(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を，遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において，
前記ペプチド化合物の前記生合成遺伝子群がゴードスポリン生合成遺伝子群であり，前記遺伝子組換え可能な放線菌がストレプトマイセス  エスピーＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５１８）もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌であり，godA遺伝子配列の塩基の１又は複数個を置換，欠失，又は挿入することによって製造されるゴードスポリンの類縁体であって，
転写活性化因子godR遺伝子で形質転換することにより，形質転換前と比較して， godR 遺伝子の発現が増強されたストレプトマイセス  エスピーＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５１８）もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌を培養する, 下記化学式２−４７のいずれか１つの式の構造式で表わされるゴードスポリン類縁体を製造することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【化１−Ａ】
0005596271.tif 000052
【化１−Ｂ】
0005596271.tif 000053
【化１−Ｃ】
0005596271.tif 000054
【化１−Ｄ】
0005596271.tif 000055
【化１−Ｅ】
0005596271.tif 000056
【請求項２】
前記転写活性化因子godR遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体ＤＮＡ上に１個又は複数個組み込むことによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする請求項１に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項３】
前記ゴードスポリン生合成遺伝子群は，ゴッドエー（godA），ゴッドビー（godB），ゴッドシー（godC），ゴッドディー（godD），ゴッドイー（godE），ゴッドエフ（godF），ゴッドジー（godG），ゴッドエッチ（godH），ゴッドアイ（godI），及びゴッドアール（godR）の１０個の遺伝子からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項４】
前記ゴードスポリンの類縁体のうち，前記ゴードスポリンが色素生産もしくは胞子形成を誘導することと同様に，色素生産もしくは胞子形成を誘導することができる前記ゴードスポリンの類縁体は，下記の化学式２，４，５，７，９，２０，２４，２５及び３６のいずれか１つの式の構造式で表わされることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【化１−１】
0005596271.tif 000057
【請求項５】
下記の化学式２，４，５，７，９，２０，２４，２５及び３６のいずれかの１つの式の構造式で表わされる，ゴードスポリンが色素生産もしくは胞子形成を誘導することと同様に，色素生産もしくは胞子形成を誘導することができることを特徴とするゴードスポリンの類縁体。
【化１−２】
0005596271.tif 000058
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，複素環のうち，チアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環を含有するペプチド化合物の製造方法であって，例えば，複素環含有ペプチド化合物であるゴードスポリン及びゴードスポリン類縁体を効率的に製造する方法及びゴードスポリンの類縁体に関する。
【背景技術】
【０００２】
複素環含有ペプチド化合物であるゴードスポリン(Goadsporin)は，一般式（１）で示される構造式を持ち，放線菌の二次代謝産物生産，及び胞子形成促進効果，更には生育阻害効果を有する化合物として富山県立大学の尾仲らによって発見された（例えば，非特許文献１参照）。
【０００３】
【化１】
0005596271.tif 000002
ＧＳ−−−−（１）
【０００４】
ゴードスポリン(Goadsporin)は，上記式（１）に示すように，１９個のアミノ酸を前駆体として生合成されるペプチド化合物であり，ゴードスポリン前駆体は，リボゾームによる翻訳により生合成される。このゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子は，ゴッドエー（godA）であり，全長１５０塩基，４９個のアミノ酸をコードしている。この内，Ｃ末端側１９個のアミノ酸部位がゴードスポリン前駆体の配列である。ゴードスポリンを生産する放線菌であるストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp) ＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号：ＴＰ−Ａ０５８４，ＮＩＴＥ  Ｐ−５１８）における生合成は，図１１に示すような経路で行われる。図１１に示すように，まず，菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるゴッドエー(godA)が転写翻訳され，ゴッドエー（GodA）蛋白が発現する。次に，ゴッドビー(GodB)，ゴッドシー(GodC)蛋白によってゴッドエー(godA)蛋白は細胞膜へ係留される。その後，ゴッドディー(GodD)，ゴッドイー(GodE)，ゴッドエフ(GodF)，ゴッドジー(GodG)蛋白が，ゴッドエー(GodA)蛋白内のセリン，スレオニン，システイン残基をそれぞれオキサゾール，メチルオキサゾール，チアゾールに変換する。このように翻訳後, 修飾されたゴッドエー（GodA）蛋白は，次に, Ｎ末端から３０番目のアラニンと３１番目のアラニンの間でプロテア−ゼ酵素によって切断され，Ｃ末端側１９残基が遊離する。その遊離したＣ末端側１９残基のＮ末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて，ゴードスポリンが完成する（例えば，非特許文献２参照）。
【非特許文献１】H. Onaka, H. Tabata, Y. Igarashi, Y. Sato and T. Furumai, Goadsporin, a chemical substance which promotes secondary metabolism and morphogenesis in streptomycetes. I. Purification and Characterization, The Journal of Antibiotics, 54, 1036-1044, (2001)
【非特許文献２】H. Onaka, M. Nakaho, K. Hayashi, Y. Igarashi, T. Furumai, Cloning and characterization of goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584.Microbiology, 151: 3923-3933 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで，ゴードスポリンは，放線菌の二次代謝産物生産，胞子形成促進効果，更には生育阻害効果を有する化合物であるので，放線菌の二次代謝生産をコントロールすることができれば，抗生物質等の生理活性物質の放線菌からの探索等において有用な技術となるために，その作用メカニズムの解析が行われている。同時に，ゴードスポリンは，ユニークな構造を有する化合物であり，生分解性や熱安定性にも優れていることから，医薬品，生化学試薬としての用途が期待でき，そこで，ゴードスポリンの生合成機構の解明を行うことにより，ゴードスポリンの醗酵生産への応用を目指した研究が続けられている。
【０００６】
また，今日まで，ゴードスポリン生産を増大させることに関する知見はなく，その生産量を増大させる方法は知られていない。また，ゴードスポリンの類縁体の製造に関しては，非特許文献２に記載されているように，４種類について報告されているのみであったが，ゴードスポリン類縁体は，ゴッドエー(godA)遺伝子を組み換えることにより，野生型ゴードスポリンの１２分の１程度まで生産量が減少してしまい，ゴードスポリンの製造法として実用化するには生産量を増大することが必須である。また，ゴードスポリンは，多様な類縁体が従来の製造法で製造できるかどうかは明らかではなかったが，ゴッドエー
（godA）蛋白のＣ末端側１９残基に相当する部分のゴッドエー（godA）遺伝子塩基配列を変更することによって，ゴードスポリン類縁体の化合物を生合成することができると考えられる。
【０００７】
ゴードスポリンを初めとするチアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環である複素環を含有したペプチド化合物は，抗菌活性を有するために医薬品としての用途が考えられる他に，様々な用途が考えられる。しかしながら，ゴードスポリン及びその類縁体の製造は，高分子化合物であるために有機合成反応による製造方法では多段階反応となり，これまでのところ実現していなかった。ゴードスポリン等の複素環を含有したペプチド化合物について，簡便な製造方法が発明されれば，より薬効の高い類縁体を発見することができる。そのためには微生物醗酵法による製造法が有力であるが，ゴードスポリン生産野生株の生産量が少ないために，効率的な製造は難しかった。
【０００８】
この発明の目的は，遺伝子操作によりゴードスポリン等の複素環含有ペプチド化合物の生産野生株の生産量を増やし，更に，野生型ゴードスポリン等に複素環含有ペプチド化合物に比べて生産量が少なくなるゴードスポリン類縁体等の複素環含有ペプチド化合物の生産量を増やすことを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法及びゴードスポリンの類縁体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明は，リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を，遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において，
前記ペプチド化合物の前記生合成遺伝子群がゴードスポリン生合成遺伝子群であり，前記遺伝子組換え可能な放線菌がストレプトマイセス  エスピーＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５１８）もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌であり，godA遺伝子配列の塩基の１又は複数個を置換，欠失，又は挿入することによって製造されるゴードスポリンの類縁体であって，
転写活性化因子godR遺伝子で形質転換することにより，形質転換前と比較して， godR 遺伝子の発現が増強されたストレプトマイセス  エスピーＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５１８）もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌を培養する, 下記化学式２−４７のいずれか１つの式の構造式で表わされるゴードスポリン類縁体を製造することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法に関する。
【００１０】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，前記転写活性化因子godR遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体ＤＮＡ上に１個又は複数個組み込むことによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大するものである。
【００１１】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法において，前記ゴードスポリン生合成遺伝子群は，ゴッドエー（godA），ゴッドビー（godB），ゴッドシー（godC），ゴッドディー（godD），ゴッドイー（godE），ゴッドエフ（godF），ゴッドジー（godG），ゴッドエッチ（godH），ゴッドアイ（godI），及びゴッドアール（godR）の１０個の遺伝子からなるものである。
【００１２】
また，前記ゴードスポリンの類縁体のうち，前記ゴードスポリンが色素生産もしくは胞子形成を誘導することと同様に，色素生産もしくは胞子形成を誘導することができる前記ゴードスポリンの類縁体は，後述の化学式２，４，５，７，９，２０，２４，２５及び３６のいずれか１つの式の構造式で表わされるものである。
【００１３】
また，この発明は，後述の化学式２，４，５，７，９，２０，２４，２５及び３６のいずれか１つの式の構造式で表わされる，ゴードスポリンが色素生産もしくは胞子形成を誘導することと同様に，色素生産もしくは胞子形成を誘導することができることを特徴とするゴードスポリンの類縁体に関する。
【００１４】
ゴードスポリンは，放線菌・ストレプトマイセス・エスピー  ティーピーエー０５８４（Streptomyces sp. TP-A0584 ）が生産する二次代謝産物であり，リボゾームを介して生合成されることが明らかとなっている。そこで，この発明では，はじめに生産菌にゴードスポリン生合成遺伝子群転写活性化因子であるゴッドアール（godR）遺伝子を染色体上に複数組み込むことにより，ゴードスポリン生産量を野生株の２．５倍以上に増大させたゴードスポリン生産増大株を作製した。次に，作製株のゴードスポリン構造遺伝子・ゴッドエー(godA)の塩基配列を置換することにより，ゴードスポリン類縁体を従来の方法に比べて，１４倍以上高生産する株を作製した。そして，ゴードスポリン類縁体を４７種類製造し，本製造方法において製造できるゴードスポリン類縁体の種類について明らかにし（実施例６），本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１５】
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，上記のように構成されており，ゴードスポリン醗酵生産における生産量を増大することができ，また，従来の報告では生産量が少なかったゴードスポリン誘導体の生産も増大することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
−ゴードスポリン高生産株の使用−
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，非特許文献１に記載されている従来のゴードスポリン類縁体生産株に比べて１４．６倍の生産量が増大したゴードスポリン高生産株ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株を使用することにより，ゴードスポリン類縁体の生産量を飛躍的に増大させることができる。ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株は，実施例に示したようにピーティーワイエム１イーピーゴッドアール (pTYM1epgodR)プラスミドをゴードスポリン生産菌に導入することにより作製することができる。ここで，ゴッドエー（godA）遺伝子及びその周辺塩基配列を，配列番号１及び２に示す。ここで，ゴッドエー（godA）遺伝子は，１０１番目〜２５０番目の塩基である。
【００１７】
また，この発明については，ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株以外にも，ゴッドアール（godR）遺伝子を複数コピーし，細胞内に導入する遺伝子組換え操作をすることによって，ゴッドアール（godR）の細胞内での発現量を増大させることによりゴードスポリンの生産量を増大させた微生物を使用することもできる。ここで，ゴッドアール（godR）遺伝子及びその周辺塩基配列を，配列番号３及び４に示す。ここで，ゴッドアール（godR）遺伝子は，１０１番目〜８１７番目の塩基である。
【００１８】
また，この発明については，ゴードスポリン生合成遺伝子群を別の微生物に移すことにより，ゴードスポリンを異種発現できるようになった微生物に対して，上記と同様なゴッドアール（godR）の細胞内での発現量を増大させる処理を行った微生物を使用することもできる。
【００１９】
−ゴードスポリン類縁体及びゴードスポリン製造法−
ゴードスポリン類縁体を製造するためには，上記のように，ゴッドアール（godR）遺伝子発現が増大したゴードスポリン高生産株のゴッドエー（godA）遺伝子を破壊した株に新たに変異ゴッドエー（godA）遺伝子を導入することによって，変異ゴッドエー（godA）遺伝子を高発現させることができる。この結果，ゴッドエー（godA）遺伝子の変異に従ったゴードスポリン類縁体を製造できる。新たに変異ゴッドエー（godA）遺伝子を導入するには，実施例に示したようなピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて，塩基変異を導入したプラスミドを用いることができる。ゴードスポリン類縁体を製造するためには上記ピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて，塩基変異を導入したプラスミド以外でも，変異ゴッドエー（godA）遺伝子を生産菌に導入できれば特にベクターの種類は問わない。変異ゴッドエー（godA）遺伝子を用いれば，ゴードスポリン類縁体は，後述の化学式（２）〜式（４７）に示した構造式以外のゴードスポリン類縁体を製造することができることは勿論である。
【００２０】
−実施例−
実施例１及び実施例５において，ゴードスポリン生合成遺伝子群内に存在する転写因子・ゴッドアール（godR）が転写アクチベーターであることが明らかとなり，ゴッドアール（godR）を複数個，遺伝子操作によって染色体上に組み込んだ株のゴードスポリン生産が増大することを明らかにした。
【００２１】
また，実施例３及び実施例６において，これまで，ゴードスポリン類縁体の製造では，４種類しか成功していなかった類縁体作製に関しても，多様な塩基配列置換を試みた結果，本生産菌が生産することのできる類縁体の化学構造には制限があるが，少なくとも４７種類の類縁体を製造できることが明らかとなった。
【００２２】
実施例７では，いくつかのゴードスポリン類縁体においても生理活性が見出されていることを示したものである。
【００２３】
ゴードスポリン類縁体を作製するにあたり，ゴッドエー（godA）遺伝子破壊株に，再びゴッドエー（godA）遺伝子を組み込んだ復帰株（図１）が野生株同量程度のゴードスポリンを生産するのかを確認したところ，生産量が約１／１２に減少してしまった（図９）。そこで，ゴードスポリン生合成遺伝子群転写活性化因子であるゴッドアール（godR）をゴッドエー（godA）遺伝子破壊株に組み込むことによって，生産量を増加させた。図８に野生株，ゴッドエー（godA）遺伝子復帰株，ゴッドエーアールツー（godA-R2)株の染色体上における，ゴードスポリン生合成遺伝子群の様子を示した。これにより野生株の約１．２倍のゴードスポリンを生産する復帰株を得ることができた（図９）。そこで，このゴッドアール（godR）遺伝子の２倍体株（受託番号：ＴＰ−Ａ０５８４ΔgodA−R2，ＮＩＴＥ  Ｐ−５１９），ゴッドエーアールツー（godA-R2)株を利用して，ゴードスポリン類縁体の作製を行った。
ゴッドエー(godA)及び周辺部位の塩基配列を配列番号１及び２に示す。また，ゴッドエー(godR)遺伝子及び周辺部位の塩基配列を配列番号３及び４に示す。
【００２４】
−ゴードスポリン生産菌における，耐性遺伝子，転写調節因子コピー数増加によるゴードスポリン生産量への影響−
ゴードスポリン生合成遺伝子の中でゴッドアイ（godI）が耐性遺伝子，ゴッドアール
godR) が転写調節遺伝子であるとＤＮＡ配列情報より推定された。一般的に生産物量を増大するためには，その物質に対する宿主菌株の薬剤耐性度を上げること，又は生合成遺伝子群の転写量を増大する操作による増大法が考えられる。そこで，どちらがゴードスポリン生産において有効な手段であるかを明らかにするために，ゴードスポリン生産菌の染色体にゴッドアイ（godI），ゴッドアール(godR)をそれぞれ１コピー導入した株を作製し，ゴッドアイ（godI）の２倍化株，ゴッドアール(godR)の２倍化株のゴードスポリン生産量を測定した。ゴッドアイ（godI）の２倍化株については，耐性遺伝子の増加により宿主のゴードスポリンへの耐性度が増加することが考えられた。また，ゴッドアール(godR)の２倍化株については転写調節遺伝子の増加によりゴードスポリン生合成遺伝子群の転写量が増大して生産量が増大することを期待した。ゴッドアール(godR)においては，転写因子であることまではＤＮＡ配列情報より推定できたが，転写活性化因子であるか転写阻害因子であるかまでは推定できなかったので，本実験によって転写活性化因子であることも初めて明らかになった。
【００２５】
ゴッドアイ（godI）遺伝子の２倍化株の作製
材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) （図２）
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアイ（godI）クローニング用プライマー
godI-C   5'-TGGAAGCTTCTGCTTGCGGTCACCGGATC-3'（配列番号９３）
godI-N   5'-GCGACCCATATGTTCGACACTCTCTCCGA-3'（配列番号９４）
【００２６】
ゴッドアイ（godI）のクローニング
ゴードスポリン（goadsporin）生合成遺伝子上でゴッドアイ（godI）遺伝子のＣ末側，Ｎ末側の配列を基に，デザインしたプライマーを用いて，PCR により増幅してインサート断片（約1.6 kb）を得た。これをピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) のマルチクローニングサイトにNde I ，Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム１イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を作製した。
【００２７】
遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いてＴＰ−Ａ０５８４の染色体上に組み込ませ，形質転換体
（godI２倍化株）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【００２８】
ゴッドアール(godR)２倍体株の作製
１−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) （図２）
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアール(godR)遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind   5'-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3'（配列番号９５）
godR-N-Nde    5'-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3'（配列番号９６）
【００２９】
ゴッドアール(godR)のクローニング
ゴードスポリン（goadsporin）生合成遺伝子上でgodR遺伝子を含む配列を基にデザインしたプライマーを用いて，ＰＣＲにより増幅してインサート断片（約０．７ｋｂ）を得た。これをpTYM1ep のマルチクローニングサイトにNde I ，Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を作製した（図３）。
【００３０】
遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いてＴＰ−Ａ０５８４の染色体上に組み込ませ，形質転換体
（godR２倍化株）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【００３１】
−ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産量の確認について−
ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産パターンを図７に示した（それぞれ２個体ずつ解析）。
図７から分かるように，野生型と比較して，ゴッドアイ（godI）２倍化株ではゴードスポリン生産量は大きく変化しないが，野生型に比べてゴードスポリン生産が早い時期に起こることが示された。一方，ゴッドアール(godR)２倍化株では，ゴードスポリン生産量が大きく増加した。更に，野生型よりも早期にゴードスポリン生産量が増加し始めることが示された。
【００３２】
−実施例１−
ゴッドアール（godR）遺伝子２倍体株〔ＴＰ−Ａ０５８４ΔgodA−R2〕の作製
１−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) 
・ピーティーワイエム１９(pTYM19)
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアール（godR）遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind  5'-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3' （配列番号９５）
godR-N-Nde   5'-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3' （配列番号９６）
ａｐｈII遺伝子特異的プライマー
aph-C   5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3'（配列番号９７）
aph-N   5'-ATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-3'（配列番号９８）
ｔｓｒ遺伝子特異的プライマー
tsr-C   5'-CTTCATATGCGGGGATCGACCGCGC-3' （配列番号９９）
tsr-N   5'-GACGAATCGAGGTCGAGGAACCGAG-3' （配列番号１００）
・ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
【００３３】
１−２：プラスミドの作製
ゴードスポリン生合成遺伝子上でゴッドエー（godA）遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片（約１．２ｋｂ）をｐＴＹＭ１９にクローニングし，図５に示すピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19epgodA) を作製した。
【００３４】
１−３：遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いて，ゴッドエー（godA）遺伝子破壊株の染色体上に組み込ませ，形質転換体ゴッドエーアールツー（ΔgodA-R2 ）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
得られた形質転換体から染色体を回収し（ＣＴＡＢ法など），ａｐｈ II 遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより形質転換が確実に行われたことを確認した（図４）。
次に，生産量が増加することを確認するため構築したプラスミドピーティーワイエム１９ゴッドエー(pTYM19godA)を同様の方法でΔgodA-R2 株の染色体上に組み込ませ，ゴードスポリン高生産復帰株（godA-R2)を取得した。得られた形質転換体から染色体を回収し，ｔｓｒ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより形質転換が確実に行われたことを確認した（図４）。
【００３５】
−実施例２−
ゴードスポリンの定量法
２−１：材料・試薬
・Ｖ−２２
０．１％ Starch ，０．５％ Glucose, ０．３％ NZ-case, ０．２％ Yeast extract,   ０．５％ tryptone,０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 ，０．５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，
０．３％ＣａＣＯ3 ，ｐＨ：７．０
・ゴードスポリン生産培地
６．０％ Maltose, ４．０％ Pharmamedia, １．０％ Yeast extract, 
１．０％ Diaion HP20（脱気してｐＨ調整後に混合）, ｐＨ７．０
【００３６】
２−２：放線菌の培養
得られた形質転換体を選択薬剤カナマイシン，チオストレプトンを２０μｇ／ｍｌ添加した１０ｍｌ  Ｖ−２２培地に植菌した。３０℃で２日間振とう培養後，１００ｍｌのゴードスポリン生産培地に前培養液を３％植菌し，さらに５日間培養した。
【００３７】
２−３：ＨＰＬＣ分析法
培養液と等量のｎ−ＢｕＯＨを加えて６０分間激しく振とう撹拌した。これを遠心分離（６０００〜１００００ｒｐｍ，５分間) してＢｕＯＨを回収し，減圧濃縮した。
ＭｅＯＨで溶解後，フィルター濾過したものをＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣ（
ＨＰ１１００，Hewlett Packard ）は，Ｃ１８Cadenza カラム（Φ４．６×７５ｍｍ）を使用し，カラム温度４０℃移動相：０．１％ＣＨ3 ＣＮ−０．１％  ＨＣＯＯＨ buffer ，流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで溶出し，ＵＶ吸収スペクトルは２５４ｎｍで検出した。
【００３８】
−実施例３−
ゴードスポリン類縁体生産株の作製法
３−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１９ゴッドエー(pTYM19godA)
・ＰｆｕＵｌｔｒａT M ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ   polymerase 
・Dpn Ｉ
【００３９】
変異用プライマー
アミノ酸置換用の配列表を，配列番号５〜７４に示す。
また，アミノ酸挿入・欠失用の配列表を，配列番号７５〜９２に示す。
【００４０】
３−２：変異導入プラスミドの作製
ｐＴＹＭ１９ゴッドエー（godA）を鋳型プラスミドとして，QuikChange（登録商標）IIＸＬ Site −Directed  Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてプロトコールに従って変異導入を行った。取得した変異導入プラスミドは，ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０を用いてシーケンスし，目的の変異が導入されているかを確認した。
【００４１】
３−３：変異導入株の作製
宿主にΔゴッドエーアールツー（ΔgodA-R2)株を用いて，１−３と同様の方法により各ゴッドエー（godA）変異株を取得した。
３−４：ゴッドエー（godA）変異株による生産物の確認
ゴードスポリンの定量法と同様に分析を行った。コントロールであるゴットエーアールツー（godA-R2 ）株のＨＰＬＣデータと比較して，類縁体と思われる各ピークをＨＰＬＣの廃液配管から直接（手動で）採取した。採取した各ピークを Positive ESI-MS  にかけ，予想される分子量を参考にして構造を決定した（図１０）。
【００４２】
−実施例４−
ゴードスポリンのバイオアッセイ法
４−１：材料・試薬
・Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地
０．１％ Yeast extract,   ０．１％肉エキス（エルリッヒ),  
０．２％ＮＺ  Ａｍｉｎｅ  Ｔｙｐｅ  Ａ，１％  Ｄ（＋）−Glucose,２％Ａｇａｒ，  ｐＨ：７．２
・ＮＢソフトアガー
０．８％  Nutrient broth (Wako),  ０．５％ Agar 
【００４３】
４−２：ペーパーディスクアッセイ
図６に示すように，滅菌済みのペーパーディスク（直径１０ｍｍ）に，２−３の方法で調製した試料をＨＰＬＣ分析の結果からゴードスポリン約１０μｇになるようにしみ込ませて乾燥させた。３ｍｌのＮＢソフトアガー( 溶かして４０℃くらいに冷ましたもの) にS.lividans TK23 の胞子液を加え，Bennett's glucose 培地に均一に撒いた。アガーが乾いたら，ペーパーディスクを中央にのせ，３２℃で3 日間培養した。
【００４４】
−実施例５−
ｇｏｄＲ２倍体株（godA-R2 株）のゴードスポリン生産量
ＨＰＬＣ分析結果を図９に示した。
野生株godA-R2 株のゴードスポリンの生産量は，野生型と比較して１．１５倍，ゴッドエー（godA）復帰株と比較して１４．６倍であった。
ゴッドアール（godR）遺伝子を２倍にすることで，ゴッドエー（godA）復帰株においても野生型と同等のゴードスポリンを生産する株を取得できた。
【００４５】
−実施例６−
取得したゴードスポリン類縁体
ゴードスポリン類縁体の構造は，置換したアミノ酸から予想できるため，その分子量をＭＳで測定することによって構造を決定した（図１０）。
これにより４７種類のゴードスポリン類縁体を取得した。表１に，それぞれ配列を示した。
【００４６】
【表１】
0005596271.tif 000003
【００４７】
また，取得したゴードスポリン類縁体は，表１に配列が示されており，それらの構造式を下記において，一般式である化学式２〜４７（以下，化２〜化４７と記載）として示し，各構造式の上方に付した下向き矢印は，変化した構造を指している。
【００４８】
【化２】
0005596271.tif 000004
Ａ１Ｓ  −−−−（２）
【００４９】
【化３】
0005596271.tif 000005
Ａ１Ｃ  −−−−（３）
【００５０】
【化４】
0005596271.tif 000006
Ａ１Ｇ  −−−−（４）
【００５１】
【化５】
0005596271.tif 000007
Ｔ２Ｓ  −−−−（５）
【００５２】
【化６】
0005596271.tif 000008
Ｔ２Ｃ  −−−−（６）
【００５３】
【化７】
0005596271.tif 000009
Ｖ３Ｓ  −−−−（７）
【００５４】
【化８】
0005596271.tif 000010
Ｖ３Ｃ  −−−−（８）
【００５５】
【化９】
0005596271.tif 000011
Ｓ４Ｃ  −−−−（９）
【００５６】
【化１０】
0005596271.tif 000012
Ｔ５Ｃ  −−−−（１０）
【００５７】
【化１１】
0005596271.tif 000013
Ｉ６Ｓ  −−−−（１１）
【００５８】
【化１２】
0005596271.tif 000014
Ｉ６Ｃ  −−−−（１２）
【００５９】
【化１３】
0005596271.tif 000015
Ｉ６Ｙ  −−−−（１３）
【００６０】
【化１４】
0005596271.tif 000016
Ｌ７Ｓ−１  −−−−（１４）
【００６１】
【化１５】
0005596271.tif 000017
Ｌ７Ｓ−２  −−−−（１５）
【００６２】
【化１６】
0005596271.tif 000018
Ｃ８Ｓ−１  −−−−（１６）
【００６３】
【化１７】
0005596271.tif 000019
Ｃ８Ｓ−２  −−−−（１７）
【００６４】
【化１８】
0005596271.tif 000020
Ｃ８Ａ  −−−−（１８）
【００６５】
【化１９】
0005596271.tif 000021
Ｓ９Ｃ  −−−−（１９）
【００６６】
【化２０】
0005596271.tif 000022
Ｇ１０Ｓ  −−−−（２０）
【００６７】
【化２１】
0005596271.tif 000023
Ｇ１０Ｃ  −−−−（２１）
【００６８】
【化２２】
0005596271.tif 000024
Ｇ１１Ｓ  −−−−（２２）
【００６９】
【化２３】
0005596271.tif 000025
Ｇ１１Ｃ  −−−−（２３）
【００７０】
【化２４】
0005596271.tif 000026
Ｔ１２Ｓ  −−−−（２４）
【００７１】
【化２５】
0005596271.tif 000027
Ｔ１２Ｃ  −−−−（２５）
【００７２】
【化２６】
0005596271.tif 000028
Ｔ１２Ａ  −−−−（２６）
【００７３】
【化２７】
0005596271.tif 000029
Ｌ１３Ｓ  −−−−（２７）
【００７４】
【化２８】
0005596271.tif 000030
Ｌ１３Ｃ  −−−−（２８）
【００７５】
【化２９】
0005596271.tif 000031
Ｓ１５Ｃ  −−−−（２９）
【００７６】
【化３０】
0005596271.tif 000032
Ｓ１５Ａ  −−−−（３０）
【００７７】
【化３１】
0005596271.tif 000033
Ａ１６Ｓ  −−−−（３１）
【００７８】
【化３２】
0005596271.tif 000034
Ａ１６Ｃ  −−−−（３２）
【００７９】
【化３３】
0005596271.tif 000035
Ｇ１７Ｓ  −−−−（３３）
【００８０】
【化３４】
0005596271.tif 000036
Ｃ１８Ｓ  −−−−（３４）
【００８１】
【化３５】
0005596271.tif 000037
Ｃ１８Ａ  −−−−（３５）
【００８２】
【化３６】
0005596271.tif 000038
Ｖ１９Ｓ  −−−−（３６）
【００８３】
【化３７】
0005596271.tif 000039
Ｖ１９Ｃ  −−−−（３７）
【００８４】
【化３８】
0005596271.tif 000040
Ｖ１９Ｙ  −−−−（３８）
【００８５】
【化３９】
0005596271.tif 000041
３Ａ４    −−−−（３９）
【００８６】
【化４０】
0005596271.tif 000042
６Ａ７    −−−−（４０）
【００８７】
【化４１】
0005596271.tif 000043
１０Ａ１１−−−−（４１）
【００８８】
【化４２】
0005596271.tif 000044
１０ＡＶ１１−−−−（４２）
【００８９】
【化４３】
0005596271.tif 000045
１０ＳＡ１１−−−−（４３）
【００９０】
【化４４】
0005596271.tif 000046
１３Ａ１４＋Ｓ１５Ｔ−１    −−−（４４）
【００９１】
【化４５】
0005596271.tif 000047
１３Ａ１４＋Ｓ１５Ｔ−２    −−−（４５）
【００９２】
【化４６】
0005596271.tif 000048
Ｇ１１−ｄｅｌａｔｅ      −−−−（４６）
【００９３】
【化４７】
0005596271.tif 000049
Ｓ９＋Ｇ１１−ｄｅｌｅｔｅ−−−−（４７）
【００９４】
作製した類縁体とゴードスポリン生合成酵素の関係を表２に示した。
これらの結果から以下のことが明らかになった。
（１）アミノ酸を置換，挿入，欠失させても環形成するアミノ酸は変わらない。
（２）ゴードスポリン生合成酵素は，アミノ酸を1 ，2 個挿入してもゴードスポリン前駆体として認識する。ただし，１０Ａ１１などの中央に挿入した類縁体に比べ，３Ａ４，６Ａ７などの中央から外れたところに挿入すると生産量は減少する。
（３）ゴードスポリンを構成するアミノ酸は８種類であるが，それ以外のアミノ酸に置換しても生合成酵素は認識する。
【００９５】
【表２】
0005596271.tif 000050
【００９６】
−実施例７−
ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法の結果
ゴードスポリン類縁体のうち，ゴードスポリンと同様に色素生産，胞子形成を誘導したものは９種類であった。それを表３に示す。
【００９７】
【表３】
0005596271.tif 000051
【００９８】
表３に示すように，ゴードスポリン誘導体は，化学式２で示すＡ１Ｓ，化学式４で示すＡ１Ｇ，化学式５で示すＴ２Ｓ，化学式７で示すＶ３Ｓ，化学式９で示すＳ４Ｃ，化学式２０で示すＧ１０Ｓ，化学式２４で示すＴ１２Ｓ，化学式２５で示すＴ１２Ｃ，及び化学式３６で示すＶ１９Ｓであった。ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法によって観察した際に，色素のできる円の直径は次のとおりである。＋＋は，円の直径が２０〜２９ｍｍとはっきりとした大きな色素円を示し，＋は，円の直径が１５〜１９ｍｍとはっきりとして小さな色素円を示し，また，±は，円の直径が１４ｍｍ以下のかすかに色素を誘導している状態を示す。−は，色素誘導が確認できなかったものを示す。
【００９９】
図１１には，ゴードスポリン生合成経路が示されている。
（１）菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるｇｏｄＡが転写翻訳され，ｇｏｄＡ蛋白が発現する。
（２）ｇｏｄＢ，ｇｏｄＣ蛋白によってｇｏｄＡ蛋白は細胞膜へ係留される。
（３）ｇｏｄＤ，ｇｏｄＥ，ｇｏｄＦ，ｇｏｄＧ蛋白が，ｇｏｄＡ蛋白内のセリン，スレオニン，システイン残基をそれぞれオキサゾール，メチルオキサゾール，チアゾールに変換する。このように翻訳後修飾されたゴッドエー（GodA）蛋白は，次にＮ末端から３０番目のアラニンと３１番目のアラニンの間でプロテアーゼ酵素によって切断され，Ｃ末端側１９残基が遊離する。
（４）遊離したＣ末端側１９残基のＮ末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて，ゴードスポリンが完成する。
【０１００】
図８には，上段が野生株（TP-A0584）のゴードスポリン生合成遺伝子群を示しており，中段にｇｏｄＡ遺伝子復帰株，即ち，ｇｏｄＡ破壊株にｇｏｄＡ遺伝子を組み込んだ株のゴードスポリン生合成遺伝子群を示しており，また，下段には，ｇｏｄＡ破壊株に
ｇｏｄＡ遺伝子とｇｏｄＲ遺伝子を組み込んだ株，即ち，ｇｏｄＡ−Ｒ２株染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群が示されている。
【０１０１】
図４には，ｇｏｄＲ遺伝子の２倍体株のＰＣＲによる形質転換の確認が示されている。  Ａ（左側写真）は，ａｐｈ II 遺伝子特異的プライマーでＰＣＲしたサンプルである。  Ｂ（右側写真）は，ｔｓｒ遺伝子特異的プライマーでＰＣＲしたサンプルである。
（１）ＤＮＡサイズマーカー
（２）ＴＰ−Ａ０５８４（ＷＴ）ゲノムＤＮＡ
（３）ΔｇｏｄＡ株ゲノムＤＮＡ
（４）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＲ株ゲノムＤＮＡ
（５）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＡ株ゲノムＤＮＡ
（６）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＡ＋ｇｏｄＲ株ゲノムＤＮＡ
【０１０２】
図６には，ゴードスポリンのバイオアッセイ方法の工程が示されている。
図６に示すように，まず，ＮＢソフトアガーを完全に溶かし，Ｓ.lividans の胞子液を加え，Bennet's glucose  培地上に均一に蒔く。次いで，ＮＢソフトアガーが乾いたら，ゴードスポリンを染み込ませたペーパーディスクをプレートの中央に載せる。最後に，３２℃で３日間培養すると，色素生産と胞子形成が確認できる。
【０１０３】
図９には，ゴードスポリンのＨＰＬＣの分析を示している。
上段が野生株（TP-A0584）であり，中段がゴッドエー（godA）復帰株であり，下段がゴッドエーアールツー株（godA-R2)である。
【０１０４】
図１０には，マススペクトルデータの１例としてＧ１０Ｃのスペクトルを示している。  Ｇ１０Ｃの分子量は，その構造から１６５７．６４７６と予想された。
ＭＳのデータからｍ／ｚは１６５８．６５１０（〔Ｍ＋Ｈ〕+ ）の分子量が確認されたことから，これはＧ１０Ｃであると決定した。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
この発明は，ゴードスポリンを初めとするチアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環である複素環を含有したペプチド化合物の簡便で増大させる製造方法及びその類縁体を提供することであって，より増産の高いゴードスポリン及びその類縁体の製造方法を提供し，生育阻害効果を有し，抗菌活性を有するため，抗生物質等の医薬品，生理活性物質等の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ゴードスポリン高生産復帰株（ｇｏｄＡ−Ｒ２）の作製法を示す説明図である。
【図２】ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) のプラスミドマップを示す説明図である。
【図３】ピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) の作製方法を示す説明図である。
【図４】ゴットアール(GodR)遺伝子２倍体株の，ＰＣＲによる形質転換の確認を示す写真である。
【図５】類縁体作製の際に変異を加えるゴットエー(godA)の遺伝子配列を示す説明図である。
【図６】ゴードスポリンのペーパーディスクアッセイ法の工程を示す説明図である。
【図７】ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産パターンを示すグラフである。
【図８】野生株（TP-A0584），ゴットエー(godA)遺伝子復帰株，ゴットエーアールツー(godA-R2) 染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群を示す説明図である。
【図９】ゴードスポリンのＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。
【図１０】Ｇ１０Ｃのマススペクトルを示すグラフである。
【図１１】ゴードスポリン生合成経路を示す説明図である。
【図１】
0005596271.tif 000059
【図２】
0005596271.tif 000060
【図３】
0005596271.tif 000061
【図４】
0005596271.tif 000062
【図５】
0005596271.tif 000063
【図６】
0005596271.tif 000064
【図７】
0005596271.tif 000065
【図８】
0005596271.tif 000066
【図９】
0005596271.tif 000067
【図１０】
0005596271.tif 000068
【図１１】
0005596271.tif 000069
【配列表】
0005596271000001.app