(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）を有する重合性単量体を成分として含み、式（１）を有する重合性単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．０５〜０．５μｍｏｌ／ｍ2であることを特徴とする粒子凝集測定用ラテックス粒子。
ＣＨ2＝ＣＲ1−ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ2・・・（１）
（Ｒ1は水素原子またはメチル基、Ｒ2は水素原子またはメチル基、ｎは１≦ｎ＜２０）
【請求項２】
上記フェニル基を有する重合性単量体が、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、４−ビニル安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
【請求項３】
上記フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体が、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ−メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ−メチルスチレンスルホン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１または２に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
【請求項４】
上記フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
【請求項５】
抗原または抗体を物理吸着により担持することを特徴とする請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
【請求項６】
上記請求項１〜５のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能な粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野において検体中の微量物質を定量する方法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が広く行われている。中でも抗体等を担持させたラテックス粒子（以下、感作ラテックス粒子ということがある）を用いたラテックス免疫比濁法は簡便かつ測定時間が短いことから、広く検査室等で用いられている。ラテックス免疫比濁法による検体中の抗原または抗体の定量は、免疫複合体形成に伴う感作ラテックス粒子の凝集による吸光度変化を光学的に検出することにより行われる。この吸光度の変化は、感作ラテックス粒子の凝集による見かけの粒径変化に基づくものである。【０００３】
従来、ラテックス免疫比濁法には、特許文献１に見られるように、検出対象物質と特異的に反応する抗原または抗体の固定化（感作）が容易であり、比較的安価で、かつ重合反応も制御しやすいことから、ポリスチレンを主成分とするポリスチレン系ラテックス粒子が用いられてきた。しかし、ポリスチレン系ラテックス粒子では、抗原や抗体を物理的に吸着（感作）できるメリットがある一方、検体中の非検出対象タンパク質等をも吸着するため、抗原抗体反応による特異的反応に基づかない感作ラテックス粒子の凝集反応、いわゆる非特異的反応を引き起こすことがあり、この非特異的反応を抑制することが従来からの課題であった。【０００４】
特許文献１では、非特異的反応を抑制するために、抗原や抗体を感作したラテックス粒子をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングする試みがなされているが、十分に効果を得られないことも多く、高いバックグラウンド値を与えることから、高感度測定が可能な試薬を作製する上での大きな課題であった。【０００５】
特許文献２では、スチレンと下記一般式で表される化合物とスチレンスルホン酸の塩と水溶性ラジカル重合開始剤を用いて水中で共重合させてポリマー粒子となし、診断薬用担体粒子を作製している。しかし、一般式においてｘ、ｙ、ｚの少なくともひとつが２０以上になる化合物のみが使用されており、その他の化合物についての記載はない。また、ポリマー粒子の作製に用いられる下記一般式の化合物は高濃度で、作製されたポリマー粒子は抗原や抗体を粒子表面に物理吸着させにくく、診断薬用担体としての目的を果たすことができないものであった。
ＣＨ2＝ＣＲ3−ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）X（ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2Ｏ）y（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ZＲ4
（式中Ｒ3はＨまたはＣＨ3，Ｒ4はＨまたはＣＨ3、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０または１００以下の整数であって、ｘ、ｙ、ｚは１≦ｘ+ｙ+ｚ≦１００を満たす）【０００６】
特許文献３では、鎖長の異なるポリエチレングリコールと抗体または抗原を、脱着を防止するために共有結合を介して粒子表面に共固定することで非特異的吸着を抑制するラテックス粒子としている。しかしながら、このラテックス粒子では、抗体やポリエチレングリコール鎖を結合させるための官能基が粒子表面に多く導入されている必要があり、かつ抗体を共有結合した後にポリエチレングリコールを共有結合するなど作製方法が煩雑であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３７０８９４２号公報
【特許文献２】特公昭５８−３４４８６号公報
【特許文献３】国際公開第２０１０／０８２６８１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような従来のラテックス免疫比濁法における問題を解決するためになされたものであり、非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能、かつ簡便に診断薬を作製できる粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬を提供することを目的としている。【０００９】
特許文献２では、当該単量体の使用範囲は重量によってのみ規定されており、ラテックス粒子表面における最適なエチレングリコール（含有）単量体、プロピレングリコール（含有）単量体の量（密度）については示唆も記載も無かった。そのため、十分な非特異反応抑制効果を得ることができる合成条件の検討において、分子量の違いによって最適な当該単量体の使用量を試行錯誤する必要があった。一方、特許文献３では、ラテックス粒子の合成工程とは別に、エチレングリコール（含有）単量体を結合する工程が必要であり、粒子合成時のエチレングリコール結合用官能基の制御と官能基とエチレングリコールの結合の制御の２段階の操作が必要となり、煩雑であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ラテックス粒子合成と同時に簡便な操作で本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子を作製するに至った。すなわち、本発明は、以下のものである。【００１１】
[１]フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）を有する重合性単量体を成分として含み、式（１）を有する重合性単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．０５〜０．５μｍｏｌ／ｍ2であることを特徴とする粒子凝集測定用ラテックス粒子。
ＣＨ2＝ＣＲ1−ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ2・・・（１）
（Ｒ1は水素原子またはメチル基、Ｒ2は水素原子またはメチル基、ｎは１≦ｎ＜２０）
[２]上記フェニル基を有する重合性単量体が、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、４−ビニル安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである上記[１]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[３]上記フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体が、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ−メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ−メチルスチレンスルホン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである上記[１] または[２]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[４]上記フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムであることを特徴とする上記[１]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[５]抗原または抗体を物理吸着により担持することを特徴とする上記[１]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[６]上記[１]〜[５]のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子および粒子凝集測定試薬を用いることにより、非特異凝集反応を引き起こす検体中の非検出対象タンパク質を吸着させず、目的とする特異凝集反応のみを惹起させるため、従来よりも高感度な診断薬を得ることが可能である。また、重合反応自体も一段階での反応により作製でき、かつ抗原や抗体の感作も物理吸着で行うよう設計されているため、診断薬を製造する際においても非常に簡便な方法で高感度な粒子を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例および比較例の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー標準抗原を測定した検量線である。
【図２】図２は、抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例および比較例の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー乖離検体１及びＤダイマー乖離検体２を測定し、図１の検量線に基づき濃度換算したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び水酸基末端又はメチル基末端のポリエチレングリコール（メタ）アクリレート（以下、「ＰＥＧ単量体」という）を単量体成分として含み、ＰＥＧ単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．０５〜０．５μｍｏｌ／ｍ2である粒子凝集測定用ラテックス粒子を提供するものである。
【００１５】
以下、本発明をさらに詳説する。本発明に用いられるフェニル基を有する重合性単量体としては、特に限定されず、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、４−ビニル安息香酸などが挙げられる。これらは単独で用いても良く、２種以上が混合されていても良い。なかでもスチレンが好ましく用いられる。
【００１６】
フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体としては、重合後の粒子表面にスルホン酸基を含有させることができる単量体であれば特に限定されず、例えば、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ−メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ−メチルスチレンスルホン酸塩などが挙げられる。また、この場合の塩としても、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なかでも、スチレンスルホン酸塩が好ましく、スチレンスルホン酸ナトリウムが更に好ましく用いられる。
【００１７】
ＰＥＧ単量体は、下記一般式（１）を満足するものならいかなるものでも用いることができる。
ＣＨ2＝ＣＲ1−ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ2・・・（１）
（Ｒ1は水素原子またはメチル基、Ｒ2は水素原子またはメチル基、ｎは１≦ｎ＜２０）
例えば、ブレンマー（登録商標、以下同じ）ＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）、ブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）、ブレンマーＰＥ−３５０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝８、日油製）、ブレンマーＡＥ−９０（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）、ブレンマーＡＥ−２００（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）、ブレンマーＡＥ−４００（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１０、日油製）、ブレンマーＰＭＥ−１００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝メチル基、ｎ＝２、日油製）、ブレンマーＰＭＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝メチル基、ｎ＝４、日油製）、ブレンマーＰＭＥ−４００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝メチル基、ｎ＝９、日油製）、ブレンマーＡＭＥ−４００（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝メチル基、ｎ＝９、日油製）、ライトアクリレートＭＴＧ−Ａ（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝メチル基、ｎ＝３、共栄社化学製）、ライトアクリレート１３０Ａ（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝メチル基、ｎ＝９、共栄社化学製）などが挙げられる。
【００１８】
本発明のラテックス粒子は、上記フェニル基を有する重合性単量体とフェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体とＰＥＧ単量体を含む水性媒体中でソープフリー乳化重合することにより得られる。上記重合の方法としては、従来公知のソープフリー乳化重合法を用いることができる。例えば、媒体として、水を満たした反応容器内に、上記フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、ＰＥＧ単量体、重合開始剤を添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら加熱する方法等が挙げられる。
【００１９】
重合温度は、５０〜１００℃が好ましく、より好ましくは６０〜８５℃である。また、重合時間は、重合性単量体の組成、濃度、及び、重合開始剤等の条件にもよるが、通常５〜５０時間である。
【００２０】
上記水性媒体としては、水（脱イオン水）単独、もしくは水および水溶性溶媒の混合溶媒を使用することが好ましく、例えば水とエタノールなどのアルコールとの混合溶媒である。中でも水単独を用いることが好ましい。
【００２１】
上記重合開始剤としては、公知のラジカル開始剤を用いることができる。例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、２，２'−アゾビスイソブチロニトリル、２，２'−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２'−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物、ベンゾイルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート等の有機過酸化物を挙げることができる。なかでも過硫酸塩が好ましく、より好ましくは、過硫酸カリウムが用いられる。上記重合開始剤の使用量としては特に限定されないが、好ましくは重合性単量体量に対して０．０１〜５重量％の範囲で用いる。
【００２２】
また、本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子の用途によっては、上記重合の際に、更に上記単量体と共重合可能な重合性不飽和単量体を添加してもよい。重合性不飽和単量体としては通常のラジカル重合に使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、スチレン誘導体、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸アミド、ハロゲン化ビニル、ビニルエステル、（メタ）アクロレイン、マレイン酸誘導体、フマル酸誘導体等が挙げられる。なお、本発明において（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸またはメタクリル酸を意味する。また、上記スチレン誘導体は、本発明に用いられるフェニル基を有する重合性単量体、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体以外のスチレン誘導体である。
【００２３】
重合に用いる本発明のＰＥＧ単量体の量としては、ＰＥＧ単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．０５〜０．５μｍｏｌ／ｍ2となるように用いれば特に限定はない。粒子表面に占める官能基密度が高くなると、非特異的反応を抑制する効果は高いが、感度の低下も著しくなり、好ましくない。また、粒子表面に占める官能基密度が低くなりすぎると、ＰＥＧ単量体が有する非特異的反応抑制の効果が減少し、ＰＥＧ単量体を用いない粒子と何ら変化がなくなってしまうため、好ましくない。本発明者らは、感度を低下させずに非特異的反応を抑制するには、ＰＥＧ単量体の官能基密度を０．０５〜０．５μｍｏｌ／ｍ2とすることが重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
尚、ＰＥＧ単量体の官能基密度は、以下の計算式により算出する。
官能基密度（μｍｏｌ／ｍ2）＝（ラテックス粒子製造に用いたＰＥＧ単量体のモル数）／（生成したラテックスの全表面積）
【００２４】
官能基密度は、詳しくは下記の方法で計算できる。
ｒ：生成したラテックス粒子の平均粒径（ｎｍ）
Ｙ：ラテックス粒子の製造に用いたＰＥＧ単量体のモル数（μｍｏｌ）
すなわち、
Ｙ＝（製造に用いたＰＥＧ単量体の重量（ｇ））／（製造に用いたＰＥＧ単量体の平均分子量）
Ｖ：ラテックス粒子の総体積（ｃｍ3）
Ｓ：ラテックス粒子の総表面積（ｃｍ2）
ｘ：ラテックスの総数（個）
Ｚ：官能基密度（μｍｏｌ／ｍ2）
Ｋ：重合反応に用いられる、フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、重合開始剤、ＰＥＧ単量体の重量の総和（ｇ）
としたとき、
Ｖ＝４／３π（ｒ／２×１０-7）3×ｘ
Ｓ＝４π（ｒ／２×１０-7）2×ｘ
より、Ｓ＝６Ｖ／（ｒ×１０-7）
よって、
Ｚ＝Ｙ／（Ｓ×１０-4）
＝Ｙ×ｒ×１０-3／６Ｖ
ここで、重合したポリスチレンの比重が１．０６ｇ／ｃｍ3より、
Ｖ＝Ｋ／１．０６
Ｚ＝１．７６６×１０-4×Ｙ×ｒ／Ｋ
【００２５】
本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子の平均粒子径は、０．０５〜１．０μｍであることが望ましい。０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さすぎて測定に必要な感度が得られず、また、試薬調製時の遠心分離の際に多くの時間がかかり試薬コストが高くなる。１．０μｍを超えると、検出対象物質が高濃度であるときに粒子の凝集による光学的変化量が測定可能領域を越えてしまい、検出対象物質の量に応じた光学的変化量が得られない。粒子凝集測定用ラテックス粒子を使用する測定方法、測定機器によって異なるが、好ましくは０．０５〜０．７μｍ、より好ましくは０．０５〜０．４μｍである。
【００２６】
上記粒子の粒子径の変動係数（ＣＶ値）は、２０％以下であることが好ましい。２０％を超えると、試薬調製時のロット再現性が悪く、測定試薬の再現性が低下することがある。より好ましくは１５％以下である。尚、上記粒子径の変動係数は、次の式により算出される。
粒子径の変動係数（ＣＶ値）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径
【００２７】
本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子の表面におけるＰＥＧ単量体の占める密度である官能基密度は、ラテックス粒子の製造に用いるＰＥＧ単量体のモル量によって制御することができる。すなわち、単位面積当たりのラテックス粒子表面の官能基の量を、ラテックス粒子の製造に用いるＰＥＧ単量体の重量ではなく、モル量によって規定することにより、分子量の異なるＰＥＧ単量体であっても、下記一般式（１）を満足するものであれば、いかなるものでも簡便な操作で官能基密度を決定でき、本発明効果を得ることができる。
ＣＨ2＝ＣＲ1−ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ2・・・（１）
（Ｒ1は水素原子またはメチル基、Ｒ2は水素原子またはメチル基、ｎは１≦ｎ＜２０）
【００２８】
本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子は、水又は水系溶媒に懸濁した状態で得られる。粒子濃度としては特に限定されないが、通常は１〜２０重量％であることが好ましい。１重量％未満であると、試薬調製時に濃縮する必要があり、２０重量％を超えると、凝集してしまうことがある。
【００２９】
検出対象物質と特異的に結合する物質が物理的に吸着して担持された粒子凝集測定用ラテックス粒子も本発明の１つである。上記検出対象物質と特異的に結合する物質としては、免疫血清学的検査試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質であれば特に限定されないが、なかでも、抗原抗体反応に利用できるものが好適である。
【００３０】
上記抗原抗体反応に利用できるものとしては、例えば、タンパク質、核酸、核タンパク質、エストロゲン脂質等の抗原又は抗体が挙げられる。抗原としては、例えば、各種抗原、レセプター、酵素等が挙げられ、β２マイクログロブリン、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、インスリン、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、リウマチ因子（ＲＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、マイコプラズマ抗原、ＨＢｓ抗原等が挙げられる。また、抗体としては、例えば、各種の毒素や病原菌等に対する抗体が挙げられ、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗エストロゲン抗体、抗β２マイクログロブリン抗体、抗梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗インスリン抗体、抗Ｄダイマー抗体等が挙げられる。なお、抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ’）2のような断片であってもよい。更に抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
【００３１】
上記ラテックス粒子に検出対象物質と特異的に反応する物質を担持（感作）させる方法としては、物理的な吸着方法であれば、特に限定されず、従来公知の方法により担持させればよい。
【００３２】
また、担持後には、必要に応じてウシ血清アルブミン等でブロッキング処理を施し、適当な緩衝液に分散して感作ラテックス分散液を作製することができる。この感作ラテックス分散液に、測定に用いる緩衝液および標準物質等を添付し、粒子凝集測定試薬（キット）として用いることができる。
【００３３】
上記検出対象物質と特異的に反応する物質がラテックス粒子に担持される量としては、用いられる検出対象物質と特異的に反応する物質の種類により異なり、特に限定されない。
【００３４】
抗原や抗体などを担持する上記ラテックス粒子を含む測定試薬を使用するにあたっては、測定感度の向上や抗原抗体反応の促進のために種々の増感剤を含有してもよい。上記増感剤としては、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類、プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００３５】
本発明のラテックス粒子を用いることで、高度に非特異的反応が抑制されるが、更に、検体中に存在する他の物質により引き起こされる非特異的反応を抑制するため、又は、試薬の安定性を高めるために、アルブミン（ウシ血清アルブミン、卵性アルブミン）、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質やその分解物、アミノ酸又は界面活性剤等を含有してもよい。
【００３６】
また、検出対象物質は、適当な希釈液で希釈してもよい。上記希釈液としてはｐＨ５．０〜９．０の緩衝液であればどのようなものでも用いることができ、たとえば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。
【００３７】
本発明の抗原や抗体などを担持する上記ラテックス粒子を含む測定試薬を用いれば、検体中の検出対象物質とラテックス粒子に担持された検出対象物質に特異的に反応する物質との反応により生じるラテックス粒子の凝集の度合いを光学的に測定することにより、検体中の検出対象物質の反応量を測定することができる。上記光学的測定には、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、またはこれらの検出方法を複数備えた光学機器などに代表される一般の生化学自動分析機であればいずれも使用することができる。
【００３８】
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては従来公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
【００３９】
また、凝集度合いの変化量の測定法としては、例えば、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、ある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）等が挙げられる。なかでも、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による終点試験が好適である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。尚、得られた粒子凝集測定用ラテックス粒子の粒径は下記のように測定した。
粒子凝集測定用ラテックス粒子の粒径測定：
粒子凝集測定用ラテックス粒子を常法に従ってコロジオン膜状に載せ、透過型電子顕微鏡により粒子画像を撮影し、画像上の粒子径（１００個以上）を計測することにより平均粒子径及び標準偏差を求めた。【００４１】
［実施例１］
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量２Ｌ）に、超純水１０００ｇ、スチレンモノマー１３５ｇ、ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム１．２ｇ、過硫酸カリウム０．７ｇを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃、２１０ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を実施した。
重合終了後、上記溶液をろ紙でろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、精製されたラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０９μｍ（ＣＶ８．４％）、ＰＥＧ密度は０．１９２μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４２】
［実施例２］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）０．３９ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０８μｍ（ＣＶ１１．７％）、ＰＥＧ密度は０．１９１μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４３】
［実施例３］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−３５０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝８、日油製）０．６０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０６μｍ（ＣＶ９．８％）、ＰＥＧ密度は０．１８７μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４４】
［実施例４］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）０．１２ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０１μｍ（ＣＶ１０．５％）、ＰＥＧ密度は０．０５４μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４５】
［実施例５］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）０．９８ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０５μｍ（ＣＶ１０．１％）、ＰＥＧ密度は０．４６４μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４６】
［比較例１］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇを用いなかったこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０７μｍ（ＣＶ１０．３％）であった。尚、ＰＥＧ単量体を用いていないため、ＰＥＧ密度は０である。【００４７】
［比較例２］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）０．０３ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０４μｍ（ＣＶ９．５％）、ＰＥＧ密度は０．０１８μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４８】
［比較例３］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）１．５９ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０６μｍ（ＣＶ１１．３％）、ＰＥＧ密度は０．７４９μｍｏｌ／ｍ2であった。【００４９】
［比較例４］
ブレンマーＰＥ−９０（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝２、日油製）０．２４ｇをブレンマーＰＥ−２００（Ｒ1＝メチル基、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝４〜５、日油製）４．０５ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０６μｍ（ＣＶ９．３％）、ＰＥＧ密度は１．８９１μｍｏｌ／ｍ2であった。【００５０】
［適用例］
実施例及び比較例の粒子を用いてＤダイマー試薬評価を実施した。用いた試薬及び材料は以下の通りである。
＜試薬及び材料＞
・抗Ｄダイマー抗体
・抗体担持ラテックス調製用緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。
・ブロッキング用緩衝液：２％ＢＳＡ 、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。
・検体希釈用緩衝液：０．１５％ＢＳＡ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）を用いた。【００５１】
＜Ｄダイマー測定用試薬の調製＞
実施例１〜５、比較例１〜４で得られたラテックス粒子を遠心分離で精製した後、５％（ｗ／ｖ）となるよう抗体担持ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈ラテックス液を調製した。
一方、抗Ｄダイマー抗体を濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう抗体担持ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈抗体溶液を調製した。
上記希釈ラテックス液１容を攪拌しながら上記希釈抗体溶液１容を添加・混合し、更に攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液２容を追加添加し、攪拌を続けた。その後、これを回収し、緩衝液を用いて０．５％（ｗ／ｖ）に調整して、抗体感作ラテックス分散液とした。この抗体感作ラテックス分散液を用い、Ｄダイマー抗原標準液にて検量線を作成した。
装置：日立  ７１７０型自動分析装置
使用波長：５７０／８００ｎｍ、測定温度：３７℃
検出対象物質（０〜５８μｇ／ｍＬのＤダイマー標準液）：１２μＬ
第１試薬（ウシ血清アルブミン０．１５重量％を含むＴｒｉｓバッファー）：１００μＬ
第２試薬（抗体感作ラテックス粒子の重量０．５％分散液）：１００μＬ
測光ポイント：１８−３４【００５２】
［測定例１］
抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例１〜５および比較例１〜４の抗体感作ラテックス粒子（０．５％（ｗ／ｖ））を用いて、上記測定方法に従い測定し、検量線を作成した（図１）。実施例１〜５の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は比較的高感度の測定が可能であった。一方、比較例１〜４の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は、実施例２に比較して低い感度しか得られなかった。【００５３】
［測定例２］
抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例１〜５および比較例１〜４の診断薬粒子（０．５％（ｗ／ｖ））とＤダイマー乖離検体（２種）を用いて、上記測定方法に従い測定し、その値を測定例１によって求めた検量線からそれぞれ濃度換算を行った。ここで、Ｄダイマー乖離検体とは、従来のＤダイマー免疫比濁測定系で非特異的凝集反応が観察された検体をいう。その結果を図２に示す。実施例１〜５の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は、ＰＥＧ単量体を用いなかった比較例１に対して、乖離検体の非特異凝集反応を高度に抑制することが認められた。また、比較例２〜４の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は、乖離検体の非特異凝集反応を実施例１〜５と同等以下に抑制することが認められたが、測定例１で示されたように感度が大幅に低下しており、特に比較例３および４では、測定値がマイナスを示した。比較例において十分な感度が得られなかった理由として、ラテックス粒子表面に抗体が十分に吸着（感作）しなかったことが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子および粒子凝集測定用試薬を用いることにより、非特異凝集反応を引き起こす検体中の非検出対象タンパク質を吸着させず、目的とする特異凝集反応のみを惹起させるため、従来よりも高感度な診断薬を得ることが可能である。免疫血清学的検査試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質の検査試薬として有用である。
【要約】
非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能、かつ簡便に診断薬を作製できる粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定用測定試薬を提供する。
フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）を有する重合性単量体を成分として含み、式（１）を有する重合性単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．０５〜０．５μｍｏｌ／ｍ2である粒子凝集測定用ラテックス粒子を提供する。
ＣＨ2＝ＣＲ1−ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ2・・・（１）
（Ｒ1は水素原子またはメチル基、Ｒ2は水素原子またはメチル基、ｎは１≦ｎ＜２０）【図１】
0005430804.tif 000002
【図２】
0005430804.tif 000003