(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了（ＧＥ）配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の３’非コード領域（ゲノムセンス）が前記ＧＳ配列と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に位置し、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の５’非コード領域（ゲノムセンス）が前記外来遺伝子の停止コドンと前記ＧＥ配列の間に位置していることを特徴とする、前記組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項２】
３’及び５’非コード領域が、モノネガウイルス目ウイルスのエンベロープをコードする遺伝子のものであることを特徴とする請求項１に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項３】
３’及び５’非コード領域が、Ｍ、Ｇ、Ｆ又はＨＮ遺伝子のものであることを特徴とする請求項２に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項４】
３’及び５’非コード領域が、モノネガウイルス目ウイルスのＲＮＰタンパク質をコードする遺伝子のものであることを特徴とする請求項１に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項５】
外来遺伝子が病原体の抗原をコードすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項６】
外来遺伝子が免疫調節物質をコードすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項７】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがラブドウイルス科のウイルスであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項８】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが狂犬病ウイルスであることを特徴とする請求項７に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項９】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが伝染性造血器壊死症ウイルスであることを特徴とする請求項７に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１０】
３’及び５’非コード領域が、Ｎ、Ｐ、Ｍ又はＧ遺伝子のものであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１１】
追加の転写単位が、３’近位に、又はＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に、又はＭ遺伝子とＧ遺伝子の間に、又はＧ遺伝子とＬ遺伝子の間に位置することを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１２】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがパラミクソウイルス科のウイルスであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１３】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルス、イヌジステンパーウイルス又はウシパラインフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１２に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１４】
３’及び５’非コード領域が、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ又はＨＮ遺伝子のものであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１５】
追加の転写単位が、３’近位に、又はＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に、又はＭ遺伝子とＦ遺伝子の間に、又はＦ遺伝子とＨＮ遺伝子の間に、又はＨＮ遺伝子とＬ遺伝子の間に位置することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１６】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルスであることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１７】
追加の転写単位がＦ遺伝子とＨＮ遺伝子の間に位置することを特徴とする請求項１６に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１８】
３’及び５’非コード領域がＨＮ遺伝子のものであることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１９】
外来遺伝子がトリ病原体の抗原をコードすることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項２０】
外来遺伝子がインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）をコードすることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項２１】
外来遺伝子がインフルエンザウイルスのＨ５又はＨ７ヘマグルチニンをコードすることを特徴とする請求項２０に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項２２】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが弱毒化ウイルスであることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項２３】
生又は不活化形態の、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター及び医薬として許容される担体若しくは希釈剤を含むことを特徴とする微生物病原体に対するワクチン。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
さらなるワクチン株を含むことを特徴とする請求項２３又は２４に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了（ＧＥ）配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターに関し、並びにこのようなモノネガウイルス目ウイルスベクターを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染した宿主中で複製することができる生ウイルスは、それらの発現された抗原に対して強力で、長期間持続する免疫応答を誘導する。生ウイルスは、液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答を惹起する上で、並びにサイトカイン及びケモカイン経路を刺激する上で有効である。従って、弱毒化された生ウイルスは、通例、免疫系の液性アームのみを刺激することが多い不活化された免疫源又はサブユニット免疫源を基礎とするワクチン組成物に比べて極めて優位である。
【０００３】
ここ１０年にわたって、組み換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡとＲＮＡウイルスのゲノムの遺伝子操作の分野に大きな変革をもたらした。特に、現在では、宿主動物中で新たなベクターウイルスが複製した際に、宿主動物中で生物学的効果を発揮することができる外来タンパク質が発現されるように、ウイルスのゲノム中に外来遺伝子を導入することが可能である。このような組み換えベクターウイルスは、微生物感染の管理及び予防のために活用されてきたのみならず、悪性腫瘍及び遺伝子療法などの非微生物学疾患のための標的療法を考案するためにも活用されてきた。
【０００４】
１９９４年に最初に報告された「逆遺伝学」と称される技術（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３，４１９５−４２０３，１９９４）によって、専らクローニングされたｃＤＮＡから得られたセグメント化されていないマイナス鎖のＲＮＡウイルス（モノネガウイルス目のウイルス）の作製によって、モノネガウイルス目（ＭＶ）のウイルスもベクターとして使用することが可能となった。それ以来、病原体に対するワクチンを開発することを目指して、その病原体に由来する外来抗原を発現するために、ウイルスベクターとしてＭＶ目の多くのウイルスの使用を記載する研究が公表されてきた。
【０００５】
モノネガウイルス目は、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科という４つの主な科に分類される。これらの科に属するウイルスは、単一の負の（−）センスＲＮＡ分子によって表されるゲノムを有する。すなわち、ＲＮＡゲノムの極性は、プラス（＋）センスとして表されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の極性とは反対である。主なヒト及び動物のＭＶウイルスの分類が、下表に示されている。
【０００６】
【表１】
0005432703.tif 000002
【０００７】
ＭＶ目のウイルスのゲノムの組織及び生活環の詳細は、近年、詳細に理解されており、様々な著者によって概説されている（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３，２６３５−２６６２，２００２；Ｗｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３，６３−１１９，２００４；Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｋ．；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３，１−４１，２００４）。モノネガウイルス目ウイルスは異なる宿主及び別個の形態学的及び生物学的特性を有しているが、ゲノムの構成並びに複製及び遺伝子発現の典型的なモードにとって不可欠な要素など多くの特徴を共有しており、モノネガウイルス目ウイルスは共通の祖先から生じたことを示している。モノネガウイルス目ウイルスは、細胞の細胞質中で複製し、スプライシングされていないｍＲＮＡを産生する、エンベロープに包まれたウイルスである。
【０００８】
モノネガウイルス目ウイルスは、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体及びエンベロープという２つの主な機能単位からなる。上に上げられている全ての科の属の代表的ウイルスに対する完全なゲノム配列が決定されている。ゲノムは約９，０００ヌクレオチドから約１９，０００のサイズの範囲であり、５から１０個の遺伝子を含有する。ＭＶウイルスのゲノムの構造及び構成は極めて似通っており、ウイルス特有の遺伝子発現様式によって支配されている。ＭＶウイルスゲノムは全て、ヌクレオタンパク質（Ｎ又はＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードする３つのコア遺伝子を含む。ウイルスのエンベロープは、マトリックス（Ｍ）タンパク質、並びにウイルスの集合／出芽及びウイルスの細胞付着及び／又は侵入において役割を果たしている１つ又はそれ以上の膜貫通糖タンパク質（例えば、Ｇ、ＨＮ及びＦタンパク質）から構成される。属に応じて、タンパク質のレパートリーは、転写及びウイルス複製においてある種の特異的な制御機能を示し、又はウイルス宿主反応に関与する補助タンパク質（例えば、Ｃ，Ｖ及びＮＳタンパク質）によって拡張される。ＭＶウイルスの遺伝子順序は極めて保存されており、コア遺伝子Ｎ及びＰが３’末端又は３’末端付近に位置し、巨大（Ｌ）遺伝子が５’遠位に位置する。表面糖タンパク質遺伝子Ｍ及び他の補助遺伝子は、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子の間に位置している。
【０００９】
ＲＮＰ複合体において、ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡは、Ｎタンパク質とともに強固にキャプシドを形成しており、Ｌ及びＰタンパク質からなるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを伴う。細胞の感染後に、ＲＮＰ複合体は、２つの異なるＲＮＡ合成機能（すなわち、サブゲノムのｍＲＮＡの転写及び完全長ゲノムＲＮＡの複製）に対する鋳型としての役割を果たすが、裸のＲＮＡゲノムは鋳型としての役割を果たさない。
【００１０】
直列に配置された遺伝子は全て、いわゆる「遺伝子接合部」構造によって隔てられている。遺伝子接合部は、保存された「遺伝子終了」（ＧＥ；ｇｅｎｅ  ｅｎｄ）配列、転写されない「遺伝子間領域」（ＩＧＲ）及び保存された「遺伝子開始」（ＧＳ）配列を含む。これらの配列は、遺伝子転写のために必要且つ十分である。転写の間に、各遺伝子は、最初のＧＳ配列におけるゲノムＲＮＡの３’末端において転写プロセスを開始するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、ｍＲＮＡに順次転写される。各遺伝子接合部の転写は、ＧＥ配列におけるＲＮＡポリメラーゼの離脱の結果として中断される。転写の再開は後続のＧＳ配列において起こるが、低下した効率で起こる。この中断されたプロセス（「停止−開始」プロセスとも称される。）の結果、後続の下流遺伝子に比べて、ＭＶウイルスゲノム上の３’近位遺伝子がより豊富に転写されるために、各遺伝子接合部では、転写の弱化が生じる。各遺伝子が別個のシストロン又は転写単位の一部であるＭＶウイルス遺伝子の転写のモジュール形態のために、これらのウイルスは、外来遺伝子の挿入及び発現のために極めて適切なものとなる。ＭＶウイルスゲノム中の各転写単位は、以下の要素：３’−ＧＳ−翻訳領域（ＯＲＦ）−ＧＥ−５’を含む。
【００１１】
ＭＶウイルスゲノムの全ては、３’及び５’ゲノム末端に、それぞれ、「リーダー」（約４０から５０ｎｔ）及び「トレーラー」（約２０から６００ｎｔ）と称される転写されない短い領域を有する。リーダー及びトレーラー配列は、ゲノムＲＮＡの複製、ウイルスのキャプシド形成及びパッケージングを調節する必須の配列である。
【００１２】
逆遺伝学技術及び伝染性ＭＶウイルスの救出によって、そのｃＤＮＡコピーを通じてそのＲＮＡゲノムを操作することが可能となった。ウイルスＲＮＡを合成するために必要とされる最小の複製開始複合体がＲＮＰ複合体である。感染性ＭＶウイルスは、（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼによって駆動されるプラスミドからの（アンチ）ゲノムＲＮＡ及び適切な支持タンパク質の細胞内同時発現によって救出することができる。Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（上記）による１９９４年の最初の報告以来、当初のプロトコール（又はその僅かな変形プロトコール）に基づいて、多くのＭＶウイルス種の信頼できる回収が達成されている。
【００１３】
ニューキャッスル病及びトリインフルエンザは家禽の重要な病気であり、世界中の家禽産業に著しい経済的損失をもたらし得る。ニューキャッスル病ウイルスは、ＭＶ目に属する、セグメント化されていない負鎖のＲＮＡウイルスである。約１５ｋｂの長さであるゲノムは、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、リン酸化タンパク質及びＶタンパク質（Ｐ／Ｖ）、マトリックス（Ｍ）タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又は巨大（Ｌ）タンパク質をコードする６つの遺伝子を含有する。ＮＤＶ遺伝子は、３’−ＮＰ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’の順序で順に配置されており、異なる長さの遺伝子間領域によって隔てられている。全ての遺伝子には、遺伝子開始（ＧＳ）配列が先行しており、その後に、非コード領域、ＮＤＶタンパク質をコードする翻訳領域、第二の非コード領域及び遺伝子終了（ＧＥ）配列が続いている。ＮＤＶゲノムの長さは、６の倍数であり、外来遺伝子の導入のために考慮しなければならない。
【００１４】
トリインフルエンザ（ＡＩ）は、穏やかな呼吸症状ないし死亡率が高い重度の疾病によって特徴付けられる家禽の病気である。原因因子は、オルトミクソウイルス科に属するトリインフルエンザＡ型ウイルス（ＡＩＶ）である。ＡＩＶは、１０個のタンパク質をコードする負の極性を有する８つのゲノムＲＮＡセグメントを含有する。表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）の抗原性に基づいて、ＡＩウイルスはサブタイプに分類された。現在まで、１６のヘマグルチニン（Ｈ１からＨ１６）及び９つのノイラミニダーゼ（Ｎ１からＮ９）サブタイプが知られている。Ｈ及びＮに対する抗体は、液性免疫応答において重要であり、感染を阻害し、又は疾病を予防する。
【００１５】
トリインフルエンザ及びニューキャッスル病ウイルスは、それらの病原性に従って２つの異なる病原型に分けることができる。低病原性のＡＩＶ（ＬＰＡＩ）又は弱毒性（ｌｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）ＮＤＶによって引き起こされる症候は、より重要性が低いと考えられている。これに対して、高病原性ウイルス（ＮＤＶ：中等毒性（ｍｅｓｏｇｅｎｉｃ）株及び強毒性（ｖｅｌｏｇｅｎｉｃ）株）によって引き起こされる高度に病原性のトリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）及びニューキャッスル病は、法定伝染病である。
【００１６】
弱毒性ＮＤＶ株を用いたＮＤＶに対する定型的なワクチン接種は、高度に病原性のＮＤＶ株に対してニワトリを保護するために行われているが、ＨＰＡＩは根絶戦略によって駆除されるので、多くの国で、ＨＰＡＩに対するワクチン接種は行われていない。しかしながら、損失を最小限に抑え、及び疾病の発生を低減するための戦略として、ワクチン接種を使用し得る。ワクチンによって誘導された免疫はサブタイプ特異的であり、これは、サブタイプＨ５ワクチンはＨ５ＡＩＶに対して保護することができるが、他のＨサブタイプに対しては保護できないことを意味する。通常、ＬＰＡＩウイルスのヘマグルチニンは、肺に限局したセリンプロテアーゼであるトリプターゼＣｌａｒａによってのみ切断され得るのでインフルエンザウイルスの複製は肺に限局している。これまでのところ、全てのＨＰＡＩウイルスがＨ５及びＨ７サブタイプのものであった。これらのＨＰＡＩウイルスは、遍在性のフューリン及びサブチリシン様酵素によって、サブユニットＨＡ１及びＨＡ２へ切断され得るように、Ｈ切断部位の複数の塩基性アミノ酸を含有する。従って、このようなウイルスは、他の臓器中で増殖することができる。
【００１７】
サブタイプＨ５及びＨ７ワクチンは、ＨＰＡＩによる感染後の臨床兆候及び死亡に対して、ニワトリ及びシチメンチョウの保護を与えることができる。旧来の不活化されたオイルベースの完全なＡＩＶの他に、ベクターウイルス、サブユニットタンパク質及びＤＮＡワクチンがＡＩに対する免疫に関して有効であることが実験的に示されている。様々なウイルスに対する逆遺伝学の登場以来、ワクチンベクターとして使用するための組み換えウイルスの作製は重要な応用である。外来タンパク質を発現する、異なる組み換え負鎖ＲＮＡウイルスが構築されてきた。また、ＡＩＶのヘマグルチニンは、伝染性咽頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）（Ｌｕｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，４２４９−５９，２００１）、牛疫ウイルス（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１０１６５−７５，２０００）及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２４７，４７０４−１１，１９９８）のような様々なベクターウイルス中に挿入された。
【００１８】
牛疫ウイルスは、口蹄疫ウイルスＶＰ１キャプシドタンパク質の発現のためのベクターウイルスとしても使用された（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．ｏｆＧｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．８０，ｐ．２０３１−２０３９）。
【００１９】
Ｔａｏら（１９９８，Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐ．２９５５−２９６１）は、内在性のｈＰＩＶ３型ＨＶ及びＦ遺伝子を（付加ではなく）置換するために、ｈＰＩＶ１型由来のＨＮ及びＦ遺伝子が使用されたキメラヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）３型の構築を記載している。
【００２０】
ＮＤＶは、ＡＩＶヘマグルチニンの発現のためにも使用された。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３のヘマグルチニン遺伝子は、ＮＤＶ株ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１のＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に挿入された。この組み換え体は致死的な感染からマウスを保護したが、マウスに検出可能な体重減少が存在し、１０日以内に完全に回復したＮａｋａｙａら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，１１８６８−７３，２００１）。外来遺伝子に対する同一の挿入部位を有するさらなる組み換えＮＤＶはＬＰＡＩのＨ７を発現したが、ワクチン接種されたニワトリの４０％が強毒性ＮＤＶ及びＨＰＡＩの両者から保護されたに過ぎなかった（Ｓｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４７，１０４７−５０，２００３）。
【００２１】
しかしながら、これらの公報は、ＭＶベクターのゲノム中に挿入されたさらなる外来遺伝子の発現に対する、内在性ＭＶ遺伝子のいわゆる非コード領域の有利な効果を開示していない。
【００２２】
ベクターウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子によってコードされるタンパク質のより高い発現レベルを示し、及び／又は既存のＭＶウイルスベクターより強い免疫原性を示す組み換えＭＶウイルスベクターを提供することが本発明の目的である。
【００２３】
本発明者らは、本発明に係る組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターによって、この目的を達し得ることを見出した。従って、本発明は、上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了（ＧＥ）配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、前記ＧＳ配列と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、及び前記外来遺伝子の停止コドンと前記ＧＥ配列の間に、それぞれ、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の３’非コード領域及び５’非コード領域（ゲノムセンス）が位置していることを特徴とする、前記組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを提供する。
【００２４】
ここでの及び本明細書の他の箇所での核酸鎖の極性の表記は、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列の場合を除き、ゲノム（−）センスで与えられていることに注意されたい。
【００２５】
ＭＶウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子を含む転写単位中のＭＶウイルス遺伝子の３’及び５’非コード領域の存在は、外来遺伝子の転写及び／又は発現に対して正の効果を有することが見出された。ＧＳ配列とトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子の間に及びＡＩＶＨＡ遺伝子とＧＥ配列の間に、ＭＶウイルス遺伝子の非コード領域を設計することによって、ＡＩＶＨＡ遺伝子を保有するＭＶウイルスベクターによって合成されるＨＡｍＲＮＡの量が増加することが図３に示されている。タンパク質発現レベルに対しても、正の効果が観察される。ＭＶウイルスベクターの比較は、外来ＡＩＶＨＡ遺伝子を保有するＭＶウイルスベクターが非コード領域に隣接している場合に、ＡＩＶＨＡ特異的抗血清での強烈な免疫学的染色を示したに過ぎなかった（図４）。従って、本発明者らは、これらの観察を説明し得る何れの理論又はモデルにも拘泥することを望まないが、外来遺伝子に隣接するＭＶウイルス非コード領域の存在は、生じたＭＶウイルスベクターの性能に対して正の効果を有することを見出した。
【００２６】
外来遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質をコードし、レシピエントＭＶウイルスのゲノム中に本来存在しないポリヌクレオチド分子である。
【００２７】
上で既に詳しく記載されているように、ＭＶウイルスのゲノムの構成の共通する特徴は、直列に配置された転写単位が連続的に転写される、それらの転写のモジュール形態である。野生型ＭＶウイルスでは、転写された遺伝子は、（ｉ）それらの３’末端において、ＧＳ配列及び本分野において「非コード領域」と表記されるヌクレオチド配列と隣接しており、並びに（ｉｉ）それらの５’末端において、本分野において同じく「非コード領域」と表記されるヌクレオチド配列及びＧＥ配列と隣接している。従って、本明細書において使用される（３’又は５’）「非コード領域」という用語は、ＭＶウイルスの天然遺伝子の上流（３’）又は下流（５’）に位置し、それぞれ、ＧＳ配列とＭＶウイルス遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）との間の領域及びＭＶウイルス遺伝子の停止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ）とＧＥ配列との間の領域を貫くヌクレオチド配列を定義する。本明細書において使用される非コード領域は、ベクターウイルスと同じウイルスの遺伝子に由来する（すなわち、非コード領域は、ＭＶウイルスベクターと相同である。）。
【００２８】
様々なＭＶウイルス遺伝子のヌクレオチド配列及びそれらの転写調節（ＧＳ及びＧＥ）配列及び遺伝子に隣接する非コード配列など、ＭＶウイルスのゲノムの構成の詳しい情報は、本分野において公知である。このような情報は、例えば、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｖ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｖ（ＮＣＢＩ）のデータから入手することができる（表２及び３参照）。
【００２９】
本発明において好ましく使用される非コード配列は、天然のＭＶウイルス遺伝子に由来するが、天然の非コード領域中の１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換も、本発明に属すると考えられる。特に、それぞれ、外来遺伝子の開始／停止コドンのすぐ上流又は下流に位置しており、これらの領域の遺伝的操作を可能とする人工の制限酵素切断部位の導入から得られるヌクレオチド置換が想定される。
【００３０】
本発明の好ましい組み換えＭＶウイルスベクターにおいて、非コード領域は、ＭＶウイルスエンベロープタンパク質、特に、Ｍ、Ｇ、Ｆ若しくはＨＮタンパク質又はＲＮＰタンパク質、特に、Ｎ、Ｐ若しくはＬタンパク質をコードする非コード領域である。
【００３１】
本発明の特に好ましい組み換えＭＶウイルスにおいて、非コード領域は、Ｆ又はＨＮタンパク質をコードする遺伝子の非コード領域である。
【００３２】
本発明の組み換えＭＶウイルスベクター中で使用されるべき非コード領域の特異的ヌクレオチド配列が、表３に示されている。
【００３３】
【表２】
0005432703.tif 000003
【００３４】
本発明において、転写調節配列として使用されるべきＧＳ及びＧＥ配列は、好ましくは、ＭＶウイルスの天然遺伝子に由来するものである。これらの配列は、転写プロセスの間に、特に、転写開始及びｍＲＮＡ５’末端修飾のプロセスにおいて、及び転写３’末端ポリアデニル化及び終結の調節において、ＲＮＡポリメラーゼの活性を調節すると考えられている。各ＭＶウイルスに関して、各遺伝子の始まりは、約１０ヌクレオチドの配列によって印が付されている。幾つかのＭＶウイルス種では、ＧＳ配列は各遺伝子に対して同じであるが、他のＭＶウイルス種のゲノム中のＧＳ配列は、僅かな差を示し得る。
【００３５】
ｍＲＮＡ３’末端ポリＡ尾部の形成及び転写の終結におけるそれらの共通する機能に照らして、ＭＶウイルス中のＧＥ配列は共通の配列特性を共有している。典型的なＧＥ配列は、４から８ヌクレオチド長の間のウリジントラクト（Ｕ−ｔｒａｃｔ）を含む。さらに、ウリジントラクトのすぐ上流に位置するＣ残基の強い保存が存在し、これには、Ａ／Ｕに富むヌクレオチドの連なりが先行する。様々なＧＥ配列において、ウリジントラクトのすぐ上流の４ヌクレオチドは、３’−ＡＵＵＣ−５’から構成される。
【００３６】
ゲノムテンプレート中のヌクレオチド配列とｍＲＮＡ末端に存在するヌクレオチド配列を比較することによって、ＭＶウイルス遺伝子の遺伝子境界又は遺伝子接合部を規定する転写調節配列が多くのＭＶウイルス遺伝子に対して同定されてきた。さらに、多くの研究が、効率的な遺伝子発現のために必要とされるＧＳ及びＧＥコンセンサス配列を同定してきた。ＧＳ及びＧＥ配列の一般的な特徴及び具体例は、ＮＣＢＩ配列データベース中の情報から得ることができ（ＮＣＢＩ受入番号に関しては、表２を参照）、Ｎｅｕｍａｎｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３，２６３５−２６６２，２００２）及びＷｈｅｌａｎら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３，６３−１１９，２００４）によっても概説されている。
【００３７】
本発明の組み換えＭＶウイルスベクター中で使用されるべき特に好ましいＧＳ及びＧＥ配列が表３に列記されているが、ＧＳ−、ＮＣＲ−及びＧＥ配列の間の正確な境界は、必ずしも決定できるわけではないことが認められている。この配列情報は、ＮＣＢＩデータベース中に開示されている（表２中の受入番号を参照されたい。）。ＮＤＶに関しては、ＥＭＢＬ受入番号Ｙ１８８９８を、ＲＶに関しては、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ３１０４６を参照されたい。
【００３８】
【表３】
0005432703.tif 000004
0005432703.tif 000005
0005432703.tif 000006
【００３９】
本発明の好ましい組み換えＭＶウイルスベクターにおいて、ＧＳ、ＧＥ配列及び非コード領域は、同じＭＶウイルス遺伝子に由来する。
【００４０】
外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えＭＶウイルスベクターの調製方法は、本分野において周知である。例えば、表２は、様々なＭＶウイルス種に関して、このような組み換えベクターウイルスの調製を記載する文献を参照している。原理的には、本発明において使用される方法は、ＭＶウイルスゲノム中に挿入されるべき外来遺伝子が、上記のように、適切な３’及び５’非コード領域に隣接していることを除き、従来技術と同じ方法である。
【００４１】
本発明の一般的な方法において、組み換えＭＶウイルスベクターは、得られたＭＶウイルスベクターにおいて、特に、ＧＥ−ＩＧＲ−ＧＳ要素を含むゲノムヌクレオチド配列断片によって、外来遺伝子にＭＶウイルス遺伝子接合部が先行し、且つ後続するように、（ｉ）上記のような３’及び５’非コード領域に隣接している外来遺伝子及び（ｉｉ）適切な転写調節配列を含む単離された核酸分子をＭＶウイルスのゲノム中に挿入することによって調製される。このような上流及び下流要素の存在は、挿入された外来遺伝子の適切な転写を保証するのみならず、挿入された外来遺伝子の上流及び下流に位置する相同的なＭＶウイルス遺伝子の適切な転写を保証する。
【００４２】
さらに具体的には、本方法において、ＭＶウイルスの単離された核酸分子及びゲノムは、それらのｃＤＮＡ形態（＋センス）で使用される。これによって、所望の核酸分子の取り扱い及びウイルスゲノム中への挿入が容易になる。
【００４３】
一般に、２つの遺伝子間に、すなわち遺伝子間領域（ＩＧＲ）中に、遺伝子の３’又は５’非コード領域及びゲノムの３’プロモーター近位（Ｎ／ＮＰ遺伝子の前）又は５’遠位末端（Ｌ遺伝子の後）に外来遺伝子を挿入するためにゲノムの様々な部分を使用することができる。
【００４４】
外来遺伝子は、Ｎ／ＮＰ遺伝子の前、ＮＰ−Ｐ，Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｇ／Ｆ、Ｇ／Ｆ−ＨＮ、ＨＮ−Ｌの間に及びＬ遺伝子の後に有利に挿入することができる。
【００４５】
最も単純な方法は、酵素で切断し、適切な転写カセットを導入することによって、これらの部位の１つに、既存の制限酵素（ＲＥ）認識配列を使用することである。天然に存在する制限酵素認識配列は、常に所望の位置に存在しているわけではなく、ＲＥ認識部位は、位置指定突然変異導入又はＰＣＲ突然変異導入によって、ゲノム中に都合よく導入することが可能である。外来遺伝子を挿入するための適切なＩＧＲの例は、表３に見出すことができる。
【００４６】
挿入すべき転写カセットの組成は、挿入の部位に依存する。例えば、転写カセットがＩＧＲに挿入される場合、カセットは次のエレメント：３’ＲＥ認識部位−ＧＳ−非コード領域−（外来遺伝子の）ＯＲＦ−非コード領域−ＧＥ−ＲＥ認識部位５’を含み得る。
【００４７】
あるいは、転写カセットが天然のＭＶウイルス遺伝子の５’非コード領域に導入される場合、カセットは、３’ＲＥ認識部位−ＧＥ−ＩＧＲ−ＧＳ−非コード領域−（外来遺伝子の）ＯＲＦ−非コード領域−ＲＥ認識部位５’から構成され得る。
【００４８】
同様に、転写カセットが天然のＭＶウイルス遺伝子の３’非コード領域に導入されるべき場合、カセットは、３’ＲＥ認識部位−非コード領域−（外来遺伝子の）ＯＲＦ−非コード領域−ＧＥ−ＩＧＲ−ＧＳ−ＲＥ認識部位５’から構成され得る。
【００４９】
このような転写カセットの調製及びＭＶウイルスゲノムへのこの挿入は、列挙した参考文献及び本発明の実施例で例示されるものなどの通常の分子生物学的技術しか含まない。特に、この目的に対して、部位特異的及びＰＣＲ突然変異誘発などの技術を使用することができる（Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９、前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編：Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら、Ｗｉｌｅｙ  Ｎ．Ｙ．、１９９５編集、８．５．１．−８．５．９頁；及びＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５４、３７６−３８２、１９８７）。
【００５０】
とりわけ、ＭＶ目の分節されていない負鎖ＲＮＡウイルスの遺伝子修飾を可能にする、よく確立された「逆遺伝学」法により、本発明による組み換えＭＶウイルスベクターを調製することができる（例えばＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３、１−４１、２００４；及びＷａｌｐｉｔａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４４、９−１８、２００５により概説される。）。
【００５１】
この方法において、ＭＶ（アンチ）ゲノム及びサポートタンパク質の転写及び同時発現及び組み換えＭＶベクターの作製を可能にするのに十分な条件下で、全長ゲノム又は、好ましくはＭＶウイルスのアンチゲノム（ポジティブセンス）をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子を含むベクター及び、必要とされるサポートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子を含む１つ又はそれ以上のベクターにより、適切な細胞の同時形質移入を行う。この方法において、全長ＭＶウイルス（アンチ）ゲノムをコードする前記核酸分子は、上記で定義されるようなさらなる転写単位を含む。
【００５２】
ベクターは、このベクターにより形質移入が行われた細胞において連結されるＤＮＡセグメントの複製及びその転写及び／又は発現を起こすような、別のＤＮＡセグメントが連結される、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンを意味する。
【００５３】
好ましくは、完全長ゲノムの転写のためのベクターは、その５’末端でＴ７ポリメラーゼプロモーター及びその３’末端で（デルタ肝炎）リボザイム配列に隣接する、ＭＶウイルスの（アンチ）ゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドであるが、Ｔ３又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用することもできる。
【００５４】
適切なサポートタンパク質の細胞内発現に対して、適切な発現調節配列（例えばＴ７ポリメラーゼプロモーター）の調節下で、好ましくは、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを使用する。
【００５５】
本発明による組み換えＭＶウイルスベクターの調製のための特に好ましい方法において、ＭＶウイルスのＮ（又はＮＰ）、Ｐ及びＬタンパク質をコードする発現プラスミドを使用する。
【００５６】
この逆遺伝学技術で使用される形質移入されたサポートプラスミドの量又は割合は、幅広い範囲にわたる。サポートプラスミド、Ｎ：Ｐ：Ｌに対する割合は約２０：１０：１から１：１：２の範囲であり得、各ウイルスに対する効率的な形質移入プロトコールは当技術分野で公知である。
【００５７】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びリボザイム配列の複合作用により、形質移入が行われた細胞中でゲノムＲＮＡの正確なコピーが生成され、続いて、このＲＮＡが、同時形質移入された発現プラスミドにより与えられるウイルスサポートタンパク質によりパッケージ化され複製される。
【００５８】
形質移入された細胞に感染する組み換えワクシニアウイルスにより、特にワクシニアウイルスｖＴＦ７−３、またその他の組み換えポックスベクター（鶏痘ウイルスなど、例えばｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ）により、Ｔ７ポリメラーゼ酵素が与えられることが好ましいか又はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現のために他のウイルスベクターを使用し得る。
【００５９】
ろ過など単純な物理的技術により、ワクシニアウイルスから救出されたウイルスの分離を容易に行うことができる。センダイウイルス又はＮＤＶの救出のために、孵化卵での形質移入細胞の上清の接種によって、救出を行うことができる。
【００６０】
さらにより好ましい実施形態において、（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は必要な支持タンパク質の１以上を構成的に発現する転写及び発現ベクターの形質移入に対して、細胞株を使用する。
【００６１】
例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び麻疹ウイルス支持タンパク質、Ｎ及びＰの両方を発現するヒト胚腎臓細胞株、２９３−３−４６において、麻疹ウイルスの救出を行うことができる（Ｒａｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４、５７７３−５７８４、１９９５）。本発明において有利に使用できる別の非常に有用な細胞株は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＳＲ細胞、即ち細胞株ＢＳＲ−Ｔ７／５に基づく（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２５１−２５９、１９９９）。
【００６２】
さらに、本発明によるＭＶウイルスの調製のために本明細書中で使用されるべき逆遺伝学技術に関するより詳細な情報はＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．（前出）による概説及び実施例１において開示される。
【００６３】
組み換えＭＶウイルスベクターが外来遺伝子を安定に発現する能力の結果、予防的及び治療的適用の両方に対してベクターが開発されてきた。
【００６４】
本発明による組み換えＭＶウイルスベクターにおいて、特異的ＭＶウイルスベクター種及びベクターウイルスの適用に依存して、外来遺伝子は様々であり得る。
【００６５】
外来遺伝子は、（その他の）微生物病原体（例えば、ウイルス、寄生生物の細菌）抗原をコードし得、特に外来遺伝子は、防御的免疫反応を誘導することができる病原体の抗原をコードする。
【００６６】
例えば、本発明のウイルスベクターに挿入することができる非相同遺伝子配列には、以下に限定されないが、インフルエンザウイルス糖タンパク質遺伝子、特に鳥インフルエンザウイルスのＨ５及びＨ７ヘマグルチニン遺伝子、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、特に（ＩＢＤＶ）のＶＰ２由来の遺伝子、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、狂犬病ウイルス、エールリヒア生物、特にエールリヒア犬、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス及び麻疹ウイルス由来の遺伝子が含まれる。
【００６７】
あるいは、外来遺伝子は、例えばインターロイキンなどのサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α又はＧＭ−ＣＳＦ）を同時発現させることにより、ウイルス感染に対する免疫反応を促進又は調節することができるポリペプチド免疫調節因子をコードし得る。
【００６８】
ＭＶ目には、ヒト及び動物において又は両方において複製することができるウイルスの両方が含まれる（例えば狂犬病ウイルス及びニューキャッスル病ウイルス）。従って、ヒト及び脊椎動物微生物病原体の幅広い範囲から外来遺伝子を選択することができる。
【００６９】
本発明においてベクターウイルスとして全てのＭＶウイルスを使用することができるが、本発明の好ましい実施形態において、組み換えＭＶウイルスベクターはラブドウイルス科のウイルス、好ましくはリッサウイルス属又はノヴィラブドウイルス、より好ましくはそれぞれ狂犬病ウイルス又はＩＨＮＶ種のウイルスである。
【００７０】
また好ましい実施形態において、組み換えＭＶウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスであり、好ましくはレスポウイルス属、特にｈＰＩＶ３又はｂＰＩＶ３種；麻疹ウイルス、特にＣＤＶ種；肺炎ウイルス、特にＲＳＶ種；及びアブラウイルス、特にＮＤＶ種である。
【００７１】
本発明の特に好ましい実施形態において、ウイルスがニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である組み換えＭＶウイルスベクターが提供される。ＮＤＶはヒト及び動物の両方、特に家禽、とりわけニワトリ、で複製可能なので、本発明による組み換えＮＤＶベクターは、病原体の、特に呼吸器病原体の抗原又はヒトもしくはこれらの動物の何れにおいても適切な免疫反応を誘導し得る免疫調節因子をコードする外来遺伝子を含み得る。
【００７２】
Ｐｅｅｔｅｒｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３、５００１−５００９、１９９９）、Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０、２９８７−２９９５、１９９９）により、及びＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．（前出）による概説において、ＮＤＶの遺伝子操作のための逆遺伝学的方法が具体的にＮＤＶについて開示されている。さらに、外来遺伝子の発現のために、例えば、ＮＤＶベクターによって感染した動物での免疫反応の誘発のために、ベクターとしてＮＤＶを使用することができることも知られている。（Ｎａｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、上記）及び（Ｓｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４７、１０４７−５０、２００３）。
【００７３】
上述のＭＶウイルスについて全般的に概説するように、ＮＤＶゲノムの様々な位置に外来遺伝子を有利に導入することができる。特に、本発明による組み換えＮＤＶベクターにおいて、外来遺伝子（適切な転写単位の一部として）を次のＮＤＶ遺伝子の間（ＮＰ−Ｐ、Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｆ、Ｆ−ＨＮ、ＨＮ−Ｌ）及び３’隣接及び５’遠位遺伝子座に（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記；Ｎａｋａｙａら、２００１、上記）、好ましくは３’隣接、Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｆ及びＦ−ＨＮ領域に挿入することができ、Ｆ−ＨＮ領域が最も好ましい。
【００７４】
さらに、本発明の組み換えＮＤＶベクターでは、外来遺伝子に隣接する非コード領域は、天然に存在する全てのＮＤＶ遺伝子から、特に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ又はＨＮ遺伝子から得ることができ、ＨＮ遺伝子が好ましい。
【００７５】
本発明の特定の実施形態において、追加の転写単位がＦ−ＨＮ遺伝子間に位置し、及び挿入された外来遺伝子がＨＤＶＨＮ遺伝子の非コード領域と隣接している組み換えＮＤＶベクターが提供される。
【００７６】
より具体的には、３’及び５’ＮＣＲ（並びに、場合によって、ＧＳ及びＧＥ配列）が配列番号１及び２又は３及び４に示されているようなヌクレオチド配列を有するＮＤＶベクターが提供される。
【００７７】
その他の病原体に対して家禽、特にニワトリにおいて免疫反応を誘導するために、本発明による組み換えＮＤＶベクターを有利に使用することができる。従って、組み換えＮＤＶベクターは、好ましくは、鳥類病原体、特にインフルエンザウイルス、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、Ｅ．コリ、アイメリア種、クリプトスポリジア、マイコプラズマ、例えばＭ．ガリナルム（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｍ．シノビエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）及びＭ．メレグリディス（Ｍ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）など、サルモネラ、カンピロバクター、オルニトバクテリウム（ＯＲＴ）又はパスツレラ種、の防御抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【００７８】
より好ましくは、組み換えＮＤＶベクターは、ＡＩＶ、ＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＶ、ＴＲＴＶ、Ｅ．コリ、ＯＲＴ又はマイコプラズマの抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【００７９】
特に、組み換えＮＤＶベクター突然変異体は、インフルエンザウイルス、好ましくは鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、より好ましくは高病原性ＡＩＶ、特にＨ５又はＨ７ＡＩＶの、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を含む。
【００８０】
原則として、本発明において、全ての（トリ）インフルエンザ株のＨＡ遺伝子を使用することができる。当技術分野で多くのＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、ＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬデータベースなどの核酸配列データベースから検索することができる。
【００８１】
上記で概説されるように、本発明において、最近単離された高病原性Ｈ５Ｎ２サブタイプＡＶＩＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を外来遺伝子として有利に使用することができる。この遺伝子を逆転写し、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングし、配列決定を行う（Ｌｕｓｃｈｏｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１９、４２４９−４２５９頁、２００１年及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ３０５３０６）。得られた発現プラスミドｐＣＤ−ＨＡ５から、ＮＤＶゲノム配列におけるＨＡ遺伝子の挿入を可能にする人為的ＲＥ認識部位を生成する特異的プライマーを用いた増幅によって、ＨＡ遺伝子を得ることができる。
【００８２】
さらなる実施形態において、上記で概説されるように、本発明において、高病原性Ｈ７Ｎ１サブタイプＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／４４５／９９のＨＡ遺伝子を外来遺伝子として使用することができる。このＨＡ遺伝子を逆転写しＰＣＲにより増幅する。ＳｍａＩで消化したベクターｐＵＣ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において１７１１ｂｐ産物をクローニングし、配列決定を行う（Ｖｅｉｔｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４．３３４３−３３５２、２００３；及びＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ５８０３５３）。
【００８３】
本発明による特に有利な組み換えＭＶウイルスベクターにおいて、ＭＶベクターウイルスは弱毒化されている、つまり、このベクターウイルスは標的動物にとって病原性ではないか、又は野生型ウイルスと比較して毒性が顕著に低下している。ウイルスベクターとして本明細書中で使用される多くのＭＶウイルスは、麻疹ウイルス及びＮＤＶなどの弱毒化生ワクチンとして長らく安全であった記録があり、一方、ＳｅＶ及びＶＳＶなどのその他のウイルスはヒトに対して非病原性であると考えられる。さらに、限定的な複製又は感染能を示す弱毒化ウイルスを得てそれに対してスクリーニングを行うために、従来の技術が存在する。このような技術には、異種培養基におけるウイルスの連続的（コールド）継代及び化学的突然変異誘発が含まれる。
【００８４】
本発明による組み換えＮＤＶベクターは、何らかの従来のＮＤワクチン株由来であり得る。市販のＮＤワクチンにおいて存在するこのような適切なＮＤＶ株の例は：Ｃｌｏｎｅ−３０（Ｒ）、Ｌａ  Ｓｏｔａ、Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  ＢＩ、ＮＤＷ、Ｃ２及びＡＶ４であり；Ｃｌｏｎｅ−３０（Ｒ）は好ましい株である。
【００８５】
本発明による組み換えＭＶウイルスベクターが動物において防御的免疫反応を誘導できることもまた本発明により見出された。
【００８６】
従って、本発明の別の実施形態において、生又は不活性化型の上記で定義されるような組み換えＭＶウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含む微生物病原体に対するワクチンが提供される。
【００８７】
市販の生及び不活性化ＭＶウイルスワクチンに対して一般に使用されるものなどの従来の方法により、本発明によるワクチンを調製することができる。
【００８８】
簡潔に述べると、組み換えＭＶウイルスベクターを用いて感受性物質を接種し、所望のタイターにウイルスが複製するまで増殖させ、その後、物質を含有するウイルスを回収する。続いて、免疫付与特性を有する医薬製剤へと回収した物質を処方する。
【００８９】
本発明において、組み換えＭＶウイルスベクターの複製を支えることができる全ての培養基を使用することができる。培養基として、ＭＶウイルスに依存して、原核及び真核源の両方からの宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞は脊椎動物、例えば霊長類細胞であり得る。適切な例は；ヒト細胞株ＨＥＫ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５又はＨ−２３９、サル細胞株Ｖｅｒｏ、げっ歯類細胞株ＣＨＯ、ＢＨＫ、イヌ細胞株ＭＤＣＫ又は鳥類ＣＥＦ又はＣＥＫ細胞である。
【００９０】
本発明による組み換えＮＤＶベクターを増殖させることができる特に適切な培養基はＳＰＦ孵化卵である。例えば卵あたり少なくとも１０２．０ＥＩＤ５０を含む尿膜腔液を含有する０．２ｍＬ  ＮＤＶを孵化卵に接種することができる。好ましくは、９から１１日胚の孵化卵に約１０５．０ＥＩＤ５０を接種し、続いて３７℃で２−４日間温置する。２−４日後、好ましくは尿膜腔液を回収することによって、ＮＤウイルス産物を回収することができる。その後、２５００ｇで１０分間、この液体を遠心し、続いてフィルター（１００μｍ）に通して上清を濾過することができる。
【００９１】
本発明によるワクチンは、このような組成物に対して慣習的に使用される医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とともに、組み換えＭＶウイルスベクターを含む。
【００９２】
生ウイルスを含有するワクチンを懸濁液又は乾燥凍結形態で調製し、販売することができる。担体には、安定化剤、保存料及び緩衝剤が含まれる。希釈剤には、水、水性緩衝液及びポリオールが含まれる。
【００９３】
本発明の別の態様において、不活性形態の組み換えＭＶウイルスベクターを含むワクチンが提供される。不活性化ワクチンの主要な長所は、その安全性及び長期にわたり高レベルの防御抗体を誘導できることである。
【００９４】
増殖段階後に回収されたウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの複製を排除することである。一般に、周知の化学又は物理的手段によってこれを達成することができる。
【００９５】
必要に応じて、本発明によるワクチンは、アジュバントを含有し得る。この目的のためのアジュバント活性のある適切な化合物及び組成物の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えば鉱物油（Ｂａｙｏｌ  Ｆ（Ｒ）又はＭａｒｃｏｌ  ５２（Ｒ）など）又は植物油（ビタミンＥアセタートなど）に基づく水中油又は油中水乳液及びサポニンである。
【００９６】
本発明によるワクチンの投与は、周知の有効な形態の何れかによるものであり得、ＭＶウイルスベクターのタイプに基づき得る。投与の適切な形式には、非経口、鼻腔内、経口及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【００９７】
本発明によるＮＤＶベクターワクチンは、好ましくは、ＮＤＶワクチン接種に対して一般に使用される安価な大量適用技術により投与される。ＮＤＶワクチン接種の場合、これらの技術には、飲用水及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【００９８】
本発明によるワクチンは、活性成分として組み換えＭＶウイルスベクターの有効量、即ちワクチン接種された鳥類において毒性微生物による曝露処置に対して免疫を誘導する免疫付与ＭＶウイルス物質の量、を含む。免疫は、本明明細書中で、ワクチン接種していない群と比較した、ワクチン接種後の死亡及び臨床症状に対する、ヒト又は動物集団における顕著に高い防御レベルの誘導として定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種されたヒト又は動物の大部分において、疾患の臨床症状の発生及び死亡を防ぐ。
【００９９】
通常、１０２．０−１０８．０組織培養／胚感染用量（ＴＣ／ＥＩＤ５０）の用量で、好ましくは、１０４．０−１０７．０ＴＣ／ＥＩＤ５０の範囲の用量で、生ワクチンを投与することができる。不活性化ワクチンは、１０４．０−１０９．０の抗原当量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を含有し得る。
【０１００】
本発明はまた、本発明による組み換えＭＶウイルスベクターに加えてさらなる病原体に対する保護を誘導することができるワクチン株を含む、混合ワクチンも含む。
【０１０１】
実施例
【実施例１】
【０１０２】
トリインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子を発現する組み換えＭＶウイルスの作製（ＮＤＶ／ＡＩＶＨ５）
・ウイルスと細胞
救出された組み換えＮＤＶ及びインフルエンザウイルス単離株Ａ／ニワトリ／イタリア／８／９８を、特定病原体が除去された（ＳＰＦ）１０日齢の有胚のニワトリの卵中で増殖させた。強毒性ＮＤＶ株Ｈｅｒｔｓ３３／５６及びＮＤＶクローン３０ワクチン（Ｎｏｂｉｌｉｓ（Ｒ））を使用した。
【０１０３】
ｃＤＮＡから伝染性ＮＤＶを回収するために、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現するＢＳＲ−Ｔ７／５細胞を使用した。
【０１０４】
・ＡＩＶＨ５遺伝子を含有するＮＤＶアンチゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡの構築
ＮＤＶゲノム上のヌクレオチド位置及びＮＤＶタンパク質中のアミノ酸残基上を特定するために、本明細書において使用されている括弧内の付番は、Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｄｅｒら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２９８７−２９９５，１９９９，ＥＭＢＬ受入番号Ｙ１８８９８）によって記載されているとおりである。ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａに対する人工のＭｌｕＩ制限部位（ＰＨ５Ｆ１：５’−ｃｔａ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔａａ  ａａｔ  ｇｇａ  ｇａａ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｃ−３’（配列番号５）及びＰＨ５Ｒ１：５’−ｔｃｇ  ｇａｃ  ｇａｇ  ｔｔｔ  ａａａ  ｔｇｃ  ａａａ  ｔｔｃ  ｔｇｃ  ａｃｔ  ｇ−３’（配列番号６）、ＭｌｕＩ部位には下線が付されている。）並びにｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂに対するＮｃｏＩ又はＡｆｌＩＩ部位（ＰＨ５Ｆ２：５’−ｃｃｔ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇａｇ  ａａａ  ａｔａ  ｇｔｇ  ｃｔｔ  ｃ−３’（配列番号７）及びＰＨ５Ｒ２：５’−ｃｃｔ  ｃｃｔ  ｔａａ  ｇｔａ  ｔａａ  ｔｔｇ  ａｃｔ  ｃａａ  ｔｔａ  ａａｔ  ｇｃａ  ａａｔ  ｔｃｔ  ｇｃａ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｔｇａ  ｔｃｃ−３’（配列番号８）、制限部位には下線が付されている。）を有する特異的なプライマーによってプラスミドｐＣＤ−ＨＡ５（Ｌｕｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，上記）から増幅されたＡＩＶＨ５遺伝子を導入するために、クローン３０の完全長アンチゲノムＲＮＡを発現する（Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒら、上記）プラスミドｐｆｌＮＤＶを使用した。クローン３０アンチゲノム（図１Ａ）中へのＨ５の導入は、ＧＦＰ挿入に関して以前に記載されたように（Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０８，１９−２８，２００３）、ＭｌｕＩ部位を用いて行った。簡潔に述べると、完全長プラスミドｐｆｌＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａの構築のために、ＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子の間の最小遺伝子カセット中にＨ５ＯＦＲを挿入するために使用された人工ＭｌｕＩ部位を含有するプライマーを用いて、Ｈ５ＯＲＦを増幅した。ｒＮＤＶ／ＡｌＶＨ５−Ｂの作製のためのＡＩＶＨ５遺伝子を含有する完全長プラスミドの構築は、図１Ｂに記載されている。突然変異導入反応は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）ＩＩＸＬ位置指定突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。この目的のために、クローン３０ゲノムのＮｏｔＩＢｓｉＷＩ断片（ヌクレオチド４９５３−８８２５）を含有するｐＵＣ１８プラスミド（ｐＵＣＮＤＶ１）及び突然変異導入Ａ（図１Ｂ）のための以下のプライマーＭＰ１（５’−ｇａｃ  ａａｃ  ａｇｔ  ｃｃｔ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ａｃｃ  ｇｃｇ  ｃｃｇ−３’）（配列番号９）及びＭＰ２（５’−ｃｔｇ  ｇｃｔ  ａｇｔ  ｔｇａ  ｇｔｃ  ａａｔ  ｔｃｔ  ｔａａ  ｇｇａ  ｇｔｔ  ｇｇａ  ａａｇ  ａｔｇ  ｇｃ−３’）（配列番号１０）を使用して、新たに作出されたＮｃｏＩ及びＡｆｌＩＩ部位を有するプラスミドｐＵＣＮＤＶＩａを得た（プライマー中の制限部位には、下線が付されている。）。ＮｃｏＩ及びＡｆｌＩＩでの消化後、増幅されたＡＩＶＨ５ＯＲＦによって、クローン３０のＨＮＯＦＲを置換した。ｐＵＣＮＤＶＨＳのＬ遺伝子の前の遺伝子間領域中にＳｇｆＩ−及びＳｎａＢＩ部位を��出し、ｐＵＣＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−１ｂをもたらす突然変異導入Ｂに関しては（図１Ｂ）、プライマーＭＰ３（５’−ｃａａ  ａａｃ  ａｇｃ  ｔｃａ  ｔｇｇ  ｔａｃ  ｇｔａ  ａｔａ  ｃｇｇ  ｇｔａ  ｇｇａ  ｃａｔ  ｇｇ−３’）（配列番号１１）及びＭＰ４（５’−ｇｔａ  ａｇｔ  ｇｇｃ  ａａｔ  ｇｃｇ  ａｔｃ  ｇｃａ  ｇｇｃ  ａａａ  ａｃａ  ｇｃｔ  ｃａｔ  ｇｇ−３’）（配列番号１２）を使用した。ＭＰ３及びＭＰ５（５’−ｇａａ  ａａａ  ａｃｔ  ａｃｃ  ｇｇｃ  ｇａｔ  ｃｇｃ  ｔｇａ  ｃｃａ  ａａｇ  ｇａｃ  ｇａｔ  ａｔａ  ｃｇｇ  ｇ  −３’）（配列番号１３）を用いて突然変異導入Ｃを行い、プラスミドｐＵＣＮＤＶＨ５ １ｂ中のＬ遺伝子の前の遺伝子間領域中にクローン３０ＨＮ遺伝子を導入するために使用したＳｇｆＩ及びＳｎａＢＩ部位を取得するためのプラスミドｐＵＣＮＤＶＩｃを得た。最後に、ｐｆｌＮＤＶ−１のＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ断片を、ｐＵＣＮＤＶＨ５ １ｃのＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ断片によって置換した（図１Ｂ）。生成された新しい完全長ゲノムの長さは、６の倍数に相当する（ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａに関しては１６９３８ヌクレオチド及びｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂに関しては１７１９６ヌクレオチド）。
【０１０５】
形質移入及びウイルス増殖
形質移入実験、ウイルス増殖及び伝染性ウイルスの回収の確認は、以前に記載されたとおりに実施した（Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。唯一の差は、形質移入のために２０μｇのＤＮＡの総量（完全長ゲノム含有プラスミド１０μｇ、ｐＣｉｔｅＮＰ６μｇ、ｐＣｉｔｅＰ２μｇ及びｐＣｉｔｅＬ２μｇ）を使用したことであった。
【０１０６】
・結果
以前に記載されたプラスミドｐｆＩＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子の間に、ＡＩＶＨ５翻訳領域を挿入した（Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。この目的のために、ｐｆＩＮＤＶｏｌｉｇｏ１の唯一のＭｌｕＩ制限部位中にＡＩＶＨ５ＯＦＲを挿入するために使用されたＭｌｕＩ制限部位を有する特異的プライマーによって、プラスミドＣＤ−ＨＡ５（Ｌｕｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，上記）からＡＩＶ単離株Ａ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）のＡＩＶＨ５ＯＲＦを増幅し（Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、プラスミドｐｆｌＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａを得た（図１Ａ）。この構築物中において、ＡＩＶＨ５ＯＲＦは、ＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子間の遺伝子間領域中で、人工の遺伝子開始（ＧＳ）及び遺伝子終了（ＧＥ）配列と隣接していた。完全長プラスミドｐｆｌＮＤＶ／ＡｌＶＨ５−Ｂの構築のために、プラスミドｐＵＣＮＤＶ１ａのＨＮＯＲＦを、ＮｃｏＩ／ＡｆｌＩＩ断片として増幅されたＨ５ＦＲによって置換した（図１Ｂ）。得られたプラスミドｐＵＣＮＤＶＨ５中において、Ｈ５遺伝子の下流の遺伝子間領域中にＳｇｆＩ及びＳｎａＢＩ制限部位を作製して、プラスミドｐＵＣＮＤＶＨ５ １ｂを得た（図１Ｂ）。その中でＨＮ遺伝子がＳｇｆＩ及びＳｎａＢＩ制限部位とも隣接しているプラスミドｐＵＣＮＤＶＩｃから得られたＨＮ遺伝子を導入するために、作製されたＳｇｆＩ及びＳｎａＢＩ制限部位を使用した（図１Ｂ）。最後に、ｐｆｌＮＤＶのＮｏｔＩ／ＢｓＷＩ断片を置換するために、得られたプラスミドｐＵＣＮＤＶＨ５ １ｃを使用した（図１Ｂ）。ＮＤＶＨＮの非コード領域が転写調節要素（ＧＳ、ＧＥ）及びＨ５ＯＲＦの間にさらに挿入されていたので、構築されたｐｆｌＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂは、プラスミドｐｆｌＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａとは異なる。
【０１０７】
ＮＤＶ組み換えｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ及びｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂは、以前に記載されたように、それぞれの完全長ｃＤＮＡ及び支持プラスミドで形質移入されたＢＳＲ−Ｔ７／５細胞から回収した（Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。ウイルス回収のために、１０日齢の有胚のニワトリの卵の尿膜腔中に形質移入上清を注入し、５日間温置した。尿膜液を採集し、血球凝集検査又は間接免疫蛍光（ＩＦ）によって、ウイルスの存在に関して分析を行った。さらなるウイルス増殖のための第二の卵の継代のために、ウイルスを含有する尿膜液を使用した。ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ及びｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂのウイルスゲノム中の挿入されたＨ５遺伝子の存在は、逆転写−ＰＣＲ及び配列決定によって確認した（データは示さず。）。図２Ａ及び２Ｂは、ＮＤＶ中のＨＮＯＲＦに隣接する領域のヌクレオチド配列及びＮＤＶベクター中のＨ５ＯＲＦのヌクレオチド配列を示している。
【実施例２】
【０１０８】
ＮＤＶ／ＡＩＶＨ５ベクターのインビトロでの性質決定
・ＲＮＡ分析
細胞当り１０の感染効率で、ＣＥＦ細胞をＮＤＶクローン３０、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂ及びＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）に感染させ、３７℃で８時間温置した。感染細胞及び非感染細胞の全ＲＮＡを調製し、変性アガロースゲル中で分離し、放射線標識されたｃＲＮＡとハイブリッド形成させた。３２Ｐ標識されたｃＲＮＡのインビトロ転写のために、それぞれ、ＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）Ｈ５及びＮＤＶクローン３０ＨＮの翻訳領域を含有するプラスミドｐＣＤ−ＨＡ５及びｐＣＤ−ＮＤＶＨＮを使用した（ＳＰ６／Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ）。
【０１０９】
ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ及びＢ中の挿入されたＡＩＶＨ５遺伝子の転写を確認するために、ＮＤＶ／ＡＩＶＨ５組み換え感染された一次ニワトリ胚繊維芽細胞の全ＲＮＡを用いて、ノーザンブロット分析を行った。ＮＤＶクローン３０及びＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）感染細胞のＲＮＡ調製を、対照として使用した。遺伝子特異的ｃＲＮＡを用いて、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ及びｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂに関して、挿入されたＡＩＶＨ５遺伝子の転写を検出した（図３）。ＡＩＶ−Ｈ５Ｂ転写物が約８１ヌクレオチド伸長されていること、ＡＩＶ−Ｈ５Ａ転写物より豊富に存在していることを観察することができる。
【０１１０】
・ウェスタンブロット分析
ＣＥＫ細胞をＮＤＶクローン３０、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂ及びＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）に感染させ、３７℃で２０時間温置した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（約１０４細胞／レーン）によって、感染細胞及び非感染対照細胞の可溶化液を分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（Ｒ）ＳＤ  ｃｅｌｌ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。それぞれ、１：２００００及び１：２５００の希釈で、ＮＤＶに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプＨ５のＡＩＶに対するポリクローナルニワトリ抗血清とともにブロットを温置した。Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ｒ）ＭＰ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａ（Ｒ）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用する化学発光によって、ペルオキシダーゼが連結された種特異的二次抗体の結合を検出した。
【０１１１】
ウェスタンブロット分析では、Ｈ５タンパク質は、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂ感染細胞中においてのみ検出可能であった。ＡＩＶサブタイプＨ５特異的抗血清は、約７０及び５０ｋＤａの２つの主要なタンパク質並びにＮＤＶクローン３０感染細胞中には見出されなかった約２５ｋＤａの殆ど見えないタンパク質を検出した（図４）。
【０１１２】
・間接免疫蛍光（ＩＦ）試験
間接ＩＦ試験のために、ＣＥＫ細胞をＮＤＶクローン３０、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂ及びＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）に、低いＭＯＩで２０時間感染させた。メタノール及びアセトン（１：１）で固定した後、続いて、それぞれ、１：３０００及び１：１００の希釈で、ＮＤＶに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプＨ５のＡＩＶに対するポリクローナルニワトリ抗血清の何れかとともに細胞を温置した。抗ウサギＩｇＧのＦ（ａｂ）２断片及びフルオレセイン連結された抗ニワトリＩｇＧ抗体試料との温置後、慣用の蛍光顕微鏡によって、試料を分析した。
【０１１３】
感染したＣＥＦ細胞の間接ＩＦ試験によって、Ｈ５発現を調べた。ＮＤＶ特異的抗血清との温置後に、ＮＤＶクローン、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ及びｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂに感染された細胞中で顕著な蛍光を検出することが可能であったが、ＡＩＶＡ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）に感染された細胞中又は非感染細胞中では検出することができなかった（図５、右パネル）。ＡＩＶサブタイプＨ５特異的抗血清との温置は、ＡＩＶ感染細胞中に顕著な蛍光を示した。２つの組み換え体を比較すると、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂは、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａより強烈なＨ５特異的蛍光を示し、Ｈ５タンパク質のより高い発現レベルを示唆した（図５、左パネル）。
【０１１４】
・免疫電子顕微鏡
Ｆｏｒｍｖａｒで被覆された銅の格子に、ウイルス粒子を７分間吸着させた。０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで格子を４回洗浄し、続いて、ＮＤＶ特異的又はＡＩＶサブタイプＨ５特異的抗血清とともに４５分間温置した。ＰＢで数回洗浄した後、プロテインＡゴールド（１０ｎｍ，ＰＡＧ１０，Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）又はウサギ抗ニワトリゴールド（１０ｎｍ，ＲＣＨＬ１０，Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とともに、格子をさらに４５分間温置した。ＰＢでの最終洗浄後、リンタングステン酸（ＰＴＡ、ｐＨ７．２）でウイルス粒子を対比し、電子顕微鏡を用いて調べた。
【０１１５】
ＮＤＶクローン３０又はｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａのビリオンを調べると、ＮＤＶ特異的抗血清を用いた場合のみ染色が観察された。これに対して、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂに関しては、ＮＤＶに対する抗血清を用いて染色が観察されるとともに、ＡＩＶに対する抗血清を使用することによっても染色が観察され、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−ＢのビリオンがヘマグルチニンＨ５を含有することを示している。金粒子は、主に、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂビリオンの表面に沿って見出され、ヘマグルチニンがウイルスの膜に固着されたことを示唆している。
【実施例３】
【０１１６】
ＮＤＶ／ＡＩＶＨ５ベクターのインビトロでの性質決定
組み換えｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａ及びｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂによる保護の評価：
１日齢のニワトリを、２つの群へ無作為に割り振り、スプレーを介して、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａの１０６ＥＩＤ５０又は市販のＮＤＶクローン３０ワクチン（Ｎｏｂｉｌｉｓ（Ｒ），Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，ＮＬ）を眼鼻的にワクチン接種した。２８日齢の時点で、同じように、第二の免疫化を施した。第二の免疫化から１２日後に、ＨＩ試験によって、ＮＤＶ及びＡＩＶＨ５抗体の存在を評価するために血液を集めた。第二のワクチン接種から２週後に、免疫化された群を分け、高度に病原性のＡＩＶ単離株Ａ／ニワトリ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）の１０８ＥＩＤ５０で、眼鼻的に各群の一部に攻撃誘発を行った。残りのニワトリは、強毒性ＮＤＶに対するワクチンの防御効果を評価するために使用した。従って、トリ及びさらなる対照動物は、筋肉内に、ＮＤＶ株Ｈｅｒｔｓ３３／５６の１０５．３ＥＩＤ５０を受けた。
【０１１７】
免疫化及び攻撃誘発感染後、臨床兆候に関して、全てのトリを１０日の期間にわたって毎日観察し、健康（０）、病気（１；以下の兆候の１つ：呼吸器兆候、抑うつ、下痢、チアノーゼ、浮腫、神経兆候）、重度の病気（２；以下の兆候の２以上：呼吸器兆候、抑うつ、下痢、チアノーゼ、浮腫、神経兆候）又は死亡（３）として分類した。
【０１１８】
この期間にわたる全てのニワトリ／群の平均値に相当する臨床スコアを計算した。最後に、攻撃誘発から３週後、ＡＩＶ及びＮＤＶに対する抗体力価を評価するために、生存している全ての動物から血液試料を採取した。
【０１１９】
ほぼ同一の実験デザインの別個の動物試験において、ＮＤＶ組み換えｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂを検査した。唯一の差は、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂ又はＮＤＶクローン３０ワクチンの１０６ＥＩＤ５０での免疫化が両群において眼鼻的に施されたこと、及びＮＤＶ攻撃誘発感染が行われなかったことであった。
【０１２０】
これらの実験の全データは、表４及び図６に要約されている。ワクチン接種から３週後に、ＨＩ試験によって、免疫化されたニワトリの血清を分析したが、何れの事例でも、ＨＡ特異的血清抗体は検出することができなかった。第一の免疫化（２６−２７の平均ＨＩ力価）後に、既に、両群の全ての動物は、高いレベルでＮＤＶ特異的抗体を生成し、強毒性ＮＤＶでの感染に対して動物が完全に保護されたのに対して、ＮＤの典型的な兆候を示して、４日以内に、全ての対照動物が死亡した。予想されたとおり、ＡＩＶ攻撃誘発感染は、ＮＤＶＩクローン３０で免疫化されたニワトリに、９０％の死亡率で、重い疾病を引き起こした。ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａによって免疫化された群の動物は、高度に病原性のＡＩＶの致死用量を生き延びたが、全てのニワトリは、０．６４の臨床スコアで、トリインフルエンザの変動する兆候を示し、有意であるが、部分的な保護であることを示唆した。しかしながら、ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ｂで免疫化されたニワトリは、高度に病原性のトリインフルエンザＡウイルスでの感染後に、疾病のあらゆる兆候に対して完全に保護された。
【０１２１】
【表４】
0005432703.tif 000007
【実施例４】
【０１２２】
ＮＤＶＦ遺伝子由来の隣接するｎｃｒを有するＮＤＶ／ＡＩＶ−Ｈ５ベクターの構築
上述のものと実質的に同一の方法及び材料を用いて（Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、以前に記載されたプラスミドｐｆｌＮＤＶ（Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）のＦ及びＨＮ遺伝子間にＨ５ＡＩＶ遺伝子を担持するＮＤＶベクター構築物が作製されたが、ここでは、Ｈ５挿入物は、ＮＤＶＦ−遺伝子由来の非コード領域と隣接していた。
【０１２３】
簡潔に述べると、使用した様々な工程及び材料は、以下のとおりであった。
【０１２４】
突然変異導入プライマー：ｐＭＰＭＬＵＩＧＲＦＨＮＦ
【０１２５】
【化１】
0005432703.tif 000008
（ＭｌｕＩ部位には下線が付されており、ＧＳ配列は太字で記載されている。）を用いて、ＭｌｕＩ制限酵素部位を作出するために、ＮＤＶＨ５（ｐＵＣＩＲＡ）の１．６ｋｂＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片を有するｐＵＣプラスミドを変異させ、プラスミドｐＵＣＩＲＡＭＬＵを得た。
【０１２６】
２つのオリゴ：ＯＦＶＯＦ：５’−ａｇｇ  ａｃｇ  ｃｇｔ  ｔａｃ  ｇｇｇ  ｔａｇ  ａａｇ  ａｔｔ  ｃｔｇ  ｇａｔ  ｃｃｃ  ｇｇｔ  ｔｇｇ  ｃｇｃ  ｃｃｔ  ｃｃａ  ｇｇｔ  ｇｃａ  ｇｃａ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ａｇ−３’（配列番号１６、ＭｌｕＩ部位に下線が付されている。）及びＯＦＶＯＲ：５’−ｅｔｃ  ｃａｔ  ｇｇｔ  ｇｃｔ  ｇｃａ  ｃｃｔ  ｇｇａ  ｇｇｇ  ｃｇｃ  ｃａａ  ｃｃｇ  ｇｇａ  ｔｅｃ  ａｇａ  ａｔｃ  ｔｔｃ  ｔａｃ  ｃｃｇ  ｔａａ  ｃｇｃ  ｇｔｃ  ｃｔ−３’（配列番号１７、ＭｌｕＩ部位に下線が付されている。）を徐冷した。次に、ＭｌｕＩ及びＮｃｏＩでこれらを消化した。
【０１２７】
ＭｌｕＩ及びＮｃｏＩでのプラスミドｐＵＣＩＲＡＭＬＵの消化
ｐＵＣＩＲＡＭＬＵの約４．３ｋｂのＭｌｕＩ−ＮｃｏＩ断片の、ＭｌｕＩ−ＮｃｏＩによって消化されたＯＦＶＯＦ／ＯＦＶＯＲオリゴハイブリッドとの連結。得られたプラスミドは、ｐＵＣ１ＲＡ２と名付けられた。
【０１２８】
ＨＮｏｒｆの代わりにＨ５ｏｒｆを有するＮＤＶのＮｏｔＩ−ＢｓｉＷＩ断片を有するｐＵＣプラスミド（ｐＵＣＡＲＯＫ）及びｐＵＣＩＲＡ２を、ＮｃｏＩ及びＳｇｆＩで消化し、ｐＵＣＡＲＯＫのＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ断片をｐＵＣＩＲＡ２のＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ断片によって置換して、プラスミドｐＵＣＡＲＯＫ２を得た。
【０１２９】
プライマーＰＮＣＲＦＨＩＦ：５’−ａｔａ  ｃｔｔ  ａａｇ  ｔｔｃ  ｃｃｔ  ａａｔ  ａｇｔ  ａａｔ  ｔｔｇ  ｔｇｔ−３’（配列番号１８，ＡｆｌＩＩ部位に下線が付されている。）及びＰＮＣＲＦＨＩＲ：５’−ｃａｃ  ｇａｇ  ａｔc  ｇｃａ  ｔｔｇ  ｃｃａ  ｃｔｇ  ｔａｃ  ａｔｔ  ｔｔｔ  ｔｃｔ  ｔａａ  ｃｔｃ  ｔｃｔ  ｇａａ  ｃｔｇ  ａｃａ  ｇａｃ  ｔａｃ  ｃ  −３’（配列番号１９、ＳｇｆＩ部位に下線が付されている。）及びプラスミドｐＵＣＡＲＯＡ（ＮＤＶのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片を有するｐＵＣ）を用いて、挿入されたＦ遺伝子の後ろにＮＤＶＦ遺伝子のｎｃｒを増幅するためにＨＦ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）を実施した。得られた約１００ｂｐ断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結して、ｐＧＥＭＦｎｃｒｈｉプラスミドを得た。
【０１３０】
プラスミドｐＵＣＡＲＯＫ２のＨ５の後ろのＨＮｎｃｒを、ｐＧＥＭＦｎｃｒｈｉ由来のＦのものによって置換するために、ｐＵＣＡＲＯＫ２及びｐＧＥＭＦｎｃｒｈｉプラスミドをＡｆｌＩＩ及びＳｇｆＩで消化した。得られたプラスミドは、ｐＵＣＡＲＯＫ４と名付けられた。
【０１３１】
最後の工程において、ＮＤＶＨ５プラスミドのＮｏｔＩ−ＳｇｆＩ断片を、ｐＵＣＡＲＯＫ４のものによって置換して、Ｆ及びＨＮの間においてＮＤＶベクター中に挿入されたＡＩＶＨ５遺伝子を含み、Ｆ遺伝子ｎｃｒによって隣接された新しい完全長プラスミドＥ１８Ｃを得た。
【０１３２】
新しい構築物形質移入実験を用いて、ｒｅｃウイルスの増殖及び伝染性ウイルスの回収の確認を上述のように実施した。次に、生化学的に及び生物学的にウイルスを性質決定した。
【実施例５】
【０１３３】
他のＮＤＶベクター構築物及びｒｅｃウイルスの作製：
類似の技術を使用し、異なる挿入遺伝子及び異なる挿入部位を用いて、幾つかの他の挿入物をＮＤＶベクター中に作製した。
【０１３４】
本明細書に既に記載されている詳細を用いて、これらは全て当業者が容易に到達できる範疇にあり、従って、これらは表の形態で与えれば十分である。
【０１３５】
【表５】
0005432703.tif 000009
【実施例６】
【０１３６】
ＥＩＡＶエンベロープ遺伝子を発現する組み換え狂犬病ウイルスベクターの作製
本発明の有利な効果（ｒｅｃＭＶビリオン中の外来タンパク質の発現及び／又は提示を増加させるためのＭＶ遺伝子非コード領域の使用）は、パラミクソウイルス科を超えて及ぶことを実証するために、無関係なウイルスであるウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）から得られたエンベロープタンパク質を発現させるためのベクターとして、ラブドウイルス科のメンバーである狂犬病ウイルスを使用した。
【０１３７】
本実施例では、狂犬病遺伝子Ｇ及びＬの間に挿入されたＥＩＡＶエンベロープタンパク質を含むｒｅｃ狂犬病ベクターウイルスの構築物が記載されており、ここで、ｅｎｖ遺伝子は狂犬病Ｇタンパク質遺伝子由来のｎｃｒに隣接している。
【０１３８】
ＳＡＤ−Ｄ２９完全長クローンを用いて、狂犬病ウイルスのサブクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＳＫ＋ファジミド中に調製し（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７５，ｐ．１１４９６−１１５０２）、ここでは、ＯＲＡ−Ｄと称する。クローニングベクターを調製するために、まず、ＳａｃＩでｐＳＫベクターを消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化した後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約３Ｋｂ断片のゲル精製を行った。ＳｔｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでＯＲＡ−Ｄを消化し、得られた１．３ｋｂ断片を精製し、調製されたｐＳＫベクター中への連結によって、挿入物を調製して、プラスミドｐＮＣＲ−ｂを作製した。
【０１３９】
ＢｓｔＸＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでｐＮＣＲ−ｂプラスミドを消化し、約４．０ｋｂ断片を精製し、最小転写カセットを含有するプラスミドｐＳＳＮｓｃを作出するためのオリゴＢＳＳＮＨ＋及びＢＳＳＮＨ−（表６参照）との連結及び最小の転写単位の他に非コード領域を含有する構築物ＧＮＣＲ−ｂを作製するためのオリゴＲＡＢＧＮＣＲ１−４（表６）との連結のために使用した（図７）。
【０１４０】
コドンが最適化され、ＲＮＡスプライス部位が除去され（Ｃｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏ．，ｖｏｌ．１０８，ｐ．２３−３７）、元の遺伝子の３’コード領域の１３４アミノ酸が末端切断された２０５２ヌクレオチドの合成遺伝子からの増幅によって、ＥＩＡＶ株ワイオミングｅｎｖ遺伝子を得た。
【０１４１】
【表６】
0005432703.tif 000010
【０１４２】
増幅されたｅｎｖ遺伝子をキナーゼ処理し、以下のようにサブクローン中へ挿入した。プライマーセットＥＩＡｓｙｎＣＤＦ＋ＥＩＡｓｙｎＣＤｓｔｏｐＲを用いて、末端切断されたＥＩＡＶエンベロープタンパク質全体に対応するように加工された約２．０Ｋｂアンプリコンを作製した（表６参照）。ＳｎａＢｉで予め消化され、脱リン酸化されたサブクローンＧＮＣＲ−ｂ中にアンプリコンを挿入して、組み換えプラスミドｐＧＮＣＲ−ｂ：ｅｎｖＧを作製した。ＮｈｅＩで予め消化され、平滑末端化され、及び脱リン酸化されたＳＳＮｓｃサブクローン中に約２．０Ｋｂ断片を挿入して、組み換えプラスミドｐＳＳＮｓｃ−ｂ：ｅｎｖを作製した。
【０１４３】
ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで、各組み換え構築物を消化し、ＳＳＮｓｃサブクローン中に連結し、これをＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩで予め消化し、ＣＩＡＰで脱リン酸化した。ＳＳＮｓｃサブクローンに復帰した後、修飾された挿入物は、ＳｐｈＩ及びＭｌｕＩでの消化によってＯＲＡ−Ｄ骨格に復帰して、組み換え狂犬病ウイルスＲＶ−ｅｎｖ及びＲＶ−ｅｎｖＧが生成された（図８）Ｂｉｇ−Ｄｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた配列分析によって構築物の５’及び３’末端を確認し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１００−  Ａｖａｎｔ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて分析した。
【０１４４】
修飾されたＳＡＤ狂犬病株ＯＲＡ−Ｄを基礎とする完全長ｃＤＮＡクローンの構築及び組み換え狂犬病ウイルスの作製が記載されている（Ｓｃｈｎｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．１３，ｐ．４１９５−４２０３；Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，２００１、上記）。Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓ−ＩＴ−ＬＴ１を用いて、以前に記載されたように（Ｓｃｈｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，上記）、各組み換え狂犬病ウイルスをＢＳＲ細胞中に形質移入した。形質移入から３日後に、細胞及び上清を採集し、継代した。その後の継代は、０．５の推定ｍｏｉを使用する上清のみによって行った。安定性を確認するために、各組み換えウイルスは、最低５回継代した。
【０１４５】
組み換え狂犬病に感染したＢＳＲ細胞を、感染から約４０時間後に固定した。ＦＩＴＣ抗狂犬病モノクローナルグロブリン（ＦＤＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を用いた又は抗ＥＩＡＶポリクローナルウマ血清を用いた直接免疫蛍光によって、これらを分析した。１０倍の系列希釈において、ウイルス安定性及び組み換え抗原発現をモニターするために、狂犬病ウイルスを産生する感染細胞の比を、ＥＩＡＶｅｎｖを発現する感染細胞とも比較した。
【０１４６】
０．０１のｍｏｉの新鮮なＢＳＲ細胞を有するＴ−７５フラスコ中に、継代５から得られた組み換え狂犬病ウイルスを接種した。感染から２４時間後、培地を無血清に交換した。感染から７２時間後に、上清を集め、遠心（１０，０００×ｇ）によって清澄化した。精製されたビリオンを分析するために、スクロース勾配によって、ウイルス上清を精製した。
【０１４７】
精製されたビリオン及び全ての感染された細胞タンパク質を、２×Ｌａｅｍｍｌｉ還元試料緩衝液と合わせ、５から１０分間、沸騰水中に入れた。１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中の１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣＬアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に試料を載せた。色素の先頭がゲルの底付近に又はゲルの底に位置するまで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２０ｍＡで走行させた。２２５ｍＡで４５分間ブロッティングすることによって、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ＰＶＤＦ）膜（ＩＰＶＨ１０１００，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）上に、分離したタンパク質を転写した。室温で１時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０＋１％乾燥無脂肪乳）中でブロックを温置し、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で、５分間、３回濯いだ。ブロッキング緩衝液中の、それぞれ、１：２００００及び１：２，０００に希釈された狂犬病糖タンパク質及び核タンパク質に対して誘導されたウサギ抗狂犬病ポリクローナル血清を用いて、狂犬病発現を検出した。
【０１４８】
同時に、ブロッキング緩衝液中に１：５００希釈された抗ＥＩＡＶポリクローナルウマ血清を用いて、ＥＩＡＶｅｎｖ発現を検出した。室温で１時間、ブロットを温置し、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で５分間、３回濯いだ。それぞれ、ブロッキング緩衝液中に１：２０００希釈された、ＨＲＰ標識された連結体ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＫＰＬ）及びＨＲＰ標識された連結体ヤギ抗ウマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ）中にブロットを配置し、室温で１時間温置した。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で、ブロットを３×５分濯いだ。展開が完結するまで（約１から３分）、ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）中でブロットを温置した。反応を停止させるために、ブロットを蒸留水中に配置した。
【０１４９】
このようなウェスタンブロット実験の典型的な結果が図９に示されており、ＥＩＡＶエンベロープタンパク質を発現する組み換え狂犬病ウイルスのタンパク質組成を示している。
【０１５０】
レーン１：広範囲の分子量ラダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；
レーン２：ＯＲＡ−Ｄ骨格ウイルス：
レーン３：狂犬病Ｇ及びＬ遺伝子の間に挿入され、隣接するｎｃｒを持たないＥＩＡＶ−ｅｎｖ遺伝子を含むＲＶ−ｅｎｖ
レーン４：狂犬病ウイルスＧタンパク質のｎｃｒ領域に隣接するＥＩＡＶ−ｅｎｖ遺伝子を含むＲＶ−ｅｎｖＧ
両組み換え狂犬病ウイルスは、同等の感染力価を与え、インビトロでの複数回の継代後に、ＥＩＡＶ−ｅｎｖ遺伝子挿入物を安定に発現した。
【０１５１】
しかしながら、ウェスタンブロットへビリオンの同等量を供したにもかかわらず、通常の様式で構築された（従って、隣接するｎｃｒを持たない。）組み換えＲＶ−ｅｎｖは、ＥＩＡＶ−ｅｎｖタンパク質に対応する極めて弱いバンドのみを示した。これに対して、挿入されたＥＩＡＶ−ｅｎｖタンパク質に隣接するＧタンパク質非コード領域を有する組み換えウイルスＲＶ−ｅｎｖＧは、ずっと高い割合で発現された。図９、レーン３から４中のｅｎｖタンパク質に対するバンドを比較されたい。
【０１５２】
ＲＶ−ｅｎｖＧ及びＲＶ−ｅｎｖの構築物及び挿入物は、それ以外では同一なので、外来タンパク質の産生及び免疫提示の高いレベルを促進する上で、非コード領域が正の効果を有するという確かな証拠である。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１Ａ】ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａを示す図である。
【図１Ｂ】ｒＮＤＶ／ＡＩＶＨ５−Ａを示す図である。
【図２Ａ】NDVクローン３０ＨＮ隣接配列を示す図である。
【図２Ｂ】ＡＩＶ−Ｈ５遺伝子挿入物及びＮＤＶ−ＨＮ隣接配列を有するｒＮＤＶを示す図である。
【図３】ノーザンブロットを示す図である。
【図４】ウェスタンブロットを示す図である。
【図５】ＩＦ試験を示す図である。
【図６】臨床指標及び死亡率を示す図である。
【図７】ＧＮＣＲ／ＳＳＮ構築物のクローニング領域を示す図である。
【図８】組み換え狂犬病／ＥＩＡＶ構築物の要約を示す図である。
【図９】狂犬病−ＥＩＡＶｅｎｖ精製されたビリオンのウェスタンブロットを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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