(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真正細菌に由来する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と真正細菌に由来する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と少なくとも１種の非天然アミノ酸とセレクターコドンを含む該当組換え核酸とを含む真核細胞であって、
Ｏ−ＲＳは細胞で構成的プロモーターを用いて発現され、
Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を真核細胞において非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、
Ｏ−ｔＲＮＡが細胞内で発現され、セレクターコドンを特異的に認識し、
細胞が翻訳中にセレクターコドンに応じて該当組換え核酸によりコードされる該当蛋白質に、非天然アミノ酸を特異的に組込み、
細胞が非天然アミノ酸の存在下における該当蛋白質の収率の３０％未満の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当核酸を翻訳し、
Ｏ−ＲＳが、配列番号３−１９のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるか、
あるいは前記Ｏ−ＲＳが、配列番号３６−４７もしくは８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むか、
あるいは前記Ｏ−ＲＳが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、
Ａ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；
Ｂ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；
Ｃ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び
Ｄ）大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニン
から構成される群から選択される２種以上のアミノ酸を含む、前記細胞。
【請求項２】
Ｏ−ＲＳが大腸菌に由来する請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
真核細胞が酵母細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
Ｏ−ＲＳが天然アミノ酸に比較して少なくとも１種の非天然アミノ酸に１種以上の改善又は強化された酵素性質をもち、前記性質がＫｍ増加、Ｋｍ低下、ｋｃａｔ増加、ｋｃａｔ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ低下、及びｋｃａｔ／ｋｍ増加から構成される群から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
非天然アミノ酸を含み、前記非天然アミノ酸がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸から構成される群から選択される請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
Ｏ−ｔＲＮＡが大腸菌に由来する請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸の細胞内プロセシングにより生産されるｔＲＮＡの少なくとも５０％の効率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号６５に対応する核酸の細胞内プロセシングにより細胞内で生産される請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む該当蛋白質の収率がポリヌクレオチドにセレクターコドンを含まない細胞から天然に存在する該当蛋白質で得られる収率の少なくとも５％であるか、あるいは細胞が少なくとも１種の非天然アミノ酸の存在下における蛋白質の収率の５％未満の収率で少なくとも１種の非天然アミノ酸の不在下に該当蛋白質を生産する請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
該当蛋白質が治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、転写モジュレーター蛋白質、転写アクチベーター蛋白質、ＧＡＬ４、転写リプレッサー蛋白質、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、及びコルチコステロンから構成される群から選択される蛋白質又は蛋白質の一部を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
Ｏ−ｔＲＮＡが転写後修飾される請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種の蛋白質を請求項１に記載の真核細胞で生産する方法であって、
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む前記真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含む、前記方法。
【請求項１３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む蛋白質を真核細胞で生産するためのキットであって、
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするポリヌクレオチド配列を収容する容器を含み、
ここで、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、
Ｏ−ＲＳが配列番号３６−４７及び８６から構成される群から選択されるポリペプチド配列を含み、
細胞が非天然アミノ酸の存在下における蛋白質の収率の１０％未満の収率で非天然アミノ酸の不在下に蛋白質を生産し、そして
Ｏ−ｔＲＮＡが細胞中の該当組換え核酸のセレクターコドンを特異的に認識する前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願はＵＳＳＮ６０／４６３，８６９、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」、発明者Ｃｈｉｎら、出願日２００３年４月１７日；ＵＳＳＮ６０／４７９，９３１、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」、発明者Ｃｈｉｎら、出願日２００３年６月１８日；ＵＳＳＮ６０／４９３，０１４、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」、発明者Ｃｈｉｎら、出願日２００３年８月５日；及びＵＳＳＮ６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」、発明者Ｃｈｉｎら、出願日２００３年８月１９日の各出願に基づく通常特許出願である。本願はこれらの各原出願の優先権と特典を主張する。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国国立衛生研究所により交付された助成番号ＧＭ６２１５９と、エネルギー省により交付された助成番号ＤＥ−ＦＧ０３００ＥＲ４５８１２として政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は真核細胞における翻訳生化学の分野に関する。本発明は真核細胞で直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を作製するための方法と組成物に関する。本発明は非天然アミノ酸の組成物、蛋白質、及び非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を真核細胞で生産する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
細菌からヒトに至る全公知生物の遺伝コードは同一の２０種の標準アミノ酸をコードする。これらの同一の２０種の天然アミノ酸の種々の組み合わせが光合成からシグナル伝達や免疫応答に至る複雑な生命プロセスのほぼ全てを行う蛋白質を形成する。蛋白質構造及び機能を研究及び修飾するために、科学者らは蛋白質の遺伝コードとアミノ酸配列の両者を操作しようと試みている。しかし、遺伝的にコードされる２０種の標準構成単位（稀なケースではセレノシステイン（例えばＡ．Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５１５−２０参照）とピロリジン（例えばＧ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４５９−６２参照）も含む）に蛋白質を制限する遺伝コードによる制約を取り除くことは困難であった。
【０００５】
これらの制約を取り除く試みは多少進展しているが、その進展は限定されており、蛋白質構造及び機能を合理的に制御する能力は未だ揺籃期にある。例えば、化学者らは小分子構造を合成及び操作する方法及びストラテジーを開発している（例えばＥ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ，＆  Ｘ．−Ｍ．Ｃｈｅｎｇ，Ｔｈｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）参照）。完全合成（例えばＢ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−７（１９８６）参照）、及び半合成法（例えばＤ．Ｙ．Ｊａｃｋｓｏｎら，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２４３−７；及びＰ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ，＆  Ｓ．Ｂ．Ｋｅｎｔ，（２０００），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：９２３−６０参照）によりペプチドと小蛋白質を合成することが可能になったが、これらの方法は１０キロダルトン（ｋＤａ）を上回る蛋白質での利用に限られている。突然変異誘発法は強力であるが、限られた数の構造変化に限定されている。多くの場合には、標準アミノ酸の近似構造類似体を蛋白質全体に競合的に組込むことしかできなかった。例えばＲ．Ｆｕｒｔｅｒ，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７：４１９−２６；Ｋ．Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３：２３５−７；及びＶ．Ｄｏｒｉｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：５０１−４参照。
【０００６】
蛋白質構造及び機能を操作する能力を拡張するために、化学的にアシル化された直交ｔＲＮＡを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が開発され、ナンセンスコドンに応答して非天然アミノ酸を選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組込むことが可能になった（例えばＪ．Ａ．Ｅｌｌｍａｎら，（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９７−２００参照）。蛋白質フォールディング及び安定性と生体分子認識及び触媒作用を研究するために新規構造及び物性をもつアミノ酸が蛋白質に選択的に組込まれた。例えばＤ．Ｍｅｎｄｅｌら，（１９９５），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４３５−４６２；及びＶ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈら（Ｍａｒ．３１，１９９５），Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３４：６２１−６３３参照。しかし、この方法は化学量論的であるため、作製できる蛋白質の量が著しく制限された。
【０００７】
非天然アミノ酸は細胞にマイクロインジェクションされている。例えば、化学的にミスアシル化されたＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ｔＲＮＡ（例えばＭ．Ｅ．Ｓａｋｓら（１９９６），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔＲＮＡＧｌｎ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３１６９−２３１７５）と関連ｍＲＮＡのマイクロインジェクションにより、非天然アミノ酸がアフリカツメガエル卵母細胞でニコチン性アセチルコリン受容体に導入された（例えばＭ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら（１９９８），Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９３：５０４−５２９）。この結果、ユニークな物理的又は化学的性質をもつ側鎖を含むアミノ酸の導入により卵母細胞で受容体の詳細な生物理学的研究が可能になった。例えばＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ（２０００），  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：６４５−６５２参照。しかし、残念なことにこの方法はマイクロインジェクションすることができる細胞の蛋白質に限られており、該当ｔＲＮＡは化学的にｉｎ  ｖｉｔｒｏアシル化され、再アシル化できないため、蛋白質収率が非常に低い。
【０００８】
これらの制約を解決するために、原核生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の蛋白質生合成機構に新規成分を付加し（例えばＬ．Ｗａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）、非天然アミノ酸を遺伝的にｉｎ  ｖｉｖｏコードすることが可能になった。フォトアフィニティーラベルや光異性化可能なアミノ酸、ケトアミノ酸、及びグリコシル化アミノ酸を含む新規化学的、物理的又は生物学的性質をもつ多数の新規アミノ酸がこの方法を使用してアンバーコドンＴＡＧに応答して高い忠実度で効率的に大腸菌の蛋白質に組込まれている。例えばＪ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４：及びＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０参照。しかし、原核生物と真核生物の翻訳機構は高度に保存されていないので、多くの場合には大腸菌に付加された生合成機構の成分を使用して非天然アミノ酸を真核生物で蛋白質に部位特異的に組込むことはできない。例えば、大腸菌で使用されたＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対は真核細胞では直交でない。また、原核生物と異なり、真核生物におけるｔＲＮＡの転写はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより行われるため、真核細胞で転写することができるｔＲＮＡ構造遺伝子の一次配列は制限される。更に、原核細胞と異なり、真核細胞ではｔＲＮＡが翻訳機能するためにはその転写の場である核から細胞質に輸送する必要がある。更に、真核８０Ｓリボソームは７０Ｓ原核リボソームと異なる。従って、真核遺伝コードを拡張するためには生合成機構の改良成分を開発する必要がある。本発明は以下の開示から明らかなように、前記及び他の必要を満たすものである。
【非特許文献１】Ａ．Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５１５−２０
【非特許文献２】Ｇ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４５９−６２
【非特許文献３】Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ，＆  Ｘ．−Ｍ．Ｃｈｅｎｇ，Ｔｈｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）
【非特許文献４】Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−７（１９８６）
【非特許文献５】Ｄ．Ｙ．Ｊａｃｋｓｏｎら，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２４３−７
【非特許文献６】Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ，＆  Ｓ．Ｂ．Ｋｅｎｔ，（２０００），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：９２３−６０
【非特許文献７】Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７：４１９−２６
【非特許文献８】Ｋ．Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３：２３５−７
【非特許文献９】Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：５０１−４
【非特許文献１０】Ｊ．Ａ．Ｅｌｌｍａｎら，（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９７−２００
【非特許文献１１】Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌら，（１９９５），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４３５−４６２
【非特許文献１２】Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈら（Ｍａｒ．３１，１９９５），Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３４：６２１−６３３
【非特許文献１３】Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓら（１９９６），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔＲＮＡＧｌｎ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３１６９−２３１７５
【非特許文献１４】Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら（１９９８），Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９３：５０４−５２９
【非特許文献１５】Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ（２０００），  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：６４５−６５２
【非特許文献１６】Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００
【非特許文献１７】Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７
【非特許文献１８】Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７
【非特許文献１９】Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４
【非特許文献２０】Ｌ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は真核細胞で成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために真核蛋白質生合成機構で使用される翻訳成分、例えば直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の対とその個々の成分を組込んだ真核細胞に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の組成物は（例えば大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の非真核生物に由来する）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を組込んだ真核細胞（例えば酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞等）を含み、Ｏ−ＲＳは真核細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。場合により、所与真核細胞で２種以上のＯｔＲＮＡをアミノアシル化することができる。１側面では、Ｏ−ＲＳは例えば配列番号８６又は４５に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの例えば少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様では、本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する場合の例えば少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍等の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。
【００１１】
１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は配列番号３−３５（例えば３−１９、２０−３５、又は配列３−３５の他の任意サブセット）のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。別の態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。更に別の態様では、Ｏ−ＲＳは天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％以上一致するアミノ酸配列を含むと共に、Ａ−Ｅ群の２種以上のアミノ酸を含む。Ａ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、アラニン、又はスレオニンを含む。Ｂ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸を含む。Ｃ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン又はグリシンを含む。Ｄ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、アラニン、バリン、又はチロシンを含み、Ｅ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、メチオニン、バリン、システイン、スレオニン、又はアラニンを含む。
【００１２】
これらの群の組み合わせの任意サブセットが本発明の特徴である。例えば、１態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから選択される２種以上のアミノ酸をもつ。別の態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン、大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸、大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン、大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン、及び／又は大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから選択される２種以上のアミノ酸を含む。
【００１３】
別の態様では、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸に比較して非天然アミノ酸に１種以上の改善又は強化された酵素性質をもつ。例えば、天然アミノ酸に比較して非天然アミノ酸に改善又は強化された酵素性質としては、例えばＫｍ増加、Ｋｍ低下、ｋｃａｔ増加、ｋｃａｔ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ増加等が挙げられる。
【００１４】
真核細胞は更に場合により非天然アミノ酸を含む。真核細胞は場合により（例えば大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及び／又は同等物等の非真核生物に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される。１側面では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列から細胞でプロセシングされるｔＲＮＡの例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９９％の効率で非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する。別の側面では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５の配列を含み、Ｏ−ＲＳは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列、及び／又はその保存変異体から選択されるポリペプチド配列を含む。
【００１５】
別の態様では、真核細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。１側面では、非天然アミノ酸を含む該当ポリペプチドの収率はポリヌクレオチドがセレクターコドンを欠失する細胞から天然に存在するポリペプチドで得られる収率の例えば少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、５０％以上である。別の側面では、細胞は非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の例えば３５％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満等の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する。
【００１６】
本発明は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を組込んだ真核細胞を提供する。前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。更に、Ｏ−ＲＳは真核細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、細胞は非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の例えば３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満等の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する。
【００１７】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を組込んだ真核細胞を含む組成物も本発明の特徴である。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡによりｉｎ  ｖｉｖｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを媒介する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列から細胞でプロセシングされるｔＲＮＡの例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９９％以上の効率で非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列からプロセシングされる。更に別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはリサイクル可能なＯ−ｔＲＮＡを含む。
【００１８】
本発明の１側面では、Ｏ−ｔＲＮＡは転写後修飾される。本発明は真核細胞でＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸、又はその相補的ポリヌクレオチドも提供する。１態様では、核酸はＡボックスとＢボックスを含む。
【００１９】
本発明は翻訳成分、例えばＯ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の作製方法（及びこれらの方法により作製された翻訳成分）にも関する。例えば、本発明は真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の作製方法を提供する。本方法は例えば（ａ）ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む第１の種の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施し、ポジティブ選択後に生存している細胞が非天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含むと判定する段階を含む。ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除する。こうして、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳが得られる。
【００２０】
所定態様では、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは応答エレメントに機能的に連結されており、細胞は、ａ）応答エレメントからの転写を調節する転写モジュレーター蛋白質（例えば真核転写モジュレーター蛋白質等）をコードすると共に、ｂ）少なくとも１種のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを更に含む。非天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより非天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてポジティブ選択マーカーが転写される。１態様では、転写モジュレーター蛋白質は転写アクチベーター蛋白質（例えばＧＡＬ４等）であり、セレクターコドンはアンバー終止コドンであり、例えばアンバー終止コドンは転写アクチベーター蛋白質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの一部又は実質的にその近傍に配置される。
【００２１】
ポジティブ選択マーカーは種々の分子の任意のものとすることができる。１態様では、ポジティブ選択マーカーは増殖用栄養補助剤を含み、選択は栄養補助剤を含まない培地で実施される。別の態様では、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは例えばｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｌａｃＺ遺伝子、ｈｉｓ３（例えばｈｉｓ３遺伝子は３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を添加することにより検出されるイミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素をコードする）、及び／又は同等物である。更に別の態様では、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドはセレクターコドンを含む。
【００２２】
ポジティブ選択マーカーと同様に、ネガティブ選択マーカーも種々の分子の任意のものとすることができる。所定態様では、ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは転写モジュレーター蛋白質により転写を媒介される応答エレメントに機能的に連結されている。天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてネガティブ選択マーカーが転写される。１態様では、ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは例えばｕｒａ３遺伝子であり、ネガティブ選択は５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で実施される。別の態様では、ネガティブ選択に使用される培地はネガティブ選択マーカーにより検出可能な物質に変換される選択又はスクリーニング物質を含む。本発明の１側面では、検出可能な物質は毒性物質である。１態様では、ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドはセレクターコドンを含む。
【００２３】
所定態様では、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するポリペプチドを含む。本発明の１側面では、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光により検出される。所定態様では、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは親和性に基づくスクリーニングマーカー、又は転写モジュレーター蛋白質を含む。１態様では、同一ポリヌクレオチドがポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両者をコードする。
【００２４】
１態様では、本発明のポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは少なくとも２個のセレクターコドンを含むことができ、セレクターコドンは各々又は両方が少なくとも２個の異なるセレクターコドンを含むこともできるし、少なくとも２個の同一セレクターコドンを含むこともできる。
【００２５】
本発明の方法では付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。１態様では、本方法は例えば段階（ａ）、（ｂ）又は（ａ）と（ｂ）の両方で変動量の不活性シンテターゼを添加することができ、変動量の不活性シンテターゼは付加レベルの選択又はスクリーニングストリンジェンシーを提供する。１態様では、Ｏ−ＲＳの作製方法の段階（ａ）、（ｂ）又は（ａ）と（ｂ）の両方で例えばポジティブ及び／又はネガティブ選択マーカーの選択又はスクリーニングストリンジェンシーを変動させる。本方法は場合によりＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳについて付加ポジティブ選択ラウンド、付加ネガティブ選択ラウンド又は付加ポジティブ選択ラウンドと付加ネガティブ選択ラウンドの組み合わせを実施する段階を含む。
【００２６】
１態様では、選択／スクリーニングは例えばアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等から選択される１種以上のポジティブ又はネガティブ選択／スクリーニングを含む。前記１種以上の変化は蛋白質を生産するために使用される直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の成分をコードする１種以上のポリヌクレオチドの突然変異に基づく。
【００２７】
一般に、ＲＳのライブラリー（例えば突然変異体ＲＳのライブラリー）は例えば非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む。１態様では、ＲＳのライブラリーは不活性ＲＳに由来し、例えば不活性ＲＳは活性ＲＳを突然変異させることにより作製される。別の態様では、不活性ＲＳはアミノ酸結合ポケットを含み、結合ポケットを構成する１種以上のアミノ酸は１種以上の異なるアミノ酸で置換されており、例えば置換アミノ酸はアラニンで置換されている。
【００２８】
所定態様では、Ｏ−ＲＳの作製方法はＲＳをコードする核酸でランダム突然変異、部位特異的突然変異、組換え、キメラ構築、又はその任意組み合わせを実施することにより、突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階を更に含む。所定態様では、本方法は例えば（ｃ）Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離する段階と；（ｄ）（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、キメラ構築、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドセットを核酸から作製する段階と；（ｅ）Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ａ）及び／又は（ｂ）を繰り返す段階を更に含む。本発明の１側面では、段階（ｃ）−（ｅ）を少なくとも２回実施する。
【００２９】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の作製方法も本発明の特徴である。１態様では、Ｏ−ＲＳは上記のように得られ、Ｏ−ｔＲＮＡはｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施し、真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除することにより得られる。こうして第１の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールが得られる。本発明の１側面では、ｔＲＮＡのライブラリーは例えば非真核生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡを含む。本発明の別の側面では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーは例えば非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む。本発明の更に別の側面では、ｔＲＮＡのライブラリーは第１の非真核生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡを含む。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーは場合により第２の非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む。１態様では、第１の非真核生物と第２の非真核生物は同一である。あるいは、第１の非真核生物と第２の非真核生物は異なっていてもよい。本発明の方法により作製された特定Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対も本発明の特徴である。
【００３０】
本発明の別の特徴は第１の種で翻訳成分を作製し、選択／スクリーニングした翻訳成分を第２種に導入するための方法である。例えば、第１の種（例えば酵母等の真核種）でＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を作製する方法はＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種（例えば哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、植物等）の真核細胞に導入する段階を更に含む。第２の種は例えば翻訳中に非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むために、導入された翻訳成分を使用することができる。
【００３１】
別の例では、真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は（ａ）第１の種（例えば酵母等の真核種）の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施する段階を含む。第１の種の真核細胞はｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む。ポジティブ選択後に生存している細胞は非天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含む。ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳが得られる。Ｏ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種（例えば哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、植物及び／又は同等物）の真核細胞に導入する。これらの成分は第２の種で翻訳されると、非天然アミノ酸を第２の種で該当蛋白質又はポリペプチドに組込むために使用することができる。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳを第２の種の真核細胞に導入する。
【００３２】
所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施し、真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除することにより得られる。こうして第１の種と第２の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールが得られる。
【００３３】
１側面では、本発明は蛋白質を含有する組成物を含み、前記蛋白質は少なくとも１種の非天然アミノ酸と少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、前記少なくとも１種の翻訳後修飾は第１の反応基を含む少なくとも１種の非天然アミノ酸への［３＋２］シクロ付加による第２の反応基を含む分子の結合を含む。
【００３４】
従って、少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質（又は該当ポリペプチド）も本発明の特徴である。本発明の所定態様では、少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は少なくとも１種の翻訳後修飾を含む。１態様では、少なくとも１種の翻訳後修飾は第１の反応基を含む少なくとも１種の非天然アミノ酸への［３＋２］シクロ付加による第２の反応基を含む分子（例えば色素、ポリマー、例えばポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質又はポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）等）の結合を含む。例えば、第１の反応基は（例えば非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおける）アルキニル部分（この基はアセチレン部分と言う場合もある）であり、第２の反応基はアジド部分である。別の例では、第１の反応基は（例えば非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおける）アジド部分であり、第２の反応基はアルキニル部分である。所定態様では、本発明の蛋白質は少なくとも１種の翻訳後修飾を含む少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばケト非天然アミノ酸）を含み、少なくとも１種の翻訳後修飾は糖部分を含む。所定態様では、翻訳後修飾は真核細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００３５】
所定態様では、蛋白質は真核細胞によりｉｎ  ｖｉｖｏで行われる少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、翻訳後修飾は原核細胞により行われない。翻訳後修飾の例としては限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾等が挙げられる。１態様では、翻訳後修飾はＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖とアスパラギンの結合を含む（例えばオリゴ糖は（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ等を含む）。別の態様では、翻訳後修飾はＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合によるオリゴ糖（例えばＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ等）とセリン又はスレオニンの結合を含む。所定態様では、本発明の蛋白質又はポリペプチドは分泌もしくは局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合配列、及び／又は同等物を含むことができる。
【００３６】
一般に、蛋白質は例えば入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分、及び／又は同等物）と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１態様では、本発明の組成物は該当蛋白質又はポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。
【００３７】
該当蛋白質又はポリペプチドは少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は１０個以上の非天然アミノ酸を組込むことができる。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。所定態様では、蛋白質の天然形に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個は非天然アミノ酸で置換されている。
【００３８】
蛋白質（又は該当ポリペプチド）の例としては限定されないが、例えばサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子���容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、コルチコステロン、Ｇｅｎｅｂａｎｋ又は他の入手可能なデータベースに含まれる蛋白質等、及び／又はその一部が挙げられる。１態様では、該当ポリペプチドは転写モジュレーター蛋白質（例えば転写アクチベーター蛋白質（例えばＧＡＬ４）、又は転写リプレッサー蛋白質等）又はその一部を含む。
【００３９】
真核細胞におけるＧＡＬ４蛋白質、又はその部分の組成物も本発明の特徴である。一般に、ＧＡＬ４蛋白質又はその部分は少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む。
【００４０】
本発明の真核細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。例えば、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞抽出液、緩衝液、医薬的に許容可能な賦形剤、及び／又は同等物中に例えば少なくとも１０μｇ／ｌ、少なくとも５０μｇ／ｌ、少なくとも７５μｇ／ｌ、少なくとも１００μｇ／ｌ、少なくとも２００μｇ／ｌ、少なくとも２５０μｇ／ｌ、又は少なくとも５００μｇ／ｌ以上の蛋白質濃度で生産することができる。所定態様では、本発明の組成物は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、又は少なくとも５００μｇ以上含有する。
【００４１】
所定態様では、該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、又は１０個以上のセレクターコドンを含む。
【００４２】
本発明は少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産するための方法（及び前記方法により生産された蛋白質）も提供する。本方法は例えば少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含む。真核細胞は更に前記細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、培地は非天然アミノ酸を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳは例えば配列番号８６又は４５に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９９％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６４もしくは６５、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか、前記配列からプロセシングされるか、又は前記配列によりコードされる。更に別の態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
１態様では、前記方法は第１の反応基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；第２の反応基を含む分子（例えば色素、ポリマー、例えばポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質又はポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）等）と蛋白質を接触させる段階を更に含む。第１の反応基は第２の反応基と反応し、［３＋２］シクロ付加により分子を非天然アミノ酸と結合する。１態様では、第１の反応基はアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第１の反応基は（例えば非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおける）アルキニル部分であり、第２の反応基はアジド部分である。別の例では、第１の反応基は（例えば非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおける）アジド部分であり、第２の反応基はアルキニル部分である。
【００４４】
所定態様では、コードされる蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分を含む。１態様では、前記方法により生産された蛋白質は非天然アミノ酸を介して修飾されている。例えば、非天然アミノ酸は例えば求核−求電子反応、［３＋２］シクロ付加等により修飾されている。別の態様では、前記方法により生産された蛋白質は少なくとも１種の翻訳後修飾（例えばＮ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾等）によりｉｎ  ｖｉｖｏ修飾されている。
【００４５】
スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質の生産方法（及び前記方法により生産されたスクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質）も提供する。本方法は例えば核酸結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；少なくとも１個のセレクターコドンを含むように第１のポリヌクレオチド配列を突然変異させる段階を含む。こうしてスクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列が得られる。本方法は更に例えば転写活性化ドメインをコードする第２のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；第２のポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたスクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列を含む構築物を提供する段階と；前記構築物と、非天然アミノ酸と、直交ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を細胞に導入する段階を含む。これらの成分のうち、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、スクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を核酸結合ドメインに組込む。こうしてスクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質が得られる。
【００４６】
所定態様では、本発明の組成物と方法は真核細胞を含む。本発明の真核細胞としては例えば哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞等の任意のものが挙げられる。本発明の翻訳成分は種々の生物に由来することができ、例えば原核生物（例えば大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）や始原菌等の非真核生物、又は例えば真核生物が挙げられる。
【００４７】
本発明のセレクターコドンは真核蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。本発明では各種セレクターコドンの任意のものを使用することができ、終止コドン（例えばアンバーコドン、オーカーコドン、又はオパール終止コドン）、ナンセンスコドン、レアコドン、４塩基（以上の）コドン、及び／又は同等物が挙げられる。
【００４８】
本明細書に記載する組成物と方法で使用することができる非天然アミノ酸の例としては（限定されないが）、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギルフェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニンル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ、又はその組み合わせで置換されたアミノ酸；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸、及び／又は同等物が挙げられる。
【００４９】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド、例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分（例えばシンテターゼの活性部位）をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体を構築するために使用されるオリゴヌクレオチド、該当蛋白質又はポリペプチドをコードし、１個以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド等も提供する。例えば、本発明のポリペプチドとしては、配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３−３５（例えば３−１９，２０−３５，又は配列３−３５の他の任意サブセット）のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は配列番号３−３５（例えば３−１９，２０−３５，又は配列３−３５の他の任意サブセット）のいずれか１種に記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的免疫反応性のポリペプチドが挙げられる。
【００５０】
天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）（例えば配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共にＡ−Ｅ群（上記）の２種以上のアミノ酸を含むポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。同様に、本発明のポリペプチドは場合により配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）及び／又は８６の任意１種の少なくとも２０個の連続するアミノ酸と、上記Ａ−Ｅ群に記載の２種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドも含む。上記ポリペプチドの任意のものの保存変異体を含むアミノ酸配列も本発明のポリペプチドに含まれる。
【００５１】
１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は更に本発明のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。
【００５２】
本発明はポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードし、１個以上のセレクターコドンを含むものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号３−３５（例えば３−１９、２０−３５、又は配列３−３５の他の任意サブセット）、６４−８５のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はそのポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド；及び／又は配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその保存変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も本発明のポリヌクレオチドである。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）（例えば配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に上記Ａ−Ｅ群（上記参照）に示したような２種以上の突然変異を含むポリペプチドをコードするポリペプチドも含む。上記ポリヌクレオチド及び／又は上記ポリヌクレオチドの任意のものの保存変異体を含むポリヌクレオチドと少なくとも７０％、（又は少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％以上）以上一致するポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【００５４】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【００５５】
別の側面では、本発明は化合物の組成物と前記化合物の製造方法を提供する。例えば、化合物としては例えば非天然アミノ酸（例えばｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（例えば図１１の１）、（化学構造４及び化学構造６に示すような）アジド色素、（化学構造７に示すような）アルキニルポリエチレングリコール等が挙げられ、前記構造中、ｎは例えば５０〜１０，０００、７５〜５，０００、１００〜２，０００、１００〜１，０００等の整数である。本発明の１態様では、アルキニルポリエチレングリコールは例えば約５，０００〜約１００，０００Ｄａ、約２０，０００〜約５０，０００Ｄａ、約２０，０００〜約１０，０００Ｄａ（例えば２０，０００Ｄａ）の分子量をもつ。
【化１】
0005642916.tif 000002
【００５６】
例えば蛋白質及び細胞と共にこれらの化合物を含有する組成物も提供する。１側面では、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含有する組成物は更に直交ｔＲＮＡを含有する。非天然アミノ酸は直交ｔＲＮＡに（例えば共有的に）結合することができ、例えばアミノアシル結合を介して直交ｔＲＮＡに共有結合することもできるし、直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに共有結合することもできる。
【００５７】
本発明の１側面では、（例えば化学構造４又は化学構造６の）アジド色素を含有する蛋白質は更に少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばアルキニルアミノ酸）を含有しており、アジド色素は［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合している。
【００５８】
１態様では、蛋白質は化学構造７のアルキニルポリエチレングリコールを含む。別の態様では、組成物は更に少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばアジドアミノ酸）を含み、アルキニルポリエチレングリコールは［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合している。
【００５９】
各種化合物の合成方法も本発明に含まれる。例えば、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物の合成方法が提供される。例えば、本方法は（ａ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルチロシンとＫ２ＣＯ３を無水ＤＭＦに懸濁する段階と；（ｂ）臭化プロパルギルを（ａ）の反応混合物に加え、ヒドロキシル基とカルボキシル基をアルキル化することにより、構造：
【化２】
0005642916.tif 000003
をもつ保護中間化合物を得る段階と；（ｃ）保護中間化合物をＭｅＯＨ中で無水ＨＣｌと混合し、アミン部分を脱保護することにより、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を合成する段階を含む。１態様では、前記方法は（ｄ）ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニンＨＣｌをＮａＯＨとＭｅＯＨの水溶液に溶かし、室温で撹拌する段階と；（ｅ）ｐＨをｐＨ７に調整する段階と；（ｆ）ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を沈殿させる段階を更に含む。
【００６０】
アジド色素の合成方法も提供する。例えば、１方法は、（ａ）ハロゲン化スルホニル部分を含む色素化合物を提供する段階と；（ｂ）３−アジドプロピルアミンとトリエチルアミンの存在下に色素化合物を室温まで昇温させ、３−アジドプロピルアミンのアミン部分を色素化合物のハロゲン化物位置にカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む。１態様では、色素化合物はダンシルクロリドを含み、アジド色素は化学構造４の組成物を含む。１側面では、前記方法は反応混合物からアジド色素を精製する段階を更に含む。
【００６１】
別の例では、アジド色素の合成方法は（ａ）アミン含有色素化合物を提供する段階と；（ｂ）アミン含有色素化合物を適切な溶媒中でカルボジイミドと４−（３−アジドプロピルカルバモイル）−酪酸と混合し、酸のカルボニル基を色素化合物のアミン部分とカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む。１態様では、カルボジイミンは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）を含む。１側面では、アミン含有色素はフルオレセインアミンを含み、適切な溶媒はピリジンを含む。例えば、アミン含有色素はフルオレセインアミンを含み、アジド色素は化学構造６の組成物を含む。１態様では、前記方法は（ｃ）アジド色素を沈殿させる段階と；（ｄ）沈殿をＨＣｌで洗浄する段階と；（ｅ）洗浄した沈殿をＥｔＯＡｃに溶かす段階と；（ｆ）アジド色素をヘキサン中で沈殿させる段階を更に含む。
【００６２】
プロパルギルアミドポリエチレングリコールの合成方法も提供する。例えば、本方法はプロパルギルアミンを有機溶媒（例えばＣＨ２Ｃｌ２）中で室温にてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ、化学構造７のプロパルギルアミドポリエチレングリコールを得る段階を含む。１態様では、前記方法は酢酸エチルを使用してプロパルギルアミドポリエチレングリコールを沈殿させる段階を更に含む。１側面では、前記方法はプロパルギルアミドポリエチレングリコールをメタノール中で再結晶させる段階と；生成物を減圧乾燥する段階を更に含む。
【００６３】
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列又はＯ−ｔＲＮＡと、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列又はＯ−ＲＳを収容した容器を含む。１態様では、キットは更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。
（定義）
【００６４】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又は生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
【００６５】
本欄及び本明細書の他の欄で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００６６】
相同：蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、入手可能な任意突然変異誘発法により任意天然核酸を改変し、１個以上のセレクターコドンを加えることができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。より高レベルの配列類似度、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【００６７】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、又は細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する場合に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する場合に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できず、例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率であることを意味する。直交分子は細胞中に機能的内在相補的分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞中の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ＲＳが内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対の効率に対して所定の効率（例えば５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において相互に共働する導入相補的成分を含む。
【００６８】
相補的：「相補的」なる用語は、相互に共働することができる直交対の成分であるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを意味し、例えばＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する。
【００６９】
優先的にアミノアシル化する：「優先的にアミノアシル化する」なる用語はＯ−ＲＳが天然ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡを作製するために使用される出発材料をアミノアシル化する効率の例えば７０％の効率、７５％の効率、８５％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は約９９％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化することを意味する。非天然アミノ酸は高い忠実度で成長中のポリペプチド鎖に組込まれ、例えば所与セレクターコドンで７５％を上回る効率、所与セレクターコドンで約８０％を上回る効率、所与セレクターコドンで約９０％を上回る効率、所与セレクターコドンで約９５％を上回る効率、又は所与セレクターコドンで約９９％を上回るか又はそれ以上の効率である。
【００７０】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００７１】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン、レアコドン、及び／又は同等物を読み飛ばすことができる。
【００７２】
リサイクル可能なｔＲＮＡ：「リサイクル可能なｔＲＮＡ」なる用語は翻訳中にアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を１個以上のポリペプチド鎖に組込むためにアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）で繰り返しアミノアシル化することができるｔＲＮＡを意味する。
【００７３】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）に天然アミノ酸を組込む成分の集合を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ、アミノ酸等を挙げることができる。本発明の成分（例えばＯＲＳ、ＯｔＲＮＡ、非天然アミノ酸等）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系（例えば真核細胞、例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）に加えることができる。
【００７４】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種、セレノシステイン又はピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。
【００７５】
〜に由来：本明細書で使用する「〜に由来」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか又はその情報を使用して作製された成分を意味する。
【００７６】
不活性ＲＳ：本明細書で使用する「不活性ＲＳ」なる用語はその天然コグネイトｔＲＮＡをアミノ酸でアミノアシル化できないように突然変異させたシンテターゼを意味する。
【００７７】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、ポジティブ選択マーカーをもつ細胞がポジティブ選択マーカーをもたない細胞から識別されるマーカーを意味する。
【００７８】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、（例えば所望性質をもつ細胞に対して）所望性質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００７９】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当システムのターゲット成分を選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、親和性に基づくスクリーニングマーカー、又は選択マーカー遺伝子（例えばｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ））等を挙げることができる。
【００８０】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００８１】
非真核生物：本明細書で使用する「非真核生物」なる用語は真核生物以外の生物を意味する。例えば、非真核生物は系統発生分類の真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）、又は系統発生分類の始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ等）に属することができる。
【００８２】
抗体：本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【００８３】
保存変異体：「保存変異体」なる用語は翻訳成分を意味し、例えば保存変異体の原成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と機能的には同様であるが、配列に変異をもつ保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳである。例えば、Ｏ−ＲＳは相補的Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡと保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同一配列ではない。保存変異体は保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００８４】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現ポリヌクレオチド（例えば転写モジュレーター蛋白質）等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等により変動させることができる。
【００８５】
検出可能な物質：本明細書で使用する「検出可能な物質」なる用語は活性化、変化、発現等させた場合に集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、検出可能な物質は所定条件下（例えばＵＲＡ３レポーターの発現下）で検出可能（例えばＵＲＡ３レポーターを発現する細胞を死滅させる毒性物質）になる化学物質（例えば５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）とすることができる。
【００８６】
図面の簡単な説明
図１Ａ、Ｂ及びＣは真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝コードを拡張させるための一般ポジティブ及びネガティブ選択スキームを模式的に示す。図１ＡはＧＡＬ４におけるＴＡＧコドンのアンバー抑圧により誘導されるレポーター遺伝子の活性化転写を模式的に示す。ＤＮＡ結合ドメインを縞部分に示し、主及び潜在活性化ドメインをハッチ部分に示す。図１Ｂはレポーター遺伝子の例（例えばＭａＶ２０３におけるＨＩＳ３，ＬａｃＺ，ＵＲＡ３）を示す。図１Ｃは選択スキームで使用することができるプラスミド（例えばｐＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ及びｐＧＡＤＧＡＬ４ｘｘＴＡＧ）を模式的に示す。
【００８７】
図２は選択培地における第１世代ＧＡＬ４レポーターのＥｃＴｙｒＲＳ及びｔＲＮＡＣＵＡ依存性表現型を示す。ＤＢ−ＡＤはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインの融合体である。ＤＢ−ＴＡＧ−ＡＤはＤＢとＡＤの間の合成リンカーでチロシンコドンに置換するＴＡＧコドンをもつ。Ａ５は活性部位の５残基がアラニンに突然変異しているＥｃＴｙｒＲＳの不活性形である。
【００８８】
図３Ａ及びＢは選択培地における第２世代ＧＡＬ４レポーターのＥｃＴｙｒＲＳ及びｔＲＮＡＣＵＡ依存性表現型を示す。ＤＮＡ結合ドメインを縞部分に示し、主及び潜在活性化ドメインをハッチ部分に示す。図３Ａは各々ＧＡＬ４に単独アミノ酸突然変異をもつ構築物を示す。図３Ｂは各々ＧＡＬ４に２カ所のアミノ酸突然変異をもつ構築物を示す。
【００８９】
図４Ａ，Ｂ及びＣはＭａＶ２０３にＥｃＴｙｒＲＳと各種レポーターをもつｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）ともたないものを示す。図４ＡはＸ−ｇａｌ，−Ｕｒａ，又は−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐの存在下の結果を示す。図４Ｂは各種濃度の３−ＡＴの存在下の結果を示す。図４Ｃは各種百分率の５−ＦＯＡの存在下の結果を示す。
【００９０】
図５Ａ及びＢは例えば残基Ｔ４４（Ａ）及びＲ１１０（Ｂ）を許容部位とする各種ＧＡＬ４突然変異体によるＯＮＰＧ加水分解を示す。図５ＡはＴ４４位に各種突然変異を形成した場合のＯＮＰＧ加水分解測定を示す。図５ＢはＲ１１０位に各種突然変異を形成した場合のＯＮＰＧ加水分解測定を示す。「ＧＡＬ４」はｐＣＬ１で形質転換したＭａＶ２０３であり、目盛外の〜６００ＯＮＰＧ加水分解単位であった。「なし」はＧＡＬ４  ＤＢとＧＡＬ４  ＡＤを別々にコードするプラスミドで形質転換したＭａＶ２０３である。
【００９１】
図６は活性ＥｃＴｙｒＲＳクローンの選択を示す。ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ：ｐＡ５−ｔＲＮＡＣＵＡの１：１０混合物を含むＭａＶ２０３を（−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ）プレート（左）又は（−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ，−Ｈｉｓ＋５０ｍＭ  ３−ＡＴ）プレート（右）に１０３倍の希釈倍率でプレーティングし、ＸＧＡＬ重層法を使用して処理した。
【００９２】
図７Ａはチロシンを結合したＢ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼの活性部位の立体構造を示す。突然変異残基を示し、これらは大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼＴｙｒ３７（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳ残基Ｔｙｒ３４）、Ａｓｎ１２６（Ａｓｎ１２３）、Ａｓｐ１８２（Ａｓｐ１７６）、Ｐｈｅ１８３（Ｐｈｅ１７７）、及びＬｅｕ１８６（Ｌｅｕ１８０）に由来する残基に対応する。図７Ｂは非天然アミノ酸（左から右に向かって）ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（１）、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（２）、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（３）、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（４）、及びｐ−ヨード−Ｌ−チロシン（５）の構造式を示す。
【００９３】
図８Ａは真核細胞で直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルシンテターゼ又は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対の選択／スクリーニングに使用することができるベクター及びレポーター構築物を示す。図８Ｂは選択培地で活性（ＴｙｒＲＳ）又は不活性（Ａ５ＲＳ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに応答するＧＡＬ４応答性ＨＩＳ３，ＵＲＡ３及びｌａｃＺ応答性レポーターをもつ酵母の表現型を示す。図８ＣはＵＡＡを非天然アミノ酸として真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で付加アミノ酸をコードする突然変異体シンテターゼを選択するために使用した選択スキームの１例を示す。図８Ｄはｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンによる選択から単離した酵母の表現型を示す。
【００９４】
図９は図７Ｂに示したような非天然アミノ酸を遺伝的にコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）（３３ＴＡＧ）ＨＩＳの蛋白質発現を示す。
【００９５】
図１０Ａ−Ｈは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ａは非天然アミノ酸ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（１）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｂは非天然アミノ酸ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（２）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｃは非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（３）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｄは非天然アミノ酸Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（４）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｅは非天然アミノ酸ｐ−ヨード−Ｌ−チロシン（５）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０ＦはＹ＊位にアミノ酸トリプトファン（Ｗ）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０ＧはＹ＊位にアミノ酸チロシン（Ｙ）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。図１０ＨはＹ＊位にアミノ酸ロイシン（Ｌ）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【００９６】
図１１は２種の非天然アミノ酸の例として（１）パラ−プロパルギルオキシフェニルアラニンと（２）パラ−アジドフェニルアラニンを示す。
【００９７】
図１２Ａ、Ｂ及びＣは図１１に示した非天然アミノ酸１及び２の存在下又は不在下におけるＳＯＤ発現を示す。図１２ＡはＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色実験を示す。図１２Ｂは抗ＳＯＤ抗体によるウェスタンブロットを示す。図１２Ｃは抗６ｘＨｉｓ抗体によるウェスタンブロットを示す。
【００９８】
図１３Ａ、Ｂ及びＣは［３＋２］シクロ付加による蛋白質標識を示す。図１３Ａは合成色素ラベル３−６を示す。図１３ＢはＳＯＤと色素の反応を示す。図１３Ｃはゲル内蛍光走査とＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色を示す。
【００９９】
図１４はウラシルを含まないＳＤ培地で図１１に示したような１又は２の不在下又は存在下にシンテターゼ突然変異体で形質転換させた真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）の増殖を示す。
【０１００】
図１５Ａ及びＢはアジド（Ａｚ）（図１５Ａ）又はアルキン（Ａｌ）（図１５Ｂ）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。Ｙ＊位の非天然アミノ酸を予想フラグメントイオン質量と共に示す。矢印は各ペプチドに観察されたｂ（青）及びｙ（赤）イオン系列を示す。
【０１０１】
図１６は成長中のポリペプチド鎖への非天然アミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニンのｉｎ  ｖｉｖｏ組込みとこの非天然アミノ酸を介する［３＋２］−シクロ付加反応による小有機分子とのバイオコンジュゲーションを示す。
【０１０２】
図１７Ａ、Ｂ及びＣは［３＋２］シクロ付加を使用した非天然アミノ酸を含む蛋白質のＰＥＧ化を示す。図１７ＡはＣｕ（Ｉ）とリン酸緩衝液（ＰＢ）の存在下におけるプロパルギルアミドＰＥＧとアジドアミノ酸（例えばＮ３−ＳＯＤ）を含む蛋白質の反応を示す。図１７Ｂはゲル分析による蛋白質のＰＥＧ化を示す。図１７ＣはプロパルギルアミドＰＥＧの合成を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０３】
遺伝コードによる化学的制約を解消して蛋白質の構造を真核細胞で直接遺伝的に改変できるならば、細胞プロセスを精査及び操作するための強力な分子ツールとなろう。本発明は真核細胞で遺伝的にコードされるアミノ酸の数を拡張する翻訳成分を提供する。これらの成分は、ｔＲＮＡ（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ））、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば直交シンテターゼＯ−ＲＳ））、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対、及び非天然アミノ酸を含む。
【０１０４】
一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは真核細胞で効率的に発現及びプロセシングされ、翻訳機能するが、宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより有意にアミノアシル化されない。セレクターコドンに応答して、本発明のＯ−ｔＲＮＡは２０種の標準アミノ酸をコードしない非天然アミノ酸をｍＲＮＡ翻訳中に成長中のポリペプチド鎖に送達する。
【０１０５】
本発明のＯ−ＲＳは真核細胞において本発明のＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するが、細胞質宿主のｔＲＮＡをアミノアシル化しない。更に、本発明のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの特異性は内在アミノ酸を排除しながら非天然アミノ酸を受容する。代表的Ｏ−ＲＳ又はその部分のアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明の特徴である。更に、翻訳成分であるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びその部分をコードするポリヌクレオチドも本発明の特徴である。
【０１０６】
本発明は真核細胞用非天然アミノ酸を利用する所望翻訳成分、例えばＯ−ＲＳ、及び／又は直交対（直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ）の作製方法（及び前記方法により作製された翻訳成分）も提供する。例えば、大腸菌に由来するチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対が本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対である。更に、本発明はある真核細胞で翻訳成分を選択／スクリーニングし、選択／スクリーニング後にこれらの成分を別の真核細胞（選択／スクリーニングに使用しなかった真核細胞）で使用する方法にも関する。例えば、真核細胞用翻訳成分を作製するための選択／スクリーニング方法は酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で実施することができ、その後、選択された成分を別の真核細胞（例えば別の酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞等）で使用することができる。
【０１０７】
本発明は更に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を真核細胞で生産するための方法も提供する。蛋白質は本発明の翻訳成分を使用して生産される。本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質（及び本発明の方法により生産された蛋白質）も提供する。該当蛋白質又はポリペプチドは更に例えば［３＋２］シクロ付加、又は原核細胞では行われない求核−求電子反応等により付加される翻訳後修飾を含むことができる。所定態様では、非天然アミノ酸を組込んだ転写モジュレーター蛋白質の作製方法（及び前記方法により作製された蛋白質）も本発明に含まれる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も本発明の特徴である。
【０１０８】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質又はポリペプチドを作製するためのキットも本発明の特徴である。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
【０１０９】
真核細胞において非天然アミノ酸を該当蛋白質又はポリペプチドを特異的に組込むためには、所望非天然アミノ酸のみをｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸は負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変する。直交シンテターゼが無差別な場合には、ターゲット位置に天然アミノ酸と非天然アミノ酸の混合物を含む突然変異体蛋白質となる。本発明は特定非天然アミノ酸に対する基質特異性を改変した直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの組成物と作製方法を提供する。
【０１１０】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む真核細胞が本発明の特徴である。Ｏ−ＲＳは真核細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは２種以上（例えば２種以上、３種以上等）の非天然アミノ酸を利用する。従って、本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを複数の異なる非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する能力をもつことができる。このため、どの非天然アミノ酸もしくは非天然の組み合わせを細胞に添加するかを選択することにより及び／又は組込みのために細胞に添加する各種量の非天然アミノ酸を選択することにより制御レベルを増すことができる。
【０１１１】
本発明のＯ−ＲＳは場合により天然アミノ酸に比較して非天然アミノ酸に１種以上の改善又は強化された酵素性質をもつ。これらの性質としては、例えば天然アミノ酸（例えば２０種の公知標準アミノ酸）に比較して非天然アミノ酸のＫｍ増加、Ｋｍ低下、ｋｃａｔ増加、ｋｃａｔ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ低下、ｋｃａｔ／ｋｍ増加等が挙げられる。
【０１１２】
場合により、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳもしくはその一部をコードするポリヌクレオチドにより真核細胞に付加することができる。例えば、Ｏ−ＲＳ又はその一部は配列番号３−３５（例えば３−１９，２０−３５，又は配列３−３５の他の任意サブセット）のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。別の例では、Ｏ−ＲＳは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については、例えば本明細書の表５、６及び８並びに実施例６参照。
【０１１３】
Ｏ−ＲＳは更に天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列（例えば配列番号２に記載する配列）に例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％一致するアミノ酸配列を含むと共に、Ａ−Ｅ群の２種以上のアミノ酸を含むことができる。Ａ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、アラニン、又はスレオニンを含み；Ｂ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸を含み；Ｃ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン又はグリシンを含み；Ｄ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、アラニン、バリン、又はチロシンを含み；Ｅ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、メチオニン、バリン、システイン、スレオニン、又はアラニンを含む。これらの群の組み合わせの任意サブセットが本発明の特徴である。例えば、１態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから選択される２種以上のアミノ酸をもつ。別の態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン、大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸、大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン、大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン、及び／又は大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから選択される２種以上のアミノ酸を含む。例えば本明細書の表４、表６、及び表８も参照。
【０１１４】
Ｏ−ＲＳに加え、本発明の真核細胞は付加成分（例えば非天然アミノ酸）も含むことができる。真核細胞は更に（例えば大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及び／又は同等物等の非真核生物に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチド、又はこれらの１種以上の組み合わせを含む核酸も細胞に存在することができる。
【０１１５】
１側面では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列からプロセシングされるｔＲＮＡの例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９９％以上の効率で非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する。別の側面では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５を含み、Ｏ−ＲＳは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のポリペプチド配列、及び／又はその保存変異体を含む。代表的Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ分子の配列については、例えば本明細書の表５及び実施例６も参照。
【０１１６】
１例では、真核細胞は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。Ｏ−ＲＳは真核細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、細胞は非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の例えば３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満等の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する。
【０１１７】
本発明の特徴であるＯ−ＲＳの作製方法は場合により野生型シンテターゼの骨格から突然変異体シンテターゼのプールを作製する段階と、その後、２０種の標準アミノ酸と比較した非天然アミノ酸に対する特異性に基づいて突然変異ＲＳを選択する段階を含む。このようなシンテターゼを単離するために、本発明の選択方法は（ｉ）初期ラウンドからの所望シンテターゼの活性を低くすることができ、集団が小さいので高感度であり、（ｉｉ）各選択ラウンドで選択ストリンジェンシーを変えることが望ましいので「調節可能」であり、（ｉｉｉ）汎用性であるため、種々の非天然アミノ酸に使用できる。
【０１１８】
真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の作製方法は一般にポジティブ選択後にネガティブ選択を行う組み合わせを適用する段階を含む。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンの抑圧により、真核細胞をポジティブ選択圧下で生存させる。従って、非天然アミノ酸の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンの抑圧により、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼを除去する。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸でのみ（又は少なくとも優先的に）アミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。
【０１１９】
例えば、前記方法は（ａ）ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを各々含む第１の種の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施し、ポジティブ選択後に生存している細胞が非天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳであると判定する段階と；（ｂ）ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除することにより、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを得る段階を含む。
【０１２０】
ポジティブ選択マーカーは種々の分子の任意のものとすることができる。１態様では、ポジティブ選択マーカーは増殖用栄養補助剤を提供する物質であり、選択は栄養補助剤を含まない培地で実施される。ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの例としては限定されないが、例えば細胞のアミノ酸栄養要求性の相補に基づくレポーター遺伝子、ｈｉｓ３遺伝子（例えばｈｉｓ３遺伝子は３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を添加することにより検出されるイミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素をコードする）、ｕｒａ３遺伝子、ｌｅｕ２遺伝子、ｌｙｓ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ａｄｈ遺伝子等が挙げられる。例えばＧ．Ｍ．Ｋｉｓｈｏｒｅ，＆  Ｄ．Ｍ．Ｓｈａｈ，（１９８８），Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５７：６２７−６６３参照。１態様では、ｌａｃＺ生産はオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）加水分解により検出される。例えばＩ．Ｇ．Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，＆  Ｅ．Ａ．Ｇｏｌｅｍｉｓ，（２０００），Ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｌａｃＺ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙｓ  ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５：１−１５参照。その他のポジティブ選択マーカーとしては、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、抗生物質耐性遺伝子産物（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、転写モジュレーター蛋白質（例えばＧＡＬ４）等が挙げられる。場合により、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドはセレクターコドンを含む。
【０１２１】
ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは応答エレメントに機能的に連結することができる。応答エレメントからの転写を調節する転写モジュレーター蛋白質をコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含む付加ポリヌクレオチドも存在することができる。非天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより非天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチド（例えばレポーター遺伝子）が転写される。例えば、図１Ａ参照。場合により、セレクターコドンは転写モジュレーター蛋白質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの一部又は実質的にその近傍に配置される。
【０１２２】
ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドも転写モジュレーター蛋白質により転写を媒介される応答エレメントに機能的に連結することができる。例えばＡ．Ｊ．ＤｅＭａｇｇｉｏら，（２０００），Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｓｐｌｉｔ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｔｍｏｌ．３２８：１２８−１３７；Ｈ．Ｍ．Ｓｈｉｈら，（１９９６），Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＢＰ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３８９６−１３９０１；Ｍ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｙｅａｓｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３２１−１０３２６；及びＭ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｄ  Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３１５−１０３２０参照。天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡにより天然アミノ酸が転写モジュレーター蛋白質に組込まれる結果としてネガティブ選択マーカーが転写される。場合により、ネガティブ選択マーカーはセレクターコドンを含む。１態様では、本発明のポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは少なくとも２個のセレクターコドンを含むことができ、セレクターコドンは各々又は両方が少なくとも２個の異なるセレクターコドンを含むこともできるし、少なくとも２個の同一セレクターコドンを含むこともできる。
【０１２３】
転写モジュレーター蛋白質は核酸配列（例えば応答エレメント）と（直接又は間接的に）結合し、応答エレメントに機能的に連結された配列の転写を調節する分子である。転写モジュレーター蛋白質としては、転写アクチベーター蛋白質（例えばＧＡＬ４、核内ホルモン受容体、ＡＰ１、ＣＲＥＢ、ＬＥＦ／ｔｃｆファミリーメンバー、ＳＭＡＤ、ＶＰ１６、ＳＰ１等）、転写リプレッサー蛋白質（例えば核内ホルモン受容体、Ｇｒｏｕｃｈｏ／ｔｌｅファミリー、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄファミリー等）、又は環境に依存して両活性をもつことができる蛋白質（例えばＬＥＦ／ｔｃｆ、ホメオボックス蛋白質等）が挙げられる。応答エレメントは一般に転写モジュレーター蛋白質により認識される核酸配列又は転写モジュレーター蛋白質に呼応して作用する付加物質である。
【０１２４】
転写モジュレーター蛋白質の別の例は転写アクチベーター蛋白質ＧＡＬ４（例えば図１Ａ参照）である。例えばＡ．Ｌａｕｇｈｏｎら，（１９８４），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ  ｇｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２６８−２７５；Ａ．Ｌａｕｇｈｏｎ，＆  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，（１９８４），Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４  ｇｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２６０−２６７；Ｌ．Ｋｅｅｇａｎら，（１９８６），Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：６９９−７０４；及びＭ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８８），Ｈｏｗ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｗｏｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：６８３−６８９参照。この８８１アミノ酸蛋白質のＮ末端１４７アミノ酸はＤＮＡ配列と特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を形成する。例えばＭ．Ｃａｒｅｙら，（１９８９），Ａｎ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｂｉｎｄｓ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  ｄｉｍｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９：４２３−４３２；及びＥ．Ｇｉｎｉｇｅｒら，（１９８５），Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＧＡＬ４，ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ，Ｃｅｌｌ  ４０：７６７−７７４参照。ＤＢＤはＤＮＡと結合すると転写を活性化することができるＣ末端１１３アミノ酸活性化ドメイン（ＡＤ）と介在蛋白質配列により連結されている。例えばＪ．Ｍａ，＆  Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８７），Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｃｅｌｌ  ４８：８４７−８５３：及びＪ．Ｍａ，＆  Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８７），Ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３０  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ａｒｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＧＡＬ８０，Ｃｅｌｌ  ５０：１３７−１４２参照。例えばＧＡＬ４のＮ末端ＤＢＤとそのＣ末端ＡＤの両者を含む単一ポリペプチドのＮ末端ＤＢＤ側にアンバーコドンを配置することにより、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対によるアンバー抑圧をＧＡＬ４による転写活性化に連携させることができる（図１Ａ）。ＧＡＬ４により活性化されたレポーター遺伝子を使用してこの遺伝子によりポジティブ選択とネガティブ選択の両方を実施することができる（図１Ｂ）。
【０１２５】
ネガティブ選択に使用される培地はネガティブ選択マーカーにより検出可能な物質に変換される選択又はスクリーニング物質を含むことができる。本発明の１側面では、検出可能な物質は毒性物質である。ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは例えばｕｒａ３遺伝子とすることができる。例えば、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部位を含むプロモーターの制御下にＵＲＡ３レポーターを置くことができる。例えばセレクターコドンをもつＧＡＬ４をコードするポリヌクレオチドの翻訳によりネガティブ選択マーカーが生産されると、ＧＡＬ４はＵＲＡ３の転写を活性化する。ネガティブ選択はｕｒａ３遺伝子の遺伝子産物により検出可能な物質（例えば細胞を死滅させる毒性物質）に変換される５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で実施される。例えばＪ．Ｄ．Ｂｏｅｋｅら，（１９８４），Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ：５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９７：３４５−３４６）；Ｍ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｙｅａｓｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３２１−１０３２６；及びＭ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３１５−１０３２０参照。図８Ｃも参照。
【０１２６】
ポジティブ選択マーカーと同様に、ネガティブ選択マーカーも種々の分子の任意のものとすることができる。１態様では、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するポリペプチドである。例えば、ネガティブ選択マーカーとしては限定されないが、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、抗生物質耐性遺伝子産物（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、ｌａｃＺ遺伝子産物、転写モジュレーター蛋白質等が挙げられる。本発明の１側面では、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光により検出される。別の例では、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーは親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。同一ポリヌクレオチドがポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両者をコードすることもできる。
【０１２７】
本発明の方法では付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えばポジティブ及び／又はネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドにおける応答エレメントの量を変動させたり、段階の一方又は両方に変動量の不活性シンテターゼを添加したり、選択／スクリーニング物質の使用量を変動させる等の操作により実施することができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。
【０１２８】
選択又はスクリーニングは更に１種以上のポジティブ又はネガティブ選択又はスクリーニングを含むことができ、例えばアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等が挙げられる。一般に、前記１種以上の変化は蛋白質を生産するために使用される直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対の成分を含むか又はコードする１種以上のポリヌクレオチドの突然変異に基づく。
【０１２９】
過剰の不活性シンテターゼから活性シンテターゼを迅速に選択するためにモデル集積試験を使用することもできる。ポジティブ及び／又はネガティブモデル選択試験を実施することができる。例えば、潜在的活性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む真核細胞を変動倍過剰の不活性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと混合する。非選択培地で増殖させ、例えばＸ−ＧＡＬ重層法によりアッセイした細胞と、選択培地で（例えばヒスチジン及び／又はウラシルの不在下に）増殖させて生存することができ、例えばＸ−ＧＡＬアッセイによりアッセイした細胞の比率を比較する。ネガティブモデル選択では、潜在的活性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを変動倍過剰の不活性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと混合し、ネガティブ選択物質（例えば５−ＦＯＡ）により選択を実施する。
【０１３０】
一般に、ＲＳのライブラリー（例えば突然変異体ＲＳのライブラリー）は例えば非真核生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳを含む。１態様では、ＲＳのライブラリーは不活性ＲＳに由来し、例えば不活性ＲＳは例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの種々のドメインを組み合わせた種々の部位等において活性ＲＳを突然変異させることにより作製される。例えば、ＲＳの活性部位の残基を例えばアラニン残基に突然変異させる。アラニンに突然変異したＲＳをコードするポリヌクレオチドを鋳型として使用し、アラニン残基を全２０種のアミノ酸に突然変異誘発する。Ｏ−ＲＳを生産するように突然変異ＲＳのライブラリーを選択／スクリーニングする。別の態様では、不活性ＲＳはアミノ酸結合ポケットを含み、結合ポケットを構成する１種以上のアミノ酸は１種以上の異なるアミノ酸で置換されている。１例では、置換アミノ酸はアラニンで置換されている。場合により、アラニンに突然変異したＲＳをコードするポリヌクレオチドを鋳型として使用し、アラニン残基を全２０種のアミノ酸に突然変異誘発し、選択／スクリーニングする。
【０１３１】
Ｏ−ＲＳの作製方法は当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用することによりＲＳのライブラリーを作製する段階を更に含む。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼに更に突然変異誘発法を実施することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、段階を少なくとも２回実施する。
【０１３２】
Ｏ−ＲＳの作製に関するその他の詳細についてはＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」に記載されている。Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕら，（２０００）Ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｈａｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５（５１）：４０３２４−４０３２８；Ｋｉｇａら（２００２），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ，ＰＮＡＳ  ９９（１５）：９７１５−９７２３；及びＦｒａｎｃｋｌｙｎら，（２００２），Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ：Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅａｔｅｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；ＲＮＡ，８：１３６３−１３７２も参照。
直交ｔＲＮＡ
【０１３３】
本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む真核細胞を提供する。直交ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡによりｉｎ  ｖｉｖｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを媒介する。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは配列番号６５に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列から細胞でプロセシングされるｔＲＮＡの例えば少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は９０％以上の効率で非天然アミノ酸の蛋白質組込みを媒介する。本明細書の表５参照。
【０１３４】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの１例は配列番号６５である（本明細書の実施例６及び表５参照）。配列番号６５は場合により例えば細胞の内在スプライシング及びプロセシング機構を使用して細胞中でプロセシングされ、修飾されて活性Ｏ−ｔＲＮＡを形成するプレスプライシング／プロセシング転写産物である。一般に、このようなプレスプライシング転写産物の集団は細胞中で活性ｔＲＮＡの集団を形成する（活性ｔＲＮＡは１種以上の活性形態とすることができる）。本発明はＯ−ｔＲＮＡの保存変異体とそのプロセシングされた細胞内産物も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、配列番号６５のＯ−ｔＲＮＡと同様に機能し、例えばプロセシングされた形態でｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、同一配列をもたない（野生型ｔＲＮＡ分子と異なる）。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンに応答してポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを再媒介するためにｉｎ  ｖｉｖｏ再アミノアシル化することができるのでリサイクル可能なＯ−ｔＲＮＡである。
【０１３５】
原核生物と異なり、真核生物におけるｔＲＮＡ転写はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより行われるので、真核細胞で転写することができるｔＲＮＡ構造遺伝子の一次配列は制限される。更に、真核細胞ではｔＲＮＡが翻訳機能するためにはその転写の場である核から細胞質に輸送する必要がある。本発明のＯ−ｔＲＮＡ又はその相補的ポリヌクレオチドをコードする核酸も本発明の特徴である。本発明の１側面では、本発明のＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸としては内部プロモーター配列、例えば例えばＡボックス（例えばＴＲＧＣＮＮＡＧＹ）とＢボックス（例えばＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ，配列番号８８）が挙げられる。本発明のＯ−ｔＲＮＡは転写後修飾することもできる。例えば、真核生物におけるｔＲＮＡ遺伝子の転写後修飾としては夫々Ｒｎａｓｅ  Ｐ及び３’−エンドヌクレアーゼによる５’−及び３’−フランキング配列の除去が挙げられる。３’−ＣＣＡ配列の付加も真核生物におけるｔＲＮＡ遺伝子の転写後修飾である。
【０１３６】
１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施することにより得られ、真核細胞はｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む。ネガティブ選択は真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして第１の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールが得られる。
【０１３７】
別法として又は非天然アミノ酸をポリペプチドに組込みための他の上記方法と組み合わせてトランス翻訳システムを使用することができる。このシステムは大腸菌に存在するｔｍＲＮＡと言う分子を利用する。このＲＮＡ分子はアラニルｔＲＮＡと構造的に関連しており、アラニルシンテターゼによりアミノアシル化される。ｔｍＲＮＡとｔＲＮＡの相違はアンチコドンループが特殊な大きい配列で置換されていることである。この配列はｔｍＲＮＡ内でコードされるオープンリーディングフレームを鋳型として使用し、停止している配列でリボソームに翻訳を再開させることができる。本発明では、直交シンテターゼで優先的にアミノアシル化され、非天然アミノ酸を負荷される直交ｔｍＲＮＡを作製することができる。遺伝子をこのシステムにより転写することにより、リボソームは特定部位で停止し；非天然アミノ酸をこの部位に導入し、直交ｔｍＲＮＡ内でコードされる配列を使用して翻訳が再開する。
【０１３８】
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際特許出願ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ    ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交ｔＲＮＡ及び直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対
【０１３９】
直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳから構成される。Ｏ−ｔＲＮＡは内在シンテターゼによりアシル化されず、Ｏ−ｔＲＮＡによりｉｎ  ｖｉｖｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを媒介することができる。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを認識し、真核細胞においてＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。直交対の作製方法と前記方法により作製された直交対及び真核細胞で使用するための直交対の組成物も本発明に含まれる。多重直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対の開発により、真核細胞で各種コドンを使用して多重非天然アミノ酸の同時に組込みが可能になる。
【０１４０】
種間アミノアシル化が非効率的な異なる生物から対（例えばナンセンスサプレッサー対）を取り込むことにより真核細胞で直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を作製することができる。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは真核細胞で効率的に発現及びプロセシングされ、Ｏ−ｔＲＮＡは効率的に核から細胞質に輸送される。例えば、このような対の１例は大腸菌に由来するチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対である（例えばＨ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎら，（１９６８），Ｎａｔｕｒｅ  ２１７：１０１９−２４；及びＤ．Ｇ．Ｂａｒｋｅｒら，（１９８２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５０：４１９−２３参照）。大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼはそのコグネイト大腸菌ＲＮＡＣＵＡと共にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞質で発現させると前記コグネイトを効率的にアミノアシル化するが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡをアミノアシル化しない。例えばＨ．Ｅｄｗａｒｄｓ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，（１９９０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１６３３−４１；及びＨ．Ｅｄｗａｒｄｓら，（１９９１），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８８：１１５３−６参照。更に、大腸菌チロシルｔＲＮＡＣＵＡはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの不良基質である（例えばＶ．Ｔｒｅｚｅｇｕｅｔら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２７４４−５１参照）が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで蛋白質翻訳に効率的に機能する。例えばＨ．Ｅｄｗａｒｄｓ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１６３３−４１；Ｈ．Ｅｄｗａｒｄｓら，（１９９１），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８８：１１５３−６；及びＶ．Ｔｒｅｚｅｇｕｅｔら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２７４４−５１参照。更に、大腸菌ＴｙｒＲＳはｔＲＮＡにライゲートした非天然アミノ酸をプルーフリードするための編集メカニズムをもたない。
【０１４１】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、種々の生物に由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを形成する天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。本明細書の「資源及び宿主生物」のセクション参照。種々の態様において、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは少なくとも１種の生物に由来する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたｔＲＮＡに由来し、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたＲＳに由来する。１態様では、第１の非真核生物と第２の非真核生物は同一である。あるいは、第１の非真核生物と第２の非真核生物は異なるものでもよい。
【０１４２】
Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡの作製方法については本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」及び「Ｏ−ｔＲＮＡ」のセクション参照。国際特許出願ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」も参照。
忠実度、効率、及び収率
【０１４３】
忠実度とは所望分子（例えば非天然アミノ酸又はアミノ酸）が成長中のポリペプチドの所望位置に組込まれる確度を意味する。本発明の翻訳成分はセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を高い忠実度で蛋白質に組込む。例えば、本発明の成分を使用すると、（例えばセレクターコドンに応答して）成長中のポリペプチド鎖の所望位置に所望非天然アミノ酸が組込まれる効率は成長中のポリペプチド鎖の所望位置への特定天然アミノ酸の望ましくない組込みに比較して例えば＞７５％、＞８５％、＞９５％、又は＞９９％又はそれ以上である。
【０１４４】
効率とは、Ｏ−ＲＳが関連対照に比較してＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する程度を意味する場合もある。本発明のＯ−ＲＳはその効率により定義することができる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳを別のＯ−ＲＳと比較する。例えば、本発明のＯ−ＲＳは例えば配列番号８６又は４５に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳ（又は表５に示す別の特定ＲＳ）がＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する場合の例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９９％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。別の態様では、本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する場合の少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍等の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。
【０１４５】
本発明の翻訳成分を使用すると、非天然アミノ酸を含む該当ポリペプチドの収率はポリヌクレオチドにセレクターコドンをもたない細胞から天然に存在する該当ポリペプチドで得られる収率の例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、５０％以上である。別の側面では、細胞は非天然アミノ酸の存在下におけるポリペプチドの収率の例えば３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満等の収率で非天然アミノ酸の不在下に該当ポリペプチドを生産する。
資源及び宿主生物
【０１４６】
本発明の直交翻訳成分は一般に真核細胞又は翻訳系で使用するために非真核生物に由来する。例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは例えば真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）や始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ等）等の非真核生物に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは例えば真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）や始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ等）等の非真核生物に由来することができる。あるいは、植物、藻類、原生動物、真菌、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源も使用することができ、例えば成分は該当細胞もしくは翻訳系に直交であるか又は該当細胞もしくは翻訳系に直交となるように修飾（例えば突然変異）されている。
【０１４７】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は大腸菌に由来するチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対に由来することができる。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
【０１４８】
直交Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために真核細胞で選択又はスクリーニング及び／又は使用することができる。真核細胞は種々の資源に由来することができ、例えば植物（例えば単子葉植物や双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等が挙げられる。本発明の翻訳成分を組込んだ真核細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１４９】
本発明は第１の種及び／又は第２の種で（場合により、それ以上選択／スクリーニングせずに）場合により使用するための第１の種における効率的スクリーニングも提供する。例えば、第１の種（例えば操作し易い種（例えば酵母細胞等））でＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの成分を選択又はスクリーニングし、第２の種（例えば植物（例えば単子葉植物や双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等）への非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに使用するために第２の種に導入する。
【０１５０】
例えば、単細胞であり、１世代の寿命が短く、遺伝が比較的十分に特性決定されていることから、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を第１の真核種として選択することができる。例えばＤ．Ｂｕｒｋｅら，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照。更に、真核生物の翻訳機構は高度に保存されている（例えば（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｙ．Ｋｗｏｋ，＆  Ｊ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，（１９８０），Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ａｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：２１３−２１８；及び（２００１）Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）ので、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発見された非天然アミノ酸の組込み用ａａＲＳ遺伝子を高等真核生物に導入し、非天然アミノ酸を組込むためにコグネイトｔＲＮＡと併用することができる（例えばＫ．Ｓａｋａｍｏｔｏら，（２００２）Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９；及びＣ．Ｋｏｈｒｅｒら，（２００１），Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４３１０−１４３１５参照）。
【０１５１】
１例では、本明細書に記載するように第１の種でＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳを生産する方法はＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を第２の種（例えば哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、植物等）の真核細胞に導入する段階を更に含む。別の例では、真核細胞において直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は（ａ）第１の種（例えば酵母等）の真核細胞の集団について非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択を実施する段階を含む。前記真核細胞は各々ｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のライブラリーのメンバーと、ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、ｉｉｉ）ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、ｉｖ）ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。ポジティブ選択後に生存している細胞は非天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性ＲＳを含む。ポジティブ選択後に生存している細胞について非天然アミノ酸の不在下でネガティブ選択を実施し、Ｏ−ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化する活性ＲＳを排除する。こうしてＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳが得られる。Ｏ−ｔＲＮＡをコードする核酸と、Ｏ−ＲＳをコードする核酸（又は成分Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳ）を第２の種（例えば哺乳動物、昆虫、真菌、藻類、植物及び／又は同等物）の真核細胞に導入する。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の種の真核細胞の集団についてネガティブ選択を実施することにより得られ、前記真核細胞はｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む。ネガティブ選択は真核細胞に内在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む細胞を排除し、こうして第１の種と第２の種の真核細胞に直交なｔＲＮＡのプールが得られる。
セレクターコドン
【０１５２】
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。１個の遺伝子が所与セレクターコドンの複数のコピーを含むこともできるし、複数の異なるセレクターコドン又はその任意組み合わせを含むこともできる。
【０１５３】
１態様では、本方法は非天然アミノ酸を真核細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組込むためにに終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドン（例えばＵＡＧ）を認識し、Ｏ−ＲＳにより所望非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して終止コドン（例えばＴＡＧ）を該当ポリペプチドの該当部位に導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８８），５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで混合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を含むポリペプチドが得られる。
【０１５４】
非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは真核宿主細胞にさほど影響を与えずに行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。
【０１５５】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含む。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の１特徴はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。例えば、アンチコドンループ（例えば少なくとも８〜１０ｎｔアンチコドンループ）をもつ突然変異Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば特殊フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡ）の存在下では、４塩基以上のコドンは単一アミノ酸として読取られる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基以上のコドンをデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で多重非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ”Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９参照。
【０１５６】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様において、本発明ではレアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
【０１５７】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠失する系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【０１５８】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び未完成非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２参照。他の関連文献は以下に挙げる。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定であり、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生物機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は直交ｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１６０】
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
【０１６１】
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化３】
0005642916.tif 000004
により表される。
【０１６２】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。
【０１６３】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。所定態様では、非天然アミノ酸は例えば蛋白質を固体支持体に結合するために使用される光架橋基をもつ。１態様では、非天然アミノ酸はアミノ酸側鎖（例えばグリコシル化アミノ酸）に結合した糖部分及び／又は他の糖鎖修飾をもつ。
【０１６４】
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化４】
0005642916.tif 000005
の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１６５】
例えば、多数の非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）ベースとする。チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンは例えばケト基（例えばアセチル基）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アリコニル基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基は例えばヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド基、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（例えばアセチル基）、ベンゾイル、アルキニル基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。非天然アミノ酸の構造の例を図７Ｂ及び図１１に示す。各種非天然アミノ酸のその他の構造は例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」の図１６、１７、１８、１９、２６及び２９に記載されている。その他のメチオニン類似体については、Ｋｉｉｃｋら，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇｔａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ  ９９：１９−２４の図１構造２−５も参照。
【０１６６】
１態様では、非天然アミノ酸（例えばｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン）を含有する組成物が提供される。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンと、例えば蛋白質及び／又は細胞を含有する各種組成物も提供する。１側面では、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含有する組成物は更に直交ｔＲＮＡを含有する。非天然アミノ酸は直交ｔＲＮＡに（例えば共有的に）結合することができ、例えばアミノアシル結合を介して直交ｔＲＮＡに共有結合することもできるし、直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに共有結合することもできる。
【０１６７】
蛋白質に組込むことができる非天然アミノ酸による化学部分は蛋白質の種々の利点と操作を提供する。例えば、ケト官能基のユニークな反応性により、多数のヒドラジン又はヒドロキシルアミンを含有する試薬を使用して蛋白質を選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ修飾することが可能になる。重原子非天然アミノ酸は例えばｘ線構造データのフェージングに有用であると思われる。非天然アミノ酸を使用して重原子を部位特異的に導入すると、重原子の位置の選択に選択性と柔軟性も得られる。光反応性非天然アミノ酸（例えばベンゾフェノンをもつアミノ酸やアリールアジド（例えばフェニルアジド）側鎖）は例えば蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸の例としては限定されないが、例えばｐ−アジド−フェニルアラニンとｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。光反応性非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質はその後、光反応基を付与する時間（及び／又は空間）制御の励起により任意に架橋することができる。１例では、例えば核磁気共鳴及び振動スペクトロスコピーを使用することにより局所構造及び力学のプローブとして同位体標識した例えばメチル基で非天然アミノ酸のメチル基を置換することができる。アルキニル又はアジド官能基は例えば［３＋２］シクロ付加反応により蛋白質を分子で選択的に修飾することができる。
非天然アミノ酸の化学的合成
【０１６８】
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により本明細書に記載する方法や各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３，発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｌａｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。２００２年１２月２２日付け特許出願，発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」（代理人整理番号Ｐ１００１ＵＳ００）も参照されたい。
【０１６９】
本発明の１側面では、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物の合成方法が提供される。１方法は、例えば（ａ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−チロシンとＫ２ＣＯ３を無水ＤＭＦに懸濁する段階と；（ｂ）臭化プロパルギルを（ａ）の反応混合物に加え、ヒドロキシル基とカルボキシル基をアルキル化することにより、構造：
【化５】
0005642916.tif 000006
をもつ保護中間化合物を得る段階と；（ｃ）保護中間化合物をＭｅＯＨ中で無水ＨＣｌと混合し、アミン部分を脱保護することにより、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を合成する段階を含む。１態様では、前記方法は（ｄ）ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニンＨＣｌをＮａＯＨとＭｅＯＨの水溶液に溶かし、室温で撹拌する段階と；（ｅ）ｐＨをｐＨ７に調整する段階と；（ｆ）ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン化合物を沈殿させる段階を更に含む。例えば本明細書の実施例４のプロパルギルオキシフェニルアラニンの合成の欄参照。
非天然アミノ酸の細胞取込み
【０１７０】
真核細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸の電荷密度が高いと、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は一連の蛋白質輸送システムにより真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば２００２年１２月２２日付け特許出願，発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」（代理人整理番号Ｐ１００１ＵＳ００）；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６−４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々の方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
【０１７１】
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば真核細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で構築される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより真核細胞に導入することができる。遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋから入手できる。場合により人工的に進化させた酵素も同様に細胞に付加する。こうして、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１７２】
生合成経路で使用する新規酵素の生産方法又は既存経路を進化させる方法は種々のものが入手可能である。例えば、場合により例えばＭａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（世界ウェブサイトｗｗｗ．ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍ参照）により開発されたような再帰的組換えを使用して新規酵素及び経路を構築する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１参照。同様に、場合によりＧｅｎｅｎｃｏｒ（世界ウェブサイトｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍ参照）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（登録商標）を代謝経路構築に使用し、例えば細胞でＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生産するように経路を構築する。この技術は例えば機能ゲノミクスと分子進化及び設計により同定した新規遺伝子の組合せを使用して宿主生物で既存経路を再構成する。Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（世界ウェブサイトｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍ参照）も例えば新規経路を構築するために遺伝子ライブラリーと遺伝子経路を迅速にスクリーニングするための技術を提供している。
【０１７３】
一般に、本発明の人工生合成経路で生産される非天然アミノ酸は効率的蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他のアミノ酸の濃度を変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するために使用される遺伝子を含むプラスミドで細菌を形質転換し、非天然アミノ酸が生産されたら、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖のために非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
非天然アミノ酸を組込んだポリペプチド
【０１７４】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドが本発明の特徴である。本発明は本発明の組成物と方法を使用して生産された少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだポリペプチド又は蛋白質も含む。賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）も蛋白質に加えることができる。
【０１７５】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドを真核細胞で生産することにより、蛋白質又はポリペプチドは一般に真核翻訳後修飾を含む。所定態様では、蛋白質は少なくとも１種の非天然アミノ酸と、真核細胞によりｉｎ  ｖｉｖｏで行われた少なくとも１種の翻訳後修飾を含み、前記翻訳後修飾は原核細胞により行われない。例えば、翻訳後修飾としては例えばアセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化等が挙げられる。１側面では、翻訳後修飾はＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（例えば（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）とアスパラギンの結合を含む。真核蛋白質のＮ結合オリゴ糖の数例を示す表７も参照（記載以外の残基も存在することができる）。別の側面では、翻訳後修飾はＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合によるオリゴ糖（例えばＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ等）とセリン又はスレオニンの結合を含む。
【表１】
0005642916.tif 000007
【０１７６】
更に別の側面では、翻訳後修飾は前駆体（例えばカルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロ−オピオメラノコルチン、プロ−オピオメラノコルチン等）の蛋白分解プロセシング、マルチサブユニット蛋白質又は巨大分子アセンブリへの会合、細胞の別の部位への輸送（例えば小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンゴリア、クロロプラスト、液胞等のオルガネラへの輸送又は分泌経路を介する輸送）が挙げられる。所定態様では、蛋白質は分泌又は局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合配列等を含む。
【０１７７】
非天然アミノ酸の利点の１つは付加分子を付加するために使用することができる付加化学部分を付与する点である。これらの修飾は真核細胞でｉｎ  ｖｉｖｏ実施することもできるし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実施することもできる。従って、所定態様では、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介して行われる。例えば、翻訳後修飾は求核−求電子反応を介して実施することができる。蛋白質の選択的修飾に現在使用されている大半の反応は求核反応パートナーと求電子反応パートナーの間の共有結合形成、例えばα−ハロケトンとヒスチジン又はシステイン側鎖の反応を利用している。これらの場合の選択性は蛋白質中の求核残基の数とアクセシビリティにより決定される。本発明の蛋白質では、非天然ケトアミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ反応等の他のより選択的な反応を使用することができる。例えばＣｏｒｎｉｓｈら，（１９９６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎら，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ（印刷中）参照。このため、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体及び細胞傷害性分子等の多数の試薬でほぼ任意の蛋白質を選択的に標識することができる。特許出願ＵＳＳＮ  １０／６８６，９４４、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（出願日２００３年１０月１５日）も参照。例えばアジドアミノ酸を介する翻訳後修飾も（例えばトリアリールホスフィン試薬を用いて）シュタウジンガーライゲーションにより実施することができる。例えばＫｉｉｃｋら，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇｔａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ  ９９：１９−２４参照。
【０１７８】
本発明は蛋白質の選択的修飾方法と非常に効率的な別法を提供するものであり、例えばアジド又はアルキニル部分を含む非天然アミノ酸（例えば図１１の２及び１参照）をセレクターコドンに応答して蛋白質に遺伝的に組込む。これらのアミノ酸側鎖をその後、例えばＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加反応（例えばＰａｄｗａ，Ａ．ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．ｉｎ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１７６参照）により例えば夫々アルキニル又はアジド誘導体で修飾することができる。例えば図１６参照。この方法は求核置換ではなくシクロ付加を利用するので、蛋白質を非常に高い選択性で修飾することができる。この反応は触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に加えることにより室温で水性条件下に優れた部位選択性（１，４＞１，５）で実施することができる。例えばＴｏｒｎｏｅら，（２００２）Ｏｒｅ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９参照。使用可能な別法はビスヒ素化合物上でテトラシステインモチーフとのリガンド交換である。例えばＧｒｉｆｆｉｎら，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２６９−２７２参照。
【０１７９】
［３＋２］シクロ付加により本発明の蛋白質に付加することができる分子としてはアジド又はアルキニル誘導体をもつほぼ任意分子が挙げられる。例えば本明細書の実施例３及び５参照。このような分子としては限定されないが、色素、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（例えばポリエチレングリコール誘導体）、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２（又は第３以下）の蛋白質又はポリペプチド、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。例えば本明細書の図１３Ａと実施例３及び５参照。これらの分子は夫々アルキニル基（例えばｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン）又はアジド基（例えばｐ−アジド−フェニルアラニン）をもつ非天然アミノ酸に付加することができる。例えば図１３Ｂ及び図１７Ａ参照。
【０１８０】
別の側面では、本発明はこのような分子を含む組成物と、これらの分子の作製方法を提供し、分子は例えば（化学構造４及び化学構造６に示すような）アジド色素、（化学構造７に示すような）アルキニルポリエチレングリコールであり、前記構造中、ｎは例えば５０〜１０，０００、７５〜５，０００、１００〜２，０００、１００〜１，０００等の整数である。本発明の１態様では、アルキニルポリエチレングリコールは例えば約５，０００〜約１００，０００Ｄａ、約２０，０００〜約５０，０００Ｄａ、約２０，０００〜約１０，０００Ｄａ（例えば２０，０００Ｄａ）等の分子量をもつ。
【化６】
0005642916.tif 000008
【０１８１】
例えば蛋白質及び細胞と共にこれらの化合物を含有する種々の組成物も提供する。本発明の１側面では、（例えば化学構造４又は化学構造６の）アジド色素を含有する蛋白質は更に少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばアルキニルアミノ酸）を含有しており、アジド色素は［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合される。
【０１８２】
１態様では、蛋白質は化学構造７のアルキニルポリエチレングリコールを含む。別の態様では、組成物は更に少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばアジドアミノ酸）を含み、アルキニルポリエチレングリコールは［３＋２］シクロ付加により非天然アミノ酸と結合される。
【０１８３】
アジド色素の合成方法も提供する。例えば、このような方法の１例は（ａ）ハロゲン化スルホニル部分を含む色素化合物を提供する段階と；（ｂ）３−アジドプロピルアミンとトリエチルアミンの存在下に色素化合物を室温まで昇温させ、３−アジドプロピルアミンのアミン部分を色素化合物のハロゲン化物位置にカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む。１態様では、色素化合物はダンシルクロリドを含み、アジド色素は化学構造４の組成物を含む。１側面では、前記方法は反応混合物からアジド色素を精製する段階を更に含む。例えば本明細書の実施例５参照。
【０１８４】
別の例では、アジド色素の合成方法は（ａ）アミン含有色素化合物を提供する段階と；（ｂ）アミン含有色素化合物を適切な溶媒中でカルボジイミドと４−（３−アジドプロピルカルバモイル）−酪酸と混合し、酸のカルボニル基を色素化合物のアミン部分とカップリングすることにより、アジド色素を合成する段階を含む。１態様では、カルボジイミンは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）を含む。１側面では、アミン含有色素はフルオレセインアミンを含み、適切な溶媒はピリジンを含む。例えば、アミン含有色素は場合によりフルオレセインアミンを含み、アジド色素は場合により化学構造６の組成物を含む。１態様では、前記方法は（ｃ）アジド色素を沈殿させる段階と；（ｄ）沈殿をＨＣｌで洗浄する段階と；（ｅ）洗浄した沈殿をＥｔＯＡｃに溶かす段階と；（ｆ）アジド色素をヘキサン中で沈殿させる段階を更に含む。例えば本明細書の実施例５参照。
【０１８５】
プロパルギルアミドポリエチレングリコールの合成方法も提供する。例えば、本方法はプロパルギルアミンを有機溶媒（例えばＣＨ２Ｃｌ２）中で室温にてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ、化学構造７のプロパルギルアミドポリエチレングリコールを得る段階を含む。１態様では、前記方法は酢酸エチルを使用してプロパルギルアミドポリエチレングリコールを沈殿させる段階を更に含む。１側面では、前記方法はプロパルギルアミドポリエチレングリコールをメタノール中で再結晶させる段階と；生成物を減圧乾燥する段階を更に含む。例えば本明細書の実施例５参照。
【０１８６】
本発明の真核細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。１側面では、組成物は場合により、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を真核細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０１８７】
非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット等を改変するように例えば蛋白質構造及び／又は機能を調整するために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
【０１８８】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が非天然アミノ酸で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０１８９】
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を組込んだほぼ任意蛋白質（又はその部分）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０１９０】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」、１種以上の非天然アミノ酸の組込みによる改変の好適ターゲット）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性シ��ック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
【０１９１】
本明細書に記載する非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。自明の通り、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。例えば、ＧＡＬ４蛋白質又はその部分を真核細胞に含む組成物も本発明の特徴である。一般に、ＧＡＬ４蛋白質又はその部分は少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む。本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」のセクションも参照されたい。
【０１９２】
本発明の蛋白質（例えば１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０１９３】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０１９４】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００２カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃を通して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断関連特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性、特異性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能、特異性等が挙げられる。
【０１９５】
他の各種蛋白質も本発明の１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質の１種以上の天然アミノ酸を１種以上の非天然アミノ酸で置換することができる。
【０１９６】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾に適切なターゲットである。
【０１９７】
本発明は少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を真核細胞で生産するための方法（及び前記方法により生産された蛋白質）も提供する。例えば、１方法は少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む真核細胞を適当な培地で増殖させる段階を含む。真核細胞は更に前記細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、培地は非天然アミノ酸を含む。
【０１９８】
１態様では、前記方法は第１の反応基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；第２の反応基を含む分子（例えば色素、ポリマー、例えばポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、第２の蛋白質又はポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）等）と蛋白質を接触させる段階を更に含む。第１の反応基は第２の反応基と反応し、［３＋２］シクロ付加により分子を非天然アミノ酸と結合する。１態様では、第１の反応基はアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第１の反応基は（例えば非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおける）アルキニル部分であり、第２の反応基はアジド部分である。別の例では、第１の反応基は（例えば非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおける）アジド部分であり、第２の反応基はアルキニル部分である。
【０１９９】
１態様では、Ｏ−ＲＳは例えば配列番号８６又は４５に記載のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳの少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号６５もしくは６４、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか、前記配列からプロセシングされるか、又は前記配列によりコードされる。更に別の態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含む。
【０２００】
コードされる蛋白質は例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分を含むことができる。場合により、前記方法により生産された蛋白質は更に非天然アミノ酸により修飾されている。例えば、前記方法により生産された蛋白質は場合により少なくとも１種のｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後修飾により修飾されている。
【０２０１】
スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質の生産方法（及び前記方法により生産されたスクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質）も提供する。例えば、１方法は、核酸結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；少なくとも１個のセレクターコドンを含むように第１のポリヌクレオチド配列を突然変異させる段階を含む。こうしてスクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列が得られる。本方法は更に転写活性化ドメインをコードする第２のポリヌクレオチド配列を選択する段階と；第２のポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたスクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列を含む構築物を提供する段階と；前記構築物と、非天然アミノ酸と、直交ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を細胞に導入する段階を含む。これらの成分のうち、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、スクリーニング又は選択用ポリヌクレオチド配列のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を核酸結合ドメインに組込むことにより、スクリーニング又は選択用転写モジュレーター蛋白質が得られる。
【０２０２】
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０２０３】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は本明細書の「突然変異誘発法及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して例えば非天然アミノ酸を組込むための１個以上のセレクターコドンを付加するように突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上の非天然アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンをもつ任意核酸も含む。
【０２０４】
１態様では、本発明はＧＡＬ４のＴｈｒ４４，Ａｒｇ１１０  ＴＡＧ突然変異体を含む組成物（及び本発明の方法により製造された組成物）を提供し、前記ＧＡＬ４蛋白質は少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む。別の態様では、本発明はヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）のＴｒｐ３３  ＴＡＧ突然変異体を含む組成物を提供し、前記ｈＳＯＤ蛋白質は少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む。
非天然アミノ酸を組込んだ組換え蛋白質の精製
【０２０５】
本発明の蛋白質（例えば非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質に対する抗体等）は当業者に使用されている公知標準手順に従って部分的又は実質的に均質まで精製することができる。従って、本発明のポリペプチドは当分野で周知の多数の方法の任意のものにより回収及び精製することができ、このような方法としては例えば硫安又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクラマトグラフィー、アフィニティーカラムクラマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等が挙げられる。所望により蛋白質リフォールディング段階を使用して正しく折畳まれた成熟蛋白質を作製することができる。高純度が所望される最終精製段階では、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適当な方法を使用することができる。１態様では、例えば１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質をアフィニティー精製するために、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）に対して作製した抗体を精製試薬として使用する。所望に応じて部分的又は均質まで精製した後、ポリペプチドを場合により例えばアッセイ成分、治療試薬又は抗体生産用免疫原として使用する。
【０２０６】
本明細書に引用する他の文献以外に各種精製／蛋白質フォールディング方法が当分野で周知であり、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；並びにその引用文献に記載されている方法が挙げられる。
【０２０７】
非天然アミノ酸を組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドを真核細胞で生産する１つの利点は一般に蛋白質又はポリペプチドがその天然コンフォーメーションで折り畳まれることである。しかし、本発明の所定態様では、当業者に自明の通り、合成、発現及び／又は精製後に蛋白質は該当ポリペプチドの所望コンフォーメーションと異なるコンフォーメーションをもつことができる。本発明の１側面では、発現される蛋白質を場合により変性させた後に再生する。これは例えばシャペロニンを該当蛋白質もしくはポリペプチドに添加するか、及び／又はグアニジンＨＣｌ等のカオトロピック剤で蛋白質を可溶化することにより実施される。
【０２０８】
一般に、発現されたポリペプチドを変性及び還元した後にポリペプチドを好適コンフォーメーションにリフォールディングすることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを該当翻訳産物に添加することができる。蛋白質の還元、変性及び再生方法も当業者に周知である（上記文献や、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒら，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０参照）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらはグアニジン−ＤＴＥでの封入体蛋白質の変性と還元について記載している。蛋白質は例えば酸化グルタチオンとＬ−アルギニンを加えたレドックス緩衝液中でリフォールディングすることができる。リフォールディング試薬を流すか又は他の方法で移動させて１種以上のポリペプチド又は他の発現産物と接触させるか、又はポリペプチドを移動させて試薬と接触させることができる。
抗体
【０２０９】
１側面では、本発明は例えばシンテターゼ、ｔＲＮＡ、及び非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含む分子に対する抗体を提供する。本発明の分子に対する抗体は例えば本発明の分子を精製するための精製試薬として有用である。更に、抗体は例えば前記分子の存在又は位置を（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕ）追跡するために、シンテターゼ、ｔＲＮＡ、及び非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の存在を指示するための指示試薬として使用することができる。
【０２１０】
本発明の抗体は免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的又は部分的にコードされる１種以上のポリペプチドを含む蛋白質とすることができる。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。Ｌ鎖はκ又はλに分類される。Ｈ鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、夫々免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ類と言う。典型的な免疫グロブリン（例えば抗体）構造単位は四量体からなる。各四量体は各々１個の「Ｌ」鎖（約２５ｋＤ）と１個の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤ）からなる同一の２対のポリペプチド鎖から構成される。各鎖のＮ末端は主に抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変Ｌ鎖（ＶＬ）及び可変Ｈ鎖（ＶＨ）なる用語は夫々これらのＬ鎖とＨ鎖を意味する。
【０２１１】
抗体は無傷の免疫グロブリンとして存在するか又は各種ペプチドによる消化により生産された多数の明確に特性決定されたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンはヒンジ部のジスルフィド結合下の抗体を消化し、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合したＬ鎖であるＦａｂの二量体Ｆ（ａｂ’）２を生産する。Ｆ（ａｂ’）２を温和な条件下に還元してヒンジ部のジスルフィド結合を切断すると、Ｆ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は主にヒンジ部を構成するＦａｂである（他の抗体フラグメントの更に詳細な説明についてはＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ａｄｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）参照）。各種抗体フラグメントが無傷の抗体の消化により定義されているが、当業者に自明の通り、化学的方法又は組換えＤＮＡ技術を使用することによりこのようなＦａｂ’フラグメント等をｄｅ  ｎｏｖｏ合成してもよい。従って、本明細書で使用する抗体なる用語は場合により抗体全体の改変により生産されるか又は組換えＤＮＡ技術を使用してｄｅ  ｎｏｖｏ合成された抗体フラグメントを含む。抗体は単鎖抗体を含み、可変Ｈ鎖と可変Ｌ鎖が（直接又はペプチドリンカーを介して）結合して連続ポリペプチドを形成している単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）抗体を含む。本発明の抗体は例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生産されたフラグメント等とすることができる。
【０２１２】
一般に、本発明の抗体は各種分子生物学又は医薬プロセスで一般試薬及び治療試薬として有用である。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の製造方法は入手可能であり、本発明の抗体の製造に適用することができる。多数の基礎教科書が標準抗体製造法を記載しており、例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ），及びＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ）；Ｐａｕｌ（ｅｄ．），（１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡとその引用文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；及びＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７が挙げられる。
【０２１３】
例えば動物への抗原注射に依存しない各種組換え抗体製造技術が開発されており、本発明でも使用することができる。例えば、ファージ又は同様のベクターで組換え抗体のライブラリーを作製及び選択することが可能である。例えばＷｉｎｔｅｒら（１９９４）Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５とその引用文献参照。更にＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ａｎｄ  Ｄｕｎｃａｎ（１９９８）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１０２−８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；Ｇｒａｍら（１９９２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；及びＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６も参照されたい。
【０２１４】
１態様では、抗体ライブラリーは糸状バクテリオファージの表面にＨ鎖及びＬ鎖可変領域を組合せて提示するためにクローニングされる（例えばリンパ球集団から回収するか又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ構築した）Ｖ遺伝子のレパートリーを含むことができる。ファージは抗原との結合により選択する。ファージ感染細菌から可溶性抗体を発現させ、例えば突然変異誘発法により抗体を改良することができる。例えばＢａｌｉｎｔ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ（１９９３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９３）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４（２）：２５６−６５；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：１００−１０３；及びＣｒａｍｅｒｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｌｌ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｗｉｌｄｔｙｐｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：１９４−１９５参照。
【０２１５】
組換え抗体ファージシステムのクローニング及び発現用キットも公知であり、市販されており、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）から「組換えファージ抗体システム、マウスＳｃＦｖモジュール」が販売されている。鎖シャフリングにより高親和性ヒト抗体を製造するためのバクテリオファージ抗体ライブラリーも作製されている（例えばＭａｒｋｓら（１９９２）Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：７７９−７８２参照）。更に、当然のことながら、多数の業者（例えばＢｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）、Ａｎａｗａ（スイス）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー及び米国Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ等）等）により抗体を製造させることもできる。
【０２１６】
所定態様では、例えば抗体を治療投与しようとする場合には、本発明の抗体を「ヒト化」することが有用である。ヒト化抗体を使用すると、（例えば患者がヒトである場合に）治療用抗体に対する望ましくない免疫応答が発生しにくくなる。上記抗体関連文献はヒト化ストラテジーを記載している。ヒト化抗体に加え、ヒト抗体も本発明の特徴である。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン配列から構成されることを特徴とする。ヒト抗体は多様な方法を使用して製造することができる（例えばＬａｒｒｉｃｋら，米国特許第５，００１，０６５号参照）。トリオーマ法によりヒト抗体を製造するための一般アプローチはＯｓｔｂｅｒｇら（１９８３），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７、Ｏｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号、及びＥｎｇｅｌｍａｎら，米国特許第４，６３４，６６６号に記載されている。
【０２１７】
蛋白質の精製と検出に抗体を使用する方法は種々のものが公知であり、本明細書に記載するような非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の検出と精製に適用することができる。一般に、抗体はＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫化学法、アフィニティークロマトグラフィー法、ＳＰＲ及び他の多数の方法の有用な試薬である。上記文献にはＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等の実施方法が詳細に記載されている。
【０２１８】
本発明の１側面では、本発明の抗体はそれ自体非天然アミノ酸を含み、該当特性（例えば半減期、安定性、毒性等の改善）をもつ抗体を提供する。本明細書の「非天然アミノ酸を組込んだポリペプチド」のセクションも参照。抗体は臨床試験で現在使用されている全化合物のほぼ５０％を占めており（Ｗｉｔｔｒｕｐ，（１９９９）Ｐｈａｇｅ  ｏｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｉｂｔｅｃｈ  １７：４２３−４２４）、抗体は診断試薬として広く使用されている。従って、抗体を非天然アミノ酸で修飾できるならば、これらの有用試薬を修飾するための重要なツールとなる。
【０２１９】
例えば、ＭＡｂは診断分野に多数の用途がある。アッセイは単純なスポット試験から腫瘍イメージングに使用されているＤｕＰｏｎｔ  Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏ．製品放射標識ＮＲ−ＬＵ−１０ＭＡｂ（Ｒｕｓｃｈら（１９９３）ＮＲ−ＬＵ−１０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｃａｎｎｉｎｇ．Ａ  ｈｅｌｐｆｕｌ  ｎｅｗ  ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｏ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １０６：２００−４）等のより複雑な方法まで多岐にわたる。周知の通り、ＭＡｂはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫化学法、アフィニティークロマトグラフィー法等の中心試薬である。１種以上の非天然アミノ酸を含むようにこのような任意診断用抗体を修飾し、例えばターゲットに対するＡｂの特異性又はアビディティを改変したり、例えば検出可能なラベル（例えば分光、蛍光、発光等）を非天然アミノ酸に付加することにより１種以上の検出可能な特性を改変することができる。
【０２２０】
有用な抗体試薬の１類は治療用Ａｂである。例えば、抗体は抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体介在性溶解（ＣＭＬ）により破壊するために腫瘍細胞にターゲティングすることにより腫瘍増殖を阻止する腫瘍特異的ＭＡｂとすることができる（これらの一般型のＡｂを「魔法の弾丸」とも言う）。１例は非ホジキンリンパ腫の治療に使用される抗ＣＤ２０ＭＡｂであるリツキサンである（Ｓｃｏｔｔ（１９９８）Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒａｃｔ  ６：１９５−７）。第２の例は腫瘍増殖の重要成分を妨害する抗体に関連する。ハーセプチンは転移性乳癌の治療に使用される抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体であり、この作用メカニズムをもつ抗体の１例である（Ｂａｓｅｌｇａら（１９９８）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９９）５９（８）：２０２０に誤載］，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：２８２５−３１）。第３の例は腫瘍又は他の該当部位に直接細胞傷害性化合物（毒素、放射性核種等）を送達するための抗体に関連する。例えば、１例のＭａｂは前立腺腫瘍細胞に放射線を直接送達する９０Ｙ結合抗体であるＣＹＴ−３５６である（Ｄｅｂら（１９９６）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ９０Ｙ  ＣＹＴ−３５６  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：１２８９−９７）。第４の例は抗体特異的酵素プロドラッグ療法であり、腫瘍に同時局在させた酵素が全身投与したプロドラッグを腫瘍近傍で活性化する。例えば、カルボキシペプチダーゼＡに結合した抗Ｅｐ−ＣＡＭ１抗体が大腸癌治療用に開発中である（Ｗｏｌｆｅら（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｔ２６８Ｇ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ＧＷ１０３１  ａｎｄ  ＧＷ１８４３  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：３８−４８）。この他に、治療効果のために正常細胞機能を特に阻害するように設計したＡｂ（例えばアンタゴニスト）もある。１例は急性臓器移植拒絶を緩和するためにＪｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎから販売されている抗ＣＤ３ＭＡｂであるオルソクローンＯＫＴ３である（Ｓｔｒａｔｅら（１９９０）Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３  ａｓ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｎａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆ���  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ２２：２１９−２０）。別の類の抗体製品はアゴニストである。これらのＭａｂは治療効果のために正常細胞機能を特に強化するように設計されている。例えば、神経治療用のアセチルコリン受容体のＭａｂアゴニストが開発中である（Ｘｉｅら（１９９７）Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｕＳＫ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔ  ＳｃＦｖ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７６８−７１）。１種以上の治療特性（特異性、アビディティ、血清半減期等）を強化するために１種以上の非天然アミノ酸を含むようにこれらの抗体に任意のものを修飾することができる。
【０２２１】
別の類の抗体製品は新規機能を提供する。この類の主な抗体は酵素の触媒能に似せて構築されたＩｇ配列等の触媒抗体である（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｊａｎｄａ（１９９８）Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２：１３８−４４）。例えば、興味深い１例では触媒抗体ｍＡｂ−１５Ａ１０を使用し、中毒治療のためにコカインをｉｎ  ｖｉｖｏ加水分解している（Ｍｅｔｓら（１９９８）Ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｃａｉｎｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃｏｃａｉｎｅ’ｓ  ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：１０１７６−８１））。触媒抗体も１種以上の該当性質を改善するために１種以上の非天然アミノ酸を含むように修飾することができる。
免疫反応性によるポリペプチドの特性決定
【０２２２】
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば本発明の新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体の作製又は抗体と前記抗体又は抗血清と結合したポリペプチドも本発明の特徴の１つである。
【０２２３】
例えば、本発明は配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６の１種以上から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して作製した抗体又は抗血清に特異的に結合するか又は特異的に免疫反応性であるシンテターゼ蛋白質を含む。他の相同体との交差反応性をなくすために、野生型大腸菌チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）（例えば配列番号２）等の入手可能な対照シンテターゼ相同体を用いて抗体又は抗血清をサブトラクションする。
【０２２４】
典型的なフォーマットの１例では、イムノアッセイは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６の１種以上に対応する配列の１種以上又はその実質的サブ配列（即ち記載する全長配列の少なくとも約３０％）を含む１種以上のポリペプチドに対して作製したポリクローナル抗血清を使用する。配列番号３６−６３及び８６に由来する潜在的ポリペプチド免疫原群を以下の文中では「免疫原性ポリペプチド」と総称する。得られた抗血清を場合により対照シンテターゼ相同体に対する交差反応性が低くなるように選択し、ポリクローナル抗血清をイムノアッセイで使用する前に例えば対照シンテターゼ相同体の１種以上に免疫吸着させることによりこのような交差反応性を除去する。
【０２２５】
イムノアッセイで使用する抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と標準マウス免疫プロトコールを使用して近交系マウス（マウスの仮想遺伝的同一性により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用）に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。抗体に関する他の文献や解説も本明細書に記載しており、免疫反応性によりポリペプチドを特性決定／検出する抗体を作製するためにここで適用することができる）。あるいは、本明細書に開示する配列から誘導される１種以上の合成又は組換えポリペプチドをキャリヤー蛋白質に結合して免疫原として使用してもよい。
【０２２６】
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化した免疫原性蛋白質の１種以上を使用する固相イムノアッセイ）で免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。１０６以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照シンテターゼポリペプチドでサブトラクションし、高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを作製する。
【０２２７】
高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを比較イムノアッセイで対照相同体に対する交差反応性について試験する。この比較アッセイでは、高力価ポリクローナル坑血清が免疫原性シンテターゼと結合する場合のシグナル対ノイズ比が対照シンテターゼ相同体と結合する場合の少なくとも約５〜１０倍となるように、サブトラクション高力価ポリクローナル坑血清に差別的な結合条件を決定する。即ち、アルブミン又は脱脂粉乳等の非特異的競合剤を加えるか及び／又は塩条件、温度及び／又は同等条件を調節することにより結合／洗浄反応のストリンジェンシーを調整する。これらの結合／洗浄条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチド及び／又は対照ポリペプチドに比較するポリペプチド）がサブトラクションポリクローナル坑血清プールに特異的に結合しているか否かを調べる後期アッセイで使用される。特に、差別的結合条件下で対照シンテターゼ相同体の少なくとも２〜５倍のシグナル対ノイズ比と、免疫原性ポリペプチドの少なくとも約１／２のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは公知シンテターゼに比較して免疫原ポリペプチドと実質的な構造類似性をもつので、本発明のポリペプチドである。
【０２２８】
別の例では、試験ポリペプチドの検出に競合的結合フォーマットのイムノアッセイを使用する。例えば、自明の通り、対照ポリペプチドに免疫吸着させることにより坑血清混合物プールから交差反応性抗体を除去する。次に、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化し、支持体をサブトラクション坑血清プールに暴露する。試験蛋白質をアッセイに添加し、サブトラクション坑血清プールとの結合を競合させる。試験蛋白質が固定化蛋白質に対してサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を、アッセイに添加した免疫原性ポリペプチドが結合を競合する能力と比較する（免疫原性ポリペプチドは坑血清プールとの結合について固定化免疫原性ポリペプチドと有効に競合する）。標準計算を使用して試験蛋白質の交差反応性百分率を計算する。
【０２２９】
平行アッセイで場合により対照蛋白質がサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を、免疫原性ポリペプチドが坑血清との結合を競合する能力と比較測定する。この場合も、標準計算を使用して対照ポリペプチドの交差反応性百分率を計算する。試験ポリペプチドの交差反応性百分率が対照ポリペプチドの少なくとも５〜１０倍である場合又は試験ポリペプチドの結合が免疫原性ポリペプチドの結合とほぼ同一範囲である場合に、試験ポリペプチドはサブトラクション坑血清プールに特異的に結合すると言う。
【０２３０】
一般に、本明細書に記載する競合的結合イムノアッセイでは任意試験ポリペプチドを免疫原性及び／又は対照ポリペプチドに比較するために免疫吸着坑血清プールを使用することができる。この比較を行うためには、免疫原性、試験及び対照ポリペプチドを各々広い濃度範囲でアッセイし、サブトラクション坑血清と例えば固定化した対照、試験又は免疫原性蛋白質との結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準技術により決定する。競合アッセイで結合に必要な試験ポリペプチドの量が免疫原性ポリペプチドの必要量の２倍未満であり、対照ポリペプチドの少なくとも約５〜１０倍である場合には試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質に対して作製した抗体に特異的に結合すると言う。
【０２３１】
付加特異性試験として、得られる免疫原性ポリペプチドサブトラクション坑血清プールと免疫吸着に使用する免疫原性ポリペプチドの結合が殆ど又は全く検出できなくなるまで場合により坑血清プールを（対照ポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドに完全に免疫吸着させる。この完全に免疫吸着した坑血清を次に試験ポリペプチドとの反応性について試験する。反応性が殆ど又は全く観察されない場合（即ち完全に免疫吸着した坑血清と免疫原性ポリペプチドの結合に観察されるシグナル対ノイズ比の２倍以下）には、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質により誘導される坑血清に特異的に結合している。
医薬組成物
【０２３２】
本発明のポリペプチド又は蛋白質（例えばシンテターゼ、１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質等）は場合により例えば適当な医薬キャリヤーと共に治療用に使用される。このような組成物は例えば治療有効量の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤を含有する。このようなキャリヤー又は賦形剤としては限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はその組合せが挙げられる。製剤は投与方法に合わせて製造される。一般に、蛋白質の投与方法は当分野で周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
【０２３３】
１種以上の本発明のポリペプチドを含有する治療用組成物は場合により１種以上の適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ動物疾患モデルで試験し、当分野で周知の方法により効力、組織代謝を確認し、用量を推定する。特に、天然アミノ酸相同体に対する本発明の非天然アミノ酸の活性、安定性又は他の適切な尺度（例えば１種以上の非天然アミノ酸を含むように修飾したＥＰＯと天然アミノ酸ＥＰＯの比較）により、即ち関連アッセイでまず用量を決定することができる。
【０２３４】
投与は分子を最終的に血液又は組織細胞と接触させるために通常使用されている任意経路で行う。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは場合により１種以上の医薬的に許容可能なキャリヤーと共に適切な任意方法で投与される。本発明においてこのようなポリペプチドを患者に投与するのに適した方法は入手可能であり、特定組成物を投与するために２種以上の経路を使用することもできるが、特定経路が別の経路よりも迅速で有効な作用又は反応を生じることが多い。
【０２３５】
医薬的に許容可能なキャリヤーは投与する特定組成物や、組成物を投与するために使用される特定方法によっても異なる。従って、本発明の医薬組成物の適切な製剤は多様である。
【０２３６】
ポリペプチド組成物は多数の経路で投与することができ、限定されないが、例えば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段が挙げられる。非天然アミノ酸ポリペプチド組成物はリポソームにより投与することもできる。このような投与経路及び適切な製剤は一般に当業者に公知である。
【０２３７】
非天然アミノ酸ポリペプチドは単独又は他の適切な成分と共にエアゾール製剤に処方（即ち「噴霧」）して吸入投与することもできる。エアゾール製剤はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容可能な加圧噴射剤に加えることができる。
【０２３８】
例えば関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路等の非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を所期レシピエントの血液に等張にする溶質を添加できる水性及び非水性等張滅菌注射溶液と、懸濁剤、溶解補助剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を添加できる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。アンプルやバイアル等の単位用量又は多重用量密閉容器でパッケージ核酸製剤とすることもできる。
【０２３９】
非経口投与と静脈内投与が好ましい投与方法である。特に、天然アミノ酸相同体治療で既に使用されている投与経路（例えばＥＰＯ、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は医薬として送達される他の任意蛋白質に一般に使用される投与経路）と現行製剤が本発明の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の好ましい投与経路と製剤となる（例えば現行治療蛋白質のペグ化変異体等）。
【０２４０】
本発明において患者に投与する用量は患者に有益な治療応答を経時的に生じるために十分な量又は例えば用途に応じて病原体による感染を阻害するか又は他の適当な活性を生じるために十分な量とする。用量は特定組成物／製剤の効力、使用する非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性又は血清半減期、患者の症状、更には治療する患者の体重又は体表面積により異なる。用量は特定患者における特定組成物／製剤の投与に伴う副作用の存在、性質及び程度等によっても異なる。
【０２４１】
疾病（例えば癌、遺伝病、糖尿病、エイズ等）の治療又は予防に投与する組成物／製剤の有効量を決定する際には、医師は循環血漿値、製剤毒性、疾病の進行及び／又は該当する場合には抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の生産を考慮する。
【０２４２】
例えば体重７０ｋｇの患者の用量は一般に現在使用されている治療用蛋白質の用量と同等の範囲であり、該当組成物の活性又は血清半減期の変化に合わせて調節する。本発明の組成物／製剤は抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生体応答調節剤等の投与を含む任意公知慣用治療による治療条件を補うことができる。
【０２４３】
投与に当たり、本発明の製剤は該当製剤のＬＤ５０及び／又は例えば患者の体重と総合健康状態に応じた各種濃度の非天然アミノ酸の副作用の観察により決定される頻度で投与する。一度に投与してもよいし、分割して投与してもよい。
【０２４４】
製剤を注入した患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を生じる場合には、適当な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又は他の鎮痛／解熱剤を投与する。発熱、筋肉痛及び悪寒等の注入反応を生じる患者には、次回注入の３０分前にアスピリン、アセトアミノフェン又は例えばジフェニルヒドラミンを前投薬する。解熱剤や抗ヒスタミン剤がすぐに効かない重度悪寒及び筋肉痛にはメペリジンを使用する。反応の重度に応じて治療を遅らせるか又は中断する。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
【０２４５】
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物と方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する（表５，例えば配列番号３−６５，８６，並びに配列番号１及び２以外の配列参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書（例えば実施例と表５）に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする）多数の関連及び非関連配列も提供する。
【０２４６】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分（例えばシンテターゼの活性部位）をコードするポリヌクレオチド）、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体を構築するために使用されるオリゴヌクレオチド等を提供する。例えば、本発明のポリペプチドとしては、配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３−３５（例えば３−１９、２０−３５、又は配列３−３５の他の任意サブセット）のいずれか１種に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに配列番号３６−６３、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は配列番号３−３５（例えば３−１９、２０−３５、又は配列３−３５の他の任意サブセット）のいずれか１種に記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的免疫反応性のポリペプチドが挙げられる。
【０２４７】
天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）（例えば配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に、Ａ−Ｅ群の２種以上のアミノ酸を含むポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。例えば、Ａ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、アラニン、又はスレオニンを含み；Ｂ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸を含み；Ｃ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン又はグリシンを含み；Ｄ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、アラニン、バリン、又はチロシンを含み；Ｅ群は大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、メチオニン、バリン、システイン、スレオニン、又はアラニンを含む。これらの群の組み合わせの任意サブセットが本発明の特徴である。例えば、１態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にバリン、イソロイシン、ロイシン、又はスレオニン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にスレオニン、セリン、アルギニン、又はグリシン；大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にメチオニン、又はチロシン；及び大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にセリン、又はアラニンから選択される２種以上のアミノ酸をもつ。別の態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３７に対応する位置にグリシン、セリン、又はアラニン、大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｎ１２６に対応する位置にアスパラギン酸、大腸菌ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１８２に対応する位置にアスパラギン、大腸菌ＴｙｒＲＳのＰｈｅ１８３に対応する位置にアラニン、又はバリン、及び／又は大腸菌ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１８６に対応する位置にメチオニン、バリン、システイン、又はスレオニンから選択される２種以上のアミノ酸を含む。同様に、本発明のポリペプチドは配列番号３６−６３（例えば３６−４７、４８−６３、又は３６−６３の他の任意サブセット）及び／又は８６の少なくとも２０個の連続するアミノ酸と、上記Ａ−Ｅ群の２種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドも含む。本明細書の表４、表６、及び／又は表８も参照。上記ポリペプチドの任意のものの保存変異体を含むアミノ酸配列も本発明のポリペプチドに含まれる。
【０２４８】
１態様では、１組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は更に本発明のポリペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。
【０２４９】
本発明はポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の該当蛋白質もしくはポリペプチドをコードするか、又は１個以上のセレクターコドンを含むか、又はその両方であるポリヌクレオチドが挙げられる。例えば、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号３−３５（例えば３−１９、２０−３５、又は配列３−３５の他の任意サブセット）、６４−８５のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はそのポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド；及び／又は配列番号３６−６３、及び／又は８６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその保存変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も本発明のポリヌクレオチドである。
【０２５０】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するチロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）（例えば配列番号２）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むと共に上記Ａ−Ｅ群（上記参照）に示したような２種以上の突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。上記ポリヌクレオチド及び／又は上記ポリヌクレオチドの任意のものの保存変異体を含むポリヌクレオチドと少なくとも７０％（又は少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％以上）一致するポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。本明細書の表４、表６、及び／又は表８も参照。
【０２５１】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０２５２】
当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列にハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
保存変異
【０２５３】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することは自明である。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。
【０２５４】
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸１個を欠失するか、アミノ酸１個が付加されるか、又はアミノ酸１個が化学的に類似するアミノ酸１個で置換される場合には、これらの改変は「保存改変変異」である。従って、本発明のポリペプチド配列の「保存変異」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基の保存的に選択されたアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０２５５】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知である。相互に「保存置換」を含む天然アミノ酸を含む代表群を以下に示す。
【表２】
0005642916.tif 000009
核酸ハイブリダイゼーション
【０２５６】
比較ハイブリダイゼーションを使用して本発明の核酸の保存変異体を含む本発明の核酸を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好適な方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号３−３５（例えば３−１９、２０−３５、又は配列３−３５の他の任意サブセット）、６４−８５により示す核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０２５７】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブにハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言う。
【０２５８】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０２５９】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで非関連プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０２６０】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、総合選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０２６１】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０２６２】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０２６３】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０２６４】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
【０２６５】
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０２６６】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０２６７】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
【０２６８】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０２６９】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在することが好ましく、少なくとも約１００残基長の配列の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０２７０】
配列比較及び相同性決定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０２７１】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
【０２７２】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０２７３】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発法及び他の分子生物学技術
【０２７４】
分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９９年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
【０２７５】
例えばｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発法も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発法を実施することができる。
【０２７６】
上記教科書と本明細書の実施例はこれらの手順について記載している。以下の刊行物とその引用文献にも情報が記載されている。Ｌｉｎｇら，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；Ｋｕｎｋｌｅｌ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら，Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０９：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＮｃｉＩ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら，Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐ���ｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら，Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋａｍａｒ  ＆  Ｋｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら，Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ���ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５１（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記方法の多くに関する更に詳細な説明はＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｏｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４に記載されており、この文献には各種突然変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題の有用な解決方法も記載されている。
【０２７７】
本発明は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介する非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに用いる真核宿主細胞及び生物にも関する。本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを含む構築物（例えば本発明のベクター、例えばクローニングベクター又は発現ベクターとすることができる）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０２７８】
組換え宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の機能に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０２７９】
ターゲット核酸を細胞に導入する方法は数種の周知方法が入手可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃及びウイルスベクターによる感染（下記に詳述）等が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅するためには細菌細胞を使用することができる。対数期まで細菌細胞を増殖させると、細菌内のプラスミドを当分野で公知の各種方法により分離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。更に、細菌からプラスミドを精製するために多数のキットが市販されている（例えばＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；及びＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ））。単離精製したプラスミドを更に操作して他のプラスミドを作製し、細胞をトランスフェクトするために使用するか又は生物に感染させるために関連ベクターに組込む。典型的ベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製と組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ参照）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ参照）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
キット
【０２８０】
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳ収容する容器を含む。１態様では、キットは更に少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。
【０２８１】
以下、実施例により本発明を例証するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に理解されよう。
【実施例１】
【０２８２】
非天然アミノ酸を真核細胞に組込むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの生産方法と組成物
新規な物理的、化学的又は生物学的性質をもつ非天然アミノ酸を付加するような真核遺伝コードの拡張は、これらの細胞における蛋白質機能を分析及び制御するための強力なツールとなろう。この目的のために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でアンバーコドンに応答して高い忠実度で非天然アミノ酸を蛋白質に組込むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを単離するための一般アプローチについて記載する。この方法はＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性ドメインの間のアンバーコドンの抑圧によるＧＡＬ４応答性レポーター遺伝子ＨＩＳ３、ＵＲＡ３又はＬａｃＺの活性化に基づく。活性大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ）変異体のポジティブ選択のためのＧＡＬ４レポーターの最適化について記載する。「毒性対立遺伝子」として増殖培地に添加した小分子（５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ））の使用によりＵＲＡ３レポーターを用いて不活性ＥｃＴｙｒＲＳ変異体のネガティブ選択も行った。重要な点として、ポジティブ選択とネガティブ選択の両者を単一細胞で一連のストリンジェンシー下に実施することができる。このため、突然変異体シンテターゼの大きなライブラリーから一連のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）活性を容易に単離できる。所望ａａＲＳ表現型を単離するこの方法の能力をモデル選択により立証する。
【０２８３】
非天然アミノ酸を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝コードに付加する最近の方法は蛋白質構造及び機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両面で分析及び操作するための強力な新規アプローチである。フォトアフィニティーラベル、重原子、ケト基、オレフィン基及びクロモフォアをもつアミノ酸が２０種の標準アミノ酸に匹敵する効率と忠実度で大腸菌の蛋白質に組込まれている。例えばＣｈｉｎら，（２００２），Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１０２０−１１０２４；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃｈｅｍ  ＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２），Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；Ｚｈａｎｇら，（２００２），Ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｋｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄ．ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ４１：２８４０−２８４２；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１−１０参照。
【０２８４】
化学的にミスアシル化されたＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ｔＲＮＡ（例えばＭ．Ｅ．Ｓａｋｓら（１９９６），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔＲＮＡＧｌｎ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３１６９−２３１７５）と関連ｍＲＮＡのマイクロインジェクションにより、非天然アミノ酸がアフリカツメガエル卵母細胞でニコチン性アセチルコリン受容体に導入されている（例えばＭ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら（１９９８），Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９３：５０４−５２９）。この結果、ユニークな物理的又は化学的性質をもつ側鎖を含むアミノ酸の導入により卵母細胞で受容体の詳細な生物理学的研究が可能になった。例えばＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ（２０００），Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：６４５−６５２参照。しかし、残念なことにこの方法はマイクロインジェクションすることができる細胞の蛋白質に限られており、ｔＲＮＡは化学的にｉｎ  ｖｉｔｒｏアシル化され、再アシル化できないため、蛋白質収率が非常に低い。従って、蛋白質機能をアッセイするために高感度の技術が必要である。
【０２８５】
アンバーコドンに応答して非天然アミノ酸を真核細胞の蛋白質に遺伝的に組込む方法が注目されている。Ｈ．Ｊ．Ｄｒａｂｋｉｎら，（１９９６），Ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｐｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：９０７−９１３；Ａ．Ｋ．Ｋｏｗａｌら，（２００１），Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ  ａｒｎｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ  ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：２２６８−２２７３；及びＫ．Ｓａｋａｍｏｔｏら，（２００２），Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９も参照。ｔＲＮＡはそのコグネイトシンテターゼにより再アシル化され、大量の突然変異体蛋白質が得られるのでこの方法は技術的及び実用的に非常に有利である。更に、遺伝的にコードされるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとｔＲＮＡは遺伝性であるため、指数的希釈なしに多数の細胞分裂を介して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことができる。
【０２８６】
大腸菌の遺伝コードに新規アミノ酸を付加するために必要な段階が記載されており（例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４７８０−４７８５参照）、真核生物の遺伝コードを拡張するためにも同様の原理が有用であると思われる。第１段階では、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡＣＵＡ対を同定する。この対は宿主細胞翻訳機構と共働する必要があるが、ａａＲＳは内在ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷すべきではなく、ｔＲＮＡＣＵＡは内在シンテターゼによりアミノアシル化されるべきではない。例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕら，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｔＲＮＡ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１００９２−１００９７参照。第２段階では、非天然アミノ酸しか使用することができないａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を突然変異体ａａＲＳのライブラリーから選択する。大腸菌で２段階「二重シーブ」選択を使用してＭｊＴｙｒＲＳの変異体を利用する非天然アミノ酸の選択を実施した。例えばＤ．Ｒ．Ｌｉｕ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（１９９９），Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４７８０−４７８５参照。改変選択法を真核細胞で使用する。
【０２８７】
単細胞であり、１世代の寿命が短く、遺伝が比較的十分に特性決定されていることから、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を真核宿主生物として選択した。例えばＤ．Ｂｕｒｋｅら，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照。更に、真核生物の翻訳機構は高度に保存されている（例えば（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｙ．Ｋｗｏｋ，＆  Ｊ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，（１９８０），Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ａｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：２１３−２１８；及び（２００１）Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）ので、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発見された非天然アミノ酸の組込み用ａａＲＳ遺伝子を高等真核生物に「切り貼り」し、非天然アミノ酸を組込むためにコグネイトｔＲＮＡと併用できると思われる（例えばＫ．Ｓａｋａｍｏｔｏら，（２００２）Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９；及びＣ．Ｋｏｈｒｅｒら，（２００１），Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４３１０−１４３１５参照）。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝コードの拡張は複雑な多細胞真核生物の遺伝コードを拡張する糸口となる。例えばＭ．Ｂｕｖｏｌｉら，（２０００），Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：３１１６−３１２４参照。大腸菌の遺伝コードを拡張するために従来使用されているＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ（ＭｊＴｙｒＲＳ）／ｔＲＮＡに由来するチロシル対（例えばＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１−１０参照）は真核生物では直交でなく（例えばＰ．Ｆｅｃｈｔｅｒら，（２００１），Ｍａｊｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）  ａｒｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｕｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：７６１−７６７）、真核遺伝コードを拡張するためには新規直交対が必要である。Ｓｃｈｉｍｍｅｌらは大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ）／ｔＲＮＡＣＵＡ対がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでアンバーコドンを抑圧し、大腸菌ｔＲＮＡＣＵＡが酵母サイトゾルで内在アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより負荷されないことを示している（図２）。例えばＨ．Ｅｄｗａｒｄｓら，（１９９１），Ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｉｓ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１１５３−１１５６；及びＨ．Ｅｄｗａｒｄｓ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（１９９０），Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｉｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１６３３−１６４１も参照。更に、ＥｃＴｙｒＲＳは酵母ｔＲＮＡにｉｎ  ｖｉｔｒｏ負荷しないことが示されている。例えばＹ．Ｋｗｏｋ，＆  Ｊ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，（１９８０），Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ａｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：２１３−２１８；Ｂ．Ｐ．Ｄｏｃｔｏｒら，（１９６６），Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔＲＮＡｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３１：５４３−５４８；及びＫ．Ｗａｋａｓｕｇｉら，（１９９８），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：２９７−３０５参照。従って、ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと高等真核生物の両者において直交対の候補である（例えばＡ．Ｋ．Ｋｏｗａｌら，（２００１），Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ  ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２００１）２２６８−２２７３）。
【０２８８】
大腸菌におけるＥｃＴｙｒＲＳの基質特異性を拡大するために、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらはエラープローンＰＣＲにより作製したＥｃＴｙｒＲＳの突然変異体のライブラリーをスクリーニングし、３−アザチロシンを組込む能力が改善された突然変異体を発見した。例えばＦ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕら，（２０００），Ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｙｌ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｈａｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４０３２４−４０３２８参照。しかし、このアミノ酸は大腸菌のプロテオーム全体に組込まれ、進化後の酵素は依然としてチロシンを基質とする。Ｙｏｋｏｙａｍａらは麦芽翻訳系でＥｃＴｙｒＲＳの設計活性部位変異体の小集合をスクリーニングし、３−ヨードチロシンをチロシンよりも有効に利用するＥｃＴｙｒＲＳ変異体を発見した。Ｄ．Ｋｉｇａら，（２００２），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：９７１５−９７２０参照。本発明者らが大腸菌で進化させた酵素（例えばＪ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９９：１１０２０−１１０２４；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００１），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；及びＬ．Ｗａｎｇら，（２００２），Ａｄｄｉｎｇ  Ｌ−３−（２−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅ−ｃｏｌｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１８３６−１８３７）と異なり、この酵素は依然として非天然アミノ酸の不在下にチロシンを組込む。例えばＤ．Ｋｉｇａら，（２００２），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：９７１５−９７２０参照。最近、ＹｏｋｏｙａｍａらはこのＥｃＴｙｒＲＳ突然変異体が哺乳動物細胞でアンバーコドンを抑圧するためにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するｔＲＮＡＣＵＡと共働することも立証している。Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏら，（２００２），Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９参照。
【０２８９】
真核遺伝コードに付加した任意アミノ酸を２０種の標準アミノ酸と同等の忠実度で組込むことが必要である。この目的を達成するために、アンバーコドンＴＡＧに応答して非天然アミノ酸を組込むが、標準アミノ酸は全く組込まないようにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能するＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ変異体を見いだすために一般的なｉｎ  ｖｉｖｏ選択法が使用されている。選択の主要な利点は非天然アミノ酸を選択的に組込む酵素を１０８個のＥｃＴｙｒＲＳ活性部位変異体のライブラリーから迅速に選択集積できることであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングされるよりも６〜７桁上回るダイバーシティである。例えばＤ．Ｋｉｇａら，（２００２），Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：９７１５−９７２０参照。このダイバーシティの増加は多種多様な有用機能を非常に高い忠実度で組込むためのＥｃＴｙｒＲＳ変異体を単離する可能性を著しく拡げる。例えばＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１−１０参照。
【０２９０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの選択アプローチを拡大するために、転写アクチベーター蛋白質ＧＡＬ４を使用した（図１参照）。例えばＡ．Ｌａｕｇｈｏｎら，（１９８４），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４  ｇｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２６８−２７５；Ａ．Ｌａｕｇｈｏｎ，＆  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，（１９８４），Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４  ｇｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２６０−２６７；Ｌ．Ｋｅｅｇａｎら，（１９８６），Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：６９９−７０４；及びＭ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８８），Ｈｏｗ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｗｏｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：６８３−６８９参照。この８８１アミノ酸蛋白質のＮ末端１４７アミノ酸はＤＮＡ配列と特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を形成する。例えばＭ．Ｃａｒｅｙら，（１９８９），Ａｎ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｂｉｎｄｓ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  ｄｉｍｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９：４２３−４３２；及びＥ．Ｇｉｎｉｇｅｒら，（１９８５），Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＧＡＬ４，ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ，Ｃｅｌｌ  ４０：７６７−７７４参照。ＤＢＤはＤＮＡと結合すると転写を活性化することができるＣ末端１１３アミノ酸活性化ドメイン（ＡＤ）と介在蛋白質配列により結合している。例えばＪ．Ｍａ，＆  Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８７），Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｃｅｌｌ  ４８：８４７−８５３：及びＪ．Ｍａ，＆  Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８７），Ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３０  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ａｒｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＧＡＬ８０，Ｃｅｌｌ  ５０：１３７−１４２参照。本発明者らはＧＡＬ４のＮ末端ＤＢＤとそのＣ末端ＡＤの両者を含む単一ポリペプチドのＮ末端ＤＢＤ側にアンバーコドンを配置することにより、ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によるアンバー抑圧をＧＡＬ４による転写活性化と連携できるのではないかと予想した（図１Ａ）。ＧＡＬ４で活性化された適当なレポーター遺伝子を選択することにより、ポジティブ選択とネガティブ選択の両者を遺伝子で実施することができる（図１Ｂ）。細胞のアミノ酸栄養要求性の相補に基づく多数のレポーター遺伝子（例えばＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＨＩＳＳ，ＬＹＳ２）をポジティブ選択に使用することができるが、ＨＩＳ３���伝子はコードされる蛋白質（イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素）の活性を３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の添加により用量依存的に調節することができるので魅力的なレポーター遺伝子である。例えばＧ．Ｍ．Ｋｉｓｈｏｒｅ，＆  Ｄ．Ｍ．Ｓｈａｈ，（１９８８），Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５７：６２７−６６３参照。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ネガティブ選択には少数の遺伝子しか使用されていない。数種のネガティブ選択ストラテジー（例えばＡ．Ｊ．ＤｅＭａｇｇｉｏら，（２０００），Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｓｐｌｉｔ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：１２８−１３７；Ｈ．Ｍ．Ｓｈｉｈら，（１９９６），Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＢＰ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３８９６−１３９０１；Ｍ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｙｅａｓｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３２１−１０３２６；及びＭ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｓｓｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３１５−１０３２０参照）のうちで使用に成功している１例はＶｉｄａｌらにより開発された「逆二重ハイブリッド」システムで記載されているＵＲＡ３／５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）ネガティブ選択（例えば、Ｊ．Ｄ．Ｂｏｅｋｅら，（１９８４），Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ：５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９７：３４５−３４６）システムである。Ｍ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｙｅａｓｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０���２１−１０３２６；及びＭ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｓｓｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０３１５−１０３２０参照。逆二重ハイブリッドシステムでは、ゲノムに組込んだＵＲＡ３レポーターを、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部位を含む厳密に制御されたプロモーター下におく。相互作用する２種の蛋白質がＧＡＬ４  ＤＢＤ及びＧＡＬ４  ＡＤとの融合体として生産される場合には、ＧＡＬ４の活性を再構成し、ＵＲＡ３の転写を活性化する。５−ＦＯＡの存在下で、ＵＲＡ３遺伝子産物は５−ＦＯＡを毒性物質に変換し、細胞を死滅させる。Ｊ．Ｄ．Ｂｏｅｋｅら，前出参照。蛋白質−蛋白質相互作用を妨害する蛋白質と蛋白質−蛋白質相互作用を妨害する突然変異を選択するためにこの選択が使用されている。蛋白質−蛋白質相互作用の小分子阻害剤をスクリーニングするための変異体も記載されている。例えば、Ｊ．Ｈｕａｎｇ，  ＆  Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，（１９９７）Ａ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎａｎｏｄｒｏｐｌｅｔｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１３３９６−１３４参照。
【０２９１】
全長ＧＡＬ４でアンバーコドンを適切に選択すると、酵母細胞でヒスチジン又はウラシル栄養要求性を相補するためにＨＩＳ３又はＵＲＡ３  ＧＡＬ４で活性化されたレポーターを使用して活性ＥｃＴｙｒＲＳ変異体の効率的なポジフィブ選択が可能になる。更に、５−ＦＯＡの存在下で不活性ＥｃＴｙｒＲＳ変異体のネガティブ選択にＵＲＡ３レポーターを使用することができる。更に、ｌａｃＺを使用する比色アッセイを使用して酵母細胞におけるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ活性を読み取ることができる。
結果と考察
【０２９２】
構成的ＡＤＨ１プロモーターの制御下にＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子を発現させ、同一の高コピー酵母プラスミド（ｐＥｃＴｙｒＲＳｔＲＮＡＣＵＡ，図１Ｃ）からｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子を発現させた。ｐＥｃＴｙｒＲＳｔＲＮＡＣＵＡとキメラＧＡＬ構築物のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインの間に単一アンバー突然変異を含む低コピーレポーターをＭａＶ２０３に同時形質転換すると、細胞は１０−２０ｍＭ  ３−ＡＴを添加したヒスチジン非含有培地で増殖した（図２）。ＭａＶ２０３細胞を同一ＧＡＬ４構築物と不活性シンテターゼ突然変異体（Ａ５）又はＥｃｔＲＮＡ遺伝子を欠失する構築物のいずれかで形質転換すると、１０ｍＭ  ３−ＡＴで増殖は観察されなかった（図２）。これらの実験から明らかなように、ＡＤＨ１プロモーターからＥｃＴｙｒＲＳを機能的形態で構成的に発現させることができ、ＭａＶ２０３における内在アンバー抑圧は最小であり、このシステムではＥｃｔＲＮＡＣＵＡは酵母シンテターゼにより殆ど負荷されない。例えば、Ｈ．Ｅｄｗａｒｄｓら，（１９９１），Ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｉｓ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１１５３−１１５６；及びＨ．Ｅｄｗａｒｄｓ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，（１９９０），Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｍｂｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｉｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１６３３−１６４１参照。ＥｃＴｙｒＲＳはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡに負荷しない（例えば、Ｙ．Ｋｗｏｋ，＆  Ｊ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，（１９８０），Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ａｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：２１３−２１８；Ｂ．Ｐ．Ｄｏｃｔｏｒら，（１９６６），Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔＲＮＡｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３１：５４３−５４８；及びＫ．Ｗａｋａｓｕｇｉら，（１９９８），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：２９７−３０５）ので、これらの実験はＥｃＴｙｒＲＳ／ＥｃｔＲＮＡＣＵＡがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて直交対であることを裏付けるもの���ある。
【０２９３】
第１世代ＧＡＬ４キメラは弱いＨＩＳ３レポーターの転写を活性化することができたが、３−ＡＴ＞２０ｍＭの濃度又は−ＵＲＡプレートで有意増殖を可能にするために十分にＭａＶ２０３でＵＲＡ３レポーターの転写を活性化することはできなかった（図２）。ＥｃＴｙｒＲＳ変異体の選択の目的で、第２世代ＧＡＬ４構築物を作製した。このＧＡＬ４レポーターは活性が強く、ダイナミックレンジが広く、復帰突然変異体の蓄積を避けるように設計した。ＧＡＬ４レポーターの活性を増加するために、（ＤＢＤ−ＡＤ融合体の２倍の転写活性化活性をもつ）全長ＧＡＬ４（例えばＪ．Ｍａ，＆  Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８７），Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｃｅｌｌ  ４８：８４７−８５３参照）を強力なＡＤＨ１プロモーターの制御下に使用し、高コピー２−μｍプラスミド（元のＧＡＬ４キメラのセントロメアプラスミドの１０−３０倍のコピー数）を使用した。プラスミドのコピー数とコードされる蛋白質の活性の両者の増加は、レポーターのダイナミックレンジを拡大すると思われる。アミノ酸残基２及び１４７をコードするＧＡＬ４遺伝子の領域にアンバー突然変異を標的化した（図３）。この領域は配列特異的ＤＮＡ結合に十分であり（例えばＭ．Ｃａｒｅｙら，（１９８９），Ａｎ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｂｉｎｄｓ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  ｄｉｍｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９：４２３−４３２参照）、ＧＡＬ４遺伝子の最初の潜在的活性化ドメインの５’側に位置する（例えばＪ．Ｍａ，＆  Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ，（１９８７）Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＧＡＬ４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｃｅｌｌ  ４８：８４７−８５３参照）ので、アンバー抑圧の不在下に生産される切断産物は転写を活性化しないと予想される。突然変異させるアミノ酸コドンの選択はＧＡＬ４での従来の飽和突然変異誘発選択（例えばＭ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，＆  Ｊ．Ｄｏｖｅｒ，（１９８８），Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＬ４−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：６３−７４参照）と、ＧＡＬ４のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインのＸ線構造（例えばＲ．Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎら，（１９９２），ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＧＡＬ４：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４０８−４１４；及びＪ．Ｄ．Ｂａｌｅｊａら，（１９９２），Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃｄ２−ＧＡＬ４  ｆｒｏｍ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．［ｃｏｍｍｅｎｔ］，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４５０−４５３参照）及びその二量化領域のＮＭＲ構造に従った。例えば、Ｐ．Ｈｉｄａｌｇｏら，（２００１），Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＧＡＬ１１Ｐ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＬ４  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：１００７−１０２０参照。  
【０２９４】
全長ＧＡＬ４を小さいｐＵＣ系ベクターにクローニングし、（アミノ酸Ｌ３，Ｉ１３，Ｔ４４，Ｆ６８，Ｒ１１０，Ｖ１１４，Ｔ１２１，Ｉ１２７，Ｓ１３１，Ｔ１４５のコドンで）１０種の単独アンバー突然変異体を部位特異的突然変異誘発法により迅速に構築した。ＧＡＬ４と得られたアンバー突然変異体を次に全長ＡＤＨ１プロモーターの制御下に２−μｍ酵母ベクターにサブクローニングしてｐＧＡＤＧＡＬ４と一連のアンバー突然変異体ｐＧＡＤＧＡＬ４（ｘｘＴＡＧ）（図１Ｃ）（但し、ｘｘはアンバーコドンに突然変異されたＧＡＬ４遺伝子内のアミノ酸コドンを表す）を作製した。各ＧＡＬ４突然変異体をＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ又はＡ５／ｔＲＮＡＣＵＡと共にＭａＶ２０３細胞に同時形質転換し、形質転換細胞をロイシン及びトリプトファン栄養要求性に変換した。ｐＧＡＤＧＡＬ４自体は非常に低い効率で変換し（ＧＡＬ４アンバー突然変異体の＜１０−３倍）、このような高コピー数ではＭａＶ２０３細胞に有害であると予想されるが、このような作用はＧＡＬ４のアンバー突然変異体では全く認められなかった。
【０２９５】
活性又は不活性シンテターゼの存在下のＧＡＬ４レポーターの表現型を−ＵＲＡプレートと０．１％  ５−ＦＯＡプレートでアッセイした（図３Ａ）。野生型又は不活性ＥｃＴｙｒＲＳの存在下では、５個のＧＡＬ４突然変異体（Ｌ３ＴＡＧ，Ｉ１３ＴＡＧ，Ｔ４４ＴＡＧ，Ｆ６８ＴＡＧ，Ｓ１３１ＴＡＧ）が−ＵＲＡプレートで増殖したが、０．１％  ５−ＦＯＡでは増殖できなかった。これらのアンバー突然変異体では、内在抑圧がＭａＶ２０３でＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡに媒介される抑圧をＵＲＡ３レポーターのダイナミックレンジより高くするために十分であると思われる。５個のＧＡＬ４単独アンバー突然変異体（Ｒ１１０ＴＡＧ，Ｖ１１４ＴＡＧ，Ｔ１２１ＴＡＧ，Ｉ１２７ＴＡＧ，Ｔ１４５ＴＡＧ）がウラシルの不在下でＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡの存在下に増殖し（Ａ５／ｔＲＮＡＣＵＡの存在下では増殖しない）、５−ＦＯＡでは逆の表現型を示した。これらの突然変異体はＭａＶ２０３でＵＲＡ３レポーターのダイナミックレンジに該当するＥｃＴｙｒＲＳ依存性表現型を示した。−ＵＲＡ及び０．１％５−ＦＯＡの両者で最も純粋なＥｃＴｙｒＲＳ依存性表現型はＧＡＬ４のＲ１１０ＴＡＧ突然変異体で観察された。しかし、この突然変異体はＡ５と同時形質転換させると、Ｘ−ＧＡＬアッセイで多少青色を示した。ダイナミックレンジを更に改善するために、Ｒ１１０ＴＡＧを含むＧＡＬ４の６種の二重アンバー突然変異体を作製した（図３Ｂ），（Ｌ３ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ；Ｉ１３ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ；Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ；Ｒ１１０ＴＡＧ，Ｔ１２１ＴＡＧ；Ｒ１１０ＴＡＧ，Ｉ１２７ＴＡＧ；Ｒ１１０ＴＡＧ，Ｔ１４５ＴＡＧ）。これらの二重突然変異体のうちの４種（Ｉ１３ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ；Ｒ１１０ＴＡＧ，Ｔ１２１ＴＡＧ；Ｒ１１０ＴＡＧ，Ｉ１２７ＴＡＧ及びＴ１４５ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）はウラシルの不在下では増殖できず、０．１％  ５−ＦＯＡで増殖した。これらの二重突然変異体の活性はプレートアッセイのダイナミックレンジ外（未満）であった。二重突然変異体の２種（Ｌ３ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ及びＴ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）は−ＵＲＡプレートで野生型ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡの存在下に増殖したが、Ａ５／ｔＲＮＡＣＵＡの存在下では増殖せず、これらの突然変異体も５−ＦＯＡで予想された逆表現型を示した。これらの２種のＧＡＬ４突然変異体のうちで活性が高いほうのｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）を選択し、更に詳細に特性決定した（図４）。ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）／ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡを含むＭａＶ２０３はＸ−ＧＡＬで青色であったが、ｐＡ５／ｔＲＮＡＣＵＡを含む対応株はそうではなかった。同様に、ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）／ｐＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡを含むＭａＶ２０３は７５ｍＭまでの３−ＡＴ濃度のプレートと−ＵＲＡプレートで確実に増殖したが、ｐＡ５／ｔＲＮＡＣＵＡを含む対応株は１０ｍＭ  ３ＡＴプレート又はウラシルの不在下では増殖できなかった。以上をまとめると、ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）のＥｃＴｙｒＲＳ依存性表現型はＭａ���２０３でＵＲＡ３，ＨＩＳ３及びｌａｃＺレポーターのダイナミックレンジを拡大することができる。
【０２９６】
ＧＡＬ４の活性を変化させずに各種アミノ酸を置換できるならば非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことができる突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの選択に有用であると思われるので、Ｔ４４又はＲ１１０をチロシン以外のアミノ酸で置換したＧＡＬ４突然変異体の活性を調べることが注目された。例えば、Ｍ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋら，（２０００），Ａ  ｎｅｗ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ８３：２２７７参照。ｐＧＡＤＧＡＬ４はそれ自体毒性であるので、ＧＡＬ４における残基Ｔ４４の５種の突然変異体（Ｔ４４Ｙ，Ｔ４４Ｗ，Ｔ４４Ｆ，Ｔ４４Ｄ，Ｔ４４Ｋ）をｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｒ１１０ＴＡＧ）で構築した。ＧＡＬ４のＲ１１０位の同様の突然変異体（Ｒ１１０Ｙ，Ｒ１１０Ｗ，Ｒ１１０Ｆ，Ｒ１１０Ｄ，Ｒ１１０Ｋ）もｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ）で構築した。これらの突然変異体は本発明者らが蛋白質組込みに着目した大きな疎水性アミノ酸側鎖が目立つが、許容性のストリンジェント試験として正負荷電残基も含む。各突然変異体をｐＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡと共にＭａＶ２０３細胞に同時形質転換し、ｌｅｕ＋ｔｒｐ＋単離株のｌａｃＺ生産をオルトニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）加水分解によりアッセイした（図５）。Ｔ４４又はＲ１１０を異なるアミノ酸で置換したＧＡＬ４を含む細胞間の活性変動はいずれの場合も３倍未満であった。この最小限の変動はＧＡＬ４の転写活性を変化させずにこれらの部位のアミノ酸置換を許容できることを実証するものである。選択プレートでアッセイした単独アンバー突然変異体の活性から予想される通り、ＧＡＬ４（Ｒ１１０ＴＡＧ）バックグラウンドで作製したＴ４４の突然変異体はＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ）バックグラウンドで作製したＲ１１０の突然変異体よりもＯＮＰＧの加水分解が低下する。
【０２９７】
システムが大過剰の不活性シンテターゼから活性シンテターゼを選択する能力を試験するためにモデル集積試験を実施した（表１，表２，図６）。この選択は非天然アミノ酸の存在下で変異体ライブラリーから活性シンテターゼを選択する能力をモデル化する。ＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０）とＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡを含むＭａＶ２０３細胞を１０〜１０６倍過剰のＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）及びＡ５／ｔＲＮＡＣＵＡと混合し、非選択的−ｌｅｕ，−ｔｒｐ培地にプレーティングしてＸ−ＧＡＬ重層法によりアッセイした場合に青変したコロニーの割合とＯＤ６６０の両者により判定した。５０ｍＭ  ３−ＡＴ上又はウラシルの不在下で生存することが可能な細胞を選択した。３−ＡＴ又は−ＵＲＡで生存する細胞のうち、Ｘ−ＧＡＬアッセイで青色の細胞と白色の細胞の比を選択の不在下の同一比と比較すると、ポジティブ選択は不活性シンテターゼから活性シンテターゼを＞１０５倍に集積できることが明白である（表１）。表現型を不確実にする細胞間の有意クロストークを生じずに１０６個以上の細胞を適切にプレーティングすることはできないので、１：１０５を上回る出発比の正確な集積の測定は一般に不可能であった。
【表３】
0005642916.tif 000010
【表４】
0005642916.tif 000011
【０２９８】
非天然アミノ酸の存在下でポジティブ選択後に、選択された細胞は天然アミノ酸を使用することが可能なシンテターゼと付加した非天然アミノ酸を使用することが可能なシンテターゼを含む。非天然アミノ酸のみを使用することが可能なシンテターゼを単離するためには、選択したクローンから天然アミノ酸を使用するシンテターゼをコードする細胞を除去しなければならない。これは、非天然アミノ酸を保持すると共に天然アミノ酸と共働するシンテターゼを除去するネガティブ選択により実施することができる。モデルポジティブ選択と同様にモデルネガティブ選択を実施した。ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡを１０〜１０５倍過剰のＡ５／ｔＲＮＡＣＵＡと混合し、０．１％  ５−ＦＯＡで選択を行った。０．１％  ５−ＦＯＡで生存する細胞のうち、Ｘ−ＧＡＬアッセイで白色の細胞と青色の細胞の比を非選択条件下の同一比と比較する（表２参照）と、ネガティブ選択は活性シンテターゼから不活性シンテターゼを少なくとも０．６×１０４倍に集積できることが明白である。表現型を不確実にする細胞間の有意クロストークを生じずに１０５個以上の細胞を適切にプレーティングすることはできないので、１：１０４を上回る出発比の正確な集積の測定は一般に不可能であった。
【０２９９】
非天然アミノ酸を認識するａａＲＳのポジティブ選択と天然アミノ酸を認識するａａＲＳのネガティブ選択の両者を可能にする一般アプローチを開発した。選択のストリンジェンシーを変えることにより、種々のシンテターゼを単離することができる。ＥｃＴｙｒＲＳの変異体を使用するモデル選択にこの方法を適用した処、ポジティブ選択１ラウンドで＞１０５、ネガティブ選択１ラウンドで＞０．６×１０４の集積を示した。これらの知見は、多様な側鎖をもつ非天然アミノ酸をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの蛋白質に部位特異的に組込むように機能する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをこの方法により迅速に入手できることを示唆している。更に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで進化させた酵素を高等真核生物で使用することができる。
材料と方法
ベクター構築
【０３００】
ｐＥＳＣＳＵ３ＵＲＡに由来するプライマーｔＲＮＡ５’：ＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡ（配列番号８９）、及びｔＲＮＡ３’：ＧＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＴ（配列番号９０）を使用してｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。この反応及び他の全ＰＣＲ反応はＲｏｃｈｅ製品Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲキットを製造業者の指示に従って使用して実施した。ＮｈｅＩとＡｇｅＩで制限エンドヌクレアーゼ消化後に、このｔＲＮＡ遺伝子を２μｍベクターｐＥＳＣＴｒｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の同一部位間に挿入し、ｐｔＲＮＡＣＵＡを得た。プライマーＡＤＨｆ：ＩＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＴＩＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＧ（配列番号９１）及びｐＡＤＨＲ：ＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＡ  ＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号９２）を使用してｐＤＢＬｅｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から全長ＡＤＨ１プロモーターをＰＣＲにより増幅し、ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで消化した。プライマーｐＥＳＣＴｒｐ１：ＴＣＡＴＡＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＡＡＣＴＴＧ（配列番号９３）及びｐＥＳＣＴｒｐ２：ＴＴＡＣＴＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＡＡＣＴＴＧＴＴＡＣＴＡＣＧＴＧＣＧ  ＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＡＧＡＣ（配列番号９４）を使用してＥｃＴｙｒＲＳを増幅した。ＥｃＴｙｒＲＳ  ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した。ｐｔＲＮＡＣＵＡを次にＡｇｅＩとＮｏｔＩで消化した。これらの３種のＤＮＡの三重ライゲーションにより、ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡを得た。オリゴヌクレオチドＦ３７Ａｆｗｄ：ＣＣＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＧＧＣＴＴＣＧＡＴＣ（配列番号９５）、Ｎ１２６Ａｆｗｄ：ＡＴＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＴＴＣ（配列番号９６）、１８２，１８３，１８６Ａ，ＧＴＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＣ（配列番号９７）及びその逆相補配列と、フランキングオリゴヌクレオチド４７８３：ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＡＴＡＧ（配列番号９８）、３２５６：ＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＧ（配列番号９９）と鋳型としてｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡを使用して活性部位のアミノ酸残基３７，１２６，１８２，１８３及び１８６をアラニンに突然変異させたプラスミドｐＡ５−ｔＲＮＡＣＵＡをオーバーラップＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、同一酵素で消化して単離したｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡの大きいフラグメントに��イゲートした。第１世代ＤＢ−ＡＤレポーターを構築するために、フォワードプライマーｐＡＤｆｗｄ：ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣ（配列番号１００）又はｐＡＤｆｗｄ（ＴＡＧ）ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＧＧＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧ  ＧＡＡＴＡＴＴＧＣ（配列番号１０１）とＡＤｒｅｖ：ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＧ  ＧＧＴＡＴＣ（配列番号１０２）を使用してｐＧＡＤＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをＰＣＲ増幅した。Ｃｌｏｎａｓｅ法を製造業者の指示に従って使用してこれらのＰＣＲ産物をベクターｐＤＥＳＴ３−２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＤＢ−ＡＤとｐＤＢ−（ＴＡＧ）−ＡＤを得た。ＰＧＡＤＧＡＬ４と変異体を構築するために、プライマーＡＤＨ１４２８−１４２９  ＡＡＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＴＣ（配列番号１０３）、及びＧＡＬ４Ｃ：ＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＴＴＣ（配列番号１０４）を使用してＧＡＬ４遺伝子をｐＣＬ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲにより増幅した。このフラグメントをベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造業者の指示に従ってクローニングした。ＧＡＬ４遺伝子を含むクローン（ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯＧＡＬ４）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２．７ｋｂ  ＧＡＬ４フラグメントをゲル精製し、予めＨｉｎｄＩＩＩで消化して仔ウシ腸ホスファターゼで処理してゲル精製しておいたｐＧＡＤＴ７の大きいフラグメントにライゲートした。添付情報に記載されているプライマーを使用してＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ反応（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示に従ってｐＣＲ２．１で実施することによりＧＡＬ４遺伝子の変異体を作製した。ＧＡＬ４突然変異体を野生型ＧＡＬ４遺伝子と同様にｐＧＡＤＴ７にクローニングした。全最終構築物をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
酵母培地及び操作
【０３０１】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭａＶ２０３，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はＭＡＴα；ｌｅｕ２−３，１１２；ｔｒｐ１１０９；ｈｉｓ３  Δ２００；ａｄｅ２−１０１；ｃｙｈ２Ｒ；ｃｙｈ１Ｒ；ＧＡＬ４Δ；ｇａｌ８０Δ；ＧＡＬ１：：ｌａｃＺ；ＨＩＳ３ＵＡＳＧＡＬ１：：ＨＩＳ３＠ＬＹＳ２；ＳＰＡＬ１０ＵＡＳＧＡＬ１：：ＵＲＡ３である。酵母培地はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、５−ＦＯＡとＸ−ＧＡＬはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、３−ＡＴはＢＩＯ  １０１から購入した。ＹＰＥＲ（Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）とＯＮＰＧはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。プラスミド形質転換はＰＥＧ／リチウム酢酸法（例えばＤ．Ｂｕｒｋｅら，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）により実施し、形質転換細胞は適当な合成完全ドロップアウト培地で選択した。ＭａＶ２０３で各種プラスミド組み合わせにより付与される表現型を試験するために、各形質転換の合成完全ドロップアウトプレートからの酵母コロニーを滅菌水１５μＬに再懸濁し、該当選択培地でストリークした。各表現型を少なくとも５個の独立コロニーで確認した。Ｘ−ＧＡＬアッセイはアガロース重層法により実施した。Ｉ．Ｇ．Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，＆  Ｅ．Ａ．Ｇｏｌｅｍｉｓ，（２０００），Ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｌａｃＺ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙｓ  ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５：１−１５参照。要約すると、ニートクロロホルムを数回加えることによりコロニー又は細胞パッチを寒天プレート上で溶解させた。クロロホルムの蒸発後、０．１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４で緩衝した０．２５ｇ／Ｌ  ＸＧＡＬ含有１％アガロースをプレート表面に添加した。アガロースが固まったら、プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。９６ウェルブロックのＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ１ｍＬにコロニー１個を接種することによりＯＮＰＧアッセイを実施し、３０℃で振盪下にインキュベートした。細胞１００μＬのＯＤ６６０と数回の細胞希釈倍率を９６ウェルマイクロタイタープレートで平行して記録した。細胞（１００μＬ）をＹＰＥＲ：ＯＮＰＧ（１Ｘ  ＰＢＳ，５０％  ｖ／ｖ  ＹＰＥＲ，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２５％  ｖ／ｖ  β−メルカプトエタノール，及び３ｍＭ  ＯＮＰＧ）１００μＬと混合し、３７℃で振盪下にインキュベートした。発色後、細胞を遠心によりペレット化し、上清を清浄な９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ，ｃａｔ．＃１６７００８）に移し、Ａ４２０を記録した。記載する全データは少なくとも４個の独立クローンからの試験の平均であり、記載する誤差線は標準偏差を表す。ＯＮＰＧ加水分解は式：β−ガラクトシダーゼ単位＝１０００．Ａ４２０／（Ｖ．ｔ．ＯＤ６６０）（式中、Ｖはｍｌで表した細胞容量であり、ｔは分で表したインキュベーシ���ン時間である）を使用して計算した。例えば、Ｉ．Ｇ．Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，＆  Ｅ．Ａ．Ｇｏｌｅｍｉｓ，（２０００），Ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｌａｃＺ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙｓ  ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５：１−１５参照。β−ガラクトシダーゼ１単位は１μｍｏｌ  ＯＮＰＧ／分／細胞の加水分解に対応する。Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ  ａｎｄ  Ｇｏｌｅｍｉｓ，前出参照。分光光度読み取りはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ１９０プレートリーダーを使用して実施した。
モデル選択
【０３０２】
ポジティブ選択：２種の一晩培養液をＳＤ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐで増殖させた。一方はｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を接種したＭａＶ２０３を含み、他方はｐＡ５−ｔＲＮＡＳＵ３／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を接種した。これらの細胞を遠心により回収し、ボルテックスにより０．９％  ＮａＣｌに再懸濁した。次に２種の細胞溶液を等しくＯＤ６６０まで希釈した。ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を含むＭａＶ２０３を１０７倍以上に連続希釈した後、ｐＡ５−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を含む未希釈ＭａＶ２０３と各希釈液を１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌで混合し、活性チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼと不活性チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む規定比の細胞を得た。各比について２回目の連続希釈を実施し、ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を含む細胞とｐＡ５−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を含む細胞の比を維持しながら細胞数を減らした。これらの希釈液をＳＤ−Ｌｅｕ，−ｔｒｐ，ＳＤ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ，−ＵＲＡとＳＤ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ，−Ｈｉｓ＋５０ｍＭ  ３−ＡＴにプレーティングした。６０時間後にＥａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＣＣＤカメラ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して各プレートのコロニー数をカウントし、生存細胞の表現型をＸ−ＧＡＬ  β−ガラクトシダーゼアッセイで確認した。数個の独立した青色又は白色コロニーからの細胞を単離し、ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐで飽和まで増殖させ、プラスミドＤＮＡを標準法により単離した。ＥｃＴｙｒＲＳ変異体をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０３０３】
ネガティブ選択：ｐＡ５−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を含むＭａＶ２０３を連続希釈し、ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ／ｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４，Ｒ１１０ＴＡＧ）を含む一定密度のＭａＶ２０３と混合した以外はポジティブ選択と同様にモデルネガティブ選択を実施した。細胞をＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ＋０．１％  ５−ＦＯＡにプレーティングし、４８時間後にコロニー数をカウントし、プレートを上記のように処理した。
【０３０４】
以下のオリゴヌクレオチド（表３）をその逆相補配列と併用し、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発法により部位特異的突然変異体を構築した。突然変異の位置を太字で示す。
【表５】
0005642916.tif 000012
【実施例２】
【０３０５】
拡張真核遺伝コード
非天然アミノ酸をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝コードに付加するための一般的で迅速な方法について記載する。５種のアミノ酸がナンセンスコドンＴＡＧに応答して高い忠実度で効率的に蛋白質に組込まれている。これらのアミノ酸の側鎖は広範な化学的プローブ及び試薬でユニークにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ修飾することができるケト基と；構造試験用重原子含有アミノ酸と；蛋白質相互作用の細胞内試験用光架橋剤を含む。この方法は酵母で蛋白質構造及び機能を操作する能力に及ぼす遺伝コードの制約を取り除くだけでなく、多細胞真核生物の遺伝コードの体系的拡張の糸口となる。
【０３０６】
化学者らは小分子構造を合成及び操作するための強力な各種方法及びストラテジーを開発している（例えばＥ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ，＆  Ｘ．−Ｍ．Ｃｈｅｎｇ，Ｔｈｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）参照）が、蛋白質構造及び機能を合理的に制御する能力は未だ揺籃期にある。多くの場合には、標準アミノ酸の近似構造類似体をプロテオーム全体に競合的に組込むことは可能であったが、突然変異誘発法は２０種の標準アミノ酸構成単位に限られている。例えばＫ．Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３：２３５−７；及びＶ．Ｄｏｒｉｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：５０１−４参照。完全合成（例えばＢ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−７（１９８６）参照）、及び半合成法（例えばＤ．Ｙ．Ｊａｃｋｓｏｎら，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２４３−７；及びＰ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ，＆  Ｓ．Ｂ．Ｋｅｎｔ，（２０００），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：９２３−６０参照）によりペプチドと小蛋白質を合成することが可能になったが、これらの方法は１０キロダルトン（ｋＤａ）を上回る蛋白質での利用に限られている。化学的にアシル化された直交ｔＲＮＡを利用する生合成法（例えばＤ．Ｍｅｎｄｅｌら，（１９９５），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４３５−４６２；及びＶ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈら（Ｍａｒ．３１，１９９５），Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３４：６２１−６３３参照）により、非天然アミノ酸をより大きな蛋白質にｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えばＪ．Ａ．Ｅｌｌｍａｎら，（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９７−２００参照）及びマイクロインジェクション細胞（例えばＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：６４５−５２参照）の両者で組込むことが可能になった。しかし、化学的アシル化は化学量論的であるため、作製できる蛋白質の量が著しく制限される。このように、多大な労力にも拘わらず、蛋白質と、恐らく完全な生物の性質は２０種の遺伝的にコードされるアミノ酸（稀なケースではピロリジンとセレノシステインも含む（例えばＡ．Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５１５−２０；及びＧ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４５９−６２）参照）により全進化を制限されている。
【０３０７】
この制約を解決するために、原核生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の蛋白質生合成機構に新規成分を付加し（例えばＬ．Ｗａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）、非天然アミノ酸を遺伝的にｉｎ  ｖｉｖｏコードすることが可能になった。新規化学的、物理的又は生物学的性質をもつ多数の新規アミノ酸がアンバーコドンＴＡＧに応答して効率的且つ選択的に蛋白質に組込まれている。例えばＪ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４：及びＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１：１−１０参照。しかし、原核生物と真核生物の翻訳機構は十分に保存されていないので、真核細胞で細胞内プロセスを試験又は操作するために、大腸菌に付加された生合成機構の成分を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むことは一般にはできない。
【０３０８】
そこで、真核細胞で遺伝的にコードされるアミノ酸の数を拡大する翻訳成分を作製した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは有用なモデル真核生物であり、遺伝操作が容易であり（例えばＤ．Ｂｕｒｋｅら，（２０００），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）参照）、その翻訳機構が高等真核生物と高度に相同である（例えばＴ．Ｒ．Ｈｕｇｈｅｓ，（２００２），Ｆｕｎｃｔ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２：１９９−２１１参照）ので、初期真核宿主生物として選択した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝コードに新規構成単位を付加するには、酵母翻訳機構の成分と交差反応しないユニークコドン、ｔＲＮＡ、及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（「ａａＲＳ」）が必要である（例えばＮｏｒｅｎら，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２；Ｆｕｒｔｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：４１９；及びＬｉｕら，（１９９９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：４７８０参照）。１つの候補直交対は大腸菌に由来するアンバーサプレッサーチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡＣＵＡ対である（例えばＨ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎら，（１９６８），Ｎａｔｕｒｅ  ２１７：１０１９−２４；及びＤ．Ｇ．Ｂａｒｋｅｒら，（１９８２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５０：４１９−２３参照）。大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）は両者がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで遺伝的にコードされる場合には大腸菌ｔＲＮＡＣＵＡを効率的にアミノアシル化するが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞質ｔＲＮＡをアミノアシル化しない。例えばＨ．Ｅｄｗａｒｄｓ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，（１９９０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１６３３−４１；及びＨ．Ｅｄｗａｒｄｓら，（１９９１），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８８：１１５３−６参照。更に、大腸菌チロシルｔＲＮＡＣＵＡはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの不良基質である（例えばＶ．Ｔｒｅｚｅｇｕｅｔら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２７４４−５１参照）が、プロセシングされ、核から細胞質に輸送され（例えばＳ．Ｌ．Ｗｏｌｉｎ，＆  Ａ．Ｇ．Ｍａｔｅｒａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３：１−１０参照）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで蛋白質翻訳に効率的に機能する。例えばＨ．Ｅｄｗａｒｄｓ，＆  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１６３３−４１；Ｈ．Ｅｄｗａｒｄｓら，（１９９１），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８８：１１５３−６；及びＶ．Ｔｒｅｚｅｇｕｅｔら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２７４４−５１参照。更に、大腸菌ＴｙｒＲＳは編集メカニズムをもたないので、ｔＲＮＡにライゲートした非天然アミノ酸をプルーフリードできないと思われる。
【０３０９】
ｔＲＮＡＣＵＡを所望非天然アミノ酸でアミノアシル化し、内在アミノ酸でアミノアシル化しないように直交ＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変するために、ＴｙｒＲＳ突然変異体の大きなライブラリーを作製し、遺伝的選択を実施した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同ＴｙｒＲＳの結晶構造（例えばＰ．Ｂｒｉｃｋら，（１９８９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０８：８３参照）に基づいて、結合チロシンのアリール環のパラ位から６．５Å以内にある大腸菌ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の残基（（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，図７Ａ））を突然変異させた。例えば、突然変異体のＥｃＴｙｒＲＳライブラリーを作製するために、突然変異の標的とした５個の位置をまずアラニンコドンに変換し、Ａ５ＲＳ遺伝子を作製した。これを遺伝子のユニークＰｓｔＩ部位で２つのプラスミドに分割した。ライブラリーはほぼ当分野で公知の技術により記載されているように実施した（例えばＳｔｅｍｍｅｒら，（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２５６−２６５参照）。一方のプラスミドはＡ５ＲＳ遺伝子の５’側半分を含み、他方のプラスミドはＡ５ＲＳ遺伝子の３’側半分を含む。完全プラスミドの増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを使用して各フラグメントでＰＣＲにより突然変異誘発法を実施した。プライマーにはＮＮＫ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ＋Ｃ及びＫ＝Ｇ＋Ｔ）とＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を加える。ＢｓａＩ消化とライゲーションにより、各々ＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子の片側半分の突然変異体コピーを含む２個の環状プラスミドを得た。次に２個のプラスミドをＰｓｔＩで消化し、ライゲーションにより単一プラスミドに組み立て、全長突然変異体遺伝子を構築した。突然変異体ＥｃＴｙｒＲＳ遺伝子をこのプラスミドから切り出し、ｐＡ５ＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡのＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位の間にライゲーションした。ＰＥＧ−酢酸リチウム法を使用してライブラリーをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍａｖ２０３：ｐＧＡＤＧＡＬ４（２ＴＡＧ）に形質転換し、〜１０８個の独立した形質転換細胞を得た。  
【０３１０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの選択株［ＭａＶ２０３：ｐＧＡＤＧＡＬ４（２ＴＡＧ）（例えばＭ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３：１０３２１−６；Ｍ．Ｖｉｄａｌら，（１９９６），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３：１０３１５−２０１及びＣｈｉｎら，（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：５１１参照）］を前記ライブラリーで形質転換し、１０８個の独立した形質転換細胞を得、１ｍＭ非天然アミノ酸の存在下に増殖させた（図８Ｃ）。転写アクチベーターＧＡＬ４内の２個の許容アンバーコドンを抑圧すると、全長ＧＡＬ４の生産と、ＧＡＬ４応答性ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、及びｌａｃＺレポーター遺伝子の転写活性化が生じる（図８Ａ）。例えば、許容コドンはＧａｌ４のＴ４４とＲ１１０に配置する。ウラシルを含まない（−ｕｒａ）か又は２０ｍＭ  ３−アミノトリアゾールを含み（例えばＧ．Ｍ．Ｋｉｓｈｏｒｅ，＆  Ｄ．Ｍ．Ｓｈａｈ，（１９８８），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５７，６２７−６３参照）（３−ＡＴ，Ｈｉｓ３蛋白質の競合的阻害剤）、ヒスチジンを含まない（−ｈｉｓ）培地でＨＩＳ３とＵＲＡ３を発現させると、活性ａａＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ対を発現するクローンをポジティブ選択することができる。突然変異体ＴｙｒＲＳがｔＲＮＡＣＵＡにアミノ酸を負荷するならば、細胞はヒスチジンとウラシルを生合成し、生存する。生存細胞を３−ＡＴと非天然アミノ酸の不在下に増幅させ、非天然アミノ酸を選択的に組込む細胞から全長ＧＡＬ４を除去した。アンバーコドンに応答して内在アミノ酸を組込むクローンを除去するために、０．１％  ５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含み、非天然アミノ酸を含まない培地で細胞を増殖させた。天然アミノ酸によるＧＡＬ４突然変異の抑圧の結果として、ＵＲＡ３を発現する細胞は５−ＦＯＡを毒性物質に変換し、細胞を死滅させる。例えばＪ．Ｄ．Ｂｏｅｋｅら，（１９８４），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９７：３４５−６参照。生存クローンを非天然アミノ酸の存在下に増幅させ、再びポジティブ選択する。ｌａｃＺレポーターは活性シンテターゼ−ｔＲＮＡ対と不活性シンテターゼ−ｔＲＮＡ対を比色分析により区別することができる（図８Ｂ）。
【０３１１】
このアプローチを使用することにより、異なる立体的及び電子的性質をもつ５種の新規アミノ酸（図７Ｂ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝コードに個々に付加した。これらのアミノ酸はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（１）、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（２）、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（３）、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（４）、及びｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（５）（括弧内は図７Ｂの番号）である。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのケト官能基のユニークな反応性により、多数のヒドラジン又はヒドロキシルアミン含有試薬で蛋白質を選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ修飾することができる（例えばＶ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈら，（Ａｕｇ．２８，１９９６），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１８：８１５０−８１５１；及びＺｈａｎｇ，Ｓｍｉｔｈ，Ｗａｎｇ，Ｂｒｏｃｋ，Ｓｃｈｕｌｔｚ，近刊参照）。ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンの重原子は（多波長異常回折の使用により）ｘ線構造データのフェージングに有用であると思われる。ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンとｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンのベンゾフェノン及びフェニルアジド側鎖は蛋白質の効率的ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ光架橋を可能にする（例えばＣｈｉｎら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：９０２６；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１１：１１３５；及びＣｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  ９９：１１０２０参照）。Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンのメチル基は核磁気共鳴及び振動スペクトロスコピーの使用により局所構造及び力学のプローブとして同位体標識したメチル基で容易に置換することができる。３ラウンドの選択（ポジティブ−ネガティブ−ポジティブ）後に、−ｕｒａ又は２０ｍＭ  ３−ＡＴ−ｈｉｓ培地での生存が選択した非天然アミノ酸の付加に厳密に依存する数個のコロニーを単離した。図８Ｄ参照。同一クローンは１ｍＭ非天然アミノ酸の存在下のみにｘ−ｇａｌで青色であった。これらの実験は観察される表現型が進化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ−ｔＲＮＡＣＵＡ対とそのコグネイトアミノ酸の組み合わせの結果であることを立証するものである（表４参照）。
【０３１２】
例えば、突然変異体シンテターゼを選択するために、細胞（〜１０９）を液体ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ＋１ｍＭアミノ酸中で４時間増殖させた。次に細胞を遠心により回収し、０．９％  ＮａＣｌに再懸濁し、ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ，−ｈｉｓ＋２０ｍＭ  ３−ＡＴ，＋１ｍＭ非天然アミノ酸又はＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ，−ｕｒａ，＋１ｍＭ非天然アミノ酸にプレーティングした。３０℃で４８〜６０時間後に細胞をプレートから掻き取って液体ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐに加え、１５時間３０℃で増殖させた。細胞を遠心により回収し、０．９％  ＮａＣｌに再懸濁し、ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ＋０．１％  ５−ＦＯＡにプレーティングした。３０℃で４８時間後に細胞をプレートから掻き取って液体ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ＋１ｍＭ非天然アミノ酸に加え、１５時間増殖させた。細胞を遠心により回収し、０．９％  ＮａＣｌに再懸濁し、ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ，−ｈｉｓ＋２０ｍＭ  ３−ＡＴ，＋１ｍＭ非天然アミノ酸又はＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ，−ｕｒａ，＋１ｍＭ非天然アミノ酸にプレーティングした。選択細胞の表現型をスクリーニングするために、各選択からのコロニー（１９２）をＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ０．５ｍＬを加えた９６ウェルブロックのウェルに移し、３０℃で２４時間増殖させた。グリセロール（５０％  ｖ／ｖ；０．５ｍＬ）を各ウェルに加え、細胞レプリカを１ｍＭ非天然アミノ酸の存在下又は不在下で寒天（ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ；ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ，−ｈｉｓ，＋２０ｍＭ  ３−ＡＴ；ＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐ，−ｕｒａ）にプレーティングした。アガロース重層法を使用してＳＤ−ｌｅｕ，−ｔｒｐプレートでＸ−Ｇａｌアッセイを実施した。
【０３１３】
観察される表現型が直交突然変異体ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対による非天然アミノ酸の部位特異的組込みに起因することを更に立証するために、各々非天然アミノ酸を含むヒトスーパーオキシドジスムターゼ１（ｈＳＯＤ）の突然変異体（例えばＨ．Ｅ．Ｐａｒｇｅら，（１９９２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８９：６１０９−１３参照）を作製し、特性決定した。
【０３１４】
例えば、ＰＳ３５６（ＡＴＣＣ）を鋳型としてオーバーラップＰＣＲにより、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグをコードするＤＮＡの付加と、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のＴｒｐ３３のコドンからアンバーコドンへの突然変異を実施した。ｈＳＯＤ（Ｔｒｐ３３ＴＡＧ）ＨＩＳをｐＹＥＳ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）からのＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターの間にクローニングした。ｐＥＣＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡに由来するプラスミド上の突然変異体シンテターゼ及びｔＲＮＡ遺伝子をｐＹＥＳ２．１  ｈＳＯＤ（Ｔｒｐ  ３３  ＴＡＧ）ＨＩＳと共にＩｎｖＳｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に同時形質転換した。蛋白質発現のために、細胞をＳＤ−ｔｒｐ，−ｕｒａ＋ラフィノースで増殖させ、ガラクトース添加によりＯＤ６６０＝０．５で発現を誘導した。ＨＳＯＤ突然変異体をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により精製した。
【０３１５】
３３位にアンバーコドンを含む遺伝子からのヘキサヒスチジンタグ付きｈＳＯＤの生産はｐ−アセチルＰｈｅＲＳ−１−ｔＲＮＡＣＵＡと１ｍＭ  ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに厳密に依存していた（いずれかの成分の不在下でデンシトメトリーによると＜０．１％）（図９参照）。大腸菌ＴｙｒＲＳｔＲＮＡＣＵＡを含む細胞から精製した収率と同等の５０ｎｇ／ｍＬの収率で全長ｈＳＯＤを含むｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを（例えばＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより）精製した。比較のために、野生型ｈＳＯＤＨＩＳは同一条件下で２５０ｎｇ／ｍＬの収率で精製することができる。
【０３１６】
図９は非天然アミノ酸（図７Ｂに例示し、図９に図７Ｂの番号で示す）を遺伝的にコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｈＳＯＤ（３３ＴＡＧ）ＨＩＳの発現を示す。図９の上段は図７Ｂに示す非天然アミノ酸に対応する番号で示す非天然アミノ酸の存在下（＋）及び不在下（−）で酵母から精製したｈＳＯＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のクーマシー染色を示す。細胞は指定アミノ酸に選択した突然変異体シンテターゼ−ｔＲＮＡ対を含む。図９の中段はｈＳＯＤに対する抗体でプローブしたウェスタンブロットを示す。図９の下段はＣ末端Ｈｉｓ６タグに対する抗体でプローブしたウェスタンブロットを示す。
【０３１７】
突然変異体蛋白質のトリプシン消化産物で液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を実施することにより、組込まれたアミノ酸を同定した。例えば、質量分析では、コロイド状クーマシー染色により蛋白質バンドを可視化した。野生型と突然変異体のＳＯＤに対応するゲルバンドをポリアクリルアミドから切り出し、１．５ｍｍ立方にスライスし、還元及びアルキル化後、ほぼ従来記載されているようにトリプシン加水分解した。例えばＡ．Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら，（１９９６），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８，８５０−８５８参照。ＬＣＱイオントラップ質量分析計を使用してナノフロー逆相ＨＰＬＣ／μＥＳＩ／ＭＳにより非天然アミノ酸を含むトリプシンペプチドを分析した。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）にＮａｎｏｓｐｒａｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ）を装着して液体クロマトグラフィータンデム質量（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析を実施した。例えば図１０Ａ−Ｈ参照。
【０３１８】
非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むペプチドＶａｌ−Ｙ＊−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（配列番号８７）の１価及び２価イオンに対応する前駆イオンを分離し、イオントラップ質量分析計でフラグメント化した。フラグメントイオン質量は明白に割り当てることができ、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的取り込みが確認された（図１０Ａ参照）。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの代わりとなるチロシン又は他のアミノ酸を表すものは全く認められず、ペプチドスペクトルのシグナル対ノイズ比から最低９９．８％の組込み純度が得られた。ｐ−ベンゾイルＰｈｅＲＳ−１、ｐ−アジドＰｈｅＲＳ−１、Ｏ−メチルＴｙｒＲＳ−１、又はｐ−ヨードＰｈｅＲＳ−１を使用してｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチルＬ−チロシン、又はｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンをｈＳＯＤに組込んだ場合にも蛋白質発現に同様の忠実度と効率が観察された（図９及び図１０Ａ−Ｈ参照）。本実験では、サンプル製造でｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンをｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンに還元し、後者を質量スペクトルで観察する。還元はｉｎ  ｖｉｖｏではｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む精製ＳＯＤの化学的誘導体化により生じない。対照実験では、３３位にトリプトファン、チロシン、及びロイシンを含むヘキサヒスチジンタグ付きｈＳＯＤを作製し、質量分析した（図１０Ｆ、Ｇ及びＨ参照）。アミノ酸３３を含むイオンはこれらのサンプルの質量スペクトルで明白に出現した。
【０３１９】
５種の非天然アミノ酸をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝コードに別々に付加した結果、本発明の方法の汎用性が実証され、スピン標識、金属結合、又は光異性化可能なアミノ酸を含む他の非天然アミノ酸にも適用できると思われる。この方法は新規又は強化した性質をもつ蛋白質を作製できると共に、酵母における蛋白質機能の制御を容易にする。更に、哺乳動物細胞において大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｔＲＮＡＣＵＡと共に直交対を形成する。例えばＳａｋａｍｏｔｏら，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２参照。従って、非天然アミノ酸を高等真核生物の遺伝コードに付加するために、酵母で進化させたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用することができる。
【表６】
0005642916.tif 000013
【実施例３】
【０３２０】
真核生物の遺伝コードへの新規反応性をもつアミノ酸の付加
［３＋２］シクロ付加に基づく蛋白質への部位特異的で迅速で確実で不可逆的なバイオコンジュゲーション法を立証する。生理的条件下で高度に選択的に蛋白質を修飾する化学反応が大いに必要とされている。例えばＬｅｍｉｎｅｕｘ，＆  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ，１６：５０６−５１３参照。蛋白質の選択的修飾に現在使用されている大半の反応は求核反応パートナーと求電子反応パートナーの間の共有結合形成、例えばα−ハロケトンとヒスチジン又はシステイン側鎖の反応を利用している。これらの場合の選択性は蛋白質中の求核残基の数とアクセシビリティにより決定される。合成又は半合成蛋白質の場合には、非天然ケトアミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物の反応等の他のより選択的な反応を使用することができる。例えばＣｏｒｎｉｓｈら，（１９９６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；及びＭａｈａｌら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８参照。最近、アミノ酸特異性を改変した直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を使用して細菌と酵母でケトン含有アミノ酸（例えばＷａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎら，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，印刷中参照）を含む非天然アミノ酸を遺伝的にコードすることが可能になった（例えばＷａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；及びＣｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４参照）。この方法により、フルオロフォア、架橋剤及び細胞傷害性分子等の多数の試薬でほぼ任意の蛋白質を選択的に標識することが可能になった。
【０３２１】
蛋白質の非常に効率的な選択的修飾方法として、アジド又はアセチレンを含む非天然アミノ酸を例えばアンバーナンセンスコドンＴＡＧに応答して蛋白質に遺伝的に組込む方法について記載する。これらのアミノ酸側鎖はその後、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加反応（例えばＰａｄｗａ，Ａ．ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．ｉｎ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１７６参照）により例えば夫々アルキニル（アセチレン）又はアジド誘導体で修飾することができる。この方法は求核置換ではなくシクロ付加を利用するので、蛋白質を非常に高い選択性で修飾することができる（使用可能な別法はビスヒ素化合物上でテトラシステインモチーフとのリガンド交換である。例えばＧｒｉｆｆｉｎら，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２６９−２７２参照）。この反応は触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に加えることにより室温で水性条件下に優れた部位選択性（１，４＞１，５）で実施することができる。例えばＴｏｒｎｏｅら，（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９参照。実際に、Ｆｉｎｎらはこのアジド−アルキン［３＋２］シクロ付加を無傷のカウピーモザイクウイルスの表面で実施できることを示している。例えばＷａｎｇら，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５：３１９２−３１９３参照。アジド基の求電子的蛋白質導入とその後の［３＋２］シクロ付加の別の最近の例については、例えばＳｐｅｅｒｓら，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５：４６８６−４６８７参照。
【０３２２】
アルキニル（アセチレン）又はアジド官能基を真核蛋白質のユニーク部位に選択的に導入するために、夫々アセチレン及びアジドアミノ酸（図１１の１及び２）を遺伝的にコードする進化型直交ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を酵母で作製した。得られた蛋白質は後続シクロ付加反応で生理的条件下にフルオロフォアで効率的且つ選択的に標識することができる。
【０３２３】
従来、大腸菌チロシルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対は酵母で直交であることが立証されており、即ちｔＲＮＡもシンテターゼも内在酵母ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応しないことが立証されている。例えばＣｈｉｎら，（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１０：５１１−５１９参照。この直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対はＴＡＧコドンに応答して多数の非天然アミノ酸を酵母に選択的且つ効率的に組込むために使用されている（例えばＣｈｉｎら，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。図１１のアミノ酸１又は２を受容するように大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸特異性を改変するために、Ｔｙｒ３７、Ａｓｎ１２６、Ａｓｐ１８２、Ｐｈｅ１８３、及びＬｅｕ１８６のコドンをランダムに選択することにより突然変異体〜１０７個のライブラリーを作製した。これらの５種の残基はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同シンテターゼの結晶構造に基づいて選択した。特定アミノ酸を基質とするシンテターゼを得るために、転写アクチベーターＧＡＬ４の遺伝子のＴｈｒ４４及びＡｒｇ１１０のコドンをアンバーナンセンスコドン（ＴＡＧ）に変換した選択スキームを使用した。例えばＣｈｉｎら，（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１０：５１１−５１９参照。ＭａＶ２０３：ｐＧＡＤＧＡＬ４（２ＴＡＧ）酵母株でこれらのアンバーコドンの抑圧により、全長ＧＡＬ４が生産され（例えばＫｅｅｇａｎら，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：６９９−７０４；及びＰｔａｓｈｎｅ，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５：６８３−６８９参照）、その結果、ＨＩＳ３及びＵＲＡ３レポーター遺伝子が発現される。後者遺伝子産物はヒスチジンとウラシルの栄養要求性を相補し、活性シンテターゼ突然変異体を含むクローンを図１１の１又は２の存在下で選択することができる。図１１の１又は２を含まず、ＵＲＡ３により毒性物質に変換される５−フルオロオロト酸を含む培地で増殖させることにより、内在アミノ酸に負荷するシンテターゼを除去する。ライブラリーを３ラウンド選択（ポジティブ、ネガティブ、ポジティブ）することにより、表８に示すような図１１の１（ｐＰＲ−ＥｃＲＳ１−５）と図１１の２（ｐＡＺ−ＥｃＲＳ１−６）に選択的なシンテターゼを同定した。
【０３２４】
全シンテターゼはＡｓｎ１２６の保存を含む強い配列類似性を示し、この残基の重要な機能的役割を示唆している。驚くべきことに、夫々図１１の１及び２と結合するように進化させたシンテターゼｐＰＲ−ＥｃＲＳ−２及びｐＡＺ−ＥｃＲＳ−６は同一配列に集束した（Ｔｙｒ３７→Ｔｈｒ３７、Ａｓｎ１２６→Ａｓｎ１２６、Ａｓｐ１８２→Ｓｅｒ１８２、及びＰｈｅ１８３→Ａｌａ１８３、Ｌｅｕ１８６→Ｌｅｕ１８６）。結合チロシンのフェノールヒドロキシ基とＴｙｒ３７及びＡｓｐ１８２の間の水素結合は夫々Ｔｈｒ及びＳｅｒへの突然変異により妨害される。Ｐｈｅ１８３はＡｌａに変換され、恐らく非天然アミノ酸を受容するためのより大きなスペースを提供すると思われる。このシンテターゼ（及び他のシンテターゼ）が基質としていずれかのアミノ酸を受容できるかどうかを確認するために、ウラシルを含まず（ヒスチジンを含まない培地でも同じ結果が得られた）、図１１の１又は２を補充した培地でシンテターゼプラスミドを含む選択株を増殖させた。増殖結果によると、５種のアルキンシンテターゼのうちの４種が両者非天然アミノ酸をそのｔＲＮＡに負荷できることが判明した。ｐＡＺ−ＥｃＲＳ−６（ｐＰＲ−ＥｃＲＳ−２と同一）のみがそのｔＲＮＡを図１１の１及び２の両方でアミノアシル化することができたので、アジドシンテターゼはより選択的であると思われる。図１１の１又は２の不在下では増殖が検出されなかったという事実は、これらのシンテターゼが２０種の標準アミノ酸を基質としないことを示唆している。図１４参照。
【０３２５】
他の全実験ではｐＰＲ−ＥｃＲＳ−２（ｐＡＺ−ＥｃＲＳ−６）を使用し、発現株を含む培地に図１１の１又は２を添加するだけでどの非天然アミノ酸が組込まれるかを確認できるようにした。蛋白質生産のために、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグに融合したヒトスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ）の許容残基Ｔｒｐ３３のコドンをＴＡＧに突然変異させた。例えば、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（Ｔｒｐ３３ＴＡＧ）ＨＩＳをｐＹＥＳ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）からのＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターの間にクローニングした。ｐＥＣＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡに由来するプラスミド上の突然変異体シンテターゼ及びｔＲＮＡ遺伝子をｐＹＥＳ２．１  ｈＳＯＤ（Ｔｒｐ  ３３  ＴＡＧ）ＨＩＳと共にＩｎｖＳｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に同時形質転換した。蛋白質発現のために、細胞をＳＤ−ｔｒｐ，−ｕｒａ＋ラフィノースで増殖させ、ガラクトース添加によりＯＤ６６０＝０．５で発現を誘導した。１ｍＭの図１１の１又は２の存在下又は不在下で蛋白質を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により精製した。
【０３２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットによる分析の結果、非天然アミノ酸依存性蛋白質発現は図１１の１又は２の不在下の蛋白質発現とのデンシトメトリー比較により判定した場合に＞９９％の忠実度であることが判明した。図１２参照。組込まれたアミノ酸を更に同定するために、トリプシン消化産物で液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を実施した。
【０３２７】
例えば、ニッケルアフィニティーカラムを使用して野生型と突然変異体のｈＳＯＤを精製し、コロイド状クーマシー染色により蛋白質バンドを可視化した。野生型と突然変異体のＳＯＤに対応するゲルバンドをポリアクリルアミドから切り出し、１．５ｍｍ立方にスライスし、還元及びアルキル化後、ほぼ従来記載されているようにトリプシン加水分解した。例えばＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａら，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：８５０−８５８参照。ＬＣＱイオントラップ質量分析計を使用してナノフロー逆相ＨＰＬＣ／μＥＳＩ／ＭＳにより非天然アミノ酸を含むトリプシンペプチドを分析した。図１５Ａ及びＢ参照。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）にＮａｎｏｓｐｒａｙＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ）を装着して液体クロマトグラフィータンデム質量（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析を実施した。
【０３２８】
非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）の１価及び２価前駆イオンに対応する前駆イオンを分離し、イオントラップ質量分析計でフラグメント化した。フラグメントイオン質量は明白に割り当てることができ、各非天然アミノ酸の部位特異的取り込みが確認された。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳはこの位置に天然アミノ酸の組込みを示さなかった。全突然変異体のシグナル対ノイズ比は＞１０００であり、９９．８％を上回る組込み忠実度が示唆された。図１５Ａ及びＢ参照。
【０３２９】
アジド−アルキレン［３＋２］シクロ付加反応により小有機分子を蛋白質に共役できることを立証するために、アセチレン基又はアジド基を含み、ダンシル又はフルオレセインフルオロフォアをもつ図１３Ａに示す色素３−６を合成した（本明細書の実施例５参照）。シクロ付加自体は２ｍＭの図１３Ａの３−６、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４、及び〜１ｍｇ  Ｃｕ線の存在下にリン酸緩衝液（ＰＢ），ｐＨ８中０．０１ｍＭ蛋白質の濃度で４時間３７℃で実施した（図１３Ｂ参照）。
【０３３０】
例えば、ＰＢ緩衝液（ｐＨ＝８）中蛋白質４５μＬにＣｕＳＯ４（Ｈ２Ｏ中５０ｍＭ）１μＬ、色素（ＥｔＯＨ中５０ｍＭ）２μＬ、トリス（１−ベンジル−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イルメチル）アミン（ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）２μＬ、及びＣｕ線を加えた。室温もしくは３７℃で４時間又は４℃で一晩後に、Ｈ２Ｏ  ４５０μＬを加え、混合物を透析膜（１０ｋＤａカットオフ）に通して遠心した。上清を遠心により２×５００μＬで洗浄後、溶液を容量５０ｍＬにした。２０ｍＬサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。色素が残留している場合にはＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ（５：５：１）に一晩浸漬することによりゲルから除去することができる。トリス（カルボキシエチル）ホスフィンを還元剤として使用すると、一般に標識効率が低下した。初期知見（例えばＷａｎｇ，Ｑ．ら，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：３１９２−３１９３）に反して、トリス（トリアゾール）アミンリガンドの有無は反応結果に実質的影響がなかった。
【０３３１】
透析後に、標識蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、図１３Ａに示すダンシル色素３−４の場合にはデンシトメーター（λｅｘ＝３３７ｎｍ，；λｅｍ＝５０６ｎｍ）を使用し、図１３Ａに示すフルオレセイン色素５−６の場合にはホスホロイメージャー（λｅｘ＝４８３ｎｍ，λｅｍ＝５１６ｎｍ）を使用してゲル内イメージングした。例えばＢｌａｋｅ，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１：５３３−５３９；Ｗｏｕｔｅｒｓら，（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２０３−２１１；及びＺａｃｈａｒｉａｓら，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１０：４１６−４２１参照。標識蛋白質をトリプシン消化産物のＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析により特性決定した処、フルオロフォアの部位特異的結合が判明し、（例えば図１３Ａに示す５又は６で標識したＳＯＤのＡ２８０／Ａ４９５値の比較により測定した場合に）変換率は平均７５％であった。このバイオコンジュゲーションの選択性は図１３Ａに示す３とアルキン蛋白質又は図１３Ａに示す４とアジド蛋白質の間に観察可能な反応がなかったという事実により確認される。
【表７】
0005642916.tif 000014
【実施例４】
【０３３２】
アルキンアミノ酸の合成
本発明の１側面では、本発明はアルキニルアミノ酸を提供する。アルキニルアミノ酸の構造の１例は式ＩＶ：
【化７】
0005642916.tif 000015
により示される。
【０３３３】
アルキンアミノ酸は一般にＲ１が２０種の天然アミノ酸の１種で使用される置換基であり、Ｒ２がアルキニル置換基である式ＩＶをもつ任意構造である。例えば、図１１の１はパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニンの構造を示す。ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは例えば以下に要約するように合成することができる。この態様では、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンの合成は市販Ｎ−Ｂｏｃ−チロシンから出発して３段階で完了することができる。
【０３３４】
例えば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−チロシン（２ｇ，７ｍｍｏｌ，１当量）とＫ２ＣＯ３（３ｇ，２１ｍｍｏｌ，３当量）を無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）に懸濁した。臭化プロパルギル（２．１ｍＬ，２１ｍｍｏｌ，３当量，トルエン中８０％溶液）をゆっくりと加え、反応混合物を１８時間室温で撹拌した。水（７５ｍＬ）とＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、層分離し、水相をＥｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）し、溶媒を減圧除去した。生成物が黄色油状物として得られ（２．３ｇ，９１％）、それ以上精製せずに次段階で使用した。Ｂｏｃ保護生成物は下記化学構造８として示される：
【化８】
0005642916.tif 000016
２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−［４−（プロプ−２−イニルオキシ）フェニル］−プロピオン酸プロパルギルエステル。
【０３３５】
塩化アセチル（７ｍＬ）を０℃のメタノール（６０ｍＬ）に注意深く加え、無水ＨＣｌのＭｅＯＨ中５Ｍ溶液を得た。前段階の生成物（２ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を周囲温度まで昇温させながら４時間撹拌した。揮発分を減圧除去後、黄色がかった固体（１．６ｇ，９８％）（化学構造９参照）が得られ、次段階で直接使用した。
【化９】
0005642916.tif 000017
２−アミノ−３−［４−（プロプ−２−イニルオキシ）フェニル］−プロピオン酸プロパルギルエステル。
【０３３６】
前段階からのプロパルギルエステル（１．６ｇ，５．５ｍｍｏｌ）を２Ｎ  ＮａＯＨ（１４ｍＬ）とＭｅＯＨ（１０ｍＬ）の水溶液の混合物に溶かした。１．５時間室温で撹拌後に濃ＨＣｌを加えることによりｐＨを７に調整した。水（２０ｍＬ）を加え、混合物を４℃に一晩維持した。沈殿を濾過し、氷冷Ｈ２Ｏで洗浄し、減圧乾燥すると、図１１の１（２−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（１）（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンとも言う））１．２３ｇ（９０％）が白色固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）（Ｄ２Ｏ中カリウム塩として）δ７．２０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２  Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．７５（ｓ，２  Ｈ），３．５０（ｄｄ，Ｊ＝５．６，７．２Ｈｚ，１  Ｈ），２．９５（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１３．６Ｈｚ，１  Ｈ），２．８２（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１３．６Ｈｚ，１  Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１８１．３，１６４．９，１５５．６，１３１．４，１３０．７，１１５．３，５７．３，５６．１，３９．３；ＨＲＭＳ（ＣＩ）ｍ／ｚ  ２２０．０９６９［Ｃ１２Ｈ１３ＮＯ３（Ｍ＋１）理論値２２０．０９６８］。
【実施例５】
【０３３７】
［３＋２］シクロ付加による非天然アミノ酸をもつ蛋白質への分子付加
１側面では、本発明は付加置換基分子に結合した非天然アミノ酸を含む蛋白質の製造方法と関連組成物を提供する。例えば、［３＋２］シクロ付加により付加置換基を非天然アミノ酸に付加することができる。例えば図１６参照。例えば、（例えばアジド基又は三重結合等の第１の反応基をもつ）非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質への（例えばアルキン三重結合又はアジド基等の第２の反応基をもつ）所望分子の［３＋２］シクロ付加は［３＋２］シクロ付加反応について公開されている条件に従って実施することができる。例えば、ＰＢ緩衝液（ｐＨ＝８）中に非天然アミノ酸を含む蛋白質をＣｕＳＯ４、所望分子、及びＣｕ線に加える。混合物を（例えば室温もしくは３７℃で４時間又は４℃で一晩）インキュベートした後に、Ｈ２Ｏを加え、混合物を透析膜で濾過する。サンプルの付加を例えばゲル分析により分析することができる。
【０３３８】
このような分子の例としては限定されないが、例えば三重結合又はアジド基をもつ分子（例えば図１３Ａの式３、４、５、及び６等の構造をもつ分子）が挙げられる。更に、他の該当分子（例えばポリマー（例えばポリエチレングリコール及び誘導体）、架橋剤、付加色素、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン、糖類、樹脂、ビーズ、第２の蛋白質又はポリペプチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）等）の構造に三重結合又はアジド基を組込むことができ、その後、更に［３＋２］シクロ付加で使用することができる。
【０３３９】
本発明の１側面では、図１３Ａの式３、４、５、又は６をもつ分子を以下のように合成することができる。例えば、プロパルギルアミン（２５０μＬ，３．７１ｍｍｏｌ，３当量）をダンシルクロリド（５００ｍｇ，１．８５ｍｍｏｌ，１当量）とトリエチルアミン（２５８μＬ，１．８５ｍｍｏｌ，１当量）の０℃のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に加えることにより、図１３Ａの３と下記化学構造３に示すようなアルキン色素を合成した。１時間撹拌後、反応混合物を室温まで昇温させ、更に１時間撹拌した。揮発分を減圧除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｅｔ２Ｏ／ヘキサン＝１：１）により精製すると、図１３Ａの３（４１８ｍｇ，７８％）が黄色固体として得られた。分析データは文献に報告されているデータに一致する。例えば、Ｂｏｌｌｅｔｔａ，Ｆら，（１９９６）Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  １５：２４１５−１７参照。本発明で使用することができるアルキン色素の構造の１例を化学構造３に示す：
【化１０】
0005642916.tif 000018
【０３４０】
（例えばＣａｒｂｏｎｉ，Ｂら，（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：３７３６−３７４１に記載されているような）３−アジドプロピルアミン（３７１ｍｇ，３．７１ｍｍｏｌ，３当量）をダンシルクロリド（５００ｍｇ，１．８５ｍｍｏｌ，１当量）とトリエチルアミン（２５８μＬ，１．８５ｍｍｏｌ，１当量）の０℃のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に加えることにより、図１３Ａの４と下記化学構造４に示すようなアジド色素を合成した。１時間撹拌後、反応混合物を室温まで昇温させ、更に１時間撹拌した。揮発分を減圧除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｅｔ２Ｏ／ヘキサン＝１：１）により精製すると、図１３Ａの４（５４８ｍｇ，８９％）が黄色固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．２３（ｄｄ，Ｊ＝１．２，７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．４９（ｃｏｍｐ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．２１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９５（ｄｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８９（ｓ，６Ｈ），１．６２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３４．３，１３０．４，１２９．７，１２９．４，１２８．４，１２３．３，１１８．８，１１５．３，４８．６，４５．４，４０．６，２８．７（第四級炭素の全シグナルが１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル中に出現しているわけではない）；ＨＲＭＳ（ＣＩ）ｍ／ｚ  ３３４．１３３６［Ｃ１５Ｈ２０Ｎ５Ｏ２Ｓ（Ｍ＋１）理論値３３４．１３３２］。アジド色素の構造の１例を化学構造４に示す：
【化１１】
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【０３４１】
ＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロプル）カルボジイミド塩酸塩）（８３ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ，１当量）をフルオレセインアミン（１５０ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ，１当量）と１０−ウンデシン酸（７９ｍｇ，０．４３，１当量）の室温のピリジン（２ｍＬ）溶液に加えることにより、図１３Ａの５と下記化学構造５に示すようなアルキン色素を合成した。懸濁液を一晩撹拌し、反応混合物をＨ２Ｏ（１５ｍＬ）に注入した。濃ＨＣｌを加えることにより溶液を酸性化した（ｐＨ＜２）。１時間撹拌後、沈殿を濾別し、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）で洗浄し、少量のＥｔＯＡｃに溶かした。ヘキサンを加えると、図１３Ａの５がオレンジ色結晶として沈殿し、これを集めて減圧乾燥した（１３８ｍｇ，６３％）。分析データは文献に報告されているデータに一致する。例えばＣｒｉｓｐ，Ｇ．Ｔ．；＆  Ｇｏｒｅ，Ｊ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：１５０５−１５２２参照。アルキン色素の構造の１例を化学構造５に示す：
【化１２】
0005642916.tif 000020
【０３４２】
ＥＤＣＩ（８３ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ，１当量）をフルオレセインアミン（１５０ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ，１当量）と４−（３−アジドプロピルカルバモイル）−酪酸（例えば３−アジドプロピルアミンをグルタル酸無水物と反応させることにより合成）（９２ｍｇ，０．４３，１当量）の室温のピリジン（２ｍＬ）溶液に加えることにより、図１３Ａの６と下記化学構造６に示すようなアジド色素を合成した。懸濁液を一晩撹拌し、反応混合物をＨ２Ｏ（１５ｍＬ）に注入した。濃ＨＣｌを加えることにより溶液を酸性化した（ｐＨ＜２）。１時間撹拌後、沈殿を濾別し、１Ｎ  ＨＣｌ（３×３ｍＬ）で洗浄し、少量のＥｔＯＡｃに溶かした。ヘキサンを加えると、図１３Ａの６がオレンジ色結晶として沈殿し、これを集めて減圧乾燥した（２００ｍｇ，８６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．６５（ｓ，１  Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１  Ｈ），７．６１−７．５１（ｃｏｍｐ，２  Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１  Ｈ），７．３５（ｂｒ  ｓ，２  Ｈ），７．２２−７．１４（ｃｏｍｐ，２  Ｈ），６．８５−６．５６（ｃｏｍｐ，３  Ｈ），３．４０−３．２４（ｃｏｍｐ，４  Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２  Ｈ），２．３９−２．３０（ｃｏｍｐ，２  Ｈ），２．１０−１．９９（ｃｏｍｐ，２  Ｈ），１．８２−１．７２（ｃｏｍｐ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７５．７，１７４．４，１７２．４，１６７．９，１６０．８，１４３．０，１３４．３，１３２．９，１３１．８，１２９．６，１２４．４，１２３．３，１２１．１，１１８．５  １０３．５，５０．２，３８．０，３７．２，３６．２，２９．８，２２．９（第四級炭素の全シグナルが１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル中に出現しているわけではない）；ＨＲＭＳ（ＣＩ）ｍ／ｚ  ５４４．１８３５［Ｃ２８Ｈ２５Ｎ５Ｏ７（Ｍ＋１）理論値５４４．１８２７］。アジド色素の構造の１例を化学構造６に示す：
【化１３】
0005642916.tif 000021
【０３４３】
１態様では、非天然アミノ酸（例えばアジドアミノ酸又はプロパルギルアミノ酸）を組込んだ蛋白質にＰＥＧ分子を付加することもできる。例えば、アジドアミノ酸を組込んだ蛋白質に［３＋２］シクロ付加により（例えば図１７Ａに示す）プロパルギルアミドＰＥＧを付加することができる。例えば図１７Ａ参照。図１７ＢはＰＥＧ置換基を付加した蛋白質のゲル分析を示す。
【０３４４】
本発明の１側面では、（例えば図１７Ａに示す）プロパルギルアミドＰＥＧを以下のように合成することができる。例えば、プロパルギルアミン（３０μＬ）のＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）溶液を２０ｋＤａ  ＰＥＧ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１２０ｍｇ，Ｎｅｋｔａｒから購入）に加えた。反応混合物を４時間室温で撹拌した。次にＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、沈殿を濾別し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を加えることによりＭｅＯＨ（１ｍＬ）から２回再結晶させた。生成物を減圧乾燥すると、白色固体が得られた（１０５ｍｇ，８８％収率）。例えば図１７Ｃ参照。
【実施例６】
【０３４５】
代表的Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ
代表的Ｏ−ｔＲＮＡとしては配列番号６５か挙げられる（表５参照）。代表的Ｏ−ＲＳとしては配列番号３６−６３，８６が挙げられる（表５参照）。Ｏ−ＲＳ又はその部分（例えば活性部位）をコードするポリヌクレオチドの例としては配列番号３−３５が挙げられる。更に、Ｏ−ＲＳの代表的アミノ酸置換を表６に示す。
【表８】
0005642916.tif 000022
【０３４６】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０３４７】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【表９−１】
0005642916.tif 000023
【表９−２】
0005642916.tif 000024
【表９−３】
0005642916.tif 000025
【表９−４】
0005642916.tif 000026
【表９−５】
0005642916.tif 000027
【表９−６】
0005642916.tif 000028
【表９−７】
0005642916.tif 000029
【表９−８】
0005642916.tif 000030
【表９−９】
0005642916.tif 000031
【表９−１０】
0005642916.tif 000032
【表９−１１】
0005642916.tif 000033
【表９−１２】
0005642916.tif 000034
【表９−１３】
0005642916.tif 000035
【表９−１４】
0005642916.tif 000036
【表９−１５】
0005642916.tif 000037
【図面の簡単な説明】
【０３４８】
【図１Ａ】図１Ａは真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝コードを拡張させるための一般ポジティブ及びネガティブ選択スキームを模式的に示す。図１ＡはＧＡＬ４におけるＴＡＧコドンのアンバー抑圧により誘導されるレポーター遺伝子の活性化転写を模式的に示す。ＤＮＡ結合ドメインを縞部分に示し、主及び潜在活性化ドメインをハッチ部分に示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝コードを拡張させるための一般ポジティブ及びネガティブ選択スキームを模式的に示す。図１Ｂはレポーター遺伝子の例（例えばＭａＶ２０３におけるＨＩＳ３，ＬａｃＺ，ＵＲＡ３）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝コードを拡張させるための一般ポジティブ及びネガティブ選択スキームを模式的に示す。図１Ｃは選択スキームで使用することができるプラスミド（例えばｐＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ及びｐＧＡＤＧＡＬ４ｘｘＴＡＧ）を模式的に示す。
【図２】選択培地における第１世代ＧＡＬ４レポーターのＥｃＴｙｒＲＳ及びｔＲＮＡＣＵＡ依存性表現型を示す。ＤＢ−ＡＤはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインの融合体である。ＤＢ−ＴＡＧ−ＡＤはＤＢとＡＤの間の合成リンカーでチロシンコドンに置換するＴＡＧコドンをもつ。Ａ５は活性部位の５残基がアラニンに突然変異しているＥｃＴｙｒＲＳの不活性形である。
【図３】図３Ａ及びＢは選択培地における第２世代ＧＡＬ４レポーターのＥｃＴｙｒＲＳ及びｔＲＮＡＣＵＡ依存性表現型を示す。ＤＮＡ結合ドメインを縞部分に示し、主及び潜在活性化ドメインをハッチ部分に示す。図３Ａは各々ＧＡＬ４に単独アミノ酸突然変異をもつ構築物を示す。図３Ｂは各々ＧＡＬ４に２カ所のアミノ酸突然変異をもつ構築物を示す。
【図４Ａ】図４ＡはＭａＶ２０３にＥｃＴｙｒＲＳと各種レポーターをもつｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）ともたないものを示す。図４ＡはＸ−ｇａｌ，−Ｕｒａ，又は−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐの存在下の結果を示す。
【図４Ｂ】図４ＢはＭａＶ２０３にＥｃＴｙｒＲＳと各種レポーターをもつｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）ともたないものを示す。図４Ｂは各種濃度の３−ＡＴの存在下の結果を示す。
【図４Ｃ】図４ＣはＭａＶ２０３にＥｃＴｙｒＲＳと各種レポーターをもつｐＧＡＤＧＡＬ４（Ｔ４４ＴＡＧ，Ｒ１１０ＴＡＧ）ともたないものを示す。図４Ｃは各種百分率の５−ＦＯＡの存在下の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは例えば残基Ｔ４４（Ａ）及びＲ１１０（Ｂ）を許容部位とする各種ＧＡＬ４突然変異体によるＯＮＰＧ加水分解を示す。図５ＡはＴ４４位に各種突然変異を形成した場合のＯＮＰＧ加水分解測定を示す。「ＧＡＬ４」はｐＣＬ１で形質転換したＭａＶ２０３であり、目盛外の〜６００ＯＮＰＧ加水分解単位であった。「なし」はＧＡＬ４  ＤＢとＧＡＬ４  ＡＤを別々にコードするプラスミドで形質転換したＭａＶ２０３である。
【図５Ｂ】図５Ｂは例えば残基Ｔ４４（Ａ）及びＲ１１０（Ｂ）を許容部位とする各種ＧＡＬ４突然変異体によるＯＮＰＧ加水分解を示す。図５ＢはＲ１１０位に各種突然変異を形成した場合のＯＮＰＧ加水分解測定を示す。「ＧＡＬ４」はｐＣＬ１で形質転換したＭａＶ２０３であり、目盛外の〜６００ＯＮＰＧ加水分解単位であった。「なし」はＧＡＬ４  ＤＢとＧＡＬ４  ＡＤを別々にコードするプラスミドで形質転換したＭａＶ２０３である。
【図６】活性ＥｃＴｙｒＲＳクローンの選択を示す。ｐＥｃＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＣＵＡ：ｐＡ５−ｔＲＮＡＣＵＡの１：１０混合物を含むＭａＶ２０３を（−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ）プレート（左）又は（−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ，−Ｈｉｓ＋５０ｍＭ  ３−ＡＴ）プレート（右）に１０３倍の希釈倍率でプレーティングし、ＸＧＡＬ重層法を使用して処理した。
【図７Ａ】図７Ａはチロシンを結合したＢ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼの活性部位の立体構造を示す。突然変異残基を示し、これらは大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼＴｙｒ３７（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳ残基Ｔｙｒ３４）、Ａｓｎ１２６（Ａｓｎ１２３）、Ａｓｐ１８２（Ａｓｐ１７６）、Ｐｈｅ１８３（Ｐｈｅ１７７）、及びＬｅｕ１８６（Ｌｅｕ１８０）に由来する残基に対応する。
【図７Ｂ】図７Ｂは非天然アミノ酸（左から右に向かって）ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（１）、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（２）、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（３）、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（４）、及びｐ−ヨード−Ｌ−チロシン（５）の構造式を示す。
【図８Ａ】図８Ａは真核細胞で直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルシンテターゼ又は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対の選択／スクリーニングに使用することができるベクター及びレポーター構築物を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは選択培地で活性（ＴｙｒＲＳ）又は不活性（Ａ５ＲＳ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに応答するＧＡＬ４応答性ＨＩＳ３，ＵＲＡ３及びｌａｃＺ応答性レポーターをもつ酵母の表現型を示す。
【図８Ｃ】図８ＣはＵＡＡを非天然アミノ酸として真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で付加アミノ酸をコードする突然変異体シンテターゼを選択するために使用した選択スキームの１例を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄはｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンによる選択から単離した酵母の表現型を示す。
【図９】図９は図７Ｂに示したような非天然アミノ酸を遺伝的にコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）（３３ＴＡＧ）ＨＩＳの蛋白質発現を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ａは非天然アミノ酸ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（１）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｂは非天然アミノ酸ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（２）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｃは非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（３）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｄは非天然アミノ酸Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（４）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０Ｅは非天然アミノ酸ｐ−ヨード−Ｌ−チロシン（５）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０ＦはＹ＊位にアミノ酸トリプトファン（Ｗ）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０ＧはＹ＊位にアミノ酸チロシン（Ｙ）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは図７Ｂに示したような非天然アミノ酸（Ｙ＊で示す）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。図１０ＨはＹ＊位にアミノ酸ロイシン（Ｌ）を含むトリプシンペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１は２種の非天然アミノ酸の例として（１）パラ−プロパルギルオキシフェニルアラニンと（２）パラ−アジドフェニルアラニンを示す。
【図１２】図１２Ａ、Ｂ及びＣは図１１に示した非天然アミノ酸１及び２の存在下又は不在下におけるＳＯＤ発現を示す。図１２ＡはＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色実験を示す。図１２Ｂは抗ＳＯＤ抗体によるウェスタンブロットを示す。図１２Ｃは抗６ｘＨｉｓ抗体によるウェスタンブロットを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは［３＋２］シクロ付加による蛋白質標識を示す。図１３Ａは合成色素ラベル３−６を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは［３＋２］シクロ付加による蛋白質標識を示す。図１３ＢはＳＯＤと色素の反応を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは［３＋２］シクロ付加による蛋白質標識を示す。図１３Ｃはゲル内蛍光走査とＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色を示す。
【図１４】図１４はウラシルを含まないＳＤ培地で図１１に示したような１又は２の不在下又は存在下にシンテターゼ突然変異体で形質転換させた真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）の増殖を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａはアジド（Ａｚ）（図１５Ａ）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。Ｙ＊位の非天然アミノ酸を予想フラグメントイオン質量と共に示す。矢印は各ペプチドに観察されたｂ（青）及びｙ（赤）イオン系列を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂはアルキン（Ａｌ）（図１５Ｂ）を含むトリプシンペプチドＶＹ＊ＧＳＩＫ（配列番号８７）のタンデム質量スペクトルを示す。Ｙ＊位の非天然アミノ酸を予想フラグメントイオン質量と共に示す。矢印は各ペプチドに観察されたｂ（青）及びｙ（赤）イオン系列を示す。
【図１６】図１６は成長中のポリペプチド鎖への非天然アミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニンのｉｎ  ｖｉｖｏ組込みとこの非天然アミノ酸を介する［３＋２］−シクロ付加反応による小有機分子とのバイオコンジュゲーションを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは［３＋２］シクロ付加を使用した非天然アミノ酸を含む蛋白質のＰＥＧ化を示す。図１７ＡはＣｕ（Ｉ）とリン酸緩衝液（ＰＢ）の存在下におけるプロパルギルアミドＰＥＧとアジドアミノ酸（例えばＮ３−ＳＯＤ）を含む蛋白質の反応を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは［３＋２］シクロ付加を使用した非天然アミノ酸を含む蛋白質のＰＥＧ化を示す。図１７Ｂはゲル分析による蛋白質のＰＥＧ化を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは［３＋２］シクロ付加を使用した非天然アミノ酸を含む蛋白質のＰＥＧ化を示す。図１７ＣはプロパルギルアミドＰＥＧの合成を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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