(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗線維症剤の有効量と、インビトロの細胞を接触させることを含む、抗線維症剤を前記細胞に送達するインビトロの方法であって、
前記抗線維症剤が、１，３−ジベンジルイミダゾリウム、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）連結シクロファン、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム及び１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムからなる群より選択される化合物、又は薬学的に許容される任意のその塩である、前記方法。
【請求項２】
薬学的に許容される前記塩が、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物の、細胞に抗線維症剤を送達するための医薬の製造における使用であって、
前記抗線維症剤が、１，３−ジベンジルイミダゾリウム、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）連結シクロファン、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム及び１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムからなる群より選択される前記化合物、又は薬学的に許容される任意のその塩である使用。
【請求項４】
薬学的に許容される前記塩が、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記抗線維症剤が線維症疾患の治療のために送達される、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
前記線維症疾患が肝線維症である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記抗線維症剤が、１，３−ジベンジルイミダゾリウム、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）連結シクロファン、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−イミダゾリニウム及び１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウムからなる群より選択される前記化合物、又は薬学的に許容される任意のその塩である、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
抗癌剤の有効量と、インビトロの細胞を接触させることを含む、抗癌剤を前記細胞に送達するインビトロの方法であって、
前記抗癌剤が、１，３−ジベンジルイミダゾリウム、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）連結シクロファン、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム及び１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムからなる群より選択される化合物、又は薬学的に許容される任意のその塩である、前記方法。
【請求項９】
薬学的に許容される前記塩が、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物の、細胞に抗癌剤を送達するための医薬の製造における使用であって、
前記抗癌剤が、１，３−ジベンジルイミダゾリウム、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）連結シクロファン、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム及び１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムからなる群より選択される前記化合物、又は薬学的に許容される任意のその塩である使用。
【請求項１１】
薬学的に許容される前記塩が、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗癌剤が癌の治療のために送達される、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記癌が肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗癌剤が、１，３−ジベンジルイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム及び１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムからなる群より選択される前記化合物、又は薬学的に許容される任意のその塩である、請求項１２又は１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
［０００１］本出願は、その内容が参照により完全に本明細書に組み込まれる、２００８年１月３０日に出願の米国特許仮出願第６１／００６７６９号の利益及び優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
［０００２］本発明は、線維症疾患又は癌を治療する方法を含む、細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］肝星状細胞（ＨＳＣ）は肝線維形成で重要な役割を演じ、治療的介入の主要な細胞標的とみなされる。しかし、承認された抗線維症薬剤は現在市場に出ていない。
【０００４】
［０００４］肝臓の線維形成は、酸化的ストレス、化学毒性又はウイルス感染から生じる傷害の結果として起こることができる。したがって、細胞及び組織の線維症を含む線維症疾患は、酸化的ストレスを原因とする生理障害の１つである。例えば、ＲＯＳの代謝的生成から生じる酸化的ストレスは、ＨＳＣ活性化及び肝臓線維症に関連付けられた（Ｂｒｉｔｔｏｎら１９９４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら１９９５、Ｇａｌｌｉら２００５）。脂質過酸化生成物は、ＨＳＣによるコラーゲン合成の増加をもたらすことが示されている（Ｃａｓｉｎｉら１９９７及びＰａｒｏｌａら１９９６）。
【０００５】
［０００５］活性酸素種（ＲＯＳ）は、過酸化物及び酸素誘導体などのフリーラジカル及び非ラジカル反応性分子を含む酸素誘導体である。これらの分子の生成と除去又は中和との間のアンバランスによるＲＯＳの過剰量があるときに、酸化的ストレスが起こる。ＲＯＳの過剰量は細胞の脂質、タンパク質及びＤＮＡに傷害を与えることができ、正常な細胞機能の阻害又は異常な細胞行動の発達をもたらし、それらは次に、影響を受ける細胞に従い様々な疾患及び状態をもたらすことができる。ＲＯＳは、多くの生理障害、並びにいくつかの疾患の発症及び発達に関連付けられた。
【０００６】
［０００６］いくつかの抗酸化剤が、肝臓線維症の潜在的阻害剤として探究されてきた（Ｋａｗａｄａら１９９８）。茶カテキンの主活性成分（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を通してインビトロでＨＳＣ活性化を阻害することが示されている（Ｃｈｅｎら２００２、Ｎａｋａｎｕｔａら２００５、Ｆｕら２００６）。臨床試験では、ビタミンＥ及びＣの組合せが、非アルコール性脂肪性肝炎患者で線維症スコアを低下させることが示されたが、肝臓の炎症に影響しなかった（Ｈａｒｒｉｓｏｎら２００３）。抗酸化剤として臨床的に用いられているグルタチオン（ＧＳＨ）の合成前駆体Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、同様にＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制を通して抗線維形成特性を示した（Ｍｅｕｒｅｒら２００５）。
【０００７】
［０００７］酸化的ストレスは、癌の発症及び進行にも関連付けられた。抗酸化酵素活性の低下によって示される酸化的ストレスが、臨床患者での一次発癌及び転移の発達に関連すると報告されている（Ｖａｌｉら２００８）。ＲＯＳはＤＮＡ損傷を引き起こし、ＤＮＡ突然変異の危険、したがって癌の発達を増加させることが見出された（Ｈｕｓｓａｉｎら２００５）。茶ポリフェノールは抗酸化剤であり、皮膚、肺、結腸、肝臓及び膵臓癌の動物モデルにおいて発癌物質誘導性のＤＮＡ損傷を阻害することが示された（Ｆｒｅｉら２００３）。さらに、抗酸化剤ＰＢＮ及びＮＸＹ−０５９は、肝細胞癌で抗癌活性を証明した。（Ｆｌｏｙｄ  ２００６）。しかし、調査した抗酸化剤の有効性は、不明のままである（Ｖａｌｋｏら、２００４）。
【０００８】
［０００８］炎症性応答は感染又は損傷への免疫系応答であり、他の細胞をさらに活性化して感染を退けるか損傷を修復する免疫反応のカスケードをもたらす、サイトカインなどの媒介物質を生成する免疫系の細胞の活性化を含む。酸化的ストレスと同様に、炎症性ストレスは線維症疾患及び癌に関連付けられている（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  ２００６、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら１９９９、Ｂａｃｈｅｍら１９９２、Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００）。例えば、肝臓線維症の発達において、ＨＳＣは重大な役割を演ずる。肝臓損傷に応答して、ＨＳＣは「活性化」及び筋線維芽細胞様細胞へのトランス分化と呼ばれる過程を経る。この過程は、細胞増殖、平滑筋アクチン−α（ＳＭＡＡ）の過剰発現、並びにコラーゲンαＩ型（Ｉ）（ｃｏｌ１ａ１）及びフィブロネクチンを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の沈着を含む、表現型変化を特徴とする。
【０００９】
［０００９］炎症性サイトカインは、ＨＳＣ活性化の主要な媒介物質を表す。それらの間で、形質転換成長因子βＩ（ＴＧＦ−β１）及びインターロイキン６（ＩＬ−６）は、主にＥＣＭタンパク質を誘導する役割を担う線維形成促進サイトカインに分類されている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  １９９９）。ＨＳＣは、肝臓損傷の間クッパー細胞及び内皮細胞から分泌されるＴＧＦ−β１に、並びにオートクリン作用を通してそれら自身に応答し、ＨＳＣ活性化及び肝臓線維症をもたらす（Ｂａｃｈｅｍら１９９２）。さらに、ＨＳＣの活性化は炎症誘導性サイトカインＩＬ−６の分泌を通す慢性肝臓炎症に帰することもでき、それは、肝硬変（Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００）及び肝細胞癌（Ｎａｕｇｌｅｒら、２００７）をもたらす。転写因子核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）は炎症性サイトカインの分泌の重要な調節因子であり、そのサブユニットＮＦ−κＢ  ｐ６５は肝臓線維症を媒介することが報告された（Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００）。
【００１０】
［００１０］炎症性応答が酸化的ストレスを誘導すること及びその逆も可能なので、線維症疾患及び癌との共通する関連性を共有することを越えて、酸化的ストレス及び炎症性ストレスの生成及び調節は相互関連するようである。
【００１１】
［００１１］例えば、肝臓の線維形成では、ＲＯＳ及び炎症誘導性サイトカインの両方が、肝線維形成の発達における中心的事象であるＨＳＣの活性化に関与することが示された。ＴＧＦ−βはＨＳＣ活性化の主要な媒介物質であり、ＴＧＦ−βシグナル伝達は酸化的ストレス及び炎症性応答の誘導の両方の影響を受ける（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら１９９９、Ｂａｃｈｅｍら１９９２、Ｃｈｅｎら２００２、Ｎａｋａｎｕｔａら２００５、Ｆｕら２００６、Ｍｅｕｒｅｒら２００５）。線維症の発達における別の重要な分子は、炎症性サイトカインの分泌の重要な調節因子であるが、酸化的ストレスに感受性であることも知られているＮＦ−κＢである。ＮＦ−κＢを活性化するほとんどの剤は、ＲＯＳ又はオキシダント自身によって調節される。抗酸化剤レズベラトロル（Ｃｈａｖｅｚら２００７）又はビタミンＥ（Ｌｉｕら１９９５）による治療が、四塩化炭素による実験的線維症齧歯動物で誘導されたＮＦ−κＢ上昇を軽減させたことが報告されている。
【００１２】
［００１２］酸化的ストレス及び炎症性応答は、癌の病因において互いに関係することも見出されている。酸化的ストレスはＤＮＡ突然変異を引き起こすことができ、そのいくつかは癌細胞の形成をもたらす。しかし、他の突然変異は細胞死をもたらし、炎症性応答を刺激する。次に、炎症性応答は癌細胞に生存シグナル及び増殖シグナルを提供するだけでなく、ＲＯＳの生成を誘導することもできる（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  ２００６）。
【００１３】
［００１３］動物モデル及びヒトにおいて過剰の酸化的ストレスを軽減する一般手法として、食事からの抗酸化剤が広く使われている。例えば、レズベラトロルは様々な種の生存期間を延長すること、並びに高カロリー食を摂取するマウスの健康及び生存の改善に有効であることが示された（Ｂａｕｒら２００６）。
【００１４】
［００１４］今まで、天然又は合成の抗酸化剤を用いる、酸化的ストレス及び酸化的ストレスに関連する特定の疾患の有効な治療法の開発には、問題があった。天然の抗酸化剤の効力のためのストリンジェントな科学的証拠は、確立されていない（Ｄｒｏｇｅら２００１）。治療薬として天然の抗酸化剤を用いることの注目すべき限界のいくつかには、低効力及び代謝の間の速いターンオーバーが含まれる。対照的に、合成抗酸化剤の開発は、安全性への懸念によって阻害されてきた。しかし、この方向での多少の進捗が見られる。効力を高めるために、天然の抗酸化剤の改変を行った（Ｋｅｕｍら２００７）。さらに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼの合成模倣剤が、虚血性疾患及びパーキンソン病の齧歯動物モデルで有効であることが示された（Ｐｅｎｇら２００５）。さらに心強いことに、ニトロン系のフリーラジカルトラップ剤のクラス、α−フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−ニトロン（ＰＢＮ）及び二ナトリウム２，４−ジスルホフェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＮＸＹ−０５９）は強力な神経保護剤であることが示され（Ｍａｐｌｅｓら２００４）、その抗炎症特性を通して肝細胞癌で抗癌活性を証明した（Ｆｌｏｙｄ  ２００６）。
【発明の概要】
【００１５】
［００１５］本明細書で記載されるように、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法であって、イミダゾリウム及びイミダゾリニウム塩を含むイミダゾリウム及びイミダゾリニウム化合物の有効量と、細胞を接触させることを含む方法が現在提供される。
【００１６】
［００１６］一態様では、一般式Ｉの化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマー、又は薬学的に許容されるその塩の有効量と、細胞を接触させることを含む、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法が提供される。
【化１】
0005559701.tif 000002
【００１７】
式中、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、
Ｒ１及びＲ２は、
（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、
（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、
（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものが前記（ｉ）で定義される通りであるか、又は、
（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５がそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６がそれらの環原子と一緒に各々５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、
Ｒ３及びＲ４の両方がＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４が不在であり、
Ｒ５又はＲ６は、
（ｉ）Ｒ１及びＲ２について上で定義される通りであるか、又は
（ｉｉ）各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロであり、
その際、該当する場合、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えられ、且つ直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換され、
Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つが窒素原子によって任意選択で置換される。
【００１８】
［００１７］一実施形態では、化合物はイミダゾリウム又はイミダゾリウム塩である。別の実施形態では、化合物はイミダゾリニウム又はイミダゾリニウム塩である。
【００１９】
［００１８］一実施形態では、Ｒ５はＲ６と同じである。別の実施形態では、Ｒ５及びＲ６は炭化水素である。
【００２０】
［００１９］特定の実施形態では、一般式Ｉの薬学的に許容される塩は、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸塩又はヘキサフルオロリン酸塩であってもよい。
【００２１】
［００２０］様々な実施形態において、化合物は１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム（又は１，３−ジベンジルイミダゾリウム）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフェニル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００２２】
［００２１］一実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の二量体である。例えば、化合物は１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン又は２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００２３】
［００２２］別の実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の三量体である。例えば、化合物は１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩である。
【００２４】
［００２３］本方法の一実施形態では、細胞はインビトロであってもよい。
【００２５】
［００２４］別の実施形態では、細胞はインビボであってもよい。例えば、本方法は、線維症疾患の治療又は癌の治療のために対象に剤を投与することを含むことができる。特定の一実施形態では、線維症疾患は肝線維症であってもよく、化合物は、例えば３−ジイソプロピルイミダゾリウム又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。他の実施形態では、癌は肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫であってもよく、又は、化合物は、例えば３−ビスベンジルイミダゾリウム、３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００２６】
［００２５］別の態様では、インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための、一般式Ｉの構造を有する化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマーの使用が提供される。
【００２７】
［００２６］別の態様では、インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための医薬の製造における、一般式Ｉの構造を有する化合物又はそのオリゴマー若しくはポリマーの使用が提供される。
【００２８】
［００２７］本明細書で記載される使用の一実施形態では、化合物はイミダゾリウム又はイミダゾリウム塩である。別の実施形態では、化合物はイミダゾリニウム又はイミダゾリニウム塩である。
【００２９】
［００２８］他の実施形態では、Ｒ５はＲ６と同じである。別の実施形態では、Ｒ５及びＲ６は炭化水素である。
【００３０】
［００２９］特定の実施形態では、一般式Ｉの薬学的に許容される塩は、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸又はヘキサフルオロリン酸塩であってもよい。
【００３１】
［００３０］本使用の様々な実施形態では、化合物は１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００３２】
［００３１］一実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の二量体である。例えば、化合物は１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン又は２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００３３】
［００３２］別の実施形態では、化合物は一般式Ｉの構造を有する化合物の三量体である。例えば、化合物は１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩である。
【００３４】
［００３３］本使用の一実施形態では、抗線維症剤は線維症疾患の治療のために送達される。特定の実施形態では、線維症疾患は肝線維症であってもよく、化合物は、例えば１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００３５】
［００３４］本使用の別の実施形態では、抗癌剤は癌の治療のために送達される。様々な実施形態で、癌は肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は神経膠腫であってもよく、化合物は、例えば３−ビスベンジルイミダゾリウム、３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００３６】
［００３５］別の態様では、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、又は１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であるイミダゾリウム又はイミダゾリニウムである化合物が提供される。
【００３７】
［００３６］本発明の他の態様及び特徴は、付随する図面と合わせて本発明の具体的な実施形態の以下の記載の精査により、当分野の技術者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明の実施形態を例としてだけ例示する図面。
【図１ａ】ＤＢＺＩＭの細胞毒性。ＨＳＣ  Ｔ６細胞を９６ウェルプレートに１ウェルにつき５０００個の細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭで１８〜２４時間培養した後に、アッセイの前に４８時間の増殖のために１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中の様々な化合物（０〜４００μＭ）を添加した。シグナルは、媒体対照処理（０μＭの化合物）に対して正規化した。データは４つの独立した実験から得、平均値及び標準誤差又は平均値（ＳＥＭ）で示した、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｂ  Ｐ＜０．０１及び＊ｃ  Ｐ＜０．００５。
【図１ｂ】ＴＤＢＺＩＭの細胞毒性。
【図２ａ】ＤＢＺＩＭは細胞ＲＯＳレベルを減弱させた。ＨＳＣ  Ｔ６細胞をＤＢＺＩＭ（１０、５０、１００及び３００μＭ）、ＴＤＢＺＩＭ（１０、５０及び１００μＭ）、ＮＡＣ（１ｍＭ）及びＥＧＣＧ（２５μＭ）と４８時間インキュベートした後に、細胞ＲＯＳレベルについて試験した。データは、媒体対照に対する正規化の後に、相対値として示した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図２ｂ】ＴＤＢＺＩＭは細胞ＲＯＳレベルを減弱させた。
【図３ａ】ＧＳＨの量に対するＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの効果。ＤＢＺＩＭは総細胞ＧＳＨ量を減弱させた。ＨＳＣ−Ｔ６細胞を様々な濃度の化合物と４８時間インキュベートし、ＧＳＨ及びＧＳＳＧの総量について試験した。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、（ＧＳＨ−ＧＳＳＧ）／ＧＳＳＧとして計算した。ＧＳＨ及びＧＳＳＧの量を、総タンパクに対して正規化した。ＤＢＺＩＭはＤＭＳＯに溶解し、ＴＤＢＺＩＭはＨ２Ｏに溶解した点に注意する。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図３ｂ】ＴＤＢＺＩＭは総ＧＳＨを変化させなかった。
【図３ｃ】ＤＢＺＩＭは、細胞のＧＳＳＧ（ＧＳＨの酸化生成物）を抑制した。
【図３ｄ】ＴＤＢＺＩＭは、細胞のＧＳＳＧ（ＧＳＨの酸化生成物）を抑制した。
【図３ｅ】ＤＢＺＩＭは、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を高めた。
【図３ｆ】ＴＤＢＺＩＭは、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を高めた。
【図４ａ】ＧＰｘ、ＣＡＴ、ＳＯＤ及びＧＳＴに対するＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの効果。ＤＢＺＩＭは、ＧＰｘ活性に用量依存的に影響を及ぼした。ＨＳＣ  Ｔ６細胞を様々な濃度の化合物で４８時間処理し、ＧＰｘ、ＧＳＴ及びＣＡＴアッセイについてはＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、又はＳＯＤアッセイについては１ｍＭのＥＧＴＡ、２１０ｍＭのマンニトール及び７０ｍＭのショ糖を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、超音波処理（６０％の周波数で３０秒間）によってホモジナイズした。酵素活性は、総タンパクに対して正規化した。ＤＢＺＩＭはＤＭＳＯに溶解し、ＴＤＢＺＩＭはＨ２Ｏに溶解した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図４ｂ】ＴＤＢＺＩＭは、ＧＰｘ活性を抑制した。
【図４ｃ】ＤＢＺＩＭは、ＣＡＴ活性に用量依存的に影響を及ぼした。
【図４ｄ】ＴＤＢＺＩＭは、ＣＡＴ活性を抑制した。
【図４ｅ】ＤＢＺＩＭは、ＳＯＤ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。
【図４ｆ】ＴＤＢＺＩＭは、ＳＯＤ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。
【図４ｇ】ＤＢＺＩＭは、ＧＳＴ活性を誘導した。
【図５ａ】ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯによって誘導された酸化的ストレスから一次ＨＳＣ細胞を保護した。ＩＭＳで２６及び９３時間処理した細胞の光学像。スケールバー＝６０μｍ。
【図５ｂ】０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、総ＧＳＨレベルを減少させることによって、酸化的ストレスを誘導した。データは、未処理試料と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図５ｃ】０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＧＳＳＧレベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
【図５ｄ】０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を低下させることによって、酸化的ストレスを誘導した。
【図５ｅ】０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＧＰＸ活性レベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
【図５ｆ】０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＣＡＴ活性レベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
【図５ｇ】０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯは、ＳＯＤ活性レベルを誘導することによって、酸化的ストレスを誘導した。
【図６ａ】ＤＢＺＩＭは、ＨＳＣ活性化マーカー（ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡ）及び線維症エンドポイント（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）のｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制した。ＨＳＣ  Ｔ６細胞をＤＢＺＩＭ（１、１０、１００及び３００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１、１０及び１００μＭ）で４８時間処理した。正規化遺伝子としてβ−アクチンを用いた。その発現レベルは、実験条件下で一定であった。媒体対照試料をキャリブレータとして、ΔΔＣｔ法を相対的な定量化のために用いた。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図６ｂ】ＴＤＢＺＩＭは、ＨＳＣ活性化マーカー（ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡ）及び線維症エンドポイント（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）のｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制した。
【図７ａ】ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、ＧＦＡＰのｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。ＨＳＣ  Ｔ６細胞をＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭで処理し、８、２４及び４８時間の後に試験した。ＴＤＢＺＩＭについて、ＳＭＡＡ発現の一時的上昇が２４時間後に観察された。β−アクチンハウスキーピング遺伝子及び媒体対照試料に正規化することによってΔΔＣｔ法を用いてｍＲＮＡ発現を計算し、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭにより相対的な定量データで示した、Ｎ＝６、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図７ｂ】ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、ＳＭＡＡのｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。
【図７ｃ】ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、ｃｏｌ１ａ１のｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。
【図７ｄ】ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、フィブロネクチンのｍＲＮＡ発現を時間依存的に抑制した。
【図８】ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（５０μＭ）で４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡタンパク質発現のウェスタンブロット法。ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチンについては３〜８％のトリス−アセテートゲルに、ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡについては４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに１５μｇの総タンパクを溶解した。標的タンパク質をそれぞれの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照としてα−チューブリンを再精査した。
【図９ａ】ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、ＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡを抑制した。ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１、１０、１００及び３００μＭ）と４８時間インキュベートした。ＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡの発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５。
【図９ｂ】ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＴＤＢＺＩＭ（１、１０及び１００μＭ）と４８時間インキュベートした。
【図９ｃ】ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、時間依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）と８、２４及び４８時間インキュベートした。
【図１０ａ】ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、ＩＬ−６  ｍＲＮＡを抑制した。ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１、１０、１００及び３００μＭ）と４８時間インキュベートした。ＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｂ  Ｐ＜０．０１、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図１０ｂ】ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、用量依存性試験についてはＴＤＢＺＩＭ（１、１０及び１００μＭ）と４８時間インキュベートした。
【図１０ｃ】ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、時間依存性試験についてはＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（１００μＭ）と８、２４及び４８時間インキュベートした。
【図１１】ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（５０μＭ）で４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるＮＦ−κＢ及びＡＰ−１（ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＤ及びＦｒａ−１）タンパク質発現のウェスタンブロット法。１５μｇの核タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をそれぞれの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照として用いたＴａｔａ結合性タンパク質ＴＢＰを精査した。
【図１２ａ】β−ガラクトシダーゼ活性によって報告されるように、ＤＢＺＩＭはＧＦＡＰ−ＬａｃＺ導入遺伝子を減弱させた。安定してトランスフェクトされたＴ６  ＧＦＡＰ−ＬａｃＺ細胞を１〜３００μＭ濃度の化合物で処理し、２４時間及び４８時間後に試験した。β−ガラクトシダーゼ活性を総タンパクに正規化し、媒体対照と比較した後に相対値として示した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図１２ｂ】β−ガラクトシダーゼ活性によって報告されるように、ＴＤＢＺＩＭはＧＦＡＰ−ＬａｃＺ導入遺伝子を減弱させた。
【図１３Ａ】様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるＳＭＡＡ、ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦβ  ＲＩタンパク質発現のウェスタンブロット法。ＤＢＩＭ（１ｍＭ）、ＡＭＩＭ（５０μＭ）、ＴＭＰＨＩＭ（５０μＭ）、ＤＰＰＨＩＭ（１０μＭ）及びＤＢＺＢＩＭ（１００μＭ）を、０．２％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度でＤＭＳＯに溶解した。ＤＰＩＭ（２ｍＭ）、ＥＧＣＧ（２５μＭ）及びＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、Ｈ２Ｏに溶解した。αチューブリンを、負荷対照として用いた。タンパク質バンド強度の濃度測定は、それぞれの媒体対照に対して正規化した。
【図１３Ｂ】タンパク質バンド強度の相対的な濃度測定定量化。媒体処理試料を、１に正規化した。
【図１４ａ】様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるＧＦＡＰのｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。ＤＢＩＭ（１ｍＭ）、ＡＭＩＭ（５０μＭ）、ＴＭＰＨＩＭ（５０μＭ）、ＤＰＰＨＩＭ（１０μＭ）及びＤＢＺＢＩＭ（１００μＭ）を、０．２％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度でＤＭＳＯに溶解した。ＤＰＩＭ（２ｍＭ）、ＥＧＣＧ（２５μＭ）及びＤＢＺＩＭ（１００μＭ）は、Ｈ２Ｏに溶解した。正規化遺伝子としてβ−アクチンを用いた。その発現は、実験条件下で一定であった。相対的定量を、それぞれの媒体対照に対して正規化した。データは、媒体対照と比較した平均値及びＳＥＭで示した、Ｎ＝６、＊ａ  Ｐ＜０．０５、＊ｃ  Ｐ＜０．００５及び＊ｄ  Ｐ＜０．０００５。
【図１４ｂ】様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるＳＭＡＡのｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。
【図１４ｃ】様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。
【図１４ｄ】様々なＩＭＳで４８時間処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるｃｏｌ１ａ１のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量。
【図１５ａ】マウスの肝臓線維症に対するＤＢＺＩＭ及びＤＰＩＭの効果。肝臓毒素チオアセタミド（ＴＡＡ）によって誘導したマウスで、ＤＢＺＩＭを試験した。ＤＢＺＩＭはＴＡＡモデル（５００ｍｇ／Ｌ、１２週間）及びＢＤＬモデル（１０ｍｇ／Ｌ、４週間）において線維症を減弱させたが、ＤＰＩＭはＢＤＬモデルにおいて１ｇ／Ｌ（４週間）でその効果を示した。
【図１５ｂ】胆管結紮（ＢＤＬ）によって誘導したマウスで、ＤＢＺＩＭを試験した。
【図１５ｃ】ＤＰＩＭは、ＴＡＡ（データ示さず）又は胆管結紮（ＢＤＬ）によって誘導したマウスでも試験した。
【図１６】異なるＤＰＩＭ化合物で処理された群のマウスからの肝臓切片におけるシリウスレッド染色像の代表。群に１匹のマウスだけが含まれた５００ｍｇ／ｌ処理群を除いて、各処理群には６〜８匹のマウスが含まれた。赤色染色領域は、コラーゲン沈着を表す。（Ａ）疑似手術、（Ｂ）疑似手術＋ＤＰＩＭ  １ｇ／ｌ  ４週間、（Ｃ）ＢＤＬ  ４週間、（Ｄ）ＢＤＬ  ４週間＋５００ｍｇ／ｌ  ＤＰＩＭ処理、（Ｅ）ＢＤＬ  ４週間＋７５０ｍｇ／ｌ  ＤＰＩＭ処理、（Ｆ）ＢＤＬ  ４週間＋１ｇ／ｌ  ＤＰＩＭ処理。
【図１７】シリウスレッド染色領域の割合。異なる処理群マウスからのシリウスレッド染色領域は画像Ｊソフトウェアで定量化し、各マウスの肝臓の左葉及び中央葉からの少なくとも６つの異なる領域が含まれた。＊Ｐ＜０．０５、ＢＤＬ対ＤＰＩＭ処理群、＃Ｐ＜０．０５、７５０ｍｇ／ｌ対１ｇ／ｌの処理群。
【図１８】異なる処理群の肝臓重量。各群は、手術処置の開始時に１０〜１２週齢であった６〜８匹のマウスからなった。＊Ｐ＜０．０５、疑似手術対照群対ＢＤＬ  ４週間、＊＊Ｐ＜０．０５、ＤＰＩＭ化合物処理群対ＢＤＬ週群、＃Ｐ＜０．０５、７５０ｍｇ／ｌ  ＤＰＩＭ処理群対１ｇ／ｌ  ＤＰＩＭ処理群。
【図１９】肝臓切片のＨ＆Ｅ染色の代表的な像。（Ａ）対照群、（Ｂ）ＢＤＬ  ４週間群、及び（Ｃ）ＢＤＬ  ４週間＋ＤＰＩＭ  １ｇ／ｌ処理群。
【図２０】コラーゲン１ａ１  ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲ。ＤＰＩＭは、コラーゲン１ａ１  ｍＲＮＡを減少させた。
【図２１Ａ】ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞の細胞増殖を阻害し、細胞周期を破壊した。ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞の細胞増殖を阻害し、細胞周期を破壊した。ＤＢＺＩＭは、ＨＣＣ細胞増殖を阻害した。ＨＬＥ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルにつき５０００個の細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭで１８〜２４時間培養した後に、アッセイの前に４８時間の増殖のために１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中の様々な化合物（０〜１．２５ｍＭ）を添加した。細胞数はヘキスト色素染色に基づいて計算し、ＢｒｄＵ取込みは抗体染色の総蛍光強度に基づいた。
【図２１Ｂ】ＤＢＺＩＭは、Ｇ０／Ｇ１期のＨＣＣ細胞を停止した。ＨＬＥ細胞をＤＢＺＩＭ（０、１、３ｍＭ）と２４時間インキュベートした後に、ＤＮＡ含量（２Ｎ対４Ｎ）の判定のために固定及びＤＡＰＩ染色した。
【図２２Ａ】ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞でカスパーゼ３／７活性を誘導した。ＨＬＥ又はＨｅｐＧ２細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭと６時間インキュベートし、カスパーゼ３／７活性及びＬＤＨ放出（毒性割合で表した）を試験した。散布図及びヒストグラムは細胞集団分布に関する代表的な情報を与えたが、棒グラフはヒストグラムからアポトーシス細胞の割合を定量化した。ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭによって２４時間処理した後に、アネキシンＶ染色及びフローサイトメトリー分析のために収集した。
【図２２Ｂ】ＤＢＺＩＭはＨＬＥでＬＤＨ放出を引き起こさなかった。
【図２２Ｃ】ＤＢＺＩＭはＨｅｐＧ２でカスパーゼ３／７活性を誘導した。
【図２２Ｄ】ＤＢＺＩＭはＨｅｐＧ２でＬＤＨ放出を引き起こさなかった。
【図２２Ｅ】ＨＬＥでフローサイトメータを用いてアネキシンＶ染色によって特徴づけられたように、ＤＢＺＩＭはアポトーシスを誘導した。
【図２２Ｆ】ＨｅｐＧ２でフローサイトメータを用いてアネキシンＶ染色によって特徴づけられたように、ＤＢＺＩＭはアポトーシスを誘導した。
【図２３Ａ】ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞でカスパーゼ８活性を変化させず、カスパーゼ９及び３活性を誘導した。ＨＬＥ細胞をＴ７５フラスコ中で増殖させ、ＤＢＺＩＭで２４時間処理した。次に細胞を溶解し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎからのキットを用いてカスパーゼ８、９及び３を試験するために細胞質タンパク質を収集した。データを、媒体対照に対して正規化した。
【図２３Ｂ】ＤＢＺＩＭは、ミトコンドリアからサイトゾルへのチトクロームｃの放出を引き起こさなかった。ＨＬＥ細胞を１．５ｍＭのＤＢＺＩＭによって２４時間処理した。サイトゾル及びミトコンドリアのタンパク質分画を、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎからのキットを用いて収集した。１５μｇの各タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をチトクロームＣの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、サイトゾル分画については負荷対照としてα−チューブリンを、ミトコンドリア分画についてはＣｏｘ４を精査した。
【図２４】ＤＢＺＩＭは、Ｂｃｌ−２及びＩＡＰタンパク質発現に影響を及ぼした。ＨｅｐＧ２細胞をＤＢＺＩＭ（０、０．５、１．０、１．５及び２．０ｍＭ）で２４時間処理した。総タンパクは、ＲＩＰＡ緩衝剤を用いて収集した。１５μｇの総タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をそれぞれの抗体によって認識して、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照としてα−チューブリンを精査した。
【図２５Ａ】ＤＢＺＩＭは、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）タンパク質の核から細胞質への転位を誘導した。ＤＢＺＩＭ（０及び１．０ｍＭ）によって２４時間処理されたＨＬＥ細胞の代表的な免疫細胞染色像。矢印は、それぞれ対照及びＤＢＺＩＭ処理細胞の核におけるサバイビンの蓄積及び消滅を示す。像は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＴａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて獲得し、分析した。
【図２５Ｂ】転位事象の定量化。細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、様々な濃度のＤＢＺＩＭによって２４時間処理した後、サバイビンのための固定及び免疫細胞染色を行った。「細胞質−核差」のより低い値は、細胞質サバイビンのより低い量を示した。
【図２６Ａ】ＤＢＺＩＭは、細胞質から核へのＡＩＦの転位を誘導した。ＤＢＺＩＭは、ＡＩＦを細胞質から核に転位させた。ＨｅｐＧ２細胞をＤＢＺＩＭによって２４時間処理した。Ｐｉｅｒｃｅからのキットを用いて、細胞質及び核のタンパク質を分画した。１５μｇのタンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をＡＩＦの抗体によって認識し、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、細胞質分画につては負荷対照としてα−チューブリンを、核タンパク質についてはＴａｔａ結合性タンパク質ＴＢＰを再精査した。
【図２６Ｂ】ＨＬＥ細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、ＤＢＺＩＭで２４時間処理した。次に細胞を固定し、ＡＩＦの抗体によって染色した。像は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＴａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて獲得し、分析した。矢印は、それぞれ対照及びＤＢＺＩＭにおけるＡＩＦ染色の細胞質及び核の位置を示す。
【図２６Ｃ】異なる細胞下区画におけるＡＩＦ染色の定量化。「細胞質−核差」のより高い値は、より高い核ＡＩＦを示した。
【図２７】高用量ＤＢＺＩＭは、ＨＬＥ細胞でＲＯＳ生成を誘導した。ＨＬＥ細胞を９６−ウェルプレートで増殖させ、ＤＢＺＩＭで２４時間処理した。次に細胞を固定し、ＲＯＳ生成の定量化のためにＤＨＥによって染色した。像は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）及びＴａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて獲得し、分析した。
【図２８】ＤＢＺＩＭは、ＨｅｐＧ２細胞でＡＰ−１発現の上方制御を誘導した。ＨｅｐＧ２細胞をＤＢＺＩＭで２４時間処理した。Ｐｉｅｒｃｅからのキットを用いて、細胞質及び核のタンパク質を分画した。１５μｇの核タンパク質を、４〜１２％勾配のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに溶解した。標的タンパク質をそれらのそれぞれの抗体によって認識し、ＥＣＬ法によって視覚化した。膜を剥離し、負荷対照としてＴａｔａ結合性タンパク質ＴＢＰを再精査した。
【図２９Ａ】ＤＭＺＩＭは、アポトーシスを誘導した。位相差顕微鏡法からの画像は、ＤＢＺＩＭに７２時間曝露させた後の、胃癌細胞ＡＧＳのアポトーシス形態を示す。曝露時間の延長は、細胞培養でのアポトーシス細胞による集密度の喪失の増加を引き起こした。
【図２９Ｂ】位相差顕微鏡法からの画像は、ＤＢＺＩＭに７２時間曝露させた後の、肺癌細胞Ｈ１２９９のアポトーシス形態を示す。
【図３０Ａ】ＤＢＺＩＭは、グリオーマ細胞株Ｃ６で細胞増殖を阻害した。増殖アッセイのためにＣ６又はＵ８７細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭと４８時間、カスパーゼ３／７活性化アッセイのために６時間インキュベートした。ＰｒｏｍｅｇａからのＭＴＳキットを用いて増殖を測定し、対照群を１に正規化して相対的な細胞増殖で表した。Ｐｒｏｍｅｇａからのキットを用いてカスパーゼ３／７活性を定量化し、同様に対照群に対する処理群の相対的カスパーゼ３／７活性で表した。
【図３０Ｂ】ＤＢＺＩＭは、Ｃ６でカスパーゼ３／７活性を誘導した。
【図３０Ｃ】ＤＢＺＩＭは、Ｕ８７  ＭＧで細胞増殖を阻害した。
【図３０Ｄ】ＤＢＺＩＭは、Ｕ８７  ＭＧでカスパーゼ３／７活性を誘導した。
【図３１Ａ】ＤＢＺＩＭは、アポトーシスの指標として、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断を誘導する。ｐ５３野生型胃癌細胞ＡＧＳにおける、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断に及ぼすＤＢＺＩＭの影響のウェスタンブロット分析。５０μＭのＤＢＺＩＭへの７２時間の曝露の後の細胞で実行されたウェスタンブロット分析。
【図３１Ｂ】ｐ５３野生型乳癌細胞株ＭＣＦ−７における、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断に及ぼすＤＢＺＩＭの影響のウェスタンブロット分析。５０μＭのＤＢＺＩＭへの７２時間の曝露の後の細胞で実行されたウェスタンブロット分析。
【図３２】ＤＢＺＩＭは、Ａｋｔのリン酸化を阻害する。ＡＧＳ、ＭＫＮ２８、Ｈ１２９９及びＭＣＦ−７細胞をそれらの対応するＩＣ５０濃度のＤＢＺＩＭで処理したとき、Ａｋｔのセリン４７３におけるリン酸化は、ｐ５３野生型癌細胞株ＡＧＳ（Ａ）、ｐ５３突然変異体胃癌細胞ＭＫＮ  ２８（Ｂ）、ｐ５３ヌル肺癌細胞Ｈ１２９９（Ｃ）及びｐ５３野生型乳癌細胞ＭＣＦ−７（Ｄ）で下方制御された。リン酸化ＡＫＴの経時的阻害を、ウェスタンブロットによって示した。内部負荷対照として、β−アクチンを用いた。
【図３３Ａ】ＤＢＺＩＭは、インビボでＨＣＣ腫瘍を減少させた。植え付け後３週間における、対照群及び処理群のＨＣＣ異種移植マウスの腫瘍を示す。
【図３３Ｂ】腫瘍増殖曲線を示す。＊Ｐ＜０．０１。
【図３３Ｃ】体重チャートを示す。＊Ｐ＜０．０１。
【図３４】ｐ５３の内因性発現。Ｈｅｐ３Ｂ（ｐ５３ヌル）、Ｈｅｐ  Ｇ２（野生型）、Ｈｌｅ及びＰｌｃ（ｐ５３突然変異体）からの細胞溶解物を、ｐ５３（ＤＯ−１）及びアクチン抗体を用いてウェスタンブロット法にかけた。
【図３５】ＩＭＳに曝露させた細胞の位相差顕微鏡検査。位相差顕微鏡検査からの画像は、ＩＭＳ（ＩＢＮ  １５、ＩＢｎ  １９、ＩＢＮ  ２４、ＩＢＮ  ２５及びＩＢＮ  ３２）への７２時間の曝露の後の細胞培養をそれぞれ示す。曝露時間の延長は、細胞培養での集密度の喪失の増加を引き起こした。
【図３６Ａ】ＩＭＳは、肝癌細胞でアポトーシスを誘導する。細胞を媒体並びにＩＢＮ  １５、ＩＢＮ  １９、ＩＢＮ  ２４、ＩＢＮ  ２５及びＩＢＮ  ３２で７２時間処理し、アポトーシスは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色と後に続くフローサイトメトリー分析を用いて定量化した。試料ごとに１０，０００個の細胞が検出された。生細胞は、左下四分の一（ＦＩＴＣ−及びＰＩ−）にあり、初期アポトーシス細胞は右下四分の一（ＦＩＴＣ＋及びＰＩ−）に、後期アポトーシス細胞は右上四分の一（アポトーシス性ＦＩＴＣ＋及びＰＩ＋）にある。
【図３６Ｂ】異なるＩＭＳに関するアポトーシス細胞の割合。
【図３７Ａ】ＩＭＳは、肝癌細胞を停止する。細胞を媒体並びにＩＢＮ  １５、ＩＢＮ  １９、ＩＢＮ  ２４、ＩＢＮ  ２５及びＩＢＮ  ３２で７２時間処理し、細胞周期分布はフローサイトメトリーによって調査した。ヨウ化プロピジウム染色対照細胞及びＩＭＳでそれぞれ処理した細胞の例示的ＦＡＣＳプロフィール。
【図３７Ｂ】細胞周期相における細胞の割合（％）。各値は、３つの判定の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図３７Ｃ】Ｇ０下集団の細胞の割合（％）。各値は、３つの判定の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図３８】ＩＭＳは、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断を誘導する。指示された用量のＩＭＳへの７２時間の曝露の後のＨＬＥ細胞における、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９及びＰＡＲＰの切断に及ぼすＩＢＮ  １５、ＩＢＮ  １９、ＩＢＮ  ２４、ＩＢＮ  ２５、ＩＢＮ  ３２の影響のウェスタンブロット分析。
【図３９】ＩＭＳ誘導性アポトーシスには、核内のｐ５３の蓄積が付随した。ＨＬＥ細胞を、指示された用量のＩＢＮ  １９及びＩＢＮ  ２４で４８時間処理した。処理細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、抗ｐ５３（緑色蛍光）及びＤＡＰＩ（青色蛍光）で免疫染色し、共焦鏡検によって分析した。
【図４０】ｐ５３のＩＭＳ誘導性蓄積並びにｐ５３突然変異体ＨＬＥ細胞のセリン１５、２０、４６及び３９２上でのｐ５３リン酸化。（Ａ）肝癌細胞ＨＬＥを指示された濃度のＩＢＮ  １５、ＩＢＮ  １９、ＩＢＮ  ２４、ＩＢＮ  ２５及びＩＢＮ  ３２で７２時間処理した。ｐ５３タンパク質並びにＳｅｒ−１５、Ｓｅｒ−２０、Ｓｅｒ−４６及びＳｅｒ−３９２のリン酸化のレベルを、ウェスタンブロット法で測定した。負荷対照としてβ−アクチンを用いた。
【図４１】ミトコンドリア経路の開始を通してのＩＭＳ誘導性アポトーシス。細胞を様々なＩＭＳで処理し、Ｂｃｌ−２及びＢＡＸのレベルをウェスタンブロットアッセイによって評価した。
【図４２Ａ】ｐ５３シグナル伝達経路関連の遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲアレイ分析。抗アポトーシス遺伝子。遺伝子発現の相対レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨで正規化した。値を、平均±標準偏差で表す。
【図４２Ｂ】増殖阻害遺伝子ＳＥＳＮ２。
【図４２Ｃ】細胞周期チェックポイント遺伝子。
【図４２Ｄ】細胞増殖遺伝子。
【図４２Ｅ】ＤＮＡ修復遺伝子ＡＴＭ。
【図４３】肺癌及び胃癌細胞に対する化合物Ｃ（ＤＢＺＭＩＭ）及び化合物９（ＭＡＢＺＭＩＭ）の効果。処理の１２０時間後に、化合物Ｃ（ＤＢＺＭＩＭ）及び化合物９（ＭＡＢＺＭＩＭ）は、肺癌細胞ＭＤＡＭＢ  ２３１（Ａ）及び胃癌細胞ＭＫＮ  ２８（Ｂ）で形態学的変化及びアポトーシスを誘導した。
【図４４Ａ】ＨＣＣ異種移植のマウスに対する化合物９の効果。植え付け後３週間における、対照群及び処理群のＨＣＣ異種移植マウスの腫瘍を示した。
【図４４Ｂ】腫瘍増殖曲線を示す。＊Ｐ＜０．０１。
【図４４Ｃ】体重チャートを示す。＊Ｐ＜０．０１。
【図４５】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１。
【図４６】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図４７】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図４８】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図４９】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図５０】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図５１】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図５２】ＩＭＳの名称及び構造を示す表１続き。
【図５３】ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２。
【図５４】ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
【図５５】ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
【図５６】ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
【図５７】ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
【図５８】ＩＭＳのＩＣ５０値を示す表２続き。
【図５９】様々な癌細胞株におけるＤＢＺＩＭのＩＣ５０値を示す表３。
【図６０】ＨＬＥ細胞におけるＩＢＮ−１５、１９、２４、２５及び３２のＩＣ５０値を示す表４。
【図６１】胃癌細胞におけるＤＢＺＭＩＭ及び化合物９のＩＣ５０値を示す表５。
【図６２】乳癌細胞におけるＤＢＺＭＩＭ及び化合物９のＩＣ５０値を示す表６。
【図６３】正常な乳房細胞におけるＤＢＺＭＩＭ及び化合物９のＩＣ５０値を示す表７。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
［００８９］本明細書で記載の方法は、本明細書で記載される、イミダゾリウム及びイミダゾリニウム塩の形態を含むイミダゾリウム及びイミダゾリニウム化合物（総称で「ＩＭＳ」）を、抗線維症剤及び抗癌剤として、又は線維症疾患若しくは癌を治療するために用いることができるという発見に関する。発明者らは、本明細書で記載される方法で用いることができる新規ＩＭＳを合成した。
【００４０】
［００９０］イミダゾリウム及びイミダゾリニウムの両方はイミダゾール環に基づき、両方ともＮ，Ｎ’−置換されている。イミダゾリウムは、Ｎ，Ｎ’−置換イミダゾールであり、イミダゾリニウムはＮ，Ｎ’−置換イミダゾリンであって、イミダゾールに存在するＣ４及びＣ５位置の間の炭素間二重結合を有しない。イミダゾール自体は多くの生体分子に組み込まれており、合成されたＣ置換イミダゾールは多くの医薬の重要な部分になっている（Ｏｌｍｏｓら１９９９）（Ｃａｓａｎｏｖａｓら２０００）。
【００４１】
［００９１］合成化学でＩＭＳを用いることの１つの魅力的な特徴は、それらが提供する構造融通性である。ＩＭＳの電子構造及び安定性、したがって治療上の安全性及び有効性は、分子のＮ−置換基（中心環の窒素原子上の置換基）及び中心環を変更することによって微調整することができる。ＩＭＳの「中心環」は、様々な置換基が結合して異なるＩＭＳ分子を生成することができる２つの窒素原子を含む５員環（イミダゾール又はイミダゾリン環）を指すことが理解されよう。ＩＭＳは、新規治療法の開発のために、安価で化学的に調整可能なビルディングブロックを提供する。
【００４２】
［００９２］一部のＩＭＳは、Ｎ−複素環式カルベン（ＮＨＣ）の前駆体である。ＮＨＣは、中心環のＣ２位置に水素原子を有し、中心環の両窒素原子上に置換基、すなわち２つのＮ−置換基を有するＩＭＳから、容易に生成することができる。ＮＨＣは、適当な条件下でのＩＭＳの脱プロトン化によって、これらのＩＭＳから生成される。ＩＭＳの脱プロトン化は、塩基条件下で、又は中性条件下の希釈溶液中で実施することができる。
【００４３】
［００９３］中心環のＣ２位置の水素原子以外の置換基で、ＩＭＳからＮＨＣを生成するのは困難である。しかし、Ｎ−置換基を切断することによってこれらのＩＭＳからラジカル種を形成することができる。
【００４４】
［００９４］発明者らは、本明細書で記載のＩＭＳを抗線維症剤若しくは抗癌剤として用いることができること、又は線維症疾患若しくは癌を治療するために用いることができることを発見した。いかなる特定の理論にも限定されることなく、本明細書で記載のＩＭＳは、抗酸化性及び抗炎症性の特性を示すことができる。線維症疾患及び癌の両方は、酸化的ストレス応答に関連付けられた。次に、線維症疾患及び癌において、酸化的ストレスは炎症性応答と緊密に関連することが示されている。
【００４５】
［００９５］抗線維症剤又は抗癌剤として用いることができるＩＭＳは、一般式Ｉの構造を有する化合物である。
【００４６】
【化２】
0005559701.tif 000003
【００４７】
［００９６］式Ｉにおいて、破線は不在であるか、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在する。したがって、Ｒ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素を、単結合又は二重結合で連結することができる。
【００４８】
［００９７］Ｒ１及びＲ２は、（ｉ）各々独立にＨ、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであるか、又は（ｉｉ）それらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成するか、又は（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、又はＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に、５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成し、Ｒ１及びＲ２の他のものは上の（ｉ）で定義される通りであるか、又は（ｉｖ）Ｒ１及びＲ５はそれらの環原子と一緒に、並びにＲ２及びＲ６はそれらの環原子と一緒に５〜１０員環の縮合した飽和、不飽和若しくは芳香族の環系を形成する。
【００４９】
［００９８］Ｒ３及びＲ４の両方はＨであるか、又は、Ｒ１及びＲ２がそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する場合、若しくは破線が結合として存在する場合、Ｒ３及びＲ４は不在である。
【００５０】
［００９９］上記のようにＲ５又はＲ６がそれぞれＲ１又はＲ２と縮合していない場合、Ｒ５及びＲ６は各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリール若しくはＣ２〜Ｃ６アルキニル−Ｃ６〜Ｃ１０アリールである。
【００５１】
［００１００］Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル又はハロである。
【００５２】
［００１０１］該当する場合、上記の置換基Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で任意選択で置き換えることができる。同様に、該当する場合、上記の置換基Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アシロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アシル、カルボニル、アミノ、アセチル、アセトキシ、オキソ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数によって任意選択で置換されてもよい。
【００５３】
［００１０２］Ｒ１及びＲ５が結合する環炭素原子並びにＲ２及びＲ６が結合する環炭素の１つは、窒素原子によって任意選択で置換されてもよい。
【００５４】
［００１０３］上記の化合物は、塩の形態で存在してもよい。したがって、本方法で用いることができるＩＭＳには、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩並びにそのような塩のオリゴマー及びポリマーが含まれる。そのような塩は、一般式ＩＩの構造を有する。
【００５５】
【化３】
0005559701.tif 000004
【００５６】
［００１０４］一般式ＩＩは一般式Ｉについて上で定義される通りであり、対イオンＸのさらなる特徴を有する。Ｘは薬学的に許容されるアニオンであり、例えば、それらに限定されないが、塩化物、臭化物、テトラフルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸塩が含まれる。
【００５７】
［００１０５］環構造に関して本明細書で用いる場合、用語「縮合した」は、環構造の間で少なくとも２つの原子を共有することを指す。２つの環原子（そのいずれかはＣ又はＮであってよい）が縮合環系に含まれる場合、環系は中心イミダゾリウム又はイミダゾリニウム環と縮合される。
【００５８】
［００１０６］特定の実施形態では、破線は不在でもよく、又はＲ１及びＲ３が結合する炭素とＲ２及びＲ４が結合する炭素との間で第２の結合を形成する結合として存在し、Ｒ１及びＲ２は両方ともＨであるか、又はそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成し、Ｒ３及びＲ４は両方ともＨであるか無であり、Ｒ５及びＲ６は各々独立に直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル又はＣ６〜Ｃ１０アリール−Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、Ｒ７はＨであり、該当する場合、置換基Ｒ１〜Ｒ７のいずれかは、１つ又は複数の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択されるヘテロ原子で置き換えることができ、そのいずれかは、直鎖若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルケニル、直鎖若しくは分枝状のＣ２〜Ｃ６アルキニル、縮合シクロアルキル環系を含むＣ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、フルオロ、トリフルオロメチル、シアナト、カルボキシル、カルボニル、アミノ、アセチル、オキソ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケノキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキノキシの１つ又は複数で任意選択で置換されてもよい。
【００５９】
［００１０７］例えば、様々な実施形態では、化合物は、Ｒ１及びＲ２が結合する２つの環原子の間の二重結合を有する、イミダゾリウム塩であってもよい。様々な他の実施形態では、化合物は、Ｒ３及びＲ４が水素であり、それらの環炭素の間に単結合だけがあるイミダゾリニウム塩であってもよい。さらに他の実施形態では、Ｒ３及びＲ４は無であり、Ｒ１及びＲ２はそれらの環原子と一緒に６〜１０員環の縮合芳香環系を形成する。
【００６０】
［００１０８］Ｒ５及びＲ６を含む置換基が異なってもよい。例えば、一部の実施形態では、本方法のＩＭＳは、Ｒ５及びＲ６が同じである化合物であってもよい。異なる実施形態では、Ｒ５又はＲ６は、縮合環系を含むアラルキル、分枝状アルキル又はシクロアルキルであってもよい。他の実施形態では、Ｒ５又はＲ６は、フェナルキル（ｐｈｅｎａｌｋｙｌ）基を含むことができる。他の実施形態では、Ｒ５及びＲ６の１つ又は両方は、アダマンタニル基を含むことができる。
【００６１】
［００１０９］本方法で用いることができるＩＭＳには、一般式Ｉの化合物から形成されるオリゴマー又はポリマーも含まれる。したがって、本明細書で用いる「オリゴマー」は、下記の方法で連結される、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上の一般式Ｉの化合物を指す。したがって、オリゴマーには二量体及び三量体が含まれる。本明細書で用いる「ポリマー」は、下記の方法で連結される、例えば１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上、５００個以上、１０００個以上の一般式Ｉの化合物を指す。
【００６２】
［００１１０］本明細書で用いるオリゴマー又はポリマーでは、一般式Ｉの化合物は互いに連結されて巨大分子構造を形成し、それは環化されてもよい。
【００６３】
［００１１１］例えば、本明細書で記載される三量体には、１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結しているシクロファン又は薬学的に許容されるその塩（ＴＤＢＺＩＭ）が含まれる。
【００６４】
［００１１２］巨大分子構造では、存在するあらゆる一般式Ｉの化合物のオリゴマー又はポリマーに存在する関連置換基を有するよりも、一般式Ｉの２つの化合物は、１つ又は複数のＲ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７置換基が二価であり、したがって２つの化合物で共有されるように連結されてもよい。例えば、そのような二量体では、２つの化合物は共有二価Ｒ１置換基によって連結されてもよく、したがって完全な二量体では、一般式Ｉの２つの化合物のためにＲ１置換基が１つだけ出現する。
【００６５】
［００１１３］したがって、一般式Ｉの化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７などの二価置換基を通して、互いに連結されてもよい。例えば、２つの化合物が共有Ｒ５置換基を通して連結されるように、一般式Ｉの１つの化合物の上のＲ５置換基は、一般式Ｉの第２の化合物の上のＲ５であることもできる。同様にオリゴマー又はポリマーは、共有されるＲ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７置換基を通して化合物を連結することによって形成することができる。例えば、本記載の二量体には、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−ピリジン又は薬学的に許容されるその塩（ＩＢＮ−２２）が含まれる。
【００６６】
［００１１４］上に述べたような置換基の共有には、それらの環炭素と一緒に縮合環系を形成する２つの置換基の共有を含めることができる。したがって、例えば、Ｒ１及びＲ２がそれらの環炭素と一緒に式Ｉの第１の化合物の上で環系を形成する場合、環の中の追加の炭素は、一般式Ｉの第２の化合物からの環炭素になる。例えば、本記載の二量体には、ベンゾ（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ジ−ブロミド又は薬学的に許容されるその塩（ＩＢＮ−２９）が含まれる。
【００６７】
［００１１５］或いは、２つの化合物を連結してオリゴマー又はポリマーを形成するために、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７の１つ又は複数などの置換基を第２の化合物の上の別のそのような置換基に結合することができ、したがって、オリゴマー又はポリマー中の一般式Ｉの各化合物について、関連する連結置換基が１つ出現する。１つ又は複数の共有される二価Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７置換基によって、一般式Ｉに入る複数の化合物をこの方法で結合すること（オリゴマー形成）ができる。例えば、そのような二量体には、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−１，１’−ビナフタレン又は薬学的に許容されるその塩（ＩＢＮ−２３）が含まれる。
【００６８】
［００１１６］さらに、一般式Ｉの２つの化合物は、一般式ＩのＲ７が結合するそれぞれの炭素原子の間の単結合又は二重結合によって結合して、二量体を形成することができる。これらの分子には、例えば、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール又は薬学的に許容されるその塩（化合物Ｈ）が含まれる。
【００６９】
［００１１７］オリゴマー化又はポリマー化化合物は、一般式Ｉのすべての置換基が各オリゴマー化又はポリマー化化合物において同じであるように同じ化合物であるか、又は、化合物の間で１つ又は複数の置換基が異なるように異なってもよいが、但し、共有される二価置換基（複数可）は、二価置換基が共有される化合物においては明らかに同じである。
【００７０】
［００１１８］表１は、本明細書で記載されるＩＭＳの特定の例の名称及び構造を含む。
【００７１】
［００１１９］特定の実施形態では、本発明の化合物は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウム、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウム、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウム、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウム、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウム、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウム、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウム、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウム、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウム、１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウム、１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）イミダゾリウム、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその任意の塩であってもよい。
【００７２】
［００１２０］特定の実施形態では、本発明の化合物は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＩＭ）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウムテトラフルオロボレート（ＤＰＩＭ）、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート（ＤＢＩＭ）、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウムテトラフルオロボレート（ＡＭＩＭ）、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウムクロリド（ＴＭＰＨＩＭ）、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＰＨＩＭ）、１，３−ジアリルイミダゾリウムブロミド（化合物Ｄ）、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムブロミド（化合物Ｅ）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（化合物Ｇ）、１−（１−アダマンチル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ１）、２−ベンジルイミダゾ［１，５−ａ］キノリニウムクロリド（化合物Ｓ２）、１，３−ビス（１−アダマンチル）−ベンゾイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ３）、１，３−ジシクロヘキシルベンゾイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ６）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロボレート（化合物Ｓ７）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウムクロリド（化合物Ｓ８）、２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウムヘキサフルオロホスフェート（化合物Ｓ９）、１−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−３−（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウムクロリド（化合物Ｓ１０）、２−メシチル−５−メチルイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニウムクロリド（化合物Ｓ１１）、２−メシチル−２，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアゾール−４−イウムクロリド（化合物Ｓ１２）、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリニウムテトラフルオロボレート（化合物Ｓ１３）、１−ブチル−３−（２−ピリジニルメチル）−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（化合物Ｓ１４）、６，７−ジヒドロ−２−ペンタフルオロフネイル−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］−１，２，４−トリゾリウムテトラフルオロボレート（化合物Ｓ１５）、１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウムブロミド、１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムブロミド、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）イミダゾリウムクロリド、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリウムテトラフルオロボレートであってもよい。
【００７３】
［００１２１］一般式Ｉの化合物には、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウム、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−ピリジン、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウム）−１，１’−ビナフタレン、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウム、（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−ベンゼン、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウム、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウム、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウム、及び１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその任意の塩を含む新規化合物が含まれる。
【００７４】
［００１２２］一般式Ｉの化合物には、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド、１−メチル−３−（２−ヒドロキシルエチル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２）、１−メチル−３−（４−イソシアナトベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−３）、１−メチル−３−（４−カルボキシルベンジル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−４）、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−６）、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−８）、１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−９）、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−１５）、１−ベンジル−３−（４−カルボキシルベンジル）−２−メチルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−１７）、１−ベンジル−３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−メチルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−１８）、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−１９）、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−２−メチル−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２０）、１−ベンジル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−２−メチル−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２１）、２，６−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−ピリジン（ＩＢＮ−２２）、２，２’−ジ−（３−ベンジル−イミダゾリウムブロミド）−１，１’−ビナフタレン（ＩＢＮ−２３）、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２４）、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２５）、１−ベンジル−３−（４−メチルカルボキシレートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２６）、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−５−フェニル−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−２７）、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−５−フェニルイミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−２８）、ベンゾ（１，２−４，５−ジイミダゾリウム）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラベンジル−，ジ−ブロミド（ＩＢＮ−２９）、１−ベンジル−３−（２−プロピン−１−イル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３０）、１−ベンジル−３−（３−ヒドロキシル−プロピル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３１）、１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３２）、１−ベンジル−３−（４−アセテートベンジル）−イミダゾリウムクロリド（ＩＢＮ−３３）、１−ベンジル−３−（ピリジン−２−イル）−イミダゾリウムブロミド（ＩＢＮ−３４）、１，３，５−トリス−（４−メチル−イミダゾリウム）−ｌｉｎｋｅｄシクロファン・３Ｂｒ（ＴＤＢＺＩＭ）、１，３−ジベンジル−２−（１，３−ジベンジル−１Ｈ−イミダゾール−２（３Ｈ）−イリデン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール（化合物Ｈ）、１−ベンジル−３−メチル−イミダゾリウムブロミド（化合物１２）、１−（４−シアナトベンジル）−３−メチル−イミダゾリウムクロリド、１−（４−カルボキシベンジル）−３−メチル−イミダゾリウムブロミド、１−メチル−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−（２，２−ジメトキシエチル）−イミダゾリウムブロミド、及び１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウムクロリドを含む新規化合物が含まれる。
【００７５】
［００１２３］一般式Ｉの化合物並びにそのオリゴマー及びポリマーは、市販されているか、下に示す実施例に記載のように通常の化学変化を用いて合成することができる。合成方法は、Ｈａｒｌｏｗら１９９６、Ｚｈａｎｇら２００７、Ｃｈｉａｎｅｓｅ及びＣｒａｔｒｅｅ２００５並びにＢｏｙｄｓｔｏｎら２００５にも記載されている。
【００７６】
［００１２４］したがって、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に送達する方法であって、一般式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又はそのオリゴマー若しくはポリマーの有効量と、細胞を接触させることを含む方法が現在提供される。
【００７７】
［００１２５］本明細書で用いる場合、抗線維症剤又は抗癌剤を細胞に「送達する」ことは、その剤が細胞に対してその抗線維症効果又は抗癌効果を発揮することができるように、細胞に十分近接して剤を提供することを指す。例えばインビトロでは、剤を細胞培地に加えることによって剤を細胞に送達することができる。例えばインビボでは、剤を医薬組成物として対象に投与することによって剤を送達することができる。
【００７８】
［００１２６］本明細書で用いる場合、細胞を「接触させる」ことは、細胞との直接的及び間接的な接触を指す。直接的接触とは、剤と細胞との間の直接相互作用を指す。対照的に、間接的接触は、他の分子又は化合物との相互作用を通して「細胞を接触させる」ことを含む。例えば、剤は分子と相互作用して、それに細胞と相互作用させるか、又は別の分子と相互作用させ、それが次に細胞と相互作用して効果を発揮させる、その分子内の変化に影響を及ぼすことができる。間接的接触は、細胞に対する影響をもたらす一連の分子相互作用を含むことができる。
【００７９】
［００１２７］本明細書で用いる抗線維症剤は、線維症疾患に関連する分子、機構又は影響を変化させるか、減少させるか、阻害する化合物を指す。例えば、剤は抗炎症剤又は抗酸化剤であってもよく、アポトーシスを誘導すること、ＴＧＦ−β、ＮＦ−κＢ若しくはＩＬ−６などの線維形成性媒介物質の活性を変化させるか、減少させるか、阻害すること、又は細胞の増殖性、線維形成性、収縮性若しくは炎症誘発性の応答を中和することができる。いかなる特定の理論にも限定されることなく、抗線維症剤は、以下のことによって線維症疾患を減少させるか阻害することができる。（ａ）星状細胞などの線維症疾患に関与する細胞の活性化の刺激を回避するために炎症を減らすこと、（ｂ）線維症疾患に関与する細胞の活性化を直接に下方制御すること、（ｃ）線維症疾患に関与する細胞の増殖性、線維形成性、収縮性又は炎症誘発性の応答を中和すること、（ｄ）例えばＢｃｌ−ｘＬ又はＦａｓなどの、アポトーシスを誘導すること、又は（ｅ）ＥＣＭ分解を誘導すること。
【００８０】
［００１２８］本明細書で用いる抗癌剤は、癌に関連する分子、機構又は影響を変化させるか、減少させるか、阻害する化合物を指す。例えば、剤は抗炎症剤又は抗酸化剤あってもよく、アポトーシスを誘導すること、異常な細胞増殖を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、ＤＮＡ突然変異を阻害すること又は、サバイビン、カスパーゼ９、カスパーゼ３、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｋ、ＢＡＸ、ＡＴＭ、ｐ５３、Ｃｄｃ２５Ａ、Ｃｄｃ２、ＳＥＳＮ２及びＡＰ−１などの癌に関連する分子の活性又は活性のレベルを改変することができる。
【００８１】
［００１２９］抗線維症剤又は抗癌剤が提供されるべき細胞は、インビトロの細胞、培養細胞又は対象内のインビボ細胞を含む任意の細胞であってもよい。本明細書で用いる用語「細胞」は、特に明記しない限り、状況次第で単一の細胞、複数の細胞又は細胞集団を指し、且つそれらを含む。細胞は、対象から外植される細胞を含むインビトロの細胞であってもよく、又は、それは対象内のインビボ細胞であってもよい。同様に、「細胞」への言及は、特に明記しない限り、状況次第で単一の細胞への言及も含む。
【００８２】
［００１３０］細胞は、任意の生物体、例えば昆虫、細菌を含む微生物、又はヒトを含む哺乳動物を含む動物に由来してもよい。
【００８３】
［００１３１］本方法の細胞は、線維症疾患若しくは癌を有する対象内、線維症疾患若しくは癌の治療を必要とする対象内、又は線維症疾患若しくは癌の予防が望まれる対象内にあってもよい。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。
【００８４】
［００１３２］線維症疾患は、過剰な線維組織の発達又は器官若しくは組織の細胞外マトリックスの過剰生産によって特徴づけることができるかそれによって引き起こされることがある状態を指すものと当分野の技術者によって理解され、それには、例えば肝臓線維症、腎臓線維症、肺線維症、骨線維症、全身性硬化症、混合性結合組織を含めることができる。線維症疾患のさらなる例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００７／００４３０１６号で提供される。
【００８５】
［００１３３］本方法の一実施形態では、抗線維症剤は、肝臓線維症を有する対象の細胞に送達されてもよい。化合物は、例えば１，３−ジイソプロピルイミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００８６】
［００１３４］熟練者は、細胞が異常な細胞増殖及び近くの組織に侵入する能力を示す疾患クラスを癌が包含することを理解する。癌の一部の形態では、異常な細胞は、体の他の場所に広がることもできる。異なる型の癌には、例えば、乳癌、結腸直腸癌、脳癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、骨癌、皮膚癌、肺癌、膵臓癌、膀胱癌、胆嚢癌、腎臓癌、食道癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、喉頭癌、白血病、多発性骨髄腫、口内癌、胸膜中皮腫、小腸癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌及び胃癌が含まれる。
【００８７】
［００１３５］本方法の一実施形態では、抗癌剤は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌又は膠腫を有する対象の細胞に送達されてもよい。化合物は、例えば１，３−ビスベンジルイミダゾリウム、１，３，−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウム，１−（２，４，６−トリメチルフェニル）−３−（４−アセテート−ベンジル）−イミダゾリウム、１，３−ジベンジル−５−フェニルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−アセテート−ベンジル）−２−メチル−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（４−メチルベンジル）−イミダゾリウム、１−ベンジル−３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−２−メチルイミダゾリウム又は１，３−ジ（２−フェニルエチル）−イミダゾリウム、又は薬学的に許容されるその塩であってもよい。
【００８８】
［００１３６］本明細書で用いる用語「有効量」は、所望の結果を達成するのに、例えば線維症疾患又は癌を治療するのに必要な投薬量及び期間の、有効な量を意味する。投与されるＩＭＳの総量は、障害の程度及びタイプ、投与様式並びに対象の年齢及び健康を含むいくつかの因子によって異なる。線維症疾患又は癌を治療するための特定のＩＭＳの有効量を決定する方法は、当分野の技術者に容易に明らかとなる。
【００８９】
［００１３７］線維症疾患又は癌を「治療すること」は、臨床上の結果を含む有益であるか所望の結果を得るための手法を指す。有益であるか所望の臨床上の結果には、１つ又は複数の症状若しくは状態の緩和又は改善、障害若しくは疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化、障害若しくは疾患の発達の予防、障害若しくは疾患の広がりの予防、障害若しくは疾患の進行の遅延又は緩徐化、障害若しくは疾患の開始の遅延又は緩徐化、障害若しくは疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的）を含めることができるが、これらに限定されない。「治療すること」は、治療不在下で予想されるものを越えて対象の生存期間を長くすることを意味することもできる。「治療すること」は、障害若しくは疾患の進行を阻害すること、障害若しくは疾患の進行を一時的に遅くすることを意味することもできるが、より好ましくは、それは障害若しくは疾患の進行を恒久的に停止させることを含む。
【００９０】
［００１３８］投与を助けるために、ＩＭＳを医薬組成物の成分として製剤化してもよい。組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤及び様々な適合する担体又は希釈剤を含むことができる。
【００９１】
［００１３９］薬学的に許容される担体の割合及び素性は、選択される投与経路、ＩＭＳ分子との適合性及び標準の製薬業務を含む様々な因子に依存する。一般に、医薬組成物は、ＩＭＳの生物特性をあまり損なわない成分で製剤化される。
【００９２】
［００１４０］適する媒体及び希釈剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．、２００６）に記載されている。適する医薬組成物の調製方法は、当分野の技術者に分かるであろう。
【００９３】
［００１４１］当分野の技術者によって理解されるように、医薬組成物は、選択される投与経路によって様々な形態で対象に投与することができる。本発明の組成物は、例えば経口投与によって、外科的に、又は所望部位への注射によって投与することができる。
【００９４】
［００１４２］異なる実施形態では、組成物は、所望の部位、例えば治療すべき線維症疾患又は癌の近くにおける直接的注射（皮下、静脈内、筋内など）によって投与される。
【００９５】
［００１４３］用いられる医薬組成物の用量は、治療される特定の線維症疾患又は癌障害、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ及び重量を含む個々の患者のパラメータ、治療期間、併用療法（ある場合）の性質、特定の投与経路、及び医療臨床医の知識及び専門知識の範囲内である他の類似した因子によって決まる。これらの因子は当業者に公知であり、最小限の通常の実験で対処することができる。
【００９６】
［００１４４］医薬組成物を様々な剤形で提供することができ、したがって、異なる実施形態において、ＩＭＳを例えばピル、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末及び注射を含む異なる剤形で投与することができることが理解されよう。異なる剤形を調製し、投与するための従来の手順及び成分は、当業者に分かるであろうし、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．、２００６）に記載されている。
【００９７】
［００１４５］インビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための、及びインビボで細胞に抗線維症剤又は抗癌剤を送達するための医薬の調製における、一般式Ｉの構造を有する化合物、薬学的に許容されるその塩、又はそのオリゴマー若しくはポリマーを含む本明細書で記載のＩＭＳの使用も企図される。
【００９８】
［００１４６］本方法のＩＭＳは、多数の分子機構を通して機能することができる抗酸化特性の結果として、それらの抗線維症効果及び抗癌効果を発揮することができる。一般に抗酸化剤は、主に下記３つの異なる経路によってそれらの効果を発揮する。（１）代謝及び免疫応答の間に生成される細胞のフリーラジカルＲＯＳの中和、（２）内因性抗酸化酵素活性の誘導、及び（３）ヒドロキシル基の生成を触媒する鉄又は銅イオンのキレート化。いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳの抗酸化特性は、少なくとも一部、ラジカルスカベンジャーとしてのそれらの活性のために生じるようである。ＩＭＳによるフリーラジカルの中和は、（１）好ましくは塩基性条件下でのＩＭＳからＮＨＣへの自然発生の変換、（２）中間体活性ラジカルの形成及びフリーラジカルの中和をもたらす、ＮＨＣの炭素２位置でのＲＯＳなどのフリーラジカルとの相互作用を含む一連の化学反応の後に起こることができるようである。
【００９９】
［００１４７］本発明者らは、本明細書で記載されるＩＭＳが抗炎症特性も示すことを発見した。いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳの二重の抗酸化特性及び抗炎症特性は、少なくとも一部、酸化的ストレスと炎症との間の相互作用に帰することができる。例えば、肝臓線維症の治療では、本明細書で定義されるＩＭＳ化合物の抗炎症効果は、ＨＳＣ活性化を、したがってそれから生じる炎症誘発性サイトカインの生成を阻害するＩＭＳの抗酸化特性に帰することができると仮定される。同様に、いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳによる炎症媒介物質ＩＬ−６の阻害は、炎症性サイトカインの分泌の重要な調節因子である転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制する、ＩＭＳの抗酸化特性に一部帰することができる。
【０１００】
［００１４８］それらの抗酸化特性及び抗炎症特性に加えて、ＩＭＳは線維症疾患及び癌の治療で有用である他の効果を示すことができる。抗酸化剤は、アポトーシスを誘導する特性も有することが見出されている。例えば緑茶抽出物ＥＧＣＧは、培養細胞株及び異種移植モデルでヒト肝細胞癌のアポトーシスを誘導する（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら２００６）ことを示し、天然の抗酸化剤であるニンニク抽出物も、酸化的ストレスを誘導することによってヒトグリア芽細胞腫細胞（Ｄａｓら２００７）及び結腸癌細胞（Ｊａｋｕｂｉｌｏｖａら２００６）でアポトーシスを誘導することが示されている。
【０１０１】
［００１４９］いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＩＭＳはアポトーシスの誘導及び細胞周期の停止を通しての細胞増殖の阻害によって、癌の治療で有効であることができるようである。例えば、ＩＭＳは、例えばサバイビン、カスパーゼ９、カスパーゼ３、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｋ、ＢＡＸ、ＡＴＭ、ｐ５３、Ｃｄｃ２５Ａ、Ｃｄｃ２、ＳＥＳＮ２及びＡＰ−１を含む、アポトーシス及び細胞周期に関与する分子の活性及び発現を増加又は減少させることによって、アポトーシス及び細胞周期停止を誘発することができる。
【０１０２】
［００１５０］本方法及び化合物を、以下の非限定的実施例を通してさらに例示する。
【０１０３】
［００１５１］
［実施例］
［００１５２］材料及び方法
［００１５３］ＩＭＳの抗酸化、抗炎症及び抗線維症特性
【０１０４】
［００１５４］ＩＭＳの合成及び特性評価
［００１５５］ＤＢＺＩＭ、ＴＤＢＺＩＭ及びＤＢＺＢＩＭは、社内で合成した。ＤＰＩＭ、ＤＢＩＭ、ＡＭＩＭ、ＴＭＰＨＩＭ及びＤＰＰＨＩＭは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＳＡ）から購入した。ＤＢＺＩＭ（１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド）、ＤＢＺＢＩＭ（１，３−ビスベンジル−ベンゾイミダゾリウムブロミド又は１，３−ジベンジル−ベンゾイミダゾリウムブロミド）及びＴＤＢＺＩＭ（１，３，５−トリス（４−メチル−イミダゾリウム）に連結したシクロファン・３Ｂｒ）の化学構造を、表１に例示する。ＤＢＺＩＭ及びＤＢＺＢＩＭは、文献（Ｈａｒｌｏｗら１９９６）に開示の方法を用いて合成した。ＴＤＢＺＩＭは、反応バイアル内の２００ｍｌのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で４−メチルイミダゾール（１２３ｍｇ、１，５ｍｍｏｌ）及び２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（４００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を混合することによって合成した。反応混合液を、２日間１００℃に加熱した。ＴＤＢＺＩＭの無色結晶を沈殿させ、４０％の収率（１６０ｍｇ）で収集した。核磁気共鳴を行い、以下の結果を得た。１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７７（ｓ、１Ｈ）、５．５３（ｓ、２Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、４．６０（ｓ、１Ｈ）、２．５５（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｓ、６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ１４３．４９、１３６．２７、１３１．７３、１３１．５４、１２３．４５、６７．０６、１６．３５、９．５７。ＴＤＢＺＩＭ（Ｃ３６Ｈ４５Ｂｒ３Ｎ６）の元素分析は、以下の結果を与えた。Ｃ、５３．２１；Ｈ、５．８８；Ｎ、１０．１２（計算値Ｃ、５３．９５；Ｈ、５．６６；Ｎ、１０．４９）。
【０１０５】
［００１５６］一次ＨＳＣ単離及びＨＳＣ−Ｔ６株
［００１５７］ウィスターラット肝臓からの一次ＨＳＣの単離を、主に過去の報告書（Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎら２００５）で提供されている方法に従って実施した。簡潔には、肝細胞除去の後の細胞懸濁液の上清を洗浄し、９．５ｍｌのＧｅｙの均衡塩溶液（ＧＢＳＳ）で再懸濁し、ＧＢＳＳ中の８ｍｌの２８．７％（ｗ／ｖ）Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚと混合した。６ｍｌのＧＢＳＳの下に細胞懸濁液を置くことによって勾配を調製し、Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ勾配において１４００×ｇで２０分間遠心分離した。星状細胞は、Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ溶液及び水性緩衝液の界面の直上のファジーバンドに分離した。星状細胞バンドを収集、洗浄し、１ウェルにつき１×１０６個の細胞を６ウェル培養プレートの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播種した。ＨＳＣの生存度はトリパンブルー排除染色による判定で＞９５％であり、ＨＳＣの純度は計数した２００個を超える細胞でのグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）ポジティブ染色による調査で＞９０％であった。一次ＨＳＣは３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータ内で、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで通常の方法によって培養し、それらが集密まで増殖したときにトリプシン処理（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））によって１：４の比に分割した。ＨＳＣ−Ｔ６細胞株は、Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＳｃｏｔｔ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ博士が快く提供された。既報（Ｍａｕｂａｃｈら２００６）のように、安定したＴ６／ＧＦＡＰ−ＬａｃＺクローン細胞株が確立された。ＨＳＣ−Ｔ６及びＴ６／ＧＦＡＰ−ＬａｃＺ細胞は、一次ＨＳＣと同じ条件で培養した。
【０１０６】
［００１５８］ＩＭＳによる細胞処理
［００１５９］ＩＭＳの保存溶液を、それらの溶解性によってジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＨ２Ｏで調製した。培地中の最終ＤＭＳＯ濃度は、０．２％（ｖ／ｖ）以下に維持した。ＮＡＣはＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、ＥＧＣＧはＳｉｇｍａから購入し、さらなる精製なしで直接用いた。先ず細胞を細胞培養プレート又はフラスコ内の１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭに１８〜２４時間播種し、その後、様々な濃度の化合物を異なる時間加えた。各処理の詳細を、図の凡例で見ることができる。
【０１０７】
［００１６０］細胞のＲＯＳ判定
［００１６１］処理されたＨＳＣ−Ｔ６細胞のＲＯＳレベルは、ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）標識法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて判定した。培養した細胞をトリプシン処理によって収集し、無フェノールレッドＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。次に細胞をＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌの２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＤＣＦＨ−ＤＡ）と１５分間インキュベートし、その後アッセイのためにＤＭＥＭに再懸濁した。細胞溶液を黒壁の９６ウェルプレートに３反復で注入し、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩプレートリーダーによりＥｘ＝４８５ｎｍ及びＥｍ＝５３０ｎｍで蛍光を読み取った。蛍光単位は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて測定した、生存細胞数に対して正規化した。細胞のＲＯＳレベルは、対照試料と比較して表した。
【０１０８】
［００１６２］グルタチオン（ＧＳＨ）及びＧＳＨ／グルタチオンジスルフィド二量体（ＧＳＳＧ）アッセイ
［００１６３］総細胞ＧＳＨ及びＧＳＳＧレベルは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）からのアッセイキットを、製造業者の指示に従って用いて測定した。簡潔には、ＤＢＺＩＭ、ＴＤＢＺＩＭ、ＮＡＣ又はＥＧＣＧで処理したＨＳＣ−Ｔ６細胞を剥離し、６０％周波数の超音波処理によってリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３０秒間ホモジナイズし、４℃で１０分間の１６，０００×ｇによる遠心分離の後上清を収集した。試料のタンパク含有量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで測定した。
【０１０９】
［００１６４］ＧＳＨアッセイのために、タンパク質試料をメタリン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．２３９２７−５）によって脱タンパクし、マニュアルに従ってｐＨをトリエタノールアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．Ｔ５８３０−０）で調節した。試料は、還元形態及び酸化形態の両方を含む総ＧＳＨの分析の準備ができた。最初にＧＳＨを２−ビニルピリジンで誘導体化し、別々に分析することによって、ＧＳＨを除くＧＳＳＧの定量化を実施した。Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩプレートリーダーを用いて、比色シグナルを４０５ｎｍで記録した。ＧＳＨ又はＧＳＳＧのレベルは、ｎｍｏｌ／μｇのタンパク質として測定した。
【０１１０】
［００１６５］グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）アッセイ
［００１６６］３つの抗酸化酵素、ＧＰｘ、ＣＡＴ及びＳＯＤの活性レベルを、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからのアッセイキットを用いて測定した。ＧＰｘ及びＣＡＴ活性を試験するために、１ｍＭのＥＤＴＡを含む氷冷ＰＢＳにタンパク質試料を収集した。ＳＯＤ活性を試験するために、１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２１０ｍＭのマンニトール及び７０ｍＭのショ糖を含む、２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液でタンパク質試料を調製した。タンパク含有量は、ＢＣＡアッセイで測定した。
【０１１１】
［００１６７］ＧＰｘ活性は、ＧＳＨレダクターゼによる共役反応によって間接に測定した。ＧＰｘによるＨ２Ｏ２の還元後に生成される酸化されたＧＳＨは、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）によってその還元状態に再循環される。ＮＡＰＤＨの酸化はＧＰｘ活性に比例し、３４０ｎｍにおける吸光度の低下として測定することができる。ＧＰｘ活性は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質として表した。
【０１１２】
［００１６８］ＣＡＴ活性は、Ｈ２Ｏ２存在下での酵素とメタノールとの反応に基づいて測定した。生成したホルムアルデヒドは、色素原としてＰｕｒｐａｌｄを用いて５４０ｎｍで分光測光法により測定した。ＣＡＴ活性は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質として表した。
【０１１３】
［００１６９］全３種類のＳＯＤ（Ｃｕ／Ｚｎ−、Ｍｎ−及びＦｅ−ＳＯＤ）を含む総ＳＯＤは、キサンチンオキシダーゼ及びハイポサンチン（ｈｙｐｏｓａｎｔｈｉｎｅ）によって生成されたスーパーオキシドラジカルを検出するためにテトラゾリウム塩を用いて定量した。１単位のＳＯＤは、スーパーオキシドラジカルの５０％のジスムテーションを示すために必要とされる酵素の量と定義された。ＳＯＤ活性は、Ｕ／ｍｇのタンパク質として表した。
【０１１４】
［００１７０］グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）アッセイ
［００１７１］第ＩＩ相抗酸化酵素ＧＳＴの活性は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからのキットを用いて分析した。１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液でタンパク質試料を収集し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。総ＧＳＴ（サイトゾル及びミクロソーム）活性は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）と還元型ＧＳＨとのコンジュゲーションを測定することによって分析し、３４０ｎｍにおける吸光度の増加によって監視した。ＧＳＴ活性は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質として表した。
【０１１５】
［００１７２］総ＲＮＡの単離及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
［００１７３］総ＲＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡＩＩ単離キット（Ｎａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、ＮＤ−１００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＤＥ、ＵＳＡ）によって定量した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの詳細は、他で報告された（Ｚｈａｎｇら２００６）。簡潔には、Ｔａｑｍａｎ化学を用いる二段階リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであった。総ＲＮＡは、先ずｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイムＰＣＲを実行し、ＡＢＩ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で検出した。ラットＧＦＡＰ、ＳＭＡＡ、コラーゲンＩａ１、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴＧＦβ  ＲＩ）及びＩＬ−６のためのプライマー及びプローブは、Ｔａｑｍａｎのアッセイ−オン−デマンドデータベースに注文した。ラットβ−アクチンを正規化遺伝子として用い、その発現レベルは、この試験の実験設定を通じて一定であった（ＣＴ差は＜±０．５であった）。標的ｍＲＮＡの相対的定量化は、比較閾値サイクル法（ΔΔＣＴ）をＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に記載のように用いて計算した。相対的定量化は、対照と比較して処理下での標的遺伝子の上方制御又は下方制御を表す、２−ΔΔＣＴによって与えられた。
【０１１６】
［００１７４］
ウェスタンブロット法
［００１７５］タンパク質抽出物は、ＧＦＡＰのためには沸騰させた１０容量の１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（９０〜９５℃）中で細胞ペレットを１０分間溶解することによって、又は核タンパク質のためのＰｉｅｒｃｅ（ＩＬ、ＵＳＡ）からのＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬若しくはＳＭＡＡ、フィブロネクチン、コラーゲンαＩ（Ｉ）、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβ  ＲＩのためのＲＩＰＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いることによって調製した。タンパク含有量は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて定量した。１５μｇの総タンパクを４〜１２％勾配ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルに溶解し、ニトロセルロース膜に移した。次に膜を、ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＳＭＡＡ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、プロコラーゲンαＩ（Ｉ）、フィブロネクチン、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＮＦ−κＢ  Ｐ６５、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβ  ＲＩ（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）に対する一次抗体で精査し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出した。フィブロネクチン及びｃｏｌ１ａ１のブロッティングのために、タンパク質抽出物を３〜８％トリス−アセテートゲルで分離した。タンパク質バンドは、ＥＣＬ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）と反応させることによって、Ｘ線フィルムに記録した。αチューブリン（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を総タンパクのための負荷対照として用い、Ｔａｔａ結合性タンパク質（ＴＢＰ）（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を核タンパク質のための負荷対照として用いた。
【０１１７】
［００１７６］β−ガラクトシダーゼ活性の定量化
［００１７７］ＤＢＺＩＭ又はＴＤＢＺＩＭによって処理されたＴ６／ＧＦＡＰ−ｌａｃＺ細胞からの抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性は、９６ウェルプレートフォーマットで化学発光アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示通りに用いて測定した。簡潔には、細胞を氷冷１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、溶解緩衝液中で、室温で３０分間溶解した。Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩプレートリーダーによるアッセイのために、上清を収集した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）で測定した。特異的β−ガラクトシダーゼ活性は、総細胞タンパク含有量に対して正規化することによって得られた。
【０１１８】
［００１７８］マウスにおけるＩＭＳの一般毒性
［００１７９］ＩＭＳ（ＤＰＩＭ及びＤＢＺＩＭ）を生理食塩水に溶解し、フレンドウイルスＢ型（ＦＶＢ）マウス（約２５〜３０ｇ重）に２週間の間隔日、腹腔内投与した。投薬量は、ＤＰＩＭについては０、２００、３００、３５０、４００及び５００ｍｇ／ｋｇ、ＤＢＺＩＭについては０、１０、３０、３５、４０及び５５ｍｇ／ｋｇであった。注射容量は、１００〜１６０μｌに維持した。処理の後、マウスの死亡率を評価した。動物実験プロトコルは、Ｂｉｏｐｏｌｉｓ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅにあるＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認された。
【０１１９】
［００１８０］統計分析
［００１８１］すべての定量結果を、平均値及び平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で示した。実験データは、不均等な分散を仮定してスチューデントの両側ｔ検定を用いて分析した。≦０．０５のＰ値は、統計的に有意であるとみなした。
【０１２０】
［００１８２］マウスの肝臓線維症に対するＩＭＳの効果
［００１８３］肝臓毒素チオアセタミド（ＴＡＡ）モデルについては、マウスで肝臓線維症を誘導するために、ＴＡＡを体重１ｋｇにつき２００ｍｇの腹腔内注射によって週３回、１２週間与えた。胆管結紮モデル（ＢＤＬ）については、ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）による腹腔内注射を通して成体マウスに麻酔をかけた。中央線の開腹手術を行って総胆管を曝露させ、次にそれを５−０の絹糸縫合により結紮した。対照動物では、胆管を曝露させるが、結紮しない。ＤＢＺＩＭ又はＤＰＩＭは、１〜１０００ｍｇ／リットルの濃度で飲料水に含ませてマウスに与えた。線維症肝臓のコラーゲン含有量は、肝臓組織切片のシリウスレッド染色によって調査した。
【０１２１】
［００１８４］ＢＤＬによって誘導された肝臓線維症に対するＤＰＩＭの効果に関して、追加の研究を実施した。ＤＰＩＭは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１２２】
［００１８５］マウス及び化合物投与
［００１８６］１２時間の明暗周期で、特定病原体未感染（ＳＦＰ）設備で飼育され、水及び食事を自由摂取させた雄ＦＶＢ／Ｎマウス（８〜１０週齢）を試験で用いた。動物実験プロトコルは、ＳｉｎｇａｐｏｒｅのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＢＭＲＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認された。
【０１２３】
［００１８７］胆汁うっ滞線維症を、ＢＤＬによって誘導した。簡潔には、マウスをケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔をかけ、中央線開腹の後、総胆管を５−０の絹糸縫合で２回結紮した。胆管を二重結紮しなかったことを除き、疑似手術を同様に実施した。実験マウスを４群に分けた。１）対照のみ（疑似手術をしたがＢＤＬはなし）、２）対照＋ＤＰＩＭ、３）ＢＤＬだけ、４）ＢＤＬ＋ＤＰＩＭ。各群は、６〜８匹のマウスからなる。処理のためのＤＰＩＭ化合物は、それぞれ５００ｍｇ／ｌ、７５０ｍｇ／ｌ、１ｇ／ｌの３つの濃度で飲料水に入れて与えた。ＤＰＩＭを含有する飲料水は、毎週交換した。平均して、各マウス（正常であるか手術された）は、約３〜４ｍｌの真水又はＤＰＩＭを含有する水を毎日飲んだことが観察された。ＮＭＲ分析による試験も実施し、ＤＰＩＭが室温条件で少なくとも２週間、水中で安定であることが確認された。化合物による処理は、動物がＢＤＬ処置から回復した後の３日目に開始した。４週間後に、肝臓をマウスから取り出し、１０％ホルマリンで固定し、その後パラフィンで包埋した。
【０１２４】
［００１８８］肝酵素の測定
［００１８９］血清を眼窩後法によって収集し、Ｃｏｂａｓｅ  ｃ  １１１（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）による自動手順で血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を測定した。
【０１２５】
［００１９０］シリウスレッドによるコラーゲン染色
［００１９１］コンシステンシーについては、コラーゲン量を視覚化するために、左及び中央の葉から調製したパラフィン切片をシリウスレッドで染色した。簡潔には、ワックス除去、再水和、自然乾燥の後、切片を０．１％シリウスレッド溶液で１時間染色し、０．５％酢酸で２回洗浄し、次にエタノールを３回交換して脱水し、最後に切片をキシレンで透明にし、Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）でマウントした。それぞれ左及び中央の各葉について、コラーゲンの染色領域を低倍率（４×）の下で少なくとも６つの独立視野で測定し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで定量化した。
【０１２６】
［００１９２］統計分析
［００１９３］特に明記しない限り、全表示画像は、６〜８匹のマウスを代表する。すべての定量データは、平均値±ＳＥで表し、異なる処理群の間の差は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定によって分析し、０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であるとみなした。
【０１２７】
［００１９４］肝細胞癌及び他の腫瘍細胞に対するＤＢＺＩＭの効果
［００１９５］ＤＢＺＩＭ（１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド）は、公開された方法（Ｈａｒｌｏｗら１９９６）に基づいて合成した。
【０１２８】
［００１９６］細胞培養及び化合物による処理
［００１９７］ヒト肝細胞癌細胞株。ＨＬＥ（未分化細胞株）及びＨｅｐＧ２（分化細胞株）は、ＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）から購入した。ヒト胃癌細胞株ＡＧＳ及びＭＫＮ２８、肺癌細胞株Ｈ１２９９、乳癌細胞株ＭＣＦ−７、グリオーマ細胞株Ｕ８７  ＭＧ及びＣ６のすべては、ＡＴＣＣから購入した。細胞株は、３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータ内で、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで通常の方法によって培養し、それらが集密まで増殖したときにトリプシン処理（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））によって１：４の比に分割した。
［００１９８］ＤＢＺＩＭの保存溶液は、水で調製した。先ず細胞を細胞培養プレート又はフラスコ内の１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭに１８〜２４時間播種し、その後、様々な濃度の化合物を異なる時間加えた。各処理の詳細を、図の凡例で見ることができる。
【０１２９】
［００１９９］ＤＮＡ含量分析
［００２００］９６ウェルプレートで増殖させたＨＬＥ細胞を、６反復により化合物で２４時間処理した。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色した。細胞は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で分析、画像化し、ＤＮＡ含量（２Ｎ対４Ｎ）は、ＤＡＰＩ染色に基づいて測定した。
【０１３０】
［００２０１］細胞増殖アッセイ
［００２０２］ＨＬＥ細胞を増殖させ、９６ウェルプレートにおいて６反復により化合物で４８時間処理した。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドによって固定し、Ｈｉｔｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてＤＡＰＩ及びＢｒｄＵ抗体で染色した。細胞は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で画像化、分析した。核染色に基づいて細胞数を計数し、ＢｒｄＵの取込みを測定して、陽染性細胞の割合で表した。
【０１３１】
［００２０３］グリオーマ細胞株の増殖。ＤＢＺＩＭ処理下のＵ８７  ＭＧ及びＣ６を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）に基づく増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて調べた。対照及び処理細胞（４８時間後）に直接ＭＴＳ試薬を加え、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩプレートリーダーを用いて吸光度シグナルを４９０ｎｍで読み取った。胃癌細胞株ＡＧＳ、肺癌細胞株Ｈ１２９９及び乳癌細胞株ＭＣＦ−７についても同様に増殖を実施したが、ＩＣ５０値は４８時間の代わりに７２時間時に測定した。
【０１３２】
［００２０４］細胞ベースのカスパーゼ３／７及びＬＤＨアッセイ
［００２０５］カプスパーゼ（Ｃａｐｓｐａｓｅ）３／７活性及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、蛍光定量アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、ＷＩ、ＵＳＡ）によって測定した。ＨＣＣ細胞を９６ウェルプレートで培養し、様々な濃度のＤＢＺＩＭによって６時間処理した後アッセイにかけた。カスパーゼ３／７アッセイについては、培地を除去し、基質緩衝液を加えて細胞を溶解し、カスパーゼ３／７と反応させ、蛍光シグナルを発生させ、それを１時間のインキュベーションの後、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩプレートリーダーによりＥｘ＝４８５ｎｍ及びＥｍ＝５３０ｎｍで読み取った。化合物処理による試料細胞のカスパーゼ３／７活性は、対照細胞への正規化の後の相対的な倍率変化で表した。ＬＤＨアッセイ（膜統合性を示す）は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐからのキットを製造業者の指示に従って用いて実施した。
【０１３３】
［００２０６］タンパク質抽出物に基づくカスパーゼ３／８／９比色アッセイ
［００２０７］カプスパーゼ３／８／９活性は、出発物質として総タンパク抽出物を用いて測定した（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）。ＨＬＥ細胞をＴ７５フラスコ中で培養し、様々な濃度のＤＢＺＩＭで処理した。サイトゾルタンパク質抽出物は、細胞をペレット化、溶解し、遠心分離によって破片を除去することによって収集した。カプスパーゼ３、８及び９の活性は、同じタンパク質抽出物を用いたが、それぞれの基質を加えて分析した。吸光度は、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで読み取った。結果は、化合物処理のない対照細胞に正規化することによって、相対カスパーゼ活性で表した。
【０１３４】
［００２０８］アネキシンＶ染色及びサイトメトリーによる分析
［００２０９］ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２細胞を様々な濃度のＤＢＺＩＭ又はＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、収集し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識した。標識細胞は、フローサイトメトリーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによって分析した。原形質膜の緑色の染色を示す細胞は、アポトーシス細胞とみなした。
【０１３５】
［００２１０］ＡＩＦ／サバイビン転位アッセイ
［００２１１］９６ウェルプレートで培養したＨＬＥ細胞をＤＢＺＩＭで２４時間処理した後、染色及び画像化を実施した。次に細胞を固定し、アポトーシス誘導性タンパク質（ＡＩＦ）及びサバイビン（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．ＣＡ、ＵＳＡ）に対する抗体、並びにＨｉｔｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）からの緩衝試薬で染色した。細胞を、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）で画像化し、分析した。細胞質から核への転位を表示するために、細胞質及び核領域の蛍光強度をプロットした。
【０１３６】
［００２１２］ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット
［００２１３］タンパク質抽出物は、細胞ペレットを、総タンパク抽出のためにはＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）で、又は核及び細胞質分画のためにはＰｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）からのＮＥ−ＰＥＲ試薬で、又はミトコンドリア及びサイトゾル分画のためにはＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（ＣＡ、ＵＳＡ）からのキットで溶解することによって調製した。ＢＣＡ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、タンパク含有量を定量した。１５マイクログラムのタンパク質を４〜１２％勾配ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルに溶解し、ニトロ細胞（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌａｒ）膜に移した。次に膜をそれぞれＢｃｌ−ＸＬ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−２α、Ｂａｘ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）、サバイビン、ｘＩＡＰ、ｃＩＡＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ＭＮ、ＵＳＡ）、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）に対する一次抗体で精査し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出した。タンパク質バンドは、ＥＣＬ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）と反応させることによって、Ｘ線フィルムに記録した。αチューブリン（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を総タンパクのための負荷対照として用い、Ｔａｔａ結合性タンパク質（ＴＢＰ）（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を核タンパク質のための負荷対照として用い、Ｃｏｘ４（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）をミトコンドリアタンパク質のための負荷対照として用いた。
【０１３７】
［００２１４］ＲＯＳ測定
［００２１５］酸化的ストレスは、Ｃｅｌｌｏｍｉｃ  ＨｉｔＫｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ＨＬＥ細胞をＤＢＺＩＭで２４時間処理し、固定し、ＲＯＳ生成の定量化のためにはジヒドロエチジウムプローブで、核染色のためにはヘキスト色素で標識した。結果を、Ｔａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアによって分析した。ＲＯＳ量の指標として、陽性応答細胞の割合をプロットした。
【０１３８】
［００２１６］細胞毒性及びアポトーシスのための高含有量分析
［００２１７］Ｈｉｔｋｉｔ：追加のＩＭＳの細胞毒性及びアポトーシスプロフィールを調べるために、多パラメータ細胞毒性１及び多パラメターアポトーシス１アッセイキット（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いた。細胞を９６−ウェルプレートで２４時間培養、処理した後に検査した。細胞は、基本的に製造業者の指示に従って固定、染色した。画像は、それぞれ、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ、ＵＳＡ）によってとり、Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。
【０１３９】
［００２１８］ＨＣＣ異種移植モデル及び投薬
［００２１９］５〜６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、０．２ｍｌ容量のマトリゲル／ＤＭＥＭミックス中の１×１０７個のＨｕｈ７細胞で接種した。ＨＣＣ細胞の植え付け後にすべてのマウスが腫瘍を発達させたわけではないので、可視的腫瘍（植え付け後約８週間）を有するものだけを以降の実験のために用いた。担癌マウスは、それぞれ対照及び処理群（ｎ＝３）にランダムに分割した。処理群のマウスはＤＢＺＩＭ（２グラム／リットル）を含有する飲料水だけを自由摂取させ、対照群のマウスは水だけを自由摂取させた。化合物処理は、３週間続いた。腫瘍サイズは毎週測定し、腫瘍容量は、式０．５２×幅２×長さを用いて計算した。
【０１４０】
［００２２０］追加のＩＭＳの抗癌活性
［００２２１］ＩＭＳの合成及び特性評価
［００２２２］特に明記しない限り、すべての溶媒及び化学物質は、民間納入業者から得たまま用いた。遠心分離は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ（４０００ｒｐｍ、１０分間）で実施された。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−４００（４００ＭＨｚ）装置に記録した。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲのデータは、化学シフト（δｐｐｍ）及び多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項）で記録した。ＧＣ−ＭＳは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣＭＳ  ＱＰ２０１０で実施した。気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）は、分割モード毛細管注入系及び炎イオン化検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフで実施した。
【０１４１】
［００２２３］置換されたイミダゾールを調製するために、ＮａＨ（油中に６０％、４２０ｍｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を０℃のイミダゾール（Ａ１）（６８０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に加え、生じた懸濁液を室温で２時間撹拌した。ベンジルブロミド（１．７１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、残留物に加えた。生じた溶液を、室温でさらに４時間撹拌した。溶媒を、減圧下で除去した。生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出し、溶媒を除去した後にＢ１を定量的な収量で得た。Ｂ２〜Ｂ４は、イミダゾール出発物質でＡ２〜Ａ４と同じプロトコルで合成した。生成物は、ＭＳ及びＮＭＲによって確認した。
【０１４２】
【化４】
0005559701.tif 000005
【０１４３】
［００２２４］ＤＢＺＩＭ、ＤＢＺＢＩＭ、１，３−ジベンジル−２−メチルイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＭＩＭ、化合物Ｃ）、ＩＢＮ−２、３、４、６、８、９（化合物）、１２、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４は、１ｍｌのＤＭＦ中で１ｍｍｏｌの置換されたイミダゾール（Ｂ１〜Ｂ４など）及び１ｍｍｏｌの置換された臭化（塩化）ベンジル又は臭化（塩化）アルキルを混合することによって合成した。混合液を１００℃で１６時間撹拌した。反応混合液を室温に冷却し、エーテル（１０ｍｌ）を加えて生成物を沈殿させた。粉状又はゲル状沈殿物をイミダゾリウム生成物として収集し、再結晶又はクロマトグラフ法によって精製し、ＮＭＲによって特性を決定した。
【０１４４】
［００２２５］ＩＢＮ−２２、２３、２９は、文献の方法に基づいて調製した（Ｚｈａｎｇら２００７、Ｃｈｉａｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｃｒａｔｒｅｅ  ２００５、Ｂｏｙｄｓｔｏｎら２００５）。
【０１４５】
［００２２６］表２に記載の残りのＩＭＳは、Ｓｉｇｍａから購入した。
【０１４６】
［００２２７］一般的に、ＩＭＳの１００ｍＭの保存溶液をＤＭＳＯで調製した。保存溶液の一定量を、使用時まで−２０℃で保存した。
【０１４７】
［００２２８］細胞株及び細胞培養
［００２２９］ヒト肝細胞癌細胞株ＨＬＥ（ｐ５３突然変異体）及びヒト胃癌細胞株ＭＫＮ  ２８は、Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（大阪、日本）から得た。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ２３１（突然変異体ｐ５３）及び乳房上皮細胞ＭＣＦ−１０Ａ（野生型ｐ５３）は、ＡＴＣＣから得た。これらの細胞株は、５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃でインキュベートした、１０％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシンの混合物１％を加えたＤＭＥＭ培地（ＭＤＡＭＢ２３１についてはＲＰＭＩ１６４０）で維持した。
【０１４８】
［００２３０］増殖阻害アッセイ
［００２３１］増殖阻害率は、生存細胞を測定するためにＭＴＴアッセイを用いて判定した。ＭＴＴアッセイのために、１ウェルにつき１×１０３個の細胞を９６ウェルプレートで培養し、０〜１００μＭの各種のＩＭＳで７２時間処理した。加湿インキュベータ内で３７℃で指定時間のインキュベーションの後、１０μＬのＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍＬ）で置換した１００μＬの培地を含む培地を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。１００μＬのＤＭＳＯを加えることによって、反応を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により５７０ｎｍで測定した。データは３つの別々の実験から提供され、ＩＭＳによって誘導された細胞増殖阻害の割合を判定し、そこではＤＭＳＯ処理細胞（対照）を１００％とした。
【０１４９】
［００２３２］細胞周期分析
［００２３３］細胞周期分布分析を実施するために、４×１０５個の細胞を１０ｃｍ培養皿に平板培養した。細胞（７０％集密度）を２４時間血清不足にして、それらを細胞周期のＧ０期に同期させた。２４時間のインキュベーションの後、細胞を新しい１０％ＤＭＥＭ培地に置換し、次に６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２４及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで７２時間処理した。浮遊性及びトリプシン処理をした接着性細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、７０％氷冷エタノールの添加によって固定し、−２０℃で保存した。２４時間のインキュベーションの後、遠心分離によって細胞を再ペレット化し、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含む０．１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、次に３７℃で１５分間インキュベートした。最後に、０．５ｍｌのＰＩ溶液（ＰＢＳ中に１００μｇ／ｍＬ）で細胞を３０分間染色した。細胞周期分布は、ＢＤ  ＦＡＣＳアレイフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって検出した。Ｇ０未満のＤＮＡを有する細胞は、アポトーシス細胞と分類した。
【０１５０】
［００２３４］アポトーシスアッセイ
［００２３５］アポトーシス分析を判定するために、４×１０５個の細胞を１０ｃｍ培養皿に平板培養した。次に、細胞を６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２５及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで７２時間処理した。浮遊性の及びトリプシン処理をした接着性細胞を収集し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いてアポトーシスを定量化した。簡潔には、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次に、１０μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎａｇｅｎ）及び１００μｇ／ｍｌのストックからの２μｌのＰＩを含む１００μｌの等倍結合緩衝液に細胞を再懸濁した。細胞を穏やかに撹拌し、暗所において室温で１５分間インキュベートした。その後、４００μｌの１×結合緩衝液を各チューブに加え、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって試料を直ちに分析した。アネキシン−Ｖコンジュゲート及びＰＩの蛍光シグナルは、蛍光強度ＦＬ１及びＦＬ２（ソフトウェアＢＤを含むＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）のチャネルで検出した。
【０１５１】
［００２３６］ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法
［００２３７］ＨＬＥ細胞を、１０ｃｍ培養皿に４×１０５の密度で播種した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を新しい１０％ＤＭＥＭ培地に置換し、次に６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２５及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで７２時間処理した。３日目に溶解緩衝液［１２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、６Ｍ尿素及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）並びに０．０２％ブロモフェノールブルー］で全細胞溶解物を調製した。溶解物を３０秒間超音波処理し、次に沸点で５分間加熱した。溶解物を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて各試料のタンパク質濃度を推定した。次に溶解物を５％の２−メルカプトエタノールと混合し、−８０℃で保存した。ウェスタンブロット法のために、５０μｇの総細胞溶解物を含む試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、電気泳動にかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水中の５％脱脂粉乳により、３７℃で６０分間ブロックした。５％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳＴで、４℃で一晩膜を一次抗体で精査した。次に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ又は抗マウス二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）とインキュベートした。検出は、製造業者のプロトコルに従って、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で実施した。ウサギポリクローナルホスホ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５、２０、４６、３９２）、抗カスパーゼ−９、抗カスパーゼ−３、抗ＰＡＲＰ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ｐ５３及びｐ２１に対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。マウス抗βアクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で膜を精査することによって、同等のタンパク質負荷が証明された。
【０１５２】
［００２３８］免疫染色及び共焦鏡検
［００２３９］免疫染色のために、８ウェルチャンバスライドに１×１０４の密度でＨＬＥ細胞を播種した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を２００μｌの新しい１０％ＤＭＥＭ培地に置換し、次に６０μＭのＩＢＮ−１５、９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、３０μＭのＩＢＮ−２５及び２０μＭのＩＢＮ−３２、並びに対照として０．０４５％ＤＭＳＯで２４時間及び４８時間処理した。洗浄後、４％ホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定し、ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ−１００で１０分間透過性化した。次に、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで細胞を６０分間ブロックし、次に、ヌクレオリンに対するマウス抗体と１時間インキュベートした（ＭＳ−３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ブロック緩衝液中で１：１００）。ＰＢＳで長時間洗浄した後、次に、暗所において室温で１時間、細胞をマウスＩｇＧ（１：２０希釈）に対するＦＩＴＣ結合抗体とインキュベートした。スライドは、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でマウントした。鏡検は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ（直立スタンド）共焦点顕微鏡で実施した。
【０１５３】
［００２４０］リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
［００２４１］細胞を、１０ｃｍ培養皿に１皿につき４×１０５細胞数の密度で播種した。翌日、細胞を９０μＭのＩＢＮ−１９、９０μＭのＩＢＮ−２４、４０μＭのＩＢＮ−２５、及び対照として０．０４５％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に曝露させた。４８時間後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキットを製造業者の指示に従って用いて、細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの質及び収量は、分光光度測定の後評価した。
【０１５４】
［００２４２］製造業者の指示（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってヒトアポトーシスＰＣＲアレイ（ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）を用い、９６ウェルフォーマットでアポトーシスに関与する８４個の重要な遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。第１鎖のｃＤＮＡは、ＰＣＲアレイ第１鎖−合成キット（Ｃ−０３、Ｓｕｐｅｒ  ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、１μｇのＲＮＡで合成した。このキットは、逆転写酵素（Ｐｏｗｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ、Ｓｕｐｅｒ  ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びランダムプライマーとオリゴｄＴプライマーとの組合せを用いる。反応の総容量は、１００μＬに希釈した２０μＬであった。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ２リアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックスＰＡ−０１２を有する７９ｓ００ＨＴ  ９６ウェルブロック、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ７５００）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応の総容量は、２５μｌであった。１μｇのＲＮＡの同等量を、ＰＣＲ反応に加えた。サーモサイクラーパラメータは、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルであった。遺伝子発現の相対変化は、ΔΔＣｔ（周期閾値）法を用いて計算した。５個のハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、アクチン−β、β２ｍ、Ｈｐｒｔ１及びＲｐｌ１３ｄのサイクル数の平均を用いて、試料間の発現を正規化した。発現データは、調節倍率で示す。データを正規化する内部対照として、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現レベルを利用した。記録された発現の変化倍率は、対照値に対する処理値の比である。
【０１５５】
［００２４３］化合物９によるＨＣＣマウスの処理
［００２４４］５〜６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、０．２ｍｌ容量のマトリゲル／ＤＭＥＭミックス中の１×１０７個のＨｕｈ７細胞で接種した。ＨＣＣ細胞の植え付け後にすべてのマウスが腫瘍を発達させたわけではないので、可視的腫瘍（植え付け後約８週間）を有するものだけを以降の実験のために用いた。担癌マウスは、それぞれ対照及び処理群（ｎ＝３）にランダムに分割した。処理群のマウスは０．６ｇ／ｌ又は１．５ｇ／ｌの化合物９（ＩＢＮ−９）を含有する飲料水だけを自由摂取させ、対照群のマウスは水だけを自由摂取させた。化合物処理は、３週間続いた。腫瘍サイズは毎週測定し、腫瘍容量は、式０．５２×幅２×長さを用いて計算した。
【０１５６】
［００２４５］統計分析
［００２４６］すべてのデータは、平均値±ＳＤで示す。群間の有意差は、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて判定した。有意水準は、以下の通りに定義した：ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）及びｐ＜０．００１（＊＊＊）。
【０１５７】
［００２４７］結果
［００２４８］ＩＭＳの抗酸化、抗炎症及び抗線維症特性
【０１５８】
［００２４９］培養ＨＳＣ  Ｔ６細胞及びＦＶＢマウスに対するＩＭＳの毒性の判定
［００２５０］先ず、培養ＨＳＣ−Ｔ６細胞に対するＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの毒性を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）に基づく増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて調べた。図１ａ及び１ｂは、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養したＴ６細胞の増殖に対するＤＢＺＩＭ（０〜４００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（０〜２００μＭ）の効果を示す。２５０〜４００μＭの高い濃度で、ＤＢＺＩＭは細胞増殖を統計的に有意に３．５〜８．９％阻害した。１２５〜２００μＭの高い濃度で、ＴＤＢＺＩＭは対照と比較して１３〜１９％のより強い阻害を証明した。
【０１５９】
［００２５１］予備毒性試験では、ＦＶＢ近交系マウスでのインビボ試験のために、２つの形態のＩＭＳを選択した。ＤＢＺＩＭについては、致死投薬量は５０ｍｇ／ｋｇであり、ＬＤ５０は３０〜４０ｍｇ／ｋｇと推定された。ＤＰＩＭについては、致死投薬量は５００ｍｇ／ｋｇ、ＬＤ５０は約３００〜４００ｍｇ／ｋｇであった。
【０１６０】
［００２５２］ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは細胞のＲＯＳレベルを減弱させ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を高めた。
［００２５３］ＩＭＳで処理したＨＳＣ  Ｔ６細胞の細胞内酸化的ストレスレベルを測定するために、完全血清培地でＤＢＺＩＭ（１０、５０、１００及び３００μＭ）又はＴＤＢＺＩＭ（１０、５０及び１００μＭ）と４８時間培養した細胞を、ＲＯＳ、ＧＳＨ及びＧＳＳＧについて試験した。ＮＡＣ（１又は５ｍＭ）及びＥＧＣＧ（２５μＭ）で処理した細胞を、参照として含めた。ＩＭＳ処理は、有意に減弱された細胞ＲＯＳレベルをもたらした。図２ａに示すように、ＲＯＳはＤＢＺＩＭによって投薬量依存的に抑制された（５０μＭで２５％（Ｐ＜０．００５）、３００μＭで３４％（Ｐ＜０．０００５））。ＤＢＺＩＭの三量体を含むＴＤＢＺＩＭは、１０μＭで細胞のＲＯＳレベルを１９％（Ｐ＜０．０１）、１００μＭで３６％（Ｐ＜０．００００１）実質的に抑制した（図２ｂ）。比較では、ＥＧＣＧは２５μＭでＲＯＳを１４％（Ｐ＜０．００５）減弱させることができたが、ＮＡＣは１ｍＭでさえＲＯＳレベルに対する明らかな阻害を示さなかった。
【０１６１】
［００２５４］重要な内因性抗酸化剤、ＧＳＨのレベルに対する化合物の影響も調査した。図３ａ及び３ｂに示すように、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含む、総細胞ＧＳＨ量を定量化した。図３ａに示すように、ＤＢＺＩＭは、１０、５０及び１００μＭにおいて総ＧＳＨレベルをそれぞれ７％、１２％（Ｐ＜０．００５）及び２０％（Ｐ＜０．０００１）減弱させた。ＤＢＺＩＭの３００μＭの高い投薬量で８％のわずかな増強が観察されたが、統計的有意性はなかった。ＮＡＣ（５ｍＭ）は総ＧＳＨに対するいかなる影響も示さなかったが、ＥＧＣＧ（２５μＭ）は総ＧＳＨ合成を１９％（Ｐ＜０．０１）誘導し、それは初期の報告（Ｆｕら２００６）に一致した。そのモノマーと対照的に、ＴＤＢＺＩＭは１０〜１００μＭで総細胞ＧＳＨレベルを変化させなかった（図３ｂ）。ＧＳＨは、Ｈ２Ｏ２をＨ２Ｏに還元する反応においてＧＳＳＧに酸化された。図３ｃ及び３ｄに示すように、ＧＳＳＧの量も定量した。ＤＢＺＩＭは、ＧＳＳＧを１０μＭで１３％、５０μＭで２３％（Ｐ＜０．０００５）、１００μＭで３５％（Ｐ＜０．０００１）、３００μＭで８５％（Ｐ＜０．０００１）減少させた。対照的に、ＥＧＣＧはＧＳＳＧを２５μＭで４２％減少させ（Ｐ＜０．０５）、ＮＡＣは５ｍＭでＧＳＳＧに影響を及ぼさなかった。ＴＤＢＺＩＭも、ＧＳＳＧ生成を１０μＭで１２％（Ｐ＜０．０５）、５０μＭで３５％（Ｐ＜０．０５）、１００μＭで５０％（Ｐ＜０．０００１）抑制した。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、ＤＢＺＩＭの影響下において、１０、５０及び１００μＭでそれぞれ８％、１５％（Ｐ＜０．００１）及び２３％（Ｐ＜０．０００１）高められた（図３ｅを参照）。ＤＢＺＩＭの高い投薬量（３００μＭ）で、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の増加はより劇的で、対照群のそれの７．４倍に達した。５ｍＭのＮＡＣについてはＧＳＨ／ＧＳＳＧ比に変化はなかったが、２５μＭのＥＧＣＧについてはＧＳＨ／ＧＳＳＧ比に２倍の増加が観察された（Ｐ＜０．０００１）。ＴＤＢＺＩＭについては、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、１０μＭで１４％、５０μＭで６５％（Ｐ＜０．０５）、１００μＭで１０６％（Ｐ＜０．００１）高められた（図３ｆ）。これらの結果は、これらの２つの形態のＩＭＳが、主にＧＳＨの酸化からのＧＳＳＧの生成を減弱させることを通してＧＳＨ／ＧＳＳＧ比をかなり高め、改善された抗酸化をもたらすことを示唆した。
【０１６２】
［００２５５］ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭはＧＰｘ及びＣＡＴ活性を減弱させ、ＤＢＺＩＭはＧＳＴ活性を高めた。
［００２５６］ＩＭＳの抗酸化特性をさらに調査するために、抗酸化酵素ＧＰｘ、ＣＡＴ、ＳＯＤ及びＧＳＴの活性を試験した。図４ａは、ＤＢＺＩＭがＧＰｘ活性を１０μＭで１０％（Ｐ＜０．００５）、５０μＭで１０％（Ｐ＜０．０１）減弱させたが、３００μＭの高い濃度でＧＰｘ活性を１５％高め（Ｐ＜０．００５）、わずかな二相性パターンを有することを示す。ＴＤＢＺＩＭについては、ＧＰｘ活性は１０μＭで１８％（Ｐ＜０．０５）、５０μＭで２５％（Ｐ＜０．０１）、１００μＭで３４％（Ｐ＜０．００５）抑制された（図４ｂ）。比較では、ＥＧＣＧはＧＰｘ活性を２５μＭで５３％（Ｐ＜０．００５）減弱させたが、ＮＡＣは５ｍＭであまり効果を示さなかった（図４ａ）。
【０１６３】
［００２５７］ＣＡＴ活性に対するＤＢＺＩＭの影響について類似したパターンが観察された。ＤＢＺＩＭは、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭでＣＡＴ活性をそれぞれ１９％、１６％及び１２％（Ｐ＜０．０５）減弱させることができた（図４ｃ）。濃度を３００μＭまで高くした場合、減弱効果は、統計的有意性はないものの８％に低下した。ＴＤＢＺＩＭは、ＣＡＴ活性を１０μＭで２５％（Ｐ＜０．００５）、５０μＭで３１％（Ｐ＜０．０００５）、１００μＭで２０％（Ｐ＜０．００５）阻害し、５０μＭより上ではより低い効力であった（図４ｄ）。ＥＧＣＧはＣＡＴ活性に対する１３％の抑制を示したが、データは有意でなく、他方、ＮＡＣは３５％の阻害（Ｐ＜０．０１）を証明した（図４ｃ）。
【０１６４】
［００２５８］図４ｅ及び４ｆに示すように、ＤＢＺＩＭ、ＴＤＢＺＩＭ、ＥＧＣＧ及びＮＡＣのすべてはＳＯＤ活性に対して大きな影響を示さず、これらの化合物がスーパーオキシドに作用しないことが示唆された。図４ｇは、ＤＢＺＩＭ（１０〜３００μＭ）の処理下の細胞のＧＳＴ活性を例示する。ＧＳＴ活性は、１００μＭで２２％（Ｐ＜０．００５）、３００μＭで３２％（Ｐ＜０．０００１）高められた。対照的に、ＥＧＣＧ及びＮＡＣは、ＧＳＴ活性にあまり影響を及ぼさなかった。
【０１６５】
［００２５９］ＤＭＳＯ細胞毒性からＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭによって保護された一次ＨＳＣ
ＤＭＳＯは、細胞ベースのアッセイ（≦０．５％（ｖ／ｖ）の濃度）及び細胞低温保存（約１０％（ｖ／ｖ）の濃度）で用いられる一般的な溶媒である。しかし一次ＨＳＣについては、ＤＭＳＯは０．２％（ｖ／ｖ）の濃度でかなりの毒性を与えた（図５ａ）。０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯとインキュベートした対照細胞は、２６時間後に死滅した。対照的に、細胞は１００μＭのＤＢＺＩＭ又は５０μＭのＴＤＢＺＩＭ及び０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの共存下で生存した。それらを９３時間にわたって培養した場合でも、細胞は生存能を維持し、ＴＤＢＺＩＭの存在下で集密に至るまで増殖した。しかし、ほとんどの細胞は、９３時間後にはＤＢＺＩＭの存在下でも死滅した。このことは、ＴＤＢＺＩＭが、一次ＨＳＣに対するＤＭＳＯの毒性に対してより強力な保護効果を提供することを示唆した。
【０１６６】
［００２６０］培養ＨＳＣ  Ｔ６細胞におけるＤＭＳＯ誘導酸化的ストレスは、総細胞ＧＳＨレベルの低下（対照の７４％、Ｐ＜０．０００１）、ＧＳＳＧ量の激増（対照の４．４倍、Ｐ＜０．０００１）、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の低下（対照の１７％、Ｐ＜０．００１）、誘導されたＧＰｘ（対照の２．６２倍、Ｐ＜０．０００１）及びＣＡＴ（対照の１．７倍、Ｐ＜０．０００１）の抗酸化酵素によって定量的に評価した（図５ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆを参照）。ＤＭＳＯはＳＯＤ活性をわずかに（１０％の増加）高めもしたが、データは統計的に有意でなかった（図５ｇ）。この知見は、一次ＨＳＣに対するＤＭＳＯ細胞毒性に対するＩＭＳの保護効果が、酸化的ストレスの減弱を通すものであることを示唆した。ヒトレンズ上皮細胞が１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯによって死滅することから、フラボノイドのケルセチン（０．１μＭ）が、おそらく酸化的ストレスの減弱を通して、効果的に保護することができることを見出した別の試験で、類似した観察が報告された（Ｃａｏら２００７）。
【０１６７】
［００２６１］ＩＭＳは、ＨＳＣ活性化マーカー及び線維形成エンドポイントを時間及び投薬量依存的に抑制した。
［００２６２］インビトロでのＨＳＣ活性化のためにＳＭＡＡと一緒にＧＦＡＰをバイオマーカーとして用いることができることが、以前に示されている（Ｚｈａｎｇら２００６）。ＥＣＭ（コラーゲン及びフィブロネクチンを含む）の沈着が、線維症の程度を評価するために用いられるエンドポイントであった。２つのＩＭＳ（ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭ）は、ＨＳＣ活性化マーカー（ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡ）並びに線維症エンドポイント（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）のｍＲＮＡレベルを投薬量依存的に（図６ａ及び６ｂ）及び時間依存的に（図７ａ〜ｄ）抑制した。図６ａに示すように、ＤＢＺＩＭは、ＧＦＡＰ  ｍＲＮＡ発現レベルを１０μＭ及び３００μＭでそれぞれ１８％（Ｐ＜０．０５）及び８６％（Ｐ＜０．００１）減弱させた。それは、ＳＭＡＡを１００μＭで２１％（Ｐ＜０．０５）、３００μＭで５８％（Ｐ＜０．００１）減弱させ、ｃｏｌ１ａ１を１００μＭで２１％（Ｐ＜０．０５）、３００μＭで４４％（Ｐ＜０．００１）減弱させ、フィブロネクチンを１μＭ〜３００μＭの投薬量で１９％（Ｐ＜０．００５）〜４０％（Ｐ＜０．０００１）減弱させた。
【０１６８】
［００２６３］ＴＤＢＺＩＭの投薬量依存性は、そのモノマー対応物と比較してより顕著でなかった（図６ｂ）。ＴＤＢＺＩＭは、ＧＦＡＰ  ｍＲＮＡを１μＭで３２％（Ｐ＜０．０１）、１０μＭで２０％（Ｐ＜０．０１）、１００μＭで６０％（Ｐ＜０．０００１）低減させ、ＳＭＡＡを１μＭの低い投薬量で２７％だけ（Ｐ＜０．０１）、ｃｏｌ１ａ１を１μＭで３９％（Ｐ＜０．００５）、１０μＭで３６％（Ｐ＜０．００５）、１００μＭで５３％（Ｐ＜０．００１）、及びフィブロネクチンを１μＭで３２％（Ｐ＜０．００１０）、１０μＭで２８％（Ｐ＜０．０００５）、１００μＭで４３％（Ｐ＜０．０００１）低減させた。
【０１６９】
［００２６４］経時的試験は、１００μＭのＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭのそれぞれが、８時間時にそれぞれ２８％（Ｐ＜０．０５）及び３０％（Ｐ＜０．０５）、２４時間時に４０％（Ｐ＜０．００５）及び３６％（Ｐ＜０．００５）、４８時間時に５６％（Ｐ＜０．０００１）及び６０％（Ｐ＜０．０００１）ＧＦＡＰを抑制したことを示す。それらは、８時間時に２２％及び２２％（Ｐ＜０．０１）、２４時間時に２９％（Ｐ＜０．００５）及び４０％（Ｐ＜０．０００１）、４８時間時に２１％（Ｐ＜０．０５）及び５３％（Ｐ＜０．００１）ｃｏｌ１ａ１を抑制した。それらはまた、８時間時に１５％（Ｐ＜０．０５）及び２５％（Ｐ＜０．０５）、２４時間時に１７％（Ｐ＜０．０５）及び２９％（Ｐ＜０．０５）、４８時間時に２５％（Ｐ＜０．０００５）及び４３％（Ｐ＜０．０００１）フィブロネクチンを抑制した。ＳＭＡＡが２４時間時に１００μＭのＴＤＢＺＩＭによって最高７９％一時的に誘導されたことを除き、ＩＭＳが時間及び投薬量依存的にほとんどすべてのＨＳＣ活性化マーカー及びエンドポイント分子を抑制したことは一般に真であったが、８時間時に両化合物で変化は観察されず、４８時間時にＤＢＺＩＭについて２１％の抑制（Ｐ＜０．０５）が記された。ＳＭＡＡ発現は、高投薬量のＴＤＢＺＩＭによって特に誘導された。タンパク質発現レベルに及ぼす化合物の影響を評価するために、ＧＦＡＰ、ＳＭＡＡ、ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチンのウェスタンブロット法も実施した。図８に示すように、細胞を４８時間処理した場合、ＤＢＺＩＭ（１００μＭ）及びＴＤＢＺＩＭ（５０μＭ）は、プロコラーゲンαＩ（Ｉ）及びフィブロネクチンを有意に、またＧＦＡＰ発現をより低い程度に減弱させた。ＤＢＺＩＭはＳＭＡＡタンパク質を抑制したが、ＴＤＢＺＩＭはＳＭＡＡを高め、そのことはリアルタイムＰＣＲデータに一致した。他の時点（８時間時及び２４時間時）も調べたが、有意な変化は観察されなかった（データは示さなかった）。
【０１７０】
［００２６５］ＩＭＳは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβＲＩの転写を抑制した。
［００２６６］ＴＧＦ−β１は、最も重要な線維形成促進性サイトカインである。肝臓が攻撃されると、静止しているＨＳＣはクッパー細胞及び内皮細胞によって分泌されるＴＧＦ−β１に応答し、オートクリンループを通して自身でＴＧＦ−β１の生成を開始する。ＴＧＦ−β１は、ＨＳＣ活性化及び肝線維形成の間過剰に発現される（Ｂａｃｈｅｍら１９９２）。ＩＭＳ処理下の総ＴＧＦ−β１合成を測定した。図９ａに示すように、ＤＢＺＩＭは１００μＭ及び３００μＭの高い濃度で、ＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡをそれぞれ２８％（Ｐ＜０．０５）及び３３％（Ｐ＜０．００５）抑制した。ＴＤＢＺＩＭは、投薬量（１〜１００μＭ）に関係なくＴＧＦ−β１を約２３％阻害し、統計的有意性もあった（Ｐ＜０．０５）（図９ｂ）。８〜２４時間処理については、ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの両方は、ＴＧＦ−β１転写を４０〜５０％（Ｐ＜０．０５）抑制した（図９ｃ）。より不明瞭な投薬量依存性又は時間依存性は、ＴＧＦ−β１の自己ルーピング特性によるのであろう。
【０１７１】
［００２６７］ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭは、炎症誘発性及び線維形成促進性サイトカインＩＬ−６を阻害した。
［００２６８］ＩＬ−６はＮＦ−κＢによって調節され、炎症性応答に関与する。収縮促進性及び炎症誘発性のサイトカインであるので、ＩＬ−６は肝線維形成で重要な役割を演ずる。ＩＬ−６に及ぼすＩＭＳの影響を研究するために、ＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによって定量化した。図１０ａに示すように、ＤＢＺＩＭは、ＩＬ−６転写を１μＭで３７％（Ｐ＜０．０００５）、１０μＭで４６％（Ｐ＜０．０００５）、１００μＭで５３％（Ｐ＜０．０００１）、３００μＭで５９％（Ｐ＜０．０００１）投薬量依存的に阻害した。ＴＤＢＺＩＭは、１μＭで３７％（Ｐ＜０．０１）、１０μＭで５５％（Ｐ＜０．０００１）、１００μＭで８０％（Ｐ＜０．０００１）のより強力な阻害を証明した（図１０ｂ）。経時的試験は、１００μＭのＤＢＺＩＭが４８時間時にＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現を有意に５３％（Ｐ＜０．００５）抑制したことを示した。ＤＢＺＩＭのより短い時間の処理は、ＩＬ−６の統計的に有意な抑制を示さなかった。１００μＭのＴＤＢＺＩＭは、２４時間時に５２％（Ｐ＜０．００５）、４８時間時に８０％（Ｐ＜０．０００１）の阻害作用を証明した（図１０ｃ）。
【０１７２】
［００２６９］ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭはＮＦ−κＢ及びＡＰ−１転写因子を通して媒介した。
［００２７０］転写因子ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１は、細胞の酸化還元状態に感受性であることが知られている。ＮＦ−κＢも、炎症及び組織修復などの生理学的状態で必要不可欠な役割をする。細胞をＩＭＳで処理したときの、ＮＦ−κＢ  Ｐ６５及び活性化タンパク質１（ＡＰ−１）ファミリーメンバー（ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｊｕｎ  Ｂ／Ｄ、Ｆｒａ−１／２）のタンパク質発現を調べた。図１１に示すように、活性型の核ＮＦ−κＢ  Ｐ６５は、ＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの両方によって有意に減弱された。サイトゾル中の潜在性のＮＦ−κＢの量は、影響を受けなかった（データは示さず）。ＡＰ−１、ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎ  Ｄ及びＦｒａ−１は抑制されたが、ｃ−Ｊｕｎ、Ｊｕｎ  Ｂ及びＦｒａ−２への影響はより小さかった。
【０１７３】
［００２７１］ＩＭＳは、ＨＳＣ特異的ＧＦＡＰリポーター代用物の発現を調節した。
ＧＦＡＰ−ｌａｃＺ導入遺伝子リポーターを抗線維症化合物のスクリーニングに用いることができることが、以前に示されている（Ｍａｕｂａｃｈら２００６、Ｚｈａｎｇら２００６）。本実験では、異なる投薬量（０〜３００μＭ）及び時点（２４時間及び４８時間）のＤＢＺＩＭ及びＴＤＢＺＩＭの処理下のβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。β−ガラクトシダーゼ活性への有意な抑制、すなわち１００μＭで２５％（Ｐ＜０．００１）、３００μＭで３４％（Ｐ＜０．００１）の抑制が、ＤＢＺＩＭについて観察された（図１２ａ）。ＴＤＢＺＩＭについては、２４時間時により小さく一時的な抑制（２０％）が１００μＭで観察された（図１２ｂ）。
【０１７４】
［００２７２］異なる置換基を有するさらなるＩＭＳの安全性及び有効性
［００２７３］異なる構造のＩＭＳを、構造活性関係（ＳＡＲ）予備試験でも試験した。試験は、３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＩＭ）、１，３，５−トリス（４−メチルイミダゾリウム）に連結したシクロファン・３Ｂｒ（ＴＤＢＺＩＭ）、１，３−ジイソプロピルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩（ＤＰＩＭ）、１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＤＢＩＭ）、１，３−ビス（１−アダマンチル）イミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩（ＡＭＩＭ）、１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−イミダゾリニウムクロリド（ＴＭＰＨＩＭ）、１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＰＨＩＭ）及び１，３−ビスベンジル−ベンゾイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＢＩＭ）で実施した。一般に、大きな芳香族基を有するもの、例えば１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）イミダゾリウムクロリド（ＴＭＰＨＩＭ）及び１，３−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）イミダゾリウムクロリド（ＤＰＰＨＩＭ）と比較して、より小さな脂肪族基を有するもの、例えば１，３−ジイソプロピルイミダゾリニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＤＰＩＭ）及び１，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩（ＤＢＩＭ）は、Ｔ６細胞に対してより低い毒性を示した。イミダゾリウムと芳香環との間にメチルスペーサーを有するもの、例えば１，３−ビスベンジルイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＩＭ）及び１，３−ビスベンジルベンゾイミダゾリウムブロミド（ＤＢＺＢＩＭ）は、中程度の毒性を示した。化合物の毒性は、以下の通りにＩＣ５０に基づいてランクを付けた。ＤＰＩＭ（ＩＣ５０＝３．１ｍＭ）＜ＤＢＩＭ（ＩＣ５０は限定的ＤＭＳＯ溶解性のために未測定であるが、２〜３ｍＭと推定された）＜ＤＢＺＩＭ（ＩＣ５０＝１．７ｍＭ）＜ＴＤＢＺＩＭ（約５００μＭのＩＣ５０）＜ＤＢＺＢＩＭ（ＩＣ５０＝３１０μＭ）＜ＡＭＩＭ（ＩＣ５０＝１６６μＭ）＜ＴＭＰＨＩＭ（ＩＣ５０＝１１０μＭ）＜ＤＰＰＨＩＭ（ＩＣ５０＝３４μＭ）。
【０１７５】
［００２７４］線維症の抑制における化合物の効力も、評価した。ＨＳＣ  Ｔ６細胞を、それらのそれぞれのＩＣ５０値未満の濃度のＩＭＳで処理した。化合物を、それらの溶解性によってＤＭＳＯ又はＨ２Ｏに溶解し、バンドの強度をそれぞれの対照と比較した。図１３Ａに示すように、ＳＭＡＡ、Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβＲＩのタンパク質のすべては、ＩＭＳの処理によって抑制された。バンドピクセルのグレイスケールの測定からの半定量的データを、図１３Ｂに要約する。５つのパラメータのすべてに同等の重要性を割り当てると、ＩＭＳの効力は、ＤＰＩＭ＞ＴＭＰＨＩＭ＞ＡＭＩＭ＞ＤＢＩＭ＞ＤＢＺＢＩＭ＞ＤＢＺＩＭ＞ＤＰＰＨＩＭ＞ＴＤＢＺＩＭに大きくランクを付けることができる。
【０１７６】
［００２７５］ＧＦＡＰ、ＳＭＡＡ、フィブロネクチン及びｃｏｌ１ａ１転写産物も、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。図１４ａ、ｂ、ｃ、ｄに示すように、ＧＦＡＰ  ｍＲＮＡは、２ｍＭのＤＰＩＭによって７８％（Ｐ＜０．０００１）、５０μＭのＡＭＩＭによって６９％（Ｐ＜０．０００５）、５０μＭのＴＭＰＨＩＭによって６６％（Ｐ＜０．００１）、１００μＭのＤＢＺＢＩＭによって５０％（Ｐ＜０．００５）抑制された。ＳＭＡＡ  ｍＲＮＡは、１ｍＭのＤＢＩＭによって４９％（Ｐ＜０．０５）、２ｍＭのＤＰＩＭによって７８％（Ｐ＜０．０００１）、５０μＭのＡＭＩＭによって２３％（Ｐ＜０．０５）、５０μＭのＴＭＰＨＩＭによって４９％（Ｐ＜０．０５）抑制された。フィブロネクチンｍＲＮＡは、ＤＰＩＭによって４８％（Ｐ＜０．０５）、ＴＭＰＨＩＭによって２９％（Ｐ＜０．００５）、ＤＢＺＩＭによって２６％（Ｐ＜０．００５）抑制された。Ｃｏｌ１ａ１  ｍＲＮＡは、ＤＢＩＭによって５８％（Ｐ＜０．０００５）、ＤＰＩＭによって６１％（Ｐ＜０．０００１）、ＴＭＰＨＩＭによって６２％（Ｐ＜０．０００１）、ＤＰＰＨＩＭによって４７％（Ｐ＜０．０５）抑制された。ＥＧＣＧは、ＨＳＣ活性化及び線維症に対する有意な阻害を示さなかった。このことは、４８時間の長期インキュベーションの下でのＥＧＣＧの化学的不安定性のためであろう。ＥＧＣＧの半減期が、ヒト食道癌細胞の培地でわずか３０分間（Ｈｏｕら２００５）であり、３０ｍｇ／ｋｇの投薬量でラット血液中で約７２分間（Ｌｉｎら２００４）であることが報告された。すべてのＩＭＳの中で、ＤＰＩＭ及びＴＭＰＨＩＭは全４つの遺伝子に対して有意な抑制を示し、試験条件下でＤＰＩＭが最も強力な剤であった。
【０１７７】
［００２７６］マウスの肝臓線維症に対するＩＭＳの効果
［００２７７］ＤＢＺＩＭ及びＤＰＩＭは、それぞれ肝臓毒素チオアセタミド（ＴＡＡ）又は胆管結紮（ＢＤＬ）と呼ばれる外科的方法によって誘導されたマウスの２つの肝臓線維症モデルで試験した。図１５に示すように、飲料水に入れて投与した場合、２つのＩＭＳは肝臓線維症の２つのマウスモデルで抗線維症特性を示した。特にＤＢＺＩＭは、ＴＡＡモデル（５００ｍｇ／Ｌ、１２週後）（図１５ａ）及びＢＤＬモデル（１０ｍｇ／Ｌ、４週後）（図１５ｂ）で線維症を減弱させ、ＤＰＩＭは、ＢＤＬモデルにおいて１ｇ／Ｌ（４週後）でその効果を示した（図１５ｃ）。このデータは、ＩＭＳが抗肝臓線維症治療化合物としての能力を有することを示唆する。
【０１７８】
［００２７８］ＤＰＩＭは、肝臓線維症を減弱させた。
［００２７９］ＤＰＩＭは、さらなるインビボ試験のために選択された。ＢＤＬ処置の熟達を確保するために、いくつかの練習及び試験を実施し、最終的に、ＢＤＬ手術で９０％を超える成功率、及び手術したマウスの４週間を超える生存期間を達成した。線維症の程度は、ＢＤＬから４週間後にシリウスレッドコラーゲン染色によって調べた。ＢＤＬ群において類洞領域の周りに多大なコラーゲン蓄積が観察された（図１６Ｃ）が、疑似手術群においては最小限のコラーゲン染色だけが見られた（図１６Ａ）。４週間の１ｇ／ｌのＤＰＩＭによる疑似マウスの処理は、コラーゲンのいかなる有意な蓄積も誘導しなかった（図１６Ｂ）。化合物処理の４週間後に、コラーゲン量は７５０ｍｇ／ｌ（図１６Ｅ）及び１ｇ／ｌ（図１６Ｆ）のＤＰＩＭによって激減した。５００ｍｇ／ｌのＤＰＩＭによる効果は決定的でなかったが、その理由は、データ収集時に１匹のマウスだけをこの用量で処理したからである（図１６Ｄ）。定量的には、シリウスレッド陽性領域は、７５０ｍｇ／ｌの用量によって８．６９から４．３３に減少し、１ｇ／ｌの用量によってさらに（及び用量依存的に）３．４２まで減少した（図１７）。
【０１７９】
［００２８０］ＤＰＩＭは、線維症細胞増殖を減少させた。
［００２８１］肝臓重量は、主に１）胆汁の蓄積、及び２）線維症細胞の増殖のためにＢＤＬ−マウスで増加する。異なる処理群の肝臓を計量したが、ＢＤＬの４週間後に、肝臓重量は疑似手術マウスと比較して８３％増加した（疑似手術の１．５０±０．１９ｇに対してＢＤＬ  ４週間の２．７４±０．５１ｇ、Ｐ＜０．０５）。しかし、ＤＰＩＭ化合物処理は、肝臓重量の有意な減少（Ｐ＜０．０５、ＤＰＩＭ化合物処理対ＢＤＬ  ４週間）、すなわち、７５０ｍｇ／ｌの処理群では１．９７±０．４４ｇ、１ｇ／ｌの処理群では１．６５±０．２０ｇを示した（図１８）。この用量依存性の効果は、シリウスレッド染色領域と一貫していた。疑似手術マウスと比較して、疑似手術マウスでの４週間のＤＰＩＭ処理は、肝臓重量の有意な変化をもたらさなかった（ＤＰＩＭ処理の１．５６±０．０８ｇに対して疑似手術の１．５０±０．１９ｇ、Ｐ＝０．４６）（図１８）。
【０１８０】
［００２８２］肝臓切片のＨ＆Ｅ染色（図１９）は、ＤＢＬ群（図１９Ｂ）及び対照疑似群（図１９Ａ）と比較すると、ＤＰＩＭ処理（図１９Ｃ）は類洞領域の周りの増殖性細胞（Ｈａｍｅｈｅｘｌｉｎの核染色によって同定された）の数を減少させることを示した。メッセンジャーレベルでは、ＤＰＩＭはコラーゲン１ａ１  ｍＲＮＡも減少させた（図２０）。
【０１８１】
［００２８３］肝細胞癌及び他の腫瘍細胞に対するＤＢＺＩＭの効果
【０１８２】
［００２８４］ＤＢＺＩＭはＨＬＥ細胞の細胞増殖を阻害し、細胞周期を破壊した。
［００２８５］ＨＣＣ細胞の増殖及び細胞周期に対するＤＢＺＩＭの効果は、高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）プラットホームで特徴づけた。各濃度の下で、少なくとも１０００個の細胞を分析した。複製ＤＮＡに組み込まれる５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて、細胞周期のＳ期を通過した細胞を同定する。核同定及びＤＮＡ含有量判定のために、ＤＡＰＩ染色を用いた。ＤＢＺＩＭは、より少ない総細胞数及びより少ないＢｒｄＵ陽性細胞によって用量依存的に示されたように、ＨＬＥ細胞増殖を阻害し（図２１Ａ）、ＨＬＥ細胞をＧ０／Ｇ１期に停止させた（図２１Ｂ）。
【０１８３】
［００２８６］ＤＢＺＩＭは、ＨＣＣ細胞においてアポトーシスを通して細胞死を誘導した。
［００２８７］細胞ベースのカスパーゼ３／７活性及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイは、ＤＢＺＩＭの影響下の細胞のアポトーシス及び壊死の区別を可能にする。図２２Ａ〜Ｄに示すように、ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２細胞におけるカスパーゼ３／７活性（アポトーシスを示す）はＤＢＺＩＭによって高められたが、ＬＤＨ放出（細胞毒性を示す）への影響は同じ処理レジメンの下で最も少なかった。そのことは、本処理条件で用いたＤＢＺＩＭが、壊死ではなく主にアポトーシスによってＨＣＣ細胞死を引き起こすことを示唆した。
【０１８４】
［００２８８］アポトーシスは、アネキシンＶ染色によってさらに確認された。アポトーシスの初期には、細胞は原形質膜の内面から細胞表面に膜ホスファチジルセリン（ＰＳ）を移動させた。表面ＰＳは、ＰＳに高い親和性を有し、アポトーシスマーカーとしてしばしば用いられるアネキシンＶの蛍光コンジュゲートによって容易に検出される。図２２Ｅ〜Ｆの散布図に示すように、ＤＢＺＩＭはＨｅｐＧ２及びＨＬＥ細胞の両方で用量依存的にアポトーシスを誘導した。陽性対照として、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連のアポトーシス誘導リガンド）がＨｅｐＧ２だけでアポトーシスを誘導し、ＨＬＥ細胞では誘導しなかったことが記された。
【０１８５】
［００２８９］ＤＢＺＩＭは、ミトコンドリア媒介性のアポトーシス経路を始動させた。
［００２９０］ＤＢＺＩＭが関与するアポトーシス経路を理解するために、カスパーゼ３、８、９の活性を、比色アッセイを用いて分析した。図２３Ａに示すように、カスパーゼ８活性はＤＢＺＩＭによる影響を受けなかったが、カスパーゼ９及び３の活性はＤＢＺＩＭによって用量依存的に高められ、ミトコンドリア媒介性のアポトーシス経路を指し示す。しかし、ＤＢＺＩＭは、ミトコンドリアからサイトゾルへのシトクロムＣの最小限の放出を引き起こすことが見出された（図２３Ｂ）。
【０１８６】
［００２９１］ミトコンドリア媒介性の内因性アポトーシス経路は、主にＢｃｌ−２及びＩＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）ファミリーによって調節される。図２４のウェスタンブロット法に示すように、抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−ＸＬ及びアポトーシス誘発性タンパク質Ｂａｋは、ＤＢＺＩＭによってそれぞれわずかに下方制御及び上方制御され、Ｂｃｌ−２ファミリーの他の２つのメンバー、Ｂｃｌ−２α及びＢａｘは、処理によって影響を受けなかった。ＩＡＰファミリーでは特に、サバイビンがＤＢＺＩＭによって有意に抑制されたが、ｘＩＡＰ及びｃＩＡＰは影響を受けなかった（図２４）。さらに、ＨＣＳ分析は、ＤＢＺＩＭの影響下でサバイビンが核から細胞質に転位されることを明らかにした（図２５）。
【０１８７】
［００２９２］ＤＢＺＩＭは、細胞質から核へのＡＩＦの転位を誘導した。
［００２９３］アポトーシス誘導性因子（ＡＩＦ）は、通常ミトコンドリアに位置し、アポトーシスの誘導後に核に転位する。それは、カスパーゼ９を放出するようにミトコンドリアを誘導する。核では、ＡＩＦは、カスパーゼ非依存性アポトーシス経路として知られる過程である、クロマチン凝集及びＤＮＡ断片化も誘導する。ウェスタンブロット法によって、ＤＢＺＩＭは核へのＡＩＦの転位を誘導することが見出された（図２６Ａ）。免疫細胞染色は、ＡＩＦがミトコンドリア／細胞質から核に転位することを示した（図２６Ｂ）。ＤＢＺＩＭ処理下で、核ＡＩＦ（矢印）は、アポトーシスの過程をおそらく経ているより小さな凝縮核に関連する傾向がある点に注意する価値がある。ＨＣＳによる定量分析は、ＤＢＺＩＭによって誘導される転位が用量依存性であることを示唆した（図２６Ｃ）。
【０１８８】
［００２９４］ＤＢＺＩＭは、ＲＯＳ及びＡＰ−１の誘導を通してアポトーシスを誘導した。
［００２９５］反応性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞高分子を直接改変するだけでなく、様々な細胞シグナル伝達に能動的に関与する。高いレベルのＲＯＳは、アポトーシスによるプログラム細胞死を誘発することが報告されている。ミリモル範囲のＤＢＺＩＭで処理した場合、ＨＬＥ細胞はかなりの量のＲＯＳを生成し、同時に大量細胞死を経た（図２７）。
【０１８９】
［００２９６］転写因子活性化タンパク質１（ＡＰ−１）複合体の持続した高いレベルは、アポトーシスに関与することが知られている。ＨＬＥ細胞からの核抽出物のウェスタンブロット法（図２８）は、ＤＢＺＩＭが、Ｆｒａ−２を含まないがＣ−Ｊｕｎ、Ｊｕｎ  Ｂ、Ｊｕｎ  Ｄ及びＦｒａ−１を含むＡＰ−１複合体のいくつかの重要なメンバーを有意に誘導することを示した。
【０１９０】
［００２９７］いくつかの他の腫瘍細胞株では、ＤＢＺＩＭはアポトーシスを誘導し、ｐＡＫＴを低減した。
［００２９８］ＤＢＺＩＭの効果が肝細胞特異的であるかどうか調査するために、肺、乳房及び胃癌細胞の腫瘍細胞をＤＢＺＩＭで処理し、同剤が試験した腫瘍細胞株すべてにおいて有意な細胞死を引き起こすことが判明した。ＩＣ５０値（３日目に測定）は、３日目にＨ１２９９（肺癌）では５０μＭ、ＭＣＦ−７（乳癌）では５０μＭ、ＡＧＳ胃癌では４０μＭであった（表３）。興味深いことに、ＤＢＺＩＭは正常な（非癌性の）肺細胞（ＩＭＲ９０）に対してずっと低い細胞毒性を示した。さらに、ＤＢＺＩＭによるＡＧＳ及びＨ１２９９の処理は、形態学的（アポトーシス様）変化及び細胞数の有意な減少をもたらした（図２９Ａ及び２９Ｂ）。ＤＢＺＩＭが２つのグリオーマ細胞株、Ｕ８７ＭＧ（ヒト）及びＣ６（ラット）の増殖を有意に低減させ（図３０Ａ及び３０Ｃ）、Ｕ８７  ＭＧ及びＣ６のＩＣ５０値（２日目に測定）がそれぞれ２．１ｍＭ及び１．０ｍＭであることも見出された。
【０１９１】
［００２９９］細胞がアポトーシスを経るかどうか判定するために、ＤＢＺＩＭで処理したＭＣＦ−７及びＡＧＳからのタンパク質でカスパーゼ３／９及びＰＡＲＰ活性化について先ずウェスタンブロット法を実施した。結果は、ＤＢＺＩＭが時間依存的にカスパーゼ３／９及びＰＡＲＰ活性を増加させることを示し、ＤＢＺＩＭ処理細胞が乳癌細胞株ＭＣＦ−７（図３１Ａ）及び野生型ｐ５３胃癌細胞ＡＧＳ（図３１Ｂ）でアポトーシスを経ることが示唆された。同様に、Ｃ６（２．０ｍＭで３倍）及びＵ８７  ＭＧ（２ｍＭで１７倍）で、ＤＢＺＩＭによって誘導されたカスパーゼ３／７の上昇を観察した（図３０Ｂ及び３０Ｄ）。
【０１９２】
［００３００］Ａｋｔ（別名タンパク質キナーゼＢ）キナーゼシグナル伝達経路は、Ａｋｔタンパク質自体の過剰発現及び／又はＡｋｔのリン酸化の増加を通して、肺、乳房、結腸及び膵臓の様々な癌腫並びに他の腫瘍型で活性化される。この試験は、ホスホ−ＡＫＴレベルの低減を含む機構を通して、ＤＢＺＩＭがＡＧＳ、Ｈ１２９９及びＭＣＦ−７細胞でアポトーシスを誘導することにおいて特に有効であるという証拠を提供した。次に、試験した４つの癌細胞株すべてにおいてβ−アクチンのいかなる変化もなしに、ＤＢＺＩＭがＨ１２９９、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ及びＮＫＮ２８でＡｋｔ経路を調節するかどうか、ＤＢＺＩＭ処理が２４時間〜７２時間のＡｋｔ活性型（ホスホ−Ｓｅｒ４７３−Ａｋｔ）のかなりの下方制御をもたらすかどうかを調査した（図３２）。まとめると、ＤＢＺＩＭがＡＫＴ媒介シグナル伝達の強力なサプレッサーであり、ｐ５３状態とは無関係にあることをこれらのデータは示唆する。
【０１９３】
［００３０１］ＤＢＺＩＭは、異種移植ＨＣＣマウスモデルで腫瘍増殖を低減させた。
［００３０２］いくつかのＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ及びＨＬＥ）を、ヌードマウスでＨＣＣを効率的に誘導するそれらの能力について試験し、Ｈｕｈ７株が最も効率的な１つであることが判明した。したがって、インビボでのＤＢＺＩＭの抗腫瘍効力を試験するためにＨｕｈ７細胞を用いて、マウスＨＣＣモデルを確立した。処理の３週間目、対照群及び処理群のマウスの間で腫瘍サイズの差が明らかであった（図３３Ａ）。測定は、対照マウスと比較した場合、ＤＢＺＩＭ処理マウスでの腫瘍容積が４０％（Ｐ＜０．０１）有意に減少することを示した（図３３Ｂ）。ＤＢＺＩＭ処理マウスの体重（腫瘍重量の減少を含む）が、処理の３週間後に１７％（Ｐ＜０．０１）減少したことが記された（図３３Ｃ）。
【０１９４】
［００３０３］さらなるＩＭＳの抗癌活性
【０１９５】
［００３０４］ＨＬＥ細胞における４６個のＩＭＳのＩＣ５０の判定
［００３０５］個々の化合物の大雑把なＩＣ５０値を判定するために、合計４６個のＩＭＳをＨＬＥ細胞株で４８時間培養した。（表２）最初のスクリーニングの後、７個のＩＭＳ、化合物Ｃ、化合物９、ＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２を、以降の実験のために用いた。
【０１９６】
［００３０６］ｐ５３の内因性発現
［００３０７］Ｈｅｐ  ３Ｂ（ｐ５３ヌル）、ＨｅｐＧ２（ｐ５３野生型）及びＨＬＥ及びＰＬＣ（ｐ５３突然変異体）肝癌細胞でのｐ５３の発現レベルを、ウェスタンブロットで測定した。（図３４）。ｐ５３の発現は、野生型ｐ５３を有する細胞と比較して、突然変異体ｐ５３を有する細胞で高かった。
【０１９７】
［００３０８］ＩＭＳは、ＨＬＥ細胞の増殖を阻害した。
［００３０９］ｐ５３突然変異体細胞株ＨＬＥの増殖特性に対するＩＭＳ（ＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２）の効果を調べた。腫瘍細胞におけるＩＭＳの細胞毒性活性及び増殖阻害は、ＭＴＴによって測定した。ＩＭＳによるＨＬＥ肝癌細胞の処理は、細胞増殖の用量依存的阻害をもたらした。ＤＭＳＯ単独（０．０５ｖ／ｖ％）による対照実験は、細胞増殖に対していかなる影響も及ぼさなかった。ＨＬＥ細胞におけるＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２のＩＣ５０値は、７２時間時に６０μｍ、９０μｍ、９０μｍ、３０μｍ及び２０μｍと推定された。他方、１２０時間時のＨＬＥ細胞におけるＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２のＩＣ５０値は、２０μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３５μｍ及び２０μｍであることが見出された。（表４）細胞培養の顕微鏡観察は、ＩＭＳによる細胞増殖の阻害を視覚的に確認した。（図３５）
【０１９８】
［００３１０］ＩＭＳは、アポトーシスを誘導した。
［００３１１］ＩＭＳがＨＬＥ細胞で細胞増殖を有意に阻害することをデータが示したので、増殖阻害が細胞のアポトーシスから生じたかどうか調査するために、アネキシンＶ−ＰＩ二重染色アッセイを同じ条件下の同じ細胞型で実施した。アポトーシスを経る細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣについては陽性に、ＰＩについては陰性に染色されるであろう（カドラント４、Ｑ４）。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ（Ｑ２）の両方に陽性染色の細胞は、アポトーシスの末期又は壊死の過程にあり、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ（Ｑ３）の両方に陰性染色のものは、生存していたか又は検出不能なアポトーシスを経ていた。対照的に、細胞片はＰＩ（Ｑ１）だけに染色された。図３６Ａ及びＢに示すように、ＩＭＳのＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２は、それぞれ３３％、２９％、２９％、２１％及び１８％（Ｑ２）の細胞アポトーシスを誘導したが、より少ないアポトーシス性細胞（７．２％）がＤＭＳＯ処理細胞で観察され、ＩＭＳによって誘導された細胞増殖阻害がかなりのアポトーシス性成分を有することが確認された。
【０１９９】
［００３１２］ＩＭＳは、細胞周期分布を変化させた。
［００３１３］ＨＬＥ細胞でＩＭＳによって誘導された細胞増殖阻害に細胞周期分布の変化が付随したかどうか分析するために、細胞周期の異なる段階の細胞の割合及びアポトーシス指数を、フローサイトメトリーによって分析した。それらのそれぞれのＩＣ５０値（すなわち、６０μｍ、９０μｍ、９０μｍ、３０μｍ及び２０μｍ）に対応する濃度でＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２によって細胞を７２時間処理した場合、Ｇ０期未満の細胞の有意な蓄積及びＧ２／Ｍ期の細胞数の対応する減少が見出された。代表的な結果を、図３７Ａ、３７Ｂ及び３７Ｃに示す。対照培養（ＤＭＳＯを含む）中の細胞の２％はＧ０期未満であったが、その数はＩＭＳ処理培養では２０％まで劇的に上昇した。同様に対照培養では、７２時間時に５０％の細胞がＧ１期、２４％がＳ期、３０％がＧ２／Ｍ期であったが、ＩＭＳ処理培養（ＩＢＮ−１５、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ−２４、ＩＢＮ−２５及びＩＢＮ−３２による）では、それぞれ細胞の４２％、２９％、２８．６％、３４．５％及び３２．３％がＧ１期であり、１９．７％、１９．８％、１１．３４％、１４．３％及び１４．６％がＳ期であり、２１％、２３．７％、１６．３％、１９．４％及び１８．９％がＧ２／Ｍ期であった。
【０２００】
［００３１４］ＩＭＳは、カスパーゼ活性化を通してアポトーシスを誘導した。
［００３１５］ＩＭＳのアポトーシス活性がカスパーゼ活性化によるものかどうかをさらに判断するために、ＨＬＥ細胞からの総タンパク溶解物でウェスタンブロット分析を実施した。ＩＢＮ１９、２４及び２５がカスパーゼ３及びカスパーゼ９及びＰＡＲＰの有意な活性化及び切断を誘導することが観察され（図３８）、それらの化合物がアポトーシスを経るように細胞を誘導することが示唆された。
【０２０１】
［００３１６］ＩＭＳはｐ５３及びリン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５、２０、４６及びＳｅｒ３９２）の発現を増加させた。
［００３１７］ｐ５３経路の活性化がＩＭＳによって誘導されるアポトーシスに含まれるかどうかを判断するために、ｐ５３及びその下流エフェクターの分析を、突然変異体ｐ５３を含むＨＬＥ細胞で実施した。免疫細胞化学的分析は、ＩＭＳ（ＩＢＮ−１９及びＩＢＮ−２４）が核でｐ５３の発現及び蓄積を誘導することを明らかにした（図３９）。
【０２０２】
［００３１８］細胞がＤＮＡ損傷シグナルを受け取るとき、ＡＴＭによるｐ５３のＳｅｒ１５部位のリン酸化がしばしば観察されるので、ＡＴＭがＨＬＥ細胞でＩＭＳに応答することもできると推測された。様々なヒト癌細胞において、ＤＮＡを損傷する化学薬剤がｐ５３の翻訳後修飾を通して作用し、その下流側標的を活性化することが報告されている（Ｂａｎｉｎら１９９８、Ｃａｎｍａｎら１９９８）。本結果は、これらのＩＭＳがｐ５３修飾を、例えば血管拡張性失調症突然変異（ＡＴＭ）キナーゼ遺伝子の上方制御によるＳｅｒ−１５部位のリン酸化（図４０）を誘導することも証明した。さらに、ＩＭＳはＳｅｒ−２０、４６及び３９２の位置でリン酸化を誘導した。ｐ５３のこれらの翻訳後修飾は、細胞周期停止の役割を担うようである（図４０）。
【０２０３】
［００３１９］ＩＭＳは、ミトコンドリア経路の活性化を通して、アポトーシスの実行を誘導した。
［００３２０］ＩＭＳ誘導アポトーシスに関与するミトコンドリア事象を調査するために、アポトーシス誘発性タンパク質Ｂａｘ及び抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２のレベルの変化を分析した。イムノブロット分析は、様々なＩＭＳによるＨＬＥ細胞の処理が、Ｂａｘタンパク質レベルを高め、同時にＢｃｌ−２レベルを低下させることを示した（図４１）。
【０２０４】
［００３２１］ＩＭＳ処理細胞での遺伝子発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲプロファイリング
［００３２２］ＩＭＳがＨＬＥ細胞で他の遺伝子発現にどのように影響するかということに関するより多くの情報を得るために、ｐ５３シグナル伝達に関連の８４個の遺伝子をＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒアレイ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってプロファイリングした（図４２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。アレイは、ｐ５３、アポトーシス、細胞周期、細胞の成長、増殖、分化及びＤＮＡ修復に関連する重要な遺伝子を含む。対照のそれと比較すると、ＩＢＮ−１９、ＩＢＮ２４及びＩＢＮ−２５処理の４８時間後のＡＴＭ遺伝子発現が、それぞれ３６倍、４．６倍及び９倍有意に増加することが判明した（図４２Ｅ）。これらのデータは、ＩＭＳがＡＴＭ遺伝子の転写の上方制御を誘導し、それは次にＨＬＥ細胞のＳｅｒ−１５部位で特異的ｐ５３リン酸化を引き出すことを示す。
【０２０５】
［００３２３］結果は、ＩＢＮ−２４及びＩＢＮ−２５が抗アポトーシス性遺伝子Ｂｃｌ−２を有意に下方制御することを証明した（図４２Ａ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析からの結果は、未処理のものと比較して、ＳＥＳＮ２遺伝子がＩＢＮ−１９によって著しく誘導されることも示した（図４２Ｂ）。さらに、結果は、細胞増殖遺伝子Ｍｃｌ１、Ｅｇｒ１、Ｆｏｘｏ３、Ｊｕｎ、Ｍｄｍ４、Ｎｆ１、Ｐｒｍ１Ｄ、Ｓｅｓｎ１、Ｅ２ｆ１１、Ｐｒｋｃａ及びＢｒｃａ１が、対照細胞と比較してＩＢＮ−２４及びＩＢＮ−２５処理細胞で有意に下方制御されることも証明した。（図４２Ｄ）重要な細胞周期調節遺伝子ｃｄｋ４、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２、ｅ２ｆ１及びＨｋ２は、有意に下方制御された。（図４２Ｃ）
【０２０６】
［００３２４］化合物Ｃ（ＤＢＺＭＩＭ）及び化合物９（ＭＡＢＺＩＭ）は、胃及び乳房の癌細胞の増殖を阻害する。
［００３２５］この試験では、化合物Ｃ及び化合物９のｐ５３突然変異体胃癌細胞株ＭＫＮ  ２８及びｐ５３突然変異体乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ２３１、並びに野生型ｐ５３乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）に対する抗癌作用を、予備的に探究した。最初に、これらの細胞に対するこれらの薬剤の細胞毒性をＭＴＴアッセイによって調査した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、濃度を次第に高くしたこれらの合成有機分子で７２時間処理し、次に細胞毒性を測定した。これらの合成有機分子に対応して、正常なＭＣＦ−１０Ａ細胞は両方の有機分子に耐性を示し、ＩＣ５０（５０％死亡率をもたらす薬剤濃度）は存在しなかった（表７）。癌細胞株ＭＫＮ  ２８及びＭＤＡＭＢ２３１の両方は、化合物９に最も感受性であり、ＩＣ５０は１０及び２０μＭであった（表５及び６）。他方、化合物Ｃは、３５μＭの同じＩＣ５０で、ＭＫＮ  ２８及びＭＤＡＭＢ２３１を死滅させた（表５及び６）。これらのＩＣ５０値は、通常用いられる癌薬剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で得られるものに類似していた。化合物Ｃ及び化合物９でそれぞれ処理した細胞の形態を、図４３Ａ及び４３Ｂに示した。
【０２０７】
［００３２６］化合物９は、マウスでＨＣＣ  Ｈｕｈ７細胞の増殖を阻害した
［００３２７］いくつかのＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ及びＨＬＥ）を、ヌードマウスでＨＣＣを効率的に確立するそれらの能力について試験し、Ｈｕｈ７株が最も効率的な１つであることが判明した。したがって、Ｈｕｈ７株を用いてマウスのＨＣＣモデルを確立し、ＩＭＳの１つ（化合物９）を、その抗腫瘍効力を評価するために試験した。処理の３週間目、対照群及び処理群のマウスの間で腫瘍サイズの有意な差が明らかであった（図４４Ａ）。測定は、対照マウスと比較した場合、Ｃ９処理マウスでの腫瘍容積が、０．６ｇ／ｌ及び１．５ｇ／ｌでそれぞれ４３％及び６２％（Ｐ＜０．０１）有意に減少したことを示した（図４４Ｂ）。対照マウスと比較して、Ｃ９処理マウスで体重及び肉眼的病状のいかなる変化も認めず（図４４Ｃ）、現在の投薬スキームの下でＣ９に関連する有意な一般毒性の欠如が含意された。
【０２０８】
［００３２８］考察
［００３２９］ＩＭＳの抗酸化、抗炎症及び抗線維症特性
【０２０９】
［００３３０］ＩＭＳの毒性
［００３３１］この試験で最もしばしば試験した化合物ＤＢＺＩＭのＩＣ５０は１．７ｍＭであり、脂肪族置換を有するＤＰＩＭ及びＤＢＩＭのＩＣ５０値は２〜４ｍＭであった。ＤＰＩＭ及びＤＢＩＭのインビボ毒性は、ＤＢＺＩＭのそれの約１／１０であった。対照的に、ＨＳＣにおける天然の抗酸化剤ＥＧＣＧ及びゲニステインのＩＣ５０値は、ずっと低かった（２５〜７５μＭ）（Ｋａｎｇら２００１、Ｃｈｅｎら２００２、Ｃｈｅｎら２００３、Ｈｉｇａｓｈｉら２００５、Ｚｈａｎｇら２００６）。興味深いことに、一般的に信じられていることと対照的に、予備インビトロ及びインビボデータは、合成ＩＭＳが天然の抗酸化剤よりも良好な安全性プロフィールを有するかもしれないことを示唆するようであった。確かにこのクラスの化合物の軽度の毒性は、様々な特定の治療ニーズに仕向けられた新規特性及び機能性を有する追加の候補を合成するための基本単位としてＩＭＳを用いる期待を引き出すのを助けた。
【０２１０】
［００３３２］ＩＭＳは、ＲＯＳの中和及び第ＩＩ相抗酸化酵素の誘導を通して抗酸化特性を証明した
［００３３３］ＲＯＳの生成及びスカベンジング能の速度が事実上均衡するとき、細胞又は組織は酸化還元ホメオスタシスを維持する。オキシダント／抗酸化剤均衡の変化は、応答性酸化還元シグナル伝達を誘発する。酸化的刺激剤が、ＳＯＤ、ＣＡＴ及びＧＰｘ、その他などの抗酸化防御酵素の発現を誘導して、元の酸化還元ホメオスタシスを回復するか、又は新しい平衡に到達することができることが報告されている（Ｄｒｏｇｅ  ２００２）。酸化還元調節は、細胞のＧＳＨ及びＧＳＨ／ＧＳＳＧ酸化還元状態を通しても一部媒介される。ＧＳＨは、過酸化水素の水への還元においてＧＰｘへの電子供与体として、及び生体異物の解毒におけるＧＳＴへの求核共存基質としての役目を果たすことによって、細胞の抗酸化過程で重要な役割を演ずる。抗酸化剤は、主に下記３つの異なる経路によってそれらの効果を発揮する。すなわち、（１）代謝及び免疫応答の間に生成される細胞のＲＯＳの中和、（２）内因性抗酸化酵素活性の誘導、及び（３）ヒドロキシル基の生成を触媒する鉄又は銅イオンのキレート化。細胞の抗酸化性防御の第一線を構成するＧＰｘ、ＣＡＴ及びＳＯＤは、ＲＯＳの中和に直接関与する。ＧＰｘ酵素はＨ２Ｏ２をＨ２Ｏに還元し、ＧＳＨはコファクターとして機能し、その結果ＧＳＳＧに酸化される。ＣＡＴはペルオキシゾーム酵素であり、Ｈ２Ｏ２をＨ２Ｏに変換する。ＳＯＤは、スーパーオキシドのジスムテーションを触媒する。３つの形態のＳＯＤ、すなわち、細胞外及び細胞内の銅／亜鉛（Ｃｕ／Ｚｎ）ＳＯＤ、及びミトコンドリアのマンガン（Ｍｎ）ＳＯＤがある。ＧＳＴは、第ＩＩ相抗酸化酵素である。ＨＳＣの活性化は、培養中のＧＳＴ活性の喪失に関連することが報告されている（Ｗｈａｌｅｎら１９９０）。
【０２１１】
［００３３４］この試験では、ＩＭＳはＲＯＳを効果的に投薬量依存的に減弱させた（特に、２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン二酢酸（ＤＣＦ−ＤＡ）プローブに反応するＨ２Ｏ２及び過酸化脂質（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら２００４）。ＧＳＨのレベルは比較的一定のまま維持されたが、ＧＳＳＧの量は激減し、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の有意な上昇をもたらした。さらに、過酸化水素を水に還元する役割を担うＧＰｘ及びＣＡＴの酵素活性は、わずかに減弱された。すべてのデータを一緒にすると、ＩＭＳは、主に、過酸化水素などのＲＯＳの直接中和を通してそれらの抗酸化効果を発揮した可能性が提案される。したがって、細胞の抗酸化防御への負担は外因性合成抗酸化ＩＭＳによって軽減され、第１段抗酸化酵素の発現の減少をもたらした。一方、ＧＳＨ合成及び抗酸化酵素に対するＩＭＳの効果は、低い投薬量で減弱の一般パターン、高い投薬量ではより弱い減弱、さらに増強さえも示した。このことは、ＤＢＺＩＭが、低い投薬量と高い投薬量で異なる機構を通して働くことを示唆した。低い投薬量では、抗酸化経路はＨ２Ｏ２を除去する直接反応によって優位を占め、その結果ＧＰｘ及びＣＡＴ活性が減少した。対照的に、高い投薬量ではＨ２Ｏ２の直接中和と抗酸化酵素の誘導との間に相乗効果があるかもしれない。実験的な胆汁うっ滞で観察されるような一群の抗酸化酵素ＧＰｘ、ＣＡＴ及びＳＯＤの減少は、内因性抗酸化剤メラトニンによって回復させることができることが報告された（Ｐａｄｉｌｌｏら２００４）。インターフェロンαは、活性化ＨＳＣでＧＰｘ活性を増加させることが示されている（Ｌｕら２００２）。他方、酸化的刺激剤が抗酸化酵素活性を誘導することができることが示されている（Ｄｒｏｇｅ  ２００２）。最近の１論文は、内皮細胞における増強された還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、ＧＰｘ活性及びＲＯＳ生成によって示されるように、高い投薬量のＮＡＣ（３０ｍＭ）が、細胞の酸化還元状態を酸化的ストレスの方へ移行させることも示した。この試験では、高投薬量ＩＭＳは、増強されたＧＰｘ及びＣＡＴ活性の傾向を示した。この結果は、高投薬量ＩＭＳがＲＯＳ生成（図２ａ及び２ｂ）及びＧＳＳＧ（図３ｃ及び３ｄ）の減弱、並びにＧＳＨ／ＧＳＳＧ比（図３ｅ及び３ｆ）の誘導においてより大きな効果を加えるとの他の知見とともに、高い投薬量のＩＭＳが、ＲＯＳの中和及び内因性抗酸化酵素の誘導を相乗させることによって、酸化的ストレスに対する細胞の防御活性を高めることを示唆した。さらに、ＩＭＳは総ＳＯＤ（Ｇｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ及びＭｎ−ＳＯＤ）活性に対してほとんど影響を及ぼさず、それらの化合物がスーパーオキシドと反応せず、スーパーオキシドを除去する細胞の応答に対してほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。
【０２１２】
［００３３５］一方、総ＧＳＴなどの第ＩＩ相酵素は、ＩＭＳの処理下で活性が高められた。ＧＳＴは生体異物をＧＳＨに結合させ、それによってそれらの求電子部位を中和し、生成物を水溶性にすることによって、細胞を酸化的毒物から保護することが知られていた。ＧＳＴ活性の強化は、細胞が脂質過酸化生成物などのオキシダントを除去し、それによって細胞の酸化的傷害を最小にするより優れた能力を有することを示した。
【０２１３】
［００３３６］ＩＭＳの抗酸化特性は、一次ＨＳＣ細胞でも証明された。ＤＭＳＯは細胞の酸化的ストレスを誘導し、一次ＨＳＣ細胞に致死作用を加えた。ＩＭＳの存在は、０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む培地で一次ＨＳＣ細胞が死滅することから効果的に保護した。この知見は、細胞ベースの薬剤スクリーニングアッセイ及び組織工学におけるこの群の化合物の潜在的応用を含意する。
【０２１４】
［００３３７］ＩＭＳは、ＮＦ−κＢ及びＩＬ−６の抑制を通して、抗炎症効果を示した。
［００３３８］転写因子ＮＦ−κＢは、ＩκＢとして知られる阻害性タンパク質に結合するサイトゾルで見られる。細胞が感染、炎症及び組織修復などの様々なストレス状態の下にある場合、ＮＦ−κＢが活性化されて核に転位され、そこにおいてそれはＤＮＡに結合して、免疫性又は炎症性応答に関与する遺伝子コードタンパク質の転写を調節する（Ｖａｓｉｌｉｏｕら２０００、Ａｌｉら２００４）。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢのリン酸化及び以降の分解に関連する。ＮＦ−κＢ応答部位は、ＩＬ−６及びＩＣＡＭ−１を含む多くの遺伝子のプロモーター及びエンハンサーで同定され、特徴づけられた（Ａｌｉら２００４）。ＮＦ−κＢは、酸化的ストレスに感受性であることも知られている。ＮＦ−κＢを活性化するほとんどの剤は、ＲＯＳ又はオキシダント自身によって調節される。抗酸化剤レズベラトロル（Ｃｈａｖｅｚら２００７）又はビタミンＥ（Ｌｉｕら１９９５）による処理が、四塩化炭素による実験的線維症齧歯動物で誘導されたＮＦ−κＢ上昇を軽減させたことが報告されている。
【０２１５】
［００３３９］ＩＭＳがＮＦ−κＢ活性化を抑制し、次に免疫性及び炎症性応答を調節することができるかどうか調べるために、活性ＮＦ−κＢのタンパク質発現をウェスタンブロット法及びＮＦ−κＢ応答性ＩＬ−６遺伝子転写によって分析した。我々のデータは、ＩＭＳがＮＦ−κＢの活性化を効果的に妨害することができ、その結果、ＩＬ−６の遺伝子発現を下方制御することを示した（図１０ａ〜ｃ及び１１）。これらのデータは、ＩＭＳがＮＦ−κＢシグナル伝達を通してＩＬ−６転写を下方制御することによって、抗炎症効果を有することを示した。
【０２１６】
［００３４０］ＩＭＳは、ＨＳＣ活性化の抑制を通して、抗線維症特性を示した
［００３４１］ＨＳＣは、肝臓線維症の発達においてよく認識されている細胞の調節因子である。線維形成促進性、炎症誘発性サイトカイン（例えばＴＧＦ−β１及びＩＬ−６）の分泌増大に関連するＨＳＣ活性化は、ＳＭＡＡの過剰発現を特徴とし、ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチンを含むＥＣＭタンパク質の過剰沈着をもたらす。ＩＭＳの抗線維症効果は、ＨＳＣ活性化マーカー（ＧＦＡＰ及びＳＭＡＡ）及び線維症エンドポイント（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）の投薬量及び時間依存的抑制から明らかであった。一時的に誘導されたＳＭＡＡ発現が、高投薬量ＴＤＢＺＩＭの処理下で観察された（図７ｂ）。根底にある機構は明らかでなかったが、大きなＮ置換基を有するＮＨＣのラジカル様性質に関係があるかもしれない（Ｂｏｕｒｉｓｓｏｕら２０００）。ＳＭＡＡは、過剰なラジカルに一時的な過剰反応を有するかもしれない。しかし、中程度の濃度のＩＭＳは、ＳＭＡＡ発現を減弱させることが一般にできた（図６ａ、６ｂ及び１４ｂ）。ＩＭＳは、ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチンのｍＲＮＡ及びタンパク質発現も一貫して抑制し（図６ａ〜ｂ、７ｃ〜ｄ、１３及び１４ｃ〜ｄ）、そのことは正味効果として線維症の進行を予防するか又は遅らせた。
【０２１７】
［００３４２］ＴＧＦ−β１は最も強力な線維形成促進性サイトカインであり、活性化ＨＳＣで過剰発現される。ＴＧＦ−β１シグナル伝達は、ＩＩ型受容体への活性型ＴＧＦ−β１の結合によって開始され、その後、Ｉ型受容体（ＴＧＦβＲＩ）のリン酸化に至る。活性化ＴＧＦβＲＩはＳｍａｄタンパク質を集め、下流側シグナルを増殖させてマトリックスタンパク質の遺伝子発現を調節する（Ｆｕら２００６）。肝臓線維症の治療に対するＩＭＳの効果を理解するために、ＩＭＳ処理下のＴ６細胞におけるＴＧＦ−β１及びＴＧＦβＲＩを測定した。データは、ＩＭＳが総ＴＧＦ−β１及びＴＧＦβＲＩの遺伝子及びタンパク質発現を抑制することによって、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を効果的に妨害することができることを示した（図９ａ〜ｃ及び図１３）。ＥＧＣＧが一次ＨＳＣ細胞でＴＧＦ−β１の活性形態を減少させることができることが、最近報告された（Ｆｕら２００６）。本試験では、ＥＧＣＧがＴ６細胞で総ＴＧＦ−β１タンパク質の生成を抑制することができることも示された（図１３）。一部のＩＭＳ、特にＤＰＩＭは、試験条件の下でＥＧＣＧよりも大きなＴＧＦ−β１及びＴＧＦβＲＩの抑制を示した。ブドウの皮からの別の抗酸化剤であるレズベラトロルは、実験的な線維症ラットモデルで誘導したＴＧＦ−β１タンパク質の上昇を効果的に減弱させることが報告されている（Ｃｈａｖｅｚら２００７）。
【０２１８】
［００３４３］ＨＳＣの活性化は、ＮＦ−κＢ及びＩＬ−６を含むＮＦ−κＢ応答遺伝子の上昇レベルにも関連する（Ｍａｎｎら２００６）。ＮＦ−κＢの役割は、ＨＳＣを活性状態に維持し、長期創傷治癒応答を促進することである。実際、ＮＦ−κＢは、肝臓の炎症、線維症及び肝細胞癌の発達を含む肝臓障害の様々な態様に関係するとされている（Ｅｌｓｈａｒｋａｗｙら２００７）。この試験では、ＩＭＳは活性ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質を大きく抑制した（図１１）が、サイトゾルのＮＦ−κＢ  Ｐ６５レベルには影響を及ぼさなかった（データ示さず）。ＡＰ−１は、少なくとも１つのＪｕｎファミリータンパク質（ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ及びＪｕｎＤ）及びＦｏｓファミリー（ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｒａ１及びＦｒａ２）からの別のメンバーから構成されるホモダイマー又はヘテロダイマーである。ＪｕｎＤが機能的に、活性化ＨＳＣでＩＬ−６及びメタロプロテイナーゼ組織阻害剤Ｉ（ＴＩＭＰ−１）遺伝子転写の誘導に必要とされる、最も重要なＡＰ−１因子であることが報告されている（Ｓｍａｒｔら２００１）。ＨＳＣ  Ｔ６細胞はＪｕｎ及びＦｏｓタンパク質のすべてのメンバーを発現することが知られている（Ｚｈａｎｇら、２００６）。ＩＭＳの影響下で、ｃ−Ｆｏｓ、ＪｕｎＤ及びＦｒａ−１レベルは減弱された（図１１）。ＪｕｎＤの下方制御と同調して、ＩＬ−６遺伝子転写は抑制された（図１０ａ〜ｃ）。つまり、ＩＭＳはＨＳＣ活性化の抑制を通して、並びにＥＣＭタンパク質（ｃｏｌ１ａ１及びフィブロネクチン）の沈着並びにＮＦ−κＢ及びＡＰ−１シグナル伝達を通して媒介される線維形成促進性サイトカイン（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦβＲＩ及びＩＬ−６）の生成を減少させることによって、肝線維症を予防するのかもしれない。
【０２１９】
［００３４４］ＮＨＣ前駆体は、薬剤様化合物であるかもしれない。
［００３４５］ＲＯＳは、神経変性疾患、心血管疾患、脳卒中、心発作、癌、加齢及び線維症などを含む、多くの生理学的状態に関連付けられている。したがって、抗酸化はいくつかの疾患のための治療戦略として追求されてきた。動物モデル及びヒトにおいて過剰の酸化的ストレスを軽減するために、食事からの抗酸化剤が広く使われている。例えば、レズベラトロルは様々な種の生存期間を延長すること、並びに高カロリー食を摂取するマウスの健康及び生存の改善に有効であることが示された（Ｂａｕｒら２００６）。茶ポリフェノール（ＥＧＣＧが最も多く含まれるカテキンである）は、皮膚、肺、結腸、肝臓及び膵臓癌の動物モデルにおいて発癌物質誘発性のＤＮＡ損傷を阻害することが示された（Ｆｒｅｉら２００３）。しかし、様々な要因のために、天然の抗酸化剤の効力のためのストリンジェントな科学的証拠は、確立されていない（Ｄｒｏｇｅら２００１）。治療薬として天然の抗酸化剤を用いることの注目すべき限界のいくつかには、低効力及び代謝の間の速いターンオーバーが含まれる。比較すると、安全性の懸念のために、合成抗酸化剤の研究に向けられた努力はより少ない。しかし、この方向での多少の進捗が見られる。例えば、その効力を高めるために、天然の抗酸化剤が改変されている（Ｋｅｕｍら２００７）。ＳＯＤ及びカタラーゼの合成模倣剤が、虚血性疾患及びパーキンソン病の齧歯動物モデルで有効であることが示されている（Ｐｅｎｇら２００５）。さらに心強いことに、ニトロン−フリーラジカルトラップ剤のクラス、α−フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−ニトロン（ＰＢＮ）及び二ナトリウム２，４−ジスルホフェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＮＸＹ−０５９）は強力な神経保護剤であることが示され（Ｍａｐｌｅｓら２００４）、その抗炎症特性を通して肝細胞癌で抗癌活性を証明した（Ｆｌｏｙｄ  ２００６）。これらの例は、合成抗酸化剤に基づく治療薬候補を開発することが可能なことを示唆する。この報告は、ＩＭＳの潜在的治療効果の探究に向けての最初の研究であると考えられる。ＩＭＳはＮＨＣの前駆体であり、そこにおいて、電子の構造及び安定性、したがって治療上の安全性及び効力は、Ｎ置換基を変更することによって調整することができる。大きな置換基を有するＮＨＣは三重項基底状態を有利にしてラジカル様反応性を示すが、より小さな置換基を有するものは一重項基底状態を採用して求核及び求電子両方の挙動を示す（Ｂｏｕｒｉｓｓｏｕら２０００）。
【０２２０】
［００３４６］この試験では、ＩＭＳは培養ＨＳＣにおいて強力な抗酸化、抗炎症及び抗線維症特性を証明した。同時に、ＩＭＳは比較的低く、調整可能な毒性を示し、ＩＣ５０は３５μＭ〜３．１ｍＭの範囲であった。ＩＭＳ化合物の抗線維形成及び抗炎症効果は、ＨＳＣ活性化の阻害を目標にした抗酸化特性を通して誘導されると仮定される。ＩＭＳのラジカルスカベンジング特性は、以下を含む一連の化学反応の後の生成物におそらく由来する。（１）好ましくは塩基性条件下でのＩＭＳからＮＨＣへの自然発生の変換、（２）中間体活性ラジカルの形成及びフリーラジカルの中和をもたらす、ＮＨＣの炭素２位置でのＲＯＳなどのフリーラジカルとの相互作用。
【０２２１】
［００３４７］この試験の知見は、この仮説を裏付ける。根底にある分子機構はまだよく理解されていないが、ＩＭＳの効果は、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１転写因子、並びにＴＧＦ−β１及びＩＬ−６シグナル伝達経路を通して媒介されることが示されている。肝臓線維症の治療のためのリード化合物の大規模スクリーニングは、蛍光リポーターを誘起する代理ＧＦＡＰバイオマーカーを用いて実施することができる。ラジカルスカベンジング及び抗炎症特性は、この試験での肝臓線維症の治療におけるＩＭＳの治療効果の中心である。さらなる探求は、他の変性性及び加齢関連の疾患の治療におけるこの群の化合物の治療的潜在能力を明らかにするであろう。
【０２２２】
［００３４８］肝細胞癌及び他の腫瘍細胞に対するＤＢＺＩＭの効果
［００３４９］肝細胞癌（ＨＣＣ）は、肝細胞炎症及び再生、マトリックスタンパク質リモデリング、線維症／肝硬変及び最終的にはＨＣＣをもたらす、肝臓傷害の後に発達することが知られている。ＨＣＣは本質的に化学療法耐性であり、薬剤耐性遺伝子ＭＤＲ−１を発現することが知られている。（Ｈｕａｎｇら１９９９、Ｋａｔｏら２００１）進行したＨＣＣは、外科的切除が成功した後でさえ予後が劣る（Ａｒｉｉｚｕｍｉら２００４）。データは、１つのＩＭＳ化合物ＤＢＺＩＭが、有意な細胞毒性なしで分化（ＨｅｐＧ２）及び未分化（ＨＬＥ）の両ＨＣＣ細胞株でアポトーシスを誘導することができることを示した（図２２）。ＤＢＺＩＭは、Ｇ０／Ｇ１期での細胞周期停止を通して、ＨＬＥの増殖を阻害すること（図２１Ａ）もできる（図２１Ｂ）。
【０２２３】
［００３５０］アポトーシスは、外因性経路又は内因性経路で誘発することができる。外因性経路は、Ｆａｓ受容体などの膜貫通死受容体の活性化及びカスパーゼ３／７の切断に至るカスパーゼ８の活性化を通して開始される。内因性経路は、ミトコンドリアからのアポトーシス活性化剤の放出を通して開始され、カスパーゼ９の活性化は、アポトーシスに至るカスパーゼ３／７の切断に関与する。この試験では、酵素活性アッセイは、ＤＢＺＩＭがカスパーゼ９及び３の活性を誘導するがカスパーゼ８を誘導しないことを示した（図２３）。ウェスタンブロット法によるさらなる実験は、ＤＢＺＩＭがＢｃｌ−ＸＬ及びＢａｋの発現も調節してアポトーシスを誘導することを示した（図２４）。この証拠は、ＤＢＺＩＭが、主に、アポトーシスの出現を有利にするＢｃｌ−２の調節を通してミトコンドリア媒介アポトーシスを引き起こしたことを示唆する。一方、シトクロムＣでなくＡＩＦが（図２３ｄ及び図２６）ミトコンドリアから放出されて、カスパーゼを活性化したこと、及び／又はクロマチン凝集／ＤＮＡ断片化を引き起こしたことが判明した。ＡＩＦは細胞アポトーシスのカスパーゼ非依存性様式に一般に関連付けられ、新薬標的として提案されている。（Ｍｉｇｎｏｔｔｅら１９９８、Ｌｏｒｅｎｚｏら２００７）。しかし、それは、カスパーゼ依存的に作用することも示されている。（Ａｍｏｕｌｔら２００３）ＤＢＺＩＭは、サバイビンを下方制御し（図２４）、サバイビンの細胞質位置を誘導することも示された（図２５）。サバイビンは、ヒト胎児発達の間に、及びいくつかの新生物において発現されるが、胸腺及び胎盤を除く正常な組織では発現されないＩＡＰタンパク質ファミリーの１メンバーである。ＨＣＣ内のサバイビンの核転位が、癌細胞増殖を促進することが示されている。（Ｍｏｏｎら２００３）サバイビンの核及び細胞質での発現は、膵臓癌の予後にも関連付けられている（Ｔｏｎｉｎｉら２００５）。ＤＢＺＩＭは、サバイビンの転位によって調節機構を混乱させ、ＨＣＣ化学療法の探索のために可能な新しい角度を提示している。
【０２２４】
［００３５１］ミトコンドリア機能の変化は、細胞死の初期段階に関連する。一方、ミトコンドリア呼吸鎖の観察された阻害はＲＯＳの過剰生産を引き起こし、それは死のシグナル伝達経路を媒介する。（Ｍｉｇｎｏｔｔｅら１９９８）アポトーシス又は壊死による細胞死の様式は、細胞内ＲＯＳレベルに大部分依存する。また、ＲＯＳが死滅過程の結果であるか若しくは原因であるか、又はその両方であるか区別するのが困難である。この試験で、異なる濃度のＩＭＳが、ＲＯＳ生成に関して異なる生理作用を有したことは興味深かった。ＨＣＣ細胞において、ＤＢＺＩＭがマイクロモル濃度の範囲であった場合、それはＲＯＳレベルをわずかに減弱させ、そのことはＨＳＣ−Ｔ６細胞での知見に一致した。ＤＢＺＩＭがミリモル濃度の範囲のずっとより高い濃度であった場合、それはＲＯＳの蓄積を促進した（図２７）。一方、ＲＯＳ生成に付随して、転写因子ＡＰ−１複合体の一部のメンバーは、ＤＢＺＩＭによって上方制御されることが見出された（図２８）。細胞死を促進するために、酸化的ストレスの取込み及びＪＮＫ／ｃ−Ｊｕｎ／ＡＰ−１カスケードの上方制御が必要であることが報告された（Ｓｉｎｇｈら２００７）。これらの結果を一緒にすると、高用量のＤＢＺＩＭに起因する細胞死滅が、大部分はアポトーシス及びＲＯＳ誘導によるものである可能性が示唆される。
【０２２５】
［００３５２］ＤＢＺＩＭが、ＨＣＣ株だけでなく、様々な癌試験で通常用いられる他のいくつかの腫瘍細胞株において、複数の機構（細胞周期停止、アポトーシス、ＲＯＳ、ＡＰ−１、ｐＡＫＴの阻害など）を通して細胞増殖を阻害したとの観察は、ＤＢＺＩＭが実際いくつかの有益な抗腫瘍特性をインビトロで発揮するとの推測をさらに裏付けた。その潜在的なインビボ効力は、確認のために様々な特定の腫瘍モデルで試験する必要がある。
【０２２６】
［００３５３］初期のインビボ試験では、腫瘍増殖が明白になった、細胞植え付けの約８週間後の対数期に、ＤＢＺＩＭを飲料水に入れてＨＣＣ異種移植マウスモデル（ヌードマウスのＨｕｈ７細胞）に投与した。いくつかの観察を行った。第一に、ＤＢＺＩＭによる３週間の処理は腫瘍容積の４０％の減少をもたらし、それはＤＢＺＩＭを有効な抗腫瘍剤として用いるための予備的で重要な実証である。第二に、インビボ試験で観察された有効用量（２ｇ／ｌ）は、インビトロ細胞培養試験のもの（一般に１〜２ｍＭ）よりもずっと低い。この格差は、ＤＢＺＩＭがインビボにおいてインビトロと非常に異なるＰＫ／ＰＤプロフィールを有する可能性を示唆しているのかもしれない。第三に、剤を飲料水に入れて投与する（毎週交換）ことによって達成された有効性は、ＤＢＺＩＭが水中でむしろ安定しており、胃腸（ＧＩ）管を通して効果的に吸収され、体循環に入ることができることを示す。最後に、我々はＤＢＺＩＭによる３週処理で体重の有意な減少（１７％）も認め、それはマウスにおけるある種の一般毒性を示唆しているかもしれないが、すべての主要器官で肉眼的病理学的異常を特定することができなかった。おそらく、最小限の副作用で最大治療効果を達成するために、この剤を用いる代替投薬スキームをさらに探究することができる。
【０２２７】
［００３５４］結論として、ＩＭＳの研究のためのモデル化合物としてＤＢＺＩＭを用いることにより、この剤がインビトロ及びインビボで抗腫瘍活性を有することが証明され、そのことは、より効力が高く副作用の少ない候補を同定するために、イミダゾリウム環に異なる置換基を有するさらなるＩＭＳ化合物を化学合成して、生物学的に評価するさらなる研究を正当化する。
【０２２８】
［００３５５］さらなるＩＭＳの抗癌活性
［００３５６］癌細胞死を誘発する「ＤＢＺＩＭ様」候補化合物の能力を調査し、この能力の基礎をなす分子機構（アポトーシス及び細胞周期停止）を分析した。モデルＤＢＺＩＭに埋め込まれた基礎抗腫瘍特性（アポトーシス及び細胞周期停止）が、異なるサブグループを有する、主にＩＢＮ−１５、１９、２４、２５、３２、化合物Ｃ（ＤＢＺＭＩＭ）及び化合物９（ＭＡＢＺＩＭ）を含むさらなるＩＭＳのいくつかにおいて保存されていたことが分かった。
【０２２９】
［００３５７］ＩＭＳが、細胞周期停止及びアポトーシスの誘導と並行して腫瘍細胞増殖を効果的に阻害することが判明した。ＩＭＳは、ＡＴＭ系を活性化し、その後ｐ５３のリン酸化及び安定化を起こさせる。ＨＬＥ肝癌細胞において、ｐ５３、ホスホ−ｐ５３（Ｓｅｒ−１５）及びＡＴＭのレベルの間で、相関関係が導かれた。ＡＴＭ及びＡＴＲがＤＮＡ損傷によって活性化されることは周知である。ＡＴＭ経路の活性化は、いくつかのＤＮＡ損傷／遺伝毒性ストレスによって誘導される細胞周期チェックポイントと長い間関連付けされている。活性化されると、ＡＴＭは、ｐ５３、ＭＤＭ２、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２などの様々な下流側分子をリン酸化し、細胞周期停止又は細胞死をもたらす。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、ヒト細胞及び細胞周期停止におけるＤＮＡ損傷又は細胞ストレスの後の、細胞周期停止及びアポトーシスの誘導において重要な要素である。（Ｓａｉｔｏら２００２、Ｈｏｆｓｅｔｈら、２００３）この試験では、ＩＭＳによるＨＬＥ細胞の処理が、ｐ５３及びホスホ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）の蓄積をもたらすことが示された。ＡＴＭ遺伝子発現の誘導がＤＮＡ損傷及びｐ５３活性を引き起こすことも見出され、ＤＮＡ損傷によって誘導されるｐ５３がＩＭＳ媒介細胞周期停止で重要な役割を果たすことが示唆された。実際、この結果は、セリン１５におけるｐ５３のリン酸化がＤＮＡ損傷に応じるものであることを示したＣａｎｍａｎら（１９９８）の報告と一貫している。インビトロ試験は、この特定部位のリン酸化がｐ５３応答及び以降のＩＭＳ誘導抗癌活性のために重要であることも示した。ＩＭＳが、Ｃｄｃ２５Ａ、Ｃｄｃ２及びＳＥＳＮ２を含む細胞周期にとって重要ないくつかの遺伝子の発現を減少させることも見出された。
【０２３０】
［００３５８］上方制御されたｐ５３タンパク質はアポトーシス促進性のタンパク質ＢＡＸを活性化させることができ、Ｂｃｌ−２を阻害してミトコンドリアの機能不全及びチトクロームｃ放出を引き起こし、ミトコンドリアのアポトーシス経路を刺激する（Ｍｅｌｉｎｏら、２００４）。この試験では、ＨＬＥ癌細胞でＩＭＳがＢｃｌ−２を阻害し、Ｂａｘを活性化することが証明された。ＩＭＳが、細胞周期停止及びアポトーシスの誘導と並行して腫瘍細胞増殖を効果的に阻害することが判明した。さらに、ＩＭＳが正常肺及び乳房細胞でいかなる有意な毒性も示さないという事実は、ＩＭＳが正常細胞及び癌細胞の間で選択性を有することを示唆する。カスパーゼ３活性化に関するデータは、これらの肝癌由来の細胞株におけるＩＭＳ誘導アポトーシスの機構が、カスパーゼ３活性化に至るカスパーゼ依存性シグナル伝達によって媒介されるかもしれないことを強く示唆する。本試験では、ＩＭＳが突然変異体ｐ５３を抱える癌細胞に細胞傷害活性を有し、突然変異体ｐ５３を活性化させることができることが示された。本試験では、突然変異体ｐ５３状態を有する悪性腫瘍細胞株に対するＩＭＳの抑制作用を調査した。ミトコンドリアのアポトーシス経路は、哺乳動物細胞のためにアポトーシス性細胞死をシグナル伝達することにおいて重要であると記載されている（Ｐｉｌｃｈら２００３、Ｋｌｕｃｋら、１９９７）。ＩＭＳによるＨＬＥ細胞の処理の後、ＩＭＳ処理がＢａｘ発現の有意な増加及びＢｃｌ−２の減少をもたらすことが観察され、アポトーシス促進性及び抗アポトーシス性のＢｃｌ−２タンパク質の比の変化が、ＩＭＳのアポトーシス促進活性に寄与するかもしれないことが示唆される。ＨＬＥ細胞をＩＭＳで処理した後、カスパーゼ３及びカスパーゼ９の活性化も観察された。これらの結果は、ＩＭＳによって誘導されるアポトーシスがＢＡＸ及びＢｃｌ−２タンパク質の調節に関連することを確認する。
【０２３１】
［００３５９］本明細書で、ＤＢＺＩＭに加えて化合物９すなわちＣ９がＨＣＣ異種移植モデルで強力な抗腫瘍活性を示し、しかもいかなる明らかな一般毒性も示さないことが証明される。この予備的証拠は、ＤＢＺＩＭコア構造に基づく化学的修飾が、抗腫瘍効力をかなり改善し、副作用を低減させることができるとの概念の証明を提供する。例えば、同じ経路を通して同じ時間投与される場合、濃度（１．５ｇ／ｌ）のＣ９はより高い濃度（２ｇ／ｌ）のＤＢＺＩＭよりもずっと高い効力を有することができる。
【０２３２】
［００３６０］したがって、本試験は以下を証明した。（１）ヒト肝癌ＨＬＥ細胞は、ＩＭＳによる増殖阻害に非常に感受性である。（２）ＩＭＳは、細胞周期停止及びアポトーシス誘導を通してｐ５３依存的に、またＣｄｃ２、Ｃｄｃ２５Ａの発現を減少させることによってＨＬＥ細胞の生存を低減させた。（３）ＩＭＳは、Ｓｅｒ１５でのｐ５３のリン酸化によってｐ５３を安定させ、ｐ５３及びＭＤＭ２の相互作用を低減させるＡＴＭの活性化を通して、ＨＬＥ細胞の細胞増殖を阻害した。（４）ＩＭＳは、Ｂｃｌ−２及びＢＡＸタンパク質発現の調節によって、ミトコンドリアのアポトーシス経路を誘発した。これらの知見は、ＩＭＳがヒト肝癌細胞及び他の腫瘍細胞型に対する、低毒性化学予防剤の有望なクラスであることを示唆する。
【０２３３】
［００３６１］本明細書で引用されているすべての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的に及び個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。いかなる刊行物の引用も、出願日の前のその開示のためであり、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを容認するものとして解釈されるべきでない。
【０２３４】
［００３６２］本明細書で与えられる濃度には、百分率で与えられる場合、重量／重量（ｗ／ｗ）、重量／容量（ｗ／ｖ）及び容量／容量（ｖ／ｖ）百分率が含まれる。
【０２３５】
［００３６３］本明細書及び添付請求項で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数体を含む。本明細書及び添付の請求項で用いるように、用語「含む」、「含んでいる」、「含む」及びこれらの用語の他の形態は、非限定的に包含する意味を意図し、すなわち、他の任意の要素又は成分を除外することなく特定の列挙される要素又は成分を含むものとする。特に定義されていない場合は、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【０２３６】
参照
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Ａｒｉｉｚｕｍｉ  Ｓ，  Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｏｈｔｓｕｂｏ  Ｔ，  Ｋａｔｓｕｒａｇａｗａ  Ｈ，  Ｋａｔａｇｉｒｉ  Ｓ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ｎｏｄｕｌｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｒｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  ２００４；  ５１：５００−５０４．
Ａｖｉｌａ  ＭＡ，  Ｂｅｒａｓａｉｎ  Ｃ，  Ｓａｎｇｒｏ  Ｂ，  Ｐｒｉｅｔｏ  Ｊ．  Ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；  ２５：３８６６−３８８４．
Ｂａｃｈｅｍ  Ｍ  Ｇ，  Ｍｅｙｅｒ  Ｄ，  Ｍｅｌｃｈｉｏｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｐｅｒｉｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｌｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９２；  ８９：１９−２７．
Ｂａｋｅｒ  Ｍ  Ｖ，  Ｂａｒｎａｒｄ  Ｐ  Ｊ，  Ｂｅｒｎｅｒｓ−Ｐｒｉｃｅ  Ｓ  Ｊ，  Ｂｒａｙｓｈａｗ  Ｓ  Ｋ，  Ｈｉｃｋｅｙ  Ｊ  Ｌ，  Ｓｋｅｌｔｏｎ  Ｂ  Ｗ，  Ｗｈｉｔｅ  Ａ  Ｈ．  Ｃａｔｉｏｎｉｃ，  ｌｉｎｅａｒ  Ａｕ（Ｉ）  Ｎ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃａｒｂｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ  ２００６；  ３７０８−３７１５．
Ｂａｎｉｎ  Ｓ．，  Ｍｏｙａｌ  Ｌ．，  Ｓｈｅｉｈ  Ｓ．，  Ｔａｙａ  Ｙ．，    Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃ．Ｗ．，  Ｃｈｅｓｓａ  Ｌ．，    Ｓｍｏｒｏｄｉｎｓｋｙ  Ｎ．Ｉ．，  Ｐｒｉｖｅｓ  Ｃ．，    Ｒｅｉｓｓ  Ｙ．，  Ｓｈｉｌｏｈ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｚｉｖ  Ｙ．  ，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｂｙ  ＡＴＮ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（１９９８）  １６７４−１６７７．
【０２３７】
Ｂａｒｎａｒｄ  Ｐ  Ｊ，  Ｂａｋｅｒ  Ｍ  Ｖ，  Ｂｅｒｎｅｒｓ−Ｐｒｉｃｅ  Ｓ  Ｊ，  Ｄａｙ  Ｄ  Ａ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｉｎｕｃｌｅａｒ  ｇｏｌｄ（Ｉ）−ｃａｒｂｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｊ    Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００４；  ９８：１６４２−１６４７．
Ｂａｔａｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＡ  （２００５）  Ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５（２）：  ２０９−２１８．
Ｂａｕｒ  Ｊ  Ａ，  Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｋ  Ｊ，  Ｐｒｉｃｅ  Ｎ  Ｌ，  Ｊａｍｉｅｓｏｎ  Ｈ  Ａ，  Ｌｅｒｉｎ  Ｃ，  Ｋａｌｒａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｏｎ  ａ  ｈｉｇｈ−ｃａｌｏｒｉｅ  ｄｉｅｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；  ４４４：  ３３７−３４２．
Ｂｅｒｇａｍｏ  Ａ，  Ｓａｖａ  Ｇ．  Ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｃａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．  Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．  ２００７；  １２６７−１２７２．
Ｂｏｕｒｉｓｓｏｕ  Ｄ，  Ｇｕｅｒｒｅｔ  Ｏ，  Ｇａｂｂａｉ  Ｆ  Ｐ，  Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｇ．  Ｓｔａｂｌｅ  ｃａｒｂｅｎｅｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２０００；  １００：３９−９１．
Ｂｏｙｄｓｔｏｎ  Ａ．  Ｊ．  ，    Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．  Ａ．，    Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ  Ｃ．  Ｗ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ２００５，  １２７，  １２４９６．
Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒ  Ｓ，  Ｂａｃｏｎ  Ｂ  Ｒ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９４；  ４１：３４３−３４８．
Ｂｙｋｏｖ，  ＶＪ；  Ｉｓｓａｅｖａ，  Ｎ；  Ｓｈｉｌｏｖ，  Ａ；  Ｈｕｌｔｃｒａｎｔｚ，  Ｍ；  Ｐｕｇａｃｈｅｖａ，  Ｅ；  Ｃｈｕｍａｋｏｖ，  Ｐ；  Ｂｅｒｇｍａｎ，  Ｊ；  Ｗｉｍａｎ，  ＫＧ；  Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ，  Ｇ．  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３  ｂｙ  ａ  ｌｏｗ−  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００２；  ８：２８２−８．
Ｃａｎｍａｎ  Ｃ．Ｅ．，  ．  Ｌｉｍ  Ｄ．Ｓ，    Ｃｉｍｐｒｉｃｈ  Ｋ．Ａ．，    Ｔａｙａ  Ｙ．，  Ｔａｍａｉ  Ｋ．，  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｋ．  Ａ  ，    Ａｐｐｅｌｌａ  Ｅ．，  Ｋａｓｔａｎ    Ｍ．Ｂ．，  Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ  Ｊ．Ｄ，  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＭ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（１９９８）  １６７７−１６７９
Ｃａｏ  Ｘ  Ｇ，  Ｌｉ  Ｘ  Ｘ，  Ｂａｏ  Ｙ  Ｚ，  Ｚｉｎｇ  Ｎ  Ｚ，  Ｃｈｅｎ  Ｙ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ａｎｄ  ＤＭＳＯ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２００７；４８（８）：３７１４−３７１８．
【０２３８】
Ｃａｒｏｎ  ｄｅ  Ｆｒｏｍｅｎｔｅｌ，  Ｃ；  Ｇｒｕｅｌ，  Ｎ；  Ｖｅｎｏｔ，  Ｃ；  Ｄｅｂｕｓｓｃｈｅ，  Ｌ；  Ｃｏｎｓｅｉｌｌｅｒ，  Ｅ；  Ｄｕｒｅｕｉｌ，  Ｃ；  Ｔｅｉｌｌａｕｄ，  ＪＬ；  Ｔｏｃｑｕｅ，  Ｂ；  Ｂｒａｃｃｏ，  Ｌ．  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐ５３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｐ５３  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９９；  １８：５５１−７．
Ｃａｓａｎｏｖａｓ  Ａ，  Ｏｌｍｏｓ  Ｇ，  Ｒｉｂｅｒａ  Ｊ，  Ｂｏｒｏｎａｔ  Ｍ  Ａ，  Ｅｓｑｕｅｒｄａ  Ｊ  Ｅ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｓｅｖｉｌｌａ  Ｊ  Ａ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉ２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ＬＳＬ  ６０１０１．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００；１３０：１７６７−１７７６．
Ｃａｓｉｎｉ  Ａ，  Ｃｅｎｉ  Ｅ，  Ｓａｌｚａｎｏ  Ｒ，  Ｂｉｏｎｄｉ  Ｐ，  Ｐａｒｏｌａ  Ｍ，  Ｇａｌｌｉ  Ａ，  Ｆｏｓｃｈｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｉｐ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９７；２５：３６１−３６７．
Ｃｈａｎ  Ｄ．Ｗ．，  Ｓ．Ｃ．  Ｓｏｎ，  Ｗ．  Ｂｌｏｃｋ，  Ｒ．  Ｙｅ，  Ｋ．Ｋ．  Ｋｈａｎｎａ，  Ｍ．Ｓ．  Ｗｏｌｄ，  Ｐ．  Ｄｏｕｇｌａｓ，  Ａ．Ａ．  Ｇｏｏｄａｚｒｉ，  Ｊ．  Ｐｅｌｌｅｙ，  Ｙ．  Ｔａｙａ，  Ｍ．Ｆ．  Ｌａｖｉｎ，  Ｓ．Ｐ．  Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ：  ａ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７５  （２０００）  ７８０３−７８１０．
Ｃｈａｖｅｚ  Ｅ，  Ｒｅｙｅｓ−Ｇｏｒｄｉｌｌｏ  Ｋ，  Ｓｅｇｏｖｉａ  Ｊ，  Ｓｈｉｂａｙａｍａ  Ｍ，  Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｖ，  Ｖｅｒｇａｒａ  Ｐ，  Ｍｏｒｅｎｏ  Ｍ  Ｇ，  Ｍｕｒｉｅｌ  Ｐ．  Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，  ＮＦ−？Ｂ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＧＦ−？  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ＣＣｌ４  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２００７；  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
Ｃｈｅｎ  Ａ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｘｕ  Ｊ，  Ｔａｎｇ  Ｊ．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００２；３６８（Ｐｔ  ３）：６９５−７０４．
Ｃｈｉａｎｅｓｅ  Ｒ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｒａｔｒｅｅ  Ｒ．  Ｈ．  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，  ２００５，  ２４，  ４４３２．
Ｄａｓ  Ａ，  Ｂａｎｉｋ  Ｎ  Ｌ，  Ｒａｙ  Ｓ  Ｋ．  Ｇａｒｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｔ９８Ｇ  ａｎｄ  Ｕ８７ＭＧ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００７；  １０（５）１０８３−１０９５．
Ｄｅ  Ｂｌｅｓｅｒ  Ｐ  Ｊ，  Ｘｕ  Ｇ，  Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  Ｋ，  Ｒｏｇｉｅｒｓ  Ｖ，  Ｇｅｅｒｔｓ  Ａ．  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−（  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９：２７４（８）３３８１−３３８７．
Ｄｅｕｆｆｉｃ  Ｓ，  Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，  Ｂｕｆｆａｔ  Ｌ，  Ｖａｌｌｅｒｏｎ  ＡＪ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  １９９８；  ３５１：２１４−２１５．
Ｄｏｍｉｎｉａｎｎｉ  Ｓ  Ｊ，  Ｙｅｎ  Ｔ  Ｙ．  Ｏｒａｌ  Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｐｈｅｎａｃｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  Ｈａｌｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９８９；  ３２：２３０１−２３０６．
【０２３９】
Ｄｒｏｇｅ  Ｗ．  Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００２；８２：４７−９５．
Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ  ＨＢ，  Ｄａｖｉｌａ  ＪＡ，  Ｐｅｔｅｒｓｅｒｎ  ＮＪ，  ＭｃＧｌｙｎｎ  ＫＡ．  Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：  ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２００３；  １３９：８１７−８２３．
Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ  ＨＢ，  Ｍａｓｏｎ  ＡＣ．  Ｒｉｓｉｎｇ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９９；  ３４０：７４５−７５０．
Ｅｌｓｈａｒｋａｗｙ  Ａ  Ｍ，  Ｍａｎｎ  Ｄ  Ａ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｆｉｂｒｏｓｉｓ−ｃａｎｃｅｒ  ａｘｉｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００７；４６（２）：５９０−５９７．
Ｆｅｉ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｅｌ−Ｄｉｅｒｙ，Ｗ．Ｓ．  Ｐ５３  ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（２００３）５７７４−５７８３．
Ｆｌｏｙｄ  Ｒ  Ａ．  Ｎｉｔｒｏｎｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ２００６；５（１）：５１−５７．
Ｆｒｅｉ  Ｂ，  Ｈｉｇｄｏｎ  Ｊ  Ｖ．  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｎｕｔｒ  ２００３；１３３：３２７５Ｓ−３２８４Ｓ．
Ｆｒｉｅｄｌｅｒ，  Ａ；  Ｈａｎｓｓｏｎ，  ＬＯ；  Ｖｅｐｒｉｎｔｓｅｖ，  ＤＢ；  Ｆｒｅｕｎｄ，  ＳＭ；  Ｒｉｐｐｉｎ，  ＴＭ；  Ｎｉｋｏｌｏｖａ，  ＰＶ；  Ｐｒｏｃｔｏｒ，  ＭＲ；  Ｒｕｄｉｇｅｒ，  Ｓ；  Ｆｅｒｓｈｔ，  ＡＲ．  Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｐ５３  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ：  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００２；  ９９：９３７−９４２．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ  （２００８）  Ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｒｏｔｅａｎ，  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，  ａｎｄ  ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８８（１）：  １２５−１７２．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ  （２００８ｂ）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３４（６）：  １６５５−１６６９．
【０２４０】
Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｓ  Ｌ．  Ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  −  ｆｒｏｍ  ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  ｂｅｄｓｉｄｅ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００３；  ３８（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ３８−５３．
Ｆｕ  Ｙ，  Ｚｈｏｕ  Ｙ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｓ，  Ｃｈｅｎ  Ａ．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｉｎ  ｐａｓｓａｇｅｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００６；８６：６９７−７０９．
Ｇａｌｌｉ  Ａ，  Ｓｖｅｇｌｉａｔｉ−Ｂａｒｏｎｉ  Ｇ，  Ｃｅｎｉ  Ｅ，  Ｍｉｌａｎｉ  Ｓ，  Ｒｉｄｏｌｆｉ  Ｆ，  Ｓａｌｚａｎｏ  Ｒ，  Ｔａｒｏｃｃｈｉ  Ｍ，  Ｇｒａｐｐｏｎｅ  Ｃ，  Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  Ｇ，  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ａ，  Ｓｕｒｒｅｎｔｉ  Ｇ，  Ｃａｓｉｎｉ  Ａ，  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ａ  ＭＭＰ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００５；  ４１（５）：１０７４−１０８４．
Ｇｉａｃｃｉａ  Ａ．Ｊ．  ａｎｄ    Ｋａｓｔａｎ  Ｍ．Ｂ．，  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ｐ５３  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ：  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｓ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １２  （１９９８），  ｐｐ．  ２９７３−２９８３．
Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｓ  Ａ，  Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎ  Ｓ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｐ，  Ｗａｒｄ  Ｊ，  Ｓｃｈｅｎｋｅｒ  Ｓ．  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００３；９８：２４８５−２４９０．
Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  Ｂ，  Ｗｈｉｔｅｍａｎ  Ｍ．  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｙｏｕ  ｄｏ  ｉｔ  ａｎｄ  ｗｈａｔ  ｄｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｍｅａｎ？  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００４；１４２：２３１−２５５．
Ｈａｒｌｏｗ  Ｋ  Ｊ，  Ｈｉｌｌ  Ａ  Ｆ，  Ｗｅｌｔｏｎ  Ｔ，  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｎ，Ｎ’−ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｈａｌｉｄｅｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  １９９６；６：６９７−６９８．
Ｈｏｆｓｅｔｈ  Ｌ．Ｊ．  ，  Ｓ．  Ｓａｉｔｏ，  Ｓ．Ｐ．  Ｈｕｓｓａｉｎ，  Ｍ．Ｇ．  Ｅｓｐｅｙ，  Ｋ．Ｍ．  Ｍｉｒａｎｄａ，  Ｙ．  Ａｒａｋｉ，  Ｃ．  Ｊｈａｐｐａｎ，  Ｙ．  Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｔｏ，  Ｐ．Ｈｅ．  Ｓ．Ｐ．  Ｌｉｎｋｅ，  Ｍ．Ｍ．  Ｑｕｅｚａｄｏ，  Ｉ．  Ｚｕｒｅｒ，  Ｖ．  Ｒｏｔｔｅｒ，  Ｄ．Ａ．  Ｗｉｎｋ，  Ｅ．  Ａｐｐｅｌｌａ，  Ｃ．Ｃ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐ５３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００（２００３）  １４３−１４８．
Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ，  Ｍ；  Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，  Ｄ；  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ；  Ｈａｒｒｉｓ，  ＣＣ．  ｐ５３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９１；  ２５３：４９−５３．
【０２４１】
Ｈｏｕ  Ｚ，  Ｓａｎｇ  Ｓ，  Ｙｏｕ  Ｈ，  Ｌｅｅ  Ｍ  Ｊ，  Ｈｏｎｇ  Ｊ，  Ｃｈｉｎ  Ｋ  Ｖ，  Ｙａｎｇ  Ｃ  Ｓ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ：  Ａｕｔｏ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ＫＹＳＥ  １５０  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５（１７）：８０４９−８０５６．
Ｈｕａｎｇ  Ａ，  Ｌｉｕ  Ｇ．  Ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｂｅｌ７４０２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔ．  １９９９；  １３５：９７−１０５．
Ｈｕｐｐ，  ＴＲ；  Ｓｐａｒｋｓ，  Ａ；  Ｌａｎｅ，  ＤＰ．  Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３．  Ｃｅｌｌ．  １９９５；  ８３：２３７−４５．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／００９２−８６７４（９５）９０１６５−５．
Ｈｕｓｓａｉｎ，  ＳＰ；  Ｈｏｆｓｅｔｈ，  ＬＪ；  Ｈａｒｒｉｓ，  ＣＣ．  Ｒａｄｉｃａｌ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００３；  ３：２７６−２８５．
Ｉｒｅｄａｌｅ  ＪＰ  （２００７）  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７（３）：  ５３９−５４８．
Ｉｒｅｄａｌｅ  ＪＰ  （２００３）  Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：  ｎｅｗ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．  Ｂｍｊ  ３２７（７４０７）：  １４３−１４７．
Ｊａｋｕｂｉｋｏｖａ  Ｊ，  Ｓｅｄｌａｋ  Ｊ．  Ｇａｒｌｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｇａｎｏｓｕｆｉｄｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｔｏｃｉｔｙ，  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｎｅｏｐｌａｓｍａ．  ２００６；  ５３（３）：  １９１−１９９．
Ｋａｔｏ  Ａ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ，  Ａｍｂｉｒｕ  Ｓ，  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ  Ｈ，  Ｉｔｏ  Ｈ，  Ｎａｋａｇａｗａ  Ｋ，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｈ，  Ｙｏｋｏｓｕｋａ  Ｏ，  Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｎ．  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  （ＭＤＲ−１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００１；  ７８（２）：１１０−１１５．
Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ  Ｍ，  Ｎｉｚｒａｈｉ  Ｌ，  Ｐａｐｐｏ  Ｒ，  Ｋｌｏｐｓｔｏｃｋ  Ｎ，  Ｏｌａｍ  Ｄ，  Ｂａｒａｓｈ  Ｈ，  Ｄｏｍａｎｙ  Ｅ，  Ｇａｌｕｎ  Ｅ，  Ｇｌｏｄｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｍｄｒ２  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００７；  ６（４）：  １２８３−１２９１．
Ｋａｗａｄａ  Ｎ，  Ｓｅｋｉ  Ｓ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，  Ｋｕｒｏｋｉ  Ｔ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，  ｗｕｅｒｃｅｔｉｎ，  ａｎｄ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ，  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９８；２７：１２６５−１２７４．
Ｋｅｕｍ  Ｙ  Ｓ，  Ｃｈａｎｇ  Ｐ  Ｐ  Ｊ，  Ｋｗｏｎ  Ｊ  Ｈ，  Ｙｕａｎ  Ｘ  Ｌ，  Ｌｉ  Ｗ，  Ｈｕ  Ｌ，  Ｋｏｎｇ  Ａ  Ｎ  Ｔ．  ３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐｌｙ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  （３ＭＰ−ＩＴＣ）  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｔｈａｔ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＡＲＥ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｒｆ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ／ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００７；  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
Ｋｌｕｃｋ  ＲＭ，  Ｂｏｓｓｙ−Ｗｅｔｚｅｌ  Ｅ，  Ｇｒｅｅｎ  ＤＲ，  Ｎｅｗｍｅｙｅｒ  ＤＤ  Ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：  Ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｃｌ−２  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５  （１９９７）：１１３２−１１３６．
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Ｋｏ，  ＬＪ，    Ｐｒｉｖｅｓ，  Ｃ．  ｐ５３：  ｐｕｚｚｌｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｄｉｇｍ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １９９６；  １０：１０５４−７２．
Ｌｉｎ  Ｌ  Ｃ，  Ｈｕｎｇ  Ｌ  Ｃ，  Ｔｓａｉ  Ｔ  Ｈ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｌｏｏｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ２００４；１０３２（１−２）：１２５−１２８．
Ｌｉｕ  Ｓ  Ｌ，  Ｄｅｇｌｉ  Ｅｓｐｏｓｔｉ  Ｓ，  Ｙａｏ  Ｔ，  Ｄｉｅｈｌ  Ａ  Ｍ，  Ｚｅｒｎ  Ｍ  Ａ．  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ＣＣｌ４−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９５；２２：１４７４−１４８１．
Ｌｌｏｖｅｔ  ＪＭ，  Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ  Ａ，  Ｂｒｕｉｘ  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．    Ｌａｎｃｅｔ．  ２００３；  ３６２：１９０７−１７．
Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ｈ  Ｋ，  Ｓｕｓｉｎ  Ｓ  Ａ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ＡＩＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｌｔｈ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｕｐｄａｔ．  ２００７；  １０（６）：２３５−２５５
Ｌｕ  Ｇ，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｉ，  Ｃｕｉ  Ｘ，  Ｉｔｏｎａｇａ  Ｍ，  Ｔａｍａｋｉ  Ｋ，  Ｆｕｋｕｎｏ  Ｈ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｈ，  Ｈｏｎｄａ  Ｈ，  Ｉｔｏ  Ｓ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００２；４９（３−４）：１７２−１８１．
Ｍａｐｌｅｓ  Ｋ  Ｒ，  Ｇｒｅｅｎ  Ａ  Ｒ，  Ｆｌｏｙｄ  Ｒ  Ａ．  Ｎｉｔｒｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ＮＸＹ−０５９  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．  ＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ  ２００４；１８（１５）：１０７１−１０８４．
Ｍａｕｂａｃｈ  Ｇ，  Ｌｉｍ  Ｍ  Ｃ  Ｃ，  Ｚｈａｎｇ  Ｃ  Ｙ，  Ｚｈｕｏ  Ｌ．  ＧＦＡＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｌａｃＺ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ  ２００６；１２：７２３−７３０．
Ｍｅｕｒｅｒ  Ｓ  Ｋ，  Ｌａｈｍｅ  Ｂ，  Ｔｉｈａａ  Ｌ，  Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ  Ｒ，  Ｇｒｅｓｓｎｅｒ  Ａ  Ｍ．  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＴＧＦ−（  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｅｐｓ：  Ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，  ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｒｕｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏ  ２００５；７０：１０２６−１０３４．
Ｍｉｇｎｏｔｔｅ  Ｂ，  Ｖａｙｓｓｉｅｒｅ  Ｊ−Ｌ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９８；  ２５２：１−１５．
【０２４３】
Ｍｏｏｎ  Ｗ  Ｓｕｎｇ，  Ｔａｒｎａｗｓｋｉ  Ａ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ａ  ｋｅｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３；  ３４（１１）：１１１９−１１２６．
Ｎａｋａｎｕｔａ  Ｍ，  Ｈｉｇａｓｈｉ  Ｎ，  Ｋｏｈｊｉｍａ  Ｍ，  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｍ，  Ｏｈｔａ  Ｓ，  Ｋｏｔｏｈ  Ｋ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｎ，  Ｅｎｊｏｊｉ  Ｍ．  Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ，  ａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ，  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｂｏｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００５；１６：６７７−６８１．
Ｎａｕｇｌｅｒ  Ｗ  Ｅ，  Ｓａｋｕｒａｉ  Ｔ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  Ｍａｅｄａ  Ｓ，  Ｋｉｎ  Ｋ  Ｈ，  Ｅｌｓｈａｒｋａｗｙ  Ａ  Ｍ，  Ｋａｒｉｎ  Ｍ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＭｙＤ８８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１２１−１２４．
Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，  Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，  Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｊｏ  Ｍ，  Ｓｅｋｏｇｕｃｈｉ  Ｓ，  Ｉｓｈｉｉ  Ｍ，  Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｈ，  Ｋａｔａｇｉｓｈｉ  Ｔ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｍｉｎａｍｉ  Ｍ，  Ｉｔｏｈ  Ｙ，  Ｋａｇａｗａ  Ｋ，  Ｏｋａｎｏｕｅ  Ｔ．  Ａ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ，  ｅｐｉｇａｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ，  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２００６；  ４４：１０７４−１０８２．
Ｏｌｍｏｓ  Ｇ，  ＤｅＧｒｅｇｏｒｉｏ−Ｒｏｃａｓｏｌａｎｏ  Ｎ，  Ｒｅｇａｌａｄｏ  Ｍ  Ｐ，  Ｇａｓｕｌｌ  Ｔ，  Ｂｏｒｏｎａｔ  Ｍ  Ａ，  Ｔｒｕｌｌａｓ  Ｒ，  Ｖｉｌｌａｒｒｏｅｌ  Ａ，  Ｌｅｒｍａ  Ｊ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｓｅｖｉｌｌａ  Ｊ  Ａ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｉｎｅ）  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ａｇｍａｔｉｎｅ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９９；１２７：１３１７−１３２６．
Ｏｒｒ  Ｊ  Ｇ，  Ｌｅｅｌ  Ｖ，  Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｇ  Ａ，  Ｍａｒｅｋ  Ｇ  Ｊ，  Ｈａｕｇｈｔｏｎ  Ｅ  Ｌ，  Ｅｌｒｉｃｋ  Ｌ  Ｊ，  Ｔｒｉｍ  Ｊ  Ｅ，  Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  Ｇ  Ｍ，  Ｈａｌｅｓｔｒａｐ  Ａ  Ｐ，  Ｗｒｉｇｈｔ  Ｍ  Ｃ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００４；４０（１）：２３２−２４２．
Ｏｓｔｅｒ，  ＢＡ；  Ｃｏｆｆｅｙ，  ＨＡ；  Ｍｏｒｉｎ，  ＭＪ；  Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ，  Ｆ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９９；  ２８６：２５０７−１０．  
Ｐａｄｉｌｌｏ  Ｆ  Ｊ，  Ｃｒｕｚ  Ａ，  Ｎａｖａｒｒｅｔｅ  Ｃ，  Ｂｕｊａｌａｎｃｅ  Ｉ，  Ｂｒｉｃｅｎｏ  Ｊ，  Ｇａｌｌａｒｄｏ  Ｊ  Ｉ，  Ｍａｒｃｈａｌ  Ｔ，  Ｃａｂａｌｌｅｒｏ  Ｒ，  Ｔｕｎｅｚ  Ｉ，  Ｍｕｎｔａｎｅ  Ｊ，  Ｍｏｎｔｉｌｌａ  Ｐ，  Ｐｅｒａ−Ｍａｄｒａｚｏ  Ｃ．  Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ  ２００４；３８（７）：６９７−７０４．
Ｐａｒｋｉｎ  ＤＭ，  Ｂｒａｙ  Ｆ，  Ｆｅｒｌａｙ  Ｊ，  Ｐｉｓａｎｉ  Ｐ．  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｕｒｄｅｎ：  Ｇｌｏｂｏｃａｎ  ２０００．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；  ９４：１５３−１５６．
Ｐａｒｏｌａ  Ｍ，  Ｐｉｎｚａｎｉ  Ｍ，  Ｃａｓｉｎｉ  Ａ，  Ｌｅｏｎａｒｄｕｚｚｉ  Ｇ，  Ｍａｒｒａ  Ｆ，  Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ  Ａ，  Ｃｅｎｉ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｎｏｎｅｎａｌ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ａｌｋｅｎａｌｓ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９６；２２２：２６１−２６４．
Ｐｅｎｇ  Ｊ，  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＦＦ，  Ｄｏｃｔｒｏｗ  ＳＲ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＪＫ．  Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ／ｃａｔａｌａｓｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｒｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐａｒａｑｕａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ    ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｎｉｇｒａ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００５；２８０：２９１９４−２９１９８．
【０２４４】
Ｐｉｌｃｈ  Ｄ．Ｒ．，  Ｏ．Ａ．  Ｓｅｄｅｌｎｉｋｏｖａ，  Ｃ．  Ｒｅｄｏｎ，  Ａ．  Ｃｅｌｅｓｔｅ，  Ａ．  Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，  Ｗ．Ｍ．  Ｂｏｎｎｅｒ，  ｃｈａｒｅｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸ  ｆｏｃｉ  ａｔ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｓｉｔｅｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８１  （２００３）  １２３−１２９．
Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  Ｓ，  Ｗｈｙ  Ｃａｎａｃｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  Ｙａｌｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００６）；  ７９；  １２３−１３０．
Ｓａｉｔｏ  Ｓ．，  Ｈ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ，  Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｃ．  Ｃｈａｏ，  Ｙ．  Ｘｕ，  Ａ．Ｊ．  Ｆｏｒａｎｃｅ  Ｊｒ．  Ｅ．  Ａｐｅｌｌａ，  Ｃ．Ｗ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐ５３  ｐｏｓｔ−  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｔｒｅｓｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８（２００３）  ３７５３６−３７５４４）
Ｓａｉｔｏ  Ｓ．，  Ａ．Ａ．  Ｇｏｏｄａｚｒｉ，  Ｙ．Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｙ．  Ｎｏｄａ，  Ｓ．ｐ．  Ｌｅｅｓ−ｍｉｌｌｅｒ，  Ｅ．  Ａｐｐｅｌｌａ，  Ｃ．Ｗ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  ＡＴＭ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐ５３  ｓｉｔｅｓ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｅｒ（４６），  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７  （２００２）  １２４９１−１２４９４．
Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ，  Ｇ；  Ｉｏｔｓｏｖａ，  Ｖ；  Ｏｋａｎ，  Ｉ；  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，  Ｍ；  Ｓｔｒｏｍ，  Ｍ；  Ｇｒｏｎｅｒ，  Ｂ；  Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ，  ＲＣ；  Ｗｉｍａｎ，  ＫＧ．  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３  ｂｙ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐ５３  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９７；  ３：６３２−８．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｍ０６９７−６３２．
Ｓｈｉｅｈ  Ｓ．Ｙ．，    Ｉｋｅｄａ  Ｍ．，    Ｔａｙａ  Ｙ．  ａｎｄ    Ｐｒｉｖｅｓ  Ｃ．，  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＤＭ２，  Ｃｅｌｌ  ９１  （１９９７），  ｐｐ．  ３２５−３３４．
Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ  Ｊ．Ｄ．  ，  Ｃ．Ｅ．  Ｃａｎｍａｎ，  Ｙ．  Ｔａｙａ，  Ｋ．  Ａ  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｅ．  Ａｐｐｅｌｌａ，  Ｍ．Ｂ．  Ｋａｓｔａｎ，  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｐ５３，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １１  （１９９７）  ３４７１−３４８１．
Ｓｍａｒｔ  ＤＥ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＫＪ，  Ａｒｔｈｕｒ  ＭＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ−１  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１；２７６：２４４１４−２４４２１．
Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｃ．，  Ｒ．Ｂ．  Ｃａｒｙ，  Ｎ．Ｄ．  Ｌａｋｉｎ，  Ｂ．Ｃ．  Ｈａｎｎ，  Ｓ．Ｈ．  Ｔｅｏ，  Ｄ．Ｊ．  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．Ｐ．  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｔａｘｉａ−  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ＡＴＭ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９６  （１９９９）  １１１３４−１１１３９．
Ｔａｙｌｏｒ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＳＤ，  Ｆｏｓｔｅｒ  ＧＲ，  Ａｒｏｒａ  Ｓ，  Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  Ｓ，  Ｔｈｏｍａｓ  ＨＣ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＫ，  １９７９−１９９４．  Ｌａｎｃｅｔ  １９９７；  ３５０：１１４２−１１４３．
【０２４５】
Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ  Ｂ．  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  Ｔｈｅ  Ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２００５；  ２３（１３）：  ２８９２−２８９９
Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ  Ｓ  Ｓ，  Ｇｒｉｓｈａｍ  Ｊ  Ｗ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ２００２；  ３１：  ３３９−３４６
Ｔｏｎｉｎｉ  Ｇ，  Ｖｉｎｖｅｎｚｉ  Ｂ，  Ｓａｎｔｉｎｉ  Ｄ，  Ｓｃａｒｐａ  Ｓ，  Ｖａｓａｔｕｒｏ  Ｔ，  Ｍａｌａｃｒｉｎｏ  Ｃ，  Ｃｏｐｐｏｌａ  Ｒ，  ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉ  Ｐ，  Ｂｏｒｚｏｍａｔｉ  Ｄ，  Ｂａｌｄｉ  Ａ，  Ａｎｔｉｎｏｒｉ  Ａ，  Ｃａｒｉｃａｔｏ  Ｍ，  Ｎｕｚｚｏ  Ｇ，  Ｐｉｃｃｉｏｃｃｈｉ  Ａ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ６７  ｓｕｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｅｃｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００５；  ９２：２２２５−２２３２．
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｒｉｐｐｅ  Ｒ，  Ｎｉｅｍｅｌａ  Ｏ，  Ｌｉｎ  Ｍ．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ａｎｄ  Ｉｔｏ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９９５；１０：ｓ５０−ｓ５３．
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｈ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ  １９９９；２３：９１１−９１６．
Ｖａｌｉ  Ｌ，  Ｈａｈｎ  Ｏ，  Ｋｕｐｃｓｕｌｉｋ  Ｐ，  Ｄｒａｈｏｓ  Ａ，  Ｓａｒｖａｒｙ  Ｅ，  Ｓｚｅｎｔｍｉｈａｌｙｉ  Ｋ，  Ｐａｌｌａｉ  Ｚ，  Ｋｕｒｕｃｚ  Ｔ，  Ｓｉｐｏｓ  Ｐ，  Ｂｌａｚｏｖｉｃｓ  Ａ．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ＡＴＰ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２００８；  ２０（５）；  ３９３−３９８．
Ｖａｌｋｏ  Ｍ，  Ｉｚａｋｏｖｉｃ  Ｍ，  Ｍａｚｕｒ  Ｍ，  Ｒｈｏｄｅｓ  Ｃ，  Ｔｅｓｌｅｒ  Ｊ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｒａｄｉｃａｌ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００４；  ２６６；  ３７−５６．
Ｖａｓｉｌｉｏｕ  Ｖ，  Ｌｅｅ  Ｊ，  Ｐａｐｐａ  Ａ，  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＤＲ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐ６５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋＢ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０００；２７３：５４６−５５０．
【０２４６】
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ；  Ｌａｎｅ，  Ｄ；  Ｌｅｖｉｎｅ，  ＡＪ．  Ｓｕｒｆｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｎｅｔｗｏｒｋ  ［ｎｅｗｓ］  ［Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｉｔａｔｉｏｎ］．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０００；  ４０８：３０７−１０．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／３５０４２６７５．
Ｗａｇｌｅ  Ｄ  Ｒ，  Ｖａｓａｎ  Ｓ，  Ｇａｌｌ  Ｍ．  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＵＳ  ２００７／００４３０１６  Ａ１．  ２００７．
Ｗａｈｌ  Ｇ．Ｍ．  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．  Ｃａｒｒ，  Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  ｐ５３，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３（２００１）  Ｅ２７７−２８６．
Ｗｅｉ    Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．，  Ｗｅｉ−Ｘｉｎｇ  Ｚｏｎｇ，  Ｅｍｉｌｙ  Ｈ．−Ｙ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｔｕｌｌｉａ  Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，  Ｖｉｌｙ  Ｐａｎｏｕｔｓａｋｏｐｏｕｌｏｕ，  Ａｎｄｒｅａ  Ｊ．  Ｒｏｓｓ，  Ｋｅｖｉｎ  Ａ．  Ｒｏｔｈ，  Ｇｒａｎｔ  Ｒ．  ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，  Ｃｒａｉｇ  Ｂ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｊ．  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ．    Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＢＡＸ  ａｎｄ  ＢＡＫ：  Ａ  ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｇａｔｅｗａｙ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２  （２００１）：７２７−７３０．
Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ  Ｒ，  Ｇｒｅｓｓｎｅｒ  Ａ  Ｍ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００５；１１７：９９−１１３．
Ｗｈａｌｅｎ  Ｒ，  Ｒｏｃｋｅｙ  ＤＣ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ，  Ｂｏｙｅｒ  ＴＤ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９９；３０（４）：９２７−９３３．
Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｎｇｅｏｗ  Ｋ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｙｉｎｇ  Ｊ．  Ｙ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ９  ［１８］  （２００７）  ３４９５−３４９８．
Ｚｈａｎｇ  ＣＹ，  Ｚｈｕｏ  Ｌ．  Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１８：１１４１−１１５１．
Ｚｈａｏ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｃ，  Ｚｈｕｏ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｙｉｎｇ，  Ｙ  Ｙ  Ｊ．  Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ：  Ａ  Ｍｉｌｄ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ．  ＪＡＣＳ．  ２００８；  １３０（３８）：１２５８６−７．
【図１ａ】
0005559701.tif 000006
【図１ｂ】
0005559701.tif 000007
【図２ａ】
0005559701.tif 000008
【図２ｂ】
0005559701.tif 000009
【図３ａ】
0005559701.tif 000010
【図３ｂ】
0005559701.tif 000011
【図３ｃ】
0005559701.tif 000012
【図３ｄ】
0005559701.tif 000013
【図３ｅ】
0005559701.tif 000014
【図３ｆ】
0005559701.tif 000015
【図４ａ】
0005559701.tif 000016
【図４ｂ】
0005559701.tif 000017
【図４ｃ】
0005559701.tif 000018
【図４ｄ】
0005559701.tif 000019
【図４ｅ】
0005559701.tif 000020
【図４ｆ】
0005559701.tif 000021
【図４ｇ】
0005559701.tif 000022
【図５ｂ】
0005559701.tif 000023
【図５ｃ】
0005559701.tif 000024
【図５ｄ】
0005559701.tif 000025
【図５ｅ】
0005559701.tif 000026
【図５ｆ】
0005559701.tif 000027
【図５ｇ】
0005559701.tif 000028
【図６ａ】
0005559701.tif 000029
【図６ｂ】
0005559701.tif 000030
【図７ａ】
0005559701.tif 000031
【図７ｂ】
0005559701.tif 000032
【図７ｃ】
0005559701.tif 000033
【図７ｄ】
0005559701.tif 000034
【図９ａ】
0005559701.tif 000035
【図９ｂ】
0005559701.tif 000036
【図９ｃ】
0005559701.tif 000037
【図１０ａ】
0005559701.tif 000038
【図１０ｂ】
0005559701.tif 000039
【図１０ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３３Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４４Ｂ】
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【図４６】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５４】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図５ａ】
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【図８】
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【図１１】
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【図１３Ａ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１Ｂ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７Ａ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４７】
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【図４８】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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