(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシド(C)タンパク質をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む複製能欠損型(replication-deficient)偽感染性(peudoinfectious)フラビウイルスであって、欠失した配列が、カプシドタンパク質のアミノ酸26〜93、31〜100、31〜93、または26〜100をコードし、該偽感染性フラビウイルスが黄熱病ウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群より選択される、複製能欠損型偽感染性フラビウイルス。
【請求項２】
欠失した配列が、マーカータンパク質または抗原をコードする遺伝子により置き換わっている、請求項1記載の複製能欠損型偽感染性フラビウイルス。
【請求項３】
マーカータンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項２記載の複製能欠損型偽感染性フラビウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の複製能欠損型偽感染性フラビウイルスを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
フラビウイルスへの暴露に起因する感染から被検者を保護するための薬学的組成物を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項記載の複製能欠損型偽感染性フラビウイルスの使用であって、薬学的組成物の免疫学的有効量が被検者に投与されるものであり、かつ該組成物が被検者においてフラビウイルスに対する免疫応答を誘発し、それにより感染から被検者を保護するものであり、フラビウイルスが黄熱病ウイルスまたは西ナイルウイルスである、使用。
【請求項６】
前記投与が腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、口腔、または鼻腔内経路を介する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
被検者がヒトまたは動物である、請求項５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は分子生物学、ウイルス学および免疫学の分野に関する。一般に、本発明は、フラビウイルス科に属する複製能欠損型(replication-deficient)ウイルスの構築、およびこの科に属するウイルスによって引き起こされる疾患の予防におけるワクチンとしてのそれらの利用を開示する。より詳細には、本発明は、複製能欠損型フラビウイルスもしくは偽感染性(peudoinfectious)フラビウイルス(PIV、別名RepliVAX)、およびフラビウイルス関連性疾患に対する予防ワクチンとしてのそれの利用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
関連する技術分野の説明
フラビウイルス科のフラビウイルス属は、様々なヒトおよび動物の病原体を含み、免疫試験における異なる反応性に基づいて、4つの異なる抗原複合体に分類される。一般に、フラビウイルスは、増幅する宿主である鳥類もしくは哺乳類、またはベクターである蚊もしくはマダニの間で伝播する。
【０００３】
フラビウイルス科のゲノムは、3'末端ポリ(A)配列を欠く、陽性極性の一本鎖のキャッピングされたRNAである。それは、ウイルス粒子を形成するウイルス構造タンパク質(C、prM/M、およびE)、ならびにウイルスゲノムの複製および自身の感染性ビリオンへのパッケージングに必要な非構造タンパク質(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, およびNS5)に翻訳時および翻訳後にプロセシングされた、単一のポリペプチドをコードする(Chambers, 1990)。ビリオンは、MおよびEタンパク質のヘテロダイマーを保持する脂質エンベロープによって取り囲まれた、Cタンパク質含有ヌクレオカプシドにパッケージングされたウイルスゲノムRNAの単一のコピーを含む。多くの他のエンベロープ型ウイルスと対照的に、ヌクレオカプシドとエンベロープスパイクとの間の相互作用はそれほど特異的ではなく、またM/E含有エンベロープは、非相同的なフラビウイルス由来のヌクレオカプシドの周りに効率的に形成でき、カプシド配列における相同性のレベルの限界を示す(Lorenz, 2002)。あるいは、C非存在下におけるprMおよびEの発現は、RNAもしくはCタンパク質を含まない、ウイルスの一部分をなす構造体の粒子(subviral particle)(SVP)の形成につながり得る(Mason, 1991)。
【０００４】
ウイルスの一部分をなす構造体の粒子を産生するprM/M-Eカセットは、当技術分野において公知であるいくつかのワクチン候補のベースとなっている。これらのワクチン候補は、サブユニット (Konishi, 1992; 2001; 2002; Qiao, 2004)、DNA(Phillpotts, 1996; Kochel, 1997; Schmaljohn, 1997; Colombage, 1998; Aberle, 1999; Konishi, 2000; Konishi, 2000; Kochel, 2000; Davis, 2001)、および生ベクター(Mason, 1991 ; Konishi, 1992; Pincus, 1992; Fonseca, 1994; Pugachev, 1995; Colombage, 1998; Kanesa, 2000; Minke, 2004)ワクチンを含む。しかしながら、これらのワクチンは重大な短所がある。例えば、サブユニットワクチンは、使用は安全だが、大量生産が困難である；DNAワクチンは免疫原性が不十分であり、また、ウイルスベクターワクチンは、ベクター免疫存在下では効力不足を被る。
【０００５】
従って、フラビウイルス関連性疾患および新しい場所へのフラビウイルスの伝播が続いていることが非常に懸念される一方で、抗ウイルス治療がこれらの感染症に関してまだ発展しておらず、また現在までに認可されたワクチンは非常に限られた数しか製造されていない。不活化ウイルスワクチン(INV)がダニ媒介脳炎(TBEV)および日本脳炎(JEV)を予防するために認可されている。しかしながら、他の不活化ウイルスワクチンのように、これらのワクチンは、低い限られた力価しかなく、複数回のワクチン接種を必要とする。これらの欠点にもかかわらず、日本脳炎およびダニ媒介脳炎INVは良好な安全成績の利点を有する。フラビウイルスに関し唯一認可された弱毒化生ワクチン(LAV)は、鶏胚組織中の黄熱病ウイルスの野生型Asibi株の連続投与で発生した黄熱病ウイルス(YFV)17D株に基づいた、広く利用された弱毒化生ワクチンである。この弱毒化生ワクチンは非常に安全かつ有効と考えられているが、米国の軍隊入隊者における最近の事例(Gerasimon、2005)を含む、ワクチン接種を受けた人における黄熱病の事例が報告されている。さらに、このワクチンは、ワクチン関連脳炎を含む副作用のため、乳幼児、妊娠中の女性、または免疫障害を持つ個体における使用は推薦されない。
【０００６】
しかしながら、フラビウイルスに関する逆遺伝学システムの発展は、これらのウイルスの合理的な弱毒化に基づいて、新型の弱毒化生ワクチンの作製および設計をもたらした。この新しい種類のワクチンは、黄熱病ウイルスprM-Eコードゲノム断片カセットを異種のフラビウイルス由来のprM-Eカセットと置換した、黄熱病ウイルスの17Dをベースとしたキメラを含む(Chambers, 1999)。同様のキメラウイルスベースのアプローチを、デングウイルスおよびTBEウイルスベースのバックボーンに適用した(Pletnev, 2002; Huang, 2003)。多くの場合、キメラフラビウイルスは、、非常に弱毒化した表現型を示し、また効率的な防御免疫応答を誘発することができ、またキメラによって構造タンパク質が発現されるウイルスによるその後のウイルス感染から防護する(Monath, 2002)。これらのキメラワクチン候補を用いた有効なワクチン投与は、他のウイルスベクターに基づく組換え型のウイルスワクチンの力価を妨げる、既存の「ベクター」免疫性(Monath, 2002)により妨げられないようである。さらに、キメラフラビウイルスは、新しいワクチン作製に関し合理的で普遍的なアプローチを提供すると考えられるが、キメラ自体が少なくとも免疫無防備状態の個体で病原性である可能性があり(Chambers, 1999)、または変異がこれらのウイルス増殖の過程の間で検出されているため、病原性のキメラが現れる可能性があるという懸念がある(Pugachev, 2004)。
【０００７】
ワクチン開発における別の有望な方向は、ワクチン接種された宿主における増殖性ウイルス複製をそれほど効率的でない、あるいは不可能な事態にする、フラビウイルスゲノムにおける回復不能な欠失を作製することに基づく。後者の場合、例えばCコード領域を欠失しているが全体の複製の仕組みをコードしているウイルスゲノムは、自己複製可能なインビトロ合成されたRNA(Kofler, 2004; Aberle, 2005)、または恐らくDNA形態(RNAポリメラーゼIIプロモーターの調節下にある)または自己複製可能なインビトロ合成されたRNA(Kofler, 2004; Aberle, 2005)のいずれかとして、インビボ免疫化のために送達され得る。完全なウイルス複製サイクル非存在下におけるSVPの産生を規定する、インビトロ合成された欠損型RNAゲノムでの直接免疫は、防御免疫生成において安全および有効であることが示されている(Kofler, 2004; Aberle, 2005)。しかしながら、合成、安定性、および送達における問題点のため、RNAベースのワクチン候補の製造には重要な障害があると考えられる。
【０００８】
このように、従来技術は、フラビウイルス科に属するウイルスの感染によって引き起こされる疾患に対して用いることができる、安全、強力、および有効な型のワクチンを欠いている。本発明は、この分野における、この積年の必要性および要求を充足するものである。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の1つの態様において、フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスが提供される。そのようなフラビウイルス科複製能欠損型偽感染性ウイルスは以下を含む：欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組み合わせを妨害しないような、カプシド(C)タンパク質をコードするヌクレオチド配列における欠失を含み、フラビウイルス科のウイルスの、Cタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞においてのみ複製する、複製能欠損型偽感染性ウイルス。
【００１０】
本発明の別の関連する態様において、適切な条件下でフラビウイルス科の上記複製能欠損型偽感染性ウイルスの増殖を可能にするのに有効な、フラビウイルス科のウイルスの、Cタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞培養システムが提供される。
【００１１】
本発明の更に別の態様において、上記フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを産生する方法が提供される。そのような方法は、以下を含む：欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組み合わせを妨害しないような、カプシド遺伝子における欠失を有する、フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを作製する工程；フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスの増殖に必要な高レベルのフラビウイルス科のタンパク質を提供する細胞株である、フラビウイルス科のウイルスのCタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞株を作製する工程；ならびに、フラビウイルス科の偽感染性ウイルスに前記細胞株を感染させ、それによってフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを作製する工程。
【００１２】
本発明の別の関連する態様において、本明細書に記載の方法によって作製されたフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを含む、薬学的組成物が提供される。
【００１３】
本発明の更なる関連する態様において、フラビウイルス科への暴露に起因する感染から被検者を保護する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載の方法で産生された薬学的組成物の免疫学的有効量を被検者に投与することを含み、該組成物は被検者においてフラビウイルス科に対する免疫応答を誘発し、それにより感染から被検者を保護する。
【００１４】
発明の詳細な説明
安全および有効なワクチンは、フラビウイルスが原因の一握りの疾患のために作られるだけだった。YF、JE、およびTBEVに対するワクチンを製造するのに用いられてきた、古典的な不活化ウイルスワクチン(INV)および弱毒化生ワクチン(LAV)の方法は、他のフラビウイルスが原因の疾患、特にデング熱および西ナイル脳炎(WNE)を予防するためのライセンス製品をまだ得ていない。既存のLAV(残余菌力または毒力復帰変異)およびINV産物(抗原負荷および外来抗原による反応源性)に関する安全に対する懸念が残っている。さらに、通常、INVは複数のワクチン接種を必要とする。さらに、両タイプのワクチンは、弱毒化生ワクチンの増殖中の毒力復帰変異を回避する必要性、および不活化ウイルスワクチン産物に対する強い免疫応答を引き起こすために必要な材料の量に起因する、INV産物の産生に用いられる毒性ウイルス増殖用の高度封じ込め施設の必要性を含む、製造の問題を免れない。フラビウイルスワクチンの新型については有望な候補があるが、それらの開発への道は、これらの問題を克服する必要があると考えられる。
【００１５】
本発明は概して、フラビウイルス科に属する複製能欠損型偽感染性ウイルスの構築および利用を目的とする。この点において、本発明は、弱毒化生ワクチンの効力および適応性と不活化ワクチンの安全性とを兼ね備えるRepliVAXとも称される新型の複製能欠損型フラビウイルスの開発を記載する。本発明において、偽感染性ウイルス(PIV)としても同定されたこれらのフラビウイルスは、カプシド(C)コード領域の大部分の欠失を有する遺伝学的に設計されたフラビウイルスゲノムを含み、それにより、正常細胞株またはワクチン接種した動物において、このゲノムから感染性子孫ウイルスが産生されないようにする。しかしながら、これらの偽感染性ウイルスは、CまたはC-prM-Eカセットのいずれかを発現する細胞株で増殖でき、これらの複製レベルは高レベルである。したがって、これらの偽感染性フラビウイルスは、Cタンパク質によるトランス型相補性が欠けているため、インビトロまたはインビボの正常細胞における感染の拡大を起こすことができず、結果として、動物において疾患を引き起こすことができない。
【００１６】
当技術分野で公知のワクチンおよびこれらのワクチンを産生する方法と比較して、本発明は偽感染性フラビウイルスの工業規模生産のシステムを提供し、このことは、そのようなワクチンを不活化ワクチンよりも安価に製造することを可能にし、同時にその利用を弱毒化生ワクチンよりも安全にする。これは、免疫した動物またはヒトにおいて１回のみ複製可能な新型組換えワクチンを提供し、遺伝物質を欠くが有効な免疫原としての役割を果たすウイルスの一部分をなす構造体の粒子(SVP)の放出を導くことによって成される。
【００１７】
本発明は、偽感染性フラビウイルスが、黄熱病ウイルス(YFV)または西ナイルウイルス(WNV)のいずれに対しても製造できることを示す。これに基づいて、本発明は、本明細書に記載された方法が、他のフラビウイルスに対するワクチンの開発に広く適用可能であることを意図する。さらに、そのような偽感染性フラビウイルスを有する正常細胞株の感染は、ヌクレオカプシドおよび遺伝物質を欠くSVPを産生した。本明細書に記載された偽感染性フラビウイルスは、いかなる疾患原因となることも不可能であり、したがって安全であることが示された。さらにこれらの偽感染性フラビウイルスは、1回の複製およびウイルス抗原提示SVP放出の能力により、マウスにおいて免疫原性であった。また、WN PIVもまた、WNVチャレンジ後の致死性脳炎からネズミを保護した。
【００１８】
本明細書記載のPIVは、細胞培養で高い収率で、かつ動物において疾患を引き起こすことができない方法で、産生することができる。これらの産物は動物に送達することができ、それらの欠陥のある複製過程は拡大および疾患を阻止するが、いくつかのフラビウイルスによって引き起こされた疾患に対して効果的な免疫応答を誘発するのに有効であることが示されているフラビウイルスサブユニット免疫原であるSVPの産生は可能である。
【００１９】
本発明はまた、偽感染性フラビウイルスのアプローチが、2つの遠縁の蚊媒介性フラビウイルスに適用できることを示した。ダニ媒介性フラビウイルス(Kofler, 2004)に対するRNAベースワクチンの開発に対する同様の技術の適用は、PIVベースの技術が、より遠縁のフラビウイルスに適用可能であることを示している。さらに、TBEV RNAベースワクチンを用いた研究は、SVP(本明細書に記載されたものと同様)への抗体反応に加えて、ワクチン接種した宿主の細胞中への複製的に活性なフラビウイルスゲノムの導入が、同様にT細胞応答を引き起こすことを示す(Kofler, 2004; Aberle, 2005)。T細胞応答は本明細書では測定されなかったが、PIVは、ウイルス感染により引き起こされたT細胞応答を模倣するT細胞応答を誘導しうると予想される。
【００２０】
本明細書に記載されたPIVワクチンは、同じフラビウイルス複製、およびTBEVに対し調製されるRNAベースのワクチンに利用されるSVP産生戦略に依存するが(Kofler, 2004; Aberle, 2005)、これらのPIVワクチンは動物への遺伝子銃送達を必要とせず、細胞培養で容易に増殖させることが可能であり、商業的に製造されるYFV 17Dワクチンに現在適用されている同じタイプの安定化および保存(凍結乾燥)条件に供することができ、したがって、スケーラブルで、貯蔵可能であり、かつ市場向きのワクチン産物を供給する。WN RepliVAXの安定性における予備研究は、30日間4℃に格納した場合、凍結乾燥製剤は検出可能な力価の低下を示さないことを示した。
【００２１】
偽感染性フラビウイルスの効率的なトランス型相補性(および後の収量)に必要な高レベルの増殖条件を開発するため、本発明は、VEEVレプリコンから高レベルのC(または、C-prM-E)を発現する細胞を利用した。VEEVレプリコンは、他のアルファウイルス由来のレプリコンより細胞変性が少なく、脊椎動物および昆虫由来のいくつかの細胞株における持続的な複製を容易に確立する。このシステムは、(i) VEEVレプリコンが異種タンパク質の合成に高度に効率的であり、かつ本発明では、フラビウイルスゲノムの被包化に必要なレベルまでCが合成された、(ii) VEEVレプリコンは検出可能な程フラビウイルス複製を妨げず(Petrakova, 2005)、そのうえ、VEEレプリコンおよびYF PIVゲノムは、CPEを引き起こさずにBHK-21細胞中で一緒に複製可能である、(iii) VEEVレプリコンは高力価でVEEビリオンにパッケージング可能であり、フラビウイルス構造タンパク質を産生するパッケージング細胞株の迅速な確立に用いることができる、という理由から、偽感染性フラビウイルスの作製に適切と考えられる。
【００２２】
さらに、PIV収量へのC発現の状況の効果の試験から、prMの追加の20アミノ酸を伴う固定された形状のCを発現するパッケージング細胞が、固定されたCを単独で発現する細胞よりも多くの粒子を産生したことが示され、ビリオン形成におけるプロセシング事象の適切な配列の重要性が示唆される。prMの最初の20のアミノ酸を含む構築物によるパッケージング効率の増加の根底にある理由は明らかではないが、この現象は、2つの近接した切断部位(NS2B/NS3およびシグナルペプチダーゼ特異的) (Yamshchikov and Compans, 1994)での特異的な切断指示の必要性、および/またはこれらの2つの異なる状況におけるCタンパク質産物の配分/安定性の差により説明されると考えられる。さらに、prMの断片と共に固定化Cを発現したVEErep/C2/Pacと比較して、CとprMおよびEとの共発現(VEErep/C-prM-E/Pac)がPIV収量の軽微な増大のみを引き起こしたことが観察された。
【００２３】
VEEVレプリコンにコードされるC遺伝子のコドン最適化について、C遺伝子配列のこの改変がPIVの収量を高めたかどうかを判定するために試験した場合、コドン最適化C遺伝子を発現しない細胞からのYFV PIV放出における極端な差は示されなかった。この観察結果は、非最適化遺伝子を用いたとしても、VEEVレプリコンは飽和レベルでCを産生すると考えられることを示唆した。これらの結果は、WNV C-EカセットをコードするVEEVレプリコンを発現した細胞株が、WNV感染細胞中に検出されたものよりも大きなレベルのEを産生したことを示す他の研究と一致していた。トランス型発現した最適化C遺伝子がYF PIVの収量を増加させることができないにもかかわらず、Coptを発現するVEEVレプリコンを保持する細胞は、YF PIVに感染した場合、CPEを発生し、プラークを生じた。これは、複製可能ウイルスにより発生した感染にさらによく似たCopt細胞におけるPIV感染を発生させた。偽感染性フラビウイルス産生におけるYFV Copt遺伝子をコードするVEEVレプリコンの使用の更なる利点は安全性レベルであって、コドンにおける変化が、偽感染性フラビウイルスゲノムとの相同組換えの機会を減少させたことによるものである。さらに、Copt遺伝子はまた、組換えが複製的に活性なCをコードするフラビウイルスを産生する機会を減少させるために、その環状化配列(本明細書において、BHK(VEErep/C*-E*-Pac)細胞のWNV Cコード領域と記載される配列)内が変更された。これまで、本明細書に記載されたWNおよびYF PIVシステムのいずれも、細胞培養、もしくは高い感受性を有する動物のいずれかで検出され得る複製的に活性なフラビウイルスを産生しなかった。さらに、in vivo実験は、YFおよびWN PIVの両方が安全であることを示し、PIVの最も高い用量による3〜4日齢のマウスの頭蓋内接種後でさえ、いかなる疾患も引き起こさなかった。それにもかかわらず、WN PIVは高レベルの中和抗体を誘導することができ、複製能力を有するWNVの感染からマウスを保護した。
【００２４】
さらに、C型肝炎は罹病率および死亡率の主な感染性の原因としてAIDSと並ぶものであり、これに対しては、今もなお利用可能なワクチンが存在しない。日本および韓国では、HCVは現在、最も一般的なタイプの癌の1つであり、かつ肝臓疾患による死亡原因の一般的な状態である肝細胞癌の発生要因として、B型肝炎を上回っている。B型肝炎に対する有効な免疫と結びついたHCVの流行が増加しているため、このパターンは他のアジア諸国および開発途上地域のいたる所でますます一般的になると考えられる。エジプトおよびほかの場所のいくつかの共同体では、C型肝炎感染の流行が目覚ましく高く、伝統的な健康管理習慣、および/または、過去の危険な西欧技術の導入の少なくとも一部が原因と考えられる(例えば、住血吸虫症に対して行われた公衆衛生活動の間の、針を媒介したウイルスの伝播)。
【００２５】
多くの発展途上国では、輸血の間のC型肝炎の有効な管理がほとんど行われず、肝臓癌および硬変の比率が高い。また、C型肝炎は合衆国内で主な公衆衛生問題であり、HCVのキャリヤーは約400万人存在し、その多くが末期の肝臓疾患または肝臓癌のために死の危険にさらされている。現在、合衆国では、毎年、C型肝炎が原因で8,000〜1万人が死亡していると見積もられている。新しい治療法または予防方法がない場合、この数は、可能性としてはAIDSが原因の死亡者数を超えて、次の10〜20年間で3倍になると考えられる。
【００２６】
今もなおこの感染症の予防に利用可能なワクチンは存在せず、また、ワクチン開発の努力(国家的および国際的な努力)は、認識されている技術的困難性、一般に巨大な製薬会社側のワクチン開発に対する関心の低さ、および主要な資金調達機関の無気力さが原因で、厳しく制限されている。そして、多くの感染症のように、C型肝炎が原因で重篤な肝臓疾患または死亡の大きな危険にさらされるのは貧困で恵まれない人々である。
【００２７】
現在までに、HCV感染に対する有効なワクチンを作製する試みは成功していない。しかしながら、ここ数年で、HCV分野は急速に発展をし始め、現在、このウイルスは106inf.u/mlに達する適度に高い力価まで、組織培養中で複製されている。HCVゲノムとYF、JEV、TBE等の他のフラビウイルスのゲノムとの間には、多くの明らかな類似性がある。したがって、フラビウイルス属のメンバーだけでなく、ヘパシウイルス属(HCVを含む)にも、複製能欠損型フラビウイルス設計の戦略を適用できる。HCVカプシドタンパク質は、組換え型のアルファウイルスレプリコン(SINV、VEEV EEEV、およびその他に基づく)によって、HCV感染に感受性があることが現在知られているHuh-7およびHuh-7.5細胞を含む、多くの細胞株で産生されうる。カプシド遺伝子を欠く、複製能欠損型HCVゲノムは、カプシド産生細胞株にトランスフェクトでき、感染性のカプシド含有粒子にパッケージングされる。大量生産に必要な感染の連続が、同様にこれらの細胞に行われ得る。しかしながら、インビボの、ナイーブな肝細胞(およびことによると他の種類の細胞)において、完全なカプシド遺伝子を欠く、または全くカプシド遺伝子を持たないHCVゲノムは、非構造ウイルスタンパク質、ならびに糖タンパク質E1およびE2のみを産生すると考えられる。これらのタンパク質は、(i)プロテアソーム分解後；(ii)細胞表面上で、かつ(iii) E1およびE2含有エンベロープを有するウイルス様粒子の形で、免疫系に提示されると考えられる。カプシド欠損は、ウイルスの拡散を不可能にし、それにより、ワクチン接種用量により感染した細胞に限定されると考えられる。
【００２８】
要約すると、本発明はカプシド欠損型の偽感染性フラビウイルスが、(i)カプシドまたはフラビウイルスの構造遺伝子のすべてを発現する細胞株で感染の拡大を引き起こすことができ；(ii) PIVは正常細胞では感染拡大を引き起こすことができず；(iii) 正常細胞に感染した場合に、PIVはEタンパク質含有SVPを産生し；(iv) PIVは動物で高レベルの安全性を示し；(v) PIVはそれに続くフラビウイルス感染からマウスを保護したことを示した。総合すると、本発明は、フラビウイルスPIVが、フラビウイルス感染およびフラビウイルスと同様のウイルスによって引き起こされた感染に対するワクチンの開発のための、安全で、強力で、かつ有効なプラットホームである可能性を示した。
【００２９】
本発明は、複製能欠損型偽感染性フラビウイルス科に関し、以下を含む：欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組み合わせを妨害しないような、カプシド(C)タンパク質をコードするヌクレオチド配列における欠失を含み、フラビウイルス科のウイルスのCタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞においてのみ複製する、フラビウイルス科。一般に、フラビウイルス科は、フラビウイルス属、ヘパシウイルス属、もしくはペスチウイルス属に属するウイルス、または他のウイルスのprM-Eカセットを偽感染性フラビウイルス科のprM-Eカセットと交換することにより作製された、該ウイルスの他のキメラを含む。フラビウイルス属に属するウイルスの例は限定されないが、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルスも含み得る。さらに、ヘパシウイルス属に属するウイルスの例は、C型肝炎ウイルスを含むがこれに限定されず、またペスチウイルス属に属する例は、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ブタ熱ウイルス、または豚コレラウイルスを含むがこれらに限定されない。
【００３０】
フラビウイルスの場合、欠失した、フラビウイルスのCタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Cタンパク質のアミノ酸26〜100、もしくはアミノ酸26〜100内のアミノ酸の組み合わせをコードしうる。そのような組合せは、アミノ酸26〜93、31〜100、または31〜93を包含する場合があるが、これらに限定されない。当業者は、フラビウイルス科に属する他のウイルス、またはこれらのウイルスと同じ遺伝子構造を有する他のウイルス由来のCタンパク質のヌクレオチド配列を欠失させるために、同じガイドラインを用いることができる。一般に、かつすべてのウイルスに当てはまるが、欠失した遺伝子は、マーカータンパク質または抗原をコードする遺伝子により置き換えた。マーカータンパク質の例には緑色蛍光タンパク質が含まれるがこれに制限されない。
【００３１】
また本発明は、フラビウイルス科のウイルスのCタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはそれらの組み合わせを発現する細胞培養システムに関し、適切な条件下で上記の複製能欠損型フラビウイルス科の増殖を可能にするのに有効である。この目的のため、フラビウイルス科の野生型または変異型タンパク質を発現する細胞は、ウイルスベクターから得られた遺伝子操作されたレプリコンを用いて作製される場合がある。
【００３２】
一般に、レプリコン中の、フラビウイルス科ウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子が、該ウイルスのタンパク質をコードしている遺伝子のコドン最適化バージョンにより置換されており、該置換が、細胞株にコードされている遺伝子のフラビウイルス科の偽感染性ウイルスのゲノムと組換えを起こす能力を減少させ、かつ／またはフラビウイルス科の偽感染性ウイルスの産生を増加させる。
【００３３】
例えば、そのようなレプリコンは、フラビウイルス科のウイルスのCタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも36ヌクレオチド部位に変異を有するCタンパク質を発現しうる。非天然の環状化配列を含むレプリコンにおいてレプリコンがCタンパク質を発現し、該環状化配列の存在が、複製能欠損型偽感染性ウイルスと天然ウイルスとの増殖性の組換えの機会を減少させる。さらに、タンパク質を発現し得るレプリコンは切り詰められたC-prM接合部をコードする改変ヌクレオチド配列を含み、該改変配列の存在が、細胞培養における複製能欠損型偽感染性ウイルスの収量、インビボにおけるprM/E含有SVPの収量、またはそれらの組合せを増加させる。
【００３４】
さらに、フラビウイルス科のタンパク質を発現するレプリコンは、インビトロ合成されたレプリコンRNAのトランスフェクション、細胞性RNAポリメラーゼII特異的プロモーターから機能的なアルファウイルスレプリコン合成するために設計されたプラスミドDNAのトランスフェクション、またはアルファウイルス構造タンパク質内にパッケージングされたアルファウイルスレプリコンの感染によって細胞へ導入される。本明細書で使用されたウイルスベクターはアルファウイルスであってよい。そのようなアルファウイルスの代表的な例には、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、シンドビスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、またはロスリバーウイルスが含まれるが、それらに限定されない。
【００３５】
さらに本発明は、以下を含むフラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを産生する方法に関する；欠失がゲノム環状化に必要なRNA配列、prM/Mの適切な成熟に必要なprMタンパク質のシグナル配列、またはそれらの組合せを妨害しないような、カプシド遺伝子における欠失を有する、フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスを作製する工程；フラビウイルス科の複製能欠損型偽感染性ウイルスの増殖に必要な高レベルのタンパク質を提供する細胞株である、フラビウイルス科のウイルスのCタンパク質、またはC、prM、エンベロープタンパク質、変異Cタンパク質、変異prM、変異エンベロープタンパク質、またはこれらの組み合わせを発現する細胞株を作製する工程；ならびに、フラビウイルス科の偽感染性ウイルスに細胞株を感染させて、それによってフラビウイルス科の複製能欠損型ウイルスを作製する工程。ウイルスの種類、カプシド遺伝子における欠失部位、フラビウイルス科の変異型および野生型タンパク質を発現する細胞株作製方法、レプリコンの型、ならびにレプリコン中の変異、ならびにレプリコンにおけるフラビウイルス科の変異型および野生型タンパク質をコードする遺伝子における修飾に関する他のすべての局面は、上記と同様である。
【００３６】
また、本発明は上記方法で産生されたフラビウイルス科の複製能欠損偽感染性ウイルスを含む、薬学的組成物に関する。本発明はさらに、本明細書に記載された薬学的組成物の免疫学的有効量を被検者へ投与することを含む、フラビウイルス科への暴露に起因する感染から被検者を保護する方法に関し、該組成物は被検者においてフラビウイルス科に対する免疫応答を誘発し、それにより感染から被検者を保護する。そのような組成物は腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経口的、または、鼻腔内の経路で投与されてもよい。さらに、この組成物の使用の利益を得る被検者は、ヒトまたは動物であってよい。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「a」または「an」という用語は1つまたは複数を意味し得る。本明細書の特許請求の範囲において使用される際、「含む」という用語と併用して用いられる場合、「a」または「an」という用語は1つまたは複数を意味し得る。本明細書において使用される場合、「他の(another)」または「他の(other)」という用語は、同じもしくは異なる請求項要素またはそれらのコンポーネントの少なくとも2つ目またはその他を意味し得る。本明細書において使用される場合、「フラビウイルス科」という用語はフラビウイルス属、ヘパシウイルス属、およびペスチウイルス属を含む。フラビウイルス属に属するウイルスの例には、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはマレー渓谷脳炎ウイルスが含まれるがこれらに限定されない。同様に、ヘパシウイルス属に属するウイルスの例には、C型肝炎ウイルスが含まれるがこれに限定されず、ペスチウイルス属に属するウイルスの例には、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブタ熱ウイルス、またはブタコレラウイルスが含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
さらに、本発明は、フラビウイルス属に属する複製能欠損型偽感染性フラビウイルス科ウイルスの構造および有用性を開示し、当業者は、フラビウイルス科に属する他のウイルスを含むキメラ構築のため、またはフラビウイルス科内のウイルスもしくは他の同様のウイルスとフラビウイルス科内のウイルスのprM-Eカセットを交換することによるキメラ構築のために同じガイドラインを利用できる。
【００３９】
本明細書において考察されたフラビウイルス科に属する偽感染性ウイルスを含む薬学的組成物は、互いにまたは他の薬学的組成物と共に同時にまたは連続して投与されてもよい。そのような組成物の同時投与の効果は、そのようなウイルスおよび他のワクチンで治る疾患によって引き起こされる感染から個体を保護することである。本明細書に記載の組成物、他の薬学的組成物、またはそれらの組み合わせは、独立して、全身的にまたは局所的のいずれかで、当技術分野において標準的な任意の手法、例えば、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、皮内、筋肉内、局所的、経腸的、直腸的、経鼻的、口内、腟内に投与されるか、または吸入スプレーにより、薬剤ポンプにより、または経皮パッチもしくはインプラントの中に含まれたものにより、投与されうる。本明細書に記載された組成物の投与製剤は、従来の無毒で生理学的もしくは薬学的に許容される担体、または投与の方法に適切な賦形物を含んでいてよく、当業者に周知である。
【００４０】
本明細書に記載された組成物、他の薬学的組成物、またはそれらの組合せは、治療効果を達成、維持、または改善するために独立して1回または複数回投与されてもよい。用量の決定、または1回投薬量もしくは複数回投薬量を含む組成物のいずれかまたは両方の適切な用量かどうか決定は当業者の技術の範囲内である。適切な用量は被検者の健康、フラビウイルス感染からの個体の保護、投与経路、および用いられた製剤に依存する。
【００４１】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する目的で提供されており、いかなる形においても本発明を限定することを意図したものではない。本発明が、本明細書に内在する目的、目標、および利益と同様に、言及された目的の達成ならびに目標および利益の取得のために十分適合化されていることを、当業者は容易に理解するであろう。添付の特許請求の範囲により定義された本発明の趣旨に含まれる変更およびその他の用途は、当業者により想起されよう。
【００４２】
実施例1
細胞培養
BHK-21細胞はPaul Olivoから提供された(ワシントン大学, St. Louis, Mo)。それらを、10％ウシ胎仔血清(FBS)およびビタミンを添加したアルファ最小必須培地(αMEM)において37℃で維持した。ヒトのワクチン製造に用いるため最初に調製されたWHO-認定Vero細胞は、NIHのSteve Whitehead博士から提供された。Vero細胞を6% FBS含有MEMで維持した。
【００４３】
実施例2
プラスミド構築
標準的な組換えDNA技術をすべてのプラスミド構築に用いた。用いたプラスミドの概略図を図7A〜7Fに示す。地図および配列を図8A〜8Fに示す。YFV 17D株ゲノムの感染性cDNAを含む低コピー数親プラスミドpACNR/FLYF-17Dxは他で述べられており(Bredenbeek ら、2003)、Charles M. Rice博士(ロックフェラー大学, New York, N.Y.)より提供された。pYFPIVは、YFカプシド遺伝子のアミノ酸26〜93をコードする断片がpEGFP-N1(Clontech)由来のコドン最適化GFP遺伝子により置換されている、欠損のあるYFVゲノム(YF PIV)を有した。WN PIVゲノム(pWNPIV)は、Cのコドン30をCのコドン101へ融合することにより、Texas 2002感染性cDNA(Rossi ら、2005)から得た(図5A参照)。プラスミドpVEErep/Cl/Pac、pVEErep/C2/Pac、およびpVEErep/C-prM-E/Pac(図2A)は、二重サブゲノムVEEVレプリコンをコードし、そこでは、最初のサブゲノムのプロモーターが、YFVゲノムのnt 119〜481、119〜541、および119〜2452にそれぞれ相当する配列が後に続くVEEV26S RNAの5'UTRを含むRNAの転写を誘導した。2番目のサブゲノムプロモーターは、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ(Pac)遺伝子の発現を誘導し、その遺伝子産物は細胞をピューロマイシン(Pur)が原因の翻訳阻止に抵抗するようにしていた。Pac遺伝子と融合したWNV{シンドビスウイルスレプリコン(pVEErep/C*-E*-Pacと命名)(Scholle ら、2004)に由来}のC-prM-Eカセットを発現する非細胞変性VEEVレプリコンは、VEE非細胞変性レプリコン(Petrakova ら、2005)から作製した；E-コード配列は、NS1の最初の9つのコドンおよびNS2Bの最後の25のコドンから成るリンカーを介したPac遺伝子と融合し、続いてNS3の2つのコドンは直接FMDV2Aと融合した(図5A参照)。YFV 17Dカプシドをコードするコドン最適化配列および最初のprMの20アミノ酸を、別の文献に記載されたコドン頻度データを利用して設計した(Haas ら、1996)。この遺伝子を、オーバーラップする合成オリゴヌクレオチドからPCRによって合成した。増幅された断片を、発現カセットVEErep/C2opt/Pacおよび VEErep/Copt-prM-E/Pac中にクローニングする前に配列決定した。後者のレプリコンは、基本的にpVEErep/C2/PacおよびpVEErep/C-prM-E/Pacと同じデザインを有したが、図4Aに示したコドン最適化配列を含んだ。
【００４４】
さらに、JEV prM-Eを発現するキメラWN-RepliVAXも作製した。これはWNVゲノムをコードするRepliVAXにおけるJEVのNakayama株のprMおよびE遺伝子を置換することによって構築した。遺伝子交換は、切り詰められたWNV Cタンパク質の最後のコドンをJEV(Nakayama株)のprMコード配列の最初のコドンへ直接融合させることによって達成された。同様の融合方法を、JEV Eタンパク質の最後のコドンをWNVのNS1の最初のコドンへ直接に融合させたカセットの3'末端で用いた。これらの融合を、T7プロモーターおよびリボザイムに結合したWN RepliVAX cDNA全体をコードするBACプラスミドに導入し、このBAC DNAから回収したRNAをBHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)細胞の中に導入した。結果として生じるRepliVAX(JE RepliVAXと命名)は、BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)における伝播性の感染性増殖巣を形成した。WN RepliVAXと同様に、この細胞株に形成された増殖巣は、完全な感染性WNV JEVキメラによって生じたものより小さい。JE RepliVAXは、BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)における106U/ml以上の力価を達成するWN RepliVAXより約10倍低い力価まで増殖する。予想されたとおり、JE RepliVAXはJE特異的なMAbと反応し、キメラフラビウイルスのように、JE RepliVAXは高レベルのJEV中和抗体を誘導し、JEから保護すると予想される。
【００４５】
実施例3
RNA転写
プラスミドをCsCl勾配において遠心分離によって精製した。転写反応前に、プラスミドをXhoI(pYFPIV用)またはMhuI(VEEレプリコンおよびVEEヘルパーをコードするプラスミド用)またはSwaI(pWNPIV用)によって直鎖状にした。RNAをキャップアナログの存在下でSP6またはT7RNAポリメラーゼにより合成した。転写物の収量および完全性を非変性条件下でゲル電気泳動によって分析した。転写反応物のアリコートを、さらなる精製をせずにエレクトロポレーションに用いた。
【００４６】
実施例4
RNAトランスフェクションおよびPIV複製分析
BHK-21細胞のエレクトロポレーションを、以前に記載された条件(Liljestrom ら、1991)下で行った。パッケージング細胞培養を確立するため、VEEVレプリコンのエレクトロポレーションの24時間後に10 g/mlの濃度となるようにPurを培地に添加した。インビトロ合成されたYF PIVゲノムのトランスフェクションを、レプリコン含有細胞が効率的な増殖を再開する、5日後に行った。図面に示された時点で、Purを含む同じ培地で培地交換することによってサンプルを回収した。多くの試験において、PIV-分泌細胞をコンフルエントに達した後分割した。
【００４７】
BHK-21細胞の中へ、インビトロ合成されたレプリコンおよび2ヘルパーRNA(Volkova ら、2006)の同時エレクトロポレーションにより、VEEVレプリコンをVEEV感染性ビリオンにパッケージングした。レプリコン含有ウイルス粒子を、トランスフェクションの24時間後に回収し、ナイーブなBHK-21細胞の感染、続いてPur選択に利用した。WN PIVの場合、インビトロ合成されたPIV RNAを、WN C、prMおよびEならびにPacを発現するVEErep/C*-E*-Pac レプリコンを含むBHK細胞[BHK(VEErep/C*-E*-PAC) 細胞]にトランスフェクトした。VEErep/C*-E*-PACゲノムのスキームを図5Aに示す。回収されたPIVを、標準的な方法(Rossi ら、2005)を用いてこれらの細胞において継代した。
【００４８】
実施例5
YF PIVの力価の測定
放出されたYF PIVの力価を測定するため、BHK-21細胞を6-ウェルコースター皿中に、5 x 105 細胞/ウェルの濃度で播いた。4時間後、細胞を、異なる希釈度のパッケージングされたレプリコンに感染させ、5% CO2インキュベーターにおいて37℃で1時間インキュベートした後、それらを10％FBSを添加した2 ml MEMで覆った。感染細胞数を、倒立UV顕微鏡下でGFP-陽性細胞を数えることによって測定した。播いた量から感染細胞の割合を、顕微鏡視野の規定の領域における蛍光産生細胞の計数により求めた。5つの異なる領域に対する計数を平均し、各希釈系列に対応する力価について再計算した。後者の実験では、細胞をプラーク発生のためにアガロース下で5日間インキュベートし、その後2.5%のホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色したことを除いて、力価は、以前に記載された条件(Lemm ら、1990)を用いて、VEErep/Copt-prM-E/Pacレプリコンを保持する単層のBHK-21細胞のプラークアッセイにより測定した。
【００４９】
実施例6
YF PIVの継代
パッケージング細胞株を、インビトロ合成されたVEEVレプリコンRNAのトランスフェクション、または10 inf.u/細胞の感染の多重度(MOI)でVEEV構造タンパク質へパッケージングされた同じレプリコンを細胞に感染させることによって樹立した。Pur選択後、それらを異なるMOIでYF PIVに感染させた。培地を交換することによって、サンプルを図面に指摘された時点で回収した。
【００５０】
実施例7
YF SVP産生の分析
BHK-21細胞を100-mm皿あたり2 x 106の濃度で播いた。37℃で4時間インキュベーションした後、細胞を10 inf.u/細胞のMOIでYF PIVに感染させ、その後、10％FBSを添加したMEM 10 ml中で24時間インキュベートした。その後、培地を無血清培地VP-SF(Invitrogen) 10mlに交換し、SVP放出を分析するため24時間ごとに交換した。回収されたVP-SFサンプルを低速遠心分離(5,000 r.p.m, 10分, 4℃)によって精製し、その後、39,000 r.p.m, 4℃で6時間SW-41ローターにおいて、PBSにおいて調製された、10%ショ糖 2mlを介する超遠心分離により濃縮した。ペレット材料を、β-メルカプトエタノールを欠く(D1-4G2 MABへの結合維持のため)、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のローディングバッファー中に溶解し、さらにウエスタンブロッティングにより分析した。タンパク質のトランスファー後、ニトロセルロース膜をD1-4G2 MAB、およびSanta Cruz Biotechologyから購入したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)-結合ロバ抗マウス二次抗体により処理した。HRPを、製造元(Santa Cruz Biotechnology)の推奨に従って、ウエスタンブロッティングルミノール試薬を用いて検出した。陽性対照サンプルを得るため、YFV (2x108 PFU)を、SVPに関して上述したように、10%ショ糖クッションを介して超遠心分離に供した。
【００５１】
YFV SVPのショ糖密度勾配分析のために、BHK-21細胞にインビトロ合成されたYF PIVゲノムRNAをエレクトロポレーションした。トランスフェクションの24時間後に、全MEMをVP-SF培地に交換し、24時間後に回収した。この時点で、95%を上回る細胞が、GFP陽性であり、CPEのいかなる兆候も示さなかった。回収したサンプルを低速遠心分離(5000 rpm. 10分、4℃)により精製し、その後、4℃、25,000 rpmでSW-28ローターにおける終夜の遠心分離により濃縮した。得られたペレットをTNバッファー(10 nm Tris HCl(pH7.5)、10O mM NaCl、0.1% BSA)に懸濁し、更なる分析を記載(Schalich ら、1996)のように実施した。
【００５２】
簡潔にいうと、0.5 mlサンプルを、不連続ショ糖勾配(PBSバッファーで調製した50%ショ糖1.5 ml、35%ショ糖1.5 ml、および10%ショ糖1.5ml)にロードした。遠心分離を、Optima MAX Ultracentrifuge (Beckman)において、1時間4℃で45,000 rpmでSW-55ローターにおいて行った。ペレットを、β-メルカプトエタノールを欠く(D1-4G2 MABへの結合維持のため)、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動用のローディングバッファーに溶解し、さらにウエスタンブロッティングにより分析した。タンパク質のトランスファー後、ニトロセルロース膜をD1-4G2 MAB、およびSanta Cruz Biotechnologyから購入したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)-結合ロバ抗マウス二次抗体により処理した。HRPを、製造元(SantaCruz Biotechnology)の推奨に従って、ウエスタンブロッティングルミノール試薬を用いて検出した。並行して勾配分析をYFV (2 x 108 PFU)で行い、YFP-PIV由来のSVPに関する上記の同じ方法に供した。
【００５３】
実施例8 
WN PIVの分析
WN PIVの力価を、ウイルスの系列希釈をVero細胞単層に感染させ、それから24時間後に固定し、既に記載されたように(Rossi ら、2005)、WNVに特異的なポリクローナル過免疫マウス腹水で免疫組織化学染色を行うことにより測定した。感染細胞を数え、力価の測定に用いた。Vero細胞またはBHK(VEErep/C*-E*-PAC)細胞における増殖巣形成に関するWN PIVの能力を評価するために、上記同様、単層に希釈液のWN PIVを感染させ、半固体トラガカントオーバーレイで覆い、37℃でインキュベートし、それから固定し、WNV NS1に特異的なMAB(E.Konishi、神戸、日本により提供された)で染色した。
【００５４】
実施例9
PIV安全性調査
PIVの安全性を、頭蓋内(i.c.)経路(20 ml容量)による3〜4日齢マウス(非近交系Swiss Webster, Harlan)への、または腹腔内(i.p.)経路(100 ml容量)による4〜5週齢メスマウス(非近交系Swiss Webster、Harlan)への、異なる用量のウイルス(親の感染性cDNAから回収したYFV 17DまたはWNV TX02)またはPIVの接種により確認した。マウスを、疾患の兆候および死亡について14日間モニタリングし、瀕死、および翌日まで生存が不可能とみられた動物は、人道的に安楽死させ、翌日に「死亡」と記録した。
【００５５】
実施例10
WN PIV効力および有効性調査
上述のようにWN PIVを接種され選択された動物を、接種の21日後に安楽死させ且つ採血した。血清を動物から回収し、プールし、上述の方法を用いて、Vero細胞単層上におけるWNV増殖巣形成を減少させるそれらの能力について試験した。残った動物をWNVのNY99株(Xiao ら、2001)の約100 LD50に対応する、1,000 inf.u(Vero細胞上の増殖巣形成アッセイによって決定された)で接種し、また動物をその後上述のようにさらに14日間観察した。
【００５６】
実施例11
YFV C-およびYFV C-prM-E発現カセットは両方、YFV PIVの複製を補完できる
フラビウイルスゲノムにおける、あるC欠失の欠陥を補完するための全体的な戦略を図1に示す。これは、C遺伝子を欠いているゲノムの発生、および、Cを発現する細胞におけるこれらの偽感染性ウイルスゲノム(PIVゲノム)の伝播(または、ウイルス性構造タンパク質のすべて)に基づいているが、正常細胞におけるものではない。PIVゲノムにおける欠陥のトランス型の補完に必要なウイルス性構造タンパク質を産生しない、後者の細胞における複製は、重要な保護的な免疫原Eを含むが、Cおよびウイルス性の遺伝物質を含むヌクレオカプシドを欠いているSVPの放出につながる。
【００５７】
組換え型のYFVゲノム(YF PIVゲノム)は、Cの26〜93アミノ酸の代わりにGFPを含むように設計し、ポリペプチドの残りとインフレームになるようにクローニングした(図2A)。GFPの発現は、実験におけるゲノム含有PIVの力価の測定に便利な方法を提供した。このPIVゲノム由来のCコード配列における欠失は、機能的なヌクレオカプシドを形成するCの能力を消失させると予想されたが、prMおよびEの機能的な形状の産生に影響するとは予想されなかった。したがって、GFP蛍光を発する、このゲノムを発現する細胞は、感染性ウイルスを放出できなかった。しかしながら、高レベルのCを発現する「パッケージング」細胞からは、感染性子孫ウイルスが産生されると予想された。
【００５８】
効率的なPIV産生のための細胞株の迅速な発生のために、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)ゲノムに基づく発現系(レプリコン)(Petrakova ら、2005)を用いた。VEEVレプリコンは、他のアルファウイルス由来レプリコンよりも細胞変性が少なく、容易に脊椎動物および昆虫由来のいくつかの細胞株において持続的な複製を確立する。発現カセットを、サブゲノムプロモーターのうちいずれか1つがPacの発現を誘導し、トランスフェクトされた培養物におけるPac-発現VEEVレプリコンを含まない細胞を排除するための効率的な手段を提供する、二重サブゲノム構造として設計した(図2B)。2番目のサブゲノムプロモーターは、YFV構造タンパク質をコードするサブゲノムRNAの転写を誘導した。最も効率的なパッケージングカセットを特定するために、VEEVレプリコンは、(i)固定されたC(Lindenbach and Rice, 2001)としても知られているprMのシグナルペプチドを伴うYFV C(VEErep/Cl/Pac)、または(ii)前記シグナルペプチド、およびprMの20アミノ酸を伴うC(VEErep/C2/Pac)、または(iii) YFV構造タンパク質のすべて(VEErep/C-prM-E/Pac)、のいずれかをコードする。設計の理論的根拠は、適切な細胞画分にCを標的にするのに必須であると予想された、Cをコードするカセットにおいてシグナルペプチドを保持することである。
【００５９】
インビトロ合成されたVEEVレプリコンRNAをBHK-21細胞中にトランスフェクトし、PurR安定細胞株を、その後4〜5日にわたってPur含有培地において選択した。トランスフェクション後の最初の2〜3日の間、VEEV由来RNAの複製は成長停止を引き起こし、その後、先に記載されたように(Petrakova ら、2005)、複製は効率が低下し、細胞はそれらの増殖を再開した。結果として得られたPurR培養物を、インビトロ合成されたYF PIV RNAでトランスフェクトし、トランスフェクション後の異なる時間で、GFP発現ゲノムを含有する放出された感染性粒子の力価を測定した(図2C)。驚くべきことに、BHK-21細胞中の2つの異なる複製RNA(YFVおよびVEEV特異的)の存在は、細胞変性効果(CPE)をもたらさず、Purへの耐性およびGFPの高レベルの発現の両方を維持していることから、VEEVレプリコンおよびYF PIV RNAの両方の複製を示した。図2Cに示すように、これらのマーカー遺伝子の両方を発現する培養物は成長する能力を有し、培養物がコンフルエントに達するのを防ぐためにサブ継代を必要とした(〜1:5の比率で4日間毎)。図2に示された実験は、3つのVEEVレプリコン全てが、感染性PIVの形成に十分なレベルでYFV Cを供給可能であることを示し；感染性粒子は、VEEVレプリコンの非存在下でYF PIV RNAをトランスフェクトしたナイーブなBHK-21細胞から放出されなかった(データ示さず)。しかしながら、これらのパッケージングカセットを発現する細胞は、PIVを産生する能力が異なった。YFV Cの後にprMシグナルペプチドを発現する構築物(固定されたC; VEErep/Cl/Pac)が、より長いタンパク質配列を発現するカセットと比べて、最も低いレベルのYF PIV RNAパッケージングを示した。Cl構築物による、より低いパッケージング効率の根底にある理由は不明確だが、この現象は、2つの近接する切断部位(NS2B/NS3およびシグナルペプチダーゼ) (Yamshchikov and Compans, 1994)での特異的な切断指示の必要性、および/またはこれらの2つの異なる状況において産生されたCタンパク質の配分/安定性の差により説明されると考えられる。したがって、これらの実験の後に、VEErep/Cl/Pacをすべての後の実験から排除した。VEErep/C2/PacおよびVEErep/C-prM-E/Pacレプリコンの両方が、107inf.u/mlを上回る力価に達する同様の力価までYF PIVをパッケージングした。そのうえ、PIV粒子の放出は実験が終わるまで続き、各細胞の放出は24時間当たり約20個の感染性YF PIVであった。同じ細胞は恐らく、ヌクレオカプシドおよびゲノムを欠いているprM/E含有SVPも放出したが、この可能性に関するさらなる調査は行わなかった。
【００６０】
実施例12
欠陥ゲノムを有するYF PIVは大規模に産生可能である
ワクチン候補としてのPIVの究極の有用性は、例えば商業生産に必要な規模でこれらの粒子を産生する能力に依存する。ワクチン製造に関するRNAベースのトランス型相補性系(VEEVレプリコン)への信頼性は、RNAウイルスのゲノムの中にクローニングされた異種遺伝子における変異蓄積の可能性があるため、更に標準化が必要とされる。継代数の少ない細胞株の使用は、この限界を克服するための解答の1つである。あるいは、ナイーブ細胞へのレプリコンのトランスフェクションの繰り返しによって、またはナイーブ細胞の感染が後に続くパッケージングされたVEEVレプリコンの産生によって、VEErepゲノムにおける変異の蓄積を最小にできる。パッケージングされたVEEレプリコンの使用は、パッケージング細胞株を樹立するための1つの単純且つ効率的な手段であると考えられた。
【００６１】
効率的にPIVを産生するため、先にパッケージングされたVEEVレプリコンにおいてアルファウイルスレプリコン発現細胞培養物の作製を可能にする技術を用いた。簡潔にいうと、VEEVレプリコンを、先に記載した2-ヘルパーシステム(Volkova ら、2006)を用いて、VEEV感染性ビリオン中に、109 inf.u/mlに達する力価を含有している調製物中にパッケージングした。これらの粒子に感染し、またPurの存在下で選択されたBHK-21細胞は、3〜5日でYFV構造タンパク質をコードする細胞培養物を得るのに用いられうる。樹立後、VEErep/C2/PacおよびVEErep/C-prM-E/Pac含有細胞株を、高い(10 inf.u/細胞)および低い(0.1 inf.u/細胞)MOIで、YF PIVの予め作製したサンプルに感染させた。すべての場合において、欠陥を有するYFVは増殖的に複製し(図3参照)、高力価のPIVを産生する単層においてすべての細胞に感染した。したがって、PIVの感染が後に続く、パッケージングされたVEEVレプリコンに細胞を感染させることによるパッケージング細胞株の樹立が、ゲノム中のC配列が欠失したPIVの大規模産生にとって単純且つ効率的システムであると考えられる。
【００６２】
実施例13
YFV C遺伝子のコドン最適化形態を発現するVEEレプリコンを用いるYF PIV
欠陥ウイルスの複製をサポートするためにパッケージングシステムを用いることに対する別の起こりうる問題は、欠陥ウイルスゲノムとトランス型相補性遺伝子をコードするRNAとの間の組換えである。そのような組換えは、感染性ウイルスの発生につながると考えられる。本明細書において記載された実験では、感染性YFVはプラーク分析法を用いても全く検出されなかったが、生ウイルスがこれらの細胞において形成されうる可能性を排除する必要があった。
【００６３】
さらに、多くの節足動物媒介ウイルスによりコードされたタンパク質が、2つの非常に異なる宿主における翻訳機構を利用するために進化したと予想される。したがって、それらのコドン利用は、どちらかの宿主では発現に最適とは予想されない。したがって、発現カセットにおけるCコード配列は、以下の2つの目的を実現するように改変された：(i) C産生の収量を高めること、および(ii) YF PIVゲノムとVEEレプリコンのCをコードするサブゲノムRNAとの間の相同組換えの可能性を減少させること。YFV Cは、最も効率的に翻訳された哺乳類遺伝子(図4A)において見い出されたコドン頻度を用いて合成された。また、これらのサイレント突然変異は、フラビウイルスゲノム複製に必要な環状化配列を乱し、したがってYF PIVゲノムとVEEVレプリコンのYFV CをコードするRNAとの間の組換え事象において、複製可能なYFVを発生させる可能性を減少させる。
【００６４】
Copt遺伝子を、VEErep/C2/Pac およびVEErep/C- prM-E/Pacと同じ戦略を用いて、VEErep構築物であるVEErep/Copt/PacおよびVEErep/Copt-prM-E/Pac中にクローニングし、ならびにトランス型相補性PurR細胞株を、RNAをトランスフェクションすること、またはパッケージングされたRNAを細胞に感染させることのいずれかによって樹立した。インビトロ合成されたPIVゲノムRNAのこれらの細胞へのトランスフェクションは、最適化されていないYFV Cの遺伝子を発現するVEEVレプリコンを発現する細胞で選択されたものと同様の効率でPIVを生じた(図4B)。しかしながら、コドン最適化Cを発現する細胞は、CPEを発生させ、且つYF PIVを感染させ低濃度のFBSの培地を含むアガロースで覆った場合に可視的なプラークを明確に形成させることが可能なことから(図4C)、有用な反応物であると判明した。したがって、YFV C遺伝子のコドン最適化は、これらの細胞からのPIV産生を変化させなかったが、コドン最適化YFV Cを発現する細胞は、特に蛍光マーカーを全く発現しないYF PIVの評価に、非常に有用なシステムを示す。追試では、プラーク形成アッセイおよびGFP増殖巣アッセイで測定した同じサンプルの力価間で非常に良好な相関関係が観察された。
【００６５】
YF PIVによって形成されたプラークは、ウイルス粒子形成において、より効率的にシス機能において構造タンパク質が産生される可能性がもっとも高いことを示すYFVによって形成されたプラークよりも小さい。プラークを形成する能力を獲得する理由は、まだ完全に理解されたわけではない。しかしながら、本タンパク質のコドン最適化バージョンを発現するVEEVレプリコンを含む細胞株が、天然C遺伝子をコードしているレプリコンを有する対応するカウンターパートよりも低い増殖率を示したことから、YFV Cはいくらかの細胞障害性レベルを有すると推測される。したがって、YF PIVゲノム複製は、CPEを引き起こすのに十分な、細胞内環境における付加的な変化をもたらすと考えられる。
【００６６】
実施例14
PIVは他のフラビウイルスに関しても作製可能である
PIVが他のフラビウイルスに関して容易に作製可能であることを立証するため、上記戦略をWNVに適用した。このために、35アミノ酸長のCタンパク質を有するWN PIVゲノムを作製した(図5A)。このWN PIVゲノムをパッケージングするため、WNV C/prM/E およびPac を発現する非細胞変性VEEVレプリコンをBHK細胞にトランスフェクションすることにより作製したパッケージング細胞株[BHK(VEErep/C*-E*-Pac)]を用いた。この細胞株で複製するWN PIVゲノムとCタンパク質をコードするVEErep RNAとの間の組換えが、感染性WNVの発生につながる機会を最小にするため、VEEVレプリコン中のWNV Cをコードする遺伝子を、WNV環状化ドメインにクラスター化したサイレント突然変異を含むように改変した。
【００６７】
合成WN PIVゲノムをトランスフェクトしたBHK(VEErep/C*-E*-Pac)細胞から回収した培地は、パッケージング細胞において抗原陽性増殖巣を生じることが可能であった(図5B)。これは、感染性WN PIVが産生されていたことを示す。しかしながら、抗原陽性細胞のみが、同じサンプルによるVero細胞単層の感染時に検出された(図5C)。最大1 x 108 inf.u/mlまでのWN PIVの力価がパッケージング細胞で生じ、また予想されたように、WN PIVはこの細胞株で繰り返し継代可能であった。したがって、樹立された細胞株を用いて、YFVに関する上述の同じ相補性システムを用いることで、WIN PIVの高い力価の系統を容易に得ることができる。興味深いことに、WNVパッケージング細胞株およびWN PIVの場合、CPEの出現と同時に、感染においてウイルス収量が横ばいになることが遅れたのに対して(結果示さず)、YF PIVゲノムとVEEVレプリコンを共に複製する細胞は、何日もPIVを産生し続けたことが観察された(図2)。
【００６８】
実施例15
YFまたはWN PIVで感染した細胞はSVPを産生する
PIVに感染した細胞がSVPを産生したことを示すために、BHK-21細胞を、インビトロ合成されたYF PIV RNAでトランスフェクトするか、またはC-発現細胞において産生されたYF PIVに感染させた。BHK-21細胞から放出された粒子を、超遠心分離で精製し、Eに特異的なマウスモノクローナル抗体(MAB)であるD1-4G2(Gentry ら、1982)を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。RNAトランスフェクト細胞およびPIV感染細胞の両方が、培地からペレット化できたEタンパク質を産生し(図6A)、これは、Eタンパク質が粒子形状で存在したことを示している。これらの細胞がいかなるCPEも示さず、またサンプルが超遠心分離前に低速遠心分離で精製されたため、ペレット化画分で検出されたEタンパク質が、細胞性デブリを示す可能性は低い。同様に、WN PIVで感染したVero細胞が、(CPEのいかなる兆候の発生前に)WNV感染Vero細胞により産生されたものとサイズにおいて区別がつかなかった細胞外形状のEを産生したことが、ウェスタンブロット分析により示された(図6B)。
【００６９】
PIV感染細胞によって放出されたEタンパク質の物理的性質をさらに評価するため、複製PIVゲノムのみを含む細胞から回収された培地を、公表データ(Schalich ら、1996)に従ってショ糖密度勾配分析に供した。SVPを、2%のショ糖を有する画分で発見した(図6C)。同じ実験で、YFVビリオンは高い密度を示し、42%ショ糖を有する画分で検出された。また、WNV SVPの予想サイズで移動するEタンパク質含有粒子は、WNV PIV感染培地で検出された。PIV-感染細胞の培地におけるEの存在は、prM/Eのみを発現する細胞または機能的なC遺伝子を欠いているTBEV RNAワクチンによるSVPの産生と一致した。
【００７０】
実施例16
動物における、PIVの安全性、効力、および有効性
WNおよびYF PIVの安全性は、すなわち、3〜4日齢のマウスの同腹子の頭蓋内接種により証明した。これらの研究は、WT YFVまたはWNVを接種されたマウスはすぐに死に、これらウイルスがこれらの動物において約1PFUの50パーセント致死量(LD50)を示すことを示した(表1)。しかしながら、2 x 106 inf.uの用量で乳飲みマウスに接種されたWNおよびYF PIVは、いかなるマウスも殺すことができなかった(表1)。安全性は、野生型(wt)ウイルスおよびWN PIVによる成体マウスの腹腔内接種によってさらに実証した。これらの研究は、WN PIVが成体マウスで完全に安全であることを示した(表2)。さらに、1 PFU未満のLD50でwt WNVは成体マウスの多くを殺し、WN PIVの最大3 x 106 inf.uの用量では、どんな死も引き起こすことができなかった(表2)。しかしながら、もっとも興味深い知見は、WN PIVが非常に強力な免疫原(NEUT力価はわずか3万 inf.uの接種で検出した)であり、3 x 104、3 x 105、または3 x 106 inf.uでワクチン接種された動物の100％が、WNVのNY99株の100 LD50病原菌投与から保護されたことである(表2)。
【００７１】
(表１)乳飲みマウスにおけるPIVの安全性
0005538729.tif 000002
a 10%FBS含有培地で希釈された、接種された調製物。
b 20 ml/動物の容量で頭蓋内経路により送達。
c 接種後14日目の生存(生/死)。
d 感染により死んだ動物に基づく平均生存期間(標準偏差)。
e 不適切。
【００７２】
(表２)成体マウスにおける、PIVの安全性、効力、および有効性
0005538729.tif 000003
a 10%FBS含有培地で希釈された、接種された調製物。
b 100 ml/動物の容量で腹腔内経路により送達。
c 接種後14日目の生存(生/死)。
d 感染により死んだ動物に基づく平均生存期間(標準偏差)。
e 接種後21日目に2匹の動物から採取しプールした血清のNEUT力価(示された力価は、WNV増殖巣形成の80%の減少をもたらす最も高い希釈である)。
f 病原菌投与後14日目の生存により示された、WNVのNY99株の100 LD50の病原菌投与からの保護；希釈接種群から唯一生存した動物は、8〜14日の間、疾患の兆候(曲った背中、波立つ毛皮、および倦怠)を見せた。PIV接種動物はいずれも、病原菌投与後14日の観察期間に疾患のいかなる兆候も見せなかった。
g 不適切。
h WN PIV接種マウス由来の血清と並行して試験された、非免疫マウス由来の血清のNEUT力価。
【００７３】
実施例17
PIV/RepliVAXの収量および安全性を増加させるためのさらなる修飾
本発明は、RepliVAXの繰り返しの継代は組換えを起こさないが、増殖が増強された変異体が選択されたことを示す: WNV RepliVAXは、WNV Cタンパク質をコードする細胞株において繰り返し継代されている。このCタンパク質は、非細胞変性VEErepのサブゲノムプロモーターによって誘導されたPac遺伝子にWNVのC遺伝子のコピーを融合させることによって作製された(Petrakova ら、2005)。結果として得られた構築物(VEErep/Pac-Ubi-C*)において、ユビキチン(Ubi)遺伝子をC遺伝子の前に挿入し、またCの後ろに停止コドンを配置した。この場合、Pac-Ubi融合タンパク質は成熟Cタンパク質(疎水性のアンカーを欠く； 図9参照)と共に作製されると考えられる。このVEErep(「C*」として表わされる)におけるC遺伝子は、CSシグナルを除去する36個の変異を導入して、この11塩基の領域を、Cのコード能を維持しながら、GUCAAUAUGCU(SEQ ID NO：2)からGUgAAcAUGuU(SEQ ID NO：3)に変換することにより、さらに修飾した。この多くの変異が相同組換えの可能性を劇的に減少させ、またさらに、組換えがゲノムの間に生じた場合、結果として生じるRNAは非対応のCSを有し、複製を防ぐと考えられるため、複製活性ゲノムの産生は起こらない(図9)。
【００７４】
増殖的な組換えの可能性の低さを検証するため、クローン細胞株をVEErep/Pac-Ubi-C*を発現するBHK細胞から得て{BHK(VEErep/Pac- Ubi-C*)}、この細胞株を、10回のWN RepliVAXの継代に使用し(各回の感染は、MOI 0.01)、結果として生じたRepliVAXを詳細に特徴付けた。この10継代目(p10)の集団が生ウイルスを含むかどうか判定するため、Vero細胞単層にp10 WN RepliVAXを0.1、1、および10の多重度で感染させ、次に細胞外のRepliVAXを取り除くために徹底的に洗浄した。これらの単層を、24時間後に再洗浄し、その2日後に回収した。新鮮なVero細胞培養物へのこれらの培養からの上清液の継代は、WNVに対する高感度なポリクローナル抗体で染色した場合にいかなる免疫陽性細胞も示すことはできず、このことは、RepliVAXがパッケージング細胞株によってコードされるCタンパク質との増殖的な組換えが起こっていなかった事を示している。
【００７５】
興味深いことに、p10 WN RepliVAXをBHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)細胞株でp0 RepliVAXと比較すると、p10 RepliVAXは感染の多様な増殖巣を生じ、その多くがp0 RepliVAXにより生じたものよりはるかに大きかった(図10)。さらに、p10 RepliVAXは、早い時点でp0 RepliVAXより10倍多く複製し、最終的な力価は2倍となる。
【００７６】
このp10 RepliVAXに感染したVero細胞から産生されたcDNAから得たPCR産物の分析は、Cコドン領域の全長を含む産物が全くないことを示した。しかしながら、これらの領域にまたがる産物のC-prM接合部の配列分析から、2つの変異が継代中に起こっていたことが判明した。パッケージング細胞上のp10 RepliVAXにより生じた増殖巣の異種性の性質から予想されたように(図10)、両方の変異は元のRepliVAX配列を有する混合物として存在していた。変異の1つは、これらの配列反応(両方向においてシーケンスされた)における核酸集団の半分に存在するように見え、RepliVAXゲノムにおけるシグナルペプチダーゼ切断部位(S(c)VGA| VTLS)(SEQ ID NO：4)の前のP4位置でのAGC>uGC(S>C)変異からなった。2番目の変異は、増幅配列の約30%のみに存在し(再び、反応については両方向で終了)、NS2B/NS3切断部位(QKKR|GGK(m)T)(SEQ ID NO：5)の後ろのP3部位でのAAG>AuG(K>M)からなった。これらの変異は欠失したSL5の位置にあるが、それらは予測されたRNA構造を変化させない。より良好に増殖している変異体の選択がRepliVAX改良の強力な方法であることが示すため、より良好に増殖しているRepliVAXの迅速な選択(10増殖サイクルのみ)は、非常におもしろい。NS2B/NS3対シグナルペプチダーゼ切断の効率を変更するとフラビウイルス粒子収量および感染力に影響を及ぼすことができることが知られており(Keelapang ら、2004; Lee ら、2000;Lobigs and Lee, 2004;Yamschikov ら、1997)、これらの変異部位は予想外ではなかった。研究は、さらに良好に増殖している変異体の選択を継続しており、これらの2つの変異が、RepliVAX収量および抗原産生を向上させるために、別々に(または一緒に)動作するそれらの能力を確認するために、第二世代RepliVAX構築物中への挿入の標的となる。それにもかかわらず、本明細書に提示されたデータは、以下の継代条件下で示す：(1)組換えの発生なし、(2)改良されたRepliVAXを作製するため陽性選択が用いられうる。
【００７７】
JE RepliVAXのブラインド継代は、ゲノムの同じ領域に変異を有するより良好に増殖している変異体を同様にもたらした。良好に増殖する変異体を産生する、ブラインド継代RepliVAX産物に関する能力は、本発明の重要な特徴であり、より良好に増殖している変異体の産生が、これらの良好に増殖している変異体がヒト内でそれらの弱毒を失ったかもしれないという懸念により常に煩雑である、伝統的なLAVよりも明らかに有利である。
【００７８】
さらに、BHK細胞株(ヒトワクチン製造用に認可されていない)において用いられた場合に安定していると示され、かつ組換えを含まないことが実証された、変異し改良されたC発現カセット(VEErep/Pac-Ubi-C*)は、Vero細胞(ヒトワクチン製造用に承認された細胞株)に導入した場合に、安定し、PIV伝播に有用であることも示された。特に、VEEレプリコンに対応するRNAは、BHK細胞に適用した方法と同じ方法を用いて、認可された種子由来のVero細胞に導入された。これらのVero細胞へのRNAの導入後、細胞をピューロマイシン含有無血清培地で維持し(ワクチン製造のための重要な課題)、これらの細胞はPIV増殖に有用であることが示された。これらの増殖条件下では、これらの細胞は、同様に誘導されたBHK細胞よりも、PIVのわずかに低い力価を生じることが示されたが、VEErep/Pac-Ubi-C*-Vero細胞はこれらの培養条件下で良好な力価を維持し、多数の回収を可能にした。図11は、これらの細胞からのPIVの作製が、無血清条件下での多数回収のために得られることを示す。
【００７９】
要約すると、C(特に、prMのシグナル配列、またはこの領域に追加してprMおよびE遺伝子の部分を含むCカセット)を発現する細胞株におけるPIVの増殖は、疾患を引き起し得る生ウイルスを作製し、ワクチン製造の方法のリスクを増加する、PIVゲノムと理論的に再び組み合わせるできる。この課題を克服するため、本発明は、WN PIVの増殖のための細胞株が、NS2B/NS3切断部位で正確に終了するCタンパク質を用いて作製することができ、PIVゲノムのこの領域での組換えの機会を最小にし、細胞株がPIVにより共有されるCの固定部分の一部(prMのシグナルペプチドとしても知られている)をコードするRNAをコードする、他の増殖方法以上の利点を提供することを示した。
【００８０】
さらにこのC発現カセットの安全性を高めるために、本発明は、PIVゲノムを補足するVEErepによりコードされるCを作るのに用いられるカセットの一部が(すなわち、基となるRNAエレメントにより、複製PIVゲノムの産生に必要なアミノ酸配列をコードする最初の30のコドンが、ウイルス複製に必要であった)、特に、PIVゲノムとの組換えの可能性を劇的に減少させるC遺伝子をもたらす36ヌクレオチド部位(タンパク質産物を改変せず導入)でPIVゲノムと異なるカセットを産生するように変異できたことを示す(図9)。さらに、この変異したC遺伝子を、ウイルス複製を許容するために、PIVゲノムの3'UTRにおけるCSを補完しなければならない環状化シグナル(CS)における3つの変異を有するように作製し、組換えを防ぐためのさらなる安全性の特徴を提供する(図9)。選択可能なマーカー遺伝子(Pac)に続いて、最終的に、このC遺伝子は、結果として生じたポリプロテイン(FMDVの自動プロテナーゼ2Aなどの代わりの自己開裂配列、または容易にユビキチンの代わりとなりえる他の関連配列)由来の無傷のC産物にユビキチン遺伝子を用いることによって、VEEレプリコンに挿入された。この単一ポリプロテインカセットの作製は、増殖細胞株での組換えの可能性を小さくし、C発現カセットを取り除き、かつPIV収量を減少させる、遺伝学的により安定なVEEレプリコンを産生する利点を提供する。結果として生じる構築物(VEErep/Pac-Ubi-C*、図9)は、BHK細胞の中に導入され、そして、その細胞は、確立された方法(Fayzulin ら、Virology 2006)を用いてVEEレプリコンを発現するクローン細胞株を作製するのに用いられた。
【００８１】
1個のクローン細胞株が、単一細胞クローニングから18継代後に試験され、Cカセットのいかなる遺伝的欠失に関する証拠も有しないことが判明し(RT-PCRによる)、またC発現カセット中にいかなる検出可能な変異を有することも示されなかった。最も重要なのは、この細胞株は、41と同様に高い継代レベルで、同様のWNV PIV増殖能を示したことである。最後に、この細胞株におけるPIVの10継代後、Cカセットを発現しない細胞(すなわちWT Vero細胞)で増殖的な複製を可能なPIV組換え体が作られる組換えの証拠がないこと、およびRT-PCRによりPIVゲノムへのCコード配列の導入の証拠がないことが観察された。
【００８２】
さらに、PIVがワクチン接種時点でワクチン中のフラビウイルスと再結合して新規で有毒なフラビウイルスが生じ得るという危惧に対応するように、本発明は、すべての公知の天然に環状化するフラビウイルスにおいて存在する「非天然」環状化シグナル(CS)を有する、高レベルに複製されるWNVゲノムが作製可能であることを示した。すべてのフラビウイルスのゲノムの5'および3'末端で発見された2つのCSが、増殖的なウイルス複製をもたらすために100%相補的でなければならない、という証拠がいくつかの実験室にてもたらされている(Khromykh ら、J. Virol., 2001; Lo ら、J. Virol., 2003; Alvarez ら、Virol., 2003)。また、これらの研究は、CSが100％相補的である限り、非天然CSが、複製ゲノムを作り得ることを示した。しかしながら、これらの研究者は、非天然CS配列を有する全ゲノムが複製欠陥を有することを報告した。WNVゲノムにおけるCSの系統的分析により、特に高レベルの複製をもたらすように交換する慎重に選択された単一塩基の能力の試験により、単一塩基変化、および高レベルのゲノム複製を可能にするその後の二重塩基変化(図12A)が同定された。図12Bは、2塩基置換があるWNVゲノムの高レベルの複製が可能であり、ミスマッチCS配列(すなわち、WTおよび2塩基の変異)を含んで意図的に作られたゲノムが複製活性でないことを示す。従って、この変異、および他の同様の変異は、CS改変PIVワクチンおよび人々がワクチン接種をうけている地域を循環するウイルスの間での単一点遺伝的組換えから結果として生じるいかなる組換えウイルスも複製活性でないと考えられ、それ故に疾患の原因となり得ないために、優れた安全性プロフィールを有するPIVを作製するために利用することができる。
【００８３】
実施例18
WNV C遺伝子を発現するBHK細胞は、多数継代の間それらの表現型を維持する
VEErep/Pac-Ubi-C*でトランスフェクトしたBHK細胞由来のWNV C発現クローン細胞株による研究は、いくつかの理由から、その長期間安定性およびRepliVAX作製における有用性を示した。まず第一に、これらの細胞はRepliVAXの繰り返しの継代に有用であった。第二に、2つの異なる継代レベル(単一細胞クローニング後の8および24継代)での細胞における並行増殖巣形成アッセイは、区別できないWN RepliVAX力価および増殖巣サイズを示した。最後に、継代24レベルでのこれらの細胞におけるCコードカセットの配列の直接分析は、元のVEErep配列と比較して、変化がないことを明らかにした。これらのデータを一緒にすると、C-発現VEErepsを有する細胞が、ヒトワクチン製造において使用される、現在認可されたマスター細胞シードロットフォーマットにおける使用において、十分安定しているはずであることを示す。さらに、VEErepが人体試験で既に用いられているという事実は、規制許可の間、Vero細胞に対するVEErep細胞工学の適用がいかなる予期しないハードルにも遭遇することがないようにする。
【００８４】
実施例19 
WNV VLPのリンパ系組織標的化
上記のように、フラビウイルスprM/Eタンパク質を除き、WNV VLPはRepliVAXと同様であり、レポータ遺伝子をコードでき、またはレポーターなしでフラビウイルスレプリコンを単に含むことができる。VLPは、すべての3つのWNV構造タンパク質を発現するパッケージング細胞中で容易に作製され得、かつ高力価で産生されていた(Fayzulin ら、2006)。VLP 107Uを、マウスに接種をした場合、これらの動物は、接種後24時間でそれらの血清中に、1,000〜5,000 U/mlのI型インターフェロン(IFN)を産生した。IFN反応は、腹腔内および皮下組織の足蹠注射(fp)の両方によってもたらされた。さらに、b-ガラクトシダーゼ発現VLPによるfp接種後24時間後に解剖された膝窩のリンパ節は、多数のb-ガラクトシダーゼ陽性細胞を含み、このことは、RepliVAXから区別できない方法で細胞に入るVLPが重要なリンパ器官を標的にしていることを示している。この結果は、VLP注射により誘発された高レベルのIFNと一致し、同様の標的化がRepliVAXの高い効力および有効性に関係することを示唆する。
【００８５】
以下の参考文献は、本明細書において引用されたものである。
0005538729.tif 000004
0005538729.tif 000005
0005538729.tif 000006
【００８６】
本明細書において言及された特許文献および刊行物はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。さらに、これらの特許文献および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が参照として組み入れられると明確かつ個別に示されるのと同程度に、本明細書において参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図1は、欠損のトランス型相補性について、ウイルス性構造タンパク質のCまたはすべてを産生する細胞におけるフラビウイルスPIV複製の概略図である。インビボまたはインビトロ正常細胞におけるPIVの複製は、ヌクレオカプシドを全く持たないSVPの放出を導く。
【図２】図2A〜2Cは、YFV C、ならびにYFV C、prM、およびE発現細胞株がYF PIVの複製を補完しうることを示す。図2Aは、YFVおよびGFP発現YF PIVゲノムの概略図である。図2Bは、Pac遺伝子を発現するVEEVレプリコンおよびprMのシグナルペプチドを有するYFV C(固定化C; VEErep/Cl/Pac)、またはprMの20アミノ酸を有する固定化C(VEErep/C2/Pac)、またはYFV構造タンパク質の全て(VEErep/C-prM-E/Pac)の概略図である。図2Cは、インビトロ合成されたPIVゲノムでトランスフェクトされた細胞株によるYF PIVの放出を示す。示された時点で培地を交換し、PIVの力価を測定した。矢印は、細胞を1:5の比で副次的に継代した(subpassaged)時点を示す。
【図３】図3A〜3Bは、パッケージング細胞におけるYF PIVの増殖曲線を示す。VEErep/C2/PacおよびVEErep/C-prM-E/Pacレプリコンを含むBHK-21細胞を、1細胞当たりの感染単位における指定のMOIでYF PIVに感染させた。指定された時間で、培地を交換し、放出されたPIVの力価を測定した。矢印は、1:5の比で細胞が副次的に継代された時点を示す。図3AはMOI 10 inf.u/細胞での増殖曲線を示し、図3BはMOI 0.1 inf.u/細胞での増殖曲線を示す。
【図４】図4A〜4Cは、コドン最適化C遺伝子を発現する細胞がYF PIVを産生したことを示す。図4Aは、合成遺伝子のヌクレオチド配列を示す。導入された変異を小文字で示す(SEQ ID NO：1)。図4Bは、パッケージング細胞株におけるYF PIVの増殖曲線を示す。VEErep/C2/Pac、VEErep/C-prM-E/Pac、VEErep/C2opt/Pac および VEErep/Copt-prM-E/Pacレプリコンを含むBHK-21細胞を、1細胞当たりの感染単位における指定のMOIでYF PIVに感染させた。指定された時間で、培地を交換し、放出されたPIVの力価を計測した。図4Cは、37℃で4日間のインキュベーション後に、YFVおよびYF PIVによってVEErep/C2opt/Pac含有細胞株において生じたプラークを示す。
【図５】図5A〜5Cは、パッケージング細胞における感染を拡げるWN PIVの発生を示す。図5Aは、WNV構造遺伝子を発現するWN PIVゲノムおよびVEEVレプリコンの概略図である。図5Bは、WN PIVが、WNV抗原陽性細胞の増殖巣を生じた事を示す(70時間のインキュベーション後のBHK(VEErep/C*E*-Pac)細胞の感染の際にNS1に対する抗体で明らかとなった)。図5Cは、同じWN PIV調製物が、Vero細胞単層の感染時に、単一の感染細胞のみを生じたことを示す(図5Bで用いられた同じトラガント染色法で感染後70時間で明らかとなった)。
【図６】図6A〜6Cは、YFおよびWN PIVに感染させた細胞からの放出時におけるEタンパク質の検出を示す。図6Aでは、BHK-21細胞を、5 inf.u/細胞のMOIでYF PIVに感染させた。放出されたSVPを回収し、超遠心分離によって精製した。サンプルをSDS PAGEにより分離し、フィルターに移し、Eタンパク質をD1-4G2 MABにより検出した。非感染細胞から回収した培地、レーン１；YF PIV感染細胞から、感染後48時間で回収した培地、レーン2；YF PIV感染細胞から、感染後72時間で回収した培地、レーン3；YFV (2 x 107 PFU)、レーン4。図6Bでは、Vero細胞をWN PIVに24時間感染させ、その後、(いかなる細胞溶解も検出される前に回収された)不純物を取り除いた培養液の一部をSDS PAGEにより分離し、フィルターに移し、E特異的MAB(7H2; Bioreliance)で反応させた。ポリクローナル血清での同じサンプルの反応は、この標本においていかなる細胞関連非構造タンパク質も示さず(結果示さず)、結果としてEタンパク質が活発に分泌されたことを示している。WNVのサンプル、レーン1；非感染細胞から回収した培地、レーン2；WN PIV感染細胞から、感染後48時間で回収した培地、レーン3。図6Cでは、ウエスタンブロットが、YFV PIV RNAをエレクトロポレーションされた正常(非パッケージング)BHK細胞から回収したSVPから得られたショ糖密度勾配から調製された分画のEタンパク質含量を示す。Eタンパク質反応性のピーク(32%ショ糖)は、SVPの密度に対応し、この事実に一致して、並行して行った解析におけるYFVの移動(42%)よりもゆっくり移動した。
【図７】図7A〜7Fは、黄熱病(YF)および西ナイル(WN)偽感染性ウイルス(PIV)産生に用いたプラスミドの概略図である。図7AはpYFPIVを示し、図7BはpWNPIVを示し、図7CはpVEErep/Cl/Pacを示し、図7DはpVEErep/C2/Pacを示し、図7EはpVEErep/C3/Pacを示し、図7FはpVEErep/C*-E*-Pacを示す。
【図８】図8A〜8Vは、本明細書で用いられるプラスミドの配列を示す。図8A〜8DはpYFPIVの配列(SEQ ID NO：6)を示し、図8E〜8HはpVEErep/Cl/Pacの配列(SEQ ID NO：7)を示し、図8I〜8KはpVEErep/C2/Pacの配列(SEQ ID NO：8)を示し、図8L-8OはpVEErep/C-prM-E/Pacの配列(SEQ ID NO：9)を示し、図8P〜8RはpVEErep/C2opt/pacの配列(SEQ ID NO：10)を示し、図8S〜8VはpVEErep/Copt-prM-E/Pacの配列(SEQ ID NO：11)を示す。
【図９】図9は、トランス型のCを提供するために利用される、RepliVAXおよびVEEレプリコンの重複領域の概略図を示す。１RepliVAXゲノムによってコードされたCの断片での相同組換えを最小にするために、36個の変異がVEErep/pac-Ubi-C*に挿入されている。２RepliVAXゲノムにおける5'および3'CS配列の位置。
【図１０】図10は、より良好に増殖している変異体が容易に選択されることを表す、継代0(エレクトロポレーションから)および継代10でのWN RepliVAXによるC-発現細胞株{BHK(VEErep/Pac-Ubi-C*)}において生じた感染性増殖巣の並列比較を示す。
【図１１】図11は、C-発現カセット(VEErep/Pac-Ubi-C*)を有するWHO-認可Vero細胞において産生されたRepliVAX PIVの力価測定を示す。結果として生じるPIVは、BHK細胞において生じるものよりわずかに力価が低いが、Vero細胞は、BHK細胞では不可能である高い力価のPIVを複数もたらす。
【図１２】図12A〜12Bは環状化変異体を示す。図12Aは、単一の塩基を有するWNV/IRES-RLucレプリコンの複製を示し、CS変異と一致することは、いくつかの単一塩基変異がWTレベルで複製することを証明する。パネル左部分は、5'および3' CS配列上のテストゲノムを示す。右側は、WT複製レベルのパーセンテージとして、Rlucレポーターを用いて検出された複製レベルを示す。下線を付けた塩基は、変異した塩基を示す。図12Bは、m10およびm13(パネルA)を組み合わせることによって得られた二塩基変化(m17)に合致する、WNV/IRES-RLucレプリコンの複製を示し、不活性なポリメラーゼ(陰性対照)を生産するように設計された変異と共に、可能な形式でWTと変異CSとを組み合わせた変異体で検出された複製レベルと比較した。パネル左部分は5'および3'CS配列上のテストゲノムを示す。右側はWT複製レベルのパーセンテージとしてRlucレポーターを用いて検出された複製レベルを示す。下線を付けた塩基は変異した塩基を示す。＊は複製が検出されなかったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
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【図８Ｐ】
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【図８Ｑ】
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【図８Ｒ】
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【図８Ｓ】
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【図８Ｔ】
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【図８Ｕ】
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【図８Ｖ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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