(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの疑似ペプチド単位がグラフトした支持体を含む、またはそれからなる多価合成化合物の、がんの治療用医薬の製造のための使用であり、該化合物は下記式（Ｉ）を有する前記使用：
Ψ
ｋ〔（Ｘ）n −Ｙ1 −（Ｚ）i −Ｙ2 −（Ｘ）m 〕−支持体    （Ｉ）
式中、
支持体は、以下からなる群より選ばれる直鎖ペプチドであり：
・配列SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:4 、
・２〜４個のKAKPG （SEQ ID NO:１２）単位からなる直鎖配列、および
・３〜８個の配列Aib-Lys-Aib-Gly （SEQ ID NO:６）またはLys-Aib-Gly （SEQ ID NO:７）のペプチド単位からなるらせん形構造を有する直鎖ペプチド、
各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表し；
Ｙ1 およびＹ2 は独立にアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）から選ばれ；
Ｚはプロリンであり；
ｎおよびｉは独立に０または１であり；
ｍは０〜１の整数であり；
ｋは３〜８の整数であり；そして
Ψは還元された結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）、レトロ−インバーソ結合（−ＮＨＣＯ−）、メチレンオキシ結合（−ＣＨ2 −Ｏ−）、チオメチレン結合（−ＣＨ2 −Ｓ−）、カルバ結合（−ＣＨ2 −ＣＨ2 −）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ2 −）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨＯＨ−ＣＨ2 −）、（−Ｎ−Ｎ−）結合、Ｅ−アルケン結合、および（−ＣＨ＝ＣＨ−）結合から選択された修飾ペプチド結合を表す。
【請求項２】
前記支持体が、以下からなる群より選ばれる直鎖ペプチドである、請求項１記載の使用：
・配列SEQ ID NO:１またはSEQ ID NO:4 、
・２〜４個のKAKPG （SEQ ID NO:１２）単位からなる直鎖配列、および
・３〜８個の配列Aib-Lys-Aib-Gly （SEQ ID NO:６）またはLys-Aib-Gly （SEQ ID NO:７）のペプチド単位からなるらせん形構造を有する直鎖ペプチド。
【請求項３】
前記支持体が、配列SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１８もしくはSEQ ID NO:１９の直鎖ペプチドから選択される、請求項２記載の使用。
【請求項４】
ｉが１である、請求項１〜３のいずれかの項記載の使用。
【請求項５】
Ｙ1 がリシン（Ｋ）であり、Ｙ2 がアルギニン（Ｒ）である、請求項１〜４のいずれかの項記載の使用。
【請求項６】
ｎおよびｍが０である、請求項１〜５のいずれかの項記載の使用。
【請求項７】
化合物が、下記から選択される、請求項１記載の使用。
・下記式のＨＢ１９：
【化１】
0005559531.tif 000003
・下記式のNucant ２：
【化２】
0005559531.tif 000004
・下記式のNucant ３：
【化３】
0005559531.tif 000005
・下記式のNucant ６：
【化４】
0005559531.tif 000006
および
・下記式のNucant ７：
【化５】
0005559531.tif 000007
【請求項８】
下記から選択される多価合成化合物。
・下記式のNucant ２：
【化６】
0005559531.tif 000008
・下記式のNucant ３：
【化７】
0005559531.tif 000009
・下記式のNucant ６：
【化８】
0005559531.tif 000010
および
・下記式のNucant ７：
【化９】
0005559531.tif 000011
【請求項９】
下記から選択される請求項８記載の多価合成化合物。
・下記式のNucant ６：
【化１０】
0005559531.tif 000012
および
・下記式のNucant ７：
【化１１】
0005559531.tif 000013
【請求項１０】
請求項８または９に記載の化合物を含む薬剤組成物。
【請求項１１】
少なくとも３つの疑似ペプチド単位がグラフトした支持体を含む、またはそれからなる多価合成化合物の、炎症性疾患の治療用医薬の製造のための使用であり、該化合物は下記式（Ｉ）を有する前記使用：
Ψ
ｋ〔（Ｘ）n −Ｙ1 −（Ｚ）i −Ｙ2 −（Ｘ）m 〕−支持体    （Ｉ）
式中、
支持体は、以下からなる群より選ばれる直鎖ペプチドであり：
・配列SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:4 、
・２〜４個のKAKPG （SEQ ID NO:１２）単位からなる直鎖配列、および
・３〜８個の配列Aib-Lys-Aib-Gly （SEQ ID NO:６）またはLys-Aib-Gly （SEQ ID NO:７）のペプチド単位からなるらせん形構造を有する直鎖ペプチド、
各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表し；
Ｙ1 およびＹ2 は独立にアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）から選ばれ；
Ｚはプロリンであり；ｎおよびｉは独立に０または１であり；
ｍは０〜１の整数であり；
ｋは３〜８の整数であり；そして
Ψは還元された結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）、レトロ−インバーソ結合（−ＮＨＣＯ−）、メチレンオキシ結合（−ＣＨ2 −Ｏ−）、チオメチレン結合（−ＣＨ2 −Ｓ−）、カルバ結合（−ＣＨ2 −ＣＨ2 −）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ2 −）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨＯＨ−ＣＨ2 −）、（−Ｎ−Ｎ−）結合、Ｅ−アルケン結合、または（−ＣＨ＝ＣＨ−）結合から選択された修飾ペプチド結合を表す。
【請求項１２】
前記支持体が、以下からなる群より選ばれる直鎖ペプチドである、請求項１１記載の使用：
・配列SEQ ID NO:１またはSEQ ID NO:4 、
・２〜４個のKAKPG （SEQ ID NO:１２）単位からなる直鎖配列、および
・３〜８個の配列Aib-Lys-Aib-Gly （SEQ ID NO:６）またはLys-Aib-Gly （SEQ ID NO:７）のペプチド単位からなるらせん形構造を有する直鎖ペプチド。
【請求項１３】
前記支持体が、配列SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１８もしくはSEQ ID NO:１９の直鎖ペプチドから選択される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ｉが１である、請求項１１〜１３のいずれかの項記載の使用。
【請求項１５】
Ｙ1 がリシン（Ｋ）であり、Ｙ2 がアルギニン（Ｒ）である、請求項１１〜１４のいずれかの項記載の使用。
【請求項１６】
ｎおよびｍが０である、請求項１１〜１５のいずれかの項記載の使用。
【請求項１７】
化合物が、下記から選択される、請求項１１記載の使用。
・下記式のＨＢ１９：
【化１２】
0005559531.tif 000014
・下記式のNucant ２：
【化１３】
0005559531.tif 000015
・下記式のNucant ３：
【化１４】
0005559531.tif 000016
・下記式のNucant ６：
【化１５】
0005559531.tif 000017
および
・下記式のNucant ７：
【化１６】
0005559531.tif 000018
【請求項１８】
前記炎症性疾患が、自己免疫疾患、敗血症、敗血症性ショック、心臓の炎症性疾患、移植片拒絶、外傷、関節の炎症性疾患、胃腸系の炎症性疾患、皮膚の炎症性疾患、呼吸器系の炎症性疾患、およびアレルギーから選択される、請求項１１〜１７のいずれかの項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖及び／又は血管形成の調節解除（deregulation) を含む疾患の治療を意図した医薬、好ましくは表面ヌクレオリンリガンドとして作用する医薬の製造のための、少なくとも３つの疑似ペプチド単位が支持体にグラフト (graft)した多価合成化合物の使用に関し、この化合物は下記式（Ｉ）を有し、
Ψ
〔（Ｘ）n −Ｙ1 −（Ｚ）i −Ｙ2 −（Ｘ）m 〕k −支持体    （Ｉ）
式中、各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表し；Ｙ1 およびＹ2 は塩基性側鎖を有するアミノ酸から独立に選択され；Ｚはγ、βまたはδ位で置換されていてもよいプロリン、天然または非天然Ｎ−アルキルアミノ酸、ジアルキルアミノ酸、環状ジアルキルアミノ酸、ピペコリン酸またはその誘導体から選択され；ｎおよびｉは独立に０または１であり；ｍは０〜３の整数であり；ｋは３以上の整数であり、Ψは、少なくとも１種のプロテアーゼに対して正規のペプチド結合よりも有意に抵抗性である修飾ペプチド結合を表す。
【背景技術】
【０００２】
細胞分裂、即ち有糸分裂は、組織を修復または再生して死細胞に代わるために、細胞を増殖させることを可能にするプロセスである。がん細胞においては、このプロセスの調節に欠陥があり、このことが、これらの細胞が無秩序に分裂し腫瘍を生じる理由である。従って、がんの進展を防止する１つの効果的な治療経路は、抗有糸分裂（anti-mitotic）特性を有する分子を用いるがん細胞の分裂の阻止にある。
【０００３】
しかし、現在の抗有糸分裂性の分子（例えば、パクリタキセル−これはタクソールという名でより知られている−またはコルチシン）は区別なくすべての細胞に対して細胞特異性なしで作用するため、多くの望ましくない副作用を引き起こす。従って、有害な作用のより少ない抗有糸分裂性分子を開発することが必要である。
【０００４】
どの腫瘍も成長するためには栄養と酸素を必要とする。これらの要素は、血管形成として知られる機構から生じる腫瘍内血管により提供される。事実、これらの血管がないと、腫瘍細胞は細胞壊死過程を経て、腫瘍成長は遅くなり、次いで停止する。従って、がんと闘う別の治療経路の一例は、この機構を調節する分子を阻害することにより血管形成を阻止することにある。
【０００５】
現在の抗血管形成性分子の多くは、１種類の血管形成因子に特異的である。このモノ特異性は抵抗現象を生じさせる。１類種の血管形成因子の阻害は、血管形成の補償機構により別の種類の発現を生じる。従って、関係する因子に対して広い活性スペクトルを有する抗血管形成分子を利用できるのが有利である。
【０００６】
しかし、血管形成過程だけの阻害は一般的に、腫瘍成長を有効に阻止するのに不十分であることが分かっている。さらに、これは転移の形成を阻止することはない。
従って、腫瘍細胞増殖および腫瘍における血管形成過程の両方を阻害しうる新規な抗がん性分子を利用できるのが極めて有用である。事実、最近の研究は、２種類の治療用分子、即ち抗有糸分裂分子および抗血管形成分子の組み合わせが相乗効果を生じ、これらの分子の１種類のみによる治療に比べ全体の治療効率を著しく向上させることを示している。
【０００７】
これら両方の効果、即ち抗有糸分裂性および抗血管形成性をもつ分子はまだ報告されていない。
さらに、現在の抗がん剤の大多数は実際には腫瘍細胞に特異的ではなく、従って、健康な細胞も標的とし、多くの、時には重篤な副作用を生じる。この問題は、ある種の腫瘍の表面分子を標的とする抗体の開発により、解決された例もあった。しかし、抗体の使用は、その他の重大な問題を引き起こし、非毒性の有効な治療用抗体の開発は、時間がかかり、不確実で高コストの操作である。さらに、大規模での、そして厳格な健康的かつ安全な条件下での抗体の製造は特に困難である。その結果、特異的抗体に基づく治療は依然として極めてまれで非常に高コストである。
【０００８】
パクリタキセルなどの従来の抗がん剤に関連する別の問題は、これらの分子は高度に疎水性であることが多く、これにより、in vivo での許容しうる生物学的利用能を達成するには複雑で高価な薬剤処方を開発することが必要となる。核酸を用いる治療の場合には、それらを効果的かつ特異的方法でその標的細胞に到達させるのは極めて難しいので、in vivo での生物学的利用能の問題はますます深刻となる。
【０００９】
従って、下記の性質を示す抗がん性分子を利用できるようにすることは非常に有用であろう：
−従来の化学療法または放射線療法を併用せず、従ってこれらの種類の治療法に関連する副作用を制限し、単独で有効でありうるように、腫瘍増殖および血管形成に対する二重の阻害作用の結果としての大いに改善された効果、
−治療への抵抗性を防止するための血管形成因子に対するかなり広範な活性スペクトル、−腫瘍細胞へのより大きい特異的の結果としての非常に少ない副作用、
−工業的規模に容易に適合しうる合成プロセス、
−水性媒体中での良好な溶解性および改善されたin vivo 分解過程に対する抵抗性による、特に、より良好な生物学的利用能及び／又はより長いin vivo 半減期の結果としての、とりわけ、腫瘍細胞に対する直接的特異性の結果としての、より使用し易いこと。
【００１０】
ヌクレオリン（図１Ａの構造参照）は大多数の真核細胞に存在する核タンパク質として最初報告された。より最近には、細胞膜への結合を可能にする膜貫通ドメインが存在しないにもかかわらず、このタンパク質の別の分子形態が細胞表面上にも存在することが示された（１〜４）。この表面ヌクレオリンは細胞内アクチンマイクロフィラメントと密接に関連している。この関連は多分、膜貫通パートナーを介して間接的に生じている。
【００１１】
休止細胞では、ヌクレオリンは主に核小体に見られ、また部分的に細胞質および細胞表面にも見られる。細胞増殖の活性化の後、細胞質のヌクレオリンは、小胞体およびゴルジ体と無関係の、通常の機構ではない能動輸送により膜表面へ移動される（１）。
【００１２】
従って、表面ヌクレオリンの発現の度合いは、細胞の活性化後、特に細胞増殖の活性化後に大きく増加する。よって、表面ヌクレオリンは増殖相における活性化細胞のマーカーとなる。活性化細胞を標的とするヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のある特定の場合に、表面ヌクレオリンがＨＩＶによる細胞感染に関与しているかもしれないことが示された（２、５）
さらに、表面ヌクレオリンは、肝臓がん（６）、Ｔ−リンパ球性白血病（７および８）および子宮がん細胞（７）由来の腫瘍細胞などの腫瘍細胞の表面、並びに活性化内皮細胞（９）、血管形成過程に関与する細胞の表面で発現することも示された。さらに、表面ヌクレオリンは、各種リガンド、特にミドカイン（midkine)（ＭＫ）、ヘバリン結合性調節ペプチド（heparin affin regulatory peptide：ＨＡＲＰ：プレイオトロフィンとしても知られる：ＰＴＮ）およびラクトフェリンなどの数種の成長因子に対して弱い親和性を有する受容体を構成する（１０〜１２）。
【００１３】
最近、特許出願WO 2005/035579において、抗ヌクレオリン抗体、抗ヌクレオリン干渉ＲＮＡまたはアンチセンス抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチドなどのヌクレオリン結合性薬剤を用いてがんを治療することが可能であることが示唆された。提示された主な結果から、表面ヌクレオリンはがん細胞のマーカーと考えることができ、これはそれ自身は良好な標的にならないことが分かる。マウスにおける予備的結果のみから、抗ヌクレオリン抗体がタクソールによる腫瘍退縮を改善しうることが示される。しかし、かかる抗体単独の効果を証明する結果は何ら報告されておらず、そしてタクソールとの組み合わせによりこの改善を得るために必要とされる用量は示されていない。さらに、前述のように、ヒトでの抗体のin vivo の使用は投与の点で重大な問題を提起する。
【００１４】
抗ヌクレオリン剤は種々の経路で作用しうる。特に、かかる剤はタンパク質ヌクレオリンに結合することによって作用したり作用しないかもしれない。干渉性ＲＮＡ型の剤、即ちアンチセンス抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチドについては、多分これらの剤は細胞内核酸のレベルで作用し、ヌクレオリンへの結合のレベルでは作用しない。例えば、米国特許出願US2005/0026860では、アンチセンスヌクレオリンオリゴヌクレオチドがマウスモデルにおいてin vivo での腫瘍退縮に正の効果を有すると報告されている。それにもかかわらず、マウスで観察された効果は部分的であり、より小さい腫瘍が生じており、そして血管形成に対する効果は何ら報告も示唆もされていない。これらの結果は、ヌクレオリンががんの治療において標的であると考えることができることを示唆するが、抗ヌクレオリン剤単独での治療の可能性に導くのではなく、むしろ従来の化学療法に加え単に補助的治療としての平均的効果を示唆する。さらに、前述のように、in vivo でのオリゴヌクレオチドの使用は重大な生物学的利用能の問題を生じる。
【００１５】
抗ヌクレオリン剤はまたヌクレオリンタンパク質に直接結合しうる。各種のヌクレオリンリガンドが文献に記載されている：
−ペプチドＦ３（または腫瘍ホーミングペプチド）は、各種の腫瘍の血管の活性化内皮細胞に結合するタンパク質ＨＭＧ２Ｎの３４アミノ酸断片に相当するペプチドである。最近、ペプチドＦ３が内皮細胞において発現するヌクレオリンに結合し、次いで内在化され、能動プロセスによって核に輸送されることが示された。ヌクレオリンへの結合および内在化は抗ヌクレオリン抗体により阻止される。ペプチドＦ３はいくつかのアミノ酸に富む領域を含むヌクレオリンのＮ末端領域に結合することが報告された（９）。この出願において、発明者らは、ペプチドＦ３が、増殖因子ＨＡＲＰにより引き起こされるNIH-3T3 細胞の細胞増殖を阻止できないことを示した（実施例1.1.1 参照）。従って、単に表面ヌクレオリンへ結合し、内在化されるだけでは、このペプチドに腫瘍細胞増殖を阻害する能力を付与するのに十分でない；
−本発明者らにより合成され報告された多価化合物ＨＢ１９（図２Ａ参照）もまた、ＲＧＧドメイン（図１Ｂ参照）と相互作用する表面ヌクレオリンのリガンドである（７、８、１３、１４）。この化合物はＨＩＶにより活性化された細胞の感染（１３）、およびヌクレオリンへのその他の天然リガントの結合（１０〜１２）を阻害するのを可能にするかもしれないことが示された。しかし、腫瘍成長または血管形成を低下及び／又は阻害しうるその能力を証明する結果は報告されていない；
−特許出願ＷＯ００／６１５９７号はグアニンに富むオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）をヌクレオリンと思われるタンパク質に結合し、そして１５μM 以上の用量においてin vitroで腫瘍細胞の増殖を阻害するとして記載している（１５）。in vivo では、従来の化学療法治療と併用したある種の相乗効果の存在が述べられているだけである。血管形成に対する効果は記載も示唆もない。さらに、ＧＲＯは主に細胞内ヌクレオリンに結合するようである；
−ＷＯ００／６１５９７が特許登録されたグループにより発行された論文において、同じセンス鎖にＧＲＯなどのＧおよびＴ塩基を、またＡおよびＣ塩基を含む、ＭＩＸ１と称される別の混合オリゴヌクレオチドが、ＧＲＯと同じ効率で、しかし細胞増殖には影響せずにヌクレオリンに結合するとして記載されており、これはヌクレオリンへの結合だけでは細胞増殖を阻害する能力を付与するのに十分でないことを再び示唆する（１５）；
−最近、あるグループにより、抗ヌクレオリンポリクローナル抗体を含む製剤を用いてＶＥＧＦにより誘導される血管形成を阻害することができることが示された（１６）。しかし、抗ヌクレオリンポリクローナル抗体製剤は内皮細胞による細管の形成を阻止するにもかかわらず、内皮細胞の増殖は阻止しない。さらに、ＶＥＧＥにより誘導される血管形成のみが試験されているが、血管形成に関与する因子はその他多数存在し、そして細胞増殖の阻害を示す結果は記載も示唆もされていない。
【００１６】
上記より、ヌクレオリンのリガンドがすべて抗腫瘍活性を示すわけではなく、上記で引用したどの文献も、これらのリガンドのいずれかが全般的な腫瘍細胞の増殖および各種因子により引き起こされる血管形成の両方を阻害するようであることを示唆していないことは明らかである。
【００１７】
さらに、示された結果は、単独でまたは組み合わせ考慮しても、これらのリガンドが通常の抗がん治療（放射線療法、または特にタクソールなどの通常の化学療法）と組み合わせることなしに単独で使用するのに十分な活性を有するかもしれないことは決して示唆していない。
【発明の開示】
【００１８】
しかし、本発明者らは意外にも、５価ペプチド化合物ＨＢ１９、または同じ種類の少なくとも３つの疑似ペプチド単位が支持体上にグラフトされたその他の化合物が、足場依存性でも非依存性でも（トランスフォームされた細胞に特徴的な増殖）、また各種増殖因子により引き起こされようが、全般的に腫瘍細胞の増殖を阻害すること、および各種因子により引き起こされる血管形成を阻害することを可能にすることを示した。さらに、そしてより重要なことに、本発明者らはマウスモデルにおいて、５価化合物ＨＢ１９が腫瘍増殖および血管形成の両方のin vivo 阻害を可能にし、また、ペプチドについての通常の用量（５mg／kg）での化合物ＨＢ１９の抗腫瘍効果は１０mg／kgでのタクソールの効果よりも大きいことを示す。タクソールは抗腫瘍治療で使用される標準的分子の１つである。
【００１９】
従って、表面ヌクレオリンのその他の上記リガンドが補助的な種類の治療に導くような部分的効果しかもたないようであるのに対し、化合物ＨＢ１９はマウスにおいてin vivo で標準的抗がん分子であるタクソールよりも大きい効果を示し、これは通常の化学療法分子との組み合わせでなく単独で用いる可能性を示唆している。特に、タクソールの投与量は腫瘍の退縮を生じるが、腫瘍を見つけマウスを致死させてから秤量しているので、退縮は完全ではない。これに対し、２倍低い用量で５価リガンドＨＢ１９を用いると、マウスにおいてその致死後腫瘍は見つからず、従って完全な退縮を実証している。
【００２０】
従って、多価化合物ＨＢ１９は、非常に強力な抗がん剤であるようである。この効果はおそらく、本発明者らにより実証されたように、いくつかの異なる増殖因子により引き起こされようが、足場非依存性であろうが、腫瘍細胞の増殖を阻害し、かつ２種類の異なる血管形成因子による血管形成過程を阻害するという二重の能力に関連している。
【００２１】
さらに、化合物ＨＢ１９の存在下で数週間in vitro培養した細胞上でも、また化合物ＨＢ１９で処置したマウスにおいてin vivo でも、本発明者らにより毒性は何ら見出されなかった。さらに、in vivo 投与後の多価化合物ＨＢ１９に結合したタンパク質の精製により９０％超の表面ヌクレオリンを得ることが可能となり、これは多価化合物ＨＢ１９とヌクレオリンの間の相互作用の高い特異的を示唆している。これは、副作用の発生の可能性を大きく制限する。本発明者らはまた、ペプチドＨＢ１９が表面ヌクレオリンに結合後内在化されうるにもかかわらず、核に到達しないことを示したが、これは健全な細胞にとって毒性がないことを説明する重要な事実である。
【００２２】
化合物ＨＢ１９およびその誘導体もしくは類似体はまた、容易に制御可能な健全で安全な条件下で、工業的規模でさえも容易に合成される。
最後に、この化合物のヌクレオリンに対する、並びに腫瘍細胞および活性化内皮細胞に対する特異性、疑似ペプチド性および水性媒体中での高い溶解性は、それがin vivo での非常に良好な生物学的利用能を有することを意味する。化合物ＨＢ１９の表面ヌクレオリンに対する特異性は標的分子との結合を必要としない。さらに、ＨＢ１９の場合に示される各ＫＰＲ単位のリシンとプロリンの間の修飾ペプチド結合（ＨＢ１９の場合には還元）の存在は、in vivo でのプロテアーゼに対する良好な抵抗性および２４時間超のin vivo 半減期を与え、これはin vivo での半減期が３０分を超えない従来のペプチドとは異なる。さらに、化合物ＨＢ１９は完全に水性媒体に可溶であり、これによって、in vivo での循環および標的化に特定の製剤形態が必要ないため、その投与がさらにより容易になる。
【００２３】
従って、５価化合物ＨＢ１９は、以下のような新規な抗がん性化合物を供給するという、各種技術的課題を解決するのに必要な特性をすべて示す：
−腫瘍増殖および血管形成に対する二重の効果、即ち、タクソールなどの従来の化学療法分子と併用することなく単剤治療を考えることを可能にする効果の結果、単独で高い抗腫瘍効果をもちうる；
−特定の種類のがんに対する特異性を有さず、むしろ腫瘍細胞および活性化内皮細胞に対する広い活性スペクトルを有する；
−健全な細胞に比べた腫瘍細胞および活性化内皮細胞に対する特異性の結果、in vivo での副作用が極めて少ない；
−工業規模に容易に適合させうる合成プロセスをもつ；
−特定の製剤形態の開発を必要としないようにin vivo での十分な生物学的利用能を有する。
【００２４】
従って、本発明は、少なくとも３つの疑似ペプチド単位がグラフトした支持体を含む、またはそれから構成された多価合成化合物の、細胞増殖及び／又は血管形成の調節解除を含む疾患の治療を意図する医薬の製造のための使用に関し、該化合物は下記式（Ｉ）を有する：            
Ψ
〔（Ｘ）n −Ｙ1 −（Ｚ）i −Ｙ2 −（Ｘ）m 〕k −支持体    （Ｉ）
式中、
各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表し；
Ｙ1 およびＹ2 は独立に塩基性側鎖アミノ酸から選ばれ；
Ｚは以下から選ばれ：
−プロリン、ここでプロリンはγ、βもしくはδにおいてヒドロキシル、アミン、Ｃ1 −Ｃ10アルキル、Ｃ1 −Ｃ10アルケニル、Ｃ1 −Ｃ10アルキニル、Ｃ5 −Ｃ12アリール、Ｃ5 −Ｃ14アラルキル、Ｃ5 −Ｃ12ヘテロアリール (有利にはＣ5 ヘテロアリール) 基により置換されていてもよく、これらの基はそれ自身ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＯＨ、Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、ＮＨ2 、ＣＮ、トリハロメチル、Ｃ1 −Ｃ4 アシルオキシ、Ｃ1 −Ｃ4 ジアルキルアミノ、グアニジノ基、チオール基から選ばれる１〜６個の置換基で置換されていてもよい；
−天然もしくは非天然のアミノ酸のＮ−アルキル化物；
−ジアルキルアミノ酸；
−環状ジアルキルアミノ酸；または
−ピペコリン酸もしくはその誘導体；
ｎおよびｉは独立に０または１であり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｋは３以上の整数であり；そして
Ψは少なくとも１種のプロテアーゼに対して正規のペプチド結合よりも有意に抵抗性である修飾ペプチド結合を表す。
【００２５】
好ましくは、かかる多価合成化合物は表面ヌクレオリンのリガンドとして作用する。
本発明において、「支持体」なる用語は任意の薬剤的に許容しうる分子、即ち固有の毒性をもたない分子を意味し、これに式（Ｉ）の少なくとも３つの疑似ペプチド単位がグラフトしうる。従って、許容しうる支持体は、少なくとも３個の式（Ｉ）の疑似ペプチド単位、好ましくは３〜８個の式（Ｉ）の疑似ペプチド単位がそれにグラフトするのに十分な大きさを有していなければならない。好ましくは、かかる許容しうる支持体は、少なくとも３個、好ましくは３〜８個の式（Ｉ）の疑似ペプチド単位が一緒になって１または２以上のヌクレオリン分子のＲＧＧドメインに相互作用しうるのに十分な大きさであるべきでもある。さらに、支持体は免疫原性であってはならない。
【００２６】
かかる支持体は、直鎖ペプチドもしくは環状ペプチド、直鎖もしくは環状のペプトイド (peptoid)（Ｎ−置換グリシンオリゴマー）、フォルダマー（foldamer) （溶液中でコンパクトで明確かつ予測可能なコンフォメーションをとる強い傾向をもつオリゴマーもしくはポリマー）、直鎖ポリマーまたは球状デンドロマー（dendromer)（多官能性の中心核の周囲に樹木様プロセスにより結合するポリマーからなる巨大分子）、糖またはナノ粒子から選択しうる。有利には、この支持体は直鎖もしくは環状ペプチドから、または直鎖もしくは環状ペプトイドから選ばれる。
【００２７】
直鎖ペプチド（図２Ａ中のＨＢ１９の構造参照）の使用は、支持体の合成を容易にし、化合物ＨＢ１９を用いた本発明者らにより得られた結果から、かかる支持体は本願により提起された技術的課題を実質的に解決することが分かる。本発明において支持体として働く直鎖ペプチドは、有利には２５％より多い割合のリシンを含みうる。より正確には、直鎖ペプチドが本発明において支持体として用いられる場合、疑似ペプチド単位は好ましくはリシンのε位にグラフトしている。従って、直鎖ペプチドを本発明において支持体として用いる場合、これはグラフトされるべき疑似ペプチド単位の数と少なくとも同じ数のリシンを好ましくは含有する。
【００２８】
例えば、支持体の直鎖ペプチドは、KKKGPKEKGC（SEQ ID NO:１）、KKKKGC（SEQ ID NO:２）、KKKKGPKKKKGA（SEQ ID NO:３）またはKKKGPKEKAhxCONH2（SEQ ID NO:４）から選ばれた配列を有することができ、ここでAhx はヘキサノアミノ酸（hexanoic amino acid)を表し、CONH2 は酸基がアミン基で置換されていることを表し、AhxCONH2は(2S)-2- アミノヘキサンアミドを表し、あるいは２〜４個の単位（KAKPG 、SEQ ID NO:１２）からなる直鎖配列、即ち配列AcKAKPGKAKPGKAKPGCONH2（SEQ ID NO:１３、ここでAcはアセチル基、CH3-CO- を表し、そしてCONH2 はグリシンの酸基COOHがアミド基CONH2 で置換されていることを意味する）を有することができる。有利には、直鎖ペプチド支持体はKKKGPKEKAhxCONH2（例えば図２ＡのＨＢ１９、SEQ ID NO:５参照。これはこの直鎖ペプチドを支持体として有する）、またはAcKAKPGKAKPGKAKPGCONH2（SEQ ID NO:４、ここでAcはアセチル基、CH3-CO- を表し、そしてCONH2 はグリシンの酸基COOHがアミド基CONH2 で置換されていることを意味する。例えば、図２Ｆ中のNucant７、SEQ ID NO:１７。これはこの直鎖ペプチドを支持体として有する）。
【００２９】
直鎖ペプチドの中で、いくつかはらせん形構造をとることが知られている。これらの直鎖ペプチドも本発明において支持体として使用できる。らせん形構造を形成するかかる直鎖ペプチド支持体には、配列Aib-Lys-Aib-Gly （SEQ ID NO:６）またはLys-Aib-Gly （SEQ ID NO:７）（ここでAib は２−アミノ−イソ酪酸を意味する）のペプチド単位の３以上の整数、特に３〜８の繰り返しからなる支持体がある。これらの単位のそれぞれはリシン残基（Lys)を１個含むので、式（Ｉ）の疑似ペプチド単位にグラフトすべき数と同じ数のこれらの単位の繰り返しが必要である。
【００３０】
例えば、式（Ｉ）の疑似ペプチド単位５個を有する５価化合物を得るには、支持体は、式Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly (SEQ ID NO: ８）またはLys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly （SEQ ID NO:９）のらせん構造を形成する直鎖ペプチドであるうる。有利には、SEQ ID NO:８および９由来の式を有するらせん構造を形成する直鎖ペプチドが使用される。この式は、Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（SEQ ID NO:１８、ここでAcはアセチル基、CH3-CO- を表し、そしてCONH2 はグリシンの酸基COOHがアミド基CONH2 で置換されていることを意味する。例えば、図２Ｃ中のNucant２、SEQ ID NO:２０参照。これはこのペプチドを支持体として有する）、またはAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（SEQ ID NO:１９、ここでAcはアセチル基、CH3-CO- を表し、そしてCONH2 はグリシンの酸基COOHがアミド基CONH2 で置換されていることを意味する。例えば、図２Ｄ中のNucant３、SEQ ID NO:２１参照。これはこのペプチドを支持体として有する）から選択される。
【００３１】
あるいは、式（Ｉ）の疑似ペプチド単位６個を有する６価化合物を得るには、使用する支持体は、式Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（SEQ ID NO:１４、ここでAcはアセチル基、CH3-CO- を表し、そしてCONH2 はグリシンの酸基COOHがアミド基CONH2 で置換されていることを意味する）、またはAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（SEQ ID NO:１５、ここでAcはアセチル基、CH3-CO- を表し、そしてCONH2 はグリシンの酸基COOHがアミド基CONH2 で置換されていることを意味する。例えば、図２Ｅ中のNucant６、SEQ ID NO:１７参照。これはこのペプチドを支持体として有する）の、らせん構造を形成する直鎖ペプチドでありうる。
【００３２】
環状ペプチドまたはペプトイドもまた支持体として有利に使用できる。特に、これにより構造の可動性を制限できる。環状ペプチドまたはペプトイド支持体は、ヘキサ−、オクタ−、デカ−またはドデカ−環状ペプチド、好ましくは交互にＬ（左旋性）およびＤ（右旋性）の立体配置のアミノ酸残基からなるペプチド（Ｄ，Ｌ−環状ペプチド）、またはＮ−アルキルグリシン残基の鎖（環状ペプトイド）から主に選択できる。かかる支持体を有する化合物の例は、図２Ｂ（化合物Nucant０１）に示されるように、ＫとＰとの間にΨ（Ψ＝（CH2N- ））結合をもつ３個のＫＰＲ単位を有する、立体配置Ｄのアラニン（Ａ）残基および立体配置Ｌのリシン（Ｋ）残基の交互からなる環状ヘキサペプチドである。
【００３３】
有利には、本発明の式（Ｉ）の化合物のための支持体は、立体配置Ｄのアラニン（Ａ）残基および立体配置Ｌのリシン（Ｋ）残基の交互からなる環状ヘキサペプチド、または配列SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１８もしくはSEQ ID NO:１９の直鎖ペプチドから選択された支持体である。
【００３４】
本発明においては、疑似ペプチド単位に関し、「グラフトした（grafted)」なる用語は、直接あるいは疑似ペプチドと支持体との間にスペーサー化合物という中間物を介して、共有結合によって支持体に結合していることを意味する。この結果、ある特定の態様において疑似ペプチド単位は、疑似ペプチド単位と支持体との間のスペーサー化合物なしに支持体に直接グラフトしている。別の態様では、疑似ペプチド単位はスペーサーの中間物を介して支持体にグラフトしている。許容しうるスペーサーの例としては、エチレングリコール型の化合物、ピペラジンまたはアミノヘキサン酸もしくはβ−アラニン型のアミノ酸がある。
【００３５】
支持体が直鎖または環状ペプチドであり、疑似ペプチド単位がペプチドに直接グラフトしている場合は、好ましくはペプチドと疑似ペプチド単位の間の結合は、ペプチド支持体のリシン残基においてリシンのαもしくはε位のアミノ基、好ましくはε位のアミノ基（側鎖上）で行われる。従って、ペプチド支持体上の疑似ペプチド単位の直接グラフト結合は有利には、疑似ペプチド単位のＣ末端位のアミノ酸の酸基ＣＯＯＨと、リシン残基のアミノ基、好ましくはリシンのε位のアミノ基（側鎖上）との間のアミド結合により行われる。
【００３６】
本発明の化合物においては少なくとも３個の疑似ペプチド単位が支持体にグラフトしている。事実、本発明者らの結果は、化合物ＨＢ１９、誘導化合物もしくは類似体の格別の抗腫瘍効果についてヌクレオリンのＲＧＧドメイン（図１参照）への結合の重要性を示している。ヌクレオリンのＲＧＧドメインへの結合は、式（Ｉ）に取り込んだものなど、いくつかの疑似ペプチド単位の多価提示により得られる。支持体が配列KKKGPKEKGC、KKKKGC、KKKKGPKKKKGAまたはKKKGPKEKAhxCONH2の直鎖ペプチドである化合物について、本発明者らは、３単位より少ない（ｋ＜３）とヌクレオリンへの結合の効率はより低くなり、抗腫瘍効果はおそらく少なくなることを示した。従って、本発明の化合物は支持体にグラフトした少なくとも３個の疑似ペプチド単位を含み、ｋは３以上の整数である。よって本発明の化合物は有利には支持体上にグラフトした３〜８個の疑似ペプチド単位（３≦ｋ≦８）を提示する。さらに、本発明者らは、疑似ペプチド単位の数が多くなるに従いヌクレオリンへの結合の効率が増加することはないため、活性は、支持体上にグラフトした疑似ペプチド単位が５または６（ｋ＝５）で最適となることを示した。従って有利には、式（Ｉ）の化合物においてｋは３〜８、好ましくは４〜７、４〜６、４〜５、または５〜６である。さらに有利には、式（Ｉ）の化合物においてｋは５であるかより良くは６である。
【００３７】
本発明において、「任意のアミノ酸」なる用語は、１または２以上の置換基の存在により修飾されていてもよい、任意の天然または合成アミノ酸を意味する。より正確には、アミノ酸なる用語は下記の一般構造を有するαアミノ化アミノ酸を意味する：
【００３８】
【化１】
0005559531.tif 000002
【００３９】
式中、Ｒはアミノ酸の側鎖を表す。よって、本発明においてＲは天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表す。「天然アミノ酸」なる用語は生体においてin vivo で天然に見出される任意のアミノ酸を意味する。従って、天然アミノ酸には、タンパク質に翻訳されるmRNAによりコードされるアミノ酸だけでなく、代謝過程の産物または副産物である、in vivo で天然に見出されるその他のアミノ酸も含まれる。例えば、Ｌ−アルギニンからアルギナーゼにより尿素産生過程で生成するオルニチンがある。よって、本発明において、使用されるアミノ酸は天然でも非天然でもよい。特に、天然アミノ酸は一般にＬの立体配置をもつが、本発明によればアミノ酸はＬまたはＤの立体配置をもちうる。さらに、Ｒは当然、天然アミノ酸の側鎖に限定されることはなく、自由に選択されうる。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物の疑似ペプチド単位において、Ｚは存在しないか（ｉ＝０）または存在し（ｉ＝１）、以下から選ばれる：
−プロリン、これはγ、βまたはδにおいてヒドロキシル基、アミン、Ｃ1 −Ｃ10アルキル、Ｃ1 −Ｃ10アルケニル、Ｃ1 −Ｃ10アルキニル、Ｃ5 −Ｃ12アリール、Ｃ5 −Ｃ14アラルキル、Ｃ5 −Ｃ12ヘテロアリール (有利にはＣ5 ヘテロアリール) 基により置換されていてもよく、これらの基はそれ自身ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＯＨ、Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、ＮＨ2 、ＣＮ、トリハロメチル、Ｃ1 −Ｃ4 アシルオキシ、Ｃ1 −Ｃ4 ジアルキルアミノ、グアニジノ基、チオール基から選ばれる１〜６個の置換基で置換されていてもよい；
−天然もしくは非天然のアミノ酸のＮ−アルキル化物；
−ジアルキルアミノ酸( 例えばイソブチルアミノ酸) ；
−環状ジアルキルアミノ酸；または
−ピペコリン酸もしくはその誘導体；
「Ｃ1 −Ｃi アルキル」なる用語は、式−Ｃj Ｈ2j+ 1 の直鎖もしくは分岐の飽和炭化水素基を意味し、ここで１≦ｊ≦ｉである。よって、Ｃ1 −Ｃ10アルキルにはＣ1 アルキル（メチル）、Ｃ2 （エチル）、Ｃ3 （ｎ−プロピルもしくはイソプロピル）、Ｃ4 （ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルもしくはｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ5 （例：ｎ−ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル）およびＣ6 −Ｃ10アルキルが含まれる。「Ｃ1 −Ｃ10アルケニル」なる用語は、１〜１０の炭素原子からなる直鎖もしくは分岐の不飽和炭化水素基を意味し、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合を含む。「Ｃ1 −Ｃ10アルキニル」なる用語は、１〜１０の炭素原子および少なくとも１つのＣ≡Ｃ三重結合を有する直鎖もしくは分岐の不飽和炭化水素基を意味する。「Ｃ5 −Ｃ12アリール」なる用語は、炭素数５〜１２の芳香族多環式または単環式炭化水素基を意味する。「Ｃ5 −Ｃ14アラルキル」なる用語は、合計炭素数５〜１４のアルキルとアリールとの組み合わせを意味する。「Ｃ5 −Ｃ12ヘテロアリール」なる用語は、通常炭素数５〜１２の炭化水素鎖上の少なくとも１個の炭素原子が、Ｎ、ＯまたはＳから選択された別の原子により置換されているアリール基を意味する。従って、「Ｃ5 ヘテロアリール」なる用語は、炭化水素鎖上の５個の炭素原子のうち少なくとも１個の炭素原子が、Ｎ、ＯまたはＳから選択された別の原子により置換されているアリール基を意味する。「Ｃ1 −Ｃ4 アシルオキシ」なる用語は、式−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ1 −Ｃ4 アルキル）、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 −Ｃ12シクロアルキル）、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 −Ｃ12アリール）、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 −Ｃ12アリールアルキル）または、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 −Ｃ12ヘテロアリール）の基を意味する。有利には、式(I) の化合物において、かかる「Ｃ1 −Ｃ4 アシルオキシ」は、式−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ1 −Ｃ4 アルキル）、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 シクロアルキル）、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 アリール）、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 アリールアルキル）または、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−（Ｃ4 ヘテロアリール）から選択される。「Ｃ1 −Ｃ4 ジアルキルアミノ」なる用語は、式−Ｎ（Ｃ1 −Ｃ4 アルキル）2 の基を意味し、ここで各アルキルは同じでも異なっていてもよい。
【００４１】
「Ｎ−アルキルアミノ酸」なる用語は、アミン基の水素原子の１個がＣ1 −Ｃ10アルキル鎖またはＣ5 −Ｃ14、好ましくはＣ5 −Ｃ10、特にＣ10アリールアルキル基 (置換されていてもよい) で置換されている任意のアミノ酸である。Ｎ−アルキルアミノ酸の例には、Ｎ−メチルグリシン、即ちサルコシン、Ｎ−メチルイソロンシン酸、Ｎ−メチルバリン酸などがある。「ジアルキルアミノ酸」なる用語は、２個の水素原子（中央の炭素またはアミン基上の）がＣ1 −Ｃ10アルキル鎖またはＣ5 −Ｃ14、好ましくはＣ5 −Ｃ10、特にＣ10アリールアルキル基 (置換されていてもよい) で置換されている任意のアミノ酸である。ジアルキルアミノ酸の例には、２−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、アミノシクロプロパンカルボン酸などがある。
【００４２】
有利にはＺは存在し、ｉ＝１である。また有利には、Ｚが存在する（ｉ＝１）場合、Ｚはプロリンであり、これは前述のようにγ、βまたはδにおいて置換されていてもよい。
式（Ｉ）の化合物の疑似ペプチド単位において、Ｙ1 およびＹ2 は塩基性側鎖を有するアミノ酸から選択される。「塩基性側鎖を有するアミノ酸」なる用語は、側鎖Ｒが７より大きいｐＫａ値を有する（ｐＫａ（Ｒ）＞７）任意の天然または非天然のアミノ酸を意味する。従って、側鎖が７より大きい、好ましくは７．５より大きい、８より大きい、８．５より大きい、または９より大きいｐＫａ値を有する限り、任意のアミノ酸がＹ1 およびＹ2 について使用できる。特に、側鎖が７より大きいｐＫａ値を有する天然のアミノ酸には、リシン（Ｋ、ｐＫａ（Ｒ）≒１０．５）、アルギニン（Ｒ、ｐＫａ（Ｒ）≒１２．５）、オルニチン（リシンの低級類似体、ｐＫａ（Ｒ）≒１０．８）があり、一般に天然の塩基性アミノ酸と考えられる。従って、有利な態様においては、Ｙ1 およびＹ2 はアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）およびオルニチンから独立に選ばれる。より有利には、Ｙ1 はリシン（Ｋ）でありＹ2 がアノギニン（Ｒ）である。しかし、側鎖ＲのｐＫａ値が７より大きい、好ましくは７．５より大きい、８より大きい、８．５より大きい、または９より大きければ、その他の非天然アミノ酸が代わりに使用できる。
【００４３】
本発明の化合物において、ヌクレオリンのＲＧＧドメインに結合するために必須の疑似ペプチド単位は式（ＩＩ）を有するサブユニットである：
Ψ
Ｙ1 −（Ｚ）i −Ｙ2   （ＩＩ）
式中、Ｙ1 およびＹ2 は上記定義の通りである。しかし、上記に定義した複数のアミノ酸の、この必須のサブユニットの一方または他方における存在はヌクレオリンへの結合を妨げるようなものではない。これは、式（ＩＩ）の必須のサブユニットが一端及び／又は他端に、式（Ｉ）においてそれぞれ（Ｘ）n および（Ｘ）m （ここでｎは０または１、ｍは０〜３の整数である）により表される任意のアミノ酸を０〜３個含有することができる理由である。有利には、式（ＩＩ）の必須サブユニットの一端及び／又は他端に存在するアミノ酸の数は少ない、即ち、ｎは有利には０であり、ｍは有利には０〜２の整数、有利には０または１、有利には０である。よって、有利な態様ではｎおよびｍは０である。
【００４４】
本発明の化合物において、式（ＩＩ）のサブユニットは、少なくとも１種のプロテアーゼに対して正規のペプチド結合より有意に抵抗性である修飾ペプチド結合Ψを含有する。
「正規のペプチド結合」なる用語は、天然のタンパク質中の２つのアミノ酸間に通常存在する式（−ＣＯＮＨ−）のアミド結合を意味する。かかる結合はプロテアーゼの作用に対して感受性である。「修飾ペプチド結合Ψ」なる用語は、式（−ＣＯＮＨ−）を有する正規のペプチド結合とは異なる化学式をもつ、２つのアミノ酸間の化学結合を意味する。この修飾結合Ψは、少なくとも１種のプロテアーゼに対して式（−ＣＯＮＨ−）の正規ペプチド結合よりも有意に抵抗性であるようなものである。「ペプチダーゼ」または「タンパク質分解酵素」としても知られる「プロテアーゼ」とは、タンパク質中の正規ペプチド結合を開裂させる任意の酵素である。この過程はタンパク質分解として知られる。これは水分子の使用を含み、そのためプロテアーゼは加水分解酵素に分類される。プロテアーゼには特に、タンパク質のＮ末端の開裂を行うＮ−ペプチダーゼとして知られるプロテアーゼがある。これらのプロテアーゼは修飾ペプチド結合をもたないペプチドのin vivo での安定性の点で特に不都合である。これは、ヌクレオリンへの結合に必須である、式（ＩＩ）のサブユニットの、特にこれらのＮ−ペプチダーゼに対する抵抗性が有意に増加するように、式（Ｉ）の化合物の疑似ペプチド単位が、Ｙ1 およびＺの間（ｉ＝１の場合）、またはＹ1 およびＹ2 の間（ｉ＝０の場合）の修飾結合Ψを含有する理由である。従って、Ψ結合は少なくとも１種のＮ−ペプチダーゼに対する抵抗性を有意に増加させることを可能にするべきである。これによって、in vivo およびin vitroでの式（Ｉ）の化合物の半減期を有意に増加させることが可能となる。特に、修飾結合Ψを含有するＨＢ１９化合物は３７℃でヒト血清またはウシ胎仔血清において２４時間より長い半減期を有し、一方、Ψ結合の代わりに正規ペプチド結合を有する同じ化合物はこれらの同じ条件下で１時間の半減期を有するだけである。
【００４５】
さらに、本発明者らは、この修飾結合Ψの存在がヌクレオリンへの結合効率も有意に向上させうることも見出した。この現象は、これが化合物ＨＢ１９がヌクレオリンと非可逆的複合体を形成することを可能にするという事実によるかもしれない。
【００４６】
少なくとも１種のプロテアーゼに対する抵抗性を大きく向上させるような各種化学結合は既知である。従って、有利な態様において、Ψは、還元された結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）（または、結合がプロリンとの結合の場合のように第二アミン基のレベルで生じる場合には、（−ＣＨ2 Ｎ−））、レトロ−インバーソ (retro-inverso)結合（−ＮＨＣＯ−）、メチレンオキシ結合（−ＣＨ2 −Ｏ−）、チオメチレン結合（−ＣＨ2 −Ｓ−）、カルバ (carba)結合（−ＣＨ2 −ＣＨ2 −）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ2 −）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨＯＨ−ＣＨ2 −）、（−Ｎ−Ｎ−）結合、Ｅ−アルケン結合、または（−ＣＨ＝ＣＨ−）結合を表す。特に、本発明者らは、還元された結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）を用いると少なくとも１種のプロテアーゼに対する抵抗性を有意に向上させうることを見出した。従って有利には、Ψは還元された結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）を表す。
【００４７】
Ｙ1 とＺの間（ｉ＝１の場合）、またはＹ1 とＹ2 の間（ｉ＝０の場合）のΨのみが式（Ｉ）の化合物中に意図的に存在するにもかかわらず、疑似ペプチド単位の他のペプチド結合が上述のように修飾されることも可能である。特に、本発明において、特定されないアミノ酸間の結合は正規ペプチド結合であっても上記の修飾結合Ψであってもよい。追加のΨ結合の存在は、式（Ｉ）の化合物のプロテアーゼに対する抵抗性をさらに増すことができる。しかし、Ｙ1 とＺの間（ｉ＝１の場合）、またはＹ1 とＹ2 の間（ｉ＝０の場合）の最初のΨ結合の存在による増加は既に高度に有意であり、他のΨ結合の追加は疑似ペプチド単位、従って式（Ｉ）の化合物の合成を面倒にする。よって、追加のΨ結合の存在は可能であるが、任意である。
【００４８】
本発明において使用できる化合物の例には、特に以下の化合物（図２および実施例１、２、３および４参照）がある：
−ＨＢ１９（図２Ａ、SEQ ID NO:５。５つの疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）が５つのリシン残基のそれぞれのεアミノ基に共有結合しているSEQ ID NO:４の直鎖ペプチドを支持体として有する化合物）、
−Nucant０１（図２Ｂ。立体配置Ｄのアラニン残基（Ａ）と立体配置Ｌのリシン残基（Ｋ）が交互に存在する環状ヘキサペプチドを支持体として有する化合物、ここで３つの疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）は３つのリシン残基（Ｋ）のそれぞれのεアミノ基に共有結合している、SEQ ID NO:２参照）、
−Nucant２（図２Ｃ、SEQ ID NO:２０。配列SEQ ID NO:１８のらせん構造を有する直鎖ペプチドを支持体として有する化合物、ここで５つの疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）は５つのリシン残基のそれぞれのεアミノ基に共有結合している）、
−Nucant３（図２Ｄ、SEQ ID NO:２１。配列SEQ ID NO:１９のらせん構造を有する直鎖ペプチドを支持体として有する化合物、ここで５つの疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）は５つのリシン残基（Ｋ）のそれぞれのεアミノ基に共有結合している）、
−Nucant６（図２Ｅ、SEQ ID NO:１６。配列SEQ ID NO:１５のらせん構造を有する直鎖ペプチドを支持体として有する化合物、ここで６つの疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）は６つのリシン残基（Ｋ）のそれぞれのεアミノ基に共有結合している）、
−Nucant７（図２Ｆ、SEQ ID NO:１７。配列SEQ ID NO:１３の直鎖ペプチドを支持体として有する化合物、ここで６つの疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）は６つのリシン残基（Ｋ）のそれぞれのεアミノ基に共有結合している）、
上記化合物は、細胞増殖及び／又は血管形成の調節解除を含む疾患の治療に使用する医薬の製造に用いられる。「細胞増殖及び／又は血管形成の調節解除を含む疾患」なる用語は、本発明において、１または２以上の細胞、細胞もしくは組織の集団の異常な増殖現象、及び／又は異常な血管新生が観察される、１または２以上の器官を冒すヒトもしくは動物の任意の疾患を意味する。明らかに、かかる疾患には腺腫、肉腫、がん腫、リンパ腫などのすべての種類のがん、特に、卵巣、乳房、膵臓、リンパ節、皮膚、血液、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭、腔、甲状腺、中枢神経系、前立腺、結腸、直腸、子宮頸、精巣または膀胱のがんが含まれる。それらには表皮もしくは皮膚の嚢胞、乾癬、血管腫などの非がん性疾患；加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症もしくは血管新生緑内障などの眼の疾患；多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患、または狼瘡やリウマチ性多発関節炎などの自己免疫疾患、およびアテローム硬化症に関連する疾患も含まれる。
【００４９】
有利には、細胞増殖及び／又は血管形成の調節解除を含む前記疾患は、がん、特に上記したうちの１つである。
本発明はまた、下記を含む、細胞増殖および血管形成の両方を阻害する分子のスクリーニング方法にも関する：
ａ）表面ヌクレオリンを発現している細胞を試験分子と接触させ、そして
ｂ）該試験分子の、ヌクレオリンのＲＧＧドメインに結合する能力を測定する。
【００５０】
ヌクレオリンの６０アミノ酸の合成ＲＧＧドメインを、化学合成、またはその核酸ＤＮＡ配列の発現を介した遺伝子工学を用いて生産することが可能である。次いで、該試験分子の、ヌクレオリンのＲＧＧドメインに結合する能力の測定は当業者に既知の各種技術により行うことができる。
【００５１】
特に、この測定は、表面プラズモン共鳴法、殊にBiacore TR3000の装置を用いて６０アミノ酸の合成ＲＧＧドメインへの結合を測定することにより行うことができる。Biacore TRシステムは、表面プラズモン共鳴(SPR) の物理的原理を用いるバイオセンサーである。これはリアルタイムで、特異的な標識なしに、生体特異的 (biospecific)な表面における２つの分子の間の相互作用の動的定数 (KaおよびKd) の測定を可能にする。このためには、分子の１つ（リガンド）をセンサー表面に固定化し、他方（検体）を注入する。ＳＰＲによる検出の原理は、分子複合体の形成および分離によるバイオセンサー表面での質量の変化に関連する、表面近くの屈折率における変化の定量である。単色の偏光が異なる屈折率を有する２つの媒体間の界面に到達し、この界面が金属の薄い層で被覆されていると、反射光の強度は特定の入射角については明らかに減少する。これは、光の１電磁成分、一過性の波が界面に垂直に１μｍまで広がるという事実に由来する。共鳴角は特に表面近くに位置する分子の重量の関数として変動する。その結果、時間の関数としてのＳＰＲ角をモニターすることにより、リガンドと検体の結合と分離をリアルタイムで観察できる。得られたシグナルを記録する（センソグラム、sensogram)。これは共鳴単位（ＲＵ）で定量化される。1000ＲＵの変化は角度で0.1 °のずれに相当し、mm2 当たり１ｎｇのタンパク質の結合に匹敵する。従って、この技術によれば試験分子のＲＧＧドメインへの結合能だけでなく、ヌクレオリンのＲＧＧへの該分子の結合効率（親和性定数）を確認することができる。
【００５２】
ビオチンで標識された、またはＧＳＴ（グルタチオンS-トランスフェラーゼ) などのペプチドもしくはタンパク質に融合した合成ＲＧＧドメインを製造することも可能である。ビオチンまたはＧＳＴが存在すると、標識アビジン／ストレプトアビジンリガンド（蛍光性、発光性、放射性など）によって、ＲＧＧドメインがビオチニル化されているかどうか、及び／又はＲＧＧドメインがＧＳＴに融合している場合には抗ＧＳＴ抗体が存在するかどうかを検出することが可能となる。正確さは低いが、これらの技術は、ヌクレオリンのＲＧＧドメインへの結合能について多数の分子のより速く容易なスクリーニングを可能にし、その後、ヌクレオリンのＲＧＧドメインへの結合効率のより正確な決定を上述の表面プラズモン共鳴法を用いて行うことができる。
【００５３】
このように、まず、ヌクレオリンのＲＧＧドメインへの結合能の迅速かつ簡便なスクリーニングを行うことが好ましい。次いで、表面プラズモン共鳴法によりＲＧＧドメインへ結合しうる候補の、ＲＧＧドメインへの結合効率を決定することにより、検体を精製することができる。しかし、少数の化合物しか試験されない場合には、ＲＧＧドメインの結合効率は表面プラズモン共鳴法を用いて直接測定できる。
【００５４】
本発明はさらに、上記で定義した化合物に関するが、但し、その支持体が、ＫＰＧ、ＫＧＰ、ＫＧＣ、またはＫＸ1 ＫＸ4 ＫＸ1 Ｋ（ここでＸ1 は任意であり、リシン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）から選ばれ、Ｘ4 は任意であり、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）から選ばれる）から選ばれるアミノ酸配列を含む非環状ペプチドである化合物を除く。
【００５５】
特に、支持体（上記段落において除外したもの以外）、疑似ペプチド単位が支持体にグラフトされる様式、およびアミノ酸Ｘ、Ｙ1 およびＹ2 、ｎおよびｍまたはＹは上記任意の態様における形態でありうる。
【００５６】
本発明はまた、支持体が直鎖ペプチドである化合物を除いた上記化合物にも関する。特に、支持体（直鎖ペプチド以外）、疑似ペプチド単位が支持体にグラフトされる様式、およびアミノ酸Ｘ、Ｙ1 およびＹ2 、ｎおよびｍまたはＹは上記任意の態様における形態でありうる。
【００５７】
特に、支持体は、Ａｉｂ−Ｋ−Ａｉｂ−Ｇ（SEQ ID NO:６）もしくはＫ−Ａｉｂ−Ｇ（SEQ ID NO:７）から選択されたアミノ酸を含む直鎖ペプチド、環状ペプチド、直鎖もしくは環状ペプトイド、フォルダマー、直鎖ポリマーもしくは球状デンドリマー、糖またはナノ粒子から選択されうる。
【００５８】
有利ないくつかの例では、支持体はSEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９から選ばれるアミノ酸配列からなる直鎖ペプチドでありうる。
【００５９】
本発明の化合物は、特に、支持体が上記のNucant０１（図２Ｂ）などの環状ペプチド、またはNucant２（SEQ ID NO:２０、図２Ｃ）およびNucant３（SEQ ID NO:２１、図２Ｄ）などのらせん構造を有する直鎖ペプチドである化合物を含みうる。これらはまた、化合物Nucant６（SEQ ID NO:１６、実施例４および図２Ｅ参照）も含みうる。
【００６０】
本発明はまた、化合物としての、化合物Nucant７（SEQ ID NO:１７、図２Ｆ）にも関する。
本発明はさらに、医薬としての使用のための、支持体がＫＰＧ、ＫＧＰ、ＫＧＣ、またはＫＸ1 ＫＸ4 ＫＸ1 Ｋ（ここでＸ1 は任意であり、リシン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）から選ばれ、Ｘ4 は任意であり、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）から選ばれる）から選ばれるアミノ酸配列を含む非環状ペプチドである化合物を除く、上記化合物に関する。
【００６１】
特に、支持体（上記段落において除外したもの以外）、疑似ペプチド単位が支持体にグラフトされる様式、およびアミノ酸Ｘ、Ｙ1 およびＹ2 、ｎおよびｍまたはＹは上記任意の態様における形態でありうる。
【００６２】
本発明はまた、医薬としての使用のための、支持体が直鎖ペプチドである化合物を除いた上記化合物に関する。特に、支持体（直鎖ペプチド以外）、疑似ペプチド単位が支持体にグラフトされる様式、およびアミノ酸Ｘ、Ｙ1 およびＹ2 、ｎおよびｍまたはＹは上記任意の態様における形態でありうる。
【００６３】
特に、支持体は、Ａｉｂ−Ｋ−Ａｉｂ−Ｇ（SEQ ID NO:６）もしくはＫ−Ａｉｂ−Ｇ（SEQ ID NO:７）から選択されたアミノ酸配列からなる直鎖ペプチド、環状ペプチド、直鎖もしくは環状ペプトイド、フォルダマー、直鎖ポリマーもしくは球状デンドリマー、糖またはナノ粒子から選択されうる。
【００６４】
有利ないくつかの例では、支持体はSEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９から選ばれるアミノ酸配列からなる直鎖ペプチドでありうる。
【００６５】
医薬としての使用のためのかかる化合物は、特に、支持体が上記のNucant０１（図２Ｂ）などの環状ペプチド、またはNucant２（SEQ ID NO:２０、図２Ｃ）およびNucant３（SEQ ID NO:２１、図２Ｄ）などのらせん構造を有する直鎖ペプチドである化合物を含む。これらはまた、化合物Nucant６（SEQ ID NO:１６、実施例４および図２Ｅ参照）も含みうる。
【００６６】
本発明はまた、医薬としての使用のための、化合物Nucant７（SEQ ID NO:１７、図２Ｆ）にも関する。
本発明はさらに、支持体がＫＰＧ、ＫＧＰ、ＫＧＣ、またはＫＸ1 ＫＸ4 ＫＸ1 Ｋ（ここでＸ1 は任意であり、リシン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）から選ばれ、Ｘ4 は任意であり、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）から選ばれる）から選ばれるアミノ酸配列を含む非環状ペプチドである化合物を除く上記化合物を含む薬剤組成物に関する。
【００６７】
特に、支持体（上記段落において除外したもの以外）、疑似ペプチド単位が支持体にグラフトされる様式、およびアミノ酸Ｘ、Ｙ1 およびＹ2 、ｎおよびｍまたはＹは上記任意の態様における形態でありうる。
【００６８】
本発明はまた、支持体が直鎖ペプチドである化合物を除いた上記化合物を含む薬剤組成物に関する。特に、支持体（直鎖ペプチド以外）、疑似ペプチド単位が支持体にグラフトされる様式、およびアミノ酸Ｘ、Ｙ1 およびＹ2 、ｎおよびｍまたはＹは上記任意の態様における形態でありうる。
【００６９】
特に、支持体は、Ａｉｂ−Ｋ−Ａｉｂ−Ｇ（SEQ ID NO:６）もしくはＫ−Ａｉｂ−Ｇ（SEQ ID NO:７）から選択されたアミノ酸配列からなる直鎖ペプチド、環状ペプチド、直鎖もしくは環状ペプトイド、フォルダマー、直鎖ポリマーもしくは球状デンドリマー、糖またはナノ粒子から選択されうる。
【００７０】
有利ないくつかの例では、支持体はSEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９から選ばれるアミノ酸配列からなる直鎖ペプチドでありうる。
【００７１】
本発明の薬剤組成物は、特に、支持体が上記のNucant０１（図２Ｂ）などの環状ペプチド、またはNucant２（SEQ ID NO:２０、図２Ｃ）およびNucant３（SEQ ID NO:２１、図２Ｄ）などのらせん構造を有する直鎖ペプチドである化合物を含みうる。これらはまた、化合物Nucant６（SEQ ID NO:１６、実施例４および図２Ｅ参照）も含みうる。
【００７２】
本発明はまた、化合物Ｎｕｃａｎｔ７（SEQ ID NO:１７、図２Ｆ）を含む薬剤組成物にも関する。
かかる薬剤組成物は、本発明の化合物と、薬剤的に許容しうる支持体とを混合する。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも３個の疑似ペプチド単位がグラフトした支持体を含むまたはそれから構成される合成多価化合物の、炎症性疾患の治療を意図する医薬の製造のための使用に関し、該化合物は式（Ｉ）を有し：
Ψ
〔（Ｘ）n −Ｙ1 −（Ｚ）i −Ｙ2 −（Ｘ）m 〕k −支持体    （Ｉ）
式中、
各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表し；
Ｙ1 およびＹ2 は独立に塩基性側鎖アミノ酸から選ばれ；
Ｚは以下から選ばれ：
−プロリン、ここでプロリンはγ、βもしくはδにおいて置換されていてもよく；
−天然もしくは非天然のアミノ酸のＮ−アルキル化物；
−ジアルキルアミノ酸；
−環状ジアルキルアミノ酸；または
−ピペコリン酸もしくはその誘導体；
ｎおよびｉは独立に０または１であり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｋは３以上の整数であり；そして
Ψは少なくとも１種のプロテアーゼに対して正規ペプチド結合よりも有意に抵抗性である修飾ペプチド結合を表す。
【００７４】
現在、慢性炎症性疾患、特に細胞媒介による自己免疫疾患は一部はサイトカインにより引き起こされることは確立されている。各種実験動物モデルで得られる結果は、疾患の病因論においてサイトカインが果たす役割を明らかにした（１７）。例えば、腫瘍壊死因子α (TNF-α) 、インタロイキン1(IL-1) 、IL-6、IL-15 およびIL-18 などの前炎症性（proinflammatory)サイトカインは、リウマチ性多発関節炎の患者において免疫および炎症反応を調節する。特に、TNF-αおよびIL-1βは軟骨および骨髄の破壊を促進する。
【００７５】
さらに、炎症過程において、血管内皮は炎症巣における白血球の補充に関与する種々のケモカインおよび接着分子を発現する (18) 。
IL-8 は炎症の部位である組織において白血球の活性化および選択的補充を引き起こすC-X-C ケモカインである。高いレベルで発現されると、IL-8は生体にとって病的結果をもたらす。リポ多糖類 (LPS)およびTNF-αやIL-1などの前炎症性サイトカインは、man y 細胞種、特に内皮細胞によるIL-18 の分泌を生じさせる (19) 。
【００７６】
細胞間接着分子-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1, ICAM-1)は、内皮細胞および免疫応答に関与する細胞を含むいくつかの細胞種の表面において発現される免疫グロブリン型タンパク質である。これは、炎症の部位への白血球の接着および遊走に重要な役割を果たす (20) 。
【００７７】
前炎症性サイトカインはまた、細菌感染により生じる全身の炎症反応 (敗血症性ショック) にも関与する。リポ多糖類  (LPS) はグラム陰性細菌の外側の膜の必須成分である。この免疫刺激分子は、グラム陰性細菌感染にしばしば伴う、敗血症性ショックと称される全身の炎症反応を引き起こす一因となる。LPS はリンパ性網皮細胞によるTNF-α、IL-1およびIL-6などのサイトカインの産生を刺激するという生物学的性質を有する。これらのサイトカインの誘導は敗血症症候群の進展において中心的役割を担う、というのはTNF-αはin vivo においてIL-1およびIL-6の産生を引き起こしうるので、TNF-α単独の投与は敗血症症状と死亡に至らしめうるからである。さらに、動物モデルにおいて抗TNF-α抗体およびIL-1受容体アゴニストでの予備処置により、動物をLPS の致死的影響から防御することが可能になる (21) 。
【００７８】
重篤な敗血症は、攻撃的炎症反応と器官不全を伴う。これはしばしば高い死亡率につながる。これは、細菌、真菌またはウイルス感染により生じるうる。この反応は前炎症性サイトカイン、次いで炎症性のサイトカインの連続的分泌を特徴とする。最も重要な前炎症性サイトカインにTNF-αおよびIL- βがある。現在まで、抗LPS または抗サイトカイン薬を含む臨床試験は成功していない (22、23) 。
【００７９】
前炎症性サイトカインはまた、心内膜の炎症（心内膜炎）、心膜の炎症（心膜炎）または心筋の炎症（心筋炎）の形で現れる、心炎、即ち心臓の炎症に罹患した患者において生理病理学的役割も果たしているようである。例えば、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)感染により生じうる感染性心内膜炎の患者においてはIL-6の血清レベルが有意により高い。このように、IL-6の高い血清レベルは、感染性心膜炎の存在を示唆することができ、この疾患の診断および治療の経過観察の手段として使用できる (24、25) 。
【００８０】
炎症性疾患におけるTNF-α、IL-1およびIL-6などの前炎症性サイトカインの役割の重要さを考え、抗TNF-α、抗IL-1および抗IL-6薬を含む抗炎症性サイトカイン療法が、炎症性疾患に罹患した患者の治療のために開発されてきた (26) 。
【００８１】
リウマチ性関節炎や腹部炎症性疾患などの慢性の炎症性疾患の治療における抗炎症性サイトカイン薬を含む各種の臨床試験はいくつか成功した：Etanercept (TNF 受容体-P75 Fc 融合タンパク質) 、Infliximab (キメラヒト抗TNF-αモノクローナル抗体) 、Adalimumab (組換えヒト抗TNF-αモノクローナル抗体) およびAnakinra (ヒトIL-1β受容体アンタゴニストの組換え形態) (22)。
【００８２】
それにもかかわらず、現在まで利用可能な抗炎症性サイトカイン薬はすべてタンパク質であり、従ってタンパク質医薬に伴う欠点、特に生産の高コストおよび大規模生産に関連する問題がある。
【００８３】
従って、前炎症性サイトカインの合成経路を特異的に標的としうる低分子量の分子が真に必要とされている。
意外にも、本発明者らは、上記したような式(I) の化合物が抗炎症性活性を有すること、特に、LPS に刺激された各種細胞種によるTNF-α、IL-6およびIL-8の産生およびICAM-1の発現を阻害することを見出した。上述のようにこれらの化合物は非常に興味深い、というのは：
−これらの化合物の毒性は、本発明者らによりin vitroでもin vivo でも観察されていない、
−これらの化合物は、容易に調節される条件下で工業的規模でさえも合成が容易である、
−これらの化合物はin vivo での十分な生物学的利用能を有し、特定の剤型を開発する必要がない。
【００８４】
従って、本発明はまた、上記の任意の態様において定義した、式(I) の合成多価化合物の、炎症性疾患の治療を意図した医薬の製造のための使用に関する。
特に、式(I) において、支持体、疑似ペプチド単位の数ｋ、疑似ペプチドが支持体にグラフトする様式、アミノ酸Ｘ、Ｙ1 、Ｙ2 ；ｎおよびｍまたはΨは上記任意の態様の形態でありうる。
【００８５】
「炎症性疾患」なる用語は、炎症性の反応が生体に対して病理的結果を有する任意の疾患を意味する。特に、本発明における炎症性疾患には、自己免疫疾患（狼瘡やリウマチ性多発関節炎）、敗血症、敗血症性ショック、心臓の炎症性疾患（心炎、殊に心内膜炎、心膜炎、心筋炎、特にStaphylococcus aureus による炎症などの感染性炎症）、移植片拒絶、外傷、関節の炎症性疾患 (特に、各種形態の関節炎) 、胃腸系の炎症性疾患 (特に、結腸炎、腸炎、胃炎、胃腸炎、およびクローン病や出血性直腸結腸炎 (HRC)などの腸の慢性炎症性疾患) 、皮膚の炎症性疾患 (湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、皮膚病) 、呼吸器系の炎症性疾患、殊に慢性閉塞性肺疾患  (COPD)、およびアレルギーがある。
【００８６】
有利な態様において、炎症性疾患は自己免疫疾患、特に狼瘡またはリウマチ性多発関節炎である。別の有利な態様において、炎症性疾患は敗血症性ショックである。さらに別の有利な態様において、炎症性疾患は心内膜炎、殊にStaphylococcus aureus を原因とする炎症などの感染性心内膜炎である。
【００８７】
本発明の利点を以下に示す図および実施例において説明する。
図１Ａはヌクレオリンタンパク質の構造を示す。ヒトヌクレオリンは７０７アミノ酸からなる。ヌクレオリンは２つの主要部分に分けられる（３、４）：Ｎ−末端（aa 1-308) およびＣ−末端 (309-706)。Ｎ−末端ドメインはグルタミン酸とアスパラギン酸の連続した繰り返しからなる長い酸ドメイン４個からなる（Ａ１、２Ａ、Ａ３、Ａ４）。Ｃ−末端ドメインは、ＲＢＤと称されるＲＮＡに結合する４つの領域（ＲＮＡ結合ドメイン (RNA Binding Domain) に関して：Ｉ、II、 III 、 IV）を形成する、疎水性領域と親水性領域の繰り返しからなり、その端部（aa 644-707) はArg-Gly-Gly の反復から構成される高度に塩基性のＲＧＧドメインを有する。Ｂは化合物ＨＢ１９のヌクレオリンへの結合ドメイン：ＲＧＧドメインの同定。Ｎ−およびＣ−末端領域に対応するヌクレオリン構造をウサギ網状赤血球の溶解物を用いる系においてin vitro転写／翻訳により得た。このようにして、[35S  Met/Cys で標識された、それぞれアミノ酸1-707 、1-308 および309-707 を含む全ヌクレオリンおよびＮ−およびＣ−末端部分を作製した。次いで標識粗生成物をビオチニル化ＨＢ１９と共にインキュベートし、複合体をアビジン−アガロースカラムで精製した。期待通り、全ヌクレオリンはＨＢ１９と相互作用する。他方、酸残基に富むヌクレオリンのＮ−末端部分は化合物と全く相互作用しないのに対し、ヌクレオリンのＣ−末端部分はＨＢ１９に対する標的を含有する (14) 。ヌクレオリンのＣ−末端部分がＨＢ１９に対する標的を含有することを同定したので、この領域の各種構築物（Ｎ°１〜９）を作製した。第１の構築物は４つのＲＢＤとＲＧＧドメインを含むヒトヌクレオリンのＣ−末端部分をコードするcDNAに対応し、ＧＳＴタンパク質（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）と融合して抗ＧＳＴ抗体の検出を可能にする。その他の構築物も、ＧＳＴと融合し、この同じ部分であるが１または２以上ドメインが少ないものに対応する。これらのタンパク質はすべてE.coliにより産生される。各構築物と相互作用するＨＢ１９の能力を、異なるヌクレオリン構築物を発現する細菌粗抽出物をビオチニル化ＨＢ１９とインキュベートし、次いで、これをアビジン−アガロースへの固定化により精製することにより試験した。次いで、これらの検体をポリアクリルアミドゲルおよびＧＳＴにより分析し、抗ＧＳＴ抗体を用いた免疫検出（ウエスタンブロット）により明らかにした。結果は、ＲＧＧドメインの存在がＨＢ１９とヌクレオリンのＣ−末端部分との相互作用に必要であることを示す。さらに、この相互作用にはＲＧＧドメイン単独で十分である。
【００８８】
図２Ａは化合物ＨＢ１９の構造を示す。Ｂは、支持体として、立体配置Ｄのアラニン残基（Ａ）と立体配置Ｌのリシン残基（Ｋ）が交互にある環状ヘキサペプチド有する３価化合物Nucant０１の構造を示す。３個の疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）が各リシン残基のεアミノ基に共有結合している。Ｃは、５個の疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）が５個の各リシン残基のεアミノ基に共有結合している、支持体として配列SEQ ID NO:８のらせん構造をもつ直鎖ペプチドを有する５価化合物Nucant２（SEQ ID NO:１０）の構造を示し、ＡｃはＣＨ3 −ＣＯ−基を表す。Ｄは、５個の疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）が５個の各リシン残基のεアミノ基に共有結合している、支持体として配列SEQ ID NO:９のらせん構造をもつ直鎖ペプチドを有する５価化合物Nucant３（SEQ ID NO:１１）の構造を示し、ＡｃはＣＨ3 −ＣＯ−基を表す。Ｅは、６個の疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）が６個の各リシン残基のεアミノ基に共有結合している、支持体として配列SEQ ID NO:１５のらせん構造をもつ直鎖ペプチドを有する６価化合物Nucant６（SEQ ID NO:１６）の構造を示し、ＡｃはＣＨ3 −ＣＯ−基を表す。Ｆは、６個の疑似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝ＣＨ2 −Ｎ）が６個の各リシン残基のεアミノ基に共有結合している、支持体として配列SEQ ID NO:１３のらせん構造をもつ直鎖ペプチドを有する６価化合物Ｎｕｃａｎｔ７（SEQ ID NO:１７）の構造を示し、ＡｃはＣＨ3 −ＣＯ−基を表す。
【００８９】
図３は、Ａ．抗ヌクレオリン（抗Ｎｕ）、Ｂ．アイソタイプＩｇＧ、Ｃ．ペプチドＦ３およびＤ．ＨＢ１９が、ＨＡＲＰにより刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。静止状態のＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、表記した濃度でＨＢ１９の存在下または不在下において４ｎＭのＨＡＲＰで刺激するか、またはしない。２４時間のインキュベーション後、細胞増殖をトリチウムチミジンの取り込みを測定することにより定量した。結果はＨＡＲＰで刺激された対照（１００％）に対する％で示す。ＭＳＤ（閾値）、（**p ＜0.01、 ***p ＜0.001)。
【００９０】
図４は、ＨＢ１９でのＮＩＨ−３Ｔ３細胞の１時間予備処理が、ＨＡＲＰで誘導された増殖に及ぼす影響を示す。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＨＢ１９で１時間処理し、次いで洗浄し、３．６ｎＭのＨＡＲＰで刺激するか、またはしなかった。２４時間のインキュベーション後、細胞増殖をトリチウムチミジンの取り込みを測定することにより定量した。結果はＨＡＲＰで刺激された対照（１００％）に対する％で示す。ＭＳＤ（閾値）、（**p ＜0.01、 ***p ＜0.001)。
【００９１】
図５は、ＨＢ１９が、０．２ｎＭのＦＧＦ−２（Ａ）または５％のウシ胎仔血清（Ｂ）により刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。静止状態のＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、表記した濃度のＨＢ１９の存在下または不在下でＦＧＦ−２または５％血清で刺激する。２４時間のインキュベーション後、細胞増殖をトリチウムチミジンの取り込みを測定することにより定量した。結果はＨＡＲＰで刺激された対照（１００％）に対する％で示す。ＭＳＤ（閾値）、（**p ＜0.01、 ***p ＜0.001)。
【００９２】
図６は、抗ヌクレオリン（抗Ｎｕ）（Ａ）、アイソタイプＩｇＧ（Ｂ）およびＨＢ１９（Ｃ）が、湿寒天上でのＭＤＡ−ＭＢ２３１の増殖に及ぼす影響を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を０．６％寒天マトリックス上の０．３５％寒天含有培地で培養する。培養１０日後、５０μｍより大きい直径を有するコロニーを計測した。ウェル当たり５つの領域および各点３回実施する（**p ＜0.01) 。
【００９３】
図７は、抗ヌクレオリン（抗Ｎｕ）（Ａ）およびＨＢ１９（Ｂ）が、湿寒天上でのＢ１６−ＢＬ6 の増殖に及ぼす影響を示す。Ｂ１６−ＢＬ6 細胞を０．６％寒天マトリックス上の０．３５％寒天含有培地で培養する。培養１０日後、５０μｍより大きい直径を有するコロニーを計測した。ウェル当たり５つの領域および各点３回実施する（ *p ＜0.05、 ** p ＜0.01) 。
【００９４】
図８は、ＨＢ１９の血管形成に及ぼす影響を示す。Ａ．ＨＢ１９のＨＵＶＥＣ細胞のin vitro増殖に及ぼす影響を示す。２００００個のＨＵＶＥＣ細胞をウェル中で培養し、化合物ＨＢ１９を各日異なる濃度で添加した。処理の６日後に細胞を計測した。Ｂ．ＨＢ１９（１μＭ）の、ＨＡＲＰ血管形成因子（１ｎＭ）の存在下で培養した３次元コラーゲンゲル中のＨＵＶＥＣ細胞の分化に及ぼす影響を示す；ＶＥＧＦ（１ｎＭ）およびＦＧＦ−２（３ｎＭ）も試験した。４日後に管状の網目構造を計測した。結果は任意単位で示す。Ｃ．ＨＢ１９の、in vivo での血管形成モデル（/matrigel ＜plug assay＞) におけるＨＡＲＰまたはＦＧＦ−２により生じる血管形成に及ぼす影響を示す。表示した分子を含有するマトリゲル（３００μL ）をマウスに皮下注射する。１週間後マウスを致死させ、マトリゲルを除いた。８μｍ厚の切断を行った。染色後、内皮細胞の数を画像解析により評価する。各マトリゲルについて各実験点につき５つの断面および４匹のマウスを分析した。  図９は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける腫瘍増殖に及ぼすＨＢ１９の影響を示す。ヒト乳房がんＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を無胸腺マウス（ヌード）に皮下注射した。腫瘍が２００mm3 に達した時に、グラフＡに示すようにマウスを皮下経路により処置した。Ｂ．４０日目で致死させたマウスにおける腫瘍の観察および測定を示す。Ｃ．４０日目で致死させたマウスにおける腫瘍重量を示す。
【００９５】
図１０はＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける腫瘍増殖に及ぼすＨＢ１９の影響を示す。腫瘍増殖における変化。腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）注射。
図１１はＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける転移腫瘍増殖に及ぼすＨＢ１９の影響を示す。ＨＢ１９で処置または処置しない異種移植マウスの血液中のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の検討を、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により行った。ＨＬＡ−ＤＲ+ 細胞は囲まれ、血球中のＨＬＡ−ＤＲ+ 細胞の割合を表示する。Ａ. 未処置のＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植していないマウスの血液、末梢血球中のＨＬＡ−ＤＲ+ 細胞の割合：0.36％、Ｂ. 未処置のＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植したマウスの血液、末梢血球中のＨＬＡ−ＤＲ+ 細胞の割合：22.2％、Ｃ. 皮下経路でＨＢ１９で処置したＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植マウスの血液、末梢血球中のＨＬＡ−ＤＲ+ 細胞の割合：0.1 ％、Ｄ. 腹腔内経路でＨＢ１９で処置したＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植マウスの血液、末梢血球中のＨＬＡ−ＤＲ+ 細胞の割合：0.31％。
【００９６】
図１２は、ＨＢ１９およびＮｕｃａｎｔ０１の、ＨＡＲＰで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。静止状態のＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、表示した濃度のＨＢ１９またはＮｕｃａｎｔ０１の存在下で４ｎＭのＨＡＲＰで刺激するか、またはしなかった。２４時間のインキュベーション後、細胞増殖をトリチウムチミジンの取り込みを測定することにより定量した。結果（３点の平均）はＨＢ１９およびまたはＮｕｃａｎｔ０１の不在下でＨＡＲＰで刺激された対照（１００％細胞増殖）に対する細胞増殖の割合 (％) として示す。
【００９７】
図１３は、ＨＢ１９、Ｎｕｃａｎｔ２およびＮｕｃａｎｔ３の、ＨＡＲＰで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。静止状態のＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、表示した濃度（０．１、０．２５および０．５≧Ｍ）のＨＢ１９、Nucant２またはNucant３の存在下で４ｎＭのＨＡＲＰで刺激するか、またはしなかった。２４時間のインキュベーション後、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の細胞増殖をトリチウムチミジンの取り込みを測定することにより定量した。結果（３点の平均）はＨＡＲＰで刺激された対照（１００％細胞増殖）に対する細胞増殖の割合 (％) として示す。IC50濃度 (ＨＡＲＰで刺激された対照に対して細胞増殖を50％阻害する濃度) も示す。
【００９８】
図１4 は、Ｎｕｃａｎｔ3 、6 および７の、5 ％ＦＣＳで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を血清欠乏により静止状態とし、０．１２５〜２μM の範囲の各種濃度のNucant３、６および７の存在下または不在下で５％のＦＣＳで刺激する。２４時間のインキュベーション後、細胞増殖をトリチウムチミジンの取り込みを測定することにより定量した。結果は５％のＦＣＳで刺激された対照に対する割合 (％) として示す。ＩＣ50を点線で示す。
【００９９】
図１５：Ｎｕｃａｎｔ６およびＮｕｃａｎｔ７はＨＢ１９よりも良好な抗表面ヌクレオリン活性を示す。ＩＤ50：表面ヌクレオリンを５０％阻害するμM での濃度。ＩＤ95：表面ヌクレオリンを９５％阻害するμM での濃度。
【０１００】
図１６は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞によるヌクレオリンの細胞発現に及ぼすＨＢ１９、Ｎｕｃａｎｔ３、Ｎｕｃａｎｔ６およびＮｕｃａｎｔ７の阻害効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をウシ胎仔血清を１０％含有するＤＭＥＭ７５cm2 中で培養した。培養２日後、サブコンフルエント細胞（約３×１０6 細胞／バイアル）を１０μM のＨＢ１９（ライン１）、Ｎｕｃａｎｔ３（ライン２）、Ｎｕｃａｎｔ６（ライン３）またはＮｕｃａｎｔ７（ライン４）で２４または４８時間処理した。ラインＣは未処理細胞を表す。処理の２４または４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％ウシ胎仔血清およびビオチニル化ＨＢ１９（５μM ）を含むＤＭＥＭ１０mLを用いて室温で４５分間インキュベートした。１mMのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）中で強く洗浄した後、20mM Tris HCl 、pH7.6 、150mM NaCl、５mM MgCl2、0.2mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、5mM β- メルカプトエタノール、アプロチニン (1000 U/ml)および0.5 ％ Triton X-100 を含む溶菌パッファーを用いて細胞質抽出物を調製した。表面ヌクレオリンとビオチニル化ＨＢ１９の間に形成された複合体を、PBS-EDTA中のアビジン−アガロース (100 μL ；ImmunoPure Immobilized Avidine, Pierce Chemical 社, 米国) を用いた抽出物の精製により分離した。４℃での２時間のインキュベーション後、アビジン−アガロース試料をPBS-EDTAで十分に洗浄した。精製表面ヌクレオリン (Ａ；２×106 細胞に対応する材料) および細胞粗抽出物 (ＢおよびＣ；４×105 細胞に対応する材料) を含有するこれらの試料を、SDS 含有電気泳動バッファー中で加熱することにより変性させ、SDS-PAGEにより解析した。表面ヌクレオリンの存在は、D3モノクローナル抗体を用いた免疫ブロット法により明らかにされた (ＡおよびＢ) 。クーマシーブルーで染色後の電気泳動分析をＣに示す。ラインＭは分子量マーカーに相当する。
【０１０１】
図１７は、ex vivo CAM モデルでの血管形成の阻害を示す。ＨＢ１９ (10μM ；0.6 μｇ) またはＮｕｃａｎｔ７（10μM ；0.8 μｇ) を含む、または含まない (対照) 水20μL をCAM の表面に置く。インキュベーション48時間後に血管の観察を行う。
【０１０２】
図１８は、各種LPS 調製物により刺激された初代ヒト単核末梢血細胞 (PBMC) によるTNF-α産生の、ＨＢ１９による阻害を示す。PBMCをヒト全血EDTA- カリウムを用いてFicoll密度勾配上で遠心分離することにより分離し、１％ヒト血清AB (Invitrogen) を含むRPMI 1640 に再懸濁した。ＨＢ１９の不在下 (0)または存在下 (１および５μM ) の106 細胞/0.5mL濃度の細胞を、Esherichia coli 0111:B4 および055:B5型由来のLPS 、およびSalmonella enterica セロタイプRe 595由来のLPS 100ng/mlで刺激した。同じPBMCを20ng/ml : １μM のPMA ：イオノマイシン (ホルボール12- ミリステート13- アセテート) で刺激した。PBMC培養物を CO2５％のインキュベーター中37℃でインキュベートした。20時間のインキュベーション後に集めた培養上清中で、ELIZA によりTNF-αタンパク質濃度を測定した。
【０１０３】
図１９は、各種LPS 調製物により刺激された初代マウス腹膜マクロフォージによるTNF-αおよびIL-6産生の、ＨＢ１９による阻害を示す。４μM ＨＢ１９の不在下 (−）または存在下 (＋) のマウス腹膜マクロファージを、刺激しないか (B4 0) 、またはEsherichia coli 0111:B4 型由来のLPS 100 ng/ml (B4 100)、および1000 ng/ml (B4 1000)で刺激した。培養物を CO2５％のインキュベーター中37℃で20時間インキュベートし、ELIZA によりTNF-α (A)およびIL-6 (B)の濃度を測定した。
【０１０４】
図２０は、各種LPS により刺激された初代マウス腹膜マクロフォージによるTNF-αおよびIL-6産生の、Ｎｕｃａｎｔ７による阻害を示す。10μM Ｎｕｃａｎｔ７の不在下 (−）または存在下 (+)のマウス腹膜マクロフォージを、刺激しないか (−) 、またはEsherichia coli 0111:B4 型由来のLPS 10 ng/ml、100 ng/ml 、および1000 ng/mlで刺激した (＋) 。培養物を CO2５％のインキュベーター中37℃で20時間インキュベートし、ELIZA によりTNF-α (A)およびIL-6 (B)の濃度を測定した。
【０１０５】
図２１は、LPS により刺激されたヒト臍血管内皮細胞 (HUVEC)によるIL-8産生およびICAM-1発現の、ＨＢ１９による阻害を示す。10000 細胞/cm2のHUVEC 細胞を、ウシ胎仔血清を２％含有するEBM-2 培地中96- ウェルプレートにおいて培養した。５μM ＨＢ１９の不在下または存在下の細胞を、Esherichia coli セロタイプ055:B5型由来のLPS 100ng/mlで刺激した。細胞培養物を CO2５％のインキュベーター中37℃で20時間インキュベートし、ELIZA によりIL-8産生およびICAM-1タンパク質濃度を測定した。５μM ＨＢ１９の存在下または不在下のHUVEC 細胞を基準濃度用の対照として用いた。
【０１０６】
図２２は、熱で不活化したStaphylococcus aureus (HKSA, heat-killed Staphylococcus aureus) により刺激された初代ヒト単核末梢血細胞 (PBMC) によるTNF-αおよびIL-6産生の、ＨＢ１９による阻害を示す。PBMCをヒト全血EDTA- カリウムを用いてFicoll密度勾配上で遠心分離することにより分離し、１％ヒト血清AB (Invitrogen) を含むRPMI 1640 に再懸濁した。ＨＢ１９、Ｎｕｃａｎｔ3 、Ｎｕｃａｎｔ6 もしくはＮｕｃａｎｔ7 (10 μM ) 、またはデキサメタゾン (Dex.１μｇ／mL) の不在下 (対照) または存在下の106 細胞/0.5mL濃度の細胞を、108 HKSA／mL粒子 (InvivoGen,サンディエゴ、米国) で刺激した。PBMC培養物をCO2 ５％のインキュベーター中37℃でインキュベートし、20時間のインキュベーション後に集めた培養上清中で、ELIZA によりTNF-α (A)およびIL-6(B) の濃度を測定した。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１）
５価化合物ＨＢ１９の抗腫瘍活性
1.1  in vitro での腫瘍細胞の増殖に及ぼす５価化合物ＨＢ１９の影響
1.1.1 足場依存性細胞増殖における表面ヌクレオリンの役割およびこの増殖に及ぼすＨＢ１９の阻害効果
HARP分子の生物学的活性におけるヌクレオリンの役割を一連の実験で検討した：NIH 3T3 細胞によるトリチウムチミジンの取り込みの測定により試験されるHARPの分裂促進活性を、ヌクレオリンを特異的に認識するモノクローナル抗体の存在下または不在下で評価した。結果は、この抗体がNIH 3T3 細胞中で用量依存的にHARPの分裂促進活性を阻害することを示す (図３Ａ）。
【０１０８】
抗ヌクレオリン抗体の50nMの添加は、４nM HARP による分裂促進活性を完全に阻害するのに対し、同じアイソタイプのヌクレオリンに非特異的な抗体はHARPにより誘導される増殖に対して何の影響も及ぼさない。これは、どのような免疫グロブリン濃度を使用した場合でも同じであり、従って観察された阻害の特異的を実証している。
【０１０９】
ペプチドF3および化合物ＨＢ１９はヌクレオリンの２種類のリガンドである。ヌクレオリンのＣ末端部分に位置するＲＧＧドメインに結合する化合物ＨＢ１９（図１参照）に対し、ペプチドF3は、多数のアミノ酸領域を含むヌクレオリンのＮ末端部分に結合する (９）。化合物ＨＢ１９の細胞表面への特異的結合がペプチドＦ３の存在に影響されないことも示された（FACSを用いた本発明者らにより行われた実験) 。
【０１１０】
本発明者らは、ペプチドF3および５価化合物ＨＢ１９が増殖因子HARPにより生じるNIH-3T3T3 細胞の細胞増殖を阻害しうるかどうかを検討した。従って、同じ系列の実験において、表面ヌクレオリンに特異的に結合する化合物ＨＢ１９およびペプチドF3の影響を試験した。
【０１１１】
ペプチドF3での結果を図３Ｃの１a に示し、これは、ペプチドF3がIgG のように、HARPにより生じるNIH 3T3 増殖の阻害には導かないことを明らかに示す。
ＨＢ１９での結果を図３Ｄに示し、これは、ＨＢ１９がHARPにより生じるNIH 3T3 増殖の用量依存的阻害に導くことを示す。0.5 μM のＨＢ１９の添加により、４ＭのHARPにより生じる効果の81％を阻害する結果となる。これは明らかに、ヌクレオリンリガンドを内在化して増殖の阻害をもたらしうるようにするのでは十分でないことを示し、そして有効であるためにはヌクレオリンリガンドは多価であり、１または２以上のヌクレオリン分子のＣ末端ドメインにおける１または２以上のＲＧＧ単位に結合する必要があることを示唆する。
【０１１２】
さらに、細胞を種々のＨＢ１９の濃度で１時間予備処理し、洗浄し、次いでHARPで刺激した場合に同様の阻害がみられることに注意するのは興味深い (図４) 。この結果は、ＨＢ１９がNIH 3T3 上に存在する表面ヌクレオリンに結合し、そして１時間後にHARPにより誘導される細胞増殖を阻止することを示す。
【０１１３】
細胞増殖の阻害に及ぼすＨＢ１９の影響がHARPなどの所定の増殖因子に特異的であるかどうかを検討するために、下記により刺激されたNIH 3T3 細胞に対するＨＢ１９の影響を検討することからなる２系列の実験を行った：
−別の増殖因子であるFGF-2 、または
−各種増殖因子の混合物を含む５％ウシ胎仔血清。
【０１１４】
これらの実験の結果を図５に示し、これは0.5 μM 濃度のＨＢ１９がFGF-2 (A) またはウシ胎仔血清(B) により刺激された細胞の増殖を阻害しうることを示す。
このように、結果は、全般的にＨＢ１９は腫瘍細胞の増殖のin vitro阻害が可能であることを示す。これは、細胞増殖を引き起こすのに用いる試薬が何でなろうと同じである。
1.1.2 足場非依存性細胞増殖におけるヌクレオリンの役割およびこの増殖に及ぼすＨＢ１９の阻害効果
細胞増殖に関するこれらの検討と並行して、足場非依存性増殖に対するヌクレオリンの役割、形質転換細胞の表現型特性を、ヒト乳がん系MDA-MB-2312 およびマウス黒色腫系B16-BL6 を用いた湿寒天上の増殖モデルにおいて試験した。
【０１１５】
これらの実験においては、細胞を各種濃度の対照抗ヌクレオリン抗体、対照免疫グロブリンまたは化合物ＨＢ１９の存在下または不在下で寒天ゲル上で培養した。37℃でのインキュベーション10日後、各培養皿中に存在するコロニーの数を計測した。図６に示すように、0.1 μM 抗ヌクレオリン(A) で処理した培養物ではコロニー数が60％低下したのに対し、同じアイソタイプの免疫グロブリン(B) で培養物を処理した場合何ら影響は見られなかった。
【０１１６】
さらに詳しくは、対照に対するコロニー数の阻害は、ＨＢ１９で処理した培養物でも見られ、これは用量依存的であった。１μM のＨＢ１９で処理した培養物でコロニー数の59％の減少が見られた (図６Ｃ) 。
【０１１７】
同様の結果が、標的細胞としてB16-BL6 などのマウス黒色腫を用いても得られた。これらの結果は図７に示す。結果の考察より、抗ヌクレオリン抗体(A) およびＨＢ１９分子(B) の両方とも用量依存的に湿寒天上のB16-BL6 の増殖を阻害することが分かる。クローン数の50％より高い阻害が１μM のＨＢ１９の存在下で見られる。
【０１１８】
この結果を組み合わせると、化合物ＨＢ１９が足場非依存性細胞増殖に阻害効果を有することが実証される。これはヒト乳がんおよびマウス黒色腫の両方の細胞モデルにおい言える。
1.2 血管形成因子により生じる血管形成に及ぼす５価化合物ＨＢ１９の影響
表面ヌクレオリンが活性化内皮細胞の表面に存在するとして(9) 、ＨＢ１９の、内皮細胞の分化に及ぼす影響を試験した。
【０１１９】
まず、この影響を内皮細胞 (HUVEC:ヒト臍血管内皮細胞、Human umbilical vein endothelial cells) のin vitro増殖に対して試験した。ウェル当たり20000 個のHUVEC 細胞を培養し、化合物ＨＢ１９を各日、種々の濃度で添加した。処理の６日後に細胞を計測した。結果は図８Ａに示され、これはHaung et al.による論文(16)で使用された抗ヌクレオリンポリクローナル抗体製剤とは反対に、ＨＢ１９が内皮細胞の増殖の阻害を導くことを示す。
【０１２０】
HARPアンギオゲン (1nM)、VEGF (1 nM) およびFGF-2 (3 nM)の存在下で培養された三次元コラーゲンゲル中のHUVEC 細胞の分化に対するＨＢ１９(1μM ) の存在の影響も試験した。４日後、血管網状構造を計測した。結果は図８Ｂに任意単位で示され、これは、ＨＢ１９がアンギオゲン因子の存在下で培養された三次元コラーゲンゲル中のHUVEC 細胞の分化を阻害することも示す。
【０１２１】
最後に、内皮細胞の分化に対するＨＢ１９の影響をin vivo 血管形成モデルにおいて試験した。この試験は、血管の形成に導く過程の最初の段階を模している。
この血管形成実験モデルは、血管形成の刺激または阻害特性について解析すべき物質を含むマトリゲルをマウスに皮下注射することを含む。１週間後マトリゲルを除き、組織学的切開を行い、免疫組織化学法の後の画像解析により、内皮細胞 (CD31＋、因子VIII＋) の数を定量した。図８から明らかなように、ＨＢ１９単独ではマトリゲル中の内皮細胞の増加に何ら影響がない。これに対し、これはHARPまたはFGF-2 により引き起こされる血管形成は阻害する。
【０１２２】
結果の分析により、ＨＢ１９がFGF-2 またはHARPなどの前血管形成因子により引き起こされる血管形成を阻害しうることが示される。これは、血管形成に関与する内皮細胞を特異的に標的とするＨＢ１９の全般的血管静止 (angiostatic)効果を示す。
【０１２３】
このように、化合物ＨＢ１９は、HARP、VEGFおよびFGF-2 により生じるHUVEC 細胞の増殖および分化を劇的に阻害する。従って、これは、Huang et al.の論文(16)で使用された抗ヌクレオリンモノクローナル抗体よりもさらに著しい効果を有する。
【０１２４】
抗がん標的細胞として内皮細胞を使用するのにはいくつかの利点がある。遺伝的不安定性を示す腫瘍細胞とは反対に、内皮細胞は遺伝的に極めて安定であり、従って抵抗性のメカニズムを制限する。さらに、分子標的は表面ヌクレオリンであるので、ＨＢ１９は原理的に活性化内皮細胞、従って新生血管形成相に入ったものを標的とする。腫瘍性内皮細胞は正常な内皮細胞により70倍速く分裂し、このことが、腫瘍性内皮細胞が主要な標的であり、こうして可能な副作用を制限する理由である。
1.3 ５価化合物ＨＢ１９のin vivo 抗腫瘍作用
５価化合物ＨＢ１９のin vivo での腫瘍増殖に及ぼす影響を無胸腺マウスにおける腫瘍増殖モデルで試験した。この実験において、標的細胞はヒト乳腺のがん由来である：MDA-MB231 。
【０１２５】
４匹の無胸腺マウス (ヌード／ヌード) の群に２×106 細胞を側腹部に注射した。腫瘍体積が少なくとも200 mm3 に達した場合に、マウスを100 μL のPBS 溶液 (対照群) またはＨＢ１９溶液 (5 mg/kg)、または従来の臨床試薬、タモキシフェン (タクソールともいう、10mg/kg)を２日毎に腫瘍に注射 (腫瘍周囲または皮下経路) することによって処置するか処置しなかった。腫瘍サイズはカリパー (calliper) を用いて７、14、21、28、34および40日目に測定した。
【０１２６】
結果は図８に示され、これは５mg/kg の用量で用いたペプチドＨＢ１９が、７倍の大きさの腫瘍をもつ未処置の対照に比べ、腫瘍増殖を阻害する結果を生じることを示す。
さらに、タモキシフェンで処置したマウスにおける腫瘍体積は処置の開始から有意には変化しなかったのに対し、ＨＢ１９で処置したマウスの腫瘍は処置の21日後は検出できなかった (図９Ａ）。10mg/kg でのタモキシフェンのみで腫瘍体積の安定化または部分的退縮という結果となったが、5 mg/kg での５価化合物ＨＢ１９は実際に、明らかに完全な腫瘍の退縮に至った。
【０１２７】
これらの結果を確認するために、マウスを処置の40日後に致死させ、腫瘍を取り出し、次いで重量を計測した。未処置のマウスにおける腫瘍の平均重量は0.22ｇ (分布0.083 〜0.34ｇ) であり、タモキシフェン10mg/kg で処置したマウスでは0.06ｇ (分布0.006 〜0.22ｇ) であり、そしてＨＢ１９で処置したマウスでは腫瘍は見られず (図９ＢおよびＣ）、こうして、体外での大きさの測定により、実施した腫瘍体積の見積もりを確認した。
【０１２８】
別の実験では、ＨＢ１９ (5mg/kg) を腹腔内経路 (IP) および腫瘍周囲の経路 (SC) で投与した (図１０) 。結果は、ＨＢ１９の抗腫瘍作用は腹腔内経路 (IP) および腫瘍周囲の経路 (SC) で同じように有効であり、これは５価化合物ＨＢ１９の予想外の効果だけでなく、全身投与の場合を含む腫瘍部位でのin vivo 生物学的利用能を実証している。
【０１２９】
ＨＢ１９による処置の過程で、異種移植されたマウスにおいて異常な生理学的または挙動の徴候は何ら観察されなかったことに留意すべきである。さらに、実験の終わりの器官の解剖学的検査によっても、組織毒性の目に見える徴候も、また血液組成や血小板数における何らの変化も見られなかった。
【０１３０】
さらに、ＨＢ１９で処置した異種移植マウスの末梢血細胞においてHLA-DR+ ヒト細胞 (従ってMDA-MB231 腫瘍細胞) を検出することはできなかった (図１１）。事実、MDA-MB231 細胞 (HLA-DR+ ) の割合が末梢血細胞の22.3％を示す未処置のマウス (PBS)とは反対に、皮下または腹腔内経路によりＨＢ１９で処置したマウスでは、この割合は0.1 ％〜0.31％にすぎない。これらの結果から、ＨＢ１９は血液における腫瘍細胞の循環の防止、従って転移現象の防止も可能であることが示唆される。
1.4 結論
実施例２に示される結果から、５価化合物ＨＢ１９は、腫瘍増殖および血管形成の二重の作用の結果としての細胞増殖の強力な阻害剤であることが分かる。これらの観察は、無胸腺マウスでのPC3 細胞移植モデルにおいて、ＨＢ１９の腫瘍周辺への注射による処置が、腫瘍の阻害および退縮を誘導することができ、そして組織毒性のないことを示すin vivo モデルにおいて確認された。
【０１３１】
がん療法におけるタキソールなどの慣用の治療法に比べ、使用した実験モデルにおけるＨＢ１９はより効果的であるようである。タモキシフェンに比べたＨＢ１９のこのより大きい効果は、腫瘍成長および腫瘍増殖に必要な血管形成の両方に対するＨＢ１９の阻害的効果の結果であるかもしれない。腫瘍細胞の場合でも活性化内皮細胞の場合でも、ＨＢ１９はこれら２種類の細胞の増殖を標的とし阻止する。
【０１３２】
腫瘍細胞の増殖を阻害する性質を有する分子は多数存在する。これらの分子は実際には細胞標的をもたずに作用することが多い。事実、多数の化学療法薬剤について、腫瘍細胞に存在する分子標的は正常細胞にも見出され、これはかかる治療の多数の副作用を説明している。標的化生物製剤は、正常細胞には存在しないか極めて少ししか存在しない標的を阻止するので、副作用はほとんどもたない。活性化細胞の表面に存在するヌクレオリンはこの性質に応答し、従って、がんの治療において理想的な治療上の標的となる。我々は腫瘍細胞だけでなく活性化内皮細胞も標的とすることに注目することも重要である。さらに、表面ヌクレオリンは特定の種類のがんに限定されないようである。
【０１３３】
二重の標的化 (腫瘍細胞自身と活性化内皮細胞) の効果は、無作為の治験で抗血管形成剤 (アバスチン) と抗増殖性薬剤 (5-フルオロウラシル) との併用がヒト結腸直腸がんの患者に非常に有効である (28) ことを示したGenentech により行われた検討の結果と比べるべきである。第３相治験において、化学療法 (イリノテカン／5-フルオロウラシル／ロイコボリン) の補完としてのアバスチン治療は、その前には未処置の転移結腸がんの患者において生存率を平均で５ヶ月 (15.6ヶ月に対し20.3ヶ月) と非常に大きく延ばした。これらの患者において、腫瘍が増殖しなかった期間は、化学療法のみを受けた患者に比べて6.2 ヶ月から10.6ヶ月に増加した (29) 。
【０１３４】
腫瘍細胞および内皮細胞に対するこの二重の効果により、ＨＢ１９はがんの治療における選択分子となる。
【０１３５】
（実施例２）
３価化合物Nucant 01 の抗腫瘍活性
2.1 ３価化合物Nucant 01 の合成
３価化合物Nucant 01 の化学構造を図２Ｂに示す。この化合物は、交互の立体配置Ｄのアラニン残基( Ａ) と立体配置Ｌのリシン残基( Ｋ) とからなる環式ヘキサペプチドを支持分子として有する。３個の擬似ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ＝CH2 −NH）が３個のリシン残基( Ｋ) のそれぞれのεアミノ基に共有結合している。
【０１３６】
化合物Nucant 01 の合成は、ＫΨＰＲ単位をＣ３対称環式≪コア≫分子に共有結合させることを含む。このコア分子の合成は、S. Fournel et al. (30)に記載されている。保護されたＫΨＰＲ単位をFmoc型化学反応に従って標準的な固相合成法を用いてクロロトリチル型樹脂上で組み立て、次いで弱酸性条件下で樹脂から切り離した。次に、保護されたＫΨＰＲ単位をコア分子の各リシン残基( Ｋ) のε-NH2基に、ＫΨＰＲ１. １／環式分子１の化学量論比の基準で結合させた。結合はBOP ／HoBt活性化手法に従って48時間行った。この反応の終了後、ＫΨＰＲを保護している基をトリフルオロ酢酸中で脱離させ、最終化合物をエーテル中で沈殿させた。この手順の最後に得られたNucant 01 分子をHPLCで精製し、質量分析法により完全に特性決定した。
【０１３７】
2.2 Nucant 01 のin vitro腫瘍細胞増殖に対する阻害活性
HARPにより刺激されたNIH-3T3 細胞の増殖に及ぼすNucant 01 の効果を、５価化合物であるHB-19 のそれと比較した。静止NIH-3T3 細胞を、所定濃度 (0.1 、0.2 、0.4 、１、２、及び４μM)のHB-19 又はNucant 01 の存在下で、4 nMのHARPによって刺激し、又は刺激しなかった。24時間のインキュベーション後、前述したようなトリチウム化チミジン取り込みを測定することによってNIH-3T3 細胞の細胞増殖を求めた。
【０１３８】
HB-19 及びNucant 01 の不存在下でHARPにより刺激された対照 (100 ％細胞増殖) と比べて、ＫＰＲ単位に関して３価の化合物にすぎないNucant 01 でも、２μM 濃度でHARP刺激されたNIH-3T3 細胞の細胞増殖の50％阻害を生じることが認められる。従って、この結果は、環式ペプチド上にグラフトされた一般式( Ｉ) の少なくとも３個の擬似ペプチド単位をもつ合成多価化合物でも、支持分子が線状ペプチドである５価化合物のHB-19 と同様に、HARPにより発動された腫瘍細胞増殖を阻害することができることを実証している。
【０１３９】
必要な濃度は、HB-19 で同レベルの阻害を得るのに必要な濃度 (0.2 μM)より10倍高いが、化合物Nucant 01 は一般式( Ｉ) の擬似ペプチド単位を３個しか有していないのに対し、化合物HB-19 が有するのは５個である。
【０１４０】
従って、Nucant 01 で使用する種類の環式ペプチドにグラフトされる一般式( Ｉ) の擬似ペプチド単位の数を４又は５に増やすと、化合物の効力が恐らく100 倍までさらに増大すると見込まれる。
【０１４１】
2.3 結論
これらの結果は、本発明で使用する化合物の活性に対する、一般式( Ｉ) で示される多価形態の擬似ペプチドの重要性を、多様な支持分子の使用の可能性と共に、明らかに実証しており、本化合物の効力に影響を及ぼさずに線状ペプチド又は環式ペプチドを使用することができる。
【０１４２】
従って、他の許容できる支持分子も、それらの上に少なくとも３個、好ましくは３〜８個、好ましくは４〜６個、好ましくは５又は６個の一般式( Ｉ) で示される擬似ペプチド単位をグラフトすることが可能である限り、等しく使用することができる。
【０１４３】
(実施例３) 
５価化合物Nucant 2及びNucant 3の抗腫瘍活性
3.1 ５価化合物Nucant 2及びNucant 3の合成
その上にＫΨＰＲ単位が固定されるらせん構造をとることが知られている２つのペプチド支持分子を固相合成により組み立てた。これらの支持分子は、Nucant 2についてはAib-Lys-Aib-Gly 配列、Nucant 3についてはLys-Aib-Gly 配列を５回一体に連結した反復単位から構成されていた。ここで、Aib は２−アミノ−イソ酪酸を表す。組み立てはBoc 型化学反応によって行った。次いで、リシン残基側鎖のFmoc保護基を、DMF 中でのピペリジン処理 (５分間を３回) によって脱離させた。次に、リシンの５個のε-NH2をＫΨＰＲ単位 (Ψ＝CH2-N)に対するアンカー (固定部) として作用させた。フッ化水素酸中で最後の酸開裂を行った。エーテル中でペプチドを沈殿させた後、水条件で溶解させ、凍結乾燥した後、Nucant 2及びNucant 3アナログをHPLCにより精製し、質量分析法で分析してから、凍結乾燥した。
【０１４４】
3.2 Nucant 2及びNucant 3のin vitro腫瘍細胞増殖に対する阻害活性
HARPにより発動されたNIH-3T3 細胞の増殖に及ぼすNucant 2及びNucant 3の効果を、５価化合物であるHB-19 のそれと比較した。静止NIH-3T3 細胞を、所定濃度 (0.1 、0.25及び0.5 μM)のHB-19 、Nucant 2、又はNucant 3の存在下で、4 nMのHARPによって刺激し、又は刺激しなかった。24時間のインキュベーション後、前述したようなトリチウム化チミジン取り込みを測定することによってNIH-3T3 細胞の細胞増殖を求めた。
【０１４５】
本実験では、HB-19 は0.1 μM のIC50で阻害する。Nucant 2及びNucant 3は1.5 μM のIC50で用量依存性のある細胞増殖阻害を示す。
従って、５価化合物Nucant 2およびNucant 3は、化合物HB19と非常に似たIC50 (細胞増殖の50％阻害を生じる濃度) で用量依存的に細胞増殖を阻害しうる。
【０１４６】
5 ％のFCS で処理されたNIH-3T3 細胞の増殖に及ぼすNucant 3の効果もHB-19 のそれと比較した。血清剥奪によって静止状態にしたNIH-3T3 細胞を、0.125 〜２μM の範囲内の異なる濃度のNucant 3、 6又は7 の存在下又は不存在下で5 ％ FCSにより刺激した。24時間のインキュベーション後、前述したようなトリチウム化チミジンの取り込みを測定することによって細胞増殖を求めた。
【０１４７】
結果を図14に、5 ％ FCSにより刺激された対照細胞に対する％として示す。この結果は、Nucant 3が細胞増殖に対して阻害効果を有することを示している。グラフの解析から、Nucant 3はHB-19 分子と同等であるが、わずかにより低いID50値 (50％での阻害用量) を有し、従ってHB-19 よりわずかに効果が大きいことがわかる。刺激されなかった細胞に対しては、Nucant 3では効果が認められなかった。これは、これらの分子に毒性がないことを示している。
【０１４８】
3.3 結論
これらの結果は、本発明で使用する化合物の活性に対する、一般式( Ｉ) で示される多価形態の擬似ペプチドの重要性をやはり実証しており、等しく十分に使用される支持分子は、構造要素 (βフォールド、βシート) を含み、若しくは含んでいない線状ペプチド、らせん構造の線状ペプチド、さらには環式化合物であり、これが構造の効力に影響することはない。
【０１４９】
従って、各種の許容できる支持分子も、それらの上に少なくとも３個、好ましくは３〜８個、好ましくは４〜６個、好ましくは５又は６個の一般式( Ｉ) で示される擬似ペプチド単位をグラフトすることが可能である限り、交替可能に使用することができる。
【０１５０】
(実施例４) 
６価化合物Nucant 6及びNucant 7の抗腫瘍活性
4.1 ６価化合物Nucant 6及びNucant 7の合成
これらの６価化合物は、５価化合物であるNucant 2及び3 について用いたのと同じ合成法を用いて得た。
【０１５１】
4.2 Nucant 6及びNucant 7のin vitro腫瘍細胞増殖に対する阻害活性
5 ％FCS により発動されたNIH-3T3 細胞の増殖に及ぼす６価化合物Nucant 6及びNucant 7の効果を、５価化合物であるHB-19 のそれと比較した。血清剥奪により静止状態にされたNIH-3T3 細胞を、0.125 〜２μM の範囲内の異なる濃度のNucant 3、 6又は7 の存在下で5 ％ FCSにより刺激した。24時間のインキュベーション後、前述したようなトリチウム化チミジンの取り込みを測定することによって細胞増殖を求めた。
【０１５２】
結果を図14に、5 ％ FCSにより刺激された対照細胞に対する％として示す。この結果は、Nucant 6及び7 が細胞増殖に対する阻害効果を有することを示している。Nucant 6及び7 のID50値 (50％での阻害用量) は、HB-19 分子のそれと同等であるが、わずかにより低く、従ってHB-19 よりわずかに効果が大きい。刺激されなかった細胞に対しては、Nucant 6及び7 では効果が認められず、これらの分子に毒性がないことがわかる。
【０１５３】
4.3 結論
これらの結果は、本発明で使用する化合物の活性に対する、一般式( Ｉ) で示される多価形態の擬似ペプチドの重要性をさらに実証している。等しく十分に使用される支持分子は、構造要素 (βフォールド、βシート) を含み、若しくは含んでいない線状ペプチド、らせん構造の線状ペプチド、さらには環式化合物であり、これが構造の効力に影響することはない。
【０１５４】
特に、６個の擬似ペプチド単位を持つ形態は、所望の抗増殖及び抗血管形成効果を得るのに非常に有効であるようである。
【０１５５】
(実施例５) 
Nucant 6及びNucant 7はHB-19 より強力な表面ヌクレオリン阻害剤である
5.1 Nucant 6及びNucant 7はHB-19 より強力な阻害剤であって、表面ヌクレオリンの活性を阻害する
表面ヌクレオリンの活性を、我々が既に述べた技法 (13) も用いてHeLa P4 細胞において試験した。
【０１５６】
図15に示した結果は、Nucant 3による表面ヌクレオリン活性の阻害がHB-19 のそれに匹敵することを示している。これに対し、Nucant 6及びNucant 7は、HB-19 より大きな表面抗ヌクレオリン活性を有する。HB-19 とNucant 3のID50値 (50％での阻害用量) は、0.1 〜0.2 μM であるのに対し、Nucant 6及びNucant 7のID50値は0.1 μM より小さい。さらに、0.8 μM で使用されたNucant 6及びNucant 7は、表面ヌクレオリン活性の95％以上の阻害を生ずる。
【０１５７】
5.2 HB-19 、Nucant 3、 6、及び 7は、ヒト乳がん細胞MDA-MB 231における表面ヌクレオリンの阻害を生ずる
表面ヌクレオリンは腫瘍の増殖と血管形成に重要な役割を果たす。HB-19 並びに関連分子のNucant 3、Nucant 6及びNucant 7は、表面ヌクレオリンに特異的に結合し、こうして腫瘍の成長と血管形成を阻止する。これらの擬似ペプチドが表面ヌクレオリンに結合した後、[ 擬似ペプチド−ヌクレオリン] 複合体は活発なプロセスによって急速に内部移行される。これらの結果は図16Ａに示され、HB-19 ( ライン1)、Nucant 3 (ライン2)、Nucant 6 (ライン3)、又はNucant 7 (ライン4)による細胞の処理は、未処理の細胞に比べて表面ヌクレオリンの存在の減少を生ずることを示している。この減少は、24時間の処理後に観察されるが、ヌクレオリンが検出されなくなる48時間の処理後も認められる。
【０１５８】
細胞を擬似ペプチドのNucant 6及びNucant 7で24時間処理した時の表面ヌクレオリンの減少 (ライン3 及び4)が、HB-19 及びNucant 3で処理された細胞 (ライン1 及び2)に比べてかなり大きくなることを知ることは興味深い。同じことが48時間の処理後も認められる。表面ヌクレオリンの減少は表面ヌクレオリンの細胞内の量の減少の結果ではないことを知ることは重要である。実際、HB-19 や各種のNucantで処理された細胞、又は未処理の細胞の細胞抽出物中に認められるヌクレオリンの量は同じである (図16B)。同様に、細胞がHB-19 や異なる種類のNucantで処理されたか、又は未処理であるかにかかわらず、細胞から抽出されたタンパク質の電気泳動図の間に違いがないことも認められている。この結果は、タンパク質合成がHB-19 又は試験した異なる種類のNucantにより影響されないことを例証している。さらに、HB-19 又は試験した異なる種類のNucantが、細胞毒性効果を有しておらず、これは表面ヌクレオリンの観察された減少を説明するかもしれないことを知ることも興味深い。
【０１５９】
5.3 結論
これらの結果は下記を示す: 
ａ) ヌクレオリンは、例えばヒト乳がん細胞 (MDA-MB 231) において、腫瘍細胞の表面に多量に発現する。
【０１６０】
ｂ) HB-19 、Nucant 3、Nucant 6及びNucant 7による処理は、細胞の表面に存在するヌクレオリン≪プール≫の著しい減少を引き起こす。
ｃ) 擬似ペプチドNucant 6及びNucant 7は、細胞の表面に存在するヌクレオリン≪プール≫の減少を生ずる効果、並びに表面ヌクレオリンの活性を阻害する効果がより高い。
【０１６１】
(実施例６) 
HB-19 及びNucant 7の血管形成に及ぼす効果
方法
HB-19 及びNucant 7が血管形成に及ぼす効果を、血管形成のex vivo モデルであるニワトリ胚の漿尿膜 (CAM)において試験した。
【０１６２】
HB-19 (10 μM; 0.6μg)又はNucant 7 (10μM; 0.8μg)を含有し、又は含有しない (対照) 20μl の水をCAM の表面に置いた。48時間のインキュベーション後に血管の観察を行った。
【０１６３】
結果
結果を図17に示すが、48時間のインキュベーション後にHB-19 及びNucant 7はあきらかに血管形成の阻害を生じていることが見られる。毛管長さのみならず、枝部の数も考慮に入れた画像解析の検討から、対照に比べて50％の領域における阻害が示唆される。
【０１６４】
(実施例７) 
化合物HB-19 及びNucant 7の抗炎症活性
7.1 LPS で刺激されたヒト初代PBMCによるTNF-α産生のHB-19 による阻害
方法
PBMCは、ヒト全血EDTA- カリウムを用いてフィコール密度勾配遠心分離により単離し、1 ％ヒト血清AB (Invitrogen社) を含有するRPMI 1640 中に再懸濁させた。HB-19 の不存在下 (0)又は存在下 (1 及び5 μM)における106 個／0.5 mlの濃度の細胞を、大腸菌 (Escherichia coli) タイプ0111 :B4及び055 :B5 由来のLPD 、並びにサルモネラ・エンテリカ (Salmonella enterica)セロタイプ Re 595 由来のLPS 100 ng/ml で刺激した。同じPBMCを、20 ng/ml : 1μM のPMA : イオノマイシン (フォルボール・12- ミリステート・13- アセテート :イオノマイシン) で刺激した。PBMC培養液をCO2 5 ％のインキュベータ内で、37℃でインキュベーションした。TNF-αタンパク質の濃度を、20時間のインキュベーション後に集めた培養液上清中でELISA により測定した。
【０１６５】
結果
結果 (図18を参照) は、単離したばかりのPBMCがTNF-αを産生し、このTNF-αの構成的産生はHB-19 による影響を受けない。他方、HB-19 は、大腸菌又はサルモネラ・エンテリカ由来の各種LPS 調製物による刺激に反応したPBMCによるTNF-α産生を用量依存的に阻害する。この効果は特異的である。なぜなら、HB-19 は、PMA −イオノマイシンによる刺激に反応したPBMCによるTNF-α産生には効果を示さないからである。
【０１６６】
5 μM のHB-19 では、各種LPS 調製物による刺激に反応したヒトPBMCによるTNF-α産生は、LPS による刺激の不存在下で認められたベースレベルと同じ程度まで阻害される。
7.2 LPS で刺激された初代腹膜由来マウスマクロファージによるTNF-α及びIL-6の産生のHB-19 及びNucant 7による阻害
方法
刺激されたマクロファージを得るために、7 〜8 週齢のbalb/cマウスに、実験の４日前に、1.5 mlのチオグリコレート溶液 (3 ％食塩水溶液) を用いて腹腔内注射を行った。ウシ胎児血清1 ％を含有するRPMI培地5 mlで腹腔を洗浄することにより、腹腔内のマクロファージを集めた。次いで、RPMI 1640 培地中106 個／0.5 mlの濃度で細胞をプレートに載せ、CO2 5 ％のインキュベータ内で、37℃でインキュベーションし、２時間後に付着していない細胞を除去した。
【０１６７】
4 μM のHB-19 又は10μM のNucant 7の不存在下( −) 又は存在下( ＋) で、10 ng/ml、100 ng/ml 及び1000 ng/mlの大腸菌セロタイプ0111 : B4 由来のLPS によりマクロファージを刺激し、又は刺激しなかった。細胞培養液をCO2 5 ％のインキュベータ内で、37℃で20時間インキュベーションした。TNF-α及びIL-6タンパク質濃度をELISA により測定した。
【０１６８】
結果
HB-19 について得られた結果を図19に示す。4 μM のHB-19 で、LPS による刺激に反応したマウス腹腔マクロファージによるTNF-α及びIL-6の産生は著しく阻害される。LPS による刺激の不存在下で認められたベースレベルを考慮すると、正味の阻害率はTNF-αに対しては72〜75％、IL-6に対しては68〜71％である。
【０１６９】
Nucant 7で得られた結果を図20に示す。10μM のNucant 7で、LPS による刺激に反応したマウス腹腔マクロファージによるTNF-α及びIL-6の産生は、ほぼ完全に阻害される。なぜなら、LPS による刺激に反応しNucant 7で処理された培養液で認められたサイトカイン産生レベルはLPS の不存在下で認められたものに似ているからである。
【０１７０】
LPS による刺激の不存在下で認めらたベースレベルを考慮すると、10μM のNucant 7での阻害率は、10、100 及び1000 ng/mlのLPS により刺激された培養液中では95％を超えている。100 倍も高いLPS 濃度の存在下でも阻害率が変化しないことは、Nucant 7による阻害のメカニズムが主に表面ヌクレオリンへの結合に起因することを示唆している。実際、もしNucant 7による阻害のメカニズムがLPS との相互作用の結果であったなら、LPS 10 ng/mlよりLPS 100 ng/ml では阻害効果がより低くなる筈である。
【０１７１】
7.3 LPS で刺激されたHUVEC 細胞によるIL-8の産生及びICAM-1の発現のHB-19 による阻害
方法
10,000個／cm2 の濃度のHUVEC 細胞を、96ウェルプレートを用いて2 ％のウシ胎仔血清を含有するEBM-2 培地中で培養した。5 μl のHB-19 の存在下又は不存在下での細胞を、大腸菌セロタイプ055 : B5由来のLPS 100 ng/ml により刺激した。細胞培養液をCO2 5 ％のインキュベータ内で、37℃で20時間インキュベーションした。IL-8及びICAM-1の濃度をELISA により測定した。5 μM のHB-19 の不存在下又は存在下でのHUVEC 細胞を、ベースレベルを示すための対照として使用した。
【０１７２】
結果
LPS による刺激の不存在下で認められたベースレベルを考慮すると、5 μM のHB-19 によるIL-8及びICAM-1産生の阻害率はほぼ50％である。従って、これらの結果は、IL-8及びICAM-1の産生の阻害剤としての、HB-19 及び関連Nucant型化合物の潜在的な効力を実証する (図21を参照) 。
【０１７３】
7.4 不活化黄色ブドウ球菌で刺激されたヒト初代PBMCによるTNF-α産生のHB-19 による阻害
黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus)への感染は心内膜炎の主な原因の１つであることが示されている (24, 25) 。
【０１７４】
従って、本発明者らは、10μM の化合物HB-19 、Nucant 3、Nucant 6又はNucant 7の不存在下 (対照) 又は存在下での、熱により不活化した黄色ブドウ球菌 (HKSA, <heat-killed Staphylococcus aureus>)に反応したヒト初代PBMC培養液中のTNF-α及びIL-6濃度を測定した。陽性対照 (Dex.) として、既知の抗炎症及び免疫抑制活性を有するグルココルチコステロイドであるデキサメタゾンでもPBMCを処理した。
【０１７５】
方法
PBMCは、ヒト全血EDTA- カリウムを用いてフィコール密度勾配遠心分離により単離し、1 ％ヒト血清AB (Invitrogen社) を含有するRPMI 1640 中に再懸濁させた。HB-19 、Nucant 3、Nucant 6、Nucant 7、及びデキサメタゾン (1 μg/ml) の不存在下 (対照) 又は存在下 (10μM)における106 個／0.5 mlの濃度の細胞を、108 HKSA／ml粒子 (InvivoGen 社, 米国サンディエゴ) で刺激した。PBMC培養液をCO2 5 ％のインキュベータ内で、37℃でインキュベーションした。TNF-α及びIL-6タンパク質の濃度を、20時間のインキュベーション後に集めた培養液上清中でELISA により測定した。
【０１７６】
結果
結果を図22に示すが、試験した全ての擬似ペプチド (HB-19 、Nucant 3、Nucant 6、及びNucant 7) で、熱不活化黄色ブドウ球菌による刺激に反応したTNF-α及びIL-6産生の著しい阻害を得ることができる。これらの擬似ペプチドはデキサメタゾンのような標準的な抗炎症処置と同程度に有効である。
【０１７７】
従って、HB-19 、Nucant 3、Nucant 6、及びNucant 7のような一般式( Ｉ) で示される擬似ペプチドは、心臓炎症の治療剤、特に感染性の心内膜炎の治療剤として使用できる。
7.5 結論
よって、本発明者らが得た結果は、化合物HB-19 及びNucant 7が、LPS による刺激に応答した各種細胞タイプによる、TNF-α及びIL-6のような前炎症性サイトカインの産生と、ケモカインIL-8及び接着分子ICAM-1の産生とを阻害することができることを示している。
【０１７８】
さらに、これらの化合物はまた、多くの形態の感染性心内膜炎の原因病原体の１つである黄色ブドウ球菌による刺激に応答したTNF-α及びIL-6のような前炎症性サイトカインの産生の著しい阻害を生ずる。
【０１７９】
従って、これらの化合物並びに本発明において説明する一般式( Ｉ) で示される関連化合物は、前炎症性サイトカイン及び炎症部位への白血球の補充に関与する分子の産生を阻害することができる。これらの化合物は従って抗炎症用途、特に概説において述べた各種疾患の治療に使用することができる。
【０１８０】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】Ａはヌクレオリンタンパク質の構造を示し、Ｂは化合物ＨＢ１９のヌクレオリンへの結合ドメイン：ＲＧＧドメインの同定を示す。
【図２】Ａは化合物ＨＢ１９の、Ｂは３価化合物Nucant01の、Ｃは５価化合物Nucant 2の、Ｄは５価化合物Nucant 3の、Ｅは６価化合物Nucant 6の、Ｆは６価化合物Nucant 7の構造を示す。
【図３】Ａ．抗ヌクレオリン（抗Ｎｕ）、Ｂ．アイソタイプＩｇＧ、Ｃ．ペプチドＦ３およびＤ．ＨＢ１９が、ＨＡＲＰにより刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図４】ＨＢ１９でのＮＩＨ−３Ｔ３細胞の１時間予備処理が、ＨＡＲＰで誘導された増殖に及ぼす影響を示す。
【図５】ＨＢ１９が、０．２ｎＭのＦＧＦ−２（Ａ）または５％のウシ胎仔血清（Ｂ）により刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図６】抗ヌクレオリン（抗Ｎｕ）（Ａ）、アイソタイプＩｇＧ（Ｂ）およびＨＢ１９（Ｃ）が、湿寒天上でのＭＤＡ−ＭＢ２３１の増殖に及ぼす影響を示す。
【図７】抗ヌクレオリン（抗Ｎｕ）（Ａ）およびＨＢ１９（Ｂ）が、湿寒天上でのＢ１６−ＢＬ6 の増殖に及ぼす影響を示す。
【図８】ＨＢ１９の血管形成に及ぼす影響を示す。Ａ．ＨＢ１９のＨＵＶＥＣ細胞のin vitro増殖に及ぼす影響を示す。Ｂ．ＨＢ１９（１μＭ）の、ＨＡＲＰ血管形成因子（１ｎＭ）の存在下で培養した３次元コラーゲンゲル中のＨＵＶＥＣ細胞の分化に及ぼす影響を示す。Ｃ．ＨＢ１９の、in vivo での血管形成モデル（/matrigel ＜plug assay＞) におけるＨＡＲＰまたはＦＧＦ−２により生じる血管形成に及ぼす影響を示す。
【図９】ＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける腫瘍増殖に及ぼすＨＢ１９の影響を示す。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける腫瘍増殖に及ぼすＨＢ１９の影響を示す。
【図１１】ＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける転移腫瘍増殖に及ぼすＨＢ１９の影響を示す。
【図１２】ＨＢ１９およびNucant０１の、ＨＡＲＰで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図１３】ＨＢ１９、Nucant２およびNucant３の、ＨＡＲＰで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図１４】Nucant3 、6 および７の、5 ％ＦＣＳで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図１５】Nucant６およびNucant７がＨＢ１９よりも良好な抗表面ヌクレオリン活性を示す図である。
【図１６】ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞によるヌクレオリンの細胞発現に及ぼすＨＢ１９、Nucant３、Nucant６およびNucant７の阻害効果を示す。
【図１７】ex vivo CAM モデルでの血管形成の阻害を示す。
【図１８】各種LPS 調製物により刺激された初代ヒト単核末梢血細胞 (PBMC) によるTNF-α産生の、ＨＢ１９による阻害を示す。
【図１９】各種LPS 調製物により刺激された初代マウス腹膜マクロフォージによるTNF-αおよびIL-6産生の、ＨＢ１９による阻害を示す。
【図２０】各種LPS により刺激された初代マウス腹膜マクロフォージによるTNF-αおよびIL-6産生の、Nucant７による阻害を示す。
【図２１】LPS により刺激されたヒト臍血管内皮細胞 (HUVEC)によるIL-8産生およびICAM-1発現の、ＨＢ１９による阻害を示す。
【図２２】熱で不活化したStaphylococcus aureus (HKSA, heat-killed Staphylococcus aureus) により刺激された初代ヒト単核末梢血細胞 (PBMC) によるTNF-αおよびIL-6産生の、ＨＢ１９による阻害を示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【配列表】
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