(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された終糸（ＦＴ）細胞の集団を含む組成物であって、
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、神経幹細胞（ＮＳＣ）を富化され、
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、上衣細胞、神経芽細胞、星状膠細胞様細胞、小膠細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、繊維芽細胞、脂肪細胞および／または神経節細胞から選択される１種または２種以上を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、神経球または神経球開始幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、少なくとも１０％の神経幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、少なくとも３０％の神経幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、少なくとも９０％の神経幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
出生後の動物から採取されたＦＴ組織からＦＴ−ＮＳＣを単離する方法であって、該方法は、（ｉ）該ＦＴ組織を分離して、神経球を取得する工程、および（ｉｉ）該神経球を培養する工程を包含する、前記方法。
【請求項７】
被験体の神経学的機能を増強または回復させる方法における使用のための、単離されたＦＴ細胞の集団を含む医薬組成物であって、
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、神経幹細胞と、上衣細胞、神経芽細胞、星状膠細胞様細胞、小膠細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、繊維芽細胞、脂肪細胞および／または神経節細胞から選択される１種または２種以上とを含む、前記医薬組成物。
【請求項８】
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、単離されたＦＴ−ＮＳＣを富化された集団からなる、被験体の神経学的障害を処置する方法における使用のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記神経学的障害が、傷害または変性状態を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記神経学的障害が、脳もしくは脊髄の傷害または脳もしくは脊髄の機能の減損を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記被験体が、脳卒中に罹患していると診断されるか、または脳卒中に罹患していると疑われる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
出生後の動物から単離されたＦＴ−ＮＳＣ細胞集団を増殖させる方法であって、該方法は、（ｉ）該動物から採取されたＦＴ組織からＦＴ−ＮＳＣ集団を取得する工程、および（ｉｉ）該ＦＴ−ＮＳＣの増殖または分化を可能にする条件下で、該ＦＴ−ＮＳＣ集団を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記神経球が、ニューロンに特異的なβ−チューブリンＩＩＩ（Ｔｕｊ−１）およびグリア繊維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）を発現する１種または２種以上のヒト細胞を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
さらに、（ｉｉｉ）ネスチン陽性ＮＳＣを回収する工程を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記の細胞の集団が、前記被験体から単離した自系のＦＴ細胞を含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記被験体の神経学的機能を増強または回復させる自家療法における使用のための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記被験体の神経学的障害を処置する自家療法における使用のための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記の単離されたＦＴ細胞の集団が、ＮＳＣを富化された、請求項７〜１１および１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００７年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９３７，５７１号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）に関する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経幹細胞（ＮＳＣ）および前駆体細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）内に存在する発生的に始原の細胞であり、そこでの主要な細胞型（ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞）の全てを生じることができる。ＮＳＣは、ヒトの神経の発生および神経学的疾患の研究ならびにそのような疾患を処置するために有用である。
【０００４】
ＮＳＣは、脳内の深い領域（ａｒｅａ）（例えば、側脳室の脳室下帯および海馬の顆粒細胞層）から採取されてきた。これらの領域からＮＳＣを採取する間、上にある脳領域を損傷する可能性は、自系ＮＳＣの採取についてのこのストラテジを危険かつ非現実的にしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨
本発明は、容易に入手可能なＮＳＣの集団を同定すること、ならびに既存の方法に比べて傷害の危険がはるかに少ない、それらを単離するための方法を記載することによって、これらの困難に取り組む。これらの細胞は、同種異系または自系である。異種組織の移植に起因する合併症を回避するために、ＮＳＣは、好ましくは自系である。例えば、細胞置換（ｃｅｌｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）または組織再生のための薬学的組成物は、ＮＳＣに富んだ終糸（ＦＴ）神経細胞の集団を含む。この集団は、神経球または神経球開始細胞（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＮＳ−ＩＣ）を含む。神経球は、神経幹細胞を含む細胞の凝集物または塊である。これらは、代表的に、事実上球状であり、培養において自由に浮遊する。神経球内の細胞は、培養において増殖し、一方、ニューロンおよびグリアに分化する能力を維持している。ＮＳ−ＩＣは、長期間の神経球培養を開始することのできる細胞である。ＮＳ−ＩＣは、ネスチン陽性であり、適切な分化条件下で、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞に分化する能力を有する。好ましくは、この組成物は、単離されたＦＴ細胞の集団（このうちの少なくとも１０％は、ＮＳＣまたはＮＳ−ＩＣである）を含む。例えば、この細胞集団のうちの少なくとも３０％、５０％、８５％、９０％、９９％または１００％はＮＳＣである。
【０００６】
ＦＴ（必須ではない神経組織）は、被験体（例えば、神経学的傷害または他の障害に罹患しているか、これらを発症する危険を有するヒト患者）から採取される。出生後の動物からのＮＳＣの単離は、被験体由来のＦＴ組織を提供すること、ＦＴ組織を分離して神経球を取得すること、そしてネスチン陽性ＮＳＣを回収することによって実行される。この様式で取得された、単離されたＮＳＣ（すなわち、自系ＮＳＣの集団）を含む組成物は、この組織が取得された被験体を処置するために使用される。ＦＴ組織から取得された神経幹細胞は、ＦＴ−ＮＳＣと呼ぶ。ＦＴ−ＮＳＣの多分化能の子孫細胞を含む細胞株もまた、本発明の範囲内である。
【０００７】
したがって、被験体の神経学的機能を増強または回復させる方法は、単離されたＦＴ細胞の集団をこの被験体に投与することによって実行される。これらの細胞は、被験体に投与される（例えば、これらの細胞は、傷害もしくは損傷の部位に局所的に直接移植されるか、または罹患した部位から離れた部位に投与される）。例えば、細胞は、脳の損傷した部分に脳室内に導入されるか、または脊髄液に注入される。神経学的障害を処置する方法は、被験体からＦＴ組織を採取する工程、ＦＴ細胞を生体外で培養して、単離されたＦＴ−ＮＳＣの富化された集団を生成する工程、および単離されたＦＴ−ＮＳＣの富化された集団を被験体に投与する工程を包含する。処置されるべき神経学的障害は、傷害（急性または慢性）または変性状態を含む。神経学的障害は、欠陥の起源に関係なく、脳もしくは脊髄の傷害または脳もしくは脊髄の機能の減損を含む。例えば、この被験体は、脳卒中に罹患していると診断されるか、脳卒中に罹患していると疑われる。
【０００８】
上記の細胞は、疾患または傷害を通じて失われた神経組織を再構成するために使用される。神経細胞に関連する遺伝病は、遺伝子の欠損を修正するか、または疾患に対して保護するように処置する、自系もしくは同種異系の幹細胞の遺伝子改変によって処置され得る。処置されるべきＣＮＳ障害としては、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病）、急性脳傷害（例えば、脳卒中、頭部傷害、脳性麻痺）および他のＣＮＳ機能不全（例えば、うつ病、てんかんおよび統合失調症）が挙げられる。
【０００９】
動物由来の単離されたＦＴ−ＮＳＣを提供すること、およびＦＴ−ＮＳＣの増殖または分化を可能にする条件下でＦＴ−ＮＳＣを培養することによって、出生後の動物由来のＦＴ−ＮＳＣを増殖させる方法もまた本発明の範囲内である。
【００１０】
本明細書に記載の組成物は、精製または単離される。「実質的に純粋」によって、天然でそれに付随する成分から分離されている核酸、ポリペプチドまたは他の分子を意味する。代表的に、ポリペプチドは、それが、天然で関連しているタンパク質および天然に存在する有機分子を、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％またはさらには９９重量％含まない場合、実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然の供給源からの抽出、通常そのタンパク質を発現しない細胞における組換え核酸の発現または化学合成によって取得され得る。用語「単離された核酸」は、ＤＮＡであって、所定の核酸が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、このＤＮＡと隣接している遺伝子を含まない、ＤＮＡを意味する。したがって、用語「単離された核酸」は、クローニングされた核酸または合成核酸（ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＤＮＡ）を包含する。
【００１１】
有効量は、臨床上の利益を付与するのに必要とされる組成物（例えば、細胞のサンプル）の量である。この有効量は、投与の経路、被験体の年齢、体重および全身の健康に依存して変動する。薬学的組成物は、少なくとも１つの治療的または生物学的に活性な薬剤を含み、そして患者への投与に適した組成物である。このような組成物は、当該分野の周知でありかつ容認された方法によって調製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０００を参照のこと。静脈内送達経路、皮下送達経路、筋肉内送達経路および腹腔内送達経路のような非経口投与は、これらの薬学的組成物を送達するために使用され得る。あるいは、化合物は、局所的に（例えば、ＣＮＳ部位に直接）投与される。神経学的障害の処置のために、脳脊髄液への直接注入または脳組織への直接注射が使用される。任意の１人の患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の核酸、性別、時間および投与の経路、全身の健康、ならびに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。例えば、約５×１０５〜１×１０６個の細胞を含む、濃縮された細胞懸濁物が、部位に注射される。パーキンソン病の処置のために、これらの細胞は、脳室の壁に注射される。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、それらの好ましい実施形態の以下の説明および特許請求の範囲から明らかである。引用された参考文献は、参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、腰椎および仙椎に対するＦＴを示す矢状の断面の図（左側のパネル）であり、胚発生の間のＦＴへの尾側の脊髄の脱分化を示す図（中央のパネルおよび右側のパネル）である。図１Ｂは、切開した１７．５週のヒト胎児脊髄である。矢印は、ＦＴを示す。スケールバー＝２．５ｍｍ。図１Ｃは、ＮＳＣマーカーであるネスチン（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）について染色した８ヶ月齢のＦＴの横断面の部分からの合成画像（ｍｅｒｇｅｄ  ｉｍａｇｅ）である。スケールバー＝１００μｍ。
【図２】図２Ａは、７  ＤＩＶ後の胚性ヒト（１７週）ＦＴに由来する神経球におけるネスチン発現神経幹細胞（緑色）の存在を示す、蛍光顕微鏡写真である。図２Ｂは、３５  ＤＩＶ後の出生後日数（Ｐ）５のラットの終糸に由来する神経球におけるネスチン発現神経幹細胞（赤色）の継続した存在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】図３Ａは、６ヶ月齢のヒトの終糸に由来する神経球から採取された細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図３Ｂは、１８  ＤＩＶ後に接着性培養においてβ−ＩＩＩチューブリンを発現するニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。細胞を、１２歳のヒトの終糸に由来する神経球から採取した。図３Ｃは、１８  ＤＩＶ後の培養においてＯ１（緑色）を発現する乏突起膠細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。細胞は、Ｐ６のラットの終糸から得られる神経球に由来する。細胞核を、ＤＡＰＩで対比染色する（青色）。図３Ｄは、神経球由来の細胞の接着性培養におけるビメンチンを発現する神経前駆体細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）（赤色）とＧＦＡＰを発現する大グリア細胞（緑色）との共在を示す蛍光顕微鏡写真である。神経球自体は、Ｐ４のラットの終糸に由来した。核を、ＤＡＰＩで対比染色する（青色）。
【図４】図４Ａは、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦとともにレチノイン酸およびソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）へ神経球由来細胞を曝露した後のβ−ＩＩＩチューブリン（緑色）を発現する運動ニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。細胞は、Ｐ７のラットの終糸から採取された神経球に由来した。図４Ｂは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（赤色）の運動ニューロンの発現を示す、４（Ａ）における細胞と同一の視野の蛍光顕微鏡写真である。図４Ｃは、β−ＩＩＩチューブリンを発現する運動ニューロン（赤色）を示す異なる神経球の蛍光顕微鏡写真である。図４Ｄは、ＭＣＮ−２（運動ニューロンによって固有に発現されるマーカー）の同時発現を示す、同じ視野の細胞の蛍光顕微鏡写真である。全ての細胞は、Ｐ７のラットの終糸に由来する。これらの図は、終糸の神経球に由来する細胞の運動ニューロンへの指向性の分化を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、神経前駆体細胞（ＮＰＣ）、ニューロンおよび／またはグリアへ分化した神経球を示す蛍光顕微鏡写真である。ａ）ビメンチン（ｉ、緑色）およびＴｕｊ−１（ｉｉ、赤色）（合成画像（ｉｉｉ））について染色した、単一の神経球に由来する分化した細胞。５％血清中ポリ−Ｌ−リジンおよびラミニン上で７日間平板培養した。ドナー：１２歳、インビトロで１８日。ｂ）ＧＦＡＰ（ｉ、赤色）およびＴｕｊ−１（ｉｉ、緑色）を発現する、単一の神経球に由来する分化した細胞。合成画像は、（ｉｉｉ）に示される。（ａ）と同一のドナーおよび条件。インビトロで１７日間。ｃ）７日間にわたって５％血清中においてＦＴ神経球から分化したニューロンの３［Ｈ］−チミジン標識された核に対する銀粒子を示す位相差顕微鏡法（Ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）。神経球を、分化条件で培養する前に３［Ｈ］−チミジンに８時間曝露した。細胞を、Ｔｕｊ−１について対比染色する（緑色）。ドナー：６ヶ月のＦＴ、インビトロで１０７日間、ｄ、ｅ）ＲＡおよびＳｈｈ−Ｎで処理した後に、ＭＮマーカーについて染色した、ＦＴ神経球から分化した細胞。ｄ）Ｔｕｊ−１（赤色）およびＭＮＲ−２（緑色）について染色した、分化した細胞。ドナー：１４週の胎児、インビトロで８１日間。ｅ）Ｔｕｊ−１（ｉ、緑色）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ｉｉ、赤色）について染色した、分化した細胞。合成画像を、（ｉｉｉ）に示す。ドナー：１８歳、インビトロで２５日間。ｆ）Ｏ１（緑色）について染色し、ＤＡＰＩについて対比染色した、分化した細胞。ドナー：６ヶ月齢、インビトロで１１１日間。スケールバー：ａ〜ｆ＝５０ｕｍ。
【図６】図６Ａは、ＦＴを示すＰ７でのラット脊髄の尾側の面（ｃａｕｄａｌ  ａｓｐｅｃｔ）の顕微鏡写真である。矢印は、神経球を生成するために使用した構造物の部分を示す。図６Ｂは、（ｉ）ＮＳＣマーカーであるネスチン（赤色）の発現；（ｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｉｉ）合成画像を示す、Ｐ７のＦＴ組織切片の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、１００ｕｍである。図６Ｃは、インビトロで１０日後の、Ｐ１０のラットＦＴに由来する神経球を示す顕微鏡写真である。スケールバーは、１００ｕｍである。図６Ｄは、（ｉ）ネスチン発現；（ｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色、および（ｉｉｉ）合成画像を示す、インビトロで５日後の、Ｐ５のＦＴに由来する神経球の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、１００ｕｍである。
【図７】図７Ａは、（ｉ）ＮＳＣマーカーであるＯｌｉｇ２の発現（赤色）；（ｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｉｉ）合成画像を示す、インビトロで３４日後の、Ｐ７のＦＴに由来する神経球の蛍光顕微鏡写真である。図７Ｂは、（ｉ）ビメンチンの発現（緑色）；（ｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｉｉ）合成画像を示す、６０  ＤＩＶ後の、Ｐ７のＦＴに由来する神経球の蛍光顕微鏡写真である。図７Ｃは、（ｉ）一部の細胞におけるＳｏｘ２の発現（赤色）；（ｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｉｉ）合成画像を示す、３０  ＤＩＶ後の、Ｐ６のｒＦＴから単離された神経球の蛍光顕微鏡写真である。図７Ｄは、（ｉ）Ｍｕｓａｓｈｉ（色（ＣＯＬＯＲ））の弱い染色；（ｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｉｉ）合成画像を示す、３０  ＤＩＶ後の、Ｐ６のＦＴに由来する神経球の蛍光顕微鏡写真である。図７Ｅは、（ｉ）β−ＩＩＩ−チューブリンの発現（色）；（ｉｉ）ＧＦＡＰの発現（ＣＯＬＯＲ）；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｖ）合成画像を示す、３４  ＤＩＶ後の、Ｐ７のＦＴに由来する神経球の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】図８Ａは、（ｉ）Ｐａｘ６発現（緑色）；（ｉｉ）Ｏｌｉｇ２発現（赤色）；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｖ）合成画像を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、１００ｕｍである。３０  ＤＩＶでのＰ７のラットＦＴに由来する細胞。データは、運動ニューロンがＦＴ由来神経球から生成されることを示す。図８Ｂは、（ｉ）Ｐａｘ６発現（緑色）；（ｉｉ）Ｏｌｉｇ２発現（赤色）；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｖ）合成画像を示す、同様な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、５０ｕｍである。３０  ＤＩＶでのＰ７のラットＦＴに由来する細胞。図８Ｃは、（ｉ）β−ＩＩＩチューブリンの発現（緑色）（初期のニューロンのマーカー）；（ｉｉ）ＣｈＡＴ（赤色）（コリン作用性神経伝達のマーカー）；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色（青色）；および（ｉｖ）合成画像を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、１００ｕｍである。ドナー：Ｐ６のラットＦＴ  ３６  ＤＩＶ。図８Ｄは、（ｉ）ＭＮＲ２（緑色）（運動ニューロン特異的マーカー）の発現；（ｉｉ）β−ＩＩＩ−チューブリン（赤色）（初期のニューロンのマーカー）の発現；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色；および（ｉｖ）合成画像を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、５０ｕｍである。ドナー：Ｐ７のＦＴ、３０  ＤＩＶ。図８Ｅは、（ｉ）ＭＲＮ２（緑色）；（ｉｉ）ＧＦＡＰ（赤色）の重ならない発現；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色；および（ｉｖ）合成画像を示す、分離していない神経球培養物の蛍光顕微鏡写真である。これらの培養物は、ソニックヘッジホッグおよびレチノイン酸で処理されていない；正確に言えば、これらは、専ら、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦを含む分化培地で維持した。スケールバーは、５０ｕｍである。ドナー：Ｐ７のＦＴ、３０  ＤＩＶ。図８Ｆは、ＧＦＡＰ発現細胞の中の運動ニューロンの島（ｉｓｌａｎｄ）を示す、７Ｅと同じ条件下で培養した別の分離していない神経球の蛍光顕微鏡写真である。パネルは、（ｉ）ＭＲＮ２（緑色）の発現；（ｉｉ）ＧＦＡＰ（赤色）の発現；（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ対比染色；および（ｉｖ）合成画像を示す。スケールバーは、５０ｕｍである。ドナー：Ｐ７のＦＴ、３０  ＤＩＶ。
【図９】図９は、レチノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦで処理した培養物における増大した割合のＭＲＮ２発現を示す、ラットのＦＴ  ＮＳＣを使用する２８個の指向性の分化実験の結果をまとめる散布図（ｓｃａｔｔｅｒ−ｐｌｏｔ）である。ＭＮＲ２がまた、Ｓｈｈのみで処理した神経球から分化した細胞においても発現され、一部の場合において、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦのみの存在下で増殖させた未処理の神経球から分化した細胞において発現されたことに留意すること。３例のうちの１例において、ＭＮＲ２についての免疫染色を、いかなる特定の神経栄養因子も含まない血清で分化させた、未処理の神経球に由来する細胞のうちの４０％において観察した。
【図１０】図１０Ａ〜Ｆは、細胞型発現（ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を特徴付けるために、細胞マーカーについて染色した神経球の蛍光顕微鏡写真である。ａ）ネスチン（赤色）について染色した、図１（ｃ）と同一の８ヶ月のＦＴに由来する神経球、インビトロで１１日間。ｂ）ビメンチン（緑色）について染色した神経球。ドナー：６ヶ月のＦＴ、インビトロで１２３日間。ｃ）（ｂ）と同一のドナーに由来する、２つの神経球におけるＯｌｉｇ−２染色（赤色）。ｄ）１０歳に由来する神経球におけるＳｏｘ−２発現（赤色）。インビトロで５１日間。ｅ）（ａ）と同一のドナーに由来する神経球のＴｕｊ−１（ｉ、緑色）、ＧＦＡＰ（ｉｉ、赤色）、合成画像（ｉｉｉ）。ｆ）１８歳のＦＴ由来の神経球の位相差顕微鏡写真。インビトロで６日間。スケールバー：ａ〜ｆ＝１００μｍ。画像ａ〜ｄおよびｅ（ｉｉｉ）は、ＤＡＰＩで対比染色する（青色）。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、α−アマガサヘビ毒素（緑色）およびＴｕｊ−１（赤色）について染色した、得られたヒトＭＮおよびラット筋肉の同時培養物（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）を示す神経筋接合部の蛍光顕微鏡写真である。ＲＡおよびＳｈｈ−Ｎで分化させた単一の神経球を、６日間、ラット筋線維と同時培養した。ａ）ＭＮ（赤色）およびα−アマガサヘビ毒素標識アセチルコリンレセプター（緑色）の蛍光顕微鏡写真。ｂ）（ａ）に見られる神経筋接合部の共焦点顕微鏡画像。ｃ）Ｉｍａｒｉｓ  Ｓｕｒｐａｓｓにおいて最大値投影（ｍａｘｉｍｕｍ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＭＩＰ）レンダリングに処理させた（ｂ）の側面図。神経終末（赤色）は上にあり、標識レセプター（緑色）は下にあり、黄色は、重なった領域を示す。ドナー：６ヶ月齢のＦＴ。スケールバー：５０μｍ。
【図１２】図１２は、ｒＦＴ由来神経球の不均質な分化能力を示す散布図である。この散布図は、神経球分化の１４の実験における、Ｔｕｊ−１（ニューロンのマーカー）およびＧＦＡＰ（星状膠細胞のマーカー）の発現の変動性を示す。個々の神経球を、ポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンでコートしたカバーガラス上にプレートし、５％血清中でそれらを培養することによって分化させた。分化した細胞を、２４時間後、または７〜１０日後のいずれかに免疫細胞化学によって評価した。両方の場合において、ニューロンおよび星状膠細胞の生成の変動が存在した。両方のマーカーについて二重に染色した、神経球から分化した細胞のおおよその割合は、２４時間後に見出された重なりの割合と比較して、分化条件に７〜１０日間の曝露した後では減少した。
【図１３】図１３は、ＭＮ分化をしているｒＦＴ由来神経球におけるＭＮＲ２の発現の変動を示す散布図である。この散布図は、分化した神経球におけるＭＮＲ２発現の変動性を示す。ＭＮＲ２は、ＭＮ生成を同定するのに使用される複数のマーカーのうちの一つである。チャートで明らかなように、ＭＮＲ２はまた、Ｓｈｈのみで処理した神経球から分化した細胞においても発現され、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦの存在下で増殖させた、未処理の神経球に由来するものにおいても発現された。３例のうちの１例において、ＭＮＲ２についての免疫染色は、いかなる特定の神経栄養因子も含まない血清中で分化させた、未処理の神経球に由来する細胞の‘４０％で観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は、幹細胞ベースの治療において多大な進歩を表す。この分野は、治療目的のための幹細胞を獲得する、供給源および信頼のおける方法の不足に悩まされている。脳または脊髄の傷害または変性疾患に起因して失われた脳細胞（ニューロンおよびグリア）の置換において使用するための、神経幹細胞の獲得が特に困難であった。
【００１５】
自系ヒト神経幹細胞のための完全に新規な供給源が同定された。ＦＴは、脊髄の尾側末端にあり、索（ｃｏｒｄ）を尾骨に付着させる。これは、脊髄円錐から分離した、構造的に異なる解剖学的組織である。例えば、成人のヒトにおいて、この組織は、２〜３ｃｍ離れている。それは、神経系において消耗性の痕跡組織である。神経幹細胞の他の供給源とは対照的に、ＦＴは、外科的に到達可能であり、組織は、「係留脊髄症候群」の手術の間にそれから慣例的に取得される。これは、神経幹細胞のための信頼できる供給源である。この供給源から取得された幹細胞を、組織培養中に長期の時間にわたって増殖および維持させることができ、かつニューロンおよびグリアへ分化したことが実証されている。ＦＴ  ＮＳＣを、神経学的傷害または変性を罹患する患者から容易に採取し、組織培養において増殖および分化させ、続いて患者に移植して戻す。このストラテジは、非自系細胞の移植に伴う組織拒絶の問題を克服する。ＦＴは、神経細胞置換ストラテジに適した細胞の供給源として役立つ、第一の容易に入手可能で、増殖可能な神経組織を代表する。
【００１６】
ＦＴの単離
本発明は、ＦＴ（幹細胞の存在について調査されたことのない中枢神経系の領域）からの神経幹細胞の単離を介してＮＳＣ治療の実行可能性を増大させる組成物および方法を提供する。以前の研究は、幹細胞を含むＣＮＳ内の既知の領域（これは、正常な脳機能に必須であり、外科的に到達することが困難である）からのＮＳＣの単離および増殖に注力していた。ＦＴは、ＮＳＣの以前に使用された供給源に対する、新規かつ魅力的な代替物である。なぜなら、ＦＴは、出生後の哺乳動物における発達中の脊髄の、機能を有さない（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）レムナントを示す、組織学的に始原の構造物だからである。これらの特性は、ＦＴを、治療上の使用のための自系ＮＳＣの魅力的な供給源にする。ＦＴは、出生後の哺乳動物（例えば、ラットまたはヒト）、廃棄されたヒト胎児、小児から青年までのヒト（特に、係留脊髄についての外科的切除を受けた者）、および治療上の使用に神経幹細胞を必要とするあらゆる出生後の被験体から取得される。この組織を分離し、神経球を単離し、幹細胞の生存および/または増殖を促進する条件下で増殖させる。ＦＴに由来する細胞は、発生もしくは変性状態もしくは障害、疾患、傷害もしくは外傷、感染、投薬もしくは医学手順に由来する合併症、または任意の他の自然の原因(例えば、加齢)もしくは誘発された原因(例えば、脳卒中)に起因して、神経学的機能の回復を必要とする患者に投与される。移植された細胞は、宿主の中枢または末梢の神経系に統合され、機能的な回復を促進させる。
【００１７】
幹細胞
幹細胞は、大半（全てではないが）の多細胞生物に見出される細胞である。それらは、有糸細胞分裂を介して自身を更新し、そして特殊化した細胞型に分化する能力によって特徴付けられる。２つの大まかな型の哺乳動物幹細胞は、以下である:胚盤胞に見出される胚性幹細胞、および成体組織に見出される成体幹細胞。発生している胚において、幹細胞は、特殊化した胚性組織の全てに分化することができる。成体の器官において、幹細胞および前駆体細胞は、特殊化した細胞を補充する、身体のための修復システムとして働くが、血液、皮膚または腸組織のような再生性器官の正常なターンオーバーもまた維持する。
【００１８】
本明細書で使用されるように、用語「幹細胞」は、自己再生し、１つより多い型の細胞に分化することのできる細胞を記載することが意図される。自己再生は、細胞分裂の多くの周期を通過するが、未分化の状態を維持する能力として本明細書で定義される。
【００１９】
能力は、特殊化した細胞型に分化する能力である。最も厳密な意味において、これは、幹細胞が、全能または多能性のいずれかであること−あらゆる成熟細胞型を生じることができることを必要とするが、多分化能または単能性の前駆体細胞は、時折、幹細胞と呼ばれる。他の用語において、能力は、幹細胞の分化能力（異なる細胞型に分化する能力）を指定する。全能性幹細胞は、卵と精子細胞との融合物から生成される。受精した卵の最初の数回の分裂によって生成される細胞もまた全能である。これらの細胞は、胚および胚外の細胞型に分化することができる。多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、全能細胞の子孫であり、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる。多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、密接に関連するファミリーの細胞の細胞しか生成できない（例えば、造血幹細胞は、赤血球、白血球、血小板などに分化する）。単能性細胞は、一つの細胞型しか生成できないが、非幹細胞からこれらを区別する自己再生の特性を有する（例えば、筋肉幹細胞）。
【００２０】
本発明の幹細胞は、分子的および機能的な方法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）によって同定される。幹細胞の実際の定義は、機能的な定義−一生にわたって組織を再生する能力である。幹細胞の特性は、単一の細胞がそれらの分化および自己再生する能力によって特徴付けられる試験管内腫瘍細胞感受性試験のような方法を使用して、インビトロで示され得る。さらに、幹細胞および幹細胞の集団は、細胞表面マーカーおよび細胞内マーカーの特有のセットに基づいて同定および単離される。
【００２１】
胚性幹細胞株（ＥＳ細胞株）は、胚盤胞またはより初期の桑実胚段階の胚の内細胞塊（ＩＣＭ）の胚盤葉上層組織に由来する細胞の培養物である。胚盤胞は、初期段階の胚である-ヒトにおける約４〜５日齢であり、５０〜１５０個の細胞からなる。ＥＳ細胞は、多能性であり、発生の間に３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉の全ての派生物のもとになる。言い換えると、これらは、特定の細胞型のための十分かつ必要な刺激を与えられた場合、成体の身体の２００種超の細胞型の各々に発達し得る。
【００２２】
ほぼ１０年間の研究の後に、胚性幹細胞を使用する認可された処置もヒト治験も存在しない。全能細胞であるＥＳ細胞は、正しい分化のために特異的なシグナルを必要とする−別の身体に直接注射された場合、ＥＳ細胞は、多くの異なる型の細胞に分化し、奇形腫（すなわち、新生物の一つの型）を生じる。移植片拒絶を回避しながら、使用可能な細胞に分化するＥＳ細胞は、胚性幹細胞の研究者達が依然として直面しているごくわずかの障害物である。多くの国が、現在、ＥＳ細胞の研究も新規なＥＳ細胞株の生産も一時停止している。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「成体幹細胞」とは、２つの特性：分裂し、それ自体に似た別の細胞を生成する（すなわち、自己再生）能力、およびまた分裂し、それ自体よりもより分化した細胞を生成する能力（すなわち、この細胞は、少なくとも単能性であるが、選択的に少なくとも多分化能である）を有する、発生した生物に見出される任意の細胞をいう。成体幹細胞はまた、体性幹細胞および生殖系列幹細胞としても一般的に知られている。成体幹細胞は、全ての出生後の哺乳動物において同定され得る。
【００２４】
多能性の成体幹細胞は、臍帯血を含む多くの組織に見出され得る。大半の成体幹細胞は、系統が制限されており（多分化能）、一般的に、それらの組織起源によって呼ばれる（間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞など）。
【００２５】
一局面において、自己再生を確実にするために、幹細胞は、分裂の面（ｐｌａｎｅ  ｏｆ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）および／または細胞内要素の分裂が異なる２つの型の細胞分裂を実行する。対称的な分裂は、共に幹細胞の特性を付与された、２つの同一の娘細胞を生じる。対称的な分裂は、２つの同一の細胞を生成する細胞分裂、上皮の障壁（例えば、大脳半球の側脳室）に平行な分裂の面で生じる細胞分裂、２つの均等なサイズの細胞を生成するかまたは細胞の中心点（ｃｅｎｔｅｒ  ｐｏｉｎｔ）（赤道）で生じる細胞分裂、あるいは分離に続いて同一または等価な細胞内成分／要素を有する２つの細胞を生成する細胞分裂として定義される。他方、非対称的な分裂は、１つの幹細胞および制限された自己再生能力を有する先祖細胞のみを生成する。非対称的な分裂は、先に列挙されたシナリオの全てについて非対称的である細胞分裂として定義される。娘細胞間で対称的にまたは非対称的に分裂され得る例示的な細胞内成分または要素としては、細胞内または細胞表面タンパク質；細胞骨格要素；接着結合、細胞接触または細胞接着要素；細胞内小器官；およびシグナル伝達分子が挙げられるが、これらに限定されない。前駆体は、成熟細胞に最終的に分化する前に、数回の細胞分裂を経験し得る。
【００２６】
代替的な理論は、幹細胞が、それらの特定のニッチにおいて環境上のキューに起因して未分化のままであることである。幹細胞は、それらがそのニッチから離れるか、またはもはやそのようなシグナルを受け取らなくなった場合、分化する。インビトロにおいて、幹細胞のニッチを繰り返し、指向性の生体外幹細胞分化を誘導し得る。特定の局面において、幹細胞のニッチの特定の成分が過剰発現、除去、組換え、および／または合成され、所望の幹細胞応答を誘導し得る。
【００２７】
神経幹細胞
本明細書で使用されるように、用語「神経幹細胞」とは、ニューロンおよびグリア細胞を生じ得る、成体神経組織に見出される幹細胞を記載することが意図される。例示的なグリア細胞としては、星状膠細胞および乏突起膠細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ニューロン（ニューロンおよび神経細胞としても知られる）は、情報を処理し伝達する神経系内の電気的に興奮性の細胞である。ニューロンは、脊椎動物の脳、脊髄および末梢神経の中心的な成分である。十分に発達したニューロンは、永久に有糸分裂しない（ａｍｉｔｏｔｉｃ）（これらは分裂しない）が；しかしながら、脳のいたるところのさらなるニューロンは、神経発生の過程を介して、脳室下帯およびやや顆粒状のゾーン（ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）で見出される神経幹細胞から生じ得る。本発明はまた、ＦＴを含む脊髄内の神経幹細胞の供給源を提供する。
【００２８】
ニューロン
ニューロンは、代表的に細胞体（ｓｏｍａ）（すなわち、細胞体（ｃｅｌｌ  ｂｏｄｙ））、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｔｒｅｅ）および軸索から構成される。大部分の脊椎動物のニューロンは、細胞体および樹状突起に入力を受け、軸索を介して出力を伝達する。しかしながら、ニューロンのサイズ、形状および機能において、神経系および動物界を通じて大きな異質性が存在する。一部の特殊化したニューロンのサブタイプが知られており、これらとしては、かご細胞（小脳内の、拡張した、節の多い樹状突起を有するニューロン）；ベッツ細胞（大型の運動ニューロン）；中型の有棘ニューロン（Ｍｅｄｉｕｍ  ｓｐｉｎｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ）（線条体における大半のニューロン）；プルキンエ細胞（小脳内の巨大ニューロン、ゴルジＩ型多極ニューロンの１つの型）；錐体細胞（三角形の細胞体を有するニューロン、ゴルジＩＩ型の１つの型）；レンショー細胞（両端がα運動ニューロンに連結されたニューロン）；顆粒細胞（ゴルジＩＩ型ニューロンとしての１つの型）；および前角細胞（脊髄にある運動ニューロン）が挙げられるが、これらに限定されない。ニューロンのサブタイプの広範な変動に起因して、本発明の成熟ニューロンは、細胞型間の形態学的な差、分子的な差および／または機能的な差を利用する１つ以上の方法を使用して同定される。
【００２９】
分化したニューロンは、他のニューロンまたは細胞に対するそれらの作用によって特徴付けられる。興奮性ニューロンは、それらの標的ニューロンを興奮させる。脳を含む中枢神経系内の興奮性ニューロンは、しばしばグルタミン酸作用性（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ）である。筋肉細胞へシナプスを形成する脊椎の運動ニューロンのような末梢神経系のニューロンは、しばしばそれらの興奮性神経伝達物質としてアセチルコリンを使用する。抑制ニューロン（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ）は、それらの標的ニューロンを抑制する。抑制ニューロンは、しばしば介在ニューロンである。一部の脳の構造物（新線条体、淡蒼球、小脳）の出力は、抑制性である。一次抑制性神経伝達物質は、ＧＡＢＡおよびグリシンである。調節性ニューロン（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ）は、ニューロン調節（ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）と呼ばれるより複雑な効果を引き起こす。これらのニューロンは、ドーパミン、アセチルコリン、セロトニンおよびその他のような神経伝達物質を使用する。
【００３０】
分化したニューロンは、それらの放電パターンによって特徴付けられる。ニューロンは、それらの電気生理学的特徴にしたがって分類される。ニューロンは、持続性または規則正しい「スパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）」を示す（例えば、スパイク（ｓｐｉｋｅ）は、活動電位の検出をいう）。一部のニューロンは、代表的に、一定で（または持続して）活性である（例えば、神経線条（ｎｅｕｒｏｓｔｒｉａｔｕｍ）内の介在ニューロン）。他のニューロンは、規則正しいスパイキング（これは、少なくとも１回の刺激によって引き起こされる活動電位をいう）を示す。あるいは、またはさらに、ニューロンは、位相性の挙動またはバースト挙動を示す。バーストで発火するニューロンは、位相性と呼ばれる。一部のニューロンは、それらの迅速な発火速度に関して顕著である（例えば、一部の型の皮質の抑制介在ニューロン、淡蒼球内の細胞）。あるいは、またはさらに、一部のニューロンの活動電位は、その他のものと比べてより狭い（検出した場合、薄いスパイク（ｔｈｉｎ−ｓｐｉｋｅ））。例えば、前前頭皮質内の介在ニューロンは、薄いスパイクのニューロンである。
【００３１】
分化したニューロンは、それらが放出する神経伝達物質によって特徴付けられる。限定しない例示的なニューロンの型は、コリン作用性ニューロン、ＧＡＢＡ作用性ニューロン、グルタミン酸作用性ニューロン、ドーパミン作用性ニューロンおよび５−ヒドロキシトリプタミンニューロン（５−ＨＴ；セロトニン）が挙げられる。
【００３２】
ＦＴ−ＮＳＣの特徴付け
さらに上記の細胞を特徴付けるために、ＦＴ−ＮＳＣ株を樹立し維持した。ＦＴに由来する神経球を、ＮＳＣマーカーであるビメンチン、ＣＤ１３３、Ｏｌｉｇ２およびＳｏｘ２の発現について調べる。ＦＴ−ＮＳＣを、分化を促進する条件下でインビトロで培養する。分化した細胞の型を、免疫細胞化学技術および電気生理学的方法の両方を使用して同定する。ラットおよびヒトのＦＴ−ＮＳＣを、正常なげっ歯類または脊髄外傷もしくは神経学的疾患のモデルとなるげっ歯類のいずれかのＣＮＳに移植する。
【００３３】
ＦＴ−ＮＳＣを、ラットおよびヒト（約２４人のヒトドナー）から単離し、組織培養において多くの継代にわたって神経球として維持した。例えば、細胞を、１５〜２０回継代し、一部の細胞株を、１２ヶ月超にわたり維持した。この様式で取得したＦＴ−ＮＳＣを、免疫細胞化学によって決定されるＣＮＳニューロンおよびグリアに分化するように誘導した。細胞は、ニューロンおよびグリアの両方（星状膠細胞と乏突起膠細胞との両方）を生じる。細胞を、誘導して分化させ、８０〜１００％の運動ニューロンである細胞集団を得た。
【００３４】
自系幹細胞の供給源の同定
ヒトＮＳＣの供給源を同定し、神経系の外傷および変性の症例におけるそれらの治療上の使用を研究した。自系ＮＳＣを、脊髄のＦＴから単離し、増殖させ、続いて、神経組織の損傷の部位に移植する。
【００３５】
自系ＮＳＣの信頼できる供給源は、脊髄のＦＴであり、これは、脊髄の尾側末端の細長い延長部分であり、脊柱の基部にある尾骨に索を係留する（図１Ａ）。組織学的研究は、ＦＴが、室周囲（ｐｅｒｉ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）上衣細胞に囲まれた脊柱管（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃａｎａｌ）ならびに種々の型のニューロンおよびグリアを封入することを示す。この局所的な環境は、ＮＳＣを生成する他のＣＮＳ領域に類似する（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，Ａ．およびＤ．Ａ．Ｌｉｍ．  Ｎｅｕｒｏｎ（２００４）４１（５）：ｐ．６８３〜６；Ｄｏｅｔｓｃｈ，Ｆ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ（２００３）１３（５）：ｐ．５４３〜５０；Ｒｉｑｕｅｌｍｅ，Ｐ．Ａ．、Ｅ．ＤｒａｐｅａｕおよびＦ．Ｄｏｅｔｓｃｈ．Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ，２００７）。ＦＴは、神経系の残りと相互に連結されてなく、また身体の神経も刺激しない。本質的に、それは、神経系の消耗性のレムナントである。
【００３６】
ＦＴは、独特な発生上の由来を有する（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｇ．Ｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ａｎａｔ（１９１９）２２：ｐ．１〜１２；Ｎｉｅｖｅｌｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ（１９９３）４８（１）：ｐ．２１〜３１；Ｋｅｒｎｏｈａｎ，Ｊ．Ｗ．  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ（１９２４）３８：ｐ．１０７〜１２５；Ｋｕｎｉｔｏｍｏ，Ｋ．（１９１８）８：ｐ．１６１〜２０４）。これは、胚の痕跡尾（ｖｅｓｔｉｇｉａｌ  ｔａｉｌ）に対する神経支配（またはげっ歯類の場合、最も尾側の尾分節（ｔａｉｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の一過的な神経支配）を発生の初期に提供する神経系のレムナントである。初期の段階において、推定上のＦＴは、脊髄神経節が付いた、十分に分化した脊髄である（図１Ｂ、左側）。尾が再吸収されたときに、糸の細胞は、Ｓｔｒｅｅｔｅｒによって「脱分化」と呼ばれる過程（図１Ｂ、右側）を経験し、上衣細胞で裏打ちされ、線維芽細胞、ニューロンおよびグリアの見かけ上ゆるく組織化された収集物で環状に囲まれた中心管を有する膠原性の構造物をもたらす。パラガングリオーマおよび始原の神経外胚葉性腫瘍は、この構造物から生じることが示され、このことは、幹細胞が存在する可能性を示唆する（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ，（１９９８）１１（６）：ｐ．５４０〜２；Ｇａｇｌｉａｒｄｉ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｈｉｌｄｓ  Ｎｅｒｖ  Ｓｙｓｔ，（１９９３）９（１）：ｐ．３〜６；Ｋａｍａｌｉａｎ，Ｎ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ，（１９８７）２３５（１）：ｐ．５６〜９；Ｋｏｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｋ．、Ｒ．Ｓ．ＲｏｓｅｎｂｌｕｍおよびＡ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ（２０００）２０（６）：ｐ．１７２１〜４９）。ＦＴは、外科的に容易に到達可能であり、脊柱にしっかりと係留され、動きに十分な自由を欠く場合、脊髄に対する緊張を軽減するために、慣例的に切開される。この状態は、「係留脊髄症候群」と呼ばれる（Ｂａｋｋｅｒ−Ｎｉｅｚｅｎ，Ｓ．Ｈ．、Ｈ．Ａ．ＷａｌｄｅｒおよびＪ．Ｌ．Ｍｅｒｘ．Ｚ  Ｋｉｎｄｅｒｃｈｉｒ、（１９８４）３９  Ｓｕｐｐｌ  ２：ｐ．１００〜３；Ｂｏｄｅ，Ｈ．ら、Ｋｌｉｎ  Ｐａｄｉａｔｒ（１９８５）１９７（５）：ｐ．４０９〜１４）。本発明より前に、終糸が、神経幹細胞の潜在的な供給源として採取されたことはない。
【００３７】
ＦＴは、以下の理由に関してＮＳＣの安全かつ信頼できる供給源である。これは、外科的に到達可能であり、消耗性の神経組織である。ヒト組織は、胎児組織から、そして脊髄の外科的な解放（ｕｎｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に続いてＦＴの生検を行う小児神経外科センターから容易に入手可能である。ＮＳＣの自家移植は、神経系への異種移植に伴う重大な問題であることが実証されている、免疫学的拒絶を回避する明確な利点を有する（Ｂａｒｋｅｒ，Ｒ．Ａ．およびＨ．Ｗｉｄｎｅｒ．  ＮｅｕｒｏＲｘ，（２００４）１（４）：ｐ．４７２〜８１；Ｌｉｎａｚａｓｏｒｏ，Ｇ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉａ（２００３）１８（２）：ｐ．７４〜１００）。ＮＳＣは、哺乳動物のＣＮＳで同定されているが、現行の供給源は、外科的に到達するのが困難であり、これは、代表的に、正常な機能に重要な領域（例えば、脊髄および前脳の側脳室）に由来する（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，Ａ．、Ｄ．Ｇ．ＨｅｒｒｅｒａおよびＨ．Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ．  Ｐｒｏｇ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，（２０００）１２７：ｐ．１〜１１；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，Ａ．、Ｂ．ＳｅｒｉおよびＦ．Ｄｏｅｔｓｃｈ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ，（２００２）５７（６）：ｐ．７５１〜８）。これらの領域の外科的な破壊は、顕著な（ｐｒｏｆｏｕｎｄ）神経学的な欠損をもたらす。ＦＴ由来のＮＳＣは、一生にわたって採取され得、自系ＮＳＣのための供給源として役立ち得、それによって、免疫学的拒絶の問題を回避する。単離、培養、増殖、分化に続いて、自系ＦＴ−ＮＣＳは、神経学的な障害または傷害の処置のために、被験体に移植される。
【００３８】
主要な組織は、動物から取得される（例えば、げっ歯類（ラット、マウス）、またはヒト（例えば、胎児および出生後のヒト）ＦＴ）。例えば、胎児ヒト組織は、廃棄された胎児から取得される。若年のヒトＦＴは、係留された索の切除のための手術の間に取得される。加えて、ＦＴは、出生後のラットから取得される。出生後ラットＦＴは、ヒトＦＴと同じ組織学的特徴を有し、このクラスのＮＳＣのさらなる特徴付けのための、容易に入手可能で、大規模の組織の供給であるという利点を有する。
【００３９】
胎児から成人までの種々な年齢の、死後のヒト材料由来の組織切片におけるＦＴ−ＮＳＣ局在は、種々の段階において存在するＮＳＣの数に関する情報を提供し、より正確な切開をもたらす。ＦＴを、切開し、固定し、低温槽上で切片にする（ｓｅｃｔｉｏｎ）。ＮＳＣを、ネスチンおよびＳｏｘ２のようなＮＳＣマーカーに対して指向される抗体を用いて組織切片を染色することによって同定する（Ｂａｚａｎ，Ｅ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ，（２００４）１９（４）：ｐ．１２６１〜７５）。
【００４０】
ＮＳＣの培養
本発明のＮＳＣを、被験体への移植に先立って、維持および増殖のために培養する。
【００４１】
ＦＴを、当該分野で公知の培地および増殖因子を含む種々の条件（例えば、Ｎ２、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ＋ヘパリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を使用して、組織培養に置く（Ｒａｊａｎ，Ｐ．およびＥ．Ｓｎｙｄｅｒ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，（２００６）４１９：ｐ．２３〜５２；Ｖｅｓｃｏｖｉ，Ａ．Ｌ．およびＥ．Ｙ．Ｓｎｙｄｅｒ．  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，（１９９９）９（３）：ｐ．５６９〜９８）。神経球を単離し、継代する。これらは、非限定的な、先に検討した免疫学的なマーカーを使用して同定する。
【００４２】
分離のための手順は、抗体でコートされた磁気ビーズを使用する磁気分離、固体マトリクス（例えば、プレート）に付着させた抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィおよびパニング、または他の便利な技術を含む。他の分離技術は、多色チャネル、小角および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどのような種々の程度の洗練を有し得る蛍光励起セルソーターを含む。死細胞は、例えば、死細胞と結合する色素(ヨウ化プロピジウム[PI]、LDS)を使用する選択による標準的な方法を使用して排除される。選択された細胞の生存度に過度に有害ではない、あらゆる技術が使用され得る。
【００４３】
ＮＳＣ株を樹立し、移植／回復研究のために増殖され、ヒトＮＳＣの場合、治療用の細胞株の供給源として発達させる。ヒトＮＳＣのための培養条件は、増殖速度および細胞の収量を最大化するために最適化される。培地、増殖因子、酵素などの操作による。細胞株の増殖速度は、生成された神経球の数を計数すること、および生存細胞の数を計数することによって測定される（Ｃａｒｄｏｚｏ，Ｄ．Ｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）５６（２）：ｐ．４０９〜２１）。
【００４４】
ＦＴ−ＮＳＣは、ニューロンおよびグリアに分化する
個々の神経球を単離し、ニューロンおよびグリアへの分化を促進する種々の条件下でインビトロで平板培養する（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．、Ｗ．ＴｅｔｚｌａｆｆおよびＳ．Ｗｅｉｓｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，（１９９２）１２（１１）：ｐ．４５６５〜７４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．およびＳ．Ｗｅｉｓｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９２）２５５（５０５２）：ｐ．１７０７〜１０）。分化をさらに特徴付けるために、神経球を他の細胞と同時培養し、分化条件への曝露の前に、脂肪親和性膜染料（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔａｉｎ）（例えば、ＤｉＩ）、カルボキシフルオレセインまたはＢｒｄＵのような試薬で予め標識する。この追跡ストラテジは、生成されるニューロンおよびグリアの供給源として神経球を確実に樹立する。３つの基本的なアプローチが、これらの細胞を特徴付けるために使用される：ａ．血清の存在下で接着基質上で平板培養すること；ｂ．特定の表現型を促進することが知られている規定された試薬（例えば、運動ニューロンを生成するために、レチノイン酸＋ソニックヘッジホッグタンパク質を使用すること）での前処理に続いて、接着基質上で平板培養すること；ならびにｃ．標識された神経球と筋肉のような標的組織に由来する培養細胞またはＣＮＳの異なる領域に由来する細胞との同時培養。同時培養データは、ＦＴ−ＮＳＣの運命に対する標的組織の影響を確立し、ＦＴ神経球が、筋肉細胞およびニューロンとのシナプスの相互作用を形成することを確認する。
【００４５】
神経球由来の細胞型は、ニューロンおよびグリアのサブタイプに特異的な抗体ならびに未熟なニューロンのサブタイプと成熟ニューロンのサブタイプとの間を区別する抗体を含む、ニューロンおよびグリアに対して指向される抗体を使用して同定される。これらとしては、以下が挙げられる：神経−特異的エノラーゼおよび神経−チューブリンＩＩＩ（ニューロン）；ビメンチン（神経前駆体）；ＧＦＡＰ（星状膠細胞）；Ｏ１（乏突起膠細胞）；コリンアセチルトランスフェラーゼおよびＭＮＲ２（運動ニューロン）（Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．、Ｊ．ＲａｙおよびＬＪ．Ｆｉｓｈｅｒ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，（１９９５）１８：ｐ．１５９〜９２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｐ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，（２００３）７４（６）：ｐ．８３８〜５１；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｐ．Ｈ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００５）２３（９）：ｐ．１２８６〜９４；Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，（２００２）１１０（３）：ｐ．３８５〜９７）。
【００４６】
運動ニューロンの表現型を促進する試薬に曝露した神経球を、筋肉細胞(筋管)と同時培養する。得られたニューロンを、神経筋接合部に結合する標識されたアマガサヘビ毒素で培養物を染色することによって、筋肉細胞とのシナプスを確立するそれらの能力について試験する。機能的な運動ニューロンを、電子顕微鏡法を使用して、さらに評価し、機能しているシナプスのシナプス前の要素およびシナプス後の要素(例えば、シナプス小胞、シナプス後密度)の存在を同定する。
【００４７】
神経球に由来する形態学的に同定可能なニューロンを、細胞が、ニューロンに典型的な生理的特徴を有するか否かを決定する、標準的な電気生理学的技術（静止電位、活動電位を生成する能力、および添加された神経伝達物質に対する応答を測定すること）を使用して特徴付ける。筋肉の同時培養の場合に、分化したニューロンを、視覚的方法および電気生理学的方法の両方で筋肉の単収縮応答について評価する（Ｃａｒｄｏｚｏ，Ｄ．Ｌ．およびＢ．Ｐ．Ｂｅａｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ，（１９９５）７４（３）：ｐ．１１３７〜４８；Ｅｌｋｅｓ，Ｄ．Ａ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ，（１９９７）１９（１）：  ｐ．１６５〜７４）。
【００４８】
インビボ移植、統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）および機能的な回復実験
ＦＴ−ＮＳＣ株を、げっ歯類宿主組織へ再統合するそれらの能力ならびにヒト被験体および脊髄外傷と神経変性とについてのげっ歯類モデルにおける機能的な回復を生成するそれらの能力について評価する。当該分野で認識される腰部脊髄外傷についてのげっ歯類モデルを、ＦＴ−ＮＳＣの評価について使用する。これらのモデルは、欠損の程度および機能的な回復の程度に特異的な測定基準を含む（Ｋａｒｉｍｉ−Ａｂｄｏｌｒｅｚａｅｅ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，（２００６）２６（１３）：ｐ．３３７７〜８９；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ，（２００５）２７（８）：ｐ．８１２〜９；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，（２００５）８１（４）：ｐ．４５７〜６８；Ｖｒｏｅｍｅｎ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，（２００３）１８（４）：ｐ．７４３〜５１）。ＧＦＰ標識されたＦＴ−ＮＳＣを、脊髄外傷を経験したラットの傷害部位に移植する。動物を機能的な回復について試験し、その後屠殺し、死後の脊髄を、移植した細胞の統合について組織学的に調べる。
【００４９】
ＦＴ−ＮＳＣ細胞の再統合を、以下のように評価する。ＦＴ−ＮＳＣ株を、全てのＣＮＳ細胞が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識されているトランスジェニックラットから樹立する（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，（２００６）１１２５（１）：ｐ．１〜８）。これらのＧＦＰ標識されたＦＴ−ＮＳＣを濃縮し、正常なラットの脊髄に移植する。移植された細胞が生存し、宿主組織に統合する能力を、標準的な組織学的方法を使用して死後に調べる。
【００５０】
ヒト由来ＦＴ−ＮＳＣ株を、ヒト被験体および免疫不全マウス系統（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）への移植によって評価する。移植した細胞を、ＳＣ１０１およびＳＣ１２１のようなヒト特異的抗原についての染色によって同定する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＡＪ．、Ｂ．Ｊ．ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＣＷ．Ｃｏｔｍａｎ．  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，（１９９４）１２５（２）：ｐ．２８６〜９５；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，（２００５）１０２（３９）：ｐ．１４０６９〜７４）。
【００５１】
細胞をまた、神経変性疾患についてのげっ歯類モデルにおいても評価する（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，（２０００）８４（３）：ｐ．２３７〜４３；Ｏｒｔｈ，Ｍ．およびＳ．Ｊ．Ｔａｂｒｉｚｉ．（２００３）１８（７）：ｐ．７２９〜３７；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｗ．およびＰ．Ｊ．Ｋａｈｌｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｐ，（２００６）６（５）：ｐ．４３２〜６）。動物を、機能的な回復について試験し、そして死後に、宿主組織への移植した細胞の統合について試験する。
【００５２】
神経変性疾患および神経外傷を処置するためのＦＴ−ＮＳＣの使用
自系ＦＴ  ＮＳＣは、パーキンソン病および他の神経変性疾患ならびに外傷性脳傷害の処置に有用である。研究は、ドーパミン産生細胞が、マウスパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）モデルおよびヒトパーキンソン病患者の両方の線条に統合し得、この疾患の症状を緩和し得ることを示唆する。本発明以前には、ＮＳＣの豊富かつ容易に入手可能な供給源の欠如は、個々の移植片において比較的少数の細胞が使用されていたことを意味する。さらに、以前の移植片は、中枢神経系の「免疫学的に特権のある（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）」性質にも拘らず、拒絶をもたらす免疫反応を引き起こす、異種細胞を使用した。本発明は、これらの問題の両方を解決する：全ての患者はＦＴを有し、したがって、全ての患者は、増殖可能であり、かつ適切な条件下で、自家移植のための特定の細胞型（ドーパミンニューロンおよびコリン作用性運動ニューロンが挙げられる）を効率よく生成する、自系ＮＳＣの準備のできた供給源を有する。ＦＴ−ＮＳＣは、自系細胞の利用可能性に対する根本的な拘束を排除するので、それらの治療上の使用に対する唯一の制限は、生じる細胞型の多様性である。例えば、ＦＴ由来乏突起膠細胞を使用して、多発性硬化症のような脱髄疾患を処置する一方で、ＦＴ由来運動ニューロンは、筋萎縮性側索硬化症のような運動ニューロンの喪失の疾患または脊髄傷害に適用可能である。
【００５３】
ヒト患者からの細胞の採取
ＦＴ細胞を、公知の方法を使用して患者から採取する。例えば、手術を使用して、「係留脊髄症候群」の症例においてなされるように、ＦＴを切断および切開する。第二に、少量の組織を、針穿刺吸引（ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）によって採取する。これらの細胞に関してたくさんの数の継代が可能であること、そして単回の注射に必要とされるのが比較的少数（５００，０００〜１，０００，０００）であることを考慮して、単一のサンプルは、複数回の注射に十分な細胞をもたらし得る。蛍光検査（ｆｌｕｏｒｏｓｃｏｐｉｃ）または他の誘導を使用して、複数のサンプルを、単一の手順の間に採取することができる。
【００５４】
出生後組織をＴＣＳの外科的な標本から取得したが、同じ実験の全てをまた、胎児由来ＨｕＦＴ  ＮＳＣおよび出生後のラット終糸を使用して実行した。この結果は、全ての年齢において、終糸内にＮＳＣが存在することを一貫して確認した。実際に、正常な７８歳のＨｕＦＴの免疫染色は、ネスチン陽性細胞の証拠を示し、この主張をさらに支持した。１８歳までのＨｕＦＴ由来のＮＳＣの単離および分化は、これらの幹細胞が、成人期に残存する可能性を示唆する。
【００５５】
ＦＴは、バイオセイフティー、組織適合性およびその除去に続いて何の欠損も存在しないという利点を付与する（ｐｒｏｆｅｒ）、自系、消耗性かつ到達可能なＮＳＣのための未開発の資源である。この組織供給源由来のＮＳＣは、神経系の外傷および変性の処置に有用である。
【００５６】
以下の試薬および方法を使用して、以下の実施例に記載されたデータを生成した。
【００５７】
インビトロ分化
非特異的分化のために、単一の神経球を、可視化のための解剖顕微鏡の補助を使用して単離し、１％  Ｎ２、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、および５〜１０％  ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で９６穴の培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の個々のウェルにおいて、ポリ−Ｌ−リジン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でコートしたカバーガラス上で平板培養した。培地を、実験の残りの間、変更しなかった。免疫細胞化学のために、カバーガラスを２〜１０日後に処理した。分化した細胞が増殖性細胞に由来したことを確認するために、神経球を、トリチウム化チミジン（Ｃｅｐｋｏ  ｌａｂから贈呈、培地１ｍｌあたり５ｍＬ）で８時間インキュベートした。続いて、神経球を、視覚的に単離し、３回、幹細胞培地で洗浄し、次に、上記のように分化させた。運動ニューロンへの指向性の分化は、まず、４〜５日間のレチノイン酸（ＲＡ、２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ−Ｎ  ５００〜１００ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製、またはＨｈ−Ａｇ１．３、Ｃｕｒｉｓ）での神経球の処理を含んだ。この処理を、以前に記載した幹細胞培地中で行った。その後、個々の神経球を単離し、１％  Ｎ２、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、５％  ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ＣＮＴＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およびＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で７〜１０日間、９６穴の培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の個々のウェルにおいて、ポリ−Ｌ−オルニチン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）、Ｉ型コラーゲン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でコートされたカバーガラス上で平板培養した。３つの型の対照実験を実行した。神経球を、ＲＡを含まずＳｈｈ−Ｎのみで処理した。神経球を、ＲＡおよびＳｈｈ−Ｎで処理しないが、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦの存在下で増殖させた。最後に、一部の神経球は、Ｓｈｈ−ＮでもＲＡでも処理せず、それらを、ＢＤＮＦもＣＮＴＦもＧＤＮＦも存在しない中で培養したが、上記のように、５〜１０％血清中で非特異的分化を受けた。また、先に記載したように、対照も、コートしたカバーガラスを含む９６穴の培養ディッシュの個々のウェル中で７〜１０日間培養した。その後、全てのカバーガラスを免疫細胞化学のために処理した。
【００５８】
神経筋接合部の形成の存在を証明するために、個々の神経球を、ＲＡ（２ｍＭ）およびＳｈｈ−Ｎ（１０００ｎＭ）で４〜６日間処理し、続いて、先に記載した、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを含むＭＮの増殖および生存のための分化培地中で、筋肉培養物上で平板培養した。対照培養物は、筋肉培養物上で平板培養した未処理の神経球を有したか、または全く神経球を有さなかった。２１日後、培養物を、蛍光αアマガサヘビ毒素（２．５ｍｇ／ｍｌ、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識）で２．５時間インキュベートした。その後、これらを洗浄し、固定し、免疫細胞化学（ニューロンのマーカーＢＴＩＩＩ）のために処理した。
【００５９】
抗体
ネスチンに対するウサギポリクローナル抗血清（１：４００）、ＣｈＡＴに対するヤギポリクローナル抗体（１：１００）およびニューロン特異的エノラーゼに対するマウスモノクローナル抗体（１：１０００）を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから取得した。ウサギポリクローナルＳｏｘ２（１：１０００）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｂｃａｍに由来する。ビメンチンに対するマウスモノクローナル抗体は、Ｃｅｐｋｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから贈呈された。マウスモノクローナルＣＤ１３３（１：１０００）は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから購入した。ＧＦＡＰに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００）は、Ｄａｋｏに由来し、ＧＦＡＰに対するマウスモノクローナル（１：１０００）は、Ｓｉｇｍａに由来した。βチューブリンＩＩＩに対するウサギポリクローナルは、Ｃｏｖａｎｃｅに由来した。Ｔｕｊ  １（１：１０００）およびＮｅｕ−Ｎ（１：１０００）に対するマウスモノクローナル抗体も、Ｏｌｉｇ−２に対する抗体と同様に使用した。ＮＩＣＨＤの賛助の下に開発され、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ  ５２２４２によって維持された、神経フィラメント、ＭＮＲ２、Ｌｉｍ３およびＩｓ１−１、ならびにＰａｘ６に対するモノクローナル抗体を、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから購入した。ＡＦ  ４８８結合体化ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＡＦ  ４８８結合体化ロバ抗マウスＩｇＧ、ＡＦ  ５６８結合体化ロバ抗ヤギＩｇＧ、ＡＦ  ４８８結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ、およびＡＦ  ５６８結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した二次抗体であった。全て１：１０００で使用した。
【００６０】
免疫細胞化学
免疫細胞化学を、カバーガラスに付着した全神経球または分化した神経球を使用して実行した。カバーガラスを、４％  ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、ｐＨ７．２）で２０〜３０分間、固定し、次に、ＰＢＳでそれぞれ１０分間、３回洗浄した。抗体希釈物を、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．２％  ウシ血清アルブミン中、１０％  正常ヤギ血清、１０％  アイシングラス、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）で調製し、一次抗体を、カバーガラスを用いて、それら各々の希釈物で一晩（８時間）インキュベートした。このことの後、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、適切な二次抗体で４時間インキュベートした。ＰＢＳでの３回のさらなる洗浄の後、カバーガラスをＤａｐｉ（０．０３ｍｇ／ｍｌ）で３０分間インキュベートした。その後、カバーガラスを、もう一度３回（それぞれ１０分間）洗浄し、それから封入剤としてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを使用してガラススライド上に載せた。このスライドを、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡写真機（ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して免疫蛍光検査のために視覚化した。特定のマーカーについての細胞染色のおおよその割合を、４〜５  ２０×視野の平均カウントによって決定した。Ｄａｐｉを、細胞の総数を計数するためのマーカーとして使用した。細胞の数が極めて多い（＞５００）場合、またはそれらが、一部の視野で共に塊になるが、他の視野では存在しない場合、Ｄａｐｉに対するマーカー陽性細胞のパーセンテージを見積もった。
【００６１】
免疫細胞化学を使用して、インビトロでのＨｕＦＴ由来の未分化神経球における種々のＮＳＣ、神経前駆体細胞（ＮＰＣ）、ニューロンおよびグリアのマーカーの存在を証明した。全ての神経球（ｎ＝１３）は、ＮＳＣマーカーであるネスチンについて陽性に染色した。より小さな神経球（＜１００ミクロン）において、１００％の細胞がネスチンを発現した。しかしながら、より大きな神経球において、それらのコアは、ネスチン陰性のようであった。このコアは、おそらく細胞の壊死性の塊である。神経球（ｎ＝３３）はまた、神経前駆体マーカーであるビメンチン、ＣＤ１３３（ｎ＝１８）、Ｏｌｉｇ２（ｎ＝１７）およびＳｏｘ２（ｎ＝１７）について陽性である細胞を含んだ。ＮＰＣマーカーの発現は、神経球間で変動した。試験した全ての神経球（ｎ＝３０）はまた、ニューロンのマーカーであるＢＴＩＩＩおよびグリアのマーカーであるＧＦＡＰを示差的に発現し、おそらく分化に際して観察された変動したパターンを先触れした。
【実施例】
【００６２】
実施例１：ＦＴ組織からの神経球の生成
２９の実験において、ＦＴを、Ｐ４〜Ｐ１９齢のラットから切開し、培養した。神経球は、２９個の培養物のうち、２６個で生成された（８９．５％）。個々の培養物を、最大１８回まで継代し、３つの細胞株を樹立し、凍結させた。ヒトＦＴ組織を、４つの胎児および６ヶ月齢〜１８歳の１２の出生後手術から単離した。神経球は、１６個の培養物のうち、１４個で生成され（８７．５％）、これらの培養物を、最大６回継代した。神経球をもたらした最も年長の組織ドナーは、１８歳である。図２Ａ〜Ｄは、ＦＴおよび尾方の脊髄ならびにこれらから得られた神経球を示す。２０個を超えるヒトまたはラット神経球を、ネスチン免疫反応性について染色した（図２、ＣおよびＤ）。試験した全ての神経球はネスチン陽性であった。図３Ａ〜Ｄは、ＦＴ神経球からニューロンおよびグリアへの細胞の分化を示す。ラットおよびヒト由来の個々の神経球を、血清存在下でポリ−ｌ−リジン、ラミニンおよびコラーゲンを含む種々の接着基質上で平板培養した。全ての場合において、ＦＴ−ＮＳＣは、免疫細胞化学的判断基準によって決定されるように、ニューロンおよびグリア（星状膠細胞および乏突起膠細胞を含む）に分化した。
【００６３】
単一の神経球を、レチノイン酸およびソニックヘッジホッグタンパク質とともにインキュベートし、血清および神経栄養因子の存在下で接着基質上で平板培養した。ＦＴ−ＮＳＣは、形態学的に同定可能なニューロンに分化し、ＭＮＲ２、ＬＩＭ−３、ＩＳＬ−Ｉおよびコリンアセチルトランスフェラーゼを含む運動ニューロンマーカーに対して染色した（図４Ａ〜Ｄ）。ＤｉＩまたはカルボキシフルオレセインで予め標識した神経球は、初代ラット筋肉細胞と同時培養した場合にニューロンに分化した（運動ニューロンまたはそれらが神経筋接合部を形成したか否かの証明に関して）。
【００６４】
実施例２：ヒトＦＴの培養ならびに得られたＮＳＣの増殖および継代
１４〜２１週齢のヒト胎児組織を、妊娠の人工的な終結の後に取得した。脊髄を迅速に切開し、氷冷ハンクス溶液中に置いた。その後、顕微鏡での視覚化の下で、ヒトＦＴを同定し、切開した。ヒトＦＴの周囲の脊髄神経根を、時折切開し、陰性対照として別個に培養した。６ヶ月齢〜１８歳のヒト出生後組織を、係留された索の解放（ＴＣＳのための慣例的な神経外科手順）を受けた小児から取得した。これらの場合において、ヒトＦＴを、顕微鏡の補助を使用して神経外科医が視覚的に同定し、取り出しに先立って、その正体を、電気生理学的試験を用いて確認した。この組織を、氷冷ハンクス溶液中で、手術室から研究室に移した。
【００６５】
一度、胎児または出生後のＦＴ組織を取得したら、それを、標準的な培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１，Ｇｉｂｃｏ）、１％  Ｎ２処方物（Ｇｉｂｃｏ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ｂＧＦＧ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）および３ｍＭカルシウムをともなうＩＩ型コラゲナーゼ  １００Ｕ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ））を含む培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ピンセットおよび外科用メスを用いて掻き裂いた。ＦＧＦは、安定性のために、８ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液中で調製した。培養物は、加湿したインキュベーター中に、３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。２４時間後、その組織を、コラゲナーゼで部分的に消化し、さらなる分離のために先端熱加工したピペットで機械的に粉砕した。初代幹細胞の増殖を、３〜５日後にインビトロで検出し、そして未分化細胞の球体の形成により特徴付けた。
【００６６】
組織を、４つの胚供給源および１７の出生後供給源から取得した。インビトロでの３〜４日間の後、神経球は、胚培養物のうちの１００％および出生後培養物のうちの８２％で観察された。神経球は、球状、自由に浮遊する、ＮＳＣの異種起源の凝集物であり、これは、種々のニューロンおよびグリアに分化する能力を維持しながら、培養において増殖する。観察された神経球の数は、初代培養物あたり１個から５０個を超える神経球の範囲で変動し、ドナーの年齢と相関しなかった。増殖および自己再生についてのそれらの能力を示すために、それらを、最大１０回まで継代し、最大６ヶ月までそれらをインビトロで維持した。８つの株を凍結し、神経球の首尾良い回復について試験した。
【００６７】
継代頻度は、初代培養物の間で変動した。一部の培養物は迅速に増殖し、１０〜１４日ごとに継代することを必要とし、他のものは、３〜４週間ごとに継代することしか必要としなかった。神経球を、５〜７分間、１×ＡｃｃｕｍａｘＴＭ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離し、その後、機械的に粉砕して、神経球の部分的な分離を達成した。遠心分離（１０分間、１０００ｒｐｍ）後、細胞を、新鮮培地と馴化培地の１：１の組み合わせ中に再懸濁した。これらの継代の間に、神経球を単一の細胞に分離した場合に、死滅率は高く、時折１００％であったことに注意すべきである。
【００６８】
実施例３：ニューロンおよびグリアへのヒトＦＴ−ＮＳＣの自発的な分化
一部の神経球は、培養容器に接着し、そして培地からのいずれの因子の添加も除去もなく自発的に分化するようだった。種々のドナーに由来する単一の神経球は、ＬＩＦ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの除去の後に血清の存在下で神経前駆体細胞（ＮＰＣ）、ニューロンおよびグリアに成功裏に分化した。個々の神経球を、ポリリジンおよびラミニンでコートしたカバーガラスに２〜１０日間、これらの分化条件で平板培養した。全ての場合（ｎ＝５０の実験）において、神経球は、免疫細胞化学で同定されるＮＰＣ、ニューロンおよび／またはグリアの変動した組み合わせ（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を生成した（図５  ＡおよびＢ）。これらとしては、ニューロン特異的エノラーゼ、神経フィラメント、ｎｅｕ−ｎおよびβチューブリンＩＩＩ（ニューロンのマーカー）、ＧＦＡＰ（星状膠細胞のマーカー）、Ｏ１（成熟乏突起膠細胞のマーカー）、ｍｕｓｈａｓｈｉ、ビメンチンおよびｓｏｘ−２（ＮＰＣマーカー）が挙げられる（図５  ＡおよびＢ）。
【００６９】
これらの分化実験は、インビトロでの細胞の組成および分化能力における神経球の異質性の観察と一致して、使用したドナー供給源（６ヶ月齢および１２歳）内およびそれらの間の両方で不均質な神経球の能力を明らかにした。観察された染色パターンもまた、細胞塊が特定のマーカーを発現すること、またはより均一に分散した細胞が種々のマーカーを発現することのいずれかをともなって、変動した。４８時間を超えて分化させた場合、高い割合の細胞（約７９％、ｎ＝８、ＳＥＭ  ０．０８）が、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの両方について二重染色された。しかしながら、分化条件で７〜１０日後（ｎ＝７）、神経球あたりのニューロンおよびグリアのマーカーについて二重染色した細胞の平均の割合は、約２３％（ＳＥＭ  ０．０９）に低下した。さらに、７日後に、分化した細胞を、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの両方について染色した、これらの実験において、神経球の能力のおおよそ半分が、ニューロン優位であるかまたはグリア優位であるかのいずれかのようであり、二重染色は最小であるかまたは存在しなかった。他の場合において、ニューロンおよびグリアの両方の変動する割合を生成し、部分的に二重染色された。この変動性の能力は、供給源にかかわらず神経球で一貫し、ドナーの年齢には関係しないようだった。ＮＰＣマーカーの染色の一貫性は、７〜１０日後でさえも分化した細胞の約９８％で観察された（ｎ＝２１、ＳＥＭ  ０．０１）。これらの細胞は、頻繁にニューロンのマーカーまたはグリアのマーカーを同時発現した。このことは、ニューロンおよびグリアのマーカーの二重染色（分化時間の増大とともに低下する）と組み合わせて、生成された細胞が未熟なニューロンおよびグリアを表すことを示す。
【００７０】
ヒトＦＴ神経球は、インビトロで増殖し、これを継代した。これらの増殖性神経球は、ＮＰＣ、ニューロンおよびグリアの収集物に分化した。分化したニューロンおよびグリアが増殖性細胞に由来することを確認するために、単一の神経球を、トリチウム化チミジンで８時間処理した（ｎ＝４の実験）。その後、これらの神経球を、トリチウム化チミジンを含む環境から取り出し、先に記載したように７日間分化させた。４つの場合全てにおいて、生じたニューロンおよびグリアのうち３３〜６３％が、それらの核にトリチウム化チミジンの証拠を有し、８時間の曝露ウインドウ（ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｗｉｎｄｏｗ）が、細胞周期のＳ期にある増殖性の神経球細胞を捕捉したことを示した。これらの細胞は、Ｓ期にある間に放射性ヌクレオチド標識を取り込み、続いてニューロンおよびグリアに分化した（図５Ｃ）。
【００７１】
同様に、ラットＦＴ神経球は増殖し、これをインビトロで継代することができ、これらの増殖性の神経球は、ＮＰＣ、ニューロンおよびグリアの収集物に分化する。これらの分化した細胞が増殖性細胞に由来することを証明するために、トリチウム化チミジンを使用して細胞を標識した。５つの実験において、神経球をトリチウム化チミジンで８時間処理した。その後、これらを、トリチウム化チミジンを含む環境から取り出し、洗浄し、上記の標準的な条件において７日間にわたって分化させ、ＢＴＩＩＩおよびＧＦＡＰについて染色した。５つの場合全てにおいて、生じたニューロンおよびグリアのうちの２７〜９０％が、それらの核にトリチウム化チミジンの証拠を有した。これらのデータは、８時間の曝露ウインドウが、細胞周期の「Ｓ」期にあるＮＳＣの一部のパーセンテージを捕捉し、これらの増殖性細胞がこの時間の間に放射性ヌクレオチド標識を取り込んだことを示す。これらの細胞は、続いてニューロンおよびグリアに分化し、それらの核内で明白なトリチウム化チミジンによって同定された。
【００７２】
実施例４：ヒトＦＴ−ＮＳＣの運動ニューロンへの指向性の分化Ｒ
本発明以前には、運動ニューロンを生成する出生後の神経球についての先行する報告はなかった。以前に記載されたＷｉｃｈｔｅｒｌｅの、胚性幹細胞の運動ニューロン（ＭＮ）への指向性の分化の方法の変形を用いることで、単離され本明細書中に記載されたようなＨｕＦＴ由来神経球を、ＭＮに分化するように一貫して誘導した。最初に、単一の神経球をレチノイン酸およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ−Ｎタンパク質またはＨｈ−Ａｇ１．３として知られるＳｈｈシグナル伝達の特異的小分子アゴニスト）で、運動ニューロン前駆体（ＭＮＰ）の誘導のために処理した。次に、これらの個々の神経球を、血清ならびにＭＮの成長および生存を支持することが公知の三つの神経栄養因子の存在下で、接着基質上で培養した。その三つの神経栄養因子は、毛様体由来神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。これらの分化条件での７〜１０日の後、ＭＮ特異的マーカーの存在について免疫細胞化学により細胞を分析した。これらは、ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ−２（ＭＮＲ２）、Ｉｓｌｅｔ  １（Ｉｓｌ１）、Ｌｉｍ３およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を含んだ。ＭＮＰの最終分割の間に最初に発現されるＭＮＲ２は、ＭＮの同一性にかかわる決定因子である。Ｉｓｌ１およびＬｉｍ３は、ＭＮの発達に関連するホメオボックス転写因子である。Ｉｓｌ１は、全てのクラスのＭＮにより発現される。分化した神経球は、ＭＮＰにおいて発現されることが公知の二種類の前駆体マーカー（転写因子のＯｌｉｇ−２およびＰａｘ６）について試験した。全ての実験において（ｎ＝１６）、ニューロンの異なる部分が、上記（図５Ｄおよび５Ｅ）のＭＮまたはＭＮＰマーカーを発現した。この変動性は、単一のマーカー（例えば、ＭＮＲ２）の使用においてさえ持続する。体細胞性の運動ニューロンにより選択的かつ一貫して発現されるホメオボックスドメインタンパク質であるホメオボックス９（ＨＢ９）、およびＰａｘ６の存在は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【００７３】
過去の研究において、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、Ｈｈ−Ａｇ１．３およびＲＡに曝露した場合、機能性の運動ニューロンに容易に分化する。アゴニストは、実際のペプチドよりも、より効果があることが公知であり、そしてＭＮの生成のためのペプチドに優先して用いられた。本発明者らのデータは、この観察と矛盾がなかった。ＲＡおよびＨｈ−Ａｇ１．３への初期の曝露後ＨｕＦＴ神経球が分化した両方の実験において、１００％のニューロンがＭＮＲ２を発現した。ＲＡおよびＳｈｈ−Ｎでの処理後生成した５〜４０％のＭＮＲ２陽性細胞と比較して、この観察はＨｈ−Ａｇ１．３が、ＨｕＦＴ神経球のＭＮ分化のための、より有力な薬剤であることを示した。Ｓｈｈ−Ｎ濃度を増加させることは、結果を変化させないようだった。Ｓｈｈ−Ｎ単独ではまた、Ｓｈｈ−ＮおよびＲＡで処理したものと同様の範囲でＭＮＲ２陽性細胞を生成した。ＧＤＮＦ、ＣＤＮＦおよびＢＤＮＦの存在下で培養された未処理神経球はまた、変動する割合のＭＮＲ２陽性細胞を一貫して生成した（図５Ｃ）。多数の例において、ＭＮＲ２について免疫染色された細胞は、一緒にかたまりになる傾向があった。指向性のＭＮ分化のためのＲＡおよびＳｈｈ−Ｎの使用は、ＣＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦの存在下で神経球を単に分化させることよりも顕著には優れていないようだった（図５Ｄ）。さらに３つの実験の１つにおいて、血清のみにおいて増殖した未処理神経球由来の細胞の約４０％が、ＭＮＲ２について陽性に染色された。神経球の公知の異質性、および発生的に意図される本来のＨｕＦＴの機能と組み合わせて、この観察は、ＲＡの腹方化作用および誘導的なＳｈｈ−Ｎシグナル伝達を必要とすることなく、ＭＮに分化するいくらかのＨｕＦＴ  ＮＳＣの本質的な能力を示した。Ｈｈ−Ａｇ１．３の有効な作用は、全てのＨｕＦＴ神経球由来細胞をＭＮに指向させるようである。ＲＡおよびＳｈｈで処理した、ならびに／またはＣＮＴＦ、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦを含む培地中で培養されたＨｕＦＴ由来ＮＳＣは、インビトロで筋繊維と神経筋シナプスを形成することができた（ｎ＝１６）。
【００７４】
実施例５：ＥＧＦ＋ＦＧＦ＋ＬＩＦに応答して自己再生するラット−ＦＴ由来神経球の単離と性格づけ
ラットＦＴ（ｒＦＴ）において可能性のあるＮＳＣに、いずれかの特定のニッチまたは特異的な場所があるか否かを決定するため、組織を切開し、そしてホルムアルデヒドで固定した組織の複数の切片をＮＳＣマーカーであるネスチンについて染色した（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの試料の免疫組織化学が、明白な分布パターンをともなわない散在する個別的なネスチン陽性細胞を示した。
【００７５】
インビトロでのＮＳＣの単離は、コラゲナーゼで分離した一次組織を、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む標準的な幹細胞培地（ＤＭＥＭ、Ｆ１２、Ｎ２補充）中で培養することを含む。先行する研究は、これらの分裂促進因子を、おそらく付加的な効果をともなう、ＮＳＣ増殖に対する好結果の刺激剤として同定した。インビトロで３〜４日後、神経球が、３４の初代培養のうち３１で観察された。これらの神経球は、初めは自由に浮遊しており、そしてその球状構造、位相での明るい外観、一定の細胞膜、および回折リングにより同定された（図６Ｃ）。初代培養当たりの神経球の数は、１０から４０より多くまで変化した。この数は、ドナーの年齢と相関していないようだった。それらの増殖および自己再生の能力を示すため、神経球を分離し、そして二次球体を生成するよう１９回まで継代し、そしてインビトロで７ヶ月まで維持した。
【００７６】
初期の考察とは反対に、神経球は、ＮＳＣの同種集団ではないが、おそらく異なる能力を持つ、異なるＮＳＣおよび神経前駆体細胞（ＮＰＣ）の不均質な収集物であることが示された。この不均質な性質を考慮して、ｒＦＴ由来神経球は、種々のＮＳＣ、ＮＰＣ、神経およびグリアのマーカーの発現を決定する免疫細胞化学を用いて特徴付けられた（表１）。特に、神経球は、ＮＳＣマーカーであるネスチン（ｎ＝９）、ＮＰＣマーカーであるＳｏｘ２（ｎ＝８）、ビメンチン（ｎ＝６）、Ｏｌｉｇ−２（ｎ＝３）、およびＭｕｓａｓｈｉ（ｎ＝４）、ニューロン特異的マーカーであるβ−チューブリンＩＩＩ（ＢＴ  ＩＩＩ、ｎ＝１２）、ならびに星状膠細胞マーカーであるグリア繊維酸性タンパク（ＧＦＡＰ、ｎ＝１２）について染色した。
【００７７】
９例全てにおいて、変化する割合での細胞が、ネスチンについて陽性であった。９例のうち４例で、神経球中の１００％の細胞が、このＮＳＣマーカーを発現し、これはＮＳの年齢またはサイズに相関しないようであった（図２Ｄ）。神経前駆体マーカーについての染色は変化した。３つの実験全てにおいて、より強い染色を示すいくらかの領域をともなって、神経球細胞の１００％が、Ｏｌｉｇ−２について陽性に染まった（図７Ａ）。Ｓｏｘ２およびビメンチンに関して、全ての神経球が、これらのマーカーについて陽性に染まるいくらかの割合の細胞を有したが（図７Ｂおよび７Ｃ）、このパーセンテージは、Ｓｏｘ２で４０から１００％、ビメンチンで３３から１００％で変化した。Ｍｕｓａｓｈｉの染色は弱く、時折のホットスポットをともなった（図７Ｄ）。全ての神経球がまた、ＢＴ  ＩＩＩおよびＧＦＡＰを発現し、この発現は、いくらかの神経球では均一であったが、他では違った（図７Ｅ）。示差的発現の後者の例では、ＢＴ  ＩＩＩまたはＧＦＡＰのどちらかが周縁部で発現し、他のマーカーは、逆に神経球の中心部で発現した。
【００７８】
実施例６：運動ニューロン（ＭＮ）を生成するＲＦＴ由来神経球の指向性の分化
ｒＦＴ由来神経球からのＭＮの生成を一貫して誘導するために、単一の神経球をレチノイン酸（ＲＡ）およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ−Ｎタンパク質、またはＨｈ−Ａｇ１．３と呼ばれるＳｈｈシグナル伝達の特異的小分子アゴニスト）で、ＭＮ前駆体を誘導するために４〜５日間処理した。これらの処理された個々の神経球は、その後、血清ならびに、ＭＮの成長および生存を支持することが公知の三つの神経栄養因子の存在下で、接着基質上で平板培養した。用いた神経栄養因子は、毛様体由来神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。これらの条件において処理した神経球を７〜１０日間分化させた後、細胞をＭＮ特異的マーカーの存在について免疫細胞化学により分析した（図８、図９）。用いたマーカーは、ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ−２（ＭＮＲ２）、Ｉｓｌｅｔ  １（Ｉｓｌ１）、Ｌｉｍ３およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）であった。ＭＮＲ２、Ｉｓｌ１およびＬｉｍ３は、Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅらにより、ＭＮＳへの胚様体の規定された分化を記載する彼らのもともとの論文において用いられた。Ｐａｘ６およびＯｌｉｇ２は、ＭＮ前駆体細胞を同定するためのマーカーとして用いた。
【００７９】
ＭＮＲ２は、運動ニューロン前駆体の最終分裂の間に最初に発現され、そしてＭＮの同一性にかかわる決定因子である。Ｉｓｌ１およびＬｉｍ３は、ＭＮの発達に関連する二つのホメオボックス転写因子である。Ｉｓｌ１は、全てのクラスのＭＮにより発現される。全ての実験において（ｎ＝２５）、種々の割合の分化したニューロンが、上に記載したＭＮまたはＭＮＰマーカーを発現した（図８）。この変動性は、ＭＮＲ２のような単一のマーカーの使用においても持続する（図９）。Ｈｈ−Ａｇ１．３を使用した９つの実験において、分化したニューロンの９５〜１００％が、ＭＮマーカー（例えば、ＭＮＲ２、Ｉｓｌ１、Ｌｉｍ３およびＣｈＡＴ）を発現した。このアゴニストは、実際のペプチドよりも、より有効であり、そしてＭＮの生成について、Ｓｈｈ−Ｎを優先して用いられてきた。そのデータは、Ｓｈｈ−Ｎで処理した神経球は、そのうちほんの２０〜４０％がＭＮマーカーを発現する分化したニューロンを生じるという観察と一致する。Ｓｈｈ−Ｎ濃度の増加は、結果を変化させないようであった。
【００８０】
三つの形態の対照実験を実施した。第一番目は、神経球をＲＡなしで、Ｓｈｈ−Ｎで処理し（ｎ＝８）、そしてその後それらを、血清ならびにＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦを含む培地中で分化させることを含んだ。第二番目は、未処理の神経球を、血清および３つのノイロトロピンを含む培地中で培養することを含んだ（ｎ＝８）。そして第三番目は、未処理の神経球を、特定の神経栄養のサポートはない、血清を含む培地中で分化させることを含む（ｎ＝３）。初めの二つの条件は、変動する割合のＭＮＲ２陽性細胞を一貫して生成した（図８Ｅおよび８Ｆ）。複数の例において、ＭＮＲ２について免疫染色した細胞は、島において互いに塊になる傾向があり、そしてグリアにより取り巻かれることが、時折言及された。指向性および一貫したＭＮの生成のためのＲＡおよびＳｈｈ−Ｎの使用は、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦの存在下において神経球を単に分化させることよりも優れてはいないことが明らかとなった。しかしながら、神経球を、神経栄養のサポートなしで、血清中で培養した場合、ＭＮの生成は一貫性がなく、３つの実験の１つのみで、約４０％の細胞がＭＮＲ２を発現した。神経球の公知の異質性、および発生的に意図される本来のＦＴの機能と組み合わせて、これらのデータは、ＲＡの尾方化作用または外因性の腹方化Ｓｈｈ−Ｎシグナル伝達を必要とすることなく、ＭＮに分化するいくらかのｒＦＴ  ＮＳＣの本質的な能力を示す。しかしながらＨｈ−Ａｇ１．３の使用は、大半だが全てではない神経球由来細胞がＭＮを生成するように指向した点において、ＭＮの収量を増加させるために有益であることが見出された。
【００８１】
実施例７：ＦＴ由来神経球は、多分化能性であり、ニューロンおよびグリアに分化する
いくらかの神経球は、培養容器に接着し、そして培地からのいずれの因子の添加も除去もなく自発的に分化する。ｒＦＴ由来神経球が、ニューロンおよびグリアに分化するために必要とされる条件を決定するために研究を実行した。ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＬＩＦの除去後、３４の実験において単一の神経球を、ポリ−Ｌ−リジンおよび／もしくはラミニンコートしたカバーガラスならびに／または５〜１０％の血清への曝露の種々の組み合わせ上で平板培養した。その神経球をこれらの分化条件に７日間供した。接着基質単独または血清単独のどちらかの使用が、形態学的分化を開始するために十分であったが、血清の添加は、より迅速な分化を結果として生じた。全ての例において、分化した神経球は、ＢＴＩＩＩ、神経フィラメント、Ｏ１、およびＧＦＡＰを含むニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーを発現した（表１および２）。
【００８２】
一度これらの条件が確立されると、次の６５の実験が、ｒＦＴ神経球の分化の能力をさらに特徴付けた。これらの実験において、その分化条件は、３つの増殖因子全ての除去、５〜１０％の血清による培地の補充、ならびにポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンでコートしたカバーガラス上での単一神経球の平板培養を含んだ。これらの実験のうちの３０において、神経球は、２４時間を越えて分化し、そして３５の実験において、神経球は７〜１０日間を越えて分化した。哺乳動物ＣＮＳの他の領域から培養された神経球の報告された不均一さと一致して、ｒＦＴ由来神経球は、さまざまな分化能力を有した。
【００８３】
その変動性にもかかわらず、全ての実験において、各神経球由来のいくらかの割合のＮＰＣ、ニューロンおよび／またはグリアが、免疫細胞化学マーカーを用いて同定された。これらは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ＮｅｕＮ、ＢＴＩＩＩ、ＧＦＡＰ、Ｏ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチンおよびＳｏｘ２を含んだ（表１）。２４時間を越えて分化した神経球（ｎ＝９）は、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの両方について二重染色された総細胞の高い割合を有した（約７０％、表３）。この割合は、神経球が７〜１０日間を越えて分化した後、平均約１４．５％まで減少した（ｎ＝１３、表３）。時折、７日間の分化の後、神経球由来の細胞は、ニューロンのマーカーまたはグリアのマーカーのどちらかを主に発現した。しかしながら、ほとんどの例において、明白な優勢は観察されなかった。１４の実験における同じ二つのマーカーの使用にもかかわらず、分化した神経球は、ＢＴＩＩＩおよびＧＦＡＰ発現のさまざまなアレイを示した。この変化は、同一の供給源由来、および異なるｒＦＴ供給源の間由来の両方の神経球において持続していた。
【００８４】
分化した神経球の間の染色パターンもまた変化する。しばしば、神経球由来の細胞の塊は、一つの特定のマーカーについて全て染色陽性であり、そして他の領域における細胞は異なるマーカーを発現する。しかしながら、より頻繁に、異なるマーカーについて染まる細胞が、一緒に点在する。
【００８５】
【表１−１】
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【００８６】
【表１−２】
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【００８７】
【表２】
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【００８８】
【表３】
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実施例８：ＦＴ−ＮＳＣはインビトロで運動ニューロンを生成する
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）における未分化細胞であって自己再生が可能であり、そしてニューロンおよびグリアに分化するように誘導され得る。哺乳動物のＮＳＣの現用の供給源は、正常な機能にとって大切であり、外科的に到達することが困難であるＣＮＳの領域に制限されている。これは、ヒト疾患におけるそれらの治療上の能力を制限する。以前に調べられておらず、犠牲にしてもよく、そして容易に到達することができる、脊髄の尾方末端の組織である終糸（ＦＴ）が、哺乳動物における多分化能の神経球の供給源であることが、予期せず発見された。本研究では、単離し、そしてこれらの細胞の能力を特徴付けるためにラットモデルを用いた。ラットＦＴ（ｒＦＴ）由来の神経球は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）の組み合わせによるインビトロでの増殖に耐えられる。増殖している細胞は、血清への曝露により神経前駆体細胞、ニューロン、星状膠細胞およびグリアへと分化するように誘導された神経球を形成した。種々の神経栄養因子と組み合わせてソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）およびレチノイン酸（ＲＡ）を用いる指向性の分化をとおして、ｒＦＴ由来神経球は、運動ニューロン（ＭＮ）をインビトロで生じた。
【００８９】
多分化能ＮＳＣの存在が、ラットからヒトまでの範囲の種において成体の哺乳動物ＣＮＳの複数の領域において示された。これらの領域は、嗅球、脳室の上衣下裏打ち、海馬、小脳、脊髄および網膜を含む。哺乳動物ＮＳＣの現用の供給源は、それらが、正常な機能にとって重要であり、そして到達することが困難な領域から取得されることから、ヒト疾患における移植治療のためには理想的ではない。これらの領域の外科的破壊は、自系ＮＳＣを採取するためにそれらを用いることを非現実的にする、甚大な神経学的な欠損を導いた。
【００９０】
ＦＴは、自系多分化細胞の供給源として優れた候補である。それは、容易に到達することができ、そして犠牲にしてもよい、成体において持続する組織である点において、現在利用可能な供給源を凌駕する明確な利点を提供する。本発明の方法は、ＦＴを自家置換療法のために用いることにより、免疫学的な問題を回避する。
【００９１】
発生の初期に、ＦＴは、胚の予定運命の尾への神経支配（あるいはげっ歯類において、最も尾側の尾分節の一時的な神経支配）を与える。成体において、それは痕跡のレムナントである。いくらかのヒトは、動かせる尾をもって生まれるが、しかしながら、尾の異常な残存は、おそらく発生過程の欠陥を示す。ヒトの尾の胚発生は、最初に３．５〜５ｍｍの段階（約４週）で検出される。１１〜１５ｍｍの段階（約７週）では、尾骨領域はより進んだ発達を示し、脊髄が上衣領域、マント領域および境界領域に分化し、そしてそれぞれの脊髄神経節からそれに入るよく発達した脊髄根を有す。この時点では、この領域が脊髄のより頭方の部分のような成体の状態へと完全に分化し始めないという、組織学的証拠はない。
【００９２】
発生が続くと、脊髄の尾骨／尾の部分は再吸収され、そして細胞は、Ｓｔｒｅｅｔｅｒにより「脱分化」と名付けられた（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｇ．Ｌ．１９１９．Ａｍ  Ｊ  Ａｎａｔ  ２２：１−１２）過程をうける。３０ｍｍの段階（約９．９週）までに、脊髄の尾骨領域は、顕著に変化した。尾骨の脊髄組織は初期の胚の型に戻り、線維芽細胞、ニューロンおよびグリアのゆるく組織化された収集物によって囲まれた上衣細胞により裏打ちされた狭い中心管をもつ膠原性の構造を、結果として生じる（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｇ．Ｌ．１９１９．Ａｍ  Ｊ  Ａｎａｔ  ２２：１−１２）。最後の三つの尾骨神経節が消失するように、境界領域およびマント領域は、完全に消失する。再吸収は、尾から吻への方向で生じ、そして結果として生じる構造が、ＦＴ（脊髄を尾骨に固定する脊髄の尾方末端の細長い延長部分）として成体中に残る。
【００９３】
通常、脱分化した出生後のＦＴは、残りの神経系と相互連結せず、身体の神経を刺激しない。それは偽りなく痕跡のレムナントである。ヒトにおいて、脊椎に固くつながれ、動作の十分な自由を欠く（係留脊髄症候群として公知の状態である）例において、脊髄に対する緊張を軽減するために、それは慣例的に外科的に切開される。ＦＴ細胞は、初期の胚細胞型に似ており、脊髄の残部に存在する複数の細胞型に再分化する能力を維持する。
【００９４】
ヒトおよびラットの両方において、ＦＴは、脊柱管を囲む膠原性の構造である。室周囲の上衣細胞ならびにゆるく組織化された線維芽細胞、ニューロンおよびグリアの収集物が、その管を囲む。ラットにおいてＦＴニューロンは、通常よりも、より小さいものとして記載され、そして拘束および分化の初期段階においてニューロンを示す。パラガングリオーマおよび他の初期の神経外胚葉性腫瘍は、成体ＦＴから生じ、ＮＳＣが存在することを再び示唆する。ＦＴは、多分化細胞の供給源である。ラットモデルの使用は、制御された環境中での、これらの細胞の全身性の制限のない研究を可能にする。げっ歯類では、ＦＴは、最も尾側の尾分節の一時的な神経支配を与える。
【００９５】
細胞培養
ｒＦＴの培養および得られた神経球
初代培養：全ての手順は、滅菌条件下で実施した。Ｐ２〜Ｐ１１齢の出生後のラット（雄および雌、ＳＤ系（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）、チャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ））を、イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ）で麻酔し、そして頚椎脱臼により殺した。脊柱を、氷冷したＨａｎｋｓ溶液中で迅速に切開した。顕微鏡での可視化のもと、ｒＦＴを同定し切開した。各切開は、細胞死を最小にするため、５分未満で実施した。ｒＦＴの周囲の脊髄神経根を時折切開し、陰性対照として別個に培養した。ｒＦＴ（通常、培養ディッシュ当たり、３つの同胞ｒＦＴ）をプールし、そして幹細胞培地（ＳＣＭ）（Ｗｅｉｓｓら、１９９６．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：７５９９−７６０９；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１９９９．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １５８：２６５−２７８；Ｌｉら、２００５ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２６：４２５−４３４；Ｋｉｍら、２００６．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９９：２２２−２３５）を含む培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に移した。この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１、Ｇｉｂｃｏ）、１％  Ｎ２処方物（Ｇｉｂｃｏ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、およびＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）から作製した。ＦＧＦは、安定性のために、８ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液中で調製した。
【００９６】
組織を分離するため、３ｍＭのカルシウム（Ｇｉｂｃｏ）をともなうＩＩ型コラゲナーゼ  １００Ｕ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ）をＳＣＭに加えた。切開した組織をその後、このコラゲナーゼを含む培地に移し、そしてピンセットおよび外科用メスを用いて掻き裂いた。培養物は、加湿したインキュベーター中に、３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。２４時間後、その組織を、さらなる分離のために先端熱加工したピペットで機械的に粉砕し、そしてコラゲナーゼ含有ＳＣＭ中に残した。初代幹細胞の増殖を、３〜５日後にインビトロで検出し、そして未分化細胞の球体の形成（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．１９９２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１７０７−１７１０）により特徴付けた。
【００９７】
培養の継代：培養物は、２〜３週毎に継代した。神経球を、５〜８分間、１×ＡｃｃｕｍａｘＴＭ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離し、そしてその後、神経球の部分的分離を達成するために機械的に粉砕した。初期の実験において、神経球を完全に分離した場合、細胞が生存しても少数だった。酵素的分離後、細胞を遠心分離し（１０００ｒｐｍで１０分間）、そして新鮮培地と馴化培地の１：１の組み合わせ中に再懸濁した。
【００９８】
ラット筋肉の培養
Ｐ０〜Ｐ７のラットを殺し、そして近位の肢の筋肉を、氷冷したＨＢＳＳ中で迅速に切開した。その組織を、穏やかに別々に掻き裂き、そしてその後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、１％  Ｎ２補充物および１％  ペニシリン−ストレプトマイシンからなる培地を含む培養ディッシュに移した。３ｍＭのカルシウムをともなうＩＩ型コラゲナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）を、筋肉繊維を単一の細胞に分散させるために、この培地に加えた。ディッシュは、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベーター中に２４時間置いた。２４時間後、組織を完全に分離するために、先端熱加工したパスツールピペットで培養物を粉砕した。培養物をその後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。そのペレットを２回洗浄し、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１、１％  Ｎ２補充物、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、１０％  ウシ胎児血清を含む培地中に再懸濁した。シス−ヒドロキシプロリン（１００μｇ／ｍｌ）を、線維芽細胞の増殖を抑制するために平板培養培地に加えた。細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（０．０１％）およびラミニン（２０μｇ／ｍｌ）でコートしたカバーガラス上で、約１０６細胞／ｍｌの密度で平板培養した。
【００９９】
細胞分化
インビトロ分化
血清をもちいての非特異的分化：単一の神経球を、可視化のための解剖顕微鏡を用いて単離し、そして９６穴の培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の個々のウエル中で、１％  Ｎ２、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、および５〜１０％  ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、ポリ−Ｌ−リジン（０．０１％）およびラミニン（２０μｇ／ｍｌ）でコートしたカバーガラス上で平板培養した。培地は、実験の残りの間、変更しなかった。カバーガラスを、２４時間後、または７〜１０日後に免疫細胞化学のために処理した。
【０１００】
トリチウム化したチミジンとのインキュベーション：チミジン標識実験を、Ｃｅｐｋｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｄｙｅｒ，Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．２０００．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：８７３−８８０）のプロトコールを用いて実施した。神経球を、ＳＣＭ中で８時間、３Ｈチミジン（ＮＥＮ、５μＣｉ／ｍｌ；８９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とインキュベートした。個々の神経球を単離し、ＳＣＭ中で３回洗浄し、そして上述のように血清中で分化させた。分化後、カバーガラスを免疫細胞化学のために処理した。カバーガラスをスライド上に載せる前に、乳化剤のオイルをカバーガラスに加え、そして暗室に２日間置いた。乳化剤のオイルを除去し、そしてカバーガラスを水で洗浄した。現像液を４分間加えた。続いて、その現像液を吸引し、そしてそのカバーガラスを４％  パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。その後、カバーガラスを水で洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてスライド上に載せ、そして蛍光顕微鏡使用法下で（免疫細胞化学について）および明視野顕微鏡使用法下で（トリチウム化チミジンの取り込みについて）可視化した。
【０１０１】
指向性の分化：神経球を、レチノイン酸（ＲＡ、２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）タンパク質（Ｓｈｈ−Ｎ  ４００〜１０００ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓより入手）、またはソニックヘッジホッグシグナル伝達の小分子アゴニスト（Ｈｈ−Ａｇ１．３、Ｃｕｒｉｓ）で、当該分野で認識される方法（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら、２００２．Ｃｅｌｌ  １１０：３８５−３９７；Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎら、２００６．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：３２５６−３２６８）の変形を用いて４〜５日間、処理した。この処理は、ＳＣＭ中で実施した。個々の神経球をその後単離し、そして９６穴の培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の個々のウエル中で、１％  Ｎ２、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、５％  ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ＣＮＴＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、およびＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、ポリ−Ｌ−オルニチン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）、Ｉ型コラーゲン（０．０１％）およびラミニン（２０ｍｇ／ｍｌ）でコートしたカバーガラス上で７〜１０日間、平板培養した。四つの条件を用いた：（１）神経球を上記のように処理した；（２）ＲＡなしで上記のように処理した；（３）ＳｈｈもＲＡもなしで上記のように処理した；（４）ＳｈｈもＲＡも三つのノイロトロピンもなしで、血清単独を用いて。カバーガラスをその後、免疫細胞化学のために処理した。
【０１０２】
神経筋接合部の形成：個々の神経球を、ＲＡ（２ｍＭ）およびＳｈｈ−Ｎ（６００〜１０００ｎＭ）で、４〜６日間処理し、そして続いて上記の、ＭＮ成長および生存のための分化培地中の筋培養物上で平板培養した。二つの型の対照培養物を用いた：１）筋細胞単独および２）未処理の神経球をその上で平板培養した筋細胞。６〜２１日後、培養物を蛍光α−アマガサヘビ毒素（２μｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８）と２．５時間インキュベートした。それらをその後、洗浄し、固定し、そして免疫細胞化学（ニューロンマーカーＴＵＪ−１）のために処理した。単一の神経球を、同時培養に先立って、１時間、１μＭのジ−Ｉ（Ｄｉ−Ｉ）またはジ−Ｄ（Ｄｉ−Ｄ）で標識した。
【０１０３】
細胞マーカー
抗体：ネスチンに対するヤギポリクローナル抗血清（１：５０）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓより入手）。ＣｈＡＴに対するヤギポリクローナル抗体（１：１００）およびニューロン特異的エノラーゼに対するマウスモノクローナル抗体（１：１０００）はＣｈｅｍｉｃｏｎから入手した。Ｓｏｘ２に対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００）は、ＳｉｇｍａおよびＡｂｃａｍから入手した。ビメンチンに対するマウスモノクロ−ナル抗体はＺｙｍｅｄから入手した。ＧＦＡＰに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００）はＤａｋｏから入手し、ＧＦＡＰに対するマウスモノクローナル抗体（１：１０００）はＳｉｇｍａから入手した。β−チューブリンＩＩＩ（Ｔｕｊ−１）に対するウサギポリクローナル抗体はＣｏｖａｎｃｅから入手した。Ｔｕｊ−１に対するマウスモノクローナル抗体（１：１０００）およびＮｅｕ−Ｎに対するマウスモノクロ−ナル抗体（１：１０００）はＣｏｖａｎｃｅから入手した。Ｏｌｉｇ−２に対するマウスモノクローナル抗体は、使用に先立って前希釈した。ＮＩＣＨＤの援助のもとに開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ  ５２２４２によって維持された、神経フィラメント；ＭＮＲ２、Ｌｉｍ３およびＩｓｌ−１；ならびにＰａｘ６に対するモノクローナル抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから入手した。ＡＦ４８８結合体化ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＡＦ４８８結合体化ロバ抗マウスＩｇＧ、ＡＦ５６８結合体化ロバ抗ヤギＩｇＧ、ＡＦ４８８結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ、およびＡＦ５６８結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓより入手し、全て１：１０００で使用した。
【０１０４】
免疫細胞化学：はカバーガラスに付着した全神経球または分化した神経球で実施した。カバーガラスを、（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の）４％ホルムアルデヒド中で２０〜３０分間固定し、その後ＰＢＳ中で各１０分で３回洗浄した。抗体希釈液をブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．２％  ウシ血清アルブミンにおいて、１０％  正常ヤギ血清、１０％  アイシングラス、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）中で調製し、そして一次抗体をそのカバーガラスと一晩（８時間）インキュベートした。その後、適切な二次抗体との４時間のインキュベーションの前に、ＰＢＳ中で３回洗浄した。ＰＢＳ中での追加の３回の洗浄後、カバーガラスをＤａｐｉ（０．０３ｍｇ／ｍｌ）中で３０分間インキュベートした。カバーガラスを、その後、３回洗浄し（各１０分間）、そしてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ中にスライドガラス上に載せた。そのスライドは、Ｚｅｉｓｓ写真用顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて、免疫蛍光検査のために可視化した。特定のマーカーについての細胞染色のおおよその割合を、４〜５の２０×視野の平均カウントにより決定した。細胞カウントは、Ｄａｐｉを用いる核染色に基づく。
【０１０５】
ｒＦＴ由来神経球の単離および特徴付け
単離：ｒＦＴから単離した細胞を、コラゲナーゼで分離し、そして、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む標準的な幹細胞培地（ＤＭＥＭ、Ｆ１２、Ｎ２補充物）中で培養した。インビトロで３〜４日後（ＤＩＶ）、３４の初代培養物中３１において、神経球が観察された。これらの神経球は、最初は自由に浮遊し、そしてそれらの球状構造、位相での明るい外観、および一定の細胞膜により同定した。神経球は、やがてより大きな神経球へと成長する、３〜４の丸い細胞のより小さな塊として、初めは出現する。これらの、より大きな神経球のサイズは、サイズにおいて約５０ｕｍ未満〜１ｍｍ超までの広い範囲であった。３０ｕｍより小さい細胞塊は、神経球としてカウントしなかった。初代培養物当たりの神経球の数は、約３０から、５０を超えるまで変化した。この数はドナーのラットの年齢とは相関しないようだった。増殖および自己再生の能力を示すため、神経球を分離し、そして１９回まで継代した。これらの培養物は、インビトロで７ヶ月まで維持した。１２の培養物を凍結し、そして二つを生存能力について試験し、成功裡に回復した。
【０１０６】
特徴付け：神経球は、ＮＳＣの均質な集団ではなく、むしろ異なる分化能力をもつ異なるＮＳＣおよび神経前駆体細胞（ＮＰＣ）の不均質な収集物である。ｒＦＴ由来神経球を、種々の神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカー、神経前駆体細胞（ＮＰＣ）マーカー、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカー（表１）の発現を決定するために、免疫細胞化学を用いて特徴付けた。特に、神経球を、ＮＳＣマーカーのネスチン（ｎ＝９）；ＮＰＣマーカーのＳｏｘ２（ｎ＝８）、ビメンチン（ｎ＝６）、Ｏｌｉｇ−２（ｎ＝３）、およびＭｕｓａｓｈｉ（ｎ＝４）；ニューロン特異的マーカーのβ−チューブリンＩＩＩ（Ｔｕｊ−１、ｎ＝１２）；ならびに星状膠細胞のマーカーのグリア線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ、ｎ＝１２）について染色した。
【０１０７】
全ての例において、変動する割合の細胞が、ネスチンについて陽性であった。９例中４例において、神経球中の１００％の細胞が、ネスチン＋であった。このネスチン染色の存在は、神経球の培養における時間とは相関しないようであった。加えて、固定された全載（whole mount）（ｎ＝１）および組織切片（ｎ＝２）をネスチンについて染色した。免疫組織化学が、ネスチン＋細胞を示した。神経前駆体のマーカーの染色は変化した。三つの実験のうちの三つにおいて、神経球内の１００％の細胞が、Ｏｌｉｇ−２について陽性に染色され、いくらかの領域は、より強い染色を示した。全ての神経球が、Ｓｏｘ−２およびビメンチンについて陽性に染まる、ある割合の細胞を有したけれども、このパーセンテージは、Ｓｏｘ−２については４０から１００％まで変化し、そしてビメンチンについては３３から１００％まで変化した。Ｍｕｓａｓｈｉの染色は弱く、時折の高強度の染色の塊をともなった。
【０１０８】
Ｔｕｊ−１＋およびＧＦＡＰ＋細胞は、全ての神経球中に存在した（ｎ＝１２）。どの神経球も、両方のマーカーについて陽性のいくらかの細胞を含み、そしてこの比は神経球の間で大きく変化した。異なるマーカーを発現する細胞の空間的な塊形成がある。この塊形成は、ほとんどの神経球において明瞭であるが、そのパターンは変化した。
【０１０９】
ニューロンおよびグリアへの分化
いくらかの神経球は、培養容器に接着し、そして培地へのいずれの因子の付加も除去もなしに、ニューロンおよびグリアの形態学的特徴を有する細胞へ自発的に分化する。ｒＦＴ由来神経球をニューロンおよびグリアに分化させるために必要とされる条件を決定した。ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＬＩＦの除去後、単一の神経球を、表２に示した接着基質±５〜１０％のウシ胎児血清への曝露の７種類の異なる組み合わせで処理したカバーガラス上に平板培養した。各条件につき５回の実験を実施した。７日後、培養物をＴｕｊ−１、神経フィラメント、Ｏ１、ＧＦＡＰおよびネスチンについて染色した。接着基質単独または血清単独のどちらかの使用が、形態学的な分化を開始するために十分であったが、血清の付加が、より迅速な分化を結果として生じた。全ての例において、Ｔｕｊ−１、神経フィラメント、Ｏ１、およびＧＦＡＰを含むニューロンのマーカーまたはグリアのマーカーのどちらかを発現する神経球に由来する細胞を検出した。
【０１１０】
全ての続いて起こる分化の実験（ｎ＝６５）は、３つの増殖因子全ての除去、５〜１０％ウシ胎児血清の培地への補充、およびポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンの両方でコートしたカバーガラス上への単一神経球の平板培養により、実施した。細胞を、これらの条件で２４時間（ｎ＝３０）または７〜１０日間（ｎ＝３５）培養し、そして培養物を免疫細胞化学のためにその後固定した。これらの実験において用いられた神経球のサイズの広い分布を考慮すると、得られた分化した細胞の数は、神経球当たり約５０細胞未満から、５０００細胞超の範囲であり、最初に平板培養した神経球のサイズと相関する。より大きい神経球（通常１００ｕｍより大きい）は、５０００より多い分化した細胞を生成することができる。
【０１１１】
神経球が、ＮＰＣ、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞を産生する能力があるか否かを決定した。これらの細胞型を同定するために用いた免疫細胞化学マーカーは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ＮｅｕＮ、Ｔｕｊ−１、ＧＦＡＰ、Ｏ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチンおよびＳｏｘ２を含んだ（表１および表３）。各例において、単一の神経球から得られた細胞を、これらのマーカーの二つについて二重染色した。これらの実験由来のデータは、ｒＦＴ由来神経球が変動した分化能力を有することを示した。２４時間を超えて分化した神経球（ｎ＝９）は、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの両方について二重に染まった細胞の高い割合を有した（表３）。Ｔｕｊ−１およびＧＦＡＰ染色の例において、６９±１４％（ｎ＝５）の細胞がその二つのマーカーについて二重に染まった。７〜１０日後、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの両方について二重に染まった細胞の割合は、顕著に減少した（表３）。Ｔｕｊ−１およびＧＦＡＰ染色の例において、わずかに１３±１０％（ｎ＝９）の細胞が、その二つのマーカーについて二重に染まった。Ｔｕｊ−１およびＧＦＡＰの変動する発現が、２４時間後の分化を７〜１０日後の分化と比べた１４の実験において観察された。これらのｒＦＴ由来細胞集団中に存在するＴｕｊ−１＋およびＧＦＡＰ＋の変動する割合は、各神経球の不均質な分化能力を反映する。この変動は、ラットの年齢とは拘わりなく、両方を同一の供給源から得た神経球の間でなされた比較において、異なるｒＦＴ供給源に由来する場合と同様に持続した。
【０１１２】
まれな場合において、７日間の分化の後、単一の神経球由来の８５％を超える細胞が、ニューロンのマーカーまたはグリアのマーカーのどちらかを発現した（ｎ＝２）。しかしながら、ほとんどの例において、明白な優勢は観察されず、そしてニューロンの細胞およびグリア細胞の両方の変動する割合は、単一の神経球の分化から見出された。ＮＰＣマーカーの染色は、分化条件に７〜１０日間曝露した後でさえ持続した（表３）。実際、その染色は、使用した全てのＮＰＣマーカーについての２４時間での染色と比較して、７〜１０日後にわずかに増加するようである。
【０１１３】
分化した細胞が、増殖性細胞に由来することを立証するため、本発明者らは、活発に分裂している細胞をトリチウム化したチミジン（３Ｈ）で標識した。神経球を、３Ｈで８時間処理した（ｎ＝５）。その神経球を、その後洗浄し、上述の標準的な条件において、７日間を超えて分化させた。得られた細胞を、Ｔｕｊ−１およびＧＦＡＰについて染色した。５例全てにおいて、ニューロンおよびグリアとして免疫学的に同定された細胞の２７〜９０％が、それらの核中に取り込まれたトリチウム化したチミジンを有した（図１２）。この結果は、得られた細胞が、活発に分裂している細胞の子孫であったことを示す。
【０１１４】
ＲＦＴ由来神経球は運動ニューロン（ＭＮ）を生成する
全ての実験において（ｎ＝２５）、種々の割合の分化した細胞が、上述のＭＮマーカーまたは運動ニューロン前駆体マーカーを発現した。図１２は、ＭＮＲ−２、Ｔｕｊ−１およびＧＦＡＰについての染色に基づいて、運動ニューロン、ニューロンおよびグリアの割合を示す。
【０１１５】
Ｓｈｈ−Ｎで処理した神経球は、分化したニューロンを生じ、その２０〜４０％のみがＭＮマーカーであるＭＮＲ−２、Ｉｓｌ１、Ｌｉｍ３およびＣｈＡＴを発現した（ｎ＝１４）。Ｓｈｈ−Ｎ濃度を４００ｎＭから１０００ｎＭまで増加させることは、その結果を変化させないようだった。Ｈｈ−Ａｇ１．３が用いられた場合（ｎ＝９、１．５μＭ）、分化したニューロンの９５〜１００％がＭＮマーカーを発現した。この結果は、これらの濃度において、Ｈｈ−Ａｇ１．３アゴニストが、実際のＳｈｈ−Ｎペプチドよりも、ＦＴ由来神経球からのＭＮの生成のために、より有効であり得ることを示唆した。
【０１１６】
ＦＴからＭＮを生成するために、どの因子が本質的であるかを決定するため、分化条件を変化させた：（１）神経球を、ＲＡなしで、Ｓｈｈ−Ｎで処理し（ｎ＝８）、そしてそれらを血清ならびにＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦを含む培地中で分化させた；（２）未処理の神経球を、血清および３つのノイロトロピンを含む培地中で培養した（ｎ＝８）；（３）未処理の神経球を、神経栄養因子の付加なしで、血清を含む培地中で分化させた（ｎ＝３）。図１３に示したように、（１）および（２）の条件において、神経球は、変動する割合のＭＮＲ２＋細胞（５〜６７％）を一貫して生成した。
【０１１７】
条件（３）において、ＭＮの生成は一貫性がなかった。３例中１例において、神経球から得られた細胞の４０％はＭＮＲ２を発現し、そして３例中２例において、細胞はＭＮＲ２＋ではなかった。ＭＮの指向されかつ一貫した生成のための、ＲＡおよびＳｈｈ−Ｎの使用は、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦの存在下において神経球を単に分化させることよりも優れているとは立証しなかった。しかしながら、上述し、そして図１３に示したように、Ｈｈ−Ａｇ１．３は、ＭＮの収量を増大させるうえで有益である。ＦＴが脊髄の痕跡のレムナントであることを考慮して、これらの結果は、ＲＡの尾方化作用も外因性の腹方化Ｓｈｈ−Ｎシグナル伝達もなしに、いくらかのｒＦＴ  ＮＳＣをＭＮに分化させる能力を示す。
【０１１８】
この研究の結果は、多分化能幹細胞が出生後のｒＦＴ中に存在することを示す。これらの細胞は、ＮＳＣの二つの基本的な特性を示す：それらは、自己再生／増殖でき、ならびにニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞を含む複数の細胞型へ分化できる。ＭＮを生成するＦＴの能力は、ＡＬＳのような神経変性疾患に対して、特に治療上重要であり得る。
【０１１９】
ＮＳＣのニッチとしてのＦＴ
本発明の方法を、先に記載された、例えば側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）のようなＮＳＣのためのＣＮＳのニッチの多くの特性を、ＦＴの組織学的環境が有することを決定するために用いた。ＳＶＺにおける細胞構成は、Ａ型（神経芽細胞）、Ｂ型（ゆっくりと増殖するＧＦＡＰ＋神経形成星状膠細胞）、Ｃ型（中間前駆体細胞）およびＥ型（上衣）細胞からなる。この系において、Ｅ型細胞は脳室を裏打ちし、そして、脳室に接触するためにＥ細胞の間を縫うように続くＢ細胞によって、時折置き換えられる。Ｂ型細胞は、Ｅ細胞の脳室下側に向かって位置し、吻側移動経路（Ｒｏｓｔｒａｌ  Ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  Ｓｔｒｅａｍ）として公知の経路に沿って嗅球へ移動するＡ細胞をさや状に覆う。Ｃ型細胞は、Ａ細胞の鎖に沿って分散する。
【０１２０】
これらの研究は、ＦＴにおける細胞型が、上衣細胞、神経芽細胞、星状膠細胞様細胞、小膠細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、線維芽細胞、脂肪細胞および神経節細胞を含むことを示した。ＦＴ細胞は、脊柱管を裏打ちする上衣細胞の周りにゆるく組織化される。ＦＴの上衣細胞は、広範囲なモザイクまたはサイズの変化する環を形成する脳室の裏打ち上のロゼットとして、しばしば伸長する。理論によって拘束されることを望まないが、本発明は、ＦＴの上衣細胞は、ＳＶＺのＥ細胞に類似するという驚くべき発見に基づく。さらに、ＳＶＺのＢ細胞と同様に、ＦＴ中のいくらかのＧＦＡＰ＋星状膠細胞様細胞は、上衣細胞の間に互いに入り込む突起を有する。さらに、これらの突起の構造は、ＳＶＺ中でＡ細胞をさや状に覆うＢ細胞に類似する。本発明の方法を用いて実施した研究からのデータは、ＦＴの頭方の部分に見出されるニューロンが、ラットおよびヒトの両方における形態において神経芽細胞に類似することを示す。それらは、しばしば神経線維の管に沿って存在し、そして時折、ＦＴの外側縁に伸長する。本発明の特定の実施形態において、これらの細胞は、ＳＶＺのＡ細胞に相似性であると考慮される。
【０１２１】
腫瘍形成
ＣＮＳの腫瘍は、神経組織のニッチ近くにしばしば見出される。脊髄およびＦＴ内の腫瘍は、全てのＣＮＳの腫瘍の４〜１０％を構成する。パラガングリオーマおよび原始神経外胚葉性腫瘍（例えば、脳室上衣腫）は、終糸に対する親和性を有する。パラガングリオーマは、神経内分泌腫瘍であり、そして脳室上衣腫は、中心管の上衣細胞から生じる腫瘍である。それらは、全てのグリアの脊髄腫瘍の６０％の原因であり、そして成体における最も一般的な髄内脊髄性新生物である；粘液乳頭型脳室上衣腫（ＦＴにおける上衣のグリアの腫瘍）は、脳室上衣腫の１３％を構成し、そしてＦＴに対する明瞭な偏好を有する（Ｋｏｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ  ２０：１７２１−１７４９）。
【０１２２】
細胞の同一性は分化プロセスの前に決定される
２４時間と７〜１０日間で分化した単一の神経球におけるニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの発現を対比した。２４時間の分化プロセス後、ほとんどの細胞が、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーの両方を発現した。一つの局面において、この結果は、分化プロセスの初期における未解明の細胞運命を反映する。７〜１０日後、単一の神経球に由来するほとんどの細胞は、ニューロンのマーカーまたはグリアのマーカーのどちらかを発現し、非常に少数の細胞が両方について二重に染色される。この結果は、ドナーの年齢とともには変化しない。２４時間後の相対的に不明瞭な細胞同一性と比べて、細胞は時間とともに、より拘束された細胞運命を発現する。
【０１２３】
細胞同一性は、分化プロセスの前に決定される。分化前に染色した神経球は、同一の処理にもかかわらずＴｕｊ−１＋およびＧＦＡＰ＋細胞の異なるパターンを示した。神経球内のいくらかの細胞が、両方のマーカーについて二重に染まったが、ほとんどの細胞は、Ｔｕｊ−１またはＧＦＡＰのどちらかの一つのマーカーのみを発現した。同一のマーカーについて陽性の細胞は、空間的に一緒に塊を形成する傾向がある。
【０１２４】
神経球分化の前に取得されたニューロンの特徴またはグリアの特徴は、各神経球の分化能力を予測する。分化の初期段階の間の一過的な二重染色は、細胞運命が未決定であるよりもむしろあいまいである分化経路に沿った点を示す。分化前の神経球細胞の初期の染色パターン（ＧＦＡＰ＋またはＴｕｊ−１＋）は、よりニューロンまたはグリアの運命へと神経球を操るためには、最初とは異なる条件でその神経球を培養することを必要とすることを示す。
【０１２５】
神経前駆体細胞（ＮＰＣ）マーカーは、７〜１０日で持続する
ＮＰＣマーカーの発現は、分化の２４時間後に高く、そして７〜１０日後でさらに高かった。ほとんどの細胞は、二重に染まらなくなり、そしてより成熟した表現型を示すマーカー（すなわち、ニューロンまたはグリア細胞マーカー）を発現することを考慮すると、これは驚きであった。
【０１２６】
その持続、およびＮＰＣ染色におけるわずかな増加は、二つの機構に帰する。一つの説明は、時間にそった細胞の代謝活性における変化を含む。一局面において、分化プロセスの初期に、いくらかの細胞は、迅速なタンパク質ターンオーバーをともなって高度に代謝的に活性であり、ＮＰＣマーカーの検出を妨げる。数日の分化の後、ターンオーバー速度が低下することから、そのタンパク質レベルが増加し、それゆえ免疫細胞化学を介してのタンパク質検出を可能とする。代替的な説明は、７〜１０日の分化後、細胞は系統特異的なＮＰＣであり、そしてそれゆえ、ニューロンまたはグリア特異的マーカーに加えてＮＰＣマーカーを発現するというものである。
【０１２７】
ＲＦＴ神経球はＭＮを生成する本質的な能力を有する
ＲＦＴ由来神経球は、インビトロで胚性幹細胞をＭＮに分化させるために用いられたＲＡおよびＳｈｈへの暴露の有りおよび無しでＭＮを生成した。胎仔身体における吻側神経前駆体は、ＲＡ（尾方化シグナル）に応答して脊髄の位置の同一性を獲得し、そしてその後、Ｓｈｈの腹方化シグナルに応答して運動ニューロン前駆体の同一性を獲得する。
【０１２８】
ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦは、ＭＮの成長および生存を支持することが公知のノイロトロピンである。血清、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、およびＧＤＮＦの存在下で分化させる前に、ＲＡおよびＳｈｈ−Ｎで処理したＲＦＴ神経球は、２０〜４０％のＭＮを生成した。ＲＡ処理もＳｈｈ−Ｎ処理もなく、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、およびＧＤＮＦを有する血清中で平板培養した神経球は、５〜６７％のＭＮを生成し、ｒＦＴ神経球をＳｈｈ−ＮおよびＲＡで処理することは、ＭＮを生成するためにＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、およびＧＤＮＦの存在下で、それらを平板培養するよりも、より効果的ではないことを示した。ＲＡおよびＳｈｈは、胚性幹細胞の分化をＭＮへ指向させるために重要であるが、胚の発生の間にすでに、ある程度まで尾方化され腹方化されていてもよい出生後ｒＦＴから得られたＮＳＣとは、これらのシグナルは関連するものでなくともよい。
【０１２９】
ＦＴにおけるいくらかのＮＳＣは、血清以外の因子を必要とすることなくＭＮへと分化する能力を持ち得る。ＦＴ由来神経球を血清単独で平板培養した場合、１／３は、４０％のＭＮを生成し、時折のＭＮ発現は、特定の介入なしに起こり得ることを示した。一局面において、ＦＴは、胎仔の尾への神経支配を与える（または、げっ歯類の例においては、最も尾側の尾分節の一過的な神経支配を与える）、脊髄の部分の痕跡のレムナントであることから、このことが起こる。ＦＴ「脱分化」の発生上のプロセスがヒトで欠けている場合、新生児は、動かせる尾をもって生まれ得、持続するＭＮ神経支配を示唆する。この状況において、ＦＴから単離されたＮＳＣは、ＭＮのような脊髄に固有の細胞型を生成する能力を有し得る。
【０１３０】
ｒＦＴ由来神経球からのＭＮ収量の増加
Ｓｈｈ−Ｎに加えて、Ｓｈｈシグナル伝達はまた、小分子アゴニストのＨｈ−Ａｇ１．３により活性化される。胚性幹細胞（ＥＳＣ）からのＭＮの生成のために、研究は３００〜５００ｎＭのＳｈｈ−Ｎまたは１〜２μＭのＨｈ−Ａｇ１．３を使用した（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．ら、  ２００２．  Ｃｅｌｌ  １１０：３８５−３９７；Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、  ２００４．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１：  ７１２３−７１２８；Ｍｉｌｅｓ，Ｇ．Ｂ．ら、  ２００４．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４：７８４８−７８５８；Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．ら、  ２００５．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：  ２１５−２２１  ；Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ，Ｐ．ら、  ２００６．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：３２５６−３２６８）．  Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅらは、これらの濃度においてＳｈｈ−ＮおよびＨｈ−Ａｇ１．３で同一の結果を報告したが、ほとんどの研究は、ＥＳＣからＭＮを生成するために１μＭのＨｈ−Ａｇ１．３を使用した。ｒＦＴ神経球において、Ｈｈ−Ａｇ１．３は、Ｓｈｈ−Ｎと比較した場合、生成されたＭＮの収量の増加において特に有効であった。Ｈｈ−Ａｇ１．３を用いた場合、１００％近くのＭＮが生成され、一方、Ｓｈｈ−Ｎが加えられた場合、わずか２０〜４０％のＭＮが生成した。Ｈｈ−Ａｇ１．３は、ＥＳＣ神経球に比較してｒＦＴ神経球におけるＭＮ収量の増加のために選択的に有効のようである。これらの結果は、ｒＦＴ神経球の一つの予期せぬ、そして優れた特性を強調する。
【０１３１】
ＦＴ神経球由来のＧＦＡＰ＋細胞
ＧＦＡＰを星状膠細胞のマーカーとして用いたが、しかしながらＧＦＡＰは、星状膠細胞様成体幹細胞についてのマーカーでもある。成体哺乳動物において、神経形成星状膠細胞は、側脳室のＳＶＺ、および海馬中の歯状回のやや顆粒状のゾーンにおいてインビボで同定された。神経形成星状膠細胞を、非神経形成星状膠細胞の非常に大きい集団から区別する特徴およびマーカーは、未解明である。ｒＦＴから分化したＧＦＡＰ＋細胞は、神経形成および／または非神経形成星状膠細胞である。分化実験において、細胞は、時折ＧＦＡＰおよびニューロンのマーカーについて二重染色される。指向性のＭＮ分化をうけた神経球由来の細胞は、時折ＭＮＲ２およびＧＦＡＰの両方を発現する。ＧＦＡＰが、単に非神経形成星状膠細胞マーカーである場合、ＧＦＡＰと運動ニューロンマーカーの同時発現は驚きである。なぜならば、ＧＦＡＰはまた、星状膠細胞様成体ＮＳＣについてのマーカーであり、二重染色された細胞は、ＭＮの細胞運命に拘束された神経形成星状膠細胞を示し得る。
【０１３２】
ＲＦＴ神経球は増殖し、インビトロで継代され得、そしてＮＰＣ、ニューロンおよびグリアの収集物に分化する。哺乳動物ＣＮＳ内の多分化能細胞の発見は、外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および多発性硬化症を含む多くの現在治療不能のＣＮＳ疾患の治療の可能性のためにすばらしい意味を有した。多分化能細胞の供給源としてのＦＴの発見は、これらの神経学的疾患の自家移植療法の分野における新しい可能性を開く。
【０１３３】
実施例９：出生後のヒト終糸は、運動ニューロンを生成することが可能な自系多分化能神経球の供給源である
本発明の方法を、年齢１８歳までのドナーからヒトＮＳＣを単離するために用いた。これらの細胞は、培養の時間の延長した期間にわたって増殖した神経球を生じた。その神経球を、ニューロンおよびグリアに分化するように誘導した。さらに、それらを、インビトロで横紋筋を刺激することが可能な運動ニューロンを形成するように誘導した。これは、到達可能および消耗可能の両方である多分化能ＣＮＳ細胞の最初のヒトの供給源であり、そして出生後の組織から得られたヒト神経球由来の運動ニューロンの最初の報告である。本発明は、免疫学的拒絶を回避する自系細胞に基づく移植療法を提供する。
【０１３４】
ヒトにおいて消耗可能な自系ＮＳＣの供給源を探した。その独特の発生歴ならびにパラガングリオーマおよび神経外胚葉性腫瘍を生成するその性質のために、ＦＴを焦点として選択した。ＦＴは、脊柱の基部にある尾骨に脊髄を固定する脊髄の尾方末端の細長い延長（成体で約１５ｃｍ）である（図１Ａ）。それは、発生初期に胎仔の痕跡尾への神経支配を与えるか、または尾のある脊椎動物において最も尾側の尾分節の一過的な神経支配を与える神経系のレムナントである。初期の段階において、予定運命のＦＴは、三つの追加の脊髄神経節（Ｃ３〜Ｃ５）をもつ分化した脊髄である（図１Ａ）。尾が再吸収される時、ＦＴの細胞は、Ｓｔｒｅｅｔｅｒにより「脱分化」と名付けられたプロセスにより初期の胚段階への逆戻りをうける（図１Ａ、右図）。  その結果は、消失する尾側の点へと狭まり、上衣細胞により裏打ちされ、そして見たところゆるく組織化された線維芽細胞、脂肪細胞、繊毛のない上衣細胞のロゼット、神経芽細胞、ニューロンおよびグリアの収集物で環状に囲まれた中心管を有する、細長い構造物である。この局所的環境は、ＮＳＣを生成する他のＣＮＳ領域の特性の多くを有する。ＦＴは、外科的に接近可能であり、そして脊髄が動作の十分な自由を欠く「係留脊髄症候群」（ＴＣＳ）の例において脊髄上で牽引力を軽減するために、慣例的に外科的に切断される。
【０１３５】
ＦＴ組織は、ヒト胎児および出生後の手術より得た。ＦＴは、選択的に人工中絶された１４週〜２１週齢の胎児から切開した（図１Ｂ）。年齢が６ヶ月から１８歳の出生後組織を、ＴＣＳの神経外科例から得た。組織供給源に関する不明瞭さはなく、全ての外科的ＦＴ試料を硬膜鞘内から取得し、そしてＦＴの同一性を、切除前に臨床的電気生理学を用いて確認した。切片は、３つの出生後のＦＴから作製し、そしてＮＳＣのマーカーのネスチンの存在について試験した。年齢が８ヶ月〜５歳の３つのＦＴ試料の免疫組織化学が、ネスチン＋上衣細胞ならびに分散した神経前駆体細胞の存在を示した。（図１Ｃ）。
【０１３６】
増殖している細胞の浮遊凝集物である神経球を、ＦＴから単離した。組織は、４つの胎児および１７つの出生後ドナーから得た。初代組織は、酵素的に分離し、そして神経球の成長を促進する標準的な条件を用いて培養した。インビトロで３〜４日後（ＤＩＶ）、本発明者らは、胎児の１００％および出生後培養の８２％に神経球を観察した（図１０Ｆ）。その神経球は、細胞の小さい塊としてスタートし、そして直径で約２５μｍから５００μｍ超の球体に成長した。単離した神経球の数は、初代培養物当たり約１から５０を超える神経球で変化し、そしてこの存在量は、ドナーの年齢に依存しなかった。それらの増殖および自己再生の能力を示すため、神経球を成功裏に分離し、そして１０回まで継代し、そして試みた最長の期間である６ヶ月間インビトロで維持した。８つの培養物を凍結し、そして一つを生存能力について試験し、そして成功裏に回復した。
【０１３７】
神経球、ならびにニューロンおよびグリアを生成するそれらの能力を特徴付けるため、神経球を種々の免疫細胞学的マーカーの発現について試験した。免疫細胞化学を単一の神経球で実施し、そして各アッセイについて、神経球は、１以上のドナーに由来した。神経球を、種々の神経の幹細胞（ＮＳＣ）、神経前駆体細胞（ＮＰＣ）、ニューロンのマーカーおよびグリアのマーカーについて試験した。全ての神経球はネスチン＋（ｎ＝１３）（図１０Ａ）であった。より小さい神経球（１００μｍ未満）においては、１００％の細胞がネスチン＋であったが、一方、より大きな神経球においては、中心部はネスチン−のようであった。試験した全ての神経球はまた、ＮＰＣマーカーのビメンチン（ｎ＝３３）、ＣＤ１３３（ｎ＝１８）、Ｏｌｉｇ−２（ｎ＝１７）およびＳｏｘ−２（ｎ＝１７）（図１０Ｂ〜Ｄ）に対して陽性の細胞を含んだ。ＮＰＣ＋細胞の発現パターンおよび割合は、神経球の間で変化した。本発明者らは、神経のタンパク質であるβ−チューブリンＩＩＩを認識するＴｕｊ−１、および星状膠細胞マーカーのＧＦＡＰについて４２の神経球を染色した（図１０Ｅ）。Ｔｕｊ−１＋およびＧＦＡＰ＋細胞は、全ての神経球中に存在した。加えて、各神経球は、両方のマーカーについて陽性のいくらかの細胞を含み、そしてこの二重に陽性の割合は著しく変化した。図１０Ｅで示したように、異なるマーカーを発現する細胞の空間的な塊形成があった。ほとんどの神経球について、塊形成は明白であったが、一方でそのパターンは変化した。
【０１３８】
分化した細胞型を生成する神経球の能力を試験するため、単一の神経球を、５％ウシ胎児血清で増殖因子を置換した上記の培地を用いて、ポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンでコートしたカバーガラス上に平板培養した。その神経球は、年齢が６ヶ月および１２歳の２人のドナーから得た。個々の神経球から得た培養物を、平板培養２〜１０日後に免疫細胞化学を用いて試験した。分化した細胞が、増殖している細胞に由来したことを確認するために、単一の神経球を、トリチウム化したチミジンと８時間インキュベーションした（ｎ＝４）。その神経球をその後、分化させ、そして７日後に試験した。全ての例において、結果として生じるニューロンおよびグリアの顕著な割合（３３〜６３％）が、それらの核に取り込まれた放射性のヌクレオチドを有した（図５Ｃ）。
【０１３９】
培養物を、ニューロンのマーカーであるニューロン特異的エノラーゼ（ｎ＝４）、およびＴｕｊ−１（ｎ＝１９）；星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰ（ｎ＝１１）；乏突起膠細胞マーカーであるＯ１（ｎ＝５）；ならびにＮＰＣマーカーであるビメンチン（ｎ＝９）、ＣＤ１３３（ｎ＝４）、Ｏｌｉｇ−２（ｎ＝３）およびＳｏｘ−２（ｎ＝８）に対する抗体で染色した。各培養物から得た分化した細胞の数は、約５０細胞より少ないから５０００細胞超までの範囲であって、それは平板培養した神経球のサイズと相関した（ｎ＝５０）。各神経球により生成された細胞型の割合には大きな変動性があり、それは神経球のサイズまたはドナーの年齢とは相関しなかった。平板培養の２日後、神経球から得た細胞の７９＋／−８％（ｎ＝８）が、ニューロンのマーカーおよびＧＦＡＰまたはＯ１のどちらかについて二重に染まった（図５Ｂ）。７〜１０日後、二重に染まったものは、２３＋／−９％（ｎ＝７）に減少し、そして培養物の約半分において、ニューロンまたは星状膠細胞のどちらかが優位を占め、神経球の変動する能力を示唆した。分化後１０日でネスチン＋細胞はなかったが（ｎ＝３）、しかしながら細胞の９８％が、ニューロンのマーカーまたはグリアのマーカーに加えてＮＰＣマーカーについて陽性で残り（ｎ＝２１）（図５Ａ）、その細胞が、まだ十分に分化していないことを示した。
【０１４０】
ＦＴは、脊髄の痕跡の部分を示すことから、本発明者らは、ＦＴの神経球が、脊髄の外傷またはＭＮの変成の例における細胞置換ストラテジにおいて用いられ得る、脊髄運動ニューロン（ＭＮ）を生成することが可能かどうかを決定した。ＭＮ前駆体を生成するために、単一の神経球を、２μＭのレチノイン酸および０．４〜１μＭのソニックヘッジホッグタンパク質（Ｓｈｈ−Ｎ）で４〜６日処理した（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．ら、  ２００２．  Ｃｅｌｌ  １１０：３８５−９７）。神経球をその後、５％のウマ血清ならびにＭＮの成長および生存を促進することが公知の３つの神経栄養因子：毛様体由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、および神経膠由来神経栄養因子（Ｚｕｒｎ，Ａ．Ｄ．ら、  １９９６．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ４４：１３３−４１）の存在下で接着基質上で平板培養した。７〜１０日後、各神経球により生成されたＭＮの割合を、ＭＮマーカーのＭｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ−２（ＭＮＲ−２）（Ｊｅｓｓｅｌ，Ｔ．Ｍ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １：２０−９）についての免疫細胞化学を用いて決定した。Ｓｈｈ−Ｎで処理した神経球は２０＋／−１２％のＭＮＲ−２＋細胞（ｎ＝６）を生成し、そしてＳｈｈ−Ｎ濃度を増加させることは、ＭＮの割合に影響しないようだった（図５Ｄ）。興味深いことに、小分子Ｓｈｈ−ＮアゴニストのＨｈ−Ａｇ１．３（１．５μＭ）（Ｆｒａｎｋ−  Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍら、  ２００２．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  １：１０；Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、  ２００４．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１：７１２３−８）を処理に含めた場合、１００％の細胞がＭＮＲ−２を発現し（ｎ＝２）、Ｈｈ−Ａｇ１．３が、ＭＮ分化の誘導において、より有効であり得ることを示唆した。未処理の神経球を３つの神経栄養因子と平板培養した場合（ｎ＝４）、本発明者らは、５〜５０％のＭＮＲ２＋細胞、および血清単独において平板培養した２／３の未処理神経球が陽性細胞を生じたことを検出し（１％および４０％）、いくらかの神経球は、加えられた因子の非存在下でＭＮを生成し得ることを示唆した。ＭＮの同一性を確認するため、本発明者らは追加のＭＮマーカーについて試験した：Ｌｉｍ−３（ｎ＝３）、Ｉｓｌｅｔ−１（ｎ＝１）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｎ＝２）（図５Ｅ）（Ｏｄａ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｉ．  ２０００．  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  １５，８２５−３４；Ａｒｂｅｒ，Ｓ．ら、１９９９．  Ｎｅｕｒｏｎ  ２３，６５９−７４；Ｐｆａｆｆ，Ｓ．  Ｌ．ら、１９９６．  Ｃｅｌｌ  ８４，３０９−２０；Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、  １９９４．  Ｃｅｌｌ  ７９，９５７−７０）。全ての例において、その結果は、染まった細胞の割合に関して、ＭＮＲ−２についての結果と類似した。さらに４／４の神経球は、ＲＴ／ＰＣＲ（Ｐｆａｆｆ，Ｓ．Ｌ．ら、  １９９６．  Ｃｅｌｌ  ８４：３０９−２０）により決定されたように体細胞の運動ニューロンによって選択的に発現されるホメオボックスタンパク質のＨｏｍｅｏｂｏｘ−９を発現した。
【０１４１】
免疫細胞化学の基準によりＭＮとして特徴付けられた細胞が、筋肉を刺激することが可能であるか決定するため、神経球を出生後ラット由来の横紋筋培養物に加えた。神経球を、上述のようにレチノイン酸およびＳｈｈ−Ｎで処理し、そしてその後、単一の神経球を各筋肉培養物に加えた。同時培養中のニューロンが、平板培養した神経球に由来したか決定するため、４つの神経球を、平板培養の前に脂肪親和性カルボシアニン色素のＤｉＤで２．５時間プレインキュベーションした。全ての例において、本発明者らは、ニューロンの形態学的な特徴を有するＤｉＤ＋細胞を検出した。位相差顕微鏡法により、または神経球の付加なしに筋肉培養物におけるＴｕｊ−１染色により検出できるニューロンはなかった（ｎ＝１２）。神経球と６〜２１日の同時培養後、神経筋接合部でのニコチン酸アセチルコリンレセプターの塊形成を検出するために、培養物を、蛍光α−アマガサヘビ毒素とインキュベートした。全ての同時培養物は、この基準による神経筋接合部の証拠を示した（ｎ＝１８）。図１１Ｂは、神経筋接合部および刺激を与えるニューロンを示すために、α−アマガサヘビ毒素およびＴｕｊ−１の両方について染色した培養物を示す。筋繊維のみを含む対照培養物は、神経筋接合部を含まなかった（ｎ＝１２）。
【０１４２】
ほとんどのＦＴは、ＴＣＳの外科的試料から得たが、実質的に区別できない結果を、中絶した胎児由来のＦＴをもちいて、および出生後のラット由来のＦＴでの広範囲な実験から得た。これらの結果は、ＦＴ中の多分化能細胞の存在が、正常の条件を反映することを示す。ＦＴは、神経系の外傷または変性の例における使用のための、自系の、消耗可能な、到達可能な多分化能細胞の供給源である。年齢が１８歳までのドナーからの、これらの細胞の単離および分化は、それらが成人期まで持続することを示す。
【０１４３】
ＨｕＦＴからの神経球の単離および分化
ヒト胎児組織（１４〜２１週齢）を、ヒト小児組織でと同じように、氷冷したＨａｎｋｓ緩衝液中で切開した（図１ｂ）。その組織をＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１、Ｇｉｂｃｏ）中で、ＩＩ型コラゲナーゼ  １００Ｕ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ）で分散し、そして標準的な幹細胞培地のＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％  Ｎ２処方物（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）  ｂＧＦＧ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．ら、  １９９６．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６，７５９９−６０９）中で維持した。２〜４週毎に、神経球を、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での分離後継代した。神経球の分化を、増殖因子の除去、培地への５〜１０％血清の付加およびポリリジンおよび／またはラミニンでコートしたカバーガラスでの平板培養により誘導した。ＭＮへの分化のために、神経球をＲＡ（２ｕＭ、Ｓｉｇｍａ）および０．４〜１μＭのＳｈｈ−Ｎ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）または１．５μＭのＨｈ−Ａｇ１．３（Ｃｕｒｉｓ）で４〜６日で処理し、その後、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニンおよびコラーゲンでコートしたカバーガラス上で、ＢＤＮＦ、  ＣＮＴＦおよびＧＤＮＦ（Ｓｉｇｍａ）を含む神経基本培地（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．ら、  ２００２．  Ｃｅｌｌ  １１０，３８５−９７）中で７〜１０日間、平板培養した。
【０１４４】
他の実施形態
本発明をその詳細な明細とともに記載したが、先述の明細は説明を意図するものであって、付録の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を制限するものではない。多の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
0005559680.tif 000006
【図２Ａ】
0005559680.tif 000007
【図２Ｂ】
0005559680.tif 000008
【図３Ａ】
0005559680.tif 000009
【図３Ｂ】
0005559680.tif 000010
【図３Ｃ】
0005559680.tif 000011
【図３Ｄ】
0005559680.tif 000012
【図４Ａ】
0005559680.tif 000013
【図４Ｂ】
0005559680.tif 000014
【図４Ｃ】
0005559680.tif 000015
【図４Ｄ】
0005559680.tif 000016
【図５】
0005559680.tif 000017
【図６】
0005559680.tif 000018
【図７ａ】
0005559680.tif 000019
【図７ｂ】
0005559680.tif 000020
【図７ｃ】
0005559680.tif 000021
【図７ｄ】
0005559680.tif 000022
【図７ｅ】
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【図８ａ】
0005559680.tif 000024
【図８ｂ】
0005559680.tif 000025
【図８ｃ】
0005559680.tif 000026
【図８ｄ】
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【図８ｅ】
0005559680.tif 000028
【図８ｆ】
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【図９】
0005559680.tif 000030
【図１０】
0005559680.tif 000031
【図１１】
0005559680.tif 000032
【図１２】
0005559680.tif 000033
【図１３】
0005559680.tif 000034