(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を造影するための、式：
【化１】
0005632813.tif 000002
で示される化合物および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２】
該化合物が、その医薬的に許容される塩、水和物または溶媒和物である、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性細胞集団の存在を特徴とする疾患の処置における使用のための方法および医薬組成物に関する。特に、細胞標的リガンド免疫原複合体を疾患宿主に、好ましくは免疫系促進物質などの治療因子と組み合せて投与し、病原性細胞に対する宿主の免疫応答を高めおよび／または再導する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の免疫系は、腫瘍細胞、他の病原性細胞、侵入する外来病原体を認識し、消失せしめる手段を提供する。免疫系は強い防衛線を普通提供するが、多くの場合に、癌細胞、他の病原性細胞、感染性物質が宿主の免疫応答を免れ、随伴的な宿主病原性をもち増殖または持続する。化学療法剤および放射線治療法が開発され、複製される腫瘍を消失せしめている。しかし、現在用いられている化学療法剤および放射線治療法の大部分は、そのすべてではないが、有害な副作用を持っている。すなわち、これらは、癌細胞の破壊に働くだけでなく、造血系細胞などの正常な宿主細胞にも作用する。さらに、化学療法剤は、宿主の薬物抵抗性が生じる場合には限定的な効力しか有しない。
【０００３】
外来病原体も宿主中で有効な免疫応答を免れて増殖でき、あるいは宿主の免疫系が薬物治療または他の健康上の問題で傷められている。多くの治療化合物が開発されているが、多くの病原体がこの治療に対して抵抗性であり、また抵抗性をつくる。治療物質に対する抵抗性を発達させる癌細胞および感染性生物体の能力、および現在使用されている抗癌剤の有害な副作用からして、低い宿主毒性をもつ病原性細胞集団に特異的な新しい治療法を開発する必要性がある。
【０００４】
研究者は、このような細胞に特異的に細胞毒性化合物を標的とすることにより癌細胞を破壊する治療プロトコールを開発してきた。これらのプロトコールは、癌細胞に独特の受容体または癌細胞により過剰に発現された受容体に結合するリガンドにコンジュゲートするトキシンを用いて、トキシンの正常細胞への配送を少なくしようとする。この方法を用いて、病原性細胞上の特殊な受容体に対する抗体からなるある種の免疫トキシンが開発されており、抗体はリシン、シュードモナス属エキソトキシン、ジフテリアトキシン、腫瘍壊死因子などのトキシンに結合している。これらの免疫トキシンは、抗体により認識された特異的受容体を保持する腫瘍細胞を標的とする（Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１０，２９１−２９５，１９８９；Ｍｅｌｂｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８（８），１７５５−１７６０，１９９３；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０７４１８，公開１９９１年５月３０日）。
【０００５】
宿主中の癌細胞または外来病原体の集団を選択的に標的とする他の方法は、病原性細胞に対する宿主の応答を高め、もって独立的な宿主毒性も示すことのある化合物の投与の必要性を回避することである。免疫療法について報告されているひとつの戦略は、抗体、例えば遺伝子学的に処理された多重的抗体を腫瘍細胞の表面に結合し、細胞表面上の抗体の定常領域を表示し、もって種々の免疫系仲介プロセスによって腫瘍細胞が殺されるのを誘発することである（Ｄｅ  Ｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２ｄ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９９５；Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ，Ｊ．Ｐ．，米国特許５，６７２，４８６）。しかし、この方法は、腫瘍特異的抗原を明確にするのが難しく複雑である。宿主の免疫能力に基づく他の方法は、腫瘍表面に対する抗Ｔ細胞受容体抗体または抗Ｆｃ受容体抗体を標的にし、免疫細胞の腫瘍との直接結合を誘導する（Ｋｒａｎｚ．Ｄ．Ｍ．，米国特許５，５４７，６６８）。ワクチンを基とする方法も報告されている。これは、サイトカインに融合した抗原を含有するワクチンを基とし、ワクチン抗原の免疫原性を修飾するサイトカインを有し、もって病原体物質に対する免疫応答を刺激する（Ｐｉｌｌａｉ，Ｓ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１１１４６，公開１９９１年２月７日）。この方法は、報告された免疫応答の間接的調節によっている。望ましくない細胞集団を殺すための別の方法は、ＩＬ−２または抗原に結合した抗胸腺細胞グロブリンのＦａｂ断片を利用する。しかし、報告された実験データからすると、この方法は、標的にされた細胞集団の５０％のみを消失せしめるようであり、インビボで非特異的な細胞を殺す（すなわち、Ｔ細胞でない末梢血のリンパ球の５０％）（Ｐｏｕｌｅｔｔｙ，Ｐ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３７６９０，公開１９９７年１０月１６日）。このように、宿主における病原性細胞集団を特徴とする疾患状態の処置を目的とする治療について大きい必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９１／０７４１８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，６７２，４８６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５４７，６６８号明細書
【特許文献４】国際公開第９１／１１１４６号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９７／３７６９０号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１０，２９１−２９５，１９８９
【非特許文献２】Ｍｅｌｂｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８（８），１７５５−１７６０，１９９３
【非特許文献３】Ｄｅ  Ｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２ｄ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、病原性細胞集団に対する宿主の免疫系の認識および応答を増加することにより、宿主中の病原性細胞集団を消失せしめる方法に関する。効果的には、細胞性病原体の抗原性を増加して、内因性免疫応答の仲介で病原性細胞集団の消失を高める。この方法は細胞毒性または抗菌性治療剤の使用を避けるか、最小とする。本方法は、リガンド免疫原コンジュゲートの投与を含む。リガンドは、リガンド結合部分を特に発現するか、優先的に発現するか、過剰に発現するような病原性細胞集団に、インビボで特異的に結合できる。また、リガンドコンジュゲート免疫原は、抗体産生を誘発でき、より好ましくは、宿主動物において内因性または共投与の外因性の抗体により認識され得る。病原性細胞の免疫系仲介消失は、病原性細胞が独特的に発現するか、優先的に発現するか、過剰に発現するような受容体やトランスポーターなどの表面提示タンパク質との免疫原コンジュゲートリガンドの結合により導かれる。病原性細胞が独特的に発現するか、優先的に発現するか、過剰に発現するような表面提示タンパク質は、非病原性細胞上では存在しないか、少量でのみ存在する受容体であって、病原性細胞の選択的消失について手段を提供する。少なくとも１つの追加の治療因子、例えば、免疫系促進物質、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤を、宿主に共投与して、治療効率を高める。
【０００９】
ひとつの実施態様において、本方法は、標的の病原性細胞集団上で独特的に発現されるか、優先的に発現されるか、過剰に発現される細胞表面タンパク質に、インビボで高い親和性特異的結合力をもつリガンドを投与する工程を含む。このリガンドは、宿主動物中にすでに存在しまたは誘発され得る先天性または獲得性の免疫に対する免疫原にコンジュゲートしている。選択的に、内因性免疫応答活性物質または細胞毒性化合物である治療因子の少なくとも１つを共投与する。
【００１０】
好ましいひとつの実施態様において、本方法は、リガンド免疫原コンジュゲート組成物を投与することを含む。その場合、リガンドは葉酸または他の葉酸塩の受容体結合リガンドである。リガンドは共有結合などにより、宿主動物における抗体応答を誘発し得る免疫原に、さらに好ましくは、宿主動物における前存在の内因性抗体（先天性または獲得性の免疫の結果）または共投与の抗体（すなわち、受動免疫付与）に結合し得る免疫原にコンジュゲートしている。少なくとも１つの治療因子、リガンド免疫原複合体に特異的結合し得ないで、内因性免疫応答を促進または高め得る因子、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤を、リガンド免疫原コンジュゲートとともに宿主に共投与できる。
【００１１】
本発明の他の実施態様において、病原性細胞集団（この病原性細胞集団のメンバーはリガンドについて接近可能結合部位を有する）を保持する宿主動物において該集団の、内因性免疫応答仲介による特異的消失を高める方法を提供する。この方法は、該宿主に、リガンドと免疫原との複合体を含むリガンド免疫原コンジュゲート組成物および治療因子を含む少なくとも１つの追加的組成物を投与する工程を含む。該免疫原は、宿主動物において内因性または外因性の抗体により認識されることが知られているか、または宿主動物において免疫細胞により直接的に認識されることが知られているものである。該因子は、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤、リガンド免疫原複合体に特異的結合しないで内因性免疫応答を促進し得る化合物よりなる群から選択する。
【００１２】
本発明の他の実施態様において、病原性細胞集団（この集団はリガンドについて結合部位を発現する）を保持する宿主動物において該集団の、内因性免疫応答仲介による特異的消失を高める方法を提供する。この方法は、宿主に該リガンドと免疫原との複合体を含む組成物を投与すること、宿主に免疫原に対する抗体を投与すること、宿主に少なくとも１つの追加的治療因子を投与することを含む。該因子は、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤、リガンド免疫原複合体に特異的結合しない内因性免疫応答の促進物質よりなる群から選択する。
【００１３】
本発明の他の実施態様において、病原性細胞集団（該集団が葉酸受容体を独特的に発現するか、優先的に発現するか、過剰に発現する）を保持する宿主動物において該集団の、内因性免疫応答仲介による特異的消失を高める方法を提供する。この方法は、宿主に免疫原の共有結合コンジュゲートを含む組成物を投与する工程を含む。該免疫原は、宿主動物おいて内因性または外因性の抗体により認識されることが知られているか、または宿主動物において免疫細胞により直接的に認識されることが知られているものである。葉酸またはその同族体を含むリガンドはグルタミル基を有す。免疫原との共有結合はグルタミル基のγ−カルボキシ基のみを介する。他の実施態様において、宿主に治療因子を含む少なくとも１つの追加の組成物を投与する。該因子は、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤、リガンド免疫原複合体に特異的結合しないで内因性免疫応答を促進し得る化合物よりなる群から選択する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施態様において、病原性細胞集団（該集団が葉酸受容体を独特的に発現するか、優先的に発現するか、過剰に発現する）を保持する宿主動物において該集団の、内因性免疫応答仲介による特異的消失を高める方法を提供する。この方法は、宿主に免疫原の共有結合コンジュゲートを含む組成物を投与する工程を含む。該免疫原は、宿主動物おいて内因性または外因性の抗体により認識されることが知られているか、または宿主動物において免疫細胞により直接的に認識されることが知られているものである。葉酸またはその同族体を含むリガンドはグルタミル基を有す。免疫原との共有結合はグルタミル基のα−カルボキシ基のみを介する。他の実施態様において、宿主に治療因子を含む少なくとも１つの追加の組成物を投与する。該因子は、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤、リガンド免疫原複合体に特異的結合しないで内因性免疫応答を促進し得る化合物よりなる群から選択する。
【００１５】
本発明のひとつの別の実施態様において、標的の病原性細胞集団は癌細胞集団である。他の実施態様において、標的の病原性細胞集団はウイルス感染内因性細胞である。他の実施態様において、標的の病原性細胞集団は細菌、マイコプラズマ酵母、真菌などの外因性生物体の集団である。リガンド免疫原コンジュゲートは、腫瘍細胞または病原性生物体の表面に結合し、標的の細胞集団の細胞メンバーを免疫原で「標識」し、もって標識された細胞集団に対する免疫仲介応答を起こす。受動免疫付与において宿主に投与された抗体または前存在の先天性または獲得性の免疫に由来する宿主に存在の抗体は、免疫原に結合して、内因性免疫応答を起こす。細胞結合リガンド免疫原コンジュゲートと抗体の結合は、補体仲介細胞毒性、抗体依存性の細胞仲介細胞毒性、抗体のオプソニン効果または食作用、抗体誘導受容体クラスター・シグナル伝達細胞の死または静止、細胞結合リガンド免疫原コンジュゲートに結合する抗体により促進される他の液性または細胞性免疫応答をもたらす。抗原が前もっての抗体オプソニン効果なしに免疫細胞により直接的に認識される場合、病原性細胞は直接殺される。
【００１６】
外来の病原体または感染もしくは新生の外因性細胞の消失を、内因性免疫応答を促進し得る治療因子、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤を投与することによりさらに高め得る。ひとつの実施態様において、細胞毒性免疫細胞は、単離され、生体外で増やされ、宿主動物に注入される細胞毒性免疫細胞集団である。本発明の他の実施態様において、免疫促進物質を使用する。免疫促進物質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどのＩＦＮまたはＧＭ−ＣＳＦであり得る。他の実施態様において、免疫促進物質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのサイトカインとＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦとの組み合せ、あるいはこれらの効果的な組み合せ、あるいはサイトカインの他の効果的な組み合せを含むサイトカイン組成物であり得る。
【００１７】
本発明の他の実施態様において、治療上有効な量のリガンド免疫原コンジュゲート、治療因子およびその薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。リガンド免疫原コンジュゲートは、宿主動物における病原性細胞集団に特異的に結合でき、先天性または獲得性の免疫応答、共投与された抗体による該細胞の特異的消失、または宿主における免疫細胞による該細胞の直接的な特異的消失を促進する。治療因子は、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞、抗菌剤、リガンド免疫原複合体に特異的結合しないで内因性免疫応答を促進し得る化合物よりなる群から選択する。ひとつの実施態様において、医薬組成物は、非経口的持続放出投与形態にある。他の実施態様において、治療因子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどのＩＦＮまたはＧＭ−ＣＳＦよりなる群から選ばれる化合物を含む免疫促進物質またはこれらの組合せである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】肺腫瘍埋め込み体をもつマウスの生存に対する葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートの効果を示す。
【図２】フルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした葉酸塩による正常組織と腫瘍組織の影像を示す。
【図３】フルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした葉酸塩またはフィコエリトリン標識ヤギ抗マウスＩｇＧによる腫瘍組織の影像を示す。
【図４】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートの固形腫瘍成長に対する効果を示す。
【図５】サイトカイン併用処置の効果を示す。
【図６】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートの複数回注射の効果を示す。
【図７】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートとＩＬ−２との相乗効果を示す。
【図８】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートとＩＬ−２との相乗効果におけるＮＫ細胞の関与を示す。
【図９】Ｍ１０９腫瘍細胞に対する細胞性免疫の発達を示す。
【図１０】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートで処置したマウスの生存に対するＩＬ−２投与の効果を示す。
【図１１】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートおよびＩＬ−２で処置したマウスの生存のＩＦＮ−αによる増大を示す。
【図１２】葉酸塩標的の免疫治療に対するＣＤ８＋Ｔ細胞除去の効果を示す。
【図１３】ＩＬ−２およびＩＦＮ−αにより高められた葉酸塩標的の免疫治療に対するＧＭ−ＣＳＦの増加効果を示す。
【図１４】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートで処置したマウスの生存に対するＩＦＮ−α投与の効果を示す。
【図１５】葉酸塩標的の免疫治療に対する免疫原としてのジニトロフェニルの効果を示す。
【図１６】葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートとＩＦＮ−αの相乗効果を示す。
【図１７】マウスの長期間生存に対する免疫原としてのジニトロフェニルと高濃度でのサイトカインの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、癌を有する宿主または病原性生物に感染した宿主の治療的処置についての方法を提供する。この方法は、病原性細胞を抗原性とし／標識とすることにより病原性細胞集団の免疫応答仲介による消失を高め、宿主免疫系によるその認識および消失をもたらす。この方法は、癌細胞または他の病原性物質に対して高い親和性結合を有するリガンド免疫原コンジュゲートを用いる。高い親和性結合は、リガンドに本来性であるか、化学的に修飾されたリガンドの使用により、またはリガンドとコンジュゲートに存在する免疫原との特定の化学的結合により、改変される（高められる）。本方法はまた、リガンド免疫原コンジュゲートと追加の治療因子を使用することによる組み合せ治療を利用して、病原性細胞集団の免疫応答仲介による消失を高める。治療因子は、内因性免疫応答を促進し得る物質、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、細胞毒性免疫細胞または抗菌剤である。
【００２０】
本発明の方法を用いて、病原性細胞集団を保持する宿主動物における病原性細胞集団の内因性免疫応答仲介による消失を高める。本発明は、癌や感染性疾患などの種々の病原をもたらす病原性細胞集団に適用できる。病原性細胞集団は、腫瘍原性である癌細胞集団であり得る。これには良性腫瘍および悪性腫瘍が含まれる。また、非腫瘍原性でもあり得る。癌細胞集団は自然に、または宿主動物の生殖系に存在する変異または体細胞変異により生じる。あるいは化学的に、ウイルスにより、または放射線で誘導される。本発明を使用して、癌腫、肉腫、リンパ腫、ホジキン病、黒色腫、中皮腫、ブルキット・リンパ腫、鼻咽頭癌腫、白血病、骨髄腫などの癌を処置できる。癌細胞集団は、限定でないが、口腔、甲状腺、内分泌器、皮膚、胃、食道、咽頭、膵臓、結腸、膀胱、骨、卵巣、脳、子宮、乳房、睾丸、前立腺、直腸、腎、肝、肺の癌を含み得る。
【００２１】
病原性細胞集団はまた、外因性病原体であるか、または外因性病原体、例えばウイルスを保持する細胞集団であり得る。本発明は、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマ、寄生虫などの病原体に適用できる。本発明で処置し得る感染性物質は、動物で病原となるすべての現技術で認識し得る感染性生物体であり、グラム陽性またはグラム陰性の球菌または桿菌などの細菌、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。ＤＮＡウイルスは、限定でないが、パピロマウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスを、そしてＲＮＡウイルスは、アレナウイルス、コロナウイルス、リノウイルス、呼吸系合胞体層ウイルス、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルスを含む。特に興味があるのは、抗生物質耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種やＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種などの抗生物質に耐性の細菌、または抗生物質に感受性であるが抗生物質で処置後の再発感染を起こし耐性が生じるような細菌である。このような生物体を、本発明のリガンド免疫原コンジュゲートで、患者に通常投与するよりも低い量の抗生物質とともに処置して、これらの抗生物質耐性細菌株の成長を防止できる。
【００２２】
本発明はまた、すべての真菌、マイコプラズマ種、寄生虫、または動物で疾患を起こす他の感染性生物体に適用できる。本発明方法で処置し得る真菌の例は、かびとして成長する真菌や酵母様の真菌、例えば、白癬、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリコーシス症、コクシジオイドミセス症、パラコクシジオ−イドミセス症、カンジダ症などの疾患を起こす真菌を含む。
【００２３】
本発明を用いて、寄生虫感染を処置できる。これには、限定でないが、体細胞条虫類、血中吸虫類、組織回虫、アメーバ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ種などにより起こされる感染がある。特に興味ある寄生虫は、葉酸塩受容体を発現し葉酸塩に結合するものである。感染性生物体に高い親和性を示すリガンドについて多くの発表がある。例えば、抗生物質活性および細菌細胞壁前駆物に対する特異的結合について知られているペニシリンおよびセファロスポリンを、本発明での使用についてのリガンド免疫原コンジュゲートのためのリガンドとして同様に用い得る。本発明のリガンド免疫原コンジュゲートは、内因性病原体を保持する細胞集団を対象とする。そこでは、病原体特異的抗原が、病原体を保持する細胞集団の表面で発現され、リガンド受容体として抗原に特異的に結合するリガンドとともに働く。
【００２４】
本発明の方法は、ヒト臨床医学および獣医学において使用できる。すなわち、病原性細胞集団を保持し、リガンド免疫原コンジュゲートで処置される宿主動物は、ヒトであり、また獣医学的適用では、実験動物、農業用動物、家畜、野生動物である。本発明を宿主動物に適用できる。これらの動物には、限定でないが、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）のような実験動物、ウサギ、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウサギなどの家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業用動物、クマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、ゼブラ、キリン、ゴリラ、イルカ、クジラなどの野生動物がある。
【００２５】
リガンド免疫原コンジュゲートを宿主動物に非経口的に、例えば、皮膚内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内に好ましくは投与する。あるいは、このコンジュゲートを宿主動物に他の医学的に有用な方法で投与する。いかなる有効量も、また持続放出投与形態を含む適当な治療用量形態を使用できる。本発明の方法は、腫瘍の外科的除去、放射線治療、化学療法、免疫療法などの生物学的治療法と併用できる。生物学的治療には、限定でないが、モノクローナル抗体治療法、免疫調節物質での処置、免疫エフェクター細胞の養子転移、造血性成長因子、サイトカインでの処置、ワクチン接種などがある。
【００２６】
本発明にしたがって、リガンド免疫原コンジュゲートを、広い範囲のリガンドおよび免疫原から選択できる。リガンドは、病原性細胞上でリガンド結合をなし得るリガンド受容体を優先的に発現することにより、宿主動物における病原性細胞集団を特異的に消失せしめ得るものである。許容できるリガンドは、葉酸、その同族体、他の葉酸塩受容体結合分子、その他のビタミン、ライブラリー・スクリーニングから同定されるペプチド・リガンド、腫瘍特異的ペプチド、腫瘍特異的アプタマー、腫瘍特異的炭水化物、腫瘍特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体、抗体のＦａｂまたはｓｃＦｖ（すなわち、単鎖可変領域）断片、例えばＥｐｈＡ２などの転移性癌細胞で特異的に発現され独自的に近接し得るタンパク質に対する抗体のＦａｂ断片、組み合せ的ライブラリーから誘導される小さい有機分子、成長因子、例えばＥＧＦ、ＦＧＦ、インスリン、インスリン様成長因子、相同性ポリペプチド、ソマトスタチンおよびその同族体、トランスフェリン、リポタンパク質複合体、胆汁酸塩、セレクチン、ステロイドホルモン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド、レチノイド、種々のガラクチン、γ−オピオイド受容体リガンド、コレシストキニンＡ受容体リガンド、アンギオテンシンＡＴ１またはＡＴ２受容体特異的リガンド、ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体γリガンド、β−ラクタム抗生物質、抗菌剤を含む低有機分子、腫瘍細胞の表面または感染性生物体で優先的に発現された受容体に特異的に結合する他の分子またはこれらの分子の断片を含む。感染性生物体に結合するリガンドで興味深いのは、微生物に優先的に結合するのが知られているような分子、抗生物質などの薬剤である。
【００２７】
本発明はまた、受容体などの細胞表面タンパク質の結晶構造に基づいて特定の受容体の結合ポケットに適合するように設計された抗菌剤などの分子であるリガンドに適用できる。その場合、該受容体は、腫瘍の表面、細胞、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、寄生虫などの病原体で優先的に発現されるものである。本発明の好ましい実施態様において、腫瘍細胞の表面で優先的に発現される腫瘍抗原などの分子に結合するリガンドを使用できる。
【００２８】
受容体などのタンパク質が病原性細胞集団上で優先的に発現されている受容体に特異的に結合し得るすべての分子についての受容体を含み得る。例えば、成長因子、ビタミン、オピオイドペプチドを含むペプチド、ホルモン、抗体、炭水化物、小さい有機物質を含む。結合部位は、微生物上で優先的に存在する既知のいかなる分子、例えば抗生物質などの薬剤についての結合部位である。例えば、対象結合部位は、ペニシリンなどのβ−ラクタム抗生物質についての細菌細胞壁における結合部位、またはウイルス表面に独自的に存在する抗ウイルス剤についての結合部位である。本発明はまた、受容体の結晶構造に基づいて受容体の結合部位に適合するように設計された抗菌剤などのリガンドに適用できる。その場合、該受容体は、病原体細胞または生物体の表面で優先的に発現されるものである。腫瘍特異的抗原は本発明方法においてリガンドについての結合部位として機能し得ると考える。リガンド免疫原コンジュゲートについての結合部位として機能し得る腫瘍特異的抗原の例は、ＥｐｈＡ２などのエフリン・ファミリータンパク質の細胞外エピトープである。ＥｐｈＡ２発現は正常細胞における細胞−細胞接合に限定されるが、ＥｐｈＡ２は転移腫瘍細胞において全細胞表面に分布する。転移腫瘍細胞上のＥｐｈＡ２は、例えば免疫原にコンジュゲートした抗体のＦａｂ断片に結合のために接近し得、一方、このタンパク質は正常細胞上のＦａｂ断片に結合のための接近をなし得ないので、転移性癌細胞に特異的リガンド免疫原コンジュゲートが分かる。本発明はさらに、リガンド免疫原コンジュゲートの組み合せ使用を含み、獲得性または先天性の免疫応答または共投与の抗体による消失のために病原性細胞の標的化を最大にする。
【００２９】
本発明での使用のために許容される免疫原は、宿主動物において抗体産生を起こし得る免疫原、宿主動物において以前から抗体産生を起こし前存在の免疫性をもたらす免疫原、または先天性免疫系の部分を構成する免疫原である。あるいは、免疫原に対する抗体を宿主動物に投与して受動免疫をつくる。本発明における使用に適する免疫原は、抗原または抗原性タンパク質であって、これらに対する前存在性の免疫性が、ポリオウイルス、破傷風、チフス、風疹、はしか、流行性耳下腺炎、百日せき、結核、インフルエンザの抗原、α−ガラクトシル基などの通常計画されるワクチン接種またはその自然曝露により生じるものである。そのような場合、リガンド免疫原コンジュゲートを用いて、外来性細胞または病原性生物体の消失のために、宿主動物における病原性細胞集団に対する前もって獲得された液性または細胞性の免疫をつくる。他の適当な免疫原は、非天然の抗原やハプテン（例えば、フルオレセインイソチオシアネートまたはジニトロフェニル）および先天性免疫が存在する抗原（例えば、スーパー抗原およびムラミルジペプチド）に対する免疫付与によって宿主動物が新しい免疫性を発達させるような抗原および抗原性ペプチドを含む。
【００３０】
本発明のリガンドおよび免疫原は、複合体形成について既知の方法を用いて、コンジュゲートできる。これは、リガンドの免疫原に対する共有結合、イオン結合または水素結合を含み、直接的に、または２価リンカーなどの連結基を介して間接的に行い得る。コンジュゲートの典型的な形成は、複合体の各々の構成要素上の酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ、ヒドラド基の間でのアミド、エステルまたはイミノ結合の形成を介してリガンドを免疫原に共有結合せしめることによる。本発明の好ましい実施態様において、リガンドは葉酸、その同族体または他の葉酸塩の受容体結合分子であり、葉酸塩リガンドの免疫原との結合はトリフルオロ酢酸無水物を用いプテロイルアジド中間体を介する葉酸のγ−エステルをつくる方法による。この好ましい方法により、葉酸塩のグルタミン酸のγ−カルボキシ基を介してのみ免疫原にコンジュゲートされた葉酸塩リガンドを合成でき、そこではγ−コンジュゲートが葉酸塩受容体に高い親和性で結合しており、α−コンジュゲートとγ−コンジュゲートの混合物との形成を回避できる。あるいは、純粋のα−コンジュゲートを、γ−カルボキシ基が選択的に遮断された中間体から作り得る。α−コンジュゲートの形成に続いて、当分野でよく知られている有機合成法を用いてγ−カルボキシ基の遮断を解く。特に他のビタミン類を、本発明におけるコンジュゲートをつくるためのリガンドとして用い得る。例えば、リガンド免疫原コンジュゲートを、葉酸と同様にビオチンおよびリボフラビンで作り得る（参照、米国特許５，１０８，９２１、５，４１６，０１６、５，６３５，３８２：出典明示により本明細書の一部とする）。
【００３１】
本発明のリガンド免疫原コンジュゲートは、病原性細胞集団の内因性免疫応答による消失を高める。内因性免疫応答には、液性応答、細胞仲介免疫応答、宿主動物に対する内因性の他のすべての免疫応答があり、補体仲介細胞分解、抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用に導く抗体オプソニン効果、アポトーシス、抗増殖または分化のシグナル伝達をもたらす抗体結合での受容体のクラスター化、分配された抗原／ハプテンの直接的免疫細胞認識を含む。内因性免疫応答が、免疫細胞の増加または移動などのプロセスを調節するサイトカインの分泌を用いることも考え得る。内因性免疫応答は、Ｂ細胞、ヘルパーおよび細胞毒性Ｔ細胞を含むＴ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、ＬＡＫ細胞などの免疫細胞型の関与を含み得る。
【００３２】
液性応答は、通常計画されるワクチン接種、または天然抗原や非天然の抗原もしくはハプテン（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）で新規の免疫性を誘導する非天然抗原をもつ活性免疫付与などのプロセスにより誘導される応答である。活性免疫付与は、新しい免疫性を誘導するために、通常のワクチン接種外で計画された非天然の抗原またはハプテンの複数注射を含む。液性応答は、宿主動物がα−ガラクトシル基に対する免疫性などの天然にすでに存在する免疫性を有するような先天性免疫からも生じる。あるいは、受動免疫を、宿主動物に抗体を投与して作り得る。例えば、血清から集められた天然の抗体またはヒト化された抗体を含む遺伝子処理されまたはされていないモノクローナル抗体を投与する。受動免疫を起こすための抗体試薬の特定量の使用、および受動的に投与された抗体が免疫原に働くようなリガンド免疫原コンジュゲートの使用は、患者の前存在抗体力価が治療的に有用でない場合に使用される試薬の標準的セットの利点を提供する。受動的に投与される抗体は、リガンド免疫原コンジュゲートとともに「共投与」できる。共投与は、リガンド免疫原コンジュゲートの投与の前、同時、後での抗体の投与と定義する。
【００３３】
前存在の抗体、誘導された抗体または受動的に投与された抗体は、リガンド免疫原コンジュゲートの、その侵略の細胞または生物体との優先的結合によって、腫瘍細胞または感染生物体に再動し、病原体細胞が補体仲介分解、ＡＤＣＣ、抗体依存性食作用、受容体の抗体クラスター化により殺されると考える。細胞毒性プロセスは、細胞仲介免疫などの他の型の免疫応答、および第２次応答も含み得る。この応答は、刺激された抗原提示細胞が、不必要な細胞および存在する天然腫瘍抗原または外来病原体の抗原を、抗原を保持する細胞または生物体の消失のために免疫系に食するときに生じる。
【００３４】
治療因子を含む少なくとも１つの追加の組成物を、併用してまたは上記詳細の方法の補助として宿主に投与し、病原性細胞集団の内因性免疫応答による消失を高め得る。また１以上の追加の治療因子を投与できる。治療因子は、内因性免疫応答を促進し得る化合物、化学療法剤、抗菌剤、投与されたリガンド免疫原複合体の効力を補い得る他の治療因子から選択できる。本発明方法において、上記のコンジュゲートに加えて内因性免疫応答を促進し得る化合物または組成物を宿主に投与できる。それには、限定でないが、サイトカインまたは免疫細胞成長因子、例えば、インターロイキン１−１８、幹細胞因子、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＫ−２リガンド、ＨＩＬＤＡ、ＭＩＰ−１α、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、溶性ＣＤ２３、ＬＩＦおよびこれらの組み合わせがある。
【００３５】
これらのサイトカインの治療上有効な組み合せも使用できる。好ましい実施態様において、例えば、治療上有効な量のＩＬ−２を、例えば複数回毎日療法において約５０００〜５００，０００ＩＵ／用量／日で、およびＩＦＮ−αを、例えば複数回毎日療法において約７５００〜１５０，０００ＩＵ／用量／日で、葉酸結合のフルオレセインイソチオシアネートともに使用して、病原性細胞集団を保持する宿主動物における病原性細胞を無くする。他の好ましい実施態様においてＩＬ−１２およびＩＦＮ−αを治療上有効な量で用い、また別の好ましい実施態様においてＩＬ−１５およびＩＦＮ−αを治療上有効な量で用いる。別の好ましい実施態様においてＩＬ−２、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−γをＧＭ−ＣＳＦと併用する。好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦなどの治療因子およびその組み合せは、ナチュラルキラー細胞および／またはＴ細胞を活性化する。あるいは、治療因子およびその組み合せは、インターロイキンのインターフェロンおよびＧＭ−ＣＳＦとの組合せを含み、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、ＬＡＫ細胞などの他の免疫エフェクター細胞を活性化し得る。本発明はまた、他のインターロイキンおよびインターフェロンの組合せを含むサイトカインおよびコロニー刺激因子の他の有効な組合せについての使用を含む。
【００３６】
細胞毒性自体であり、腫瘍の透過性を高めるように働き、本発明方法での使用に適している化学療法剤は、下記のものを含む。アドレノコルチコイド、アルキル化剤、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、エストロゲン、サイトシン・アラビノシドなどの抗代謝物質、プリン同族体、ピリミジン同族体、メトトレキセート、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチンおよび他の白金化合物、タモキシフェン、タキソール、シクロホスファミド、植物アルカロイド、プレドニソン、ヒドロキシウレア、テニポシド、マイトマイシンやブレオマイシンなどの抗生物質、ナイトロゲンマスタード、ニトロスレア、ビンクリスチン、ビンブラスチン、炎症性および炎症様物質、および当分野で認められている化学療法剤。本コンジュゲートの投与の補助として投与できる治療物質は、下記のものを含む。ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、クロラムフェニコール、アミノグリコシド、ゲンタミシン、アムホテリシンＢ、アシクロビル、トリフルリジン、ガンシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リバビリン、および当分野で認められている抗菌化合物。
【００３７】
病原性細胞集団の消失は、腫瘍塊または病原生物体の減少および消失を含み、治療的応答となるものである。腫瘍の場合、原発性の腫瘍細胞または原発性腫瘍から転移したか分離しつつある細胞の消失であり得る。外科的除去、放射線治療、化学療法、生物学的治療法などを含む治療手段により腫瘍の除去がなされた後に、腫瘍の再発を防ぐための予防的処置も本発明は含む。予防的処置は、複数回毎日療法での処置などのリガンド免疫原コンジュゲートによる最初の処置、および／または最初の処置に続く追加または連続の処置であり得る。
【００３８】
本発明はまた、内因性免疫応答または共投与抗体による特異的消失のため宿主動物における病原性細胞集団を「標識」するのに効果的な量のリガンド免疫原コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。この組成物はさらに、病原性細胞集団の消失を高めるのに有効な量の追加の因子を含む。それは、殺細胞物質、腫瘍透過エンハンサー、化学療法剤、抗菌剤、細胞毒性免疫細胞、リガンド免疫原コンジュゲートに結合しないで内因性免疫応答を促進し得る化合物よりなる群から選択する。医薬組成物は、治療上有効な量のリガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子を含有する。この因子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５を含むサイトカインの組み合せ、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−γなどのインターフェロン、インターフェロンの組合せ、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子を含み得る。
【００３９】
リガンド免疫原コンジュゲートの一日単位用量は、宿主の状態、処置される病状、コンジュゲートの分子量、投与経路と組織分布、放射線療法などの他の治療処置との併用の可能性によって、大きく変り得る。患者に投与される有効な量は、体表面積、体重、患者の状態についての医師の判断が基になる。有効量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの範囲にあり得る。
【００４０】
腫瘍細胞または感染生物体に対する既存の抗体を再動するために、または免疫原に対する液性応答を誘導するために、リガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子を投与する効果的な療法を使用できる。例えば、リガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子を単回用量で投与でき、または分けて複数回毎日療法として投与できる。さらに、いくぶん変えた療法、例えば毎週１ないし３日の療法を毎日の処置の代替として使用できる。本発明の目的からして、このような中間的なまたはいくぶん変えた療法は、毎日の処置と等価であり、本発明の範囲内にある。本発明の好ましい実施態様において、宿主をリガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子の複数回注射で処置して、病原性細胞集団を消失せしめる。ひとつの実施態様において、宿主にリガンド免疫原コンジュゲートを複数回（好ましくは約２回から約５０回まで）、例えば１２−７２時間の間隔または４８−７２時間の間隔で注射する。リガンド免疫原コンジュゲートの追加の注射を患者に最初の注射後に日または月の間隔をおいて行うことができる。追加の注射は疾患の再発を防止する。あるいは、リガンド免疫原コンジュゲートの最初の注射が疾患の再発を防止できる。
【００４１】
治療因子を宿主動物に、リガンド免疫原コンジュゲートの前、同時、後に投与でき、治療因子は、コンジュゲートを含有する同じ組成物の一部として、またはリガンド免疫原コンジュゲートと異なる組成物の一部として投与できる。治療因子を治療上有効な用量で含有するいかなる治療組成物も本発明において使用できる。さらに、２以上のリガンド免疫原コンジュゲートを使用し得る。例えば、フルオレセインイソチオシアネートおよびジニトロフェニルの両方で予め免疫付与し、次いで共投与プロトコールにおける同一または相違のリガンドに連結しているフルオレセインイソチオシアネートおよびジニトロフェニルで処置し得る。化学療法剤および抗菌剤の場合、併用治療におけるリガンド免疫原コンジュゲートとともに最適に次ぐ用量で投与して、宿主動物による化学療法剤および抗菌剤に対する抵抗性の発達を回避できる。
【００４２】
リガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子は、好ましくは非経口的に注射し、かかる注射は、腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、鞘内の注射であり得る。リガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子は、遅速ポンプを用いての配送もできる。非経口用量形態の例は、活性物質の等張塩類水溶液を含み、５％グルコースまたは液体アルコール、グリコール、エステル、アミドなどの周知の薬学的に許容される液体担体である。本発明の非経口用量形態は、リガンド免疫原コンジュゲートおよび治療因子を含む再製可能な凍結乾燥物であり得る。この好ましい実施態様おいて、いくつかの当分野で既知のいくつかの持続放出用量形態で投与できる。例えば、米国特許４，７１３，２４９、５，２６６，３３３、５，４１７，９８２（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のバイオ分解性炭水化物マトリクスである。
【実施例】
【００４３】
実施例１
肺腫瘍埋め込み体をもつマウスの生存に対する葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートの効果
６から８週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２２ｇ）を、市販のアジュバント（例えば、フロイントアジュバントまたはＴｉｔｅｒ  ＭａｘＴＭ−Ｇｏｌｄ）を用いるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を複数部位に皮下注射して、免疫付加した。抗ＦＩＴＣ抗体力価がすべてのマウスで高いことを確認した後（マウスの血清サンプルについてのＥＬＩＳＡアッセイによる）、各マウスに、５ｘ１０５Ｍ１０９細胞、葉酸塩受容体を高レベルで発現する同系肺癌細胞を腹腔内注射した。癌部分を固着し成長にまかせた。癌細胞埋め込み４日および７日後に、すべてのマウスに、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）またはγ−カルボキシ連結エチレンジアミン・ブリッジを介して葉酸にコンジュゲートしている特定量のＦＩＴＣのいずれかを腹腔内に注射した。注射した葉酸塩−ＦＩＴＣの濃度は、０（対照ＰＢＳ）、４．５、４５、４５０、４５００ｎｍモル／ｋｇである。８匹に各濃度の葉酸塩−ＦＩＴＣを投与し、合計で４０匹に注射した。免疫系を刺激するために、５０００ＩＵの組換えヒトＩＬ−２を５日間（８から１２日目）すべてのマウスに注射した。この免疫治療の効果を、葉酸塩−ＦＩＴＣ処置マウスを対照マウスと比べて時間関数での生存を調べることで評価した。
【００４４】
図１に示すように、葉酸塩−ＦＩＴＣ処置マウスの生存の中央値は用量依存性であって、対照マウスの生存の中央値が腫瘍埋め込み後２３日であるのに対し、コンジュゲートの用量を増加すると葉酸塩−ＦＩＴＣ処置マウスの生存が長くなった。少量４５ｎモル／ｋｇの葉酸塩−ＦＩＴＣがマウスの長期間生存を促進するが、より高い量が比例的に大きい効果を有する。葉酸塩−ＦＩＴＣは腫瘍に集中するが、いくぶんの葉酸塩−ＦＩＴＣが腎組織に存在した（しかし、他の正常組織では匹敵するようなレベルでない）。腎および正常臓器における毒性は、資格ある獣医病理学者による剖検で認めなかった。
【００４５】
実施例２
フルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした葉酸塩による正常組織と腫瘍組織の影像
マウスに２４ＪＫ−ＦＢＰ腫瘍細胞を注射した以外は、実施例１と同様の方法である。葉酸塩−ＦＩＴＣを注射した後すぐにマウスを殺し、組織を薄切片にし、腫瘍を含む特定の組織、腎、肝、筋肉の組織について葉酸塩−ＦＩＴＣの所在を、共焦点蛍光顕微鏡を用いるＦＩＴＣ免疫蛍光で調べた。図２は、種々の組織切片を比較した顕微鏡写真を対照の蛍光顕微鏡写真とともに示す。葉酸塩−ＦＩＴＣは、腫瘍組織および葉酸受容体が非常に豊富である腎近位管細胞に特に局在していた。
【００４６】
実施例３
フルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした葉酸塩またはフィコエリトリン標識ヤギ抗マウスＩｇＧによる腫瘍組織の影像
Ｍ１０９細胞を用いた以外は、実施例２と同様の方法である。ＦＩＴＣ蛍光（緑の影像）、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光（赤の影像）により組織を調べた。ＰＥ蛍光のために、蛍光標識をヤギ抗マウスＩｇＧに結合せしめ、内因性マウス抗ＦＩＴＣ抗体の、腫瘍細胞に蓄積する葉酸塩−ＦＩＴＣコンジュゲートとの結合を調べた。葉酸塩−ＦＩＴＣで処理および未処理の腫瘍組織を比較し、両タイプのサンプルを、実施例２に記載ように位相差顕微鏡で調べた。ＦＩＴＣ蛍光によると、腫瘍細胞への葉酸塩−ＦＩＴＣの局在がある（図３）。ＰＥ蛍光によると、内因性マウス抗ＦＩＴＣ抗体が腫瘍細胞に局在の葉酸塩−ＦＩＴＣコンジュゲートに結合する。別の試験（示さず）によると、腎を含む正常細胞へのＩｇＧなどの結合はない。腎組織に局在の葉酸塩−ＦＩＴＣへの抗体の結合がないことは、葉酸塩受容体が腎近位管細胞の先端膜にあると、抗体が腎領域に接近しないことから来る。位相差影像（変位像）は、処置および未処置の腫瘍組織の形態を示し、処置サンプルにおいて細胞死がある。
【００４７】
実施例４
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートの固形腫瘍成長に対する効果
ＦＩＴＣでの免疫付与の前に１ｘ１０６Ｍ１０９細胞を各マウスの肩に皮下注射（０日目）した以外は、実施例１と同様の方法である。腫瘍細胞埋め込み後の葉酸塩−ＦＩＴＣによる免疫付与には、４８時間間隔で６回（７、９、１１、１３、１５、１７日目）、１５００ｎモル／ｋｇの葉酸塩−ＦＩＴＣを腹腔内投与した。次いで肩の固形腫瘍を測定し、腫瘍の大きさの増加％を決めた。図４に表す腫瘍成長曲線によると、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２との併用で処置されたマウスにおいて、固形腫瘍の成長が有意に阻止された。
【００４８】
実施例５
サイトカイン併用処置の効果
５０００ＩＵの組換えヒトＩＬ−２（８〜１２日目の５日間）を、ＩＦＮ−α（５日間２．５ｘ１０４Ｕ／日注射）、ＩＬ−１２（５日間０．５μｇ／日注射）またはＴＮＦ−α（８、１０、１２日目に３回、０．５μｇ／日注射）のいずれかとともに、腫瘍細胞埋め込み後の４および７日目での１５００ｎモル／ｋｇの葉酸塩−ＦＩＴＣまたはアミノフルオレセインとの投与に続き、マウスに与えた。他は実施例１の方法と同様である。さらに、長期間生存データを得るのに要する時間を短くするために、腫瘍細胞を肝の近くに腹腔内埋め込みをした。従って、腫瘍保持マウスの生存期間は、実施例１の場合に比して一般的に短い。図５に示す結果によると、マウスの長期間生存を促進するのに、ＩＬ−２単独は、ＩＬ−２とＩＬ−１２またはＩＬ−２とＴＮＦ−αの併用処置に比して、より効果的である。一方、ＩＬ−２とＩＦＮ−αの併用処置は、マウスの長期間生存を促進するのに、ＩＬ−２単独よりも効果的である。対照としてアミノフルオレセインを種々のサイトカインの組合せとともに注射した。この化合物は葉酸塩と結合しないので、腫瘍細胞に対する抗フルオレセイン抗体を再標的としないからである。
【００４９】
実施例６
葉酸塩フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートの複数回注射の効果
４８時間間隔で６回（腫瘍細胞埋め込み後の７、９、１１、１３、１５、１７日目）、１５００ｎモル／ｋｇの葉酸塩−ＦＩＴＣを腹腔内投与した以外は、実施例１と同様の方法である。結果を示す図６によると、葉酸塩−ＦＩＴＣの複数回注射が葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２で処置したマウスの長期間生存を、腫瘍細胞埋め込み後４および７日目に与えた葉酸塩−ＦＩＴＣの２注射に比して改善した。
【００５０】
実施例７
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートとＩＬ−２との相乗効果
１５００ｎモル／ｋｇの葉酸塩−ＦＩＴＣをＩＬ−２と併用、葉酸塩−ＦＩＴＣまたはＩＬ−２の単独をマウスに注射した以外は、実施例１と同様の方法である。さらに、腫瘍細胞を実施例５に記載のように腹腔内に埋め込んだ。この実験によって（参照、図７）、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２が腫瘍保持マウスの長期間生存を促進するのに相乗的に作用するかどうかを調べた。対照群（ｎ＝８）およびＩＬ−２、葉酸塩−ＦＩＴＣ、葉酸塩−ＦＩＴＣ＋ＩＬ−２での処置群についての生存時間の中間値は、それぞれ１８、１９、２２、４２日であった。図７に示す結果によると、腫瘍保持マウスの長期間生存を促進する葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２の能力は強く相乗的であり、低量のＩＬ−２単独は葉酸塩−ＦＩＴＣを欠くとマウスの生存に負の作用であり、葉酸塩−ＦＩＴＣは小さい作用に過ぎなかった。
【００５１】
実施例８
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートとＩＬ−２との相乗効果におけるＮＫ細胞の関与
ポリクローナルウサギ抗マウスＮＫ細胞抗体（ａｎｔｉ−ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．）で、葉酸塩−ＦＩＴＣおよびＩＬ−２と組み合せて、１群のマウスを処置した以外は、実施例７に記載の方法と同様に行った。ＮＫ細胞を除去するために、腫瘍埋め込み後１、４、９、１４日目に０．２ｍｌの１：１０稀釈の抗体保存液を各マウスに注射した。対照群（ｎ＝８）および葉酸塩−ＦＩＴＣ＋ＩＬ−２または葉酸塩−ＦＩＴＣ＋ＩＬ−２＋α−ＮＫＡｂでの処置群についての生存時間の中間値は、それぞれ１８、４２、１８．５日であった。図８に示す結果によると、ＮＫ細胞は、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２との併用処置による腫瘍保持マウスの長期間生存についての相乗的上昇を仲介する。
【００５２】
実施例９
Ｍ１０９腫瘍細胞に対する細胞性免疫の発達
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込みし、腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）、ＩＬ−２（２５０，０００ＩＵ／回）、ＩＦＮ−α（２５，０００Ｕ／回）を共注射した。加えて、最初の腫瘍細胞の埋め込み後６５日目に５ｘ１０５Ｍ１０９細胞を、最初の腫瘍細胞の埋め込み後９６日目に５ｘ１０６Ｍ１０９細胞を、最初の腫瘍細胞の埋め込み後１２７日目に５ｘ１０５Ｌｉｎｅ１細胞（Ｂａｌｂ／ｃ  自発的肺腫瘍）をマウスに注射した。
【００５３】
図９に示すように、５ｘ１０５Ｍ１０９細胞を注射した対照マウスの生存期間の中間値は１８．５日であった。５ｘ１０６Ｍ１０９細胞を注射した対照マウスの生存期間の中間値は１８日であった。５ｘ１０５Ｌｉｎｅ１細胞を注射した対照マウスの生存期間の中間値は２３．５日であった。５ｘ１０５Ｍ１０９細胞を注射し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−αと併用の葉酸塩−ＦＩＴＣで処理し、６２日目に５ｘ１０５Ｍ１０９細胞を注射し、９６日目に５ｘ１０６Ｍ１０９細胞を注射し、１２７目に５ｘ１０５Ｌｉｎｅ１細胞を注射したマウスの生存期間の中間値は、１９２日以上であった。
【００５４】
図９に示す結果によると、ＩＬ−２およびＩＦＮ−αと併用の葉酸塩−ＦＩＴＣで処置されたマウスにおいて長い持続的な細胞型特異的細胞性免疫が発達している。この長い持続的免疫は、Ｍ１０９細胞を埋め込み、葉酸塩標的免疫治療を与えたマウスにおいて、その後のＭ１０９細胞注射によって病気が再発するのを防止する。Ｌｉｎｅ１細胞の最終注射後のマウスの生存期間は、Ｍ１０９細胞におけるよりも低いレベルでのＬｉｎｅ１細胞おける葉酸塩受容体の存在によるのであろう。Ｍ１０９細胞とＬｉｎｅ１細胞に共通する腫瘍抗原の存在で、Ｌｉｎｅ１細胞と密接な関係をもち得るＭ１０９特異的細胞性免疫応答が生じる。
【００５５】
実施例１０
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートで処置したマウスの生存に対するＩＬ−２投与の効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込み、腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）およびＩＬ−２を５ｘ１０３ＩＵ（１ｘ）、０．５ｘ１０５ＩＵ（１０ｘ）、２．５ｘ１０５ＩＵ（５０ｘ）、５ｘ１０５ＩＵ（１００ｘ）で共注射した。これ以外は実施例１に記載の方法と同様である。加えて、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡよりもＦＩＴＣ標識鍵穴リンピット・ヘモシアニンで免疫付与した。図１０に示すように、Ｍ１０９細胞を埋め込み、葉酸塩−ＦＩＴＣで処置したマウスの生存期間の中央値が、５ｘ１０３ＩＵ以上にＩＬ−２を増やすと、増加した。一方、対照マウス（Ｍ１０９細胞を注射し、ＰＢＳで処置したマウス）とＩＬ−２単独で処置したマウスとの間には、生存期間の中央値に有意な差異を認めなかった。
【００５６】
実施例１１
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートおよびＩＬ−２で処置したマウスの生存のＩＦＮ−αによる増大
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込み、腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２（５０００ＩＵ／回）、または葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２（５０００ＩＵ／回）とＩＦＮ−α（２５，０００Ｕ／回）を共注射した。これ以外は実施例１に記載の方法と同様である。追加群のマウスに葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αを共注射したが、ＰＢＳ−ＦＩＴＣで予め免疫付与しなかった。図１１に示すように、ＰＢＳ処置の対照マウスの生存期間の中間値は１８．５日であり、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２を共注射したマウスの生存期間の中間値は２０．５日であり、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αを共注射したマウスの生存期間の中間値は６０日より大きく、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αを共注射し、予め免疫付与しなかったマウスの生存期間の中間値は２４．３日であった。葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２を共注射したマウスの生存期間の中間値は、対照マウスの場合と有意の差異がなかった。なぜなら、マウスに５０００ＩＵのＩＬ−２を注射し、そして実施例１０に記載のように、５０００ＩＵ以上のＩＬ−２用量を、７、８、９、１１、１４日に葉酸塩−ＦＩＴＣで処置したマウス生存期間の中間値の増加に必要とするからである。図１１に示す結果によると、ＩＦＮ−αは、腫瘍細胞を埋め込んだマウスの葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２による処置の結果として起きる生存期間の中間値の増加をさらに高めた。
【００５７】
実施例１２
葉酸塩標的の免疫治療に対するＣＤ８＋Ｔ細胞除去の効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込み、腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２（５０００ＩＵ／回）とＩＦＮ−α（２５，０００Ｕ／回）を共注射した。これ以外は実施例１に記載の方法と同様である。追加群のマウスにアミノフルオレセイン（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２とＩＦＮ−αまたは葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αと抗ＣＤ８＋Ｔ細胞抗体（腹水の形態で、２、３、７、１１、１５日目）を共注射した。図１２に示すように、抗ＣＤ８＋Ｔ細胞抗体は、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αで処置したマウスの生存期間中間値の増加を阻止した。ＣＤ８＋Ｔ細胞が葉酸塩標的の免疫治療による細胞性免疫応答の活性化において、役割を演じていることがわかる。対照としてアミノフルオレセインをＩＬ−２、ＩＦＮ−αサイトカインの組合せとともに注射した。この化合物は葉酸塩と結合しないので、腫瘍細胞に対する抗フルオレセイン抗体を再標的としないからである。図１２に示すように、ＩＬ−２とＩＦＮ−αとアミノフルオレセインは、Ｍ１０９細胞を埋め込んだマウスの生存期間の中間値の増加について葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αよりも効果が低い。
【００５８】
実施例１３
ＩＬ−２およびＩＦＮ−αにより高められた葉酸塩標的の免疫治療に対するＧＭ−ＣＳＦの増加効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込む以外は実施例１に記載の方法と同様である。加えて、図１３に示すように、マウスにＩＬ−２（５０００ＩＵ／回）、ＩＦＮ−α（２５，０００Ｕ／回）、ＧＭ−ＣＳＦ（３０００Ｕ／回）を含む複数のサイトカインを注射した。サイトカインは、１５００ｎモル／ｋｇの葉酸塩−ＦＩＴＣをＭ１０９細胞埋め込み後４および７日目に注射した後、続けて５日間８〜１２日目に共注射した。図１３に示す結果によると、ＰＢＳで処置したマウスの生存期間の中間値は１９日であり、ＩＬ−２とＩＦＮ−αとＧＭ−ＣＳＦ（葉酸塩−ＦＩＴＣなし）を注射したマウスの生存期間の中間値は２２日であり、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αを注射したマウスの生存期間の中間値は３８日であり、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＬ−２とＩＦＮ−αとＧＭ−ＣＳＦを注射したマウスの生存期間の中間値は５７．５日より大きかった。結果によると、ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−２とＩＦＮ−αで処置したマウスにおいて葉酸塩標的の腫瘍細胞を殺すのをさらに増加する。ＰＢＳとＩＬ−２とＩＦＮ−αとＧＭ−ＣＳＦを注射したマウスの生存期間の中間値は、対照マウスと有意な差異がなく、葉酸塩−ＦＩＴＣによる腫瘍特異的免疫応答の標的化の重要性を示している。
【００５９】
実施例１４
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートで処置したマウスの生存に対するＩＦＮ−α投与の効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込む以外は実施例１に記載の方法と同様である。マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＦＮ−αを１．５ｘ１０５ＩＵ／回（６ｘ）、７．５ｘ１０４ＩＵ／回（３ｘ）、２．５ｘ１０４ＩＵ／回（１ｘ）、７．５ｘ１０３ＩＵ／回（０．３ｘ）で共注射した。加えて、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡよりもＦＩＴＣ標識鍵穴リンピット・ヘモシアニンで免疫付与した。マウスに葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＦＮ−αを、腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に注射した。図１４に示すように、Ｍ１０９細胞を埋め込み、葉酸塩−ＦＩＴＣで処置したマウスの生存期間の中央値が、０．８ｘ１０４ＩＵ以上にＩＦＮ−αを増やすと、増加した。
【００６０】
実施例１５
葉酸塩標的の免疫治療に対する免疫原としてのジニトロフェニルの効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込む以外は実施例１に記載の方法と同様である。腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２（５０００ＩＵ／回／日）とＩＦＮ−α（２．５ｘ１０４ＩＵ／日）または葉酸塩−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２（５０００ＩＵ／回／日）とＩＦＮ−α（２．５ｘ１０４ＩＵ／日）を共注射した。加えて、ＤＮＰ標識鍵穴リンピット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）でマウスに免疫付与した。図１５に示すように、葉酸塩−ＤＮＰとＩＬ−２とＩＦＮ−αで処置したマウスの生存期間の中央値が、対照マウス（ＰＢＭで処置）およびＤＮＰとＩＬ−２とＩＦＮ−αで処置したマウスに比べて増加した。すなわち、ＤＮＰは葉酸塩標的の免疫治療についての効果的な免疫原でもある。
【００６１】
実施例１６
葉酸塩−フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲートとＩＦＮ−αの相乗効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込む以外は実施例１に記載の方法と同様である。腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）、ＩＦＮ−α単独（７．５ｘ１０４ＩＵ／日）、葉酸塩−ＦＩＴＣ単独（１５００ｎモル／ｋｇ）を注射するか、葉酸塩−ＦＩＴＣ（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＦＮ−α（７．５ｘ１０４ＩＵ／日）を共注射した。加えて、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡよりもＦＩＴＣ標識鍵穴リンピット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）でマウス（５匹／群）に免疫付与した。図１６に示すように、ＰＢＳ（対照）、ＩＦＮ−α、葉酸塩−ＦＩＴＣ、葉酸塩−ＦＩＴＣとＩＦＮ−αで処置したマウスの生存期間の中央値が、それぞれ１７、１７、２３、３３であった。この結果からして、ＩＦＮ−αは、ＩＬ−２と同様に、葉酸塩−ＦＩＴＣと相乗的に作用し、腫瘍保持マウスの長期間生存を促進する。
【００６２】
実施例１７
マウスの長期間生存に対する免疫原としてのジニトロフェニルと高濃度でのサイトカインの効果
腫瘍細胞を実施例５に記載の場所に腹腔内埋め込む以外は実施例１に記載の方法と同様である。腫瘍細胞の埋め込み後７、８、９、１１、１４日に、マウスにＰＢＳ（対照）を注射するか、ＰＢＳとＩＬ−２（２．５ｘ１０４ＩＵ／日）とＩＦＮ−α（７．５ｘ１０４ＩＵ／日）または葉酸塩−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）（１５００ｎモル／ｋｇ）とＩＬ−２（２．５ｘ１０４ＩＵ／日）とＩＦＮ−α（７．５ｘ１０４ＩＵ／日）を共注射した。加えて、ＤＮＰ標識鍵穴リンピット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）でマウスに免疫付与した。図１７に示すように、葉酸塩−ＤＮＰとＩＬ−２とＩＦＮ−αで処置したマウスの生存期間の中央値が、対照マウス（ＰＢＳで処置）およびＰＢＳとＩＬ−２とＩＦＮ−αで処置したマウスに比して増加した。葉酸塩−ＤＮＰとＩＬ−２とＩＦＮ−α（ＩＬ−２およびＩＦＮ−αの濃度は、それぞれ２．５ｘ１０４ＩＵ／日および７．５ｘ１０４ＩＵ／日）で処置したマウスは完全に緩解した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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