(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫患者における溶解性骨疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、ヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ−１ホモログ（ＤＫＫ１）（登録番号ＮＭ０１２２４２）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＤＫＫ１抗体、又はＤＫＫ１と相互作用する可溶性ＬＲＰ受容体、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
患者における多発性骨髄腫によって引き起こされる悪性腫瘍関連骨減少を調節する医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、ＤＫＫ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＤＫＫ１抗体、又はＤＫＫ１と相互作用する可溶性ＬＲＰ受容体、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
国庫補助の説明
本発明は、部分的に、米国立がん研究所助成金ＣＡ５５８１９およびＣＡ９７５１３の下に連邦政府からの助成金を用いて開発された。このため、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００２年１２月５日出願で現在放棄されている米国特許仮出願第６０／４３１，０４０号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は一般的に多発性骨髄腫の研究に関する。より詳細には、本発明は全遺伝子発現プロファイリング比較による骨髄腫骨疾患の分子決定因子の同定に関する。
【０００４】
関連技術
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、米国で年間約１５，０００人が罹患する、最終分化した形質細胞（ＰＣ）の稀でさらに不治の悪性腫瘍であって、二番目に多い造血器悪性腫瘍に当たる。多発性骨髄腫は、白人人口においてリンパ性悪性腫瘍全体の１３％に相当し、および黒人人口においてリンパ性悪性腫瘍の３１％に相当する。悪性形質細胞は、骨髄へホーミングしおよび骨髄で増殖し、正常造血の消失による貧血および免疫抑制を引き起こす。
【０００５】
多発性骨髄腫はまた、全身性骨粗鬆症および局所性骨破壊を伴い、消耗性骨痛および、骨折、脊髄圧迫および高カルシウム血症への感受性に繋がる。骨髄腫は、溶解性骨疾患を常に伴う唯一の血液悪性腫瘍であって、および局所性骨破壊は形質細胞に隣接する部分に限られており、悪性形質細胞が破骨細胞機能および／または骨芽細胞アネルギーを促進する因子を分泌することを示唆する。骨疾患の有病率はしばしば骨の併発を伴わないくすぶり型骨髄腫から、孤立性形質細胞腫、骨塩密度の全身性損失または限局性溶解性骨病変が患者の約８０％にみられるびまん性または限局性多発性骨髄腫まで、骨髄腫の症状によって異なる。
【０００６】
近年、溶解性骨疾患は、骨髄腫の結果であるだけでなく、疾患進行を促進することに複雑に関与していることが明らかになっている。骨代謝回転速度における変化は、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）からの顕性骨髄腫への最大３年までの臨床的進行を予測する。最初は破骨細胞と骨芽細胞活性とは連動している一方、その連動は疾患進行に伴って失われる。破骨細胞活性は上昇したままでありおよび骨芽細胞活性は低下し、結果として溶解性骨疾患を伴う。５Ｔ２マウス骨髄腫および原発性ヒト骨髄腫のＳＣＩＤ−ｈｕモデルでの研究は、破骨細胞活性の阻害は骨髄腫増殖の阻害および骨髄腫腫瘍組織量の減少を伴うことを実証した。これらの研究は、ビスホスホネートを用いた骨吸収の阻害は抗骨髄腫作用を有したという報告を支持する。
【０００７】
骨髄腫関連溶解性骨疾患における破骨細胞の生物学は集中的に調べられている一方、骨芽細胞活性における疾患関連変化およびその基礎となる機構についてはほとんど知られていない。骨髄腫において、間葉幹細胞が造骨系譜へ分化する能力が損なわれていると示唆されている。しかし、そのような障害を担う機構は解明されていない。
【０００８】
正常な健常ドナー由来の骨髄形質細胞および新たに診断された多発性骨髄腫由来の悪性骨髄形質細胞の全遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）比較が、多発性骨髄腫の悪性形質転換に関与する疾患遺伝子候補および妨害された経路を同定するための強力な方法に当たることが示されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉ    ｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ，ｍｏｎｏｃｌｏ    ｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａ    ｎｃｅ，ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ．    Ｂｌｏｏｄ ９９： １７４５−１７５７ （２００２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
先行技術は、多発性骨髄腫骨疾患の原因となり得る悪性形質細胞で発現されている遺伝子を同定するための比較分析、および、多発性骨髄腫骨疾患を診断および治療するための方法に欠けている。本発明は本分野におけるこの年来の必要及び要望を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
溶解性骨疾患の分子決定因子を同定するため、溶解性病変の放射線的証拠を示さない（ｎ＝２８）新たに診断された多発性骨髄腫(newly diagnosed multiple myeloma) に由来するＣＤ１３８濃縮形質細胞における最大１２，０００個の遺伝子の発現プロファイルを、３個以上の溶解性病変を有するもの（ｎ＝４７）と比較した。骨芽細胞分化におけるＷＮＴシグナル伝達の決定的な役割と合致して、２種類の分泌型ＷＮＴシグナル伝達拮抗因子である、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（ＳＦＲＰ−３／ＦＲＺＢ）およびＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）のヒトホモログが、溶解性骨病変を有する４７例中４０例で発現されていたが、骨病変を欠く２８例中の１６例だけで発現されていた（Ｐ＜０．０５）。免疫組織化学は、遺伝子発現が高い例に由来する形質細胞で、高レベルのＤＫＫ−１およびＦＲＺＢを示した。重要なことに、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢは、正常骨髄ドナー４５例、または、骨疾患を欠く関連する形質細胞悪性腫瘍であるワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症１０例に由来する形質細胞では発現されていなかった。
【００１２】
高いＤＫＫ−１を有する多発性骨髄腫患者に由来した血清は、Ｗｎｔシグナル伝達および骨芽細胞分化の両方をｉｎ ｖｉｔｒｏで遮断した。重要なことに、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢ抗体との血清のプレインキュベートは、この機能を阻害した。ＤＫＫ−１発現の調節および次にはアポトーシスにおけるＪＵＮの主要な役割と合致して、髄外疾患および原発性難治性疾患に由来する形質細胞は、ＪＵＮおよびＤＫＫ−１の低発現を有した。
【００１３】
多発性骨髄腫形質細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ処理後にＤＫＫ−１およびＦＲＺＢ遺伝子発現の大幅なアップレギュレーションを示した。ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢは、多発性骨髄腫形質細胞において、その疾患を治療するために用いられる遺伝毒性薬での患者の治療後に、アップレギュレートすることができ、そのようにして多発性骨髄腫細胞アポトーシスにおけるＤＫＫ−１の役割を助長する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来破骨細胞（ＯＣ）と共培養した原発性多発性骨髄腫細胞はアポトーシスを欠き、しかもこれはＪＵＮ、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、およびＤＫＫ−１のダウンレギュレーションと密接に相関した。
【００１４】
本発明で開示される結果は、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの産生および／または分泌を遮断することが多発性骨髄腫患者における骨減少を防ぐかまたは逆転させる可能性があることを示す。他の用途は、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢ阻害因子を一般人口における骨減少を防ぐために用いることを含む。加えて、Ｗｎｔシグナル伝達は近年、造血幹細胞の自己再生能力にとって決定的に重要であることが示されている。さらに、ＨＳＣ増殖に必要な骨髄ニッチは、成熟骨芽細胞によって形成される。Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤＫＫ１およびＦＲＺＢによる遮断は、直接的におよび間接的に肝星細胞（ＨＳＣ）増殖を障害し、およびそのようにして、多発性骨髄腫で見られる免疫抑制および貧血の部分的な原因となり得る。このように、ＤＫＫ１および／またはＦＲＺＢの遮断はまた、骨髄腫を有する患者の大部分に見られる造血の欠陥を、防ぐかまたは逆転することができる。
【００１５】
本発明のその他の態様、特性、および利点は、本発明の現在好ましい実施形態の下記の説明から明らかになる。これらの実施形態は開示の目的のために与えられる。
【００１６】
本発明の上述した特性、利点、および目的、およびその他明らかになる内容が達成されおよび詳細に理解可能となるように、上記に簡潔に要約した、より具体的な説明および本発明の一部の実施形態が、添付の図面に図解されている。これらの図面は本明細書の一部を成す。しかし、添付の図面は本発明の好ましい実施形態を図解し、およびしたがって実施形態の範囲を制限しないと考えられることに注意する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、骨髄腫における骨病変を反映する全遺伝子発現パターンを示す。図１Ａは、ＭＲＩ限局性病変が０個（ｎ＝３６）および１個以上（ｎ＝１３７）の患者に由来する悪性形質細胞において有意に差がある発現がされているとロジスティック回帰分析によって同定された（Ｐ＜０．０００１）５７遺伝子の正規化発現レベルのクラスタビューを示す。１個以上のＭＲＩ病変がある患者に由来する形質細胞における発現上昇を示している２８遺伝子は、有意性の階層に基づいて上から下へ並べられている。同様にＭＲＩ病変が無い患者において有意な上昇を示す３０遺伝子は、有意性階層に基づいて下から上へ並べられている。遺伝子名（遺伝子名が無い場合はアフィメトリクス・プローブセット識別子）は左に列記する。正規化発現スケールは、データ表示の下に示す通り、−３０（青）から＋３０（赤）の範囲にわたる。順列調整後に有意なままである４個の遺伝子を下線で示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｘ軸上に示す正常骨髄（ＢＰＣ）、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）の患者に由来する形質細胞におけるＤＫＫ１遺伝子発現の棒グラフを示す。ＭＭ標本は：ＭＲＩ病変なし／Ｘ線病変なし、ＭＲＩ病変１個以上／Ｘ線病変なし、およびＭＲＩ病変１個以上／Ｘ線病変１個以上、の３つの骨病変群に分けられている。ＭＡＳ５．０１から得られる遺伝子発現の定量尺度であるアフィメトリクス・シグナルをｙ軸上に示す。各標本中のＤＫＫ１遺伝子発現レベルを棒で示し、棒の高さは遺伝子発現強度に比例する。標本は、ＤＫＫ１遺伝子発現が最低から最高へ、ｘ軸の左から右へ並べられている。各群の標本の数は、各群の名称の下に示す。ＭＭ部分群間の比較についての統計値は本文中に示す。
【図２】図２は、ＲＨＡＭＭが骨病変を有する多発性骨髄腫患者においてアップレギュレートされたことを示す。
【図３】図３は、ＲＨＡＭＭは正常形質細胞および意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）にはほとんど存在しないが、事実上すべてのヒト骨髄腫細胞株に存在したことを示す。
【図４】図４は、ｓｅｃｕｒｉｎが骨疾患を有する多発性骨髄腫患者においてアップレギュレートされたことを示す。
【図５】図５は、ＭＩＰ−１αおよびＣＣＲ１が多発性骨髄腫において「スパイク」    遺伝子であったことを示すが、それらは溶解性病変と相関しなかった。黒棒：ＣＣＲ    １；灰色棒：ＭＩＰ−１α。
【図６】図６は、ＭＩＰ−１αが正常形質細胞（ＰＣ）において低レベルで発現されたことを示す。
【図７】図７は、骨病変を有する多発性骨髄腫におけるＷＮＴ拮抗因子ＤＫＫ−１の発現を示す。
【図８】図８は、溶解性骨病変を有する多発性骨髄腫におけるＷＮＴおとり受容体ＦＲＺＢの発現を示す。
【図９】図９は、溶解性骨病変を有する多発性骨髄腫におけるＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの発現を示す。黒棒：ＤＫＫ−１；灰色棒：ＦＲＺＢ。
【図１０】図１０は、扁桃形質細胞でＦＲＺＢが発現されたことを示す。ＰＢＣ、ＴＢＣ＝扁桃Ｂ細胞、ＴＰＣ＝扁桃形質細胞、ＢＰＣ＝骨髄形質細胞、ＷＰＣ、ＷＢＣ、ＣＬＬ。
【図１１】図１１は、ＤＫＫ−１が正常Ｂ細胞または形質細胞で発現されなかったことを示す。ＰＢＣ、ＴＢＣ＝扁桃Ｂ細胞、ＴＰＣ＝扁桃形質細胞、ＢＰＣ＝骨髄形質細胞、ＷＰＣ、ＷＢＣ、ＣＬＬ。
【図１２】図１２は、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）におけるＤＫＫ−１発現が、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）および新たに診断された多発性骨髄腫（ＭＭ）と比較して低かったことを示す。
【図１３】図１３は、ＦＲＺＢが意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）において上昇したこと、およびくすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）および新たに診断された多発性骨髄腫（ＭＭ）において発現がより高かったことを示す。
【図１４】図１４は、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）およびくすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）におけるＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの発現を示す。
【図１５】図１５は、髄外疾患におけるＤＫＫ−１の低発現を示す。
【図１６】図１６は、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの発現が、髄質ＰＣＴ由来の形質細胞において、腸骨稜由来のものよりも高い傾向があることを示す。ＰＣＴ、ＦＮＡ。
【図１７】図１７は、髄質ＰＣＴの穿刺吸引検体におけるＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの発現を示す。
【図１８】図１８は、髄質形質細胞腫におけるＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの高発現を示す。
【図１９】図１９は、骨減少症を伴う多発性骨髄腫におけるＤＫＫ−１のより高い発現を示す。
【図２０】図２０は、ＤＫＫ−１がワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症に由来する形質細胞で発現されていなかったことを示す。
【図２１】図２１は、ＷＮＴ５Ａが新たに診断された多発性骨髄腫で上昇していたことを示す。
【図２２】図２２は、ＷＮＴ５Ａが溶解性病変を有する多発性骨髄腫でより高い傾向があることを示す。
【図２３】図２３は、ＷＮＴ５Ａが意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）およびくすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）でも上昇していたことを示す。
【図２４】図２４は、ＷＮＴ１０Ｂが溶解性病変を有する多発性骨髄腫より低い傾向があることを示す。
【図２５】図２５は、ＷＮＴ５ＡおよびＷＮＴ１０Ｂが逆相関する傾向があることを示す。黒棒：ＷＮＴ１０Ｂ、灰色棒：ＷＮＴ５Ａ。
【図２６】図２６は、ＤＫＫ−１がＳＫ−ＬＭＳ細胞株に存在したことを示す。
【図２７】図２７は、原発性多発性骨髄腫がＤＫＫ−１タンパク質を合成したことを示す。
【図２８】図２８は、再発性および原発性難治性多発性骨髄腫におけるＤＫＫ−１低発現を示す。
【図２９】図２９は、エンドセリン受容体Ｂは新たに診断された多発性骨髄腫の３分の１において「スパイク」遺伝子であったことを示す。
【図３０】図３０は、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）およびくすぶり型多発性骨髄腫におけるエンドセリン受容体Ｂの発現を示す。正常形質細胞はエンドセリン受容体Ｂを発現しない。
【図３１】図３１は、骨形成におけるエンドセリン受容体Ｂの関与を示す。
【図３２】図３２は、ＰＳ−３４１を用いた治療後のＤＫＫ−１発現を示す。
【図３３】図３３は、新たに診断された多発性骨髄腫におけるサロミド（サリドマイド）を用いた治療後のＤＫＫ−１発現を示す。
【図３４】図３４は、ＩＭｉＤを用いた治療後のＤＫＫ−１発現を示す。
【図３５】図３５は、新たに診断された多発性骨髄腫における、デキサメタゾン処理後のＤＫＫ−１発現を示す。
【図３６】図３６は、破骨細胞との共培養後の多発性骨髄腫細胞におけるＪＵＮおよびＦＯＳのダウンレギュレーションを示す。
【図３７】図３７は、破骨細胞共培養におけるＪＵＮおよびＤＫＫ−１ダウンレギュレーションを示す。
【図３８】図３８は、多発性骨髄腫骨疾患におけるＷＮＴシグナル伝達を示す。
【図３９】図３９は、疾患進行に伴い発現が消失する、軽度骨髄腫におけるＤＫＫ１の過剰発現を示す。ＤＫＫ１の発現は骨髄腫骨髄生検の免疫組織化学検査によって調べた。ＤＫＫ１遺伝子発現が高い（ａ〜ｂ）および低い（ｃ〜ｄ）骨髄腫患者に由来する骨髄生検の連続切片（倍率５５０ｘ）を示す。スライドは、Ｈ＆Ｅ（ａおよびｃ）または抗ＤＫＫ１および二次抗体（ｂおよびｄ）を用いて染色している。二次抗体単独の使用では細胞を染色できなかった（データ記載せず）。拡大像（倍率１，２００ｘ）は各Ｈ＆Ｅ像の左上隅にある。図ａは多量の細胞質を有し核小体が見えない軽度の形態を示している形質細胞との関与の間質性パターンを伴う骨髄腫を示す。図ｂは骨に非常に近い抗ＤＫＫ１抗体を用いた間質性パターン中の形質細胞のポジティブ染色を示す。図ｃは大型化した核および顕著な核小体を有する重度の形態を示している形質細胞との結節状または閉塞性パターンを伴う骨髄腫を示す。図ｄは抗ＤＫＫ１抗体を用いて形質がポジティブ染色されないことを示す。
【図４０Ａ】図４０Ａおよび４０Ｂは、骨髄形質中のＤＫＫ１タンパク質がＤＫＫ１遺伝子発現とおよび骨病変の存在と高度に相関することを示す。図４０Ａは、ＤＫＫ１ｍＲＮＡの発現がマイクロアレイによっておよびＤＫＫ１タンパク質がＥＬＩＳＡによって、新たに診断された骨髄腫の計１０７例で検出されたことを示す。両方の分析の結果は平均値０および変動１となるように底２の対数で変換および正規化した。棒のそれぞれは各標本における遺伝子発現およびタンパク質発現の相対的関係を示す。骨髄腫形質細胞中のＤＫＫ１ｍＲＮＡと骨髄形質中のタンパク質との間には有意な相関があった（ｒ＝０．６５，Ｐ＜０．００１）。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、骨髄形質中のＤＫＫ１タンパク質レベルの棒グラフ表示を示す。正常ドナー（ＢＰＣ）、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の形質細胞をｘ軸上に示す。ＭＭ標本は：ＭＲＩ病変なし／Ｘ線病変なし、ＭＲＩ病変１個以上／Ｘ線病変なし、およびＭＲＩ病変１個以上／Ｘ線病変１個以上、の３つの骨病変群に分けられている。ＤＫＫ１タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）をｙ軸上に示す。より低い範囲でのＤＫＫ１タンパク質レベルの比較を可能にするため、２００ｎｇ／ｍｌを最大値とした。この結果、ＤＫＫ１濃度が４７６ｎｇ／ｍｌである１標本の切り捨てが生じた。各標本中のＤＫＫ１タンパク質レベルを棒で示し、棒の高さはＤＫＫ１タンパク質レベルに比例する。標本は、ＤＫＫ１タンパク質レベルが最低から最高へ、ｘ軸の左から右へ並べられている。各群の標本の数を各群の下に示す。
【図４１Ａ】図４１Ａおよび４１Ｂは、組み換えＤＫＫ１およびＭＭ形質が、ＢＭＰ−２処理Ｃ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼ産生を、ＤＫＫ１に依存する方法で遮断することができることを示す。図４１Ａは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、５パーセントウシ胎仔血清単独またはＢＭＰ２、ＢＭＰ２＋ＤＫＫ１、ＢＭＰ２＋ＤＫＫ１＋抗ＤＫＫ１、またはＢＭＰ−２＋ＤＫＫ１＋ポリクローナルＩｇＧを加えての存在下での５日間の培養後に測定した、骨芽細胞分化のマーカーであるアルカリホスファターゼレベルを示す（ｙ軸）。棒のそれぞれは３連の実験の平均値（±ＳＥＭ）を表す。アルカリホスファターゼの活性はＢＭＰ−２の存在下で上昇したこと、および組み換えＤＫＫ１との共培養によるこのタンパク質の顕著な減少に注意する。同じく、抗ＤＫＫ１抗体はＤＫＫ１の抑制活性を遮断できたが、ポリクローナルＩｇＧはできなかったことに注意する。
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、Ｃ２Ｃ１２細胞における、５パーセントウシ胎仔血清単独または５０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ−２＋正常骨髄形質（ＮＳ）１０パーセントまたはＢＭＰ−２＋新たに診断された骨髄腫の患者１０名に由来する骨髄腫骨髄形質１０パーセント（同定された標本を提供）、またはＢＭＰ２＋骨髄腫患者形質１０パーセント＋抗ＤＫＫ１またはヤギポリクローナルＩｇＧ中で５日間これらの細胞を培養後に測定したアルカリホスファターゼレベル（ｙ軸）を示す。棒のそれぞれは３連の実験の平均値（±ＳＥＭ）を表す。各骨髄形質標本からのＤＫＫ１濃度はＥＬＩＳＡによって測定し、および１：１０希釈後の培養中の終濃度をｘ軸上に示す。ＤＫＫ１が１２ｎｇ／ｍｌより大である標本はアルカリホスファターゼ産生に影響を有したことに注意する。星印はＢＭＰ２＋正常ヒト骨髄形質１０パーセント中のアルカリホスファターゼと比較してＰ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、分泌型ＷＮＴシグナル伝達拮抗因子ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢが多発性骨髄腫にみられる骨破壊を媒介することを実証する。Ｗｎｔシグナル伝達が骨芽細胞増殖および分化に絶対的に必須であることの新たな証拠と共に、これらのデータは、これらの因子が骨減少に続く正常な補償的骨産生を抑制することによって骨芽細胞アネルギーを生じることおよび多発性骨髄腫骨疾患に寄与することを強く示唆する。
【００１９】
破骨細胞活性を刺激することにおける多発性骨髄腫形質細胞の役割は集中的に研究されており、およびいくつかの鍵となる関連が確立されている。ここに示すデータは、多発性骨髄腫における骨芽細胞機能不全の、可能な機構的説明の証拠を初めて提供する。これらは、最近の研究がＷＮＴシグナル伝達の阻害が骨芽細胞機能における欠陥を引き起こすことを示した点で有意義である。分泌型ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢは、多発性骨髄腫でみられる全身性骨粗鬆症、および形質細胞病巣近傍の悪化した局所性骨破壊の両方を説明し得る。
【００２０】
重要なことに、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢは、独立した経路を介しＷＮＴシグナル伝達を阻害するように作用し、このことはそれらの同時発現が相乗作用を有することを示す。
したがって、これらの遺伝子は、骨疾患の程度および骨疾患を発症する将来のリスクを予測するのに用いることができる可能性がある。さらに、これらのタンパク質の阻害因子は、骨疾患を阻害するのに用いることができる可能性がある。また、これらの因子が一般集団における骨粗鬆症に関与している可能性もある。
【００２１】
ＷＮＴシグナル伝達経路
Ｗｎｔ遺伝子は、脊椎動物胚発生中に空間的におよび組織限定パターンで発現される分泌型ポリペプチドの大きなファミリーを構成する。マウスでの突然変異分析は、体軸、中枢神経系および四肢のパターン化、および器官形成中の誘導現象の調節といったさまざまな発生段階を調節することにおけるＷｎｔの重要性を示している。分泌型増殖因子のＷｎｔファミリーは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）受容体およびその共受容体であるＬＤＬ受容体関連タンパク質５または６（ＬＰＲ５またはＬＲＰ６）を介して、おそらくＷｎｔによって誘導されるＦｚ−ＬＰＲ５／ＬＲＰ６複合体形成を通じて、シグナル伝達を開始する。
【００２２】
Ｗｎｔの分泌型拮抗因子は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）関連タンパク質（ＦＲＰｓ）、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｗｎｔ阻害因子（ＷＩＦ）およびＤｉｃｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）を含む。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）関連タンパク質、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＷｎｔ阻害因子は全部が、Ｗｎｔに結合および封鎖することによって作用することが示されている。Ｆｚの分子模倣または他の機構によるＷｎｔ封鎖によって作用を発揮するＷｎｔ拮抗因子とは異なり、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）は受容体複合体のＬＰＲ５／ＬＲＰ６成分に結合することによって正規のＷｎｔシグナル伝達を特異的に阻害する。
【００２３】
ＤＫＫ−１は脊椎動物頭部オーガナイザーから分泌される頭部誘導因子であり、およびＷｎｔシグナル伝達に拮抗することによって全部発生を誘導する。ＤＫＫ−１はＬＲＰ６に対する高親和性リガンドであり、およびＷｎｔによって誘導されるＦｚ−ＬＲＰ６複合体形成を妨げることによってＷｎｔシグナル伝達を阻害する。ＤＫＫ−１はＷｎｔともＦｚとも結合せず、Ｗｎｔ−Ｆｚ相互作用にも影響しない。頭部誘導およびＷｎｔシグナル伝達阻害におけるＤＫＫ−１機能は、ＬＰＲ５／ＬＲＰ６と結合しおよびＦｚ−ＬＰＲ５／ＬＲＰ６会合を破壊する能力と密接に相関する。ＬＰＲ５／ＬＲＰ６機能およびＤＫＫ−１阻害は、Ｗｎｔ／Ｆｚベータカテニン経路に特異的であるように見える。これらの知見はしたがって、Ｗｎｔシグナル調節のための新規の機構を明らかにする。
【００２４】
ＷＮＴシグナル伝達および骨芽細胞分化
近年の研究は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が骨芽細胞分化および機能に決定的であることを示している。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）の遺伝子にターゲッティング破壊を有するマウスは低骨量表現型を発生する。ＬＲＰ５は骨芽細胞で発現され、および骨芽細胞における最適なＷｎｔシグナル伝達に必要である。Ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、この表現型は生後に明らかになり、さらにそれはＣｂｆａ１非依存的な態様で骨芽細胞増殖および機能の低下に対して二次的なものである。
【００２５】
ヒトでは、ＬＲＰ５における突然変異は、常染色体劣性疾患である骨粗鬆症−偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）を引き起こす。骨粗鬆症−偽神経膠腫症候群のキャリヤーは、年齢および性別が一致する対照と比較した場合に骨量低下がある。
【００２６】
重要なことに、ＬＲＰにおける別々のおよび異なる突然変異は、高骨量表現型を結果として生じる。骨粗鬆症−偽神経膠腫突然変異とは対照的に、高骨量の性質は機能突然変異の利益である。その変異を有する対象者において骨吸収のマーカーは正常であった一方、オステオカルシンといった骨形成のマーカーは顕著に増加していた。Ｗｎｔによるシグナル伝達の既知の標的であるフィブロネクチンのレベルもまた上昇していた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）によるＷｎｔシグナル伝達の正常な阻害は本突然変異の存在下では不完全であったこと、およびこのことが抑制されないＷｎｔ活性によるシグナル伝達増加を結果として生じたことを示した。これらの知見は、高骨量でのＬＲＰ５機能変化の役割を実証し、および骨粗鬆症の予防または治療のための標的候補としてＤＫＫを指し示す。
【００２７】
多発性骨髄腫におけるＷＮＴ シグナル伝達および骨疾患
骨芽細胞機能におけるＤＫＫ−１の役割の間接的証拠が、高骨量表現型と連鎖しているＬＲＰ−５における機能突然変異の利益の同定によって与えられている。加えて、ＦＲＺＢ（ＳＦＲＰ−３）のホモログである分泌型ｆｉｒｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ−１）のターゲッティング破壊は、骨芽細胞の減少および骨細胞アポトーシスおよび骨梁形成増加に繋がる。
【００２８】
骨量に影響する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）がＬＲＰ−５領域に局在化されており、一般の人口は骨粗鬆症を発症する異なるリスクを有することを示唆する。多発性骨髄腫骨疾患は、ＤＫＫ−１／ＦＲＺＢ発現とＬＲＰ−５対立遺伝子によって与えられる低骨量の遺伝的素因との組み合わせ作用によって影響され得ると考えられる。多発性骨髄腫の症例をＬＲＰ−５対立遺伝子変異について遺伝子型分析することができ、およびこの情報を骨疾患、およびＤＫＫ−１およびＦＲＺＢ発現と相関させることができる。
【００２９】
意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）は、多発性骨髄腫を発症する傾向がある形質細胞疾患であり、明らかな骨疾患を欠くことによって多発性骨髄腫から区別される。ＤＫＫ−１および／またはＦＲＺＢ発現が意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の３分の１で発見されることの意義は不明であるが、しかしこれらの症例が多発性骨髄腫を発症するより高いリスクにある可能性があることを示唆し得る。多発性骨髄腫と同様に、この素因はまた遺伝するＬＲＰ５対立遺伝子と関連する可能性がある。代替的に、これらの意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の例は、放射線スキャンではまだ明らかでない基礎となる発症前骨疾患を有するであろう。
【００３０】
ここに示すデータは、多発性骨髄腫形質細胞によるＤＫＫ−１発現がどのように多発性骨髄腫疾患増殖調節および骨破壊に結びつき得るか、およびこれらの二つの現象がどのように１つの分子によって統合され得るかについてのモデルを示唆する。そのモデルでは、原発性多発性骨髄腫は高レベルのＤＫＫを発現し、およびこれらのレベルはその疾患を治療するのに用いられる薬物療法で上昇させることができる。高レベルのＤＫＫ−１は多発性骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導する可能性が高く、および、細胞増殖が高率のＤＫＫ−１誘導性アポトーシスによって緩和されるため、本疾患の初期における相対的に遅い進行を説明し得る。しかし、疾患が進行するにつれ、ＪＵＮおよびＤＫＫ−１に、破骨細胞に誘導される低下が生じ、これは最終的に髄外疾患に見られるような、ＪＵＮおよびＤＫＫ−１発現の構成的消失に発展する。
【００３１】
このように、ＤＫＫ−１発現を多発性骨髄腫形質細胞の視点から見るならば、高レベルのＤＫＫ−１発現は本疾患を肯定する性質と見なすことができる。しかし、ＤＫＫ−１誘導性アポトーシスに対して極めて感受性である間葉性細胞系譜については、高レベルのこの分泌産物は、前駆骨芽細胞のおよびおそらく間葉幹細胞さえの大規模なプログラム細胞死もまた誘導する点で、二通りの効果を有するであろう。疾患初期における高レベルのＤＫＫ−１は間葉幹細胞の永久的損失に繋がる可能性があると考えられ、この概念は、寛解誘導後または疾患進行中に破骨細胞が多発性骨髄腫形質細胞によるＤＫＫ−１分泌を抑制する可能性が高い際に、骨修復の欠如が観察されることによって支持される。したがって、この知識の活用は、多発性骨髄腫形質細胞に対するＤＫＫ−１の作用を強調するが同時に骨芽細胞またはその前駆細胞に対するＤＫＫの骨損傷作用を妨げる、多発性骨髄腫のための新しい治療法の開発に繋がり得る。
【００３２】
本発明の一実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達拮抗因子の発現レベルを調べることによって、多発性骨髄腫患者において骨疾患を発症する可能性を判定する方法が提供される。その拮抗因子の、正常個体における発現と比較して増加した発現は、その患者が骨疾患を発症する可能性を有することを示す。好ましくは、そのＷＮＴシグナル伝達拮抗因子は可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（ＳＦＲＰ−３／ＦＲＺＢ）、またはＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）のヒトホモログである。一般的に、これらのタンパク質の発現レベルは、核酸またはタンパク質レベルで測定することができる。
【００３３】
別の一実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達拮抗因子の発現を阻害することによって、多発性骨髄腫患者において骨疾患を治療する方法が提供される。好ましくは、そのＷＮＴシグナル伝達拮抗因子は可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（ＳＦＲＰ−３／ＦＲＺＢ）、またはＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）のヒトホモログである。一般的に、これらの拮抗因子の発現は、核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる。
【００３４】
さらに別の一実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達拮抗因子の発現を阻害することによって、個体において骨減少を防ぐ方法が提供される。好ましくは、そのＷＮＴシグナル伝達拮抗因子は可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（ＳＦＲＰ−３／ＦＲＺＢ）、またはＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）のヒトホモログである。一般的に、これらの拮抗因子の発現は、核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる。
【００３５】
さらに別の一実施形態では、ＤＫＫ１遺伝子（登録番号ＮＭ０１２２４２）の発現またはＤＫＫ１遺伝子によって発現されるタンパク質の活性を阻害する工程を含む、個体において骨減少を調節する方法が提供される。ＤＫＫ１遺伝子発現は、たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または抗ＤＫＫ１抗体または可溶性ＬＲＰ受容体によることを含む、当業者に既知である任意の方法によって阻害される。
【００３６】
さらに別の一実施形態では、ＤＫＫ１タンパク質の阻害薬を個体に投与する工程を含む、個体において骨減少を調節する方法が提供される。一般的に、この方法はその個体が多発性骨髄腫、骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症または悪性腫瘍関連骨減少といった疾患を有する場合に有効である。一般的に、悪性腫瘍関連骨減少は、骨への乳がん転移または骨への前立腺がん転移によって引き起こされる。
【００３７】
下記の実施例は本発明のさまざまな実施例を説明する目的のために与えられ、および本発明をいかなる方法でも制限しないことが意図される。当業者は、本発明は目的を実施および上記の結果および利点、およびここに内在する目的、結果および利点を得るためによく適合されていることを容易に理解し得る。請求項の範囲によって定義される通りの本発明の精神の内に包含される、その中の変化および他の用途を当業者は考えることができる。
【実施例】
【００３８】
実施例１
患者
新たに診断された多発性骨髄腫の患者１７４名、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の患者１６名、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症の患者９名、および健常者４５名を試験した。米国アーカンソー医科大学の施設内倫理委員会は本研究を承認し、およびすべての被験者はインフォームド・コンセントを書面で提供した。表１は多発性骨髄腫の患者の特性を示す。
【００３９】
【表１】
0005432966.tif 000002
【００４０】
実施例２
骨画像処理
画像は、遺伝子発現データの予備知識無しで、Ｃａｎｏｎ ＰＡＣＳ（画像保存およびカタログ化システム）を用いて検査した。ＭＲＩスキャンは１．５テスラＧＥ Ｓｉｇｎａスキャナで実施した。Ｘ線は米国放射線医学会（ＡＣＲ）規格に準拠してフィルムからデジタル化した。ＭＲＩスキャンおよびＸ線はＡＣＲのＤＩＣＯＭ（医用デジタル画像処理および通信）規格を用いてＣａｎｏｎ ＰＡＣＳシステムに接続した。画像処理は取扱説明書に従って実施した。ＭＲＩ画像は、ガドリニウムＴ１前および後強調処理およびＳＴＩＲ（短τ反転回復）強調処理を用いて作成した。
【００４１】
実施例３
形質細胞単離および遺伝子発現プロファイリング
フィコール・ハイパック勾配遠心分離後に、骨髄から得られた形質細胞を単核細胞画分から、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１３８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いる免疫磁気ビーズ選択によって単離した。ＣＤ１３８＋／ＣＤ４５−およびＣＤ３８＋／ＣＤ４５−マーカーを用いた二色フローサイトメトリー、免疫細胞化学法による免疫グロブリン軽鎖の存在、およびライト−ギムザ染色による形態で示された通り、遺伝子発現プロファイリングに使用した細胞の９０パーセント超が形質細胞であった。総ＲＮＡはＲｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離した。標識化ｃＲＮＡの調製および約１０，０００遺伝子を含むＵ９５Ａｖ２マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）へのハイブリダイゼーションは以前に記載した通りに実施した（Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２； Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＲＮＡ増幅は不要であった。
【００４２】
実施例４
免疫組織化学
ヒト総ＤＫＫ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に対して免疫化したヤギに由来する抗体をＴｒｉｓ緩衝液で１：２００希釈し、およびホルマリン固定してパラフィン包埋された骨髄生検切片に２時間室温にて加えた。隣接する切片をＨ＆Ｅで染色した。抗原−抗体反応はＤＡＢ（ビオチニル化抗ヤギ抗体[Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ] [１： ４００ 希釈]およびストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ[Ｄａｋｏ]染色後）を用いて発色させ、およびヘマトキシリン−２を用いて対比染色した。
【００４３】
実施例５
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ表面マイクロタイタープレートを、１ｘリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２に溶解した１ｍｇ／ｍｌの抗ＤＫＫ１抗体５０ｍｌを用いて４℃にて一夜被覆し、および４パーセントウシ血清アルブミンを用いてブロックした。骨髄形質を希釈緩衝液（１×リン酸緩衝生理食塩水＋０．１Ｔｗｅｅｎ−２０＋１パーセントウシ血清アルブミン）で１：５０希釈した。ウェル当たり計５０μｌを負荷し、および４℃にて一夜インキュベートし、洗浄し、および緩衝液で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈したビオチニル化ヤギ抗ヒトＤＫＫ１ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートし、その後ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：１０，０００希釈５０μｌを加え、すべて取扱説明書に従った。発色はＯＰＤ基質系（Ｄａｋｏ）を用いて取扱説明書に基づいて達成した。組み換えヒトＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の連続希釈を用いて標準曲線を作成した。内因性ＤＫＫ１を発現しない細胞株Ｔ２９３、および安定にトランスフェクションされたＤＫＫ１を有するＴ２９３（Ｆｅｄｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）を用いて本ＥＬＩＳＡ測定法のバリデーションを行った。
【００４４】
実施例６
骨芽細胞分化測定法
Ｃ２Ｃ１２間葉性前駆細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ）は、１０パーセント熱不活化ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性は記載の通りに測定した（Ｇａｌｌｅａ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｐｉｎｅｌｌａ−Ｊａｅｇｌｅ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。細胞溶解物はタンパク質含量についてマイクロＢＣＡ測定法キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて分析した。各実験は３連で実施した。
【００４５】
実施例７
統計解析
多発性骨髄腫患者における骨疾患は、ロジスティック回帰を用いてモデル化した。考慮した独立変数は、新たに診断された多発性骨髄腫１７４例からバージョン５．０１ＭＡＳ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて測定した最大１０，０００個の遺伝子（１２，６２５個のプローブセット）からの遺伝子発現強度値（アベレージ・ディファレンス・コール）であった。各プローブセットについて、遺伝子発現の定量尺度である「シグナル」は、ロジスティック回帰モデルおよび順列調整分析への入力前にｌｏｇ２に変換した。骨髄腫において骨疾患に関連し得る遺伝子については、先行する仮説は無かった。結果として、１２，６２５個のプローブセットのそれぞれについて骨疾患の一変量モデルが用いられた。候補遺伝子は、順列調整された有意水準でのｔ検定（ＷｅｓｔｆａｌｌおよびＹｏｕｎｇ，１９９３）を用いて選別した。ウェストフォールおよびヤングの分析を用いて、複数の単変量仮説検定に合わせて調節した。ＤＫＫ１シグナルおよびＤＫＫ１タンパク質レベルの群差は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて検定した。骨疾患の状態による患者の特徴における有意差は、フィッシャーの正確確率検定またはカイ二乗検定のどちらかを用いて検定した。ロジスティック回帰によって同定された遺伝子の発現強度は、Ｃｌｕｓｔｅｒｖｉｅｗ（Ｇｏｌｕｂ，ｅｔ．ａｌ．，１９９９）を用いて視覚化した。スピアマンの相関係数を用いて、遺伝子発現およびタンパク質レベルの相関を測定した。骨芽細胞分化における対照と各実験条件との間の有意差は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて検定した；独自のＣ２Ｃ１２実験それぞれについて別個の比較を実施した。両側ｐ値０．０５未満を有意とし、および両側ｐ値０．１０未満を傾向差とした。
【００４６】
実施例８
骨髄腫細胞の発現プロファイリング
過剰発現されおよび骨病変の存在に伴っていた遺伝子を同定するために、骨病変を有するかまたは有しない患者に由来するマイクロアレイデータの比較を実施した。ＭＲＩで定義される骨の限局性病変は、放射線で同定可能な溶解性病変の前に生じ得るので、骨病変を評価するためにＴ１強調およびＳＴＩＲ強調画像処理を用いた。骨病変の無い患者（ｎ＝３６）およびＭＲＩで定義される限局性病変１個以上（１＋）を有する患者（ｎ＝１３７）の骨髄に由来する精製形質細胞中の遺伝子約１０，０００個の遺伝子発現パターンを、ロジスティック回帰分析によってモデル化した。そのモデルによって、２群の患者で発現に差のあった（Ｐ＜０．０００１）５７個の遺伝子が同定された（図１Ａ）。これらの遺伝子５７個をさらに、順列調整された有意性でｔ検定によって分析した（ＷｅｓｔｆａｌｌおよびＹｏｕｎｇ，１９９３）。これらの統計検定は、その５７個の遺伝子のうち４個が、ＭＲＩ病変１個以上を有する患者で過剰発現されていたことを示した：ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、プロテアソーム活性化因子サブユニット（ＰＳＭＥ２）、ＣＤＣ２８プロテインキナーゼ２（ＣＫＳ２）、およびｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達拮抗因子の遺伝子ＤＫＫ１が４個のうちで唯一分泌型因子をコードすること、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は骨の生物学に関与することを考慮して、ＤＫＫ１に関する追加の試験を実施した。骨髄腫の患者１７３名からの結果の分析は、ＭＲＩ病変１個以上およびＸ線病変なしの患者についてのＤＫＫ１シグナルは、ＭＲＩ病変なしおよびＸ線病変なしの患者と比較して有意に異なるが（中央値シグナル：２，２２０対２８５；ｐ＜０．００１）、ＭＲＩ病変１個以上およびＸ線病変１個以上の患者と比較して有意差がない（中央値シグナル：２，２２０対１，８６５；ｐ＝０．６３）ことを示した（図１Ｂ、表２）。
【００４７】
意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）は、溶解性骨病変を伴わない形質細胞疾患であり、および多発性骨髄腫に先行し得る。ＭＧＵＳの１６例中１５例で、ＤＫＫ１は骨髄形質細胞によって、骨のＭＲＩ病変またはＸ線病変が無い多発性骨髄腫におけるレベルと同等のレベルで発現されていた（図１Ｂ）。ＤＫＫ１は、正常ドナー４５名、および骨病変を欠く骨の形質細胞悪性腫瘍であるワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症の患者９名に由来する形質細胞では検出不能であった（図１Ｂ）。
【００４８】
【表２】
0005432966.tif 000003
【００４９】
実施例９
全遺伝子発現は、多発性骨髄腫において溶解性骨病変と関連するＤＫＫ−１およびＦＲＺＢを明らかにする
溶解性骨疾患の分子決定因子をさらに特定するために、骨検査で溶解性病変の放射線的証拠を示さない新たに診断された多発性骨髄腫患者（ｎ＝２８）に由来するＣＤ１３８濃縮形質細胞における最大１２，０００個の遺伝子の発現プロファイルを、３個以上の溶解性病変を有する患者（ｎ＝４７）と比較した。アブソルート・コール（遺伝子発現の定性尺度）のカイ二乗検定を用いて、疾患の２つの型を区別した遺伝子３０個を同定した（Ｐ＜０．０５）。シグナル・コール（遺伝子発現の定量尺度）のウィルコクソンの順位和（ＷＲＳ）検定は、１０４個の遺伝子（アップレギュレート４９個およびダウンレギュレート５５個）が２つの疾患亜型で差があった（Ｐ＜０．００１）ことを明らかにした。
【００５０】
カイ二乗検定は、ＲＨＡＭＭ前がん遺伝子をその２群間の最も有意な識別子として同定した。それは骨疾患の患者４７名中３４名と比較して、骨疾患のない患者２８名中７名にしか発現されていなかった（図２）。予想される通り、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症１１例中の１例に由来する形質細胞しかＲＨＡＭＭを発現しなかった（図３）。ＷＲＳはＲＨＡＭＭを溶解性病変群と非溶解性病変群の間の１４番目に有意な識別子として順位づけた。ＮＣＡＬＤは、神経細胞シグナル伝達に関与するカルシウム結合タンパク質であるが、非溶解性病変群の１１／２８例（４０％）に存在したが溶解性病変群の２／４７例（４％）にしか存在しなかった。カイ二乗分析によって同定された他の注目すべき遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達の拮抗因子である、溶解性病変群の４０／４７例（８５％）および非溶解性病変群の１５／２８（５３％）に存在したＦＲＺＢを含んだ。ＣＢＦＡ２／ＡＭＬ１ＢはＭＩＰ１α発現と結びつけられており、および非溶解性病変群の５０％および溶解性病変群の７９％に存在した。
【００５１】
染色体分離に関与するＰＴＴＧ１（ｓｅｃｕｒｉｎ）はＷＲＳによって最も有意な識別遺伝子（Ｐ＝４ｘ１０−６）と同定された。それは非溶解性病変群の１１％で存在するとされたが溶解性病変群の５０％で存在した（図４）。ＷＲＳ検定での他の注目すべき遺伝子は、溶解性病変群でより低レベルに発現された（Ｐ＝３ｘ１０−５）ＴＳＣ−２２ホモログＤＳＩＰＩを含んだ。ＤＳＩＰＩはまた、破骨細胞とのｅｘ−ｖｉｖｏ共培養後の多発性骨髄腫形質細胞１２例中１２例でダウンレギュレートされた。
【００５２】
加えて、非溶解性病変群に対して溶解性病変群でより高頻度に見出された（ｐ＜０．０５）４個のいわゆる「スパイク遺伝子」が同定された：非溶解性病変群０／２８例および溶解性病変群７／４７例でスパイクを示すＩＬ６（ｐ＝０．０３２）；非溶解性病変群０／２８例および溶解性病変群７／４７例でスパイクを示すオステオナイドジェン（ＮＩＤ２）（ｐ＝０．０３２）；非溶解性病変群１／２８例および溶解性病変群１１／４７例でスパイクを示すＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ１３）（ｐ＝０．０２３）；および非溶解性病変群１／２８例および溶解性病変群１／４７例でスパイクを示すピリミジン受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ６）（ｐ＝０．０２３）。
【００５３】
このように、これらのデータは遺伝子発現パターンが骨疾患と関連し得るということを示唆する。溶解性骨疾患の出現および意義不明単クローン性免疫グロブリン血症から顕性多発性骨髄腫への転換の予測指標として潜在的に有用であることに加えて、それらはまた潜在的介入のための標的を特定し得る。
【００５４】
実施例１０
ＤＤＫ１およびＦＲＺＢは無作為の骨髄由来よりも限局性病変由来の形質細胞でより高レベルに発現される傾向がある
溶解性病変に対するＤＫＫ−１およびＦＲＺＢの関係を考慮して、無作為の腸骨稜の骨髄吸引液由来の形質細胞と、脊椎の限局性病変のＣＴ補助穿刺吸引で得られたものとで、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢ発現を比較した。これらの結果は、限局性病変由来の形質細胞における有意に高いレベルでの発現を示した。
【００５５】
実施例１１
ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症由来の形質細胞で発現されていない
ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症は、モノクローナルＩｇＭ異常蛋白血症および骨髄、リンパ節および脾臓のリンパ形質細胞浸潤によって特徴づけられる稀な形質細胞疾患である。その臨床症状は、臨床経過がそうであるように非常に変わりやすく、しかし多発性骨髄腫とは異なり骨病変は稀である。ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症１０例に由来するＣＤ１３８濃縮骨髄形質細胞の全遺伝子発現プロファイリングは著しい異常を示したが（Ｚｈａｎｅｔａｌ．，２００２）、これらの細胞は、正常骨髄形質細胞のように、ＦＲＺＢおよびＤＫＫの発現を欠いた（図２０）。
【００５６】
実施例１２
ＦＲＺＢおよびエンドセリン受容体ＢはＤＫＫ−１と相関する
エンドセリン１は２１アミノ酸の血管収縮因子である。エンドセリンの２種類の受容体である受容体ＡおよびＢが同定されている。乳がんおよび前立腺がん細胞はエンドセリン１を産生することができ、および、エンドセリン１およびエンドセリン受容体Ａの濃度上昇が骨転移を伴う進行前立腺がんで見出されている。エンドセリン１を産生した乳がん細胞は雌マウスで骨芽細胞転移を生じた。条件付け培地および外因性エンドセリン１はマウス頭頂骨培養において骨芽細胞増殖および新しい骨形成を刺激した（図３１）。これらの結果は、エンドセリンが骨形成に関連することを示唆する。
【００５７】
表３は、エンドセリン受容体Ｂ（ＥＮＤＲＢ）の発現がＤＫＫ−１の発現と相関したことを示す。エンドセリン受容体Ｂは新たに診断された多発性骨髄腫の３分の１において「スパイク」遺伝子であった（図２９）。エンドセリン受容体Ｂはまた、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）およびくすぶり型多発性骨髄腫の部分集合で発現されていたが、正常形質細胞では発現されていなかった（図３０）。
【００５８】
【表３】
0005432966.tif 000004
【００５９】
実施例１３
Ｉｎ Ｖｉｖｏ薬物治療はＤＫＫ−１をアップレギュレートする
ＤＫＫ−１発現はＵＶ照射およびいくつかの他の遺伝毒性刺激によって大幅にアップレギュレートされることが示されている。多発性骨髄腫形質細胞もまたこの疾患を治療するのに用いられる薬物に反応してその遺伝子をアップレギュレートするかどうか調べるために、多発性骨髄腫形質細胞の遺伝子発現プロファイリングを、サリドマイド（図３３）、ＩｍｉＤ（図３４）、ＰＳ−３４１（図３２）、またはデキサメタゾン（図３５）を用いた４８時間のｉｎ ｖｉｖｏ処理の前後に実施した。これらのデータは、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢ発現を多くの例で大幅にアップレギュレートすることができ、およびそのようにして多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを誘発することにおけるＤＫＫ−１の直接的役割を支持することを示した。最初の予備試験で試験したすべての物質に対して一次性に不応性であった新たに診断された患者がＤＫＫ−１の低レベルを示したこと、および薬物治療後にＤＫＫ−１またはＦＲＺＢの発現増大を示さなかったことに注目するのは興味深く、アポトーシスｏｆ多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを促進することにおけるＤＫＫ−１発現の役割を支持する。この概念を支持して、ＤＫＫ−１およびＦＲＺＢは、３０例のＨＭＣＬおよび数例の髄外疾患で、低レベルから検出不能レベルにて発現されていた（図１５）。
【００６０】
実施例１４
破骨細胞との多発性骨髄腫の共培養の結果としてＪＵＮ、ＦＯＳ、およびＤＫＫ−１の大幅なダウンレギュレーションが生じる
骨髄腫細胞と破骨細胞の間の密接な関係は、消耗性溶解性骨破壊の多発性骨髄腫との関連によって臨床的に現れている。溶解性骨病変の発生は、骨髄腫形質細胞との直接的および間接的相互作用を介して破骨細胞の活性化によって引き起こされる。骨髄腫細胞の生存および増殖および疾患過程の維持における破骨細胞の決定的役割は、臨床的に調べられており、および原発性ヒト骨髄腫に関するＳＣＩＤ−ｈｕモデルといった実験モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで実証されている。
【００６１】
多発性骨髄腫形質細胞／破骨細胞相互作用の分子的結果を調査するために、ＣＤ１３８濃縮多発性骨髄腫形質細胞を、多発性骨髄腫の末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）または健常ドナー由来ＰＢＳＣおよびＭＮＣから得られた破骨細胞と共培養するｅｘ ｖｉｖｏ系を開発した。正常ドナーまたは多発性骨髄腫患者に由来する末梢血幹細胞から得られたヒト破骨細胞と共培養したＣＤ１３８濃縮多発性骨髄腫形質細胞は、アネキシンＶフローサイトメトリー、ＢｒｄＵ標識化指数および[３Ｈ]ＴｄＲ取り込みによって示される生存度および増殖活性を５０日間の長期にわたって維持した。共培養の前後の形質細胞の純度レベルは、ＣＤ３８／ＣＤ４５フローサイトメトリーによって測定された通り、９５％より大であった。
【００６２】
１２例の多発性骨髄腫形質細胞における最大１２，０００個の遺伝子の発現のマイクロアレイ分析を、４日間の共培養の前および後に実施した。１２例の多発性骨髄腫形質細胞対および１５０例の新たに診断された多発性骨髄腫形質細胞の、７，９１３個のプローブセット（遺伝子）を用いた階層的クラスター分析は、共培養前標本が３つの主要なクラスター群内に分布した一方、共培養後標本は主要な枝のうち２つに互いに密にクラスター化したことを明らかにした。共培養後のその顕著な遺伝子発現変化の分析は、９５個のプローブセット（遺伝子）が、共培養後に多発性骨髄腫形質細胞１２例中少なくとも８例で２〜５０倍変化したことを示した（アップレギュレート７７個、およびダウンレギュレート１８個）。健常ドナー５名に由来するＣＤ１３８濃縮形質細胞はその同じ遺伝子のうち多数で同様の変化を示し、多発性骨髄腫形質細胞は破骨細胞に対して反応の変化を示さないことを示唆した。しかし、正常形質細胞は、その悪性対応物とは対照的に、破骨細胞との長期共培養で生存しなかった。
【００６３】
最も著しい変化は、ケモカインＧＲＯ１、ＧＲ０２、ＧＲ０３、ＳＣＹＡ２、ＳＣＹＡ８、ＳＣＹＡ１８、およびＩＬ８のアップレギュレーションにあった。他の注目すべき遺伝子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ１、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、インテグリンＩＴＧＢ２およびＩＴＧＢ５、マトリクスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）およびカテプシンＬ（ＣＴＳＬ）を含んだ。驚くべきことに、多数の破骨細胞関連遺伝子が、７７個のアップレギュレートされた遺伝子に含まれた。ダウンレギュレートされた遺伝子は、サイクリンＢ（ＣＣＮＢ１）、サイクリンＢ特異的ユビキチンリガーゼＵＢＥ２Ｃ、ＴＳＣ−２２ホモログＤＳＩＰＩ、およびＪＵＮ、ＪＵＮＤ、ＦＯＳ、およびＦＯＳＢを含んだ。
【００６４】
遺伝子発現変化はまた、単独で培養された、および多発性骨髄腫形質細胞との共培養後の、破骨細胞１０例で試験した。２４個の遺伝子（アップレギュレート１４個およびダウンレギュレート１０個）が、共培養後の破骨細胞１０例中少なくとも７例で２〜１０倍変化した。多発性骨髄腫患者からまたは健常ドナーから得られた破骨細胞と共に培養した多発性骨髄腫形質細胞の間に遺伝子発現の有意差は無く、多発性骨髄腫破骨細胞は正常ドナーから得られたものと質的に異ならないことを示唆した。
【００６５】
共培養実験から得られた培地で多発性骨髄腫形質細胞を培養した際に、遺伝子発現に有意差は観察されず、接触が重要であることを示唆した。共培養実験における多発性骨髄腫形質細胞の破骨細胞に対する低い比（１０００：１）を考慮すると、すべての形質細胞が破骨細胞と同時に接触できる可能性は低い。したがって、破骨細胞と接触している多発性骨髄腫形質細胞と他の多発性骨髄腫形質細胞との間の何らかの細胞間情報伝達が起こる可能性が高い。
【００６６】
破骨細胞が多発性骨髄腫骨疾患で主要な役割を果たすことおよび多発性骨髄腫に抗アポトーシス性シグナルを提供することが知られている。近年の研究は、ＪＵＮが直接的にＤＫＫ−１発現を調節すること、および、ＪＵＮおよびＤＫＫ−１がアポトーシスを調節することを示している。
【００６７】
ＪＵＮおよびＤＫＫ−１を調節することによって破骨細胞が多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを阻害し得るかどうかを判定するため、原発性多発性骨髄腫１２例に由来する精製した形質細胞について、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた破骨細胞との４８時間の共培養の前および後に、遺伝子発現プロファイリングを実施した。共培養中の多発性骨髄腫形質細胞は単独で培養された細胞よりも有意に高い長期生存度を有した。破骨細胞共培養の前後の多発性骨髄腫形質細胞の遺伝子発現プロファイリングは、ＪＵＮ、ＦＯＳ、およびＦＯＳＢは全例で２倍より大きくダウンレギュレートされた４０個の遺伝子のうちの３個であることを明らかにした（ｎ＝１２／１２）。共培養後の多発性骨髄腫形質細胞で顕著に調節された９５個の遺伝子を用いたＨＭＣＬおよび原発性多発性骨髄腫細胞の階層的クラスター分析は、ＨＭＣＬ、破骨細胞と共培養した原発性多発性骨髄腫、および新たに診断された多発性骨髄腫の部分集合の間に、これらの細胞型が相対的に低レベルのｃ−ＪＵＮおよびｃ−ＦＯＳを有した点で著しい類似性を明らかにした。
【００６８】
重要なことに、原発性多発性骨髄腫細胞は単独で培養した際に高い程度の自発的アポトーシスを示す一方、破骨細胞の存在下で培養した多発性骨髄腫形質細胞は無限に生存することができる。これらのデータはＪＵＮとＤＫＫ−１の間の関連を支持し、およびまた、髄外疾患および常に髄外疾患に由来するＨＭＣＬはＪＵＮおよびＤＫＫの両方を欠くため、多発性骨髄腫におけるＪＵＮおよびＤＫＫ発現の消失は疾患進行と関連し得ることを示唆する。多発性骨髄腫増殖および挙動に対する破骨細胞の主要な影響の１つが、ＪＵＮおよびＤＫＫ−１をダウンレギュレートすることであってこれが直接的に形質細胞アポトーシスに影響を与えると推測するのは興味深い。ＨＭＣＬおよび原発性多発性骨髄腫／破骨細胞共培養のＤＫＫ−１を用いた処理は、多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを結果として生じることが予想される。ＤＫＫ−１は破骨細胞に対して作用を有しない可能性が高く、それはこれらの細胞がＷｎｔ共受容体ＬＲＰ−５を発現しないためである。正常骨髄由来形質細胞もまたＤＫＫ−１を発現せず、およびそれらの長命性を説明するのに役立つであろう。
【００６９】
実施例１５
形質細胞によるＤＫＫ１タンパク質の合成
多発性骨髄腫６５例の骨髄生検由来の連続切片を、ＤＫＫ１の存在に関して染色した。これらの例中の形質細胞は、遺伝子発現データと一致する形でＤＫＫ１を含んだ（図３９）。正常ドナー５例由来の生検を用いた同様の実験は、どの細胞にもＤＫＫ１を検出できなかった。ＤＫＫ１陽性骨髄腫には、間質性増殖パターンを伴う軽度の形態（核小体が見えない多量の細胞質）を有する強い傾向があった。この染色は骨に隣接する形質細胞で最も強かった。ＤＫＫ１陰性骨髄腫は結節状または閉塞性増殖パターンを伴う重度の形態（大型化した核および顕著な核小体）を有する傾向があった。間質性増殖パターンについての生検では、ＤＫＫ１は存在した（細胞のさまざまな割合で）かまたは存在しなかった。対照的に、より悪性の結節状増殖パターンを有する骨髄腫では一律にＤＫＫ１は存在しなかった。重要なことに、間質性および結節状増殖の両方を伴う例では、間質性細胞は陽性でありおよび結節状細胞は陰性であった。
【００７０】
実施例１６
骨髄形質中のＤＫＫ１タンパク質
酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）は、遺伝子発現データもまた利用可能である新たに診断された多発性骨髄腫患者１７３例のうち１０７例に由来する骨髄形質中のＤＫＫ１タンパク質の濃度は２４．０２ｎｇ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．４９．５８）であったことを示した。対照的に、ＤＫＫ１は健常ドナー１４例では８．９ｎｇ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．４．２）、ＭＧＵＳ１４例では７．５ｎｇ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．４．５）、およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症９例では５．５ｎｇ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．２．４）であった。ＤＫＫ１遺伝子発現および骨髄形質中のＤＫＫ１のレベルは、骨髄腫１０７例で正に相関していた（ｒ＝０．６５、Ｐ＜０．００１）（図４０Ａ）。また、骨髄形質および末梢血形質中のＤＫＫ１タンパク質レベル間に、両方の標本を同時に採取した骨髄腫４１例において強い相関があった（ｒ＝０．５７、Ｐ＜０．００１）。
【００７１】
骨髄形質中のＤＫＫ１タンパク質レベルおよび骨病変の存在の両方が測定された患者６８例のうち、ＭＲＩ病変１個以上およびＸ線病変なしの患者におけるＤＫＫ１タンパク質は、ＭＲＩ病変なしおよびＸ線病変なしの患者と比較して有意に差があったが（中央値レベル：２０ｎｇ／ｍｌ対９ｎｇ／ｍｌ；ｐ＝０．００２）、ＭＲＩ病変１個以上およびＸ線病変１個以上の患者と比較して有意差は無かった（中央値レベル：２０ｎｇ／ｍｌ対１４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＝０．３６）（図４０Ｂ、表２）。
【００７２】
実施例１７
ｉｎ ｖｉｔｒｏ骨芽細胞分化に対する骨髄血清の作用
骨形成タンパク質−２は、運命決定されていない間葉性前駆細胞株Ｃ２Ｃ１２ （Ｋａｔａｇｉｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）の骨芽細胞への分化を、Ｗｎｔ／ｂ−カテニンシグナル伝達（Ｂａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｒｏｍａｎ−Ｒｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２）が関与する経路を介して誘導することができる。骨芽細胞分化の特異的マーカーであるアルカリホスファターゼは、５パーセントウシ胎仔血清中で５日間培養したＣ２Ｃ１２細胞において検出不能であった（図４１Ａ）。Ｃ２Ｃ１２細胞の、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を用いた５日間の処理は、Ｃ２Ｃ１２細胞がアルカリホスファターゼを産生するように誘導したが、一方、アルカリホスファターゼはＢＭＰ−２および５０ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＤＫＫ１と一緒に培養したＣ２Ｃ１２細胞によって産生されなかった。アルカリホスファターゼ産生に対するこのｉｎ ｖｉｔｒｏ 作用は、ポリクローナル 抗ＤＫＫ１ 抗体によって中和されたが、非特異的ポリクローナルヤギＩｇＧでは中和されなかった。骨髄腫患者５例に由来する、ＤＫＫ１濃度が１２ｎｇ／ｍｌを超える骨髄血清は、ＢＭＰ−２で処理したＣ２Ｃ１２細胞によるアルカリホスファターゼの産生を阻害し、およびこの作用は抗ＤＫＫ１抗体によって逆転されたが非特異的ＩｇＧでは逆転されなかった（図４１Ｂ）。対照的に、５０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ−２および正常ドナーの骨髄由来の血清１０パーセントで処理したＣ２Ｃ１２細胞は、細胞によるアルカリホスファターゼの産生を誘導した（図４１Ｂ）。
【００７３】
下記の参考文献をここで引用した：
Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ９９： １７４５−１７５７ （２００２）．
Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ １０１：１１２８−１１４０ （２００３）．
Ｆｅｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎＤｋｋ−１ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４： １９４６５−７２ （１９９９）．
Ｇａｌｌｅａ ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ２８ ： ４９１−８ （２００１）．
Ｓｐｉｎｅｌｌａ−Ｊａｅｇｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ２９： ３２３−３０ （２００
１）．
Ｗｅｓｔｆａｌｌ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ．Ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ： Ｅｘａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐ−ｖａｌｕｅ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ．Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ： Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，３６０ （１９９３）．
Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： ５３１−７ （１９９９）．
Ｋａｔａｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２７： １７５５−６６ （１９９４）．
Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０１： ８４−９１（２００３）．
Ｒｏｍａｎ−Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２．
本明細書中で言及した特許または出版物はいずれも、本発明が関係する分野の当業者のレベルを示す。さらに、これらの特許および出版物は、個々の出版物が参照により本開示に含まれると具体的および個別に示されたのと同等に、参照により本開示に含まれる。
【図１Ａ】
0005432966.tif 000005
【図１Ｂ】
0005432966.tif 000006
【図２】
0005432966.tif 000007
【図３】
0005432966.tif 000008
【図４】
0005432966.tif 000009
【図５】
0005432966.tif 000010
【図６】
0005432966.tif 000011
【図７】
0005432966.tif 000012
【図８】
0005432966.tif 000013
【図９】
0005432966.tif 000014
【図１０】
0005432966.tif 000015
【図１１】
0005432966.tif 000016
【図１２】
0005432966.tif 000017
【図１３】
0005432966.tif 000018
【図１４】
0005432966.tif 000019
【図１５】
0005432966.tif 000020
【図１６】
0005432966.tif 000021
【図１７】
0005432966.tif 000022
【図１８】
0005432966.tif 000023
【図１９】
0005432966.tif 000024
【図２０】
0005432966.tif 000025
【図２１】
0005432966.tif 000026
【図２２】
0005432966.tif 000027
【図２３】
0005432966.tif 000028
【図２４】
0005432966.tif 000029
【図２５】
0005432966.tif 000030
【図２６】
0005432966.tif 000031
【図２７】
0005432966.tif 000032
【図２８】
0005432966.tif 000033
【図２９】
0005432966.tif 000034
【図３０】
0005432966.tif 000035
【図３１】
0005432966.tif 000036
【図３２】
0005432966.tif 000037
【図３３】
0005432966.tif 000038
【図３４】
0005432966.tif 000039
【図３５】
0005432966.tif 000040
【図３６】
0005432966.tif 000041
【図３７】
0005432966.tif 000042
【図３８】
0005432966.tif 000043
【図３９】
0005432966.tif 000044
【図４０Ａ】
0005432966.tif 000045
【図４０Ｂ】
0005432966.tif 000046
【図４１Ａ】
0005432966.tif 000047
【図４１Ｂ】
0005432966.tif 000048