(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンジェンシャルフロー濾過によって免疫グロブリン溶液を濃縮する方法であって、
ａ）濃縮される溶液１mlあたり３０mgまでの免疫グロブリンの濃度範囲において、１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフロー、
ｂ）１５mg／ml〜５５mg／mlの濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフロー、
ｃ）４５mg／mlを超える濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフロー
で、膜間圧およびクロスフローが変化し、
濃縮される溶液中の実際の免疫グロブリン濃度が、適用される膜間圧およびクロスフローを決定し、膜間圧およびクロスフローを、免疫グロブリンの実際の濃度に応じて調整することを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｃ）における濃度範囲が、４５mg／ml〜１３０mg／mlであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
膜間圧およびクロスフローが、
工程ａ）において１．５バールおよび８０ml／分、
工程ｂ）において、０．８５バールおよび１５０ml／分、および／または
工程ｃ）において０．８５バールおよび１３０ml／分
であることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
ａ）異種免疫グロブリンをコードする１以上の核酸を含む組換え哺乳動物細胞を提供し、
ｂ）前記細胞を異種免疫グロブリンの発現に適した条件下で培養し、
ｃ）異種免疫グロブリンを組換え哺乳動物細胞または培地から回収し、
ｄ）変化する膜間圧およびクロスフローを用いたタンジェンシャルフロー濾過を用いて、異種免疫グロブリンを含む得られた水性、緩衝溶液を濃縮する
を含み、
工程ｄ）が、
ｉ）濃縮される溶液１mlあたり３０mgまでの免疫グロブリンの濃度範囲において、１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフロー、
ｉｉ）１５mg／ml〜５５mg／mlの濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフロー、
ｉｉｉ）４５mg／mlを超える濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフロー
で膜間圧およびクロスフローが変化するタンジェンシャルフロー濾過を用いて、得られた水性、緩衝溶液を濃縮することを含み、
濃縮される水性、緩衝溶液中の実際の異種免疫グロブリン濃度が、適用される膜間圧およびクロスフローを決定し、膜間圧およびクロスフローを、異種免疫グロブリンの実際の濃度に応じて調整することを特徴とする異種免疫グロブリンを産生する方法。
【請求項５】
工程ｄ）の前または後に：
ｅ）異種免疫グロブリンを含む水性、緩衝溶液を精製する工程
を含むことを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
異種免疫グロブリンが、完全免疫グロブリン、または免疫グロブリンフラグメント、または免疫グロブリン複合体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｓｐ２／０細胞、またはＰＥｓＲ．Ｃ６（登録商標）細胞であることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
タンジェンシャルフロー濾過が、２０〜５０kDaの範囲の分子量カットオフ値を有する膜を使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリン溶液が、ｐＨ３．０〜ｐＨ１０．０のｐＨ値を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨ値が、ｐＨ３．０〜ｐＨ７．０の範囲である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
方法が、可変的タンジェンシャルフロー濾過法であって、濃縮される溶液中の免疫グロブリンの実際の濃度が、適用される膜間圧およびクロスフローを決定することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
膜間圧およびクロスフローを重複する濃度範囲での任意の濃度値で変えることができることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
濃度範囲が、工程ａ）においては５〜２５mg／mlであり、工程ｂ）においては２５〜５０mg／mlであり、工程ｃ）においては５０〜１４０mg／mlであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質濃縮の分野であり、さらに詳細には、免疫グロブリン濃縮のためのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質および特に免疫グロブリンは、今日の医薬製品において重要な役割を果たしている。組換えポリペプチドを産生するための発現系は、現在の技術水準で周知であり、たとえば、Marino, M. H., Biopharm. 2(1989)18-33;Goeddel, D.V., et al, Methods Enzymol. 185(1990)3-7;Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10(1999)156-159によって記載されている。薬学的用途において使用されるポリペプチドは、主に、哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などにおいて産生される。
【０００３】
人間へ応用するためには、すべての薬学的物質は明確な基準を満たさなければならない。生物医薬製剤の人間に対する安全性を保証するために、たとえば、重大な危害をもたらすであろう核酸、ウイルス、および宿主細胞タンパク質を除去しなければならない。規制仕様を満たすために、製造プロセスの後に１以上の精製工程をおこなわなければならない。特に、適切な精製プロセスの決定において、純度、スループット、および収率が重要な役割を果たす。
【０００４】
その化学的および物理的特性、たとえば分子量および二次修飾などのドメイン構造のために、免疫グロブリンの後処理プロセスは非常に複雑である。たとえば、調合された薬剤だけでなく、後処理プロセス（ＤＳＰ）における中間体についても、経済的な処理および貯蔵用途に適した低用量を得るため濃縮溶液が必要とされる。さらに、スムーズな処理および短時間の操作を保証するためには、短い濃縮時間が好ましい。これに関連して、不完全なＴＦＦプロセスは、特に最終精製工程後に、持続的な損傷を引き起こし、さらには薬剤製品にも影響を及ぼす。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）中間体溶液のタンジェンシャルフロー濃縮プロセスにおける剪断応力と凝集との間の相関が、Ahrer, K., et al.によって研究された(J. Membr. Sci. 274(2006)108-115)。濃縮時間ならびに選択された流れおよび圧力の、プロセス性能および凝集状態に対する影響がモニタリングされた（たとえば、Dosmar, M., et al., Bioprocess Int. 3(2005)40-50;Luo, R., et al., Bioprocess Int. 4(2006)44-46を参照）。
【０００５】
Mahler, H.-Cら(Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 59(2005)407-417)は、異なる撹拌ストレス法によって形成される液状ＩｇＧｌ抗体配合物における凝集物の誘導および分析を報告した。ＵＳ６，２５２，０５５において、濃縮モノクローナル抗体調製物が報告されている。濃縮抗体調製物を生成する方法は、ＵＳ２００６／０１８２７４０で報告されている。限外濾過、ダイアフィルトレーション、および第２の限外濾過シークエンスを包含する複合プロセスが、ＵＳ２００６／００５１３４７において報告されている。ＥＰ０９０７３７８において、２５０ml／分の一定再循環速度でクロスフロー限外濾過を用いて抗体調製物を濃縮するプロセスが報告されている。タンジェンシャルフロー濾過の方法およびその装置は、したがって、ＵＳ２００４／０１６７３２０で報告されている。ＷＯ９７／４５１４０において、濃縮抗体溶液が報告されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、組換えにより産生される免疫グロブリンを含む溶液を濃縮するための方法を提供する。
【０００７】
さらに詳細には、本発明の一態様は、タンジェンシャルフロー濾過によって免疫グロブリン溶液を濃縮する方法であり、この方法において、適用される膜間圧およびクロスフローは、次のように変化し得る：
ａ）濃縮される溶液１mlあたり３０mgまでの免疫グロブリン濃度範囲において、１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフロー、
ｂ）１５mg／mlから最高５５mg／mlまでの濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフロー、ならびに
ｃ）４５mg／mlを超える濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフロー。
【０００８】
一つの態様において、工程ｃ）における濃度範囲は、５０mg／ml〜２７５mg／mlである。好適な態様において、工程ｃ）での濃度範囲は、５０mg／ml〜１８０mg／mlである。さらに好適な態様において、工程ｃ）での濃度範囲は、５０mg／ml〜１３０mg／mlである。もう一つの態様において、膜間圧およびクロスフローは、工程ａ）において１．５バールおよび８０ml／分、工程ｂ）において０．８５バールおよび１５０ml／分、および／または工程ｃ）において０．８５バールおよび１３０ml／分である。もう一つの態様において、免疫グロブリン溶液は緩衝、水性免疫グロブリン溶液である。
【０００９】
本発明のもう一つ別の態様は、次の工程：
ａ）異種免疫グロブリンをコードする１以上の核酸を含む組換え哺乳動物細胞を提供し、
ｂ）異種免疫グロブリンの発現に適した条件下で、工程ａ）の細胞を培養し、
ｃ）組換え哺乳動物細胞または培地から異種免疫グロブリンを回収し、
ｄ）可変的膜間圧およびクロスフローでタンジェンシャルフロー濾過を用いて、異種免疫グロブリンを含む得られた水性、緩衝溶液を濃縮する
をこの順序で含む、異種免疫グロブリンを産生する方法である。
【００１０】
一つの態様において、この方法の工程ｄ）は、
ｉ）濃縮される溶液１mlあたり３０mgまでの免疫グロブリンの濃度範囲において、１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフロー、
ｉｉ）１５mg／ml〜５５mg／mlの濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフロー、ならびに
ｉｉｉ）４５mg／mlを超える濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフロー
で変化し得る膜間圧およびクロスフローでタンジェンシャルフロー濾過を用いて、得られた水性、緩衝溶液を濃縮することを含む。
【００１１】
もう一つの態様において、方法は、工程ｄ）の前または工程ｄ）の後に次の工程：
ｅ）異種免疫グロブリンを含む水性、緩衝溶液を精製する
を含む。
【００１２】
もう一つの態様において、異種免疫グロブリンは、完全免疫グロブリン、または免疫グロブリンフラグメント、または免疫グロブリン複合体である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫グロブリン溶液を１００mg／mlを超える濃度まで濃縮する方法を記載する。驚くべきことに、本発明の方法を用いて、凝集物の形成が少なく、短時間でこれを達成できることが判明した。
【００１４】
「タンジェンシャルフロー濾過」または「ＴＦＦ」という用語は、本発明では交換可能に用いられ、濃縮されるポリペプチドを含む溶液が、濾過膜の表面にそって、すなわち接線方向に流れる濾過プロセスを意味する。濾過膜は、あるカットオフ値の孔サイズを有する。一つの態様において、カットオフ値は、２０kDa〜５０kDaの範囲、好ましくは３０kDaである。この濾過プロセスは、限外濾過プロセスの一種である。「クロスフロー」という用語は、膜に対して接線方向の、濃縮される溶液の流れ（未透過流）を意味する。「流束」または「透過流」という用語は、本発明では交換可能に用いることができ、膜を横切る、すなわち膜の孔を通過する流体の流れを意味する。すなわち、膜を通過する透過物の容積流量を意味する。流れは、通常、リットル／ｍ２／ｈ（ＬＭＨ）のように単位膜面積あたり単位時間あたりの容積で記載される。一つの態様において、クロスフローは、０．０２ｍ２の膜面積についてのml／分で表されることを特徴とする。もう一つの態様において、クロスフローは、各工程で、２４０ｌ／ｍ２／ｈ、４５０ｌ／ｍ２／ｈ、および３９０ｌ／ｍ２／ｈである。透過物は、濃縮される溶液の溶媒ならびに用いられる膜のカットオフ値に満たない分子量を有する分子を含むが、異種免疫グロブリンは含まない。「膜間圧」または「ＴＭＰ」という用語は、本発明では交換可能に使用することができ、溶媒および濾過膜のカットオフ値よりも小さな成分に、濾過膜の孔を通過させるために加えられる圧力を意味する。膜間圧は、入口、出口、および透過物の平均圧力であり、次のようにして計算できる：
【数１】
0005432137.tif 000002
【００１５】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認められている免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）２ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）または二重特異性抗体をはじめとする様々な形式で存在し得る（たとえば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883;Bird, R.E., et al., Science 242(1988)423-426;一般に, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition(1984);およびHunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323(1986)15-16）。
【００１６】
「完全免疫グロブリン」という用語は、２つのいわゆる軽免疫グロブリン鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重免疫グロブリン鎖ポリペプチド（重鎖）を含む免疫グロブリンを意味する。完全免疫グロブリンの重および軽免疫グロブリン鎖ポリペプチドのそれぞれは、抗原と相互作用できる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。完全免疫グロブリンの重および軽免疫グロブリン鎖ポリペプチドのそれぞれは、定常領域（一般的にカルボキシル末端部分）も含む。重鎖の定常領域は、ｉ）Ｆｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）を有する細胞、たとえば食細胞、またはｉｉ）新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）（Ｂｒａｍｂｅｌｌレセプターとしても知られる）を有する細胞に対する抗体の結合に関与する。これはまた、成分（Ｃ１ｑ）などの伝統的な補体系の因子をはじめとするいくつかの因子との結合にも関与する。免疫グロブリンの軽または重鎖の可変ドメインは、こんどは異なるセグメント、すなわち４個のフレームワーク領域（ＦＲ）および３個の超可変領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１７】
「免疫グロブリンフラグメント」という用語は、重鎖の可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、軽鎖の可変ドメインまたはＣＬドメインの少なくとも１個のドメインを含むポリペプチドを意味する。また、それらの誘導体および変異体も含まれる。たとえば、１以上のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在してもよい。
【００１８】
「免疫グロブリン複合体」という用語は、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドと共役した免疫グロブリン重鎖または軽鎖の少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを意味する。さらなるポリペプチドは、非免疫グロブリンペプチド、たとえばホルモン、または成長レセプター、または抗融合性（ａｎｔｉｆｕｓｏｇeｎｉｃ）ペプチド、または補体因子などである。
【００１９】
一般的なクロマトグラフ法およびその使用は、当業者には既知である。たとえば、Chromatography,5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York,(1992);Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands,(1998);Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York,(1991);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982);Sambrook, J., et al.(ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989;またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al.(eds), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。
【００２０】
組換えによって産生された異種免疫グロブリンの精製のために、多くの場合、異なるカラムクロマトグラフィーの工程の組み合わせを用いる。一般的にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後に、１または２の追加の分離工程を行う。最終精製工程は、凝集した免疫グロブリン、残存ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）、ＤＮＡ（宿主細胞核酸）、ウイルス、または内毒素などの微量の不純物および汚染物質を除去するための、いわゆる「ポリッシング工程」である。このポリッシング工程に関して、しばしば、フロースルーモードでアニオン交換物質を使用する。
【００２１】
様々な方法、たとえば微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえばカチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、硫黄親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）吸着（たとえばベータ−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドを使用）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（たとえばフェニル−セファロース、アザ−アレーン親和性（ａｒｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸を使用）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（たとえばＮｉ（ＩＩ）親和性材料およびＣｕ（ＩＩ）親和性材料を使用）、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに電気泳動法（たとえばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動法）（Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102）も十分に確立され、タンパク質回収および精製のために広く使用されている。
【００２２】
「異種免疫グロブリン」という用語は、哺乳動物細胞により自然に産生されない免疫グロブリンを意味する。本発明の方法に従って産生される免疫グロブリンは、組換え法によって産生される。このような方法は、現在の技術において広く知られており、真核細胞においてタンパク質を発現し、それに続いて異種免疫グロブリンを回収および単離し、そして通常は薬学的に許容される純度まで精製することを含む。免疫グロブリンの産生、すなわち発現に関して、軽鎖をコードする核酸および重鎖をコードする核酸を標準的方法によりそれぞれ発現カセット中に挿入する。免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードする核酸は、通常の手順を用いて容易に単離し、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このような核酸の供給源として機能し得る。発現カセットを発現プラスミド中に挿入することができ、この発現プラスミドを次いで宿主細胞中にトランスフェクトし、宿主細胞は、そうでなければ方法では免疫グロブリンを産生しない。発現は、適切な原核または真核宿主細胞において行われ、免疫グロブリンを、溶解後の細胞から、または培養上清から回収する。
【００２３】
本出願において用いられる「免疫グロブリン溶液」という用語は、完全免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、または免疫グロブリン複合体を含む水性、緩衝溶液を意味する。この溶液は、たとえば培養上清、またはカラムクロマトグラフィー溶出液、またはポリッシュされた免疫グロブリン溶液であってよい。
【００２４】
「異種ＤＮＡ」または「異種ポリペプチド」とは、与えられる宿主細胞内で自然に存在しないＤＮＡ分子もしくはポリペプチド、またはＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団を意味する。特定の宿主細胞に対して異種であるＤＮＡ分子は、この宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち外来性ＤＮＡ）と結合しているならば、宿主細胞種由来のＤＮＡ（すなわち内在性ＤＮＡ）を含み得る。たとえば、プロモーターを含む宿主ＤＮＡ断片と作用可能に結合したポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。反対に、異種ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターと作用可能に結合した内在性構造遺伝子を含むことができる。非宿主ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００２５】
「異種免疫グロブリンの発現に適した条件下」という用語は、免疫グロブリンを発現する哺乳動物細胞の培養に使用され、当業者に知られているか、または当業者が容易に決定できる条件を意味する。これらの条件が、培養される哺乳動物細胞の種類および発現される免疫グロブリンの種類によって変わり得ることも当業者に知られている。一般的に、哺乳動物細胞を、２０℃〜４０℃の温度で、免疫グロブリンの有効なタンパク質産生を可能にするために十分な時間、たとえば４日〜２８日の期間で培養する。
【００２６】
「組換え哺乳動物細胞」という用語は、たとえば、異種ポリペプチドをコードする核酸がその中に存在し得るか、または導入／トランスフェクトされる細胞を意味する。「細胞」という用語は、核酸の発現に使用される細胞を包含する。一つの態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞（たとえばＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４）、またはＢＨＫ細胞、またはＮＳ０細胞、またはＳＰ２／０細胞、またはＨＥＫ２９３細胞、またはＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、またはＣＯＳ細胞である。好適な態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞、またはＨＥＫ細胞、またはＳｐ２／０細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。本明細書において用いる場合、「細胞」という表現は、対象の細胞およびその子孫を包含する。したがって、「組換え細胞」という用語は、最初にトランスフェクトされた細胞および移転回数に関係なくこれから誘導される子孫細胞を含む培養物を包含する。また、意図的または偶発的突然変異のために、全ての子孫は、ＤＮＡ含量が正確に同じでなくてもよいと理解される。初代形質転換細胞と同じ機能または生物活性を有する様々な子孫が含まれる。
【００２７】
本出願内で用いられる「緩衝された」という用語は、酸性もしくは塩基性物質の添加または放出によるｐＨ変化が、緩衝物質によって平らになった溶液を意味する。このような効果をもたらす任意の緩衝物質を使用できる。一つの態様において、薬学的に許容される緩衝物質、たとえばリン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリンもしくはその塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸もしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）もしくはその塩を使用する。好適な態様において、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩、またはヒスチジンもしくはその塩である。場合によって、緩衝溶液は、さらなる塩、たとえば塩化ナトリウム、および／または硫酸ナトリウム、および／または塩化カリウム、および／または硫酸カリウム、および／またはクエン酸ナトリウム、および／またはクエン酸カリウム含むことができる。本発明の一つの態様において、緩衝水性溶液のｐＨ値は、ｐＨ３．０〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ７．０、さらに好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０、最も好適にはｐＨ４．５〜ｐＨ５．５である。
【００２８】
濾過プロセス中で膜間圧およびクロスフローが変化し得、濃縮される溶液中の実際の免疫グロブリン濃度に応じて適用される本発明のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）法を用いて、凝集物の形成が少ない濃縮免疫グロブリン溶液を短時間で得ることができることが驚くべきことに判明した。すなわち、本発明のＴＦＦ法、すなわち、濾過プロセス中で、膜間圧が変化し、実際の抗体溶液濃度にしたがって適応する方法が適用される場合、驚くべきことに、タンジェンシャルフロー濾過中の凝集物形成が少ないことが判明した。本発明の方法は、当該分野において既知の定常的方法、すなわち、濾過プロセスの前に膜間圧が採用され、タンジェンシャルフロー濾過プロセスの間中、一定に保持される方法と比べて、可変的方法である。
【００２９】
本発明は、タンジェンシャルフロー濾過によって免疫グロブリン溶液を濃縮する方法を含み、この方法では、適用される膜間圧およびクロスフローは可変的であり、濃縮免疫グロブリン溶液中の免疫グロブリン濃度に応じて濾過プロセス中に変化し、これによって
ａ）１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフローが、濃縮される溶液１mlあたり３０mgまでの免疫グロブリンの濃度範囲で適用され、
ｂ）０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフローが、１５mg／ml〜５５mg／mlの濃度範囲で適用され、そして
ｃ）０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフローが、４５mg／mlを超える濃度範囲で適用される。
【００３０】
ＴＦＦにおける剪断応力とＴＦＦと凝集物形成との間に相関関係が存在する。効果を評価するために、使用する膜表面上の流動誘起剪断応力τｗを、次式
【数２】
0005432137.tif 000003
（式中、ｄＨは
【数３】
0005432137.tif 000004
である）を用い、Gerhartら(Fundamentals of Fluid Mechanics, Addison-Wesley Publishing Company(1993))およびCheryanら(Ultrafiltration and Microfiltration Handbook, second edition CRC Press LLC(1998)）に基づいて計算した。この式において、ｄＨは水圧直径であり、ａは流路の幅であり、ｂは流路の高さであり、Ｌは流路の長さである。さらに、Δｐ＝ｐｉ−ｐｏであり、ここでｐｉは加えられた入口圧であり、ｐ０は出口圧である。一例において、再生セルロースからなり、３０kDaの表示分子量カットオフおよび０．０２ｍ２の膜面積を有するＨｙｄｒｏｓａｒｔ（商標）膜（Sartorius AG, Gottingen, GermanyのSartocon Slice 200 Hydrosart（商標））を使用した。使用した膜カセットについて、１．０８mmの水圧直径が算出された。膜をまず標準的ＴＦＦ法で、すなわち、濃縮プロセス中の膜間圧およびクロスフローを変えずに、作動させた。３つの異なる定常的方法（事前に設定された一定のΔｐおよび事前に設定された一定の膜間圧（ＴＭＰ）０．６バールを使用）を分析した。
【００３１】
表１：加えられた圧力差および対応する剪断応力の概要
【表１】
0005432137.tif 000005
【００３２】
流束対増加するタンパク質濃度を観察すると、異なるΔｐでプロセスの曲線において有意な差はない。しかし、３バールモードでは、高い入口圧のために、低い最終濃度が観察された。低い一定のクロスフロー（ＣＦ；９０ml／分）および低い平均Δｐ（約０．９バール）下で実施された濃縮モードと比較して、１．２〜１．８バールの高いΔｐは、時間とともに改善される流束性能および高い最終濃度（ＴＭＰは常に０．６バール）の一因となる。
【００３３】
濃縮プロセスの前後で、濁度、光遮蔽（ＬＯ）、および動的光散乱（ＤＬＳ）データを比較することにより、剪断応力が増加するにつれ、凝集物形成の増加が見られた（図２）。
【００３４】
ＴＭＰ／ＣＦスカウト（ｓｃｏｕｔｉｎｇ）実験に基づいて、応力を与える高入口圧力モード（Δｐ＝３バール）と比較して匹敵するプロセス時間のＴＦＦ法を開発した（たとえばLuo, R., et al., Bioprocess Int. 4(2006)44-54を参照）。本発明の方法は、免疫グロブリン凝集物形成を減少させ流束を経時的に改善するために、すなわち、低凝集物形成と短い全体的な濃縮時間とを組み合わせるために開発された。本発明の方法の開発中に、濃縮される免疫グロブリン溶液中の主な免疫グロブリン濃度に応じて、ＴＭＰおよびＣＦスカウトを実施した。与えられる濃度での最良の流束特性に依存して採用されるＴＭＰおよびＣＦを用いる方法が見いだされた。濃縮の最終段階での高い入口圧力の不都合がなく（たとえばDosmar, M., et al., Bioprocess Int. 3(2005)40-50を参照）、本発明の方法は、生成した濃縮物の濁度、ＬＯ、およびＤＬＳデータにおいて低い凝集負荷を示した（図３および４参照）。加えて、本発明の方法を用いて、さらに高い最終濃度が達成された。
【００３５】
本発明の方法において、膜間圧およびクロスフローは、濃縮免疫グロブリン溶液の実際の濃度に関して変化する。一つの態様において、本発明の方法は、可変的タンジェンシャルフロー濾過法であり、この方法では、濃縮される溶液中の実際の免疫グロブリン濃度が、適用される膜間圧およびクロスフローを決定する。したがって、加えられる応力を減少させ、かくして凝集免疫グロブリン分子の形成を減少させ、短い全体的な濃縮時間を提供するために、膜間圧およびクロスフローを、免疫グロブリンの実際の濃度に応じて調整する。
【００３６】
本発明の方法において、３つの濃度範囲が規定される。濃縮される溶液の第１の実際の濃度範囲は、０mg／ml〜３０mg／mlであり、第２の実際の濃度範囲は１５mg／ml〜５５mg／mlであり、第３の実際の濃度範囲は４５mg／ml〜１８０mg／mlである。明らかなように、これらの濃度範囲は重複する範囲である。１５mg／ml〜３０mg／mlおよび４５mg／ml〜５５mg／mlの重複する濃度範囲において、膜間圧およびクロスフローについて異なる値を本発明の方法において使用できることが判明している。これらの重複する濃度範囲において、２つのＴＭＰおよびＣＦ設定のうちのいずれかを、凝集物形成またはプロセス時間に対して顕著な影響を及ぼすことなく適用することができる。
【００３７】
このように、本発明の方法の一つの態様において、ａ）〜ｂ）、およびｂ）〜ｃ）の条件は、重複する濃度範囲の任意の濃度で変えることができる。
【００３８】
一つの態様において、工程ｃ）における濃度範囲は、５０mg／ml〜２７５mg／mlである。もう一つの態様において、膜間圧およびクロスフローは、工程ａ）で１．５バールおよび８０ml／分であり、工程ｂ）で０．８５バールおよび１５０ml／分であり、および／または工程ｃ）で０．８５バールおよび１３０ml／分である。もう一つの態様において、免疫グロブリン溶液は、緩衝、水性免疫グロブリン溶液である。一つの態様において、濃度範囲は、工程ａ）で５〜２５mg／mlであり、工程ｂ）で２５〜５０mg／mlであり、工程ｃ）で５０〜１４０mg／mlである。
【００３９】
本発明のもう一つの態様は、以下の工程を以下の順で含む異種免疫グロブリンの産生方法である：
ａ）異種免疫グロブリンをコードする１以上の核酸を含む組換え哺乳動物細胞を提供し、
ｂ）哺乳動物細胞を異種免疫グロブリンの発現に適した条件下で培養し、
ｃ）異種免疫グロブリンを組換え哺乳動物細胞または培地から水性、緩衝溶液として回収し、
ｄ）膜間圧およびクロスフローに依存して免疫グロブリン濃度が変化し得るタンジェンシャルフロー濾過を用いて、異種免疫グロブリンを含む得られた水性、緩衝溶液を濃縮する。
【００４０】
本発明の産生方法の一つの態様において、
ｉ）濃縮される溶液１mlあたり３０mgまでの濃度範囲において、１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフロー、
ｉｉ）１５mg／ml〜５５mg／mlの濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフロー、および
ｉｉｉ）４５mg／mlを超える濃度範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフロー
のように膜間圧およびクロスフローに応じて免疫グロブリン濃度が変わり得るタンジェンシャルフロー濾過を用いて、得られた水性、緩衝溶液を濃縮する工程ｄ）を含む。
【００４１】
もう一つの態様において、方法は、工程ｄ）に先だって、すなわち工程ｄ）の前、または後に、次の工程：
ｅ）異種免疫グロブリンを含む水性、緩衝溶液を精製する工程
を含む。
【００４２】
工程ｅ）における精製は、様々な方法および技術、たとえば、クロマトグラフィー工程、または異なるか、もしくは類似したクロマトグラフィー工程の組み合わせ、または沈降、または塩析、または限外濾過、またはダイアフィルトレーション、または凍結乾燥、または緩衝液変更、またはこれらの組み合わせなどによってであり得る。
【００４３】
もう一つの態様において、異種免疫グロブリンは、完全免疫グロブリン、または免疫グロブリンフラグメント、または免疫グロブリン複合体である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。好適な態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞、またはＨＥＫ細胞、またはＳｐ２／０細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【００４４】
本発明の理解を助けるために以下の実施例および図面を提供し、本発明の真の範囲を添付の請求の範囲に記載する。本発明の本質を逸脱することなく、記載された手順に修正を行うことができると理解される。
【００４５】
抗ＩＬ−ＩＲ抗体（たとえばＷＯ２００５／０２３８７２を参照）および抗Ｐ−セレクチン抗体（たとえばＷＯ２００５／１００４０２を参照）は、本発明者らの実験室において、発明の時点で十分な量で利用可能であったので、本発明をこれら２種の免疫グロブリンを用いて説明する。同様に、本発明は一般的に任意の免疫グロブリンを用いて実施可能である。この例示された記載は、例示のみのためであり、本発明をなんら制限しない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】異なる一定Δｐモードおよび９０ml／分の一定のＣＦ下での濃縮法の膜をフラッシュする前の、抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の流束対タンパク質濃度。１：定常的方法  Δｐ＝１．２バール、２：定常的方法  Δｐ＝１．８バール、３：定常的方法  Δｐ＝３．０バール、４：定常的方法  ＣＦ９０ml／分
【図２】定常的方法を用いた抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の濃縮前および濃縮後の粒子数。１：濃縮前、２：τｗ＝２１６、３：τｗ＝３２４、４：τｗ＝５４１。
【図３】異なる方法を用いた濃縮前および濃縮後の抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の粒子数の比較。１：濃縮前、２：本発明の可変的方法、３：定常的方法  ＣＦ９０ml／分、４：τｗ＝５４１。
【図４】抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の流束対タンパク質濃度。１：定常的方法  ＣＦ＝９０ml／分、２：τｗ＝５４１、３：本発明の可変的方法。
【図５】５０ml／分（●）、８０ml／分（▲）、および１３０ml／分（■）のクロスフローについて、５．３mg／mlのタンパク質濃度での抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の膜貫通流束対膜間圧。
【図６】８０ml／分（●）、１３０ml／分（▲）、および１５０ml／分（■）のクロスフローについて、４５mg／mlのタンパク質濃度での抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の膜貫通流束対膜間圧。
【図７】５０ml／分（●）、８０ml／分（▲）、および１３０ml／分（■）でのクロスフローについて、９０mg／mlのタンパク質濃度での抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の膜貫通流束対膜間圧。
【図８】５０ml／分（●）、８０ml／分（▲）、および１３０ml／分（■）でのクロスフローについて、１８０mg／mlのタンパク質濃度での抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液の膜貫通流束対膜間圧。
【図９】異なる方法によって得られるクエン酸緩衝液中抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液濃縮物の粒子分析。１：濃縮前、２：本発明の可変的方法、３：定常的方法  ＣＦ９０ml／分、４：定常的方法  Δｐ＝１．８バール、５：定常的方法  Δｐ＝３．０バール。
【図１０】異なる方法によって得られるクエン酸緩衝液中抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液濃縮物の動的光散乱分析。◆：濃縮前、■：本発明の可変的方法、▲：定常的方法ＣＦ  ９０ml／分、●：定常的方法  ΔＰ＝１．８バール。
【図１１】異なる方法によって得られるクエン酸緩衝液中抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液濃縮物の濁度測定。１：濃縮前、２：本発明の可変的方法、３：定常的方法  ＣＦ＝９０ml／分、４：定常的方法  Δｐ＝１．８バール、５：定常的方法Δｐ＝３．０バール。
【図１２】本発明の方法および異なる緩衝液を用いる定常的方法を用いて得られる抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液濃縮物の濁度測定。１：クエン酸緩衝液中での濃縮前、２：クエン酸緩衝液を用いる本発明の可変的方法、３：定常的方法  Δｐ＝３．０バール（クエン酸緩衝液を使用）、４：ヒスチジン緩衝液中での濃縮前、５：ヒスチジン緩衝液を用いた本発明の可変的方法、６：定常的方法  Δｐ＝３．０バール（ヒスチジン緩衝液を使用）。
【図１３】異なる方法によって得られ、以下の異なる緩衝液中で得られる濃縮物の動的散乱光分析：ａ）クエン酸緩衝液中抗ＩＬ−ＩＲ抗体（◆：濃縮前、■：本発明の可変的方法を用いた濃縮後、▲：定常的方法  Δｐ＝１．８バール）、ｂ）ヒスチジン緩衝液中抗ＩＬ−ＩＲ抗体（◆：濃縮前、■：本発明の可変的方法を用いた濃縮後、▲：定常的方法Δｐ＝３．０バール）。
【図１４】ヒスチジン緩衝液中での抗Ｐ−セレクチン抗体の濃度の濁度測定結果（ａ）および動的光散乱結果（ｂ）。１：濃縮前（◆）、２：本発明の可変的方法（■）、３：定常的方法  Δｐ＝３．０バール（▲）。
【図１５】濃縮免疫グロブリン溶液の濾過性に対する濃縮モードの影響。
【００４７】
実施例１
分析法
ａ）濁度測定
抗体溶液中の固有発色団が吸収しない３５０nmおよび５５０nmで吸光度を測定した（UV-VIS spectrophotometer Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）。試料を希釈せずに測定した。参考媒体として、適切な緩衝液を使用した。すべての測定は３回実施した。
【００４８】
ｂ）サイズ排除ＨＰＬＣ
ＡＳＩ−１００ＨＰＬＣシステム（Dionex, Idstein, Germany）でＴｏｓｏｈ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ３０００ＳＷＸＬカラムを用いてクロマトグラフィーを実施した。溶出ピークを、ＵＶダイオードアレイ検出器（Dionex）により２８０nmでモニターした。濃縮試料を１mg／mlに溶解させた後、カラムを、２００mMのリン酸二水素カリウムおよび２５０mMの塩化カリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．０）で、安定なベースラインが得られるまで洗浄した。分析を、アイソクラチック条件下、０．５ml／分の流速を用い、３０分間にわたって室温で実施した。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（Dionex, Idstein, Germany）を用いてクロマトグラムを手動で積分した。高分子量形成の曲線下の面積（ＡＵＣ）を単量体ピークのＡＵＣと比較することによって、凝集率（％）を決定した。
【００４９】
ｃ）光遮蔽
１〜２００μmの範囲で粒子負荷をモニターするために、ＳＶＳＳ−Ｃ粒子分析器を使用した（PAMAS Partikelmess- und Analysesysteme, Rutesheim, Germany）。このシステムを、米国薬局方第２４巻＜７８８＞の要件にしたがい、単一サイズに近いポリスチレン球を用いて較正した。０．５mlの体積（フラッシュ前体積０．５ml）の測定を３回実施した。結果を平均値として計算し、１．０mlの試料体積に換算した。計測した粒子の数は、センサーの濃度限度内であった。
【００５０】
ｄ）動的光散乱（ＤＬＳ）
ＤＬＳは、典型的にはミクロン以下のサイズ範囲の粒度を測定するための非侵襲的技術である。本発明においては、１nmから６μmの範囲のサイズをモニターするために、温度調節石英キュベット（２５℃）を有するＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ装置（Malvern Instruments, Worcestershire,UK）を使用した。後方散乱レーザー光の光強度を１７３°の角度で検出した。光強度は、粒子拡散速度に依存した割合で変動し、これは次に粒度により支配される。粒度データは、したがって散乱光強度における変動の分析から得ることができる（Dahneke, B.E.(ed), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc.(1983);Pecora, R., Dynamic Light  Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press(1985)）。多重ナローモードのＤＴＳソフトウェア（Malvern）を用いて、強度によるサイズ分布を計算した。未希釈試料を用いて実験をおこなった。
【００５１】
ｅ）フーリエ変換赤外分光
サーモスタットに接続されたフロースルー透過セル（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）（AquaSpec）を有するＴｅｎｓｏｒ２７分光計（Bruker Optik, Ettlingen, Germany）を用いることによって、未希釈タンパク質溶液のＦＴ−ＩＲスペクトルを記録した。各スペクトルに関して、４ｃｍ−１分解能の単一ビームモードで１２０スキャンインターフェログラムを集めた。参考媒体として、適切な透過物を使用した。タンパク質および緩衝液系の集められたインターフェログラムをフーリエ変換した。さらに、タンパク質のスペクトルを、対応する緩衝液系のスペクトルに関して補正した。
【００５２】
実施例２
ＴＭＰおよびＣＦ条件の決定
表示分子量カットオフが３０kDaであり、膜面積が０．０２ｍ２の再生セルロースのＨｙｄｒｏｓａｒｔ（商標）膜を有するスケーラブルフラットシートカセット（Sartorius, Gottingen, Germany）を用いることにより自動ＴＦＦシステムＡＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（商標）（GE Healthcare, Amersham Bioscience AB, Uppsala,Sweden）の使用によって、調整され、濾過された抗ＩＬ−ＩＲ抗体のクエン酸緩衝水溶液（ｐＨ５．５）を１００mg／mlまで２０倍濃縮した。ＡＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（商標）を制御するＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアを用いて得られた様々な濃度プログラムを実行した。全膜負荷は約４００ｇ／ｍ２であった。
【００５３】
４のプリセット膜間圧での流束および圧力分布を、クロスフローに関して濃縮される免疫グロブリン溶液中の様々な免疫グロブリン濃度で決定した。ＴＭＰを０．３バール、０．５バール、０．９バール、または２．０バールに設定した。各ＴＭＰおよびタンパク質濃度についてのクロスフローは、５０ml／分、８０ml／分、１３０ml／分（４５mg／mlのタンパク質濃度でない）、および１５０ml／分（４５mg／mlのタンパク質濃度でのみ）であった。様々なタンパク質濃度は、５．３mg／ml、４５mg／ml、９０mg／ml、および１８０mg／mlであった。結果を図５〜８に示す。
【００５４】
濃縮プロセスの間の高いフィード流束および高いフィード圧の結果、良好な膜貫通流束が得られることが判明した。しかし、濃縮プロセス中、特にプロセスの最後に、分極層が確立され、その結果、膜超過圧となり、また（透過流）流束が減少する。フィード圧の増加の結果、流束がさらに高くなり、したがって、濃縮プロセスが速くなるが、このような加速は、凝集物形成の増加を伴う（図９〜１１）。
【００５５】
前記事項を考慮して、免疫グロブリン濃縮の改善された方法の範囲および条件は次のとおりであることが判明した：
濃縮される溶液１mlあたり、３０mgまでの免疫グロブリンまでの濃縮範囲において、１．４バール〜１．６バールの膜間圧および７５ml／分〜９０ml／分のクロスフロー、
１５mg／ml〜５５mg／mlの濃縮範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１４０ml／分〜１６０ml／分のクロスフロー、および
４５mg／mlを超える濃縮範囲において、０．８バール〜０．９バールの膜間圧および１２０ml／分〜１４０ml／分のクロスフロー。
【００５６】
これらのパラメータにより、凝集物形成が減少し、濃縮時間が短い方法が得られる。
【００５７】
実施例３
本発明の可変的方法と定常的方法との比較
本発明の方法を、濃縮免疫グロブリン溶液を製造するための様々な定常パラメータ法と比較した。目標濃度を９０mg／mlに設定した。実施例２の装置を使用して、タンジェンシャルフロー濾過を実施した。比較法（方法１〜４は定常的方法であり、方法５は本発明の可変的方法である）の様々なパラメータは次のとおりであった：
方法１：膜間圧０．６バール
クロスフロー＝９０ml／分
Δｐ＝０．７バール
方法２：膜間圧＝０．６バール
Δｐ＝１．２バール
方法３：膜間圧＝０．６バール
Δｐ＝１．８バール
方法４：膜間圧＝０．６バール
Δｐ＝３．０バール
方法５：ａ）膜間圧＝１．５バール、Δｐ＝０．５バール、
ｂ）膜間圧＝０．８５バール、Δｐ＝１．２バール、
ｃ）膜間圧＝０．８５バール。
【００５８】
免疫グロブリン溶液を９０mg／mlの免疫グロブリン濃度にするために必要な様々なパラメータおよび時間を表２に示す。
【００５９】
表２：様々な濃縮法のパラメータの比較
【表２】
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【００６０】
様々な方法の結果から、方法５、すなわち可変的方法を使用すると、方法２〜４と比較して、凝集物形成を劇的に減少させることができ、このようにして改善された特性を有する免疫グロブリン濃縮物が得られることがわかる。方法１と比較して、より速い濃縮プロセスを達成することができる。
【００６１】
実施例４
様々な緩衝系中の抗ＩＬ−ＩＲ抗体の濃縮
クエン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液で緩衝した水性抗ＩＬ−ＩＲ抗体溶液緩衝液の比較濃縮を、実施例２の装置および本発明の方法（実施例３の方法５）を用いて実施した。結果を図１２および１３に示す。それぞれ図１２および図１３から、用いられる緩衝液は本発明の濃縮プロセスに影響を及ぼさないことがわかる。
【００６２】
実施例５
抗Ｐ−セレクチン抗体の濃縮
抗Ｐ−セレクチン抗体の濃縮を、実施例２の方法にしたがって実施し、結果を図１４に示す。
【００６３】
実施例６
濃縮溶液の濾過
実施例２の方法に従って得られる濃縮溶液を、０．７５バールの圧力でＤｕｒａｐｏｒｅ（PVDF, Millipore GmbH, Schwalbach, Germany）膜（濾過面積４．５２cm2）を通してタンジェンシャルフロー濾過後に濾過した。
【００６４】
高濃縮免疫グロブリン溶液の濾過性は、用いられる濃縮法に依存することが判明した。本発明の可変的方法により得られる濃縮免疫グロブリン溶液は、他の固定法と比較した場合、濾過流量の減少が軽減されていることがさらに判明した（図１５）。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１３】
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【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図１１】
0005432137.tif 000018
【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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