(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トゲハニガナの有機溶剤抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項２】
前記有機溶剤が、１価若しくは２価のアルコール類及び／又は飽和炭化水素類である請求項１記載の美白剤。
【請求項３】
前記有機溶剤抽出物が、親水性有機溶剤で抽出された後、更に疎水性有機溶剤で抽出されたものである請求項１又は２項記載の美白剤。
【請求項４】
前記親水性有機溶剤が、含水量４０容量％以下のものである請求項３記載の美白剤。
【請求項５】
前記有機溶剤抽出物が、有機溶剤で抽出後に、水で洗浄されたものである請求項１〜４の何れか１項記載の美白剤。
【請求項６】
トゲハニガナの有機溶剤抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項７】
前記有機溶剤が、１価若しくは２価のアルコール類及び／又は飽和炭化水素類である請求項６記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項８】
前記有機溶剤抽出物が、親水性有機溶剤で抽出された後、更に疎水性有機溶剤で抽出されたものである請求項６又は７項記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項９】
トゲハニガナの有機溶剤抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
【請求項１０】
前記有機溶剤が、１価若しくは２価のアルコール類及び／又は飽和炭化水素類である請求項９記載のドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
【請求項１１】
前記有機溶剤抽出物が、親水性有機溶剤で抽出された後、更に疎水性有機溶剤で抽出されたものである請求項９又は１０項記載のドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤、メラニン生成抑制剤又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容上、色素沈着やシミ・ソバカスの少ない白い肌が好まれる傾向にあることから、長期間使用しても安全性の高い美白作用を有する物質が望まれている。
この色素沈着やシミ・ソバカス等は、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン生成が亢進した結果生じるものと考えられている。このメラニン生成亢進のメカニズムは複雑であるが、メラニンは酵素チロシナーゼの作用により生合成され、チロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与していることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
ところで、アキノノゲシ属植物の一種である食用レタス（Lactuca sativa）は、抗酸化作用、メラニン生成抑制作用及び美白作用を有する水溶性フラボノイドのルテオリン又はその配糖体を含むことが知られている（特許文献１）。また、食用レタスの熱水抽出物、３０％エタノール抽出物、３０％１，３−ブチレングリコール抽出物及び超臨界二酸化炭素抽出物は、ファゴサイトーシス抑制作用、メラニン輸送阻害作用及び美白作用を有することも知られている（特許文献２）。
一方で、同じアキノノゲシ属植物であるアキノノゲシ（Lactuca indica）のメタノール抽出物やこれに含まれるルペオールは、メラニン生成促進作用、白髪改善作用及び皮膚黒化作用を有することが知られている（特許文献３）。
そして、同じアキノノゲシ属植物のトゲハニガナ（Lactuca virosa）は、鎮静、催眠誘発や咳止め、関節痛や筋肉痛の緩和等に用いられているが、この植物が、美白作用、メラニン生成抑制作用又はドーパオキシダーゼ活性阻害作用を有していることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２０１２０８号公報
【特許文献２】特開２００６−１２４３５５号公報
【特許文献３】特開２００４−３４５９５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta 1247, 1-11(1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性が高く、ドーパオキシダーゼ活性を阻害させることができ、化粧料や医薬等として有用な美白剤、メラニン生成抑制剤及びドーパオキシダーゼ阻害活性剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、美白作用やメラニン生成抑制作用等を有する天然由来の物質を探索したところ、トゲハニガナの有機溶剤抽出物に、ドーパオキシダーゼ活性を阻害する作用があることから、当該抽出物がメラニン過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカス等の予防又は改善等の効果を発揮する医薬、化粧料、皮膚外用剤及び美白剤等として又は素材として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の１）〜５）に係るものである。
１）トゲハニガナの有機溶剤抽出物を有効成分とする美白剤、メラニン生成抑制剤、又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
２）前記有機溶剤が、１価若しくは２価のアルコール類及び／又は飽和炭化水素類である前記記載の美白剤、メラニン生成抑制剤、又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
３）前記有機溶剤抽出物が、親水性有機溶剤で抽出された後、更に疎水性有機溶剤で抽出されたものである前記記載の美白剤、メラニン生成抑制剤、又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
４）前記親水性有機溶剤が、含水量４０容量％以下のものである前記記載の美白剤、メラニン生成抑制剤、又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
５）前記有機溶剤抽出物が、有機溶剤で抽出後に、水で洗浄されたものである前記項記載の美白剤、メラニン生成抑制剤、又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤又はドーパオキシダーゼ活性阻害剤を用いれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け等の色素沈着やシミ・ソバカスの予防、改善又は治療等が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明におけるトゲハニガナとは、キク科アキノノゲシ属（Lactuca）植物のトゲハニガナ（Lactuca virosa）（別名：ワイルドレタス）又はこの近縁植物を意味する。
【００１１】
前記トゲハニガナとしては、その植物の全草、葉（葉身、葉柄等）、果実（成熟、未熟等）、種子、花（花弁、子房等）、茎、根茎、根、塊根等を、そのまま、破砕、粉砕、搾取して用いるか、又はこれら処理されたものを乾燥若しくは粉末化して用いることができる。
用いる部位としては、全草を、使用するのが好ましい。
【００１２】
本発明に用いられる有機溶剤としては、極性有機溶剤、非極性有機溶剤の何れをも使用することができる。
当該有機溶剤としては、１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類等が挙げられ、このうち、薬理活性の点で、アルコール類及び飽和炭化水素類が好ましい。
【００１３】
前記アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の２価アルコール類；グリセリン等の３価以上のアルコール類等が挙げられ、このうち、薬理活性の点で、１価アルコール類及び２価アルコール類が好ましい。
【００１４】
前記アルコール類としては、炭素数１〜１０、より炭素数１〜４が好ましい。具体的にはメタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等が挙げられ、取り扱いが容易な点から、エタノール及び１，３−ブチレングリコールが好ましい。
【００１５】
また、前記飽和炭化水素類としては、直鎖、分岐鎖又は環状の飽和炭化水素が挙げられ、例えば、メタン、エタン、プロパン、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン等の直鎖飽和炭化水素；２−メチルブタン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，２，４−トリメチルペンタン等の分岐鎖飽和炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン等の環状飽和炭化水素等が挙げられ、このうち、薬理活性の点で、直鎖飽和炭化水素が好ましい。
【００１６】
前記飽和炭化水素類としては、炭素数１〜１０、より炭素数５〜１０、更に炭素数５〜８が好ましい。具体的には、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、２−メチルブタン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、シクロヘキサン等が挙げられ、取り扱いが容易な点から、ｎ−ヘキサンが好ましい。
【００１７】
上記有機溶剤は、単独で又は２種以上混合して混合液として使用することができる。
【００１８】
本発明に用いる有機溶剤は含水のものでもよい。
前記含水有機溶剤に使用される有機溶剤としては、親水性有機溶剤が好ましい。
ここで、親水性有機溶剤としては、特に限定されないが、上述した、前記アルコール類、酢酸、前記ピリジン類等のプロトン性親水性有機溶剤及び前記ケトン類、アセトニトリル、ジメチルスルホオキシド等の非プロトン性親水性有機溶剤が挙げられ、このうちプロトン性親水性有機溶剤が好ましい。このプロトン性親水性有機溶剤のうち、取り扱いが容易な点から、前記アルコール類、より前記１価及び２価のアルコール類、更に炭素数１〜４のアルコール類、より更にエタノール及び１，３−ブチレングリコールが好ましい。
尚、これらを単独で又は２種以上混合して混合液として使用することができる。
【００１９】
前記含水有機溶剤中の含水量は、特に限定されないが、薬理活性の点から４０容量％以下、より３０容量％以下、更に２５容量％以下とするのが、好ましい。
例えば、含水有機溶剤中の親水性有機溶剤の濃度としては、少なくとも親水性有機溶剤６０容量％以上、より７０〜１００容量％、更に７５〜１００容量％、より更に７５〜９９．９容量％とするのが、薬理活性の点で、好ましい。
【００２０】
本発明における抽出の手段としては、特に限定されないが、例えば、液液抽出、固液抽出、浸漬、浸出、煎出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、遠心抽出等が挙げられ、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。このとき、バッチ式抽出器やソックスレー抽出器等を用いてもよい。
【００２１】
抽出条件としては、特に限定されないが、抽出温度は、０〜１００℃、より４〜８０℃、更に４〜４０℃であるのが好ましく、抽出期間は、１分〜５０日間、より１時間〜５０日間、更に１〜３０日間であるのが好ましい。
また、前記有機溶剤の使用量は、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、１〜１００質量部、さらに１〜５０質量部、より５〜４０質量部であるのが好ましい
【００２２】
抽出の一例として、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、有機溶剤濃度７５〜１００容量％含有の１価若しくは２価のアルコール水溶液（好ましくは炭素数１〜３の１価アルコール類又は炭素数３〜５の２価アルコール類）及び／又は飽和炭化水素類（好ましくは炭素数５〜１０の飽和炭化水素）を１〜５０質量部用いて、１０〜４０℃（好ましくは２０〜４０℃）で、１時間〜３０日間（好ましくは５〜２０日間）抽出するのが好ましい。
また、抽出は、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、非酸化的雰囲気下で行ってもよい。
【００２３】
上述のようにして得られたトゲハニガナの有機溶剤抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥等して、液状、粉末状又はペースト状に調製して用いることもできる。
【００２４】
また、トゲハニガナを前記有機溶剤、好ましくは前記親水性有機溶剤で抽出した後に、水洗や液液分液、固液抽出等の抽出手段を用いることが、水溶性の夾雑物等を除去でき、薬理活性の点で、有利である。
具体的には、トゲハニガナの有機溶剤抽出物、好ましくは親水性有機溶剤抽出物に、水及び／又は疎水性有機溶媒等の溶媒を添加し、混合、撹拌、振とう、遠心分離等の物理的手段を行ったのち、薬理活性成分が主として含まれる画分（層）の回収を行う。適宜この操作を１〜３回繰り返し行ってもよい。回収後は濃縮し、得られた固形物をアルコール水溶液等に溶解させても良い。
【００２５】
前記有機溶剤抽出物に添加する溶媒（以下、「添加溶媒」とする。）としては、水、疎水性有機溶媒又は水・疎水性有機溶媒混合液を用いればよい。
【００２６】
ここで、疎水性有機溶媒としては、特に限定されないが、例えば、上述した、前記飽和又は不飽和の炭化水素類；前記芳香族炭化水素類；前記ハロゲン化炭化水素類；前記鎖状若しくは環状のエーテル類又は前記ポリエーテル類；前記オイル等が挙げられる。このうち、薬理活性の点から、前記飽和又は不飽和の炭化水素類が好ましく、より前記飽和炭化水素類が好ましい。飽和炭化水素類のうち、炭素数５〜１０の飽和炭化水素、より炭素数５〜８の直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素、より更にｎ−ヘキサンが好ましい。
尚、これら各有機溶剤を単独で又は２種以上混合して混合液として使用することができる。
【００２７】
前記添加溶媒として、水・疎水性有機溶媒混合液を用いるのが、水洗と疎水性有機溶剤抽出とが同時に行え、作業効率がよい点で、有利である。尚、水と疎水性有機溶剤とを同時又は別々に、上述の有機溶剤抽出物に添加してもよい。
水・疎水性有機溶媒混合液を用いて抽出、特に液液分液（分配）を行う場合には、分層性を改善するため、あるいは、抽出物中に混在する酸性成分や塩基性成分を除去する目的で、アルコール類や無機塩等をさらに加えても良い。
前記水・疎水性有機溶媒混合液中の水と疎水性有機溶媒との混合割合は、特に限定されないが、水（ｖ）：疎水性有機溶媒（ｖ）＝１：０．１〜１：１０、より１：０．１〜１：５とするのが好ましい。
【００２８】
前記添加溶媒に、水溶性夾雑物の除去を容易にするため、前記アルコール類を含有させてもよく、この場合、当該溶媒中、アルコール類の含有量は、１〜５０容量％とするのが好ましい。
【００２９】
前記添加溶媒に、水溶性夾雑物の除去を容易にするため、適宜、水溶性無機塩類を含有させてもよく、当該水溶性無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩化物；炭酸ナトリウム等の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム等の炭酸水素塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩等；リン酸ナトリウム等のリン酸塩等が挙げられる。
また、水中の水溶性無機塩類の含有量は、０．５〜１０％（ｍ／ｖ）とするのが好ましい。
【００３０】
前記添加溶媒の使用量は、特に限定されないが、乾固物１ｇに対して、１０〜１００ｍＬであるのが好ましい。また、抽出温度は、４〜８０℃であるのが好ましく、１０〜４０℃、さらに１０〜３０℃であるのがより好ましい。
【００３１】
上述のようにして得られたトゲハニガナの有機溶剤抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥等して、液状、粉末状又はペースト状に調製して用いることもできる。
【００３２】
なお、必要に応じて、上記トゲハニガナの有機溶剤抽出物を、活性炭処理、液体クロマトグラフィー、液々分配、ゲルろ過、精密蒸留等の分離精製技術に供して、不活性な夾雑物等を除去し、更に精製してもよい。
【００３３】
後記実施例に示すように、本発明のトゲハニガナの有機溶剤抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を強く阻害すると云う優れたドーパ−オキシダーゼ活性阻害作用を有し、細胞毒性も低いことから、長期間使用しても安全性の高い美白作用を有している。
ここで、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与すること（非特許文献１）から、ドーパオキシダーゼ活性を阻害すれば、メラニン生成抑制作用及び美白作用や紫外線被爆等による色素沈着やシミ・ソバカス等の症状を予防、改善又は治療効果を有すると考えられる。
従って、上記トゲハニガナの有機溶剤抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性阻害；メラニン生成抑制；美白；色素沈着やシミ・ソバカス等の症状を予防、改善又は治療等の各効果を発揮する、ヒト若しくは非ヒト動物用の医薬品、医薬部外品、化粧品、外用剤、皮膚外用剤、美白剤、食品、機能性食品又は飼料等の有効成分として又はこれら医薬品等の有効成分として配合し得る製剤として使用可能であり、またこれらを、製剤を製造するために使用することができる。
【００３４】
上記トゲハニガナの有機溶剤抽出物を含む医薬品は、任意の投与形態で投与され得る。当該医薬品の投与形態としては、経口投与、並びに経皮、経腸、経結膜及び注射等の非経口投与が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤の剤型としては、塗布剤又は貼付剤等の外用剤、静脈内注射用、皮下注射用又は点滴注射用等の注射剤、吸入剤、輸液、座剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
斯かる医薬品製剤では、薬学的に許容される担体を配合してもよく、当該担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００３５】
上記トゲハニガナの有機溶剤抽出物を含む外用剤、外用医薬品、医薬部外品又は化粧品は、皮膚外用剤、洗浄剤、入浴剤、又はメイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、これらを、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末剤、パック、パップ剤、顆粒剤、ファンデーション、口紅、シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、吸収性物品、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。
このような種々の剤型の外用剤、外用医薬品、医薬部外品又は化粧品は、上述した活性成分を、単独で、又は外用剤、外用医薬品、医薬部外品若しくは皮膚化粧料に配合される、油又は油状物質（油脂類、ロウ類、高級脂肪酸類、精油類、シリコーン油類等）、保湿剤（グリセロール、ソルビトール、ゼラチン、ポリエチレングリコール等）、粉体（チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム等）、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、他の植物抽出物（生薬、漢方薬、ハーブ類）、アルコール類、多価アルコール類、無機酸（重炭酸塩、炭酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等）、有機酸（コハク酸、グルタル酸、フマル酸、グルタミン酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ類、ビタミンＥ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、葉酸等）、水溶性高分子、アニオン性界面活性剤（アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等）、カチオン性界面活性剤（アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等）、両性界面活性剤（アルキル基を有するイミダゾリン系、カルボベタイン系等）等を組み合わせることにより調製することができる。
【００３６】
医薬品、医薬部外品又は化粧品等の場合、上記トゲハニガナの有機溶剤抽出物の含有量は、製剤全質量中、乾燥物換算で、通常０．０００１〜５質量％、より０．００１〜１質量％であるのが好ましい。
医薬品等の場合、上記トゲハニガナの有機溶剤抽出物の投与量は、乾燥物換算で、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１日当たり、通常０．００１〜１ｍｇ、より０．０１〜０．１ｍｇであるのが好ましい。また、当該製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日当たり１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
〔製造例１〕  トゲハニガナの７５％エタノール抽出物の調製
トゲハニガナ（和名）（別名：ワイルドレタス／学名：Lactuca virose）（以下、「トゲハニガナ」と云う）の全草（Monteagle Herbs社製）２０ｇ（乾燥物）に、７５容量％（以下、「％」とする）エタノール含有の水溶液２００ｍＬを加え、３０℃で１４日間浸漬抽出後、濾過し、得られた抽出液を減圧下濃縮し、７５％エタノール抽出乾固物４．０３ｇを得た。得られた抽出乾固物を１．０質量／容量％（以下「ｍ／ｖ％」とする。）の濃度となるようジメチルスルホキシドで溶解し、トゲハニガナの７５％エタノール抽出物とした。
【００３９】
〔製造例２〕  トゲハニガナの９５％エタノール抽出物の調製
トゲハニガナの全草（Monteagle Herbs社製）１００ｇ（乾燥物）に、９５％エタノール含有の水溶液１０００ｍＬを加え、３０℃で１６日間浸漬抽出後、濾過し、得られた抽出液を減圧下濃縮し、９５％エタノール抽出乾固物８．５８ｇを得た。得られた抽出乾固物を１．０ｍ／ｖ％の濃度となるようジメチルスルホキシドに溶解し、トゲハニガナの９５％エタノール抽出物とした。
【００４０】
〔製造例３〕  トゲハニガナの７５％１，３−ブタンジオール抽出物の調製
トゲハニガナの全草（Monteagle Herbs社製）２０ｇ（乾燥物）に、７５％１，３−ブタンジオール含有の水溶液２００ｍＬを加え、３０℃で７日間浸漬抽出後、濾過し、この溶液をトゲハニガナの７５％１，３−ブタンジオール抽出物とした。なお、当該溶液中の固形分含有量（蒸発残分）は、１．６％であった。
【００４１】
〔製造例４〕  トゲハニガナの９５％１，３−ブタンジオール抽出物の調製
トゲハニガナの全草（Monteagle Herbs社製）２０ｇ（乾燥物）に、９５％１，３−ブタンジオール含有の水溶液２００ｍＬを加え、３０℃で７日間浸漬抽出後、濾過し、この溶液を９５％１，３−ブタンジオール抽出物とした。なお、当該溶液中の固形分含有量（蒸発残分）は、０．７％であった。
【００４２】
〔製造例５〕  トゲハニガナのエタノール抽出後、更にｎ−ヘキサン抽出した抽出物（ｎ−ヘキサン抽出物１）の調製
製造例２の製法により調製したトゲハニガナの９５％エタノール抽出乾固物３．４３ｇに、ｎ−ヘキサン１００ｍＬ、エタノール５０ｍＬ、及び１％炭酸ナトリウム水溶液５０ｍＬ（液温２０℃）を加え、攪拌混合して水洗し、静置後、上層のｎ−ヘキサン層を分離し、水溶性の夾雑物を除去した。分離したｎ−ヘキサン層を、１％炭酸ナトリウム水溶液３５ｍＬとエタノール３５ｍＬの混合溶媒（液温２０℃）で２回の水洗浄後、減圧下濃縮し、抽出乾固物０．５８ｇを得た。得られた抽出乾固物を１．０ｍ／ｖ％の濃度となるようジメチルスルホキシドで溶解し、これを、トゲハニガナのｎ−ヘキサン抽出物１とした。
【００４３】
〔製造例６〕  ワイルドレタス（トゲハニガナ）のｎ−ヘキサン抽出物（ｎ−ヘキサン抽出物２）の調製
トゲハニガナの全草（Monteagle Herbs社製）５．２２ｇに、ｎ−ヘキサン１０５ｍＬを加え、３０℃で７日間抽出後、濾過し、得られた粗抽出液を減圧下濃縮し、ｎ−ヘキサン抽出物０．０７５ｇを得た。得られた抽出物を１．０ｍ／ｖ％の濃度となるようジメチルスルホキシドへ溶解し、ワイルドレタス（トゲハニガナ）のｎ−ヘキサン抽出物２とした。
【００４４】
〔試験例１〕  ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μＬを１×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human  Melanocyte  Growth  Supplement）（いずれもCascade  Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ／ｍ3になるように添加した。
【００４５】
また、前記製造例１〜６で調製したトゲハニガナの各抽出物が表１に示すような最終濃度（それぞれ、０．０１％、０．０１％、０．０１６％、０．００７％、０．００２％、０．００５％（ｍ／ｖ））となるように添加した。最終的に培地量は２００μＬ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００４６】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）  ３ｎｇ／ｍＬ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）          ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）                ０．５体積％
ハイドロコーチゾン                    ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン                            ５μｇ／ｍＬ
トランスフェリン                      ５μｇ／ｍＬ
ヘパリン                              ５μｇ／ｍＬ
【００４７】
培養終了後、各ウェルにアラマーブルー（Alamar  Blue、商品名、インビトロジェン社製）試薬２０μＬを添加し、２〜３時間培養後、培地の蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、蛍光波長；５９０ｎｍ）を測定して細胞増殖活性を測定した。その結果を表１に示す。
細胞増殖活性を測定したメラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）で洗浄し、抽出バッファー（0.1M Tris-HCL(pH7.2)、1%Nonidet P-40、0.01%SDS、100μM PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍＬアプロチニン）を２０μＬ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する100mM Sodium phosphate-buffered（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder  A．J.，Harris  H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００４８】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン  ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を表１に示す。なお、表１の細胞増殖活性の値は、トゲハニガナの各抽出物を添加しなかった場合の蛍光強度に対する相対値で示している。また、ドーパオキシダーゼ活性の値は、トゲハニガナの各抽出物を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００４９】
〔ルテオリン及びその配糖体の測定方法〕
以下の測定方法にて抽出物中のルテオリン及びその配糖体の含有量を測定した。
表品購入先：ルテオリン（SIGMA）、ルテオリン配糖体（フナコシ株式会社）
測定機器：日立HPLCマルチシステムソフトウェアZ30ZL200、日立HPLCマネージャーD-7000、日立HPLC用オートサンプラーL-7200、日立HPLC用カラムオーブンL-7300、日立HPLC用紫外可視検出器L-7420、日立HPLCポンプL-7100
流速：ルテオリンの場合、0.5mL/min；ルテオリン配糖体の場合、0.6mL/min
使用したカラム：Inertsil ODS-3 5μm(GL Science)，3.0I.D. × 150mm
カラム温度：40℃
移動相１：ルテオリン分析の場合  0.1%HCOOHaq:MeOH=1:1（ルテオリンリテンションタイム 8.57min）
移動相２：ルテオリン配糖体の場合  0.1%HOOHaq:CH3CN=10:90（0分）→0.1%HOOHaq:CH3CN=0：100（20分）、ルテオリン配糖体のリテンションタイム 9.77min）
【００５０】
【表１】
0005432772.tif 000002
【００５１】
表１に示したとおり、各有機溶剤抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することが認められた。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成に関与するチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられている。したがって、表１の結果から、本発明のトゲハニガナの有機溶剤抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制し、その結果、美白作用を有することがわかる。また、各有機溶剤抽出物には、細胞増殖活性を低下させる作用（すなわち、細胞毒性）が少ないことがわかった。
特に、トゲハニガナを親水性有機溶剤のエタノールで抽出した後、疎水性有機溶剤であるｎ−ヘキサンで抽出した抽出物は、このなかで、最もドーパオキシダーゼ阻害活性が高く、細胞毒性も少なかった。
以上の結果から、本発明のトゲハニガナの有機溶剤抽出物は細胞増殖活性を抑制することなく、ドーパオキシダーゼ活性を抑制できることがわかった。
【００５２】
尚、特許文献１には、ルテオリン及びルテオリン配糖体が、本願発明の植物と同属である食用レタスに含まれていることが記載されている。しかしながら、表１に示す結果から、トゲハニガナ有機溶剤抽出物中にルテオリン及びルテオリングリコシドはそれぞれ最大０．１ｐｐｍとほとんど含まれておらず、水分含量の高い１０％エタノール水溶液による抽出物でも、ルテオリン含有量０．００２ｐｐｍ及びルテオリングリコシド含有量０．０３２ｐｐｍと、ほとんど含まれていなかった。特許文献１には、ルテオリン又はルテオリン配糖体の含有量は、メラニン生成抑制剤において０．００１％（１０ｐｐｍ）、また化粧料組成物において０．００１％〜５％とするのが薬理効果を発揮する点から望ましいとあり、実施例においてもメラニン生成抑制作用が確認されているルテオリン及びルテオリン配糖体の固形分の最低濃度は０．００１％であると記載されていることから、この１００分の１しか含まれていないトゲハニガナ有機溶剤抽出物中の有効成分はルテオリン及びルテオリン配糖体ではないと考えられる。また、トゲハニガナ有機溶剤抽出物を、水や疎水性有機溶剤を用いて精製すると、薬理活性を損なうことなく、ルテオリン及びその配糖体を除去することも可能である。