(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号70と同一の配列を有するポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含む、卵巣癌を治療するための組成物。
【請求項２】
卵巣癌細胞において前記ポリペプチドの活性を損なうことができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性が卵巣癌腫瘍発生である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記卵巣癌が上皮起源である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記卵巣癌が悪性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記卵巣癌が漿液性、明細胞性、または、類内膜性に分類される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記卵巣癌が悪性である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記卵巣癌が後期として特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記卵巣癌が後期として特徴付けられる、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原結合断片がFv、Fab、Fab'またはF(ab')2である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
配列番号７０と同一の配列を有するポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含む、卵巣腫瘍発生を阻害するための組成物。
【請求項１６】
卵巣癌を治療するための医薬の製造における、配列番号70と同一の配列を有するポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項１７】
前記医薬が卵巣癌細胞において前記ポリペプチドの活性を損なうことができる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記活性が卵巣癌腫瘍発生である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記卵巣癌が上皮起源である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記卵巣癌が悪性である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記卵巣癌が漿液性、明細胞性、または、類内膜性に分類される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記卵巣癌が悪性である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記卵巣癌が後期として特徴付けられる、請求項１６に記載の使用。
【請求項２４】
前記卵巣癌が後期として特徴付けられる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２６】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２９】
前記抗原結合断片がFv、Fab、Fab'またはF(ab')2である、請求項１６に記載の使用。
【請求項３０】
卵巣腫瘍発生を阻害するための医薬の製造における、配列番号７０と同一の配列を有するポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常細胞と比較して癌細胞において差次的に発現するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に関する。本発明は、より具体的には、癌の診断、予後予測または治療、および癌細胞の検出におけるこれらの配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
婦人科悪性腫瘍の中でも、卵巣癌は、米国では女性において最も高い腫瘍関連死亡率を占める(Jemal他、2005年)。これは、米国において女性の癌関連の主要死亡原因の第4位である(Menon他、2005年)。米国癌協会は、2005年に計22,220例の新規症例を見積もり、16,210例の死亡を、その疾患に起因するものとした(Bonome他、2005年)。過去30年の間、統計値は、依然として概ね同じ(卵巣癌を発症した女性の大部分がこの疾患で死亡する)である(ChambersおよびVanderhyden、2006年)。疾患は、1:70の生涯リスクであり、死亡率は60%を超える(ChambersおよびVanderhyden、2006年)。高い死亡率は、悪性腫瘍が卵巣にすでに広がった場合に、卵巣癌を早期に検出することが困難であることに起因する。実際、>80%の患者が進行期の疾患(III期またはIV期)であると診断される(Bonome他、2005年)。これらの患者は、80%から90%が化学療法に対して初期は反応するであろうが、5年生存率が45%未満であるように予後が不良となっている(Berek他、2000年)。数年前の5年生存率である20%と比較したこの成功の増加は、少なくとも一部は、卵巣癌の重要な予後予測因子である、腫瘍組織が卵巣に限定された場合に、腫瘍組織を最適に減量できることに起因する(Bristow R.E.、2000年およびBrown他、2004年)。早期(I期)であると診断された患者において、5年生存範囲は90を超える(ChambersおよびVanderhyden、2006年)。
【０００３】
卵巣癌は、卵巣の表面上皮または表面封入物に由来する、腫瘍の異種のグループを含む。それらは、漿液性、粘液性、類内膜性、明細胞性および女性の生殖器官の臓器における上皮の異なる型に対応するブレンナー(過渡的)型に分類される(ShihおよびKurman、2005年)。これらのうち、漿液性腫瘍は、診断された卵巣癌症例の約60%を占める。各組織学的サブカテゴリーは、それらの臨床的挙動を反映し、3つのグループ:良性、中間型(境界腫瘍または低悪性度(LMP))、および悪性にさらに分けられる(Seidman他、2002年)。LMPは、漿液性と診断された腫瘍の10%から15%を示し、それらは核構造の異型および転移性挙動を示し、さらにそれらは高度漿液性腫瘍より侵攻性が低いと考えられるため難問である。LMP腫瘍を有する患者の5年生存率は、同じ期間にわたる進行した高度疾患が45%未満であるのに対して95%である(Berek他、2000年)。
【０００４】
疾患の病因の知識、腫瘍縮小手術および最新の併用化学療法が改善されたにもかかわらず、死亡率にはわずかな変化しかない。転帰が不良であることの原因は、(1)この期におけるほんのわずかな症状の現れと組み合わせる、早期疾患検出のための適切なスクリーニング検査がないこと(診断は、しばしば後期に進行した後にのみ為され、この時点では癌の腹膜播種により有効な治療は制限される)、および(2)患者の5年生存率の改善を制限する、標準化学療法戦略に対する耐性の頻繁な発生、となっている。卵巣癌の初回化学療法計画は、カルボプラチン(パラプラチン（登録商標）)とパクリタキセル(タクソール（登録商標）)との併用を含む。数年の臨床検査により、この併用が有効な手術後に最も効果的であることが立証され、新規に診断された卵巣癌を有する女性の約80%において腫瘍容積が減少し、40%から50%が完全に退縮したと思われるが、研究はそれを改善する道を探すために続く。到達しにくい標的細胞に対する、最近の化学療法薬の腹部への注入は、静脈送達と組み合わせることにより有効性を増す。しかし、重い副作用がしばしば不完全な治療過程をもたらす。いくつかの他の化学療法薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、エトポシド、ビンブラスチン、塩酸トポテカン、イホスファミド、5-フルオロウラシルおよびメルファランを含む。疾患早期に化学療法を受けた女性の生存率が優れていることから、卵巣癌の検出を改善するための戦略の開発のための研究努力は当然のことである。さらに、新規な卵巣癌関連のバイオマーカーの発見により、将来の卵巣癌治療のための、副作用が最少となるより有効な治療戦略が開発される。
【０００５】
現在、卵巣癌の診断は、一部は、患者の病歴の日常的な分析を介して、物理学的検査、超音波検査およびX線検査ならびに血液学的スクリーニングを実施することによって達成される。2つの代替の戦略が、血清バイオマーカーの早期血液学的検出に関して報告されている。1つの取組みは、癌の有無を検出する未知の識別性のタンパク質またはタンパク質断片を発見するための、質量分析による血清試料の分析である(Mor他、2005年およびKozak他、2003年)。しかし、この戦略は高価であり、広範には利用できない。あるいは、血清中の周知のタンパク質/ペプチドの有無を、抗体マイクロアレイ、ELISAまたは他の同様の取組みを使用して検出する。CA-125(癌抗原-125)と呼ばれるタンパク質バイオマーカーのための血清検査が、卵巣癌のためのマーカーとして長い間広く実施されている。しかし、卵巣癌細胞はこれらのタンパク質分子を過剰に産生できるが、卵管または子宮内膜の癌(子宮の内壁の癌)を含むいくつかの他の癌、膵臓癌を有する人々の60%、他の悪性腫瘍を有する人々の20%〜25%でCA-125が高値である。CA-125検査により、I期の卵巣癌患者の約50%に対して真陽性の結果が出るだけであり、II、IIIおよびIV期の卵巣癌患者から真陽性結果が出る可能性は80%である。卵巣癌患者の他の20%は、CA-125濃度は少しも高値を示さない。さらに、高値CA-125検査は、癌に付随しない他の良性活性、例えば、月経、妊娠または子宮内膜症などを示す場合もある。結果として、まだ治療可能であり、陽性予測値(PPV)が10%未満を示す場合、この検査は、早期疾患の検出には臨床適用が非常に限られる。また、CA-125に対する超音波スクリーニングを加えても、PPVは20%前後にしか改善されない(Kozak他、2003年)。したがって、この検査は有効なスクリーニング検査ではない。
【０００６】
他の研究は、CA-125単独に関する卵巣癌の特異性および感受性が増加した、多くのバイオマーカーの組合せをもたらしている(Mclntosh他、2004年、Woolas他、1993年、Schorge他、2004年)。排他的ではないが、上皮卵巣癌を有する女性においてしばしば上昇する血清バイオマーカーは、癌胎児性抗原、卵巣嚢胞腺癌抗原、脂質結合シアル酸、NB/70、TAG72.3、CA-15.3およびCA-125を含む。残念なことに、この取組みは、早期検出の感受性および特異性を増加するが、公開されたバイオマーカーの組合せは、有意なパーセンテージのI/II期の上皮卵巣癌を検出できない。別の研究(Elieser他、2005年)により、CA-125を含む46種のバイオマーカーの血清濃度が測定され、これらのうち20種のタンパク質が、結合した形で他の良性骨盤疾患と比較して卵巣癌を有する女性の血清試料の98%を上回って正確に認識された。他の悪性腫瘍はこの研究には含まれなかったが、このマルチマーカーパネルアッセイは、卵巣癌の早期検出に対して、これまでのところ最も高い診断能力を提供する。
【０００７】
さらに、差次的遺伝子発現分析技術(例えば、DNAマイクロアレイおよびサブトラクション法)の到来により、多くのグループが上皮卵巣において上方制御される遺伝子の大きなコレクションを現在報告している(以下の番号で公開された米国特許出願:第20030124579号、第20030087250号、第20060014686号、第20060078941号、第20050095592号、第20050214831号、第20030219760号、第20060078941号、第20050214826号)。しかし、これらの遺伝子の1つまたは組合せの卵巣癌に関する臨床的有用性は、まだ十分確定されていない。
【０００８】
癌の診断および/または予後予測を改善するための新規な腫瘍マーカーの必要性がある。さらに、腫瘍の遺伝的多様性および多くの患者による化学療法耐性の発生のため、癌の治療のためのより優れた、より万能な治療的取組みに関するさらなる必要性が存在する。このような治療法の開発のための分子標的は、他の体細胞組織と比較して腫瘍組織に高度な特異性を示し、望ましくない副作用を最小化または排除するために機能し、治療法候補の有効性を増加することが好ましいと思われる。
【０００９】
本発明は、これらの必要性および他の必要性を扱うつもりである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許公開第20030124579号
【特許文献２】米国特許公開第20030087250号
【特許文献３】米国特許公開第20060014686号
【特許文献４】米国特許公開第20060078941号
【特許文献５】米国特許公開第20050095592号
【特許文献６】米国特許公開第20050214831号
【特許文献７】米国特許公開第20030219760号
【特許文献８】米国特許公開第20060078941号
【特許文献９】米国特許公開第20050214826号
【特許文献１０】米国特許公開第20040242606号
【特許文献１１】米国特許公開第20050009851号
【特許文献１２】米国特許第5,712,127号
【特許文献１３】米国特許公開第2005/0153333A1
【特許文献１４】米国特許出願第11/000,958号
【特許文献１５】米国特許第7,030,236号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明によれば、新規なポリヌクレオチド配列および新規なポリペプチド配列ならびに組成物、これらの配列に特異的な抗体、これらの新規な配列の組み換え型を含むベクターおよび細胞を提供する。
【００１２】
本発明は、これらの腫瘍細胞に特異的である1本または複数のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチド配列を使用する癌細胞の検出方法をさらに提供する。本明細書中で提供されたポリヌクレオチド配列および/またはポリペプチド配列のいくつかは、正常細胞と比較して卵巣癌において差次的に発現し、悪性卵巣癌と低悪性度の卵巣癌および/または正常状態(卵巣癌のない個体)との識別にさらに使用できる。
【００１３】
本発明により、本明細書中に記載された1種または複数種のポリペプチド配列および/またはポリヌクレオチド配列または抗体を含む、診断方法、予後予測方法、検出方法、キット、アレイ、ライブラリーおよびアッセイならびに癌治療のための新規な治療手段も包含される。
【００１４】
本出願人は、本明細書中に記載されたポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチド配列が、低悪性度の卵巣癌と比較して、および/または正常細胞と比較して、悪性卵巣癌において優先的に上方制御されるという驚くべき発見に至った。より興味深いことには、これらの配列のいくつかは、後期卵巣癌において過剰発現されると思われる。
【００１５】
本出願人は、本明細書中に記載された配列のいくつかが、卵巣癌細胞においてのみでなく、他の癌細胞(乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ（黒色腫）、白血病由来の細胞および中枢神経系の癌由来の細胞など)においても発現するという、驚くべき発見に至った。これらの配列のいくつかは、単独または組合せでそれ自体が万能腫瘍マーカーに相当し得る。それ故、本明細書中に記載された、いくつかのNSEQおよびPSEQは、卵巣癌の検出および治療の分野において有用性を発見するだけでなく、他の腫瘍型の検出および治療においても有用性が発見される。
【００１６】
それ故、本発明のNSEQまたはPSEQを使用して、癌である細胞を容易に同定できる。NSEQまたはPSEQそれ自体が、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、腎臓癌細胞、メラノーマ由来の細胞、白血病細胞または中枢神経系の癌由来の細胞である細胞の同定に使用できる。
【００１７】
さらにより詳細には、本明細書中に記載されたNSEQまたはPSEQは、悪性卵巣癌または低悪性度卵巣癌である細胞を同定するために使用できる。
【００１８】
卵巣癌細胞にいくつかのNSEQまたはPSEQが存在することから、卵巣癌が悪性であることが優先的に示唆され得る。いくつかの本発明のNSEQまたはPSEQから、癌が後期悪性卵巣癌であることもより具体的に示唆され得る。
【００１９】
NSEQまたはPSEQは、さらに、卵巣癌(すなわち、LMPおよび/または悪性卵巣癌)、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、メラノーマ、白血病または中枢神経系の癌を含む、癌の治療または癌の治療に有用な化合物を同定するために使用できる。
【００２０】
本明細書中および本発明のいくつかの実施形態において使用する場合、「NSEQ」という用語は、全般に、配列番号1から49および169(例えば単離形態)のいずれか1つを含む、またはからなる、あるいは配列番号1から49および169のいずれか1つの断片を含む、またはからなるポリヌクレオチド配列を指す。「NSEQ」という用語は、より具体的には、例えば、非翻訳部分または翻訳不可能な部分がない(すなわち、配列番号1から49および169のいずれか1つのコード部分である)と思われる、配列番号1から49および169のいずれか1つの転写部分を含む、またはからなるポリヌクレオチド配列を指す。「NSEQ」という用語は、上記のいずれか1つと実質的に同一、より具体的には、例えば非翻訳部分または翻訳不可能な部分を含まないと思われる、配列番号1から49および169のいずれか1つの転写部分を含む、またはからなるポリヌクレオチド配列と実質的に同一な配列をさらに指す。「NSEQ」という用語は、ポリペプチドをコードする、またはコードできる、配列番号1から49および169のいずれか1つの核酸配列領域をさらに指す。「NSEQ」という用語は、本明細書中に記載されたポリペプチドのいずれか1つまたは上記のいずれか1つのポリペプチド断片をコードできるポリヌクレオチド配列を指す。最終的に、「NSEQ」という用語は、上記のいずれか1つと実質的に相補的な配列を指す。
【００２１】
卵巣癌以外の癌の検出および/または治療に関するものなど、本発明の他の実施形態において、NSEQは、配列番号50(例えば、単離形態)を含む、またはからなる、あるいは、例えば非翻訳部分または翻訳不可能な部分を含まないと思われる、配列番号50のいずれか1つの転写部分を含む、またはからなるポリヌクレオチド配列(すなわち、配列番号50のコード部分)などの配列番号50のいずれか1つの断片を含む、またはからなるいずれかのポリヌクレオチドを含む配列番号50にさらに関し得る。「NSEQ」という用語は、上記のいずれか1つと実質的に同一、より具体的には、非翻訳部分または翻訳不可能な部分を含まないと思われる、配列番号50の転写部分を含む、またはからなるポリヌクレオチド配列と実質的に同一な配列をさらに指す。「NSEQ」という用語は、ポリペプチドをコードする、またはコードできる、配列番号50の核酸配列領域をさらに指す。最終的に、「NSEQ」という用語は、上記のいずれか1つと実質的に相補的な配列を指す。
【００２２】
本発明の実施形態それ自体において、NSEQは、例えば、配列番号1から49、50および169を包含し、さらに配列番号1から49、50または169を含む、配列番号1から49、50または169から設計される、または配列番号1から49、50または169に由来するポリペプチド配列を包含する。このような配列の限定されない例は、例えば、配列番号103〜150または151〜152を含む。
【００２３】
「抑制NSEQ」という用語は、全般に配列番号1から49、50または169のいずれか1つと実質的に相補的な、配列番号1から49、50または169のいずれか1つの断片と実質的に相補的な、配列番号1から49、50または169と実質的に同一な配列と実質的に相補的な、より具体的には、配列番号1から49、50または169のいずれか1つの転写部分(例えば、非翻訳部分または翻訳不可能な部分を含まないと思われる)と実質的に相補的な、mRNAの転写産物に対して、あるいは対応する配列番号1から49、50または169によってコードされたポリペプチドの発現に対して、減衰またはさらに抑制作用を有することのできる配列を指す。適切な「抑制NSEQ」は、例えば、限定されることなく、約10から約30のヌクレオチド、約10から約25のヌクレオチドまたは約15から約20ヌクレオチドを有することができる。
【００２４】
本明細書中で使用する場合「PSEQ」という用語は、全般に、本明細書中で述べたありとあらゆるポリペプチド配列、例えば本明細書中に記載のNSEQのいずれか1つ(例えば、配列番号1から49または169のいずれか1つ)(それらの単離形態または実質的精製形態を含む)によってコードされた(推定的にコードされた)任意のポリペプチド配列などを指す。したがって、本発明の実施形態において、配列番号51から88または170(それらの変異体(例えば、単離天然タンパク質変異体)、相同体、誘導体および断片を含む)のいずれか1つを含む、またはからなるポリペプチドは、本明細書中でまとめて「PSEQ」と称される。卵巣癌以外の癌の検出および/または治療に関するような、本発明の他の実施形態において、PSEQは、配列番号89(変異体(例えば、単離天然タンパク質変異体)、相同体、誘導体および断片を含む)を含む、またはからなるポリペプチドをさらに指す。
【００２５】
本明細書中に記載のNSEQまたはPSEQのいくつかは、本明細書中に記載の目的以外の目的のためにこれまでに特徴づけられている。それ故、それらのNSEQまたはPSEQを標的とすることで知られる診断薬および治療薬それ自体(例えば、抗体および/または抑制因子)を、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、白血病または中枢神経系の癌の治療の状況においてこれらのNSEQまたはPSEQの抑制に現在用いることができる。これらの周知の治療薬および診断薬の、本明細書中に記載の有用性などの、これまでに記載されていない有用性のための使用は、本発明に包含される。
【００２６】
例えば、葉酸受容体-1に結合できる抗体は、それ故、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、白血病および中枢神経系の癌由来などの卵巣癌細胞以外の腫瘍細胞の特異的結合のために使用できる。前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、白血病および中枢神経系の癌の治療の使用における、葉酸受容体-1の抗体および/または抑制因子(例えば、US20040242606、US20050009851などに記載されたものである、シクロペンタ[g]キナゾリンに基づくチミジル酸シンターゼ抑制因子であるCB300638、CB300945)の使用それ自体が、本発明に包含される。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
スクリーニングツールとしてのNSEQの使用
本明細書中に記載のNSEQは、直接、あるいは発現産物(mRNA、mRNA前駆体、hnRNAなど)、ゲノムDNAまたは合成産物(cDNA、PCR断片、NSEQを含むベクターなど)の検出または単離用ツールの開発においてのどちらかに使用できる。NSEQは、コードされたポリペプチドまたはタンパク質の適切な検出用ツールを調製するためにもまた使用できる。NSEQは、それ故、コードされたポリペプチドを提供するため、およびポリペプチドに特異的な抗体を作製するためにも使用できる。
【００２８】
当業者は、短鎖オリゴヌクレオチド配列が、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列に基づいて調製できることもまた認識するであろう。例えば、10から20のヌクレオチドまたはそれ以上を有するオリゴヌクレオチドは、実質的に相補的な配列を有するNSEQと特異的にハイブリダイズするために調製でき、ハイブリダイズすることによる核酸配列の検出、同定、および単離を可能にする。例えば、少なくとも10〜20ヌクレオチドのプローブ配列は、配列番号1から49、50または169のいずれか1つに見出される配列、より具体的には、望ましくない配列に対する相同性を欠いた領域から選択される配列に基づいて調製できる。このような相同性を欠いた20またはそれ以上のヌクレオチドのプローブ配列は、標的配列に対する特異性の増加を示し得る。プローブおよびプライマーに関する有用なハイブリダイズ条件は、当業者によって容易に決定できる。本明細書に包含されるストリンジェントなハイブリダイズ条件は、90%を超えて相同である核酸のハイブリダイズを可能にするが、70%未満が相同である核酸のハイブリダイズを妨げることのできる条件である。プローブの特異性は、ユニーク領域、調節領域から、または保存モチーフから作製されるかどうかによって決定される場合がある。プローブの特異性および診断的ハイブリダイズまたは増幅(最大、高度または低度)反応のストリンジェント性は両方とも、プローブが相補的配列、対立遺伝子変異または関連配列を正確に同定するか否かに依存する。関連配列を検出するために設計されたプローブは、例えば、選択されたポリペプチドのいずれかと少なくとも50%の配列同一性を有し得る。  
【００２９】
さらに、プローブは、当分野において公知の任意の手法、例えば、「レポーター分子」に連結されたヌクレオチドを組み込むことによって標識できる。本明細書中で使用する場合、「レポーター分子」は、ハイブリダイズされたプローブの検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子であり得る。検出は、定性的または定量的のどちらかであってよい。普通使用されるレポーター分子は、蛍光色素分子、酵素、ビオチン、化学発光分子、生物発光分子、ジゴキシゲニン、アビジン、ストレプトアビジンまたはラジオアイソトープを含む。普通使用される酵素は、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼを含む。酵素は、ビオチン化プローブとの使用のためにアビジンまたはストレプトアビジンに結合できる。同様に、プローブは、ビオチン化酵素との使用のためにアビジンまたはストレプトアビジンと結合できる。レポーター分子のDNAプローブへの組み込みは、当業者に公知の任意の方法、例えば、ニックトランスレーション法、プライマー伸長法、ランダムオリゴプライミング法により、3'または5'末端を標識することにより、あるいは他の方法により達成できる。さらに、ハイブリダイゼーションプローブは、mRNAプローブの作製のための核酸配列のベクターへのクローニングを含む。このようなベクターは、当分野では周知であり、市販されており、インビトロでRNAを合成するために使用できる。標識化ポリペプチド配列は、サザンまたはノーザン分析、ドットブロットまたは他のメンブレンベースの技術に、PCR技術に、また発現の変化を検出するために、対象由来の試料を使用するマイクロアレイに使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイによる試料のスクリーニングのためのプローブとしてまたは増幅のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドは、キットに梱包できる。このようなキットは、あらかじめ測定したまたはあらかじめ決められた量のプローブまたはプライマーならびに特定のハイブリダイゼーションまたは増幅プロトコルに必要な、他の適切に梱包された試薬および材料を含むことができる。
【００３０】
本発明のNSEQと同一なまたは実質的に同一なmRNAの発現は、それ故当分野において周知の方法を使用して、検出および/または単離できる。このような方法の例示的実施形態は、例えば、限定されることなくオリゴヌクレオチドプローブ、逆転写およびインビトロの核酸増幅方法を使用するハイブリダイゼーションアッセイを含む。
【００３１】
このような手法は、したがって、卵巣細胞(例えば、卵巣癌細胞)において、またはこのようなmRNAを発現する任意の他の細胞において、mRNAの検出を可能にできる。組織特異的または疾患特異的な方法におけるmRNAの発現は、組織および/または特定の疾患状態を明示するために有用であり得る。当業者は、これらの目的のためにNSEQを容易に適合させることができる。
【００３２】
NSEQが、試験試料(例えば、細胞、組織など)に見出された実質的に相補的な配列とハイブリダイズできることは、本明細書中で理解されるべきである。さらに、NSEQ(断片を含む)と実質的に相補的な配列は、NSEQおよび試験試料(例えば、細胞、組織など)に見出された実質的に同一な配列に結合できる。
【００３３】
単離されたNSEQによりコードされたポリペプチド、それらのポリペプチド変異体、ポリペプチド類似体、またはポリペプチド断片もまた、本発明に包含される。ポリペプチドは、未成熟、成熟または融合形態であろうとなかろうと、溶解細胞または培養培地から単離でき、意図される使用に必要な程度に精製できる。当業者は、これらのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを、任意の利用可能な手法によって容易に精製できる。例えば、精製は、塩分別、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによって達成できる。あるいは、PSEQは、化学合成によって作製できる。
【００３４】
天然の変異体は、NSEQおよび由来するツールを使用して、異なる組織、細胞型、集団、種などに由来する核酸ライブラリーまたはポリペプチドライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを介して同定できる。
【００３５】
発現系の開発のためのNSEQの使用
ポリペプチドを発現させるために、本明細書中に記載のPSEQのいずれか1つをコードできるNSEQを、発現ベクター、すなわち特定の宿主に挿入されたコード配列の、転写および翻訳の調節に関する要素を含むベクターに挿入できる。これらの要素は、エンハンサー、構成的および誘導的プロモーターならびに5'および3'非翻訳領域などの調節配列を含み得る。当業者にとって周知である方法を、このような発現ベクターの構築に使用できる。これらの方法は、インビトロの組換えDNA技術、合成技術およびインビボの遺伝子組み換えを含む。
【００３６】
当業者に公知の、様々な発現ベクター/宿主細胞系は、NSEQ由来のポリペプチドまたはRNAを発現させるために利用できる。これらは、限定するものではないが、組み換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された細菌などの微生物、酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、バキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞系、ウイルスまたは細菌発現ベクターにより形質転換された植物細胞系、あるいは動物細胞系を含む。哺乳動物系における組み換えタンパク質の長期産生では、細胞系における安定な発現が達成できる。例えば、NSEQは、ウイルス起源の複製要素および/または内在性発現要素と、選択可能なまたは可視的なマーカー遺伝子とを、同じベクターまたは別のベクター上に含むことができる発現ベクターを使用して、細胞系に形質転換できる。本発明は、用いたベクターまたは宿主細胞により限定されるものではない。
【００３７】
あるいは、RNAおよび/またはポリペプチドは、インビトロの転写系または連動したインビトロの転写/翻訳系をそれぞれ使用してNSEQを含むベクターから発現できる。
【００３８】
一般的に、NSEQを含む宿主細胞および/またはNSEQまたはそれらの部分によりコードされたポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な手法により同定できる。これらの手法は、限定するものではないが、DNA/DNAまたはDNA/RNAのハイブリダイゼーション、PCR増幅ならびに核酸配列またはアミノ酸配列の検出および/または定量に関する、メンブレン、溶液またはチップに基づく技術を含む、タンパク質のバイオアッセイまたは免疫測定技術を含む。特異的なポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体のどちらかを使用する、ポリペプチドの発現を検出および測定するための免疫学的方法は、当分野で公知である。このような技術の例には、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)および蛍光活性化細胞分類法(FACS)が挙げられる。当業者は、これらの方法論を本発明に容易に適合できる。
【００３９】
したがって、NSEQを含む宿主細胞は、対応するRNA(mRNA、siRNA、shRNAなど)の転写、および/または細胞培養由来のポリペプチドの発現のための条件下で培養できる。細胞により作製されたポリペプチドは、使用した配列および/またはベクター次第で、細胞内に分泌され得、または保持され得る。当業者には理解されるであろうが、NSEQを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して直接ポリペプチドを分泌するシグナル配列を含むように設計できる。遺伝コード、それをコードする他のDNA配列の生来の退縮により、実質的に同一または機能的に等価なアミノ酸配列が、例えば、NSEQによりコードされたポリペプチドの発現のために作製および使用できる。本発明のヌクレオチド配列は、限定するものではないが、クローン化の改良、遺伝子産物のプロセッシングおよび/または発現を含む様々な目的のために、ヌクレオチド配列を改変するために、当分野において一般的に公知の方法を使用して処理できる。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムな断片化と、PCR再構築とによるDNAシャッフリングは、ヌクレオチド配列を処理するために使用できる。例えば、オリゴヌクレオチド仲介部位指向性突然変異生成を、新しい制限部位を作製する、グリコシル化パターンを改変する、コドン選択を改変する、スプライス変異体を作製するなどの、突然変異導入のために使用できる。さらに、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節するためのその能力、または発現したポリペプチドを望ましい型に処理するためのその能力に関して選択できる。ポリペプチドのこのような改良は、限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含む。ポリペプチドの「プレプロ(prepro)」形態を切断する、翻訳後のプロセッシングもまた、タンパク質の標的化、フォールディングおよび/または活性を特定するために使用できる。翻訳後活性に関して特異的な細胞機構および特徴的な機序を有する異なる宿主細胞(CHO、HeLa、MDCK、HEK293およびW138)は、市販されており、またAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手でき、発現したポリペプチドの正確な修飾およびプロセッシングを確実にするために選択できる。
【００４０】
当業者は、天然の、修飾された、または組み換えの核酸配列を、非相同ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドの翻訳をもたらす非相同配列に、前述の宿主系のいずれかにおいて連結できることを、容易に認識するであろう。このような非相同ポリペプチド部分は、市販のアフィニティーマトリックスを使用する融合ポリペプチドの精製を容易することができる。このような部分は、限定するものではないが、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、6-His(His)、FLAG、c-myc、ヘマグルチニン(HA)およびモノクロナール抗体エピトープなどの抗体エピトープを含む。
【００４１】
さらにさらなる態様において、本発明は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得るポリヌクレオチドに関し、該融合タンパク質は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質のペプチド断片、または本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされた、天然に発生した対立遺伝子変異体ポリペプチドと融合した融合相手を含むことができる。
【００４２】
当業者は、核酸およびポリペプチド配列は、当分野において周知の化学的または酵素的な方法を使用して、全体または部分的に合成できることもまた、容易に認識するであろう。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技術を使用して実施でき、ABI 431Aペプチド合成装置(PE Biosystems)などの機械を自動合成に使用できる。所望であれば、合成および/または変異タンパク質を産生するために他のタンパク質由来の配列と組み合わせる間に、アミノ酸配列を改変できる。
【００４３】
本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドの潜在的アンタゴニストとして、化合物を評価するためのバイオアッセイにさらに関し、該バイオアッセイは、
a)試験細胞を、本明細書中に記載のポリペプチドの活性を抑制するその能力を確定するために、少なくとも1種の化合物の濃度を上昇させた培養培地において培養し、試験細胞が、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列(例えば、野生型ポリヌクレオチドと比較して、トランス活性化転写活性が改善されており、レポーター遺伝子に動作可能に連結した応答要素を含む形態)を含むことができるステップと、その後、
b)培養培地における潜在的アンタゴニスト化合物の濃度の関数として、(レポーター分子をコードする)レポーター遺伝子の産物の発現レベルを細胞内で観察し、その結果、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの活性を阻害する、潜在的アンタゴニスト化合物の能力を示すステップと
を含む。
【００４４】
本発明は、本明細書中に記載のポリペプチド配列によってコードされたポリペプチドのための潜在的アゴニストとして、化合物を評価するためのバイオアッセイにさらに関し、該バイオアッセイは、
a)本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの活性を促進するその能力を確定しようとする、少なくとも1種の化合物の濃度を上昇させた培養培地において試験細胞を培養し、試験細胞が、本明細書中に記載のポリペプチド配列(例えば、野生型ポリペプチドと比較して、トランス活性化転写活性が改善されており、レポーター遺伝子に動作可能に連結した応答要素を含む形態)を含むことができるステップと、その後、
b)培養培地における潜在的アゴニスト化合物の濃度の関数として、レポーター遺伝子の産物の発現レベルを細胞内で観察し、これによって、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの活性を促進する、潜在的アゴニスト化合物の能力を示唆するステップと
を含む。
【００４５】
同定ツールとして、または診断スクリーニングツールとしてのNSEQの使用
技術者は、NSEQが特定の細胞、細胞型、組織、疾患を同定するために使用でき、それ故、遺伝子の発現産物の、発現の有無または変化(すなわち、正常と比較した増減)を決定するための診断目的に使用できることを容易に認識するであろう。適切なNSEQは、例えば、10から20またはそれ以上、すなわち少なくとも10ヌクレオチド長、または少なくとも12ヌクレオチド長、または少なくとも15ヌクレオチド長から任意の所望の長さまでであってよく、例えば、RNA、DNA、分岐型核酸、および/またはペプチド核酸(PNA)を含んでいてよい。1つの代替の方法において、ポリヌクレオチドは、NSEQの発現が疾患と関連している試料中の遺伝子発現を、検出および定量するために使用できる。別の代替の方法において、NSEQは、疾患に伴う遺伝的多型を検出するために使用できる。これらの多型は、例えば、転写産物、cDNAまたはゲノムDNAの中に検出できる。
【００４６】
本発明は、本明細書中に記載の少なくとも1つのNSEQのアレイへの使用および癌の予後予測または診断のための、特定の細胞、細胞型、組織、疾患の検出方法へのそのアレイの使用を提供する。本方法は、アレイと患者の試料(NSEQと実質的に相補的な標的ポリヌクレオチド配列を、推測的に含むまたは含む)とを、複合体(NSEQと標的ポリヌクレオチドとの)の形成を可能にする条件下で、ハイブリダイズするステップ、複合体形成を検出するステップを含み、複合体の形成が患者の試料中のポリヌクレオチドの存在を示し、複合体の形成の不在はポリヌクレオチドの不在を示す。ポリヌクレオチドの有無は、例えば、卵巣癌または本明細書中に示した他の癌などの癌を示すことができる。
【００４７】
本方法は、患者の試料中における複合体形成のレベルと、正常な細胞または個体あるいは癌の他の型、起源または悪性度に関する基準値とを、定量的または定性的に比較するステップ(例えば、コンピュータシステム、装置を用いて)もまた含むことができる。
【００４８】
本発明は、卵巣癌の診断または予後予測のための、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチド検出用の、1種または複数種の区分化されたキットを提供する。第1のキットは、少なくとも1種の単離されたNSEQまたはNSEQを含むプローブを含む容器を有することができる。このようなプローブは、正常細胞に存在する/不在であるが、罹患したまたは疾患である細胞には不在である/存在する核酸断片に結合できる。このようなプローブは、正常には活性/不活性であるが、特定の細胞型においては不活性/活性であり得る核酸部位に特異的であると思われる。同様に、このようなプローブは、特定の細胞型において異常に発現し得るに核酸部位特異的であり得る。最終的に、このようなプローブは、特定の突然変異を同定できる。プローブは、変異した核酸配列(正常な核酸配列と同一ではない)とハイブリダイズ可能であると思われる、または変異した核酸配列に隣接した核酸配列とハイブリダイズ可能であると思われる。本発明のキットに提供されたプローブは、共有結合しているレポーター分子を有することができる。プローブおよびレポーター分子は、当業者によって上記のように容易に調製できる。
【００４９】
本明細書中に記載のタンパク質またはポリペプチド(PSEQ)、ならびにこのような抗体をコードする核酸と特異的に結合できる抗体(例えば、単離抗体)もまた、本発明に包含される。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫感作抗体、抗原結合断片、Fab断片、F(ab')2断片およびFv断片、CDRまたは抗原結合断片を含む一本鎖抗体(例えば、一本鎖Fv)を意味する。
【００５１】
抗体は、マウス、ラットまたは他の任意の哺乳動物に、あるいは組み換えDNA技術を介するなど、他の供給源に由来し得る。
【００５２】
抗体はまた、例えば、ヒトIg遺伝子を発現できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるヒトの抗体であってよい。抗体は、さらに、例えば、非ヒト起源の領域を確定する1種または複数種の相補性を含み得るヒト化抗体であってもよい。ヒト抗体および/またはヒト抗体のフレームワーク領域の表面残基もまた含み得る。抗体は、さらに例えば、非ヒト抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を含み得るキメラ抗体であってもよい。
【００５３】
本発明の抗体は、本明細書中に記載のポリペプチドに対する親和性、溶解度、安定性、特異性の増加に基づいて、および/または所望の宿主における免疫原性もしくは他の望ましい特性の減少に基づき、変異および選択され得る。
【００５４】
適切な抗体は、ポリペプチドの特有の抗原性領域またはエピトープあるいはそれらの部分に結合できる。抗体作製のために有用なエピトープおよび抗原領域は、当業者に利用可能な手法によるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド内に見出し得る。例えば、短い、特有のペプチド配列は、公知のアミノ酸配列に相同性をほとんど有さない、または相同性を有さないタンパク質およびポリペプチドにおいて同定できる。ペプチドエピトープまたは抗原として作用するために選択されたタンパク質の領域は、すべてが疎水性ではないことが好ましく、それらの領域は、タンパク質およびポリペプチドの内部領域ではなく表面エピトープをおそらく構築するため、親水性領域が好ましい。これらの表面エピトープは、タンパク質およびポリペプチドの存在に関して検査された試料において、より容易に検出される。このような抗体は、限定するものではないが、ポリクロナール、モノクロナール、キメラおよび一本鎖の抗体、Fab断片およびFab発現ライブラリーにより作製された断片を含み得る。抗体の作製は、当業者には周知であり、本明細書中に限定する意図ではない。
【００５５】
ペプチドは、当業者に公知の任意の手法、例えば、インビトロ翻訳または化学合成手法の使用あるいは適切な発現ベクターの細胞への導入によって作製できる。抗原エピトープを提供するが、単独では免疫応答を誘導するには小さすぎる短鎖ペプチドは、適切な担体に接合できる。適切な担体および連結方法は、当分野において周知である。適切な担体は、通常、タンパク質、多糖類および高分子アミノ酸などの大型の巨大分子である。例としては、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、ポリリシンなどが挙げられる。当業者は、利用可能な手法およびカップリング剤を、望ましいペプチドエピトープをこのような担体に連結するために使用できる。例えば、カップリング剤は、担体から対象となるペプチドへのジスルフィド結合またはチオエーテル結合を形成するために使用できる。ペプチドがジスルフィド基を欠いていた場合、システイン残基を付加することによって提供できる。あるいは、カップリングは、カルボキシル基の活性化によって達成できる。
【００５６】
抗原特異的抗体を得るために有用なペプチドの最小サイズは、非常に広範囲であると思われる。最小サイズは、タンパク質またはポリペプチドに特異的な抗原エピトープを提供するために十分でなくてはならない。最大サイズは、1つの特定のエピトープに対する抗体を得ることが望ましい場合でなければ、重要ではない。例えば、大型のポリペプチドは複数のエピトープを含むことができ、1種のエピトープが特に有用であり、第2のエピトープは、免疫優性である、などである。通常、本タンパク質およびポリペプチドから選択される抗原ペプチドは、限定するものではないが、5から約100アミノ酸長の範囲となる。しかし、さらに典型的には、このような抗原ペプチドは、最大約50アミノ酸長であり、最大約30アミノ酸が好ましい。普通は、約6、8、10、12または15アミノ酸から20または25アミノ酸(およびその間の任意の数)までの配列を選択することが望ましい。
【００５７】
有用なエピトープを含むアミノ酸配列は、多くの方法で同定できる。例えば、全タンパク質配列を一度に測る一連の短鎖ペプチドの調製は、全タンパク質配列のスクリーニングに使用できる。当業者は、いくつかの大型ポリペプチドを、望ましい反応性を示すエピトープの存在に関して普通に試験でき、望ましい特異性および反応性を有する好ましいエピトープを同定するために、徐々に、より小型の断片および重複した断片もまた、試験できる。
【００５８】
本明細書中で述べたように、抗原ポリペプチドおよび抗原ペプチドは、モノクロナール抗体およびポリクロナール抗体の作製に有用である。NSEQのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、ポリペプチド類似体またはそれらの部分に対する抗体は、当分野において周知の方法を使用して作製できる。例えば、モノクロナール抗体は、細胞系の連続培養によって抗体分子の作製を提供する、任意の技術を使用して調製できる。これらは、限定するものではないが、ハイブリドーマ、ヒトB細胞ハイブリドーマおよびEBVハイブリドーマ技術を含む。さらに、技術は、キメラ抗体の作製のために開発された技術もまた使用できる。あるいは、一本鎖抗体の作製のために記載された技術もまた用いることができる。NSEQのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはそれらの部分に対する特異的結合部位を含み得るFabもまた作製できる。様々な免疫測定法を、所望の特異性を有する抗体を同定するために使用できる。競合的結合または特異性の確立されたポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体のどちらかを使用する免疫放射定量測定法に関する数多くのプロトコルが、当分野において周知である。
【００５９】
ポリクロナール抗体を得るために、選択された動物を、タンパク質またはポリペプチドを用いて免疫感作できる。動物からの血清を、公知の手法に従って収集し処理できる。対象とするタンパク質またはポリペプチドに対するポリクロナール抗体を、その後アフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。ポリクロナール抗血清作製の技術は、当分野において周知である。
【００６０】
モノクロナール抗体(MAb)は、当業者に利用可能ないくつかの手法の1つによって、例えば抗体作製細胞と不死化細胞とを融合し、それによりハイブリドーマを作製することによって作製できる。抗体作製B細胞と不死化細胞系との融合に関する一般的方法論は、当業者の十分範囲内である。別の例は、コンビナトリアル抗体ライブラリー技術を使用して免疫感作された動物の、骨髄および脾臓細胞から抽出されたmRNAからのMAbの作製である。
【００６１】
動物に由来する、または細胞系に由来するMAbの1つの欠点は、それらは診断目的または治療目的で患者に投与できるが、それらは多くの場合免疫系によって外来抗原として認識され、連続使用には適さないということである。ヒト免疫系によって外来抗原として認識されない抗体は、診断および治療の両方にとって非常に有力である。ヒト抗体およびヒト化抗体を作製する方法は、現在当分野において周知である。
【００６２】
キメラ抗体は、非ヒトMAbの領域を、それらのヒト対応物で交換して構築できる。好ましいキメラ抗体は、NSEQのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドまたはそれらの部分に結合する、ヒトフレームワーク(FW)領域に接合された非ヒトMabの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、アミノ酸配列を有するものである。このような抗体の作製方法は、当分野において周知である。CDRおよびFWに対応するアミノ酸残基は、当分野の平均的な技術者に公知である。
【００６３】
様々な方法が、接合されたCDRを含む抗体の、抗原に対する親和性を維持するまたは増強するために開発されている。1つの方法は、キメラ抗体に、CDR領域の構造を左右する外来フレームワーク残基を含むことである。第2の方法は、外来可変領域に最も近い相同性を有するヒト可変ドメインに、外来CDRを接合することである。それ故、1つまたは複数の非ヒトCDRのヒト抗体への接合は、特定のCDR配列に隣接するアミノ酸残基、またはCDR配列には連続していないが、全抗体可変ドメイン構造においてCDRに対してパックされ、CDRの構造を左右するアミノ酸残基、の置換に関与すると思われる。本発明のヒト化抗体は、したがって、1つまたは複数の非ヒトCDRを含むヒト抗体ならびに結合特性を維持または増強するために追加の置換または交換がなされたような抗体を含む。
【００６４】
本発明のキメラ抗体は、表面露出残基を交換することによってMAbをヒトに見せる、ヒト化された抗体もまた含む。抗原結合部位の近隣におけるアミノ酸残基の内部パッキングは変化しないままなので、親和性は保存される。ヒト化を目的とする、本発明によるNSEQ-抗体のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド(またはそれらの部分)の表面露出残基の置換は、CDR残基またはNSEQのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらの部分に対する親和性に影響を与える隣接残基の置換を意味するものではない。
【００６５】
キメラ抗体は、非ヒト定常ドメインの一部または全部がヒト対応物で交換された抗体もまた含む。この取組みは、抗原結合部位が影響されないままであるという利点を有する。しかし、有意量の非ヒト配列は、可変ドメインが、完全に非ヒト抗体に由来する場合に存在し得る。
【００６６】
本発明の抗体は、原則的にヒト配列からなる抗体である、ヒト抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインの組合せが線状ファージの表面に露呈されている、ファージディスプレイライブラリーから得ることができる。可変ドメインの組合せは、通常、Fab'またはscFvの形態で線状ファージ上に露呈される。ライブラリーは、望ましい抗原結合特性を有する可変ドメインのファージを担持する組合せをスクリーニングできる。好ましい可変ドメインの組合せは、NSEQのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらの部分に対する高い親和性によって特徴づけられる。好ましい可変ドメインの組合せは、NSEQのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらの部分に対する高い特異性および他の関連抗原に対する交差反応性がほとんどないことによって、さらに特徴づけられる。抗体断片の非常に大きいレパートリー(2〜10×1010)からのスクリーニングによって、多様性に富んだ高親和性Mabが単離でき、その多くがNSEQのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらの部分に対するナノモル以下の親和性を有する事が期待される。
【００６７】
あるいは、ヒト抗体は、再構成されていないヒトIg遺伝子セグメントが導入されており、内在性マウスIg遺伝子が不活性化されている、トランスジェニック動物から得ることができる。好ましいトランスジェニック動物は、サイズが1Mbを超える非常に大きな連続したIg遺伝子断片を含むが、中程度の親和性のヒトポリペプチド特異的Mabは、より小さい遺伝子座を含むトランスジェニック動物から得ることができる。ヒトIg遺伝子のみを発現できるトランスジェニック動物は、ヒト起源のみの抗体を含むポリクロナール抗血清を得るためにもまた使用できる。
【００６８】
本発明の抗体は、直接突然変異によって、または親和性成熟の方法によって結合特性が改善されているものを含み得る。親和性および特異性は、CDRを突然変異させること、および所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって、修正または改善できる。CDRは、様々な方法で突然変異させられる。1つの方法は、個々の残基または残基の組合せを、他の同一抗原結合部位の集団において全20種のアミノ酸を特定の位置に見出し得るようにランダム化することである。あるいは、突然変異は、エラープローンPCR法によって、CDR残基の範囲より多く、誘導できる。重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌(E.coli)の突然変異誘発株において繁殖させることができる。突然変異生成のこれらの方法は、当業者に公知の多くの方法の例示である。
【００６９】
抗体は、それらに結合した検出可能な標識(レポーター分子)をさらに含むことができる。
【００７０】
本明細書中に記載のポリペプチド、ポリペプチド断片またはポリペプチド類似体の1つに特異的に結合できる抗体を作製する方法をさらに提供し、本方法は
a)哺乳動物(例えば、マウス、ヒトIgを作製できるトランスジェニック哺乳動物など)を、適切な量の、例えばPSEQの少なくとも6個(例えば、8、10、12個など)の連続したアミノ酸を含むポリペプチド断片を含む、本明細書中に記載のPSEQを用いて免疫感作するステップと、
b)該哺乳動物から血清を収集するステップと、
c)該哺乳動物の血清からポリペプチド特異的抗体を単離するステップと
を含む。
【００７１】
本方法は、哺乳動物(例えば、動物)に、2回目の用量を投与するステップをさらに含むことができる。
【００７２】
ポリペプチドに特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを作製する方法もまた本明細書に包含され、当分野において公知である。
【００７３】
本方法は、
a)哺乳動物(例えば、マウス、ヒトIgを作製できるトランスジェニック哺乳動物など)を、適切な量のそれらのPSEQで免疫感作するステップと、
b)(a)で得た免疫感作動物由来のリンパ球様細胞を得るステップと、
c)該リンパ球様細胞と不死化細胞とを、ハイブリッド細胞の作製のために融合するステップと、
d)それらのPSEQに特異的に結合する抗体を作製するハイブリッド細胞を選択するステップと
を含むことができる。
【００７４】
本明細書に記載のポリペプチドの1つに特異的に結合する抗体を作製する方法も、本発明に包含され、本方法は、
a)抗体(例えば、抗原結合断片)のライブラリーを、ファージまたはリボソームに合成するステップと、
b)ファージまたはリボソームを、本明細書中に記載のポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む組成物と接触させることによって、ライブラリーを試料に対して作動させるステップと、
c)ポリペプチドまたはポリペプチド断片に結合するファージを単離するステップと、
d)ファージまたはリボソームから抗体を得るステップと
を含む。
【００７５】
したがって、本発明の抗体は、例えば
a)宿主哺乳動物から抗体作製に関与する細胞を抽出するステップと、
b)(a)の細胞からRNAを単離するステップと、
c)cDNAを作製するためにmRNAを逆転写するステップと、
d)(抗体特異的)プライマーを使用してcDNAを増幅するステップと、
e)(d)のcDNAを、抗体がファージまたはリボソーム上に発現するように、ファージディスプレイベクターまたはリボソームディスプレイカセットに挿入するステップと
によって調製できるライブラリー(例えば、バクテリオファージライブラリー)から得ることができる。
【００７６】
抗体を作製するために、宿主動物は、本明細書中に記載のポリペプチドおよび/またはポリペプチド断片および/または類似体を用いて免疫感作でき、抗体作製に関与する細胞を抽出する前に免疫応答を誘導できる。
【００７７】
本明細書中に記載の方法によって得られる抗体は、特定の組織または体液においてタンパク質、変異体および誘導体ポリペプチドを検出するために有用であり得る。さらに異常に発現したタンパク質またはタンパク質断片の検出は、疾患状態の証拠となる。例えば、NSEQのポリヌクレオチドによってコードされる本ポリペプチドまたはそれらの部分の発現は、タンパク質が不適切な速度でまたは不適切な発生段階で発現していることを示唆できる。故に、本抗体は、本明細書中に開示のNSEQ由来のタンパク質発現に関連する疾患の検出に有用であり得る。
【００７８】
インビボの検出目的に関しては、抗体は、腫瘍細胞の表面に存在するエピトープを好んで認識するものであってよい。
【００７９】
ELISA、RIAおよびFACSを含む、ポリペプチドを測定するための様々なプロトコルが当分野において周知であり、発現レベルの変化および異常を診断するための基準を提供する。ポリペプチド発現の標準値は、健康な対象、好ましくはヒトから採取した試料を、ポリペプチドに対する抗体と、複合体形成のための条件下で、結合させることによって確立される。複合体形成の量は、光度法などの様々な方法によって定量化できる。疾患の試料において発現したポリペプチドの量を、標準値と比較できる。標準値と対象値との偏差は、疾患の診断および観察のためのパラメーターを確立できる。
【００８０】
免疫測定法の設計には多くの変形があり、これらの多くは当分野において公知である。免疫測定法は、検査する抗原の1つのエピトープに対する、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体の試薬が使用できる。あるいは、複数のエピトープに対する、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体の組合せが使用できる。プロトコルは、例えば、競合的薬剤スクリーニングアッセイを使用できる競合に基づき、このアッセイではNSEQのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらの部分に結合できる中和抗体が、ポリペプチド結合用試験化合物と特異的に競合する。あるいは、直接抗原-抗体反応またはサンドウィッチ型アッセイが使用でき、プロトコルは、例えば、固体担体または免疫沈降法を使用する。さらに、抗体は、検出を容易にするためにレポーター分子を用いて標識できる。結合した試薬からのシグナルを増幅するアッセイもまた、公知である。例としては、アビジンおよびビオチンを利用するまたはELISAアッセイなどの酵素-標識抗体または抗原複合体を利用する免疫測定法が挙げられる。
【００８１】
免疫診断に適した、適切な標識試薬を含むキットは、残りの試薬およびアッセイの実施に必要な材料ならびにアッセイの指示書の適切なセットと共に適切に梱包された、ポリペプチドタンパク質エピトープまたは抗原領域に対する抗体を含む。
【００８２】
本発明はしたがって、本明細書中に記載のポリペプチドを特異的に検出するためのキットを提供し、キットは、例えば、本明細書中に記載のポリペプチドと特異的に結合できる抗体または抗体断片を含むことができる。
【００８３】
本発明によれば、キットは診断キットであってよく、
a)本明細書中に記載の1種または複数種の抗体と、
b)レポーター基を含み得る検出試薬と
を含むことができる。
【００８４】
本発明によれば、抗体は、固体担体に固定化されてよい。検出試薬は、例えば、抗免疫グロブリン、プロテインG、プロテインAまたはレクチンなどを含み得る。レポーター基は、限定するものではないが、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび染料粒子からなる群から選択してよい。
【００８５】
治療薬または治療標的としてのNSEQ、PSEQの使用
当業者は、上述のNSEQ、PSEQ、発現系、アッセイ、キットおよびアレイが、特定の治療処置計画の有効性を評価するために、動物実験において、臨床試験において、あるいは個体対象の治療を観察するためにもまた使用できることを容易に認識するであろう。ひとたび疾患の存在が確立され、治療計画を開始すると、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイを、患者におけるmRNAまたはタンパク質のレベル(患者の血液、組織、細胞など)が、健康な対象において観察されるレベルに近づき始めるかどうかを確定するために定期的に繰り返す場合がある。継続的なアッセイから得られた結果を、数日から何年かにおよぶ期間にわたる治療の有効性を示すために使用できる。
【００８６】
本発明のさらに別の態様において、mRNAおよびポリペプチドを発現するあるいは逆にmRNAの転写および/または翻訳を遮断する目的のために、NSEQを治療的に使用できる。発現ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスもしくはワクチンウイルス由来の成分または細菌のプラスミドなどを使用して構築できる。これらのベクターは、ヌクレオチド配列を、特定の標的臓器、組織または細胞集団に送達するために使用できる。当業者に公知の方法を、核酸配列またはそれらの相補体を発現するためのベクターを構築するために使用できる。
【００８７】
あるいは、NSEQは、体細胞または幹細胞の遺伝子療法のために使用できる。ベクターを、インビボ、インビトロおよびエクスビボで導入できる。エクスビボ療法では、ベクターを、対象から採取した幹細胞に導入し、得られたトランスジェニック細胞を、同じ対象に自己移植するためにクローン的に繁殖させる。形質移入、リポソーム注入またはポリカチオン性アミノポリマーによるNSEQの送達は、当分野において周知の方法を使用して達成できる。さらに、内在性NSEQの発現は、不活性遺伝子配列をコード領域または他のNSEQの標的化領域に挿入する、相同的組み換え法を使用して不活性化できる。
【００８８】
達成すべき特定の目的により、NSEQを含むベクターは、欠損したポリペプチドの発現、または非機能的ポリペプチドの交換のために、細胞または組織に導入できる。当然のことながら、細胞または組織においてPSEQの発現を希望する場合、その目的のためにこのようなPSEQをコードできるNSEQが使用でき、あるいはその細胞または組織にPSEQを直接投与できる。
【００８９】
他方では、PSEQの発現を減衰または抑制することを希望する場合、このようなPSEQをコードできるNSEQの少なくとも一部と実質的に相補的なNSEQ(例えば、抑制NSEQ)が使用できる。
【００９０】
抑制NSEQの発現は、抑制NSEQをベクター内にクローン化し、ベクターを細胞に導入し、標的NSEQによりコードされるポリペプチドの発現を下方制御することによって実施することができる。相補的またはアンチセンス配列は、転写開始部位(ATGから約-10と+10の位置の間のヌクレオチドが使用できる)に由来するオリゴヌクレオチドもまた含むことができる。したがって、抑制NSEQは、抑制されるべき望ましい核酸分子と実質的に相補的な部分および核酸の非翻訳部分に結合する部分(配列)を包含できる。
【００９１】
同様に、抑制は三重らせん塩基対方法論を使用して達成できる。三重らせん対は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子と結合するために十分開くための二重らせんの能力を抑制するため、有用である。三重DNAを使用する最近の治療法の進歩は、文献に記載されている(Gee他、1994年等を参照されたい)。
【００９２】
リボザイム、酵素的RNA分子は、mRNAの切断を触媒し、本発明のポリヌクレオチド配列を含むものなどの特定のmRNAのレベルを減少させるためにもまた、使用できる。リボザイムは、特定の切断部位でmRNAを切断できる。あるいは、リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成するフランキング領域により指示された位置でmRNAを切断できる。リボザイムの構築および作製は、当分野において周知である。
【００９３】
RNA分子は、細胞内の安定性および半減期の増加のために修飾できる。有望な修飾は、限定するものではないが、分子の5'および/または3'末端へのフランキング配列の付加、あるいは分子骨格内においてホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエート結合または2'O-メチル結合を使用することを含む。あるいは、イノシン、キューオシンおよびワイブトシンなどの非伝統的塩基ならびに内在性エンドヌクレアーゼにより容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および類似の修飾形態が含まれ得る。
【００９４】
医薬組成物もまた、本発明に包含される。医薬組成物は少なくとも1種のNSEQまたはPSEQと、薬学的に許容可能な担体とを含み得る。
【００９５】
当業者に認識されるであろうが、腫瘍細胞における発現NSEQおよび/またはPSEQの特異性は、このような配列を発現する腫瘍を有するまたは有する疑いのある個体において、免疫応答の誘導(それらの投与を介して)のために、有利に使用できる。このような配列を発現する腫瘍の発生の危険にある個体における、NSEQおよび/またはPSEQの投与もまた本明細書中に包含される。
【００９６】
活性成分に加えて、医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用できる製剤に加工することを容易にする、賦形剤および補助剤を含む、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
【００９７】
任意の化合物では、治療有効量は、細胞培養アッセイあるいはマウス、ラット、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルのどちらかにおいて、初めに確定できる。動物モデルもまた、投与の濃度範囲および経路を決定するために使用できる。このような情報は、その後ヒトにおける投与の有用な用量および経路を決定するために使用できる。これらの技術は、当業者に周知であり、治療有効量は、症状または病態を改善する活性成分の量を指す。治療有効性および毒性は、ED50(集団の50%において治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50%に対して死をもたらす用量)の統計値を算出し、対比することによってなどの、細胞培養による、または実験動物を用いた標準的な薬学的手法により決定できる。上記載の治療組成物のいずれかを、限定するものではないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルおよび最も好ましくはヒトなどの哺乳類を含む、このような療法を必要とする任意の対象に適用できる。
【００９８】
本発明に利用する医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下の、腹腔内、経鼻、腸内、局所的、舌下または直腸の方法を含む、いくつもの経路によって投与できる。
【００９９】
本開示の目的のための「治療」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指し、目的は標的とする病態または障害を防止するまたは遅延(減少)させることである。治療を必要とする人々は、すでに障害を有する人々ならびに障害を有しやすい人々または障害が防止されるべき人々を含む。
【０１００】
一般研究におけるNSEQの使用
本発明は、本明細書中に記載のNSEQ、本明細書中に記載のNSEQによりコードされるポリペプチド、本明細書中に記載のPSEQを、研究、生物学的、臨床的および治療の目的のために利用する、製品、組成物、過程および方法もまた提供する。例えば、スプライス変異体、突然変異および多型を同定すること、ならびに診断および予後予測ツールを作製すること。
【０１０１】
NSEQは、一部のヌクレオチド配列を利用して、プロモーターおよび他の調節要素などの上流配列を検出するための、当分野において公知の様々なPCRに基づく方法を用いて、伸長できる。さらに、XL-PCRキット(PE Biosystems、Foster City Calif.)、ネストプライマーおよび市販のcDNAライブラリー(Life Technologies、Rockville Md.)またはゲノムライブラリー(Clontech、Palo Alto Calif.)を、配列を伸長するために使用できる。
【０１０２】
ポリヌクレオチド(NSEQ)は、マイクロアレイにおいて標的としてもまた使用できる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現パターンを同時に観察でき、スプライス変異体、突然変異および多型を同定するために使用できる発現パターンの分析からの情報は、遺伝子機能の決定、特定の細胞、細胞型、組織の同定、疾患の遺伝的基礎への理解、疾患の診断および疾患の治療に使用した治療薬の活性の発展および観察に使用できる。マイクロアレイは、遺伝的多様性、ゲノムレベルで特定の集団を特徴づけできる、一塩基多型の検出にもまた使用できる。
【０１０３】
ポリヌクレオチド(NSEQ)は、天然発生のゲノム配列のマッピングにおいて有用な、ハイブリダイゼーションプローブの作製にもまた使用できる。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子地図データと相関させることができる。
【０１０４】
卵巣癌細胞(例えば、悪性卵巣癌細胞)において上方制御される配列は、癌細胞(本明細書中において、卵巣癌の陽性制御因子と称する)の成長、発生、悪性度などにかかわる、または関与する配列を表し得ることが、本明細書において理解される。悪性卵巣癌細胞において下方制御される配列(発現しない、または低いレベルで発現する)が、卵巣細胞の正常状態(形質転換しない)の維持に関与する配列(本明細書中では卵巣癌の陰性調節因子と称する)を表し得ることもまた理解される。したがって、いくつかの配列の存在または不在の両方が疾患を示唆でき、あるいは疾患、疾患を有する可能性、疾患の重篤度(病期)を示唆できる。
【０１０５】
したがって、本発明は、本発明の態様において、
a)配列番号1から配列番号49および配列番号169のいずれか1つを含み得る、またはからなるポリヌクレオチド、
b)配列番号1から配列番号49および配列番号169のいずれか1つのオープンリーディングフレームを含み得るポリヌクレオチド、
c)配列番号1から配列番号49および配列番号169のいずれか1つの転写部分または転写可能部分を含み得、例えば、非翻訳部分または翻訳不可能部分を含み得ないポリヌクレオチド、
d)配列番号1から配列番号49および配列番号169のいずれか1つの翻訳部分または翻訳可能部分(例えば、コード部分)を含み得るポリヌクレオチド、
e)a)、b)、c)またはd)と実質的に同一である(例えば、全配列または配列の部分にわたって約50から100%、または約60〜100%、または約70〜100%、または約80〜100%、または約85、90、95〜100%同一である)配列を含み得るポリヌクレオチド、
f)a)、b)、c)またはd)と実質的に相補的な(例えば、全配列または配列の部分にわたって約50から100%、または約60〜100%、または約70〜100%、または約80〜100%、または約85、90、95〜100%の相補性)配列を含み得るポリヌクレオチド、および
g)a)からf)のいずれか1つの断片
からなる群から選択されるメンバーを含み得る、上記からなるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド(例えば、外来型)に関する。
【０１０６】
より具体的には、本発明は、
a)配列番号1、配列番号14、配列番号16、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号28、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46、配列番号47および配列番号49のいずれか1つを含み得る、またはからなるポリヌクレオチド、さらにより具体的には、配列番号14、配列番号19、配列番号22、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46および配列番号49からなる群から選択されるポリヌクレオチド、
b)配列番号1、配列番号14、配列番号16、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号28、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46、配列番号47および配列番号49のいずれか1つのオープンリーディングフレームを含み得るポリヌクレオチド、さらにより具体的には、配列番号14、配列番号19、配列番号22、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46および配列番号49からなる群から選択されるポリヌクレオチド、
c)配列番号1、配列番号14、配列番号16、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号28、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46、配列番号47および配列番号49のいずれか1つの転写部分または転写可能な部分を含み得るポリヌクレオチド、さらにより具体的には、配列番号14、配列番号19、配列番号22、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46および配列番号49からなる群から選択され、例えば、非翻訳部分または翻訳不可能な部分を含み得ないポリヌクレオチド、
d)配列番号1、配列番号14、配列番号16、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号28、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46、配列番号47および配列番号49のいずれか1つの翻訳部分または翻訳可能な部分を含み得るポリヌクレオチド、さらにより具体的には、配列番号14、配列番号19、配列番号22、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号46および配列番号49からなる群から選択されるポリヌクレオチド(例えば、コード部分)、
e)a)、b)、c)またはd)と実質的に同一である(例えば、全配列または配列の部分にわたって約50から100%、または約60〜100%、または約70〜100%、または約80〜100%、または約85、90、95〜100%同一である)配列を含み得るポリヌクレオチド、
f)a)、b)、c)またはd)と実質的に相補的な(例えば、全配列または配列の部分にわたって約50から100%、または約60〜100%、または約70〜100%、または約80〜100%、または約85、90、95〜100%の相補性)配列を含み得るポリヌクレオチド、
g)a)からf)のいずれか1つの断片
からなる群から選択される、上記からなるポリヌクレオチドを含む発現ポリヌクレオチドに関する。
【０１０７】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドを含み得るベクター(例えば、ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、プラスミド、コスミドなど)もまた、本発明に包含される。ベクターは、例えば、発現ベクターであってもよい。
【０１０８】
本発明は、本明細書中に記載の少なくとも1種のポリヌクレオチド(例えば、少なくとも2種)(配列番号50を含み得る)を含む、ポリヌクレオチドのライブラリーをさらに提供する。ライブラリーは、例えば、発現ライブラリーであってもよい。本明細書中に記載のポリヌクレオチドのいくつかまたは全部は、発現ベクター内に含むことができる。本発明は、本明細書中に記載の少なくとも1種(例えば、少なくとも2種)のポリペプチドを含み得るポリペプチドライブラリーにも関する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載の少なくとも1種のポリヌクレオチド(例えば、少なくとも2種)を含み得るアレイを提供する。本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド、ベクターまたはポリペプチドを含み得る単離細胞(単離された哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などの単離生細胞)を、さらに提供する。
【０１１０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１１１】
本発明によれば、組成物は、例えば、本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含み得る医薬組成物であってよい。より具体的には、医薬組成物は、卵巣癌の治療および/または卵巣癌細胞の成長を抑制するために使用できる。
【０１１２】
上記のポリヌクレオチド断片は、a)からe)のいずれか1つに対応する部分、より具体的には、配列番号1から49、50または169のいずれか1つのコード部分と同一であり得る、少なくとも10個の核酸を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１１３】
本発明に包含されるポリヌクレオチド断片の別の例示的実施形態は、配列番号1から49、50または169のいずれか1つのコード部分の対応部分と実質的に相補的であり得る、少なくとも10個の核酸を含むポリヌクレオチドを含み、例えば、配列番号103から150のいずれか1つからなる群から選択される断片を包含する。
【０１１４】
これら上記の配列は、癌、より具体的には、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、白血病、メラノーマ、腎臓癌、結腸癌、肺癌、中枢神経系の癌およびそれらの任意の組合せの強力なマーカーを表す。
【０１１５】
本明細書中に提示された結果および本説明の見解に基づき、当業者は、癌細胞において発現したこれらの中の所与の配列の存在に関する試験(ハイブリダイゼーション、PCR増幅など)に関する陽性シグナルが、このような配列がその型の癌細胞において特異的に発現したことを示すことを理解するであろう。当業者は、特定の型の癌細胞において特異的に発現する配列が、この特定の型の癌細胞の検出用ツールの開発に使用でき、抗癌剤の開発において標的として使用できることを、さらに理解するであろう。
【０１１６】
陽性シグナルは、電気泳動、ノーザンブロットまたはウェスタンブロットによるゲルのバンド、蛍光発光により検出したPCR断片の形態であってよい。
【０１１７】
理解されるであろうが、癌細胞の検出用ツールの開発に特に有用である配列は、少なくともいくつかの正常細胞(非癌細胞)において低いレベルで発現できることが好ましい。
【０１１８】
例えば、図57および関連する説明において、卵巣癌細胞、腎臓癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞およびメラノーマ細胞から得られたmRNAのRT-PCR増幅によるバンドの出現は、配列番号1がこのような癌細胞において発現したこと、したがって、配列番号1は有効なマーカーを表すことができ、これらの型の癌細胞を標的とできることを示唆する。同様の結論が、他の図および関連する説明から得られた結果から導かれる。
【０１１９】
表2に記載されたNSEQ、または表2のNSEQの断片と実質的に相補的であるNSEQから選択されたNSEQは、癌の治療に使用できる。
【０１２０】
したがって、本発明は、癌細胞を同定する方法に関する。本方法は、細胞、細胞試料(細胞溶解物)、体液(血液、尿、血漿、唾液など)または組織を、例えば、本明細書中に記載のNSEQまたはPSEQの少なくとも1種に特異的に結合できる試薬と接触させるステップを含み得る。本方法は、より詳細には、このような細胞、試料、体液または組織から単離した、または由来する配列を接触させるステップを含み得る。複合体の形成は、当分野において公知の方法を使用して検出できる。
【０１２１】
本発明によれば、上述の複合体の存在から、癌細胞の存在が示唆され得る(存在の積極的示唆)。
【０１２２】
本発明は、それらの追加の態様において、癌の診断または予後予測のための方法にもまた、さらに関する。本方法は、例えば、細胞、組織、試料、体液などにおいて、本明細書中に記載の少なくとも1種のNSEQまたはPSEQを検出するステップを含み得る。
【０１２３】
細胞、細胞試料、体液または組織は、例えば、癌、より具体的には、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、白血病、メラノーマ、腎臓癌、結腸癌、肺癌および/または中枢神経系の癌を有する、または有すると疑われる個体に由来し得る。上述の方法はいずれも、得られたレベルを、少なくとも1つの基準のレベルまたは値と比較するステップをさらに含む。
【０１２４】
NSEQの検出は、目的とする検出に十分な材料を有するために増幅(例えば、PCR)ステップを必要とする。
【０１２５】
本発明によれば、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、例えば、部分または完全な、一本鎖または二本鎖の、ハイブリッドの、基によって修飾されたものを含むRNA分子、DNA分子を含むことができる。
【０１２６】
本明細書に包含される本発明の他の態様は、本明細書中に記載の少なくとも1種のNSEQまたはPSEQおよび由来する抗体の、癌細胞(例えば、腫瘍細胞)の同定または検出用、あるいは癌細胞の成長を抑制または低減させるための組成物の製造への使用(例えば、卵巣癌または他の癌の治療用)を含む。
【０１２７】
いくつかのNSEQおよびPSEQは、LMPより悪性卵巣癌において高いレベルで発現するので、個体由来(またはインビボ)の試料においてNSEQまたはPSEQなどが検出されることにより、低悪性度の潜在的卵巣癌を除外でき、したがって悪性卵巣癌の診断において結論を出せる。さらに、個体由来の細胞、組織、試料または体液におけるNSEQまたはPSEQの検出は、後期悪性卵巣癌もまた表示できる。そのようにして、悪性卵巣癌または後期悪性卵巣癌の治療に適用された療法が開始できる。
【０１２８】
本発明の実施形態に従って、本方法は、試験細胞、試験試料、試験体液または試験組織に存在する、少なくとも1種の複合体のレベル(量、存在)と、正常細胞、正常細胞試料、正常体液、正常組織または基準値(例えば、非癌性状態の)における複合体のレベルとを比較するステップをさらに含むことができる。
【０１２９】
正常細胞は、検出されるべき望ましい配列を実質的に発現しない、任意の細胞であってよい。このような正常細胞の例は、例えば、図の項の説明に含まれる。正常細胞試料または組織は、したがって、例えば正常(非癌性)卵巣細胞、正常乳腺細胞、正常前立腺細胞、正常リンパ球、正常皮膚細胞、正常腎臓細胞、正常結腸細胞、正常肺細胞および/または中枢神経系の正常細胞を含む。比較の目的で、正常細胞を、同一または類似の細胞型のものから選択できる。
【０１３０】
当然のことながら、診断方法の正確さを増すために、複数の複合体を存在させることができる。そのような場合、少なくとも2種の複合体(例えば、第1の試薬と第1のポリヌクレオチドおよび第2の試薬または第2のポリヌクレオチドにより形成される)または複数の複合体が検出できる。
【０１３１】
本明細書中に記載のNSEQを検出するために使用できる試薬の例示的実施形態は、該NSEQと実質的に相補的な配列を含み得るポリヌクレオチドである。
【０１３２】
適切な基準のレベルまたは値は、例えば、低悪性度の潜在的卵巣癌内の、および/または正常細胞の特定の配列の発現レベルに由来し得る。
【０１３３】
基準値または試料と比較して、癌細胞、組織または試料において測定された高い発現レベルから、被験個体における癌の存在が示唆されることが、本明細書において理解されるであろう。
【０１３４】
例えば、正常細胞(正常卵巣細胞または正常な非卵巣細胞)に関する基準のレベルまたは値と比較して、卵巣細胞、卵巣組織または卵巣起源の試料において測定された高いレベルから、卵巣癌が示唆され得る。比較の目的で、検出または同定されるべき望ましいNSEQまたはPSEQの発現の存在またはレベルを、望ましい配列が発現しないことが本明細書中で示されている正常細胞で認められる発現の存在またはレベルと比較できる。
【０１３５】
治療的使用および治療方法は、本明細書にさらに包含される。
【０１３６】
本発明は、したがって、卵巣癌細胞(例えば、哺乳動物またはそれらの哺乳動物細胞における)の成長を減少できるまたは抑制できるポリヌクレオチドを提供する。
【０１３７】
本発明は、したがって、さらなる態様において、
a)配列番号1から配列番号49、50または169のいずれか1つと実質的に相補的な配列を含み得るポリヌクレオチド、
b)配列番号1から49、50または169のいずれか1つの転写部分または転写可能部分と実質的に相補的な配列を含み得るポリヌクレオチド、
c)配列番号1から49、50または169のいずれか1つの翻訳部分または翻訳可能部分と実質的に相補的な配列を含み得るポリヌクレオチド、および
d)a)からc)のいずれか1つの断片
からなる群から選択され得るポリヌクレオチド配列の、癌細胞の成長を減少、低減または抑制するための使用に関する。
【０１３８】
ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号1から配列番号49、50および169のいずれか1つの核酸配列と(例えば、非翻訳部分を含み得ない、翻訳部分に)相補的である、少なくとも10個のヌクレオチドの配列を含み得るポリヌクレオチドからなる群から選択できる。
【０１３９】
当然のことながら、本発明は、NSEQ(例えば、発現ベクターにおいて)またはPSEQを投与するステップによって個体を免疫感作するステップを包含する。
【０１４０】
本発明は、必要とする個体において卵巣癌細胞の成長を低下または遅延させる方法にも関する。本方法は、個体に
a)配列番号1から配列番号49および169または50のいずれかと実質的に相補的な(部分にわたって100%相補的な、例えば完全な一致も含む)配列を含み得るポリヌクレオチド、
b)配列番号1から49および169または50のいずれか1つの転写部分または転写可能部分と実質的に相補的な(部分にわたって100%相補的な、例えば完全な一致も含む)配列を含み得るポリヌクレオチド、
c)配列番号1から49および169または50のいずれか1つの翻訳部分または翻訳可能部分と実質的に相補的な(部分にわたって100%相補的な、例えば完全な一致も含む)配列を含み得るポリヌクレオチド、および
d)a)からc)のいずれか1つの断片
からなる群から選択できるポリヌクレオチド配列を投与するステップを含み得る。
【０１４１】
本発明は、したがって、それらのさらに別の態様において、
a)配列番号1から配列番号49および配列番号169または配列番号50のいずれか1つを含み得るポリヌクレオチド、
b)配列番号1から49および169または配列番号50のいずれか1つの転写部分または転写可能部分を含み得るポリヌクレオチド、
c)配列番号1から49および169または配列番号50のいずれか1つの翻訳部分または翻訳可能な部分を含み得るポリヌクレオチド、および
d)a)、b)またはc)と実質的に同一な配列を含み得るポリヌクレオチド
からなる群から選択される核酸の発現を低減できるsiRNAまたはshRNA分子を提供する。
【０１４２】
ポリヌクレオチドの例示的実施形態は、例えば、配列番号103から150のいずれか1つからなる群から選択される配列を有する、または含むポリヌクレオチドなどの、例えば、卵巣癌細胞の成長を抑制できるポリヌクレオチドである。これらの特定の配列を、単なる手引きとして、本発明の範囲を限定する意図ではなく提供する。
【０１４３】
本発明は、癌の診断用キットをさらに提供する。キットは、本明細書中に記載の少なくとも1種のポリヌクレオチドおよび/または本明細書中に記載の少なくとも1種のポリヌクレオチドと特異的に結合できる試薬を含むことができる。
【０１４４】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドに関する。
【０１４５】
本発明は、より具体的には、
a)配列番号51から88および170のいずれか1つを含み得るポリペプチド、
b)本明細書中に記載のポリヌクレオチドのいずれか1つによりコードされ得るポリペプチド、
c)a)またはb)のいずれか1つの断片、
d)a)またはb)のいずれか1つの誘導体、および
e)a)またはb)のいずれか1つの類似体
からなる群から選択され得る単離ポリペプチドを提供する。
【０１４６】
本発明によれば、類似体は、そのアミノ酸配列中に、例えば少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含み得る。
【０１４７】
置換は、保存的または非保存的であってもよい。ポリペプチド類似体は、元の配列と比較して、例えば少なくとも1個のアミノ酸置換(保存的または非保存的)、例えば、1から5個、1から10個、1から15個、1から20個、1から50個(その間の任意の数を含む)などを含み得る生理活性類似体または免疫原性類似体であってもよい。免疫原性類似体は、例えば、元の配列と比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含み得、依然として元の配列に特異的な抗体と結合できる。
【０１４８】
本発明によれば、ポリペプチド断片は、配列番号1から49および169からなる群または配列番号51から88および170のいずれか1つ(それらの変異体または類似体を含む)から選択されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドからなる群から選択される、例えば、少なくとも6個の連続したアミノ酸、少なくとも8個の連続したアミノ酸またはそれを超えるアミノ酸配列を含み得る。断片は、免疫原性であってもよく、例えば抗体の作製目的に使用できる。
【０１４９】
本発明に包含されるポリペプチドの例示的実施形態は、配列番号1から49および169のいずれか1つによりコードされ得るポリペプチド、より具体的には、配列番号1、14、16、19、20、22、28、37、41、45、46、47または49のいずれか1つによりコードされるポリペプチド、さらにより具体的にはには、配列番号14、19、22、37、41、45、46または49のいずれか1つによりコードされるポリペプチドである。
【０１５０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の単離された差次的発現配列によりコードされ得るポリペプチドに関する。本発明は同様に、非ヒトオルソログポリペプチド、それらの類似体、誘導体および断片によりコードされるポリペプチドに関する。
【０１５１】
当業者は、一般的に特定のコード配列に存在する最大6つの有望なオープンリーディングフレームの様な、特定の核酸配列によりコードされる有望なペプチド配列を容易に決定できる。第1の有望なオープンリーディングフレームは、配列の最初のヌクレオチドから開始でき(5'〜3')、したがって5'から3'方向に、ヌクレオチドの1番から3番を第1コドンとして使用し、ヌクレオチドの4番から6番を第2のコドンとして使用する、などとなる。第2の有望なオープンリーディングフレームは、配列の2番目のヌクレオチドから開始でき(5'〜3')、したがって5'から3'方向に、ヌクレオチドの2番から4番を第1コドンとして使用し、ヌクレオチドの5番から7番を第2のコドンとして使用する、などとなる。最後に第3の有望なオープンリーディングフレームは、配列の3番目のヌクレオチドから開始でき(5'〜3')、したがって5'から3'方向に、ヌクレオチドの3番から5番を第1コドンとして使用し、ヌクレオチドの6番から8番を第2のコドンとして使用する、などとなる。第4の有望なオープンリーディングフレームは、配列の1番目のヌクレオチドから、3'から5'方向に開始でき、したがって3'から5'方向に、ヌクレオチドの1番から3番を第1コドンとして使用し、ヌクレオチドの4番から6番を第2のコドンとして使用する、などとなる。第5の有望なオープンリーディングフレームは、配列の2番目のヌクレオチドから、3'から5'方向に開始でき、したがって3'から5'方向に、ヌクレオチドの2番から4番を第1コドンとして使用し、ヌクレオチドの5番から7番を第2のコドンとして使用する、などとなる。最後に第6の有望なオープンリーディングフレームは、配列の3番目のヌクレオチドから、3'から5'方向に開始でき、したがって3'から5'方向に、ヌクレオチドの3番から5番を第1コドンとして使用し、ヌクレオチドの6番から8番を第2のコドンとして使用する、などとなる。
【０１５２】
追加の態様において、本発明は、癌細胞(腫瘍細胞)の同定または検出用組成物の製造における少なくとも1種のポリペプチドの使用に関する。ポリペプチドは、例えばアッセイにおける基準および/または特定のポリペプチドに特異的な抗体の検出用に使用できる。さらに追加の態様において、本発明は、本明細書中に記載の少なくとも1種のポリペプチドの、例えば、卵巣癌細胞または本明細書中に記載のような任意の他の癌細胞などの癌細胞の同定または検出への使用に関する。
【０１５３】
本発明は、したがって、さらなる態様において、本明細書中に記載の少なくとも1種のポリペプチドの、例えば悪性卵巣癌または低悪性度の潜在的卵巣癌などの癌の予後予測または診断への使用に関する。
【０１５４】
したがって、本発明によれば、個体由来の細胞(例えば、卵巣細胞)、組織(例えば、卵巣組織)、試料または体液におけるポリペプチドの検出から、悪性卵巣癌の診断が低悪性度の潜在的卵巣癌の診断より優先的に示唆され、したがって、低悪性度の潜在的卵巣癌ではなく悪性卵巣癌が優先的に示唆され得る。
【０１５５】
さらに本発明によれば、個体由来の細胞、組織、試料または体液におけるポリペプチドの存在から、後期悪性卵巣癌が優先的に示唆され得る。
【０１５６】
本発明は、癌細胞を同定する方法を提供し、本方法は、例えば、試験細胞、試験細胞試料(細胞溶解物)、試験体液(血液、尿、血漿、唾液など)または試験組織と、本明細書中に記載のポリペプチドと特異的に結合できる試薬とを接触させるステップと、ポリペプチドおよび試薬により形成される複合体を検出するステップを含み得る。複合体の存在から、例えば、卵巣癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、白血病、メラノーマ、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、中枢神経系の癌およびそれらの任意の組合せなどの癌細胞が示唆され得る(存在の積極的示唆)。
【０１５７】
ポリペプチドおよび特異的な試薬により形成される複合体の存在から、例えば、低悪性度の潜在的卵巣癌または悪性卵巣癌を含む卵巣癌が示唆され得る。
【０１５８】
しかし、本方法は、悪性型の卵巣癌の検出に関して、とりわけ強力である。したがって、複合体の存在から、低悪性度の潜在的卵巣癌と比較して(ではなく)悪性卵巣癌が優先的に示唆され得る。
【０１５９】
複合体の検出から、後期悪性卵巣癌も示唆され得る。
【０１６０】
本発明によれば、本方法は、試験細胞、試験試料、試験体液または試験組織に存在する少なくとも1種の複合体のレベル(量、存在)を、正常細胞、正常細胞試料、正常体液、正常組織における複合体のレベルまたは(例えば、非癌性状態の)基準値と定性的または定量的に比較するステップをさらに含むことができる。
【０１６１】
当然のことながら、複数のポリペプチドまたは複合体(2種の複合体またはそれ以上(複数種の複合体))の存在も決定でき、例えば、第1特異試薬と第1のポリペプチドにより形成されるもの、および第2の特異試薬と第2のポリペプチドにより形成される別のものが検出できる。複数種のポリペプチドまたは複合体の検出は、細胞の腫瘍原性の決定を助けることができる。
【０１６２】
本明細書中に記載のポリペプチドの検出に使用できる試薬の例示的実施形態は、抗体およびその抗体断片である。
【０１６３】
本発明は、さらに、本明細書中に記載の少なくとも1種のポリペプチドおよび/または本明細書中に記載の少なくとも1種のポリペプチドに特異的に結合できる試薬を含み得るキットに関する。
【０１６４】
当業者なら理解するであろうが、ポリペプチドを含む組成物は、例えば、特定のポリペプチドに対する抗体作製に使用でき、アッセイおよびキットなどの基準として使用できる。
【０１６５】
本発明の追加の態様は、
a)配列番号51から89または170のいずれか1つを含む、またはからなるポリペプチド、および
b)本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列(例えば、ポリペプチドの少なくとも6個のアミノ酸の断片)を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドと特異的に結合できる単離または精製抗体(その抗原結合断片を含む)に関する。
【０１６６】
より具体的には、本発明の例示的実施形態は、配列番号1、14、16、19、20、22、28、37、41、45、46、47もしくは49のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列または該ポリペプチドの少なくとも6個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドと特異的に結合できる抗体に関する。
【０１６７】
本発明のさらにより具体的な例示的実施形態は、配列番号14、19、22、37、41、45、46もしくは49のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列または該ポリペプチドの少なくとも6個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドと特異的に結合できる抗体に関する。
【０１６８】
さらなる追加の態様において、本発明は、
a)配列番号51から88、89および170のいずれか1つを含み得るポリペプチド、および
b)本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列または該ポリペプチドの少なくとも6個のアミノ酸の断片を含み得るポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドと特異的に結合できる抗体を産生できるハイブリドーマ細胞に関する。
【０１６９】
本発明により具体的に包含される例示的ハイブリドーマは、配列番号1、14、16、19、20、22、28、37、41、45、46、47、もしくは49のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列または該ポリペプチドの少なくとも6個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドと特異的に結合できる抗体を産生できるハイブリドーマである。
【０１７０】
本発明に、さらにより具体的に包含されるハイブリドーマの例示的実施形態は、配列番号14、19、22、37、41、45、46、もしくは49のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列または該ポリペプチドの少なくとも6個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドと特異的に結合できる抗体を産生できるハイブリドーマである。
【０１７１】
本発明はさらに、本明細書中に記載の抗体を含み得る組成物に関する。
【０１７２】
さらなる態様において、本発明は、例えば、
a)配列番号51から88、89および170またはそれらの断片のいずれか1つを含み得、またはからなり得るポリペプチド、および
b)本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列またはその部分を含み得るポリペプチド
からなる群から選択され得るポリペプチドの免疫原性断片(少なくとも6個のアミノ酸、少なくとも8個のアミノ酸など)で非ヒト動物を免疫感作するステップを含み得る、抗体の作製方法を提供する。
【０１７３】
抗体作製に使用できる例示的ポリペプチドは、より具体的には、配列番号1、14、16、19、20、22、28、37、41、45、46、47または49のいずれか1つによりコードされるポリペプチド(およびこれらの特定のPSEQのポリペプチド断片を含むポリペプチド)である。本発明により包含されるさらにより具体的なポリペプチドは、配列番号14、19、22、37、41、45、46または49のいずれか1つによりコードされるポリペプチドである。
【０１７４】
さらなる態様において、本発明は、例えば、配列番号51から88および170のいずれか1つからなる群から選択され得るポリペプチド、または配列番号1から49および169のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列(例えば、転写部分、翻訳部分、断片、実質的に同一およびさらと実質的に相補的な配列)を含むポリペプチドの活性または機能を抑制できる化合物を同定する方法に関する。本方法は、ポリペプチドを推定上の化合物と接触させるステップと、上述のポリペプチドのいずれか1種と特異的に結合できる化合物を単離または同定するステップとを含み得る。化合物は、コンビナトリアルライブラリーから得られる。
【０１７５】
本方法はまた、ポリペプチドの活性または機能(例えば、表2に示される機能など)が、化合物と結合することによって影響を受けるかどうかを確定するステップをさらに含み得る。ポリペプチドと結合できるおよび/またはポリペプチドの機能活性を改変できるそれらの化合物は、癌療法に使用されるべき望ましい化合物を表している。
【０１７６】
本方法はまた、卵巣癌細胞などの癌細胞の成長に対する推定上の化合物の効果を確定するステップもさらに含み得る。
【０１７７】
本発明は、卵巣癌の成長または発生に関与する核酸配列および/またはタンパク質を同定するためのアッセイおよび方法にさらに関する。本アッセイおよび方法は、卵巣癌細胞などの癌細胞の内在性遺伝子をサイレンシングするステップと、候補核酸(またはタンパク質)を有する細胞を提供するステップとを含み得る。癌細胞(例えば卵巣癌細胞)の死(例えばアポトーシス)に積極的に関与する候補遺伝子(またはタンパク質)は、サイレンシングされた内在性遺伝子を補うその能力により同定され得る。内在性遺伝子がサイレンシングされている細胞に提供された、例えば卵巣癌に関与する候補核酸は、アポトーシスの誘導因子の存在下で、より多くの細胞をアポトーシスに至らせることが可能である。
【０１７８】
あるいは、アッセイまたは方法は、評価すべき候補の核酸配列またはタンパク質配列に対応する内在性遺伝子(遺伝子発現)をサイレンシングするステップと、癌の成長(例えば、卵巣癌細胞の成長)に関する候補の核酸またはタンパク質の効果を確定するステップとを含み得る。癌の成長、発生または悪性度の促進または抑制に関与する配列は、細胞の生存能力を改変でき、細胞の成長またはコロニー形成などの能力を改変できる。ポリペプチドの活性は、抗体分子を有するこのようなポリペプチドまたは他の型の化合物のいずれかを標的とすることによって損なわれ得る。コンビナトリアルライブラリー、ファージライブラリーなどをスクリーニングすることによって、再度、このような化合物を同定できる。
【０１７９】
本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドの機能(活性)または発現を損なうことができる抑制化合物(抑制因子、アンタゴニスト)の同定方法をさらに提供する。本方法は、例えば、(実質的に精製または単離された)ポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞を、候補化合物と接触させるステップと、ポリペプチドの機能(活性)または発現を測定するステップとを含み得る。ポリペプチドの機能または活性における低下(候補化合物不在下と比較して)により、したがって適切な抑制化合物が積極的に同定できる。
【０１８０】
本発明によれば、機能または活性の障害は、例えば、ポリペプチドの卵巣癌細胞の成長を低下させる能力の減少または例えば表2に同定された酵素的活性または機能の低下に関連し得る。
【０１８１】
スクリーニング試験の実施に使用される細胞は、天然に(内生的に)ポリペプチドまたは類似体を発現できない、あるいは、天然発現ポリペプチド類似体の発現は抑制され得る。
【０１８２】
本明細書中で使用される場合「配列同一性」は、元のヌクレオチド配列と比較して同じである、または同じヌクレオチドの特定のパーセントを有するヌクレオチド配列の(連続的)ヌクレオチドに関する。
【０１８３】
同一性は、核酸配列のある領域にわたって、または全配列にわたって比較できる。したがって「同一性」は、例えば10、19、20ヌクレオチドまたはそれ以上(およびその間の任意の数)の領域にわたって、ならびにより好ましくは、表4に記載のポリヌクレオチド配列(例えば、配列番号1から49および169のいずれか1つ)のより長い領域にわたって、または全領域にわたって比較できる。非同一ヌクレオチドのギャップは、同一核酸領域(同一ヌクレオチド)間に見出し得ることが本明細書中において理解されるべきである。例えば、ポリペプチドは別のポリヌクレオチドのそれらの部分にわたって100%の同一性を有し得る。しかし、両方のポリヌクレオチドの全配列を比較する場合、2つのポリヌクレオチドは、相互にそれらの総合(全)配列同一性の50%を有し得る。
【０１８４】
同一性のパーセントは、例えば、デフォルトのギャップの重みを使用する、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0のnアルゴリズムGAP、BESTFIT（登録商標）またはFASTAを用いて確定できる。
【０１８５】
元のポリヌクレオチドと約50から約100%およびそれらの間の任意の範囲、または約60から約100%または約70から約100%または約80から約100%または約85%から約100%、約90%から約100%、約95%から約100%の配列同一性を有する本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの部分は、本明細書に包含される。約50%から100%の同一性を有するポリヌクレオチドが元のポリヌクレオチドと同様の様式で機能でき(例えば、実質的に相補的な配列へのアニール)、したがって元のポリヌクレオチドの交換に使用できることは、当業者には公知である。例えば、ポリヌクレオチド(核酸配列)は、規定の領域にわたり、元のポリヌクレオチドと約50%から約100%の同一性を含む、または有することができ、依然として本発明を達成するために効果的にまたは十分に作用できる。本発明のポリヌクレオチドを定義するために用いられる「実質的に同一」という用語は、例えば、元の配列のポリヌクレオチドと50%から100%およびその間の任意の範囲の配列同一性を有するが、好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、100%の同一性もまた含む(ポリヌクレオチド配列の全長にわたって100%同一な配列を含む)ポリヌクレオチドを指す。
【０１８６】
「実質的に同一な」ポリヌクレオチド配列は、配列番号1から49および169のいずれか1つの配列(より具体的には、配列番号1から49および169のいずれか1つの転写部分および/または翻訳部分)およびそれらの相補的配列に基づく約10から約25またはそれ以上、あるいは約10から約20ヌクレオチド長(またはそれ以上)のプローブを提供するステップ、ならびに別の種、組織、細胞、個体などから得たポリヌクレオチドのライブラリー(例えば、cDNAまたは他)をハイブリダイズするステップによって同定できる。高度にストリンジェントな条件下(例えば、6×SCC、65℃)で、プローブとハイブリダイズさせたポリヌクレオチドは、当分野において公知の方法を使用して単離および同定できる。「実質的に同一な」配列は、例えば、単離対立遺伝子変異体、単離スプライシング変異体、単離非ヒトオルソログ、修飾NSEQなどを含む。
【０１８７】
本明細書中で使用する場合「配列相補性」という用語は、基準(元の)ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列の(連続した)ヌクレオチドを指す。相補性は、核酸配列のある領域にわたって、または全配列にわたって比較できる。
【０１８８】
元のポリヌクレオチドと約50から約100%、または約60から約100%または約70から約100%または約80から約100%または約85%、約90%、約95%から約100%の配列相補性を有する本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの部分は、したがって本明細書に包含される。元の配列と約50から約100%の相補性を有するポリヌクレオチドが、本発明を実施する(例えば、元のポリヌクレオチドの発現を抑制する)ために十分な様式でその配列にアニールできることは、当業者により公知である。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチドを定義するために使用される「実質的に相補的」という用語は、例えば、元の配列のポリヌクレオチドと50%から100%の配列相補性およびその間の任意の範囲を有するが、好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列相補性を有し、100%の相補性もまた含む(ポリヌクレオチド配列の全長にわたって100%相補的な配列を含む)ポリヌクレオチドを指す。
【０１９０】
本明細書中で使用する場合「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかを全般に指し、これは非修飾のRNAまたはDNAであっても、あるいは修飾されたRNAまたはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、限定するものではないが、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖のRNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるRNA、DNAおよびRNA(一本鎖であっても、あるいはより典型的には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であってよい)を含むハイブリッド分子を含む。さらに「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNAあるいはRNAおよびDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語は、1つまたは複数の修飾された塩基を含むDNAまたはRNAおよび安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAもまた含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの特殊な塩基を含む。多様な修飾がDNAおよびRNAに実施でき、それ故「ポリヌクレオチド」は、通常天然に見出される、または見出されないような化学的、酵素的または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、限定するものではないが、線形の末端が閉じた分子を含む。「ポリヌクレオチド」は、多くの場合オリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドもまた包含する。
【０１９１】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により相互に結合した2個以上のアミノ酸(すなわち、ペプチドアイソスター)を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般に、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖および一般的にタンパク質と称される長鎖の両方を指す。上記のように、ポリペプチドは、遺伝子をコードする20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。
【０１９２】
本明細書中で使用する場合「ポリペプチド類似体」または「類似体」という用語は、突然変異体、キメラ、融合体、少なくとも1個のアミノ酸の欠失を含むポリヌクレオチド、少なくとも1個のアミノ酸の挿入または付加を含むポリペプチド、少なくとも1個のアミノ酸の置換を含むポリペプチドおよび所与のポリペプチドに関してなされた他の型の修飾に関する。
【０１９３】
「類似体」は、それ故本明細書中において本明細書中に記載されたポリペプチドのものに類似した生理活性および/または化学構造を有する分子として理解されるべきである。「類似体」は、元の配列または元の配列の部分と配列類似性を有することができ、本明細書中に述べられたその構造の修飾もまた有することができる。例えば、「類似体」は、元の配列または元の配列の部分に対して少なくとも80%または85%または90%の配列類似性を有することができる。「類似体」は、例えば元の配列または元の配列の部分に対して少なくとも70%またはさらに50%の配列類似性もまた有することができ、適切な方法で機能できる。
【０１９４】
「誘導体」は、元の配列または元の配列の部分から発生したポリペプチドとして本明細書中で理解されるべきであり、これは、1種または複数種の修飾を含む;例えばアミノ酸配列における1種または複数種の修飾(例えば、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換など)、1つまたは複数のアミノ酸の骨格または側鎖における1種または複数種の修飾、あるいは基または別の分子の1つまたは複数のアミノ酸(側鎖または骨格)への付加を含む。本明細書中に記載の担体の生理活性誘導体は、本発明により包含される。さらに、「誘導体」は、例えば、アミノ酸の骨格または側鎖における1種または複数種の修飾の組合せ、あるいは基または別の分子の付加などを有する元の配列に対して、少なくとも50%、70%、80%、90%の配列類似性を有することができる。
【０１９５】
本明細書中で使用する場合「生理的に活性」という用語は、元のポリペプチドの生理活性の一部またはすべてを保持する類似体、すなわち、表2に記載のポリペプチドに関連する活性または機能の一部を有すること、または卵巣癌の成長を促進または抑制できることを指す。
【０１９６】
したがって、元のポリペプチドと比較して、望ましい活性、機能または免疫原性が有意に破壊されていない、修飾された任意のポリペプチドは、本明細書中に包含される。本発明のポリペプチドに、それらの生理活性に有害に作用することなく、多くの修飾を実施できることは、当分野において周知である。これらの修飾は、他方で、元のポリペプチドの生理活性を維持または増加でき、あるいは時には望ましいと思われる本発明の1種または複数種のポリペプチドの特殊性(例えば、安定性、生物学的利用能など)を最適化できる。本発明のポリペプチドは、例えば、翻訳後プロセッシングなどの天然の過程により、または当分野において公知の化学的修飾技術によるどちらかで修飾されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み得る。修飾は、ポリぺプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどこにおいても起こり得る。同じ型の修飾は、所与のポリペプチドのいくつかの部位において同じまたは様々な程度で存在し得る。さらに、所与のポリペプチドは、多くの型の修飾を含み得る。本明細書中に記載の、ポリペプチドに対する複数の修飾は、生理活性が元の(親の)ポリペプチドに類似している限り、本発明に包含されることは、本明細書において理解されるべきである。
【０１９７】
上記のように、ポリペプチドの修飾は、このような変化によりポリペプチドの総合的な生理活性が実質的に改変されない場合、例えば、ポリペプチド配列においてアミノ酸の挿入、欠失および置換(即ち交換)を、保存的であってもまたは非保存的であっても(例えば、D-アミノ酸、desアミノ酸)含み得る。
【０１９８】
置換の例は、保存的(すなわち、残基が同じ一般型またはグループの別の残基で交換される)あるいは所望であれば非保存的(すなわち、残基は、別の型のアミノ酸によって交換される)なものであり得る。さらに、非天然発生アミノ酸は、天然発生アミノ酸に置換できる(すなわち、非天然発生保存アミノ酸の置換または非天然発生非保存アミノ酸の置換)。
【０１９９】
理解されるように、天然発生アミノ酸は、酸性、塩基性、中性かつ極性または中性かつ非極性として副分類できる。さらに、コードされるアミノ酸の3種は、芳香族である。本発明の確定したポリペプチドと異なるコードされたポリペプチドが、交換されるアミノ酸の型またはグループと同じ型またはグループに由来するアミノ酸に対する、置換されたコドンを含むことは有用である。それ故、いくつかの場合において、塩基性アミノ酸のLys、ArgおよびHisは相互に交換可能であり得、酸性アミノ酸のAspおよびGluは相互に交換可能であり得、中性極性アミノ酸のSer、Thr、Cys、GlnおよびAsnは相互に交換可能であり得、非極性脂肪族アミノ酸Gly、Ala、Val、IleおよびLeuは相互に交換可能であり得るが、サイズのためGlyおよびAlaがより密接に関係しており、Val、IleおよびLeuが相互により密接に関係しており、芳香族アミノ酸のPhe、TrpおよびTyrは相互に交換可能であり得る。
【０２００】
ポリペプチドが合成的に作製された場合、DNAにより天然にはコードされないアミノ酸(非天然発生または非天然のアミノ酸)による置換もまた実施できることにさらに留意するべきである
【０２０１】
非天然発生アミノ酸は、哺乳動物において天然に産生または見出されないアミノ酸として、本明細書中において理解されるべきである。非天然発生アミノ酸は、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、ペグ化アミノ酸などを含む。したがって、定義されたポリペプチド配列中に非天然発生アミノ酸を含めることにより、元のポリペプチドの誘導体が得られる。非天然発生アミノ酸(残基)は、nが2〜6である式NH2(CH2)nCOOHのオメガアミノ酸、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、ノルロイシンなどの中性非極性アミノ酸などもまた含む。フェニルグリシンは、Trp、TyrまたはPheと置換でき、シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは、中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、およびオルニチンは塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンと置換でき、特性を付与する配座を維持できる。
【０２０２】
類似体は、置換的突然変異生成により作製でき、本発明のポリペプチドの生理活性を維持できることは、当分野において公知である。これらの類似体は、タンパク質分子内の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去されており、その場所に別の残基が挿入されている。例えば、置換的突然変異生成の対象となる1つの部位は、限定するものではないが、活性部位または免疫原性部位として同定される部位を含み得る。対象となる他の部位は、例えば、様々な種から得られた特定の残基が同一である部位であり得る。これらの位置は、生理活性のために重要であると思われる。「保存的置換」として同定される置換の例を、表Aに示す。このような置換が望ましくない変化をもたらす場合、その後、表Aに「典型的置換」と命名された、またはアミノ酸の分類に関して本明細書中にさらに記載された、他の型の置換を導入し、産物をスクリーニングする。
【０２０３】
一部の場合において、アミノ酸の置換、挿入または欠失によるポリペプチドの生理活性を修正することは興味深いと思われる。例えば、ポリペプチドの修飾は、ポリペプチドの生理活性の増加をもたらし得、その毒性を調節でき、生物学的利用能または安定性に変化をもたらし得、あるいは、その免疫学的活性または免疫学的同一性を調節できる。機能または免疫学的同一性の実質的修正は、(a)置換範囲のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはらせん配座、(b)標的部位の分子の電荷または疎水性、あるいは(c)側鎖のバルク、の維持についてのそれらの効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然発生残基は、共通の側鎖特性:
(1)疎水性:ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)
(2)中性親水性:システイン(Cys)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)
(3)酸性:アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)
(4)塩基性:アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)
(5)鎖の配向に影響を与える残基:グリシン(Gly)、プロリン(Pro);および芳香族:トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)
に基づきグループ分けされる。
【０２０４】
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを必要とする。
【０２０５】
【表１】
0005589149.tif 000002
【０２０６】
物質(例えば、アミノ酸)の「範囲」または「グループ」、「置換基」等について述べる場合、あるいは他の型の特定の特性(例えば、温度、圧力、化学構造、時間など)を述べる場合、本発明は、ありとあらゆる特定のメンバーおよびその中のいかなるサブ範囲またはサブグループの組合せにも関し、明確に本明細書中に組み込むことを理解するべきである。したがって、任意の特定された範囲またはグループは、個々の範囲またはグループのありとあらゆるメンバーならびにそこに包含されるありとあらゆる考えられるサブ範囲またはサブグループを指す省略法として理解されるべきであり、そこにある任意のサブ範囲またはサブグループに関しても同様である。それ故、例えば、約80から100%の同一性のパーセント(%)に関しては、例えば80%、81%、84.78%、93%、99%などのありとあらゆる個々の%ならびにサブ範囲が明確に本明細書中に組み込まれるとして理解すべきであり、「約10から約25」の長さに関しては、例えば、10、11、12、13、14、15から25を含む25までなどのありとあらゆる個々の数字が明確に組み込まれるとして理解されるべきであり、濃度、成分などの他のパラメーターに関しても同様である。
【０２０７】
添付の図面において、
図1から図31、図33、図34、図36、図37、図39、図40、図42、図43、図46、図47、図49、図50および図56は、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。マイクロアレイは、6例のヒトLMP試料(A〜Fの1)および20例の悪性卵巣腫瘍試料(表B)(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)ならびに30種の異なる正常ヒト組織(副腎(A7)、乳腺(B7)、空腸(C7)、気管(D7)、肝臓(E7)、胎盤(F7)、大動脈(G7)、脳(H7)、肺(A8)、副腎皮質(B8)、食道(C8)、結腸(D8)、卵巣(E8)、腎臓(F8)、前立腺(G8)、胸腺(H8)、骨格筋(A9)、大静脈(B9)、胃(C9)、小腸(D9)、心臓(E9)、ファローピウス管(F9)、脾臓(G9)、膀胱(H9)、頚部(A10)、膵臓(B10)、回腸(C10)、十二指腸(D10)、甲状腺(E10)および精巣(F10))からRAMP増幅RNAを使用して調製した。RNAマイクロアレイ上には、乳癌細胞系(MDA(A5)、MCF7(B5)およびMCF7+エストラジオール(C5))およびLCM顕微解剖前立腺正常上皮(A〜Cの6)および前立腺癌(D〜Fの6)、前立腺癌細胞系、LNCap(G6)およびLNCap+アンドロゲン(H6)がさらに含まれる。これらの図において、プローブ標識反応物を、シロイロナズナ(Arabidopsis)に関するdsDNA配列にさらにスパイクし、これらは標識反応の対照の役目を果たすためにマイクロアレイにスポットした同じ配列(M)とハイブリダイズする。
【０２０８】
図32、図35、図38、図41、図44、図45および図48は、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列に関する差次的発現データを示す、RT-PCRの結果の写真である。相補的DNAを、図に示すように、6例のヒトLMP試料および少なくとも20例の悪性卵巣腫瘍試料(表B)由来のRAMP増幅RNAからのランダムな六量体を使用して調製した。cDNAを定量化し、当業者に公知の標準的方法を使用した、遺伝子特異的プライマーを用いたPCRの鋳型として使用した。
【０２０９】
図57から図105は、癌細胞系のNCI-60パネルに由来するRNA試料における、STARにより選択された癌関連ヒト配列に関する差次的発現データを示す、RT-PCRの結果の写真である。これらの59種の細胞系は、白血病(Leukemia)、中枢神経系(CNS)、乳腺(Breast)、結腸(Colon)、肺(Lung)、メラノーマ(Melanoma)、卵巣(Ovarian)、前立腺(Prostate)および腎臓(Renal)を含む、9種のヒトの癌型を包含する腫瘍に由来する。相補的DNAを、59種のヒト癌細胞系(表C)由来のRAMP増幅RNAからのランダムな六量体を使用して調製した。cDNAを定量化し、当業者に公知の標準的方法を使用した、遺伝子特異的プライマーを用いたPCRの鋳型として使用した。図57から図105に示した各PCRの結果に関して、各PCR反応に使用した、等量の鋳型cDNAを、このハウスキーピング遺伝子に対する特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いて、GAPDHを再増幅することによって確認した。
【０２１０】
より具体的には、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号1に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号1で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の1種(胎盤(F7))および乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)においてのみ観察された。
【図２】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号2に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号2で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、さらに30種の正常組織の6種(乳腺(B7)、胎盤(F7)、大動脈(G7)、結腸(D8)、卵巣(E8)および胸腺(H8))において明白であった。
【図３】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号3に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号3で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認するが、全体として低レベルの発現にすぎなかった。正常組織のいずれにおいても有意な発現は見られなかった。
【図４】は、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号4に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号4で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の2種(食道(C8)およびファローピウス管(F9))において明白であった。
【図５】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号5に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号5で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。LMPの配列に類似したこの配列の弱い発現が、多くの正常組織においてもまた観察された。
【図６】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号6に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号6で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の3種(肝臓(E7)、胎盤(F7)および腎臓(F8))において明白であった。
【図７】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号7に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号7で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)のいくつかにおいて、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の1種(精巣(Fl0))において明白であった。
【図８】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号8に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号8で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の2種(食道(C8)および胃(C9))ならびに乳癌細胞系および前立腺癌細胞系、それぞれMDA(A5)およびLNCap(G6およびH6)においてのみ明白であった。
【図９】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号9に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号9で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の1種(胎盤(F7))、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)およびLCM顕微解剖された前立腺癌試料(D6およびF6)においてのみ明白であった。
【図１０】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号10に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号10で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の発現は、30種の正常組織の1種(精巣(F10))、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)ならびに前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)においてのみ明白であった。
【図１１】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号11に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号11で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現は、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)においてのみ明白であった。
【図１２】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号12に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号12で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現は、30種の正常組織の1種(精巣(F10))、および前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)においてのみ明白であった。より弱い発現が、正常卵巣(E8)においてもまた観察された。
【図１３】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号13に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号13で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現は、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)においてのみ明白であった。より弱い発現が、いくつかの正常組織および前立腺癌系LNCap(G〜Hの6)においてもまた観察された。
【図１４】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号14に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号14で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列のより弱い発現は、正常な腎臓(F8)組織においてのみ観察された。
【図１５】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号15に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号15で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。LMPの配列に類似したこの配列のより弱い発現が、多くの正常組織において同様に見られた。
【図１６】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号16に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号16で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現は、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)においてもまた明白であった。LMPの発現に類似したより弱い発現が、前立腺およびいくつかの正常組織の試料において見られた。
【図１７】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号17に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号17で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現は、30種の正常組織の2種(乳腺(B7)および膀胱(H9))においてのみ明白であった。
【図１８】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号18に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号18で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)において、若干弱い発現が前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)および8種の正常組織(副腎(A7)、胎盤(F7)、肺(A8)、副腎皮質(B8)、食道(C8)、結腸(D8)、卵巣(E8)および精巣(F10))においてもまた明白であった。
【図１９Ａ】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号19に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号19で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較していくつかの悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現はまた、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)においてのみ明白であった。
【図１９Ｂ】(パネルAおよびB)は、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号19およびユニジーンクラスタ(Unigene cluster)、Hs.478368に属するKCNMB2遺伝子に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号19のSTARクローン配列またはKCNMB2遺伝子のどちらかに特異的なプライマー対を使用し、正常卵巣組織ならびに良性卵巣癌および病期/悪性度の異なる卵巣癌についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(図19BパネルA)により示されるように、正常試料(レーン1)、良性試料(レーン2〜3)およびLMP試料(レーン4〜7)と比較して、配列番号19のmRNAの発現の増加が、明細胞癌(レーン8〜9)、後期類内膜癌(レーン12)および悪性重篤癌(レーン15〜17)において明白であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号19の遺伝子発現の上方制御を確認する。しかし、KCNMB2の発現は、異なる卵巣試料の中で基本的にその発現に違いを示さない配列番号19の発現とは明らかに異なっていた(図19B、パネルB)。
【図２０】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号20に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号20で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較していくつかの悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、30種の正常組織の4種(空腸(C7)、気管(D7)、結腸(D8)および胸腺(H8))においてもまた明白であった。
【図２１】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号21に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号21で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、30種の正常組織の3種(副腎(A7)、胸腺(B7)および大動脈(G7))においてもまた明白であった。
【図２２】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号22に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号22で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)においてもまた明白であった。LMPの発現と類似のより弱い発現が、大部分の正常細胞において見られた。
【図２３】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号23に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号23で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較していくつかの悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)ならびに前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)においてもまた明白であった。
【図２４】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号24に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号24で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較していくつかの悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)においてもまた明白であった。
【図２５】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号25に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号25で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)においてもまた明白であった。
【図２６】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号26に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号26で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)、前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)および1種の正常組織、精巣(F10)においてもまた明白であった。LMPの発現と類似のより弱い発現が、いくつかの正常細胞において見られた。
【図２７】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号27に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号27で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)、前立腺癌細胞系LNCap(G〜Hの6)においてもまた明白であった。LMPの発現と類似のより弱い発現が、30種の正常組織の7種(副腎(A7)、胎盤(F7)、肺(A8)、食道(C8)、結腸(D8)、卵巣(E8)および精巣(F10))において見られた。
【図２８】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号28に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号28で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MDA(A5)およびMCF7(B〜Cの5)においてもまた明白であった。LMPの発現と類似のより弱い発現が、他のすべての組織に関して見られた。
【図２９】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号29に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号29で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)および30種の正常組織の3種(乳腺(B7)、食道(C8)およびファローピウス管(F9))においてもまた明白であった。
【図３０】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号30に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号30で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)、前立腺癌試料(D〜Hの6)においてもまた明白であった。LMPの発現と類似のより弱い発現が、ごくわずかな正常組織において見られた。
【図３１】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号31に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号31で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、乳癌細胞系MCF7(B〜Cの5)、前立腺癌試料(D〜Hの6)においてもまた明白であった。LMPの発現と類似のより弱い発現が、ごくわずかな正常組織のみにおいて見られた。
【図３２】は、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号32に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号32のためのプライマー対、OGS1077(GCGTCCGGGCCTGTCTTCAACCT;配列番号153)およびOGS1078(GCCCCACCCTCTACCCCACCACTA;配列番号154)を使用し、正常卵巣組織ならびに良性卵巣癌および病期/悪性度の異なる卵巣癌についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物により示されるように、正常試料(レーン1)および良性試料(レーン2〜3)と比較して、配列番号32のmRNAの発現の増加が、LMP(レーン4〜7)、明細胞癌腫(レーン8〜9)、後期類内膜癌腫(レーン12)および悪性重篤癌腫(レーン15〜17)において明白であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号32の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３３】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号33に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号33で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、前立腺癌試料(B〜Fの6)においてもまた明白であった。より弱い発現が多くの正常組織において、強い発現が気管(D7)、結腸(D8)、小腸(D9)、胸腺(H8)および脾臓(G9)において見られた。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号33の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３４】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号34に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号34で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、前立腺癌試料(B〜Fの6)においてもまた明白であった。より弱い発現が多くの正常組織において、強い発現が気管(D7)、結腸(D8)、小腸(D9)、胸腺(H8)および脾臓(G9)において見られた。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号34の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３５】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号35に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号35のためのプライマー対、OGS1141(GAGATCCTGATCAAGGTGCAGG;配列番号155)およびOGS1142(TGCACGCTCACAGCAGTCAGG;配列番号156)を使用し、LMP試料、病期/悪性度の異なる卵巣癌および正常ヒト組織試料についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(AB-0201として示される)により示されるように、配列番号35のmRNAの発現の増加が、いくつかの卵巣癌レーン(レーン10、11、14、18、28および29)において明白であり、mRNAはLMP試料においては発現しなかった。1種の正常組織試料、回腸(レーン27)においてのみ、発現が観察された。各PCR反応に使用した等量の鋳型cDNAが、ハウスキーピング遺伝子に対する特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いたGAPDHの再増幅によって確認された。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号35の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３６】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号36に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号36で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して数種の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。他の癌型においても、正常ヒト組織においても発現は見られなかった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号36の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３７】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号37に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号37で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の弱い発現が、前立腺癌試料(B〜Fの6)においてもまた明白であった。より弱い発現がいくつかの正常組織において見られた。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号37の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３８】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号38に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号38のためのプライマー対、OGS1202(AACATGACTAAGATGCCCAACC;配列番号157)およびOGS 1203(AATCTCCTTCACCTCCACTACTG;配列番号158)を使用し、LMP試料、病期/悪性度の異なる卵巣癌および正常ヒト組織試料についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(AB-0332として示される)により示されるように、配列番号38のmRNAの発現の増加が、およそ半数の卵巣癌レーンにおいて明白であり、より弱い発現がLMP試料において見られた。発現は、多くの正常組織において観察された。各PCR反応に使用した等量の鋳型cDNAが、ハウスキーピング遺伝子のための特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いたGAPDHの再増幅によって確認された。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号38の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図３９】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号39に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号39で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。強い発現が、乳癌試料(A〜Cの5)において、弱い発現が、前立腺癌試料(A〜Hの6)においてもまた観察された。より弱い発現が数種の正常組織において見られ、精巣(F10)において強い発現であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号39の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４０】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号40に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号40で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。弱い発現が数種の正常組織において見られ、腎臓(F8)において強い発現であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号40の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４１】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号41に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号41のためのプライマー対、OGS1212(AAGCATAGCCATAGGTGATTGG;配列番号159)およびOGS1213(ACAGGTATCAGACAAGGGAGCAG;配列番号160)を使用し、LMP試料、病期/悪性度の異なる卵巣癌および正常ヒト組織試料についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(AB-0532として示される)により示されるように、配列番号41のmRNAの発現の増加が、非常に多くの卵巣癌レーンにおいて明白であり、より弱い発現がLMP試料において見られた。発現は、腎臓,胸腺および脾臓(それぞれ、レーン14、16および23)などの数種の正常組織において観察された。各PCR反応に使用した等量の鋳型cDNAが、ハウスキーピング遺伝子のための特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いたGAPDHの再増幅によって確認された。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号41の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４２】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号42に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号42で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)およびLMP試料(A〜Fの1)の両方において、その発現が示された。弱い発現が、乳癌試料(A〜Cの5)においてさらに観察された。弱い発現が少数の正常組織において見られ、胎盤(F7)おいて中程度の発現であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号42の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４３】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号43に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号43で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。強い発現が、乳癌試料(A〜Cの5)において、弱い発現が前立腺癌試料(A〜Hの6)においてさらに観察された。より弱い発現が正常組織において見られ、精巣(F10)において強い発現であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号43の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４４】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号44に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号44のためのプライマー対、OGS1171(TTACGACCTATTTCTCCGTGG;配列番号161)およびOGS1172(AATGCAATAATTGGCCACTGC;配列番号162)を使用し、LMP試料、病期/悪性度の異なる卵巣癌および正常ヒト組織試料についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(AB-0795として示される)により示されるように、配列番号44のmRNAの発現の増加が、非常に多くの卵巣癌レーンにおいて明白であり、より弱い発現がLMP試料において見られた。発現は、大動脈、骨格筋、小腸および脾臓(それぞれ、レーン7、17、20および23)などの数種の正常組織において観察された。各PCR反応に使用した等量の鋳型cDNAが、ハウスキーピング遺伝子のための特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いたGAPDHの再増幅によって確認された。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号44の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４５】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号45に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号45のためのプライマー対、OGS1175(ACACATCAAACTGCTTATCCAGG;配列番号163)およびOGS1176(ACTGATGTGAAAATGCACATCC;配列番号164)を使用し、LMP試料、病期/悪性度の異なる卵巣癌および正常ヒト組織試料についてのRT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(AB-0846として示される)により示されるように、配列番号45のmRNAの発現の増加が、半数の卵巣癌レーンにおいて明白であり、より弱い発現がLMP試料において見られた。発現は、腎臓、ファローピウス管および精巣(それぞれ、レーン14、22および30)などの少数の正常組織試料において観察された。各PCR反応に使用した等量の鋳型cDNAが、ハウスキーピング遺伝子のための特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いたGAPDHの再増幅によって確認された。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号45の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４６】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号46に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号46で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。弱い発現が前立腺癌試料(A〜Hの6)においてさらに観察された。より弱い発現が少数の正常組織において見られ、乳腺(B7)および卵巣(F8)において中程度の発現であった。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号46の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４７】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号47に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号47で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、前立腺癌試料(B〜Fの6)においてさらに明白であった。より弱い発現が多くの正常組織において見られ、強い発現が気管(D7)、結腸(D8)、小腸(D9)、胸腺(H8)および脾臓(G9)において見られた。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号47の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４８】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号48に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。この遺伝子に関しては、マイクロアレイのデータは利用できなかった。配列番号48のためのプライマー対、OGS 1282(ATGGCTCATACAGCACTCAGG;配列番号165)およびOGS 1283(GAACTGTCACTCCGGAAAGCCT;配列番号166)を    使用し、LMP試料、病期/悪性度の異なる卵巣癌および正常ヒト組織試料についてのRT    -PCRを実施した。期待PCRアンプリコン産物(AB-1120として示される)により示されるように、配列番号48のmRNAの発現の増加が、大部分の卵巣癌レーンにおいて明白であり、より弱い発現がLMP試料において見られた。発現は、実質的にすべての正常組織において明白であった。各PCR反応に使用した等量の鋳型cDNAが、ハウスキーピング遺伝子のための特異的プライマー対、OGS315(TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT;配列番号167)およびOGS316(CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC;配列番号168)を用いたGAPDHの再増幅によって確認された。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号48の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図４９】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号49に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号49で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。強い発現が、乳癌試料(A〜Cの5)において、弱い発現が前立腺癌試料(A〜Hの6)においてさらに観察された。より弱い発現が、正常組織において見られた。これらの結果により、悪性卵巣癌における配列番号49の遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図５０】STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号50に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号50で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して大部分の悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。この配列の有意な発現が、30種の正常組織の7種(副腎(A7)、乳腺(B7)、気管(D7)、胎盤(F7)、肺(A8)、腎臓(F8)およびファローピウス管(F9))において明白であった。
【図５１】卵巣癌試料に関するSTARサブトラクションの実施例を示す写真である。ハウスキーピング遺伝子のGAPDH(パネルA)およびβ-アクチン(パネルB)は、LMP-(マイナス)悪性(SL133からSL137)および悪性-LMP(SL123からSL127)の両方を良好にサブトラクトしているが、一方、悪性卵巣腫瘍における公知の差次的発現上方制御遺伝子、CCNE1(パネルC)は、悪性-LMP STARライブラリーにおいてサブトラクトされず、それどころか豊富であった(レーン6から10と比較してレーンSL123からSL127)。
【図５２】形質移入されたTOV-21G細胞における、配列番号1および3によりコードされる内在性遺伝子の発現に関するshRNAの効果を示す写真である。配列番号当たり2つのshRNAをTOV-21G卵巣癌細胞系に形質移入し、遺伝子特異的プライマーを使用するRT    -PCRにより観測した。各々の場合において、両方のshRNAが遺伝子の発現を減衰させた。
【図５３】TOV-21G細胞の増殖に関する、配列番号特異的shRNAの効果を示す写真である。減衰された場合に、増殖の減少により癌細胞の正常な成長に必要な遺伝子が示される。細胞を、2つの別のshRNA発現ベクターを用いて安定に形質移入し、細胞の増殖をMTTアッセイにおいて測定した。陽性対照プラスミドは、ヒトにおいては未知の遺伝子に相同性を有するshRNAを発現する。
【図５４】TOV-21G細胞の生存に関する、配列番号特異的shRNAを示す写真である。減衰された場合に、染色の弱さによりこのアッセイにおいて癌細胞の生存に必要な遺伝子を示す。細胞を、2つの別のshRNA発現ベクターを用いて一過性に形質移入し、残存コロニーを、クリスタルバイオレットを用いて染色し、撮影した。陽性対照プラスミドは、ヒトにおいては未知の遺伝子に相同性を有するshRNAを発現する。
【図５５Ａ】STARにより選択された卵巣癌関連のヒト配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。マイクロアレイ分析後に選択されたSTAR配列番号が、LMPおよび正常卵巣試料と比較して悪性卵巣癌試料において上方制御されたことをさらに実証するために、半定量的RT-PCRを、HotStarTaq（登録商標）ポリメラーゼを、製造業者(Qiagen)の指示書に従って使用し、25サイクル実施した。さらに、これらの結果は、これらの配列の、卵巣癌に対する潜在的な、診断、予後予測またはセラノスティックマーカーとしての有用性を実証するために役に立つ。配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に関して、それぞれに対する特異的プライマー対を使用した。各被験配列番号に関して得られた差次的発現結果を図55Aに示す。各配列番号に関する期待PCRアンプリコン産物により示されるように、正常(レーン1)、良性(レーン2〜3)およびLMP(レーン4〜7)卵巣癌試料と比較して、明細胞癌(レーン8〜9)、後期類内膜癌(レーン12)および異なる期の悪性漿液癌{しょうえき}(レーン15〜17)において、配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に対応するmRNAの発現の増加に対して明らかな傾向があった。これらの結果により、マイクロアレイを使用して観察されたように、異なる期の悪性卵巣癌において配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に関する遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図５５Ｂ】STARにより選択された卵巣癌関連のヒト配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。マイクロアレイ分析後に選択されたSTAR配列番号が、LMPおよび正常卵巣試料と比較して悪性卵巣癌試料において上方制御されたことをさらに実証するために、半定量的RT-PCRを、HotStarTaq（登録商標）ポリメラーゼを、製造業者(Qiagen)の指示書に従って使用し、25サイクル実施した。さらに、これらの結果は、これらの配列の、卵巣癌に対する潜在的な、診断、予後予測またはセラノスティックマーカーとしての有用性を実証するために役に立つ。配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に関して、それぞれに対する特異的プライマー対を使用した。各被験配列番号に関して得られた差次的発現結果を図55Bに示す。各配列番号に関する期待PCRアンプリコン産物により示されるように、正常(レーン1)、良性(レーン2〜3)およびLMP(レーン4〜7)卵巣癌試料と比較して、明細胞癌(レーン8〜9)、後期類内膜癌(レーン12)および異なる期の悪性漿液癌{しょうえき}(レーン15〜17)において、配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に対応するmRNAの発現の増加に対して明らかな傾向があった。これらの結果により、マイクロアレイを使用して観察されたように、異なる期の悪性卵巣癌において配列番号01、09、12、15、17、19、20および24に関する遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図５６】STARにより選択された卵巣癌関連のヒト配列番号169に関する差次的発現データを示す、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果の写真である。配列番号169で表されるSTAR dsDNAクローンを32Pで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。得られたハイブリダイゼーション結果により、LMP試料(A〜Fの1)と比較して悪性卵巣癌試料(A〜Fの2およびA〜Gの3〜4)において、その上方制御を確認する。より弱い発現が、いくつかの正常組織において見られ、強い発現が肝臓(E7)および大動脈(G7)において見られた。これらの結果により、悪性卵巣癌において、配列番号169に関する遺伝子発現の上方制御が確認される。
【図５７】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号1に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号1のためのプライマー対、OGS1136(GCTTAAAAGAGTCCTCCTGTGGC;配列番号171)およびOGS1044(TGGACATTGTTCTTAAAGTGTGG;配列番号172)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号1のmRNAの発現の増加が、卵巣、腎臓、肺、結腸、乳腺の癌において明白であり、より弱い発現がメラノーマ試料において見られた。
【図５８】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号2に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号2のためのプライマー対、OGS1250(AGGTTTTATGGCCACCGTCAG;配列番号173)およびOGS1251(ATCCTATACCGCTCGGTTATGC;配列番号174)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号2のmRNAの発現の増加が、9種の癌型すべてにおいて明白であるが、より弱い発現がメラノーマ試料および白血病試料において見られた。
【図５９】癌胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号3に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号3のためのプライマー対、OGS1049(GGGCGGCGGCTCTTTCCTCCTC;配列番号175)およびOGS1050(GCTAGCGGCCCCATACTCG;配列番号176)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号3のmRNAの発現の増加が、8種の癌型において明白であり、白血病試料においてはなかった。
【図６０】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号4に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号4のためのプライマー対、OGS1051(ACACTGGATGCCCTGAATGACACA;配列番号177)およびOGS1052(GCTTTGGCCCTTTTTGCTAA;配列番号178)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号4のmRNAの発現の増加が、メラノーマ、卵巣、CNSおよび肺の癌において明白であり、白血病試料において弱く発現した。
【図６１】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号5に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号5のためのプライマー対、OGS1252(CCCACTTCTGTCTTACTGCATC;配列番号179)およびOGS1253(CATAGTACTCCAGGGCTTATTC;配列番号180)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号5のmRNAの発現の増加が、すべての癌型において明白であった。
【図６２】は、癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号6に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号6のためのプライマー対、OGS1083(AACGATTGCCCGGATTGATGACA;配列番号181)およびOGS1084(TACTTGAGGCTGGGGTGGGAGATG;配列番号182)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号6のmRNAの発現の増加が、すべての癌型において明白であった。
【図６３】は、癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号7に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号7のためのプライマー対、OGS1053(CACTACGCCAGGCACCCCCAAAAC;配列番号183)およびOGS1054(CGAGGCGCACGGCAGTCT;配列番号184)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号7のmRNAの発現の増加は、卵巣癌試料においてのみ明白であった。
【図６４】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号8に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号8のためのプライマー対、OGS1037(ATCCGTTGCTGCAGCTCGTTCCTC;配列番号185)およびOGS1038(ACCCTGCTGACCTTCTTCCATTCC;配列番号186)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号8のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図６５】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号9に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号9のためのプライマー対、OGS1045(TCGGAGGAGGGCTGGCTGGTGTTT;配列番号187)およびOGS1046(CTTGGGCGTCTTGGAGCGGTTCTG;配列番号188)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように(ゲルの下方のバンドおよび最上のバンドは、PCR反応の人工産物である)、配列番号9のmRNAの発現の増加は、卵巣、肺、結腸、乳腺の癌およびメラノーマにおいて明白であり、白血病およびCNS癌において弱く発現した。
【図６６】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号10に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号10のためのプライマー対、OGS1240(AGAGCCTATTGAAGATGAACAG;配列番号189)およびOGS1241(TGATTGCCCCGGATCCTCTTAGG;配列番号190)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号10のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図６７】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号11に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号11のためのプライマー対、OGS1304(GGACAAATACGACGACGAGG;配列番号191)およびOGS1305(GGTTTCTTGGGTAGTGGGC;配列番号192)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号11のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図６８】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号12に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号12のためのプライマー対、OGS1039(CCCCGGAGAAGGAAGAGCAGTA;配列番号193)およびOGS1040(CGAAAGCCGGCAGTTAGTTATTGA;配列番号194)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号12のmRNAの発現の増加はすべての癌型において明白であったが、CNS癌および白血病において弱かった。
【図６９】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号13に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号13のためのプライマー対、OGS1095(GGCGGGCAACGAATTCCAGGTGTC;配列番号195)およびOGS1096(TCAGAGGTTCGTCGCATTTGTCCA;配列番号196)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号13のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図７０】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号15に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号15のためのプライマー対、OGS1284(CAACAGTCATGATGTGTGGATG;配列番号197)およびOGS1285(ACTGCACCTTGTCCGTGTTGAC;配列番号198)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号15のmRNAの発現の増加が、卵巣、前立腺、肺、結腸および乳腺の癌において明白であった。
【図７１】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号16に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号16のためのプライマー対、OGS1063(CCGGCTGGCTGCTTTGTTTA;配列番号199)およびOGS1064(ATGATCAGCAGGTTCGTTGGTAGG;配列番号200)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号16のmRNAの発現の増加が、卵巣、肺、結腸および乳腺の癌において明白であった。
【図７２】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号17に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号17のためのプライマー対、OGS1031(ATGCCGGAAGTGAATGTGG;配列番号201)およびOGS1032(GGTGACTCCGCCTTTTGAT;配列番号202)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号17のmRNAの発現の増加は、卵巣、腎臓、肺、結腸および乳腺の癌において明白であったが、CNS癌において弱かった。
【図７３】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号18に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号18のためのプライマー対、OGS1308(ACATTCGCTTCTCCATCTGG;配列番号203)およびOGS1309(TGTCACGGAAGGGAACCAGG;配列番号204)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号18のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図７４】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号19に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号19のためのプライマー対、OGS1069(ACGCTGCCTCTGGGTCACTT;配列番号205)およびOGS1070(TTGGCAAATCAATGGCTTGTAAT;配列番号206)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号19のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図７５】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号20に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号20のためのプライマー対、OGS1061(ATGGCTTGGGTCATCAGGAC;配列番号207)およびOGS1062(GTGTCACTGGGCGTAAGATACTG;配列番号208)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号20のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であったが、乳腺および結腸の癌において弱かった。
【図７６】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号21に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号21のためのプライマー対、OGS1097(CACCAAATCAGCTGCTACTACTCC;配列番号209)およびOGS1098(GATAAACCCCAAAGCAGAAAGATT;配列番号210)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号21のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であったが、白血病において弱かった。
【図７７】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号22に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号22のためのプライマー対、OGS1075(CGAGATTCCGTGGGCGTAGG;配列番号211)およびOGS1076(TGAGTGGGAGCTTCGTAGG;配列番号212)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号22のmRNAの発現の増加は、卵巣、肺、乳腺およびCNSの癌において明白であった。別のより大きな転写が、メラノーマに加えて結腸および腎臓の癌において弱く発現した。
【図７８】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号23に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号23のためのプライマー対、OGS1232(TCAGAGTGGACGTTGGATTAC;配列番号213)およびOGS1233(TGCTTGAAATGTAGGAGAACA;配列番号214)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号23のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図７９】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号24に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号24のためのプライマー対、OGS1067(GAGGGGCATCAATCACACCGAGAA;配列番号215)およびOGS1068(CCCCACCGCCCACCCATTTAGG;配列番号216)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号24のmRNAの発現の増加は、卵巣、腎臓、肺、結腸、乳腺の癌およびメラノーマにおいて明白であったが、CNS癌および白血病において弱かった。
【図８０】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号25に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号25のためのプライマー対、OGS1099(GGGGGCACCAGAGGCAGTAA;配列番号217)およびOGS1100(GGTTGTGGCGGGGGCAGTTGTG;配列番号218)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号25のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であったが、白血病において弱かった。
【図８１】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号26に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号26のためのプライマー対、OGS1246(ACAGACTCCTGTACTGCAAACC;配列番号219)およびOGS1247(TACCGGTTCGTCCTCTTCCTC;配列番号220)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号26のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図８２】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号27に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号27のためのプライマー対、OGS1093(GAAGTTCCTCACGCCCTGCTATC;配列番号221)およびOGS1094(CTGGCTGGTGACCTGCTTTGAGTA;配列番号222)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号27のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図８３】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号28に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号28のためのプライマー対、OGS1332(TAGGCGCGCCTGACATACAGCAATGCCAGTT;配列番号223)およびOGS1333(TAAGAATGCGGCCGCGCCACATCTTGAACACTTTGC;配列番号224)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号28のmRNAの発現の増加は、卵巣、前立腺および腎臓の癌において明白であったが、他のすべての型において弱かった。
【図８４】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号29に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号29のためのプライマー対、OGS1101(TGGGGAGGAGTTTGAGGAGCAGAC;配列番号225)およびOGS1102(GTGGGACGGAGGGGGCAGTGAAG;配列番号226)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号29のmRNAの発現の増加は、卵巣、腎臓、肺、結腸および乳腺の癌において明白であったが、CNSの癌およびメラノーマにおいて弱かった。
【図８５】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号30に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号30のためのプライマー対、OGS1300(GCAACTATTCGGAGCGCGTG;配列番号227)およびOGS1301(CCAGCAGCTTGTTGAGCTCC;配列番号228)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号30のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図８６】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号31に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号31のためのプライマー対、OGS1302(GGAGGAGCTAAGCGTCATCGC;配列番号229)およびOGS1303(TCGCTTCAGCGCGTAGACC;配列番号230)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号31のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図８７】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号32に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号32のためのプライマー対、OGS1077(GCGTCCGGGCCTGTCTTCAACCT;配列番号153)およびOGS1078(GCCCCACCCTCTACCCCACCACTA;配列番号154)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号32のmRNAの発現の増加は、卵巣癌およびメラノーマにおいて明白であったが、より弱い発現が、CNS、乳腺、結腸、肺および腎臓の癌において検出可能であった。
【図８８】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号33に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号33のためのプライマー対、OGS1292(TATTAGTTGGGATGGTGGTAGCAC;配列番号231)およびOGS1294(GAGAATTCGAGTCGACGATGAC;配列番号232)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号33のmRNAの発現の増加は、卵巣癌試料においてのみ明白であった。
【図８９】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号34に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号34のためのプライマー対、OGS1242(GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC;配列番号233)およびOGS1243(AGGCACACAACAGAGGCAGTTC;配列番号234)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号34のmRNAの発現の増加は、卵巣癌試料においてのみ明白であった。
【図９０】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号35に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号35のためのプライマー対、OGS1141(GAGATCCTGATCAAGGTGCAGG;配列番号155)およびOGS1142(TGCACGCTCACAGCAGTCAGG;配列番号156)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号35のmRNAの発現の増加は、卵巣、肺および乳腺の癌において明白であったが、結腸およびCNSの癌において弱かった。
【図９１】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号36に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号36のためのプライマー対、OGS1280(GTACATCAACCTCCTGCTGTCC;配列番号235)およびOGS1281(GACATCTCCAAGTCCCAGCATG;配列番号236)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号36のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図９２】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号37に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号37のためのプライマー対、OGS1159(AGTCTCTCACTGTGCCTTATGCC;配列番号237)およびOGS1160(AGTCCTAAGAACTGTAAACG;配列番号238)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号37のmRNAの発現の増加は、卵巣および腎臓の癌においてのみ明白であった。
【図９３】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号38に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号38のためのプライマー対、OGS1202(AACATGACTAAGATGCCCAACC;配列番号157)およびOGS1203(AATCTCCTTCACCTCCACTACTG;配列番号158)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号38のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図９４】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号39に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号39のためのプライマー対、OGS1310(CATCTATACGTGGATTGAGGA;配列番号239)およびOGS1311(ATAGGTACCAGGTATGAGCTG;配列番号240)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号39のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図９５】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号40に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号40のためのプライマー対、OGS1155(TGTCCACATCATCATCGTCATCC;配列番号241)およびOGS1156(TGTCACTGGTCGGTCGCTGAGG;配列番号242)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号40のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図９６】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号41に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号41のためのプライマー対、OGS1212(AAGCATAGCCATAGGTGATTGG;配列番号159)およびOGS1213(ACAGGTATCAGACAAGGGAGCAG;配列番号160)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号41のmRNAの発現の増加は、卵巣および腎臓の癌ならびに白血病においてのみ明白であった。
【図９７】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号42に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号42のためのプライマー対、OGS1316(CATGGGGCTTAAGATGTC;配列番号243)およびOGS1317(GTCGATTTCTCCATCATCTG;配列番号244)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号42のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図９８】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号43に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号43のためのプライマー対、OGS1306(AAGAGGCGCTCTACTAGCCG;配列番号245)およびOGS1307(CTTTCCACATGGAACACAGG;配列番号246)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号43のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図９９】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号44に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号44のためのプライマー対、OGS1171(TTACGACCTATTTCTCCGTGG;配列番号161)およびOGS1172(AATGCAATAATTGGCCACTGC;配列番号162)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号44のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図１００】は、癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号45に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号45のためのプライマー対、OGS1175(ACACATCAAACTGCTTATCCAGG;配列番号163)およびOGS1176(ACTGATGTGAAAATGCACATCC;配列番号164)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号45のmRNAの発現の増加は、卵巣癌試料においてのみ明白であった。
【図１０１】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号46に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号46のためのプライマー対、OGS1286(CATTTTCCTGGAATTTGATACAG;配列番号247)およびOGS1287(GTAGAGAGTTTATTTGGGCCAAG;配列番号248)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号46のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図１０２】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号47に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号47のためのプライマー対、OGS1244(CATCTATGGTAACTACAATCG;配列番号249)およびOGS1245(GTAGAAGTCACTGATCAGACAC;配列番号250)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号47のmRNAの発現の増加は、卵巣癌においてのみ明白であった。
【図１０３】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号48に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号48のためのプライマー対OGS1282(ATGGCTCATACAGCACTCAGG;配列番号165)およびOGS1283(GAACTGTCACTCCGGAAAGCCT;配列番号166)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号48のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であった。
【図１０４】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号50に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号50のためのプライマー対OGS1035(CTGCCTGCCAACCTTTCCATTTCT;配列番号251)およびOGS1036(TGAGCAGCCACAGCAGCATTAGG;配列番号252)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号50のmRNAの発現の増加は、すべての癌型において明白であったが、CNSの癌および白血病において弱かった。
【図１０５】癌細胞系のNCI-60パネル由来のRNA試料における、STARにより選択された卵巣癌関連ヒト配列番号169に関する差次的発現データを示す、RT-PCRデータの写真である。配列番号169のためのプライマー対OGS1248(CACCTGATCAGGTGGATAAGG;配列番号253)およびOGS1249(TCCCAGGTAGAAGGTGGAATCC;配列番号254)を使用し、RT-PCRを実施した。期待PCRアンプリコンにより示されるように、配列番号169のmRNAの発現の増加は、卵巣、腎臓および肺の癌において明白であったが、CNSの癌においては弱かった。
【発明を実施するための形態】
【０２１２】
出願人は、慎重に計画した戦略を、卵巣癌に関連する遺伝子配列を同定および単離するために用いた。本方法は、以下のステップを含む:1)ヒト起源のLMPおよび悪性の卵巣癌の試料から単離したmRNAを使用する、非常に代表的なcDNAのライブラリーを調製するステップ、2)悪性卵巣癌試料において上方制御される配列を単離するステップ、3)上方制御された配列を同定し、特徴付けするステップ、4)組織特異性に関して上方制御された配列を選択するステップ、5)卵巣癌細胞系の増殖および遊走に対するノックダウン効果を確定するステップ、および6)9種の異なる癌型に由来する試料において、上方制御された各配列の発現パターンを確定するステップ。この開示において述べた結果により、正常組織と比較してこの分化細胞型に非常に特異的である、標的となる卵巣癌関連遺伝子の利点を実証し、遺伝子に基づく疾患または障害を研究する場合のより効果的なスクリーニング方法を提供する。公知であるが、本開示までにそれらに割り当てられた役割を有していなかったポリヌクレオチド配列および/またはポリペプチド配列もまた単離しており、卵巣癌細胞系の増殖および遊走において重要な役割を有することを示している。最終的に、同様の役目を果たす新規なポリヌクレオチド配列および/またはポリペプチド配列を同定している。
【０２１３】
本発明を、以下に限定されない方法でさらに詳細に例示する。
【０２１４】
A-材料および方法
本開示において述べる市販の試薬は、特に示さない限り供給業者の指示に従って使用した。本発明の開示を通して、特定の出発材料を以下のように調製した。
【０２１５】
B-LMPおよび悪性の卵巣癌細胞の調製
LMPおよび悪性卵巣腫瘍の試料を、組織病理学に基づいて選択し、それぞれの病期および悪性度を同定した(表B)。排卵のための増殖に関連する遺伝子を避けるために、正常卵巣組織の代わりにLMPを選択した。さらに非常にわずかな細胞も回収し、間質細胞が主要な混入物質であった。LMPおよび漿液性(最も一般的)卵巣腫瘍は、極度の腫瘍原性、分化、または浸潤を表す。試料を選択したら、組織を均一化した後に全RNAをTrizol(商標)(InVitrogen、Grand Island、NY)を用いて抽出した。RNAの特性を、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)を使用して評価した。
【０２１６】
【表２】
0005589149.tif 000003
【０２１７】
C-差次的に発現したmRNAを単離する方法
悪性卵巣癌に特有の差次的発現配列の発見のカギとなるのは、出願人の特許であるSTAR技術(Subtractive Transcription-based Amplification of mRNA;米国特許第5,712,127号、Malek他1998年)の使用である。この手法に基づき、悪性卵巣腫瘍試料から単離したmRNAを使用し、「テスターRNA」を調製し、これをLMP試料由来のmRNAから調製した、相補的一本鎖「ドライバーDNA」にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていない「テスターRNA」のみを回収し、「サブトラクトライブラリー」と名付けた、クローン化cDNAライブラリーの作製に使用する。それ故、「サブトラクトライブラリー」は、マイクロアレイハイブリダイゼーション分析によりしばしば不足する、稀で新規なmRNAを含む、差次的発現配列が豊富である。これらの稀で新規なmRNAは、より優れた診断および治療の戦略の開発のための、重要な遺伝子標的の代表と思われる。
【０２１８】
豊富な「サブトラクトライブラリー」に含まれるクローンを、DNA配列分析により同定し、それらの潜在的な機能を、公開データベース(NCBIおよびGeneCard)で利用可能な情報を獲得することにより判断する。重複していないクローンを、その後DNAマイクロアレイの調製に使用し、DNAマイクロアレイは、蛍光cDNAプローブにハイブリダイズさせることによって、それらの相対的差次的発現パターンの定量に使用する。同じサブトラクトライブラリーから調製したRNA転写産物(サブトラクトプローブ)または異なる卵巣LMP試料および卵巣悪性試料から単離したmRNA(標準プローブ)のどちらかから作製された、2種のcDNAプローブを使用できる。サブトラクトプローブの使用により、STARにより、保存され、濃縮された少量のmRNA配列の検出に対する感受性の増加が提供される。さらに、悪性卵巣癌に対する差次的発現配列の特異性を、各選択配列から調製された放射標識プローブを、異なるLMP試料および悪性卵巣癌試料ならびに異なる正常ヒト組織由来のRNAを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせることによって、測定する。
【０２１９】
遺伝子発現プロファイリングにおける主な課題は、分子分析に利用できるRNAの量が限られていることである。多くのヒトの検査試料(針吸引、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture micro-dissection(LCM))試料および形質移入培養細胞)から単離されたRNAの量は、多くの場合、1)STARのための従来のテスターおよびドライバー材料、2)DNAマイクロアレイ分析のための標準cDNAプローブ、3)発現の特異性を試験するためのRNAマイクロアレイ、4)ノーザンブロット、5)さらなる生物学的検証および特徴づけのための完全長cDNAクローン、などを調製するためには十分ではない。それ故、本出願人は、RAMP(RNA増幅手法(RNA Amplification Procedure))と呼ぶ、独自の技術を開発し(2005年7月14日に米国2005/0153333A1で公開された、「核酸の優先的末端タグ化」と題した、米国特許出願第11/000,958)、これにより、全RNA試料に含まれるmRNAを線形に増幅し、様々な分析的応用に十分な、μg量の増幅RNAが得られる。作製されるRAMP RNAは、線形転写増幅に使用するための、末端配列タグを一本鎖cDNA分子の3'-末端に付加する独自の方法の結果得られるほぼ完全長のmRNA様の配列である。RAMP反応で増幅された配列の99.5%より多くが、2倍に満たない多様性を示し、それ故、RAMPは、偏りのないRNA試料を、卵巣癌に関連する特有のmRNA配列の発見を可能にするために十分な量で提供する。
【０２２０】
D-ヒト悪性卵巣癌のサブトラクトライブラリーの調製
5種のヒト卵巣LMP試料(MF-15、-16、-18、-19および-20)(表B)および5種の悪性卵巣癌試料(MF-22、-25、-27、-28、および-30)(表B)(CHUM、Montreal、QC)由来の全RNAを、上記のように調製した。Malek他、1998年(米国特許第5,712,127号)の教示を少し変更した、(すなわち、以下に記載のように常磁性ビーズ上にcDNAライブラリーを調製した)後で、1μgの各試料由来の全RNAを使用し、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズ(inVitrogen、Grand Island、NY)上に、テスターおよびドライバーの材料を調製するために、非常に代表的なcDNAライブラリーを調製した。各々の場合において、第1鎖cDNAを、3'がロックされたヌクレオチド(例えば、A、GまたはC)であり、5'がビオチン部分であり、Not 1認識部位(OGS364:配列番号90)を含むオリゴdT11プライマーを使用して、合成した。次に、第2鎖cDNAの合成を、二本鎖cDNA合成のための製造業者(Invitrogen、Burlington、ON)の手法に従って実施し、Asc I認識部位を含むリンカー(New England Biolabs、Pickering、ON)に連結した二本鎖cDNAを得た。二本鎖cDNAは、その後Asc IおよびNot Iの制限酵素(New England Biolabs、Pickering、ON)を用いて消化し、Invitrogen(Burlington、ON)によるcDNA分画化カラムを、製造業者による指示のように使用して、過剰のリンカーから精製した。各試料を、等しく分割し、特殊化したオリゴヌクレオチドプロモータータグ、TAG1(OGS 594および595:配列番号91および配列番号92)およびTAG2(OGS458および459:配列番号93および配列番号94)に別々に連結し、それぞれテスター材料およびドライバー材料を調製するために使用した。その後、各連結cDNAを、供給業者(InVitrogen、Grand Island、NY)により記載されたようにストレプトアビジンビーズに捕捉することによって精製し、T7RNAポリメラーゼ(Ambion、Austin、TX)を用いてインビトロで転写した。
【０２２１】
次に、3'-表示テスターおよびドライバーのライブラリーを調製するために、インビトロで合成したRNAのそれぞれの10μgアリコートを、上記のように第1鎖cDNAの合成を実施することによって、二本鎖cDNAに転換し、続いて、Advantage（登録商標）-2 Taqポリメラーゼ(BD Biosciences Clontech、Mississauga、ON)を使用して、プライマーに従って(TAG1にプライマーOGS494(配列番号95)およびTAG2にプライマーOGS302(配列番号96))第2鎖DNA合成を実施した。二本鎖cDNAを、Qiaquick（登録商標）カラムを使用して精製し、A260nmで定量化した。その後、それぞれの二本鎖cDNAの6×1μgアリコートを、以下の4塩基認識制限酵素Rsa I、Sau3A1、Mse I、Msp I、HinPI IおよびBsh 1236I(MBI Fermentas、Burlington、ON)の1つを用いて個別に消化し、cDNAライブラリーに含まれる各RNA種のための6つまでの有望な3'-断片を得た。消化の後で、制限酵素を、フェノールを用いて不活性化し、6つの反応物のセットをプールした。制限酵素部位を、その後、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、Asc I認識部位を含むリンカーに連結した。各リンカーを適用し、プールしたDNA試料を、Asc IおよびNot I制限酵素を用いて消化し、脱塩し、特殊化したオリゴヌクレオチドプロモータータグ、TAG1(OGS 594および595)を、テスターRNAを作製するために元のTAG1に由来する材料に、およびTAG2関連OGS 621および622(配列番号97および配列番号98)を、ドライバーDNAの作製のために元のTAG2に由来する材料のためのプロモーター配列とだけ連結した。プロモーター連結材料を、ストレプトアビジンビーズを使用して精製し、これを、その後インビトロでいずれかのT7RNAポリメラーゼ(Ambion、Austin、TX)を用いて転写し、精製し、A260nmで定量化した。得られたTAG1を3'-に表示したRNAを、直接「テスターRNA」として使用し、一方、TAG2を3'に表示したRNAは、第1鎖cDNAの合成のために使用し、これはその後、一本鎖「ドライバーDNA」としての役目を果たした。各「ドライバーDNA」反応をRNase AおよびRNase Hを用いて処理し、RNAを除去し、使用前にフェノールを抽出し精製した。5種のLMP試料用のドライバーRNAそれぞれの当量を、一本鎖ドライバーDNAの合成の前にプールした。
以下の3'-表示ライブラリーを調製した:
テスター1(MF-22)-ヒト悪性卵巣癌ドナー1
テスター2(MF-25)-ヒト悪性卵巣癌ドナー2
テスター3(MF-27)-ヒト悪性卵巣癌ドナー3
テスター4(MF-28)-ヒト悪性卵巣癌ドナー4
テスター5(MF-30)-ヒト悪性卵巣癌ドナー5
ドライバー1(MF-15)-ヒト卵巣LMPドナー1
ドライバー2(MF-16)-ヒト卵巣LMPドナー2
ドライバー3(MF-18)-ヒト卵巣LMPドナー3
ドライバー4(MF-19)-ヒト卵巣LMPドナー4
ドライバー5(MF-20)-ヒト卵巣LMPドナー5
【０２２２】
各テスターRNA試料を、プールしたドライバーDNA(MF-15、-16、-18、-19および-20)から、Malek他、1998年(米国特許第5,712,127号)の教示に従って、1:100の比で、2ラウンド、米国特許第5,712,127号の教示に従ってサブトラクトした。さらに、テスターRNAを含むがドライバーDNAを含まない、ならびにRNAとドライバーDNAとを含むがRNaseHを含まない対照反応物を調製した。サブトラクションの後で各反応物に残存したテスターRNAを、二本鎖DNAに転換し、5%量を取り出し、標準PCR反応において30サイクル、分析目的で増幅した。2ラウンド後の、残りの95%のテスター-ドライバーとRNaseHとだけの、サブトラクトされた試料を、PCRにおいて4サイクル増幅し、Asc IおよびNot I制限酵素を用いて消化し、半分をpCATRMAN(配列番号99)プラスミドベクターに連結し、他の半分をp20(配列番号100)プラスミドベクターに連結した。連結した材料により大腸菌(E.coli)DH10Bを形質転換し、pCATRMANライブラリーに含まれる個々のクローンを、さらなる分析(DNA配列決定およびハイブリダイゼーション)のために採取し、一方各p20ライブラリーに含まれるクローンをサブトラクトプローブとしての使用のためにプールした。それぞれ4サイクル増幅し、クローン化したサブトラクトライブラリーは、それぞれ、15000から25000のコロニーを含んだ。さらに、サブトラクトcDNAプローブを調製するために、プールしたドライバーRNAを「テスター」として、各悪性テスターRNAを「ドライバー」として代わりに使用して、相互サブトラクションを2ラウンド実施した。各々へのサブトラクションの後に残存する材料を、PCRにおいて4サイクル同様に増幅し、Asc IおよびNot I制限酵素を用いて消化し、半分をp20プラスミドベクターに連結した。
以下のクローン化サブトラクトライブラリーを調製した:
SL123-テスター1(MF-22)-(マイナス)プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)
SL124-テスター2(MF-25)-(マイナス)プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)
SL125-テスター3(MF-27)-(マイナス)プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)
SL126-テスター4(MF-28)-(マイナス)プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)
SL127-テスター5(MF-30)-(マイナス)プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)
SL133-プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)-(マイナス)テスター1(MF-22)
SL134-プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)-(マイナス)テスター2(MF-25)
SL135-プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)-(マイナス)テスター3(MF-27)
SL136-プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)-(マイナス)テスター4(MF-28)
SL137-プールしたドライバー(MF-15、-16、-18、-19および-20)-(マイナス)テスター5(MF-30)
【０２２３】
30サイクルのPCRで増幅し、サブトラクトした、およびサブトラクトしない材料の5μLアリコートを、臭化エチジウムを含む1.5%アガロースゲルにおいて視覚化し、その後、サザンブロット分析のために、Hybond（登録商標） N+(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)ナイロンメンブレンに転写した。通常ハウスキーピング遺伝子を差次的に発現しない、GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ;アクセッション番号M32599.1)およびβ-アクチン(アクセッション番号X00351)に特異的な放射標識プローブを使用すると、GDPAHおよびβ-アクチンの両方のサブトラクションがあったことが明らかであった(図51、パネルAおよびB)。さらに同時に、CCNE1(アクセッション番号NM_001238、悪性卵巣癌において上方制御されることが公知の遺伝子)に特異的なプローブは、サブトラクトされなかったことが示された(図51、パネルC)。これらの結果に基づき、サブトラクトライブラリーは、差次的に発現し、上方制御された配列に富むことが見込まれた。
【０２２４】
E-サブトラクトライブラリーに含まれるクローンの配列の同定およびアノテーション
上記のpCATRMANサブトラクトライブラリー(SL123からSL127)に含まれる、およそ約5300の個々のコロニーを、Qbot(Genetix Inc.、Boston、MA)を使用して、60μLのオートクレーブをかけた水にランダムに採取した。その後、それぞれの42μLを、オリゴヌクレオチドプライマー、OGS1およびOGS142を含む100μLの標準PCR反応に使用し、40サイクル(94℃10分間、40×(94℃40秒、55℃30秒および72℃2分間)その後、72℃7分間)、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、HotStartTM Taqポリメラーゼ(Qiagen、Mississauga、ON)を使用して増幅した。完全PCR反応物を、96ウェルフィルタープレート(Corning)を使用して脱塩し、アンプリコンを100μLの10mM Tris(pH8.0)に回収した。各PCR反応物の5μLアリコートを、臭化エチジウムを含む1.5%アガロースゲルにおいて視覚化し、単独の増幅産物を含む反応物だけを、ABI 3100機器(Applied Biosystems、Foster City、CA)において実施した、標準DNA配列決定を使用するDNA配列分析のために選択した。得られた各DNA配列に、配列ID番号を与え、その後の追跡およびアノテーションのためにデータベースに入れた。
【０２２５】
各配列を、公開データベース(例えば、NCBI)のBLAST分析のために選択した。これらの配列には、標準ハウスキーピング遺伝子(GAPDH、アクチン、大部分のリボソームタンパク質など)がなく、これは、サブトラクトライブラリーに、少なくとも、相対的に豊富な差次的に発現しない配列がなかったという好ましい兆しであった。
【０２２６】
選択したクローンの配列決定およびアノテーションが完了したら、次のステップは、LMP試料と比較して、悪性卵巣癌試料において実際に上方制御されたそれらの配列の同定を含む。
【０２２７】
F-上方制御された配列の同定のためのハイブリダイゼーション分析
上記のpCATRMANライブラリーからのアノテーション配列を表すPCRアンプリコンを、DNAマイクロアレイを調製するために使用した。前項において調製したPCR反応物の70μLに含まれる精製PCRアンプリコンを、凍結乾燥し、それぞれを20μLの、3×SSCおよび0.1%サルコシルを含むスポッティング溶液で再構成した。各アンプリコンの三連のDNAマイクロアレイを、その後、CMT-GAP2スライド(Corning、Corning、NY)およびGMS417スポッター(Affymetrix、Santa Clara、CA)を使用して、調製した。
【０２２８】
DNAマイクロアレイを、その後、標準の、またはサブトラクトした、cy3およびcy5により標識したcDNAプローブのどちらかと、供給業者(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)により推奨されたようにハイブリダイズした。標準cDNAプローブを、異なるヒト卵巣のLMP試料および悪性試料から調製したRAMP増幅RNAを使用して合成した。標準cDNAプローブが限られた検出の感受性しか提供せず、その結果cDNAプローブに含まれる少量の配列は、普通、見逃されてしまうことは、当業者には周知である。それ故、ハイブリダイゼーション分析は、サブトラクトライブラリー(SLP123からSLP127およびSLP133からSLP137)から作製したインビトロ転写RNAから調製した、cy3およびcy5で標識したサブトラクトcDNAプローブを、p20プラスミドベクターにクローン化し、異なるテスターおよびドライバーの材料を表示した。これらのサブトラクトライブラリーは、以下のMalek他、1998年(米国特許第5,712,127号)の教示に従った結果として、少量の配列に富んでいると思われ、したがって、検出感受性の増加を提供できる。
【０２２９】
全ハイブリダイゼーション反応を、供給業者(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)による推奨のように色素交換(dye-swap)手法を使用して実施し、およそ750種の推定的差次的発現した上方制御された(2倍未満)配列をさらなる分析のために選択した。
【０２３０】
G-同定された差次的発現配列の悪性卵巣癌特異性の確定
異なるヒト悪性卵巣癌のサブトラクトライブラリー(SL123からSL127)のために、Fの項において同定された差次的発現配列を、ナイロンメンブレンに基づくマイクロアレイにハイブリダイズすることにより、特異性に関して試験した。マイクロアレイを、6種のLMPおよび20種の悪性のヒト卵巣試料ならびに市販(Ambion、Austin、TX)の30種の正常ヒト組織(副腎、肝臓、肺、卵巣、骨格筋、心臓、頚部、甲状腺、乳腺、胎盤、副腎皮質、腎臓、大静脈、ファローピウス管、膵臓、精巣、空腸、大動脈、食道、前立腺、胃、脾臓、回腸、気管、脳、結腸、胸腺、小腸、膀胱および十二指腸)由来のRAMP増幅RNAを使用して調製した。さらに、乳癌細胞系、MDAおよびMCF7、前立腺癌細胞系、LNCapならびに正常および前立腺癌のLCM顕微解剖試料から、RAMP RNAを調製した。これらの試料の多くに関して、利用できるmRNAの量が限られているため、RAMP方法論を使用して、まずmRNAを増幅する必要があった。各増幅RNA試料を、3×SSCおよび0.1%サルコシル中に最終濃度250ng/μLに、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて再構成し、1μLをHybond（登録商標） N+ナイロンメンブレン上に、特殊化MULTI-PRINT(商標)装置(VP Scientific、San Diego、CA)を使用してスポットし、風乾させ、UV架橋させた。マイクロアレイ分析のために、SL123からSL127選択した約750の異なる配列のうち250の配列のみを、個別に、α-32P-dCTPを用いて、供給業者(Amersham、Piscataway、NJ)により推奨されるランダムプライミング法を使用して放射標識し、今のところマイクロアレイ上のプローブとして使用した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップを、当業者には周知の標準的手法に従って実施した。
【０２３１】
時として、マイクロアレイ方法論から得た結果は決定的でなかった。例えば、メンブレンを、特定のSTARクローンを用いてプロービングすることにより、すべてのRNA試料が同じレベルのメッセージを発現すると思われるパターン、またはシグナルがなかったパターンがもたらされた。このことは、すべてのSTARクローンが、それらの個別の遺伝子発現を確認するための有用なツールであるとは限らないことを示唆している。この問題を回避するために、RT-PCRを、発現の特異性を確定するために使用した。マイクロアレイ上にスポットした同じRAMP RNA試料を使用することで、500μgのRNAを、製造業者による記載のようにThermoscript（登録商標） RT(Invitrogen、Burlington、ON)を用いて、一本鎖cDNAに転換した。cDNA反応物を、反応物の1/200が各PCR実験に使用するように希釈した。各被験配列番号に対して設計された、遺伝子特異的プライマーを用いたPCR反応の試験後、反応物の線形範囲を確定し、すべての試料に適用し、PCRを、96ウェルプレートにおいて、Qiagen(Mississauga、ON)によるHotStarTaq（登録商標）ポリメラーゼを使用し、MJ ResearchによるDNA Engine Tetrad（登録商標）において実施した。反応混合物の半分を、1.2%アガロース/臭化エチジウムゲルに添加し、アンプリコンを、UV光を用いて可視化した。
【０２３２】
250の被験配列のおよそ55%が、LMPと比較して多くの悪性試料において上方制御されたことが見出された。しかし、これらの配列の多くは、大部分の異なる正常ヒト組織においてもまた容易に検出された。これらの結果に基づき、多くの他のヒト組織で有意にレベルが上昇して検出された配列は、排除した。結果として、上方制御され、悪性卵巣癌に非常に特異的であると思われる49の配列のみを、生物学的検証の研究のために選択した。この49の配列のサブセットは、卵巣癌において上方制御されることが、これまでにも文献において報告されているが、正常組織におけるそれらの相対的発現の実証が報告されていないいくつかの遺伝子を含む。FOLR1(配列番号50)に関するマイクロアレイデータは、卵巣癌の発生に関連のあることが既に公知である遺伝子の、ハイブリダイゼーションパターンおよび特異性を例示するために含まれる。
【０２３３】
図1〜49および51は、生物学的検証のために単離され、選択された50の配列に関する、LMPと比較した悪性卵巣癌および正常ヒト組織に関するマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルパターンおよびRT-PCR増幅データを示す。50の選択された配列のうち、27配列が機能的アノテーションを有する遺伝子に関連し、15配列が機能的アノテーションを有さない遺伝子に関連し、8配列は、新規の配列であった(ヒットしたゲノム)。それ故、卵巣癌の発生の調節に関連する遺伝子産物の同定により、新規な標的を含む、卵巣癌の管理に対する新規な治療的戦略の開発のための非常に具体的な発見がもたらされる。表2に要約した代表的配列を以下に提示し、対応する配列を表4に例示する。
【０２３４】
本発明は、それ故、それらの1つの態様において、卵巣癌に関連する差次的発現配列を、典型的に同定する方法に関する。配列は、例えば、LMP卵巣癌細胞または正常細胞と比較して、悪性卵巣癌細胞において差次的に発現し得る。配列は、例えば、正常卵巣細胞と比較して、悪性卵巣癌細胞およびLMP卵巣癌細胞において差次的に発現し得る。
【０２３５】
本発明の方法は、
a)悪性およびLMPの卵巣癌細胞ならびに正常卵巣細胞から全メッセンジャーRNAを個別に提供し、全メッセンジャーRNAは、例えば、少なくとも1種の内因的差次的発現配列を含み得るステップ、
b)悪性卵巣癌細胞の各メッセンジャーRNAから一本鎖cDNAを作製(例えば、a)のシングルコピー)し、RNAポリメラーゼプロモーター配列および第1配列タグを用いて一本鎖cDNAの3'末端にタグを付ける(例えば、ランダムに)ステップ、
c)LMP卵巣癌細胞または正常卵巣細胞の各メッセンジャーRNAから一本鎖cDNAを作製(例えば、a)のシングルコピー)し、RNAポリメラーゼプロモーター配列および第2配列タグを用いて一本鎖cDNAの3'末端にタグを付ける(例えば、ランダムに)ステップ、
d)b)およびc)のそれぞれから部分的または完全な二本鎖5'タグ化DNAを、個別に作製し、それ故、二本鎖5'タグ化DNAが、5'から3'方向に二本鎖RNAポリメラーゼプロモーター、第1または第2の配列タグおよび発現核酸配列を含み得るステップ、
e)d)のそれぞれから、RNAポリメラーゼ酵素(タグ付けに使用したプロモーターに基づき選択できる)を用いて、第1および第2のタグ化センスRNAを個別に線形に増幅するステップ、
f)e)の1つから、一本鎖の相補的第1または第2タグ化DNAを作製するステップ、
g)f)の一本鎖の相補的第1または第2タグ化DNAと、e)の他の線形に増幅されたセンスRNAとをハイブリダイズさせるステップ、
h)第1または第2の配列タグの助け(例えば、PCRまたはハイブリダイゼーション)により、ハイブリダイズしていないRNAを回収するステップ、
i)ハイブリダイズしていないRNAのヌクレオチド配列を同定(確定)するステップ
を、またはこれらのステップのいくつかを含み得る。
【０２３６】
本方法は、正常細胞(例えば、正常卵巣細胞、正常前立腺細胞、正常乳腺細胞など)と比較して、または基準値と比較して、癌細胞における同定された差次的発現配列の存在を、比較的に確定するステップをさらに含み得る。
【０２３７】
本方法を使用して、低悪性度の潜在的卵巣癌由来の細胞および/または正常細胞と比較して、悪性卵巣癌細胞において上方制御される配列を優先的に同定することができる。
【０２３８】
本発明によれば、配列は、他の正常細胞(例えば、正常卵巣細胞)または組織のサブセットにおいて、減少した、低減した、または実質的に存在しない発現に基づいてさらに選択でき、したがって、卵巣癌に特異的に関連する候補配列を代表する。
【０２３９】
本方法は、ヌクレオチド配列の完全な配列を確定するステップをさらにまた含み得、ヌクレオチド配列のコード配列を確定するステップもまた含み得る。
【０２４０】
配列を、他の型の腫瘍細胞に対するその特異性に関してもまた選択でき、それ故、癌の発生において、より全身に関与する配列も同定できる。これらの型の配列は、したがって、癌の治療および/または検出においてより万能な有用性を有する望ましい候補を表し得る。
【０２４１】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法により同定された、単離差次的発現配列(ポリヌクレオチドおよびポリペプチド)にもさらに関する。
【０２４２】
配列番号1:
配列番号1に対する候補STAR配列は、NCBIのnrまたはestデータベース(表2を参照のこと)に従ってヒットしたゲノムおよびヒットしたestに対してマッピングする。しかし、マッチしたestは、新規のUnigeneID番号、Hs.555871にクラスタリングされているが、STAR配列は、このクラスタに記載の公知のmRNA配列のいずれに対してもマッピングされておらず、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、γ-誘導活性ポリペプチド1(GNGT1)をコードする。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されていることを実証したが(図1)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列を含む遺伝子、またはUnigeneクラスタに概説されたような関連する遺伝子メンバーは、卵巣癌腫瘍発生に必要であり得ると考えられる。
【０２４３】
配列番号2:
単離された配列番号2によりコードされる候補タンパク質は、予測ポリペプチドである、機能未知のインターフェロン誘導タンパク質44様(IFI44L)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図2)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、この遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要または関連し得ることが考えられる。
【０２４４】
配列番号3:
単離された配列番号3によりコードされる候補タンパク質は、ホメオボックスDNA結合ドメインを含む公知のポリペプチド、HOX D1をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する。この遺伝子は、Antpホメオボックスファミリーのメンバーであり、分化および四肢の発生に関連することがすでに公知である核配列特異的転写因子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図3)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、この遺伝子は、卵巣癌の腫瘍発生に、同様に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２４５】
配列番号4:
単離された配列番号4によりコードされる候補タンパク質は、機能未知の死関連タンパク質と類似の仮想ポリペプチド、LOC92196をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図4)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、この遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２４６】
配列番号5:
単離された配列番号5によりコードされる候補タンパク質は、機能未知の予測ポリペプチド、テトラトリコペプチド反復配列1(IFIT1)を有するインターフェロン誘導タンパク質をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図5)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、この遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２４７】
配列番号6:
単離された配列番号6によりコードされる候補タンパク質は、グリシンの分解を触媒するミトコンドリア内酵素である公知のタンパク質、グリシンデヒドロゲナーゼ(GLDC)(脱炭酸;グリシンデカルボキシラーゼ、グリシン切断系タンパク質P)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図6)、このことは今までのところ報告されていない。
それ故、この遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。GLDC活性は、例えば、グリシンの尿素への分解を測定することによって検出できる。
【０２４８】
配列番号7:
単離された配列番号7によりコードされる候補タンパク質は、メンブレンジペプチダーゼ(タンパク質分解およびペプチド分解)活性を有するタンパク質、ジペプチダーゼ3(DPEP3)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図7)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、この遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２４９】
配列番号8
単離された配列番号8によりコードされる候補タンパク質は、平滑筋に対して強力な活性を有する神経ペプチドであるタンパク質、ニューロメジンU(NMU)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図8)、このことは今までのところ報告されていない。
それ故、この遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５０】
配列番号9
単離された配列番号9によりコードされる候補タンパク質は、カルシウムの調節および骨の恒常性において役目を果たすタンパク質、骨形成タンパク質7(BMP7)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図9)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５１】
配列番号10
単離された配列番号10によりコードされる候補タンパク質は、細胞周期のG1からSへの移行において発現するタンパク質、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子3(CDKN3)(CDK2関連二重特異性ホスファターゼ)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図10)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５２】
配列番号11
単離された配列番号11によりコードされる候補タンパク質は、細胞周期の調節においてサイクリン依存性タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質、CDC28タンパク質キナーゼ調節サブユニット1B(CKS1B)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図11)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５３】
配列番号12
単離された配列番号12によりコードされる候補タンパク質は、公知の機能を有さないタンパク質、メラノーマにおいて優先的に発現される抗原(PRAME)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図12)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５４】
配列番号13
単離された配列番号13によりコードされる候補タンパク質は、ユビキチン依存性タンパク質異化作用に関係するタンパク質、ISG15ユビキチン様修飾因子(ISG15)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図13)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５５】
配列番号14
単離された配列番号14により表される候補STAR配列は、アクセッション番号AI922121.1に関する、すでに同定された部分遺伝子配列に関連し、いまだ未知のタンパク質をコードする(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図14)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(および本STAR配列を含むポリヌクレオチド配列)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５６】
配列番号15
単離された配列番号15によりコードされる候補タンパク質は、公知の機能を有さない仮想タンパク質、FLJ33790をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図15)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５７】
配列番号16
単離された配列番号16により表される候補STAR配列は、いまだ未知のタンパク質をコードする、UnigeneクラスタHs.334302に含まれる転写ゲノム遺伝子座に由来する、すでに同定されたest、BG213598にマッピングされる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図16)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子またはUnigeneクラスタに概説されるような関連遺伝子メンバーの発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５８】
配列番号17
単離された配列番号17によりコードされる候補タンパク質は、公知の機能を有さないタンパク質、T細胞活性化抑制因子1を含むVセットドメイン(VTCN1)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図17)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２５９】
配列番号18
単離された配列番号18によりコードされる候補タンパク質は、細胞分裂およびゴルジ体内の膜輸送に関係するタンパク質、キネシンファミリーメンバー20A(KIF20A)をコードする、すでに同定された遺伝子に関連する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図18)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６０】
配列番号19
単離された配列番号19により表されるSTAR配列は、ヒットしたゲノム、アクセッション番号AY769439およびアクセッション番号AA744939により表されるestのグループにマッピングされる。estは、タンパク質の、カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーM、βメンバー2(KCNMB2)を表す、Unigene ID、Hs.478368にクラスタリングされる。しかし、STAR配列は、Hs.478368 Unigeneクラスタに記載されたいずれのmRNAとも、今までのところ重複してない(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図19A)、このことは今までのところ報告されていない。さらに、配列番号19に対するSTARクローン配列またはアクセッション番号NM_005832により表されるKCNMB2配列のどちらかに対して特異的なプライマーを使用して、RT-PCRを実施したところ、増幅プロフィールは、多くの被験卵巣試料にわたって同じではなかった(図19B)。KCNMB2が、本質的に、正常を含むすべての卵巣試料において、同様のレベルで発現したことは明らかであり、一方、配列番号19に関するPCRアンプリコンは、LMPおよび正常な卵巣試料と比較して、悪性卵巣腫瘍試料においてより高いレベルで観察された(図19B)。それ故、このSTAR配列(および本STAR配列を含むポリヌクレオチド配列)に対応する遺伝子、または関連遺伝子メンバーの発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６１】
配列番号20
単離された配列番号20により表されるSTAR配列は、いまだ未知のタンパク質をコードするすでに同定されたest、UnigeneクラスタHs.603908に含まれる、転写ゲノム遺伝子座に由来するestのグループに属するBU595315にマッピングされる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図20)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド配列)に対応する遺伝子またはUnigeneクラスタにおいて概説されるような関連遺伝子メンバーの発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６２】
配列番号21
単離された配列番号21によりコードされる候補タンパク質は、ケモカイン活性を有するタンパク質、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド10(CXCL10)をコードするすでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図21)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６３】
配列番号22
単離された配列番号22により表されるSTAR配列は、14番染色体にマッピングされ、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図22)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６４】
配列番号23
単離された配列番号23によりコードされる候補タンパク質は、タンパク質のN結合グルコシル化のために第2のグルコース残基を脂質結合オリゴ糖前駆体へ付加することを触媒するタンパク質、アスパラギン結合グリコシル化8相同体(酵母、α-1,3-グルコシルトランスフェラーゼ)(ALG8)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図23)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６５】
配列番号24
単離された配列番号24によりコードされる候補タンパク質は、公知の機能を有さないタンパク質、腎臓関連抗原1(KAAG1)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図24)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６６】
配列番号25
単離された配列番号25によりコードされる候補タンパク質は、細胞周期の調節、G1/Sチェックポイントに関係するタンパク質、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子2A(CDKN2A)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図25)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６７】
配列番号26
単離された配列番号26によりコードされる候補タンパク質は、G1/S移行から細胞質分裂の終りまでの細胞増殖に関係するタンパク質、微小管関連タンパク質相同体(アフリカツメガエル(Xenopus laevis))(TPX2)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図26)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６８】
配列番号27
単離された配列番号27によりコードされる候補タンパク質は、有糸分裂サイクリンの分解および細胞周期の進行に必要なタンパク質、ユビキチン結合酵素E2C(UBE2C)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図27)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２６９】
配列番号28
単離された配列番号28により表されるSTAR配列は、UnigeneクラスタHs.590469のSPLEN2002463をクローン化し、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる、cDNA FLJ35538 fisにマッピングされる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図28)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子またはUnigeneクラスタに概説されるような関連遺伝子メンバーの発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７０】
配列番号29
単離された配列番号29によりコードされる候補タンパク質は、機能は正確には確定されていないが、イソ型が、ヒトの皮膚の成長および分化のレチノイン酸仲介調節において重要であるタンパク質、細胞内レチノイン酸結合タンパク質2(CRABP2)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図29)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７１】
配列番号30
単離された配列番号30によりコードされる候補タンパク質は、ヌクレオソームの形成に関係するタンパク質、ヒストン3、H2a(HIST3H2A)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図30)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７２】
配列番号31
単離された配列番号31によりコードされる候補タンパク質は、ヌクレオソームの形成に関係するタンパク質、ヒストン1、H4h(HIST1H4H)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図31)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７３】
配列番号32
単離された配列番号32によりコードされる候補タンパク質は、発生および分化に関係する核転写因子である仮想タンパク質、ホメオボックス  D3(HOXD3)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図32)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７４】
配列番号33
単離された配列番号33によりコードされる候補タンパク質は、おそらく免疫応答および抗原結合において役目を果たす免疫グロブリン遺伝子ファミリーのメンバー、免疫グロブリン定常領域γ1(IGHG1)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図33)、このことは今までのところ報告されていない。この遺伝子の発現パターンは、本明細書に開示された2種の他の遺伝子、配列番号34および配列番号47に類似し、これらもまた免疫グロブリンをコードする。卵巣癌におけるこの型のクラスタリングされた免疫グロブリンの発現は、今までに記載されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得ると考えられる。
【０２７５】
配列番号34
単離された配列番号34によりコードされる候補タンパク質は、おそらく免疫応答および抗原結合において役目を果たす免疫グロブリン遺伝子ファミリーのメンバー、免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図34)、このことは今までのところ報告されていない。この遺伝子の発現パターンは、本明細書に開示された2種の他の遺伝子、配列番号33および配列番号47に類似し、これらもまた免疫グロブリンをコードする。卵巣癌におけるこの型のクラスタリングされた免疫グロブリンの発現は、今までに記載されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得ると考えられる。
【０２７６】
配列番号35
単離された配列番号35によりコードされる候補タンパク質は、機能未知のオープンリーディングフレームをコードする、10番染色体に位置する遺伝子である(表2を参照のこと)。この遺伝子は、DiGeorge症候群において重要な領域で発現されることが見出されたアストロプリンシン(astroprincin)と称するタンパク質をコードできる。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図35)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７７】
配列番号36
単離された配列番号36によりコードされる候補タンパク質は、公知の機能は有さないタンパク質、組織適合性(マイナー)13(HM13)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図36)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７８】
配列番号37
単離された配列番号37により表されるSTAR配列は、13番染色体にマッピングされ、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図37)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２７９】
配列番号38
単離された配列番号38によりコードされる候補タンパク質は、症候性骨関節炎に関係し、骨格形態形成において役目を果たすと思われるタンパク質、frizzled関連タンパク質(FRZB)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図38)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８０】
配列番号39
単離された配列番号39によりコードされる候補タンパク質は、細胞増殖に関係する遺伝子を調節する転写因子であるタンパク質、フォークヘッドボックスM1(FOXM1)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図39)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８１】
配列番号40
単離された配列番号40によりコードされる候補タンパク質は、機能未知のオープンリーディングフレームをコードする、20番染色体に位置する遺伝子である(表2を参照のこと)。この遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予測される。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図40)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８２】
配列番号41
単離された配列番号41により表されるSTAR配列は、1番染色体にマッピングされ、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる(表2を参照のこと)。弱い相同性が配列番号41と、ヒト内在性レトロウイルスの表面に存在するエンベロープタンパク質とに見出された。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図41)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８３】
配列番号42
単離された配列番号42によりコードされる候補タンパク質は、機能未知のオープンリーディングフレームをコードする、16番染色体に位置する遺伝子である(表2を参照のこと)。この遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予測される。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図42)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８４】
配列番号43
単離された配列番号43によりコードされる候補タンパク質は、Rho GTPaseと相互に作用し多くの細胞過程を調節するGTPaseであるタンパク質、Rac GTPase活性化タンパク質1(RACGAP1)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。これら型のタンパク質はRho GTPaseの下流のシグナル伝達のための重要なエフェクター分子である。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図43)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８５】
配列番号44
単離された配列番号44によりコードされる候補タンパク質は、公知の機能を有さない膜貫通タンパク質19(TMEM19)をコードする遺伝子である(表2を参照のこと)。この遺伝子は、膜タンパク質をコードすると予測される。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図44)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８６】
配列番号45
単離された配列番号45により表されるSTAR配列は、4番染色体にマッピングされ、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図45)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８７】
配列番号46
単離された配列番号46により表されるSTAR配列は、1番染色体にマッピングされ、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図46)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２８８】
配列番号47
単離された配列番号47によりコードされる候補タンパク質は、Unigeneクラスタ、Hs.449585によりすでに同定された遺伝子であり、免疫グロブリンλ遺伝子座(IGLV@)の一部を表すと思われ、これは、おそらく免疫応答および抗原結合において役目を果たす(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図47)、このことは今までのところ報告されていない。この遺伝子の発現パターンは、本明細書に開示された2種の他の遺伝子、配列番号33および配列番号34に類似し、これらもまた免疫グロブリンをコードする。卵巣癌におけるこの型のクラスタリングされた免疫グロブリンの発現は、今までに記載されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得ると考えられる。
【０２８９】
配列番号48
単離された配列番号48によりコードされる候補タンパク質は、小胞輸送の間の細胞表面担体タンパク質として機能するタンパク質、分泌担体膜タンパク質3(SCAMP3)をコードする、すでに同定された遺伝子である(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子の発現が、卵巣LMP試料と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されるが、大部分の正常ヒト組織においても発現することを実証し(図48)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、本遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２９０】
配列番号49
単離された配列番号49により表されるSTAR配列は、2番染色体にマッピングされ、未知の遺伝子配列の一部を表すと思われる(表2を参照のこと)。本発明者らは、このSTARクローン配列が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図49)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２９１】
配列番号50
単離された配列番号50によりコードされる候補タンパク質は、タンパク質、葉酸受容体1(成人)(FOLR1)をコードする、すでに同定された遺伝子であり、この遺伝子ファミリーのメンバーは、葉酸およびいくつかの還元された葉酸誘導体に高い親和性を有し、細胞内部への5-メチルテトラヒドロ葉酸の送達を仲介する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証した(図50)。卵巣癌治療におけるFOLR1の有力な役割は、すでに立証されている(LeamonおよびLow、2001年ならびにJhaveri他、2006年、米国特許第7,030,236号)。FOLR1遺伝子標的の例のつもりで、本明細書中に記載の、悪性卵巣腫瘍において上方制御され、大部分の正常組織において制限され、または発現しない類似の遺伝子もまた、卵巣癌の潜在的治療標的として機能し得る。
【０２９２】
配列番号169
単離された配列番号169によりコードされる候補タンパク質は、血漿中のほとんどの銅と結合し、Fe(II)トランスフェリンの過酸化に関係するタンパク質、セルロプラスミン(CP)をコードする、すでに同定された遺伝子である。無セルロプラスミン血症と呼ばれる、この金属タンパク質の不足は、鉄の蓄積および組織の損傷をもたらし、糖尿病および神経系の疾患に関係する(表2を参照のこと)。本発明者らは、この遺伝子が、卵巣LMP試料および大部分の正常ヒト組織と比較して、悪性卵巣癌試料において明らかに上方制御されることを実証したが(図56)、このことは今までのところ報告されていない。それ故、このSTAR配列(およびこのSTAR配列を含むポリヌクレオチド)に対応する遺伝子の発現は、卵巣癌の腫瘍発生に必要であり得る、または関連し得ると考えられる。
【０２９３】
H-RNA干渉研究
RNA干渉は、mRNAを分解の標的とすることによる遺伝子発現における配列-特異的減少に関する、最近発見された遺伝子調節機序であり、もともとは植物において記載されたが、原生動物および無脊椎動物から高等真核生物までの多くの動物界にわたって発見されている(Agrawal他、2003年の総説)。生理的環境において、RNA干渉の機序は、21〜23bpのsiRNAを放出する、ダイサーと呼ばれる、細胞において活性なRNAseIII様タンパク質により切断された二本鎖RNA分子の存在によって誘発される。siRNAは、相同性が作動する方法で、RISC(RNA-誘導型サイレンシング複合体)と呼ばれるRNAタンパク質の融合体に、mRNAの存在下で組み込まれ、mRNAの発現の減衰をもたらす分解を起こす(Agrawal他、2003)。
【０２９４】
遺伝子ノックアウトマウスおよび優勢阻害などの遺伝子機能を研究するための現在の取組みは、多くの場合効果がなく、一般的に高価であり、時間がかかる。RNA干渉は、迅速で比較的安価な方法で、多くの遺伝子を分析するための選択法であることが分かっている。合成siRNAの形質移入は有効な方法であるが、効果は多くの場合良くても一時的である(Hannon G.J.、2002年)。安定した形質移入により短鎖ヘアピンRNAを発現したプラスミドの送達は、長期的研究においてRNA干渉の分析を可能にすることにおいて成功している(Brummelkamp他、2002年;Elbashir他、2001年)。
【０２９５】
I-卵巣癌細胞系の増殖に対するノックダウン効果の確定
どの卵巣癌特異的遺伝子が卵巣癌細胞の増殖に加わるかを確定するために、レベルが減衰した(即ち、ノックダウン)調査している特異的遺伝子を含む、安定した形質移入細胞系を使用したアッセイを開発した。化学療法にナイーブな患者に由来する、それらの形態、腫瘍原性および広範囲の発現プロフィールに関してあらかじめ特徴付けされている2種のヒト卵巣癌細胞系を利用した。さらに、これらの分析により、これらの細胞系がヒトにおける卵巣腫瘍のインビボの挙動に関する優れたモデルであったことが明らかになった(Provencher他、2000年およびSamouelian他、2004年)。これらの細胞系は、TOV-21GおよびTOV-112Dと指定した。
【０２９６】
個々のshRNAの発現カセットの設計およびサブクローニングならびに各ヌクレオチド配列の特徴付けに利用した手法を、以下に記載した。ポリヌクレオチドの選択を、上記のように、卵巣腫瘍におけるそれらの上方制御および他の組織と比較したこれらの腫瘍におけるそれらの発現の選択特性に基づき選択した。shRNA配列の設計を、当業者が自由に利用可能なウェブベースのソフトウェア(例えば、Qiagen)を使用して実施した。これらの選択配列、通常19merが、shRNAの鋳型を形成する2種の相補的オリゴヌクレオチド、すなわち、19ntのセンス配列、9ntのリンカー領域(ループ)、19ntのアンチセンス配列、そのあとにRNAポリメラーゼIIIの終止のために5〜6ポリ-Tトラクトに含まれた。適切な制限部位をこれらのオリゴヌクレオチドの末端に挿入し、転写開始点がhU6プロモーターの下流の正確な位置であるように、インサートの適切な位置決めを容易にした。すべてのRNA干渉研究に利用したプラスミドであるpSilencer 2.0(配列番号101)を、商業的供給業者(Ambion、Austin、TX)から購入した。選択した各配列に関した少なくとも2種の異なるshRNA発現ベクターを構築し、RNA干渉を観察する機会を増やした。
【０２９７】
TOV-21GまたはTOV-112D細胞を、10%ウシ胎児血清を含むOSEに、600000細胞/ウェルの濃度で、6ウェルプレートに播種し(Samouelian他、2004年)、プレートを一晩放置し、1μgのpSil-shRNAプラスミド(図53、sh-1およびsh-2)を、フュージーン(Fugene)（登録商標）6試薬(Roche、Laval、QC)を使用して、形質移入させた。培養16時間後、2μg/mlのピューロマイシン(Sigma、St.Louis、Mo)を含む新鮮な培地を加え、安定な形質移入体を選択した。対照細胞に、公知のヒト遺伝子には相同性を示さない、スクランブルshRNA配列を含む、対照pSil(sh-scr(配列番号102)を形質移入した。およそ4〜5日後、プールおよび/または個々の細胞クローンを単離し、さらなる分析に広げた。減衰の有効性を、全shRNA細胞系において検証した。全RNAを、6ウェルプレートにおいて増殖した細胞から、Trizol（登録商標）)試薬を使用する標準的方法により調製し、標的遺伝子の発現を、遺伝子特異的プライマーを使用するRT-PCRにより確定した。第1鎖cDNAを、サーモスクリプト(Thermoscript)（登録商標）(Invitrogen、Burlington、ON)を使用して作製し、半定量的PCRを、標準的方法(Qiagen、Mississauga、ON)により実施した。対照pSilプラスミド(sh-scr)を形質移入された細胞において見出された発現を、所与の遺伝子に関する100%の発現レベルと定めた。図52は、2種の候補遺伝子、配列番号1および配列番号3の減衰による代表的結果を示す。RT-PCRを、対照細胞系由来の全RNAを使用して実施した場合(図52、pSil-scr)、期待したサイズの一本のバンドが観察された。配列番号1(0094)(sh-1:配列番号103およびsh-2:配列番号104)または配列番号3(0671)(sh-1:配列番号107およびsh-2:配列番号108)のためのshRNAを含む細胞系由来の全RNAを、同じ条件で増幅した場合、これらの遺伝子の発現レベルに、有意な減少が観察された。これらの結果は、TOV-21G安定形質移入体において発現したshRNAが、それらの標的遺伝子の発現の減衰に成功したことを示唆している。すべての反応物中の等量のRNAに対する対照として、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの発現を観測し(図52、GAPDH)、使用した全試料において同じレベルで発現したことが見出された。
【０２９８】
各shRNA発現細胞系の増殖能力を確定し、スクランブルshRNA(対照)を発現する細胞と比較した。細胞数を、570nmにおいてMTTアッセイにより、分光光度法で測定した(Mosmann、1983年)。安定的にshRNAを発現するプールの選択および系の拡大の後、5000細胞/ウェルの各細胞系を、48ウェルプレートに三連に播種し、標準的成長条件下で4日間インキュベートした。2つの実験の代表的データ±SEMを示し、実験は通常少なくとも3回反復し、観察された結果を確認した。図53は、増殖アッセイを安定TOV-21G細胞系に適用した時に得られた、代表的結果を示す。スクランブルshRNAを発現する対照細胞系における、4日後の細胞数(図53、sh scr)を、適宜100%に設定した。配列番号1(sh-1:配列番号103およびsh-2:配列番号104)、配列番号3(sh-1:配列番号107およびsh-2:配列番号108)および配列番号8(0065)(sh-1:配列番号117およびsh-2:配列番号118)に対するshRNAを含むTOV-21G細胞系は、少なくとも1種のshRNAに関して対照細胞系と比較して50%未満の増殖を示した(図53、それぞれsh-1およびsh-2)。配列番号2(0478)(sh-1:配列番号105およびsh-2:配列番号106)および配列番号7(1096)(sh-1:配列番号115およびsh-2:配列番号116)に対するshRNAを含むTOV-21G細胞系の増殖は、同程度には影響を与えなかったが、それでもなお成長の有意な抑制はまだ観察された。これらの結果は、これらの遺伝子の減衰がこの卵巣癌細胞系の成長に遅延を起こすことを示唆している。これらのshRNA発現ベクターのいくつかを、さらにTOV-112D細胞系に形質移入し、同様の結果を得た(データ未掲載)。このことは、これらの遺伝子が卵巣癌細胞の増殖のために重要であることを示唆している。
【０２９９】
卵巣癌の重要なマーカーであると立証されている葉酸受容体1、配列番号50(0967A)(図53、0967A)をコードする遺伝子(LeamonおよびLow、2001年)を、TOV-21G細胞においてもまた減衰させ、著しい成長抑制を、shRNA(sh-1:配列番号151およびsh-2:配列番号152)の存在下で観察した。このことは、この特許において提示された遺伝子の正当性を立証するために用いた方法に信用性を与え、卵巣癌細胞の増殖におけるそれらの機能的重要性を立証する。
【０３００】
以下の表1に、全被験遺伝子およびTOV-21G細胞において観察された、平均成長抑制(n=3〜4)を記載する。対照細胞系と比較して20%未満の差(表1を参照のこと、<20)は、増殖において統計的に有意な減少が、5〜20%の範囲で測定された細胞を表す。
【０３０１】
【表３】
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【０３０２】
J-卵巣癌細胞の生存における特異的遺伝子に関する必要条件の確定方法
安定TOV-21G細胞系を用いて作製された成長抑制データを補完する方法として、コロニー生存アッセイを使用し、癌細胞の生存において選択される遺伝子の必要条件を確定した。「コロニー形成アッセイ」、または「クローン形成アッセイ」は、治療後の細胞成長を評価するための古典的な試験である。本アッセイは、本アッセイが放射線治療および/または抗癌剤を用いた治療の後の癌細胞系の増殖力を試験するために使用する、腫瘍学研究の分野では広く知られている。卵巣癌において機能的に重要であった遺伝子を分析する場合に得られた結果は、成長抑制研究とコロニー生存アッセイとの間に相関があることが期待された。
【０３０３】
TOV-21G細胞を、12ウェルプレートに、50000細胞/ウェルの濃度で播種し、24時間後、これまでのアッセイに使用した同じプラスミドである、pSil-shRNAベクター1μgを形質移入した。翌日、2μg/mlのピューロマイシンを含む新鮮な培地を加え、細胞の選択を3日間実施した。細胞を洗浄し、ピューロマイシンを含まない新鮮な培地を加え、さらに5日間成長を続けさせた。残存コロニーを視覚化するために、細胞をPBSで洗浄し、1%クリスタルバイオレット/10%エタノールのPBSで、15分間室温において、同時に固定および染色した。さらにPBSで洗浄した後で、乾燥させたプレートを、写真解析のためにスキャンした。
【０３０４】
図37に示すように、また配列番号1(0094)、配列番号3(0671)および配列番号9(1313)により例示されるように、生存したTOV-21G由来のコロニーの量は、成長抑制データと相関していた。例えば、増殖アッセイにおける成長抑制(図53)と、コロニーアッセイにおける細胞死(図54)は、配列番号1(0094)(0094-sh2が0094-sh1より強力である)および配列番号3(0671)(0671-sh2が0671-sh1より強力である)に関してはshRNA-1を含むTOV-21G細胞と比較してshRNA-2を含むTOV-21G細胞においてより多く、一方配列番号9(1313)に関しては1313-sh1が1313-sh2より強力であった。同様の合致が、これらの2つのアッセイを使用して分析した、いくつかの他の遺伝子で観察された。(データ未掲載)。したがって、これらの結果は、両方のアッセイにおける表現型の発現が、卵巣癌細胞において機能的に必要とされる重要な遺伝子を示すこと意味し、それらがコードするタンパク質の抑制は、新規な抗癌剤を開発するための重要な標的としての役目を果たし得ることを示唆する。
【０３０５】
K-他の腫瘍への適用に、介入の範囲を広げる方法
当業者は、本発明において記載された配列が、卵巣癌のみに有用性を有するものではなく、これらの適用は、この遺伝子が発現する他の腫瘍への適用にもまた拡大できることを認識するであろう。このことを解決するためにPCRベースの方法を適合させ、9種の癌から単離した癌細胞系において、上記のすべての配列の発現パターンを確定した。細胞系により表される癌型は、白血病、中枢神経系、乳腺、結腸、肺、メラノーマ、卵巣、前立腺および腎臓の癌である(表Cを参照のこと)。これらのRNA試料を、NCI/NIHのDevelopmental Therapeutics Programから得た。NICから得た全RNA試料から増幅させた同じRAMP RNA試料を使用して、500μgのRNAを、Thermoscript（登録商標） RT(Invitrogen、Burlington、ON)を用いて、製造業者による記載の通りに、一本鎖cDNAに転換した。cDNA反応物を、1/200の反応物を各PCR実験に使用するように希釈した。試験すべき各配列番号に対して設計された、遺伝子特異的プライマーを用いた試験的PCR反応の後で、反応物の線形範囲を確定し、全試料に対して適用し、PCRを、96ウェルプレートにおいて、Qiagen(Mississauga、ON)によるHotStarTaq（登録商標）ポリメラーゼを使用して、MJ ResearchによるDNA Engine Tetrad（登録商標）で実施した。反応混合物の半分を、1.2%アガロース/臭化エチジウムゲルに添加し、アンプリコンを、UV光を用いて視覚化した。各反応物に等量のRNAを使用したことを検証するために、RNAのレベルをGAPDHの発現により観測した。
【０３０６】
【表４Ａ】
0005589149.tif 000005
【０３０７】
【表４Ｂ】
0005589149.tif 000006
【０３０８】
当業者は、すべての哺乳動物に関するオルソログが同定可能であり、当分野において確立された技術を使用して検証できること、およびこの開示が1種の哺乳動物に限定されるものではないことを、容易に認識するであろう。本開示の目的のための「哺乳動物」という用語は、ヒト、家庭および農場の動物ならびにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの動物園、スポーツ用またはペットの動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【０３０９】
上記で論じた実験中の配列は、特許請求に係るNSEQを代表するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。卵巣癌細胞の増殖におけるNSEQの役割の開示は、卵巣癌疾患をよりよく理解するための当分野における必要性を満たし、卵巣癌および前記遺伝子が同様に発現する他の癌のための、診断、予後予測、治療、予防、および治療法の評価に有用である、新規な組成物を提供する。
【０３１０】
遺伝子操作、分子生物学および医薬的標的開発の技術は、ここ20年ほどで大幅に前進した。遺伝子配列に対して新しく同定された機能および対応するタンパク質配列は、それらの配列、変異体および誘導体を、この遺伝子配列が関係している障害または疾患状態のための、研究ツール、診断ツール、療法および治療の開発のための現実世界への応用に、直接または間接的に使用可能にすることが、当業者にはすぐに理解できるであろう。
【０３１１】
【表５Ａ】
0005589149.tif 000007
【０３１２】
【表５Ｂ】
0005589149.tif 000008
【０３１３】
【表５Ｃ】
0005589149.tif 000009
【０３１４】
【表５Ｄ】
0005589149.tif 000010
【０３１５】
【表５Ｅ】
0005589149.tif 000011
【０３１６】
【表５Ｆ】
0005589149.tif 000012
【０３１７】
【表５Ｇ】
0005589149.tif 000013
【０３１８】
【表６Ａ】
0005589149.tif 000014
【０３１９】
【表６Ｂ】
0005589149.tif 000015
【０３２０】
【表６Ｃ】
0005589149.tif 000016
【０３２１】
【表６Ｄ】
0005589149.tif 000017
【０３２２】
【表６Ｅ】
0005589149.tif 000018
【０３２３】
【表６Ｆ】
0005589149.tif 000019
【０３２４】
【表７Ａ】
0005589149.tif 000020
【０３２５】
【表７Ｂ】
0005589149.tif 000021
【０３２６】
【表７Ｃ】
0005589149.tif 000022
【０３２７】
【表７Ｄ】
0005589149.tif 000023
【０３２８】
【表７Ｅ】
0005589149.tif 000024
【０３２９】
【表７Ｆ】
0005589149.tif 000025
【０３３０】
【表７Ｇ】
0005589149.tif 000026
【０３３１】
【表７Ｈ】
0005589149.tif 000027
【０３３２】
【表７Ｉ】
0005589149.tif 000028
【０３３３】
【表７Ｊ】
0005589149.tif 000029
【０３３４】
【表７Ｋ】
0005589149.tif 000030
【０３３５】
【表７Ｌ】
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【０３３６】
【表７Ｍ】
0005589149.tif 000032
【０３３７】
【表７Ｎ】
0005589149.tif 000033
【０３３８】
【表７Ｏ】
0005589149.tif 000034
【０３３９】
【表７Ｐ】
0005589149.tif 000035
【０３４０】
【表７Ｑ】
0005589149.tif 000036
【０３４１】
【表７Ｒ】
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【０３４２】
【表７Ｓ】
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【０３４３】
【表７Ｔ】
0005589149.tif 000039
【０３４４】
【表７Ｕ】
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【０３４５】
【表７Ｖ】
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【０３４６】
【表７Ｗ】
0005589149.tif 000042
【０３４７】
【表７Ｘ】
0005589149.tif 000043
【０３４８】
【表７Ｙ】
0005589149.tif 000044
【０３４９】
【表７Ｚ】
0005589149.tif 000045
【０３５０】
【表７ａ】
0005589149.tif 000046
【０３５１】
【表７ｂ】
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【０３５２】
【表７ｃ】
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【０３５３】
【表７ｄ】
0005589149.tif 000049
【０３５４】
【表７ｅ】
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【０３５５】
【表７ｆ】
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【０３５６】
【表７ｇ】
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【０３５７】
【表７ｈ】
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【０３５８】
【表７ｉ】
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【０３５９】
【表７ｊ】
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【０３６０】
【表７ｋ】
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【０３６１】
【表７ｌ】
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【０３６２】
【表７ｍ】
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【０３６３】
【表７ｎ】
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【０３６４】
【表７ｏ】
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【０３６５】
【表７ｐ】
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【０３６６】
【表７ｑ】
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【０３６７】
【表７ｒ】
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【０３６８】
【表７ｓ】
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【０３６９】
【表７ｔ】
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【０３７０】
【表７ｕ】
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【０３７１】
【表７ｖ】
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【０３７２】
【表７ｗ】
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【０３７３】
【表７ｘ】
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【０３７４】
【表７ｙ】
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【０３７５】
(参考文献)
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0005589149.tif 000073
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【配列表】
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