(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出溶媒として水、エタノール、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、又はこれらの二種以上の混合溶媒を用いてパッションフルーツの種子から抽出して得られた、ピセアタンノールを含有する組成物を有効成分とすることを特徴とするメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
前記抽出溶媒が、熱水又はエタノール含有水である請求項１記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
前記抽出溶媒が、エタノール含有水である請求項１記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項４】
経口剤として用いられる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のメラニン生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パッションフルーツの種子抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤及び化粧料並びにメラニン生成抑制のための経口用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼けの予防、回復や、シミ、ソバカス等色素沈着を抑えることは美容術の重要な要素であり、肌の色素沈着の原因となるメラニンの合成を抑える技術に対する関心は高い。
【０００３】
一方、パッションフルーツは、パッシフローラ属トケイソウ科の植物であり、別名：クダモノトケイソウ(果物時計草)とよばれ、その実は甘酸っぱく果物として実をそのまま食したり、その果汁をジュースにして飲んだり、ゼリー、ケーキ等の飲食品に配合して、風味付けに用いられたりされている。
【０００４】
パッションフルーツ又はその類縁植物に由来する植物成分を美容のための有効成分とする技術に関しては、例えば、下記特許文献１には、パッシフローラ属植物抽出物には、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制させる作用効果のあることが記載されている。また、下記特許文献２には、トケイソウ、パッションフルーツなどのトケイソウ科植物の水蒸気蒸留水を含有することを特徴とする化粧料組成物が記載されている。
【特許文献１】特開２００１−４８７７３号公報
【特許文献２】特開２００１−２２６２１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
パッションフルーツの種子は硬く、ジュースなどにする場合には果実から取り除かれ、果実を種ごと飲食した場合であってもその外皮は硬く消化を受けにくいのでそのまま排泄されてしまう。このような背景のなか、従来、パッションフルーツの種子中の成分に着目した技術はなかった。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、パッションフルーツの種子を有効利用するとともに、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの合成を抑え、しかも肌に優しい植物由来の成分からなるメラニン生成抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、パッションフルーツの種子抽出物に、メラニン産生細胞によるメラニンの生成を抑制する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明のメラニン生成抑制剤は、パッションフルーツの種子抽出物を有効成分とすることを特徴とする。より具体的には、抽出溶媒として水、エタノール、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、又はこれらの二種以上の混合溶媒を用いてパッションフルーツの種子から抽出して得られた、ピセアタンノールを含有する組成物を有効成分とすることを特徴とする。本発明においては、前記パッションフルーツの種子抽出物が、熱水又はエタノール含有水で抽出されたものであることが好ましい。より具体的には、前記抽出溶媒が、熱水又はエタノール含有水であることが好ましい。また、パッションフルーツの種子抽出物由来のポリフェノールを有効成分とすることが好ましい。
【０００９】
一方、本発明のもう一つは、パッションフルーツの種子抽出物をその固形分換算で０．００１〜９９質量％含有することを特徴とする化粧料である。また、本発明の更にもう一つは、パッションフルーツの種子抽出物をその固形分換算で０．００１〜９９質量％含有することを特徴とするメラニン生成抑制のための経口用組成物である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のメラニン生成抑制剤によれば、日焼けや、シミ、ソバカス等、肌の色素沈着の原因となるメラニンの合成を抑えることができるので、化粧料の有効成分などとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いられるパッションフルーツの種子抽出物の調製方法は特に限定されが、例えば、種子を細断、破砕、又は磨砕等し、種々の溶媒を用いて抽出する方法があげられる。抽出温度は適宜設定することができる。また、上記種子は、抽出効率をよくするため、適宜、酸又はアルカリ分解、酵素分解等の化学的処理を施してから抽出することもできる。
【００１２】
抽出溶媒としては、水、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。これらの中で、熱水又はエタノール含有水は、後述するポリフェノール関連化合物を含む有効成分を効率よく抽出することができるので好ましい。
【００１３】
本発明に用いられるパッションフルーツの種子抽出物は、上記の方法で得られた抽出液を、そのまま又は濃縮して液体のまま用いてもよく、更に上記抽出液を凍結乾燥又は噴霧乾燥により粉末化して用いることもできる。抽出物中に含まれる不溶物は、適宜、濾過などで除くことができる。不溶物はさらに粉砕し、微細粒子状にしてもよい。
【００１４】
本発明に用いられるパッションフルーツの種子抽出物は、上記のようにして得られる一次抽出物をそのまま用いてもよいが、これをイオン交換、サイズ排除カラムクロマト法、ＨＰＬＣ法、ゲルろ過、膜分離等により、分画、精製して用いることもできる。特に、後述する実施例で示されるように、ポリフェノール関連化合物が有効成分であることが推測されることから、ＨＰＬＣ等のその通常の方法でその有効活性成分を高度に精製し、これを用いることができる。
【００１５】
本発明のメラニン生成抑制剤の有効成分とされる種子抽出物は、パッションフルーツの食経験からも裏付けられるように、安全性には問題がないものである。
【００１６】
本発明のメラニン生成抑制剤の使用形態としては、日焼けの予防、回復や、シミ、ソバカス等色素沈着の予防、改善したい肌の部位に塗布することができる。あるいは、経口的に摂取して、体の中から作用させるようにしてもよい。
【００１７】
本発明のメラニン生成抑制剤の有効投与量は、皮膚に塗布する場合には、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物の固形物換算で、単位面積あたり一回およそ0.025〜50ｍｇ／ｃｍ２である。また、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物から有効活性成分を高度に精製する場合には、有効活性成分の質量換算で、単位面積あたり一回およそ0.005〜10ｍｇ／ｃｍ２である。経口摂取する場合には、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物の固形物換算で、成人１日当りおよそ2.5〜5,000ｍｇである。また、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物から有効活性成分を高度に精製する場合には、有効活性成分の質量換算で、成人１日当りおよそ0.5〜1,000ｍｇである。
【００１８】
本発明のメラニン生成抑制剤は、液剤、軟膏剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ゼリー状剤等に製剤化することができる。これらの製剤化は常法に従って行なえばよい。
【００１９】
本発明のメラニン生成抑制剤は、メラニン生成抑制のための経口用組成物とすることができ、皮膚に適用される化粧料、医薬部外品等の製品形態とすることもできる、また、本発明のメラニン生成抑制剤を、各種飲食品に添加して、メラニン生成抑制効果が期待できる飲食品とすることもできる。各製品形態とした場合におけるパッションフルーツの種子抽出物の含有量は、その製品が使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよく、特に制限されるものではないが、通常、固形状の製品の場合には、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物の固形物換算で、0.001〜99質量％含有させることが好ましく、0.001〜20質量％含有させることがより好ましい。また、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物から有効活性成分を高度に精製する場合には、その有効活性成分の質量換算で、0.0002〜20質量％含有させることが好ましく、0.0002〜4質量％含有させることがより好ましい。そして、液状又はゼリー状の製品の場合には、上記パッションフルーツの種子の一次抽出物の固形物換算で、0.001〜99質量％含有させることが好ましく、0.001〜20質量％含有させることがより好ましい。また、液状又はゼリー状の製品の場合であって上記パッションフルーツの種子の一次抽出物から有効活性成分を高度に精製する場合には、その有効活性成分の質量換算で、0.0002〜20質量％含有させることが好ましく、0.0002〜4質量％含有させることがより好ましい。
【実施例】
【００２０】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２１】
＜試験例１＞  
パッションフルーツの部位ごとに抽出物を調製し、そのメラニン生成抑制効果を検討した。
【００２２】
[サンプル調整方法]  
パッションフルーツは果皮・果肉・種子の３つの部位に分け、それぞれをフリーズドライして粉砕し、各部位を８０％エタノールで抽出した。遠心後その上清をとりエバポレートで濃縮後、フリーズドライして粉末にした。この粉末を水に溶かして抽出物とした。
【００２３】
[メラニンアッセイ方法]  
１２−ウェルプレートにヒトメラノーマ細胞（MNT-1）を7×104/well播種し、DMEM（10％FBS）培地で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸引除去し、固形分濃度換算で0〜1000μg/mlの抽出物濃度となるように上記抽出物をDMEM（10％FBS）に添加して調製した培地を、各１ウェル中に２ｍｌずつ添加した。３日間培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗い、トリプシンで細胞を剥離した。細胞は1500rpm、4℃で５分遠心分離し、上清を吸引除去し、ＰＢＳで洗い、さらに遠心を行いこれを２回繰り返した。細胞のペレットに１ＮのNaOHを加え、メラニンを415nmで測定した。そしてあらかじめメラニンの標品から求められた検量線に基づいて、細胞数あたりのメラニン生成量を求めた。図１には、抽出物を添加しない対照（コントロール）に対するメラニン生成量の比を示す。
【００２４】
図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、パッションフルーツの果皮又は果肉からの抽出物においては、最大濃度1000μg/mlでも、ヒトメラノーマ細胞（MNT-1）からのメラニン生成を抑制する効果は認められなかった。これに対し、図１（ｃ）に示すように、パッションフルーツの種子抽出物には、メラニン生成抑制効果が認められた。なお、上記の試験における抽出物の濃度範囲で、ヒトメラノーマ細胞（MNT-1）に対する細胞毒性がないことは別途確認した。
【００２５】
なお、上記の試験はヒト由来のメラノーマ細胞を用いたが、当該研究分野で汎用されているマウス由来のメラノーマ細胞B16を用いて同様の試験を行うことができる。
【００２６】
＜試験例２＞  
パッションフルーツの種子抽出物の活性成分を探るため、以下のような実験を行った。
【００２７】
すなわち、活性のあった種子抽出物を、ポリフェノールを吸着する樹脂であるポリビニルポリピロリドン（PVPP：Polyvinylpolypyrrolidone）を水で膨潤させたものとともに３０分間攪拌し、15000rpmで１５分遠心分離し、上清を種子抽出物のPVPP処理サンプルとした。なお、サンプル中のポリフェノール濃度をFolin-Ciocalteu法で測定した結果、このPVPP処理によりポリフェノール濃度は９５％以上低下していた。したがって、PVPP処理により大部分のポリフェノールは除かれたことが確認された。
【００２８】
図２に示すように、PVPP処理を行った結果、種子抽出物にメラニン生成抑制効果が見られなくなった。したがって、種子抽出物中のポリフェノールが主な活性成分であることが示唆された。
【００２９】
＜試験例３＞  
パッションフルーツの種子抽出物の活性成分の同定を、以下のようにして行った。
【００３０】
まず、試験例１と同様にして調製されたパッションフルーツの種子抽出物（４ｍｌ）を、ODSカラムを用いたＨＰＬＣによって分画した。
【００３１】
ＨＰＬＣ条件は、以下のとおりとした。
・  カラム：Mightysil RP-18 GP250-10  径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・  カラム温度：40℃
・  溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・  ＵＶ検出：280nm
ODSカラムからの溶出フラクションを図３に示すように、フラクション１、フラクション２、フラクション３の３つに分け、得られたフラクションの溶媒をエバポレート後に凍結乾燥し、水によってもとの粗抽出物の体積に戻した。そして、試験例１、２と同様にして、ヒトメラノーマ細胞（MNT-1）によるメラニン生成に与える影響を調べた。
【００３２】
具体的には、１２−ウェルプレートにヒトメラノーマ細胞（MNT-1）を7×104/well播種し、DMEM（10％FBS）培地で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸引除去し、もとの粗抽出液の固形分濃度換算で50μg/ml相当の濃度となるように、上記フラクションからの溶出フラクション組成物をDMEM（10％FBS）に添加して培地を調製し、各１ウェル中に２ｍｌずつ添加した。３日間培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗い、トリプシンで細胞を剥離し、試験例１と同様にして、細胞数あたりのメラニン生成量を求めた。図４には、抽出物を添加しない対照（コントロール）に対するメラニン生成量の比を示す。
【００３３】
図４に明らかなように、フラクション１とフラクション３からの溶出フラクション組成物にはメラニン生成抑制効果は認められなかった。一方、フラクション２からの溶出フラクション組成物には粗抽出物とほぼ同等の活性が認められた。したがって、上記ＨＰＬＣにおいて保持時間２０．６分に溶出する成分が、パッションフルーツの種子抽出物によるメラニン生成抑制効果の活性成分であると考えられた。
【００３４】
そこで、上記保持時間２０．６分に溶出する成分について、ＨＰＬＣ／質量分析装置（サーモエレクトロン株式会社製、装置名「Thermo-LCQ-MS/MS」）を用いて、そのマススペクトルを測定した（図５Ａ）。なお、ポジティブ、ネガティブの両イオンモードで検討したがネガティブに良好なイオンが見出されたので、そのデータを用いた。その結果、主要シグナルｍ／ｚ２４３は、（Ｍ−Ｈ）−であり、その他のピークｍ／ｚ２７９は（Ｍ＋２Ｈ２Ｏ−Ｈ）−と帰属され、ｍ／ｚ４８７は（Ｍ×２−Ｈ）−と帰属できた。したがって、分子量が２４４と決定できた。また、ＵＶスペクトルを取ると、λｍａｘとして、220nm、304nm、322nmが観察された（図５Ｂ）。
【００３５】
これらのマススペクトルやＵＶスペクトルの結果は、ピーナッツ果皮に含まれるポリフェノールであるレスベラトロール(Resveratrol、分子量228)に類似していた（図６Ａ，Ｂ参照）。また、上記ＨＰＬＣ条件でのレスベラトロールの保持時間が２４．５分であり、未知化合物はレスベラトロールよりも逆相カラムでの保持時間が小さいことから、水酸基１個分の分子量が大きい、下記式（１）で表されるピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)であることが推定された。
【００３６】
【化１】
0005430891.tif 000002
そこで、ピセアタンノールの純化合物（シグマ社製）について、上記と同じ条件でのＨＰＬＣ分析を行ない（図７）、さらにマススペクトルやＵＶスペクトルを得た（図８Ａ，Ｂ）。その結果、ＨＰＬＣにおける保持時間や、マススペクトルやＵＶスペクトルの帰属が全て一致した。よって、パッションフルーツの種子抽出物の活性成分が、ピセアタンノールであることが明らかとなった。
【００３７】
＜試験例４＞  
試験例１と同様にして調製されたパッションフルーツの種子抽出物について、そのピセアタンノール含量を、上記ＨＰＬＣ分析によるピーク面積を利用した標準濃度の検量線から求めた。その含有量は約１．９μｇ／１００μｇ粗抽出物（１．９質量％）であった。また、パッションフルーツの種子抽出物中の含有量から原料とされたパッションフルーツの種子のフリーズドライ乾燥物中の含有量を算出すると、約１ｍｇ／ｇであった。そこで、ピセアタンノール換算で０、４．５、９、１８μＭの濃度となるように培養液に添加した以外は、試験例３と同様にして、ヒトメラノーマ細胞（MNT-1）によるメラニン生成に与える影響を調べた。また、ピセアタンノールの純化合物についても同様にメラニン生成に与える影響を調べた。その結果を図９に示す。
【００３８】
図９に明らかなように、パッションフルーツの種子抽出物と、ピセアタンノールの純化合物の両者は、ヒトメラノーマ細胞（MNT-1）によるメラニン生成抑制効果ついて、ピセアタンノール換算で０〜１８μＭの濃度範囲において、ほぼ同等の濃度依存性を示した。よって、パッションフルーツの種子抽出物の活性成分がピセアタンノールであることが明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】果皮（ａ）、果肉（ｂ）及び種子（ｃ）からの抽出物のメラニン生成抑制効果を示す図表である。
【図２】種子抽出物及びポリフェノールを除いた種子抽出物のメラニン生成抑制効果を示す図表である。
【図３】種子抽出物のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す図表である。
【図４】ＨＰＬＣで分画された種子抽出物の各溶出フラクション組成物によるメラニン生成抑制効果を示す図表である。
【図５】種子抽出物中の未知化合物のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図６】レスベラトロール(Resveratrol、分子量228)のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図７】ピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す図表である。
【図８】ピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図９】パッションフルーツの種子抽出物によるメラニン生成抑制効果とピセアタンノールの純化合物によるメラニン生成抑制効果とを比較した図表である。
【図１】
0005430891.tif 000003
【図２】
0005430891.tif 000004
【図３】
0005430891.tif 000005
【図４】
0005430891.tif 000006
【図５】
0005430891.tif 000007
【図６】
0005430891.tif 000008
【図７】
0005430891.tif 000009
【図８】
0005430891.tif 000010
【図９】
0005430891.tif 000011