(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非侵襲的に皮膚から採取された皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判定する方法であって、前記分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化度により発現が変化するＫｅｒａｔｉｎ７である皮膚の老化度判定方法。
【請求項２】
分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現をタンパク質レベルで測定する請求項１記載の皮膚の老化度判定方法。
【請求項３】
分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の遺伝子発現をＲＮＡレベルで測定する請求項１記載の皮膚の老化度判定方法。
【請求項４】
皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質を特異的に認識できる抗体を含む、皮膚の老化度を判定するためのキットであって、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ７である皮膚の老化度判定キット。
【請求項５】
皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを含む、皮膚の老化度を判定するためのキットであって、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ ７である皮膚の老化度判定キット。
【請求項６】
皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記ｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを含む、皮膚の老化度を判定するためのキットであって、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ７である皮膚の老化度判定キット。       
【請求項７】
皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）被験物質と継代培養ヒト皮膚由来の細胞を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で被験物質と接触させた細胞を所定時間インビトロで培養する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で培養した細胞における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を測定する工程であって、前記分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化するものである前記工程、及び（ｄ）工程（ｃ）で測定した分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を対照の細胞における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現と比較することにより、細胞における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現に対する被験物質の効果を評価する工程、を含み、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ ７である皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法。     
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化マーカーとその利用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の加齢変化はしわ、たるみ等見た目から認知されるのが一般的で、肌年齢の推定は外観変化をもとに機器を用いた客観的な評価が試みられてきた。実際に行われている方法としては、しわやたるみの程度から実年齢を推定したり、ファイバースコープなどで皮膚の外観的なきめの細かさ度合いを測定したり、皮膚に振動体を接触させた時の振動変化で肌年齢を判定する方法が報告されている（特許文献１〜３）。
老化の要因として細胞老化が提唱されているが、これまで細胞老化が個体老化の原因であることは実証されていなかった。最近、細胞老化が個体老化の原因であることを実証する結果が報告された（非特許文献１）。皮膚においても加齢変化はしわ、たるみ等の外観が変化する前に細胞レベルでの加齢変化が先に始まっていると考えられる。例えば、皮膚老化に伴って細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）であるコラーゲンなどが減少し、ＥＣＭ分解性プロテアーゼの発現が増加する等様々な因子の発現変化が起こる（非特許文献２〜４）。また、生体内に発生する酸化修飾などを受けた異常なタンパク質はプロテアソームにより分解されるが、加齢とともに皮膚中のプロテアソームの発現が低下し、酸化コラーゲンの蓄積が起こる（非特許文献５）。よって、皮膚老化度を的確に測定するには外観変化に基づく評価では不十分で、細胞レベルでの生化学的な加齢変化を調べることが重要である。
【０００３】
これまでに、皮膚細胞の老化マーカーとしてｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）が同定され、ＳＡ−β−Ｇａｌは最終分化した細胞では発現せずに老化した細胞のみに特異的に発現し、ヒトの皮膚組織での老化とも非常に良く相関することが明らかになった（非特許文献６）。それ以外の皮膚老化マーカーとしてｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの１種であるＭａｓｐｉｎやｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの１種であるＣｙａｔａｔｉｎ Ａなどが報告されている（非特許文献７、８）
皮膚老化のバイオマーカーを探索する手法として、特定の細胞が特定の条件下に置かれたときに、その細胞内に存在する全タンパク質（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）を２次元電気泳動により分離し、質量分析機により同定する手法（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）が有用である。実際に、若年と老年のヒトの皮膚組織からタンパク質を抽出し、ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓにより皮膚老化により有意に変化したタンパク質としてｅＩＦ−５Ａ、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡ２８−α、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＨＳＰ６０、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｉ、ＮＭ２３ Ｈ２（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）、ＰＩ３Ｋ ｐ８５β ｉｓｏｆｏｒｍ、Ｍｎ−ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、ＰＡＩ−２、Ｍｘ−Ａ ｐｒｏｔｅｉｎが見出されている（非特許文献９）。しかし、これまで皮膚に関して実施されたｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓは皮膚組織の抽出物もしくは細胞抽出物を用いた解析であり、微量な分泌タンパク質が多く含まれている細胞培養上清液に着目してｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓを行った例はない。また、同定した皮膚老化マーカーのヒト皮膚での検証はバイオプシーにより摘出した皮膚組織での免疫染色など実用性が低い方法であり、非浸襲的に安全、簡便に角層採取ができる角質チェッカーを用いて角層を採取し、そこからタンパク質を抽出して皮膚老化マーカーの発現を調べる実用性の高い方法で調べた例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３３０９４３号公報
【特許文献２】特開２００２−３６０５４４号公報
【特許文献３】特開２００１−２１２０８７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４，１２９９−１３０７，２００４
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９ Ａｐｒ，１９４（１−２）：９９−１０８
【非特許文献３】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．，３（２），１７２−１７９，１９９８
【非特許文献４】Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．，１２３（７），８０１−８１０，２００２．
【非特許文献５】Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，５５（５），２２０−２２７，２０００
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，９３６３−９３６７，１９９５
【非特許文献７】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４，２９５６−２９６１，２００４
【非特許文献８】Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１８８，２１−２４，１９９４
【非特許文献９】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２（２），７０−８４，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、皮膚老化マーカーとなりうる物質を探索することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微量な分泌タンパク質が多く含まれている細胞培養上清液に着目し、表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化するタンパク質のｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓを行った。すなわち、ヒト正常表皮角化細胞の２代目（若い細胞）〜５代目（老化した細胞）の培養上清液を調製し、２次元電気泳動と質量分析機によるｐｒｏｔｅｏｍｅ解析を行った。さらに、本発明の特徴として、超微量タンパク質（１ ｆｅｍｔｏ−ｍｏｌ以下）の同定を可能とする技術｛実験医学，２０（１６），２３６７−２３７０，２００２｝を用いて同定を試みた。
その結果、表皮角化細胞の老化に伴って発現が減少したタンパク質が１９個（表１）、発現が増加したタンパク質が４９個同定された（表２）。これらのタンパク質の中には既知の皮膚老化マーカー以外にもβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＰＡＩ−１、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７などの新規な皮膚老化マーカーが含まれていた。さらに、ｐｒｏｔｅｏｍｅ解析により同定されたタンパク質の発現を１次元のウェスタンブロッティングにより確認し、表皮角化細胞の老化と相関するいくつかのタンパク質を同定した（表３）。また、ｐｒｏｔｅｏｍｅ解析により細胞骨格タンパク質である２種のＫｅｒａｔｉｎが同定されたことから、表皮角化細胞の老化に伴う種々のＫｅｒａｔｉｎの発現変化も調べた。その結果、表皮角化細胞の老化に伴って８種のＫｅｒａｔｉｎ（Ｋｅｔｒａｔｉｎ １０、１３、１４、１５、１６、１８、１９および２０）の発現が増加し、Ｋｅｒａｔｉｎ ７の発現が減少した。発現が変化するタンパク質以外にも、表皮角化細胞の老化に伴いプロテアーゼにより切断された切断型に対する非切断型の割合が増加するタンパク質としてβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎが同定された。
さらに、前述のようにして見出した皮膚老化マーカーとヒトの皮膚老化度との相関を調べるために、２０〜６０代のボランティアから、非浸襲的に安全、簡便に角層採取ができる角質チェッカーを用いて角層を採取し、そこからタンパク質を抽出して皮膚老化マーカーの発現をウェスタンブロッティングにより調べた。その結果、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １５およびＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７が皮膚老化の指標として知られる皮膚弾力性およびしわ体積率と非常に良く相関することが明らかとなった。
【０００８】
本願発明の要旨は、以下の通りである。
（１）非侵襲的に皮膚から採取された皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判定する方法であって、前記分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化度により発現が変化するＫｅｒａｔｉｎ７である皮膚の老化度判定方法。
（２）分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現をタンパク質レベルで測定する（１）記載の皮膚の老化度判定方法。
（３）分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の遺伝子発現をＲＮＡレベルで測定する（１）記載の皮膚の老化度判定方法。
（４）皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質を特異的に認識できる抗体を含む、皮膚の老化度を判定するためのキットであって、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ７である皮膚の老化度判定キット。
（５）皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを含む、皮膚の老化度を判定するためのキットであって、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ ７である皮膚の老化度判定キット。
（６）皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記ｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを含む、皮膚の老化度を判定するためのキットであって、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ７である皮膚の老化度判定キット。
（７）皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）被験物質と継代培養ヒト皮膚由来の細胞を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で被験物質と接触させた細胞を所定時間インビトロで培養する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で培養した細胞における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を測定する工程であって、前記分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化するものである前記工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で測定した分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現を対照の細胞における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現と比較することにより、細胞における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現に対する被験物質の効果を評価する工程、を含み、分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質が、Ｋｅｒａｔｉｎ ７である皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、皮膚老化における細胞レベルでの加齢変化を指標とする評価系が確立できる。この評価系を用いて、従来法に比べてより詳細に、的確に皮膚の老化度を判定することができる。また、皮膚の老化度を判定するためのキットおよび皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】表皮角化細胞の継代による増殖変化（ａ）および形態変化（ｂ）を示す。
【図２】表皮角化細胞の継代数ごとにＳＡ−β−Ｇａｌにより染色した細胞の染色像（ａ）およびＳＡ−β−Ｇａｌ染色された細胞の割合（ｂ）を示す。
【図３】表皮角化細胞の継代数２代目および５代目から抽出したタンパク質の２次元電気泳動泳動解析により得られた発現パターンを示す。
【図４】表皮角化細胞の老化に伴うＬａｍｉｎｉｎ ５およびＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎの発現変化を１次元ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図５（ａ）（ｂ）】表皮角化細胞の老化に伴うプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターの発現変化を１次元ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図６】表皮角化細胞の老化に伴う熱ショックタンパク質の発現変化を１次元ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図７】表皮角化細胞の老化に伴う細胞内タンパク質及び細胞骨格系タンパク質の発現変化を１次元ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図８】表皮角化細胞の老化に伴うＧａｌｅｃｔｉｎおよびＩＧＦＢＰ−３の発現変化を１次元ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図９】表皮角化細胞の老化に伴うＫｅｒａｔｉｎの発現変化を１次元ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図１０】目尻角層から抽出したＫｅｒａｔｉｎ １５の発現と年齢との相関を示す。
【図１１】目尻角層から抽出したＫｅｒａｔｉｎ １０の発現と年齢との相関を示す。
【図１２】年齢と目尻弾力性との相関を示す。
【図１３】年齢と目尻しわ体積率との相関を示す。
【図１４】目尻角層から抽出したＫｅｒａｔｉｎ ７の発現と目尻弾力性との相関を示す。
【図１５】目尻角層から抽出したＫｅｒａｔｉｎ １５の発現と目尻弾力性との相関を示す。
【図１６】目尻角層から抽出したＫｅｒａｔｉｎ ７の発現と目尻しわ体積率との相関を示す。
【図１７】目尻角層から抽出したＫｅｒａｔｉｎ １５の発現と目尻しわ体積率との相関を示す。
【図１８】目尻角層から抽出したＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７の発現と目尻弾力性との相関を示す。
【図１９】目尻角層から抽出したＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７の発現と目尻しわ体積率との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現を測定することを含む、皮膚の老化度を判定する方法を提供する。分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化するものである。「発現が変化する」態様としては、タンパク質及び／又はその遺伝子の発現の有無が変わること、発現量が増減すること、発現したタンパク質のプロテアーゼによる切断型と非切断型の割合が変わることなどが挙げられる。皮膚の老化度を判定するための分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ、ＧＲＰ ９４、ＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅｎｏｌａｓｅ−１、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ｅｚｒｉｎ、Ｒａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １３、Ｋｅｒａｔｉｎ １４、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １６、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｋｅｒａｔｉｎ １９、Ｋｅｒａｔｉｎ ２０およびβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群より選択することが好ましい。選択するタンパク質は１種でも複数種であってもよい。
本発明において、皮膚の老化度は、下記［００４２］「皮膚の老化度とは、加齢により生じたしわ、たるみなどの皮膚の老化現象の程度を言う。」であり、上記［０００２］に記載するように、「皮膚においても加齢変化はしわ、たるみ等の外観が変化する前に細胞レベルでの加齢変化が先に始まっていると考えられる。」のであって、本願発明は細胞レベルあるいは皮膚組織レベルで老化に着目している。
【００１２】
Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７は、分子質量２７，５２５Ｄａの分泌タンパク質である。角質層の細胞間どうしの結合部分を切断することにより皮膚表面からの細胞の落屑を促す働きをもつ。組織中では皮膚で多く発現される一方、脳、乳腺、脊髄、腎臓に発現が見られる。遺伝子配列情報（Ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｃｈｙｍｏｔｒｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９４２０−１９４２６，１９９４，Ｌ３３４０４）。アミノ酸配列情報（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９４２０−１９４２６，１９９４， Ｐ４９８６２）。
ＰＡＩ−１は、分子質量４５，０６０Ｄａの分泌タンパク質である。セリンプロテアーゼの一種でｔＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ），ｕＰＡ， ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ等の活性を阻害する。ＰＡＩ−１は酸に安定な糖タンパク質で、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）ファミリーに属している。血漿、血小板、内皮細胞、肝細胞、繊維肉腫細胞にみられる。遺伝子配列情報（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８：１６７３−１６８０，１９８６，Ｍ１６００６）。アミノ酸配列情報（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１０：１１−１６，１９８７，Ｐ０５１２１）。
【００１３】
ｕＰＡは、分子質量４８，５２５Ｄａの分泌タンパク質である。ｕＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼの一種。前駆体タンパク質（５５ｋＤａ）として細胞外へ分泌され、切断型（３５ｋＤａ）となってプロテアーゼ活性を示す。乳がんで多くの発現が見られる。遺伝子配列情報（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２７５９−２７７１，１９８５，ＢＣ０１３５７５）。アミノ酸配列情報（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ'ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６３：１０４３−１０５８，１９８２，Ｐ００７４９）。
【００１４】
Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅは、分子質量７５，６２６Ｄａの分泌タンパク質である。細胞外マトリックスを分解する酵素。乳がんで浸潤と転移に関与するという報告がある。トリプシン様の酵素活性を示す。さらにｍａｔｒｉｐｔａｓｅのインヒビターであるＨＡＩ−１（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１）と複合体を示すことが明らかとなっている。また、この遺伝子をノックアウトしたマウスでは皮膚での水分蒸散のコントロールができずに致死に至ることがわかっている。遺伝子配列情報（Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ ｓｅｒｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ １，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２３１−１８２３６，１９９９，ＡＦ１８８２２４）。アミノ酸配列情報（Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ ｓｅｒｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ １， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２３７−１８２４２，１９９９，Ｑ９ＢＳ０１）。
【００１５】
ＧＲＰ９４は、分子質量９２，４６９Ｄａの分泌タンパク質である。熱ショックタンパク質の一種で分泌タンパク質の切断や輸送で働くシャペロン分子である。シグナルペプチドを持っているので細胞外に分泌されるものもあるがＥＲに局在するものもある。遺伝子配列情報（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ（ｇｐ９６）１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：５６５８−５６６２，１９９０，ＢＣ０６６６５６）アミノ酸配列情報（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：５６６−５６９，２００３，Ｐ１４６２５）。
【００１６】
ＨＳＰ７０は、分子質量７０，０５２ Ｄａの細胞内タンパク質である。通常、細胞内で分子シャペロンとして機能し、タンパク質のフォールディング、輸送、集合や分解などに関与している。また、ミトコンドリアやＥＲでのＨＳＰ７０の働きはタンパク質を正常に移転させることである。ＨＳＰ９０と協調して細胞内のシグナル伝達にも関与する。遺伝子塩基配列情報（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３２：２４２−２５１，１９９０，ＢＣ００２４５３）。アミノ酸配列情報（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ １，Ｐ０８１０７）。
【００１７】
ＨＳＰ９０は、分子質量８５，４５３Ｄａの細胞内タンパク質である。ふだんはステロイドホルモン受容体などの複合体に結合・解離することでシグナル伝達系において重要な働きをしている。細胞が高温にさらされると、ＨＳＰ９０は構造を変えてタンパク質の不可逆的損傷を防ぐ分子シャペロンとして働く。遺伝子塩基配列情報（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７１０８−７１０，１９８９，Ｘ１５１８３）。アミノ酸配列情報（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２４３１−２４３７，１９８９，Ｐ０７９００）。
【００１８】
Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１は、分子質量１４，５８５Ｄａの細胞内タンパク質である。細胞外に分泌されるものもある。心臓、胃、骨格筋、神経、胸腺、腎臓、胎盤などに存在する。β−ガラクトシドやＣＤ４５， ＣＤ３，ＣＤ４等に結合する。細胞の増殖促進効果、細胞死の誘導、また免疫応答に影響を与えることが知られている。また、ラミニン、インテグリンなどの細胞外マトリックスの構成成分や細胞受容体に特異的に結合し、細胞接着や移動に大きな影響を与えている。遺伝子配列情報（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３１０−１３１６，１９８９，ＢＴ００６７７５）。アミノ酸配列情報（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１−４，１９８８，Ｐ０９３８２）。
【００１９】
Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３は、分子質量３５，６７８Ｄａの細胞内タンパク質である。ＩｇＥに結合する、ガラクトース特異的なレクチン。主な発現は大腸の上皮や活性化マクロファージにおいて見られる。ガレクチン３は表皮角化細胞によって産生され皮膚のランゲルハンス島の表面に存在し、ＩｇＥと結合して免疫系を調節しているという報告がある。遺伝子配列情報（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：７３２４−７３２８，１９９０，ＡＢ００６７８０）。アミノ酸配列情報（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３，Ｐ１７９３１）。
【００２０】
Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７は、分子質量１４，９４４Ｄａの細胞内タンパク質である。一般的には細胞間どうし、細胞と細胞外マトリックス間で細胞の増殖を制御している。アポトーシス関連タンパク質でＪＮＫの活性やシトクロームＣの放出を制御している。細胞質、核、また細胞外にも分泌されている。ヒト表皮で最初にクローニングされたガレクチンサブファミリーのメンバーで、培養表皮角化細胞の研究からガレクチン７は角質化の程度に影響を受けず、総ての表皮細胞に発現する。遺伝子配列情報（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８：２５９−２７１，１９９５，Ｌ０７７６９），アミノ酸配列情報（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５８２３−５８２９，１９９５，Ｐ４７９２９）。
【００２１】
ＩＧＦＢＰ−３は、分子質量３１，６６０Ｄａの分泌タンパク質である。一般的にＩＧＦと結合することにより半減期までの時間が長くなる。細胞培養においては細胞増殖を抑制もしくは促進する。細胞表面でＩＧＦ受容体に結合する。ＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦ−１よりＩＧＦ−２に対して結合力が高い。組織中においてはほとんどん組織において発現が見られる。遺伝子配列情報（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５， １２６４２−１２６４９，１９９０，Ｍ３５８７８）。アミノ酸配列情報（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５， １４８９２−１４８９８，１９９０， Ｐ１７９３６）。
【００２２】
Ｅｎｏｌａｓｅ−１は、分子質量４７，０３８Ｄａの細胞内タンパク質である。２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ＝ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ＋Ｈ２Ｏの酵素活性を持ち解糖系で働く。また一部は細胞増殖、アレルギーにも関与するという報告がある。白血球や神経では細胞表面においてプラスミノーゲンの活性化を制御しフィブリンを形成するのに関与している。二量体の安定な構造を持つにはマグネシウムが必要である。細胞質内に局在するが、ホモダイマーのみ細胞膜にも見られる。α−ｅｎｏｌａｓｅはほとんどの組織に発現し、β−ｅｎｏｌａｓｅは筋組織、γ−ｅｎｏｌａｓｅは神経組織のみに発現している。遺伝子配列情報（Ａｌｐｈａ ｅｎｏｌａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：６７４１−６７４５，１９８６，Ｍ１４３２８）。アミノ酸配列情報（Ａｌｐｈａ ｅｎｏｌａｓｅ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４８：３７−４４，１９９５，Ｐ０６７３３）。
【００２３】
Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩは、分子質量３８，４７３Ｄａの細胞内タンパク質である。一部細胞外へ分泌されるという報告もある。カルシウムで制御される膜結合タンパク質でこのタンパク質には二つのカルシウムイオンが結合する。細胞膜近傍に局在している。２組あるａｎｎｅｘｉｎリピートのうち、１つはカルシウムが結合し、１つはリン脂質が結合する。このタンパク質は細胞膜にあるリン脂質に結合しているアクチンや細胞骨格系のタンパク質と架橋したり、ｔＰＡを介してプラスミノーゲンを活性化したりする。遺伝子塩基配列情報（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２，Ｇｅｎｅ ９５：２４３−２５１，１９９０，ＢＣ０１５８３４）。アミノ酸配列情報（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：５１６９−５１７６，１９９１，Ｐ０７３５５）。
【００２４】
Ｅｚｒｉｎは、分子質量６９，２６８Ｄａの細胞内タンパク質である。下記のＲａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎは同族の分子。主に細胞骨格系のタンパク質を細胞膜につなぐ働きをしている。細胞膜のｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉと呼ばれる糸状突起の内側に局在する。腸上皮細胞のｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉを構成している。チロシンキナーゼによってリン酸化される。遺伝子配列情報（Ｅｚｒｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６７２７−１６７３２，１９８９，Ｘ５１５２１）。アミノ酸配列情報（Ｅｚｒｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４：６６６−６７４，１９９６，Ｐ１５３１１）。
【００２５】
Ｒａｄｉｘｉｎは、分子質量６８，５６４Ｄａの細胞内タンパク質である。主に細胞骨格系タンパク質と細胞膜とをつなぐ働きをしている。遺伝子配列情報（Ｒａｄｉｘｉｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１６：１９９−２０６，１９９３，Ｌ０２３２０）。アミノ酸配列情報（Ｒａｄｉｘｉｎ，Ｐ３５２４１）。
【００２６】
Ｍｏｅｓｉｎは、分子質量６７，６８９Ｄａの細胞内タンパク質である。主に細胞骨格系タンパク質と細胞膜とをつなぐ働きをしている。異常な分化をした表皮角化細胞において発現が低下するという報告がある。遺伝子配列情報（Ｍｏｅｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：８２９７−８３０１，１９９１，Ｍ６９０６６）。アミノ酸配列情報（Ｍｏｅｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：８２９７−８３０１，１９９１，Ｐ２６０３８）。
【００２７】
Ｇｅｌｓｏｌｉｎは、分子質量８５，６９８Ｄａの分泌タンパク質である。細胞外へ分泌されるものと細胞内で働くタイプの２つがある。細胞外へ分泌されたものはフィブロネクチンと結合する。ゲルゾリンは、重合核形成によるアクチン線維伸長の促進、アクチン線維の切断、およびその末端の保護という、3つのアクチン重合調節機能を持つ。これらの両面性の機能を通じて重合−脱重合という両局面を制御し、細胞運動において重要な役割を担っている。血小板や繊維芽細胞で多く発現がみられる。遺伝子情報（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ，Ｎａｔ．３２３，４５５−４５８，１９８６，Ｘ０４４１２）。アミノ酸配列情報（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１．５６６−５６９，２００３，Ｐ０６３９６）。
【００２８】
Ｋｅｒａｔｉｎ ７は、分子質量５１，２８７Ｄａの細胞骨格タンパク質で中間系フィラメントの成分である。腺細胞を含む多様な上皮細胞で発現が見られる。尿管の移行上皮、胆管、肺、乳腺上皮でも発現している。一部、腫瘍マーカーとしても使用されている。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ ７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０７：１３３７−１３５０，１９８８，ＡＦ５０９８８７）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ７，Ｐ０８７２９）。
【００２９】
Ｋｅｒａｔｉｎ １０は、分子質量５９，５１９Ｄａの細胞骨格タンパク質である。Ｋｅｒａｔｉｎ １とヘテロ四量体を作る、中間系フィラメントの成分である。皮膚全般に見られるが特に有棘層に多く見られる。遺伝子情報配列（Ｋｅｒａｔｉｎ １０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０４：８４１−８５６，１９８８，Ｍ１９１５６）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １０，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３：９６０−９６９，１９９２，Ｐ１３６４５）。
【００３０】
Ｋｅｒａｔｉｎ １３は、分子質量４９，５８６Ｄａの細胞骨格タンパク質である。ケラチン４とヘテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。舌、食道、上皮、尿路上皮などで発現が見られる。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １３，Ｇｅｎｅ ２１５：２６９−２７９，１９９８，Ｘ５２４２６）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ， ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １３，Ｐ１３６４６）。
【００３１】
Ｋｅｒａｔｉｎ １４は、分子質量５１，４９０Ｄａの細胞骨格タンパク質である。ケラチン５とヘテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。上皮に存在し、特に基底層に近いところにおいて発現が多く見られる。上皮系の未分化マーカーとしても使われている。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：１６０９−１６１３，１９８５，ＢＣ００２６９０）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １４，Ｐ０２５３３）。
【００３２】
Ｋｅｒａｔｉｎ １５は、分子質量４９，１６７Ｄａの細胞骨格タンパク質である。中間系フィラメントの成分である。主に上皮基底層に局在している。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １５， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：１２４９−１２６１，１９８８，Ｘ０７６９６）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １５，Ｐ１９０１２）。
【００３３】
Ｋｅｒａｔｉｎ １６は、分子質量５１，１３６Ｄａの細胞骨格タンパク質である。Ｋｅｒａｔｉｎ ６とヘテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。毛包、爪、口腔の扁平上皮層、上皮の基底層、手掌の上皮、また汗腺で発現が見られる。細胞の増殖や分化に関与している。遺伝子情報配列（Ｋｅｒａｔｉｎ １６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１５：５１７−５２３，１９９５，ＡＦ０６１８１２）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １６，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３：９６０−９６９，１９９２，Ｐ０８７７９）。
【００３４】
Ｋｅｒａｔｉｎ １８は、分子質量４７，９２６Ｄａの細胞骨格タンパク質である。Ｋｅｒａｔｉｎ ８とヘテロ四量体を作る中間系フィラメントの成分である。ほとんどの単層腺上皮に存在する。Ｋｅｒａｔｉｎ １８が欠損している患者は特発性肝疾患になる可能性がある。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １８，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３３：６１−６８，１９８６，Ｍ２６３２５）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １８，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：６０５−６１３，１９９７，Ｐ０５７８３）。
【００３５】
Ｋｅｒａｔｉｎ １９は、分子質量４４，１０６Ｄａの細胞骨格タンパク質である。ケラチンの中で一番分子量が小さい。中間系フィラメントの成分である。ほとんどの単層上皮、非角質化型重層上皮で多く発現している。また、すべての腺癌で発現している。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９２：７０７−７１６，１９８９，Ｙ００５０３）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １９，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３：９６０−９６９，１９９２，Ｐ０８７２７）。
【００３６】
Ｋｅｒａｔｉｎ ２０は、分子質量４８，４８６Ｄａの細胞骨格タンパク質である。中間系フィラメントの成分である。正常細胞では腸管上皮、消化管上皮、胃幽門上部に存在する内分泌細胞や尿管上皮、皮膚のメンケル細胞に存在する。大腸癌などの特異的マーカータンパク質として用いられている。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ ２０，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５３：７５−９３，１９９３，ＢＣ０３１５５９）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ２０，Ｐ３５９００）。
【００３７】
β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、分子質量１３，１７５Ｄａの分泌タンパク質である。ＨＬＡクラスＩ抗原（組織適合性抗原）のＬ鎖。多くの細胞表面に存在している。腎機能障害や各種悪性腫瘍などの診断の指標として使用されている。一部切断型が見られるがそれらの意義についてはあまり明らかになってない。遺伝子配列情報（Ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３１３２−３１３８，１９８７，ＡＢ０２１２８８）。アミノ酸配列情報（Ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：４８１１−４８２２（１９７３）， Ｐ６１７６９）。
【００３８】
上記のタンパク質は、前駆体タンパク質であっても、成熟タンパク質であってもよく、また、切断型であっても、非切断型であってもよい。前駆体タンパク質としては、プロタンパク質、プレプロタンパク質などを挙げることができる。プロタンパク質、プレプロタンパク質などには、分泌タンパク質の特徴的な配列であるシグナルペプチドを持つものもある。
【００３９】
本発明の方法において、皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現を測定してもよいし、その遺伝子発現を測定してもよい。例えば、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析法などで測定することができる。あるいはまた、ｃＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ法、抗体アレイなどを利用して測定してもよい。
分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現をタンパク質レベルで測定するためには、測定の対象となるタンパク質を特異的に認識する抗体を用いるとよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は公知の方法で製造することができるし、また、市販されているものもある。ウェスタンブロット法で測定する場合には、抗体は、１２５Ｉ標識プロテインＡ、ペルオキシダーゼ結合ＩｇＧなどを用いて二次的に検出される。免疫組織化学分析法で測定する場合には、抗体は、蛍光色素、フェリチン、酵素などで標識するとよい。
【００４０】
分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の遺伝子発現をＲＮＡレベルで測定するためには、測定の対象となるタンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを用いるとよい（ノーザンブロット法で測定する場合）。あるいはまた、測定の対象となるタンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記ｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを用いてもよい（ＰＣＲ法で測定する場合）。核酸プローブ及び核酸プライマーは、測定の対象となるタンパク質の遺伝子情報に基づいて設計することができる。核酸プローブは、通常、約１５〜１５００塩基のものが適当である。核酸プローブは、放射性元素、蛍光色素、酵素などで標識するとよい。核酸プライマーは、通常、約１５〜３０塩基のものが適当である。
【００４１】
本発明において、皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現の有無を検出してもよいし、発現量を測定してもよい。タンパク質及び／又はそのｍＲＮＡの発現の有無は所定の位置におけるスポットやバンドの出現の有無により確認できる。タンパク質及び／又はそのｍＲＮＡの発現量はスポットやバンドの染色強度により測定できる。あるいはまた、タンパク質及び／又はそのｍＲＮＡを定量してもよい。複数の遺伝子発現や複数のタンパク発現を同時に検出するためには、ＤＮＡアレイ（プローブを基板に固定）（ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ， ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ， ＶＯＬＵＭＥ １， ＤＥＣＥＭＢＥＲ ２００２， ９５１−９６０）、プロテインチップ（抗体を基板に固定）（ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ， ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ， ＶＯＬＵＭＥ １， ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ ２００２， ６８３−６９５）、ルミネックス（ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ， ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ， ＶＯＬＵＭＥ １， ＪＵＮＥ ２００２， ４４７−４５６）等の検出法を用いることが好ましい。
【００４２】
皮膚細胞及び皮膚組織はいかなる生物に由来するものであってもよく、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物などに由来するものを挙げることができる。ヒトの皮膚の老化度を判定するためには、ヒト由来組織を使用する必要がある。
本発明の方法においては、皮膚の老化度を判定するためには、皮膚生検試料、あるいはそこから得られる培養皮膚細胞、培養皮膚組織などを用いることができる。
皮膚細胞としては、表皮角化細胞、皮膚繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞、メラニン細胞、肥満細胞、内皮細胞、皮脂細胞、毛乳頭細胞、毛母基細胞などを挙げることができる。皮膚細胞は、国内ではヒューマンサイエンス研究資源バンク、理化学研究所細胞銀行、海外ではｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから供給される。またＣｌｏｎｔｅｃｈ社、クラボウ社、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社から購入できる。また、公知の方法により皮膚から採取することができる（分子生物学研究のための新細胞培養実験法，ｐ５７−７１，羊土社，１９９９）。
皮膚組織としては、皮膚の角層、表皮、真皮などを挙げることができる。皮膚組織は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ社、Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ社から購入できる。また、公知の方法により皮膚から採取することができる（Ａｃｔａ．Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．，８５，３８９−３９３，２００５）。
皮膚モデルはクラボウ社、ＴＯＹＯＢＯ社などから市販されており、これらを使用することが出来る。また、公知の方法{Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４（１）,１０７−１１２,１９９５}により作製することもできる。
皮膚生検試料は、細胞であっても、組織であってもよい。皮膚生検試料としては、後述の実施例に記載のように、皮膚の角層を角層チェッカーなどのテープにより採取したものを用いるとよい。角層チェッカーは角層の不全角化度や細胞面積を測定し、肌荒れの程度や角層のターンオーバー速度を評価するための角層サンプルを採取する際に従来から使用されている（化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望，日本化粧品技術者会，薬事日報社，ｐ９５−９６）。カウンセリング店舗や自宅で簡単に安全に角層サンプルを採取でき、非浸襲で角層からタンパク質を得る方法として非常に有用である。
皮膚の老化度とは、加齢により生じたしわ、たるみなどの皮膚の老化現象の程度を言う。しわ、たるみは加齢により進行することが明らかである。また、加齢に加えて紫外線曝露によりしわ、たるみ、くすみ、しみの進行度は増す。しわ、たるみは公知の方法により測定できる（化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望，日本化粧品技術者会，薬事日報社，１５４−１５８，１６９−１７５，１７９−１８２，１８７−１９０，２００１）。
また、加齢に伴いしわやたるみが形成されてくると、皮膚の内部では表皮細胞および皮膚線維芽細胞などの皮膚の細胞の増殖能が低下することが知られている。よって皮膚の細胞の増殖能の低下を指標に皮膚の老化度を判定することが出来る。１例として、繰り返し継代して細胞老化させた表皮角化細胞および皮膚線維芽細胞ではｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）が増加し、ＳＡ−β−Ｇａｌの増加はヒトの皮膚老化と相関することが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２，９３６３−９３６７，１９９５）。よって、本試験において、繰り返し継代して細胞老化させた表皮角化細胞を用いて見出した各種タンパク質はヒトの皮膚老化マーカーとして利用できる可能性が高い。
【００４３】
本発明の１例として、皮膚の老化度は、以下のような基準で判定することができる。
実施例２に示すＫｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １５およびＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７の分析例のように、各年代のボランティアから皮膚検体を入手し、特定のマーカータンパク質の発現量を測定し、それらの発現量と皮膚老化の指標として知られている皮膚弾力性やしわの程度の標準曲線を作成する。標準検体と分析検体の発現量の比較から、分析検体の皮膚老化度を判定する。β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎについては、各年代のボランティアから皮膚検体を入手し、切断型と非切断型の比率の平均値を算出しておき、その発現量と皮膚老化の指標として知られている皮膚弾力性やしわの程度の標準曲線を作成する。標準検体と分析検体の発現量の比較から、分析検体の皮膚老化度を判定する。
【００４４】
本発明は、皮膚の老化度を判定するためのキットも提供する。
１例として、本発明のキットは、皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質を特異的に認識できる抗体を含む。分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ、ＧＲＰ ９４、ＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅｎｏｌａｓｅ−１、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ｅｚｒｉｎ、Ｒａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １３、Ｋｅｒａｔｉｎ １４、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １６、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｋｅｒａｔｉｎ １９、Ｋｅｒａｔｉｎ ２０およびβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群より選択することが好ましい。キットには、さらに、皮膚組織を採取するためのテープ、テープ上のタンパク質を免疫化学的に検出するための試薬一式、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、皮膚の老化度の判定基準なども記載しておくとよい。
【００４５】
別の１例として、本発明のキットは、皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを含む。分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ、ＧＲＰ ９４、ＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅｎｏｌａｓｅ−１、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ｅｚｒｉｎ、Ｒａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １３、Ｋｅｒａｔｉｎ １４、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １６、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｋｅｒａｔｉｎ １９、Ｋｅｒａｔｉｎ ２０およびβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群より選択することが好ましい。キットには、さらに、皮膚組織を採取するためのテープ、テープ上の皮膚組織からＲＮＡを抽出するための試薬類、ＲＮＡをノーザンブロット法で分析するための試薬類、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、皮膚の老化度の判定基準なども記載しておくとよい。
【００４６】
さらに別の１例として、本発明のキットは、皮膚の老化により発現が変化する分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマー及び前記ｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる核酸プライマーからなる１対の核酸プライマーを含む。分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ、ＧＲＰ ９４、ＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅｎｏｌａｓｅ−１、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ｅｚｒｉｎ、Ｒａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １３、Ｋｅｒａｔｉｎ １４、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １６、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｋｅｒａｔｉｎ １９、Ｋｅｒａｔｉｎ ２０およびβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群より選択することが好ましい。キットには、さらに、皮膚組織を採取するためのテープ、テープ上の皮膚組織からＲＮＡを抽出するための試薬類、ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で分析するための試薬類、取扱説明書などが含まれるとよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、皮膚の老化度の判定基準なども記載しておくとよい。
【００４７】
本発明は、皮膚の老化防止に効果のある物質を同定する方法も提供する。この方法は、以下の工程：
（ａ）被験物質と皮膚細胞及び／又は皮膚組織を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）で被験物質と接触させた皮膚細胞及び／又は皮膚組織を所定時間培養する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で培養した皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現を測定する工程であって、前記分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は皮膚の老化により発現が変化するものである前記工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で測定した分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現を対照の皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現と比較することにより、皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現に対する被験物質の効果を評価する工程
を含む。
【００４８】
被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、それらの混合物などを挙げることができる。
【００４９】
皮膚細胞及び皮膚組織については、上記の通りである。
被験物質と皮膚細胞及び／又は皮膚組織との接触は、いかなる方法によってもよく、例えば、被験物質を皮膚細胞及び／又は皮膚組織の培養液に添加する方法、被験物質を塗布又は固定した培養容器又は培養シート上で皮膚細胞及び／又は皮膚組織を培養する方法などを挙げることができる。また、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなど）などの生体を用いて、被験物質を直接皮膚に塗布する方法、被験物質を経口投与する方法でもよい。
皮膚細胞及び／又は皮膚組織の培養時間は特に限定されず、皮膚細胞及び／又は皮膚組織における分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であればよい。例えば、皮膚細胞としてヒト正常表皮角化細胞を用いた場合には、１２〜４８時間が適当であり、１２〜２４時間が好ましい。ここで、「皮膚細胞及び／又は皮膚組織を培養する」とは、皮膚細胞及び／又は皮膚組織を生育・増殖させることを言い、これには、単離した皮膚細胞及び／又は皮膚組織を生育・増殖させることの他、皮膚細胞や皮膚組織を有する生体自体を生存させること、飼育すること、養うことなども含まれる。
比較の対照となる皮膚細胞及び／又は皮膚組織は、被験物質を接触させる前の皮膚細胞及び／又は皮膚組織であってもよいし、被験物質を接触させないこと以外は同様の処理を行った皮膚細胞及び／又は皮膚組織であってもよい。
【００５０】
分泌タンパク質及び／又は細胞内タンパク質は、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ、ＧＲＰ ９４、ＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅｎｏｌａｓｅ−１、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ｅｚｒｉｎ、Ｒａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １３、Ｋｅｒａｔｉｎ １４、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １６、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｋｅｒａｔｉｎ １９、Ｋｅｒａｔｉｎ ２０およびβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群より選択されることが好ましい。
【００５１】
本発明の１例として、表皮角化細胞の老化に伴いＧＲＰ ９４、ＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅｎｏｌａｓｅ−１、Ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、Ｅｚｒｉｎ、Ｒａｄｉｘｉｎ、Ｍｏｅｓｉｎ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １３、Ｋｅｒａｔｉｎ １４、Ｋｅｒａｔｉｎ １５、Ｋｅｒａｔｉｎ １６、Ｋｅｒａｔｉｎ １８、Ｋｅｒａｔｉｎ １９およびＫｅｒａｔｉｎ ２０の発現量は増加していることから、被験物質を接触させた皮膚細胞及び／又は皮膚組織において、これらのマーカータンパク質の発現量が対照と比較して減少しており、被験物質がこれらのマーカータンパク質の発現を減少させる効果がある評価できた場合には、この被験物質は、皮膚の老化防止に効果がある物質と同定することができる。
【００５２】
また、本発明の別の例として、表皮角化細胞の老化に伴い、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ，Ｋｅｒａｔｉｎ ７の発現量は減少していることから、被験物質を接触させた皮膚細胞及び／又は皮膚組織において、これらのマーカータンパク質の発現量が対照と比較して増加しており、被験物質がこれらのマーカータンパク質の発現を増加させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、皮膚の老化防止に効果がある物質と同定することができる。
【００５３】
本発明のさらに別の例として、表皮角化細胞の老化に伴い、β２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎの切断型に対する非切断型の比率が増加していることから、被験物質を接触させた皮膚細胞及び／又は皮膚組織において、β２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎの切断型に対する非切断型の比率が対照と比較して減少しており、被験物質がβ２−ｍiｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎの切断型に対する非切断型の比率を減少させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、皮膚の老化防止に効果がある物質と同定することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
実験方法
１．細胞培養
正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ，Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を無血清基礎培地（ＫＢＭ，Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に添加因子（０．１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．０３ｍｇ／ｍｌ ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｍｅｄｉｕｍ、５μｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ、０．５μｇ／ｍｌ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、ＧＡ−１０００）を添加した培地ＫＧＭ（＋）を使用して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養液上清（ＣＭ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）および細胞抽出物（ＣＬ；Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）の回収用には、細胞を５×１０５個／１５０ｍｍディッシュに播き、２日おきに培地交換し、飽和するまで培養した。継代用には、細胞を１×１０５個／６０ｍｍディッシュに播き、２日おきに培地交換し、８０％飽和になった段階で継代した。ＮＨＥＫはおおよそ５代目まで継代培養でき、今回の実験においては５代目を老化した細胞として使用した。
【００５５】
２．正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）の各継代数におけるＳＡ−β‐Ｇａｌの測定
ＮＨＥＫの各継代数におけるＳＡ−β‐ＧａｌをＳｅｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて測定した。継代用とは別に細胞を１×１０５個／６０ｍｍディッシュで３ディッシュに播き、８０％飽和になった段階で細胞を２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド水溶液中で、室温で７分間固定した。さらに１×ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて３７℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔで染色した。３ディッシュ各々について、細胞１００個当たりのＳＡ−β‐Ｇａｌ染色細胞数を計測した。
【００５６】
３．ＣＭおよびＣＬの調製
３−１．ＣＭの調製
ＮＨＥＫが飽和したディッシュをＫＢＭで２回洗い、ＫＢＭに交換して１日培養し、添加因子を完全に取り除いた。さらにＫＢＭに交換して２日後にＣＭを回収した。回収したＣＭは１３０×ｇで１０分間遠心して浮遊細胞を除いた後、１０，０００×ｇで３０分間遠心し、その上清を回収した。このＣＭに硫酸アンモニウム（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）を８０％飽和になるように加えて、撹拌しながら完全に溶解させて４℃で一晩おいた。その後、２５，０００×ｇで３０分遠心してタンパク質を沈澱させた。沈殿物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で５００倍濃縮になるように溶解し、ＣＭを濃縮した。さらに、この濃縮したＣＭを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で透析した。
ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質を定量し、ウェスタンブロッティング用のサンプルとして使用した。二次元電気泳動用には、調整したＣＭを凍結乾燥し、乾燥粉末を最終的に５００倍濃縮になるように二次元電気泳動用サンプル調製液｛６．５Ｍ ｕｒｅａ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、１．５Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．１５％ ＳＤＳ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、０．８５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、０．４％ＣＨＡＰＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２．５ｍＭ ｔｒｉｂｕｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）｝に溶解し、ドット・ブロット法によりタンパク質を定量した。
３−２．ＣＬの調整
ＣＭを回収した後のディッシュをＰＢＳ（−）で３回洗浄後、−３０℃で凍結し、細胞膜を破壊した。その後、セルスクレーパー（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて細胞を回収した後、３０秒間超音波処理した。１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えた後、４℃で３０分間放置した。その後、１５，０００×ｇ、３０分間遠心し、不溶物を取り除き、上清をサンプルとした。ドット・ブロット法によりタンパク質を定量し、ウェスタンブロッティング用のサンプルとして使用した。
【００５７】
４．タンパク質の二次元電気泳動（２−ＤＥ）解析
４−１．１次元目等電点電気泳動
６０μｇのタンパク質をゲル膨潤液｛５Ｍ ｕｒｅａ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、２Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、 ０．５％ ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ（ｐＨ ３．５〜１０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．００２５％ ｏｒａｎｇｅ Ｇ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、２．５ｍＭ ｔｒｉｂｕｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００｝に全量が３４０μｌになるように混合した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ Ｄｒｙ−Ｓｔｒｉｐ ｇｅｌ（１８ｃｍ、ｐＨ３−１０、ＮＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加し、２０℃で一晩膨潤させた。電気泳動装置（Ａｎａｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、１次元目は２０℃で５００Ｖ−２時間、７００Ｖ−１時間、１０００Ｖ−１時間、１５００Ｖ−１時間、２０００Ｖ−１時間、３０００Ｖ−１時間、３５００Ｖ−１０時間のプログラムで等電点電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＳＤＳ平衡化バッファー｛５．８Ｍ ｕｒｅａ、０．０６Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ、 ０．５％ ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ，Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、０．００２５％ ＢＰＢ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）｝に浸して室温で１時間平衡化した。
【００５８】
４−２．２次元目ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
２次元目はＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ系のバッファー｛陰極バッファー：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、０．０５％ ＳＤＳ、陽極バッファー：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）｝を用いて１８ｃｍ×１８ｃｍの７．５％アクリルアミドゲルによりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
４−３．電気泳動ブロット法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のゲルを、セミドライタイプ転写装置（Ｎｉｈｏｎ Ｅｉｄｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて、２０ｃｍ×２０ｃｍのＰＶＤＦ膜 ｛ＰｒｏＢｌｏｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）｝に１５０ｍＡの定電流で２時間転写した。転写バッファーは陽極１液：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．４）、２０％ メタノール（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、陽極２液：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．４）、２０％ メタノール、陰極液：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．４）、２０％ メタノール、４０ｍＭ ６−ａｍｉｎｏ ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）を用いた。転写後はＴＴＢＳバッファー｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、０．３％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で２０分間、３回洗浄した後、純水で２分間、３回洗浄した。次にＰＶＤＦ膜をビニール膜にシーリングして５０ｍｌの金コロイド溶液｛Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）｝に浸し、１〜２時間振盪させてタンパク質を染色した。その後、金コロイド溶液を除き、純水で１分間、５回洗浄した後、乾燥させた。
【００５９】
５．タンパク質の同定
５−１．ＰＶＤＦ膜に転写されたタンパク質の還元Ｓ−アルキル化とプロテアーゼ消化
ＰＶＤＦ膜に転写されたタンパク質のスポットを切り取り、チューブに入れて還元用バッファー｛８Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、０．５Ｍ Ｔｒｉｓｂａｓｅ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、０．３％ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）、５％ アセトニトリル（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）を１００〜３００μｌ加えた。還元用バッファーに溶解したＤＴＴ１ｍｇを加えてチューブ内を窒素ガスに置換して室温、１時間静置してタンパク質を還元した。その後、１Ｍ ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）に溶解したモノヨード酢酸（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）３ｍｇを加えて遮光状態で１５〜２０分間撹拌を続けてＳ−カルボキシメチル化を行った。ＰＶＤＦ膜を取り出し純水で５分間撹拌洗浄後、２％アセトニトリル（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）中で同様に撹拌した。ＰＶＤＦ膜を取り出しＬｙｓ−Ｃ消化用バッファー｛７０％ アセトニトリル／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）｝を入れたチューブに移し２〜３回すすいだ後、Ｌｙｓ−Ｃ消化用バッファーに浸して１時間プロテアーゼ消化した。
５−２．質量分析とペプチドマスフィンガープリンティング
プロテアーゼ消化した溶液を蒸留水で７倍希釈してアセトニトリル濃度を１０％にした。前処理としてＺｉｐＴｉｐｃ１８ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の充填剤部分を活性化するために５０％ アセトニトリル／０．１％ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ，Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．）で数回、２％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで数回吸引、排出を繰り返した。次に活性化したＺｉｐＴｉｐｃ１８ピペットチップでプロテアーゼ消化液を数回吸引、排出して断片化ペプチドを充填部分に吸着させた。さらに２％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡを数回吸引、排出して塩類を除いた。５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡに溶解した飽和マトリックス溶液０．５〜１．０μｌを吸引して１０秒間程置いた後、質量分析計の付属のターゲットプローブに滴下した。サンプルを乾固させ、質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）で測定した。得られた質量値をもとにデータベース（ＭＳ−Ｆｉｔ，Ｍａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ）を用いてタンパク質の同定を行った。
【００６０】
６．ウェスタンブロット法
ウェスタンブロット用のサンプルを用いてＬａｅｍｍｌｉのＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎ系によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル中のタンパク質を１ｃｍ２あたり０．８ｍＡの定電流でＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に転写後、５％ スキムミルク／ＰＢＳ（−）に浸して、４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔでブロッキングした。ＰＶＤＦ膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、１次抗体溶液に浸して室温で１時間振盪した。
【００６１】
使用した１次抗体の種類と希釈率は次の通りである：ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍａｓｐｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｃｙｓｔａｔｉｎ Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ＰＡＩ−１ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｉｏｐｏｏｌ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｔｎｉ−ＰＡＩ−２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｕＰＡ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１０００倍希釈）、ｒａｔ ａｎｔｉ−ＧＲＰ９４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｅｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＳＰ７０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＳＰ９０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｅｎｏｌａｓｅ−１ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｅｚｒｉｎ／ｒａｄｉｘｉｎ／ｍｏｅｓｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｇｅｌｓｏｌｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｇａｌｅｃｔｉｎ−１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｇａｌｅｃｔｉｎ−３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｇａｌｅｃｔｉｎ−７ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１０００倍希釈）、ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ＩＧＦＢＰ−３ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） (１０００倍希釈)、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ７ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（５００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（５００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（５００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１６ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（５００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１７ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（１０００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）（５００倍希釈）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（５００倍希釈）
【００６２】
１次抗体として、ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ＰＡＩ−１ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍｏｕｓｅ ａｔｎｉ−ＰＡＩ−２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｕＰＡ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙを使用した場合は、２次抗体としてｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１０００倍希釈）またはｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１０００倍希釈）を用いた。２次抗体溶液に浸して室温で１時間振盪した。次に、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｖｉｄｉｎ Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１０００倍希釈）溶液に浸して室温で１時間反応させた。次に、０．６ｍｇ／ｍｌ ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１．２ｍｇ／ｍｌ ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ）て発色させた。
【００６３】
上記以外の１次抗体を使用した場合は、２次抗体としてＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０００倍希釈）、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０００倍希釈）、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０００倍希釈）またはＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）（５０００倍希釈）を使用した。次にＥｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出した。
【００６４】
７．皮膚老化マーカーとしての判定
ウェスタンブロット法により検出したタンパク質の発現量をＮＩＨ ｉｍａｇｅにより数値化し、５代目のタンパク質の発現量を２代目のタンパク質の発現量で割った値を算出した。算出した値が２．０以上の場合は表皮角化細胞の老化に伴い発現量が有意に増加したと判定し、０．５未満の場合は表皮角化細胞の老化に伴い発現量が有意に減少したと判定した。一方、算出した値が０．５以上２．０未満の場合は表皮角化細胞の老化に伴う発現変化はないと判定した。
【００６５】
実験結果
１．表皮角化細胞の老化に伴う形態変化
ヒト正常細胞は一定回数分裂すると増殖が停止する。この現象は細胞老化と呼ばれるが、この分裂回数は細胞種によって異なる。今回実験で用いたヒト表皮角化細胞は繰り返し継代することによりおおよそ５代目で増殖が停止する。図１（ａ）では１５０ｍｍディッシュが飽和になるまでの日数を各継代数でプロットしたものを示している。ディッシュが飽和になるまでの日数が１代目では６日間かかったのに対して５代目では２８日間と１代目〜５代目まで指数関数的に増殖速度が遅くなっている。さらに６代目では完全に増殖が停止した。また、細胞の形態も２代目に比べて５代目では細胞の大きさが２倍程大きくなり、細胞老化で観察される扁平肥大化の形態を示した｛図１（ｂ）｝。
また、繰り返し継代した表皮角化細胞の増殖が低下する原因として、細胞老化あるいは最終分化の可能性がある。そこで、実際に表皮角化細胞が老化しているかを判別するために、最終分化では発現せず、細胞老化でのみ発現することが知られており、表皮角化細胞の老化と皮膚組織での老化のマーカーとして同定されたＳＡ−β−Ｇａｌの活性を調べた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，９３６３−９３６７，１９９５）。２代目ではＳＡ−β−Ｇａｌを示すような青く染色された細胞は見られなかったが、５代目では青く染色された細胞が約半数まで増えた（図２）。
以上の結果から２代目の細胞を若い細胞、５代目の細胞を老化細胞として用いて、細胞老化マーカーの探索を行った。
【００６６】
２．表皮角化細胞の老化に伴って変化する分泌タンパク質の二次元電気泳動による解析
２〜５代目のＣＭを調製し、２次元電気泳動により発現が変化するタンパク質を解析した（図３）。若い細胞（２代目）と老化した細胞（５代目）の細胞培養上清液（ＣＭ）のスポットを比較したところ、細胞老化に伴って発現が減少したタンパク質が１９個（表１）、細胞老化に伴って発現が増加したタンパク質が４９個同定された（表２）。同定されたタンパク質にはＭａｓｐｉｎ、Ｃｙｓｔａｔｉｎ ＡおよびＨＳＰ ２７など既知の皮膚老化マーカーが含まれており、本試験で実施した２次元電気泳動による解析は皮膚老化に伴って変化するタンパク質を同定するのに適切な方法であると考えられた。本試験では超微量タンパク質（１ ｆｅｍｔｏ−ｍｏｌ以下）の同定を可能とする技術を用いたことから、既知の皮膚老化マーカータンパク質以外にも新規の皮膚老化マーカータンパク質が同定された。表皮角化細胞の老化に伴って発現が減少した主な分泌タンパク質としてはβ−２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＰＡＩ−１およびＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７等が同定された。一方、表皮角化細胞の老化に伴って発現が増加した分泌タンパク質としてはＭｏｅｓｉｎ、Ｋｅｒａｔｉｎ １およびＫｅｒａｔｉｎ ９等が同定された。
【００６７】
２次元電気泳動解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が減少したタンパク質を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0005596742.tif 000002
【００６９】
２次元電気泳動解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が増加したタンパク質を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0005596742.tif 000003
【００７１】
３．表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化する分泌タンパク質および細胞内タンパク質のウェスタンブロッティングによる解析
上記のタンパク質の老化に伴う発現変化をさらに確認するために、それぞれの抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。２次元電気泳動による分析ではタンパク質量をそろえて比較解析した。しかし、表皮角化細胞は老化とともに形態も変化し扁平肥大化することから、同じ飽和状態でも細胞数が異なってくる。実際に細胞１個当たりの分泌タンパク質量を計算すると細胞培養上清液（ＣＭ）、細胞溶解液（ＣＬ）、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のどのサンプルにおいても表皮角化細胞の老化に伴ってタンパク質量が増加することがわかった。そこで、細胞数をあわせたものとタンパク質量をあわせたものの２つのサンプルについて、ウェスタンブロッティングにより各タンパク質の発現量の変化を調べた。細胞数をあわせたものとタンパク質量をあわせたもので、どちらが表皮角化細胞の老化を調べる上で適しているかを検証するために、皮膚老化に伴ってダメージが蓄積する皮膚基底膜の主要構成成分であり、基底膜ケアの重要な成分であるＬａｍｉｎｉｎ ５（Ｌａｍｉｎｉｎ α３、Ｌａｍｉｎｉｎ β３、Ｌａｍｉｎｉｎ γ２の３量体）｛Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．，総説,３５（１）,１−７,２００１｝および皮膚老化に伴って発現が低下することが知られているＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ｛Ａｎｎ Ｐａｔｈｏｌ．,４（３），１８５−９４，１９８４｝の発現変化を調べた。その結果、ＣＭにおけるＬａｍｉｎｉｎ ５の発現は、細胞数であわせたものでは変化がないが、タンパク質量であわせたものでは発現量が減少した（図４）。同様に、ＣＭにおけるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎの発現は、細胞数であわせたものでは増加したが、タンパク質量であわせたものでは発現量が減少した。以上の結果から、タンパク質量をあわせたもので発現変化を解析する方が適切であることが判明した。
ここでは、各種抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果として細胞数をあわせたもの、タンパク質量をあわせたものの両方を示しているが、前述の結果からタンパク質量をあわせたものの結果により表皮角化細胞の老化との相関の有無を判断した。
【００７２】
まず、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターでは、セリンプロテアーゼインヒビターであるＭａｓｐｉｎ、ＰＡＩ−２、システインプロテアーゼインヒビターであるＣｙｓｔａｔｉｎ Ａが老化に伴って発現量が増加した｛図５（ａ）（ｂ）｝。一方、セリンプロテアーゼであるＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７、ｕＰＡ、膜結合型セリンプロテアーゼであるＭａｔｒｉｐｔａｓｅ、セリンプロテアーゼインヒビターであるＰＡＩ−１が老化に伴って発現量が減少した。また、β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎは酸性プロテアーゼにより切断を受けることが知られているが、老化に伴って切断型（１３ｋＤａ）が減少し、非切断型（１４ｋＤａ）が増加することがわかった｛図５（ａ）｝。
細胞内タンパク質である熱ショックタンパク質の一種であるＨＳＰ ７０、ＨＳＰ ９０、ＧＲＰ ９４（ＧＲＰ ９４のみシグナルペプチドを持つ）は老化に伴ってＣＭへの分泌が多くなるが、ＣＬでの発現量は変化しなかった（図６）。
細胞内の解糖系酵素であるＥｎｏｌａｓｅ−１、細胞膜のリン脂質と結合するＡｎｎｅｘｉｎ ＩＩ、細胞骨格系タンパク質であるＥｚｒｉｎ／Ｍｏｅｓｉｎ／Ｒａｄｉｘｉｎは老化に伴ってＣＭへの分泌量が増加することがわかった（図７）。細胞骨格系タンパク質であるＧｅｌｓｏｌｉｎはＣＭへの分泌量は変化しなかったが、ＣＬでの発現量は増加した（図７）。
レクチンファミリーの１つであるＧａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７およびＩＧＦＢＰ−３は表皮角化細胞の老化に伴って細胞外に分泌されたタンパク質の発現量が有意に増加した（図８）。一方、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７およびＩＧＦＢＰ−３はＣＬには検出されなかった（図８）。
細胞骨格系タンパク質であるＫｅｒａｔｉｎの中で１３種類（Ｋｅｒａｔｉｎ ３、５、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０）について調べた。その結果、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、１３、１４、１５、１６、１８、１９および２０は表皮角化細胞の老化に伴い細胞内での発現が有意に増加した（図９）。一方、ケラチン７は表皮角化細胞の老化に伴い細胞内での発現が有意に減少した（図９）。Ｋｅｒａｔｉｎ ３、５、８および１７は発現が変化しなかった。Ｋｅｒａｔｉｎ類はＣＭには検出されなかった。
１次元ウェスタンブロッティング解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化したタンパク質を表３にまとめた。
【００７３】
１次元ウェスタンブロッティング解析により表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化したタンパク質を表３に示す。
【００７４】
【表３】
0005596742.tif 000004
【００７５】
〔実施例２〕
実験方法
１．目尻の弾力性およびしわ体積率の測定
２０〜６０歳代の女性５９名を対象に、目尻の弾力性およびしわ体積率を測定した。目尻の弾力性は吸引弾力性をＣｕｔｅｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｒａｇｅ ＋ Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ）により測定した。吸引弾力性は、肌の弾力性の指標となる測定方法であり、加齢に伴って弾力性が低下することが明らかになっている。目尻のしわ体積率は、二剤混合型レプリカ剤であるスキンキャスト（Ｙａｍａｄａ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて目尻のレプリカを採取し、レプリカ画像解析によりしわの体積率を計測した。レプリカ画像解析は反射用レプリカ解析システムＡＳＡ−０３ＲＸＤを使用して行った。ＡＳＡ−０３ＲＸＤを用いて、採取したレプリカに角度30度の平行光を照射する事により得られるシワの形状に応じた陰影画像をＣＣＤカメラで撮像し、コンピュータに取り込み画像処理することでレプリカ表面のしわ体積率（μｍ３／ｍｍ２／１００）を計測した。しわ体積率は、加齢に伴って増加することが明らかになっている。
【００７６】
２．目尻の角層からのタンパク質の抽出
２０〜６０歳代の女性５９名を対象に、目尻から角層チェッカー（Ａｓａｈｉｂｉｏｍｅｄ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて角層を剥離し、そこからタンパク質抽出溶液を用いてタンパク質を抽出した。具体的には、被験者の目尻に角層チェッカーを貼り、指先で軽く擦り付けた。これを３回繰り返した。その後、３枚の角層チェッカーに貼り付いた角層にそれぞれ５０μｌのタンパク質抽出溶液｛５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｉｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）｝を加え、セルスクレーパーを用いて角層をタンパク質抽出溶液に馴染ませた後、溶液を１．５ｍｌのプラスチックチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ）に回収した。
１０，０００×ｇ、１５分間遠心し、不溶物を沈殿させ、上清を新しい１．５ｍｌのプラスチックチューブに回収した。回収したサンプルのタンパク質量をＤＣ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定した。
３．皮膚老化マーカーの測定
目尻角層から抽出したタンパク質１０μｇを用いて、実施例１に記載したＫｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ１５およびＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７の抗体を用いてウェスタンブロット法により検出した。検出したバンドの強度をデンシトロメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｎａｍｉｃｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）により測定し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅにより数値化した。
【００７７】
実験結果
表皮角化細胞の老化に伴って発現が変化するタンパク質の中で、Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０、Ｋｅｒａｔｉｎ １５およびＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７についてヒトの皮膚老化度との相関があるかどうかを調べた。
ＫｅｒａｔｉｎについてはＫｅｒａｔｉｎ １０が皮膚老化に伴って発現が低下することが明らかになっていることから、Ｋｅｒａｔｉｎ １０とＫｅｒａｔｉｎ ７およびＫｅｒａｔｉｎ １５でどの種類のＫｅｒａｔｉｎがヒトの皮膚老化度との相関があるかどうかを調べた。Ｋｅｒａｔｉｎ １０とＫｅｒａｔｉｎ １５の年齢との相関を調べた結果、Ｋｅｒａｔｉｎ １０は年齢との相関は見られず、Ｋｅｒａｔｉｎ １５は年齢との相関が見られたことから、Ｋｅｒａｔｉｎ １５は既存の皮膚老化マーカーに比べてもより適切な皮膚老化マーカーであることが明らかになった（図１０および図１１）。
ヒトの皮膚老化度の指標として、加齢との相関が明らかになっている目尻の弾力性としわ体積率を用いた。本試験で皮膚老化度を測定した２０〜６０歳代の女性５９名においても、加齢に伴って目尻の弾力性は有意に減少し、しわ体積率は有意に増加した（図１２および１３）。
Ｋｅｒａｔｉｎ ７の発現量と目尻の弾力性との相関を図１４に、Ｋｅｒａｔｉｎ １５の発現量と目尻の弾力性との相関を図１５に示した。Ｋｅｒａｔｉｎ ７の発現量は目尻弾力性の低下に伴って有意に減少し、ケラチン１５の発現量は目尻弾力性の低下に伴って有意に増加した。Ｋｅｒａｔｉｎ ７の発現量としわ体積率との相関を図１６に、Ｋｅｒａｔｉｎ １５の発現量としわ体積率との相関を図１７に示した。Ｋｅｒａｔｉｎ ７の発現量は目尻しわ体積率の増加に伴って有意に減少し、ケラチン１５の発現量は目尻しわ体積率の増加に伴って有意に増加した。
また、Ｋａｌｌｉｌｒｅｉｎ ７について皮膚老化度と発現の相関を調べた。Ｋａｌｌｉｌｒｅｉｎ ７の発現量と目尻の弾力性との相関を図１８に、Ｋａｌｌｉｌｒｅｉｎ ７の発現量と目尻のしわ体積率との相関を図１９に示した。Ｋａｌｌｉｌｒｅｉｎ ７の発現量は目尻弾力性の低下に伴って有意に減少し、目尻のしわ体積率の増加に伴って有意に減少した。
以上の結果から、表皮角化細胞の細胞老化を指標に見出した３種のマーカー（Ｋｅｒａｔｉｎ ７、Ｋｅｒａｔｉｎ １０およびＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７）がヒトの皮膚老化度と相関することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
細胞老化に伴って発現が増加あるいは減少するタンパク質および切断型から非切断型に変化するタンパク質を見出した。これら新たに見つかったタンパク質は皮膚老化の診断マーカーとして化粧品のカウンセリングシステム等への応用が期待出来る。また、これらのタンパク質の発現を指標としてより有効な化粧品や健康食品を開発することも期待できる。
【図１】
0005596742.tif 000005
【図２】
0005596742.tif 000006
【図３】
0005596742.tif 000007
【図４】
0005596742.tif 000008
【図５（ａ）】
0005596742.tif 000009
【図５（ｂ）】
0005596742.tif 000010
【図６】
0005596742.tif 000011
【図７】
0005596742.tif 000012
【図８】
0005596742.tif 000013
【図９】
0005596742.tif 000014
【図１０】
0005596742.tif 000015
【図１１】
0005596742.tif 000016
【図１２】
0005596742.tif 000017
【図１３】
0005596742.tif 000018
【図１４】
0005596742.tif 000019
【図１５】
0005596742.tif 000020
【図１６】
0005596742.tif 000021
【図１７】
0005596742.tif 000022
【図１８】
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【図１９】
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