(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式のいずれかで表されるペプチド−ポリマー共役体：
【化１】
0005639585.tif 000025
式中、ｍＰＥＧは分子量２０ｋＤを有するメトキシキャップされたポリエチレングリコー
ル部分であり、ＥＰＯはエリスロポエチン部分であり、ＧＨは成長ホルモン部分である。
【請求項２】
前記共役体が
【化２】
0005639585.tif 000026
式中、ｍＰＥＧは分子量２０ｋＤを有するメトキシキャップされたポリエチレングリコー
ル部分である、
である、請求項１の共役体。
【請求項３】
前記共役体が
【化３】
0005639585.tif 000027
式中、ｍＰＥＧは分子量２０ｋＤを有するメトキシキャップされたポリエチレングリコー
ル部分であり、ＥＰＯはエリスロポエチン部分である、
である、請求項１の共役体。
【請求項４】
前記共役体が
【化４】
0005639585.tif 000028
式中、ｍＰＥＧは分子量２０ｋＤを有するメトキシキャップされたポリエチレングリコー
ル部分であり、ＧＨは成長ホルモン部分である、
である、請求項１の共役体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照項
本出願は、２００８年７月３１日に出願された米国仮出願第６１／０８５，０７２号の優先権を主張するものであり、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞生物学および組み換えタンパク質の技術はタンパク質治療の発展をもたらしている。
【０００３】
それにも関わらず、未だ大きな障壁が存在している。ほとんどのタンパク質はタンパク質分解され、したがって循環期間が短い。低い水溶性と抗体の中和を誘起するという他の欠点も含む。
【０００４】
ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がタンパク質へ付着すると、タンパク質分解酵素のタンパク質骨格へ到達が阻害され、結果としてタンパク質の安定性が増大する。さらに、水溶性も改善し、免疫力が最小になる。ポリマーをタンパク質へ付着する効果的な方法が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明の一形態は化学式Ｉのポリマー−ポリペプチド共役体に関する：
【０００６】
【化１】
0005639585.tif 000002
【０００７】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−１０のアルキル、Ｃ２−１０のアルケニル、Ｃ２−１０のアルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−８のシクロアルキルまたはＣ３−８のヘテロシクロアルキルであり；Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、ポリマー部分（例えば、ポリアルキレンオキサイド部分）であり；Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３は、それぞれ独立して、結合または結合性官能基であり；Ｐはインターフェロン−β（ＩＮＦ−β）部分、エリスロポエチン（ＥＰＯ）部分、または成長ホルモン（ＧＨ）部分であり、；ｍは０または１〜１０の整数であり；およびｎは１〜１０の整数である。これらの共役体において、ＩＮＦ−β部分、ＥＰＯ部分、またはＧＨ部分のＮ末端はＧ３と結合している。
【０００８】
上記式において、前記ポリマーポリペプチド共役体は以下の特徴の１以上を有している；Ａ１およびＡ２は分子量２〜１００ｋＤ（好ましくは１０〜３０ｋＤ、具体的には２０ｋＤ）を有するポリアルキレンオキサイド基である；Ｇ１およびＧ２は、それぞれ、
【０００９】
【化２】
0005639585.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｏ原子はＡ１またはＡ２に結合し、Ｎ原子は化学式Ｉに示される炭素原子と結合している）である；Ｇ１およびＧ２は、それぞれ、尿素、スルホンアミドまたはアミド（その中のＮ原子は化学式Ｉに示される炭素原子に結合している）である；ｍは４である；ｎは２である；ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれＨである。これらの共役体のいくつかにおいて、ＰはｒＩＮＦ−β Ｓｅｒ１７またはＩＮＦ−βのＮ末端に１〜４の追加のアミノ酸残基を含む修飾ＩＮＦ−β部分である。
【００１１】
本発明の他の実施態様は化学式ＩＩのポリマー−ペプチド共役体に関する：
【００１２】
【化３】
0005639585.tif 000004
【００１３】
式中、Ａはポリマー部分（例えば、ポリアルキレンオキサイド基）であり；Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して、結合または結合性官能基であり；ＬはＣ２−１０のアルケニレンまたはＣ２−１０のアルキニレンであり；およびＰはＩＮＦ−β部分、ＥＰＯ部分またはＧＨ部分である。これらの共役体において、ＩＮＦ−β部分、ＥＰＯ部分またはＧＨ部分のＮ末端はＧ２に結合している。
【００１４】
化学式ＩＩにおいて、前記ポリマー−ペプチド共役体は以下の特徴の１以上を有している：Ａ１およびＡ２は分子量２〜１００ｋＤ（好ましくは１０〜３０ｋＤ、具体的には２０ｋＤ）を有するポリアルキレンオキサイド基である；Ｇ１およびＧ２は結合である；Ｃ６はアルケニレンである；ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ水素である。
【００１５】
本発明の他の実施態様は化学式ＩＩＩのポリマー−ペプチド共役体に関する：
【００１６】
【化４】
0005639585.tif 000005
【００１７】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−１０のアルキル、Ｃ２−１０のアルケニル、Ｃ２−１０のアルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−８のシクロアルキルまたはＣ３−８のヘテロシクロアルキルであり；ｎは２〜１０の整数であり；Ａはポリマー部分であり；Ｇは結合性官能基であり；およびＰはペプチド部分であり、前記ペプチド部分のＮ末端の窒素原子が上記式中に示される
【００１８】
【化５】
0005639585.tif 000006
【００１９】
部分における炭素原子に結合している。
【００２０】
化学式ＩＩにおいて、前記ポリマー−ペプチド共役体は１以上の以下の特徴を有している；ｎは１である；Ａは分子量１０〜４０ｋＤまたは２０〜３０ｋＤを有しているポリアルキレンオキサイド部分である；Ｇは
【００２１】
【化６】
0005639585.tif 000007
【００２２】
であり、式中Ｏ原子はＡに結合しており、Ｎ原子は炭素原子に結合している；およびＰはＩＮＦ部分、ＥＰＯ部分、ＧＨ部分である。
【００２３】
本明細書で使用されている「Ｃ１−１０のアルキル」との語は、１〜１０の炭素原子を含む直鎖状または分枝状炭化水素の一価のラジカルを意味する。アルキル基の具体例はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルを含む。同様に、「Ｃ２−１０のアルケニル」との語は、２〜１０の炭素原子および１以上の二重結合を含む直鎖状または分枝状炭化水素の一価のラジカルを意味する。「Ｃ２−１０のアルキニル」との語は、２〜１０の炭素原子および１以上の三重結合を含む直鎖状または分枝状炭化水素の一価のラジカルを意味する。「Ｃ２−１０のアルケニレン」との語は、２〜１０の炭素原子および１以上の二重結合を含む直鎖状または分枝状炭化水素の二価のラジカルを意味する。「Ｃ２−１０のアルキニレン」との語は、２〜１０の炭素原子および１以上の三重結合を含む直鎖状または分枝状炭化水素の二価のラジカルを意味する。
【００２４】
本明細書で使用されている「アリール」との語は、少なくとも一つの芳香環を有する炭化水素環システム（単環または二環）を意味する。アリール部分の具体例は、限定されないが、フェニル、ナフチル、およびピレニルを含む。
【００２５】
本明細書で使用されている「ヘテロアリール」との語は、環システムの部分にＯ、ＮまたはＳのような少なくとも一つのヘテロ原子を含み、残りが炭素である少なくとも一つの芳香環を有する炭化水素環システム（単環または二環）について使用されている。ヘテロアリール部分の具体例は、限定されないが、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、キナゾリニルおよびインドリルを含む。
【００２６】
本明細書で使用されている「シクロアルキル」との語は、炭素のみを環原子に有している部分的にまたは完全に飽和している単環または二環システムについて使用されている。具体的には、限定されないが、シクロプロパニル、シクロペンタニルおよびシクロヘキサニルを含む。
【００２７】
本明細書で使用されている「ヘテロシクロアルキル」との語は、環原子として、炭素に加えて、一以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）を有している単環または二環システムについて使用されている。具体的には、限定されないが、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンおよび１，４−オキサゼパンを含む。
【００２８】
本明細書で使用されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アルケニレン、アルキニレン、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは置換および非置換部分の両方を含む。置換基の具体例はＣ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキル、Ｃ５−Ｃ８のシクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ２０のジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボキシルおよびカルボン酸エステルを含む。
【００２９】
「ポリマー部分」との語は直鎖状、分枝状または星型ポリマー由来の一価のラジカルを意味する。ポリマー部分の分子量は２〜１００ｋＤであってもいい。ポリマー部分の具体例は、限定されないが、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリイソプロピレンオキサイド、ポリブテニレンオキサイド、ポリエチレングリコールおよびそれらのコポリマーを含む。デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドまたはカルボハイドレートに基づくポリマーのような他のポリマーも、それらが抗原性、毒性または免疫応答を引き起こさない限り使用されうる。
【００３０】
「ポリペプチド部分」との語は、天然ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのどちらかに由来する一価のラジカルを意味する。前記天然のペプチドはＩＮＦ−α２ｂ、ＩＮＦ−β、ＧＨ、ＥＰＯおよび顆粒球コロニー刺激因子、または抗体でありうる。前記修飾ペプチドは、例えばＩＮＦ−α２ｂのＮ末端にＩＮＦおよび１〜４の追加のアミノ酸残基を含むペプチドでありうる。そのような修飾ＩＮＦの具体例は、
【００３１】
【化７】
0005639585.tif 000008
【００３２】
であり、ＩＮＦはＩＮＦ−α２ｂ部分を表し、そのＮ末端のアミノ基がカルボニル基に結合している。
【００３３】
「インターフェロンβ」との語は、ウィルス増殖および細胞増殖を抑制しならびに免疫反応を調節する高度に同一のタンパク質類を意味する。Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）．  Ｎａｔｕｒｅ  ２８５  （５７６６）：  ５４２-７；およびＴａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）．  Ｇｅｎｅ  １０（１）：１１-５を参照。天然のＩＮＦβ類およびそれらの機能的等価体、すなわち、ポリペプチドは少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）野生型カウンターパートと同一である。ＩＮＦ−βの具体例はＡｖｏｎｅｘ、ＢｅｔａｓｅｒｏｎおよびＲｅｂｉｆのような購入可能な薬に有効成分を含んでいる。例えば、Ｅｔｅｍａｄｉｆａｒ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．，  ２００６，  １１３（５）：  ２８３−７を参照。
【００３４】
以下に列挙されるものは典型的なヒトＩＮＦ−βタンパク質の前駆体または成熟体のどちらかのアミノ酸配列である。
【００３５】
【化８】
0005639585.tif 000009
【００３６】
【化９】
0005639585.tif 000010
【００３７】
一例において、ＩＮＦ−βは変異ｒＩＮＦ−β  Ｓｅｒ１７（組み換えＩＮＦ−βであって、セリンが天然の成熟ＩＮＦ−β配列における１７位のシステインの位置にある）である。当該成熟体のアミノ酸を以下に示す：
【００３８】
【化１０】
0005639585.tif 000011
【００３９】
他の例において、前記ＩＮＦ−βは修飾された天然ＩＮＦ−βであって、１〜４の追加のアミノ酸残基が前記天然ＩＮＦ−βのＮ末端に結合している。
【００４０】
肝臓または腎臓で生成されたＥＰＯは赤血球生成または赤血球の生成を調製する糖タンパク質ホルモンである。それは天然ＥＰＯおよびその機能的等価体の両方を含む。米国特許第５，６２１，０８０号および米国特許出願公開第２００５０１７６６２７号を参照。ヒトＥＰＯのアミノ酸配列（前駆体および成熟体における）を以下に示す：
【００４１】
【化１１】
0005639585.tif 000012
【００４２】
【化１２】
0005639585.tif 000013
【００４３】
本発明の共役体を作製するのに使用されるＥＰＯはＥＰＯタンパク質であり、適当な種、例えばヒト、ネズミ、ブタまたはウシにより生成された前駆体または成熟体のどちらかでありうる。一例において、ＥＰＯタンパク質は、上記されている前記アミノ酸配列の一つと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）で同一のアミノ酸配列を有している。他の例において、前記ＥＰＯは１〜４の追加のアミノ酸残基が前記天然ＥＰＯのＮ末端に結合した修飾された天然ＥＰＯである。
【００４４】
「成長ホルモン」との語は、天然のヒト成長ホルモンを意味し、前駆体または成熟体のどちらかであって、その機能は様々である。すなわち、天然のヒト成長ホルモンと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一のアミノ酸配列を有しており、人成長ホルモンと同等の生理作用を有している。一例において、前記成長ホルモンは１〜４の追加のアミノ酸残基が前記天然の成長ホルモンのＮ末端に結合している修飾された天然の成長ホルモンである。前記天然のヒト成長ホルモンのアミノ酸配列（前駆体および成熟体）を以下に示す：
【００４５】
【化１３】
0005639585.tif 000014
【００４６】
【化１４】
0005639585.tif 000015
【００４７】
【化１５】
0005639585.tif 000016
【００４８】
二つのアミノ酸配列の「パーセントの同一性」はＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０とＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３において変更されているアルゴリズムを使用して決定している。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌらのＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０，  １９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質調査は前記発明で使用するためにタンパク質分子と同一のアミノ酸配列を得るためにＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語幅＝３で行われうる。ギャップが二つの配列の間に存在していることで、ギャップされているＢＬＡＳＴはＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２，  １９９７に記載されているように利用されうる。ＢＬＡＳＴとギャップされているＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムの初期設定のパラメーターが使用されうる。
【００４９】
「結合性官能基」との語は、２価の官能基を意味し、一端はポリマー部分に結合しており、他端はペプチド部分に結合している。具体的には、限定されないが、−Ｏ−、−Ｓ−、カルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カーバメート、尿素、スルフォニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネートまたはホスフェート基を含む。
【００５０】
上記のペプチド−ポリマー共役体は、可能であれば、遊離の形態または塩の形態でありうる。例えば、塩は本発明のペプチド−ポリマー共役体のアニオンと正電荷を帯びた基（例えば、アミノ）との間に形成されうる。適当なアニオンは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩を含む。同様に、塩は本発明のペプチド−ポリマー共役体のカチオンと負電荷を帯びた基（例えば、カルボン酸塩）の間に形成されうる。適当なカチオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびテトラメチルアンモニウムイオンのようなアンモニウムカチオンを含む。
【００５１】
さらに、前記ペプチド−ポリマー共役体は一以上の二重結合または一以上の不斉中心を有していてもいい。そのような共役体はラセミ体、ラセミ混合物、一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、およびシスもしくはトランスまたはＥもしくはＺ体の二重結合異性体でもありうる。
【００５２】
本発明のポリマー−ペプチド共役体の具体例は以下に示される：
【００５３】
【化１６】
0005639585.tif 000017
【００５４】
式中、ｍＰＥＧは分子量２０ｋＤを有するメトキシキャップされたポリエチレングリコールを表し、およびｒＩＮＦ−β  Ｓｅｒ１７、ＥＰＯおよびＧＨのＮ末端は上記の構造式の最も右側の炭素に結合している。
【００５５】
あるタンパク質は治療効能を有する。したがって、ペプチド部分を含んでいる本発明の共役体は、病気を治療するために使用されうる。例えば、ＩＮＦ−βはＨＣＶまたはＨＢＶ感染を治療するための免疫調節薬物である。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １３  （２００２）：  １９１−１９６を参照。このように、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染症またはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染症を上記ＩＮＦ−β−ポリマー共重合体を用いて治療する方法は本発明の範囲内に含まれる。他の例において、ＥＰＯは骨髄で赤血球の形成を促進する、腎臓より生成されるホルモンである。それは慢性腎臓疾患による貧血、エイズの抗ウィルス（ジドブジン）治療による貧血および癌に関連する貧血を治療するための免疫調節薬物として使用されている。最新の研究において、ＥＰＯは神経新生を増進し、脳卒中後の回復において重大な役割をすることがわかっている。例えば、Ｐ．  Ｔ．  Ｔｓａｉ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６，  ２６：  １２６９を参照。このように、本発明の他の態様は貧血の治療方法または上記ＥＰＯポリマー共役体による神経新生の増進方法に関係している。
【００５６】
治療的使用およびＨＣＶ感染症、ＨＢＶ感染症、もしくは貧血の治療または神経新生の増進のための薬剤を製造するための共役体の使用と同様、上記ＩＮＦ−βポリマー共役体を含む組成物をＨＣＶ感染症もしくはＨＢＶ感染症の治療へ使用し、および上記ＥＰＯポリマー共役体を含む組成物を貧血の治療または神経新生の増進へ使用するのは本発明の範囲内に含まれる。
【００５７】
本発明の一以上の具体例の詳細は以下の記載で説明される。本発明の他の特徴、目的および利益は当該記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
詳細な説明
本発明のペプチド−ポリマー共役体は化学分野でよく知られた合成方法で調製されうる。例えば、リンカー分子の官能基と反応しやすい官能基を有する二つのポリマー分子と一以上の活性な官能基を有するリンカー分子と結合することができる。実質的に官能基を有するペプチド分子は前記リンカー分子の官能基と反応し本発明のペプチド−ポリマー共役体を形成する。二つの例の合成式を本明細書に記載する。
【００５９】
以下のスキーム１は化学式Ｉのペプチド−ポリマー共役体の調製例を示している。アセタール基を有するジアミン化合物１はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートｍＰＥＧ（すなわち化合物２）と反応してジＰＥＧ化化合物３を形成し、続いてアルデヒド４に変換される。このアルデヒド化合物は遊離のアミノ基を有するペプチドＨ−Ｐと反応し還元的アルキル化を経て本発明のペプチド−ポリマー共役体を与える。
【００６０】
【化１７】
0005639585.tif 000018
【００６１】
以下のスキーム２は化学式ＩＩのペプチド−ポリマー共役体の調製例を示している。化学物質６はポリマー部分とアルデヒド官能基を有している。当該物質は遊離のアミノ官能基を有しているペプチド７と反応することができる。最終生成物８は、続けて、例えば水素化によりまたはＮａＢＨ３ＣＮにより還元され、ペプチド−ポリマー共役体９を与える。
【００６２】
【化１８】
0005639585.tif 000019
【００６３】
以下のスキーム３は化学式ＩＩＩのペプチド−ポリマー共役体の調製例である。βアミノ酸から調製されうるアセタール基を有する化合物１０はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートｍＰＥＧ２と反応してＰＥＧ化化合物１１を形成し、続いてアルデヒド１２に変換される。このアルデヒド化合物は遊離のアミノ基を有するペプチドＨ−Ｐと反応して還元的アルキル化を経て、所望の化合物１３を与える。
【００６４】
【化１９】
0005639585.tif 000020
【００６５】
上記の化学反応は溶媒、試薬、触媒、保護基および脱保護基試薬ならびに特定の反応条件を含む。それらは本明細書に具体的に記載されている工程の前後のどちらかに、ペプチド−ポリマー共役体の合成を最終的に可能とするために適当な保護基の付加または除去を含んでいてもいい。さらに、様々な合成工程は所望のポリペプチド−ポリマー共役体を与えるために順序を替えてまたはその順序で行われてもいい。応用可能なペプチド−ポリマー共役体の合成において有用な合成化学変換および保護基を用いた方法（保護および脱保護）は当業者に知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８９）；  Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｄ．  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９１）；  Ｌ．  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ，  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９４）；および  Ｌ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  ｅｄ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９５）ならびにそれらの続版に含有されている。
【００６６】
このように合成されるペプチド−ポリマー共役体はイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、電気泳動、透析、限外濾過または限界遠心分離のような方法によってさらに精製され得る。
【００６７】
本発明のペプチド−ポリマー共役体はその共役体の形状で薬学的に活性であってもいい。また、それは、前記ペプチド部分とポリマー部分との間のリンカーを酵素的に切断することで、インビボで（例えば、加水分解を経て）薬学的に活性なペプチドを放出しうる。インビボでのリンカーの切断に含まれる酵素の例は酸化的酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アミノオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼ）、還元的酵素（例えば、ケトリダクターゼ）、および加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼ）を含む。
【００６８】
このように、本発明の一態様は、病気（例えば、ＨＣＶもしくはＨＢＶ感染症、または貧血）を治療するために上記ペプチド−ポリマー共役体の一以上を有効的量投与する方法に関連している。具体的には、被験者に１以上のペプチド−ポリマー共役体を有効量投与して、病気は治療されうる。そのような被験者は適当な診断方法の結果に基づき医療従事者によって認定されうる。
【００６９】
本明細書において使用されるように、「治療している」または「治療」との語は、ペプチド−ポリマー共役体を含む組成物を、疾患、疾患の症状、疾患の２次的な病気または疾患、疾患への素因を有する者に、疾患、疾患の症状、疾患の２次的な病気または疾患または疾患への素因の治療、緩和、軽減、医療または改善する目的をもって塗布または投与することとして定義されている。「有効的な量」は治療されている被験者に治療効果を与えるペプチド−ポリマー組成物の量を意味する。当該治療効果は客観的（すなわち、いくつかの試験または標識を用いた測定）または主観的（すなわち、被験者の効果を主張または効果の感覚）であってもいい。
【００７０】
本発明の方法を実効するため、上述される組成物の一以上を有する組成物は、非経口的、経口的、経鼻的、経直腸的、局所的、または口膣的に投与されうる。本明細書で使用される「非経口的」との語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉、関節、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、腹腔内、気管内または頭蓋内注射であって、いかなる適当な注入技術であってもよいことを意味する。
【００７１】
無菌注射剤組成物は、１，３−ブタンジオール溶液のような無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶液中の溶液または懸濁液でありうる。用いられうる許容可能な賦形剤および溶媒はマニトール、水、リンゲル溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および等張食塩水である。さらに、固定油は溶媒または懸濁化剤（例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリド）として伝統的に用いられる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注射剤の調製において有用であり、天然の薬学上許容されうるオイルとしてはオリーブオイルまたはカストールオイルのようなものがあり、特にそれらのポリオキシエチル化されたものである。これらのオイル溶液または懸濁液はまた長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは同様の分散剤を含みうる。他の通常用いられているツィーン（Ｔｗｅｅｎｓ）もしくはスパン（Ｓｐａｎ）または他の同様の乳化剤または薬学上許容されうる固体、液体または他の剤形の製造において通常使用されうる生物学的増進剤もまた処方目的で使用されうる。
【００７２】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、乳化剤および水性懸濁液を含むいかなる経口に許容されうる剤形であることができる。錠剤の場合、通常使用される担体はラクトースおよびトウモロコシデンプンを含む。経口投与用のカプセル形において有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥したトウモロコシデンプンを含む。水性懸濁剤または乳化剤が経口的に投与される時、活性成分は懸濁されまたは乳化または懸濁化剤と併用される油層に懸濁されまたは溶解されうる。望むのであれば、特定の甘味料、香味料、または着色剤が加えられうる。
【００７３】
鼻エアロゾルまたは吸入組成物は薬剤処方の分野で良く知られた技術に基づき調製されうる。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、生物学的利用能を増進するための吸収促進剤、当該分野で知られているフッ化炭素および／または他の溶剤または分散剤を用いて生理食塩水の溶液として調製される。一以上の上記化合物を有している組成物は直腸投与用の座薬の形でも投与されうる。
【００７４】
薬学上許容されうる担体は日常的に一以上の活性な上述の共役体と共に使用される。医薬組成物において担体は組成物の活性成分と愛称がよいという意味で「許容されうる」（および、好ましくは該活性成分を安定化させれる）ものでなければならず、治療される被験者に有害であってはならない。一以上の溶剤は上述の化合物の運搬のため医薬品賦形剤として利用されうる。
【００７５】
他の担体の具体例はコロイド状酸化シリコン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウムおよびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃１０を含む。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は単に実例として解釈されるべきであり、いかなる方法であっても開示されたものに限定されない。
【００７７】
当業者は、さらなる検討なく、本明細書に基づき、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用されているすべての出版物は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
実施例１：ＩＦＮ−β−ジＰＥＧポリマー共役体
・ジＰＥＧアルデヒドの調製
【００７９】
【化２０】
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【００８０】
２０ｋＤのＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕを（アメリカ、カリフォルニア州のＳｕｎＢｉｏ  Ｉｎｃ．）から購入した２０ｋＤのｍＰＥＧＯＨからＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １９９３，  ４，  ５６８−５６９に記載されている方法によって調製した。
【００８１】
６−（1，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１，５−ジアミンの塩化メチレン溶液（ジアミンを９．０３ｍｇ、４７．８μｍｏｌ含む１１．９７ｇの溶液）を２０ｋＤのＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕ（１．７２ｇ、８６．０mｍｏｌ）を含むフラスコに加えた。ＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕを完全に溶解した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７９μＬ、４７８μｍｏｌ)を加えた。反応混合物を室温で２４時間攪拌し、その後、攪拌しながらメチルｔ−ブチルエーテル（２００ｍＬ）を滴下して加えた。最終的に得られた沈殿を集め、真空乾燥して白色固体としてジＰＥＧアセタール（１．６９ｇ、９８％）を得た。
【００８２】
【化２１】
0005639585.tif 000022
【００８３】
【化２２】
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【００８４】
ジＰＥＧアセタール（４．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）をｐＨ２．０の緩衝液（クリティック酸（critic acid）、４０ｍＬ）中懸濁した。当該反応混合物を３５℃で２４時間攪拌し、その後塩化メチレン(３ｘ５０ｍＬ)で抽出した。混合した有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮し、それから塩化メチレン（２０ｍＬ）に再溶解した。当該溶液を攪拌しながらメチルｔ−ブチルエーテル（４００ｍＬ）に滴下して加えた。最終的に得られた沈殿を集め、減圧乾燥して白色固体としてジＰＥＧアセタール（３．８ｇ、９５％）を得た。
【００８５】
【化２３】
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【００８６】
また、ジＰＥＧアルデヒドを以下の方法で調製した：
市販のホモリシン（中国のＡｓｔａｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）の二つのアミノ基をベンジルオキシカルボニルによって保護した。当該Ｎ−保護したホモリシンをエステル化し、還元してアルデヒド化合物を形成した。当該アルデヒド基を続いてエチレングリコールで保護した。それから、ベンジルオキシカルボニル保護基をパラジウム触媒の存在下での水素添加により除去した。当該Ｎ−脱保護した化合物を、穏和な塩基条件下で活性化したｍＰＥＧＯＨ（大韓民国のＳｕｎｂｉｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）と反応した。最終生成物は、２５℃で７２時間ｐＨ２．０のクエン酸緩衝液中攪拌して、アルデヒド保護基を除去した。１０９ｇのジＰＥＧポリマーアルデヒドを得た（収率：９５％）。純度は９７．７％以上（ＨＰＬＣで決定）であり、９５％以上（１Ｈ  ＮＭＲ解析で決定）であった。
【００８７】
ヒトｒｈＩＮＦ−β  Ｓｅｒ１７の調製
ヒトＩＮＦ−β  Ｓｅｒ１７をエンコードしたＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＥＴ２４ａにコピーし、発現プラスミドｒｈＩＦＮ−b  Ｓｅｒ１７−ｐＥＴ２４ａを生成した。この発現プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に転移し、陽性形質転換細胞、すなわち前記発現プラスミドを運搬するクローンを選択し、培養しおよび結果物である大腸菌培養物を−８０℃で保存した。
【００８８】
上述の保存した大腸菌培養物１０μｌを、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈとグリセロールからなる種培地２００ｍｌに３７℃および２００ｒｐｍで１５時間植菌した。このようにして得た大腸菌培養物１５０ｍｌを、グルコース（１０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．７ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（４ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（６ｇ／Ｌ）、クエン酸塩（１．７ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１０ｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５０ｍｇ／ｍｌ）、消泡剤、およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．２５ｍｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（０．５ｍｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．３ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２ｍｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４（０．１ｍｇ／Ｌ）、ＥＤＴＡ（０．８４ｍｇ／Ｌ）、およびＣｌ（５０ｍｇ／Ｌ）を含む少量の元素を含む２．５Ｌの培地に移し、３７℃で培養した。ＯＤ６００の大腸菌培養物が１２０〜１４０に達した時、ＩＰＴＧ（１Ｍ）を培養物に加え、ｒｈＩＦＮ−b  Ｓｅｒ１７の発現を誘導した。当該誘導された培養物を３７℃、３００ｒｐｍで３時間培養した。必要に応じて、８００ｇ／ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含むフィード培地を培養中、大腸菌培養物に加えた。
【００８９】
上記のようにして得られた大腸菌培養体を大腸菌細胞を集菌するため遠心分離した。当該細胞をＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中に再懸濁し、ＡＰＶホモジナイザー中に分散した。このようにして得た当該均質化された溶液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。沈殿（封入体を含んでいる）を集め、ＰＢＳに再懸濁して、室温で２０〜３０分間攪拌し、懸濁液を形成した。ＮａＯＨ（６Ｎ）を当該懸濁液に加え、そのｐＨを１２に調製し、前記封入体に含まれるタンパク質を溶解した。２分後、懸濁液のｐＨ値を６ＮのＨＣｌで７．５に調製した。その後、当該懸濁液を遠心分離し、このようにして形成された上清を集め、そのタンパク質濃度を分光光度計を用いて決定した。当該上清をリフォールディング緩衝液（ＴＥＡ、ｐＨ８．３）と混合し、室温で２４〜４８時間攪拌することなく培養した。その後、濃縮して、ＴＦＦシステムとＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．より入手できるＰＬＣＣＣカセットを使用して透析した。最終的に得られた溶液を限外濾過、透析およびＳＰＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて分別した。このようにして得られた画分Ａ９およびＡ１０は、前記組み換えタンパク質ｒｈＩＦＮ−b  Ｓｅｒ１７を含んでおり、さらに他のＳＰＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて分別して、（画分Ａ８〜Ａ１０中）の組み換えタンパク質の純度を高めた。これらのｒｈＩＦＮ−b  Ｓｅｒ１７を含んでいる部分を、さらにゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３００）で精製して、９０％以上の純度を有するｒｈＩＦＮ−b  Ｓｅｒ１７タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を得た。当該組み換えタンパク質の生物活性は＞２×１０７ＩＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００９０】
ＩＦＮ−β−ジＰＥＧポリマー共役体の調製
１８．９ｇのｒｈＩＦＮ−b  Ｓｅｒ１７と１．５１ｇのジＰＥＧアルデヒドを２６ｍＬの０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁した。この溶液に、４００ｅｑ．のＮａＣＮＢＨ３（ベルギー、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を加えた。当該反応混合物を室温で１６時間攪拌し、その後２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を用いて透析した。当該粗生成物をイオン交換カラムで精製し、２ｍｇのＩＦＮ−b−ｄｉ−ＰＥＧポリマーを得た。
【００９１】
ヒトＩＮＦ−βの調製
大腸菌プロモーターに動作可能なように結合されたＩＦＮ−βのエンコード配列を有する組み換え大腸菌ＢＬＲ  （ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞を、５０μｌ／ｍＬのカナマイシンと５０μｌ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加した２５０ｍＬのＳＹＮ培地（１０ｇ／Ｌのセレクトソイトン（ｓｅｌｅｃｔ  ｓｏｙｔｏｎｅ）、５ｇ／Ｌの酵母エキス、および１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）中培養した。その後、当該細胞を、振盪培養器中２２０ｒｐｍで一晩（すなわち、１６時間）３７℃で培養した。
【００９２】
上記のオーバーナイトの培養物２５０ｍＬを、１０ｇ／Ｌの塩基性グルコース、０．７ｇ／Ｌの供給ＭｇＳＯ４、３０ｍＬの供給少量成分（１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．８４ｇ／ＬのＥＤＴＡ、５０ｍｌ／ＬのＨＣｌ）、２５μｌ／ｍＬのカナマイシンおよび２５μｌ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した３．０Ｌの基本培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、０．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／Ｌのクエン酸塩、１０ｇ／Ｌの酵母エキスおよび２ｇ／Ｌのイソロイシン）中培養し、５リッターの発酵槽（ニュージャージー州エジソンのＢｉｏｆｌｏ  ３０００；Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏ．）中培養した。発酵中、培地のｐＨを３７％のＮＨ４ＯＨ溶液の自動添加によりｐＨ７．１に制御した。溶解した酸素（Ｄ０）レベルを３０％に維持した。Ｄ０レベルが４０〜６０を超えたときに供給するように設定したプログラム−制御したポンプを使用して前記供給溶液（８００ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５０μｌ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｌ／ｍＬのクロラムフェニコール）を加えた。前記発酵媒地中の細胞密度（ＯＤ６００）が１８０から２００に達したとき、４ｍＬの１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を酵母培地に加え、３０ｍＬの供給少量成分と２５ｇの酵母エキスと一緒にＩＦＮ−β発現を誘導した。細胞をＩＰＴＧ誘導したあと、遠心分離によって５時間かけて集菌した。
【００９３】
前記細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中、およそ１：３（湿重量ｇ／ｍＬ）の割合で懸濁し、マイクロフルイダイザーで分散し、その後４℃で２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離をした。前記封入体（ＩＢ）を含むペレットをＰＢＳ緩衝液で２度洗浄し、上記のように遠心分離をして、１ＬのＰＢＳ溶液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、３％の両性洗浄剤  ３−１４、５ｍＭのＤＴＴ）中懸濁した。３０分間攪拌した後、前記ペレットを溶解するために攪拌しながら、前記懸濁液を６．０Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ１２に調整した。その後、前記懸濁液のｐＨを６ＮのＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整した。２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、溶解したＩＦＮβを含む上清を集めた。
【００９４】
その後、溶解したＩＮＦ−βを以下のようにリフォールディングするようにした。上述の上清をリフォールディング混合物を形成するために１０Ｌの新たに調製したリフォールディング緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．５ＭのＬ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ）に希釈した。当該混合物を攪拌せずに４８時間培養した。培養後、リフォールドした組み換えＩＮＦ−βを含む当該混合物を２０ｍＭのトリス（１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％の両性洗浄剤３−１４、ｐＨ７．０である）緩衝液に対して透析した。
【００９５】
前記透析された混合物を、予め平衡化し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄したＳＰ−セファロースカラム（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。ＩＮＦβを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液で溶出した。ＩＮＦβを含む画分を２８０ｎｍの吸収度に基づき集めた。それらに含まれているＩＮＦβを、予め平衡化し、１．０Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．０５％の両性洗浄剤（ｐＨ  ４．５）を含む溶液で洗浄した疎水相互作用カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅブチルセファロース  高速流）でさらに精製した。ＩＮＦβを０．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む溶液を使用して溶出した。タンパク質を含む画分を２８０ｎｍの吸収度に基づき集めた。これらの画分を溜め、ＩＦＮβの濃度をＢＣＡタンパク質測定（ピアス、ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ測定器）で決定した。
【００９６】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β共役体の調製
水（１．４６ｍＬ）中、ジＰＥＧアルデヒド（２９６ｍｇ、７．４μｍｏｌ）の溶液に２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、０．３７ｍＬ）、両性洗浄剤３−１４（１．４８ｍＬ、１０％水溶液）およびＩＮＦ−β（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．７％の硫酸アンモニウムおよび０．０５％の合成洗剤を含むｐＨ４．５の緩衝液３．７ｍＬ中に１４．８ｍｇ）を加えた。当該反応混合物を室温で１０分間攪拌し、シアノ水素化ホウ素水溶液（４００ｍＭ、９２．５μＬ、３７μｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を暗所で４０時間攪拌し、ＳＰ  ＨＰセファロースクロマトグラフィーで精製した。所望のＰＥＧ−ＩＦＮβ共役体を含む画分を保持時間および吸収度２８０ｎｍに基づいて集めた。共役体の濃度をＢＣＡタンパク質測定器（ピアス、ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ測定器）で決定した。
【００９７】
ラットにおける薬物動態学的研究
薬物動態学的研究をラットモデルで行い、ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ−ＩＦＮ−βの血中半減期を調べた。オスのラット（２５０〜３５０ｇｍ）に６００μｇ／ｋｇのＩＦＮβ（ｎ＝３）およびＰＥＧ−ＩＦＮ  b（ｎ＝３）を静注投与した。投与前および投与後０．１、１、２、４、６、１０、２４、４８、７２、および９６時間でそれぞれのラットから血液（２５０μＬ）を採取した。当該血液から血清試料を調製し、試料中に含まれるＩＦＮ−βの量を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって解析した。ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ−ＩＦＮ−βの血中半減期を、最後３点の血清濃度から計算すると、それぞれ２時間および２０時間であった。
【００９８】
実施例２：ＥＰＯ−ＰＥＧポリマー共役体
ＰＥＧ−ＥＰＯの調製
水（２．６７ｍＬ）中、ジＰＥＧアルデヒド（２６７ｍｇ、６．１μｍｏｌ）の溶液に、２．０Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、１ｍＬ）およびＥＰＯ（２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．３の緩衝液３．０３ｍＬ中に１０ｍｇ）を加えた。当該反応混合物を室温で１０分間攪拌し、続いてシアノ水素化ホウ素水溶液（４００ｍＭ、１００μＬ、４０μｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を暗所で１７時間攪拌し、ＳＰ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（Ｔｏｓｏｈ製）を用いて精製した。当該カラムをｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液２０ｍＭで均一にした。前記反応混合物を０．３−０．４ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、前記ＳＰ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに充填した。所望のＰＥＧ−ＥＰＯ共役体を含む画分を保持時間および吸収度２８０ｎｍに基づいて集めた。共役体の濃度を２８０ｎｍのＵＶ吸収度で決定した。
【００９９】
ラットにおける薬物動態学的研究
薬物動態学的研究をラットモデルで行い、ＥＰＯおよびＰＥＧ−ＥＰＯの血中半減期を比較した。オスのラット（２５０〜３５０ｇｍ）に２５μｇ／ｋｇのＥＰＯ（ｎ＝５）およびＰＥＧ−ＥＰＯ（ｎ＝５）を静注投与した。投与前および投与後０．０８８、０．７５、１．５、３、６、１０、２４、および４８時間でそれぞれのラットから血液（２５０μＬ）を採取した。ＰＥＧ−ＥＰＯ治療されているラットにおいては、血液サンプルをさらに投与後７２および９６時間でも採取した。当該血液から血清サンプルを調製し、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって解析し、そこに含まれているＥＰＯの量を決定した。その結果、ＥＰＯの血中半減期は９時間であり、一方、ＰＥＧ−ＥＰＯの血中半減期は著しく増加し、すなわち３８時間であることを示している。
【０１００】
ＥＰＯ−ＰＥＧポリマー共役体の調製
０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）に０．２ｍｇのＥＰＯ（台湾のＣａｓｈｍｅｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）と４ｍｇのジＰＥＧアルデヒド（２０当量）を懸濁した。この溶液に４００当量のＮａＣＮＢＨ３を加えた。当該反応混合物を室温で１６時間攪拌した。ＥＰＯ−ジＰＥＧポリマーの形態をＨＰＬＣで確かめた。
【０１０１】
実施例３：ＧＨ−ＰＥＧポリマー共役体
Ｍｅｔ−ｈＧＨの調製
発現Ｍｅｔ−ｈＧＨ機能のある形質転換大腸菌ＢＬＲ  （ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞をＭｅｔ−ｈＧＨを発現させるため、上記の発酵方法で培養した。
【０１０２】
遠心分離して細胞を集菌し、細胞ペレットを約１：３（湿重量ｇ／ｍＬ）の割合でＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した。その後、当該細胞をマイクロフルイダイザーで拡散し、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。封入体（ＩＢ）を含む前記ペレットをＴＥＤ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％のデオキシコール酸塩、ｐＨ８．０）で２度洗浄し、上記するように遠心分離し、ならびにＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。前記ＩＢを４００ｍｌの５０ｍＭ  ＴＵＤ溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４Ｍの尿素、２．５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ１０．０）に懸濁し、当該懸濁液を２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を集めた。
【０１０３】
当該上清を新たに調製したリフォールディング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５％グリセロール  １０ｍＭのＧＳＨ／１ｍＭのＧＳＳＧ、ｐＨ８．０）２．０Ｌに希釈した。その後、このように形成された混合物を攪拌せずに３６時間培養し、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。
【０１０４】
Ｍｅｔ−ｈＧＨを含む当該透析した混合物を、前処理として均等化し２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．０で洗浄したＱ−セファロースカラム（ペンシルベニア州ピッツバーグのＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。Ｍｅｔ−ｈＧＨを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０および１００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液で溶出した。Ｍｅｔ−ｈＧＨを含む画分を２８０ｎｍの吸光度で決定し、集め、溜め、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）流速５ｍｌ／ｍｉｎで前処理して洗浄した疎水性相互作用カラム（ペンシルベニア州ピッツバーグのＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。Ｍｅｔ−ｈＧＨを２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液と１５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む溶液で抽出した。Ｍｅｔ−ｈＧＨを含む画分を集め、ＢＣＡタンパク質測定器（ピアス、ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ測定器）を用いて、Ｍｅｔ−ｈＧＨ濃度を決定した。
【０１０５】
ＰＥＧ−Ｍｅｔ−ｈＧＨ共役体の調製
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、３７４μＬ）とヒトＧＨ（２０ｍＭの酢酸ナトリウムと１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４．５緩衝液６．５ｍＬ中に２２．４ｍｇ）を、水（３８７μＬ）中のジＰＥＧアルデヒド（７４ｍｇ、１．７μｍｏｌ）の溶液に加えた。当該反応混合物を室温で１０分間攪拌し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（４００ｍＭ、１４０mＬ、５６mｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を暗所で１７時間攪拌し、ＳＰ  ＸＬセファロースクロマトグラフィーによって精製した。所望のポリマー−タンパク質共役体を含む画分を、保持時間と２８０ｎｍにおける吸光度に基づき集めた。共役体の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法（イリノイ州ロックフォード、ピアス）を使用するタンパク質測定キットで決定した。
【０１０６】
ラットにおける薬物動態学的研究
薬物動態学的研究をラットモデルで行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨおよびＰＥＧ−Ｍｅｔ−ｈＧＨの血中半減期を比較した。オスのラット（２５０〜３５０ｇｍ）に１００μｇ／ｋｇの投与量でＭｅｔ−ｈＧＨ（ｎ＝５）またはＰＥＧ−Ｍｅｔ−ＥＰＯ（ｎ＝５）を静注投与した。投与前および投与後０．０８３、１、２、４、８、１２、および２４時間でＭｅｔ−ｈＧＨで治療されたラットから、および投与前および投与後０．３３、１、４、８、１２、２４、４８、７２、および９６時間後にＰＥＧ−Ｍｅｔ−ＥＰＯで治療されたラットから血液サンプルを採取した。当該血液から血清サンプルを調製し、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって解析し、ｈＧＨ濃度を決定した。Ｍｅｔ−ｈＧＨおよびＰＥＧ−Ｍｅｔ−ｈＧＨの血中半減期はそれぞれ３時間と３５時間であった。
【０１０７】
他の実施例
本明細書に開示されている全ての特徴はいかなる組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示されているそれぞれの特徴は同一の、等価の、または同様の目的を与える代替可能な特徴で置き換えられてもよい。このように、明示的に述べられていない限り、開示されているそれぞれの特徴は等価なまたは同様の特徴の包括的なシリーズの単なる例である。
【０１０８】
上記から、当業者は容易に本願発明の本質的な特徴を解明でき、その精神および範囲から離れることなく様々な変更および改良を行い、様々な使用および条件に適応させられる。このように、他の実施態様もまた以下の特許請求の範囲内のものである。
【配列表】
0005639585000001.app