(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の異なる安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）の存在を検出するための方法であって、
ｉ）  前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を移動させ、前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）がそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上を推移するように、前記力場（Ｆ）を変更するステップと、
ｉｉ）  前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）の移動に関連した前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出される階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を上回る頻度で測定するステップと、
ｉｉｉ）  前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって測定される階調レベルの時間的進化に結びつけられた少なくとも一つの特性パラメータの測定を通じて、前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）内に粒子が存在するかまたは欠如しているかの分類を行うステップと、
を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）における階調レベルの測定の時間的進化に結びつけられた前記特性パラメータは、ピークツーピーク振幅を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
分類は閾値との比較を通じて行われるという特徴を備え、該閾値は、想定される力場（Ｆ）の構成では粒子によって占有されえないような基準センサにおける階調レベルのピークツーピーク測定値を、前記基準センサの前記ピークツーピーク測定値の標準偏差に比例する係数で増大させることによって決定される、方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法であって、さらに、
存在を検出された粒子の総数をカウントするステップを備え、
前記カウントするステップは、統計的基礎に基づく推定方式によって行われることを特徴とし、該ステップは、
ｉ  電極（ＥＬ）のアレイによって生成される場（Ｆ）の中に存在する、粒子（ＢＥＡＤ）を含まない安定平衡点の数（ＥＣmeasure）を、センサによって測定し、
ｉｉ）  粒子（ＢＥＡＤ）のカウント（ＮＣＥＬＬＳ）が、安定平衡点（ＰＥＱ）の数（ＮＣＡＧＥＳ）の対数と粒子を含まない安定平衡点（ＰＥＱ）の測定数（ＥＣmeasure）の対数との差の、安定平衡点（ＰＥＱ）の数（ＮＣＡＧＥＳ）の対数と安定平衡点（ＰＥＱ）の数から１を引いた数（ＮＣＡＧＥＳ−１）の対数との差に対する比率として決定する、
方法。
【請求項５】
電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の異なる安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）を特徴付けるための方法であって、
ｉ．  前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を移動させ、そこに存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）がそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上を推移するように、前記力場（Ｆ）を変更するステップと、
ｉｉ．  粒子を含む異なる安定平衡点（ＰＥＱ）の移動に関連した前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出される階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を上回る頻度で測定するステップと、
ｉｉｉ．  前記粒子の性質を推定するために、階調レベル測定の時間的進化に結び付けられた特性パラメータを処理するステップと、
を備える方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
階調レベルの時間的進化に結びつけられた前記パラメータは、
ｉ．  力場（Ｆ）の変化と、階調レベルの第１の変化との間の遅延（ｔｄ）、
ｉｉ．  階調レベルの一過性の変化の長さ（ｔｗ）、
ｉｉｉ．  階調レベルの正ピーク（Ｇｐｐ）の幅、および
ｉｖ．  階調レベルの負ピーク（Ｇｎｐ）の幅、
からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータを含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の異なる安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する多様な種類（ＮＴＰ）の前記粒子（ＢＥＡＤＳ）の数を、
ｉ．  前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を移動させ、そこに存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）がそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上を推移するように、前記力場（Ｆ）を変更するステップと、
ｉｉ．  粒子を含む異なる安定平衡点（ＰＥＱ）の移動に関連した前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を上回る頻度で測定するステップと、
ｉｉｉ．  前記安定平衡点（ＰＥＱ）が空であるか、またはある種の粒子を含むかもしくはより多くの粒子を含むかを検出するために、前記センサによって測定され、かつ各安定平衡点（ＰＥＱ）に関連付けられた階調レベルの時間的進化に結びつけられた特性パラメータを処理するステップと、
ｉｖ．  各種の単一粒子をともなう前記安定平衡点（ＰＥＱ）の測定値（Ｐｔ＿１＿ＭＥＡＳ）および空の全安定平衡点（ＰＥＱ）の測定値（ＥＣ＿ＭＥＡＳ）により良く近似される、各種の粒子のカウント（ＮＣＥＬＬＳｔ）の組み合わせを数値的に決定するステップと、
の実行を通じてカウントするための方法。
【請求項８】
請求項１、請求項５、または請求項７のいずれかに記載の方法であって、
前記安定平衡点（ＰＥＱ）は、そこに存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）が複数のそれぞれの前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上を推移するように移動され、前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）は、光センサであり、粒子の寸法を下回る空間部分に入射する光パワーを検出するようにシールドされることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１、請求項５、または請求項８のいずれかに記載の方法であって、
新しい平衡位置への前記粒子の沈降遷移の終わりを決定し、前記新しい平衡位置への前記粒子の沈降遷移の終わりの前記決定に伴って、前記安定平衡点（ＰＥＱ）の移動速度を決定するように、前記粒子を含む前記安定平衡点（ＰＥＱ）の移動に結び付けられたセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出可能な階調レベルの変化の過程が制御されることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記沈降遷移の終わりでは、前記安定平衡点（ＰＥＱ）の新たな移動を生じさせるために、前記力場（Ｆ）の変化が起こされることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法であって、
前記センサは、光センサであり、前記階調レベルは、センサに当たる光パワーに相当することを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法であって、
前記センサは、インピーダンス計センサであることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法であって、
前記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出される階調レベルの値を補正するステップを備え、該補正するステップは、前記力場（Ｆ）の前記電流構成では粒子によって絶対に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）の平均検出に正規化された値を使用して行われることを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載の方法であって、
前記力場（Ｆ）の変更は、前記力場（Ｆ）の一時的な非アクティブ化を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
粒子（ＢＥＡＤＳ）の検出および／または特徴付けのための装置であって、
電極（ＥＬ）のアレイによって生成され前記粒子に作用する力場（Ｆ）の異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を生成するための手段と、
前記電極に関連付けられた光センサ（ＰＩＸＥＬＳ）と、
前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を移動して、前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）が前記光センサ（ＰＩＸＥＬＳ）のそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上に推移するように、前記力場（Ｆ）を変更する手段と、
を備え、前記電極に関連付けられた前記光センサ（ＰＩＸＥＬＳ）は、粒子の寸法を下回るセンサ部分に入射する光パワーを検出するように作成され、
更に、前記光センサのシールド手段と、
前記各光センサについて少なくとも１つ設けられた開口であって、前記シールド手段を通して得られ、検出および／または特徴付けが行われる粒子よりも小さい既定の寸法を有する開口と、
を備えることを特徴とする、装置。
【請求項１６】
粒子（ＢＥＡＤＳ）の検出および／または特徴付けのための装置であって、
電極（ＥＬ）のアレイによって生成され前記粒子に作用する力場（Ｆ）の異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を生成するための手段と、
前記電極に関連付けられた光センサ（ＰＩＸＥＬＳ）と、
前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）を移動して、前記異なる安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する前記粒子（ＢＥＡＤＳ）が前記光センサ（ＰＩＸＥＬＳ）のそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上を推移するように、前記力場（Ｆ）を変更する手段と、
を備え、
各電極（ＥＬ）には、前記光センサとして、前記粒子の垂直方向への推移を検出するための第１のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿Ｖ）と、前記粒子の水平方向への推移を検出するための第２のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿Ｈ）とが関連付けられることを特徴とする、装置。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の装置であって、
光センサである前記センサ（ＰＩＸＥＬ）を少なくとも部分的にシールドするように構成された、既定の通過帯を有する少なくとも一つのダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の装置であって、
異なる通過帯のセットから選択された通過帯をそれぞれ有し、間で重なり合わないようになおかつ前記センサ（ＰＩＸＥＬ）をいかなる場合も少なくとも部分的にシールドするように配置された、複数のダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項１９】
請求項１７または請求項１８に記載の装置であって、
前記少なくとも一ダイクロイックフィルタは、前記電極（ＥＬ）を覆うように配置され、前記電極の各自の少なくとも一部に対応して設けられた割り込み開口を備えていることを特徴とする、装置。
【請求項２０】
請求項１７ないし請求項１９のいずれかに記載の装置であって、
前記粒子を含む流体試料の受け取りおよび内包に適したチャンバまたはマイクロチャンバを前記電極のアレイと協働して定めるカバー（ＬＩＤ）に対応して配置された、既定の通過帯を有する少なくとも一つのダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子の特徴付けおよび／またはカウントのための方法ならびに装置に関するものである。本発明は、主に、単細胞に対する生物学的手続きの実施に応用される。
【背景技術】
【０００２】
G. Medoroに属する特許出願：ＰＣＴ／ＷＯ  ００／６９５６５は、閉じられた誘電泳動ポテンシャルケージの使用を通した粒子の操作および検出のための装置ならびに方法を記載している。記載された方法は、二次元空間において、各粒子の位置を他の全ての粒子から独立してどのように制御するかを教示している。粒子を浮遊状態で捕捉するために使用される力は、負の誘電泳動である。操作の動作に対する独立制御は、同じ基板内に一体化された電極およびセンサのアレイのそれぞれの要素に関連したメモリ素子および回路のプログラミングを通じて行われる。しかしながら、センサの特性のばらつきに結び付いた固定空間「雑音」（「固定パターン雑音」として技術的に知られる）は、細胞の検出におけるセンサ自体の信頼性を大きく制限する。上記特許は、光センサおよび／またはインピーダンス計センサの使用を報告している。たとえ、センサのゲインの変化を補償するために基準画像を減じた場合でも、例えば照明（光センサの場合）または液体の導電率（インピーダンス計センサの場合）の空間的変化などのその他の要因が未補償であるので、結果は、完全に信頼性のあるものとはならない。
【０００３】
Becker et al.による特許：ＵＳ  ６，２９４，０６３は、プログラム可能な力の分布を通じてひとまとまりの固形、液状、またはガス状の生物学的物質を操作するための方法および装置を開示している。該特許は、また、センサの使用にも言及している。しかしながら、この場合もやはり、固定パターン雑音の問題がある。
【０００４】
液体粒子（液滴）の操作のためのもう１つの既知の方法は、T.B. Jones, Journal of Micromechanics and Microengineering, 15 (2005) 1184-1187に記載された、エレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック（誘電体に対するエレクトロウェッティング、ＥＷＯＤ）である。この場合は、基板上に提供された電極によって及ぼされる電場が、気相に取り囲まれた液滴を、通電された電極の配列によって制御される方向に推進可能にする。この原理に基づくデバイスは、Pamula et al.に属する特許出願：ＵＳ  ２００４／００５８４５０  Ａ１によって教示されるようにフタ（やはり誘電体を塗布されている）を含めることによって、あるいは単に、基板の上方において液滴との間に電気的接触を確立する「鎖」と称されるワイヤを含ませることによって、作成することができる。J. Berthier et al., NSTI Nanotech 2005, www.nsti.org, vol. 1, 2005。
【０００５】
粒子の操作のためのさらなる力には、電熱フロー（ＥＴＦ）またはＡＣ電気浸透などの、電気流体力学的（ＥＨＤ）フローによって生成される粘性摩擦力がある。NG. Green, A. Ramos and H. Morgan, J. Phys. D: Appl. Phys. 33 (2000)では、粒子を表示するために、ＥＨＤが使用されている。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ  ２００４／０７１６６８  Ａ１は、上述された電気流体力学的フローを活用して一部の電極上に粒子を集結させるための装置を記載している。
【０００６】
「Impedance Spectroscopy Flow Cytometry: On-Chip Label-Free Cell Differentiation（インピーダンス分光フローサイトメトリ：チップ上における無標識細胞の差別化）」, Cytometry Part A 65A: 124-132 (2005), Cheung K, Gawad S, Renuad Pでは、フロー中の粒子を差別化するために、マイクロチップ上に一体化されたインピーダンス差動センサが使用される。
【０００７】
「Near-Field Optical Sensors for Particle Shape Measurements（粒子形状測定のための近接場光センサ）」, IEEE Sensor Journal, vol. 3, No. 5, Oct. 2003, pp. 646-651では、一体型センサ（フォトダイオード）のアレイに基づく粒子形状検出のためのチップが記載されている。しかしながら、粒子の動きは、液体の流れによって操作され、これは、例えばポンプまたはその他の類似のメカニズムを必要とする。したがって、解析対象粒子の位置を正確に制御することが不可能である。
【０００８】
Medoro et alによるイタリア特許出願：ＢＯ  ２００５Ａ０００４８１では、電極のアレイによって粒子を操作するためのいくつかの方法、ならびにそれらの粒子を検出するためのいくつかの方法および装置が報告されている。しかしながら、これらは、異なる細胞を差別化する能力について、既に触れられた特許：ＰＣＴ／ＷＯ  ００／６９５６５と同様の限界がある。
【０００９】
最後に、国際特許出願：ＰＣＴ／ＩＴ０２／００５２４には、第１の生物学的実体が、それに結合する機能を有する第２の生物学的実体を通じて認識される（あるいは逆もまた可）方法が、記載されている。この方法では、第１の生物学的実体は、少なくとも一部を選択的にアクティブ化可能およびアドレス指定可能であるとともに少なくとも第２の電極の方を向くように配置された第１の電極のマトリックスによって定められた表面上に固定され、誘電泳動ケージを通して移動される第２の生物学的実体に接触される。そして、第１および第２の生物学的実体の少なくとも一部の間にもし結合相互作用がある場合に、そのような結合相互作用が、好ましくは、電極内に一体化された光センサを使用して、第２の生物学的実体に結合された蛍光基を第１の周波数の放射で励起させ、その蛍光発光を第２の周波数で検出することによって検出される。したがって、やはり、光学的検出に結び付いた「雑音」（「固定パターン雑音」）を排除するという問題が残る。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の狙いは、上述された欠点がなく、より具体的には、粒子の正確な操作が得られ、同時にまた、固定パターン雑音の欠点に対して実質的に鈍感であるような、あらゆるタイプの粒子の特徴付けおよび／またはカウントを行うための方法ならびに装置を提供することにある。
【００１１】
とりわけ、本発明の狙いは、試料中に存在する各粒子の存在を一体型の光センサおよび／もしくはインピーダンス計センサによって検出するならびに／またはそのような粒子の種類を特徴付けるために、そのような粒子を決定論的なまたは統計的な手法で移動させることを目的とした、そのような粒子の位置制御を実行することにある。
【００１２】
本明細書において、以下では、「粒子」という用語は、天然にしろ人工にしろ、細胞、細胞成分、ウィルス、リポソーム、ニオソーム、マイクロ球（マイクロスフィア）、およびナノボールなどの、マイクロメートル規模もしくはナノメートル規模の実体、または高分子、たんぱく質、ＤＮＡ、およびＲＮＡその他など、より小規模な実体を意味するほか、例えば水中の油もしくは油中の水など、懸濁培地に混じらない流体の滴、または気体中の液滴（空気中の水など）、もしくはひいては液体中の気泡（水中の空気など）なども意図するものとする。
【００１３】
細胞という用語が使用される場合もあるが、これは、特にことわりがない限り、上述された広義での、粒子の検出および特徴付けにおける、非限定的な使用例であると解釈されるべきである。
【００１４】
本発明は、したがって、上記のように、請求項１，３，５，９，１１，２０，２２にしたがった、粒子の特徴付けおよび／またはカウントのための方法ならびに装置に関する。
【００１５】
具体的に言うと、不均一な時間的に可変の力場と、一体型の光センサとが使用される。力場は、粒子（固体、液体、または気体）の安定平衡点のセットによって特徴付けられる、正もしくは負の誘電泳動の場、電気泳動の場、または電気流体力学的運動の場であることが可能である。同じ方法は、国際科学界においてエレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック（誘電体に対するエレクトロウェッティング）の名称で知られる効果の活用によって、液滴（液体粒子）の操作に適用される。
【００１６】
このように、既知の技術の制限は、本発明によって克服される。
【００１７】
本発明にしたがった方法の実現形態は、照明の空間的変化におよび固定パターン雑音に対して鈍感である。さらに、解析対象粒子の位置決めを困難にするポンプもその他の方法で生成される液体の流れも必要とすることなしに、デバイスで操作される粒子を正確に特徴付けおよび分類することが可能である。
【００１８】
最後に、粒子を移動させるために流れを利用するアプローチと異なり、粒子をセンサに対して相対的に移動させる制御された力場を使用することによって、例えば力場を受けた粒子の移動速度からなるような、より多量の情報が得られる。したがって、粒子の特性に関するさらなる情報源が得られる。この情報は、異なる種類の粒子を差別化するために有利に使用することができる。
【００１９】
添付の図面を参照にして実施される本発明の非限定的な実施形態に関する以下の説明から、本発明のさらなる特徴および利点が明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の狙いは、粒子の操作および／または検出を行うための方法ならびに装置を提供することにある。
【００２１】
本発明の方法は、不均一な力場（Ｆ）の使用に基づいており、該力場を通って単一粒子または粒子群（ＢＥＡＤＳ）が、安定平衡の位置（ＣＡＧＥ）に引き付けられる（図１）。このような場は、例えば、負の誘電泳動（ＮＤＥＰ）もしくは正の誘電泳動（ＰＤＥＰ）の場、電気泳動の場（ＥＦ）、または電気流体力学的（ＥＨＤ）運動の場、またはひいてはエレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック（ＥＷＯＤ）であることが可能である。
【００２２】
検出は、以下の態様の１つ、または以下の態様の組み合わせに関係することができる。
１．単一粒子のカウントまたは定量化
２．識別および／または特徴付け
３．位置特定
【００２３】
これに関係して、インピーダンスの変化の測定、および／または蛍光のかたちで伝えられる、拡散される、もしくは発光される光度の変化の測定が、主として活用される。
【００２４】
力の生成
粒子を移動させるための場を、基板上に提供された電極（ＥＬ）のアレイを通じて生成するための方法として、既知の技術にしたがった様々な方法が挙げられる（図１）。一般に、カバー（ＬＩＤ）が使用される。これは、電極であってよく、液体懸濁液に含まれた状態の粒子（ＢＥＡＤＳ）を一般に内部に有するマイクロチャンバの範囲を定める。様々な力の様子が図１に示されている。誘電泳動（ＤＥＰ）の場合、印加される電圧は、加算符号（＋）で示された同相周期電圧（Ｖｐｈｉｐ）と、減算符号（−）で示された異相周期電圧（Ｖｐｈｉｎ）である。異相電圧とは、１８０度位相が異なる電圧を意味する。場は、粒子に作用する力を生成し、粒子は、平衡点（ＣＡＧＥ）に引き付けられる。負のＤＥＰ（ＮＤＥＰ）の場合、もしカバー（ＬＩＤ）が導電性の電極であるならば、既知の技術にしたがって、閉じられた力のケージを生成することが可能である。この場合に、もし隣接する電極が逆位相Ｖｐｈｉｐ（＋）につながれなおかつカバー（ＬＩＤ）が位相Ｖｐｈｉｎ（−）につながれているならば、平衡点（ＣＡＧＥ）は、Ｖｐｈｉｎ（−）につながれた各電極に対応して提供される。このような平衡点（ＣＡＧＥ）は、通常、電極から隔てられて液体中に存在するので、粒子（ＢＥＡＤ）は、定常状態において、浮遊している。正のＤＥＰ（ＰＤＥＰ）の場合、平衡点（ＣＡＧＥ）は、通常、電極を提供された表面に対応して位置しており、粒子（ＢＥＡＤＳ）は、定常状態において、表面に接触している。ＰＤＥＰの場合、ＰＤＥＰの平衡点は、電場の極大に対応するので、カバーにさらなる電極を設ける必要がない。誘電泳動では、荷電粒子を異極性の電極へと引き付けるために、電極のアレイを使用することができる。電気流体力学的（ＥＨＤ）運動の場合、電極の構成は、流れが最小の点へと粒子を追い立てる何らかの流れを生成する。ＥＷＯＤの場合は、誘電体を塗布された電極を含むカバー（ＬＩＤ）が一般に使用され、電極のマトリックスは、粒子（一般に空気中の液滴である）を引き付ける必要がある点において、カバーに対して異相の信号によって通電される。粒子をその上に存在させてはならない電極は、反対に、浮動状態にとどまる。ＥＷＯＤの場合は、電極のアレイの上方において空気中の液滴を操作することによって、カバーの代わりに一連のワイヤを使用することが可能である。
【００２５】
以下では、簡単を期するため、本発明の方法および装置の説明において、閉じられた負の誘電泳動ケージを実行力として使用することは、単に、本発明の目的のための非限定的な例と見なされる（このため、電極として機能する蓋を使用する必要がある）。当業者ならば、以下で説明される方法および装置を、異なる実行力の使用および異なる種類の粒子に合わせてどのように一般化するかが明らかである。
【００２６】
使用されるセンサ
常に簡潔を期するため、以下では、電極を一体化されたフォトダイオードに入射する光パワーを検出可能にする光センサの場合についてのみ言及される。当業者ならば、以下で説明される方法および装置を、様々な場合に、光センサに代わるまたは光センサと組み合わせた一体型インピーダンス計センサの使用に合わせてどのように一般化するかが明らかである。
【００２７】
以下では、簡潔を期するため、「一体型センサの出力信号」の同義語として、「階調レベル」という用語も使用される。この信号は、（フォトダイオードなどの光センサに）「入射する光パワー」に、または測定されたインピーダンス（一体型インピーダンス計センサの場合）に比例していることが可能である。
【００２８】
光センサの使用に対応した方法
光センサの場合、一般に、暗視野（ＢＦ）タイプの照明の場合について言及される。この場合、照明は、センサに当たる。暗視野（ＤＦ）照明法、または蛍光に基づく方法もまた可能であり、本発明の目的の範囲内である。しかしながら、簡単を期するため、以下で扱われるどの方法でも取り上げられず、ここに記載されるにとどまる。
【００２９】
図１７には、光センサを使用するためのいくつかの方法が示される。この図は、基板（ＳＵＢ）内に光センサ（ＰＩＸＥＬ）を一体化されたデバイスの断面に関する。センサと、電極（ＥＬ）を提供する各種メタライズ層との間の誘電体は、単純に、酸化物（ＯＸ）層からなることも、あるいは例えば薄膜ダイクロイックミラー技術によって実現されるフィルタ層（ＤＦＬ）を含むことも可能である。
【００３０】
明視野検出の図（図１７−ＢＦ）では、光（ＬＩＧＨＴ）は、カバー（ＬＩＤ）から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、粒子（ＢＥＡＤ）によって生じた歪みおよび吸収の関数として変化する。
【００３１】
暗視野検出の図（図１７−ＤＦ）では、光（ＬＩＧＨＴ）は、センサ（ＰＩＸＥＬ）に直接達しない入射角でカバー（ＬＩＤ）を通って入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、直接的に光（ＬＩＧＨＴ）が当たったまたは場合によっては電極による反射を経た光（ＲＬＩＧＨＴ）が当たった粒子（ＢＥＡＤ）からの拡散放射（ＳＬＩＧＨＴ）の関数として変化する。
【００３２】
明視野蛍光検出の図（図１７−ＢＦＦ）では、励起（ＥＸＬＩＧＨＴ）は、カバー（ＬＩＤ）から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、粒子（ＢＥＡＤ）によって発せられた蛍光（ＥＭＬＩＧＨＴ）の関数として変化する。この場合は、発せられた光（ＥＭＬＩＧＨＴ）の信号が励起パワー（ＥＸＬＩＧＨＴ）によって負かされないようにするために、以下の１つまたは複数の工夫を凝らすことが賢明である。
＞  励起として発せられる放射の波長のために、フィルタ層（ＤＦＬ）を使用する。
＞  光センサ（ＰＩＸＥＬ）が低い量子効率を有するような（すなわちその波長に対し比較的鈍感であるような）励起周波数を使用する。これは、例えば、比較的高い深さにおいてｐ−ｎ接合を、そして好ましくはＵＶ範囲内の波長の励起放射を使用することによって可能である。波長は、３８０ｎｍ未満であるとなお良い。
【００３３】
暗視野蛍光検出（図１７−ＤＦＦ）の図では、励起（ＥＸＬＩＧＨＴ）は、センサ（ＰＩＸＥＬ）に直接達しない入射角でカバー（ＬＩＤ）から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、直接的に光（ＥＸＬＩＧＨＴ）が当たったまたは場合によっては電極による反射を経た光（ＲＬＩＧＨＴ）が当たった粒子（ＢＥＡＤ）から発せられる蛍光の関数として変化する。しかしながら、発せられた光（ＥＭＬＩＧＨＴ）の信号が、粒子によって拡散された光のパワーによって劣化されないようにするためには、明視野蛍光の場合について上述された１つまたは複数の工夫を凝らすことによって、システムの選択性を向上させることが望ましい。
【００３４】
ケージのアクティブ化および非アクティブ化を通じて満ケージを検出するための方法
図１２は、ケージ自体を移動させる必要なくどのケージが満で（少なくとも１つの粒子が封入されている）どのケージが空であるかを検出するための、本発明にしたがった方法の、考えられる一連のステップを示している。この方法は、電極への適用パターンがケージの移動を可能にしないほどに密集している場合にとりわけ適している。さらに、ケージを移動させるための回路がデバイス内に存在しない場合に好都合である。
【００３５】
方法は、ケージ（ＣＡＧＥ）への粒子の封入／ケージ（ＣＡＧＥ）からの粒子の解放のために実行の位相を交互させることと、一体型センサ（ＰＩＸＥＬ）によって１つまたは複数の画像を取得する感知と、に基づく。
【００３６】
図１３に、波形が図式化されている。
【００３７】
ケージの非アクティブ化に際して、粒子は、ケージに入れられた際に想定される安定平衡の位置（ＰＥＱ）から開始して、沈降によって堆積しはじめる、なおかつ／またはブラウン運動の結果として自身を側方に移動させはじめる（図１２の右側すなわち図１２−ｔ＿ｓｅｎｓｅ）。これらの移動ゆえに、満のケージにおいて検出される階調レベルは、空のケージに関連したセンサ（ピクセル）において生じる読み出し回路および／または光システムの熱雑音に結び付いた階調レベルの変化と比べ、かなり大きく変化する。
【００３８】
空のケージまたは満のケージの分類は、以下のように行われる。
１．  （数秒程度から何分の数秒程度の時間に及ぶ）ケージの交互操作（アクティブ化または非アクティブ化）によって、そして（例えば１００ｍｓなど何分の１秒程度から数十秒程度の時間に及ぶ）１つまたは複数の画像の感知によって、一連の画像が取得される（感知される）。
２．  ＣＡＧＥ＿ＩＪに関連した各センサＰＩＸＥＬ＿ＩＪについて、一連の画像ＮＩＭＧに関し、
【数１】
0005538720.tif 000002
として定義される階調レベルの非正規化標準偏差（この具体的ケースではセンサに入射する光パワーに比例する）が計算される。ここで、
【数２】
0005538720.tif 000003
（一連の画像ＮＩＭＧにおける、ＰＩＸＥＬ＿ＩＪの階調レベルの平均値）である。
３．  空の基準センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）における階調レベルの非正規化標準偏差平均：
【数３】
0005538720.tif 000004
と、非正規化標準偏差の相対標準偏差：
【数４】
0005538720.tif 000005
とが計算される。
４．  分類の閾値が定められる。
【数５】
0005538720.tif 000006
５．
【数６】
0005538720.tif 000007
のケージＩＪは、満であるものとして分類され、
【数７】
0005538720.tif 000008
の残りのケージは、空であるものとして分類される。
【００３９】
興味深いことに、このような方法は、信号のパワーをセンサごとに平均値に照らして考慮するが、このような平均値の絶対値は除外しているので、固定パターン雑音（フォトダイオードの特性のばらつきに結び付いた固定空間雑音）とは無関係である。
【００４０】
９５％を超える精度を得るためには、一般に、ＮＩＭＧ＝５０〜１００回の測定を行う（すなわちＮＩＭＧ＝５０〜１００の画像を取得する）と十分である。
【００４１】
取得するべき画像の数ＮＩＭＧの動的測定は、基準ピクセルの標準偏差：
【数８】
0005538720.tif 000009
をその漸近値に収束させるために必要とされる画像の数を考慮することによって得ることができる。
【００４２】
もし光の変化に結び付いた雑音１／ｆを無視できるならば、この漸近値は一定である（ｆは、雑音を想定される一般的周波数である）。
【００４３】
したがって、より一般論として、光センサが使用される場合について特に言及して今説明された方法は、電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子（例えば細胞）に作用する任意の力場（Ｆ）（したがって、誘電泳動の場に限られない）の安定平衡点（ＰＥＱ）にもし粒子（ＢＥＡＤＳ）がある場合に、その粒子の存在を検出することを可能にする。このような方法は、以下のステップを含む。
ｉ．  力場（Ｆ）を非アクティブ化する。
ｉｉ．  非アクティブ化に続き、なおかつ非アクティブ化された場にある粒子が受ける沈降運動および／またはブラウン運動の力学の関数として選択される、少なくとも一時間間隔において、安定平衡点（ＰＥＱ）に関連した第１のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって生成される階調レベル、および力場（Ｆ）の電流構成ゆえに絶対に粒子によって占有されえないような空間領域に関連した第２のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）によって生成される階調レベルを測定する。
ｉｉｉ．  力場（Ｆ）を再びアクティブ化する。
ｉｖ．  ｉ）からｉｉｉ）までのステップを、基準とみなされる第２のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）において測定される階調レベルの値の分散量が漸近値に向かう収束速度と実質的に同程度の回数にわたって繰り返す。
ｖ．  想定される時間的に一連の測定において、とある平衡点（ＰＥＱ）に関連した第１のセンサにおいて検出される階調レベル値の標準偏差が既定の閾値（ＴＨＲ）を上回る結果となる場合に、そのような平衡点を粒子によって占有されているものとして分類する。
【００４４】
ケージの運動と階調レベルの静的値の差の測定とによって満のケージを検出するための方法
図１０は、満のケージを、その運動と階調レベルの静的値の解析とを通じて検出するための、本発明にしたがった一連の操作ステップを示している。
１．  第１の時点（ｔ０）において、ケージ（ＣＡＧＥ）は、対応する初期の光センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＳＴＡ）のセット上に粒子（ＢＥＡＤＳ）を配されている。この構成に対応する階調レベルを有する画像が取得される。
２．  続く時点（ｔ１）において、ケージの運動に結び付いた過渡現象が終わると、粒子は、最終的な光センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＴＧＴ）に対応して自身を配置する。この構成に対応する階調レベルを有する新しい画像が取得される。
３．  時点１および時点２の画像に関連した階調レベルの差分画像が決定される。
４．  差分画像の絶対値が決定される。
５．  各ケージの開始位置および最終位置に関連したピクセル対（ＰＩＸＥＬ＿ＳＴＡ，ＰＩＸＥＬ＿ＴＧＴ）についての階調レベル結果が決定される。
６．  ステップ１〜４がＮＤＩＦＦ回にわたって繰り返され、ステップ５において決定された絶対変化に関連する各ケージに関する階調レベルが蓄積される。
７．  ケージのアクティブ化／非アクティブ化による分類について上述されたのと同様に、取得された全ての差分画像ＮＤＩＦＦについて、この場合は、確実に空のセンサ（ピクセル）（例えばケージのロウ間のピクセルなど）に対応する差の絶対値の平均および標準偏差を考慮して、分類の閾値ＴＨＲが決定される。
【００４５】
より一般論として、電極のアレイ（ＥＬ）によって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の安定平衡点（ＰＥＱ）にもし粒子がある場合は、その粒子（ＢＥＡＤＳ）の存在の検出は、以下の手順によって行われる。
ｉ）  先ず、安定平衡点（ＰＥＱ）に関連した第１のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＳＴＡ）によって生成される階調レベル、および力場（Ｆ）のこの第１の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）によって生成される階調レベルを測定する。
ｉｉ）  次に、第２の電流構成を付与するために、力場（Ｆ）を変更する。このとき、安定平衡点は、第１のセンサとは異なる第２のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＴＧＴ）に対応して移動される。
ｉｉｉ）  次に、第２のセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＴＧＴ）によって生成される階調レベル、および力場（Ｆ）のこの第２の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）によって生成される階調レベルを測定する。
ｉｖ）  先行する時点において検出された階調レベル値の間の差（ＤＩＦＦ＿ＩＭＧ）を決定する。
ｖ）  ステップｉ）〜ｉｖ）を繰り返す。
ｖｉ）  安定平衡点（ＰＥＱ）を粒子に占有されたものと占有されていないものとに分類するために、示差階調レベル値を処理する。
【００４６】
このような処理は、ｖｉｉ）階調レベルの差の絶対値を決定するステップと、次いで、ｖｉｉｉ）場（Ｆ）の第１および第２の電流構成では粒子に占有されえないような基準センサに関連した階調レベルの平均的変化を大幅に上回る変化を有するセンサに関連した平衡点を、占有されたものとして分類するステップと、を含む。
【００４７】
画像の差の絶対値に基づくこの方法も、やはり、固定パターン雑音に影響されず、ケージのアクティブ化／非アクティブ化による方法と同様に、照明のむらに対して比較的鈍感である。
【００４８】
第１の方法と比べて、この方法は、ケージを移動させるための回路と、もしケージに封入された細胞がある場合にその移動を一義的に決定するためにケージの運動を可能にするケージ間の距離と、を必要とするという不利点を有する。
【００４９】
この方法の利点の１つは、一般に、一定の質の（誤差率の低い）分類を得るために必要とされる画像が少ない（なおかつ時間が短い）ことにある。ケージのアクティブ化／非アクティブ化の方法の場合は、より多くの画像と、より長い時間とが必要とされる。
【００５０】
図１１には、単一ステップ（ＮＤＩＦＦ＝１）によって得られる結果が示されている。図１１（ａ）には、光学顕微鏡によって検出可能な画像が報告されており、図１１（ｂ）には、対応する階調値のマップが（固定パターン雑音を補償されている）示されており、反対に、図１１（ｃ）には、初期の階調値を有する画像と右方向への移動後の画像との差の絶対値の正規化画像が示されている。
【００５１】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とによって満のケージを検出するための方法
図２は、ケージ自体の移動を通じてケージ中の粒子の存在を動的に検出するための方法のステップにおける波形を示している。
【００５２】
先ず最初に、ケージの移動が行われるが、粒子が新しい平衡位置に沈降するのを待つことなく、運動ケージに内包された細胞（粒子）が運動している下にある光センサにおいて、その信号の変化が検出される。
【００５３】
図４は、ＩＪ位置にあるケージの運動と、光センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）上における粒子（ＢＥＡＤ）の推移を決定する平衡点（ＰＥＱ）の移動と、をともなう一連のステップを示している。
【００５４】
粒子（ＢＥＡＤ）の寸法が電極のそれより大きい場合、センサは、変化を測定するが、粒子を上に有さないピクセルに関する基準値に達することができない。この場合は、図９のような、僅かに異なる図を採用することができる。この場合は、電極より大きい寸法のケージの縁にあるピクセル（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）において階調値を測定することによって、電極の実寸法の二倍の寸法の電極を有する場合に相当する状況が再現される。
【００５５】
この技術は、ある意味では、（もしフォトダイオードが細胞と同程度の大きさでなおかつこれが垂直に移動される場合に）細胞の水平断面についての積分を考慮して入射パワーに関連した階調値を検出することによって、細胞を走査することを可能にする。実行の負荷サイクル：
【数９】
0005538720.tif 000010
を変化させることによって、異なる走査速度が得られる。
【００５６】
これらの操作は、ケージが満である場合に発生する光度の頂点および谷に基づいて粒子の存在を検出することを可能にする。センサの信号を処理することによって、当業者ならば、満のケージを空のケージと区別することを可能にする一連のパラメータ（例えば階調値のピークツーピーク振幅）を容易に検出することができる。
【００５７】
したがって、本発明の方法のこの変更形態にしたがうと、電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の安定平衡点（ＰＥＱ）にもし粒子がある場合、その粒子（ＢＥＡＤＳ）の存在は、以下のステップを行うことによって検出される。
ｉ）  粒子（ＢＥＡＤＳ）をそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）に対応して推移させることによって安定平衡点（ＰＥＱ）が移動されるように、力場（Ｆ）を変更する。
ｉｉ）  異なる安定平衡点（ＰＥＱ）の推移に関連したセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
ｉｉｉ）  センサによって生成される階調レベルの測定の時間的進化の特性パラメータの測定を通じて、粒子が存在するかまたは欠如しているかの分類を行う。階調レベルは、例えば光センサの場合、入射する光パワーに基づいて生成される。
【００５８】
センサによって生成される階調レベルの測定、すなわちセンサに当たる光パワーの測定は、粒子に作用する場をアクティブ化するステップと、上記の場を非アクティブ化するステップとを交互に行うことによって、入射する光パワーをすなわちこうして得られる階調レベルを後ほど測定することによっても、明らかに実現可能である。これは、センサの読み出しによって実行電圧間に生じるあらゆる干渉を、たとえ原則的には実行電圧のアクティブ化に対するセンサの実質的独立性があれば不要ではあるものの、回避するのに有利である。
【００５９】
光パワーの測定の時間的進化のパラメータは、階調レベルのピークツーピーク振幅を含むことが好ましく、分類は、好ましくは、想定される力場（Ｆ）の構成では粒子によって占有されえないような基準センサにおける光パワーすなわち階調レベルのピークツーピーク測定を、基準センサのピークツーピーク値の標準偏差に比例する係数で増大させることによって決定される、閾値との比較を通じて行われる。
【００６０】
このようにして、基準センサ上にある環境照明に起因する雑音１／ｆも補償される。
【００６１】
誤差補償をともなった、満のケージの数に基づいて細胞をカウントするための方法
上述された方法によって、満のケージの数が決定される。本発明の狙いは、ケージ中の細胞をカウントするための方法を見いだすことにもある。これによって、想定される試料の体積がわかるうえ、細胞の濃度も得られる。
【００６２】
第１近似として、とりわけ、ケージあたりの平均細胞数が約０．１を大幅に下回る場合は、満のケージの数は、細胞の数とおおよそ同程度である（この場合は約５％、細胞数が過小評価される）。より高い平均細胞数の場合、本発明にしたがうと、チップ上の実際の細胞数をより高い精度で近似するカウントを得るために、ケージあたりの細胞数の分布統計を補償することができる。
【００６３】
以下の仮定が想定される。
１．  細胞は、単位体積あたりに均一に分布される。この仮定は、試料が空のマイクロチャンバに注入される場合は全面的に立証される。反対に、予め緩衝材で満たされたマイクロチャンバに試料が注入される場合は、試料のフロープロファイルに結び付いた細胞密度の変化ゆえに、試料は、局所的にのみ均一である可能性がある。
２．  ケージあたりの最大細胞数に結び付いた束縛は、無視することができる。
【００６４】
この仮定は、細胞の総体積（平均細胞数あたりの平均細胞体積）がケージの体積（各ケージの引力ボールの体積を意図する）より適度に小さい場合に立証される。
【００６５】
これらの仮定のもとでは、細胞の統計的分布は、二項分布によって表される。ここで、
ＮＣＡＧＥＳ＝チップ（または想定される部分）内のケージの数
ｎ＝ＮＣＥＬＬＳ＝チップ（または想定される部分）内の細胞の数
として定義するものとする。ここで、「チップ」とは、電極ＥＬのアレイによって形成されたセットを意図しており、これは、通常、センサＰＩＸＥＬとともに単一の多層チップ内に正確に一体化される。
【００６６】
そして、ある細胞が任意のケージの引力ボールに属する確率は、
ｐ＝１／ＮＣＡＧＥＳ
である。
【００６７】
ケージあたりｋ個の細胞がある確率は、式：
【数１０】
0005538720.tif 000011
から得られる。ここで、
【数１１】
0005538720.tif 000012
は、ｎ個からｋ個を一度に選ぶ組み合わせの数である（二項分布）。
【００６８】
ケージあたりの細胞の平均値（ケージあたりの平均細胞数：ＡＣＰＣ）は、
【数１２】
0005538720.tif 000013
である。
【００６９】
一般に、チップ上には多くのケージがあるので、ケージあたり１，２，．．．，ｋ個の細胞を有する確率を、ケージの数で乗じることによって、１，２，．．．，ｋ個の細胞を有するケージの実際の値をよく近似することができる。これを考慮に入れ、さらに、空のケージおよび満のケージの総数が検出されれば、検出値に対応する満のケージおよび空のケージの期待数を提供する値を計算することによって、ケージあたりの平均細胞値（ＡＣＰＣ）を推定することができる。
【００７０】
空のケージの期待値は、
【数１３】
0005538720.tif 000014
として計算され、実際に検出された空のケージの値で置き換えることによって、細胞をカウントすることができる。これは、
【数１４】
0005538720.tif 000015
などの単純な推移を経て計算される。
【００７１】
こうして、細胞数の優れた推定が得られ、そして、もし空のケージおよび満のケージの数が統計的に多数であるならば、１を上回るＡＣＰＣ値の場合もまた、優れたカウント精度が得られる。このようにして、実際は、満のケージのみをカウントするその他の場合に見られる細胞数の過小評価に結び付いた誤差が軽減される。言うまでもなく、空のケージの検出数（ＥＣmeasure）は、ゼロより大きくなければならず、ケージの数ＮＣＡＧＥＳ未満またはそれに等しくなる。以下の表は、ケージが６，４００個であるような具体的な一例を、様々な細胞濃度の場合について数値的に示している。表からわかるように、カウント誤差は激減されており、これは、ケージあたりの平均細胞濃度が高い場合にとりわけ顕著である。実際は、報告値は、確率の密度に基づくものに過ぎないが、多数のケージを想定すれば、確率推定によって、予想される測定値をよく近似することが可能である。
【００７２】
【表１】
0005538720.tif 000016
【００７３】
言い換えると、本発明にしたがうと、ここまでに説明されてきた任意の方法にしたがって実施される満のケージおよび空のケージのカウントによって、電極ＥＬのアレイとカバー（ＬＩＤ）とによって範囲を定められたチャンバに注入される試料中に実際に存在する粒子（例えば細胞）の総数のカウントを得ることができ、予め一般的存在を検出されている単一粒子をカウントするステップは、本発明のこの態様にしたがって、以下のように、統計的基礎に基づいて推定方式で行われる。
ａ）  電極（ＥＬ）のアレイによって生成される場（Ｆ）の中に存在している、いかなる粒子（ＢＥＡＤ）も含まない、以下ではケージとも称される安定平衡点（ＰＥＱ）の数（ＥＣmeasure）が、センサによって測定される。
ｂ）  粒子（ＢＥＡＤ）のカウント（ＮＣＥＬＬＳ）が、安定平衡点（ＰＥＱ）の数（ＮＣＡＧＥＳ）の対数といかなる粒子も含まない安定平衡点（ＰＥＱ）の測定数（ＥＣmeasure）の対数との差の、安定平衡点（ＰＥＱ）の数（ＮＣＡＧＥＳ）の対数と安定平衡点（ＰＥＱ）の数から１を引いた数（ＮＣＡＧＥＳ−１）の対数との差に対する比率として決定される。
【００７４】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とを通じてケージ中の細胞を特徴付けるための方法
図３に示されるように、球（例えば図３（ａ））、ある種類の細胞（例えば図３（ｂ）にあるようなＫ５６２）、または別の種類の細胞（例えば図３（ｃ）にあるような赤血球）は、異なる寸法、形状、吸光度プロファイル、および屈折率を有するので、ケージにセンサの上を通らせることによって、それが満であるかどうかを検出するのみならず、本発明のさらなる一態様にしたがえば、もし粒子が存在する場合はその粒子の種類を特徴付けることが可能である。
【００７５】
細胞（および特定の種類のマイクロ球）は、負ピーク（細胞の暗い縁部分）および正ピーク（細胞が光を集中させる明るい中心部分）をともなう階調レベルの変化を発生させる光の歪み（ある種のレンズ効果）を呈する。
【００７６】
図５に報告される、重要だが非限定的な例にあるように、階調レベルの負ピーク（Ｇｎｐ）および正ピーク（Ｇｐｐ）の振幅の測定、ならびに例えばケージの運動と第１の階調変化の検出との間の遅延（ｔｄ）、あるいはさらには変化の時間的長さなどの、階調レベルの動的進化に結び付けられたパラメータを、追加の情報を得るためおよび細胞の種類を分類するために使用することが可能である。
【００７７】
式：
第一近似として、移動速度は、誘電泳動移動度に比例し、v ∝ k・R2となる。したがって、第一近似としての階調レベルの変化の長さは、
【数１５】
0005538720.tif 000017
である、すなわち、粒子の半径に反比例する（Ｒが増大すると減少する）。実行と階調レベルの変化の開始との間の時間遅延ｔｄは、第一近似として（単一電極上に一細胞がある図４の場合）、
【数１６】
0005538720.tif 000018
に等しくなる（やはりＲが増大すると減少する）。
【００７８】
図６は、Ｋ５６２細胞について測定された実際の過程を示している。
【００７９】
図７は、透明でない球、または上記の「レンズ」効果よりも吸光度の効果のほうが支配的であるような小細胞について期待される一般的な過程を示している。
【００８０】
図８は、ケージの移動に続く１０μｍ、６μｍ、および３μｍのポリスチレンの球の推移に際して検出された階調値の時間的進化を示している。
【００８１】
適切な識別パラメータを抽出することによって、当業者にとって明らかな方法で、満のケージおよび空のケージの分類について上述されたのと同様に、分類の基準を定めることが可能である。
【００８２】
具体的に言うと、識別方法は、粒子の際立った特性を抽出すること、ならびにニューラルネットワークに基づくアルゴリズム、第１の閉じられたｋｓ、閾値アルゴリズム、および／または主成分解析、またはこれらを組み合わせたものなどを使用することを含むことができる。
【００８３】
図１４は、同じ原理に基づく代替の一技術を示している。この技術によれば、細胞をセンサの上方で側方に移動させることによって、細胞を、水平断面内において、より高い解像度で走査することが可能である。実際、想定される細胞の「薄片」は、より小寸法である。細胞の通過にともなって、取得中の点の数に等しい水平解像度および電極間のギャップ（距離）に等しい垂直解像度で、階調値の導関数から、細胞の水平断面に沿った階調値の点値を計算することができる。
【００８４】
したがって、上述された内容に基づくと、本発明は、電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する粒子（ＢＥＡＤＳ）を、以下のステップを行うことによって特徴付ける（すなわち、例えばそれらの物理的性質を確立する）ことも可能にすることがわかる。
ａ．  上記粒子（ＢＥＡＤＳ）をそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）に対応して推移させることによって上記安定平衡点（ＰＥＱ）を移動させるように、力場（Ｆ）を変更する。
ｂ．  粒子を含む異なる安定平衡点（ＰＥＱ）の推移に関連したセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
ｃ．  粒子の性質を推定するために、階調レベル測定の時間的進化の特性パラメータを処理する。
【００８５】
この全体は、常に、センサによって検出可能な背景「雑音」、すなわち固定パターン雑音による影響を受けない。
【００８６】
使用されるセンサが光センサであり、なおかつ階調レベルの測定がセンサに当たる光パワーの測定であるような説明された例では、このような測定は、好ましくは、以下のステップ：
ｉ．  粒子に作用する場をアクティブ化する。
ｉｉ．  場を非アクティブ化し、入射する光パワーを測定する。
を交互に行うことによって実施される、あるいは、ケージ中の粒子の存在を動的に検出するためのものとして上述されたのと同じ好ましいシステムを使用して実施される。光パワーの測定の時間的進化のパラメータは、上述された内容に基づいて、
ｉ．  力場（Ｆ）の変化と、光パワーの第１の変化との間の遅延（ｔｄ）、
ｉｉ．  光パワーの一過性の変化の長さ（ｔｗ）、
ｉｉｉ．  光パワー値の正ピーク（Ｇｐｐ）の振幅、および
ｉｖ．  光パワー値の負ピーク（Ｇｎｐ）の振幅、
からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータを含む。
【００８７】
異成分からなる試料中の異種の細胞をカウントするための方法
本発明にしたがうと、単一集団の細胞をカウントするための方法論を、単一ケージ中の粒子を特徴付けるための方法論と組み合わせることによって、異種の粒子からなる試料の組成を決定することが可能である。
【００８８】
一般に、２つ以上の細胞を含むケージ中の粒子の組成を差別化することは容易でない。しかしながら、ケージ内容の特徴付けを目的として上述のように記録された、階調レベルの力学を処理すれば、そのケージが単一粒子を含むのか、あるいは多様な粒子（ＭＣ）を含むのかを決定することは、比較的簡単である。
【００８９】
異種の粒子の分布は、互いに独立している（直交している）とみなすことができる。したがって、単一粒子をともなうケージにおいて得られる各種類の粒子の数と、空のケージ（ＥＣ）の数およびケージの総数に関する情報を組み合わせれば、数値的な手順を経て、異種集団の粒子の数を推定することが可能である。問題は、ＮＰＴが変化する関数の最小化である（ここで、ＮＰＴ＝粒子の種類の数である）。図２１には、ＮＰＴ＝３である場合の問題が報告されている。
【００９０】
各種類の粒子：ｔ＝１，．．．，ＮＰＴについて、複数の粒子（ＮＣＥＬＬＳｔ）の存在が想定される場合、ケージの中にある種類ｔ単独の粒子の数（その他の種類の粒子は無視する）を表しているＮＰＴ次元の空間を有する超立方体の体積は、事実上、固定値（Ｐｔ＿１）のままである。図２１（ａ）を参照すると、第１の種類の粒子について、単一ケージではＰ１＿１個の粒子が、複数ケージではＰ１＿Ｍ個の粒子が、種類Ｐ１の粒子をともなわないケージではＰ１＿０個の粒子が得られる（図示された体積の測定値である）。単一ケージ中における種類ｔの粒子の検出数は、しかしながら、同じケージ中に１つまたは複数のその他の種類の粒子が存在しうることを考慮に入れる必要がある。したがって、図２１（ｄ）に示されるように、各種類ｔの単一粒子の検出値（Ｐｔ＿１＿ＭＥＡＳ）は、異種の粒子を少なくとも１つ含むｑ＜＞ｔ、ｈ＞０の超立方体をともなう場合に、種類ｔの粒子の超立方体の体積（Ｐｔ＿１）からＰｔ＿１とＰｑ＿ｈとの超立方体交差部分の体積を引いた値に相当する。空のケージの超立方体の体積（ＥＣ＿ＭＥＡＳ）も知られている。
【００９１】
値のセット：ＮＣＥＬＬＳｔ（ｔ＝１，．．．，ＮＰＴ）は、数値的に計算される。こうして、（統計的）期待値は、各種類ｔの単一粒子をともなうケージの実測数（Ｐｔ＿１）および空のケージの実測数（ＥＣ＿ＭＥＡＳ）に、より良く対応することができる。
【００９２】
したがって、上述された内容に基づくと、本発明は、電極（ＥＬ）のアレイによって生成され粒子に作用する力場（Ｆ）の安定平衡点（ＰＥＱ）に存在する多様な種類（ＮＴＰ）の粒子（ＢＥＡＤＳ）の数を、以下のステップの実行を通じてカウントすることも可能にすることがわかる。
ａ．  上記粒子（ＢＥＡＤＳ）をそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）に対応して推移させることによって上記安定平衡点（ＰＥＱ）を移動させるように、力場（Ｆ）を変更する。
ｂ．  粒子を含む異なる安定平衡点（ＰＥＱ）の推移に関連したセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
ｃ．  関連のケージが空であるか、またはある種の粒子を含むかもしくはより多くの粒子を含むかを検出するために、各安定平衡点（ＰＥＱ）に関連した階調レベル測定の時間的進化の特性パラメータを処理する。
ｄ．  各種の単一粒子をともなうケージの測定値（Ｐｔ＿１＿ＭＥＡＳ）および空のケージの測定値（ＥＣ＿ＭＥＡＳ）により良く近似される、各種の粒子のカウント（ＮＣＥＬＬＳｔ）の組み合わせを数値的に決定する。
【００９３】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とを通じてケージ中の細胞を高解像度で特徴付けるための装置
本発明にしたがうと、これまでに説明されてきた動的検出方法の解像度を高めるためには、より高い空間解像度によって特徴付けられるフォトダイオード（ＰＩＸＥＬ＿Ｖ１，…，ＰＩＸＥＬ＿ＶＮ）に関連した一連の電極（ＥＬ）を組み合わせる（図１５）ことによって、粒子を様々な電極の上で順次移動させ、粒子の様々な断面を順次解析することが可能である。
【００９４】
解像限界は、このように、フォトリソグラフィ解像度の最小形状によって決定され、電極（ピクセル）のアドレス指定用に異なるトランジスタを配置する必要がなく、所要面積を増大させなくてすむ。例えば、フォトダイオードの上に配されるめっきの上に、何らかの開口（ＳＬＩＴＳ）を設け、その開口に対応する部分でのみ高感度にすることができる。
【００９５】
このように、上記安定平衡点（ＰＥＱ）は、粒子（ＢＥＡＤＳ）が複数のそれぞれのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）に対応して推移されるように移動され、センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）は、光センサであり、粒子およびセンサ自体の寸法を大幅に下回る空間部分に入射する光パワーがセンサによって検出されるように（比較的小さい既定の振幅の開口ＳＬＩＴＳを備えた上記めっき層を通して）シールドされるような、さらなるステップを、これまでに説明されてきた全ての方法において、実施することができる。
【００９６】
ケージの移動速度の自動制御によって細胞を操作するための方法
こうして、ケージの移動速度の自動制御による操作の方法は、上述のように、細胞の推移検出の使用に基づくことが可能である。軌跡に沿った次のステップを直ちに開始させるため、（電極のアレイをともなう）チップ上で運動している細胞を有するケージについて、階調レベルの進化を監視するとともに、新しい平衡点への沈降遷移の終わりを検出することができる。異なる瞬間における異なる粒子の速度に時間を動的に適応させることによる、時間の最適化のほかに、このようなアプローチもまた、各細胞がブロックされたままにないように保証することができる。
【００９７】
１つの電極あたり１つの光センサが、例えば図４に示されるように２つの電極間の垂直ギャップ（距離）などに関連付けられる場合、この方法は、幅１電極×縦２電極（水平位置に１電極×垂直位置に２電極）のケージを使用して行うことができる。実際、水平移動の場合は、粒子は、２つの電極間のセンサ上において自身を全速力で位置付けし、その運動は、初期平衡点および／または最終平衡点に対応してセンサを監視することによって追跡することができる。これは、ケージの形状に対して束縛をもたらすが、後述される装置の使用によって克服することができる。
【００９８】
ケージの寸法に対する束縛をともなうことなくケージの移動速度の自動制御によって細胞を操作するための装置
図１６には、水平方向の運動決定のためのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿Ｈ）および垂直方向の運動決定のためのセンサ（ＰＩＸＥＬ＿Ｖ）の両方のセンサ（ピクセル）を有する装置の図である。このような装置は、ケージの移動速度の１つに統合されたかたちで実施される閉鎖制御によって粒子の操作を実現するのに有利である。この装置を使用すれば、１×１のケージによる水平移動も可能である。なぜならば、いかなる場合も、細胞／粒子は、２つの電極間に水平軸に沿って配されたセンサ（ＰＩＸＥＬ＿Ｈ）上を推移するからである。
【００９９】
今説明されたさらなる方法および装置を使用すれば、上述された粒子の検出および特徴付けの全ての方法に適用することが可能なステップを実現することができる。該ステップは、新しい平衡地点への粒子の沈降遷移の終わりを決定し、この測定から、新しい安定平衡点（ＰＥＱ）に向かう粒子（ＢＥＡＤＳ）の移動速度へと戻るために、粒子を含む安定平衡点（ＰＥＱ）の推移に関連したセンサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出可能な階調レベルの変化の過程を制御することからなる。このような沈降遷移の終わりでは、所望の既定の軌跡（図１５において矢印によって示される）に沿って安定平衡点（ＰＥＱ）の新たな移動を生じさせる目的で、電極自身によって生成される力場（Ｆ）の変化を（例えば電極ＥＬのアレイの、さらには既知のタイプの制御ユニットＣＴＲＬに実装された適切なソフトウェアを通じて（図１５））自動的に生成することができる。
【０１００】
ケージ中の細胞を蛍光によって検出するおよび／または特徴付けするための、一体型ダイクロイックフィルタをともなう装置
細胞の蛍光検出および／または蛍光特徴付けを目的として、本発明にしたがったいくつかの好ましい実装形態が報告されている。これらの実装形態は、蛍光発光は通過させるが励起は軽減させるようなフィルタ素子を一体化されている。これらのフィルタ素子は、ダイクロイックフィルタの実現に適した屈折率を有する材料を薄膜状に堆積させるなどの、チップの実行よりも下流のプロセスステップによって、一体化することができる。フィルタ効果は、センサ（ＰＩＸＥＬ）によって検出される励起帯中の光パワーの一部を軽減させることによって、センサ自体のダイナミックレンジに結び付けられた必要条件を減らすことができる。
【０１０１】
図１８には、蛍光細胞の検出および／または特徴付けにとりわけ適した装置の図が示されている。発光に対応する周波数を通過させるダイクロイックフィルタ（ＤＦＬ）が、当業者に知られた技術によって、チップ上に堆積される。堆積後は、電極（ＥＬ）と液体との間の電気的接触を向上させる狙いで、オプションとして、電極自体に対応していくつかの窓がダイクロイック層上に開けられる。このようにすれば、例えば、誘電泳動の場合、ダイクロイックフィルタで構成された誘電体層の存在に結び付いた電圧降下をともなうことなく高伝導性の溶液をも使用することが可能になる。この実行方式は、標準的なＣＭＯＳウエハの製造の使用に適合しており、ウエハのポスト処理のみを必要とする。
【０１０２】
あるいは、ダイクロイックフィルタは、図１９に示されるように、電極の下方で実現することができる。これは、ＣＭＯＳプロセスが変更可能である場合に有用である。また、ＣＭＯＳプロセスの変更がない場合でも、この図は、より複雑ではあるが、フィルタをあてがうこと、ＣＭＯＳの頂部金属にコンタクトを開けること、および電極（ＥＬ）を実現するためにさらなるめっきを施すこと、によって表されるポスト処理を実施することによって実現可能である。電極（ＥＬ）の上方であるか下方であるかによらず、図２０に示されるように、異なる通過帯（ＤＦＬ１，ＤＦＬＮ）を有する空間的に組織された複数のダイクロイックフィルタを実現すると有利である。これは、細胞／粒子の蛍光を異なる発光周波数で分割および個別検出するのに有用である。
【０１０３】
明らかなように、細胞の位置をチェックすることによって、それらを例えば異なる蛍光の存在について、異なるセンサ上において順次解析することが可能である。今説明された本発明のこの態様にしたがうと、本発明は、上述されたような、粒子の検出および／または特徴付けのための装置に関するが、さらに、センサのシールド手段と、各センサについて少なくとも１つの数の開口とを有する。開口は、シールド手段を通じて得られ、検出される／特徴付けられる粒子よりも小さい既定の寸法を有する。
【０１０４】
本発明にしたがった装置は、さらに、センサ（ＰＩＸＥＬ）が光センサである場合にセンサを少なくとも部分的にシールドするように構成された、既定の通過帯を有する少なくとも１つのダイクロイックフィルタを含むことができ、好ましくは、それぞれが他と異なる通過帯を有し、間で重なり合うようになおかつセンサ（ＰＩＸＥＬ）を少なくとも部分的にシールドするように配置された、複数のダイクロイックミラーを含む。もし、少なくとも１つのダイクロイックフィルタが電極（ＥＬ）を覆うように配置される場合は、それは、各電極の少なくとも一部に対応して設けられた割り込み開口を備えている。
【０１０５】
励起のフィルタリング
装置は、解析対象となる各蛍光に合わせて（外部で）励起源がフィルタリングされ最適化されるという事実をうまく活用してもよいし、しなくてもよい。これは、デバイスに一体化されていないフィルタによって容易に実現することができる。これに加えて、あるいはこの代わりに、チップの蓋に、チップのピクセルごとに異なってもよいし異ならなくてもよい下位のダイクロイックフィルタに対応した励起フィルタリングの一部を一体化することも可能である。
【０１０６】
蓋に励起フィルタリングが一体化される場合は、異なるピクセルの励起間のクロストークを回避するために、均一なダイクロイックフィルタを有するゾーンを広くする必要がある。この場合、被試験細胞は、異なる蛍光について解析されるために、より長い距離を網羅しなければならない。本発明のこの追加の態様にしたがうと、これまでに説明されてきた装置は、したがって、検出される／特徴付けられる粒子を含む流体試料の受け取りおよび内包に適したチャンバまたはマイクロチャンバを前記電極のアレイと協働して定めるカバー（ＬＩＤ）に対応して配置された、既定の通過帯を有する少なくとも一ダイクロイックフィルタを含むことができる。
【０１０７】
照明雑音の補償方法
上述された全ての方法において、光センサが使用される場合、粒子の検出または特徴付けのための信号は、照明のパワーに依存する。したがって、この種の変化は、検出される光パワーのレベルに、信号（粒子の存在および／または位置）に結び付かない何らかの変化を生じさせる可能性がある。これは、普通は問題にならないが、これらの方法は、このような変化を基準ピクセル（入射する光パワーが照明のパワーによってのみ影響される空のケージに確実に対応するピクセル）の平均検出に対して正規化された値を使用して補償することによって、性能を向上させる（精度を上げる、速度を上げる）ことが可能である。
【０１０８】
これは、低周波数の照明雑音に、主として当てはまる。なぜならば、雑音パワーのスペクトル密度（１／ｆに比例する）ゆえに、それによる影響力がより大きくなるからである。
【０１０９】
インピーダンスセンサのための雑音補償方法
上述された全ての方法において、インピーダンス計センサが使用される場合、粒子の検出および特徴付けのための信号は、粒子の懸濁培地の導電率および誘電率に依存し、これらは、ひいては、例えば温度、塩濃度、他の分子その他に依存する。したがって、これらの変化は、検出されるインピーダンスのレベルに、信号（粒子の存在および／または位置）に結び付かない何らかの変化を生じさせる可能性がある。これは、普通は問題にならないが、これらの方法は、このような変化を基準ピクセル（インピーダンスが懸濁培地の導電率および誘電率によってのみ影響される空のケージに確実に対応するピクセル）の平均検出に対して正規化された値を使用して補償することによって、性能を向上させる（精度を上げる、速度を上げる）ことが可能である。
【０１１０】
したがって、想定される力場（Ｆ）の電流構成では粒子によって絶対に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＲＥＦ）の平均検出に対して正規化された値を使用して、上記センサ（ＰＩＸＥＬ＿ＩＪ）によって検出される階調レベルを補償することからなる、さらなるステップを、これまでに説明されてきた全ての検出および特徴付けの方法において、導入することができる。
【０１１１】
用途に関する備考
これまでに説明されてきた方法および装置は、一般的な使用に関するものであり、複数の用途を見いだすことができる。本発明を限定しない例として、最も重要ないくつかの用途が挙げられる。
○  血液試料を解析する：（例えば閉じられた誘電泳動ケージを使用している）チップ上に試料を導入することによって、赤血球は、占有されている全てのケージを第一近似としてカウントすることによって、その数をカウントすることができる（実際は、存在の可能性があるその他の細胞は非常に濃度が小さいので、通常必要とされる精度の場合は無視できる）。
○  Ｅｍｏｃｈｒｏｍａ：血液中の細胞の数および種類を特徴付ける：この場合、存在する各単一細胞の正確な特徴付けを実施するための上述された方法が用いられ、その細胞を赤血球、血小板、リンパ球などに分類する。
○  試料中に存在するバクテリアをカウントする：既知の量の試料を（閉じられたＤＥＰケージを有する）チップ上に注入することによって、存在する全てのバクテリアが検出され、もし光センサによって検出される特性サインを通じて区別可能であるならば、必要に応じてバクテリアの種類が検出される。
○  混合集団から、蛍光で標識された細胞を分離する／カウントする。この種の問題は、研究および診断の両方に広く普及している。
【０１１２】
例えば、牛乳、ヨーグルト、アイスクリームの調製品などの、乳製品の試料中のバクテリアを検出することができる。
【０１１３】
別の一例として、葡萄マストの発酵用のバクテリア（例えば環境保護の用途）を検出することができる。
【０１１４】
さらなる一例として、飲用水中に存在するバクテリアを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】電極のアレイを通して行われる力場の生成の原理を示した図である。
【図２】図４および図９のケージの移動に基づいた検出および特徴付けの方法に関連する波形を示した図である。
【図３】（ａ）ポリスチレン球、（ｂ）Ｋ５６２細胞、（ｃ）赤血球の画像を顕微鏡で見た図である。
【図４】電極より小寸法の粒子を検出／特徴付けするための一連のステップを示した図である。
【図５】およそ１５〜２０μｍの寸法の細胞または球の推移に際して検出される階調値の一般的な時間的進行と、考えられるいくつかの識別パラメータの表示とを示した図である。
【図６】ケージの移動に続くＫ５６２の推移に際して検出される階調値の時間的進化を示した図である。
【図７】小細胞またはマイクロ球の推移に際して検出される階調値の一般的な時間的進行と、考えられるいくつかの識別パラメータの表示とを示した図である。
【図８】ケージの移動に続く１０μｍ、６μｍ、および３μｍのそれぞれのポリスチレン球の推移に際して検出される階調値の時間的進化を示した図である。
【図９】電極１つよりは大きいが電極２つよりは小さい寸法の粒子の検出／特徴付けに有用な一連のステップを示した図である。
【図１０】全ケージの運動を通して全粒子を同時に検出するために有用な基本的な一連のステップを示した図である。
【図１１】図１０の一連のステップの実施を通して取得することができる３つの画像を示した図である。
【図１２】ケージを運動させる必要なく全粒子を同時に検出するために示された基本的な一連のステップを示した図である。
【図１３】図１２のケージのアクティブ化および非アクティブ化に基づいた検出ならびに特徴付けの方法に関連する波形を示した図である。
【図１４】ケージ中の粒子の検出／特徴付けに有用な別の一連のステップを示した図である。
【図１５】粒子の特徴を高解像度で検査するためのデバイスのアーキテクチャを示した図である。
【図１６】垂直および水平の両方向への粒子の移動をリアルタイムで決定するためのデバイスのアーキテクチャを示した図である。
【図１７】いくつかの異なる照明モードおよび光学的検出モードを示した図である。
【図１８】チップ表面上に発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図１９】チップの内部層の上に発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図２０】チップ表面上に複数の発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図２１】異なる種類の粒子のカウントを、具体的に３種類の場合について幾何学的に表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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