(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）金属ナノ粒子の金属コアＮを調製するステップと、
ｂ）式：Ｓ−Ｃ
（式中、
Ｓは式：Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2
（式中、ＬはＸ官能基をｇｅｍ−ビスホスホネート−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2官能基に結合する有機基を表し、Ｌは、脂肪族、脂環式、脂環式−脂肪族、芳香族、または芳香族−脂肪族基であって、前記脂肪族、脂環式、および芳香族基は、メチル、ヒドロキシ、メトキシ、アセトキシもしくはアミド基または塩素、ヨウ素もしくは臭素原子で置換されてもよい、脂肪族、脂環式、脂環式−脂肪族、芳香族、または芳香族−脂肪族基、および−Ｌ1−ＮＨＣＯ−Ｌ2基（式中、Ｌ1およびＬ2は同一であるかまたは異なり、メチル、ヒドロキシ、メトキシ、アセトキシもしくはアミド基または塩素、ヨウ素もしくは臭素原子で置換されてもよい、脂肪族、脂環式、芳香族、脂環式−脂肪族、または芳香族−脂肪族基を表す）から選択される二価の基であり、
Ｘは親水性リガンドＣとカップリングできる化学官能基を表し、Ｘは−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＣＳ、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＨＯ、アルキルピロカルボニル（−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−ａｌｋ）、アシルアジジル（−ＣＯ−Ｎ3）、イミノカーボネート（−Ｏ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2）、ビニルスルフリル（−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ2）、ピリジルジスルフリル（−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ）、ハロアセチル、マレイミジル、ジクロロトリアジニル、ハロゲン、
式：
【化１】
0005632287.tif 000040
から選択される）のｇｅｍ−ビスホスホネート結合基であり、
Ｃは、
（１）式（ＩＩ）：
【化２】
0005632287.tif 000041
（式中、
Ｒ1およびＲ2は同一であるかまたは異なり、２〜６個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素ベースの鎖を表し、６〜１０個の水酸基で置換されていてもよく、あるいはＲ1および／またはＲ2に１つ以上の酸素原子が介在する場合は４〜８個の水酸基で置換されていてもよい）の化合物、および
式（ＩＶ）：
【化３】
0005632287.tif 000042
（式中、
Ｚは結合、ＣＨ2、ＣＨ2ＣＯＮＨまたは（ＣＨ2）2ＮＨＣＯであり、
Ｚ’は結合、Ｏ、Ｓ、ＮＱ、ＣＨ2、ＣＯ、ＣＯＮＱ、ＮＱＣＯ、ＮＱ−ＣＯＮＱまたはＣＯＮＱＣＨ2ＣＯＮＱであり、
Ｚ’’は結合、ＣＯＮＱ、ＮＱＣＯまたはＣＯＮＱＣＨ2ＣＯＮＱであり、
ｐおよびｑは整数であり、その和は０〜３に等しく、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5はそれぞれ独立してＨ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＣＯＮＱ1Ｑ2またはＮＱ1ＣＯＱ2（同一であるかまたは異なるＱ1およびＱ2は、Ｑ1およびＱ2が合わせて４〜１０個のＯＨ基を含むように、Ｈ、モノヒドロキシル化またはポリヒドロキシル化されており、および／または１つ以上の酸素原子が介在してもよい、（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル基から選択され、Ｒ1〜Ｒ5基の少なくとも１つ、最大でも２つはＣＯＮＱ1Ｑ2またはＮＱ1ＣＯＱ2を表すと理解される）を表し、
あるいはＲ1、Ｒ3、Ｒ5はそれぞれ独立してＨ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩを表し、Ｒ2およびＲ4は、
【化４】
0005632287.tif 000043
（式中、
同一であるかまたは異なるＲ’1、Ｒ’3、およびＲ’5はＨ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩを表し、
Ｑ1およびＱ2は上と同一の意味を有し、
Ｚ’’’はＣＯＮＱ、ＣＯＮＱＣＨ2ＣＯＮＱ、ＣＯＮＱＣＨ2、ＮＱＣＯＮＱ、ＣＯＮＱ（ＣＨ2）2ＮＱＣＯ基から選択される基である）を表し、
ＱはＨまたは（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルであり、前記アルキル基は直鎖または分枝鎖であってもよくヒドロキシル化されていてもよい）の化合物
から選択されるアミノアルコールリガンド、または
（２）式（ＩＩＩ）：
【化５】
0005632287.tif 000044
（式中、
同一であるかまたは異なるＲ1およびＲ2はＨ、アルキル基または式：−ＣＨ2−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）k−ＣＨ2ＯＲ3（式中、ｋは２〜１００で変動し、Ｒ3はＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキルまたは−（ＣＯ）Ａｌｋから選択され、「Ａｌｋ」はＣ1〜Ｃ6アルキル基を指す）のポリエチレングリコール鎖を表し、
Ｒ1、Ｒ2基の少なくとも１つはポリエチレングリコール鎖を表すと理解される）のアミノポリエチレングリコールであるポリエチレングリコールリガンド
から選択される親水性生体内分布リガンドである）の標的要素を調製するステップと、
ｃ）標的要素Ｓ−ＣのＳ基をコアＮにグラフトするステップと
を含む、ナノ粒子の安定性／生体内分布に影響を及ぼす少なくとも１つの親水性リガンドとカップリングされた有機安定化層で覆われる金属コアＮを含む金属ナノ粒子を調製する方法。
【請求項２】
金属コアが、水酸化鉄、水和酸化鉄、フェライト、または混合酸化鉄から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親水性生体内分布リガンドＣの一部分がアミノアルコールリガンドであり、別の部分がポリエチレングリコールリガンドである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
コアへグラフトされるのが、一方で標的要素Ｓ−Ｃであり、他方では生体内分布リガンドを有さない安定化基Ｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
コアへの標的要素のグラフトの程度が１〜１０％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
コアへの標的要素のグラフトの程度が１、２、３、５または１０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
要素Ｓ−Ｃ−Ｔをグラフトするステップをさらに含み、Ｃがポリエチレングリコールリガンドであり、Ｔが可視スペクトルの１つの範囲の光子のエネルギーを吸収できる有色の基である発色団を表す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属コア、有機安定化層、および病的組織を標的とする少なくとも１つのリガンドを含む、医用画像のためのナノ粒子を調製する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
画像診断、特に磁気共鳴画像法ＭＲＩで使用される、必要に応じて生物学的標的リガンドにカップリングされた、安定化有機層で覆われる金属コアを含む金属ナノ粒子については既知である。
【０００３】
これらのナノ粒子の内、一般にＵＳＰＩＯと呼ばれる金属ナノ粒子は特に知られており、それは特におよそ１００〜１５０ｎｍ未満のサイズを有する、磁鉄鉱（Ｆｅ3Ｏ4）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、およびその他の遷移元素の磁性無機化合物をはじめとする非常に小さな酸化鉄粒子である。
【０００４】
生理的溶液中で安定している磁性粒子のコロイド溶液を得るために、磁性粒子表面をコンディショニングすることが必要である。これを行うために、粒子は、炭水化物（例えばデキストラン）などの高分子またはカルボン酸などの小型有機分子などで構成される安定化有機層で覆われる。
【０００５】
医用画像診断に関連のある情報を得るために、粒子が標的組織または細胞に結合しおよび／またはそれによって認識されるように、安定化有機層を適切な標的リガンドとカップリングすることは非常に有利である。この認識は、有利には、例えばマクロファージなどの免疫系細胞による粒子の貪食作用タイプ機序を通じて、生成物の生体内分布に影響を及ぼすリガンドを使用して提供されてもよい。これらのリガンドは、例えばアミノアルコール基、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの化合物などの親水性基である。
【０００６】
文献国際公開第２００４／０５８２７５号パンフレットには、安定化／結合層としてｇｅｍ−ビスホスホネートタイプの層、およびリガンドとして多くの可能なリガンドの内、生体内分布に影響を及ぼす親水性基（生体内分布リガンド）を使用した化合物の合成について記載されている。式：
Ｓ−Ｃ
（式中、
Ｓはコアにグラフトされたｇｅｍ−ビスホスホネート基であり、式（Ｉ）：
Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2      （Ｉ）
（式中、ＬはＸ官能基をｇｅｍ−ビスホスホネート−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2官能基に結合する有機基を表し、Ｘは親水性リガンドＣとカップリングできる化学官能基を表す）で表され、
Ｃはアミノアルコールタイプおよび／またはＰＥＧタイプの親水性リガンド（Ｘ官能基とカップリングされる）である）の標的要素で覆われる、金属コアＮの形態の化合物について特に記載されている。
【０００７】
これらの化合物を調製するために、先の工程（一般にＵＳＰＩＯのために使用される）は、概略的に、
金属ナノ粒子の金属コアＮを調製するステップと、
コアＮを式：
Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2      （Ｉ）
のｇｅｍ−ビスホスホネート安定化層でコーティングするステップと、
得られた粒子と１つまたは複数の親水性基とをカップリングするステップとを含む。
【０００８】
グラフトされるリガンドの量が完璧に制御される化合物を得て、再現性を持ってコア上へのグラフトの程度を最適化して制御し、細菌または発熱物質汚染リスクを最小化することで精製ステップを避けて薬学的制御を簡素化し、ひいては工業規模における効率的な製品の生産を得るために工程を改善することが探求される。
【０００９】
さらに、特に下で詳細に記載されているアミノアルコールまたはポリエチレングリコールタイプの生体内分布リガンドの場合、国際公開第２００４／０５８２７５号パンフレットで記載されている方法で使用されるリガンドの必要量に追加的な問題がある。実際、最後に有利には高い標的要素Ｓ−Ｃの被覆度、特にコアへの可能な結合部位の８０％を超える被覆度を得るために、この以前の方法では過剰な大量のリガンドＣを使用することが必要であり（１当量の化合物Ｎ−Ｓ［コア＋ｇｅｍ−ビスホスホネート被覆］に対して親水性リガンドＣのおよそ５当量を添加することが必要であった）、したがって高い工業的経費が必要であった。この問題を解決することは、式（ＩＶ）のものなどの複雑で高価なアミノアルコール、特に本出願で下述するアミノアルコールＡＡＧ１およびその誘導体について、特に有用であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本出願人は、有機ｇｅｍ−ビスホスホネート結合基と化学的にカップリングされた１つ以上の親水性リガンドによって構成される要素が調製されて、次にこれらの要素［結合基−リガンド］が金属ナノ粒子とカップリングされる調製法（逆行経路で示される）によって、これらの技術的問題を解決することに成功した。有機結合基は、安定化（または結合）層に属し、またはそれを形成する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的で本発明は、特にナノ粒子の安定性／生体内分布に影響を及ぼす少なくとも１つの親水性リガンドとカップリングされた有機安定化層で覆われる金属コアＮを含む、医用画像のための金属ナノ粒子を調製する方法に関し、
方法は、
ａ）金属ナノ粒子の金属コアＮを調製するステップと、
ｂ）式：Ｓ−Ｃ
（式中、
Ｓは式：Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2のｇｅｍ−ビスホスホネート結合基であり、
Ｃは親水性生体内分布リガンドであり、有利にはアミノアルコールまたはＰＥＧから選択される）の標的／安定化要素を調製するステップと、
ｃ）コアＮに少なくとも１つの標的要素をグラフトするステップと
を含む。
【００１２】
便宜上、本出願中では「標的要素」という表現を標的／安定化要素を表すために使用する。
【００１３】
「少なくとも１つの標的要素のコアＮへのグラフト」という表現は、同一構造を有する標的アセンブリーが、またはＳ基および／またはＣ基が同一式を有さないいくつかの標的アセンブリーが、グラフトされることを意味するものと理解される。
【００１４】
異なるＳ基を有することの利点は、特に造影剤の流体力学的サイズを（Ｌ基のサイズを変えることで）増大または低下できることであり、それによって当該診断的徴候に応じて製品の生体内分布を最適化するのを助けることが可能になる。
【００１５】
いくつかの実施態様において、標的要素はアミノアルコールである。
【００１６】
いくつかの実施態様において、標的要素はＰＥＧである。
【００１７】
いくつかの実施態様において、標的要素の一部分はアミノアルコールであり、標的要素の別の部分はＰＥＧである。リガンドはグラフトされる標的要素間で同一であってもまたは異なってもよい。
【００１８】
したがって、いくつかの実施態様において、グラフト後に得られる金属ナノ粒子は、例えば粒子の生体内分布および／または安定性に有利な影響を及ぼす親水性リガンドがある１０〜９０％の標的要素（アミノアルコール、ＰＥＧ分枝、いくつかの異なるアミノアルコール）を有し、残り（９０〜１０％）は異なるリガンドがある標的要素である。
【００１９】
いくつかの実施態様において、コアにグラフトされるのは、一方で標的要素Ｓ−Ｃ（親水性基を有する）であり、他方では生体内分布リガンドを有さない安定化基Ｓである。例えば５〜９５％のＳ−Ｃ基があり、残部（９５〜５％）はＳ基である。
【００２０】
詳細な説明の終わりにある表は、様々な可能性を例示する。
【００２１】
これらの量は、（典型的にナノ粒子表面に位置するプロトン化部位である可能な結合部位における）要素ＳまたはＳ−Ｃによるコアの被覆度に対応する。したがって百分率は、コア上の利用できる結合部位数あたりのＳ−ＣまたはＳ分子の数として表される。１００％の被覆度のためには、コア表面は実質的に完全にＳ−Ｃおよび／またはＳ要素で覆われる（例えば８０％のＳ−Ｃ基および２０％のＳ基）。したがってこの被覆度は、下述のグラフトの程度とは異なる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
金属ナノ粒子は、ほぼ１０〜１００ｎｍ程度、特に１０〜５０ｎｍの流体力学直径を有する。
【００２３】
標的アセンブリーの各Ｓ基は、少なくとも１つのコア結合部分、およびリガンドＣとのカップリングのため、より具体的にはリガンドの反応性官能基との共有結合のための少なくとも１つの化学官能基Ｘを含む。
【００２４】
ステップａ）およびｂ）は、ステップｃ）の前であれば任意の順序で実施してもよい。
【００２５】
コアＮにグラフトされるＳ基のアセンブリーは、結合（安定化）層を構成する。結晶サイズがほぼ７〜８ｎｍ程度のコアでは、標的要素Ｓ−Ｃおよび／またはＳのコアＮへのグラフトの程度（鉄１モルあたりの化合物Ｓ−Ｃおよび／またはＳのモル百分率；グラフトの程度はリンアッセイから判定される）は、典型的に０．５〜１０％、特に１〜５％、例えば１、２、３、５または１０％である。
【００２６】
いくつかの実施態様において、標的要素Ｓ−Ｃに加えて、例えばグルコン酸、シュウ酸、マンデル酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、ラクトビオン酸、α−ヒドロキシ馬尿酸、メチル−２−ヒドロキシ酪酸、グリコール酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはホスホエノールピルビン酸から選択される、例えばヒドロキシモノカルボン酸などのナノ粒子の安定性に影響を及ぼす基もまたグラフトされる。
【００２７】
したがって非常に有利には、リガンドを有する化合物によるナノ粒子のグラフトの程度を完全に制御することが可能であり、これは製品の経費、生理学的有効性の分析および特性解析および制御にとって非常に有用である。標的要素Ｓ−Ｃの製造は、特にグラフト前のそれらの純度についてさらに完全に制御され、これは工業生産にとって重要である。
【００２８】
コアＮについてここでより厳密に記載する。調製されるナノ粒子の金属コアは、典型的に完全にまたは部分的に、水酸化鉄；水和酸化鉄；鉄とコバルト、ニッケル、マンガン、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、銅、亜鉛または白金との混合酸化物などの混合酸化鉄；またはこれらの混合物からなる。「フェライト」という用語は、一般式［ｘＦｅ2Ｏ3・ｙＭＯz］の酸化鉄を意味し、Ｍは磁界の影響下で帯磁できるＦｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、ＭｇまたはＭｎなどの金属を意味し、磁化可能金属は任意に放射性であることができる。好ましくは本発明の組成物の磁性粒子は、特に磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ2Ｏ3）および磁鉄鉱（Ｆｅ3Ｏ4）であるフェライト、あるいはコバルト（Ｆｅ2ＣｏＯ4）またはマンガン（Ｆｅ2ＭｎＯ4）と混合されたフェライトを含む。ナノ粒子のコアは酸性にされて、Ｓ−Ｃ要素のカップリングが容易になる。（硝酸を使用するステップを用いて）酸性コアを調製する方法については、文献国際公開第２００４／０５８２７５号パンフレット（米国特許出願公開第２００４／２５３１８１号明細書、特に１９頁の段落３３１〜３３９）で詳細に記載されている。Ｓおよび／またはＳ−Ｃ基結合前の（典型的に１〜３の高度に酸性のｐＨにおける）酸性化ステップを用いたこの方法は、その多分散性が完全に制御されて安定するコロイド溶液中にある、特に有利な粒子が得られるようにすることを再認識すべきである。
【００２９】
Ｌ基についてここで記載する。好ましくはＬ結合基は二価の基であり、好ましくは次から選択される。
脂肪族、脂環式、脂環式−脂肪族、芳香族、または芳香族−脂肪族基。前記脂肪族、脂環式、および芳香族基は、メチル、ヒドロキシ、メトキシ、アセトキシまたはアミド基または塩素、ヨウ素または臭素原子で任意に置換されてもよい。
−Ｌ1−ＮＨＣＯ−Ｌ2基
（式中、
Ｌ1およびＬ2は同一であるかまたは異なり、メチル、ヒドロキシ、メトキシ、アセトキシまたはアミド基または塩素、ヨウ素または臭素原子で任意に置換されてもよい、脂肪族、脂環式、芳香族、脂環式−脂肪族、または芳香族−脂肪族基を表す）。
【００３０】
脂肪族基は、ここで好ましくは１〜１６個の炭素原子、なおもより好ましくは１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝炭化水素ベースの鎖を意味する。好ましくは、脂肪族基はアルキル基を意味する。その例は特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、およびヘキシル基である。
【００３１】
「脂環式」という用語は、好ましくはシクロアルキル基である、好ましくは３〜８個の炭素原子を含む環式炭化水素ベースの鎖を意味する。一例としては、特にシクロプロピルおよびシクロヘキシルが挙げられる。
【００３２】
「芳香族」という用語は、好ましくは５〜２０個、なおもより好ましくは６〜１８個の炭素原子を含む、単環式または多環式炭化水素ベース基の芳香族を表す。その例は特にフェニルおよび１−ナフチルまたは２−ナフチル基である。特定の変形例において、本発明の意味の範囲内である「芳香族」基には、イオウ、酸素または窒素などの１つ以上のヘテロ原子が組み込まれてもよい。この特定の場合、「芳香族」基は単環式または多環式複素環式芳香族基を意味する。
【００３３】
「脂肪族−脂環式」および「脂肪族−芳香族」基は、それぞれ上で定義される脂環式または芳香族基によって置換された、前述の定義に対応する脂肪族鎖を表す。脂肪族−芳香族基の一例としては、特にベンジルが挙げられる。
【００３４】
好ましい一変形例において、Ｌは任意に置換されたフェニレン基を表し、Ｘおよびｇｅｍ−ビスホスホネート基はオルト、メタまたはパラ位にあってもよい。
【００３５】
特に好ましい一実施態様において、Ｌは置換または非置換脂肪族基、より好ましくは−（ＣＨ2）p−基を表し、ｐは１〜５の整数である。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、ＬはＬ1−ＣＯＮＨ−Ｌ2基、より好ましくは−（ＣＨ2）n−ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）m−基を表し、ｎおよびｍは０〜５の整数を表す。
【００３７】
式（Ｉ）のｇｅｍ−ビスホスホネート化合物のＸ末端は、バイオベクター上に存在する官能基と反応して共有結合を形成できるように選択される。これらのカップリングについてより詳しくは、特にＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９５，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい。
【００３８】
好ましいＸ基としては、特に、
−ＣＯＯＨ、
−ＮＨ2、−ＮＣＳ、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＨＯ、アルキルピロカルボニル（−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ａｌｋ）、アシルアジジル（−ＣＯ−Ｎ3）、イミノカーボネート（−Ｏ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2）、ビニルスルフリル（−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ2）、ピリジルジスルフリル（−Ｓ−Ｓ−Ｐｙ）、ハロアセチル、マレイミジル、ジクロロトリアジニル、ハロゲン、
式：
【化１】
0005632287.tif 000002
の基が挙げられ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ2基が特に好ましい。
【００３９】
「Ａｌｋ」という用語は、本明細書の範囲内でＣ1〜Ｃ6アルキル基を意味し、「Ｐｙ」という用語についてはピリジル基を意味する。
【００４０】
マレイミジル基は、式：
【化２】
0005632287.tif 000003
の環式基を意味する。
【００４１】
ジクロロトリアジニル基は、式：
【化３】
0005632287.tif 000004
の基を意味する。
【００４２】
ハロゲン基としては、特に塩素、臭素、フッ素、およびヨウ素が挙げられ、塩素および臭素が特に好ましい。
【００４３】
「ハロアセチル」という用語は、本明細書の範囲内で、その水素原子の１つがハロゲン原子で置換されたアセチル基ＣＨ3−ＣＯ−を意味するものと理解され、前記ハロゲン原子については上で定義される。
【００４４】
好ましくはＸは−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ2基を表し、Ｌは置換または非置換脂肪族基、なおもより好ましくは−（ＣＨ2）p−基を表し、ｐは１〜５の整数である。
【００４５】
式（Ｉａ）：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）2−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2      （Ｉａ）
の化合物が特に最も好ましい。
【００４６】
別の好ましい実施態様において、ＬはＬ1−ＣＯＮＨ−Ｌ2基、より好ましくは−（ＣＨ2）n−ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）m−基を表し、ｎおよびｍは０〜５の整数を表し、Ｘは−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ2を表す。
【００４７】
当然ながら、間接的様式での、すなわちホモ二官能性またはヘテロ二官能性試薬を通じた、Ｘ官能基とバイオベクターのカップリングもまた、本発明の文脈内に入る。ホモ二官能性試薬の例として、例えばＸ＝−ＮＨ2官能基とバイオベクターの−ＮＨ2官能基とのカップリングを実行するのに、グルタルアルデヒドが適するかもしれない。
【００４８】
本発明の好ましい一変形例において、Ｘ官能基は、バイオベクターと、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−Ｃ−Ｓ−、−Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ−、−ＣＨ2−ＮＨ−、−Ｎ−ＣＨ2−、−Ｎ−ＣＳ−Ｎ−、−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ＝ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−のタイプの、または式：
【化４】
0005632287.tif 000005
に対応するタイプの、共有結合Ｌ3を形成する。
【００４９】
ｇｅｍ−ビスホスホネート化合物のＸ官能基の全てまたはいくらか、典型的にほぼ５０〜１００％程度、特に５０、６０、７０、８０、８０または９５％は、生体内分布リガンドとカップリングされる。
【００５０】
好ましくは、親水性生体内分布リガンドはアミノアルコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧとしてもまた知られている）リガンドである。
【００５１】
本出願に従った「アミノアルコール」という用語は、２〜１０個の炭素原子を含む少なくとも１つの脂肪族炭化水素ベースの鎖を有するアミン官能基を含むリガンドを意味するものと理解され、前記炭化水素ベースの鎖はいくつかの水酸基、特に４〜１０個の水酸基によって置換される。
【００５２】
好ましい一実施態様において、アミノアルコールリガンドは、一般式（ＩＩ）：
【化５】
0005632287.tif 000006
（式中、
Ｒ1およびＲ2は同一であるかまたは異なり、好ましくは、６〜１０個の水酸基で置換された、あるいはＲ1および／またはＲ2に１つ以上の酸素原子が介在する場合は４〜８個の水酸基で置換された、２〜６個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素ベースの鎖を表す）の化合物である。
【００５３】
式（ＩＩ）のアミノアルコールリガンドの例としては、特にＲ1およびＲ2がそれぞれ独立して−（ＣＨ2）−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨまたは−（ＣＨ2）−ＣＨＯＨ−ＣＨ2ＯＨ基を表すリガンド、特にＲ1が−（ＣＨ2）−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨまたは−（ＣＨ2）−ＣＨＯＨ−ＣＨ2ＯＨ基を表し、Ｒ2が−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨ基を表すものが挙げられる。
【００５４】
別の好ましい実施態様において、アミノアルコールリガンドは、式（ＩＶ）：
【化６】
0005632287.tif 000007
（式中、
Ｚは結合、ＣＨ2、ＣＨ2ＣＯＮＨまたは（ＣＨ2）2ＮＨＣＯであり、
Ｚ’は結合、Ｏ、Ｓ、ＮＱ、ＣＨ2、ＣＯ、ＣＯＮＱ、ＮＱＣＯ、ＮＱ−ＣＯＮＱまたはＣＯＮＱＣＨ2ＣＯＮＱであり、
Ｚ’’は結合、ＣＯＮＱ、ＮＱＣＯまたはＣＯＮＱＣＨ2ＣＯＮＱであり、
ｐおよびｑは整数であり、その和は０〜３に等しく（有利な一変形例においてｐ＝ｑ＝０である）、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5はそれぞれ独立してＨ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＣＯＮＱ1Ｑ2またはＮＱ1ＣＯＱ2（同一であるかまたは異なるＱ1およびＱ2は、Ｑ1およびＱ2が合わせて４〜１０個のＯＨ基を含むように、Ｈ、モノヒドロキシル化またはポリヒドロキシル化されており、および／または１つ以上の酸素原子が介在してもよい、（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル基から選択され、Ｒ1〜Ｒ5基の少なくとも１つ、最大でも２つはＣＯＮＱ1Ｑ2またはＮＱ1ＣＯＱ2を表すと理解される）を表し、
あるいはＲ1、Ｒ3、Ｒ5はそれぞれ独立してＨ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩを表し、Ｒ2およびＲ4は、
【化７】
0005632287.tif 000008
（式中、
同一であるかまたは異なるＲ’1、Ｒ’3、およびＲ’5はＨ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩを表し、
Ｑ1およびＱ2は上と同一の意味を有し、
Ｚ’’’はＣＯＮＱ、ＣＯＮＱＣＨ2ＣＯＮＱ、ＣＯＮＱＣＨ2、ＮＱＣＯＮＱ、ＣＯＮＱ（ＣＨ2）2ＮＱＣＯ基から選択される基である）を表し、
ＱはＨまたは（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルであり、前記アルキル基は直鎖または分枝鎖であってもよくヒドロキシル化されていてもよい）の化合物である。
【００５５】
好ましくは、ＺはＣＨ2である。
【００５６】
好ましくは、ｐ＝ｑ＝０である。
【００５７】
好ましくは、Ｚ’’はＣＯＮＨである。
【００５８】
好ましくは、Ｒ2およびＲ4はＣＯＮＱ1Ｑ2を表す。
【００５９】
好ましくは、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ5はＢｒを表す。
【００６０】
好ましくはＱ1およびＱ2は、それぞれ独立して−（ＣＨ2）−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨまたは−（ＣＨ2）−ＣＨＯＨ−ＣＨ2ＯＨ基、特に−（ＣＨ2）−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨ基を表す。
【００６１】
特に好ましい一実施態様において、式（ＩＶ）のアミノアルコールリガンドは、
【化８】
0005632287.tif 000009
の化合物である。
【００６２】
好ましくは本発明におけるアミノアルコールリガンドは、ヒドロキシル官能基が遊離型のままであり、ひいてはそれらの親水性性質を保つように、それらの−ＮＨ−または−ＮＨ2アミン官能基を通じて、式：Ｘ−Ｌ−ＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2の結合基ＳのＸ官能基とカップリングされる。
【００６３】
「ポリエチレングリコール」という表現は、本出願の意味の範囲内で、一般には−ＣＨ2−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）k−ＣＨ2ＯＲ3鎖を含む化合物を意味し、ｋは２〜１００の間（例えば２、４、６、１０または５０）で変動し、Ｒ3はＨ、アルキルまたは−（ＣＯ）Ａｌｋから選択され、「アルキル」または「Ａｌｋ」という用語は、鎖中に約１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝炭化水素ベースの脂肪族基を意味する。
【００６４】
「ポリエチレングリコール」という表現は、ここでの用法では、特に式（ＩＩＩ）：
【化９】
0005632287.tif 000010
（式中、
同一であるかまたは異なるＲ1およびＲ2はＨ、アルキル基または式：
−ＣＨ2−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）k−ＣＨ2ＯＲ3（式中、ｋは２〜１００の間（例えば２、４、６、１０または５０）で変動し、Ｒ3はＨ、アルキルまたは−（ＣＯ）Ａｌｋから選択され、「アルキル」または「Ａｌｋ」という用語は、鎖中に１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝炭化水素ベースの脂肪族基を意味する）のポリエチレングリコール鎖を表し、
Ｒ1、Ｒ2基の少なくとも１つはポリエチレングリコール鎖を表すと理解される）のアミノポリエチレングリコール化合物を包含する。
【００６５】
アミノポリエチレングリコールの例は、特に化合物Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール１１００、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール２０００、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール７５０、例えば化合物ＰＥＧ３４０、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００である。
【００６６】
本出願のＳ−Ｃ化合物のＮコアへのグラフトは、Ｓ化合物のＣＨ（ＰＯ3Ｈ2）2部分によって実行されることが規定される。
【００６７】
本出願人は、特にアミノアルコールおよび／またはＰＥＧリガンドについて、合成が容易になって収率が改善されるだけでなく、さらに得られる最終生成物が薬事規制および診断用使用に非常に満足に合致することに気付いた。これらの基によるほとんど全てのコアの被覆は、特にステルスの改善（生成物の肝臓による取り込みが有利により少ない）およびマクロファージ取り込みの改善（特に粥状斑、結節腫、およびその他の炎症領域のモニタリングのために、マクロファージの標的化が有利に改善される）によって、これらの親水性リガンドにとって特に有利な安定性と生体内分布を生成物に与える。さらには製造バッチ再現性の要件、医薬品の品質および安全性の要件を満たすために、例えばアミノアルコールリガンドおよびＰＥＧリガンドの混合被覆を有する生成物において、リガンドの量を制御する利点が理解される。
【００６８】
意外にも本出願人の新規な逆行経路工程は、特にこのようなアミノアルコールにおいて生体内分布リガンドの量を１／３〜１／１０にすることを可能にする。次の表は、アミノアルコールとして実施例４からの化合物を使用した実施例１４からの化合物の例を取り上げて、この結果を例示する。
【００６９】
【表１】
0005632287.tif 000011
【００７０】
したがって本出願人は、リガンドのグラフトの程度の制御と、使用するリガンド量の低減との二重の問題を解決するのに成功した。
【００７１】
特定の一実施態様において、本発明による方法はまた、Ｓ−Ｃ−Ｔ要素のグラフトも含み、Ｃはポリエチレングリコールリガンドであり、Ｔは発色団を表す。
【００７２】
「発色団」という用語は、有色の基、すなわち可視スペクトルの１つの範囲の光子のエネルギーを吸収できる一方、その他の波長は透過または散乱するものを意味すると理解される。
【００７３】
本発明に従って使用できる発色団の例としては、特に４−（アミノ）フルオレセイン塩酸塩が挙げられる。
【００７４】
本発明はまた、診断用または治療的な組成物を調製するための本出願人の方法によって得られるナノ粒子の使用にも関する。文献国際公開第２００４／０５８２７５号パンフレットで詳細に記載されているように、ナノ粒子はＭＲＩ造影またはＸ線走査装置のために、特にナノ粒子タイプ組成物の造影剤として使用される。
【００７５】
いくつかの実施態様において、粒子は、固体脂質ナノ粒子またはリポソームタイプのカプセル封入システムなどの有効成分放出のためのシステム内で搬送され、それは診断用薬として使用されるナノ粒子に加えて、治療的有効成分もまた含有してもよい。
【００７６】
本発明の別の主題は、本発明の目的に従って使用できる、上で定義されるＳ−Ｃ標的要素である。
【００７７】
本発明は以下の詳細な実施例を使用して例示される。
【実施例】
【００７８】
以下において、略語Ｍ、Ｍ／Ｌ、理論的Ｍ、ＮおよびＭ／ｚ、ＥＳ+、ＥＳ、ｋＤ、およびＴＬＣは、文献国際公開第２００４／０５８２７５号パンフレット（米国特許出願公開第２００４／２５３１８１号明細書）と同一の意味を有する。
ＭまたはＭ／Ｌ：モル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）。
理論的Ｍ：理論的分子量。
Ｎ：規定度。
Ｍ／ｚ：質量分析法によって判定される質量対電荷比。
ＥＳ+：陽イオンモードエレクトロスプレー。
ＥＳ-：負イオンモードエレクトロスプレー。
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。
ｋＤ：分子量単位（キロダルトン）。
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー。
Ｚ  ａｖｅ：ＰＣＳによって測定される流体力学直径。
Ｐｏｌｙ  σ：ＰＣＳによって測定される多分散性。
【００７９】
続く化学命名法は、ＩＵＰＡＣ規則に従って、ＡＣＤ／ＮＡＭＥソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）から導かれる。
【００８０】
全鉄アッセイ：
鉄は、濃ＨＣｌでの無機化および希釈後に、原子吸収分光法（ＶＡＲＩＡＮ  ＡＡ１０分光光度計）によって、第二鉄イオンの標準範囲（０、５、１０、１５、および２０ｐｐｍ）を基準にしてアッセイされる。
【００８１】
粒度：
グラフト粒子の流体力学直径（Ｚ  ａｖｅ）＝ＰＣＳサイズ：注射用水で約１ミリモルに希釈され０．２２μｍを通して濾過されたサンプル上で、ＰＣＳによって判定される（Ｍａｌｖｅｒｎ  ４７００装置、９０°で４８８ｎｍのレーザー）。
ＰＣＳ＝光子相関分光法。参考文献：Ｒ．Ｐｅｃｏｒａ  ｉｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｎａｎｏ．Ｒｅｓ．（２０００），２，ｐ．１２３−１３１。
磁性粒子の直径（ｐ）（グラフト前）：様々な温度における磁化曲線（ＳＱＵＩＤ磁力計上での測定）の逆重畳積分によって判定される（参考文献：Ｒ．Ｗ．Ｃｈａｎｔｒｅｌｌ  ｉｎ  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ（１９７８），１４（５），ｐ．９７５−９７７）。
【００８２】
構造分析：
エレクトロスプレー源を用いた質量分光分析（ＭＩＣＲＯＭＡＳＳ  ＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ装置）による。
【００８３】
実施例１：
３リットルの水および１４３ｍｌ（０．３０２ｍｏｌ）の２７％ＦｅＣｌ3からなる混合物中に、１５０ｍｌのＨ2Ｏ中の３６ｇ（０．１８１ｍｏｌ）のＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏおよび２０ｍｌの３７％ＨＣｌの溶液を導入する。２５０ｍｌの２５％ＮＨ4ＯＨを激しく撹拌しながら迅速に導入する。混合物を３０分間撹拌する。流体を磁気分離によって除去する。強磁性流体を２リットルの水で引き続いて３回洗浄する。含窒素強磁性流体を２００ｍｌのＨＮＯ3［２Ｍ］と共に１５分間撹拌し、上清を磁性分離によって除去する。含窒素強磁性流体を６００ｍｌの水および２００ｍｌのＦｅ（ＮＯ3）3［１Ｍ］と共に３０分間還流させる。上清を磁性分離によって除去する。含窒素強磁性流体を２００ｍｌのＨＮＯ3［２Ｍ］と共に１５分間撹拌し、上清を磁性分離によって除去する。含窒素強磁性流体を３リットルのアセトンで３回洗浄し、次に４００ｍｌの水に取り込む。２５０ｍｌの最終容積が得られるまで、溶液を真空下で乾燥させる。
【００８４】
【表２】
0005632287.tif 000012
【００８５】
実施例２：
４リットルの水および４２９ｍｌ（０．９０６ｍｏｌ）の２７％ＦｅＣｌ3溶液中に、４５０ｍｌのＨ2Ｏ中の１０８ｇ（０．５４３ｍｏｌ）のＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏを導入する。７５０ｍｌの２５％ＮＨ4ＯＨを撹拌しながら（１２００ｒｐｍ）迅速に導入する。混合物を３０分間撹拌する。流体を磁気分離によって除去する。強磁性流体を３リットルの水で引き続いて２回洗浄する。含窒素強磁性流体を３リットルのＨＮＯ3［２Ｍ］と共に１／４時間撹拌し、上清を磁性分離によって除去する。含窒素強磁性流体を１３００ｍｌの水および７００ｍｌのＦｅ（ＮＯ3）3［１Ｍ］と共に３０分間（６００ｒｐｍ）還流させる。上清を磁性分離によって除去する。含窒素強磁性流体を３リットルのＨＮＯ3［２Ｍ］と共に１５分間撹拌し、上清を磁性分離によって除去する。
【００８６】
含窒素強磁性流体を３リットルのアセトンで３回洗浄し、次に６００ｍｌの水に取り込む。２５０ｍｌの最終容積が得られるまで、溶液を真空下で乾燥させる。
【００８７】
【表３】
0005632287.tif 000013
【００８８】
上の溶液の２００ｍｌを２．４リットルのＨＮＯ3中で４時間撹拌する。上清を磁性分離によって除去する。含窒素強磁性流体を３リットルのアセトンで２回洗浄し、次に４００ｍｌの水中に取り込む。２５０ｍｌの最終容積が得られるまで、溶液を真空下で乾燥させる。
【００８９】
【表４】
0005632287.tif 000014
【００９０】
実施例３：
【化１０】
0005632287.tif 000015
ステップａ：ジエチル−１−［ジエトキシホスホリル］ビニルホスホネート
１３ｇ（０．４３３ｍｏｌ）のパラホルムアルデヒドおよび１０ｍｌ（０．０９７ｍｏｌ）のジエチルアミンを高温条件下で２５０ｍｌのメタノールに溶解する。次に２４ｇ（８．６７×１０-2ｍｏｌ）のジエチル［ジエトキシホスホリル］メチルホスホネートを添加する。混合物を２４時間還流する。反応媒体を真空下で濃縮する。濃縮物を２５０ｍｌのトルエンで２回取り込んで、次に真空下で濃縮する。得られた油を１２５ｍｌのトルエンに溶解する。０．１４ｇのパラ−トルエンスルホン酸を添加する。混合物をディーン・スターク・トラップを用いて２４時間還流させ、次に真空下で濃縮して乾燥させる。生成物を５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、次に２５０ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、真空下で濃縮する。粗生成物を６２５ｇのＭｅｒｃｋ  Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）シリカゲル（４０〜６３μｍ）上で精製する。溶出：ＣＨ2Ｃｌ2／アセトン−５０／５０（ＴＬＣ−ＳｉＯ2：Ｒｆ＝０．４５）。収率７１％で１８．４ｇが単離される。ＭＳ：Ｍ／ｚ＝３０１．４（ＥＳ+）。
【００９１】
ステップｂ：ジエチル２−［２，２−ビス（ジエトキシホスホリル）エチル］マロネート
１．６ｇ（０．０１ｍｏｌ）のジエチルマロネート、０．０７ｇ（０．００１ｍｏｌ）のナトリウムエトキシド、および３ｇ（０．０１ｍｏｌ）のジエチル［ジエトキシホスホリル］ビニルホスホネートを１５ｍｌのエタノール中で１５分間撹拌する。５ｍｌの飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液をエタノール溶液に添加する。混合物を真空下で濃縮する。残留物を３０ｍｌの酢酸エチルで抽出し、５ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次に蒸発させて乾燥する。得られた油を２００ｇのＭｅｒｃｋ  Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）シリカ上で精製し、収率８２％で３．８ｇが単離される。ＭＳ：Ｍ／ｚ＝４６０．９（ＥＳ+）。
【００９２】
ステップｃ：４，４−ジホスホノブタン酸
７ｇ（１５．７×１０-2ｍｏｌ）のジエチル２−［２，２−ビス（ジエチルホスホリル）エチル］マロネートを３５０ｍｌのＨＣｌ［５Ｎ］中で８時間還流させる。得られた褐色油を水で溶出しながら６０ｇのシリル化シリカゲル６０（０．０６３〜０．２００ｍｍ）上で精製する。収率９２％で３．６ｇが単離される。ＭＳ：Ｍ／ｚ＝２４９（ＥＳ+）。
【００９３】
実施例４：
【化１１】
0005632287.tif 000016
化合物（アミノアルコール親水性リガンド）は、欧州特許出願公開第０９２２７００Ａ１号明細書に記載されている手順に従って調製できる。
【００９４】
実施例５：
実施例３のステップｃ（２．４２×１０-3Ｍ）で調製された６００ｍｇの化合物、および実施例４（４．８５×１０-3Ｍ）で調製された３．２ｇの化合物を２０ｍｌのＨ2Ｏに溶解する。０．１Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨを６．２に調節する。６００ｍｇのＥＤＣｌ（３．１３×１０-3Ｍ）および６５ｍｇのＨＯＢＴ（４．８×１０-4Ｍ）を添加して、混合物を室温で２４時間撹拌する。反応媒体を４００ｍｌのＩＰＡ上に注いで、２４時間撹拌する。沈殿物を濾過し、次にエチルエーテルで洗浄して真空下で乾燥させる。
【００９５】
ｐＨを９に調節することで粗生成物を最小量の水に溶解し、次に１５０ｍｌのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｎａ樹脂（Ｈ+形態）上に一晩のせる。生成物を水で溶出する。正しい画分を真空下で濃縮する。ＭＳ、ＥＳ-：１３８５．６。
【００９６】
実施例６：
ステップａ
【化１２】
0005632287.tif 000017
電極および磁気撹拌機を装着した５００ｍｌ三つ口フラスコ内で、ｇｅｍ−ビスホスホネート（実施例３のステップｃ、３０ｇ）をＨ2Ｏ（２５０ｍｌ）に溶解する。ＮａＯＨによってｐＨを５．７にして、アミン（１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン、Ｆｌｕｋａ（登録商標）、２１．８ｇ）を一度に添加する。ＨＯＢＴ（１．７２ｇ）、次にＥＤＣｌ（２１．１６ｇ）を添加する。反応媒体を室温で２４時間撹拌する。およそ１５０ｍｌの最終容積が得られるまで、媒体を蒸発させる。ＮａＯＨによってｐＨを８にする。過剰なアミノＰＥＧを除去するために、溶液を７０ｍｌ（理論量の３０倍）のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ２５２  Ｎａ樹脂（Ｈ+−１．８ｍｅｑ／ｍｌ）に通過させる。Ｈ2Ｏによる溶出（Ｖrecovered＝３００ｍｌ）。
【００９７】
およそ１５０ｍｌの最終容積が得られるまで、媒体を蒸発させる。
【００９８】
過剰なＣｌ-イオンを除去するために、溶液を１４０ｍｌ（理論量の２倍）のＩＲＡ  ６７樹脂（ＯＨ―−１．６ｍｅｑ／ｍｌ）に通過させる。Ｈ2Ｏによる溶出（Ｖrecovered＝２６０ｍｌ）。１００ｍｌの最終容積が得られるまで、溶液を蒸発させる。溶液を９００ｇのシリル化シリカに通過させる。２ｌのＨ2Ｏ、次に２ｌのＨ2Ｏ／ＣＨ3ＯＨ混合物（５０／５０）によって溶出する。ｍ＝２８．４６ｇ、収率＝７５％、ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+、ｍ／ｚ＝４４９．１２。
【００９９】
ステップｂ
【化１３】
0005632287.tif 000018
ＥｔＯＨ（３５０ｍｌ）にあらかじめ溶解したステップａ（２８．２６ｇ）で得られたアジ化物を１ｌオートクレーブ反応装置内に導入する。媒体をＨＣｌ溶液で酸性化して、スパチュラ４杯分のＰｄ／Ｃを溶液に導入する。４バールの水素下で、反応媒体を室温で４時間撹拌する。反応媒体をｃｌａｒｃｅｌ上で濾過し、麦わら色の油（３１．２１ｇ）が得られるまで、溶液を蒸発させて乾燥させる。過剰なＣｌ-イオンを除去するために、溶液を２００ｍｌのＩＲＡ  ６７樹脂（ＯＨ-−１．６ｍｅｑ／ｍｌ）に通過させて生成物を精製する。Ｈ2Ｏによる溶出。ｍ＝１２．２５ｇ、収率＝４６％（油）、ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+、ｍ／ｚ＝４２３．１２。
【０１００】
ステップｃ
【化１４】
0005632287.tif 000019
磁気撹拌機を装着した２５０ｍｌ三つ口フラスコ内で、先に調製した中間体（１２ｇ）をＤＭＳＯ（２００ｍｌ）に溶解する。トリエチルアミン（６６９６μｌ）、次に四角酸ジエチル（４２０５μｌ）を添加する。媒体を室温で７２時間撹拌する。ベーンポンプを使用して、黄色油が得られるまで溶液を濃縮して乾燥し、それをシリル化シリカ上で精製する（２０００ｍｌのＨ2Ｏ、次に２０００ｍｌのＨ2Ｏ／ＣＨ3ＯＨ（８０／２０）、次に２０００ｍｌのＨ2Ｏ／ＣＨ3ＯＨ混合物（５０／５０）、そして１０００ｍｌのＣＨ3ＯＨによる溶出。ｍ＝７．２ｇ、収率＝４６．４％（油）、ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+、ｍ／ｚ＝５４７．２５。
【０１０１】
実施例７：
【化１５】
0005632287.tif 000020
電極および磁気撹拌機を装着した丸薬製造器内で、先に調製した中間体（実施例６のステップｃ）（０．１３７ｇ；２．５×１０-4ｍｏｌ）をＨ2Ｏ（２ｍｌ）に溶解する。飽和Ｎａ2ＣＯ3溶液によって溶液のｐＨを７．５に調節する。ＤＭＳＯ（１ｍｌ）にあらかじめ溶解された染料（０．０５ｇ；１．２６×１０-4ｍｏｌ）を媒体に添加する。溶液のｐＨは６．５に等しい。溶液のｐＨを飽和Ｎａ2ＣＯ3溶液で８にする。溶液を室温で４８時間撹拌する。１Ｎ塩酸溶液によって溶液のｐＨを７にする。ベーンポンプを使用して溶液を蒸発して乾燥させる。得られた油をＨ2Ｏ（１０ｍｌ）に溶解し、９０ｇのＲＰ１８シリカ（２５〜４０μｍ）カートリッジ上でクロマトグラフィーによって精製する。９５％の収率で９５ｍｇの生成物が単離される。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ-、ｍ／ｚ＝８６０．１９。
【０１０２】
実施例８：
【化１６】
0005632287.tif 000021
電極および磁気撹拌機を装着した丸薬製造器内で、実施例６のステップｃで調製された化合物（０．１３７ｇ；２．５×１０-4ｍｏｌ）をＨ2Ｏ（２ｍｌ）に溶解する。飽和Ｎａ2ＣＯ3溶液によって溶液のｐＨを７．５に調節する。ＤＭＳＯ（１ｍｌ）にあらかじめ溶解された染料（０．１０２ｇ；１．２６×１０-4ｍｏｌ）を媒体に添加する。溶液のｐＨは５．５に等しい。溶液のｐＨを飽和Ｎａ2ＣＯ3溶液で８にする。溶液を室温で４８時間撹拌する。１Ｎ塩酸溶液によって溶液のｐＨを７にする。ベーンポンプを使用して溶液を蒸発して乾燥させる。得られた油をＨ2Ｏ（１０ｍｌ）に溶解し、９０ｇのＲＰ１８シリカ（２５〜４０μｍ）カートリッジ上でクロマトグラフィーによって精製する。６６％の収率で１００ｍｇの生成物が単離される。
【０１０３】
実施例９：
ステップａ
【化１７】
0005632287.tif 000022
分子ふるい上であらかじめ乾燥させた１８０ｍｌのトルエン中で、３０ｇのメチレンビス（ホスホン酸ジクロリド）を撹拌する。温度０℃に保つ。シリンジポンプを使用して、６０ｍｌのベンジルアルコールおよび３７．５ｍｌのピリジンの溶液を滴下して４時間かけて添加し、温度は０℃を超えないことが必要である。媒体を室温で４時間撹拌する。不溶性部分を濾過により除去し、トルエンで数回洗浄する。有機相を１５０ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム、２５０ｍｌの水で３回洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させて、次に濃縮する。混合物をシリカ上で精製する（溶出剤：ヘプタン／酢酸エチル：３０／７０）。ＴＬＣ［ＳｉＯ2−Ｈｅｐｔ／ＡｃＯＥｔ：３／７−Ｒf＝０．３］−収率：６０％。ＬＣ／ＭＳ  ＥＳ+  ５３７．２１。
【０１０４】
ステップｂ
【化１８】
0005632287.tif 000023
ステップａで調製された化合物および１５Ｃ５を２４０ｍｌの新鮮に蒸留されたＴＨＦ中で撹拌する。１．１５ｇの６０％ＮａＨを媒体に少しずつ添加する。撹拌を１／２時間継続する。氷浴内で２５ｍｌのＴＨＦに入れたブロモ酢酸ｔ−ブチルを滴下して添加する。混合物を室温で３時間撹拌する。反応媒体を真空下で濃縮してＮＨ4Ｃｌ飽和溶液に取り込み、２×２００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって抽出する。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させて精製する（Ｓｉ６０カートリッジ：２０１ｎｍ；流速＝２０ｍｌ／分；勾配：ＣＨ2Ｃｌ2／アセトン）−収率：６５％。ＬＣ／ＭＳ  ＥＳ+＝６５０．６５、ＢＰ−ｔＢｕ：（Ｍ＋１）＝５９５．２６。
【０１０５】
ステップｃ
【化１９】
0005632287.tif 000024
ステップｂからの３．４ｇの化合物を３５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解する。溶液を氷浴内に保ち、３．４ｍｌのＴＦＡを滴下して添加する。混合物を０℃で４時間、次に室温で２０時間撹拌する。反応媒体を２０℃、真空下で乾燥させる。生成物を２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に取り込んで水で洗浄し、次に精製する。（ＲＰ１８カートリッジ；２０１ｎｍにおける検出；流速＝２０ｍｌ／分；勾配：水−ＴＦＡｐＨ＝２．７７／ＣＨ3ＣＮ）−収率：５１％。ＬＣ／ＭＳ  ＥＳ+  ５９５．２８。
【０１０６】
実施例１０：
【化２０】
0005632287.tif 000025
実施例３のステップｃから得られた１ｇの化合物（４．０３×１０-3ｍｏｌ）および３．２６ｇのＰＥＧ７５０（４．４３×１０-3ｍｏｌ）を５５ｍｌの水に溶解する。ｐＨを６．２に調節する。２７２ｍｇのＨＯＢＴ（２．０１×１０-3ｍｏｌ）を添加して、反応媒体を５分間撹拌する。次に１．１４８ｇのＥＤＣｌ（６×１０-3ｍｏｌ）を添加して、撹拌を２４時間継続する。生成物をｐＨ９に固定して、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ２５２  Ｎａ樹脂上で精製。２．３ｇが得られ、すなわち収率は５９％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ-+モード、一連のピークは９６４．３５でＢＰに集中する。
【０１０７】
実施例１１：
ステップａ
【化２１】
0005632287.tif 000026
１５０ｍｇの染料（１．８８×１０-4ｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＭＦに溶解する。６０ｍｇのＨＯＢＴ（４．４４×１０-4ｍｏｌ）、５１ｍｇのＴＢＴＵ（１．５８×１０-4ｍｏｌ）、８４ｍｇのｔｅｒｔ−ブチル保護ジアミン（４．１５×１０-4ｍｏｌ）、および０．１６５ｍｌのＤＩＰＥＡ（９．４×１０-4ｍｏｌ）を連続的に添加する。反応媒体を室温で一晩撹拌する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。５５％の収率で１０３．４ｍｇの生成物が単離される。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード  ＢＰ  ９８０．８９。
【０１０８】
ステップｂ
【化２２】
0005632287.tif 000027
ステップａで調製された１０３ｍｇの化合物（１．０５×１０-4ｍｏｌ）を３ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／水（比率：９０／２．５／２．５）中で３０分間撹拌する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。４０ｍｇの生成物が得られ、すなわち収率は４３％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード  ＢＰ  ８７９．３９  ｚ＝１。
【０１０９】
ステップｃ
【化２３】
0005632287.tif 000028
５ｍｌのジクロロメタン中で、実施例９（４．３７×１０-5ｍｏｌ）のステップｃで得られた２６ｍｇの化合物、１８ｍｇのＤＣＣ（８．７２×１０-5ｍｏｌ）、および８ｍｇのＮＨＳ（６．９５×１０-5ｍｏｌ）を室温で３時間撹拌する。ＤＣＵを濾過する。次にステップｂで得られた４０ｍｇ（４．５４×１０-5ｍｏｌ）の染料および数滴のＴＥＡを添加する。撹拌を３時間継続する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。２０％の率で１２ｍｇが単離される。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード  ＢＰ  １４５７．３３。
【０１１０】
ステップｄ
【化２４】
0005632287.tif 000029
先行ステップで調製された１５０ｍｇの化合物（１．０２９×１０-4ｍｏｌ）を４ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／水（比率：９５／２．５／２．５）中で撹拌する。撹拌を室温で３時間継続する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。５０ｍｇが得られ、すなわち収率は４５％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ―モード  ＢＰ  １０９４．５３（ｚ＝１）。
【０１１１】
実施例１２：
ステップａ
【化２５】
0005632287.tif 000030
２００ｍｇの染料（２．５１×１０-4ｍｏｌ）を２０ｍｌのＤＭＦに可溶化する。８０ｍｇのＨＯＢＴ（５．９２×１０-4ｍｏｌ）、６８ｍｇのＴＢＴＵ（２．１１×１０-4ｍｏｌ）、０．２２０ｍｌのＤＩＰＥＡ（１．２５５×１０-3ｍｏｌ）、および１０８ｍｇのＦｍｏｃ−アミノエトキシエチルアミン（３．３０×１０-4ｍｏｌ）を連続的に添加する。反応媒体を室温で一晩撹拌する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製。水／ＣＨ3ＣＮ。６５％の収率で１７８ｍｇの生成物が単離される。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード、ＢＰ  １１０３．４３（ｚ＝１）。
【０１１２】
ステップｂ
【化２６】
0005632287.tif 000031
先行ステップで調製された８０ｍｇの化合物（９．０×１０-5ｍｏｌ）を２０％のピペリジンを含有する６ｍｌのＤＭＦに溶解する。撹拌を室温で１時間継続する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。５０ｍｇの生成物が得られ、すなわち収率は４０％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ-モード、ＢＰ  ８８０．０９（ｚ＝１）。
【０１１３】
ステップｃ
【化２７】
0005632287.tif 000032
実施例９のステップｃで得られた２０ｍｇのベンジル含有ピンセット（３．３６×１０-5ｍｏｌ）、１４ｍｇのＤＣＣ（６．７８×１０-5ｍｏｌ）、および６ｍｇのＮＨＳ（５．２１×１０-5ｍｏｌ）をＤＭＦに溶解して、室温で３時間撹拌する。ＤＣＵを除去する。ステップｂで得られた３０ｍｇ（３．４×１０-5ｍｏｌ）の染料および１７μｌのＤＩＰＥＡ（１．０２×１０-4ｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解する。次に活性化エステルを滴下して添加する。撹拌を室温で３時間継続する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。３０ｍｇが得られ、すなわち収率は３６％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード、ＢＰ  １４５８．９０（ｚ＝１）。
【０１１４】
ステップｄ
【化２８】
0005632287.tif 000033
ステップｃで調製された３０ｍｇの化合物（２．０３×１０-5ｍｏｌ）を３ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／水（比率：９５／２．５／２．５）に室温で３時間５０分溶解する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製。６ｍｇが得られ、すなわち収率は３５％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード、ＢＰ１０９８．２１（ｚ＝１）および５５０．３（ｚ＝２）。
【０１１５】
実施例１３：
ステップａ
【化２９】
0005632287.tif 000034
５０ｍｇのＩＲ８２０（Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、５．８８×１０-5ｍｏｌ）および１４．６５ｍｇ（８．８２×１０-5ｍｏｌ）のフェニルボロン酸を１０．７ｍｇ（９．２４×１０-6ｍｏｌ）のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムと４０．７ｍｇのＫ2ＣＯ3（２．９×１０-4ｍｏｌ）の存在下で、加熱して１１０℃で２４時間還流する。実験の終わりにパラジウムを濾過する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。３３ｍｇが得られ、すなわち収率は６２％である。ＬＣ／ＭＳ：ＥＳ+モード、ＢＰ  ９１３．２７（ｚ＝１）。
【０１１６】
ステップｂ
【化３０】
0005632287.tif 000035
ステップａで調製された１８ｍｇの化合物（１．９６×１０-5ｍｏｌ）、７ｍｇのＨＯＢＴ（４．３１×１０-5ｍｏｌ）、７ｍｇのＴＢＴＵ（４．７０×１０-5ｍｏｌ）、１０ｍｇのＦｍｏｃ−アミノエトキシエチルアミン（２．１５×１０-6ｍｏｌ）、および１１μｌのＤＩＰＥＡ（９．８×１０-5ｍｏｌ）を室温で一晩撹拌する。反応媒体をジエチルエーテル（２０ｍｇ）中で粉砕し濾過する。このようにして５５％の収率で、１３ｍｇの生成物が単離される。
【０１１７】
ステップｃ
【化３１】
0005632287.tif 000036
ステップｂで得られた１３ｍｇの化合物（１．０６×１０-5ｍｏｌ）をＤＭＦおよび２０％ピペリジン中で撹拌する。撹拌を室温で３０分間継続する。２０ｍｌのエチルエーテル中へ沈殿させ、室温で１時間撹拌する。４．３ｍｇが得られ、すなわち収率は４０％である。
【０１１８】
ステップｄ
【化３２】
0005632287.tif 000037
実施例９のステップｃで得られた２０ｍｇの化合物（３．３６×１０-5ｍｏｌ）、１４ｍｇのＤＣＣ（６．７８×１０-5ｍｏｌ）、および６ｍｇのＮＨＳ（５．２１×１０-5ｍｏｌ）を室温で３時間溶解する。ＤＣＵを除去する。ステップｃで得られた３５ｍｇ（３．４×１０-5ｍｏｌ）の染料および１７μｌのＤＩＰＥＡ（１．０２×１０-4ｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解する。次に活性化エステルを滴下して添加する。撹拌を室温で３時間継続する。５０ｍｌのエチルエーテル中に沈殿させる。２０ｍｇが得られ、すなわち収率は３７％である。
【０１１９】
ステップｅ
【化３３】
0005632287.tif 000038
ステップｄで調製される２０ｍｇの化合物（１．２５×１０-5ｍｏｌ）を３ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５）中で室温で３時間撹拌する。逆相フラッシュクロマトグラフィーによる精製。４ｍｇが単離され、すなわち収率は２６％である。
【０１２０】
実施例１４：
１００ｍｌの水中に希釈された濃度２．７５Ｍ／Ｌの実施例２の１ｍｌの溶液（酸性強磁性流体）に、１０ｍｌの水に溶解された実施例５で得られた６０μｍｏｌの化合物を滴下して添加する。混合物を室温で２０分間撹拌し、ｐＨを７．２に調節する。３０ｋＤのカットオフ閾値を有する膜を通して、得られた溶液を限外濾過する。３００ｍｌの濾液を除去して１０ｍｌの最終溶液を得る。［Ｆｅ］：０．２６０Ｍ／Ｌ  ＰＣＳサイズ＝２８ｎｍ。グラフトの程度［アミノアルコール化合物／Ｆｅ］＝２％ｍｏｌ／ｍｏｌ。
【０１２１】
実施例１５：
実施例２に記載される３ｍｌの化合物（［Ｆｅ］＝１．３３６ｍｏｌ／ｌ）を１００ｍｌの水中で希釈する。実施例５に記載される４６ｍｇの化合物を２ｍｌの水に溶かした溶液、実施例７に記載される３．８５ｍｇの化合物を２ｍｌの水に溶かした溶液、最後に実施例５からの４６ｍｇの化合物を２ｍｌの水に溶かした溶液を連続的に各添加間に１５分間の遅延を以て、溶液に添加する。溶液を室温で１５分間撹拌し、ＮａＯＨ溶液によってｐＨを７．４に調節する。３０ＫＤ膜を通して媒体を限外濾過し、０．１９１ｍｏｌ／ｌの鉄濃度のために、溶液の容積を２０ｍｌにする。ＰＣＳ：２６．８。
【０１２２】
実施例１６：
次の表に要約されるように、実施例１６からの手順に従って、変動する比率のビスホスホネート化合物の様々な二成分または三成分の組み合わせを、実施例１または２に記載される酸化鉄粒子に固定する。
【０１２３】
【表５】
0005632287.tif 000039
【０１２４】
括弧内の数字は被覆の程度を示し、例えば番号１では、被覆は実施例５の化合物（アミノアルコールリガンド）４０％、および実施例３からの化合物（リガンドに結合していないビスホスホネート化合物）６０％から構成される。