(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの１〜１０倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の回収方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）の後前記工程（ｄ）の前、又は前記工程（ｄ）の後に、前記水溶液に、１種又は２種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする請求項１に記載の微生物の回収方法。
【請求項３】
前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする請求項２に記載の微生物の回収方法。
【請求項４】
（ａ）被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの１〜１０倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される１種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からＤＮＡを抽出する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記水溶液中に、ＣＴＡＢを添加し、溶解していたセルロースを不溶化する工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後、前記水溶液からＤＮＡを精製する工程と、
を有することを特徴とする、微生物由来ＤＮＡの精製方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）の後前記工程（ｆ）の前に、前記水溶液に、１種又は２種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする請求項４に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法。
【請求項６】
前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）の後前記工程（ｄ）の前に、前記水溶液に、λ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される一種以上を添加し、
前記工程（ｅ）の後前記工程（ｆ）の前に、前記水溶液に、スキムミルク、アルブミン、及びカゼインからなる群より選択される一種以上を添加することを特徴とする請求項６に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法。
【請求項８】
前記被検液体試料が、ビール又はビール様発泡性飲料であることを特徴とする請求項４〜７のいずれか一項に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、濾過処理によってセルロース膜に捕集された微生物を回収する方法、及び当該方法により回収された微生物由来のＤＮＡを精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
典型的な微生物の検出方法として、被検試料を適当な平板培地に塗布した後、培養することにより、微生物を単離し、同定する培養法がある。当該方法は、精密な検査が可能であるという利点があるが、培養に長期間要する、培養条件が不適切であると菌が増殖できない等の問題がある。そこで、近年の核酸解析技術の進歩に伴い、より迅速に微生物を検出する方法として、被検試料から微生物を回収し、そのＤＮＡを解析する方法が報告されている。液体の被検試料中の微生物を検出する場合、まず、当該被検試料をフィルター濾過することにより、濾過膜上に微生物を捕集し、この捕集された微生物からＤＮＡを抽出する。抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより、微生物を検出することができる。
【０００３】
ここで、液体試料中の微生物をフィルター濾過により捕集する場合、通常、ポリカーボネイト膜等の膜表面が平滑な濾過膜が使用される。濾過膜の膜表面が平滑であれば、微生物は濾過膜表面に捕集されているため、捕集された微生物から容易にＤＮＡを抽出することができるためである。
【０００４】
例えば非特許文献１には、ポリカーボネイト又はポリスルホンからなる濾過膜を用いて飲料水をフィルター濾過した後、当該濾過膜にジルコニア・ガラスビーズを添加して振動を与えて菌体を破砕し、ＤＮＡを抽出する方法が開示されている。また、例えば非特許文献２には、飲料水をポリカーボネイト膜で濾過した後、当該濾過膜から市販のＤＮＡ抽出キットによりＤＮＡを抽出し、これを解析することにより、飲料水中のヘリコバクター・ピロリ菌を検出する方法が開示されている。その他、特許文献１では、血液試料をフッ化ポリビニリデン製やポリカーボネイト製等の、セルロース系以外の濾過膜を用いてフィルター濾過し、当該濾過膜を洗浄した後、当該濾過膜上に捕集された微生物からＤＮＡを抽出する方法が開示されている。
【０００５】
その他、非特許文献３には、微生物を回収した濾過膜を溶解させることにより、当該濾過膜に捕集された微生物を回収する方法が開示されている。具体的には、ビールをポリカーボネイト膜で濾過した後、当該濾過膜に水とクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）溶液とを添加し、溶解した濾過膜から遊離した微生物を水相に回収している。
【０００６】
一方で、一般的に、液体試料中の微生物を検出する場合には、検出感度を高めるため、より大量の液体試料を一の濾過膜で濾過することが好ましい。しかしながら、ポリカーボネイト膜等の膜表面が平滑な濾過膜は、水等の濾過には優れているものの、ビール等の比較的粘度の高い液体を濾過した場合には目詰まりを起こしやすい。例えばビールの場合、ポリカーボネイト膜では数十ｍＬ程度しか濾過することができず、微生物の検出感度を充分に向上させることが困難である。
【０００７】
これに対して、濾過性が優れた濾過膜として、セルロース膜が挙げられる。しかしながら、セルロース膜は膜繊維により様々な孔径の孔が形成されているため、微生物の多くは膜繊維の内部に埋め込まれるようにして捕集される。セルロース膜繊維深部に捕集された微生物からＤＮＡを抽出・回収することは困難であり、ＤＮＡ回収効率が劣る結果、微生物の検出感度も低下してしまうという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−５３７１６７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】中村、ジャーナル・オブ・エアロゾル・リサーチ（Journal of Aerosol Research）、２００３年、第１８巻第３号、第１７７〜１８０ページ。
【非特許文献２】セン（Sen）、外２名、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、２００７年、第７３巻第２２号、第７３８０〜７３８７ページ。
【非特許文献３】ディミッシェル（DiMichele）、外１名、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサエティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ（the Journal of the American Society of Brewing Chemists）、１９９３年、第５１巻第２号、第６３〜６６ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非特許文献３には、ビールをセルロースエステル膜で濾過した後、当該セルロースエステル膜をアセトンで溶解させた後、遠心分離処理を行い、微生物を含む画分として沈殿を回収したが、当該画分に対してＤＮＡ抽出操作及びＰＣＲを行ったところ、微生物を検出することができなかった、と記載されている。つまり、現在までに、セルロース膜に捕集された微生物から効率よくＤＮＡを抽出する方法は、知られていなかった。
【００１１】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、液体試料中の微生物を、セルロース膜を用いたフィルター濾過により捕集した後、当該セルロース膜から効率よく微生物を遊離し回収する方法、及び当該方法により回収された微生物からＤＮＡを精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、微生物を捕集したセルロース膜をアセトンで溶解させた後、適当量の水や緩衝液を添加してセルロース繊維を再度析出させることにより、セルロース膜から効率よく微生物を遊離させられることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）  （ａ）被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの１〜１０倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の回収方法、
（２）  前記工程（ｃ）の後前記工程（ｄ）の前、又は前記工程（ｄ）の後に、前記水溶液に、１種又は２種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする前記（１）に記載の微生物の回収方法、
（３）  前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする前記（２）に記載の微生物の回収方法、
（４）  （ａ）被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの１〜１０倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される１種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からＤＮＡを抽出する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記水溶液中に、ＣＴＡＢを添加し、溶解していたセルロースを不溶化する工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後、前記水溶液からＤＮＡを精製する工程と、
を有することを特徴とする、微生物由来ＤＮＡの精製方法、
（５）  前記工程（ｃ）の後前記工程（ｆ）の前に、前記水溶液に、１種又は２種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする前記（４）に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法、
（６）  前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする前記（５）に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法、
（７）  前記工程（ｃ）の後前記工程（ｄ）の前に、前記水溶液にλ−ＤＮＡ及び／又は動物由来のＤＮＡを添加し、
前記工程（ｅ）の後前記工程（ｆ）の前に、前記水溶液にスキムミルク及び／又はアルブミンを添加することを特徴とする前記（６）に記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法、
（８）  前記被検液体試料が、ビール又はビール様発泡性飲料であることを特徴とする前記（４）〜（７）のいずれか一つに記載の微生物由来ＤＮＡの精製方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微生物の回収方法により、濾過性に優れたセルロース膜から効率よく微生物を回収することができる。このため、本発明の微生物の回収方法は、特にビール等の濾過性が低い液体試料に対して、充分量の液体試料から微生物を効率よく回収することができる。
また、本発明の微生物由来ＤＮＡの精製方法は、本発明の微生物の回収方法により回収された微生物からＤＮＡを抽出・精製する方法であり、被検液体試料中の微生物由来ＤＮＡを、効率よく精製することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明及び本願明細書において、セルロース膜とは、セルロース分子又はその誘導体を主たる構成分子とし、膜繊維により様々な孔径の孔が形成されている多孔質膜をいう。セルロース分子の誘導体を主たる構成分子とする膜としては、例えば、ニトロセルロース膜、セルロースアセテート膜等が挙げられる。また、セルロース分子又はその誘導体のみからなる膜であってもよく、セルロース分子又はその誘導体のみからなる膜が備える濾過性を損なわない限り、その他の分子を構成分子として含んでいてもよい。このようなセルロース膜として、孔径が０．１〜５．０μｍ、空隙率が６５〜８１％、質量が４．２〜６．３ｍｇ／ｃｍ２、厚さが１１０〜１６０μｍの市販のセルロース系フィルターを用いることができる。
【００１６】
本発明の微生物の回収方法及び微生物由来ＤＮＡの精製方法に供される被検液体試料は、液体であれば特に限定されるものではなく、飲料水等の十分に粘度の低い液体であってもよく、比較的粘性の高い液体であってもよい。また、ビール、発泡酒やノンアルコールビール等のビール様発泡性飲料、お茶等の飲料であってもよく、湖沼、海等の自然から採取された液体試料であってもよく、注射剤、点眼剤等の医薬品であってもよく、化粧水等の化粧品であってもよい。本発明においては、比較的粘性が高く、濾過性に劣る液体を被検液体試料とすることが好ましく、ビール又はビール様発泡性飲料を被検液体試料とすることがより好ましい。
【００１７】
＜微生物の回収方法＞
本発明の微生物の回収方法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を有することを特徴とする。
（ａ）被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの１〜１０倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程。
【００１８】
まず、工程（ａ）として、被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する。具体的には、セルロース膜を用いて、被検液体試料を濾過する。被検液体試料中の液体成分や、セルロース膜の膜孔よりも小さな物質はセルロース膜を透過するが、膜孔よりも大きな微生物は、セルロース膜を透過することができず、捕集される。セルロース膜中では、セルロース繊維によって形状や孔径の異なる多数の孔が形成されている。このため、ポリカーボネイト膜等の膜表面が平滑な濾過膜を用いた場合と異なり、セルロース膜に捕集される微生物の大部分は、膜表面ではなく、膜中のセルロース繊維に埋もれた状態で捕集される。
【００１９】
微生物が捕集されたセルロース膜は、工程（ｂ）の前に、適当な緩衝液や水により、洗浄しておくことが好ましい。例えば、ビールやビール様発泡性飲料には、ＰＣＲ等の核酸増幅反応に対する阻害物質が含まれている（例えば、非特許文献３参照。）。このため、被検液体試料がビール等の各種阻害物質を含む液体である場合には、当該被検液体試料を透過させた後のセルロース膜に、さらに水や緩衝液等を透過させて洗浄することにより、阻害物質の混入の少ない微生物を回収することができる。
【００２０】
次いで、工程（ｂ）として、微生物が捕集されたセルロース膜にアセトン（Ｃ３Ｈ６Ｏ６）を添加して、当該セルロース膜を化学的に溶解させる。アセトンを添加した後、ボルテックス等により十分に混合することにより、アセトンにセルロース膜を完全に溶解させる。セルロース膜に添加するアセトンの量は、セルロース膜を完全に溶解させることが可能な量であれば特に限定されるものではない。例えば、セルロース膜の表面積１ｍｍ２当たり１μＬ以上のアセトンを添加することが好ましい。セルロース膜の表面積１ｍｍ２当たり１μＬ以上となるようにアセトンを添加した場合には、ボルテックス等を行うことにより、セルロース膜を十分に溶解させることができる。一方で、アセトンの量が多すぎる場合には、その後の工程（ｄ）において用いる水又は緩衝液の量が増大してしまい、試薬コストがかかるだけでなく、大きな容器を用意するか複数の試験管に小分けしなければならず、操作効率が低下し、かつＤＮＡ回収率が低下する。このため、本発明においては、セルロース膜の表面積１ｍｍ２当たり１〜２μＬ、より好ましくは１〜１．５μＬのアセトンを添加することが好ましい。
【００２１】
また、工程（ｂ）においてアセトンが添加される前に、微生物が捕集されたセルロース膜は、完全に乾燥させておくことが好ましい。例えば乾燥が不十分である場合には、水分を含んだ部位はアセトンで溶解し難くなる。
【００２２】
次いで、工程（ｃ）として、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの１〜１０倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる。水等を添加したセルロース膜溶解物をボルテックス等により十分に混合させることにより、より効率よくセルロース繊維を析出させることができる。これにより、セルロース膜に埋め込まれていた微生物を、液相に遊離させることができる。
【００２３】
セルロース膜溶解物に添加する水又は緩衝液の量が少なすぎる場合には、セルロース繊維が大きく、高密度な凝集塊となって析出されてしまい、その後の細胞壁溶解酵素やタンパク質分解酵素処理の観点から好ましくない。アセトンの１倍量以上、好ましくは５倍以上の水又は緩衝液を添加することにより、アセトンに溶解していたセルロース繊維を、適度な大きさで析出させることができる。一方で、セルロース膜溶解物に添加する水又は緩衝液の量が多すぎる場合には、試薬コストがかかり、操作効率が低下し、かつＤＮＡ回収率が低下する。本発明においては、アセトンの１０倍量以下の水又は緩衝液を添加することにより、試薬コストや操作効率、ＤＮＡ回収率等を犠牲にすることなく、セルロース繊維を析出させることができる。
【００２４】
セルロース膜溶解物に添加する緩衝液は、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の、微生物や核酸を含有する試料を調製する際に用いられる公知の緩衝液の中から適宜選択して用いることができ、また、これらの緩衝液を適宜改変したものを用いてもよい。本発明の微生物の回収方法においては、微生物は、工程（ｃ）において添加された緩衝液に含まれた状態で回収される。このため、回収された微生物のその後の処理方法に適した緩衝液を用いることも好ましい。例えば、回収された微生物に対して、細胞壁溶解酵素等の酵素処理を行う場合には、当該酵素の反応に適した緩衝液をセルロース膜溶解物に添加することが好ましい。
【００２５】
その後、工程（ｄ）として、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する。これにより、析出されたセルロース繊維が存在し、かつセルロース膜に捕集されていた微生物がセルロース繊維から遊離した状態で含まれる水溶液が得られる。アセトンの揮発除去は、水よりもアセトンを優先して揮発させられる方法であればよい。例えば、セルロース繊維が析出された水溶液をアセトンの沸点以上、好ましくは６０〜１００℃に加熱することにより、アセトンを揮発除去することができる。
【００２６】
なお、セルロースがアセトン単独に溶解された状態でアセトンを揮発させることによっても、セルロースは再度析出される。しかしながらこの場合には、析出したセルロースが容器内壁に固化付着してしまう。これに対して、本発明においては、水又は緩衝液を添加した状態でアセトンの揮発除去を行うことにより、析出したセルロースの固化付着等が防止される。
【００２７】
セルロース膜は濾過性に優れているため、被検液体試料が粘性の高い液体であった場合でも、目詰まりが生じ難く、多量の被検液体試料を濾過することができる。例えば、被検液体試料が、ビールやビール様発泡性飲料であった場合、直径２５ｍｍの円形のセルロース膜当たり、５００ｍＬもの被検液体試料、例えば、大瓶１本分（６３３ｍｌ）全量のビールを濾過することができる。このため、本発明の微生物の回収方法により、十分量の被検液体試料に含まれている微生物を濃縮して回収することができる。
【００２８】
本発明の微生物の回収方法により回収された微生物から、フェノール／クロロホルム法、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法、塩酸グアニジン／クロロホルム法等の常法により、ＤＮＡやＲＮＡといった核酸を抽出・精製することができる。さらに、得られた核酸は、他の精製方法により精製された核酸と同様に、ＰＣＲ等の核酸解析に供することができる。例えば、回収された微生物から精製された核酸を解析することにより、被検液体試料中の微生物の定性検出や定量検出が可能となる。
【００２９】
セルロースはＤＮＡ等の核酸を吸着する性質を持っている。このため、本発明においては、セルロース膜から遊離した微生物に、セルロースに対するブロッキング剤を添加しておくことが好ましい。例えば、回収された微生物を核酸の抽出・精製に用いる場合には、工程（ｃ）の後の任意の時期、例えば、工程（ｄ）の前又は工程（ｄ）の後に、遊離した微生物を含む水溶液に添加することが好ましい。本発明の微生物の回収方法により回収された微生物から核酸を抽出・精製する前に、予めブロッキング剤を添加しておくことにより、微生物から抽出された核酸がセルロースに非特異的に結合することによる核酸精製時の損失を低減することができる。
【００３０】
本発明及び本願明細書において、セルロースに対するブロッキング剤とは、セルロースと核酸との非特異的な結合に対して、阻害的に作用する物質を意味する。このようなブロッキング剤としては、核酸やタンパク質に対するブロッキング剤として一般的に用いられているものの中から、適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、スキムミルク、λ−ＤＮＡ、アルブミン、カゼイン、酵母ｔＲＮＡ、及び、サケ精子ＤＮＡ等の動物由来のＤＮＡ等が挙げられる。
【００３１】
なお、これらのブロッキング剤は、１種のみを用いてもよく、２種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。本発明においては、スキムミルク、アルブミン、及びカゼインからなる群より選択される一種以上と、λ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される一種以上とを組み合わせて用いることが好ましく、スキムミルクとλ−ＤＮＡとを組み合わせて用いることがより好ましい。また、複数のブロッキング剤を用いる場合、種類ごとに異なる時期に水溶液へ添加してもよく、同時に添加してもよい。
【００３２】
＜微生物由来ＤＮＡの精製方法＞
本発明の微生物由来ＤＮＡの精製方法は、本発明の微生物の回収方法により回収された被検液体試料中の微生物から、ＤＮＡを抽出し精製する方法である。具体的には、前記工程（ａ）〜（ｄ）に加えて、下記工程（ｅ）〜（ｇ）を有することを特徴とする。
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される１種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からＤＮＡを抽出する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記水溶液中に、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）を添加し、溶解していたセルロースを不溶化する工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後、前記水溶液からＤＮＡを精製する工程。
【００３３】
まず、工程（ｅ）として、工程（ｄ）の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される１種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からＤＮＡを抽出する。工程（ｄ）において用いられる酵素としては、微生物や培養真核細胞等から核酸を抽出する際に用いられる公知の酵素の中から適宜選択して用いることができる。例えば、細胞壁分解酵素としては、各種生物由来のＬｙｓｏｚｙｍｅ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ等が挙げられる。また、タンパク質分解酵素としては、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ、アクロモペプチダーゼ、プロナーゼ等が挙げられる。
【００３４】
これらの酵素のうち、１種類のみを用いてもよく、２種類以上の酵素を組み合わせて用いてもよい。複数の酵素を用いる場合、同時に酵素反応を行ってもよく、酵素の種類ごとに順次反応を行ってもよい。本発明においては、細胞壁分解酵素とタンパク質分解酵素とを組み合わせて用いることが好ましい。
【００３５】
次いで、工程（ｆ）として、ＤＮＡが抽出された水溶液中に、ＣＴＡＢを添加し、溶解していたセルロースを不溶化する。添加するＣＴＡＢの量は、工程（ａ）において用いたセルロース膜の大きさ等を考慮して、適宜決定することができる。なお、ＣＴＡＢにより、セルロースのみならず、水溶液中に存在するタンパク質の一部が変性され、不溶化する。
【００３６】
その後、工程（ｇ）において、当該水溶液からＤＮＡを精製する。ＤＮＡの精製は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよい。例えば、当該水溶液に対してクロロホルム抽出処理を行って、当該水溶液からタンパク質や脂質、不溶化したセルロース等の不溶物を除去した後、アルコール沈殿法やシリカゲルカラム吸着法、塩化セシウム超遠心法等により、当該水溶液中に溶解していたＤＮＡを回収し、精製することができる。その他、市販のＤＮＡ精製キットを用いてもよい。なお、クロロホルム抽出処理等の除タンパク質処理を２回以上繰り返して行うことにより、精製されるＤＮＡの純度を高めることができる。
【００３７】
前述のように、セルロースはＤＮＡ等の核酸を吸着する性質を持っているため、微生物からのＤＮＡの抽出・精製は、前記のセルロースに対するブロッキング剤の存在下で行うことが好ましい。例えば、工程（ｃ）の後から工程（ｆ）の前までの任意の時期に、微生物又は微生物から抽出された核酸が存在する水溶液中に、セルロースに対するブロッキング剤を添加しておくことが好ましい。
【００３８】
水溶液に添加するブロッキング剤は、１種のみを用いてもよく、２種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、複数のブロッキング剤を用いる場合、種類ごとに異なる時期に水溶液へ添加してもよく、同時に添加してもよい。本発明においては、工程（ｃ）の後にλ−ＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、及び動物由来のＤＮＡからなる群より選択される一種以上を添加し、工程（ｆ）の前にスキムミルク、アルブミン、及びカゼインからなる群より選択される一種以上を添加することが好ましい。
【００３９】
本発明の微生物由来ＤＮＡの精製方法により精製されたＤＮＡは、他の手法により精製されたＤＮＡと同様に、ＰＣＲ等の核酸増幅検査に供することができる。特に、本発明においては、セルロース膜に捕集した微生物を、溶解処理等を行うことなく、そのまま回収した後、濃縮された微生物からＤＮＡを精製するため、セルロース膜に捕集された状態の微生物から直接核酸を抽出し回収する方法に比べて、微生物及びそれらから回収される核酸の損失が少ない。このため、本発明の微生物由来ＤＮＡの精製方法を用いることにより、被検液体試料中の微生物を定性的又は定量的に検出する際の精度や感度を向上させることができる。
【実施例】
【００４０】
次に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［実施例１］
１０７ＣＦＵのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓを含む３００ｍＬのビールを５本、それぞれセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、製品番号：ＨＡＷＧ  ０２５  ００）で濾過し、当該ビール中の微生物をセルロース膜に捕集した。当該セルロース膜を完全に乾燥させた後、アセトンを添加し、３分間以上ボルテックスにて完全に溶解させた。続いて、このセルロース膜溶解物に、緩衝液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕と１０μＬのλ−ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社製、コード番号：ＤＮＡ−００１）とを添加し、３分間以上ボルテックスにて混和させた。アセトンと緩衝液の添加の比率は、以下の表に準じた。表１中、「緩衝液／アセトン」は、緩衝液の添加量をアセトンの添加量で除した値である。
【００４２】
【表１】
0005632668.tif 000002
【００４３】
続いて、試験区１〜５をそれぞれ１００℃で約１０分間加熱し、アセトンを揮発させた。室温に冷却後、各試験区にＬｙｓｏｚｙｍｅを最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅを５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、１００ｍｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを１１０μＬと、１．７ｍＬの緩衝液ＩＩ〔３Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ,  ２０％  Ｔｗｅｅｎ−２０〕とを添加し、５０℃で３０分間インキュベートした。続いて、２０％（ｗ／ｖ）スキムミルクを１５μＬ添加した後、２×ＣＴＡＢ緩衝液〔２％  ＣＴＡＢ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．４Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％  β−ｍｅｒｃａｏｔｏｅｔｈａｎｏｌ〕を５．９ｍＬ添加し、６５℃で１０分間インキュベートした。その後、各試験区の水溶液を、クロロホルム:イソアミルアルコール(＝２４：１)で２回抽出した。抽出後の水溶液に、３μＬのｐｅｌｌｅｔ  ｐａｉｎｔ（ＮＯＶＡＧＥＮ社製）、１／１０量の酢酸ナトリウム、及び０．７倍量のイソプロパノールを添加した。室温で５分間放置した後、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離処理し、上清を除いた。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、蒸発乾固後、得られたＤＮＡを１００μＬのＴＥで溶解した。
【００４４】
得られたＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲ試験を行った。ＰＣＲの反応条件は、Ｓａｋａｍｏｔｏらの方法( Proc. Congr. Eur. Brew. Conv. Proc. 26:631-638, 1997) に従った。具体的には、フォワードプライマーとして、5’-CTGATTTCAACAATGAAGC-3’の配列（配列番号１）を有するプライマーを、  リバースプライマーとして5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’ の配列（配列番号２）を有するプライマーを、それぞれ使用した。ＰＣＲ試薬（酵素、バッファー）は、ＰｅｒｆｅｃｔＳｈｏｔ  Ｅｘ  Ｔａｑ(Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製)を用い、サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ(ｍｏｄｅｌ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。反応条件は、９４℃で２．５分間保持した後、９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間からなるサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で３分間保持した。増幅産物の確認は、２％(ｖ／ｗ)アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色し、ＵＶトランスイルミネーターでバンドを確認した。
その結果、表２に示すように、アセトンの１〜９倍量の緩衝液を添加した試験区３及び４のみ、核酸の増幅が確認された。
【００４５】
【表２】
0005632668.tif 000003
【００４６】
［実施例２］
スキムミルク及びλ−ＤＮＡの添加の有無による影響を測定した。各試験区のスキムミルク及びλ−ＤＮＡの添加の有無は、表３の通りである。
【００４７】
【表３】
0005632668.tif 000004
【００４８】
１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓを含む３００ｍＬのビールを、それぞれセルロース膜（直径２５ｍｍ）で濾過し、当該ビール中の微生物をセルロース膜に捕集した。当該セルロース膜を完全に乾燥させた後、６７０μＬのアセトンを添加し、３分間以上ボルテックスにて完全に溶解させた。続いて、試験区２及び４のセルロース膜溶解物に、４ｍＬの緩衝液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕と１０μＬのλ−ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社製、コード番号：ＤＮＡ−００１）とを添加し、３分間以上ボルテックスにて混和させた。一方で、試験区１及び３のセルロース膜溶解物には、４ｍＬの緩衝液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕のみを添加し、３分間以上ボルテックスにて混和させた。
続いて、試験区３及び４の水溶液に対して、実施例１と同様にしてＤＮＡ溶液を調製した。一方で、試験区１及び２の水溶液に対しては、スキムミルクを含有しない２×ＣＴＡＢ緩衝液を添加した以外は、実施例１と同様にしてＤＮＡ溶液を調製した。
【００４９】
得られたＤＮＡ溶液を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ試験を行った。その結果を表４に示す。表４中、「１０ＸＣＦＵ」は、濾過したビール中に含まれていた微生物量を示す。この結果、スキムミルクを添加した試験区３及び４では、スキムミルクを添加していない試験区１及び２よりも、ＰＣＲ増幅産物が多かった。さらに、スキムミルクのみを添加した試験区３では、１０２ＣＦＵの微生物が含まれていたビールから回収したＤＮＡを鋳型とした場合に増幅産物が得られなかったが、スキムミルクとλ−ＤＮＡを併用した試験区４では、増幅産物が得られた。これらの結果から、本発明の微生物由来ＤＮＡの精製方法においては、セルロースに対するブロッキング剤を用いることにより、ＤＮＡの回収効率を改善し得ることがわかった。
【００５０】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の微生物の回収方法及び微生物由来ＤＮＡの精製方法により、濾過性に優れたセルロース膜から効率よく微生物を回収し、当該微生物からＤＮＡを抽出・精製することができる。そして、当該方法により精製されたＤＮＡは、ＰＣＲ等の核酸解析により、微生物の定性又は定量検出に供することができる。このため、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な液状の商品の製造分野、特に品質管理等において利用が可能である。
【配列表】
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