(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ
（ｉｉ）無機塩および
（ｉｉｉ）酢酸塩
を含む液体組成物であって；
ソルベート、ベンゾエートおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの合計濃度が０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満であり；
１ｍｌ中の標準プレートカウントが≦１００であり；
１ｍｌ中の酵母数が≦１０であり；
１ｍｌ中のカビ数が≦１０であり；
該組成物が４．８〜５．５のｐＨを有する、液体組成物。
【請求項２】
前記酢酸塩の濃度が少なくとも０．０５ｍｏｌ／ｌである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ベンゾエートの濃度が０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記無機塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４または（ＮＨ４）２ＳＯ４である請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも８０ｇ／ｌの無機塩または無機塩の組み合わせを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも８０ｇ／ｌのＮａＣｌを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
無機塩の濃度が１８０ｇ／ｌ未満である請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
１８０ｇ／ｌ未満のＮａＣｌを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
メチオニンを更に含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物を密閉容器中、温度４℃の暗所に保存した場合、少なくとも６ヶ月間、１ｍｌ中の標準プレートカウントが≦１００、１ｍｌ中の酵母数が≦１０、１ｍｌ中のカビ数が≦１０に維持される請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物を密閉容器中、温度４℃の暗所に保存した場合、少なくとも６ヶ月間に、酵素活性が最大で５％減少する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含む密閉容器。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の液体組成物の調製方法であって、
（ａ）発酵ブロスを用意する工程であって、前記発酵ブロスが（ｉ）リゾムコル・ミエヘイと（ｉｉ）リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテアーゼを含む上澄み液とを含有する工程；
（ｂ）固液分離により、発酵ブロスから上澄み液を分離する工程；
（ｃ）分離された上澄み液を精製して精製溶液を得る工程；
（ｄ）精製溶液へ無機塩および酢酸塩を添加する工程；および
（ｅ）（ｄ）工程において得られた精製溶液をろ過する工程
を含む方法。
【請求項１４】
ベンゾエート、ソルベートまたはパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルから選択される化合物が精製溶液に添加されない請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｅ）で得られるろ液中のソルベート、ベンゾエートおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの合計濃度が０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満である請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の、チーズ製造における凝固剤としての使用。
【請求項１７】
（ｉ）ミルクに請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を添加してミルクを凝集させ、カードを得る工程；および（ｉｉ）カードをチーズに加工する工程を含むチーズの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アスパラギン酸プロテアーゼを含む液体組成物に関する。
【０００２】
チーズの製造に、アスパラギン酸プロテアーゼの使用が含まれることはよく知られている。アスパラギン酸プロテアーゼはミルクを凝集させ、固形のカードを生成する。それはさらにチーズに加工される
【０００３】
アスパラギン酸プロテアーゼは、動物、例えば子牛、駱駝およびアザラシの胃から得ることができる。それは、また、微生物、例えばリゾムコル属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もしくはクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの宿主株によって生産することができる。
【０００４】
チーズ製造業では、アスパラギン酸プロテアーゼを含む液体組成物がしばしば使用される。そのような液体組成物は、通常、所望の安定性を得るために、ある種の添加剤を含有する。酵素安定性と微生物安定性は区別される。酵素安定性は、酵素の活性が低下する速度に関する尺度である。微生物安定性は、微生物が組成物中で増殖し成長する速度に関する尺度である。
【０００５】
組成物の微生物特性は、明確に定義された標準手順を用いて標準プレートカウント、酵母の数およびカビの数によって表すことができる。例えば、１ｍｌ中の標準プレートカウントを≦１００、１ｍｌ中の酵母数を≦１０、そして、１ｍｌ中のカビ数を≦１０にすることができる。組成物は使用の前に保存されることが多いので、長期間の保存、例えば、少なくとも３ヵ月に亘って保存する場合には、プレートカウント、酵母数およびカビ数をある境界値未満、例えば前記の値に維持することが望ましい。
【０００６】
必要な微生物安定性を得るために、保存料としてソルベートまたはベンゾエートを使用することはよく知られている。パラベン（パラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステル）も使用される。
【０００７】
例えば、米国特許第３７６３０１０号明細書には、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにソルビン酸カリウムおよび安息香酸ナトリウムを含む組成物が開示されている。国際公開第９０１５８６５Ａ号パンフレットおよび国際公開第９５２９９９９Ａ号パンフレットには、アスパラギン酸プロテアーゼを含有する組成物中に安息香酸ナトリウムを使用することが開示されている。アスパラギン酸プロテアーゼと３〜５ｇ／ｌ（０．０２〜０．０３５ｍｏｌ／ｌ）の安息香酸ナトリウムとを含む市販の組成物が知られている。
【０００８】
しかしながら、ソルベート、ベンゾエートおよびパラベンを含まないかまたはより少量しか含まない製品が要望されている。
【０００９】
本発明の目的は、ソルベート、ベンゾエートおよびパラベンを含まずとも良好な微生物安定性を有する組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明は、それらの化合物を含まないか、または、含んだとしてもその量が従来技術で知られるより少ない場合でも、驚くほど高い微生物安定性を有することができる組成物を提供する。さらに、この組成物は驚くほど高い酵素安定性を有することができる。本発明の組成物は、予想を超える長い保存期間を有することができる。
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、（ｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ；並びに（ｉｉ）無機塩および／または多価アルコールを含む液体組成物であって；
ソルベート、ベンゾエートおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの合計濃度が０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満であり；
１ｍｌ中の標準プレートカウントが≦１００であり；
１ｍｌ中の酵母数が≦１０であり；かつ
１ｍｌ中のカビ数が≦１０である
組成物が提供される。
【００１２】
当然のことながら、ソルベートの濃度にはソルビン酸もソルビン酸の塩も含まれる。ベンゾエートの濃度には安息香酸も安息香酸の塩も含まれる。パラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルは、塩の形態であっても塩の形態でなくてもよい。したがって、本明細書中で使用する場合、ソルベート、ベンゾエートおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの合計濃度は、組成物中のソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、パラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの塩の合計濃度をいう。ソルビン酸塩の例としては、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムおよびソルビン酸カルシウムが挙げられる。安息香酸塩の例としては、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウムおよび安息香酸カルシウムが挙げられる。パラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの例としては、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、エチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。パラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステル塩の例としては、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートのナトリウム塩、エチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートのナトリウム塩およびプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートのナトリウム塩が挙げられる。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、標準プレートカウントは、ＩＳＯ  ４８３３：１９９１（Ｅ）（微生物学−微生物の計数のための一般的ガイダンス−３０℃におけるコロニー計数技法）に準拠して測定される。
【００１４】
酵母数は、ＩＳＯ  ７９５４：１９８７（Ｅ）（微生物学−酵母およびカビの計数のための一般的ガイダンス−２５℃におけるコロニー計数技法）に準拠して測定される。
【００１５】
カビ数は、ＩＳＯ  ７９５４：１９８７（Ｅ）（微生物学−酵母およびカビの計数のための一般的ガイダンス−２５℃におけるコロニー計数技法）に準拠して測定される。
【００１６】
本発明の第２の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼと、ギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩またはフマル酸塩から選択される化合物とを含む液体組成物が提供される。これらの化合物は微生物安定性に寄与する。当然のことながら、これらの化合物は対応する有機酸（ギ酸、酢酸、乳酸、プロピオン酸、リンゴ酸およびフマル酸）のアニオンであり、これらの化合物は、有機酸またはその塩として組成物に補足的に添加され得る。塩としては、例えばカリウム塩、ナトリウム塩またはカルシウム塩が挙げられる。
【００１７】
有機酸および／またはその塩は、任意の適切な濃度で使用することができる。好ましい一実施形態では、ギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩もしくはフマル酸塩、またはこれらの組み合わせの組成物中の濃度は、少なくとも０．０２ｍｏｌ／ｌ、例えば少なくとも０．０５ｍｏｌ／ｌ、例えば少なくとも０．１ｍｏｌ／ｌ、例えば少なくとも０．２ｍｏｌ／ｌである。当然のことながら、これらの化合物の少なくとも１種を、ここで定義した好ましい濃度で存在させることができる。また、これらの化合物の２種以上の組み合わせを、ここで定義した好ましい濃度で存在させることも可能である。組み合わせを使用する場合、濃度はこれらの化合物の合計濃度である。濃度に特定の上限はない。ギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩もしくはフマル酸塩、またはこれらの組み合わせの濃度は、２ｍｏｌ／ｌ未満、例えば、１ｍｏｌ／ｌ未満とすることができる。
【００１８】
好ましい一実施形態では、組成物は酢酸塩を含む。組成物は、少なくとも０．０２ｍｏｌ／ｌの酢酸塩、例えば少なくとも０．０５ｍｏｌ／ｌ、例えば少なくとも０．１ｍｏｌ／ｌ、例えば少なくとも０．２ｍｏｌ／ｌの酢酸塩を含むことが好ましい。酢酸塩の濃度に特定の上限はない。組成物は、例えば、２ｍｏｌ／ｌ未満、例えば１ｍｏｌ／ｌ未満の酢酸塩を含むことができる。
【００１９】
本発明の第３の態様によれば、（ｉ）アスパラギン酸プロテアーゼと、（ｉｉ）無機塩と、（ｉｉｉ）多価アルコールとを含む液体組成物が提供される。
【００２０】
本発明の第４の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼと無機塩とを含む液体組成物であって、無機塩の濃度が、１８０ｇ／ｌ未満、好ましくは１７０ｇ／ｌ未満、より好ましくは１６０ｇ／ｌ未満である組成物が提供される。当然のことながら、組成物は１種以上の無機塩を含むことができる。無機塩濃度の好ましい上限値は、組成物中の無機塩類の合計濃度である。
【００２１】
本発明の第５の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼと多価アルコールとを含む液体組成物であって、０．８３未満、例えば０．８０未満の水分活性を有する組成物が提供される。
【００２２】
本発明の第６の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼとグリセロールとを含む液体組成物が提供される。
【００２３】
本発明の第７の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼを含む液体組成物であって、少なくとも０．８０、例えば少なくとも０．８５の水分活性を有する組成物が提供される。
【００２４】
本発明の第８の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼを含む液体組成物であって、４〜７のｐＨを有する組成物が提供される。
【００２５】
本発明の第９の態様によれば、アスパラギン酸プロテアーゼを含む液体組成物を調製する方法であって：
（ａ）発酵ブロスを用意する工程であって、前記発酵ブロスが（ｉ）プロテアーゼを生産した微生物と（ｉｉ）プロテアーゼを含む上澄み液とを含有する工程；
（ｂ）固液分離により、発酵ブロスから上澄み液を分離する工程；
（ｃ）分離された上澄み液を精製して精製溶液を得る工程；
（ｄ）場合により精製溶液へ１種以上の添加剤を添加する工程であって、前記１種以上の添加剤の少なくとも１種が、無機塩、多価アルコール、または、ギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩もしくはフマル酸塩から選択される化合物である工程；および
（ｅ）場合により前記１種以上の添加剤を含有する精製溶液をろ過する工程；
を含む方法が提供される。
【００２６】
本発明の第１０の態様によれば、第９の態様の方法により得られる組成物が提供される。
【００２７】
好ましい実施形態を後に記載するが、それらは本発明のあらゆる態様において適用可能である。さらに、当然のことながら、本発明は、本発明の種々の態様および／または好ましい特徴の任意の組み合わせをさらに含む。
【００２８】
本発明においては、ベンゾエート、ソルベートまたはパラ−ヒドロキシベンゾエートの使用が必要でないか、あるいは、より少量のベンゾエート、ソルベートまたはパラ−ヒドロキシベンゾエートが使用される。好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、ベンゾエートを０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００２ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは検出不可能な量含む。さらに別の好ましい一実施形態では、本発明の組成物中のソルベート、ベンゾエートおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの合計濃度は、０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００２ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは検出不可能な量である。発酵後の微生物の殺菌のためにベンゾエート、ソルベートおよびパラヒドロキシベンゾエートを使用し得ることが知られている。したがって、そのような殺菌工程の結果として、組成物中に少量のこれらの化合物が存在し得る。
【００２９】
本発明の別の一実施態様では、本発明の組成物中の合計保存料濃度は、０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００２ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは検出不可能な量である。保存料という用語は当業者にはよく理解されており、本明細書中で使用する場合、微生物の成長を阻害し、かつ／または、胞子の発芽を抑制し、かつ／または、増殖性細胞および／または胞子を殺す化合物をいう。本発明では、この保存料の定義には、多価アルコールも無機塩も包含されない。
【００３０】
液体組成物は、水性組成物、例えば水溶液であることが好ましい。本明細書中で使用する場合、水性組成物または水溶液は、水、例えば少なくとも２０重量％の水、例えば少なくとも４０％の水を含む任意の組成物または溶液を包含する。
【００３１】
好ましい一実施態様では、本発明の組成物は、水分活性が０．９５未満、例えば０．９２未満、例えば０．９未満、例えば０．８５未満、例えば０．８未満である。本明細書中で使用する場合、水分活性は２５℃で測定される値をいう。比較的低い水分活性であっても、所望の微生物安定性の達成に寄与することができる。無機塩および／または多価アルコールの添加により、水分活性に影響を与えることができる。水分活性は０．７超、例えば０．８超、例えば０．８３超もしくは０．８５超または０．８６超であってよい。驚くべきことに、水分活性がこれらの値より高いと、予想を超える高い微生物安定性が得られることがわかった。好ましい一実施態様では水分活性は０．８５〜０．９５である。
【００３２】
好ましい一実施態様では、本発明の組成物は無機塩を含む。無機塩は、組成物の水分活性を低下させることができる。任意の適切な無機塩が使用可能である。無機塩は、例えば、（ＣＨ３）４Ｎ＋、ＮＨ４＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋およびＢａ２＋からなる群から選択されるカチオンと、ＳＯ４２−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−およびＳＣＮ−からなる群より選択されるアニオンとを含む塩であってよい。好ましい無機塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４または（ＮＨ４）２ＳＯ４である。組成物は１種以上の無機塩を含有することができる。
【００３３】
好ましい一実施態様では、組成物は、少なくとも８０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１２０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１４０ｇ／ｌの無機塩または無機塩の組み合わせを含む。塩濃度の上昇は、組成物の水分活性を増大させる効果があり、所望の微生物安定性を達成する助けとなる。当然のことながら、少なくとも１種の無機塩をここで定義するような好ましい濃度で含有させることができる。また、無機塩の組み合わせもここで定義するような好ましい濃度で含有させることができる。無機塩の組み合わせを用いる場合、濃度は無機塩の合計濃度をいう。好ましい一実施態様では、組成物は、少なくとも８０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１２０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１４０ｇ／ｌのＮａＣｌを含む。
【００３４】
好ましい一実施態様では、組成物中の無機塩の濃度は、２００ｇ／ｌ未満、好ましくは１９０ｇ／ｌ未満、好ましくは１８０ｇ／ｌ未満、好ましくは１７０ｇ／ｌ未満、例えば１６０ｇ／ｌ未満である。好ましい一実施態様では、組成物は、２００ｇ／ｌ未満、好ましくは１９０ｇ／ｌ未満、好ましくは１８０ｇ／ｌ未満、好ましくは１７０ｇ／ｌ未満、例えば１６０ｇ／ｌ未満のＮａＣｌを含む。無機塩の濃度を低下させると、酵素安定性を増大させることができる。本発明では、比較的低濃度の無機塩を使用することができ、それは高微生物安定性と高酵素安定性の組み合わせを達成する助けとなる。当然のことながら、組成物は１種以上の無機塩を含有することができる。無機塩の濃度の好ましい上限値は、組成物中の無機塩類の合計濃度である。
【００３５】
好ましい一実施態様では、組成物は多価アルコールを含む。多価アルコールは組成物の水分活性を低下させることができる。水分活性の低下は、所望の微生物安定性を達成する助けとなる。任意の適切な多価アルコールが使用可能である。多価アルコールは、例えば、エチレングリコール（エタンジオール）、プロピレングリコール（プロパンジオール）、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトールであってよい。多価アルコールは、グリセロール、ソルビトールまたはプロパンジオールであることが好ましく、グリセロールまたはプロパンジオールであることがより好ましい。組成物は１種以上の多価アルコールを含有することができる。
【００３６】
好ましい一実施態様では、組成物は、少なくとも４０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも８０ｇ／ｌの多価アルコールまたは多価アルコールの組み合わせを含む。当然のことながら、少なくとも１種の多価アルコールをここで定義するような好ましい濃度で含有させることができる。また、多価アルコール類の組み合わせもここで定義するような好ましい濃度で含有させることができる。多価アルコールの組み合わせを用いる場合、濃度は無機塩の合計濃度をいう。
【００３７】
本発明の一実施態様では、組成物中の多価アルコールの濃度は、３００ｇ／ｌ未満、例えば２００ｇ／ｌ未満、例えば１５０ｇ／ｌ未満である。しかしながら、より低い濃度、例えば１００ｇ／ｌ未満、例えば５０ｇ／ｌ未満、例えば１０ｇ／ｌ未満の濃度を用いてもよく、０ｇ／ｌの濃度でもよい。これらの上限は、組成物中の多価アルコール類の合計濃度である。
【００３８】
一実施態様では、組成物は９０〜１２０ｇ／ｌの多価アルコールまたは多価アルコール類の組み合わせ、および、好ましくは１４０〜１８０ｇ／ｌのＮａＣｌを含む。
【００３９】
組成物は任意の適切なｐＨを有することができる。好ましい一実施態様では、組成物は７未満、好ましくは６未満のｐＨを有する。ｐＨは、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも５である。ｐＨは、例えば４．８〜５．５であってよい。
【００４０】
好ましい一実施態様では、組成物は還元剤、好ましくはメチオニンを含む。好ましくは、組成物は少なくとも１ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも２ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも５ｇ／ｌで、例えば１００ｇ／ｌ未満、例えば３０ｇ／ｌ未満のメチオニンを含む。
【００４１】
好ましい一実施態様では、酵素活性は組成物１ｍｌ当たり少なくとも１００ＩＭＣＵであり、好ましくは組成物１ｍｌ当たり少なくとも２００ＩＭＣＵであり、好ましくは組成物１ｍｌ当たり少なくとも５００ＩＭＣＵである。酵素活性には特定の上限はない。酵素活性は、組成物１ｍｌ当たり５０００ＩＭＣＵ未満、例えば１ｍｌ当たり２０００ＩＭＣＵ未満、例えば組成物１ｍｌ当たり１０００ＩＭＣＵ未満であってよい。ＩＭＣＵは、国際凝乳単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｌｋ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）であり、国際酪農連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）（ＩＤＦ）、指令第１７６：１９９６により定義されている。
【００４２】
好ましい一実施態様では、本発明の組成物の１ｍｌ中の標準プレートカウントは≦１００である。１ｍｌ中の酵母数は≦１０が好ましい。１ｍｌ中のカビ数は≦１０が好ましい。
【００４３】
本発明の組成物は、予想以上に高い微生物安定性を有する。本発明の一実施態様では、本組成物を密閉容器中、温度４℃の暗所に保存した場合、少なくとも４ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも９ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、好ましくは少なくとも１８ヶ月間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間、１ｍｌ中の標準プレートカウントが≦１００、１ｍｌ中の酵母数が≦１０、１ｍｌ中のカビ数が≦１０に維持される。
【００４４】
本発明の一実施態様では、本組成物を密閉容器中、温度３０℃の暗所に保存した場合、少なくとも４ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも９ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、好ましくは少なくとも１８ヶ月間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間、１ｍｌ中の標準プレートカウントが≦１００、１ｍｌ中の酵母数が≦１０、１ｍｌ中のカビ数が≦１０に維持される。
【００４５】
本発明の一実施態様では、本組成物を密閉容器中、温度４℃の暗所に保存した場合、少なくとも４ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも９ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、好ましくは少なくとも１８ヶ月間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間に、酵素活性は最大で５％減少する。
【００４６】
本発明の一実施態様では、本組成物を密閉容器中、温度３０℃の暗所に保存した場合、少なくとも４ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも９ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、好ましくは少なくとも１８ヶ月間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間に、酵素活性は最大で５％減少する。
【００４７】
これらの試験用の密閉容器として、瓶を使用することができる。瓶は充填前に殺菌され、ねじで密閉される。容積５０ｍｌの瓶を使用することができ、それらに試験用の組成物２０ｍｌを充填する。
【００４８】
組成物は、任意の適切なアスパラギン酸プロテアーゼを含むことができる。アスパラギン酸プロテアーゼは、凝乳酵素であることが好ましい。凝乳酵素は、カッパ−カゼインの１０５番目のフェニルアラニン残基と１０６番目のメチオニン残基との間のペプチド結合またはその隣の結合に対し特異性を有するという特徴がある。
【００４９】
アスパラギン酸プロテアーゼは、動物由来であってもよい。アスパラギン酸プロテアーゼは微生物によって産生されることが好ましい（微生物産生アルパラギン酸プロテアーゼ）。
【００５０】
微生物としては、例えば、リゾムコル属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、例えばリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）またはリゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｓｉｌｕｓ）、あるいはクリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、例えばクリフォネクトリア・パラシチカ（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）が挙げられる。微生物は、また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）またはクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）から選択することができる。これらの微生物は、例えば、宿主株として使用することができる。好ましい一実施態様では、微生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００５１】
本発明の一実施態様では、アスパラギン酸プロテアーゼはリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼである。用語「リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ」は、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）中で相同的に産生されたアスパラギン酸プロテアーゼを包含する。発酵による酵素の製造方法は、米国特許第３，９８８，２０７号明細書に記載されている。用語「リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ」は、また、組換え型リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮＡで形質転換された宿主生物（例えば、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）以外）中で産生されたリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼを包含する。宿主生物中で組換え型リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼを製造する方法は、ＥＰ−Ａ−７００２５３に記載されている。
【００５２】
本発明の別の一実施態様では、アスパラギン酸プロテアーゼはキモシンである。キモシンは、例えば、子牛、駱駝またはアザラシの胃から抽出することができる。本発明の好ましい一実施態様では、キモシンは、細菌、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母、例えばクリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、または、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）におけるＤＮＡ組換え技術などによって、微生物により産生される。
【００５３】
本発明の組成物は、任意の適切な密閉容器に入れられる。したがって、本発明はさらに、本発明の組成物を含有する密閉および／または封止容器を提供する。
【００５４】
本発明の組成物は、アスパラギン酸プロテアーゼを含む液体組成物の調製方法であって、
（ａ）発酵ブロスを用意する工程であって、前記発酵ブロスが（ｉ）プロテアーゼを生産した微生物と（ｉｉ）プロテアーゼを含む上澄み液とを含有する工程；
（ｂ）固液分離により、発酵ブロスから上澄み液を分離する工程；
（ｃ）分離された上澄み液を精製して精製溶液を得る工程；
（ｄ）場合により精製溶液へ１種以上の添加剤を添加する工程であって、前記１種以上の添加剤の少なくとも１種が、無機塩、多価アルコール、または、ギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩もしくはフマル酸塩から選択される化合物である工程；および
（ｅ）場合により前記１種以上の添加剤を含有する精製溶液をろ過する工程；
を含む方法により、調製することができる。
【００５５】
工程（ａ）は、任意の適切な方法で行うことができ、プロテアーゼの産生に適した条件下で微生物を培養し、その結果、微生物とプロテアーゼを含有する上澄み液とを含む発酵ブロスを得る工程を含むことができる。適切な方法は、例えばＥＰ−Ａ−１３６５０１９に記載されている。
【００５６】
工程（ｂ）は、任意の適切な方法で行うことができるが、遠心分離および／またはろ過を含むことが好ましい。工程（ｂ）は、メンブランフィルタープレスまたはポリッシュフィルターを用いてろ過する工程を含むことができる。
【００５７】
工程（ｃ）機能は、他の成分に対し酵素の濃度を増加させる任意の工程を含むことができる。工程（ｃ）は、クロマトグラフィまたは限外ろ過を含むことが好ましい。クロマトグラフィを行う好ましい方法は、国際公開第０３１０００４８Ａ号パンフレットおよび国際公開第０２５０２５３Ａ号パンフレットに記載されており、それらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５８】
工程（ｄ）は、精製溶液へ１種以上の添加剤を添加する工程であって、前記１種以上の添加剤の少なくとも１種が、無機塩、多価アルコール、または、ギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩もしくはフマル酸塩から選択される化合物である工程を含む。他の添加剤も添加することができる。ベンゾエート、ソルベートまたはパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルから選択される化合物は、精製溶液に添加しないことが好ましい。
【００５９】
工程（ｅ）は、仕上げろ過または無菌ろ過を含むことが好ましい。仕上げろ過は、それ自体よく知られている。工程（ｅ）の仕上げろ過は、微量の不溶粒子、例えば細胞の破片、および／または、汚染微生物を除去する作用を有する。仕上げフィルターは、通常、比較的小さなフィルター孔径（マイクロメートル領域）および厚さが薄い活性フィルター層（ミリメートルからセンチメートル領域）を有する。
【００６０】
（ｅ）で得られるろ液は次の特性：１ｍｌ中の標準プレートカウント≦１００、１ｍｌ中の酵母数≦１０、１ｍｌ中のカビ数≦１０を有することが好ましい。
【００６１】
（ｅ）で得られるろ液と接触する装置は、その装置がろ液と接触する前に蒸気と接触させることが好ましい。これによって汚染が避けられる。
【００６２】
本発明の方法の一実施態様では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の工程の１つ以上の工程が、１０℃未満、好ましくは５℃未満の温度で行われる。
【００６３】
好ましい一実施態様では、（ｅ）で得られるろ液中におけるソルベート、ベンゾエートおよびパラ−ヒドロキシベンゾエートのアルキルエステルの合計濃度は、０．０１０ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００２ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．０００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは０．００００１ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは検出不可能な量である。
【００６４】
本発明は、さらに、本発明の組成物の、チーズ製造における凝固剤としての使用を提供する。
【００６５】
本発明は、さらに、（ｉ）ミルクに本発明の組成物を添加して凝集させ、カードを得る工程；および（ｉｉ）カードをチーズに加工する工程を含むチーズの製造方法を提供する。
【００６６】
以下、次の実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６７】
［実施例］
［実施例１〜５］
ＥＰ−Ａ−１３６５０１９に記載のようにして、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）を培養した。発酵の終わりに、ブロスの冷却、殺菌、およびメンブランフィルタープレスおよび仕上げろ過による液体からの分離を行った。次に、国際公開第０３／１０００４８号パンフレットに記載のようにクロマトグラフィにより凝乳プロテアーゼを精製した。凝乳プロテアーゼを含むカラム溶出液に、ＮａＣｌ、酢酸ナトリウム、メチオニン（１０ｇ／ｌ）および必要に応じて安息香酸ナトリウムを添加し、かつ、ｐＨを調節して調合した（表１参照）。汚染が避けられる条件（バットおよび配管の蒸気処理を含む）を特に選択した。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
水分活性は、サーモコンスタンター（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｎｓｔａｎｔｅｒ）ＴＨ２００（ノバシナ（Ｎｏｖａｓｉｎａ）、アクセール・リミテッド（Ａｘａｉｒ  Ｌｔｄ）、スイス（Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ））を用いて２５℃で測定し、１１、３３、５３、７５、９０および９８％の相対湿度の６種の較正用塩を、製造業者から供給されたままの状態で使用して較正した。
【００７０】
［安定性試験］
サンプル（２０ｍｌ）をねじ蓋密閉式の瓶に入れ、３０℃に予め設定しておいたインキュベータ内に保存した。種々の時間間隔（０、１、２、４週、２、８ヶ月）で、ＩＳＯ  ４８３３：１９９１（Ｅ）（微生物学−微生物の計数のための一般的ガイダンス−３０℃におけるコロニー計数技法）に準拠して標準プレートカウントを測定し、また、ＩＳＯ  ７９５４：１９８７（Ｅ）（微生物学−酵母およびカビ計数のための一般的ガイダンス−２５℃におけるコロニー計数技法）に準拠して酵母数およびカビ数を測定した。これらの測定（ＮａＣｌを含まない培地を用いて行った）に加え、同じ方法ではあるが、５％のＮａＣｌを含む培地を使用した点が異なる方法でも測定を行った。
【００７１】
細菌、酵母およびカビのコロニーカウントは、ＮａＣｌを含むプレートであろうが、ＮａＣｌを含まないプレートであろうが、全てのサンプルで、１ｍｌ当たり＜１０であった。
【００７２】
この安定性試験は、サンプルが３０℃で少なくとも８ヶ月間保存された場合、安息香酸塩を含まない全ての処方で、１ｍｌ中の標準プレートカウントが≦１００に維持され、１ｍｌ中の酵母が≦１０に維持され、かつ１ｍｌ中のカビが≦１０に維持されることを示している。サンプルが４℃で少なくとも１２ヶ月間保存された場合、１ｍｌ中の標準プレートカウントは≦１００に維持され、１ｍｌ中の酵母は≦１０に維持され、１ｍｌ中のカビは≦１０に維持される。
【００７３】
［チャレンジ試験］
リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来凝乳プロテアーゼの５種類の処方を、ゼロトレランスの細菌、酵母およびカビから選択した微生物を計数するチャレンジ試験に供した。全ての処方が微生物に対して良好な抵抗を示すことがわかった。
【００７４】
この保存期間中の凝乳プロテアーゼの酵素活性の低下は、処方１、２および３においては、ＩＭＣＵ（国際酪農連盟（ＩＤＦ）、指令第１７６：１９９６で定義された国際凝乳単位）の値で、１ヶ月当たり０．５％未満であった。処方４および５では、より大きく低下した。
【００７５】
［実施例６〜９］
実施例１〜５と同様にして、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼを生成した。生成物を表２に示すように処方した。初期酵素活性は７６０ＩＭＣＵ／ｍｌであった。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
［安定性試験］
サンプル（５０ｍｌ）をねじ蓋密閉式の瓶に入れ、２０℃に設定したインキュベータ内に保存した。種々の時間間隔（０、１、２、４週、その後は４週間毎に８ヶ月まで）で、実施例１〜５と同様にして標準プレートカウントを測定した。これらの測定（ＮａＣｌを含まない培地を用いて行った）に加え、同じ方法ではあるが、１０％のＮａＣｌを含む培地を使用した点が異なる方法でも測定を行った。培地に１０％ＮａＣｌを含まない場合の標準プレートカウントは、開始から全保存期間に亘って１ｍｌ当たり＜１０のコロニー形成単位を示したが、酢酸塩および安息香酸塩を含まない処方８および９では、保存２週間後にこの値に達し、その後は全保存期間に亘って一定値を維持した。培地に１０％ＮａＣｌを含む場合の標準プレートカウントは、全ての処方で、開始から保存期間の終了まで、１ｍｌ当たり＜１０のコロニー形成単位を示した。
【００７８】
この安定性試験は、安息香酸塩が存在しない場合でも、酢酸塩が良好な微生物安定性を付与することを示している。
【００７９】
［チャレンジ試験］
表２に示したリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来アスパラギン酸プロテアーゼの４種類の処方に、ゼロトレランスの微生物（好塩性マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、トルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｄｉｄａ）およびハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ））の混合物を、１ｍｌ当たり約２Ｅ＋３のコロニー形成単位加えた。サンプルをねじ蓋密閉式の瓶に入れ、２０℃に設定したインキュベータ内に保存した。実施例６および７の処方（安息香酸塩または酢酸塩を含有）は、安息香酸塩も酢酸塩も含有しない実施例８と比べ、微生物に対する抵抗性に優れていることがわかった。実施例９の処方は微生物に対して良好な抵抗性を有することがわかったが、酢酸塩の使用により、より低濃度の塩の使用が可能となり、酵素安定性を高めることができることがわかった。
【００８０】
総合すると、安定性およびチャレンジ試験は、安息香酸塩の非存在下でも、酢酸塩が優れた保存効果を発揮することを示している。
【００８１】
［実施例１０〜１１］
実施例１〜５と同様にして、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼを製造した。生成物を表３に示すように処方し、１０ｇ／ｌのメチオニンを含有させた。ｐＨの調節および各種化合物の添加後、処方物を再度仕上げろ過に供した。仕上げろ過の前に、ろ過物が接触するバットおよび配管に蒸気処理を行った。その後、ろ過物を２０リットルのドラムに入れ、密閉した。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
［安定性試験］
サンプルを２０ｌの密閉ドラムに入れ、５℃または２０℃に設定したインキュベータ内に保存した。処方１０の１個のドラムと処方１１の３個のドラムとを、この安定性試験に使用した。これらのサンプルの微生物安定性を、標準プレートカウントにより、８ヶ月まで一定の間隔で定期的にチェックした。実施例１〜５と同様の方法で、標準プレートカウントまたは酵母およびカビ数を測定したところ、全ての容器で、５℃でも２０℃でも、細菌、酵母またはカビの増殖は観察されなかった。
【００８４】
安息香酸塩を含まないこれらの処方の微生物安定性は、８ヶ月の保存期間を通して良好であった。
【００８５】
［チャレンジ試験］
各処方のサンプル（５０ｍｌ）に、ゼロトレランスの微生物（好塩性マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、トルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｄｉｄａ）およびハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ））の混合物を、１ｍｌ当たり約２Ｅ＋３のコロニー形成単位加えた。これらのサンプルを、ねじぶた式の瓶に入れ、２０℃に設定したインキュベータ内に保存した。両処方ともに、微生物に対して良好な抵抗性を示した。
【００８６】
安定性およびチャレンジの両試験は、酢酸塩を含むが安息香酸塩は含まない処方が、優れた保存効果を有していることを示している。
【００８７】
［実施例１２〜１５］
ＥＰ０３０１６７０に記載のようにして、遺伝子組み換えクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主菌株の発酵法によりキモシンのサンプルを得た。発酵後、微生物を殺し、ｐＨ２の処理によりキモシンを活性化させ、その後、ろ過および透析ろ過によりブロスからキモシンを回収した。キモシンを表４に示すように処方した。汚染が避けられる条件（バットおよび配管の蒸気処理を含む）を特に選択した。初期酵素活性は６４５ＩＭＣＵ／ｍｌであった。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
［安定性試験］
４種の処方の標準プレートカウントは１ｍｌ当たり＜１００コロニー形成単位であり、酵母およびカビ数は１ｍｌ当たり＜１０コロニー形成単位である。
【００９０】
［チャレンジ試験］
サンプル（５０ｍｌ）に、ゼロトレランスの微生物（好塩性マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、トルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｄｉｄａ）およびハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ））の混合物を、１ｍｌ当たり約２Ｅ＋３のコロニー形成単位加えた。サンプルをねじ蓋密閉式の瓶に入れ、２０℃に設定したインキュベータ内に保存した。
【００９１】
実施例１２、１４、１５の処方（安息香酸塩またはプロパンジオールを含有）は、安息香酸塩もプロパンジオールも含有しない実施例１３の処方と比べ、微生物に対する抵抗性が良好であることがわかった。
【００９２】
この実験は、プロパンジオールを含み、安息香酸塩を含まない処方が、良好な微生物安定性と微生物に対する明らかな抵抗性とを有していることを明確に示している。