(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非侵襲的出生前診断のためのシステムの操作方法であって、
前記システムは、アレイ状に配置され解析部に接続されそれぞれ単一細胞の大きさに対応する大きさを有する複数の部位を有し、さらに、前記複数の部位に接続された主チャンバを有するマイクロ流体デバイスを備え、
前記方法は、
ａ．あらかじめ妊婦から採取され胎児有核細胞を含有する可能性の高い有機流体検体を前記マイクロ流体デバイス内に取り込む工程と、
ｂ．前記有機流体検体の濃縮を行い、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を得る工程と、
ｃ．前記マイクロ流体デバイスによって、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、
ｄ．前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から単離した前記少なくとも１つの細胞に対して前記解析部を用いて遺伝子解析を行い、前記診断に適した少なくとも１つの胎児有核細胞の遺伝的特徴を明らかにする工程と、を備え、
ｉ）前記工程ｃ）は、胎児細胞を母体細胞から区別するのに適した胎児細胞用特異抗体で胎児細胞を標識する段階を備え、
ｉｉ）前記工程ｃ）は、前記マイクロ流体デバイスを用いて、前記主チャンバに入れられた前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から前記複数の部位に前記遺伝子解析のために単一細胞を移動させ、前記マイクロ流体デバイスの前記複数の部位において前記単一細胞を採取することにより、単一細胞を個別に選別して実行され、
ｉｉｉ）前記工程ｃ）は、前記マイクロ流体デバイスにおいて採取された単一細胞が前記標識に基づいて個別に選択され、前記採取された単一細胞はあらかじめ前記特異抗体で標識される、ことにより実行される、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程は、
前記マイクロ流体デバイスにおける複数の部位の中の所定部位から、単一細胞を採取した後、
前記マイクロ流体デバイスの内部あるいは外部のセンサーにより検出可能な少なくとも１つのパラメータに基づいて、前記採取した細胞から単一細胞を選別する、ことによって実行される、方法。
【請求項３】
請求項１あるいは２のいずれかに記載の方法であって、
前記有機流体検体の濃縮を行う工程は、
細胞の選別であって、
ａ．密度
ｂ．形態
ｃ．電気的特性
ｄ．化学的特性
ｅ．機械的特性
ｆ．表面抗原の発現
ｇ．細胞質内抗原の発現
ｈ．誘電特性
ｉ．磁気特性
からなるパラメータ群から選択される少なくとも１つのパラメータあるいはその組み合わせに基づいて行われる、細胞の選別を含む、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記有機流体検体の濃縮を行い、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を得る工程は、
前記有機流体検体を処理することにより、前記有核細胞を分離し、濃縮の結果としての有核細胞を得る工程を含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記有機流体検体を処理することにより、前記有核細胞を分離し、濃縮の結果としての有核細胞を得る工程は、前記有機流体検体を密度勾配に基づいて遠心分離する工程を含む、方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法であって、
前記濃縮工程は、選別であって、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む前記細胞集団が有する以下の特性：すなわち、
ａ．ＣＤ７１表面抗原の発現
ｂ．ＣＤ３４表面抗原の発現
ｃ．ＧＰＡ表面抗原の発現
ｄ．ＣＤ１４表面抗原の非発現
ｅ．ＣＤ１５表面抗原の非発現
ｆ．ＣＤ４５表面抗原の非発現
のうちの少なくとも１つに基づいた選別を含む、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法であって、
前記濃縮工程の後で、かつ、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程の前に、前記有機流体検体を希釈する工程を備え、
前記希釈は、前記濃縮工程の直後に前記有機流体検体から分けた前記検体の所定体積の部分に存在する有核細胞の計数値に基づいて、行われる、方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記濃縮工程と前記遺伝子解析を行う工程のいずれか１つあるいは両方の工程は、前記単離工程で用いた前記マイクロ流体デバイスと同一の前記マイクロ流体デバイス内で、前記単離工程と組み合わせて行われる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記マイクロ流体デバイスは、相互に分離される一方で油圧で接続される複数の異なったチャンバを備え、前記複数の異なったチャンバは、活性化可能な電極アレイを備える単一のチップあるいは分離した複数のチップにより、少なくとも１つの側で区切られている、方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記胎児細胞を前記母体細胞から区別するのに適した胎児細胞用特異抗体で前記胎児細胞を標識する工程は、
＊胎児トロホブラスト抗原を認識する抗体と、
＊胎児表面抗原を認識する抗体と、
＊胎児細胞内抗原を認識する抗体と、
から成る抗体群から選択される特異抗原に対するさまざまな抗体を使用して、行われる、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記胎児トロホブラスト抗原は、ＨＬＡ−Ｇであり、
前記胎児表面抗原は、ｉ抗原であり、
前記胎児細胞内抗原は、ヘモグロビン鎖γおよびεである、方法。
【請求項１２】
請求項１０あるいは１１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記胎児細胞を母体細胞から区別するのに適した胎児細胞用特異抗体は、蛍光抗体である、方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法であって、
前記胎児細胞を母体細胞から区別するのに適した胎児細胞用特異抗体は、蛍光ビーズと接合されている、方法。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記有機流体検体は、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を含む血液検体であり、
細胞核に特異的な第１マーカーで、前記血液検体の有核細胞を標識し、
前記第１マーカーと識別可能であって、前記胎児細胞を前記母体細胞から区別するのに適した前記胎児細胞用特異抗体である第２マーカーで、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を標識して、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する工程において、前記第１マーカーと前記第２マーカーの両方で標識された単一細胞のみを選別する工程を、さらに備える、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記第１マーカーと前記第２マーカーの両方は、蛍光マーカーであり、前記蛍光マーカーは、互いに異なる第１波長と第２波長の光を放出する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記蛍光マーカーは、青色波長と緑色波長の光を放出する、方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法であって、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する工程において単一細胞を個別に選別する工程は、前記有機流体検体中の細胞の自家蛍光により放出される第３波長の光の放出を検出して、前記第１波長の光と前記第２波長の光を両方とも放出すると同時に前記第３波長の光を放出しない細胞のみを選別することにより実行される、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記第３波長の光は、赤色波長の光である、方法。
【請求項１９】
請求項１０から１８のいずれか１項に記載の方法であって、
細胞を標識後、標識した細胞の固定および透過処理を行って、細胞質内抗体を用いて胎児細胞を識別する工程をさらに備える、方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記遺伝子解析を行う工程は、
ＱＣ−ＰＣＲにより行われ、
前記少なくとも１つの胎児有核細胞の遺伝情報と少なくとも１つの母体有核細胞の遺伝子情報とを比較する工程を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法であって、
前記有機流体検体の濃縮を行い、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を得る工程は、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団が得られた濃縮された前記有機流体検体を培養液に入れて、前記検体について濃縮する工程を繰り返す工程、を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記有機流体検体は、子宮細胞、経頸管細胞、もしくは頸管内細胞、または母体末梢血から選択される細胞を含むように選択される、方法。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法であって、
単一細胞の選別に用いられる前記マイクロ流体デバイスは、使い捨て可能なデバイスである、方法。
【請求項２４】
非侵襲的出生前診断用のマイクロ流体システムを作成するためのマイクロ流体デバイスの使用であって、
前記マイクロ流体デバイスを用いて、少なくとも１種類の胎児有核細胞から単一細胞を個別に選別し、
前記胎児有核細胞は、胎児細胞を母体細胞から区別するのに適した胎児細胞用特異抗体であらかじめ標識され、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞は、胎児有核細胞を含有する可能性の高い有機流体から濃縮され、
前記有機流体は、あらかじめ妊婦から採取されて、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団が得られるように濃縮され、
前記マイクロ流体デバイスを用いて、あらかじめ前記特異抗体で標識された前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離した後に、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から単離された前記少なくとも１つの細胞に対して解析部を用いて遺伝子解析を行い、前記診断に適した少なくとも１つの胎児有核細胞の少なくとも１つの遺伝的特徴を明らかにし、
前記マイクロ流体デバイスは、
ｉ）前記マイクロ流体デバイスにおけるそれぞれ単一細胞の大きさに対応する大きさを有し前記解析部に接続された複数の部位であって前記マイクロ流体デバイスの主チャンバに接続された複数の部位であり、前記マイクロ流体デバイス内においてアレイ状に配置された複数の部位の中の所定部位から、単一細胞を採取する手段であって、前記主チャンバに入れられた前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から前記複数の部位に前記遺伝子解析のために単一細胞を移動させ、少なくとも１つのパラメータに基づいて、前記採取された細胞からの単一細胞であって、前記複数の部位における前記単一細胞を選別して、胎児細胞のみを遺伝子解析の対象とする手段と、
ｉｉ）あらかじめ前記特異抗体で標識され前記マイクロ流体デバイス内に存在する前記単一細胞を前記標識に基づいて個別に選別することにより少なくとも１つの胎児細胞を単離する手段であって、あらかじめ前記特異抗体で標識された前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する手段と、を備える、使用。
【請求項２５】
請求項２４に記載の使用であって、
前記胎児細胞を前記母体細胞から区別するのに適した前記胎児細胞用特異抗体による前記胎児細胞の標識は、
＊胎児トロホブラスト抗原を認識する抗体と、
＊胎児表面抗原を認識する抗体と、
＊胎児細胞内抗原を認識する抗体と、
から成る抗体群から選択される特異抗原に対するさまざまな抗体を使用して、行なわれる、使用。
【請求項２６】
請求項２５に記載の使用であって、
前記胎児トロホブラスト抗原は、ＨＬＡ−Ｇであり、
前記胎児表面抗原は、ｉ抗原であり、
前記胎児細胞内抗原は、ヘモグロビン鎖γおよびεである、使用。
【請求項２７】
請求項２５に記載の使用であって、
前記有機流体は、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を含有する血液検体であり、
前記血液検体の有核細胞は、細胞核に特異的な第１マーカーで標識され、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む前記少なくとも１つの細胞集団は、前記第１マーカーと識別可能な第２マーカーで標識され、
前記第２マーカーは、前記胎児細胞を前記母体細胞から区別するのに適した前記胎児細胞用特異抗体であり、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する際に、前記第１マーカーと前記第２マーカーの両方で標識された単一細胞のみを前記マイクロ流体デバイスで選別させる、使用。
【請求項２８】
請求項２７に記載の使用であって、
前記第１マーカーと前記第２マーカーの両方は、蛍光マーカーであり、前記蛍光マーカーは、互いに異なる第１波長と第２波長の光を放出する、使用。
【請求項２９】
請求項２８に記載の使用であって、
前記第１波長と前記第２波長は、それぞれ青色波長と緑色波長である、使用。
【請求項３０】
請求項２８に記載の使用であって、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する際において前記単一細胞の個別の選択は、前記有機流体中の細胞の自家蛍光により放出される第３波長の光の放出を検出して、前記第１波長の光と前記第２波長の光を両方とも放出すると同時に前記第３波長の光を放出しない細胞のみを選別することにより実行される、使用。
【請求項３１】
請求項３０に記載の使用であって、
前記第３波長は赤色波長である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非侵襲的出生前診断の方法に関し、具体的には、胎児の遺伝的障害および染色体異常を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎児の染色体の異常を明らかにする目的で、染色体異常の出生前診断が導入されている。
【０００３】
今までのところ、染色体異常をもつ胎児を確実に診断することは、侵襲的診断検査でのみ可能であった。侵襲的診断検査は、羊水穿刺、絨毛採取、あるいは臍帯穿刺により採取した胚細胞を検査して、核型を決定する。
【０００４】
このような検査はすべて侵襲的であり、流産のリスクを増大させる。したがって、通常は、３５歳以上の妊婦、染色体異常をもつ子供を妊娠した経験がある妊婦、あるいは、超音波検査により胎児の先天性異常が見つかっている場合にのみ、このような検査が推奨される。
【０００５】
まれではあるが、母体循環系に胎児の細胞が存在することが発見されたことにより、多くの研究グループが、非侵襲的出生前診断を可能にするために、このような胎児細胞を単離、回収する方法の研究および開発に携わってきた。主に３種類の胎児細胞、すなわち、リンパ球、トロホブラスト（栄養膜）、赤芽球は、胎盤関門を通過することができる。この中でも、特に、母体末梢血からの胎児赤芽球や胎盤由来の上皮細胞であるトロホブラストを単離する方法に関する研究に力が入れられてきた。トロホブラストは多核型の形態であるため、末梢血からの単離は難しいが、妊娠第６週から第１５週の期間中に、経頸管検体にトロホブラストが存在することが証明されている（参考文献［８］ないし［１３］参照）。ただし、トロホブラストは、胎盤から移動すると、他のトロボブラストや母体細胞に付着して、凝集塊を形成する傾向がある。
【０００６】
近年では、分子生物学的手法を非培養胎児細胞に直接適用することによって、胎児細胞の識別も可能になってきている。このような手法の例としては、出生前ＦＩＳＨ（Fluorescent In Situ Hybridization：蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法や定量的蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＦ−ＰＣＲ：Quantitative Fluorescent-Polymerase Chain Reaction）が挙げられる。ＱＦ−ＰＣＲは、染色体特異ＤＮＡ配列を識別すると同時に定量する方法であり、染色体特異ＤＮＡ配列を個々の細胞に適用することにより、非常に数が少ない胎児細胞に基づく遺伝子解析が可能になる。ＱＦ−ＰＣＲを利用した出生前解析に関しては、総説（明細書の末尾に添えた参考文献［１］ないし［６］参照）を含む多くの報告がなされており、その内容を参照することにより、本明細書の一部に組み込む。
【０００７】
Ｄ．Ｗ．  Ｂｉａｎｃｈｉらは、多重パラメータ評価法に基づいて、母体の血液から胎児の有核赤血球（ＮＲＢＣ）を単離するシステムを開発した。ここで用いられるパラメータには、２つの形態学的特徴（核の真円度並びに形態）と胎児ヘモグロビン標識の２つの特性（細胞質の蛍光強度並びに末梢明度）が含まれる。この手法は、密度勾配に基づく単核細胞の分離、白血球の枯渇を利用した（ＣＤ１５およびＣＤ４５に対する抗体を用いたＭＡＣＳ法による）細胞の濃縮、ガンマ抗ヘモグロビン抗体を用いたＦＡＣＳ法による細胞蛍光測定に基づく単離を行うものである。顕微鏡下で、顕微操作装置（マイクロマニピュレーター）を用いて、多重パラメータ評価法により識別された細胞を回収する。
【０００８】
しかし、この評価システムは非常に手間がかかり、マイクロマニピュレーターを使用することにより、細胞の一部が失われる。この方法による胎児細胞の回収感度は７４％であり、誤検出の割合が５％ある。
【０００９】
密度勾配に基づく単核細胞の分離と、ＣＤ７１＋細胞の枯渇を利用したＭＡＣＳ法による検体中の細胞の濃縮とに、ガンマおよびエプシロン胎児ヘモグロビン鎖に対する特異抗体を用いた標識を組み合わせる手法も提案されている（参考文献［７］参照）。しかし、成人細胞中で胎児ヘモグロビンが生成される場合があることや、胎児ヘモグロビン鎖と成人ヘモグロビン鎖との相似性により、胎児ヘモグロビンに対する抗体と成人ヘモグロビンとの間で架橋が生じることなどから、標識が非特異的となってしまう可能性がある。
【００１０】
また、ＭｏｎａＬｉｚａ  Ｍｅｄｉｃａｌ社（米国特許第２００５／０１８１４２９  Ａ１）は、経頸管細胞を用いた出生前遺伝子解析法を開発した。この手法は、サイトブラシ子宮頸部細胞診（パップスメア検査）を用いて経頸管検体を回収し、回収した検体を細胞遠心分離により処理して、スライドを作成する。顕微鏡下で、経頸管細胞に標識をして解析し、スライド上における経頸管細胞の位置及び座標を記憶させる。ＦＩＳＨ法でスライドを解析して、先に得られた座標に基づき、トロホブラスト細胞を識別する。しかし、この手法には、スライドを作成する処理の間に経頸管細胞の一部が失われ、トロホブラストの喪失によるｎｏ−ｃａｌｌ（測定不能）が発生するという問題がある。
【００１１】
さらに、ＡＶＩＶＡ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社（たとえばＥＰ−Ａ−１４３９８９７参照）は、母体血液から胎児細胞を単離するバイオチップを利用した細胞濃縮システムを開発した。この手法は、試薬を用いて、赤血球の大部分を除去し、特異性の高い電磁ビーズと胎児抗原に対する特異抗体の混合物とによる選別を行い、さらに、単離すべき細胞の種類に応じてさまざまな孔径で孔を開けた高分解能フィルタリング・チャンバによる細胞濃縮を行うものである。
【００１２】
しかし、この手法は、検体の細胞濃縮によって胎児細胞を選別する場合に限られ、母体細胞混入の可能性を否定できないため、遺伝子解析の結果が信頼性の低いものになってしまう場合がある。
【００１３】
要するに、上述した非侵襲的方法は、いずれも、胎児染色体の異数性および／あるいは他の染色体異常を日常的に診断する手法にはなりえない。
【００１４】
本発明は、循環胎児有核細胞が含有されている可能性が高く、後で胎児有核細胞を単離可能な母体の有機流体、具体的には、子宮、頸管内、あるいは経頸管流体や母体の末梢血などを検体として用いた非侵襲的出生前診断の方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、誤ったネガティブ応答がなく、誤ったポジティブ応答やｎｏ−ｃａｌｌ（測定不能）の可能性が低く、自動化が可能な出生前診断方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、非侵襲的出生前診断の方法並びに装置に関し、具体的には、胎児の遺伝学的異常を識別する方法並びに装置に関する。
【００１６】
本発明に従う診断方法は、請求項１に記載されるように、胎児有核細胞を含有する可能性が高く、後で胎児有核細胞を単離可能な母体の有機流体を検体として用いて、具体的には、子宮流体、頸管内流体、あるいは経頸管流体や母体の末梢血などを検体として用いて、有機流体内に存在する胎児細胞を識別して、これを分析することにより、診断を行うものである。
【００１７】
本発明の方法は、まず、子宮流体、頸管内流体、あるいは経頸管流体や母体の末梢血を一段階あるいは複数段階の細胞濃縮工程で処理して、胎児有核細胞の濃縮を行う。本発明の方法は、簡単に自動化可能で繰り返し可能なやり方で、マイクロ流体デバイスを用いて、細胞濃縮した検体から単一細胞を個別に選別する。マイクロ流体デバイスで単一細胞を単離することによって、遺伝子診断を行うのに十分な純度の胎児細胞集団が得られる。
【００１８】
ここで、マイクロ流体デバイスは、たとえば、層流を形成する液体の体積を制御するのに適したデバイスでもよい。
【００１９】
あるいは、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの寸法が１ｍｍ未満であるデバイスでもよい。
【００２０】
単一細胞を個別に選別可能なデバイスは、各細胞を個別に評価するパラメータに基づき、一個の単一細胞あるいは複数個の単一細胞を一度に一個ずつあるいは同時に選別可能なデバイスでもよい。
【００２１】
必要に応じて、比較のための母体細胞の解析と組み合わせて、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ：Quantitative Fluorescent-Polymerase Chain Reaction）、ＦＩＳＨ、核型分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ：Comparative Genomic Hybridization）等の手法により遺伝子解析を行うことができる。
【００２２】
マイクロ流体システムを用いることにより、分析中の検体に先に分析した検体が混入するリスクがなく、また、デバイスを完全に洗浄する必要もない使い捨て可能なシステムを構築することができる等、さまざまな利点がある。さらに、マイクロ流体システムを用いることにより、高い信頼性を持つ自動化あるいは半自動化システムを構築することができる。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、これに限定されるものではないが本発明の要旨を例示する以下の実施形態の説明から、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に従う非侵襲的出生前診断方法を示す概要図。
【図２】ＤＡＰＩの蛍光用のフィルターを用いた倍率１０倍のチップの画像。３種類の単一細胞に対応した３種類の核を示す。
【図３】ＦＩＴＣの蛍光用のフィルターを用いた倍率１０倍のチップの画像。撮影領域は、図２の撮影領域と同一であり、２つのＨｂ−εポジティブ細胞と１つのＨｂ−εネガティブ細胞を示す。
【図４】染色体マーカーＡＭＸＹ、Ｄ２１Ｓ１１およびＨＰＲＴを用いた分析結果を示す電気泳動図。上段のプロットが母体血液から回収した胎児細胞に対する分析結果を示し、下段のプロットが母体細胞に対する分析結果を示す。このグラフから、胎児が性染色体ＸおよびＹを有することがわかり、また、マーカーとしてＤ２１Ｓ１１を用いた分析結果から、胎児細胞が、母親から受け継いだ（Ｍ）第１の対立遺伝子とそれとは異なる（父親由来の（Ｐ））第２の対立遺伝子とを備えることがわかる。
【図５】染色体マーカーＤ１８Ｓ３９１、Ｄ１３Ｓ６３１およびＤ２１Ｓ１４１１を用いた分析結果を示す電気泳動図。上段のプロットが母体血液から回収した胎児細胞に対する分析結果を示し、下段のプロットが母体細胞に対する分析結果を示す。マーカーとしてＤ１３Ｓ６３１およびＤ２１Ｓ１４１１を用いた分析結果から、２つの対立遺伝子（正常なヘテロ接合体）が存在することと、母体細胞の混入をなくせることがわかる。
【図６】マーカーＤ２１Ｓ１４３７およびＤ２１Ｓ１４４６を用いた分析結果を示す電気泳動図。上段のプロットが母体血液から回収した胎児細胞に対する分析結果を示し、下段のプロットが母体細胞に対する分析結果を示す。グラフから、２つの対立遺伝子（正常なヘテロ接合体）が存在することと、母体細胞の混入をなくせることがわかる。
【図７】マーカーＤ１８Ｓ５３５を用いた分析結果を示す電気泳動図。上段のプロットが母体血液から回収した胎児細胞に対する分析結果を示し、下段のプロットが母体細胞に対する分析結果を示す。グラフから、２つのｎｏ−ｃａｌｌ(測定不能な)対立遺伝子（正常なヘテロ接合体）が存在することがわかる。
【図８】本発明に従う方法の好適な実施例を示すフローチャート。
【図９】ケージ毎の細胞の平均密度（ＡＣＰＣ）に対して、単一細胞のみを含むケージに存在する胎児細胞の数（ＮＣＩＳＣＣ）の変動を示す説明図。
【図１０】本発明に従う方法（あるいはその方法の実体である特徴的部分）を実現するためのデバイスの一例を示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、非侵襲的出生前診断を行う方法をその要旨とする。
【００２６】
経頸管検体の採取
頸管粘液の吸引、サイトブラシあるいは綿棒、頸管内洗浄や子宮内洗浄（ＩＵＬ）等、さまざまな手法により、子宮の異なった部位（外側骨、頸管の下部、子宮下極、子宮内腔）から経頸管検体（ＴＣＣ）を採取する。
【００２７】
末梢血からの細胞濃縮
さまざまな手法により、胎児細胞の割合を増大させることができる。たとえば、Ｆｉｃｏｌｌ（フィコール）やＰｅｒｃｏｌｌ（パーコール）等の媒体を用いる密度勾配に基づく遠心分離法や、赤血球（ＲＢＣ）検体から有核赤血球（ｎＲＢＣ）を選別する微細加工フィルターを用いる機械的濃縮法や、誘電泳動活性化セルソーター（ＤＡＣＳ）等の特定デバイスを用いる誘電泳動分離による濃縮法や、対象外赤血球を選択的に溶解する等の選択的溶解法が挙げられる。あるいは、免疫磁性ビーズを用いる免疫磁性分離を行い、（回収するべき胎児細胞群に対する特異抗体に結合するビーズを用いる）ポジティブ選択（対象細胞群の選択）あるいはネガティブ選択（対象外細胞群の枯渇）を行うこともできる。この場合、２種類の選択法を組み合わせて、選択性を増大させるようにしてもよい（たとえば、Ｂｉａｎｃｈｉの米国特許２００６／００５１７７５号参照）。また、胎児抗原に対する特異的蛍光抗体で細胞を標識するＦＡＣＳ法を用いることもできる。
【００２８】
これらの手法の大部分は自動化可能であり、いずれの分離手法を採用する場合でも、その前に、密度勾配に基づく遠心分離による総単核細胞の分離を行うようにしてもよい。あるいは、全血をこれらの手法で処理するようにしてもよい。
【００２９】
一般的には処理工程の最初に希釈を行うが、上述した手法すべてで、希釈が必須であるわけではない。
【００３０】
その他の細胞濃縮手法
当業者に周知のＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ミルテニーバイオテク）株式会社のＭＡＣＳやＳｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＥａｓｙ−ｓｅｐを用いることもできる。
【００３１】
母体末梢血を含有する有機流体の場合、血液検体の細胞濃縮を行って、少なくとも１種類の胎児細胞を含む細胞集団を得る工程を、複数の連続した段階で行うようにしてもよい。第１段階で、あらかじめＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液で希釈した母体検体から、Ｆｉｃｏｌｌ（フィコール）密度勾配遠心分離法により総単核細胞を分離する。あるいは、以下に示すパラメータから選択した少なくとも１つのパラメータまたはパラメータの組み合わせに基づく細胞選別法によって母体検体の細胞濃縮を行う等、図１にまとめた他の手法を用いてもよい。
ａ．密度
ｂ．形態
ｃ．電気的特性
ｄ．化学的特性
ｅ．機械的特性
ｆ．表面抗原の発現
ｇ．細胞質内抗原の発現
ｈ．誘電特性
ｉ．磁気特性
【００３２】
次に、第２段階で、たとえば、第１段階で回収した単核細胞からＣＤ７１発現細胞を選択する等の細胞のポジティブ選択（対象細胞の選択）あるいはネガティブ選択（対象外細胞の除去）により、胎児細胞の濃縮を行う。少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む細胞集団が有する以下の特性の少なくとも１つを利用した選別法により第２段階の細胞濃縮を行う。
ａ．（本発明で用いられる好適な手法である、上述した）ＣＤ７１表面抗原の発現
ｂ．ＣＤ３４表面抗原の発現
ｃ．ＧＰＡ表面抗原の発現
ｄ．ＣＤ１４表面抗原の非発現
ｅ．ＣＤ１５表面抗原の非発現
ｆ．ＣＤ４５表面抗原の非発現
【００３３】
検体の細胞濃縮を行って、少なくとも１種類の胎児細胞を含む細胞集団を得る工程の第２段階で、以下のいずれかの手法を用いるようにしてもよい。
ａ．ＭＡＣＳ（磁気活性化セルソーター：Magnetic Activated Cell Sorter）
ｂ．ＤＡＣＳ（誘電泳動活性化セルソーター：Dielectrophoretic Activated Cell Sorter）
ｃ．ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター：Fluorescence Activated Cell Sorter）
【００３４】
胎児細胞の標識
トロホブラストの免疫染色
ＴＣＣ検体の場合には、標識の前に、アセチルシステインで検体を培養し、よく攪拌して、凝集塊を溶かして、単一細胞の懸濁液を調製する。
【００３５】
周知の手法に従って、（母体細胞から胎児細胞を区別可能な）胎児細胞に対する特異抗体を用いた標識により胎児細胞を識別する。トロホブラストの標識には、それぞれの特異抗原に対して、さまざまな抗体をマーカーとして用いることができる：
＊絨毛外性トロホブラストに特異的なＨＬＡ−Ｇ、ＮＤＯＧ−５、ＢＣ１、Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩ、ＦＤＯ２０２Ｎ、ＪｕｎＤ、Ｆｒａ２、ＨＡＳＨ２およびＰＰ５（胎盤タンパク質）；
＊シンシチウム（合胞体）トロボブラストに特異的なＦＴ１．４１．１、Ｉ０３、ＮＤＯＧ−１およびＡＢ−１５４；
＊トロホブラスト上で発現するＣＫ−７（サイトケラチン７）、ＣＨＬ1（ＣＤ１４６）、ＣＨＬ２、Ｈ３１５、ＨＬＡ−Ｃ、ａＨＣＧ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＡＩ−１およびｐ５７；
＊シンシチウム（合胞体）トロホブラストおよびサイトトロホブラスト（細胞栄養芽層）上で発現するＰＬＡＰ（胎盤アルカリホスファターゼ）、ＡＢ−３４０およびＤ６；
＊絨毛性トロホブラストに特異的でなく侵入性あるいは絨毛外性トロホブラストに特異的なＴａｐａｓｉｎ（タパシン）およびＣＡＲ；
＊胎盤、特に、トロホブラスト系細胞に特異的なＰＬＡＣ１、ＰＬＡＣ４、ＰＬＡＣ８およびＰＬＡＣ９；
＊妊娠第７週から第１０週の間に胎盤細胞上で発現するＰＡＲ−１（プロテアーゼ活性化受容体）；
＊妊娠第１０週から第１２週の間にシンシチウム（合胞体）トロホブラストおよび絨毛外性トロホブラスト上で発現するＧＬＵＴ−１２（グルコース輸送タンパク質）；
＊妊娠初期３ヶ月間に絨毛外性トロホブラスト上で発現するＮＤＰＫ−Ａ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼＡ）；
【００３６】
母体末梢血検体由来の赤芽球の免疫染色
上述した細胞濃縮の工程で用いた必ずしも胎児細胞に特異的ではない抗体とは異なる（母体細胞から胎児細胞を区別可能な）胎児細胞に特異的な２次抗体を用いた標識により、胎児細胞を識別する。
【００３７】
この場合、以下のものを標識に用いることができる。
＊（ｉ抗原等の）表面抗原を認識する抗体
＊細胞内抗原（たとえば、グロビン鎖γあるいはグロビン鎖ε）
標識の効果を高めるためには、細胞をあらかじめ固定し透過処理しておくことが望ましい。
【００３８】
胎児細胞の標識に抗ｉ抗原抗体を用いることは周知であるが、従来の手法では、密度勾配に基づくデバイスに直接この抗体を用いていた。これに対して、ＣＤ７１＋細胞の濃縮を行った後に抗ｉ抗原抗体で胎児細胞を標識する方法は、胎児細胞の予備選択（検体中の胎児赤芽球の濃縮）を行って、対象となる細胞の識別を容易にし、非常に感度が高く特異性の高い標識を行うことができるという利点がある。
【００３９】
標識済みの細胞
（母体細胞から胎児細胞を区別可能な）胎児細胞に特異的な蛍光抗体、胎児細胞に特異的な抗体を接合させた蛍光ビーズ、あるいは、胎児細胞に特異的な抗体を接合させた蛍光２次抗体または蛍光３次抗体を細胞濃縮の工程で用いた場合には、胎児細胞はすでに標識された状態となる。この場合、胎児細胞の識別が可能なため、細胞濃縮された検体を単一細胞を選別可能なマイクロ流体デバイスに直接注入するようにしてもよい。
【００４０】
胎児単一細胞の単離
次に、任意の既知種類の単一細胞を個別に選別可能なマイクロ流体デバイスに、細胞を含有する検体を入れる。ここでは、誘電泳動単離（たとえば、ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００９６３あるいはＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００７５１あるいは参考文献［３１］および［３２］に記載される手法を用いたＤＥＰＡｒｒａｙ）や、光電子トラップや、光泳動単離、レーザーピンセット（参考文献［２８］ないし［３０］参照）等の手法を用いることができる。参考文献［２８］ないし［３０］および参考文献［３１］および［３２］に関しては、その内容を参照することにより、本明細書の一部に組み込む。
【００４１】
以下のセンサーを用いて、対象細胞を識別することができる。
＊外部センサー
＊蛍光顕微鏡等の光センサー
＊内部センサー
＊蛍光細胞を識別する統合方法を開示した特許ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００６３６およびＷＯ２００７０１０３６７に記載されるような光センサー
＊細胞に結合した誘電ビーズを識別する特許ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００６３６およびＷＯ２００７０１０３６７に記載されるようなインピーダンス測定センサー
【００４２】
遺伝子解析
回収した胎児細胞に対して、診断を目的として、異なった分解能および感度レベルでの遺伝学的特性あるいは染色体特性の解析を可能にするさまざまな種類の分析を行う。
【００４３】
染色体異常が予想される場合には、古典的な分子法（ＦＩＳＨ）により核型の解析を行ったり、ＱＦ−ＰＣＲにより染色体マーカーを調べるようにしてもよい。また、比較ゲノムハイブリダイゼーションにより遺伝物質の獲得あるいは喪失を調べるようにしてもよい。
【００４４】
本発明の好適な実施例
本発明に従う方法の好適な実施例を、以下図８のフローチャートを参照して説明する。ただし、以下の実施例は例示に過ぎず、何ら本発明を限定するものではない。
【００４５】
検体の採取
妊婦から１０ｍｌの末梢血を採取する。
【００４６】
細胞濃縮
本発明の好適な実施例の方法は、多段階の連続処理で細胞濃縮を行う。まず第１段階で、母体検体から総単核細胞を分離する。
【００４７】
第１段階では、母体血液検体をｐＨ７．２のＰＢＳ溶液で１：１に希釈する。希釈した検体を１．０７７ｇ／ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（フィコール）密度勾配で層別化して、２２℃で３００ｇの速度で３０分間遠心分離する。Ｆｉｃｏｌｌ（フィコール）上に環状に堆積した細胞を採取して、滅菌した試験管に移す。
【００４８】
本発明の方法では、血液細胞あるいは単核細胞の一部に対してはこれ以上の処理を行うことなく、母体ＤＮＡの解析に用いるようにしてもよい。
【００４９】
次に、第２段階で、胎児有核細胞の濃縮を行う。第２段階では、第１段階で回収した単核細胞から、ＣＤ７１発現細胞のポジティブ選択を行う。ここでは、磁気ビーズに接合させた抗ＣＤ７１抗体を用いた免疫磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ミルテニーバイオテク）株式会社のＭＡＣＳ）によりポジティブ選択を行う。
【００５０】
免疫磁気分離法では、１０7個の細胞に対して８０μｌのＰＢＳを用いて細胞を再懸濁させた後、１０7個の細胞に対して抗ＣＤ７１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ミルテニーバイオテク）株式会社）２０μｌの割合で加える。４℃で１５分間培養後、磁界に接続されてＣＤ７１ポジティブな細胞を保持するカラムに細胞を通す。保持された細胞をカラムから溶出させて、次の工程で用いる。
【００５１】
単離
３．７％のホルムアルデヒド溶液を用いて、得られたＣＤ７１＋細胞（ＣＤ７1ポジティブ細胞）を２２℃で１５分間固定する。固定した細胞を１％ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）株式会社）のＰＢＳ溶液で透過処理する。蛍光色素ＦＩＴＣを接合させた胎児ヘモグロビンのガンマ鎖を認識する抗体（１μｇ／ｍｌ）を透過処理後の細胞に加える。
【００５２】
本発明の方法では、すべての細胞の核がわかるように、検体をＤＡＰＩ（あるいは他の適当なマーカー）で付加標識するようにしてもよい。
【００５３】
誘電泳動処理および胎児細胞の単離用のチップに検体を入れる前に、検体の品質検査を行い、標識の蛍光強度と総細胞量とを確認する。標識した検体の一部を誘電泳動処理に必要な最小量の緩衝液に再懸濁して、検体の品質検査用デバイスに入れて、蛍光顕微鏡下で検査する。細胞の蛍光強度をさまざまなチャンネルで測定し、ＤＡＰＩで標識した細胞を数える（総有核細胞数）。単一細胞の単離用デバイスの正確な操作に適した最適密度を細胞密度が超えている場合には、必要な密度になるように検体を希釈する。細胞の総数が少なすぎて、最小必要数の胎児細胞を回収できない場合には、胎児細胞を回収しない（ｎｏ−ｃａｌｌ（測定不能））という結果）。
【００５４】
可動型誘電泳動ケージを備える市販のデバイス（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｐＡ社製ＤＥＰＡｒｒａｙTM  ＷＯ００６９５６５参照）を用いて、最適な細胞密度を算出することができる。中でも、１０万個のケージを備えるＣＯＮＶ６００ｋ型が望ましい。
【００５５】
このデバイスを用いる場合、以下の工程で測定を行うことが望ましい。
１．（標識にポジティブな）胎児細胞を含むケージを選択する。
２．胎児細胞がクラスタの一部を構成する場合には、すなわち、胎児細胞を含むケージに他の非胎児細胞も存在する場合には、クラスタを構成する細胞を異なったケージに分けて、他の非胎児細胞が同一のケージに存在しないように胎児細胞を単離する。他の非胎児細胞と分離できない場合には、胎児細胞を廃棄する。
３．単一細胞のみを含むケージに存在するすべての胎児細胞を回収する。
【００５６】
あるいは、このデバイスを用いる場合、以下の工程で測定を行うことも望ましい。
１．（標識にポジティブな）胎児細胞を１つ含むケージを選択する。
２．胎児細胞がクラスタの一部を構成する場合には、回収するべき細胞のリストからこの胎児細胞を消去する。
３．単一細胞のみを含むケージに存在するすべての胎児細胞を回収する。
【００５７】
後者の方法では、検体中に存在する総細胞数（ＮＣＥＬＬＳＴＯＴ）および予測される胎児細胞の割合（ＰＣＩ）を考慮して、チップに注入するべきケージ毎の細胞の平均密度（ＡＣＰＣ）を選択する。
【００５８】
ＡＣＰＣが増大すると、チップの処理チャンバ内に存在する胎児細胞の数が増加する。ただし、一方で、各細胞が単一細胞のみを含むケージに存在する確率は低下する。このため、ＡＣＰＣの値が約１の場合に、単一細胞のみを含むケージに存在する胎児細胞の数（ＮＣＩＳＣＣ）が最大になる。このＮＣＩＳＣＣ値は、ＰＣＩ値とは無関係で、ＡＣＰＣ＝１の場合の理論的な最大値に対してＮＣＩＳＣＣ値を正規化した値として、図９にその変動を示す。この密度値のときに、処理マイクロチャンバに検体をフラッシングする毎に回収できる細胞の数が最大になる。回収できる胎児細胞の総数が後段の遺伝子解析に十分であれば、この密度値を用いればよい。
【００５９】
図９に示すように、ＡＣＰＣが増大すると、他の非胎児細胞が胎児細胞と同一のケージ内に存在するという理由で廃棄せざるをえない細胞の割合が単調増加する。図９では、処理マイクロチャンバ中に存在する胎児細胞の数に対して正規化した値として示す（廃棄細胞数の正規化値）。
【００６０】
回収できる細胞の数が後段の解析に必要な最小数に満たない場合には、検体を希釈して、何度もフラッシングを行い、より多くの胎児細胞を回収するようにしてもよい。
【００６１】
上述した統計的分析に基づいて、より少ないフラッシング回数で十分な数の胎児細胞を回収するために最適なＡＣＰＣの値を算出することができる。たとえば、予測される胎児細胞の数と遺伝子解析に必要な細胞の最小数とに基づいて算出し、検体中に存在する胎児細胞の最小回収効率（単一細胞のみを含むケージに存在する細胞の数／他の細胞も同一ケージに存在する細胞の数の比）を求める。この最小回収効率から、ＡＣＰＣの最大値を、さらには、最小回収効率で検体全部を処理するのに必要なフラッシングの最低回数を推定することができる。
【００６２】
次に、検体をチップに入れて、（図１０に概略を示すようなパッケージの一部あるいはデバイス本体として）可動型誘電泳動ケージ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｐＡ社製ＤＥＰＡｒｒａｙTM  ＷＯ００６９５２５参照）を用いて細胞の単離を行い、胎児細胞の走査、同定、選別、分類、回収を行う。ケージ内に存在する細胞を、顕微鏡下において、３種類の異なった蛍光チャンネルで（すなわち３種類の異なった波長で）自動あるいは手動で観察（走査）する。これに限定されるものではないが、ブルー（青）チャンネルでは、（たとえば、検体をＤＡＰＩで標識して）核の有無と必要に応じて形態とを確認する。グリーン（緑）チャンネルでは、緑色波長の光を放出するフルオロフォア（たとえば、ＦＩＴＣ）に接合させた胎児特異抗体で標識した細胞を表示する。さらに、最初の２つのチャンネルとは異なるチャンネル（たとえば、ＴＲＩＴＣの蛍光を検出するフィルターのように、赤色波長の光を放出するチャンネル）を３番目のチャンネルとして用いるようにしてもよい。この３番目のチャンネルでは、蛍光マーカーは用いられないため、自家蛍光細胞を特定することができる。自家蛍光細胞では、ＤＡＰＩ標識で検出された信号やグリーンチャンネルで検出された信号を特異的な信号とみなすことはできない。
【００６３】
あるいは、３番目のチャンネルを用いて、フルオロフォア（蛍光色素分子）に結合した抗体に接合された細胞、たとえば、ＣＤ４５に接合された細胞を表示して、廃棄するべき細胞を特定するようにしてもよい。
【００６４】
このように、細胞の選択は、（図３に示すＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａにポジティブな）強い胎児特異抗体信号を出力し、かつ、他のチャンネル（たとえば、レッド（赤）チャンネル）で検出される自家蛍光が皆無に等しい（図２に示すＤＡＰＩにポジティブな）単一の有核細胞のみを含むケージを選択することにより行われる。
【００６５】
蛍光マーカー、特に、胎児マーカーを、単純な蛍光分子から構成する代わりに、対象となる細胞、この場合には胎児細胞、を認識できる抗体を接合させた蛍光ビーズから構成することにより、この細胞単離方法の選択性を増大することができる。
【００６６】
０．２ミリリットルのＰＣＲチューブに数マイクロリットル分（４０マイクロリットル未満）の細胞が回収される。
【００６７】
遺伝子解析
回収され細胞からＤＮＡを抽出して、増幅して、染色体異数性の有無を解析する。細胞選別の工程で用いた、さらには、必要に応じて（たとえば、ＤＡＣＳ法の場合のように）、前工程である細胞濃縮工程の少なくとも一部の工程で用いたマイクロ流体デバイスと同一のマイクロ流体デバイス内でこの工程を行うことが望ましい。この場合には、図１０に示すようなデバイスを用いることができる。
【００６８】
このデバイスは、周知のように電極アレイを備え、さらに、１つの主マイクロチャンバ（ＣＨＭ）と複数の補助マイクロチャンバ（ＣＨＪ）とを備えることを特徴とする。各補助マイクロチャンバは、活性化可能な電極アレイを備える単一のチップあるいは分離した複数のチップにより、少なくとも１つの面上で区切られている。入口（ＩＭ１）および出口（ＯＭ１）を介して、少なくとも１つの細胞を含む検体を主マイクロチャンバに入れる。各補助マイクロチャンバ（ＣＨＪ）の大きさは、細胞の大きさとほぼ同等で、かつ、少しだけ大きいことが望ましい。分析を行っている間に検体が分散して他の補助マイクロチャンバに拡散し、これを汚染することがないような（分散を防ぐあるいは少なくとも抑制する）構造（長さおよび／あるいは形状）のチャネルで、各補助マイクロチャンバを主マイクロチャンバに接続することが望ましい。図示した例では、複数の溶解用補助マイクロチャンバを、たとえば、十字型継手で、オンチップのキャピラリー電気泳動用チャネルに接続する。あるいは、周知のように、キャピラリー電気泳動用の一組のチャネルを２重Ｔ字型接合するようにしてもよい。また、キャピラリー電気泳動用チャネルの端部にインピーダンス測定および／あるいは光測定型の集積センサーを設置して、分析対象化合物の交点（十字型あるいは２重Ｔ字型の交点）からセンサーまでの移動時間に基づく電気泳動図を作成するようにしてもよい。図１０に示す例では、複数のマイクロチャンバの各々が、各補助マイクロチャンバの流体出口（ＯＪ）を介して、電気泳動用キャピラリー（ＣＡＰＪ）に接続される。
【００６９】
回収した胎児細胞のＤＮＡをアルカリ熱分解で抽出する。
【００７０】
ＱＦ−ＰＣＲによりＳＴＲ（Short Tandem Repeat：縦列型反復配列）すなわちマイクロサテライトを解析することにより、染色体変化を測定する。蛍光キャピラリー電気泳動手法では、異なった蛍光分子で標識したＤＮＡフラグメントを適切に選択することにより、複数のＳＴＲを同時に解析することができる。
【００７１】
第１３、第１８、および第２１の各染色体に含まれ、集団内での異型接合頻度の高い、少なくとも３種類の異なったＳＴＲおよび性染色体の３種類のマーカーを、マルチプレクサ‐ＰＣＲで増幅する。たとえば同型接合のＳＴＲが存在することによりｎｏ−ｃａｌｌ（測定不能）となる場合には、同一の染色体に含まれる別のＳＴＲを増幅する。第２１染色体の解析に用いられるＳＴＲは、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ２１Ｓ１４１０、Ｄ２１Ｓ１４１１、Ｄ２１Ｓ１４１２、Ｄ２１Ｓ１４３５、Ｄ２１Ｓ１４４６であり、第１３染色体の解析に用いられるＳＴＲは、Ｄ１３Ｓ６３１、Ｄ１３Ｓ６３４、Ｄ１３Ｓ２５８、Ｄ１３Ｓ３０５、Ｄ１３Ｓ７４２である。また、第１８染色体の解析に用いられるＳＴＲは、Ｄ１８Ｓ５３５、Ｄ１８Ｓ３８６、Ｄ１８Ｓ３９１、Ｄ１８Ｓ８５８、Ｄ１８Ｓ５１である。性染色体の解析に用いられるマーカーは、ＡＭＸＹ、ＳＲＹ、ＳＴＲ  Ｘ２２、ＤＸＹＳ２１８、ＤＸＳ６８０３、ＤＸＳ６８０９、ＤＸＳ８３７７、ＨＰＲＴ、ＳＢＭＡである。
【００７２】
胎児細胞ＤＮＡの増幅と並行して、母体ＤＮＡを解析して、胎児細胞が母体細胞で汚染されている可能性やＱＦ−ＰＣＲの外部汚染の可能性を調べる（図４ないし図７参照）。
【００７３】
自動シーケンサー（たとえば、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ３１０）と組み合わせたＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動により得られた電気泳動図において、増幅したマイクロサテライトのさまざまな対立遺伝子に対応するピークの面積と大きさとを解析する。母体ＤＮＡをコントロールとして同時に分析して、遺伝子解析の結果を解釈する。これにより、実験室汚染の可能性がある結果や回収された胎児細胞が母体細胞で汚染されている可能性がある結果を識別することができる。
本発明は、たとえば、以下のような態様で実現することもできる。
［適用例１］
非侵襲的出生前診断方法であって、
ａ．胎児有核細胞を含有する可能性の高い有機流体検体を妊婦から採取する工程と、
ｂ．前記有機流体検体の濃縮を行い、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を得る工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程と、
ｄ．前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から単離した前記少なくとも１つの細胞に対して遺伝子解析を行い、前記診断に適した少なくとも１つの胎児有核細胞の遺伝的特徴を明らかにする工程と、を備え、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程は、その目的用に設計されたマイクロ流体デバイスを用いて、単一細胞を個別に選別することにより実行される、方法。
［適用例２］
適用例１記載の方法であって、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程は、
好ましくは、前記マイクロ流体デバイスにおける複数の部位であって、前記マイクロ流体デバイス内においてアレイ状に配置された複数の部位の中の所定部位から、単一細胞を採取した後、
前記マイクロ流体デバイスの内部あるいは外部のセンサーにより検出可能な少なくとも１つのパラメータに基づいて、前記採取した細胞から単一細胞を選別する、ことによって実行される、方法。
［適用例３］
適用例１あるいは２のいずれかに記載の方法であって、
前記有機流体検体の濃縮を行う工程は、
細胞の選別であって、
ａ．密度
ｂ．形態
ｃ．電気的特性
ｄ．化学的特性
ｅ．機械的特性
ｆ．表面抗原の発現
ｇ．細胞質内抗原の発現
ｈ．誘電特性
ｉ．磁気特性
からなるパラメータ群から選択される少なくとも１つのパラメータあるいはその組み合わせに基づいて行われる、細胞の選別を含む、方法。
［適用例４］
適用例３に記載の方法であって、
前記有機流体検体の濃縮を行い、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を得る工程は、
前記有機流体検体を処理することにより、前記有核細胞を分離し、濃縮の結果としての有核細胞を得る工程を含む、方法。
［適用例５］
適用例４に記載の方法であって、
前記有機流体検体を処理することにより、前記有核細胞を分離し、濃縮の結果としての有核細胞を得る工程は、前記有機流体検体を密度勾配に基づいて遠心分離する工程を含む、方法。
［適用例６］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
前記濃縮工程は、選別であって、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む前記細胞集団が有する以下の特性：すなわち、
ａ．ＣＤ７１表面抗原の発現
ｂ．ＣＤ３４表面抗原の発現
ｃ．ＧＰＡ表面抗原の発現
ｄ．ＣＤ１４表面抗原の非発現
ｅ．ＣＤ１５表面抗原の非発現
ｆ．ＣＤ４５表面抗原の非発現
のうちの少なくとも１つに基づいた選別を含む、方法。
［適用例７］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
前記濃縮工程の後で、かつ、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞から少なくとも１つの細胞を単離する工程の前に、前記有機流体検体を希釈する工程を備え、
前記希釈は、前記濃縮工程の直後に前記有機流体検体から分けた前記検体の所定体積の部分に存在する有核細胞の計数値に基づいて、行われる、方法。
［適用例８］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
前記濃縮工程と前記遺伝子解析を行う工程のいずれか１つあるいは両方の工程は、前記単離工程で用いる前記マイクロ流体デバイス内で、前記単離工程と組み合わせて行われる、方法。
［適用例９］
適用例８に記載の方法であって、
相互に分離される一方で油圧で接続される複数の異なったチャンバを備え、前記複数の異なったチャンバは、単一のチップあるいは分離した複数のチップにより、少なくとも１つの面上で区切られている、マイクロ流体デバイスが使用される、方法。
［適用例１０］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
胎児細胞を母体細胞から区別するのに適した胎児細胞用特異抗体で胎児細胞を標識する工程をさらに備え、好ましくは、
＊ＨＬＡ−Ｇなどの胎児トロホブラスト抗原を認識する抗体と、
＊ｉ抗原などの胎児表面抗原を認識する抗体と、
＊ヘモグロビン鎖νおよびεのような胎児細胞内抗原を認識する抗体と、
から成る抗体群から選択される特異抗原に対するさまざまな抗体を使用して、前記標識が行われる、方法。
［適用例１１］
適用例１０に記載の方法であって、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する工程は、
前記マイクロ流体デバイス内に存在し、少なくとも１つのマーカーであらかじめ標識された、単一細胞を個別に選別することにより実行される、方法。
［適用例１２］
適用例１０あるいは１１のいずれかに記載の方法であって、
前記少なくとも１つのマーカーは、蛍光マーカーである、方法。
［適用例１３］
適用例１０あるいは１１のいずれかに記載の方法であって、
前記少なくとも１つのマーカーは、胎児細胞に対する少なくとも１つの特異抗体を接合させた蛍光ビーズである、方法。
［適用例１４］
適用例１１ないし１３のいずれかに記載の方法であって、
細胞核に特異的な第１マーカーで、前記血液検体の有核細胞を標識し、
前記第１マーカーと識別可能な第２マーカーで、前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を標識して、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する工程において、前記第１マーカーと前記第２マーカーの両方で標識された単一細胞のみを選別する工程を、さらに備える、方法。
［適用例１５］
適用例１４に記載の方法であって、
前記第１マーカーと前記第２マーカーの両方は、蛍光マーカーであり、前記蛍光マーカーは、互いに異なる第１波長と第２波長の光、好ましくは、青色波長と緑色波長の光を放出する、方法。
［適用例１６］
適用例１５に記載の方法であって、
前記少なくとも１つの胎児細胞を単離する工程において単一細胞を個別に選別する工程は、前記有機流体検体中の細胞の自家蛍光により放出される第３波長の光、好ましくは、赤色波長の光の放出を検出して、前記第１波長の光と前記第２波長の光を両方とも放出すると同時に前記第３波長の光を放出しない細胞のみを選別することにより実行される、方法。
［適用例１７］
適用例１０ないし１６のいずかれかに記載の方法であって、
細胞を標識後、標識した細胞の固定および透過処理を行って、細胞質内抗体を用いて胎児細胞を識別する工程をさらに備える、方法。
［適用例１８］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
前記遺伝子解析を行う工程は、
ＱＣ−ＰＣＲにより行われ、
前記少なくとも１つの胎児有核細胞の遺伝情報と少なくとも１つの母体有核細胞の遺伝子情報とを比較する工程を含む、方法。
［適用例１９］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
前記有機流体検体の濃縮を行い、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を得る工程は、
前記少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団が得られた濃縮された前記有機流体検体を培養液に入れて、前記検体について濃縮する工程を繰り返す工程、を含む、方法。
［適用例２０］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
前記有機流体検体は、子宮細胞、経頸管細胞、もしくは頸管内細胞、または母体末梢血から選択される細胞を含む、方法。
［適用例２１］
前記いずれかの適用例に記載の方法であって、
単一細胞の選別に用いられる前記マイクロ流体デバイスは、使い捨て可能なデバイスである、方法。
【００７４】
本発明の方法の変形例として、核型に基づく遺伝子解析を行うようにしてもよい。この場合には、少なくとも１種類の胎児有核細胞を含む少なくとも１つの細胞集団を濃縮する工程は、さらに、以下の工程を備える。
【００７５】
Ｉ．（有糸分裂）中期の細胞の成長阻害
（有糸分裂）中期で細胞の成長を止めた後、固定と透過処理とを行って、細胞質内抗体に基づいて胎児細胞を識別する。
参考文献
［１］  ｖａｎ  Ｚｗｉｅｔｅｎ  ＭＣ，  Ｗｉｌｌｅｍｓ  ＤＬ，  Ｌｉｔｊｅｎｓ  ＬＬ，  Ｓｃｈｕｒｉｎｇ−Ｂｌｏｍ  ＨＧ，  Ｌｅｓｃｈｏｔ  Ｎ．  Ｈｏｗ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ａｒｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ？  （出生前細胞遺伝学的診断における予期せぬ所見はどのくらい予期せぬものであるか？）Ａ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ．（文献総説）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ．  ２００５  Ｍａｙ  １；１２０（１）：１５−２１．  Ｒｅｖｉｅｗ．（総説）
［２］  Ｎｉｃｏｌｉｎｉ  Ｕ，  Ｌａｌａｔｔａ  Ｆ，  Ｎａｔａｃｃｉ  Ｆ，  Ｃｕｒｃｉｏ  Ｃ，  Ｂｕｉ  ＴＨ．  Ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＱＦ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓ：  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ．（出生前胎児異数性診断におけるＱＦ−ＰＣＲの導入：再考の時期）  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ．  ２００４  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１０（６）：５４１−８．  Ｒｅｖｉｅｗ．（総説）
［３］  Ｌｅｕｎｇ  ＷＣ，  Ｌａｕ  ＥＴ，  Ｌａｏ  ＴＴ，  Ｔａｎｇ  ＭＨ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  （ＦＩＳＨ  ｏｒ  ＱＦ−ＰＣＲ）：  ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｓｃｅｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ？  （迅速な異数性スクリーニング（ＦＩＳＨ法あるいはＱＦ−ＰＣＲ法）：出生前診断の変革？）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．  ２００４  Ｍａｙ；４（３）：３３３−７．  Ｒｅｖｉｅｗ．（総説）
［４］  Ｈｕｌｔｅｎ  ＭＡ，  Ｄｈａｎｊａｌ  Ｓ，  Ｐｅｒｔｌ  Ｂ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ＦＩＳＨ  ａｎｄ  ＱＦ−ＰＣＲ．（一般的な染色体異常の迅速で簡単な出生前診断：分子法であるＦＩＳＨ法およびＱＦ−ＰＣＲ法の利点と欠点）  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  ２００３  Ｓｅｐ；１２６（３）：２７９−９７．  Ｒｅｖｉｅｗ．（総説）
［５］  Ａｄｉｎｏｌｆｉ  Ｍ，  Ｐｅｒｔｌ  Ｂ，  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  Ｊ．  Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．（マイクロサテライトおよび定量的蛍光ポリメラーゼ連鎖反応を利用した異数性の迅速検出）Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  １９９７  Ｄｅｃ；１７（１３）：１２９９−３１１．  Ｒｅｖｉｅｗ（総説）．
［６］  Ａｄｉｎｏｌｆｉ  Ｍ，  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  Ｊ．  Ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．  （経頸管細胞を用いた妊娠初期の出生前診断：評価）Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ．  １９９７  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：３８３−９２．  Ｒｅｖｉｅｗ  （総説）
［７］  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ，  Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＪＬ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬＧ，  Ｅｌｉａｓ  Ｓ，  Ｈｏｌｚｇｒｅｖｅ  Ｗ，  Ｅｖａｎｓ  ＭＩ，  Ｄｕｋｅｓ  ＫＡ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＬＭ，  Ｋｌｉｎｇｅｒ  ＫＷ，  Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ＦＺ，  Ｈａｈｎ  Ｓ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＫＬ，  Ｌｅｗｉｓ  Ｄ，  Ｗａｐｎｅｒ  ＲＪ，  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ  Ｆ．  Ｆｏｅｔａｌ  ｇｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＮＩＦＴＹ  Ｉ  ｄａｔａ．  （母体血液中の胎児細胞を用いた胎児性別並びに異数性の検出：ＮＩＦＴＹ  Ｉデータの解析）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｆｏｅｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  ２００２  Ｊｕｌ；２２（７）：６０９−１５．
［８］  Ｓｈｅｔｔｌｅｓ，  ＬＢ  （１９７１）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．（Ｙ染色体を用いた出生前性別判定）  Ｎａｔｕｒｅ，  ２３０，  ５２．
［９］  Ａｄｉｎｏｌｆｉ，  Ｍ，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ａ，  Ｓｈａｒｉｆ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｓｏｍｙ  １８  ａｎｄ  Ｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｆｏｅｔａｌ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｆｌｕｓｈｉｎｇ，（経頸管フラッシングによって得られた胎児の有核細胞における１８トリソミー並びにＹ染色体由来配列の検出）  Ｌａｎｃｅｔ，  ３４２，  ４０３−４０４．
［１０］  Ａｄｉｎｏｌｆｉ，  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，  Ｊ  （１９９７）  Ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  （経頸管細胞を用いた妊娠初期の出生前診断：評価）Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ，  ３  （４），  ３８３−３９２．
［１１］  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ，  Ｂｒｉｇｇｓ，  Ｊ，  Ｓ．Ｒａｈｍａｎ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｏｗｅｒ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｐｏｌｅ：  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ／ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，（子宮下極からの胎児細胞の経頸管的回収：回収の信頼性および回収された細胞集団の組織学的／免疫細胞化学的解析）  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  １４  （２），  ５２１−５３１
［１２］  Ｂｕｓｓａｎｉ，  Ｃ，  Ｃｉｏｎｉ，  Ｒ，  Ｓｃａｒｓｅｌｌｉ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ，（経頸管検体における胎児細胞の単離および検出の方法）  Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  ２２，  １０９８−１１０１．
［１３］  Ｂｕｓｓａｎｉ，  Ｃ，  Ｓｃａｒｓｅｌｌｉ，  Ｂ，  Ｃｉｏｎｉ，  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ，（顕微操作によって得られた経頸管検体からの胎児ＤＮＡの研究における定量的蛍光ＰＣＲ分析の使用）  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ，  ８  （４），  ２５９−２６３
［１４］  Ｗａｎｇ  ＪＹ，  Ｚｈｅｎ  ＤＫ，  Ｆａｌｃｏ  ＶＭ，  Ｆａｒｉｎａ  Ａ，  Ｚｈｅｎｇ  ＹＬ，  Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉ  ＬＣ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｆｏｅｔａｌ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ：  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＣＤ４５  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．（胎児有核赤血球の回収：抗ガンマグロビンを用いた蛍光活性化細胞選別に基づくポジティブ選択と抗ＣＤ４５枯渇並びに抗ガンマグロビンポジティブ選択を用いた磁気活性化細胞選別との比較）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  ２０００  Ｍａｒ  １；３９（３）：２２４−３０．
［１５］  Ｓａｍｕｒａ  Ｏ，  Ｓｅｋｉｚａｗａ  Ａ，  Ｚｈｅｎ  ＤＫ，  Ｆａｌｃｏ  ＶＭ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ：  １．０９０  ｖｅｒｓｕｓ  １．１１９  ｇ／ｍｌ．  （初期分離工程における高密度勾配を用いた母体血液からの胎児細胞回収の比較：１．０９０ｇ／ｍｌと１．１１９ｇ／ｍｌとの比較）  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  ２０００  Ａｐｒ；２０（４）：２８１−６．
［１６］  Ｓｅｋｉｚａｗａ  Ａ，  Ｆａｒｉｎａ  Ａ，  Ｚｈｅｎ  ＤＫ，  Ｗａｎｇ  ＪＹ，  Ｆａｌｃｏ  ＶＭ，  Ｅｌｍｅｓ  Ｓ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ：  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＦＡＣＳ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．（母体血液からの胎児細胞回収の向上：ＦＡＣＳ分離法に適した密度勾配）  Ｆｏｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ．  １９９９  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１４（４）：２２９−３３．
［１７］  Ｓｅｋｉｚａｗａ  Ａ，  Ｓａｍｕｒａ  Ｏ，  Ｚｈｅｎ  ＤＫ，  Ｆａｌｃｏ  Ｖ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ：  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  ＲｈＤ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ．（胎児細胞の再利用：母体血液から回収された胎児細胞の性別およびＲｈＤ遺伝子型の診断）  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １９９９  Ｎｏｖ；１８１（５  Ｐｔ  １）：１２３７−４２．
［１８］  Ｚｈｅｎｇ  ＹＬ，  Ｚｈｅｎ  ＤＫ，  ＤｅＭａｒｉａ  ＭＡ，  Ｂｅｒｒｙ  ＳＭ，  Ｗａｐｎｅｒ  ＲＪ，  Ｅｖａｎｓ  ＭＩ，  Ｃｏｐｅｌａｎｄ  Ｄ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＭ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．（最適な胎児細胞抗体の探索：フローサイトメトリーを用いた免疫表現型解析の結果）  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７  Ｊｕｌ；１００（１）：３５−４２．
［１９］  Ｇｅｉｆｍａｎ−Ｈｏｌｔｚｍａｎ  Ｏ，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＩＭ，  Ｂｅｒｒｙ  ＳＭ，  Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＥＪ，  Ｖａｄｎａｉｓ  ＴＪ，  ＤｅＭａｒｉａ  ＭＡ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｆｏｅｔａｌ  ＲｈＤ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｉｎ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｌｏｗ  ｓｏｒｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ．（母体血液から流動選別した胎児細胞の胎児ＲｈＤ遺伝子型解析）  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １９９６  Ｍａｒ；１７４（３）：８１８−２２．
［２０］  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ，  Ｋｌｉｎｇｅｒ  ＫＷ，  Ｖａｄｎａｉｓ  ＴＪ，  Ｄｅｍａｒｉａ  ＭＡ，  Ｓｈｕｂｅｒ  ＡＰ，  Ｓｋｏｌｅｔｓｋｙ  Ｊ，  Ｍｉｄｕｒａ  Ｐ，  Ｄｉｒｉｓｏ  Ｍ，  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｃ，  Ｇｅｎｏｖａ  Ｍ，  Ｅｒｉｋｓｏｎ  ＭＳ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＭ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ  ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ．  （母体血液から胎児細胞を元利する細胞分離方法を比較するためのモデルシステムの開発）Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  １９９６  Ａｐｒ；１６（４）：２８９−９８．
［２１］  ＤｅＭａｒｉａ  ＭＡ，  Ｚｈｅｎｇ  ＹＬ，  Ｚｈｅｎ  Ｄ，  Ｗｅｉｎｓｃｈｅｎｋ  ＮＭ，  Ｖａｄｎａｉｓ  ＴＪ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｏｅｔａｌ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｐｕｒｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｆｏｅｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２．（細胞内抗胎児ヘモグロビンおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた胎児有核赤血球選別純度の改善）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  １９９６  Ｓｅｐ  １；２５（１）：３７−４５．
［２２］  Ｚｈｅｎｇ  ＹＬ，  Ｃｒａｉｇｏ  ＳＤ，  Ｐｒｉｃｅ  ＣＭ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｍａｌｅ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｂｙ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｉｓｈ．（負磁気細胞選別法およびＦＩＳＨ法による母体細胞中の雄性胎児細胞の自発的分離の実証）  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  １９９５  Ｊｕｎ；１５（６）：５７３−８．
［２３］  Ｚｈｅｎｇ  ＹＬ，  Ｄｅｍａｒｉａ  Ｍ，  Ｚｈｅｎ  Ｄ，  Ｖａｄｎａｉｓ  ＴＪ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ．  Ｆｌｏｗ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉ−ｆｏｅｔａｌ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．  （細胞質内抗胎児ヘモグロビンを用いた胎児赤芽球の流動選別：母体検体の予備観察）Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  １９９５  Ｏｃｔ；１５（１０）：８９７−９０５．
［２４］  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ，  Ｙｉｈ  ＭＣ，  Ｚｉｃｋｗｏｌｆ  ＧＫ，  Ｆｌｉｎｔ  ＡＦ．  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＤ７１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．（妊娠期間中の循環単核細胞におけるトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現）  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １９９４  Ｊａｎ；１７０（１  Ｐｔ  １）：２０２−６．
［２５］  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ，  Ｓｈｕｂｅｒ  ＡＰ，  ＤｅＭａｒｉａ  ＭＡ，  Ｆｏｕｇｎｅｒ  ＡＣ，  Ｋｌｉｎｇｅｒ  ＫＷ．  Ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ：  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｂｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．（母体血液中の胎児細胞：定量的ポリメラーゼ連鎖反応による純度および収率の測定）  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １９９４  Ｏｃｔ；１７１（４）：９２２−６．
［２６］  Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ，  Ｍａｈｒ  Ａ，  Ｚｉｃｋｗｏｌｆ  ＧＫ，  Ｈｏｕｓｅａｌ  ＴＷ，  Ｆｌｉｎｔ  ＡＦ，  Ｋｌｉｎｇｅｒ  ＫＷ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ４７，ＸＹ，＋２１  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．  （母体末梢血における４７染色体、ＸＹ染色体、＋２１核型に基づく胎児細胞の検出）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９２  Ｄｅｃ；９０（４）：３６８−７０．
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［３０］  Ｅｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｇｏｋｓｏｒ  Ｍ，  Ｒａｍｓｅｒ  Ｋ，  Ｈａｇｂｅｒｇ  Ｐ  ａｎｄ  Ｈａｎｔｓｔｏｒｐ  Ｄ，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，  ２００４；  ４：１９６−２００．
［３１］  Ｍａｎａｒｅｓｉ  Ｎ，  Ｒｏｍａｎｉ  Ａ，  Ｍｅｄｏｒｏ  Ｇ，  Ａｌｔｏｍａｒｅ  Ｌ，  Ｌｅｏｎａｒｄｉ  Ａ，  Ｔａｒｔａｇｎｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｇｕｅｒｒｉｅｒｉ  Ｒ，  ＩＥＥＥ  Ｊ．  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ，  ２００３；  ３８：２２９７−２３０５．
［３２］  Ｒｏｍａｎｉ  Ａ，  Ｍａｎａｒｅｓｉ  Ｎ，  Ｍａｒｚｏｃｃｈｉ  Ｌ，  Ｍｅｄｏｒｏ  Ｇ，  Ｌｅｏｎａｒｄｉ  Ａ，  Ａｌｔｏｍａｒｅ  Ｌ，  Ｔａｒｔａｇｎｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｇｕｅｒｒｉｅｒｉ  Ｒ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  （国際固体素子回路学会要旨集），  ２００４；  １：２２４−２２５．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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