(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タン
パク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプル
からの発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量
測定方法であって、
前記融合遺伝子は、前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タ
ンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、
当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像ステップと、
前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質
が局在するか否かを判定する判定ステップと、
前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測
定する発光量測定ステップと、
を含むことを特徴とする所定部位発光量測定方法。
【請求項２】
前記融合遺伝子が導入された生きたサンプルが撮像範囲中に複数存在する場合、
複数の前記サンプルの発光画像を撮る発光画像撮像ステップと、
前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像および前記発光画像撮像ステップで撮像
した発光画像を重ね合わせることで、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定され
たサンプルの中から測定対象のサンプルを選定する選定ステップと、
をさらに含み、
前記蛍光画像撮像ステップは、複数の前記サンプルの蛍光画像を撮り、
前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在する
か否かをサンプルごとに判定し、
前記発光量測定ステップは、前記選定ステップで選定したサンプルからの発光量を測定
すること、
を特徴とする請求項１に記載の所定部位発光量測定方法。
【請求項３】
前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定
ステップ、前記発光量測定ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位
からの発光量を経時的に得ること、
を特徴とする請求項２に記載の所定部位発光量測定方法。
【請求項４】
前記サンプルからの発光を発光色別に分離する発光分離ステップ、
をさらに含み、
前記サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、前記移行塩基配列で移行させる
発光タンパク質の移行先の部位と、前記発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、
前記蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように
予め作製され、
前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在する
か否かを蛍光色ごとに判定し、
前記発光量測定ステップは、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合
、前記発光分離ステップで分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位から
の発光を特定し、特定した発光の発光量を測定すること、
を特徴とする請求項１に記載の所定部位発光量測定方法。
【請求項５】
前記サンプルは、試料、組織、細胞、個体のいずれか１つであること、
を特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の所定部位発光量測定方法。
【請求項６】
前記発光量測定ステップで測定した発光量に基づいて、前記選定ステップで選定したサ
ンプル内の所定の部位におけるＡＴＰを定量するＡＴＰ定量ステップ、
をさらに含み、
前記サンプルは細胞であり、前記所定の部位はミトコンドリアであり、前記移行塩基配
列はミトコンドリア移行シグナルであり、前記発光タンパク質はルシフェラーゼであり、
前記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質であり、
前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定
ステップ、前記発光量測定ステップに加えてさらに前記ＡＴＰ定量ステップを繰り返し実
行することで、サンプル内の所定の部位からのＡＴＰを経時的に定量すること、
を特徴とする請求項３に記載の所定部位発光量測定方法。
【請求項７】
前記発光画像撮像ステップおよび前記蛍光画像撮像ステップは、同一の対物レンズを共用する結像光学系により実行されることを特徴とする請求項２から６のいずれかに記載の所定部位発光量測定方法。
【請求項８】
前記結像光学系は、該結像光学系の標本側の開口数をＮＡｏとし、前記発光画像を結像する倍率をβとして、（ＮＡｏ／β）2によって演算される値が０．０１以上であることを特徴とする請求項７に記載の所定部位発光量測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定する所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置に関するものである。
本発明は、解析対象の遺伝子を導入した生きた細胞を対象として、蛍光測定および発光測定を組み合わせて、細胞周期のステージを同定すると共に解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定方法に関するものである。
本発明は、標本像を撮像して標本を観察する測定装置に関し、特に微弱光を発する発光標識および励起されて蛍光を発する蛍光標識が付与された標本の観察に適用して好適な測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
［Ｉ］ＡＴＰは、細胞内のエネルギーの供給源であり、生命現象に深く関わっている物質である。一方、ホタルのルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｏ2、Ｍｇ2+の存在下で、Ｄ‐ルシフェリンを発光基質として、オキシルシフェリン、ＣＯ2、ＡＭＰ、ピロリン酸を生成する反応を触媒し、当該反応により発光する。また、ルシフェラーゼの発光反応はＡＴＰ量に依存する。
【０００３】
そのため、ルシフェラーゼの発光反応を利用してＡＴＰを定量することは古くから行われており、バイオ、臨床検査、食品衛生などの分野では、ルシフェラーゼを用いた細胞内のＡＴＰ量の測定法が開発されている。
【０００４】
例えば、細胞内のＡＴＰ量の測定は、通常、以下の（１−１）〜（１−３）の工程で行われている。
（１−１）細胞または細菌を溶解してＡＴＰを抽出する。
（１−２）その抽出液をルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む反応液に添加する。
（１−３）抽出液が添加された反応液から発光量を測定することで、細胞内のＡＴＰを定量する。
【０００５】
また、破砕されてない細胞内のＡＴＰ量の測定は、通常、以下の（２−１）〜（２−３）の工程で行われる。
（２−１）ルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入して発現させる。
（２−２）細胞を含む培養液中にルシフェリンを加える。
（２−３）ルシフェリンが加えられた培養液から発光量を測定することで、細胞内のＡＴＰを定量する。
【０００６】
さらに、生きた細胞内の所定の部位（具体的にはミトコンドリア）におけるＡＴＰ量の経時的測定は、以下の（３−１）および（３−２）の工程で行われる（非特許文献１）。
（３−１）ルシフェラーゼ遺伝子にミトコンドリア移行シグナル遺伝子を融合し、その融合した遺伝子を細胞に導入する。
（３−２）ルシフェラーゼが細胞内のミトコンドリアに局在しているという前提の下、細胞からの発光量を経時的に測定することで、細胞内のミトコンドリアにおけるＡＴＰ量の変動を測定する。
なお、細胞内から発せられる発光の強度は極めて弱いので、１つの細胞を認識するために、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラでフォトンカウンティングを行う。また、ルシフェラーゼが細胞内のミトコンドリアに局在しているか否かは、発光量を測定した細胞とは別の細胞で確認する。具体的には、当該別の細胞を固定し、固定した細胞に抗ルシフェラーゼ抗体を反応させ、蛍光抗体法で細胞を観察することで局在の確認を行なう。これにより、測定した細胞からの発光量がミトコンドリアからの発光量に対応することを示した。
【０００７】
［ＩＩ］細胞増殖は生命維持において生物の基本的且つ重要な特徴の一つである。そして、細胞周期は細胞の成長やＤＮＡの複製や染色体の分配や細胞の分裂などからなる複数の連続反応であり、細胞周期の各ステージにおいて様々な遺伝子の発現が変動することは十分に考えられる。また、細胞周期の異常や破綻は多くの慢性疾患や発癌に関与していると考えられている（特許文献１参照）。なお、特許文献１には、細胞周期調節因子の活性の測定法とそれを用いた癌の診断法に関する技術が開示されている。
【０００８】
ところで、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を指標にしてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぐことで当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、ルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターに繋いでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることで、当該遺伝子の遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることができる。なお、ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法には例えばリン酸カルシウム法やリポフェクチン法やエレクトロポーション法などがあり、各方法は目的や細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。
【０００９】
また、細胞内に導入され発現しているルシフェラーゼの活性の測定（モニター）は、まず細胞を溶解した細胞溶解液とルシフェリンやＡＴＰやマグネシウムなどを含む基質溶液とを反応させ、ついで基質溶液と反応させた細胞溶解液からの発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量する、という手順で行われている。つまり、発光量は細胞を溶解した後に測定されている。これにより、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を細胞全体の平均値として測定することができる。
【００１０】
また、時間経過に沿ってルシフェラーゼ遺伝子の発現量を捉えるには生きた細胞からの発光量を経時的に測定する必要がある。そして、生きた細胞からの発光量の経時的測定は、まず細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を付け、ついで全細胞集団からの発光量を、培養しながらルミノメーターで一定時間ごとに定量する、という手順で行われている。これにより、一定の周期性をもった発現リズムなどを測定することができ、よって、細胞全体におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができる。
【００１１】
しかし、上述した従来のレポーターアッセイでは、細胞周期のステージが異なる複数の細胞が混在しており、様々なステージの細胞を一群のデータとして取り扱っていた。そのため、細胞周期に関わる遺伝子を解析する際は、同調培養などの操作を行って細胞周期のステージを揃えている。
【００１２】
［ＩＩＩ］従来、標本像の結像倍率を高倍率と低倍率とに切り換えて標本を観察できる顕微鏡装置がよく利用されている。このような顕微鏡装置では、近年、高倍率の対物レンズによって低倍率の観察視野が制限されずに、より広範囲に標本の全体像を把握できるようにした顕微鏡装置が提案されている（たとえば、特許文献２参照）。特許文献２で開示されている顕微鏡装置では、低倍率で標本を観察する場合、高倍率の対物レンズを介さずに、焦点深度が従来よりも深い、すなわち、標本側の開口数（ＮＡ；Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ）が従来よりも小さい低倍率専用の結像レンズを用いて標本像を結像するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００２−３３５９９７号公報
【特許文献２】特開平１０−３３９８４５号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ａ．Ｅ．Ｐｏｕｌｉ，  Ｅ．Ｋ．Ａｉｎｓｃｏｗ，  Ｌ．Ｓ．Ｊｏｕａｖｉｌｌｅ，  Ｒ．Ｒｉｚｚｕｔｏ，  Ｇ．Ａ．Ｒｕｔｔｅｒ，  “Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｓｕｂ−ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｓｌｅｔ  β−ｃｅｌｌｓ．”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．２７４，  ｐｐ．１３２８１−１３２９１，  １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
［Ｉ］しかしながら、従来技術では、細胞内の所定の部位に発光タンパク質が局在しているか否かを、発光量を測定した細胞とは別の細胞で確認しており、しかも蛍光抗体法で確認する際、細胞は死んでしまうので、発光量の測定対象である生きた細胞において、当該細胞内の所定の部位に発光タンパク質が局在しているか否かは必ずしも定かでなく、よって当該細胞からの発光量が所定の部位からの発光量であることも必ずしも明確でない、という問題点があった。
特に、複数の細胞に対する一過性の遺伝子導入の場合、全ての細胞に遺伝子が導入されるわけではないので、発光量の測定対象である生きた細胞と同じものに対して、遺伝子が細胞に導入されたか否かを確認し、遺伝子が導入された細胞内の所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを確認することが必要となる。
【００１６】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定するにあたって、当該サンプルと同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在しているか否かを確認することができる所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置を提供することを目的とする。
【００１７】
［ＩＩ］しかしながら、従来技術における同調培養の操作は煩雑であるので、実験者にとって作業的に大きな負担となっていた、という問題点があった。
【００１８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる発現量測定方法を提供することを目的とする。
【００１９】
［ＩＩＩ］ところで、近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ；Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識や発光標識を付して生体細胞を観察する必要性が高まっている。このような細胞の観察では、通常、発現量の経時変化を捉えるため、時系列に細胞を観察し続ける必要がある。
【００２０】
ところが、ＧＦＰを用いる観察では、ＧＦＰが励起光の照射に応じて蛍光を発する蛋白質であり、ＧＦＰを作用させた標本に大きな強度の励起光を照射して蛍光を得るため、標本に損傷を与えやすく、１〜２時間程度の観察が限度である。これに対して、ルシフェラーゼ遺伝子を用いる観察では、ルシフェラーゼ遺伝子が自己発光酵素であり、標本に損傷を与えることがなく、数日〜数週間程度の観察が可能である。このため、ルシフェラーゼ遺伝子を用いて経過観察を行い、この観察結果に応じて適宜にＧＦＰを用いた観察に切り換えるようにして、標本の経時変化を捉えることが所望されている。
【００２１】
しかしながら、ルシフェラーゼ遺伝子から発せられる光は極めて微弱なため、ＧＦＰからの蛍光を観察する場合などの蛍光観察で通常用いられる高倍率の結像光学系や、標本側および像側のＮＡが共に小さい従来の低倍率の結像光学系では、ルシフェラーゼ遺伝子からの微弱光を観察することはできず、蛍光観察と微弱光による微弱光観察とを両立する顕微鏡装置はこれまで実現されていない。また、微弱光観察による経過観察の結果に応じて即時に蛍光観察に切り換えられる顕微鏡装置も開発されていない。
【００２２】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、微弱光観察と蛍光観察とを適宜に切り換えることができるとともに、微弱光観察による観察結果に応じて即時に蛍光観察に切り換えることができる測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
［Ｉ］上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる所定部位発光量測定方法は、発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプルからの発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量測定方法であって、前記融合遺伝子は、前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像ステップと、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定する判定ステップと、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測定する発光量測定ステップと、を含むことを特徴とする。
【００２４】
また、本発明にかかる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記融合遺伝子が導入された生きたサンプルが撮像範囲中に複数存在する場合、複数の前記サンプルの発光画像を撮る発光画像撮像ステップと、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像および前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像を重ね合わせることで、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定されたサンプルの中から測定対象のサンプルを選定する選定ステップと、をさらに含み、前記蛍光画像撮像ステップは、複数の前記サンプルの蛍光画像を撮り、前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かをサンプルごとに判定し、前記発光量測定ステップは、前記選定ステップで選定したサンプルからの発光量を測定すること、を特徴とする。
【００２５】
また、本発明にかかる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定ステップ、前記発光量測定ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からの発光量を経時的に得ること、を特徴とする。
【００２６】
また、本発明にかかる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記サンプルからの発光を発光色別に分離する発光分離ステップ、をさらに含み、前記サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、前記移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、前記発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、前記蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製され、前記判定ステップは、前記蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを蛍光色ごとに判定し、前記発光量測定ステップは、前記判定ステップの判定結果が局在すると判定された場合、前記発光分離ステップで分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位からの発光を特定し、特定した発光の発光量を測定すること、を特徴とする。
【００２７】
また、本発明にかかる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記サンプルは、試料、組織、細胞、個体のいずれか１つであること、を特徴とする。
【００２８】
また、本発明にかかる所定部位発光量測定方法は、前記に記載の所定部位発光量測定方法において、前記発光量測定ステップで測定した発光量に基づいて、前記選定ステップで選定したサンプル内の所定の部位におけるＡＴＰを定量するＡＴＰ定量ステップ、をさらに含み、前記サンプルは細胞であり、前記所定の部位はミトコンドリアであり、前記移行塩基配列はミトコンドリア移行シグナルであり、前記発光タンパク質はルシフェラーゼであり、前記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質であり、前記蛍光画像撮像ステップ、前記判定ステップ、前記発光画像撮像ステップ、前記選定ステップ、前記発光量測定ステップに加えてさらに前記ＡＴＰ定量ステップを繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からのＡＴＰを経時的に定量すること、を特徴とする。
【００２９】
また、本発明は所定部位発光量測定装置に関するものであり、本発明にかかる所定部位発光量測定装置は、発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプルからの発光量を測定することにより、前記所定の部位からの発光量を得る所定部位発光量測定装置であって、前記移行塩基配列および前記発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を用い、当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮る蛍光画像撮像手段と、前記蛍光画像撮像手段で撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定する判定手段と、前記判定手段の判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測定する発光量測定手段と、を備えたことを特徴とする。
【００３０】
［ＩＩ］上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる発現量測定方法は、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、細胞から発せられた蛍光の蛍光強度を測定する蛍光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定ステップと、を含む発現量測定方法であって、前記細胞は、前記発光関連遺伝子、前記蛍光関連遺伝子および前記解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期の所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、前記発現量測定ステップで発光強度を用いる場合には前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、前記発現量測定ステップで蛍光強度を用いる場合には前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定するステージ同定ステップ、をさらに含むことを特徴とする。
【００３１】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ステップと、前記複数の細胞の発光画像を撮像する発光画像撮像ステップと、をさらに含み、前記発光測定ステップは、前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像に基づいて、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、前記蛍光測定ステップは、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、前記ステージ同定ステップは、前記発現量測定ステップで発光強度を用いる場合には前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定し、前記発現量測定ステップで蛍光強度を用いる場合には前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定すること、を特徴とする。
【００３２】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記ステージ同定ステップでステージが同定された細胞の中から測定対象の細胞を選択する選択ステップ、をさらに含み、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度または前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて、前記選択ステップで選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定すること、を特徴とする。
【００３３】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記発光画像撮像ステップ、前記蛍光画像撮像ステップ、前記発光測定ステップ、前記蛍光測定ステップ、前記ステージ同定ステップ、前記選択ステップ、前記発現量測定ステップを繰り返し実行することで、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら前記解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すること、を特徴とする。
【００３４】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記発現量測定ステップは、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて前記解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を同定すること、を特徴とする。
【００３５】
また、本発明は発現量測定方法に関するものであり、本発明にかかる発現量測定方法は、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を測定する発現量測定ステップと、を含む発現量測定方法であって、前記細胞は、その所定の部位を蛍光物質で染色したものであり、当該細胞の蛍光画像を撮像する蛍光画像撮像ステップと、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて細胞の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定するステージ同定ステップと、をさらに含むことを特徴とする。
【００３６】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の発光画像を撮像する発光画像撮像ステップ、をさらに含み、前記蛍光画像撮像ステップは、前記複数の細胞の蛍光画像を撮像し、前記発光測定ステップは、前記発光画像撮像ステップで撮像した発光画像に基づいて、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて前記解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、前記ステージ同定ステップは、前記蛍光画像撮像ステップで撮像した蛍光画像に基づいて細胞の形状が変化したか否かを細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定すること、を特徴とする。
【００３７】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記ステージ同定ステップでステージが同定された細胞の中から測定対象の細胞を選択する選択ステップ、をさらに含み、前記発現量測定ステップは、前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて、前記選択ステップで選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定すること、を特徴とする。
【００３８】
また、本発明にかかる発現量測定方法は、前記に記載の発現量測定方法において、前記発光画像撮像ステップ、前記蛍光画像撮像ステップ、前記発光測定ステップ、前記ステージ同定ステップ、前記選択ステップ、前記発現量測定ステップを繰り返し実行することで、前記選択ステップで選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら前記解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すること、を特徴とする。
【００３９】
［ＩＩＩ］上記の目的を達成するために、この発明にかかる測定装置は、微弱光を発する発光標識および励起されて蛍光を発する蛍光標識が付与されて保持手段に保持される標本の標本像を結像する結像光学系と、該標本像を撮像する撮像手段とを備える測定装置において、前記結像光学系は、前記発光標識からの微弱光を前記標本像としての微弱光標本像を結像する微弱光結像光学系と、前記蛍光標識からの蛍光を前記標本像としての蛍光標本像を結像する蛍光結像光学系と、を備え、前記撮像手段は、前記微弱光標本像と前記蛍光標本像とを撮像することを特徴とする。なお、この発明にかかる測定装置は、顕微鏡光学系を有する計測装置を含むものである。
【００４０】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記蛍光結像光学系は、前記標本を照明する照明手段を備えることを特徴とする。
【００４１】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記撮像手段によって撮像された微弱光標本像の像特性をもとに、該微弱光標本像の撮像と前記蛍光標本像の撮像とを切り換える制御を行う撮像切換制御手段を備えたことを特徴とする。
【００４２】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記像特性は、前記微弱光標本像の像強度であり、前記撮像切換制御手段は、前記像強度が所定のしきい値より大きい場合、前記微弱光標本像の撮像から前記蛍光標本像の撮像に切り換えることを特徴とする。
【００４３】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記像強度は、前記微弱光標本像の全体または部分の像強度であって、所定時点から現時点までの累積の像強度または現時点の像強度であることを特徴とする。
【００４４】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記蛍光結像光学系は、前記蛍光標識の各点からの蛍光を略平行光束に変換する蛍光対物レンズと、前記蛍光対物レンズによって略平行光束に変換された蛍光を集光して前記蛍光標本像を結像する蛍光結像レンズと、前記蛍光標識を励起する励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルター、前記蛍光標識からの蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターおよび前記励起光を反射し前記蛍光を透過させるダイクロイックミラーを有し、前記蛍光対物レンズと前記蛍光結像レンズとの間に配置される蛍光ユニットと、前記励起光を発する励起光源を有し、該励起光源からの励起光を前記ダイクロイックミラーによって反射させ前記標本に照射させる励起光照射手段と、を備えたことを特徴とする。
【００４５】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系は、前記発光標識の各点からの微弱光を略平行光束に変換する微弱光対物レンズと、前記微弱光対物レンズによって略平行光束に変換された微弱光を集光して前記微弱光標本像を結像する微弱光結像レンズと、を備えたことを特徴とする。
【００４６】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して互いに反対側に配置され、前記励起光照射手段は、前記標本に対して励起光を未照射にする未照射手段を有し、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記未照射手段に励起光を未照射にさせ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記励起光照射手段に励起光を照射させる制御を行うことを特徴とする。
【００４７】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野を相対的に平行移動させる視野移動手段を備えることを特徴とする。
【００４８】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記保持手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野内に前記標本を移動させる標本移動手段を有することを特徴とする。
【００４９】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光対物レンズおよび前記蛍光対物レンズは、同一の対物レンズであり、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記対物レンズを共用することを特徴とする。
【００５０】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記対物レンズと前記蛍光ユニットとの間の瞳空間に挿脱可能に配置され、該瞳空間に配置された場合、前記対物レンズからの微弱光を前記微弱光結像レンズに向けて反射させるミラーを備え、前記励起光照射手段は、前記標本に対して励起光を未照射にする未照射手段を有し、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記ミラーを瞳空間に配置するとともに前記未照射手段に励起光を未照射にさせ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記ミラーを瞳空間に未配置にするとともに前記励起光照射手段に励起光を照射させる制御を行うことを特徴とする。
【００５１】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して同じ側に配置され、前記保持手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野内に前記標本を移動させる標本移動手段を有し、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記標本移動手段によって前記標本を前記微弱光結像光学系の視野内に移動させ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記標本移動手段によって前記標本を前記蛍光結像光学系の視野内に移動させる制御を行うことを特徴とする。
【００５２】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野が前記標本を含むように前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系を移動させる光学系移動手段を備え、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系は、前記標本に対して同じ側に配置され、前記撮像切換制御手段は、前記撮像手段に微弱光標本像を撮像させる場合、前記微弱光結像光学系の視野が前記標本を含むように前記光学系移動手段によって該微弱光結像光学系を移動させ、前記撮像手段に蛍光標本像を撮像させる場合、前記蛍光結像光学系の視野が前記標本を含むように前記光学系移動手段によって該蛍光結像光学系を移動させる制御を行うことを特徴とする。
【００５３】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記光学系移動手段は、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各視野の略中心点を結ぶ線分の中点を通り前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の各光軸に略平行な回転軸を有し、該回転軸を中心に前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系を回転移動させることを特徴とする。
【００５４】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記撮像手段は、前記微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段と、前記蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段と、を備えることを特徴とする。
【００５５】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記撮像手段は、前記微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段と、前記蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段と、を備え、前記光学系移動手段は、前記微弱光結像光学系および前記微弱光撮像手段と、前記蛍光結像光学系および前記蛍光撮像手段と、をそれぞれ一体に移動させることを特徴とする。
【００５６】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光標本像および前記蛍光標本像は、それぞれ前記微弱光結像レンズおよび前記蛍光結像レンズによって略同じ位置に結像され、前記撮像手段は、前記微弱光標本像および前記蛍光標本像が結像される位置に略一致して固定されることを特徴とする。
【００５７】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系および前記蛍光結像光学系の少なくとも一方に対応し、前記標本に対して透過照明を行う照明手段を備えることを特徴とする。
【００５８】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記透過照明は、明視野観察用照明、暗視野観察用照明、微分干渉観察用照明および位相差観察用照明の少なくとも１つであることを特徴とする。
【００５９】
また、この発明にかかる測定装置は、上記の発明において、前記微弱光結像光学系は、該微弱光結像光学系の標本側の開口数をＮＡｏとし、前記微弱光標本像を結像する倍率をβとして、（ＮＡｏ／β）2によって演算される値が０．０１以上（本出願人による特許出願である特願２００４−３４２９４０を引用。）であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００６０】
［Ｉ］本発明によれば、発光タンパク質をサンプル内の所定の部位に移行させる移行塩基配列と、当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と、を融合した融合遺伝子が導入された生きたサンプルからの発光量を測定することにより、所定の部位からの発光量を得るにあって、融合遺伝子は、移行塩基配列および発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、当該融合遺伝子が導入されたサンプルの蛍光画像を撮り、撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定し、判定結果が局在すると判定された場合、サンプルからの発光量を測定する。これにより、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定するにあたって、当該サンプルと同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在しているか否かを確認することができる、という効果を奏する。
【００６１】
また、本発明によれば、融合遺伝子が導入された生きたサンプルが撮像範囲中に複数存在する場合、複数のサンプルの蛍光画像を撮り、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かをサンプルごとに判定し、複数のサンプルの発光画像を撮り、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定されたサンプルの中から測定対象のサンプルを選定し、選定したサンプルからの発光量を測定する。これにより、複数のサンプルの中から個々のサンプルを識別し、単一のサンプル内の所定の部位からの発光量を測定することができる、という効果を奏する。
【００６２】
また、本発明によれば、蛍光画像の撮像、局在の判定、発光画像の撮像、測定対象のサンプルの選定、発光量の測定を繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からの発光量を経時的に得る。これにより、サンプル内の所定の部位における発光量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。
【００６３】
また、本発明によれば、サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製され、サンプルからの発光を発光色別に分離し、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを蛍光色ごとに判定し、判定結果が局在すると判定された場合、分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位からの発光を特定し、特定した発光の発光量を測定する。これにより、例えば、１つのサンプル内の複数の部位からの発光量を同時に測定することができる、という効果を奏する。
【００６４】
また、本発明によれば、サンプルは、試料、組織、細胞、個体のいずれか１つであるので、様々なサンプルを対象とすることができる、という効果を奏する。
【００６５】
また、本発明によれば、サンプルは細胞であり、所定の部位はミトコンドリアであり、移行塩基配列はミトコンドリア移行シグナルであり、発光タンパク質はルシフェラーゼであり、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質であり、測定した発光量に基づいて、選定したサンプル内の所定の部位におけるＡＴＰを定量し、蛍光画像の撮像、局在の判定、発光画像の撮像、測定対象のサンプルの選定、発光量の測定に加えてさらにＡＴＰの定量を繰り返し実行することで、サンプル内の所定の部位からのＡＴＰを経時的に定量する。これより、特定の細胞内のミトコンドリアにおけるＡＴＰ量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。
【００６６】
［ＩＩ］本発明によれば、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定し、細胞から発せられた蛍光の蛍光強度を測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定するにあたって、細胞は、発光関連遺伝子、蛍光関連遺伝子および解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期の所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、発現量の測定で発光強度を用いた場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いた場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定する。これにより、細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに当該細胞に対して細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができる、という効果を奏する。具体的には、細胞周期との直接の関与が不明である解析対象の遺伝子に関して、薬剤投与や温度変化などの刺激で引き起こされる発現量の変化を細胞周期のステージと共に得ることができるので、当該解析対象の遺伝子と細胞周期との関与を検証することができる、という効果を奏する。また、細胞周期との直接の関与が示唆される解析対象の遺伝子に関して、当該解析対象の遺伝子の発現量と細胞周期のステージとを一緒に取得することができるので、当該解析対象の遺伝子が細胞周期マーカーとして有用であるか否かを評価することができる、という効果を奏する。
【００６７】
また、本発明によれば、細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の蛍光画像を撮像し、複数の細胞の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、発現量の測定で発光強度を用いる場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いる場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定する。これにより、複数の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定すると共に、細胞周期のステージを細胞ごとに同定することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を細胞ごとに評価することができる、という効果を奏する。
【００６８】
また、本発明によれば、ステージが同定された細胞の中から測定対象の細胞を選択し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて、選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定する。これにより、複数の細胞の中から個々の細胞を識別し、単一の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、細胞周期のステージを同定することができる、という効果を奏する。
【００６９】
また、本発明によれば、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定する。これにより、単一の細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。
【００７０】
また、本発明によれば、発現量の測定において、選択された細胞を対象として、測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、撮像した蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を同定する。これにより、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができるだけでなく、解析対象の遺伝子の細胞内における発現部位を得ることができる、という効果を奏する。
【００７１】
また、本発明によれば、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞を対象として、細胞から発せられた発光の発光強度を測定し、測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定するにあたって、細胞は、その所定の部位（具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色したものであり、当該細胞の蛍光画像を撮像し、撮像した蛍光画像に基づいて細胞の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定する。これにより、細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに当該細胞に対して細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができる、という効果を奏する。具体的には、細胞周期との直接の関与が不明である解析対象の遺伝子に関して、薬剤投与や温度変化などの刺激で引き起こされる発現量の変化を細胞周期のステージと共に得ることができるので、当該解析対象の遺伝子と細胞周期との関与を検証することができる、という効果を奏する。また、細胞周期との直接の関与が示唆される解析対象の遺伝子に関して、当該解析対象の遺伝子の発現量と細胞周期のステージとを一緒に取得することができるので、当該解析対象の遺伝子が細胞周期マーカーとして有用であるか否かを評価することができる、という効果を奏する。
【００７２】
また、本発明によれば、細胞が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞の発光画像を撮像し、複数の細胞の蛍光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定し、撮像した蛍光画像に基づいて細胞の形状が変化したか否かを細胞ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞ごとに同定する。これにより、複数の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を細胞ごとに測定すると共に、細胞周期のステージを細胞ごとに同定することができる、という効果を奏する。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を細胞ごとに評価することができる、という効果を奏する。
【００７３】
また、本発明によれば、ステージが同定された細胞の中から測定対象の細胞を選択し、測定した発光強度に基づいて、選択した細胞に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定する。これにより、複数の細胞の中から個々の細胞を識別し、単一の細胞を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、細胞周期のステージを同定することができる、という効果を奏する。
【００７４】
また、本発明によれば、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、ステージの同定、細胞の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定する。これにより、単一の細胞を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量の変動を経時的に測定することができる、という効果を奏する。
【００７５】
［ＩＩＩ］本発明にかかる測定装置によれば、微弱光観察と蛍光観察とを保持手段に保持されている同一の標本に対して個別に実行することができるとともに、微弱光観察による観察結果に応じて即時に蛍光観察に切り換えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、所定部位発光量測定装置１００の全体構成の一例を示す図である。
【図２】図２は、所定部位発光量測定装置１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図３】図３は、所定部位発光量測定装置１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の別の一例を示す図である。
【図４】図４は、所定部位発光量測定装置１００の情報通信端末１１０の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】図５は、所定部位発光量測定装置１００で行われる処理の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６は、蛍光画像撮像ユニット１０８で撮像した明視野像および蛍光像の一例を示す図である。
【図７】図７は、発光画像撮像ユニット１０６で撮像した明視野像および蛍光像の一例を示す図である。
【図８】図８は、発光画像撮像ユニット１０６および蛍光画像撮像ユニット１０８で撮像した重ね合わせ画像の一例を時系列で示す図である。
【図９】図９は、特定した細胞の発光強度の経時的変動の一例を示す図である。
【図１０】図１０は、ＧＦＰ‐ミトコンドリア移行シグナル‐ルシフェラーゼを融合したプラスミドベクターを示す図である。
【図１１】図１１は、蛍光画像撮像ユニット１０８で撮像した、プラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の明視野像および蛍光像を示す図である。
【図１２】図１２は、発光画像撮像ユニット１０６で撮像した、プラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の明視野像および発光像を示す図である。
【図１３】図１３は、特定したＨｅＬａ細胞の発光強度の経時的変動を示す図である。
【図１４】図１４は、所定部位発光量測定装置１００の全体構成の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、所定部位発光量測定装置１００の全体構成の一例を示す図である。
【図１６】図１６は、所定部位発光量測定装置１００の全体構成の一例を示す図である。
【図１７】図１７は、ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の蛍光画像を示す図である。
【図１８】図１８は、ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像を示す図である。
【図１９】図１９は、ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光画像を示す図である。
【図２０】図２０は、発現量測定装置１０００の全体構成の一例を示す図である。
【図２１】図２１は、発現量測定装置１０００の発光画像撮像ユニット１０６０の構成の一例を示す図である。
【図２２】図２２は、発現量測定装置１０００の発光画像撮像ユニット１０６０の構成の別の一例を示す図である。
【図２３】図２３は、発現量測定装置１０００の情報通信端末１１００の構成の一例を示すブロック図である。
【図２４】図２４は、発現量測定装置１０００で行われる処理の一例を示すフローチャートである。
【図２５】図２５は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図２６】図２６は、図２５に示した顕微鏡装置が微弱光観察と蛍光観察とを切り換える撮像切換処理の処理手順を示すフローチャートである。
【図２７】図２７は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図２８】図２８は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。
【図２９】図２９は、本発明の実施の形態３にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図３０】図３０は、本発明の実施の形態４にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図３１】図３１は、本発明の実施の形態５にかかる顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図３２】図３２は、本発明の実施の形態５にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。
【図３３】図３３は、本発明の実施の形態５にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。
【図３４】図３４は、本発明の実施の形態５にかかる顕微鏡装置の変形例の構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
［Ｉ］以下に、本発明にかかる所定部位発光量測定方法および所定部位発光量測定装置の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００７８】
まず、本発明を実現する所定部位発光量測定装置１００の構成について、図１〜図３を参照して説明する。図１は、所定部位発光量測定装置１００の全体構成の一例を示す図である。
【００７９】
図１に示すように、所定部位発光量測定装置１００は、サンプル１０２と、サンプル１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、蛍光画像撮像ユニット１０８と、情報通信端末１１０と、で構成されている。また、所定部位発光量測定装置１００において、発光画像撮像ユニット１０６に含まれる対物レンズ１０６ａと蛍光画像撮像ユニット１０８に含まれる対物レンズ１０８ａとは、図示の如く、サンプル１０２、容器１０３およびステージ１０４を挟んで上下の対向する位置に配置される。なお、図１４に示すように、発光画像撮像ユニット１０６および蛍光画像撮像ユニット１０８の配置を入れ替えてもよい。蛍光よりも微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６を下側に配置することにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６と別体の蛍光画像撮像ユニット１０８は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
【００８０】
再び図１に戻り、サンプル１０２は、発光タンパク質をサンプル１０２内の所定の部位（例えば、ミトコンドリアや細胞質、核など）に移行させる移行塩基配列および当該発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を導入したものである。また、サンプル１０２は、生きたものであり、例えば、試料、組織、細胞、個体などである。なお、サンプル１０２は、具体的には、当該融合遺伝子が入ったプラスミドベクターを導入したものでもよい。
【００８１】
発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、サンプル１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）2の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、サンプル１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影されたサンプル１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、情報通信端末１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、サンプル１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数のサンプル１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的にはサンプル１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。
【００８２】
ここで、２色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影されたサンプル１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、サンプル１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。
【００８３】
また、複数色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影されたサンプル１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、サンプル１０２から発せられた発光をフィルター交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。
【００８４】
再び図１に戻り、蛍光画像撮像ユニット１０８は、具体的には倒立型の蛍光顕微鏡であり、サンプル１０２の蛍光画像を撮像する。蛍光画像撮像ユニット１０８は、図示の如く、対物レンズ１０８ａと、ダイクロイックミラー１０８ｂと、光源１０８ｃと、ＣＣＤカメラ１０８ｄと、結像レンズ１０８ｅと、シャッター１０８ｆと、で構成されている。対物レンズ１０８ａは、具体的には、（開口数／倍率）2の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０８ｂは、サンプル１０２からの蛍光を透過するとともに、光源１０８ｃから照射された励起光がサンプル１０２へ照射されるように励起光の方向を変える。光源１０８ｃは、励起光を照射するためのものであり、具体的には、キセノンランプ、ハロゲン等のランプ、レーザー、ＬＥＤなどである。ＣＣＤカメラ１０８ｄは、対物レンズ１０８ａ、ダイクロイックミラー１０８ｂおよび結像レンズ１０８ｅを介して当該ＣＣＤカメラ１０８ｄのチップ面に投影されたサンプル１０２の蛍光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０８ｄは、情報通信端末１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、サンプル１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０８ｄは、当該撮像範囲中に含まれる複数のサンプル１０２の蛍光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０８ｅは、対物レンズ１０８ａおよびダイクロイックミラー１０８ｂを介して当該結像レンズ１０８ｅに入射した像（具体的にはサンプル１０２を含む像）を結像する。シャッター１０８ｆは、光源１０８ｃから照射された励起光を切り替える。換言すると、シャッター１０８ｆは、光源１０８ｃから照射された励起光を透過したり遮断したりすることで、サンプル１０２への励起光の照射を切り替える。
【００８５】
ここで、発光画像撮像ユニット１０６および蛍光画像撮像ユニット１０８は、具体的には、それぞれ倒立型の発光顕微鏡および倒立型の蛍光顕微鏡でもよく、ステージ１０４は回転するものでもよい。
【００８６】
また、図１および図１４に示した所定部位発光量測定装置１００は発光画像撮像ユニット１０６と蛍光画像撮像ユニット１０８とを別々に備えた構成であったが、所定部位発光量測定装置１００は、図１５に示すように、蛍光画像撮像ユニット１０８のみを備えた構成であってもよい。換言すると、所定部位発光量測定装置１００は、蛍光画像撮像ユニット１０８のみで蛍光観察と発光観察の両方を行う構成であってもよい。なお、図１５に示す所定部位発光量測定装置１００で蛍光・発光観察を行う場合、所定部位発光量測定装置１００は、発光画像を撮像する（発光検出を行う）際に、シャッター１０８ｆの切り替えを自動又は手動で行うと共にダイクロイックミラー１０８ｂを光路（図１５中の点線）から外れた位置まで自動又は手動で移動することが可能な構成であることが好ましい。これにより、発光画像中のノイズを減らすことができる。また、図１５に示す所定部位発光量測定装置１００の場合、対物レンズ１０８ａは、具体的には、“（開口数／倍率）2の値が０．０１以上”という条件を満たすものであることが好ましい。
また、所定部位発光量測定装置１００は、図１６に示すように、励起光の照射をサンプル１０２の上方から行い且つ蛍光・発光観察をサンプル１０２の下方から行う構成であってもよい。ここで、図１６に示す所定部位発光量測定装置１００の構成のうち、これまで説明してない構成のみを説明する。励起用分光フィルター１０８ｇは、光源１０８ｃから発せられた励起光を、波長領域の異なる複数の励起光に分離する。光ファイバー１０８ｈは、励起用分光フィルター１０８ｇで分離した各励起光をサンプル１０２へ導く。コンデンサーレンズ１０８ｉは、サンプル１０２を均等に照明するために用いるレンズであり、光ファイバー１０８ｈにより導かれた各励起光を集光する。発光・蛍光分光用フィルター１０８ｊは、サンプル１０２から放出された蛍光や発光を、強度や波長などの違いで分離する。なお、図１６に示す所定部位発光量測定装置１００の場合、対物レンズ１０８ａは、具体的には、“（開口数／倍率）2の値が０．０１以上”という条件を満たすものであることが好ましい。
【００８７】
再び図１に戻り、情報通信端末１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、情報通信端末１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力部１２２と、出力部１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００８８】
記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。
【００８９】
通信インターフェース部１１８は、情報通信端末１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃおよびＣＣＤカメラ１０８ｄと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
【００９０】
入出力インターフェース部１２０は、入力部１２２や出力部１２４に接続する。ここで、出力部１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力部１２４をモニタとして記載する場合がある。）。また、入力部１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニタを用いることができる。
【００９１】
制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１０２は、大別して、蛍光画像撮像指示部１１２ａと、蛍光画像取得部１１２ｂと、判定部１１２ｃと、発光画像撮像指示部１１２ｄと、発光画像取得部１１２ｅと、選定部１１２ｆと、発光量測定部１１２ｇと、関連物質定量部１１２ｈと、で構成されている。
【００９２】
蛍光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１６を介して、ＣＣＤカメラ１０８ｄへ蛍光画像および明視野画像の撮像を指示する。蛍光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０８ｄで撮像した蛍光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１６を介して取得する。
【００９３】
判定部１１２ｃは、蛍光画像取得部１１２ｂで取得した蛍光画像および明視野画像に基づいて、サンプル１０２に融合遺伝子が導入されたか否かを判定したり、所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定したりする。ここで、蛍光画像取得部１１２ｂで取得した蛍光画像および明視野画像に複数のサンプル１０２が存在する場合、判定部１１２ｃは、蛍光画像および明視野画像に基づいて、サンプル１０２に融合遺伝子が導入されたか否かをサンプル１０２ごとに判定したり、所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かをサンプル１０２ごとに判定したりしてもよい。
【００９４】
発光画像撮像指示部１１２ｄは、通信インターフェース部１１６を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｅは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１６を介して取得する。
【００９５】
選定部１１２ｆは、蛍光画像取得部１１２ｂで取得した蛍光画像および明視野画像ならびに発光画像撮像取得部１１２ｅで取得した発光画像および明視野画像を重ね合わせることで、判定部１１２ｃの判定結果が局在すると判定されたサンプル１０２の中から測定対象のサンプル１０２を選定する。
【００９６】
発光量測定部１１２ｇは、判定部１１２ｃの判定結果が局在すると判定されたサンプル１０２や選定部１１２ｆで選定したサンプル１０２からの発光量を発光画像に基づいて測定する。関連物質定量部１１２ｈは、発光量測定部１１２ｇで測定した発光量に基づいて、当該発光量の増減に対して直接的または間接的に関連する物質の量を定量する。例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼの場合、関連物質定量部１１２ｈは、例えば当該ルシフェラーゼの発光量の増減に対して直接的に関連する物質であるＡＴＰの量を定量する。つまり、関連物質定量部１１２ｈは、発光量測定部１１２ｇで測定した発光量に基づいてＡＴＰを定量するＡＴＰ定量手段として用いることができる。
【００９７】
以上の構成において、所定部位発光量測定装置１００で行われる処理の一例を、図５を参照して説明する。なお、以下では、複数のサンプル１０２に同じ融合遺伝子を導入して、複数のサンプル１０２のうち特定のサンプル１０２における所定の部位での発光量を経時的に測定する場合の処理の一例について説明する。
【００９８】
まず、情報通信端末１１０は、蛍光画像撮像指示部１１０ａの処理で、通信インターフェース部１１６を介して、ＣＣＤカメラ１０８ｄへ蛍光画像および明視野画像の撮像を指示する（ステップＳＡ−１）。つぎに、ＣＣＤカメラ１０８ｄは、撮像範囲中に存在する複数のサンプル１０２の蛍光画像および明視野画像を撮像し、（ステップＳＡ−２：図６参照）、情報通信端末１１０へ送信する（ステップＳＡ−３）。なお、励起光は蛍光画像を撮像する時のみサンプル１０２へ照射する。つぎに、情報通信端末１１０は、蛍光画像取得部１１２ｂの処理で、ＣＣＤカメラ１０８ｄで撮像した蛍光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１６を介して取得し、記憶部１１６の所定の記憶領域に記憶する（ステップＳＡ−４）。
【００９９】
つぎに、情報通信端末１１０は、判定部１１２ｃの処理で、蛍光画像と明視野画像とを比較することで、融合遺伝子が導入されているか否かをサンプル１０２ごとに判定し、導入されていると判定されたサンプル１０２に対してさらに当該サンプル１０２の所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定する（ステップＳＡ−５）。これにより、図６に示すように、例えば、複数のサンプル１０２（細胞１〜細胞５）の中から、遺伝子が導入され、且つ所定の部位に発光タンパク質が局在しているもの（細胞１）を確認することができる。
【０１００】
つぎに、遺伝子が導入され、且つ所定の部位に発光タンパク質が局在しているサンプル１０２が存在した場合（ステップＳＡ−６：Ｙｅｓ）、情報通信端末１１０は、発光画像撮像指示部１１２ｄの処理で、通信インターフェース部１１６を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃに対して発光画像および明視野画像の撮像を指示する（ステップＳＡ−７）。つぎに、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、撮像範囲中に存在する複数のサンプル１０２の発光画像および明視野画像を撮像し（ステップＳＡ−８：図７参照）、情報通信端末１１０へ送信する（ステップＳＡ−９）。なお、図７に示した発光画像では、細胞２の発光が最も強い場合を一例として示している。
【０１０１】
つぎに、情報通信端末１１０は、発光画像取得部１１２ｅの処理で、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１６を介して取得すると共に、制御部１１２の処理で、クロック発生部１１４から時刻（後述する図８におけるＴ1に対応）を取得し、発光画像および明視野画像と時刻とを、既に記憶されている蛍光画像および明視野画像とさらに対応付けて記憶部１１６の所定の記憶領域に記憶する（ステップＳＡ−１０）。
【０１０２】
つぎに、情報通信端末１１０は、選定部１１２ｆの処理で、明視野画像、蛍光画像および発光画像を重ね合わせることで、判定部１１２ｃの判定結果が局在すると判定されたサンプルの中から測定対象のサンプルを選定（特定）する（ステップＳＡ−１１）。なお、図６に示した例では、遺伝子が導入され、且つ所定の部位に発光タンパク質が局在している細胞は細胞１のみであるので、ステップＳＡ−１１では、図８に示すように、自動的に細胞１が特定される。
【０１０３】
つぎに、情報通信端末１１０は、発光量測定部１１２ｇの処理で、選定したサンプル１０２に対応する発光量（発光強度）を発光画像に基づいて測定し、選定したサンプル１０２（例えば図８における細胞１）を識別する識別情報と当該発光量とを、既に記憶されている蛍光画像、発光画像、明視野画像および時刻とさらに対応付けて記憶部１１６の所定の記憶領域に記憶する（ステップＳＡ−１２）。
【０１０４】
そして、情報通信端末１１０は、制御部１１２の処理で、上述したステップＳＡ−１〜ステップＳＡ−１２を、例えば予め設定した時間間隔で所定の回数繰り返し実行する（ＳＡ−１３）ことで、図９に示すように、選定したサンプル１０２（例えば、図６、図７および図８に示す細胞１）内の所定の部位における発光量の変動を、経時的（例えば、図８および図９に示す時刻Ｔ1〜Ｔ4ごと）に得る。
【０１０５】
以上、詳細に説明したように、所定部位発光量測定装置１００によれば、サンプル１０２に導入する融合遺伝子は、移行塩基配列および発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものであり、当該融合遺伝子が導入されたサンプル１０２の蛍光画像を撮り、撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定し、判定結果が局在すると判定された場合、サンプル１０２からの発光量を測定する。これにより、生きたサンプル１０２内の所定の部位からの発光量を測定するにあたって、当該サンプル１０２と同一のものに対して、所定の部位に発光たんぱく質が局在しているか否かを確認することができる。また、融合遺伝子が導入された生きたサンプルに対し発光タンパク質の局在を確認すると共に、当該サンプルからの発光量を測定するので、サンプルからの発光量は所定の部位からの発光量に明確に対応しており、測定した発光量が所定の部位からのものであることの信頼性を確保することができる。なお、サンプル１０２が例えば細胞の場合、発光成分を取り込んでいない細胞をカウントせずに、正確な統計解析が可能である。また、所定部位発光量測定装置１００は、例えば、各種反応（例えば薬物刺激や光照射など）の検査や治療などに好適に用いることができる。
【０１０６】
また、所定部位発光量測定装置１００によれば、融合遺伝子が導入された生きたサンプル１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、複数のサンプル１０２の蛍光画像を撮り、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かをサンプル１０２ごとに判定し、複数のサンプル１０２の発光画像を撮り、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定されたサンプル１０２の中から測定対象のサンプル１０２を選定し、選定したサンプル１０２からの発光量を測定する。これにより、複数のサンプル１０２の中から個々のサンプル１０２を識別し、単一のサンプル１０２内の所定の部位からの発光量を測定することができる。また、蛍光および発光を画像で取得することで、測定対象のサンプル１０２と同一のサンプル１０２における発光タンパク質の局在と、当該サンプル１０２から発せられる発光強度と、を得ることができる。そのため、遺伝子の導入効率や細胞周期による個々の細胞の生理的な状態の違いの影響を排除した解析を行うことができる。ここで、本実施の形態の所定部位発光量測定装置１００では、図５に示すように、一例として、蛍光画像を撮像した後、発光タンパク質が所定の部位に局在しているか否かの判定を行い、そして、局在すると判定された場合に発光画像を撮像する、という処理を行なっているが、発光画像の撮像は、蛍光画像の撮像とともに行なってもよい。換言すると、所定部位発光量測定装置１００は、蛍光画像および発光画像を撮像した後、局在の判定を行なってもよい。具体的には、所定部位発光量測定装置１００は、融合遺伝子が導入された生きたサンプル１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、複数のサンプル１０２について、蛍光画像および発光画像を撮り、蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かをサンプル１０２ごとに判定し、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定されたサンプル１０２の中から測定対象のサンプル１０２を選定し、選定したサンプル１０２からの発光量を測定してもよい。
【０１０７】
さらに、所定部位発光量測定装置１００によれば、蛍光画像の撮像、局在の判定、発光画像の撮像、測定対象のサンプル１０２の選定、発光量の測定を繰り返し実行することで、サンプル１０２内の所定の部位からの発光量を経時的に得る。これにより、例えば特定のサンプル１０２内の所定の部位における発光量の変動を経時的に測定することができる。
【０１０８】
ここで、所定部位発光量測定装置１００において、サンプルに導入される融合遺伝子は、複数存在し、移行塩基配列で移行させる発光タンパク質の移行先の部位と、発光タンパク質から発せられる発光の発光色と、蛍光タンパク質から発せられる蛍光の蛍光色との組み合わせがそれぞれ異なるように予め作製されたものでもよい。そして、この場合、所定部位発光量測定装置１００は、サンプル１０２からの発光を発光色別に分離し、撮像した蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを蛍光色ごとに判定し、判定結果が局在すると判定された場合、分離した複数の発光のうち当該局在すると判定された部位からの発光を特定し、特定した発光の発光量を測定してもよい。これにより、例えば、１つのサンプル１０２内の複数の部位からの発光量を同時に測定することができたり、サンプル１０２内の複数の部位からの発光量をサンプル１０２ごとに同時に測定することができたりする。
具体的には、サンプル１０２が細胞である場合、細胞に導入される融合遺伝子を２つ作製し、１つは、ミトコンドリア移行シグナルで移行させる緑色ルシフェラーゼの移行先の部位であるミトコンドリアと、緑色ルシフェラーゼから発せられる発光の発光色（緑色）と、ＧＦＰから発せられる蛍光の蛍光色（緑色）と、の組み合わせで作製され、残りの１つは、細胞質で発現させる赤色ルシフェラーゼから発せられる発光の発光色（赤色）と、ＣＦＰから発せられる蛍光の蛍光色（シアン）と、の組み合わせで作製されてもよい。そして、この場合、所定部位発光量測定装置１００は、細胞からの発光を発光色別（緑色、赤色）に分離し、撮像した蛍光画像に基づいて、ミトコンドリアに緑色ルシフェラーゼが局在するか否かをＧＦＰから発せられる蛍光色（緑色）で判定し、細胞質に赤色ルシフェラーゼが局在するか否かをＣＦＰから発せられる蛍光色（シアン）で判定し、判定結果が局在すると判定された場合、分離した２つの発光（緑色、赤色）のうち当該局在すると判定された部位からの発光を特定し、特定した発光の発光量を測定してもよい。換言すると、細胞内のミトコンドリアに対しては、移行塩基配列としてミトコンドリア移行シグナル、発光タンパク質として緑色ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質としてＧＦＰを選択し、一方、当該細胞内の細胞質に対しては、移行塩基配列は用いず、発光タンパク質として赤色ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質としてＣＦＰを選択し、ミトコンドリアと細胞質での発光量（さらにはＡＴＰ量など）の変動を発光強度の変化として個別に且つ同時に測定してもよい。
【０１０９】
また、所定部位発光量測定装置１００において、測定した発光量に基づいて、当該発光量の増減に対して直接的または間接的に関連する物質の量を定量してもよい。具体的には、発光タンパク質がルシフェラーゼの場合、例えば当該ルシフェラーゼの発光量の増減に対して直接的に関連する物質であるＡＴＰの量を定量してもよい。これにより、特定のサンプル１０２内の所定の部位における関連物質（例えばＡＴＰなど）の量の変動を例えば経時的に測定することができる。
【０１１０】
また、他の実施の形態として、例えば、細胞周期ごとに発現量及び／又は局在部位が変化するような蛍光タンパク質および発光タンパク質を含む細胞を作製し、当該細胞から発せられる蛍光および発光を経時的に測定することで、細胞周期を、蛍光タンパク質の発現量及び／又は局在部位の変化で確認するとともに細胞の発光量の変動を経時的に測定してもよい。
また、複数の神経細胞を対象とした場合、神経細胞に導入する融合遺伝子として、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子、当該発光タンパク質を別の神経細胞へ移行させる移行塩基配列および蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものを作製し、当該融合遺伝子が導入された神経細胞から別の神経細胞へ発光タンパク質が移行する過程を、神経細胞から発せられる蛍光色で確認し、当該移行する過程における神経細胞における発光量の変動を経時的に測定してもよい。
【０１１１】
（付記）蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子および発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を導入したサンプルから発せられる蛍光の蛍光強度を測定する蛍光測定ステップと、
前記蛍光測定ステップで測定した蛍光強度に基づいてサンプルの位置を特定する位置特定ステップと、
当該サンプルから発せられる発光の発光強度を測定する発光測定ステップと、
前記発光測定ステップで測定した発光強度に基づいて発光量を定量する発光量定量ステップと、
を含むことを特徴とする蛍光・発光測定方法。
【０１１２】
［ＩＩ］以下に、本発明にかかる発現量測定方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【０１１３】
まず、本発明を実施するための装置である発現量測定装置１０００の構成について、図２０〜図２２を参照して説明する。図２０は、発現量測定装置１０００の全体構成の一例を示す図である。
【０１１４】
図２０に示すように、発現量測定装置１０００は、細胞１０２０と、細胞１０２０を収納した容器１０３０（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３０を配置するステージ１０４０と、発光画像撮像ユニット１０６０と、蛍光画像撮像ユニット１０８０と、情報通信端末１１００と、で構成されている。また、発現量測定装置１０００において、発光画像撮像ユニット１０６０に含まれる対物レンズ１０６０ａと蛍光画像撮像ユニット１０８０に含まれる対物レンズ１０８０ａとは、図示の如く、細胞１０２０、容器１０３０およびステージ１０４０を挟んで上下の対向する位置に配置される。なお、発光画像撮像ユニット１０６０および蛍光画像撮像ユニット１０８０の配置を入れ替えてもよい。
【０１１５】
細胞１０２０は、発光タンパク質（具体的にはルシフェラーゼ）を発現する発光関連遺伝子、蛍光タンパク質（具体的にはＧＦＰ）を発現する蛍光関連遺伝子および解析対象の遺伝子に加えてさらに、細胞周期における所定のステージで発現する細胞周期関連遺伝子を導入した生きたものである。ここで、本明細書において発光とは、生物発光および化学発光を含む概念である。
なお、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合した融合遺伝子を導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクターを導入した生きたものでもよい。また、細胞１０２０に対し発光関連遺伝子または蛍光関連遺伝子と組み合わせて導入する解析対象の遺伝子の数は複数でもよい。換言すると、細胞１０２０に対し解析対象の遺伝子と発光関連遺伝子または蛍光関連遺伝子との組を複数導入してもよい。これにより、細胞周期のステージを同定すると共に、細胞１０２０に導入した複数の解析対象の遺伝子の発現量を一緒に測定することができる。
【０１１６】
ここで、蛍光で細胞周期のステージを同定し、発光で解析対象の遺伝子の発現量を測定する場合、細胞１０２０は、蛍光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを関連付けて導入すると共に、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを関連付けて導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞１０２０は、蛍光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクター（蛍光関連遺伝子導入ベクター）を導入すると共に、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクター（発光関連遺伝子導入ベクター）を導入した生きたものでもよい。また、細胞周期関連遺伝子プロモーターを導入したベクターを細胞１０２０に導入してもよい。具体的には、細胞周期マーカーとして知られているＣｙｃｌｉｎ  Ｂ１プロモーターを導入したＧＦＰセンサー（アマシャムバイオサイエンス社製）を細胞１０２０に導入してもよい。また、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター（プロメガ社製）を細胞１０２０に導入し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（プロメガ社製）を細胞１０２０に添加して、細胞１０２０を蛍光標識してもよい。また、解析対象の遺伝子プロモーターを導入したルシフェラーゼベクターを細胞１０２０に導入し、発現させてもよい。また、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター（プロメガ社製）を細胞１０２０に導入し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（プロメガ社製）を細胞１０２０に添加して、細胞１０２０をルシフェラーゼ標識してもよい。
【０１１７】
また、蛍光で細胞周期のステージを同定し、発光で解析対象の遺伝子の発現量を測定する場合、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、細胞１０２０の所定の部位（具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きたものでもよい。具体的には、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合した融合遺伝子（具体的には、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクター）を導入し、細胞１０２０の所定の部位（具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きたものでもよい。ここで、細胞１０２０の核を、生細胞核染色試薬“ＤＲＡＱ５”（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ社製）を用いて染色してもよい。また、細胞１０２０の細胞膜を、“ＰＫＨ  ＬｉｎｋｅｒＫｉｔｓ”（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて染色してもよい（ただし、この場合、その形状から細胞周期のステージが同定可能な細胞（具体的にはＰＣ１２など）を用いる。）。
【０１１８】
また、発光で細胞周期のステージを同定し、蛍光で解析対象の遺伝子の発現量を測定する場合、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを関連付けて導入すると共に、蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを関連付けて導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクター（発光関連遺伝子導入ベクター）を導入すると共に、蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクター（蛍光関連遺伝子導入ベクター）を導入した生きたものでもよい。また、細胞周期関連遺伝子プロモーターを導入したベクターを細胞１０２０に導入してもよい。具体的には、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１プロモーターを導入したルシフェラーゼベクターを作製し、細胞１０２０に導入してもよい。また、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター（プロメガ社製）を細胞１０２０に導入し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（プロメガ社製）を細胞１０２０に添加して、細胞１０２０をルシフェラーゼ標識してもよい。また、解析対象の遺伝子プロモーターを導入した蛍光タンパク質ベクターを細胞１０２０に導入し、発現させてもよい。また、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター（プロメガ社製）を細胞１０２０に導入し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（プロメガ社製）を細胞１０２０に添加して、細胞１０２０を蛍光標識してもよい。また、β−ｌａｃｔａｍａｓｅ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞１０２０に導入してもよい。
【０１１９】
なお、細胞周期関連遺伝子としては、サイクリン（具体的には、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ３、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｃ、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ３、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｆ、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｇ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｇ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｈ、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｉ、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｔ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｔ２ａ、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｔ２ｂなど）、サイクリンキナーゼ（具体的には、ＣＤＫ２、ＣＤＫ２８など）などを適用してもよい。また、解析対象の遺伝子としては、上述した細胞周期関連遺伝子、サーカディアンリズム調節遺伝子（具体的には、ｐｅｒｉｏｄ遺伝子、Ｋａｉ遺伝子、ｔｉｍｅｌｅｓｓ遺伝子、ｐｅｒ遺伝子、ｃｌｏｃｋ遺伝子など）、その他細胞周期との関連性が不明な遺伝子などを適用してもよい。
【０１２０】
再び図２０の説明に戻り、発光画像撮像ユニット１０６０は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２０の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６０は、図示の如く、対物レンズ１０６０ａと、ダイクロイックミラー１０６０ｂと、ＣＣＤカメラ１０６０ｃと、で構成されている。対物レンズ１０６０ａは、具体的には、（開口数／倍率）2の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６０ｂは、細胞１０２０から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、対物レンズ１０６０ａを介して当該ＣＣＤカメラ１０６０ｃのチップ面に投影された細胞１０２０の発光画像や明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、情報通信端末１１００と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２０が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２０の発光画像や明視野画像を撮像してもよい。なお、図２０では、ダイクロイックミラー１０６０ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６０ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６０は、対物レンズ１０６０ａおよび１台のＣＣＤカメラ１０６０ｃで構成されてもよい。
【０１２１】
ここで、２色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６０は、図２１に示すように、対物レンズ１０６０ａと、ＣＣＤカメラ１０６０ｃと、スプリットイメージユニット１０６０ｄと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、スプリットイメージユニット１０６０ｄを介して当該ＣＣＤカメラ１０６０ｃのチップ面に投影されたサンプル１０２０の発光画像（スプリットイメージ）や明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６０ｄは、細胞１０２０から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６０ｂと同様、２色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【０１２２】
また、複数色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６０は、図２２に示すように、対物レンズ１０６０ａと、ＣＣＤカメラ１０６０ｃと、フィルターホイール１０６０ｅと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、フィルターホイール１０６０ｅを介して当該ＣＣＤカメラ１０６０ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像や明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６０ｅは、細胞１０２０から発せられた発光をフィルター交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【０１２３】
再び図２０に戻り、蛍光画像撮像ユニット１０８０は、具体的には倒立型の蛍光顕微鏡であり、細胞１０２０の蛍光画像を撮像する。蛍光画像撮像ユニット１０８０は、図示の如く、対物レンズ１０８０ａと、ダイクロイックミラー１０８０ｂと、キセノンランプ１０８０ｃと、ＣＣＤカメラ１０８０ｄと、で構成されている。ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、対物レンズ１０８０ａを介して当該ＣＣＤカメラ１０８０ｄのチップ面に投影された細胞１０２０の蛍光画像や明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、情報通信端末１１００と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２０が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２０の蛍光画像や明視野画像を撮像してもよい。ダイクロイックミラー１０８０ｂは、細胞１０２からの蛍光を透過するとともに、キセノンランプ１０８０ｃから照射された励起光が細胞１０２０へ照射されるように励起光の方向を変える。キセノンランプ１０８０ｃは励起光を照射する。
【０１２４】
ここで、発光画像撮像ユニット１０６０および蛍光画像撮像ユニット１０８０は、具体的には、それぞれ倒立型の発光顕微鏡および倒立型の蛍光顕微鏡でもよく、ステージ１０４０は回転するものでもよい。
【０１２５】
情報通信端末１１００は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、情報通信端末１１００は、図２３に示すように、大別して、制御部１１２０と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４０と、記憶部１１６０と、通信インターフェース部１１８０と、入出力インターフェース部１２００と、入力部１２２０と、出力部１２４０と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【０１２６】
記憶部１１６０は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６０は制御部１１２０の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。
【０１２７】
通信インターフェース部１１８０は、情報通信端末１１００と、ＣＣＤカメラ１０６０ｃおよびＣＣＤカメラ１０８０ｄと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８０は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
【０１２８】
入出力インターフェース部１２００は、入力部１２２０や出力部１２４０に接続する。ここで、出力部１２４０には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力部１２４０をモニタとして記載する場合がある。）。また、入力部１２２０には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニタを用いることができる。
【０１２９】
制御部１１２０は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１０２０は、大別して、蛍光画像撮像指示部１１２０ａと、発光画像撮像指示部１１２０ｂと、蛍光画像取得部１１２０ｃと、発光画像取得部１１２０ｄと、判定部１１２０ｅと、蛍光測定部１１２０ｆと、発光測定部１１２０ｇと、ステージ同定部１１２０ｈと、選択部１１２０ｉ、発現量測定部１１２０ｊと、で構成されている。
【０１３０】
蛍光画像撮像指示部１１２０ａは、通信インターフェース部１１６０を介して、ＣＣＤカメラ１０８０ｄへ蛍光画像や明視野画像の撮像を指示する。発光画像撮像指示部１１２０ｂは、通信インターフェース部１１６０を介して、ＣＣＤカメラ１０６０ｃへ発光画像や明視野画像の撮像を指示する。蛍光画像取得部１１２０ｃは、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像や明視野画像を、通信インターフェース部１１６０を介して取得する。発光画像取得部１１２０ｄは、ＣＣＤカメラ１０６０ｃで撮像した発光画像や明視野画像を、通信インターフェース部１１６０を介して取得する。
【０１３１】
判定部１１２０ｅは、蛍光画像および／または発光画像に基づいて、各遺伝子が導入されているか否かを細胞１０２０ごとに判定する。蛍光測定部１１２０ｆは、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定する。発光測定部１１２０ｇは、ＣＣＤカメラ１０６０ｃで撮像した発光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた発光強度をそれぞれ測定する。
【０１３２】
ステージ同定部１１２０ｈは、蛍光測定部１１２０ｆで測定した蛍光強度または発光測定部１１２０ｇで測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞１０２０ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定する。なお、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位（具体的には核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きた細胞１０２０を対象とした場合、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像に基づいて細胞１０２０の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定してもよい。選択部１１２０ｉは、ステージ同定部１１２０ｈでステージが同定された細胞１０２０の中から測定対象の細胞１０２０を選択する。
【０１３３】
発現量測定部１１２０ｊは、選択部１１２０ｉで選択した細胞１０２０を対象として、ステージ同定部１１２０ｈで発光強度を用いる場合には蛍光測定部１１２０ｆで測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定し、ステージ同定部１１２０ｈで蛍光強度または蛍光画像を用いる場合には発光測定部１１２０ｇで測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定する。なお、発現量測定部１１２０ｊは、複数の細胞１０２０または選択部１１２０ｉで選択した細胞１０２０を対象として、蛍光測定部１１２０ｆで測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を同定してもよい。
【０１３４】
以上の構成において、発現量測定装置１０００で行われる処理の一例を、図２４を参照して説明する。なお、以下では、発光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクターおよび蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクターを複数の細胞１０２０に導入し、導入した複数の細胞１０２０のうち特定の細胞１０２０を対象として、発光強度で細胞周期のステージを同定しながら、蛍光強度で解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定すると共に蛍光画像で解析対象の遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を経時的に同定する場合の処理の一例について説明する。
【０１３５】
まず、情報通信端末１１００は、蛍光画像撮像指示部１１００ａの処理で通信インターフェース部１１６０を介してＣＣＤカメラ１０８０ｄへ蛍光画像の撮像を指示し、発光画像撮像指示部１１２０ｂの処理で通信インターフェース部１１６０を介してＣＣＤカメラ１０６０ｃへ発光画像の撮像を指示する（ステップＳＢ−１）。つぎに、ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、撮像範囲中に存在する複数の細胞１０２０の蛍光画像を撮像し（ステップＳＢ−２）、当該蛍光画像を情報通信端末１１００へ送信する（ステップＳＢ−３）。一方、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、撮像範囲中に存在する複数の細胞１０２０の発光画像を撮像し（ステップＳＢ−４）、当該発光画像を情報通信端末１１００へ送信する（ステップＳＢ−５）。なお、蛍光画像の撮像指示および発光画像の撮像指示は、異なる時刻または時間間隔で行ってもよい。例えば、細胞周期のステージを同定するために用いる発光画像の撮像は数時間おきに行い、解析対象の遺伝子の発現量を測定するために用いる蛍光画像の撮像は数分おきに行ってもよい。また、励起光は蛍光画像を撮像する時のみ細胞１０２０へ照射する。
【０１３６】
つぎに、情報通信端末１１００は、（ａ）蛍光画像取得部１１２０ｃの処理で通信インターフェース部１１６０を介して蛍光画像を取得し、（ｂ）発光画像取得部１１２０ｄの処理で通信インターフェース部１１６０を介して発光画像を取得し、（ｃ）制御部１１２０の処理でクロック発生部１１４０から時刻を取得し、（ｄ）取得した蛍光画像と発光画像と時刻とを対応付けて記憶部１１６０の所定の記憶領域に記憶する（ステップＳＢ−６）。
【０１３７】
つぎに、情報通信端末１１００は、判定部１１２０ｅの処理で、蛍光画像および／または発光画像に基づいて、ベクターが導入されているか否かを細胞１０２０ごとに判定する（ステップＳＢ−７）。つぎに、ベクターが導入されている細胞１０２０が少なくとも１つ存在した場合（ステップＳＢ−８：Ｙｅｓ）、情報通信端末１１００は、蛍光測定部１１２０ｆの処理で蛍光画像に基づいて各細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定すると共に、発光測定部１１２０ｇの処理で発光画像に基づいて各細胞１０２０から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定する（ステップＳＢ−９）。
【０１３８】
つぎに、情報通信端末１１００は、ステージ同定部１１２０ｈの処理で、発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞１０２０ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定する（ステップＳＢ−１０）。なお、蛍光関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子とを融合したベクターおよび発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクターを細胞１０２０に導入した場合、蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞１０２０ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定してもよい。また、発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを融合したベクターを細胞１０２０に導入し、その所定の部位（具体的には核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した場合、蛍光画像に基づいて細胞１０２０の形状が変化したか否かを細胞１０２０ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定してもよい。
【０１３９】
つぎに、情報通信端末１１００は、選択部１１２０ｉの処理で、ステップＳＡ−１０でステージが同定された細胞１０２０の中から測定対象の細胞１０２０を選択する（ステップＳＢ−１１）。つぎに、情報通信端末１１００は、発現量測定部１１２０ｊの処理で、ステップＳＢ−１１で選択した細胞１０２０を対象として、蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を同定する（ステップＳＢ−１２）。なお、ステップＳＢ−１０において蛍光強度または蛍光画像を用いる場合、ステップＳＢ−１２では、発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定してもよい。
【０１４０】
そして、情報通信端末１１００は、制御部１１２０の処理で、上述したステップＳＢ−１〜ステップＳＢ−１２までの処理を例えば予め設定した時間間隔で所定の回数繰り返し実行し、所定の回数終了した場合（ステップＳＢ−１３：Ｙｅｓ）には処理を終了する。
ここで、発光画像および蛍光画像の撮像および取得だけを繰り返し実行し、解析の時点で、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞１０２０の選択、発現量の測定を行ってもよい。つまり、解析に必要な元データである発光画像および蛍光画像だけをまとめて取得し、その後、解析の時点で、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞１０２０の選択、発現量の測定を行ってもよい。具体的には、発光画像および蛍光画像の取得後に、解析の時点で、細胞１０２０の選択、発現量の測定を行ってもよい。また、発光画像および蛍光画像の取得を行った後、解析の時点で、ステージの同定、細胞１０２０の選択を行ってもよい。また、発光画像および蛍光画像の取得後に、解析の時点で、細胞１０２０の選択を行ってもよい。
また、蛍光画像を取得した後、測定対象の細胞１０２０を選択し、そして発光画像を取得してもよい。
【０１４１】
以上、詳細に説明したように、発現量測定装置１０００によれば、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入した生きた細胞１０２０を対象として、細胞１０２０から発せられた発光の発光強度を測定し、細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度を測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定するにあたって、細胞は、発光関連遺伝子、蛍光関連遺伝子および解析対象の遺伝子に加えてさらに細胞周期関連遺伝子を導入したものであり、発現量の測定で発光強度を用いる場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いる場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を判定することで、細胞周期のステージを同定する。これにより、細胞１０２０に導入した解析対象の遺伝子の発現量の測定において同調培養の操作を行わずに当該細胞１０２０に対して細胞周期のステージを同定することができ、その結果、実験者の作業的な負担を軽減することができる。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができる。具体的には、細胞周期との直接の関与が不明である解析対象の遺伝子に関して、薬剤投与や温度変化などの刺激で引き起こされる発現量の変化を細胞周期のステージと共に得ることができるので、当該解析対象の遺伝子と細胞周期との関与を検証することができる。また、細胞周期との直接の関与が示唆される解析対象の遺伝子に関して、当該解析対象の遺伝子の発現量と細胞周期のステージとを一緒に取得することができるので、当該解析対象の遺伝子が細胞周期マーカーとして有用であるか否かを評価することができる。なお、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位（具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きた細胞１０２０を対象とした場合、発現量測定装置１０００は、細胞１０２０から発せられた発光の発光強度を測定し、測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定し、当該細胞１０２０の蛍光画像を撮像し、撮像した蛍光画像に基づいて細胞１０２０の形状が変化したか否かを判定することで、細胞周期のステージを同定してもよい。なお、発光誘導蛋白遺伝子の取り込みを確認するための方法を除き、蛍光融合遺伝子の変わりに蛍光色素を用いてもよいが、励起光による光毒性の影響を最小限にするために、蛍光色素による撮像は、蛍光のみで撮像する場合に比べて撮像回数を減らすようにすることができる。また、発現量測定装置１０００は、例えば、各種反応（例えば薬物刺激や光照射など）の検査や治療などに好適に用いることができる。
【０１４２】
ここで、これまでは、レポーターアッセイを行う際に、様々な細胞周期ステージの細胞を一群のデータとして取り扱っていた。細胞周期は、細胞の成長、ＤＮＡの複製、染色体の分配、細胞の分裂などからなる複数の連続反応であり、そのステージにより様々な遺伝子の発現が変動することは十分に考えられる。そこで、発現量測定装置１０００を利用すれば、細胞周期への直接の関与が不明である遺伝子に関して、薬剤や温度変化など、何らかの刺激により引き起こされる遺伝子発現量変化を検出したい場合に、細胞周期データと合わせることで、より詳細な解析結果が得られる。また、発現量測定装置１０００を利用すれば、細胞周期との直接の関与が示唆される遺伝子に関しても、各細胞の細胞周期のステージが判別できるので、従来行ってきた同調培養などの操作を必要とせず、解析を行いたいステージの細胞のみを選択し、観察対象とすることができる。
【０１４３】
また、発現量測定装置１０００によれば、細胞１０２０が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞１０２０の蛍光画像を撮像し、複数の細胞１０２０の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を細胞１０２０ごとに測定し、発現量の測定で発光強度を用いる場合には測定した蛍光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞１０２０ごとに判定し、発現量の測定で蛍光強度を用いる場合には測定した発光強度に基づいて細胞周期関連遺伝子の発現の有無を細胞１０２０ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定する。これにより、複数の細胞１０２０を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を細胞１０２０ごとに測定すると共に、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定することができる。また、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を細胞１０２０ごとに評価することができる。なお、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位（具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きた細胞１０２０を対象とした場合、発現量測定装置１０００は、撮像範囲中に存在する複数の細胞１０２０の発光画像を撮像し、複数の細胞１０２０の蛍光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、測定した発光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を細胞１０２０ごとに測定し、撮像した蛍光画像に基づいて細胞１０２０の形状が変化したか否かを細胞１０２０ごとに判定することで、細胞周期のステージを細胞１０２０ごとに同定してもよい。また、細胞周期ごとに比較することにより、条件が等しい細胞同士の比較評価を行うようにしてもよい。
【０１４４】
また、発現量測定装置１０００によれば、ステージが同定された細胞１０２０の中から測定対象の細胞１０２０を選択し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて、選択した細胞１０２０に導入された解析対象の遺伝子の発現量を測定する。これにより、複数の細胞１０２０の中から個々の細胞１０２０を識別し、単一の細胞１０２０を対象として、解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、細胞周期のステージを同定することができる。
【０１４５】
また、発現量測定装置１０００によれば、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、蛍光強度の測定、ステージの同定、細胞１０２０の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞１０２０を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定する。これにより、単一の細胞１０２０を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量の変動を経時的に測定することができる。なお、発光タンパク質を発現する発光関連遺伝子と解析対象の遺伝子とを導入し、その所定の部位（具体的には、核、細胞膜、細胞質など）を蛍光物質で染色した生きた細胞１０２０を対象とした場合、発現量測定装置１０００は、発光画像の撮像、蛍光画像の撮像、発光強度の測定、ステージの同定、細胞１０２０の選択、発現量の測定を繰り返し実行することで、選択した細胞１０２０を対象として、細胞周期のステージを同定しながら解析対象の遺伝子の発現量を経時的に測定してもよい。また、同一視野内の異なる細胞を、各々の細胞周期に応じたタイミングで撮像したタイムラプス映像または１画像上に同時に画像再生することにより、細胞周期を一致させた動画（またはコマ送り）ないし１画像表示をしてもよい。
【０１４６】
また、発現量測定装置１０００によれば、発現量の測定において、選択された細胞１０２０を対象として、測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、撮像した蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を同定する。これにより、解析対象の遺伝子と細胞周期のステージとの関連性を評価することができるだけでなく、解析対象の遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を得ることができる。
【０１４７】
また、発現量測定装置１０００を利用すれば、具体的には、抗がん剤およびそのリード化合物の評価を行うことができる。特に、抗がん剤が細胞分裂の効率に有害な作用を持つかどうかの判断と、そのリード化合物が解析対象遺伝子の転写活性に影響を与えるかどうかを同時にモニターすることができる。また、発現量測定装置１０００を利用すれば、具体的には、細胞周期と細胞の形態との関連を調べることができる。特に、ＰＣ１２細胞などにおいては、細胞周期ステージ、分化段階によって形態が変わることが知られているが、その他の神経様細胞においても、細胞形態による詳細なステージ同定を行うことができ、細胞形態そのものを細胞周期または分化のフェーズマーカーとして用いることができる。また、発現量測定装置１０００を利用すれば、具体的には、細胞周期に関わる可能性のある遺伝子において、発光検出にて細胞周期をモニタリングしながら、蛍光検出にて発現時期・局在性を同定することで、細胞周期との関連性の有無、または細胞周期マーカーとしての有用性を評価することができる。
【０１４８】
［ＩＩＩ］以下、添付図面を参照して、本発明にかかる測定装置としての顕微鏡ユニットおよび顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付している。
【０１４９】
（実施の形態１）まず、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置について説明する。図２５は、この実施の形態１にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図２５に示すように、この実施の形態１にかかる顕微鏡装置１００ａは、蛍光観察を行う蛍光顕微鏡ユニット１０１と、微弱光観察を行う微弱光観察ユニット１０２ａと、発光標識および蛍光標識が付与された標本Ｓを保持する保持手段としての保持部７と、各顕微鏡ユニット１０１，１０２ａによって撮像した標本Ｓの標本像等を表示するモニター９と、顕微鏡装置１００ａの全体の処理および動作を制御する制御装置ＰＣ１と、を備える。蛍光顕微鏡ユニット１０１と微弱光顕微鏡ユニット１０２ａとは、互いに隣接して配置される。
【０１５０】
蛍光顕微鏡ユニット１０１は、蛍光対物レンズとしての対物レンズ１および蛍光結像レンズとしての結像レンズ２を有する高倍率の蛍光結像光学系と、この蛍光結像光学系によって結像される標本Ｓの標本像である蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段としての撮像装置３と、標本Ｓを励起する励起光を発する励起光源４と、励起光源４からの励起光を集光するレンズ５と、蛍光ユニットとしての蛍光キューブ６と、を備える。
【０１５１】
対物レンズ１は、標本側に大きなＮＡを有し、標本Ｓに付与された蛍光標識の各点から発せられる蛍光をほぼ平行光束に変換する。結像レンズ２は、対物レンズ１によってほぼ平行光束に変換された蛍光を集光して標本Ｓの標本像である蛍光標本像を結像する。蛍光結像光学系は、蛍光標本像を４０倍以上の高倍率で結像する。撮像装置３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像される蛍光標本像を撮像し、画像データを生成して制御装置ＰＣ１に出力する。
【０１５２】
蛍光キューブ６は、標本Ｓを励起するための励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルターとしての励起フィルター６ａと、この励起光によって励起された標本Ｓから発せられる蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターとしての吸収フィルター６ｂと、励起光を反射して蛍光を透過させるダイクロイックミラー６ｃとを一体に備える。励起フィルター６ａは、励起光源４から発せられる各種波長の光の中から所定の波長域の励起光を抽出するバンドパスフィルターであり、吸収フィルター６ｂは、所定のカットオフ波長を有するロングウェーブパスフィルターである。なお、吸収フィルター６ｂは、所定の波長範囲の蛍光を抽出するバンドパスフィルターでもよい。バンドパスフィルターは、標本Ｓから発せられる微弱光と蛍光の波長が近い場合に有効である。
【０１５３】
励起光源４は、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザー等によって実現され、励起光照射手段としての励起光源４およびレンズ５は、励起光源４からの励起光を、励起光フィルター６ａを介し、ダイクロイックミラー６ｃによって反射させ標本Ｓに照射する。なお、励起光源４は、制御装置ＰＣ１からの指示をもとに点灯および消灯を行う。
【０１５４】
微弱光顕微鏡ユニット１０２ａは、微弱光対物レンズとしての対物レンズ１１および微弱光結像レンズとしての結像レンズ１２を有する低倍率の微弱光結像光学系と、この微弱光結像光学系によって結像される標本Ｓの標本像である微弱光標本像を撮像する微弱光撮像手段としての撮像装置１３と、を備える。
【０１５５】
対物レンズ１１は、標本側に大きなＮＡを有し、標本Ｓに付与された発光標識の各点から自己発光によって発せられる微弱光をほぼ平行光束に変換する。結像レンズ１２は、対物レンズ１１によってほぼ平行光束に変換された微弱光を集光して標本Ｓの標本像である微弱光標本像を結像する。微弱光結像光学系は、蛍光結像光学系の結像倍率よりも低い結像倍率で微弱光標本像を結像する。このとき、微弱光結像光学系は、標本側のＮＡをＮＡｏ、結像倍率をβとして、（ＮＡｏ／β）2≧０．０１を満足することが望ましい。
【０１５６】
撮像装置１３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像される微弱光標本像を撮像し、画像データを生成して制御装置ＰＣ１に出力する。なお、撮像装置１３が有する固体撮像素子は、高感度のモノクロームＣＣＤであって０℃程度の冷却ＣＣＤを用いるとよい。
【０１５７】
保持部７は、標本Ｓを直接載置するプレパラート、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体、インキュベーター等の保持部材７ａと、この保持部材７ａとともに標本Ｓを２次元的に移動させる可動ステージ７ｂとを有する。可動ステージ７ｂは、制御装置ＰＣ１からの指示をもとに、ステージ駆動部８によって駆動される。
【０１５８】
制御装置ＰＣ１は、ＣＰＵを備えたコンピュータ等の処理装置によって実現され、撮像装置３，１３、励起光源４、ステージ駆動部８およびモニター９を電気的に接続し、これらの各構成部位の動作を制御する。制御装置ＰＣ１は、特に、撮像切換制御手段として、撮像装置１３によって撮像される微弱光標本像の像特性をもとに、微弱光顕微鏡ユニット１０２ａによる微弱光標本像の撮像と、蛍光顕微鏡ユニット１０１による蛍光標本像の撮像とを切り換える撮像切換処理の制御を行う。
【０１５９】
ここで、制御装置ＰＣ１が制御する撮像切換処理について説明する。図２６は、撮像切換処理の処理手順を示すフローチャートである。図２６に示すように、制御装置ＰＣ１は、可動ステージ７ｂによって微弱光結像光学系の視野内に移動された標本Ｓの微弱光標本像を撮像装置１３によって撮像する（ステップＳ１０１）。この撮像結果をもとに、制御装置ＰＣ１は、微弱光標本像の像特性としての像強度があらかじめ設定したしきい値より大きい領域が微弱光標本像内にあるか否かを判断する（ステップＳ１０３）。像強度がしきい値より大きい領域がないと判断された場合（ステップＳ１０３：Ｎｏ）、制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０１からの処理を繰り返す。
【０１６０】
一方、像強度がしきい値より大きい領域があると判断された場合（ステップＳ１０３：Ｙｅｓ）、制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０１で撮像した微弱光標本像を記録し（ステップＳ１０５）、可動ステージ７ｂによって蛍光結像光学系の視野内に標本Ｓを移動する（ステップＳ１０７）。そして、制御装置ＰＣ１は、微弱光標本像の像強度がしきい値より大きい領域に対応する蛍光標本像を撮像装置３によって撮像して記録し（ステップＳ１０９）、撮像切換処理を終了する。なお、標本Ｓの経過観察を行う場合、制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０９の後、可動ステージ７ｂによって標本Ｓを再び微弱光結像光学系の視野内に移動し、ステップＳ１０１からの処理を繰り返すように制御するとよい。また、ステップＳ１０９での撮像は、タイムラプス撮像または１画像の撮像のどちらでもよい。また、同一視野内の異なる細胞を、各々の細胞周期に応じたタイミングで撮像したタイムラプス映像または１画像上に同時に画像再生することにより、細胞周期を一致させた動画（またはコマ送り）ないし１画像表示をしてもよい。
【０１６１】
制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０５およびＳ１０９では、撮像した微弱光標本像および蛍光標本像を自装置内に備えるＲＡＭ等の記憶部に記憶する。また、制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０１およびＳ１０９では、撮像した微弱光標本像および蛍光標本像をモニター９に逐次表示するようにしてもよい。さらに、制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０１〜Ｓ１０５の間、すなわち、微弱光顕微鏡ユニット１０２によって標本Ｓの微弱光観察を行っている間、励起光源４を消灯し、ステップＳ１０９で標本Ｓの蛍光観察を行う場合、励起光源４を点灯するように制御を行うとよい。あるいは、励起光源４から蛍光ユニット６までの光路上にシャッター等の遮光装置を設け、制御装置ＰＣ１は、未照射手段として、励起光源４を点灯および消灯する替わりに、遮光装置を開閉することによって励起光の照射を制御するようにしてもよい。
【０１６２】
なお、制御装置ＰＣ１は、ステップＳ１０３では、微弱光標本像内の部分的な領域の像強度をもとに蛍光観察への切り換えを判断するようにしたが、微弱光標本像の全体の像強度をもとに切り換えを判断するようにしてもよい。また、制御装置ＰＣ１は、これらの像強度を、たとえば、所定時点から現時点までの累積の像強度として取得してもよく、あるいは現時点の瞬間的な像強度として取得してもよい。なお、微弱光標本像の全体の像強度を取得する場合には、撮像装置１３に替えてフォトマルチプライヤー等の高感度の受光素子を用いてもよい。
【０１６３】
以上説明したように、この実施の形態１にかかる顕微鏡装置によれば、蛍光観察用の蛍光顕微鏡ユニット１０１と微弱光観察用の微弱光顕微鏡ユニット１０２ａとを隣接して備えるとともに、蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の各視野内に標本Ｓを移動させる可動ステージ７ｂとを備えるため、適宜に蛍光観察と微弱光観察とを切り換えることができ、また、微弱光標本像の像特性としての像強度に応じて、微弱光観察から蛍光観察へ即時に切り換えることができる。
【０１６４】
なお、微弱光結像光学系は、対物レンズ１１および結像レンズ１２によって標本像を結像する無限遠補正光学系として説明したが、対物レンズのみによって標本像を結像する有限補正光学系としてもよい。
【０１６５】
また、上述した撮像切換処理では、微弱光標本像の像強度等の像特性をもとに微弱光観察から蛍光観察に切り換えるようにしたが、蛍光観察で標本Ｓに照射する励起光強度や標本Ｓから発光される蛍光強度が弱く、励起光および蛍光によって標本Ｓに与えるダメージが小さい場合などには、蛍光標本像の像強度等の像特性をもとに蛍光観察から微弱光観察に切り換えるようにしてもよい。
【０１６６】
（実施の形態２）つぎに、本発明の実施の形態２について説明する。上述した実施の形態１では、可動ステージ７ｂによって蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の各視野内に標本Ｓを移動させるようにしたが、この実施の形態２では、蛍光結像光学系および微弱光結像光学系を移動させることによって各視野内に標本Ｓを配置するようにしている。
【０１６７】
図２７は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図２７に示すように、この実施の形態２にかかる顕微鏡装置２００は、顕微鏡装置１００ａと同様に蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２を備え、また、これらの各顕微鏡ユニット２０１，２０２の中間位置に光学系移動手段としての回転駆動装置１４および保持軸１５ａ，１５ｂを備える。さらに、顕微鏡装置２００は、顕微鏡装置１００ａが備えた保持部７に替えて、可動範囲を小さくした可動ステージ１７ｂを有する保持部１７を備えるとともに、制御装置ＰＣ１に替えて、制御装置ＰＣ２を備える。その他の構成は、実施の形態１と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。
【０１６８】
蛍光顕微鏡ユニット２０１は、蛍光顕微鏡ユニット１０１と同じ各構成部位を一体に保持する筐体２１を備え、微弱光顕微鏡ユニット２０２は、微弱光顕微鏡ユニット１０２ａと同じ各構成部位を一体に保持する筐体２２を備える。
【０１６９】
回転駆動装置１４は、蛍光顕微鏡ユニット２０１が備える蛍光結像光学系および微弱光顕微鏡ユニット２０２が備える微弱光結像光学系の各視野の略中心点を結ぶ線分の中点を通り各光学系の光軸に略平行な回転軸を有し、この回転軸を中心に、複数の保持軸１５ａ，１５ｂによって保持した蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２を回転移動させる。ここで、固定軸１５ａ，１５ｂは、それぞれ筐体２１，２２を保持している。
【０１７０】
可動ステージ１７ｂは、微弱光結像光学系の視野と概ね等しい範囲内で標本Ｓを移動させる。また、可動ステージ１７ｂは、制御装置ＰＣ２からの指示をもとに、ステージ駆動部１８によって駆動される。
【０１７１】
制御装置ＰＣ２は、制御装置ＰＣ１と同様に撮像装置３，１３、励起光源４およびステージ駆動部１８の動作を制御するのに加えて、回転駆動装置１４の動作を制御する。制御装置ＰＣ２は、微弱光観察と蛍光観察とを切り換える場合、回転駆動装置１４を制御して蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２の配置を切り換える。
【０１７２】
このように、この実施の形態２にかかる顕微鏡装置２００よれば、回転駆動装置１４によって蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２を回転移動して蛍光観察と微弱光観察とを切り換えられるようにしているため、たとえば、培養液中に浸された標本等、高速で移動させることができない標本を観察対象とする場合でも、即時に蛍光観察と微弱光観察とを切り換えることができる。
【０１７３】
なお、顕微鏡装置２００では、回転駆動装置１４によって各顕微鏡ユニット２０１，２０２の全体を回転移動させるようにしているが、撮像装置３，１３を１つの撮像装置で共用し、蛍光顕微鏡ユニット２０１から撮像装置３を除いた部分と、微弱光顕微鏡ユニット２０２から撮像装置１３を除いた部分とを回転移動させて、互いに配置を切り換えるようにしてもよい。
【０１７４】
図２８は、このようにした場合の顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図２８に示すように、この実施の形態２の変形例としての顕微鏡装置３００は、顕微鏡装置２００から撮像装置１３を取り除き、微弱光顕微鏡ユニット２０２の全体を一体に保持した筐体２２に替えて、微弱光結像光学系を一体に保持する筐体２４を備えるとともに、蛍光顕微鏡ユニット２０１の全体を一体に保持した筐体２１に替えて、撮像装置３を除いた部分を一体に保持する筐体２３を備える。また、顕微鏡装置３００は、制御装置ＰＣ２に替えて、制御装置ＰＣ３を備える。その他の構成は、顕微鏡装置２００と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。
【０１７５】
制御装置ＰＣ３は、制御装置ＰＣ２と同様に撮像装置３、励起光源４、ステージ駆動部１８および回転駆動装置１４の動作を制御する。ただし、制御装置ＰＣ２が蛍光観察と微弱光観察とに応じて撮像装置３，１３の制御を切り換えていたのに対し、制御装置ＰＣ３は、蛍光観察および微弱光観察の両方の場合で撮像装置３を制御して標本像を撮像するようにしている。このとき、制御装置ＰＣ３は、蛍光観察および微弱光観察に応じて、撮像装置３によって撮像される標本像の範囲、結像倍率等を切り換えて認識する。
【０１７６】
なお、回転駆動装置１４は、固定軸１５ａ，１５ｂによって筐体２３，２４を保持し、制御装置ＰＣ３からの指示をもとに、微弱光観察および蛍光観察に応じて、筐体２３，２４の配置を切り換える。
【０１７７】
このように、この実施の形態２の変形例としての顕微鏡装置３００よれば、蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２から撮像装置３，１３を除く部分を回転駆動装置１４によって回転移動して蛍光観察と微弱光観察とを切り換えられるようにしているため、移動部分が軽量化され、より高速に移動および切り換えを行うことができる。また、顕微鏡装置３００では、顕微鏡装置１００ａ，２００に比して撮像装置の数を削減しているため、撮像装置に関連する回路構成を簡略化することができるとともに、制御装置ＰＣ３の処理負荷を軽減させて処理の高速化をはかることができる。また、装置を安価にすることができる。
【０１７８】
なお、顕微鏡装置２００，３００では、回転駆動装置１４によって蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２、またはこれら各ユニットの一部を回転移動させるようにしたが、回転移動に限らず、たとえば、可動ステージ１７ｂに沿って蛍光顕微鏡ユニット２０１および微弱光顕微鏡ユニット２０２を平行移動させて、各ユニット２０１，２０２の配置を切り換えるようにしてもよい。
【０１７９】
（実施の形態３）つぎに、本発明の実施の形態３について説明する。上述した実施の形態１および実施の形態２では、標本Ｓの同じ側に配置され独立した蛍光結像光学系および微弱光結像光学系を備えるようにしていたが、この実施の形態３では、光学系の一部を共用した蛍光結像光学系および微弱光結像光学系を備えるようにしている。
【０１８０】
図２９は、本発明の実施の形態３にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図２９に示すように、この実施の形態３にかかる顕微鏡装置４００は、顕微鏡装置１００ａが独立して備えた蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の対物レンズを共用し、一体化した顕微鏡ユニットを備える。具体的には、顕微鏡装置４００は、顕微鏡装置１００ａが備えた蛍光顕微鏡ユニット１０１と同様の顕微鏡ユニットを備え、さらに、この顕微鏡ユニットが有する対物レンズ１と蛍光キューブ６との間に挿脱可能なミラー３４を備え、このミラー３４によって図上で左側に約９０度に折り曲げられる光軸上に、結像レンズ１２に替わる結像レンズ３２と撮像装置１３とを備える。
【０１８１】
このようにして顕微鏡装置４００は、対物レンズ１を共用し、対物レンズ１と結像レンズ２を有する蛍光結像光学系と、対物レンズ１と結像レンズ３２とを有する微弱光結像光学系とを備える。また、顕微鏡４００は、顕微鏡装置２００が備えた保持部１７およびステージ駆動部１８を備えるとともに、励起光源４とレンズ５との間に未照射手段としてのシャッター３３と、このシャッター３３およびミラー３４を動作させる光路切換駆動部３５と、制御装置ＰＣ４と、を備える。その他の構成は、実施の形態１または実施の形態２と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。
【０１８２】
制御装置ＰＣ４は、制御装置ＰＣ２と同様に撮像装置３，１３およびステージ駆動部１８の動作を制御するのに加えて、光路切換駆動部３５を介してシャッター３３およびミラー３４の動作を制御する。制御装置ＰＣ４は、微弱光観察から蛍光観察に切り換える場合、対物レンズ１と蛍光キューブ６との間からミラー３４を取り除き、シャッター３３を開いて励起光源４からの励起光を標本Ｓに照射させる。一方、蛍光観察から微弱光観察に切り換える場合、制御装置ＰＣ４は、シャッター３３を閉じて励起光源４からの励起光を遮光し、標本Ｓに対して励起光を未照射にするとともに、対物レンズ１と蛍光キューブ６との間の光路上にミラー３４を挿入し配置して、標本Ｓからの微弱光を結像レンズ３２に向けて反射させる。
【０１８３】
なお、結像レンズ３２は、結像レンズ２よりも短い焦点距離を有し、結像レンズ３２を有する微弱光結像光学系は、結像レンズ２を有する蛍光結像光学系の結像倍率よりも低い結像倍率で微弱光標本像を結像する。また、結像レンズ３２を有する微弱光結像光学系は、標本側のＮＡをＮＡｏ’、結像倍率をβ’として、（ＮＡｏ’／β’）2≧０．０１を満足することが望ましい。
【０１８４】
このように、この実施の形態３にかかる顕微鏡装置４００よれば、対物レンズを共用した蛍光結像光学系および微弱光結像光学系によって一体化した顕微鏡ユニットを備えるようにしているため、顕微鏡装置全体の小型化および簡素化をはかることができるとともに、蛍光観察と微弱光観察との切り換えにともなう移動部分が単一の光学素子となって軽量化されるため、より高速に移動および切り換えを行うことができる。
【０１８５】
なお、励起光源４からの励起光および標本Ｓからの蛍光と、標本Ｓからの微弱光との波長帯域が異なる場合、ミラー３４に替えて、励起光および蛍光を透過させるとともに微弱光を反射させるダイクロイックミラーを用いるようにしてもよい。この場合、制御装置ＰＣ４は、蛍光観察と微弱光観察とを切り換える場合、ダイクロイックミラーを挿脱する必要はない。また、ダイクロイックミラーを用いる場合、制御装置ＰＣ４は、蛍光観察と微弱光観察とを同時に行うように制御してもよい。
【０１８６】
（実施の形態４）つぎに、本発明の実施の形態４について説明する。上述した実施の形態１では、標本Ｓに対して同じ側に蛍光顕微鏡ユニット１０１および微弱光顕微鏡ユニット１０２ａを配置するようにしたが、この実施の形態４では、標本Ｓに対して互いに反対側に蛍光顕微鏡ユニットおよび微弱光顕微鏡ユニットを配置するようにしている。
【０１８７】
図３０は、本発明の実施の形態４にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図３０に示すように、この実施の形態４にかかる顕微鏡装置５００は、顕微鏡装置１００ａが備えた蛍光顕微鏡ユニット１０１および微弱光顕微鏡ユニット１０２ａを備えるとともに、顕微鏡装置２００が備えた保持部１７およびステージ駆動部１８を備え、さらに、制御装置ＰＣ５およびモニター９を備える。実施の形態１または実施の形態２と同じ構成部分には同一符号を付している。
【０１８８】
図３０に示す顕微鏡装置５００では、蛍光顕微鏡ユニット１０１は、図上で標本Ｓの下側に配置され、微弱光顕微鏡ユニット１０２ａは、標本Ｓの上側に配置されている。なお、これら各ユニット１０１，１０２ａの上下の配置関係は逆転させてもよい。
【０１８９】
制御装置ＰＣ５は、制御装置ＰＣ２と同様に撮像装置３，１３、励起光源４およびステージ駆動部１８の動作を制御する。制御装置ＰＣ５は、微弱光観察から蛍光観察に切り換える場合、励起光源４を点灯して標本Ｓに励起光を照射させ、蛍光観察から微弱光観察に切り換える場合、励起光源４を消灯し標本Ｓに対して励起光を未照射にする。
【０１９０】
なお、励起光源４からダイクロイックミラー６ｃを介した標本Ｓまでの光路上にシャッター３３等の遮光装置を設け、制御装置ＰＣ５は、未照射手段として、励起光源４を点灯および消灯する替わりに、遮光装置を開閉することによって励起光の照射および未照射を制御するようにしてもよい。
【０１９１】
また、励起光源４からの励起光および標本Ｓからの蛍光と、標本Ｓからの微弱光との波長帯域が異なる場合、たとえば、結像レンズ１２と撮像装置１３との間に、微弱光を透過させるとともに励起光および蛍光を遮光する波長抽出フィルターを設け、制御装置ＰＣ５は、励起光源４を消灯させることなく蛍光観察と微弱光観察とを切り換えるようにしてもよい。あるいは、この場合、制御装置ＰＣ５は、蛍光観察と微弱光観察とを同時に行うように制御してもよい。
【０１９２】
このように、この実施の形態４にかかる顕微鏡装置５００よれば、標本Ｓに対して互いに反対側に蛍光顕微鏡ユニット１０１および微弱光顕微鏡ユニット１０２ａを配置するようにしているため、機械的な駆動を全くさせることなく、蛍光観察と微弱光観察とを即時に切り換えることができる。
【０１９３】
なお、制御装置ＰＣ５は、図示しない駆動装置によって蛍光顕微鏡ユニット１０１を微弱光顕微鏡ユニット１０２ａに対して、可動ステージ１７ｂに沿って相対的に移動させるようにしてもよい。この場合、微弱光顕微鏡ユニット１０２ａによって標本Ｓの広範囲な領域を観察し続けながら、この広範囲な領域内の任意の微小領域の拡大像を蛍光顕微鏡ユニット１０１によって観察することができるとともに、標本Ｓを全く移動させることなく蛍光観察および微弱光観察を行うことができる。
【０１９４】
（実施の形態５）つぎに、本発明の実施の形態５について説明する。上述した実施の形態１〜４では、発光標識および蛍光標識からの微弱光および蛍光によって標本Ｓを観察するようにしていたが、この実施の形態５では、さらに透過照明によって標本Ｓを観察するようにしている。
【０１９５】
図３１は、本発明の実施の形態５にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図３１に示すように、この実施の形態５にかかる顕微鏡装置６００は、実施の形態１にかかる顕微鏡装置１００ａに加えて、透過照明を行う照明手段としての透過照明ユニット１０３ａと、この透過照明ユニット１０３ａが有するシャッター４３等を駆動させる照明駆動部４６と、制御装置ＰＣ１に替わる制御装置ＰＣ６と、を備える。その他の構成は、実施の形態１と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。
【０１９６】
透過照明ユニット１０３ａは、透過照明用の白色光を発するハロゲンランプ等の白色光源４４と、白色光の照射および未照射を切り換えるシャッター４３と、白色光源４４からの白色光を標本Ｓ上に集光させる照明レンズ系４５とを備え、標本Ｓに対して、蛍光顕微鏡ユニット１０１と反対側に配置されている。照明レンズ系４５は、コレクタレンズ４５ａおよびコンデンサーレンズ４５ｂを有し、標本Ｓに対してクリティカル照明を行う。なお、照明レンズ系４５は、標本Ｓに対してケーラー照明を行うようにしてもよい。
【０１９７】
照明駆動部４６は、制御装置ＰＣ６からの指示をもとに、シャッター４３および蛍光照明ユニット１０４ａを駆動する。ここで、蛍光照明ユニット１０４ａは、筐体２６によって一体に保持された励起光源４、レンズ５および蛍光キューブ６を有する。照明駆動部４６は、シャッター４３を開閉して標本Ｓに対する白色光の照射および未照射を切り換えるとともに、蛍光キューブ６を対物レンズ１と結像レンズ２との間の光路上に挿脱するように蛍光照明ユニット１０４ａを移動させる。
【０１９８】
制御装置ＰＣ６は、制御装置ＰＣ１と同様に撮像装置３，１３、励起光源４およびステージ駆動部８の動作を制御するのに加えて、照明駆動部４６の動作を制御する。制御装置ＰＣ６は、蛍光観察から透過照明による観察に切り換える場合、蛍光キューブ６を対物レンズ１と結像レンズ２との間から取り除くように蛍光照明ユニット１０４ａを移動させ、励起光源４を消灯し、シャッター４３を開いて透過照明させる。透過照明による観察から蛍光観察に切り換える場合、制御装置ＰＣ６は、シャッター４３を閉じ、蛍光キューブ６が対物レンズ１と結像レンズ２との間に配置されるように蛍光照明ユニット１０４ａを移動させ、励起光源４を点灯する。
【０１９９】
また、微弱光観察から透過照明による観察に切り換える場合、制御装置ＰＣ６は、蛍光観察から透過照明による観察に切り換える場合の制御に加えて、ステージ駆動部８によって可動ステージ７ｂを駆動し、標本Ｓを蛍光結像光学系の視野内に移動させる制御を行う。なお、制御装置ＰＣ６は、シャッター４３を開閉する替わりに、白色光源４４を点灯および消灯するようにしてもよい。
【０２００】
なお、透過照明ユニット１０３ａは、明視野観察用の照明を行うように示したが、明視野観察用に限らず、暗視野観察用、微分干渉観察用または位相差観察用の照明を行うようにしてもよい。また、これらの各種観察用の照明を切り換え可能に備えてもよい。なお、微分干渉観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット１０３ａは、コンデンサーレンズ４５ｂの光源側に偏光子および偏光分離プリズムを備え、蛍光結像光学系には、対物レンズ１の瞳側に偏光合成プリズムおよび検光子を配設するとよい。また、位相差観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット１０３ａは、コンデンサーレンズ４５ｂの光源側にリングスリットを備え、蛍光結像光学系には、対物レンズ１の略瞳位置に位相板を配設するか、対物レンズ１を位相板を有する対物レンズに切り換えるようにするとよい。さらに、暗視野観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット１０３ａは、コンデンサーレンズ４５ｂの光源側にリングスリット等を備えるようにするとよい。
【０２０１】
また、透過照明ユニット１０３ａは、高倍率で透過照明による観察を行うために蛍光結像光学系に対応させて配置するように示したが、低倍率で観察を行えるように微弱光結像光学系に対応させて配置してもよい。あるいは、これらの結像光学系の両方に対応させて配置してもよく、各結像光学系に対して適宜配置を切り換えられるようにしてもよい。
【０２０２】
ところで、顕微鏡装置６００では、顕微鏡装置１００ａの構成に透過照明ユニット１０３ａ、照明駆動部４６をさらに備えるように示したが、これに限定されず、たとえば、図３２〜図３４に示すように、顕微鏡装置２００，３００，４００の各構成に、透過照明ユニット１０３ａと、照明駆動部４６もしくは照明駆動部４７とをさらに備えるようにしてもよい。
【０２０３】
図３２に示す顕微鏡装置７００は、顕微鏡装置２００の構成に透過照明ユニット１０３ａ、照明駆動部４６をさらに備えた場合であり、制御装置ＰＣ７は、制御装置ＰＣ２と同様に撮像装置３，１３、励起光源４、回転駆動装置１４およびステージ駆動部１８を制御するとともに、制御装置ＰＣ６と同様に照明駆動部４６によって透過照明ユニット１０３ａおよび蛍光照明ユニット１０４ａを制御する。
【０２０４】
図３３に示す顕微鏡装置８００は、顕微鏡装置３００の構成に透過照明ユニット１０３ａ、照明駆動部４６をさらに備えた場合であり、制御装置ＰＣ８は、制御装置ＰＣ３と同様に撮像装置３、励起光源４、回転駆動装置１４およびステージ駆動部１８を制御するとともに、制御装置ＰＣ６と同様に照明駆動部４６によって透過照明ユニット１０３ａおよび蛍光照明ユニット１０４ａを制御する。
【０２０５】
図３４に示す顕微鏡装置９００は、顕微鏡装置３００の構成に透過照明ユニット１０３ａ、照明駆動部４７をさらに備えた場合であり、制御装置ＰＣ９は、制御装置ＰＣ４と同様に撮像装置３，１３、およびステージ駆動部１８を制御するとともに、照明駆動部４７によって透過照明ユニット１０３ａ、ミラー３４および蛍光照明ユニット１０５を制御する。
【０２０６】
すなわち、制御装置ＰＣ９は、蛍光観察または微弱光観察から透過照明による観察に切り換える場合、ミラー３４および蛍光キューブ６を対物レンズ１と結像レンズ２との間から取り除くように蛍光照明ユニット１０５を移動させ、シャッター３３を閉じて励起光を未照射とし、シャッター４３を開いて透過照明させる。透過照明による観察から蛍光観察または微弱光に切り換える場合、制御装置ＰＣ９は、シャッター４３を閉じ、蛍光キューブ６またはミラー３４が対物レンズ１と結像レンズ２との間に配置されるように蛍光照明ユニット１０５またはミラー３４を移動させる。蛍光観察を行う場合には、さらにシャッター３３を開いて標本Ｓに蛍光を照射させる。
【０２０７】
このように、この実施の形態５にかかる顕微鏡装置６００，７００，８００，９００によれば、蛍光結像光学系および微弱光結像光学系の少なくとも一方に対応し、標本Ｓに対して透過照明を行う透過照明ユニットを備えるようにしているため、蛍光観察および微弱光観察ばかりでなく各種の透過照明による観察を行うことができ、標本Ｓを多角的に観察することができる。
【０２０８】
なお、上述した顕微鏡装置１００ａ，２００，３００，４００，６００，７００，８００，９００は、それぞれ正立型の顕微鏡装置として示したが、倒立型の顕微鏡装置としてもよい。また、上述した顕微鏡装置は、例えば、各種反応（例えば薬物刺激や光照射など）の検査や治療などに好適に用いることができる。
【０２０９】
以上、実施の形態について詳細に説明したが、本発明において、発光とは、化学反応により光を発生し得ることをいい、特に生物発光および化学発光を好適な例として含む用語である。これに対し、蛍光とは励起光により光を発生し得ることをいう。ここで、生物発光による光エネルギーにより励起されるＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）は、基質溶液との化学反応が支配的要因であるので、本発明では発光に含めるものである。サンプルから発生する光は、特に生きた細胞に危害が少ない約４００ｎｍ〜約９００ｎｍの間の波長を持つ電磁放射線をいう。発光するサンプルの撮像は、極めて低レベルの光（通常は単一光子事象）を検出し、画像の構築が可能になるまで光子放射を積分できる光検出器の使用を必要とする。そのような高感度光検出器の例には、単一光子事象を増幅した後、検出系に固有の背景ノイズに対して単一光子を検出できるカメラまたはカメラ群で、例えばＣＣＤのような撮像素子群を具備するＣＣＤカメラを例示できる。一般に、高感度を得るために、ＣＣＤカメラを液体窒素などで冷却する場合がある。高い開口数（ＮＡ）とくに、開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０１以上である対物レンズを用いる場合には、冷却温度をマイナス５℃〜マイナス２０℃、好ましくはマイナス５℃〜常温でも画像化できると本発明者らによって確認された。さらに、検討を進めた結果、上記光学的条件（ＮＡ／β）の２乗が０．０７１以上である場合に、５分以内、場合によっては１分程度で視認可能で且つ解析可能な細胞画像を提供できることを突き止めた。一般に生きたサンプルは形状ないし発光部位の変化の為に、３０分を越える撮像時間では鮮明な発光画像を得ることは困難な場合が多い。従って、本発明では、短時間、特に３０分以内、好ましくは１分〜１０分の間で１つの発光画像を取得し、撮像時間が速い蛍光測定との連携に有利な方法と装置を提供する。
【０２１０】
例えば関連する態様として、選択した生物適合成分の分布および／または局在に対するある処置の効果を記録するために、蛍光シグナルの局在および／または発光シグナルの強度を経時的に追跡したい場合は、光子放射の測定または撮像を選択した時間間隔で反復することにより、一連の画像を構築することができる。間隔は数分程度の短いものであってもよいし、数日または数週間程度に長いものであってもよい。発光画像または蛍光（または透過光）発光の重ね合せ画像は、画面表示、印刷された紙、グラフィック加工されたイメージ等の様々な形式で表現できる。
【０２１１】
他の関連する態様として、本発明は、発光性タンパク質をコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に含む構築物でトランスジェニックまたはキメラにした動物におけるプロモーター誘導事象の存在を検出した後にプロモーター誘導事象の活性度をモニタリングする方法を包含する。プロモーター誘導事象には、そのプロモーターを直接活性化する物質の投与、内因性プロモーター活性化因子の産生を刺激する物質の投与（例えばＲＮＡウイルス感染によるインターフェロン産生の剌激）、内因性プロモーター活性化因子の産生をもたらす状態に置くこと（例えば熱ショックまたはストレス）などがある。
【０２１２】
またもう１つの態様として、本発明は、病原体による感染の重篤化を抑制するのに有効な治療用化合物を同定する方法をも包含する。この方法では、病原体と蛍光成分と発光成分の複合体を対照動物と実験動物、若しくはそれらの培養された組織（ないし細胞）に投与し、その実験動物を治療用化合物候補で処置する。そして、上述の方法によって測定対象であるサンプル内の蛍光シグナルの局在を確認した後に、局内が確認されたサンプルのみから発光シグナル（生物発光または化学発光）を連続的に測定する。こうすることによって、その化合物の治療上の有効性をモニタリングできる。
【０２１３】
さらなる別な態様として、本発明は、様々な不透明度を持つ媒質を通して局在化したサンプルを蛍光シグナルによって選んだ後で、局在が確認されたサンプルのみから連続的に発光測定する方法を包含する。この方法では、発光シグナルを、その媒質を透過した光子を積分して画像を作成することもできるが、局在が確認されたサンプルのみを媒質（例えば、臓器組織）から外科的に取り出して、取り出したサンプルを適宜の培養環境下で発光測定するように方法の改良を行なうことができる。限定された外科手術（例えばバイオプシー）は、元となる生物（例えば、哺乳類、とくにヒト）への身体的負担を最小限にし、必要なサンプルのみを安定した検査環境下に移して、種々の見込み有る薬剤に対する応答、治療後の経過管理、予防医学的試験を長期に実行できるという利点を有する。
【０２１４】
さらなる態様として、本発明は、ある生物内の特定の部位で、選択した物質（例えば溶存酸素またはカルシウム）の濃度を測定する方法を含むことができる。
【０２１５】
以上の説明において、本発明では次に示すような生物発光の画像解析（またはイメージング分析）ならではの分析試薬を提供することも可能である。とくに、本発明の好適な実施の形態では、不透明な組織を含まない、単離された細胞もしくは細胞群を主に含んでいるような生物学的試料の任意な生物学的活性（酵素活性、免疫学的活性、分子生物学的活性、遺伝学的活性、内科的活性など）を分析するための方法、試薬、ならびに装置を提供する。ここに、単離された細胞もしくは細胞群は、主に光透過性が高い材質からなる収容容器（例えば、ウエル、シャーレ、マイクロスライド、マイクロフルイディクス用チップ）中で長期間保持するので、細胞内活性を損失を最小限にするか実質的に失活せずに撮像を行うための独特な試薬または試薬環境を提供する。
【０２１６】
１．基質の長期使用に関する試薬とその取扱い
試料の細胞内活性を、例えば数時間から２４時間、２日から６日間、１週間から数週間、または数週間超というように長期間培養などの技術で継続させる際、発光をもたらすためには、次のような特徴をもった取扱いが重要である。次に述べる幾つかの方法および／または試薬は、単独でもよいが、複数の方法を組み合わせる方がよい場合があるので、本発明では限定しない。
【０２１７】
（第1の取扱い方法）  現在市販または報告されている生物発光用試薬は、２４時間まで観察可能な基質があるが、それ以上、例えば、数週間だと、基質の継ぎ足しが必要となる。細胞または細胞群を配置している培地に対して定期的ないし、測定の開始に同期して基質を添加する方法が好ましい。複数回の添加を行うのに適している試薬キットとして、同じパッケージに同封される発光タンパクを含む発光性試薬を含む収容手段（容器または袋）と、発光性試薬に対応する量の基質溶液（または基質含有培養液）を複数回の使用に足りるように複数に分割されて収容している収容手段（容器または袋）とを具備するのが好ましい。
【０２１８】
（第２の取扱い方法）  他の一面において、ＰＨ調整を長期に亘り実行する。そのために、例えば気体環境としての二酸化炭素ガスの濃度を一定量以上に保つ方法である。より詳細には、細胞が生き続けるに必要な最低量よりも高濃度なガスを存在させることができる。他方、充分大きな容量の気体環境を大気圧以上の蓄積容器（例えばガス用タンク）内に蓄積し、その容器から定期的ないし徐々に細胞（ないし細胞群）に向けて移動するように装置設計する。このような気体環境の局所的な移動は、細胞（ないし細胞群）の気体に対する代謝速度に応じた速度となるようにするのが好ましい。
【０２１９】
（第３の取扱い方法および試薬）  ＰＨを長時間一定に保証することが知られているＨＥＰＥＳを添加する。そのための方法には、上記気体環境の場合のように、細胞（ないし細胞群）が消費する固体、液体、気体の全てについての消費速度と関連したＨＥＰＥＳ濃度に応じてＨＥＰＥＳを供給することができる。ＨＥＰＥＳは、公知の除放性カプセルに封入して、有効数のカプセルを細胞（ないし細胞群）とともに液中ないし培地内に含ませておくことがさらに好ましい。有効量のＨＥＰＥＳ（またはＨＥＰＥＳと同等のＰＨ維持用化合物）を封入した徐放性カプセルを主に含んでいる溶液や培地は、本発明の目的を達成する有効な試薬となり得る。
【０２２０】
（第４の取扱い方法、装置または試薬）  本発明の主旨によれば、細胞または細胞群の内部温度を致命的な変化が起きない程度に調節するための保温用装置および／または薬剤を提供することができる。
【０２２１】
（第５の取扱い方法または試薬）  発光検出のバックグラウンドを長期に低くするための方法および／または試薬に関する。すなわち、生物発光（または化学発光）によるバックグラウンドの増加に関連する要素としての組織片、有色物（例えば発色性色素物質、とくにフェノールレッド色素））を除く方法であり、或いはこれら要素を予め充分に除去した培地または溶液を試薬として提供することができる。
【０２２２】
（第６の取扱い方法または試薬）  細胞、特に細胞群に対して基質を流通させることは発光の安定性や測定精度にとって重要である。方法としては、基質の細胞膜透過を助ける処理（例えば、圧力ショック、電気的ショック）を連続的、断続的または細胞の老化に応じて実行することができる。試薬としては、細胞膜透過性を補助または促進する添加物（例えば、膜溶解物質としての界面活性剤、膜浸透圧変容物質としての塩類）を含有する基質または別途緩衝溶液を試薬として提供することができる。これらの方法および／または試薬は、長期の測定中に細胞中において活性の有る基質が不足しないように、新鮮な細胞外の基質に対して透過性が継続するか、或いは一時的に透過性が高まるように設定するのが好ましい。
【０２２３】
（第７の取扱い方法）  均一な染色方法を達成する方法に関する。磁気ビーズをあらかじめ加えておき、数時間、または一日に一回攪拌する。通常は、収容する容器の底面上には細胞が貼り付いているため、上方から攪拌するのが好ましい。
【０２２４】
（第８の取扱い方法または試薬）  長期観察を行う際に、同一の細胞（または細胞群）について多数回の発光反応を繰り返すことで生じる副産物による、光学的または化学的な阻害の影響を除去する方法や試薬に関する。すなわち、基質を継ぎ足すような取扱いに応じて発光反応に伴う反応副産物が蓄積していく。この発光反応に伴う副産物（ピロリン酸）などを除去するために、副産物排除用物質（例えば、沈殿作用を有する金属イオン）を加える。
【０２２５】
（第９の取扱い方法または試薬）  発光成分としてのルシフェリンを再生させる方法または試薬に関する。ルシフェリンが発光後、オキシルシフェリンとなるが、これをルシフェリンに再生するための試薬をルシフェリンの老化または消耗に応じて細胞（または細胞群）に供給する方法が提供される。検出オキシルシフェリンがニトリル体2に変換された後、合成でも使われたように体内にあるシステインと反応し、ルシフェリンが再生することがホタルでは知られている。このような発光成分の活性低下を再生する再生物質を含んでいる基質、或いは別途の緩衝液を提供することも可能である。基質としては、他にセレンテラジンも含まれる。
【０２２６】
（第１０の取扱い方法または試薬）  新規な試薬としてのカプセル封入型基質に関する。所定時間経過後または一定の時間間隔で溶出ないし液放出するようなカプセルに適当な基質（例えばルシフェリン）を封入しておき、基質を一定濃度を保つようにする。また、カプセルに封入されていない基質（例えばルシフェリン）と、カプセルに封入した同種の基質を同時に提供する方法、または混合した状態のカプセル含有溶液である試薬を提供することができる。また、徐放速度が異なる２以上のカプセルに同種の基質（例えばルシフェリン）を含有させた試薬を同時に細胞（ないし細胞群）と添加（または培地との接触）することにより、異なる放出時機に新鮮な基質が自動的に提供されるという利点を有する。こうすることによって、励起光照射時機と基質の放出時機を連携させることも可能となる。
【実施例１】
【０２２７】
ここでは、上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置１００を用いて、図１０に示すプラスミドベクターを導入した複数のＨｅＬａ細胞を対象として、特定のＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアからの発光量およびＡＴＰ量を経時的に測定する。
【０２２８】
まず、本実施例１における実験プロトコルを説明する。
（１）蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とミトコンドリア移行シグナルとルシフェラーゼとが繋がった融合遺伝子を作製する。
（２）融合遺伝子が入ったプラスミドベクター（図１０参照）をＨｅＬａ細胞に導入する。
（３）上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置１００（具体的には、本装置を構成する倒立蛍光顕微鏡）を用いて、ＧＦＰがミトコンドリアに局在しているか否かを判定することで、ルシフェラーゼがミトコンドリアに局在しているか否かを確認する（図１１参照）。なお、図１１は、所定部位発光量測定装置１００を構成する蛍光画像撮像ユニット１０８で撮像した、プラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の明視野像および蛍光像を示す図である。
（４）ＨｅＬａ細胞にヒスタミンを投与し、Ｃａ2+を介したミトコンドリアのＡＴＰ量の変動を引き起こす。
（５）上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置１００を用いて、ミトコンドリアから発せられる発光を画像として経時的に取得する（図１２参照）。なお、図１２は、所定部位発光量測定装置１００を構成する発光画像撮像ユニット１０６で撮像した、プラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の明視野像および発光像を示す図である。
（６）上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置１００を用いて、明視野像、蛍光像および発光像を重ね合わせることで、測定する細胞を選定する。
（７）上述した実施の形態における所定部位発光量測定装置１００を用いて、選定した細胞または領域の発光強度を経時的に測定し（図１３参照）、ＡＴＰ量の変動をモニタする。なお、図１３は、所定部位発光量測定装置１００で測定した、特定した番号１のＨｅＬａ細胞の発光強度の経時的変動を示す図である。
【０２２９】
つぎに、実験結果について説明する。図１１に示すように、番号１のＨｅＬａ細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していることが確認でき、また、番号２および番号４のＨｅＬａ細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されていないことが確認でき、さらに、番号３のＨｅＬａ細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されているがミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していないことが確認できた。なお、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していることが確認できたＨｅＬａ細胞は、番号１の細胞のみであったので、測定対象のＨｅＬａ細胞は番号１のＨｅＬａ細胞に特定された。また、図１２に示すように、番号３のＨｅＬａ細胞からの発光が最も強く、ついで番号１のＨｅＬａ細胞からの発光が強く、ついで番号２および番号４のＨｅＬａ細胞からの発光は同等の強さであることが確認できた。そして、図１３に示すように、所定部位発光量測定装置１００を用いることにより、番号１のＨｅＬａ細胞のミトコンドリアからの発光強度の経時変動をモニタすることができた。
【実施例２】
【０２３０】
ここでは、上述した実施の形態における図１６に示す所定部位発光量測定装置１００を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）遺伝子とを導入したＨｅＬａ細胞を対象として、当該ＨｅＬａ細胞の発光観察および蛍光観察を行う。
【０２３１】
まず、本実施例２における実験プロトコルを説明する。
（１）ルシフェラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）遺伝子とを縦列して配置したベクター（ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）をリポフェクチン法によりＨｅＬａ細胞に導入する。
（２）ベクター導入から約２４時間後、ベクターを導入したＨｅＬａ細胞を含む培養液（Ｄ−ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にルシフェリンを５００μＭ添加する。
（３）図１６に示す所定部位発光量測定装置１００のステージ１０４に、培養液を入れた容器を設置し、所定部位発光量測定装置１００を用いてＨｅＬａ細胞の明視野画像、蛍光画像および発光画像を撮像する。なお、蛍光画像を撮像する場合には励起用分光フィルター１０８ｇおよび発光・蛍光分光用フィルター１０８ｊを入れ、当該撮像における露出時間を０．７秒間とした。また、発光画像を撮像する場合には発光・蛍光分光用フィルター１０８ｊを外し、当該撮像における露出時間を５分間とした。ここで、本実施例２では、対物レンズ１０８ａとして、焦点距離（ｆ）が９ｍｍで開口数（ＮＡ）が０．７５であるオリンパス社製の“Ｕａｐｏ  ２０Ｘ”を用いた。また、結像レンズ１０８ｅとして、焦点距離（ｆ）が１８ｍｍで開口数（ＮＡ）が０．２５で“（ＮＡ÷β）2”の値が０．０３５であるオリンパス社製の“ＬＭＰｌａｎＦＬ  １０Ｘ”を用いた。また、光源１０８ｃとして、オリンパス社製のハロゲン光源“ＬＧ−ＰＳｓ”を用いた。また、ＣＣＤカメラ１０８ｄとして、オリンパス社製の“ＤＰ−３０ＢＷ”を用いた。また、励起用分光フィルター１０８ｇとして、オリンパス社製の“ＢＰ４７０−４９０”を用いた。また、発光・蛍光分光用フィルター１０８ｊとして、オメガ（Ｏｍｅｇａ）社製の“５１０ＡＦ２３”を用いた。
【０２３２】
つぎに、観察結果について説明する。図１７は、ベクター（ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ遺伝子）を導入したＨｅＬａ細胞の蛍光画像を示す図である。また、図１８は、ベクター（ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ遺伝子）を導入したＨｅＬａ細胞の蛍光画像と明視野画像とを重ね合わせた画像を示す図である。また、図１９は、ベクター（ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ遺伝子）を導入したＨｅＬａ細胞の発光画像を示す図である。図１７、図１８および図１９に示すように、所定部位発光量測定装置１００を用いて、遺伝子導入できたＨｅＬａ細胞を蛍光観察により特定することができ、さらに、当該特定したＨｅＬａ細胞を視野に入れてから発光画像の撮像を行うことができた。
【実施例３】
【０２３３】
ここでは、上述した実施の形態の発現量測定装置１０００を用いて、蛍光で細胞周期のステージの同定しながら発光で解析対象の遺伝子の発現量の測定（解析対象の遺伝子のプロモーターアッセイ）を行う。
【０２３４】
まず、細胞に導入するベクターを作製する。具体的には、細胞周期関連遺伝子プロモーター導入ルシフェラーゼ（緑）発現ベクターを作製する。なお、用いる細胞はＰＣ１２である。つぎに、作製したベクターを細胞に導入する（トランスフェクション）。つぎに、細胞の細胞膜を“ＰＫＨ  ＬｉｎｋｅｒＫｉｔｓ（赤）”（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて染色する。つぎに、発現量測定装置１０００を用いて、細胞周期のステージを同定しながら、解析対象遺伝子である細胞周期関連遺伝子のプロモータアッセイを行う。これにより、細胞周期と細胞の形態との関連を調べることができた。
【実施例４】
【０２３５】
ここでは、上述した実施の形態の発現量測定装置１０００を用いて、発光で細胞周期のステージの同定しながら蛍光で解析対象の遺伝子の発現量の測定および発現時期・当該遺伝子の局在の同定を行う。
【０２３６】
まず、細胞に導入するベクターを作製する。具体的には、解析対象遺伝子プロモーターを導入した蛍光タンパク質ベクターを作製する。つぎに、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター（プロメガ社製）を細胞に導入する。なお、用いる細胞はＰＣ１２である。つぎに、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（プロメガ社製）を細胞に添加して、細胞に対してルシフェラーゼ標識を行う。つまり、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ社製）に対するリガンド結合により、細胞に対してルシフェラーゼ標識を行う。つぎに、発現量測定装置１０００を用いて、細胞周期のステージをモニタリングしながら、細胞周期に関わる可能性のある解析対象遺伝子の発現時期・局在の同定を行う。これにより、当該解析対象遺伝子と細胞周期との関連性の有無、および当該解析対象遺伝子の細胞周期マーカーとしての有用性を評価することができた。
【０２３７】
以上のように、本発明にかかる所定部位発光量測定方法、所定部位発光量測定装置および測定装置は、生きたサンプル内の所定の部位からの発光量を測定する場合に有用であり、また、本発明にかかる発現量測定方法は、生きた細胞に導入した解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に細胞周期のステージを同定する場合に有用であり、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【符号の説明】
【０２３８】
１００  所定部位発光量測定装置
１０２  サンプル
１０３  容器
１０４  ステージ
１０６  発光画像撮像ユニット
１０６ａ  対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ  ダイクロイックミラー
１０６ｃ  ＣＣＤカメラ
１０６ｄ  スプリットイメージユニット
１０６ｅ  フィルターホイール
１０６ｆ  結像レンズ
１０８  蛍光画像撮像ユニット
１０８ａ  対物レンズ（蛍光観察用）
１０８ｂ  ダイクロイックミラー
１０８ｃ  光源
１０８ｄ  ＣＣＤカメラ
１０８ｅ  結像レンズ
１０８ｆ  シャッター
１０８ｇ  励起用分光フィルター
１０８ｈ  光ファイバー
１０８ｉ  コンデンサーレンズ
１０８ｊ  発光・蛍光分光用フィルター
１１０  情報通信端末
１１２  制御部
１１２ａ  蛍光画像撮像指示部
１１２ｂ  蛍光画像取得部
１１２ｃ  判定部
１１２ｄ  発光画像撮像指示部
１１２ｅ  発光画像取得部
１１２ｆ  選定部
１１２ｇ  発光量測定部
１１２ｈ  関連物質定量部
１１４  クロック発生部
１１６  記憶部
１１８  通信インターフェース部
１２０  入出力インターフェース部
１２２  入力部
１２４  出力部
１０００  発現量測定装置
１０２０  細胞
１０３０  容器
１０４０  ステージ
１０６０  発光画像撮像ユニット
１０６０ａ  対物レンズ（発光観察用）
１０６０ｂ  ダイクロイックミラー
１０６０ｃ  ＣＣＤカメラ
１０６０ｄ  スプリットイメージユニット
１０６０ｅ  フィルターホイール
１０８０  蛍光画像撮像ユニット
１０８０ａ  対物レンズ（蛍光観察用）
１０８０ｂ  ダイクロイックミラー
１０８０ｃ  キセノンランプ
１０８０ｄ  ＣＣＤカメラ
１１００  情報通信端末
１１２０  制御部
１１２０ａ  蛍光画像撮像指示部
１１２０ｂ  発光画像撮像指示部
１１２０ｃ  蛍光画像取得部
１１２０ｄ  発光画像取得部
１１２０ｅ  判定部
１１２０ｆ  蛍光測定部
１１２０ｇ  発光測定部
１１２０ｈ  ステージ同定部
１１２０ｉ  選択部
１１２０ｊ  発現量測定部
１１４０  クロック発生部
１１６０  記憶部
１１８０  通信インターフェース部
１２００  入出力インターフェース部
１２２０  入力部
１２４０  出力部
１，１１    対物レンズ
２，１２，３２    結像レンズ
３，１３    撮像装置
４    励起光源
５    レンズ
６    蛍光キューブ
６ａ    励起フィルター
６ｂ    吸収フィルター
６ｃ    ダイクロイックミラー
７，１７    保持部
７ａ    保持部材
７ｂ，１７ｂ    可動ステージ
８，１８    ステージ駆動部
９    モニター
１４    回転駆動装置
１５ａ，１５ｂ    固定軸
２１，２２，２３，２４，２５，２６    筐体
３３，４３    シャッター
３４    ミラー
３５    光路切換駆動部
４４    白色光源
４５    照明レンズ系
４５ａ    コレクタレンズ
４５ｂ    コンデンサーレンズ
４６    照明駆動部
１００ａ，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００    顕微鏡装置
１０１，２０１    蛍光顕微鏡ユニット
１０２ａ，２０２    微弱光顕微鏡ユニット
１０３ａ    透過照明ユニット
１０４ａ，１０５    蛍光照明ユニット
ＰＣ１〜ＰＣ９    制御装置
Ｓ    標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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