(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株を培養し、培養物よりビタミンＫ２を採取することを特徴とするビタミンＫ２の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、枯草菌の変異株を用いたビタミンＫ２の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、血液凝固に必要な因子として知られており、このビタミンの欠乏は血液凝固能の低下をもたらすので抗出血性ビタミンとも呼ばれる脂溶性ビタミンの一種である。近年、ビタミンＫには骨形成促進作用及び骨吸収抑制作用があり、ビタミンＫの投与で骨密度が増加することが明らかにされ、骨粗しょう症の予防薬や治療薬として期待されている。
【０００３】
ビタミンＫは、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２群という２種の形で自然界に存在する。ビタミンＫ１（フィロキノン）は緑色植物に含まれ、Ｋ２群（メナキノンＭＫ）は、腸内細菌を含めた動物およびいくつかの細菌に含まれる。
ビタミンＫ２群は、側鎖長の違いによりメナキノン−１〜１４（ＭＫ−１〜１４）の同族体（１〜１４は、イソプレノイド残基の数を表す）が知られている。これらのうち、特にメナキノン−７（単に「ＭＫ−７」ともいう）は、ビタミンＫ２の代表的な物質である。
【０００４】
ビタミンＫ２は、自然界では納豆でも微量にしか存在しない上、半減期が短いため、単離が非常に困難である。従って、ビタミンＫ２を納豆菌等の微生物を用いて大量に生産することが試みられ、例えば、大豆煮汁や豆腐粕等に納豆菌を接種して発酵させることによりビタミンＫを生産する方法（例えば特許文献１）、また、バシラス・サブチリスの変異株ＧＮ１３／７２（特許文献２）やメナジオン耐性変異株（非特許文献１）を用いてビタミンＫ２を生産する方法、フラボバクテリウム属に属する微生物の培養液からビタミンＫ２を採取する方法（例えば特許文献３）が報告されている。しかしながら、その生産性は未だ十分とは云えない。
【０００５】
一方、微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。
【０００６】
枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が生育に必須であることが指摘され（非特許文献２）、本出願人は、枯草菌に由来する遺伝子破壊株を網羅的に解析し、枯草菌ゲノムの大量域を欠失させ、各種酵素の生産性に優れた変異株を見出すことに成功している（特許文献４）。
【０００７】
しかしながら、枯草菌のゲノム欠失株を用いてビタミンＫ２の生産を試みることはこれまでに行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−２９５３９３号公報
【特許文献２】特開２００７−１８１４６１号公報
【特許文献３】特公平７−２８７４８号公報
【特許文献４】特開２００７−１３００１３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001) 26, 115-120
【非特許文献２】K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、枯草菌のゲノム欠失株を用いて、ビタミンＫ２を効率よく生産する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ビタミンＫ２生産能を有する枯草菌を培養してビタミンＫ２を生産する方法について検討したところ、枯草菌ゲノムの大量域を欠失させた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株を用いた場合にビタミンＫ２（ＭＫ−７）を効率よく生産できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株を培養し、培養物よりビタミンＫ２を採取することを特徴とするビタミンＫ２の製造方法に係るものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ビタミンＫ２を効率よく製造することができ、骨粗しょう症の予防・治療薬等として有用なビタミンＫ２のより効率的な生産が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を説明するための模式図である。
【図２】枯草菌168株から168Δupp株を作製する手順を説明するための模式図である。
【図３】cat-uppカセットＤＮＡ断片を挿入してなる組換えプラスミドpBRcatuppを作製する手順を説明するための模式図である。
【図４】Δ欠失標的領域::cat-upp株を作製する手順を説明するための模式図である。
【図５】Δ欠失標的領域株を作製する手順を説明するための模式図である。
【図６】Δ欠失標的領域::tet株を作製する手順を説明するための模式図である。
【図７】pBRcatuppΔ欠失標的領域を用いて、所定の変異株における欠失標的領域を欠失させる手順を説明するための模式図である。
【図８】枯草菌MGB874株の作製過程を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、ビタミンＫ２とは、ビタミンＫ２群、すなわちメナキノン−１〜１４（ＭＫ−１〜１４）を意味するが、好ましくはＭＫ−７が挙げられる。
【００１６】
本発明において、用いられる枯草菌変異株MGB874株は、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）を野生株とし、そのゲノムの大領域、すなわちprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域、yeeK-yesX領域、pdp-rocR領域、ycxB-sipU領域、SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK)領域、sbo-ywhH領域、yybP-yyaJ領域及びyncM-fosB領域を欠失させたものである（前記特許文献４参照）。
尚、枯草菌Bacillus subtilis Marburg １６８株は、Bacillus subtilis Marburg を親株としてYale大学のPaul Burkholder および Norman GilesによってX線照射によりトリプトファン要求性となった変異株である[Burkholder, P. R., and N. H. Giles. Am. J. Bot., 34, 345-348(1947)]。
【００１７】
枯草菌変異株MGB874株は、枯草菌ゲノム上から、上記の欠失領域を欠失させることにより製造することができ、斯かる領域を欠失させる方法としては、例えば図１に示す以下の方法を適用することができる。
すなわち、いわゆるSOE-PCR法（Gene,77,61 (1989)）によって調製される欠失用DNA断片を挿入した欠失用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いる方法によって、上記の欠失領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる。本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象領域の上流に隣接する約0.1〜3kb断片（上流断片と称する）、同じく下流に隣接する約0.1〜3kb断片が結合したDNA断片（下流断片と称する）とを連結したDNA断片である。また当該DNA断片の下流或いは上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させたDNA断片を用いることもできる。
【００１８】
まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに必要に応じて薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製する。この際、結合対象となるDNA断片の末端10〜30塩基対の配列を付加したプライマーを設計する。例えば、上流断片及び下流断片をこの順で結合させる場合、上流断片の下流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、下流断片の上流側10〜30塩基に相当する配列を付加し、また下流断片の上流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、上流断片の下流側10〜30塩基に相当する配列を付加する。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片及び下流断片を増幅した場合、増幅された上流断片の下流側には下流断片の上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片の上流側には上流断片の下流側に相当する領域が付加されることとなる。
【００１９】
次に１回目に調製した上流断片及び下流断片を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマー及び下流断片の下流側に位置する（アニールする）プライマーからなる1対のプライマーを用いて２回目のPCRを行う。この２回目のPCRにより、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用DNA断片を増幅することができる。
【００２０】
なお、欠失用DNA断片に薬剤耐性マーカー遺伝子断片を連結する場合には、１回目のPCRにおいて、下流断片の下流側に相当する領域を付加するように、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を増幅する。さらに2回目のPCRにおいて、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側に位置する（アニールする）プライマーからなる一対のプライマーを使用する。これにより、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の順で結合した欠失用DNA断片を増幅することができる。
【００２１】
また、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用DNA断片を2回目のPCRによって増幅した後、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに欠失用DNA断片を挿入することで、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片をこの順で有する欠失用DNA断片を調製しても良い。
【００２２】
更に、上述の方法などによって得られる欠失用DNA断片を、通常の制限酵素とDNAリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されないプラスミドDNA、又は温度感受性プラスミド等、容易に除去できるプラスミドDNAに挿入することによって、欠失導入用プラスミドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミドDNAの例としては、例えば枯草菌を宿主とする場合、pUC18、pUC118、pBR322などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
次いで、欠失用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）などによって行い、プラスミドに挿入された上流断片或いは下流断片とゲノム上の相同領域間での１重交差の相同組換えによって欠失用プラスミドが宿主菌ゲノムDNA内に融合した形質転換体を得る。形質転換体の選択には欠失導入用プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子による薬剤耐性を指標に行えば良い。
【００２４】
かくして得られる形質転換体のゲノム上には欠失すべきゲノム上の薬剤耐性遺伝子の上流領域及び下流領域の配列について、宿主菌ゲノム由来と欠失用プラスミドに由来するものが重複して存在している。この上流領域又は下流領域のうち、形質転換体を獲得する際に相同組換えした領域と異なる領域でゲノム内相同組換えを起こさせることにより、欠失用プラスミド由来の領域と共にゲノム上の薬剤耐性遺伝子など欠失すべき標的遺伝子の欠失が生じる。ゲノム内の相同組換えを起こさせる方法としては、例えばコンピテンスを誘導する方法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）が挙げられるが、単に通常の培地での培養中においても自然誘発的に相同組換えが生じる。目的通りにゲノム内相同組換えを起こした菌株は同時に薬剤耐性遺伝子を欠失して薬剤に対する耐性能を失うため、薬剤感受性となった菌株より選択することができる。こうした菌株からゲノムDNAを抽出し、PCR法などによって目的遺伝子の欠失を確認すれば良い。
【００２５】
目的の欠失株を選択する際、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択することは難しく、またゲノム内での相同組換えは約10-4以下の低い頻度で生じるものと考えられる。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在比率を高めるなどの工夫を施すことが望ましい。薬剤感受性株の濃縮方法としては、例えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質が、増殖細胞に対して殺菌的に作用し、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法（Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970)）などが挙げられる。アンピシリンなどによる濃縮を行う場合、例えばテトラサイクリンやクロラムフェニコールなどの様に宿主細胞に対して静菌的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子の欠失に関して有効である。こうした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地において、当該薬剤耐性遺伝子を保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐性遺伝子を欠失した感受性株は増殖も死滅もしない。この様な条件下において適当な濃度のアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しようとする耐性株が死滅する一方、感受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果として感受性株の存在比率が高まることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を適当な寒天培地に塗抹、培養し、出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の有無をレプリカ法などによって確認することにより、効率的に感受性株を選択することが可能となる。
【００２６】
以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株を製造することができる。さらに、複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株は、いわゆる、LP(lysis of protoplasts)形質転換方法によって製造することができる。LP形質転換法は、『T. Akamatsu及びJ. Sekiguchi, 「Archives of Microbiology」, 1987年, 第146巻, p.353-357』及び『T. Akamatsu及びH. Taguchi, 「Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry」, 2001年, 第65巻，第4号, p.823-829』を参照することで利用することができる。すなわち、LP形質転換法では、細胞壁を溶解させたプロトプラストを供与体DNAとして、レシピエント菌株のコンピテントセルに供与する。添加されたプロトプラストは浸透圧ショックにより破壊され、培養液中に放出された供与体DNAがレシピエント菌株のコンピテントセルに取り込まれるものと考えられている。また、LP形質転換方法によれば、一般的な形質転換方法に比べて、導入すべきDNAの損傷は大幅に軽減する。
【００２７】
このLP形質転換法を適用することによって、単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株から複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株をあらたに製造することができる。具体的には、先ず、特定の領域（第１の欠失領域と呼ぶ）を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株をプロトプラスト化し、異なる領域を（第２の欠失領域）を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株のコンピテントセルと共存させる。これにより、第１の欠失領域を有するゲノムDNA（供与体DNA）と、第２の欠失領域を有するゲノムDNA（宿主DNA）との間で一組の鎖間交換構造を形成することとなる。この一組の鎖間交換構造が供与体DNAにおける第１の欠失領域を挟み込んだ位置で生じることによって、供与体DNAにおける第１の欠失領域が宿主DNAに導入されることとなる。このようにして、LP形質転換法を適用することによって、第１の欠失領域及び第２の欠失領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株を製造することができる。この方法を応用すれば、成育に必須な遺伝子を欠失しない限り、複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株を製造することができる。
枯草菌変異株MGB874株の具体的な製造法を、後記参考例に示した。
【００２８】
本発明の枯草菌の培養に使用する培地には、枯草菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
例えば、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖等の二糖類又は可溶性澱粉等の多糖類等、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、各種動植物由来のタンパク質を酸あるいは酵素により分解した成分、または各種アミノ酸等を配合した公知の培地を使用することができる。
また、無機塩としては、ビタミンＫ２を良好に産生できうるものであれば特に制限されないが、具体的には、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。
【００２９】
本発明の枯草菌の培養に使用できる培地としては、具体的には、例えば以下に示すＬＢ培地、２ｘＬ−マルトース培地、グルコース・ブイヨン培地、肉汁培地、２ＳＹ培地(P2002-238569A)、ＴＭ培地(P2002-238569A)、ＭＭＧ培地(Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 369-373)等が挙げられる。
【００３０】
【表１】
0005432635.tif 000002
【００３１】
【表２】
0005432635.tif 000003
【００３２】
【表３】
0005432635.tif 000004
【００３３】
【表４】
0005432635.tif 000005
【００３４】
【表５】
0005432635.tif 000006
【００３５】
【表６】
0005432635.tif 000007
【００３６】
【表７】
0005432635.tif 000008
【００３７】
培養は、従来公知の方法と同様にして行うことができ、その際の培養条件は、培地の組成及び培養法によって適宜選択され、菌株が増殖しビタミンＫ２を効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。
例えば、培養温度は、通常、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃であり、培養時間も特に限定されないが２４〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間であり、必要により通気や攪拌を加えてもよい。
【００３８】
また、培養に適当な培地のｐＨは、通常、６．０〜９．５、好ましくは６．５〜８．５である。尚、ｐＨ調整には、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。
【００３９】
後記実施例に示すように、上記の条件下で枯草菌変異株MGB874株を培養すると、約４８時間程度の短期間の培養で、ビタミンＫ２（ＭＫ−７）が菌体内及び/又は培地中に蓄積されるので、生成量が最大になった時点で培養を終了させ、常法により培養物からビタミンＫ２を単離・精製して採取することができる。
【００４０】
ビタミンＫ２の単離及び精製は、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム等の有機溶剤やこれらと水との混合溶剤を用いて抽出し、シリカゲル、アルミナ、セファデックス等によるカラムクロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィー等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることにより行うことができる。
【実施例】
【００４１】
実施例1  ビタミンＫ２の製造
枯草菌168株及びMGB874株｛(Biotech. Appl. Biochem. 46:169-178 2007)(DNA research 15, 73-81 2008)（特開２００７−１３００１３号公報）｝を、それぞれ5mLのＬＢ培地にて一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.6 mLを30 mLの2ｘLマルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース1水和物、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物）に接種し、30℃にて2日間振盪培養を行った。培養液から遠心分離により上清を除き、得られた菌体に水とメタノールを加えて磨砕し、ろ過した。ろ液を2-プロパノールで適宜希釈して高速液体クロマトグラフ法（還元カラム-蛍光分光光度計）で分析し、培養液当たりのMK-7の生産量及び菌体当たりのMK-7の生産量を測定した。結果を表８に示す。
【００４２】
尚、枯草菌変異株MGB874株は、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）より、前記特許文献４に記載の方法により作製した。
【００４３】
【表８】
0005432635.tif 000009
【００４４】
表８より、枯草菌変異株MGB874株では、２日間の培養で、168株に比べて有意にその生産量が増加していた。
【００４５】
参考例  MGB874株の作製
（１）upp遺伝子欠失株（cat-uppカセットを含む）の作製
図２に示すように、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、upp-AFWとupp-ARV、及びupp-BFWとupp-BRVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のupp遺伝子（BG 13408；uracil phosphoribosyl-transferase）の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（ａ１）、及び下流に隣接する１．０ｋｂ断片（ｂ１）をＰＣＲにより増幅した。また、プラスミドpMutinT3 （Microbiology ,144, 3097 ,1998）を鋳型として、Erm-FWとErm-RVプライマーのセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子を含む１．２ｋｂ断片（ｃ１）を、ＰＣＲによって調製した。尚、ＰＣＲ反応は反応系を２０μＬとして、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて添付のプロトコールに従い、（ａ１）、（ｂ１）については鋳型ＤＮＡである枯草菌168株ゲノム５０ｎｇ、（ｃ１）についてはプラスミドＤＮＡ１ｎｇ、上記プライマーを各２００ｎＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを各２００μＭ、ＬＡＴａｑ０．２Ｕ、添付の１０×緩衝液を１×となるように混合した。増幅反応には、ＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社製GeneAmp9700）を用い、９５℃で５分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、次に５５℃で３０秒、さらに７２℃で６０秒間恒温し、これを繰り返し２５回おこない、最後に３０秒間７２℃で伸長を完了させた。このようにして得られた上記３つ（ａ１）、（ｂ１）及び（ｃ１）のＰＣＲ増幅断片をセントリコン（ミリポア社製）にて精製後、各０．５μLを混合し、さらに、プライマーupp-AFWとupp-BRVを加えて上記ＰＣＲ条件の７２℃での恒温を３分間に変更し、ＳＯＥ−ＰＣＲをおこなった。このＰＣＲの結果、３断片を（ａ１）、（ｃ１）及び（ｂ１）の順になる様に結合させた３．２ｋｂのＤＮＡ断片（ｄ１）を得た。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法（J.Bacteeriol.,81,741,1960）により枯草菌１６８株の形質転換を行った。すなわち、枯草菌１６８株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌１６８株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに上記ＤＮＡ断片（ｄ１）を含む溶液（上記ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、０．５ｇ／ｍLのエリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによってupp遺伝子がゲノム上から欠失し、エリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以後この株を168��uppと表記する。尚、後述するコンピテント法による形質転換は、使用するＤＮＡや形質転換体選抜の為の寒天培地を適宜変更する他は、上述の方法と同様にして行った。
【００４６】
（２）cat-uppカセットＤＮＡ断片の構築
図３に示すように、upp遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の転写が確実に行われる様、枯草菌で転写が確認されているプラスミドpSM5022 (Mol. Microbiol. 6, 309 ,1992) のcat遺伝子の下流にupp遺伝子を結合させた。即ち、cat-Fwとcat-Rvのプライマーセットを用い、pSM5022を鋳型として、ＰＣＲによりcatを含む１．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。また、プライマーupp-Fwとupp-RVを用いて168株ゲノムを鋳型としてPCRを行いupp遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次にこれら2断片を精製後、ＳＯＥ−ＰＣＲにより結合し、cat遺伝子の下流にupp遺伝子が結合した２．４ｋｂのca-uppカセットＤＮＡ断片（C）を調製した。更にこの断片をプラスミドpBR322のClaI切断部位に挿入することにより組換えプラスミドpBRcatuppを得た。
【００４７】
（３）Pro1領域欠失株（cat-uppカセット断片を含む）の作製
図４に示すように、Pro1-AFWとPro1-ARV、Pro1-BFWとPro1-BRVの各プライマーセットを用いて、168株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲによってPro1領域の上流に隣接する０．６ｋｂの断片（Ａ）及び下流に隣接する０．３ｋｂの断片（Ｂ）を調製した。なお、図４において、Pro1領域は「欠失標的領域」と記載した。
【００４８】
次いで、得られたＰＣＲ増幅断片（Ａ）及び（Ｂ）と、上述のcat-uppカセット断片（Ｃ）とを鋳型として、プライマーPro1-AFWとPro1-BRVによるＳＯＥ−ＰＣＲを行って３断片を（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｂ）の順になる様に結合させた。得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いてコンピテント法により実施例２で示した168Δupp株の形質転換を行い、10ppmのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に生育可能な形質転換体を分離した。得られた形質転換体はＰＣＲによってPro1領域がゲノム上から欠失し、cat-uppカセットＤＮＡ断片に置換していることを確認した。更に、本形質転換体を種々の濃度の５ＦＵ（シグマアルドリッチ社製）を添加したCg + グルコース寒天培地（７％リン酸水素二カリウム、３％リン酸二水素カリウム、０．５％クエン酸ナトリウム、１％硫酸アンモニウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０５％グルタミン酸、０．５％グルコース、１０ｎｇ／ｍＬ L-トリプトファン、０．５５μｇ／ｍＬ塩化カルシウム、０．１７μｇ／ｍＬ塩化亜鉛、４３ｎｇ／ｍＬ塩化銅二水和物、６０ｎｇ／ｍＬ塩化コバルト六水和物、６０ｎｇ／ｍＬモリブデン酸(IV)ナトリウムニ水和物、１．５％寒天）上で培養を行ったが、０．５μｇ/ｍＬ以上の５ＦＵを加えた培地では生育が認められなかった。一方、形質転換体の親株である168Δupp株は同一条件で５μｇ/ｍＬの５ＦＵを加えた培地でも生育が観察された。以上の結果から、形質転換体に導入されたupp遺伝子がcat遺伝子プロモーターからの転写により発現して５ＦＵに感受性になったものと推定された。このようにして得られた株をΔPro1::cat-upp株とした。なお、図４において、ΔPro1::cat-upp株は、Δ欠失標的領域::cat-upp株と記載した。
【００４９】
（４）Pro１領域欠失株からのcat-uppカセット断片（Ｃ）の削除
図５に示すように、ΔPro1::cat-upp株ゲノムを鋳型とし、Pro1-AFWとPro1-ERV及びPro1-FFWとPro1-BRVのプライマーセットを用いてcat-uppカセット断片（Ｃ）の上流に隣接する０．６ｋｂの断片（Ｅ）、下流に隣接する０．３ｋｂの断片（Ｆ）を増幅し、更に、得られた両ＤＮＡ断片を鋳型としPro1-AFW及びPro1-BRVプライマーセットによるＳＯＥ−ＰＣＲによって、両断片が結合した０．９ｋｂの断片（Ｇ）を調製した。この断片（Ｇ）によって、上述のΔPro1::cat-upp株をコンピテント法により形質転換し、１μｇ／ｍＬ/の５ＦＵを添加したCg + グルコース寒天培地に生育可能な株を取得した。得られた株においてクロラムフェニコール感受性と、ゲノム上のPro1領域及びcat-uppカセットＤＮＡ断片が欠失していることを確認し、これをΔPro1株とした。なお、図５において、ΔPro1::cat-upp株及びΔPro1株は、それぞれ「Δ欠失標的領域::cat-upp株」「Δ欠失標的領域株」と記載した。
上述したΔPro1株の作製手順に準じて、図４で説明した方法により、ΔPro7::cat-upp株を作製した。当該株を作製する工程における、断片（Ａ）〜断片（Ｇ）を増幅する際に使用したプライマーセットを下記の表９に示す。
【００５０】
【表９】
0005432635.tif 000010
【００５１】
（５）MGB07株の構築
次に、ΔPro7株（MGB01株とも称する）を用いて、複数の領域が欠失した株（多重欠失株）を構築した。まず、Pro7領域及びPro6領域の二重欠失株を以下のように構築した。すなわち、Pro6領域がcat-uppカセット断片で置換されたΔPro6::cat-upp株のゲノムDNAを用いてΔPro7株をコンピテント法により形質転換し、10ppmのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーを形質転換体として分離した。次に、得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換体を、ΔPro6株のゲノムDNAを用いてコンピテンと法により形質転換し、１μｇ／ｍＬの５ＦＵを添加したCg + グルコース寒天培地に生育可能な株を取得した。得られた株においてクロラムフェニコール感受性を確認し、Pro6領域とPro7領域の両方が欠失し、更に、cat-uppカセット断片を含まない二重欠失株を分離した。この株をMGB02株と命名した。
【００５２】
同様の操作を繰り返すことによってPro7領域、Pro6領域及びPro1領域を順次欠失させたMGB03株を構築した。同様の操作を繰り返すことによってPro7領域、Pro6領域、Pro1領域及びPro4領域を順次欠失させたMGB04株を構築した。同様の操作を繰り返すことによってPro7領域、Pro6領域、Pro1領域、Pro4領域及びPBSX領域を順次欠失させたMGB05株を構築した。同様の操作を繰り返すことによってPro7領域、Pro6領域、Pro1領域、Pro4領域PBSX領域及びPro5領域を順次欠失させたMGB06株を構築した。同様の操作を繰り返すことによってPro7領域、Pro6領域、Pro1領域、Pro4領域、PBSX領域、Pro5領域及びPro3領域を順次欠失させたMGB07株を構築した。
【００５３】
（６）SPβ領域欠失株の構築
次に、SPβ領域を欠失した株の構築例を説明する。図６に示すように、spB-AFWとspB-ARV2、及びspB-BFW2とspB-BRVのプライマーセットを用いて、168株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲによってSPβ領域の上流に隣接する０．６ｋｂの断片（Ｈ）及び下流に隣接する０．３ｋｂの断片（Ｉ）を調製した。なお、図６には、SPβを「欠失標的領域」と記載した。
【００５４】
またtet-FWとtet-RVのプライマーセットを用いて、テトラサイクリン耐性遺伝子領域断片（Ｊ）を増幅した。次いで、得られたＰＣＲ増幅断片（Ｈ）（Ｉ）（Ｊ）を鋳型として、プライマーspB-AFＷとspB-BRVによるＳＯＥ−ＰＣＲを行って３断片を（Ｈ）（Ｊ）（Ｉ）の順になる様に結合させた。得られたＤＮＡ断片（Ｋ）を用いてコンピテント法により、上述した168Δupp株の形質転換を行い、１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に生育可能な形質転換体を分離した。得られた形質転換体はＰＣＲによってSPβ領域がゲノム上から欠失し、テトラサイクリン耐性遺伝子断片に置換していることを確認し、これをΔSPβ::tet株とした。なお、図６には、ΔSPβ::tet株を「Δ欠失標的領域::tet株」と記載した。
同様にして上述した各領域を単独で欠失した株を作製した。作製した株は、ΔSPβ::tet株と同様に「Δ欠失標的領域::tet株」と呼称する。
【００５５】
（７）MGB07株からのSPβ領域の欠失
上記で作製したΔSPβ::tet株のゲノムDNAを用いてΔPro7株を形質転換し、テトラサイクリン耐性株MGB07ΔSPβ::tet株を取得した。一方、次の様にしてテトラサイクリン耐性遺伝子断片のゲノム上からの除去を行った。
【００５６】
図７に示すように、spB-AFWとspB-ERV、及びspB-FFWとspB-BRVのプライマーセットを用いて、168株ゲノムを鋳型としてＰＣＲによってSPβ領域の上流に隣接する０．６ｋｂの断片（Ｌ）及び下流に隣接する０．３ｋｂの断片（Ｍ）を調製した。なお、図７には、SPβを「欠失標的領域」と記載した。
【００５７】
次いで、得られたＰＣＲ増幅断片（Ｌ）（Ｍ）を鋳型として、プライマーspB-AFＷとspB-BRVによるＳＯＥ−ＰＣＲを行って２断片を（Ｌ）（Ｍ）の順になる様に結合させた。得られたＤＮＡ断片（Ｎ）を、上述したpBRcatuppのsacI-KpnI制限酵素部位（切断後に平滑末端化）に挿入して、テトラサイクリン耐性遺伝子断片削除用プラスミドpBRcatuppΔSPβを構築した。なお、図７には、pBRcatuppΔSPβを「pBRcatuppΔ欠失標的領域」と記載した。
【００５８】
構築したpBRcatuppΔSPβにてMGB07ΔSPβ::tet株を形質転換し、プラスミド上のSPβ上流または下流の領域と、ゲノム上のSPβ上流または下流の領域との間で一重交差の組換えが起こったことにより、プラスミドがゲノム上に導入され、クロラムフェニコール耐性を示す株MGB07ΔSPβ(pBR)株を取得した。
【００５９】
得られた形質転換株MGB07ΔSPβ(pBR)株をテトラサイクリン1.5μg/mLを含むLB培地50mL（500mL容坂口フラスコ）に、OD600=0.3となる様に植菌し、37℃で振盪培養して1時間目にアンピシリン15mg (300μg/mL)を加え、以降2時間毎にアンピシリン15mgを添加しながら培養を継続、培養8.5時間後に培養液を2%塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、薬剤を含まないLB寒天培地に塗沫した。生育したコロニーのうち、プラスミド領域の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となったものを選抜した。
【００６０】
選抜した菌株のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行うことにより、SPβ領域及びテトラサイクリン耐性遺伝子断片が欠失していることを確認し、MGB08株を取得した。
【００６１】
（８）MGB08株からのpks領域の欠失とPro5領域の復帰
上記で作製したMGB08株からのpks領域の欠失を、上述した方法（図７）に準じ、Δpks::tet株を用いて行った。MGB08株からpks領域を欠失させた株をMGB09株と命名した。取得したMGB09株のゲノムＤＮＡをPCRにて確認したところ、pks領域は欠失していたが、pks領域とゲノム上で近い位置に存在するPro5領域内部の配列の存在が認められ、Pro5領域が復帰していることが分かった。これはΔpks::tet株のゲノムDNAを用いてMGB08株を形質転換した際に、pks領域の欠失に伴うテトラサイクリン耐性遺伝子の導入と同時に、Δpks::tet株ゲノム上のpks領域の上流領域とPro5領域下流の領域が、MGB08株ゲノム上の相当する領域との間で相同組換えが起こったことによるものと考えられた。
【００６２】
（９）MGB09株からのSKIN領域の欠失とPro7領域の復帰
上記で作製したMGB09株からのSKIN領域の欠失を、上述した方法（図７）に準じ、ΔSKIN::tet株を用いて行った。MGB09株からSKIN領域を欠失させた株をMGB10株と命名した。取得したMGB10株のゲノムＤＮＡをPCRにて確認したところ、SKIN領域は欠失していたが、SKIN領域とゲノム上で近い位置に存在するPro7領域内部の配列の存在が認められ、Pro7領域が復帰していることが分かった。これはΔSKIN::tet株のゲノムDNAを用いてMGB09株を形質転換した際に、SKIN領域の欠失に伴うテトラサイクリン耐性遺伝子の導入と同時に、ΔSKIN::tet株ゲノム上のSKIN領域の上流領域とPro7領域下流の領域が、MGB09株ゲノム上の相当する領域との間で相同組換えが起こったことによるものと考えられた。
【００６３】
（１０）MGB10株からのpps領域の欠失
上記で作製したMGB10株からのpps領域の欠失を、上述した方法（図７）に準じ、Δpps::tet株を用いて行った。MGB10株からpps領域を欠失させた株をMGB11株と命名した。取得したMGB11株のゲノムＤＮＡをPCRにて確認したところ、他の領域が復帰することなくpps領域が欠失していた。
【００６４】
（１１）MGB11株からのPro2領域の欠失
上記で作製したMGB11株からのPro2領域の欠失を、上述した方法（図７）に準じ、ΔPro2::tet株を用いて行った。MGB11株からPro2領域を欠失させた株をMGB12株と命名した。取得したMGB12株のゲノムＤＮＡをPCRにて確認したところ、他の領域が復帰することなくPro2領域が欠失していた。
【００６５】
（１２）MGB12株からのPro5領域の欠失
MGB09株を作製する際に復帰したPro5領域を再び欠失させるため、上記で作製したMGB12株からのPro5領域の欠失を、上述した方法（図７）に準じ、ΔPro5::tet株を用いて行った。MGB12株からPro5領域を欠失させた株をMGB11d株と命名した。取得したMGB11d株のゲノムＤＮＡをPCRにて確認したところ、他の領域が復帰することなくPro5領域が欠失していた。
【００６６】
（１３）MGB874株の構築
MGB874株は、上述したように作製したMGB11d株から以下のように作製した（図８参照）。すなわち、上述した方法（図７）に準じ、MGB11d株からのNED0302領域（ydcL-ydeK-ydhU領域）の欠失を、ΔNED0302::tet株（ΔydcL-ydeK-ydhU::tet株）を用いて行った。MGB11d株からNED0302領域（ydcL-ydeK-ydhU領域）を欠失させた株をMGB533株と命名した。取得したMGB533株は、MGB11d株における欠失領域の他にNED0302領域（ydcL-ydeK-ydhU領域）が欠失したゲノム構造を有することとなる。
【００６７】
その後、NED0803領域（yisB-yitD領域）、NED3200領域（yunA-yurT領域）、NED1902領域（cgeE-ypmQ領域）、NED0501領域（yeeK-yesX領域）を順に欠失させて変異株を構築した。構築された変異株を、MGB625株と命名した。
さらに、MGB625株からNED40002領域（pdp-rocR領域）を欠失させた株をMGB723株と命名した。
【００６８】
その後、NED02021領域（ycxB-sipU領域）、SKIN-Pro7領域、NED3701領域（sbo-ywhH領域）を順に欠失させて変異株を構築した。構築された変異株を、MGB834株と命名した。
【００６９】
次に、上述した方法（図７）に準じ、構築されたMGB834株からのNED4100領域（yybP-yyaJ領域）の欠失を、ΔNED4100::tet株（ΔyybP-yyaJ::tet株）を用いて行った。MGB834株からNED4100領域（yybP-yyaJ領域）を欠失させた株をMGB860株と命名した。
【００７０】
その後、NED1602領域（yncM-fosB領域）を順に欠失させて変異株を構築した。構築された変異株を、それぞれMGB874株と命名した。
【００７１】
これら各株を作製する工程における、断片（Ｈ）〜断片（Ｎ）を増幅する際に使用したプライマーセットを下記の表１０に示す。
また、参考例で使用した各種のプライマーに関し、プライマー名と、塩基配列と、配列番号との対応を表１１〜１３として示した。
【００７２】
【表１０】
0005432635.tif 000011
【００７３】
【表１１】
0005432635.tif 000012
【００７４】
【表１２】
0005432635.tif 000013
【００７５】
【表１３】
0005432635.tif 000014
【図８】
0005432635.tif 000015
【図１】
0005432635.tif 000016
【図２】
0005432635.tif 000017
【図３】
0005432635.tif 000018
【図４】
0005432635.tif 000019
【図５】
0005432635.tif 000020
【図６】
0005432635.tif 000021
【図７】
0005432635.tif 000022
【配列表】
0005432635000001.app