(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス１１番染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス１１番染色体長腕の染色体部位であるＡＬ６７１９６８、或いはＢＸ５７２６４０、ＣＲ９５４１７０又はＡＬ７１３８７５、から長腕遠位を削除したマウス１１番染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含み、げっ歯類の細胞及び組織において９０％以上の保持率で安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。
【請求項２】
寄託細胞株ＤＴ４０  Ｂ６ｂＴ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８）に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む、請求項１記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項３】
げっ歯類がマウス、ラット又はハムスターである、請求項１記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項４】
１つ又は複数のＤＮＡ配列挿入部位をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項５】
ＤＮＡ配列挿入部位が、部位特異的組換え酵素の認識部位である、請求項４記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項６】
ＤＮＡ配列挿入部位が、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ配列、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ配列、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ配列、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ配列である、請求項４又は５記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項７】
レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子又はその両方をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項８】
外来ＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項９】
外来ＤＮＡ配列のサイズが２００ｋｂ以上である、請求項１〜８のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１０】
外来ＤＮＡ配列がヒトＤＮＡ配列である、請求項８又は９記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１１】
外来ＤＮＡ配列が、薬物代謝関連遺伝子のＤＮＡ配列である、請求項８〜１０のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１２】
薬物代謝関連遺伝子が、第一相反応又は第二相反応に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項１１記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１３】
第一相反応に関わる酵素が、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ２Ｊ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ、ＣＹＰ４Ｂ及びそれらのサブファミリーなどのＣＹＰ、並びにＣＥＳ、からなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードするものである、請求項１２記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１４】
第二相反応に関わる酵素が、ＵＧＴ１及びＵＧＴ２からなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードするものである、請求項１２記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１５】
薬物代謝関連遺伝子が、トランスポーターをコードする遺伝子である、請求項１１記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１６】
トランスポーターをコードする遺伝子が、ＭＤＲ１、ＭＤＲ２、ＭＲＰ２、ＯＡＴ、ＯＡＴＰ、ＯＣＴ及びＢＣＲＰからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をコードするものである、請求項１５記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１７】
薬物代謝関連遺伝子が、核内受容体をコードする遺伝子である、請求項１１記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１８】
核内受容体をコードする遺伝子が、ＰＸＲ、ＡｈＲ、ＣＡＲ及びＰＰＡＲαからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をコードするものである、請求項１７記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項１９】
外来ＤＮＡ配列が、ヒト染色体の長腕又は短腕のＤＮＡ配列である、請求項８〜１０のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項２０】
外来ＤＮＡ配列が、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子の配列を含む、請求項８〜１８のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項２１】
ヒト染色体が、疾患遺伝子の原因領域を含む、ヒト染色体の長腕又は短腕のＤＮＡ配列である、請求項１９記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項２２】
外来ＤＮＡ配列が、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、血液凝固・溶解因子類、イムノグロブリン類、Ｇ蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はＤＮＡの配列、或いは、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などの疾患に関連する治療用遺伝子又はＤＮＡの配列である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項２３】
細胞が、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子又は卵子である、請求項１〜２２のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項２４】
組織が、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳、骨髄、精巣又は卵巣由来の組織である、請求項１〜２２のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクターを保持する細胞。
【請求項２６】
細胞が、体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、請求項２５記載の細胞。
【請求項２７】
幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項２６記載の細胞。
【請求項２８】
細胞が、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞である、請求項２５〜２７のいずれか１項記載の細胞。
【請求項２９】
細胞がヒト抗体産生を可能にする細胞である、請求項２５〜２８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項３０】
疾患治療用の外来ＤＮＡ配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項２５〜２９のいずれか１項記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２４のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクターを保持することを特徴とする、非ヒト動物。
【請求項３２】
疾患モデル動物である、請求項３１記載の非ヒト動物。
【請求項３３】
外来のヒト薬物代謝関連遺伝子を発現可能にする動物である、請求項３１記載の非ヒト動物。
【請求項３４】
ヒト抗体を産生可能にする動物である、請求項３１記載の非ヒト動物。
【請求項３５】
マウス人工染色体ベクターに含まれる外来ＤＮＡに対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下している、請求項３１〜３４のいずれか１項記載の非ヒト動物。
【請求項３６】
外来ＤＮＡ配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項２５〜２９のいずれか１項記載の細胞を培養し、産生された該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法。
【請求項３７】
ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項３４又は３５記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法。
【請求項３８】
疾患モデル動物である請求項３２記載の非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法。
【請求項３９】
ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項３３又は３５記載の非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性の試験方法。
【請求項４０】
ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項３３又は３５記載の非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分Ｓ９を、培養細胞若しくは細菌と、薬物及び／若しくは食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす影響を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法。
【請求項４１】
請求項１〜２４のいずれか１項記載のマウス人工染色体ベクターを使用して、２００ｋｂ以上の大サイズの外来ＤＮＡをげっ歯類細胞又はげっ歯類個体内で９０％以上の保持率で安定に維持させることを含む、細胞又は個体内での大サイズＤＮＡの安定化方法。
【請求項４２】
寄託細胞株ＤＴ４０  Ｂ６ｂＴ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８）に含まれるマウス人工染色体ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、げっ歯類体内で安定に保持され、かつ、子孫伝達可能なマウス人工染色体ベクターに関する。
本発明はまた、上記マウス人工染色体ベクターを保持する細胞に関する。
本発明はさらに、上記マウス人工染色体ベクターを保持する、マウスなどの非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入マウスは遺伝子搭載ベクターを導入することにより目的遺伝子と発現産物を利用するために広く使われている。しかしながら、これまでの遺伝子導入マウスでは、遺伝子導入される部位がランダムであり、導入された位置効果によって導入遺伝子の発現が抑制されることがあり、また従来の遺伝子導入法ではコピー数の制御ができず、サイズも２００ｋｂ程度が限度である。これらのことから、哺乳動物の遺伝子としては珍しくない２００ｋｂを超える大きさの遺伝子や遺伝子クラスターは、制御領域も含めてベクターにクローニングすることが難しかった。従って、従来の遺伝子導入法では、導入遺伝子本来の機能を再現及び検証できないという限界があった。
このような問題が存在するなかで、本発明者らは、染色体レベルでの遺伝子導入という新しい染色体導入法を用いた染色体導入マウスの作製技術を開発した（非特許文献１）。この技術によりヒト染色体又はその断片をマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入しキメラマウスを作製したところ、ヒト染色体断片が独立に保持され、複数のヒト遺伝子が組織特異的に発現し、減数分裂を経て断片的に子孫伝達可能なヒト染色体も存在することを示した。また本発明者らは、ヒト２１番染色体全長（約３５Ｍｂ）をマウスに導入し、実用的にも価値の高いダウン症候群モデルマウスを作製した（非特許文献２）。このマウスを解析したところ、導入したヒト２１番染色体上の遺伝子は生理的な発現様式を再現し染色体ベクターの有効性が示された。
さらに、本発明者らは、染色体工学的手法である人工テロメア配列を使用したテロメアトランケーション技術による染色体削除、ならびに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる染色体クローニングを利用し、目的の領域のみを含むヒト人工染色体の構築を可能とし、その結果、メガベース（Ｍｂ）サイズの特定ヒト染色体領域を含むヒト人工染色体（ＨＡＣ，Ｈｕｍａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｍｅ）ベクターの構築に成功し、該ベクターがマウス個体で機能することも示した（非特許文献３）。さらに上述の技術を応用して既知遺伝子を含まない新規ＨＡＣベクターを構築した（非特許文献４）。また、本発明者らは上記背景に基づき、目的遺伝子を搭載したＨＡＣベクターを任意の細胞へ導入し、目的遺伝子の安定的発現に成功している。さらにＨＡＣベクターのヒト型モデルマウスへの適用例として、ヒト７番染色体上の薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター（１Ｍｂ）とヒトＸ連鎖型筋ジストロフィーの原因遺伝子であるヒトＤＭＤ遺伝子（２．５Ｍｂ）をそれぞれＨＡＣベクターにクローニングし（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ、ＤＭＤ−ＨＡＣ）、マウスＥＳ細胞に導入してマウスを作製した（特許文献１、非特許文献５）。
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを導入したマウスの組織保持率と発現解析から、ＨＡＣ上のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターはマウスの各組織において保持され（特許文献１の図８）、その発現様式はヒト組織でのパターンと同様に、肝臓、小腸特異的であった。さらにＤＭＤ−ＨＡＣ導入マウスの組織保持率と発現解析の解析から、マウスのそれぞれの組織でＤＭＤ−ＨＡＣは保持され（非特許文献５のＦｉｇ４Ａ）、ヒトにおいて組織特異的発現が知られているスプライシングアイソフォームの中で少なくとも３種がヒトと同様に発現することが明らかとなった。これら一連の結果から従来の遺伝子導入マウスに代わる新たな遺伝子（群）導入方法としてＨＡＣ導入マウスの有用性が示唆された。
ヒト人工染色体を含む哺乳類人工染色体ベクターは、従来のベクター系（ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、プラスミド）にはない利点を有しているために、新たな遺伝子の機能解析やヒト型モデル動物の作製系として有用であると期待されている。例えば、特許文献２及び３では、ヒト１４番染色体やヒト２１番染色体を改変し、そのサイズを縮小した染色体の断片からなる、細胞中で比較的安定に保持されるＨＡＣベクターが開示されている。
しかしながら、従来の遺伝子改変マウスでは不可能なＭｂ単位の遺伝子導入を可能にしたヒト２１番染色体導入マウス（ダウン症候群モデルマウス）やＨＡＣベクター導入マウスでは、これらのヒト染色体ベクターの保持率の低下、組織間や個体間にばらつきが生じること、子孫伝達の頻度が不安定などの問題が存在する。このため、ＨＡＣベクターなどの保持率を常に考慮する必要があり、また、特定の遺伝子領域が持つ機能や疾患との関わりについて研究する場合、目的遺伝子の発現動態や発現産物を組織細胞レベルで詳細かつ正確に解析することが難しい場合もあり、再現性の高い均一的な解析の障害となる。
さらにまた、マウス細胞とヒト細胞を細胞融合するとき、マウス細胞内ではヒト染色体は不安定であることが知られている。このように、ヒト人工染色体ベクターを含むヒト染色体はマウス細胞内では保持率が一定しないことから、ヒト人工染色体ベクターをマウス細胞に導入する場合、及び遺伝子導入マウスを作製する場合において、人工染色体ベクターとしての利点を十分に発揮できていない。遺伝子導入マウス細胞、又は遺伝子導入マウスを作製していく上で、今後は導入遺伝子の保持率を向上及び一定にすることによって、より詳細かつ正確で再現性の高い遺伝子機能の解析又は遺伝子発現産物の効率的な回収を可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ２００９／０６３７２２号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ  ２００４／０３１３８５号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−２９５８６０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１６：１３３−１４３，１９９７
【非特許文献２】Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，ＨＭＧ，１０：１１６３−７５，２００１
【非特許文献３】Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８：１０８６−１０９０，２０００
【非特許文献４】Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ，ＢＢＲＣ，３２１：２８０−２９０，２０００
【非特許文献５】Ｈｏｓｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７：３０９−１７，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでに報告された哺乳類人工染色体の多くがヒト人工染色体（特開２００５−２３００２０；特開２００８−５４５０１；特開２００７−３０６９２８；特開２００７−２９５８６０）であるが、マウス人工染色体についての報告もごくわずかながら存在し、この人工染色体ではマウスセントロメアの一部の配列を利用することを特徴としている（Ｓ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：７１９−７２３）。
天然のヒト染色体断片をマウス細胞に移入すると、前述のとおり、ヒト染色体断片はマウス細胞内で不安定である（例えば、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：７１３−７２５）。これはマウス個体内でも同様で、マウス各組織においてヒト人工染色体は不安定であり、マウス組織細胞で保持されているヒト人工染色体の割合（保持率）が低下する傾向にあり、マウス組織細胞の保持率が一定ではなくなる。あるいは、マウス個体間においても同様で、マウス個体間でのヒト人工染色体の保持率が一定ではなくなる。このようなマウス組織間や個体間での不均一な保持率によって、ヒト人工染色体によって目的遺伝子（群）を導入したマウス細胞あるいはマウス個体を用いて導入遺伝子の詳細かつ正確で再現性の高い解析を行うことが困難である。
マウスを含めたげっ歯類由来の人工染色体については、上記のとおり、それに関連する報告は非常に少ないうえに、げっ歯類細胞内又は個体内で安定に維持される人工染色体は存在しない。本発明の目的は、導入される目的遺伝子（群）がげっ歯類細胞内又はげっ歯類個体内で安定に維持され、それにより詳細かつ正確で再現性の高い解析を可能にするマウス人工染色体ベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
（１）マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、ならびに、哺乳類の細胞及び組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。
（２）マウス染色体が１〜１９番染色体のいずれか１つである、上記（１）記載のマウス人工染色体ベクター。
（３）マウス染色体由来の長腕断片が、マウス１〜１９番染色体のいずれか１つの長腕からその全内在性遺伝子数の少なくとも９９．５％が削除された残部からなる、上記（１）又は（２）記載のマウス人工染色体ベクター。
（４）寄託細胞株ＤＴ４０  Ｂ６ｂＴ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８）に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む、上記（１）〜（３）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（５）哺乳類がげっ歯類である、上記（１）〜（４）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（６）げっ歯類がマウス、ラット又はハムスターである、上記（５）記載のマウス人工染色体ベクター。
（７）１つ又は複数のＤＮＡ配列挿入部位をさらに含む、上記（１）〜（６）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（８）ＤＮＡ配列挿入部位が、部位特異的組換え酵素の認識部位である、上記（７）記載のマウス人工染色体ベクター。
（９）ＤＮＡ配列挿入部位が、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ配列、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ配列、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ配列、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ配列である、上記（７）又は（８）記載のマウス人工染色体ベクター。
（１０）レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子又はその両方をさらに含む、上記（１）〜（９）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（１１）外来ＤＮＡ配列をさらに含む、上記（１）〜（１０）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（１２）外来ＤＮＡ配列のサイズが２００ｋｂ以上である、上記（１）〜（１１）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（１３）外来ＤＮＡ配列がヒトＤＮＡ配列である、上記（１１）又は（１２）記載のマウス人工染色体ベクター。
（１４）外来ＤＮＡ配列が、薬物代謝関連遺伝子のＤＮＡ配列である、上記（１１）〜（１３）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（１５）薬物代謝関連遺伝子が、第一相反応又は第二相反応に関わる酵素をコードする遺伝子である、上記（１４）記載のマウス人工染色体ベクター。
（１６）第一相反応に関わる酵素が、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ２Ｊ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ、ＣＹＰ４Ｂ及びそれらのサブファミリーなどのＣＹＰ、並びにＣＥＳ、からなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードするものである、上記（１５）記載のマウス人工染色体ベクター。
（１７）第二相反応に関わる酵素が、ＵＧＴ１及びＵＧＴ２からなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードするものである、上記（１５）記載のマウス人工染色体ベクター。
（１８）薬物代謝関連遺伝子が、トランスポーターをコードする遺伝子である、上記（１４）記載のマウス人工染色体ベクター。
（１９）トランスポーターをコードする遺伝子が、ＭＤＲ１、ＭＤＲ２、ＭＲＰ２、ＯＡＴ、ＯＡＴＰ、ＯＣＴ及びＢＣＲＰからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をコードするものである、上記（１８）記載のマウス人工染色体ベクター。
（２０）薬物代謝関連遺伝子が、核内受容体をコードする遺伝子である、上記（１４）記載のマウス人工染色体ベクター。
（２１）核内受容体をコードする遺伝子が、ＰＸＲ、ＡｈＲ、ＣＡＲ及びＰＰＡＲαからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をコードするものである、上記（２０）記載のマウス人工染色体ベクター。
（２２）外来ＤＮＡ配列が、ヒト染色体の長腕又は短腕のＤＮＡ配列である、上記（１１）〜（１３）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（２３）外来ＤＮＡ配列が、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子の配列を含む、上記（１１）〜（２１）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（２４）ヒト染色体が、疾患遺伝子の原因領域を含む、ヒト染色体の長腕又は短腕のＤＮＡ配列である、上記（２２）記載のマウス人工染色体ベクター。
（２５）外来ＤＮＡ配列が、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、血液凝固・溶解因子類、イムノグロブリン類、Ｇ蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はＤＮＡの配列、或いは、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などの疾患に関連する治療用遺伝子又はＤＮＡの配列である、上記（１１）〜（１３）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（２６）細胞が、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子又は卵子である、上記（１）〜（２５）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（２７）組織が、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳、骨髄、精巣又は卵巣由来の組織である、上記（１）〜（２５）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。
（２８）上記（１）〜（２７）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクターを保持する細胞。
（２９）細胞が、体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、上記（２８）記載の細胞。
（３０）幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、上記（２９）記載の細胞。
（３１）細胞が、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞である、上記（２８）〜（３０）のいずれか記載の細胞。
（３２）細胞がヒト抗体産生を可能にする細胞である、上記（２８）〜（３１）のいずれか記載の細胞。
（３３）疾患治療用の外来ＤＮＡ配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記（２８）〜（３２）のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物。
（３４）上記（１）〜（２７）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクターを保持することを特徴とする、非ヒト動物。
（３５）疾患モデル動物である、上記（３４）記載の非ヒト動物。
（３６）外来のヒト薬物代謝関連遺伝子を発現可能にする動物である、上記（３４）記載の非ヒト動物。
（３７）ヒト抗体を産生可能にする動物である、上記（３４）記載の非ヒト動物。
（３８）マウス人工染色体ベクターに含まれる外来ＤＮＡに対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下している、上記（３４）〜（３７）のいずれか記載の非ヒト動物。
（３９）外来ＤＮＡ配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記（２８）〜（３２）のいずれか記載の細胞を培養し、産生された該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法。
（４０）ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記（３７）又は（３８）記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法。
（４１）疾患モデル動物である上記（３５）記載の非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法。
（４２）ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記（３６）又は（３８）記載の非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性の試験方法。
（４３）ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記（３６）又は（３８）記載の非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分Ｓ９を、培養細胞若しくは細菌と、薬物及び／若しくは食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす影響を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法。
（４４）上記（１）〜（２７）のいずれか記載のマウス人工染色体ベクターを使用して、２００ｋｂ以上の大サイズの外来ＤＮＡをげっ歯類細胞又はげっ歯類個体内で９０％以上の保持率で安定に維持させることを含む、細胞又は個体内での大サイズＤＮＡの安定化方法。
本発明により、ＤＮＡ配列挿入部位を設けたマウス人工染色体ベクターは、目的遺伝子（群）をげっ歯類細胞内又はげっ歯類個体内に導入する場合に、従来困難であったすべての細胞あるいは組織において目的遺伝子（群）を安定にかつ同一の保持率で保持させることが可能となり、また目的とする外来のＤＮＡ配列や遺伝子と共にレポーター遺伝子を挿入することができるのでベクター導入細胞を可視化でき、詳細かつ正確で再現性の高い解析又は発現産物の効率的な回収を可能にする。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−１４２５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、実施例１及び２の手順の模式図を示す。図中の細胞名等は次の形式で示してある。細胞名（細胞内遺伝子改変；保持染色体断片名，導入遺伝子−保持染色体名）。図中の記号等は次のとおりである。ＢＳｒ：ブラストサイジン（ＢＳ）耐性遺伝子、ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、人工テロメア：人工テロメア（ＴＴＡＧＧＧ）繰り返し配列、ＥＧＦＰ：緑色蛍光タンパク発現遺伝子、ｎｅｏ：ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ｌｏｘＰ：部位特異的ＤＮＡ配列挿入部位、３’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目までのエクソン配列。
図２は、実施例３の手順の模式図を示す。図中の細胞名等は次の形式で示してある。細胞名（細胞内遺伝子改変；保持染色体断片名，導入遺伝子−保持染色体名）。図中の記号等は次のとおりである。ｈＣｈｒ７：ヒト７番染色体、ＣＹＰ３Ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ：ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター、５’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の１番目と２番目のエクソン配列、ｌｏｘＰ：部位特異的ＤＮＡ配列挿入部位、ｈｙｇ：ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｈｉｓＤ：ヒスチジノール耐性遺伝子、人工テロメア：人工テロメア（ＴＴＡＧＧＧ）繰り返し配列、ＥＧＦＰ：緑色蛍光タンパク発現遺伝子、ｎｅｏ：ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、３’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目までのエクソン配列、ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子。
図３は、実施例４の手順の模式図を示す。図中の細胞名等は次の形式で示してある。細胞名（細胞内遺伝子改変；保持染色体断片名，導入遺伝子−保持染色体名）。図中の記号等は次のとおりである。ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、人工テロメア：人工テロメア（ＴＴＡＧＧＧ）繰り返し配列、５’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の１番目と２番目のエクソン配列、ｈｙｇ：ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘＰ：部位特異的ＤＮＡ配列挿入部位。
図４は、実施例５の手順の模式図を示す。図中の細胞名等は次の形式で示してある。細胞名（細胞内遺伝子改変；保持染色体断片名，導入遺伝子−保持染色体名）。図中の記号等は次のとおりである。ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、人工テロメア：人工テロメア（ＴＴＡＧＧＧ）繰り返し配列、ｎｅｏ：ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ｌｏｘＰ：部位特異的ＤＮＡ配列挿入部位、３’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目までのエクソン配列。
図５は、実施例６の手順の模式図を示す。図中の細胞名等は次の形式で示してある。細胞名（細胞内遺伝子改変；保持染色体断片名，導入遺伝子−保持染色体名）。図中の記号等は次のとおりである。ｎｅｏ：ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ｌｏｘＰ：部位特異的ＤＮＡ配列挿入部位、３’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目までのエクソン配列、ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子、人工テロメア：人工テロメア（ＴＴＡＧＧＧ）繰り返し配列、ＥＧＦＰ：緑色蛍光タンパク発現遺伝子、５’ＨＰＲＴ：ＨＰＲＴ遺伝子の１番目と２番目のエクソン配列。
図６は、マウスＡ９細胞（ｍｏｕｓｅＡ９（ｎｅｏ））（左）及び、マウスＡ９細胞とマウス線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ））との細胞融合クローン（ｍｏｕｓｅ  Ａ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ））を示す。
図７は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−Ｂｓｒ）クローンのＦＩＳＨ解析の結果を示す。
図８は、ニワトリＤＴ４０細胞内に導入されたマウス染色体（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）がマウス１１番染色体であることを示すＳＫＹ  ＦＩＳＨの解析結果（左）、並びに、ＳＫＹ  ＦＩＳＨ染色像（右）を示す。
図９は、マウス１１番染色体のＡＬ６７１９６８領域におけるテロメアトランケーション用のベクター、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたマウス１１番染色体アレルの部分構造を示す。
図１０は、ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿ＭＡＣベクターを用いて、マウス１１番染色体領域ＡＬ６７１９６８においてテロメアトランケーションが行われたマウス人工染色体ＭＡＣのアレルを含むＤＴ４０（ＭＡＣ）［ＤＴ４０（Ｂ６ｂＴ−１）］クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果（右）を示す。左図のＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）は、テロメアトランケーション実施前であるＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）クローンを示す。
図１１は、ＧＦＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰターゲティングベクター（ｐＭＡＣ１）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたマウス人工染色体ＭＡＣのアレルの部分構造を示す。
図１２は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをプローブとしたときのＤＴ４０（ＭＡＣ１）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図１３は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図１４は、マウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブとしたときのｍｏｕｓｅＥＳ（ＭＡＣ１）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図１５は、ヒト７染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＣ００４９２２領域にｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクター（ｐＭＰｌｏｘＰＨｙｇ）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたヒト７番染色体アレルの部分構造を示す（図１５ａ）。また、図１５ｂは、線状化した該ベクターでトランスフェクションしたヒト７番染色体断片含有ＤＴ４０細胞クローンのハイグロマイシン耐性株について、サザンハイブリダイゼーションによる相同組換え体の分析結果を示す。図１５ｂ中の矢頭について、上の矢頭が非相同組換え体（約１０．９ｋｂ）を表し、下の矢頭が相同組換え体（約８．９ｋｂ）を表す。
図１６は、ヒト７染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ０７３８４２領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクター（ｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴ）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたヒト７番染色体アレルの部分構造を示す。
図１７は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−，ＭＡＣ１＋ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図１８は、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ００４９２２−ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２）の約１ＭｂをＭＡＣ１へ転座クローニングしたマウス人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの構築を示す。
図１９は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ７−ΔＣＹＰ３Ａ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２０は、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２を構築するためのターゲティングベクター（ｐＭＡＣ２）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたマウス人工染色体ＭＡＣのアレルの部分構造を示す。
図２１は、マウスＣｏｔ−１ＤＮＡ及び５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ  ｈｙｇｒｏカセットをプローブとしたときのＤＴ４０（ＭＡＣ２）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２２は、マウスＣｏｔ−１ＤＮＡ及び５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ  ｈｙｇｒｏカセットををプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２３は、マウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブとしたときのｍｏｕｓｅＥＳ（ＨＰＲＴ−，ＭＡＣ２）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２４は、ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰターゲティングベクター（ｐＭＡＣ３）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたマウス人工染色体ＭＡＣ３のアレルの部分構造を示す。
図２５は、マウスＣｏｔ−１ＤＮＡ及びｍｏｕｓｅ  ｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブとしたときのＤＴ４０（ＭＡＣ３）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２６は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２７は、マウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブとしたときの薬剤耐性クローンＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）のｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図２８は、Ｂ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）クローンの長期培養の保持率解析結果を示す。実線はＢ６（ＨＰＲＴ−：ＭＡＣ３）−３、破線はＢ６（ＨＰＲＴ−：ＭＡＣ３）−ｓ６のＭＡＣベクター保持率をそれぞれ示す。
図２９は、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３に特定遺伝子（例えばＧＦＰ）をＣｒｅ−ｌｏｘＰ法にて部位特異的遺伝子挿入するための手順を示し、ＧＦＰ挿入用ベクター、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたマウス１１番染色体アレルの部分構造を示す。
図３０は、マウスＣｏｔ−１ＤＮＡ及びＸ６．１ＥＧＦＰをプローブとしたときのマウス人工染色体ＧＦＰ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞であるＣＨＯ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図３１は、ｍｏｕｓｅ  ｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡ及びＧＦＰをプローブとしたときのマウスＥＳ細胞（Ｂ６−ＥＳ株）中のマウス人工染色体ＧＦＰ−ＭＡＣの長期培養後のＦＩＳＨ解析結果を示す。
図３２は、Ｂ６（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローンの長期培養の保持率解析結果を示す。菱形は薬剤選択を行った長期培養、四角は薬剤選択を行っていない長期培養の保持率をそれぞれ示す。
図３３は、マウス人工染色体ベクター（ＧＦＰ−ＭＡＣ）を保持するキメラマウスから生まれた子孫伝達個体を示す。
図３４は、長期培養後（２５ＰＤＬ）のＣＨＯ細胞における２１ＨＡＣ１または２１ＨＡＣ２とＭＡＣ１の保持率を示す。
図３５は、長期培養後（７５ＰＤＬ）のＥＳ細胞における２１ＨＡＣ２またはＭＡＣ１の保持率を示す。
図３６は、ＴＣ（ＭＡＣ１）マウス（雌）組織における実体蛍光顕微鏡画像を示す。
図３７は、ＴＣ（ＭＡＣ１）マウスまたはＴＣ（２１ＨＡＣ２）マウスの骨髄由来細胞の血液系細胞におけるＧＦＰ陽性率を示す。
図３８は、ＴＣ（ＭＡＣ１）マウスまたはＴＣ（２１ＨＡＣ２）マウスの脾臓由来細胞の血液系細胞におけるＧＦＰ陽性率を示す。
図３９は、マウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いたＴＣ（ＭＡＣ１）マウス由来の尻尾線維芽細胞のｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図４０は、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）ならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いたＡ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図４１は、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）ＤＮＡプローブを用いたＴＴ２Ｆ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）のｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図４２は、長期培養後（１００ＰＤＬ）のＥＳ細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの保持率を示す。
図４３は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス（雄）組織における実体蛍光顕微鏡画像を示す。
図４４は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウスまたはＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスの骨髄由来細胞の血液系細胞におけるＧＦＰ陽性率を示す。
図４５は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウスまたはＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスの各組織におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持率を示す。
図４６は、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）ＤＮＡプローブを用いたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ヘテロマウスまたはＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ホモマウスにおける、ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図４７は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウスの各組織におけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの組織特異的遺伝子発現解析の結果を示した図である。ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を表す。
図４８は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス肝臓におけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの時期特異的遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図４９は、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）ならびにマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡプローブを用いたラットＥＳ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図５０は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブを用いたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図５１は、ｈＣｈｒ２１ｑ領域の約３３ＭｂをＭＡＣ１へ転座クローニングしたマウス人工染色体ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣの構築を示す。
図５２は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡおよびマウスＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図５３は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いたＴＴ２Ｆ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図５４は、長期培養後（５０ＰＤＬ）のＥＳ細胞におけるｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣの保持率を示す。
図５５は、ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するキメラマウスの蛍光写真を示す。
図５６は、ヒト２１番染色体（ｈＣｈｒ２１）のＤＳＣＲ（ダウン症候群疾患原因領域クラスター）の近位のＡＰ００１７２１へｌｏｘＰ配列を挿入するための、ターゲティングベクター（ｐＣＫｌｏｘＰＨｙｇ）、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルをに示す。
図５７は、ＤＴ４０（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）におけるサザンブロット解析結果を示す。
図５８は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡおよびハイグロマイシンＤＮＡをプローブとしたときのＤＴ４０（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図５９は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡおよびマウスＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図６０は、ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｑｔｅｒ領域の約１２ＭｂをＭＡＣ１へ転座クローニングしたマウス人工染色体ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣの構築を示す。
図６１は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡおよびマウスＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図６２は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いたＴＴ２Ｆ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図６３は、長期培養後（５０ＰＤＬ）のＥＳ細胞におけるｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣの保持率を示す。
図６４は、長期培養後（２５ＰＤＬ）のＣＨＯ細胞における２１ＨＡＣ１または２１ＨＡＣ２とＭＡＣ２の保持率を示す。
図６５は、１コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣの構造を示す。
図６６は、１から１６コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣの構築方法を示す。
図６７は、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）１−３およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）１−２における、長期培養後のＣｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ（ＦＶＩＩＩの活性比較）の結果を示す。
図６８は、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）におけるＣｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙの結果（ＦＶＩＩＩの活性比較）を示す。
図６９は、複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットの構築のためのｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ構築方法を示す。
図７０は、複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットの構築方法を示す。
図７１は、ＭＩ−ＭＡＣベクターの構築方法を示す。
図７２は、ＭＩ−ＭＡＣベクターへの遺伝子挿入方法を示す。
図７３は、ＰＸＲ−ＭＡＣの構築方法を示す。
図７４は、マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびヒトＰＸＲ−ＢＡＣ由来のＤＮＡ（ＲＰ１１−１６９Ｎ１３）（ＣＨＯＲＩ）をプローブとしたときのＣＨＯ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図７５は、ヒトＰＸＲ−ＢＡＣ由来のＤＮＡ（ＲＰ１１−１６９Ｎ１３）（ＣＨＯＲＩ）をプローブとしたときのＴＴ２Ｆ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図７６は、ＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇタイプのｌｏｘＰターゲティングベクター（ｐＭＡＣ４）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたマウス人工染色体ＭＡＣ４のアレルの部分構造を示す。
図７７は、マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇカセットをプローブとしたときのＤＴ４０（ＭＡＣ４）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図７８は、マウスＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図７９は、ヒト４染色体上のＵＧＴ２遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ１２５２３９２領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクター（ｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＵＧＴ２）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたヒト４番染色体アレルの部分構造を示す。
図８０は、ヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびピューロマイシンＤＮＡをプローブに用いたＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｔｅｌ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。左図は改変前のＤＴ４０（ｈＣｈｒ４）を示し、右図は改変後のＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｔｅｌ）を示す。
図８１は、ヒト４番染色体のＡＣ０７４３７８へのｌｏｘＰ配列を挿入するための、ターゲティングベクター（ｐＵＧＴ２ｌｏｘＰｎｅｏ）、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルをに示す。
図８２は、ヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびネオマイシンＤＮＡをプローブに用いたＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図８３は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡおよびマウスＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図８４は、ヒトＵＧＴ２遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ０７４３７８−ヒトＵＧＴ２遺伝子クラスター−ＡＣ１２５２３９）２ＭｂをＭＡＣ４へ転座クローニングしたマウス人工染色体ＵＧＴ２−ＭＡＣの構築を示す。
図８５は、ＵＧＴ２−ＢＡＣ（ＲＰ１１−６４３Ｎ１６）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ４−ΔＵＧＴ２）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図８６は、ＵＧＴ２−ＢＡＣ（ＲＰ１１−６４３Ｎ１６）（ＣＨＯＲＩ）及びマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブとしたときのＡ９（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図８７は、ＵＧＴ２−ＢＡＣ（ＲＰ１１−６４３Ｎ１６）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡをプローブとしたときのＴＴ２Ｆ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図８８は、長期培養後（７５ＰＤＬ）のＥＳ細胞におけるＵＧＴ２−ＭＡＣの保持率を示す。
図８９は、ヒト１０染色体上のＣＹＰ２Ｃ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＬ１５７８３４領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクター（ｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＣＹＰ２Ｃ）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたヒト１０番染色体アレルの部分構造を示す。
図９０は、ヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびピューロマイシンＤＮＡをプローブに用いたＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｔｅｌ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。左図は改変前のＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０）を示し、右図は改変後のＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｔｅｌ）を示す。
図９１は、ヒト１０番染色体のＡＬ１３８７５９へのｌｏｘＰ配列を挿入するための、ターゲティングベクター（ｐＣＹＰ２ＣｌｏｘＰｎｅｏ）、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルをに示す。
図９２は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときの（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図９３は、ヒトＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＬ１３８７５９−ヒトＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスター−ＡＬ１５７８３４）３８０ｋｂをＭＡＣ４へ転座クローニングしたマウス人工染色体ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣの構築を示す。
図９４は、ＣＹＰ２Ｃ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−４６６Ｊ１４）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ１０−ΔＣＹＰ２Ｃ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図９５は、ヒト７番染色体のＡＣ００５０４５へのｌｏｘＰ配列を挿入するための、ターゲティングベクター（ｐＭＤＲ１ｌｏｘＰｂｓ）、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルをに示す。
図９６は、ヒト７染色体上のＭＤＲ１遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ００３０８３領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクター（ｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＭＤＲ１）、及び、該ベクターにより相同組換えが行われたヒト７番染色体アレルの部分構造を示す。
図９７は、ヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびピューロマイシンＤＮＡをプローブに用いたＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）のｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図９８は、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
図９９は、ヒトＭＤＲ１遺伝子領域周辺（ＡＣ００５０４５−ヒトＭＤＲ１遺伝子−ＡＣ００３０８３）２１０ｋｂをＭＡＣ４ベクター転座クローニングしたマウス人工染色体ＭＤＲ１−ＭＡＣの構築を示す。
図１００は、ＭＤＲ１−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７８４Ｌ５）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブとしたときのＣＨＯ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ７−ΔＭＤＲ１）クローンのｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明をさらに詳細に説明する。
上記のとおり、本発明は、その第１の態様において、マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、ならびに、哺乳類の細胞及び個体組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクターを提供する。
本明細書中で使用する「マウス染色体由来の天然型セントロメア」という用語は、いずれか１つのマウス染色体のセントロメア全体（完全なセントロメア）を指す。したがって、このようなセントロメアには、マウス染色体のセントロメア配列の一部を用いて偶発的又は人工的に得られたセントロメア機能を有する構造体、及び、他の動物種の染色体のセントロメアは含まれない。
本明細書中で使用する「マウス人工染色体」又は「マウス人工染色体ベクター」はトップダウンアプローチで構築された人工染色体であり、ボトムアップアプローチで構築された人工染色体ではない。トップダウンアプローチとは、自然染色体から遺伝子領域を染色体改変により削除し天然セントロメアを人工染色体ベクターとして構築する方法である。ボトムアップアプローチとは、セントロメア配列の一部をクローン化ＤＮＡとして取得し、哺乳類細胞にトランスフェクションすることによりセントロメア機能を有する人工染色体を構築する方法である。
本明細書中で使用する「セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片」は、本発明のベクターがマウスの細胞又は個体組織において安定に保持されるように、かつマウスの個体発生と子孫伝達の妨げにならないように、可能な限り内在遺伝子の影響を排除することが望ましく、そのために、マウス染色体の長腕中の内在遺伝子を除去するようにセントロメアに近い長腕部位で削除して得られる長腕断片を指す。これは全内在遺伝子（数）の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９〜１００％が除去されるようにセントロメアに近い長腕部位で削除して得られる長腕断片を指す。
本明細書中の「ＤＮＡ」は、特に断らない限り、遺伝子若しくは遺伝子座、ｃＤＮＡ、化学修飾ＤＮＡを含むすべての種類のＤＮＡ核酸に対し使用するものとする。
本明細書中で使用する「保持率」とは、培養細胞、又はマウスの組織細胞の中で人工染色体が存在している細胞の割合を指す。
本発明の染色体ベクターが「安定に保持される」とは、細胞分裂の際に該染色体ベクターの脱落を起こし難く、すなわち、分裂後であっても細胞内で安定に保持されること、それゆえに、該染色体ベクターが娘細胞や子孫マウスに効率よく子孫伝達されることを意味する。
マウス染色体は、マウス染色体１〜１９、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番〜１９番染色体のいずれかである。後述の実施例では、１１番染色体を例示しているが、上記の構成を有するかぎり、他の染色体であっても同様にマウス人工染色体ベクターを作製することが可能である。
マウス１１番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、前記長腕断片は、非限定的に例えば、該１１番染色体の長腕のＡＬ６７１９６８、或いはＢＸ５７２６４０（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、ＣＲ９５４１７０（ＡＬ６７１９６８及びＢＸ５７２６４０よりセントロメア側に位置する。）又はＡＬ７１３８７５（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。あるいは、前記長腕断片は、本明細書中でのＤＴ４０（ＭＡＣ）である、寄託細胞株ＤＴ４０  Ｂ６ｂＴ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８）に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含んでもよい（図１，３，４参照）。その他、例えばマウス１５番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合、前記長腕断片は、非限定的に例えば、ＡＣ１２１３０７、ＡＣ１６１７９９などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。マウス１６番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合、前記長腕断片は、非限定的に例えば、ＡＣ１２７６８７、ＡＣ１４０９８２などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。これらの基本構造には、外来ＤＮＡ又は遺伝子を挿入するためのｌｏｘＰなどのＤＮＡ配列挿入部位をさらに含むことができる（例えば、ＭＡＣ１，ＭＡＣ２，ＭＡＣ３，ＭＡＣ４など；図１，３，４参照）。
本発明のベクターは、外来ＤＮＡ又は遺伝子配列を挿入するための部位を含むことができるため、この部位に、目的の外来ＤＮＡ又は遺伝子を組み込むことによって、該ベクターが任意の細胞に導入されたときに該目的の外来ＤＮＡ又は遺伝子を発現することが可能となり、したがって、タンパク質生産、治療用薬剤のスクリーニング、薬物代謝試験、ＤＮＡの機能解析、ｉＰＳ細胞の誘導、遺伝子治療、有用な非ヒト動物の作製などへの応用に使用することが可能である（例えば、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ，ＧＦＰ−ＭＡＣなど；図２，５参照）。
本発明のベクターはまた、マウス染色体を改変し、マウス由来の天然型セントロメアをそのままベクターの作製のために利用している。従来公知のマウス人工染色体ベクターとしては、セントロメア配列の一部を利用して作製されたサテライトＤＮＡベースの哺乳類人工染色体（Ａｃｅｓ及びＳＡＴＡＣと称される）が知られているが、マウス染色体のセントロメア全体を利用して作製されたマウス人工染色体は、これまで作製されたことがない。また、上記哺乳類人工染色体はＨＡＣベクターと同様にマウス個体の組織で保持率がばらつき安定ではない（Ｃｏ  Ｄｏら，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００；８（３）：８３−９１）。
本発明のベクターの有用なかつ意外な特性として、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類を含む哺乳類の細胞又は個体組織において保持率が向上し、これによって細胞内で安定に保持され、したがって目的遺伝子（群）を長期間安定に保持することができ、げっ歯類の個体間又は組織間において導入遺伝子量にバラつきがなく長期間発現させることができ、また、分化多能性細胞（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、等）を介したげっ歯類の個体発生及び子孫伝達の効率を向上させうる、などの特性を挙げることができる。ヒト人工染色体（ＨＡＣ）と比較される興味深い特性として、ＨＡＣの保持率が２０％未満と非常に低い血液系組織を含めて、組織間のばらつきが極端に少なく、保持率は、試験したどの組織（例えば、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳又は骨髄由来の組織）でも９０％以上であるし、また、本発明のマウス人工染色体は、ＨＡＣと比べて効率よく繁殖可能であり、ＨＡＣでは不可能であった、細胞での複数（多）コピーの保持を可能にする。
定義：
本明細書で使用する用語の定義は、当業界で使用される一般的な意味に加えて、具体的に以下の意味を包含するものとする。
本明細書中で「マウス人工染色体」又は「マウス人工染色体ベクター」と称する場合、この用語は、上記例示のようなマウス由来の染色体断片から作製された上記特徴を有する人工染色体を指し、トップダウンアプローチで構築された人工染色体であり、ボトムアップアプローチで構築されていない。繰り返しになるが、トップダウンアプローチとは、自然染色体から遺伝子領域を染色体改変により削除し天然セントロメアを人工染色体ベクターとして構築する方法である。一方、ボトムアップアプローチとは、セントロメア配列の一部をクローン化ＤＮＡとして取得し、哺乳類細胞にトランスフェクションすることによりセントロメア機能を有する構造体を構築する方法である。人工染色体は、導入すべき細胞本来の染色体から独立した染色体として安定に複製及び分配が可能である。マウス由来の染色体断片は、マウスの１〜１９番、Ｘ及びＹ染色体のうちの任意の染色体の断片（長腕の全内在遺伝子数の少なくとも９９．５％が削除された長腕断片）であり、該断片には、上で定義したような、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位が削除された長腕断片が含まれる。本発明の人工染色体の作製については、後述の実施例、特に実施例１〜５、図１〜図４に記載されており、マウス１１番染色体断片から人工染色体を作製する手法が例示されている。他の染色体断片からのマウス人工染色体の作製もまったく同様に実施しうる。
マウスの染色体の配列情報は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．などのＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓから入手可能である。
本明細書中の染色体の「長腕」とはマウス染色体のセントロメア側から遺伝子領域を含む染色体領域を指す。一方、マウス染色体には、短腕がほとんど存在しない。
本明細書中の「遠位」とは、セントロメアから遠い領域（すなわち、テロメア側）を意味する。反対に、セントロメアに近い領域（すなわち、セントロメア側）は「近位」と称する。長腕遠位は、長腕の特定部位よりもテロメア側に位置する領域を意味し、長腕近位は、長腕の特定部位よりもセントロメア側に位置する領域を意味する。この特定部位は、マウス由来の１つの染色体の長腕に存在する全内在遺伝子（数）の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９〜１００％が削除される位置である。
本明細書中の「保持率」とは、培養細胞、又はマウスの組織細胞の中で人工染色体が存在している細胞の割合を指す。
本明細書中の「ＤＮＡ配列挿入部位」とは、人工染色体における、目的ＤＮＡ（遺伝子を含む）配列を挿入できる部位、例えば、部位特異的組換え酵素の認識部位等を意味する。このような認識部位には、非限定的に、例えばｌｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位）、ＦＲＴ（Ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位）、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ（φＣ３１リコンビナーゼ認識部位）、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ（Ｒ４リコンビナーゼ認識部位）、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ（ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ認識部位）、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位）などが含まれる。
本明細書中の「部位特異的組換え酵素」とは、これら酵素の認識部位で特異的に目的のＤＮＡ配列と組換えを起こすための酵素である。その例は、Ｃｒｅインテグレース（Ｃｒｅリコンビナーゼとも称する。）、φＣ３１インテグレース、Ｒ４インテグレース、ＴＰ９０１−１インテグレース、Ｂｘｂ１インテグレースなどである。
本明細書中の「テロメア配列」は、同種又は異種の天然テロメア配列、或いは、人工テロメア配列である。ここで、同種とは、人工染色体ベクターの染色体断片が由来するマウスと同種の動物を意味し、一方、異種とは、該マウス以外の哺乳動物（これには、ヒトを含む）を意味する。また、人工テロメア配列は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列（ｎは、繰り返しを意味する。）などの人工的に作製されたテロメア機能を有する配列を指す。人工染色体へのテロメア配列の導入は、例えば国際公開ＷＯ  ００／１０３８３に記載されるようなテロメアトランケーション（テロメア配列の置換）によって行うことができる。テロメアトランケーションは、本発明の人工染色体の作製において染色体の短縮のために使用することができる。
本明細書中の「外来遺伝子」又は「外来ＤＮＡ」とは、ベクターの遺伝子挿入部位に挿入する、ベクターに搭載する目的の遺伝子又はＤＮＡであり、対象とする細胞内に本来的には存在しない、対象とする細胞内で発現させるべき遺伝子又はＤＮＡ、或いはそれらの配列、を意味する。
本明細書中の「哺乳動物」という用語は、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などを含むが、これらに限定されない。
本明細書中の「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」は、哺乳動物由来の受精卵の胚盤胞の内部細胞塊から樹立された分化多能性と半永久的増殖能とを備えた幹細胞である（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４−２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３−１６５）。この細胞と同等の性質をもつ、体細胞の再プログラミングによって人工的に誘導された細胞が「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０）。
マウス人工染色体ベクターの作製及び用途：
以下に、本発明のマウス人工染色体ベクターの作製及びその用途について説明する。具体的には、後述の実施例１〜５（図１〜４）にその手順が記載されている。
（１）マウス人工染色体ベクターの作製
本発明の人工染色体ベクターは、以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）マウス染色体を保持する細胞を得る工程、
（ｂ）内在遺伝子（数）の大部分（９９．５％以上１００％以下）を含まないようにマウス染色体の長腕遠位を削除する工程、及び
（ｃ）長腕近位に１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を挿入する工程
を含む方法によって作製することができる。ここで、工程（ｂ）及び（ｃ）の順序は逆であってもよい。
工程（ａ）：
本発明の人工染色体ベクターを作製するには、まず、マウス染色体を保持する細胞を作製する。例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ  ｒｅｇｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ（ＢＳｒ））で標識されたマウス染色体を保持するマウス線維芽細胞であるｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）とＧ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子を導入したマウスＡ９細胞（ＡＴＣＣ  ＶＡ２０１１０−２２０９）であるｍｏｕｓｅ  Ａ９（ｎｅｏ）と細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞であるｍｏｕｓｅ  Ａ９ｘ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）から、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウス繊維芽細胞は、文献記載の方法に基づいて入手することが可能であり、例えば、マウス繊維芽細胞は日本クレアより入手可能なＣ５７Ｂ６系統のマウスより樹立可能である。相同組換え率の高い細胞としては、例えば、ニワトリＤＴ４０細胞（Ｄｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１７４−１８２，１９９６）を利用できる。さらにまた、上記移入は、公知の染色体移入法、例えば、微小核細胞融合法（Ｋｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８０：４１３−４１８，１９７３）によって行うことができる。
工程（ｂ）：
マウス由来の単一の染色体を保持する細胞において、該マウス染色体の長腕遠位を削除する。このとき、重要なことは、長腕上に存在する内在遺伝子の大部分を削除（又は、除去もしくは欠失）しマウスセントロメアを保持する人工染色体を構築することである。これは長腕上に存在する全内在遺伝子の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９〜１００％を削除（又は、除去もしくは欠失）するように切断位置を決定することである。そうすることによって、人工染色体が導入された、げっ歯類などの哺乳動物由来の、好ましくはマウス由来の、細胞、組織又は個体において安定かつ高保持率で保持され、目的遺伝子（群）の正確な解析、物質生産などに用いるすることができる。上記内在遺伝子の削除は、例えば、ＷＯ  ００／１０３８３号に記載のテロメアトランケーションにより行うことができる。具体的には、マウス染色体を保持する細胞において、人工テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に（人工）テロメア配列が挿入されたクローンを取得し、これによってテロメアトランケーションにより欠失変異体が得られる。すなわち、所望の位置（又は、部位）が削除すべき長腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換、挿入されて長腕遠位が削除される。この位置は、ターゲティングベクターを構築する際の標的配列の設計により、適宜設定できる。例えば、後述の実施例では、マウス１１番染色体長腕のＡＬ６７１９６８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のＤＮＡ配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側でテロメトランケーションが起こるように設定されている（図９参照）。これにより、内在遺伝子の大部分が削除されたマウス１１番染色体断片が得られる。他の染色体の場合にも同様にテロメアトランケーションを実施できる。
工程（ｃ）：
ＤＮＡ配列挿入部位として、好ましくは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入することができる。すなわち、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象が知られており、本発明のマウス人工染色体ベクターでは、このような酵素とその酵素の認識部位からなる系を利用して、目的とする遺伝子又はＤＮＡ配列を挿入、搭載できる。このような系として、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ酵素と、その認識部位であるｌｏｘＰ配列の系（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系；Ｂ．Ｓａｕｅｒ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；１９９３，２２５：８９０−９００）や、出芽酵母由来のＦｌｐ酵素と、その認識部位であるＦＲＴ（Ｆｌｐ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔａｒｇｅｔ）配列の系（Ｆｌｐ／ＦＲＴ系）や、ストレプトミセスファージ由来のφＣ３１インテグレースと、その認識部位であるφＣ３１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｒ４インテグレースと、その認識部位であるＲ４ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、ＴＰ９０１−１インテグレースと、その認識部位であるＴＰ９０１−１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｂｘｂ１インテグレースと、その認識部位であるＢｘｂ１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、などを挙げることができるが、ＤＮＡ配列挿入部位として機能しうるのであれば、上記の系に限定されないものとする。
このような部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入のためには、公知の方法、例えば、相同組換え法が利用でき、挿入位置及び数は、長腕近位及び短腕近位内に適宜設定することができる。
本発明においては、１つの種類の認識部位又は異なる種類の認識部位を１つ挿入することも可能である。認識部位の設定により、外来遺伝子又は外来ＤＮＡの挿入位置を特定することができるので、挿入位置が一定となり、想定外の位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）を受けることもなくなる。後述の実施例に例示されるマウス人工染色体の場合には、マウス１１番染色体上のＢＸ５７２６４０に挿入されている部位特異的組換え酵素の認識部位ｌｏｘＰ配列において挿入された遺伝子を組織特異的に発現させることを可能にする（図１１、図２０、図２４）。
本発明の、ＤＮＡ配列挿入部位を有するマウス人工染色体ベクターには、好ましくは、目的とする遺伝子又はＤＮＡ配列の挿入部位を残して、レポーター遺伝子をあらかじめ挿入しておいてもよい。レポーター遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ又はＥＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、等）、タグタンパク質コードＤＮＡ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、ＧＦＰ又はＥＧＦＰが好ましい。
本発明のマウス人工染色体ベクターにはさらに、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカーは、該ベクターで形質転換された細胞を選別する際に有効である。選択マーカー遺伝子としては、ポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子のいずれか、又はその両方が例示される。ポジティブ選択マーカー遺伝子には、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ（ＢＳ）耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが含まれる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子には、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡ断片（ＤＴ−Ａ）遺伝子などが包含される。一般に、ＨＳＶ−ＴＫは、ガンシクロビル又はシクロビルと組み合わせて使用される。
本発明のマウス人工染色体ベクターに、レポーター遺伝子又は目的の外来遺伝子もしくはＤＮＡを挿入する手法としては、相同組換え法を好ましく使用できる。相同組換えは、マウス染色体上の挿入位置の５’側領域及び３’側領域の塩基配列（各々約１〜４ｋｂ、好ましくは約２〜４ｋｂ）と相同な両配列（５’ａｒｍ及び３’ａｒｍ）の間に、挿入すべきＤＮＡカセットを連結して得られたターゲティングベクターを用いて行うことができる。この目的で使用されるベクターとしては、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスなどが挙げられ、好ましくはプラスミドである。ターゲティングベクター構築のための基本プラスミドの例は、Ｖ９０７又はＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）などであるが、これらに限定されない。基本ベクターには、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー遺伝子、複製開始点などの、ベクター構築において一般的に挿入される１つ又は２つ以上の配列又はエレメントが含まれていてもよい。
上記の手法で作製されたマウス人工染色体は、マウス由来の染色体断片（これには、天然型セントロメア、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、の内在遺伝子が削除された長腕断片、及び（存在する場合の）短腕が含まれる。）と、人工テロメア配列とを含む。また、上記セントロメアは、人工染色体の作製のために利用されたマウスの染色体のセントロメア構造の全体である。
本発明のマウス人工染色体ベクターの例は、後述の実施例で作製されたマウス人工染色体ベクターであり、この人工染色体は、マウス１１番染色体において長腕遠位をＡＬ６７１９６８において削除して得られたベクターである（図１、図３、図４、図９、図１０）。このベクターは、本明細書中でのＤＴ４０（ＭＡＣ）である、寄託細胞株ＤＴ４０Ｂ６ｂＴ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８）に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む。基本構造であることから、このＤＮＡ構造中に以下のようなＤＮＡ配列挿入部位、選択マーカー遺伝子、外来遺伝子（又は、ＤＮＡ）などを挿入することができる。
上記マウス人工染色体ベクターには、好ましくは、１つ又は複数のＤＮＡ配列挿入部位、例えば部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばＣｒｅ酵素認識部位であるｌｏｘＰ配列）を含む（図１、図３、図４、図１１、図２０、図２４）。ここで、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列であるか、或いは、５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇタイプであるか、或いはＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列或いはＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列であるが、これらに限定されない。ここで、ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質遺伝子であり、ＰＧＫｎｅｏは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン耐性遺伝子カセットであり、ＨＰＲＴは、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であり、ｈｙｇはハイグロマイシン耐性遺伝子である。
上記マウス人工染色体ベクターにはさらに、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子（ポジティブ選択マーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子など）を含むことができる。該ベクターにはさらに、目的の外来遺伝子又はＤＮＡ配列を含んでもよい。
本発明のマウス人工染色体ベクターの利点としては従来の人工染色体ベクターの利点である、１）宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、宿主遺伝子を破壊しない、２）一定のコピー数（複数（多）コピー可能）で安定に保持され、宿主細胞の生理的発現制御を受けることから、挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、３）導入可能なＤＮＡサイズに制約がないことから、発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子／アイソフォームの導入が可能となることに加え、げっ歯類細胞或いはげっ歯類個体中における保持率が従来の人工染色体に比べて向上すること、導入遺伝子の長期間における安定発現を実現し、かつ子孫伝達率が向上することで遺伝子導入マウスの作製効率が向上する、（４）ベクター導入後の組織間のばらつきが少なく、すなわち保持率はどの組織でも９０％以上であり、ＨＡＣの場合２０％未満の保持率である血液系組織でさえも９０％以上の保持率である、などの利点が挙げられる。
（２）外来遺伝子又はＤＮＡの導入
本発明のマウス人工染色体ベクターには、外来遺伝子又はＤＮＡを導入することができる。
外来遺伝子又はＤＮＡ配列のサイズは、特に制限されず、２０ｋｂ以下であってもよいし、或いは２０ｋｂを超えてもよく、例えば５０ｋｂ以上、１００ｋｂ以上、２００ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、７００ｋｂ以上、１Ｍｂ以上、１０Ｍｂ以上、２０Ｍｂ以上、３０Ｍｂ以上、４０Ｍｂ以上、又は５０Ｍｂ以上である。本発明のベクターは、ＨＡＣベクターと同様に、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣなどの人工染色体ベクターでは困難なサイズ、すなわち１Ｍｂ以上の外来ＤＮＡ（染色体断片）を搭載可能である。そのうえ、本発明のベクターは、そのように２００ｋｂ以上、例えば１Ｍｂ以上、の大サイズの外来遺伝子又はＤＮＡをＨＡＣよりも安定にかつ高保持率（９０％以上）で哺乳類の細胞内、組織内又は非ヒト動物個体内、好ましくはげっ歯類の細胞内、組織内又は個体内、に保持することを可能にする。
本発明の実施形態の一つとして、本発明は、２００ｋｂ以上の巨大なサイズの外来遺伝子又はＤＮＡをげっ歯類細胞またはげっ歯類個体で９０％以上の保持率で安定に維持させることが可能なベクター、並びに、該ベクターを作製する方法を提供する。
外来遺伝子又はＤＮＡは、対象となる細胞にとって外部から導入される核酸配列であり、特に限定されるものではなく、任意の生物種由来の或いは任意の組織又は細胞由来の遺伝子又はＤＮＡであり、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子又はＤＮＡ、より好ましくはヒト由来の遺伝子又はＤＮＡである。そのような遺伝子又はＤＮＡには、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、イムノグロブリン類、Ｇ蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はＤＮＡ、その他、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、等）、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などを含む種々の疾患に関連する治療用遺伝子又はＤＮＡ、（ヒト）薬物代謝酵素の遺伝子（群）又はＤＮＡや（ヒト）薬物代謝関連遺伝子、ヒト染色体の長腕又は短腕のＤＮＡ、（ヒト）ゲノムライブラリーなどが含まれるが、これらに限定されない。
サイトカイン類には、例えば、インターフェロン類（例えばＩＦ−α，ＩＦ−β，ＩＦ−γ等）、インターロイキン類（例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２等）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−α，ＴＮＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリータンパク質（例えば骨形成促進タンパク質（ＢＭＰ）、等）などが含まれる。
ホルモン類には、例えば、成長ホルモン、、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）、ヒト下垂体性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン放出因子、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、プロラクチンなどが含まれる。
成長因子類又は栄養因子類には、例えば、インスリン様増殖因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アルブミン融合絨毛様神経栄養因子、血小板由来神経栄養因子（ＰＤＮＦ）、形質転換成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＴＮＦ成長因子などが含まれる。
血液凝固・溶解因子類には、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、ｔ−ＰＡなどが含まれる。
造血因子類には、例えば、エリスロポエチン、（顆粒球）コロニー形成刺激因子、トロンボポエチンなどが含まれる。
イムノグロブリン類には、例えば、各種抗原に対するヒト抗体類、ヒト化抗体類、キメラ抗体類、合成抗体などの組換え抗体類などが含まれる。
Ｇ蛋白質共役型受容体類には、アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、ＧＡＢＡ受容体（Ｂ型）、アンギオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ドパミン受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、ガストリンの受容体、Ｐ２Ｙ受容体などが含まれる。
酵素類には、例えば、アスパラギナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ウリカーゼ、ストレプトキナーゼ、ドパミン合成酵素、アデノシン・デアミナーゼなどが含まれる。
腫瘍、筋ジストロフィー、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、等）、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などを含む種々の疾患に関連する治療用遺伝子には、例えばジストロフィン遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ドパミン合成系酵素遺伝子、遺伝性欠損酵素の遺伝子類、などが含まれる。
薬物代謝酵素は、薬や毒物などの異物を分解・排出するための代謝反応に関わる酵素であり、第一相反応（酸化、還元、加水分解）に関わる酵素及び第二相反応（抱合）に関わる酵素を含む。第一相反応に関わる酵素には、例えばチトクロムＰ４５０（「ＣＹＰ」）などの公知の酵素、具体的にはＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ２Ｊ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ、ＣＹＰ４Ｂ及びそれらのサブファミリー、並びにＣＥＳ、などが含まれる。ＣＹＰサブファミリーとしては、例えばＣＹＰ３ＡのサブファミリーにはＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ４３，ＣＹＰ３Ａ５，ＣＹＰ３Ａ７などが含まれるし、また、ＣＹＰ２ＣのサブファミリーにはＣＹＰ２Ｃ８，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１８，ＣＹＰ２Ｃ１９などが含まれる。ちなみに、後述の実施例に記載されるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣは、ＣＹＰ３Ａクラスターを意味しており、ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ４３，ＣＹＰ３Ａ５及びＣＹＰ３Ａ７からなる。一方、第二相反応（抱合）に関わる酵素には、例えばＵＧＴ１及びＵＧＴ２などが含まれる。
薬物代謝関連遺伝子には、例えばトランスポーターをコードする遺伝子、核内受容体をコードする遺伝子などが含まれる。トランスポーターをコードする遺伝子の例は、ＭＤＲ１，ＭＤＲ２，ＭＲＰ２，ＯＡＴ，ＯＡＴＰ，ＯＣＴ，ＢＣＲＰなどであり、核内受容体をコードする遺伝子の例は、ＰＸＲ，ＡｈＲ，ＣＡＲ，ＰＰＡＲαなどである。
このように、本発明のベクターに導入可能な、薬物代謝に関係する外来ＤＮＡ配列は、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の配列、或いは、少なくとも２つの遺伝子の配列を含むことができる。
本発明のマウス人工染色体ベクターにおける外来遺伝子又は外来ＤＮＡの挿入部位の近傍又は挿入部位の両側には、少なくとも１つのインスレーター配列を存在させることができる。インスレーター配列は、エンハンサーブロッキング効果（すなわち、隣り合う遺伝子が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を有する。このような配列には、例えばヒトβグロビンＨＳ１〜ＨＳ５、ニワトリβグロビンＨＳ４などが包含される。
外来遺伝子又はＤＮＡの導入は、上記のＤＮＡ配列挿入部位として挿入されている、上で例示されるような部位特異的組換え酵素の系を利用して行うことができる。例えば、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列と外来遺伝子又はＤＮＡを保持するターゲティングベクター或いは、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列を挿入した外来遺伝子又はＤＮＡを保持する染色体断片を構築し、本発明のマウス人工染色体ベクターを保持する細胞内でＣｒｅ酵素を発現させることにより、ｌｏｘＰ配列において該ターゲティングベクター或いは該染色体断片との部位特異的組換えにより、外来遺伝子又はＤＮＡを導入できる。
本発明のマウス人工染色体ベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列など）を保持する環状ＤＮＡを挿入することもでき、大腸菌を宿主としたプラスミドや、酵母を宿主とした環状ＹＡＣ等の既存のベクターによりクローン化されたＤＮＡも挿入できる。好適なｌｏｘＰ配列はＰ１ファージに由来する野生の配列であり、Ｃｒｅ酵素による人工染色体ベクター上のｌｏｘＰ配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。一旦環状インサートが挿入されると、人工染色体ベクター上に２つのｌｏｘＰ配列が残る。このため再度Ｃｒｅ酵素を発現させると環状インサートを切り出す逆反応が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するようなさらなる人工染色体ベクターの改変が困難となる。しかし、塩基置換を行った変異ｌｏｘＰ配列やφＣ３１インテグレースの認識部位であるａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の組み合わせ等によっては、逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築できる。
（３）マウス人工染色体ベクターの細胞への移入及び非ヒト動物の作出
本発明のマウス人工染色体ベクター、或いは、外来遺伝子若しくはＤＮＡを含む本発明のマウス人工染色体ベクターは、任意の細胞に移入又は導入することができる。そのための手法には、例えば、微小核細胞融合法、リポフェクション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれるが、好ましい手法は微小核細胞融合法である。
微小核細胞融合法は、本発明のマウス人工染色体ベクターを含有する微小核形成能を有する細胞（例えばマウスＡ９細胞）と、他の所望の細胞との微小核融合によって該ベクターを該他の細胞に移入する方法である。微小核形成能を有する細胞は、倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理して微小核多核細胞を形成し、サイトカラシン処理により微小核体を形成する処理を行ったのちに、所望の細胞との細胞融合を行う。
上記のベクター導入可能な細胞は、動物細胞、好ましくはヒト細胞を含む哺乳動物細胞、例えば卵母細胞、精子細胞などの生殖系列細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、精子幹（ＧＳ）細胞、体性幹細胞などの幹細胞、体細胞、胎児細胞、成体細胞、正常細胞、疾患細胞、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞など、を包含する。幹細胞には、例えばＥＳ細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、ｍＧＳ細胞、ヒト間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、核移植クローン胚由来胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞などが含まれる。好ましい細胞は、哺乳動物（好ましくは、マウスを含むげっ歯類）由来の体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される。細胞がげっ歯類などの哺乳類由来の細胞である場合、本発明のベクターが導入された哺乳類（例えばマウスなどのげっ歯類）の細胞又は組織において、ベクターがより安定に保持される、すなわち細胞からのベクターの脱落が有意に低下する、又は脱落が起こらない。
細胞は、例えば、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子、卵子などである。
組織は、例えば肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳、骨髄、精巣、卵巣などの組織である、
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マイトマイシンＣ処理マウス胎仔線維芽細胞をフィーダーにして樹立し維持することができる（Ｍ．Ｊ．ＥｖａｎｓとＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６）。
ｉＰＳ細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む）に、ある特定の再プログラム化因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３〜５週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；あるいは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６（２００６）；ＷＯ  ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１８，６００−６０３（２００８））。培養例は、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（約１０４〜１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地、それらの混合培地などであり、ＥＳ細胞用培地は、マウスＥＳ細胞用培地、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）などを使用することができる。
ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、生殖系列に寄与することが知られているので、目的の遺伝子又はＤＮＡを含む本発明のマウス人工染色体ベクターを導入したこれらの細胞を、該細胞が由来する同種の哺乳動物の胚の胚盤胞に注入し、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させることを含む手法によって、非ヒト動物（又は、トランスジェニック動物（ヒトを除く））を作出することができる。さらにまた、得られた雌雄のトランスジェニック動物を交配することによって、ホモ接合性動物、さらにその子孫動物を作出することができる。
本発明のマウス人工染色体ベクターを介してＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの分化多能性細胞、その他の上記細胞類に、ヒト抗体遺伝子、疾患治療用遺伝子、薬物代謝関連遺伝子などの外来の遺伝子若しくはＤＮＡを導入することによって、ヒト抗体を産生可能にする細胞や非ヒト動物を作製することができるし、また、治療用タンパク質を産生可能にする細胞を作製することができるし、さらにまた、薬物代謝関連疾患などの疾患モデル非ヒト動物を作製することができる。
そのような非ヒト動物では、マウス人工染色体ベクターに含まれる外来遺伝子に対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下していることが好ましい場合もある。破壊の方法には、ジーンターゲティング法を使用することができる。内在遺伝子の発現の低下法には、ＲＮＡｉ法を用いることができる。例えば、そのような外来遺伝子の例には、薬物代謝関連遺伝子、ヒト抗体遺伝子などが挙げられる。内在遺伝子が破壊された非ヒト動物は、外来遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持するキメラ非ヒト動物若しくはその子孫と、対応する内在遺伝子をクラスターごと欠失させたキメラ動物若しくは子孫とを交配させて得られた該内在遺伝子がヘテロに欠失した動物同士をさらに交配させることによって作出することができる。
上記の手法によって、マウス人工染色体ベクターを保持する細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。具体的な非ヒト動物の例は、マウス人工染色体ベクターを保持する、マウスやラットなどのげっ歯類である。
すなわち、本発明は、マウス人工染色体ベクターを保持することを特徴とする、細胞及び非ヒト動物を提供する。
さらにまた、本発明の非ヒト動物から得られる細胞、組織又は器官は、それらから、外来遺伝子によって発現されたタンパク質を産生する細胞株を作製するために使用することも可能である。
（４）有用なタンパク質の生産法
本発明はさらに、外来ＤＮＡ配列を発現可能に含むマウス人工染色体ベクターを保持する細胞を培養し、産生された該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法を提供する。
タンパク質として、例えば上記の医療上、農業上などの産業上有用なタンパク質又はポリペプチド類が挙げられる。これらのタンパク質又はポリペプチド類をコードするＤＮＡを、プロモーター（及び必要であれば、エンハンサー）の存在下で発現可能となるようにマウス人工染色体ベクターに挿入し、適当な細胞を形質転換若しくはトランスフェクションする。得られた細胞を培養し、該ＤＮＡを発現させて該タンパク質又はポリペプチドを産生させ、これを、細胞又は培地から回収する。
細胞は、哺乳動物細胞の他に、Ｓｆ細胞などの昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、植物細胞などの真核細胞の使用も可能である。
培地を含む培養条件は、細胞の種類に応じて選択され、培養条件として公知の条件を使用しうる。例えば、動物細胞の培地としては、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、イスコフＥＭＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、これらの混合培地などが含まれる。
タンパク質又はポリペプチド類の回収（又は、単離）は、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどのクロマトグラフィー法、塩析法、硫安沈殿法、有機溶媒沈殿法、限外ろ過法、結晶化などの公知の手段を単独で又は組み合わせて実施しうる。
（５）ヒト抗体の製造法
本発明はさらに、ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法を提供する。
ヒト抗体遺伝子は、ヒトＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥのいずれかのクラス、或いは、ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２のいずれかのサブクラスをコードする遺伝子である。好ましいヒト抗体遺伝子は、ＩｇＧクラス及びそのサブクラスである。
ヒト抗体は、２本の同一配列の重鎖（Ｈ）と２本の同一配列の軽鎖（Ｌ）から構成されており、Ｈ鎖もＬ鎖もともに、可変領域と定常領域から構成されている。ヒトＨ鎖及びＬ鎖の可変領域はともに、３つの超可変領域（Ｎ末端側からＣ末端側にＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３の順番）と４つのフレームワーク領域（Ｎ末端側からＣ末端側にＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３，ＦＲ４の順番）からなり、ヒトＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれ３つずつのＣＤＲ配列によって抗体の特異性が決まる。
ヒトＩｇＧ抗体の場合、重鎖であるμ鎖と、軽鎖であるλ鎖若しくはκ鎖とによって構成されており、これらの抗体鎖遺伝子はそれぞれ、ヒト１４番染色体、２２番染色体、２番染色体上に存在する。本発明で使用するヒト抗体遺伝子としては、各抗体遺伝子座を含むヒト染色体断片を使用し、これらを異なる又は同一のマウス人工染色体に組み込む。抗体遺伝子配列は、ＮＣＢＩ（米国）のデータベースなどから入手可能である。この一連の手法は、例えば特開２００５−２３００２０号公報に記載される技術の改良である。
完全ヒト抗体を生産可能な非ヒト動物は、ヒトμ鎖遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを保持する非ヒト動物と、ヒトλ鎖遺伝子座及び／又はヒトκ鎖遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを保持する同種の非ヒト動物とを交配することによって、両方のＨ鎖及びＬ鎖遺伝子座を保有するキメラ非ヒト動物及びその子孫動物を得ることが可能である。
このようにして作製された完全ヒト抗体産生可能な非ヒト動物（例えばマウスなどのげっ歯類）に、ある特定の抗原ペプチド若しくは抗原ポリペプチドを免疫し、該動物の血液からヒト抗体を分離することを含む方法により、ヒト抗体を生産することができる。
或いは、ある特定の抗原で免疫した非ヒト動物の脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることも可能である。
（６）治療物質のスクリーニング法
本発明はさらに、疾患モデル動物である上記非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法を提供する。
疾患モデル非ヒト動物は、ある種のタンパク質の欠損、変異などによる生物機能異常、薬物代謝異常、染色体異常などの異常を原因とする疾患を持つ人工的に作製された動物である。染色体異常をもつモデル非ヒト動物の例は、以下に限定されないが、ヒト１８番又は２１番染色体トリソミーをもつ動物である。
このような非ヒト動物は、遺伝子又は染色体に上記のような異常を含む遺伝子又は染色体断片を作製し、これを本発明のマウス人工染色体ベクターに組み込み、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に導入し、受精卵の胚盤胞に注入し、この細胞を非ヒト動物の仮親の子宮に移植し、出産させることを含む方法によって作出することができる。
上記のようにして作製された非ヒト動物に、候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することによって、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングすることができる。
候補薬剤は、非限定的に、例えば、低分子化合物、高分子化合物、（糖）タンパク質、ペプチド、（リン又は糖）脂質、糖類、などである。
（７）薬物又は食品の薬理作用、代謝又は毒性の試験方法
本発明の実施形態によれば、本発明はまた、ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性の試験方法を提供する。
本発明はまた、ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分Ｓ９を、培養細胞若しくは細菌及び薬物若しくは／及び食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす（悪）影響（例えば変異、等）を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法を提供する。
ヒト薬物代謝関連遺伝子は、上に例示したものである。また、非ヒト動物の作出方法も上に記載したものと同様である。
ヒト薬物代謝関連遺伝子を有するマウス人工染色体ベクターを保持する上記の非ヒト動物を用いる上記方法では、例えば、該動物の状態の観察、臓器や染色体に及ぼす影響の試験などによって、薬物又は食品の薬理作用、代謝又は毒性を判定することができる。
本発明のもうひとつの方法では、該非ヒト動物から得られたミクロソーム若しくはミクロソーム画分Ｓ９（９０００ｇ画分であって加水分解、還元、酸化、結合などを触媒する多数の酵素を含む画分）を、培養細胞（特に、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞）又は細菌（好ましくは、サルモネラ菌）と一緒に、薬物及び／又は食品の存在下で培養する。薬物又は食品の、細胞に対する毒性の検出は、エイムス試験又は小核試験によって行うことができる。エイムス試験では、サルモネラ菌の変異に基づいて毒性を判定する。小核試験では、細胞核の染色体の異常に基づいて毒性を判定する。これらの試験法はよく知られており、本発明の方法で使用しうる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００９】
［実施例１］
マウス人工染色体ベクターＭＡＣの構築
マウス染色体にテロメアトランケーションを行うことで内在遺伝子を含まないマウス人工染色体ＭＡＣ［ＤＴ４０（Ｂ６ｂＴ）］を構築する（図１）。
［Ａ］Ａ９細胞とマウス線維芽細胞（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）のハイブリッド細胞樹立
薬剤耐性遺伝子（Ｂｓｒ遺伝子）で標識されたマウス１１番染色体を含有するマウス線維芽細胞であるｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）と公知のマウスＡ９細胞にＧ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子を挿入したｍｏｓｕｅ  Ａ９（ｎｅｏ）と細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞であるｍｏｕｓｅ  Ａ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）を樹立する。薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を微小核細胞融合法により相同組換頻度の高いニワトリＤＴ４０細胞へ導入するために、微小核形成率が高いことが知られているマウスＡ９細胞に薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を細胞融合によって導入する。
［Ａ．１］細胞融合及び二重薬剤耐性クローンの単離
日本クレアより入手可能なＣ５７Ｂ６系統のマウス胎仔より樹立し、薬剤耐性遺伝子（Ｂｓｒ遺伝子）をマウス染色体上に挿入したマウス繊維芽細胞であるｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）と、Ｇ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子が挿入されているマウスＡ９細胞であるｍｏｓｕｅ  Ａ９（ｎｅｏ）をそれぞれＰＢＳ（−）で細胞表面を洗浄後、トリプシン添加によって細胞を分散し、培養液（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に懸濁し、それぞれの細胞１ｘ１０６個を培養用フラスコ（２５ｃｍ２）に同時に植え込み、一日間培養する。ＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄した後に３ｍｌのＰＥＧ（１：１．４）溶液［５ｇ，ＰＥＧ１０００，ｃａｔ：１６５−０９０８５，ｗａｋｏを無血清ＤＭＥＭ６ｍｌに溶解させ、ジメチルスルホキシド１ｍｌを加えて濾過滅菌する］で１分間処理し、さらに３ｍｌのＰＥＧ（１：３）溶液［５ｇ，ＰＥＧ１０００，ｃａｔ：１６５−０９０８５，ｗａｋｏを無血清ＤＭＥＭ１５ｍｌに溶解させて濾過滅菌する］に換えて１分間処理した。ＰＥＧ溶液を吸引後、無血清ＤＭＥＭで３回洗浄し、通常の培養液（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）で一日間培養した。ＰＢＳ（−）で細胞表面を洗浄後、トリプシン添加によって細胞を分散し、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）及びブラストサイジンＳ（４μｇ／ｍｌ）を含む二重選択培養液（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞をプラスチック培養皿に植え込み、２〜３週間選択培養した。２回の細胞融合で得た合計３個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ｍｏｕｓｅ  Ａ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ））。
［Ａ．２］雑種細胞の選択
［Ａ．２．１］ＰＣＲ
二重薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、薬剤耐性遺伝子（Ｂｓｒ遺伝子）で標識されたマウス染色体が保持されていることを確認した。
0005557217.tif 000002
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、３クローン中３クローンが陽性であった。
【表１】
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［Ａ．２．２］キナクリン・ヘキスト二重染色
上記ＰＣＲ解析によって陽性であったクローンについて、キナクリン・ヘキスト二重染色を行った。キナクリン・ヘキスト二重染色は、まず、５０ｍｌのマキルベン溶液［クエン酸一水和物１１．１８ｇとリン酸水素二ナトリウム１３．２９ｇを１Ｌの水に溶解させ、オートクレーブする］に染色体スライドを浸し、ついで５０ｍｌのマキルベン溶液に６０μｇ／ｍｌになるようにキナクリン［ｃａｔ：Ｑ２８７６，ＳＩＧＭＡ］を溶解したものに２０分間浸し、水道水で染色体スライドの裏面を洗浄後、マキルベン溶液に浸し、５０ｍｌのマキルベン溶液に０．５μｇ／ｍｌになるようにヘキスト［ｃａｔ：Ｂ−２８８３］を溶解したものに１５分浸したあとに、カバーガラスで覆った。蛍光顕微鏡により観察したところ、３クローンすべてにおいて通常の核型が２ｎのところが大半の核型が４ｎ以上になっていた。特に、クローンＡ９（２１−Ｂ６ｂ）７において薬剤耐性遺伝子（Ｂｓｒ遺伝子）で標識されたマウス染色体を保持するマウス線維芽細胞と、Ｇ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子が挿入されているマウスＡ９細胞が一対一で細胞融合したことがわかった（図６）。
【表２】
0005557217.tif 000005
0005557217.tif 000006
以上の結果から、ｍｏｕｓｅ  Ａ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）において、標識されたマウス染色体を保持していると結論付けた。
［Ｂ］薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体のＤＴ４０細胞への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を含有するマウスＡ９雑種細胞であるｍｏｕｓｅ  Ａ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）から薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体をニワトリＤＴ４０細胞であるＤＴ４０へ導入する。マウス染色体番号の同定、及び人工テロメアの挿入による染色体部位特異的切断であるテロメアトランケーション、及び相同組換によりマウス染色体にＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰ配列の挿入を効率的に行うために、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を微小核細胞融合法により相同組換頻度の高いニワトリＤＴ４０細胞であるＤＴ４０へ導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
染色体同定と染色体改変を効率的に行うために、マウス染色体をＡ９雑種細胞クローンであるＡ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）７から相同組換え頻度の高いニワトリＤＴ４０細胞であるＤＴ４０へ移入した。フラスコ×２４で培養していたドナー細胞であるＡ９ｘｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ（ｎｅｏ；ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）７がそれぞれのフラスコにおいて７０％コンフルエントになった時点で、コルセミド処理（コルセミド０．０５μｇ／ｍｌ、２０％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ）を３７℃５％ＣＯ２の条件下にて４８時間行った。コルセミド処理が終了したら、フラスコ内のｍｅｄｉｕｍをアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを大型高速遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心（Ｒｏｒｔｏｒ  ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１ｈ、３４℃）をした。遠心終了後、サイトカラシンＢを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収した。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心（１，２００ｒｐｍ５分Ｒ．Ｔ）し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収、懸濁し、遠心（２０００ｒｐｍ５分）をした。
レシピエント細胞であるＤＴ４０細胞は浮遊細胞であるため、一度付着状態にする必要がある。ＤＴ４０を６穴プレート（Ｎｕｎｃ）のうちの１穴に付着させるために５０μｇ／ｍｌに調整したポリ−Ｌ−リジン（ＳＩＧＭＡ）１．５ｍｌで１穴を３７℃、オーバーナイトでインキュベートすることでコーティングした。ポリ−Ｌ−リジンを回収し、プレートをＰＢＳ（‐）で洗浄し、約１ｘ１０７個のＤＴ４０細胞を２ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）でプレートに静かに播種した。プレートごと遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）にセットし、３７℃、１２００ｒｐｍ、３分間遠心して付着ＤＴ４０にした。
精製した微小核細胞をＰＨＡ−Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去した付着ＤＴ４０上に静かに播種した。プレートを３７℃、１２００ｒｐｍ、３分間遠心した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］溶液を１ｍｌで正確に１分間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を４ｍｌで４回洗浄し、通常のＤＴ４０の培養液３ｍｌでピペッティングして、付着ＤＴ４０を浮遊状態に戻し、３７℃、２４穴プレート２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。ブラストサイジンＳを１５００μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で得た合計２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ））
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）のクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）−１において、９５％で正常核型（２ｎ）あたりのマウス染色体数が１コピーであったため、以降の解析を行った（図７）。
【表３】
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0005557217.tif 000008
［Ｂ．２．２］ＤＴ４０に導入され、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体の同定
Ｋａｉら（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，１９：２４７−５８，２００９）の報告に記された方法でＳＫＹ−ＦＩＳＨを行ったところ、ニワトリＤＴ４０細胞に導入されたマウス染色体はマウス１１番染色体であることがわかった（図８）。
［Ｃ］ニワトリＤＴ４０細胞内におけるマウス１１番染色体領域ＡＬ６７１９６８から遠位のテロメアトランケーションによる部位特異的切断
マウス人工染色体ベクターとして導入目的遺伝子以外の内在遺伝子は少ない方が実験系に及ぼす影響が軽減され、かつ内在遺伝子のうちインプリント遺伝子のようにマウス個体発生に遺伝子発現量の変化による影響を及ぼす遺伝子を極力残さないことが必要であるので、マウス長腕の大部分を削除する。
［Ｃ．１］テロメアトランケーションベクター作製
短腕近位部位特異的切断用の基本ベクターにはｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏコンストラクト（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００２）を用いた。ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たマウス１１番染色体長腕近位の塩基配列（ＡＬ６７１９６８）から相同組換え標的配列を設計した。ＤＴ４０（ｍＣｈｒ１１−ＢＳｒ）からゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換え標的配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーの配列を以下に示す。
0005557217.tif 000009
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６５℃８分を３５サイクル行ったＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏのＢａｍＨＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿ＭＡＣ）。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図９に示した。
［Ｃ．２］相同組換体の選別
マウス１１番染色体領域ＡＬ６７１９６８から遠位において部位特異的切断を行うベクターは上述のｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿ＭＡＣを用いてトランスフェクションを行い、ピューロマイシン耐性及びブラストサイジンＳ非耐性クローンの単離及び相同組換え体の選別を行った。その結果、マウス１１番染色体領域を切断できた５クローンを確認した（クローン名：ＤＴ４０（ＭＡＣ））。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図９に示した。
［Ｃ．３］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンの選別
上記で得られたＤＴ４０（ＭＡＣ）の５クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ５クローンうち２クローンにおいてマウス１１番染色体の長腕部分がセントロメア近傍で切断されていることを確認した（図１０）。
【表４】
0005557217.tif 000010
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以上の結果から、余分なマウス染色体長腕が切除されたマウス人工染色体ＭＡＣが構築できたと結論付けた。マウス人工染色体ベクターＭＡＣを保持するニワトリＤＴ４０細胞であるＤＴ４０（ＭＡＣ）−１は、識別名称をＤＴ４０  Ｂ６ｂＴ−１として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成２１年（２００９年）５月１４日付けでブダペスト条約の規定に基づいて国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８が与えられた。
［実施例２］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１の構築
マウス人工染色体ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列を挿入することでマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１を構築し、ＭＡＣ１のマウスＥＳ細胞での安定性を検証し、さらにＭＡＣ１を導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。
［Ａ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣへのＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列の挿入
［Ａ．１］ＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰターゲティングベクター作製
ＤＴ４０（ＭＡＣ）にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるマウス１１番染色体のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＢＸ５７２６４０．９）。薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換えの二つの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。
0005557217.tif 000012
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃５分を３５サイクル行った。
それぞれのＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９１３のＢｇｌＩＩあるいはＢａｍＨＩサイトにクローニングした（ベクター名：ＶＨ２１−１２）。３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列をクローニングした。ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目のエクソンである３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰをＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＥｃｏＲＩとＡｓｃＩにクローニングした（ベクター名：Ｘ３．１）。さらにＸ３．１のＫｐｎＩサイトとＥｃｏＲＩサイトにＫｐｎＩとＮｏｔＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ配列をクローニングした（ベクター名：Ｘ４．１）。Ｘ４．１からＫｐｎＩとＡｓｃＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴをＶ９１３のＫｐｎＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ  ＶＮＬＨ）。ｐＶＮＬＨのＥｃｏＲＶサイトにＮｏｔＩとＳａｌＩ消化後に平滑化をおこなったＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（大阪大学、岡部博士及びＮＩＨ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士より分与）をクローニングした（ベクター名：ｐ  ＶＧＮＬＨ）。ｐ  ＶＧＮＬＨからＳａｌＩとＡｓｃＩにより切り出したＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをＶＨ２１−１２のＸｈｏＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＭＡＣ１）。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図１１に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよびＧ４１８耐性クローンの単離
ニワトリＤＴ４０細胞の培養は１０％ウシ胎仔血清（ギブコ、以下ＦＢＳで記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。ＤＴ４０（ＭＡＣ）−１の約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化したターゲティングベクターｐＭＡＣ１を２５μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。Ｇ４１８（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。２回のトランスフェクションで得た合計１４個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＭＡＣ１））
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１１番染色体上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、８８クローンのうち、２クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この２クローンで以降の解析を行った。
【表５】
0005557217.tif 000015
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記から得られたＤＴ４０（ＭＡＣ１）−５２とＤＴ４０（ＭＡＣ１）−５８において、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ｌｏｘＰ配列がターゲティングされたマウス１１番染色体断片のセントロメア付近にプローブ由来のＦＩＴＣシグナルが検出され、かつネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス１１番染色体断片（例えばＤＴ４０（ＭＡＣ）−１）では現れなかったシグナルが検出されたことから、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた（図１２）。これらの結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１を保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論できた。
【表６】
0005557217.tif 000016
0005557217.tif 000017
［Ｂ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＤＴ４０細胞からＭＡＣ１のＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ細胞を介してマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１をマウスＥＳ細胞に導入するため、或いはＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１のＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰを介して安定に目的遺伝子（群）等、例えばＣＹＰ３Ａクラスターなどを挿入するため、ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ＭＡＣ１）５２及び５８を用いて、上記と同様にＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）に微小核細胞融合法を行った。２回の微小核細胞融合で得た合計２４個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１））
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工番染色体ＭＡＣ１がＣＨＯ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000018
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２４クローンのうち、２０クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この２０クローンで以降の解析を行った。
【表７】
0005557217.tif 000019
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［Ｂ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）の２０クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ２０クローン中、５クローンで９５％の割合でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１がＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した（図１３）。
【表８】
0005557217.tif 000021
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以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１がＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｃ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞へマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１の導入
マウスＥＳ細胞及びマウス個体内でのマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１の安定性を検証するために、マウス人工染色体ＭＡＣ１をマウスＥＳ細胞に導入し、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有キメラマウスならびに子孫伝達マウスを作製する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）−３，５，８，２２を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％  ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。
ドナー細胞にはＣ５７Ｂ６系統マウスのＥＳ細胞であるＢ６−ＥＳ、及びＢ６−ＥＳ細胞に６ＴＧ処理を行ったＨＰＲＴ欠損株であるＢ６（ＨＰＲＴ−）、及びＣ５７Ｂ６ｘＣＢＡ系統Ｆ１マウスのＥＳ細胞であるＴＴ２Ｆ、及びＴＴ２Ｆ細胞に６ＴＧ処理を行ったＨＰＲＴ欠損株であるＫＯ５６（ＨＰＲＴ−）を用いた。培養には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＩＧＭＡ）に、１０％ＦＣＳ、ＬＩＦ（Ｍｕｅｒｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）、１×１０−５Ｍ  ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール：ＳＩＧＭＡ）、Ｌ−グルタミン（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（０．１２５ｍＭ：ＧＩＢＣＯ）を添加し、５％  ＣＯ２、３７℃にて培養をおこなった。マウスＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加した培養液で回収し、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、無血清培養液５ｍｌに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を０．５ｍｌで正確に１分３０秒間融合した。１３ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）を静かに添加し、１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、通常のマウスＥＳ細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したＧ４１８耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径１０ｃｍ細胞培養皿２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。Ｇ４１８を２５０μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した（クローン名：Ｂ６−ＥＳ（ＭＡＣ１）及びＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）及びＫＯ５６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１））。Ｂ６−ＥＳ（ＭＡＣ１）及びＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）及びＫＯ５６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）については、それぞれ２回の微小核細胞融合で得た合計３２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った。ＴＴ２Ｆ（ＭＡＣ１）については、４回の微小核細胞融合で得た合計３０個の耐性コロニーを単離し増殖させ、ＦＩＳＨ解析以降の解析を行った
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工番染色体ＭＡＣ１がマウスＥＳ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000023
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１０分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、３２クローンのうち、３０クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、このうち１４クローンで以降の解析を行った。
【表９】
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［Ｃ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＢ６−ＥＳ（ＭＡＣ１）及びＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）及びＫＯ５６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）のクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ１４クローン中、全てのクローンで８５％以上の割合でＭＡＣ１がマウスＥＳ細胞に導入されていることを確認した。また、正常核型である内在マウス染色体の本数がＢ６−ＥＳの場合４０本、またはＫＯ５６の場合３９本であることを確認した。Ｂ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）の場合、４０本の核型クローンは得られなかった。また、同様にＴＴ２Ｆ（ＭＡＣ１）については、７クローンについて解析し、７クローン中全てのクローンで、９０％以上の割合で導入されていることを確認した。また、また、正常核型である内在マウス染色体の本数が３９本であることを、７クローン中３クローンについて確認した。
以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１がマウスＥＳ細胞に導入できたと結論付けた（図１４）。
【表１０】
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［実施例３］マウス人工染色体ベクターＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるＣＹＰ３ＡクラスターをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて転座クローニングを行い、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを構築する。また、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞での安定性を検証し、さらにＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。また、子孫伝達マウスにおいて、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の組織特異的遺伝子発現を検証する（図２）。
［Ａ］ヒト７番染色体のＡＣ００４９２２へのｌｏｘＰ配列の部位特異的挿入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にｌｏｘＰ配列を介して転座挿入するために、ＤＴ４０細胞内でヒト７番染色体（ｈＣｈｒ７）のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの近位のＡＣ００４９２２へｌｏｘＰ配列を挿入する。
［Ａ．１］ターゲティングベクターｐＭＰｌｏｘＰＨｙｇの作製
ヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＣ００４９２２領域にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐＭＰｌｏｘＰＨｙｇを以下のようにして作製した。まず、ＡＣ００４９２２ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000027
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ベーリンガー）およびＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断しＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片（３．７ｋｂおよび３．０ｋｂ）をＶ９０１プラスミドのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９０１−ＮＰ２１）。次に、Ｖ９０１−ＮＰ２１を制限酵素ＡｓｃＩ（ＮＥＢ）ならびにＫｐｎＩで切断し、カセットベクター５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ−ＴＫ（Ｋａｚｕｋｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）から、制限酵素ＡｓｃＩおよびＫｐｎＩでｌｏｘＰを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした。ｌｏｘＰ配列の方向がクローニングしたＡＣ００４９２２ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターｐＭＰｌｏｘＰＨｙｇとした。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１２ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを（図１５ａ）に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＭＰｌｏｘＰＨｙｇを制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、ＷＯ０１／０１１９５１に記載された方法で作製されたヒト７番染色体断片（ＡＦ００６７５２座で部位特異的に切断されている）を保持するニワトリＤＴ４０細胞（クローンＤＦ１４１）にトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート３枚に分注して約２週間の選択培養を行った。５回のトランスフェクションで得た合計９６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ））。
［Ａ．３］相同組換え体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
0005557217.tif 000028
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル行った。９６クローンをスクリーニングした結果、３６クローンが相同組換え体として同定された。
［Ａ．３．２］サザンブロット解析
上記ＰＣＲ解析にて組換えを確認した６クローンについて以下のようにサザンブロット解析を行った。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理し、０．８％アガロースゲル中で電気泳動し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  ＰｌｕｓＴＭハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン（ＮＥＮＴＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）へアルカリブロッティングした。このフィルターに対してＡＣ００４９２２中の遺伝子配列をＰＣＲにより増幅したＭＰｐプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の同定を行った。ＭＰｐプローブの作製は以下のプライマーを用いＤＦ１４１のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を鋳型としてランダムプライミングによる３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを作製した（アマシャム、添付のプロトコールに従った）。
ＭＰｐプローブ作製用プライマー：
0005557217.tif 000029
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５４℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。サザンハイブリダイゼーションにより、非相同組換え体では約１０．９ｋｂ、相同組換え体では約８．９ｋｂのバンドが検出されると予測された（図１５ｂ）。サザンハイブリダイゼーションの結果、６クローン中すべてのクローンが目的の相同組換え体であった。
［Ａ．３．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびハイグロマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト７番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、７ｑ２２付近にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、ヒト７番染色体断片に遺伝子導入部位であるｌｏｘＰ配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。
［Ｂ］ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰにおけるヒト７番染色体領域ＡＣ０７３８４２での部位特異的切断
ＷＯ  ２００９／０６３７２２（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８９２８）にあるように、ヒト７番染色体のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターから遠位側のマウス個体の発生に強く関わる遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。
［Ｂ．１］ターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴの作製
ヒト７染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ０７３８４２領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴを以下のようにして作製した。まず、ＡＣ０７３８４２ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000030
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ベーリンガー）及びＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断し、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ  １０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＥＬｈｉｓＤ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：８８，２００２）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＡＣ０７３８４２ゲノムシークエンスの方向はテロメア→セントロメアなので、クローニングされたＡＣ０７３８４２ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴとした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１４．４ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを（図１６）に示した。
［Ｂ．２］トランスフェクション及びヒスチジノール耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴを制限酵素ＳｒｆＩ（東洋紡）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ）１２２にトランスフェクションし、ヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。５回のトランスフェクションで得た合計３３５個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ））。
［Ｂ．３］相同組換え体の選別
［Ｂ．３．１］ＰＣＲ解析
ヒスチジノール耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000031
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、４３３クローン中２クローンが陽性であった。
次に上記プライマーで検出されなかった４３３クローンのうちの２クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをＰＣＲにて確認した。配列は以下のとおりである。
0005557217.tif 000032
上記プライマーによりＰＣＲはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった２クローンでのみ約８ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ）ではバンドは検出されなかった。
【表１１】
0005557217.tif 000033
［Ｂ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち２クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒスチジノールをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ｌｏｘＰ配列が挿入されたヒト７番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト７番染色体断片末端にヒスチジノール由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の結果から、クローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）６０８及び７４８において、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域よりテロメア側のＡＣ０７３８４２から遠位において切断できたと結論付けた。
【表１２】
0005557217.tif 000034
［Ｃ］ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ含有ＤＴ４０からｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌのＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞への導入。
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にｌｏｘＰ配列を介してヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域を転座挿入するために、ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌをマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）６０８及び７４８を用いて、上記と同様にＭＡＣ１含有ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）である、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）に微小核細胞融合法を行った。５回の微小核細胞融合で得た合計４８個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト７番染色体断片がＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000035
0005557217.tif 000036
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、４８クローンのうち、１９クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、このうち陰性１クローンを含む２０クローンで以降の解析を行った。
【表１３Ａ】
0005557217.tif 000037
0005557217.tif 000038
【表１３Ｂ】
0005557217.tif 000039
0005557217.tif 000040
［Ｃ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）の１９クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、上記陰性の１クローンを除いた１８全てにおいてＭＡＣ１ならびにｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがＣＨＯ細胞に１コピーもしくは２コピーで導入されていることを確認した（図１７）。
【表１４】
0005557217.tif 000041
0005557217.tif 000042
0005557217.tif 000043
以上の結果から、ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｄ］ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンにおけるヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ００４９２２−ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２）１ＭｂのＭＡＣ１ベクターへの部位特異的転座
１ＭｂサイズのＤＮＡであるヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターをマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１に転座挿入する（図１８）。
［Ｄ．１］トランスフェクション及びＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ７−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）−６、９、１２、４７にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ３μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の導入で得た合計４２個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ７−ΔＣＹＰ３Ａ））。
［Ｄ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｄ．２．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト７番染色体断片とＭＡＣ１上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000044
0005557217.tif 000045
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、４２クローンのうち、２７クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この２７クローンで以降の解析を行った。
【表１５】
0005557217.tif 000046
0005557217.tif 000047
［Ｄ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ７−ΔＣＹＰ３Ａ）の２７クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ２７クローン中、２５クローンで５０％以上の割合でｌｏｘＰ配列を含むマウス１１番染色体断片からなるＭＡＣ１上にヒト７番染色体由来によるシグナルが観察されていることを確認した（図１９）。
【表１６】
0005557217.tif 000048
0005557217.tif 000049
0005557217.tif 000050
0005557217.tif 000051
以上の結果から、ｌｏｘＰ配列が挿入されヒト７番染色体断片上のＣＹＰ３Ａクラスター１Ｍｂがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。
［実施例４］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２の構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣにＤＮＡ挿入配列として５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列を挿入したマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２を構築する（図３）。５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ  ｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列は、Ｋａｚｕｋｉらの報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された２１番染色体由来のＧＦＰ搭載ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）に挿入されており、ＨＡＣとＭＡＣの遺伝子発現を同じベクターで比較することができる。また、２１ＨＡＣ２への挿入のための遺伝子導入ベクターがベクター作製のステップを経ることなく、そのまま利用可能である。
［Ａ］マウス人工染色体ＭＡＣへの５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列の挿入
［Ａ．１］５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰターゲティングベクター作製
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドには上記で作成したＶＨ２１−１２を用いた。上記Ｘ６．１からＫｐｎＩとＡｓｃＩにより切り出した５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇｒｏカセットをＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＫｐｎＩとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ  Ｖ９０７−ＡＭＬ）。さらにｐ  Ｖ９０７−ＡＭＬから５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ  ｈｙｇｒｏカセットをＸｈｏＩとＳａｌＩにより切り出してＶＨ２１−１２のＸｈｏＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＭＡＣ２）。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図２０に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＭＡＣ２を制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ＭＡＣ）にトランスフェクションし、ハイグロマイシン（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。１回のトランスフェクションで得た合計４５個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＭＡＣ２））。
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000052
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、４５クローンのうち、８クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この８クローンからランダムに選んだ６クローンで以降の解析を行った。
【表１７】
0005557217.tif 000053
0005557217.tif 000054
0005557217.tif 000055
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記から得られたＤＴ４０（ＭＡＣ２）の６クローンにおいて、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡおよび５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ  ｈｙｇｒｏカセットをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス１１番染色体断片であるマウス人工染色体ベクターＭＡＣにおいては、明らかにプローブ由来のシグナルが検出された割合が１０％であったのに対し、ＤＴ４０（ＭＡＣ２）の６クローンでは、５０％以上の割合でプローブ由来のシグナルが検出されたことから、上記６クローンにおいて、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた（図２１）。これらの結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２を保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論できた。
【表１８】
0005557217.tif 000056
0005557217.tif 000057
［Ｂ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２含有ニワトリＤＴ４０細胞からＭＡＣ２のＣＨＯ細胞への導入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２をマウスＥＳ細胞へ安定に導入するために、ＣＨＯ細胞へ導入する。またマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２のＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰを介して安定に目的遺伝子等（例えばＧＦＰ遺伝子など）を挿入するためにＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ＭＡＣ２）−５及び１７を用いて、上記と同様にＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）に微小核細胞融合法を行った。２回の微小核細胞融合で得た合計４４個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２がＣＨＯ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000058
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、４４クローンのうち、１４クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この１４クローンからランダムに選んで以降の解析を行った。
【表１９】
0005557217.tif 000059
0005557217.tif 000060
［Ｂ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）の１４クローンからランダムに選んだ９クローンについて松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従った方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡと５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫ  ｈｙｇｒｏカセットをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ９クローン中、８クローンで９５％の割合でＭＡＣ２がＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した（図２２）。
【表２０】
0005557217.tif 000061
0005557217.tif 000062
以上の結果から、マウス１１番染色体由来の染色体断片であるマウス人工染色体ＭＡＣに遺伝子挿入部位であるｌｏｘＰ配列が挿入されたマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２がＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｃ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２含有ＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞へのマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２の導入
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）−１３，１８を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％  ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。微小核細胞（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。
ドナー細胞には日本クレアより入手したＣ５７Ｂ６系統マウスのＥＳ細胞であるＢ６−ＥＳ、及び該ＥＳ細胞に６ＴＧ処理を行ったＨＰＲＴ欠損株であるＢ６（ＨＰＲＴ−）、及びＴＴ２Ｆ細胞のＨＰＲＴ欠損株であるＫＯ５６（ＨＰＲＴ−）を用いた。培養には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＩＧＭＡ）に、１０％ＦＣＳ、ＬＩＦ（Ｍｕｅｒｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）、１×１０−５Ｍ  ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール：ＳＩＧＭＡ）、Ｌ−グルタミン（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ溶液（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（０．１２５ｍＭ：ＧＩＢＣＯ）を添加し、５％  ＣＯ２、３７℃にて培養をおこなった。マウスＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加した培養液で回収し、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、無血清培養液５ｍｌに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を０．５ｍｌで正確に１分３０秒間融合した。１３ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）を静かに添加し、１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、通常のマウスＥＳ細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したＧ４１８耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径１０ｃｍ細胞培養皿２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。ハイググロマイシンを２５０μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した。２回の微小核細胞融合で得た合計２８個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：Ｂ６−ＥＳ（ＭＡＣ２）及びＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）及びＫＯ５６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工番染色体ＭＡＣ２がマウスＥＳ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000063
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１０分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２８クローンのうち、２７クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この２７クローンの中からランダムに選んだ３クローンで以降の解析を行った。
【表２１】
0005557217.tif 000064
0005557217.tif 000065
［Ｃ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたｍｏｕｓｅ  ＥＳ（ＭＡＣ２）のクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｔｅｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ３クローン中、１クローンで８０％以上の割合でＭＡＣ２がマウスＥＳ細胞に１コピーで導入され、かつＫＯ５６細胞の通常核型である内在マウス染色体の本数が３９本であることを確認した。
以上の結果から、マウス１１番染色体由来の染色体断片であるマウス人工染色体ＭＡＣに遺伝子挿入部位であるｌｏｘＰ配列が挿入されたマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２がマウスＥＳ細胞に導入できたと結論付けた（図２３）。
【表２２】
0005557217.tif 000066
［Ｄ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２を保持するマウスＥＳ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性を検証できる。また、上記ＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＭＡＣ２が子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＭＡＣ２）をを作製できる。また、上記ＴＣ（ＭＡＣ２）マウス系統を用いて、体細胞におけるＭＡＣ２の安定性を検証できる。
［実施例５］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３の構築
マウス人工染色体ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列を挿入したマウス人工染色体ベクターＭＡＣ３を構築する（図４）。マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３のマウスＥＳ細胞での安定性を検証し、さらにＭＡＣ３を導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。
［Ａ］マウス人工染色体ＭＡＣへのＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列の挿入
［Ａ．１］ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰターゲティングベクターの作製
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドには上記で作成したＶＨ２１−１２を用いた。ｐ  ＶＮＬＨからＳａｌＩとＡｓｃＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをＶＨ２１−１２のＸｈｏＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＭＡＣ３）。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを示す（図２４）。
［Ａ．２］トランスフェクションおよびＧ４１８耐性クローンの単離
ニワトリＤＴ４０細胞の培養は１０％ウシ胎仔血清（ギブコ、以下ＦＢＳで記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。ＤＴ４０（ＭＡＣ）−１の約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化したターゲティングベクターｐＭＡＣ３を２５μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。Ｇ４１８（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。２回のトランスフェクションで得た合計１４個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＭＡＣ３））
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１１番染色体上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000067
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃９分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、１７クローンのうち、１６クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この１６クローンの中からランダムに２クローンを選んで以降の解析を行った。
【表２３】
0005557217.tif 000068
0005557217.tif 000069
［Ａ．３．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＤＴ４０（ＭＡＣ３）の２クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところすべてのクローンで染色体転座等が起きずに９０％以上の割合で独立に保持されていた。
【表２４】
0005557217.tif 000070
［Ａ．３．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記からランダムに選んだＤＴ４０（ＭＡＣ３）−１６０及び１８７において、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡ及びマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、マウス人工染色体ＭＡＣ３が１コピーで独立に存在していることがわかった（図２５）。
これらの結果から、ＤＮＡ挿入配列としてｌｏｘＰ配列をマウスセントロメア付近に挿入したマウス人工染色体ベクターＭＡＣ３を保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論付けた。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３含有ニワトリＤＴ４０細胞からＭＡＣ３のＣＨＯ細胞への導入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３のＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰを介して安定に目的遺伝子等（例えばＧＦＰ遺伝子など）を挿入するためにＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ＭＡＣ３）−１６０を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、１％  ニワトリ血清、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、さらに１２時間培養してミクロセルを形成させた。培養液を２４ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に置換し、予め１００μ／ｍｌのポリＬ−リジンでコートした遠心用２５ｃｍ２フラスコ１２本（コーニング）に２ｍｌずつ分注し、３７℃で３０分培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。上清を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、１７００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。
ドナー細胞にはＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）を用いた。精製した微小核をＰＨＡ−Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、培養上清液［１０％  ＦＢＳ添加Ｆ１２培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を除去したＣＨＯ細胞上に静かに播種した。プレートを３７℃、１５分間インキュベートした。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ヂメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を４ｍｌで４回洗浄し、通常のＣＨＯ細胞の培養液５ｍｌ加えてオーバーナイトでインキュベートした。ＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、直径１０ｃｍ細胞培養皿５枚に播種し、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した。２回の微小核細胞融合で得た合計１２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３がＣＨＯ細胞に導入できているかをを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000071
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１０分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、７クローンのうち、６クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。
【表２５】
0005557217.tif 000072
［Ｂ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）の６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ６クローン中、３クローンで９０％以上の割合でＣＨＯ細胞にＭＡＣ３が導入されていることを確認した（図２６）。
【表２６】
0005557217.tif 000073
0005557217.tif 000074
以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３がＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｃ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３含有ＣＨＯ細胞からＭＡＣ３のマウスＥＳ細胞への導入
マウスＥＳ細胞及びマウス個体内でのマウス人工染色体ベクターＭＡＣ３の安定性を検証するために、マウス人工染色体ＭＡＣ３をマウスＥＳ細胞に導入し、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３含有キメラマウスならびに子孫伝達マウスを作製する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）−１，６を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％  ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。
ドナー細胞には日本クレアより入手したＣ５７Ｂ６系統マウスのＥＳ細胞に６ＴＧ処理を行ったＨＰＲＴ欠損株であるＢ６（ＨＰＲＴ−）を用いた。培養には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＩＧＭＡ）に、１０％ＦＣＳ、ＬＩＦ（Ｍｕｅｒｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）、１×１０−５Ｍ  ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール：ＳＩＧＭＡ）、Ｌ−グルタミン（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（０．１２５ｍＭ：ＧＩＢＣＯ）を添加し、５％  ＣＯ２、３７℃にて培養をおこなった。マウスＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加した培養液で回収し、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、無血清培養液５ｍｌに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を０．５ｍｌで正確に１分３０秒間融合した。１３ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）を静かに添加し、１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、通常のマウスＥＳ細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したＧ４１８耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径１０ｃｍ細胞培養皿２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。Ｇ４１８を２５０μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した。２回の微小核細胞融合で得た合計２８個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：Ｂ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１１番染色体上で部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000075
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１０分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２８クローンのうち、２７クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この２７クローンで以降の解析を行った。
【表２７】
0005557217.tif 000076
0005557217.tif 000077
［Ｃ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）のうち１６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ１６クローン中、５クローンで９５％以上の割合でＭＡＣ３がマウスＥＳ細胞に導入されていることを確認した。
以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３がマウスＥＳ細胞に導入できたと結論付けた（図２７）。
【表２８】
0005557217.tif 000078
0005557217.tif 000079
［Ｄ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３のマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＢ６（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ３）−３，−ｓ６、上記［Ｃ］で取得）について０〜１００ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＭＡＣ１保持細胞の割合を計測した結果、１００ＰＤＬにおいても９５％以上の保持率であった（図２８）。
以上の結果、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３はマウスＥＳ細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、９５％以上の割合で非常に安定に維持されることが確かめられた。
［Ｅ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３を保持するキメラマウスの作製
上記で得られたＥＳ細胞クローンを用いて（ジーンターゲティング、実験医学、１９９５）の手法に従い、キメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる桑実胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうか、またＩＣＲの胚細胞に対してＥＳ細胞が個体を形成する細胞の中での寄与率としてキメラ率を判定できる。
Ｂ６（ＨＰＲＴ；ＭＡＣ３）クローン（例えばＢ６（ＨＰＲＴ；ＭＡＣ３）−ＥＳ（ＭＡＣ３）−ｓ６上記で取得）を注入した６０個の胚を仮親に移植した結果、８匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。８匹のうち、２匹は雄で１０％キメラマウスが１匹、５％キメラマウスが１匹生まれ、６匹は雌で１０％キメラマウスが４匹、５％キメラマウスが２匹生まれた。すなわち、マウス人工染色体ＭＡＣ３を保持するＥＳ細胞株（Ｂ６ＨＰＲＴ−／−株）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
［Ｆ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３を保持するキメラマウスと野生型マウスと交配させてＭＡＣ３が子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＭＡＣ３）をを作製できる。また、上記ＴＣ（ＭＡＣ３）マウス系統を用いて、体細胞におけるＭＡＣ３の安定性を検証できる。
［実施例６］マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３に有用タンパク質をコードする遺伝子の例として、蛍光遺伝子であるＥＧＦＰをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて挿入し、機能タンパク質の発現と長期安定性を検証する（図５）。
［Ａ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３ベクター含有ＣＨＯ細胞における特定の遺伝子（例えばＧＦＰ）のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによるマウス人工染色体ベクターＭＡＣ３への挿入
マウス人工染色体ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列を挿入したマウス人工染色体ベクターＭＡＣ３においてｌｏｘＰが稼働しプラスミドＤＮＡが部位特異的に挿入できるかどうか検証する。
［Ａ．１］ＥＧＦＰ挿入ベクターの作製
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列をクローニングした。５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰをＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＣｌａＩとＡｓｃＩにクローニングし、ＰＧＫｈｙｇｒｏをＣｌａＩとＫｐｎＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＸ６．１）。さらにＸ６．１のＮｏｔＩサイトとＳａｌＩサイトにＮｏｔＩとＳａｌＩにより切り出したＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（大阪大学、岡部博士及びＮＩＨ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士より分与）をクローニングし、ＨＰＲＴ再構築系のＧＦＰ挿入コンストラクトとした（ベクター名：ｐ  Ｘ６．１  ＥＧＦＰ）。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによるＨＰＲＴ再構築系のＧＦＰ挿入により生じる染色体部位特異的ＤＮＡ挿入を図２９に示す。
［Ａ．２］トランスフェクション及びＨＡＴ耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ１μｇとＧＦＰ挿入ベクター２μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計２２個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＧＦＰ−ＭＡＣ））。
［Ａ．３］薬剤耐性クローンの選別
［Ａ．３．１］蛍光顕微鏡観察によるＧＦＰ挿入体の確認
クローニングした２２個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ１００％であった。
［Ａ．３．２］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的にＧＦＰ遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000080
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、２２クローン全てが陽性であり、この２２クローンで以降の解析を行った。
【表２９】
0005557217.tif 000081
［Ａ．３．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記から結果からランダムに選んだ６クローンにおいて、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡ及びＸ６．１ＥＧＦＰをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、６クローンのうち、３クローンにおいて５０％以上の割合でＧＦＰ−ＭＡＣが１コピー保持され、さらにＸ６．１ＥＧＦＰ由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるＥＧＦＰを部位特異的挿入する前のＭＡＣ３上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にＥＧＦＰが挿入されたことが確かめられた（図３０）。
【表３０】
0005557217.tif 000082
0005557217.tif 000083
以上の実験によりマウス人工染色体ＭＡＣ３上にＧＦＰ遺伝子を搭載することにより、ＧＦＰ発現が観察され、マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞を得られたことが確認できた。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣ含有ＣＨＯ細胞からＧＦＰ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞への導入
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＣＨＯ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）−４、１０、１２を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％  ＦＢＳ、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。
ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。
ドナー細胞には日本クレアより入手したＣ５７Ｂ６系統マウスのＥＳ細胞から樹立した野生型Ｂ６細胞及び、野生型ＴＴ２Ｆ細胞のマウスＥＳ細胞を用いた。培養には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＩＧＭＡ）に、１０％ＦＣＳ、ＬＩＦ（Ｍｕｅｒｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）、１×１０−５Ｍ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール：ＳＩＧＭＡ）、Ｌ−グルタミン（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（０．１２５ｍＭ：ＧＩＢＣＯ）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃にて培養をおこなった。マウスＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加した培養液で回収し、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、無血清培養液５ｍｌに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を０．５ｍｌで正確に１分３０秒間融合した。１３ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）を静かに添加し、１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、通常のマウスＥＳ細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したＧ４１８耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径１０ｃｍ細胞培養皿２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。Ｇ４１８を２５０μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した。２回の微小核細胞融合で得た合計３６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＴＴ２Ｆ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）及びＢ６−ＥＳ（ＧＦＰ−ＭＡＣ））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１１番染色体上で部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000084
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。ＴＲＡＮＳ  Ｌ１／Ｒ１の温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃１分を３５サイクル行った。ＴＲＡＮＳ  Ｌ１／ｍ１１  ６Ｒの温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、３６クローンのうち、３４クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この中からランダムに２４クローンを選らんで以降の解析を行った。
【表３１】
0005557217.tif 000085
0005557217.tif 000086
［Ｂ．２．２］キナクリン・ヘキスト二重染色
上記ＰＣＲ解析によって陽性であったクローンについて、上述の方法と同じようにキナクリン・ヘキスト二重染色を行った。キナクリン・ヘキスト二重染色したクローンの染色体像を蛍光顕微鏡により観察したところ、２４クローン中、１８クローンにおいて１００％の割合でマウス人工染色体ＧＦＰ−ＭＡＣが保持されていることがわかった。
【表３２】
0005557217.tif 000087
0005557217.tif 000088
以上の結果から、マウス人工染色体ＧＦＰ−ＭＡＣを導入したマウスＥＳ細胞は通常核型で長期培養及びキメラマウス作製に用いることが可能であると結論付けた。
［Ｂ．２．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたマウスＥＳ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）のクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡ及びｐ  Ｘ６．１ＥをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ１２クローン中、６クローンで９５％以上の割合でＧＦＰ−ＭＡＣがマウスＥＳ細胞に導入されていることを確認した。
【表３３】
0005557217.tif 000089
0005557217.tif 000090
以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣがマウスＥＳ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｃ］マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＢ６−ＥＳ（ＭＡＣ３）−９、上記［Ｂ］で取得）について０〜１００ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＧＦＰ−ＭＡＣ３保持細胞の割合を計測した結果、１００ＰＤＬにおいても９５％以上の保持率であった（図３１、図３２）。また、コロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ１００％であった。
【表３４】
0005557217.tif 000091
0005557217.tif 000092
以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３に、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより、２０ｋｂ以下の外来遺伝子（ＥＧＦＰ遺伝子など）を部位特異的に効率的に挿入可能であり、また、外来遺伝子を搭載したＭＡＣ３はマウスＥＳ細胞において非常に安定であり、ＭＡＣ３上の外来遺伝子の発現も長期間安定であると結論付けた。
［Ｄ］マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣを保持するキメラマウスの作製
上記［Ｂ］で得られたＥＳ細胞クローンを用いて（ジーンターゲティング、実験医学、１９９５）の手法に従い、キメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる桑実胚及び８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。
野生型雄Ｂ６（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローン及び野性型（ＧＦＰ−ＭＡＣ）ＴＴ２Ｆ雌クローン（例えばＢ６−ＥＳ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）４および１８、ＴＴ２Ｆ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）−１２上記で取得）をそれぞれ注入した胚（野生型雄Ｂ６（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローン２６０個及び野性型雌ＴＴ２Ｆ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローン１８０個）を仮親に移植した結果、キメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。雄野生型Ｂ６（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローン由来のキメラマウスは４２匹生まれ、そのうち２０匹は雄マウスであり、ＧＦＰ陽性５０％キメラマウスが１匹、４０％キメラマウスが５匹、３０％キメラマウスが１匹、２０％キメラマウスが７匹、１０％キメラマウスが３匹、５％キメラマウスが３匹生まれた。また野性型ＴＴ２Ｆ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）クローン由来のキメラマウスは１４匹生まれ、そのうち１匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％かつＧＦＰ陽性の個体であった。
以上のことから、マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣを保持するＥＳ細胞株（Ｂ６及びＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を有している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
［Ｅ］マウス人工染色体ベクターＧＦＰ−ＭＡＣを保持するキメラマウスからのマウス人工染色体の子孫伝達
上記［Ｄ］で作製された雌キメラマウス（キメラ率約１００％）をＣ５７Ｂ６（黒色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配したキメラマウスより誕生した４匹の仔マウスのうち、３匹がＥＳ細胞由来のＧＦＰ−ＭＡＣの優性遺伝形質である、ＧＦＰの蛍光が観察された。また３匹のうち１匹の仔マウスについては、全身でＧＦＰの蛍光が観察され、マウス個体においてもマウス人工染色体が安定であることが示された（図３３）。ＧＦＰ−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統をＴＣ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）と呼ぶ。また、実施例８記載のように、上記ＴＣ（ＧＦＰ−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるＧＦＰ−ＭＡＣの安定性を検証できる。
［実施例７］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１の安定性
［Ａ．１］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１のＣＨＯ細胞における安定性
上記で得られたＣＨＯクローン（例えばＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）−８，２２、上記実施例２で取得）について０〜２５ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＭＡＣ１保持細胞の割合を計測した結果、２５ＰＤＬにおいても９０％以上の保持率であった。一方、Ｋａｚｕｋｉら報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された２１番染色体由来のＧＦＰ搭載ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）を保持するＣＨＯ細胞では、２５ＰＤＬにおいては７０％以下の保持率であった。その代表的な結果を図３４に示す。
［Ａ．２］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１のマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＫＯ５６（ＭＡＣ１）−５およびＴＴ２Ｆ（ＭＡＣ１）−２３、上記実施例２で取得）について０〜７５ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＭＡＣ１保持細胞の割合を計測した結果、７５ＰＤＬにおいても９０％以上の保持率であった。一方、Ｋａｚｕｋｉらの報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された２１番染色体由来のＧＦＰ搭載ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）を保持するマウスＥＳ細胞では、７５ＰＤＬにおいては７０％以下の保持率であった。その代表的な結果を図３５に示す。
［Ａ．３］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１を保持するキメラマウスの作製
上記実施例２で得られたＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。ＭＡＣ１保持ＥＳクローン（例えばＫＯ５６ＭＡＣ１−５およびＴＴ２ＦＭＡＣ１−４、上記実施例２で取得）を注入した１６２０個の胚を仮親に移植した結果、５６匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち１３匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。すなわち、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１を保持するＥＳ細胞株（ＫＯ５６およびＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
［Ａ．４］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１を保持するキメラマウスからのＭＡＣ１の子孫伝達
上記［Ａ．３］で作製された雌キメラマウス（キメラ率約１００％）２匹をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した１８匹の仔マウスのうち、１３匹がＥＳ細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちＭＡＣ１を保持するＥＳ細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。また、ＧＦＰ蛍光によりＭＡＣ１の保持を検討した結果、１３匹中６匹（４６％）においてＧＦＰ陽性であり、キメラマウス子孫におけるＭＡＣ１の保持が確認された。すなわち、メンデル遺伝の法則従い、ＭＡＣ１形質が約５０％の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるＭＡＣ１の保持率が１００％に近いことが示された。ＭＡＣ１が子孫伝達されたマウス系統をＴＣ（ＭＡＣ１）と呼ぶ。
［Ａ．５］ＴＣ（ＭＡＣ１）マウス系統の体細胞におけるＭＡＣ１の安定性
［Ａ．５．１］実体蛍光顕微鏡観察
上記で得られたＴＣ（ＭＡＣ１）マウスのうち雄（５）および雌（２）１匹ずつについて脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣（または卵巣）を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察したところ、全ての組織にてＧＦＰ陽性が観察され、その陽性率は１００％であった。その雌（５）の代表的な結果を図３６に示す。
［Ａ．５．２］血液系細胞のＦＡＣＳ解析
Ｂ細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４，ＣＤ８）、巨核球（ＣＤ４１）に対する特異的抗体（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、骨髄ならびに脾臓細胞におけるＧＦＰ陽性率を検討した結果、全ての組織で、陽性率は９５％以上であった。一方、Ｋａｚｕｋｉらの報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された２１番染色体由来のＧＦＰ搭載ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）を保持するマウスでは、全ての組織で、陽性率は１５％以下であった。その代表的な結果を図３７、図３８に示す。
［Ａ．５．３］蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
また上記と同様の個体から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、視覚的にＭＡＣ１の存在を確認し、マウス染色体とは独立に９５％以上の細胞でＭＡＣ１が存在していることが確かめられた（図３９）。
以上の結果、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１は、マウスＥＳ細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ならびにマウス組織（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、９０％以上の割合で非常に安定に維持されることが確かめられた。
［実施例８］マウス人工染色体ベクターＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持マウスの作製と安定性
［Ａ］ＣＨＯ細胞からのＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣのマウスＡ９細胞への移入
ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細を作製するために、上記実施例３で得られたＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ７−ΔＣＹＰ３Ａ）２２，２６，３４，３５など）からマウスＡ９細胞へミクロセル形成能の高いマウスＡ９細胞へ微小核細胞融合法により導入した。８回の微小核細胞融合で得た合計２５個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ））。その結果、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であるクローンが６クローンあった。さらに、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１７５７Ａ１３）（ＣＨＯＲＩ）ならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの存在が６クローン中、３クローンで確認された（図４０）。以上のことから、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持Ａ９細胞が３クローン得られたと結論付けた。
［Ｂ］Ａ９細胞からのＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞への移入
ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、上記［Ａ］で得られたＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＡ９細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へ微小核細胞融合法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＡ９細胞（Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８，９など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４  ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計３４個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８からは１４クローン、Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）９からは７クローンがＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記のうち２０クローンについて、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）（ＣＨＯＲＩ）由来のＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは８クローンであった（図４１）。以上のことから、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が８クローン得られたと結論付けた。
［Ｃ］ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞における安定性
上記［Ｂ］で得られたマウスＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８−５，８−２２，９−４，９−７，９−９，上記［Ｂ］で取得）について０〜１００ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持細胞の割合を計測した結果、１００ＰＤＬにおいても９５％以上の保持率であった。（図４２）。
［Ｄ］ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するキメラマウスの作製
上記［Ｂ］で得られたＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持ＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。ＭＡＣ１保持ＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８−５，８−１６，８−２２，９−４，９−７，９−９，９−１０など，上記［Ｂ］で取得）を注入した８４０個の胚を仮親に移植した結果、２８匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち５匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。すなわち、マウス人工染色体ベクターＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
［Ｅ］ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するキメラマウスからのＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの子孫伝達
上記［Ｄ］で作製された雌キメラマウス（キメラ率約１００％）５匹をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した６０匹の仔マウスのうち、５０匹がＥＳ細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＥＳ細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。また、ＧＦＰ蛍光によりＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの保持を検討した結果、５０匹中２９匹（５８％）においてＧＦＰ陽性であり、キメラマウス子孫におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの保持が確認された。すなわち、メンデル遺伝の法則従い、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ形質が約５０％の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの保持率が１００％に近いことが示された。ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統をＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）と呼ぶ。
［Ｆ］ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス系統の体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの安定性
［Ｆ．１］実体蛍光顕微鏡観察
上記で得られたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウスのうち雄（２）１匹、雌（１４）１匹について脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察したところ、全ての組織にてＧＦＰ陽性が観察され、その陽性率は１００％であった。その雄（２）の代表的な結果を図４３に示す。
［Ｆ．２］血液系細胞のＦＡＣＳ解析
Ｂ細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４，ＣＤ８）、巨核球（ＣＤ４１）に対する特異的抗体（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、骨髄におけるＧＦＰ陽性率を検討した結果、全ての組織で、陽性率は９４％以上であった。一方、ＷＯ  ２００９／０６３７２２（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８９２８）に記載された１４番染色体由来のＨＡＣベクター（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）を保持するマウスでは、全ての組織で、陽性率は２０％以下であった。その代表的な結果を図４４に示す。
［Ｆ．３］蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
また上記と同様の個体や組織において、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの存在を確認し、９０−９８％の細胞でＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣが存在していることが確かめられた。一方、ＷＯ  ２００９／０６３７２２（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８９２８）に記載されたヒト１４番染色体由来のＨＡＣベクター（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）を保持するマウスでは、全ての組織で、陽性率は５６−９７％であった。その代表的な結果を図４５に示す。
［Ｆ．４］ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）系統の伝達率
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）雌マウス８匹とＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウス８匹を交配することで伝達率を検討した。８１匹の仔マウスが得られ、３８匹がＧＦＰ陰性、４３匹がＧＦＰ陽性個体であった（伝達率は５３％）。すなわち、伝達率はメンデル遺伝の法則に合致しており、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ形質が約５０％の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの保持率が１００％に近いことが示された。
［Ｆ．５］ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣが２本保持されたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ホモ系統の作製と伝達率
上記で得られたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）雄マウスとＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）雌マウスを交配し、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣが２本保持されたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ホモ系統の樹立を試みた。１８匹の仔マウスの尻尾繊維芽細胞を用いて、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１７５７Ａ１３）ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの存在を確認した。４ｘ３６の系統では、１２匹の仔マウスのうち、３匹は２コピー、５匹は１コピー、４匹は０コピーであった。２４ｘ３７の系統では、６匹の仔マウスのうち、１匹は２コピー、３匹は１コピー、２匹は０コピーであった。合計１８匹が得られ、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの２コピー（４匹）、１コピー（８匹）、０コピー（６匹）の比率は、１：２：１．５であり、メンデル遺伝の法則にほぼ合致していた。その代表的な結果を図４６に示す。
以上の結果、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣは、マウスＥＳ細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、９５％以上の割合で非常に安定に長期間維持され、マウス組織（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、９０％以上の割合で非常に安定にかつホモ系統で維持されることが確かめられた。
［Ｇ］ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス系統における組織特異的ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現
上記でＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウスのうち雄（２）および雌（１４）１匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉において、トータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターおよびマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターの発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター発現検出用プライマー：
0005557217.tif 000093
0005557217.tif 000094
マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター発現検出用プライマー：
0005557217.tif 000095
コントロール遺伝子発現検出用プライマー：
0005557217.tif 000096
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。
その結果ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）を保持するマウスにおいて、ＣＹＰ３Ａ４は肝臓と小腸でのみ、ＣＹＰ３Ａ５は肝臓と小腸と肺でのみ、ＣＹＰ３Ａ７は肝臓と小腸と腎臓と肺でのみ、ＣＹＰ３Ａ４３は肝臓と小腸と腎臓でのみ、Ｃｙｐ３ａ１１は肝臓と小腸でのみ、Ｃｙｐ３ａ１３は肝臓と小腸でのみ発現を検出できた。また、コントロールのＧＡＰＤＨは全ての組織で検出された。その雌（１４）の代表的な結果を図４７に示す。このようにヒトでみられるよう組織特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。
［Ｈ］ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス系統における時期特異的ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現
ＧＦＰ陽性のＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウスの雄および雌の胎齢１４．５日、胎齢１６．５日、胎齢１８．５日、生後０日、４週齢、６週齢、１２週齢、２４週齢における肝臓からのトータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、上述のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター発現およびマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。
その結果、成体型発現のヒトＣＹＰ３Ａ４、ヒトＣＹＰ３Ａ５、マウスｃｙｐ３ａ１１、マウスＣｙｐ３ａ１３は成体期において、胎児型のＣＹＰ３Ａ７は胎児において強く発現していることが確かめられた。また、コントロールのＧＡＰＤＨは全ての胎齢、週齡で同程度の発現量が検出された。その代表的な結果を図４８に示す。このようにヒトでみられるような時期特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。
［実施例９］ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐマウス系統の作製
［Ａ］ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持し、かつ内因性Ｃｙｐ３ａ遺伝子群の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
上記実施例８で作製されたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）を、ＷＯ  ２００９／０６３７２２（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８９２８）の実施例７で作製されたΔｃｙｐ系統に戻し交配し、得られたＧＦＰ陽性マウス個体について、上記記載のＰＣＲ法を用いて遺伝子型の解析を行った。交配して得られた仔マウス５１匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡについてＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ検出用プライマーおよびＷＯ  ２００９／０６３７２２（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８９２８）の表１記載のプライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの保持およびＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターのＫＯを検討した結果、２４匹においてＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持し、かつ内因性Ｃｙｐ３ａ遺伝子群の片方のアレルが破壊された（ヘテロＫＯ）マウス系統であることが確認された。さらにこのヘテロにＣｙｐ３ａ遺伝子群が破壊され、かつＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するマウスとΔｃｙｐ系統に戻し交配し、得られたＧＦＰ陽性マウス３８匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製し、上記と同様のＰＣＲ法を用いて遺伝子型の解析を行った。その結果１８匹においてＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持し、かつ内因性Ｃｙｐ３ａ遺伝子群の両方のアレルが破壊された（ホモＫＯ）マウス系統であることが確認された。（以下、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐと記す）。
［Ｂ］ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐマウス系統における代謝解析
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐマウス、Δｃｙｐマウス個体の肝臓ミクロソームをＯｍｕｒａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９，２３７０，１９６４）に従い、ＣＹＰ３Ａ４で代謝されることがわかっているトリアゾラム（Ｔｒｉａｚｏｌａｍ）（２００μＭ）と混合し、その代謝物であるα−ＯＨ−ｔｒｉａｚｏｌａｍおよび４−ＯＨ−ｔｒｉａｚｏｌａｍを測定できる。ＷＯ  ２００９／０６３７２２（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８９２８）に記載のように、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスにおいて、同系統のマウスやヒト（ＨＬＭ：ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ）と活性が同程度であることを確かめられる。以上のことから、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐマウス系統においてＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ上のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられる。
［Ｃ］従って、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐマウス系統由来の肝臓ミクロソームは医薬品開発における第一相反応の薬効・毒性を調べるための試料として利用できる。また、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）／Δｃｙｐマウス系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第一相反応の薬効・毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のモデルマウスとして利用できる。
［実施例１０］マウス人工染色体ベクターＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持ラットの作製
［Ａ］Ａ９細胞からのＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣのラットＥＳ細胞への移入
ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するキメララットを作製するために、上記実施例８で得られたＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＡ９細胞から、子孫伝達可能なラットＥＳ細胞であるｒＥＳＷＩｖ３ｉ−１（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．２０１０  Ｆｅｂ；７７（２）：９４．）へ微小核細胞融合法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するＡ９細胞（Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８，９など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のラットＥＳ細胞ｒＥＳＷＩｖ３ｉ−１をトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計１０個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８からは２クローン、Ａ９（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）８からは３クローンがＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライーマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記の５クローンについて、ＣＹＰ３Ａ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７５７Ａ１３）（ＣＨＯＲＩ）ならびにマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつラットの核型が正常なクローンは３クローンであった（図４９）。以上のことから、ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ保持ラットＥＳ細胞が３クローン得られたと結論付けた。
［Ｂ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣを保持するラットＥＳ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性を検証できる。また、上記ＥＳ細胞からキメララットを作製し、ラットが子孫伝達されたラット系統ｒＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）を作製できる。また、上記ｒＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ラット系統を用いて、体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ｒＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ラット系統由来の肝臓ミクロソームは医薬品開発における第一相反応の薬効・毒性を調べるための試料として利用できる。また、ｒＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）ラット系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第一相反応の薬効・毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のモデルラットとして利用できる。
［実施例１１］マウス人工染色体ベクターｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣの構築
ダウン症候群モデルマウスを作製するため、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１６５７よりも遠位の領域３３Ｍｂを含むＤＮＡ配列をＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例３と同様にして、ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを構築する。
［Ａ］ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ含有ＤＴ４０からｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰのＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にｌｏｘＰ配列を介してヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１６５７よりも遠位の領域を転座挿入するために、ｌｏｘＰ配列をＡＰ００１６５７に挿入したヒト２１番染色体であるｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰをマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ａ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ含有ＤＴ４０細胞、ＤＴ４０（ｋｋ１３９）（特開２００７−２９５８６０）用いて、上記と同様にＭＡＣ１含有ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）である、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）に微小核細胞融合法を行った。１４回の微小核細胞融合で得た合計１１４個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ））。
［Ａ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ａ．２．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、上記１１４クローンのうちの６０クローンについて、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト２１番染色体断片がＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000097
0005557217.tif 000098
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、６０クローンのうち、１１クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この１１クローンで以降の解析を行った。
［Ａ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ）の１１クローンのうち６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ６クローン中、１クローンで７０％の割合でＭＡＣ１ならびにｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰがＣＨＯ細胞に１コピーで導入されていることを確認した（図５０）。
以上の結果から、ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｂ］ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ）クローンにおけるヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１６５７よりも遠位の領域３３ＭｂのＭＡＣ１ベクターへの部位特異的転座
３３ＭｂサイズのＤＮＡであるヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１６５７よりも遠位の領域をマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１に転座挿入する（図５１）。
［Ｂ．１］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１−ｌｏｘＰ）−３７にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ３μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計２個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト２１番染色体断片とＭＡＣ１上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000099
0005557217.tif 000100
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２クローンのうち、２クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この２クローンで以降の解析を行った。
［Ｂ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ）の２クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ２クローン中、２クローンで９０％以上の割合でＭＡＣ１上にヒト２１番染色体由来によるシグナルが観察されていることを確認した（図５２）。
以上の結果から、ヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１６５７よりも遠位の領域３３Ｍｂがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。
［Ｃ］ＣＨＯ細胞からのｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞への移入
ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、上記［Ｂ］で得られたｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へ微小核細胞融合法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ）１，２）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計２４個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ）１からは２クローン、ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ）２からは６クローンがｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライーマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記のうち８クローンについて、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは２クローンであった（図５３）。以上のことから、ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が２クローン得られたと結論付けた。
［Ｄ］ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）２２、上記［Ｃ］で取得）について０〜５０ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ保持細胞の割合を計測した結果、５０ＰＤＬにおいても９５％以上の保持率であった。（図５４）。
［Ｅ］ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するキメラマウスの作製
上記［Ｃ］で得られたｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ保持ＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。ＭＡＣ１保持ＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）２０，２２など，上記［Ｃ］で取得）を注入した２２０個の胚を仮親に移植した結果、１８匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち２匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。また、うち１匹はＧＦＰが陽性の個体であった（図５５）。すなわち、マウス人工染色体ベクターｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
［Ｆ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するキメラマウスから、ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）をを作製できる。また、上記ＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）系統はダウン症候群のモデルマウスとして利用でき、ダウン症候群の症状発症のメカニズム解明や症状改善のための治療薬開発に利用できる。
［実施例１２］マウス人工染色体ベクターｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣの構築
ダウン症候群も出るマウスを作製するため、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１７２よりも遠位の領域を含むＤＮＡ配列をＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例３と同様にして、ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣを構築する。
［Ａ］ヒト２１番染色体のＡＰ００１７２１へのｌｏｘＰ配列の部位特異的挿入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にｌｏｘＰ配列を介して転座挿入するために、ＤＴ４０細胞内でヒト２１番染色体（ｈＣｈｒ２１）のＤＳＣＲ（ダウン症候群疾患原因領域クラスター）の近位のＡＰ００１７２１へｌｏｘＰ配列を挿入する。
［Ａ．１］ターゲティングベクターｐＣＫｌｏｘＰＨｙｇの作製
ヒト２１番染色体上のＡＰ００１７２１のごく近傍かつセントロメア側（約５０Ｋｂセントロメア側）に位置するダウン症候群原因遺伝子領域（ＤＳＣＲ）にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐＣＫｌｏｘＰＨｙｇを以下のようにして作製した。まず、ＡＰ００１７２１ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000101
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃５分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でＰＣＲ断片（２．９ｋｂおよび２．０ｋｂ）をゲル濾過した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断しＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。次にＭＣ１−ＴＫ配列を、Ｖ８３０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からＲｓｒＩＩ（ＮＥＢ）により切り出し、Ｖ９０１プラスミドの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位にクローニングした（Ｖ９０１Ｔ−１）。上記ＰＣＲ断片（２．９ｋｂおよび２．０ｋｂ）をＶ９０１Ｔ−１プラスミドのＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩサイトにクローニングした（Ｖ９０１Ｔ−１ＨＲ２）。次にＫａｚｕｋｉらの報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された５’−ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ−ＴＫベクターから５’−ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＨｙｇをＫｐｎＩとＡｓｃＩで切り出し、Ｖ９０１Ｔ−１ＨＲ２のＡｓｃＩとＫｐｎＩサイトにクローニング（ｐＣＫｌｏｘＰＨｙｇ）。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１１．２ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを（図５６）に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＣＫｌｏｘＰＨｙｇを制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞（Ｋａｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢＢＲＣ  ２００４，ＤＴ４０（２１−２−３））にトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート３枚に分注して約２週間の選択培養を行った。４回のトランスフェクションで得た合計１７８個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ））。
［Ａ．３］相同組換え体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）
を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
0005557217.tif 000102
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル行った。１７８クローンをスクリーニングした結果、７１クローンが相同組換え体として同定された。
［Ａ．３．２］サザンブロット解析
上記ＰＣＲ解析にて組換えを確認したうちの１０クローンについて以下のようにサザンブロット解析を行った。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理し、０．８％アガロースゲル中で電気泳動し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  ＰｌｕｓＴＭ  ハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン（ＮＥＮＴＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）へアルカリブロッティングした。このフィルターに対してＡＰ００１７２１中の遺伝子配列をＰＣＲにより増幅したＳＰ７プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の同定を行った。ＳＰ７プローブの作製は以下のプライマーを用いＤＴ４０（２１−２−３）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を鋳型としてランダムプライミングによる３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを作製した（アマシャム、添付のプロトコールに従った）。
ＳＰ７プローブ作製用プライマー：
0005557217.tif 000103
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５４℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。サザンハイブリダイゼーションにより、非相同組換え体では約７．５ｋｂ、相同組換え体では約９．４ｋｂのバンドが検出されると予測された（図５６）。サザンハイブリダイゼーションの結果、１０クローン中すべてのクローンが目的の相同組換え体であった。その代表的な結果を図５７に示す。
［Ａ．３．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち１０クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびハイグロマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、２１ｑ２２付近にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた（図５８）。以上の結果から、ヒト２１番染色体断片に遺伝子導入部位であるｌｏｘＰ配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。
［Ｂ］ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ含有ＤＴ４０からｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰのＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１にｌｏｘＰ配列を介してヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１７２１よりも遠位の領域を転座挿入するために、ｌｏｘＰ配列をＡＰ００１７２１に挿入したヒト２１番染色体であるｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰをマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ含有ＤＴ４０細胞、ＤＴ４０（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）４７を用いて、上記と同様にＭＡＣ１含有ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）である、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１）に微小核細胞融合法を行った。１５回の微小核細胞融合で得た合計１４０個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、上記１４０クローンのうちの２０クローンについて、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト２１番染色体断片がＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000104
0005557217.tif 000105
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２０クローンのうち、１３クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この１３クローンで以降の解析を行った。
［Ｂ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）の１３クローンのうち６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ６クローン中、２クローンで７５％の割合でＭＡＣ１ならびにｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰがＣＨＯ細胞に１コピーで導入されていることを確認した（図５９）。
以上の結果から、ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１含有ＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｃ］ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）クローンにおけるヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１７２１よりも遠位の領域１２ＭｂのＭＡＣ１ベクターへの部位特異的転座
１２ＭｂサイズのＤＮＡであるヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１７２１よりも遠位の領域をマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ１に転座挿入する（図６０）
［Ｃ．１］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ１，ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ｌｏｘＰ）−１２，１３にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ  ３μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計１９個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト２１番染色体断片とＭＡＣ１上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000106
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、１９クローンのうち、８クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この８クローンで以降の解析を行った。
［Ｃ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２）の８クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ８クローン中、８クローンで８５％以上割合でＭＡＣ１上にヒト２１番染色体由来によるシグナルが観察されていることを確認した（図６１）。
以上の結果から、ヒト２１番染色体長腕のＡＰ００１７２１よりも遠位の領域１２Ｍｂがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ１に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。
［Ｄ］ＣＨＯ細胞からのｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞への移入
ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、上記［Ｃ］で得られたｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へ微小核細胞融合法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２）１，１２など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４  ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計１３個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２）１からは１クローン、ＣＨＯ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ２１−ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２）１２からは１クローンがｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記のうち２クローンについて、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは１クローンであった（図６２）。以上のことから、ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が１クローン得られたと結論付けた。
［Ｅ］ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ）８、上記［Ｄ］で取得）について０〜５０ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ保持細胞の割合を計測した結果、５０ＰＤＬにおいても９５％以上の保持率であった。（図６３）。
［Ｆ］ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣを保持するキメラマウスの作製
上記［Ｄ］で得られたｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ保持ＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ保持ＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ）８，上記［Ｄ］で取得）を注入した８０個の胚を仮親に移植した結果、４３匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち３匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。すなわち、マウス人工染色体ベクターｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
［Ｇ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣを保持するキメラマウスから、ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ）を作製できる。また、上記ＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ系統はダウン症候群のモデルマウスとして利用でき、ダウン症候群の症状発症のメカニズム解明や症状改善のための治療薬開発に利用できる。また、ＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ−ＭＡＣ）マウス系統とＴＣ（ｈＣｈｒ２１ｑ２２．１２−ＭＡＣ）マウス系統の表現型を比較することで、ダウン症候群の原因遺伝子領域を同定できる。
［実施例１３］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２の安定性
［Ａ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２のＣＨＯ細胞における安定性
上記で得られたＣＨＯクローン（例えばＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）−１３，１８、上記実施例４で取得）について０〜２５ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＭＡＣ２保持細胞の割合を計測した結果、２５ＰＤＬにおいても９０％以上の保持率であった。一方、Ｋａｚｕｋｉら報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された２１番染色体由来のＧＦＰ搭載ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）を保持するＣＨＯ細胞では、２５ＰＤＬにおいては７０％以下の保持率であった。その代表的な結果を図６４に示す。
［実施例１４］マウス人工染色体ベクターＦＶＩＩＩ−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２に有用タンパク質をコードする遺伝子の例として、血友病Ａの原因遺伝子である第八因子（ＦＶＩＩＩ）をＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて挿入し、機能タンパク質の発現と長期安定性を検証する。
［Ａ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２ベクター含有ＣＨＯ細胞における特定の有用タンパク質をコードする遺伝子（例えばＦＶＩＩＩ）のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによるマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２への挿入
マウス人工染色体ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列として５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列を挿入したマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２においてｌｏｘＰが稼働し環状ＤＮＡが部位特異的に挿入できるかどうか検証する。
［Ａ．１］ＦＶＩＩＩ挿入ベクターの作製
ｐＣＡＧＧＳ（大阪大学、岡部博士より分与）のプロモーターとｐｏｌｙ  Ａの領域をＳａｌＩとＰｓｔＩサイトにて切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）マルチクローニングサイトを改変したｐＢ３のＳａｌＩとＰｓｔＩサイトにクローニングした（ｐＢ−ＣＡＧ）。ｐＫＦ１７Ｋプラスミド中のＢドメイン欠損ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ（自治医科大学、坂田教授より分与）をＸｈｏＩとＳａｌＩサイトにて切断し、ｐＢ−ＣＡＧにおけるプロモーターとｐｏｌｙ  Ａの間にあるＥｃｏＲＩサイトへクローニングした（ｐＢ−ＣＡＧＦ８）。ｐＢ−ＣＡＧＦ８のＣＡＧ−Ｆ８−ｐＡ領域をＳａｌＩとＡｖｒＩＩサイトにより単離し、ｐＢ３ｉｎｓ２上の２つのＨＳ４インスレーター配列にはさまれるようにＳａｌＩとＡｖｒＩＩサイトへクローニングした（ｐＢ３−Ｆ８ｉｎｓ２）。次にｐＰＡＣ４（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ），ＢＡＣ／ＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ配列を組み込んだベクターへ導入した。ｐＢ３−Ｆ８ｉｎｓ２上のＡｓｃＩとＦｓｅＩ領域であるＦＶＩＩＩ発現カセット（ＨＳ４−ＣＡＧ−Ｆ８−ｐＡ−ＨＳ４）をｐＰＡＣ４のＡｓｃＩとＦｓｅＩサイトへクローニングし、ＨＰＲＴ再構築系の１コピーＦＶＩＩＩ挿入コンストラクトとした（ベクター名：ｐＰＡＣ４  Ｆ８ｉｎｓ２  Ｈ３−９（１コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣ））（図６５）。ＡｖｒＩＩサイトとＮｈｅＩサイトのｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄの特徴を利用し、１コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣにおけるＡｓｃＩからＡｖｒＩＩ１の１発現カセット領域を同ベクターにおけるＡｓｃＩからＮｈｅＩサイトへの再クローニングにより２発現カセットをもつ２コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣを得た。また同様に挿入カセットをＡｓｃＩとＡｖｒＩＩ、ベクター側をＡｓｃＩとＮｈｅＩサイトにて再クローニングすることにより２、４、８、１６コピーまでのＦＶＩＩＩ発現カセットをもつＰＡＣベクターを作製した（図６６）。
［Ａ．２］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ１μｇと１コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣベクター１０μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い、上記ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）−１３およびＫａｚｕｋｉらの報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載されたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；２１ＨＡＣ２）へ導入した（クローン名：ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ））。また、Ｃｒｅ１μｇと１６コピーＦＶＩＩＩ−ＰＡＣベクター１０μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い、上記ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）−１３へ導入した（クローン名：ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ））。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の導入で得たそれぞれＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）については４６クローン、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）については１８クローン、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）については１９クローン、合計８３個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。
［Ａ．３］薬剤耐性クローンの選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的にＦＶＩＩＩ遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000107
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）由来については４クローン、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）由来については１７クローン、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）由来については３クローン、において陽性であり、この２４クローンで以降の解析を行った。
［Ａ．３．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記の結果から７クローンにおいて、ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡまたはヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）由来については１クローンが９０％以上の割合でＦＶＩＩＩ−ＭＡＣが保持され、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）由来については２クローンが９０％以上の割合でＦＶＩＩＩ−ＨＡＣが保持され、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）由来については１クローンが９０％以上の割合でＦＶＩＩＩ−ＨＡＣが保持されていた。
［Ｂ］ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩ遺伝子の遺伝子発現解析
上記のＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣが保持されているＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）１−３およびＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣが保持されているＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）１−２およびＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣが保持されているＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）１６−１，１６−２，１６−３を用いて、ＦＶＩＩＩ  ｍＲＮＡが発現しているかどうかを検討するため、上記記載に従い、ＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ合成し、さらに以下のプライマー（前出）を用いてＰＣＲを行った。温度、サイクル条件は９４℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を２５サイクル行った。
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その結果、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）では同等に発現しており、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）では、前記ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）よりも高く発現していた。
［Ｃ］ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩ遺伝子の遺伝子機能解析
上記、ＦＶＩＩＩ  ｍＲＮＡの発現が確認されたＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）１−３およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）１−２におけるＦＶＩＩＩタンパク発現が機能的か否かを検証するためＣｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ（コスモバイオ）を添付のプロトコールに従い、行った。０ＰＤＬおよび非選択培養で２５ＰＤＬまで培養した上記細胞を６ウェルディッシュに培養し１００％コンフルエント状態から新しいメディウムに交換した。２４時間後培養上清を回収しＦＶＩＩＩ活性によるＦＶＩＩＩの活性化度合いを測定した。その結果、０ＰＤＬではＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）１−３およびＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）１−２に活性の差はほとんど見られなかった。一方、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）１−３では２５ＰＤＬにおいても活性が１．８倍に上昇していたのに対し、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＨＡＣ）１−２では２５ＰＤＬにおいては活性が１／６倍に低下していた（図６７）。また、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１−ＭＡＣ）１−３に比べ、ＣＨＯ（ＦＶＩＩＩｘ１６−ＭＡＣ）１６−１，１６−２，１６−３の活性は約１０倍に上昇しており、コピー数依存的に活性が上昇することが確かめられた（図６８）。
以上の実験によりマウス人工染色体ＭＡＣ２ベクター上にＦＶＩＩＩ遺伝子を搭載することにより、ＦＶＩＩＩ遺伝子の機能的な発現が観察され、さらにＦＶＩＩＩ−ＭＡＣを保持するＣＨＯではＦＶＩＩＩ−ＨＡＣ保持するＣＨＯよりも長期間安定に機能的発現を呈することが確かめられた。また、ＰＡＣベクターによって、２００ｋｂ以内の有用タンパク質をコードするＤＮＡが挿入可能である。
［実施例１５］複数遺伝子の導入が可能なマウス人工染色体ベクターＭＩ−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ２に複数の遺伝子を搭載できる例として、５つの部位特異的組換え酵素認識部位（ΦＣ３１  ａｔｔＰ、Ｒ４  ａｔｔＰ、ＴＰ９０１−１  ａｔｔＰ、Ｂｘｂ１  ａｔｔＰ、ＦＲＴ）を持つｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて挿入し、複数遺伝子の導入・発現を検証する。
［Ａ．１］複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットの作製
マウス人工染色体ベクターに複数の遺伝子を導入するための複数遺伝子搭載部位を持つカセットをＭｕｌｔｉｓｉｔｅ−Ｇａｔｅｗａｙ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、以下のようにして作製した。まず、ＰＧＫ−ｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして、遺伝子導入部位であるΦＣ３１  ａｔｔＰ  ｓｉｔｅ、Ｒ４  ａｔｔＰ  ｓｉｔｅ、ＴＰ９０１−１  ａｔｔＰ  ｓｉｔｅ、Ｂｘｂ１  ａｔｔＰ  ｓｉｔｅ、ＦＲＴ  ｓｉｔｅをｆｉｒｓｔ  ＰＣＲ（以下の各ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ  Ｆ１−Ｒ１）によりＰＧＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列に付加した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、Ｔａｑポリメラーゼはｋｏｄｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃２分の熱変性後、９４℃１５秒、６８℃３０秒、７２℃９０秒を２０サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）で精製した。
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こうして得られたｆｉｒｓｔ  ＰＣＲ断片をテンプレートに、Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ−Ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ  ｒｅａｃｔｉｏｎに必要なｇａｔｅｗａｙ  ａｔｔＢ配列を付加するｓｅｃｏｎｄ  ＰＣＲ（以下の各ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ  Ｆ１−Ｒ２、ΦＣ３１のみＦ２−Ｒ２）を行った。ＰＣＲ条件等は、サイクル数を２５サイクルとした以外は上記と同様である。また、ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ１の配列についても上記のとおりである。
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これらのＰＣＲ断片と対応するｇａｔｅｗａｙ  ａｔｔＰ配列を持つｄｏｎｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ｐＤＯＮＲ２２１  Ｐ１−Ｐ５ｒ、ｐＤＯＮＲ２２１  Ｐ５−Ｐ４、ｐＤＯＮＲ２２１  Ｐ４ｒ−Ｐ３ｒ、ｐＤＯＮＲ２２１  Ｐ３−Ｐ２）を混合し、ＢＰ  ｃｌｏｎａｓｅを用いた試験管内組換え反応（ＢＰ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、ｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＥＮＴＲ  Ｌ１−ＦＲＴ−ＰＧＫ−ΦＣ３１−Ｒ５、ｐＥＮＴＲ  Ｌ５−ＰＧＫ−Ｒ４−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ  Ｒ４−ＰＧＫ−ＴＰ９０１−１−Ｒ３、ｐＥＮＴＲ  Ｌ３−ＰＧＫ−Ｂｘｂ１−Ｌ２）を作製した（図６９）。ＢＰ  ｒｅａｃｔｉｏｎは、推奨される条件に従って行った。
次に、これらの遺伝子導入部位をマウス人工染色体ベクターに導入するために必要な、３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ配列を組み込んだｐｌａｓｍｉｄを以下の手順で作製した。上記Ｘ３．１をテンプレートとして、以下のプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、上記の条件（サイクル数２５）と同様である。
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このＰＣＲ断片とＤＥＳＴ  ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｒ１−ｃｃｄＢ−Ｃｍ−Ｒ２）をブラントライゲーションし、ｐＤＥＳＴとした。次に、このｐＤＥＳＴと上記で作製したｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＥＮＴＲ  Ｌ１−ＦＲＴ−ＰＧＫ−ΦＣ３１−Ｒ５、ｐＥＮＴＲ  Ｌ５−ＰＧＫ−Ｒ４−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ  Ｒ４−ＰＧＫ−ＴＰ９０１−１−Ｒ３、ｐＥＮＴＲ  Ｌ３−ＰＧＫ−Ｂｘｂ１−Ｌ２）を混合し、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅを用いた試験管内組換え反応（ＬＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットを作製した（図７０）。ＬＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎは、推奨される条件に従って行った。
［Ａ．２］複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットのマウス人工染色体ベクターへの搭載
複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットは上述のＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ２）や下記記載のＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４）に上述のようにＣｒｅ−ｌｏｘＰ組み換え後、ＨＡＴ耐性クローンを取得することでマウス人工染色体ベクターＭＡＣ２やＭＡＣ４に挿入できる（ＭＩ−ＭＡＣとよぶ）（図７１）。
［Ａ．３］遺伝子導入カセットの作製
ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍに外来遺伝子を導入するためのカセットベクターを以下のように作製した。まず、薬剤選択のために必要なＰｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓのＮｅｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅをｐＩＲＥＳ  Ｎｅｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートに、以下のプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、上記の条件（サイクル数２５）と同様である。
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その後、制限酵素ＥｃｏＲＶとＳｍａＩサイトで切断したＳＬＲ  ｔｅｓｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）に、このＰＣＲ断片をブラントクローニングし、ｐＮｅｏを作製した。次に、各ａｔｔＰ  ｓｉｔｅまたはＦＲＴ  ｓｉｔｅに対応する組換え配列（ΦＣ３１  ａｔｔＢ、Ｒ４  ａｔｔＢ、ＴＰ９０１−１  ａｔｔＢ、Ｂｘｂ１  ａｔｔＢ、ＦＲＴ）をｄｅ  ｎｏｖｏ合成した（ΦＣ３１、Ｂｘｂ１、ＦＲＴ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒ４、ＴＰ９０１−１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ｐＮｅｏを制限酵素ＳａｌＩで切断し、上記の合成したベクターから制限酵素ＳａｌＩでΦＣ３１  ａｔｔＢまたはＲ４  ａｔｔＢを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした（ｐＮｅｏ−ΦＣ３１  ａｔｔＢ、ｐＮｅｏ−Ｒ４  ａｔｔＢ）。同様に、ｐＮｅｏを制限酵素ＣｌａＩで切断し、上記の合成したベクターから制限酵素ＣｌａＩでＴＰ９０１−１  ａｔｔＢまたはＦＲＴを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションしたｐＮｅｏ−ＴＰ９０１−１  ａｔｔＢ、ｐＮｅｏ−ＦＲＴや、ｐＮｅｏを制限酵素ＮｈｅＩで切断し、上記の合成したベクターから制限酵素ＮｈｅＩでＢｘｂ１  ａｔｔＢを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションしたｐＮｅｏ−Ｂｘｂ１  ａｔｔＢを作製した。これらのベクターはＢａｍＨＩサイトに任意の外来遺伝子を挿入でき、それを、複数遺伝子搭載部位を持ったマウス人工染色体に搭載できるカセットベクターとなっている（図７２）。
［Ａ．４］部位特異的組換え酵素発現ベクターの作製
各々対応したａｔｔＢ−ａｔｔＰ間の組換えを起こす部位特異的組み換え酵素（ΦＣ３１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、Ｒ４  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、ＴＰ９０１−１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、Ｂｘｂ１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ：ΦＣ３１，ＣＡＡ０７１５３；Ｒ４，ＢＡＡ０７３７２；ＴＰ９０１−１，ＣＡＡ５９４７５；Ｂｘｂ１，ＡＡＧ５９７４０）をｄｅ  ｎｏｖｏ合成した（ΦＣ３１：Ｃｏｄｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ、他：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。これらのｉｎｔｅｇｒａｓｅは哺乳類細胞での高発現を行うよう、ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅを哺乳類に最適化して合成したものである。この合成したベクターから制限酵素ＫｐｎＩ−ＸｂａＩでΦＣ３１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅを含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＫｐｎＩ−ＸｂａＩで切断したｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションしたｐＣＭＶ−ΦＣ３１や、制限酵素ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩでＲ４  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、あるいはＴＰ９０１−１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、Ｂｘｂ１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅを含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩで切断したｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションしたｐＣＭＶ−Ｒ４、ｐＣＭＶ−ＴＰ９０１−１、ｐＣＭＶ−Ｂｘｂ１を作製した（図７２）。
［Ａ．５］ＭＩ−ＭＡＣベクターへの遺伝子導入
Ｃｒｅ発現ベクターの代わりに上述の各種部位特異的組換え酵素発現ベクターと、ＦＶＩＩＩ挿入ベクターの代わりに遺伝子導入カセットを導入することで、複数（１〜５個）の遺伝子をマウス人工染色体ベクターＭＩ−ＭＡＣベクター上へ挿入することができる。また、複数遺伝子搭載部位（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）カセットをマウス人工染色体ＭＡＣベクター上に複数搭載することも可能であるので、無制限に遺伝子を挿入することもできる（図７２）。
［実施例１６］マウス人工染色体ベクターＰＸＲ−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ３に核内受容体であるヒトＰＸＲをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて挿入し、ＰＸＲ−ＭＡＣを構築する。
［Ａ．１］ヒトＰＸＲ挿入ベクターの作製
ヒトＰＸＲ遺伝子およびｌｏｘＰ配列を挿入するための基本ＢＡＣベクターにはヒトＰＸＲ遺伝子全長を含むＲＰ１１−１６９Ｎ１３（ＣＨＯＲＩ）を用いた。Ｙａｍａｄａら（Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００８；５３（５）：４４７−５３）の方法に従い、上記ＢＡＣベクター上のカナマイシン耐性遺伝子領域にマウス人工染色体ベクターＭＡＣ３に挿入するためのＡｍｐ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ配列を相同組み換えにより挿入した（ベクター名：ＰＸＲ−ｌｏｘＰ）。
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによるＨＰＲＴ再構築系によるヒトＰＸＲ挿入により生じる部位特異的ＤＮＡ挿入を（図７３）に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ１μｇとＰＸＲ−ｌｏｘＰベクター２μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計１１個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＰＸＲ−ＭＡＣ））。
［Ａ．３］薬剤耐性クローンの選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的にＰＸＲ遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、１１クローンのうち、６クローンが全てのプライマーで陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。
［Ａ．３．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記から結果から選んだ６クローンにおいて、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびヒトＰＸＲ−ＢＡＣ由来のＤＮＡ（ＲＰ１１−１６９Ｎ１３）（ＣＨＯＲＩ）をプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、６クローンのうち、５クローンにおいて６０％以上の割合でＰＸＲ−ＭＡＣが保持され、さらにＰＸＲ−ＢＡＣ由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるＰＸＲ−ＢＡＣを部位特異的挿入する前のＭＡＣ３上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にヒトＰＸＲ遺伝子が挿入されたことが確かめられた（図７４）。
以上の実験によりマウス人工染色体ＭＡＣ３上にヒトＰＸＲ遺伝子を搭載することにより、マウス人工染色体ベクターＰＸＲ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞を得られたことが確認できた。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクターＰＸＲ−ＭＡＣ含有ＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞へマウス人工染色体ベクターＰＸＲ−ＭＡＣの導入
ＰＸＲ−ＭＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、上記［Ａ］で得られたＰＸＲ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へ微小核細胞融合法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＰＸＲ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）７，９，１０など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計３４個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。ＣＨＯ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）７からは２クローン、ＣＨＯ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）９からは２クローン、ＣＨＯ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）１０からは１２クローンがＰＸＲ−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記の１６クローンについて、ヒトＰＸＲ−ＢＡＣ由来のＤＮＡ（ＲＰ１１−１６９Ｎ１３）（ＣＨＯＲＩ）を用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されたクローンは１６クローンのうち、４クローンであった。以上のことから、ＰＸＲ−ＭＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が４クローン得られたと結論付けた（図７５）。
［Ｃ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＰＸＲ−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＰＸＲ−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）を作製できる。また、上記ＴＣ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるＰＸＲ−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ＴＣ（ＰＸＲ−ＭＡＣ）マウス系統はヒトにおける薬物によるＣＹＰ遺伝子発現誘導を再現できる。また、上記ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス系統との交配により、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ／ＰＸＲ−ＭＡＣ）系統を作製でき、医薬品開発における薬効・毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のモデルマウスとして利用できる。
［実施例１７］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４の構築
マウス人工染色体ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列を挿入したマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４を構築する。５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列は、Ｋａｚｕｋｉらの報告（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＭＩＤ：２１０８５１９４，２０１０）に記載された２１番染色体由来のＧＦＰ搭載ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）に挿入されており、ＨＡＣとＭＡＣの遺伝子発現を同じベクターで比較することができる。また、２１ＨＡＣ２への挿入のための遺伝子導入ベクターがベクター作製のステップを経ることなく、そのまま利用可能である。
［Ａ］マウス人工染色体ＭＡＣへのＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列の挿入
［Ａ．１］ＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇタイプのｌｏｘＰターゲティングベクターの作成
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドには上記で作成したｐＭＡＣ２を用いた。ＮｏｔＩとＳａｌＩにより切り出したＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（大阪大学、岡部博士及びＮＩＨ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士より分与）を平滑化し、上記ｐＭＡＣ２をＸｈｏＩ切断ならびに平滑化後にクローニングした（ベクター名：ｐＭＡＣ４）。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図７６に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＭＡＣ４を制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ＭＡＣ）にトランスフェクションし、ハイグロマイシン（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。１回のトランスフェクションで得た合計３６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＭＡＣ４））
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス染色体ベクターＭＡＣ上で部位特異的に組換えが起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、３６クローンのうち、５クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この５クローンで以降の解析を行った。
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記から得られたＤＴ４０（ＭＡＣ４）の５クローンにおいて、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇカセットをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス人工染色体ベクターＭＡＣにおいては、プローブ由来のシグナルが検出されなかったのに対し、ＤＴ４０（ＭＡＣ４）の５クローンでは、６５％以上の割合でプローブ由来のシグナルが検出されたことから、上記５クローンにおいて、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた（図７７）。これらの結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４を保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論できた。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ニワトリＤＴ４０細胞からＭＡＣ４のＣＨＯ細胞への導入
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ＭＡＣ４）−Ｂ１−５及びＢ１−７４及びＢ２−３及びＢ２−４を用いて、上記と同様にＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）に微小核細胞融合法を行った。４回の微小核細胞融合で得た合計２３個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４））
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４がＣＨＯ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２３クローンのうち、７クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この７クローンを用いて以降の解析を行った。
［Ｂ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４）の７クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ７クローン中、４クローンで９５％以上の割合でＣＨＯ細胞にＭＡＣ４が導入されていることを確認した（図７８）。
以上の結果から、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４がＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｃ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４を保持するマウスＥＳ細胞を作製し、そのＥＳ細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性を検証できる。また、上記ＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＭＡＣ４が子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＭＡＣ４）を作製できる。また、上記ＴＣ（ＭＡＣ４）マウス系統を用いて、体細胞におけるＭＡＣ４の安定性を検証できる。
［実施例１８］マウス人工染色体ベクターＵＧＴ２−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるＵＧＴ２クラスターをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例３と同様にして、ＵＧＴ２−ＭＡＣを構築する。また、ＵＧＴ２−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞での安定性を検証する。
［Ａ］ヒト４番染色体上のＡＣ１２５２３９における部位特異的切断
ヒト４番染色体のＵＧＴ２遺伝子クラスターから遠位側の遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。
［Ａ．１］ターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＵＧＴ２の作製
ヒト４染色体上のＵＧＴ２遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ１２５２３９領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＵＧＴ２を以下のようにして作製した。まず、ＡＣ１２５２３９ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000119
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断し、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ  １０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：８８，２００２）のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＡＣ１２５２３９ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたＡＣ１２５２３９ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＵＧＴ２とした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１１．９ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図７９に示した。
［Ａ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
Ｋａｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢＢＲＣ  ２００４に記載された方法で、ヒト４番染色体を保持するＡ９（ＫＭ６４−４）（Ｋｕｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９）からヒト４番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞を作製した（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ４））。次に上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＵＧＴ２を制限酵素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ４）１にトランスフェクションし、ピューロマイシン（０．３ｕｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。４回のトランスフェクションで得た合計９６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｔｅｌ））。
［Ａ．３］相同組換え体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ピューロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000120
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル行った。  次に上記プライマーで検出されなかった２クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをＰＣＲにて確認した。配列は以下のとおりである。
0005557217.tif 000121
上記プライマーによりＰＣＲはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった２クローンでのみ約８ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（ｈＣｈｒ４）１ではバンドは検出されなかった。
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち２クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびピューロマイシンＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト４番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト４番染色体断片末端にピューロマイシン由来のシグナルが検出され、目的部位で切断されていたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた（図８０）。
以上の結果から、クローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｔｅｌ）３５及び７３において、ＵＧＴ２遺伝子クラスター領域よりテロメア側のＡＣ１２５２３９から遠位において切断できたと結論付けた。
［Ｂ］ヒト４番染色体のＡＣ０７４３７８へのｌｏｘＰ配列の部位特異的挿入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にｌｏｘＰ配列を介して転座挿入するために、ＤＴ４０細胞内でｈＣｈｒ４−ｔｅｌのＵＧＴ２遺伝子クラスターの近位のＡＣ０７４３７８へｌｏｘＰ配列を挿入する。
［Ｂ．１］ターゲティングベクターｐＵＧＴ２ｌｏｘＰｎｅｏの作製
ヒト４番染色体上のＵＧＴ２遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＣ０７４３７８領域にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐＵＧＴ２ｌｏｘＰｎｅｏを以下のようにして作製した。まず、ＡＣ０７４３７８ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000122
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＫｐｎＩ（ニッポンジーン）およびＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断しＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片（２．７ｋｂおよび２．６ｋｂ）をＶ９０７プラスミドのＫｐｎＩ又はＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９０７−ＵＧＴ２ＨＲ２）。次にｌｏｘＰ−ＦＲＴ−ｐＧＫｎｅｏ−ＦＲＴ−ｌｏｘＰカセットであるｐＮＴ１．１（大阪大学、遺伝情報実験センターより分与）からＦＲＴ−ｐＧＫｎｅｏ−ＦＲＴをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切り出し、上記Ｘ３．１のＢｇｌＩＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｘ３．１−ＦＲＴ−ｐＧＫｎｅｏ−ＦＲＴ）。次に、Ｖ９０７−ＵＧＴ２ＨＲ２を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、上記Ｘ３．１−ＦＲＴ−ｐＧＫｎｅｏ−ＦＲＴから、制限酵素ＥｃｏＲＩでｌｏｘＰを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした。ｌｏｘＰ配列の方向がクローニングしたＡＣ０７４３７８ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターｐＵＧＴ２ｌｏｘＰｎｅｏとした。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１１．１ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図８１に示す。
［Ｂ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＵＧＴ２ｌｏｘＰｎｅｏを制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、ヒト４番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞（クローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｔｅｌ）３５にトランスフェクションし、ネオマイシン（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート３枚に分注して約２週間の選択培養を行った。２回のトランスフェクションで得た合計１２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｔｅｌ−ｌｏｘＰ））。
［Ｂ．３］相同組換え体の選別
［Ｂ．３．１］ＰＣＲ解析
ネオマイシン耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
0005557217.tif 000123
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル行った。１２クローンをスクリーニングした結果、５クローンが相同組換え体として同定された。
［Ｂ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち４クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびネオマイシンＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト４番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、４ｑ１３付近にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた（図８２）。以上の結果から、ヒト４番染色体上のＡＣ０７４３７８に遺伝子導入部位であるｌｏｘＰ配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。
［Ｃ］ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ含有ＤＴ４０からｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌのＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞への導入。
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にｌｏｘＰ配列を介してヒトＵＧＴ２遺伝子クラスター領域を転座挿入するために、ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌをマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）５及び１０を用いて、上記と同様にＭＡＣ４含有ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）である、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４）に微小核細胞融合法を行った。３回の微小核細胞融合で得た合計２２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
ネオマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト４番染色体断片がＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000124
0005557217.tif 000125
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、２２クローンのうち、５クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この５クローンで以降の解析を行った。
［Ｃ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）の５クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、１クローンにおいて９０％以上のＭＡＣ１ならびにｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがＣＨＯ細胞に１コピーもしくは２コピーで導入されていることを確認した（図８３）。
以上の結果から、ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｄ］ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンにおけるヒトＵＧＴ２遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ０７４３７８−ヒトＵＧＴ２遺伝子クラスター−ＡＣ１２５２３９）２ＭｂのＭＡＣ４ベクターへの部位特異的転座
２ＭｂサイズのＤＮＡであるヒトＵＧＴ２遺伝子クラスターをマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４に転座挿入する（図８４）。
［Ｄ．１］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ４−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）８にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ３μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計６個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ４−ΔＵＧＴ２））。
［Ｄ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｄ．２．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト４番染色体断片とＭＡＣ４上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000126
0005557217.tif 000127
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、６クローンのうち、全てのクローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。
［Ｄ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ４−ΔＵＧＴ２）の６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＵＧＴ２−ＢＡＣ（ＲＰ１１−６４３Ｎ１６）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ６クローン中、２クローンで５０％以上の割合でＭＡＣ４上にヒトＵＧＴ２由来によるシグナルが観察されていることを確認した（図８５）。
以上の結果から、ヒト４番染色体断片上のＵＧＴ２クラスター２Ｍｂがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。
［Ｅ］ＣＨＯ細胞からのＵＧＴ２−ＭＡＣのマウスＡ９細胞への移入
ＵＧＴ２−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細を作製するために、上記［Ｄ］で得られたＵＧＴ２−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ４−ΔＵＧＴ２）４，５）からマウスＡ９細胞へミクロセル形成能の高いマウスＡ９細胞へ微小核細胞融合法により導入した。４回の微小核細胞融合で得た合計１６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：Ａ９（ＵＧＴ２−ＭＡＣ））。その結果、ＵＧＴ２−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であるクローンが５クローンあった。さらに、ＵＧＴ２−ＢＡＣ（ＲＰ１１−６４３Ｎ１６）（ＣＨＯＲＩ）及びマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるＵＧＴ２−ＭＡＣの存在が５クローン中、全てのクローンで確認された（図８６）。以上のことから、ＵＧＴ２−ＭＡＣ保持Ａ９細胞が５クローン得られたと結論付けた。
［Ｆ］Ａ９細胞からのＵＧＴ２−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞への移入
ＵＧＴ２−ＭＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、上記［Ｅ］で得られたＵＧＴ２−ＭＡＣを保持するＡ９細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へ微小核細胞融合法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＵＧＴ２−ＭＡＣを保持するＡ９細胞（Ａ９（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）１３，１５など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング社）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計２５個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。Ａ９（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）１３からは５クローン、Ａ９（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）１５からは４クローンがＵＧＴ２−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記のうち９クローンについて、ＵＧＴ２−ＢＡＣ（ＲＰ１１−６４３Ｎ１６）（ＣＨＯＲＩ）ならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは７クローンであった（図８７）。以上のことから、ＵＧＴ２−ＭＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が７クローン得られたと結論付けた。
［Ｇ］ＵＧＴ２−ＭＡＣのマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＴＴ２Ｆ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）９，１０，１９、上記［Ｆ］で取得）について０〜５０ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析によるＵＧＴ２−ＭＡＣ保持細胞の割合を計測した結果、５０ＰＤＬにおいても９５％以上の保持率であった。（図８８）。
［Ｈ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＵＧＴ２−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＵＧＴ２−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）を作製できる。また、上記ＴＣ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるＵＧＴ２−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ＴＣ（ＵＧＴ２−ＭＡＣ）マウス系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第二相反応の薬効・毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のモデルマウスとして利用できる。
［実施例１９］マウス人工染色体ベクターＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるＣＹＰ２ＣクラスターをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例３と同様にして、ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣを構築する。
［Ａ］ヒト１０番染色体上のＡＬ１５７８３４における部位特異的切断
ヒト１０番染色体のＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスターから遠位側の遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。
［Ａ．１］ターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＣＹＰ２Ｃの作製
ヒト１０染色体上のＣＹＰ２Ｃ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＬ１５７８３４領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＣＹＰ２Ｃを以下のようにして作製した。まず、ＡＬ１５７８３４ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000128
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断し、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ  １０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：８８，２００２）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＡＬ１５７８３４ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたＡＬ１５７８３４ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＣＹＰ２Ｃとした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１１．６ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図８９に示した。
［Ａ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
Ｋａｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢＢＲＣ  ２００４に記載された方法で、ヒト１０番染色体を保持するＡ９（ＫＭ３２−２）およびＡ９（ＫＭ２６−３）（Ｋｕｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９）からヒト１０番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞を作製した（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０））。次に上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＣＹＰ２Ｃを制限酵素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０）１，４２にトランスフェクションし、ピューロマイシン（０．３ｕｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。４回のトランスフェクションで得た合計９６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｔｅｌ））。
［Ａ．３］相同組換え体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ピューロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000129
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル行った。  次に上記プライマーで検出されなかった３クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをＰＣＲにて確認した。配列は以下のとおりである。
0005557217.tif 000130
0005557217.tif 000131
上記プライマーによりＰＣＲはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった２クローンでのみ約８ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０）１，４２ではバンドは検出されなかった。
［Ｂ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認した３クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびピューロマイシンＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト１０番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト１０番染色体断片末端にピューロマイシン由来のシグナルが検出され、目的部位で切断されていたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた（図９０）。
以上の結果から、クローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｔｅｌ）５及び９８及び１０１において、ＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスター領域よりテロメア側のＡＬ１５７８３４から遠位において切断できたと結論付けた。
［Ｂ］ヒト１０番染色体のＡＬ１３８７５９へのｌｏｘＰ配列の部位特異的挿入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にｌｏｘＰ配列を介して転座挿入するために、ＤＴ４０細胞内でｈＣｈｒ１０−ｔｅｌのＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスターの近位のＡＬ１３８７５９へｌｏｘＰ配列を挿入する。
［Ｂ．１］ターゲティングベクターｐＣＹＰ２ＣｌｏｘＰｎｅｏの作製
ヒト１０番染色体上のＣＹＰ２Ｃ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＬ１３８７５９領域にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐＣＹＰ２ＣｌｏｘＰｎｅｏを以下のようにして作製した。まず、ＡＬ１３８７５９ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000132
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＳａｃＩＩ（ニッポンジーン）およびＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）およびＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で切断しＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片（１．５ｋｂおよび３．０ｋｂ）をＶ９０７プラスミドのＳａｃＩＩとＥｃｏＲＩ又はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９０７−ＣＹＰ２ＣＨＲ２）。次に、Ｖ９０７−ＣＹＰ２ＣＨＲ２を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、上記Ｘ３．１−ＦＲＴ−ｐＧＫｎｅｏ−ＦＲＴから、制限酵素ＥｃｏＲＩでｌｏｘＰを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした。ｌｏｘＰ配列の方向がクローニングしたＡＬ１３８７５９ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターｐＣＹＰ２ＣｌｏｘＰｎｅｏとした。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１０．３ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図９１に示す。
［Ｂ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＣＹＰ２ＣｌｏｘＰｎｅｏを制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、ヒト１０番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞（クローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｔｅｌ）１−９８にトランスフェクションし、ネオマイシン（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート３枚に分注して約２週間の選択培養を行った。２回のトランスフェクションで得た合計１５個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｔｅｌ−ｌｏｘＰ））。
［Ｂ．３］相同組換え体の選別
［Ｂ．３．１］ＰＣＲ解析
ネオマイシン耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）
を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
0005557217.tif 000133
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル行った。１５クローンをスクリーニングした結果、１クローンが相同組換え体として同定された。
［Ｂ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち１クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびネオマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト１０番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、１０ｑ２４付近にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、ヒト１０番染色体上のＡＬ１３８７５９に遺伝子導入部位であるｌｏｘＰ配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。
［Ｃ］ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ含有ＤＴ４０からｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌのＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞への導入。
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にｌｏｘＰ配列を介してヒトＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスター領域を転座挿入するために、ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌをマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）７を用いて、上記と同様にＭＡＣ４含有ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）である、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４）に微小核細胞融合法を行った。３回の微小核細胞融合で得た合計８個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
ネオマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト１０番染色体断片がＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000134
0005557217.tif 000135
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、８クローンのうち、全てのクローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この８クローンで以降の解析を行った。
［Ｃ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）の８クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、２クローンにおいて９０％以上の割合でＭＡＣ１ならびにｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがＣＨＯ細胞に１コピーもしくは２コピーで導入されていることを確認した（図９２）。
以上の結果から、ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｄ］ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンにおけるヒトＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＬ１３８７５９−ヒトＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスター−ＡＬ１５７８３４）３８０ｋｂのＭＡＣ４ベクターへの部位特異的転座
３８０ｋｂサイズのＤＮＡであるヒトＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスターをマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４に転座挿入する（図９３）。
［Ｄ．１］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ１０−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）１及び５にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ３μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計１１個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ１０−ΔＣＹＰ２Ｃ））。
［Ｄ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｄ．２．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト１０番染色体断片とＭＡＣ４上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000136
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、１１クローンのうち、９クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この９クローンで以降の解析を行った。
［Ｄ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ１０−ΔＣＹＰ２Ｃ）の９クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＣＹＰ２Ｃ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−４６６Ｊ１４）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ９クローン中、３クローンで５０％以上の割合でＭＡＣ４上にヒトＣＹＰ２Ｃ由来によるシグナルが観察されていることを確認した（図９４）。
以上の結果から、ヒト１０番染色体断片上のＣＹＰ２Ｃクラスター３８０ｋｂがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。
［Ｅ］ＣＨＯ細胞からのＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣのマウスＡ９細胞への移入
ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細を作製するために、上記［Ｄ］で得られたＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ１０−ΔＣＹＰ２Ｃ）２，８，１０）からマウスＡ９細胞へミクロセル形成能の高いマウスＡ９細胞へ微小核細胞融合法により導入した。４回の微小核細胞融合で得た合計４個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：Ａ９（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ））。その結果、ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であるクローンが４クローンあった。さらに、ＣＹＰ２Ｃ−ＢＡＣ（ＲＰ１１−４６６Ｊ１４）（ＣＨＯＲＩ）ならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣの存在が４クローン中、２クローンで確認された。以上のことから、ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ保持Ａ９細胞が２クローン得られたと結論付けた。
［Ｆ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を作製し、そのＥＳ細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性を検証できる。また、上記ＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ）を作製できる。また、上記ＴＣ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ＴＣ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ）マウス系統由来の肝臓ミクロソームは医薬品開発における第一相反応の薬効・毒性を調べるための試料として利用できる。また、ＴＣ（ＣＹＰ２Ｃ−ＭＡＣ）マウス系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第一相反応の薬効・毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のモデルマウスとして利用できる。
［実施例２０］マウス人工染色体ベクターＭＤＲ１−ＭＡＣの構築
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるＭＤＲ１遺伝子をＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例３と同様にして、ＭＤＲ１−ＭＡＣを構築する。
［Ａ］ヒト７番染色体のＡＣ００５０４５へのｌｏｘＰ配列の部位特異的挿入
マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にｌｏｘＰ配列を介して転座挿入するために、ＤＴ４０細胞内でヒト７番染色体（ｈＣｈｒ７）のＭＤＲ１遺伝子の近位のＡＣ００５０４５へｌｏｘＰ配列を挿入する。
［Ａ．１］ターゲティングベクターｐＭＤＲ１ｌｏｘＰｂｓの作製
ヒト７番染色体上のＭＤＲ１遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約５０Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＣ００５０４５領域にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐＭＤＲ１ｌｏｘＰｂｓを以下のようにして作製した。まず、ＡＣ００５０４５ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000137
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断しＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片（２．５ｋｂおよび５．３ｋｂ）をＶ９０１プラスミドのＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９０１−ＭＤＲ１ＨＲ２）。次に、Ｖ９０１−ＭＤＲ１ＨＲ２を制限酵素ＡｓｃＩ（ＮＥＢ）ならびにＫｐｎＩで切断し、カセットベクターＢｓ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴ（Ｈｏｓｈｉｙａら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９；１７（２）：３０９−１７）から、制限酵素ＡｓｃＩおよびＫｐｎＩでｌｏｘＰを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした。ｌｏｘＰ配列の方向がクローニングしたＡＣ００５０４５ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターｐＭＤＲ１ｌｏｘＰｂｓとした。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１３．０ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図９５に示す。
［Ａ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＭＤＲ１ｌｏｘＰｂｓを制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化後、ＷＯ０１／０１１９５１に記載された方法で作製されたヒト７番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞（クローンＤＴ４０−＃７）にトランスフェクションし、ブラストサイジンＳ（１５μｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート３枚に分注して約２週間の選択培養を行った。２回のトランスフェクションで得た合計９個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ））。
［Ａ．３］相同組換え体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
ブラストサイジンＳ耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
0005557217.tif 000138
0005557217.tif 000139
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル行った。９クローンをスクリーニングした結果、３クローンが相同組換え体として同定された。
［Ａ．３．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認した３クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびブラストサイジンＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト７番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、７ｑ２１付近にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、ヒト７番染色体上のＡＣ００５０４５に遺伝子導入部位であるｌｏｘＰ配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。
［Ｂ］ヒト７番染色体上のＡＣ００３０８３における部位特異的切断
ヒト７番染色体のＭＤＲ１遺伝子から遠位側の遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。
［Ｂ．１］ターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＭＤＲ１の作製
ヒト７染色体上のＭＤＲ１遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ００３０８３領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＭＤＲ１を以下のようにして作製した。まず、ＡＣ００３０８３ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
0005557217.tif 000140
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）およびＰｓｔＩ（ニッポンジーン）で切断し、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ  １０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：８８，２００２）のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位にクローニングした。ＡＣ００３０８３ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたＡＣ００３０８３ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＭＤＲ１とした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１３．１ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを（図９６）に示した。
［Ｂ．２］トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離
上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＴＥＬｐｕｒｏ−ＭＤＲ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ）８，９にトランスフェクションし、ピューロマイシン（０．３ｕｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。４回のトランスフェクションで得た合計９６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ））。
［Ｂ．３］相同組換え体の選別
［Ｂ．３．１］ＰＣＲ解析
ピューロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000141
0005557217.tif 000142
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル行った。
次に上記プライマーで検出されなかった３クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをＰＣＲにて確認した。配列は以下のとおりである。
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0005557217.tif 000144
上記プライマーによりＰＣＲはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった３クローンでのみ約８ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ）８，９ではバンドは検出されなかった。
［Ｂ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記で組換えを確認した３クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびピューロマイシンＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト７番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト７番染色体断片末端にピューロマイシン由来のシグナルが検出され、目的部位で切断されていたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた（図９７）。
以上の結果から、クローンＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）１０及び１２及び７０において、ＭＤＲ１遺伝子領域よりテロメア側のＡＣ００３０８３から遠位において切断できたと結論付けた。
［Ｃ］ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ含有ＤＴ４０からｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌのＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞への導入。
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４にｌｏｘＰ配列を介してヒトＭＤＲ１遺伝子領域を転座挿入するために、ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌをマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＤＴ４０（ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）１０及び７０を用いて、上記と同様にＭＡＣ４含有ＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）である、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４）に微小核細胞融合法を行った。４回の微小核細胞融合で得た合計１５個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ））。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｃ．２．１］ＰＣＲ解析
ブラストサイジンＳ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト７番染色体断片がＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000145
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、１５クローンのうち、６クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。
［Ｃ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）の６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、２クローンにおいて８０％以上の割合でＭＡＣ１ならびにｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがＣＨＯ細胞に１コピーもしくは２コピーで導入されていることを確認した（図９８）。
以上の結果から、ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４含有ＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。
［Ｄ］ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）クローンにおけるヒトＭＤＲ１遺伝子領域周辺（ＡＣ００５０４５−ヒトＭＤＲ１遺伝子−ＡＣ００３０８３）２１０ｋｂのＭＡＣ４ベクターへの部位特異的転座
２１０ｋｂサイズのＤＮＡであるヒトＭＤＲ１遺伝子をマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターＭＡＣ４に転座挿入する（図９９）。
［Ｄ．１］トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；ＭＡＣ４，ｈＣｈｒ７Ｍ−ｌｏｘＰ−ｔｅｌ）７及び１５にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ３μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計１０個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ７−ΔＭＤＲ１））。
［Ｄ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｄ．２．１］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト７番染色体断片とＭＡＣ４上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
0005557217.tif 000147
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ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６８℃７分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、１０クローンのうち、６クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。
［Ｄ．２．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ７−ΔＭＤＲ１）の６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＭＤＲ１−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７８４Ｌ５）（ＣＨＯＲＩ）ＤＮＡ及びマウスＣｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ６クローン中、３クローンで６０％以上の割合でＭＡＣ４上にヒトＭＤＲ１由来によるシグナルが観察されていることを確認した（図１００）。
以上の結果から、ヒト７番染色体断片上のＭＤＲ１遺伝子２１０ｋｂがマウス人工染色体ベクターＭＡＣ４に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。
［Ｅ］ＣＨＯ細胞からのＭＤＲ１−ＭＡＣのマウスＡ９細胞への移入
ＭＤＲ１−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細を作製するために、上記［Ｄ］で得られたＭＤＲ１−ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ，ｈＣｈｒ７−ΔＭＤＲ１）１，２，４）からマウスＡ９細胞へミクロセル形成能の高いマウスＡ９細胞へ微小核細胞融合法により導入した。４回の微小核細胞融合で得た合計７個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：Ａ９（ＭＤＲ１−ＭＡＣ））。その結果、ＭＤＲ１−ＭＡＣ領域のみを検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であるクローンが５クローンあった。さらに、ＭＤＲ１−ＢＡＣ（ＲＰ１１−７８４Ｌ５）（ＣＨＯＲＩ）ならびにマウスｍｉｎｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるＭＤＲ１−ＭＡＣの存在が５クローン中、３クローンで確認された。以上のことから、ＭＤＲ１−ＭＡＣ保持Ａ９細胞が３クローン得られたと結論付けた。
［Ｆ］実施例８記載のように、マウス人工染色体ベクターＭＤＲ１−ＭＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を作製し、そのＥＳ細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性を検証できる。また、上記ＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、ＭＤＲ１−ＭＡＣが子孫伝達されたマウス系統ＴＣ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ）を作製できる。また、上記ＴＣ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ）マウス系統を用いて、体細胞におけるＭＤＲ１−ＭＡＣの安定性を検証できる。また、ＴＣ（ＭＤＲ１−ＭＡＣ）マウス系統はヒトにおける薬物の輸送等を再現できる。また、上記ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ）マウス系統との交配により、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＭＡＣ／ＭＤＲ１−ＭＡＣ）系統を作製できるので、医薬品開発における薬効・毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のモデルマウスとして利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明のマウス人工染色体ベクターは、ＷＯ  ２００９／０６３７２２に記載されるヒト人工染色体と同様の有用性をもつが、さらに齧歯類細胞又は齧歯類個体において保持率が向上していることによって齧歯類細胞内で安定に保持され、目的遺伝子（群）を長期間安定に保持することができ、かつマウスなどのげっ歯類の個体間及び組織間において導入遺伝子量にバラつきがないため、個体間又は組織間での導入遺伝子のより精確な解析を可能にする。本発明のマウス人工染色体ベクターは、例えば、外来遺伝子の受容細胞への導入、ｉＰＳ細胞の樹立や再生医療への利用、外来遺伝子を発現する細胞や有用な非ヒト動物の作製、タンパク質の製造、遺伝子機能の解析などの種々の用途や目的のために利用できる。
【受託番号】
【００１１】
ＤＴ４０  Ｂ６ｂＴ−１の受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２８
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号１〜２１２：プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図９】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２４】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図４２】
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【図４５】
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【図５１】
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【図５４】
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【図５６】
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【図６０】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６７】
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【図６８】
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【図７３】
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【図７６】
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【図７９】
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【図８１】
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【図８４】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９１】
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【図９３】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５５】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７７】
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【図７８】
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【図８０】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図９０】
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【図９２】
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【図９４】
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【図９７】
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【図９８】
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【図１００】
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