(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨基質を産生する細胞を永久株化する永久株化工程と、
永久株化された細胞を骨補填材に付着させる付着工程と、
骨補填材に付着した細胞を増殖させることにより、前記骨補填材を足場として骨形成作用を生じさせる形成工程と、
細胞を不活化させる処理工程とを含む人工骨の製造方法。
【請求項２】
骨基質を産生する永久株化した細胞を、ヒトを除く生体から採取する採取工程と、
採取された細胞を骨補填材に付着させる付着工程と、
骨補填材に付着した細胞を増殖させることにより、前記骨補填材を足場として骨形成作用を生じさせる形成工程と、
細胞を不活化させる処理工程とを含む人工骨の製造方法。
【請求項３】
前記処理工程が、凍結処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【請求項４】
前記処理工程が、超音波振動を与える処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【請求項５】
前記処理工程が、放射線照射処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【請求項６】
前記処理工程が、界面活性剤に浸漬する処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【請求項７】
前記処理工程が、減圧処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【請求項８】
前記処理工程が、酸溶液に浸漬する処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【請求項９】
前記処理工程が、加熱処理である請求項１または請求項２に記載の人工骨の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工骨の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、患者以外の第三者から採取した幹細胞を使用して製造した生体組織補填体を移植すると、免疫拒絶反応が引き起こされるという不都合を防止する技術が知られている（特許文献１参照。）。
この技術は、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着された幹細胞を分化させることにより生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせ、形成された組織細胞を死滅させるものである。これにより、製造された生体組織補填体は、生きた組織細胞を有しないので生体内に移植されても組織細胞に起因する免疫拒絶反応を引き起こすことがない。
【特許文献１】特開２００４−３０５２５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１においては、生体組織形成作用を生じさせる組織細胞は、幹細胞を分化させることにより得られている。幹細胞を分化させて得られる組織細胞を大量に得るためには、幹細胞を大量に増殖させた後に分化させるか、患者から幹細胞を大量に採取してくる必要がある。
【０００４】
患者から幹細胞を大量に採取する場合には、患者にかかる負担が大きいという問題がある。また、患者から採取した幹細胞を大量に増殖させる場合には、増殖後の細胞が疲弊して活きが悪くなり、生体組織形成能が低下するという問題がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、移植による免疫拒絶反応の発生を抑制することができる人工骨を効率的に製造することができる人工骨の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、骨基質を産生する細胞を永久株化する永久株化工程と、永久株化された細胞を骨補填材に付着させる付着工程と、骨補填材に付着した細胞を増殖させることにより、前記骨補填材を足場として骨形成作用を生じさせる形成工程と、細胞を不活化させる処理工程とを含む人工骨の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、骨基質を産生する細胞、例えば、骨芽細胞等を永久株化しているので、幹細胞を分化させることにより得る必要がない。したがって、必要に応じて必要なだけ、十分な骨形成作用を発揮する細胞を提供することができ、提供された細胞を用いて、十分な量の骨基質を含む人工骨を製造することができる。そして、人工骨内に活きた細胞が存在しないので、第三者に移植しても免疫拒絶反応の発生を抑制することができる。
【０００８】
また、本発明は、骨基質を産生する永久株化した細胞を、ヒトを除く生体から採取する採取工程と、採取された細胞を骨補填材に付着させる付着工程と、骨補填材に付着した細胞を増殖させることにより、前記骨補填材を足場として骨形成作用を生じさせる形成工程と、細胞を不活化させる処理工程とを含む人工骨の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明によれば、癌化することにより永久株化した骨芽細胞等の骨基質を産生する細胞を採取し、採取した細胞を用いて骨補填材に骨基質を産生させた後に、細胞を不活化することにより、第三者に移植しても免疫拒絶反応の発生を抑制する人工骨を製造することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記処理工程が、凍結処理であることとしてもよい。
このようにすることで、細胞内の水分を凍結させ、細胞の体積を膨張させ、または氷塊を生成することにより、細胞膜を損傷させて細胞を死滅させることができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記処理工程が、超音波振動を与える処理であることとしてもよい。
このようにすることで、細胞内の水分を振動させ、細胞内組織を破壊して、細胞を死滅させることができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記処理工程が、放射線照射処理であることとしてもよい。
このようにすることで、放射線の有するエネルギにより、細胞の核等の細胞内組織を破壊して、細胞を死滅させることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記処理工程が、界面活性剤に浸漬する処理であることとしてもよい。
このようにすることで、界面活性剤の作用により細胞膜を破壊して、細胞を死滅させることができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記処理工程が、減圧処理であることとしてもよい。
このようにすることで、細胞内部への浸透圧が高まり、細胞膜が破損するので、細胞を死滅させることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記処理工程が、酸溶液に浸漬する処理であることとしてもよい。
このようにすることで、酸溶液内に含有される非解離型分子が細胞内に取り込まれ、細胞内での代謝により水素イオンが増加することにより、細胞を変性させて死滅させることができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記処理工程が、加熱処理であることとしてもよい。
このようにすることで、細胞を熱により変性させて死滅させることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、移植による免疫拒絶反応の発生を抑制することができる人工骨を効率的に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一実施形態に係る人工骨の製造方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る人工骨の製造方法は、図１に示されるように、骨基質を生成する細胞、例えば、骨芽細胞を永久株化するステップＳ０１と、永久株化された骨芽細胞を骨補填材に付着させるステップＳ０２と、付着させた骨芽細胞を培養し、骨補填材を足場として骨基質を産生させるステップＳ０３と、骨補填材に付着している骨芽細胞を不活化させるステップＳ０４とを備えている。
【００１９】
永久株化するステップＳ０１は、例えば、採取した骨芽細胞にＳＶ４０のようなウィルスを直接感染させることにより行われる。なお、永久株化するステップＳ０１に代えて、癌化により永久株化した骨芽細胞を採取するステップを採用してもよい。永久株化した骨芽細胞は、例えば、永久に増え続ける骨芽細胞であり、骨形成能を失うことなく、増殖し続けることができる。
【００２０】
骨芽細胞が永久株化しているか否かについては、テロメラーゼ活性を調べることにより、判断することができる。したがって、永久株化ステップＳ０１の後に、テロメラーゼ活性を調べることによる永久株化の判定を行うステップを設けてもよい。
【００２１】
付着させるステップＳ０２は、例えば、β−ＴＣＰの多孔体により構成されたブロック状の骨補填材を永久株化された骨芽細胞が浮遊している培地内に浸漬することにより行われる。これにより、骨芽細胞が骨補填材の表面に付着する。培地は、例えば、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳである。
【００２２】
産生させるステップＳ０３は、上記ステップＳ０２において、骨補填材に付着させた骨芽細胞を、適度に培地交換を行いながら、１週間程度培養することにより行われる。これにより、骨補填材に付着した骨芽細胞が、骨基質を産生する。この時点で、骨補填材に骨芽細胞と産生された骨基質とを含有する人工骨が製造される。
【００２３】
不活化させるステップＳ０４は、骨芽細胞を凍結して死滅させることにより行われる。
例えば、ステップＳ０３において製造された人工骨を、−８０℃で１時間冷却後、室温で融解させるステップを所定回繰り返す。これにより、骨該細胞内の水分が膨張し、または氷塊が生成されることによって細胞膜が損傷し、骨芽細胞が死滅する。一方、骨芽細胞によって産生された骨基質は、低温状態に晒されても変質することなくその状態が維持される。
【００２４】
これにより、骨補填材内に骨芽細胞が死滅し、骨基質が十分に付着した人工骨を得ることができる。
このように、本実施形態に係る製造方法によれば、幹細胞を分化させて骨芽細胞を得る従来の製造方法と比較すると、骨芽細胞の骨形成能を失うことなく、骨芽細胞に多量の骨基質を産生させることができ、大量の幹細胞を患者から採取しなくても、十分な量の骨基質を含む人工骨を製造することができる。
【００２５】
したがって、患者に多大な負担を強いることなく、効率的に骨形成能の高い人工骨を製造することができる。
そして、このようにして製造された人工骨は、骨芽細胞が産生した骨基質を変性させることなく骨補填材内の骨芽細胞を死滅させているので、患者以外の第三者から採取した骨芽細胞を使用して製造したものであっても、患者に移植した際における免疫拒絶反応や、癌化、感染症等の不都合の発生を抑制することができる。
【００２６】
なお、本実施形態に係る人工骨の製造方法においては、凍結、融解により骨芽細胞を死滅させることとしたが、これに代えて、４７ｋＨｚ程度の超音波振動を与える処理、８０Ｇｙ程度の放射線を照射する放射線照射処理、界面活性剤に浸漬する処理、減圧処理、酸溶液に浸漬する処理あるいは加熱処理により、細胞を不活化させることにしてもよい。
【００２７】
また、本実施形態においては、骨基質を産生する細胞として、骨芽細胞を例示して説明したが、これに代えて、ＮＯＳ−１、ＮＯＳ−２、Ｓａｏｓ−２、Ｈｕ０９、チャイニーズハムスター卵巣細胞等を採用してもよい。
【実施例】
【００２８】
以下に、本実施形態に係る人工骨の製造方法の実施例を説明する。
本実施例においては、まず、骨形成シグナルの発現が見られる永久樹立の骨芽細胞をαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地内において、温度３６．５℃、ＣＯ２濃度０．５％の培養条件下で培養し、増殖させた。次いで、トリプシンを用いて骨芽細胞を回収し、細胞浮遊液を作成した。
【００２９】
２４穴プレート上に設置した５ｍｍβ−ＴＣＰディスク上に１×１０６個の骨芽細胞を含む細胞浮遊液を滴下し、１０分間インキュベータ内に静置した。
次いで、さらに静かにα−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を追加し、β−ＴＣＰを培養液内に埋没させた。
【００３０】
２日に１回の割合で培地を交換した。
そして、１週間の培養後に、骨芽細胞の付着したβ−ＴＣＰを−８０℃に１時間冷却後、室温で融解するステップを３回繰り返した。これにより、細胞の不活化を行った。
【００３１】
このようにして製造された人工骨をＳＣＩＤマウス背部に移植し、１，２，６週で採取して組織学的に観察した。
その結果、表１、図２および図３に示されるように、２週で骨形成および血管新生が確認され、６週では骨髄の再生も確認された。図２および図３において（ａ）、（ｂ）はそれぞれ、２つのサンプルの顕微鏡写真を示している。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係る人工骨の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法を用いて製造された人工骨の移植２週後の骨形成を示す顕微鏡写真である。
【図３】図１の製造方法を用いて製造された人工骨の移植６週後の骨形成を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００３３】
Ｓ０１  永久株化するステップ（永久株化工程）
Ｓ０２  付着させるステップ（付着工程）
Ｓ０３  産生させるステップ（形成工程）
Ｓ０４  不活化させるステップ（処理工程）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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