(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に記載の構造を有する二本鎖ＲＮＡ化合物：
５’      （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、修飾又は非修飾のリボヌクレオチド、または非慣用部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続したヌクレオチドであり；
ｚ’’は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャップ部分であり；
ｘ＝ｙ＝１９であり；
（Ｎ）ｘは、３’末端を起点として少なくとも５個の交互に現れる修飾リボヌクレオチドかつ合計で少なくとも９個の修飾リボヌクレオチドを含み、それぞれの修飾リボヌクレオチドはその糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、それぞれの残りのＮは非修飾リボヌクレオチド又は非慣用部分であり；
（Ｎ’）ｙ中にあって、１５、１６、１７、又は、１８位に存在するＮ’の少なくとも１つは、非慣用部分であり、当該非慣用部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾または非修飾のデオキシリボヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、又は２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘの配列は、５’  ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣ  ３’（配列番号１４０）であり；
（Ｎ’）ｙの配列は、５’  ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵ３’（配列番号１３９）である］。
【請求項２】
（Ｎ’）ｙにおける少なくとも１つの非慣用部分が鏡像異性体ヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
鏡像異性体ヌクレオチドが位置１７、位置１８、位置１７と１８、または、位置１９に存在する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
少なくとも１つのＮ’がＬＮＡである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、ＺおよびＺ’は、存在しないことを特徴とする化合物。
【請求項７】
請求項３に記載の化合物であって、（Ｎ）ｘが、位置２，４，６，８，１１，１３，１５，１７及び１９、または、位置１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７及び１９に２’Ｏ−Ｍｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、それぞれの残りのＮは、非修飾リボヌクレオチドであることを特徴とする化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物であって、（Ｎ’）ｙにおける前記少なくとも１つの非慣用部分は２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドである化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合している前記ヌクレオチドの少なくとも１つが位置１７、位置１８、位置１９、または位置１７と１８に存在する化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物であって、ｚ’’が、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、反転脱塩基リボース部分、反転脱塩基デオキシリボース部分、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、又は鏡像異性体ヌクレオチドから選択される化合物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の化合物であって、ｚ’’が、脱塩基デオキシリボース部分又は反転脱塩基デオキシリボース部分である化合物。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物であって、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙのどちらも３’および５’末端でリン酸化されていないか、または、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が３’末端でリン酸化されている（３’Ｐｉ）、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の全体にわたって、様々な特許文献および科学出版物を引用する。これらの出版物の開示は、本出願中で最新技術をより十分に説明するために、その全体が本出願中に参考として組み込まれている。
【０００２】
本発明は、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＲＨＯＡおよびＤＵＯＸ１を含めた特定の哺乳動物遺伝子を阻害するための、新規化合物、それを含む薬剤組成物およびその使用方法に関する。したがって、化合物および組成物は、遺伝子の発現が有害な結果をもたらす疾患もしくは状態およびまたはそのような疾患もしくは状態に関連する症状に罹患している対象の治療に有用である。特定の実施形態では、本発明は、新規化合物を含む組成物およびその使用方法を提供する。また、本発明は、化学修飾されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製、それを含む組成物およびその使用方法に有用な新規構造モチーフも提供する。
【背景技術】
【０００３】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性の遺伝子特異的な転写後サイレンシングに関与する現象である。この現象を研究し、哺乳動物細胞を実験的に操作した初期の試みは、長いｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化された、活性のある非特異的な抗ウイルス防御機構によって妨げられた（Ｇｉｌ他、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０００．５：１０７〜１１４）。後に、２１個のヌクレオチドのＲＮＡの合成二重鎖が、哺乳動物細胞において一般的な抗ウイルス防御機構を刺激せずに遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介できることが発見された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１：４９４〜４９８およびＣａｐｌｅｎ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：９７４２〜９７４７参照）。その結果、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子機能を理解する試みにおける強力なツールとなっている。
哺乳動物におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１：８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２００４、４３１（７００６）：３５０〜３５５；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ、２００４、１１６（２）：２８１〜９７）によって媒介される。植物における対応するプロセスは、一般的に特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、また、真菌ではくエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれる。
【０００４】
ｓｉＲＮＡとは、その内在性（細胞性）対応物の遺伝子／ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションまたはサイレンシング（防止）する、二本鎖ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ干渉の機構を以下に詳述する。
いくつかの研究により、ｓｉＲＮＡ治療剤が、哺乳動物およびヒトのどちらにおいてもｉｎ  ｖｉｖｏで有効であることが明らかとなっている。Ｂｉｔｋｏ他は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドのＮ遺伝子に向けられた特異的ｓｉＲＮＡ分子が、鼻腔内投与した場合にマウスの治療に有効であることを示している（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００５、１１（１）：５０〜５５）。ｓｉＲＮＡ治療剤を論じている最新の総説が入手可能である（Ｂａｒｉｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ、２００５、８３：７６４〜７７３；ＤａｌｌａｓおよびＶｌａｓｓｏｖ、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔｏｒ、２００６、１２（４）：ＲＡ６７〜７４；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００７、８（３）：４６９〜８２；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００６．１３：５４１〜５５２）。
【０００５】
Ｍｕｃｋｅ（ＩＤｒｕｇｓ、２００７、１０（１）：３７〜４１）は、眼疾患、たとえば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および緑内障を治療するための、様々な標的に対するｓｉＲＮＡを含めた最新の治療剤の総説を提示する。
【０００６】
ｓｉＲＮＡの構造
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成は、幅広く報告されている（たとえば、Ｕｉ−Ｔｅｉ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００６；２００６：６５０５２；Ｃｈａｌｋ他、ＢＢＲＣ．、２００４、３１９（１）：２６４〜７４；ＳｉｏｕｄおよびＬｅｉｒｄａｌ、Ｍｅｔ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；２００４、２５２：４５７〜６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ他、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、２００４、２０（３）：４３０〜２；Ｕｉ−Ｔｅｉ他、ＮＡＲ．、２００４、３２（３）：９３６〜４８参照）。
修飾ｓｉＲＮＡの使用および生成の例には、たとえば、Ｂｒａａｓｃｈ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３、４２（２６）：７９６７〜７５；Ｃｈｉｕ他、ＲＮＡ、２００３、９（９）：１０３４〜４８；ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ  ＡＧ）およびＷＯ０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ他）号を参照されたい。米国特許第５，８９８，０３１号および第６，１０７，０９４号は、化学修飾されたオリゴマーを教示している。米国特許公開第２００５／００８０２４６号および第２００５／００４２６４７号は、それぞれ交互に現れるモチーフを有するオリゴマー化合物および化学修飾されたヌクレオシド間結合を有するｄｓＲＮＡ化合物に関する。
【０００７】
他の修飾が開示されている。５’−リン酸部分の含有は、ショウジョウバエ胚においてｓｉＲＮＡの活性を増強することが示され（Ｂｏｕｔｌａ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、２００１、１１：１７７６〜１７８０）、ヒトＨｅＬａ細胞中でのｓｉＲＮＡ機能に必要である（Ｓｃｈｗａｒｚ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２、１０：５３７〜４８）。Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ他（ＮＡＲ、２００３、３１（２）：５８９〜９５）は、ｓｉＲＮＡ活性が２’−Ｏ−メチル修飾の位置に依存することを示している。Ｈｏｌｅｎ他（ＮＡＲ．、２００３、３１（９）：２４０１〜０７）は、少数の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡは野生型と比較して良好な活性を与えたが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドの数が増加するにつれて活性が低下したことを報告している。ＣｈｉｕおよびＲａｎａ（ＲＮＡ．２００３、９：１０３４〜４８）は、センスまたはアンチセンス鎖中に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを取り込むことで（完全に修飾された鎖）、非修飾のｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ活性が激しく低下したことを教示している。２’−Ｏ−メチル基をアンチセンス鎖上の５’末端に配置することにより活性が大幅に制限されたが、一方で、アンチセンスの３’末端およびセンス鎖の両末端に配置することは許容されたことが報告されている（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ他、ＮＡＲ．、２００３、３１（１１）：２７０５〜１６；ＷＯ２００４／０１５１０７号）。本発明の分子は、無毒性であり、様々な疾患を治療するための薬剤組成物の調製に有用であるという利点を提供する。
【０００８】
アポトーシス促進遺伝子
アポトーシス促進遺伝子とは、一般に、アポトーシス細胞死に役割を果たす遺伝子として定義される。本発明において有用なアポトーシス促進遺伝子の非限定的なリストは以下のとおりである：腫瘍タンパク質ｐ５３結合タンパク質２（ＴＰ５３ＢＰ２）；ロイシンリッチリピートおよびデスドメイン含有（ＬＲＤＤ）；チトクロムｂ−２４５、αポリペプチド（ＣＹＢＡ、ｐ２２ｐｈｏｘ）；活性化転写因子３（ＡＴＦ３）；カスパーゼ２、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ２）；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ３（ＮＯＸ３）；ハラキリ、ＢＣＬ２相互作用タンパク質（ＨＲＫ、ＢＩＤ３）；補体成分１、ｑ小成分結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３（ＢＮＩＰ３）；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８（ＭＡＰＫ８、ＪＮＫ１）；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４、ｐ３８）；ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質ＲＡＣ１）；グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３Ｂ）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ、リガンド開口型イオンチャネル、７（Ｐ２ＲＸ７）；一過性受容体電位陽イオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー２（ＴＲＰＭ２）；ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（ＰＡＲＧ）；ＣＤ３８分子（ＣＤ３８）；ＳＴＥＡＰファミリーメンバー４（ＳＴＥＡＰ４）；骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）；ギャップ結合タンパク質、α１、４３ｋＤａ（コネキシン４３、ＧＪＡ１）；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ）；結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）；分泌リンタンパク質１（オステオポンチン、ＳＰＰ１）；ｒａｓ相同体遺伝子ファミリー、メンバーＡ（ＲＨＯＡ）；ならびに二重オキシダーゼ１（ＤＵＯＸ１）。
本発明の譲受人のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００７／００１２７８号（ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０５０３２９号）および米国出願第１１／９７８，０８９号は、上述の遺伝子の阻害剤に関し、その全体が参考として組み込まれている。
【０００９】
聴覚損失
化学誘発聴器毒性
聴覚細胞およびらせん神経節ニューロンに対する様々な治療薬の聴器毒性効果は、しばしば、その治療上の有用性を制限する要素である。一般的に使用されている聴器毒性薬物には、幅広く使用されている化学療法剤シスプラチンおよびその類似体、アミノグリコシド抗生物質、たとえばゲンタマイシン、キニーネおよびその類似体、サリチレートおよびその類似体、ならびにループ利尿剤が含まれる。
【００１０】
たとえば、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシンなどの抗細菌アミノグリコシドは、重大な毒性副作用、特に聴器毒性および腎毒性を有することが知られており、それにより、治療剤としてのその価値が低下する（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、治療学の薬理学的基礎（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、第６版、Ａ．Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ他編；Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、１９８０．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１１６９〜７１ページ参照）。したがって、聴器毒性は、抗生物質投与の認識されている用量規制副作用である。研究により、１グラム／日を１週間より長く受けている患者の４〜１５％が測定可能な聴覚損失を発生し、これは次第に悪化して、治療を続けた場合に永久的な聴覚消失をもたらす可能性があることが示されている。
【００１１】
また、聴器毒性は、精巣、卵巣、膀胱、および頭頸部の癌を含めた様々なヒト癌に有効であることが証明された白金配位錯体であるシスプラチンの重大な用量規制副作用でもある。シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））は、聴覚および前庭系に損傷を与えることが示されている。アスピリンなどのサリチレートは、その抗炎症性、鎮痛性、解熱性および抗血栓性の効果について、最も一般的に使用されている治療薬である。残念ながら、これらも聴器毒性副作用を有し、耳鳴（「耳鳴り」）および一時的な聴覚損失をもたらす場合がある。さらに、薬物を高用量で長期間使用した場合、慢性かつ不可逆的な難聴が生じる場合がある。
【００１２】
理論に束縛されずに、シスプラチン薬および他の潜在的に聴器毒性のある薬物は、内耳組織、特に内耳毛細胞におけるアポトーシスを介して聴器毒性効果を誘発する（Ｚｈａｎｇ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００３、１２０（１）：１９１〜２０５；Ｗａｎｇ他、２００３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２３（２４）：８５９６〜８６０７）。高用量の聴器毒性薬物の長期使用は、持続性かつ不可逆的な難聴をもたらす。哺乳動物では、聴覚有毛細胞は胚発生中にのみ産生され、出産後生活中に損失した場合でも再生しない。したがって、有毛細胞の損失は深刻かつ不可逆的な聴覚消失をもたらす。
【００１３】
残念ながら、聴覚消失を逆転させるために蝸牛を治療する有効な治療は現在存在しない。したがって、聴覚有毛細胞の細胞死を予防する有効な治療が大きな治療的価値となる。本発明の出願人に譲渡された米国出願第１１／６５５，６１０号は、対象に、有効量のｐ５３ポリヌクレオチド阻害剤を含む組成物、および任意選択でアポトーシス促進遺伝子の阻害剤を投与することを含む、対象において難聴を治療する方法に関する。
【００１４】
老人性難聴
別の種類の聴覚損失は老人性難聴であり、これは、高齢の個体において次第に起こる聴覚損失である。６５〜７５歳の成人の約３０〜３５％および７５歳以上の人の４０〜５０％が聴覚損失を経験する。したがって、内耳障害および内耳組織、特に内耳毛細胞に関与する難聴の発生率および／または重篤度を予防、軽減または治療する手段の必要性が存在する。
【００１５】
音響外傷
音響外傷とは、大きな音に長期的に曝されることによって引き起こされる聴覚損失の一種である。理論に束縛されることを望まずに、大きな音への曝露は、蝸牛上の有毛細胞の感受性の低下を引き起こす。より重篤な曝露により、傷害は、隣接する支持細胞の損失からコルチ器官の完全な破壊まで進行する場合がある。感覚細胞の死は、進行性ウォーラー変性および一次聴覚神経線維の損失をもたらす場合がある。
【００１６】
したがって、内耳障害および難聴、腎損傷（腎毒性）および神経損傷（神経毒性）を含めた、化学毒性から生じる疾患または障害の発生率および／または重篤度を予防、軽減または治療する手段の必要性が存在する。
【００１７】
急性腎不全
急性腎不全（ＡＲＦ）とは、数日以内に起こる急速な腎機能の悪化によって特徴づけられる臨床症候群である。ＡＲＦの主な特長は、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の急激な低下であり、これは、窒素性廃棄物（尿素、クレアチニン）の保持をもたらす。世界中で、年間に百万人あたり約１７０〜２００人が重篤なＡＲＦを発生している。現在、確立されたＡＲＦには具体的な治療は存在しない。低下した血清クレアチニンレベル、軽減した組織学的損傷およびより速い腎機能の回復によって明らかであるように、いくつかの薬物が、動物モデルにおいて毒性かつ虚血性の実験的ＡＲＦを寛解させることが見い出されている。これらには、抗酸化剤、カルシウムチャネル遮断剤、利尿剤、血管作動性物質、成長因子、抗炎症剤などが含まれる。しかし、これらの薬物を臨床治験で試験した際、利点は示されず、ＡＲＦを治療するためのその使用は認可されなかった。
入院ＡＲＦ患者の大多数で、ＡＲＦは、虚血性および／または腎毒性の侵襲から生じる急性尿細管壊死（ＡＴＮ）によって引き起こされる。腎臓低灌流は、血管収縮薬の投与または腎血管損傷による、血液量減少性、心原性および敗血症性のショックによって引き起こされる。腎毒素には、造影剤およびアミノグリコシドなどの外因性毒素ならびにミオグロビンなどの内在性毒素が含まれる。最近の研究により、腎組織中のアポトーシスがＡＲＦのヒト事例のほとんどにおいて顕著であることが示唆されている。アポトーシス細胞死の主な部位は遠位ネフロンである。虚血性傷害の初期段階の間、アクチン細胞骨格の完全性の損失は、刷子縁の損失、細胞接着点の損失、および続く下部の基層からの細胞の離脱を伴った、上皮の平板化をもたらす。アポトーシス尿細管細胞死が、壊死性細胞死よりも機能変化の予測となり得ることが示唆されている（Ｋｏｍａｒｏｖ他、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８５（５４３４）：１７３３〜７；Ｓｕｐａｖｅｋｉｎ他、２００３、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、６３（５）：１７１４〜２４）。結論として、急性腎不全を予防および／または治療するための十分な治療様式は現在存在せず、この目的のために新規化合物を開発する明白な必要性が存在する。
【００１８】
腎臓移植
臓器移植後臓器機能障害
臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）は、腎臓移植の手術直後の期間の最も一般的な合併症であり、不良な移植の転帰をもたらす（Ｍｏｒｅｓｏ他、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１９９９．１４（４）：９３０〜３５）。ＤＧＦの発生率および定義は移植センター間で異なるが、その結果は不変であり、長期入院、追加の侵襲性手順、ならびに患者および医療制度への追加の費用が含まれる。
【００１９】
急性移植
拒絶移植片拒絶は、移植片破壊の発症に応じて３つの部分組に分類されている。超急性拒絶とは、移植片破壊の最初期、通常は最初の４８時間以内に適用される用語である。急性拒絶は、移植の数日後〜数カ月後またはさらには何年か後の発症を有し、液性および／または細胞性の機構を含む場合がある。慢性拒絶は、慢性アロ反応性免疫応答に関連する。
【００２０】
緑内障
緑内障は、世界中で盲目の主要な原因の１つである。これは、世界中で約６６８０万人に影響を与えている。毎年少なくとも１２，０００人の米国人がこの疾患によって失明している（ＫａｈｎおよびＭｉｌｔｏｎ、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１９８０、１１１（６）：７６９〜７６）。緑内障は、主に眼圧上昇（ＩＯＰ）が原因の、視神経乳頭中の軸索の変性によって特徴づけられている。原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）として知られる緑内障の最も一般的な形態の１つは、小柱網（ＴＭ）中の眼房水流出の耐性の増加、それによって引き起こされるＩＯＰ上昇および最終的な視神経損傷から生じる。Ｍｕｃｋｅ（ＩＤｒｕｇｓ、２００７、１０（１）：３７〜４１）は、眼疾患、たとえば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）および緑内障を治療するための、様々な標的に対するｓｉＲＮＡを含めた、最新の治療学を総説している。
【００２１】
急性呼吸窮迫症候群
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）とは、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）または成人呼吸窮迫症候群（乳児呼吸窮迫症候群ＩＲＤＳの対照として）としても知られ、肺への様々な形態の傷害に対する重大な反応である。これは、透過性亢進肺水腫をもたらす、最も重要な障害である。
ＡＲＤＳは、様々な直接および間接的な侵襲によって引き起こされる重篤な肺疾患である。これは、炎症、低酸素血症を引き起こし、しばしば多臓器不全を生じる、炎症伝達物質の全身性放出が伴う気体交換の障害をもたらす肺実質の炎症によって特徴づけられている。この状態は命を脅かし、しばしば致死的であり、通常は機械的人工呼吸および集中治療室への入院を必要とする。重篤度の低い形態は急性肺傷害（ＡＬＩ）と呼ばれる。
【００２２】
臓器移植後虚血再灌流傷害
虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、臓器同種移植のレシピエントの主要な死亡原因の１つである。顕著なＩＲＩが、死亡したドナーからのすべての臓器移植および生きたドナーからの一部で起こる。これは、急性拒絶の増加および長期同種移植機能不全に寄与する。末期肺疾患に罹患している多くの患者の唯一の決定的な治療である肺移植は、すべての固体同種移植レシピエントにおいて生存率が乏しい。
【００２３】
急性肺移植片拒絶
急性同種移植片拒絶は、免疫抑制医薬品の進歩にもかかわらず、依然として肺移植における顕著な問題である。拒絶、および最終的には早期の罹患率および死亡率は、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害および低酸素傷害から生じ得る。
【００２４】
脊髄傷害
脊髄傷害とは、感覚および／または可動性の損失をもたらす脊髄の障害であり、骨髄障害としても知られる。２つの最も一般的な脊髄傷害の種類は、外傷および疾患が原因である。外傷性傷害は、しばしば、自動車事故、転倒、銃撃、潜水事故などが原因である。脊髄を冒す可能性がある疾患には、ポリオ、二分脊椎、腫瘍、およびフリードライヒ失調症が含まれる。
【００２５】
褥瘡
褥瘡とは、しばしば床ずれまたは褥瘡性潰瘍として知られ、損傷した皮膚および組織の領域である。圧力が開放されない場合、組織虚血が発生する場合があり、これは、間質組織中に代謝廃棄物の蓄積をもたらし、無酸素症および細胞死をもたらす。この圧力誘発性虚血は過剰の組織低酸素ももたらし、細菌増殖および組織破壊がさらに促進される。
加齢黄斑変性症
【００２６】
米国において６５歳を超える個体の最良矯正視力の低下の最も一般的な原因は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）として知られる網膜障害である。ＡＭＤによって冒される眼の領域は、網膜の中心にあり、主に光受容体細胞からなる小さな領域である斑である。ＡＭＤが進行するにつれて、疾患は、はっきりした中心視力の損失によって特徴づけられる。いわゆる「ドライ」ＡＭＤは、ＡＭＤ患者の約８５％〜９０％を占め、眼の色素分布の変更、光受容体の損失および細胞の全体的萎縮による網膜機能の消失を含む。「ウェット」ＡＭＤは、血餅または網膜下空間の瘢痕をもたらす異常脈絡膜血管の増殖を含む。したがって、「ウェット」ＡＭＤの発症は、神経網膜の下での異常な脈絡膜新血管網（脈絡膜血管新生、ＣＮＶ）の形成が原因で起こる。新しく形成された血管は過剰に漏れやすく、網膜下に体液および血液の蓄積をもたらし、視力の損失をもたらす。最終的に、脈絡膜および網膜を含む大きな円板状の瘢痕が形成されるため、関与する領域中の機能的網膜の全損失が生じる。ドライＡＭＤ患者は品質が低下した視覚を保ち得るが、ウェットＡＭＤは、しばしば盲目の結果をもたらす（ＨａｍｄｉおよびＫｅｎｎｅｙ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｅ３０５〜３１４、２００３年５月）。
【００２７】
糖尿病性網膜症
糖尿病性網膜症（ＤＲ）とは、過剰の毛細血管透過性、血管閉鎖、および新しい血管の増殖を示す、網膜血管の障害として認識されている。ＤＲは２段階、すなわち、非増殖性および増殖性で起こる。非増殖性段階では、疾患は、網膜毛細周皮細胞の損失、基底膜の肥厚および微小動脈瘤の発生、ドットブロット出血、ならびに硬性白斑によって特徴づけられている。増殖性段階では、疾患は、大規模な血管新生、硝子体内への血管進入、出血および続く網膜牽引を伴う線維症によって特徴づけられており、これは重篤な視覚機能障害をもたらす。本発明の譲受人の米国特許第６，７４０，７３８号ならびに関連する特許および出願は、とりわけ網膜症を治療するための、ＲＴＰ８０１遺伝子およびタンパク質を阻害する方法に向けられている。
【００２８】
口腔粘膜炎
口腔粘膜炎は、口内炎とも呼ばれ、化学療法および放射線療法レジメンの一般的かつ衰弱させる副作用であり、口および咽頭の紅班および有痛性の潰瘍性病変として顕在化する。重篤な口腔粘膜炎に罹患している対象では、飲食、嚥下、および会話などの日常活動が困難または不可能であり得る。対症治療には、鎮痛剤の投与および局所的な洗い流しが含まれる。
【００２９】
ドライアイ症候群
ドライアイ症候群とは、通常は眼を潤滑する涙膜の産生の低下から生じる一般的な問題である。ドライアイに罹患している患者のほとんどが、不快感を経験するが盲目は経験しない。しかし、重篤な事例では、角膜が損傷または感染し得る。湿潤滴（人工涙）を治療に使用し得る一方で、潤滑軟膏がより重篤な事例に役立ち得る。
【００３０】
虚血性の眼球状態
虚血性視神経症（ＩＯＮ）には、視神経に虚血を生じる様々な障害が含まれる。定義により、ＩＯＮは、視神経円板の浮腫が急性的に存在し、眼球に最も近い視神経の部分の梗塞が示唆される場合に、前側と呼ぶ。また、ＩＯＮは、眼球の数センチメートル後ろに位置する場合には後側であり得る。虚血性視神経症は、通常、６０歳を超えた人のみで起こる。ほとんどの事例が非動脈炎性であり、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、または視神経灌流による高血圧の効果に起因する。側頭動脈炎が事例の約５％を引き起こす（動脈炎性ＩＯＮ）。
【００３１】
症状および徴候は、突発性、部分的または完全な盲目であり、視神経乳頭の腫脹およびしばしば出血を伴う。視野欠損は、水平の分界を有する視野の半分の損失として、または中心暗点もしくは盲点中心暗点（自然の盲点の周辺）として顕在化し得る。視力低下のすぐ後に視神経円板の蒼白が続く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
上述の疾患および障害を治療するより有効な治療が、大きな治療的価値となる。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、新規ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＲＨＯＡおよびＤＵＯＸ１のｓｉＲＮＡ、ならびに、遺伝子発現全般、特に哺乳動物遺伝子ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＨＯＡ、およびＤＵＯＸ１を阻害するための、新規の化学的およびまたは構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を提供する。（遺伝子の詳細には下記表Ａを参照）。
【００３４】
有利な特性を有し、任意の標的配列、特に本明細書中に開示するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡに適用し得る、二本鎖オリゴヌクレオチドの新規構造をさらに提供する。本発明中に開示する化学修飾ｓｉＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に有用な安定かつ活性のある化合物の調製に有用である。
【００３５】
また、本発明は、１つまたは複数のそのようなオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物も提供する。本発明はさらに、それを必要としている対象において疾患または状態の発生率または重篤度を治療または予防する方法に関し、疾患もしくは状態および／またはそれに関連する症状は、標的遺伝子の発現と関連している。一部の実施形態では、疾患または状態は、聴覚損失、急性腎不全（ＡＲＦ）、緑内障、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性の肺や呼吸器の傷害、肺移植後の虚血再灌流傷害、眼球虚血状態、肺、肝臓、心臓、膵臓、および腎臓の移植を含めた臓器移植、腎臓および神経毒性、脊髄傷害、褥瘡、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、ドライアイ症候群、口腔粘膜炎、虚血性眼球神経障害（ＩＯＮ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される。そのような方法は、そのような治療を必要としている哺乳動物に、予防上または治療上有効な量の、少なくとも１つのそのような遺伝子の発現または活性を阻害または軽減する１つまたは複数のそのような化合物を投与することを含む。
【００３６】
したがって、一態様では、本発明は、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＲＨＯＡ、およびＤＵＯＸ１から選択される遺伝子の阻害に有用な新規オリゴヌクレオチド配列を提供し、そのｍＲＮＡポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１〜２、３〜５、６、１０〜１１、１２、１３、２４〜２６、４６および４７〜４８に記載する。表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）は、本発明の１９、２１および２３量体のセンスおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、遺伝子発現全般、またはＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、ＳＰＰ１、ＲＨＯＡ、もしくはＤＵＯＸ１から選択される遺伝子の遺伝子発現の阻害に有用な、化学的およびまたは構造的に修飾された核酸化合物を提供する。様々な実施形態では、修飾化合物は、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）およびＣ（Ｃ１〜Ｃ３）に表す、配列番号９７〜６８６５４に記載のオリゴヌクレオチド配列を含む（その全体が参考として本明細書中に組み込まれている、米国出願第１１／９７８，０８９号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００７／００１２７８号に開示）。
【００３８】
特定の実施形態では、化学的およびまたは構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物は、表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４；配列番号６８，６５５〜８７，０８８）に表すオリゴヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本発明は、以下に記載の構造（Ａ）を有する化合物を提供する：
（Ａ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続したヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘの配列は、表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に表すアンチセンス配列のうちの１つまたは複数を含む］。
【００３９】
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは実質的に相補的である。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に対して実質的に相補的である。特定の好ましい実施形態によれば、本発明は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物を提供し、修飾ヌクレオチドは、糖部分、塩基部分またはヌクレオチド間結合部分中に修飾を保有する。
一態様では、本発明は、以下に記載の構造（ＩＸ）を有する化合物を提供する：
（ＩＸ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ              ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾もしくは修飾であり得るリボヌクレオチド、または非慣用部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続したヌクレオチドであり；
ｚ’’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャップ部分であり；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘは、修飾および非修飾のリボヌクレオチドを含み、それぞれの修飾リボヌクレオチドはその糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの３’末端のＮは修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、３’末端を起点として少なくとも５個の交互に現れる修飾リボヌクレオチドかつ合計で少なくとも９個の修飾リボヌクレオチドを含み、それぞれの残りのＮは非修飾リボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙ中に少なくとも１つの非慣用部分が存在し、非慣用部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾または非修飾のデオキシリボヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドであってよく；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子によってコードされているｍＲＮＡの配列と実質的に同一である］。
【００４０】
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。一部の実施形態では、少なくとも１つの非慣用部分は、（Ｎ’）ｙ中の位置１５、１６、１７、または１８に存在する。一部の実施形態では、非慣用部分は、鏡像異性体ヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。一部の好ましい実施形態では、非慣用部分は、鏡像異性体ヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分は、位置１７、位置１８または位置１７および１８に存在する。
【００４１】
他の実施形態では、非慣用部分は脱塩基部分である。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも５個の脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分を含む。
さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも５個の脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分を含み、Ｎ’のうちの少なくとも１つはＬＮＡである。
構造（ＩＸ）の一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、９個の交互に現れる修飾リボヌクレオチドを含む。構造（ＩＸ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２に２’Ｏ修飾ヌクレオチドをさらに含む、９個の交互に現れる修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、奇数位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２および１８の一方または両方に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００４２】
様々な実施形態では、ｚ’’が存在し、脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；反転脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；鏡像異性体ヌクレオチドから選択される。
【００４３】
別の態様では、本発明は、以下に記載の構造（Ｘ）を有する化合物を提供する：
（Ｘ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ              ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾もしくは修飾であり得るリボヌクレオチド、または非慣用部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続したヌクレオチドであり；
ｚ’’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャップ部分であり；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘは、修飾または非修飾のリボヌクレオチド、および任意選択で少なくとも１つの非慣用部分を含み；
（Ｎ’）ｙ中に、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾もしくは非修飾のデオキシリボヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体または２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドであり得る少なくとも１つの非慣用部分が存在し；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子によってコードされているｍＲＮＡの配列と実質的に同一である］。
【００４４】
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。一部の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは、修飾および非修飾のリボヌクレオチド、ならびに少なくとも１つの非慣用部分を含む。様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、ｍＲＮＡに相補的な１５個未満の連続したヌクレオチドを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中で、３’末端のＮは修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、少なくとも８個の修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、少なくとも８個の修飾リボヌクレオチドのうちの少なくとも５個が、３’末端を起点として交互に現れる。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のうちの１つに脱塩基部分を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の少なくとも１つの非慣用部分は、位置１５、１６、１７、または１８に存在する。一部の実施形態では、非慣用部分は、鏡像異性体ヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。一部の好ましい実施形態では、非慣用部分は、鏡像異性体ヌクレオチド鏡像異性体ヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分は、位置１７、位置１８または位置１７および１８に存在する。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の少なくとも１つの非慣用部分は、脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分である。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの間に１５未満の塩基対しか存在しない。
【００４７】
構造（Ｘ）の様々な実施形態では、ｚ’’が存在し、脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；反転脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；鏡像異性体ヌクレオチドから選択される。
【００４８】
さらに別の態様では、本発明は、以下に記載の構造（ＸＩ）を有する化合物を提供する：
（ＸＩ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ              ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾もしくは修飾であり得るリボヌクレオチド、または非慣用部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続したヌクレオチドであり；
ｚ’’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャップ部分であり；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘは、修飾または非修飾のリボヌクレオチドおよび非慣用部分の組合せを含み、任意の修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有し；
（Ｎ’）ｙは、修飾または非修飾のリボヌクレオチドおよび任意選択で非慣用部分を含み、任意の修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’ＯＭｅを有し；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子によってコードされているｍＲＮＡの配列と実質的に同一であり；ｍＲＮＡに相補的な１５個未満の連続したヌクレオチドが存在する］。
【００４９】
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。一部の好ましい実施形態では、少なくとも１つの好ましい１つの非慣用部分は、（Ｎ）ｘ中に存在し、脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分である。他の実施形態では、少なくとも１つの非慣用部分は、（Ｎ）ｘ中に存在し、非塩基対合ヌクレオチド類似体である。様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、ｍＲＮＡに相補的な１５個未満の連続したヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、非修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、少なくとも５個の脱塩基リボース部分もしくは脱塩基デオキシリボース部分またはその組合せを含む。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび／または（Ｎ’）ｙは、（Ｎ’）ｙおよび／または（Ｎ）ｘ中の対応する修飾または非修飾のリボヌクレオチドと塩基対合しない修飾リボヌクレオチドを含む。
【００５０】
構造（ＩＸ）、（Ｘ）および（ＸＩ）のモチーフは、哺乳動物または非哺乳動物の遺伝子に対する任意のオリゴヌクレオチド対（センスおよびアンチセンス鎖）で有用である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子はヒト遺伝子である。様々な実施形態では、ヒト遺伝子のｍＲＮＡは、配列番号１〜４１、４６〜４８のうちの１つに記載されている。
【００５１】
一部の実施形態では、構造（ＩＸ）、（Ｘ）および（ＸＩ）のモチーフは、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、Ｃ（Ｃ１〜Ｃ３Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）（配列番号９７〜８７、１７８）に表すオリゴヌクレオチド対と組み合わせて使用する。
様々な実施形態では、本発明は、構造（ＩＶ）に記載のｓｉＲＮＡを提供する：
（ＩＶ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
それぞれの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘ＝ｙ＝１９であり；
（Ｎ’）ｙ中で、位置１５、１６、１７、１８および１９のうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、脱塩基擬似ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み；
（Ｎ）ｘは、交互に現れる修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含み、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央位置に位置するリボヌクレオチドは、修飾されているまたは修飾されていない、好ましくは修飾されておらず；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡと実質的に同一である］。
構造（ＩＶ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、位置１７および１８の一方または両方のヌクレオチドは、脱塩基擬似ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡから選択される。様々な実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
【００５２】
様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１５に、鏡像異性体ヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【００５３】
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、修飾ヌクレオチドまたは擬似ヌクレオチドを位置２にさらに含み、擬似ヌクレオチドは脱塩基擬似ヌクレオチド類似体であってよく、修飾ヌクレオチドは任意選択で鏡像異性体ヌクレオチドである。
【００５４】
様々な実施形態では、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは、奇数位置（５’から３’；位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９）に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）Ｘは、位置２および１８の一方または両方に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００５５】
ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３である、構造（ＩＶ）、（ＩＸ）および（Ｘ）の他の実施形態が想定される。これらの実施形態では、上述した（Ｎ’）ｙの修飾は、位置１７および１８にある代わりに、２１量体オリゴヌクレオチドでは位置１９および２０にあり、２３量体オリゴヌクレオチドでは２１および２２にある。同様に、位置１５、１６、１７、１８または１９の修飾は、２１量体オリゴヌクレオチドでは位置１７、１８、１９、２０または２１にあり、２３量体オリゴヌクレオチドでは位置１９、２０、２１、２２、または２３にある。アンチセンス鎖上の２’ＯＭｅ修飾も同様に調節される。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、奇数位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む（５’から３’；２１量体オリゴヌクレオチドでは位置１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０［位置１１のヌクレオチドは非修飾］、２３量体オリゴヌクレオチドでは１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３［位置１２のヌクレオチドは非修飾］。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２１量体オリゴヌクレオチドでは位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０に［位置１１のヌクレオチドは非修飾、２３量体オリゴヌクレオチドでは位置２、４、６、８、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３［位置１２のヌクレオチドは非修飾］に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００５６】
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端キャップヌクレオチドをさらに含む。様々な実施形態では、末端キャップ部分は、脱塩基擬似ヌクレオチド類似体、反転脱塩基擬似ヌクレオチド類似体、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、およびＣ６−イミンホスフェートから選択される。
【００５７】
構造（ＩＶ）のモチーフは、哺乳動物または非哺乳動物の遺伝子に対する任意のオリゴヌクレオチド対（センスおよびアンチセンス鎖）で有用である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子はヒト遺伝子である。様々な実施形態では、ヒト遺伝子のｍＲＮＡは、配列番号１〜４１、４６〜４８のうちの１つに記載されている。
【００５８】
一部の実施形態では、構造（ＩＶ）のモチーフは、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、Ｃ（Ｃ１〜Ｃ３Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）（配列番号９７〜８７、１７８）に表すオリゴヌクレオチド対と組み合わせて使用する。
【００５９】
他の実施形態では、本発明は、以下に記載の構造Ｖを有する化合物を提供する：
５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、擬似ヌクレオチドおよびヌクレオチドから選択され；
それぞれのヌクレオチドは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡと実質的に同一であり；
Ｎのうちの少なくとも１つは、脱塩基擬似ヌクレオチド、非対合ヌクレオチド類似体、および（Ｎ）ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な１５個未満の連続したヌクレオチドを含むように（Ｎ）ｘ中の位置に標的遺伝子のｍＲＮＡに対するミスマッチが存在するヌクレオチドから選択される］。
【００６０】
他の実施形態では、本発明は、以下に記載の構造（ＶＩ）を有する二本鎖化合物を提供する：
（ＶＩ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡと実質的に同一であり；
（Ｎ）ｘ、（Ｎ’）ｙまたは（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙが二本鎖化合物中で１５未満の塩基対を形成するように、非塩基対合修飾ヌクレオチドを含む］。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、以下に記載の構造（ＶＩＩ）を有する化合物を提供する：
（ＶＩＩ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、Ｎのそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
Ｎ’のそれぞれは、６員糖ヌクレオチド、７員糖ヌクレオチド、モルホリノ部分、ペプチド核酸およびその組合せから選択されるヌクレオチド類似体であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡと実質的に同一である］。
【００６２】
他の実施形態では、本発明は、以下に記載の構造（ＶＩＩＩ）を有する化合物を提供する：
（ＶＩＩＩ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘもしくは（Ｎ’）ｙの内部位置中のＮもしくはＮ’のうちの１つ、または（Ｎ）ｘもしくは（Ｎ’）ｙの末端位置のＮもしくはＮ’のうちの１つもしくは複数は、脱塩基部分または２’修飾ヌクレオチドを含み；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対して実質的に相補的であり；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡと実質的に同一である］。
構造（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、交互に現れる修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含み；それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されている。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘの中央位置に位置するＮは修飾されていない。
【００６３】
構造（ＩＶ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、位置１７および１８の一方または両方のヌクレオチドは、脱塩基擬似ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡから選択される。様々な実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
【００６４】
様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１５に、鏡像異性体ヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【００６５】
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２に、鏡像異性体ヌクレオチドおよび脱塩基擬似ヌクレオチド類似体から選択される修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【００６６】
様々な実施形態では、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは、奇数位置（５’から３’；位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９）に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２および１８の一方または両方に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００６７】
ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３である、構造（ＩＶ）の他の実施形態が想定される。
これらの実施形態では、上述した（Ｎ’）ｙの修飾は、位置１７および１８にある代わりに、２１量体オリゴヌクレオチドでは位置１９および２０にあり、２３量体オリゴヌクレオチドでは２１および２２にある。同様に、位置１５、１６、１７、１８または１９の修飾は、２１量体オリゴヌクレオチドでは位置１７、１８、１９、２０または２１にあり、２３量体オリゴヌクレオチドでは位置１９、２０、２１、２２、または２３にある。アンチセンス鎖上の２’ＯＭｅ修飾も同様に調節される。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、奇数位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む（５’から３’；２１量体オリゴヌクレオチドでは位置１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０［位置１１のヌクレオチドは非修飾］、２３量体オリゴヌクレオチドでは１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３［位置１２のヌクレオチドは非修飾］。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２１量体オリゴヌクレオチドでは位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０に［位置１１のヌクレオチドは非修飾、２３量体オリゴヌクレオチドでは位置２、４、６、８、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３［位置１２のヌクレオチドは非修飾］に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００６８】
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端キャップヌクレオチドをさらに含む。様々な実施形態では、末端キャップ部分は、脱塩基擬似ヌクレオチド類似体、反転脱塩基擬似ヌクレオチド類似体、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、およびＣ６−イミンホスフェートから選択される。
【００６９】
構造（ＩＶ）のモチーフは、哺乳動物または非哺乳動物の遺伝子に対する任意のオリゴヌクレオチド対（センスおよびアンチセンス鎖）で有用である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子はヒト遺伝子である。様々な実施形態では、ヒト遺伝子のｍＲＮＡは、配列番号１〜４１、４６〜４８のうちの１つに記載されている。
【００７０】
一部の実施形態では、構造（ＩＶ）のモチーフは、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に表すオリゴヌクレオチド対と組み合わせて使用する。
【００７１】
第２の態様では、本発明は、本明細書中に開示する構造（Ｃ）〜（Ｈ）および関連構造（Ｉ）〜（ＸＩ）に基づいた、化学的およびまたは構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を提供する。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および／または表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に示す、センスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つに基づく。
【００７２】
別の態様では、本発明は、ヒト遺伝子の発現の阻害に有効な量の、表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に表すアンチセンス配列（Ｎ）ｘを含む、本発明の修飾または非修飾の化合物と、製薬上許容される担体と含む薬剤組成物を提供する。
【００７３】
さらに別の態様では、本発明は、ヒト遺伝子の発現の阻害に有効な量の、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）または表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および／または表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に表すアンチセンス配列（Ｎ）ｘを含む、１つまたは複数の本発明の修飾化合物と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物を提供する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、一定量の本発明によるｓｉＲＮＡを、それによって対象を治療するために治療上有効な用量で、対象に投与することを含む、そのｍＲＮＡポリヌクレオチド配列が配列番号１〜４１、４６〜４８のうちの任意の１つに記載されている遺伝子の発現に関連している疾患もしくは障害または疾患もしくは障害に関連する症状の治療を必要としている対象を、治療する方法に関する。
【００７５】
より詳細には、本発明は、急性腎不全（ＡＲＦ）、聴覚損失、緑内障、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性の肺や呼吸器の傷害、肺、腎臓、骨髄、心臓、膵臓、角膜または肝移植を含めた臓器移植における傷害（たとえば虚血再灌流傷害）（臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）を含む）腎毒性、脊髄傷害、褥瘡、ドライアイ症候群、口腔粘膜炎、虚血性眼球神経障害（ＩＯＮ）ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患している対象の治療に有用な、方法および組成物を提供する。
【００７６】
本発明の方法は、対象に、そのｍＲＮＡポリヌクレオチド配列が配列番号１〜４１、４６〜４８のうちの任意の１つに記載されている遺伝子の発現を阻害する、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ化合物を投与することを含む。本明細書中に開示する新規構造は、任意の標的遺伝子に対するアンチセンスおよび対応するセンス核酸配列中に組み込まれた場合に、その標的遺伝子の発現の減少に有用な、ｓｉＲＮＡ化合物を提供する。標的遺伝子は、哺乳動物または非哺乳動物の遺伝子である。特定の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜４１、または４６〜４８のうちの任意の１つから選択されるｍＲＮＡを有する哺乳動物遺伝子である。
【００７７】
表ＢおよびＣに記載のセンスおよび対応するアンチセンスヌクレオチド配列は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、本発明の譲受人のＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０５０３２９号に開示されれている。
配列および修飾がどちらも知られているｓｉＲＮＡ化合物は、本発明から排除する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、１９量体のｓｉＲＮＡ構造および本発明の２’−Ｏ−メチル化化合物で得られた実験結果を示す図である。
【図２】センス鎖上およびアンチセンス（ＡＳ）鎖上に交互に現れるメチル化パターンを有する２３量体のｓｉＲＮＡ化合物の例を示す図である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、２’−Ｏ−メチル化単量体を含む２３量体のＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ構造およびそれらの化合物で得られた実験結果を示す図である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、２’−Ｏ−メチル化単量体を含む２３量体のＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ構造およびそれらの化合物で得られた実験結果を示す図である。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、２’−Ｏ−メチル化単量体を含む２３量体のＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ構造およびそれらの化合物で得られた実験結果を示す図である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２’５’架橋ヌクレオチドを含む１９量体のＱＭ５（ｐ５３を標的とする）のｓｉＲＮＡ構造およびそれらの化合物を用いて得られた実験結果を示す図である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、２’５’架橋ヌクレオチドを含む１９量体のＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ構造およびそれらの化合物を用いて得られた実験結果を示す図である。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ２’５’架橋ヌクレオチドを含む１９量体のＲＥＤＤ２およびＱＭ５のｓｉＲＮＡ構造を示す図である。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、２’５’架橋ヌクレオチド（スター）および２’−Ｏメトキシリボヌクレオチド（太字、下線）の組合せを含む１９量体のＱＭ５のｓｉＲＮＡ構造を示し、図９Ｃ〜９Ｅは、それらの化合物の活性を示す図である。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、２’５’架橋ヌクレオチド（スター）および２’−Ｏメトキシリボヌクレオチド（太字、下線）の組合せを含む１９量体のＱＭ５のｓｉＲＮＡ構造ならびにそれらの化合物を用いた実験結果を示す図である。図１０Ｃおよび１０Ｄは、血清安定性の結果を示す図である。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、２’５’架橋ヌクレオチド（スター）および２’−Ｏメトキシリボヌクレオチド（太字、下線）の組合せを含む２３量体のＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ構造ならびにそれらの化合物を用いた実験結果を示す図である。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、２’５’架橋ヌクレオチド（スター）を含む２３量体のＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ構造およびそれらの化合物を用いた実験結果を示す図である。
【図１３】図１３Ａは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドを含むＱＭ５のｓｉＲＮＡ構造を示す図である。図１３Ｂは、それらの化合物を用いた実験結果を示す図である。図１３Ｃは、交互に現れる２’メトキシパターンを含むｓｉＲＮＡと比較した、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡの血清安定性を示し、図１３ＤはそのＩＣ５０値を示す図である。
【図１４】図１４Ａは、ＬＮＡヌクレオチドを含むＱＭ５のｓｉＲＮＡ構造を示す図である。図１４Ｂは、それらの化合物を用いた実験結果を示す図である。
【図１５】タンデムｓｉＲＮＡ化合物の例およびその血清安定性の結果を示す図である。
【図１６】スターのｓｉＲＮＡ化合物の例およびその血清安定性の結果を示す図である。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃは、修飾の組合せを含むｓｉＲＮＡ化合物の例を示す図である。
【図１８】ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、Ｌ−ＤＮＡモチーフを、単独でまたはさらなる修飾と組み合わせて含む、オリゴヌクレオチドの例を示す図である。
【図２０】本発明による二重鎖化合物の調製に有用なさらなるオリゴヌクレオチド構造を示す図である。
【図２１】本明細書中に詳述する様々な構造中で使用する非塩基対合ヌクレオチド単量体の例を示す図である。
【図２２】本発明中の５’キャップ構造として有用なＣ６−アミノ−ホスフェート（Ｃ６−アミノ−Ｐｉ）部分の化学構造の画像を提供する図である。
【図２３】本発明による配列および構造モチーフを含む、ＲＮＡｉに有用な化合物の表を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、一般に、様々な遺伝子の発現をダウンレギュレーションする化合物、特に新規低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および様々な病状に罹患している対象の治療におけるこれら新規ｓｉＲＮＡの使用に関する。
【００８０】
したがって、一態様では、本発明は、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＲＨＯＡ、およびＤＵＯＸ１から選択される遺伝子の阻害に有用な新規オリゴヌクレオチド配列を提供し、そのｍＲＮＡポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１〜２、３〜５、６、１０〜１１、１２、１３、２４〜２６、４６および４７〜４８に記載する。オリゴヌクレオチド配列を表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に表し、センス鎖は、相補的なアンチセンス鎖と対をなしている。任意の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡの調製に有用な新規構造モチーフも提供する。本発明で使用する好ましいｓｉＲＮＡのリストを表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）およびＤ（Ｄ１〜Ｄ３４）に提供する。それぞれの遺伝子について、１９量体、２１量体および２３量体の配列の別の表があり、それらは、独自のアルゴリズムにおけるそのスコアに基づいて、ヒト遺伝子の発現を標的とするための最良配列として優先順位がつけられている。
【００８１】
本発明の遺伝子を阻害する分子および組成物を本明細書中に詳細に記載し、前記分子および／または組成物のうちの任意のものを、前記状態の任意のものに罹患している対象の治療に有益に用い得る。
【００８２】
本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、たとえば、活性を増加させ得る、安定性を増加させ得る、およびまたは毒性を最小限にし得る構造および修飾を保有する。本発明のｓｉＲＮＡの新規修飾は、標的遺伝子の発現、特に本明細書中に記載した標的遺伝子発現の抑制または低下に有用な二本鎖ＲＮＡに、有益に適用する。
【００８３】
特定の標的遺伝子および好ましい適応症の詳細を、本明細書中以下の表Ａに表す。
【表１−１】
0005646997.tif 000002
【表１−２】
0005646997.tif 000003
ＡＲＤＳ：急性呼吸窮迫症候群；ＡＭＤ：加齢黄斑変性症；ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患；ＡＲＦ：急性腎不全；ＳＣＩ：脊髄傷害、ＩＯＮ：虚血性眼球神経障害。
【００８４】
表Ａは、配列番号１〜４８として示したｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列のｇｉ（ＧｅｎｅＩｎｆｏ識別子）およびアクセッション番号を提供する。対応するポリペプチドは、配列番号４９〜９６に記載する。上記表Ａに記載した遺伝子を、以下により詳細に説明する。
【００８５】
（１）腫瘍タンパク質ｐ５３結合タンパク質、２（ＴＰ５３ＢＰ２）：
遺伝子の別名：ＢＢＰ；５３ＢＰ２；ＡＳＰＰ２；ｐ５３ＢＰ２；ＰＰＰ１Ｒ１３Ａ、ＡＩ７４６５４７、Ｘ９８５５０
この遺伝子は、ｐ５３相互作用タンパク質のＡＳＰＰ（ｐ５３のアポトーシス刺激タンパク質）ファミリーのメンバーをコードしている。対応するタンパク質は、タンパク質−タンパク質の相互作用に関与する４つのアンキリン反復およびＳＨ３ドメインを含有する。これは細胞質の核周囲領域に局在しており、ｐ５３ファミリーメンバーを含めた他の制御分子との相互作用によってアポトーシスおよび細胞成長を制御する。様々なアイソフォームをコードしている複数の転写変異体が、この遺伝子で見つかっている。ヒトＴＰ５３ＢＰ２のｍＲＮＡ転写変異体１および２のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１および２であり、対応するポリペプチド配列は、それぞれ配列番号４９〜５０に記載されている。
【００８６】
（２）ロイシンリッチリピートおよびデスドメイン含有（ＬＲＤＤ）
遺伝子の別名：ＰＩＤＤ；ＭＧＣ１６９２５；ＤＫＦＺｐ４３４Ｄ２２９、１２０００１１Ｄ０９Ｒｉｋ、ＡＵ０４２４４６
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、ロイシンリッチリピートおよびデスドメイン（ＬＲＤＤ）を含有する。このタンパク質は、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）結合デスドメイン（ＦＡＤＤ）およびＭＡＰ−キナーゼ活性化デスドメイン含有タンパク質（ＭＡＤＤ）などの他のデスドメインタンパク質と相互作用することが示されており、したがって、細胞死関連シグナル伝達プロセスにおいてアダプタータンパク質として機能し得る。この遺伝子のマウス対応物の発現は、腫瘍抑制因子ｐ５３によって陽性に制御されること、およびＤＮＡ損傷に応答して細胞アポトーシスを誘発することが見い出され、これは、この遺伝子の、ｐ５３依存性アポトーシスのエフェクターとしての役割を示唆している。明白に異なるアイソフォームをコードしている、３つの選択的スプライシングされた転写変異体が報告されている。ヒトＬＲＤＤ転写変異体２、１および３のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号３〜５に記載されており、対応するポリペプチド配列は、それぞれ配列番号５１〜５３に記載されている。
国際公開公報ＷＯ０１／１８０３７号は、ＬＲＤＤのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を開示している。国際公開公報ＷＯ０３／０８７３６８号は、遺伝子を阻害するための組成物および方法を教示している。
【００８７】
（３）チトクロムｂ−２４５、αポリペプチド（ＣＹＢＡ）
遺伝子の別名：チトクロムｂ軽鎖；チトクロムｂ（５５８）α−サブユニット；チトクロムｂ、αポリペプチド；フラボチトクロムｂ−５５８αポリペプチド；ｐ２２−ｐｈｏｘ。
チトクロムｂは、軽鎖（α）および重鎖（β）からなる。この遺伝子は、食細胞の殺微生物オキシダーゼ系の主要な構成要素として提案されている、軽αサブユニットをコードしている。この遺伝子中の突然変異は、活性食細胞によるこれらの細胞の殺微生物活性に重要なスーパーオキシドの産生が不全であることによって特徴づけられている、常染色体劣勢の慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）に関連している。ヒトＣＹＢＡのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号６に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号５４に記載されている。
国際公開公報ＷＯ２００５／１０３２９７号は、ｐ２２ｐｈｏｘ活性の変調を教示している。
【００８８】
（４）活性化転写因子３（ＡＴＦ３）
遺伝子の別名：ＡＴＦ３δＺｉｐ２；ＡＴＦ３δＺｉｐ２ｃ；ＡＴＦ３δＺｉｐ３、ＬＲＧ−２１、ＬＲＦ−１
ＡＴＦ３は、哺乳動物活性化転写因子／ｃＡＭＰ応答性配列結合（ＣＲＥＢ）タンパク質の転写因子ファミリーのメンバーである。２つの異なるアイソフォームをコードしている複数の転写変異体が、この遺伝子で見つかっている。より長いアイソフォームは、ＡＴＦ結合配列を有するプロモーターからの転写を、活性化するよりも抑制する。より短いアイソフォーム（δＺｉｐ２）は、ロイシンジッパータンパク質二量体化モチーフを欠き、ＤＮＡと結合せず、また、恐らくは阻害性補因子をプロモーターから離して隔絶することによって、転写を刺激する。選択的スプライシングが標的遺伝子の制御に生理的に重要であり得る可能性がある。ヒトＡＴＦ３転写変異体３、１および２のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号７〜９に記載されており、対応するポリペプチド配列はそれぞれ配列番号５５〜５７に記載されている。
米国特許公開第２００３／０１２５２７７号は、ＡＴＦ３に対するアンチセンスを教示している。国際公開公報ＷＯ２００５／１０３２９７号は、神経疾患を治療する方法に関する。
【００８９】
（５）カスパーゼ２、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（神経前駆細胞発現、発生的ダウンレギュレーション２（ＣＡＳＰ２）
遺伝子の別名：ＣＡＳＰ−２、ＩＣＨ−ＩＬ、ＩＣＨ−１Ｌ／１Ｓ、ＩＣＨ１、ＮＥＤＤ２；ＩＣＨ−１プロテアーゼ；ＮＥＤＤ２アポトーシス制御遺伝子；カスパーゼ２、アポトーシス関連システインプロテアーゼ。
この遺伝子はシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）ファミリーのメンバーであるタンパク質をコードしている。カスパーゼの逐次的な活性化は、細胞アポトーシスの実行段階に中心的な役割を果たす。カスパーゼは不活性の酵素前駆体として存在し、保存されたアスパラギン酸残基でタンパク質分解性のプロセッシングを受けて大小２つのサブユニットを生じ、これらが二量体化して活性酵素を形成する。このタンパク質のタンパク質分解的切断は、様々なアポトーシス刺激によって誘発される。この遺伝子の選択的スプライシングは、様々なアイソフォームをコードする複数の転写変異体をもたらす。ヒトＣＡＳＰ２転写変異体１および３のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１０〜１１に記載されており、対応するポリペプチド配列はそれぞれ配列番号５８〜５９に記載されている。
米国特許第６，０８３，７３５号は、Ｃａｓｐ２の選択的スプライシング産物に関する。米国特許第５，９２９，０４２号および第７，２２３，８５６号は、神経変性障害を治療するための特異的Ｃａｓｐ２アンチセンス化合物を開示している。国際公開公報ＷＯ０２／０２４７２０号は、Ｃａｓｐ２アンチセンスを教示している。国際公開公報ＷＯ０２／０３４２０１号は、糖尿病性網膜症を治療する方法を開示しており、ＷＯ０３／０５８２１号は、アポトーシス関連遺伝子の阻害に関し、ＷＯ２００４／００９７９７号は、Ｃａｓｐ２アンチセンスを教示しており、ＷＯ２００４／１０３３８９号は、細胞死を予防する方法に関する。
【００９０】
（６）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ３（ＮＯＸ３）
遺伝子の別名：ＧＰ９１〜３、ＭＧＣ１２４２８９、ｈｅｔ、ｎｍｆ２５０；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ触媒サブユニット様３、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ１；頭部傾斜
ＮＯＸ３などのＮＡＤＰＨオキシダーゼは、多くの細胞種中に見つかる形質膜結合酵素である。これらは、ＮＡＤＰＨを電子供与体として用いた酸素の１−電子還元によって、スーパーオキシドの産生を触媒する。ヒトＮＯＸ３のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号１２に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号６０に記載されている。
国際公開公報ＷＯ２００５／１１９２５１号は、聴覚損失を治療する方法に関する。
【００９１】
（７）ハラキリ、ＢＣＬ２相互作用タンパク質（ＢＨ３のみを含有）（ＨＲＫ）
遺伝子の別名：ＤＰ５、Ｂｉｄ３；ＢＣＬ２相互作用タンパク質；アポトーシス活性化剤Ｈｒｋ；ＢＨ３相互作用（ＢＣＬ２ファミリーと）ドメイン、アポトーシス作用剤。
アポトーシスの活性化剤として、Ｈｒｋは、死抑制タンパク質Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）との相互作用によってアポトーシスを制御する。ＨＲＫタンパク質は、ＢＩＫのＢＣＬ２相同性ドメイン−３（ＢＨ３）モチーフに類似していた８個のアミノ酸の領域以外は、他のＢＣＬ２ファミリーメンバーとの有意な相同性を欠く。ＨＲＫは、ＢＨ３ドメインを介してＢＣＬ２およびＢＣＬＸＬと相互作用するが、死促進ＢＣＬ２関連タンパク質ＢＡＸ、ＢＡＫ、またはＢＣＬＸＳとは相互作用しない。ＨＲＫは、ＢＣＬ２およびＢＣＬＸＬについて以前に報告されているものと類似のパターンで、細胞内オルガネラの膜に局在化する。ヒトＨＲＫのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号１３に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号６１に記載されている。
【００９２】
（８）補体成分１、ｑ小成分結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）
遺伝子の別名：ＧＣ１ＱＢＰ、ＨＡＢＰ１、ＳＦ２ｐ３２、ｇＣ１Ｑ−Ｒ、ｇＣ１ｑＲ、ｐ３２、ＲＰ２３−８３Ｉ１３．１、ＡＡ４０７３６５、ＡＡ９８６４９２、Ｄ１１Ｗｓｕ１８２ｅ、ＭＧＣ９１７２３；Ｃ１ｑ球状ドメイン結合タンパク質；ヒアルロナン結合タンパク質１；スプライシング因子ＳＦ２関連タンパク質。
ヒト補体小成分Ｃ１ｑは、血清補体系の最初の構成要素を与えるためにＣ１ｒおよびＣ１ｓと会合する。この遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ｃ１ｑ分子の球状頭部と結合してＣ１の活性化を阻害することが知られている。また、このタンパク質は、プレｍＲＮＡスプライシング因子ＳＦ２のｐ３２サブユニット、およびヒアルロン酸−結合タンパク質としても同定されている。ヒトＣ１ＱＢＰのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号１４に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号６２に記載されている。
【００９３】
（９）ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３（ＢＮＩＰ３）
遺伝子の別名：ＮＩＰ３、ＭＧＣ９３０４３；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤ相互作用タンパク質３、ミトコンドリア産物のためのＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３核遺伝子。
この遺伝子は、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋｄ相互作用タンパク質（ＢＮＩＰ）ファミリーのメンバーである。これは、ウイルス誘発性の細胞死の保護を担っているＥ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質、およびやはりアポトーシスプロテクターであるＢＣＬ２のＥ１Ｂ  １９ｋＤａ様配列と相互作用する。この遺伝子は、アポトーシス促進機能と関連づけられているＢＨ３ドメインおよび膜貫通ドメインを含有する。この遺伝子によってコードされている二量体ミトコンドリアタンパク質は、ＢＣＬ２の存在下でもアポトーシスを誘発することが知られている。ヒトＢＮＩＰ３のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号１５に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号６３に記載されている。
米国特許第５，８５８，６７８号は、ＢＮＩＰ３のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関する。国際公開公報ＷＯ２００４／００９７８０号は、虚血誘発性の細胞損傷を予防する方法を開示している。
【００９４】
（１０）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８（ＭＡＰＫ８）
遺伝子の別名：ＪＮＫ；ＪＮＫ１；ＰＲＫＭ８；ＳＡＰＫ１；ＪＮＫ１Ａ２；ＪＮＫ２１Ｂ１／２；ＪＮＫ１αプロテインキナーゼ；ＪＮＫ１βプロテインキナーゼ；ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ１；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８転写変異体２；プロテインキナーゼＪＮＫ１；ストレス活性化プロテインキナーゼＪＮＫ１。
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。ＭＡＰキナーゼは、複数の生化学的シグナルの組込み点として作用し、増殖、分化、転写制御および発生などの様々な細胞プロセスに関与している。このキナーゼは様々な細胞刺激によって活性化され、特異的転写因子を標的とし、したがって、細胞刺激に応答して前初期遺伝子発現を媒介する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）によるこのキナーゼの活性化が、ＴＮＦ−α誘発性アポトーシスに必要であることが見い出されている。また、このキナーゼは、チトクロムｃ媒介性の細胞死経路に関連していると考えられているＵＶ照射誘発性アポトーシスにも関与している。この遺伝子のマウス対応物の研究により、Ｔ細胞増殖、アポトーシスおよび分化におけるその役割が示唆された。明白に異なるアイソフォームをコードしている、４つの選択的スプライシングされた転写変異体が報告されている。ＭＡＰＫ８転写変異体２、１、３および４のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１６〜１９に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号６４〜６７に記載されている。
国際公開公報ＷＯ９９／０９２１４号および米国特許第５，８７７，３０９号は、ＪＮＫファミリーメンバーに対するアンチセンスを開示している。
【００９５】
（１１）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）
遺伝子の別名：ＣＳＢＰ１；ＣＳＢＰ２；ＣＳＰＢ１；ＥＸＩＰ；Ｍｘｉ２；ＰＲＫＭ１４；ＰＲＫＭ１５；ＲＫ；ＳＡＰＫ２Ａ；ｐ３８；ｐ３８α；ＭＧＣ１０２４３６；ｐ３８ＭＡＰＫ；ＣＳＢＰ；Ｅｘｉｐ；Ｈｏｇ；ＭＧＣ１０５４１３；ｐ３８Ｈｏｇ；Ｃｓａｉｄｓ結合タンパク質；ＭＡＰキナーゼＭｘｉ２；ＭＡＸ相互作用タンパク質２；サイトカイン抑制性抗炎症薬結合タンパク質；ｐ３８ＭＡＰキナーゼ；ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ；ｐ３８αＥｘｉｐ；ストレス活性化プロテインキナーゼ２Ａ、ｔＲＮＡ合成酵素補因子ｐ３８。
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、複数の生化学的シグナルの組込み点として作用し、増殖、分化、転写制御および発生などの様々な細胞プロセスに関与している、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。このキナーゼは、様々な環境ストレスおよび炎症誘発サイトカインによって活性化される。活性化は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）によるそのリン酸化、またはＭＡＰ３Ｋ７ＩＰ１／ＴＡＢ１タンパク質とのその相互作用によって始動されるその自己リン酸化を必要とする。このキナーゼの基質には、転写調節因子ＡＴＦ２、ＭＥＦ２Ｃ、およびＭＡＸ、細胞周期制御因子ＣＤＣ２５Ｂ、ならびに腫瘍抑制因子ｐ５３が含まれ、これにより、ストレス関連転写および細胞周期の制御、ならびに遺伝毒性のストレス応答におけるその役割が示唆される。明白に異なるアイソフォームをコードしている、この遺伝子の４つの選択的スプライシングされた転写変異体が報告されている。ヒトＭＡＰＫ１４転写変異体２、４、１および３のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２０〜２３に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号６８〜７１に記載されている。
国際公開公報ＷＯ２０００／５９９１９号およびＷＯ２００５／０１６９４７ならびに米国特許第６，１４０，１２４号および第６，４４８，０７９号は、ｐ３８アンチセンス阻害を教示している。
【００９６】
（１２）Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１；ＲＡＣ１）
遺伝子の別名：ＭＧＣ１１１５４３、ＭＩＧ５、ＴＣ−２５、ｐ２１−Ｒａｃ１；遊走誘発遺伝子５；遊走誘発タンパク質５；ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１；ｒｈｏファミリー、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１）
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＲＡＳスーパーファミリーに属するＧＴＰａｓｅである。このスーパーファミリーのメンバーは、細胞成長の調節、細胞骨格の再編成、およびプロテインキナーゼの活性化を含めた、多様なアレイの細胞事象を制御する。この遺伝子のいくつかの選択的スプライシングされた転写変異体が記載されているが、これらの変異体の一部の完全長の性質は決定されていない。ヒトＲＡＣ１転写変異体１ｃ、１ｂおよび１のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２４〜２６に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号７２〜７４に記載されている。
米国特許第６，１８０，５９７号は、内皮細胞の一酸化窒素合成酵素レベルを増加させるｒｈｏＧＴＰａｓｅ阻害剤に関する。国際公開公報ＷＯ０１／１５７３９号は、ｒｈｏファミリーメンバーのアンチセンス変調を教示している。国際公開公報ＷＯ２００４／０４２０５２号は、ＴＮＦ−αの分泌を抑制する方法を教示している。
【００９７】
（１３）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３Ｂ）
遺伝子の別名：７３３０４１４Ｆ１５Ｒｉｋ、８４３０４３１Ｈ０８Ｒｉｋ、Ｃ８６１４２、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ−３β、ＧＳＫ３
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）は、ホスホリル化および失活化グリコーゲン合成酵素として最初に同定された、プロリン指向性セリン−スレオニンキナーゼである。２つのアイソフォーム、すなわちα（ＧＳＫ３Ａ；ＭＩＭ６０６７８４）およびβが、高い度合のアミノ酸相同性を示す（ＳｔａｍｂｏｌｉｃおよびＷｏｏｄｇｅｔｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、１９９４、３０３（第３部）：７０１〜４）。ＧＳＫ３Ｂは、エネルギー代謝、神経細胞発生、および身体パターン形成に関与している（Ｐｌｙｔｅ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１９９２．１１１４（２〜３）：１４７〜６２）。ヒトＧＳＫ３ＢのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号２７に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号７５に記載されている。
米国特許第６，３２３，０２９号は、ＧＳＫ３Ｂのアンチセンス阻害に関する。
【００９８】
（１４）プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ、リガンド開口型イオンチャネル、７（Ｐ２ＲＸ７）
遺伝子の別名：ＭＧＣ２００８９、Ｐ２Ｘ７、ＡＩ４６７５８６；ＡＴＰ受容体；Ｐ２Ｘプリン受容体７；Ｐ２Ｘ７受容体；Ｐ２Ｚ受容体；プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ７。
この遺伝子の産物は、ＡＴＰのプリン受容体のファミリーに属する。この受容体はリガンド開口型イオンチャネルとして機能し、大分子に透過性の膜孔の形成を介したマクロファージのＡＴＰ依存性溶解を担っている。細胞質中のＡＴＰによるこの核内受容体の活性化は、細胞活性を遺伝子発現の変化に連結させることができる機構であり得る。様々なアイソフォームをコードする、複数の選択的スプライシングされた変異体が同定されているが、一部はナンセンス媒介分解（ＮＭＤ）基準に当てはまる。ヒトＰ２ＲＸ７のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号２８に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号７６に記載されている。
【００９９】
（１５）一過性受容体電位陽イオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー２（ＴＲＰＭ２）
遺伝子の別名：ＥＲＥＧ１、ＫＮＰ３、ＬＴＲＰＣ２、ＭＧＣ１３３３８３、ＮＵＤＴ９Ｈ、ＮＵＤＴ９Ｌ１、ＴＲＰＣ７、９８３０１６８Ｋ１６Ｒｉｋ、Ｃ７９１３３、Ｔｒｐ７、Ｔｒｒｐ７；エストロゲン応答性配列関連遺伝子１；長期一過性受容体電位チャネル２；一過性受容体電位チャネル７、一過性受容体電位陽イオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー２（Ｔｒｐｍ２）；一過性受容体電位チャネル７；一過性受容体タンパク質７。
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、遊離細胞内ＡＤＰ−リボースによって制御されているカルシウム透過性陽イオンチャネルである。コードされているタンパク質は酸化的ストレスによって活性化され、細胞死に対する感受性を与える。ヒトＴＲＰＭ２のポリヌクレオチド配列は配列番号２９に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号７７に記載されている。（異なるアイソフォームＳおよびＬをコードしている２つの転写変異体がこの遺伝子で見つかっている。Ｓ変異体（配列番号３０）は、配列決定エラーを含有し、存在しないため、ＮＣＢＩによって削除された）。
【０１００】
（１６）ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（ＰＡＲＧ）
遺伝子の別名：ＰＡＲＧ９９；ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ
ＰＡＲＧは、染色体タンパク質の可逆的共有結合モディファイヤーであるポリ（ＡＤＰ−リボース）の異化を担っている主要な酵素である。このタンパク質は多くの組織中に見つかり、より小さな活性産物を生じるタンパク質分解に供され得る。ヒトＰＡＲＧのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号３１に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号７９に記載されている。
【０１０１】
（１７）ＣＤ３８分子（ＣＤ３８）
遺伝子の別名：Ｔ１０、Ｃｄ３８−ｒｓ１；ＡＤＰ−リボシル環化酵素／環状ＡＤＰ−リボース加水分解酵素；ＣＤ３８抗原；ＣＤ３８抗原（ｐ４５）；環状ＡＤＰ−リボース加水分解酵素。
ＣＤ３８は、細胞および組織、特に白血球中で広く発現されている新規の多機能的エクトエンザイムである。また、ＣＤ３８は、細胞接着、シグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達においても機能する。ヒトＣＤ３８のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号３２に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８０に記載されている。
【０１０２】
（１８）ＳＴＥＡＰファミリーメンバー４（ＳＴＥＡＰ４）
遺伝子の別名：ＤＫＦＺｐ６６６Ｄ０４９、ＦＬＪ２３１５３、ＳＴＡＭＰ２、ＴＩＡＲＰ、ＴＮＦＡＩＰ９、１１１００２１Ｏ１７Ｒｉｋ、ＡＩ４８１２１４、ドゥドゥリン（ｄｕｄｕｌｉｎ）４；６回膜貫通前立腺タンパク質２；腫瘍壊死因子α−誘発タンパク質９；腫瘍壊死α誘発脂肪関連タンパク質、ＴＮＦα誘発脂肪関連タンパク質；腫瘍壊死因子α誘発タンパク質９。
膜タンパク質は、脂肪組織中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６によって誘発される。ＩＬ−６およびＴＮＦ−αはどちらも脊髄傷害モデルにおいて制御されていないことが示され（Ａｈｎ他、ＢＢＲＣ、２００６、３４８（２）：５６０〜７０）、アポトーシス事象を促進すると考えられている。ヒトＳＴＥＡＰ４のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号３３に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８１に記載されている。
【０１０３】
（１９）骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）
遺伝子の別名：ＢＭＰ２Ａ、ＡＩ４６７０２０、ＢＣ０６９２１４ＣＲ６１８４０７、Ｍ２２４８９
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦＢ）スーパーファミリーに属する。コードされているタンパク質はジスルフィド結合したホモ二量体として作用し、骨および軟骨の形成を誘発する。ヒトＢＭＰ２のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号３４に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８２に記載されている。
本出願の譲受人に共同譲渡された国際公開公報ＷＯ２００５／０４１８５７号は、虚血および神経系疾患を治療するためのＢＭＰ阻害に関する。
【０１０４】
（２０）ギャップ結合タンパク質、α１、４３ｋＤａ（コネキシン４３、ＧＪＡ１）
遺伝子の別名：ＣＸ４３、ＤＦＮＢ３８、ＧＪＡＬ、ＯＤＤ、ＯＤＤＤ、ＯＤＯＤ、ＳＤＴＹ３、ＭＧＣ９３６１０、ＡＵ０４２０４９、ＡＷ５４６２６７、Ｃｎｘ４３、ＣＸ４３α１、Ｇｊａ−１、Ｎｐｍ１、ギャップ結合タンパク質、α様；眼歯指形成異常（ＩＩＩ型合指症）、ギャップ結合タンパク質α１  ４３ｋＤ；ギャップ結合タンパク質、α１、４３ｋＤ、α１コネキシン。
ギャップ結合タンパク質α１は、コネキシン遺伝子のタンパク質ファミリーのメンバーであり、心臓におけるギャップ結合の構成要素であり、心臓の同期収縮および胚発生において重大な役割を持つと考えられている。コネキシン４３は、心筋の細胞−細胞カップリングを制御するいくつかのプロテインキナーゼの標的となっている。関連するイントロンの無いコネキシン４３擬似遺伝子であるＧＪＡ１Ｐは、染色体５にマッピングされている。ヒトＧＪＡ１のｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号３５に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８３に記載されている。
米国特許第７，０９８，１９０号は、とりわけ創傷および脊髄傷害を治療するためのアンチセンス化合物を教示している。
【０１０５】
（２１）ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ）
遺伝子の別名：ＤＡＰ１２、ＫＡＲＡＰ、ＰＬＯＳＬ、Ｌｙ８３；ＤＮＡＸ−活性化タンパク質１２；キラー活性化受容体関連タンパク質。
この遺伝子は、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する膜貫通シグナル伝達ポリペプチドをコードしている。このタンパク質は、キラー細胞阻害受容体（ＫＩＲ）の膜糖タンパク質ファミリーと会合して、活性化シグナル伝達配列として作用し得る。このタンパク質は、ζ鎖（ＴＣＲ）関連プロテインキナーゼ７０ｋＤａ（ＺＡＰ−７０）および脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）と結合して、シグナル伝達、骨モデリング、脳ミエリン化、および炎症において役割を果たし得る。この遺伝子内の突然変異は、硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨形成異常症（ＰＬＯＳＬ）と関連づけられており、那須−ハコラ病としても知られている。その推定上の受容体である骨髄性細胞２上で発現される始動性受容体（ＴＲＥＭ２）もＰＬＯＳＬを引き起こす。明白に異なるアイソフォームをコードしている２つの選択的転写変異体が、この遺伝子で同定されている。他の選択的スプライシング変異体が記載されているが、その完全長の性質は決定されていない。ヒトＴＹＲＯＢＰ転写変異体１および２のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号３６〜３７に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８４〜８５に記載されている。
【０１０６】
（２２）結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）
遺伝子の別名：ＣＣＮ２、ＨＣＳ２４、ＩＧＦＢＰ８、ＭＧＣ１０２８３９、ＮＯＶ２、ＣＴＧＲＰ、Ｆｉｓｐ１２、Ｈｃｓ２４、ｆｉｓｐ−１２；肥大性軟骨細胞特異的タンパク質２４；インスリン様成長因子結合タンパク質８、ＦＩＳＰ−１２タンパク質；線維芽細胞誘発性分泌タンパク質；線維芽細胞誘発性分泌タンパク質；肥大性軟骨細胞特異的遺伝子産物２４。
血管内皮細胞によって分泌された主要な結合組織マイトジェン誘引物質である。軟骨細胞の増殖および分化を促進する。ヒトＣＴＧＦのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号３８に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８６に記載されている。
【０１０７】
（２３）分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）
遺伝子の別名：ＡＡ９６０５３５、ＡＩ７９０４０５、Ａｐｌ−１、ＢＮＳＰ、ＢＳＰＩ、Ｂｓｐ、ＥＴＡ−１、Ｅｔａ、ＯＰ、Ｏｐｎ、Ｏｐｎｌ、Ｒｉｃ、Ｓｐｐ−１、ミノポンチン（ｍｉｎｏｐｏｎｔｉｎ）、ＯＳＰ；４４ｋＤａ骨リンタンパク質；４４ｋＤａ骨リンタンパク質；骨シアロタンパク質Ｉ；オステオポンチン、初期Ｔリンパ球活性化１。
ＳＳＰ１は、Ｉ型免疫をもたらす経路に必須の、インターフェロン−γおよびインターロイキン−１２の産生の増強ならびにインターロイキン−１０の産生の減少に関与しているサイトカインとして作用する分泌タンパク質である。ヒトＳＰＰ１転写変異体１、２および３のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号３９〜４１に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号８７〜８９に記載されている。
米国特許第６，４５８，５９０号ならびに米国特許公開第２００４／０１４２８６５号および第２００６／０２５２６８４号は、オステオポンチンの阻害に関する。
【０１０８】
（２４）レティキュロン４受容体（ＲＴＮ４Ｒ）
遺伝子の別名：ＮＧＲ、ＮＯＧＯＲ、ＮｇＲ１；Ｎｏｇｏ−６６受容体；ＵＮＱ３３０／ＰＲＯ５２６；ｎｏｇｏ受容体；レティキュロン４受容体前駆体。
この遺伝子は、レティキュロン４、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質およびミエリン関連糖タンパク質の受容体をコードしている。この受容体は軸索成長の阻害を媒介し、成人の中枢神経系において、軸索の再生および柔軟性の制御に役割を果たし得る。ヒトＲＴＮ４ＲのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号４２に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号９０に記載されている。
【０１０９】
（２５）アネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）
遺伝子の別名：ＡＮＸ２、ＡＮＸ２Ｌ４、ＣＡＬ１Ｈ、ＬＩＰ２、ＬＰＣ２、ＬＰＣ２Ｄ、Ｐ３６、ＰＡＰ−ＩＶ；アネキシンＩＩ、カルパクチンＩ重ポリペプチド；クロモビンディン（ｃｈｒｏｍｏｂｉｎｄｉｎ）８；リポコルチンＩＩ；胎盤抗凝固タンパク質ＩＶ。
この遺伝子は、アネキシンファミリーのメンバーをコードしている。このカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質ファミリーのメンバーは、細胞成長の制御およびシグナル伝達経路において役割を果たす。このタンパク質は自己分泌因子として機能し、これは破骨細胞形成および骨吸収を高める。この遺伝子は、それぞれ染色体４、９および１０上に位置する３つの擬似遺伝子を有する。様々なアイソフォームをコードしている、複数の選択的スプライシングされた転写変異体が、この遺伝子で見つかっている。ヒトＡＮＸＡ２転写変異体１、３および２のポリヌクレオチド配列は配列番号４３〜４５に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号９１〜９３に記載されている。
【０１１０】
（２６）ｒａｓ相同体遺伝子ファミリー、メンバーＡ（ＲＨＯＡ）
遺伝子の別名：ＡＲＨ１２、ＡＲＨＡ、ＲＨＯ１２、ＲＨＯＨ１２、アメフラシ属（Ａｐｌｙｓｉａ）ｒａｓ関連相同体１２；癌遺伝子ＲＨＯ  Ｈ１２；低分子量ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＡ。
ＲＨＯＡは、張力線維の形成においてアクチン細胞骨格を制御することが知られている低分子量ＧＴＰａｓｅタンパク質である。これは、エフェクタータンパク質、すなわち軸索再生の阻害に到るｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）に作用する。Ｒｈｏ−Ａ拮抗剤Ｃ３トランスフェラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ミエリン基質上の軸索成長が増強される一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は有効でなかった。ヒトＲＨＯＡのｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は配列番号４６に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号９４に記載されている。
【０１１１】
（２７）二重オキシダーゼ１（ＤＵＯＸ１）
遺伝子の別名：ＬＮＯＸ１、ＭＧＣ１３８８４０、ＭＧＣ１３８８４１、ＮＯＸＥＦ１、ＴＨＯＸ１  ＮＡＤＰＨ甲状腺オキシダーゼ１；フラビンタンパク質ＮＡＤＰＨオキシダーゼ；ニコンチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ。
この遺伝子によってコードされているタンパク質は、糖タンパク質かつＮＡＤＰＨオキシダーゼファミリーのメンバーである。甲状腺ホルモンの合成は、甲状腺濾胞細胞の頂端膜に位置するタンパク質複合体によって触媒される。この複合体は、このコードされたタンパク質およびＤＵＯＸ２が含まれる、ヨウ化物トランスポーター、チロペルオキシダーゼ、およびペルオキシドの産生系を含有する。このタンパク質は、ペルオキシダーゼ相同性ドメインおよびｇｐ９１ｐｈｏｘドメインをどちらも有する。同じタンパク質をコードしている２つの選択的スプライシングされた転写変異体が、この遺伝子について記載されている。ヒトＤＵＯＸ１転写変異体１および２のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号４７〜４８に記載されており、対応するポリペプチド配列は配列番号９５〜９６に記載されている。
【０１１２】
「アポトーシス促進ポリペプチド」とは、スプライシング変異体、アイソフォーム、相同分子種、またはパラログなどを含めた、上記に記載した遺伝子のうちの任意のものによってコードされているポリペプチドをいう。
【０１１３】
一態様によれば、本発明は、非修飾および修飾されたヌクレオチドを含む阻害性オリゴヌクレオチド化合物を提供する。化合物は、糖修飾、塩基修飾およびヌクレオチド間結合修飾からなる群から選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ、および、修飾ヌクレオチド、たとえば、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸；ＰＮＡ（ペプチド核酸）；アラビノシド；ＰＡＣＥ（ホスホノアセテートおよびその誘導体）、鏡像異性体ヌクレオチド、または６炭糖類似体を有するヌクレオチド（たとえば六単糖もしくはモルホリノ）を含めたＬＮＡ（ロックされた核酸）を含有し得る。
【０１１４】
一実施形態では、化合物は、少なくとも１つのリボヌクレオチドの糖部分上に２’修飾を含む（「２’糖修飾」）。特定の実施形態では、化合物は、２’０−アルキルもしくは２’−フルオロもしくは２’Ｏ−アリルまたは任意の他の２’糖修飾を、任意選択で代替位置上に含む。好ましい２’修飾は、２’Ｏ−メチル（２’メトキシ、２’ＯＭｅ）である。
他の安定化する修飾も可能である（たとえば、オリゴマーの３’または５’末端上に付加される修飾ヌクレオチド）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの主鎖は修飾されており、リン酸−Ｄ−リボース部分を含むが、チオリン酸−Ｄ−リボース部分、リン酸ジエステルＬ−リボース部分、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋主鎖（５’−２’とも呼び得る）、ＰＡＣＥ修飾ヌクレオチド間結合または任意の他の種類の修飾も含有し得る。
【０１１５】
他の修飾には、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端への付加が含まれる。そのような末端修飾は、脂質、ペプチド、糖または他の分子であり得る。
【０１１６】
また、本発明は、様々な遺伝子の発現をダウンレギュレーションする化合物、特に新規低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに様々な疾患および病状の治療におけるこれらの新規ｓｉＲＮＡの使用にも関する。治療する特定の疾患および状態は、急性腎不全（ＡＲＦ）、聴覚損失、緑内障、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性の肺や呼吸器の傷害、肺、腎臓、骨髄、心臓、膵臓、角膜または肝移植を含めた臓器移植における傷害（たとえば虚血再灌流傷害）、眼球虚血状態、臓器移植腎毒性、脊髄傷害、褥瘡、ドライアイ症候群、口腔粘膜炎、ＩＯＮならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【０１１７】
本発明で使用する好ましいｓｉＲＮＡのリストを、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に提供する。それぞれの遺伝子について、１９量体、２１量体および２３量体の配列の別のリストがあり、それらは、独自のアルゴリズムにおけるそのスコアに基づいて、ヒト遺伝子の発現を標的とするための最良配列として優先順位がつけられている。また、２１量体または２３量体のｓｉＲＮＡ配列は、本明細書中に開示する１９量体の配列の５’および／または３’伸長によっても作製する。そのような伸長は、好ましくは、対応するｍＲＮＡ配列に相補的である。特定の２３量体オリゴマーは、優先順位が対応する１９量体の順序であるこの方法によって考案した。
【０１１８】
構造モチーフ
本発明によれば、ｓｉＲＮＡ化合物は、構造（Ａ）〜（Ｈ）に記載の以下の修飾のうちの１つに従って、またはタンデムｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｓｔａｒとして、化学的およびまたは構造的に修飾する。
一態様では、本発明は、構造（Ａ）として記載する化合物を提供する：
（Ａ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’（センス鎖）
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続したヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘの配列は、表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）のうちの任意の１つに記載されており；ただし、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれが、５０％を超える非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドを含まない］。
【０１１９】
本発明の好ましいアンチセンス配列は、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＲＡＣ１、ＲＨＯＡおよびＤＵＯＸ１に向けられた新規ｓｉＲＮＡ化合物であり、そのｍＲＮＡポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１〜２、３〜５、６、１０〜１１、１２、１３、２４〜２６、４６および４７〜４８に記載する。
特定の実施形態では、本発明は、構造Ｂ（表Ｄの両方の鎖で交互に現れる２’−Ｏ−メチル修飾を有する構造）を有する化合物を提供する：
（Ｂ）５’  （Ｎ）ｘ  ３’    アンチセンス鎖
３’  （Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が、共有結合によって次のＮまたはＮ’と結合した非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドである、オリゴマーであり；
ｘおよびｙのそれぞれ＝１９、２１または２３であり、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは完全に相補的であり
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれ中の交互に現れるリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドの糖残基中に２’−Ｏ−メチル修飾がもたらされるように修飾されており；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに相補的な配列であり；（Ｎ）ｘの配列は、表Ｄのうちの任意の１つに表す］。
【０１２０】
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、独立して、３’および５’末端でリン酸化されているまたはリン酸化されていない。
本発明の特定の実施形態では、交互に現れるリボヌクレオチドは、化合物のアンチセンスおよびセンス鎖の両方が修飾されている。
【０１２１】
ｘおよびｙのそれぞれ＝１９または２３である特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの５’および３’末端のそれぞれのＮは修飾されており；
（Ｎ’）ｙの５’および３’末端のそれぞれのＮ’は修飾されていない。
ｘおよびｙのそれぞれ＝２１である特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの５’および３’末端のそれぞれのＮは修飾されておらず；
（Ｎ’）ｙの５’および３’末端のそれぞれのＮ’は修飾されている。
【０１２２】
特定の実施形態では、ｘおよびｙ＝１９である場合、ｓｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）基が、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘの第１、第３、第５、第７、第９、第１１、第１３、第１５、第１７および第１９個目のヌクレオチド上に存在し、その全く同じ修飾、すなわち２’−ＯＭｅ基が、センス鎖（Ｎ’）ｙの第２、第４、第６、第８、第１０、第１２、第１４、第１６および第１８個目のヌクレオチドに存在するように、修飾されている。様々な実施形態では、これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物は、両末端で平滑末端化されている。
【０１２３】
ｓｉＲＮＡの新規構造Ｃ〜Ｈ
以下の構造モチーフがｓｉＲＮＡ化合物の設計に有用である。
一部の実施形態では、本発明は、構造（Ｃ）を有する化合物を提供する：
（Ｃ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドと結合しているオリゴマーであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは修飾されていないか、または、（Ｎ）ｘは、交互に現れる修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含み；それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央位置に位置するリボヌクレオチドは、修飾されているまたは修飾されていない、好ましくは修飾されておらず；
（Ｎ’）ｙは、末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、鏡像異性体ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙ中の複数のヌクレオチドが修飾されている場合は、修飾ヌクレオチドは連続していてよく；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに対して実質的に相補的な配列を含み；（Ｎ）ｘの配列は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続したリボヌクレオチドに対して実質的に相補的なアンチセンス配列を含む］。
【０１２４】
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列を、表Ａ〜Ｄのいずれか１つに表す。
特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘ中で、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されていない。したがって、ｘ＝１９である化合物では、（Ｎ）ｘは、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置６にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１４にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置６にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１４にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、４、６、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１４、１６、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１５にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置７にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置８にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置９にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１０にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１１にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１２にさらに含み得る。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１５、１７および１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１つの脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを、たとえば位置１３にさらに含み得る。
【０１２５】
さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的遺伝子と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む。特定の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置５、６、または１４に単一のヌクレオチドミスマッチを含む。構造（Ｃ）の一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の一方または両方の少なくとも２個のヌクレオチドは、２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドが交互し、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されておらず；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個のヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている（本明細書中で構造Ｉとして記載する）。他の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドが交互し、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されておらず；（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｙの中央位置に位置するさらなるヌクレオチドは、その糖上で２’−Ｏ−メチルで修飾され得る。別の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドが交互し、（Ｎ’）ｙ中で、５’末端の４個の連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２個もしくは３個の連続したヌクレオチドは、３’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１２６】
構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中で、少なくとも１つの位置が脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを含み、好ましくは５つの位置が脱塩基または反転脱塩基擬似ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、以下の位置が脱塩基または反転脱塩基を含む：位置１および１６〜１９、位置１５〜１９、位置１〜２および１７〜１９、位置１〜３および１８〜１９、位置１〜４および１９ならびに位置１〜５。（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドをさらに含み得る。
【０１２７】
構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中で、少なくとも１つの位置のヌクレオチドは、鏡像異性体ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドを含む。
【０１２８】
構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは鏡像異性体ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−ＤＮＡヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡはＬ−デオキシリボシチジンである。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１８にＬ−ＤＮＡを含む。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１７および１８にＬ−ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２ならびに位置１７および１８の一方または両方にＬ−ＤＮＡ置換を含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’−Ｏ−メチルＤＮＡなどの５’末端キャップヌクレオチドまたはオーバーハングなどの脱塩基もしくは反転脱塩基擬似ヌクレオチドをさらに含む。
【０１２９】
さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、標的遺伝子と比較して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む。特定の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置６、１４、または１５に単一のヌクレオチドミスマッチを含む。
【０１３０】
さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１５にＤＮＡを含み、位置１７および１８の一方または両方にＬ−ＤＮＡを含む。その構造中で、位置２にＬ−ＤＮＡまたは脱塩基擬似ヌクレオチドが含まれ得る。
【０１３１】
ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３である、構造Ｃの他の実施形態が想定される。これらの実施形態では、上述した（Ｎ’）ｙの修飾は、位置１５、１６、１７、１８上である代わりに、２１量体では位置１７、１８、１９、２０上にあり、２３量体では位置１９、２０、２１、２２上にある。同様に、位置１７および１８の一方または両方の修飾は、２１量体では位置１９または２０の一方または両方にあり、２３量体では位置２１および２２の一方または両方にある。１９量体中のすべての修飾を、２１および２３量体について同様に調節する。
【０１３２】
構造（Ｃ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ’）ｙ中で、３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって連結している。好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する２’−５’ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、３’−Ｏ−メチル糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含む。構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中で、位置１５、１６、１７、１８および１９の２個以上の連続したヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の位置１７および１８のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されている。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の位置１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されている。
【０１３３】
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２にＬ−ＤＮＡを含み、位置１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８に２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８に２’−５’ヌクレオチド間結合を含み、５’末端キャップヌクレオチドを含む。
【０１３４】
構造（Ｃ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ’）ｙ中で、どちらかの末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したヌクレオチド、または５’および３’末端のそれぞれの２〜８個の修飾ヌクレオチドは、独立して、鏡像異性体ヌクレオチドである。一部の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。鏡像異性体ヌクレオチドは、糖もしくは塩基部分またはヌクレオチド間結合中でさらに修飾されていてもよい。
【０１３５】
構造（Ｃ）の好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドまたは３’末端の２個もしくは３個の連続したヌクレオチドは、Ｌ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１３６】
構造（Ｃ）の他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、どちらかの末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したリボヌクレオチド、または５’および３’末端のそれぞれの２〜８個の修飾ヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分を含む（２’−ＯＭｅ）。
【０１３７】
一連の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３、４または５個の連続したヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾を含む。別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１３８】
構造（Ｃ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、どちらかの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、または５’および３’末端のそれぞれの２〜８個の修飾ヌクレオチドは、独立して、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドはロックされた核酸（ＬＮＡ）である。２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）がＬＮＡの一種である（以下参照）。
様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端または３’および５’末端の両方に修飾ヌクレオチドを含む。
【０１３９】
構造（Ｃ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の一方または両方の少なくとも２個のヌクレオチドは、Ｐ−エトキシ主鎖修飾によって結合されている。特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドが交互し、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央位置に位置するリボヌクレオチドは修飾されておらず；（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の４個の連続したヌクレオチドは、３つのＰ−エトキシ主鎖修飾によって結合されている。別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つのＰ−エトキシ主鎖修飾によって結合されている。
【０１４０】
構造（Ｃ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、５’および３’末端のそれぞれの２、３、４、５、６、７または８個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、鏡像異性体ヌクレオチド、２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されたヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチドまたは二環状ヌクレオチドである。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の修飾は同一である。好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾は、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾とは異なる。具体的な一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。別の具体的な実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続したヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドが交互し、それぞれの修飾リボヌクレオチドは、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドは修飾されていないか、または（Ｎ）ｘ中のリボヌクレオチドは修飾されていない。
【０１４１】
構造（Ｃ）の別の実施形態では、本発明は、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドは修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドが交互し、それぞれの修飾リボヌクレオチドが、その糖上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、（Ｎ）ｘの中央に位置するリボヌクレオチドが修飾されておらず；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個のヌクレオチドが、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドがＥＮＡなどのＬＮＡである、化合物を提供する。
構造（Ｃ）の別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含み、（Ｎ’）ｙの３’末端の２個の連続したヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘが非修飾リボヌクレオチドからなり；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドが、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続したヌクレオチドがＥＮＡなどのＬＮＡである、化合物を提供する。
【０１４３】
構造（Ｃ）の他の実施形態によれば、（Ｎ’）ｙ中で、５’もしくは３’末端ヌクレオチド、またはどちらかの末端の２、３、４、５もしくは６個の連続したヌクレオチド、または５’および３’末端のそれぞれの１〜４個の修飾ヌクレオチドは、独立して、ホスホノカルボキシレートまたはホスフィノカルボキシレートヌクレオチドである（ＰＡＣＥヌクレオチド）。一部の実施形態では、ＰＡＣＥヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。一部の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、５’および３’末端のそれぞれの１個または２個の連続したヌクレオチドは、ＰＡＣＥヌクレオチドである。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は、どちらも参考として組み込まれている、米国特許第６，６９３，１８７号および第７，０６７，６４１号に開示されている。
さらなる実施形態では、本発明は、構造（Ｄ）を有する化合物を提供する：
（Ｄ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドと結合しているオリゴマーであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘは、３’末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙは、５’末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれ中で、修飾および非修飾のヌクレオチドは交互に現れず；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに対して実質的に相補的な配列であり；（Ｎ）ｘの配列は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続したリボヌクレオチドに対して実質的な同一性を有するアンチセンス配列を含む］。
【０１４４】
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列および相補的な（Ｎ’）ｙを、表Ａ〜Ｄのいずれか１つに表す。
構造（Ｄ）の一実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘは、２個の連続したヌクレオチドが１つの２’−５’ヌクレオチド間結合によって３’末端で結合されている、非修飾リボヌクレオチドを含み；（Ｎ’）ｙは、２個の連続したヌクレオチドが１つの２’−５’ヌクレオチド間結合によって５’末端で結合されている、非修飾リボヌクレオチドを含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘは、３’末端の３個の連続したヌクレオチドが、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって一緒に結合されている、非修飾リボヌクレオチドを含み；（Ｎ’）ｙは、５’末端の４個の連続したヌクレオチドが３つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって一緒に結合されている、非修飾リボヌクレオチドを含む（本明細書中で構造ＩＩとして記載する）。
【０１４６】
構造（Ｄ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって連結されている。
【０１４７】
構造（Ｄ）の好ましい一実施形態によれば、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｘの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｘの３’末端の２個のヌクレオチドも３’−Ｏ−メチル修飾を含み得る。
【０１４８】
構造（Ｄ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、鏡像異性体ヌクレオチドである。一部の実施形態では、鏡像体はＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１４９】
構造（Ｄ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分を含む（２’−ＯＭｅ）。
【０１５０】
構造（Ｄ）の好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。構造（Ｄ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１０個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。構造（Ｄ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１３個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１５１】
構造（Ｄ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。
【０１５２】
構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１５３】
構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１５４】
同じ鎖の３’および５’末端のそれぞれが修飾ヌクレオチドを含む実施形態では、５’および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾とは異なる。具体的な一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。
【０１５５】
構造（Ｄ）の具体的な一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｙの３’末端の２個の連続したヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。さらに、化合物は、（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続した２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドをさらに含み得る。
【０１５６】
構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドとは異なる。たとえば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドである。
【０１５７】
さらなる実施形態では、本発明は、構造（Ｅ）を有する化合物を提供する：
（Ｅ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドと結合しているオリゴマーであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘは、５’末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙは、３’末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれ中で、修飾および非修飾のヌクレオチドは交互に現れず；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに対して実質的に相補的な配列であり；（Ｎ）ｘの配列は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続したリボヌクレオチドに対して実質的な同一性を有するアンチセンス配列を含む］。
【０１５８】
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列および相補的な（Ｎ’）ｙを、表Ａ〜Ｄのいずれか１つに表す。
特定の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端の最後のヌクレオチドは修飾されていない。
【０１５９】
構造（Ｅ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として、好ましくは５’の最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって連結されている。
【０１６０】
構造（Ｅ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として、好ましくは５’の最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したヌクレオチドは、独立して、鏡像異性体ヌクレオチドである。一部の実施形態では、鏡像体はＬ−リボヌクレオチドである。
【０１６１】
他の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。構造（Ｅ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として、好ましくは５’の最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分を含む（２’−ＯＭｅ）。
【０１６２】
構造（Ｅ）の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中で、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として、好ましくは５’の最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を起点として２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。
【０１６３】
構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ主鎖修飾によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチド、あるいは、２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合または３’末端もしくは３’および５’末端のそれぞれでのＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１６４】
構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、あるいは、２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合または５’末端もしくは３’および５’末端のそれぞれでのＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１６５】
同じ鎖の３’および５’末端がどちらも修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾とは異なる。具体的な一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。
【０１６６】
構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドとは異なる。たとえば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドである。
【０１６７】
さらなる実施形態では、本発明は、構造（Ｆ）を有する化合物を提供する：
（Ｆ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドと結合しているオリゴマーであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、非修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれが、独立して、３’末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドが、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ主鎖修飾によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれ中で、修飾および非修飾のヌクレオチドは交互に現れず；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに対して実質的に相補的な配列であり；（Ｎ）ｘの配列は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続したリボヌクレオチドに対して実質的な同一性を有するアンチセンス配列を含む］。
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列および相補的な（Ｎ’）ｙを、表Ａ〜Ｄのいずれか１つに表す。
【０１６８】
構造（Ｆ）の一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ’）ｙは、３’末端の２個の連続したヌクレオチドが２個の連続した鏡像体デオキシリボヌクレオチドを含む、非修飾リボヌクレオチドを含み；（Ｎ）ｘは、３’末端の１個のヌクレオチドが鏡像体デオキシリボヌクレオチドを含む、非修飾リボヌクレオチドを含む（本明細書中で構造ＩＩＩとして記載する）。
【０１６９】
構造（Ｆ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって連結されている。
【０１７０】
構造（Ｆ）の好ましい一実施形態によれば、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｘの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。
【０１７１】
構造（Ｆ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したヌクレオチドは、独立して、鏡像異性体ヌクレオチドである。一部の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
【０１７２】
構造（Ｆ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分を含む（２’−ＯＭｅ）。
【０１７３】
構造（Ｆ）の一部の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。
【０１７４】
構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、あるいは、２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合または３’末端もしくは３’および５’末端の両方でのＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１７５】
構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、あるいは、２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合または３’末端もしくは３’および５’末端のそれぞれでのＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１７６】
同じ鎖の３’および５’末端のそれぞれが修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾とは異なる。具体的な一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。
【０１７７】
構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドとは異なる。たとえば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドである。
【０１７８】
さらなる実施形態では、本発明は、構造（Ｇ）を有する化合物を提供する：
（Ｇ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドと結合しているオリゴマーであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、非修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、独立して、５’末端または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ主鎖修飾によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合によって隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘでは、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、５’末端の最後から２番目の位置であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれ中で、修飾および非修飾のヌクレオチドは交互に現れず；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに対して実質的に相補的な配列であり；（Ｎ）ｘの配列は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続したリボヌクレオチドに対して実質的な同一性を有するアンチセンス配列を含む］。
【０１７９】
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列および相補的な（Ｎ’）ｙを、表Ａ〜Ｄのいずれか１つに表す。
構造（Ｇ）の一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３である。
構造（Ｇ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって連結されている。（Ｎ）ｘでは、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、５’末端の最後から２番目の位置を起点とする。
【０１８０】
構造（Ｇ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したヌクレオチドは、独立して、鏡像異性体ヌクレオチドである。一部の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、鏡像異性体ヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。（Ｎ）ｘでは、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、５’末端の最後から２番目の位置を起点とする。
【０１８１】
構造（Ｇ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分を含む（２’−ＯＭｅ）。一部の好ましい実施形態では、連続した修飾ヌクレオチドは、好ましくは、（Ｎ）ｘの５’末端の最後から２番目の位置を起点とする。
【０１８２】
構造（Ｇ）の好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続したリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｘの５’の最後から２番目の位置の１個のリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。構造（Ｇ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続したリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｘの５’末端位置の２個の連続したリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
構造（Ｇ）の一部の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。一部の好ましい実施形態では、連続した修飾ヌクレオチドは、好ましくは、（Ｎ）ｘの５’末端の最後から２番目の位置を起点とする。
【０１８３】
構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、あるいは、２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合または５’末端もしくは３’および５’末端のそれぞれでのＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１８４】
構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、あるいは、２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合または５’末端もしくは３’および５’末端のそれぞれでのＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
【０１８５】
同じ鎖の３’および５’末端のそれぞれが修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾とは異なる。具体的な一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドとは異なる。たとえば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドである。
【０１８６】
さらなる実施形態では、本発明は、構造（Ｈ）を有する化合物を提供する：
（Ｈ）５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’  アンチセンス鎖
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ  ５’  センス鎖
［式中、ＮおよびＮ’のそれぞれは、非修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドと結合しているオリゴマーであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘは、３’末端もしくは最後から２番目の位置または５’末端もしくは最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙは、内部位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含む非修飾リボヌクレオチドを含み、修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合、Ｐ−アルコキシ結合もしくはＰＡＣＥ結合から選択されるヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれ中で、修飾および非修飾のヌクレオチドは交互に現れず；
ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、それが結合している任意のオリゴマーの３’末端で共有結合している１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに対して実質的に相補的な配列であり；（Ｎ）ｘの配列は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続したリボヌクレオチドに対して実質的な同一性を有するアンチセンス配列を含む］。
【０１８７】
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列および相補的な（Ｎ’）ｙを、表Ａ〜Ｄのいずれか１つに表す。
構造（Ｈ）の一実施形態では、（Ｎ）ｘの３’末端もしくは５’末端または両末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したリボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続した内部リボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分を含む（２’−ＯＭｅ）。
【０１８８】
構造（Ｈ）の別の実施形態では、３’末端または５’末端の最後または最後から２番目の位置を独立して起点とする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したリボヌクレオチド、または（Ｎ’）の５’および３’末端のそれぞれの２〜８個の連続したヌクレオチドｙは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続した内部リボヌクレオチドは、独立して、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’リン酸ジエステル結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドである。
【０１８９】
同じ鎖の３’および５’末端のそれぞれが修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾とは異なる。具体的な一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されている。
【０１９０】
構造（Ｈ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドとは異なる。たとえば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは鏡像異性体ヌクレオチドである。
【０１９１】
構造（Ｈ）の好ましい一実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり；（Ｎ’）ｙの９〜１１個のヌクレオチド位置９〜１１の３個の連続したリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端位置の５個の連続したリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０１９２】
すべての上記構造（Ａ）〜（Ｈ）について、様々な実施形態では、ｘ＝ｙであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１９、２０、２１、２２または２３である。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。さらに他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。さらなる実施形態では、化合物は、交互に現れる位置の修飾リボヌクレオチドをを含み、（Ｎ）ｘの５’および３’末端のそれぞれのＮは、その糖残基が修飾されており、中央リボヌクレオチドは修飾されておらず、その例は、１９量体の鎖中の位置１０、２１量体中の位置１１および２３量体の鎖中の位置１２のリボヌクレオチドである。
【０１９３】
ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３である一部の実施形態では、１９量体中の修飾の位置を２１および２３量体について調節するが、ただし、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチドは修飾されていないことが好ましい。
【０１９４】
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙのどちらも、３’および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が、３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が、切断不可能のリン酸基を用いて３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が、切断可能または切断不可能のリン酸基を用いて末端の２’末端位置でリン酸化されている。これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物も、平滑末端化されており、末端がリン酸化されていない。しかし、比較実験により、３’末端の一方または両方がリン酸化されたｓｉＲＮＡ化合物が、リン酸化されていない化合物と比較してｉｎ  ｖｉｖｏで同様の活性を有することが示されている。
【０１９５】
特定の実施形態では、上述の構造のすべてについて、たとえばＺおよびＺ’がどちらも存在しない場合に、化合物は平滑末端化されている。代替実施形態では、化合物は、少なくとも１つの３’オーバーハングを含み、ＺまたはＺ’のうちの少なくとも１つが存在する。ＺおよびＺ’は、独立して、１つまたは複数の共有結合した修飾または非修飾のヌクレオチド、たとえば、反転ｄＴまたはｄＡ；ｄＴ、ＬＮＡ、鏡像異性体ヌクレオチドなどを含む。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’のそれぞれは、ｄＴおよびｄＴｄＴから独立して選択される。Ｚおよび／またはＺ’が存在するｓｉＲＮＡは、ＺおよびＺ’が存在しないｓｉＲＮＡと同様の活性および安定性を有する。
【０１９６】
特定の実施形態では、上述の構造のすべてについて、化合物は、１つまたは複数のホスホノカルボキシレートおよび／またはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＣＥヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、ホスフィノカルボキシレートヌクレオチドはホスフィノアセテートヌクレオチドである。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は、どちらも本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，６９３，１８７号および第７，０６７，６４１号に開示されている。
【０１９７】
特定の実施形態では、上述の構造のすべてについて、化合物は、１つまたは複数のロックされた核酸（ＬＮＡ）を含み、これは架橋核酸または二環状ヌクレオチドとしても定義される。好ましいロックされた核酸は、２’−Ｏ，４−Ｃ−エチレンヌクレオシド（ＥＮＡ）または２’−Ｏ，４−Ｃ−メチレンヌクレオシドである。ＬＮＡおよびＥＮＡヌクレオチドの他の例は、すべて本明細書中に参考として組み込まれている、ＷＯ９８／３９３５２号、ＷＯ００／４７５９９号およびＷＯ９９／１４２２６号に開示されている。
【０１９８】
特定の実施形態では、上述の構造のすべてについて、化合物は、１つまたは複数のアルトリトール単量体（ヌクレオチド）と含み、これは、１，５無水−２−デオキシ−Ｄ−アルトリト−ヘキシトールとしても定義される（たとえば、すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Ａｌｌａｒｔ他、１９９８．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１７：１５２３〜１５２６；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ他、１９９９．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１８：１３７１〜１３７６；Ｆｉｓｈｅｒ他、２００７、ＮＡＲ、３５（４）：１０６４〜１０７４参照）。
【０１９９】
本発明は、Ｎおよび／またはＮ’のそれぞれがデオキシリボヌクレオチド（Ｄ−Ａ、Ｄ−Ｃ、Ｄ−Ｇ、Ｄ−Ｔ）である化合物を明白に排除する。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれより多くのデオキシリボヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明は、Ｎのそれぞれが非修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドまたは３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである化合物を提供する。さらに他の実施形態では、Ｎのそれぞれは非修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個の連続したヌクレオチドおよび３’末端の１、２、３、４、５、もしくは６個の連続したヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’のそれぞれは非修飾リボヌクレオチドである。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｘは、非修飾リボヌクレオチドを含み、５’および３’末端のそれぞれで、１または２、３または４個の連続したデオキシリボヌクレオチドを独立して含み、１または２、３、４、５または６個の連続したデオキシリボヌクレオチドを内部位置に含み；Ｎ’のそれぞれは非修飾リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドまたは３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したヌクレオチド、および（Ｎ）ｘの末端５’ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個の連続したヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。本発明は、Ｎおよび／またはＮ’のそれぞれがデオキシリボヌクレオチドである化合物を排除する。一部の実施形態では、Ｎの５’末端ヌクレオチドまたはＮのうちの連続した２もしくは３個およびＮ’のうちの１、２、もしくは３個は、デオキシリボヌクレオチドである。活性ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｉＲＮＡキメラの特定の例は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許公開２００５／０００４０６４号およびＵｉ−Ｔｅｉ、２００８（ＮＡＲ、３６（７）：２１３６〜２１５１）に開示されている。
別段に指定しない限りは、本明細書中に記載した構造の好ましい実施形態では、それぞれの連続するＮまたはＮ’の間の共有結合はリン酸ジエステル結合である。
【０２００】
本発明によって提供されるさらなる新規分子は、そのようなヌクレオチドの第１のセグメントが第１の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、そのようなヌクレオチドの第２のセグメントが第２の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、そのようなヌクレオチドの第３のセグメントが第３の阻害性ＲＮＡ分子をコードしている、連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。第１、第２および第３のセグメントのそれぞれは、二本鎖ＲＮＡの１本の鎖を構成していてもよく、第１、第２および第３のセグメントは、リンカーによって一緒に結合されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のリンカーによって一緒に結合されている３つの二本鎖セグメントを含んでいてもよい。
【０２０１】
したがって、本発明によって提供される１つの分子は、３つの阻害性ＲＮＡ分子をコードしている連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、３つの二本鎖のアームが、本明細書中上記に提示したリンカーのうちの任意のものなどの、１つまたは複数のリンカーによって一緒に連結されているように、三本鎖構造を保有し得る。この分子は「スター」様構造を形成し、本明細書中でＲＮＡｓｔａｒとも呼び得る。前記三本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の一般的構造を有するオリゴリボヌクレオチドであり得る：
５’  オリゴ１（センス）        リンカーＡ  オリゴ２（センス）        ３’
３’  オリゴ１（アンチセンス）  リンカーＢ  オリゴ３（センス）        ５’
３’  オリゴ３（アンチセンス）  リンカーＣ  オリゴ２（アンチセンス）  ５’
または
５’  オリゴ１（センス）        リンカーＡ  オリゴ２（アンチセンス）  ３’
３’  オリゴ１（アンチセンス）  リンカーＢ  オリゴ３（センス）        ５’
３’  オリゴ３（アンチセンス）  リンカーＣ  オリゴ２（センス）        ５’
または
５’  オリゴ１（センス）        リンカーＡ  オリゴ３（アンチセンス）  ３’
３’  オリゴ１（アンチセンス）  リンカーＢ  オリゴ２（センス）        ５’
５’  オリゴ３（センス）        リンカーＣ  オリゴ２（アンチセンス）  ３’
ただし、リンカーＡ、リンカーＢまたはリンカーＣのうちの１つまたは複数が存在し；鎖の極性および分子の一般的構造が保持される限りは、２つ以上のオリゴヌクレオチドとリンカーＡ〜Ｃのうちの１つまたは複数との任意の組合せが可能である。さらに、リンカーＡ〜Ｃのうちの２つ以上が存在する場合、これらは同一または異なっていてよい。
したがって、３本アーム構造が形成され、それぞれのアームは、センス鎖および実質的に相補的なアンチセンス鎖を含む（すなわち、オリゴ１アンチセンスはオリゴ１センスと塩基対合するなど）。３本アーム構造は、それぞれのアームが塩基対合を保有する三本鎖であってもよい。
【０２０２】
さらに、上記三本鎖構造は、鎖のうちの１つまたは複数においてリンカーの代わりにギャップを有し得る。１つのギャップを有するそのような分子は、理論的には三本鎖ではなく四本鎖である。追加のギャップまたはニックの挿入は、追加の鎖を有する分子をもたらす。本発明者らによって得られた予備結果は、ギャップを有する分子は、特定の標的遺伝子の阻害に関して、類似であるがギャップを有さない分子よりも活性が高いことを示している。これは、ニックを有する分子についても同様であり得る。
【０２０３】
共有結合とは、１つのヌクレオチド単量体を隣接ヌクレオチド単量体と連結するヌクレオチド間結合をいう。共有結合には、たとえば、リン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合、Ｐ−アルコキシ結合、Ｐ−カルボキシ結合などが含まれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常のヌクレオシド間結合は、３’から５’のリン酸ジエステル結合である。特定の好ましい実施形態では、共有結合はリン酸ジエステル結合である。共有結合には、とりわけＷＯ２００４／０４１９２４号に開示されているものなどの、リン非含有ヌクレオシド間結合が包含される。別段に指定しない限りは、本明細書中に記載した構造の好ましい実施形態では、それぞれの連続するＮまたはＮ’の間の共有結合はリン酸ジエステル結合である。
【０２０４】
上記構造のすべてについて、一部の実施形態では、（Ｎ）ｘのオリゴヌクレオチド配列は、（Ｎ’）ｙのオリゴヌクレオチド配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは実質的に相補的である。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に対して実質的に相補的である。
【０２０５】
定義
利便上、明細書、実施例および特許請求の範囲中で用いる特定の用語を、本明細書中で説明する。
【０２０６】
内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、本明細書中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることを注意されたい。
【０２０７】
本発明の態様または実施形態をマーカッシュ群または他の代替群に関して記載する場合、当業者は、本発明が、それにより、任意の個々のメンバーまたは群のメンバーの部分群に関しても記載されていることを理解されよう。
【０２０８】
「アポトーシス促進ポリペプチド」とは、スプライシング変異体、アイソフォーム、相同分子種、またはパラログなどを含めた、上記に記載した遺伝子のうちの任意のものによってコードされているポリペプチドをいう。
【０２０９】
「阻害剤」とは、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、生物学的または生理的効果を達成するために十分な程度まで軽減させることができる化合物である。本明細書中で使用する用語「阻害剤」とは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイムを含めた、オリゴヌクレオチド阻害剤のうちの１つまたは複数をいう。また、阻害は、ダウンレギュレーション、またはＲＮＡｉではサイレンシングとも呼ばれ得る。
【０２１０】
本明細書中で使用する用語「阻害する」とは、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、生物学的または生理的効果を達成するために十分な程度まで軽減させることをいう。阻害は完全または部分的であり得る。
【０２１１】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換性があるように使用してよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列をいう。また、この用語には、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製したＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかの類似体が含まれることも理解されたい。本出願の全体にわたって、ｍＲＮＡ配列は、その対応する遺伝子の標的を表すものとして記載する。用語「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」およびｍＲＮＡは、互換性があるように使用する。
【０２１２】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、約２〜約５０個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列をいう。それぞれのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立して、天然または合成であってよく、かつまたは修飾されていても修飾されていなくてもよい。修飾には、オリゴヌクレオチド内の糖部分、塩基部分およびまたはヌクレオチド間の結合への変化が含まれる。本発明の化合物には、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドおよびその組合せを含む分子が包含される。
【０２１３】
本明細書中で使用する用語「非対合ヌクレオチド類似体」とは、それだけには限定されないが、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣを含めた非塩基対合部分を含む、ヌクレオチド類似体を意味する。一部の実施形態では、非塩基対合ヌクレオチド類似体はリボヌクレオチドである。他の実施形態では、これはデオキシリボヌクレオチドである。
【０２１４】
本発明は、標的遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する方法および組成物を提供する。一般に、この方法には、配列番号１〜４１、４６〜４８のうちの任意の１つに記載のｍＲＮＡを標的とするために、オリゴリボヌクレオチド、特に低分子干渉ＲＮＡ（すなわちｓｉＲＮＡ）、または細胞中でｓｉＲＮＡを産生することができる核酸物質を、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするために十分な量で投与することが含まれる。具体的には、この方法は、その遺伝子の発現に関連する疾患に罹患している対象を治療するための、遺伝子の発現の阻害に有用である。本発明によれば、標的遺伝子のｓｉＲＮＡ分子または阻害剤は、様々な病理を治療するための薬物として使用する。
【０２１５】
「ヌクレオチド」とは、天然または合成であってよく、修飾されていても修飾されていなくてもよいデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。修飾には、糖部分、塩基部分および／またはヌクレオチド間結合への変化および置換が含まれる。
【０２１６】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドのすべての類似体、またはそれへの修飾を本発明で用いてよいが、ただし、前記類似体または修飾は、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に有害な影響を、実質的に与えない。許容される修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間結合中の修飾およびその組合せが含まれる。
【０２１７】
本発明中で時々「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド類似体」と呼ぶものは、より正確には擬似ヌクレオチドまたは非慣用部分として呼ばれる。ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡ中ではアデニン、グアニン、チミン、またはシトシン；ＲＮＡ中ではアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシン）からなる、単量体の核酸単位である。修飾ヌクレオチドは、糖、リン酸およびまたは塩基のうちの１つまたは複数中に修飾を含む。脱塩基擬似ヌクレオチドは塩基を欠き、したがって、厳密にはヌクレオチドではない。
【０２１８】
本明細書中で使用する用語「キャップ部分」には、２’Ｏアルキル修飾を含めた脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾の脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分；反転脱塩基リボースや脱塩基デオキシリボース部分およびその修飾体；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含めた鏡像異性体ヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；ならびに、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；α−ヌクレオチド；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分を含めたヌクレオチド類似体が含まれる。
【０２１９】
特定の好ましいキャップ部分は、脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；反転脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含めた鏡像異性体ヌクレオチドである。図２２は、Ｃ６−アミノリン酸５’キャップ部分および５’末端（Ｎ’）とのその付着点の化学構造を示す。
【０２２０】
本明細書中で使用する用語「非慣用部分」とは、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチド；ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含めた架橋核酸をいう。
【０２２１】
脱塩基デオキシリボース部分には、たとえば、脱塩基デオキシリボース−３’−リン酸；１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−リン酸；１，４−無水−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−リン酸が含まれる。反転脱塩基デオキシリボース部分には、反転デオキシリボ脱塩基；３’，５’反転デオキシ脱塩基５’−リン酸が含まれる。
鏡像異性体ヌクレオチドには、たとえば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＡ）；Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｄＣ）；Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｄＧ）；Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−リン酸（鏡像体ｄＴ））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＡ）；Ｌ−リボシチジン−３’−リン酸（鏡像体ｒＣ）；Ｌ−リボグアノシン−３’−リン酸（鏡像体ｒＧ）；Ｌ−リボウラシル−３’−リン酸（鏡像体ｄＵ）が含まれる。
修飾デオキシリボヌクレオチドには、たとえば、５’末端位置（位置番号１）のヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテートが含まれる。
架橋核酸には、ＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）；およびＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’一リン酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３’一リン酸、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’一リン酸）が含まれる。
【０２２２】
本発明の一部の実施形態では、好ましい非慣用部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、鏡像異性体ヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドと結合しているヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、天然に存在する塩基または合成修飾塩基から選択される。天然に存在する塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン、他のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンが含まれる。脱塩基擬似ヌクレオチド、ならびに交互に現れるＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドを含む分子が、本発明によって包含される。脱塩基擬似ヌクレオチド単量体を含めた、修飾塩基を含むヌクレオチド単量体を、オリゴヌクレオチドの１つまたは複数のリボヌクレオチドと置き換え得る。脱塩基擬似ヌクレオチド単量体を、末端位置のうちの１つもしくは複数に、または５’末端キャップとして含め得る。また、５’末端キャップは、反転脱塩基擬似ヌクレオチド類似体、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、およびＣ６−イミンホスフェートからも選択してもよい。
【０２２３】
さらに、１つまたは複数のヌクレオチドの構造が本質的に変更されており、治療的または実験的試薬としてより良好に適している、ポリヌクレオチドの類似体を調製する。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸主鎖が、ペプチド中で見つかるものに類似のポリアミド主鎖を含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素分解に対して耐性であること、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて寿命が延長されていることが示されている。
糖残基への可能な修飾は多様であり、２’−Ｏアルキル、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド；アルトリトール（ＡＮＡ）ならびにモルホリノおよびシクロへキシニルを含めた他の６員糖が含まれる。
【０２２４】
ＬＮＡ化合物は、国際特許公開ＷＯ００／４７５９９号、ＷＯ９９／１４２２６号、およびＷＯ９８／３９３５２号に開示されている。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ他（ＮＡＲ、２００５．３３（１）：４３９〜４４７）および国際公開公報ＷＯ２００４／０８３４３０号に開示されている。六員環ヌクレオチド類似体は、Ａｌｌａｒｔ他（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９８、１７：１５２３〜１５２６；およびＰｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ他、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇ．ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６：１４５７〜１４６０）に開示されており、ヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチド単量体を含めた６員環ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開ＷＯ２００６／０４７８４２に開示されている。
【０２２５】
本発明の化合物は、１つまたは複数の反転ヌクレオチド、たとえば、反転チミジンまたは反転アデニンを用いて合成する（たとえば、Ｔａｋｅｉ他、２００２．ＪＢＣ、２７７（２６）：２３８００〜０６参照。
【０２２６】
本発明のコンテキストでは、「鏡像体」ヌクレオチド（スピーゲルマーとも呼ぶ）とは、天然に存在するまたは一般的に用いられるヌクレオチドに対して逆のキラリティを有するヌクレオチド類似体、すなわち、天然に在するまたは一般的に用いられるヌクレオチドの鏡像体である。鏡像異性体ヌクレオチドは、リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）であり、少なくとも１つの糖もしくは塩基の修飾および／または主鎖修飾、たとえば、ホスホロチオエートまたはホスホネート部分をさらに含み得る。米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示している。
主鎖修飾、たとえば、エチル（ホスホ−エチルトリエステルをもたらす）；プロピル（ホスホ−プロピルトリエステルをもたらす）；およびブチル（ホスホ−ブチルトリエステルをもたらす）も可能である。他の主鎖修飾には、ポリマー主鎖、環状主鎖、非環状主鎖、チオリン酸−Ｄ−リボース主鎖、アミデート、ホスホノアセテート誘導体が含まれる。特定の構造には、１つまたは複数の複数の２’−５’ヌクレオチド間結合（架橋または主鎖）を有するｓｉＲＮＡ化合物が含まれる。
【０２２７】
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙのどちらも、３’および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が、３’末端でリン酸化されている（３’Ｐｉ）。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が、切断不可能のリン酸基を用いて３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの一方または両方が、切断可能または切断不可能のリン酸基を用いて末端の２’末端位置でリン酸化されている。さらに、本発明の阻害性核酸分子は、１つもしくは複数のギャップおよび／または１つもしくは複数のニックおよび／または１つもしくは複数のミスマッチを含み得る。理論に束縛されることを望まずに、ギャップ、ニックおよびミスマッチは、核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定化させるという利点を有し、それにより、これらは、ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡまたはＲＩＳＣなどの内在性細胞機構によってその阻害性構成要素へとプロセッシングされることがより容易になり得る。
【０２２８】
本発明のコンテキストでは、核酸中のギャップとは、鎖中に１つまたは複数の内部ヌクレオチドが存在しないことをいい、一方で、核酸中のニックとは、鎖中の２つの隣接ヌクレオチド間のヌクレオチド間結合が存在しないことをいう。本発明の分子のうちの任意のものが、１つもしくは複数のギャップおよび／または１つもしくは複数のニックを含有し得る。
【０２２９】
オリゴヌクレオチド
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）は、ｓｉＲＮＡ化合物の調製に有用なセンスおよび対応するアンチセンスオリゴマーの核酸配列を含む。化合物は、化学的およびまたは構造的に修飾された化合物として使用する。
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成は、幅広く報告されている。たとえば、Ｕｉ−Ｔｅｉ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００６；６５０５２；Ｃｈａｌｋ他、ＢＢＲＣ．、２００４、３１９（１）：２６４〜７４；ＳｉｏｕｄおよびＬｅｉｒｄａｌ、Ｍｅｔ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００４、２５２：４５７〜６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ他、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、２００４、２０（３）：４３０〜２；Ｕｉ−Ｔｅｉ他、ＮＡＲ．、２００４、３２（３）：９３６〜４８を参照されたい。修飾ｓｉＲＮＡの使用および産生の例には、たとえば、Ｂｒａａｓｃｈ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３、４２（２６）：７９６７〜７５；Ｃｈｉｕ他、ＲＮＡ．、２００３、９（９）：１０３４〜４８；ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０１５１０７号およびＷＯ０２／４４３２１号ならびに米国特許第５，８９８，０３１号および第６，１０７，０９４号を参照されたい。
【０２３０】
本発明は、所望の遺伝子の発現をダウンレギュレーションする二本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばｓｉＲＮＡ）を提供する。本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖が所望の遺伝子のｍＲＮＡ配列に由来し、アンチセンス鎖がセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である、二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。一般に、標的ｍＲＮＡ配列からのある程度の逸脱が、ｓｉＲＮＡ活性を損なわずに許容される（たとえば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ他、ＮＡＲ．、２００３、３１（１１）：２７０５〜２７１６参照）。本発明のｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を、転写後レベルで、ｍＲＮＡを破壊してまたは破壊せずに阻害する。理論に束縛されずに、ｓｉＲＮＡは、特異的切断および分解についてｍＲＮＡを標的とし得る、ならびに／または標的とされたメッセージからの翻訳を阻害し得る。
【０２３１】
一部の実施形態では、表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）から選択されるオリゴヌクレオチド対は、本明細書中に開示する修飾のうちの任意のものを１つまたは複数有する修飾ｓｉＲＮＡを含む。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡは、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡ二重鎖を含み、第１の鎖は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡである標的核酸の約１８〜約４０個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的リボヌクレオチド配列を含み、第２の鎖は、第１の鎖に対して少なくとも部分的に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、前記第１の鎖およびまたは前記第２の鎖は、任意選択で糖部分の２’位置に修飾を有する、修飾リボヌクレオチドの複数の群を含み、それぞれの鎖内で、修飾リボヌクレオチドのそれぞれの群は、一方または両側にフランキングヌクレオチド、任意選択でリボヌクレオチドの群が隣接し、フランキングリボヌクレオチドの群を形成するそれぞれのリボヌクレオチドは、非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドの群の修飾とは異なる修飾を有するリボヌクレオチドから選択される。
【０２３２】
一部の実施形態では、修飾リボヌクレオチドの群および／またはフランキングヌクレオチドの群は、１〜１２の整数からなる群から選択される数のリボヌクレオチドを含む。したがって、群は、１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、１１個のヌクレオチドまたは１２個のヌクレオチドを含む。
【０２３３】
修飾ヌクレオチドおよびフランキングヌクレオチドの群は、鎖の一方または両方上のパターンに整理し得る。一部の実施形態では、アンチセンスおよびセンス鎖は、交互に現れる非修飾および２’糖修飾のリボヌクレオチドを含む。一部の好ましい実施形態では、アンチセンス鎖中の中央リボヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。たとえば、１９−オリゴマーのアンチセンス鎖では、位置１０のリボヌクレオチドは修飾されておらず；２１−オリゴマーのアンチセンス鎖では、位置１１のリボヌクレオチドは修飾されておらず；２３−オリゴマーのアンチセンス鎖では、位置１２のリボヌクレオチドは修飾されていない。ｓｉＲＮＡの修飾または修飾パターンは、存在する場合は、これを可能にするために計画しなければならない。偶数数のオリゴマー、たとえば２２量体では、中央ヌクレオチドは位置１１または１２であり得る。
【０２３４】
糖残基の２’部分上の可能な修飾には、とりわけ、欧州特許ＥＰ０  ５８６  ５２０  Ｂ１号またはＥＰ０  ６１８  ９２５  Ｂ１号に記載されている、アミノ、フルオロ、メトキシアルコキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロジクロアルキル；ヘテロジクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノまたは置換シリルが含まれる。１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドも本発明の化合物中で許容される。本明細書中に開示する分子の設計、ＲＮＡｉまたはＲＮＡｉの任意の実施形態のための任意の戦略の説明において本明細書中で使用する用語「末端修飾」とは、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の５’または３’ヌクレオチドに付加する化学部分を意味する。そのような末端修飾の例には、それだけには限定されないが、とりわけ、欧州特許ＥＰ  ０  ５８６  ５２０  Ｂ１号またはＥＰ  ０  ６１８  ９２５  Ｂ１号に記載されている、３’または５’リン酸、反転脱塩基、脱塩基、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ３、メトキシ、イミダゾリル、カルボキシレート、ホスホチオエート、Ｃ１〜Ｃ２２および低級アルキル、脂質、糖およびポリアミノ酸（すなわちペプチド）、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノまたは置換シリルが含まれる。
【０２３５】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、一方または両方の末端で、平滑末端化されている、すなわち、ＺおよびＺ’は存在しない。より詳細には、ｓｉＲＮＡは、第１の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端によって定義される末端、ならびに／または第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端によって定義される末端が平滑末端化されていてよい。
【０２３６】
他の実施形態では、２本の鎖のうちの少なくとも１つは、５’末端に少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドからなり得る。また、鎖のうちの少なくとも１つは、任意選択で、３’末端にも少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。オーバーハングは、約１〜約５個のヌクレオチドからなり得る。
【０２３７】
ＲＮＡ二重鎖の長さは、約１８〜約４０個のリボヌクレオチド、好ましくは１９、２１または２３個のリボヌクレオチドである。さらに、それぞれの鎖の長さは、独立して、約１５〜約４０個の塩基、好ましくは１８〜２３個の塩基、より好ましくは１９、２１または２３個のリボヌクレオチドからなる群から選択される長さを有し得る。
【０２３８】
特定の実施形態では、前記第１の鎖と標的核酸との間の相補性は完全であり得る。一部の実施形態では、鎖は実質的に相補的である、すなわち、前記第１の鎖と標的ｍＲＮＡとの間、または第１と第２の鎖との間に、１、２または５個までのミスマッチを有する。実質的に相補的とは、別の配列に対する、約７０％を超え、１００％未満の相補性をいう。たとえば、１９個の塩基対からなる二重鎖領域では、１つのミスマッチは９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは約８４．２％の相補性をもたらし、４つのミスマッチは約７９％の相補性をもたらし、５つのミスマッチは約７４％の相補性をもたらし、二重鎖領域が実質的に相補的となる。したがって、実質的に同一とは、別の配列に対する約７０％を超える同一性をいう。
【０２３９】
第１の鎖および第２の鎖は、とりわけポリエチレングリコールなどの非核酸ポリマーからなり得るループ構造によって連結されていてもよい。あるいは、ループ構造は、修飾および非修飾のリボヌクレオチドならびに修飾および非修飾のデオキシリボヌクレオチドを含めた核酸からなり得る。
さらに、ｓｉＲＮＡの第１の鎖の５’末端は第２の鎖の３’末端に連結されていてよく、または、第１の鎖の３’末端は第２の鎖の５’末端に連結されていてよく、前記連結は、典型的には２〜１００個の核酸塩基、好ましくは約２〜約３０個の核酸塩基の長さを有する、核酸リンカーによるものである。
【０２４０】
化合物のアンチセンスおよびセンス鎖のうちの少なくとも１つが修飾された、交互に現れるリボヌクレオチドを有する本発明の化合物の好ましい実施形態では、１９量体および２３量体オリゴマーでは、アンチセンス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されており、センス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されていない。２１量体オリゴマーでは、センス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されており、アンチセンス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されていないか、または、任意選択の追加の修飾を３’末端に有し得る。上述のように、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチドは修飾されていないことが好ましい。
【０２４１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、オリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡのアンチセンスおよびセンス鎖は、３’末端でのみリン酸化され、５’末端ではリン酸化されない。本発明の別の好ましい実施形態によれば、アンチセンスおよびセンス鎖はリン酸化されていない。本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏ５’−リン酸化の可能性をすべて消滅させるために、センス鎖の最も５’側のリボヌクレオチドは修飾されている。
【０２４２】
本明細書中に開示する任意のｓｉＲＮＡ配列は、本明細書中に開示する修飾／構造のうちの任意のものを有するように調製する。配列および構造の組合せは新規性があり、本明細書中に開示する状態の治療で使用した場合に有用である。
【０２４３】
薬剤組成物
本発明の化合物を未加工の化合物として投与することは可能であり得るが、これらを薬剤組成物として提示することが好ましい。したがって、本発明は、本発明の化合物のうちの１つまたは複数と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物を提供する。この組成物は、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡの混合物を含み得る。
本発明は、上記開示した１つまたは複数の遺伝子を阻害するために有効な量の、１つまたは複数の本発明の化合物と共有または非共有結合した少なくとも１つの本発明の化合物と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物をさらに提供する。化合物は、内在性細胞複合体によって細胞内でプロセッシングされて、１つまたは複数の本発明のオリゴリボヌクレオチドを生じ得る。
【０２４４】
本発明は、製薬上許容される担体と、細胞中での標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするために有効な量の、本発明の化合物のうちの１つまたは複数とを含む薬剤組成物をさらに提供し、化合物は、（Ｎ）ｘの配列に対して実質的に相補的な配列を含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ウイルス、細菌または哺乳動物の遺伝子である。様々な実施形態では、標的遺伝子は、哺乳動物遺伝子、好ましくはヒト遺伝子である。
さらに、本発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を、本発明の化合物のうちの１つまたは複数と接触させることを含む、標的遺伝子の発現を、対照と比較して少なくとも５０％阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、活性ｓｉＲＮＡ化合物は、遺伝子発現を、対照と比較して少なくとも５０％、６０％または７０％のレベルで阻害する。特定の好ましい実施形態では、阻害は、対照と比較して少なくとも７５％、８０％または９０％のレベルである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、本明細書中に開示するようにアポトーシス促進遺伝子である。
【０２４５】
一実施形態では、オリゴリボヌクレオチドは、本発明のアポトーシス促進遺伝子のうちの１つまたは複数を阻害し、阻害は、遺伝子機能の阻害、ポリペプチドの阻害およびｍＲＮＡ発現の阻害を含む群から選択される。
一実施形態では、化合物は、標的遺伝子によってコードされているポリペプチドの発現を阻害し、阻害は、機能の阻害（とりわけ、ネイティブ遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用剤を用いた酵素アッセイまたは結合アッセイによって検査し得る）、タンパク質の阻害（とりわけ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降によって検査し得る）およびｍＲＮＡ発現の阻害（とりわけ、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイハイブリダイゼーションによって検査し得る）を含む群から選択される。
【０２４６】
さらなる実施形態では、本発明は、対象に本発明の化合物を治療上有効な用量で投与し、それにより対象を治療することを含む、本発明のアポトーシス促進遺伝子のレベルの上昇を伴う疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。
より詳細には、本発明は、１本の鎖が５’から３’方向で表Ｂに記載の配列またはその相同体を有する連続したヌクレオチドを含み、２個までのリボヌクレオチドが相補鎖中のリボヌクレオチドと塩基対合しない、オリゴリボヌクレオチドを提供する。
【０２４７】
さらに、本発明によるさらなる核酸は、表Ｂ（表Ｂ１〜Ｂ７４）に記載のポリヌクレオチドオリゴマーのうちの任意の１つの少なくとも１４個の連続的したヌクレオチド、より好ましくは、上述の第１の鎖および第２の鎖からなる、二本鎖構造の任意の末端の１４個の連続的したヌクレオチド塩基対を含む。
【０２４８】
送達
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、担体または希釈剤を用いて調製したままの分子を直接施用することによって標的組織に送達し得る。
用語「ネイキッドｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡ）」とは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム配合物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含めた、細胞内への進入を支援、促進または容易にするように作用する送達ビヒクルをまったく含まないｓｉＲＮＡをいう。たとえば、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡは「ネイキッドｓｉＲＮＡ」である。
【０２４９】
しかし、一部の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、リポソームまたはリポフェクチン配合物など中で送達し、当業者に周知の方法によって調製する。そのような方法は、たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号に記載されている。
哺乳動物細胞内への増強および改善されたｓｉＲＮＡ送達を具体的に目的とする送達系が開発されている（たとえば、Ｓｈｅｎ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．、２００３、５３９：１１１〜１１４；Ｘｉａ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００２、２０：１００６〜１０１０；Ｒｅｉｃｈ他、Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ、２００３、９：２１０〜２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００３．３２７：７６１〜７６６；Ｌｅｗｉｓ他、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．、２００２、３２：１０７〜１０８およびＳｉｍｅｏｎｉ他、ＮＡＲ、２００３、３１，１１：２７１７〜２７２４参照）。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類における遺伝子発現の阻害での使用が成功している（たとえば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ他、Ｒｅｔｉｎａ、２４（４）：６６０参照。
【０２５０】
製薬上許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびビヒクルならびに移植担体とは、一般に、本発明の活性成分と反応しない、不活性かつ無毒性な固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル封入物質をいい、これらにはリポソームおよびミクロスフェアが含まれる。本発明で有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２号；第５，１６９，３８３号；第５，１６７，６１６号；第４，９５９，２１７号；第４，９２５，６７８号；第４，４８７，６０３号；第４，４８６，１９４号；第４，４４７，２３３号；第４，４４７，２２４号；第４，４３９，１９６号；および第４，４７５，１９６号が含まれる。多くの他のそのような移植片、送達系、およびモジュールが当業者に周知である。本発明の具体的な一実施形態では、局所および経皮配合物を選択し得る。本発明のｓｉＲＮＡまたは薬剤組成物は、個々の患者の臨床状態、治療する疾患、投与の部位および方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重ならびに医療従事者に知られている他の要素を考慮して、良好な医療行為に従って投与および投薬する。
【０２５１】
したがって、本発明の目的のための「治療上有効な用量」は、当分野で知られているそのような検討事項によって決定する。用量は、それだけには限定されないが、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは排除および当業者によって適切な手段によって選択される他の指標を含めた、改善を達成するために有効なものでなければならない。
一般に、ヒトにおける化合物の活性用量は、１日あたり体重１ｋｇあたり１ｎｇ〜約２０〜１００ｍｇ、好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約２〜１０ｍｇの範囲、１日１回または１日２もしくは３回の用量のレジメンで、１〜４週間またはそれより長い期間である。
【０２５２】
本発明の化合物は、慣用の投与経路のうちの任意のものによって投与する。化合物は、化合物それ自体として、または製薬上許容される塩として投与し、単独で、または活性成分として製薬上許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて投与することに注意されたい。化合物は、経口、局所、皮下、または、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および鼻腔内、吸入、経鼓膜を含めた非経口の投与、ならびにくも膜下腔内およびインフュージョン技術によって投与する。化合物の移植も有用である。液体形態を注射用に調製してもよく、この用語には、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、および他の親の投与経路が含まれる。液体組成物には、有機共溶媒、水性または油性の懸濁液、食用油を用いた乳濁液、および同様の製薬ビヒクルを用いた、ならびに用いない、水溶液が含まれる。特定の実施形態では、投与は静脈内投与を含む。別の実施形態では、投与は、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）または局所（ｌｏｃａｌ）投与を含む。
さらに、特定の実施形態では、本発明の新規治療で使用するための組成物は、たとえば鼻腔内投与用に、エアロゾルとして配合し得る。
特定の実施形態では、経口組成物（錠剤、懸濁液、液剤など）が、口腔粘膜炎を治療するための洗口液に適した経口組成物などの、口腔への局所送達に有効であり得る。
好ましい実施形態では、治療する対象は、温血動物、特にヒトを含めた哺乳動物である。
さらなる実施形態では、修飾はリン酸部分の修飾であり、修飾リン酸部分は、リン酸基の欠如またはホスホロチオエートを含む群から選択される。
【０２５３】
本発明の分子は、他の核酸配列またはそのような分子もしくは他の阻害性ヌクレオチド分子をコードしている分子に加えて、ｓｉＲＮＡ、合成ｓｉＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡを含み得る。
さらなる末端修飾はビオチン基である。そのようなビオチン基は、好ましくは、第１および／もしくは第２の鎖の最も５’側もしくは最も３’側のヌクレオチドのいずれか、または両方の末端に結合していてよい。より好ましい実施形態では、ビオチン基は、ポリペプチドまたはタンパク質とカップリングしている。また、ポリペプチドまたはタンパク質が、他の前述の末端修飾のうちの任意のものを介して結合していることも、本発明の範囲にある。
【０２５４】
本明細書中に開示する様々な末端修飾は、好ましくは、本発明による核酸のヌクレオチドのリボース部分に位置する。より詳細には、末端修飾は、それだけには限定されないが、２’ＯＨ、３’ＯＨおよび５’ＯＨ位置を含めた、リボース部分のＯＨ基のうちの任意のものに結合しているか、またはそれを置き換えていてもよいが、ただし、そのようにして修飾されたヌクレオチドは末端ヌクレオチドである。反転脱塩基または脱塩基は、核酸塩基部分を有さないデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのどちらかであるヌクレオチドである。この種の化合物は、とりわけ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．他、（２００２）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ、１２、１３１〜４３に記載されている。ｓｉＮＡ化合物は、国際特許出願ＷＯ０３／０７０９１８号に記載されている。
【０２５５】
本発明のコンテキストでは、本明細書中に開示するｓｉＲＮＡ分子のうちの任意のもの、または内在性細胞複合体（ＤＩＣＥＲなど−上記参照）によってプロセッシングされて本明細書中に開示するｓｉＲＮＡ分子、もしくは本明細書中に開示するｓｉＲＮＡ分子を含む分子を形成する、任意の長い二本鎖ＲＮＡ分子（典型的には２５〜５００個のヌクレオチドの長さ）が、本発明の分子内に取り込まれて追加の新規分子を形成し、本明細書中に記載の疾患または障害の治療に用いられることを理解されよう。
具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドがステム領域を含む、１つまたは複数のステムおよびループ構造を含む、長いオリゴヌクレオチド（典型的には約８０〜５００個のヌクレオチドの長さ）は、担体、好ましくは製薬上許容される担体中で送達してよく、また、内在性細胞複合体によって（たとえば、上述のようにＤＲＯＳＨＡおよびＤＩＣＥＲによって）細胞内でプロセッシングされて、本発明のオリゴヌクレオチドである１つまたは複数のより小さな二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を生じてもよいことが想定される。このオリゴヌクレオチドは、タンデムｓｈＲＮＡ構築体と呼ばれる。この長いオリゴヌクレオチドは、それぞれのステム領域がセンスおよび対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含む、１つまたは複数のステムおよびループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであることが想定される。たとえば、本明細書中に開示する阻害性配列を（適切な核酸修飾と共に）含むアンチセンスＤＮＡ分子などの任意の分子が特に望ましく、本明細書中に開示するすべての使用および方法に関して、その対応するＲＮＡ／ｓｉＲＮＡと同じ能力として使用し得る。
【０２５６】
さらに、ヌクレオチドの構造が本質的に変更されており、治療的または実験的試薬としてより良好に適している、ポリヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸主鎖が、ペプチド中で見つかるものに類似のポリアミド主鎖を含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して耐性であること、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて寿命が延長されていることが示されている。さらに、ＰＮＡは、ＤＮＡ分子よりも相補的ＤＮＡ配列と強力に結合することが示されている。この観察は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間に電荷斥力が欠けていることに起因している。オリゴヌクレオチドの合成に有用な他の修飾単量体には、ポリマー主鎖、環状主鎖、または非環状主鎖を有する部分が含まれる。
【０２５７】
治療方法
別の態様では、本発明は、対象に、標的遺伝子、表Ａのアポトーシス促進遺伝子の発現を軽減または阻害する量の阻害剤を投与することを含む、これらの遺伝子の異常発現に関連する疾患または障害の治療を必要としている対象の治療方法に関する。
好ましい実施形態では、治療する対象は、温血動物、特にヒトを含めた哺乳動物である。
本発明の方法は、対象に、表Ａのアポトーシス促進遺伝子発現をダウンレギュレーションする１つまたは複数の阻害性化合物、特にｓｉＲＮＡを、それによって対象を治療するために治療上有効な用量で投与することを含む。
【０２５８】
用語「治療」とは、治療処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段のどちらもいい、その目的は、本明細書中に記載の障害を予防するまたは遅延させる（減少させる）ことである。治療を必要としているものには、既に疾患または状態を経験しているもの、疾患または状態に罹患し易いもの、および疾患または状態を予防するものが含まれる。本発明の化合物は、疾患もしくは状態またはそれに関連する症状が発症する前、その間またはそれに続いて投与する。治療が予防目的のためである場合は、本発明は、疾患または障害の発症を遅延させるまたは発生を防ぐ方法に関する。
【０２５９】
本発明は、アポトーシス促進遺伝子発現の阻害が有益である以下の疾患または状態の治療における、本発明のアポトーシス促進遺伝子の発現をダウンレギュレーションする化合物、特に新規低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用に関する：聴覚損失、急性腎不全（ＡＲＦ）、緑内障、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性の肺や呼吸器の傷害、肺移植後の虚血再灌流傷害、肺、肝臓、心臓、骨髄、膵臓、角膜および腎臓の移植を含めた臓器移植（ＤＧＦを含む）；脊髄傷害、褥瘡、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、ドライアイ症候群、ＩＯＮおよびＡＩＯＮを含めた眼球虚血状態；口腔粘膜炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）。他の適応症には、化学誘発腎毒性および化学誘発神経毒性、たとえば、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、アミノグリコシド、ループ利尿剤、ならびにヒドロキノンおよびその類似体によって誘発される毒性が含まれる。
【０２６０】
本発明のアポトーシス促進遺伝子を阻害する方法、分子および組成物を本明細書中に詳細に記載し、前記分子および／または組成物のうちの任意のものを、前記状態の任意のものに罹患している対象の治療に有益に用い得る。
また、本発明は、
１つまたは複数の本発明の化合物を提供することと、
前記化合物を製薬上許容される担体と混合することと
を含む、薬剤組成物を調製する方法も提供する。
また、本発明は、１つまたは複数の本発明の化合物は、製薬上許容される担体と混合することを含む、薬剤組成物を調製する方法も提供する。
好ましい実施形態では、薬剤組成物の調製に使用する化合物を、担体と、製薬上有効な量で混合する。特定の実施形態では、本発明の化合物は、ステロイドもしくは脂質または別の適切な分子、たとえばコレステロールとコンジュゲートさせる。
【０２６１】
修飾化合物の合成
本発明の化合物は、リボ核酸（またはデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドを合成するための、当分野で周知の方法のうちの任意のものによって合成することができる。そのような合成は、とりわけ、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２；４８：２２２３〜２３１１；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９３；４９：６１２３〜６１９４ならびにＣａｒｕｔｈｅｒｓ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８７；１５４：２８７〜３１３に記載されており；チオエートの合成は、とりわけ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８５；５４：３６７〜４０２に記載されており、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００５、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．編；Ｋａｐ．２：１７〜３１に記載されており、対応する下流プロセスは、とりわけ、Ｐｉｎｇｏｕｄ他、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒ．Ｗ．Ａ．編；Ｋａｐ．７：１８３〜２０８に記載されている。
【０２６２】
当分野で知られている他の合成手順は、たとえば、Ｕｓｍａｎ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８７、１０９：７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ他、ＮＡＲ、１９９０、１８：５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ他、ＮＡＲ、１９９５、２３：２６７７〜２６８４；およびＷｉｎｃｏｔｔ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、１９９７、７４：５９に記載されている手順であり、これらの手順では、５’末端のジメトキシトリチルおよび３’末端のホスホルアミダイトなどの一般的な核酸の保護およびカップリング基を利用する。修飾された（たとえば２’−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾のヌクレオチドは、所望に応じて取り込ませる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、別々に合成し、合成後に、たとえば、ライゲーションによって（Ｍｏｏｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、２５６：９９２３；国際公開公報ＷＯ９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａ他、ＮＡＲ、１９９１、１９：４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６：９５１；Ｂｅｌｌｏｎ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、１９９７、８：２０４）、またはハイブリダイゼーションによって、合成および／または脱保護後に一緒に結合することができる。
市販の機器（とりわけＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入可能）を使用できることに注意されたい。オリゴヌクレオチドは、本明細書中に開示する配列に従って調製する。化学合成断片の重複する対は、当分野で周知の方法を用いてライゲーションすることができる（たとえば米国特許第６，１２１，４２６号参照）。鎖を別々に合成し、その後、チューブ内で互いにアニーリングさせる。その後、二本鎖ｓｉＲＮＡを、アニーリングしなかった一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば、一方が過剰であることが原因）から、ＨＰＬＣによって分離する。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ断片に関して、本発明で使用するために、２つ以上のそのような配列を合成して一緒に連結することができる。
【０２６３】
また、本発明の化合物は、たとえば米国特許公開第２００４／００１９００１号（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載のタンデム合成方法によって合成することもでき、両方のｓｉＲＮＡ鎖は、切断可能なリンカーによって分離されている単一の連続的したオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成し、続いてリンカーは切断されてｓｉＲＮＡ断片または鎖がもたらされ、これらはハイブリダイズし、ｓｉＲＮＡに重鎖の精製が可能となる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーから選択される。
本発明は、本明細書中に言及した疾患および状態のうちの任意のものを治療するための、２つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む薬剤組成物をさらに提供し、前記２つの分子は、等価もしくは他の様式で有益の活性を生じる量で薬剤組成物中で物理的に混合するか、または共有もしくは非共有結合するか、または２〜１００、好ましくは２〜５０もしくは２〜３０個のヌクレオチドの範囲の長さの核酸リンカーによって一緒に結合されていてよい。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は本明細書中に記載の二本鎖核酸構造からなり、２つのｓｉＲＮＡ配列は、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）から選択される。
【０２６４】
したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、共有もしくは非共有結合する、またはリンカーによって結合されて、タンデムｓｉＲＮＡ化合物を形成し得る。２つのｓｉＲＮＡ配列を含むそのようなタンデムｓｉＲＮＡ化合物は、典型的には約３８〜１５０個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは３８または４０〜６０個のヌクレオチドの長さであり、２つより多いｓｉＲＮＡ配列がタンデム分子中に含まれる場合は、それに応じてより長い。内部細胞プロセッシングによって産生されるｓｉＲＮＡをコードしている、２つ以上のより長い配列からなるより長いタンデム化合物、たとえば、長いｄｓＲＮＡも想定され、２つ以上のｓｈＲＮＡをコードしているタンデム分子も想定される。合成修飾タンデム分子も、本発明の一部であるとみなされる。本発明の２つ以上のｓｉＲＮＡ配列を含むタンデム化合物が想定される。
【０２６５】
本発明のアポトーシス促進遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、薬剤組成物中の主活性構成要素であるか、あるいは、２つ以上のｓｉＲＮＡ（または分子の混合物であるか２つ以上のｓｉＲＮＡをコードしている１つもしくは複数のタンデム分子であるかにかかわらず、２つ以上のｓｉＲＮＡをコードしているもしくはそれを内在的に産生する分子）を含有する薬剤組成物の１つの活性構成要素であってよく、前記薬剤組成物は、さらに１つまたは複数の追加の遺伝子を標的とする１つまたは複数の追加のｓｉＲＮＡ分子からなる。前記追加の遺伝子の同時阻害は、本明細書中に開示する疾患の治療において相加的または相乗的な効果をもたらす可能性が高い。
さらに、本明細書中に開示するアポトーシス促進ｓｉＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡを含むもしくはコードしている任意の核酸分子は、本明細書中に開示する疾患を治療するための標的化の増強を達成するために、任意選択で、標的細胞上に発現される細胞表面内部移行可能分子に対する抗体（アプタマー分子を含む）と連結または結合（共有もしくは非共有）し得る。たとえば、抗Ｆａｓ抗体（好ましくは中和抗体）を、任意のアポトーシス促進ｓｉＲＮＡと（共有または非共有的に）合わせ得る。
【０２６６】
本発明の化合物は、たとえば、二本鎖化合物として、二本鎖ヘアピン化合物として、またはタンデム化合物として送達する。ステム領域が本発明のオリゴヌクレオチドの配列を含む、１つまたは複数のステムおよびループ構造を含む長いオリゴヌクレオチド（典型的には２５〜５００個のヌクレオチドの長さ）は、担体、好ましくは製薬上許容される担体中で送達してよく、また、内在性細胞複合体によって（たとえば、上述のようにＤＲＯＳＨＡおよびＤＩＣＥＲによって）細胞内でプロセッシングされて、本発明のオリゴヌクレオチドである１つまたは複数のより小さな二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を生じてもよいことも想定される。このオリゴヌクレオチドは、タンデムｓｈＲＮＡ構築体と呼ばれる。この長いオリゴヌクレオチドは、それぞれのステム領域が本発明のアポトーシス促進遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含む、１つまたは複数のステムおよびループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであることが想定される。具体的には、このオリゴヌクレオチドは、表Ｂ〜Ｄ（Ｂ１〜Ｂ７４、Ｃ１〜Ｃ４、Ｄ１〜Ｄ３４）に示す配列番号９７〜８７、７８に記載のセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列であることが想定される。
【０２６７】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡｉ現象に関連するいくつかのＰＣＴ出願が最近公開されている。これらには、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４８９５号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／４９０３５号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４号；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４１号；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４号；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８号；およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４号が含まれる。
【０２６８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡ種の、細胞質タンパク質複合体内に入り、その後、それ内で相補的細胞ＲＮＡを標的としてそれを特異的に分解する能力に基づく。ＲＮＡ干渉応答は、一般的にはＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特長とし、これは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こり得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２００１、１５（２）：１８８〜２００）。より詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮａｓｅ（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡなど；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４０９（６８１８）：３６３〜６；Ｌｅｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、２００３、４２５（６９５６）：４１５〜９）によって、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片（短期阻害性ＲＮＡ「ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる）へと消化される。ＲＩＳＣタンパク質複合体がこれらの断片および相補的ｍＲＮＡを認識する。プロセス全体は、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断という結果となる（ＭｃＭａｎｕｓおよびＳｈａｒｐ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、２００２、３（１０）：７３７〜４７；ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２００３、５（３）：２１７〜２４）。（これらの用語および提案された機構のさらなる情報には、たとえば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ他、ＲＮＡ、２００１、７（１１）：１５０９〜２１；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ、Ｃｅｌｌ、２００１、１０７（４）：４１５〜８およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６号を参照されたい）。
いくつかのグループが、細胞内でｓｉＲＮＡを生じることができるＤＮＡ系ベクターの開発を記載している。方法は、一般に、効率的にプロセッシングされて細胞内でｓｉＲＮＡを形成する短いヘアピンＲＮＡの転写を含む（Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００２、９９：１４４３〜１４４８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ、２００２、１６：９４８〜９５８；Ｓｕｉ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００２、８：５５１５〜５５２０；およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９６：５５０〜５５３）。これらの報告は、数々の内在的および外因的に発現された遺伝子を特異的に標的化することができるｓｉＲＮＡを作製する方法を記載している。
【０２６９】
本発明は例示的な様式で記載し、使用した用語は、限定するのではなく、説明する性質の言葉であることを意図することを、理解されたい。
明らかに、本発明の多くの改変および変形が、上記教示に鑑みて可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に記載ものとは別の様式で実施できることを、理解されたい。
本発明は、実施例を参照して以下に詳細に例示するが、それに限定されると解釈されるべきでない。
本明細書中の任意の文書引用は、そのような文書が関連する従来技術であることの承認であること、または本出願の任意の特許請求の範囲の特許性の問題となるみなされることを意図しない。任意の文書の内容または日付に関する任意の記述は、出願人が出願時に入手可能な情報に基づいており、そのような記述の正確性の承認を構成するものではない。
【実施例】
【０２７０】
さらなる詳述なしに、当業者が、前述の記載を用いて、本発明をその完全な範囲まで利用できると考えられる。したがって、以下の好ましい具体的な実施形態は、単に例示的であると解釈されるべきであり、いかなる様式でも特許請求した発明を限定するものではない。
本明細書中で具体的に記載しない、当分野で知られている標準の分子生物学プロトコルは、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８８）、およびＡｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）およびＰｅｒｂａｌ、分子クローニングの実用的な指針（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ他、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＢｉｒｒｅｎ他（編）、ゲノム分析：実験室の手引きシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９および第５，２７２，０５７号に記載の方法に本質的に従い、これらは本明細書中に参考として組み込まれている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一般に、ＰＣＲプロトコル：方法および応用の指針（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）のように実施した。フローサイトメトリーと組み合わせたｉｎ  ｓｉｔｕ（細胞内）ＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含有する細胞の検出に有用である（Ｔｅｓｔｏｎｉ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６、８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲを行う方法も当分野で周知である。
【０２７１】
（細胞培養）
ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ他（ＮＡＲ、２００３．３１：６７０〜８２）に記載のように培養した。ヒトケラチノサイトは、３７℃で、１０％のＦＣＳを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウス細胞系Ｂ１６Ｖ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、３７℃で、１０％のＦＣＳを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。培養条件は、（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９７年５月；１９（４）：２３１〜９）に記載のとおりであった。
それぞれの場合で、細胞を約５０，０００個の細胞／ウェルの密度で本明細書中に記載の実験に供し、本発明による二本鎖核酸を２０ｎＭで加え、二本鎖核酸は、以下に記載のように１μｇ／ｍｌの専売の脂質を用いて複合体形成させた。
【０２７２】
（低酸素症様状態の誘発）
低酸素症様状態を誘発させるために、以下のように細胞をＣｏＣｌ２で処理した：ｓｉＲＮＡの形質移入は、１０ｃｍのプレート（３０〜５０％コンフルエント）中で、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ他、２００３；Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ他、２００３に記載のように実施した。手短に述べると、ｓｉＲＮＡは、無血清培地中の事前に形成させたＧＢと脂質との１０×濃縮複合体を、完全培地中の細胞に加えることによって、形質移入した。全形質移入体積は１０ｍｌであった。別段に記述しない限りは、最終脂質濃度は１．０μｇ／ｍｌであり、最終ｓｉＲＮＡ濃度は２０ｎＭであった。低酸素応答の誘発は、ＣｏＣｌ２（１００μＭ）を、溶解の２４時間前に組織培地に直接加えることによって実施した。
【０２７３】
（細胞抽出物の調製および免疫ブロッティング）
細胞抽出物の調製および免疫ブロット分析は、本質的に（Ｋｌｉｐｐｅｌ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９８．１８：５６９９〜７１１；Ｋｌｉｐｐｅｌ，Ａ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９６．１６：４１１７〜２７）に記載のように実施した。
【０２７４】
（実施例１  ｓｉＲＮＡ化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）
１個のウェルあたり約１．５〜２×１０５個の試験細胞（ヒト遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡにはＨｅＬａ細胞および／または２９３Ｔ細胞、ラット／マウス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡにはＮＲＫ５２細胞および／またはＮＭＵＭＧ細胞）を６ウェルプレートに播種した（７０〜８０％コンフルエント）。
２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５ｎＭまたは２０ｎＭの最終濃度で使用して、細胞をｓｉＲＮＡ化合物で形質移入した。細胞を、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で７２時間インキュベーションした。
陽性対照として、形質移入ＰＴＥＮ−Ｃｙ３で標識したｓｉＲＮＡ化合物を使用した。使用したさらなる陽性対照は、平滑末端化した１９量体のｓｉＲＮＡ、すなわち、ｘ＝ｙ＝１９であり、ＺおよびＺ’はどちらも存在しないものであった。このｓｉＲＮＡはリン酸化されておらず、糖残基の２’位置が修飾された交互に現れるリボヌクレオチドをアンチセンスおよびセンス鎖の両方中に有しており、２’位置の部分はメトキシ（２’−Ｏ−メチル）であり、アンチセンス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されており、センス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されていない。
ｓｉＲＮＡ活性の陰性対照として、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ化合物を使用した。
形質移入の７２時間後、細胞を収集し、ＲＮＡを細胞から抽出した。蛍光顕微鏡観察によって形質移入効率を試験した。
特定の好ましいｓｉＲＮＡ構造を用いた遺伝子発現の阻害の％は、内在性遺伝子を発現する細胞中の標的遺伝子のｑＰＣＲ分析を用いて決定した。
【０２７５】
一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために選択した特定の配列を有するｓｉＲＮＡは、ヒトおよびラットまたはウサギなどの第２の種の遺伝子に特異的であった。これらのＲＮＡ配列を有し、本明細書中に記載のように修飾されたｓｉＲＮＡを用いて、同様の結果が得られる。特定の遺伝子の発現の軽減という同様の結果が、その配列が表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載されている他のｓｉＲＮＡオリゴマーで得られる。表ＢのｓｉＲＮＡオリゴマーは、配列番号９７〜６８６５４に記載されている（その全体が参考として本明細書中に組み込まれている、米国出願第１１／９７８，０８９号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００７／００１２７８号に開示されている）。
【０２７６】
以下の表Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４は好ましいｓｉＲＮＡ配列を開示し、これらのすべてで、ｓｉＲＮＡが上記アッセイにおいて活性であることが判明している（表Ｃ１、Ｃ３およびＣ４−１９量体のｓｉＲＮＡ分子；表Ｃ２−２３量体のｓｉＲＮＡ分子）。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために選択した特定の配列を有するｓｉＲＮＡは、ヒトおよびラット／ウサギ遺伝子のどちらに対しても特異的であった。これらのＲＮＡ配列を有し、本明細書中に記載のように修飾されたｓｉＲＮＡを用いて、同様の結果が得られる。特定の遺伝子の発現の軽減という同様の結果が、その配列が表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載されている他のｓｉＲＮＡで得られる。
【０２７７】
【表２−１】
0005646997.tif 000004
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表３】
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【表４】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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表Ｃ１〜Ｃ４によるアンチセンス配列およびセンス配列を含む化合物および構造的修飾体の活性およびまたは安定性の一部の例を、図２３に示す。
【０２７８】
（実施例２  急性腎不全（ＡＲＦ）のモデル系）
ＡＲＦとは、数日以内に起こる急速な腎機能の悪化によって特徴づけられる臨床症候群である。理論に束縛されずに、急性腎傷害は、心臓の大手術などの大手術を受けている患者における腎臓虚血再灌流傷害などの、腎臓虚血再灌流傷害の結果であり得る。ＡＲＦの主な特長は、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の急激な低下であり、これは、窒素性廃棄物（尿素、クレアチニン）の保持をもたらす。最近の研究により、腎組織中のアポトーシスがＡＲＦのヒト事例のほとんどにおいて顕著であることが支持されている。アポトーシス細胞死の主な部位は遠位ネフロンである。虚血性傷害の初期段階の間、アクチン細胞骨格の完全性の損失は、刷子縁の損失、細胞接着点の損失、および続く下部の基層からの細胞の離脱を伴った、上皮の平板化をもたらす。
活性ｓｉＲＮＡ化合物の試験を、虚血再灌流誘発性ＡＲＦの動物モデルを用いて行った。
【０２７９】
虚血再灌流誘発性ＡＲＦに対する保護
ラットにおいて、両側腎動脈のクランプを４５分間行い、続いてクランプを放出して再灌流を可能にした後に、虚血再灌流傷害が誘発された。再灌流の７日後にラットを屠殺した。１２ｍｇ／ｋｇのＣａｓｐ２＿４  ｓｉＲＮＡ化合物（Ｃａｓｐ２＿４：センス配列：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵ、配列番号１３９；アンチセンス配列：ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣ、配列番号１４０）を、クランプの４時間に頸静脈内に注射した。ＡＲＦの進行は、手術前（０日目）ならびに１日後、３日後、５日後および７日後の血清クレアチニンレベルを測定することによって監視した。実験の最後に、ラットに、留置大腿ラインを介して温かいＰＢＳ、次いで４％のパラホルムアルデヒドを灌流した。左の腎臓を手術によって取り出し、続く組織学的分析のために４％のパラホルムアルデヒド中で保管した。急性腎不全とは、しばしば、血清クレアチニンレベルがベースラインから急性的に増加することとして定義される。少なくとも０．５ｍｇ／ｄＬまたは４．２μｍｏｌ／Ｌの血清クレアチニンの増加が、急性腎不全の指標であるとみなされる。血清クレアチニンは、手術前の０時点ならびにＡＲＦ手術の１日後、３日後、５日後および７日後に測定した。
【０２８０】
この実験で使用した、ＡＲＦを治療および予防するために特に好ましい化合物は、（Ｎ’）ｙ（センス鎖）が、位置１８にＬ−ＤＮＡを含むか（結果は以下の「グループ２」の見出しの表に表す）、または（Ｎ’）ｙ（センス鎖）が、位置１７および１８にＬ−ＤＮＡを含み（結果は以下の「グループ３」の見出しの表に表す）、（Ｎ）ｘ（アンチセンス鎖）が交互に現れる修飾および非修飾のリボヌクレオチドを含み、修飾リボヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾を含む、構造（ＩＶ）の一実施形態によるＣＡＳＰ２＿４  ｓｉＲＮＡ化合物である。プラセボを用いた結果は、以下の「グループ１」の見出しの表に表す。ｓｉＲＮＡ化合物は、（Ｎ’）ｙの位置１５にＤＮＡヌクレオチドおよびまたは位置２にＬ−ＤＮＡヌクレオチドをさらに含み得る。以下の結果から明らかとなるように、クランプの４時間後に投与したＣａｓｐ２＿４  ｓｉＲＮＡ化合物は、虚血再灌流傷害の１日後および３日後にクレアチニンレベルの上昇を軽減した。クランプの前にｓｉＲＮＡ化合物を投与することは、虚血再灌流に対して保護的でもあることが見い出された。
【０２８１】
グループ１：クランプの４時間後にプラセボを注射した動物における血清クレアチニンレベル（ｍｇ／ｄＬ）。
【表６】
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グループ２：クランプの４時間後に注射したＣＡＳＰ２＿４  ｓｉＲＮＡ（センス鎖の位置１８にＬ−ＤＮＡ、１２ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物における血清クレアチニンレベル。
【表７】
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グループ３：クランプの４時間後に注射したＣＡＳＰ２＿４  ｓｉＲＮＡ（センス鎖の位置１７および１８にＬ−ＤＮＡ、１２ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物における血清クレアチニンレベル。
【表８】
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表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）のｓｉＲＮＡ化合物、特に表Ａの特定のアポトーシス促進遺伝子、特に、遺伝子ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、およびＳＰＰ１）に向けられたｓｉＲＮＡを上記モデル系で試験し、虚血再灌流に対して保護的であることが見い出された。
【０２８２】
（実施例３  褥瘡および褥瘡性潰瘍のモデル系）
褥瘡および糖尿病性潰瘍を含めた褥瘡性潰瘍は、持続的な圧力（通常はベッドまたは車椅子から）により身体の脆弱な部分、特に臀部、腰および踵の皮膚への循環が遮断された際に発生する、損傷した皮膚および組織の領域である。十分な血流の欠損は、患部組織の虚血性壊死および潰瘍形成をもたらす。褥瘡は、感覚が消失したもしくは存在しない、または衰弱した、痩せた、麻痺した、もしくは長期病臥中の患者で、最も頻繁に起こる。仙骨、坐骨、大転子、外踝、および踵の上の組織が特に影響されやすく、患者状態に応じて他の部位が関与している場合もある。
褥瘡、潰瘍および同様の創傷の治療についての本発明の活性阻害剤（ｓｉＲＮＡ化合物など）の試験は、Ｒｅｉｄ他、Ｊ  Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．、１１６：１７２〜１８０、２００４に記載されているようにマウスモデル中で行う。
【０２８３】
さらなるウサギモデルがＭｕｓｔｏｅ他、ＪＣＩ、１９９１．８７（２）：６９４〜７０３；ＡｈｎおよびＭｕｓｔｏｅ、Ａｎｎ  Ｐｌ  Ｓｕｒｇ、１９９１．２４（１）：１７〜２３によって記載されており、本発明のｓｉＲＮＡ化合物を試験するために使用されている。表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）によるｓｉＲＮＡ、特に遺伝子ＣＩＱＢＰ、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、またはＴＹＲＯＢＰに向けられた化合物を動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が褥瘡および潰瘍を治療および予防することが示される。
【０２８４】
（実施例４  慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のモデル系）
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、主に、末端細気管支に遠位の末梢気腔の永久的な破壊である気腫によって特徴づけられている。また、気腫は、細気管支および肺胞構造中のマクロファージおよび好中球などの炎症細胞の蓄積によっても特徴づけられている。気腫および慢性気管支炎は、ＣＯＰＤの一部として、または独立して起こり得る。
ＣＯＰＤ／気腫／慢性気管支炎の治療についての本発明の活性阻害剤（ｓｉＲＮＡなど）の試験は、以下に開示するものなどの動物モデル中で行う：
ＳｔａｒｃｈｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８９．Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌｓ、２３：２３４〜２４０；Ｐｅｎｇ他、２００４．；Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１６９：１２４５〜１２５１；Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ他、２００４．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、７２：７２４７〜５６。
【０２８５】
さらなるモデルは、本出願中に参考として組み込まれている、本出願の譲受人に譲渡されたＰＣＴ特許公開ＷＯ２００６／０２３５４４号に記載されている。
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）によるｓｉＲＮＡ、特に遺伝子ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、およびＤＵＯＸ１に対するｓｉＲＮＡを、これら動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が気腫、慢性気管支炎およびＣＯＰＤを治療および／または予防し得ることが示される。
【０２８６】
（実施例５  脊髄傷害のモデル系）
脊髄傷害、または骨髄障害とは、感覚および／または可動性の損失をもたらす脊髄の障害である。２つの最も一般的な脊髄傷害の種類は、外傷および疾患が原因である。外傷性傷害は、とりわけ、自動車事故、転倒、銃撃、潜水事故が原因である場合があり、脊髄を冒す可能性がある疾患には、ポリオ、二分脊椎、腫瘍およびフリードライヒ失調症が含まれる。
損傷した脊髄内への注射後の、ｓｉＲＮＡ分子のニューロン内への取り込み：
様々な種類の細胞におけるＣｙ３で標識したｓｉＲＮＡ（損傷した脊髄内に注射したもの）の取り込みを、脊髄挫傷後および損傷していないラットにおいて検査する。矢状凍結切片を作製し、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞および／またはマクロファージ／ミクログリア中で取り込みが起こったかどうかを決定するために、４つの異なる抗体群を用いた免疫染色を行う。ニューロンのマーカーにはＮｅｕＮまたはＧＡＰ４３が含まれ；星状膠細胞および潜在的な神経幹細胞のマーカーにはＧＦＡＰ、ネスチンまたはビメンチンが含まれ；乏突起膠細胞のマーカーにはＮＧ２またはＡＰＣが含まれ；マクロファージ／ミクログリアのマーカーにはＥＤ１またはＩｂａ−１が含まれる（Ｈａｓｅｇａｗａ他、２００５．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、１９３：３９４〜４１０）。
【０２８７】
ラットに２つの異なる用量のＣｙ３で標識したｓｉＲＮＡ（１μｇ／μｌ、１０μｇ／μｌ）を注射し、１日間および３日間放置した後に屠殺する。組織学的分析により、多くの糸状プロフィールならびに他のプロセスおよび細胞体への標識したｓｉＲＮＡの取り込みが示される。ＭＡＰ２に対する抗体を用いた免疫染色により、運動ニューロンを含めたニューロンの樹状突起内および細胞体内への標識の取り込みが同定される。星細胞またはマクロファージに特異的な他の抗体を用いた染色により、ニューロンと比較してＣｙ３で標識したｓｉＲＮＡの取り込みがより低いことが明らかとなる。これらの結果は、損傷した脊髄内に注射したｓｉＲＮＡ分子が、運動ニューロンを含めたニューロンの細胞体および樹状突起に到達することを示している。
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜３４）によるｓｉＲＮＡ化合物、特に遺伝子ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、およびＲＨＯＡに向けられたｓｉＲＮＡをこの動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が脊髄傷害後の機能的回復を促進し、したがって脊髄傷害の治療に使用し得ることが示される。
【０２８８】
（実施例６  緑内障のモデル系）
緑内障の治療または予防についての本発明の活性阻害剤（ｓｉＲＮＡなど）の試験は、動物モデル中で、たとえば、Ｐｅａｓｅ他、Ｊ．Ｇｌａｕｃｏｍａ、２００６、１５（６）：５１２〜９（実験的緑内障に罹患しているラットおよび正常マウスのおける、圧測定の較正ならびにＴｏｎｏＬａｂおよびＴｏｎｏＰｅｎ眼圧計の比較）に記載のように実施する。
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）によるｓｉＲＮＡ、特に遺伝子ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＨＲＫ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、およびＲＨＯＡに対するｓｉＲＮＡをこの動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が緑内障を治療および／または予防することが示される。
【０２８９】
（実施例６Ａ  虚血性視神経症（ＩＯＮ）のモデル系）
虚血性視神経症の動物モデルを、視神経挫滅傷のプロトコルを用いてウィスターラットの成体で確立させた。視神経挫滅の７日前に、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ（２％、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ、コロラド州Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ）を上丘に施用することによって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を選択的に標識した。トレーサーはＲＧＣ軸索に沿った逆行性輸送によって輸送させて、蛍光トレーサーを注入した１週間後以内にすべてのＲＧＣの完全かつ特異的な標識がもたらされた。動物は、逆行性トレーシングの７日後に視神経挫滅傷に供した。眼窩視神経を眼窩上手法によって曝露させ、篩骨篩板から２ｍｍを鉗子で１０秒間挫滅することによって、視神経中のすべての軸索を横切した。視神経挫滅時に、単一用量の、２０μｇ／５μｌのＰＢＳのＣａｓｐ２＿４  ｓｉＲＮＡ化合物を、硝子体内の神経頭部の２ｍｍ前側に、ガラスマイクロピペットを用いて微量注入した（Ｃａｓｐ２＿４：センス配列：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵ、配列番号１３９；アンチセンス配列：ＡＧＧＡＧＵＵＣＣＡＣＡＵＵＣＵＧＧＣ、配列番号１４０；センス鎖は位置１７および１８にＬ−ＤＮＡを含み、アンチセンス鎖は交互に現れる修飾および非修飾のリボヌクレオチドを含み、修飾リボヌクレオチドは２’ＯＭｅ修飾を含む）。ＲＧＣの生存は、視神経挫滅の７日後に、平らにした網膜上のＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄで標識されたＲＧＣを計数することによって決定した。実験動物は、視神経挫滅の１週間後に４％のパラホルムアルデヒドを用いて経心的に灌流した。両方の網膜を解剖して取り出し、さらに３０分間固定し、神経節細胞層を定量するためにスライドガラス上に平らに乗せた。それぞれの網膜中の１６個の明白な領域中の蛍光ＲＧＣの数を計数し、視神経挫滅傷を全く受けなかったラットから得られた試料、または視神経挫滅傷と共にＰＢＳ、対照ｓｉＲＮＡもしくはＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを注射したラットから得られた試料と比較して、ＲＧＣの生存の％を決定した。瀕死のＲＧＣの貪食後にＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを取り込んだ可能性のあるミクログリア細胞は、その特徴的な形態学によって識別され、定量分析から排除した。以下の表に実証される結果により、関連性のないｓｉＲＮＡ化合物と比較して、Ｃａｓｐ２＿４化合物で治療した動物において、ＲＧＣの生存の％の２倍を超える増加が明らかとなった。
【０２９０】
【表９】
0005646997.tif 000016
【０２９１】
眼に近い視神経を横切することによってＲＧＣの集団全体を軸索切断する、視神経軸索切断の別のモデルを用いて、同様の結果が得られる。（Ｃｈｅｎｇ  Ｌ、Ｓａｐｉｅｈａ  Ｐ、Ｋｉｔｔｌｅｒｏｖａ  Ｐ、Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ＷＷ、Ｄｉ  Ｐｏｌｏ  Ａ．ＴｒｋＢ遺伝子移入がｉｎ  ｖｉｖｏで網膜神経節細胞を軸索切断誘発性の死から保護する（ＴｒｋＢ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｘｏｔｏｍｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２年５月１５日、２００２；２２：３９７７〜３９８６）。
【０２９２】
（実施例７  ラットにおける肺移植後の虚血／再灌流傷害のモデル系）
肺移植後の虚血／再灌流傷害または低酸素傷害の治療または予防についての本発明の活性阻害剤（ｓｉＲＮＡなど）の試験は、実験動物モデルのうちの１つまたは複数中で、たとえば、Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ他、２００４．Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２３：８８９〜９３；Ｈｕａｎｇ他、１９９５．Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１４：Ｓ４９；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ他、１９９５．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５９：１５０９〜１５１７；Ｗｉｌｋｅｓ他、１９９９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６７：８９０〜８９６；Ｎａｋａ他、１９９６．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７９：７７３〜７８３に記載のように実施する。
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）によるｓｉＲＮＡ、特にＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＢＮＩＰ３、ＲＡＣ１、およびＤＵＯＸ１に対するｓｉＲＮＡをこの動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が肺移植後の虚血再灌流傷害を治療および／または予防し、したがって移植手術と併せて使用し得ることが示される。
【０２９３】
（実施例８  急性呼吸窮迫症候群のモデル系）
急性呼吸窮迫症候群の治療についての本発明の活性阻害剤（ｓｉＲＮＡなど）の試験は、動物モデル中で、Ｃｈｅｎ他（Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．２００３；１０（６  Ｐｔ  １）：５８８〜９２によって記載のように実施する。表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）によるｓｉＲＮＡ化合物、特に遺伝子ＣＹＢＡ、ＨＲＫ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＳＰＰ１、およびＤＵＯＸ１に対するｓｉＲＮＡをこの動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡが急性呼吸窮迫症候群を治療および／または予防し、したがってこの状態の治療に使用し得ることが示される。
【０２９４】
（実施例９  聴覚損失状態のモデル系）
（ｉ）耳の正円窓に局所施用した後の、蝸牛中のＣｙ３−ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡの分布
１μｇ／１００μｌのＣｙ３−ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡ（合計０．３〜０．４μｇ）のＰＢＳ溶液を、チンチラの正円窓に施用する。治療した蝸牛内のＣｙ３で標識した細胞を、ｓｉＲＮＡの正円窓施用の２４〜４８時間後に、チンチラを屠殺した後に分析した。蝸牛内の標識のパターンは２４時間および４８時間後で類似しており、蝸牛の基底回転、蝸牛の中回転および蝸牛の頂回転中の標識が含まれる。鼓室階上にＣｙ３−ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡを施用することで、主に蝸牛の基底回転および蝸牛の中回転中での標識が明らかとなる。Ｃｙ３シグナルは、Ｃｙ３−ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡを施用した１５日間後まで持続する。本発明のｓｉＲＮＡ化合物をこの動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が蝸牛の基底、中および頂回へと有意に浸透され、これらの化合物を聴覚損失の治療に使用し得ることが示される。
【０２９５】
（ｉｉ）カルボプラチン誘発性またはシスプラチン誘発性の蝸牛有毛細胞死のチンチラモデル
チンチラを、生理食塩水中の特異的ｓｉＲＮＡをそれぞれの動物の左耳に直接投与することによって、事前に治療した。生理食塩水を、それぞれの動物の右耳にプラセボとして与える。本発明の特異的ｓｉＲＮＡ化合物を投与した２日後、カルボプラチン（７５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）またはシスプラチン（１３ｍｇ／ｋｇを３０分間かけて腹腔内インフュージョン）で処置する。チンチラを屠殺した後（カルボプラチン処置の２週間後）、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）の死細胞の％を、左耳（ｓｉＲＮＡで治療）および右耳（生理食塩水で治療）で計算する。内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）の死細胞の％は、右耳（生理食塩水で治療）よりも左耳（ｓｉＲＮＡで治療）で低いことが計算される。
【０２９６】
（ｉｉｉ）音響誘発性蝸牛有毛細胞死のチンチラモデル
音響外傷モデルにおける特異的ｓｉＲＮＡの活性をチンチラで研究する。動物を、４ｋＨｚを中心とする１オクターブの帯域の雑音に、２．５時間、１０５ｄＢで曝す。雑音に曝したチンチラの左耳は、約１０μＬまでの生理食塩水中の３０μｇのｓｉＲＮＡで事前に治療する（音響外傷の４８時間前）。右耳はビヒクル（生理食塩水）で事前に治療する。複合活動電位（ＣＡＰ）は、蝸牛から伝達される神経活性を測定するための、好都合かつ信頼性のある電気生理学的方法である。ＣＡＰは、クリックまたはトーンバーストなどの音刺激が急激に開始された際に生じる局所電場電位を検出するために、蝸牛の基底周辺に電極を配置することによって記録する。それぞれの耳の機能状態を、音響外傷の２．５週間後に評価する。具体的には、ｓｉＲＮＡで治療した耳中の閾値が治療していない（生理食塩水）耳よりも低い（良好である）かどうかを決定するために、正円窓から記録された複合活動電位の平均閾値を、音響外傷の２．５週間後に決定する。さらに、内および外有毛細胞の損失のレベルを、ｓｉＲＮＡで治療した耳および対照耳において決定する。
【０２９７】
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）によるｓｉＲＮＡ分子、特に遺伝子ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＮＯＸ３、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、およびＣＴＧＦに対するｓｉＲＮＡをこの動物モデル中で試験し、それにより、ｓｉＲＮＡで治療した耳が、治療していない（生理食塩水）耳よりも低い（良好である）ことが示される。さらに、内および外有毛細胞の損失の量は、対照耳よりもｓｉＲＮＡで治療した耳で低い。
【０２９８】
（実施例１０  骨関節炎（ＯＡ）の動物モデル）
コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）：マウスにおけるＣＩＡは、Ｔｒｅｎｔｈａｍ他（１９７７．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４６：８５７〜８６８）に記載されている。アジュバント誘発性関節炎（ＡＡ）：ＡＡは、Ｋｏｎｇ他（１９９９．Ｎａｔｕｒｅ、４０２：３０４〜３０８）に記載されている。半月板切除モデルは、Ｈａｎ他（１９９９．Ｎａｇｏｙａ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、６２（３〜４）：１１５〜２６）に記載されている。
【０２９９】
ＳＳＰ１に対するｓｉＲＮＡなどの様々なｓｉＲＮＡ阻害剤の、軟骨細胞増殖、最終分化および関節炎の発生などのＯＡに関連する様々なパラメータに対する効果は、当分野で知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに加えて、上記モデルのうちの１つまたは複数を用いて評価する。表Ａの特定のアポトーシス促進遺伝子、特にＳＳＰ１に向けられたｓｉＲＮＡ化合物をこれらの動物モデル中で試験し、それにより、これらのｓｉＲＮＡがＯＡを治療および／または予防し、したがってこの状態の治療に使用し得ることが示される。
【０３００】
（実施例１１  移植関連急性腎傷害のラットモデル系）
温虚血−試験ラットに左側腎摘除術を行い、次いで自己移植を行って、４５分間の温腎臓移植片保存期間がもたらされる。自己移植後、同じ動物に右側腎摘除術を行う。標的に対する化学修飾ｓｉＲＮＡを、腎臓移植片を収集する前（ドナーの治療を模倣）（「プレ」）、もしくは腎臓の自己移植後（レシピエントの治療を模倣）、または収集前および移植後の両方（ドナーおよびレシピエントの治療の組合せ）（「プレ−ポスト」）に、大腿静脈を介して静脈内投与する。
冷虚血−ドナー動物に左側腎摘除術を行い、次いで、収集した腎臓を５時間の間冷保存（氷上）する。この期間の終わりに、レシピエントラットは両側腎摘除術を受け、次いで例保存した腎臓移植片の移植を受ける。全温虚血時間（外科的処置を含める）は約３０分間である。化学修飾ｓｉＲＮＡを、ドナー動物に腎臓を収集する前に（「プレ」）、またはレシピエント動物に移植の１５分後（「１５分後」）もしくは４時間後に（４時間後）、大腿静脈を介して静脈内投与する。
【０３０１】
移植後腎機能の改善におけるｓｉＲＮＡの有効性を評価するために、温および冷虚血モデルの両方で、移植後１、２、および７日目に血清クレアチニンレベルを測定する。
【０３０２】
（実施例１２  アポトーシス促進遺伝子に対する活性ｓｉＲＮＡ化合物の配列の作製およびｓｉＲＮＡの産生）
独自のアルゴリズムおよび任意の遺伝子、任意選択で本明細書中に開示するアポトーシス促進遺伝子の既知の配列を用いて、多くの潜在的なｓｉＲＮＡの配列を作製した。アルゴリズムに加えて、２３量体オリゴマーの一部の配列を１９量体の配列の５’および／または３’伸長によって作製した。この方法を用いて作製された配列は、対応するｍＲＮＡ配列に対して完全に相補的である。
【０３０３】
表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）は、以下のアポトーシス促進遺伝子のｓｉＲＮＡを示す：腫瘍タンパク質ｐ５３結合タンパク質、２（ＴＰ５３ＢＰ２）；ロイシンリッチリピートおよびデスドメイン含有（ＬＲＤＤ）；チトクロムｂ−２４５、αポリペプチド（ＣＹＢＡ）；活性化転写因子３（ＡＴＦ３）；カスパーゼ２、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（神経前駆細胞発現、発生的ダウンレギュレーション２）（ＣＡＳＰ２）；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ３（ＮＯＸ３）；ハラキリ、ＢＣＬ２相互作用タンパク質（ＢＨ３のみを含有）（ＨＲＫ）；補体成分１、ｑ小成分結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３（ＢＮＩＰ３）；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８（ＭＡＰＫ８）；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）；ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１）；グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３Ｂ）；プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ、リガンド開口型イオンチャネル、７（Ｐ２ＲＸ７）；一過性受容体電位陽イオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー２（ＴＲＰＭ２）；ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（ＰＡＲＧ）；ＣＤ３８分子（ＣＤ３８）；ＳＴＥＡＰファミリーメンバー４（ＳＴＥＡＰ４）；骨形成タンパク質２−ＢＭＰ２；ギャップ結合タンパク質、α１、４３ｋＤａ（コネキシン４３）（ＧＪＡ１）；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ）；結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）；分泌リンタンパク質１（オステオポンチン、ＳＰＰ１）；ｒａｓ相同体遺伝子ファミリー、メンバーＡ（ＲＨＯＡ）；二重オキシダーゼ１（ＤＵＯＸ１）。それぞれの遺伝子について、１９量体、２１量体および２３量体のｓｉＲＮＡ配列の別のリストがあり、それらは、独自のアルゴリズムにおけるそのスコアに基づいて、ヒト遺伝子の発現を標的とするための最良配列として優先順位がつけられている。
【０３０４】
（実施例１３  修飾ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ化合物において有用な特定の構造モチーフが試験されており、活性を有するおよびまたは安定であることが示されている。構造Ｃ〜Ｈは、表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載の配列のうちの任意の１つで、活性を有するおよびまたは安定である。
【０３０５】
他の活性構造には、構造（ＩＸ）〜（ＸＩ）による構造モチーフを有するｓｉＲＮＡが含まれる。表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載の配列ならびに構造（Ｉ）〜（ＸＩ）に記載のモチーフを含む化合物を、本明細書中の図２３に示す。
一例では、ｘ＝ｙ＝１９であるＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡを様々な構造モチーフで試験し、活性および安定性について比較した。第１の化合物（Ｃａｓｐ２−ｉ）では、（Ｎ）ｘ（アンチセンス）は、交互に現れる２’−ＯＭｅ修飾および非修飾のリボヌクレオチドからなり；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチド（センス鎖）は、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドはＬＮＡである。第２の化合物（Ｃａｓｐ２−ｉｉ）では、（Ｎ）ｘは非修飾リボヌクレオチドからなり；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続したヌクレオチドはＬＮＡである。第３の化合物（Ｃａｓｐ２−ｉｉｉ）であ、（Ｎ）ｘ中で、５’’末端の２個の連続したヌクレオチド（末端および最後から２番目のヌクレオチド）は、２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合によって結合されており、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続したヌクレオチドはＬＮＡである。これらの分子を以下の表Ｅに示し、ヒトＨｅＬａ細胞における％阻害およびＩＣ５０によって表すその活性を表Ｆに表す。化合物は、ＨｅＬａ細胞中で活性（＞５０％の阻害）であることが示された。化合物を血清安定性についてさらに試験した。構造ＣＡＳＰ２−ｉは、ヒト血清中で２４時間安定であった。Ｃａｓｐ２−ｉｉおよびＣａｓｐ２−ｉｉｉは２４時間を超える安定性を示し、低いレベルの分解生成物が同定された。オリゴマーは、任意のセンスおよびアンチセンスの対または表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）もしくは表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に示すセンスおよびアンチセンスの対によって置き換えることができる、ＣＡＳＰ２に基づいた配列である。
【０３０６】
【表１０】
0005646997.tif 000017
【表１１】
0005646997.tif 000018
【０３０７】
表Ｇは、構造（Ｅ）に基づいた１９量体および２３量体のｓｉＲＮＡ化合物（ラットｐ５３）を示し、下線のヌクレオチドはＬ−ＤＮＡヌクレオチドである。それらの化合物中で、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、非修飾リボヌクレオチドを含み、３’の最後から２番目のヌクレオチドまたは３’の最後から２番目の位置の２個の連続したヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドである。オリゴマーは、任意のセンスおよびアンチセンスの対または表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）もしくは表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に示すセンスおよびアンチセンスの対によって置き換えることができる、ｐ５３に基づく配列である。
【０３０８】
【表１２】
0005646997.tif 000019
【０３０９】
（実施例１４  本発明の２’−メチル化構造を用いた実験結果）
ａ）示した以下の構造を有するｐ５３遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）を、内在性ｐ５３を発現する細胞中で、遺伝子発現を阻害する能力について試験した。
図１Ａは、５＝２’Ｏ−メチル化リボウリジン；６＝２’Ｏ−メチル化リボアデニン；７＝２’Ｏ−メチル化リボシトシン；および８＝２’Ｏ−メチル化リボグアニンである構造を示す。小文字は非修飾リボヌクレオチドを表す。
【０３１０】
結果
構造番号＃２；＃４、＃５、＃６、＃８および＃１１の形質移入後に、８５〜９０％の阻害が観察された。
構造番号＃１の形質移入後に、７５％の阻害が観察された。
構造番号＃３；＃７、＃１０および＃１２の形質移入後に、６０％の阻害が観察された。
構造番号＃９の形質移入後に、５０％の阻害が観察された。
図１Ｂは、上記構造の一部、すなわち＃４、＃５、＃８および＃１１の血清安定性を表す。
ｂ）本発明の２３量体の２’Ｏ−Ｍｅ構造を用いたさらなる実験結果
ｐ５３に向けられた、図２に示すｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドを下線の大文字によって示す。９０％以上のの阻害が構造＃４、＃５、＃６、＃８および＃１１で達成され、７５％の阻害が構造＃２で達成された。
ｃ）図３Ａに示すＣＡＳＰ２に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドを下線の大文字によって示す。
活性の結果を図３Ｂに表し、すべての上記分子が約７５〜９５％の阻害をもたらした。
ｄ）図４Ａに示すｓｉＲＮＡ化合物はＣＡＳＰ２に向けられており、上記アッセイで試験した。２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドを下線の大文字によって示す。
結果を図４Ｂに表し、すべての上記分子が約７５〜９５％の阻害をもたらした。
ｅ）図５Ａに示すＣＡＳＰ２に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−０−Ｍｅ修飾ヌクレオチドは下線の大文字である。
結果を図５Ｂに表し、すべての上記分子が約７５〜９０％の阻害をもたらした。
【０３１１】
（実施例１５  ２’−５’架橋構造を用いたさらなる実験結果）
ａ）図６Ａに示す構造を有するｐ５３遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡ化合物（２０ｎＭ）を、内在性ｐ５３を発現する細胞中で、遺伝子発現を阻害する能力について試験した。
図６Ａでは、５＝２’−５’’架橋リボウリジン；６＝２’−５’’架橋リボアデニン；７＝２’−５’’架橋リボシトシン；および８＝２’−５’’架橋リボグアニンである。下線は２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドを示す。
【０３１２】
結果
構造番号１〜３、１０および１２の形質移入後に、９０〜９５％の阻害が観察された。
構造＃４および＃１５の形質移入後に、８０〜８５％の阻害が観察された。
他の構造は活性がより低かった。図６Ｂは、上記構造の一部の血清安定性を表す。ｂ）ＣＡＳＰ２に関連する２’−５’構造を用いた結果
図７Ａに示すＣＡＳＰ２に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−５’架橋によって連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスク（＊）によって示す。
結果を図７Ｂに表し、ＣＡＳＰ２に対する４つのｓｉＲＮＡはすべて活性であることが示され、７５〜９２％の阻害が得られた。
ｃ）ＤＤＩＴ４（ＲＥＤＤ２）に関連する２’−５’構造を用いた結果
図８Ａに示すＤＤＩＴ４に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−５’架橋によって連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスクによって示す。
ｓｉＲＮＡ化合物１および３は上記アッセイで活性であり、内在性遺伝子の６０％の阻害がもたらされた。
ｄ）ＱＭ５に関連する２’−５’構造を用いた結果：
図８Ｂに示すマウスｐ５３に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−５’架橋によって連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスクによって示す。
構造１および３は９０〜９５％の阻害をもたらし、構造４は７０％の阻害をもたらし、構造２は約５０％の阻害をもたらした。
ｅ）２’−５’および２’−Ｏ−メチルの組合せ修飾を有するさらなる構造
図９Ａ〜９Ｂに示すｐ５３に向けられたｓｉＲＮＡ化合物（ＱＭ５のｓｉＲＮＡ）を上記アッセイで試験した。２’−５’架橋によって連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスクによって示す。２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドは下線である。
結果を図９Ｃ、９Ｄおよび９Ｅに示し、構造の多くが９０％を超える阻害をもたらす。
ｆ）２’−５’および２’−Ｏ−メチルの組合せ修飾を有するさらなる２３量体の構造
図１０Ａに示すｐ５３に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−５’架橋で連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスクによって示す。２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドは下線である。
結果を図１０Ｂに表す。構造１〜３は８０〜９５％の阻害をもたらした。図１０Ｃおよび１０Ｄは、ＳＳ上に２’５’連結を有し、ＡＳ上に交互に現れるメチル化パターンを有する構造の血清安定性の結果を示す。
ｇ）図１１Ａに示すＣＡＳＰ２に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドは下線であり、２’−５’架橋によって連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスクによって示す。
結果を図１１Ｂに表し、構造３〜５が約７０〜９５％の阻害をもたらすことが示される。
ｈ）図１２Ａに示すＣＡＳＰ２に向けられたｓｉＲＮＡ化合物を上記アッセイで試験した。２’−５’架橋によって連結されたヌクレオチドは、その間のアスタリスクによって示す。
結果を図１２Ｂに表し、構造３〜５が約８０〜９５％の阻害をもたらすことが示される。
（実施例１６  鏡像異性体ヌクレオチド含有構造を用いたさらなる実験結果）
図１３Ａに示す構造を有するｐ５３遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡ化合物（５ｎＭおよび２０ｎＭ）を、内在性ｐ５３を発現する細胞中で、遺伝子発現を阻害する能力について試験した。
下線を引いたヌクレオチドは、鏡像体ＤＮＡヌクレオチド、すなわちＬ−デオキシリボヌクレオチドであることに注意されたい。
【０３１３】
結果
構造１〜３、１０、１２および１５の形質移入後に、８０〜９５％の阻害が観察された。両方の鎖上に交互に現れるヌクレオチドを含む構造１６が陽性対照として役割を果たす。
他の構造は、低から中等度の活性を示した。結果を図１３Ｂに表す。図１３Ｃは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド単量体（隣接ヌクレオチド単量体と共有結合）を含むｓｉＲＮＡ化合物の血清安定性を示す。ｓｉＲＮＡ＃１を用いた活性アッセイのさらなる一連の結果により、０．０９ｎＭのＩＣ５０が実証された。この活性レベルは、０．２３ｎＭのＩＣ５０を有する、両方の鎖上に交互に現れるメチル化構造を有する同じ配列よりも２倍高い（図１３Ｄ参照）。
【０３１４】
（実施例１７  ＬＮＡ含有構造を用いたさらなる実験結果）
図１４Ａに示す構造を有するｐ５３遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡ化合物（５ｎＭおよび２０ｎＭ）を、内在性ｐ５３を発現する細胞中で、遺伝子発現を阻害する能力について試験した。ＬＮＡヌクレオチドを示すことに注意されたい。実施例１に表したものと同じアッセイを使用した。
【０３１５】
結果
構造１０、１２および１５の形質移入後に、８０〜９５％の阻害が観察された。他の構造は、低から中等度の活性を示した。結果を図１４Ｂに表す。
（実施例１８  タンデムおよびスター構造）
図１５および１６は、それぞれタンデムｓｉＲＮＡおよび「スター」ｓｉＲＮＡ構造の例および血清安定性を示す。
（実施例１９  複数の修飾種を有するｓｉＲＮＡ化合物）
図１７Ａ−１７Ｃは、様々な位置で修飾ヌクレオチド単量体（隣接ヌクレオチド単量体と共有結合）を含むＣＡＳＰ２のｓｉＲＮＡ化合物、および２０ｎＭで測定し、％標的遺伝子ノックダウン（ＫＤ）を示すその活性を示す。図１７Ａでは、太字の下線文字は２’メトキシ修飾ヌクレオチドを表し、大文字の斜体文字は、２’５’ヌクレオチド間結合および３’メトキシ修飾を含むヌクレオチドを表す。図１７Ｂでは、太字の下線文字は２’メトキシ修飾ヌクレオチドを表し、大文字の斜体文字は、Ｐ−エトキシヌクレオチド間結合を含むヌクレオチドを表す。図１７Ｃでは、太字の下線文字は２’メトキシ修飾ヌクレオチドを表し、大文字の斜体文字は、２’５’ヌクレオチド間結合を含むヌクレオチドを表し、斜体の小文字はＬ−ＤＮＡ修飾ヌクレオチドを表し、小文字はＬＮＡ（２’Ｏ−４’Ｃ）ヌクレオチドを表す。
【０３１６】
（実施例２０  デオキシリボヌクレオチド含有構造）
図１８は、ＤＮＡ単量体を様々な位置で含む（太字および斜体の文字ならびに隣接ヌクレオチド単量体と共有結合）、ＣＡＳＰ２＿４  ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ＡＳ）およびセンス鎖（Ｓ）の例を示す。ｓｉＲＮＡ化合物は、任意のセンス鎖を、アンチセンス鎖のうちの任意のものと組み合わせることによって、合成する。図１８では、５＝２’Ｏメチル化リボウリジン；６＝２’Ｏメチル化リボアデニン；７＝２’Ｏメチル化リボシトシン；および８＝２’Ｏメチル化リボグアニンである。図１９Ａ〜１９Ｄは、ＣＡＳＰ２＿４およびＲｈｏＡ＿２４の配列で例示されるＬ−ＤＮＡモチーフの例を示す。
図１９Ａは、ＲＮＡｉに有用なＣＡＳＰ２を標的とする、２つの好ましい二本鎖の二重鎖を示す。図１９Ｂは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド（ｎ＝Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボヌクレオチド）；Ｎ（下線の大文字）−２’−ＯＭｅリボヌクレオチド；Ｌｃ−Ｌ−デオキシシチジン５’−オーバーハング；ａｂ−脱塩基擬似デオキシリボヌクレオチド類似体を含むＣＡＳＰ２＿４の二重鎖を示す。
図１９Ｃは、ＲＮＡｉ活性を示す二重鎖の調製に有用な、非修飾リボヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチドおよびＬ−ＤＮＡヌクレオチド類似体の組合せを含むＣＡＳＰ２＿４のＳＥＮオリゴヌクレオチド、ならびに、交互に現れる非修飾および修飾されたリボヌクレオチドを含むＣＡＳＰ２＿４のＡＳオリゴヌクレオチドを示す。
図１９Ｄは、ＣＡＳＰ２＿４修飾二重鎖の活性および安定性を示す。
図１９Ｅは、一方または両方の３’末端に３’リン酸を有するまたは有さない、ＲｈｏＡ＿２４配列で例示される特定の二重鎖モチーフを示す。
【０３１７】
（実施例２１  脱塩基、反転脱塩基、２’Ｏ−メチル、ミスマッチ塩基対および他の修飾を含有する構造）
図２０は、本明細書中に開示する状態のうちの任意のものの治療に有効な、そのような構造を記載する。
図２０Ａ〜２０Ｇでは、ヌクレオチド類似体および擬似ヌクレオチドの凡例は以下のとおりである。
下線の大文字「Ｎ」−２’ＯＭｅリボヌクレオチド；「ａｂ」−脱塩基擬似ヌクレオチド；Ｉ−反転脱塩基擬似ヌクレオチド；斜体「５Ｎ」＝５’ＯＭｅ  ＤＮＡ、白色の大文字「Ｎ」−ＬＮＡ；斜体の小文字の下線ｎ：Ｌ−ＤＮＡ；取り消し線Ｎ−ミスマッチ
図２０Ａ：第１セットは、標的配列に対する脱塩基ミスマッチを含むＡＳ鎖を示し、オリゴヌクレオチドは３’リン酸を欠く。
図２０Ｂ：第２セットは、ｄｓ構造中で１５ｂｐ未満を有する二重鎖化合物の調製に有用なオリゴヌクレオチドを示し、オリゴヌクレオチドは３’リン酸を欠く。
図２０Ｃ：第３セットは、標的配列に対する少なくとも１つのミスマッチの挿入を有するオリゴヌクレオチドを示す。
図２０Ｄ〜２０Ｅ：第４および５セットは、第１セットに示すセンス鎖と対合した、脱塩基擬似ヌクレオチド（複数可）（「ａｂ」）を含むＡＳ鎖を示す。
図２０Ｆ：第６セットは、非修飾センス鎖と対合した脱塩基擬似ヌクレオチド（複数可）（「ａｂ」）を含むＡＳ鎖を示す。
図２０Ｇ：第７セットは、第１セットのセンス鎖と対合した非修飾ＡＳ鎖を示す。
図２１は、ＲＮＡｉ活性を有するオリゴヌクレオチドの調製に有用な非塩基対合ヌクレオチド類似体中の塩基修飾の例を示す。（化学構造を示す列では、ｄＲはデオキシリボース部分との結合点を示し、Ｒはリボース部分との結合点を示す）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２３−７】
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【図２３−８】
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【図２３−９】
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【図２３−１０】
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【図２３−１１】
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【図２３−１２】
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【図２３−１３】
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【図２３−１４】
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【図２３−１５】
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【図２３−１６】
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【図２３−１７】
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【図２３−１８】
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【図２３−１９】
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【図２３−２０】
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【図２３−２１】
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【図２３−２２】
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【図２３−２３】
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【図２３−２４】
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【図２３−２５】
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【図２３−２６】
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【図２３−２７】
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【図２３−２８】
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【図２３−２９】
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【図２３−３０】
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【図２３−３１】
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【図２３−３２】
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【配列表】
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