキメラ酵素を形成する。
-  EE1234LおよびRR1234LロイシンジッパーがそれぞれワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素のサブユニットの1つおよびT7RNAポリメラーゼのアミノ末端へ融合することによって作出された、2つのヘテロ三量体キメラ酵素。RR1234L-D1RまたはpRR1234L-D12LとワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素他のサブユニットとEE1234L-T7RNAPとを共発現して、ヘテロ三量体のD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPおよびD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素を形成する。
【０１９９】
I.方法
キメラ酵素を作出するのに使用する配列は、PCRに基づく方法を使用して合成オリゴヌクレオチドから構築し、クローニングし、全配列を確認した。これらの配列は、上記のサブクローニングカセットを有するpCMV-Scriptプラスミドにサブクローニングした。最後に、発現に使用する全てのプラスミドは類似の設計、すなわちCMV IE1プロモーター/エンハンサープロモーター、コザック配列に続いて翻訳領域(ORF)、ポリ[A]領域、ファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有していた(図10(A〜H))。
【０２００】
サブクローニング方法の結果として、2つのアミノ酸がいくつかのプラスミドのコザック配列のATGの直ぐ下流に(pT7RNAPに関してLeu-Glu、pNP868R、pD1R、pD12L、pD1R-T7RNAPおよびpD12L-T7RNAPに関してGlu-Phe)、ロイシンジッパー配列の直ぐ下流に(pEE1234L-T7RNAPに関してLeu-Glu、pRR1234L-NP868R、pRR1234L-D1RおよびpRR1234L-D12Lに関してGlu-Phe)、いくつかのコードタンパク質のカルボキシル末端に(pNP868R、pRR1234L-NP868R、pD1R、pD12L、pRR1234L-D1RおよびpRR1234L-D12Lに関してGly-Pro)付加された。加えて、2つのアミノ酸が(Gly3Ser)4リンカーの直ぐ上流(pD1R-T7RNAPおよびpD12L-T7RNAPに関してGly-Pro)または下流(pD1R-T7RNAPおよびpD12L-T7RNAPに関してLeu-Glu)に付加された。
【０２０１】
上記のように、ヒト胚性腎臓293細胞(HEK-293)を24ウェルプレート中で生育させた。上記のように、リポフェクタミン2000試薬および適切なプラスミド(トランスフェクションしたプラスミドあたり0.4μg DNA/ウェルと1μL/ウェルのリポフェクタミン2000)を使用してHEK-293細胞へトランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ発光は、pET-22b(+)T7RNAPp-ルシフェラーゼレポータープラスミド(以後pT7p-ルシフェラーゼと名付ける)およびルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、上記のようにアッセイした。上記のように、pORF-eSEAPプラスミドの発現を使用してトランスフェクション効率を標準化した。
【０２０２】
レポーター遺伝子の発現は、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験条件のルシフェラーゼ発光(RLU、相対的な光単位)として表し、次にSEAPの吸光度(OD、光学濃度)比で割った。必要に応じて多重検定に関してホルム-ボンフェローニの補正によって調整した、スチューデントの両側t検定を使用して、統計解析を行った。0.05未満のP値を統計的に有意であるとみなした。
【０２０３】
II.結果
II.1ヘテロ二量体のRR1234L-NP868R/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素
(それぞれpRR1234L-pNP868RおよびpEE1234L-T7RNAPプラスミドにコードされる)ヘテロ二量体の酵素であるRR1234L-NP868R/EE1234L-T7RNAキメラ酵素の活性を実証した。このヘテロ二量体の酵素は、単量体のアフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素pNP868Rと単量体のT7RNAポリメラーゼとの間の、EE1234LおよびRR1234Lロイシンジッパーを介する非共有結合によって作出する(図9)。EE1234L(酸性のロイシンジッパー、LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGPLGGGK、一文字アミノ酸コード)およびRR1234Lロイシンジッパー(ロイシンジッパーの二量体化に関わらない(Moll、Ruvinovら2001年)GGGKの配向をわずかに修正した塩基性のロイシンジッパー、LEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGPLGGGK、一文字アミノ酸コード)をそれぞれ、NP868RおよびT7RNAPのアミノ末端にそれぞれ付加した。RR1234LおよびEE1234Lロイシンジッパーは、好ましくは逆平行の配向のヘテロ二量体として溶解する2つの両親媒性のαへリックスからなる二量体のコイルドコイルペプチド構造である(Moll、Ruvinovら2001年)。
【０２０４】
期待通りに、ロイシンジッパー配列を有するまたは有さないアフリカブタコレラウイルスmRNAキャッピング酵素(すなわち、それぞれpRR1234L-NP868RおよびpNP868R)のみをコードするプラスミドのトランスフェクションは、検出可能なルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を何も誘導しない(図11)。また期待通りに、EE1234Lロイシンジッパーを有するT7RNAポリメラーゼ(pEE1234L-T7RNAによってコードされる)をコードするプラスミドをトランスフェクションした細胞は、ロイシンジッパーを有さないT7RNAポリメラーゼ(pT7RNAによってコードされる)と非常に類似した活性を示し、このことは、天然のT7RNAポリメラーゼのアミノ末端はその酵素処理能力を大きく損なうことなく修飾することができることのさらなる証拠を提供するものである。
【０２０５】
pRR1234L-NP868RおよびpEE1234L-T7RNAプラスミド(ロイシンジッパーを有するNP868RおよびT7RNAPをコードする)をレポーターのpT7p-ルシフェラーゼプラスミドと共にトランスフェクションしたHEK-293細胞は、強いルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現シグナルを示し、そのシグナルはpCMV-T7RNAPプラスミドのシグナルに対して87%である(非統計学的有意差、スチューデントのt検定、(図11))。さらに、レポーターのpT7p-ルシフェラーゼプラスミド存在下でpRR1234L-NP868RおよびpEE1234L-T7RNAプラスミドと共にトランスフェクションした細胞は、pNP868RおよびpT7RNAP(ロイシンジッパーを有さないNP868RおよびT7RNAPをコードする)と共にトランスフェクションした細胞よりも3.7倍高いルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を示す(p<0.05、スチューデントのt検定)。
【０２０６】
これらの結果は、本発明によるヘテロ二量体のキメラ酵素の活性およびロイシンジッパーによるNP868RとT7RNAPとの非共有結合が、前記キメラ酵素によって駆動する遺伝子レポーターの発現を有意に増加させることを実証するものである。
【０２０７】
II.2ヘテロ二量体のD1R/D12L-T7RNAPおよびD12L/D1R-T7RNAPキメラ酵素
ワクシニアのmRNAキャッピング酵素を使用して、他のタイプのヘテロ二量体キメラ酵素の活性も実証した。
【０２０８】
ワクシニアmRNAキャッピング酵素はそれ自体で、(i)RNAトリホスファターゼ、RNAグアニリルトランスフェラーゼおよびRNA N7-グアニンメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有し(CongおよびShuman1993年;NilesおよびChristen1993年;HigmanおよびNiles1994年;MaoおよびShuman1994年;GongおよびShuman2003年)、ワクシニアウイルスD1R遺伝子(ゲノム配列ID#NC006998.1;遺伝子ID#3707562;UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232988.1)にコードされる、今後D1Rと名付ける95kDaサブユニット、(ii)および固有の酵素活性を持たないが、D1RサブユニットのRNA N7-グアニンメチルトランスフェラーゼ活性を強烈に増強し(Higman、Bourgeoisら1992年;Higman、Christenら1994年、MaoおよびShuman1994年)、ワクシニアウイルスD12L遺伝子(ゲノム配列ID#NC_006998.1;遺伝子ID#3707515;UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232999.1)にコードされる、今後D12Lと名付ける31kDaサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。
【０２０９】
(Gly3Ser)4リンカーを介してD1RまたはD12LをT7RNAポリメラーゼのアミノ末端に融合させた(それぞれD1R-T7RNAPまたはD12L-T7RNAPによってコードされる)。共発現させた際は、各融合タンパク質は、他のワクシニアのmRNAキャッピング酵素サブユニット(それぞれpD12LまたはD1Rによってコードされる)と共に、それぞれD12L/D1R-T7RNAPおよびD1R/D12L-T7RNAPと名付けた2つの異なるヘテロ二量体のキメラ酵素を作出する(図9)。ヘテロ二量体のキメラ酵素は、HEK-293細胞においてレポーターのpT7p-ルシフェラーゼプラスミドの存在下で、強いルシフェラーゼ遺伝子レポーターシグナルを発生する(図12)。ヘテロ二量体のD12L/D1R-T7RNAPキメラ酵素は、pCMV-T7RNAPプラスミドの活性に対して32%の活性を有する(p<0.01、スチューデントのt検定)が、一方D1R/D12L-T7RNAPヘテロ二量体酵素は、pCMV-T7RNAPプラスミドよりも1.5倍高いルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を有する(非統計学的有意差、スチューデントのt検定)。さらに、T7RNAポリメラーゼに結合していないワクシニアのmRNAキャッピング酵素の2つのサブユニット(pD1R、pD12LおよびpT7RNAPによってコードされる)の共発現は、それぞれヘテロ二量体のD12L/D1R-T7RNAPおよびD1R/D12L-T7RNAPキメラ酵素の9分の1および42分の1のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現シグナルを示す(両方の統計学的比較に関してP<0.05、スチューデントのt検定)。
【０２１０】
これらの結果は、本発明による異なるタイプのヘテロ二量体のキメラ酵素の活性およびワクシニアのmRNAキャッピング酵素のサブユニットとT7RNAPとの共有結合がレポーター遺伝子の発現を有意に促進することを実証する。また期待通りに、レポーターのpT7p-ルシフェラーゼプラスミドの存在下で、T7RNAポリメラーゼを有さないD1Rおよび/またはD12Lの発現は、検出可能なルシフェラーゼ発現を実質的に誘導しない。
【０２１１】
II.3ヘテロ三量体のD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPおよびD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素
ヘテロ三量体キメラ酵素の活性も実証した。
【０２１２】
塩基性RR1234LロイシンジッパーをワクシニアウイルスのmRNAキャッピング酵素のD1RまたはD12Lサブユニット(それぞれpRR1234L-D1RおよびRR1234L-D12Lによってコードされる)のいずれかのアミノ末端に融合し、一方、相補的な酸性EE1234LロイシンジッパーをT7RNAポリメラーゼ(pEE1234L-T7RNAプラスミドにコードされる)のアミノ末端に付加した。pEE1234L-T7RNAPをpRR1234L-D1RまたはpRR1234L-D12Lのいずれかと他のワクシニアのmRNAキャッピング酵素サブユニット(それぞれpD12LおよびpD1Rプラスミド)と共発現させると、それによって、それぞれD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPおよびD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPと名付けた2つの異なるヘテロ三量体CCPP酵素が作り出される(図9)。
【０２１３】
T7RNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素のD1R/D12Lサブユニットと共発現させた際は、このD1R/D12Lサブユニットがない場合よりも7倍高いルシフェラーゼ遺伝子のレポーターシグナルを示した。したがって、これらの結果は、組換えウイルスによって産生されたワクシニアmRNAキャッピング酵素の発現によってキャッピングされていないT7転写産物の翻訳能力が高まる(Fuerst、Nilesら1986年;Fuerst、Earlら1987年:Elroy-Stein、Fuerstら1989年:Fuerst、Fernandezら1989年;FuerstおよびMoss1989年;Elroy-SteinおよびMoss1990年)という、ワクシニアウイルス/バクテリオファージRNAPハイブリッド発現系で得られた結果と一致する。
【０２１４】
レポーターのpT7p-ルシフェラーゼプラスミドの存在下で、D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPまたはD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP CCPP酵素のいずれかを発現するHEK-293細胞において、強いルシフェラーゼ遺伝子レポーターシグナルが示された(図13)。ヘテロ二量体のD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPおよびD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素は、pCMV-T7RNAPプラスミドの活性に対してそれぞれ57%および33%の活性を有する(非統計学的有意差、スチューデントのt検定)。ヘテロ二量体のD12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAPおよびD1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAPキメラ酵素は、ロイシンジッパーを有さないD1、D12LおよびT7RNAPを発現する細胞よりも、それぞれ11倍および6.7倍強いルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現シグナルを示す(それぞれp=0.05および統計学的有意差、スチューデントのt検定)。
【０２１５】
これらの結果は、本発明によるヘテロ三量体キメラ酵素の活性およびワクシニアのmRNAキャッピング酵素のサブユニットのいずれかとT7RNAポリメラーゼとの非共有結合は、遺伝子レポーター発現を有意に増加させることを実証するものである。
【０２１６】
III.結論
これらの本結果は、共有結合または非共有結合によって作出される本発明による異なるタイプのヘテロ二量体のおよびヘテロ三量体キメラ酵素の活性を示すものである。
【０２１７】
本結果はまた、キメラ酵素の異なる触媒ドメイン間、特にキャッピング酵素およびRNAポリメラーゼ間の共有結合または非共有結合は、キメラ酵素による遺伝子レポーター発現の最適化を可能にするという証拠を提供する。
【０２１８】
(実施例4)
細胞のRNAポリメラーゼIIおよびキャッピング酵素に対するサイレンシング配列によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現促進
I.方法
上記のように、HEK-293細胞を24ウェルプレートで生育させ、リポフェクタミン2000試薬および適切な濃度のsiRNA(Qiagen、Hilden、Germany)およびプラスミド(トランスフェクションするプラスミドあたり0.4μg DNA/ウェルと1μl/ウェルのリポフェクタミン2000)を使用してトランスフェクションした。活性を強く示すNP868R-SP6キメラ酵素を本試験で使用した。pT7p-ルシフェラーゼ(これはT3およびSP6プロモーターの両方も含む)およびルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、上記のようにホタルルシフェラーゼ発光をアッセイした。上記のように、pORF-eSEAPプラスミドの発現を使用してトランスフェクション効率を標準化した。
【０２１９】
ヒトPOLR2A(NCBI遺伝子ID#5430;mRNA配列ID#NM_000937.4;NCBIタンパク質配列ID#NP_000928.1)を標的にする4種のsiRNA:SI04364381(mRNA配列1255〜1275:CAGCGGTTGAAGGGCAAGGAA)、SI04369344(mRNA配列830〜850:ATGCGGAATGGAAGCACGTTA)、SI04250162(mRNA配列2539〜2559:ATGGTCGTGTCCGGAGCTAAA)およびSI04354420(mRNA配列4896〜4916:CAGCGGCTTCAGCCCAGGTTA)を使用した。
【０２２０】
加えて、ヒトRNGTT(遺伝子ID#8732;mRNA配列ID#NM_003800.3;NCBIタンパク質配列ID#NP_003791.3)を標的にする4種のsiRNA:SI00055986(mRNA配列3187〜3207:ATGGATTTAAAGGGCGGCTAA)、SI03021508(mRNA配列430〜450:TTCAAGGTTCTATGACCGAAA)、SI00055972(mRNA配列2530〜2550:CAGGGTTGTTAAGTTGTACTA)およびSI00055979(mRNA配列4132〜4152:TACCATCTGCAGTATTATAAA)を使用した。
【０２２１】
II.結果
第1次試験で、4種のPOLR2A siRNAおよび4種のRNGTT siRNAの効果を25nM終濃度で試験した(図14)。これらのsiRNAをpNP868R-SP6RNAPキメラ酵素プラスミドおよびレポーターのpT7p-ルシフェラーゼプラスミドと共にトランスフェクションした。全体として、siRNAなしの同条件と比較して、POLR2A siRNAはルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を平均で127%増大させる傾向を示す。同様に、siRNAなしの同条件と比較して、RNGTT siRNAの添加は、ルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を全体として平均で147%増加させた。
【０２２２】
最も高い促進率を示したPOLR2A SI04369344およびRNGTT SI00055972 siRNAを第2次試験用に選択した。NP868R-SP6RNAPで駆動するルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を0から100nMの濃度範囲のsiRNA存在下でアッセイした(図15)。両方のsiRNAで用量反応が観察された。3.8倍という最も強い発現促進がPOLR2A SI04369344の100nMで、5.1倍という最も強い発現促進がRNGTT SI00055972 siRNAの100nMで観察された。
【０２２３】
III.結論
本発見は、siRNAによる細胞の転写および転写後機構のサイレンシングは、NP868R-SP6RNAPキメラ酵素によって駆動するレポーター遺伝子の発現を促進することを実証するものである。
【受託番号】
【０２２４】
ATCC CRL 1573
(参考文献)
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0005432415.tif 000003
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0005432415.tif 000011
0005432415.tif 000012
【図１】
0005432415.tif 000013
【図２Ａ】
0005432415.tif 000014
【図２Ｂ】
0005432415.tif 000015
【図３Ａ】
0005432415.tif 000016
【図３Ｂ】
0005432415.tif 000017
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
0005432415.tif 000019
【図４Ｂ】
0005432415.tif 000020
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
0005432415.tif 000022
【図５Ｂ】
0005432415.tif 000023
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
0005432415.tif 000025
【図６Ｂ】
0005432415.tif 000026
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0005432415.tif 000029
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0005432415.tif 000031
【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0005432415.tif 000035
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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