(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤を使用して海藻の水性抽出物からアガロースを精製するための改良方法であって：
ａ．前記乾燥海藻を２５〜９５℃の４〜１５％（重量／重量）水酸化ナトリウム水溶液２０〜３５部（重量／重量）によって０．５〜５時間処理し、続いて洗浄してｐＨを７〜９の範囲に調整するステップと；
ｂ．アルカリ処理高温海藻抽出物（７０〜８０℃）を１００００〜１４０００ｒｐｍにて５〜１５分間遠心分離するステップと；
ｃ．ステップ（ａ）で取得した高温海藻抽出物を、２〜５％の界面活性剤と、６０〜１００℃の範囲の温度にて連続撹拌して混合するステップと；
ｄ．ステップ（ｂ）で取得した含有物を２５〜３５℃の範囲の温度にて１〜１０時間静置して、アガロースの固体塊体を沈殿させるステップと；
ｅ．前記固体中の残留界面活性剤を除去するために、上清液をデカンテーションして、前記塊体を水で洗浄するステップと；
ｆ．アガロースを沈殿させるために、ステップ（ｄ）で取得した湿潤塊体を最小量の水に、アガロース生成物を７〜１０重量／重量％の範囲で再溶解させ、アガロースゾル対イソプロパノールの比が１：０．５〜１：１．５重量／重量であるような最小量のイソプロパノールで処理するステップと；
ｇ．２００〜３００の範囲のメッシュサイズを有するアガロース粉末を取得するために、該固体生成物を単離して、好適な乾燥器で乾燥させるステップと；
を含み、
前記抽出物の調製に使用される海藻が、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）種およびゲリジエラ（Ｇｅｌｉｄｉｅｌｌａ）種から選択され、
前記使用された界面活性剤が、前記アガロース中のサルフェート含有率が０．８０％（重量／重量）未満であるときにのみ、綿状沈殿を誘発する、
方法。
【請求項２】
前記抽出物の調製に使用される海藻が、グジャラートおよびタミルナドゥの海岸から取得されたインド海域のグラシラリア・デュラ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｄｕｒａ）およびゲリジエラ・アセロサ（Ｇｅｌｉｄｉｅｌｌａ  ａｃｅｒｏｓａ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出物が、前記ｐＨを調整するステップの次に、脱塩水を洗浄した海藻に添加して、１００〜１２５℃に及ぶ温度にて１〜２．５時間オートクレーブ処理するステップを含む公知の方法によって調製された、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
使用された前記界面活性剤が市販のオクチルフェノールエトキシレートおよびノニルフェノールエトキシレートから選択された非イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）の前記洗浄または透析操作が周囲条件下で、洗浄液の表面張力が水の表面張力と同じになるまで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤が使用済み抽出物および洗浄液から再利用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記使用された界面活性剤が、前記アガロース中のサルフェートのレベルが０．５％（重量／重量）未満であるときにのみ、綿状沈殿を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、本質的に少ないサルフェートを含有しているか、およびまたはこのような低レベルのサルフェート含有率まで化学的もしくは生化学的に脱硫酸できるかのどちらかであるこれらのポリサッカライドを精製するために有用である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
取得されたアガロースポリマーがＤＮＡのゲル電気泳動に好適である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
取得されたアガロースの品質が、少なくとも最長１年間いずれの劣化もなく、プラスチック容器中に保管することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記使用された界面活性剤が、前記アガロース中のサルフェート含有率が０．２５％（重量／重量）以下であるときのみ、綿状沈殿を誘発する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属およびゲリジエラ（Ｇｅｌｉｄｉｅｌｌａ）属の抽出物ならびにさらに詳細にはグジャラートおよびタミルナドゥの海岸から取得されたインド（Ｉｎｄｉａ）海域の海藻のグラシラリア・デュラ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｄｕｒａ）およびゲリジエラ・アセロサ（Ｇｅｌｉｄｉｅｌｌａ  ａｃｅｒｏｓａ）の抽出物からのアガロースの改良された単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半の市販の寒天が高温抽出によって産生されることが指摘されている、Ｓｅｌｂｙ＆Ｗｙｎｎｅ（ｉｎ  Ｒ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ（ｅｄ．）：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７３，ｐｐ．２９−４８）が参照され得る。グリセロール、無水アンモニア、また他の溶媒による抽出などの他の方法が可能であるが、高温を使用する伝統的なプロセスが最も推奨される（ｗｗｗ．ｍａｒｉｎａｌｇ．ｏｒｇ）。寒天抽出手順は、処置された海藻の品種によって変動する。手順は概して、下記のような（１）抽出（２）精製（３）脱水の３つの段階に従う：最初に、海藻は、海塩および砂などの異物を除去するために、水で慎重に洗浄される。抽出は、高温水によって圧力下で、または海藻がアルカリ性処置を受けている場合には開放タンク中で行われる。この後者のプロセスは、生じた寒天中のサルフェート含有率を低下させるために、主にグラシラリア海藻に適用される。抽出液は、９９％の水および１％の寒天で構成され、高温条件下で濾過されて、次に室温に冷却される。生じたゲルは機械圧の下でまたは凍結解凍によって脱水される。加圧脱水では、４９〜９８Ｎ／ｃｍ２の圧力が印加されて、挿入フィルタを通じてゲルを圧迫する。水がフィルタを通過して、寒天分子がフィルタケーキとして保持される。ゲル凍結は−１８℃にて行われる。この温度にて寒天分子は、氷網目から選択的に排除され、細片を形成する。解凍ステップは氷細片を溶融して、寒天細片が選択的に回収される。個別に行われるこのような２回の脱水操作によって、最初の含水量の約７０％が除去される。次に残留水分の一部は、温風を用いた乾燥によって除去される。乾燥寒天フレークは、異なるメッシュサイズを有する粉末形の最終製品を調製するために粉砕される。
【０００３】
寒天の処理が記載され、寒天が抽出ステップで海藻から抽出され、次に脱水ステップで脱水されて寒天ゲルまたは粉末を形成し、脱水が凍結解凍もしくは機械圧搾によって、または単軸もしくは２軸押出機を通過させることによって行われた、Ｌｅｂｂａｒ  Ｔｈａｍｉ，Ｌｅｂｂａｒ  Ｒａｃｈｉｄ  ａｎｄ  Ｒｉａｄ  Ａｂｄｅｌｗａｈａｂによる特許（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，４９６，９３６）が参照され得る。本プロセスは、凍結解凍のエネルギー集約的プロセスまたはさもなければ高性能の機器を必要とする機械圧搾の厄介なプロセスを使用するという欠点を被っている。
【０００４】
寒天が「浸漬、中和、漂白、およびゼラチン抽出を含む産生プロセス。材料は高温および加圧条件の低濃度アルカリ溶液に浸漬され、続いての濾過、水洗浄、酸によるｐＨ調節、次亜塩素酸ナトリウムによる漂白、助剤の添加、ゼラチンを抽出するための煮沸、脱水および乾燥のための加圧濾過によって、ゲルが取得される」後に産生された、Ｄ．Ｄｕ，Ｚ．Ｚｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｚｈｕａｎｇによる特許（ＣＮ１５８７２８４−Ａ，Ｍａｒｃｈ  ２，２００５；ＣＮ１２９６３９０−Ｃ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２４，２００７）が参照され得る。本プロセスの欠点は、該プロセスが高性能の機器を必要とする「寒天を脱水および乾燥させるための加圧濾過」を使用するという事実にある。
【０００５】
「アガロースは、寒天または寒天を含む海藻から単離された直鎖ガラクタンハイドロコロイドである。アガロースは、バイオポリマーの拡散および動電学的移動にほぼ理想的であるゲルマトリクスを形成する。したがってアガロースは、電気泳動、免疫電気泳動および免疫拡散に有用である」ことが示されている、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００６−２００７；ｐａｇｅｓ  ２６９−２７０）が参照され得る。そこでは各種のグレードのアガロースが、分子生物学、タンパク質電気泳動および細胞培養での用途に好適である０．１０〜０．３５％に及ぶサルフェート含有率を有することがさらに記されている。
【０００６】
アガロースが寒天から単離された、または紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）などの寒天を含む海藻から直接回収された精製直鎖ガラクタンハイドロコロイドであることが示されている、複数の報告が参照され得る。アガロースが抽出される属は、テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）、グラシラリア、ユイキリ（Ａｃａｎｔｈｏｐｅｌｔｉｓ）、イギス（Ｃｅｒａｍｉｕｍ）、オバクサ（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉａ）、およびエゴノリ（Ｃａｍｐｙｌａｅｐｈｏｒａ）を含む。Ｇｒａｂａｒ（１９５７）は、寒天が水中で煮沸することによって紅藻類から抽出され、次に微粒子の濾過、水溶性不純物を除去するためのコロイドのゲル化および凍結解凍、およびエタノールによる沈殿によって単離されることを報告した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．７（１９５７）１−３８）。生じた生成物は、１，４−結合３，６−無水−α−Ｌ−ガラクトースおよび１，３−結合β−Ｄ−ガラクトースの交互コポリマーであるポリサッカライドの混合物である。反復ジサッカライドは、アガロビオースと称される（Ａｒａｋｉ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ５ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｗｅｅｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｈａｌｉｆａｘ，１９６５，ｐｐ．３-１７）。もちろんこれが理想化された構造であるのは、精製されたアガロースでさえ、測定可能な量の以下の置換基：サルフェート基、ピルベート基、およびメトキシル基を含有するためである。サルフェートは概して、β−Ｄ−ガラクトピラノースのＣ−４、ならびに３，６−無水−α−Ｌ−ガラクトースのＣ−２およびＣ−６にてヒドロキシルにエステル化される。ピルベートは、β−Ｄ−ガラクトピラノースのいくつかの残基のＣ−４およびＣ−６の両方に結合される。得られた化合物は、ＤｕｃｋｗｏｒｔｈおよびＹａｐｈｅ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１６，１９７１，１８９-１９７）
によって４，６−Ｏ−カルボキシエチリデンと称される。
【０００７】
粗寒天２５０ｍｇが沸騰蒸留水１００ｍｌに溶解されたＣｒａｉｇｉｅおよびＬｅｉｇｈによる「部分精製アガロースの第４級塩基による単離」（ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ  Ａ  Ｈｅｌｌｅｂｕｓｔ  ａｎｄ  Ｊ  Ｓ  Ｃｒａｉｇｉｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９７８；ｐｐ．１２６）が参照され得る。ラムダ−カラゲナン２５ｍｇが添加され、２％セタブロン（セチルピリジニウムクロライド）１０ｍｌが８０〜１００℃の溶液で添加された。高温抽出物がセライトで濾過され、膜（０．８ミクロン）で加圧濾過されて、生成物の凍結および解凍が続き、部分精製アガロースが得られるが、本プロセスの欠点は、アガロースポリマーが高温抽出物から、エネルギー集約的である凍結解凍プロセスによって分離されたことである。
【０００８】
本発明で使用されたインド（Ｉｎｄｉａ）海域の海藻グラシラリア・デュラが１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子についての受入番号ＤＱ３９９７９５を有する、米国（ＵＳＡ）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖが参照され得る。
【０００９】
異なる方法による寒天およびアガロースの調製の従来技術が含まれている、Ｓｉｄｄｈａｎｔａ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＴ  ２００５／１１８８３０；ＵＳ  ２００５０２６７２９６  Ａ１）が参照され得る。発明者らは、グラシラリア・デュラからの高ゲル強度および低ゲル化温度のアガロースの改良された調製プロセスをさらに開示し、前記プロセスは、乾燥海藻をアルカリによって前処理するステップと；前処理された海藻を、洗浄液が７〜８の範囲のｐＨを示すまですすぐステップと；水を添加し、オートクレーブ処理して抽出物を取得するステップと；高温抽出物を木炭およびセライトで処理して、高温抽出物を取得すステップと；高温抽出物をセライト床で真空濾過するステップと；濾液を凍結して塊体とし、塊体を解凍するステップと；オートクレーブ内で加熱することによ
り塊体を水に再溶解させて、凍結−解凍サイクルを反復して、生成物を濾して解凍された液体を除去して、その後、圧搾してアガロース、およびそのアガロースを取得できる程度まで残留液体を放出させるステップとを含み、本プロセスの欠点は、高温抽出物が−１５℃未満で１５時間冷却され、このことが非常に時間を消費して、エネルギー集約的であることである。さらに本プロセスの凍結−解凍サイクルの反復によって、本プロセスは、より費用重視型となる。
【００１０】
同じアガロースが特徴づけられ、その性能が市販のアガロースと比較された、Ｍｅｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．の論文（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６９：１７９−１８８，２００７）も参照され得る。
【００１１】
粗寒天がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）によって抽出されて、高純度アガロースが分離されることが報告されている、Ｋｉｙｏｓｈｉ  Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．による「寒天の精製」（ＪＰ  ７０１７，１３０，Ｊａｎｕａｒｙ  １３，１９７０；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒ．７４，３２８８９ｒ，１９７１）が参照され得る。寒天１０ｇを撹拌しながらＤＭＦ  ５００ｍｌと混合し、高温水に１０時間浸漬して、遠心分離して、上清をアセトン２リットルに注入し、沈殿をガラスフィルタに通し、アセトン５００ｍｌで洗浄して、高温水に溶解させ、濾過してアガロース粉末を得る。
【００１２】
精製アガロースを寒天または純粋でないアガロースから、寒天またはアガロースを低級アルキレングリコールに溶解させることによって回収して、ここで十分な寒天またはアガロースをグリコールに溶解して、少なくとも約０．１重量％の寒天またはアガロースを含有するグリコール溶液を高温にて形成して、寒天またはアガロース含有グリコール溶液を冷却して、精製アガロース生成物の沈殿を誘発し、沈殿したアガロース生成物を回収する、Ｒ．Ｂ．Ｐｒｏｖｏｎｃｈｅｅによる「グリセロールを使用するアガロース精製法」（ＵＳ  ４，９９０，６１１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９１）が参照され得る。
【００１３】
０．２重量％未満のサルフェート含有率および少なくとも１２００ｇ／ｃｍ２の（１％）のゲル強度を特徴とする、高速電気泳動に好適な精製アガロースの調製について記載している、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．によるＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９８３，２６８が参照され得る。アガロースは、アガロースまたはアルカリ修飾寒天をｐＨ６．０〜８．０に緩衝させ、２．０ｎＭ以下のクロライドとしての塩を含有する水性媒体に溶解させること、およびアガロースを低級アルカノールとの接触により、次のように：「アガロースを再度濾過して、次に総重量１０００ｇまで水に再懸濁させて、沸騰することによって溶解させ、そのため２％溶液が形成された。溶液を７４℃まで冷却して、共沸イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（８７．７重量％のＩＰＡ）２リットルと混合した。」沈殿させることによって精製される。
【００１４】
アガロースの調製についてアガロースおよびアガロペクチンの混合物の分画が記載された、Ａｌｆｒｅｄ  Ｐｏｌｓｏｎの研究（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ６５：ｐ５８６５ａ；１９６５）も参照され得る。混合物を分子量３００のポリエチレングリコールの水溶液で処理して、アガロースが濃縮された沈殿を得る。本プロセスでは、Ｉｏｎ  ａｇａｒ  Ｎｏ．２  ８０ｇを水２リットルに溶解させた。高温溶液（８０℃）を分子量６０００の４０％（重量／体積）ポリエチレングリコール２リットルを添加して、生じた沈殿を１１０メッシュナイロン布による濾過で分離した。次に沈殿を４０℃にて２〜３分間洗浄して、１５℃の水に懸濁させ、水５リットル中で一晩撹拌して、ナイロンメッシュ中に収集して、アセトンで洗浄し、温風で乾燥させた。
【００１５】
イオン性および非イオン性界面活性剤が寒天ゾルおよびゲルのレオロジー的特性および熱的特性を異なる方法で修飾することが報告されている、Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．による論文（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．３５，１３５−１４４，２００５）が参照され得る。該論文は、界面活性剤が使用する他の従来技術についても記載している。
【００１６】
上記従来技術では、大量の複数の有機溶媒を使用することに加えて、エネルギー集約型の海藻抽出物からの寒天単離の問題も残存している。しかし上記論文もその他の従来技術も、本発明の主な目的である、水性海藻抽出物からアガロースを周囲条件下でいずれの有機溶媒も使用せずに沈殿させるための界面活性剤の有用性を開示していない。
【００１７】
寒天／アガロースが水性海藻抽出物から凍結−解凍方法によって、および他の場合で加圧シネレシス（ｓｙｎｅｒｅｓｉｓ）によって単離されることは、従来技術より明らかである。生成物は続いて、溶媒沈殿またクロマトグラフィー画分によって精製される。抽出物からの生成物の単離のために従った方法はしたがって、非常にエネルギー集約的であるか、または高性能の機器を必要とし、抽出物からの生成物の改良された単離方法を同定することが所望である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の主な目的は、凍結−解凍または機械圧搾または抽出物中への大量の溶媒の添加に対する要求を不要にする、希薄水性海藻抽出物からのアガロースの改良された単離方法を発明することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、非イオン性界面活性剤を凝固剤として使用して、水性抽出物からのアガロースの凝固を誘発することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、凝固方法が、通例０．３％（重量／重量）以下のサルフェートを有するアガロースで特に有効であることを証明することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、上記目的のためにグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサからの抽出物を利用することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、海藻をアルカリで処理して、従来技術で開示されたようにそのゲル強度を向上させることに加えて、寒天／アガロースのサルフェート含有率を低減させて、本発明の方法による凝固に適するようにすることである。
【００２３】
別の目的は、高温抽出物を遠心分離して、界面活性剤の添加前にすべての懸濁物を除去することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、単に生成物を水で洗浄することによって、凝固アガロース中の残留界面活性剤を除去することである。
【００２５】
別の目的は、アガロースをただちに分散可能にすることである。
【００２６】
別の目的は、生成物を高温水に７％（重量／体積）までの濃度で再溶解させることおよび溶液をイソプロピルアルコールで処理することによってこのように容易な分散可能性を達成して、最低限の溶媒の使用により所望の生成物を取得することである。
【００２７】
別の目的は、溶媒および界面活性剤を再循環および再使用することである。
【００２８】
別の目的は、本発明のアガロースが従来技術の方法によって取得されたアガロースに似ていることを証明することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、グラシラリア種およびゲリジエラ種から調製された希薄海藻抽出物よりアガロースを取得する改良方法に関する。海藻を、（ｉ）アルカリによって処理してサルフェート含有率を低下させ、（ｉｉ）水で洗浄してアルカリを除去し、次に（ｉｉｉ）水中で加熱して希薄抽出物を調製する。材料を次に、（ｉｖ）ホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）して、（ｖ）高温条件下で遠心分離して、不溶性不純物を含まない透明な海藻抽出物が得られる。次に高温抽出物を（ｖｉ）激しく撹拌しながら水溶性非イオン性界面活性剤で処理して、（ｖｉｉ）含有物を静置して室温まで冷却すると、アガロースが沈殿して、次に（ｖｉｉｉ）沈殿を遠心分離によって分離し、（ｉｘ）水で洗浄して付着している界面活性剤を除去する。次に、（ｘ）湿潤アガロース塊体を高温条件下で最小体積の水に再分散させ、（ｘｉ）等体積のイソプロピルアルコールで処理してアガロース塊体を脱水し、これを（ｘｉｉ）濾過および乾燥すると、ＤＮＡゲル電気泳動に好適な、精製されただちに分散可能な生成物を生じる。
【００３０】
したがって、本発明は、界面活性剤を使用して海藻の水性抽出物からアガロースを精製するための改良方法を提供し、前記方法は：
（ａ）アルカリ処理高温海藻抽出物（７０〜８０℃）を１００００〜１４０００ｒｐｍにて５〜１５分間遠心分離するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）で取得した高温海藻抽出物を、２〜５％の界面活性剤と、６０〜１００℃の範囲の温度にて連続撹拌して混合するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で取得した含有物を２５〜３５℃の範囲の温度にて１〜１０時間静置して、アガロースの固体塊体を沈殿させるステップと；
（ｄ）固体中の残留界面活性剤を除去するために、上清液をデカンテーションして、前記塊体を水で洗浄するステップと；
（ｅ）アガロースを沈殿させるために、ステップ（ｄ）で取得した湿潤塊体を最小量の水に、アガロース生成物を７〜１０重量／重量％の範囲で再溶解させて、アガロースゾル対イソプロパノールの比が１：０．５〜１：１．５重量／重量であるような最小量のイソプロパノールで処理するステップと；
（ｆ）２００〜３００の範囲のメッシュサイズを有するアガロース粉末を取得するために、固体生成物を単離して、好適な乾燥器で乾燥させるステップと；
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１．１】グラシラリア・デュラアガロースゲル試料での、ＰＣＲ増幅生成物のＤＮＡゲル電気泳動を表す。本発明のアガロースゲル試料は図１．１ａによって指摘されるが、以前の発明（ＰＣＴ  ２００５／１１８８３０；ＵＳ  ２００５／０２６７２９６  Ａ１）のアガロースゲル試料は図１．１ｂによって示されている。図ａおよびｂは同様のレーンから成り、レーンは：レーン１：１ｋｂラダーレーン２、３：１．２ｋｂのＰＣＲ生成物レーン４、５：１．４ｋｂのＰＣＲ生成物である。
【図１．２】グラシラリア・デュラアガロースゲル試料での、図１．１のゲルから溶離されたＤＮＡのゲル電気泳動を扱う。本発明のアガロースゲル試料は図１．２ａによって表されるが、以前の発明（ＰＣＴ  ２００５／１１８８３０；ＵＳ  ２００５／０２６７２９６  Ａ１）のアガロースゲル試料は図１．２ｂによって指摘されている。図ａおよびｂは同様のレーンから成り、レーンは：レーン１：１００ｂｐラダーレーン２：ゲルからの溶離１．２ｋｂ生成物（１．１ｂ）レーン３：ゲルからの溶離１．４ｋｂ生成物（１．１ｂ）レーン４：ゲルからの溶離１．２ｋｂ生成物（１．１ａ）レーン５：ゲルからの溶離１．４ｋｂ生成物（１．１ａ）である。
【図１．３】グラシラリア・デュラアガロースゲル試料での、（図１．１から取得）溶離生成物をテンプレートとして使用する、ＰＣＲ増幅生成物のＤＮＡゲル電気泳動を表す。本発明のアガロースゲル試料は図１．３ａとして示されるが、以前の発明（ＰＣＴ  ２００５／１１８８３０；ＵＳ  ２００５／０２６７２９６  Ａ１）のアガロースゲル試料は図１．３ｂによって指摘されている。図ａおよびｂは同様のレーンから成り、レーンは：レーン１：１ｋｂラダーレーン２：−ｖｅ対照レーン３、４：ゲル（１．１ｂ）および（１．１ａ）溶離生成物からのＰＣＲ生成物１．０ｋｂレーン５：−ｖｅ生成物レーン６、７：ゲル（１．１ｂ）および（１．１ａ）溶離生成物からのＰＣＲ生成物１．４ｋｂである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、グラシラリア属およびゲリジエラ属、さらに詳細にはグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサから高いおよび低いゲル化温度を有する高強度のアガロースを調製するための、新規で直接の費用効率的な方法に関し、前記方法は、（ｉ）乾燥海藻をアルカリによって前処理してサルフェート含有率を低下させるステップと、（ｉｉ）水で洗浄してアルカリを除去するステップと、および次に（ｉｉｉ）水中で加熱して希薄抽出物を調製するステップとを含む。材料を次に、（ｉｖ）ホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）して、（ｖ）高温条件下で遠心分離して、不溶性不純物を含まない透明な海藻抽出物が得られる。次に高温抽出物を（ｖｉ）激しく撹拌しながら水溶性非イオン性界面活性剤で処理して、（ｖｉｉ）含有物を静置して室温まで冷却すると、アガロースが沈殿して、次に（ｖｉｉｉ）沈殿を遠心分離によって分離し、（ｉｘ）水で洗浄して付着している界面活性剤を除去する。次に、（ｘ）湿潤アガロース塊体を高温条件下で最小体積の水に再分散させ、（ｘｉ）等体積のイソプロピルアルコールで処理してアガロース塊体を脱水し、これを（ｘｉｉ）濾過および乾燥すると、ＤＮＡゲル電気泳動に好適な、精製されただちに分散可能な生成物を生じる。さらに、取得されたアガロースの品質は、少なくとも最長１年間いずれの劣化もなく、プラスチック容器中に保管することができる。
【００３３】
本発明は、新規方法による、グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサそれぞれからの「海藻抽出物からのアガロースポリマーの改良された調製方法」について記載し、アガロースポリマーは高性能用途、高いゲル強度を有し、高いおよび低いゲル化温度を有し、新規方法は（ｉ）グラシラリア属３５部およびゲリジエラ属２０部それぞれを（体積／重量）を、アルカリが１〜１５％の濃度範囲のアルカリ性水溶液によって、２５〜９５℃の範囲の温度にて、０．５〜５．０時間の範囲にわたって前処理すること、（ｉｉ）前処理された海藻を水で完全にすすいで、洗浄液が７〜９の範囲のｐＨを示すまで過剰なアルカリを除去すること、（ｉｉｉ）元の海藻各１部に対してグラシラリア属には約３５部およびゲリジエラ属には２０部（体積／重量）の水をそれぞれ添加して、１００〜１２５℃の範囲で１．０〜２．５時間の範囲の期間にわたってオートクレーブ処理して抽出物を取得すること、（ｉｖ）遠心分離の前に高温抽出物をホモジナイズすること、（ｖ）高温抽出物を１０，０００〜１４，０００ｒｐｍにて５〜１５分間遠心分離すること、（ｖｉ）抽出物を約２〜５％の界面活性剤によって、連続撹拌しながら６０〜１００℃の範囲の温度にて処理すること、（ｖｉｉ）抽出物を界面活性剤と共に周囲温度（２５〜３５℃）に維持して、１〜１０時間の範囲の期間にわたって海藻抽出物固体塊体を凝固させること、（ｖｉｉｉ）遠心分離によってアガロースの固体塊体を液体から分離すること、（ｉｘ）最終洗浄液が水に類似した表面張力を示すまで、単なる洗浄によってまたは透析を使用することによって、残留界面活性剤を除去すること、（ｘ）場合により、湿潤塊体を７〜１０％（重量／重量）の範囲の最小量の水に再溶解させること、（ｘｉ）アガロース分散物１００ｇに対して５０〜１５０ｇの範囲のＩＰＡ中の最小量のイソプロパノールで、アガロース分散物を脱水すること、（ｘｉｉ）濾過、乾燥および粉砕して、ＤＮＡゲル電気泳動に好適な、ただちに分散可能なアガロース生成物を取得すること、を包含する。
【００３４】
本発明のアガロース生成物のゲル強度は、１．０％および１．５％のアガロースゲルを２０℃にて日寒水型ゲル試験機で測定した。熱重量分析（ＴＧＡ）は、ＳＴＡＲ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＴＧＡ装置、スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。分子量の決定は、オストワルド粘度計で固有粘度を測定して行った（Ｃ．Ｒｏｃｈａｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌａｈａｙｅ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９８９，１０：２８９を参照）。ゲル化および溶融温度は、Ｃｒａｉｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈａｎｄ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９７８（Ｅｄｓ．Ｈｅｌｌｅｂｕｓｔ．Ｊ  Ａ  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇｉｅ  Ｊ  Ｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ｐｐ．１２７）によって記載された方法に従って測定し、灰分含有率は固体を８００℃にて６時間焼却することによって測定し、サルフェート含有率は、灰
分を濃硝酸によって処理すること、蒸発乾固させること、残渣を水に溶解すること、濾過すること、および硫黄について誘導結合プラズマ発光分光（ＩＣＰ−ＯＥＳ）分析を受けさせることによって概算した。
【００３５】
本発明の実施形態において、アガロースは、グラシラリア属およびゲリジエラ属ならびにさらに詳細にはグジャラートおよびタミルナドゥの海岸から取得されたインド（Ｉｎｄｉａ）海域のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサから取得され得る。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、ステップｉ〜ｉｖは従来技術で実施されたように行われる。
【００３７】
本発明のなお別の実施形態において、界面活性剤は６０〜９０℃の、かつさらに明確には７０〜８０℃の温度範囲の高温抽出物中に添加され得て、高温抽出物を１０，０００〜１４，０００ｒｐｍにて５〜１５分間遠心分離する。
【００３８】
本発明のまた別の実施形態において、界面活性剤は高温抽出物に、２％〜５％（重量／重量）およびさらに明確には３％（重量／重量）の範囲で、６０〜１００℃の温度範囲にて連続撹拌しながら添加され得る。
【００３９】
本発明のなお別の実施形態において、アガロースポリマーは、界面活性剤含有抽出物を周囲温度（２５〜３５℃）にて１〜１０時間およびさらに明確には３〜４時間にわたって静置したときに凝固され得る。
【００４０】
本発明のまた別の実施形態において、沈殿後の粗アガロースは周囲温度での遠心分離によって分離され得る。
【００４１】
本発明のなお別の実施形態において、粗アガロース中の残留界面活性剤は、単なる水洗浄によってまたは再分散された粗アガロースに透析を受けさせることによって除去され得る。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、アガロースの濃度を７％〜１０％の範囲の、かつさらに明確には７％に維持しながら、湿潤アガロース塊体を高温水（１２０℃）に再分散させる。
【００４３】
本発明のまた別の実施形態において、アガロース塊体の脱水および容易な分散のために、濃縮アガロース塊体を等体積のイソプロパノールによって処理する。
【００４４】
本発明のなお別の実施形態において、好適な乾燥器にて固体生成物の単離および乾燥を行って、２００〜３００の範囲のメッシュサイズを有するアガロース粉末を取得する。
【００４５】
本発明のまた別の実施形態において、抽出物は、乾燥海藻を２５〜９５℃の１〜１５％（重量／重量）水酸化ナトリウム水溶液２０〜３５部（重量／重量）によって０．５〜５時間処理し、続いて洗浄してｐＨを７〜９の範囲に調整するステップと、次に脱塩水を洗浄した海藻に添加して、１０〜１２５℃に及ぶ温度にて１〜２．５時間オートクレーブ処理するステップとを含む公知の方法によって調製した。
【００４６】
本発明のなお別の実施形態において、使用された界面活性剤は、水溶性非イオン性界面活性剤ならびにさらに詳細にはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６である。
【００４７】
本発明のなお別の実施形態において、洗浄操作の数は５〜２０回の範囲、さらに明確には６〜１０回の操作であり得て、洗浄の期間は各洗浄操作で１０〜３０分間の範囲であり得る。
【００４８】
本発明のまた別の実施形態において、他のポリサッカライドは、サルフェート含有率および灰分含有率が同様であるかまたはそれぞれ０．３％および１．０％以下であり、かつ本方法に適するときに使用され得る。
【００４９】
本発明の別の実施形態において、高温抽出物中のアガロースのサルフェート含有率は、グラシラリア海藻およびゲリジエラ海藻それぞれで０．２０％〜０．２５％の範囲であり得る。
【００５０】
本発明のまた別の実施形態において、使用された界面活性剤は、アガロース中のサルフェートのレベルは、１％（重量／重量）未満、好ましくは０．５％（重量／重量）未満およびなおさらに好ましくは０．２５％未満であるときにのみ、綿状沈殿を誘発する。
【００５１】
本発明のまた別の実施形態において、ポリサッカライドは、化学的または生化学的に脱硫化されて、約０．３％以下の硫酸化含有率を有し得る。
【００５２】
本発明のなお別の実施形態において、海藻抽出物から単離され得るアガロースポリマーは、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動に好適であり、より低い濃度、たとえば０．８％以下の濃度で満足な分解性能を呈する。
【００５３】
本発明のまた別の実施形態において、ＤＮＡの質および量は、アガロースゲルから回収された後に同様であった。
【００５４】
本発明のまた別の実施形態において、ＤＮＡセグメントの分離は、本発明で取得されたアガロースから調製されたアガロースゲルで良好であった。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態において、取得されたアガロースの品質は、少なくとも最長１年間いずれの劣化もなく、プラスチック容器中に保管することができる。
【００５６】
以下の例は、例証の目的で与えられ、したがって本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。例１〜６は、従来技術で記されたような凍結解凍プロセスに従う。しかし本発明の主な目的は、凍結解凍プロセスを使用しない例７〜１１に存する。
（例１）
【００５７】
グラシラリア・デュラ（２５ｇ）海藻を水道水に３５℃にて１時間浸漬して、次に水酸
化ナトリウム（ＮａＯＨ）なしで８５℃にて２時間浸漬した。浸漬した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、非水溶性不純物から透明抽出物を得た。高温抽出物をステンレス鋼トレーに入れて、室温まで冷却した。ゲル化抽出物を含有するトレーを冷蔵庫内に−２０℃にて２０時間維持した。凍結したゲルを次に室温にて解凍した。解凍したゲルを圧搾して付着した液体を除去して、その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、最後に圧搾して付着した水を除去した。未変性寒天を空気乾燥させて、続いて５０℃の乾燥器内で２時間乾燥させた。
【００５８】
収率：絶乾海藻に対して６．５ｇ（２６．０％）；ゲル強度（１％ゲル）：２０℃にて２５０ｇｃｍ−２；ゲル化温度：３４．０℃；灰分：８．０６％以下；サルフェート：３．２６％以下。
（例２）
【００５９】
ゲリジエラ・アセロサ（２５ｇ）海藻を水道水に３５℃にて１時間、次にＮａＯＨなしで８５℃にて２時間浸漬した。浸漬した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、非水溶性不純物から透明抽出物を得た。高温抽出物をステンレス鋼トレーに入れて、室温まで冷却した。ゲル化抽出物を含有するトレーを冷蔵庫内に−２０℃にて２０時間維持した。凍結したゲルを次に室温にて解凍した。解凍したゲルを圧搾して付着した液体を除去して、その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、最後に圧搾して付着した水を除去した。未変性寒天を空気乾燥させて、続いて５０℃の乾燥器内で２時間乾燥させた。
【００６０】
収率：絶乾乾燥に対して５．５ｇ（２２．０％）；ゲル強度（１．５％ゲル）：２０℃にて３００ｇ；ゲル化温度：４１．０℃；灰分：４．５６％以下；サルフェート：２．６０％以下。
（例３）
【００６１】
グラシラリア・エデュリス（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｅｄｕｌｉｓ）（２５ｇ）海藻を水道水に３５℃にて１時間、次にＮａＯＨなしで８５℃にて２時間浸漬した。浸漬した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、非水溶性不純物がない透明抽出物を得た。高温抽出物をステンレス鋼トレーに入れて、室温まで冷却した。ゲル化抽出物を含有するトレーを冷蔵庫内に−２０℃にて２０時間維持した。凍結したゲルを次に室温にて解凍した。解凍したゲルを圧搾して付着した液体を除去して、その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、最後に圧搾して付着した水を除去した。未変性寒天を空気乾燥させて、続いて５０℃の乾燥器内で２時間乾燥させた。
【００６２】
収率：絶乾乾燥に対して５．０ｇ（２０．０％）；ゲル強度（１．５％ゲル）：２０℃にて１００ｇｃｍ−２未満；ゲル化温度：４０．０℃；灰分：６．５６％以下；サルフェート：５．６０％以下。
（例４）
【００６３】
例１および２のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサ（各２５ｇ）海藻を別々の実験で３５℃の水道水に１時間浸漬した；洗浄水を廃棄して、湿潤海藻を２％ＮａＯＨによって８５℃にて２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。前処理した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５または１：２０重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサの抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、１．８７％以下および１．７６％以下のサルフェート含有率をそれぞれ有する、非水溶性不純物を含まない透明抽出物を得た。これらの抽出物を２つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤（抽出物
に対して３重量／重量％）で処理した。界面活性剤を激しく撹拌しながらそのままの形で徐々に添加した。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。いずれの場合でも沈殿は観察されなかった。
【００６４】
グラシラリア・デュラのアガロース：収率：１８％；ゲル強度：５３０ｇｃｍ−２；サルフェート：１．８７％以下。
ゲリジエラ・アセロサのアガロース：収率：１４％；ゲル強度：８５０ｇｃｍ−２；サルフェート：１．７６％以下。
（例５）
【００６５】
例１および２のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサ海藻を別々の実験で３５℃の水道水に１時間浸漬した；洗浄水を廃棄して、湿潤海藻を３．５％ＮａＯＨによって８５℃にて２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。３．５％ＮａＯＨによって前処理した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５または１：２０重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサの抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、１．２２％以下および１．４７％以下のサルフェート含有率をそれぞれ有する、非水溶性不純物を含まない透明抽出物を得た。これらの抽出物を２つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤（抽出物に対して３重量／重量％）で処理した。界面活性剤を激しく撹拌しながらそのままの形で徐々に添加した。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。いずれの場合でも沈殿は観察されなかった。
【００６６】
グラシラリア・デュラのアガロース：収率：１６％；ゲル強度：８２０ｇｃｍ−２；サルフェート：１．０２％以下。
ゲリジエラ・アセロサのアガロース：収率：１４％；ゲル強度：９８０ｇｃｍ−２；サルフェート：１．４７％以下。
（例６）
【００６７】
例１および２のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサ海藻を別々の実験で３５℃の水道水に１時間浸漬した；洗浄水を廃棄して、湿潤海藻を４％ＮａＯＨによって８５℃にて２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。４％ＮａＯＨによって前処理した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５または１：２０重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサの抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、０．７２％以下および１．３８％以下のサルフェート含有率をそれぞれ有する、非水溶性不純物を含まない透明抽出物を得た。これらの抽出物を２つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤（抽出物に対して３重量／重量％）で処理した。界面活性剤を激しく撹拌しながらそのままの形で徐々に添加した。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。沈殿は非イオン性界面活性剤によって、０．８２％以下のサルフェートを含有するグラシラリア・デュラから調製した抽出物で観察された。１．３８％以下のサルフェートを含有するゲリジエラ・アセロサから調製した抽出物では、上記の界面活性剤のいずれによっても沈殿が観察されなかった。
【００６８】
グラシラリア・デュラのアガロース：収率：１５％；ゲル強度：１３００ｇｃｍ−２；サルフェート：０．８２％以下．
ゲリジエラ・アセロサのアガロース：収率：１３％；ゲル強度：１０２０ｇｃｍ−２；サルフェート：１．３８％以下．
【００６９】
【表１】
0005642152.tif 000002
【００７０】
例６は、サルフェート含有率がポリサッカライドの０．８２％以下である場合に、非イオン性界面活性剤は高温海藻抽出物からアガロースを凝固させるのに有用であり、したがって本発明の方法は低硫酸化寒天またはアガロースの調製に理想的に適用されるという結論に至る。
（例７）
【００７１】
例１および２のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサ海藻を別々の実験で３５℃の水道水に１時間浸漬した；洗浄水を廃棄して、湿潤海藻を５％ＮａＯＨによって８５℃にて２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。５％ＮａＯＨによって前処理された海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、０．５０％以下および１．０８％以下のサルフェート含有率をそれぞれ有する、非水溶性不純物を含まない透明抽出物を得た。これらの抽出物を２つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤（抽出物に対して３重量／重量％）で処理した。界面活性剤を激しく撹拌しながらそのままの形で徐々に添加した。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。沈殿は、０．５％サルフェートを含有するグラシラリア・デュラから調製した抽出物で観察された。１．０８％サルフェートを含有するゲリジエラ・アセロサから調製した抽出物では、沈殿は観察されなかった。
【００７２】
グラシラリア・デュラのアガロース：収率：１４％；ゲル強度：１６００ｇｃｍ−２；サルフェート：０．５０％以下．
ゲリジエラ・アセロサのアガロース：収率：１３％；ゲル強度：１１４０ｇｃｍ−２；サルフェート：１．０８％以下。
【００７３】
【表２】
0005642152.tif 000003
【００７４】
例７は、サルフェート含有率が０．５０％以下である場合に、非イオン性界面活性剤が高温海藻抽出物からアガロースを完全に凝固させるのに有用であるという結論に至る。
（例８）
【００７５】
例１および２のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサ海藻を別々の実験で３５℃の水道水に１時間浸漬した；洗浄水を廃棄して、湿潤海藻を７％ＮａＯＨによって８５℃にて２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。５％ＮａＯＨによって前処理された海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、０．５０％以下および１．０８％以下のサルフェート含有率をそれぞれ有する、非水溶性不純物を含まない透明抽出物を得た。これらの抽出物を２つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤（抽出物に対して３重量／重量％）で処理した。界面活性剤を激しく撹拌しながらそのままの形で徐々に添加した。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。沈殿は、０．５％サルフェートを含有するグラシラリア・デュラから調製した抽出物で観察された。０．８０％サルフェートを含有するゲリジエラ・アセロサから調製した抽出物では、沈殿は観察されなかった。
【００７６】
グラシラリア・デュラのアガロース：収率：１３％；ゲル強度：１８００ｇｃｍ−２；サルフェート：０．３８％以下．
ゲリジエラ・アセロサのアガロース：収率：１２％；ゲル強度：１５５０ｇｃｍ−２；サルフェート：０．８０％以下。
【００７７】
【表３】
0005642152.tif 000004
【００７８】
例８は、サルフェート含有率が０．８０％以下である場合に、非イオン性界面活性剤がゲリジエラ・アセロサから取得された高温海藻抽出物からアガロースを完全に凝固させるのに有用であるという結論に至る。
（例９）
【００７９】
例１のグラシラリア・デュラ（ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｄｕｒａ）（それぞれ２５ｇ）海藻を３５℃の水道水に１時間浸漬し、次に水を廃棄して、湿潤海藻を８５℃にて１０％ＮａＯＨで２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。前処理した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、非水溶性不純物から透明抽出物を得た。高温抽出物をステンレス鋼トレーに入れて、室温まで冷却した。ゲル化抽出物を含有するトレーを冷蔵庫内に−２０℃にて２０時間維持した。凍結したゲルを次に室温にて解凍した。解凍したゲルを圧搾して付着した液体を除去して、その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、最後に圧搾して付着した水を除去した。未変性寒天を空気乾燥させて、続いて５０℃の乾燥器内で２時間乾燥させた。
【００８０】
収率：絶乾乾燥に対して５．０ｇ（２０．０％）；ゲル強度（１．０％ゲル）：２０℃にて１９００ｇｃｍ−２より大きい；ゲル化温度：３５．００℃；灰分：１．０％以下；サルフェート：０．２５％以下。
（例１０）
【００８１】
例２のゲリジエラ・アセロサ（Ｇ．ａｃｅｒｏｓａ）（２５ｇ）海藻を３５℃の水道水に１時間浸漬し、次に水を廃棄して、湿潤海藻を８５℃にて１０％ＮａＯＨで２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。前処理した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、非水溶性不純物から透明抽出物を得た。高温抽出物をステンレス鋼トレーに入れて、室温まで冷却した。ゲル化抽出物を含有するトレーを冷蔵庫内に−２０℃にて２０時間維持した。凍結したゲルを次に室温にて解凍した。解凍したゲルを圧搾して付着した液体を除去して、その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、最後に圧搾して付着した水を除去した。未変性寒天を空気乾燥させて、続いて５０℃の乾燥器内で２時間乾燥させた。
【００８２】
収率：絶乾乾燥に対して３．５ｇ（１４．０％）；ゲル強度（１．５％ゲル）：２００℃にて２０００ｇｃｍ−２以上；ゲル化温度：４１．０℃；灰分：１．１％以下；サルフェート：０．３０％以下。
（例１１）
【００８３】
例３のグラシラリア・エデュリス（Ｇ．ｅｄｕｌｉｓ）（２５ｇ）海藻を３５℃の水道水に１時間浸漬し、次に水を廃棄して、湿潤海藻を８５℃にて１０％ＮａＯＨで２時間処理して、続いて海藻を水で洗浄して過剰なアルカリを除去した。前処理した海藻を次に蒸留水（海藻：水＝１：３５重量／重量）に取り、１２０℃にて１．５時間オートクレーブ処理した。抽出物をホモジナイズおよび遠心分離して、非水溶性不純物から透明抽出物を得た。高温抽出物をステンレス鋼トレーに入れて、室温まで冷却した。ゲル化抽出物を含有するトレーを冷蔵庫内に−２０℃にて２０時間維持した。凍結したゲルを次に室温にて解凍した。解凍したゲルを圧搾して付着した液体を除去して、その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、最後に圧搾して付着した水を除去した。未変性寒天を空気乾燥させて、続いて５０℃の乾燥器内で２時間乾燥させた。
【００８４】
収率：絶乾乾燥に対して３．０ｇ（１２．０％）；ゲル強度（１．５％ゲル）：２０℃にて４００ｇｃｍ−２以上；ゲル化温度：４０．０℃；灰分：２．５６％以下；サルフェート：１．９０％以下。
（例１２）
【００８５】
例１、２および３で調製され、ならびに３．２６、２．６０および５．６０のサルフェート含有率（％重量／重量）をそれぞれ有する、グラシラリア・デュラ、ゲリジエラ・アセロサおよびグラシラリア・エデュリス海藻の高温（７０℃）寒天抽出物を、２つのカチオン性［セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；およびセチルピリジニウムクロライド（ＣＰＣ）］、３つのアニオン性［ナトリウムラウリルサルフェート（ＳＬＳ）；ＳＣ−８９６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））およびＳＣ−２２９（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］および５つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））；ＳＣ−８９２（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））；Ｔｗｅｅｎ−８０（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ）；およびＡｔｐｌｕｓ  ２４５（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤によって処理した。界面活性剤を激しく撹拌しながらそのままの形で徐々に添加した。抽出物に対して用いた界面活性剤の濃度は３％（重量／重量）であった。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。いずれの場合でも沈殿は観察されなかった。
（例１３）
【００８６】
０．２５、０．３０および１．９０のサルフェート含有率をそれぞれ有するアガロースを含有する例９、１０および１１のアルカリ処理海藻の高温（７０℃）抽出物を使用して、例１２の実験を反復した。観察結果を表４にまとめる。例９および１０の高温抽出物が３％の濃度で用いた非イオン性界面活性剤によって沈殿を生じたのに対して、イオン性界面活性剤ではいずれの濃度によっても沈殿が観察されなかったことがわかる。さらに例１１の抽出物は、非イオン性界面活性剤によってもいずれの沈殿も生じなかった。すべての非イオン性界面活性剤が例９および１０の高温抽出物によって沈殿を誘発したのに対して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６は３重量／重量％のより低い濃度にて完全沈殿を生じ、本発明のさらなるプロセスのために選択された。
【００８７】
【表４】
0005642152.tif 000005
【００８８】
例１２および１３は、ポリサッカライドのサルフェート含有率がアガロースの場合と同様に低い場合、非イオン性界面活性剤が高温海藻抽出物からアガロースを凝固させるのに有用であり、したがって本発明の方法はアガロースの調製に理想的に適用されるという結論に至る。
【００８９】
例１２の結果は、グラシラリア・デュラ、ゲリジエラ・アセロサおよびグラシラリア・エデュリスからの未変性寒天の凝固または沈殿は、未変性寒天が３％を超える高いサルフェート含有率を有したときには、イオン性および非イオン性界面活性剤の存在下では起こらないことを指摘した。
【００９０】
例１３（表４）は、カチオン性およびアニオン性界面活性剤の存在下では、アガロースポリマー中のサルフェート含有率が約１％であるときでも、グラシラリア・デュラ、ゲリジエラ・アセロサ）、およびグラシラリア・エデュリスから取得された海藻抽出物からの凝固または沈殿が発生しなかったことを示す。例１３（表４）はさらに、非イオン性界面活性剤の存在下では、アルカリ処理グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサのみから取得された海藻抽出物からの完全凝固または沈殿は、アガロース中のサルフェート含有率がそれぞれ０．２５％および０．３％であるときに発生するという結論に至る。アルカリ処置後でも比較的高いサルフェート含有率（１．９％）を有したグラシラリア・エデュリスの海藻抽出物の場合、寒天ポリマーの沈殿は、非イオン性界面活性剤の添加時に起こらなかった。寒天のサルフェート含有率が十分に低い（１％未満）場合のみに、寒天の界面活性剤（非イオン性）誘発沈殿が良好に作用することが結論付けられる。
（例１４）
【００９１】
例９および１０で調製され、それぞれ０．２５および０．３０のサルフェート含有率（重量／重量％）を有する、グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサ海藻の高温（７０℃）アガロース抽出物を、２つの非イオン性［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓ．Ｄ．Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インド（Ｉｎｄｉａ））；およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６（ＩＣＩ  Ｕｎｉｑｅｍａ、インド（Ｉｎｄｉａ））］界面活性剤で処理した。抽出物に対する界面活性剤の濃度は３％（重量／重量）であった。界面活性剤の添加が完了した後、撹拌を中止して、含有物を室温にて５時間静置した。アガロースポリマーの完全沈殿は、両方の非イオン性界面活性剤の存在下で起こった。抽出物からのアガロースポリマーの沈殿後、沈殿したポリマーを遠心分離によって収集した。過剰な界面活性剤を水（６×１リットル）による反復洗浄によってアガロースポリマーから除去し、各洗浄操作は水−ポリマー混合物を１５分間撹拌することによって、または粗アガロース塊体の再分散後の透析に行い、その後、遠心分離によって洗浄液を除去することによりアガロース塊体を分離した。界面活性剤を含まない湿潤アガロース塊体を高温水に再溶解させて、濃縮溶液を生じさせた（７重量／重量％）。これを次に脱水のために等量のイソプロピルアルコールで処理して、容易に分散可能なアガロースを得た。
【００９２】
非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ９１／６による処理後の、グラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサの海藻抽出物から取得されたアガロースポリマー生成物の基準値（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）は、以下の通りである。
【００９３】
グラシラリア・デュラのアガロース：収率：絶乾乾燥に対して３．１５ｇ（１４．０％）；ゲル強度（１％ゲル）：２０℃にて１９００ｇｃｍ−２以上；ゲル化温度：３５．０℃；灰分：０．８０％以下；サルフェート：０．２０％以下。
ゲリジエラ・アセロサのアガロース：収率：絶乾乾燥に対して２．４７ｇ（１１．０％）；ゲル強度（１．５％ゲル）：２０℃にて１９００ｇｃｍ−２以上；ゲル化温度：４１．０℃；灰分：０．９５％以下；サルフェート：０．２５％以下。
（例１５）
【００９４】
例１４でグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサから調製されたアガロースポリマーをその金属イオン含有量について、Ｗｏｌｎｉｋ，Ｋ．Ａ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５８：１９０−２０５，１９８８）によって記載された方法に従って、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法によってＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＩＣＰ−ＯＥＳ  Ｏｐｔｉｍａ  ２０００ＤＶ装置で分析した。結果を、Ｆｌｕｋａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．０５０６８，２００３／２００４）のアガロースについて報告された値と比較した（表５）。本発明のアガロースは、電気泳動作業に好適であると思われる。
【００９５】
【表５】
0005642152.tif 000006
（例１６）
【００９６】
本発明（例１４）および前の発明（ＰＣＴ  ２００５／１１８８３０；ＵＳ  ２００５／０２６７２９６  Ａ１）のグラシラリア・デュラ［ゲル強度：１％ゲル中１９００ｇｃｍ−２以上］アガロースゲルの比較評価を同一の実験条件下で行い、ゲル電気泳動のゲル濃度は両方のゲルで０．８％であった。これらの２つのアガロース試料の適切な量を９０℃のマイクロ波オーブンを使用して、１×ＴＢＥ（１０．８ｇｍトリスベース、５．５ｇｍホウ酸、０．７４４ｇｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）緩衝液５０ｍｌに溶解させた。アガロース溶液を６０℃まで冷却して、エチジウムブロミド溶液２μｌ（１ｍｌ当り１０ｍｇ）を添加して、ゲルをゲルトレーにキャストした。
【００９７】
ＤＮＡラダーおよび２つの異なるＤＮＡ試料（１．２ｋｂおよび１．５ｋｂ）を両方のゲルに添加して、１×ＴＢＥ緩衝液を使用して電気泳動を５０Ｖにて９０分間受けさせた。ゲルを泳動させた後、ＤＮＡを含有するゲル片をゲルから切断して、滅菌水５０μｌ中でＱＩＡ−ｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国（ＵＳＡ））を使用してＤＮＡを抽出した。溶離後、ＤＮＡ  ５μｌを新たにキャストしたゲルに添加して、溶離したＤＮＡの濃度および品質を確認した。
【００９８】
溶離したＤＮＡは、遺伝子特異的プライマーを標準ＰＣＲ条件（反応体積５０μｌ中に、ＤＮＡテンプレート２５ｎｇ、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、ＰＣＲプライマー１５０ｎｇ、ｄＮＴＰ  ２００μＭおよびＴａｑポリマメラーゼ酵素  ２．５Ｕ）で使用して、再度増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃にて５分間；５５℃にて１分間および７２℃にて１分間を３５サイクルであった。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを、電気泳動によって０．８％の新旧のアガロースゲルを使用して再確認した。ゲルをＵＶ光下で描出した（ＵＶ管８Ｗ、３１２ｎｍ；Ｂａｎｇａｌｏｒｅ  Ｇｅｎｅｉ、インド（Ｉｎｄｉａ））。
【００９９】
本発明で取得されたアガロースゲル（図１．１、１．２および１．３のゲル）の品質および性能を確認するために、ＤＮＡゲル電気泳動を行って、前の発明（ＰＣＴ  ２００５／１１８８３０；ＵＳ  ２００５／０２６７２９６  Ａ１）のアガロースゲル（図１．１、１．２および１．３のゲルｂ）と比較した。図１．１において、ＰＣＲ増幅ＤＮＡを分析して、ＤＮＡ生成物をこれらのゲルから溶離させ、ＤＮＡゲル電気泳動によって再分析した（図１．２）。図１．１のゲルから溶離したＤＮＡ生成物を使用してＰＣＲ増幅を行い、増幅ＤＮＡ生成物の品質をＤＮＡゲル電気泳動によって確認した（図１．３）。ＤＮＡ試料の分離ならびに溶離したＤＮＡの品質は、両方のゲル試料、すなわちすべての図（図１．１、１．２および１．３）のゲルａおよびｂで類似していることが見出された。
【０１００】
例６は、本発明の方法が、従来技術によってグラシラリア・デュラから取得されたアガロースと比較して類似の品質のアガロースを生じるという結論に至る。
【０１０１】
本発明の利点
本発明の主な利点は、所望の基準値（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）のアガロースが、インド（Ｉｎｄｉａ）海域のグラシラリア・デュラおよびゲリジエラ・アセロサから、従来技術と比較してあまり大きな資本を必要とせず、より好都合に着手され、匹敵する品質の生成物をなお与えるプロセスを通じて産生できるということである。
【０１０２】
別の利点は、凍結解凍操作を不要にすることにより、アガロースがさらにエネルギー効率のよい方式で調製されたことである。
【０１０３】
別の利点は、高温海藻抽出物が清澄剤としてのセライトおよび木炭への要求を不要にする方法である遠心分離によって浄化されたことである。
【０１０４】
別の利点は、本発明で使用されたすべての非イオン性界面活性剤が水溶性であり、水溶性であることにより簡単な水による洗浄によって生成物から非イオン性界面活性剤を容易に除去できることである。
【０１０５】
別の利点は、界面活性剤が再利用可能であることである。
【０１０６】
別の利点は、生成物が抽出物からの凝固および洗浄の後に、高濃度の水性分散物を調製して、最小量のアルコールによって析出させて所望の粒子サイズ範囲の生成物を取得することによって、よりただちに水に分散可能とさせて、これによりいずれの粉砕に対する要
も不要になることである。
【０１０７】
別の利点は、このような精製生成物が周知の市販生成物によって要求されるよりも低い濃度にてＤＮＡゲル電気泳動に好適であったことである。
【０１０８】
別の利点は、取得されたアガロースの品質は、少なくとも最長１年間いずれの劣化もなく、プラスチック容器中に保管できることである。
【図１．１ａ】
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【図１．１ｂ】
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【図１．２】
0005642152.tif 000009
【図１．３】
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