(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Xaa Pro Proとして、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを必須に含む、獣乳カゼインの加水分解物又はその濃縮物を有効成分として含有し、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤。
【請求項２】
Xaa Pro Proの含有割合が、獣乳カゼインの加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して１重量％以上である請求項１記載の剤。
【請求項３】
Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proの含有割合が、獣乳カゼインの加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して０．３重量％以上である請求項１又は２記載の剤。
【請求項４】
獣乳カゼインの加水分解物が、Xaa Proを含む請求項１〜３のいずれか１項記載の剤。
【請求項５】
Xaa Proが、Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Pro及びこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項４記載の剤。
【請求項６】
Xaa Proの含有割合が、獣乳カゼインの加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５重量％以上である請求項４又は５記載の剤。
【請求項７】
獣乳カゼインの加水分解物が、獣乳カゼインを、麹菌により発酵して得た発酵物である請求項１〜６のいずれか１項記載の剤。
【請求項８】
獣乳カゼインの加水分解物が、獣乳カゼインを、麹菌由来の酵素により酵素分解して得た分解物である請求項１〜６のいずれか１項記載の剤。
【請求項９】
麹菌由来の菌体外酵素が、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素である請求項８記載の剤。
【請求項１０】
Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを有効成分として含有し、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤。
【請求項１１】
ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株により乳蛋白質を含む原料を発酵させて得られた、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを含む発酵物を有効成分として含み、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ヘルベティカスが、ラクトバチルス・ヘルベティカス CM４株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０)である請求項１１記載の剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の剤を有効成分として含む動脈硬化予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内膜の肥厚抑制作用や血管内皮の収縮・拡張機能改善作用を示し、抗動脈硬化作用が期待できる動脈硬化予防剤、血管内膜の肥厚抑制剤、血管内皮の収縮・拡張機能改善剤及びこのような作用を示す機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞や脳梗塞等の動脈硬化性疾患は、ガンと並んで我が国における死因の最も大きな割合を示している。動脈硬化の危険因子としては、高脂血症、高血圧、糖尿病、喫煙、肥満、高尿酸血症、加齢、ストレス等が挙げられ、それらが相互に絡み合って血管障害を引き起こす。このため、個々の危険因子の程度が軽度であっても、それらの重複により危険度が相加的、相乗的に増加する。
従来、発酵乳、乳酸菌又は乳の酵素分解物における生理機能が多く見出されている。例えば、特許文献１及び２には、コレステロール低下作用があること、特許文献３及び非特許文献１には、血圧低下作用があること、特許文献４には、抗ストレス作用があることが記載され、更に特許文献５には、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として２．１以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物が、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性又は血圧降下作用を有することが記載されている。即ち、これらの文献には、動脈硬化に対する個々の危険因子を軽減する知見が記載されている。
一方、上述の１つの危険因子作用を低下させることだけでは、動脈硬化の発症予防には至らないと考えられている。例えば、非特許文献２又は３には、血中コレステロール濃度と動脈硬化発症が相関しないことが、非特許文献４には、高血圧状態を抑制しても動脈硬化の程度に変化が見られないことが、また、非特許文献５には、アンジオテンシンI変換酵素阻害剤(エナラプリル)を投与しても動脈硬化抑制作用は見られないことが記載されている。
従って、上記特許文献５に記載された特定のカゼイン加水分解物に、動脈硬化に対する個々の危険因子を軽減する知見が得られていても、このことにより、該特定の加水分解物が抗動脈硬化作用を有するとは言えない。【０００３】
ところで、動脈は、外膜と、血管の拡張・収縮を行う平滑筋層を有する中膜と、血液と直接接し、且つ前記中膜の平滑筋層に指令を出す内皮細胞層を有する内膜とから主に構成される。該内膜における内皮細胞は、血液の線溶・凝固、血管の拡張・収縮、炎症の抑制・進展、血管の増殖・退縮等の血管機能に係る様々な指令を司ることが近年明らかにされつつあり、該内皮機能は、動脈硬化をはじめとする種々の疾病に関係するものと考えられている。従って、血管内皮機能を改善することで、動脈硬化の予防等が期待できる。
また、動脈硬化は、動脈壁が肥厚して弾力性がなくなる病態であり、中でもアテローム性動脈硬化は、動脈の内膜下における斑点状の肥厚(アテローム)を特徴とする血流を減少又は途絶させる症状を示す動脈硬化である。近年、このような症状の要因として、血管内皮細胞の損傷や機能低下が挙げられている。
従って、血管内膜の肥厚を抑制することで、アテローム性動脈硬化発症の緩和、予防作用が期待できる。
上記血管内皮機能の測定をヒトにおいて非破壊条件で診断測定する方法としては、例えば、非特許文献６に示されるとおり、プレティスモグラフィー法が知られている。該プレティスモグラフィー法は、動脈の血流を一時的に止めたとき、内皮細胞が産生・放出する血管拡張物質の量が増大し、一過性に血流量が増加することを利用して、血管拡張性から内皮細胞の機能を測定する方法であり、内皮細胞の機能が傷害されていると、血管拡張物質の放出量が低下するため、血流量も低下することに基づく方法である。
【特許文献１】特開２００３−３０６４３６号公報
【特許文献２】特開２００２−６５２０３号公報
【特許文献３】特開２００５−５２０９０号公報
【特許文献４】特開平１０−４５６１０号公報
【特許文献５】国際公開２００５−１０２５４２号パンフレット
【非特許文献１】American Journal of Clinical Nutrition 64 (1996) p767−771
【非特許文献２】食の科学 257 (1999) p20−25
【非特許文献３】Atherosclerosis 151 (2000) p501−508
【非特許文献４】Circulation 104 (2001) p2391−2394
【非特許文献５】International Journal of Cardiology 81 (2001) p107−115
【非特許文献６】The American Journal of Cardiology 87 (2001) p121−125
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、血管内皮に係る収縮・拡張機能を改善でき、血管内皮の収縮・拡張機能に係る各種疾病、例えば、動脈硬化予防等の作用が期待でき、また血管内膜の肥厚を緩和、予防作用を示し、アテローム性動脈硬化予防が期待できる、安全性に優れた血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤及び動脈硬化予防剤を提供することにある。
本発明の別の課題は、日常的に連用可能で、安全性に優れ、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、Xaa Pro Proとして、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを必須に含む、獣乳カゼインの加水分解物又はその濃縮物を有効成分として含有し、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤が提供される。
また本発明によれば、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを有効成分として含有し、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤が提供される。
更に本発明によれば、ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株により乳蛋白質を含む原料を発酵させて得られた、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを含む発酵物を有効成分として含み、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤が提供される。
更にまた本発明によれば、上記いずれかの剤を有効成分として含む動脈硬化予防剤が提供される。
【０００６】
また本発明によれば、Xaa Pro Proとして、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを必須に含む、獣乳カゼインの加水分解物又はその濃縮物を有効成分として含有し、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する機能性食品が提供される。
更に本発明によれば、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを有効成分として含有し、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する機能性食品が提供される。
更にまた本発明によれば、ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株により乳蛋白質を含む原料を発酵させて得られた、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを含む発酵物を有効成分として含み、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する機能性食品が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜の肥厚抑制の少なくとも一方の作用を有する剤又は機能性食品は、特定のカゼイン加水分解物又はその濃縮物、Xaa Pro Proとして、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを含む特定の発酵物若しくは該Xaa Pro Proを有効成分として含むので、安全性に優れ、特に、機能性食品の場合は、日常的に連用可能である。従って、血管内皮の収縮・拡張機能に関わる、慢性的な高血圧症の改善や、動脈硬化症、血管内膜の肥厚を抑制し、特に加齢、生活習慣等により血管内皮細胞の機能低下や損傷によるアテローム形成を抑制し、アテローム性動脈硬化の発症を緩和、予防することが期待できる。
本発明の動脈硬化予防剤は、本発明の上記剤を有効成分として含むので、動脈硬化の予防作用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２−１及び比較例２で行った血管内膜の肥厚抑制効果の確認試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の血管内皮の収縮・拡張機能改善及び血管内膜抑制の少なくとも１つの作用を有する剤及び機能性食品は、(a)Xaa Pro Proとして、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを必須に含む成分(以下、(a)成分という)又は、(b)Xaa Pro Proとして、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを必須に含む、獣乳カゼインの加水分解物又はその濃縮物(以下、(b)成分という)、(c)ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株により乳蛋白質を含む原料を発酵させて得られる、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proを含む発酵物(以下、(c)成分という)を有効成分として含有する。即ち、(b)及び(c)成分は、(a)成分を含み、(a)成分、特に、Ile Pro Pro及び／又はVal Pro Proが有効成分として有用であることは、後述する実施例等により理解できる。
(b)成分は、更にXaa Proを含むことが好ましい。
【００１１】
(b)成分中に含まれるXaa Pro Proの含有割合は、(b)成分中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して通常１重量％以上、好ましくは１〜５重量％である。該含有割合を１重量％以上とすることにより、より高い作用が期待される。また、(b)成分中に含まれるIle Pro Pro又はVal Pro Proの含有割合は、成分中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して、それぞれ単独で０．３重量％以上であっても、Ile Pro Pro及びVal Pro Proの合計量が０．３重量％以上であっても、高い効果が期待される。更に、Ile Pro Pro及びVal Pro Proのそれぞれを０．３重量％以上含有する場合には、より高い効果が期待される。
(b)成分中に含まれるXaa Proの含有割合は、(b)成分中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して通常５重量％以上、好ましくは５〜２５重量％である。該含有割合を５重量％以上とすることによって、より高い作用が期待される。
(c)成分中に含まれるIle Pro Pro及び／又はVal Pro Proの含有割合は、発酵物の凍結乾燥物１００ｇ中に換算して１０ｍｇ以上、好ましくは１５ｍｇ以上であれば所望の効果が期待される。【００１２】
(b)成分中のXaa Pro Pro及びXaa ProのXaaは、任意のアミノ酸であって良い。例えば、Xaa Pro Proとしては、Ser Pro Pro、Leu Pro Pro、Ile Pro Pro、Val Pro Proが挙げられ、Xaa Proとしては、Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Proが挙げられる。(b)成分としては、前記例示したXaa Pro Proの少なくとも１種若しくは２種以上を含むことが好ましく、更には、前記例示したXaa Proの１種若しくは２種以上を含むカゼイン加水分解物が好ましく挙げられる。【００１３】
(b)又は(c)成分は、ペプチド以外に遊離アミノ酸を含んでいても良く、更に、前記ペプチド及び遊離アミノ酸の他に、例えば市販の獣乳カゼイン、乳蛋白質に通常含まれる、脂質、灰分、炭水化物、食物繊維、水分等が含まれていても良く、また、必要に応じてこれらのうちの適当な成分の一部若しくは全部を除去しても良い。【００１４】
(b)成分を製造するには、例えば、前記Xaa Pro Pro、更にはXaa Proが得られる酵素群を用いて、獣乳カゼインを加水分解する方法、獣乳カゼインを麹菌により発酵する方法により得ることができる。
獣乳カゼインは、Proを多く含む食品等に用いられる安全性が確認されたタンパク質であり、例えば、牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等のカゼインが挙げられ、特に牛乳カゼインが好ましく使用できる。
獣乳カゼインを加水分解又は発酵する際のカゼイン濃度は、特に限定されないが(b)分解物を効率良く生産するために、３〜１９重量％が好ましい。【００１５】
前記酵素群としては、例えば、Xaa Pro Xaa又はXaa Pro Pro Xaaのカルボキシ末端のPro Xaa配列が切断可能なペプチダーゼを含む酵素群が好ましく挙げられる。
酵素群は、活性中心にセリンを持つ、セリンタイプのプロティナーゼもしくは、活性中心に金属を持つ金属プロティナーゼを含むことが好ましい。金属プロティナーゼとしては、中性プロテアーゼＩ、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼ等が挙げられ、これらの少なくとも１種を更に含むことが、所望の加水分解物を効率良く、且つ短時間で、更には１段階反応で得ることができる点で好ましい。また前記Pro Xaa配列が切断可能なペプチダーゼとしては、等電点が酸性域を示す酵素であることが好ましい。
【００１６】
前記酵素群としては、例えば、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)等の麹菌由来の酵素群が挙げられる。このような酵素群は、適当な培地で菌体を培養し、生産される酵素を水抽出した酵素群等が挙げられ、特に、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素群のうちの等電点が酸性域を示す酵素群が好ましく挙げられる。
アスペルギルス・オリゼー由来の酵素群としては、市販品を利用することができ、例えば、スミチームFP、LP又はMP(以上、登録商標、新日本化学(株)製)、ウマミザイム(登録商標、天野エンザイム(株)製）、Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL(以上、商品名、株式会社樋口商会製）、オリエンターゼONS(登録商標、阪急バイオインダストリー(株)製)、デナチームAP(登録商標、ナガセ生化学社製)等が挙げられ、特に、スミチームFP(登録商標、新日本化学(株)製)の使用が好ましい。
これら市販の酵素群を用いる場合には、通常、至適条件が設定されているが、前記カゼイン加水分解物が得られるように条件、例えば、使用酵素量や反応時間等を、用いる酵素群に応じて適宜変更して行なうことができる。
【００１７】
前記獣乳カゼインを加水分解する際の酵素群の添加量は、例えば、獣乳カゼインを溶解した水溶液に、酵素群／獣乳カゼインが重量比で１／１０００以上、好ましくは１／１０００〜１／１０、特に好ましくは１／１００〜１／１０、更に好ましくは１／４０〜１／１０の割合となるような量である。
反応条件は、酵素群に応じて目的のカゼイン加水分解物が得られるように適宜選択できるが、温度は、通常２５〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃であり、pHは、３〜１０、好ましくは５〜９、特に好ましくは５〜８である。また、酵素反応時間は、通常２〜４８時間、好ましくは７〜１５時間である。【００１８】
酵素反応の終了は、酵素を失活させることにより行なうことができ、通常、６０〜１１０℃で酵素を失活させ、反応を停止させることができる。
酵素反応停止後、必要に応じて沈澱物を、遠心分離除去や各種フィルター処理により除去することが好ましい。
また、必要に応じて、得られる加水分解物から苦味や臭味を有するペプチドを除去することもできる。このような苦味成分や臭味成分の除去は、活性炭又は疎水性樹脂等を用いて行なうことができる。例えば、得られた加水分解物中に、使用したカゼイン量に対して活性炭を１〜２０重量％添加し、１〜１０時間反応させることにより実施できる。使用した活性炭の除去は、遠心分離や膜処理操作等の公知の方法により行なうことができる。【００１９】
得られる(b)成分を含む反応液は、そのまま飲料等の液体製品に添加して機能性食品に利用することができる。また、(b)成分のうちのカゼイン加水分解物の汎用性を高めるために、前記反応液を濃縮後、乾燥し粉末の形態とすることが好ましい。粉末にすることで、例えば、血管内膜の肥厚抑制作用、血管内皮の収縮・拡張機能改善作用、動脈硬化予防作用の少なくとも１つの作用を各種食品等に付与することができる、機能性付与剤とすることが可能である。
このような粉末には、栄養的バランスや風味等を改善するために、各種補助添加剤を含有させることもできる。例えば、各種炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、甘味料、香料、色素、テクスチュア改善剤等が挙げられる。
【００２０】
本発明の血管内皮の収縮・拡張機能改善及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有する剤において(b)成分を有効成分とする際の投与量は、ヒトの場合、１日あたり、(b)成分中のXaa Pro Pro若しくは、Xaa Pro Pro及びXaa Proの合計量として、通常１０μｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは３ｍｇ〜１ｇ程度であり、１日に何回かに分けて摂取しても良い。
投与期間は、その疾病の症状等により調整することができ、通常１日以上、好ましくは７日〜３６５日間で、常用的な摂取が望ましい。
【００２１】
(c)成分の製造に用いるラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株は、ラクトバチルス・ヘルベティカス種単独であるが、発酵に際しては、本発明の所望の効果を損なわない範囲で他の乳酸菌等を含んでいても良い。
ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株としては、血管内皮の収縮・拡張機能改善作用及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有するIle Pro Pro及び／又はVal Pro Proを高生産しうる生産菌として好ましい菌体外プロティナーゼ活性の高いものの使用が好ましい。例えば、Twiningらの方法(Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410(1984))をもとにしたYamamotoらの方法(Yamamoto, N.ら J.Biochem. (1993) 114, 740)に準じて測定したU／OD590の値が４００以上を示す菌株が好ましい。
【００２２】
好ましいラクトバチルス・ヘルベティカスとしては、例えば、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６ 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０，寄託日１９９７．８．１５）（以下、CM4株と称す)が挙げられる。このCM4株は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。【００２３】
(c)成分は、ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株を含む発酵乳スターターを乳蛋白質を含む原料に添加し、発酵温度等の発酵条件を適宜選択して発酵させることにより得ることができる。
有効成分である(c)成分は、得られる(c)成分の濃縮物等を凍結乾燥、噴霧乾燥等により粉末としたものを含む。【００２４】
ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株は、あらかじめ前培養しておいた十分に活性の高いスターターとして用いることが好ましい。初発菌数は、好ましくは１０5〜１０9個／ｍｌ程度である。
(c)成分は、例えば、特定保健用食品等の機能性飲食品に利用するに際して、風味を良好にし、嗜好性を良好とするために、前記ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属する菌株に酵母を併用して発酵させることもできる。酵母の菌種は特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ等のサッカロマイセス属酵母等が好ましく挙げられる。酵母の含有割合は、その目的に応じて適宜選択することができる。【００２５】
乳蛋白質を含む原料としては、例えば、牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等の動物乳、及び豆乳等の植物乳、これらの加工乳である脱脂乳、還元乳、粉乳、コンデンスミルクが挙げられ、牛乳、豆乳、これらの加工乳が好ましく、牛乳又はその加工乳が特に好ましい。
乳の固形分濃度は特に限定されないが、例えば、脱脂乳を用いる場合の無脂乳固形分濃度は、通常３〜１５重量％程度であり、生産性的には６〜１５重量％が好ましい。【００２６】
前記発酵は、通常静置若しくは撹拌発酵により、例えば、発酵温度２５〜４５℃、好ましくは３０〜４５℃、発酵時間３〜７２時間、好ましくは１２〜３６時間で、乳酸酸度が１．５％以上になった時点で発酵を停止する方法により行なうことができる。【００２７】
本発明の血管内皮の収縮・拡張機能改善及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有する剤において(c)成分を有効成分とする際の投与量は、ヒトの場合、１日あたり、(c)成分の乾燥量として、通常１〜１００ｇ、特に２〜５０ｇ程度が好ましく、１日に何回かに分けて摂取しても良い。また、(c)成分中のVal Pro Pro及び／又はIle Pro Pro量として、通常１０μｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは３ｍｇ〜１ｇ程度であり、１日に何回かに分けて摂取しても良い。
投与期間は、その疾病の症状等により調整することができ、通常１日以上、好ましくは７日〜３６５日間で、常用的に摂取することが好ましい。
【００２８】
本発明の動脈硬化予防剤は、前記血管内皮の収縮・拡張機能改善及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有する剤を含む。特に、血管内膜の肥厚抑制作用を有する場合には、アテローム性動脈硬化予防剤として有用である。
本発明の動脈硬化剤の投与量は、１日あたり、ヒトの場合、前記(a)〜(c)成分中のXaa Pro Pro若しくは、Xaa Pro Pro及びXaa Proの合計量、又はVal Pro Pro及び／又はIle Pro Pro量として、通常１０μｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは３ｍｇ〜１ｇ程度であり、１日に何回かに分けて摂取しても良い。
動脈硬化予防剤の投与期間は、摂取するヒト又は動物の年齢やそのヒトや動物の動脈硬化危険因子に対する環境等を考慮して種々調整することができ、通常１日以上、好ましくは７日〜３６５日間で、常用的な摂取が望ましい。
【００２９】
本発明の血管内皮の収縮・拡張機能改善及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有する剤、並びに動脈硬化予防剤の投与方法は、経口投与が通常である。
本発明の剤の形態は、経口投与用の製剤の形態とすることができる。例えば、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル、散剤、顆粒剤、液剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、適宜必要に応じて、薬剤として許容される担体、アジュバント、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で製造することができる。
【００３０】
本発明の機能性食品は、本発明の血管内皮の収縮・拡張機能改善及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有する剤の有効成分としての前記(b)又は(c)成分を含み、血管内皮の収縮・拡張機能改善及び／又は血管内膜の肥厚抑制作用を有する特定保健用食品等の健康食品とすることができる。
このような効能を得るための摂取量は、機能性食品が、連用可能であり、連続的又は断続的に長期間摂取することを鑑みると、ヒトの場合、１日あたり、前記(b)成分中のXaa Pro Pro若しくは、Xaa Pro Pro及びXaa Proの合計量として、また前記(c)成分中のVal Pro Pro及び／又はIle Pro Pro量として、通常１０μｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは３ｍｇ〜１ｇ程度であり、１日あたりの摂取回数に応じて、機能性食品における１回あたりの摂取量を前記量より更に低くすることも可能である。
【００３１】
本発明の機能性食品の摂取期間は、特に限定されず、長期間摂取することが好ましいが、上記効能を得るために、通常１日間以上、特に７日〜３６５日程度で、常用的な摂取が好ましい。【００３２】
本発明の機能性食品は、前記有効成分である(b)又は(c)成分の他に、必要に応じて、ラクトバチルス・ヘルベティカス以外の乳酸菌の発酵物や、飲食品に用いる他の成分、例えば、糖類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、フレーバー、またはこれらの混合物等の添加物を添加することもできる。
本発明の機能性飲食品の形態は、前記(b)又は(c)成分を、そのまま、若しくは粉末や顆粒とし、各種飲食品に添加することで、固形物、ゲル状物、液状物の何れの形態とすることができ、例えば、乳酸菌飲料等の発酵乳製品、各種加工飲食品、乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等が挙げられ、更には各種飲料、ヨーグルト、流動食、ゼリー、キャンディ、レトルト食品、錠菓、クッキー、カステラ、パン、ビスケット、チョコレート等とすることができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例、分析例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されない。
製造例１
牛乳由来カゼイン(日本NZMP社製)１ｇを約８０℃に調整した蒸留水９９ｇに加えて充分に撹拌した後、１N水酸化ナトリウム(和光純薬社製)溶液を添加してpH７．０とし、また温度を２０℃に調整して基質溶液を調製した。
得られた基質溶液にアスペルギルス・オリゼー由来であり、少なくとも金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼを含む市販の酵素(登録商標「スミチームFP」、新日本化学工業社製)を、酵素／カゼインの重量比が１／２５となるように添加して、５０℃で１４時間反応させた。続いて、１１０℃で１０分間のオートクレーブを行い、酵素を失活させ、カゼイン酵素分解物溶液を得た。次に、得られた酵素分解物溶液をスプレードライヤーにより乾燥し、粉末を調製した。
得られた粉末中の含有成分の分析を行なった。タンパク質はケルダール法で測定し、アミノ酸はアミノ酸分析装置にて測定した。また、該タンパク質量からアミノ酸を引いた量をペプチド量とした。更に、脂質は酸分解法で、灰分は直接灰化法で、水分は常圧加熱乾燥法でそれぞれ測定した。尚、１００％から各成分を引いた残りを炭水化物量とした。その結果、アミノ酸は３５．８重量％、ペプチドは４５．７重量％、水分は６．６重量％、脂質は０．２重量％、灰分は４．１重量％及び炭水化物は７．６重量％であった。【００３４】
＜ペプチド構成アミノ酸の測定＞
上記で調製した粉末を適量の蒸留水に溶解し、自動ペプチド分析機(商品名PPSQ-10(株)島津製作所製)を用いて解析し、粉末中においてN末端側から順に如何なるアミノ酸が位置するかを調べた。尚、自動ペプチド分析機は遊離アミノ酸を検出しない。
また、５残基目のアミノ酸の合計は１２０ｐｍｏｌ、６残基目のアミノ酸の合計は１００ｐｍｏｌであった。これらの結果より、前記粉末中に含まれるペプチドのほとんどがジペプチド及びトリペプチドであることが判った。また、２残基目のアミノ酸がProであるペプチドの割合が４９．５％と顕著に上昇していた。更に３残基目のアミノ酸がProであるペプチドの割合も２９．８％と多かった。
従って、前記粉末には、Xaa Pro又はXaa Pro Proが多く含まれ、これらペプチドは生体内プロテアーゼによる酵素分解作用に対する抵抗性が高いペプチドであると推定できる。【００３５】
＜酵素分解物中に含まれるペプチドの測定＞
上記酵素分解物の粉末について、各種の化学合成標準ペプチドを用いて、常法に従い、該粉末に含まれる表１に示すジペプチド及びトリペプチド量を求めた。結果を表１に示す。【００３６】
【表１】
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【００３７】
また、前記粉末を蒸留水で希釈溶解した溶液中のペプチド及び遊離アミノ酸量が８．１５ｍｇ／ｍｌであり、ペプチド量が４．５７ｍｇ／ｍｌであり、該ペプチド中のXaa Pro量が５１４．５μｇであったので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対するXaa Proの割合は６．３重量％であり、更に、該ペプチド中のXaa Pro Pro量が１１６．５μｇであったので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対するXaa Pro Proの割合は１．４重量％であることを確認した。【００３８】
実施例１−１
血管内皮機能改善効果を検討するために、４０歳以上６５歳以下の成人男性のうち、収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇ又は拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇを示す２４人づつの２群を対象として、製造例１で調製したカゼイン加水分解物の粉末１．２５ｇをカプセルに充填した被験食又は、カゼインナトリウム粉末１．２５ｇをカプセルに充填したプラセボを、朝食時又は朝食後３０分以内に、１日１回７日間摂取させ、２群間の二重盲検クロスオーバー試験を実施した。
試験は、プレティスモグラフィー(Plethysmograph EC6、Primetech Co.製)を用いて、被験食及びプラセボを摂取する前、並びに７日間摂取後における、安静時と駆血解放後の前腕動脈血流量を測定することにより行った。結果を各群の平均として表２に示す。【００３９】
【表２】
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表２中の検査値は、各２４人の平均値±標準偏差における表示であり、ＦＢＦは、前腕血流量(Forearm Blood Flow)を示す。
被験食群の最大血流量及び(B)／(A)×100は、プラセボ群との比較でｐ＜0.001で有意であった。被験食群の最大血流量及び(B)／(A)×100は、摂取前との比較でｐ＜0.001で有意であった。【００４０】
表２より、安静時の前腕動脈血流量は、摂取前後で被験食群とプラセボ群との比較において有意な差異が認められなかった。
一方、駆血解放後の最大流入量は、摂取前は両群間で有意な差異は認められなかったが、摂取後は、摂取前と比較しても、プラセボ群と比較しても被験食群で有意な高値を示した(いずれもｔ検定でｐ＜０．００１)。
また、反応性充血後の最大血流量の安静時比について、摂取前は両群間で有意な差異は認められなかったが、摂取後は摂取前と比較しても、プラセボ群と比較しても被験食群で有意な高値を示した(いずれもｔ検定でｐ＜０．００１)。また、試験期間における血圧の有意な改善は認められなかった。
以上の結果より、製造例１で製造したカゼイン分解物は、摂取することにより、プレティスモグラフィーを用いた生理的な血管内皮機能評価において、顕著な改善作用を示すことが明らかとなり、血管内皮機能改善剤として有効であることが確認された。また、この改善作用は、血圧降下作用に付随したものでないことも確認できた。【００４１】
上記各群の被験者に対して、口腔内にニトログリセリン０．３ｍｇを噴霧投与し、その後１０分間、血管内皮非依存性の外因性ＮＯに対する血管拡張反応を観察して、そのうちの最大血流量を測定値とした。結果を表３に示す。【００４２】
【表３】
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表３中の検査値は、各２４人の平均値±標準偏差における表示であり、ＦＢＦは、前腕血流量(Forearm Blood Flow)を示す。【００４３】
表３より、両群とも、摂取前後の比較、並びに両群間での比較において有意な差異は認められなかった。また、安静時比についても同様な結果であった。
以上の結果より、製造例１で製造したカゼイン加水分解物による反応性血流量の改善効果は、ＮＯに応答する血管中膜の機能改善に関連したものでなく、血管内皮機能の改善を直接反映したものであることが確認された。【００４４】
合成例
IPP及びVPPを以下に示す有機化学合成法により合成した。合成は島津製作所製のペプチド自動合成装置(PSSM-8型)を用いた固相法によって行った。
固相担体として２−クロロトリチル(2-Chlorotrityl)タイプのポリスチレン樹脂であって、アミノ基をフルオレニルメチルオキシカルボニル基(以下Fmocと略す)で保護されたプロリンが結合した樹脂５０ｍｇを使用した(島津製作所社製 登録商標SynProPep Resin）。前記アミノ酸配列に従って、アミノ基がFmoc基で保護されたFmoc−Ile、Fmoc−Pro及びFmoc−Valを１００μｍｏｌずつ、常法に従い、ペプチド配列通り順次反応させてペプチド結合樹脂を得た。
次にこのペプチド結合樹脂を１ｍｌの反応液A(１０容量％酢酸、１０容量％トリフルオロエタノール、８０容量％ジクロロメタン)に懸濁し、室温で３０〜６０分間反応させてペプチドを樹脂から切離した後、反応液Aをガラスフィルターで濾過した。濾液の溶媒を減圧除去後、直ちに１ｍｌの反応液B(８２．５％容量トリフルオロ酢酸、３％容量エチルメチルスルフィド、５％容量純水、５％容量チオアニソール、２．５％容量エタンジチオール、２％容量チオフェノール)を加え、室温で６時間反応させて側鎖保護基を外した。これに無水エーテル１０ｍｌを加えてペプチドを沈殿させ、３０００回転、５分間遠心して分離した。その沈殿を無水エーテルにて数回洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチド全量を、０．１Ｎ塩酸水溶液２ｍｌに溶解した後に、Ｃ18の逆層カラムを用いたＨＰＬＣで、以下の条件に従って精製した。【００４５】
ポンプ：形式Ｌ６２００インテリジェントポンプ（日立製作所）、検出機：形式Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所）にて２１５ｎｍの紫外部吸収を検出カラム：マイクロボンダスフェアー５μＣ18（ウォーターズ社製）、溶出液：Ａ液；０．１重量％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液；０．１重量％ＴＦＡ入りアセトニトリル（Ｂ／Ａ＋Ｂ）×１００（％）：０→４０％（６０分）、流速：１ｍｌ／分。最大吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することにより目的とする合成ペプチドIPP及びVPPをそれぞれ５．７ｍｇ、６．５ｍｇ得た。精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置（形式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析し、さらにアミノ酸分析装置（形式８００シリーズ、日本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが確認できた。【００４６】
実施例１−２
試験動物として、Wistar系ラット(７週齢、雄)を用い、一週間馴化飼育した。次いで、一酸化窒素合成阻害剤であるNG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩(L-NAME、Sigma社製)を１ｇ／L、またL-NAME１ｇ／Lと合成したVal Pro Pro０．３ｇ／L或いは、L-NAME１ｇ／Lと合成例で合成したIle Pro Pro０．３ｇ／Lの濃度になるように、それぞれ飲水中に溶解させて一週間、自由摂取させた。対照としてL-NAMEを溶解しない水のみを摂取させたものを無処置とした。
その後、ラットをジエチルエーテル麻酔下で放血致死させ、胸部大動脈血管を摘出して２ｍｍ幅に切断し、大動脈リングを作製した。該リングを５ｍｌのtyrode液(組成：NaCl 158.3mM、KCl 4.0mM、CaCl2 2.0mM、MaCl2 1.05mM、NaH2PO4 0.42mM、NaHCO3 10.0mM、グルコース5.6mM(pH 7.4、37±0.5℃))で満たしたマグヌス装置(ラボサポート社製、製品名マイクロティッシュオーガンバスMTOB-1Z)に取付け、２．０ｇの静止張力をかけ平衡化させた。続いて、１μMフェニレフリン(Phenylephrine)にて大動脈リングを収縮させ、安定した収縮が得られた標本を、１０μMアセチルコリンで、血管内皮依存性の拡張反応を観察した。血管拡張反応による拡張度を、１μMフェニレフリンによる収縮に対しての割合として求めた。結果を表４に示す。尚、各値とも一群８匹の平均値である。【００４７】
比較例１
Val Pro Pro又はIle Pro Proの代わりに、アンジオテンシンI(ACE)阻害薬であるエナラプリルを、Val Pro Pro又はIle Pro Proと同程度の阻害活性を示す０．５mg／Lの濃度として摂取させた以外は、実施例１−２と同様に血管拡張反応による拡張度を測定した。結果を表４に示す。尚、値は一群９匹の平均値である。【００４８】
【表４】
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表４の結果から、L-NAME単独摂取の群よりもVal Pro Pro又はIle Pro Proを同時に摂取した群が血管拡張の割合が有意に増加し、Val Pro Pro及びIle Pro Proに血管内皮機能改善作用があることが判った。一方、ACE阻害活性を有するエナラプリルを用いた比較例１では、L-NAME単独摂取の群と比較して血管拡張の有意差は認められなかった。従って、ACE阻害活性を有する物質であれば血管内皮機能改善作用を有するとは言えないことが判った。【００４９】
実施例２−１
(CM4発酵乳飼料の調製)
市販の脱脂粉乳を固形率９％(w／w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで１０５℃、１０分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、CM４株スターター発酵液(菌数５×１０8個／mL)を３％(v／w)接種して、３７℃で２４時間、静置状態で発酵させCM4発酵乳を得た。
得られたCM4発酵乳を８０℃達温殺菌後、凍結乾燥により粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末と市販の粉末飼料(商品名「CE-2」、日本クレア株式会社製)を、質量比１０：９０で混合し、固型飼料を作成し、CM4発酵乳飼料とした。この飼料には、CM4発酵乳由来のVal Pro Proが３４．１ｍｇ／ｋｇ及びIle Pro Proが１７．１ｍｇ／ｋｇ含まれていた。【００５０】
(血中脂質の改善に依存しない血管内膜の肥厚抑制効果の確認試験)
アポE欠損マウス(５週齢、雄)を１週間予備飼育し、上記で調製したCM4発酵乳飼料又は、CM4発酵乳の凍結乾燥粉末を配合していない市販の粉末飼料(商品名「CE-2」、日本クレア株式会社製)から固型飼料を調製した対照飼料を３１週間自由摂取させた(各群５匹)。
上記摂取後のマウスの血液を心臓より採取し、血液生化学検査により、総コレステロール量、LDLコレステロール量、HDLコレステロール量及び中性脂肪量を測定した。結果を表５に示す。
また、マウスの胸部大動脈を採取し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、血管の内膜／中膜の面積比を算出した。その値をグラフ化した結果を図１に示す。【００５１】
比較例２
市販の脱脂粉乳を固形率９％(w／w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで１０５℃、１０分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却した。実施例２−１で調製したCM４発酵乳と同等の酸度(２．３％)となるよう乳酸を添加し、未発酵乳を得た。
得られた未発酵乳を８０℃達温殺菌後、凍結乾燥により粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末と市販の粉末飼料(商品名「CE-2」、日本クレア株式会社製)を、質量比１０：９０で混合し、固型飼料を作成し、未発酵乳飼料とした。この未発酵乳飼料には、Xaa Pro Pro及びXaa Proは含まれていなかった。
得られた未発酵乳飼料を用いて、実施例２−１と同様にマウスに摂取させた後、実施例２−１と同様の血液生化学検査及び血管の内膜／中膜の面積比の算出を行った。結果をそれぞれ表５及び図１に示す。【００５２】
【表５】
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【００５３】
表５の結果より、Val Pro Pro及びIle Pro Proを含むCM4発酵乳は、対照飼料及び未発酵乳飼料に対して高脂血症改善作用がないことがわかった。一方、図１の結果より、Val Pro Pro及びIle Pro Proを含むCM4発酵乳は、対照飼料及び未発酵乳飼料の何れに対しても血管内膜の肥厚を有意に抑制していることがわかった。未発酵乳にもCM４発酵乳と同等以上の乳成分が含まれることから、本発明の効果は、単に乳成分だけによる効果ではないことがわかった。
従って、CM４発酵乳の血管内膜の肥厚抑制効果は、高脂血症改善とは別のメカニズムによるものであり、ヒトを含む動物の高脂血症以外によるアテローム性動脈硬化に対しても有効であることがわかった。【００５４】
実施例２−２
合成例により合成したVal Pro Pro及びIle Pro Pro、並びに実施例２−１で調製したCM４発酵乳、及び製造例１で調製したカゼイン加水分解物の粉末(製造例１の粉末という)を、それぞれ市販の粉末飼料(商品名「CE-2」、日本クレア株式会社製)に、表６に示す割合で混合し、固型飼料を作製した。また、対照として市販の粉末飼料も用意した。
（血管内膜の肥厚抑制効果の確認試験）
アポE欠損マウス(６週齢、雄、１群８匹)に表６に示す飼料１〜７をそれぞれ３１週間自由摂取させた。次いで、マウスの胸部大動脈を摘出して１０％中性緩衝ホルマリンで固定後、エラスチカ・ワンギーソン染色を実施した。組織標本について顕微鏡下で撮影した画像をコンピュータに取込み、画像処理ソフト(Image J)により血管の内膜肥厚度(内膜／中膜の面積比(％))を算出した。結果を表６に示す。尚、内膜肥厚度の値は、各群における平均値である。【００５５】
【表６】
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【００５６】
表６の結果より、Val Pro Pro及びIle Pro Proは、濃度依存的に血管内膜の肥厚を抑制することが判った。またVal Pro Pro及びIle Pro Proを含むCM４発酵乳や、Xaa Pro Pro及びXaa Proを含む製造例１で製造した獣乳カゼイン加水分解物である粉末も血管内膜の肥厚を抑制することが判った。従って、Val Pro Pro及びIle Pro Proの少なくとも１つのペプチドを含む剤又は食品は、血管内膜の肥厚を抑制し、アテローム性動脈硬化症の予防に有効であることが判った。【００５７】
実施例３−１〜３−２、比較例３及び４
CM4株(実施例３−１)、ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM1004(L. helveticus JCM1004)(実施例３−２)、ラクトバチルス・ガッセリJCM1131(L. gasseri JCM1131)(比較例３)又は市販の凍結乾燥スターターCH-1(クリスチャンハンセン社製、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus delbruckii sp. bulgaricusを含む)を、表７に示すスターター液添加率及び発酵時間の条件を採用し、実施例２−１に準じて発酵乳を調製し、その凍結乾燥物をそれぞれ得た。
得られた凍結乾燥物を、市販の粉末飼料(商品名「CE-2」、日本クレア株式会社製)とそれぞれ重量比で１０：９０となるように混合し、固型飼料を製造した。この飼料中のVal Pro Pro及びIle Pro Pro量を表７に示す。
次に、製造した各固型飼料を用い、実施例２−２と同様に血管内膜の肥厚抑制効果の確認試験を行い、内膜肥厚度(内膜／中膜の面積比(％))を算出した。結果を表７に示す。尚、内膜肥厚度の値は、各群における平均値である。【００５８】
【表７】
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表７の結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカス発酵物は、他の菌種により調製した発酵物には無い、血管内膜の肥厚抑制効果を有することが明らかになった。
【図１】
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