(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキサンカルバルデヒドを有効成分とするノナン酸臭又はヘキサン酸臭の抑制剤。
【請求項２】
4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキサンカルバルデヒドを有効成分とする嗅覚受容体OR10A6に対する受容体拮抗剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪臭抑制剤及び悪臭抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の生活環境には、極性や分子量が異なる多数の悪臭分子が存在する。多様な悪臭分子を消臭するために、これまで様々な消臭方法が開発されてきた。一般的に消臭方法は、生物的方法、化学的方法、物理的方法、感覚的方法に大別される。悪臭分子の中で、極性の高い短鎖脂肪酸やアミン類については、化学的方法、すなわち中和反応による消臭が可能である。またチオールなどの硫黄化合物に関しては、物理的方法、すなわち吸着処理による消臭が可能である。しかし、中鎖・長鎖脂肪酸やスカトールなど、従来の消臭法では対応できない悪臭分子が数多く残されている。
【０００３】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は３８７個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約３％にあたる。
一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００４】
従って、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができる。また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもない。
【０００５】
体臭の代表的な原因物質であるノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸等については、従来、その匂いは、防臭又は消臭剤の使用や香料や芳香剤の使用（特許文献１及び非特許文献１）などの手段により防臭・消臭されていた。しかし、これらの手段は、そもそもの匂い物質の発生を減少させるか又は別の匂いをより強く認識させる方法であって、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによる消臭とは異なる。また従来の方法では、消臭剤を使用する場合は、匂い物質減少までに時間を要するため即効性に欠ける。芳香剤を使用する場合、芳香剤自体の匂いに対する不快感が生じることがある。あるいは従来の方法では、目的とする悪臭以外の匂いも消されてしまう場合がある。嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングによる消臭であれば、上記の点を解消できる可能性がある。
【０００６】
嗅覚受容体アンタゴニズムのためには、個々の悪臭分子に対して有効な嗅覚受容体アンタゴニスト作用を示す物質を探索、同定しなければならないが、そのような探索は容易ではない。従来、匂いの評価は、専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。
【０００７】
嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い制御のためには、匂いと嗅覚受容体とを関連付けることは重要であろう。ノナン酸やヘキサン酸を受容する嗅覚受容体に関しては、これまでに、OR2W1がヘキサン酸およびノナン酸に対して応答すること、OR51E1がノナン酸に対して応答すること、及びOR51L1がヘキサン酸に応答することが報告されている（非特許文献２）。またOR51E1がイソ吉草酸に対して応答するという報告もある（非特許文献３）。
【０００８】
アルデヒド系香料成分は、以前より、人体又は環境用の芳香・消臭剤やクリーニング組成物等に配合されていた（特許文献１〜３）。しかし、これらは芳香成分として使用されており、悪臭に応答する嗅覚受容体の活動を抑制するアンタゴニストとして使用されてはいなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2003-190264号公報
【特許文献２】特開2003-113392号公報
【特許文献３】特表2003-518162号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】嗅覚とにおい物質  川崎通昭、堀内哲嗣郎（におい・香り環境協会）
【非特許文献２】Saito H., Chi Q., Zhuang H., Matsunami H., Mainland J.D. Sci Signal., 2009, 2:ra9
【非特許文献３】Philippeau et al., ACHEMS 2009 Annual Meeting Abstract, 31st Annual Meeting of The Association for Chemoreception Sciences, #P121
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づく悪臭抑制方法及び悪臭抑制剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸等の悪臭原因物質に応答する嗅覚受容体、及び当該嗅覚受容体に対するアンタゴニストを同定することに成功した。本発明者はさらに、当該受容体アンタゴニストを用いることによって、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより悪臭を抑制することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体のいずれか１に対するアンタゴニストであって、且つ4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、3-(4-tert-ブチルフェニル)プロパナール、3-(4イソプロピルフェニル)-2-メチルプロパナール、3-(3-イソプロピル-フェニル)-ブチルアルデヒド、3,7-ジメチル-7-ヒドロキシオクタナール、p-tert-ブチル-α-メチルヒドロシナムアルデヒド、7-メトキシ-3,7-ジメチルオクタナール、3-(4-イソブチル-フェニル)-2-メチル-プロピオンアルデヒド、4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキシルメタノール、4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール、テトラヒドロ-4-メチル-2-(2-メチルプロピル)-2H-ピラン-4-オール、2,2-ジメチル-3-(3-メチルフェニル)プロパノール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、3,7-ジメチル-6-オクテナール、1,2,3,4,5,6,7,8-オクタヒドロ-8,8-ジメチル-2-ナフタレンカルボキシアルデヒド、2,4,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、3,5,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、2,4-ジメチル-3-シクロヘキサン-1-カルボキシアルデヒド、4-イソプロピルベンズアルデヒド、及び2-シクロヘキシルプロパナールからなる群より選択されるアンタゴニストの１種以上を有効成分とする、悪臭抑制剤。
（２）前記悪臭がノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸の匂いである、（１）記載の悪臭抑制剤。
（３）3-(4-tert-ブチルフェニル)プロパナール、3-(3-イソプロピル-フェニル)-ブチルアルデヒド、7-メトキシ-3,7-ジメチルオクタナール、2,4,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、及び3,5,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒドからなるより選択される１種以上を有効成分とする、（１）又は（２）記載の悪臭抑制剤。
（４）4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、3-(4-tert-ブチルフェニル)プロパナール、3-(4イソプロピルフェニル)-2-メチルプロパナール、3-(3-イソプロピル-フェニル)-ブチルアルデヒド、3,7-ジメチル-7-ヒドロキシオクタナール、p-tert-ブチル-α-メチルヒドロシナムアルデヒド、7-メトキシ-3,7-ジメチルオクタナール、3-(4-イソブチル-フェニル)-2-メチル-プロピオンアルデヒド、4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキシルメタノール、4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール、テトラヒドロ-4-メチル-2-(2-メチルプロピル)-2H-ピラン-4-オール、2,2-ジメチル-3-(3-メチルフェニル)プロパノール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、3,7-ジメチル-6-オクテナール、1,2,3,4,5,6,7,8-オクタヒドロ-8,8-ジメチル-2-ナフタレンカルボキシアルデヒド、2,4,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、3,5,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、2,4-ジメチル-3-シクロヘキサン-1-カルボキシアルデヒド、4-イソプロピルベンズアルデヒド、及び2-シクロヘキシルプロパナールからなる群より選択される、OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体のいずれか１に対する受容体拮抗剤。
（５）3-(4-tert-ブチルフェニル)プロパナール、3-(3-イソプロピル-フェニル)-ブチルアルデヒド、7-メトキシ-3,7-ジメチルオクタナール、2,4,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、又は3,5,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒドである、（４）記載の拮抗剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来の消臭剤や芳香剤を用いる消臭方法において生じていた即効性の低さや、芳香剤の香りに基づく不快感等の問題を生じることなく、悪臭を特異的に消臭することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】嗅覚受容体のヘキサン酸及びノナン酸に対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す。
【図２】種々の濃度のイソ吉草酸に対する嗅覚受容体の応答。
【図３】受容体のヘキサン酸応答における試験物質の濃度依存的阻害を示す。
【図４】ブルゲオナール及びフロルヒドラールによるヘキサン酸臭抑制能の官能評価。
【図５】試験物質によるノナン酸臭抑制能の官能評価。
【図６】試験物質によるイソ吉草酸臭抑制能の官能評価。
【図７】試験物質によるクレゾール臭抑制能の官能評価。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段(例えば、封じ込め)、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。
【００１７】
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂いの匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の活動を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその活動を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答活動が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。
【００１８】
従って、一態様として、本発明は、悪臭に対する嗅覚受容体のアンタゴニストを有効成分とする、悪臭抑制剤を提供する。抑制される悪臭としてはヘキサン酸臭、ノナン酸臭及びイソ吉草酸臭が挙げられる。これらの匂いは、例えば汗や皮脂を原因とする体臭の匂い（もしくは脂肪酸臭）等として一般的に知られている。本発明の悪臭抑制剤により、これらの匂いのいずれか１つ以上、好ましくは両方が抑制される。
【００１９】
上記悪臭に対する嗅覚受容体としては、OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体のいずれか１つが挙げられる。本発明の悪臭抑制剤の有効成分であるアンタゴニストは、これらの嗅覚受容体のいずれか１つに対するアンタゴニストであっても、又は複数に対するアンタゴニストであってもよい。上記嗅覚受容体は、図１及び２に示すとおり、ノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸臭に対して応答を示す。従って、これらの受容体の応答活動を抑制すれば、中枢におけるノナン酸臭、ヘキサン酸臭又はイソ吉草酸臭の認識に変化が生じるため、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによりノナン酸、ヘキサン酸又はイソ吉草酸による悪臭を抑制することができる。
【００２０】
アンタゴニストとしては、下記表１に示される物質が挙げられる。表３に示すとおり、これらの物質は、上記嗅覚受容体の活動を抑制する、当該嗅覚受容体のアンタゴニスト（拮抗剤）である。これらの物質は、従来香料として知られていたが、嗅覚受容体アンタゴニスト活性を有することは今まで知られていなかった。
【００２１】
【表１−１】
0005646255.tif 000002
【００２２】
【表１−２】
0005646255.tif 000003
【００２３】
表１に記載のアンタゴニストのうち、本発明の悪臭抑制剤の有効成分として、好ましくは、4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキサンカルバルデヒド、ブルゲオナール、フロルヒドラール、ヒドロキシシトロネラール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール、フロローザ、シクレモンＡ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールII、メトキシシトロネラールが挙げられ、より好ましくは、ブルゲオナール、フロルヒドラール、ヒドロキシシトロネラール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、フロローザ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールII、メトキシシトロネラールが挙げられ、さらに好ましくは、ブルゲオナール、フロルヒドラール、メトキシシトロネラール及びイソシクロシトラールが挙げられる。
【００２４】
表１に記載のアンタゴニストのうち、ブルゲオナール（3-(4-tert-ブチルフェニル)プロパナール）、フロルヒドラール（3-(3-イソプロピル-フェニル)-ブチルアルデヒド）、リリアール（p-tert-ブチル-α-メチルヒドロシナムアルデヒド）、フロローザ（テトラヒドロ-4-メチル-2-(2-メチルプロピル)-2H-ピラン-4-オール）はGivaudan社より入手可能であり、スザラール（3-(4-イソブチル-フェニル)-2-メチル-プロピオンアルデヒド）は高砂香料工業から、マジャントール（2,2-ジメチル-3-(3-メチルフェニル)プロパノール）はSymrise社より入手が可能である。また、シクレモンＡ（1,2,3,4,5,6,7,8-オクタヒドロ-8,8-ジメチル-2-ナフタレンカルボキシアルデヒド）、トリプラール（2,4-ジメチル-3-シクロヘキサン-1-カルボキシアルデヒド）はInternational Flavors & Fragrances社より入手可能であり、ポレナールII（2-シクロヘキシルプロパナール）は花王株式会社より入手可能である。シクラメンアルデヒド（3-(4-イソプロピルフェニル)-2-メチルプロパナール）、ヒドロキシシトロネラール（3,7-ジメチル-7-ヒドロキシオクタナール）、メトキシシトロネラール（7-メトキシ-3,7-ジメチルオクタナール）、シトロネラール（3,7-ジメチル-6-オクテナール）、イソシクロシトラール（2,4,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド、3,5,6-トリメチル-3-シクロヘキセン-1-カルボキシアルデヒド）、クミンアルデヒド（4-イソプロピルベンズアルデヒド）は、「合成香料  化学と商品知識  増補改訂版  印藤元一著  化学工業日報社」に記載の通り、例えばInternational Flavors & Fragrances社やGivaudan社、高砂香料工業などから入手することが可能である。4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキサンカルバルデヒドは、例えば特開2009-149811号公報に記載の方法で合成することが可能である。また、4-イソプロピル-1-メチルシクロヘキシルメタノールは例えば特開2008-1667号公報に記載の方法で合成することが可能であり、4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノールは、例えば特開平9-111281号公報に記載の方法で合成が可能である。
一例として、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒドは、特開平2-188549号公報に記載の方法により、4-イソプロピルシクロヘキシルメタノール（Mayol）(マイヨール：フィルメニッヒ社) 1554.57gを出発原料として合成することができ、得られる生成物は、例えば下記の通りに同定される。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz, δ ppm): 0.80 (3H, d, 6.8Hz) 0.84 (3H, d, 6.8Hz), 0.97-1.03, 1.19-1.30, 1.37-1.48, 1.51-1.61, 1.81-1.86, 1.95-1.99, 2.10-2.20 (10H, all m), 2.38-2.42 (1H, m), 9.56 (0.5H, s), 9.66 (0.5H,s)
13C-NMR(CDCl3, 100MHz, δ ppm): 19.87, 19.92 (q), 24.79, 26.32, 26.57, 28.63 (t), 32.14, 32.84, 43.31, 43.60 (d), 47.18, 50.68 (d), 204.60, 205.51 (d)
【００２５】
本発明の悪臭抑制剤の有効成分は、上記アンタゴニストのいずれか１つ以上であればよい。すなわち、本発明の悪臭抑制剤は、上記アンタゴニストのいずれかを単独又は２つ以上の組み合わせとして含有する。好ましくは、本発明の悪臭抑制剤は、上記アンタゴニストのいずれかの単独又は２つ以上の組み合わせから本質的に構成される。
【００２６】
別の態様として、本発明は、悪臭と、悪臭に対する嗅覚受容体のアンタゴニストとを共存させる工程を含む悪臭抑制方法を提供する。当該方法においては、悪臭の認識の阻害を必要とする個体、好ましくは嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによる悪臭の認識の阻害を必要とする個体に、当該悪臭に対する受容体のアンタゴニストを適用して、当該悪臭と当該アンタゴニストとを共存させる。それによって、当該悪臭受容体とアンタゴニストが結合して、当該受容体の活動が抑制されるので、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングが生じ、悪臭が抑制される。
【００２７】
本発明の方法において、個体は哺乳類であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。抑制される悪臭、嗅覚受容体、及び使用されるアンタゴニストのタイプは、上述の悪臭抑制剤の場合と同様である。
【００２８】
表１に記載のアンタゴニストは、上記嗅覚受容体のいずれか１の活動抑制に基づく嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによる悪臭抑制のために使用することができ、またそうした悪臭抑制のための化合物又は組成物の製造のために使用することができる。当該悪臭抑制用化合物又は組成物は、表１に記載のアンタゴニストに加えて、他の消臭効果を有する成分、又は消臭剤や防臭剤に使用される任意の成分、例えば、香料、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、植物抽出物、漢方成分、高級アルコール類、低級アルコール類、エステル類、長鎖脂肪酸、界面活性剤（非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤等）、ステロール類、多価アルコール類、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、殺菌剤、防腐剤、紫外線吸収剤、保留剤、冷感剤、温感剤、刺激剤、金属イオン封鎖剤、糖分、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、酸化防止助剤、油分、粉体、カプセル類、キレート剤、無機塩、有機塩色素、増粘剤、殺菌剤、防腐剤、防カビ剤、着色剤、消泡剤、増量剤、変調剤、有機酸、ポリマー、ポリマー分散剤、酵素、酵素安定剤等を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。
【００２９】
上記悪臭抑制用化合物又は組成物に含有され得る消臭効果を有する他の成分としては、公知の消臭剤が何れも使用できるが、例えば、植物の葉、葉柄、実、茎、根、樹皮等の各部位から抽出された消臭有効成分（例えば、緑茶抽出物）；乳酸、グルコン酸、コハク酸、グルタン酸、アジピン酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸等の有機酸、各種アミノ酸およびこれらの塩、グリオキサール、酸化剤、フラボノイド類、カテキン類、ポリフェノール類；活性炭、ゼオライトなどの多孔性物質；シクロデキストリン類などの包接剤；光触媒；各種マスキング剤、等が挙げられる。
【００３０】
下記実施例に示すとおり、表１に記載のアンタゴニストは、OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2及びOR51L1から選択される嗅覚受容体の匂い分子に対する応答を抑制し、また当該アンタゴニストを使用すれば、当該嗅覚受容体によって感受する匂い分子に由来する匂いを、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによって、匂い特異的に抑制することが可能となる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００３２】
実施例１  ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はGenBankに登録されている配列情報を基に、human genomic DNA female (G1521：Promega)を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をpENTRベクター（Invitrogen）にマニュアルに従って組込み、pENTRベクター上に存在するNot I、Asc Iサイトを利用して、pME18Sベクター上のFlag-Rhoタグ配列の下流に作成したNot I、Asc Iサイトへと組換えた。
【００３３】
実施例２  pME18S-hRTP1Sベクターの作製
ヒトRTP1Sはhuman RTP1遺伝子（MHS1010-9205862：Open Biosystems）を鋳型としたPCR法によりクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にEcoR I、アンチセンス側にXho Iサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したhRTP1S遺伝子（配列番号１）をpME18SベクターのEcoR I、Xho Iサイトへ組込んだ。
【００３４】
実施例３  悪臭に応答する嗅覚受容体の同定
１）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体３５０種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表２に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
【００３５】
【表２】
0005646255.tif 000004
【００３６】
２）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（fluc2P-CRE-hygro）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（hRluc-CMV）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記１）で作製した培養物から、培地をピペットで取り除き、ＣＤ２９３培地（Invitrogen）で調製した匂い物質（ヘキサン酸１ｍＭ又はノナン酸３００μＭ）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Dual-GloTM luciferase assay system（promega）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をfold increaseとして算出し、応答強度の指標とした。
【００３７】
３）結果
OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2、OR51L1の５種類の嗅覚受容体がヘキサン酸に対して応答を示し、OR2W1、OR10A6、OR51E1の３種類の嗅覚受容体がノナン酸に対して応答を示した（図１）。
【００３８】
上記と同様の手順で、嗅覚受容体OR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2、OR51L1のイソ吉草酸（０、３、１０、３０、１００、３００、及び１０００μＭ）に対する応答を調べた。嗅覚受容体OR51E1及びOR51I2が、イソ吉草酸に対して濃度依存的に応答した（図２）。
【００３９】
実施例４  悪臭受容体阻害活性の測定
実施例３で同定された嗅覚受容体を対象とし、５２種類の試験物質について受容体活動阻害活性を調べた。
実施例３と同様の方法でＨＥＫ２９３細胞にOR2W1、OR10A6、OR51E1、OR51I2、OR51L1をそれぞれ発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイにおいては、匂い物質としてヘキサン酸を用い、且つヘキサン酸とともに試験物質を添加した。ヘキサン酸に対する嗅覚受容体の応答を測定し、試験物質添加による受容体応答活動の低下を評価した。
試験物質による受容体活動の阻害率は、以下のとおり算出した。ヘキサン酸単独での匂い刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値（Ｘ）を、同じ受容体を導入し匂い刺激を行わなかった細胞での発光値（Ｙ）で引き算した。同様に、ヘキサン酸と試験物質の混合物での刺激による発光値（Ｚ）を、匂い刺激を行わない細胞での発光値（Ｙ）で引き算した。以下の計算式により、ヘキサン酸単独刺激による発光値の増加分（Ｘ−Ｙ）を基準に、試験物質による受容体活動阻害活性を算出した。独立した実験を二連で複数回行い、各回の実験の平均値を得た。
阻害率（％）＝｛１−（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝×１００
その結果、OR2W1に対しては７種類、OR10A6に対しては３種類、OR51E1に対しては７種類、OR51I2に対しては１０種類、OR51L1に対しては６種類の試験物質が、受容体活動阻害活性を示した（表３）。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
さらに、阻害活性を示した試験物質全てに関して、ヘキサン酸応答の濃度依存的応答阻害を調べた。試験物質の濃度は、３、１０、３０、１００、３００μＭを用いた。各試験物質濃度下におけるヘキサン酸１ｍＭに対する受容体の応答について、試験物質濃度０μＭ下での受容体の応答強度を１００％として、相対応答強度を調べた。その結果、阻害活性を示した試験物質の中でもブルゲオナール及びフロルヒドラールが、４つの嗅覚受容体OR2W1、OR51E1、OR51I1、OR51L1のヘキサン酸応答を、いずれも濃度依存的に阻害することが示された（図３）。
【００４２】
実施例５  試験物質の悪臭抑制能の評価
実施例４で同定した受容体活動阻害活性を有する試験物質の悪臭抑制能を、官能試験によって確認した。
ガラス瓶（柏洋硝子Ｎｏ．１１、容量１１０ｍｌ）に綿球を入れ、悪臭としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したヘキサン酸、１０倍に希釈したノナン酸又は１０００倍に希釈したイソ吉草酸、及び試験物質を綿球に２０μｌ滴下した。ガラス瓶を一晩室温で静置し、匂い分子をガラス瓶中に十分揮発させた。官能評価試験はパネラー３名（イソ吉草酸については５名）で行い、悪臭を単独で滴下した場合の匂いの強さを５とし、試験物質を混合した場合の悪臭の強さを０から１０（０．５刻み）として２０段階で評価した。
試験物質は、ヘキサン酸に対してはプロピレングリコールで１００倍に希釈したフロルヒドラール、ブルゲオナール、ヒドロキシシトロネラール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、（4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール）、フロローザ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールIIを、ノナン酸に対しては１０倍に希釈したフロルヒドラールを、イソ吉草酸に対しては１０００倍に希釈したフロルヒドラールを用いた。試験物質の対照物質として、上記嗅覚受容体に対する活動阻害効果のない物質である香料フロラロール（プロピレングリコールで１００倍に希釈）を用い、ヘキサン酸に関して同様の試験を行った。
【００４３】
OR2W1、OR51E1、OR51I2、OR51L1のヘキサン酸応答を抑制するフロルヒドラール及びブルゲオナールは、ヘキサン酸の匂いを著しく抑制させた（図４）。このヘキサン酸臭の抑制は、対照物質（フロラロール）を混合した場合に比べ顕著であった。またノナン酸及びイソ吉草酸について調べた結果、やはりこれらの試験物質によって匂いが抑制された（図５及び６）。なお、１種類又は複数のヘキサン酸受容体の応答を抑制する他の物質（ヒドロキシシトロネラール、4-イソプロピルシクロヘキサンカルバルデヒド、4-(2-メトキシフェニル)-2-メチル-2-ブタノール、フロローザ、イソシクロシトラール、トリプラール、ポレナールII）についてもヘキサン酸臭の抑制効果を検証したところ、いずれの試験物質もヘキサン酸臭を抑制することが明らかとなった（表４）。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
実施例４で同定した受容体活動阻害活性を有する試験物質による悪臭抑制の特異性を調べるため、脂肪酸と構造の異なる悪臭であり、実施例３で同定した嗅覚受容体が応答しない匂い物質であるクレゾールを用いて、同様の官能試験を行った。実験では、悪臭としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したクレゾールを用い、試験物質としてプロピレングリコールで１００倍に希釈したフロルヒドラールを用いた。
試験の結果、クレゾールの匂いはフロルヒドラールによって抑制されなかった（図７）。従って、抑制効果は匂い特異的であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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