(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の免疫原性組成物によって先にワクチン接種されたヒトに再ワクチン接種するための第２の免疫原性組成物の製造におけるインフルエンザウイルス又はその抗原調製物の使用であって、
第１の組成物は、パンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与する可能性があるインフルエンザウイルス株由来の小量のインフルエンザウイルス抗原又は抗原調製物とアジュバントとを組合わせて含み、該小量の抗原量が1用量当たり15μgの赤血球凝集素(HA)を超えず、且つ前記アジュバントがスクアレン、トコフェロール及び乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンであり、
前記再ワクチン接種用の第２の免疫原性組成物は、初回ワクチン接種に使用するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物の変種であるインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含有する、
前記使用。
【請求項２】
再ワクチン接種に使用する組成物がアジュバントを含有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アジュバントが水中油型エマルジョンアジュバントである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記再ワクチン接種用の免疫原性組成物が、パンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与する可能性があるインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記パンデミック株がH5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1及びH1N1から成るリストより選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
初回ワクチン接種を、潜在的にパンデミックを引き起こしうるインフルエンザ株を含有するインフルエンザ組成物によって行い、且つ再ワクチン接種を、広まっているパンデミック株を含有するインフルエンザ組成物によって行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記トコフェロールがα-トコフェロールである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記スクアレンが前記第１の免疫原性組成物の全体積の0.5％〜20％の量で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記スクアレンが前記第１の免疫原性組成物の全体積の1.0％〜10％の量で存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記トコフェロール又はα-トコフェロールが前記第１の免疫原性組成物の全体積の1.0％〜20％の量で存在する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
スクアレン：トコフェロール又はスクアレン：α-トコフェロールの比が1以下である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記乳濁化剤がTween 80である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記乳濁化剤が前記免疫原性組成物の0.01〜5.0重量(w/w)％の量で存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
HA抗原の量が1用量当たり10μg以下である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
HA抗原の量が1用量当たり1〜7.5μg又は1〜5μgである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記パンデミックインフルエンザウイルス株がH5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1及びH1N1から成るリストより選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
抗原又は抗原組成物が、精製された全インフルエンザウイルス、非生存インフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスのサブユニット成分の形態である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記非生存インフルエンザウイルスがスプリットインフルエンザウイルスである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記インフルエンザ抗原又は抗原組成物が細胞培養物由来であるか又は胚性卵で産生された、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記第１の免疫原性組成物に対する免疫応答又は防護が全て、表１に記載のインフルエンザワクチン効力に対する国際規制判定基準の少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は3つ全てに適合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記免疫応答又は防護がワクチンの1又は2用量投与後に得られる、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ワクチンを非経口的に投与する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ疾患に対して免疫感作するためのインフルエンザワクチン製剤およびワクチン接種レジメン、医療におけるそれらの使用、特に様々な抗原に対する免疫応答を増強する上でのそれらの使用、ならびに調製の方法に関する。とりわけ、本発明は、パンデミック（pandemic）（大流行）に関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性があるインフルエンザ株由来の小量のインフルエンザウイルス抗原または抗原調製物と、水中油型エマルジョンアジュバントとを組合わせて含む一価インフルエンザ免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に最も偏在するウイルスの1つであり、ヒトと家畜をどちらも侵す。インフルエンザは、大きな経済的負担、罹患率、さらには死亡率をもたらす。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、直径約125nmの粒径を有するRNAエンベロープウイルスである。このウイルスは、脂質二重層構造と外部糖タンパク質を有するウイルスエンベロープで囲まれた内部ヌクレオカプシド（または核タンパク質と会合したリボ核酸（RNA）のコア）から基本的になる。ウイルスエンベロープの内層は、マトリックスタンパク質で主に構成され、その外層は、宿主由来の脂質で大部分が構成されている。インフルエンザウイルスは、粒子の表面に10〜12nmの長さのスパイクとして現れる2種の表面抗原、糖タンパク質ノイラミニダーゼ（NA）と赤血球凝集素（HA）を含む。インフルエンザ亜型の抗原特異性を決定するのは、これらの表面タンパク質、特に赤血球凝集素である。ウイルス株は、元来の宿主種、単離の地理学的位置と年、連続番号、および、インフルエンザAについては、HAおよびNAの亜型の血清学的特性によって分類される。16種のHA亜型（H1〜H16）と9種のNA亜型（N1〜N9）がインフルエンザAウイルスに対して同定されている（Webster RG et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol.Rev. 1992;56:152-179；Fouchier RA et al. Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005;79:2814-2822）。全てのHAおよびNA亜型のウイルスが水鳥から回収されている、しかしヒト集団においては、1918年以後に3種のHA亜型（H1、H2、およびH3）と2種のNA亜型（N1およびN2）しか安定な株は確立されてない。インフルエンザBウイルスについては、1種のHAの亜型と1種のNAの亜型が認識されているだけである。
【０００４】
インフルエンザAウイルスは連続的に進化しかつ抗原可変性を受ける［Wiley D, Skehel J. The structure and the function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann. Rev. Biochem. 1987 ; 56:365-394］。ウイルスRNAポリメラーゼによる効果的な校正がないと急速な転写誤差を生じて、表面タンパク質のアミノ酸置換をもたらしうる。これを「抗原ドリフト」と呼ぶ。セグメント化したウイルスゲノムは第2の型の抗原性変異を生じうる。もし2種のインフルエンザウイルスが同時に宿主細胞に感染すれば、「抗原シフト」と呼ばれる遺伝的再詰め合わせが新しい表面または内部タンパク質をもつ新規ウイルスを作製しうる。これらの抗原変化、「ドリフト」と「シフト」の両方は予測不可能であり、最終的に新たなインフルエンザ株の出現をもたらし、またウイルスが免疫系を回避し、周知のエピデミック（epidemic)(流行)をほとんど毎年引き起こしうるため、免疫学的な観点から劇的な影響を与える恐れがある。これらの両方の遺伝的改変がヒトにおけるパンデミックに関わる新しいウイルス変種を生じてきた。
【０００５】
HAは、様々なインフルエンザ株の血清学的特異性を定義する上で最も重要な抗原である。この75〜80kDのタンパク質は、数多くの抗原決定基を含有し、そのいくつかは異なる株では配列変化を受ける領域にあり(株特異的決定基)、また他のものは多くのHA分子に共通である領域にある(決定基に共通)。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、ほとんど毎冬、エピデミックを引き起こし、A型またはB型ウイルスの感染率は、6週間にわたって40％の高さである。インフルエンザ感染は、潜伏感染から軽度の上気道炎、重篤なウイルス性肺炎まで様々な疾患状態をもたらす。インフルエンザの典型的なエピデミックは、入院率または死亡率の増大によって証明されるとおり、肺炎および下部呼吸器疾患の発生率の増大を引き起こす。疾患の重篤度は、宿主の年齢、その免疫状態、および感染部位によって主として判定される。
【０００７】
65歳以上の高齢者は特に感染しやすく、先進国における全てのインフルエンザ関連死の80〜90％を占める。慢性基礎疾患を有する個人もまた、そのような合併症を経験する可能性が非常に高い。年少の乳児も重篤な疾患を患う恐れがある。したがって、こうしたグループは特に防護される必要がある。保健機関は、こうした「危険性がある」グループに加えて、保険医療提供者にもワクチン接種することを勧めている。
【０００８】
ワクチン接種は、毎年のインフルエンザのエピデミックを抑制する上で極めて重要な役割を果たす。現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチンまたは弱毒生インフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、抗原調製物の可能な3つの型:不活化全ウイルス、サブビリオン(精製ウイルス粒子を脂質エンベロープを溶解する界面活性剤または他の試薬を用いて破壊したもの、いわゆる「スプリット」ワクチン)、または精製HAおよびNA(サブユニットワクチン)で構成される。これらの不活化ワクチンは、筋肉内(i.m.)、皮下（i.n.）または鼻腔内(i.n.)に投与される。
【０００９】
パンデミックの間期に使用する、色々な種類のインフルエンザワクチンは通常3価のワクチンである。こうしたワクチンは通常、2種のインフルエンザA型ウイルス株と1種のインフルエンザB型株に由来する抗原を含有する。0.5mlの標準的な注射用量はほとんどの場合、各株由来の（少なくとも）15μgの赤血球凝集素抗原成分を含有し、これは一元放射免疫拡散法(SRD：single radial immunodiffusion)により測定される(J.M. Wood et al.:An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247；J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)。
【００１０】
各季節にインフルエンザワクチンに組込むべきパンデミックの間期のインフルエンザウイルス株は、世界保健機構（the World Health Organisation）と国家保険当局およびワクチン製造業者の協同により決定される。現在利用可能なパンデミックの間期のインフルエンザワクチンは、全ての年齢グループにおいて安全であると考えられる（De Donatoら. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101）。しかし、現在のインフルエンザワクチンが2歳未満の小児に効き目がある証拠はほとんどない。さらに、確認された典型的なインフルエンザ疾病を予防するためのワクチン有効性の報告された割合は、高齢者について23〜72％であり、これは、若年成人について報告された有効性の割合60〜90％よりも有意に低い（Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665；Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527）。インフルエンザワクチンの有効性は、ウイルス株に対する赤血球凝集抑制（HI）抗体の血清力価と相関していることが示され、いくつかの試験により、インフルエンザ免疫の後、高齢者の方が若年成人の場合よりも低いHI力価を示すことが認められている（Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439）。
【００１１】
アジュバントMF59を、水中油型エマルジョンの形態で添加したサブユニットインフルエンザワクチンが、高齢者およびリスク集団用に市販されていて、アジュバント無添加のサブユニットワクチンで得られるより高い抗体価を誘発できることが実証されている（De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101）。しかし、より最近の刊行物では、同じワクチンが、アジュバント無添加のスプリットワクチンと比較して、その改善されたプロファイルを示さないことが実証された（Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289）。
【００１２】
背景として、パンデミックの間期（inter-pandemic）には、前のエピデミックに由来するインフルエンザウイルスに関係のあるインフルエンザウイルスが広まる。ウイルスは、人生のより早い時期の感染から様々なレベルの免疫を有する人々の間で広がる。かかる広まり(circulation)は、通常2〜3年の期間にわたって、一般集団の間で再びエピデミックを引き起こすのに十分な変化をした新しい株の選択を促進する。この過程は、「抗原ドリフト」と呼ばれる。「ドリフト変種」は場合によっては1年以内にでも異なるコミュニティ、地域、国または大陸で異なる影響を及ぼしうるが、数年にわたると、それらの全体的な影響は類似することが多い。言い換えると、インフルエンザのパンデミックは、ヒト集団が免疫を持っていない新しいインフルエンザウイルスが出現するときに起こる。典型的なインフルエンザのエピデミックは肺炎および下気道疾患の発生率の増加を引き起こし、それが入院率または死亡率の増加に見られる。高齢者または慢性疾患を根底に有する者はかかる合併症を最も起こしやすいが、幼い幼児も重篤な疾患に罹りうる。
【００１３】
予測できない間隔で、新規インフルエンザウイルスが、前シーズンに広まった株と全く異なる亜型の重要な表面抗原、赤血球凝集素を伴って出現する。この場合、生じる抗原は、以前ヒトで広まっていた株の対応するタンパク質とは、20％から50％変わっている可能性がある。この結果、ウイルスは「集団免疫」を逃れてパンデミックを確立することができる。この現象は「抗原シフト」と呼ばれる。少なくとも過去においては、異なる種、例えばトリまたはブタのインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルスが種の障壁を超えたときにパンデミックが起こったと思われる。かかるウイルスが人から人へ広がる能力を持てば、これらは2、3ヶ月から1年以内に世界中に広がって、パンデミックを起こしうる。例えば、1957年(アジアかぜパンデミック)に、H2N2亜型のウイルスがH1N1ウイルス（少なくともウイルスが最初に単離された1918年以降ヒト集団で広まっていた）と入れ替わった。1957〜1968年の間、H2 HAおよびN2 NAは抗原ドリフトを受けた後、HAは1968年(香港かぜパンデミック)にH3N2インフルエンザ亜型の出現により取って代わられて、その後、N2 NAはH3 HAと共にドリフトし続けた(Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395)。
【００１４】
パンデミックの発生を引き起こす能力を有するインフルエンザウイルス株の特長は、以下の通りである：現在広まっている株の赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素を含み、それがノイラミニダーゼ亜型の変化を伴っても伴わなくてもよく；ヒト集団で水平伝染することができ；かつヒトに病原性である。新しい赤血球凝集素は、H2のように、長期間、おそらく数十年間ヒト集団に顕れなかったものである可能性がある。または、それは以前にヒト集団で広まって井いなかった赤血球凝集素、例えば鳥類で見られるH5、H9、H7またはH6である可能性がある。いずれの場合にも、集団の大多数、または少なくともその大部分、またはさらにその全てが以前にその抗原に遭遇したことがなくかつその抗原に対して免疫的にナイーブである。
【００１５】
広まっていないH2N2またはH9N2株などのパンデミック株を含有する一価の候補ワクチンを用いて、初回刺激を受けてない集団における安全性と免疫原性を評価するいくつかの臨床研究がなされている。研究は、ミョウバンアジュバント添加または無添加の、様々なHA濃度（1用量当たり1.9、3.8、3.8、7.5または15μgHA）のスプリットまたは全ウイルス製剤について行われた。H2N2亜型のインフルエンザウイルスは、1957から1968年まで巡回した後に「香港パンデミック」の期間にH3N2株により置き換わられた。現在、1968年以後に生まれた個人は免疫学的にH2N2株にナイーブである。これらのワクチン候補は、免疫原性がありかつ良い耐性のあることが示されている。結果は、Hehme, N et al. 2002, Med. Microbiol. Immunol. 191, 203-208；Hehme N. et al. 2004, Virus Research 103, 163-171に報じられており；また、H5N1については2つの研究（Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664；Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351）が報じられている。他の研究は、MF59を用いてアジュバント添加したインフルエンザワクチンの結果を報じている。1つの研究は、MF59を用いてアジュバント添加したH5N3インフルエンザワクチンの2用量が、初回刺激した集団のインフルエンザH5N1に対する免疫を追加免疫（boost）したことを報じ（Stephenson et al., Vaccine 2003, 21, 1687-1693）、そして他の1つの研究は、MF59を用いてアジュバント添加したインフルエンザH5N3ワクチンの3用量後に、H5N1ウイルスに対する交差反応性抗体を得たことを報じている（Stephenson et al., J. Infect. Diseases 2005, 191, 1210-1215）。
【００１６】
インフルエンザパンデミックの場合の人のリスクは、季節性インフルエンザによる合併症について定義されたリスクグループとは異なりうる。WHOによると、鳥類インフルエンザ株H5N1が原因であるヒトの場合の50％は20歳未満の人で起こり、90％は40歳未満の間で起こった（WHO、週刊、疫学記録、2006年6月30日）。
【００１７】
パンデミック中に、抗ウイルス薬は必要量をカバーするのに十分でないかもしれないし、またインフルエンザのリスクがある個人の数はパンデミックの間期のそれより大きいであろう。それ故に、大量生産の可能性と効率的な配布および投与の可能性を備えた好適なワクチンの開発が必須である。これらの理由で、パンデミックに備えて、三価の代わりに一価のワクチンが、免疫的にナイーブな受給者の防護抗体レベルを達成するために2用量のワクチンが必要でありうるので、主にワクチン体積を減少する企てで、開発されている（Wood JM et al. Med Mircobiol Immunol. 2002;191:197-201；Wood JM et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001;356:1953-1960）。
【００１８】
これらの問題はアジュバント添加により対抗することができる、その場合、アジュバント添加の目的は、抗原含量を減少（抗原を節約）できるようにするためワクチンの免疫原性を増強して、利用しうるワクチン用量数を増加することである。アジュバントの使用により、ナイーブな集団における抗原の潜在的に弱い免疫原性も克服しうる。以上の例は、アルミニウム塩でアジュバント添加した全不活化H2N2またはH9N2ウイルスを用いて示されている（N. Hehme et al. Virus Research 2004, 103, 163-171）。単味のサブビリオンH5N1ワクチンまたは水酸化アルミニウムのアジュバントを添加したスプリットウイルスH5N1ワクチンによる臨床試験は既に実施されている。これらの試験の結果は、単味とアジュバント添加したものとの両方のH5N1ウイルスワクチンは90μgまでの抗原に対して安全であることを示す（単味のサブビリオンワクチンとしてのみ試験して）（Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664; Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351）。
【００１９】
免疫原性（特に、免疫原性が弱いかまたは無いパンデミック株に対する免疫原性）の改善された、または高齢集団などの免疫無防備の個人向けの新ワクチンは、それ故に、なお必要とされる。交差防護能力をもつ新ワクチンであって、パンデミックの宣言前にまたは宣言時に、パンデミック株に対して免疫的にナイーブな集団を初回刺激するためのパンデミック前または備蓄ワクチンとして使用しうる新ワクチンも必要とされる。強力なアジュバントを用いるワクチン抗原の製剤は、サブビリオン抗原に対する免疫応答を増強するための可能な手法である。本発明が提供する新規のアジュバント製剤は、全ての年代のグループに十分な防護（以前に血清陰性であった被験者を陽性とみなされるHI力価である1：40に、または力価を4倍に増加するセロコンバージョン）を与える抗原節約型の製剤を可能にする。
【発明の概要】
【００２０】
発明の開示
本発明の第1の態様においては、パンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性があるインフルエンザウイルス株由来の小量のインフルエンザウイルス抗原または抗原調製物と、アジュバントとを組合わせて含むインフルエンザ免疫原性組成物であって、小量の抗原量が1用量当たり15μgの赤血球凝集素（HA）を超えずかつ前記アジュバントが代謝可能な油、ステロールまたはトコフェロール（例えばα-トコフェロール）、および乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンである、前記組成物、特にワクチンを提供する。好適なワクチン組成物は一価組成物である。
【００２１】
明細書全体を通して、パンデミックインフルエンザA株のようなインフルエンザ疾患のパンデミックに関与しているかまたは関連する感受性があるインフルエンザ株はパンデミック株と呼ぶことにする。好適なパンデミック株は、限定されるものでないが、H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1およびH1N1である。他の好適なパンデミック株はH7N3（カナダで報じられた2例）、H10N7（エジプトで報じられた2例）およびH5N2（日本で報じられた1例）である。
【００２２】
他の態様においては、本発明は、パンデミックの状況またはパンデミック前の状況に対するインフルエンザ免疫原性組成物、特にワクチンの製造方法であって、パンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性がある単一インフルエンザウイルス株由来のインフルエンザウイルス抗原もしくは抗原調製物と本明細書で先に定義した水中油型エマルジョンアジュバントとを混合するステップ、ならびに1用量当たり15μg以下のインフルエンザ赤血球凝集素抗原を含有するワクチンユニットを提供するステップを含んでなる前記方法を提供する。インフルエンザウイルスは、卵由来、植物由来、細胞培養物由来であってもよく、または遺伝子組換えで作製されてもよい。好適なインフルエンザウイルス抗原は卵由来かまたは細胞培養物由来である。
【００２３】
第3の態様においては、医療用の、本明細書に定義した免疫原性組成物を提供する。
【００２４】
さらに他の態様においては、ヒトにおけるインフルエンザウイルス抗原またはその抗原調製物に対して、i)改善されたCD4 T細胞免疫応答、ii)改善されたB細胞記憶応答、およびiii)改善された液性応答の少なくとも１つを誘導する免疫原性組成物、またはキットの製造における、(a)小量の、本明細書に定義した、パンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性がある単一のインフルエンザ株由来のインフルエンザウイルス抗原またはその抗原調製物と(b)水中油型エマルジョンアジュバントとの使用を提供する。前記免疫応答は特に、免疫低下した個人または集団、例えば高リスク成人または高齢者で誘導される。好適な免疫原性組成物は本明細書に定義した通りである。
【００２５】
インフルエンザに対するヒト高齢者のワクチン接種用の本明細書に定義した免疫原性組成物の調製における、インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と水中油型エマルジョンアジュバントとの使用も提供する。
【００２６】
具体的な実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、アジュバント無添加の抗原または抗原組成物により得られる応答と比較して、改善されたCD4 T細胞免疫応答および改善された記憶B細胞応答の両方を誘導する能力を有する。他の具体的な実施形態において、前記免疫原性組成物は、アジュバント無添加の抗原または抗原組成物により得られる応答と比較して、改善されたCD4 T-細胞免疫応答および改善された液性応答の両方を誘導する能力を有する。特に、前記液性免疫応答または防護は少なくとも1つの、好適には2つの、典型的には全て3つのインフルエンザワクチン効力に対するEUまたはFDA規制判定基準（regulatory criteria)に適合する。好適には、前記免疫応答または防護は、ワクチンの1用量、好適には2用量の後に得られる。具体的には、前記免疫応答または防護は、1用量のアジュバント添加したワクチンの後に、少なくとも1つの、好適には2つの、または全て3つのインフルエンザワクチン効力に対するEUまたはFDA規制判定基準に適合する。具体的には、ただ1用量のワクチンの後に、少なくとも1つの、好適には2つのEUまたはFDA判定基準に適合する。本発明による組成物に対する効力判定基準をさらに詳しく以下に説明する（表1および以下の「効力判定基準」を参照）。好適には、前記組成物を非経口で、特に筋肉内または皮下経路を経由して投与する。
【００２７】
さらなる実施形態においては、以前に、パンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性がある単一のインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物と、本明細書に定義した水中油型エマルジョンアジュバントとを組合わせて含む一価インフルエンザ免疫原性組成物を用いてワクチン接種したヒトの、再ワクチン接種用の免疫原性組成物の製造における、小量のインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物の使用を提供する。
【００２８】
具体的な実施形態において、再ワクチン接種に使用する組成物は、アジュバント無添加であってもよく、またはアジュバント、特に水中油型エマルジョンアジュバントを含有してもよい。他の具体的な実施形態において、再ワクチン接種用の免疫原性組成物は、初回ワクチン接種に使用したインフルエンザウイルスまたはそのウイルス抗原調製物と共通CD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含有する。再ワクチン接種用の免疫原性組成物は古典的量（すなわち、約15μgのHA）の前記変種パンデミック株を含有してもよい。
【００２９】
好適な再ワクチン接種は、以前の季節にインフルエンザに対してワクチン接種されている被験者に行う。好適な再ワクチン接種は、初回ワクチン接種に用いたのと同じ亜型（例えば、H5N1 Vietnam）であるインフルエンザ株（例えば、H5N1 Vietnam）を含むワクチンを用いて行う。ある具体的な実施形態において、再ワクチン接種は、同じ亜型、例えばH5N1 Indonesiaのドリフト株を用いて行われる。他の実施形態において、再ワクチン接種に用いる前記インフルエンザ株はシフト株である、すなわち、初回ワクチン接種に用いられたものと異なり、例えば、異なるHAまたはNA亜型、例えばH5N2（H5N1と同じHA亜型であるが、異なるNA亜型）またはH7N1（H5N1と異なるHA亜型であるが、同じNA亜型）を有する。
【００３０】
好適な初回ワクチン接種はパンデミックの宣言時に行い、再ワクチン接種はその後に行う。あるいは、初回ワクチン接種はパンデミック前の戦略の一部であり、パンデミックの宣言前に初回刺激戦略として行って免疫系が初回刺激されるようにして、再ワクチン接種をその後に行う。典型的には、再ワクチン接種は、初回ワクチン接種後、少なくとも4か月、好適には6または8〜14か月、好適には、ほぼ10〜12か月、またはもっと経って行う。好適なことに、1年後または1年以上経ってでも、再ワクチン接種は抗体および／または細胞の免疫応答をブーストすることができる。これは、感染のさらなる波が最初のパンデミック後、数か月に起こりうるのでとりわけ重要ある。必要に応じて、再ワクチン接種は2回以上行ってもよい。
【００３１】
好適な前記水中油型エマルジョンは、代謝可能な油、ステロールまたはトコフェロール（例えばα-トコフェロール）、および乳濁化剤を含む。他の具体的な実施形態において、前記水中油型エマルジョンアジュバントは、全体積の0.5％〜20％量の少なくとも1種の代謝可能な油を含み、その油滴は強度で少なくとも70％が1μm未満の直径を有する。好適には、前記トコフェロール（例えばα-トコフェロール）が、前記免疫原性組成物の全体積の1.0％〜20％の量で、特に1.0％〜5％の量で存在する。
【００３２】
本発明のさらなる態様においては、変種インフルエンザ株により引き起こされるインフルエンザ感染に対する防護のための、本明細書に定義した免疫原性組成物の製造における、最初のパンデミックインフルエンザ株由来の抗原または抗原調製物の使用を提供する。
【００３３】
具体的な態様においては、高リスク成人または高齢者などの免疫低下した個人または集団にワクチン接種する方法であって、前記ヒト個人または集団に、小量の単一のパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原またはその抗原調製物と、本明細書に定義した水中油型エマルジョンアジュバントとを組合わせて含むインフルエンザ免疫原性組成物を投与するステップを含んでなる前記方法が提供される。
【００３４】
さらに他の実施形態において、本発明は、以前に、単一のパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原またはその抗原調製物と、水中油型エマルジョンアジュバントとを組合わせて含む一価インフルエンザ免疫原性組成物を用いてワクチン接種されたヒトに再ワクチン接種する方法であって、前記ヒトにアジュバントを添加したまたはアジュバント無添加のインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物を投与するステップを含んでなる、前記方法を提供する。
【００３５】
さらなる実施形態においては、ヒト集団または個人に1種のパンデミックインフルエンザウイルス株に対してワクチン接種し、次いで、前記ヒトまたは集団に変種インフルエンザウイルス株に対して再ワクチン接種する方法であって、前記ヒトに、(i)最初のパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と水中油型エマルジョンアジュバントとを含む第1組成物、および(ii)前記最初のインフルエンザウイルス株のインフルエンザウイルス株変種を含む第２の免疫原性組成物を投与するステップを含んでなる前記方法を提供する。ある具体的な実施形態において、前記変種株は、パンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性がある。他の具体的な実施形態において、前記変種株は多価組成物の一部分であり、前記パンデミックインフルエンザウイルス変種の他に、少なくとも1種の広まっている（季節性）インフルエンザウイルス株を含むものである。特に、前記パンデミックインフルエンザウイルス株は、さらに、1、2または3種の季節株をそれぞれ含む二価、または三価、または四価組成物の一部分である。
【００３６】
本明細書全体にわたって、小量のパンデミックインフルエンザウイルス抗原の、インフルエンザ感染または疾患を予防するための本明細書に定義した組成物の製造における使用と、請求項に記載の組成物を用いるヒトの治療法とは互換的に使いうる。
【００３７】
本発明の他の態様および効果を、以下の好ましい実施形態の詳細な説明においてさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ−１】PCSにより測定したSB62水中油型エマルジョンの油滴粒子サイズ分布を示し、Malvern Zetasizer 3000HSによる、SB62ロット1023のサイズ測定値を示す：A＝希釈率1/10000（Rec22〜Rec24）（Continでの解析、光学モデル1.5/0.01に適合させた）；B＝希釈率1/20000（Rec28〜Rec30）（Continでの解析、光学モデル1.5/0.01に適合させた）。
【図１Ａ−２】図1A-１の続きである。
【図１Ａ−３】図1A-２の続きである。
【図１Ｂ】PCSにより測定したSB62水中油型エマルジョンの油滴粒子サイズ分布を示し、記録22（上部）および記録23（下部）の強度による概略図を示す。
【図２Ａ】フェレット実験を示し、H5N1A/Vietnamを用いて免疫感作したフェレットの赤血球凝集抑制試験（GMT）を示す。
【図２Ｂ】フェレット実験を示し、死亡または安楽死の日にフェレットから得た肺組織の平均H5N1 PCRデータ（左のグラフ）および平均ウイルス力価測定データ（右のグラフ）である（PCRデータは、コントロール希釈単位（CDU）として表現し、これは、ウイルスのストックを連続希釈し、各希釈液を試験サンプルと同じ方式で核酸抽出およびTaqman PCR増幅して作製した標準曲線から決定した。ウイルス力価測定データはTCID50/g組織として表現した）。
【図３】色々な用量のH5N1 A/Vietnamを用いて免疫感作したフェレットの抗-A/インドネシア中和抗体応答を示す。
【図４】インフルエンザ一価バルクの製造の概要を示す。
【図５】抗原の最終バルクの製剤フローシートを示す。
【図６】AS03アジュバントを添加したまたは無添加のH5N1スプリットウイルス抗原の用量範囲を用いたヒト臨床試験を示す。0、21および42日の時点における抗HA抗体に対するGMT（95％CI）。
【図７】AS03アジュバントを添加したまたは無添加のH5N1スプリットウイルス抗原の用量範囲を用いたヒト臨床試験を示す。ワクチン接種後、21日および42日における抗HA抗体に対するセロコンバージョン率（95％CI）。
【図８】AS03アジュバントを添加したまたは無添加のH5N1スプリットウイルス抗原の用量範囲を用いたヒト臨床試験を示す。それぞれの時点（0、21および42日）における抗HA抗体に対する血清防護率（95％CI）。
【図９】AS03アジュバントを添加したまたは無添加のH5N1スプリットウイルス抗原の用量範囲を用いたヒト臨床試験を示す。ワクチン接種後（21日および42日）の抗HA抗体に対するセロコンバージョン係数（95％CI）。
【図１０Ａ】H5N1 Vietnam株に対する中和力価（GMT）を示す。HN4＝アジュバント無添加の3.8μgHA；HN8＝アジュバント無添加の7.5μgHA；HN4AD＝AS03アジュバント添加した3.8μgHA；HN8AD＝アジュバント添加した7.5μgHA。
【図１０Ｂ】5N1 Vietnam株に対する中和力価（セロコンバージョン率）を示す。HN4＝アジュバント無添加の3.8μgHA；HN8＝アジュバント無添加の7.5μgHA；HN4AD＝AS03アジュバント添加した3.8μgHA；HN8AD＝アジュバント添加した7.5μgHA。
【図１１】H5N1 Vietnam 株に対するCD4特異的応答を示す。HN4＝アジュバント無添加の3.8μgHA；HN8＝アジュバント無添加の7.5μgHA；HN4AD＝AS03アジュバント添加した3.8μgHA；HN8AD＝アジュバント添加した7.5μgHA。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明者らは、小量の、パンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する感受性のあるインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と、代謝可能な油、ステロール、トコフェロール（例えばα-トコフェロール）および乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバントとを一緒に含むインフルエンザ製剤は、ヒトまたは集団における前記抗原または抗原組成物に対する液性応答および／またはCD4 T細胞免疫応答および/またはB細胞記憶応答を、アジュバント無添加のウイルスまたはその抗原調製物を用いて得られる応答と比較して、改善できることを見出した。これらは同種インフルエンザ株により生じる罹患率／死亡率に対する防護を達成することを可能にする。本明細書に定義した水中油型エマルジョンアジュバントを添加した製剤は、MHCクラスII分子により提示されたインフルエンザエピトープを検出しうる抗インフルエンザCD4-T細胞応答を誘発するために用いると有利である。本明細書に定義した水中油型エマルジョンアジュバントを添加した製剤は、交差反応性免疫応答、すなわち、変種株に対するまたはある範囲の関係株に対する検出可能な免疫（液性および／または細胞性）を誘発するために用いると有利である。このアジュバントを添加した製剤は、（ワクチン接種および感染時に）同種およびドリフトインフルエンザ株に対する反応性を増加する目的で、液性および／または細胞媒介性免疫系を標的化するのに有利な効果がある。これらはまた、交差-初回刺激戦略を誘発する、すなわち、変種株による再ワクチン接種（1用量）時の応答を容易にする「初回刺激された（primed）」免疫記憶を誘発するために用いると有利である。
【００４０】
本発明によるアジュバント添加パンデミックインフルエンザ組成物は、次のいくつかの利点を有する：
1)改善された免疫原性：これらは、免疫原性の弱いインフルエンザ株に対する低い免疫応答を、アジュバント無添加製剤により得られるレベルより高いレベルに改善することを可能にしうる；
2)アジュバントの使用により、ナイーブな集団における抗原の潜在的な弱い免疫原性を克服することができる；
3)これらは 高齢者（典型的には60歳超）などの特定の集団の免疫原性を、18〜60歳いの若年者に見られるレベルまで改善しうる（抗体およびT細胞応答）；
4)これらは、交差防護プロファイルを改善しうる：交差反応性、変種（ドリフト）インフルエンザ株に対する交差防護が増加するので、交差初回感作（cross-priming）戦略の仕組みを可能にする、すなわち、これらを（広まっている）パンデミック株に対する防護を促進するのに1用量だけが必要であるパンデミック前ワクチンとして使用することを可能にする；
5)抗原用量の低減によるこれらのさらなる利点のいずれかまたは全てを達成することにより、これらは、危機に際して、またはパンデミックの状況の準備に対する能力の増強を確保しうる（パンデミックの状況における抗原節約）。
【００４１】
その他の利点は明細書および以下の実施例セクションから明らかであろう。本発明に用いる組成物は、再ワクチン接種後にインフルエンザに対してより優れた血清防護を提供することができ、これはインフルエンザの防護相関要因（correlates of protections）を満たすヒト被験体の数により評価された。さらに、本発明に使用する組成物はまた、アジュバント無添加組成物と比較して、ヒト被験体の初回ワクチン接種後のより高い液性応答またはB細胞記憶応答、および再ワクチン接種後のより高い応答を誘導をすることもできる。
【００４２】
特許請求の範囲に記載のアジュバント添加組成物はまた、アジュバント無添加組成物の場合より多くの個人において、ワクチン内に存在するインフルエンザ株に対する抗体を防護レベルで誘発するだけではなく、維持することもできる
したがって、さらに別の実施形態において、請求の範囲に記載の組成物は、インフルエンザ関連疾患に対する持続免疫応答を確実にすることができる。特に、持続とは、ワクチン接種後、少なくとも3ヶ月後に、好ましくは少なくとも6ヶ月後に規制判定基準を満たすことができるHI抗体免疫応答を意味する。特に、請求される組成物は、少なくとも3ヶ月後に、ワクチン中に存在するパンデミックインフルエンザ株に対して、防護率により測定した抗体の防護レベル（表1を参照）を、個人の＞50％、好適には個人の＞60％、個人の＞70％、好適には個人の＞80％、または好適には個人の＞90％で誘導できる。具体的な態様においては、ワクチン組成物のインフルエンザ株に対して、＞90％の抗体の防護レベルが、ワクチン接種後少なくとも6ヶ月に得られる。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、請求の範囲に記載の組成物は、ワクチンインフルエンザ株に対してEU要件が与えたものより高度の血清防護およびセロコンバージョンを誘発できる。これをさらに詳しく以下に説明する（表1および以下の「効力判定基準」）。
【００４４】
インフルエンザウイルス株と抗原
一実施形態において、本発明に従って使用するインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物は、スプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットウイルス抗原調製物であってもよい。代わりの実施形態において、インフルエンザ調製物は、他の型の不活化インフルエンザ抗原、例えば、不活化全ウイルスまたは組換え体および／または精製HAおよびNA(サブユニットワクチン)、またはインフルエンザビロソームを含有してもよい。なおさらなる実施形態において、インフルエンザウイルスは、弱毒生インフルエンザ調製物であってよい。
【００４５】
本発明に従って使用するスプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットウイルス抗原調製物は、好適には、ウイルス粒子が、脂質エンベロープを溶解する界面活性剤または他の試薬を用いて破壊されている不活化ウイルス調製物である。スプリットウイルスまたはそのスプリットウイルス抗原調製物は、好適には、可溶化濃度の有機溶剤または界面活性剤を用いて感染性または不活化全インフルエンザウイルスを断片化し、続いて可溶化剤の全てまたは大部分およびウイルス性脂質物質の一部または大部分を除去することによって調製される。このスプリットウイルス抗原調製物とは、スプリットウイルス成分の抗原特性の大部分を保持しながらスプリットウイルスと比較してある程度精製されていてもよいスプリットウイルス調製物を意味する。例えば、卵において製造する場合、スプリットウイルスを卵夾雑タンパク質から採取してもよいし、または細胞培養において製造する場合、スプリットウイルスは宿主細胞夾雑物から採取してもよい。スプリットウイルス抗原調製物は、2種以上のウイルス株のスプリットウイルス抗原成分を含みうる。スプリットウイルスを含有するワクチン（「インフルエンザスプリットワクチン」と呼ばれる）またはスプリットウイルス抗原調製物は通常、残余のマトリックスタンパク質および核タンパク質、および時には脂質、ならびに膜エンベロープタンパク質を含有する。このようなスプリットウイルスワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質の大部分または全種類を含有するが、それらは全ウイルスに存在するのと同じ割合であるとは限らない。
【００４６】
あるいはまた、インフルエンザウイルスは全ウイルスワクチンの形態であってもよい。これはパンデミックの状況でスプリットウイルスワクチンよりも有利でありうる、というのは、全ウイルスワクチンであれば、新しいインフルエンザウイルス株に対するスプリットウイルスワクチンの製造が成功するかどうかという不確実性が回避されるからである。一部の株については、スプリットウイルスを製造するために使用する慣用の界面活性剤がウイルスに損傷を与えて使用不能にする可能性がある。スプリットワクチンを製造するために様々な界面活性剤を使用するおよび／または様々な方法を開発する可能性は常にあるが、時間がかかりうるし、パンデミックの状況ではかかる時間はないかも知れない。全ウイルスアプローチは、その確実性の程度が高いだけでなく、スプリットウイルスよりもワクチン生産能力が高い、というのは、好適なスプリットワクチンを調製するために必要な追加の精製工程で相当な量の抗原が失われるからである。
【００４７】
他の実施形態において、インフルエンザウイルス調製物は、精製サブユニットインフルエンザワクチンの形態である。サブユニットインフルエンザワクチンは通常、2種の主要エンベロープタンパク質、HAおよびNAを含有し、サブユニットインフルエンザワクチンは特に若年のワクチン受給者において通常反応原性が少ないので、全ビリオンワクチンに勝る追加の利点を有しうる。サブユニットワクチンは、組換えにより、または破壊されたビリオンからの精製により作製することができる。
【００４８】
他の実施形態において、インフルエンザウイルス調製物は、ビロソームの形態である。ビロソームは球状の単層小胞であって、これはビロソームのリン脂質二分子膜中に挿入された、信頼しうる高次構造の機能的ウイルスエンベロープ糖タンパク質HAおよびNAを保持する。
【００４９】
前記インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物は、卵由来または細胞培養物由来であってよい。それらはまた、昆虫細胞、植物、酵母または細菌などの他の系で作製されてもよいしまたは遺伝子組換えにより作製されてもよい。
【００５０】
例えば、本発明によるインフルエンザウイルス抗原またはその抗原調製物は、卵でインフルエンザウイルスを増殖し、収穫した尿膜腔液を精製することによる従来の発育鶏卵法に由来するものであってもよい。卵は、直ぐに数多く蓄積することができる。あるいは、上記ウイルス抗原またはその抗原調製物は、組織培養を使用してウイルスを増殖させるかまたは組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させる、新しい作製方法のいずれかに由来するものであってもよい。ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質には、例えば、MDCK、MDCKのクローン由来の細胞、またはMDCK様細胞などのイヌ腎細胞、ベロ細胞を含むAGMK細胞などのサル腎細胞、好適なブタ細胞系、またはワクチン用インフルエンザウイルスを作製するのに好適ないずれかの他の哺乳動物細胞型が含まれる。好適な細胞基質には、ヒト細胞、例えば、MRC-5細胞またはPer-C6細胞も含まれる。好適な細胞基質は細胞系に限られることなく、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞などの一次細胞およびトリの細胞系も含まれる。
【００５１】
インフルエンザウイルス抗原またはその抗原調製物は、いくつかの商業的方法のいずれか、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許第DD 300833号および第DD 211444号に記載のスプリットインフルエンザ法によって作製することができる。従来より、スプリットインフルエンザは、リン酸トリ-n-ブチル、またはTween(商標)とジエチルエーテルとの組合わせ(「Tween-エーテル」スプリット剤として公知)などの溶剤/界面活性剤処理を使用して作製され、この方法は一部の製造施設でまだ使用されている。現在使用されている他のスプリット剤には、界面活性剤、タンパク質分解酵素、または胆汁酸塩、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許第DD 155875号に記載のデオキシコール酸ナトリウムが含まれる。スプリット剤として使用することができる界面活性剤には、カチオン界面活性剤、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、他のイオン界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸塩、タウロデオキシコール酸塩、または非イオン界面活性剤、例えば、Triton X-100（例えば、Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103に記載の方法で）およびTriton N-101を含む上記界面活性剤、または任意の2種以上の界面活性剤の組合せが含まれる。
【００５２】
スプリットワクチンの調製方法には、いくつかの様々な濾過および/または他の分離ステップ、例えば、様々に組み合わされた、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換)ステップ、および、場合によっては、例えば、加熱、ホルムアルデヒドもしくはβ-プロピオラクトン、またはUVによる不活化ステップ（スプリット前にまたは後に実施してもよい）が含まれうる。スプリット法は、バッチ法、連続法、または半連続法として実施することができる。スプリット免疫原性組成物用の好適なスプリットおよび精製方法は、WO02/097072に記載されている。
【００５３】
本発明による好適なスプリットインフルエンザワクチン抗原調製物は、製造過程で残存したある剰余量のTween80および/またはTriton X-100を含むが、これらは、スプリット抗原の調製後に添加してもよいし、またはその濃度を調節してもよい。好適にはTween80とTriton X-100が両方とも存在する。ワクチン用量中のこのような非イオン性界面活性剤の最終濃度の好適な範囲は、Tween80が0.01〜1％、好適には約0.1％(v/v)であり、Triton X-100が0.001〜0.1％(w/v)、好適には0.005〜0.02％(w/v)である。
【００５４】
具体的な実施形態において、Tween80の最終濃度は、0.045％〜0.09％w/vの範囲にある。他の具体的な実施形態において、抗原は、2倍濃縮混合物として提供され、この混合物は、0.045％〜0.2％(w/v)の範囲のTween80濃度を有し、アジュバント添加物(または対照製剤中のバッファー)との最終製剤時に2倍に希釈しなければならない。
【００５５】
他の具体的な実施形態において、Triton X-100の最終濃度は、0.005％〜0.017％w/vの範囲にある。他の具体的な実施形態において、抗原は、2倍濃縮混合物として提供され、この混合物は、0.005％〜0.034％(w/v)の範囲にあるTriton X-100濃度を有し、アジュバント添加物(または対照製剤中の緩衝液)との最後の配合時に2倍に希釈しなければならない
インフルエンザ調製物は、低レベルの保存剤、特にチメロサールの存在下で、または好適にはチメロサールの不在下で調製することが好適である。好適には、得られたインフルエンザ調製物が有機水銀保存剤の不在下で安定であり、特に、調製物は剰余のチメロサールを含有しない。特に、インフルエンザウイルス調製物は、チメロサールの不在下で、または低レベルのチメロサール（通常5μg/ml以下）で安定化された赤血球凝集素抗原を含む。具体的には、B型インフルエンザ株の安定化は、コハク酸α-トコフェロール(コハク酸ビタミンE、すなわちVESとも言う)などのα-トコフェロールの誘導体によって実施される。かかる調製物とこれを調製する方法はWO02/097072に開示されている。
【００５６】
あるいは、とりわけ多用量容器については、汚染リスクを低減するためにチメロサールまたは任意の他の好適な保存剤が存在する。これは特に可及的速やかにできるだけ多くの人にワクチン接種するように設計されたパンデミックワクチン用には妥当な処置である。
【００５７】
再ワクチン接種用の好適な組成物は、パンデミックインフルエンザ株に加えて、適当なインフルエンザシーズンのWHO推奨株から調製した3種の不活化スプリットビリオン抗原を含有する。
【００５８】
一実施形態においては、インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と水中油型エマルジョンアジュバントは、同じ容器内に含まれる。これは「1バイアルアプローチ」と呼ばれる。好適なバイアルは、予め充填したシリンジである。代わりの実施形態において、インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と水中油型エマルジョンアジュバントは、別々の容器またはバイアルまたはユニット内に含まれ、被験者への投与直前にまたは投与時に混合される。これは「2バイアルアプローチ」と呼ばれる。例として、ワクチンが0.5mlの注射用量の合計投与体積の2成分ワクチンである場合、濃縮抗原（例えば、濃縮不活化スプリットビリオン抗原）は1つのバイアル（330μl）（抗原容器）に入れて提供してもよく、予め充填されたシリンジ（アジュバント容器）はアジュバント（400μl）を含有する。典型的には、パンデミックワクチンは0.5ml注射用量であり、最初の被験者に注射する前に多用量バイアルは1：1のバイアル：バイアル混合物を含有する。あるいは、パンデミックワクチンは1.0mlバイアル：シリンジ注射用量である。注射時に、濃縮不活化スプリットビリオン抗原を含有するバイアルの内容物を、アジュバントを含有するシリンジを使用してバイアルから吸い出し、続いてシリンジを穏やかに混合する。注射前に、使用済みの針を筋肉注射針と交換し、容量を530μlに調整する。用時調製するアジュバント添加インフルエンザワクチン候補の1回用量は、530μlに相当する。
【００５９】
好適なアジュバント添加したパンデミックインフルエンザ候補ワクチンは、二成分ワクチンであり、I型ガラスバイアルで提供される濃縮不活化スプリットビリオン抗原と、アジュバント0.5mlを含有する予め充填したI型ガラスシリンジから構成される。あるいは、ワクチンは2つのバイアル（1つは抗原用、1つはアジュバント用で、それぞれ10用量である）で提供される二成分ワクチンであって、最初の患者に投与する前に混合物とし、その後は4℃にて短時間（例えば、1週間まで）次の投与用に保存する。注射の時点で、予め充填したアジュバントを含有するシリンジの内容物を、濃縮された三価不活化スプリットビリオン抗原を含有するバイアル中に射出する。混合後、内容物をシリンジ中に吸い込み、そして注射針を筋肉用注射針と取り替える。用事調製したアジュバント添加インフルエンザ候補ワクチンの1用量は0.5mlに対応する。0.5mlの各ワクチン用量は、1.9μg、3.8μg、7.5μg、15μもしくは30μg赤血球凝集素（HA）、またはワクチン組成が本明細書に定義した効力判定基準に適合するように決定した任意の好適量のHAを含有する。1ml（0.5mlアジュバント＋0.5ml抗原調製物）のワクチン用量も好適である。
【００６０】
本発明によると、本明細書に定義した一価免疫原性組成物中のインフルエンザ株は、パンデミックに関与しているまたはパンデミックに関与する可能性がある。かかる株のことを以下の記載において「パンデミック株」とも言う。特に、ワクチンが、二価、三価、または四価ワクチンのような再ワクチン接種用の多価ワクチンである場合、少なくとも1種の株はパンデミックに関与しているまたはパンデミックに関与する可能性がある。好適な株は、限定されるものでないが、H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1およびH1N1である。ヒトにおける他のパンデミック株は、H7N3（カナダで2例が報じられた）、H10N7（エジプトで2例が報じられた）およびH5N2（日本で1例が報じられた）である。
【００６１】
再ワクチン接種用の前記インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物は、適当に、二価、三価または四価のように多価であるかまたはさらに多くの種のインフルエンザ株を含有する。好適には、再ワクチン接種用のインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物は、三価または四価であり、3種の異なるインフルエンザ株（その少なくとも1種の株はパンデミックに関与しているかまたはパンデミックに関与する可能性がある）由来の抗原を有する。好適な再ワクチン接種組成物は、パンデミック株（初回ワクチン接種用組成物中に存在するパンデミック株の変種であってもよい）および3種の他の株（典型的には古典的な広まっている株）を含む。
【００６２】
あるいは、好適なパンデミック前ワクチン戦略は、異なる潜在的パンデミック株による周期的な（例えば、1〜2年毎の）免疫化を必要とし、これらのウイルスに対して長期にわたる応答を維持しかつ広げることである。例えば一実施形態においては、初回ワクチン接種を、ある年にH5N1などのパンデミック株を含む、請求の範囲に記載のアジュバント添加一価ワクチンを用いて行い、その後、次の時点に（例えば、6か月、1年、または2年後に）H9N2などの異なるパンデミックインフルエンザ株を含むアジュバント添加組成物を用いて行い、その後、さらにH7N7などの他のパンデミックインフルエンザ株を含むアジュバント添加組成物を用いて行い、これを続ける。a）可能性のあるパンデミックのタイミングおよびb）具体的なパンデミック株を予測することは不可能であるので、請求の範囲に記載のアジュバント添加組成物に依存するこの戦略は、正しいタイミングにおける防護免疫応答の量と範囲を最大化するための保険の強化を提供しうる。これらの戦略において、本明細書に定義したアジュバントが好適である。
【００６３】
パンデミックまたはパンデミックインフルエンザ株に関与するインフルエンザ疾患の発生を引き起こす能力を与えるインフルエンザウイルス株の特長は、次のとおりである：すなわち、その株は現在広まっている株の赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素を含み、それ故にほとんど全ての人が免疫学的にナイーブであること；ヒト集団で水平伝染することができること；および、ヒトに病原性であること。新しい赤血球凝集素は、H2のように長期間、おそらく数十年間ヒト集団に顕れなかった可能性がある。または、それは以前にヒト集団で広まっていなかった赤血球凝集素、例えばトリに存在するH5、H9、H7またはH6である可能性がある。いずれにせよ集団の大多数、または少なくともその大部分、またはその全てでさえ、以前にその抗原に遭遇したことがなく、免疫学的にそれにナイーブである。現在のところ、WHOが潜在的にヒトでパンデミックを引き起こしうると同定しているインフルエンザAウイルスは、強力な病原性H5N1トリインフルエンザウイルスである。それ故に、本発明によるパンデミックワクチンは好適にはH5N1を含みうる。
【００６４】
ある特定の集団は、一般に、パンデミックの状況下でインフルエンザに感染するリスクが高い。高齢者、慢性病患者および小児は特に感受性であるが、多くの若く見かけ上健康な人々も危険にさらされる。H2インフルエンザについては、1968年以降に生まれた集団の部分のリスクが高い。これらのグループをできるだけ早く、かつ簡単な方法で効果的に防護することが重要である。
【００６５】
リスクの高い他の集団は旅行者である。現在、以前にもまして多くの人々が旅行をし、新しいウイルスのほとんどが出現する地域である中国および東南アジアは、近年人気の旅行目的地となっている。この旅行パターンの変化は、新しいウイルスが数ヶ月または数年でなく、数週間で世界中に到達することを可能にする。
【００６６】
したがって、パンデミックの状況または潜在的パンデミックの状況で、これらの人々の集団をインフルエンザから防護するワクチン接種が特に必要である。好適なパンデミック株は、限定されるものでないが、H5N1、H9N2、H7N7、H2N2およびH1N1である。他のヒトにおけるパンデミック株はH7N3（カナダで報じられた2例）、H10N7（エジプトで報じられた2例）およびH5N2（日本で報じられた1例）である。
【００６７】
水中油型エマルジョンアジュバント
本発明のアジュバント組成物は、水中油型エマルジョンアジュバントを含有し、好適には、前記エマルジョンが代謝可能な油を全体積の0.5％〜20％の量で含み、その少なくとも70強度％は直径1μm未満である油滴を有する。
【００６８】
水中油型組成物の任意の油がヒトへの投与に好適であるためには、エマルジョン系の油相が、代謝可能な油を含む必要がある。代謝可能な油という用語の意味は、当技術分野で周知である。代謝可能とは、「代謝によって変換され得る」と定義することができる（Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition （1974)）。この油は、受給者にとって毒性がなく、代謝によって変換され得る任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であってよい。堅果、種子、および穀粒が植物油の一般的供給源である。合成油も本発明の一部分であり、これには市販の油、例えば、NEOBEE(登録商標)などが含まれる。特に好適な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン)は、サメ肝油に大量に、またオリーブ油、コムギ胚芽油、コメ糠油、および酵母に少量存在する不飽和油であり、本発明において使用するのが特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実に基づき、代謝可能な油である（Merck index, 10th Edition, entry no.8619）。
【００６９】
水中油型エマルジョンそれ自体は、当技術分野で周知であり、アジュバント組成物として有用であることが示唆されている（EP 399843、WO 95/17210）。
【００７０】
好適には、代謝可能な油は免疫原性組成物の全体積の0.5％〜20％の量（最終濃度）、好適には、全体積の1.0％〜10％の量、好適には、全体積の2.0％〜6.0％の量で存在する。
【００７１】
具体的な実施形態において、代謝可能な油は、免疫原性組成物の全体積の約 0.5％、1％、3.5％、または5％の最終量で存在する。他の具体的な実施形態において、代謝可能な油は、免疫原性組成物の全体積の0.5％、1％、3.57％、または5％の最終量で存在する。スクアレンの好適な量はワクチン1用量当たり約10.7mg、好適には、ワクチン1用量当たり10.4〜11.0mgである。
【００７２】
好適には、本発明の水中油型エマルジョン系は、サブミクロン範囲の小さな油滴サイズを有する。好適には、この液滴サイズは直径で120〜750nm、好適には、120〜600nmのサイズの範囲にある。典型的には、水中油型エマルジョンは、少なくとも70強度％が直径500nm未満であり、特に、少なくとも80強度％が直径300nm未満であり、好適には少なくとも90強度％が直径120〜200nmの範囲にある油滴を含有する。
【００７３】
本発明による油滴サイズ、すなわち直径は、強度によって表される。油滴の直径を強度によって測定する方法はいくつかある。強度は、好適にはMalvern Zetasizer 4000、または好適にはMalvern Zetasizer 3000HSなどの動的光散乱による粒度測定（sizing）計器によって測定される。詳細な手順は実施例II.2に示す。第1の可能な手法は、z平均直径（z average diameter）ZADを動的光散乱(PCS-光子相関分光法)により測定することである。この方法は追加的に多分散指数(polydispersity index)PDIを得て、ZADとPDIの両方をキュムラントアルゴリズムを用いて計算する。これらの値は、粒子屈折率の知見を必要としない。第2の手法は、全粒径分布を他のアルゴリズム、すなわち、ContinもしくはNNLS、または自動「Malvern」アルゴリズム(粒度測定計器に備わっているデフォルトアルゴリズム)のいずれかで測定することにより油滴の直径を計算する手法である。ほとんどの場合、複合組成物の粒子屈折率が不明であるため、強度分布のみ、また必要に応じて、この分布から導き出される強度平均を考察する。
【００７４】
本発明の水中油型エマルジョンはステロールまたはα-トコフェロールなどのトコフェロールを含む。ステロールは、当技術分野で周知であり、例えば、コレステロールが周知であり、例えば、Merck Index, 11th Edn., page 341で動物脂肪に存在する天然のステロールとして開示されている。他の好適なステロールには、β-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、およびエルゴカルシフェロールが含まれる。前記ステロールが、好適には、免疫原性組成物の全体積の0.01％〜20％(w/v)の量、好適には、0.1％〜5％(w/v)の量で存在する。好適には、ステロールがコレステロールである場合、これは、免疫原性組成物の全体積の0.02％〜0.2％(w/v)の量、典型的には、ワクチン用量0.5ml中0.02％(w/v)もしくはワクチン用量0.5ml中0.07％(w/v)、またはワクチン用量0.7ml中0.1％(w/v)の量で存在する。
【００７５】
好適には、α-トコフェロール、またはその誘導体、例えばコハク酸α-トコフェロールが存在する。好適には、α-トコフェロールは、免疫原性組成物の全体積の0.2％〜5.0％(v/v)の量、好適には、ワクチン用量0.5ml中2.5％(v/v)もしくはワクチン用量0.5ml中0.5％(v/v)、またはワクチン用量0.7ml中1.7〜1.9％(v/v)、好適には、1.8％の量で存在する。明確にするため付け加えると、v/vで示された濃度は、次の変換係数を適用することによりw/v濃度に変換することができる：5％(v/v)α-トコフェロール濃度は4.8％(w/v)のα-トコフェロール濃度と等価である。α-トコフェロールの好適な量はワクチン1用量当たり約11.9mg、好適には、ワクチン1用量当たり11.6〜12.2mgである。
【００７６】
水中油型エマルジョンは乳濁化剤を含む。乳濁化剤は、免疫原性組成物の0.01〜5.0重量％(w/w)の量、好適には、0.1〜2.0重量％(w/w)の量で存在してよい。好適な濃度は、全組成物の0.5〜1.5重量％(w/w)である。
【００７７】
乳濁化剤は、好適には、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(Tween80)でありうる。具体的な実施形態において、ワクチン用量0.5mlは1％(w/w)のTween80を含有し、ワクチン用量0.7mlは0.7％(w/w)のTween80含有する。別の具体的な実施形態において、Tween80の濃度は0.2％(w/w)である。他の具体的な実施形態において、Tween80の濃度は0.2％（w/w）である。ポリソルベート80の好適な量はワクチン1用量当たり約4.9mgであり、好適には、ワクチン1用量当たり4.6〜5.2mgである。
【００７８】
好適には、ワクチン用量はα-トコフェロールをワクチン1用量当たり約11.9mgの量で、スクアレンをワクチン1用量当たり約10.7mgの量で、およびポリソルベート 80をワクチン1用量当たり約4.9 mgの量で含む。
【００７９】
水中油型エマルジョンアジュバントは、他のアジュバントまたは免疫賦活剤と共に利用してもよく、したがって、本発明の重要な実施形態は、スクアレンまたは他の代謝可能な油、トコフェロール（例えばα-トコフェロール）、およびTween80を含む水中油型製剤である。水中油型エマルジョンは、span85および/またはレシチンを含有してもよい。典型的には、水中油型エマルジョンは、免疫原性組成物の全体積の2〜10％のスクアレン、2〜10％のα-トコフェロール、および0.3〜3％のTween80を含み、WO95/17210に記載の手順によって作製することができる。好適には、スクアレン：α-トコフェロールの比は1に等しいかまたは1未満である、それは、これがより安定なエマルジョンを提供するからである。Span85(トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)も、例えば1％のレベルで存在してよい。
【００８０】
本発明の初回ワクチン接種に使用する免疫原性組成物の免疫原性特性
本発明の一価インフルエンザ組成物は、アジュバント無添加の、すなわち、いかなる外来アジュバントも含有しない対応組成物（本明細書では「単味組成物」とも呼ぶ）によって得られるCD4 T細胞免疫応答と比較して、成分抗原の少なくとも1つまたは抗原組成物に対して、改善されたCD4 T細胞免疫応答を引き起こすことができる。具体的な実施形態において、前記改善されたCD4 T細胞免疫応答はパンデミックインフルエンザ株に対するものである。
【００８１】
「改善されたCD4 T細胞免疫応答」とは、本発明のアジュバント添加免疫原性組成物を投与した後に、アジュバント無添加の同じ組成物の投与後に得られる応答より高いCD4応答が、ヒト患者で得られることを意味する。例えば、インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と、代謝可能な油、トコフェロール（例えばα-トコフェロール）および乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバントとを、一緒に含む免疫原性組成物を投与することにより、アジュバント無添加のインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含む免疫原性組成物の投与後に誘導される応答と比較して、より高いCD4 T細胞応答がヒト患者で得られる。かかる製剤を有利に使用して、MHCクラスII分子により提示されるインフルエンザエピトープを検出できる抗インフルエンザCD4-T細胞応答を誘発しうる。
【００８２】
好適には、本発明に用いるアジュバント添加スプリットインフルエンザ組成物によって引き起こされる前記免疫学的応答は、サブユニットインフルエンザワクチンや全インフルエンザウイルスワクチンなどの、任意の他のアジュバント無添加の従来のインフルエンザワクチンによって引き起こされる免疫学的応答より高い。
【００８３】
特に、限定するものではないが、前記「改善されたCD4 T細胞免疫応答」は、免疫学的に初回刺激がなされてない患者において、すなわち前記インフルエンザウイルスもしくは抗原に対して血清陰性の患者においてもたらされる。この血清陰性は、前記患者が、かかるウイルスまたは抗原にこれまで遭遇したことがなく(いわゆる「ナイーブ」患者)、または、あるいは前記抗原に遭遇したときに応答できなかった結果でありうる。好適には、前記改善されたCD4 T細胞免疫応答は、免疫低下した患者、例えば高齢者（一般的には少なくとも50歳、典型的には65歳以上）もしくは高リスクの医学的症状を有する65歳未満の成人（「高リスク」成人）、または２歳未満の小児においてもたらされる。
【００８４】
改善されたCD4 T細胞免疫応答は、下記のサイトカインのいずれかを産生する細胞の数を測定することによって、評価することができる。
【００８５】
・少なくとも2種の異なるサイトカイン（CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα）を産生する細胞
・少なくともCD40Lおよび他のサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）を産生する細胞
・少なくともIL-2および他のサイトカイン（CD40L、TNFα、IFNγ）を産生する細胞
・少なくともIFNγおよび他のサイトカイン（IL-2、TNFα、CD40L）を産生する細胞
・少なくともTNFαおよび他のサイトカイン（IL-2、CD40L、IFNγ）を産生する細胞
上記サイトカインのいずれかを産生する細胞が、アジュバント添加組成物の投与後にアジュバント無添加組成物の投与と比べて、より多い場合、改善されたCD4 T細胞免疫応答があることになる。典型的には、上に挙げた5つの条件のうち、少なくとも1つ、好ましくは2つが満たされる。特別な実施形態において、4種のサイトカイン全てを産生する細胞は、アジュバント無添加グループと比較して、アジュバント添加グループにおけるより多く存在する。
【００８６】
具体的な実施形態において、改善されたCD4 T細胞免疫応答を本発明のアジュバント添加インフルエンザ組成物によって付与することができ、そして理想的には1用量の単一投与後に得ることができる。単一用量の手法は、例えば、急速に展開する発生状況において極めて好適である。ある特定の状況では、特に高齢者集団について、またはインフルエンザに対して初めてワクチン接種された若年の小児(9歳未満)の場合に、あるいはパンデミックの場合に、その季節に対する同じ組成物の2用量を投与することが有益でありうる。前記同じ組成物の第2用量（依然として「初回ワクチン接種用組成物」と見なされる）は、進行中の1次免疫応答中に投与してもよく、十分に間隔を置く。典型的には、組成物の第2用量は、第1用量の2〜3週間後または約1ヶ月後に、例えば2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間後に与えて、非応答性のまたは応答不十分な個人の免疫系を初回刺激するのを助ける。具体的な態様においては、原ワクチン接種（primo-vaccination）に続いて、異種インフルエンザ株を含有するアジュバント添加ワクチン産物の次のワクチン接種コースを行う。
【００８７】
具体的な実施形態において、前記免疫原性組成物の投与は、代わりにまたはさらに、アジュバント無添加組成物で免疫感作した個人で引き起こされる記憶B細胞応答と比較して、アジュバント添加免疫原性組成物を投与した患者において改善された記憶B細胞応答を引き起こす。改善された記憶B細胞応答とは、in vitro分化の刺激によって測定した、抗原との遭遇時に抗体分泌形質細胞に分化しうる末梢血Bリンパ球の頻度の増加を意味するものとする(実施例のセクション、例えばエリスポットB細胞記憶の方法を参照)。
【００８８】
そのうえ、さらなる具体的な実施形態において、アジュバント添加した初回ワクチン接種用の組成物によるワクチン接種は、CD8応答に対して測定可能な影響を及ぼさない。
【００８９】
好適には、水中油型エマルジョンアジュバント(特に、代謝可能な油、ステロールまたはトコフェロール（例えばα-トコフェロール）、および乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバント)を用いて製剤したインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含む、請求の範囲に記載の組成物は、免疫低下したヒト集団において、T細胞応答を促進するのに有効でありうる。好適には、本発明で記載した、初回ワクチン接種のために免疫原性組成物の単一用量を投与すると、インフルエンザに対するワクチン再接種後に、インフルエンザの防護相関要因によって評価される通り、アジュバント無添加インフルエンザワクチンを用いてワクチン接種を行うよりも優れた血清防護を提供できるであろう。請求の範囲に記載のアジュバント添加した製剤はまた、インフルエンザウイルスに対して、アジュバント無添加の製剤と比較して、改善されたCD4 T-細胞 免疫応答を誘発するであろう。この特性は、ワクチン接種またはインフルエンザ抗原曝露に対する感染時の反応性の増加に関連しうる。さらに、この特性はまた、交差反応性、すなわち、変種インフルエンザ株に対する高い応答能力にも関連しうる。この定性的におよび／または定量的に改善された応答は、パンデミックの場合に、全集団にとりわけ免疫能力の低下したヒト集団、例えば高齢者集団（65歳以上）および特に高リスク高齢者集団に有益でありうる。この特性はまた、乳幼児集団(5歳未満、好適には2歳未満)にも有益でありうる。この改善された応答は、例えば、パンデミック発生前または発生時に、ドリフト変種を含有する備蓄ワクチンによる初回刺激への利用に有益でありうる。これは、全体的な罹患率および死亡率を低下させることができ、肺炎およびその他のインフルエンザ様の病気の場合の緊急入院を防止することができる。さらに、アジュバント無添加製剤で引き起こされた応答と比較して、時間的にもっと持続する、例えば初回ワクチン接種の１年後に依然として存在するCD4 T細胞応答を誘発することを可能にする。
【００９０】
好適には、初回刺激していない被験者で得られる改善されたCD4 T細胞免疫応答のようなCD4 T細胞免疫応答は、交差反応性CD4 Tヘルパー応答の誘導に関わる。特に、交差反応性CD4 T細胞の量が増加する。「交差反応性」CD4応答とは、インフルエンザ株間で共有されるエピトープをCD4 T細胞が標的化することを意味する。
【００９１】
通常、利用可能なインフルエンザワクチンは、類似した抗原特性の赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスの感染株に対してのみ有効である。感染性（広まっている）インフルエンザウイルスが、表面糖タンパク質、特に赤血球凝集素に小さな変化（例えばアミノ酸の変化をもたらす点変異や点変異の蓄積など）を経た場合（抗原性ドリフト変種ウイルス株）、ワクチンは依然としていくらかの防護をもたらすことはできるが、新たに生成した変種は、従来のインフルエンザ感染またはワクチン接種により引き起こされる免疫性を逃れる可能性があるので、限定された防護しか提供し得ない。抗原のドリフトは、パンデミックの間期に生ずる例年の伝染病の原因となる（Wiley & Skehel, 1987,Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394）。交差反応性CD4 T細胞の誘発によって、本発明の組成物にさらなる利点がもたらされる、すなわち、交差防護、言い換えれば異種感染に対する防護、すなわち免疫原性組成物中に含有されるインフルエンザ株の変種（例えばドリフト）である広まっているインフルエンザ株によって引き起こされる感染に対する防護を提供しうる。これは、広まっている株を卵で増殖するのが難しい場合、または細胞培養物中で作製するのが難しい場合、ドリフト株の使用を実用的な代替案にできることから、有利でありうる。これは、被験者が初回ワクチン接種と第2のワクチン接種とを数ヶ月または1年離れて受け、かつ第2の免疫感作で使用する免疫原性組成物中のインフルエンザ株が、初回ワクチン接種で使用した組成物中の株のドリフト変種株である場合にも有利である。
【００９２】
本明細書に定義したアジュバント添加インフルエンザ免疫原性組成物は、したがって、ワクチン接種した高齢被験者において血清防護および交差反応性CD4 T細胞を誘導する、より高い能力を有する。この特徴は、上記免疫原性組成物中に存在する株の変種株に対して応答する能力が、より高いことに結びつけることができる。このことは、パンデミックの状況において重要な利点であることを証明しうる。例えば、H5、H2、H9、H7またはH6株のいずれかを含む一価インフルエンザ免疫原性組成物は、パンデミック変種株、すなわち前記パンデミック株のドリフト株に対する、より高い応答能力を、前記ドリフト株を用いたその後のワクチン接種時に、または前記ドリフト株による感染時に提供することができる。
【００９３】
インフルエンザワクチンによるワクチン接種後の、交差反応性CD4 T細胞の検出
古典的な三価インフルエンザワクチンの投与後（3週間）、ワクチン内に存在する抗原性株（H3N2:A/Panama/2007/99、H1N1:A/New Caledonia/20/99、B:B/Shangdong/7/97）と同種である抗原性株調製物（全ウイルスまたはスプリット抗原）に応答する末梢血CD4 T細胞の頻度に実質的な増加が見られる（実施例III参照）。ドリフト株として分類されたインフルエンザ株（H3N2:A/Sydney/5/97、H1N1:A/Beijing/262/95、B:B/Yamanashi/166/98）を用いて末梢血CD4 T細胞を再刺激すれば、同程度の頻度の増加が認められる。
【００９４】
対照的に、末梢血CD4 T細胞が、この分野の専門家によってシフト株として分類されるインフルエンザ株(H2N2:A/Singapore/1/57、H9N2:A/Hongkong/1073/99)により再刺激を受ければ、ワクチン接種後に観察可能な増加はない。
【００９５】
同種とドリフトインフルエンザ株の両方を認識できるCD4 T細胞を、本発明の文書では「交差反応性」と呼ぶ。本明細書に記載のアジュバント添加インフルエンザ組成物は、ドリフトインフルエンザ株に対する観察可能な交差反応性が存在することから、異種亜型の交差反応性を示す能力を有する。上に記載のとおり、パンデミック株ワクチン製剤がドリフトパンデミック株に対して有効であるという能力は、パンデミックの場合に重要な特性であることを証明しうる。
【００９６】
上記観察と合致して、異なるインフルエンザ株により共有されるCD4 T細胞エピトープはヒトにおいて確認されている（Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22；Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90； Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506）。
【００９７】
その免疫原性特性によって、請求範囲に記載の組成物は、パンデミック発生に対してより優れた準備をするための、パンデミック前のワクチンの備蓄を含むヒトインフルエンザパンデミックの脅威に対する前向きなワクチン接種戦略を確立できるであろう。
【００９８】
具体的には、パンデミック前ワクチンは、例えば、逆行遺伝を利用して、鳥類集団で現在広まっている株に類似したH5N1（鳥類インフルエンザ）の株を用いて作製されたワクチンである。パンデミック前ワクチンに反応して発生する免疫は、免疫系が待機して「初回刺激される」または「教育される」ことを可能にし、それにより、実際にパンデミックウイルス株が現れた後に、より迅速な防護免疫応答の発生を可能にし、関係するインフルエンザパンデミック株に対する感受性を低下させる。WHOがパンデミックを宣言しかつ最終的なパンデミック株が同定され（それがドリフト株であっても）、パンデミックワクチンが利用可能になる時には、パンデミック前ワクチンも、そのパンデミックワクチンに対する、より迅速な免疫応答を可能にするであろう。
【００９９】
具体的な実施形態において、アジュバント添加組成物は、現在利用可能なワクチンが効力も持たない赤血球凝集素における大きな変化（例えば、2つの異なる種の間での、遺伝子組換えなど）を経た（抗原シフト）広まっている株に対して、より良好な防護を提供するというさらなる利益をもたらしうる。
【０１００】
その他のアジュバント
上記組成物は、追加のアジュバント、特にTRL-4リガンドアジュバント、好適には、リピドAの無毒性誘導体を含みうる。好適なTRL-4リガンドは3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）である。他の好適なTLR-4リガンドはリポ多糖（LPS）およびその誘導体、MDP（ムラミルジペプチド）およびRSVのFプロテインである。
【０１０１】
一実施形態において、上記組成物はさらに、Toll様受容体（TLR）4リガンド、例えばリピドAの非毒性誘導体、特にモノホスホリルリピドAまたはさらに特に3-脱アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）を含みうる。
【０１０２】
3D-MPLは、商標MPL（登録商標）の下でCorixa corporation、現在はGSKにより販売されており（本明細書中ではMPLと呼ぶ）、IFN-γ（Th1）表現型によるCD4+T細胞応答を主に促進する。3D-MPLは、GB 2220211Aで開示されている方法によって作製することができる。化学的には、これは、3、4、5、または6個のアシル化鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。特に、本発明の組成物においては、微粒子3D-MPLを使用する。微粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌濾過できる粒径を有する。かかる調製物は、WO 94/21292および実施例IIに記載されている。
【０１０３】
3D-MPLは、例えば、組成物1用量当たり1〜100μg(w/v)の量、好適には、組成物1用量当たり10〜50μg(w/v)の量で使用することができる。3D-MPLの好適な量は、例えば、組成物1用量当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50μg（w/v）のいずれかである。好適には、3D-MPLの量は、組成物1用量当たり25〜75μg（w/v）の範囲にある。通常、組成物1用量は、約0.5ml〜約1mlの範囲にある。典型的なワクチン1用量は、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、または1mlである。好適な実施形態においては、ワクチン組成物1ml当たり50μg、またはワクチン用量0.5ml当たり25μgの最終濃度の3D-MPLが含まれる。他の好適な実施形態において、ワクチン組成物1ml当たり35.7μgまたは71.4μgの最終濃度の3D-MPLが含まれる。具体的には、ワクチン用量体積0.5mlは、1用量当たり25μgまたは50μgの3D-MPLを含有する。
【０１０４】
MPLの用量は、好適には、ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強しうる用量である。特に、好適な量のMPLとは、アジュバント無添加組成物と比較して、または他の量のMPLを用いてアジュバント添加された組成物と比較して、その組成物の免疫学的潜在力を改善し、なおかつ反応原性プロファイルの観点からも許容可能な量である。
【０１０５】
リピドAの合成誘導体は公知であり、いくつかはTLR-4アゴニストと記述され、限定するものではないが下記の誘導体を含む：
OM174
(2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルジハイドロジェンホスフェート)、(WO 95/14026)
OM 294 DP
(3S,9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(ジハイドロジェンホスフェート)(WO 99/64301およびWO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP
(3S,9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジハイドロジェンホスフェート10-(6-アミノヘキサノエート)(WO 01/46127)
その他の好適なTLR-4リガンドは、例えば、リポ多糖およびその誘導体、ムラミルジペプチド（MDP）、または呼吸器合胞体ウイルスのFプロテインである。
【０１０６】
本発明で使用される、他の好適な免疫刺激物質は、Quil Aおよびその誘導体である。Quil Aは、南アフリカの木であるキラジャサポナリアモリナ（Quilaja Saponaria Molina）から分離されたサポニン調製物であり、最初にDalsgaardらによって1974年にアジュバント活性を有することが記述された（"Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243-254）。Quil Aの精製断片がHPLCにより分離されているが、これはQuil Aに関連した毒性を有することなくアジュバント活性を保持しており（EP 0362278）、例えばQS7およびQS21である（QA7およびQA21としても知られる）。QS-21は、キラジャサポナリアモリナの樹皮に由来する天然のサポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞（CTL）、Th1細胞、および支配的なIgG2a抗体応答を誘発するものであり、本発明の文脈における好適なサポニンである。
【０１０７】
特に好適であるQS21の特定の製剤が記述されており、これらの製剤はさらに、ステロールを含む（WO 96/33739）。本発明の一部を形成するサポニンは、水中油型エマルジョンの形態をとることができる（WO 95/17210）。
【０１０８】
再ワクチン接種および再ワクチン接種に使用する組成物 （追加免疫組成物）
本発明の一態様は、以前に、本請求範囲に記載の一価インフルエンザ組成物を用いて、または本明細書に定義した水中油型エマルジョンアジュバントと共に製剤化した変種インフルエンザ株を含む前記一価インフルエンザ組成物を用いてワクチン接種されたヒトの再ワクチン接種用のインフルエンザ免疫原性組成物の製造における、インフルエンザ抗原の使用を提供する。
【０１０９】
典型的には再ワクチン接種は初回ワクチン接種から少なくとも6ヶ月後、好適には8〜14ヶ月後、より好適には約10〜12ヶ月後に行われる。
【０１１０】
再ワクチン接種用の免疫原性組成物（追加免疫組成物）は、不活化であれ、遺伝子組換えであれ、弱毒生ワクチンであれ、いずれの種類の抗原調製物も含むことができる。該組成物は、初回ワクチン接種に使用された免疫原性組成物と同じ種類の抗原調製物、すなわちスプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、全ビリオン、精製HAおよびNA （サブユニット）ワクチンまたはビロソーム、を含有することができる。あるいはまた、追加免疫組成物は、初回ワクチン接種に使用されたものとは別の種類のインフルエンザ抗原、すなわちスプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、全ビリオン、精製HAおよびNA（サブユニット）ワクチンまたはビロソームを含有することができる。好適には、スプリットウイルスまたは全ビリオンワクチンが使用される。
【０１１１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、以前に、本請求範囲に記載の一価のパンデミック免疫原性組成物を用いてワクチン接種されたヒトの再ワクチン接種用の免疫原性組成物の製造におけるインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物の使用を提供する。
【０１１２】
追加免疫組成物は、アジュバントが添加されてもよく、またはアジュバント無添加であってもよい。一実施形態において、再ワクチン接種用の組成物はアジュバント無添加であり、そして適当なインフルエンザシーズンのWHO推奨株、例えばFluarix（登録商標）/α-Rix（登録商標）/Influsplit（登録商標）から調製される3種の不活化スプリットビリオン抗原を含有する古典的インフルエンザワクチンを筋肉内に注射する。
【０１１３】
他の実施形態において、再ワクチン接種用の組成物はアジュバントが添加される。好適には、追加免疫組成物は、水中油型エマルジョンアジュバント、特に代謝可能な油、ステロールまたはトコフェロール（例えば、α-トコフェロール）および乳濁化剤を含んでなる水中油型エマルジョンアジュバントを含む。具体的には、前記水中油型エマルジョンアジュバントは、全体積の0.5％〜20％の量で少なくとも1種の代謝可能な油を含み、かつ油滴を有し、その油滴の少なくとも70強度％は直径が1μm未満である。あるいは、追加免疫組成物は、ミョウバンアジュバント、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムのどちらかまたは両方の混合物を含む。
【０１１４】
一実施形態において、初回ワクチン接種は本明細書に定義したパンデミックインフルエンザ組成物、好適には、スプリットインフルエンザ組成物を用いて行い、再ワクチン接種は次の通り行う。
【０１１５】
具体的な実施形態において、ワクチン再接種のための免疫原性組成物は、初回ワクチン接種で使用したインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と共通CD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含有する。共通CD4 T細胞エピトープとは、同じCD4細胞により認識されうる異なる抗原からのペプチド／配列／エピトープを意味するものとする(Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22； Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90； Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506に記載されているエピトープの例を参照されたい)。
【０１１６】
本発明による一実施形態において、追加免疫組成物は、パンデミックに関与しているまたはパンデミックに関与する可能性があるインフルエンザ株を含む一価インフルエンザ組成物である。好適な株は、限定するものではないが、H5N1、H9N2、H7N7、H2N2およびH1N1である。前記株は、初回ワクチン接種に使用された組成物中に存在する株と同じ、またはそのうちの1種と同じでありうる。代わりの実施形態において、前記株は、変種株、すなわち初回ワクチン接種に使用された組成物中に存在する株のドリフト株でありうる。
【０１１７】
他の具体的な実施形態においては、再ワクチン接種用の組成物は多価インフルエンザワクチンである。特に、追加免疫組成物が、二価、三価または四価ワクチンのような多価ワクチンであるときには、少なくとも1種の株はパンデミックに関与しているまたはパンデミックに関与する可能性がある。ある具体的な実施形態においては、追加免疫組成物中の2種以上の株がパンデミック株である。他の具体的な実施形態においては、追加免疫組成物中の前記少なくとも1種のパンデミック株は、初回ワクチン接種に使用された組成物中に存在する株と同種またはそれらのうちの1種と同種である。代わりの実施形態においては、少なくとも1種の株は、初回ワクチン接種に使用された組成物中に存在する少なくとも1種のパンデミック株の変種株、すなわちドリフト株でありうる。
【０１１８】
したがって、本発明の他の態様においては、第1のパンデミックインフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物の使用であって、前記第1のインフルエンザ株由来の変種であるインフルエンザ株により引き起こされるインフルエンザ感染症に対する防護のための本明細書に定義した免疫原性組成物の製造における前記使用を提供する。
【０１１９】
したがって、本発明の他の態様において、
(a)第1のインフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物、および
(b)本明細書に定義される水中油型エマルジョンアジュバント
の使用であって、前記第1のインフルエンザ株由来の変種であるインフルエンザ株により引き起こされるインフルエンザ感染症に対する防護のための免疫原性組成物の製造における前記使用を提供する。
【０１２０】
再ワクチン接種用の組成物は、アジュバントを添加してもしなくてもよい。
【０１２１】
典型的には追加免疫組成物を使用する場合は、それを次のインフルエンザシーズン、例えば初回の免疫原性組成物投与のほぼ１年後に与える。追加免疫組成物はまた、その後、毎年与えることもできる(第３ワクチン接種、第４ワクチン接種、第５ワクチン接種など)。追加免疫組成物は、初回ワクチン接種に使用された組成物と同じであってもよい。好適には、追加免疫組成物は、初回ワクチン接種に使用されたインフルエンザウイルスの変種株であるインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含有する。特に、インフルエンザウイルス株またはその抗原調製物は、それらが再ワクチン接種の年に広まっているインフルエンザ株に適合するように、世界保健機関により配布される参考資料に従って選択される。好適には、 初回ワクチン接種はパンデミックの宣言時に行われ、再ワクチン接種はその後に行われる。好適には、再ワクチン接種は、初回ワクチン接種用に使用されたのと同じ亜型（例えば、H5N1 Vietnam）であるインフルエンザ株（例えば、H5N1 Vietnam）を含むワクチンを用いて行う。具体的な実施形態においては、再ワクチン接種は同じ亜型、例えば、H5N1 Indonesiaのドリフト株を用いて行われる。他の実施形態においては、再ワクチン接種に使用されるインフルエンザ株はシフト株である、すなわち、初回ワクチン接種に使用されたものとは異なる、例えば、それは異なるHAまたはNA亜型、例えばH5N2（H5N1と同じHA亜型であるが異なるNA亜型である）またはH7N1（H5N1と異なるHA亜型であるが同じNA亜型である）を有する。
【０１２２】
ワクチン再接種で使用されるインフルエンザ抗原または抗原組成物は、好適には上述のように、アジュバントまたは水中油型エマルジョンを含み、好適には先に記載の通りである。アジュバントは、本明細書で既に述べたような水中油型エマルジョンアジュバントであってもよく、それが好適であり、場合により3D-MPLのようなTRL-4リガンドもしくはサポニンなどの追加のアジュバントを含有してもよく、または、例えばミョウバンもしくはポリホスファゼンのようなミョウバン誘導体などの他の好適なアジュバントでもあってもよい。
【０１２３】
好適には、ワクチン再接種は、アジュバント無添加インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を用いて初回ワクチン接種した後に引き起こされる相当する応答と比較して、下記事項のいずれか１つ、好適には、2つ、または全てを引き起こす：(i)インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物に対する改善されたCD4応答、あるいは(ii)改善されたB細胞記憶応答、あるいは(iii)改善された液性応答。好適には、本明細書で定義された、アジュバント添加インフルエンザウイルスまたはその抗原調製物によるワクチン再接種後に引き起こされる免疫応答は、アジュバント無添加組成物によるワクチン再接種後に引き起こされた相当する応答よりも高い。好適には、アジュバント無添加の、好適にはスプリットの、インフルエンザウイルスによるワクチン再接種後に引き起こされる免疫学的応答は、アジュバント添加された、好適にはスプリットの、インフルエンザ組成物で初回ワクチン接種された集団において、アジュバント無添加の、好適にはスプリットの、インフルエンザ組成物で初回ワクチン接種された集団における対応する応答よりも高い。
【０１２４】
本発明による一態様において、上記に定義した、インフルエンザウイルスと、代謝可能な油、ステロールまたはトコフェロール（例えばα-トコフェロール）および乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバントとを含んでなる追加免疫組成物を用いた被験体の再ワクチン接種は、アジュバント無添加組成物を用いて初回ワクチン接種され、アジュバント無添加組成物を用いて追加免疫された人の集団における対応する抗体力価よりも高い抗体力価を示しうる。再ワクチン接種における抗体応答を増強するというアジュバントの作用は、インフルエンザウイルスによるワクチン接種または感染に対する応答が低いことが知られている高齢者集団において、特に重要である。特に、アジュバント添加組成物に伴う利点はまた、再ワクチン接種後のCD4 T細胞応答の改善という点においても際立つであろう。
【０１２５】
本発明のアジュバント添加組成物は、対照ワクチンにより付与される防護と比較して、ドリフト株（次のインフルエンザシーズン由来のインフルエンザ株）に対してよりよい交差応答性を誘発する能力を有しうる。前記交差応答性は、アジュバント無添加配合物により得られる応答性と比較して高い持続性を示した。アジュバントのドリフト株に対する交差応答性の増強作用は、パンデミック状況において重要である。
【０１２６】
さらなる実施形態において、本発明は、初回ワクチン接種を、潜在的にパンデミックを引き起こしうる少なくとも1種のインフルエンザ株を含有するインフルエンザ組成物、好ましくはスプリットインフルエンザ組成物を用いて行い、かつ再ワクチン接種を、少なくとも1種の広まっている株（パンデミック株または従来株のいずれか）を含む、一価もしくは多価のいずれかの組成物を用いて行うことを特徴とする、ワクチン接種レジメンに関する。
【０１２７】
HAのCD4エピトープ
この抗原ドリフトは、主にウイルス表面タンパク質赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)のエピトープ領域に存在する。宿主免疫系の適応反応を避けるためにウイルスが用いる、異なるインフルエンザ株の間でのCD4およびB細胞エピトープの何らかの差が、インフルエンザワクチン接種で主要な役割を果たしうることが知られている。
【０１２８】
異なるインフルエンザ株によって共有されるCD4 T細胞エピトープは、ヒトにおいて同定されている(例えば、Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22； Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90；およびGelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506を参照)。
【０１２９】
具体的な実施形態において、ワクチン再接種は、初回ワクチン接種に使われたインフルエンザウイルス抗原、またはその抗原調製物と共通CD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含む追加免疫組成物を用いて行われる。したがって、本発明は、複数用量ワクチンの初回ワクチン接種成分の製造における、パンデミックインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物と、水中油型エマルジョンアジュバント、特に代謝可能な油、ステロール、トコフェロール（例えばα-トコフェロール）および乳濁化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバントとを含んでなる免疫原性組成物の使用に関するものであって、前記複数用量ワクチンはさらに、追加免疫用量として、初回ワクチン接種時に与える用量中のパンデミックインフルエンザウイルス抗原またはそのウイルス抗原調製物と共通CD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスまたはその抗原調製物を含んでなる。
【０１３０】
ワクチン接種方法
本発明の組成物は、皮内、粘膜、例えば鼻腔内、経口、筋肉内または皮下など、いずれかの適当な送達経路で投与することができる。他の送達経路は当技術分野において公知である。
【０１３１】
筋肉内送達経路は特にアジュバント添加したインフルエンザ組成物用に好適である。本発明による組成物は、1用量容器、または場合によっては、特にパンデミックワクチン用に好適である複数用量容器に入れて提供しうる。この場合、チメロサールなどの抗菌保存剤が典型的には存在して使用中の汚染を防止する。5μg/0.5ml用量（すなわち、10μg/ml）または10μg/0.5ml用量（すなわち、20μg/ml）のチメロサール濃度が好適である。好適なIM送達デバイスは、無針液ジェット式注入デバイス、例えばBiojector 2000 （Bioject、Portland、OR）などを使用しうる。あるいは、エピネフリンの自宅での送達用に用いられるような、ワクチンの自己投与を可能にするペン注射器デバイスを使用しうる。かかる送達デバイスは、特に、パンデミック中に必要とされうる大規模免疫化キャンペーンに受け入れられよう。
【０１３２】
皮内送達が他の適当な経路である。皮内送達のためにいずれかの好適なデバイスを使用することができ、例えば、短い針デバイス、例えばUS 4,886,499、US 5,190,521、US 5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662に記載されているものがある。皮内ワクチンは、皮膚への針の有効貫入長を制限するデバイス、例えば参照により本明細書に組み込まれているWO 99/34850およびEP 1092444に記載されているもの、およびその機能等価物によって投与することもできる。液体ジェット注射器を介してまたは角質層を貫通して真皮に到達するジェットを起こさせる針を介して液体ワクチンを真皮に送達するジェット式注射デバイスも好適である。ジェット注射デバイスは、例えばUS 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705およびWO 97/13537に記載されている。粉状のワクチンを加速させて皮膚外層を通し真皮へ到達させるために圧縮ガスを使う、バリスティック粉体/粒子送達デバイスも好適である。さらに、従来の注射器を、皮内投与の古典的マントゥー法で使うこともできる。
【０１３３】
他の適当な投与経路は、皮下経路である。皮下送達のためにいかなる適当なデバイスでも、例えば古典的な針も使うことができる。 好適には、無針ジェット式注射器方式が使われ、例えば、WO 01/05453、WO 01/05452、WO 01/05451、WO 01/32243、WO 01/41840、WO 01/41839、WO 01/47585、WO 01/56637、WO 01/58512、WO 01/64269、WO 01/78810、WO 01/91835、WO 01/97884、WO 02/09796、WO 02/34317で公開されている。好適には、前記デバイスに液体ワクチン製剤が予め充填されている。
【０１３４】
あるいは、ワクチンは鼻腔内に投与される。典型的には、ワクチンは、好適には、肺に吸入されることなく、鼻咽頭の領域に局所投与される。肺に全くまたは実質的に入らないように、ワクチン製剤を鼻咽頭の領域に送達する鼻腔内送達デバイスを使うことが望ましい。
【０１３５】
本発明によるワクチンの鼻腔内投与のための好適なデバイスは、噴霧デバイスである。市販の好適な鼻内噴霧デバイスとしては、Accuspray(商標)(Becton Dickinson)がある。ネブライザーは非常に微細な噴霧を生成し、肺中に容易に吸入され、それ故に鼻粘膜に有効に到達しない。したがって、ネブライザーは好ましくない。
【０１３６】
鼻腔内の使用のための好ましい噴霧デバイスは、デバイスの性能が使用者の加える圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは、圧力閾デバイスとして知られる。閾値圧を加えたときだけ、液体はノズルから放出される。これらのデバイスは、一定の液滴サイズを有する噴霧の達成をより簡単にする。本発明での使用に好適な圧力閾デバイスは当技術分野で公知であり、例えば、本明細書で参照により組み込まれているWO 91/13281およびEP 311 863 BおよびEP 516 636に記載されている。かかるデバイスはPfeiffer GmbHから市販され、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999にも記載されている。
【０１３７】
好適な鼻腔内デバイスは、1〜200μm、好適には、10〜120μmの範囲の液滴（液体として水を使って測定）を生成する。10μm以下では吸入のリスクがあるので、10μm以下の液滴は約5％以下であることが望ましい。120μmより大きい液滴はそれより小さな液滴のように都合よく拡散しないので、120μmを上回る液滴は約5％以下であることが望ましい。
【０１３８】
二用量送達は、本発明によるワクチンで使用するための鼻腔内送達系のさらなる好適な機構である。二用量デバイスは、単一ワクチン用量の2サブ用量を含有し、1サブ用量をそれぞれの鼻孔へ投与する。一般に、2サブ用量が単一チャンバー内に存在し、デバイスの構造によって一度に単一サブ用量の効率的送達が可能になる。代わりに、本発明によるワクチンを投与するために、単用量デバイスを使ってもよい。
【０１３９】
代わりに、本発明では表皮または経皮のワクチン接種経路も意図している。
【０１４０】
本発明の一態様においては、初回投与のためのアジュバント添加免疫原性組成物を筋肉内投与してもよく、追加免疫組成物をアジュバント添加の有無にかかわらず異なる経路により、例えば皮内、皮下または鼻腔内に投与してもよい。具体的な実施形態においては、初回投与用の組成物はパンデミックインフルエンザ株については15μg未満のHA量を含有し、追加免疫組成物は15μgの標準量または、好適には、小量、すなわち15μg未満のHAを含有してもよく、これらの量は、投与経路によっては、より少ない量で与えてもよい
ワクチン接種をする集団
ワクチン接種をする標的集団は、全集団、例えば、健康な成人（例えば、18〜60歳）、高齢者（典型的には60歳超）または乳幼児／小児である。標的集団は、特に免疫低下した集団であってもよい。免疫低下したヒトは、一般に健康な成人と比較して、抗原に、特にインフルエンザ抗原に上手く反応することができない。
【０１４１】
本発明の一態様において、標的集団はインフルエンザに対して初回刺激されてない集団であり、ナイーブであるか(例えばパンデミック株に対して)、または以前にインフルエンザ感染またはワクチン接種に応答できなかった集団である。好適には、標的集団は、高齢者（好適には少なくとも60歳、または65歳以上）、より若い高リスクの成人（すなわち18歳〜60歳）、例えば保健機関労働者、または心血管および肺の疾患もしくは糖尿病などの危険因子を有する若年成人である。他の標的集団は、年齢が6月齢以上の全ての小児、特にインフルエンザ関連の入院率が比較的高い6〜23月齢の小児である。
【０１４２】
ワクチン接種レジメン、投薬および効力判定基準
好適には本発明による免疫原性組成物は、ほとんどの場合、標準0.5mlの注射可能な用量であり、一元放射免疫拡散法（SRD）により測定して、パンデミックインフルエンザ株由来の赤血球凝集素抗原成分の15μg未満を含む（J.M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247；J. M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330）。好適には、ワクチン用量は0.5mlから1mlの間であり、特に標準0.5mlまたは0.7mlワクチン用量である。通常、用量は元のバルク試料中のHA濃度に応じておよび送達経路に応じて（鼻腔内または皮内経路はより少ない用量を与える）若干調節される。
【０１４３】
好適には、前記免疫原性組成物は、低用量のHA抗原を、例えば1インフルエンザ株当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14μgのいずれかのHA、または1株当たり15μg以下のHAを含む。前記低用量のHA量は、その量が以下に詳述した効力に対する国際的、例えば、EUまたはFDA判定基準に適合するワクチンの製剤を可能にすることを条件として、実用的に実現しうるだけ低くてよい（表1および先に記載した具体的なパラメーターを参照）。HAの好適な低用量は、1インフルエンザ株当たり1〜7.5μgのHA、好適には1インフルエンザ株当たり3.5〜5μg、例えば3.75μgまたは3.8μgのHAであり、典型的には1インフルエンザ株当たり約5μgのHAである。その他のHAの好適な用量は1インフルエンザ株当たり0.1〜5μgのHA、好適には1インフルエンザ株当たり1.0〜2μg、例えば1.9μgのHAである。
【０１４４】
有利には、本発明によるワクチンの用量、特に低HA用量ワクチンは、一般に1用量につき約0.5、0.7または1mlである従来の注射式スプリットインフルエンザワクチンよりも、少ない体積で提供することができる。本発明による低体積用量は、1用量当たり、好適には500μl未満、典型的には300μl未満、好適には約200μl以下である。
【０１４５】
したがって、本発明の一態様による好適な低体積ワクチン用量は、低体積中に低抗原用量、例えば約200μlの体積中に約15μgもしくは約7.5μgのHAまたは約3.0μgのHA(1株当たり)を有する用量である。
【０１４６】
本発明のインフルエンザ医薬品は、好適には、ワクチンに対するある特定の国際判定基準に適合する。インフルエンザワクチンの効力を測定するための標準が国際的に応用されている。血清学的変数は、インフルエンザワクチンの年度認可手順に関係する、臨床試験のためのヒト用医薬品評価欧州機関（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products for human use）の判定基準により評価した（CHMP/BWP/214/96, Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for harmonization of requirements for influenza vaccines（インフルエンザワクチンに対する要件の調和についての注釈）, 1997. CHMP/BWP/214/96 circular No. 96-0666:1-22）（表1）。要件は、成人の集団(18〜60歳)および高齢者集団(＞60歳)で異なる（表1）。パンデミックの間期のインフルエンザワクチンについては、評価（セロコンバージョン係数、セロコンバージョン率、血清防護率）の少なくとも1つが、ワクチンに含まれるインフルエンザの全ての株に対して欧州要件に適合しなければならない。1：40以上の力価の比率が最も妥当であるとみなされる、何故ならば、これらの力価は最良の防護相関要因であると予想されるからである［Beyer W et al. 1998. Clin Drug Invest.;15:1-12］。
【０１４７】
「Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorisation application（パンデミックインフルエンザワクチンのマーケティング認可出願に関する文書の構成と内容のガイドライン）（CHMP/VEG/4717/03、2004年4月5日）」に記載されているように、広まっていない株由来のインフルエンザワクチンに対する判定基準が存在しない中で、パンデミック候補ワクチンは、2用量のワクチン投与後に、初回刺激を受けてない成人または高齢被験者において現存ワクチンに対する現行標準セットの、好適には、3つ全てに適合するのに十分な免疫応答を（少なくとも）惹起すべきであると予想されている。
【０１４８】
本発明の組成物は、組成物中に含まれる、好適には、少なくとも1つのパンデミック株に対するかかる判定基準（1つの判定基準が認可を得るのに十分である）、好適には、少なくとも2つの、または典型的には少なくとも3つ全ての表1に掲げた防護に対する判定基準に適合する。
【表１】
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【０１４９】
*セロコンバージョン率は、各グループにおける防護性のワクチン接種後力価≧1：40を有する被験者の比率として定義される。単純におかれたセロコンバージョン率は、ワクチン接種前に＜1:10およびワクチン接種後に≧1：40のHI力価を有する被験者の％である。しかし、もし初期力価が≧1：10であれば、その時には、ワクチン接種後の抗体の量が少なくとも4倍増加である必要がある。
【０１５０】
**コンバージョン係数は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清HI幾何平均力価（GMT）の倍数増加として定義される。
【０１５１】
***防護率は、ワクチン接種前に血清陰性であってワクチン接種後に≧1：40の（防護性）HI力価を有するか、またはワクチン接種前に血清陽性であってワクチン接種後に力価の有意な4倍増加を有する被験者の比率として定義される：これは通常、防護を示すものとして容認されている。
【０１５２】
70％血清防護率は欧州保健規制機関（European health regulatory authority）（CHMP：Committee for Medicinal Products for Human Use）が定義した年度季節性インフルエンザワクチンに適合するために通常要求される3つの判定基準の1つであり、かつCHMPがパンデミック候補ワクチンも適合することを期待しているものである。しかし、数学モデルは、ある特定のドリフト株に対して30％しか有効でないワクチンも、パンデミックの大きさを減じる助けになりうることを示している（Ferguson et al、Nature 2006）。
【０１５３】
FDAは、パンデミックインフルエンザワクチンの実施権を支持するために必要な臨床データに関する草案ガイダンスを公開していて（the Office of Communication、Training and Manufacturers Assistance （HFM-40）、1401 Rockville Pike、Suite 200N、Rockville、MD 20852-1448から、または電話1-800-835-4709 または 301-827-1800により、またはインターネットhttp：//www.fda.gov/cber/guidelines.htmから入手可能である）、その提案された判定基準もCHMP 判定基準に基づいている。適当な終点には同様に次が含まれる：1）HI抗体力価≧1：40を達成する被験者の％、および 2）ワクチン接種後におけるHI 抗体力価の4倍上昇として定義されるセロコンバージョン率。幾何平均力価（GMT）が結果に含まれなければならない。これらのデータおよびこれらの評価の点見積値の95％信頼区間（CI）が提供されなければならない。
【０１５４】
従って、本発明の一態様においては、考えられるパンデミック組成物の投与により誘発される前記免疫応答または防護が全て3つのインフルエンザワクチン効力に対するEU規制判定基準に適合するものである、本請求の範囲に記載の組成物、方法または使用が提供される。好適には、次の判定基準の少なくとも1つ、好適には、2つ、または3つが本組成物のパンデミック株に適合する：
・成人集団（18〜60歳）において、および／または、好適には高齢者集団（＞60歳）においても、＞50％の、＞60％の、＞70％の、好適には＞80％の、また＞90％のセロコンバージョン率；
・成人集団（18〜60歳）において、および／または、好適には高齢者集団（＞60歳）においても、＞75％、＞80％、＞85％、好適には、＞90％の防護率；
・成人集団（18〜60歳）において、および／または、好適には高齢者集団（＞60歳）においても、＞4.0の、＞5.0の、＞6.0の、＞7.0の、＞8.0の、＞9.0の、または10の、または10を超えるコンバージョン係数。
【０１５５】
具体的な実施形態において、本発明による組成物は、成人集団において＞60％、または＞70％、または好適には、＞80％のセロコンバージョン率と＞75％、好適には、＞80％の防護率の両方に適合しうる。他の具体的な実施形態において、本発明による組成物は、成人集団において＞5.0、または＞7.0または好適には、＞10.0のコンバージョン係数と＞60％、または＞70％、または好適には、＞80％のセロコンバージョン率の両方に適合しうる。他の具体的な実施形態において、本発明による組成物は、成人集団において＞5.0、または＞7.0または好適には、＞10.0のコンバージョン係数と＞75％、好適には、＞80％の防護率の両方に適合しうる。さらに他の具体的な実施形態において、本発明による組成物は、10.0以上のコンバージョン係数、80％以上のセロコンバージョン率、および80％以上の防護率の全てに適合しうる。
【０１５６】
他の実施形態においては、請求の範囲に記載のワクチンはドリフト株に対して少なくとも30％の、好適には、ドリフト株に対して少なくとも  40％、または ＞50％ または ＞60％の血清防護率に適合しうる。好適には、その血清防護率はドリフト株に対して＞70％、または好適には、＞80％でありうる。
【０１５７】
好適には、かかる判定基準のいずれかまたは全てはまた、例えば、小児およびいずれかの免疫低下した集団などの他の集団についても適合する。
【０１５８】
好適には、上記応答は1用量後にまたは典型的には2用量後に得られる。免疫応答がたった1用量のアジュバント添加したワクチン投与後に得られることが、請求の範囲に記載の組成物の特別な利点である。従って、本発明の一態様においては、インフルエンザに対する1用量ワクチン接種用のワクチン組成物の製造における、非生（non-live）パンデミックインフルエンザウイルス抗原調製物、特にスプリット インフルエンザ ウイルス調製物の使用であって、その1用量ワクチン接種がインフルエンザワクチンに対する少なくとも1つの、好適には、2つまたは3つの国際規制要件に適合する免疫応答を産生することを特徴とする前記使用が提供される。他の特別な実施形態において、前記1用量ワクチン接種はまた、さらに、アジュバント無添加ワクチンを用いて得られるより高いCD4 T細胞免疫応答および／またはB細胞記憶応答も産生する。特別な実施形態において、前記免疫応答は交差反応性抗体応答、または交差反応性CD4 T細胞応答、またはそれらの両方である。具体的な実施形態において、そのヒト患者はワクチン接種株に対して免疫学的にナイーブである（すなわち、予め免疫が存在しない）。具体的に、そのワクチン組成物は小量のHA抗原を含有する。具体的に、ワクチン組成物は本明細書に定義した通りである。特にワクチン組成物の免疫原性特性は本明細書に定義した通りである。好適には、ワクチンは筋肉内に投与される。
【０１５９】
再ワクチン接種用組成物については、多価組成物である場合、少なくとも2つまたは全3つの判定基準が全ての株に、特に新しいワクチン、例えば、異なる経路を介して送達する新しいワクチンに対して適合する必要がありうる。ある状況では、2つの判定基準が十分でありうる。例えば、全ての株が3つの判定基準のうち2つに適合する一方、第3の判定基準には全ての株でなくいくつか（例えば、3つの株のうちの2つ）が適合することが容認される。
【０１６０】
さらなる態様において、本発明は、CD4+ T細胞活性化を介して治癒するまたは治療されることが公知である疾患のワクチンを設計する方法であって、1)CD4+エピトープを含む抗原を選択すること、および2)前記抗原と、本明細書で先に定義した水中油型エマルジョンアジュバントとを組合わせることを含んでなり、前記ワクチンが前記哺乳動物に投与されると前記哺乳動物の増強されたCD4 T細胞応答を誘発できることを特徴とする、前記方法を提供する。
【０１６１】
特許出願および許可された特許を含む、本明細書中の全ての参考文献の教示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本出願が優先権を請求するいずれの特許出願も参照により本明細書にその全てが、開示物および参考文献として本明細書に記載されたものとして、組み入れられる
疑問を回避するため、本明細書の用語「含んでいる」および「含む」は、各事例において、場合により用語「からなっている」、および「からなる」でそれぞれ代替可能であるものとする。
【実施例】
【０１６２】
以下の非限定的な実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。
【０１６３】
実施例Iは、フェレットおよびヒトの研究で使用される、免疫学的読み取り方法を記述する。
【０１６４】
実施例IIは、例示された研究で使用される、水中油型エマルジョンおよびアジュバント製剤の調製および特徴付けを記述する。
【０１６５】
実施例IIIは、アジュバント添加したおよびアジュバント無添加のインフルエンザワクチンのフェレットにおける前臨床評価を示す。
【０１６６】
実施例IVは、パンデミックH5N1株とAS03アジュバントから作製したスプリットインフルエンザ抗原調製物を含有するワクチンによる、18〜60歳の成人集団における臨床試験を記述する。
【０１６７】
免疫学的読み取り方法
I.1.  フェレット法
季節性株で実施される実験のために日常使用される好適な方法を以下に記載する。当業者は、使用するインフルエンザ株に応じていくつかの適合または最適化を必要としうることを理解するであろう。
【０１６８】
I.1.1. 赤血球凝集抑制試験 （HI）
試験手順
インフルエンザウイルス株に対する抗赤血球凝集素の抗体力価を、血液凝集抑制試験（HI）を用いて決定する。HI試験の原理はウマ赤血球（RBC）の赤血球凝集を抑制する、特異的抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。血清を前処理（コレラ、RDE、熱不活化など）した後に、2倍希釈した血清をインフルエンザ株の4赤血球凝集単位と共にインキュベートする。次いでウマ（順応：シチメンチョウ、またはウマ）赤血球を加え、凝集の抑制を記録する。力価を、赤血球凝集を完全に抑制した血清の希釈率の逆数として表わした。血清の第1の希釈が1:10であるとき、検出できないレベルを、5に等しい力価として記録した。さらに詳しくは、以下の1.2.1.節で詳しく説明する。
【０１６９】
I.1.2.  体温モニタリング
体温は、ケタミン-ロンプン-アトロピン混合物（2.5％-0.25％-0.025％）による麻酔下で14日に、白線の小切開を介して腹膜腔中に移植した温度センサー（Star Oddi、Iceland）を用いて記録した。傷は縫い閉じて、毎日検査した。
【０１７０】
I.2.3.  ウイルスの力価滴定
咽頭、鼻および直腸のスワブ（swab）を全ての動物から採集した。個々のスワブを3mlウイルス輸送培地［VTM；滅菌PBSまたは好適な等張性溶液、例えば、抗生物質（100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン）および2％ウシ胎児血清または0.5％ゼラチンのいずれかを含有するHankのBSS］中に置いて、分析まで-80℃にて保存した。剖検後、各動物からの右肺の頭蓋腹面（cranioventral）、頭蓋背面（craniodorsal）、尾腹面（caudoventral）および尾背面（caudodorsal）切片を評量し、分析まで-80℃にて保存した。これらの肺切片を3mlVTM中でホモジナイズした。ウイルス力価を、H5N1特異的TaqMan PCRおよびMadine Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞におけるウイルス力価測定培養の方法で決定した。
【０１７１】
TaqMan PCRについては、ウイルスのH5N1インフルエンザRNAをフェレットサンプルから抽出し、次いで定量RT-PCRアッセイによりインフルエンザゲノムの保存領域に設計したプライマーおよびプローブを用いて増幅した。データを、肺組織の1グラム当たりまたはスワブの1ml当たりコントロール希釈ユニット（CDU）およびTCID50としてそれぞれ表現した。コントロール希釈ユニット（CDU）は、ウイルスのストックを連続希釈し、各希釈物を試験サンプルと同じ方式で核酸抽出およびTaqman PCR増幅して作製した標準曲線から決定した。
【０１７２】
ウイルスの培養については、全サンプルの連続希釈物を培地とMDCK細胞を含有するマイクロタイタープレートに移し、次いで35℃にて5〜7日間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス排泄（viral shedding）力価を、ReedおよびMuenchの方法より決定し、肺組織の1グラム当たりまたはスワブの1ml当たりLog TCID50として表現した。
【０１７３】
I.1.4.  中和抗体アッセイ
中和抗体測定を解糖した凍結血清サンプルで実施した。血清が含有する抗体によるウイルス中和をミクロ中和アッセイで測定する。血清は、さらなる処理なしにアッセイで用いる。各血清を3重で試験した。ウイルスの標準化量と血清の連続希釈物とを混合してインキュベートし、抗体をウイルスと結合させる。規定量のMDCK細胞を含有する細胞懸濁液を次に、ウイルスと抗血清の混合物に加えて33℃でインキュベートする。インキュベーション期間の後、ウイルス複製物を、ニワトリ赤血球の赤血球凝集によって可視化する。血清の50％中和力価を、ReedおよびMuench（Am.J；Hyg.1938、27： 493-497）の方法により計算する。
【０１７４】
I.2.  ヒトにおける免疫応答を評価するアッセイ
I.2.1.  赤血球凝集抑制アッセイ
免疫応答は、WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991)に記載の方法を用いてHI抗体を測定することにより決定した。
【０１７５】
抗体力価測定は、解凍した凍結血清サンプルで、標準化されかつ全体的に検証されたマイクロメソッドにより、適当な抗原の4赤血球凝集抑制単位(4 HIU)および0.5％トリ（またはH5N1に対する0.5％トリおよびウマ）赤血球懸濁液を用いて実施した。非特異的血清インヒビターは熱処理および受容体破壊性酵素により除去した。
【０１７６】
得た血清のHI抗体レベルを評価した。初期希釈1:10から開始して、最終希釈が1:20480になるまで、一連の希釈物(2倍)を調製した。
【０１７７】
滴定終点は、赤血球凝集の完全な抑制(100％)を示す最高希釈ステップとした。すべてのアッセイは、2重で行った。
【０１７８】
H5N1に対する適応
ウマ赤血球を用いるHIの具体的な説明：
糖タンパク質（赤血球凝集素）はウイルスエンベロープ中に位置して、多くの種、例えば、ニワトリの赤血球を凝集させることができる。
【０１７９】
赤血球凝集抑制試験は2段階で行う：
1)  抗原-抗体反応：インフルエンザ抗原（DTA、透析試験抗原）が被験者の血清の抗体と反応する。
【０１８０】
2)  過剰抗原の凝集：過剰抗原は添加した赤血球と反応する。
【０１８１】
ウマの赤血球をH5N1パンデミック株として使用する。
【０１８２】
0.5％BSA（ウシ血清アルブミン、最終濃度）を含有するリン酸バッファー中の0.5％（最終濃度）ウマ赤血球懸濁液。
【０１８３】
この懸濁液は、毎日、赤血球を同じリン酸バッファーにより洗浄し、次いで遠心分離ステップ（10分間、2000rpm）にかけることにより調製する。この洗浄ステップは1回繰り返さなければならない。
【０１８４】
ウマ赤血球を、患者／被験者血清とウイルス懸濁液との反応混合液に付加した後、プレートは室温（RT、20℃±2℃）にて2時間インキュベートしなければならない（ウマ赤血球の沈降率が低いので）。
【０１８５】
I.2.2.  ノイラミニダーゼ阻害アッセイ
このアッセイは、フェチュインでコーティングされたマイクロタイタープレートで行った。抗血清の連続2倍希釈物を調製し、標準量のインフルエンザA H3N2、H1N1、またはインフルエンザBウイルスと混合した。試験は、酵素作用によってフェチュインからノイラミン酸を放出するノイラミニダーゼの生物活性に基づいた。末端ノイラミン酸の切断後、β-D-ガラクトース-N-アセチル-ガラクトサミンをアンマスキングした。ピーナツから得た、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で標識されたピーナツアグルチニンは、ガラクトース構造に特異的に結合するが、このピーナルアグルニチンをウエルに添加した。結合したアグルチニンの量を、テトラメチルベンジジン(TMB)との基質反応で検出し、定量することができる。依然としてウイルスのノイラミニダーゼ活性を少なくとも50％阻害する最高の抗体希釈率を、NI力価として示した。
【０１８６】
I.2.3.  中和抗体アッセイ
中和抗体測定を、解凍した凍結血清サンプルに関して実施した。血清に含有される抗体によるウイルス中和は、マイクロ中和アッセイで測定する。血清はさらなる処理なしに本アッセイで使用する。各血清について、3重に試験をする。 標準量のウイルスを、血清の連続希釈物と混合し、抗体をインキュベートしてウイルスと結合させる。次いで定義した量のMDCK細胞を含有する細胞懸濁液を、ウイルスと抗血清との混合物に添加し、33℃でインキュベートする。インキュベーション期間の後、ウイルス複製物を、ニワトリ赤血球の赤血球凝集によって可視化する。血清の50％中和力価を、ReedおよびMuenchの方法（Am.J;Hyg.1938, 27: 493-497）によって計算する。
【０１８７】
I.2.4.  サイトカインフローサイトメトリー(CFC)によって細胞媒介性免疫を評価した
末梢血抗原特異的CD4およびCD8 T細胞は、これらに対応する抗原と共にインキュベートすれば、in vitroで再刺激されて、IL-2、CD40L、TNF-α、およびIFNを産生することができる。その結果、抗原特異的CD4およびCD8 T細胞は、細胞内サイトカイン産生と同様に、細胞表現型の従来の免疫蛍光標識の後、フローサイトメトリーによって数え上げることができる。本発明の研究では、インフルエンザワクチン抗原を、インフルエンザ特異的T細胞を再刺激する抗原として使用する。結果を、CD4またはCD8 T細胞亜集団内のサイトカイン陽性CD4またはCD8の頻度として表わす。
【０１８８】
I.2.5.  ELISPOTによる記憶B細胞
ELISPOT技法は、所与の抗原に特異的な記憶B細胞の定量を可能にする。記憶B細胞は、CpGとともに5日間培養後、形質細胞にin vitroで分化するように誘導することができる。in vitroで作製された抗原特異的形質細胞は、従って、ELISPOT アッセイを用いて数えることができる。簡単に説明すると、in vitroで作製された形質細胞を抗原でコーティングした培養プレートにおいてインキュベートする。抗原特異的形質細胞は抗体／抗原スポットを形成するので、このスポットを従来の免疫-酵素手順により検出することができる。本発明の研究においては、インフルエンザ特異的抗体またはIgG分泌性形質細胞をそれぞれ数える目的で、インフルエンザワクチン株または抗ヒト免疫グロブリンを用いて培養プレートをコーティングする。結果は、IgG産生形質細胞内のインフルエンザ特異的抗体分泌性形質細胞の頻度として表わす。
【０１８９】
I.2.6.  統計的方法
I.2.6.1.  主要エンドポイント
・ワクチン接種後7日間のフォローアップ期間中(すなわち、ワクチン接種の日およびそれに続く6日間)および全期間における、懇請された局所および全身の徴候および症状のパーセント、強度、およびワクチン接種との関係。
【０１９０】
・ワクチン接種後21日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種の日およびそれに続く20日間)および全期間にわたる、懇請されない局所および全身の徴候および症状の、パーセント、強度、およびワクチン接種との関係。
【０１９１】
・全研究期間における、重篤な有害事象の発生。
【０１９２】
I.2.6.2.  二次的なエンドポイント
液性免疫応答について：
観察された変数：
・0日目および21日目：ワクチン中に提示された3種のインフルエンザウイルス株（抗H1N1、抗H3N2、および抗B抗体）のそれぞれに対して別々に試験した、血清赤血球凝集抑制（HI）およびNI抗体力価。
【０１９３】
・0日目および21日目：ワクチン中に提示された3種のインフルエンザウイルス株のそれぞれに対して別々に試験した、中和抗体力価。
【０１９４】
誘導された変数(95％信頼区間)：
・ワクチン接種前後の95％信頼区間での、血清HI抗体の幾何平均力価(GMT)。 
・21日目、95％CIでのセロコンバーション率＊
・21日目、95％CIでのコンバーション係数＊＊
・21日目、95％CIでの血清防護率＊＊＊
・すべての時点での血清NI抗体GMT(95％信頼区間)。 
＊セロコンバーション率は、各ワクチン株に関し、0日目に比べて21日目に血清HI力価が少なくとも4倍増加しているワクチン受給者のパーセントと定義される。 
＊＊コンバーション係数は、各ワクチン株に関する、0日目と比べた21日目の血清HI GMTの倍数増加と定義される。 
＊＊＊防護率は、ワクチン接種後(各ワクチン株毎)に通常、防護を示すとして容認される血清HI力価=40をもつワクチン受給者のパーセントと定義される。
【０１９５】
細胞媒介性免疫(CMI)応答について
観察された変数
0日目および21日目：様々な試験における、106当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8 T細胞の頻度。各試験は、下記の事項に対するCD4/CD8 T細胞の応答を定量する:
・ペプチドインフルエンザ（pf）抗原（これら抗原の厳密な性質および起源を得ること／説明することが必要である）
・スプリットインフルエンザ（sf）抗原
・全インフルエンザ（wf）抗原。
【０１９６】
誘導された変数：
・少なくとも2種の異なるサイトカイン(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)を産生する細胞
・少なくともCD40Lと他のサイトカイン(IL-2、TNFα、IFNγ)を産生する細胞
・少なくともIL-2と他のサイトカイン(CD40L、TNFα、IFNγ)を産生する細胞
・少なくともIFNγと他のサイトカイン(IL-2、TNFα、CD40L)を産生する細胞
・少なくともTNFαと他のサイトカイン(IL-2、CD40L、IFNγ)を産生する細胞
I.3.5.3.  免疫原性の分析
免疫原性の分析は、ワクチン接種したコホートすべてに基づいた。
【０１９７】
各治療グループ毎に、下記のパラメータ(95％信頼区間と共に)を計算した：
・0日目および21日目のHIおよびNI抗体力価の幾何平均力価(GMT)
・0日目および21日目の中和抗体力価の幾何平均力価(GMT)。 
・21日目のコンバーション係数。 
・21日目のセロコンバーション率(SC)は、0日目に比べて21日目の血清HI力価が少なくとも4倍増加しいるワクチン受給者のパーセントと定義される。
【０１９８】
・21日目の防護率は、血清HI力価=1:40であるワクチン受給者のパーセントと定義される。 
・応答中に分泌されるCD4/CD8 Tリンパ球の頻度を、各ワクチン接種グループ毎に、各時点（0日、21日目）毎に、各抗原（ペプチドインフルエンザ（pf）、スプリットインフルエンザ（sf）、および全インフルエンザ（wf））毎にまとめた（記述統計学）。
【０１９９】
・5つの異なる試験毎の、各ワクチン接種グループおよび各抗原（pf、sf、およびwf）毎の、時点（後（Post）-前（Pre））応答間の個々の相違の記述統計学。 
・ノンパラメトリック検定(クルスカル-ワリス検定)を使用して、3つのグループの間での位置の相違を比較し、統計的p値を、5つの異なる試験毎に、各抗原に関して計算した。すべての有意検定は、両側検定であった。0.05以下のP値を、統計的に有意と見なした。
【０２００】
実施例II  水中油型エマルジョンおよびアジュバント製剤の調製と特徴付け
他に特に指示しない限り、後続の実施例で使用される油/水エマルジョンは、2種の油（α-トコフェロールおよびスクアレン）から作製された有機層と、乳濁化剤としてTween80を含有するPBSの水相とからなる。他に特に指示しない限り、後続の実施例で使用される水中油型エマルジョンアジュバント製剤は、下記の水中油型エマルジョン成分（所与の最終濃度）、すなわちスクアレン2.5％（v/v）、α-トコフェロール2.5％（v/v）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン0.9％（v/v）（Tween80）を含むものが作製された。WO95/17210を参照されたい。後続の実施例でAS03と呼ぶこのエマルジョンは、下記の通り2倍濃縮物として調製した。
【０２０１】
II.1.  エマルジョンSB62の調製
II.1.1.  実験室規模の調製
Tween80を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解して、2％PBS溶液を得た。100mlの2倍濃縮物エマルジョンを得るために、DLα-トコフェロール5gおよびスクアレン5mlを撹拌して完全に混合した。PBS/Tween溶液90mlを添加し、完全に混合した。次いで得られるエマルジョンをシリンジに通し、最終的に、M110Sミクロ流体マシンを使用してミクロ流動化する。得られた油滴は、約120〜180nmのサイズ（PCSによって測定されたZ平均として表す）を有する。その他のアジュバント／抗原成分をエマルジョンに添加して、簡単に混合する。
【０２０２】
II.1.2.  スケールアップした調製
SB62エマルジョンの調製は、疎水性成分（α-トコフェロールおよびスクアレン）からなる油相と、水溶性成分（Tween80およびPBS（変性）、pH6.8）を含有する水相とを強く撹拌しながら混合することによって行う。撹拌しながら、油相（1/10全容積）を水相（9/10全容積）に移し、混合物を室温で15分間撹拌する。次いで得られる混合物を、ミクロフルイダイザー（15000 PSI-8サイクル）の相互作用チャンバ内で剪断力、衝撃力、および空洞力にかけることにより、サブミクロンの液滴（100〜200nmの分布）が生成される。得られるpHは、6.8±0.1の間である。次いでSB62エマルジョンを、0.22μm膜に通す濾過によって滅菌し、滅菌バルクエマルジョンを、2〜8℃のCupac容器に冷蔵保存する。滅菌不活性ガス（窒素またはアルゴン）を、少なくとも15秒間、SB62エマルジョンの最終バルク容器の死容積に一気に流す。
【０２０３】
SB62エマルジョンの最終的な組成は、下記の通りである:
Tween80:1.8％(v/v) 19.4mg/ml; スクアレン:5％(v/v) 42.8mg/ml; α-トコフェロール:5％(v/v) 47.5mg/ml; PBS-mod:NaCl 121mM、KCl 2.38mM、Na2HPO4 7.14mM、KH2PO4 1.3mM; pH6.8±0.1。
【０２０４】
II.2.  油滴サイズ動的光散乱の測定
II.2.1.  概要
油滴の直径のサイズを、下記の手順に従って、かつ下記の実験条件下で決定する。液滴サイズの測定は、強度測定として行い、PCSにより測定したZ平均として表す。
【０２０５】
II.2.2.  サンプル調製
サイズの測定を水中油型エマルジョンアジュバントで行った：SB62はスケールアップ方法に従って調製し、AS03とAS03+MPL(50μg/ml)の両者は使用直前に調製した。サンプルの組成を以下に示す(セクションII.2.4.を参照)。サンプルを、PBS 7.4中で4000×〜8000×に希釈した。対照として、PL-Nanocal粒度標準100nm(カタログ番号6011-1015)を10mM NaCl中に希釈した。
【０２０６】
II.2.3.  Malvern Zetasizer 3000HSサイズ測定
すべてのサイズ測定は、共にMalvern Zerasizer 3000HSで行った。サンプルを、Malvern分析用のプラスチックのキュベットに入れて、好適な希釈率（通常は、サンプル濃度に応じて4000×〜20000×）で、かつ2つの光学モデル：
-実際の粒子屈折率が0であり、想像上の屈折率も0であるモデル、あるいは、
-実際の粒子屈折率が1.5であり、想像上の屈折率が0.01であるモデル（文献中に見出された値に従って適合させた光学モデル）
を用いて測定した。
【０２０７】
技術的条件は、
・レーザ波長:532nm(Zeta3000HS)、
・レーザ出力:50mW(Zeta3000HS)、
・90℃で検出された散乱光(Zeta3000HS)、
・温度:25℃、
・所要時間:ソフトによる自動測定、
・数:3つの連続測定値、
・z平均直径:キュムラント解析による、
・サイズ分布:Continまたは自動方法による
という条件であった。
【０２０８】
自動Malvernアルゴリズムは、キュムラント、Contin、および非負最小2乗(NNLS)アルゴリズムの組合せを使用する。強度分布は、Mie理論に従って体積分布に変換することができる。
【０２０９】
II.2.4.  結果（表2参照）
キュムラント解析（Z平均直径）：
【表２】
0005639760.tif 000003
【０２１０】
（*）次の通り調製した：注射用水、PBS 10×濃縮、SB62エマルジョン250μlおよびMPL 25μgを一緒に混合して最終体積280μlとする。
【０２１１】
Z平均直径(ZAD)サイズは、サンプル中の各サイズの粒子により散乱した光量によって重み付けした。この値は、サンプルのモノモーダル（monomodal）分析に関連しており、主に再現性を目的として使用される。計数率（count rate）(CR)は、散乱光の尺度であり、1秒当たり何千個の光子に相当する。多分散性(Poly)指数は、分布の幅である。これは、分布広さの無次元測定値である。
【０２１２】
Continと自動分析：
2つの別のSB62調製物（2倍濃縮したAS03）を作り、次のわずかな変更を行った上で、上記手順に従って評価した。すなわち、サンプルを、Malvern分析用のプラスチックのキュベットに入れて、上記の例で使用したものと同じ光学モデル、Zetasizer3000HSにおいて、最適な計数率の値が得られると確認した2つの希釈率：10000×および20000×で測定した。
【０２１３】
結果を表3に示す。
【表３】
0005639760.tif 000004
【０２１４】
「-」は得た値が干渉性でなかったことを示す。
【０２１５】
これらの結果の概略的な表示を、製剤1023について図1に示す。図示されるように、大部分の粒子(例えば少なくとも80％)は、強度で300nm未満の直径を有する。
【０２１６】
II.2.5.  全体的な結論
SB62製剤を、Malvern Zetasizer 3000HSと2つの光学モデルを用いて、様々な希釈率で測定した。以上で評価した製剤の粒度ZAD（すなわち、キュムラント解析による強度平均）は、150〜155nm程度であった。キュムラント解析を使用したとき、本発明者らは、希釈率がZADおよび多分散性に影響を与えないことを見出した。
【０２１７】
実施例III  フェレットにおける、アジュバント添加したパンデミックスプリットインフルエンザワクチン（H5N1株を含む）の前臨床評価
III.1.  理論的根拠と目標
フェレットモデルにおけるインフルエンザ感染は、感染と臨床応答の両方について、ヒトインフルエンザを厳密に模倣している。フェレットは、ウイルス株の事前の適合がないと、インフルエンザA型およびB型ウイルスの両方の感染に非常に感受性がある。それ故に、投与したインフルエンザワクチンが与える防護の研究に対する優れたモデル系を提供する。
【０２１８】
本研究は、H5N1同種株A型/Vietnam/1194/2004または異種株A型/インドネシアによる致死チャレンジに対してフェレットを防護するための、ASO3を用いてアジュバント添加したH5N1スプリットワクチンの効力を研究した。本実験の目的は、PBSまたはアジュバント単独で免疫感作したフェレットと比較して、アジュバント添加したインフルエンザワクチンの効力を実証することであった。
【０２１９】
III.2.  実験設計
III.2.1.   治療／グループ（表4）
ほぼ8月齢（体重0.8〜1.5kg）の若い非近交系成熟雄の36フェレット（Mustela putorius furo）（6フェレット/グループ）に、0日および21日に完全なヒト用量（500μlワクチン用量）を用いて筋肉内注射した。フェレットの4グループ（n＝6）を4レベルの異なる濃度のA/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）（15、5.0、1.7および0.6μgHA）とAS03（標準ヒト用量、250μl/用量）との組合わせを用いて免疫感作した。2つの対照グループはプラセボおよびAS03で処置した動物から成った。血清を21日および42日に採集して血清学的応答を分析した。同種ウイルスに対する抗体力価を血液凝集抑制アッセイ（HI力価）により測定した。49日に全ての動物を、鼻腔内経路によりホモタイプの株A/Vietnam/1194/04の106 TCID50の1用量をチャレンジした。チャレンジのコースの期間中、鼻、咽頭および直腸スワブを採集してウイルス出芽を評価した。剖検後、各動物からの右肺の頭蓋腹面（cranioventral）、頭蓋背面（craniodorsal）、尾腹面（caudoventral）および尾背面（caudodorsal）切片を評量し、分析まで-80℃にて保存した。ウイルス力価を、H5N1特異的TaqMan PCRおよびMDCK細胞におけるウイルス力価測定培養の方法で決定した。データを、肺組織の1グラム当たりまたはスワブの1ml当たりコントロール希釈ユニット（CDU）およびTCID50としてそれぞれ表現した。CDUは、ウイルスのストックを連続希釈し、各希釈物を試験サンプルと同じ方式で核酸抽出およびTaqman PCR増幅して作製した標準曲線から決定した。
【表４】
0005639760.tif 000005
【０２２０】
III.2.2.ワクチン製剤の調製
III.2.2.2.  500μl用量の水中油型エマルジョンアジュバントAS03Aをアジュバント添加したスプリットH5N1
バージョン1
予め混合したバッファーを、細菌株中のそれらの濃度を考慮した量のチメロサール、Tween 80およびTriton X100を含有する最終バルクバッファー（PBS pH 7.4）で先行して調製する。免疫感作の日に、15、5、1.7または0.6μgのH5N1株を、予め混合したバッファーに加える。30分攪拌の後、250μlのSB62エマルジョンを加える。その製剤を30分間攪拌する。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０２２１】
バージョン2
好適には、製剤を次のとおり調製する。細菌株中のそれらの濃度を考慮した量のTween 80、Triton X100およびチメロサールを最終バルクバッファーに加える。5分攪拌の後、5、5、1.7または0.6μgのH5N1株を加える。30分攪拌の後、250μlのSB62エマルジョンを加える。その製剤を30分間攪拌する。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０２２２】
III.2.2.3.  500μl用量のAS03A
バージョン1
250μl SB62エマルジョンを250μl PBS pH6.8と混合し、5分間攪拌し、そして投与まで4℃にて保存した。
【０２２３】
バージョン2
好適には、製剤を次のとおり調製する。250μl SB62エマルジョンを250μl PBS pH6.8と混合し、5分間攪拌する。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０２２４】
注意:各製剤において、等張となるように10倍濃縮PBSを添加し、これは最終容積では、1倍濃縮となる。H2O容積は、目的の容積に達するように計算する。
【０２２５】
III.2.3.  読み取り（表5）
【表５】
0005639760.tif 000006
【０２２６】
III.3.  結果と結論
表6は、同種H5N1株によるチャレンジ後にフェレットで得た肺組織および咽頭スワブの防護データ、HI力価およびウイルス負荷を総括したものである。
【表６】
0005639760.tif 000007
【０２２７】
aPBSにより免疫感作した一動物および1.7μgHAのアジュバント添加したワクチンにより免疫感作した一動物はワクチン接種の過程で安楽死させた（25日）。ワクチン接種とこれらの死亡率との間に関連は見られなかった。
【０２２８】
b幾何平均HI力価（D42）：+++（>160）、++（60〜160）、+（40〜60）、-（<40）。
【０２２９】
Cウイルス培養物により確認したウイルス負荷が1ｇ組織当たりまたは1mlスワブ当たり＞102 TCID50の動物数。
【０２３０】
III.3.1.  防護データ
H5N1によるチャレンジ前に、2動物を安楽死させた。一動物は、ワクチン接種の過程で過剰な体重損失が理由で安楽死させた（14日）。1.7μgHAのアジュバント添加したワクチンにより免疫感作した一動物は、ワクチン接種の過程で過剰な体重損失が理由で安楽死させた（25日）。ワクチン接種とこれらの死亡率との間に関連は見られなかった。
【０２３１】
AS03をアジュバント添加したH5N1ワクチンによりワクチン接種したフェレットにおけるA/Vietnam/1194/04によるチャレンジは、抗原用量に応じた防護または生存曲線を示した（表6）。AS03をアジュバント添加したワクチンの5または15μgHAにより免疫感作した全ての動物は致死チャレンジに対して防護された。重要なこととして、AS03をアジュバント添加したワクチンにより免疫感作したフェレットの全てのグループにおいて、同種A/Vietnam/1194/2004ウイルスに対する平均HI力価は＞40であり、これには、最低用量を受けて、すなわちAS03をアジュバント添加したH5N1スプリットワクチンのそれぞれ、0.6および1.7μgにより免疫感作したフェレットにおいて、同種チャレンジに対して66.67および80.00％防護を得たグループが含まれた。PBSまたはアジュバント単独により免疫感作した全てのフェレットは105 TCID50/g肺組織を超えるウイルス負荷を示し、全ての動物が感染の過程を通じて咽頭に高レベルのウイルスを排泄した。逆に、AS03をアジュバント添加した ワクチンの投与は、大部分の動物においてウイルス負荷を、肺組織1g当たりまたは咽頭スワブからの液1ml当たり102 TCID50の閾値未満に減じた（表6）。ただ、AS03をアジュバント添加したワクチンにより免疫感作した1グループ当たり1または2フェレットは中〜高ウイルス負荷（＞102 TCID50）を有した。
【０２３２】
これらのデータについて行った統計解析は、次の結論を導いた：
・全てのワクチン用量は統計的に対照とは異なった。
【０２３３】
・P値（フィッシャーの直接確率検定）は最低用量に対して0.0276〜最高用量に対して0.0006の範囲にあった。
【０２３４】
・90％防護を誘導すると見積もられる用量は本モデルにおいて2.9μgであった。
【０２３５】
・100％防護を誘導する最低用量は本モデルにおいて2.9〜5μgと見積もられた。
【０２３６】
III.3.2.  液性応答（HI力価）
ワクチン接種に対する液性免疫応答を、21日および42日のそれぞれの免疫感作後に測定した。血清サンプルを、血液凝集抑制（HI）試験によりウマ赤血球を用いて試験した。結果を表6に示す。
【０２３７】
AS03アジュバント添加した一価H5N1スプリット製剤は、PBSまたはAS03単独により免疫感作したフェレットと比較して、同種の株に対する最強のHI応答を誘導した。2つの最低用量（アジュバント添加したワクチンの1.7または0.8μgHA）を受けたフェレットにおける、より低い免疫応答と比較して、最高の抗原用量（アジュバント添加したワクチンの15または5μgHA）を用いて免疫感作したフェレットで得られる最高のHI力価によって、抗原用量効果が観察された。
【０２３８】
表6および図2Aに示すように、Hi力価とA/VietnamH5N1によるフェレットチャレンジにおける防護の間の相関を見出した。40より高いHI力価は、AS03をアジュバント添加したH5N1スプリット ワクチンにより免疫感作したフェレットにおける防護と相関があるようと思われた。
【０２３９】
III.3.3.  液性応答（中和抗体力価）
ワクチン接種に対する液性免疫応答はまた、各免疫感作後の21日および42日における中和アッセイによっても試験した。結果を図3に示す。
【０２４０】
AS03アジュバント添加した一価H5N1スプリット製剤は、PBSまたはASO3単独により免疫感作したフェレットと比較して、異種株に対して最強の中和抗体応答を誘導した。2つの最低用量（アジュバント添加したワクチンの1.7または0.8μgHA）を受けたフェレットにおける、より低い免疫応答と比較して、最高の抗原用量（アジュバント添加したワクチンの15または5μgHA）を用いて免疫感作したフェレットで得られる最高のHI力価によって、抗原用量効果が観察された。
【０２４１】
III.3.4.  A/Vietnam H5N1 同種チャレンジ後のウイルス排泄
ウイルス排泄をウイルス培養およびTaqManPCRにより、肺組織および鼻／咽頭／直腸スワブについて行った。
【０２４２】
表6に見られるように、防護はまた、AS03をアジュバント添加したH5N1スプリットワクチンを用いて免疫感作したフェレットの肺組織および咽頭スワブにおけるウイルス負荷の低下（ほとんどの動物で組織1グラム当たりまたはスワブ1ml当たり102TCID50未満）によっても観察された。PBSまたはアジュバント単独により免疫感作した全てのフェレットは、感染の過程を通じて、肺組織および咽頭に高いウイルス負荷を示した。
【０２４３】
図2Bは、各グループにおけるPCRおよびウイルス培養の両方により確認した平均ウイルス負荷を示す。この図は、アジュバント添加したワクチンを受ける全てのグループが、PBSまたはアジュバント単独を受ける対照グループと比較して、低下したウイルス負荷を示す傾向にあり、アジュバント添加したワクチンの0.7μgHAを用いて免疫感作したフェレットはウイルス負荷のより穏やかな低下を示すことを実証した。アジュバント添加したワクチンの1.6、5または15μg HAを用いて免疫感作したフェレットの間では少しの差しか見られなかった。最後に、肺のウイルス負荷については、PCR結果がウイルス力価測定と一致した。
【０２４４】
さらに、鼻および直腸スワブにおける、ならびに血漿におけるウイルス排泄をウイルス培養およびPCRにより研究した。一般に、ウイルス力価測定はPCR分析より感受性が低い。この分析は、PBSを受けている2/5フェレットの鼻腔および直腸スワブ中へのH5N1ウイルスの存在を示した。このグループでは、1/5の動物も血清にウイルスを排泄した。AS03をアジュバント添加したH5N1スプリットワクチンを用いて免疫感作した動物は、直腸スワブまたは血漿にウイルスを排泄しなかった。興味深いことに、それぞれの個々のフェレットの分析は、いくつかの防護されたフェレットは高いウイルス負荷と低いHI力価を有し、防護が達成される機構は、少なくとも、部分的に、細胞免疫の誘導によりうることを実証することを示した（この実験では評価されなかった）。
【０２４５】
III.3.5.  体温
全動物の体温を記録した。ワクチン接種期に体温の変化は観察されなかった。A/Vietnam/1194/04によるチャレンジは、40℃〜42℃の範囲の体温の発熱を誘導し、チャレンジ開始後12〜24時間の間がピークであった。チャレンジを切り抜けて生き残った動物では、感染の過程で体温が正常なレベルに低下した。5日前に死亡した動物は、熱がピークに達した後に体温の急速な低下を示した。
【０２４６】
総括すると、血清学的試験は、アジュバント添加したワクチンで免疫感作した動物では、PBSまたはアジュバント単独で免疫感作した動物と比較して有意に高いHI力価が得られることを示した。同種のA/Vietnam/1194/04 ウイルスを用いたチャレンジは抗原用量に応じた生存曲線を示し、対照グループと比較して、アジュバント添加したワクチンを受けているグループからの肺組織および咽頭スワブにおけるウイルス負荷が低下した。対照グループ（PBSまたはアジュバント単独で免疫感作した）の全動物は、ウイルスを上気道中に排泄し、ウイルス負荷が約105 TCID50/g肺であった一方、アジュバント添加したワクチンを受けているグループでは、ある比率の動物しかウイルスを上気道中に排泄しなかった（4/17動物が105〜107 TCID50/g肺組織で、大部分の動物は肺1グラム当たりまたは 咽頭スワブ1ml当たり102 TCID50未満であった ）。さらに、アジュバント添加したワクチンを受けているグループからの肺組織では、プラセボとアジュバントだけで処置したグループと比較して、ウイルス力価が低下した。この低下は、部分的に抗原用量に依存し、5μg抗原で明らかな平坦域に達した。
【０２４７】
実施例IV  スプリットインフルエンザ抗原調製物とAS03アジュバントを含有するワクチンによる、18〜60歳の成人集団の臨床試験
IV.1.  概要
パンデミックインフルエンザ候補の反応原性および免疫原性を評価する目的で、AS03をアジュバント添加したまたは無添加の異なる抗原用量（3.8μg、7.5μg、15μgおよび30μgHA）を投与して、第I相、観察者ブラインド、無作為化研究を、18〜60歳の成人集団で、2006年に広く実施した。液性免疫応答（すなわち、抗赤血球凝集素、中和および抗ノイラミニダーゼ抗体力価）および細胞媒介性免疫応答（CD4および／またはCD8T細胞応答）を、候補ワクチン製剤の2回筋肉内投与のそれぞれの後、21日に測定する。アジュバント無添加グループは、同じ抗原含量を受けるそれぞれのアジュバント添加グループに対する参照としての役割を果たした。
【０２４８】
IV.2.  研究設計
それぞれ50被験者の8グループ（計画）は次のワクチン筋肉内投与を  平行して受けた：すなわち、
・50被験者の1グループは3.8μgHAを含有するパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・51被験者の1グループは3.8μgHAを含有しかつASO3でアジュバント添加したパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・50被験者の1グループは7.5μgHAを含有するパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・51被験者の1グループは7.5μgHAを含有しかつASO3でアジュバント添加したパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・50被験者の1グループは15μgHAを含有するパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・51被験者の1グループは15μgHAを含有しかつASO3でアジュバント添加したパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・50被験者の1グループは30μgHAを含有するパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受け、
・49被験者の1グループは30μgHAを含有しかつASO3でアジュバント添加したパンデミックスプリットウイルスインフルエンザワクチンの2回投与を受けた。
【０２４９】
登録を行い、各グループからの被験者の半分が18〜30歳の間の年でありうることを保証した。
【０２５０】
ワクチン接種スケジュール：0日および21日にパンデミックインフルエンザ候補ワクチンの2回注入；21日および42日に血液サンプル採集、読み取り分析 （HI抗体測定、NI抗体測定、中和抗体の測定、およびCMI分析）、研究結論（51日）および研究終了（180日間）。
【０２５１】
IV.3.  研究目的
IV.3.1.  主要な目的
・研究ワクチンより誘導される液性免疫応答を、抗赤血球凝集素抗体力価として評価すること。
【０２５２】
・研究ワクチンの安全性および反応原性を、懇請された局所および全身の有害事象、懇請されない有害事象および重篤な有害事象として評価すること。
【０２５３】
液性免疫応答について：
0、21、42および180日の観察変数：血清赤血球凝集抑制抗体力価。
【０２５４】
誘導変数（95％信頼区間で）：
・0、21、42および180日における血清抗体の幾何平均力価（GMT）
・21、42および180日におけるセロコンバージョン率*
・21、42および180日におけるコンバージョン係数**
・0、21、42および180日における防護率***
*赤血球凝集素抗体応答に対するセロコンバージョン率は、ワクチン接種前力価＜1：10およびワクチン接種後力価≧1：40、またはワクチン接種前力価≧1：10および少なくともワクチン接種後力価の4倍増加を有するワクチン受給者のパーセントとして定義される。
【０２５５】
**コンバージョン係数は、0日と比較したワクチン接種後の血清HI GMTの倍数増加として定義される。
【０２５６】
***防護率は、ワクチン接種後に通常、防護を示すと容認される血清HI力価≧1：40を有するワクチン受給者のパーセントとして定義される。
【０２５７】
安全性／反応原性評価について：
1.  各ワクチン接種後7日の追跡期間（すなわち、ワクチン接種日とその後の6日）および全期間における、懇請された局所および全身の徴候および症状のパーセント、強度およびワクチン接種との関係。
【０２５８】
2.  初回ワクチン接種後21日の追跡期間、第2のワクチン接種後30日の追跡期間および全期間における、懇請されない局所および全身の徴候および症状のパーセント、強度およびワクチン接種との関係。
【０２５９】
全研究期間における重篤な有害事象の発生。
【０２６０】
IV.3.2.  二次的な目的
・研究ワクチンより誘導される液性免疫応答を、血清中和抗体力価として評価すること。
【０２６１】
・研究ワクチンより誘導される細胞媒介性免疫応答を、インフルエンザ特異的CD4/CD8 Tリンパ球の頻度として評価すること。
【０２６２】
さらにワクチン接種のインフルエンザ特異的記憶B細胞に与える影響は、Elispot技法を用いて評価しうる。
【０２６３】
液性免疫応答について：
0、21、42 および 180日の観察変数：血清中和抗体力価。
【０２６４】
誘導変数（95％信頼区間で）：
・0、21、42および180日の血清抗体の幾何平均力価（GMT）
・21、42および180日のセロコンバージョン率*
*中和抗体応答に対するセロコンバージョン率は、ワクチン接種後に力価の少なくとも4倍増加を有するワクチン受給者のパーセントとして定義される。
【０２６５】
CMI応答について：
1.少なくとも2種の異なるサイトカイン（CD40L、IL-2、TNF-α、IFN-γ）を産生する、試験した細胞106当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０２６６】
2.少なくともCD40Lと他のシグナル分子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）を産生する、試験した細胞106当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０２６７】
3.少なくともIL-2と他のシグナル分子（CD40L、IFN-γ、TNF-α）を産生する、試験した細胞106当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０２６８】
4.少なくともTNF-αと他のシグナル分子（IL-2、IFN-γ、CD40L）を産生する、試験した細胞106当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０２６９】
5.少なくともIFN-γと他のシグナル分子（CD40L、IL-2、TNF-α）を産生する、試験した細胞106当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０２７０】
0、21、42および180日における：試験した細胞106当たりのインフルエンザ特異的記憶B細胞の頻度。
【０２７１】
IV.4.  ワクチン組成物および投与（表7）
III.4.1.  ワクチン調製物
III.4.1.1.  AS03アジュバント添加したインフルエンザワクチンの組成
AS03は、DL-α-トコフェロールとスクアレンを含有する油相と非イオン性界面活性剤ポリソルベート80を含有する水層とから成る水中油型SB62エマルジョンを含有する。
【０２７２】
パンデミックインフルエンザワクチン候補の活性物質は、ワクチンウイルス株A/VietNam/1194/2004（H5N1）NIBRG-14由来のホルムアルデヒド不活化スプリットウイルス抗原である。HA抗原の用量は1用量当たり3.8〜30μgの範囲である。
【０２７３】
AS03アジュバント添加インフルエンザ ワクチンを作製するために用いるスプリットウイルス一価バルクは、GSK Biologicalsの実施権を受けたパンデミックの間期のインフルエンザワクチンFluarix（登録商標）／α-Rix（登録商標）に対して使われるのと同じ手順に従って製造される。この臨床試験に際して、臨床ロットを製造するために用いたウイルス株は、強い病原性A/Vietnam/1194/04由来のH5N1ワクチン株A/Vietnam/1194/04NIBRG-14組換えH5N1プロトタイプワクチン株である。この組換え体プロトタイプ株は、NIBSCがリバース遺伝学を利用して開発したものである（好適な参考文献は、Nicolson et al. 2005, Vaccine, 23, 2943-2952である）。再詰め合せ株は、H5とN1のセグメントをA/PR/8/34株の背骨と組合わせたものであり、H5を遺伝子操作して元来の株の強い病原性に関わるHA切断部位のアミノ酸の多塩基性伸展部が排除された。これは、HA遺伝子（高い病原性決定要因を取除くように改変された）とヒトの単離体A/Viet Nam/1194/2004 （H5N1）のNA遺伝子を含有するプラスミド、ならびにPR8の内部因子を含有するプラスミドでVero細胞をトランスフェクトすることにより達成された。救出されたウイルスを卵で2回継代させ、そして参照ウイルスNIBRG-14と名付けた。このH5N1再詰め合せ体の弱毒化特性は臨床前安全評価（NIBSCが実施したもの）に詳しく記載されていて、これは通常、古典的インフルエンザワクチン株についても行われている通りである。
【０２７４】
本発明によるAS03アジュバントが添加されたパンデミックインフルエンザ候補ワクチンは、I型ガラスバイアルで提供される0.5mlの濃縮不活化スプリットビリオン抗原と、0.5mlのAS03アジュバントを含有する予め充填したI型ガラスシリンジとから成る2成分ワクチンである。注射の時点で、予め充填したアジュバントを含有するシリンジの内容物を、濃縮された不活化スプリットビリオン抗原を含有するバイアル中に射出する。混合後、内容物をシリンジ中に吸い込み、注射針を筋肉用注射針と取り替える。用事調製したASO3アジュバント添加インフルエンザ候補ワクチンの1用量は1mlに対応する。1mlの各ワクチン用量は、3.8μg、7.5μg、15μまたは30μg赤血球凝集素（HA）または本明細書に詳述した効力判定基準にワクチンが適合するように決定しておいた任意の好適なHA量を含有する。
【０２７５】
あるいは、本発明によるAS03アジュバントが添加されたパンデミックインフルエンザ候補ワクチンは、I型ガラスバイアルで提供される0.25mlの濃縮不活化スプリットビリオン抗原と、0.25mlのAS03アジュバントを含有する予め充填したI型ガラスシリンジとから成る2成分ワクチンである。注射の時点で、予め充填したアジュバントを含有するシリンジの内容物を、濃縮された不活化スプリットビリオン抗原を含有するバイアル中に射出する。混合後、内容物をシリンジ中に吸い込み、注射針を筋肉用注射針と取り替える。用事調製したASO3アジュバント添加インフルエンザ候補ワクチンの1用量は0.5mlに対応する。0.5mlの各ワクチン用量は、3.8μg、7.5μg、15μまたは30μg赤血球凝集素（HA）または本明細書に詳述した効力判定基準にワクチンが適合するように決定しておいた任意の好適なHA量を含有する。
【０２７６】
ワクチン賦形剤は、ポリソルベート80（Tween80）、オクトキシフェノール10（TritonX-100）、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム六水和物および注射用水である。パンデミックが起こると主な提供物は保存剤を必要とする多用量容器（バイアルまたはアンプル）に入れて提供されるので、チメロサールを抗菌保存剤として加えておいて使用中の汚染を防止する。この理由で、パンデミックワクチンは5μg/用量のチメロサールを保存剤として製剤する。好適には、パンデミックワクチンは、10μg/用量のチメロサールを保存剤としてまたは若干高い用量、例えば25μg/用量のワクチンを用いて製剤することができる。
【０２７７】
III.4.1.2.  スプリット不活化インフルエンザH5N1抗原調製物の生産
ウイルスモノバルクは、胎生の雌鶏卵中のH5N1現役種を生育させることにより調製する。図4に図解したスプリット不活化インフルエンザH5N1株の一価バルクの製造方法はα-Rix（登録商標）の一価バルクの製造方法と同じである。
【０２７８】
基本的に、一価バルクの製造方法は、4つの主な部分に分けることができる：
1）雌鶏の受精卵内の現役種の増殖、感染した尿膜液の収穫およびプールを経て「粗一価全ウイルスバルク」を得る（ステップ1）。
【０２７９】
2）各ウイルス株を精製して「精製一価全ウイルスバルク」を得る（ステップ2〜6）。
【０２８０】
3）デオキシコール酸ナトリウムによる精製一価全ウイルスバルクをスプリット処理して「精製一価スプリットウイルスバルク」を得る（ステップ7〜8/1）。
【０２８１】
4）精製一価スプリットウイルスバルクのデオキシコール酸ナトリウムとのおよびホルムアルデヒドとのインキュベーションによる2ステップの不活化と、次いで、限外濾過および滅菌濾過によって「精製一価不活化スプリットウイルスバルク」または「一価バルク」を得る（ステップ8/2〜8/9）。
【０２８２】
1）粗一価全ウイルスバルクの生産
ウイルス接種物の調製：
胚性卵（embryonic egg)の接種の日に、現役ウイルス種ロットを、25μg/mLヒドロコルチゾンおよび0.5mg/mLゲンタマイシン硫酸塩を含有するリン酸バッファーと混合することによって、接種物を調製する。ウイルス接種物を、接種まで室温にて保持する。
【０２８３】
胚性卵の接種：
11日齢の培養前胎生卵をウイルス複製用に使う。卵を、ホルムアルデヒド燻蒸後、生産室に移す。ほぼ120,000個の卵を0.2mLのウイルス接種物によりそれぞれ自動卵接種装置を用いて接種する。接種した卵を34.0℃にて72時間インキュベートする。
【０２８４】
インキュベーション期間が終わると、卵を目視で生存胚および年齢に十分な血管の存在について検査する。卵を冷却して死滅させ、12〜46時間、2〜8℃にて保存する。
【０２８５】
収穫
冷却した胎生卵から尿膜液（ほぼ12mL）を、卵収穫機により収穫する。尿膜液を、2〜8℃に温度制御したステンレススチールタンクに採集する。この段階の産物を「粗一価全ウイルスバルク」と呼ぶ。粗一価全ウイルスバルクは保存されずに、直ぐ清澄化ステップに移される。
【０２８６】
2）精製一価全ウイルスバルクの生産
全操作を2〜8℃で実施し、その後に限外濾過を室温で実施する。
【０２８７】
清澄化：
収穫した尿膜液を、連続の中速遠心分離により清澄化する。このステップは尿膜液の収穫中に採集されうる大粒子（例えば、卵殻の部分）を取除く。
【０２８８】
吸着ステップ：
このステップは、二塩基性リン酸水素カルシウムゲルへの吸着によるウイルス物質の沈降を介して、尿膜液をさらに清澄化することができる。
【０２８９】
二塩基性リン酸水素カルシウム（CaHPO4）ゲルを得るために、0.5mol/Lリン酸水素二ナトリウム（Na2HPO4）と0.5mol/L塩化カルシウム（CaCl2）を清澄化したウイルスプールに加えて、1L当たり1.87gCaHPO4の最終濃度に到達させる。
【０２９０】
少なくとも8時間〜最高36時間沈降の後、上清を取り除いて、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を8.7％EDTA二ナトリウム溶液を加えることによって再溶解する。
【０２９１】
濾過：
再懸濁したインフルエンザ沈降物を6μmフィルター膜を通して濾過し、残留する可能性のあるペレットを取除く。
【０２９２】
超遠心分離を通しての流動：
インフルエンザウイルスを、直線スクロース勾配（0〜55％）の等密度超遠心分離により流速8〜20リットル/時間にて、さらに精製し（タンパク質とリン脂質の除去）かつ濃縮する。勾配は0.01％チメロサールを含むスクロース溶液55％（w/w）と0.01％チメロサールを含むリン酸塩バッファーpH7.4とを用いて形成する。このプロセスは、遠心分離を室温で実施するので、プロセスの生物負荷を抑制するために、100±15μg/mLチメロサールの存在のもとで行う。
【０２９３】
次の4つの異なる画分を、屈折計を用いてスクロース濃度を測定することにより回収する：
画分4/1：55〜47％スクロース
画分4/2：47〜38％スクロース
画分4/3：38〜20％スクロース
画分4/4：20〜0％スクロース
画分4/2の上限は、高純度係数HA／タンパク質と全ウイルスの最大回収とがバランスするように選択する。画分4/2と4/3の間の限界は、画分4/2中の卵白アルブミン含量を最小化するように選択する。画分4/3の低限界は、低スクロース勾配範囲に見出されるHA含量に基づいて選択する。画分 4/2と4/3は、さらなる調製に使用する。ほとんどのウイルスは画分4/2に採集される。ウイルスとタンパク質の両方を含有する画分4/3をさらに精製する。最初に画分4/3のスクロース濃度を限外濾過により6％未満に低下させる（次の遠心分離ステップに必要）。次いで、画分4/3を遠心分離を介してペレット化して水溶性汚染物（タンパク質）を取除く。ペレットをリン酸塩バッファーpH7.4に再懸濁して十分に混合し、均質な懸濁液を得る。保持時間は画分4/3については最大36時間、画分4/2については最大60時間、精製画分4/3については最大36時間である。
【０２９４】
希釈
処理した画分4/3と無処理の画分4/2の両方の画分をプールし、60Lのリン酸バッファーpH7.4を加えて希釈する。 
この段階で、プールした物質は「精製一価全ウイルスバルク」に対応する。
【０２９５】
3）精製一価スプリットウイルスバルクの調製
デオキシコール酸ナトリウムの存在のもとでの超遠心分離を介する流動：
インフルエンザ ウイルスをスプリットし、かつ1.5％ デオキシコール酸ナトリウムを含有する直線スクロース勾配（0〜55％；スクロース溶液S8aおよびバッファーS6aを用いて形成した）を介する遠心分離によりさらに精製する。Tween-80は勾配中に0.1％で存在する。ウイルスを1時間当たり8リットルの速度で処理する。遠心分離の終わりに、3つの異なる画分を採集する。主画分（画分 7/2）の範囲は、スプリット処理条件の株に応じた検証に基づいて選択し、目的として専ら破壊されたインフルエンザウイルス抗原から成る画分を採集する一方、スプリット処理後のウイルス膜から来る残留全ウイルス粒子およびリン脂質をできるだけ最小化する。
【０２９６】
A/Vietnam/1194/2004 NIBRG-145については、画分7/2の範囲を20〜41％スクロースに設定する。赤血球凝集素抗原はほぼ1.2％デオキシコール酸ナトリウムを含有する画分7/2に濃縮される。この物質は「精製一価スプリットウイルスバルク」に対応する。
【０２９７】
4）精製した最終一価スプリット不活化ウイルスバルクの調製
濾過：
画分7/2を、0.025％Tween-80を含有するリン酸塩バッファーS7cで3倍希釈する。次いで、画分7/2を、大雑把に超音波をかけて（濾過を容易にするために）0.45μm濾過膜で徐々に濾過し、そして0.2μm膜を通して濾過する。濾過の終わりにフィルターを0.025％ Tween-80を含有するリン酸バッファー（S107c）を用いてすすぎ洗いする。濾過とすすぎ洗いの結果、濾液の最終体積は元来の画分7/2体積の5倍になる。
【０２９８】
デオキシコール酸ナトリウム不活化：
得られる溶液を22±2℃で少なくとも84時間インキュベートする。最初の不活化ステップを終えた後に、この物質をリン酸塩バッファーS7cを用いて希釈し、全タンパク質含量を計算濃度500μg/mLに減じる。
【０２９９】
ホルムアルデヒド不活化：
ホルムアルデヒドを計算最終濃度100μg/mLまで加える。不活化は、低密度ポリエチレン100Lバッグを1つ使用して、20±2℃で少なくとも72時間行われる。
【０３００】
限外濾過： 
不活化スプリットウイルス物質を、バッファーS7bとS1bを連続使用し、分子量カットオフ30,000ダルトンの膜を通して限外濾過する。体積低下の後、限外濾過（透析濾過）の間、その体積を0.01％Tween-80を含有するリン酸バッファーおよびリン酸バッファー生理食塩水（S1b）を加えることにより一定に留まらせる。限外濾過の間、ホルムアルデヒド、NaDocおよびスクロースの含量は低下する。この物質を15〜25リットルに濃縮し、最終濾過ステップに直接移す。
【０３０１】
滅菌濾過：
限外濾過の後に、スプリット不活化物質を徐々に濾過して0.2μm膜に取る。0.22μm滅菌グレード膜を通す最終滅菌濾過は、クラス100環境で実施する。濾過が終わると、フィルターを、0.01％ Tween-80を含有するリン酸バッファー生理食塩水溶液S1bを用いてすすぎ洗いする。ここで、次の貯蔵中の凝集を避けるために、濾液を1000μg/mL未満のタンパク質濃度まで希釈する。得られる物質は「精製一価不活化スプリットウイルスバルク」または「一価 バルク」である。
【０３０２】
貯蔵：
スプリット不活化インフルエンザH5N1ウイルスの最終一価バルクを2〜8℃にて、I型ガラスボトル中で最大18ヶ月間、貯蔵する。
【０３０３】
III.4.1.3.  AS03アジュバント添加H5N1を用いるワクチン組成物の調製
1）組成物
第I相臨床試験H5N1-007で評価する、AS03アジュバント添加不活化スプリットウイルスパンデミックインフルエンザ候補ワクチンは筋肉内投与を意図する。このワクチンは、I型ガラスバイアルで提供される濃縮不活化スプリットビリオン（H5N1）抗原と予め充填したI型ガラスシリンジに含有されるAS03アジュバントとから成る2成分ワクチンである。
【０３０４】
用事調製したAS03アジュバント添加パンデミックインフルエンザワクチンの1用量は1mlに対応する。その組成を表7に掲げる。研究H5N1-007は用量を見出す研究であるので、試験臨床ロットのそれぞれについての1用量当たりのHA含量は異なる。1用量は3.8、7.5、15または30μgHAを含有する。ワクチンは、その薬物の製造プロセスに由来する次の残留物を含有する：ホルムアルデヒド、卵白アルブミン、スクロース、チメロサールおよびデオキシコール酸ナトリウム。
【表７】
0005639760.tif 000008
【０３０５】
2）製剤
AS03アジュバント添加パンデミックインフルエンザワクチンの製造は次の3つの主要ステップから成る：
（a）アジュバント無添加スプリットウイルス最終バルク（2×濃縮）の製剤と抗原容器の充填、
（b）AS03アジュバントの調製とアジュバント容器の充填、
（c）AS03アジュバント添加スプリットウイルスワクチンの用事調製。
【０３０６】
1）アジュバント無添加最終バルクの製剤と抗原容器の充填
製剤のフローシートを図5に示す。一価バルクの体積は、製剤前に一価バルクで測定したHA含量と標的体積4000mlに基づく。最終バルクバッファー（製剤バッファー中の含量：塩化ナトリウム：7.699g/l；リン酸二ナトリウム十二水和物：2.600g/l；リン酸二水素カリウム：0.373g/l；塩化カリウム：0.2g/l；塩化マグネシウム六水和物：0.1g/l）および補正体積のTritonX-100（5％オクトキシノール10（TritonX-100）溶液）およびチメロサール（0.9％チメロサールストック溶液）を連続攪拌下で一緒に混合する。次いでモノバルクH5N1を、得られるバルクバッファー-TritonX-100-チメロサールで希釈して、最終バルク（30、15、7.5または3.8μgHA/500μl最終バルク）1ml当たり60/30/15/7.6μgH5N1の最終濃度とする。この混合物を30〜60分間攪拌する。pHが7.2±0.3であることをチェックする。Tween80を加える必要はなかった、というのは、モノバルク中に存在するTween80の濃度（822μg/ml）は濃度標的（12.26μg/μgHA）に十分到達するからである。
【０３０７】
最終バルクを滅菌状態で3ml滅菌I型（Ph. Eur.） ガラスバイアル中に充填する。各バイアルは0.65ml±0.05mlの体積を含有する。
【０３０８】
2）AS03滅菌アジュバントバルクの調製とアジュバント容器の充填
アジュバントAS03を、次の2成分の混合により調製する：SB62エマルジョンとリン酸バッファー。
【０３０９】
SB62エマルジョン
SB62エマルジョンの調製は、疎水成分（α-トコフェロールとスクアレン）からなる油相と、水溶性成分（Tween80とリン酸塩-生理食塩水バッファー、pH6.8）を含有する水相とを強く撹拌しながら混合することによって行う。攪拌しながら、油相（全容積の1/10）を水相（全容積の9/10）に移し、その混合物を15分間室温にて攪拌する。次いで、得られる混合物に、ミクロフルイダイザー（15000 PSI〜8 サイクル）の相互作用チャンバ内で剪断力、衝撃力、および空洞力にかけることにより、サブミクロン液滴（100〜200nmの間の分布）を作製した。得られるpHは6.8 ± 0.1の間である。次いでSB62エマルジョンを、0.22μm膜を通しての濾過によって滅菌し、滅菌バルクエマルジョンを、2〜8℃のCupac容器に冷蔵保存する。滅菌不活性ガス（窒素）を、少なくとも15秒間、SB62エマルジョンの最終バルク容器の死容積に一気に流す。
【０３１０】
SB62エマルジョンの最終的な組成は次の通りである（表8）：
【表８】
0005639760.tif 000009
【０３１１】
AS03アジュバント系
AS03アジュバント系は、バッファー（PBS mod）をSB62バルクと混合することにより調製する。混合物を15〜45分間室温で攪拌し、NAOH（0.05または0.5M）/HCl（0.03Mまたは0.3M）によってpHを6.8±0.1に調節する。さらに15〜20分間室温で攪拌し、pHを測定して混合物を、0.22μm膜を通す濾過により滅菌する。滅菌AS03アジュバントは1.25ml滅菌I型（Ph. Eur.）ガラスシリンジ中に無菌充填するまで、+2〜8℃で保存する。各シリンジは720μl（500μl+220μlで一杯になる）の全体積を有する。
【０３１２】
AS03 アジュバントの最終組成物は次の通りである（表9）：
【表９】
0005639760.tif 000010
【０３１３】
3）AS03アジュバント添加スプリットウイルスワクチンの用事調製
注射の時点で、予め充填したアジュバントを含有するシリンジの内容物を、濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原を含有するバイアル中に射出する。混合後に、内容物をシリンジ中に吸い込み、そして注射針を筋肉用注射針と取り替える。用事調製したアジュバント添加インフルエンザ候補ワクチンの1用量は1mlに対応する。
【０３１４】
III.4.2  ワクチン調製物
ワクチンを、利き腕でない方の腕の三角筋部に、筋肉内投与した。パンデミックインフルエンザ候補ワクチンは、バイアル（抗原容器）に入れて提供される抗原とアジュバント（アジュバント容器）または希釈剤のいずれかを含有する予め充填したシリンジとから成る2成分ワクチンである。注射の時点で、予め充填したアジュバントを含有するシリンジの内容物を、抗原を含有するバイアル中に射出する。混合後、内容物をシリンジ中に吸い込む。使用した注射針を筋肉用注射針と取り替える。ワクチンの1用量は1mlに対応する。
【０３１５】
IV.5  研究集団の結果
この試験では、合計400名の対象を登録し、それぞれ被験者49〜50名の8グループを作った。ワクチン接種時の、ワクチン接種した全コホートの平均年齢は、34.3歳であり、標準偏差は12.76歳であった。8種のワクチングループ全体にわたる被験者の平均年齢および性別分布は類似していた。
【０３１６】
IV.6  安全性の結論
ASO3アジュバント添加パンデミックインフルエンザ候補ワクチンの投与は安全であり、試験集団、すなわち18〜60歳の成人において臨床上十分に耐えられるものである。
【０３１７】
IV.7  免疫原性の結果
免疫原性の分析を、ATPコホート（394被験者）について行った。
【０３１８】
III.7.1.  液性免疫応答
AS03アジュバント添加パンデミックインフルエンザH5N1候補ワクチンにより誘発された液性免疫応答を評価するために、下記のパラメータ(95％信頼区間で)を各治療グループ毎に計算した。
【０３１９】
・0、21および42日のHI抗体力価の幾何平均力価(GMT)
・21および42日のセロコンバージョン率（SC）
・21および42日のコンバージョン係数
・21および42日の防護率
III.7.1.1  抗赤血球凝集素抗体応答
a）HI幾何平均力価（GMT）
95％CIでのHI抗体に関するGMTを、表10（抗HI抗体に対するGMT）および図6に示す。H5N1ワクチン接種株に対する抗体のワクチン接種前GMTは8つの研究グループで同じ範囲内にあった。初回ワクチン接種後、全てのアジュバント無添加のグループにおいて、抗赤血球凝集素抗体レベルは用量に依存して非常に穏やかに増加しただけであった。アジュバント添加したワクチン接種グループにおいては、抗赤血球凝集素抗体レベルのより顕著な増加が、初回ワクチン接種後、早くも観察され、最高のGMTは最高の抗原用量を受けたグループ（HN30AD）であった。第2ワクチン接種後、アジュバント無添加グループのGMTは初回ワクチン接種GMTをわずかに上回って増加した。対照的に、全てのアジュバント添加グループの第2ワクチン接種後に有意な最高GMTが観察され、用量に依存した形で3.8μg〜7.5μg〜15μg グループで増加が観察された。30μgグループについては、7.5μgに対するGMTより低いGMTが観察された。最低用量の3.8μg HAを含む、全てのアジュバント添加研究グループは、FDA草案ガイダンス（2006年3月）に基づく判定基準ならびにEMEAが設定した判定基準を満たす免疫応答を誘発した。
【表１０】
0005639760.tif 000011
【０３２０】
HN30   ＝ H5N1 30μg
HN15   ＝ H5N1 15μg
HN8    ＝ H5N1 7.5μg
HN4    ＝ H5N1 3.8μg
HN30AD ＝ H5N1 30μg + AS03
HN15AD ＝ H5N1 15μg + AS03
HN8AD  ＝ H5N1 7.5μg + AS03
HN4AD  ＝ H5N1 3.8μg + AS03
GMT ＝ 全被験者について計算した幾何平均抗体力価
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ 規定した範囲内の力価をもつ被験者の数／パーセント
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
MIN/MAX ＝ 最小／最大
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
データ源 ＝ 付表 IIIA
b）抗HI抗体力価のコンバージョン係数、血清防護率およびセロコンバージョン率（ヒトのインフルエンザワクチンに対して設定された防護相関要因）
結果を表11（コンバージョン係数）、12（血清防護率）および13（セロコンバージョン率）に掲げる。
【０３２１】
コンバージョン係数（表11、図9）は、0日と比較して21日および42日におけるワクチン株に対する血清HIGMTの倍数増加を表す。第2回ワクチン接種後のコンバージョン係数は、4つのアジュバント無添加グループでは1.2〜3.9で変化し、アジュバント添加グループでは27.9〜60.5で変化する。AS03アジュバント添加グループのコンバージョン係数は、成人に対するパンデミックの間期のワクチンに対する欧州機関が要求するGMTの2.5倍増加（表1に記載）より大幅に優れている。現在、パンデミック候補ワクチンに対して、パンデミックの間期のインフルエンザワクチンの年間認可に対して使われるのと同じ判定基準が適用されている。注目すべきは、最低抗原濃度を除く全てのアジュバント添加グループは初回ワクチン接種後に早くも≧2.5のコンバージョン係数を達成する。
【０３２２】
血清防護率（表12、図8）は、21日および42日に血清HI力価≧40の被験者の比率を表す。ワクチン接種前に、被験者のうちの3人（グループ HN15の1人、グループ HN8ADの1人およびグループHN4Dの1人）はワクチン株H5N1A/Vietnam/1194/2004に対する抗体の防護レベルを有することが見出された。H5N1について、ワクチン接種前に血清防護された個人は非常に低いパーセントであり、これは従来の研究の観察を立証するものであった（Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664； Treanor JJ ら N Engl J Med. 2006;354:1343-1351）。21日に、アジュバント無添加グループの血清防護率は0.0％〜28.6％の範囲である（表12）一方、アジュバント添加グループでは被験者の26.0％〜58.3％が防護力価を達成した。パンデミックインフルエンザ候補ワクチンの第2用量後、アジュバント無添加グループの被験者の4.0〜42.9 ％およびアジュバント添加グループの84.0％〜95.9％が防護とみなされる閾値（すなわち、HI力価≧ 1：40）以上の力価を有した。従って、アジュバント添加パンデミック候補ワクチンを受けた被験者（グループ15HNAD）の95.9％は2ワクチン接種後に血清HI力価≧40を有し、H5N1ワクチン接種株に対して防護されるとみなされた。全4種の候補製剤は、欧州機関が18〜60歳集団に要求する70％の血清防護率を超え、被験者の実質的な比率は初回用量後に早くも防護力価を達成する一方、アジュバント無添加の候補ワクチンはどれもこの判定基準に到達しなかった。
【０３２３】
セロコンバージョン率（表13、図7）は、0日と比較して21日および42日に、ワクチン接種前力価＜1：10でワクチン接種後力価≧1：40、またはワクチン接種前力価≧1：10で少なくともワクチン接種後力価の4倍増加のどちらかを有するワクチン受給者のパーセントを表す。初回ワクチン接種後、アジュバント無添加グループのセロコンバージョン率は0.0％〜14.9％の範囲にあった（表13）。対応するアジュバント添加研究グループにおいて、24.0％〜58.3％のセロコンバージョン率が初回ワクチン接種後に観察され、異なる抗原含量を受けている4アジュバント添加グループのうちの3グループが早くもEMEAの要件（18〜60歳集団で40％を超えるセロコンバージョン率が要求される）を超えた。第2のワクチン接種後、アジュバント無添加グループの被験者では4.0％〜40.8％、しかしアジュバント添加グループの被験者では82.0％〜95.9％がセロコンバージョン または 4倍増加のどちらかを達成した。従って、2回ワクチン接種後に、候補ワクチンの全4種のアジュバント添加製剤は、EMEAが設定した認可に対する判定基準を満たしたが、アジュバント無添加ワクチンはその最高用量だけがやっとこの閾値（HN30：40.8％）を達成しただけであった。
【表１１】
0005639760.tif 000012
【０３２４】
HN30   ＝ H5N1 30μg
HN15   ＝ H5N1 15μg
HN8    ＝ H5N1 7.5μg
HN4    ＝ H5N1 3.8μg
HN30AD ＝ H5N1 30μg + AS03
HN15AD ＝ H5N1 15μg + AS03
HN8AD  ＝ H5N1 7.5μg + AS03
HN4AD  ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ 規定した範囲内の力価をもつ被験者の数／パーセント
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
【表１２】
0005639760.tif 000013
【０３２５】
HN30   ＝ H5N1 30μg
HN15   ＝ H5N1 15μg
HN8    ＝ H5N1 7.5μg
HN4    ＝ H5N1 3.8μg
HN30AD ＝ H5N1 30μg + AS03
HN15AD ＝ H5N1 15μg + AS03
HN8AD  ＝ H5N1 7.5μg + AS03
HN4AD  ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％  ＝ 規定した範囲内の力価をもつ被験者の数／パーセント
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
【表１３】
0005639760.tif 000014
【０３２６】
HN30   ＝ H5N1 30μg
HN15   ＝ H5N1 15μg
HN8    ＝ H5N1 7.5μg
HN4    ＝ H5N1 3.8μg
HN30AD ＝ H5N1 30μg + AS03
HN15AD ＝ H5N1 15μg + AS03
HN8AD  ＝ H5N1 7.5μg + AS03
HN4AD  ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
PI（D21） ＝ ワクチン接種後、21日
PII（D42） ＝ ワクチン接種後、42日
データ源 ＝ 付表 IIIA
n/％ ＝ワクチン接種前力価＜1：10でワクチン接種後力価≧1：40、またはワクチン接種前力価≧1：10で少なくともワクチン接種後力価の4倍増加のどちらかを有する被験者の数／パーセント
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
結論：
インフルエンザパンデミックの場合、集団の大部分はパンデミックインフルエンザ株に対してナイーブであって、おそらく防護するために2用量のワクチンが必要であろう。アジュバント無添加H5N1候補ワクチン（H5N1が次のインフルエンザパンデミックを引き起こす有力候補である）は抗原の大量投与後でのみ免疫応答を誘発することがわかっているので、可能性のあるパンデミックワクチンの抗原含量を節減するためには、従ってワクチン供給を増加するためにはアジュバント戦略が採用される（Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006；354：1343-1351）。
【０３２７】
AS03を伴うH5N1パンデミックインフルエンザ候補ワクチンについての本明細書で報じた最初の試みでは、次の結果を得た：
・アジュバントASO3には、単味の抗原製剤と比較して、試験した全ての色々な赤血球凝集素投与について明らかな利点がある。第2ワクチン接種後に、HI抗体のGMTにおいて、アジュバント添加グループは明らかに優れていた：最低の抗原用量（3.8μg HA）を受けたアジュバント添加グループのGMTでも、最高の抗原用量（30μgのHAの2回注入）により誘発されてアジュバント無添加グループが達成した最高のGMTよりなお7.5倍高かった。24日のアジュバント添加グループのいずれかとアジュバント無添加グループのいずれかとの間で、95％CIの重複はなかった。
【０３２８】
・42日におけるセロコンバージョン率は、3.8μg、7.5μg、15μgおよび30μg＋アジュバントグループに対して、それぞれ、82.0％、90.0％、95.9％および85.6％であった。これは、試験したAS03アジュバントを添加した全4種の抗原含量について、欧州機関の要求する40％より優れることを示した。アジュバント無添加グループのうちの1つ、最高抗原用量グループ（30μg）だけが設定された閾値をやっと達成しただけである。
【０３２９】
・42日において、4種のアジュバント添加グループの血清防護率は、3.8μg、7.5μg、15μgおよび30μg＋アジュバント添加グループに対して、それぞれ、84.0％、90.0％、95.9％および85.4％であった。60歳未満の成人グループに対するEMEAの要求するパーセントは70％であり、従って、全てのアジュバント添加グループはこの判定基準を満たす一方、単味のアジュバント無添加グループはどれも要求される血清防護率を達成できなかった。
【０３３０】
・本研究において、異なる候補ワクチン接種による2回ワクチン接種の後、4つのアジュバント添加グループに対するセロコンバージョン係数は27.9より大きく、従って、2.5に設定された要求を大幅に上回った。アジュバント無添加グループについても、最高抗原用量（15μgおよび30μg）を受けた2グループは前記要求を満たして2.8（HN15グループ）および3.9（HN30グループ）であった。
【０３３１】
パンデミックインフルエンザ候補ワクチンの評価に対しても適用可能であるEMEAが設定した3つの判定基準について、全てのアジュバント添加グループは、ASO3をアジュバント添加したそれぞれのH5N1ワクチンの第2用量後に、この年齢グループに定義された全ての3つの判定基準を達成した。全てのアジュバント添加グループはまた、セロコンバージョン、血清防護およびコンバージョン係数に対してFDAが提案した判定基準も、第2用量後に達成した。
【０３３２】
III.7.1.2  抗赤血球凝集素抗体応答異種株
ワクチン株と抗原的に異なるH5N1株に対する免疫原性を評価することは、パンデミックワクチン候補の可能性をさらに評価することが可能になると考えられる。交差反応性試験を、ワクチン接種株を受給した被験者の血清について実施し、ワクチンにより誘発される抗体が抗原的に異なる株と反応する可能性を評価する。交差反応性の評価については、H5N1 A/インドネシア/5/2005を選んだ。H5N1A/インドネシアはクレード2に属するが、H5N1A/Vietnam/1194/2004、ワクチン株はクレード1に属し、かつWHOが発表した新しい遺伝グループ由来の第1のパンデミックワクチンプロトタイプ株である。両方の株はそれ故に抗原性は異なると考えることができる。
【０３３３】
a）研究H5N1-007におけるH5N1 Indonesiaに対する幾何平均力価および血清陽性（表14）
血清陽性は≧1：10のHI 抗体力価として定義した。全ての被験者は、Vietnam 株による初回ワクチン接種前にIndonesia株に対して血清陰性であった。第2のワクチン接種後、アジュバント添加グループの被験者の48％（3.8μgグループは28％、7.5μgグループは48％、15μgグループは26.5％、30μgグループは33.3％）までが血清陽性の状態を達成した。対照的に、3.8、7.5および15μgのアジュバント無添加抗原グループでは血清陽性を全く見出せない一方、最高のアジュバント無添加抗原グループ（30μg）においてわずかに2％（1名の被験者）がH5N1 Indonesia株に対して陽性であることを見出した。
【表１４】
0005639760.tif 000015
【０３３４】
HN30＝H5N1 30μg、HN15＝H5N1 15μg、HN8＝H5N1 7.5μg、HN4＝H5N1 3.8μg
HN30AD＝H5N1 30μg + AS03、HN15AD＝H5N1 15μg + AS03、HN8AD＝H5N1 7.5μg + AS03、HN4AD＝H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ 血清陽性被験者（HI力価＞＝1：10）の数／パーセント
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
GMT ＝ 幾何平均抗体 Titer
MIN/MAX ＝ 最小／最大
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
b）研究H5N1-007におけるH5N1 Indonesia株に対する血清防護（表15）
第2のワクチン接種後、アジュバント添加グループの被験者の32.0％までがワクチンに含有されてないIndonesia株に対して血清防護されていることを見出した。3.8μg、7.5μg、15μgおよび30μgアジュバント添加グループにおいて、20.0％、32.0％、20.4％および29.2％の被験者が第2のワクチン接種後にそれぞれ≧1：40の力価を有した。アジュバント無添加グループの被験者は誰も血清防護されなかった。
【表１５】
0005639760.tif 000016
【０３３５】
HN30＝H5N1 30μg、HN15＝H5N1 15μg、HN8＝H5N1 7.5μg、HN4＝H5N1 3.8μg
HN30AD＝H5N1 30μg + AS03、HN15AD＝H5N1 15μg + AS03、HN8AD＝H5N1 7.5μg + AS03、HN4AD＝H5N1 3.8μg + AS03
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ 血清陽性被験者 （HI 力価 ＞＝ 1：40）の数／パーセント
n/％ UNPROT＝ 非防護被験者の数／パーセント（HI 力価 ＜ 1：40）
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
c）研究H5N1-007におけるH5N1 Indonesia株に対するセロコンバージョン（表16）
アジュバント添加グループの被験者の32.0％までがワクチンに含有されてないIndonesia 株に対してセロコンバージョンを達成した。3.8μg、7.5μg、15μgおよび30μgアジュバント添加グループにおいて、20.0％、32.0％、20.8％および29.2％の被験者が第2のワクチン接種後にそれぞれセロコンバージョンを受けた。アジュバント無添加グループの被験者は誰もセロコンバージョンを実証できなかった。
【表１６】
0005639760.tif 000017
【０３３６】
HN30＝H5N1 30μg、HN15＝H5N1 15μg、HN8＝H5N1 7.5μg、HN4＝H5N1 3.8μg
HN30AD＝H5N1 30μg + AS03、HN15AD＝H5N1 15μg + AS03、HN8AD＝H5N1 7.5μg + AS03、HN4AD＝H5N1 3.8μg + AS03
PI（D21） ＝ ワクチン接種後、21日
PII（D42） ＝ ワクチン接種後、42日
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ セロコンバージョンを受けた数（規定された時点後）／パーセント
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
d）研究H5N1-007におけるH5N1 Indonesia株に対するセロコンバージョン係数
試験において、アジュバント添加グループは2〜2.8の間のセロコンバージョン係数を達成した。3.8μg、7.5μg、15μg および 30μgアジュバント添加グループにおいて、セロコンバージョン係数はそれぞれ2.0、2.8、2.1 および 2.3であった。
【０３３７】
e）H5N1 A/Indonesia株に対する交差反応データについての結論
結論として、AS03アジュバントを用いてアジュバント添加したスプリットウイルス候補ワクチンの2用量の後、そのワクチン株と異なるクレード由来のH5N1株（アジアにおいてヒトにかなりの罹患率と死亡率を引き起こしたことのある株）に対して得た交差反応データは陽性であった。48％までの被験者が初回刺激されている徴候を示しかつ32％までの被験者が実際に非ワクチン株に対して血清防護された。これらの結果は、パンデミックワクチンのアジュバント添加がワクチン候補で用いられるパンデミック株のドリフト変種に対して交差反応性を提供できることを示す。これらの結果は、このアジュバント添加ワクチンの初回刺激および交差初回刺激の可能性を立証するものである。
【０３３８】
III.7.1.3  同種の株、H5N1 A/Vietnamに対する中和抗体応答
中和アッセイは、インフルエンザウイルスの細胞中への結合、貫入ならびに増殖を抑制する抗体の定量を可能にする方法である。赤血球凝集素抑制アッセイでは血清防護閾値が設立されるが、本アッセイではそうでない。代わりに、中和力価の4倍増加を用いて、ワクチン接種された個人がワクチン接種株または異種株に対して応答したかどうかを評価する。セロコンバージョン率は、CHMP/FDAが候補インフルエンザワクチンの有効性を評価するために用いる主な免疫原性パラメーターの1つである。ドリフト株を用いるかかる中和アッセイにおける血清サンプルの試験は、少なくとも、ワクチン株と異なる所与の株に対して「初回刺激」されている個人の頻度を予測することを可能にしうる。
【０３３９】
a）研究H5N1-007においてH5N1 Vietnamに対する中和アッセイで測定した幾何平均力価および血清陽性（表17）
血清陽性の閾値を≧1：28の力価に設定する、この中和アッセイはまた、高感度の試験でもある。0日のGMTはアジュバント無添加グループで14.0〜18.1、アジュバント添加グループで18.5〜25.2の範囲にある。第2のワクチン接種後、力価はアジュバント無添加グループでは、用量に応じて、3.8、7.5、15 および 30μg グループに対してそれぞれ43.9、61.7、86.9 および 177.8に増加した。アジュバント添加グループでは、3.8、7.5、15 および 30μg グループに対してそれぞれ381.0、421.2、464.7 および 333.3の力価を達成し、HI力価でなされた観察を正確に再現した；3.8μgから7.5μgを越えて15μgまでのアジュバント添加グループについて用量に応じたGMTの増加が観察された（表17）。
【表１７】
0005639760.tif 000018
【０３４０】
HN30 ＝ H5N1 30μg； HN15 ＝ H5N1 15μg； HN8 ＝ H5N1 7.5μg； HN4 ＝ H5N1 3.8μg
HN30AD ＝ H5N1 30μg + AS03； HN15AD ＝ H5N1 15μg + AS03； HN8AD ＝ H5N1 7.5μg + AS03； HN4AD ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ 血清陽性被験者（HI力価＞＝1：10）の数／パーセント
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
GMT ＝ 幾何平均抗体力価
MIN/MAX ＝ 最小／最大
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
b）研究H5N1-007においてH5N1 Vietnam株に対する中和抗体力価のセロコンバージョン率（表18）
先に述べたように、4倍増加をインフルエンザ株に対するセロコンバージョンを決定するために用いる。それ故に、0日に血清陽性の被験者は、もし4倍増加を達成したときだけ含まれ、それにより潜在的バックグラウンドを差し引く。
【０３４１】
第2用量以後、アジュバント無添加グループのセロコンバージョンは再び用量に応じて観察することができ：3.8、7.5、15および30μgグループでそれぞれ20.9、37.5、53.5および76.0％の被験者がセロコンバージョンされた。アジュバント添加グループでは、3.8、7.5、15および30μgグループでそれぞれ86.0、83.3、86.0および100.0％の被験者がセロコンバージョンされ、ここでもまた、HI結果が確認された。注目すべきは、アジュバント添加ワクチンの初回用量の後に、早くも、4つのアジュバント添加グループの被験者の66.7〜88.0％がセロコンバージョンしていた。
【表１８】
0005639760.tif 000019
【０３４２】
HN30 ＝ H5N1 30μg； HN15 ＝ H5N1 15μg； HN8 ＝ H5N1 7.5μg； HN4 ＝ H5N1 3.8μg
HN30AD ＝ H5N1 30μg + AS03； HN15AD ＝ H5N1 15μg + AS03； HN8AD ＝ H5N1 7.5μg + AS03； HN4AD ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ セロコンバージョンを受けた数／パーセント（少なくとも4倍増加（時点後））
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
Vietnam株に対するGMT力価およびセロコンバージョン率を10Aおよび10Bにそれぞれ図解する。結論として、ワクチン株（Vietnam）に対して測定した中和抗体はHIにより得た結果を立証する。3.8μgの最低用量グループを含むすべてのアジュバント添加グループは、パンデミック候補ワクチンの初回用量後に試験した被験者の65％を超える、第2の用量後に試験した被験者の80％を超えるセロコンバージョンを達成した。
【０３４３】
III.7.1.4  異種株、H5N1 A/Indonesiaに対する中和抗体応答
部分的データ（3.8μgおよび7.5μgHAアジュバント添加グループだけの）を以下に記載する。既に考察したとおり、ウイルスの結合の抑制だけでなく、インフルエンザウイルスの細胞中への貫入および細胞から細胞への伝播を抑制する抗体を測定する中和アッセイの性質によって、ドリフト株を評価することにより、非ワクチン株に対しても初回刺激するワクチンの能力を評価することが可能になる。
【０３４４】
a）H5N1-007においてH5N1 A/Indonesia株に対する中和アッセイで測定した幾何平均力価および血清陽性（表19）
2つの最低アジュバント添加グループにおいて、ワクチンの2用量後に達成されるIndonesia株に対するGMTは、3.8μgおよび7.5μgアジュバント添加グループについてそれぞれ70.6および73.1であった。
【表１９】
0005639760.tif 000020
【０３４５】
HN8AD ＝ H5N1 7.5μg + AS03、
HN4AD ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ 血清陽性被験者（HI力価＞＝1：10）の数／パーセント
95％ CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
GMT ＝ 幾何平均抗体力価
MIN/MAX ＝ 最小／最大
PRE ＝ ワクチン用量接種前（0日における）
PI（D21） ＝ ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ ワクチン接種後（42日における）
b）研究H5N1-007においてH5N1 A/Indonesiaに対する中和抗体力価に対するセロコンバージョン率（表20）
3.8および7.5μgアジュバント添加グループの両方は、抗原的に異なる非ワクチン接種株に対して高いセロコンバージョン率を受けた：A/Indonesia 株に対して試験すると、被験者の84.2％がセロコンバージョンされた。
【表２０】
0005639760.tif 000021
【０３４６】
HN8AD ＝ H5N1 7.5μg + AS03、
HN4AD ＝ H5N1 3.8μg + AS03
PRE ＝ ワクチン接種前用量（0日における）
PI（D21） ＝ 初回ワクチン接種後（21日における）
PII（D42） ＝ 第2のワクチン接種後（42日における）
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
n/％ ＝ セロコンバージョンを受けた数／パーセント（少なくとも4倍増加（時点後））
95％CI ＝ 95％信頼区間； LL ＝ 下限、UL ＝ 上限
中和アッセイにおける交差反応性の利用しうるデータは、試験したIndonesia 株にとって異種株を含有するアジュバント添加ワクチンの顕著な効果を示し、候補ワクチンの交差反応性能力を立証する。
【０３４７】
III.7.1.5  細胞媒介性免疫（CMI）
CMIの評価については、I.2、I.3、および IV.3.2節を参照されたい。ワクチンの免疫原性を増強する上での、アジュバントの重要な特徴の1つは、細胞媒介性免疫、CMIを刺激する能力である。この試験において、Th1に関係するサイトカインの頻度を含むインフルエンザ特異的CD4-およびCD8-細胞の評価、ならびに記憶B細胞の頻度の評価が予知された。ASO3アジュバント添加または無添加の2つの最低抗原グループのT細胞応答に対するデータが利用しうる。CMI結果はサイトカイン陽性CD4 T細胞の頻度として表現される。
【０３４８】
メジアン値（第1および第3四分位を含む、表21を参照）を図11に掲げる。この結果は、アジュバント添加したグループは、アジュバント無添加グループと比較して、明らかにはるかに強いCD4応答を誘発することを示した。
【表２１】
0005639760.tif 000022
【０３４９】
0005639760.tif 000023
【０３５０】
0005639760.tif 000024
【０３５１】
HN8 ＝ H5N1 7.5μg
HN4 ＝ H5N1 3.8μg
HN8AD ＝ H5N1 7.5μg + AS03
HN4AD ＝ H5N1 3.8μg + AS03
N ＝ 利用しうる結果のある被験者数
N ミス ＝ 結果の無い被験者数
GMT ＝ 幾何平均抗体力価
SD ＝ 標準偏差
Q1,Q3 ＝ 第1および第3四分位
MIN/MAX ＝ 最小／最大
推定解析において、初回ワクチン接種後の21日（IFN γ陽性CD4細胞を除く）と第2のワクチン接種後の42日の両方で、アジュバント添加グループでは、同じ用量を受けたアジュバント無添加グループと比較して、サイトカイン陽性CD4細胞の誘発が有意に高いことが立証された。それ故に、ワクチンにより誘発された抗体の血清学的評価に見られるアジュバント効果は、CMI結果によって立証された。類似の方式で、この解析は、CMIに与える効果が明らかにアジュバントによるものであって、用量によるものでないことを示し（3.8μgと7.5μg用量だけの比較）、これはHI結果と一致する（表22を参照）。
【表２２】
0005639760.tif 000025
【０３５２】
HN8 ＝ H5N1 7.5μg
HN4 ＝ H5N1 3.8μg
HN8AD ＝ H5N1 7.5μg + AS03
HN4AD ＝ H5N1 3.8μg + AS03
結論として、潜在的パンデミック株A/Vietnamと組合わせたASO3は、試験した2つの最低抗原用量によって細胞媒介性免疫応答を刺激することができた。さらに、アジュバント添加グループにおいて観察された応答は、アジュバント無添加グループにより誘発されたCD4応答より強かった。
【０３５３】
IV.8.全体の結論
IV.8.1.  反応原性と安全性の結果
次のインフルエンザのパンデミックに対する有望な候補は、鳥類ウイルスH5N1であり、これは鳥類からヒトへの伝染の場合、高い死亡率をもたらしたが、効率的なヒトからヒトへの伝染は完全に立証されてない。もしH5N1がグローバルな輸送ネットワークと組んでヒトからヒトへ効率的に伝播する能力を示せば、その結果、容易に広範なインフルエンザが発生し、高いパーセントの個人を冒し、全ての国々で死亡率および罹患率の増加をもたらしうる。
【０３５４】
それ故に、ワクチン接種のための免疫学的に有効でかつ抗原を節約する手法を確立してパンデミックの潜在的な破壊効果を防止しなければならない。これは好適なアジュバントを用いることにより達成できるのであり、初めて、新規アジュバントのH5N1候補ワクチンに与える免疫原性増強効果を本発明の試みにおいて示すことができた。
【０３５５】
本研究は（1）水中油型エマルジョン、すなわち、AS03を添加または無添加したパンデミックインフルエンザ候補ワクチンの、健常な成人における安全性と反応原性、および（2）抗体および細胞媒介性免疫応答を評価するために設計した。
【０３５６】
反応原性データは、アジュバント添加パンデミック候補ワクチンがアジュバント無添加グループよりもっと局所的かつ全体的な症候群を（抗原含量とは独立して）誘導したことを示す。しかし、全ての4つのアジュバント添加グループの安全性プロファイルは臨床的に容認できるものであった。重篤な有害事象は報じられなかった。
【０３５７】
これらの結果から、AS03アジュバント添加したパンデミック候補ワクチンの反応原性および安全プロファイルは満足なものであって臨床上容認しうると結論することができる。
【０３５８】
IV.8.2.  免疫原性の結果
免疫原性について、ASO3をアジュバント添加したパンデミックインフルエンザ候補ワクチンは、試験した全ての抗原含量（3.8μg、7.5μg、15μgおよび30μg HA、H5N1 A/Vietnam/1194/2004）で、パンデミック候補インフルエンザワクチンの評価の基準として現在用いられる、スプリットビリオンインフルエンザ ワクチンの年登録に対する欧州機関の要件（“Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines” for the immuno-logical assessment of the annual strain changes -CPMP/BWP/214/96）を越えるものであった（Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza marketing authorization application, CPMP/VEG/4717/03）。
【０３５９】
この試みで試験したアジュバント添加パンデミックインフルエンザ候補ワクチン用の4つの異なる抗原含量は、HIで測定してインフルエンザ赤血球凝集素に対して優れた抗体応答を生じる健常な成人の免疫原性であった（表23）。
【表２３】
0005639760.tif 000026
【０３６０】
抗原的に異なる株、H5N1 A/ Indnesia/5/05に対する交差反応性を赤血球凝集素抑制アッセイによって評価するデータは、さらに、ドリフト株に対するアジュバント添加グループのワクチン受給者の交差初回刺激を示した。血清学的尺度は、同種および異種株に対する中和アッセイを用いる評価により完全なものになった。中和アッセイによっても、ワクチン候補の免疫原性と交差防護の可能性を確認することができた。
【０３６１】
総括すると、2用量の新規アジュバント添加パンデミックインフルエンザ候補ワクチンは、試験した最低用量の3.8μgで、ワクチン株H5N1 A/Vietnam/1194/2004に対する防護力価を、非常に高比率の被験者において誘導し、インフルエンザワクチンの免疫原性を評価するために確立された全ての判定基準を超える。さらに得られた結果は、ドリフト株に対する免疫を誘導する候補パンデミック前ワクチンの能力を実証している。
【０３６２】
この結果は、パンデミックの状況のもとで血清防護を達成するための請求の範囲に記載のワクチン組成物の使用であって、広まっているパンデミック株と異種の株を含むワクチンを用いてパンデミック前の初回刺激を行う前記使用を支持する。換言すれば、請求の範囲に記載の組成物は、ドリフトパンデミック株に対するその後の応答に対して初回刺激するために使用することができる。この結果は、AS03アジュバント添加したパンデミック一価（H5N1）インフルエンザワクチンの異種および同種の1および2用量の初回刺激-追加免疫使用における、請求の範囲に記載の組成物の使用：すなわち、
・選択した用量で低いHA量を含む1種のパンデミック株（例えば、Vietnam株）を含有するアジュバント添加したワクチンの1または2用量を用いて患者を初回刺激すること
・次いで数か月後に（例えば、6または12ヶ月後に）、i）同じパンデミック株（例えば、Vietnam株、すなわち、同種の初回刺激-追加免疫）またはii）異種（例えば、Indonesia株、すなわち、異種の初回刺激-追加免疫）株のどちらかの1用量を追加免疫として与えることを支持するものである。
【０３６３】
このアジュバント添加したワクチンの価値は、個人がパンデミック勃発の前にまたは同じ頃に「パンデミック」と同じまたは異なる株のどちらかで1回もしくは2回初回刺激された後に、パンデミックが宣言された状況で重要な役割を果たしうる。
【図１Ａ−１】
0005639760.tif 000027
【図１Ａ−２】
0005639760.tif 000028
【図１Ａ−３】
0005639760.tif 000029
【図１Ｂ】
0005639760.tif 000030
【図２Ａ】
0005639760.tif 000031
【図２Ｂ】
0005639760.tif 000032
【図３】
0005639760.tif 000033
【図４】
0005639760.tif 000034
【図５】
0005639760.tif 000035
【図６】
0005639760.tif 000036
【図７】
0005639760.tif 000037
【図８】
0005639760.tif 000038
【図９】
0005639760.tif 000039
【図１０Ａ】
0005639760.tif 000040
【図１０Ｂ】
0005639760.tif 000041
【図１１】
0005639760.tif 000042