(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
B細胞悪性腫瘍の治療を要する患者のB細胞悪性腫瘍を治療するための医薬を製造するための(1)抗CD20抗体もしくはそのCD20結合断片である特異結合細胞減少剤および(2)該特異結合細胞減少剤の投与終了後8週間以内に投与を開始する自己Idタンパク質を含む、該自己Idタンパク質がオープンリーディングフレームによってコードされ、該オープンリーディングフレームのDNA配列が該自己Idタンパク質で治療すべき該患者からのB細胞悪性腫瘍由来の核酸配列から得られる、免疫療法組成物の使用。
【請求項２】
B細胞悪性腫瘍の治療を要する患者のB細胞悪性腫瘍を治療するための医薬を製造するための(1)抗CD20抗体もしくはそのCD20結合断片である特異結合細胞減少剤および(2)該特異結合細胞減少剤の投与終了後8週間以内に投与を開始する自己Idタンパク質を含む樹状細胞を含む、該自己Idタンパク質がオープンリーディングフレームによってコードされ、該オープンリーディングフレームのDNA配列が該自己Idタンパク質で治療すべき該患者からのB細胞悪性腫瘍由来の核酸配列から得られる、免疫療法組成物の使用。
【請求項３】
該B細胞悪性腫瘍が以前に治療されていない請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
該B細胞悪性腫瘍が以前に化学療法剤で治療されていない請求項1または2に記載の使用。
【請求項５】
該B細胞悪性腫瘍が再発性B細胞悪性腫瘍である請求項1または2に記載の使用。
【請求項６】
該自己Idタンパク質の投与を該特異結合細胞減少剤の最終投与の1カ月以内に開始する請求項1または2に記載の使用。
【請求項７】
該自己Idタンパク質の投与を該特異結合細胞減少剤の最終投与の1週間以内に開始する請求項1または2に記載の使用。
【請求項８】
該B細胞悪性腫瘍がB細胞リンパ腫およびB細胞白血病からなる群から選ばれる請求項1または2に記載の使用。
【請求項９】
該B細胞リンパ腫がホジキン病および非ホジキンリンパ腫からなる群から選ばれる請求項８記載の使用。
【請求項１０】
該非ホジキンリンパ腫が低悪性度、中悪性度、または高悪性度である請求項９記載の使用。
【請求項１１】
該非ホジキンリンパ腫が、小リンパ球性、濾胞性・小開裂細胞優位型、濾胞性・小開裂細胞および大細胞混合型、濾胞性・大細胞優位型、びまん性小開裂細胞型、びまん性小細胞および大細胞混合型、びまん性大細胞型、免疫芽球性大細胞型、リンパ芽球性・小非開裂バーキットおよび非バーキット型、AIDS関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、および単球様B細胞リンパ腫からなるサブタイプの群から選ばれる請求項９記載の使用。
【請求項１２】
該非ホジキンリンパ腫がマントル細胞リンパ腫である請求項９記載の使用。
【請求項１３】
該B細胞白血病が慢性B細胞白血病、B細胞系の急性リンパ芽球性白血病、またはB細胞系の慢性リンパ球性白血病である請求項８記載の使用。
【請求項１４】
該特異結合細胞減少剤が抗原結合細胞減少剤である請求項1または2記載の使用。
【請求項１５】
該自己Idタンパク質が組換え的に生成される請求項1または2記載の使用。
【請求項１６】
該自己Idタンパク質が昆虫細胞系中で組換え的に生成される請求項1または2記載の使用。
【請求項１７】
該自己Idタンパク質がKLHと結合する請求項1または2記載の使用。
【請求項１８】
該自己Idタンパク質が完全長抗体重鎖または完全長抗体軽鎖を含まない請求項1または2記載の使用。
【請求項１９】
該自己Idタンパク質が完全長抗体重鎖を含まない請求項1または2記載の使用。
【請求項２０】
該自己Idタンパク質が完全長抗体軽鎖を含まない請求項1または2記載の使用。
【請求項２１】
該樹状細胞が自己樹状細胞である請求項2記載の使用。
【請求項２２】
該自己Idタンパク質が酵母細胞中で組換え的に生成される請求項1または2記載の使用。
【請求項２３】
該自己Idタンパク質が細菌細胞中で組換え的に生成される請求項1または2記載の使用。
【請求項２４】
該自己Idタンパク質が哺乳類細胞中で組換え的に生成される請求項1または2記載の使用。
【請求項２５】
該自己Idタンパク質が哺乳類Tリンパ細胞中で組換え的に生成される請求項1または2記載の使用。
【請求項２６】
B細胞悪性腫瘍の治療を要する患者のB細胞悪性腫瘍を治療するための医薬を製造するための、(1)抗CD20抗体もしくはそのCD20結合断片である特異結合細胞減少剤、および(2)自己Idタンパク質を含む免疫療法組成物の使用であって、該自己Idタンパク質の投与が該特異結合細胞減少剤の投与終了前に開始され、該自己Idタンパク質および該細胞減少剤を用いる治療が並行して継続される、該自己Idタンパク質がオープンリーディングフレームによってコードされ、該オープンリーディングフレームのDNA配列が該自己Idタンパク質で治療すべき該患者からのB細胞悪性腫瘍由来の核酸配列から得られる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願)
本出願は、米国仮出願No.60/560,305、発明の名称「Altering a B Cell Pathology Using Self-Derived Antigens in Conjunction With Specific-Binding Cytoreductive Agent」(2004年4月6日出願)、および米国仮出願No.60/505,497、発明の名称「Altering a B Cell Pathology Using Self-Derived Antigens in Conjunction With Specific-Binding Cytoreductive Agent」(2003年9月23日出願)の優先権を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、一般的には免疫学および免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、療法の組み合わせを用いて、B細胞介在病状、例えば、B細胞悪性腫瘍、および/または自己免疫疾患を変化させるための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
循環器系の癌
種々のタイプの癌が循環器系起源である。主なタイプには、白血病、骨髄および血液の新生物; ミエローマ、B細胞の癌; およびリンパ腫、リンパ系起源の癌がある。リンパ腫は、さらに種々の群に細分され、臨床的に最も重要なリンパ腫に非ホジキンリンパ腫(NHL)がある。
【０００４】
非ホジキンリンパ腫は広範な癌のグループを形成する。これらリンパ腫の3つの広義のカテゴリーは、腫瘍分類のためのInternational Working Formulationに従って定義される：低悪性度、中悪性度、および高悪性度。これらは悪性度と治療に対する反応が異なる(Cheson、et al.、「Report of an International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin's lymphomas」、J. Clin. Oncol. 17(4)：1244,1999)。低悪性度リンパ腫は通常結節性疾患として存在し、無痛性または増殖が遅いことが多い。中および高悪性度疾患は、通常、大節外性腫瘍を伴うはるかに侵攻性の癌として存在する。全体的に、これらリンパ腫は癌の発生率と死亡率について合計で米国で50位にランクされ、毎年新たに約50,000例が診断されている。
【０００５】
NHLの患者は、Ann Arbor分類システムを用いて分類してもよい：病期I−1つのリンパ節領域の侵襲(障害)または1つのリンパ節外臓器または部位の限局侵襲。病期II−横隔膜の同側の2またはそれ以上のリンパ節領域の侵襲、または横隔膜の同側の他のリンパ節領域を含むかまたは含まない、1つの関連リンパ節外臓器または部位およびその領域リンパ節の限局侵襲。病期III−リンパ節外臓器または部位の限局侵襲、脾臓への侵襲またはその両方を伴うことがある、横隔膜の両側のリンパ節領域の侵襲。病期IV−遠隔(非局所性)節侵襲を伴う、関連リンパ節侵襲または単独リンパ節外臓器侵襲を伴うか伴わない1またはそれ以上のリンパ節外部位の播種性(多発性)侵襲。Ann Arborシステムにおいて、成人NHLの病期I、II、III、およびIVは、患者が明確な全身症状がある(B)か否か(A)に応じてAおよびBのカテゴリーに細分される。B表示は、以下の症状を示す患者に関連する：診断前6カ月間に10%以上の原因不明の体重損失、温度約38℃以上の原因不明の発熱、および盗汗。さらなる詳細は、The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project：A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. New Eng. J. Med. 329 (14)：987-994 (1993)参照のこと。
リンパ腫および白血病の治療
【０００６】
白血病およびリンパ腫の両方を含む該新生物リンパ増殖性疾患では、成功度の異なる多数の医薬的、外科的、および免疫学的治療法に焦点が当てられてきた。あるタイプ、例えば、特に低悪性度、B細胞非ホジキンリンパ腫の治療の著しい進歩にも関わらず、大部分の患者が、現在利用可能な最良の治療に反応後再発する。患者は、典型的にはその頭文字語で表す薬剤の組み合わせ(例えば、メクロレタミン、ビンクリスチン(Oncovin(登録商標))、プレドニゾン、およびプロカルバジンについてはMOPP；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンについてはCHOP；シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾンについてはCVP；ならびにエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびドキソルビシンについてはEPOCH)を用いる細胞減少化学療法を用いて開始する。再発患者については新しい療法が最近承認され、今やそのような患者は、一般に抗CD20モノクローナル抗体Rituxan(登録商標)または同様の抗体の形の受け身免疫療法を用いて治療される。本療法は一時的寛解をもたらすことが多い。
化学療法
【０００７】
リンパ腫および白血病の初回の治療は化学療法であることが多い。種々の化学療法のアプローチが当該分野でB細胞およびT細胞悪性腫瘍の治療に利用可能である。一般に、上記のCHOP、CVP、およびEPOCHのような化学療法剤の組み合わせが用いられる。化学療法剤およびその投与方法の詳細な考察については、Dorr、et al.、Cancer Chemotherapy Handbook、第2版、Appleton & Lange (Connecticut、1994)参照(本明細書の一部を構成する。)。化学療法のさらなる説明とプロトコールは当業者によく知られている。
モノクローナル抗体
【０００８】
最近の治療法は、B細胞表面上にみいだされるCD20抗原に対する抗体を用いるB細胞リンパ腫の治療用に開発されてきた。CD20は、悪性B細胞表面に高レベルに発現することによりB細胞リンパ腫上の魅力的な標的である。さらに、CD20抗原は、(1)腫瘍B細胞が脱落せず、(2)腫瘍B細胞により内在化せず、(3)その発現が変調しないため療法の論理的標的である。非病的組織中のCD20は、初期前B細胞発生中にBリンパ球が発現する抗原であり、B細胞が形質細胞に分化するまで表面上に発現したままである。CD20分子は、細胞周期の開始および分化に必要なB細胞の活性化プロセスにおける工程を調節すると考えられている。
【０００９】
抗CD20抗体は、単独または第二抗体または他の化学療法剤と組み合わせた療法として報告されてきた(例えば、米国特許No.6,455,043 B1、2002年9月24日発行)。Rituxan(登録商標)、抗CD20抗体は、再発性の以前に治療された低悪性度非ホジキンリンパ腫(NHL)に用いるためFood and Drug Administration(食品医薬品局)に承認された。関連モノクローナル抗体、Zevalin(登録商標)による治療も承認されている(例えば、Witzig TE、et al.、「Randomized controlled trial of yttrium-90-labeled ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy versus rituximab immunotherapy for patients with relapsed or refractory low-grade、follicular, or transformed B-cell non-Hodgkin's lymphoma」、J Clin Oncol. (2002) May 15; 20(10)：2453-63参照)。さらなる抗CD20抗体、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)は、最近FDAによりB細胞リンパ腫の治療用に承認された。B細胞リンパ腫の治療のための臨床試験における他のモノクローナル抗体療法には、Oncolym(登録商標)(HLA-Dr10タンパク質に対する)、エプラツズマブ(CD22に対する)、および抗CD52抗体(Campath(登録商標)/MabCampath(登録商標))(アレムツズマブ)が含まれる。
【００１０】
その作用機序についてはまだ論争があるが、抗CD20モノクローナル抗体はアポトーシスの誘導を介して治療効果をもたらすのに関与している。アポトーシスは、発生、分化、および細胞代謝回転を含む種々のプロセスにおける身体の細胞数の調節を可能にする。アポトーシスを受ける細胞のある特徴的変化は、ゲル電気泳動で解析するとDNAがエンドヌクレアーゼ活性関連分解により梯子様外観を呈することである。他の特徴的変化には、膜のブレブ形成(blebbing)および他の細胞骨格の崩壊、細胞収縮、および隣接細胞との接触の損失、および原形質膜の変性が含まれる。TGF-β、TNF、Fasリガンド、ある種の神経伝達物質、カルシウム、グルココルチコイド、細菌毒素、腫瘍抑制因子、および化学療法剤、例えばシスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プレドニゾンなどを含むアポトーシスの種々の誘導因子が同定されてきた。さらに、アポトーシスは、物理的損傷、例えば熱ショック、ウイルス感染、フリーラジカル、γ線、および毒素、例えばβ-アミロイドペプチドにより誘導されるかもしれない。
免疫療法
【００１１】
上記治療方法に加え、患者自身の免疫系の刺激に基づくB細胞癌の種々の実験的治療法が開発されてきた。悪性B細胞が独自に生成した抗原に対する免疫学に基づく治療を開発する最初の試みには、病的B細胞から直接イデオタイプ(Id)タンパク質を苦労して単離および精製することが含まれた。この技術は、これら単離タンパク質上のイデオタイプ決定基に対する能動免疫を用いて腫瘍増殖に対する抵抗性をもたらすマウスモデル系において最初に用いられた(Daley et al.、J. Immunol. 120 (5)：1620-24,1978；Sakato et al.、Microbiol. Immunol. 23 (9)：927-31,1979)。これらの結果は多くのさらなる実験的腫瘍モデルにおいて確認された(Stevenson et al.、J. Immunol. 130 (2)：970-03,1983；George et al.、J. Immunol. 141(6)：2168-74,1988；およびKwak、et al.、Blood 76 (11)：2411-17,1990)。
【００１２】
この考えと技術を臨床に持ち込む最初の試みは非常に集中的な労働であった。これら最初の試みは、生検後の患者の個々のリンパ腫から単離したタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を利用した。ある研究において、Meekerと共同研究者は、ほとんどがすでに従来のリンパ腫の化学療法的処置を受けた後の小グループの患者を治療するためのマウスモノクローナル抗イデオタイプ抗体を作製した(Meeker et al.、Blood 65：1349-63,1985)。しかしながら、肯定的な結果が得られたのは患者のほぼ半数のみであった。リンパ腫細胞は、種々の手段、例えば(a)細胞表面発現抗体のクラスの切り替え(Meeker et al.、N Engl J Med. 312：1658-65、1985)、または(b)CDR2領域の体細胞突然変異によりそのような治療に対する抵抗性を生じ得ることにも注意のこと(Cleary et al.、Cell 44：97-106,1986)。すなわち、治療のためのこの受け身免疫アプローチにはマウスにおける抗体反応を生じるのに必要な比較的小量の患者のイデオタイプタンパク質の単離および精製が必要なだけであるという利点があるが、それにも関わらず、そのリンパ腫治療への有用性は非常に限られている。
【００１３】
Kwakらは異なるアプローチをとり、患者自身の固有のリンパ腫から精製したタンパク質を用いて患者を能動免疫した。このアプローチは、大量のイデオタイプタンパク質を単離しなければならない論理的必要性に支障がある(Kwak et al.、N. Engl. J. Med. 327：1209-15, 1992)。化学療法後に疾患がないか最小限である患者を自己イデオタイプタンパク質を用いるワクチネーションにより治療した。ワクチネーション用の充分量のイデオタイプタンパク質を得るために、生検により得られたリンパ腫細胞を樹立組織培養細胞系と融合して組織培養中の増殖を促進し、分泌したイデオタイプタンパク質をクロマトグラフィで精製した。しかしながら、この治療方法の大規模な適用は、大変な労働を要し、技術的障害があり、比較的大量の生腫瘍細胞が必要であり、費用がひどく高いことにより妨げられる。さらに、哺乳類細胞のタンパク質生成に伴うウイルスロードに関する心配が最近生じてきており、そのような供給源の使用により一層の注意が必要である。
【００１４】
以下の論文で、Hsuらは、B細胞リンパ腫の治療にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合したイデオタイプのワクチネーションを用いる上記臨床試験の第I/II相の結果を報告した(Hsu et al.、Blood 89：3129-35,1997)。得られた結果は、抗イデオタイプ反応の発生が臨床成績の改善と関連があることを示した。抗イデオタイプ細胞性免疫反応を生じた(mounting)すべての患者において、疾患の進行をまぬがれる期間および全体的生存が免疫反応を生じなかった患者に比べて有意に延長された。再度、個々の患者をそれぞれ治療するため、生検により得られたリンパ腫細胞を樹立細胞系と融合し、典型的患者を免疫するのに充分なタンパク質の生成を可能にした。この結果は見込みがあるが、この方法は普及または市販する規模で用いるには困難過ぎて実施不能である。
【００１５】
より最近、Bendandiらは、濾胞リンパ腫の患者においてイデオタイプ患者特異的免疫誘導寛解を証明した(Bendandi et al.、Nat. Med. 5：1171-77, 1999)。標準的化学療法後、完全臨床的寛解の患者20人を、顆粒球-単球コロニー刺激因子(GM-CSF；下記参照)を併用し、患者特異的イデオタイプタンパク質を用いて免疫した。このリンパ腫に特徴的な転座の分子分析を、化学療法前、臨床的寛解時、およびワクチネーション療法後に行った。化学療法誘導寛解後に検出可能な転座を有する患者11人中8人が、このワクチネーション後に完全な分子的寛解を経験していることがわかった。腫瘍特異的細胞障害性CD8+およびCD4+T細胞が患者20人中19人にみられた。腫瘍特異的抗体も検出されたが、寛解に必要であるかわからなかった。また、この研究では、患者のリンパ腫に関連してみられ、ヘテロハイブリドーマ融合により生成された、免疫グロブリンの完全な可変および定常領域を構成するイデオタイプタンパク質を用いた。
【００１６】
B細胞介在悪性腫瘍に対するより効果的な治療法を開発するための一つの手段は、抗CD20療法と他の治療方法の統合である。そのような併用(組み合わせ)療法は、一般に患者の免疫系を刺激する他の抗体、他の化学療法剤、または治療であるかもしれない。あるそのような併用療法は、例えば、米国特許No.6,420,378 B1(2002年7月16日発行)に記載の、抗CD20抗体と20(S)-カンプトテシンを組み合わせた使用である。他のそのような併用療法は米国特許出願No.2001/0018041 A1(IDEC Pharmaceuticals Corp.に譲渡、2001年8月30日公開)(抗CD20および抗CD40L抗体を使用)に記載されている。これらの併用療法は、低悪性度の濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)に加えて他のタイプのリンパ腫に対する療法として有用かもしれない。
【００１７】
しかしながら、残念なことに癌患者は、あらゆる治療法の後に該疾患を再発することが多い。1999年のみでほぼ57,000例の新規NHL症例が米国において推定され、より効果的またはさらなる治療が有効であろう。
(発明の要約)
【００１８】
本発明は、イデオタイプタンパク質を用いる免疫を用いる特異結合細胞減少剤、例えば、抗CD20抗体によるB細胞介在疾患の治療直後の驚くべき相乗効果を特徴とする。すなわち、第一の局面において、本発明は、(1)特異結合細胞減少剤および(2)自己Idタンパク質を含む免疫療法組成物を同時に同時投与することを含む併用療法を用いる患者のB細胞悪性腫瘍の治療方法を特徴とする。本発明の目的において、同時に同時投与するとは、先の治療中、またはその前または後、もしくは先の治療終了から3カ月以内に免疫療法組成物を投与することをいう。
【００１９】
別の局面において、本発明は、(1)特異結合細胞減少剤および(2)自己Idタンパク質の少なくとも部分を含む、樹状細胞内にロードされる免疫療法組成物を同時に同時投与することを含む併用療法を用いる患者のB細胞悪性腫瘍の治療方法を特徴とする。この局面の好ましい態様において、樹状細胞は自己樹状細胞である。ランゲルハンス細胞は、樹状細胞と同様にしてこの局面に用いることができよう。
【００２０】
異なる局面において、本発明は、特異結合細胞減少剤の投与を含むB細胞悪性腫瘍の、自己Idタンパク質を同時に同時投与することを含む改良された治療方法を特徴とする。
【００２１】
好ましい態様において、B細胞悪性腫瘍は以前に治療されていないかまたは少なくとも化学療法剤で以前に治療されていない。
【００２２】
他の好ましい態様において、治療すべき疾患は、再発性B細胞悪性腫瘍、B細胞リンパ腫、B細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(ここで、非ホジキンリンパ腫は低悪性度、中悪性度、または高悪性度である)、小リンパ球性B細胞リンパ腫、濾胞性・小開裂細胞優位型B細胞リンパ腫、濾胞性・小開裂細胞大細胞混合型B細胞リンパ腫、濾胞性・大細胞優位型B細胞リンパ腫、びまん性小開裂細胞型B細胞リンパ腫、びまん性小細胞大細胞混合型B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、免疫芽球性・大細胞型B細胞リンパ腫、リンパ芽球性B細胞リンパ腫、小型非開裂バーキットおよび非バーキット型B細胞リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、単球様B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性B細胞白血病、B細胞系急性リンパ芽球性白血病、およびB細胞系慢性リンパ球性白血病からなる一覧から選ばれる。
【００２３】
さらなる態様において、自己Idタンパク質を用いる同時に同時投与する治療は、該特異結合細胞減少剤の最終投与の3カ月以内、該特異結合細胞減少剤の最終投与の2カ月以内、該特異結合細胞減少剤の最終投与の1カ月以内、または該特異結合細胞減少剤の最終投与の1週間以内に開始する。自己Idタンパク質を用いる同時に同時投与する治療法は、細胞減少剤治療と同時に、または1週間以内であってもよい。
【００２４】
他の態様において、特異結合細胞減少剤は抗原結合細胞減少剤である。これら態様のあるものは、抗原結合細胞減少剤は、抗CD20抗体、抗CD52抗体、抗CD22抗体、抗B7抗体、抗CD19抗体、抗CD32抗体、抗CD33抗体、抗CD64抗体、抗CD16抗体、抗CD86抗体、および抗CD156抗体からなる群から選ばれる。他の特異結合細胞減少剤も本発明において有用である。悪性免疫細胞、例えばB細胞の細胞表面は、特異結合細胞減少剤のリガンドとしての役割を果たすかもしれない多くのタンパク質を含む。悪性B細胞と結合し、細胞減少をもたらすことができるそのような特異結合細胞減少剤を本発明に用いることもできよう。
【００２５】
さらなる態様において、自己Idタンパク質は宿主細胞中で組換え的に生成され、潜在的宿主細胞は、哺乳類、細菌、酵母、昆虫、または他の宿主細胞を含む。他の好ましい態様において、自己Idタンパク質は、昆虫細胞系中で組換え的に生成される。さらなる好ましい態様において、自己Idタンパク質はCHO細胞およびBHK細胞を含む哺乳類細胞系中で組換え的に生成される。さらなる好ましい態様において、自己Idタンパク質は、S. cerevisiaeを含む細菌細胞または酵母細胞中で組換え的に生成される。他の好ましい態様において、Idタンパク質は、Idタンパク質をコードするDNA分子、例えばDNAワクチンの形で患者に送達される。
【００２６】
ある好ましい態様において、自己Idタンパク質は投与前にKLHと結合される。
【００２７】
関連する局面において、自己Idタンパク質は、オープンリーディングフレームのDNA配列の部分が治療する患者のB細胞悪性腫瘍から単離された核酸配列から得られる、オープンリーディングフレームによりコードされる。ある態様において、自己Idタンパク質は完全長抗体重鎖も完全長抗体軽鎖も含まない。他の態様において、該Idタンパク質は、完全長抗体重鎖を含まない。さらなる態様において、該自己Idタンパク質は完全長抗体軽鎖を含まない。
【００２８】
本発明の別の局面において、自己Idタンパク質を用いて同時に同時投与する治療は、特異結合細胞減少剤の投与終了前に開始され、自己Idタンパク質および細胞減少剤を用いる治療を並行して継続する。すなわち、特異結合細胞減少剤による治療を自己Idタンパク質の最初の投与後に継続し、特異結合細胞減少剤の投与と自己Idタンパク質の投与を一連の治療中に周期的に継続する。
(図面の簡単な説明)
【００２９】
図1：化学療法後の再発性/難治性の濾胞性NHL患者のRituxanを用いる細胞減少後のFavId治療。図1は、Witzig T. E. et al.、「Randomized controlled trial of yttrium-90-labeled ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy versus rituximab immunotherapy for patients with relapsed or refractory low-grade、follicular、or transformed B-cell non-Hodgkin's lymphoma」、J Clin Oncol. (2002) May 15；20 (10)：2453-63と比較した実施例1の本願出願時における臨床試験結果を示す。グラフは、リツキシマブ、次いでAvid(登録商標)による治療の結果とWitzig、et al.に記載のリツキシマブ単独の結果を比較している。これらの結果は、化学療法再発性/難治性B細胞NHL患者のFavId(登録商標)による治療をリツキシマブの1回の一連の治療の2カ月後に開始するとリツキシマブ単独による治療に比べて疾患の進行までの時間の有意な延長を生じることを示す。
【００３０】
図2：治療経験のない濾胞性NHL患者のRituxanによる細胞減少後のFavId治療。図2は、Colombat P、et al.、「Rituximab (anti-CD20 monoclonal antibody) as single first-line therapy for patients with follicular lymphoma with a low tumor burden：clinical and molecular evaluation」、Blood (2001) 97(1)：101-106と比べて実施例2における本願出願時点の臨床試験結果を示す。これらの結果は、リツキシマブの1回の一連の治療後2カ月間FavId(登録商標)を投与された治療経験のない(ナイーブ)B細胞NHL患者はリツキシマブによる治療と比較して疾患の進行までの時間の有意な延長を生じることを示す。
【００３１】
図3：治療経験のない濾胞性NHL患者におけるRituxanによる細胞減少とFavId治療。図3は、リツキシマブの1回の一連の治療、次いでFavIdによる治療の利点と、Hainsworth JD、et al. 「Rituximab as First-Line and Maintenance Therapy for Patients With Indolent Non-Hodgkin's lymphoma」、J Clin Oncol. (2002) October 15;20：4261-4267に示す結果との比較を示す。Hainsworthらのデータは、図3に示すように6カ月間毎に投与したリツキシマブの治療法の価値を示す。これは、当業者に「維持Rituxan(登録商標)」療法として知られており、無痛性B細胞NHLの患者のRituxan療法の1回の一連の治療と比較して進行までの時間がより長くなると一般に認められている。「維持Rituxan(登録商標)」は、Colombat Pらの結果からの改良を示す。すなわち、実施例2からの治療経験のないB細胞NHL患者におけるリツキシマブとFavId(登録商標)の単回治療の結果とHainsworthらのデータとの比較は、FavId(登録商標)がHainsworthらの維持療法と組み合わされ、免疫系の全体的抑制がFavId(登録商標)の利益を損なわなければ、患者にさらなる利益をもたらす可能性を示唆する。この臨床試験のプロトコールは実施例8に示す。
(発明の詳細な説明)
【００３２】
本発明は、特異結合細胞減少剤、例えば、抗CD20抗体、次いですぐにイデオタイプタンパク質による免疫の驚くべき併用を特徴とする。以前に用いた療法において、ある治療法、例えば化学療法には回復および寛解期間が続き、次いで再発が次回の療法を余儀なくする。さらに、イデオタイプタンパク質を用いる免疫を意図する場合、治療する医師は免疫系が先の治療から回復するのを待って免疫反応の誘導を試みる傾向があるかもしれない。これは、抗CD20抗体による治療がこの患者の全B細胞ポピュレーションを特異的に除去すれば特にあてはまるであろう。イデオタイプタンパク質の形の免疫原を速やかまたは同時に同時投与するとイデオタイプタンパク質に対する実質的な抗体反応を誘導しないだろう。しかしながら、本発明者らは、免疫反応のB細胞/抗体反応力(arm)の欠失が予想されたにも関わらず、イデオタイプタンパク質による免疫と、それに次いで速やかに行う特異結合細胞減少剤、例えば抗CD20抗体、例えばリツキシマブによる処置により驚くべき相乗効果があることを発見した。このまたはあらゆる他の理論に縛られることなく、本発明のある利点は、免疫療法剤の意図する標的が細胞が減少したポピュレーション内にみられる、特異結合剤、次いで速やかに活性免疫療法剤を用いる細胞減少はその治療効果について主としてT細胞に依存する強力な抗腫瘍免疫反応を生じることである。
【００３３】
本発明は、自己Idタンパク質の投与が特異結合細胞減少剤による治療の終了前に最初になされ、両薬剤による治療を協調して継続する、重複する時間経過で特異結合細胞減少剤および自己Idタンパク質を投与することも特徴とする。重複する時間経過のある態様では、特異結合細胞減少剤を6カ月ごとに投与し、特異結合細胞減少剤を投与するのと同じでない月に自己Idタンパク質を毎月投与する。該特異結合細胞減少剤は、約2週間毎、約3週間毎、約1月毎、約2月毎、約3月毎、約4月毎、または約6月毎に投与してもよい。自己Idタンパク質は、約2週間毎、約3週間毎、約1月毎、約2月毎、約3月毎、約4月毎、または約6月毎に投与してよい。ある態様において、特異結合細胞減少剤または自己Idタンパク質の投与計画は、その他の投与のために中断してよい。
【００３４】
特異結合細胞減少剤を用いる併用治療がさらに有利である。該治療は癌の容積の減少後に残存する癌に有効である可能性が高いことが当業者によく認められている。Idタンパク質を標的とする特異結合細胞減少剤療法の利点は、患者のB細胞悪性腫瘍が独特に発現したIdタンパク質が身体の他の場所にはみられないことである。したがって、リンパ腫のIdタンパク質に対する免疫反応の発生は正常組織に重大な毒性を生じない。さらに、Idタンパク質を免疫原に用いて誘発したそのような能動免疫反応は寿命が長く、疾患の再発を遅延または抑制するはずである。最終的に、能動免疫反応は、リツキシマブまたは同様の薬剤を用いるような受け身抗体療法を用いてみられるものより広い免疫反応をもたらす。Idタンパク質を用いる免疫により誘導されたこの能動免疫反応は、時間とともにB細胞悪性腫瘍のIdタンパク質配列の腫瘍の不均一性および突然変異傾向をよりよく中和することができるかもしれない。
(定義)
【００３５】
用語「治療(処置)する(treating)」は、異常な状態、例えばB細胞悪性腫瘍に罹患した生物に組成物を投与し、該組成物の投与は、治療効果があり、異常な病状を少なくとも部分的に軽減または排除することを表す。治療は完全な治癒をもたらす必要はなく、少なくとも1症状が改善または除去されれば治療は有効と考えられることに注意のこと。さらに、治療が、病状または他の異常な状態、例えばB細胞悪性腫瘍の永久的な改善をもたらすことが好ましいが、その必要はない。該治療は、癌性細胞を殺滅し、癌性細胞の殺滅を促進し、癌性細胞の増殖を阻害し、および/または癌の転移プロセスを阻害することにより奏功するかもしれない。
【００３６】
用語「患者」は、治療剤による治療の必要性が示唆される特定の症状または症状(複数)を伴う病態にある生物を表す。治療は一般に医学会で許容されているか、実験的であってよい。好ましい態様において、患者は、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ブタ、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスを含む哺乳動物である。さらなる好ましい態様において、患者はヒトである。患者の診断を、自然のまたは治療計画または治療の経過中の疾患の進行の経過中に変更することができるが、それにも関わらず、患者はまた治療が必要と考えることができることに注意のこと。
【００３７】
用語「治療効果」は、異常な状態(疾患または障害を含む)を生じるかまたはそれに関与する因子の阻害または活性化を表す。治療効果は、異常な状態の症状の1またはそれ以上をある程度軽減または抑制する。本発明に関連する異常な状態の治療に関して、治療効果は以下の1またはそれ以上を表しうる：
(a)特定の位置にまたは生物内に存在する細胞数の増加または減少、例えば、リンパ腫細胞の全体的減少；(b)細胞の移動能力の増加または低下；(c)細胞の増殖、成長、および/または分化の増加または低下；(d)細胞死の阻害(すなわち、遅延または停止)または加速、例えば、リンパ腫細胞のアポトーシスの速度の増加；(e)異常な病状に関連する、1またはそれ以上の症状のある程度の緩和；(f)罹患細胞ポピュレーションの機能を増大または阻害、例えば、T細胞の活性化。
【００３８】
本明細書で用いている用語「治療的有効量」は、治療効果を提供するために研究者、獣医師、医者、または他の臨床家が求める、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医薬的反応を促す活性化合物の量を意味する。
【００３９】
用語「異常な状態」は、該生物の正常な機能から逸脱する生物の細胞または組織の機能を表し、限定されるものではないがB細胞悪性腫瘍が含まれる。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞生存、細胞機能、または細胞内酵素の活性に関連しうる。細胞増殖障害に関する異常な状態には、癌、例えばB細胞悪性腫瘍、B細胞リンパ腫、B細胞白血病、T細胞悪性腫瘍、T細胞リンパ腫、およびT細胞白血病が含まれる。細胞の生存に関する異常な状態とは、プログラムされた細胞死(アポトーシス)経路が活性化または無効になる病状を表す。
【００４０】
用語「投与」または「投与する(administering)」は、異常な状態またはB細胞悪性腫瘍を治療または予防するために動物、好ましくは哺乳動物の細胞または組織に化合物を取り込ませる方法を表す。本発明組成物を活性物質の組み合わせとして提供するときは、用語「投与」および「投与する」には、その他の薬剤を含む組成物を連続的または同時に導入することが含まれる。生物内に存在する(harbored)細胞については、化合物を投与する多くの技術が当該分野に存在する。治療用組成物は、注射を含む従来のあらゆる経路によるか、または時間と共に徐々に注入することにより投与することができよう。投与は投与する組成物に応じて、例えば経口、肺、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または経皮である。生物から細胞を単離または回収し、単離または回収した細胞に化合物を投与し、次いで該細胞を該生物に戻すことにより、化合物を生物に投与することもできよう。生物の外側および少数例では生物内の細胞について、(限定されるものではないが)細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術、インキュベーション、および担体技術を含む、該組成物を投与するための多くの技術が当該分野に存在する。
【００４１】
用語「同時に(contemporaneously)同時投与する(co-administering)」は、第2治療法を第1治療法の終了時または第1治療法の終了後3カ月まで以内に開始する、関連した時期に2またはそれ以上の治療法を施すことを表す。すなわち、仮定上の治療法Aが3月1日に終わるとすると、同時に同時投与する治療法Bは、同じ年の3月1日から5月31日までの期間中のどこかで開始してよい。本発明の他の態様において、「同時に同時投与する」は、自己Idタンパク質を用いる治療法を、特異結合細胞減少剤による治療と同時、治療中、または治療終了3カ月以内に開始することを表す。本発明の方法において、自己Idタンパク質は、該細胞減少剤と同時に、最終特異結合細胞減少剤の最終投与以降、1カ月、2カ月、3カ月以内、またはあらゆる週部分区間、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間で投与することができよう。
【００４２】
さらなる態様において、自己Idタンパク質および該細胞減少剤を、自己Idタンパク質の投与を細胞減少剤の最終投与前に開始し、2つの投与を並行して継続する、重複する方法で投与することができよう。すなわち、自己Idタンパク質を投与し、次いで特異結合細胞減少剤を投与し、次いで順に自己Idタンパク質を投与し、この重複投与パターンを継続することができよう。ある態様において、特異結合細胞減少剤を約2週間毎、約3週間毎、約1月毎、約2カ月毎、約3カ月毎、約4カ月毎、または約6カ月毎に投与することができよう。自己Idタンパク質は、約2週間毎、約3週間毎、約1月毎、約2カ月毎、約3カ月毎、約4カ月毎、または約6カ月毎に投与することができよう。特異結合細胞減少剤または自己Idタンパク質の投与スケジュールはその他の投与を中断させるかもしれない。特異結合細胞減少剤または自己Idタンパク質の投与は定期的なスケジュールに従う必要はなく、間隔を変動させて投与することができよう。
【００４３】
好ましい態様において、第1治療法には特異結合細胞減少剤を用いる。他の好ましい態様において、第1治療法に抗CD20抗体を用いる。さらに好ましい態様において、第1治療法にリツキシマブまたはトシツモマブを用いる。好ましい態様において、第2治療法にはイデオタイプタンパク質を用いる治療を用いる。
【００４４】
特異結合細胞減少剤治療法の一例は、抗CD20モノクローナル抗体を用いる一連の治療である。「同時に同時投与する」と同様に、本明細書で用いている用語「同時投与(処置)する」、「近接関連処置」、「近接投与処置」、または「時間的に関連した処置」は、同時にもしくは重複する方法で行うか、または第2治療法を最後のアポトーシス剤の最終投与後3カ月間以内に開始する2つの治療方法も表すことがある。これら用語は、2つの治療法が重複する場合に、第1治療法が第2が始まる前に終了しない治療も表すことにも注意のこと。
【００４５】
ある種の態様において、用語「同時に同時投与する」は、自己Idタンパク質を、最後の特異結合細胞減少剤の最終投与と同時に、またその1カ月、2カ月、3カ月以内、またはあらゆる週部分区間、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間で投与することができよう。好ましい態様において、第1治療法には特異結合細胞減少剤を用いる。他の好ましい態様において、第1治療法は抗CD20抗体を利用する。さらなる好ましい態様において、第1治療法はリツキシマブまたはトシツモマブを含む。さらに好ましい態様において、特異結合細胞減少剤は、抗CD52抗体、抗CD22抗体、抗B7抗体、抗CD19抗体、抗CD32抗体、抗CD16抗体、抗CD86抗体、および抗CD156抗体からなる群から選ばれる。他の特異結合細胞減少剤も本発明において有用である。悪性免疫細胞、例えばB細胞の細胞表面は、特異結合細胞減少剤のリガンドとしての役割を果たすかもしれない多くのタンパク質を含む。悪性B細胞と結合し、細胞減少を生じることができるそのような特異結合細胞減少剤を本発明に用いるもできよう。好ましい態様において、第2治療法はイデオタイプタンパク質による処置を利用する。
【００４６】
別の態様において、自己Idタンパク質および該細胞減少剤は、自己Idタンパク質の投与を細胞減少剤の第1投与後、細胞減少剤の最終投与前に開始し、自己Idタンパク質および細胞減少剤の投与を並行して継続する、重複する方法で投与することができよう。
【００４７】
用語「特異結合細胞減少剤」は、その所定の標的、おそらく細胞表面抗原と選択的および特異的に結合し、標的細胞を殺滅し、またはその成長を阻害し、または標的細胞ポピュレーションを殺滅することにより細胞減少をもたらす細胞減少剤を表す。好ましい態様において、「特異結合細胞減少剤」は抗原結合細胞減少剤である。さらなる好ましい態様において、特異結合細胞減少剤は抗CD20モノクローナル抗体、例えばリツキシマブである。他の好ましい態様において、特異結合細胞減少剤は、種々の表面抗原、例えばCD19、CD22、B7、またはCD156と特異的に結合する抗体であってもよい。特異結合細胞減少剤は抗体であるか、または抗体の機能的誘導体、例えば、ScFv、カメリド抗体断片、または抗体の他の機能的誘導体であってよい。細胞減少剤はアポトーシス剤であってよい。他の特異結合細胞減少剤が考えられる。2以上の細胞表面抗原と結合することができる二重特異性抗体も本発明に有用である。さらに、悪性免疫細胞、例えばB細胞の細胞表面は、特異結合細胞減少剤のリガンドとしての役割を果たすかもしれない多くのタンパク質を含む。悪性B細胞と結合し、細胞減少をもたらすことができるそのような特異結合細胞減少剤も本発明に用いることができよう。
【００４８】
用語「細胞減少剤」は、細胞数を減少させるかまたは細胞の標的ポピュレーションの細胞分裂を遅らせる薬剤を表す。細胞減少剤は、アポトーシスの誘導を介して作用するかもしれないが、他の機序が考えられる。
【００４９】
本発明の化合物を対象に投与するときは、一般にそれらを「組成物」として製造する。そのような組成物はしばしば混合物であり、常套的に医薬的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合担体、および所望により他の治療剤を含むかもしれない。組成物は、担体タンパク質、例えば、KLHおよびアジュバント、例えば、KLH、BCG、アルミニウム塩、およびMF59 (Singh and O'Hagen、Nat. Biotech 17：1075-81(1999))、および刺激核酸化合物、例えば、CpGオリゴヌクレオチドを含むかもしれない(例えば、Jahrsdorfer B、et al.、J Leukoc Biol. 69(1)：81-8 (2001); Krieg AM、et al.、Trends Microbiol. 6(1)：23-7(1998))。該組成物の成分は、自己Idタンパク質と共有結合していてよい。組成物は、サイトカイン、例えば、GM-CSFおよびMCP-3を含むかもしれない。治療用組成物は、注射または時間とともに徐々に注入することを含むあらゆる従来の経路により投与されるかもしれない。該投与は、投与する組成物に応じて、例えば、経口、肺、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または経皮であってよい。
【００５０】
本明細書で用いている用語「自己(autologous)」は、治療する患者由来の患者の、免疫グロブリンの可変領域のアミノ酸配列、または免疫グロブリンの可変領域をコードする遺伝子の核酸配列を表す。該タンパク質は次いでin vitroで合成し、該核酸配列をin vitroで合成し、操作し、または組み立てることができるが、それにも関わらず、患者から得た生検から得られる、Idタンパク質の可変領域の配列は患者の悪性腫瘍で処置した患者と関連がある。イデオタイプタンパク質に用いる可変領域および免疫グロブリンサブタイプの正確な組み合わせは、患者の悪性腫瘍により発現されないかもしれないが、自己Idタンパク質の定常領域は一般にヒトにみられ、該可変領域は患者から誘導される。樹状細胞または生物由来の他の細胞について、用語「自己」はさらなる意味を持つ。「自己」細胞を治療する患者から得、そして/または単離する。すなわち、自己樹状細胞を治療する患者から得、好ましい態様において、自己樹状細胞を自己Idタンパク質と接触させ、次いで該患者に投与して戻す。
【００５１】
本明細書で用いている用語「Idタンパク質」または「自己Idタンパク質」は、イデオタイプタンパク質としても知られる、特定の患者由来の自己腫瘍由来イデオタイプ表面Igを表す。好ましい態様において、Idタンパク質は患者のB細胞腫瘍、患者のB細胞悪性腫瘍、または腫瘍または悪性腫瘍由来の細胞から誘導される。
【００５２】
用語「組換え自己Idタンパク質」は、組換え手段により患者の外部で合成された自己Idタンパク質を表す。好ましい態様において、組換え自己Idタンパク質は昆虫細胞中で合成されている。他の好ましい態様において、該組換え自己Idタンパク質は酵母または細菌細胞中で合成されている。さらなる好ましい態様において、該組換え自己Idタンパク質は哺乳類細胞中で合成されている。患者に投与するIdタンパク質は、一般的に、最終配列が患者および発現ベクターの両者に由来するキメラタンパク質である。ある場合において、組換え自己Idタンパク質のアミノ酸配列は患者にみいだされるIdタンパク質と同じであってよい。
【００５３】
本明細書で用いている用語「接触させる(contacting)」は、Idタンパク質を含む溶液または組成物をポリペプチドまたは細胞を入れた液体培地に一緒に加えることを表す。Idタンパク質を含む溶液は、Idタンパク質を該方法の細胞に取り込むのを促進するのに用いる別の成分を含んでいてもよい。被検化合物を含む溶液は、送達装置、例えば、ピペットベースの用具またはシリンジベースの用具を利用して細胞を入れた培地に加えることができよう。
【００５４】
本明細書で用いている用語「原発性悪性腫瘍」は、特異結合細胞減少剤による治療を開始する前に化学療法による治療が以前になされていないB細胞悪性腫瘍を表す。同様に、用語「治療されていない」は、本発明の手段により治療を受ける前にB細胞悪性腫瘍の治療がなされていない患者由来のB細胞悪性腫瘍を表す。例えば、そのような患者は一連の化学療法を受けていない。
【００５５】
本明細書で用いている用語「アポトーシス剤」は、細胞のアポトーシス、またはプログラムされた細胞死のプロセスを開始または促進する化合物、薬剤、毒素、組成物、または希に生物学的存在である。好ましい態様において、アポトーシスが開始または促進される細胞はB細胞悪性腫瘍の細胞である。典型的アポトーシス剤には、限定されるものではないが、TNF-α、AIM I(国際公開公報No. WO97/33899参照)、AIM II(国際公開公報No. WO 97/34911参照)、およびFasリガンド(Takahashi et al.、Int. Immunol.、6：1567-1574 (1994))、VEGI(国際公開公報No. WO 99/23105参照)が含まれる。
【００５６】
本明細書で用いている用語「組換え的に」は、天然に結合しているもの以外の他のDNA配列と結合しているDNA配列を最初に転写し、次いで翻訳することにより化合物を生成する手段を表すことができる。組換え産物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、調節エレメントと結合するポリペプチド、構造タンパク質、RNA分子、および/またはリボザイムなどであり得る。好ましい態様において、本発明の組換え産物はイデオタイプタンパク質である。他の好ましい態様において、本発明の組換え産物はモノクローナル抗体である。さらに好ましい態様において、本発明の組換え産物は抗体類似体である。
【００５７】
この組換え産物のリストは、単に例示のためであって、本発明は他のタイプの組換え産物に関することがある。遺伝子産物を生成するための供給源として用いるDNA配列は、一般に、全てまたは一部が発現に用いるものと別の生物または細胞から得られ、次いで連結して組換え方法において遺伝子産物を生成するための発現ベクターとする。ヒト遺伝子を最初に単離し、次いで発現ベクターに挿入し、次いでヒト細胞に戻すと、ヒト細胞系中でヒト遺伝子を組換え的に発現させるかもしれないことに注意のこと。
【００５８】
本明細書で用いている用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は互換性であり、その従来の意味、すなわちアミノ酸鎖に用いられる。いずれの用語も、いかなる規定した長さまたはいかなる範囲の長さのアミノ酸鎖を意味しない。これら用語は、ポリペプチドの翻訳後(または合成後)修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化など、および当業者に知られた他の修飾(ともに天然および非天然の)を意味しないか排除する。ポリペプチドは、完全タンパク質または一定領域のアミノ酸鎖であってよい。タンパク質は2以上のポリペプチドを含むことができよう。
【００５９】
用語「昆虫細胞系」は、昆虫由来の細胞系を表す。多くのそのような昆虫細胞系は、バキュロウイルスによる感染に感受性である。当業者は、そのような細胞系およびそれらを利用するのに必要な技術をよく知っている。昆虫細胞系の典型的例には、Spodoptera frugiperda(sf9)およびTrichoplusia ni細胞系が含まれる(米国特許No.5,300,435および5,298,418参照)。
【００６０】
用語「Trichoplusia ni細胞」および「Spodoptera frugiperda細胞」は、しばしばバキュロウイルス発現ベクターと組み合わせて用いる昆虫細胞系を表す。当業者はこれら細胞系およびそれを得る方法をよく知っている。
【００６１】
本明細書において用語「ベクター」は、Idタンパク質をコードする分子のような目的とする別のDNA分子をベクターのDNA中に挿入することができるDNA分子を表す。ベクターのクラスの例にはプラスミド、コスミッド、ウイルス、およびバクテリオファージ(「ファージ」)がある。典型的には、ベクターは、種々の挿入DNA分子に許容され、次いで宿主細胞(例えば細菌、酵母、高等真核細胞)に目的とするDNAを移動または伝達するのに用いられるように設計される。ベクターは、挿入するDNA分子のサイズに基づき、意図する使用に基づいて選ぶことができよう。RNAに転写するか、または転写し、次いで翻訳してコードされたポリペプチドを生成するための発現ベクターを選ぶことができよう。特異的DNA配列(例えば、cDNAライブラリー中のあるDNA配列)を保存または同定し、または特異的DNA配列の大量のコピーを製造するためにクローニングベクターを選ぶことができるが、発現ベクターもクローニングまたは保存に用いることができよう。該ベクターがウイルスまたはバクテリオファージであれば、用語ベクターはウイルスまたはバクテリオファージ外被を含むかもしれない。
【００６２】
細胞内に侵入後、挿入DNAを含むすべてまたは部分の該ベクターDNAを宿主細胞染色体に組み込むか、または該ベクターを染色体外で維持することができよう。染色体外で維持されるそれらベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的に複製する能力があることが多い(例えば、細菌の複製起源を有する多くのプラスミド)。他のベクターは宿主細胞中に導入されるとすぐに宿主細胞のゲノムに統合され、宿主ゲノムとともに複製される。
【００６３】
本明細書で用いている用語「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物、通常タンパク質をコードする遺伝子を、選択した遺伝子産物を選択した宿主細胞の該機構またはin vitro 発現系により発現させることができるベクター中の特定の位置に置くことができるDNA構築物を表す。このタイプのベクターはプラスミドであることが多いが、他の形の発現ベクター、例えば、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、複製欠損レトロウイルス、およびアデノ関連ウイルス)を用いることができよう。発現ベクター、制御配列、形質転換方法などの選択は、遺伝子発現に用いる宿主細胞のタイプに依存する。本発明の発現ベクターは、p10プロモーター、プロヘドリンプロモーター、ミツバチメリチンシグナル配列、またはヒトアルカリホスファターゼシグナル配列を用いることができよう。そのような発現ベクターは、これらまたは他のプロモーターまたはシグナル配列のあらゆる組み合わせを用いることができよう。すなわち、p10プロモーターは、ミツバチメリチンシグナル配列またはヒトアルカリホスファターゼシグナル配列と機能的に連結してよく、プロヘドリンプロモーターは、ミツバチメリチンシグナル配列またはヒトアルカリホスファターゼシグナル配列と連結することができよう。該プロモーターは、発現ベクター中の該キメラタンパク質をコードする両遺伝子と機能的に連結することができよう。該シグナル配列は、発現ベクター中のキメラタンパク質をコードする両遺伝子と個々に機能的に連結することができよう。
【００６４】
用語「バキュロウイルス発現ベクター」は、通常、昆虫細胞を用いて発現が行われる、バキュロウイルス系に用いると目的の挿入遺伝子を発現するように設計されるDNA構築物を表す。バキュロウイルス系において機能するように設計された、あらゆる可能性のあるバキュロウイルスまたは発現ベクターを本発明に用いることができよう。同様に、用語「発現ベクター」は、バキュロウイルス発現ベクターの特定の態様を含む属であるが、「発現ベクター」は、昆虫細胞系に加えて、またはそれとは別の細胞及び細胞系中で機能することができよう。
【００６５】
用語「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を表す。この領域は、コーディング配列の部分または全コーディング配列を示すことがある。好ましい態様において、出発コドンと終止コドンの間の完全配列を表す。
【００６６】
用語「患者由来の」は、患者から得られた血液または組織試料から単離または精製された遺伝子物質または細胞を表す。用語「B細胞悪性腫瘍由来の」は、患者から得たB細胞悪性腫瘍の試料から単離または精製した遺伝子物質を表す。
【００６７】
用語「完全長重鎖」は、患者のB細胞悪性腫瘍から単離した無傷のcDNA分子または無傷の重鎖免疫グロブリンポリペプチド鎖の配列を表す。完全長重鎖は、あらゆるサブタイプの免疫グロブリン鎖であってよい。
【００６８】
用語「完全長軽鎖」は、患者のB細胞悪性腫瘍から単離された、無傷のcDNA分子または無傷の軽鎖免疫グロブリンポリペプチド鎖の配列を表す。そのような完全長軽鎖はκまたはλ鎖であってよい。
【００６９】
用語「キメラタンパク質」は、少なくとも2つの異なるタンパク質由来の断片を含む単一ポリペプチド鎖を含むタンパク質を表す。キメラタンパク質の断片は、ヘテロローガスなタンパク質由来でなければならない。すなわち、キメラポリペプチドのすべての断片は、天然の同じタンパク質から生じない。本発明に用いるキメラタンパク質には、免疫グロブリン鎖のVHまたはVL領域の部分を含むタンパク質が含まれるが、キメラタンパク質は、VHまたはVL領域が誘導されるB細胞クローンにみられるそれらの鎖の完全C領域を含まない。さらに、VHまたはVL領域は必ずしも完全可変領域を含まなくてよいが、免疫反応を生じるのに充分なものを含む。本発明に用いるキメラタンパク質には、天然タンパク質の断片が等価な天然または非天然の断片で置換されているタンパク質も含まれ得る。これは、患者由来のIgG1定常領域を異なる供給源のIgG1定常領域で置換することを含み、タンパク質の断片が部分的または完全に合成品であるリンカー、断片、またはドメインで置換されている免疫グロブリンの定常領域も含む。しかしながら、ある例では、本発明のキメラタンパク質の遺伝子またはコーディング領域は、患者の天然の免疫グロブリンの遺伝子と同じであるかもしれない。キメラタンパク質の遺伝子またはオープンリーディングフレームは、以下の理由の1またはそれ以上により天然のタンパク質のオープンリーディングフレームと区別することができよう：
(1)それが患者由来の完全長免疫グロブリン遺伝子またはcDNA、または免疫グロブリン遺伝子またはcDNAのいくつかのより小さな部分であるか、(2)患者から単離されたものと異なるサブタイプであるか、または(3)患者のIgG1定常領域をコードする核酸配列は発現ベクターに用いるIgG1遺伝子の部分と異なり、そして/または(4)イデオタイプ発現に用いる遺伝子は、B細胞悪性腫瘍のメッセンジャー前mRNAに発現したものと同じイントロンを含まないであろう。キメラタンパク質は「融合タンパク質」も表すことがある。
【００７０】
用語「断片(segment)」または「部分(portion)」または「部分(part)」は、それが由来する完全長ポリペプチドより長さが短いポリペプチドのアミノ酸配列由来のポリペプチドの部分を示すのに用いる。そのような断片は、天然のポリペプチドの1またはそれ以上の特徴的部分を維持し得ると理解される。そのように保持された特性の例には、天然ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的な抗体と結合することが含まれる。
【００７１】
用語「VH」および「VL」は、免疫グロブリン分子のポリペプチド鎖の可変領域を表すか、または当業者が理解するようなポリペプチド鎖をコードする核酸を表す。可変領域の正確な配列は推定することができず、該配列(タンパク質または遺伝子)を単離することにより決定する必要がある。特定の患者から単離したVHおよびVL領域を本発明に用いる。カッパ(κ)またはラムダ(λ)鎖の正確な配列は、軽鎖遺伝子座のV領域、J領域、および定常領域のクローン的再配列により決定される(κおよびλ遺伝子座は分離しており、明確である。)。重鎖の正確な配列は、重鎖遺伝子座のV領域、D領域、J領域、および定常領域のクローン的再配列により決定される。可変領域のさらなる配列の変動は、組換え工程中の不正確さから生じ、組換え工程終了後の体細胞突然変異によっても生じる。用語「VH」および「VL」は、VHおよびVL領域の部分または断片も表す。VHまたはVL領域の断片は、V領域のすべてまたは実質的にすべてを含むことがある。用語「実質的にすべて」は、完全な可変領域の約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、またはそれ以下を表す。存在するVHまたはVL領域の部分は、本発明において該キメラ分子が機能するのに充分なものでなければならない。用語「VH」および「VL」は、そのようなポリペプチド領域の機能的誘導体を表すこともある。
【００７２】
用語「免疫グロブリン定常領域」は、免疫グロブリンの可変領域によりコードされない免疫グロブリン分子の部分の全てまたは部分を表す。用語「免疫グロブリン定常領域」は、免疫グロブリン定常領域をコードするDNA配列を表すこともある。該免疫グロブリン定常領域には、断片CL、CH1、CH2、CH3、およびヒンジ領域が含まれる。免疫グロブリンの種類には、IgGγ1、IgGγ2、IgGγ3、IgGγ4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、およびκまたはλ軽鎖、またはその断片が含まれる。あらゆる免疫グロブリン定常領域断片をキメラIdタンパク質に用いることができよう。免疫グロブリン定常領域断片の機能的誘導体を用いることもできよう。
【００７３】
用語「IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE」は、ヒト免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスを表す。該用語は、該タンパク質のDNA配列、RNA配列、またはアミノ酸配列を表すことがある。免疫グロブリン分子のクラスおよびサブクラスはその重鎖により決定する。IgGとIgDは異なるクラスの免疫グロブリンであり、IgG1とIgG2は異なるサブクラスの免疫グロブリン分子である。用語「IgA」は、あらゆるサブクラスのIgA分子を表す。好ましい態様において、該用語はIgA1分子を表す。他の好ましい態様において、該用語はIgA2分子を表す。ある態様において、用いる免疫グロブリン重鎖は、第2タンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質であってよい。用語「IgGγ1」は、免疫グロブリンのIgG1クラスと関連する重鎖を表す。IgG1は、ヒトIgG免疫グロブリンの約66%を表す(Roitt et al.、Immunology、Mosby、St. Louis、pg. 4.2、1993)。
【００７４】
用語「カッパ定常領域」、「ラムダ定常領域」、「κ定常領域」、および「λ定常領域」は、免疫系の発生時に不変のままであるカッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖の定常領域を表す。該用語は、タンパク質のDNA配列、RNA配列、またはアミノ酸配列を表すこともある。本発明のある態様において、免疫グロブリン軽鎖の部分は、1またはそれ以上の他のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質を含むことができよう。
【００７５】
用語「単離する(isolating)」は、その正常な細胞環境から天然の核酸配列を取り出すことを表す。すなわち、該配列は、無細胞溶液中にあるか、または異なる細胞環境に置くうことができよう。該用語は、該配列が存在する唯一のヌクレオチド鎖であることを意味しないが、それと天然に結合する非ヌクレオチド物質を実質的に含まず(少なくとも純度約90-95%)、単離された染色体と区別されることを意味する。核酸に関して用語「単離する」を用いることにより、特異的DNAまたはRNA配列が、該配列が得られた細胞中より目的の溶液中に存在する総DNAまたはRNAが有意に高い割合(2〜5倍)に増加することを意味する。この豊富化は、ヒトによる、存在する他のDNAまたはRNAの量の選択的減少、または特異的DNAまたはRNA配列の量の選択的増加、またはその2つの組み合わせにより生じるかもしれない。しかしながら、この「豊富化」は他のDNAまたはRNA配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の相対量が有意に増加していることに注意すべきである。用語「顕著な(significant)」は、増加のレベルがそのような増加を生じるヒトに有用であることを示すのに用い、一般に少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも5〜10倍、またはそれ以上の、他の核酸に対する増加を意味する。該用語も、他の供給源由来のDNAまたはRNAが存在しないことを意味しない。他の供給源由来のDNAは、例えば、酵母または細菌ゲノム、またはクローニングベクター、例えば、pUC19由来のDNAを含む。この用語は、あるmRNAのレベルが他の種のmRNAに比べて天然に増加し得る天然の事象、例えば、ウイルス感染または腫瘍型増殖と区別される。すなわち、該用語は、ヒトが目的とする核酸の割合を増加させるのに介入する状況のみに及ぶことを意味する。用語「単離する」は、当該分野でよく知られた技術によりcDNA配列に変換される工程も含むことがある。
【００７６】
単離されたDNA配列は、天然環境より相対的により純粋である(天然のレベルに比べてこのレベルが少なくとも2〜5倍大きくなければならない(例えばmg/mLで))。PCRから得られた個々の配列は、電気泳動的に同質性に精製することができよう。このPCR反応から得られるDNA分子は、総DNAまたは総RNAから得られるかもしれない。これらDNA配列は、天然でも非天然でもよいが、好ましくは部分的に精製された天然物質(例えばメッセンジャーRNA(mRNA))の操作を介して得られる。例えば、mRNAからのcDNAライブラリーの構築は合成物質(cDNA)の作製を含み、純粋な個々のcDNAクローンは、cDNAライブラリーを保持する細胞からのクローン選択により合成ライブラリーから単離することができる。mRNAからのcDNAライブラリーの構築および異なるcDNAクローンの単離を含む方法は、天然メッセージの約106倍の精製をもたらす。すなわち、少なくとも1桁の、好ましくは2または3桁の、より好ましくは4または5桁の精製が明確に予期される。
【００７７】
用語「〜をコードする遺伝子」は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の配列を表す。該核酸配列は、DNAまたはRNA分子であってよい。好ましい態様において、該分子はDNA分子である。他の好ましい態様において、該分子はRNA分子である。DNA分子として存在する場合、該分子は該遺伝子の発現を指示するのに必要または有益な配列を含むことがある。RNA分子として存在する場合、該分子は宿主細胞のリボソームに翻訳開始を指示する配列(例えば、開始コドン、ATG)および該リボソームに翻訳終了を指示する配列(例えば終止コドン)を含むであろう。開始コドンと終止コドンの間にオープンリーディングフレーム(ORF)がある。
【００７８】
用語「挿入する(inserting)」は、制限酵素およびリガーゼの使用を介してDNA配列を操作し、通常、目的遺伝子をコードする目的のDNA配列を両分子を適切な制限酵素で消化して適合性重複を作製し、次いでリガーゼを用いて該分子と一緒に結合することにより他の核酸分子に組み込むことができる。当業者は、そのような操作を大変よく知っており、例はSambrook et al.にみることができよう(Sambrook、Fritsch、& Maniatis、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、1989)(この内容は本明細書の一部を構成する。)。
【００７９】
用語「〜の発現を可能にする」は、発現ベクターを目的遺伝子が発現する環境に置くことを表す。これは、一般に、発現ベクターを適切な細胞種に挿入し、遺伝子発現に必要なプロモーターおよび他の領域を宿主細胞の成分により認識し、目的遺伝子の発現をもたらすことを意味する。該発現は、通常、転写と翻訳の2工程からなる。発現は、細胞由来の成分を用いてin vitroで行うこともできる。当業者はこれら技術をよく知っており、そのような技術はSambrook et al. に記載されている(Sambrook、Fritsch、& Maniatis、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、1989)。好ましい態様において、発現産物はタンパク質またはポリペプチドである。他の好ましい態様において、発現産物はVH/IgGγ1、VL/Cκ、VL/Cλ、またはVL/IgGλ1である。
【００８０】
用語「分泌シグナル配列」は、細胞からのタンパク質の運び出しを指示するペプチド配列またはヌクレオチド配列を表す。このヌクレオチド配列は、選択したポリペプチドのアミノ末端に結合したペプチドとインフレーム(in frame)に翻訳され、該ペプチド分泌シグナル配列は、宿主細胞の機構と相互作用することにより選択したポリペプチドの分泌をもたらすであろう。分泌プロセスの部分として、この分泌シグナル配列は開裂除去され、運び出された後に目的のポリペプチドのみが残るであろう。好ましい態様において、ミツバチメリチン分泌シグナル配列を用いる。他の好ましい態様において、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を用いる。バキュロウイルス発現系は、これら分泌シグナル配列に限定されず、当業者に知られた他のものをこれらに代えて、これらに加えて置換することができよう。
【００８１】
用語「プロモーター制御」は、プロモーターが目的遺伝子の5’に位置し、DNA配列のmRNA分子への転写を指示する発現ベクター中のDNAの配置を表す。次いで、このmRNA分子は、宿主細胞の機構により翻訳することができる。
【００８２】
用語「プロテインA」、「プロテインG」、および「プロテインL」は、抗原結合部位と相互作用することなく免疫グロブリン分子と特異的に結合することができる特異的細菌タンパク質を表す。プロテインAは、免疫グロブリン分子のFc領域と結合するStaphylococcus aureusから単離したポリペプチドである。プロテインGは、ヒトG群連鎖球菌株(G148)から単離された免疫グロブリンG(IgG)と親和性を有する細菌細胞壁タンパク質である。プロテインLは、嫌気性細菌種のPeptostreptococcus magnusのいくつかの菌株が発現する免疫グロブリン軽鎖結合タンパク質である。
【００８３】
用語「機能的に連結した(operatively linked)」は、調節領域、例えばプロモーターまたはエンハンサーが目的の結合DNA遺伝子と、その転写が生じ、その翻訳を可能にするように結合しているDNAの配列を表す。用語「機能的に連結した」は、ポリペプチドをコードする遺伝子と結合し、単一のオープンリーディングフレームを形成する、プロセシングシグナル、例えば、分泌シグナル配列をコードするDNA配列を表すこともある。転写および翻訳後、分泌シグナル配列は、翻訳したポリペプチドの運び出しを生じる可能性を有する。
【００８４】
タンパク質またはポリペプチドに関して用語「単離する(isolating)」は、その正常な細胞環境から天然のポリペプチドまたはタンパク質を取り出すか、または発現系の他のコンポーネントから発現系(例えば、本明細書に記載のバキュロウイルス系)において合成されたポリペプチドまたはタンパク質を取り出すことを表す。すなわち、ポリペプチド配列は無細胞溶液中にあっても、異なる細胞環境におかれてもよい。該用語は、該ポリペプチド配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味しないが、それと天然に結合する非アミノ酸ベースの物質を実質的に含まない(純度が少なくとも約90-95%)ことを意味する。
【００８５】
ポリペプチドについて用語「豊富化された」は、特定のアミノ酸配列において、目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列が正常細胞もしくは病的細胞中または該配列を得た細胞中より有意に高い分画(2〜5倍)を構成することを意味する。これは、存在する他のアミノ酸配列(または他の物質)の量が選択的に減少するか、目的の特異的アミノ酸配列の量が選択的に増加し、またはその2つの組み合わせによりヒトに生じるかもしれない。しかしながら、豊富化されたは、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味せず、ただ、目的の配列の相対量が有意に増加しているのであることに注意すべきである。該用語は、特に本明細書において、増加のレベルがそのような増加をさせるヒトに有用であり、一般に、他のアミノ酸配列に対して少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも5〜10倍、またはそれ以上の増加を意味することを示すのに有用である。該用語は、他の供給源由来のアミノ酸配列が存在しないことも意味しない。アミノ酸配列の他の供給源は、例えば、酵母または細菌ゲノム、またはクローニングベクター、例えばpUC19によりコードされるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、該アミノ酸配列は上記キメラタンパク質である。該用語は、ヒトが目的アミノ酸配列の割合を増加させるのに介入しているその状況のみに及ぶことを意味する。
【００８６】
アミノ酸配列が精製された形であることもある目的には好都合である。ポリペプチドについて用語「精製された」は、完全な純度(例えば均質な調製物)を必要としないが、該配列が天然環境より比較的純度が高いことを表す。天然のレベルに比べてこのレベルは少なくとも2〜5倍大きいべきである(例えば、mg/mLで)。少なくとも1桁の、好ましくは2または3桁の、より好ましくは4または5桁の精製が明確に予期される。該物質は、機能的に有意なレベルで夾雑物を含まない、例えば純度90%、95%、または99%であることが好ましい。
【００８７】
本明細書で用いている用語「化学療法剤」は、癌患者に治療効果を誘導するのに用いる化合物、薬剤、毒素、または組成物である。好ましい態様では、癌はB細胞悪性腫瘍である。化学療法剤の種々の可能性を本明細書に記載しており、これらおよび他のものは当該分野でよく知られている。バイオテクノロジー治療剤、例えば、リツキシマブおよびトシツモマブも利用可能である。
【００８８】
本明細書で用いている用語「化学療法剤」は、例えば、DNA相互作用剤、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、ホルモン剤、およびその他、例えば、アスパラギナーゼ、またはヒドロキシ尿素も含む。化学療法剤は、DNA相互作用剤、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、ホルモン剤、および他の薬剤、例えば、アスパラギナーゼまたはヒドロキシ尿素としてグループ分けすることができよう。各タイプの化学療法剤はさらに細分することができる。化学療法剤は、限定されるものではないがこれらのあらゆる群から選ぶことができよう。
昆虫細胞で生成された患者の自己イデオタイプを用いる免疫療法
【００８９】
これまで、循環細胞および免疫系の表面抗原が広範に特徴付けられてきた。この有利な点は、循環器系の多くの癌はクローン的にユニークな表面抗原を有し、B細胞腫瘍は、特に、イデオタイプタンパク質として細胞表面上に提示される単一抗体を発現する大量生産細胞からなるという認識をもたらす。即座に、これは、化学療法で大量破壊を行うより免疫系の正確さを用いて選択的に攻撃することができることを示唆する。
【００９０】
正常組織を損傷せずに、新生物細胞のみを認識し、排除する免疫反応を引き起こす可能性は、癌治療に対する刺激的なアプローチを示す。上記発明の背景に示したように、これを達成する非実用的な手段が開発されてきた。そのような免疫反応を誘導するにはユニークな腫瘍抗原を同定し、それを免疫原として提示する必要がある。ほとんどのB細胞悪性腫瘍は、1個のB細胞のクローン的増殖から生じ、各B細胞は免疫グロブリンイデオタイプの生成に用いるユニークな遺伝子配列を保持する。すなわち、イデオタイプタンパク質は、十分な量で生成することができれば、あらゆるB細胞悪性腫瘍 (またはB細胞クローン性疾患)の免疫ベースの療法に理想的な標的の役割を果たすはずである。
【００９１】
これを達成するには各患者のIdタンパク質を同定し、免疫に抗原として用いるために大量に生成しなければならない。該同定は、種特異的なフレームワーク領域の配列およびPCRを用いて達成することができよう。さらに、本プロセスは、比較的クローン的に豊富なB細胞腫瘍を利用する。該腫瘍細胞は、体内で最も豊富な抗体産生細胞のポピュレーションであるはずである。すなわち、免疫療法に必要な遺伝子部分を単離するための技術が開発された。1例として、PCT出願No.PCT/US01/25204、発明の名称「Method and Composition for Altering a B Cell Mediated Pathology」、(WO 02/13862として2002年2月21日に公開)(この内容は本明細書の一部を構成する)を参照のこと。特許査定が対応米国特許出願No. 09/927,121についてなされており、米国特許が発行されるであろう。しかしながら、Idタンパク質のすべてまたは部分が能動免疫療法のために用いる十分量を生成するのを可能にするあらゆる適切な技術を用いることができる。このために多くの技術が当該分野で利用可能である。
【００９２】
この能動免疫療法は、受け身免疫戦略を用いて示された突然変異回避の現象を避け、より広い免疫反応を生じることにより、時間とともに生じうる異種腫瘍細胞ポピュレーションを認識する可能性がある。
【００９３】
該遺伝子を単離した後、標準的技術を用いてイデオタイプタンパク質を製造することができる。種々の技術が利用可能であり、一般に、抗体はin vitroで哺乳類細胞、酵母、細菌、真核、または原核性細胞を用いて生成される。哺乳類細胞は、適切なグリコシル化を含む機能的抗体を生成する。細菌細胞は増殖が容易であり、生物工学的に抗体を産生することができるが、そのように生成される抗体はグリコシル化されていない。他の真核細胞は、内在性遺伝子の発現用の宿主であってよく、生成される抗体はグリコシル化されている。PCT公開公報WO02/13862において、GoldおよびShopesは、昆虫細胞をグリコシル化イデオタイプタンパク質の生成に用いることができ、さらに、これらイデオタイプタンパク質を用いて免疫反応を生じることができることを証明した。
抗CD20抗体によるB細胞アポトーシスの誘導
【００９４】
上記のように、Rituxan(登録商標)は成熟B細胞上にみられるCD20抗体に特異的なモノクローナル抗体である。その効果はB細胞に特異的であるが、悪性B細胞に特異的な特異的抗イデオタイプ免疫反応を導くより、依然として患者のB細胞の全ポピュレーションを攻撃する。
【００９５】
GoldおよびShopesが示すようにイデオタイプタンパク質による免疫療法後の免疫刺激の効果の全てまたは大部分が抗体産生によるのであれば、Rituxan(登録商標)で処置した直後のイデオタイプタンパク質の注射は資源の浪費であり、該処置は免疫系の1つの武器を奪うであろう。しかしながら、驚くべきことに、リツキシマブで処置し、その直後にIdタンパク質で免疫すると相乗反応が生じ、B細胞ポピュレーションの抑制は、Idタンパク質免疫に対する反応の増大をもたらす。このことは、これまたはいかなる他の理論にも縛られることなく、Idタンパク質療法は主としてB細胞介在病状を変化させるためのin vivo細胞性(例えばT細胞)免疫反応を誘導することにより機能する。
B細胞悪性腫瘍を治療するための化学療法剤
【００９６】
本明細書において用語化学療法剤には、種々の小分子、例えば、DNA相互作用剤、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、ホルモン剤、および他のもの、例えば、アスパラギナーゼまたはヒドロキシ尿素が含まれる。化学療法剤は、限定されるものではないが、以下のあらゆる群から選ぶことができよう。
【００９７】
DNA相互作用剤には、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン；DNA鎖切断剤、例えば、ブレオマイシン；挿入トポイソメラーゼII阻害剤、例えばダクチノマイシンおよびドキソルビシン)；非挿入トポイソメラーゼII阻害剤、例えばエトポシドおよびテニポシド；およびDNAマイナーグローブバインダー(minor groove binder)プリカミジンが含まれる。
【００９８】
アルキル化剤は、細胞DNA、RNA、またはタンパク質分子、またはより小さなアミノ酸、グルタチオン、または同様の化学物質と共有化学付加化合物を形成することができよう。典型的なアルキル化剤の例には、限定されるものではないがナイトロジェンマスタード(ビスクロロエチルアミン)、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード；アジリジン、例えば、チオテパ；メタンスルホン酸エステル(またはアルキルアルコンスルホネート)、例えば、ブスルファン；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン(streptozocin)；プラチナ複合体、例えば、シスプラチン、カルボプラチン；および非古典的アルキル化剤、例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、およびアルトレタミンが含まれる。
【００９９】
抗生物質は、天然生成物の修飾物として抗生物質と同様の方法で製造される1群の薬剤である。抗生物質の例には、限定されるものではないが、生体内還元アルキル化剤、例えば、マイトマイシンC、および例えばブレオマイシンを含むDNA鎖切断剤が含まれる。他の抗生物質には、DNAトポイソメラーゼII阻害剤として作用すると考えられる化合物が含まれ、挿入剤、例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、およびミトキサントロン；および非挿入剤、例えば、エトポシドおよびテニポシドが含まれる。他の同様の薬剤には、エピルビシンおよびアントラセンジオンが含まれる。
【０１００】
一般的に、代謝拮抗剤は核酸の生成に干渉し、2つの大きなメカニズムの1つにより細胞の増殖に干渉する。ある種の薬剤は、DNA合成の前駆体であるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の生成を阻害し、DNA複製を阻害する。これら化合物の例には、プリンまたはピリミジンの類似体があり、同化ヌクレオチド経路に組み込まれる。次いで、これら類似体は置換され、その正常な対応物の代わりのDNAまたはRNAとなる。
【０１０１】
化学療法剤として有用な代謝拮抗剤には、限定されるものではないが、葉酸拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよびトリメトトレキセート；ピリミジン拮抗剤、例えば、フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスウリジン；プリン拮抗剤、例えば、メルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン；およびリボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えば、ヒドロキシ尿素が含まれる。他の代謝拮抗剤には、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン(2-CDA)、およびゲムシタビンが含まれる。
【０１０２】
他の物質には、ヒドロキシ尿素(主として酵素、リボヌクレオチド還元酵素の阻害を通して作用するようである)、およびアスパラギナーゼ(アスパラギンをアスパラギン酸に変換し、タンパク質合成を阻害する酵素)が含まれる。
【０１０３】
植物由来物質は、植物由来または植物由来物質の修飾物である一群の薬剤である。植物由来物質の例には、限定されるものではないがビンカアルカロイド(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、およびビノレルビン)、ポドフィロトキシン(例えば、エトポシド(VP-16)およびテニポシド(VM-26))、タキサン(例えば、パクリタキセル(Taxol)およびドセタキセル)が含まれる。これら植物由来物質のあるもの、例えば、ビンカアルカロイドのあるものおよびパクリタキセルは、チューブリンと結合して有糸分裂を停止させる細胞分裂抑制剤として作用する。ポドフィロトキシン、例えば、エトポシドは、トポイソメラーゼIIと相互作用し、DNA鎖の切断を生じることによりDNA合成と干渉すると考えられている。他の植物由来化学療法剤は20(S)-カンプトテシンである。
【０１０４】
ホルモン剤も癌および腫瘍の治療に有用であり、ホルモン感受性腫瘍に適用される。そのような物質は、通常、天然の供給源由来である。ホルモン剤には、限定されるものではないが、エストロゲン、結合型エストロゲンおよびエチニルエストラジオール、およびジエチルスチルベステロール、クロルトリアニセン、およびイデネストロール；プロゲスチン、例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロール；ならびにアンドロゲン、例えば、テストステロン、プロピオン酸テストステロン；フルオキシメステロン、およびメチルテストステロンが含まれる。副腎皮質ホルモンは、天然の副腎コルチゾールまたはヒドロコルチゾンから誘導され、B細胞悪性腫瘍を治療するのに用いられる。それらは、抗炎症作用の利点、および有糸分裂を阻害しDNA合成を停止させる能力があるため使用される。これら化合物には、限定されるものではないが、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンが含まれる。
【０１０５】
さらなる化学療法剤には、2-CDA、2'-デオキシコホルニシン、エトポシドイホスファミド、およびアントラサイクリンが含まれる。
【０１０６】
クラスに従った現在利用可能な化学療法剤の、該薬剤が適用される疾患を含む一覧は米国特許No. 6,608,096の表3に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する。)。
【０１０７】
特に、化学療法剤の以下の組み合わせがB細胞およびT細胞悪性腫瘍を治療するのに用いられる：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPPプラスABVD、MOPPプラスABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、およびEPOCH。化学療法剤の他の典型的組み合わせには、限定されるものではないが、CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、CAMP、CMP；COP、CAP、(ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドまたはアスパラギナーゼ)；および(ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン、シクロホスファミド、およびアスパラギナーゼ)が含まれる。化学療法剤およびその投与方法のさらなる考察については、Dorr、et al.、Cancer Chemotherapy Handbook、第2版、Appleton & Lange (Connecticut、1994)参照のこと(この内容は本明細書の一部を構成する)。化学療法のさらなる説明およびプロトコールは当業者によく知られている。
【０１０８】
癌療法に用いる他の薬剤には、単独または化学療法および/または放射線療法と組み合わせて用いると癌/腫瘍の退縮を誘導するバイオ技術による薬剤が含まれる。バイオ技術による薬剤の例には、限定されるものではないが、免疫調節タンパク質、例えば、サイトカイン、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、および癌細胞を攻撃する免疫系を刺激する化合物が含まれる。
【０１０９】
全てのサイトカインは免疫調節活性を有する。あるサイトカイン、特に、例えば、インターロイキン-2(IL-2、アルデスロイキン)、およびインターフェロン-α(IFN-α)は、抗腫瘍活性が証明されたある種の癌を有する患者の治療のために承認されている。
【０１１０】
IL-2は、T細胞性免疫反応の中心となるT細胞成長因子である。ある患者に対するIL-2の選択的抗腫瘍効果は、自己と非自己を識別する細胞性免疫反応の結果であるかもしれない。IFN-αは、固形悪性腫瘍と血液悪性腫瘍の両方に対する活性が証明され、後者が特に感受性であるようである。本発明において有用な他のサイトカインには、造血および免疫機能の調節をもたらすサイトカインが含まれる。そのようなサイトカインの例には、限定されるものではないが、エリスロポイエチン(エポイエチン-α)、顆粒球-CSF(フィルグラスチム)、および顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF、サルグラモスチム)が含まれる。本発明に用いることができる他のバイオ技術による薬剤は、B細胞悪性腫瘍に対する治療効果をもたらす。そのような免疫調節剤の例には、限定されるものではないが、カルメット・ゲラン菌(バチルスCalmette-Guerin)、レバミゾール、およびオクトレオチドが含まれる。
【０１１１】
特定の理論に縛られることなく、GM-CSFは、自己Idタンパク質の注射部位に樹状細胞を補充する能力に基づく本発明に特に有用であろう。したがって、該注射部位に樹状細胞を補充する他の薬剤も本発明に有用であると分かるかもしれない。
モノクローナル抗体治療
【０１１２】
腫瘍細胞上に存在する抗原に対するモノクローナル抗体は、治療剤として有効であることが示されてきた。特に、悪性B細胞上に存在するCD20抗原(「抗CD20抗体」)に対するモノクローナル抗体は、B細胞悪性腫瘍の治療に有効であることが示されている。
【０１１３】
例えば、モノクローナル抗体RITUXAN(登録商標)(リツキシマブ)は、リンパ腫細胞上のCD20抗原(Bp35抗原としても知られる)に対して生じ、正常および悪性CD20+前Bおよび成熟B細胞を選択的に枯渇させる。RITUXAN(登録商標)は、再発性または難治性、低悪性度、または濾胞性CD20+B細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療に治療剤として単独で用いられることが多い。癌の化学療法剤として用いられるモノクローナル抗体の別の例にHERCEPTIN(登録商標)(トラスツルズマブ)がある。HERCEPTIN(登録商標)は、ある種の転移性の乳房の腫瘍に過剰発現することがわかったヒト上皮成長因子レセプター2(HER2)に対して生じた。HER2タンパク質の過剰発現は、臨床においてより進行性の疾患および予後不良と関連している。HERCEPTIN(登録商標)は、HER2タンパク質を過剰発現する転移性乳癌の患者の治療として用いられる。
【０１１４】
Rituxan(登録商標)は、再発性若しくは難治性、低悪性度、または濾胞性の、CD20陽性B細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療のために承認されている。166人の患者のIII相試験の結果は、全反応率48%(完全反応(CR)6%)、すべての治療患者の疾患進行までの中央値が9.0カ月、反応の持続時間の中央値が11.2カ月[1.9〜42.1+カ月]であることを示す(McLaughlin P、et al.、「Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma：half of patients respond to a four-dose treatment program」、J. Clin. Oncol. 1998;16(8)：2825-33))。FDAは、Rituxan(登録商標)の一連の前治療に対して客観的反応を達成した患者の再治療を含むよう標示を最近拡張した(多施設、比較対象を置かない(single-arm)臨床試験において、60人の患者に375mg/m2のRituxan(登録商標)を1週間に4用量投与した。(Davis T、et al.、「Rituximab anti-CD20 monoclonal antibody therapy in non-Hodgkin's lymphoma：safety and efficacy of re-treatment」、J. Clin. Oncol. 2000；18(17)：3135-43))。すべての患者は、再発性若しくは難治性、低悪性度または濾胞性のB細胞NHLを有し、Rituxan(登録商標)の一連の前治療に対して客観的反応を達成した。これら60人の患者のうち55人は、本試験において、Rituxant(登録商標)の第二の一連の治療を受け、3人の患者は第三の一連の治療を、また2人の患者はRituxan(登録商標)の第二および第三の一連の治療を受けた。全体の反応率(ORR)は38%(10%CRおよび28%部分反応(PR))であり、反応の持続時間の予測中央値は15カ月であった(範囲、3.0〜25.1+カ月)。主として抗体反応を生じるワクチンでは、循環および組織ベースのB細胞の急速および持続的(83%の患者で治療後6〜9カ月まで)枯渇を生じるRituxan(登録商標)との併用免疫療法はあらゆる抗体反応も鈍らせる心配がある。
【０１１５】
別の抗CD20抗体、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)は、最近、B細胞リンパ腫の治療のためにFDAにより承認された(例えば、米国特許No. 6,565,827；6,287,537；6,090,365；6,015,542；5,843,398；および5,595,721)。臨床試験中または最近承認された他のモノクローナル抗体療法には、Oncolym(登録商標)(HLA-Dr10タンパク質に対する)、Zevalin(登録商標))、エプラツヅマブ、および抗CD52抗体Campath(登録商標)/MabCampath(登録商標)(アレムツズマブ)が含まれる。
自己Idタンパク質免疫療法
【０１１６】
本発明は、B細胞悪性腫瘍上の特異抗原、免疫グロブリンイデオタイプ(Id)を免疫療法として使用することを予期する。このIdは、定常抗体ドメイン内にセットされた可変免疫グロブリン重および軽領域(VHおよびVL)の両者由来のタンパク質配列を含む。
【０１１７】
イデオタイプタンパク質を免疫原に用いることにより、イデオタイプを定義するユニークな決定基が、その存在がイデオタイプ遺伝子が最初にクローンされたB細胞悪性腫瘍の、その後の認識と破壊をもたらす免疫系を指示し、活性化することを示すことができる。イデオタイプ免疫グロブリンの可変領域をコードするDNA配列を、軽および重免疫グロブリン鎖の各ユニークなサブファミリーの5’末端由来のプライマーを定常領域プライマーと一緒に用いてクローンする。典型的には、この方法は、種々の適切なクローニング技術の一つ、例えばPCRを用いる。これら定常領域プライマーは、VH領域のためのものおよびVL領域のためのものと組み合わせて可変領域および定常領域を含むキメラタンパク質の製造における第1工程として可変領域をクローンするのに用いることができよう。あるいはまた、5'RACEのような技術を用いることができよう。本明細書に記載の試験において、5'RACEを用いて重および軽免疫グロブリン鎖の可変領域をクローンし、キメラタンパク質を製造した。キメラタンパク質の例には、VL/Cλ、VL/Cκ、VL/IgGγ1、VH/IgGγ1、VH/Cλ、およびVH/Cκが含まれる。すなわち、該キメラタンパク質は、患者の免疫グロブリン分子由来の可変領域の部分を含み、患者以外の供給源由来の定常領域の部分も含む。好ましい態様において、該重および軽鎖定常領域配列は9F12細胞由来である。しかしながら、免疫グロブリン定常領域遺伝子の他の供給源を用いることができよう。これらキメラタンパク質は、イデオタイプタンパク質を生成するための既存の系を用いるより効率的に生成されると予想され、免疫プロトコールに用いるための優れた免疫原であろう。
【０１１８】
能動免疫療法を含むこの方法は、受け身免疫戦略でみられる突然変異的回避の現象を避けることができよう。そのような療法は、より広い免疫反応を生じ、時間とともに生じうる異種腫瘍細胞ポピュレーションを認識する可能性がある。能動免疫療法の困難さは、患者の免疫系に、感知した腫瘍発現「自己抗原」に反応することを納得させることにある。B細胞悪性腫瘍にみられるイデオタイプタンパク質と異なり、腫瘍が発現した多くの抗原は弱い免疫原である。
【０１１９】
特定の患者に対するin vitro生成イデオタイプタンパク質を用意するには、最初にユニークな抗原をコードする遺伝子を同定および単離し、次いでこれら抗原を製造する手段が必要である。これは、当業者に利用可能な多くの異なる方法を用いて達成することができよう。例えば、本発明の要求に適合する最近開発された方法は、新規バキュロウイルス/昆虫細胞発現系を用い、免疫療法のための機能的抗体を効率的に製造するために最近開発された(例えば、PCT出願No.PCT/US 01/25203、発明の名称「Method and Composition for Altering a T-Cell Mediated Pathology」(WO 02/13861として2002年2月21日に公開)参照。この内容は図表を含め本明細書の一部を構成する。)。
【０１２０】
WO 02/13861およびWO 02/13862に記載の本発明において、これらキメラタンパク質は昆虫細胞中でバキュロウイルスベクターを用いて生成される。用いたバキュロウイルス/昆虫細胞発現系は、多くの患者からの免疫療法のための機能的抗体およびIdタンパク質の効率的な生成が示すように有効であることが示されている。バキュロウイルス系を用いる組換えタンパク質の発現は、細菌中で生成されるタンパク質に関連する多くの障害なしに、大量の生物学的に活性なタンパク質の生成をもたらし、哺乳類細胞の使用による面倒な事態を避ける。例えば、破傷風毒素特異的なヒトIgGγ1/κ抗体を生成する、安定なヒト細胞系9F12(ATCC No.HB8177)からの免疫グロブリン遺伝子を、バキュロウイルスデュアルプロモーター発現伝達ベクターにクローンした。SDS-PAGE分析およびWesternブロットにおいて哺乳類抗体と同様な挙動をする完全なIgGγ1/κ免疫グロブリンを昆虫細胞を用いて製造した。昆虫細胞が産生する抗体はグリコシル化された。精製Mab9F12および精製バキュロウイルス発現抗体の結合親和性は同じであると判断され、生成レベルは約5-10μg/mlと決定された。
【０１２１】
すなわち、バキュロウイルス発現系は、E.coliおよび哺乳類細胞における抗体生成の優れた代替方法である。バキュロウイルス系を用いる、真核細胞における生物活性タンパク質の高収量の生成(1-100mg/L)が可能である(Haseman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. 87：3942-46,1990)。バキュロウイルス/昆虫細胞系は、組換えタンパク質が原核生物で過剰発現するときにしばしば遭遇する可溶性の問題を回避する。さらに、昆虫細胞は、原核生物にはみられない、真核細胞の正しいホールディング、ジスルフィド形成、グリコシル化、β-ヒドロキシル化、脂肪酸のアシル化、プレニル化、ホスホリル化、およびアミド化に関与する翻訳後修飾機構を含む。バキュロウイルス発現系由来のヒト結腸直腸癌細胞を認識する機能的グリコシル化モノクローナル抗体の生成が証明された(Nesbit、J. et al.、Immunol. Methods、151：201-208、1992)。このバキュロウイルス生成抗体はADCCに関与することが示されたが、細菌中で生成される抗体はグリコシル化されず、検出可能なADCC活性をもたない。しかしながら、昆虫細胞組換えタンパク質生成により生じるグリコシル化は、組換えタンパク質が哺乳類細胞中で生成されるときに付与されるものと同じではない。(例えば、Altmann et al.、Glycoconjugate J 16：109-123 (1999)参照。)
方  法
(自己Id可変タンパク質の製造)
【０１２２】
患者由来の免疫グロブリン可変領域のVHまたはVL領域の少なくとも部分および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を有する少なくとも1のキメラタンパク質を含む組成物を投与する。本組成物に用いられるVHまたはVL領域は、B細胞介在病状を有する患者由来のB細胞により生成された特定の免疫グロブリンと関連がある。該組成物は2つの異なるキメラタンパク質を含んでいてよい。各キメラタンパク質は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分と結合した患者由来の免疫グロブリン鎖のVHおよび/またはVL領域の少なくとも部分を有する。該キメラタンパク質の部分であるVHおよび/またはVL領域は、B細胞介在病状を有する患者のB細胞由来の特定の免疫グロブリン鎖と関連する。すなわち、患者由来のユニークなVHおよび/またはVL鎖を含む特異的免疫グロブリン鎖は、治療用組成物として開発することができる。
【０１２３】
患者に投与したIdタンパク質は、患者由来の完全VHCHプラスVLCLまたはそのあらゆる部分であってもよい。
【０１２４】
上記組成物およびキメラタンパク質に用いる免疫グロブリン定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、およびκまたはλ軽鎖、またはその部分由来であり得る。ある態様において、該キメラタンパク質は免疫グロブリン定常領域と免疫グロブリン領域のVHおよび/またはVL領域のみを含む。キメラタンパク質の例には、VH-IgGλ1、VL-κ、およびVL-λが含まれる。別の態様において、該組成物は、免疫グロブリン定常領域とVHおよびVL領域をそれぞれ含む2つのキメラタンパク質を含む。例にはVH-IgGλ1および、VL-κ、およびVH-IgGλ1、およびVL-λが含まれる。
【０１２５】
組換えDNA技術および発現系を用いてキメラタンパク質を製造することができよう。この方法は以下の工程を含む：(a)B細胞性病状を有する患者のB細胞由来の免疫グロブリン鎖のVHまたはVL領域をコードする遺伝子を単離し、(b)単離された、免疫グロブリン鎖のVHまたはVL領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、キメラタンパク質を発現させる発現ベクターに挿入し、(c)発現ベクターを細胞に導入し、その発現を可能にすることによりキメラタンパク質を生成し、次いで(d)キメラタンパク質を単離する。キメラタンパク質の製造方法は、さらに免疫グロブリン鎖のVHおよび/またはVL領域をコードする遺伝子および第2免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、第2キメラタンパク質を発現させる。
【０１２６】
第1のキメラタンパク質は、完全VH領域および免疫グロブリンIgGγ1のヒト定常領域(VH-IgGγ1)を含むことがあり、第2キメラタンパク質は完全VLおよびヒトκまたはλ定常領域(VL-Cκ-VL-Cλ)を含むことがある。キメラタンパク質の一方または両方は、免疫グロブリン鎖のVHおよび/またはVL領域の少なくとも部分、さらにリンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分を含むことがある。
【０１２７】
該組成物は、患者のB細胞由来の特定の免疫グロブリン鎖由来のVHおよび/またはVL領域、および免疫グロブリン定常領域を含む単一のキメラタンパク質を含むことができよう。例には、キメラタンパク質VH-IgGγ1、VL-κ、VL-λ、VL-IgGγ1、VH-κ、およびVH-λが含まれる。
【０１２８】
キメラタンパク質を発現させるのに用いる発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターであってよい。該キメラタンパク質は昆虫細胞中で発現させることができよう。キメラタンパク質を発現させるのに用いる発現ベクターは酵母発現ベクターであってよい。該キメラタンパク質は酵母細胞中で発現させることができよう。キメラタンパク質を発現させるのに用いる発現ベクターは哺乳類細胞発現ベクターであってよい。該キメラタンパク質は哺乳類細胞中で発現させることができよう。キメラタンパク質を発現させるのに用いる発現ベクターは細菌発現ベクターであってもよい。該キメラタンパク質は細菌細胞中で発現させることができよう。
【０１２９】
本発明の方法に用いるベクターは、それぞれプロモーター、分泌シグナル配列、およびキメラタンパク質を有する2つの発現カセットを含むことが好ましい。ある態様において、該発現カセットはミツバチメリチン分泌シグナル配列と結合したバキュロウイルスAcNPVp10プロモーターを含んでよい。その他の発現カセットは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列と結合したポリヘドリンプロモーターを有してよい。他のプロモーターおよびシグナル配列も用いてよい。ある態様において、シグナル配列は、患者から単離したVHおよびVL遺伝子関連内在シグナル配列、または抗体生成に関与する他のシグナル配列である。バキュロウイルス発現態様において、免疫グロブリン鎖のVHまたVL部分をコードする遺伝子、および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子をバキュロウイルスベクターの上記発現カセット中に別個におよび/または一緒に挿入し、1または2のキメラタンパク質の発現を可能にする。ある好ましい態様において、免疫グロブリン重鎖、例えばIgGγ1とVHまたはVL領域の定常領域は、プロヘドリンプロモーターにより調節される。プロヘドリンプロモーターは、ミツバチメリチンプロモーターまたはヒトアルカリホスファターゼプロモーター(p10プロモーターであってよい)と機能的に結合することができよう。
【０１３０】
生成されたキメラタンパク質は、抗免疫グロブリン抗体またはIg結合タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖の定常領域にはプロテインA、およびκ軽鎖にはプロテインL、および/または免疫グロブリン結合ドメインと結合するあらゆる他のタンパク質を用いるアフィニティカラムを用いて精製する。
【０１３１】
キメラタンパク質は担体タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共有結合させることができよう。該組成物は、サイトカイン、例えば顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、またはケモカイン、例えば単球走化性タンパク質3(MCP3)と一緒に患者に投与することもできよう。キメラタンパク質を含む本発明は、B細胞性病状を有する患者のB細胞由来の特定の免疫グロブリンと特に関連があるため、本組成物の投与が特定のVHまたはVL断片が関与する疾患特異的イデオタイプに対する免疫反応を誘導する。本発明組成物の投与経路には、限定されるものではないが、経口送達、吸入送達、注射送達、経皮送達等が含まれる。
【０１３２】
この技術は、B細胞病状に関与するB細胞表面に存在するユニークな細胞表面抗原を利用し、患者特異的に調製される。そのような自己Idタンパク質は、患者の免疫系を、特定患者にみられる病的B細胞と関連するユニークなマーカーに向けさせるための優れた選択性をもたらす。
(組換えタンパク質のバキュロウイルスによる発現)
【０１３３】
上記のように、バキュロウイルス系を用いる組換えタンパク質系を用いる発現は、真核細胞中で生物学的に活性なタンパク質を高収量で生成(1-100mg/L)するための優れた選択として浮上してきた。Nesbitおよび共同研究者は、バキュロウイルス発現系からの機能的グリコシル化モノクローナル抗体の生成を示した(Nesbit、J.et al.、Immunol. Methods 151：201-208,1992)。さらに、組換えIgAの発現は、バキュロウイルス細胞でも示されており、このIgAは重鎖/軽鎖ヘテロダイマーに正しく組み立てられ、N-グリコシル化され、分泌された(Carayannopoulos et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. 91：8348-52, 1994、PCT公開公報No. WO 98/30577、米国特許No. 6,063,905)。
【０１３４】
バキュロウイルス/昆虫細胞発現系は、あらゆる特定の患者から免疫療法のための機能的抗体およびIdタンパク質を効率的な生成に有効であると考えられる。WO 02/13862に記載のあるバキュロウイルス発現ベクターは、2個のカスタム遺伝子特異的プライマーのみが、ヒトκ軽鎖およびIgGγ1重鎖に基づくキメラタンパク質として容易にサブクローンし、発現させるために抗体可変領域のあらゆるペアを増幅する必要であるように設計された。昆虫細胞の分泌経路に重鎖および軽鎖を向かわせるヘテロローガスな分泌シグナル配列の組み込みは、大量の能動免疫グロブリンを発現させるために組み込まれた。このベクターは、ヒトκ定常領域とインフレームにあらゆるκ軽鎖可変領域(VL)を発現させ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌させ、また、ミツバチメリチン分泌シグナル配列に先導されたヒトIgGγ1定常ドメインとインフレームにあらゆる重鎖可変領域(VH)を発現させるのに有用である。該λ軽鎖定常領域は、κ定常領域と置換することができよう。次に、該キメラタンパク質は、ヒトλ定常領域とインフレームにVL領域とともに発現し、次いで、ミツバチメリチン分泌シグナル配列に先導されたヒトIgGγ1定常ドメインとインフレームにあらゆる重鎖可変領域(VH)とともにヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌される。モノクローナル細胞系由来のまたはファージ表現クローニングにより同定されたマウスまたはヒトのあらゆるモノクローナル抗体は、2つの単一サブクローニング工程後、このベクター中に全ヒトIgGγ1/λまたはIgGγ1/κとして容易に発現することもあり得る。さらに、IgGγ2、IgGγ3、IgGγ4、IgA、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、またはその断片を含む種々の免疫グロブリン種を、IgGγ1定常領域の代わりに用いることもあり得る。さらに、上記シグナル配列に加えて、本発明は他の分泌シグナル配列、例えば、特定患者由来の免疫グロブリン遺伝子と関連する内在分泌配列を用いることができよう。さらに、当業者は、簡単にサブクローニングするための抗体可変領域のあらゆるペアを増幅するのに同等の結果を得るためにこの系において同等に用いることができる種々の異なるプライマーを選択することができるであろう。
【０１３５】
ある場合には、生物学的に活性なタンパク質を発現させるためのバキュロウイルス系の利用は、過剰のタンパク質分解なしに組換えタンパク質を効率的に可溶化することができないために妨げられてきた。昆虫細胞中の組換えタンパク質の発現に伴う可溶性およびタンパク質分解の問題を回避するため、バキュロウイルストランスファーベクターが、生物学的に活性なタンパク質の効率的な分泌のために開発された。宿主昆虫細胞由来の組換えタンパク質の分泌を促すこれらベクターは、プロヘドリンプロモーター、p10プロモーター、または他のプロモーターの下流の機能的分泌リーダー配列を挿入することにより構築される。cDNA配列のインフレームな挿入は、組換えタンパク質を分泌経路に向かわせるヘテロローガスなシグナル配列を含むタンパク質の合成をもたらす。他のヒトおよび昆虫リーダー配列を試験して、昆虫細胞由来のヘテロローガスなタンパク質の分泌を最大にすることができよう。リーダー配列の例については、GoldおよびShopesのWO 02/13862公開公報参照のこと。
【０１３６】
さらに、バキュロウイルスベクターは、培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)中で大量の目的タンパク質を発現するよう操作することができる(Jasny、Science 238：1653、1987；Miller et al.、in：Genetic Engineering、Vol.8、Plenum、Setlow et al.、eds.、pp. 277-297,1986)。用いてよいベクターにはpAc系(Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3：2156-2165)およびpVL系(Lucklow and Summers(1989) Virology 170：31-39)が含まれる。
組換えタンパク質のための他の発現系
【０１３７】
タンパク質、タンパク質断片、および類似体は、タンパク質のすべてまたは部分をコードする発現ベクターを用いる組換え方法により全体または部分として合成してもよい。
(原核性宿主)
【０１３８】
原核性宿主は、一般的に組換えポリペプチドの生成に非常に効率的で好都合であり、好ましい発現系の1タイプである。原核生物は、最も高頻度にE. coliの種々の菌株に代表されるが、他の細菌菌株を含む他の微生物菌株を用いてよい。認識された原核性宿主には、細菌、例えば、E. coli、Bacillus(バチルス)、Streptomyces(ストレプトマイセス)、Pseudomonas(シュードモナス)、Salmonella(サルモネラ)、Serratia(セラチア)などが含まれる。原核性宿主の遺伝子操作は、これら宿主がタンパク質をグリコシル化するのを可能にする。(例えば、Wacker et al.、「N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli」、Science(2002) 298(5599)：1790-93参照)。
【０１３９】
原核生物系では、該宿主と適合性の種由来の複製部位と制御配列を含むベクターを用いることができる。好ましい原核性ベクターには、プラスミド、例えば、E. coli中で複製することができるもの(例えば、pBR322、ColE1、pSC101、pACYC184、VX、pUCl18、pUCl19など)が含まれる。適切なファージまたはバクテリオファージベクターには、λgt10、λgt11、フィラメント状バクテリオファージ由来のベクター、例えばm13などが含まれる。適切なStreptomycesプラスミドにはplJ101が含まれ、Streptomycesバクテリオファージには例えばphi.C31が含まれる。BacillusプラスミドにはpC194、pC221、pT127などが含まれる。適切なPseudomonasプラスミドはIzaki(Jpn. J. Bacteriol. 33：729-742,1978)およびJohn et al. (Rev. Infect. Dis. 8：693-704, 1986)が概説している。
【０１４０】
原核性細胞中でタンパク質(またはその機能的誘導体)を発現するには、本発明のプロテアーゼをコードする配列を機能的原核性プロモーターと機能的に結合する必要がある。そのようなプロモーターは構成的または誘導的プロモーターであるが、一般的には誘導的プロモーターを用いる。構成的プロモーターの例には、バクテリオファージλのプロモーター、pBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子配列のblaプロモーター、およびpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のcatプロモーターなどが含まれる。誘導的原核性プロモーターの例には、バクテリオファージλの主要右および左プロモーター、E. coliのtrp、recA、lacZ、lacI、およびgalプロモーター、B. subtilisのα-アミラーゼおよびシグマ-28-特異的プロモーター、Bacillusのバクテリオファージのプロモーター、およびStreptomycesプロモーターが含まれる。原核性プロモーターはGlick (Ind. Microbiot. 1：277-282,1987)、Cenatiempo(Biochimie 68：505-516,1986)、およびGottesman (Ann. Rev. Genet. 18：415-442,1984)に概説されている。さらに、原核性細胞中の適切な発現には、遺伝子配列コーディング配列上流にリボソーム結合部位が存在することも必要である。そのようなリボソーム結合部位は、例えば、Gold,et al(Ann. Rev. Microbiol. 35：365-404,1981)が開示している。
(融合タンパク質)
【０１４１】
タンパク質は、融合タンパク質として発現することがある。融合タンパク質として発現するタンパク質の遺伝子を、コードされ、発現したタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する発現ベクター中に結合した。そのような融合タンパク質生成戦略は、通常、3つの目的で採用される：(1)アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより精製を助ける、(2)生成物の可溶性を増大させる、および(3)生成物の発現を増大させる。しばしば、融合タンパク質生成に用いる発現ベクター、原核生物の開裂部位は、融合タンパク質のアフィニティ精製後の融合領域からの組換えタンパク質の精製を可能にする目的タンパク質と融合領域の接合部位に含まれる。そのような酵素とその同種の認識配列には、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれ、トリプシンやキモトリプシンも含まれることがある。典型的融合発現ベクターには、それぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAと標的組換えタンパク質を融合させる、epGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith、D. B. and Johnson、K. S.、Gene 67：31-40, 1988)、pMAL (New England Biolabs、Beverly、Mass.)、およびpRIT5(Pharmacia、Piscataway、N.J.)が含まれる。
(収量の改善)
【０１４２】
E. coli中の組換えタンパク質の発現の最大化は、組換えタンパク質の合成後の分解を減少させるために障害タンパク質分解系を有する宿主細菌中でタンパク質または融合タンパク質を発現させることにより助けることができる(Gottesman、S.、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. 119-128,1990)。他の戦略は、宿主中の各アミノ酸の個々のコドンの使用を反映するためにコーディング配列に用いるコドンの混合を変えることである(例えば、E. coli (Wada,et al.、Nucleic Acids Res. 20：2111-2118、1992)。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的DNA合成技術により行うことができ、種々の原核性および真核発現系に有用であると分かるかもしれない。
(真核宿主)
【０１４３】
適切な宿主には真核細胞が含まれよう。好ましい真核宿主には、例えば、酵母、真菌、昆虫細胞、およびin vivoおよび細胞培養中の哺乳類細胞が含まれよう。有用な哺乳類細胞宿主には、HeLa細胞、繊維芽細胞起源の細胞、例えば、VEROまたはCHO-K1、リンパ起源の細胞およびその誘導体、ならびにNSOミエローマ細胞系が含まれる。好ましい哺乳類宿主細胞には、より良好な正しい翻訳後プロセシング能力をもたらす、SP2/0およびJ558L、ならびに神経芽細胞腫細胞系、例えば、IMR332が含まれる。組換え遺伝子の発現に用いることができる他の好ましい細胞系には、CHO細胞の他の変異体、マウスL細胞、BW5147細胞、およびその変異体が含まれる。一般的には、真核生物、例えば酵母は、翻訳後修飾を行うこともできる点で実質的な利点をもたらす。
【０１４４】
多数の酵母発現系は、場合により、糖分解酵素をコードする活発に発現する配列由来のプロモーターおよび末端エレメントを組み込むのに利用することができよう。これら発現系は、酵母をグルコースを豊富化した培地中で増殖させると大量のタンパク質を生成する。既知の解糖系遺伝子配列は、非常に効率的な転写制御シグナルをもたらすこともできる。強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する多くの組換えDNA戦略が存在し、酵母中で目的タンパク質を生成するのに利用することができる。S. cerevisiae中の発現に適したベクターの例には、pYepSec1 (Baldari、et al.、(1987) EMBO J. 6：229-234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz、(1982) Cell 30：933-943)、pJRY88 (Schultz et al.、(1987) Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation、San Diego, Calif.)、およびpicZ (InVitrogen Corp、San Diego、Calif.)が含まれる。MFα(α因子)シグナルおよびリーダーペプチドを組み込む発現ベクターは、酵母中でヘテロローガスなタンパク質を発現させるのに用いられることが多い；例えば、米国特許No. 5,162,498および4,546,082参照。'082特許において、目的遺伝子をS.cerevisiae MFαシグナル/リーダー配列と融合させ、目的タンパク質の分泌とプロセシングをもたらした。他の酵母発現系は米国特許No. 6,183,989に記載されている。さらに、Pichia pastorisを用いてヘテロローガスなタンパク質を発現させることができよう(Cregg、et al.,「Recombinant protein expression in Pichiapastoris」、Mol. Biotechnol. 16：23 (2000))。さらに、よりヒト様グリコシル化パターンを有するタンパク質を酵母で発現させる新たな技術が開発されている (Hamilton、R.、et al.、Science 301：1244-46 (2003))。
【０１４５】
他の態様において、目的タンパク質は、昆虫細胞、例えばDrosophila larvae中で発現させることがあるが、上記方法も含まれる。昆虫細胞を宿主に用い、Drosophilaアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができよう(Rubin、Science 240：1453-1459,1988)。Sf9細胞は、ベクター、例えばpAc系(Smith et al.、Mol. Cell Biol. 3：2156-65(1983))、またはpVL系(Lucklow et al.、Virology 170：31-39 (1989))と一緒に用いることもできよう。
【０１４６】
植物細胞を宿主として利用してもよく、植物細胞と適合性の制御配列、例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sおよび19Sプロモーター、およびノパリンシンターゼプロモーター、ならびにポリアデニル化シグナル配列が利用可能である。さらに、目的タンパク質は、発現ベクターをその生殖細胞系に組み込んだ植物中で発現させることができよう。
(哺乳類発現ベクター)
【０１４７】
さらに他の態様において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞中で発現させることができよう。哺乳類細胞中で発現させる技術は最近まとめられた(Colosimo、et al.,「Transfer and expression of foreign gene in mammalian expression」、Biotechniques 29(2)：314-8, 320-2、324 passim、2000(この内容は本明細書の一部を構成する)。哺乳類発現ベクターの例には、pCDM8(Seed、B. (1987) Nature 329：840)およびpMT2PC(Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-193)がある。哺乳類細胞中で用いるには、発現ベクターの制御配列はウイルス調節エレメント由来であることが多い。例えば、一般に用いられるプロモーターは、Simian(シミアン)ウイルス40(SV40)、ポリオーマ、アデノウイルス2、およびサイトメガロウイルス(CMV)ウイルス由来である。好ましい真核プロモーターには、例えば、マウスメタロチオネインI遺伝子配列のプロモーター(Hamer et al.、J. Mol. Appl. Gen. 1：273-288、1982)；ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight、Cell 31：355-365、1982)；SV40初期プロモーター(Benoist et al.、Nature (London) 290：304-31,1981)；および酵母gal4遺伝子配列プロモーター(Johnston et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79：6971-6975,1982；Silver et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)81：5951-5955、1984)が含まれる。あるいはまた、哺乳類発現産物、例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシンなど由来のプロモーターを用いることができよう。調節エレメントは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルスなど由来であってもよい。
【０１４８】
抑制または活性化をもたらす転写開始調節シグナルを選ぶことにより、遺伝子配列の発現を調節することができる。温度感受性であり、温度を変化させることにより発現を抑制または開始させることができるか、または化学物質(例えば代謝産物)調節を受ける調節シグナルが重要である。真核宿主中の目的タンパク質の発現には真核調節領域を用いる必要がある。そのような領域は、一般的には、RNA合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。
【０１４９】
組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞種における選択的な核酸の発現を指示することができるように設計することもできよう(すなわち、組織特異的調節エレメントを用いて発現を調節する)。そのような組織特異的プロモーターには、肝臓特異的アルブミンプロモーター(Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1：268-277)；リンパ特異的プロモーター(例えば、Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43：235-275)、および特に免疫グロブリンおよびT細胞レセプターのプロモーター((Winoto and Baltimore (1989) EMBO J.8：729-733、Banerji et al. (1983) Cell 33：729-740; Queen and Baltimore(1983) Cell 33：741-748)；乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター；米国特許No. 4,873,316および欧州特許出願公開公報No. 264,166)；および膵臓特異的プロモーター(Edlund et al. (1985) Science 230：912-916)が含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、α-フェトプロテインプロモーター(Camper and Tilghman (1989) Genes Dev. 3：537-546)、およびネズミ・ホメオボックス(hox)プロモーター(Kessel and Gruss (1990) Science 249：374-379)を用いることもできよう。
【０１５０】
好ましい真核プラスミドには、例えば、SV40、BPV、pMAM-neo、pKRC、ワクシニア、2ミクロン環(2-micron circle)など、またはその誘導体が含まれる。そのようなプラスミドは当該分野でよく知られている(Botstein et al.、Miami Wntr. Symp. 19：265-274,1982 ; Broach、「The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces：Life Cycle and Inheritance」中、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、p. 445-470,1981; Broach、Cell 28：203-204,1982；Bollon et al.、J. Clin. Hematol. Oncol. 10：39-48,1980；Maniatis、Cell Biology中：A Comprehensive Treatise、Vol.3、Gene Sequence Expression、Academic Press、NY、pp.563-608、1980)。
【０１５１】
ベクターまたは核酸分子を含む構築物を発現のために作製したら、DNA構築物を、種々のあらゆる適切な手段、すなわち、形質転換、トランスフェクション、接合(conjugation)、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、電子銃(particle gun)技術、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどにより、適切な宿主細胞内に導入することができよう。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに適した方法は、Sambrook、et al. (「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory、2001)にみることができる。ベクターを導入した後、レシピエント細胞を選択培地に増殖させ、ベクターを含む細胞の増殖を選択する。クローンした遺伝子の発現は、目的タンパク質またはその断片の生成をもたらす。
【０１５２】
原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系は、当業者によく知られており、さらに実験マニュアル、例えば、Sambrook et al.、2001またはAusubel et al. (「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、1998)に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する)。
【０１５３】
真核細胞の形質転換について、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、小さな細胞分画のみが外来DNAをそのゲノムに統合できることが知られている。これら統合物を同定および選択するため、一般的には、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子を目的遺伝子とともに宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、薬剤、例えば、G418、ヒグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキセート、グリホセート(glyphosate)、およびビアロホス(bialophos)に対する耐性を付与するものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、目的タンパク質をコードするものと同じベクターを用いて宿主細胞に導入するか、または別個のベクターを用いて導入することができる。導入した核酸で安定に形質転換された細胞は、薬剤選択により同定することができる(例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)。
【０１５４】
他の態様において、組換え産物の発現に用いるDNA遺伝子配列は、宿主生物の好みに調整することができよう。さらに、コドンの好みも宿主細胞の起源の組織に合わせて調整することができよう(例えば、Plotkin JB、et al.、「Tissue-specific codon usage and the expression of human gene」、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug 24; 101 (34)：12588-91参照)。
【０１５５】
本発明の宿主細胞、例えば、培養中の原核性または真核宿主細胞を用いて目的タンパク質を生成する(すなわち、発現させる)ことができる。したがって、本発明は、さらに本発明の宿主細胞を用いる目的タンパク質の製造方法を提供する。ある態様において、本方法は、目的タンパク質を生成し、当業者が精製することができるように、目的タンパク質をコードする組換え発現ベクターを適切な培地中で導入した宿主細胞を培養することを含む。
【０１５６】
ベクターまたは好ましくは発現ベクターは、目的ポリペプチド、例えばイデオタイプタンパク質をコードする遺伝子を含むことができよう。これらベクターを用いて原核細胞または真核細胞中でコードされたポリペプチドを発現させることができよう。
(In Vitro転写および翻訳)
【０１５７】
タンパク質、タンパク質断片、および類似体も、発現ベクターの組換え組み立て、次いでin vitro転写および翻訳を用いて合成することもできよう。
(DNAワクチン)
【０１５８】
患者自身の細胞は、DNAワクチンを与えるとタンパク質およびタンパク質断片を生成することができる。目的遺伝子をコードする組換えプラスミドを構築し、次いでDNAワクチンとして用いることができる。
患者の治療
【０１５９】
本発明に用いる組成物は、無菌であり、患者に投与するのに適した重量または容量の目的とする反応を生じるための治療的有効量の活性物質を含むことが好ましい。該組成物を投与する保健従事者の知識および技能内にある因子には、治療する特定の病状、該病状の重症度、患者の年齢、患者の健康状態、患者の体重、治療の継続期間、併用療法の性質(もしあれば)、投与経路などの因子が含まれる。これら因子は当業者によく知られており、常套的な調整で対処することができる。一般的に、個々の成分または組み合わせの最大用量、すなわち、適切な医学的判断に従った最高安全用量を用いるのが好ましい。患者が、医学的理由、精神的理由、または他の理由でより低い用量または耐容量を要求することがあることを当業者は理解するであろう。
【０１６０】
患者の反応は、当業者によく知られたアッセイにより測定することができる。そのようなアッセイは反応レベルを測定するのに用いることができる。
【０１６１】
用量、投与計画、注射部位、投与方法などが前記と異なる、治療用組成物を投与するための他のプロトコールは当業者に知られている。例えば、試験目的または獣医治療目的の、ヒト以外の哺乳動物に対する治療用組成物の投与は、実質的に上記と同じ条件下で実施される。
【実施例】
【０１６２】
実施例1
特異結合細胞減少剤および自己Idタンパク質を用いる以前のリンパ腫療法からの再発性/難治性のB細胞NHL患者の治療
(試験原理)
Rituxan(登録商標)は、再発性若しくは難治性、低悪性度、または濾胞性、CD20-陽性、B細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療用に承認されている(例えば、McLaughlin P、et al.,「Rituximab chimera anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma：half of patients respond to a four-dose treatment program」、J Clin Oncol. (1998) 16 (8)：2825-33参照)。Rituxan(登録商標)とId-KLH免疫プラスGM-CSFを組み合わせた使用が下記の通り研究された。マウスモデル系において、強いT細胞反応を誘導する免疫、例えばId-KLHプラスGM-CSFでは、宿主のB細胞を枯渇させると免疫原に対するT細胞反応を実際に増加させることができたという証拠がある(Qin Z、et al.、「B cells inhibit induction of T cell-dependent tumor immunity」、Nature Med. 4 (5)：627-30 (1998); Monach PA、et al.、「CD4+ and B lymphocytes in transplant immunity. II. Augmented rejection of tumor allografts by mice lacking B cell」、Transplantation 55 (6)：1356-61 (1993); Epstein MM、et al.、「Successful T-cell priming in B-cell deficient mice」、J. Exp. Med. 182 (4)：915-22 (1995))。
【０１６３】
NCIは、現在、マントル細胞リンパ腫の患者における化学療法およびRituxan(登録商標)後のId-KLHプラスGM-CSF免疫療法の第2相臨床試験を行っている。NCIは、イデオタイプ免疫原に対するT細胞反応を増加する患者の能力に対するRituxan(登録商標)の効果を評価している。さらに、最近、遺伝的B細胞欠損マウスを用いるT-細胞リンパ腫ネズミモデルにおける最近の前臨床試験がFavrille、Inc.で行われた。これら試験において、処置動物はId-KLHとGM-CSFとの組み合わせに対する防御反応の増大を証明する。これら試験において、免疫マウスではKLH/GM-CSF処置コントロールに比べて腫瘍の発現が有意に少なかった。これら観察結果に照らして、下記試験ではFavId(登録商標)能動免疫とRituxan(登録商標)との組み合わせを評価した。化学療法後の再発性または難治性悪性度1または2の濾胞リンパ腫を有するか、またはRituxan(登録商標)後に再発した本臨床試験の患者は、Rituxan(登録商標)プラスFavId(登録商標)、およびGM-CSFを投与するのに適格である。
【０１６４】
このプロトコールは、Rituxan(登録商標)プラスFavId(登録商標)およびGM-CSFで処置した患者におけるKLHおよびそのイデオタイプに対する免疫反応(液性および/または細胞性)を増大する能力について評価することであった。さらに、FavIdおよびGM-CSFとRituxan(登録商標)との組み合わせにより生じた、客観的奏功率、反応期間中央値、および進行時間中央値を評価した。
(試験計画)
(1) 概要
【０１６５】
これは、Rituxan(登録商標)で処置した患者がリツキシマブ処置直後のFavId(登録商標)プラスGM-CSF処置に対する免疫反応を増加させることができるか否かを評価するために設計した、比較対象を置かない非盲検第II相試験であった。
【０１６６】
すべての患者について、形態学的分類、免疫表現型的特徴付けのための組織を得、FavId(登録商標)を製造するための物質を提供するためにリンパ節生検を行った。生検でモノクローナル表面免疫グロブリンを発現することがわかった(腫瘍が単離されたことを示唆する)、悪性度1または2の濾胞性リンパ腫の患者のみを試験の候補者として受け入れた。残りの生検細胞浮遊液は、記録保管目的で液体窒素に保存した。しかしながら、該物質のいくつかをin vitro免疫反応試験に用い、処置患者血清中の腫瘍特異抗体、または処置患者の末梢血由来の腫瘍反応性Tリンパ球の存在を検出した。さらに、DNAを残りの組織試料から調製し、腫瘍調製物中のt(14；18)転座の存在を確立することができよう。そのような転座が同定されたときは、次いで、末梢血リンパ球におけるこの転座の発生を評価することができよう。生検と治療的投与の間が18カ月以上経過するか、最初の反応後に患者が進行し始める場合は、第2生検、中心生検、または穿刺吸引を得、治療用製剤の分子特性を確認し、腫瘍の進行を伴う患者の初期腫瘍との遺伝的類似性を検討した。
【０１６７】
参加にあたり、患者は、各寸法が少なくとも2cmの、少なくとも1の残存する2寸法が測定可能な病変を有する必要がある。全てのリンパ節のCTスキャンをベースラインで得た(できるだけRituxan(登録商標))投与と近接して、しかし、あらゆる症例で1カ月以内に)。反復CTスキャンをその後3カ月毎に得た。第2オリジナルを得、中央盲検試験のためにFavrilleに提出した。
【０１６８】
適格患者は、用量375mg/m2のRituxan(登録商標)を1週間に1回(毎週)計4回注入し、次いで、約8週間後に皮下FavId(登録商標)/GM-CSF処置を1月に1回(毎月)計6回行った。客観的反応(CRまたはPR)があるか、または進行性疾患がみられない患者は、疾患の進行の証拠がなければ、FavId(登録商標)/GM-CSF処置を、2カ月に1回(2カ月毎に)計6回、次いで3カ月に1回(3カ月毎に)投与し続けることがよう。全ての患者で試験を通して厳密に毒性をモニターした。患者は、連続的に免疫反応(液性およびT細胞反応)の観察を受けた。血清抗イデオタイプおよび抗KLH抗体を、ベースライン(Rituxan(登録商標)前)、各FavId(登録商標)処置前、および最終Avid処置後4週間目に得た試料から調査した。PBMCのイデオタイプ特異的およびKLH特異的増殖も、ベースライン(Rituxan(登録商標)前)、各FavId(登録商標)処置前、および最終Avid処置後4週間目に得た試料から測定した。
(薬剤投与)
(1)Rituxan(登録商標)
【０１６９】
Rituxan(登録商標)は、各試験場所により供給され、添付文書に従って1週間に1回、4週間、静脈内注入により投与した。製造業者により提供された処方詳細を用いた。
(2)FavId(登録商標)およびGM-CSF
【０１７０】
FavId(登録商標)およびGM-CSFはFavrille、Inc.により供給され、Rituxan(登録商標)の完了後約8週間目に開始した(FavId(登録商標)の製造完了が許すかぎりすみやかに)。FavId(登録商標)は、一部、PCT出願No. PCT/US01/25204(発明の名称「Method and Composition for Altering a B-cell Mediated Pathology」(WO 02/13862として2002年2月21日に公開))に記載の方法にしたがって調製した。
【０１７１】
FavId(登録商標)、1mg(0.5mgのKLH担体タンパク質と結合した0.5mgの腫瘍Idタンパク質)および250mcgの可溶性GM-CSFを、同様の処置計画および用量を用いた以前の臨床経験に基づいて選択した。(例えば、Hsu FJ、et al.、「Tumor-specific idiotype vaccines in the treatment of patients with B cell lymphoma--long-term results of a clinical trial」、Blood 89 (9)：3129-35 (1997)；Bendandi M、et al.、「Complete molecular remissions induced by patient-specific vaccination plus granulocyte-monocyte colony-stimulating factor against lymphoma」、Nat. Med. 5 (10)：1171-7 (1999)；Massaia M、et al.、「Idiotype vaccination in human myeloma：Generation of tumor-specific immune responses after high-dose chemotherapy」、Blood 94 (2)：673-83 (1999)参照)。患者は、FavId(登録商標)およびGM-CSFの皮下注射(2注射部位に分けた)を1月に1度、6カ月間投与された。定用量250mcgのGM-CSFのみを各FavId(登録商標)注射後3日間皮下注射により投与した。すべてのGM-CSF注射も分割し(1注射部位あたり125mcg)、FavId(登録商標)注射部位の近くに(FavId(登録商標)の第1日注射の正確な部位のできるだけ近くに)投与した。注射部位を1月毎に上肢と下肢で交代した。
【０１７２】
GM-CSF単独投与は、必ずしも主な観察者の場所で行わなかったが、ある場合には適切な指示後、患者またはその被指名人により自己投与されることもあった。
(3)試験手順/評価計画の概要
【０１７３】
下記計画に従って患者を処置した。Rituxam(登録商標)で1週間に1回、4週間処置を完了後、管理不能な毒性、または他の抗癌療法の介入が必要な臨床的に重要な疾患の進行が記録されない限り、6カ月間の一連の治療にわたりFavIdプラスGM-CSFを患者に皮下注射した。客観的反応(CRまたはPR)または進行性疾患(PD)の欠如が達成された患者は、疾患の進行の証拠がない場合はFavId(登録商標)/GM-CSF処置を2カ月毎に6回、次いで3カ月毎に投与し続けることができよう。腫瘍反応の評価はその後3カ月間隔でCTスキャンにより得られた。すべての患者の安全性評価は、試験処置中少なくとも1月に一度、およびその後処置中に3カ月間隔で行った。
(試験集団)
(1)試験対象患者基準
【０１７４】
患者は少なくとも年齢18歳であった。患者は化学療法後に再発性または難治性であるか、またはRituxan(登録商標)処置後に再発性であった。(注：Rituxan(登録商標)は、化学療法に対する初期反応後の二次療法としてかまたは該疾患の初期療法のために化学療法と組み合わせて投与してよい。)試験中の患者は、生検が利用できる腫瘍を有するか、または少し以前の生検物質が利用可能であり、患者は各寸法が少なくとも2cmである少なくとも1のさらなる二次元病変も有する。患者は、組織学的に確認した悪性度1または2の濾胞性B細胞リンパ腫(WHO分類)に罹患し、一般状態(ECOG)は0、1、または2であり、絶対顆粒球数は1,000/mm3に等しいかそれ以上であり(5,000リンパ球以上の患者は除外した)、血小板100,000/mm3以上、総ビリルビンは2mg/dLに等しいかまたはそれ以下、ASTおよびALTは正常の上限の2倍に等しいかそれ以下、およびクレアチニンは1.5mg/dLに等しいかそれ以下である。
【０１７５】
以下の患者を試験から除外した：(1)Rituxan(登録商標)もしくは化学療法または化学療法プラスRituxan(登録商標)に対して難治性である患者、(2)以前に2以上の治療計画を受けている患者(例えば、CHOPプラスRituxan(登録商標)は1治療計画であり、CHOP、次いで初期再発時のRituxan(登録商標)は2治療計画に等しい。)、(3)FavId(登録商標)治療開始前少なくとも1年間予めフルダラビンを投与、(4)5,000リンパ球以上の患者、(5)予め腫瘍特異的イデオタイプ免疫療法を受けた患者、(6)同時免疫抑制療法(高用量ステロイドなど)を受けている患者、(7)以前に脾臓摘出を受けている患者、(8)CNSリンパ腫または硬膜リンパ腫症の病歴がある患者、(9)HIV陽性の患者、(10)重症の非悪性腫瘍疾患(例えば、精神疾患、肺機能不全(例えば、活動性ぜんそく、COPD、肺炎、閉塞性細気管支炎)、鬱血性心不全、または活動性管理不良細菌、ウイルス、または真菌感染症)、または観察者の意見でプロトコールの客観性が損なわれたであろう他の病状、(11)2年またはそれ以上寛解していない以前に悪性腫瘍があった患者(皮膚の非メラノーマ癌、およびin situ子宮頸癌)、(12)試験参加前30日以内に試験研究中の薬剤で治療された患者、または(13)妊娠または哺乳中の女性(子供を出産する可能性がある女性は試験治療を受けながら妊娠するのを避けるよう忠告された)。
(患者の登録)
【０１７６】
本試験に登録される状態にある患者は観察者により適格性が評価された。適格基準を満たした患者を生検前に登録し、試験番号を割り当てた。
(倫理および監督機関の考慮)
【０１７７】
本試験はGood Clinical Practice(医薬品の臨床試験実施基準)、Declaration of Helsinki、ならびにUS21 CFR Part 50-Protection of Human SubjectsおよびPart 56-Institutional Review Boardsに従って行った。プロトコールに規定した手順を実施する前に、患者全員から本試験のための日付入り同意書を得た。署名後に各患者に同意書の写しを渡した。本試験の承認は、患者を試験に登録する前にInstitutional Review Boardから得た。同意書は、予想される患者が完全に理解できる言語で作成された。同意は患者の日付入り署名、または患者の同意を記録する独立した証人の署名により証明した。各患者の署名された同意書は、個々の患者が訪れる臨床研究診療室にファイルして保存した。
(反応の評価)
(1)腫瘍反応評価
【０１７８】
登録する患者には、再発性または難治性疾患の証拠が証明された(CTスキャン、疾患の臨床状態の観察者による記述など)。患者を、CTスキャンおよび健康診断によりベースライン時(治療開始前)およびその後3カ月毎に評価した。第2オリジナルスキャンは、盲検中央検査のためにFavrilleに提出するのに必要であった。すべてのリンパ節をベースライン時およびその後3カ月毎に評価した。反応は、Cheson et al. (Cheson BD、et al.、「Report of an International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin's lymphomas」、J. Clin Oncol. 17 (4)：1244 (1999))が定義した臨床試験の標準結果判定法(完全反応(CR)または完全反応/未確認(CRu)、部分反応(PR)、安定疾患(SD)、および進行疾患(PD))を用いて報告した。客観的反応(CR、CRu、PR)は、最低限4週間後に確認する必要があった。
(2)免疫反応評価
【０１７９】
免疫応答患者は、Id-KLHに対する液性および/または細胞性免疫反応が2回またはそれ以上証明された者と定義した。
(3)液性免疫反応評価
【０１８０】
イデオタイプおよびKLHに特異的な抗体レベル用の血清をベースライン時(Rituxan(登録商標)前)、次いで各FavId(登録商標)投与前に再度、および最終FavId(登録商標)処置後4週間目に得た。血清試料にラベルを貼り、Favrilleが要求するまで凍結保存し、次いでELISAによりKLHまたは特異的ワクチン接種イデオタイプに対する反応性について試験した。
(4)細胞性免疫反応評価
【０１８１】
ヘパリン化血液試料からバフィーコートを、ベースライン時(Rituxan(登録商標)前)、次いで各FavId(登録商標)投与前に再度、および最終FavId(登録商標)処置後4週間目に得た。試料にラベルを貼り、Favrilleにより供給された凍結用培地中に保存した。KLHまたは特異的ワクチン接種イデオタイプで刺激後の細胞のサイトカインまたはインターフェロンγの合成能を試験した。
(薬剤情報)
【０１８２】
Rituxan(登録商標)は各試験場所により供給され、製造業者の指示書に従って375mg/m2の用量で1週間に1回、4週間、静脈内注入により投与した。
【０１８３】
Rituxanの添付文書に記載の毒性には、注入関連反応(発熱、悪寒/寒気、低血圧、呼吸困難、気管支けいれん、血管浮腫、吐き気、嘔吐、蕁麻疹、疲労、頭痛、痒み、鼻炎、疾患部位の痛み)；腫瘍崩壊症候群；血液異常(血小板減少症、好中球減少症、貧血)；心不整脈；および水疱性皮膚反応(中毒性表皮剥離症を含む)が含まれる。
【０１８４】
FavId(登録商標)(Id-KLH)は、各患者のリンパ腫から回収したイデオタイプ遺伝子から製造した。この患者特異的遺伝子を用い、組換え技術を用いてイデオタイプタンパク質を生成した。得られた精製タンパク質は、患者に投与する前にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共有結合させた。皮下投与用の製剤化したFavId(登録商標)(Id-KLH)は、生理食塩水1mlあたり0.5mgのIdおよび0.5mgのKLHを含み、スクリューキャッププラスチックバイアルにいれて供給し、投与するまで-20℃で保存した。
【０１８５】
FavId(登録商標)をGM-CSFと一緒に投与した。FavId(登録商標)注射日に、250mcgのGM-CSFをプラスチックツベルクリン注射筒にとり、FavId(登録商標)の解凍用バイアルに加えた。該バイアルを静かに撹拌し、バイアルの内容を18ゲージ針を用いて吸い取った。全内容を吸い取ったら、18ゲージ針をSQ注射用の25ゲージ針に交換した。この手順はすべての微粒子がバイアルから得られることを確実にするために重要である。該用量を2本の上肢または下肢(例えば右腕と左腕)に同じに分配した。注射部位は上肢と下肢を交代すべきである。
(1)予測される副作用-FavId(登録商標)
【０１８６】
Id-KLH、およびId-KLHと可溶性GM-CSFが以前に非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫の患者に投与されていた(Hsu et al、1997; Bendandi M、et al.、1999; Massaia、et al.、1999; Harris NL、et al.、「World Health Organization Classification of Neoplastic Diseases of the Hematopoietic and Lymphoid Tissues：Report of the Clinical Advisory Committee Meeting-Airlie House、Virginia、November 1997」、17 (12)：3835-49 (1999))。副作用は最小限であり、最も頻繁なものには注射部位の局所反応が含まれた。考えられる有害事象を以下にあげる：(1)注射部位の局所皮膚反応：水腫、圧痛、硬結、蕁麻疹/発疹、痒み；(2)発熱、筋肉痛/関節痛、悪寒/寒気、吐き気、疲労、頭痛、血小板減少症、および他の血球減少、高血糖、嘔吐、低血圧；および(3)さらに自己免疫疾患が発生する危険性もあるかもしれないが、現在のところこの証拠はいかなる免疫療法試験でもみられていない。
(2) GM-CSF(Sargramostim；LEUKINE(登録商標))
【０１８７】
本試験に用いるGM-CSFは、Immunex Corporationが酵母(S.cerevisiae)発現系を用いて組換えDNA技術により製造したグリコシル化ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(rhu GM-CSF)であった。供給されたLEUKINE(登録商標)液は、500mcg/mL(2.8x106IU/mL)のサルグラモスチム(sargramostim)を含み、Favrille、Inc.により供給された。LEUKINE(登録商標)液は、２〜８℃（３６〜４６°Ｆ）で冷蔵され、凍結も振盪もさせなかった。バイアルは20日後に捨てた。
【０１８８】
一定250mcg用量のGM-CSFをFavId(登録商標)とともに各処置の第1日に2注射部位に分けて投与した。GM-CSF単独用量(250mcg)も分割して(1注射部位あたり125mcg)第2〜4日に、第1日FavId(登録商標)両側注射部位のできるだけ近くにSQ注射した。GM-CSF単独投与は、必ずしも主たる観察者の場所で行わなかったが、患者またはその被指名人が適切な指示に従って自分で投与することがあった。
【０１８９】
GM-CSFを投与する患者に説明された毒性には、発熱、悪寒、発汗、筋肉痛、疲労、倦怠感、頭痛、眩暈、呼吸困難、気管支けいれん、胸水、拒食症、消化不良、吐き気、嘔吐、下痢、注射部位の圧痛、蕁麻疹、発疹、痒み、過敏反応、骨痛、血栓塞栓事象、静脈炎、低血圧、末梢浮腫、白血球増加症、血小板増加症、肝酵素異常、およびビリルビン値の上昇が含まれる。
(職業上の安全)
【０１９０】
FavId(登録商標)は、正常な使用および投与条件下で研究スタッフに重大な職業上の安全面の危険性をもたらすとは予想されない。しかしながら、試験的薬物療法に伴う直接接触を避けるための予防措置をとるべきである。Rituxan(登録商標)およびLeukine(登録商標)は添付資料に従って取り扱うべきである。
(有害事象)
(1)有害事象
【０１９１】
有害事象(AE)とは、因果関係評価に関わらず医薬製剤を投与した患者または臨床研究患者におけるあらゆる有害な医学的事件である。したがって、有害事象は、医薬(研究的)製剤に関連すると考えられるか否かに関わらず、医薬(研究的)製剤の使用に一時的に関連するあらゆる好ましくない偶発的徴候(異常な検査所見を含む)、症状または疾患であり得る。
あらゆるその後の化学療法開始後の新規有害事象のさらなる報告は必要ない。
(2)重大な有害事象
【０１９２】
重大な有害事象(SAE)は、あらゆる用量で(過剰量を含む)致死的で生命にかかわる、入院が必要であるか長引く、不可逆的な障害をもたらす、先天異常である、医療的／外科的検討を要する、医学的に重大な事象である、あらゆる有害な医学的事件である。
【０１９３】
すべてのSAEは、その発生の24時間以内にFavrille、Inc.に報告しなければならない。重大な有害事象記入用紙はFavrilleにより供給され、試験場所で全項目に記入された。次いで、MedWatch書類を作成し、主たる研究者の再検討が終わるまでFDAに保管した。
(患者の終了および中止)
(1)患者を試験から除外する目安
【０１９４】
免疫療法の6用量すべての終了時に進行性疾患の明らかな証拠がある患者(新しい病変；SPDで>50%の増加)を試験から除外した。
注：明らかな疾患の進行がみられた患者で、研究者がそうすることが患者にとって最善であると感じた場合は、遅れて免疫反応がある可能性があるため免疫療法の全6用量を完了した。
【０１９５】
Rituxan(登録商標)に続発したグレード3または4の毒性(注入速度に関する反応または血液学的毒性を除く)、またはGM-CSFの用量を減らした後のFavId(登録商標)およびGM-CSFからの第2のグレード3の局所注射部位毒性を経験したあらゆる患者を試験から除外した。治療の継続が研究者の判断で患者にとって最善でないか、または患者が試験の中止を要求した場合も患者を試験から除外した。
【０１９６】
全ての一連の処置および最終評価を完了した場合は患者を試験から除外すべきであった。全ての一連の処置後(すなわち、Rituxan(登録商標)4用量およびFavId(登録商標)6用量)客観的反応(CR、PR)があるかまたは進行性疾患(PD)がない患者は、所望により、FavId(登録商標)免疫療法を2カ月毎に6用量、次いで疾患の進行が証明されるまで3カ月毎に投与し続けたことに注意のこと。
(2)試験の完了
【０１９７】
目的とする登録者数を満たし、全ての患者が試験処置の全ての一連の処置(Rituxan(登録商標)4用量およびFavId(登録商標)6用量)、さらに最小1カ月間の追跡調査期間を完了したとき、試験が完了したとみなす。
(データの評価)
(3)統計および標本サイズ
【０１９８】
この第II相試験では、通常通り、患者の標本サイズは統計処理しなかった。合計20名の評価可能な患者が12〜18月間にわたり参加した。
(4)評価可能な患者の定義
【０１９９】
患者は、考慮すべきRituxan(登録商標)全4用量およびFavId(登録商標)全6用量を投与後の客観的反応についてのみ完全に評価された。FavIdを少なくとも2用量投与されたすべての患者について、免疫反応のあらゆる事象を評価した。患者は、以下の2時点で客観的反応を評価された：(1)Rituxan(登録商標)投与開始後3カ月目、および(2)すべての6回の一連のFavId(登録商標)処置終了時。あらゆる客観的反応を少なくとも4週間後に確認した。患者は、Rituxan(登録商標)またはFavId(登録商標)療法中はいつでも進行性疾患を有すると考えられたかもしれない。あらゆる試験治療を受けたあらゆる患者において安全性と毒性を評価した。
(5)結果報告
【０２００】
免疫反応、安全性、および効果の記述的統計分析は試験の結論を与えた。CR、PR、SD、およびPDの客観的反応率は評価可能と判断された患者について報告された。安全性は特定の有害事象を経験した患者のパーセントで報告した。
実施例2
以前にリンパ腫に対する療法を受けていないB細胞NHL患者の、特異結合細胞減少剤および自己Idタンパク質を用いる治療
【０２０１】
FavId(登録商標)は、KLHと結合する、無痛性NHLを有する患者における能動免疫の誘導に用いる腫瘍特異的B細胞組換え免疫グロブリンイデオタイプ(Id)タンパク質である。
【０２０２】
目的：
本試験は、Witzigらのリツキシマブ単独療法の病歴データと比較した、リツキシマブ後の客観的反応率を増加または持続させるFavId(登録商標)の能力を評価するために行った。
【０２０３】
適格性：
治療を受けていない、悪性度1または2の濾胞性NHL患者
治療(処置)：
上記実施例1に示すように、リツキシマブ375mg/m2を1週間に1回、4週間投与した。リツキシマブの最終投与後2カ月に、FavId(登録商標)を1カ月に1回、6カ月間s.q.投与するFavId(登録商標)(1mg)治療を開始した。GM-CSF250mcgをFavId(登録商標)注射部位に第1〜4日に投与した。FavId(登録商標)の6用量後に少なくともSDを有する患者が、ワクチンを2カ月毎に計6用量、次いで疾患が進行するまで3カ月毎に投与され続けるのに適格であった。合計40人の患者が参加し、リツキシマブおよびFavId(登録商標)による治療を受けた。
【０２０４】
FavId(登録商標)は、一部、PCT出願No.PCT/US01/25204、発明の名称「Method and Composition for Altering a B Cell Mediated Pathology」(WO 02/13862として2002年2月21日に公開)に記載の方法に従って製造する。
【０２０５】
結論：
リツキシマブ後にこの用量および計画で投与したFavId(登録商標)は、極めて耐容性がよく、図2に示すように反応率が増加し、リツキシマブ後の進行までの時間が延長する。リツキシマブ+FavId(登録商標)の無作為化二重盲検臨床試験を開始している。
実施例3：
併用療法の一部としての樹状細胞の使用
【０２０６】
樹状細胞は、免疫反応の開始に重要な役割を演じることが示されている。これを利用するため、癌抗原で患者を免疫しようとする数グループが、患者から樹状細胞を取り出して免疫原でパルスし、次いでそれを患者に再接種した。実際に、あるグループはそれを「天然アジュバント」と呼んでいる((Thurner B、et al.、「Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature、monocyte-derived dendritc cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma」、J Exp Med. 190：1669-1678 (1999))(Schuler G & RM Steinman、「Dendritc cells as adjuvants for immune-mediated resistance to tumors」、J Exp Med.、186 (8)：1183-87 (1997))。
【０２０７】
試験した癌は、B細胞リンパ腫(Hsu、FJ、et al.、Vaccination of patients with B cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritc cells. Nat Med. 2：52-58 (1996)、(Timmerman JM、et al.、「Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B cell lymphoma：clinical and immune responses in 35 patients」、Blood 99 (5)：1517-26 (2002))；メラノーマ(Nestle FO、et al.、「Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritc cells」、Nat Med. 4：328-332 (1998))、(Thurner B、et al.、「Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature、monocyte-derived dendritc cells expands specific cytotoxic T cell and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma」、J Exp Med. 190：1669-1678 (1999))；前立腺癌(Murphy、et al.、「Phase II prostate tumor vaccine trial：report of a study involving 37 patients with disease recurrence following primary treatment」、Prostate 39：54-59 (1999))、(Murphy GP、et al.、「Infusion of dendritc cells pulsed with HLA-A2-specific prostate-specific membrane antigen peptides：a phase II prostate tumor vaccine trial involving patients with hormone-refractory metastatic disease」、Prostate. 38 ：73-78 (1999))；および腎細胞癌(Kugler A、et al.、「Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids」、Nat Med. 6：332-336 (2000))、および癌胎児性抗原発現癌(Fong L、et al.、「Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritc cells for tumor immunotherapy」、Proc Natl Acad Sci U S A. 98:8809-8814 (2001))がある。
【０２０８】
わかるように、樹状細胞のローディングを数種の癌を処置する試験に用いたが、イデオタイプタンパク質の急速クローニング、次いでその発現に利点はなく、特異結合細胞減少剤による療法に密接に従った。
【０２０９】
樹状細胞を単離し、次いでTimmermanらの方法によりIdタンパク質でロードした。Timmermanらは、一連の密度勾配遠心工程により白血球搬出法の生成物から樹状細胞を単離した。末梢血単核細胞(PBMC)を、COBE細胞分離装置を用いる白血球搬出法または同様の技術を用いて得る。次いで、Ficoll-Hypaque沈降法(Pharmacia、Uppsala、Sweden)を行う。次に、単核球を不連続(50%)Percoll勾配(Pharmacia)で除去する。この高密度分画をテフロン容器(Savillex、Minneapolis、MN)中のRPMI1640プラス10%ヒト自己血清または10%AB血清中で抗原2μg/mLとともに一夜培養する。高密度リンパ球を15%メトリザミド勾配(Sigma、St Louis、MO)を用いて除去する。低密度樹状細胞豊富化分画をIdタンパク質(50μg/mL)の濃度を増加してIdタンパク質中で一夜再度培養する。この最終インキュベーション後、樹状細胞を回収し、洗浄し、次いで無菌生理食塩水に再浮遊して再注入する(Timmerman J M、et al.、「Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B cell lymphomas：clinical and immune responses in 35 patients」、Blood 99 (5)：1517-26 (2002))。
【０２１０】
Timmermanは、彼らの方法を用い、Idタンパク質の限られた利用可能性に一部基づいて逐次一夜インキュベーション用の免疫原濃度の基礎を形成したことに注意せよ。本発明のIdタンパク質の改善された製造方法を用いることによりこの制限を除くことができよう。
【０２１１】
Thurnerらはロードした樹状細胞を製造するためのわずかに異なるプロトコールを用いた。すなわち、樹状細胞は、Thurner et al.、1999 (Thurner、B. et al.、「Generation of large numbers of fully mature and stable dendritc cells from leukapheresis products for clinical application」、J. Immunol. Methods 223：1-15 (1999))に記載の単回白血球搬出法を用いて得ることもできよう。患者から細胞を取り出した後、PBMCを、例えば、Lymphoprep(登録商標)(Nycomed Pharma)により単離し、3分画に分割する。109個のPBMCの第1分画を、20μg/mlゲンタマイシン、2mMグルタミン、および1%加熱不活化ヒト血漿を添加した完全RPMI1640培地(BioWhittaker)中、ヒトIg(100μg/mL)コートした細菌用ペトリ皿で24時間培養する。これによりDC成熟を刺激するのに次に用いる、単球順化培地(MCM)が生じる。PBMCの第2分画を、Idタンパク質またはIdタンパク質の部分でロードする樹状細胞の供給源に用い、患者に戻し、また、これをあらゆる必要な試験に用いた。そのような試験には遅延型過敏(DTH)試験Iが含まれよう。付着性単球を、ヒトIL-4R+CTLLの6日間増殖を用いるバイオアッセイにおいて1,000U/ml GM-CSF(10x107U/mg)および800U/ml IL-4 (純度>98%；4.1x107U/mg)中で培養し、次いでMCMを添加して樹状細胞の成熟を促す。何人かの患者においてMCMに10ng/ml GMP-rhu TNF-α(純度>99%;5x107)を添加し、DCの完全な成熟を評価することができよう。成熟DCは第7日に回収した。PBMCの第3分画を部分標本に分けて凍結し、将来使用するために液体窒素中に保存した(Thurner B、et al.、「Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature、monocyte-derived dendritc cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma」、J Exp Med. 190：1669-1678 (1999))。
【０２１２】
樹状細胞を免疫原、この場合は濃度10μg/ml〜10μMのFavId(登録商標)でパルスする。7日間後、樹状細胞を回収し、完全培地に再浮遊させ、洗浄し、次いで30μMのペプチドで37℃で60分間パルスする。樹状細胞を洗浄し、PBSに再浮遊させ、患者に戻す(Thurner、et al.、1999)。
【０２１３】
好ましい態様において、樹状細胞のローディングは特異結合細胞減少剤、例えば、抗CD22抗体で処置後12週間以内である。
実施例4
併用療法の部分としてのランゲルハンス細胞の使用
【０２１４】
Kumamotoらは、最近、リンパ節中に捕捉したランゲルハンス細胞をエチレンビニルアセテートポリマーロッドでロードする技術も開発した。この技術を用い、抗原提示細胞細胞をin vivoで免疫原(腫瘍関連抗原)でロードする(Kumamoto et al.、Nat. Biotech. 20：64-69 (2002))。本発明に用いる免疫原は、in vitro系、例えば、細菌細胞、酵母、哺乳類細胞、または昆虫細胞中で発現したIdタンパク質である。好ましい態様において、ランゲルハンス細胞のローディングは、特異結合細胞減少剤、例えば、抗CD22抗体で処置後12週間以内である。
実施例5
特異結合細胞減少剤および哺乳類細胞中で生成された自己Idタンパク質を用いる患者の治療
【０２１５】
抗CD20抗体は、ある種類のB細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療用に承認されている。それらは、KLH結合Idタンパク質の免疫とサイトカインまたはケモカイン、例えば、GM-CSFと組み合わせて用いる。
【０２１６】
すべての患者は、形態学的分類、免疫表現型的特徴付けのための組織を得、Idタンパク質をin vitroで生成するための材料を提供するためリンパ節生検を受ける。
【０２１７】
リンパ腫の特徴付け後、残りの生検細胞浮遊液を公記録保管用に液体窒素に保存する。この材料をin vitro免疫学的反応試験に用い、治療患者の血清中の腫瘍特異抗体の存在を検出し、または治療患者の末梢血由来の腫瘍反応性Tリンパ球を検出することができよう。
【０２１８】
適格患者は、標準用量のRituxan(登録商標)を1週間毎に4回注入し、次いで12週間以内に、GM-CSFとともにKLH結合Idタンパク質を1ヶ月毎に6回、初回皮下注射する。客観的反応(CRまたはPR)を有するか、または進行性疾患を欠く患者は、2カ月毎に6回、次いで疾患の進行の証拠がない場合は3カ月毎にIdタンパク質/GM-CSF処置を受け続ける。血清抗イデオタイプおよび抗KLH抗体は、処置前(抗CD20抗体前)、各Idタンパク質処置前、および最終Idタンパク質処置の4週間後に得た試料から評価する。PBMCのイデオタイプ-特異的およびKLH-特異的増殖を、処置前(抗CD20抗体前)、各Idタンパク質処置前、およびIdタンパク質療法が完了して4週間後に得た試料からも測定する。
投  与
【０２１９】
(1)抗cd20抗体を、添付書類に従って1週間に1回、4週間静脈内注入として、または処置する医師が適切とみなすように投与する。製造業者が提供する処方の詳細を用いる。
(2)Idタンパク質/KLHおよびGM-CSF
【０２２０】
Idタンパク質/KLHおよびGM-CSF処置を、抗CD20抗体処置完了後約8週間に、またはIdタンパク質の生成完了後可能な限り速やかに開始する。Idタンパク質1mg(KLH担体タンパク質0.5mgと結合した腫瘍Idタンパク質0.5mg)および可溶性GM-CSF250mcgは、一般的に同様の処置計画および用量を用いる先の臨床経験を用いる。
【０２２１】
患者は、GM-CSFとともにIdタンパク質(2注射部位に分けて)を1カ月に1回、6カ月間皮下注射する。一定用量250mcgのGM-CSFのみを各Idタンパク質注射後3日間皮下注射により投与する。すべてのGM-CSF注射も分割し(125mcg/注射部位)、FavId(登録商標)注射部位の近くに、FavId(登録商標)の第1日注射部位の正確な部位のできるだけ近くに投与する。注射部位は各月毎に上肢と下肢を交代させる。
薬剤情報
【０２２２】
抗CD20抗体は、製造業者から得、推奨される手順に従って用いる。Idタンパク質は、各患者のリンパ腫から捕捉したイデオタイプ遺伝子から生成する。この患者の特異的遺伝子を用いて、組換え技術を用い、免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするベクターに挿入するイデオタイプ領域を発現する遺伝子を生成する。
【０２２３】
組換え遺伝子は、当該分野で知られた標準的技術を用いて哺乳類細胞中で発現させる。例えば、米国特許No.4,399,216、4,634,665、および5,179,017(Axel特許)に記載のごとく、Idタンパク質をコードする該発現ベクターをDHFR遺伝子とともにCHO細胞に形質転換し、次いで増幅することができよう。
【０２２４】
得られる精製タンパク質を患者にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共有結合させ、次いで患者に投与する。皮下投与用の製剤化FavId(登録商標)(Id-KLH)は、生理食塩水1mlあたり0.5mgのIdと0.5mgのKLHを含み、スクリューキャッププラスチックバイアルに入れられ、投与するまで-20℃に保存する。FavId(登録商標)は、本明細書の他の箇所に記載のごとくGM-CSFと共に投与する。
実施例6
特異結合細胞減少剤および酵母細胞中で生じた特異結合自己Idタンパク質を用いる患者の治療
【０２２５】
抗CD20抗体は、ある種類のB細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療用に承認されている。それらは、KLH結合Idタンパク質の免疫とサイトカインまたはケモカイン、例えば、GM-CSFと組み合わせて用いる。
【０２２６】
すべての患者は、形態学的分類、免疫表現型的特徴付けのための組織を得、Idタンパク質をin vitroで生成するための材料を提供するためリンパ節生検を受ける。
【０２２７】
リンパ腫の特徴付け後、残りの生検細胞浮遊液を公記録保管用に液体窒素に保存する。この材料をin vitro免疫学的反応試験に用い、治療患者の血清中の腫瘍特異抗体の存在を検出し、または治療患者の末梢血由来の腫瘍反応性Tリンパ球を検出することができよう。
【０２２８】
適格患者は、標準用量のRituxan(登録商標)を1週間毎に4回注入し、次いで12週間以内に、GM-CSFとともにKLH結合Idタンパク質を1ヶ月毎に6回、初回皮下注射する。客観的反応(CRまたはPR)を有するか、または進行性疾患を欠く患者は、2カ月毎に6回、次いで疾患の進行の証拠がない場合は3カ月毎にIdタンパク質/GM-CSF処置を受け続けよう。血清抗イデオタイプおよび抗KLH抗体は、処置前(抗CD20抗体前)、各Idタンパク質処置前、および最終Idタンパク質処置の4週間後に得た試料から評価する。PBMCのイデオタイプ-特異的およびKLH-特異的増殖を、処置前(抗CD20抗体前)、各Idタンパク質処置前、およびIdタンパク質療法が完了して4週間後に得た試料からも測定する。
投  与
【０２２９】
(1)抗cd20抗体を、添付書類に従って1週間に1回、4週間静脈内注入として、または処置する医師が適切とみなすように投与する。製造業者が提供する処方の詳細を用いる。
(2)Idタンパク質/KLHおよびGM-CSF
【０２３０】
Idタンパク質/KLHおよびGM-CSF処置を、抗CD20抗体処置完了後約8週間に、またはIdタンパク質の生成完了後可能な限り速やかに開始する。Idタンパク質1mg(KLH担体タンパク質0.5mgと結合した腫瘍Idタンパク質0.5mg)および可溶性GM-CSF250mcgは、一般的に同様の処置計画および用量を用いる先の臨床経験を用いる。
【０２３１】
患者は、GM-CSFとともにIdタンパク質(2注射部位に分けて)を1カ月に1回、6カ月間皮下注射する。一定用量250mcgのGM-CSFのみを各Idタンパク質注射後3日間皮下注射により投与する。すべてのGM-CSF注射も分割し(125mcg/注射部位)、FavId(登録商標)注射部位の近くに、FavIdの第1日注射部位の正確な部位のできるだけ近くに投与する。注射部位は各月毎に上肢と下肢を交代させる。
薬剤情報
【０２３２】
抗CD20抗体は、製造業者から得、推奨される手順に従って用いる。Idタンパク質は、各患者のリンパ腫から捕捉したイデオタイプ遺伝子から生成する。この患者の特異的遺伝子を用いて、組換え技術を用い、免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするベクターに挿入したイデオタイプ領域を発現する遺伝子を生成する。
【０２３３】
組換え遺伝子は、当該分野で知られた標準的技術を用いて酵母細胞中で発現させる。例えば、米国特許No.4,546,082、5,162,498、または6,183,989に記載のごとく、Idタンパク質をコードする該発現ベクターを酵母細胞に形質転換し、次いで発現させることができよう。
【０２３４】
得られる精製タンパク質を患者にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共有結合させ、次いで患者に投与する。皮下投与用の製剤化FavId(登録商標)(Id-KLH)は、生理食塩水1mlあたり0.5mgのIdと0.5mgのKLHを含み、スクリューキャッププラスチックバイアルに入れられ、投与するまで-20℃に保存する。FavId(登録商標)は、本明細書の他の場所に記載のごとくGM-CSFと共に投与する。
実施例7
特異結合細胞減少剤および細菌中で生成される自己Idタンパク質を用いる患者の治療
【０２３５】
抗CD20抗体は、ある種類のB細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療用に承認されている。それらは、KLH結合Idタンパク質の免疫とサイトカインまたはケモカイン、例えば、GM-CSFと組み合わせて用いる。
【０２３６】
すべての患者は、形態学的分類、免疫表現型的特徴付けのための組織を得、Idタンパク質をin vitroで生成するための材料を提供するためリンパ節生検を受ける。
【０２３７】
リンパ腫の特徴付け後、残りの生検細胞浮遊液を公記録保管用に液体窒素に保存する。この材料をin vitro免疫学的反応試験に用い、治療患者の血清中の腫瘍特異抗体の存在を検出し、または治療患者の末梢血由来の腫瘍反応性Tリンパ球を検出することができよう。
【０２３８】
適格患者は、標準用量のRituxan(登録商標)を1週間毎に4回注入し、次いで12週間以内に、GM-CSFとともにKLH結合Idタンパク質を1ヶ月毎に6回、初回皮下注射する。客観的反応(CRまたはPR)を有するか、または進行性疾患を欠く患者は、2カ月毎に6回、次いで疾患の進行の証拠がない場合は3カ月毎にIdタンパク質/GM-CSF処置を受け続けよう。血清抗イデオタイプおよび抗KLH抗体は、処置前(抗CD20抗体前)、各Idタンパク質処置前、および最終Idタンパク質処置の4週間後に得た試料から評価する。PBMCのイデオタイプ-特異的およびKLH-特異的増殖を、処置前(抗CD20抗体前)、各Idタンパク質処置前、およびIdタンパク質療法が完了して4週間後に得た試料からも測定する。
投  与
【０２３９】
(1)抗cd20抗体を、添付書類に従って1週間に1回、4週間静脈内注入として、または処置する医師が適切とみなすように投与する。製造業者が提供する処方の詳細を用いる。
(2)Idタンパク質/KLHおよびGM-CSF
【０２４０】
Idタンパク質/KLHおよびGM-CSF処置を、抗CD20抗体処置完了後約8週間に、またはIdタンパク質の生成完了後可能な限り速やかに開始する。Idタンパク質1mg(KLH担体タンパク質0.5mgと結合した腫瘍Idタンパク質0.5mg)および可溶性GM-CSF250mcgは、一般的に同様の処置計画および用量を用いる先の臨床経験を用いる。
【０２４１】
患者は、GM-CSFとともにIdタンパク質(2注射部位に分けて)を1カ月に1回、6月間皮下注射する。一定用量250mcgのGM-CSFのみを各Idタンパク質注射後3日間皮下注射により投与する。すべてのGM-CSF注射も分割し(125mcg/注射部位)、FavId(登録商標)注射部位の近くに、FavIdの第1日注射部位の正確な部位のできるだけ近くに投与する。注射部位は各月毎に上肢と下肢を交代させる。
薬剤情報
【０２４２】
抗CD20抗体は、製造業者から得、推奨される手順に従って用いる。Idタンパク質は、各患者のリンパ腫から捕捉したイデオタイプ遺伝子から生成する。この患者の特異的遺伝子を用いて、組換え技術を用い、免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするベクターに挿入したイデオタイプ領域を発現する遺伝子を生成する。
【０２４３】
組換え遺伝子は、当該分野で知られた標準的技術を用いて細菌細胞中で発現させる。例えば、米国特許No. 4,816,567および6,331,415(Cabilly特許)に記載のごとく、Idタンパク質をコードする該発現ベクターを細菌細胞に形質転換し、次いで発現させることができよう。
【０２４４】
得られる精製タンパク質を患者にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共有結合させ、次いで患者に投与する。皮下投与用の製剤化FavId(登録商標)(Id-KLH)は、生理食塩水1mlあたり0.5mgのIdと0.5mgのKLHを含み、スクリューキャッププラスチックバイアルに入れられ、投与するまで-20℃に保存する。FavId(登録商標)は、本明細書の他の場所に記載のごとくGM-CSFと共に投与する。
実施例8
無痛性B細胞リンパ腫の患者における細胞減少剤維持リツキシマブプラスFavId(登録商標)処置およびGM-CSF免疫療法による治療中の特異結合細胞減少剤および自己Idタンパク質を用いる患者の治療
【０２４５】
本実施例の目的は、無痛性非ホジキンリンパ腫(濾胞性小開裂細胞型、濾胞性混合小リンパ球性[SLL])の治療である。本実施例は、無事象生存および反応率に基づき、治療経験のない患者(ECOG状態0、1、または2)における維持リツキシマブおよびFavId(登録商標)の組み合わせの安全性を評価するために計画する。本実施例は、さらに抗Id免疫反応(FavId後の細胞性および液性両方)の発現を評価することを意図する。
【０２４６】
患者は、最初に標準的用量および計画(例えば、375mg/m2/週x4)でリツキシマブ処置を開始する。FavId(登録商標)が利用可能になるとすぐに(処置開始後約12週間)、患者はFavId(登録商標)の1月に1回の皮下注射を開始する。すなわち、特異結合細胞減少剤および自己Idタンパク質の投与は重複または並行して継続する。GM-CSFは、FavId(登録商標)と一緒に、およびFavId(登録商標)投与後2、3、4日目に単独で投与される。リツキシマブによる処置は、FavId(登録商標)/GM-CSF(リツキシマブを投与する月には投与されない)と6カ月毎に4全サイクル反復される。第12月に開始する場合、FavId(登録商標)/GM-CSFの投与頻度は、2カ月毎に減少させる。25カ月後に疾患の進行がみられない患者には、疾患が進行するまで3カ月毎にFavId(登録商標)/GM-CSFを投与し続けてよい。
【０２４７】
患者を臨床検査データ、健康診断、有害事象の観察結果に従って評価する。結果を第6月におけるEFS(無事象生存)反応率、全反応率(反応率)、TTP、DR、およびFavId(登録商標)に対する免疫反応(細胞および液性両方)により評価する。有効性データを、包括解析(ITT)および有効性解析可能(EE)患者集団により分析する。
【０２４８】
FavId(登録商標)は、一般的に1mg/ml溶液の濃度で投与される。GM-CSFは、500mcg/mlで投与される。リツキシマブは、一般に10mg/mlで投与される。FavId(登録商標)およびリツキシマブの最小限の毒性は、全用量および計画で両薬剤の組み合わせを可能にするはずである。いかなる理論に縛られることなく、リツキシマブにより誘導されるB細胞の枯渇は、FavId(登録商標)免疫に対する細胞性免疫反応の増大をもたらすかもしれない。
【０２４９】
Hainsworth et al. (Hainsworth JD、et al.、J Clin Oncol 20 (20)：4261 4267 (2002))の維持リツキシマブの計画は、先のFavId(登録商標)試験に用いたFavId(登録商標)の計画と同様に用いる(最初の1月に1回の注射を最初の6回の注射後2カ月毎に遅らせ、次いで最初の1〜2年後3カ月毎に注射)。リツキシマブおよびFavId(登録商標)を異なる日に投与することにより、全処置計画より特定の薬剤に対する副作用が決定しやすい。
(試験集団)
【０２５０】
試験に関与する患者は、以下の基準を満たす必要がある：(1)年齢>18歳、(2)ECOG一般状態0、1、または2、(3)以前に局所放射線療法以外の抗癌療法なし、(4)FavId(登録商標)を製造するのに適しているとFavrilleが判定した生検のための評価可能な腫瘍または利用可能な生検材料、(5)節生検後の測定可能または評価可能な疾患、(6)WHO分類系により組織学的に確認された悪性度1または2の濾胞性B細胞リンパ腫または小リンパ球性リンパ腫(SLL)、(7)治療する医師がリツキシマブで治療するのに適すると判断したこと、(8)WBC数>3,000/mm3、(9)血小板>100,000/mm3、(10)総ビリルビン<2mg/dL、(11)ASTおよびALT <2x正常の上限、(12)クレアチニン<1.5mg/dL、(13)妊娠の可能性がある患者および妊娠の可能性がある配偶者がいる患者は、同意書(インフォームド・コンセント)の署名から彼らが試験を中止した後30日間までは避妊法を用いるのに同意しなければならない、(14)試験の性質を理解し、自由意志で同意する能力。
処置計画
【０２５１】
患者はリンパ腫のFNAを受け、FavIdを製造するための生検を得る。患者は、最初にリツキシマブ375mg/m2IVを1週間に1回、4週間連続投与される。
【０２５２】
患者は、第9週(第3月)にリツキシマブに対する反応を再評価される。客観的反応(CR、CRu、PR)または安定疾患を有する患者は、維持療法を続ける。リンパ腫の進行がある患者は試験から除外する。
【０２５３】
維持療法を開始するすべての患者は、6カ月間隔でリツキシマブの一連の反復治療を受け、合計24カ月間、FavId(登録商標)/GM-CSFの間欠注射を受けるかもしれない。
【０２５４】
維持療法の最初の1年は、FavId/GM-CSFを第4月(第13週)に開始し、1月毎に投与する。FavId/GM-CSFの組み合わせは、最初の12カ月間はリツキシマブと同時に投与し、FavId注射は一般的に第4、5、6、8、9、10、および11月に投与する。第2年は、FavId/GM-CSFを2カ月毎に投与する(リツキシマブを投与する月以外)。したがって、第2年の注射は、第14、16、18、20、22、および24月である。2年間の療法終了後に反応が継続する患者については、FavId/GM-CSFをリンパ腫が進行するまで3カ月間隔で継続する。
【０２５５】
FavId/GM-CSFを投与する日に、FavIdタンパク質(0.5mg)およびKLHタンパク質(0.5mg)をGM-CSF250μgと混合し、皮下注射する。第2〜4日に、GM-CSF 250μg SQを投与し、FavId注射部位の近くに注射する。第2〜4日の用量は、患者の家で自己投与してよい。
リツキシマブによる維持：
【０２５６】
リツキシマブの一連の維持治療は、3回の一連の維持治療では6カ月毎に投与する(すなわち、第7、13、および19に開始)。リツキシマブの各一連の維持治療は一般的に4回の1週間に1回の投与からなる(375mg/m2IV注入)。
予備治療評価
【０２５７】
予備治療評価が必要な試験および最初の12ヶ月間の治療試験を表1に要約する。すべての患者はFavId抗体を生成するための生検を受ける。X線評価は試験参加の1カ月以内に行う。臨床検査を試験参加の1週間以内に行う。該試験が試験参加の6カ月以内に行われなかった場合は、患者の骨髄を吸引し、生検する。
表1．最初の12カ月間における予備治療試験および評価
【０２５８】
0005430824.tif 000002
a 妊娠の可能がある女性のみ。
b 臨床的に示された場合のみ。
c bcl-2遺伝子再配列を検出するためのフローサイトメトリーを含む。6カ月以内に骨髄吸引した患者では不要。
d FavId抗体を作製する標本について必要 (付表I参照)。
e 処置前および各FavId投与前。標本を保存し、Favrilleに送付する(付表III)。
f 最初異常で、CRを確認する必要がある場合のみ(フローサイトメトリーを含む)患者の治療反応を3カ月間隔で再評価する。最初の1年間は1カ月毎に患者を検査し、CBC、血小板、示差(differential)、および化学を1カ月毎に行う。腫瘍リステイジング(restaging)および腫瘍測定を6カ月間間隔で継続する。CBC、血小板、CMP、および液性/細胞性免疫の試験を、FavId/GM-CSFの各計画投与前、およびリツキシマブの各一連の治療前に行う。
表2．第12〜25月における患者の評価
【０２５９】
0005430824.tif 000003
【０２６０】
2年間の維持の完結後(第25月)、患者の腫瘍状態の再評価を行う。臨床的に完全寛解であれば、この時に患者に骨髄吸引/生検を反復し、骨髄が以前に行われていれば、完全寛解が確認される。
【０２６１】
2年間の維持療法の完結後、患者を3カ月毎に病歴および健康診断、CBC、示差、化学プロフィール、および健康診断により評価可能なあらゆる病変の腫瘍測定を行う。6カ月間隔で、胸部および腹部のCTスキャンを反復し、腫瘍状態を評価する。この評価は腫瘍の進行が証明されるときまで継続すべきである。
効果の評価
【０２６２】
以下に効果を決定するのに用いたパラメーターを記載する。
腫瘍反応評価
【０２６３】
反応はInternational Workshop Response Criteria(国際ワークショップ反応基準)を用いて定義する。基準の完全な表については下記表に要約した付表II参照。
0005430824.tif 000004
免疫反応評価
【０２６４】
液性および細胞性免疫反応分析は、標準的技術を用い各患者から得た血液試料を用いて行う。
【０２６５】
以下の項に治療に用いた薬剤に対する特定の情報を記載する。
薬剤情報
1.FavId(登録商標)
【０２６６】
説  明：
FavId(登録商標)は、リンパ節生検から得た遺伝子情報を用いて各患者について製造した。FavId(登録商標)は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共有結合した患者由来のユニークなIdタンパク質からなる。
【０２６７】
製  剤：
皮下(SQ)投与用のFavId(登録商標)は、生理食塩水1mLあたり0.5mgのIdタンパク質および0.5mgのKLHタンパク質を含む。
【０２６８】
製  造：
FavId(登録商標)注射の日に、250mcgの市販のGM-CSFをプラスチックツベルクリンシリンジに吸引し、取っておく。FavId(登録商標)の解凍したバイアルの全内容を18ゲージ針付き3mLシリンジに調製する。あらゆる粒子を針で破壊し、注意深くバイアル中の全ての微粒子を患者に投与するためのシリンジに確実にとる。プランジャーを引いて針のハブからあらゆる試験物質を除去し、GM-CSFを加えるための空間を残す。全バイアル内容を調製した後、18ゲージ針を3mLシリンジから外す。予め吸引したGM-CSF用量を3mLシリンジに加え、シリンジ外筒に空気の余地を残す。18ゲージ針を再度取り付け、シリンジを静かに揺り動かして溶液を混合する。空気を追い出し、試験溶液を投与用の2本のツベルクリンシリンジに分ける。25ゲージ針を投与に用いる。
【０２６９】
保存および安定性：
FavId(登録商標)は-20℃に保存する。
【０２７０】
投  与：
投与の日に、全FavId(登録商標)用量を2上肢または2下肢(例えば右腕と左腕)に等量に分割する。次の投与では注射部位を上肢と下肢で交代する。
【０２７１】
予想される副作用：
Id-KLH(FavId(登録商標)と同様)(GM-CSFの併用あり、なしの両方)を患者に先に投与した。副作用は最小限であり、最も頻度の高い副作用には注射部位の局所反応が含まれた。考えられる有害事象には、注射部位の局所皮膚反応、例えば水腫、圧痛、硬結、じんま疹/発疹、掻痒；および全身反応、例えば、発熱、筋肉痛/関節痛、悪寒/硬直、吐き気、疲労、頭痛、血小板減少症、および他の血球減少、高血糖、嘔吐、低血圧が含まれる。
【０２７２】
さらに、自己免疫病が発現する理論的危険性があるが、臨床的自己免疫疾患はId-KLHワクチンを投与された患者ではまだ記載されていない。
2. GM-CSF(Sargramostim(サルグラモスチム)；Leukine登録商標)
【０２７３】
説  明：
GM-CSF(LEUKINE(登録商標))は、Immunex Corporationが製造した酵母(S. cerevisiae)発現系中の組換えDNA技術により製造されたグリコシル化ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(rhuGM-CSF)である。GM-CSFは、製造業者の説明およびプロトコールに従って用いる。
3. リツキシマブまたは他の細胞減少剤
【０２７４】
説  明：
リツキシマブまたはあらゆる他の細胞減少剤は、製造業者の説明およびプロトコールに従って用いる。
【０２７５】
エンドポイント(一次および二次)：
以下は試験に用いたエンドポイントの説明である。
【０２７６】
一次：
無事象生存(EFS)は、リツキシマブの最初の投与時からあらゆる以下の事象：死亡、疾患の進行、またはさらなる(非プロトコール特定)処置の設定の時までと定義する。
【０２７７】
二次的効果のエンドポイント：
第6月(リツキシマブの第2の一連の治療の直前)の客観的反応率
6月間の客観的反応率は、6月間評価における完全反応(CR)または部分反応(PR)を達成または維持している患者の百分率で定義する。
【０２７８】
全客観的反応率：全客観的反応率は試験参加中のあらゆる時点で完全反応(CR)または部分反応(PR)を達成した患者の百分率で定義する。
【０２７９】
進行までの時間：進行までの時間(TTP)は、リツキシマブの第1回投与から進行性疾患の最初の記録時までの時間と定義する。進行していない患者は追跡調査しないか、進行前の死亡はその最後の評価時で打ち切る。
【０２８０】
反応の持続時間：反応の持続時間(DR)は、反応(CRまたはPR)の最初の記録日から進行性疾患の最初の記録時までの時間と定義する。進行していない患者は追跡調査しないか、進行前の死亡はその最後の評価時で打ち切る。
【０２８１】
免疫反応：患者がIdワクチン接種の開始後のあらゆる時点でIdタンパク質に対する陽性細胞性および/または液性反応を発現する場合は免疫反応陽性とみなす。患者のKLHに対する陽性細胞性または液性免疫反応についても評価する。
試験集団(個体群)
【０２８２】
包括解析集団：包括解析集団(ITT)はリツキシマブの少なくとも1用量を投与された全ての患者を含む。
【０２８３】
効果評価可能集団：効果評価可能集団(EE)には、リツキシマブ療法を投与され、少なくとも1用量のFavId(登録商標)/GM-CSFを投与され、少なくとも1回追跡腫瘍評価を受けたすべての患者が含まれる。
【０２８４】
安全性を評価可能な集団：あらゆる試験治療(リツキシマブまたはFavId(登録商標)/GM-CSF)を受けるすべての患者について安全性および毒性が評価可能であろう。
【０２８５】
本明細書に実例的に記載の本発明は、本明細書に具体的に開示していないあらゆる要素、限定なしに適切に実施することができる。すなわち、例えば、用語「含む(包含する、comprising)、「含む(including)」、「含む(含有する、containing)」などは広く、限定無しに読むものとする。さらに、本明細書で用いる用語および表現は、限定でなく説明の用語として用いており、本発明のあらゆる等価物またはその部分を除くそのような用語および表現の使用を意図しないが、種々の修飾が特許請求の範囲の発明の範囲内で可能であると認識される。すなわち、本発明は好ましい態様および任意的特徴により具体的に開示されているが、本明細書に具体的に記載の本発明の修飾および変更を当業者が容易になすことができること、およびそのような修飾および変更は本明細書に開示した本発明の範囲内にあると考えられると理解すべきである。本発明は本明細書では広く、一般的に記載されている。一般的開示内にあるより狭い種および亜属グループ分けのそれぞれも本発明の部分を形成する。これは、本発明のそれぞれの一般的説明内に、除く物質が具体的に記載されているか否かに関わらず、属(genus)からあらゆる対象を除くことを可能にする消極的な限定や但し書きを含む。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュグループにより記載されている場合、当業者は、本発明はマーカッシュグループのあらゆる個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていると認識するであろう。さらに、本発明の局面への言及が、一定範囲の個々のメンバーを、例えば、配列番号1〜配列番号100(含む)として記載するときは、個々に記載のすべてのメンバーを記載するのと同じであることを意図し、さらに全ての個々のメンバーは、個々の特許請求の範囲に含まれ、または除外されることがあると理解すべきである。
【０２８６】
本明細書の方法で用いおよび/または示した工程は、示しおよび/または記載したのと異なる順番で行うことができよう。該工程は該工程が生じるかもしれない順番の単なる例示である。該工程はさらに本発明の目的が達成されるように所望のあらゆる順番で生じてよい。
【０２８７】
本明細書の本発明の説明から、種々の等価物を用いて本発明の精神から離れることなく本発明の概念を実施することができることが明らかである。さらに、本発明はある種の態様に具体的に言及して説明してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲から離れることなく形式および詳細を変更することができる。記載した態様は、あらゆる点で例示的であり、制限的ではないと考えられる。本発明は本明細書に記載の特定の態様に限定されないが、本発明の範囲から離れることなく多くの等価物、再配列、修飾、および置換が可能であることも理解すべきである。すなわち、さらなる態様は本発明の範囲内であり、特許請求の範囲内である。
【０２８８】
本明細書に記載したすべての米国特許および出願、外国特許および出願、科学文献、書籍、および刊行物の内容は、あらゆる図面、図表、および表を含め、本明細書の一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】化学療法後の再発性/難治性の濾胞性NHL患者のRituxanを用いる細胞減少後のFavId治療。
【図２】治療経験のない濾胞性NHL患者のRituxanによる細胞減少後のFavId治療。
【図３】治療経験のない濾胞性NHL患者におけるRituxanによる細胞減少とFavId治療。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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