(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの可変ドメインを具える免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、一方の可変ドメインがターゲット分子に結合し、少なくとも１つの他方の可変ドメインが精製タグを含み、前記精製タグが前記少なくとも１つの他方の可変ドメインのＣＤＲ領域中に含まれ、前記精製タグがヒスチジンタグ若しくはそれと実質的に同一な変異体、ヘキサヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ及びＶ５タグから選択されることを特徴とすることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、２つの可変ドメインを具えることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグを具える可変ドメインが、ターゲット分子に結合しないことを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫グロブリンにおいて、前記免疫グロブリンが抗体であることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫グロブリンにおいて、前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項６】
請求項５に記載の免疫グロブリンにおいて、前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項７】
請求項６に記載の免疫グロブリンにおいて、前記ヒト抗体がＩｇＧクラスであることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項８】
請求項７に記載の免疫グロブリンにおいて、前記ヒト抗体がＩｇＧ１サブクラス、ＩｇＧ２サブクラス、ＩｇＧ３サブクラス及びＩｇＧ４サブクラスのいずれかであることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項９】
請求項８に記載の免疫グロブリンにおいて、前記ヒト抗体がＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記可変ドメインのそれぞれが可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とを具えることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１０に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記可変重鎖（ＶＨ）が３つの相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）を具えることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１０に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記可変軽鎖（ＶＬ）が３つの相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）を具えることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグが可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）に含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１３に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグが可変重鎖（ＶＨ）に含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
請求項１４に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグが、可変重鎖（ＶＨ）の３つの相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）のいずれか１つに含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
請求項５に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグがＨ−ＣＤＲ３又はＨ−ＣＤＲ２に含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
請求項１６に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグがＨ−ＣＤＲ３に含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１３に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグが可変軽鎖（ＶＬ）に含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
請求項１８に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグが、可変軽鎖（ＶＬ）の３つの相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）のいずれか１つに含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
請求項１９に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片において、前記精製タグがＬ−ＣＤＲ２に含まれていることを特徴とする免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸において、当該核酸が精製タグを含む可変ドメインをコードし、前記精製タグが前記少なくとも１つの他方の可変ドメインのＣＤＲ領域中に含まれ、前記精製タグがヒスチジンタグ若しくはそれと実質的に同一な変異体、ヘキサヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ及びＶ５タグから選択されることを特徴とする核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸において、前記精製タグが前記可変重鎖（ＶＨ）のＨ−ＣＤＲ３に含まれていることを特徴とする核酸。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の核酸を具えることを特徴とするベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の細胞において、前記細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする細胞。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の細胞において、前記細胞が、分離された細胞であることを特徴とする細胞。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片と、その薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と、を具えることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２９】
対象又はサンプル中のターゲット分子を検出する方法において、前記対象又はサンプルを、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片に接触させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片の医薬品製造のための使用。
【請求項３１】
疾病又は疾患の治療のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項３２】
疾病又は疾患を診断するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片の、ターゲット分子を検出するための使用。
【請求項３４】
免疫グロブリン又はその抗原結合断片を精製する方法において：
（ａ）請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫グロブリン又はその抗原結合断片を含む溶液を提供するステップと；
（ｂ）前記免疫グロブリン又はその抗原結合断片の精製タグに対する親和性を有する部分にステップ（ａ）の溶液を接触させるステップと；
（ｃ）前記免疫グロブリン又はその抗原結合断片を前記部分に結合させるステップと、
（ｄ）前記部分に結合しない溶液成分のすべて又は実質的すべてを除去するステップと；
（ｅ）前記部分から免疫グロブリン又はその抗原結合断片を回収するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記溶液が、２個の精製タグを具える免疫グロブリン又はその抗原結合断片をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の前記免疫グロブリン又はその抗原結合断片を、勾配によって２個の精製タグを具えるタンパク性結合分子から分離することを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、前記勾配がイミダゾール勾配であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗体などの免疫グロブリンは、医薬品工業用として継続的に関心が寄せられ、関心が高まっている。２０個を超えるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が市場に出ており、１００個を超えるモノクローナル抗体が臨床試験中である。この十年間に、従来の免疫グロブリン及び抗体とは異なるいくつかの特性を有する免疫グロブリンの誘導体及び断片が数多く設計された。これらは、診断及び治療への応用に望ましい。具体例は、組み換え抗体断片（古典的一価抗体断片（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）など）、又は、人工的に作り出した変異体（二重特異性抗体、三重特異性抗体、ミニ抗体及びシングルメイン抗体）である。現在、これらのいくつかは、信頼性のある選択肢として浮上している。そのような断片及び変異体は、通常、完全長免疫グロブリンのターゲット特異性を保持しているが、多くの場合、より安価に生産することができる。さらに、新規な「抗体様」タンパクディスプレイ骨格が開発された。これらは、同様に、従来の免疫グロブリン及び抗体にはない、いくつかの特性を有している。
【背景技術】
【０００２】
治療用アプリケーションとして、一価の抗体抗原相互作用、すなわち、免疫グロブリン、又は、別の骨格を、対象ターゲット分子に結合する１個のみの可変ドメインと共に、有することが望ましい。いくつかのＩｇＧは、ターゲットレセプタと架橋することによって天然リガンドの効果を模倣することがわかっている。架橋することによってレセプタを活性化（例えばレセプタリン酸化）できる。対照的に、同じ抗体に由来する一価のＦａｂは、レセプタと橋架せず、適切な抗原決定基がターゲットにされていれば、天然リガンドが結合するのを防ぐ。従って、ＩｇＧがアゴニスト的に作用するのに対して、同じ抗体のＦａｂ断片はアンタゴニスト的に作用する。具体例は、インシュリン受容体（Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９７８）７５：４２０９−１３）、ＥＧＦレセプタ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５８：８４６−５３）、ＥＰＯレセプタ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：４７３−８２）、ＧＨレセプタ（Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００３）１７：２２４０−５０）又はβ２−アドレナリン受容体（Ｍｉｊａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０００）５８：３７３−９）である。
【０００３】
しかしながら、そのような一価の特性を有する構築物（例えばＦａｂ断片）は、インビボ短半減期などの別の特性のせいで不利である場合もある。従って、一価の抗体抗原相互作用を、Ｆｃドメインを具える完全長免疫グロブリンの特性と組み合わせることが非常に望ましい。本発明においてはそのような分子を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ターゲット分子との結合に関しては一価であるが、Ｆｃドメインのサイズ及び存在に関しては完全長免疫グロブリンの特性を保持している、免疫グロブリンなどのタンパク性結合分子を提供することを目的とする。
【０００５】
本発明は、一価のタンパク性結合分子、特に、各生産細胞系の培養液上清から容易に精製することができる完全長免疫グロブリンを提供することも目的とする。
【０００６】
本発明は、精製タグに対する親和性を有するマトリックス又は樹脂へのタンパク性結合分子の結合などの精製工程用精製タグを使用することによって、本発明によるタンパク性結合分子を精製する方法を提供することも目的とする。
【０００７】
本発明のタンパク性結合分子は、完全長免疫グロブリンなどのタンパク性結合分子の少なくとも１個の可変ドメイン中に精製タグを導入することによって生成される。精製タグを、好ましくは免疫グロブリンの１つのアームの可変重鎖中に導入し、最も好ましくはＨ−ＣＤＲ３領域中又は代替的にＨ−ＣＤＲ２領域中に導入する。精製タグの導入は、免疫グロブリンの各アームを特異性の欠損を生じさせる。
【０００８】
本発明のタンパク性結合分子は、例えば、精製タグに対する親和性を有するマトリクスを用いた親和性クロマトグラフィーによって、各生産細胞系の培養液上清を簡便に精製することができる。
【０００９】
少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子であって、一方の可変ドメインがターゲット分子と結合し、他方の可変ドメインが不活性であるタンパク性結合分子を提供することも本発明の目的である。そのようなタンパク性結合分子は、ターゲット分子と結合することに関しては一価であるが、Ｆｃドメインのサイズ及び存在に関しては完全長免疫グロブリンの特性を保持している。
【００１０】
本発明のタンパク性結合分子は、癌、免疫疾患又は炎症性疾患などの、疾病及び疾患の診断及び治療において多くの用途がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによる本発明のタンパク性結合分子の精製を示している。ｘ軸は時間軸である。ｙ軸は、カラム（このケースにおいてはイミダゾール）から物質を溶出させるために用いた成分の濃度を示している。「黒丸」は、ＶＨ又はＶＬのそれぞれが精製タグを具えていないことを示している。そのようなＶＨが精製タグを具えていないＶＬと結合している場合は、それぞれのアームがターゲット分子に対して特異的である。「白丸」は、ＶＨ又はＶＬのそれぞれの少なくとも１つのＣＤＲが精製タグを具えていることを示している。イミダゾール勾配中の異なる画分において、３つの異なる免疫グロブリン種が溶出している。精製タグを有していない免疫グロブリン種はフロースルー画分中にみられ、分子の１のアームに精製タグを具えている免疫グロブリン種は、分子の両方のアームに精製タグを具えている免疫グロブリン種と比較して、早く溶出される。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡによって分析した４つのＦａｂ断片の結合特異性を示している。ニワトリ卵白リゾチーム又はＣＤ３８−ＦｃのいずれかをＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）にコーティングした（５μｇ／ｍｌ）。Ｆａｂ断片を加え、洗浄した後に、特異的に結合しているＦａｂ断片を、ＡＰが結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２特異抗体を用いたインキューベーションによって検出し、次いで、水中に希釈した可溶性Ａｔｔｏ−Ｐｈｏｓ基質（Ｒｏｃｈｅ）を用いて現像した。螢光測定を５３５ｎｍの発光においてＴｅｃａｎプレートリーダで行った。試験を行ったＦａｂは、ＭＯＲ０３２０７（ニワトリ卵白リゾチーム特異的）、ＭＯＲ０３０８０（ＣＤ３８特異的）、ＭＯＲ０８４２８（ＭＯＲ０３２０７のＨ−ＣＤＲ３はＧＹＳＧＨＨＨＨＨＨＳＧＤＹで置換されている）及びＭＯＲ０８４４１（ＭＯＲ０８４２８のＶＨ及びＭＯＲ０３０８０のＶＬ）であった。
【図３】図３は、組み換えられてヒトＣＤ３８を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いてＦＡＣＳによって分析した３つのＦａｂ断片の結合特異性を示している。Ｆａｂ断片を細胞に加え、洗浄の後、特異的に結合したＦａｂ断片を、ＰＥが結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いたインキューベーションによって検出した。中央の螢光をＦＡＣＳアレー装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定した。試験を行ったＦａｂは、ＭＯＲ０３２０７（ニワトリ卵白リゾチーム特異的）、ＭＯＲ０３０８０（ＣＤ３８特異的）及びＭＯＲ０８４４１（ＭＯＲ０８４２８のＶＨ及びＭＯＲ０３０８０のＶＬ）であった。
【図４】図４は、溶出にイミダゾール勾配を適用するヒスバインドフラクトゲル（Ｍｅｒｃｋ＃７０６９３−３）カラムを用いたＩＭＡＣ精製から得たタンパク画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。ｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿ＩｇＧ１＿ＭＯＲ０８４２８、ｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿ＩｇＧ１＿ＭＯＲ０３０８０、ｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿Ｉｇ＿ｌａｍｂｄａ２＿ＭＯＲ０３０８０の共トランスフェクション後に得た、プロテインＡカラムで予め精製したＩｇＧ１画分を、還元ＳＤＳゲルにロードした。１ｍｌ／分の流速で１ｍｌの画分を得た。２０ｍＭＮａリン酸、ｐＨ７．４／５００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭイミダゾールを泳動バッファとして用いた。前記泳動バッファに２５０ｍＭのイミダゾールを加えたものを溶出バッファーとして用い、溶出バッファーの勾配（０〜１００％）を適用した。ＬＲＭ：タンパクサイズマーカー；ＣＬ：予備精製してカラムにロードしたＩｇＧ１画分；ＦＴ：カラムフロースルー；番号は、異なる溶出画分を示している。
【図５】図５は、親和性クロマトグラフィーフロースルー（レーン３）から得たタンパク画分及びプールした画分＃３０−５８（レーン２）及び＃７０−９０（レーン１）からのサンプルの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーン４にタンパクサイズマーカーをロードした。詳細については実施例３を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、当業界で知られている分子よりも優れた有点がある、免疫グロブリンなどのタンパク性結合分子を提供する。免疫グロブリンは、多くの場合、その分子の二価の性質によってそれぞれのターゲットと橋架する。そのような架橋活性は、例えばレセプタ活性化（例えばレセプタのリン酸化を介する）といった、特定の用途においていくつかの望ましくない効果を生じさせることがある。
【００１３】
一方で、非常に多くの場合、完全長の免疫グロブリンと必要とされている。この要求は、より長い半減期を有する分子の必要性（例えば、Ｆａｂ分子は免疫グロブリンと比較して非常に短い短半減期を有する）、又は、免疫グロブリン、特に完全長の免疫グロブリンの全特性（一例としてエフェクター機能）を有する分子の必要性といった、いくつかの理由による。
【００１４】
この明らかなジレンマは本発明によって解決される。本明細書に記載されているタンパク性結合分子は、本来は一価であるが、完全長免疫グロブリンの特性をすべて具えている。更に、タンパク性結合分子を構築する方法によって、本発明は、これらの分子の簡便な精製を可能にする方法も提供する。
【００１５】
ここで用いていられているように、タンパク性結合分子などの分子が、「特異的に結合する」とは、結合特異性が絶対的ではないが相対的な特性であることによって、そのようなタンパク性結合分子がそのようなターゲット分子と１以上の参照分子とを区別することができる場合に、抗原などのターゲット分子「に対して／について特異的に」又は「を特異的に認識する」ことをいう。その大部分の一般形態において（及び基準が定められていない場合）、「特異的結合」は、タンパク性結合分子が、例えば下記方法の１つに従って決定されるように、対象のターゲット分子と無関係な分子とを区別できることを意味している。そのような方法は、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験及びペプチドスキャンを含んでいる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡ分析を実行することができる。スコアリングは、標準的色現像（例えばホースラディッシュ過酸化水素と第２抗体、及び、テトラメチルベンジジンと過酸化水素）によって実行してもよい。いくつかの穴における反応を、例えば４５０ｎｍで光電密度によってスコアリングする。標準的なバックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであってもよい。標準的な陽性反応は１ＯＤであってもよい。これは、陽性と陰性との差が１０倍を超えることがあることを意味している。一般的に、結合特異性の測定は、単一の参照分子ではなく、粉乳、ＢＳＡ、又は、トランスフェリンなどなどの約３〜５個の無関係な分子の１セットを用いて行う。
【００１６】
しかしながら、「特異的結合」は、ターゲット分子と、例えば、ターゲットＸとターゲットＹ間のような、基準点として用いられる１以上の密接に関連する分子とを区別するタンパク性結合分子の能力を意味するものでもある。さらに、「特異的結合」は、例えば、ターゲットの分子Ｎ末端若しくはＣ末端領域の抗原決定基などのターゲット分子の異なるドメイン又は領域といった、ターゲット分子の異なる部分間、又は、１個以上の重要なアミノ酸残基、又は、ターゲット分子のアミノ酸残基の伸展間を区別するタンパク性結合分子の能力に関するものである。
【００１７】
ここで用いられている「タンパク性結合分子」という用語は、互いに結合したペプチド結合中に少なくとも２つのアミノ酸を具えている分子を意味する。そのタンパク性分子は、好ましくは生物有機体によって生産される分子、又は、その一部、誘導体及び／又は類似化合物である。生体分子による生産の後に化合物の修飾によって生成される誘導体も本発明の好ましい化合物であることは明らかである。特に好ましい実施形態において、タンパク性結合分子は、抗体などの免疫グロブリン又はその断片である。別の好ましいタンパク性結合分子は、アフィボディ（プロテインＡのＺドメインを具えている）、免疫タンパク（ｌｍｍＥ７など）、チトクロムｂ５６２、アンキリン反復、ＰＤＺドメイン又はクニッツドメインを具えているタンパク、昆虫デフェンシンＡ、サソリ毒（カリブドトキシン又はＣＴＬＡ−４など）、ノッティン（Ｍｉｎ−２３、ネオカルチノスタチン、ＣＢＭ４−２又はテンダミスタットなど）、アンチカリン又はアルマジロ反復タンパクなどの抗体様特性を有する骨格を含む。
【００１８】
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ここで用いられているように、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、ＩｇＥクラス、ＩｇＡクラス又はＩｇＤクラス（又はこれらの任意のサブクラス）に属するタンパクを意味し、従来既知の抗体及びその機能性断片をすべて含む。ここで定義されている抗体／免疫グロブリンの「機能性断片」は、少なくとも２個の可変ドメインを具えている抗体／免疫グロブリン断片（例えばＩｇＧの可変領域）であって、第１可変ドメインが、それぞれの完全長免疫グロブリンのターゲット分子に対する結合特性を保持している断片を意味する。本発明の機能性断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片又はＦａｂ−ｄＨＬＸの断片を含む。そのような断片を組み替えて、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小にするか又は完全になくしてもよい。本発明のタンパク性結合分子の「機能性断片」という用語は、任意のタンパク性の部分であって、第１可変ドメインが、対象のターゲット分子に結合するが、別の可変ドメインのいずれもが対象のターゲット分子に結合しない部分を意味する。いくつかの好ましい実施形態においては、本発明の免疫グロブリンは、完全長の免疫グロブリン又は実質的に完全長の免疫グロブリンである。
【００１９】
「可変ドメイン」という用語は、異なるタンパク性結合分子間で配列が大きく異なり、対象のターゲット分子（又はその欠損）にタンパク性結合分子の結合及び特異性を与えるタンパク性結合分子の部分を意味する。本発明によれば、ペプチド配列、特に、ここで定義されている精製タグが、可変ドメインがもはやターゲット分子に特異的に結合しなくなるような態様で可変ドメイン中に導入される。可変ドメインは、いかなる形状又は形態を有していてもよい。可変ドメインは、１個、２個又は２個より多いポリペプチド鎖に含まれるポリペプチド配列からなっていてもよい。抗体などの免疫グロブリンの可変ドメイン、又は、その機能性断片は、一般的に免疫グロブリン分子の１つのアームの完全な抗原結合領域を具えている。その領域には、免疫グロブリン分子の１本のアームの両方の可変鎖のＣＤＲ領域、すなわち、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ２、及び、Ｌ−ＣＤＲ１及び、所定のターゲット分子に特異的に結合するために必要な隣接する骨格領域が含まれる。
【００２０】
抗体の「抗原結合領域」は、一般に、抗体の１つ以上の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２及び／又はＣＤＲ−３中にみられるが、可変「骨格」領域も、ＣＤＲのための骨格を提供することなどによって、抗原結合に重要な役割を果たし得る。「抗原結合領域」は、好ましくは可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸残基４〜１０３と可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸残基５〜１０９とを少なくとも具えており、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３〜１０７とＶＨのアミノ酸残基４〜１１１とを具えており、特に好ましくは完全長のＶＬ鎖とＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１〜１０９とＶＨのアミノ酸位置１〜１１３；ＷＯ９７／０８３２０による番号付けに従う）である。本発明で使用される好ましいクラスの免疫グロブリンはＩｇＧである。
【００２１】
本発明によれば、タンパク性結合分子の第１可変ドメインは、ターゲット分子に結合する。タンパク性結合分子のその他の可変ドメインは、同じターゲット分子に対する結合特異性を有さない。従って、タンパク性結合分子は、ターゲット分子に結合することに関して一価である。更に、その他の可変ドメインの少なくとも１つ、すなわち、ターゲット分子に結合しない可変ドメインは、前記タンパク性結合分子の精製に適した精製タグを具えている。
【００２２】
本発明の抗体は、コンピュータ内で設計されて合成によって作成された核酸でコードされたアミノ酸配列をベースとする組み換え抗体ライブラリに由来するものでもよい。抗体配列のコンピュータによる設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、このデータベースから得たデータを利用してポリペプチド配列を開発することによって達成される。コンピュータ作成配列における設計及び取得の方法は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１  ）２５４：６７；Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（２００８）ｉｎ  ｐｒｅｓｓ、及び、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌに付与された米国特許第６３０００６４号に記載されており、これらの文献はここで言及することによって全体が組み込まれている。
【００２３】
本明細書中に言う「ターゲット分子」は、タンパク性結合分子の第１可変ドメインに結合する任意の対象分子を意味する。ターゲット分子は、そのターゲット分子へのタンパク性結合分子の結合が、ある生物学的作用を達成する目的において望ましく、精製タグを具えているか又は不活性である、第２可変ドメイン又は後の任意の可変ドメインの結合パートナーから識別可能な分子を意味する。一般的に及び好ましくは、このターゲット分子は、ペプチド、タンパク又はその他の任意のタンパク性分子である。代替的に、ターゲット分子は、炭水化物、脂肪酸、脂質、染料又は蛍光色素分子などの、その他の有機分子又は無機分子であってもよい。
【００２４】
本明細書で用いられている「精製タグ」という用語は、タンパク性結合分子の精製又は同定に適したすべてのペプチド配列を意味する。精製タグは、精製タグに対する親和性を有する別の部分に特異的に結合する。精製タグに特異的に結合する部分は、通常、アガロースビーズなどのマトリクス又は樹脂に付いている。精製タグに特異的に結合する部分には、抗体、ニッケルイオン若しくはコバルトイオンン若しくは樹脂、ビオチン、アミロース、マルトース及びシクロデキストリンが含まれる。例示的精製タグは、ヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジンペプチドなど）を含み、そのタグは、ニッケル又はコバルトイオンなどの金属イオンに結合する。従って、ある実施形態において、精製タグは、金属イオンに特異的に結合するペプチド配列を具えている。その他の実施形態においては、精製タグは、金属イオンに特異的に結合するペプチド配列からなる。好ましい実施形態において、精製タグは、ニッケルイオン又はコバルトイオンに特異的に結合するペプチド配列を具えているか、又は、該ペプチド配列からなる。その他の実施形態において、精製タグは、ニッケルイオンに特異的に結合するペプチド配列を具えているか、又は、該ペプチド配列からなる。代替の実施形態において、精製タグは、コバルトイオンに特異的に結合するペプチド配列を具えているか、又は、該ペプチド配列からなる。その他の例示的精製タグは、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）及びＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）である。「精製タグ」という用語には、「抗原決定基タグ」、すなわち、抗体によって特異的に認識されるペプチド配列も含まれる。例示的な抗原決定基タグには、モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体によって特異的に認識されるＦＬＡＧタグが含まれる。抗ＦＬＡＧ抗体によって認識されるペプチド配列は、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ又はこれと実質的に同一な変異体からなる。従って、ある実施形態において、精製タグは、抗体によって特異的に認識されるペプチド配列を具えているか、又は、該ペプチド配列からなる。「精製タグ」という用語には、精製タグと実質的に同一な変異体が含まれる。ここで用いられている「実質的に同一の変異体」は、オリジナルの精製タグ（例えばアミノ酸置換、欠失又は挿入による）と比較して修飾されるが、特異的に精製タグを認識する部分に特異的に結合する精製タグの特性を保持する精製タグの誘導体又は断片を意味する。精製タグは、４個未満、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２０個より多いアミノ酸からなるペプチド配列を具えてもよいし、又は、該ペプチド配列からなっていてもよい。ある実施形態において、精製タグは、４〜２０個のアミノ酸、５〜２０個のアミノ酸、６〜２０個のアミノ酸、４〜１５個のアミノ酸、５〜１５個のアミノ酸、６〜１５個のアミノ酸、４〜１２個のアミノ酸、５〜１２個のアミノ酸、６〜１２個のアミノ酸を具えているか、又は、該アミノ酸からなる。
【００２５】
ある実施形態において、本発明は少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子であって、一方の可変ドメインがターゲット分子と結合し、他方の可変ドメインが不活性であるタンパク性結合分子に関する。
【００２６】
可変ドメインの結合特異性に関する文脈において用いられている「不活性である」とは、別の分子に対する結合特異性を有しない可変ドメイン表す。特に、不活性可変ドメインは、ターゲット分子又はその他のいずれの分子にも結合せず、不活性可変ドメインは、精製タグを具えていない。少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子であって、一方の可変ドメインがターゲット分子に結合し、他方の可変ドメインが不活性である分子は、ターゲット分子に対して一価の結合特異性を有しており、本発明に従って用ることができる。
【００２７】
本発明は、可変ドメイン中に精製タグを導入することができるタンパク性結合分子を開示する。好ましくは、前記タンパク性結合分子は、可変重鎖及び可変軽鎖が由来するオリジナルの親バインダのターゲット分子にもはや結合しない。代替的に、前記タンパク性結合分子は、可変重鎖及び可変軽鎖が由来するオリジナルの親バインダと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は、少なくとも１０００倍より小さい親和性でターゲット分子と結合する。代替的に、前記タンパク性結合分子は、可変重鎖及び可変軽鎖が由来するオリジナルの親バインダーと比較して、ターゲット分子に残されている結合親和性だけを示す。親和性を測定及び比較する方法及び分析は、当業者に知られており、実験手順セクションに記載されている。
【００２８】
本発明によれば、免疫グロブリンの可変ドメインなどの可変ドメイン中に精製タグを導入することができる。免疫グロブリンの任意のＣＤＲ領域中に精製タグを導入することができる。免疫グロブリンのＣＤＲ領域は骨格領域に隣接している。それぞれの構造及びＣＤＲ領域と骨格領域との境界は、当業者に知られている。いくつかの異なる方法で可変ドメイン中に精製タグを導入することができる。精製タグがオリジナルのＣＤＲ領域全体を置換するような方法で、ＣＤＲ領域中に精製タグを導入することができる。また、オリジナルのＣＤＲ領域のオリジナルのアミノ酸の１つ以上が精製タグによって置換されるが、オリジナルのＣＤＲ領域のオリジナルのアミノ酸の１つ以上がなお存在するように精製タグを導入することができる。また、精製タグがＣＤＲ領域に挿入されるように、すなわち、ＣＤＲ領域のオリジナルのアミノ酸のいずれもが削除又は置換されないように精製タグを導入することができる。また、言い換えれば、例えば構造変化によって、前記精製タグの導入後にそれぞれの可変ドメインがもはやターゲット分子に結合しない方法で精製タグを可変ドメインの骨格領域中に導入することができる。また、ＣＤＲ領域及び骨格領域と重複する可変ドメインの領域中に精製タグを導入することができる。すべてのこのような可能性及びオプション並びにこれらの組み合わせは当業者に自明である。
【００２９】
本発明は、本発明のタンパク性結合分子をコードするＤＮＡ分子にも関する。本発明のＤＮＡ分子は、ここで開示されている配列に限定されず、その変異体を含む。本発明に含まれるＤＮＡ変異体をハイブリダイゼーションにおける物性を参考にして記載してもよい。当業者は、ＤＮＡが２本差であるので、核酸ハイブリダイゼーション技術によって、ＤＮＡを用いて、ＤＮＡの相補体やＤＮＡの相当物又は同族体を同定できることを理解するであろう。相補性が１００％未満であってもハイブリダイゼーションが生じる場合があることも理解されるであろう。しかしながら、条件を適切に選択すれば、ハイブリダイゼーション技術を用いて、特定のプローブに対するＤＮＡ塩基配列の構造的関連性に基づいてそのＤＮＡ塩基配列を区別することができる。そのような条件に関するガイダンスとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，米国）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．ニューヨーク：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
【００３０】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列の１つ以上を具える組換ＤＮＡ構築物をさらに提供する。本発明の組み換え構築物は、本発明のタンパク性結合分子をコードするＤＮＡ分子が挿入される、プラスミド、ファージミド、ファージ又はウイルスベクターなどのベクターに接続させて用いることができる。コードされた遺伝子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている技術によって作ることができる。代替的に、例えば合成装置を用いて、ＤＮＡ塩基配列を化学的に合成してもよい。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４，Ｇａｉｔ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）に記載されている技術を参照されたい。この文献はここで言及することによってその全体が組み込まれている。本発明の組み換えの構築物は、ＲＮＡ及び／又はコードされたＤＮＡのタンパク産物を発現することができる発現ベクターで構成されている。このベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作用可能な状態で連結されたプロモータを含む調節配列をさらに具えていてもよい。このベクターは、選択可能なマーカー配列をさらに具えてもよい。特定の開始シグナル及び細菌分泌シグナルが、挿入されたターゲット遺伝子コード配列の効率的な翻訳に必要な場合もある。
【００３１】
本発明は、本発明のＤＮＡ構築物の少なくとも１つを含む宿主細胞をさらに提供する。この宿主細胞は、発現ベクターを入手可能な事実上すべての細胞であり得る。この宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞などの高等真核生物性宿主細胞若しくは酵母菌などの下等真核生物性宿主細胞であってもよいし、又は、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。宿主細胞中への組み換え構築物の導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション又はファージ感染によって実行することができる。
【００３２】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子であって、１個の可変ドメインがターゲット分子に結合し、少なくとも１個の別の可変ドメインが精製タグを具えているタンパク性結合分子を提供する。タンパク性結合分子は、２個、３個、４個又は４個以上の可変ドメインを具えていてもよい。好ましい実施形態においては、タンパク性結合分子が２個の可変ドメインを具えている。
【００３３】
本発明によれば、タンパク性結合分子の１個の可変ドメインは、ターゲット分子に結合する。その他の可変ドメインのいずれも、特に精製タグを具える可変ドメインは、ターゲット分子に結合しない。ある実施形態において、本発明は少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子に関し、第１可変ドメインがターゲット分子に結合し、少なくとも１つの別の可変ドメインが前記タンパク性結合分子の精製に適した精製タグを具えており、前記別の可変ドメインのいずれもが前記ターゲット分子に結合しない。その他の実施形態においては、少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子は、第１可変ドメインがターゲット分子に結合するが、その他の可変ドメインのいずれもが前記ターゲット分子に結合しない。
【００３４】
ある実施形態において、精製タグは、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、及び、Ｆｌａｇタグ、又は、これらと実質的に同一な変異体から選択される。好ましい実施形態において、精製タグは、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）であり、最も好ましくはヘキサヒスチジンペプチドである。代替的実施形態において、精製タグは、ペンタヒスチジンペプチド又はヘプタヒスチジンペプチドなどのヒスチジンタグと実質的に同一な変異体である。８個、９個、１０個又はそれ以上のヒスチジン残基などのように、さらなるヒスチジン残基を有するその他のヒスチジンタグ、又は、１個以上のヒスチジン残基が別のアミノ酸で置換されているが、Ｎｉ−ＮＴＡになお結合することができるポリヒスチジン配列を、本発明に従って同様に用いてもよい。
【００３５】
ある実施形態において、タンパク性結合分子は、免疫グロブリン又はその機能性断片である。前記免疫グロブリンは、好ましい実施形態においては抗体であり、より好ましくは完全長の抗体である。
【００３６】
ある実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施形態において、前記免疫グロブリンは、マウス又はラットなどのげっ歯動物の免疫グロブリンである。
【００３７】
ある実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、ＩｇＥクラス、ＩｇＡクラス及びＩｇＤクラスのいずれかである。好ましい実施形態において、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。ある実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、ＩｇＥクラス、ＩｇＡクラス及びＩｇＤクラスのいずれかのヒト免疫グロブリンである。好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧクラスのヒト免疫グロブリンである。
【００３８】
ある実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス、ＩｇＧ２サブクラス、ＩｇＧ３サブクラス及びＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つである。好ましい実施形態においては、免疫グロブリンがＩｇＧ１サブクラスである。ある実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス、ＩｇＧ２サブクラス、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つのヒト免疫グロブリンである。好ましい実施形態において、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスのヒト免疫グロブリンである。
【００３９】
好ましい実施形態においては、タンパク性結合分子が免疫グロブリンである。これらの実施形態において、可変ドメインは可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を具える。好ましい実施形態において、タンパク性結合分子は、それぞれの可変ドメインが可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とを具えている２個の可変ドメインを具える免疫グロブリンである。
【００４０】
ある実施形態においては、可変重鎖（ＶＨ）が３つの相補性決定領域であるＨ−ＣＤＲを具える。好ましい実施形態において、タンパク性結合分子は、３つの相補性決定領域であるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３を具えている可変重鎖（ＶＨ）を具える免疫グロブリンである。
【００４１】
ある実施形態においては、可変軽鎖（ＶＨ）が３つの相補性決定領域であるＬ−ＣＤＲを具える。好ましい実施形態において、タンパク性結合分子は、３つの相補性決定領域であるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を具えている可変軽鎖（ＶＨ）を具える免疫グロブリンである。
【００４２】
ある実施形態において、精製タグは、タンパク性結合分子又は免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）に含まれている。好ましい実施形態において、前記精製タグは、タンパク性結合分子又は免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）に含まれている。より好ましい実施形態において、精製タグは、可変重鎖（ＶＨ）の３つの相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）のいずれか１つに含まれている。さらに好ましい実施形態においては、精製タグが、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ２又はＨ−ＣＤＲ１に含まれており、より好ましくはＨ−ＣＤＲ３又はＨ−ＣＤＲ２に含まれ、最も好ましくはＨ−ＣＤＲ３に含まれている。
【００４３】
ある実施形態において、精製タグは、タンパク性結合分子又は免疫グロブリンの可変軽鎖（ＶＬ）に含まれている。より好ましい実施形態において、精製タグは、可変軽鎖（ＶＬ）の３つの相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）のいずれかに含まれている。さらに好ましい実施形態において、精製タグは、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ２又はＬ−ＣＤＲ１に含まれており、最も好ましくはＬ−ＣＤＲ３に含まれている。
【００４４】
「ＣＤＲ領域」という用語は、一般的に、任意の相補性決定領域を含む免疫グロブリンの領域を意味する。免疫グロブリンの相補性決定領域は、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）に含まれている。特に、免疫グロブリンの相補性決定領域は、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２又はＬ−ＣＤＲ３領域である。
【００４５】
本発明は、本発明のタンパク性結合分子をコードする核酸配列をさらに提供する。本発明のタンパク性結合分子は、１個、２個、３個、４個又はそれより多いポリペプチドからなっていてもよい。前記ポリペプチドのそれぞれは、同一又は異なる核酸によってコードされてもよい。同様に、本発明のタンパク性結合分子のそれぞれの前記ペプチドをコードする核酸は、同一又は異なるベクター上に存在していてもよい。
【００４６】
本発明は、精製タグを具える可変ドメインをコードする核酸配列をさらに提供する。好ましくは、前記可変ドメインは、免疫グロブリン又はその機能性断片に含まれている。ある実施形態において、前記可変ドメインは、前記免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）に含まれており、好ましくは可変重鎖（ＶＨ）に含まれ、より好ましくは前記可変重鎖（ＶＨ）のＨ−ＣＤＲ３に含まれている。
【００４７】
本発明は、タンパク性結合分子の核酸配列を具えているか又は本発明による精製タグを具える可変ドメインの核酸配列を具えているベクターをさらに提供する。
【００４８】
本発明は、前記ベクターを具えている細胞及び宿主細胞をさらに提供する。好ましくは前記細胞又は宿主細胞が哺乳動物細胞である。また、前記細胞又は宿主細胞が単離された細胞又は単離された宿主細胞であることが好ましい。
【００４９】
本発明は、本発明のタンパク性結合分子と、該タンパク用の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを具えている医薬品組成物をさらに提供する。
【００５０】
本発明は、疾病又は疾患を治療するための治療方法であって、本発明のタンパク性結合分子と、該タンパク用の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを具えている医薬品組成物の治療的有効量を、必要性のある対象に投与するステップを具える方法をさらに提供する。好ましくは、前記疾病又は疾患は、望ましくないターゲット分子の存在を伴うものである。
【００５１】
本明細書による「治療的に有効な」量は、単独で又は別の治療と組み合わせて、不都合な病状の治療又は処置において治療的な利益を与えるタンパク性結合分子の量として定義される。この用語は、治療を全般的に改善するか、望ましくない効果を低減若しくは回避するか、治療的効果又は別の治療薬と相乗作用を強める量を包含し得る。治療を必要とする「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物（例えばウサギ、ラット、マウス、サル又は別の下等霊長類）であってもよい。
【００５２】
本発明のタンパク性結合分子を公知の医薬品と共に共投与してもよく、ある事例においてはタンパク性結合分子自体を修飾してもよい。例えば、タンパク性結合分子を抗毒素又は放射性同位元素に結合させて有効性をさらに高めることができる。
【００５３】
ターゲット分子が望ましくなく発現され又はみられる様々な状況における治療的又は診断的ツールの１つとしてタンパク性結合分子を用いることができる。任意の疾病又は疾患を治療するために、本発明の使用のための医薬品組成物を、１以上の生理的に許容可能な担体又は賦形剤を用いて従来の方法で調剤してもよい。本発明のタンパク性結合分子を任意の適切な手段で投与することができ、その手段は治療する疾患の種類に応じて変わり得る。可能な投与経路には、非経口投与（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は、皮下）、肺内投与及び鼻腔内投与、及び、局所的免疫抑制療法において必要であれば、病巣内投与が含まれる。さらに、例えば用量を減らしたタンパク性結合分子と共に、本発明のタンパク性結合分子をパルス注入によって投与してもよい。投与が短期的であるか又は長期的であるかに応じて、好ましくは注射によって、最も好ましくは静脈内注射又は皮下注射によって投薬する。投与量は、臨床症状、患者の体重、その他の医薬品を投与するか否かなどの様々な要因に依存するであろう。当業者は、治療する疾患又は病状に応じて投与経路が変わることを理解するであろう。
【００５４】
本発明のタンパク性結合分子の治療的有効量の決定は、大部分において、特定の患者の特性、投与経路及び治療する疾患の性質に依存するであろう。一般的なガイダンスは、例えば、ハーモナイゼーション国際会議の出版物及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２７章及び２８章，第４８４−５２８頁（１８ｔｈ  ｅｄ．，  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）においてみることができる。特に、治療的有効量の決定は、医薬品の毒性及び効能のような要因に依存するであろう。当業界で周知の方法及び先行文献にみられる方法を用いて毒性を決定してもよい。効能を同じガイダンスを用いて決定してもよい。
【００５５】
本発明は、対象又はサンプル内のターゲット分子を検出する方法であって、前記対象又はサンプルを、本発明のタンパク性結合分子に接触させるステップを具える方法をさらに提供する。
【００５６】
本発明は、対象の疾病又は疾患を診断する方法であって、前記対象又はサンプルを、本発明のタンパク性結合分子に接触させるステップを具える方法をさらに提供する。
【００５７】
本発明は、本発明のタンパク性結合分子の、医薬品製造のための使用をさらに提供する。
【００５８】
本発明は、疾病又は疾患の治療のための本発明のタンパク性結合分子をさらに提供する。
【００５９】
本発明は、本発明のタンパク性結合分子の、疾病又は疾患の診断のための使用をさらに提供する。
【００６０】
本発明は、本発明のタンパク性結合分子の、ターゲット分子の検出のための使用をさらに提供する。
【００６１】
ある実施形態においては、タンパク性結合分子が抗体などの免疫グロブリンである。そのようなケースにおいて、本発明の核酸分子をトランスフェクトされた細胞系は、２つの異なる可変重鎖（ＶＨ）：ターゲット分子に結合する可変ドメインの一部であるＶＨ鎖（以下、「ＶＨ−ｔａｒｇ」とする。）；及び、精製タグを具える可変ドメインの一部であるＶＨ鎖（以下、「ＶＨ−ｐｕｒｉ」とする。代替的に、このＶＨ鎖は不活性であってもよい。）を生産する。１種のみの可変軽鎖（ＶＬ）が作られる。これは３つの異なる免疫グロブリン種の生産をもたらす。
−種Ａは、タイプＶＨ−ｔａｒｇの２つの可変重鎖（ＶＨ）を具える。
−種Ｂは、タイプＶＨ−ｔａｒｇの１つの可変重鎖（ＶＨ）と、タイプＶＨ−ｐｕｒｉの１つの可変重鎖（ＶＨ）とを具える。
−種Ｃは、タイプＶＨ−ｐｕｒｉの２つの可変重鎖（ＶＨ）を具える。
すべての免疫グロブリン種は、２つの同じ可変軽鎖（ＶＬ）を具える。
【００６２】
上述した免疫グロブリン種Ａは、精製タグを具えていない。種Ｂは、１個の精製タグを具えており、種Ｃは、２個の精製タグを具えている。種Ｂは、本発明による望ましい特性、すなわち、ターゲット分子の一価結合を有する種である。
【００６３】
種Ｂ及び種Ｃはいずれも、精製タグに対する親和性を有する部分によって、例えば精製タグがヒスチジンタグであればＮｉ−ＮＴＡによって、精製することができる。免疫グロブリン種Ｃの親和性は、第２精製タグの存在によって種Ｂよりもはるかに強いので、これらの種は、適切な精製ステップによって簡便に分離することができる。可能な精製技術には、カラムクロマトグラフイーなどのクロマトグラフィーが含まれる。様々な方法によって溶出を実行することができる。好ましくは、勾配を適用する。それぞれの技術は当業者に知られている。ヒスチジンタグを用いれば、イミダゾール勾配によって最も容易に溶出させることができる。そのプロセスを図１に示す。より結合力が強いため、種Ｃはカラムとのより強い親和性を有しており、従って、クロマトグラフィーカラムから前記種を回収するためにイミダゾールを含む溶液などのより高濃度の溶液が必要であろう。この技術（すなわち、溶出用高濃度イミダゾール）によって、種Ｂを種Ｃから簡便に分離することができる。
【００６４】
従って、本発明は、本発明のタンパク性結合分子を精製する方法であって、（ａ）本発明のタンパク性結合分子を含む溶液を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の溶液を、前記タンパク性結合分子の精製タグに対して親和性を有する部分に接触させるステップと、（ｃ）タンパク性結合分子を前記部分に結合させるステップと、（ｄ）前記部分に結合しない溶液成分のすべて又は実質的すべてを除去するステップと、（ｅ）前記部分からタンパク性結合分子を回収するステップとを具える方法を提供する。
【００６５】
本発明のタンパク性結合分子を含む溶液は、好ましくは前記タンパク性結合分子を発現する細胞の培養液上清である。代替的に、本発明のタンパク性結合分子を含む他の溶液を用いてもよい。
【００６６】
本発明のタンパク性結合分子を含む溶液は、２個の精製タグを具えるタンパク性結合分子をさらに具えてもよい。
【００６７】
好ましくは、本発明のタンパク性結合分子は、勾配、好ましくはイミダゾール勾配によって、２個の精製タグを具えるタンパク性結合分子を含む溶液から分離される。
【００６８】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも２個の可変ドメインを具える第１タンパク性結合分子であって、一方の可変ドメインがターゲット分子に結合しており、他方の可変ドメインが精製タグを具えている第１タンパク性結合分子を、２個の精製タグを具える第２タンパク性結合分子から分離する方法であって、（ａ）第１タンパク性結合分子と第２タンパク性結合分子とを含む溶液を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の溶液を、前記タンパク性結合分子の精製タグに対する親和性を有する部分に接触させるステップと、（ｃ）前記タンパク性結合分子を前記部分に結合させるステップと、（ｄ）前記部分に結合しない溶液成分のすべて又は実質的すべてを除去するステップと、（ｅ）前記第２タンパク性結合分子から第１タンパク性結合分子を分離する方法で、前記部分から前記タンパク性結合分子を回収するステップと、を具える方法を提供する。好ましい実施形態において、ステップ（ｅ）は、精製タグに対する親和性を有する部分からタンパク性結合分子を回収するために勾配を適用するステップを具える。精製タグがヒスチジンタグであれば、イミダゾール勾配が好ましい。
【００６９】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも２個の可変ドメインを具える免疫グロブリン又はその機能性断片であって、１個の可変ドメインがターゲット分子に結合し、少なくとも１個の別の可変ドメインが精製タグを具えており、前記精製タグが前記別の可変ドメインのＣＤＲ領域に具えられている免疫グロブリン又はその機能性断片を提供する。最も好ましい前記免疫グロブリンは、完全長の免疫グロブリンである。
【００７０】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも２個の可変ドメインを具えるタンパク性結合分子であって、１個の可変ドメインがターゲット分子に結合し、少なくとも１個の別の可変ドメインが精製タグを具えているか又は不活性であるタンパク性結合分子を提供する。ある実施形態において、前記タンパク性結合分子は、２個の可変ドメインを具えていてもよい。ある実施形態において、精製タグを具える可変ドメインは、ターゲット分子に結合しない。ある実施形態において、精製タグは、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｖ５タグ及びこれらと実質的に同一の変異体から選択される。ある実施形態において、精製タグは、ヒスチジンタグ又はこれと実質的に同一の変異体である。ある実施形態において、ヒスチジンタグは、ヘキサヒスチジンペプチドである。ある実施形態においては、タンパク性結合分子が免疫グロブリン又はその機能性断片である。ある実施形態においては、免疫グロブリンが抗体である。ある実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。ある実施形態においては、抗体がヒト抗体である。ある実施形態においては、ヒト抗体がＩｇＧクラスである。ある実施形態において、ヒト抗体は、ＩｇＧ１サブクラス、ＩｇＧ２サブクラス、ＩｇＧ３サブクラス及びＩｇＧ４サブクラスのいずれかである。ある実施形態において、ヒト抗体は、ＩｇＧ１サブクラスである。ある実施形態において、前記可変ドメインは、それぞれ、可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とを具える。ある実施形態においては、可変重鎖（ＶＨ）が３つの相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）を具える。ある実施形態においては、可変軽鎖（ＶＬ）が３つの相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）を具える。ある実施形態において、精製タグは、可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）に含まれている。ある実施形態においては、精製タグが可変重鎖（ＶＨ）に含まれている。ある実施形態においては、精製タグが、可変重鎖（ＶＨ）の３つの相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）のいずれか１つに含まれている。その他の実施形態においては、精製タグが、可変重鎖（ＶＨ）の３つの相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）の１つ以上に含まれている。ある実施形態においては、精製タグがＨ−ＣＤＲ３又はＨ−ＣＤＲ２に含まれている。ある実施形態においては、精製タグがＨ−ＣＤＲ３に含まれている。ある実施形態においては、精製タグが可変軽鎖（ＶＬ）に含まれている。ある実施形態においては、精製タグが、可変軽鎖（ＶＬ）の３つの相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）のいずれか１つに含まれている。他の実施形態においては、精製タグが、可変軽鎖（ＶＬ）の３つの相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）の１つ以上に含まれている。ある実施形態においては、精製タグがＬ−ＣＤＲ２に含まれている。
【００７１】
ある実施形態において、本発明は、列挙されている上記タンパク性結合分子を含む、本発明のタンパク性結合分子をコードする核酸配列を提供する。ある実施形態において、これらの核酸配列は、精製タグを具える可変ドメインをコードする。ある実施形態において、可変ドメインは、免疫グロブリン又はその機能性断片に含まれている。ある実施形態において、これらの核酸配列の可変ドメインは、前記免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）に含まれている。ある実施形態において、これらの核酸配列の可変ドメインは、前記免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）に含まれている。ある実施形態において、これらの核酸配列の可変ドメインは、前記可変重鎖（ＶＨ）のＨ−ＣＤＲ３に含まれている。
【００７２】
ある実施形態において、本発明は、上記核酸配列を具えるベクターを提供する。
【００７３】
ある実施形態において、本発明は、上記ベクターを含む、本発明のベクターを具える細胞を提供する。ある実施形態においては、この細胞が哺乳動物細胞である。ある実施形態において、この細胞は、単離された細胞である。
【００７４】
ある実施形態において、本発明は、上記タンパク性結合分子と、該タンパク用の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と具える医薬品組成物を提供する。
【００７５】
ある実施形態において、本発明は、疾病又は疾患を治療する方法であって、必要性のある対象に上記医薬品組成物を含む本発明の医薬品組成物を治療的有効量で投与するステップを具える方法を提供する。ある実施形態において、疾病又は疾患は、ターゲット分子の望ましくない存在を伴うものである。
【００７６】
ある実施形態において、本発明は、対象又はサンプル中のターゲット分子を検出する方法であって、前記対象又はサンプルを上記タンパク性結合分子に接触させるステップを具える方法を提供する。
【００７７】
ある実施形態において、本発明は、対象の疾病又は疾患を診断する方法であって、前記対象又はサンプルを上記タンパク性結合分子に接触させるステップを具える方法を提供する。
【００７８】
ある実施形態において、本発明は、上記タンパク性結合分子の医薬品製造のための使用を提供する。
【００７９】
ある実施形態において、本発明は、疾病又は疾患の治療のための上記タンパク性結合分子を提供する。
【００８０】
ある実施形態において、本発明は、上記タンパク性結合分子の疾病又は疾患の診断のための使用を提供する。
【００８１】
ある実施形態において、本発明は、ターゲット分子を検出するための、上記タンパク性結合分子の使用を提供する。
【００８２】
ある実施形態において、本発明は、上記タンパク性結合分子を精製する方法であって、（ａ）タンパク性結合分子を含む溶液を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の溶液を精製タグに対する親和性を有する部分に接触させるステップと、（ｃ）前記タンパク性結合分子を前記部分に結合させるステップと、（ｄ）前記部分に結合しない溶液成分のすべて又は実質的にすべてを除去するステップと、（ｅ）前記部分からタンパク性結合分子を回収するステップと、を具える方法を提供する。ある実施形態においては、溶液が、２個の精製タグを具えるタンパク性結合分子をさらに含んでいる。ある実施形態においては、２個の精製タグを具えるタンパク性結合分子から、１個の精製タグを具えるタンパク性結合分子を勾配によって分離する。ある実施形態においては、勾配がイミダゾール勾配である。
【００８３】
実施例
実施例１：Ｈ−ＣＤＲ３領域に精製タグを含むＦａｂ断片の生成
ＭＯＲ０３２０７＿ＦＳは、ニワトリ卵白リゾチームに対する特異性を有するＦａｂである。ＭＯＲ０３２０７＿ＦＳは、ＶＨ鎖のＣ末端、すなわち、可変ドメインの外に、ＦｌａｇタグとＳｔｒｅｐタグとを具える。適切なプライマー設計及び従来のクローニング技術によって、ヘキサヒスチジンタグは、Ｈ−ＣＤＲ３配列：ＧＹＳＧＨＨＨＨＨＨＳＧＤＹをコードするｐＭｘ９＿ＭＯＲ０８４２８を作るコード発現ベクターであるｐＭｘ９＿ＭＯＲ０３２０７＿ＦＳ（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３）の可変重鎖のＨ−ＣＤＲ３に導入される。ＭＯＲ０８４２８は、ＶＨ鎖のＣ末端にＦｌａｇタグとＳｔｒｅｐタグ（ＦＳ）とを具える。
【００８４】
試験精製によって、ＭＯＲ０３２０７＿ＦＳ及びＭＯＲ０８４２８＿ＦＳの両方をＳｔｒｅｐタグによって精製することができることが確かめられた。しかしながら、ヘキサヒスチジンタグを自由に入手でき、それによって親和性クロマトグラフィーの目的に利用することができることを確認して、代替的に固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によってＭＯＲ０８４２８＿ＦＳを精製することができる。最後に、ＥＬＩＳＡによる試験によって、ＭＯＲ０３２０７＿ＦＳがニワトリ卵白リゾチームに結合することができ、ＭＯＲ０８４２８＿ＦＳは結合できないことが確認され、Ｈ−ＣＤＲ３にヘキサヒスチジンタグを導入することによってオリジナルのＦａｂ断片の特異性が破壊されたことが示された（図２）。
【００８５】
次いで、ＭＯＲ０８４２８＿ＦＳのＶＨを、クローンニングによってＭＯＲ０３０８０のＶＬと結合させた。ＭＯＲ０３０８０は、ヒトＣＤ３８に対する特異性を有するＦａｂである。得られる構築物は、ＭＯＲ０８４４１＿ＦＳと呼ばれ、従ってＭＯＲ０８４２８のＶＨとＭＯＲ０３０８０のＶＬとを含んでいる。
【００８６】
ＦＡＣＳ分析（図３）及びＥＬＩＳＡ試験（図２）によって、ＭＯＲ０３０８０はヒトＣＤ３８に結合できるが、ＭＯＲ０８４２８及びＭＯＲ０８４４１はヒトＣＤ３８に結合できないことを確認した。同様に、ＭＯＲ０３２０７＿ＦＳはニワトリ卵白リゾチームに結合することができるが、ＭＯＲ０８４２８及びＭＯＲ０８４４１はニワトリ卵白リゾチームに結合できないことが確認された。最後に、ＭＯＲ０８４２８＿ＦＳをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製できることは、Ｈ−ＣＤＲ３に組み込まれた６Ｈｉｓ配列が親和性カムマトリクスに近接可能であることを示している。
【００８７】
要約すると、ヒトＦａｂ断片のＨ−ＣＤＲ３中へのヘキサヒスチジンタグの導入などの、タンパク性結合分子の可変ドメイン中へのヘキサヒスチジンタグなどの精製タグの導入によって、（ａ）各親和性樹脂への結合によって容易に精製することができ、かつ、（ｂ）可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）が由来したオリジナルの親バインダのターゲット分子にもはや結合できないＦａｂを生成することが可能であることが証明されている。
【００８８】
実施例２：Ｈ−ＣＤＲ３領域中に精製タグを含む完全長ＩｇＧの生成
この実施例に記載されているように、本発明の一価免疫グロブリンを生成することができる。代替的に、別の技術を使用してもよい。例えば、所望の免疫グロブリン重鎖の好ましい対合を可能にするいくつかの実験技術が存在する。例えば、組み換えたジスルフィド結合及び「ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ」突然変異（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６，６７７）を用いた技術よって二重特異性ＩｇＧを生成することができ、所望の重鎖の効率的な対合を可能する。当業界で知られているその他の関連技術を同様に使用してもよい。
【００８９】
下記において実施例１のＦａｂ断片をＩｇＧ１型に変換する。従って、各構築物を適切なベクターにクローンニングする。
【００９０】
不変ヒトガンマ１定常領域を有するベクターであるｐＭｏｒｐｈ２＿ｈｕＩｇＧ１中にＭＯＲ０８４２８及びＭＯＲ０３０８０の可変重鎖をクローニングすることによってｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿ＩｇＧ１＿ＭＯＲ０８４２８ベクター及びｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿ＩｇＧ１＿ＭＯＲ０３０８０ベクターをそれぞれ生成した。不変ヒトラムダ軽鎖を有するベクターであるｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿Ｉｇ＿ラムダ２中にＭＯＲ０３０８０の可変軽鎖ををクローニングすることによってベクターｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿Ｉｇ＿ラムダ２＿ＭＯＲ０３０８０を作成した。３つの構築物のすべてをＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１２５６８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．（２００２）：６３１−８）などのヒト細胞系中に共トランスフェクトして発現させる。細胞培養上澄みはさらなる試験に用いられる。標準的なプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上澄みを予め精製した。
【００９１】
トランスフェクトされた細胞系において２つの異なる重鎖と１つの軽鎖とが作られるので、全部で３つの異なる免疫グロブリン種が生産される。１つの種は、ＭＯＲ０３０８０の２つの重鎖を含む。この免疫グロブリン種は、ヘキサヒスチジンタグを含んでおらず、従って、Ｎｉ−ＮＴＡに対しては親和性がないが、ＣＤ３８に対しては一価ではなく二価の特異性を有する。第２の免疫グロブリン種は、ＭＯＲ０３０８０の１つの重鎖とＭＯＲ０８４２８の１つの重鎖とを含む。この免疫グロブリン種は、本発明における望ましい特性を有する種である。この免疫グロブリン種は、１つのＭＯＲ０８４２８重鎖のＨ−ＣＤＲ３中のヘキサヒスチジンタグによって、Ｎｉ−ＮＴＡに対する親和性を有している。最後に、第３の免疫グロブリン種は、ＭＯＲ０８４２８の２つの重鎖を含む。この種は、ターゲット分子（このケースにおいてはヒトＣＤ３８）に対する親和性を有していない。しかしながら、この種は、免疫グロブリンの両方のアームにヘキサヒスチジンタグを含んでおり、従って、ＩＭＡＣカラム（例えばＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）又はヒスバインドフラクトゲル（Ｍｅｒｃｋ））の樹脂に対して二価の結合を示し、従って樹脂に対してより高い親和性を有する。この免疫グロブリン種の樹脂に対する親和性は、望ましい第２の免疫グロブリン種の一価の親和性よりもはるかに強いので、例えば、イミダゾール勾配などの親和性クロマトグラフィーによってこの免疫グロブリン種を簡便に分離することができる。この溶出プロセスを図１に示す。
【００９２】
このプロテインＡで精製したＩｇＧ１分子の混合物をＩＭＡＣ精製に供した。Ａｋｔａ−ＦＰＬＣシステムを用い、予備精製したＩｇＧ１混合物をヒスバインドフラクトゲル（Ｍｅｒｃｋ＃７０６９３−３）カラムに装填した。１ｍｌ／分の流速で１ｍｌの画分を得た。
【００９３】
２０ｍＭのＮａリン酸（ｐＨ７．４）／５００ｍＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのイミダゾールを泳動バッファとして用いた。泳動バッファに２５０ｍＭのイミダゾールを加えたものを溶出バッファーとして用い、溶出バッファーの勾配：０〜１００％を適用した。代表的な画分を還元分析的ＳＤＳ  ＰＡＧＥにロードした（図４）。予想したように、約３０ＫＤに単一の軽鎖バンドがみられた。対照的に、２本の別々の重鎖バンドを区別することができた（いずれも約５０ＫＤ）。カラム流出液中に下のバンドが観察され、一方で、イミダゾールを用いた溶出時には上のバンドのみが確認された。高濃度のイミダゾール（すなわち、後の画分）では、上の重鎖バンドだけが溶出された。下の重鎖バンドがＭＯＲ０３０８０の重鎖を示しており、一方で、上のバンドがヘキサヒスチジンタグを有するＭＯＲ０８４２８の重鎖を示していることが結論付けられる。
【００９４】
従って、ヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ種によって、タグされていない（二価の）ＭＯＲ０３０８０ＩｇＧ１を容易に分離することができる。更に、イミダゾール勾配による溶出は、１個のヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ１種と２個のヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ１種とのさらなる分離を可能にした。
【００９５】
実施例３：分離したＩｇＧ１種の機能分析
画分＃３０−５８及び画分＃７０−９０を貯留した（図４を参照）。これらの貯留した画分のバッファー及びカラム流出液を透析によってＰＢＳに交換した。これらのサンプルのタンパク濃度をＡ２８０ｎｍ測定によって決定した。これらの３つのサンプルを還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図５）。ＭＯＲ０３０８０の重鎖は、ＭＯＲ０８４２８の重鎖よりも見掛けの分子量が小さかった。流出液サンプルはＭＯＲ０３０８０の重鎖だけを含んでいたが、一方で、画分＃７０−９０の貯留サンプルは、主としてＭＯＲ０８４２８の重鎖を含んでいた。対照的に、＃３０−５８の貯留サンプルは、およそ１：１の比率で両方の重鎖を含んでいた。これらのデータは、１つのヘキサヒスチジンでタグされた一価のＩｇＧ１及びヘキサヒスチジンで二重にタグされたＩｇＧ１から、溶出のためにイミダゾール勾配を適用して親和性クロマトグラフィーを用いることによって、二価のＩｇＧ１が分離されたことを示している。
【００９６】
ＦＡＣＳにおけるＥＣ５０の決定
これらのＩｇＧ１画分の結合特性を明らかにするために、ＣＤ３８を発現するＲＰＭＩ８２２６細胞を用いてＦＡＣＳ  ＥＣ５０試験を行った。この目的のために、規定の濃度（２５０ｎＭ〜０．２４ｐＭ）のＩｇＧを一次抗体として用いた。１ウェル当たり５０μｌの１：２００に希釈したＰＥが結合した第２抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）’２断片特異的；ＪＩＲＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃１０９−１１６−０９７）を用いて検出を行った。非線形回帰曲線フィットモデル（Ｓ字用量反応；可変傾斜）を応用するプリズム３．０３ソフトウェア（グラフバッドソフトウェア）を用いてＥＣ５０値を決定した。表１は、このＦＡＣＳ滴定試験で得られたＥＣ５０値を示している。
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【００９７】
流出液ＩｇＧ１画分のＥＣ５０値がＭＯＲ０３０８０参照ＩｇＧ１と非常に近似していたことは、流出液が二価のＣＤ３８結合ＩｇＧ１に一致することを示している。対照的に、画分＃３０−５８は、１／３のＥＣ５０（１．５ｎＭ）を示し、ＭＯＲ０３０８０の一価の参照Ｆａｂ断片と同じ範囲内であった。このことは、ＩｇＧ１画分＃３０−５８が、ＣＤ３８が結合する一価のＩｇＧ１からなっていたことを示している。基準ＩｇＧ１、ＭＯＲ０８５８８は、もっぱらＭＯＲ０８４２８の可変重鎖（ＶＨ）とＭＯＲ０３０８０の可変軽鎖（ＶＬ）とからなっており、従って、予想したように、２個のヘキサヒスチジンでタグされており、ＣＤ３８には結合しない。高濃度のイミダゾールで溶出された画分＃７０−９０は、そのＥＣ５０が画分＃３０−５８のＥＣ５０と比較して１０分の１であることによって証明されるように、主として、２個のヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ１種からできている。残りの結合特性は、共溶出した１個のヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ１種のサンプル不純物に起因する。
【００９８】
プラズモン表面共鳴（バイアコア）による親和性測定
バイアコア３０００装置（バイアコア、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、共有結合で固定化されたヒトＣＤ３８−Ｆｃに結合する各精製抗体の段階希釈を用いて反応速度定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを決定した。標準的なＥＤＣ−ＮＨＳカップリング手法で共有結合による抗原固定化を実行した。１．５〜５００ｎＭの濃度の抗体を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で２０μｌ／分の流速で反応速度測定を行った。各濃度における注入時間は１分であり、次いで、３分の電離段階を行った。再生のために、５μｌの１０ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ１．５）を２回注入した。１：１の結合反応速度を想定して、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．２（バイアコア）を用いてすべてのセンサーグラムを合わせた。
【００９９】
表２は、バイアコア試験から得たみかけの親和性値を示している。
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【０１００】
流出液サンプルのみかけのＫＤが精製したＭＯＲ０３０８０ＩｇＧ１に非常に近似していたことは、このサンプルが二価のＩｇＧ１からなっていることを示している。対照的に、＃３０−５８の貯留サンプルは、ＭＯＲ０３０８０ＩｇＧ１の１０分の１であるＭＯＲ０３０８０Ｆａｂ断片に非常に近似したみかけのＫＤを示した。この結果は、画分＃３０−５８の貯留サンプルが、ＭＯＲ０３０８０Ｆａｂ断片と同じ一価の結合特性を示すことを表している。ＭＯＲ０８５８８ＩｇＧ１は、予想したように、ＣＤ３８−Ｆｃに対していかなる結合性も示さなかった。しかしながら、画分＃７０−９０ＩｇＧ１は、ＣＤ３８−Ｆｃに対する結合性を示した。高濃度のイミダゾールで溶出された画分＃７０−９０は、主として、２個のヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ１種からなっているようである。このことは、例えば画分＃３０−５８よりも低いＲｍａｘによって説明される。これらのサンプルにおいてみられたｋｏｎ及びｋｏｆｆは、ほとんど、共溶出された１個のヘキサヒスチジンでタグされたＩｇＧ１種のサンプル不純物に起因している。
【０１０１】
要約すると、ターゲット分子に対して一価の親和性を有する完全長の免疫グロブリンが生産される。これらの分子は、容易に生産され、精製タグを用いてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製され、それによって、そのような精製タグ有しない二価結合する免疫グロブリン分子から分離される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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