(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発がん性物質であるベンツピレンの含有量が１ｐｐｔ以下である木酢液。
【請求項２】
精製前の木酢液を精製した木酢液であり、精製前に含有する有機酸成分が精製後除去されず残存している請求項１記載の木酢液。
【請求項３】
オクタデシル基結合型シリカゲルを吸着剤としてベンツピレンを含有する精製前の木酢液を処理することを特徴とすると精製木酢液の製造方法。
【請求項４】
スラリー状にしたオクタデシル基結合型シリカをオープンカラムに充填し、その後、精製前の木酢液を前記カラムに通液することを特徴とする精製木酢液の製造方法。
【請求項５】
オクタデシル基結合型シリカは表面が親水化されていることを特徴とする請求項４記載の精製木酢液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば竹酢液などの木酢液及びその製造方法に係る。
より詳細には、例えば竹酢液中に微量に含まれるとされる、発がん性物質の一つである3、4-Benz[a]pyrene （以下、ベンツピレン）を効率的に除去することを目的とし、市販品竹酢液中のベンツピレン濃度を明らかにするとともに、簡便手法による除去した竹酢液などの液体組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
木酢液は木材を乾留した際に生じる乾留液の上澄分のことであり。代表的な例としては、炭焼き時に副産物として木酢液が製造される。なお、本明細書においては、木材としては、竹、松などの一般的な木材のみならず、椿科植物などの花をも含む植物一般を意味するものとする。
【０００３】
木酢液は、外見は赤褐〜暗褐色の液体。ほとんどが水分であるが、木材由来の有機酸（酢酸など）が含まれ弱酸性を示す。それ以外の成分として
、アルコール類、カルボニル化合物、あるいはフェノール類やフラン類といった芳香族化合物などが含まれる。
【０００４】
ベンツピレンとは図１に示す構造を有する多環芳香族類の1種である。これまでの研究において、発がん性（発がん性の誘発）物質としての可能性が強く示されており、主に、土壌、大気に広く分布することが知られている。急性毒性を示す半致死量LD50はマウスの実験から250mg/kgとされている。日本国内における食品類に対する基準値は定められていないが、EUでは食品中のベンツピレン濃度基準が1〜5μg/L（1〜5ppb）と定められており、また、WHOの水質ガイドラインは0.7ppbとされていることから、日本国内でも濃度管理項目として注視されている[非特許文献１]。
【０００５】
一方、木酢液の一例として竹酢液を説明する。
竹酢液とは竹（炭）を高温で処理する際に得られる生成物で、90%程度の水成分を含む溶液中には、多種の有機酸、ポリフェノール、アルコール類を含んでおり、抗菌作用等を目的として広く市販化されている。しかしながら、製造過程で生じるタール成分中には上記ベンツピレンを含む多環芳香族の含有が示唆されている。
【０００６】
これまでに報告されている竹酢液製造法において、低温蒸留によりベンツピレンを除去する方法や[特許文献１−６]、活性炭を用いたろ過でタール成分を除去する方法が明らかと成っている[特許文献７-１１]。
その一方で、市販品竹酢液には依然としてベンツピレンを含む可能性が否定できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１７９２４５号公報
【特許文献２】特開２００５−１５７２２号公報
【特許文献３】特開２００３−２７７７６６号公報
【特許文献４】特開２００２−３０９２６号公報
【特許文献５】特開２０００−４４９６５号公報
【特許文献６】特開平９−２４９８８６号公報
【特許文献７】特開平１１−２６９４６９号公報
【特許文献８】特開２００１−３４８５７７号公報
【特許文献９】特開２００６−８３１９９号公報
【特許文献１０】特開２００２−２９３７３３号公報
【特許文献１１】特開２００３−２９２９６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】農林水産省：食品安全に関するリスクプロファイルシートhttp://www.maff.go.jp/j/syouan/seisaku/risk_analysis/priority/pdf/chm_pah.pdg
【非特許文献２】HongZhang，Ming Xue，Zhiyuan Dai，“Determinationof polycyclic aromatic  hydrocarbons in aquatic products by HPLC-fluorescence” Journal ofFood Composition and Analysis，23(2010)469-474
【非特許文献３】SabineAndree，W.Jira，K.-H.Schwind，H.Wagner，F.Schwagele，“Chemicalsafety of meat andmeat products” Meat Science，8 6(2010)38-48
【非特許文献３】Silvia A.V. Tfouni，Rita M.D. Machado，Monica C.R. Camargo，SilviaH.P.Vitorino，Eduardo Vicente，M.Ceci1ia F.Toledo，“Determinationof polycyclicaromatic hydrocarbons in cachaca by HPLC with fluorescencedetection” Food Chemistry 101 (2007)334-338
【非特許文献５】Tomas Wenzl, Rupert Simon, Juliane Kleiner, Elike Anklam, “Analyticalmethods for plysyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in food and the environmentneeded for new food legislation in the European Union” Trends in AnalyticalChemistry, 25(2006)716-725
【非特許文献６】宮川雄太、徳江千代子，椎原康史，宮川富三雄、“異なる溶媒を用いた流木木酢燻臭成分の比較と変異原性”日本食品科学工学会誌25(2005)125-130
【非特許文献７】Yoshihiko Akakabe, Yuta Tamura, Soota Iwamoto, Miho Takabayashi,TakeshiNyuugaku, “Volatile organic comounds with characteristic odor in bamboovinegar” Biosscience Biotechnology and Biochnistry 70(2006)2797-2799
【非特許文献８】Jun Mu, Tohru Uehara, Takeshi Furuno, “Effect of bamboo vinegaronregulation of germination and radicle growth of seed plants II :composition fomoso bamboo vinegar at different collection temperature and its effects”Journal of Wood Science, 50(2004)70-476
【非特許文献９】Shih-Guei Fu, Youngmo Yoon, Russell Bazemore, “Aroma-ActiveComponentsin Fermented Bamboo Shoots” Jornal of Agricultural and Food Chemistry 50(2002)549-554
【非特許文献１０】Sung Phil Mun Chang Sub Ku, ”Pyrolysis GC-MS analysis of tars formedduring the aging of wood and bamboo crude vinegars“ Journal of Wood Science56(2010)47-52
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、簡易手法による精製により、ベンツピレンを１ｐｐｔ（重量ｐｐｔ、以下同じ）以下まで除去した液体組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に係る発明は、発がん性物質であるベンツピレンの含有量が１ｐｐｔ以下である木酢液
である。
請求項２に係る発明は、精製前の木酢液を精製した木酢液であり、精製前に含有する有機酸成分が精製後除去されず残存している請求項１記載の木酢液である。
請求項３に係る発明は、オクタデシル基結合型シリカゲルを吸着剤としてベンツピレンを含有する精製前の木酢液を処理することを特徴とすると精製木酢液の製造方法である。
請求項４に係る発明は、スラリー状にしたオクタデシル基結合型シリカをオープンカラムに充填し、その後、精製前の木酢液を前記カラムに通液することを特徴とする精製木酢液の製造方法である。
請求項５に係る発明は、オクタデシル基結合型シリカは表面が親水化されていることを特徴とする請求項４記載の精製木酢液の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、人体に有効な成分を減少させることなく、木酢液中のベンツピレンを２０ｐｐｔ以下、さらには１ｐｐｔ以下に低減することができる木酢液の製造方法を提供することができる。
本発明によれば、発がんのリスクがない木酢液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ベンツピレンの構造
【図２】液体クロマトグラフィーシステムの概略図
【図３】液体クロマトグラフィー−蛍光検出における多環芳香族の分析例
【図４】ベンツピレン標準品(50μL)の蛍光クロマトグラム    (A): 1.0ppb , (B): 10ppt
【図５】竹酢液１の蛍光クロマトグラム    ((A)フルスペクトル, (B) 拡大スペクトル)
【図６】ODSシリカカートリッジによる簡易処理でのベンツピレン除去効果
【図７】カラムスイッチング液体クロマトグラフィーの概略図
【図８】ベンツピレン濃度測定における検量線
【図９】市販竹酢液サンプル３のODSシリカバッチ吸着後写真(A) :未処理、 (B): ODSシリカ5g使用、 (C) :ODSシリカ10g使用、 (D) :ODSシリカ20g使用、 (E) :コンディショニング済みODSシリカ10g使用
【図１０】ODSシリカバッチ吸着による精製後のクロマトグラム（市販品サンプル３の分析結果）
【図１１】カラム法による竹酢精製の概略図
【図１２】市販竹酢液サンプル３の精製前後写真(A):未処理、(B):カラム法による処理後
【図１３】ODSシリカ精製後の市販竹酢液サンプル５の最終クロマトグラム
【図１４】GC-MSシステムの構成図
【図１５】市販竹酢液サンプル２のGC-MSクロマトグラム(A): 溶出前半、  (B): 溶出後半
【図１６】市販竹酢液サンプル（未精製）のGC-MSクロマトグラム
【図１７】市販竹酢液サンプル５のODSシリカ精製前後のGC-MSクロマトグラム(A): 精製前、  (B): ODSシリカ精製後（カラム法）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本形態においては、以下の順で実験を行った。
本形態においては木酢液の例として竹酢液を用いた。
・竹酢液中のベンツピレン濃度測定
・シリカ系吸着剤による竹酢液中のベンツピレン除去法開発
・上記手法によるベンツピレン未含有サンプルの作製
・他成分分析結果
【００１４】
以下に、各項目における詳細について述べる。
・竹酢液中のベンツピレン濃度測定
多環芳香族の定量分析手法としては、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー的手法を用いることが有効である。これまでに報告されている、食品中の多環芳香族類の定量分析では、主として液体クロマトグラフィーと蛍光検出器を組み合わせたシステムが用いられている[非特許文献２-５]。液体クロマトグラフィーとは図２に示す装置で構成されており、分析カラム内で分離された各溶質は各種検出器で検出され、電気信号に変換することで、クロマトグラムと呼ばれる分離チャートを得る。この際、クロマトグラム中の各ピーク面積は検出された溶質の濃度に依存しており、その面積値を測定することで、目的の溶質の濃度を知ることができる。
【００１５】
また、本分析で用いる蛍光検出器とは、蛍光を有する物質群に対して通常の紫外光検出よりも高い感度を得ることができる。特に、多環芳香族類は蛍光性の物質であることから、ベンツピレンの分析においても同様の手法が有効であるとされている。
【００１６】
図３には、参考文献中での液体クロマトグラフィー−蛍光検出における多環芳香族類のクロマトグラムを示した。ここで、ベンツピレンは矢印で示すピークにより検出される。
【００１７】
この例での、ベンツピレンの定量限界値および検出限界値は、それぞれ48ng/L(48ppt)、 16ng/L(16ppt)とされている。また、その他の参考文献中でも蛍光検出における定量限界値は数十pptとされている。
分析装置
: Agilent 1100、Agilent 1046A、20mL loop injector. The
分析条件
: カラム-C18 column (4.6 mm x 260 mm)、温度-30℃、移動相-流速:0.8mL/min、0-12 minアセトニトリル 85-95% ;12-26 minアセトニトリル95%)。
【００１８】
一方、これまでに報告されている竹酢液分析の学術論文[非特許文献６-１０]のうち、一つの報告では、ベンツピレン濃度が50ppt以下であることが示されている。この濃度は、上記に示すヨーロッパ諸国での食品中のベンツピレン濃度はクリアーしているものの、それ以下の濃度については、言及されていない。しかし、本発明の目的の一つはベンツピレンを限りなくゼロに近づけることであるため、液体クロマトグラフィーと蛍光検出器における最適分析条件を探索し、試供された竹酢液サンプル（市販竹酢液サンプル１が入手）におけるより高感度な分析条件を設定した。以下に分析条件を記す。

分析装置
送液ポンプ:LC-20AD （島津製作所）
オートサンプラー:SIL-20A/20AC （島津製作所）
カラムオーブン:CTO-20A/20AC（島津製作所）
検出器:RF-20A （島津製作所）

分析条件
分析カラム:VP-ODS（150mmx4.6mmi.d.）
移動相:アセトニトリル/10mMリン酸緩衝液=8/2
流速:0.8 mL/min, Isocratic mode
評価温度:40℃
検出:蛍光検出、励起波長-295nm、蛍光波長-403nm
【００１９】
以上の条件により、ベンツピレン標準品の分析を行い、次いで、市販竹酢液サンプル１を直接測定することで、竹酢液中のベンツピレン濃度を検定した。
【００２０】
図４には1.Oppb(A)および10ppt(B) ベンツピレン標準液を50μL注入した際のクロマトグラムを示す。図のクロマトグラムに示すとおり、ppbレベルではっきりとしたベンツピレンのピークが確認できる。さらに、今回用いた高感度蛍光分析条件では、超希薄濃度の10pptの分析においても、良好なクロマトグラムが得られた。この際、ベンツピレンのピークは14.2分付近のピークであり、13分付近のピークに関しては、1ppbのクロマトグラムにおいても同程度の強度で見られることから、その他の条件に由来するピークであると判断できる。この程度の高感度分析では、特に蛍光分析の場合にはしばしば見られるゴーストピークであるが、ベンツピレンの定量分析には支障を来さないと判断し、竹酢液の分析を行った。
【００２１】
次に、同じく市販竹酢液サンプル１のダイレクト注入におけるクロマトグラムを図５の(A) (B) に示す。(A) には高いピーク強度含むクロマトグラムを示しているが、多量に存在する他成分のピークが非常に大きく、全体のクロマトグラムからは、ベンツピレン溶出付近のピークを確認することが不可能である。そこで、(B) にはベンツピレン溶出時間付近の拡大クロマトグラムを示した。その結果、竹酢液１中にはおおよそ10pptのベンツピレンの存在が確認された。また、この際の分析条件における検出限界は1pptとした。
【００２２】
上記の通り、市販竹酢液サンプル１において、pptレベルでのベンツピレンの存在が確認された。そこで、次にベンツピレン除去の可能性を探索するべく、疎水性物質の吸着剤として汎用である、オクタデシル基結合型シリカゲル(ODSシリカ)を充てんした固相抽出剤を用いて、ベンツピレン除去の可能性を確認した。操作方法は以下の通りである。
1.市販竹酢液サンプル１を0.45μmの細孔を有するメンブランフィルターによりろ過(目では確認できない不溶成分を除去するため)
2. ODSシリカカートリッジ(Waters社製、Sep-Pak C18) をメタノール、水を用いてコンディショニング(オクタデシル基を活性化させて、疎水性物質の吸着を促すため)
3. ろ過済み市販竹酢液サンプル１を10mL、ODSシリカカートリッジに通液し、その通過液を回収
4. 処理済みサンプルを上記液体クロマトグラフィー−蛍光検出により分析し、ベンツピレンの有無を確認
図６には、ODSシリカカートリッジによる精製前後でのクロマトグラムを示した。図６に示すとおり、ODSシリカカートリッジにより処理されたサンプルでは、ベンツピレンのピークが格段に小さくなっていることが確認できる。このクロマトグラムからは、ベンツピレン濃度が1ppt程度にまで除去されていることが確認できた。
【００２３】
以上のことから、竹酢液中の微量ベンツピレンの除去技術として、ODSシリカによる固相処理が有効であると判断されたため、市販品数種を含むベンツピレン濃度測定および簡易除去法の評価を続けた。
【００２４】
上記した通り、ODSシリカカートリッジの処理により、竹酢液中のベンツピレン除去の可能性が示された。しかしながら、上記カートリッジ処理では依然として約1ppt程度のベンツピレンの残存が確認された。そこで、ODSシリカでの完全除去の可能性を評価することを目的として、カラムスイッチング法により、ODSシリカにおける完全除去の可能性を分析した。
【００２５】
カラムスイッチング液体クロマトグラフィーとは、図７に示すシステムで構成されており、前処理カラムとしてのODSシリカ充てんカラムに対して一定量のサンプルを導入することが可能である。本手法を用いることで、ODSシリカ充てんカラムにおいて完全除去が可能であるかと知ることができる。
【００２６】
竹酢液の導入量を段階的に変化させた結果、ベンツピレン濃度を検出限界以下の1ppt以下にまで低減できることが示された。
これらの結果から、ODSシリカでのベンツピレン完全除去の可能性が見出されたため、続いて、簡易処理法としての検討を行うとともに、数種の市販竹酢液を用いた更なる検討を続けた。
【００２７】
・シリカ系吸着剤による竹酢液中のベンツピレン除去法開発
1.市販竹酢液サンプル中のベンツピレン濃度測定
前項の評価結果より、依頼者から試供された竹酢液中に微量ではあるがベンツピレンの存在が確認された。また、ODSシリカを充てんしたカートリッジ、カラム精製の結果からは、同吸着剤での処理により、ベンツピレンを完全に除去できる可能性が示された。そこで、本項では市販竹酢液中の簡便なベンツピレン除去技術を確立することを目的とし、ODSシリカ吸着剤を用いて、多量竹酢液の処理を行い、その効果を確認した。
【００２８】
まず、現状市販竹酢液として多くの種類が市販されている。また、本項の実験では、多量の竹酢液処理の必要があるため、数種の市販竹酢液を新たに購入し、検討を行った。用いた竹酢液は以下の通りである。
試料
市販竹酢液サンプル２
市販竹酢液サンプル３
市販竹酢液サンプル４
市販竹酢液サンプル５(サンプル４の蒸留精製品として市販)
【００２９】
また、これらの市販竹酢液中のベンツピレン濃度を測定するため、前項と同じく液体クロマトグラフィー−蛍光検出を用いて、各竹酢液中のベンツピレン濃度測定を試みた。その際用いた検量線は図８に示すとおりである。本検量線では、ベンツピレン濃度が1ppt (1ng/L)から10ppb (10μg/L)の範囲で相関係数0.9999の良好な直線性を得ている。
【００３０】
各竹酢液におけるベンツピレン濃度を表1にまとめた。ここで、4種の竹酢液中、2種の竹酢液ではベンツピレンの明確なピークが確認できなかった。この理由としては、竹酢液の精製度合いが極めて低く、そのため、ベンツピレン以外の來雑成分が非常に多く、ベンツピレンを検出することが不可能であることに依存すると考えられる。
【００３１】
一方、市販竹酢液サンプル４、５ではベンツピレンの濃度が確認され、それぞれ、サンプル４では10ppb程度、サンプル５では60ppt程度となり、蒸留により大半のベンツピレンが除去されることが示唆されている。しかし、蒸留品であるサンプル５についても、依然として明確なベンツピレンの存在が確認されたため、上記4種のサンプルを用いてベンツピレンの除去を目的とした除去法の検討を続けた。
【００３２】
【表１】
0005465190.tif 000002
※竹酢液の精製が不十分であるため、多くの來雑成分が混在すると予想される。前項の一般的な知見から、精製不足の竹酢液にはより高濃度でのベンツピレンの存在が予想される。
【００３３】
2. 0DSシリカを用いたベンツピレン除去法検討
(i)バッチ吸着法による除去法検討
前項において、ODSシリカの処理により、竹酢液中のベンツピレンの除去の可能性が見出された。そこで、同吸着剤での簡易処理法を検討するべく、バッチ吸着によるベンツピレン除去を試みた。
【００３４】
評価に用いた試薬および操作方法は以下の通りである。
試薬
・アセトニトリル(和光純薬工業)
・メタノール(和光純薬工業)
・純水(Milli-Q 純水製造装置)
・ODSシリカ(Cosmosil 140C18-0PN、ナカライテスク)
※評価に用いたODSシリカは平均粒径が140μmである。
このＯＤＳ表面は親水性となっている。このＯＤＳシリカはオープンカラムにて使用できる。
操作
各竹酢液サンプルを0.45μmの細孔を持つメンブランフィルターを用いてろ過(不溶成分を除去するため)
↓
それぞれのろ過済みサンプル各50mL量り、ビーカーに移した
↓
各サンプル中に、上記ODSシリカ(乾燥状態) 5 g、10 g、20 gを分散させた。
この際、
ODSシリカのコンディショニング効果確認のため、10g添加分について、別途メタノール/水でコンディショニングした比較サンプルも作製した。
↓
上記ODSシリカ分散液をかくはん器を用いて、回転数200rpm、室温で12時間撹拌した。
撹拌後のサンプルはろ過によりODSシリカを取り除いた。さらに、得られた精製液中のベンツピレンを定量した。
【００３５】
図９には竹酢液サンプル３を用いた際の、ODSシリカバッチ吸着処理後の各竹酢液の写真を示した。4種の竹酢液サンプル中で、サンプル３の着色が著しく、この着色はタール分に依存すると考えられる。したがって、可視的な変化で精製が確認できればベンツピレンの除去にも効果的であると予想される。
【００３６】
これらの写真から明らかなとおり、添加したODSシリカの量に依存して、竹酢液の色が劇的に変化していることが分かる。さらに、(C) と(E) の比較から明らかなように、ODSシリカのコンディショニング操作が、吸着効果に重要であることが確認された。これは、前項でも言及したとおり、ODSシリカの吸着活性化を図るためには、有機溶剤/水系での処理が重要であることに起因する。
【００３７】
さらに、図１０には、市販竹酢液サンプル３の上記バッチ吸着処理で最も精製効果が高いと予想されるサンプルのベンツピレン測定クロマトグラムを示した。このクロマトグラムが示すように、精製後のサンプルにおいてわずかではあるが、ベンツピレンの存在が確認された。このときのベンツピレン濃度は約20pptであった。
【００３８】
以上のように、ODSシリカのパッチ処理において、竹酢液のタール成分等の除去効果が確認された一方で、方法ではベンツピレンの除去が完全ではないことから、別法により、ベンツピレン完全除去の検討を続けた。
【００３９】
(ii)カラム法による除去法検討
上記検討の結果、ODSシリカによる吸着処理により、竹酢液中のベンツピレン除去の可能性が見出された。しかしながら、単純なバッチ吸着処理では、目的とする完全除去に対しては除去効果が十分ではなく、別手法での検討が必要となった。そこで、通常大量の溶液を処理する手法として用いられる、カラムクロマトグラフィー法により、処理を試みた。
【００４０】
本評価で用いたカラム法の概念図を図１１に示した。一般的には、ガラス管に吸着剤(今回の場合はODSシリカ)をスラリー状(液体に分散した状態で)にて充てんし、その後コンディショニングを施した後、測定すべき試料を通液する。その過程で、化学的な相互作用により要除去成分(今回の場合はベンツピレン)が除去され、通過液を回収することで、精製試料を得ることが可能である。本試験では、市販竹酢液サンプル4種を用いて評価を行った。回収液は、上記クロマトグラフィー手法(蛍光での検出)による分析し、ベンツピレンの濃度を確認した。
【００４１】
次に、実際に行った操作方法について、以下に示す。なお、用いた試薬類は上記バッチ吸着法の場合と同じである。

操作
30%アセトニトリル水溶液、100mL中にODSシリカ20gを分散させスラリーとした。
↓
脱脂綿、海砂を一端に充てんした内径25mmのガラスカラムに、上記スラリーを充てんした。
↓
コンディショニングとして、メタノール、水を各100mL通液し、ODSシリカを活性化した。
↓
市販竹酢液サンプルを各100mL通液し、通過液を回収した。
↓
回収液中のベンツピレン濃度を測定するため、液体クロマトグラフィー−蛍光検出により、各回収液を分析した。
【００４２】
ここで、通常ODSシリカの再生方法として、有機溶剤を用いた洗浄が有効であるとされている。今回の評価においても、通過液回収後にアルコールを用いてODSシリカ充てんカラムの洗浄を行った結果、 ODSシリカの着色がほぼ除去され、再利用の可能性が示唆された。
【００４３】
次に、カラム法により得られた試料評価結果について述べる。まず、カラム法による処理における酸性度の評価について、すべてのサンプルにおいて精製前後でのpH変化は見られなかった。例えば、市販竹酢液サンプル３では、精製前のpHが2.62であったのに対して、精製後では2.65となった。この結果が意味するところは、精製前後において主要成分である酢酸を含む有機酸成分は除去されておらず、抗菌性を有する有機酸の残存が示唆されている。
【００４４】
一方、可視的な変化として、バッチ吸着法の結果として示した竹酢液サンプル３の精製前後の様子を図１２に示す。これらの写真から明らかなように、精製前後において、タール成分由来の着色がほぼ完全に除去されていることが分かる。同様に、竹酢液特有の燻臭もほぼ消失していることが分かった。このことから、ベンツピレンを含むタール成分等が効率よく除去される可能性が高いと判断できる。
【００４５】
さらに、ベンツピレンの除去効果について評価した。その結果、用いた市販竹酢液サンプルすべてにおいてベンツピレンの濃度が検出限界以下にまで低減されていることが明らかとなった。例として、精製後の市販竹酢液サンプル５の最終のクロマトグラムを図１３に示した。この図の通り、ベンツピレンのピークは確認できず、ODSシリカのカラム法により、竹酢液中のベンツピレン除去が可能となった。
【００４６】
また、再現性評価についても、市販竹酢液サンプル５の繰り返し実験を行った結果、いずれのサンプルでもベンツピレンは確認されず、上記4種ですべて機能したことからも本法の再現性が良好であると判断できる。
【００４７】
以上のことより、竹酢液中のベンツピレン除去技術として、シリカ系吸着剤の一つであるODSシリカによる固相処理が有効であることが示された。さらに、精製法として、カラム法の有効性が確認され、ベンツピレン除去効果および再現性の点からも本法が良好な手法であることが証明された。
【００４８】
・他成分分析結果
上記の通り、竹酢液中のベンツピレン除去法として、ODSシリカによる固相処理が有効であることが確認された。また、ベンツピレンに関しては、当初の目標である1ppt以下(検出限界以下)までの精製が達成された。
【００４９】
一方、本操作により除去される物質は、ベンツピレンのみではなく、他のタール成分や疎水成分、その他いくつかの極性化合物が考えられる。上記の可視的な評価結果から、竹酢液に特有の着色がODSシリカ処理によって、除去されていることが確認された。しかしながら、同じく上記の評価結果から、酸性度を示すpHの値は精製前後でほとんど変化していないことから、竹酢液中の抗菌作用の主成分として考えられる有機酸の除去は起こっていないことを考えられる。これらのベンツピレン以外の他成分を定性的に確認するために、ガスクロマトグラフィー−質量分析(GC-MS)により、市販竹酢液およびODSシリカ処理サンプルの分析を行い、含有成分の違いを評価した。GC-MSのシステム概略図は以下の通りである(図１４)。この手法では、移動相としてガスを用い、効率よく分離成分の質量数に応じた検出、定性を達成する。
【００５０】
また、評価に用いた分析条件、使用サンプルは以下の通りである。評価した市販品サンプルのうちもっとも多くの成分が混在すると考えられる、市販竹酢液サンプル２を用いて、各成分の同定を行った。また、下記に示すODSシリカ処理サンプルは、上記カラム法過程と同じサンプルであり、市販竹酢液サンプル５を用いた処理サンプルである。

分析条件
GC-MS装置 : Agilent 5973
Vent-free GC/MS adaptor使用
キャピラリーカラム : UA5-15M-0.25F (5%polydiphenylsiloxane)
(15m、 0.25mmi.d.、0.25micron)
サンプル注入量
: 1μL
インジェクター
: Split/split less injector-300℃、split
ratio: 1/30
GC/MS interface : 300℃
MSイオン源 : 250℃

試料
市販竹酢液サンプル２(未精製)
市販竹酢液サンプル３(未精製)
市販竹酢液サンプル４(未精製)
市販竹酢液サンプル５(未精製) (サンプル４の蒸留精製品として市販)
ODSシリカ精製サンプル(市販竹酢液サンプル５を使用)
【００５１】
図１５には、市販竹酢液サンプル２のGC-MSクロマトグラムを示した。溶出時間の違いにより、前半(A) と後半(B) をそれぞれ示す。また、化合物データベースより得られた各ピークの主要化合物名は表示の通りである。これらのクロマトグラムに示すとおり、市販品サンプルには極めて多くの有機酸、フェノール系化合物、炭化水素、アルコール、ケトン類等が含まれていることが分かる。一方、この条件では、ベンツピレンを含む多環芳香族類は全く検出されないことから、ベンツピレンは主成分に比べて極めて希薄であることが再確認できる。
【００５２】
上記クロマトグラムに示すとおり、市販品の竹酢液中には主成分として酢酸などの無毒性物質の他に、フェノール系化合物２、クレゾール系化合物、その他芳香族化合物類が高濃度で存在することが分かる。
【００５３】
これらのフェノール、クレゾール類は、ベンツピレンのような発がん誘発物質としての報告はされていないが、化学物質としての急性毒性値は、フェノールで約500mg/kgおなじくクレゾールでは350mg/kgとなっており、ベンツピレンのそれ(250mg/kg) とそれほど大きな差異がないと言える。その為、竹酢液の簡易精製では、可能な限り主成分中の毒性(可能性)物質群の除去が望ましいと予想される。
【００５４】
次に、上記市販竹酢液サンプル２を含む4種の市販竹酢液に関して、同様の分析を行い、その含有物の違いを評価した。各市販竹酢液サンプルのGC-MSクロマトグラムを図１６に示した。
【００５５】
それぞれのクロマトグラムの比較において、含有物質量に比例するピークシグナル強度(縦軸)のスケールを統一していることから、それぞれのクロマトグラムを比較することで、各竹酢液中の含有物質濃度が定性的に見ることができる。
【００５６】
それぞれを比較すると、市販竹酢液サンプル２において、最も多種の物質が高濃度で存在していることが分かる。さらに、他の竹酢液サンプル間の比較においても、含有物質の濃度が大きく異なっており、竹酢液製造方法の違いで含有物が劇的に変化することが示唆されている。
【００５７】
次に、市販竹酢液サンプル５については、上記のサンプルの説明通り、市販竹酢液サンプル４の蒸留精製品として、市販されている。そこで、これら2種のクロマトグラムを比較することで、蒸留の効果を見ることができる。これらの結果、蒸留品である５では、フルフラール、クレゾール、シリンゴールなどの芳香族化合物の他炭化水素類がほぼ除去されていることが分かつた。
【００５８】
上記の通り、GC-MSによる定性分析によって、特に、蒸留精製により竹酢液中の芳香族系化合物が除去される可能性が示された。一方、我々の行ったベンツピレンの分析結果からは、蒸留精製によってベンツピレン濃度が大きく減少はしているものの、依然として、ベンツピレンが検出できる程度で存在することが明らかとなった。さらに、我々の用いた簡易精製法としてのODSシリカによる固相処理の結果として、ベンツピレンを検出限界以下にまで低減できることを示した。
【００５９】
そこで、上記GC-MSの未処理サンプル分析に追加して、ODSシリカでの処理後のサンプルについても、同様にGC-MS分析を行った。用いた処理サンプルは、上記に示すとおり市販竹酢液サンプル５を同様の処理によって精製したサンプルである。
【００６０】
得られたクロマトグラムを図１７に示した。図には、市販竹酢液サンプル５ (A)の精製前とODSシリカによる処理後のクロマトグラム(B) を示している。また、クロマトグラム(B) 中には、縦軸(検出強度)を10倍に拡大したクロマトグラムも合わせて示した。
【００６１】
これらの結果から、市販竹酢液サンプル５に含まれるブチルアクトン、フェノール系、グアイアコール、シリンゴール等が完全に除去されていることが分かる。
【００６２】
一方、酢酸を主成分とするl分付近の非常に大きなピークはほとんど変化していないことから、ODSシリカ処理によって、ベンツピレンのみではなく、同じく毒性を有する芳香族系化合物も除去されていることが明らかとなった。
【００６３】
確認のために、精製後の竹酢液中に含まれる多環芳香族類を高感度GC-MSを用いて評価した。評価に用いたのは、市販竹酢液サンプル５の未精製サンプルとそのODSシリカ精製品(カラム法)である。詳細な分析の結果、未精製の竹酢液サンプル５では、上記蛍光分析と同じく、数十pptのベンツピレンが確認された。一方、ODSシリカ精製後のサンプルでは、ベンツピレンを含む主要な多環芳香族類は全く検出されなかった。これらの結果から、他の分析法においてもベンツピレン除去が証明され、ODSシリカを用いたカラム法による精製が効果的であることが支持された。
【００６４】
以上の通り、市販竹酢液中には非常に低濃度であるものの、発がん性物質であるベンツピレンの存在が、高感度液体クロマトグラフィー−蛍光検出によって確認された。
【００６５】
また、竹酢液中の低濃度ベンツピレンの除去方法として、ODSシリカを用いた固相処理法を種々の方法により評価した。その結果、ガラスカラム管内にODSシリカを充てんし、竹酢液サンプルを通液することで、ベンツピレン濃度を検出限界以下にまで低減できることが明らかとなった。
【００６６】
加えて、ODSシリカ処理により得られた竹酢液サンプルでは、未精製品に特有のタール成分に依存する着色がほぼ完全に除去されていることから、わずかに残存するタール成分も同様に除去されたと考えられる。一方で、精製前後の酸性度の結果からは、大きな変化は見られないことから、抗菌作用に重要と考えられる有機酸類の除去はほとんど無いと判断できる。
【００６７】
さらに、ガスクロマトグラフィーを用いた定性的な分析結果からは、市販品間でもその含有成分が大きく異なることが明らかとなり、同様に蒸留精製による効果も定性的に見ることができた。同じく、ODSシリカ処理効果の確認分析では、いくつかの芳香族系化合物の除去が確認され、ODSシリカ処理の有効性を支持する結果となった。
【００６８】
これらの総括より、本研究において取り扱ったODSシリカによる竹酢液の処理は、極低濃度ベンツピレン除去を含む精製法として有用であると結論づけられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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