(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化３】
0005465542.tif 000215
（Ａｃはアセチル基である）
を含む、糖脂質含有リポソーム。
【請求項２】
リポソーム構成用脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、該糖脂質、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をモル比３５：４０：５：１５：５で含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記リポソームの６８０ｎｍでの吸光度が、０．５〜３．０である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記リポソームの脂質量が、０．５〜５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記リポソームがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、その量が、０．１〜１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記リポソームの平均粒子径が、５０〜３００ｎｍである、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記リポソームのＺ電位が、−３０ｍＶ〜−１２０ｍＶである、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記リポソームが、所望の物質を内包する、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記所望の物質が、ｃｙ５．５、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ルシフェラーゼ、抗体、ｔＰＡ、β−ガラクトシダーゼ、アルブミン、ボツリヌス毒素、ジフテリアトキシン、メチルプレゾニゾロン、リン酸プレゾニゾロン、ペプチド、金コロイド、Ｇｄ錯体、Ｆｅ錯体、シスプラチン、プラバスタチン、ヘパリン、塩酸ファスジル、クロドロン酸、水溶性ヨード、キチン、キトサン、プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡｉからなる群より選択される、請求項８に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記リポソームが、標的認識プローブを該リポソームの表面に含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記標的認識プローブが、糖鎖、抗体、抗原、ペプチド、核酸およびヒアルロン酸からなる群より選択される、請求項１０に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記糖鎖の付加量が、糖鎖結合密度０．５〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記抗体の付加量が、０．１〜５０μｇ／ｍＬである、請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記糖脂質が、天然由来の糖脂質に付随する成分を含まない、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
糖脂質含有リポソームを製造する方法であって、以下：
Ａ）
【化３】
0005465542.tif 000216
（Ａｃはアセチル基である）
を含む糖脂質を提供する工程；および
Ｂ）提供された該糖脂質とリポソーム原料とを混合し、リポソーム形成される条件に供する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成した糖脂質を用いたリポソームおよびその製造法に関する。特に、合成ＧＭ３および合成ＧＭ４を用いたリポソームおよびその合成法に関する。【０００２】
本発明はまた、植物型セラミド部分および糖鎖部分を含む糖脂質を用いたリポソームおよびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）として、標的部位を認識するプローブ（例えば、糖鎖、抗体など）をリポソーム膜面に結合させたリポソームが開発されている（特許文献１〜４および非特許文献１）。このリポソームの原料として、ブタなどの脳から抽出した天然由来の糖脂質が一般的によく用いられている。しかし、天然由来の糖脂質抽出物は、単一の糖脂質から構成されているのではなく、種々の糖脂質および脳に由来する未知・未同定物質の混入しているので、糖脂質成分の比率、純度などのロット間較差が大きい。【０００４】
例えば、糖鎖を結合させたリポソームを作製するときには、リポソーム膜面に埋め込まれた糖脂質上に架橋スペーサーを介して糖鎖を結合させている。原料として同じ量の糖鎖を使用しても、糖脂質のロット間較差によって糖脂質成分が変化するのに依存して、調製された糖鎖結合リポソームの膜面に結合した糖鎖密度が変動し、その結果、集積性に差が生じる。したがって、天然由来の糖脂質を用いたリポソーム（天然由来糖脂質含有リポソーム）を用いて糖鎖結合リポソームを調製する場合は、糖脂質のロット毎に糖鎖量を調製し、リポソーム膜面上の糖鎖密度が最大の集積性を示す最適な範囲に入るように調製しなければならなかった。【０００５】
また、天然由来の糖脂質には、脳に由来する未知・未同定物質が混入している可能性があるので、ヒトにおいて使用するのに適していない。
【特許文献１】国際公開第２００７／０９１６６１号パンフレット
【特許文献２】特許３９２４６０６号
【特許文献３】特許３８８２０３４号
【特許文献４】国際公開第２００７／０１８２７２号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｉｒａｉ，Ｍ．，Ｍｉｎｅｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｎ．，Ｏｉｅ，Ｋ．，Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，２００７．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｐｏｓｏｍｅ  ｗｉｔｈ  ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏ−ｉｍａｇｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．３５３，５５３−５５８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、バイオテクノロジー、特にＤＤＳ、分子イメージングにおいて利用できる新規なリポソームを提供することにある。【０００７】
本発明の別の課題は、標的部位認識プローブを均質にリポソーム表面に結合させるのに有用なリポソームを提供し、集積性のばらつきを解決する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、糖脂質として合成した糖脂質（例えば、ＧＭ３、ＧＭ４）を採用したことにより、標的部位認識プローブを均質にリポソームの表面に結合させ、天然由来の糖脂質のロット間較差による集積性のばらつきを解決することができる方法を見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。【０００９】
また、本発明者等は、予想外にも、糖脂質含有リポソームが、従来の天然由来糖脂質含有リポソームと少なくとも同一の、むしろ改善された物性を示し、天然由来糖脂質含有リポソームの代替として使用できることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。【００１０】
従来、牛の脳などから抽出した糖脂質を用いていた。これらに含まれる糖脂質は均一ではなく、例えば、シアル酸を１残基有するＧＭシリーズ、２残基有するＧＤシリーズ、３残基有するＧＴシリーズ、４残基有するＧＱシリーズのガングリオシドなどの混合物である。また、天然由来の糖脂質では、混合比率もロットにより差が生じる。本発明では、比較的構造の単純なＧＭ４やＧＭ３を化学合成し、均一な糖脂質を用いてもリポソーム作製できることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。【００１１】
本発明はまた、植物型セラミド部分を含む糖脂質を用いることにより、リポソームの標的指向性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
糖脂質含有リポソームであって、
該糖脂質は、合成糖脂質を含み、
天然由来の糖脂質に付随する成分を含まない、リポソーム。
（項目２）
前記糖脂質が、ＧＭ３およびＧＭ４からなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３）
前記リポソームの６８０ｎｍでの吸光度が、０．５〜３．０である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目４）
前記リポソームの脂質量が、０．５〜５ｍｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目５）
前記リポソームがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、その量が、０．１〜１ｍｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目６）
前記リポソームの平均粒子径が、５０〜３００ｎｍである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目７）
前記リポソームのＺ電位が、−３０ｍＶ〜−１２０ｍＶである、上記項目に記載のリポソーム
（項目８ａ）
前記リポソームが、所望の物質を内包する、上記項目１に記載のリポソーム。
（項目８ｂ）
前記所望の物質が、ｃｙ５．５、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ルシフェラーゼ、抗体、ｔＰＡ、β−ガラクトシダーゼ、アルブミン、ボツリヌス毒素、ジフテリアトキシン、メチルプレゾニゾロン、リン酸プレゾニゾロン、ペプチド、金コロイド、Ｇｄ錯体、Ｆｅ錯体、シスプラチン、プラバスタチン、ヘパリン、塩酸ファスジル、クロドロン酸、水溶性ヨード、キチン、キトサン、プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡｉからなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９）
前記リポソームが、標的認識プローブを該リポソームの表面に含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目１０）
前記標的認識プローブが、糖鎖、抗体、抗原、ペプチド、核酸およびヒアルロン酸からなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目１１）
前記糖鎖の付加量が、糖鎖結合密度０．５〜５００μｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目１２）
前記抗体の付加量が、０．１〜５０μｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目１３）
糖脂質含有リポソームを製造する方法であって、以下：
Ａ）合成糖脂質を提供する工程；および
Ｂ）提供された該合成糖脂質とリポソーム原料とを混合し、リポソーム形成される条件に供する工程
を包含する、方法。
（項目１４）
前記Ａ）工程が、以下の工程：
（ａ）保護された糖と脂質アミド保護体とを、該保護された糖と該脂質アミド保護体とが結合する条件下で反応させて、糖−脂質アミドアクセプター前駆体を生成させる工程；
（ｂ）該糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件で反応させて、糖−脂質アミドアクセプターを生成させる工程；
（ｃ）該糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーとを、該糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件下で反応させて、保護された糖脂質を生成させる工程；および
（ｄ）該保護された糖脂質を、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下で脱保護反応をさせて、糖脂質を生成させる工程
を包含する工程である、上記項目に記載の方法。
（項目１５）
前記保護された糖が、【００１３】
【化６】
0005465542.tif 000002
【００１４】
からなる群より選択される糖の保護体であり、ここで、
ＰＲＯは、独立して、ベンゾイル（Ｂｚ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、ＭＰＭ（ｐ−メトシキベンジル)、メトキシフェニル（ＭＰ)、アセチル、ベンジル、およびメチルからなる群より選択される保護基であり、
Ｌは、独立して、−ＳＰｈ、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ、−ＯＰＯ（ＯＰｈ）２（ここで、Ｐｈはフェニルである。）、−ＯＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２およびトリクロロアセトイミデートからなる群より選択される脱離基である、上記項目に記載の方法。
（項目１６）
前記脂質アミド保護体が、以下の式：【００１５】
【化７】
0005465542.tif 000003
【００１６】
ここで、該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基またはアルケニル基から選択され；
該Ｒ３は、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリチル（Ｔｒ）、イソプロピリデンケタールおよびメトキシベンジリデンアセタールからなる群より選択され；
該Ｒ４は、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチルおよびピバロイルからなる群より選択される保護基である、
上記項目に記載の方法。
（項目１７）
前記脂質アミド保護体が、【００１７】
【化８】
0005465542.tif 000004
【００１８】
からなる群より選択され；
前記糖−脂質アミドアクセプター前駆体が、【００１９】
【化９】
0005465542.tif 000005
【００２０】
であり、前記糖−脂質アミドアクセプターが、【００２１】
【化１０】
0005465542.tif 000006
【００２２】
であり、ここで
該Ｒ１が、ｐ−メトキシベンジル(ＭＰＭ)、メトキシフェニル(ＭＰ)、アリルであり；
該Ｒ２が、ＭＰＭ、Ｂｚ、ＭＰ、アリルであり；
該Ｒ３は、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳ、Ｔｒ、イソプロピリデンケタールおよびメトキシベンジリデンアセタールからなる群より選択され；
該Ｒ４および該Ｒ５は、独立して、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチルおよびピバロイルからなる群より選択される保護基であり、Ｐｈはフェニルである、
上記項目に記載の方法。
（項目１８）
前記保護された糖と脂質アミド保護体とが結合する条件は、アルコールとカルボン酸とが結合する条件である、上記項目に記載の方法。
（項目１９）
前記工程（ａ）は、溶媒中において試薬の存在下で所定の反応温度および反応時間、前記保護された糖鎖と、前記脂質アミドとを混合し、反応させることを包含し、
該反応温度が、室温以上であり；
該溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＣＨ２Ｃｌ２、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびそれらの組合せからなる群より選択され；
該試薬が、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）、アゾジカルボン酸ジエチルエステル（ＤＥＡＤ）、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）、および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびそれらの組合せからなる群より選択され；および
該反応時間が、２時間〜４時間である、
上記項目に記載の方法。
（項目２０）
前記試薬が、ＰＰｈ３およびＤＥＡＤであり、前記溶媒がＴＨＦであり、前記反応温度が９０℃以上である、上記項目に記載の方法。
（項目２１）
前記試薬が、ＷＳＣあるいは２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、Ｅｔ３ＮおよびＤＭＡＰであり、前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり、前記反応温度が、３０〜６０℃である、上記項目に記載の方法。
（項目２２）
前記試薬が、ＷＳＣであり、前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり、前記反応温度が室温である、上記項目に記載の方法。
（項目２３）
前記反応時間が、３時間である、上記項目に記載の方法。
（項目２４）
前記溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であり、
前記試薬がトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３：３．０当量）およびＤＥＡＤ（３．０当量）であり、該当量は、前記保護された糖鎖に対する当量であり、
前記反応温度が、９０℃であり、前記反応は還流下で実施される、
上記項目に記載の方法。
（項目２５）
前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり、
前記試薬が、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ：３．０等量）であり、該当量は、前記保護された糖鎖に対する当量であり、
前記温度が、室温である、
上記項目に記載の方法。
（項目２６）
前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり、
前記試薬が、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド（１．１等量）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ：１．５等量）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：３．０等量）であり、該当量は、前記保護された糖鎖に対する当量であり、
前記温度が、室温である、
上記項目に記載の方法。
（項目２７）
前記工程（ａ）は、前記糖および前記脂質アミド保護体に、さらにスペーサー前駆体を加えることにより、前記脂質アミド保護体を、スペーサーを介して該糖に結合させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２８）
前記スペーサーと、前記糖または前記脂質アミド保護体とが予め結合されている、上記項目に記載の方法。
（項目２９）
前記脂質アミド保護体を、該脂質アミド保護体の１位水酸基が脱保護される条件下で反応させて、該１位水酸基を脱保護する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目３０）
前記スペーサー前駆体がコハク酸であり、該コハク酸が前記脂質アミド保護体のＲ３に結合する場合、
Ｒ３は、イソプロピリデンケタールまたはメトキシベンジリデンアセタールであり、Ｒ４は、【００２３】
【化１１】
0005465542.tif 000007
【００２４】
（Ａｃ）または【００２５】
【化１２】
0005465542.tif 000008
【００２６】
（Ｂｘ）であり、そして
Ｒ５は、ＡｃまたはＢｘである、上記項目に記載の方法。
（項目３１）
前記スペーサー前駆体がコハク酸であり、該コハク酸が前記脂質アミド保護体のＲ４に結合する場合、
Ｒ３は、トリチル（Ｔｒ）、ＴＢＤＰＳおよびＴＢＤＭＳからなる群より選択され、
Ｒ４は、スクシニル、マロニル、オキサリル、カルボニル、グルタリルおよびフタロイル、からなる群より選択され、そして
Ｒ５は、アセチルまたはベンゾイルである、
上記項目に記載の方法。
（項目３２）
前記スペーサー前駆体がコハク酸であり、該コハク酸が前記脂質アミド保護体のＲ５に結合する場合、
Ｒ３は、Ｔｒ、ＴＢＤＰＳおよびＴＢＤＭＳからなる群より選択され、
Ｒ４は、スクシニル、マロニル、オキサリル、カルボニル、グルタリルおよびフタロイル、からなる群より選択され、そして
Ｒ５は、アセチルまたはベンゾイルである、
上記項目に記載の方法。
（項目３３）
前記オリゴ糖の還元末端側の糖残基が、前記脂質アミド保護体とスペーサーを介して結合する、上記項目に記載の方法。
（項目３４）
前記工程（ｂ）は、前記分子内縮合反応を活性化させるための活性化剤の存在下で行われ、該活性化剤は、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目３５）
前記工程（ｂ）は、
−８０℃〜室温の反応温度にて；
ＣＨ２Ｃｌ２、ジエチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタンおよびそれらの組合せからなる群より選択される溶媒中で；
Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）およびそれらの組合せからなる群より選択されるの試薬の存在下で；および
１〜４８時間の反応時間にわたり行われる、
上記項目に記載の方法。
（項目３６）
前記反応温度が、−２０〜０℃である、上記項目に記載の方法。
（項目３７）
前記溶媒が、ジクロロメタンである、上記項目に記載の方法。
（項目３８）
前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）である、上記項目に記載の方法。
（項目３９）
前記反応時間が、１時間〜５時間である、上記項目に記載の方法。
（項目４０）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、ＴＭＳＯＴｆおよびモレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）を試薬として用いて、１．５時間の反応時間、０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４１）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）を試薬として用いて、５時間の反応時間、−４０℃で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４２）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）を試薬として用いて、３６時間の反応時間、初めは−８０℃で、次に−６０℃で、次に−４０℃で、次に０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４３）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）を試薬として用いて、４８時間の反応時間、初めは−４０℃で、次に０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４４）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）を試薬として用いて、１．５時間の反応時間、−０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４５）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）を試薬として用いて、３時間の反応時間、−２０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４６）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ジエチルエーテルを用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）を試薬として用いて、２５時間の反応時間、初めは０℃で、次に、室温の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４７）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）を用いて、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）およびモレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）を試薬として用いて、１時間の反応時間、０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４８）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）を試薬として用いて、５時間の反応時間、０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目４９）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびモレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）を試薬として用いて、１．５時間の反応時間、−２０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目５０）
前記工程（ｂ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）およびモレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）を試薬として用いて、２時間の反応時間、０℃で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目５１）
前記分子内縮合反応が、グリコシル化である、上記項目に記載の方法。
（項目５２）
前記工程（ｃ）は、
２．５当量より多くのアクセプターに対するドナーの当量にて；−４０〜０℃の反応温度にて；ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒中で；トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）試薬の存在下で、１〜４８時間の反応時間反応をさせることを包含する、
上記項目に記載の方法。
（項目５３）
前記アクセプターに対するドナーの当量が２．５当量であり；
前記反応温度が、０℃であり；
前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；
前記試薬が、ＴＭＳＯＴｆであり；および
前期反応時間が、７時間である、
上記項目に記載の方法。
（項目５４）
前記保護された糖鎖ドナーが、【００２７】
【化１３】
0005465542.tif 000009
【００２８】
−ＳＰｈ、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ、−ＯＰＯ（ＯＰｈ）２（ここで、Ｐｈはフェニルである。）および−ＯＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目５５）
前記工程（ｄ）は、
ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒中で；
トリフルオロ酢酸の試薬の存在下で；
室温の反応温度にて；および
２〜１２時間の反応時間にわたり行われる、
上記項目に記載の方法。
（項目５６）
前記反応時間が、２時間である、上記項目に記載の方法。
（項目５７）
（ｅ）前記工程（ｄ）の生成物を、アシル系保護基が脱保護する条件下で反応させ、脱保護する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目５８）
前記（ｅ）工程は、
メタノール（ＣＨ３ＯＨ）または水（Ｈ２Ｏ）の溶媒中で；
ナトリウムメトキシド（ＮａＯＣＨ３）またはＫＯＨの試薬の存在下で；
室温〜１００℃の反応温度にて；および
１時間〜１週間の反応時間にわたり行われる、
上記項目に記載の方法。
（項目５９）
前記溶媒が、メタノール（ＣＨ３ＯＨ）であり；
前記試薬が、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＣＨ３）であり；
前記反応温度が、室温であり；および
前記反応時間が、１２時間である、
上記項目に記載の方法。
（項目６０）【００２９】
【化１４】
0005465542.tif 000010
【００３０】
を生成させる方法であって、該方法は、アクセプター化合物【００３１】
【化１５】
0005465542.tif 000011
【００３２】
とドナー化合物【００３３】
【化１６】
0005465542.tif 000012
【００３４】
とを、該アクセプター化合物と該ドナー化合物とが結合する条件下で反応させる工程（Ａ）、
を包含し、ここで、
Ｒ１は、ＡｃまたはＨであり；
Ｒ２は、Ａｃまたは２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）【００３５】
【化１７】
0005465542.tif 000013
【００３６】
であり；
ＳＰｈは、【００３７】
【化１８】
0005465542.tif 000014
【００３８】
であり；
ＭＰは、【００３９】
【化１９】
0005465542.tif 000015
【００４０】
であり；
ＳＥは、【００４１】
【化２０】
0005465542.tif 000016
【００４２】
であり；
Ａcは、【００４３】
【化２１】
0005465542.tif 000017
【００４４】
であり；
Ｂｚは、【００４５】
【化２２】
0005465542.tif 000018
【００４６】
であり、
Ｂｎは、【００４７】
【化２３】
0005465542.tif 000019
【００４８】
であり；
Ｍｅは、メチルである、方法。
（項目６１）
前記工程（Ａ）は、以下：
−４０℃〜室温の反応温度にて；
ＣＨ３ＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２、ジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタンおよびそれらの組合せの溶媒中で；
Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）およびそれらの組合せの触媒の存在下で；および
１時間〜３日間の反応時間にわたり行われる、
上記項目に記載の方法。
（項目６２）
前記工程（Ａ）は、以下：
−５０℃〜室温の反応温度にて；
ＣＨ３ＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２、ジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタンおよびそれらの組合せの溶媒中で；
Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）およびそれらの組合せの触媒の存在下で；および
１時間〜３日間の反応時間にわたり行われる、
上記項目に記載の方法。
（項目６３）
前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目６４）
前記溶媒が、ＣＨ３ＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２またはＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液である、上記項目に記載の方法。
（項目６５）
前記反応温度が、−３０℃〜０℃である、上記項目に記載の方法。
（項目６６）
前記反応時間が、１時間〜１日間である、上記項目に記載の方法。
（項目６７）
前記工程（Ａ）は、
初めに溶媒としてＣＨ３ＣＮを、次にＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）を触媒として用いて、２日間の反応時間、初めは−３０℃で、次に室温の反応温度にて反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目６８）
前記工程（Ａ）は、
溶媒として、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびＴＭＳＯＴｆを触媒として用いて、３日間の反応時間、初めは−３０℃で、次に室温の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目６９）
前記工程（Ａ）は、
溶媒として、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）を触媒として用いて、２日間の反応時間、初めは−３０℃で、次に０℃の反応温度で反応させることを包含する、上記項目に記載の方法。
（項目７０）
前記工程（Ａ）は、
溶媒として、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）を触媒として用いて、３日間の反応時間、−３０℃の反応温度で反応させることを包含する、
上記項目に記載の方法。
（項目７１）
前記工程（Ａ）は、
溶媒として、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）を触媒として用いて、１日間の反応時間、−３０℃の反応温度で反応させることを包含する、
上記項目に記載の方法。
（項目７２）
前記工程（Ａ）は、
溶媒として、プロピオニトリルとＣＨ２Ｃｌ２との混合液を用いて、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）を触媒として用いて、６時間の反応時間、−５０℃の反応温度で反応させることを包含する、
上記項目に記載の方法。
（項目７３）
以下の式：【００４９】
【化２４】
0005465542.tif 000020
【００５０】
または【００５１】
【化２５】
0005465542.tif 000021
【００５２】
で示される化合物。
（項目７４）アミノ基がトリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）で保護されたアミノ糖と、メトキシフェニル（ＭＰ）で保護された糖とを、該Ｔｒｏｃで保護されたアミノ糖と該ＭＰで保護された糖とが結合する条件下で反応させる工程を包含する、オリゴ糖を合成するための方法。
（項目７５）前記アミノ糖が、該アミノ糖と前記ＭＰで保護された糖とが結合するときに脱離する脱離基Ｌを有する、上記項目に記載の方法。
（項目７６）前記脱離基Ｌが、−ＳＰｈ、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ、−ＯＰＯ（ＯＰｈ）２（ここで、Ｐｈはフェニルである。）および−ＯＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目７７）前記Ｔｒｏｃで保護されたアミノ糖が、以下【００５３】
【化２６】
0005465542.tif 000022
【００５４】
であり、
Ｐｒｏは、独立して、アセチル（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、ＭＰＭ（ｐ−メトシキベンジル)およびメトキシフェニル（ＭＰ)からなる群より選択される保護基であり、
Ｒ１は、アルキルである、上記項目に記載の方法。
（項目７８）前記ＭＰで保護された糖が、以下【００５５】
【化２７】
0005465542.tif 000023
【００５６】
からなる群より選択され、
Ｐｒｏは、独立して、アセチル（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、ＭＰＭ（ｐ−メトシキベンジル)およびメトキシフェニル（ＭＰ)からなる群より選択される保護基である、
上記項目に記載の方法。
（項目７９）前記Ｔｒｏｃ基を、Ｚｎ（Ｃｕ）存在下で脱保護する工程を包含する、項上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）以下の構造：【００５７】
【化２８】
0005465542.tif 000024
【００５８】
からなる群より選択される構造を有する、化合物。
（項目８１）以下の式：【００５９】
【化２９】
0005465542.tif 000025
【００６０】
で示される化合物であって、ここで、
該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基およびアルケニル基から選択され；
該Ｒ４は、ベンゾイル、アセチルおよびピバロイルからなる群より選択される保護基である、化合物。
（項目８２）以下の式：【００６１】
【化３０】
0005465542.tif 000026
【００６２】
で示される化合物であって、ここで
該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基およびアルケニル基から選択され；
該Ｒ４は、ベンゾイル、アセチルおよびピバロイルからなる群より選択される保護基である、化合物。
（項目８３）
糖脂質含有リポソームであって、
該糖脂質は、植物型セラミド部分および糖鎖部分を含む、リポソーム。
（項目８４）
前記植物型セラミド部分は、【００６３】
【化３１】
0005465542.tif 000027
【００６４】
である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目８５）
前記糖鎖部分が、【００６５】
【化３２】
0005465542.tif 000028
【００６６】
である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目８６）
糖脂質含有リポソームであって、
該糖脂質が、【００６７】
【化３３】
0005465542.tif 000029
【００６８】
である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目８７）
前記糖脂質が【００６９】
【化３４】
0005465542.tif 000030
【００７０】
を有し、
該糖脂質含有リポソームは、リポソーム構成用脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、該糖脂質、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をモル比３５：４０：５：１５：５で含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目８８）
前記リポソームの６８０ｎｍでの吸光度が、０．５〜３．０である、上記項目に記載のリポソーム。
（項目８９）
前記リポソームの脂質量が、０．５〜５ｍｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９０）
前記リポソームがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、その量が、０．１〜１ｍｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９１）
前記リポソームの平均粒子径が、５０〜３００ｎｍである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９２）
前記リポソームのＺ電位が、−３０ｍＶ〜−１２０ｍＶである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９３）
前記リポソームが、所望の物質を内包する、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９４）
前記所望の物質が、ｃｙ５．５、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ルシフェラーゼ、抗体、ｔＰＡ、β−ガラクトシダーゼ、アルブミン、ボツリヌス毒素、ジフテリアトキシン、メチルプレゾニゾロン、リン酸プレゾニゾロン、ペプチド、金コロイド、Ｇｄ錯体、Ｆｅ錯体、シスプラチン、プラバスタチン、ヘパリン、塩酸ファスジル、クロドロン酸、水溶性ヨード、キチン、キトサン、プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡｉからなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９５）
前記リポソームが、標的認識プローブを該リポソームの表面に含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９６）
前記標的認識プローブが、糖鎖、抗体、抗原、ペプチド、核酸およびヒアルロン酸からなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９７）
前記糖鎖の付加量が、糖鎖結合密度０．５〜５００μｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９８）
前記抗体の付加量が、０．１〜５０μｇ／ｍＬである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目９９）
前記糖脂質が、天然由来の糖脂質に付随する成分を含まない、上記項目に記載のリポソーム。
（項目１００）
糖脂質含有リポソームを製造する方法であって、以下：
Ａ）糖脂質を提供する工程であって、該糖脂質は、植物型セラミド部分および糖鎖部分を含む、工程；および
Ｂ）提供された該糖脂質とリポソーム原料とを混合し、リポソーム形成される条件に供する工程
を包含する、方法。
（項目１０１）
前記Ａ）工程が、以下の工程：
（ａ）保護された糖と脂質アミド保護体とを、該保護された糖と該脂質アミド保護体とが結合する条件下で反応させて、糖−脂質アミドアクセプター前駆体を生成させる工程；
（ｂ）該糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件で反応させて、糖−脂質アミドアクセプターを生成させる工程；
（ｃ）該糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーとを、該糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件下で反応させて、保護された糖脂質を生成させる工程；および
（ｄ）該保護された糖脂質を、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下で脱保護反応をさせて、糖脂質を生成させる工程
を包含する工程であって、該脂質アミド保護体が、【００７１】
【化３５】
0005465542.tif 000031
【００７２】
である、上記項目に記載の方法。【００７３】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明を読めば、明白である。
【発明の効果】
【００７４】
本発明により、標的部位認識プローブを均質にリポソーム表面に結合させるのに有用なリポソームを提供することにより、標的部位認識プローブを均質にリポソームの表面に結合させ、天然由来の糖脂質のロット間較差による集積性のばらつきを解決することができる。【００７５】
天然由来の糖脂質には、脳に由来する未知・未同定物質が混入している可能性があるので、ヒトにおいて使用するのに適していないが、合成した糖脂質を用いることにより、ヒトにおいての使用に適したリポソームになり得る。【００７６】
本発明の組成物は、標的指向性が向上したリポソームを提供することにより、所望の部位（特に、腫瘍）への集積性が顕著に向上し、より精巧な診断、予防および治療を提供することができる。【００７７】
なお、本発明が達成した効果は上記に限られず、本明細書に記載された事項から当業者が理解しうるすべてものを含むことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、リポソームのタンパク質量を測定するための検量線の一例を示す。Ｘ軸は、タンパク質スタンダードの濃度（μｇ／５０μｌ）であり、Ｙ軸は、５４０ｎｍの吸光度である。ｙ＝０．１５９４ｘ＋０．０００４、ｒ＝０．９９９６
【図２】図２は、リポソームの脂質量を測定するための検量線の一例を示す。Ｘ軸は、コレステロールスタンダードの濃度（μｇ／２０μｌ）であり、Ｙ軸は、５５０ｎｍの吸光度である。ｙ＝０．０６１６ｘ＋０．００６７、ｒ＝０．９９９２
【図３】図３は、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソームの粒子径分布の一例を示す。実線は、ブタ脳由来の天然型ガングリオシドを用いて調製したリポソームの粒子径分布をしめす。破線は、合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソームの粒子径分布を示す。Ｘ軸は、粒子径（直径．ｎｍ）を示し、Ｙ軸は、強度（％）を示す。
【図４】図４は、合成ガングリオシドＧＭ３およびＧＭ４の構造式、ならびに天然型セラミド、植物型セラミド、疑似セラミドの構造を示す。上段はＧＭ３の構造式を示す。ＧＭ３の構造の左から、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸：ＮｅｕＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｕ）、セラミド（Ｃｅｒａｍｉｄｅ）である。中段はＧＭ４の構造式を示す。ＧＭ４の構造の左からＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸：ＮｅｕＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、セラミド（Ｃｅｒａｍｉｄｅ）である。下段は３種類のセラミドを示す。左から天然型セラミド、植物型セラミド、擬似セラミドである。
【図５ａ】図５ａは、合成ＧＭ３（天然型セラミド）リポソームの粒子径分布の一例を示す。Ｘ軸は、粒子径（直径．ｎｍ）を示し、Ｙ軸は、強度（％）を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、合成ＧＭ３（疑似セラミド）リポソームの粒子径分布の一例を示す。Ｘ軸は、粒子径（直径．ｎｍ）を示し、Ｙ軸は、強度（％）を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、合成ＧＭ４（植物型セラミド）リポソームの粒子径分布の一例を示す。Ｘ軸は、粒子径（直径．ｎｍ）を示し、Ｙ軸は、強度（％）を示す。
【図５ｄ】図５ｄは、合成ＧＭ４（疑似セラミド）リポソームの粒子径分布の一例を示す。Ｘ軸は、粒子径（直径．ｎｍ）を示し、Ｙ軸は、強度（％）を示す。
【図６ａ】図６ａは、合成ＧＭ３植物型セラミドを用いて調製したリポソーム表面のＦＩＴＣ結合量を示す。Ｘ軸は、反応時のＦＩＴＣ濃度（μＭ）であり、Ｙ軸は、ＦＩＴＣ結合量（ｎＭ）を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、合成ＧＭ３  疑似セラミドまたは合成ＧＭ３  天然型セラミドを用いて調製したリポソーム表面のＦＩＴＣ結合量を示す。Ｘ軸は、反応時のＦＩＴＣ濃度（μＭ）であり、Ｙ軸は、ＦＩＴＣ結合量（ｎＭ）を示す。
【図６ｃ】図６ｃは、合成ＧＭ４  植物型セラミドまたは合成ＧＭ４  疑似セラミドを用いて調製したリポソーム表面の抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体結合量を示す。Ｘ軸は、反応濃度（μＭ）であり、Ｙ軸は、抗体結合量（μｇ／ｍｇ  Ｌｉｐｉｄ）を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、担癌モデルマウスを用いたシアリルルイスＸリポソームおよび抗Ｅ−セレクチン抗体リポソームの担癌集積性を確認した図である。合成ＧＭ３植物型セラミドを利用したリポソームの癌部位への集積性を示す。糖鎖なしリポソームおよびＳＬＸリポソームの集積性を確認した。糖鎖なしリポソームに比べ、ＳＬＸリポソームは癌部位へ集積することがわかり、合成ＧＭ３植物型は、リポソーム原料として利用することができることがわかった。上から投与直後、投与後２４時間、投与後４８時間、投与後７２時間である。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、担癌モデルマウスを用いたシアリルルイスＸリポソームおよび抗Ｅ−セレクチン抗体リポソームの担癌集積性を確認した図である。合成ＧＭ４植物型セラミドを利用したリポソームの癌部位への集積性を示す。抗体なしリポソームおよび抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体リポソームの集積性を確認した。抗体なしリポソームに比べ、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリポソームは癌部位へ集積することがわかり、合成ＧＭ４植物型は、リポソーム原料として利用することができることがわかった。上から投与直後、投与後２４時間、投与後４８時間である。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、担癌モデルマウスを用いたシアリルルイスＸリポソームおよび抗Ｅ−セレクチン抗体リポソームの担癌集積性を確認した図である。合成ＧＭ４擬似型セラミドを利用したリポソームの癌部位への集積性を示す。抗体なしリポソームおよび抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体リポソームの集積性を確認した。抗体なしリポソームと抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリポソームとでは、癌部位への集積性に差がなかった。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。上から投与直後、投与後２４時間、投与後４８時間である。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図８Ａ】図８Ａは、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１４）を用いて作製したリポソームの癌部位への集積性を示す、投与の２４時間後の画像データである。上段は、０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群であり、下段は、５０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群である。それぞれ、別個の個体のデータを示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１４）を用いて作製したリポソームの癌部位への集積性を示す、投与の４８時間後の画像データである。上段は、０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群であり、下段は、５０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群である。それぞれ、別個の個体のデータを示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１３）を用いて作製したリポソームの癌部位への集積性を示す、投与の２４時間後の画像データである。上段は、０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群であり、下段は、５０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群である。それぞれ、別個の個体のデータを示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１３）を用いて作製したリポソームの癌部位への集積性を示す、投与の４８時間後の画像データである。上段は、０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群であり、下段は、５０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群である。それぞれ、別個の個体のデータを示す。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図９】図９は、天然ガングリオシド（ＴＧＡＮＧ１３）を用いたリポソームの糖鎖密度と集積性の関係を示す。糖鎖密度は、炎症部位への集積性に大きく影響を与えることがわかった。上段から、結合反応時の糖鎖密度が０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌの群である。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１０】図１０は、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１４）を用いたリポソームの癌部位への集積と糖鎖密度との関係を示す。Ａは投与の２４時間後、Ｂは投与の４８時間後の画像データである。上段から、糖鎖密度０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌのリポソームを作製して、集積性を確認したイメージング図を示す。その結果、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１３）リポソームでは、５０μｇ／ｍｌのとき、最も高い集積性を示したが、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１４）リポソームでは、１０および２０μｇ／ｍｌで最も高い癌部位への集積性が確認できた。このことから、リポソームへの糖鎖結合密度がガングリオシドのロット間差によりずれていたことが確認できた。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１１】図１１は、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１６）を用いたリポソームの癌部位への集積と糖鎖密度との関係を示す。Ａは投与の２４時間後、Ｂは投与の４８時間後の画像データである。上段から、糖鎖密度  ０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌのリポソームを作製して、集積性を確認したイメージング図を示す。その結果、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１３）リポソームでは、５０μｇ／ｍｌのとき、最も高い集積性を示したが、天然ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１４）リポソームでは、１０および２０μｇ／ｍｌで最も高い癌部位への集積性が確認できた。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソームの癌部位への集積性を示す。投与の２４時間後の画像データである。上段は０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群であり、下段は、１５μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群である。糖鎖結合密度１５μｇ／ｍｌのとき、糖鎖なしリポソームに比べ、投与２４時間では有意に癌部位へ集積したことが確認できた。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソームの癌部位への集積性を示す。投与の４８時間後の画像データである。上段は０μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群であり、下段は、１５μｇ／ｍＬ、１００μｌ投与群である。糖鎖結合密度１５μｇ／ｍｌのとき、糖鎖なしリポソームに比べ、投与４８時間後では有意に癌部位へ集積したことが確認できた。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソームの癌部位への集積性を示す。上図は糖鎖なしリポソーム投与群であり、下図はシアリルルイスＸリポソーム投与群である。各図とも、上から投与直後、投与２４、４８、７２時間後のイメージングの結果である。糖鎖結合密度１５μｇ／ｍｌのとき、糖鎖なしリポソームに比べ、投与の２４時間後、４８時間後、７２時間後ともに有意に癌部位へ集積したことが確認できた。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、リポソームへの糖鎖およびＦＩＴＣ付加の模式図である。ＢＳ３：ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン、ＤＴＳＳＰ：３，３−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ＦＩＴＣ：フルオレセイン−４−イソチオシアネート。各工程を概略を以下に示す：リポソーム形成と同時にＣｙ５．５標識ＨＳＡを内包（工程Ａ）、リポソーム表面に架橋剤ＢＳ３を介してＴｒｉｓを結合させる。（工程Ｂ）、リポソーム膜に埋め込まれたガングリオシドは、リポソーム表面に白矢印で示したように、ラフトを形成する。そのラフト上にＨＳＡをカップリングさせる。ラフトの大きさ、性質（ガングリオシド性質）が変わるとＨＳＡのカップリング量は変動する（工程Ｃ）。リポソーム表面のＨＳＡに架橋剤を介して糖鎖やＴｒｉｓを結合させる。ＨＡＳ量が異なると表面に結合する糖鎖量およびＦＩＴＣ量は変動する（工程Ｄ）
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＦＩＴＣ量（ｎＭ）と蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｔｙ）との関係（検量線）を示す。Ｘ軸は、ＦＩＴＣ量（ｎＭ）であり、Ｙ軸は、蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｔｙ）である。ｙ＝３Ｅ−０６ｘ２＋０．０１０１ｘ＋０．１７４９、Ｒ２＝０．９９６３
【図１４】図１４は、合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソーム表面への糖鎖結合量をＦＩＴＣの結合量によって評価した図である。リポソーム表面へのＦＩＴＣ結合量（反応時のＦＩＴＣ濃度０〜４０００μＭ）。結合反応時のＦＩＴＣ濃度依存的な挙動が認められた。１０００μＭ以上の濃度になると、結合量の増加は認められなかった。合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソームと天然型ガングリオシド（ＴＧＡＮＧ１４）リポソームの表面には、同程度のＦＩＴＣが結合することがわかった。Ｘ軸は、反応時のＦＩＴＣ濃度（μＭ）であり、Ｙ軸は、ＦＩＴＣ結合量（ｎＭ）を示す。白ひし形は、合成ＧＭ３リポソームを示し、黒ひし形は、天然由来ガングリオシドを用いて作製したリポソームを示す。
【図１５】図１５は、リポソーム表面へのＦＩＴＣ結合量  図１４の０〜３００μＭの部分を詳細化したグラフ。合成ＧＭ３（植物型セラミド）リポソームと天然型ガングリオシド（ＴＧＡＮＧ１４）リポソームの表面には、同程度のＦＩＴＣが結合することがわかった。Ｘ軸は、反応時のＦＩＴＣ濃度（μＭ）であり、Ｙ軸は、ＦＩＴＣ結合量（ｎＭ）を示す。白ひし形は、合成ＧＭ３リポソームを示し、黒ひし形は、天然由来ガングリオシドを用いて作製したリポソームを示す。
【図１６】図１６は、従来リポソーム（天然ガングリオシド（ＴＧＡＮＧ１４））と合成ＧＭ３（天然型セラミド）リポソームのＦＩＴＣ結合量の差を示す相関図。Ｘ軸は、従来リポソーム（天然ガングリオシド（ＴＧＡＮＧ１４））を示し、Ｙ軸は、合成ＧＭ３（天然型セラミド）リポソームのＦＩＴＣ量を示す。ｙ＝０．８５７５ｘ−０．００１９、Ｒ２＝０．９９５７。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘにより得たイメージング画像である。上から、植物型ＧＭ３リポソームを投与したラット、ブタ由来総ガングリオシドリポソームを投与したラット、疑似型ＧＭ３リポソームを投与したラット、天然型ＧＭ３リポソームを投与したラットである。右端のバーは、イメージングによって得られた蛍光シグナル強度を示す。イメージング図では、バーの上方の白色になるほど蛍光シグナルが強く、下方になるほど蛍光シグナルが弱いことを示す。単位は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）：１秒間にカウントされる蛍光シグナルｐｈｏｔｏｎ数）を表す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、図１７Ａに示すイメージング画像をｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔにより数値化したグラフである。Ａ：植物型ＧＭ３リポソームを投与したラット、Ｂ：ブタ由来総ガングリオシドリポソームを投与したラット、Ｃ：疑似型ＧＭ３リポソームを投与したラット、Ｄ：天然型ＧＭ３リポソームを投与したラット。Ｙ軸は、ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔ，ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ（ｐｈ／ｓ）である。
【００７９】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。【００８０】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００８２】
（略記一覧）
本明細書において、必要に応じて以下に示す省略表記を用いた。
Ａｃ：アセチル（ａｃｅｔｙｌ）Ａｃ２Ｏ：無水酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）
ＢＤＡ：ベンズアルデヒドジメチルアセタール（ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）
ＢＦ３・ＯＥｔ２：トリフルオロボランジエチルエーテラート（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｎｅ  ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒａｔｅ）
Ｂｎ：ベンジル（ｂｅｎｚｙｌ）
Ｂｚ：ベンゾイル（ｂｅｎｚｏｙｌ）
Ｂｚ２Ｏ：安息香酸無水物（ｂｅｎｚｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）
ＣＳＡ：（±）−カンファースルホン酸（（±）−ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
ＤＢＴＯ：ジブチル錫オキシド（ｄｉｂｕｔｙｌ  ｔｉｎ  ｏｘｉｄｅ）
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ）
ＤＥＡＤ：アゾジカルボン酸ジエチルエステル（ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＤＭＴＳＴ：ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｓｕｌｆｏｎｉｕｍ  ｔｒｉｆｌａｔｅ）
Ｅｔ：エチル
Ｍｅ：メチル
ＭＰ：ｐ−メトキシフェニル（ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）
ＭＰＭ：ｐ−メトキシフェニルメチル（ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ＭＳ３Ａ：モレキュラーシーブ３Å（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｅｖｅｓ  ３Å）
ＭＳ４Ａ：モレキュラーシーブ４Å（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｅｖｅｓ  ４Å）
ＰＰｈ３：トリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）
ＴＢＡＢ：臭化テトラブチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）
ＴＥＡ：トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）
ｐ−ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
ＷＳＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（一般技術）
本発明における有機化学的な手法を実施するに当たっては、実験化学講座（日本化学会編、丸善、第４版、１９９２年）、有機化学実験の手引き１〜５  化学同人、取り扱い注意試薬ラボガイド  東京化成工業（株）編  講談社サイエンティフィク、生理活性糖鎖研究法  生物化学実験法４２  学会出版センター、精密有機合成−実験マニュアル−南江堂などのような実験マニュアルを参照することができ、これらの内容は、その全体が参考として援用される。【００８３】
糖脂質の合成について、Ｋａｍｅｙａｍａ，Ａ．；Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．；Ｋｉｓｏ，Ｍ．；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．Ｃａｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９０，２００，２６９−２８５；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．；Ｎａｇａｈａｍａ，Ｔ．；Ｏｈｋｉ，Ｈ．；Ｋｉｓｏ，Ｍ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．１９９２，１１，６９９−７１４；Ａｎｄｏ，Ｈ．；Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．；Ｋｉｓｏ，Ｍ．；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９７，３００，２０７−２１７；Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．−Ｋ．；Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．；Ｋｉｓｏ，Ｍ．；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９４，２６０，Ｃ１−Ｃ６等の文献を参照することができ、これらの内容は、その全体が参考として援用される。【００８４】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００８５】
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約２０種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。【００８６】
本明細書において「糖鎖基」とは、糖鎖が別の基と結合したときに付される名称である。糖鎖基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、糖鎖基としては、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基が挙げられる。【００８７】
本明細書において「糖」または「単糖」とは、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において、糖はまた、炭水化物ともいい、両者は互換的に用いられる。本明細書において、特に言及するときは、糖鎖は、１つ以上糖が連なった鎖または配列をいい、糖または単糖というときは、糖鎖を構成する１つの単位をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。【００８８】
本発明において使用され得る糖鎖は、一般的な糖鎖合成方法によって合成され得る。これらの方法としては、（１）化学合成による方法、（２）遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法、（３）糖加水分解酵素（グリコシダーゼ）を用いて合成する方法、（４）糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）を用いて合成する方法が挙げられる。（ＷＯ２００２／０８１７２３、特開平９−３１０９５公報、特開平１１−４２０９６公報、特開２００４−１８０６７６公報、畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎および小林一清（１９９７）糖質の科学と工業、講談社、東京などを参照のこと）。【００８９】
本発明において糖を記載するために使用する命名法および略称は、通常の命名法に従う。例えば、β−Ｄ−ガラクトース【００９０】
【化３６】
0005465542.tif 000032
【００９１】
は、Ｇａｌ；
Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン【００９２】
【化３７】
0005465542.tif 000033
【００９３】
は、ＧａｌＮＡｃ；
α−Ｄ−マンノース【００９４】
【化３８】
0005465542.tif 000034
【００９５】
は、Ｍａｎ；
β−Ｄ−グルコース【００９６】
【化３９】
0005465542.tif 000035
【００９７】
は、Ｇｌｃ；
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン【００９８】
【化４０】
0005465542.tif 000036
【００９９】
は、ＧｌｃＮＡｃ；
α−Ｌ−フコース【０１００】
【化４１】
0005465542.tif 000037
【０１０１】
は、Ｆｕｃ；
α−Ｎ−アセチルノイラミン酸【０１０２】
【化４２】
0005465542.tif 000038
【０１０３】
は、Ｎｅｕ５Ａｃ；
セラミドはＣｅｒと示される。【０１０４】
環状の２つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、ａまたはｂと表すことがある。従って、本明細書において、αとａ、βとｂは、アノマー表記については交換可能に使用される。【０１０５】
本明細書において、「ガラクトース」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−Ｄ−ガラクトースであり、特に言及しないときには、β−Ｄ−ガラクトースを指すものとして使用される。【０１０６】
本明細書において、「アセチルガラクトサミン」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミンを指すものとして使用される。【０１０７】
本明細書において、「マンノース」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｄ−マンノースであり、特に言及しないときには、α−Ｄ−マンノースを指すものとして使用される。【０１０８】
本明細書において、「グルコース」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−Ｄ−グルコースであり、特に言及しないときには、β−Ｄ−グルコースを指すものとして使用される。【０１０９】
本明細書において、「アセチルグルコサミン」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンを指すものとして使用される。【０１１０】
本明細書において、「フコース」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｌ−フコースであり、特に言及しないときには、α−Ｌ−フコースを指すものとして使用される。【０１１１】
本明細書において「シアル酸」とは、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）の誘導体の総称である。Ｎ−アシル（Ｎ−アセチルまたはＮ−グリコリル）ノイラミン酸およびＮ−アシル−Ｏ−アセチルノイラミン酸が天然に存在する。９以上の炭素数を有するアミノ糖の総称．ノイラミン酸のＮ‐またはＯ‐アシル誘導体で表すことができる。【０１１２】
本明細書において、「アセチルノイラミン酸」とは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、特に言及しないときにはα−Ｎ−アセチルノイラミン酸を指すものとして使用される。【０１１３】
本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称（Ｇｌｃなど）などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基が結合先の糖の水酸基とが脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。【０１１４】
糖が、アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がアミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができるが、その場合は還元末端の水酸基がアミン基に置換されたものを指すことに留意する。【０１１５】
単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、αおよびβにより示す。２つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。【０１１６】
必要に応じて、本明細書において糖鎖は、【０１１７】
【化４４】
0005465542.tif 000039
【０１１８】
により表すがこれに限定されない。この方法を用いた場合、例えば、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間のβグリコシド結合はβ１，４により表される。従って、例えば、シアリルルイスＸ（ＳＬＸ）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃと表される。Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇ４ＧＮ）は、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃと表される。α１−６マンノビオース（Ａ６）は、Ｍａｎα１，６Ｍａｎと表される。本明細書では、必要に応じて、他の表示方法も用いることができる。【０１１９】
糖鎖の分岐は、括弧により表し、結合する単位糖のすぐ左に配置して表記する。例えば、【０１２０】
【化４５】
0005465542.tif 000040
【０１２１】
と表され、括弧の中は、【０１２２】
【化４６】
0005465542.tif 000041
【０１２３】
と表記される。従って、例えば、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間がβグリコシド結合し、さらにこのグルコースのＣ−３がフコースのＣ−１とαグリコシド結合している場合、Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）Ｇｌｃと表される。【０１２４】
単糖は、（潜在）カルボニル原子団になるだけ小さい番号を付けることを基本にして表される。有機化学命名法の一般基準では（潜在）カルボニル原子団より優位な原子団が分子中に導入されたときでも、通常上記の番号付けで表される。【０１２５】
【化４７】
0005465542.tif 000042
【０１２６】
【化４８】
0005465542.tif 000043
【０１２７】
本明細書において使用される糖鎖としては、例えば、シアリルルイスＸ、Ｎ−アセチルラクトサミン、α１−６マンノビオースならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される糖鎖が挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖鎖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンに対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。【０１２８】
本明細書において使用される「ガングリオシド」とは、当該分野において使用されるものと同様の意味を有し、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質をいう。代表的なガングリオシドとしては、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃなどを挙げることができ、これらの構造は以下のとおりである。【０１２９】
ＧＭ１：Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＭ２：ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＭ３：ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＭ４：ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−１Ｃｅｒ
ＧＤ３：ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＤ２：ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＤ１ａ：ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＤ１ｂ：Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＴ３：ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＴ２：ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＴ１ａ：ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＴ１ｂ：ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＴ１ｃ：Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＱ１ｂ：ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＱ１ｃ：ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
ＧＰ１ｃ：ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４［ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３］Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
本明細書において使用される「糖脂質含有リポソーム」とは、糖脂質を含む任意のリポソームをいう。本発明の糖脂質含有リポソームは、おもに合成した糖脂質（合成糖脂質）を含むことを特徴とする。好ましくは、糖脂質はリポソーム膜に組み込まれている。【０１３０】
本明細書において使用される「ガングリオシド含有リポソーム」とは、ガングリオシドを含む任意のリポソームをいう。【０１３１】
本明細書において「天然由来のガングリオシドに付随する成分」とは、動物、植物などから抽出することによって得られるガングリオシドに付随し、通常の操作で除去することができない成分をいう。ガングリオシドは脂溶性を指標にして抽出されるため脂溶性のタンパク質が容易に混入してくる。また脂質のみに精製してからも、ガングリオシドは総脂質の中でも微量成分であるため、圧倒的に多く存在する中性糖脂質を除くのが難しい。また最後の酸性糖脂質画分にはスルファチドのような硫酸機を有する酸性糖脂質も豊富に存在し、それからの分離が難しい。また抽出及び生成の過程で塩を多量に使うため脱塩操作をしても塩の混入は避けられない。理論に束縛されることを望まないが、このような成分がないことにより、本発明が本明細書において示されるような顕著な効果を奏することができることが明らかになった。また、天然由来のガングリオシドには、ＧＭ１，ＧＭ２，ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃなどが含まれているが、ガングリオシド中に含まれるこれらの組成を変更することは困難であるからである。【０１３２】
本明細書において「リポソームの６８０ｎｍでの吸光度」とは、内包させたＣｙ５．５の吸光度を示す。この数値は、内包されたＣｙ５．５量の指標として使用することができるものである。リポソームの６８０ｎｍでの吸光度が、０．５〜３．０であれば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによる生体内の観察において体外から蛍光シグナルを検出することができることを意味する。【０１３３】
本明細書において、用語「抗体」とは、免疫原である抗原によって惹起された特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、Ｂ細胞により生産され、血液、体液中に存在する。抗体は、抗原と特異的に反応するという特徴を有する。抗体は、抗原の呈示による刺激の結果としてではなく自然に存在する場合もあり得る。基本的には、抗体の分子構造は各２本の軽鎖と重鎖とから形成されるが、二量体、三量体、五量体としても存在し得る。これらとしては、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体修飾リポソームにおいて使用される抗体は、臓器、疾患、免疫細胞等に特異的に発現する抗原に対する抗体が挙げられ得る。好ましくは、例えば、炎症血管内皮に発現するＥ−セレクチン、ｐ−セレクチンに対する抗体であり得るが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本発明の抗体リポソームにおいて使用され得る抗体は、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、ＩｇＧであり得る。本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。【０１３４】
本明細書において使用される場合「添加抗体量」とは、添加した抗体の最終濃度をいう。例えば、抗体修飾リポソーム作製時では、リポソームと抗体溶液とを反応させるときの抗体の最終濃度をいう。架橋スペーサーを介した抗体修飾リポソームの場合には、この添加抗体量は、架橋スペーサーの結合したリポソームと抗体溶液の反応時の抗体濃度をいう。本明細書において、この「添加抗体量」は「抗体量」とも称され得る。【０１３５】
本明細書において使用される場合、タンパク質量の「添加抗体量換算」とは、抗体修飾リポソーム作製時の、抗体溶液の最終濃度で換算した場合のタンパク質量をいう。【０１３６】
本明細書において使用される場合、用語「レクチン」とは、細胞膜複合糖質（糖タンパク質および糖脂質）の糖鎖と結合能を有する物質をいい、細胞凝集，分裂誘発，機能活性化，細胞障害などの効果をおよぼす能力を有する。糖鎖を細胞が発信する情報分子とすれば、レクチンは受信分子であるといえる。一定の性質を有する細胞または組織は、それに相応したレクチンのパターンを有する。レクチンは、感染、生体防御、免疫、受精、標的細胞へのターゲティング、細胞分化、細胞間接着、新生糖タンパク質の品質管理および細胞内選別輸送などを実現する。レクチンは、多用な糖鎖結合性を有し、速やかな結合および解離という固有の物理化学的性質を有することにより厳格に制御されている。糖鎖認識蛋白質とも呼ばれる。植物レクチンについての研究は古く、既に約３００種類が知られている。最近、動物レクチンについても活発に研究が行われており、新規レクチンの発見が続いている。動物細胞膜上に在る主要なレクチンファミリーのレクチン群（約１００種類）に基づく多彩な糖鎖認識機能が研究されている。とりわけ、多様な構造をもつ糖鎖リガンドの構造情報を受け取るレセプター（情報受容蛋白質、または、標的分子）としての機能が注目されている。【０１３７】
本明細書において使用される場合、用語「相補的核酸」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、核酸の塩基対合律により、互いに塩基対を形成し得る核酸をいう。これらとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１３８】
本明細書において使用される場合、用語「レセプター」とは、「受容体」とも称され、細胞に存在して外部からの刺激を認識し、伝達するための構造を有するものをいう。これらとしては、例えば、細胞表面受容体、細胞内受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１３９】
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、物質にとって、それ自体が非常に強固に吸着される分子をいう。これらとしては、例えば、タンパク質、核酸、化学物質等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１４０】
本明細書において使用される場合、用語「アプタマー」とは、種々の物質（タンパク質、化学物質など）の構造を認識し、結合し得る比較的分子量の小さい核酸をいう。これらとしては、例えば、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１４１】
本明細書において使用される場合、用語「抗原」とは、抗体の産生を促す働きを有する物質をいう。例えば、高分子の糖、タンパク質、それらの複合体、ウイルス、細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。【０１４２】
（リポソーム）
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでＤＤＳ用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有し得る。【０１４３】
（リポソームの調製）
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製されたものであり得る（例えば、「リポソーム応用の新展開〜人工細胞の開発に向けて〜監修  秋吉一成/辻井薫  ＮＴＳ  ｐ３３〜４５（２００５）」、「リポソーム  野島庄七  ｐ２１−４０  南江堂（１９８８）」を参照のこと。）が挙げられ得る。【０１４４】
例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、ａ）脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびｂ）混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明の糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の２段階反応によって行うことができる。ａ）リポソーム膜上の糖脂質（例えば、ガングリオシド）部分の過ヨウ素酸酸化、およびｂ）還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法（ＧＰＣ）および走査型電顕（ＳＥＭ）や動的光散乱法（ＤＬＳ）などを使うことができる。一例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７のタイプのリポソームを製造することができる。なお、これらのリポソームは４℃で数ヶ月保存しても安定である。リポソームのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性は、マウスを使って調べることができる。リポソームをマウスに静注し、３時間後に採血して血清を調製し、孔径０．０３μｍの膜を用いて限外濾過を行いリポソームを精製し回収する。そのＳＥＭ観察の結果、このリポソームの形態はｉｎ  ｖｉｖｏでの３時間処理・回収前後においても変化がないことを確認することができる。【０１４５】
リポソームは、凍結乾燥法によっても作製することができる。凍結乾燥法は、例えば、Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓ．，１７，５８９−６０５（１９９９）等により報告されている。例えば、以下の方法により調製することができる。リポソーム溶液を−４０〜−５０℃で凍結させ、凍結乾燥させる。凍結乾燥粉末に内包物質溶液を添加して再水和する。限外濾過法または透析法で、内包されなかった物質を除去する。必要に応じて、最初のリポソーム溶液に糖などを添加する。また、目的に応じて、フレンチプレス法、メンブランフィルター法により粒子サイズを調整する。【０１４６】
本明細書において「合成ガングリオシド含有リポソーム」とは、合成したガングリオシドを用いて調製したリポソームをいう。本明細書において、「合成ガングリオシド含有リポソーム」と「合成ガングリオシドリポソーム」とは、交換可能に使用され得る。合成したガングリオシドには、例えば、合成したＧＭ３、ＧＭ４、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、これらは、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ−５ＡＣ）を有するため、架橋スペーサーとカップリング反応により結合性を有するからである。【０１４７】
本明細書において「合成ＧＭ３リポソーム」とは、合成したＧＭ３を用いて調製したリポソームをいう。合成ＧＭ３リポソームには、例えば、天然型セラミドを含むもの、植物型セラミドを含むもの、擬似セラミドを含むものなどが挙げられるが、これらに限定されない。【０１４８】
本明細書において「合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム」とは、糖鎖を含む合成ＧＭ３リポソームをいう。本明細書において、「合成ＧＭ３抗体修飾リポソーム」とは、抗体を含む合成ＧＭ３リポソームをいう。【０１４９】
本明細書において「合成ＧＭ４リポソーム」とは、合成したＧＭ４を用いて調製したリポソームをいう。合成ＧＭ４リポソームには、例えば、天然型セラミドを含むもの、植物型セラミドを含むもの、擬似セラミドを含むものなどが挙げられるが、これらに限定されない。【０１５０】
本明細書において「合成ＧＭ４糖鎖修飾リポソーム」とは、糖鎖を含む合成ＧＭ４リポソームをいう。本明細書において、「合成ＧＭ４抗体修飾リポソーム」とは、抗体を含む合成ＧＭ４リポソームをいう。【０１５１】
本明細書において「天然型セラミド」とは、主に動物由来のガングリオシドに含まれるものをいう。【０１５２】
本明細書において「植物型セラミド」とは、植物由来のものであり、天然型セラミドに含まれる二重結合の代わりに水酸基を１つ含むものをいう。本セラミドは酵素の培養により安価かつ大量に得られ、ガングリオシドの大量合成に適している。【０１５３】
本明細書において「植物型セラミド部分」とは、糖脂質のうち植物型セラミドにより構成されている部分をいう。【０１５４】
本明細書において「糖鎖部分」とは、糖脂質のうち糖鎖により構成されている部分をいう。【０１５５】
本明細書において「擬似セラミド」とは、二重結合、水酸基などの官能基を含まず、分岐アルキル構造を有するセラミド様物質をいう。【０１５６】
本明細書において「リポソーム原料」とは、リポソームを形成することができる脂質をいう。リポソームを形成することができる脂質は、下記の糖脂質含有リポソームを構成する脂質と同じであってよい。【０１５７】
本明細書において「リポソームが形成する」条件とは、リポソームが形成するための条件をいう。リポソームが形成する条件は、例えば、糖脂質（例えば、合成糖脂質）とリポソーム原料との混合物を限外濾過に供すること、該混合物を一晩静置すること等であり得る。さらに好ましくは、リポソームが形成する条件は、この混合物を分画分子量５００〜３００，０００（好ましくは、１０，０００）で限外濾過に供することであり得る。【０１５８】
本明細書において使用される場合、用語「脂質」とは、長鎖の脂肪族炭化水素またはその誘導体をいう。「脂質」は、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどからなる化合物の総称である。【０１５９】
本発明の糖脂質含有リポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガングリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１６０】
ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１６１】
ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１６２】
ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルホスフェート等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１６３】
糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガングリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤｌａ、ガングリオシドＧＴｌｂ等が挙げられるが、これらに限定されない。【０１６４】
ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ−ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。【０１６５】
このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。例えば、本発明において使用されるリポソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含むことが好ましい。アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。【０１６６】
本発明の糖脂質含有リポソームを構成する脂質としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。【０１６７】
好ましい実施形態において、リポソームは、ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含ませてそれにペプチドなどのリンカーを結合させ、糖鎖を結合させることが可能である。【０１６８】
リポソームを作製するときにガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを合わせることによって、この糖脂質中に含まれる糖鎖を構成成分として含む、糖鎖で修飾した糖脂質含有リポソームを作製することができる。【０１６９】
別の好ましい実施形態では、本発明におけるリポソームは、ホスファチジルエタノールアミンを含むことが好ましい。ホスファチジルエタノールアミンを含むことによって、親水性付与基（トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンなど）との結合が容易になるからである。【０１７０】
（標的部位認識プローブ修飾リポソーム）
本明細書において「標的部位認識プローブ」とは、目的とする標的部位または物質を検出・観測する指標となる物質をいう。例えば、糖鎖、抗体、抗原、機能性ペプチド、核酸（アプタマー）、ヒアルロン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、リポソームに付与することでき、かつ、目的とする標的部位または物質を検出・観測することができるような物質であれば、どのようなものであってもよいからである。好ましくは、標的部位認識プローブは、架橋となるスペーサーを介してリポソームに化学結合させることができるものである。【０１７１】
本明細書において「標的部位認識プローブ修飾リポソーム」とは、標的部位認識プローブと、リポソームとを含む物質をいい、好ましくは、標的部位認識プローブ（例えば、糖鎖、抗体など）が直接または間接的に結合することによって修飾されたリポソームをいう。【０１７２】
（糖鎖修飾リポソーム）
本明細書において「糖鎖修飾リポソーム」とは、糖鎖とリポソームとを含む物質をいい、好ましくは、糖鎖が直接または間接的に結合することによって修飾されたリポソームをいう。本明細書において、「糖鎖修飾リポソーム」と、「糖鎖リポソーム」と、「糖鎖結合リポソーム」とは、交換可能に使用され得る。【０１７３】
本明細書において、「ＳＬＸ修飾リポソーム」とは、ＳＬＸで修飾されたリポソームをいう。糖鎖がリポソームに結合した形態を具体的に表すと、
構造Ｉ  Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３
Ｘ：前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とＣＨ２−ＮＨ結合可能な官能基ａを含む構成単位から、該官能基ａがとれた基
Ｒ１：リンカータンパク質基
Ｒ２：リンカータンパク質架橋基
Ｒ３：糖鎖
であり、ＸとＲ１とはＣＨ２−ＮＨ結合し、Ｒ１とＲ２とはペプチド結合し、Ｒ２とＲ３とはペプチド結合している。
従って、より詳細には、構造Ｉは、
Ｘ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ３
という構造式で表すことができる。【０１７４】
本発明において糖鎖修飾リポソームは、以下の構造により親水性化されている：
構造ＩＩ  Ｙ−Ｒ４−Ｒ５
Ｙ：前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基ｂを含む構成単位から該官能基ｂがとれた基
Ｒ４：親水性化合物架橋基
Ｒ５：親水性化合物基
ＹとＲ４はペプチド結合し、Ｒ４とＲ５はペプチド結合している。
従って、より詳細には、構造ＩＩは、
Ｙ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ４−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ５
という構造式で表すことができる。【０１７５】
糖鎖修飾リポソームは、上述の構造Ｉおよび構造ＩＩを有し得し、必要に応じて、常磁性または蛍光性を付与され得る。【０１７６】
本発明において、常磁性は、糖脂質含有リポソームの構成要素の少なくとも１つが常磁性を有すること、または糖脂質が新たに常磁性を有する要素をさらに有することによって付与される。【０１７７】
常磁性を有する要素としては、例えば、常磁性の金属（例えば、ガドリニウム、鉄など）、造影剤（例えば、酸化鉄粒子、ガドリニウムキレート剤、硫酸バリウム、水溶性ヨードなど）によって付与され得るが、これらに限定されない。なぜなら、磁気共鳴画像法において組成物を検出可能な状態にし得るものでありさえすればよいからである。【０１７８】
本発明において、蛍光性は、糖脂質含有リポソームの構成要素の少なくとも１つが蛍光性を有すること、または糖脂質含有リポソームが新たに蛍光性を有する要素をさらに有することによって付与される。【０１７９】
蛍光性を有する要素としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光色素としては、例えば、ｃｙ５．５（例えば、【０１８０】
【化４９】
0005465542.tif 000044
【０１８１】
【化５０】
0005465542.tif 000045
【０１８２】
ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識、それらの組み合わせのような蛍光色素によって付与され得る。【０１８３】
本発明の標的部位認識プローブで修飾された、糖脂質含有リポソーム（例えば、糖鎖修飾リポソーム、抗体リポソームなど）は、目的の送達部位への送達のために適切な密度で標的認識プローブ（例えば、糖鎖、抗体など）を含み得る。【０１８４】
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質１ｍｇあたりに結合した糖鎖の密度（ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）として表される。本明細書において、「修飾結合密度」と「糖鎖密度」とは、交換可能に使用され得る。糖鎖修飾リポソームの修飾結合密度は、経験的に、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることから、当業者は調製するときに使用した糖鎖の量をもって、修飾結合密度を表現することができることを理解する。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって修飾結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、Ｅ−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）は、リポソームに結合される糖鎖の種類と修飾結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表１にリポソーム番号、糖鎖の構造、および修飾結合密度を示す。【０１８５】
【表１】
0005465542.tif 000046
【０１８６】
上記の表に記載されるような糖鎖修飾リポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、（ａ）脂質を、メタノール／クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程；（ｂ）該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理してリポソームを提供する工程；（ｃ）該リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理する工程；（ｄ）該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程；および（ｅ）該リポソームに、上記表に記載される糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程を包含する。該（ｂ）において、超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合することにより、リポソームに蛍光性を付与することができる。【０１８７】
好ましくは、この蛍光標識溶液は、１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートカリウム塩，ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｃｙ５．５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートカリウム塩−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｃｙ３）を含み得る。【０１８８】
好ましい実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）の製造では、工程（ｄ）のリンカータンパク質は、ヒト血清アルブミンであり、工程（ｅ）において、糖鎖はＳＬＸであり、該ＳＬＸとリポソームを、目的とする処置または診断に適切な条件で結合させてＳＬＸ修飾リポソームを生成する。【０１８９】
リポソームとリンカー、リンカーと糖鎖とは、二官能性架橋基（例えば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ））などを利用して結合されることが好ましい。【０１９０】
本明細書において使用される場合、「リンカー」とは、糖鎖とリポソーム表面との結合を介在する分子である。本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）において、糖鎖はリンカーを介してリポソーム表面に結合してもよい。リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において「リンカータンパク質」とは、リンカー分子のうち、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のポリマーをいう。本明細書において使用されるリンカータンパク質としては、例えば、生体由来タンパク質、好ましくは、ヒト由来タンパク質、より好ましくは、ヒト由来血清タンパク質、さらにより好ましくは、血清アルブミンであり得る。特に、ヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。【０１９１】
本明細書において「リンカー（タンパク質）基」とは、リンカー（タンパク質）が別の基と結合したときに付される名称である。リンカー（タンパク質）基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、哺乳動物由来タンパク質基、ヒト由来タンパク質基、ヒト血清タンパク質基、血清アルブミン基が挙げられる。リンカー（タンパク質）基は「ヒト」由来が好ましい。ヒト投与において適合性が高いと考えられるからである。また、免疫原性がないタンパク質が好ましい。【０１９２】
本明細書において「架橋基」とは、橋をかけるように，鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる基をいう。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子（例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖）との間に作用し、分子内または分子間で、共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる基をいう。本明細書において架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、グルタルアルデヒドを用いることができる。【０１９３】
本明細書において、「リンカータンパク質架橋基」とは、リポソームと糖鎖との間にペプチド結合を形成させる基をいう。リンカータンパク質架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、ビススルホスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベラート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート等の２価試薬などを使用することができる。本明細書において使用され得るリンカータンパク質架橋基としては、例えば、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、ビススルホスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基などが挙げられ得るが、これらに限定されない。なぜなら、両端にアミノ基と反応する反応基を持つ架橋剤でありさえすれば、リポソームと糖鎖との間にペプチド結合を形成させることが可能であるからである。従って、他の代替可能な例としては、ビス（スルホスクシンイミジル）グルテート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，４，４−グルタレート−ｄ４基、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，７，７−スベレート−ｄ４基、ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン基、ジスクシンイミジルグルタレート、ジオチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）基、ジスクシンイミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）基、スルホジスクシンイミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート）基、トリス−（スクシンイミジルアミノトリステート）基等が挙げられる。【０１９４】
本明細書において、「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（ＣＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシルエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、その他のグット緩衝液（例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミンクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、アミノアセトアミド（グリシンアミド）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ））などが挙げられるが、これらに限定されない。【０１９５】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。【０１９６】
本明細書では、特に言及するときは、「タンパク質」は、比較的大きな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指し、「ペプチド」というときは、比較的小さな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指すことがあることが理解されるべきである。そのような分子量としては、例えば、約３０ｋＤａ、好ましくは約２０ｋＤａ、より好ましくは約１０ｋＤａなどを挙げることができるがそれらに限定されない。【０１９７】
本明細書中で使用される場合、「生体由来タンパク質」とは、生物に由来するタンパク質をいい、どの生物（例えば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（例えば、単子葉植物、双子葉植物など）など））由来のタンパク質でもよい。好ましくは、脊椎動物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来のタンパク質、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来のタンパク質が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくは投与を目的とする生体由来のタンパク質が用いられる。本明細書において、生体由来タンパク質が別の物質と結合した状態を示す場合、生体由来タンパク質基と称される。【０１９８】
本明細書で使用される場合「ヒト由来血清タンパク質」は、ヒトの血液が自然に凝固したときに残る液体部分に含まれるタンパク質をいう。本明細書において、ヒト由来タンパク質が別の物質と結合した状態を示す場合、ヒト由来タンパク質基と称される。【０１９９】
本明細書で使用される場合、「血清アルブミン」は、血清中に含まれるアルブミンをいう。本明細書において、血清アルブミンが別の物質と結合した状態を示す場合、血清アルブミン基と称される。【０２００】
本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）は、リポソーム膜またはリンカーの少なくとも一方が親水性化合物、好ましくは、トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンを結合させることにより親水性化されていてもよい。【０２０１】
本明細書中で使用される場合、「親水性化」は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンによる糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチン等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンが結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。【０２０２】
親水性化されたリポソームと親水性化されていないリポソームとでは、溶液中での安定性が異なる。親水性化されていないリポソームは、安定性が悪く、沈殿を起こしたり、リポソーム同士が凝集することがある。一方、リポソームは、親水性化されることにより、安定性が改善され、沈殿を起こすこともなく、リポソーム同士が凝集することもない。【０２０３】
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（本明細書において「アルカン」という）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。アルカンについては、これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルカン、Ｃ１〜Ｃ３アルカン、Ｃ１〜Ｃ４アルカン、Ｃ１〜Ｃ５アルカン、Ｃ１〜Ｃ６アルカン、Ｃ１〜Ｃ７アルカン、Ｃ１〜Ｃ８アルカン、Ｃ１〜Ｃ９アルカン、Ｃ１〜Ｃ１０アルカン、Ｃ１〜Ｃ１１アルカンまたはＣ１〜Ｃ１２アルカン、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルカン、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルカンまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルカンであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。Ｒとしては、Ｃ１〜Ｃ６アルキルが好ましく、特にＣ１〜Ｃ６アルキルが好ましい。【０２０４】
本発明の物質または上で定義した官能基が置換基Ｒによって置換されている場合、そのような置換基Ｒは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ−ル、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、アシル、チオカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される。【０２０５】
さらに、ＯＨ基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンが結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質ホスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式（１）、式（２）、式（３）等で示される。【０２０６】
Ｚ−Ｒ１（Ｒ２ＯＨ）ｎ  式（１）
Ｈ２Ｎ−Ｒ３−（Ｒ４ＯＨ）ｎ  式（２）
Ｈ２Ｎ−Ｒ５（ＯＨ）ｎ  式（３）
ここで、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、Ｃ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、Ｒ２、Ｒ４は存在しないかもしくはＣ１からＣ４０、好ましくはＣ１からＣ２０、さらに好ましくはＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Ｚはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ、ＮＨ２、ＣＨＯ、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ＥＤＣ、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。ｎは自然数を示す。このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。【０２０７】
本明細書において「親水性化合物基」とは、上記のような親水性化合物が他の基と結合したときの呼称である。親水性化合物基は場合に応じて一価または二価であり得る。【０２０８】
本明細書において、「親水性化合物架橋基」とは、一端がリンカータンパク質とペプチド結合し、他の一端が糖鎖とペプチド結合する基であり、親水性化合物基とリポソームまたはリンカータンパク質との間にペプチド結合を形成させる基をいう。親水性化合物架橋基としては、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基などを挙げることができる。好ましくは、親水性化合物架橋基は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基である。親水性化合物架橋基は、両端にアミノ基と反応する反応基を持ち、酸化・還元条件下でも開裂しない架橋剤であれば、上記以外の基でも代替可能である。例としては、ビス（スルホスクシンイミジル）グルテート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，４，４−グルタレート−ｄ４基、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，７，７−スベレート−ｄ４基、ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン基、ジスクシンイミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）基、エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート）基、トリス−（スクシンイミジルアミノトリステート）基等が挙げられるが、これらに限定されない。【０２０９】
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作製する方法（特開２０００−３０２６８５号（例えば、ＣＮＤＡＣ含有リポソーム製剤ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール；スフィンゴミエリン；コレステロール；ポリエチレングリコール部分の分子量が約２０００であるＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥとする。）；ＣＮＤＡＣ塩酸塩、グルコース水溶液およびトレハロース水溶液を使用し、Ｂａｎｇｈａｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８、６６０−６６８（１９６４）参照。）の方法により、多重層リポソームの粗分散液を得た。）と記載されている。））等の方法を採用することによっても行うことができる。このうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。本発明のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識タンパク質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。【０２１０】
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒子径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルホスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベラート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート等の２価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の−方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、リポソーム膜面に組み込まれ、親水基にアミノ基を持つものでありさえすれば、上記以外であってもよい。【０２１１】
（抗体修飾リポソーム）
本明細書において「抗体修飾リポソーム」とは、抗体とリポソームとを含む物質をいい、好ましくは、抗体が直接または間接的に結合することによって修飾されたリポソームをいう。本明細書において、「抗体修飾リポソーム」と「抗体リポソーム」とは交換可能に用いられ得る。【０２１２】
本明細書において「架橋スペーサー」とは、抗体とリポソームを架橋できる物質、例えば、血清アルブミン、プロテインＡ、その他タンパク質、２価の架橋剤などをいう。【０２１３】
抗体と血清アルブミンを共役するのに適する広範な架橋スペーサーは、その骨格に−（ＣＨ２）１−〜−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝２０程度）の原子を有するのが好ましい。このようなジラジカル（ｄｉｒａｄｉｃａｌ）スペーサーは、任意に置換されていてもよく、鎖内に、二重結合、ジスルフィド結合、三重結合、アリール基、ヘテロ原子を含有し得る。1つの実施形態では、この架橋スペーサー基は、１またはそれ以上の炭素を任意に有し得
、各炭素は、置換されていても置換されていなくてもよく、鎖中の結合は任意に飽和又は不飽和であり、分岐状または直鎖状であってもよい。架橋スペーサー化合物は、その鎖中の炭素原子がＮ、ＯまたはＳで置換されていてもよい。好ましくは、Ｃ１〜Ｃ２０の鎖であり、好ましくは置換され得る置換基としては、アリール、カルボニル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシなどを挙げることができる。架橋スペーサーとしては非常に広い範囲のものを選択することができ、架橋を目的とする標的によって変動し、当業者は本明細書の記載に基づき、本発明を実施するにおいて適切に架橋スペーサーを選択することができる。【０２１４】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えるか、または二重結合もしくは三重結合とすることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換するかまたは単結合と一緒にして二重結合とすることも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換するか、または単結合と一緒にして三重結合とすることも可能である。【０２１５】
本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。このような置換基は、本発明において、アミノ酸の設計のときに、適宜利用することができる。【０２１６】
好ましくは、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素原子またはアルキルであり得るが、複数の置換基全てが水素原子であることはない。より好ましくは、独立して、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より選択され得る。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有していても良いが、好ましくは、少なくとも１つの水素、より好ましくは、２〜ｎ（ここでｎは置換基の個数）の水素を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る。大きな置換基または極性のある置換基は本発明の効果（特に、アルデヒド基との相互作用）に障害を有し得るからである。従って、水素以外の置換基としては、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることもあることから、大きな置換基を有することもまた好ましくあり得る。【０２１７】
本明細書において、Ｃ１、Ｃ２、、、Ｃｎは、炭素数を表す。従って、Ｃ１は炭素数１個の置換基を表すために使用される。【０２１８】
（タンパク質量および脂質量の定量）
本発明の糖脂質含有リポソーム、（例えば、合成ＧＭ３リポソーム、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソームなど）のタンパク質量は、例えば、リポソームに内包されたＨＳＡ量とリポソーム表面にカップリングしたＨＳＡの総タンパク質量をＢＣＡ法により測定することができる。【０２１９】
【化５１】
0005465542.tif 000047
【０２２０】
タンパク質量の測定は、例えば、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｏ．ＬＴＤ）などを用いることができる。標準物質として、２ｍｇ／ｍｌアルブミン（ＢＳＡ）を使用し得る。（１）スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍｌ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μｌ溶液を調製する。（２）Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、検体溶液を調製する。（３）スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に５０μｌ分注する。（４）各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ溶液）を１００μｌ添加する。（５）キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを、試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合し、各試験管に１５０μｌ添加する。（６）この試験管を、６０℃で１時間、静置する。（７）室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのタンパク質量を測定する。検量線の一例を図１に示す。【０２２１】
本発明の糖脂質含有リポソームのタンパク質量は、例えば、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。Ｃｙ３により標識された糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．２４ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ５．５により標識された糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．４５ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ７により標識された糖鎖修飾リポソームのタンパク質量は、例えば、０．２０ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。【０２２２】
本発明において糖脂質含有リポソームの構成脂質量は、例えば、コレステロール量を定量することにより算出することができる。【０２２３】
＜脂質定量の原理＞【０２２４】
【化５２】
0005465542.tif 000048
【０２２５】
脂質の定量には、例えば、デタミナーＴＣ５５５キット（カタログ番号ＵＣＣ／ＥＡＮ１２８）（ＫＹＯＷＡ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いることができる。標準物質として、キットに添付されている５０ｍｇ／ｍｌ  コレステロールを使用する。（１）スタンダード溶液として、標準物質（５０ｍｇ／ｍｌ：コレステロール）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０μｇ／２０μｌ溶液を調製する。（２）糖脂質含有リポソームをＰＢＳ緩衝液で５倍希釈し、検体溶液を調製する。（３）スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に２０μｌ分注する。（４）各試験管に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１０％溶液）を１７μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、４０分間、静置する。（５）デタミナーＴＣ５５５キットの酵素試薬を３００μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、２０分間、静置する。（６）吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線（検定線の一例を図２に示す。）を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求める。【０２２６】
コレステロール量から脂質量を求める換算式は、例えば、以下のように表される。
脂質量（μｇ／５０μｌ）＝コレステロール量（μｇ／５０μｌ）×４．５１（換算係数）
リポソーム中の脂質に対するタンパク質の割合は、例えば、上述のタンパク質定量および脂質定量の結果から導くことができる。本発明の糖脂質含有リポソームは、好ましくは、脂質に対するタンパク質の割合が、約０．１から約０．５である。【０２２７】
本発明の糖脂質含有リポソームの脂質量は、例えば、０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。Ｃｙ３により標識された糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、１．２ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ５．５により合成ＧＭ３標識された糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、１．４ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。Ｃｙ７により標識された糖鎖修飾リポソームの脂質量は、例えば、２．１ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。【０２２８】
本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３リポソーム、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）の粒子径分布および粒子径は、例えば、リポソーム粒子を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザーナノ（Ｎａｎ−ＺＳ：ＭＡＬＶＥＲＮ  Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて測定することができる。粒子径分布の一例を図３に示す。【０２２９】
本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３リポソーム、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）は、粒度分布の最大域において、約５０ｎｍ〜２００ｎｍの粒子径を有することが好ましい。なぜなら、約５０ｎｍ〜２００ｎｍの粒子径は、マクロファージなどの免疫系細胞の認識を回避でき、そして肝臓や脾臓の内皮細網系（ＲＥＳ）からの取り込みをある程度回避することができるからである。約５０ｎｍ〜２００ｎｍｎｍの粒子径の糖鎖修飾リポソームは、薬物を内包させ、その薬物を標的臓器、疾患部分に送達させるのに適している。【０２３０】
本発明の糖脂質含有リポソーム（例えば、合成ＧＭ３リポソーム、合成ＧＭ３糖鎖修飾リポソーム）は、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均粒子径を有し、好ましくは、約６５ｎｍ〜約１６５ｎｍ、より好ましくは、約１００ｎｍの粒子径を有する。なぜなら、リポソームの粒子径が小さすぎると、肝臓・脾臓の細胞内皮系に非特異的に入り、粒子径が大きすぎると、マクロファージなどの免疫系細胞に貪食されやすくなるからである。また、本発明の糖脂質含有リポソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明の糖脂質含有リポソーム表面のゼ−タ電位は、生理食塩水中において、３７℃で、−５０〜１０ｍＶ、好ましくは−４０〜０ｍＶ、さらに好ましくは−３０〜−１０ｍＶである。リポソーム表面のゼータ電位は、２５℃で、−１２０ｍＶ〜−３０ｍＶであり得るが、これらに限定されない。好ましくは、２５℃で、−３０ｍＶ未満である。リポソーム表面のゼータ電位は、−１２０ｍＶ（２５℃）未満であっても、−３０ｍＶ以上であってもよい。なぜなら、リポソーム間の凝集が生じさえしなければよいからである。【０２３１】
（リポソーム膜面上へ結合した糖鎖付加量の簡易評価）
（ＦＩＴＣ結合評価）
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）に架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０２３２】
精製水に溶解したＦＩＴＣに炭酸水素アンモニウムを添加して、撹拌することにより、アミノ化ＦＩＴＣ溶液を得る。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＦＩＴＣを添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し撹拌した。限外濾過により遊離のＦＩＴＣとＴｒｉｓを除去し、ＦＩＴＣ結合リポソームを得る。【０２３３】
リポソームへのＦＩＴＣ結合量は、蛍光量（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定することで求めることができる。【０２３４】
（抗体結合量評価）
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）に架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０２３５】
このリポソーム溶液に抗体（例えば、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体）を添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し、撹拌する。限外濾過により遊離の抗体とＴｒｉｓを除去し、抗体結合リポソームを得る。【０２３６】
リポソーム表面に結合した抗体量は、Ｅｎｚｙｍｅｄ  ｉｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法によって測定することができる。抗原となるタンパク質（例えば、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））ＰＢＳ溶液を９６穴マイクロプレートに１  ｗｅｌｌにつき５０μｌずつ添加し、固相化する。プレート内の抗原溶液をすて、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを３００μｌずつ添加し、静置する。ＢＳＡ溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体標準液および抗体結合リポソームサンプルを１００μｌずつ添加し、１時間置いた後、ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄する。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１０％  Ｔｗｅｅｎ２０／９％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで希釈し、これを１００μｌずつ添加し、１時間置いた。ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄したのち１−ＳｔｅｐＴＭ  ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、反応させ、反応停止液（２Ｍ硫酸）を１００μｌずつ添加する。吸光度４５０ｎｍを測定し、抗体標準溶液からリポソーム表面の抗体結合量を求めることができる。【０２３７】
（組成物）
本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、シアリルルイスＸ（ＳＬＸ）、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。【０２３８】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。【０２３９】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【０２４０】
以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。【０２４１】
本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、シアリルルイスＸ、脂質など以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。【０２４２】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。【０２４３】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２４４】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。【０２４５】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２４６】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２４７】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２４８】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２４９】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０２５０】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。【０２５１】
さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。【０２５２】
本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。【０２５３】
本明細書において「磁気共鳴画像法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）」とは、核磁気共鳴現象を利用して生体内の内部情報を画像化する方法をいう。【０２５４】
本明細書において「核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）」とは、原子核のスピンエネルギー準位がゼーマン効果によって分離しているとき、振動磁場または電磁波との間に共鳴を起こすことをいう。【０２５５】
本明細書において「造影剤」とは、画像診断において組織の濃度（信号強度）を上昇あるいは低下させるために使われる薬剤をいう。上昇させるものを陽性造影剤、低下させるものを陰性造影剤という。陽性造影剤としては、例えば、ガドリニウムキレート剤、硫酸バリウム、水溶性ヨード造影剤等が挙げられるが、これらに限定されない。陰性造影剤には、超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ）、空気、二酸化炭素等が挙げられるが、これらに限定されない。【０２５６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置、検出または診断の対象とされる生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。本発明が対象とする動物は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットなどの小動物が用いられ得る。【０２５７】
（糖脂質の合成）
本明細書において、「保護された糖」とは、保護基で保護された糖をいう。保護基としては、糖の基を一定の反応から保護することができる限り、どのようなものでも用いることができる。なぜなら、保護基は、一般的には、水酸基またはアミノ基の保護のみならず、グリコシルかの立体制御に使われることもあるが、本発明の方法では、溶媒効果により立体制御を達成しているので、保護基の役割は一定の反応から糖を保護することにあり、それさえ達成することができれば、糖脂質を生成することができるからである。また、保護基は、その反応性を考慮して種々のものを用いることができる。したがって、保護された糖は、例えば、【０２５８】
【化５３】
0005465542.tif 000049
【０２５９】
を挙げることができるが、これらに限定されない。上に例示した保護された糖鎖は、天然に存在する主要な糖を用いたものであり、これらの組み合わせにより多彩な糖鎖が構築され得る。また、式中オリゴ糖の表示は例示であり、含まれる糖の数は２以上であれば任意の数であってよいことが理解される。また、上記の糖は、糖誘導体であってもよい。なぜなら、非天然型の糖誘導体であっても、生理活性を有する例が報告されているからである。【０２６０】
１つの実施形態において、本発明において使用される保護された糖では、水酸基の保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基等が使用され得、カルボキシル基の保護としては、メチル基、ベンジル基などが使用され得るが、これらに限定されない。脱離基としては、フェニルチオ基、フッ素基、トリクロロアセトイミデート基などが使用され得るが、これらに限定されない。【０２６１】
本明細書において、「脂質アミド保護体」とは、以下の式：【０２６２】
【化５４】
0005465542.tif 000050
【０２６３】
を有する、保護基を有する脂質アミド（例えば、セラミド）の総称であり、ここで、該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基またはアルケニル基から選択され；該Ｒ３は、ＴＢＤＰＳ、ＴＩＰＳ、Ｔｒ、イソプロピリデンケタール、メトキシベンジリデンアセタールであり得；該Ｒ４は、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチル、ピバロイルであり得る保護基である。保護基は、その反応性を考慮して種々のものを用いることができる。これらの保護基は、保護機能を果たす限り、例示された保護基以外のどのような保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、１位の１級水酸基のみをグリコシル化し、それ以外の水酸基を保護することができれば、上記以外の脂質アミド保護体を使用しても糖脂質を生成することができるからである。【０２６４】
例えば、脂質アミド保護体としては、【０２６５】
【化５５】
0005465542.tif 000051
【０２６６】
が挙げられるが、これらに限定されない。これらの保護基Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、保護機能を果たす限り、例示された保護基以外であっても、どのような保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、１位の１級水酸基のみをグリコシル化し、それ以外の水酸基を保護することができれば、上記以外の脂質アミド保護体を使用しても糖脂質を生成することができるからである。【０２６７】
本明細書において、「保護された糖と脂質アミド保護体とが結合する条件」とは、保護された糖と脂質アミド保護体とが結合する任意の条件であればよく、当業者は、上記技術に列挙した教科書を参考にして適宜実施することができる。例示的な条件としては、例えば、アルコールとカルボン酸とが結合する条件であり得る。なぜなら、保護された糖には、一カ所だけ保護されてない遊離の水酸基が存在し、脂質アミド保護体にはカルボキシル基を有するスペーサーが存在するからである。理論に束縛されることは望まないが、保護された糖と脂質アミド保護体とが結合する条件が、アルコールとカルボン酸とが結合する条件であればよいという、合理的な説明が提示される。【０２６８】
別の例示的な条件として、例えば、溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＣＨ２Ｃｌ２、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、それらの組合せであり得るが、これらに限定されない。【０２６９】
試薬は、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）、ＤＥＡＤ、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、それらの組み合わせなどであり得るが、これらに限定されない。【０２７０】
反応時間は、２時間〜４時間であり得るが、この範囲以下の時間であっても、この範囲を超える反応時間であってもよい。なぜなら、反応が充分に進まなければ、反応時間を延長することができ、他方、効率よく反応が進めば、反応時間は短縮されるからである。【０２７１】
反応温度は、例えば、０℃、０℃〜室温（例えば、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃等）、室温以上（例えば、室温〜９０℃、還流９０℃、９０℃以上）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、反応温度は、溶媒などの他の条件によって変動し得るからである。【０２７２】
これらの反応条件は、反応の進行状況を考慮しながら、当業者が適宜選択することができる。【０２７３】
本発明において使用される場合、「室温」とは、約１５℃〜約３０℃、好ましくは約２０℃〜約２５℃の範囲の温度をいう。【０２７４】
本明細書において、「糖−脂質アミドアクセプター前駆体」とは、糖−脂質アミドアクセプターではないが、これをさらに反応（例えば、縮合）させると糖−脂質アミドアクセプターとなる任意の物質をいう。別の表現方法を用いると、糖と脂質アミドアクセプター前駆体とが結合した化合物の総称である。脂質アミドがセラミドである場合は、糖−セラミドアクセプター前駆体と称することもできる。【０２７５】
糖−脂質アミドアクセプター前駆体としては、例えば、【０２７６】
【化５６】
0005465542.tif 000052
【０２７７】
該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基、アルケニル基等であり得；該Ｒ３はｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｈｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌｓｉｌｙｌ（ＴＢＤＰＳ））、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌｙ（ＴＩＰＳ））、トリチル（Ｔｒ）、イソプロピリデンケタール、メトキシベンジリデンアセタールであり得；該Ｒ４は、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチル、ピバロイルのような保護基であり得るが、これらに限定されない。これらの保護基は、保護機能を果たす限り、例示された保護基以外であっても、どのような保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、脱離基としてチオグリコシドが用いられており、その活性化条件に耐性が有りさえすれば、上記以外の保護基を使用した糖−脂質アミドアクセプター前駆体を用いても糖脂質を生成することができるからである。【０２７８】
本明細書において、「糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件」とは、糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する任意の条件であればよく、当業者は、上記技術に列挙した教科書を参考にして適宜実施することができる。【０２７９】
例示的な条件としては、反応温度は、例えば、−８０℃〜室温（例えば、−４０℃〜室温、−２０℃〜０℃、−８０℃〜０℃）であり得るが、これらに限定されない。【０２８０】
１つの実施形態において、反応温度は、反応の間に変動してもよい。反応温度を変動する例としては、例えば、初めは−８０℃、次に−６０℃、次に−４０℃、次に０℃と順に上昇させてもよいし、−４０℃から０℃に低下させてもよいし、０℃から室温へ上昇させてもよい。なぜなら、反応温度は、反応が充分に進みさえすればよいからである。従って、当業者は、反応の状況を考慮して、反応温度を適宜変更することができる。【０２８１】
溶媒としては、例えば、ＣＨ２Ｃｌ２、ジエチルエーテル（（ＣＨ２ＣＨ３）２Ｏ）、ジエチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタン、それらの組合せなどが使用され得るが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような溶媒を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する溶媒を適宜選択することができる。【０２８２】
試薬としては、例えば、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）などを使用することができる。ここで、用いられる試薬としては、触媒の他、乾燥剤などを適宜存在させることができることが理解される。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような試薬を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する試薬を適宜選択することができる。【０２８３】
反応時間としては、例えば、１〜４８時間（例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３６時間、４８時間）（好ましくは１時間〜５時間）などであり得るが、これら以外の範囲であってもよい。なぜなら、反応が充分に進まなければ、反応時間を延長することができ、他方、効率よく反応が進めば、反応時間は短縮されるからである。【０２８４】
本明細書において、「糖−脂質アミドアクセプター」とは、糖鎖を受け取る機能を有し、その構造中に糖−脂質構造を有する化合物をいう。【０２８５】
糖−脂質アミドアクセプターとしては、例えば、【０２８６】
【化５７】
0005465542.tif 000053
【０２８７】
該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基、アルケニル基であり得；該Ｒ３は、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳ、Ｔｒ、イソプロピリデンケタール、メトキシベンジリデンアセタールであり得；該Ｒ４は、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチル、ピバロイルであり得る保護基である。これらの保護基は、保護機能を果たす限り、例示された保護基以外であっても、どのような保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、脱離基としてチオグリコシドが用いられており、その活性化条件に耐性が有りさえすれば、上記以外の保護基を使用した糖−脂質アミドアクセプターを用いても糖脂質を生成することができるからである。【０２８８】
本明細書において、「保護された糖鎖ドナー」とは、保護基で保護された「糖鎖ドナー」をいう。用いられる保護基は、保護機能を果たす限り、例示された保護基以外であっても、どのような保護基であってもよいことが理解される。これら保護された糖鎖ドナーとしては、例えば、【０２８９】
【化５８】
0005465542.tif 000054
【０２９０】
を挙げることができるが、これらに限定されない。この保護された糖鎖ドナーは、糖鎖還元末端に脱離基を有し、他の保護基が保護してあれば、いかなる糖であってもよい。なぜなら、グリコシル化において活性化剤によって糖鎖還元末端の糖残基のアノマー位だけが脱離し、そこへ糖−脂質アミドアクセプターが求核攻撃を起こすからである。したがって、そのような脱離基としては、例えば、−ＳＰｈ、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ，−ＯＰＯ（ＯＰｈ）２、−ＯＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２（ここで、Ｐｈはフェニル）を挙げることができるがこれらに限定されない。【０２９１】
本明細書において、「糖鎖ドナー」とは、糖アクセプターに糖鎖を与える化合物をいう。したがって、「糖鎖ドナー」とは、糖アクセプターに対して糖鎖を提供することができる任意の物質であってもよく、代表的には、糖部分とそれ以外の部分とからなる。本明細書では、「糖鎖ドナー」と「糖供与体（ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｄｏｎｏｒ）」とは、交換可能に使用され得る。【０２９２】
本明細書において、「糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件」とは、糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する任意の条件であればよく、当業者は、上記技術に列挙した教科書を参考にして適宜実施することができる。【０２９３】
例示的な例として、例えば、約２．５当量より多くのアクセプターに対するドナーの当量が使用され得るが、これらに限定されない。なぜなら、他の条件を考慮して、当業者はドナーの当量を適宜変更することができるからである。【０２９４】
反応温度としては、例えば、約−４０〜約０℃（例えば、約−４０℃、約−３５℃、約−３０℃、約−２５℃、約−２０℃、約−１５℃、約−１０℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃など）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、反応温度は、反応が充分に進みさえすればよいからである。従って、当業者は、反応の状況を考慮して、反応温度を適宜変更することができる。【０２９５】
溶媒としては、例えば、ＣＨ２Ｃｌ２などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような溶媒を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する溶媒を適宜選択することができる。【０２９６】
試薬としては、例えば、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような試薬を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する試薬を適宜選択することができる。【０２９７】
反応時間としては、例えば、約１〜約４８時間（例えば、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間）（好ましくは１時間〜５時間）などであり得るが、これら以外の範囲であってもよい。なぜなら、反応が充分に進まなければ、反応時間を延長することができ、他方、効率よく反応が進めば、反応時間は短縮されるからである。【０２９８】
本明細書において「保護された糖脂質」とは、保護基で保護された糖脂質をいう。用いられる保護基は、保護機能を果たす限り、例示された保護基以外であっても、どのような保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、脱離基としてチオグリコシドが用いられており、その活性化条件に耐性が有りさえすれば、上記以外の保護基を使用した保護された糖脂質を用いても糖脂質を生成することができるからである。【０２９９】
本明細書において「糖脂質」とは、炭水化物残基を含む複合脂質の総称である。脂質部分の種類によりスフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質、その他の糖脂質に分けられるこれらとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＭ４が挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴ糖脂質を代表するものとしてはガラクトセレブロシド，グルコセレブロシド，グロボシドなどの中性スフィンゴ糖脂質，ガングリオシドなどの酸性スフィンゴ糖脂質があり，グリセロ糖脂質にはモノおよびジガラクトシルジアシルグリセロールなどを挙げることができる。ウロン酸を含むもの(ウロン酸含有糖脂質)、ホスホン酸を含むホスホノ糖脂質，燐酸を含む燐糖脂質など別の種類のものも見出されている。【０３００】
本明細書において「合成糖脂質」とは、合成された任意の糖脂質をいう。合成された糖脂質は、例えば、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質などが挙げられ得る。代表的な糖脂質としては、ＧＭ１，ＧＭ２，ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ，ＧＰ１ｃなどを挙げることができるが、これらに限定されない。【０３０１】
【化５９】
0005465542.tif 000055
【０３０２】
本明細書において、「アルコールとカルボン酸とが結合する条件」とは、アルコールとカルボン酸が反応する任意の条件であればよく、当業者は、上記一般技術に列挙した教科書を参酌して適宜実施することができる。例示的な条件としては、以下を挙げることができる。【０３０３】
【表２】
0005465542.tif 000056
【０３０４】
本明細書において、「スペーサー前駆体」とは、糖と糖脂質アミド保護体との間に介在して、糖と糖脂質アミド保護体とを結合する「スペーサー」の前駆体をいう。【０３０５】
本明細書において、「スペーサー」とは、糖と糖脂質アミド保護体とを結合する物質をいう。例えば、スペーサーとしては、コハク酸、マロン酸、フタル酸、オキザル酸、カルボン酸、イソプロピリデンケタール、メトキシベンジリデンアセタールが挙げられるがそれらに限定されない。なぜなら、分子内反応では反応する官能基間の相対的位置が重要であるが、本発明の方法では、比較的自由度の大きな分子（例えば、コハク酸など）で縮合反応をしても充分に良い成績が得られたので、上記以外の分子での架橋も充分に有効であると考えられるからである。【０３０６】
本明細書において、「保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件」とは、保護された糖鎖ドナーが脱保護する任意の条件であればよく、当業者は、上記技術に列挙した教科書を参考にして適宜実施することができる。【０３０７】
例示的な例として、反応温度は、例えば、室温、好ましくは、室温であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、反応温度は、反応が充分に進みさえすればよいからである。従って、当業者は、反応の状況を考慮して、反応温度を適宜変更することができる。【０３０８】
溶媒としては、例えば、ＣＨ２Ｃｌ２などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような溶媒を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する溶媒を適宜選択することができる。【０３０９】
試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような試薬を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する試薬を適宜選択することができる。【０３１０】
反応時間としては、例えば、約２〜約１２時間（例えば、約２時間、約２．５時間、約３時間、約５時間、約１０時間、約１２時間）などであり得るが、これら以外の範囲であってもよい。なぜなら、反応が充分に進まなければ、反応時間を延長することができ、他方、効率よく反応が進めば、反応時間は短縮されるからである。【０３１１】
本明細書において、「脂質アミド保護体の１位水酸基が脱保護される条件下」とは、脂質アミド保護体の１位水酸基のみが選択的に脱保護され、他の保護基に影響を与えない条件をいう。例えば、セラミド１位水酸基をシリル系保護基で保護した場合、この条件は、ＴＨＦ溶媒中、ＴＢＡＦ、ＡｃＯＨの存在下、０℃にて起こり得る。【０３１２】
本明細書において、「アシル系保護基」とは、アシル基を有する保護基をいい、例えば、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基などが挙げられるが、これらに限定されない。【０３１３】
本明細書において、「アシル系保護基が脱保護する条件」とは、アシル系保護基が脱保護する任意の条件であればよく、当業者は、上記技術に列挙した教科書を参考にして適宜実施することができる。【０３１４】
例示的な例として、反応温度は、例えば、室温〜約１００℃（例えば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、反応温度は、反応が充分に進みさえすればよいからである。従って、当業者は、反応の状況を考慮して、反応温度を適宜変更することができる。【０３１５】
溶媒としては、例えば、メタノール（ＭｅＯＨ）、水（Ｈ２Ｏ）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような溶媒を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する溶媒を適宜選択することができる。【０３１６】
試薬としては、例えば、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＣＨ３）、ＫＯＨなどが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、目的の反応が進みさえすれば、どのような試薬を用いてもよいからである。当業者は、反応の状況を考慮して、使用する試薬を適宜選択することができる。【０３１７】
反応時間としては、例えば、約１時間〜約１週間（例えば、約１時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約５時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間）などであり得るが、これら以外の範囲であってもよい。なぜなら、反応が充分に進まなければ、反応時間を延長することができ、他方、効率よく反応が進めば、反応時間は短縮されるからである。【０３１８】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【０３１９】
（糖脂質含有リポソーム）
１つの局面において、本発明は、糖脂質含有リポソームであって、該糖脂質は、合成糖脂質を含み、天然由来の糖脂質に付随する成分を含まない、リポソームを提供する。【０３２０】
１つの実施形態において、前記糖脂質は、例えば、好ましくは、ＧＭ４、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃ好ましくは、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、より好ましくは、ＧＭ３、ＧＭ４などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、これらは、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ−５ＡＣ）を有するため、架橋スペーサーとカップリング反応により結合性を有するからである。【０３２１】
他の実施形態において、前記リポソームの６８０ｎｍでの吸光度は、約０．５〜約３．０(例えば、約０．６〜３．０、０．８〜３．０、１．０〜３．０、１．５〜３．０、２．５〜３．０、０．５〜２．５、０．５〜２、０．５〜１．５、０．５〜１．０、０．５〜０．８、０．５〜０．６、０．６〜２．５、０．６〜２．０、０．６〜１．５、０．６〜１．０、０．６〜０．８、０．７〜２．５、０．７〜２．０、０．７〜１．５、０．７〜１．０、０．７〜０．８、０．８〜２．５、０．８〜２．０、０．８〜１．５、０．８〜１．０、１．０〜２．５、１．０〜２．０、１．０〜１．５、１．５〜２．５、１．５〜２．０、２．０〜２．５）であり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、リポソームの６８０ｎｍでの吸光度、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにより生体内の蛍光シグナルが検出できる範囲でありさえすればよいからである。好ましくは、リポソームの６８０ｎｍでの吸光度は、０．５以上であり得る。吸光度は、高ければ高いほど、高感度に蛍光シグナルを検出することできる。【０３２２】
別の実施形態において、前記リポソームの脂質が、約０．５〜約５．０(例えば、約０．６〜５．０、０．８〜５．０、１．０〜５．０、２．０〜５．０、３．０〜５．０、４．０〜５．０、０．５〜４．０、０．６〜４．０、０．８〜４．０、１．０〜４．０、２．０〜４．０、３．０〜４．０、０．５〜３．０、０．６〜３．０、０．８〜３．０、１．０〜３．０、２．０〜３．０、０．５〜２．０、０．６〜２．０、０．８〜２．０、１．０〜２．０、０．５〜１．０、０．６〜１．０、０．８〜１．０、０．５〜０．８、０．６〜０．８）ｍｇ／ｍＬであり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、リポソームはその使用目的によって、濃縮などの操作を行うことがあり、脂質量が５ｍｇ以上となることもあり得るからである。【０３２３】
別の実施形態において、前記リポソームのＨＳＡ量は、約０．１〜約１．０（例えば、約０．２〜１．０、０．４〜１．０、０．６〜１．０、０．８〜１．０、０．１〜０．８、０．２〜０．８、０．４〜０．８、０．６〜０．８、０．１〜０．６、０．２〜０．６、０．４〜０．６、０．１〜０．４、０．２〜０．４）ｍｇ／ｍＬであり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、リポソームはその使用目的によって、濃縮などの操作を行うことがあり、タンパク質量が１ｍｇ以上となることもあり得るからである。【０３２４】
別の実施形態において、前記リポソームの平均粒子径は、約５０〜約３００（例えば、約６０〜３００、８０〜３００、１００〜３００、１５０〜３００、２００〜３００、２５０〜３００、５０〜２５０、６０〜２５０、８０〜２５０、１００〜２５０、１５０〜２５０、２００〜２５０、５０〜２００、６０〜２００、８０〜２００、１００〜２００、１５０〜２００、５０〜１５０、６００〜１５０、８０〜１５０、１００〜１５０、５０〜１００、６０〜１００、８０〜１００、５０〜８０、６０〜８０、５０〜６０ｎｍであり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、リポソームの使用目的によっては、平均粒子径が５０ｎｍ以下あるいは３００ｎｍ以上のリポソームも企図され得、当業者は、当業者は本明細書の記載に基づき、本発明を実施するにおいて適切にリポソームの大きさを変更することができるからである。【０３２５】
別の実施形態において、前記リポソームのＺ電位は、約−１２０〜約−３０（例えば、約−１１０〜−３０、−１００〜−３０、−８０〜−３０、−５０〜−３０、−４０〜−３０、−１２０〜−４０、−１１０〜−４０、−１００〜−４０、−８０〜−４０、−５０〜−４０、−１２０〜−５０、−１１０〜−５０、−１００〜−５０、−８０〜−５０、−１２０〜−６０、−１１０〜−６０、−１００〜−６０、−８０〜−６０、−１２０〜−８０、−１１０〜−８０、−１００〜−８０、−１２０〜−１００、−１１０〜−１００、−１２０〜−１１０）ｍＶであり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、ポソームの用途によっては、リポソームのＺ電位が−１２０ｍＶ以下あるいは−３０ｍＶ以上のリポソームも企図され得、当業者は、当業者は本明細書の記載に基づき、本発明を実施するにおいて適切に上記範囲以外のリポソームを作製することができるからである。【０３２６】
他の実施形態において、前記リポソームは、所望の物質を内包し得る。所望の物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、ｃｙ５．５、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ，ＣＦＰ，ＹＦＰ）、発光酵素（ルシフェラーゼなど）、タンパク質（抗体、ｔＰＡ、β−ガラクトシダーゼ、アルブミン、ボツリヌス毒素、ジフテリアトキシンなど）、化合物（メチルプレゾニゾロン、リン酸プレゾニゾロン、ペプチド、金コロイド、Ｇｄ錯体、Ｆｅ錯体、シスプラチン、プラバスタチン、ヘパリン、塩酸ファスジル、クロドロン酸、水溶性ヨード、キチン、キトサンなど）、核酸（プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡｉなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、本発明の糖脂質含有リポソームは、内包物質の物性に併せて組成を変更することにより様々な物質を内包することができるからである。したがって、本発明の糖脂質含有リポソームは、目的に応じて、内包物質を変えることができる。【０３２７】
別の実施形態において、前記リポソームは、標的認識プローブを該リポソームの表面に含みうる。標的認識プローブとしては、例えば、糖鎖、抗体、抗原、ペプチド、核酸（例えば、アプタマーなど）、ヒアルロン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、本発明の糖脂質含有リポソームは、内包物質の物性に併せて組成を変更することにより様々な物質を内包することができるからである。したがって、本発明の糖脂質含有リポソームは、目的に応じて、内包物質を変えることができる。【０３２８】
好ましい実施形態において、前記糖鎖の付加量は、糖鎖結合密度約０．５〜約５００μｇ／ｍＬ、（例えば、約１〜５００μｇ／ｍＬ、５〜５００μｇ／ｍＬ、１０〜５００μｇ／ｍＬ、５０〜５００μｇ／ｍＬ、１００〜５００μｇ／ｍＬ、１５０〜５００μｇ／ｍＬ、２００〜５００μｇ／ｍＬ、３００〜５００μｇ／ｍＬ、４００〜５００μｇ／ｍＬ、０．５〜４００μｇ／ｍＬ、１〜４００μｇ／ｍＬ、５〜４００μｇ／ｍＬ、１０〜４００μｇ／ｍＬ、５０〜４００μｇ／ｍＬ、１００〜４００μｇ／ｍＬ、１５０〜４００μｇ／ｍＬ、２００〜４００μｇ／ｍＬ、３００〜４００μｇ／ｍＬ、０．５〜３００μｇ／ｍＬ、１〜３００μｇ／ｍＬ、５〜３００μｇ／ｍＬ、１０〜３００μｇ／ｍＬ、５０〜３００μｇ／ｍＬ、１００〜３００μｇ／ｍＬ、１５０〜３００μｇ／ｍＬ、２００〜３００μｇ／ｍＬ、０．５〜２００μｇ／ｍＬ、１〜２００μｇ／ｍＬ、５〜２００μｇ／ｍＬ、１０〜２００μｇ／ｍＬ、５０〜２００μｇ／ｍＬ、１００〜２００μｇ／ｍＬ、１５０〜２００μｇ／ｍＬ、０．５〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１００μｇ／ｍＬ、５〜１００μｇ／ｍＬ、１０〜１００μｇ／ｍＬ、５０〜１００μｇ／ｍＬ、０．５〜５０μｇ／ｍＬ、１〜５０μｇ／ｍＬ、５〜５０μｇ／ｍＬ、１０〜５０μｇ／ｍＬ、０．５〜５０μｇ／ｍＬ、１〜１０μｇ／ｍＬ、５〜１０μｇ／ｍＬ、１〜５μｇ／ｍＬ、０．５〜１μｇ／ｍＬ）であり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、糖鎖結合密度が上記範囲以外であっても、糖鎖が標的認識プローブとして機能しさえすればよいからである。【０３２９】
別の好ましい実施形態において、抗体の付加量は、約０．１〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．１〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．３〜約１００μｇ／ｍＬ（例えば、約０．４〜１００μｇ／ｍＬ、０．５〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１００μｇ／ｍＬ、５〜１００μｇ／ｍＬ、１０〜１００μｇ／ｍＬ、５０〜１００μｇ／ｍＬ、９０〜１００μｇ／ｍＬ、０．３〜９０μｇ／ｍＬ、０．４〜９０μｇ／ｍＬ、０．５〜９０μｇ／ｍＬ、１〜９０μｇ／ｍＬ、５〜９０μｇ／ｍＬ、１０〜９０μｇ／ｍＬ、５０〜９０μｇ／ｍＬ、０．３〜５０μｇ／ｍＬ、０．４〜５０μｇ／ｍＬ、０．５〜５０μｇ／ｍＬ、１〜５０μｇ／ｍＬ、５〜５０μｇ／ｍＬ、１０〜５０μｇ／ｍＬ、０．３〜１０μｇ／ｍＬ、０．４〜１０μｇ／ｍＬ、０．５〜１０μｇ／ｍＬ、１〜１０μｇ／ｍＬ、５〜１０μｇ／ｍＬ、０．３〜５μｇ／ｍＬ、０．４〜５μｇ／ｍＬ、０．５〜５μｇ／ｍＬ、１〜５μｇ／ｍＬ、０．３〜１μｇ／ｍＬ、０．４〜１μｇ／ｍＬ、０．５〜１μｇ／ｍＬ、０．３〜０．５μｇ／ｍＬ、０．４〜０．５μｇ／ｍＬ、０．３〜０．４μｇ／ｍＬ）であり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、抗体の付加量が上記範囲以外であっても、抗体が標的認識プローブとして機能しさえすればよいからである。【０３３０】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガングリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられるが、これらに限定されない。【０３３１】
ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられるが、これらに限定されない。【０３３２】
ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられるが、これらに限定されない。【０３３３】
ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルホスフェート等が挙げられるが、これらに限定されない。【０３３４】
糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガングリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤｌａ、ガングリオシドＧＴｌｂ等が挙げられるが、これらに限定されない。【０３３５】
ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ−ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。【０３３６】
このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。例えば、本発明において使用されるリポソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０〜７０％）を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含むことが好ましい。アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。【０３３７】
本発明の糖脂質含有リポソームを構成する脂質としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボチド、ＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＤ１ｂ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウム、ジセチルフォスファチジルエタノールアミン−ポリグリセリン８Ｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールであり得る。【０３３８】
好ましい実施形態において、リポソームは、ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを含ませてそれにペプチドなどのリンカーを結合させ、糖鎖を結合させることが可能である。【０３３９】
リポソームを作製するときにガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロールを合わせることによって、この糖脂質中に含まれる糖鎖を構成成分として含む、合成ガングリオシド糖鎖修飾リポソームを作製することができる。【０３４０】
別の好ましい実施形態では、本発明におけるリポソームは、ホスファチジルエタノールアミンを含むことが好ましい。ホスファチジルエタノールアミンを含むことによって、親水性付与基（トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンなど）との結合が容易になるからである。【０３４１】
別の実施形態において、本発明では、常磁性は、糖脂質含有リポソームの構成要素の少なくとも１つが常磁性を有すること、または糖脂質が新たに常磁性を有する要素をさらに有することによって付与される。【０３４２】
常磁性を有する要素としては、例えば、常磁性の金属（例えば、ガドリニウム、鉄など）、造影剤（例えば、酸化鉄粒子、ガドリニウムキレート剤、硫酸バリウム、水溶性ヨードなど）によって付与され得るが、これらに限定されない。なぜなら、磁気共鳴画像法において組成物を検出可能な状態にし得るものでありさえすればよいからである。【０３４３】
別の実施形態において、本発明では、蛍光性は、糖脂質含有リポソームの構成要素の少なくとも１つが蛍光性を有すること、または糖脂質含有リポソームが新たに蛍光性を有する要素をさらに有することによって付与される。【０３４４】
蛍光性を有する要素としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光色素としては、例えば、ｃｙ５．５（例えば、【０３４５】
【化６０】
0005465542.tif 000057
【０３４６】
【化６１】
0005465542.tif 000058
【０３４７】
ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識、それらの組み合わせのような蛍光色素によって付与され得る。【０３４８】
別の実施形態において、本発明の標的部位認識プローブで修飾された、糖脂質含有リポソーム（例えば、糖鎖修飾リポソーム、抗体リポソームなど）は、目的の送達部位への送達のために適切な密度で標的認識プローブ（例えば、糖鎖、抗体）を含み得る。【０３４９】
本発明の糖脂質含有リポソームにおいて、修飾結合密度の上限は、標的部位認識プローブ（例えば、糖鎖、抗体）によってリポソームが標的部位に集積する程度の密度であればよい。なぜなら、修飾結合密度が高密度すぎると集積性が低下するからである。例えば、糖鎖の場合、修飾結合密度の上限は、約５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、またはそれより大きくてもよく、あるいは約１００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、１０ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．９ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．８ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．７ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．６ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．４ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．３ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．２ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０９ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０８ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０７ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０６ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０４ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０３ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０２９ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０２８ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０２７ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０２６ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質であり得る。【０３５０】
抗体の場合、リポソーム溶液１ｍｌあたり３ｍｇの脂質量として換算すると、０．１μｇ／ｍｇ脂質、０．５μｇ／ｍｇ脂質、１μｇ／ｍｇ脂質、２μｇ／ｍｇ脂質、４μｇ／ｍｇ脂質、８μｇ／ｍｇ脂質、１６μｇ／ｍｇ脂質、３２ｍｇ／ｍｇ脂質であり得る。【０３５１】
修飾結合密度の下限は、標的部位への集積性を検出できる程度の密度であればよい。なぜなら、使用目的、用途、実験手法によって、修飾結合密度の下限値は、変動するからである。糖鎖の場合、修飾結合密度の下限は、例えば、約０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約０．００５ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．００２５糖質／ｍｇ脂質、０．００２ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．００１ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０９ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０８ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０７ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０６ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０５ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０４ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質、０．０３ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０２９ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０２８ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０２７ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０２６ｍｇ糖質／ｍｇ脂質、０．０２５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質であり得る。【０３５２】
抗体の場合、リポソーム溶液１ｍｌあたり約３ｍｇの脂質量として換算すると、約０．１μｇ／ｍｇ脂質、０．５μｇ／ｍｇ脂質、１μｇ／ｍｇ脂質、２μｇ／ｍｇ脂質、４μｇ／ｍｇ脂質、８μｇ／ｍｇ脂質、１６μｇ／ｍｇ脂質、３２ｍｇ／ｍｇ脂質であり得る。【０３５３】
従って、本発明の糖脂質含有リポソームとしては、上記の任意の上限と、任意の下限とを組み合わせた密度範囲（例えば、約５００ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質〜約０．０００１ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質）のものを使用することができる。理論に束縛されないが、本発明の糖脂質含有リポソームは、標的部位に集積することができれば、ＤＤＳとしての効果を期待されるからである。従って、上記の修飾結合密度の上限および下限の任意の組合せの範囲において、ＤＤＳに使用できるという効果を達成できる。なぜなら、これらの範囲では、リポソームは血中で安定であり、リポソームが標的部位に結合することができるからである。【０３５４】
１つの実施形態において、前記親水性化は、水酸基が多く存在し、アミノ基を持つ基、例えば、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）エチルアミノ基、トリス（ヒドロキシエチル）エチルアミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）エチルアミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基、トリス（ヒドロキシエチル）メチルアミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）メチルアミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）プロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシエチル）プロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシプロピル）プロピルアミノ基など）によって付与され得る。この親水性化は、上記以外のものにより付与されてもよい。なぜなら、血管内でのステルス性、安定性、および標的部位への集積性をリポソームに保持させる程度の親水性度を付与できさえすればよいからである。【０３５５】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームにおいて使用されるリポソームを構成する脂質の一部は、親水性化合物架橋基−Ｗ−トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基とＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合しており、ここで、該Ｗは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合であり得る。好ましくは、トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基であり得る。理論に束縛されないが、本発明の糖脂質含有リポソームは、上記構成をとれば、ＤＤＳに使用できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基により親水性化されたリポソームは、血中で親水性化していないものに比べて安定でステルス性も高く、それによって、血中滞留性が向上し、血液中のリポソーム濃度が低下しにくくなり、疾患部位への集積も向上するからである。【０３５６】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームでは、前記リポソームと前記標的認識プローブ基（例えば、ＳＬＸ基）とは、血清アルブミン基（例えば、ヒト血清アルブミン基）を介して結合していてもよい。理論に束縛されないが、本発明の糖脂質含有リポソームでは、血清アルブミン基を介してリポソームと標的認識プローブとを結合させれば、ＤＤＳとして使用できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リポソームの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからである。【０３５７】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームでは、前記リポソームを構成する脂質の一部は、血清アルブミン基−Ａ−リンカータンパク質架橋基−Ｘ−標的認識部位基（例えば、ＳＬＸ基）とＣＨ２−ＮＨ結合していてもよく、ここで、該Ａは、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合であり、該Ｘは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合であり得る。血清アルブミン基は、例えば、ヒト血清アルブミン基であり得る。理論に束縛されないが、上記構成をとれば、本発明の糖脂質含有リポソームが、ＤＤＳとして使用できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リポソームの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからであり、また、血清アルブミン上に架橋剤を介して糖鎖を結合させることによって、立体障害が少ない状態で標的認識プローブ基（例えば、ＳＬＸ基）をリポソーム表面に提示させることができるので、標的認識プローブ基の機能を阻害することがないからである。【０３５８】
１つの好ましい実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、
（ａ）ホスファチジルコリン類（モル比０〜７０％）
（ｂ）コレステロール類（モル比０〜７０％）
（ｃ）糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜４０％）
（ｃ’）糖脂質類の改変体、ホスファチジルグリセロール類の改変体およびスフィンゴミエリン類の改変体からなる群から選択される１種以上の脂質改変体（モル比０〜４０％）、
（ｄ）ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０〜３０％）
（ｅ）ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０〜３０％）および
（ｅ’）ホスファチジルエタノールアミン類改変体（モル比０〜３０％）
からなるリポソームを含み得る。例えば、このリポソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、３５：４０：１５：５：５：１６７の割合で含み得る。このリポソームには、さらに（ｆ）負電荷の界面活性剤が含まれ得る。負電荷の成分をリポソームに含ませることにより、負電荷を帯びている細胞にリポソームが取り込まれにくくなり、その結果、血管内皮細胞等への非特異的な吸着を阻止できると考えられるからである。【０３５９】
１つの実施形態において、このリポソームには、疾患の有無を診断するため物質として、（ｈ）標識物質が内包され得る。【０３６０】
上記リポソームにおいて、該（ｃ'）脂質改変体は、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質が、血清アルブミン基−Ａ−リンカータンパク質架橋基−Ｘ−標的認識プローブ基（例えば、ＳＬＸ基）とＣＨ２−ＮＨ結合したものであり、ここで、該Ａは、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合であり、該Ｘは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合であり得る。理論に束縛されないが、上記構成をとれば、本発明の糖脂質含有リポソームが、ＤＤＳとして使用できるという効果を達成できることは、本明細書の記載から理解されるように、血中に存在する血清アルブミンをリポソーム表面に結合させることによって、リポソームの血中での安定性およびステルス性を高め、血中滞留性を向上することで疾患部位への集積性も向上するからであり、また、血清アルブミン上に架橋剤を介して標的認識プローブ（例えば、糖鎖）を結合させることによって、立体障害が少ない状態で標的認識プローブ基（例えば、ＳＬＸ基）をリポソーム表面に提示させることができるので、標的認識プローブ基の機能を阻害することがないからである。【０３６１】
上記リポソームにおいて、該（ｅ’）改変体は、ホスファチジルエタノールアミンが、親水性化合物架橋基−Ｗ−トリス（ヒドロキシアルキル）アルキルアミノ基とＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合したものであり、ここで、該Ｗは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合であり得る。ここで、該標的認識プローブ基は、該リポソームの表面に存在し得る。本発明において使用されるリポソームは、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基により親水性化されたリポソームは、血中で親水性化していないものに比べて安定でステルス性も高く、それによって、血中滞留性が向上することで疾患部位への集積も向上すること、さらに、標的認識プローブ基がリポソームの表面に存在することにより、標的部位との結合が容易になることから、この形態をとることが好ましい。【０３６２】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームにおいて使用され得るリンカータンパク質架橋基としては、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）グルテート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，４，４−グルタレート−ｄ４基、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート基、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，７，７−スベレート−ｄ４基、ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン基、ジスクシンイミジルグルタレート、ジオチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）基、ジスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）基、スルホジスクシンイミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート）基、トリス−（スクシンイミジル）アミノトリステート）基が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、血清アルブミンのアミノ基と糖鎖のアミノ基とを架橋できさえすれば、どのような架橋基であってもよいからである。【０３６３】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームにおいて使用され得る親水性化合物架橋基は、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）グルテート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，４，４−グルタレート−ｄ４基、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート−ｄ０基、ビス（スルホスクシンイミジル）２，２，７，７−スベレート−ｄ４基、ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン基、ジスクシンイミジルグルタレート、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタータレート基、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）基、エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート）基、トリス−（スクシンイミジルアミノトリステート）基が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、親水性化合物基とリポソームまたはリンカータンパク質との間にペプチド結合を形成させることができさえすれば、どのような架橋剤であってもよいからである。【０３６４】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、さらに、（ｇ）生体適合性緩衝液を含み得る。この（ｇ）生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（ＣＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシルエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、その他のグット緩衝液（例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミンクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、アミノアセトアミド（グリシンアミド）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ））が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、リポソームに含まれる緩衝液は、生体に害を与えないものであれば良いからである。【０３６５】
（植物型セラミド部分を含むリポソーム）
他の局面において、本発明は、糖脂質として、植物型セラミド部分および糖鎖部分を含む、糖脂質含有リポソームを提供する。ここで、本発明の糖脂質含有リポソームにおいて使用される、糖脂質、リポソーム、標的認識プローブ、所望の物質等は、上述の（糖脂質含有リポソーム）等に記載される任意の形態が使用され得る。【０３６６】
１つの実施形態として、本発明の糖脂質含有リポソームに含まれる植物型セラミド部分は、例えば、【０３６７】
【化１−１】
0005465542.tif 000059
【０３６８】
であり得るが、これらに限定されない。【０３６９】
別の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームに含まれる糖鎖部分は、
例えば、【０３７０】
【化２−１】
0005465542.tif 000060
【０３７１】
であり得るが、これらに限定されない。【０３７２】
好ましい実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームに含まれる糖脂質は、例えば、【０３７３】
【化３−１】
0005465542.tif 000061
【０３７４】
であり得るが、これらに限定されない。【０３７５】
より好ましい実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームに含まれる糖脂質は、例えば、【０３７６】
【化４−１】
0005465542.tif 000062
【０３７７】
を有し、
該糖脂質含有リポソームは、リポソーム構成用脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、該糖脂質、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をモル比３５：４０：５：１５：５で含み得る。【０３７８】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、６８０ｎｍでの吸光度が、０．５〜３．０であり得るが、これらに限定されない。【０３７９】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、脂質量が、約０．５〜約５ｍｇ／ｍＬであり得る。【０３８０】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、その量は、例えば、約０．１〜約１ｍｇ／ｍＬであり得る。【０３８１】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、平均粒子径が、約５０〜約３００ｎｍであり得る。【０３８２】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、Ｚ電位が、約−３０ｍＶ〜約−１２０ｍＶであり得る。【０３８３】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、所望の物質を内包し得る。この所望の物質としては、例えば、ｃｙ５．５、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ユウロピウム含有標識、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ルシフェラーゼ、抗体、ｔＰＡ、β−ガラクトシダーゼ、アルブミン、ボツリヌス毒素、ジフテリアトキシン、メチルプレゾニゾロン、リン酸プレゾニゾロン、ペプチド、金コロイド、Ｇｄ錯体、Ｆｅ錯体、シスプラチン、プラバスタチン、ヘパリン、塩酸ファスジル、クロドロン酸、水溶性ヨード、キチン、キトサン、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡｉ等が挙げられるが、これらに限定されない。【０３８４】
１つの実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームは、標的認識プローブを該リポソームの表面に含み得る。この標的認識プローブは、例えば、糖鎖、抗体、抗原、ペプチド、核酸、ヒアルロン酸等であり得るが、これらに限定されない。【０３８５】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームに標的認識プローブとして含まれる糖鎖の付加量は、糖鎖結合密度約０．５〜約５００μｇ／ｍＬ（例えば、約１〜５００μｇ／ｍＬ、５〜５００μｇ／ｍＬ、１０〜５００μｇ／ｍＬ、５０〜５００μｇ／ｍＬ、１００〜５００μｇ／ｍＬ、１５０〜５００μｇ／ｍＬ、２００〜５００μｇ／ｍＬ、３００〜５００μｇ／ｍＬ、４００〜５００μｇ／ｍＬ、０．５〜４００μｇ／ｍＬ、１〜４００μｇ／ｍＬ、５〜４００μｇ／ｍＬ、１０〜４００μｇ／ｍＬ、５０〜４００μｇ／ｍＬ、１００〜４００μｇ／ｍＬ、１５０〜４００μｇ／ｍＬ、２００〜４００μｇ／ｍＬ、３００〜４００μｇ／ｍＬ、０．５〜３００μｇ／ｍＬ、１〜３００μｇ／ｍＬ、５〜３００μｇ／ｍＬ、１０〜３００μｇ／ｍＬ、５０〜３００μｇ／ｍＬ、１００〜３００μｇ／ｍＬ、１５０〜３００μｇ／ｍＬ、２００〜３００μｇ／ｍＬ、０．５〜２００μｇ／ｍＬ、１〜２００μｇ／ｍＬ、５〜２００μｇ／ｍＬ、１０〜２００μｇ／ｍＬ、５０〜２００μｇ／ｍＬ、１００〜２００μｇ／ｍＬ、１５０〜２００μｇ／ｍＬ、０．５〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１００μｇ／ｍＬ、５〜１００μｇ／ｍＬ、１０〜１００μｇ／ｍＬ、５０〜１００μｇ／ｍＬ、０．５〜５０μｇ／ｍＬ、１〜５０μｇ／ｍＬ、５〜５０μｇ／ｍＬ、１０〜５０μｇ／ｍＬ、０．５〜５０μｇ／ｍＬ、１〜１０μｇ／ｍＬ、５〜１０μｇ／ｍＬ、１〜５μｇ／ｍＬ、０．５〜１μｇ／ｍＬ）であり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、糖鎖結合密度が上記範囲以外であっても、糖鎖が標的認識プローブとして機能しさえすればよいからである。【０３８６】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームに標的認識プローブとして含まれる抗体の付加量は、約０．１〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．１〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．３〜約１００μｇ／ｍＬ（例えば、約０．４〜１００μｇ／ｍＬ、０．５〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１００μｇ／ｍＬ、５〜１００μｇ／ｍＬ、１０〜１００μｇ／ｍＬ、５０〜１００μｇ／ｍＬ、９０〜１００μｇ／ｍＬ、０．３〜９０μｇ／ｍＬ、０．４〜９０μｇ／ｍＬ、０．５〜９０μｇ／ｍＬ、１〜９０μｇ／ｍＬ、５〜９０μｇ／ｍＬ、１０〜９０μｇ／ｍＬ、５０〜９０μｇ／ｍＬ、０．３〜５０μｇ／ｍＬ、０．４〜５０μｇ／ｍＬ、０．５〜５０μｇ／ｍＬ、１〜５０μｇ／ｍＬ、５〜５０μｇ／ｍＬ、１０〜５０μｇ／ｍＬ、０．３〜１０μｇ／ｍＬ、０．４〜１０μｇ／ｍＬ、０．５〜１０μｇ／ｍＬ、１〜１０μｇ／ｍＬ、５〜１０μｇ／ｍＬ、０．３〜５μｇ／ｍＬ、０．４〜５μｇ／ｍＬ、０．５〜５μｇ／ｍＬ、１〜５μｇ／ｍＬ、０．３〜１μｇ／ｍＬ、０．４〜１μｇ／ｍＬ、０．５〜１μｇ／ｍＬ、０．３〜０．５μｇ／ｍＬ、０．４〜０．５μｇ／ｍＬ、０．３〜０．４μｇ／ｍＬ）であり得るが、この範囲に限定されない。なぜなら、抗体の付加量が上記範囲以外であっても、抗体が標的認識プローブとして機能しさえすればよいからである。【０３８７】
他の実施形態において、本発明の糖脂質含有リポソームに含まれる糖脂質は、天然由来の糖脂質に付随する成分を含まなくてもよい。【０３８８】
（植物型セラミド部分を含むリポソームの製造方法）
他の局面において、本発明は、植物型セラミド部分および糖鎖部分を含む糖脂質含有リポソームの製造方法を提供する。この製造方法は、以下：Ａ）糖脂質を提供する工程であって、該糖脂質は、植物型セラミド部分および糖鎖部分を含む、工程；およびＢ）提供された該糖脂質とリポソーム原料とを混合し、リポソーム形成される条件に供する工程を包含し得る。ここで、本発明の糖脂質含有リポソームにおいて使用される、糖脂質、リポソーム、標的認識プローブ、所望の物質等は、上述の（糖脂質含有リポソーム）、（植物型セラミド部分を含むリポソーム）等に記載される任意の形態が使用され得る。【０３８９】
１つの実施形態において、本発明の製造方法におけるＡ）工程は、以下の工程：（ａ）保護された糖と脂質アミド保護体とを、該保護された糖と該脂質アミド保護体とが結合する条件下で反応させて、糖−脂質アミドアクセプター前駆体を生成させる工程；（ｂ）該糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件で反応させて、糖−脂質アミドアクセプターを生成させる工程；（ｃ）該糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーとを、該糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件下で反応させて、保護された糖脂質を生成させる工程；および（ｄ）該保護された糖脂質を、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下で脱保護反応をさせて、糖脂質を生成させる工程を包含し得、ここで、脂質アミド保護体は、【０３９０】
【化５−１】
0005465542.tif 000063
【０３９１】
であり得る。【０３９２】
（用途）
１つの局面において、本発明は、医薬材料として使用するための、糖脂質含有リポソームを提供する。本発明を利用すれば、動物由来の原料も含め生体由来の原料を含まない、医薬品材料としてのリポソームを提供することができる。生体由来の原料を使用する場合、大きなコストおよびリスク（不明な生体内挙動、汚染等）を抱えることになることから、本発明はこれらを回避することができる点は顕著に優れているといえる。【０３９３】
本発明を用いた場合、医薬品等において均一性および安定性の向上を図ることができる。これは、不純物を除去することによる。【０３９４】
本発明を用いた場合、医薬品等の安全、安定供給が可能である。例えば、必要なスケールアップを可能とし、汚染及び品不足が起きないからである。【０３９５】
本発明の糖脂質含有リポソームに標的部位認識プローブを均質に結合させることにより、集積性のばらつきのないＤＤＳとしての利用が期待される。【０３９６】
また、本発明は、従来の天然由来糖脂質含有リポソームと少なくとも同一の、むしろ改善された物性を示し、天然由来糖脂質含有リポソームの代替として使用することができる。【０３９７】
他の局面において、本発明は、医薬を製造するための糖脂質含有リポソームを提供する。【０３９８】
これらのリポソームは、糖脂質として、合成した糖脂質（例えば、合成ＧＭ３、合成ＧＭ４）を用いて、当該分野において公知の任意の手法により調製することによって得ることができる。例えば、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製されたものであり得る（例えば、「リポソーム応用の新展開〜人工細胞の開発に向けて〜  監修  秋吉一成/辻井薫  ＮＴＳ  ｐ３３〜４５（２００５）」、「リポソーム  野島庄七  ｐ２１−４０  南江堂（１９８８）」を参照のこと。）が挙げられ得る。本発明の糖脂質含有リポソームは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、直接投与、経口投与され得るが、これらに限定されない。【０３９９】
ここで、本発明の医薬材料として使用するためのリポソームは、上述の（糖脂質含有リポソーム）、（組成物）等に記載される任意の形態が使用され得る。【０４００】
（糖脂質含有リポソームの製造方法）
本発明は、糖脂質含有リポソームを製造する方法を提供する、この製造方法、以下：
Ａ）合成糖脂質を提供する工程；および
Ｂ）提供された該合成糖脂質とリポソーム原料とを混合し、リポソーム形成される条件に供する工程
を包含し得る。【０４０１】
１つの実施形態において、前記Ａ）工程は、以下の工程：
（ａ）保護された糖と脂質アミド保護体とを、該保護された糖と該脂質アミド保護体とが結合する条件下で反応させて、糖−脂質アミドアクセプター前駆体を生成させる工程；
（ｂ）該糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件で反応させて、糖−脂質アミドアクセプターを生成させる工程；
（ｃ）該糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーとを、該糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件下で反応させて、保護された糖脂質を生成させる工程；および
（ｄ）該保護された糖脂質を、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下で脱保護反応をさせて、糖脂質を生成させる工程
を包含し得る。【０４０２】
ここで、本発明の糖脂質含有リポソームの製造方法において使用される糖脂質は、下記の（糖脂質の生成方法）等に記載される任意の形態が使用され得る。【０４０３】
（糖脂質の生成方法）
本発明の糖脂質含有リポソームを製造するための材料となる糖脂質は、例えば、以下の生成方法により生成することができる。この方法は、（ａ）保護された糖と脂質アミド保護体とを、該保護された糖と該脂質アミド保護体とが結合する条件下で反応させて、糖−脂質アミドアクセプター前駆体を生成させる工程；（ｂ）該糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件で反応させて、糖−脂質アミドアクセプターを生成させる工程；（ｃ）該糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーとを、該糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件下で反応させて、保護された糖脂質を生成させる工程；および（ｄ）該保護された糖脂質を、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下で脱保護反応をさせて、糖脂質を生成させる工程を包含する。【０４０４】
（ａ）保護された糖と脂質アミド保護体とを、該保護された糖と該脂質アミド保護体とが結合する条件下で反応させて、糖−脂質アミドアクセプター前駆体を生成させる工程は以下のように実施することができる。【０４０５】
適切に保護された糖と脂質アミド保護体をジクロロメタン溶媒中、室温にて、ＷＳＣ、ＤＭＡＰなどの適切な試薬を作用させ、脂質アミド保護体のカルボキシル基と糖の水酸基を結合させる。続いて、脂質アミド保護体１位の保護基の脱保護を行う。これらの条件は、当業者が、本明細書に基づき、周知技術を考慮して任意に設計することができることが理解される。【０４０６】
（ｂ）該糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件で反応させて、糖−脂質アミドアクセプターを生成させる工程は以下のように実施することができる。【０４０７】
糖−脂質アミドアクセプター前駆体を、分子内グリコシル化反応（例えば、ジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤に、ＮＩＳ２当量、ＴｆＯＨを０．３当量用いる。）を行う。これらの条件は、当業者が、本明細書に基づき、周知技術を考慮して任意に設計することができることが理解される。【０４０８】
（ｃ）該糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーとを、該糖−脂質アミドアクセプターと該保護された糖鎖ドナーとが連結する条件下で反応させて、保護された糖脂質を生成させる工程は以下のように実施することができる。【０４０９】
得られた糖−脂質アミドアクセプターと保護された糖鎖ドナーをを、適切な溶媒（例えば、ジクロロメタン溶媒）中，適切な温度（例えば、０℃）にて、活性化剤（例えば、ＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸）を０．０４当量を使用する）を作用させ、縮合反応を行う。これらの条件は、当業者が、本明細書に基づき、周知技術を考慮して任意に設計することができることが理解される。【０４１０】
（ｄ）該保護された糖脂質を、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下で脱保護反応をさせて、糖脂質を生成させる工程は以下のように実施することができる。【０４１１】
得られた保護された糖脂質を適切な溶媒（例えば、ジクロロメタン溶媒）中、室温にて、脱保護剤（例えば、ＴＦＡ（トリフルオロメタンスルホン酸））を作用させ、保護基（例えば、ＭＰＭ基）を脱保護し、続いて、適切な溶媒（例えば、メタノール溶媒）中、室温にて、別の脱保護剤（例えば、ＮａＯＭｅ（ナトリウムメトキシド））を作用させ、別の保護基（例えば、この場合、アシル系保護基）の脱保護を行う。最後に、シアル酸の有するメチルエステルがある場合は、適切な加水分解剤（例えば、水（Ｈ２Ｏ））を加え、アルカリ加水分解することで、シアル酸の有するメチルエステルを脱保護し糖脂質へと導く。これらの条件は、当業者が、本明細書に基づき、周知技術を考慮して任意に設計することができることが理解される。【０４１２】
一つの実施形態において、本方法により使用され得る保護された糖としては、例えば、【０４１３】
【化６２】
0005465542.tif 000064
【０４１４】
が挙げられる得るが、これらに限定されない糖の保護体である。【０４１５】
１つの実施形態において、本発明において使用される保護された糖では、水酸基の保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基等が使用され得、カルボキシル基の保護としては、メチル基、ベンジル基などが使用され得るが、これらに限定されない。脱離基としては、フェニルチオ基、フッ素基、トリクロロアセトイミデート基などが使用され得るが、これらに限定されない。【０４１６】
他の実施形態において、本方法において使用され得る脂質アミド保護体は、例えば、【０４１７】
【化６３】
0005465542.tif 000065
【０４１８】
ここで、該Ｒ１および該Ｒ２は、独立して、アルキル基またはアルケニル基から選択され；
該Ｒ３は、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳ、Ｔｒ、イソプロピリデンケタール、メトキシベンジリデンアセタールであり得；該Ｒ４は、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチル、ピバロイルであり得る保護基である。これらの保護基は、その機能を果たす限り別の保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、１位の１級水酸基のみをグリコシル化し、それ以外の水酸基を保護することができれば、上記以外の脂質アミド保護体を使用しても糖脂質を生成することができるからである。【０４１９】
好ましい実施形態において、本発明において使用され得る脂質アミド保護体は、【０４２０】
【化６４】
0005465542.tif 000066
【０４２１】
であり得、糖−脂質アミドアクセプター前駆体は、【０４２２】
【化６５】
0005465542.tif 000067
【０４２３】
であり得、糖−脂質アミドアクセプターが、【０４２４】
【化６６】
0005465542.tif 000068
【０４２５】
であり得、ここで
該Ｒ１が、ＭＰＭであり；該Ｒ２が、ＭＰＭ、Ｂｚであり；該Ｒ３は、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳ、Ｔｒ、イソプロピリデンケタールおよびメトキシベンジリデンアセタールからなる群より選択され；該Ｒ４および該Ｒ５は、独立して、スクシニル、マロニル、フタロイル、オキザリル、カルボニル、ベンゾイル、アセチルおよびピバロイルであり得る保護基である。これらの保護基は、その機能を果たす限り別の保護基であってもよいことが理解される。なぜなら、本発明の方法では、脱離基としてチオグリコシドが用いられており、その活性化条件に耐性が有りさえすれば、上記以外の保護基を使用した糖−脂質アミドアクセプターを用いても糖脂質を生成することができるからである。【０４２６】
別の実施形態において、本方法において、前記保護された糖と脂質アミド保護体とが結合する条件は、例えば、アルコールとカルボン酸とが結合する条件であり得る。なぜなら、保護された糖には、一カ所だけ保護されてない遊離の水酸基が存在し、脂質アミド保護体にはカルボキシル基を有するスペーサーが存在するからである。理論に束縛されることは望まないが、保護された糖と脂質アミド保護体とが結合する条件が、アルコールとカルボン酸とが結合する条件であればよいという、合理的な説明が提示される。【０４２７】
別の実施形態では、前記工程（ａ）は、溶媒中において試薬の存在下で所定の反応温度および反応時間、前記保護された糖鎖と、前記脂質アミドとを混合し、反応させることを包含する。ここで、該溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＣＨ２Ｃｌ２、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびそれらの組合せであり得；該試薬は、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）、ＤＥＡＤ、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはそれらの組み合わせであり得；および該反応時間は、２時間〜４時間であり得る。【０４２８】
別の実施形態において、この工程（ａ）では、前記反応温度は、室温以上であり得、好ましくは、室温〜９０℃であり得るが、これらは、溶媒等によって変動する。【０４２９】
１つの例示的実施形態として、試薬が、ＰＰｈ３およびＤＥＡＤであり、前記溶媒がＴＨＦであり、前記反応温度が９０℃以上である条件を挙げることができる。【０４３０】
好ましい実施形態において、工程（ａ）は、前記溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であり、前記試薬がトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３：３．０当量）およびＤＥＡＤ（３．０当量）であり、前記温度が、還流（９０℃）であり得る。【０４３１】
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）は、前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり、前記試薬が、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ：３．０当量）および２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド（１．１当量）であり、前記温度が、室温であり得る。ここで、当量は、反応の主物質（例えば、保護された糖鎖）に対する当量である。【０４３２】
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）は、前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり、前記試薬が、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ：１．５当量）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：３．０当量）であり、前記温度が、室温である。【０４３３】
別の実施形態において、前記工程（ａ）は、前記糖および前記脂質アミド保護体に、さらにスペーサー前駆体を加えることにより、前記脂質アミド保護体を、スペーサーを介して該糖に結合させることを包含し得る。前記脂質アミド保護体を、スペーサーを介して該糖に結合させるには、例えば、（１）ＷＳＣ，ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２の存在下、室温；（２）ＰＰｈ３、ＤＥＡＤ、ＴＨＦの存在下、還流、（３）２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２の存在下、室温などの条件が挙げられるが、これらに限定されない。このスペーサーと、前記糖または前記脂質アミド保護体とは予め結合されていてもよい。【０４３４】
さらなる実施形態において、工程（ａ）は、前記脂質アミド保護体を、該脂質アミド保護体の１位水酸基が脱保護される条件下で反応させて、該１位水酸基を脱保護する工程を包含し得る。該脂質アミド保護体の１位水酸基が脱保護される条件下としては、セラミド１位水酸基をシリル系保護基で保護した場合、この条件は、ＴＨＦ溶媒中、ＴＢＡＦ，ＡｃＯＨの存在下０℃を挙げることができる。【０４３５】
別の実施形態において、前記スペーサー前駆体がコハク酸であり、該コハク酸が前記脂質アミド保護体のＲ３に結合する場合、Ｒ３は、イソプロピリデンケタール、メトキシベンジリデンアセタールであり得、Ｒ４は、【０４３６】
【化６７】
0005465542.tif 000069
【０４３７】
【化６８】
0005465542.tif 000070
【０４３８】
であり得、そしてＲ５は、Ａｃ、Ｂｘであり得るが、これらに限定されない。【０４３９】
別の実施形態において、前記スペーサー前駆体がコハク酸であり、該コハク酸が前記脂質アミド保護体のＲ４に結合する場合、Ｒ３は、Ｔｒ、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳであり得、Ｒ４は、スクシニル、マロニル、オキサリル、カルボニル、グルタリル、フタロイル等であり得、そしてＲ５は、アセチル、ベンゾイルであり得るが、これらに限定されない。【０４４０】
別の実施形態において、前記スペーサー前駆体はコハク酸であり、該コハク酸が前記脂質アミド保護体のＲ５に結合する場合、Ｒ３は、Ｔｒ、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ等であり得、Ｒ４は、スクシニル、マロニル、オキサリル、カルボニル、グルタリル、フタロイル等であり得、そしてＲ５は、アセチル、ベンゾイル等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、分子内反応では反応する官能基間の相対的位置が重要であるが、本発明の方法では、比較的自由度の大きな分子（例えば、コハク酸など）で縮合反応をしても充分に良い成績が得られたので、上記以外の分子での架橋も充分に有効であると考えられるからである。【０４４１】
別の実施形態において、前記オリゴ糖の還元末端側の糖残基は、前記脂質アミド保護体とスペーサーを介して結合し得る。【０４４２】
一つの実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記分子内縮合反応を活性化させるための活性化剤の存在下で行われ、該活性化剤は、シアル酸のＳＰｈ基を活性化するものであれば、何でもよく、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）ＴＭＳＯＴｆ、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）およびそれらの組合せであり得るが、これらに限定されない。なぜなら、シアル酸のＳＰｈ基を活性化することができれば、分子内縮合反応の活性化を達成することができ、同時に糖−脂質アミドアクセプターを精製することができるからである。【０４４３】
他の実施形態において、前記工程（ｂ）は、−８０℃〜室温の反応温度にて、ＣＨ２Ｃｌ２、ジエチルエーテル（（ＣＨ２ＣＨ３）２Ｏ）、ジエチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタンおよびそれらの組合せのような溶媒中で；Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）の試薬（ここで、用いられる試薬としては、触媒の他、乾燥剤などを適宜存在させることができることが理解される。）の存在下で；１〜４８時間の反応時間にわたり行われることができる。【０４４４】
好ましい実施形態において、前記反応温度は、−２０〜０℃であり得るが、これらに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、反応が有利に進むからであり、グリコシル化の反応温度は、反応の進行を阻害しない程度でなるべく低温下で行われるのが一般的であるからである。【０４４５】
好ましい実施形態において、前記溶媒は、ジクロロメタンであり得るが、これらに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、ジクロロメタンが最も高反応性を示したからであるが、他にもジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタンを用いてもよいことが理解される。【０４４６】
好ましい実施形態において、前記試薬は、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）であり得るが、これらに限定されない。【０４４７】
好ましい実施形態において、前記反応時間は、１時間〜５時間であり得るが、これらに限定されない。ただし、反応溶媒や温度によって変化することが理解される。【０４４８】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、ＴＭＳＯＴｆ、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）であり；前記反応時間が、１．５時間であり得る。【０４４９】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、−４０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）であり；前記反応時間が、５時間であり得る。【０４５０】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、−８０℃→−６０℃→−４０℃→０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）であり；前記反応時間が、３６時間であり得る。【０４５１】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、−４０℃→０℃であり；
前記溶媒が、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）であり；前記反応時間が、４８時間であり得る。【０４５２】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、−０℃であり；前記溶媒が、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）であり；前記反応時間が、１．５時間であり得る。【０４５３】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、−２０℃であり；前記溶媒が、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）であり；前記反応時間が、３時間であり得る。【０４５４】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、０℃→室温であり；前記溶媒が、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）であり；前記反応時間が、２５時間であり得る。【０４５５】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、０℃であり；前記溶媒が、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり；前記試薬が、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、モレキュラーシーブス３オングストローム（ＭＳ３Å）であり；前記反応時間が、１時間であり得る。【０４５６】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）であり；前記反応時間が、５時間であり得る。【０４５７】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、−２０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）であり；前記反応時間が、１．５時間であり得る。【０４５８】
別の実施形態において、前記工程（ｂ）は、前記反応温度が、０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ＤＭＴＳＴ）、モレキュラーシーブス４オングストローム（ＭＳ４Å）であり；前記反応時間が、２時間であり得る。【０４５９】
工程（ｂ）における「該糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件」は、上記の条件でなくても、糖−脂質アミドアクセプター前駆体内の分子内縮合反応が進行する条件であれば、いかなる条件であってもよい。なぜなら、本法の目的は効率的な脂質部位の導入であるため、条件は問わない。また、分子内グリコシル化が達成されれば、同時に糖−脂質アミドアクセプターが合成されたことになるからであるからである。【０４６０】
別の実施形態において、前記分子内縮合反応は、グリコシル化であり得るが、これらに限定されない。グリコシル化を用いることによって、本発明では、脂質アミドを適切に糖に導入することができることを見出した。【０４６１】
一つの実施形態において、本方法の工程（ｃ）は、２．５当量より多くのアクセプターに対するドナーの当量にて；−４０〜０℃の反応温度にて；ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒中で；トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）試薬の存在下で、１〜４８時間の反応時間反応をさせることを包含し得る。【０４６２】
好ましい実施形態において、工程（ｃ）は、前記アクセプターに対するドナーの当量が２．５当量であり；前記反応温度が、０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；
前記試薬が、ＴＭＳＯＴｆであり；前記反応時間が、７時間であり得る。【０４６３】
他の実施形態において、前記保護された糖鎖ドナーは、例えば、【０４６４】
【化６９】
0005465542.tif 000071
【０４６５】
を挙げることができるが、これらに限定されない。この保護された糖鎖ドナーは、糖鎖還元末端に脱離基を有し、他の保護基が保護してあれば、いかなる糖であってもよい。なぜなら、グリコシル化において活性化剤によって糖鎖還元末端の糖残基のアノマー位だけが脱離し、そこへ糖−脂質アミドアクセプターが求核攻撃を起こすからである。したがって、そのような脱離基としては、例えば、−ＳＰｈ、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ，−ＯＰＯ（ＯＰｈ）２、−ＯＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２（ここで、Ｐｈはフェニル）を挙げることができるがこれらに限定されない。【０４６６】
一つの実施形態において、本方法の工程（ｄ）は、ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒中で；トリフルオロ酢酸の試薬の存在下で；室温の反応温度にて；２〜１２時間の反応時間にわたり行われ得るが、これらに限定されない。工程（ｄ）は、該保護された糖鎖ドナーが脱保護する条件下であれば、いかなる条件下であってもよい。【０４６７】
好ましい実施形態において、工程（ｄ）は、前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記試薬が、トリフルオロ酢酸であり；前記反応温度が、室温であり；前記反応時間が、２時間であり得る。【０４６８】
一つの実施形態において、本方法の工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）の生成物を、アシル系保護基が脱保護する条件下で反応させ、脱保護する工程をさらに包含し得る。【０４６９】
別の実施形態において、前記（ｅ）工程は、メタノール（ＭｅＯＨ）または水（Ｈ２Ｏ）の溶媒中で；ナトリウムメトキシド（ＮａＯＣＨ３）またはＫＯＨの試薬の存在下で；室温〜１００℃の反応温度にて；１時間〜１週間の反応時間にわたり行われ得るが、この条件に限定されない。なぜなら、工程（ｅ）では、アシル系保護基を脱保護することができさえすればよいからである。【０４７０】
好ましい実施形態において、工程（ｅ）の実施される条件は、前記溶媒が、メタノール（ＭｅＯＨ）であり；前記試薬が、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＭｅ）であり；前記反応温度が、室温であり；前記反応時間が、１２時間であり得る。【０４７１】
（糖鎖の合成方法）
一つの局面において、本発明は、【０４７２】
【化７０】
0005465542.tif 000072
【０４７３】
を生成させる方法を提供する。この方法は、アクセプター化合物【０４７４】
【化７１】
0005465542.tif 000073
【０４７５】
とドナー化合物【０４７６】
【化７２】
0005465542.tif 000074
【０４７７】
とを、該アクセプター化合物と該ドナー化合物とが結合する条件下で反応させる工程（Ａ）、を包含し、ここで、Ｒ１は、ＡｃまたはＨであり；Ｒ２は、ＡｃまたはＴｒｏｃであり；ＳＰｈは、【０４７８】
【化７３】
0005465542.tif 000075
【０４７９】
であり；ＭＰは、【０４８０】
【化７４】
0005465542.tif 000076
【０４８１】
であり；ＳＥは、【０４８２】
【化７５】
0005465542.tif 000077
【０４８３】
であり；Ａcは、【０４８４】
【化７６】
0005465542.tif 000078
【０４８５】
であり；Ｂｚは、【０４８６】
【化７７】
0005465542.tif 000079
【０４８７】
であり、Ｂｎは、【０４８８】
【化７８】
0005465542.tif 000080
【０４８９】
であり；Ｍｅは、メチルである。【０４９０】
他の実施形態において、前記工程（Ａ）は、以下：−４０℃〜室温の反応温度にて；ＣＨ３ＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２、ジエチルエーテル、アセトニトリル、プロピオニトリル、トルエン、ニトロメタンおよびそれらの組合せとの混合液の溶媒中で；Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、ＴＭＳＯＴｆまたはそれらの組合せの触媒の触媒の存在下で；１時間〜３日間の反応時間にわたり行われ得るが、これらに限定されない。【０４９１】
好ましい実施形態において、前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）またはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。本方法において使用され得る触媒は、シアリルドナーとラクトシルアクセプターとよく溶解し、縮合時によく立体制御(αシアリル化)を達成するものでありさえすれば、どうような触媒であってもよい。活性化したシアリルドナーとラクトシルアクセプターさえ存在すれば、縮合反応は進行するからである。【０４９２】
好ましい実施形態において、前記溶媒は、例えば、ＣＨ３ＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液であり得るが、これらに限定されない。本方法において使用され得る溶媒は、シアル酸のSPｈ基を活性化するものでありさえすれば、どうような溶媒であってもよい。なぜなら、シアリルドナーが活性化されれば、ラクトースの遊離の水酸基の求核性により速やかに反応が進行するからである。【０４９３】
好ましい実施形態において、前記反応温度は、例えば、−３０℃〜０℃であり得るが、これらに限定されない。他の好ましい実施形態において、前記反応温度は、−５０℃であり得る。【０４９４】
好ましい実施形態において、前記反応時間は、例えば、２〜３日間、約４〜８時間、好ましくは約６時間であり得るが、これらに限定されない。グリコシル化は通常１時間〜１日以内であるが、反応の進行状態によって任意に反応時間を設定することが可能であり、これらに限定されない。【０４９５】
別の実施形態において、前記工程（Ａ）は、
−３０℃→室温の反応温度で；ＣＨ３ＣＮ→ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液を溶媒として用いて；Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）を触媒として用いて；および２日間の反応時間反応させることを包含し得る。【０４９６】
別の実施形態において、前記工程（Ａ）は、
前記反応温度が、−３０℃→室温であり；前記溶媒が、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液であり；前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）およびＴＭＳＯＴｆであり；前記反応時間が、３日間であり得る。【０４９７】
別の実施形態において、工程（Ａ）は、前記反応温度が、−３０℃→０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液であり；前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）であり；前記反応時間が、２日間であり得る。【０４９８】
別の実施形態において、工程（Ａ）は、前記反応温度が、−３０℃であり；前記溶媒が、ＣＨ３ＣＮとＣＨ２Ｃｌ２との混合液であり；前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）であり；前記反応時間が、３日間であり得る。【０４９９】
別の実施形態において、工程（Ａ）は、前記反応温度が、室温であり；前記溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２であり；前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）であり；前記反応時間が、１日間であり得る。【０５００】
別の実施形態において、前記工程（Ａ）は、前記反応温度が、−５０℃であり；前記溶媒が、プロピオニトリルとＣＨ２Ｃｌ２との混合液であり；前記触媒が、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）およびトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）であり；前記反応時間が、約６時間であり得る。【０５０１】
１つの局面において、本発明は、アミノ基がトリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）で保護されたアミノ糖と、メトキシフェニル（ＭＰ）で保護された糖とを、該Ｔｒｏｃで保護されたアミノ糖と該ＭＰで保護された糖とが結合する条件下で反応させる工程を包含する、オリゴ糖を合成するための方法を提供する。【０５０２】
1つの実施形態において、本方法において使用され得る前記アミノ糖は、脱離基Ｌを有し得る。【０５０３】
他の実施形態において、前記脱離基Ｌは、例えば、−ＳＰｈ、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ、−ＯＰＯ（ＯＰｈ）２（ここで、Ｐｈはフェニルである。）、−ＯＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２、Ｂｒ、Ｃｌであり得るが、これらに限定されない。なぜなら、糖のグリコシドに用いられる脱離基であれば、同じように作用することができるからである。【０５０４】
好ましい実施形態において、前記Ｔｒｏｃで保護されたアミノ糖は、例えば、以下【０５０５】
【化７９】
0005465542.tif 000081
【０５０６】
であり得、
Ｐｒｏは、例えば、独立して、アセチル（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、ＭＰＭ（ｐ−メトシキベンジル）、メトキシフェニル（ＭＰ）などであり得るが、これらに限定されず、
Ｒ１は、例えば、アルキル、アリル（Ａｒｙｌ）であり得る。【０５０７】
他の好ましい実施形態において、前記ＭＰで保護された糖は、例えば、以下【０５０８】
【化８０】
0005465542.tif 000082
【０５０９】
であり得、
Ｐｒｏは、例えば、独立して、アセチル（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、ＭＰＭ（ｐ−メトシキベンジル）、メトキシフェニル（ＭＰ）である保護基であり得る。【０５１０】
別の実施形態において、本方法は、前記Ｔｒｏｃ基を、Ｚｎ（Ｃｕ）存在下で脱保護する工程を包含し得る。【０５１１】
（糖脂質の中間体）
１つの局面において、本発明は、例えば、以下の構造：【０５１２】
【化８１】
0005465542.tif 000083
【０５１３】
などの構造を有する化合物を提供しうるが、これらに限定されない。なぜなら、シアル酸と基本糖鎖を有しており、その還元末端がが化学選択的にに除去可能な保護基で保護されていれば、同様の方法で脂質を導入しガングリソイドに導けるからである。【０５１４】
別の局面において、本発明は、例えば、以下の式：【０５１５】
【化８２】
0005465542.tif 000084
【０５１６】
で示される化合物であって、ここで、
該Ｒ１および該Ｒ２は、例えば、独立して、アルキル基、アルケニル基などであり得；
該Ｒ４は、例えば、ベンゾイル、アセチル、ピバロイル基であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、糖脂質構築後温和な条件で除去可能なものであれば問題がないからである。【０５１７】
別の局面において、本発明は、例えば、以下の式：【０５１８】
【化８３】
0005465542.tif 000085
【０５１９】
で示される化合物であって、ここで
該Ｒ１および該Ｒ２は、例えば、独立して、アルキル基、アルケニル基であり得；
該Ｒ４は、例えば、ベンゾイル、アセチル、ピバロイルである保護基であり得る。【０５２０】
（糖鎖）
一つの局面において、本発明は、本方法の糖鎖の合成方法により製造された糖鎖を提供する。ここで糖鎖の合成方法は、上述の（糖鎖の合成方法）に記載される任意の形態が使用され得る。【０５２１】
最近、糖タンパク、プロテオグリカン、糖脂質などの複合糖質が生化学的見地から注目を集めている。さらに、植物および細菌の細胞壁に存在する多糖類の生理的役割も徐々に明らかにされている。それに伴って、それらのオリゴ糖部分（糖鎖）の構築が有機合成化学的に重要な課題として認識されるようになった（Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｈ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９８２，２１，１５５−．）。糖鎖の構造は、糖鎖を構成する糖の種類、数、配列順序、グリコシド結合の立体化学、糖残基間の結合の位置をあわせると極めて多様性に富んでいる。従って、糖鎖の合成を効率よく行うためには、グリコシド結合を立体及び位置選択的に形成させる手段が必要となる。その際の基本的な方法論となるＯ−グリコシル化反応についてこれまで数多くの研究がなされている。しかし、その立体化学を支配する要因について十分な理解が及んでいるとは言い難い。また、現状ではあらゆる種類のＯ−グリコシド結合に適用できる万能の反応は存在しない。しかしながら、既存のグリコシル化反応は立体選択性に影響を及ぼす因子について微妙に異なった特性を持っている。従って、脱離基および保護基ならびに溶媒、活性化剤、温度等の反応条件を組み合わせることにより立体選択性について幅広いバリエーションを持たせることが可能である。実際、現在では、ピラノシドに関しては、殆どのＯ−グリコシル化反応についてかなりの程度まで立体化学を制御することが可能になってきている（Ｗｕｌｆｆ，Ｇ．；Ｒｏｈｌ，Ｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９７４，１３，１５７−．）。【０５２２】
（グリコシル化反応における立体化学制御）
Ｏ−グリコシル化反応を一般式で表すと次のようになる（Ｏ−グリコシル化反応）。通常（１）を糖供与体（グリコシルドナー、ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｄｏｎｏｒ）、（２）を糖受容体（グリコシルアクセプター、ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）もしくはアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎ）と呼んでいる。糖供与体のアノマー位の置換基Ｘは脱離基（ｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）と呼ばれる。グリコシル化反応を行うためには、糖供与体の脱離能を高めるために、触媒量または化学量論量の活性化剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒまたはｐｒｏｍｏｔｅｒ）が必要である。また、活性化剤は、反応に伴って生成する酸の捕捉剤としての役割を果たすこともある。【０５２３】
（Ｏ−グリコシル化反応）【０５２４】
【化８４】
0005465542.tif 000086
【０５２５】
Ｏ−グリコシドを合成化学的見地から大別すると、２−ヒドロキシ系、２−アミノ系及び２−デオキシ系に分類される。この中で、２−ヒドロキシ系及び２−アミノ系グリコシドは、１，２−ｃｉｓ型及び１，２−ｔｒａｎｓ型に分けて考えられる。さらに、２−ヒドロキシ系グリコシドの合成においては、１，２−ｃｉｓ及び１，２−ｔｒａｎｓのそれぞれについてマンノース型（マンノ型）とグルコース型（グルコ型）で異なった方法論が用いられる。Ｏ−グリコシル化反応における立体化学制御に用いられる方法論を大まかに分類すると次の三つになる。（１）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎによるα−グリコシドの合成、（２）ＳＮ２型反転によるβ−グリコシドの合成、（３）隣接基関与を利用する１，２−ｔｒａｎｓグリコシドの合成である。下記表（Ｏ−グリコシドの分類と合成法）にＯ−グリコシドの基本構造とその合成に利用されている方法論をまとめた。以下、脱離基としてＢｒまたはＣｌを有するグリコシルハライドを例にとって基本となる考え方を述べる。【０５２６】
（Ｏ−グリコシドの分類と合成法）【０５２７】
【化８５】
0005465542.tif 000087
【０５２８】
（ａ．ｉｎ  ｓｉｔｕアノマー化（ａｎｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）法）
グルコシルハライドは、通常、その大部分が熱力学的に安定なα体（３ａ）として存在している。しかし、α体（３ａ）を重金属塩、第四級アンモニウム塩などで活性化するとオキソカルベニウムイオン（４ａ）が生成し、β−型のイオン対を経由してβ−ハライド（３ｂ）との間に平衡が成立する。ここで系内にアルコール（Ｒ−ＯＨ）が存在すれば（４ａ）はβ−グリコシド（５ｂ）を、（４ｂ）はα−グリコシド（５ａ）を与えると考えられる。隣接基関与を行わないような糖供与体はこのような様式で反応し、その立体化学はこれらの一連の反応の相対的な速度によって決定される。ここでアノマー効果を考えに入れると、（４ｂ）の方が（４ａ）より反応性が高いと考えられる（Ｋ２＞Ｋ１）。従って、この平衡が十分速ければ（Ｋ３≫Ｋ１）、反応は主として（４ｂ）を経由して進行し、α−グリコシド（５ａ）を与える。このような型の反応は、α−グルコ型及びα−マンノ型グリコシドの合成に有用である。Ｃ−２位水酸基の保護基としては、隣接基関与を防ぐためにベンジル基、アリル基などのエーテル系保護基が用いられる。２−アミノ系グリコシドもアミノ基と等価なＣ−２位置換基の種類を選ぶことにより、同様にα選択的に行うことができる。ここで注意すべきことは、高い選択性を得るためには、基質の反応性との兼ね合いで、なるべく穏和な反応条件を選ぶ必要があるということである。すなわち、基質の反応性に対して活性化剤が強すぎたり反応温度が高すぎたりすると、（３ａ）→（４ａ）→（５ｂ）の経路に沿って反応が進み、β体をかなり副生することがある。一方、あらかじめβ−ハライドを調製して直接反応に用いる方法も知られている。この方法は、反応性の高い基質のα−グリコシル化に有用である。【０５２９】
（グリコシル化反応の経路（その１））【０５３０】
【化８６】
0005465542.tif 000088
【０５３１】
（ｂ．ＳＮ２型反転を伴うグリコシル化）
ある種の不溶性触媒を活性化剤として用いるとハライドの活性化によって生成するイオン対が触媒表面に固定されるので、ハライドのアノマー間の平衡が抑制される。このような条件下では、ＳＮ２的な立体化学の反転を伴ってα−ハライドが反応し、β−グリコシドを与える。この型の反応は、特に、β−マンノ型グリコシドの合成に有用である。また、非常に強い活性化剤、脱離能の高い糖供与体を用いると、アノメリゼーションの速度を置換反応の速度が上回るため（Ｋ１＞Ｋ３）β体を主生成物として得ることができる。【０５３２】
（ｃ．隣接基関与による立体化学の制御）
糖供与体のＣ−２位水酸基の保護基としてアセチル基、ベンゾイル基などのアシル基を用いると、β−グルコ及びα−マンノ型グリコシドを選択的に合成することができる。この現象はアシル基の隣接基関与を想定することにより説明されている。すなわち、グリコシルハライド（６）から生成するオキソカルベニウムイオン（７）に対してアシルオキシ基が隣接基関与を起こし、より安定な環状アシロキソニウムイオン（８）へと異性化する。（８）に対してはアノマー位へのアルコールの求核攻撃の方向が限定されるため（経路（ａ））、１，２−ｔｒａｎｓ配位の生成物（９）のみが得られる。この方法は立体化学制御の点からは非常に信頼性の高い反応である。ただし、しばしば、（ｂ）の経路が競合しオルトエステル（１０）の副生が問題となる。また、アノマー位の隣に電子求引性のアシル基が存在するためハライドの反応性が低下し、一般的に強い反応条件が必要である。【０５３３】
２−アミノ糖についてもＮ−アシル基やＮ−フタロイル基などの隣接基関与が利用されている。一方、２−デオキシ糖はそのままでは当然隣接基関与は利用できないが、Ｃ−２位にハロゲン、硫黄、セレンなどの置換基を導入して立体化学を制御する試みが盛んに行われている。【０５３４】
（グリコシル化反応の経路（その２））【０５３５】
【化８７】
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【０５３６】
もう一つの問題点として、糖残基間の結合位置の制御がある。オリゴ糖は分子内に数多くの水酸基を有しており、これを厳密に区別して目的とする水酸基のみを反応させる必要がある。そのための手段の一つとして水酸基の反応性の相違を利用する方法がある。例えば、Ｃ−６位の第一級水酸基は他の水酸基と比べて遙かに反応性が高いため選択的に糖残基を導入することができる。また、エカトリアル水酸基がアキシアル水酸基より立体障害が小さいことを利用して、位置選択的なグリコシル化を行うこともしばしば可能である。しかしこれらはあくまで特殊な例であって、より一般的には保護基の選択的な導入によって糖質の有機溶媒に対する溶解性を高め、必要とする水酸基のみを遊離にさせておくのが望ましい。実際に複雑なオリゴ糖を合成する際には、種々の保護基をその特性に応じて使い分ける必要があり、その適切な選定が合成の正否に決定的な重要性を持っている。【０５３７】
（反応条件の設定）
グリコシル化反応は当然ながら厳密に無水の条件下で行うことが望ましい。従って溶媒、試薬、基質、反応容器の全てについてできる限り水分を除去することが必要である。特に銀塩は吸湿性が高いため注意を要する。現在では、反応の実行にあたっては窒素またはアルゴンの雰囲気下、注射器を用いて溶液を注入する方法が一般的である。銀塩を用いる反応は光を遮断して行う方がよい。一方、殆どのグリコシル化反応はモレキュラーシーブス（ＭＳ）や無水硫酸カルシウム（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ）によって妨げられない。特に小スケールの精密合成においては、その技術的な困難を軽減するためにこれらの乾燥剤の存在下で反応を行うことが多い。汎用されている溶媒にはジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、トルエン、ベンゼンなどの芳香族炭化水素、ジエチルエーテルがあり、ニトロメタンやアセトニトリル等の極性溶媒もしばしば用いられる。グリコシル化反応における溶媒の効果を一律に解釈することは困難であるが、一般的にはニトロメタンのような極性溶媒中では反応が加速される。立体選択性との関連についても多くのデータが蓄積されている。特に興味深いのはアセトニトリルとジエチルエーテルの溶媒効果である。すなわちある種の反応においてアセトニトリル中ではβ体が、ジエチルエーテルではα体が主生成物として得られる。ジクロロメタンの様な他の非極性溶媒と比べてもエーテル中ではα選択性が向上することがしばしば認められるため、アセトニトリルとの方向性の相違は単純に極性の差によるものではないようである。反応温度は基質の反応性により−７０℃から１００℃前後と極めて幅広いが、普通は反応の進行に差し障りのない限り低温で行うのが望ましいとされている。濃度の影響については系統的な研究はされていないが、分子間反応の通例として高濃度で行う方がよいと考えられる。しかし中には、高希釈下でのみよい結果が得られるという例もあり（Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｄａｉｎｅｓ，Ｒ．Ａ．；Ｏｇａｗａ，Ｙ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｔｙ，Ｔ．Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８，１１０，４６９６−．）、当業者はこれらの情報を考慮して、本明細書の記載に基づき、適宜適切な条件を選択することができる。【０５３８】
（セラミド導入新規合成戦略の好ましい製造例の立案）
上述の通り、本発明者らは、複雑なガングリオシドを合成する際には、アジドスフィンゴシンを用いてセラミド部位を導入する方法(下記参照のこと。)を汎用してきた。その理由として、糖鎖の分子量が上がるにつれて、他の方法では脂質の導入が非常に困難であることが挙げられる。アジド体にすることで、セラミドが有する二本のアルキル鎖の立体障害を軽減し、さらにセラミドの一級水酸基とアミドの水素結合に起因する一級水酸基の求核性低下を抑制することにより、セラミド骨格の導入を容易にしている。【０５３９】
糖鎖構築を完了した後に脂質を導入する方法(脂質受容体側の改良）【０５４０】
【化８８】
0005465542.tif 000090
【０５４１】
しかしながら、この従来技術の方法においても満足な導入収率は得られていない。加えて本法は、アジドスフィンゴシンの調製、アジド基の還元、脂肪酸の導入と縮合の前後に煩雑な合成ステップを要する。そこで、これらの問題を精査した結果、改善のポイントは以下の三点であると考えられる。（１）糖鎖と脂質の縮合収率の向上（２）脂質導入における立体選択性（３）セラミドの調製と変換の簡便化。本発明では、以上の点を考慮して、分子内縮合反応を用いる新規合成戦略を立案した。適切に設計された分子内グリコシル化によって、上記全ての問題点を改善できると考えられる。【０５４２】
分子内グリコシル化の主な利点は、反応性と立体選択性、位置選択性の向上にある。さらに、固相合成や連結合成への応用も可能となる。分子内反応は、分子間反応に比べて、二つの分子が一つになるためにエントロピー的に有利となり、結果として反応性が大幅に増大すると考えられる。適切に化合物を設計することで、二分子が反応点においてより頻繁に衝突し、反応の平衡状態を目的化合物側に傾けることが期待できる。また、立体選択性および位置選択性についても、用いるスペーサーの種類(長さ、有する官能基の性質、柔軟性)および位置、あるいは溶媒および反応温度を複合して考慮することによって、両分子が立体的に様々な規制を受ける結果、選択性を向上させることが可能になる。【０５４３】
合成糖化学の分野においても、この特質を生かした合成が数多く利用されてきた。分子内グリコシル化の歴史は古く、これまでに様々な反応が検討されてきた（Ｊｕｎｇ，Ｋ．Ｈ．；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０００，１００，４４２３−４４４２．）。分子内グリコシル化は、糖供与体（ｄｏｎｏｒ）と糖受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）を結合するスペーサーによって大きく三種類のタイプに分類することができる。【０５４４】
（分子内グリコシル化の分類）【０５４５】
【化８９】
0005465542.tif 000091
【０５４６】
脱離基ベース分子内グリコシル化（Ｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、糖受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）が糖供与体（ｄｏｎｏｒ）の脱離基に結合しており、脱離基の脱離と同時に受容体が供与体のアノマー炭素に攻撃するものである。【０５４７】
二機能性を有するスペーサーに結合した受容体原子（Ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ａｔｏｍ  ｖｉａ  ａ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）は、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）が二機能性を有するスペーサーを介して糖供与体（ｄｏｎｏｒ）（一般的には２位水酸基）に結合しており、脱離基が脱離すると受容体原子が同時か後処理において、スペーサーの除去に働くものである。【０５４８】
反応点でない部位をスペーサーが仲介する結合（Ｓｐａｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｖｉａ  ｎｏｎｒｅａｃｔｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒｓ）は、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）が、機能や位置を問わず反応に関与しないスペーサーによって、糖供与体（ｄｏｎｏｒ）と結合しており、一般に受容体に一つ（あるいはそれ以上）存在する無保護の水酸基によって反応が進行するものである。【０５４９】
分子内グリコシル化を利用した最も有名な提案の一つに、Ｉｔｏ、Ｏｇａｗａらによるβ−マンノシドの合成が挙げられる(Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，５５６２−．)。β−マンノシドは、マンノースの構造上、前述したｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ法も隣接基によるの立体制御法も用いることができず、その上熱力学的にも速度論的にも不安定なβグリコシドを形成しなければならない。したがって、様々な立体制御法が報告されている今日においても、最も困難な課題の一つとして存在している。以下には、高等動物における主なグリコシドの結合様式と合成難度を示す。【０５５０】
（高等動物における主なグリコシドの結合様式と合成難度）【０５５１】
【化９０】
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【０５５２】
Ｉｔｏ、Ｏｇａｗａらは分子内グリコシル化を固相合成に応用し、高立体選択的、効率的なβ−マンノシドの合成に成功している（Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，５５６２−．）。【０５５３】
（Ｉｔｏ・Ｏｇａｗａらによる分子内グリコシル化を利用したβ−マンノシドの合成）【０５５４】
【化９１】
0005465542.tif 000093
【０５５５】
上記の反応では、糖供与体を樹脂に結合することで従来のカラムクロマトグラフィーを用いた精製を省略化した。また、適切に設計された構造より、困難とされるβ-マンノシド化を立体選択的に行っている。【０５５６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本明細書の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【０５５７】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
【実施例】
【０５５８】
（合成例）
本発明において、分子内グリコシル化を用いるとき、還元末端の糖(グルコース)およびセラミドのどの水酸基を架橋するか、スペーサーとして何を用いるか、そして３種類の分子内グリコシル化のタイプのうちどの方法を用いるかを検討した。まず、還元末端の糖(グルコース)とセラミドのどの水酸基を架橋するかについては、結合収率を考慮した結果、反応性の高いグルコースの一級水酸基である６位とセラミドの３位水酸基とを結合するのが適切であると考えられる。スペーサーとして何を用いるかについては様々な検討が可能である。そこで、まずは分子内グリコシル化において汎用されており、扱いが容易で、かつ最終の脱保護においてＺｅｍｐｌｅｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｇｌｅｓｓ，Ｒ．Ｄ．；Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７２，９４，８６１３−．）によって効率的に脱保護が可能であるコハク酸を用いることとした。以上の理由より、３種類の分子内グリコシル化のタイプのうち（Ｓｐａｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｖｉａ  ｎｏｎｒｅａｃｔｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒｓ）を用いることとした。【０５５９】
分子内グリコシル化を用いるセラミドの導入にも２種類の合成戦略が考えられる。一つ目は、糖鎖構築後に分子内グリコシル化を用いる方法である（下式）。また、二つ目の方法として、先に糖鎖還元末端となるグルコースにセラミドを、コハク酸を介した分子内縮合によって導入し、その後、グルコシルセラミドアクセプターとして、糖鎖へ導入する方法も存在する（下式）。【０５６０】
（糖鎖構築後に分子内グリコシル化を用いる方法）【０５６１】
【化９２】
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【０５６２】
（グルコースに分子内グリコシル化を用いグルコシルセラミドアクセプターを利用する方法）【０５６３】
【化９３】
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【０５６４】
まず、分子内グリコシル化によって、セラミドが糖に導入できること検証することとした。そこで、糖鎖として単糖のグルコースを用いた。グルコースをセラミドと架橋させ、分子内グリコシル化を行って、分子内グリコシル化の結果を考察した。その後、二つの合成戦略をそれぞれ検討した。【０５６５】
以上の理由により、まず適切に保護されたグルコースドナーおよびセラミドアクセプターを調製し、ＧｌｃＨ−６とＣｅｒＨ−３とをコハク酸を用いて架橋する。次いで、分子内グリコシル化を行う。その結果を考察し、得られたグルコシルセラミドアクセプターを用いて糖鎖に導入を行う。そして、より複雑な糖鎖においても分子内グリコシル化の検討を行っていくこととした(スキーム１)。【０５６６】
(スキーム１)【０５６７】
【化９４】
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【０５６８】
（グルコースドナーの調製）
天然のガングリオシドにおいてグルコースは糖鎖還元末端に位置し、ガラ系（糖鎖・セラミド間がβ-ガラクトシド結合により構成される糖脂質）を除くほとんどのガングリオシドでＧａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ（１−１）Ｃｅｒの構造を有している。【０５６９】
（代表的なスフィンゴ糖脂質の基本糖鎖構造）【０５７０】
【化９５】
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【０５７１】
上記の構造を踏まえるとグルコースドナー２位の保護基には、隣接基関与が期待できるアシル系のＢｚ基を導入することが最も確実な方法であると考えられる。また、グルコースの４位へは糖鎖を導入するため、グルコースの３位の保護基は、４位糖鎖導入の際、４位水酸基の反応性低下を招かない保護基がより好ましい。以上から、３位保護基は、電子供与性保護基でその有用性が確認されているエーテル系のＢｎ基やＭＰＭ基などによる保護が適切であると考えられる。Ｂｎ基の脱保護には、主に接触水素添加が用いられているが、本法を用いると、セラミドの有する不飽和結合を還元してしまうため、Ｂｎ基よりもＭＰＭ基を用いるほうがよいようである。グルコースの４，６位は、コハク酸を用いたセラミドとの架橋の際は、遊離の水酸基で行い、最も反応性が高い６位の一級水酸基と反応性が低い４位の２級水酸基との反応性の差を利用することにより、６位選択的にコハク酸と架橋を行うこととした。コハク酸を用いた架橋の後は、グルコース４位の水酸基を選択的脱保護が可能なクロルアセチル基で保護し、分子内グリコシル化へ導くこととした。また、アノメリック位の保護については様々な保護基が考えられるが、保護基として比較的安定であり、セラミドとの縮合時に、そのまま脱離基として利用することが可能であるＳＰｈ基を用いることとした。ＳＰｈ基は、活性化剤の種類が豊富であり、他の脱離基に容易に誘導可能であるなどの特徴を有している（下式：求められるグルコースアクセプターの保護様式）。【０５７２】
（求められるグルコースアクセプターの保護様式）【０５７３】
【化９６】
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【０５７４】
さらに、より効率的なグルコースアクセプターも考案し、合成することとした。具体的には、グルコースアクセプターの２位をＢｚ基から、電子供与性のＭＰＭ基に変換し、グルコースアクセプターの調製を簡便にすると共に、アームド糖として、１位ＳＰｈ基の脱離能の向上、並びに４位糖鎖導入における反応性の向上を期待した（下式：求められるグルコースアクセプターの保護様式２）。ＭＰＭ基に変換することで、２位の隣接基関与は失われるが、コハク酸を用いた分子内グリコシル化の高立体選択性の特性を活用し、セラミド導入時の立体選択性を巧みに制御したいと考えられる。【０５７５】
（求められるグルコースアクセプターの保護様式２）【０５７６】
【化９７】
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【０５７７】
（グルコースドナー(２−Ｂｚ)の調製例）
まず、化合物１に４５℃にて、Ａｃ２Ｏ、ピリジン（ｐｙｒ．）を作用させ、定量的に化合物２を得た。その後、グルコースのアノメリック位をＳＰｈ基で保護するため、アルゴン雰囲気下、ＣＨ２Ｃｌ２溶媒中、室温にて、ＰｈＳＨとＢＦ３・ＯＥｔ２を作用させ、収率６７％で化合物３へと導いた。続いて、アルゴン雰囲気下、ＭｅＯＨ溶媒中、室温にて、ＭｅＯＮａを作用させ、２，３，４，６位のＡｃ基を脱保護し、収率９３％にて化合物４を得た。続いて、化合物４にアルゴン雰囲気下、ＭｅＣＮ溶媒中、室温にて、ＢＤＡとｐ−ＴｓＯＨを作用させ、収率９３％にて、化合物５を得た。なお、生成物の構造決定のため、化合物５をＡｃ化し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを確認したところ、化合物５の２位プロトンのシグナルδ（ｐｐｍ）３．４（ｍ、１Ｈ）と３位プロトンのシグナル３．８（ｍ、１Ｈ）が、それぞれ５．０（ｔ、１Ｈ）、５．３−５．４（ｔ、１Ｈ）と低磁場シフトを示した。このことから、４，６位のベンジリデン基導入を確認した。【０５７８】
次に、化合物５をｔｏｌｕｅｎｅ溶媒中、還流下にて、ＤＢＴＯ、ＴＢＡＢ、ＭＰＭＣｌを作用させ、収率７７％にて、化合物６を導いた。Ｂｕ２ＳｎＯは環状のｓｔａｎｎｙｌｅｎｅ化合物を形成し、シスーグリコールを真っ先に活性化し、そのうちのｅｑｕａｔｏｒｉａｌの水酸基に反応が起こりやすいとされている。化合物５には、シスグリコールが存在せず、４，６位がベンジリデン基で保護されているため、２，３位でｓｔａｎｎｙｌｅｎｅ化合物を形成し、３位選択的にＭＰＭ化が進行したものと考えられる。生成物の構造決定のため、化合物６をＡｃ化し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを確認したところ、化合物６の２位プロトンのシグナルδ（ｐｐｍ）３．５（ｍ、１Ｈ）が、５．２−５．３（ｔ、１Ｈ）と低磁場シフトしていた。このことから、２位がＡｃ化されている、つまり３位にＭＰＭ基が導入していることが確認された。【０５７９】
続いて、化合物６にアルゴン雰囲気下、ピリジン（ｐｙｒ．）溶媒中、室温にて、ベンゾイルクロライドとＤＭＡＰを作用させ、収率８０％で、化合物７を得た。化合物７を８５％−ＡｃＯＨ水溶液、４０℃にて、４，６位ベンジリデン基を脱保護し、収率８２％にて化合物８を得た（スキーム２）。【０５８０】
(スキーム２)【０５８１】
【化９８】
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【０５８２】
（グルコースドナー（２−ＭＰＭ）の調製例）
より効率的なグルコースアクセプターの調製に向けて、グルコースアクセプターの２位をＢｚ基から、電子供与性のＭＰＭ基に変換したものも調製することとした。２位をＭＰＭ基にすることで、グルコースアクセプターの調製を簡便にすると共に、アームド糖として、１位ＳＰｈ基の脱離能の向上、並びに４位糖鎖導入における反応性の向上を期待した。ＭＰＭ基に変換することで、２位の隣接基関与は失われるが、コハク酸を用いた分子内グリコシル化の立体選択性という特質を利用し、セラミド導入におけるアノメリック位の立体選択性を上手く制御したいと考えられる。【０５８３】
グルコースドナー（２−ＭＰＭ）の調製では、調製していた化合物７にＭｅＯＨ／ＴＨＦ混合溶媒中、室温にて、ＮａＯＭｅを触媒量作用させ、２位のＢｚ基を脱保護し、続いて、ＤＭＦ溶媒中、室温にて、ＮａＨとＭＰＭＣｌを作用させ、２位をＭＰＭ化し、２工程収率７０％にて、化合物９を得た。続いて化合物９に８３％酢酸を３０℃で作用させ、収率８６％にてグルコースドナー（２−ＭＰＭ）を調製した（スキーム３）。【０５８４】
(スキーム３)【０５８５】
【化９９】
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【０５８６】
（セラミドの調製例）
本発明では、当初、哺乳動物に広く存在するスフィンゴシン型のセラミドを用いて研究を進めていた。しかしながら、分子内グリコシル化の有用性が確認できない中、スフィンゴシン型のセラミドが有する不飽和結合のために、研究を遂行する上で様々な困難を強いられた。具体的には、Ｂｎ基などを脱保護する際に用いられている接触水素添加法が不飽和結合を還元してしまうために容易に用いることができない点、およびグリコシル化において、ＮＩＳのような不飽和結合に付加する可能性がある活性化剤を用いることができない点である。また、セラミドのサンプル不足にも苦しめられた。現在では、セラミドを調製する方法がいくつか報告されている（（ａ）Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｖ．；Ｋｏｒｅｖａａｒ，Ｃ．；Ｏｖｅｒｋｌｅｅｆｔ，Ｈ．；Ｍａｒｅｌ，Ｇ．Ｖ．；Ｂｏｏｍ  Ｊ．Ｖ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，６９，５６９９−５７０４．（ｂ）Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．；Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｋ．Ｔ．；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ．Ｗ．；Ｎｏｒｍａｎ，Ｌｅｗｉｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．１９９４，３１−３３．（ｃ）Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．；Ｆｕｒｕｓａｗａ．Ｋ．；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．２００２，５８，９２５７−９２６３．）が、分子内グリコシル化の有用性についての確証が早急に望まれた。そこで、まずは、大量に入手でき、保護基、活性化剤等の制限が少なく、詳細な条件検討が可能であるファイトスフィンゴシン型のセラミドを用いて、セラミド導入法の開発を行うこととした。【０５８７】
なお、本実施例ではファイトスフィンゴシン型のセラミドを用いた実施例を主に記載しているが、本明細書の他の場所に記載されているように、本発明において、哺乳動物に広く存在するスフィンゴシン型のセラミドを用いても、分子内縮合によって糖脂質が合成することができることが明らかになった。したがって、本発明は、従来では予想することができなかったセラミド一般、特にスフィンゴシン型のセラミドでも、糖脂質を分子内縮合によって製造することができることを見出した点においても顕著であるといえる。【０５８８】
スフィンゴシン型のセラミドにおいては、１位の一級水酸基の他に３位に２級の水酸基を有している。そこで、以前３位水酸基にコハク酸を結合し、１位水酸基を選択的保護・脱保護が可能な保護基で保護することでセラミドアクセプターとして用いていた。一方、ファイトスフィンゴシン型のセラミドは、１位の一級水酸基の他に３位および４位に２級の水酸基を有している。本研究では、ファイトスフィンゴシン型のセラミドを用いて、スフィンゴシン型のセラミドにも適用可能なセラミド導入法の開発を目的としているため、ファイトスフィンゴシン型のセラミドにおいても３位にコハク酸を有するセラミドアクセプターを調製することとした。また、セラミド１位の保護には、一級選択的保護が可能であり、かつ脱保護の際に他の保護基との選択性を有する保護基が求められた。グルコースドナーにおいて酸性条件に弱いＭＰＭ基を用いているため、一級水酸基の保護基として汎用されているＴｒ基は適さず、塩基性条件下で保護、脱保護が可能である保護基が求められた。この要求に叶う保護基として、シリル系のＴＢＤＰＳ基、ＴＢＤＭＳ基が考えられた。シリル系の保護基は、フッ素アニオンの求核攻撃によって選択的に脱保護が可能であり、ＴＢＤＰＳ基、ＴＢＤＭＳ基は、その嵩高さから、一級水酸基の選択的保護に汎用されている。セラミドの４位水酸基は導入が簡便で、最後の脱保護においてＺｅｍｐｌｅｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎによって同時に脱保護されるアシル系のＢｚ基を用いることとした（下式）。【０５８９】
（求められるセラミドの保護様式例）【０５９０】
【化１００】
0005465542.tif 000102
【０５９１】
（セラミドの調製１）
ファイトスフィンゴシンをスタート物質とし、２位アミノ基にステアリン酸を導入した。続いて、ＣｅｒＨ−１、ＣｅｒＨ−３をベンジリデン基を用いて、保護したところ、１，３位ベンジリデン体に加えて、３，４位ベンジリデン体が１対１の割合で、生成してくる結果となった。さらに、１，３位ベンジリデン体において、ピリジン（ｐｙｒ．）溶媒中、室温にて、無水安息香酸を１当量作用させ、セラミド４位水酸基のＢｚ化を行ったところ、反応がわずかしか進まないことが確認された。このことから、セラミド４位水酸基の周りの立体障害がＢｚ化を阻害しているのではないかと考察した（スキーム４）。【０５９２】
(スキーム４)【０５９３】
【化１０１】
0005465542.tif 000103
【０５９４】
そこで、当初の調製計画を変更し、ファイトスフィンゴシンセラミドの１位をＴＢＤＰＳ化し、３，４位遊離の水酸基で、ピリジン（ｐｙｒ．）溶媒中、室温にて、無水コハク酸を１当量作用させれば、４位水酸基の周りの立体障害により、３位選択的にコハク酸を導入できるのではないかと考えられる。しかしながら、予想に反して、４位優先的にコハク酸が導入してくるという結果となった。このため当初予定していたセラミドの３位にコハク酸を有するセラミド誘導体は得られず、４位にコハク酸を有するセラミド誘導体を得た（スキーム５）。【０５９５】
(スキーム５）【０５９６】
【化１０２】
0005465542.tif 000104
【０５９７】
（セラミドの調製例２）
前述したセラミドアクセプターの調製１（スキーム５）において、３，４位の選択性、合成効率において課題を残していたが、１，３位ベンジリデン化を検討し、これらの課題を改善した。これまでセラミド１，３位のベンジリデン基を用いた保護には、アセトニトリル溶媒中、室温にて、ＢＤＡ，ｐ−ＴｓＯＨを作用させていた。ここで、ベンジリデン基がセラミドの１，３位では六員環を形成し、３，４位では五員環を形成する事実に注目し、４０℃の熱をかけて行った。これにより、ベンジリデン基が熱力学的安定な六員環構造を優先して形成し、１，３位ベンジリデン基を用いた保護の収率向上を達成した。その後、化合物１５をピリジン（ｐｙｒ．）溶媒中，４０℃にて、無水コハク酸、ＤＭＡＰを作用させ、４位にコハク酸を導入した。化合物１６はカルボキシル基を有しているために非常に高極性となり、精製がきわめて困難であった。そこで、カルボキシル基をＢｎ基で保護した後に精製を行った。続いて、化合物１７に８０％酢酸水溶液を用いてベンジリデン基の脱保護を行った。ここで、ベンジリデン基が脱保護された１位および３位の水酸基にコハク酸が転位した化合物がそれぞれ確認された。酸性条件下、６０℃という反応温度が転位を促進したものと考えられる。続いて、化合物１８にジクロロメタン溶媒中、４０℃にて、ＴＢＤＰＳＣｌ、ＴＥＡ、ＤＭＡＰを作用させ、セラミド１位水酸基の選択的保護を行った。続いて、セラミドの３位をＡｃ基を用いて保護し、化合物２０に導いた。最後に、接触水素添加法を用いることで、セラミドアクセプターへと導いた（スキーム６）。【０５９８】
(スキーム６)【０５９９】
【化１０３】
0005465542.tif 000105
【０６００】
（グルコシルセラミドアクセプターの合成例）
（グルコースドナーとセラミドの縮合）
上述のとおり、当初予定していたセラミドの３位にコハク酸を有するセラミド誘導体は得られず、４位にコハク酸を有するセラミド誘導体を得た。しかしながら、Ｇｌｃとの大環状を形成する分子内グリコシル化や新たなグルコシルセラミドアクセプターの開発には十分に参考になると考え、得られた４位にコハク酸を有するセラミド誘導体をそのまま用いていくこととした。【０６０１】
（グルコース（２−Ｂｚ  ４−ＣＡ）とセラミドの縮合）
先に調製したグルコースドナー８とセラミドアクセプター１４を用い、ジクロロメタン溶媒中、室温にて、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロライド、ＴＥＡ、ＤＭＡＰを作用させ、収率７５％にてグルコースとセラミドをコハク酸を介して結合した（スキーム７）。懸念されていたグルコースの４位水酸基とセラミドとの縮合物は生成しなかった。その後、Ｇｌｃの４位をクロルアセチル基で保護した。続いて、セラミド１位のＴＢＤＰＳ基の脱保護を行った。Ｅｎｔｒｙ１では、ＴＨＦ溶媒中、室温にて、ＴＢＡＦを２当量作用させるという条件で行った（表３）。反応開始から３時間でスタート物質がなくなったが、６割近く、セラミド３位のアセチル基が１位へ転移し、またＧｌｃの４位のクロルアセチル基が脱離したものが生成してきた。そこで、ｅｎｔｒｙ２の条件では、ＴＢＡＦの塩基性を緩衝する酢酸を７．５当量加え、ＴＢＡＦを１．５当量作用させた。この場合は、反応終了まで、１８時間かかったが、副生成物も見られず、９２％と高収率であった。Ｅｎｔｒｙ３は、少しスケールをアップして、ｅｎｔｒｙ２と同じ条件で行った。しかし、１８時間たっても、反応が終了していなかったため、ＴＢＡＦを０．５当量追加した。そして、さらに１８時間反応させたところ、Ｇｌｃ４位のＣＡ基が脱保護された副生成物が多く生成し、目的化合物の収率は、３６％であった。ここで再現性が得られなかった詳細な原因は言及できないが、ＴＢＡＦ１．５当量に対して酢酸を７．５当量用いているため、反応の進行が遅く、スケールアップに伴ってより強くその傾向が現れたものと考えられる。【０６０２】
(スキーム７)【０６０３】
【化１０４】
0005465542.tif 000106
【０６０４】
（セラミド１−ＴＢＤＰＳ基の脱保護）【０６０５】
【表３】
0005465542.tif 000107
【０６０６】
（グルコース（２−ＭＰＭ  ４−ＣＡ）とセラミドの縮合例）
グルコースドナー１０とセラミドアクセプター１４とを、ジクロロメタン溶媒中、室温にて、ＷＳＣ、ＤＭＡＰを作用させ、２ステップ収率６１％で化合物２４を得た。続いてＧｌｃ４位のクロルアセチル化を収率９５％で行った。次に、セラミド１位のＴＢＤＰＳ基の脱保護を行った（スキーム８）。上記脱ＴＢＤＰＳ化で、反応時間が長くなるとバイプロの生成が増加してくる傾向がみられることがわかったため、ｅｎｔｒｙ１では、ＴＨＦ溶媒中、室温にて、酢酸とＴＢＡＦをそれぞれ１当量用いて、反応を行った（表４）。２時間たってもスタートは消失しなかったが、反応を停止し、生成物を確認した。主に２つの生成物が確認された。そのうち一つは、収率２２％で、目的化合物２６であった。副生成物は、目的化合物よりも極性が少し高く、分子量が１３４２であった。この化合物を１Ｈ−ＮＭＲで解析した結果、目的化合物の１Ｈ−ＮＭＲとほぼ一致したが、ＣＡ基のメチレン（−ＣＨ２）水素だけが異なり、低磁場シフトしていた。このため、ＣＡ基のＣｌがＦで置き換わった化合物が生成したのではないかと考えられたが、マススペクトルより得られた分子量が一致せず、同定には至らなかった。続いて、ｅｎｔｒｙ２では、３位Ａｃ基の転位やグルコース４位のＣＡ基への影響を抑える目的で、低温条件で反応を行った。ＴＨＦ溶媒中、０℃にて、酢酸を１当量、ＴＢＡＦを１当量用いて、反応を行った。ＴＬＣ上では、比較的高収率で進行したようにみられたが、セラミド３位のＡｃ基がセラミドの１位へ転位している副生成物も得られた。この副生成物は、反応中に生成したもの以外にも、精製中に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーの酸性によっても、増加していると考えられる。反応温度を低温にしたことで、３位Ａｃ基の転位が多少抑制された結果となった。【０６０７】
(スキーム８)【０６０８】
【化１０５】
0005465542.tif 000108
【０６０９】
（表４  セラミド１−ＴＢＤＰＳ基の脱保護）【０６１０】
【表４】
0005465542.tif 000109
【０６１１】
（グルコース（２−Ｂｚ  ４−ＯＨ）とセラミドの縮合）
これまで、分子内グリコシル化の前にグルコース４位をＣＡ基を用いて保護していたが、効率面を考慮して、その必要性について検討を行った。ＣＡ基の存在によって、セラミド１位の脱ＴＢＤＰＳ化の際に、様々な副反応が起こり問題となっていた。そこで、セラミド１位の一級水酸基とグルコース４位の二級水酸基との反応性の違い、およびコハク酸で架橋された際の立体環境の違い、分子間と分子内の反応性の違いを検討した。その結果、グルコース４位水酸基の保護を行わなくても目的の分子内グリコシル化が達成されると考えられる。そこで、グルコース４位を保護せず、分子内グリコシル化を行うこととした（スキーム９）。【０６１２】
グルコースドナー８およびセラミドアクセプター１４を、溶媒中、室温にて、ＷＳＣ、ＤＭＡＰを作用させ、２ステップ収率６８％で化合物２１へと導いた。続いて、セラミド１位のＴＢＤＰＳ基の脱保護を行った。上述のとおり、低温条件下での脱ＴＢＤＰＳでセラミド３位のＡｃ基の１位への転位が抑制されることが明らかとなったので、反応温度を０℃に設定した。化合物２１を、ＴＨＦ溶媒中、０℃にて、酢酸を３．０当量、ＴＢＡＦを３．０当量用いて反応を行った。１２時間後に反応を停止し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、収率７５％で目的化合物を得た。この反応条件においては、セラミド３位のＡｃ基が１位へ転位した化合物は殆ど確認されなかった。【０６１３】
(スキーム９)【０６１４】
【化１０６】
0005465542.tif 000110
【０６１５】
（グルコース（２−ＭＰＭ  ４−ＯＨ）とセラミドの縮合例）
グルコースドナー１０およびセラミドアクセプター１４を、溶媒中、室温にて、ＷＳＣ、ＤＭＡＰを作用させ、２工程収率６１％で化合物２４を得た。次に、セラミド１位のＴＢＤＰＳ基の脱保護を行った。ＴＨＦ溶媒中、０℃にて、酢酸を１当量、ＴＢＡＦを１当量用いて反応を行った。ＴＬＣ上では、比較的高収率で進行したようにみられたが、収率は５８％であった。副生成物として、セラミド３位のＡｃ基がセラミドの１位へ転位している副生成物も得られた。この副生成物は、反応中に生成したもの以外にも、精製中に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーの酸性によっても、増加していると考えられる（スキーム１０）。【０６１６】
(スキーム１０)【０６１７】
【化１０７】
0005465542.tif 000111
【０６１８】
（分子内グリコシル化例）
（グルコース（２−Ｂｚ  ４−ＣＡ）とセラミドの分子内グリコシル化）
化合物２３をジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤にＮＩＳ、ＴｆＯＨを用いて、反応させたところ、反応は６時間で終了し、収率６０％にて、目的の化合物２９を得た。１Ｈ−ＮＭＲにて、グルコースの１位および２位のプロトンのカップリング定数は７．８１３であり、β体であることを確認した。グルコース２位のＢｚ基によって、完全なβ選択的なグリコシル化が進行した。再現性を得る目的でもう一度同じ条件で分子内グリコシル化を行った結果、反応は３時間で終了し、収率は６９％であった（下式）。【０６１９】
（分子内グリコシル化）【０６２０】
【化１０８】
0005465542.tif 000112
【０６２１】
（グルコース（２−ＭＰＭ  ４−ＣＡ）とセラミドの分子内グリコシル化例）
化合物２６を、ジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤に、ＮＩＳを２当量、ＴｆＯＨを０．２当量用いて反応させた。アームド糖として、反応性が期待された化合物であったが、反応の進行は確認されなかった。２時間後、ＴｆＯＨを０．２当量追加し、温度を室温まで上昇させたが、僅かにラクトールが生成したのみであった。【０６２２】
（分子内グリコシル化）【０６２３】
【化１０９】
0005465542.tif 000113
【０６２４】
（グルコース（２−Ｂｚ  ４−ＯＨ）とセラミドの分子内グリコシル化例）
化合物２７をジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤にＮＩＳを２．０当量、ＴｆＯＨを０．３当量を用いて反応させた。この反応は、５時間で終了し、収率８５％にて目的の化合物３１を得た。１Ｈ−ＮＭＲから、ＧｌｃＨ−１とＧｌｃＨ−２とのカップリング定数が７．８Ｈｚであったことから、β体であることを確認した。続いて、化合物２７を、ジクロロメタン溶媒中、−２０℃にて、活性化剤にＮＩＳ３．０当量、ＴｆＯＨ０．３当量を用いて、反応させたところ（ｅｎｔｒｙ２）、収率８５％にて目的の化合物３１を得た。１Ｈ−ＮＭＲにて、ＧｌｃＨ−１とＧｌｃＨ−２とのカップリング定数が７．８Ｈｚであったことから、β体であることを確認した。Ｅｎｔｒｙ３では、ジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤にＤＭＴＳＴを１．５当量用いて、反応を行ったところ、２時間で反応は終了し、収率７５％にて、目的の化合物３１を得た。１Ｈ−ＮＭＲにて、ＧｌｃＨ−１とＧｌｃＨ−２とのカップリング定数が７．８Ｈｚであったことから、β体であることを確認した。活性化剤にＤＭＴＳＴを用いた系（ｅｎｔｒｙ３）でも反応が進行したことから、不飽和結合を有するため、活性化剤としてＮＩＳを用いることができないスフィンゴシン型のセラミドにおいても、本法の適用が期待できる結果となった。Ｅｎｔｒｙ１〜３の全てにおいて、グルコース２位Ｂｚ基の隣接基関与によって、β選択的に目的とする化合物が得られた。しかしながら、ｅｎｔｒｙ１〜３の全ての反応において僅かながら、副生成物の存在が確認された。この化合物は、目的化合物と一致する分子量を持つが、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル上に違いが現れた。ＧｌｃＨ−２は、Ｂｚ基の存在にもかかわらず高磁場シフトしており、ＧｌｃＨ−３およびＧｌｃＨ−５は目的化合物に比べてやや低磁場シフトしていた。そして、ＧｌｃＨ−４は遊離のまま存在しているが、ＧｌｃＨ−６は、低磁場シフトしていた。さらに、ＧｌｃＨ−１とＧｌｃＨ−２とのカップリング定数は１０．９Ｈｚであった。以上の点から、副生成物はオルソエステルであると予想した。オルソエステルの生成により、２位Ｂｚ基のカルボニル基が消失し、電子吸引性が低下したものと考えられる。また、ＧｌｃＨ−３、ＧｌｃＨ−５、ＧｌｃＨ−６が低磁場シフトしたことについては、コハク酸の架橋によるピラノース環のひずみによるものと推測される。オルソエステル生成時におけるＧｌｃＨ−１とＧｌｃＨ−２のカップリング定数が１０．９Ｈｚとやや大きいが、こちらもコハク酸による架橋が影響しているのではないかと考えられる。【０６２５】
（分子内グリコシル化）【０６２６】
【化１１０】
0005465542.tif 000114
【０６２７】
（グルコース（２−ＭＰＭ  ４−ＯＨ）とセラミドの分子内グリコシル化例）
まず、化合物２８をジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤にＮＩＳを２．０当量、ＴｆＯＨを０．２当量を用いて反応させた。この反応は、１時間半ほどで終了し、収率５５％（α／β比は１／１）にて目的化合物３２を得た。続いて、ｅｎｔｒｙ２では、ジクロロメタン溶媒中、−４０℃にて、活性化剤にＮＩＳ２．０当量、ＴｆＯＨ０．２当量を用いて、反応を行ったところ、５時間で反応は終了し、収率７４％（α／β比は１／１）にて目的化合物３２を得た。続いて、ｅｎｔｒｙ３では、ジクロロメタン溶媒中、−８０℃にて、活性化剤にＮＩＳ２．０当量、ＴｆＯＨ０．２当量を用いて、反応を行った。ｅｎｔｒｙ３では、反応の進行が見られなかったため、ＮＩＳ２．０当量とＴｆＯＨ０．２当量を追加し、反応温度を−６０℃、−４０℃、０℃と徐々に上げていった。３６時間反応させたが原料は消失せず、副生成物として少量のヘミアセタール体を確認した。続いて、ｅｎｔｒｙ４では、アセトニトリル溶媒中、−４０℃にて、活性化剤にＮＩＳ２．０当量、ＴｆＯＨ０．２当量を用いて、反応を行ったところ、反応の進行が遅く３５時間後に反応温度を０℃にした。４８時間で反応は終了し、収率２８％（α／β比は１／６．３）にて目的化合物３２を得た。この時副生成物として、大量のラクトールが確認された。アセトニトリルの溶媒効果によって、ジクロロメタン溶媒に比べ、β選択性は向上したが、アセトニトリル溶媒に−４０℃という反応温度が低かったためか、反応の進行が緩やかであった。極性溶媒であるアセトニトリルを用いた反応は通常加速され、ニトリル溶媒効果と合わさり、β選択性が高まると考えられる。しかしながら、反応が緩やかに進行したために本来のβ選択性が発揮されなかったのではないかと考察した。続いて、ｅｎｔｒｙ５では、アセトニトリル溶媒中、０℃にて、活性化剤にＮＩＳを３．０当量、ＴｆＯＨを０．３当量を用いて、反応を行ったところ、１．５時間で反応は終了し、収率８１％（α／β比は１／８．４）にて目的化合物３２を得た。この場合は、反応が早く進行し、β配位のカウンターアニオンを経ることなく、アセトニトリルの溶媒効果も合わさって、高いβ選択性が得られたものと考えられる。次にｅｎｔｒｙ６では、アセトニトリル溶媒中、−２０℃にて、活性化剤にＮＩＳ３．０当量、ＴｆＯＨ０．３当量を用いて、反応を行い、３時間で反応を終了させ、収率４７％（α／β比はβｏｎｌｙ）にて目的化合物３２を得た。０℃のｅｎｔｒｙ５と比べて、反応の進行が遅く、副生成物としてヘミアセタール体が確認された。Ｅｎｔｒｙ７では、α選択性を目的として、ジエチルエーテル溶媒中、０℃にて、活性化剤にＮＩＳ３．０当量、ＴｆＯＨ０．３当量を用いて、反応を行ったところ、反応の進行が遅く２０時間後に反応温度を室温にした。２５時間で反応は終了し、収率４４％（α／β比は１／１．９）にて目的化合物３２を得た。ジエチルエーテルを用いたときは通常反応は緩やかに進行し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎによってα選択的なグリコシル化が起こる。しかしながら、コハク酸を用いた架橋が不適切であるためか、目立ったα選択性は見られなかった。Ｅｎｔｒｙ８では、アセトニトリル溶媒中、０℃にて、活性化剤��ＤＭＴＳＴ４．０当量を用いて、反応を行ったところ、１時間で反応は終了し、収率７６％（α／β比は１／６）にて目的化合物３２を得た。活性化剤にＤＭＴＳＴを用いた系でも反応が進行したことから、不飽和結合を有し、活性化剤にＮＩＳが用いられないスフィンゴシン型のセラミドにおいても本法の適用が期待できる結果となった。【０６２８】
２位がＭＰＭ基のグルコースドナーを用いた分子内グリコシル化において、ａｒｍｅｄ糖としての高い反応性、すなわち高収率を期待したが、２位がＢｚ基のグルコースドナーに比べて特に目立った反応性の向上は観測されなかった。また、コハク酸による架橋によって高い立体選択性を期待したが、架橋による立体選択性は殆ど見られず、アセトニトリル等の溶媒効果による立体選択性のみ得られる結果となった。したがって、本発明は、これらの情報を元に、適宜適切な設計をすることによって実施することができることが明らかになった。【０６２９】
（分子内グリコシル化）【０６３０】
【化１１１】
0005465542.tif 000115
【０６３１】
（ＧＭ３類縁体の合成例）
（シアリルガラクトースドナーとグルコシルセラミドアクセプターの縮合）
分子内グリコシル化を用いるセラミドの導入にも２種類の合成戦略が考えられる。一つ目は、糖鎖構築後に分子内グリコシル化を用いる方法である(上式：糖鎖構築後に分子内グリコシル化を用いる方法)。また、二つ目の方法は、先に糖鎖還元末端となるグルコースにセラミドを、コハク酸を介した分子内縮合によって導入し、その後、グルコシルセラミドアクセプターとして、糖鎖へ導入する方法である（上式：グルコースに分子内グリコシル化を用いグルコシルセラミドアクセプターを利用する方法）。先の合成戦略において、まず単糖のグルコースを用いて、セラミドと架橋し、分子内グリコシル化を行い、その結果を受けて二つの合成戦略をそれぞれ検討していくと述べた。そこで、まずは、合成戦略の２つ目の方法の得られたグルコシルセラミドアクセプターを用いて、糖鎖（Ｎｅｕα(２−３）Ｇａｌ)に導入することとした。【０６３２】
アクセプターに対して２．５当量のシアリルα（２−３）ガラクトースドナー３３およびグルコシルセラミドアクセプター３２をジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤にＴＭＳＯＴｆ０．０２当量用い反応させた。反応の進行が現れなくなったため、２時間後にＴＭＳＯＴｆを０．０２当量追加した。７時間後に反応は終了し、収率は７２％（βｏｎｌｙ）であった。１Ｈ−ＮＭＲにて、ＧａｌＨ−１とＧａｌＨ−２のカップリング定数を８．１Ｈｚとβ体であることを確認した。副生成物としてシアリルガラクトースのラクトールが確認された。シアリルガラクトースドナーを２．５当量用いたときは、アクセプターの穏やかな反応性にもドナーが十分量存在したため、反応が完結した。【０６３３】
アクセプターに対して１．２当量のシアリルα（２−３）ガラクトースドナー３３およびグルコシルセラミドアクセプター３２を、ジクロロメタン溶媒中、０℃にて、活性化剤にＴＭＳＯＴｆ０．０２当量用い反応させた。４時間後にＴＭＳＯＴｆを０．０２当量追加した。６時間後に反応は終了し、収率は１８％(βｏｎｌｙ)であった。アクセプターが消失せず、ドナーがラクトールとなってしまった。副生成物としてシアリルガラクトースのラクトールとシアリルガラクトースのガラクトースの２位Ｂｚ基が１位へ転位した化合物が確認された。１Ｈ−ＮＭＲにて、ＧａｌＨ−１とＧａｌＨ−２のカップリング定数を８．１Ｈｚとβ体であることを確認した。シアリルがラクとードナーを１．２当量用いた時は、アクセプターの攻撃が起こる前に、ドナーがラクトールとなり、反応が完結しなかった。以上の結果から、グルコシルセラミドアクセプターは高い反応性を有しているとは言い難い。しかしながら、ドナーを十分量用いたｅｎｔｒｙ１では、高収率でグリコシル化が達成されており、また、ｅｎｔｒｙ２においても未反応のアクセプターが回収可能なことからアクセプターの安定性は高いといえる。よって、ドナーの脱離基として非常に不安定なイミデートを他の安定な脱離基に変換することでグリコシル化の収率向上が期待できるのではないかと考えられる。【０６３４】
（ＮｅｕＧａｌドナー＋ＧｌｃＣｅｒアクセプター）【０６３５】
【化１１２】
0005465542.tif 000116
【０６３６】
（脱保護例）【０６３７】
【化１１３】
0005465542.tif 000117
【０６３８】
（実施例１．一般手順）
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ４００および５００により測定した。化学シフトを、δ０  ｐｐｍに調節したＭｅ４Ｓｉのシグナルと相対的なｐｐｍ（δ）で示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を使用したＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘでの推定イオン形式で記録した。モレキュラーシーブを、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から購入し、使用前に、マッフル炉中で３００℃、２時間、乾燥させた。反応媒体としての溶媒をモレキュラーシーブで乾燥させ、精製せずに用いた。ＴＬＣ分析を、Ｍｅｒｃｋ  ＴＬＣ（ガラスプレート上シリカゲル６０Ｆ２５４）上で実施した。Ｆｕｊｉ  Ｓｉｌｙｓｉａ  Ｃｏ．により製造されたシリカゲル（８０メッシュおよび３００メッシュ）を、フラッシュカラムクロマトグラフィーに用いた。シリカゲルの量は、充填したサンプルの２００〜４００倍の重量として通常見積もった。カラムクロマトグラフィーにおける溶媒系は、ｖ／ｖで記載した。エバポレーションおよび濃度を減圧下で実施した。比旋光度を、Ｈｏｒｉｂａ  ＳＥＰＡ−３００高感度偏光計で測定した。【０６３９】
（グルコースドナー（２−Ｂｚ）の調製例）
まず、化合物１に４５℃にて、Ａｃ２Ｏ、ピリジン（ｐｙｒ．）を作用させ、定量的に化合物２を得た。その後、グルコースのアノメリック位をＳＰｈ基で保護するため、アルゴン雰囲気下、ＣＨ２Ｃｌ２溶媒中、室温にて、ＰｈＳＨとＢＦ３・ＯＥｔ２を作用させ、収率６７％で化合物３へと導いた。続いて、アルゴン雰囲気下、ＭｅＯＨ溶媒中、室温にて、ＭｅＯＮａを作用させ、２，３，４，６位のＡｃ基を脱保護し、収率９３％にて化合物４を得た。続いて、化合物４にアルゴン雰囲気下、ＭｅＣＮ溶媒中、室温にて、ＢＤＡとｐ−ＴｓＯＨを作用させ、収率９３％にて、化合物５を得た。なお、生成物の構造決定のため、化合物５をＡｃ化し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを確認したところ、化合物５の２位プロトンのシグナルδ（ｐｐｍ）３．４（ｍ、１Ｈ）と３位プロトンのシグナル３．８（ｍ、１Ｈ）が、それぞれ５．０（ｔ、１Ｈ）、５．３−５．４（ｔ、１Ｈ）と低磁場シフトを示した。このことから、４，６位のベンジリデン基導入を確認した。【０６４０】
次に、化合物５をトルエン溶媒中、還流下にて、ＤＢＴＯ、ＴＢＡＢ、ＭＰＭＣｌを作用させ、収率７７％にて、化合物６を導いた。Ｂｕ２ＳｎＯは環状のスタニレン（ｓｔａｎｎｙｌｅｎｅ）化合物を形成し、シスーグリコールを真っ先に活性化し、そのうちのｅｑｕａｔｏｒｉａｌの水酸基に反応が起こりやすいとされている。化合物５には、シスグリコールが存在せず、４，６位がベンジリデン基で保護されているため、２，３位でｓｔａｎｎｙｌｅｎｅ化合物を形成し、３位選択的にＭＰＭ化が進行したものと考えた。生成物の構造決定のため、化合物６をＡｃ化し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを確認したところ、化合物６の２位プロトンのシグナルδ（ｐｐｍ）３．５（ｍ、１Ｈ）が、５．２−５．３（ｔ、１Ｈ）と低磁場シフトしていた。このことから、２位がＡｃ化されている、つまり３位にＭＰＭ基が導入していることが確認された。【０６４１】
（フェニル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−１−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコプラノシド（７）の調製）
ピリジン（３．５６ｍＬ）中、化合物６（１７１ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ベンゾイル（６２．０μＬ、０．５３４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４．３５ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を添加した。そしてこの混合物を、室温で４時間攪拌した。出発物質が完全に消費したことを、ＴＬＣ分析（トルエン／ＭｅＯＨ  ５０／１）で確認した。この反応混合物に０℃でメタノールを添加し、トルエンで共エバポレートした。この混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、２  Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残渣を、シリカゲル（ＣＨＣｌ３）のカラムクロマトグラフィーにより精製し、７（１６６ｍｇ、８０％）を得た。【０６４２】
【数１−１】
0005465542.tif 000118
【０６４３】
【数１−２】
0005465542.tif 000119
【０６４４】
（フェニル２−Ｏ−ベンゾイル−１−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）の調製）
ＡｃＯＨ（１５．０ｍＬ）中、化合物７（２００ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（３．００ｍＬ）を添加した。４０℃で１２時間攪拌（ＴＬＣモニタリング：トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／１）した後、この混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、そしてＨ２Ｏ、飽和水性のＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。この残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ３／１）により精製して８（１４５ｍｇ、８６％）を得た。【０６４５】
【数２−１】
0005465542.tif 000120
【０６４６】
【数２−２】
0005465542.tif 000121
【０６４７】
（フェニル４，６−Ｏ−ベンジリデン−１−デオキシ−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（９）の調製）
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ，Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ，Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ，ａｎｄ  Ｍａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、以下の実験を行った。【０６４８】
例えば、ＭｅＯＮａを含むＭｅＯＨ／ＴＨＦ＝２／１中の化合物７の溶液を室温で撹拌して、化合物７ａを得た。【０６４９】
ＤＭＦ（８５．６ｍＬ）中、化合物７ａ（４．１１ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨ（３０７ｍｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間攪拌した後、０℃で、この混合物にＭＰＭＣｌ（１．７４ｍＬ，１２．５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１２時間攪拌した。出発物質が完全に消費したことを、ＴＬＣ分析（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２０／１）で確認した。この混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、２  Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）そして濃縮した。この残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２００／１）により精製し、９（３．６０ｇ、７０％）を得た。【０６５０】
【数３】
0005465542.tif 000122
【０６５１】
（グルコースドナー１０（２−ＭＰＭ）の調製）
化合物８の調製と同様の方法を使用して、以下の実験を行なった。例えば、化合物９に８３％酢酸を３０℃で作用させ、収率８６％にてグルコースドナー１０（２−ＭＰＭ）を調製した。【０６５２】
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン（１３）の調製）
ＣＨ２Ｃｌ２中、化合物１１の溶液に、ＷＳＣ存在下、ステアリン酸を添加した。室温で攪拌し、１２（９６％）を得た。【０６５３】
ＣＨ２Ｃｌ２（８．５７ｍＬ）中、化合物１２（５００ｍｇ、０．８５７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０．０ｍＬ）の溶液に、ＴＢＤＰＳＣｌ（０．２６０ｍＬ，１．０３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２０９ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２０時間攪拌（ＴＬＣモニタリング：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ  ５０／１）した後、この混合物にＭｅＯＨを０℃で添加した。濃縮後、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ  １００／１）により精製し、１３（５３３ｍｇ、７６％）を得た。【０６５４】
【数４】
0005465542.tif 000123
【０６５５】
（セラミド誘導体１４の調製１）
Ｎｕｍａｔａ，Ｍ．；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９０，２０３，２０５−２１７．の記載に基づいて、以下の実験を行った。例えば、化合物１３を、ピリジン溶媒中、室温にて、ＤＭＡＰ存在下、無水コハク酸を１当量と作用させ、次いで、４０℃に昇温した。この生成物をＡｃ２Ｏで処理して、４位にコハク酸を有するセラミド誘導体１４を得た（２工程で収率４０％）。【０６５６】
（化合物１６の調製）
Ｎｕｍａｔａ，Ｍ．；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９０，２０３，２０５−２１７．の記載に基づいて、以下の実験を行った。例えば、化合物１２を、アセトニトリル溶媒中、ＢＤＡ、ｐ−ＴｓＯＨを加えて、４０℃の熱をかけ、化合物１５を得た。この化合物１５をピリジン溶媒中、４０℃にて、無水コハク酸、ＤＭＡＰを作用させ、４位にコハク酸を導入した化合物１６を得た。【０６５７】
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１，３−Ｏ−ベンジリデン−１−デオキシ−４−Ｏ−スクシノイルベンジルエステル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン（１７）の調製）
ＭｅＣＮ（１３０ｍＬ）およびＤＭＦ（１３０ｍＬ）中、化合物１６（１０．０ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．８０ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）およびＢｎＢｒ（１．７０ｍＬ，１４．３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１６時間攪拌（ＴＬＣモニタリング：トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／１）した。この反応混合物をトルエンで共エバポレートし、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を、２  Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ４０／１）により精製し、１７（９．０ｇ、８０％）を得た。【０６５８】
【数５】
0005465542.tif 000124
【０６５９】
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−Ｏ−スクシノイルベンジルエステル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン（１８）の調製）
ＡｃＯＨ（０．８ｍＬ）中、化合物１７（２０．３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（０．２ｍＬ）を添加した。６０℃で１２時間、攪拌（ＴＬＣモニタリング：トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／１）した後、この混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／１）により精製し、１８（１１．０ｍｇ、６２％）を得た。【０６６０】
【数６−１】
0005465542.tif 000125
【０６６１】
【数６−２】
0005465542.tif 000126
【０６６２】
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−４−Ｏ−スクシノイルベンジルエステル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン（２０）の調製）
１，２−ジクロロエタン（１．３ｍＬ）中、化合物１８（１００ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．０ｍＬ）の溶液に、ＴＢＤＰＳＣｌ（６６．５μＬ、０．２５９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３０．６ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、４０℃で１２時間攪拌した。出発物質が完全に消費したことを、ＴＬＣ分析（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／１）で確認した後、０℃でＭｅＯＨを添加した。この反応混合物を、エバポレートし、３０時間、真空ラインで引いた。この残渣を、ピリジン（３．０ｍＬ）に溶解し、Ａｃ２Ｏを添加した。この混合物を、室温で、１６時間、攪拌（ＴＬＣモニタリング：トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／１）した。この反応混合物を、トルエンで共エバポレートし、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を、２Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ４／１）により精製し、２０（９８．０ｍｇ、７２％）を得た。【０６６３】
【数７−１】
0005465542.tif 000127
【０６６４】
【数７−２】
0005465542.tif 000128
【０６６５】
（セラミド誘導体１４の調製２）
Ｎｕｍａｔａ，Ｍ．；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９０，２０３，２０５−２１７．の記載に基づいて、以下の実験を行った。例えば、化合物２０を、ＥｔＯＨ中、Ｐｄ（ＯＨ）２を使用して、４０℃で、接触水素添加法を用いることで、セラミドアクセプター１４を得た。【０６６６】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−２−Ｏ−ベンゾイル−１−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２１）の調製１）
ＣＨ２Ｃｌ２（２．１２ｍＬ）中、化合物１４（２０４ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４，６−トリクロロ塩化ベンゾイル（５０．０μＬ、０．３１８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３９．０ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４４．４μＬ、０．３１８ｍｍｏｌ）および化合物８（１０５ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温で２時間攪拌した。出発物質が完全に消費したことを、ＴＬＣ分析（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／１）で確認した。この混合物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、そして飽和水溶性ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残渣を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／６）により精製し、２１（２２９ｍｇ、７５％）を得た。【０６６７】
【数８−１】
0005465542.tif 000129
【０６６８】
【数８−２】
0005465542.tif 000130
【０６６９】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−クロロアセチル−１−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２２）の調製）
ＣＨ２Ｃｌ２（２．２０ｍＬ）中、化合物２１（２００ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（３８．７μＬ、０．２７７ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（４７．４ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温で２時間攪拌した。出発物質が完全に消費したことを、ＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／３）で確認した。この反応混合物に、０℃でメタノールを添加し、この混合物をＣＨＣｌ３希釈し、２Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。残渣を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／８）により精製し、２２（２０８ｍｇ、９８％）を得た。【０６７０】
【数９−１】
0005465542.tif 000131
【０６７１】
【数９−２】
0005465542.tif 000132
【０６７２】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−クロロアセチル−１−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２３）の調製）
ＴＨＦ（２２４μＬ）中、化合物２２（１７．０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｃＯＨ（５．００μＬ、０．０８４ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（１６．８μＬ、０．０１７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を、室温で１８時間攪拌した。出発物質が完全に消失したことをＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／１）で確認した。この混合物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、２  Ｍ  ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。この残渣を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ２／３）により精製、２３（１３．２ｍｇ、９２％）を得た。【０６７３】
【数１０−１】
0005465542.tif 000133
【０６７４】
【数１０−２】
0005465542.tif 000134
【０６７５】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−１−デオキシ−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２４）の調製）
ＣＨ２Ｃｌ２（９．６ｍＬ）中、化合物１０（４９０ｍｇ、０．９５７ｍｍｏｌ）および化合物１４（１．１１ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＷＳＣ（５５０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温で６時間攪拌した。反応を終わりを、ＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ３／１）で確認した。この反応混合物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：３）により精製し、２４（８５１ｍｇ、６１％）を得た。【０６７６】
【数１１−１】
0005465542.tif 000135
【０６７７】
【数１１−２】
0005465542.tif 000136
【０６７８】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−４−Ｏ−クロロアセチル−１−デオキシ−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２５）の調製）
ＣＨ２Ｃｌ２（１．６ｍＬ）中、化合物２４（１５０ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（２８．８μＬ、０．２０６ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（３５．１ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温で２時間攪拌した。出発物質が完全に消費したことを、ＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／３）で確認した後、０℃でＭｅＯＨを添加した。この混合物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、２  Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ２／９）により精製し、２５（１５８ｍｇ、定量的）を得た。【０６７９】
【数１２】
0005465542.tif 000137
【０６８０】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−４−Ｏ−クロロアセチル−１−デオキシ−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２６）の調製）
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中、化合物２５（１５７ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｃＯＨ（６．４μＬ、０．１０２ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（１０２μＬ、０．１０２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３時間、攪拌（ＴＬＣモニタリング：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／１）した後、この混合液を、ＣＨＣｌ３で希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／４）により精製し、２６（７６ｍｇ、５８％）を得た。【０６８１】
【数１３−１】
0005465542.tif 000138
【０６８２】
【数１３−２】
0005465542.tif 000139
【０６８３】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−２−Ｏ−ベンゾイル−１−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２７）の調製）
ＴＨＦ（３３８μＬ）中、化合物２１（４８．８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｃＯＨ（６．０μＬ、０．１０１ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（１０２μＬ、０．１０２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１２時間攪拌（ＴＬＣモニタリング：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／２）した後、この混合物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １．５：１）により精製し、２７（３０ｍｇ、７５％）を得た。【０６８４】
【数１４】
0005465542.tif 000140
【０６８５】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−１−デオキシ−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２８）の調製）
ＴＨＦ（１．１ｍＬ）中、化合物２４（１５７ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｃＯＨ（６．５μＬ、０．１０８ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（１１０μＬ、０．１１０ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３時間、攪拌（ＴＬＣモニタリング：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／１）した後、この混合液を、ＣＨＣｌ３で希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ３／２）により精製し、２８（７６ｍｇ、５８％）を得た。【０６８６】
【数１５−１】
0005465542.tif 000141
【０６８７】
【数１５−２】
0005465542.tif 000142
【０６８８】
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２−オクタデカノイルアミノ−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−２−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（７）【０６８９】
【化１１４】
0005465542.tif 000143
【０６９０】
ＣＨ２Ｃｌ２（２．１ｍＬ）中の化合物６（２０４ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化２，４，６−トリクロロベンゾイル（５０．０μＬ、０．３１８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３９．０ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ），トリエチルアミン（４４．４μＬ，０．３１８ｍｍｏｌ）および化合物３（１０５ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を２時間室温で撹拌した。開始物質の消費をＴＬＣ分析（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／１）で確認した後、この混合物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３，Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／６）を行い、化合物７を得た（２２９ｍｇ、７６％）：
［α］Ｄ＋０．３９°（ｃ  １．９，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  ６．６０−８．１０（ｍ，２４Ｈ，５Ｐｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ，Ｊ２，ＮＨ＝９．５Ｈｚ，ＮＨ），５．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３Ｃｅｒ），５．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ１，２＝Ｊ２，３＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２Ｇｌｃ），４．９５（ｄｔ，１Ｈ，Ｈ−４Ｃｅｒ），４．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝９．９Ｈｚ，Ｈ−１Ｇｌｃ），４．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．０Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．０Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６’Ｇｌｃ），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６’Ｇｌｃ），４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２Ｃｅｒ），３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４Ｇｌｃ），３．７１（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ），３．６３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３Ｇｌｃ），３．５３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５Ｇｌｃ），２．６０−２．６６（２ｄ，４Ｈ，−ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−），１．００−２．２０（ｍ，５８  Ｈ，−ＣＨ２−），０．９０（ｔ，６Ｈ，２−ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  １７２．７，１７２．２，１７１．９，１７０．５，１６５．１，１５９．３，１３５．７，１３５．５，１３３．２，１３２．８，１３２．６，１２９．９，１２９．８，１２９．７，１２８．７，１２８．４，１２７．９，１２７．８，１２７．８，１１３．８，
８６．３，８２．９，７３．９，７２．１，７１．６，６９．８，６３．０，６２．３，５５．１，４９．２，３６．８，３１．９，２９．７，２９．７，２９．６，２９．５，２９．４，２９．４，２９．４，２９．１，２７．９，２６．８，２５．７，２２．７，２０．７，１９．２，１４．１；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４６４［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（フェニル６−Ｏ−［｛（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカノイルアミノ−オクタデカン−４−イルオキシ｝カルボニルプロパノイル］−２−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−４−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）
ＴＨＦ（３３８μＬ）中の化合物７（４８．８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｃＯＨ（６．０μＬ，０．１０１ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム（１０２μＬ，０．１０２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１２時間攪拌した後（ＴＬＣモニタリング：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １／２）、この混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）そして濃縮した。この残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーを行い（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １．５／１）、化合物８を得た（３０ｍｇ、７７％）：
［α］Ｄ＋７．４°（ｃ  ０．６，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  ６．６６−８．０５（ｍ，１３Ｈ，３  Ｐｈ），６．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ２，ＮＨ＝９．０Ｈｚ，ＮＨ），５．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ１，２＝Ｊ２，３＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−２Ｇｌｃ），５．０１−５．０６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３Ｃｅｒ，Ｈ−４Ｃｅｒ），４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１Ｇｌｃ），４．６３（２  ｄ，２Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．５Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−６’Ｇｌｃ），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−６Ｇｌｃ），４．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２Ｃｅｒ），３．６５−３．７４（ｍ，６Ｈ，Ｈ−１’Ｃｅｒ，Ｈ−３Ｇｌｃ，Ｈ−４Ｇｌｃ，ＯＭｅ），３．５４−３．５９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１Ｃｅｒ，Ｈ−５Ｇｌｃ），２．６０−２．７５（ｍ，４Ｈ，−ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−），２．１５（ｓ，３Ｈ，ＯＡｃ），１．２０−２．２０（ｍ，５８Ｈ，−ＣＨ２−），０．８９（ｔ，６Ｈ，２−ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  １７３．３，１７２．６，１７１．９，１７１．５，１６５．２，１５９．３，１３３．２，１３２．８，１３２．５，１２９．８，１２９．８，１２９．７，１２９．０，１２８．７，１２８．４，１２８．２，１２７．８，１２５．３，１１３．７，８６．４，８２．９，７７．８，７４．５，７３．４，７３．２，７２．０，６９．７，６３．３，６１．４，５５．１，４９．６，３６．７，３１．９，２９．７，２９．６，２９．５，２９．３，２９．３，２９．１，２８．６，２５．６，２５．５，２２．７，２０．９，１４．１；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１２２６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（２−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−４−メトキシベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１（Ｒ）１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカノイルアミノ
−オクタデカン−４，６−スクシネート（９）
ＣＨ２Ｃｌ２（１．２ｍＬ）中の化合物８（４３ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭＳ４Å（４０ｍｇ）を添加した。１時間攪拌後、この懸濁液に、ＮＩＳ（１６．０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．６μＬ、０．００７９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を５時間攪拌した。反応の終了をＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／１）で確認した。反応混合物をＣｅｌｉｔｅを通して濾過した。合わせた濾液および洗浄液をＣＨＣｌ３で抽出し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３，ｓａｔ．Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーを行い（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ３：１）、化合物９（３３ｍｇ、８５％）を得た：
［α］Ｄ＋３．７°（ｃ  １．１，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  ６．６７−８．００（ｍ，９Ｈ，２  Ｐｈ），６．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ２，ＮＨ＝９．０Ｈｚ，ＮＨ），５．１８（ｍ，２Ｈ，Ｊ１，２＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４Ｃｅｒ，Ｈ−２Ｇｌｃ），５．１０（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３Ｃｅｒ），４．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．５Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．５Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１Ｇｌｃ），４．３９（ｍ，３Ｈ，Ｊ１，２＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２Ｃｅｒ，Ｈ−６Ｇｌｃ，Ｈ−６’Ｇｌｃ），３．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．５Ｈｚ，Ｊ１，２＝５．５Ｈｚ，Ｈ−１Ｃｅｒ），３．７３（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ），３．６１−３．６９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−１Ｃｅｒ，Ｈ−３Ｇｌｃ，Ｈ−５Ｇｌｃ），３．４９（ｄｔ，１Ｈ，Ｈ−４Ｇｌｃ），２．５０−２．８０（ｍ，４Ｈ，−ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−），２．１０（ｓ，３Ｈ，ＯＡｃ），１．１０−２．００（ｍ，５８Ｈ，−ＣＨ２−），０．８４（ｔ，６Ｈ，２−ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  １７２．９，１７１．４，１７１．２，１７０．８，１６５．０，１５９．３，１３３．３，１２９．８，１２９．７，１２９．６，１２９．５，１２８．５，１１４．０，１１３．９，１００．１，８１．５，７４．７，７４．３，７３．８，７３．７，７２．７，７０．４，６３．８，５５．１，４７．４，３７．４，３７．１，３６．５，３３．５，３２．７，３１．９，３０．２，３０．０，２９．７，２９．６，２９．６，２９．５，２９．５，２９．４，２９．３，２９．３，２９．２，２７．４，２７．１，２５．４，２５．０，２４．４，２２．７，２１．０，１９．７，１４．１；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１１６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２→３）−（２，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−４−メトキシベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカノイルアミノオクタデカン−４，６−スクシネート（１１）【０６９１】
【化１１５】
0005465542.tif 000144
【０６９２】
ＣＨ２Ｃｌ２（１．１ｍＬ）中の化合物９（６３ｍｇ、０．０５７８ｍｍｏｌ）および化合物１０（１５２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）の溶液に、モレキュラーシーブ（ＡＷ−３００）（２００ｍｇ）を添加した。１時間攪拌後、この懸濁液に、ＴＭＳＯＴｆ（１．０μＬ、０．００５４８ｍｍｏｌ）を添加した。反応の過程をＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／３）でモニタリングした。４時間の攪拌後、この反応混合物をＣｅｌｉｔｅのパッドを通して濾過した。濾液および洗浄液を合わせ、ＣＨＣｌ３で抽出し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３，およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）そして濃縮した。残留物をシリカゲルのクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／２）を行い、化合物１１を得た（８３ｍｇ、７０％）：
［α］Ｄ  ＋２４．４°（ｃ  ０．７，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  ７．３４−８．２１（ｍ，２０Ｈ，４Ｐｈ），６．４３−７．０１（２ｄ，４Ｈ，ＰＭＢ），５．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ２，ＮＨ＝８．２Ｈｚ，ＮＨＣｅｒ），５．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８Ｎｅｕ），５．５５（ｎｅａｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ１，２＝８．２Ｈｚ，Ｈ−２Ｇａｌ），５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４Ｇａｌ），５．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−７Ｎｅｕ），５．０４−５．１２（ｍ，３Ｈ，Ｊ１，２＝８．２Ｈｚ，Ｈ−１Ｇａｌ  Ｈ−３Ｃｅｒ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−２Ｇｌｃ），４．９１−４．９８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４Ｃｅｒ，ＮＨＮｅｕ，Ｈ−３Ｇａｌ），４．８１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４Ｎｅｕ），４．６６−４．８７（２ｄ，２Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１１．０Ｈｚ，ＰｈＣＨ２），４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１２．４Ｈｚ，Ｈ−９’Ｎｅｕ），４．１４−４．３７（ｍ，７Ｈ，Ｈ−５Ｇａｌ，Ｈ−６Ｇａｌ，Ｈ−６’Ｇａｌ，Ｈ−６Ｇｌｃ，Ｈ−６’Ｇｌｃ，Ｊ１，２＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１Ｇｌｃ，Ｈ−２Ｃｅｒ），４．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊｇｅｍ＝１２．４Ｈｚ，Ｈ−９Ｎｅｕ），３．７１−３．８２（ｍ，８Ｈ，Ｈ−１Ｃｅｒ，Ｈ−１’Ｃｅｒ，Ｈ−３Ｇｌｃ，Ｈ−４Ｇｌｃ，Ｈ−５Ｎｅｕ，ＯＭｅ），３．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６Ｎｅｕ），３．５７（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ），３．５０（ｔ，１Ｈ，Ｈ−５Ｇｌｃ），２．３６−２．６７（ｍ，４Ｈ，−ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−），２．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３ｅｑＮｅｕ），１．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３ａｘＮｅｕ），１．５２−２．１８（６ｓ，１８Ｈ，ＯＡｃ），１．１０−１．４０（ｍ，５８Ｈ，−ＣＨ２−），０．８７（ｔ，６Ｈ，２−ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ  １７２．８４，１７０．９７，１７０．９０，１７０．７５，１７０．６７，１７０．６１，１７０．２５，１７０．０８，１６８．１６，１６５．７３，１６５．５６，１６５．０５，１５８．８２，１３３．３３，１３３．１２，１３０．３６，１３０．１５，１２９．８８，１２９．７８，１２９．７２，１２９．６３，１２９．３５，１２８．５６，１２８．５３，１２８．３１，１１３．３７，１０１．２９，９８．７８，９６．９４，７９．５０，７８．７２，７７．６６，７４．５３，７４．３６，７３．３６，７３．１２，７３．０６，７１．９５，７１．５５，７１．４１，７０．９４，６９．３９，６８．２３，６７．６１，６６．５９，６３．３３，６２．３５，６１．７２，５４．９７，５３．２３，４８．８２，４６．５５，３７．３５，３６．３４，３１．９３，３０．８０，３０．０４，２９．６７，２９．６２，２９．５５，２９．４５，２９．３８，２９．２０，２５．３０，２５．１５，２３．１６，２２．７０，２１．４７，２０．９３，２０．８３，２０．７３，２０．４１，１４．１３；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２０６４［Ｍ＋Ｎａ］＋．【０６９３】
【表５】
0005465542.tif 000145
【０６９４】
上記の表２に記載される条件で反応させて、ＧｌｃとＣｅｒとを架橋させた。【０６９５】
（化合物２９の調製）【０６９６】
【化１１６】
0005465542.tif 000146
【０６９７】
例えば、上記と同様の方法を使用して、化合物２９を、ＥｔＯＨ中、ＤＡＢＣＯ存在下で、５５℃で処理すると、化合物３５を得た（収率６０％）。【０６９８】
【化１１７】
0005465542.tif 000147
【０６９９】
（化合物３０の調製）
例えば、上記と同様の方法を使用して、以下に記載される条件で反応させると、化合物３０を得た。【０７００】
【化１１８】
0005465542.tif 000148
【０７０１】
（２−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４，６−スクシネート（３１）の調製）
ＣＨ２Ｃｌ２（１．２ｍＬ）中、化合物２７（４３ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液に、モレキュラーシーブ４Å（ＭＳ４Å）（４０ｍｇ）を添加した。１時間、攪拌した後、この懸濁液に、ＮＩＳ（１６．０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．６μＬ，０．００７９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を５時間攪拌した。反応を終わりを、ＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／１）により確認した。この反応混合物を、セライトにより濾過した。合わせた濾過物および洗浄物をＣＨＣｌ３で抽出し、そして飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ３：１）により精製し、３１（３３ｍｇ、８５％）を得た。【０７０２】
【数１６】
0005465542.tif 000149
【０７０３】
（２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−グルコピラノシド−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４，６−スクシネート（３２）の調製）
ＭｅＣＮ（８７０μＬ）中、化合物２８（３２ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、モレキュラーシーブ３Å（ＭＳ３Å）（３０ｍｇ）を添加した。１時間、攪拌した後、この懸濁液に、ＮＩＳ（１７．７ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．７μＬ、０．００７９ｍｍｏｌ）を添加し、１．５時間にわたって攪拌を続けた。反応の終わりを、ＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／１）で確認した。この反応混合物を、セライトでろ濾過した。合わせた濾過物および洗浄物を、ＣＨＣｌ３で抽出し、飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ３／１）により精製し、３２（２．５ｍｇ、９％）を得た。【０７０４】
【数１７−１】
0005465542.tif 000150
【０７０５】
【数１７−２】
0005465542.tif 000151
【０７０６】
（２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４，６−スクシネート（３２）の調製）
ＭｅＣＮ（８７０μＬ）中、化合物２８（３２ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭＳ３Å（３０ｍｇ）を添加した。１時間、攪拌した後、この懸濁液に、ＮＩＳ（１７．７ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（０．７μＬ、０．００７９ｍｍｏｌ）を添加し、そして１．５時間にわたって攪拌を続けた。反応を終わりを、ＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／１）により確認した。この反応混合物を、セライトにより濾過した。合わせた濾過物および洗浄物を、ＣＨＣｌ３で抽出し、そして飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ
３／１）により精製し、３２（２１ｍｇ、７２％）を得た。【０７０７】
【数１８】
0005465542.tif 000152
【０７０８】
（シアリルα（２−３）ガラクトースドナー３３の調製）
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ，Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ，Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ，ａｎｄ  Ｍａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、以下の実験を行った。【０７０９】
例えば、シアリルα（２−３）ガラクトースドナー３３を、（化合物４９Ａの調製）と同様の方法を使用して調製した。【０７１０】
（（メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノンウロピラノシロネート−（２→３）−（２，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−４，６−スクシネート（３４）の調製）
ＣＨ２Ｃｌ２（４３０μＬ）中、化合物３２（２３．９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）および化合物３３（６０．０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、モレキュラーシーブ（ＡＷ３００）（８４ｍｇ）を添加した。１時間、攪拌した後、この懸濁液に、ＴＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中、０．５５  Ｍ溶液、０．２μＬ，０．００１ｍｍｏｌ）を添加した。この反応の進行を、ＴＬＣ（トルエン／ＥｔＯＡｃ  １／３）によりモニタリングした。攪拌の７時間後、この反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドにより濾過した。この濾過物を、ＣＨＣｌ３で希釈し、有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ  ２／５）により精製し、３４（３２ｍｇ、７２％）を得た。【０７１１】
【数１９−１】
0005465542.tif 000153
【０７１２】
【数１９−２】
0005465542.tif 000154
【０７１３】
ＣＨ２Ｃｌ２中、化合物２９および保護された糖鎖ドナー（例えば、化合物３３）の溶液に、モレキュラーシーブ（ＡＷ３００）を添加する。攪拌した後、この懸濁液に、ＴＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中）を添加する。この反応の進行を、ＴＬＣによりモニタリングする。攪拌後、この反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドにより濾過する。この濾過物を希釈し、有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮する。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ）により精製し、生成物を得る。【０７１４】
ＣＨ２Ｃｌ２中、化合物３０および保護された糖鎖ドナー（例えば、化合物３３）の溶液に、モレキュラーシーブ（ＡＷ３００）を添加する。攪拌した後、この懸濁液に、ＴＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中）を添加する。この反応の進行を、ＴＬＣによりモニタリングする。攪拌後、この反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドにより濾過する。この濾過物を希釈し、有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮する。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ）により精製し、生成物を得る。【０７１５】
ＣＨ２Ｃｌ２中、化合物３１および保護された糖鎖ドナー（例えば、化合物３３）の溶液に、モレキュラーシーブ（ＡＷ３００）を添加する。攪拌した後、この懸濁液に、ＴＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中）を添加する。この反応の進行を、ＴＬＣによりモニタリングする。攪拌後、この反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドにより濾過する。この濾過物を希釈し、有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ３、飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして濃縮する。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ）により精製し、生成物を得る。【０７１６】
（脱保護）
（フィトスフィンゴシンＧＭ３の脱保護）【０７１７】
【化１１９】
0005465542.tif 000155
【０７１８】
Ｏ−（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸）−（２→３）−（Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−オクタデカンアミド−オクタデカン−１，３，４−トリオール（３）．
１，２−ジクロロエタン（８００μＬ）中の化合物１（３８ｍｇ、０．０１８４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３７０μＬ）を加えた。この混合物を７時間室温で攪拌した。開始物質の完全な消費をＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ６／１）で確認した後、０℃で、Ｅｔ３Ｎを添加した。反応混合物をエバポレートし、トルエンとともに同時に蒸発させた。エバポレーションの後に、３０時間ポンプで減圧にした。残留物をＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）に溶解させ、ＮａＯＭｅ（７．２ｍＭのＭｅＯＨ溶液，１００μＬ、０．００５１８ｍｍｏｌ）を、０℃で添加した。室温で２６時間攪拌した後（ＴＬＣモニタリング：ＢｕＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  １０／１／１）、この混合物に０℃でＨ２Ｏを添加した。この混合物を室温で１０時間攪拌した（ＴＬＣモニタリング：ＢｕＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  １０／１／１）。この反応混合物をＤｏｗｅｘ（Ｈ＋）で中和し、濾過した。濾液を合わせ、洗浄液を濃縮した。残留物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０  ２００（ｇ）のカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ）によって、化合物３（２２．１ｍｇ、定量的）を得た。【０７１９】
【化１２０】
0005465542.tif 000156
【０７２０】
上記方法と同様の方法をしようして、例えば、化合物３４を、トリフルオロ酢酸の存在下で、ＣＨ２Ｃｌ２中、室温で撹拌し、次いで、ＭｅＯＨおよびＨ２Ｏ中のＮａＯＭｅで、室温で処理して、脱保護された生成物を得る。【０７２１】
（スフィンゴシン型セラミドのグルコース（Ｇｌｃ）との架橋）【０７２２】
【化１２１】
0005465542.tif 000157
【０７２３】
化合物２（１．６ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）をアルゴン下ＣＨ２Ｃｌ２（１９ｍｌ）に溶解し、ＷＳＣ（１．１ｇ、５．６４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６９ｍｇ、０．５６４ｍｍｏｌ）、化合物１（９３５ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて、４時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、水、ｂｒｉｎｅで洗浄した後、カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝１／３）で精製を行い、化合物３（１．６４ｇ）を得た。【０７２４】
化合物３（２８０ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）をアルゴン下ＴＨＦ（２．３ｍｌ）に溶解し、０℃にて、ＡｃＯＨ（４０μＬ、０．６６９ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＦ（６７０μＬ、０．６６９ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて１時間反応させた。１時間後、反応温度を室温に上げ、４時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄した後、カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝１／１．３）で精製を行い、化合物４（２２５ｍｇ）を得た。【０７２５】
（スフィンゴシン型セラミド−コハク酸−グルコース（Ｇｌｃ）、分子内グリコシル化）【０７２６】
【化１２２】
0005465542.tif 000158
【０７２７】
化合物４（７２ｍｇ、０．０６３０ｍｍｏｌ）をアルゴン下、ＣＨ２Ｃｌ２（１３ｍｌ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（７０ｍｇ）を入れて、室温にて１時間攪拌した。一時間後、反応温度を０℃にし、ＤＭＴＳＴ（１０２ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を加えた。０℃にて２時間攪拌し、反応終了後、セライト濾過を行った。ろ液をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄した後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１３０／１）で精製を行い、化合物５（５８ｍｇ）を得た。【０７２８】
（ＧＭ３の合成：（ＮｅｕＧａｌドナー＋ＧｌｃＣｅｒアクセプター））【０７２９】
【化１２３】
0005465542.tif 000159
【０７３０】
化合物６（２１ｍｇ、０．０１８９ｍｍｏｌ）と化合物５（１３ｍｇ、０．０１２６ｍｍｏｌ）をアルゴン下、ＣＨＣｌ３（４２０μＬ）に溶解し、ＡＷ３００（１００ｍｇ）を加え、室温で１時間攪拌した。１時間後、反応温度を０℃にし、ＴＭＳＯＴｆ（０．３μＬ、０．００１５１ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて、２時間半攪拌した。反応終了後、セライト濾過をし、ろ液をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄した後、カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ＝５０／２０／１）で精製し、化合物７（２３ｍｇ）を得た。【０７３１】
（ＧＭ３の脱保護）【０７３２】
【化１２４】
0005465542.tif 000160
【０７３３】
化合物７（３５ｍｇ，０．０１７７ｍｍｏｌ）をアルゴン下、ＣＨ２Ｃｌ２（７００μｌ）に溶解し、０℃にて、ＴＦＡ（３５０μｌ）を加え、室温で、２時間攪拌した。反応終了後、０℃にて、Ｅｔ３Ｎ（２ｍｌ）を加え、トルエン共沸を行い、残留物を減圧下、１２時間乾燥させた（化合物８）。続いて、化合物８をアルゴン下、ＭｅＯＨ（１．０ｍｌ）に溶解させ、０℃にて、ＮａＯＭｅ（０．３４ｍｇ，０．００１７７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１７時間攪拌した。１７時間後、Ｈ２Ｏ（０．５ｍｌ）を加え、１３時間攪拌した。反応終了後、Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）で中和を行い、綿濾過し、ろ液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）にてゲル濾過し、化合物９（１９ｍｇ）を得た。【０７３４】
（ＧＭ２の合成：（ＧＭ２ドナー＋ＧｌｃＣｅｒアクセプター））【０７３５】
【化１２５】
0005465542.tif 000161
【０７３６】
化合物１０と化合物５をアルゴン下、ＣＨＣｌ３に溶解し、ＡＷ３００を加え、室温で攪拌する。反応温度を０℃にし、ＴＭＳＯＴｆを加え、０℃にて、攪拌する。反応終了後、セライト濾過をし、ろ液をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄した後、カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ）で精製し、化合物１１を得る。【０７３７】
（ＧＭ２の脱保護）【０７３８】
【化１２６】
0005465542.tif 000162
【０７３９】
化合物１１をアルゴン下、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、０℃にて、ＴＦＡを加え、室温で、攪拌する。反応終了後、０℃にて、Ｅｔ３Ｎを加え、トルエン共沸を行い、残さを減圧下、乾燥させる（化合物１２）。続いて、化合物１２をアルゴン下、ＭｅＯＨに溶解させ、０℃にて、ＮａＯＭｅを加え、室温にて攪拌する。その後、Ｈ２Ｏを加え、攪拌する。反応終了後、Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）で中和を行い、綿濾過し、ろ液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）にてゲル濾過し、化合物１３を得る。【０７４０】
（ＧＭ１の合成：（ＧＭ１ドナー＋ＧｌｃＣｅｒアクセプター）【０７４１】
【化１２７】
0005465542.tif 000163
【０７４２】
化合物１４と化合物５をアルゴン下、ＣＨＣｌ３に溶解し、ＡＷ３００を加え、室温で攪拌する。反応温度を０℃にし、ＴＭＳＯＴｆを加え、０℃にて、攪拌する。反応終了後、セライト濾過をし、ろ液をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄した後、カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ）で精製し、化合物１５を得る。【０７４３】
（ＧＭ１の脱保護）【０７４４】
【化１２８】
0005465542.tif 000164
【０７４５】
化合物１５をアルゴン下、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、０℃にて、ＴＦＡを加え、室温で、攪拌する。反応終了後、０℃にて、Ｅｔ３Ｎを加え、トルエン共沸を行い、残さを減圧下、乾燥させる（化合物１６）。続いて、化合物１６をアルゴン下、ＭｅＯＨに溶解させ、０℃にて、ＮａＯＭｅを加え、室温にて攪拌する。その後、Ｈ２Ｏを加え、攪拌する。反応終了後、Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）で中和を行い、綿濾過し、ろ液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）にてゲル濾過し、化合物１７を得る。【０７４６】
（ＧＭ４の合成：（ＧＭ４ドナー＋ＧｌｃＣｅｒアクセプター））【０７４７】
【化１２９】
0005465542.tif 000165
【０７４８】
化合物１８と化合物５をアルゴン下、ＣＨＣｌ３に溶解し、ＡＷ３００を加え、攪拌する。ＴＭＳＯＴｆを加え、攪拌する。反応終了後、セライト濾過をし、ろ液をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄した後、カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１９を得る。【０７４９】
（ＧＭ４の脱保護）【０７５０】
【化１３０】
0005465542.tif 000166
【０７５１】
化合物１９をアルゴン下、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ＴＦＡを加え、攪拌する。反応終了後、Ｅｔ３Ｎを加え、トルエン共沸を行い、残留物を減圧下、乾燥する（化合物２０）。続いて、化合物２０をアルゴン下、ＭｅＯＨに溶解させ、ＮａＯＭｅを加え、攪拌する。Ｈ２Ｏを加え、攪拌する。反応終了後、Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）で中和を行い、綿濾過し、ろ液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）にてゲル濾過し、化合物２１を得る。【０７５２】
（Ｌａｃｔｏｓｅ部位の調製）【０７５３】
【化１３１】
0005465542.tif 000167
【０７５４】
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ、Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ、およびＭａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、上記表に記載の条件で反応を行い、ラクトース部位を調製した。【０７５５】
（シアル酸部位の調製）【０７５６】
【化１３２】
0005465542.tif 000168
【０７５７】
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ、Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ、およびＭａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、上記表に記載の条件で反応を行い、シアル酸部位を調製した。【０７５８】
（シアル酸部位の調製）
（３糖の合成）【０７５９】
【化１３３】
0005465542.tif 000169
【０７６０】
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ、Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ、およびＭａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、上記表に記載の条件で反応を行い、シアル酸部位を調製した。【０７６１】
（シアル酸部位の変更１）【０７６２】
【化１３４】
0005465542.tif 000170
【０７６３】
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ、Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ、およびＭａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、上記表に記載の条件で反応を行い、シアル酸部位を変更した。【０７６４】
（シアル酸部位の変更２）【０７６５】
【化１３５】
0005465542.tif 000171
【０７６６】
Ｈｉｒｏｍｕｎｅ  Ａｎｄｏ、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｋｏｉｋｅ、Ｈｉｄｅｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｄａ、およびＭａｋｏｔｏ  Ｋｉｓｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４（２００３）６８８３-６８８６の記載に基づいて、上記表に記載の条件で反応を行い、シアル酸部位を変更した。【０７６７】
（実施例２．ＧＭ３の調製）
（化合物３１Ａの調製）【０７６８】
【化１３６】
0005465542.tif 000172
【０７６９】
４−メトキシフェニル［メチル４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−５−（２，２，２−トリクロロエトキシカルバモイル）−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート（ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｎａｔｅ）］−（２→３）−（２，６−Ｏ−ジ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−Ｏ−トリ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（３１Ａ）【０７７０】
【化１３７】
0005465542.tif 000173
【０７７１】
化合物２５Ａ（５００ｍｇ、０．５５７ｍｍｏｌ：Ｂｏｒｂaｓ，Ａ．；Ｃｓaｖaｓ，Ｍ．；Ｓｚｉｌaｇｙｉ，Ｌ．；Ｍaｊｅｒ，Ｇ．；Ｌｉｐｔaｋ，Ａ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．２００４，２３，１３３−１４６．に従って調製した）と化合物３０Ａ（７９６ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ：Ａｎｄｏ，Ｈ．；Ｋｏｉｋｅ，Ｙ．；Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．；Ｋｉｓｏ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２００３，４４，６８８３−６８８６．に従って調製した）を、１０：１  Ｃ２Ｈ５ＣＮ−ＣＨ２Ｃｌ２（８．５ｍｌ）に溶解し、ＭＳ−４Ａ（１．３ｇ）存在下室温にて１時間攪拌した。その後、Ｎ−ヨードスクシンイミド（５０１ｍｇ，２．２２ｍｍｏｌ）を加え、−５０℃に冷却、トリフルオロメタンスルホン酸（２４μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を加え−５０℃にて６時間攪拌した。ＴＥＡを加え中和後、固形物をセライト濾過しクロロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、Ｈ２Ｏ、ｓａｔ．、ブラインの順で洗浄、得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥し有機層と固形物とに濾別した。濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：ＡｃＯＥｔ＝６：１）にて精製し、化合物３１α（４６８ｍｇ、４５％）を得た。さらに、副生成物として化合物３１β（１４６ｍｇ、１４％）を得た。【０７７２】
【化１３８】
0005465542.tif 000174
【０７７３】
【化１３９】
0005465542.tif 000175
【０７７４】
（化合物３３Ａの調製）【０７７５】
【化１４０】
0005465542.tif 000176
【０７７６】
４−メトキシフェニル［メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート］−（２→３）−（４−Ｏ−アセチル−２，６−Ｏ−ジ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−Ｏ−トリ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（３３Ａ）
化合物３１Ａ（５０ｍｇ、０．０３３３ｍｍｏｌ）を、３：１  ＡｃＯＨ−（ＣＨ２Ｃｌ）２（１ｍｌ）に溶解しＺｎ（Ｃｕ）（２５０ｍｇ）存在下５０℃にて１．５時間攪拌した。その後、セライト濾過を行い固形物を濾別しクロロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせＨ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物とを濾別しトルエンと共に減圧濃縮して得られたシロップを減圧下で１時間乾燥。その後、ピリジンに溶解させ氷浴で冷却後、無水酢酸（５０μｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）触媒量を加えた後、氷浴を除き２．５時間攪拌した。その後、ＭｅＯＨを加え反応を停止、減圧濃縮して得られたシロップを２Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物を濾別し濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝６０：１）にて精製し、化合物３３Ａ（３５ｍｇ、７５％）を得た。【０７７７】
【化１４１】
0005465542.tif 000177
【０７７８】
（化合物３５Ａの調製）【０７７９】
【化１４２】
0005465542.tif 000178
【０７８０】
４−メトキシフェニル［メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート］−（２→３）−（２，４，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（３５Ａ）
化合物３３Ａ（４５０ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）を、１：１  ＥｔＯＨ−ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解しＰｄ（ＯＨ）２−Ｃ（１．０ｇ）を加え水素ガス気流下４０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、固形物をセライト濾過しククロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせトルエンと共に減圧濃縮した。得られたシロップを減圧下で１時間乾燥。その後、Ａｒ置換し、ピリジンに溶解、氷浴で冷却後無水酢酸（１ｍｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒量加え氷浴を除き５時間攪拌した。氷浴で冷却後ＭｅＯＨを加え反応を停止、減圧濃縮して得られたシロップを２Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物と濾別し濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：１）にて精製し、化合物３５Ａ（３５８ｍｇ、９６％）を得た。【０７８１】
【化１４３】
0005465542.tif 000179
【０７８２】
（化合物３７Ａの調製）【０７８３】
【化１４４】
0005465542.tif 000180
【０７８４】
メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート］−（２→３）−（２，４，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート（３７Ａ）
化合物３５Ａ（５３ｍｇ、０．０４５２ｍｍｏｌ）を６：５：３トルエン−ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ（２ｍｌ）に溶解し、氷浴にて冷却後、硝酸ジアンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）（７４ｍｇ）を加えた。１５分後、氷浴を除き室温にて５．５時間攪拌した。反応終了後、ＡｃＯＥｔにて溶液を希釈し、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物を濾別し濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２５：１）にて精製し、化合物３６Ａを得た。【０７８５】
【化１４５】
0005465542.tif 000181
【０７８６】
得られた化合物３６ＡをＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）に溶解し、氷浴にて冷却後ＣＣｌ３ＣＮ（４５２μｌ、４．５１６ｍｍｏｌ）、ＤＢＵ（３．４μｌ、０．０２１ｍｍｏｌ）を加えた。加えた後、氷浴を除き室温にて２時間攪拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝５：１）にて精製し、化合物３７Ａ（４４ｍｇ、８１％  ２工程）を得た。【０７８７】
【化１４６】
0005465542.tif 000182
【０７８８】
（化合物３８Ａ）の調製【０７８９】
【化１４７】
0005465542.tif 000183
【０７９０】
メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート］−（２→３）−（２，４，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−２−（テトラデシル）−ヘキサデカノール（３８Ａ）
化合物８Ａ【０７９１】
【化１４８】
0005465542.tif 000184
【０７９２】
（９１ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）と化合物３７Ａ（５０ｍｇ、０．０４１４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍｌ）に溶解し、ＡＷ３００（１５０ｍｇ）存在下室温にて１時間攪拌した。その後、０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１．５μｌ、０．００８２ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて１０時間攪拌した。ＴＥＡを加え中和後、固形物をセライト濾過しクロロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、ｓａｔ．、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物と濾別し濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝２：１）にて精製し、化合物３８Ａ（２２ｍｇ、３６％）得た。【０７９３】
【化１４９】
0005465542.tif 000185
【０７９４】
（化合物３Ａの調製）【０７９５】
【化１５０】
0005465542.tif 000186
【０７９６】
５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−２−（テトラデシル）ヘキサデカノール（３Ａ）
化合物３８Ａ（２２ｍｇ、０．０１４８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１．０ｍｌ）に懸濁しＮａＯＭｅ（０．０４０ｍｇ，０．０００７４ｍｍｏｌ）を加え室温にて２１時間攪拌した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより化合物中の全Ａｃ基の脱保護を確認した後、Ｈ２Ｏを加え３．５時間攪拌後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによりカルボン酸の生成を確認した。Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）を用いて溶液をＰＨ７に中和、溶液とＤｏｗｅｘ（Ｈ＋）を濾別し、濾別して得られた溶液を減圧濃縮後、得られたシロップをカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，ＭｅＯＨ）にて精製し化合物３Ａ（１１ｍｇ、６９％）を得た。【０７９７】
【化１５１】
0005465542.tif 000187
【０７９８】
（化合物３９Ａの調製）【０７９９】
【化１５２】
0005465542.tif 000188
【０８００】
メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート］−（２→３）−（２，４，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−３，４−Ｏ−ジベンゾイル−２−オクタデカンアミド−４−オクタデセン−１，３−ジオール（３９Ａ）
化合物６Ａ【０８０１】
【化１５３】
0005465542.tif 000189
【０８０２】
（５５ｍｇ、０．０８２６ｍｍｏｌ）と化合物３７Ａ（５０ｍｇ、０．０４１３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に溶解し、ＡＷ３００（１５０ｍｇ）存在下室温にて１時間攪拌した。その後、０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１．５μｌ，０．００８１８ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて２２時間攪拌した。ＴＥＡを加え中和後、固形物をセライト濾過しクロロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせＮａＨＣＯ３  ｓａｔ．、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥後、濾別し減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝２：１）にて精製し、化合物３９Ａ（１３ｍｇ、１８％）を得た。【０８０３】
【化１５４】
0005465542.tif 000190
【０８０４】
（実施例３．ＧＭ４の調製）
（化合物４５Ａの調製）【０８０５】
【化１５５】
0005465542.tif 000191
【０８０６】
４−メトキシフェニル（メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル３，５−ジデオキシＤ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２→３）−４−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４５Ａ）
１，２−ジクロロエタン（１５．０ｍＬ）中の化合物４３Ａ【０８０７】
【化１５６】
0005465542.tif 000192
【０８０８】
（２．０ｇ、１．８７ｍｍｏｌ：Ｆｕｓｅ，Ｔ．；Ａｎｄｏ，Ｈ．；Ｉｍａｍｕｒａ，Ａ．；Ｓａｗａｄａ，Ｎ．；Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．；Ｋｉｓｏ，Ｍ．；Ａｎｄｏ，Ｔ．；Ｌｉ，Ｓ．Ｃ．；Ｌｉ  ｌｉ  Ｙ．−Ｔ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．２００６，２３，３２９−３４３に従って調製した）の溶液に、アルゴン雰囲気下、０℃で、酢酸（４５．０ｍＬ）および  Ｚｎ−Ｃｕ（１０．０ｇ）を添加した。この混合物を、反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１５：１）でモニターしながら、４０°Ｃで１．５時間撹拌した。この反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅで濾過した。濾液および洗浄液を合わせ、ＣＨＣｌ３で抽出し、有機層をＨ２Ｏ，ｓａｔ．Ｎａ２ＣＯ３，およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。ピリジン（９．０ｍＬ）中の残留物の溶液に、無水酢酸（６１４μＬ）を、アルゴン雰囲気下、０℃で添加した。この混合物を、反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１５：１）でモニターしながら、１３時間、周囲温度で撹拌した。この反応混合物をトルエンと同時に蒸発させ、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を２Ｍ  ＨＣｌ，Ｈ２Ｏ，ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ｈｅｘａｎｅ＝３：１）で精製して、４５Ａ（１．６９ｇ、９２％）を得た；【０８０９】
【化１５７】
0005465542.tif 000193
【０８１０】
（化合物４７Ａの調製）
４−メトキシフェニル（メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラＯ−アセチル３，５−ジデオキシＤ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２→３）−４−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４７Ａ）【０８１１】
【化１５８】
0005465542.tif 000194
【０８１２】
ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中の化合物４５Ａ（３８５ｍｇ、３９２μｍｏｌ）の溶液に、水酸化パラジウム［Ｐｄ（ＯＨ）２］（２０  ｗｔ．％  炭素担持Ｐｄ）（４００ｍｇ）を、周囲温度で、アルゴン雰囲気下で添加した。この混合物を、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１５：１）でモニターしながら、反応の進行を４時間、水素雰囲気下、周囲温度で激しく撹拌した。この反応混合物をＣｅｌｉｔｅで濾過し、合わせた濾液および洗浄液を濃縮した。ピリジン（５．０ｍＬ）中の残留物の溶液に、無水安息香酸（３５４ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、０℃で添加した。この混合物を、反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１５：１）でモニターしながら、１６時間、周囲温度で撹拌した。この反応混合物をトルエンと同時に蒸発させ、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を２Ｍ  ＨＣｌ，Ｈ２Ｏ，ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ｈｅｘａｎｅ＝３：１）で精製して、４７Ａ（３８０ｍｇ、９５％）を得た；【０８１３】
【化１５９】
0005465542.tif 000195
【０８１４】
化合物４７Ａは、化学式Ｃ４９Ｈ５５ＮＯ２２であり、正確な質量は１００９．３２１６であり、分子量は、１００９．９５４５である。Ｎａ塩は、化学式Ｃ４９Ｈ５５ＮＮａＯ２２であり、正確な質量は１０３２．３１１３であり、分子量は、１０３２．９４４３である。Ｋ塩は、化学式Ｃ４９Ｈ５５ＮＫＯ２２であり、正確な質量は１０４８．２８５３であり、分子量は、１０４９．０５２８である。【０８１５】
（化合物４９Ａの調製）【０８１６】
【化１６０】
0005465542.tif 000196
【０８１７】
メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート−（２→３）−４−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（４９Ａ）
混合溶媒（ＭｅＣＮ−ＰｈＭｅ−Ｈ２Ｏ＝３．５ｍＬ：２．９ｍＬ：１．７ｍＬ）中の化合物４７Ａ（１６４ｍｇ、１６２μｍｏｌ）の溶液に、硝酸ジアンモニウムセリウム（ＩＶ）（ＣＡＮ）（４４５ｍｇ、８１２μｍｏｌ）を添加した。この混合物を、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）でモニターしながら、反応の進行を５時間、周囲温度で撹拌した。この反応混合物を、ＣＨＣｌ３で抽出し、有機層をＨ２Ｏ，ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝６５：１）で精製し、標的化合物（１４７ｍｇ）を得た。ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の化合物の溶液に、トリクロロアセトニトリル（４１０μＬ、４０７μｍｏｌ）および１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（４．９μＬ、３３．０μｍｏｌ）を添加した。この混合物を、反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）でモニターしながら、２時間、０℃で撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝７５：１）で精製し、４９Ａ（１３２ｍｇ、７８％）を得た；【０８１８】
【化１６１】
0005465542.tif 000197
【０８１９】
（化合物５０Ａの調製）【０８２０】
【化１６２】
0005465542.tif 000198
【０８２１】
メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート−（２→３）−４−Ｏ−アセチル−２，６−Ｏ−ジベンゾイルβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→１）−２−（テトラデシル）−ヘキサデカノール（５０Ａ）
化合物８Ａ【０８２２】
【化１６３】
0005465542.tif 000199
【０８２３】
（１３６ｍｇ、０．３１０ｍｍｏｌ）と化合物４９Ａ（６５ｍｇ、０．０６２１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）に溶解し、ＡＷ３００（２００ｍｇ）存在下室温にて１時間攪拌した。その後、０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２．２μｌ，０．０１２４ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて２０時間攪拌した。ＴＥＡを加え中和後、固形物をセライト濾過しクロロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせｓａｔ．ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物とを濾別し濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝２：１）にて精製し、化合物５０Ａ（６２ｍｇ、７６％）を得た。【０８２４】
【化１６４】
0005465542.tif 000200
【０８２５】
（化合物５１Ａの調製）【０８２６】
【化１６５】
0005465542.tif 000201
【０８２７】
５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１）−２−（テトラデシル）−ヘキサデカノール（５１Ａ）
化合物５０Ａ（２８ｍｇ，０．０２１２ｍｍｏｌ）とＭｅＯＨ（５．０ｍｌ）に懸濁し触媒量のＮａＯＭｅを加え室温にて２１時間攪拌後、５５℃に加熱し４８時間攪拌後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより各水酸基のＡｃ基とＢｚ基の脱保護を確認した。その後、Ｈ２Ｏを加え３．５時間攪拌し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによりカルボン酸の生成を確認した。Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）を用いて溶液をｐＨ７に中和、溶液とＤｏｗｅｘ（Ｈ＋）を濾別し溶液を減圧濃縮後、得られたシロップをカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，ＭｅＯＨ）にて精製し化合物５１Ａ（１５ｍｇ、７９％）を得た。【０８２８】
【化１６６】
0005465542.tif 000202
【０８２９】
（化合物５２Ａの調製）【０８３０】
【化１６７】
0005465542.tif 000203
【０８３１】
メチル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート］−（２→３）−（２，４，６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→１）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−３，４−Ｏ−ベンゾイル−２−オクタデカンアミド−４−オクタデカ−１，３，４−トリオール（５２Ａ）
化合物４９Ａ（７６ｍｇ、０．９５６ｍｍｏｌ）と化合物７Ａ（５０ｍｇ、０．０４７８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍｌ）に溶解しＡＷ３００（１５０ｍｇ）存在下室温にて１時間攪拌した。その後、０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１．８μｌ，ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて２４時間攪拌した。【０８３２】
【化１６８】
0005465542.tif 000204
【０８３３】
ＴＥＡを加え中和後、固形物をセライト濾過しクロロホルムにて洗浄した。濾液と洗液を合わせｓａｔ．ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、ブラインの順で洗浄した。得られた有機層をＮａ２ＳＯ４にて乾燥、有機層と固形物と濾別し濾液と洗液を合わせ減圧濃縮して得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝２：１）にて精製し、化合物５２Ａ（５６ｍｇ、７０％）を得た。【０８３４】
【化１６９】
0005465542.tif 000205
【０８３５】
（化合物５３Ａの調製）【０８３６】
【化１７０】
0005465542.tif 000206
【０８３７】
５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−３，４−Ｏ−ベンゾイル−２−オクタデカンアミド−４−オクタデカ−１，３，４−トリオール（５３Ａ）
化合物５２Ａ（３５ｍｇ、０．０２０８ｍｍｏｌ）とＭｅＯＨ（５．０ｍｌ）に懸濁し触媒量のＮａＯＭｅを加え５５℃にて６０時間攪拌した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより化合物中の各水酸基のＡｃ基及びＢｚ基の脱保護を確認した。その後、Ｈ２Ｏを加え３．５時間攪拌後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによりカルボン酸の生成を確認。Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）を用いて溶液をｐＨ７に中和、溶液とＤｏｗｅｘ（Ｈ＋）を濾別し溶液を減圧濃縮後、得られたシロップをカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，ＭｅＯＨ）にて精製し化合物５３（２１ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。【０８３８】
【化１７１】
0005465542.tif 000207
【０８３９】
（実施例４．合成ＧＭ３および合成ＧＭ４を用いたリポソームの調製）
リポソームは、改良コール酸透析法を用いて調製する。【０８４０】
本実施例では、実施例１および２において調製したガングリオシド（ＧＭ３およびＧＭ４（セラミドの構造が天然型、植物型、もしくは疑似型のもの（図４））を用いる。【０８４１】
リポソーム構成用脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ガングリオシド、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をモル比３５：４０：５：１５：５で混合する（合計脂質量４５．６ｍｇ）。【０８４２】
次いで、この混合したリポソーム構成用脂質に、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解する。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得る。得られた脂質膜をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに再懸濁し、攪拌する。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得る。さらに、ミセル懸濁液をＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一リポソームを調製する。【０８４３】
本実施例で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ溶液のｐＨを８．５にする。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌する。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結させる。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかける。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加える。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結させる。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化される。【０８４４】
（リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用う。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、はじめに、本実施例で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化する。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得る。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合させる。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌを得る。【０８４５】
（比較例１：天然由来のガングリオシドを用いたリポソームの調製）
ガングリオシドとして、Ａｖａｎｔｉ製のブタ脳Ｔｏｔａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ（カタログ番号．１００２３２）を使用すること以外、実施例４と同様の方法を使用し、リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌを得る。【０８４６】
（脂質・タンパク質定量）
実施例４および比較例１により得られたリポソーム中間体ＨＳＡの脂質量は、０．５％
ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することにより求めることができる。【０８４７】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定することができる。【０８４８】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定することができる。【０８４９】
（実施例５．合成ＧＭ３および合成ＧＭ４を用いた、Ｃｙ５．５内包リポソームの調製）
リポソームは、改良コール酸透析法を用いて調製した。【０８５０】
本実施例では、実施例１および２において調製したガングリオシド（ＧＭ３およびＧＭ４（セラミドの構造が天然型、植物型、もしくは疑似型のもの（図４））を用いた。【０８５１】
リポソーム構成用脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）、ガングリオシド、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をモル比３５：４０：５：１５：５で混合した（合計脂質量４５．６ｍｇ）。【０８５２】
次いで、この混合したリポソーム構成用脂質に、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加して、クロロホルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）３ｍｌに溶解し、エバポレーターで蒸発させた後、真空下で乾燥させて脂質膜を得た。この脂質膜をＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に再懸濁し、超音波処理を行いミセル懸濁液を得た。【０８５３】
一方、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２０ｍｇをトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ  ｐＨ８．４）３ｍｌに溶解し、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）２ｍｇを混合し、３７℃で３時間反応させた後、ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）を行うことにより遊離のＣｙ５．５−ＮＨＳ  エステルを除去し、Ｃｙ５．５結合ＨＳＡ溶液３ｍｌを得た。上記のミセル懸濁液に、Ｃｙ５．５結合ＨＳＡ溶液を混合し、ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）を行った。更に、ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）をした。リポソーム溶液（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｃｙ５．５）１０ｍｌを得た。このリポソーム溶液（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｃｙ５．５）１０ｍｌに架橋試薬スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３；ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加え、室温で２時間、４℃で一晩撹拌してリポソーム膜にＢＳ３を化学結合させた。ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により遊離のＢＳ３を取り除いた後、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）４０ｍｇを加え、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した。ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により遊離のＴｒｉｓを取り除いた後、メタ過ヨウ素酸ナトリウム１０．８ｍｇを加え、４℃で一晩撹拌した。【０８５４】
ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により未反応の過ヨウ素酸を取り除いた後、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２０ｍｇを加え、室温で２時間反応させた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１．２５ｍｇを加え、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した。ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により未反応のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを取り除き、合成ＧＭ３リポソーム溶液（合成ＧＭ３リポソーム中間体ＨＳＡ（合成ＧＭ３リポソームにヒト血清アルブミンが結合した状態）１０ｍｌを得た。【０８５５】
（比較例２：天然由来のガングリオシドを用いたリポソームの調製）
ガングリオシドとして、Ａｖａｎｔｉ製のブタ脳Ｔｏｔａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ（カタログ番号．１００２３２）を使用すること以外、実施例５と同様の方法を使用し、リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌを得た。【０８５６】
（脂質・タンパク質定量）
実施例５および比較例２により得られたリポソーム中間体ＨＳＡの脂質量は、０．５％
ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することにより求めることができる。【０８５７】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定することができる。【０８５８】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定する。【０８５９】
（実施例６Ａ．合成ガングリオシドを用いた糖鎖修飾リポソームの調製）
（リポソーム糖鎖付加）
本実施例では、実施例４において調製した合成ＧＭ３および合成ＧＭ４リポソーム溶液を用いる。【０８６０】
各リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌに架橋試薬３，３−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０８６１】
精製水に溶解したシアリルルイスＸ（ＳＬＸ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に、炭酸水素アンモニウムを添加して、撹拌することにより、アミノ化ＳＬＸ溶液を得る。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＳＬＸを添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し、撹拌する。限外濾過により遊離のＳＬＸとＴｒｉｓを除去する。【０８６２】
（実施例６Ｂ．合成ガングリオシドを用いた抗体修飾リポソームの調製）
本実施例では、実施例４において調製した合成ＧＭ３および合成ＧＭ４リポソーム溶液を用いて抗体修飾リポソームを調製する。【０８６３】
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌに架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加えて、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過（ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により除去する。【０８６４】
このリポソーム溶液に抗体を添加し、室温で２時間反応させた後、１３２ｍｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｓ溶液を添加し、室温で２時間、４℃で一晩撹拌する。限外濾過（ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）とを用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により遊離の抗体とＴｒｉｓを除去することにより、抗体結合リポソームを得る。【０８６５】
（比較例３．認識プローブを結合させていないリポソームの調製）
本比較例では、認識プローブを結合させていない、合成ＧＭ３リポソーム、合成ＧＭ４リポソームおよび天然由来のガングリオシドを用いたリポソームを、実施例４および比較例１と同様の方法を用いて調製する。【０８６６】
（実施例６Ａ、６Ｂおよび比較例３で調製したリポソームの物性評価）
（各リポソーム表面へ結合した認識プローブの評価）
（１．糖鎖の結合量評価（ＦＩＴＣ結合評価））
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）に架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０８６７】
精製水に溶解したＦＩＴＣに炭酸水素アンモニウムを添加して、撹拌することにより、アミノ化ＦＩＴＣ溶液を得る。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＦＩＴＣを添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し撹拌した。限外濾過により遊離のＦＩＴＣとＴｒｉｓを除去し、ＦＩＴＣ結合リポソームを得る。【０８６８】
リポソームへのＦＩＴＣ結合量は、蛍光量（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定することで求めることができる。【０８６９】
（２．抗体結合量評価）
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）に架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０８７０】
このリポソーム溶液に抗体（例えば、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体）を添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し、撹拌する。限外濾過により遊離の抗体とＴｒｉｓを除去し、抗体結合リポソームを得る。【０８７１】
リポソーム表面に結合した抗体量は、Ｅｎｚｙｍｅｄ  ｉｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法によって測定することができる。抗原となるタンパク質（例えば、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））ＰＢＳ溶液を９６穴マイクロプレートに１  ｗｅｌｌにつき５０μｌずつ添加し、固相化する。プレート内の抗原溶液をすて、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを３００μｌずつ添加し、静置する。ＢＳＡ溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体標準液および抗体結合リポソームサンプルを１００μｌずつ添加し、１時間置いた後、ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄する。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１０％  Ｔｗｅｅｎ２０／９％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで希釈し、これを１００μｌずつ添加し、１時間置いた。ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄したのち１−ＳｔｅｐＴＭ  ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、反応させ、反応停止液（２Ｍ硫酸）を１００μｌずつ添加する。吸光度４５０ｎｍを測定し、抗体標準溶液からリポソーム表面の抗体結合量を求めることができる。【０８７２】
（脂質・タンパク質定量）
得られた各リポソームの脂質量は、０．５％  ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することができる。【０８７３】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定することができる。【０８７４】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、各リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いて測定することができる。【０８７５】
（実施例７Ａ．合成ガングリオシドを用いた、ＳＬＸ修飾Ｃｙ５．５内包リポソームの調製）
本実施例では、標的部位認識プローブとしてＳＬＸを用い、合成ガングリオシドとして合成ＧＭ３およびＧＭ４を用いた。【０８７６】
（リポソーム糖鎖付加）
本実施例では、実施例５において調製したＣｙ５．５内包リポソームを用いた。各リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌに架橋試薬３，３−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加えて、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去した。【０８７７】
精製水０．５ｍｌに溶解したシアリルルイスＸ（ＳＬＸ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）２ｍｇに、炭酸水素アンモニウム０．２５ｇを添加して、３７℃、３日間撹拌することにより、アミノ化ＳＬＸ溶液を得た。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＳＬＸを、最終糖鎖濃度が１５μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温で２時間反応させた後、１３２ｍｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｓ溶液を添加し、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した。ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とHEPES緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により遊離のＳＬＸとＴｒｉｓを除去した。【０８７８】
（実施例７Ｂ．合成ガングリオシドを用いた抗体修飾Ｃｙ５．５内包リポソームの調製）
本実施例では、実施例５において調製したＣｙ５．５内包リポソームを用いて抗体修飾リポソームを調製した。【０８７９】
（抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎモノクローナル抗体の作製）
抗ヒトＥ−セレクチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（株名ＣＬ−３  ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−２５１５）より購入し、モノクローナル抗体を精製した。Ｂａｌｂ／ｃ  マウス６週の雌を日本ＳＬＣより購入して、腹腔内にプリスタンを５００μｌ、５日間隔で２回投与した。１×１０７個の細胞を腹腔内に投与して、２０日後に腹水を採取した。腹水を遠心（１２０００ｇ×３０分）したのち、上清を採取した。上清に０．６飽和の硫酸アンモニウムを加え、４℃で数時間、静置した。沈殿物をＰＢＳに再けんだく後、外液ＰＢＳの透析を行った。その後、ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  カラム（ＧＥヘルスケア）にてアフィニティー精製を行い、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体を得た。【０８８０】
（リポソームへの抗体付加）
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌに架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加えて、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過（ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により除去した。【０８８１】
このリポソーム溶液に抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎモノクローナル抗体を添加し、室温で２時間反応させた後、１３２ｍｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｓ溶液を添加し、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により遊離の抗体とＴｒｉｓを除去し、抗体結合リポソームを得た。【０８８２】
（比較例４．認識プローブを結合させていないＣｙ５．５内包リポソームの調製）
本比較例では、実施例５および比較例２において調製したリポソーム溶液を用いた。ＳＬＸを結合させていないＣｙ５．５内包リポソーム（Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５）を、糖鎖を結合させないことを除き、最終工程までＳＬＸ結合Ｃｙ５．５内包リポソームの場合と同様の方法を用いて調製した。【０８８３】
（実施例７Ａ、７Ｂおよび比較例４で調製したリポソームの物性評価）
（リポソーム表面へ結合した認識プローブの評価）
（１．糖鎖の結合量評価（ＦＩＴＣ結合評価））
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌに架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加えて、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰをＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により除去した。【０８８４】
精製水５ｍｌに溶解したＦＩＴＣ  ９．５ｍｇに炭酸水素アンモニウム１．０ｇを添加して、３７℃、３日間撹拌することにより、アミノ化ＦＩＴＣ溶液を得た。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＦＩＴＣを添加し、室温で２時間反応させた後、１３２ｍｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｓ溶液を添加し、室温で２時間、４℃で一晩撹拌した。限外濾過（ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）とHEPES緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）により遊離のＦＩＴＣとＴｒｉｓを除去し、ＦＩＴＣ結合リポソームを得た。【０８８５】
リポソームへのＦＩＴＣ結合量は、蛍光量（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定することで求めた。【０８８６】
（２．抗体の結合量評価）
リポソーム表面に結合した抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎモノクローナル抗体量は、Ｅｎｚｙｍｅｄ  ｉｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法によって測定した。Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液を９６穴マイクロプレートに１  ｗｅｌｌにつき５０μｌずつ添加し、室温で１時間置き、固相化した。プレート内の抗原溶液をすて、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを３００μｌずつ添加し、室温で２時間置いた。ＢＳＡ溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した後、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体標準液および抗体結合リポソームサンプルを１００μｌずつ添加し、室温で１時間置いた後、ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）を１０％  Ｔｗｅｅｎ２０／  ９％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで希釈し、これを１００μｌずつ添加し、室温で１時間置いた。ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄したのち１−ＳｔｅｐＴＭ  ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＰＩＥＲＣＥ）を１００μｌずつ添加し、室温で２０分間反応させ、反応停止液（２Ｍ硫酸）を１００μｌずつ添加した。吸光度４５０ｎｍを測定し、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体標準溶液からリポソーム表面の抗体結合量を求めた。【０８８７】
（脂質・タンパク質定量）
本実施例により得られたＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５およびＬｉｐｏ−Ｃｙ５．５の脂質量は、０．５％  ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した。【０８８８】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて行った。【０８８９】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いて測定した。【０８９０】
ＳＬＸ−Ｌｉｐｏ−Ｃｙ５．５についての結果を、以下の表５に示す。【０８９１】
【表６】
0005465542.tif 000208
【０８９２】
＊コントロール：天然由来のガングリオシドを用いて作製したリポソーム
（担癌マウスを用いた評価）
癌部位への集積性を担癌マウスを用いて確認した。担癌マウスは、Ｅｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞（ＡＴＣＣより購入した。ＡＴＣＣＮｕｍｂｅｒは、ＣＣＬ−７７；約５×１０６個）を雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢；日本ＳＬＣより購入）の右大腿部皮下に移植して、１０日後に実験に用いた。麻酔はイソフルランを用いた。次に、リポソームを１００μｌ／ｍｏｕｓｅ尾静脈投与し、ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、同一の個体の癌部位（右大腿部）を投与直後、２４、４８時間後に観察した。励起波長６８０ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍで蛍光物質Ｃｙ５．５の検出を行った。【０８９３】
（結果）
種々の合成ガングリオシド（合成ＧＭ３および合成ＧＭ４）を用いたリポソームについて、物性、認識プローブ結合能、癌部位への集積性を比較評価した。コントロールとしては、天然のガングリオシドのＡｖａｎｔｉ製のブタ脳Ｔｏｔａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ（カタログ番号．１００２３２）を用いた。【０８９４】
その結果、合成ガングリオシドを用いたリポソームも、天然のガングリオシドを用いたリポソームも、粒子径はいずれも約１００ｎｍであった（図３、図５ａ〜ｄ、表５）。【０８９５】
合成ＧＭ３（植物型セラミド、天然型セラミド、疑似セラミド）リポソーム表面への認識プローブの結合能評価はＦＩＴＣ結合評価を用いて行った。天然型セラミドの合成ＧＭ３リポソーム、疑似セラミドの合成ＧＭ３リポソームでは、コントロール（天然のガングリオシドを用いたリポソーム）とほぼ同等量が結合した。植物型セラミドの合成ＧＭ３では、コントロールの約６５％の結合量であった（図６ａ，ｂ）。【０８９６】
また、合成ＧＭ４（植物型セラミド、疑似セラミド）リポソームへの認識プローブの結合能評価は、抗体の結合性を確認することによって評価した。リポソーム表面に抗Ｅ−セレクチン抗体を付加させて、付加量をＥＩＡ法により測定した。植物型セラミドおよび疑似型セラミドいずれもコントロールとほぼ同程度の抗体付加量であった（図６ｃ）。【０８９７】
合成ＧＭ３（植物型セラミド）を用いて作製したＣｙ５．５内包ＳＬＸリポソームの担癌集積性を調べたところ、ＳＬＸリポソームはコントロール（ＳＬＸを付加していないもの）に比べ有意に集積した（図７Ａ）。【０８９８】
合成ＧＭ４（植物型セラミド、疑似セラミド）を用いて作製した抗Ｅ−セレクチン抗体リポソームの担癌部位への集積性を調べた。植物型セラミドのものでは、コントロール（抗体を付加していないもの）に比べ有意に集積した（図７Ｂ）。疑似セラミドを用いて作製した抗体リポソームについては、抗体を付加していないものと集積性に差が認められなかった（図７Ｃ）。【０８９９】
（実施例８．ガングリオシドと集積性との関係）
（方法）
（担癌マウスの作製）
エールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞；５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃマウス（雌性、６週齢）の右大腿部皮下に移植し、移植後、１０日後に、リポソーム１００μｌを尾静脈投与して腫瘍部位への集積性を確認した。【０９００】
（リポソームの調製）
リポソーム脂質成分中、ガングリオシドとして、総ガングリオシド（Ｌｏｔ．ＴＧＡＮＧ１３、ＴＧＡＮＧ１４、ＴＧＡＮＧ１６）および合成ＧＭ３植物型を用いて、実施例７と同様の方法を用いてＣｙ５．５標識ヒト血清アルブミンを内包させたリポソームを調製した。担癌マウスの癌部位への集積性について比較検討を行った。【０９０１】
（評価方法）
１／１０ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に３００μｌ投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により投与前の画像データを取った。尾静脈より、ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）（２００μｌ：脂質量７５０μｇ相当）を投与して、投与後、２４および４８時間の画像データを取った。【０９０２】
コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて腹側より撮影した。【０９０３】
（結果）
総ガングリオシド（Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１３：Ａｖａｎｔｉ）を、糖鎖結合リポソームの原料として用いた場合、糖鎖密度５０μｇ／ｍＬでは、投与後２４時間および４８時間で糖鎖未結合リポソームと比較して、顕著な集積性の差が認められた（図８Ｃおよび図８Ｄ）。【０９０４】
しかし、異なるロットのガングリオシド（Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１４：Ａｖａｎｔｉ）を用いた糖鎖結合リポソームの場合、同じ糖鎖密度では、糖鎖なしリポソームと比較し集積性の差が認められなかった（図８Ａおよび図８Ｂ）。これらのリポソームは糖鎖密度は同一であるが、集積性についてロット差が認められた。【０９０５】
糖鎖密度と集積性との関係から、リポソーム膜面上に糖鎖が過剰に存在すると集積性が低下することが、以前に報告されたリウマチモデルマウスを用いた実験（国際公開第２００７／０９１６６１号パンフレット）から明らかになっている（図９）。【０９０６】
このことから、総ガングリオシド（Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１４）を用いて調製した糖鎖修飾リポソームでは、リポソーム膜面の糖鎖密度が最適密度からずれている可能性が考えられた。【０９０７】
次いで、ガングリオシドとして、総ガングリオシド（Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１４およびＬｏｔ．Ｎｏ．ＴＧＡＮＧ１６）を用いて糖鎖結合リポソームを作製し、糖鎖密度と集積性について評価した。【０９０８】
その結果、ＴＧＡＮＧ１４およびＴＧＡＮＧ１６のガングリオシドを用いて作製したリポソームはいずれも、糖鎖密度が５０μｇ／ｍＬのとき、糖鎖なしリポソームと比較して集積性の差がなかった。他方、糖鎖密度が１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬのときには、糖鎖修飾リポソームは、糖鎖なしリポソームよりも高い集積性を示した。【０９０９】
以上から、ガングリオシドのロット間較差によって、同量の糖鎖を使用したとしても、リポソーム膜面に結合する糖鎖の密度が変動し、その結果、ＴＧＡＮＧ１４では糖鎖密度が最適糖鎖密度からずれたと考えられる（図１０および図１１）。【０９１０】
合成ＧＭ３（植物型）を用いた糖鎖結合リポソームを作製して担癌部位への集積性を確認した結果、糖鎖密度５０μｇ／ｍＬで、糖鎖なしリポソームと比較してより高い集積性を示した（図１２Ａ〜Ｃ）。このことから、合成ＧＭ３は、分子イメージングに適した糖鎖結合リポソームの原料として、ロット間で集積性に影響を与える市販の総ガングリオシドの代わりに用いることができることがわかった。【０９１１】
合成ＧＭ３は合成品であり、単一物質から構成されていることから、原料としてロット間較差は殆どなくなると考えられる。よって、合成ＧＭ３を用いて調製されたリポソームは、常に一定の糖鎖量をリポソーム膜面に結合させることができると考えられる。したがって、合成ＧＭ３は糖鎖リポソームの原料として最適であると考えられる。【０９１２】
（実施例９．糖鎖修飾Ｃｙ５．５内包リポソーム粒子の作製）
（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＣｙ５．５標識）
ＨＳＡ／トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン（ＴＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ８．４）溶液に、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）／ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）溶液を混合して、３７℃、３時間撹拌した。遊離のＣｙ５．５を除去するため限外ろ過（ＮＭＷＬ：１０，０００）を行った。【０９１３】
（リポソームの作製）
（リポソーム形成とＣｙ５．５標識ＨＳＡの内包（工程Ａ））
ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）１６．８ｍｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）１０．１ｍｇ、ガングリオシド（合成ＧＭ３）１４．６ｍｇ、ジセチルフォスフェート（ＤＣＰ）１．８ｍｇ、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）２．３ｍｇ、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを秤量し、メタノール・クロロホルム溶液（１：１）３ｍｌに懸濁させ、３７℃、１時間撹拌した。【０９１４】
クロロホルム・メタノールをロータリーエバポレーターで蒸発させ、真空乾燥させた。ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）３ｍｌに再懸濁させ、３７℃、１時間撹拌後、窒素置換し超音波処理をした。この超音波処理溶液とＣｙ５．５標識ＨＳＡ溶液とを混合して、限外濾過（ＮＭＷＬ：１０，０００）を行った。これにより、Ｃｙ５．５標識ＨＳＡを内包したリポソーム粒子が得られた。【０９１５】
（リポソームの親水性化処理（工程Ｂ））
ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換するため、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。架橋剤としてＢＳ３（ＰＩＥＲＣＥ）を１０ｍｇ添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離のＢＳ３を除去するため、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。Ｔｒｉｓ４０ｍｇを添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離のＴｒｉｓを除去し、ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）にバッファー交換するために、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）をおこなった。【０９１６】
（リポソームとＨＳＡの結合（工程Ｃ））
メタ過ヨウ素酸ナトリウムを１０．８ｍｇ添加し、冷蔵下、一晩撹拌し、リポソーム粒子表面を酸化した。遊離のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換するために、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。ＨＳＡ２０ｍｇを添加して、室温で２時間反応させた溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム３．１３ｍｇを添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離のシアノホウ素酸ナトリウム、ＨＳＡを除去し、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換する目的で、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）をおこなった。【０９１７】
（リポソームへの糖鎖の結合（工程Ｄ））
糖鎖２ｍｇを精製水０．５ｍｌに溶解し、炭酸水素アンモニウム飽和下で３７℃、３日間反応させた（アミノ化糖鎖溶液）。リポソーム溶液１０ｍｌに架橋剤ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離のＤＴＳＳＰを除去するため、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。１ｍｌのリポソーム溶液（ＤＴＳＳＰ結合）に対して、アミノ化糖鎖溶液３．７４μｌを添加して、室温で２時間反応させた後、Ｔｒｉｓを１３２ｍｇを添加し、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離の糖鎖とＴｒｉｓとを除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）にバッファー交換するため、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。【０９１８】
（リポソームへのＦＩＴＣの結合（工程Ｄ’））
ＦＩＴＣ９．５ｍｇをＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）５．００ｍｌに溶解し、炭酸水素アンモニウム飽和下で３７℃、１日間反応させた（アミノ化ＦＩＴＣ）。リポソーム溶液１ｍｌに架橋剤ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）１ｍｇを添加して、室温で２時間の後、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離のＤＴＳＳＰを除去するため、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。アミノ化ＦＩＴＣを添加した。各ＦＩＴＣ濃度についてのアミノ化ＦＩＴＣ添加量を以下の表に示す。これらはリポソーム溶液０．５ｍｌについての値である。【０９１９】
【表７】
0005465542.tif 000209
【０９２０】
その後、室温で２時間反応させた後、Ｔｒｉｓ／ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）をリポソーム溶液０．５ｍｌに対して１０μｌずつ添加し、冷蔵下、一晩撹拌した。遊離のＦＩＴＣとＴｒｉｓを除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）にバッファー交換するため、限外濾過（ＮＭＷＬ：３００，０００）を行った。【０９２１】
次いで、０．４５μｍフィルター濾過をおこなった。【０９２２】
（合成ＧＭ３リポソームの評価（コントロールリポソームとの比較））
本実施例では、合成ＧＭ３を用いて調製したリポソームと、従来使用していたガングリオシド（ブタ抽出物）を用いて調製したリポソーム（コントロールリポソーム）とを比較した。【０９２３】
（粒子径・Ｚ電位の測定）
上記（工程Ａ）の終了後、リポソーム溶液２０μｌをＭｉｌｌｉ−Ｑ水  ９８０μｌと混合し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ（シスメックス）を用いて粒子径分布、Ｚ電位を測定した。【０９２４】
（内包効率）
本実施例において調製したそれぞれのリポソーム溶液について、Ｃｙ５．５の吸光度（６８０ｎｍ）を測定し比較した。ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ法（ＢＣＡを標準物質とした）を用いて、タンパク質（ＨＳＡ）濃度を測定し、比較した。【０９２５】
（糖鎖結合）
本実施例において調製した各リポソーム溶液について、糖鎖の変わりにＦＩＴＣをリポソームに結合させ（工程Ｄ’）、蛍光を測定することによりリポソームに結合したＦＩＴＣ量を測定し、比較した（図１３Ａ）。【０９２６】
蛍光分光器として、島津ＲＦ５３００ＰＣをもちいた。【０９２７】
標準物質として、アミノ化ＦＩＴＣ  １．９６ｍｇ／ｍＬを精製水で１６００倍に希釈した（最終濃度  １．２２５μｇ／ｍＬ、３．１５μＭ）。【０９２８】
さらに、このアミノ化ＦＩＴＣ溶液を精製水で希釈し、０／１０溶液、１／１０溶液、２／１０溶液、３／１０溶液、４／１０溶液、５／１０溶液、６／１０溶液、７／１０溶液、８／１０溶液、９／１０溶液、１０／１０溶液を作製した。【０９２９】
また、この標準物質を３ｍＬの精製水に１０μＬ添加して、四面透過型のセルに入れ、蛍光強度の測定を行った。【０９３０】
従って、以下の表に示すようなＦＩＴＣを用いて検量線を作成した（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍ）（図１３Ｂおよび表６Ｂ）。【０９３１】
【表８】
0005465542.tif 000210
【０９３２】
アミノ化ＦＩＴＣ  ０μＭ、１２８μＭ、２５７μＭ、１２８４μＭ、２５６８μＭと反応させたリポソーム溶液を検体として、表面に結合しているＦＩＴＣ量を求めた。【０９３３】
アミノ化ＦＩＴＣ  ０μＭ、１２８μＭ、２５７μＭについては３ｍＬの精製水にリポソーム溶液を３０μＬ添加して、四面透過型のセルに入れ、蛍光強度の測定を行った、１２８４μＭ、２５６８μＭについては３ｍＬの精製水にリポソーム溶液を１０μＬ添加して、四面透過型のセルに入れ、蛍光強度の測定を行った、これらを四面透過型のセルに入れ、蛍光強度の測定を行った（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍ）。【０９３４】
（結果）
合成ＧＭ３を含むリポソームは、ブタ脳から抽出したガングリオシドを用いたリポソームとほぼ同等の粒子径分布を示した（図３）。【０９３５】
天然由来ガングリオシドを用いて調製したリポソームと合成ＧＭ３リポソームとでは、粒子径分布、Ｚ電位、脂質量、内包されたＣｙ５．５標識ＨＳＡ量ともに、ほぼ同等の値となった。以下の表７を参照のこと。【０９３６】
【表９】
0005465542.tif 000211
【０９３７】
従来リポ：天然由来ガングリオシドを用いて調製したリポソーム
合成ＧＭ３リポ：合成ＧＭ３を用いて調製したリポソーム
Ａｂｓ６８０：６８０ｎｍでの吸光度を示す
Ｌｉｐｉｄ：リポソームに含まれる脂質量を示す。
ＨＳＡ：リポソームに含まれるＣｙ５．５標識ＨＳＡ量を示す。【０９３８】
合成ＧＭ３リポソーム表面に結合されたＦＩＴＣ量は豚抽出ガングリオシドを用いたリポソームの約８割〜９割となった（図１４〜１６、表８）。【０９３９】
【表１０】
0005465542.tif 000212
【０９４０】
従来リポ：天然由来ガングリオシドを用いて調製したリポソーム
合成ＧＭ３リポ：合成ＧＭ３を用いて調製したリポソーム
リポ付加ＦＩＴＣ：リポソームに付加したＦＩＴＣの量
ＦＩＴＣ反応濃度：リポソームと反応させたＦＩＴＣの濃度
以上のことから、合成ＧＭ３を用いて作製したリポソームは、ブタ抽出ガングリオシドを用いて作製したリポソームとほぼ同等のものとして得られたことは確認できた。【０９４１】
（実施例１０．リポソーム膜面上への糖鎖付加量の簡易評価）
（ＦＩＴＣ結合評価）
リポソーム膜面への糖鎖の付加は、リポソーム膜面上に結合させたＤＴＳＳＰなどの架橋剤にアミノ化糖鎖を結合させている。これまで、結合糖鎖量の評価には、ＨＰＬＣポスト蛍光ラベル化法などサンプルの前処理の後、ＨＰＬＣ解析を行うなど非常に時間と手間がかかっていた。本ＦＩＴＣ結合評価方法では、１級アミノ基を１分子の蛍光物質に対し１分子の割合で結合させ、糖鎖をリポソーム膜面上に結合させるのと同様の反応を行い、リポソーム膜面上に結合した蛍光物質の量を測定し、結合しうる糖鎖量を評価することができる。【０９４２】
反応）リポソーム膜面へのシアリルルイスＸ（ＳＬＸ  Ｍ．Ｗ．８２０．８３）の付加は、糖鎖を０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌとなるようにリポソーム溶液に添加し、反応させることにより行っている。このときのＳＬＸのモル濃度は、それぞれ、０μＭ、１８．２μＭ、６０．６μＭ、１２１．３μＭ、２４２．７μＭ、６０６．７μＭ、１２１３．３μＭ、１７４３μＭとなる。【０９４３】
本実施例では、蛍光物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒ−Ｉ（ＦＩＴＣ）（Ｍ．Ｗ．３８９．３８、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いた。ＦＩＴＣの励起波長は、４９５ｎｍ、蛍光波長は５２０ｎｍである。【０９４４】
ＦＩＴＣをアミノ化させるために、ＦＩＴＣ  １８．８ｍｇを精製水１０ｍｌに溶解し、炭酸水素アンモニウム  ５ｇを添加して、３７℃、２時間反応させた後、氷上で冷却後、溶液を回収した。表面にＤＴＳＳＰを結合させたＣｙ５．５内包リポソーム溶液２ｍＬ（脂質量  ４ｍｇ／ｍＬ）に対して、ＦＩＴＣ溶液を最終モル濃度が、０μＭ、１８．２μＭ、６０．６μＭ、１２１．３μＭ、２４２．７μＭ、６０６．７μＭ、１２１３．３μＭ、１７４７μＭとなるように添加して、２時間室温で反応させた後、１３２ｍｇ  Ｔｒｉｓ／ＣＢＳ緩衝液をそれぞれ４０μＬ添加して、２〜８℃で１６時間反応させ、分画分子量（３００Ｋ）の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、遊離のＦＩＴＣおよびＴｒｉｓを除去した。【０９４５】
（定量）
蛍光分光器として、島津ＲＦ５３００ＰＣをもちいた。【０９４６】
標準物質として、アミノ化ＦＩＴＣ  １．８８ｍｇ／ｍＬを精製水で１６００倍に希釈した（最終濃度１．１８μｇ／ｍＬ、４．５μＭ）。【０９４７】
さらに、このアミノ化ＦＩＴＣ溶液を精製水で希釈し、０／１０溶液、１／１０溶液、２／１０溶液、３／１０溶液、４／１０溶液、５／１０溶液、６／１０溶液、７／１０溶液、８／１０溶液、９／１０溶液、１０／１０溶液を作製した。【０９４８】
また、この標準物質を３ｍＬの精製水に１０μＬ添加して、四面透過型のセルに入れ、蛍光強度の測定を行った。【０９４９】
従って、１０．１３ｐＭ、９．１２ｐＭ、８．１１ｐＭ、７．０９ｐＭ、６．０８ｐＭ、５．０７ｐＭ、４．０５ｐＭ、３．０４ｐＭ、２．０３ｐＭ、１．０１ｐＭ、０ｐＭのＦＩＴＣを用いて検量線を作成した（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍ）（表９）。【０９５０】
【表１１】
0005465542.tif 000213
【０９５１】
アミノ化ＦＩＴＣ  ０μＭ、１８．２μＭ、６０．６μＭ、１２１．３μＭ、２４２．７μＭ、６０６．７μＭ、１２１３．３μＭ、１７４７μＭと反応させたリポソーム溶液（糖鎖の反応時のモル濃度と同一モル濃度）を検体として、表面に結合しているＦＩＴＣ量を求めた。【０９５２】
アミノ化ＦＩＴＣ  ０μＭ、１８．２μＭ、６０．６μＭ、１２１．３μＭについては、３ｍＬの精製水に３０μＬ添加した。アミノ化ＦＩＴＣ  ２４２．７μＭ、６０６．７μＭについては、３ｍＬの精製水に１０μＬ添加した。アミノ化ＦＩＴＣ  １２１３．３μＭ、１７４３μＭについては、３ｍＬの精製水に５μＬ添加した。これらを四面透過型のセルに入れ、蛍光強度の測定を行った（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍ）。【０９５３】
（結果）
反応時のＳＬＸ濃度に対応するＦＩＴＣ濃度でリポソーム膜面上にアミノ化ＦＩＴＣを付加させると、下記表１０のような結果となった。リポソーム膜面上に結合させたアミノ化ＦＩＴＣ量を測定することにより、結合糖鎖量の評価が可能であることがわかった。【０９５４】
【表１２】
0005465542.tif 000214
【０９５５】
（実施例１１．ＧＭ３およびＧＭ４以外の糖脂質を用いて調製したリポソーム）
（１．合成糖脂質を用いたリポソームの調製）
本実施例では、実施例１〜３と同様の方法を使用してガングリオシド（ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ，ＧＰ１ｃを調製する。【０９５６】
リポソームは、実施例４と同様の方法により改良コール酸透析法を用いて調製する。【０９５７】
リポソーム構成用脂質を混合する。【０９５８】
次いで、この混合したリポソーム構成用脂質に、コール酸ナトリウムを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液に溶解する。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得る。得られた脂質膜をＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液に再懸濁し、攪拌する。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得る。さらに、ミセル懸濁液を限外濾過にかけ均一リポソームを調製する。【０９５９】
このリポソーム溶液１０ｍｌを限外濾過にかけ溶液のｐＨを調製する。次に、架橋試薬を加え、攪拌する。そして、このリポソーム液を限外濾過にかける。次に、緩衝液に溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム液に加える。次いで、この溶液を攪拌した後、限外濾過にかける。【０９６０】
（リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて、実施例４と同様の方法によって行う。【０９６１】
（脂質・タンパク質定量）
実施例４と同様の方法を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することにより求めることができる。【０９６２】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定することができる。【０９６３】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定することができる。【０９６４】
（合成ガングリオシドを用いた、Ｃｙ５．５内包リポソームの調製）
本実施例では、実施例５と同様の方法を用いてミセル懸濁液を調製する。【０９６５】
一方、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を緩衝液に溶解し、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を混合し、反応させた後、限外濾過を行うことにより遊離のＣｙ５．５−ＮＨＳ  エステルを除去し、Ｃｙ５．５結合ＨＳＡ溶液を得る。【０９６６】
上記のミセル懸濁液に、Ｃｙ５．５結合ＨＳＡ溶液を混合し、限外濾過をしてＣｙ５．５を内包したリポソーム溶液（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｃｙ５．５）を得る。以下、実施例５と同様の処理をする。【０９６７】
（脂質・タンパク質定量）
実施例５と同様の方法を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することにより求めることができる。【０９６８】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定することができる。【０９６９】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定することができる。【０９７０】
（２．合成糖脂質を用いた糖鎖修飾リポソームの調製）
（リポソーム糖鎖付加）
本実施例において調製した合成糖脂質リポソーム溶液を用いる。【０９７１】
各リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）１０ｍｌに架橋試薬３，３−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；ＰＩＥＲＣＥ）１０ｍｇを加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０９７２】
精製水に溶解したシアリルルイスＸ（ＳＬＸ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に、炭酸水素アンモニウムを添加して、撹拌することにより、アミノ化ＳＬＸ溶液を得る。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＳＬＸを添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し、撹拌する。限外濾過により遊離のＳＬＸとＴｒｉｓを除去する。【０９７３】
（リポソーム表面への認識プローブ結合評価）
（ＦＩＴＣ結合評価）
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）に架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０９７４】
精製水に溶解したＦＩＴＣに炭酸水素アンモニウムを添加して、撹拌することにより、アミノ化ＦＩＴＣ溶液を得る。上記のＤＴＳＳＰを付加したリポソーム溶液にアミノ化ＦＩＴＣを添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し撹拌した。限外濾過により遊離のＦＩＴＣとＴｒｉｓを除去し、ＦＩＴＣ結合リポソームを得る。【０９７５】
リポソームへのＦＩＴＣ結合量は、蛍光量（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定することで求めることができる。【０９７６】
（抗体結合量評価）
リポソーム溶液（リポソーム中間体ＨＳＡ）に架橋試薬ＤＴＳＳＰ（ＰＩＥＲＣＥ）を加えて、撹拌した後、遊離のＤＴＳＳＰを限外濾過により除去する。【０９７７】
このリポソーム溶液に抗体（例えば、抗Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体）を添加し、反応させた後、Ｔｒｉｓ溶液を添加し、撹拌する。限外濾過により遊離の抗体とＴｒｉｓを除去し、抗体結合リポソームを得る。【０９７８】
リポソーム表面に結合した抗体量は、Ｅｎｚｙｍｅｄ  ｉｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法によって測定することができる。抗原となるタンパク質（例えば、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））ＰＢＳ溶液を９６穴マイクロプレートに１  ｗｅｌｌにつき５０μｌずつ添加し、固相化する。プレート内の抗原溶液をすて、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを３００μｌずつ添加し、静置する。ＢＳＡ溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体標準液および抗体結合リポソームサンプルを１００μｌずつ添加し、１時間置いた後、ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄する。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１０％  Ｔｗｅｅｎ２０／  ９％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで希釈し、これを１００μｌずつ添加し、１時間置いた。ウェル内の溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄したのち１−ＳｔｅｐＴＭ  ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、反応させ、反応停止液（２Ｍ硫酸）を１００μｌずつ添加する。吸光度４５０ｎｍを測定し、抗体標準溶液からリポソーム表面の抗体結合量を求めることができる。【０９７９】
（脂質・タンパク質定量）
得られたリポソームの脂質量は、０．５％  ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することができる。【０９８０】
タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定することができる。【０９８１】
（粒子径・ゼータ電位測定）
粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いて測定することができる。【０９８２】
（３．合成糖脂質を用いた、Ｃｙ５．５内包糖鎖修飾リポソームの調製）
（リポソーム糖鎖付加）
本実施例において調製したＣｙ５．５内包リポソーム溶液を用いる。【０９８３】
実施例７と同様の方法を用いて、Ｃｙ５．５内包リポソームに標的部位認識プローブを付与した。【０９８４】
（リポソーム表面へ結合した認識プローブの評価）
（ＦＩＴＣ結合評価）
実施例７と同様の方法を用いて、リポソームへのＦＩＴＣ結合量を求めることができる。【０９８５】
（抗体結合量評価）
実施例７と同様の方法を用いて、リポソームへの抗体結合量を求めることができる。【０９８６】
（脂質・タンパク質定量）
実施例７と同様の方法を用いて、リポソームの脂質量およびタンパク質量を求めることができる。【０９８７】
（粒子径・ゼータ電位測定）
実施例７と同様の方法を用いて、リポソームの粒子径およびゼータ電位を求めることができる。【０９８８】
（担癌マウスを用いた評価）
癌部位への集積性を担癌マウスを用いて、実施例７と同様の方法により確認する。【０９８９】
（実施例１２．糖鎖修飾リポソームにおけるガングリオシド（ＧＭ３）と集積性との関係）
本実施例では、種々のガングリオシド（ＧＭ３）を含むリポソームについて、担癌部位への集積性を比較検討した。【０９９０】
（担癌マウスの作製）
エールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞；５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃマウス（１２匹）（雌性、６週齢）の右大腿部皮下に移植し、移植の１０日後に以下の実験に使用した。【０９９１】
（リポソームの調製）
リポソームの脂質組成成分中、ガングリオシドとして総ガングリオシド（豚由来、ＴＧＡＮＧ１４、ＡＶＡＮＴＩ）、合成ＧＭ３  植物型セラミド、合成ＧＭ３  疑似型セラミド、合成ＧＭ３  天然型セラミドを用いて、実施例７Ａと同様の方法により、Ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミンを内包させたＳＬＸ修飾リポソーム（Ｋ１）を調製した。用いた糖鎖密度は、５０μｇ／ｍｌであった。【０９９２】
各リポソームについて、実施例７と同様の方法により、物性（脂質量、粒子径およびゼータ電位）を確認した。各リポソームに含まれる脂質量は、０．５％  ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出した。各リポソームに含まれるタンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて算出した。粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定した。【０９９３】
その結果、本実施例により作製したリポソームは、表５に示したのと同様の物性（脂質量、粒子径およびゼータ電位）を示した。【０９９４】
（担癌マウスへのリポソーム投与および集積性の評価）
１／１０ネンブタール溶液を各担癌マウスの腹腔内に３００μｌ投与して麻酔をかけた。尾静脈からＣｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）を移植し、移植の１０日後にリポソーム１００μｌ（脂質量３７５μｇ相当）を投与して４８時間後に、蛍光イメージング装置ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により画像データをとった。【０９９５】
（結果）
図１７Ａおよび図１７Ｂに示す通り、植物型ＧＭ３を用いて作製した糖鎖修飾リポソームが担癌部位へ最も集積性が高かった。（Ａ）に示す天然型ＧＭ３では、当初の予測に反し、担癌部位への集積は軽微であった。また、植物型ＧＭ３を用いた糖鎖修飾リポソームは、総ガングリオシドで作製した糖鎖修飾リポソームよりも、約１．４倍高い担癌部位への集積が確認された。このことから、植物型ＧＭ３は担癌部位を標的化するリポソームを作製する上で、評価を行った合成ガングリオシドおよび総ガングリオシド中、最も有用であることが見いだされた。【０９９６】
（実施例１３．糖鎖修飾リポソームにおけるガングリオシド（ＧＭ４）と集積性との関係）
（担癌マウスの作製）
エールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞；５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃマウス１２匹（雌性、６週齢）の右大腿部皮下に移植し、移植の１０日後に以下の実験に使用する。【０９９７】
（リポソームの調製）
リポソームの脂質組成成分中、ガングリオシドとして総ガングリオシド（豚由来、ＴＧＡＮＧ１４、ＡＶＡＮＴＩ）、合成ＧＭ４  植物型セラミド、合成ＧＭ４  疑似型セラミド、合成ＧＭ４  天然型セラミドを用いて、実施例７Ａと同様の方法により、Ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミンを内包させたＳＬＸ修飾リポソーム（Ｋ１）を調製した。用いる糖鎖密度は、５０μｇ／ｍｌである。【０９９８】
本実施例により作製したリポソームは、実施例７と同様の方法を用いてその物性（脂質量、粒子径およびゼータ電位等）を確認することができる。リポソームに含まれる脂質量は、０．５％  ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することができる。タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて算出することができる。粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定することができる。【０９９９】
（担癌マウスへのリポソーム投与および集積性の評価）
１／１０ネンブタール溶液を各担癌マウスの腹腔内に３００μｌ投与して麻酔をかける。尾静脈からＣｙ５．５内包糖鎖修飾リポソーム（Ｋ１）１００μｌ、脂質量３７５μｇ相当）を投与して４８時間後に、蛍光イメージング装置ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により画像データをとることにより、各リポソームついて腫瘍への集積性を評価することができる。【１０００】
（実施例１４．抗体修飾リポソームにおけるガングリオシド（ＧＭ３および４）と集積性との関係）
（担癌マウスの作製）
エールリッヒ腹水癌細胞（ＥＡＴ細胞；５×１０６個）をＢａｌｂ／ｃマウス（２１匹）（雌性、６週齢）の右大腿部皮下に移植し、移植の１０日後に以下の実験に使用する。【１００１】
（リポソームの調製）
リポソームの脂質組成成分中、ガングリオシドとして総ガングリオシド（豚由来、ＴＧＡＮＧ１４、ＡＶＡＮＴＩ）、合成ＧＭ３  植物型セラミド、合成ＧＭ３  疑似型セラミド、合成ＧＭ３  天然型セラミド、合成ＧＭ４  植物型セラミド、合成ＧＭ４  疑似型セラミド、合成ＧＭ４  天然型セラミドを用いて、実施例７Ｂと同様の方法により、Ｃｙ５．５標識ヒト血清アルブミンを内包させた抗Ｅセレクチン抗体修飾リポソームを調製した。用いる抗体の量は、５０〜５００μｇ／ｍｌである。【１００２】
本実施例により作製したリポソームは、実施例７と同様の方法を用いてその物性（脂質量、粒子径およびゼータ電位等）を確認することができる。リポソームに含まれる脂質量は、０．５％  ＴｉｔｏｎＸ−１００存在下、デタミナーＴＣ５５５（協和メディクス）を用いて、総コレステロール量を測定し、各脂質のモル比から総脂質量を算出することができる。タンパク質量は、１％  ＳＤＳ存在下、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて算出することができる。粒子径とゼータ電位は、リポソーム溶液を精製水で５０倍に希釈し、２５℃でゼータサイザーＮａｎｏ−Ｓ９０（シスメックス）を用いることにより測定することができる。【１００３】
（担癌マウスへのリポソーム投与および集積性の評価）
１／１０ネンブタール溶液を各担癌マウスの腹腔内に３００μｌ投与して麻酔をかける。尾静脈からＣｙ５．５内包抗体修飾リポソーム１００μｌ（脂質量３７５μｇ相当）を投与して４８時間後に、蛍光イメージング装置ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により画像データをとることにより、各リポソームついて腫瘍への集積性を評価することができる。【１００４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本明細書の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１７Ａ】
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