(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩を有効成分として含む製剤、並びに、テモゾロミド及び／又はパクリタキセル若しくはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分として含む製剤を含む、悪性神経膠腫の治療用のキット。
【請求項２】
前記悪性神経膠腫が多形膠芽腫である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
マシテンタン又はその薬学的に許容される塩が経口投与されることが意図される、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
マシテンタン又はその薬学的に許容される塩が、静脈内投与又は腹腔内投与されることが意図される、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項５】
活性成分としてマシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩を、テモゾロミド若しくはそれらの薬学的に許容される塩、及び／又は、パクリタキセル若しくはそれらの薬学的に許容される塩と組み合わせて含み、そして少なくとも１種の無毒性の賦型剤を含有する、悪性神経膠腫の治療用の医薬組成物。
【請求項６】
多形膠芽腫の治療用の、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性神経膠腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ）、特に多形膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）の治療において、同時に、別々に又はある期間に渡って、治療のために使用する、マシテンタン（ｍａｃｉｔｅｎｔａｎ）、すなわち、式（Ｉ）の化合物、
【化１】
0005642892.tif 000002
の、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）若しくはパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）等の化学療法剤との、放射線療法との、又は化学療法剤と放射線療法の双方との組み合わせ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性神経膠腫及び多形膠芽腫はまれな癌であり、現在のところ、満足のいく治療法は存在しない。適用可能な最良の治療をもってしても、患者の予後は不良である（例えば、Ｍ．Ｋｈａｓｒａｗ及びＡ．Ｂ．Ｌａｓｓｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．（２０１０）、１２、２６−３３を見よ。）。
【０００３】
ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５３５５７は、式（Ｉ）の化合物（その国際一般名はマシテンタンである。）を含むエンドセリン受容体アンタゴニスト、及び癌一般を含む種々の疾患の治療における当該エンドセリン受容体アンタゴニストの使用を記載する。
【０００４】
さらに、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００９／１０４１４９は、マシテンタンとパクリタキセルの組み合わせが、卵巣癌の治療において相乗効果を有することを開示している。
【０００５】
テモゾロミド（米国において、Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）の商標で販売されている医薬の活性成分）は、経口アルキル化剤である。この化合物は現在欧州連合及び米国において、特に多形膠芽腫の治療に対して承認されている。
【０００６】
悪性神経膠腫及び多形膠芽腫におけるエンドセリン、特にエンドセリン−１（ＥＴ−１）の潜在的役割が文献から知られており、エンドセリン受容体アンタゴニストは、一般に、多形膠芽腫の潜在的治療剤として言及されている。
【０００７】
例えば、Ｇ．Ｅｇｉｄｙら（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０００）、８０、１６８１−１６８９）は、「ヒト神経膠芽腫細胞株[において]、ＥＴ−１系は腫瘍の増殖に関与しないが、ＥＴ−１は生存因子である（．．．）」ことを教示する。
【０００８】
さらに、Ｍ．Ｐａｏｌｉｌｌｏら（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．（２０１０）、６１
、３０６−３１５）は、「神経膠腫細胞株において、ＥＴＢアンタゴニストが増殖を抑制し、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発する」ことを教示する。しかしながら、著者らは、「神経膠腫の治療における将来性のある薬理学的ツールとしてのＥＴＢアンタゴニストの信頼性を確認するためには、将来の研究が（．．．．．．）必要である」ことを認めている。
【０００９】
他方、Ｐｈｕｐｈａｎｉｃｈらは、エンドセリン受容体アンタゴニストであるアトラセンタン（ａｔｒａｓｅｎｔａｎ）の第一相臨床試験が、再発悪性神経膠腫の患者について行われてきたことを報告する（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．（２００８）。１０（４）、６１７−６２３）。しかしながら、この適応症に対するこの化合物の開発は今日継続されていない。
【００１０】
本願出願人は、テモゾロミド又はパクリタキセル等の細胞毒性化学療法剤と組み合わせた場合に、エンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡＲ）及びエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＢＲ）の双方のアンタゴニストであるマシテンタンが、膠芽腫のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、並はずれて高い効果を示すことを見出した。結論として、テモゾロミド又はパクリタキセル等の細胞毒性化学療法剤と組み合わせたマシテンタンは、医薬の製造に用いることができ、そして悪性神経膠腫、特に多形膠芽腫の治療に適切である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の種々の態様を以下に記述する：
１）  第一に、本発明は、細胞毒性化学療法剤と、放射線療法と、又は化学療法剤と放射線療法の双方と組み合わせた、悪性神経膠腫の治療において使用するための、マシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩を含有する製品（ｐｒｏｄｕｃｔ）に関する。本発明によれば、上記組み合わせ剤の成分は、同時に、別々に又はある期間に渡って、投与される。
【００１２】
以下の段落では、本特許出願において使用される種々の用語の定義をしており、他の表現によりなされた定義が、より広い又はより狭い定義を与えない限り、当該定義は、本明細書及び請求項を通じて、一律に適用されることを意図している。
【００１３】
「薬学的に許容される塩」という用語は、無毒性の、無機若しくは有機酸及び／又は塩基付加塩を意味する。「Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９８６）、３３、２０１−２１７を参照してもよい。
【００１４】
本明細書で使用する「細胞毒性化学療法剤」という用語は、細胞死又は細胞壊死を引き起こす物質を意味する。本発明のＥＲＡと組み合わせて用いてもよい細胞毒性化学療法剤の例は下記のものを含む：
−  アルキル化剤（例えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｏ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）又はアルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ））；
−  プラチナ製剤（例えば、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）又はオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ））；
−  代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔ
ｏｐｕｒｉｎｅ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）又はペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ））；
−  抗腫瘍抗生物質（例えば、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシン−Ｄ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ−Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン−Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃ）又はミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ））；及び
−  有糸分裂阻害物質（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）又はエストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ））；及び
−  トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ジフロモテカン（ｄｉｆｌｏｍｏｔｅｃａｎ）又はエロモテカン（ｅｌｏｍｏｔｅｃａｎ））。
【００１５】
投与形態に関連する場合の、「同時に」又は「同時の」という用語は、本特許出願において、関連する投与形態が、２又はそれ以上の活性成分の同じ経路による同時投与であることを意味する。
【００１６】
投与形態に関連する場合の、「別々に」または「別々の」という用語は、本特許出願において、関連する投与形態が、２又はそれ以上の活性成分の、少なくとも２つの異なる経路によるほぼ同時の投与であることを意味する。
【００１７】
「ある期間に渡る」投与という用語は、本特許出願において、２又はそれ以上の活性成分を異なる時に投与すること、そして特に、一の活性成分の全投与が完結した後に、他方又は他の活性成分の投与を開始する投与法を意味する。従って、活性成分の一方を数カ月間投与した後に、他方の又は他の活性成分を投与することが可能である。この場合には同時投与は生じない。「ある期間に渡る」投与はまた、複数の活性成分を同じ周期で投与しない状況（例えば、一方の活性成分を１日に１回投与し、別の活性成分を１週間に１回投与する）をも包含する。
【００１８】
２）  特に、態様１）の悪性神経膠腫は多形膠芽腫である。
【００１９】
３）  好ましくは、態様１）又は２）の製品は、細胞毒性療法剤又は細胞毒性療法剤と放射線療法の双方と組み合わせられ、当該細胞毒性療法剤は、アルキル化剤と有糸分裂阻害物質から選択される。
【００２０】
４）  態様３）の変形の１つによれば、上記細胞毒性療法剤はアルキル化剤（特に、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、アルトレタミン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択されるアルキル化剤）である。
【００２１】
５）  特に、態様４）のアルキル化剤は、テモゾロミド又はその薬学的に許容される塩である。
【００２２】
６）  態様３）の別の変形によれば、上記細胞毒性療法剤は有糸分裂阻害物質（そして
特に、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エストラムスチン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択される有糸分裂阻害物質）である。
【００２３】
７）  特に、態様６）の有糸分裂阻害物質は、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩である。
【００２４】
８）  態様１）〜７）の変形の１つによれば、マシテンタン又はその薬学的に許容される塩は経口投与されることが意図される。
【００２５】
９）  態様１）〜７）の別の変形によれば、マシテンタン又はその薬学的に許容される塩は、静脈内投与又は腹腔内投与（そして特に、静脈内投与）されることが意図される。
【００２６】
１０）  具体的な副態様の１つにおいて、態様１）〜９）の１つに従う製品は、細胞毒性療法剤を経口投与することが意図される製品である。
【００２７】
１１）  別の具体的な副態様において、態様１）〜４）の１つに従う製品は、細胞毒性療法剤を静脈内投与又は腹腔内投与（そして特に、静脈内投与）することが意図される製品である。
【００２８】
１２）  本発明はまた、活性成分としてマシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩を細胞毒性療法剤と組み合わせて、そして少なくとも１種の無毒性の賦型剤を含有し、任意に放射線療法を組み合わせた、悪性神経膠腫の治療において使用するための医薬組成物にも関する。
【００２９】
１３）  特に、態様１２の医薬組成物は、多形膠芽腫の治療において使用するためのものである。
【００３０】
１４）  好ましくは、態様１２）又は１３）の細胞毒性療法剤はアルキル化剤及び有糸分裂阻害物質から選択される。
【００３１】
１５）  態様１４）の変形の１つによれば、細胞毒性療法剤はアルキル化剤（特に、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、アルトレタミン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択されるアルキル化剤）である。
【００３２】
１６）  特に、態様１５）のアルキル化剤はテモゾロミド又はその薬学的に許容される塩である。
【００３３】
１７）  態様１４）の別の変形によれば、細胞毒性療法剤は有糸分裂阻害物質（そして特に、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エストラムスチン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択される有糸分裂阻害物質）である。
【００３４】
１８）  特に、態様１７）の有糸分裂阻害物質はパクリタキセル又はその薬学的に許容される塩である。
【００３５】
１９）  好ましい副態様の１つにおいて、態様１２）〜１８）の１つに従う医薬組成物は、静脈内投与に適切な液体形態である。
【００３６】
２０）  態様１９）の医薬組成物は、例えば、マシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩及びテモゾロミド又はその薬学的に許容される塩を、マンニトール、Ｌ−トレオニン、ポリソルベート８０、クエン酸ナトリウム及び塩酸を含む水溶液（そのような水溶液は、例えば、市販の注射用ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）を注射用水と混合し、マシテンタン又はその薬学的に許容される塩を添加することにより得られる。）中に含有してもよい。
【００３７】
２１）  態様１９）の医薬組成物はまた、マシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩及びテモゾロミド又はその薬学的に許容される塩を、メチルセルロース、ポリソルベート８０、グルコース、ポリオキシエチレン化ヒマシ油（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）及びエタノールを含む水溶液中に含有してもよい。
【００３８】
２２）  別の好ましい副態様において、態様１２）〜１８）の１つに従う医薬組成物は、経口投与に適切な固体形態であってもよい。
【００３９】
２３）  本発明の別の態様において、マシテンタンはＷＯ２００７／０３１９３３に記載のように錠剤として製剤化され、一方、細胞毒性療法剤はその市販の製剤（入手可能であれば、好ましくは経口製剤）の１つであってもよく、上記組み合わせ剤を、悪性神経膠腫、特に多形膠芽腫の治療において、同時に、別々に又はある期間に渡って、治療のために使用することが意図される。
【００４０】
医薬組成物の製造は、いずれの当業者によく知られた様式で（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）、Ｐａｒｔ  ５、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」［Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓにより出版］を見よ。）、記述された化合物又はこれらの薬学的に許容される塩を、任意にその他の治療的に有益な物質と組み合わせて、適切な無毒の不活性な治療上適合性のある固体又は液体の担体材料、及び必要に応じて、通常の薬学的アジュバントと共に、製剤投与形態とすることにより遂行することができる。
【００４１】
２４）  本発明はさらに、細胞毒性療法剤と組み合わせたマシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩の、任意に放射線療法と組み合わせた、悪性神経膠腫の治療において使用することを意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００４２】
２５）  特に、態様２４）の悪性神経膠腫は多形膠芽腫である。
【００４３】
２６）  好ましくは、態様２４）又は２５）の細胞毒性療法剤は、アルキル化剤及び有糸分裂阻害物質から選択される。
【００４４】
２７）  態様２６）の変形の１つによれば、細胞毒性療法剤はアルキル化剤（特に、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、アルトレタミン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択されるアルキル化剤）である。
【００４５】
２８）  特に、態様２７）のアルキル化剤はテモゾロミド又はその薬学的に許容される塩である。
【００４６】
２９）  態様２６）の別の変形によれば、細胞毒性療法剤は有糸分裂阻害物質（そして
特に、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エストラムスチン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択される有糸分裂阻害物質）である。
【００４７】
３０）  特に、態様２９）の有糸分裂阻害物質はパクリタキセル又はその薬学的に許容される塩である。
【００４８】
３１）  本発明はさらに、マシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される塩の、悪性神経膠腫の治療において放射線療法と組み合わせて使用することを意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００４９】
３２）  特に、態様３１）の悪性神経膠腫は多形膠芽腫である。
【００５０】
３３）  本発明はさらに、マシテンタン又はこの化合物の薬学的に許容される塩の、細胞毒性療法剤との、放射線療法との、又は細胞毒性療法剤と放射線療法の双方との組み合わせ剤を患者に投与することにより、悪性神経膠腫患者を治療する方法に関する。
【００５１】
３４）  特に、態様３３）の悪性神経膠腫は多形膠芽腫である。
【００５２】
３５）  好ましくは、態様３３）又は３４）の細胞毒性療法剤はアルキル化剤及び有糸分裂阻害物質から選択される。
【００５３】
３６）  態様３５）の変形の１つによれば、細胞毒性療法剤はアルキル化剤（特に、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、アルトレタミン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択されるアルキル化剤）である。
【００５４】
３７）  特に、態様３６）のアルキル化剤はテモゾロミド又はその薬学的に許容される塩である。
【００５５】
３８）  態様３５）の別の変形によれば、細胞毒性療法剤は有糸分裂阻害物質（そして特に、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エストラムスチン及びこれらの化合物の薬学的に許容される塩から選択される有糸分裂阻害物質）である。
【００５６】
３９）  特に、態様３８）の有糸分裂阻害物質はパクリタキセル又はその薬学的に許容される塩である。
【００５７】
さらに、本発明の製品について示された好適性は、当然のことながら、本発明の医薬組成物、使用及び方法に準用される。
【００５８】
本発明の製品の有効成分の正確な投与用量は、治療を行う医師により決定されなければならないが、１日に患者の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇ（好ましくは０．１〜５ｍｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ）のマシテンタンを、例えば、１日に患者の体重１ｋｇ当たり１〜２０ｍｇ（好ましくは２〜１５ｍｇ）の用量のテモゾロミド又は１日に患者の体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇ（好ましくは１〜３ｍｇ）の用量のパクリタキセルと任意に組み合わせることが適切と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１の４つの処置群のマウスの生存結果を示すグラフ。
【図２】実施例２の４つの処置群のマウスの生存結果を示すグラフ。
【図３】実施例３の７つの処置群のマウスの生存結果を示すグラフ。
【００６０】
本発明の有用性を示す実施例を以下に記載するが、それは、本発明をより詳細に説明するために供されるものであり、その範囲をいかなる意味においても限定するものではない。
【００６１】
本発明の製品の薬理学的特性
実施例１〜３：ヌードマウス脳に定位的に注入したＬＮ２２９ヒト神経膠芽腫細胞：
試験材料
マシテンタン用ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）：
マシテンタン用ビークルは０．５％メチルセルロース及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０とした。マシテンタンの調製に先だって、Ｔｗｅｅｎ  ８０を適宜な量（ｖｏｌｕｍｅ）の滅菌０．５％メチルセルロース溶液に添加した。マシテンタンを秤量し、室温にて１時間、ビークルとホモジナイズして、きめ細かく均一な２ｍｇ／ｍｌの懸濁液を得た。用いるマシテンタン溶液は毎週調製した。各処置日に対して７つのアリコートを調製し、遮光して４℃で保存した。使用後に残った溶液は他の使用のために保存することなく破棄した。
【００６２】
テモゾロミド用ビークル：
最初に、テモゾロミド（１００ｍｇ）をＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／エタノール（２：１、ｗ／ｗ）中に調製した。希釈が完了した後、テモゾロミドをグルコース５％（Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）で希釈して、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。使用するテモゾロミドの溶液はマウスへの各投与前に調製し、他の使用のために保存することはしなかった。
【００６３】
投与経路
マシテンタンの投与経路：
５ｍｌ／ｋｇのマシテンタンをカニューレを介して強制経口投与した。投与量は、個々のマウスの直近の体重に合わせて調整した。
【００６４】
テモゾロミドの投与経路：
１０ｍｌ／ｋｇのテモゾロミドをカニューレを介して強制経口投与した。投与量は、個々のマウスの直近の体重に合わせて調整した。
【００６５】
動物
４８匹の雌性Ｓｗｉｓｓ  ＮｕｄｅマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。処置前の順応期間中にに、動物をＳＰＦ動物ケアユニット（ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ｕｎｉｔ）内で７日間観察した。動物実験は、動物実験に関する欧州倫理ガイドライン（ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に従って行った。
【００６６】
ヒト神経膠芽腫ＬＮ２２９細胞のヌードマウス脳内への定位的注入の一般的方法
培養したヒト神経膠芽腫ＬＮ２２９細胞を、０．０２％ＥＤＴＡ−０．２５％トリプシンに短時間暴露した後にハーヴェストし、Ｍｇ＋＋／Ｃａ＋＋フリーハンクス平衡塩溶液中に再懸濁した（１０μｌ当たり１ｘ１０５細胞に調整）。ネンブタール（０．５ｍｇ／ｇ体重、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）の腹腔内注射によりヌードマウスを麻酔し、マウス当たり１ｘ１０５個のＬＮ２２９細
胞を定位的に髄腔内に注入した。要約すると、頭蓋骨の前極から後稜線（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｒｉｄｇｅ）にかけて単切り込みを入れ、頭皮を露出させた。標的部分に孔を開け、下記の定位座標（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を用いてＬＮ２２９細胞を注入した：すべて前項（ｂｒｅｇｍａ）に対して：吻側（ｒｏｓｔｒａｌ）に１．５ｍｍ、前（ａｎｔｅｒｉｏａ）に１．５ｍｍ、かつ脳表面下４ｍｍ。自動マイクロポンプ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）を用いて、懸濁液１０μｌ当たり１ｘ１０５個の細胞を５分間に渡って射出した。注入後、孔をボーンワックスで塞ぎ、スキンステープラーで皮膚を閉じた。
【００６７】
実施例１：マシテンタン及びテモゾロミドによる処置：
（上記の一般的方法を用いて）腫瘍細胞を定位的に髄腔内に注入してから２週間後、マウスを４つの処置群に無作為に分けた：
−  処置を受けない１３匹のマウスからなる群（「ＣＯＮＴＲＯＬ群」）；
−  ７．５ｍｇ／ｋｇのテモゾロミドを１日に１回、１週間に渡って経口投与され、次いで２週間の間処置を受けず、再び７．５ｍｇ／ｋｇのテモゾロミドを１日に１回、１週間に渡って経口投与され、次いで再び２週間の間処置を受けないというサイクルを繰り返す１２匹のマウスからなる群（「ＴＭＺ群」）；
−  １０ｍｇ／ｋｇのマシテンタンを毎日１回経口投与される１２匹のマウスからなる群（「ＭＣＴＮＴ群」）；及び
−  前の２群と同じ用量、投与経路及びスケジュールで、テモゾロミドとマシテンタンの双方の投与を受ける１３匹のマウスからなる群（「ＴＭＺ＋ＭＣＴＮＴ群」）。
【００６８】
マウスを毎日モニターし、神経症状が進行し又は瀕死状態になった場合には安楽死させた。生存日数を記録し、脳組織をハーヴェストし、組織学的検討を行った。実験を第１００日目に終了した。
【００６９】
結果：
４つの群のマウスのそれぞれについて得られた生存結果を図１に示す。１００日後の生存率は、ＣＯＮＴＲＯＬ群が２０％未満であり、ＴＭＺ群及びＭＣＴＮＴ群の生存率が約４０％であったのとは対照的に；ＴＭＺ＋ＭＣＴＮＴ群の生存率が１００％であったことがわかる。さらに、マシテンタンとテモゾロミドで処置したマウスはすべて、第１００日目において、脳内に腫瘍の証拠なく生存していた。
【００７０】
実施例２：マシテンタン及びパクリタキセルによる処置：
実験方法：
（上記の一般的方法を用いて）腫瘍細胞を定位的に髄腔内に注入してから２週間後、マウスを４つの処置群に無作為に分けた：
−  処置を受けない８匹のマウスからなる群（「ＣＯＮＴＲＯＬ群」）；
−  ８．５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを１週間に１回腹腔内投与される８匹のマウスからなる群（「ＰＴＬ群」）；
−  １０ｍｇ／ｋｇのマシテンタンを毎日１回経口投与される８匹のマウスからなる群（「ＭＣＴＮＴ群」）；及び
−  前の２群と同じ用量、投与経路及びスケジュールで、パクリタキセルとマシテンタンの双方の投与を受ける８匹のマウスからなる群（「ＰＴＬ＋ＭＣＴＮＴ群」）。
【００７１】
処置を７０日間継続した後、実験を終了した。瀕死状態のマウスは安楽死させた。
【００７２】
結果：
４つの群のマウスのそれぞれについて得られた生存結果を図２に示す。７０日後において、ＣＯＮＴＲＯＬ群、ＰＴＬ群又はＭＣＴＮＴ群では約６０％の動物がなお生存してい
たのとは対照的に；終了時において、ＰＴＬ＋ＭＣＴＮＴ群の生存率は、いかなる疾患の兆候を示すことなく１００％であったことがわかる。
【００７３】
実施例３：テモゾロミドと組み合わせたエンドセリン受容体アンタゴニストが関与する
処置の比較：
実験方法：
（上記の一般的方法を用いて）ルシフェラーゼ標識ＬＮ２２９神経膠芽腫細胞を定位的に髄腔内に注入してから２１日後（第０日）、マウスを７つの処置群に無作為に分けた：−  処置を受けない１０匹のマウスからなる群（「ＣＯＮＴＲＯＬ群」）；
−  ７．５ｍｇ／ｋｇのテモゾロミドを１日に１回、１週間に渡って経口投与され、次いで２週間の間処置を受けず、再び７．５ｍｇ／ｋｇのテモゾロミドを１日に１回、１週間に渡って経口投与され、次いで再び２週間の間処置を受けないというサイクルを繰り返す１０匹のマウスからなる群（「ＴＭＺ群」）；
−  １０ｍｇ／ｋｇのマシテンタンを毎日１回経口投与される一方、ＴＭＺ群と同じ用量、投与経路及びスケジュールでテモゾロミドの投与を受ける１０匹のマウスからなる群（「マシテンタン＋ＴＭＺ群」）；
−  １０ｍｇ／ｋｇのアトラセンタンを毎日腹腔内投与される１０匹のマウスからなる群（「アトラセンタン群」）；
−  アトラセンタン群及びＴＭＺ群と同じ用量、投与経路及びスケジュールで、それぞれアトラセンタン及びテモゾロミドの双方の投与を受ける１０匹のマウスからなる群（「アトラセンタン＋ＴＭＺ群」）；
−  ２０ｍｇ／ｋｇのジボテンタン（Ｚｉｂｏｔｅｎｔａｎ）を毎日経口投与される１０匹のマウスからなる群（「ジボテンタン群」）；及び
−  ジボテンタン群及びＴＭＺ群と同じ用量、投与経路及びスケジュールで、それぞれジボテンタン及びテモゾロミドの双方の投与を受ける１０匹のマウスからなる群（「ジボテンタン＋ＴＭＺ群」）。
【００７４】
処置を１２０日間継続した後、実験を終了した。瀕死状態のマウスは安楽死させた。
【００７５】
結果：
７つの群のマウスのそれぞれについて得られた生存結果を図３に示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ群、アトラセンタン群又はジボテンタン群のマウスはすべて、試験の最初の５０〜８０日の間に瀕死状態となり、安楽死させなければならなかったことがわかる。ＴＭＺ群、アトラセンタン＋ＴＭＺ群又はジボテンタン＋ＴＭＺ群の動物はより長く生存したが、試験終了時において、すべての動物が瀕死状態にあり、安楽死させなければならなかった。対照的に、腫瘍細胞注入後第１２０日目の試験終了時において、マシテンタン＋ＴＭＺ群のマウスはすべて、いかなる疾患の兆候を示すことなく生存していた。動物をルシフェリンで処理した後に行ったＩＶＩＳ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅイメージングにより、マシテンタン＋ＴＭＺの組み合わせで処置した動物においては、微小残存病変が確認された。
【００７６】
リン酸化ＡＫＴ及びＭＡＰＫに対する抗体を用いた実施例１及び２の腫瘍の免疫組織化学染色により、マシテンタンで処置した動物においては、両タンパク質が強く還元されていることが示された。これらのタンパク質は生存及び増殖経路の高いレベルでの亢進の指標であるが、その還元は、アトラセンタン又はジボテンタンで処置した動物の腫瘍においては顕著に低い（本実施例）。生存及び増殖経路の抑制が細胞を化学療法に感受性にし、それが、マシテンタンを化学療法と併用した場合の高い効果の理由であり得る。
【図３】
0005642892.tif 000003
【図１】
0005642892.tif 000004
【図２】
0005642892.tif 000005