(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体（３）表面に塗布されると共に、分析対象物質との相互作用に適した固定化生物学的活性物質（４）を含み、背面に位置決めされた光源を有する、バイオセンサ（２）であって、
前記担体（３）が、サファイア基板上にエピタキシャル成長された窒化ガリウムコーティング、酸化亜鉛コーティング若しくはダイアモンドコーティングの形態の半導体であるか、又はこれらの物質を含む化合物（Ａｌ２Ｇａ１−ｘＮ；ＺｎｘＭｇ１−ｙＯ）として形成され、
前記バイオセンサが、再生する装置を更に含み、該再生する装置が、それぞれ異なる溶液を含む、少なくとも２つの溶液の容器と、前記生物学的活性物質（４）を洗浄するためにポンプ（６）を用いて少なくとも１つの溶液（Ａ〜Ｇ）を前記担体（３）表面上に導くことが可能な少なくとも１つのノズル（５）と、前記ノズル（５）及び前記ポンプ（６）によって１つ又は複数の溶液（Ａ〜Ｇ）を前記担体（３）表面に導くことが可能な弁配列（７）と、を更に含み、
少なくとも１つの溶液が分子を除去する溶液であり、少なくとも１つの溶液が生物学的活性物質であることを特徴とする、バイオセンサ。
【請求項２】
前記バイオセンサ（２）の前記生物学的活性物質（４）が、抗体、酵素、細胞小器官、微生物、タンパク質又は核酸を含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記バイオセンサ（２）が、増幅器（９）によって増幅可能であると共に、評価システム（１０）に送信可能な信号を出力する変換器（８）を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記ノズル（５）を通じた前記生物学的活性物質（４）上への前記少なくとも１つの溶液（Ａ〜Ｇ）の供給が、微小流体システムを用いて実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記試薬及び／又は前記担体（３）が温度制御され、及び／又は前記担体（３）を備えるチャンバーに超音波に作用させることができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記担体（３）表面上の前記生物学的活性物質（４）が交換され、ここで、前記生物学的活性物質（４）の特定の結合特性が交換され、この際に、既存の該生物学的活性物質が前記担体（３）表面から除去されると共に、異なる生物学的活性物質が塗布されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオセンサ（２）を再生する方法。
【請求項７】
前記担体（３）表面上の抗体又は酵素を、タンパク質−タンパク質相互作用を解除することによって手動又は自動で除去することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記担体（３）表面上の核酸、補酵素、基質又は他の巨大分子を含む前記生物学的活性物質を、物理的結合又は化学的結合を解除することによって手動又は自動で除去することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液（Ａ〜Ｇ）を供給することによって前記担体（３）表面上の前記生物学的活性物質（４）を除去及び再固定化し、且つ前記洗浄工程を自動化することを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象物質と相互作用するように設計された固定化生物学的活性物質（biologically active material：生理活性物質）を担体表面上に担持するバイオセンサを再生する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここでの分野に関連するバイオセンサは生物学的構成要素を備える。バイオセンサの機能原理は、電子、光又は他の信号変換器、及び電子増幅器とセンサ素子表面上に位置決めされる固定化生物学的活性物質との直接的な空間的カップリングに基づく。かかる生物学的物質は、例えば抗体、酵素、細胞小器官、微生物又は核酸であり得る。
【０００３】
センサ表面上に位置決めされる固定化生物学的物質は分析対象物質と相互作用する。この相互作用は、例えば酵素と基質との間の相互作用又は抗体と抗原との間の相互作用となり得る。この相互作用は、例えば各表面の領域における特定のイオンのコーティング厚、屈折度、光吸収、電荷又はイオン濃度の物理的変化（例えばｐＨ値の変化）を生じる。これらの変化は、光センサ、アンペロメトリック電極、又は電位差測定法に基づいて作動する電界効果トランジスタ等の測定装置によって測定することができる。しかしながら、測定手順後、システムの初期状態を回復させる必要がある。したがって、バイオセンサを用いた分析対象物質の測定は、３つの工程で実施される。まず、バイオセンサの生物学的システムによる分析対象物質の生化学反応がある。次いで、この反応が電気信号又は光信号に変換される。引き続いて、この信号が処理及び増幅される。結果的に、バイオセンサの選択性及び感度は、用いる生物学的システムに由来する。
【０００４】
物質が塗布されるか、又は２つの膜の間に物質が埋め込まれた担体を用いてバイオセンサ上に生物学的物質を配置する。生物学的物質は、担体の化学的機能化の後に担体上に直接固定することもできる。さらに、生物学的システムは、後に変換器表面と接続される膜上に塗布することができる。水及び汚水の分析におけるバイオセンサに好適な用途形態は、単一成分分析用のバイオセンサ、毒性分析及び変異原性分析用のバイオセンサ、並びに生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）分析用のバイオセンサに分けることができる。他の例としては、例えば手術後の、ヒトの血中グルコース濃度の測定が挙げられる。グルコース濃度は、グルコースオキシダーゼが触媒するグルコース酸化の結果としてのｐＨ値の変化又は酸素濃度の変化として分析することができる。
【０００５】
ペニシリンを発現して培養培地中に分泌する細菌株を培養したバイオリアクタ（発酵槽）中のペニシリン濃度を測定するさらなるバイオセンサが既知である。濃度が十分に高い場合には、有機溶媒によって、また、数回の沈降反応後に培養培地から物質を抽出することができる。この状況で用いられるセンサの生物学的構成要素は酵素アシラーゼである。ペニシリン分解酵素が、ｐＨ電極が配置される膜に埋め込まれる。培地中のペニシリン濃度が増加すると、酵素の触媒により、フェニル酢酸の生成量が増加し、それにより電極近傍のｐＨ値が変化する。それゆえ、ｐＨ値を通じてペニシリン濃度を導出することが可能である。
【０００６】
バイオセンサのさらなる用途は、風呂水又は汚水中の細菌含量の分析に関する。振動している膜上に或る特定種の細菌に対して指向性を有する抗体を塗布することが可能である。各細菌はセンサの近くを浮遊する際に、抗体と結合し、それにより膜の振動を減衰させる。膜の振動が或る特定の値を下回ると、対応する信号が提供される。
【０００７】
バイオセンサ表面は、例えば窒化ガリウム（ＧａＮ）又は別の光透過性半導体（ＳＣ）から構成することができる。窒化ガリウムは、同様に光透過性であるサファイア基板上でエピタキシャルに成長することができる光透過性半導体である。この特性を用いることにより、背面に位置決めする光源を用いて遊離（mobile）抗体で標識された蛍光色素を励起することができる。この遊離抗体は、抗原と結合し、抗原は、未標識固定化抗体と同時に結合する。このタイプの抗原−抗体結合は、それにより、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡの原理に従う。遊離抗体が発した蛍光は、抗原認識後、高感度検出器で捕捉することができる。半導体表面上、又は他の物質、例えばＺｎＯ、ＳｎＯ２又はダイアモンド上での抗体の固定化は、各種方法、例えばグルタルアルデヒド又はブロモシアニド（ＢｒＣＮ）を用いた架橋によって実現することができる。
【０００８】
センサ表面上での抗体の固定化は、プロテインＧ及びプロテインＡとのタンパク質−タンパク質相互作用によっても実現することができ、このプロテインＧはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus：黄色ブドウ球菌）に由来する。プロテインＧの代替としては、プロテインＡを使用することができる。固定化する物質としてプロテインＧ又はプロテインＡを使用するかどうかは、抗体の起源、すなわち、抗体を産生した特定の生物によって決められることが多い。どちらの方法も、適切な架橋剤との組合せで適用することができる。この場合、プロテインＡ又はプロテインＧはそれぞれ、グルタルアルデヒドを用いてセンサ表面上に固定化される。架橋後、抗体のＦｃ−ドメインでのタンパク質−タンパク質相互作用を介して抗体が実際に塗布される。この方法の利点は、センサ表面上で抗体が最適に利用されることである。細菌であるエシェリヒア・コリ（E. coli：大腸菌）が、抗原の一例として用いられることができる。
【０００９】
かかるバイオセンサの１つの欠点は、その特徴として、寿命が短く、生物学的安定性が低いことである。この点に関して、固定化したタンパク質成分及び核酸成分の変性がセンサ表面上で生じることを考慮しなければならず、固定化した巨大分子、例えば核酸及びタンパク質の分解がかかるバイオセンサの欠点であると理解することができる。結論として、かかる固定化生物学的活性物質の寿命及び安定性を改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、バイオセンサを再生する装置及び方法を提供することによって上記の先行技術の欠点を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本課題は、添付の特許請求の範囲の請求項１の前文の一部である技術的特徴に係るバイオセンサに基づき、また、添付の特許請求の範囲の請求項６の前文の一部である技術的特徴に係る方法によって、さらには、それらの各特徴（characterizing features）によって解決される。本発明のさらに有利な実施の形態は、特許請求の範囲の従属請求項にて示される。
【００１２】
本発明は、装置が、生物学的活性物質を洗浄するためにポンプによって少なくとも１つの溶液を担体表面上に導くことができる少なくとも１つのノズルを有するという技術的教示を含む。
【００１３】
したがって、本発明は、抗体又は酵素等の生物学的成分を自動的に除去する装置を作製するという思想に基づく。このプロセスでは、使用した生物学的物質、例えば抗体、酵素、核酸及び他の残留物を除去する特別な溶液を、自動微小流体システムを用いてセンサ表面全体に圧送することができる。センサ表面を浄化してから、固定化プロセスを反復する。
【００１４】
有利には、装置は、ノズル及びポンプを介して異なる溶液を担体表面上に任意に導くことができる弁配列を有することができる。バイオセンサの生物学的活性物質には、抗体、酵素、細胞小器官、微生物、タンパク質又は核酸が含まれる。さらに、バイオセンサは、増幅器で増幅することができると共に、評価システムに提示することができる信号を生成する変換器を有する。
【００１５】
有利には、ノズルによる生物学的活性物質上への少なくとも１つの溶液の供給は、微小流体システムの形態であることである。この微小流体システムは生物学的センサに組み込むことができるため、センサと共に本発明による装置を構成する。弁システムは、手動又は自動で作動可能であるため、各要件に応じて、異なる溶液を担体表面上に供給することができる。寿命をより長くするために、貯蔵期間中、これらの試薬は冷蔵され得る。
【００１６】
バイオセンサの担体は、例えば、担体物質上に塗布される窒化ガリウムコーティング、酸化亜鉛コーティング又はダイアモンドコーティングの形態の半導体から構成することができる。システムは単一のノズルに限定されず、担体表面を洗浄するために幾つかのノズルを同時に使用することができる。
【００１７】
さらに、本発明は、上記の装置を用いてバイオセンサを再生するプロセスに関する。担体表面の固定化に関するすべての工程だけでなく、すべての浄化工程を、自動化流体システムを用いて実施することができる。自動化システムの主要構成要素は、異なる溶液に接続することができる弁が含まれる。さらに、このシステムには、弁を介して異なる溶液を吸引するポンプが含まれ、ノズルを介して溶液がセンサ表面に導かれる。本発明のシステムは、弁、ポンプ及びノズルのそれぞれをいずれか１つ、又はそれらの複数を含み得る。結果的に、先に使用した生物学的活性物質からバイオセンサ表面を浄化することが可能であるばかりか、洗浄によって担体表面上の生物学的活性物質を再生及び／又は交換することさえも可能である。浄化及び新たな固定化のプロセスは、温度制御流体及び／又はセンサ構成要素によって、並びに超音波とのカップリングを通じてサポートすることができる。
【００１８】
本発明が開示する自動化バイオセンサ再生のさらなる利点は、例えば酵素特性又は核酸の交換である。本目的のために、溶液を用いてセンサ表面から酵素を脱離させ、別の酵素に交換する。この交換は、弁配列を用いて異なる溶液を選択することによって実施される。本目的のためには、変換器は、異なる酵素にも対応できるようにしておくだけでよい。さらに、再生したバイオセンサは、固定化の特定の条件に応じて、再現性、較正可能性、好ましくは線形性を示す必要がある。
【００１９】
本発明のさらなる実施の形態によれば、担体表面上の抗体は、タンパク質−タンパク質相互作用を解除することによって除去される。プロテインＡ又はプロテインＧの固定化はアフィニティクロマトグラフィから既知である。通常、タンパク質は、セファロース等のポリマーマトリクスとカップリングされてから、抗体の精製に使用される。プロテインＧと窒化ガリウム、半導体表面又は他の表面とのカップリングは、それにより、本発明による再生の利点をもたらす。引き続く、抗体のＦｃ−ドメイン（抗体フラグメント）と、半導体表面上に固定化したプロテインＧとのタンパク質−タンパク質相互作用は、さらなる利点をもたらす。
【００２０】
さらに、プロテインＧとのタンパク質−タンパク質相互作用を解除することによって、抗体を自動的に除去することが可能になる。抗体のＦｃ−ドメインとプロテインＧとのタンパク質−タンパク質相互作用のために、結合した抗体を解放することが有利である。本目的のために、抗体の一部である発現及び精製したＦｃ−ドメインを上記バイオセンサに過剰に与える。精製Ｆｃ−ドメインは、表面から抗体を除去し、抗体に代わってプロテインＧと結合する。新たな抗体を、高濃度で、タンパク質複合体、すなわち、プロテインＧ及びＦｃ−ドメインに添加すると、今度は、その抗体がプロテインＧ上のＦｃ−ドメインを置換する結果、バイオセンサが再度測定用途で利用可能となる。この再生も自動化流体システムで実施することができ、この場合、バイオセンサの再生は実質的に加速される。
【００２１】
有利には、担体表面上で除去及び再度固定化する生物学的活性物質は溶液で提供され、洗浄プロセスが自動化される。
【００２２】
適切な試薬を用いると、バイオセンサ表面を分子から完全に清浄化することができるため、プロテインＧも除去することができる。引き続いて、これらの分子も再度固定化される。
【００２３】
さらなる実施の形態は、核酸の固定化である。したがって、センサ表面、例えば半導体上に一本鎖核酸を塗布し、検出対象の相補的核酸をハイブリダイゼーションによって結合することができる。相補的核酸は、核酸塩基対間の水素結合によって結合する。核酸は次に、生物学的物質、化学的物質又は物理的物質と結合する、すなわち、生物学的物質、化学的物質又は物理的物質で標識することができる。この標識核酸を基にして、実際の信号をバイオセンサで検出することができる。バイオセンサを再生する目的で、核酸全体を化学的又は熱的に別の相補的核酸に置換することができる。
【００２４】
さらに、カップリングしたニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）又は別の金属キレートとの相互作用によってヒスチジンタグを付加した酵素を固定化することが可能である。酵素は、ヒスチジンタグ（ＨＩＳ−タグ）を用いて組換えで製造することができる。これらのいわゆるＨＩＳ−タグ酵素は、付加的なヒスチジンでニッケルイオン（Ｎｉ２＋）又は他の金属イオンと選択的に結合する。生物化学において、この特性は酵素精製に用いられる。本目的のために、ＨＩＳ−タグ酵素を、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）又は別の金属キレートを介して結合させ、イミダゾール又はＥＤＴＡを用いた数回の洗浄工程後に再度除去する。
【００２５】
さらに、半導体上でのＮｉ−ＮＴＡ又は別の金属キレート−リガンドの固定化を通じて、一方では、効率よく酵素を結合させることが可能であり、他方では、容易に酵素を除去することができると共に、別の酵素に交換することができる。酵素の除去及び交換は、自動化流体システムを用いて実行される。
【００２６】
好ましい実施形態の一例を記載すると共に、本発明の別のさらなる実施形態を図示する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】弁配列を通じて異なる溶液（Ａ〜Ｇ）をバイオセンサ担体表面上に導出することができる、バイオセンサを再生する装置を示す模式図である。
【図２】ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）を介したセンサ表面上での酵素とＨＩＳ−タグとの結合を示す模式図である。
【図３】センサ表面上での基質のカップリングを介したＧＳＴ融合酵素の結合を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
バイオセンサ２を再生する装置１の機構を図１に示す。バイオセンサは、その表面上に固定化生物学的活性物質４を塗布した担体３を含む。バイオセンサ２は、担体３、変換器８、増幅器９及び評価システム１０を含むその主要構成要素で構成される。より詳しく説明することを目的として、担体３表面上の生物学的活性物質４を拡大フォーマットで示す。
【００２９】
装置１は、ポンプ６を介して溶液Ａ〜Ｇを担体３表面上に任意に導出することができるノズル５を特徴とする。異なる溶液Ａ〜Ｇの選択は、自動又は手動のいずれかで作動し得る弁配列７によって行われる。溶液Ａ〜Ｇは、それぞれの容器に保存され、溶液はそれぞれ異なる生物学的活性物質を含む。担体３表面の上部にある、生物学的物質を洗浄するノズル５の説明図は、単に模式的に示しているに過ぎず、システムは、担体３又は少なくともバイオセンサ２のカバーに組み込まれた微小流体システムであり得る。
【００３０】
図２は、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）を介したセンサ表面上での酵素とＨＩＳ−タグとの結合を示す模式図である。ここで、ＨＩＳ−タグ酵素は、固定化したニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）又は別の金属キレートを介して結合し、イミダゾール又はＥＤＴＡを用いた数回の洗浄工程の後に再度脱離する。酵素１１は、参照符号１２のニッケルイオン（Ｎｉ２＋）の上部に模式的に示したものであり、ここで、Ｇ−ヒスチジン−タグの結合は、複数のＨ−符号で示される。酵素１１及び担体３表面上の生物学的活性物質４及びニッケルイオン１２が分子複合体の結合部分を構成する。
【００３１】
センサ表面上での基質（還元グルタチオン）のカップリングを介したＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合酵素の結合を図３に示す。生物学的活性物質４は、酵素１１、酵素１１とペプチド結合で共有結合したＧＳＴ−タグ１５並びに遊離基質１３及びＧＳＴ−基質として固定化した結合基質１４によって構成される。遊離基質１３は、担体３表面からのＧＳＴ−タグの脱離に役立つ。
【００３２】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。実際、別の異なる実施形態で提示した解決策を用いる多くの変形が可能である。
【符号の説明】
【００３３】
１  装置
２  バイオセンサ
３  担体
４  生物学的活性物質
５  ノズル
６  ポンプ
７  弁配列
８  変換器
９  増幅器
１０  評価システム
１１  酵素
１２  Ｎｉ２＋
１３  遊離基質
１４  固定化ＧＳＴ基質
１５  ＧＳＴタグ
Ａ〜Ｇ  溶液
【図１】
0005557743.tif 000002
【図２】
0005557743.tif 000003
【図３】
0005557743.tif 000004