(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５の９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列で表され、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ−Ａ２４型クラスＩ分子に結合するペプチドを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項２】
配列番号５の９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列で表され、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞の表面のＨＬＡ−Ａ２４型クラスＩ分子に結合するペプチドを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病治療用の医薬組成物。
【請求項３】
配列番号５の９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列で表され、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞の表面のＨＬＡ−Ａ２４型クラスＩ分子に結合するペプチドを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の予防または治療に用いられるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、およびそれを用いた医薬組成物およびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルスに感染すると、自然免疫によるウイルス排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答が誘導され、ウイルスの排除反応が起こる。
【０００３】
特異的免疫応答では、体液中のウイルスが中和抗体により排除され、細胞内のウイルスが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により排除される。すなわち、ＣＴＬは、感染細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に提示された、８〜１１のアミノ酸からなるウイルス抗原（ＣＴＬエピトープ）を特異的に認識し、感染細胞を傷害することによりウイルスを排除する。したがって、このようなウイルスに特異的なＣＴＬエピトープを同定することは、特異的免疫応答について調査する上で重要である。
【０００４】
このＣＴＬエピトープの同定、および免疫誘導能の確認方法については、非特許文献１〜４に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｔｔｅｒｇａｙ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｆｉｋｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）．  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｈａｖｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｈｉｃｈ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＨＬＡ−Ａ２．１  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：  ｐｐ２４６２−２４７０
【非特許文献２】Ｃｅｒｎｙ，  Ａ．，  Ｊ．  ＭｃＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）．  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ａ２．１  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：  ｐｐ５２１−５３０
【非特許文献３】Ｋｕｒｏｋｏｈｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｋ．  Ａｒｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ａ２４  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｒｙ  ３４：  ｐｐ９３０−９３５
【非特許文献４】Ｎａｋａｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｓ．  Ｋａｎｅｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ８−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｕｓｉｎｇ  ＨＬＡ−Ａ＊２４０２  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：  ｐｐ５１−６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上記文献では２〜５配列のＨＬＡ結合性ペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するものが挙げられている。一方で、Ｃ型肝炎ウイルスは非常に変異しやすいことが知られており、一度人体に入ってからも変異する。したがって、上記文献に記載された配列のみでは変異したＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の治療には対応できないことがある。そこで、Ｃ型肝炎ウイルスに依存した疾病の治療および予防のためには、使用できるアミノ酸配列の候補を増やすべく、さらに細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド配列を同定することが望まれている。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｃ型肝炎ウイルスに依存した疾病の治療および予防を有効に行うことを可能にする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、およびこれを用いた医薬組成物およびワクチンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、配列番号５、１１および７よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチド、またはその前駆体由来のペプチドを、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合させることを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、配列番号５、１１および７よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、配列番号５、１１および７よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病治療用の医薬組成物が提供される。
【００１１】
また、本発明によれば、配列番号５、１１および７よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の予防または治療に用いられるワクチンが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞傷害性Ｔ細胞を有効に誘導することができるため、特にＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の治療または予防に有用な医薬組成物およびワクチンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
【００１４】
【図１】実施例で用いた能動学習実験計画を説明する模式図である。
【図２】実施例にて、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例にて、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例にて、Ｃ型肝炎ウイルス発現細胞の傷害を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。
【００１６】
＜実施形態１＞
本実施形態にかかる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法では、配列番号１から１３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチド、またはその前駆体由来のペプチド（以下、「ＨＬＡ結合性ペプチド」という）を、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合させることを含むことを特徴としている。
【００１７】
配列番号１〜１３に示されるアミノ酸配列は、いずれも配列番号１５および１６に示したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の所定のゲノムタンパク質に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。
【００１８】
また、これらアミノ酸配列は、能動学習実験法（特開平１１−３１６７５４号公報）を用いて得られる仮説により予測された、ＨＬＡ分子との結合性が、−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列の中から、ＨＬＡ分子との結合実験により、実際にＨＬＡ結合性を示すことが確認され、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能が示されたものである。
【００１９】
なお、候補の選定にあたり、ＨＬＡ分子との結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列としたのは、生化学の分野では、−ｌｏｇＫｄ値に換算しておおよそ結合能の３前後が、実際にペプチドがＨＬＡをはじめとするＭＨＣに結合するかしないかのしきい値として取り扱うことができるという観点からである。
【００２０】
すなわち、配列番号１から１３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞により表面のＨＬＡ分子に提示される抗原ペプチドのエピトープに相当する。
【００２１】
配列番号１から１３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、遺伝子Ａの対立遺伝子型のひとつであるＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ２４型分子）に結合することが確認されており、日本人種の約５０％がこのサブクラスのＨＬＡ−Ａ２４型分子を持つ。
【００２２】
ここで、配列番号１から１３、およびこれらと比較するための配列番号１４の配列を、下記の表１に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
配列番号１から１４の配列のうち、配列名に「Ｄ９０」が付されたものは、後述するＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質（配列番号：１５）に含まれる９アミノ酸残基からなる配列を表す。また、配列名に「Ｄ８９」が付されたものは、後述するＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質（配列番号：１６）に含まれる９アミノ酸残基からなる配列を表す。さらに、「Ｄ９０Ｄ８９」が付されたものは、前述の両方に共通して含まれる配列を表す。また、表中には、各配列のＨＬＡ−Ａ２４型分子との結合性に関する予測スコアおよび結合実験データが、−ｌｏｇＫｄ値で示されている。このように予測スコアと結合実験データとの間には関連性が存在している。
【００２５】
従来は、このように実験計画法を活用してＨＬＡ結合性ペプチドを見出す手法は採られていなかったために、実験的にＨＬＡ結合性が確認された極少数のＨＬＡ結合性ペプチドが知られていたに過ぎなかった。そのため、従来の手法で全くランダムに９アミノ酸残基からなるペプチドを合成し、ＨＬＡ分子との結合実験を行っても、結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して６を超えるものは、確率的には約１００個に１個しかなかった。
【００２６】
また、さらに、後述するように能動学習実験法にて予測された候補の中で、配列番号１４のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ分子との結合実験において高い結合性を示したものの、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を示さなかった。一方で、配列番号１〜１３のアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を示した。
【００２７】
このように、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためには、能動学習実験法にてＨＬＡ結合性ペプチドの配列予測をするだけではなく、それらの予測された候補の中から、特定のアミノ酸配列を選択することは重要なファクターとなる。
【００２８】
本実施形態において、配列番号１から１３のアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の標的となる細胞を含む系に導入されて、この細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合し、抗原ペプチドとして細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、これを特異的に認識し、誘導される。また、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、前記抗原ペプチドを提示している細胞を傷害する。このようにして、配列番号１から１３のアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのウイルス抗原（ＣＴＬエピトープ）として作用する。
【００２９】
ここで、「誘導する」とは、ある活性もしくは作用をほとんど有さないものまたは状態から、活性もしくは作用を発生させることを意味する。特に、「細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する」とは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を、標的細胞を殺傷する能力を持つエフェクター細胞に分化させる、および／または増殖させることを意味する。
【００３０】
したがって、別の観点によれば、配列番号１から１３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤を得ることができる。
【００３１】
「細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤」とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないかあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、この抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用、および個々の細胞傷害性Ｔ細胞の標的殺傷能力を高める作用を示す薬剤を意味する。
【００３２】
また、能動学習実験法にて予測され、結合実験により実際に結合することが確認されたアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドのうち、一部のもののみに細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたということから、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためには、ペプチドが細胞表面のＨＬＡ分子に結合することが重要であることには変わりないが、個人ごとのＴ細胞レパートリーの違いなど、さらに別の要因が作用しているものと考えられる。
【００３３】
なお、本実施形態にて用いるＨＬＡ結合性ペプチドには、配列番号１から１３の配列を有するペプチドにおいて、ＨＬＡ分子への結合能に影響を及ぼさない配列または部位を、化学的な修飾、ＨＣＶのゲノムタンパク質で使用されるアミノ酸とは異なる立体異性体への置換など、修飾を入れたものも含まれる。また、このようなＨＬＡペプチドは、上述のようなアミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。
【００３４】
本実施形態では、日本人種を含むアジア人種に多いＨＬＡ−Ａ２４型分子に対して結合するペプチドにより細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるため、これを利用して日本人種を含むアジア人種に特に効果的な治療薬、予防薬などの開発に利用できる。欧米では、ＨＬＡ−Ａ２４型分子を持つヒトの割合は十数％と低下するが、それでも主だったＨＬＡ遺伝子型のひとつであることには変わりはなく、免疫治療薬の対象分子として重要である。
【００３５】
また、本実施形態で使用されるＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。また、これらのＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ断片または組み換えベクターから発現することにより、これらのＨＬＡ結合性ペプチドを製造してもよい。また、こうして得られたＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、エドマン分解法や質量分析法などを用いて同定可能である。
【００３６】
＜実施形態２＞
本実施形態にかかる医薬組成物は、実施形態１にて説明した細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤を含む。すなわち、この医薬組成物は、配列番号１から１３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、Ｃ型肝炎ウイルスを発現した細胞（以下、「発現細胞」という）の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病治療用の医薬組成物である。
【００３７】
配列番号１〜１３のアミノ酸配列を有するペプチドは、実施形態１で説明したように、ＨＬＡ結合性を有し、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００３８】
そこで、実施形態１の説明において、細胞傷害性Ｔ細胞の標的細胞として発現細胞を用いることで、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができ、この誘導された細胞傷害性Ｔ細胞により、発現細胞が傷害される。
【００３９】
すなわち、本実施形態の医薬組成物をＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の患者に投与することにより、組成物中に含まれるペプチドが、患者の体内で細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合し、抗原ペプチドとして細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、これを特異的に認識し、活性化する。これにより、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導される。また、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、前記抗原ペプチドを提示している感染細胞を傷害して、この働きによりＣ型肝炎の治療に寄与することができる。
【００４０】
なお、本実施形態に含まれるＨＬＡ結合性ペプチドは、上述のようにアミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。また、このようなＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。
【００４１】
本実施形態の医薬組成物は、水溶性溶剤に溶かして、製薬上許容される塩の形態で製剤にして、患者に投与することができる。
【００４２】
このような製薬上許容される塩の形態としては、生理的に受け入れられる水溶性の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などの塩の形で生理的なｐＨにて緩衝させた形態が挙げられる。また、水溶性溶剤の他に、非水溶性溶剤を用いることもでき、このような非水溶性溶剤としては、例えばアルコール、例えばエタノール、プロピレングリコールなどが挙げられる。
【００４３】
また、本実施形態の医薬組成物を含む製剤には、様々な目的に対する薬剤を含めてもよく、このような薬剤としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。
【００４４】
保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することできる量で存在することができる。
【００４５】
＜実施形態３＞
本実施形態にかかるワクチンは、実施形態２にて説明した医薬組成物を含む。すなわち、このワクチンは、配列番号１から１３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、Ｃ型肝炎ウイルスを発現した細胞（以下、「発現細胞」という）の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の予防または治療に用いられるワクチンである。
【００４６】
前記医薬組成物に含まれる配列番号１から１３のアミノ酸配列を有するペプチドは、実施形態１で説明したように、ＨＬＡ結合性を有し、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００４７】
そこで、実施形態２と同様に、実施形態１の説明において、細胞傷害性Ｔ細胞の標的細胞としてＨＣＶ発現細胞を用いることで、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができ、この誘導された細胞傷害性Ｔ細胞により、ＨＣＶ発現細胞が傷害される。
【００４８】
すなわち、本実施形態のワクチンをＣ型肝炎患者に投与することにより、組成物中に含まれるペプチドが、注射部位に常在する樹状細胞をはじめとする患者の組織細胞表面のＨＬＡ−Ａ２４型分子に結合する。これを、このペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が認識すると活性化し、増殖して全身循環に回る。ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が発現肝組織に侵入すると、Ｃ型肝炎ウイルス発現肝細胞の表面にあるＨＬＡ−Ａ２４型分子に自然に結合しているウイルス由来の同一ペプチドを認識して、その発現細胞を殺傷し、ウイルスの発生源が断たれる。この働きによりＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の治療に寄与することができる。
【００４９】
あるいは、本実施形態のワクチンを健康な人体に投与することにより、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導され、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞が体内で留まるため、Ｃ型肝炎ウイルスが侵入したときに、このＣ型肝炎ウイルスを発現する細胞を傷害することができる。この働きによりＣ型肝炎ウイルスに依存した疾病の予防に寄与することができる。
【００５０】
なお、本実施形態に含まれるＨＬＡ結合性ペプチドは、上述のようにアミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。また、このようなＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。
【００５１】
また、本実施形態のワクチンは、医薬組成物以外の成分であり、それ自身には活性がなく、医薬組成物のワクチンとしての効果をより一層高める効果のある成分を含んだ不活性成分含有ワクチンの剤型で使用することができる。不活性成分としては、アジュバント、トキソイドなどが挙げられる。
【００５２】
実施形態２の医薬組成物、実施形態３のワクチンは、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射または注入、または経皮、または鼻、咽などの粘膜からの吸入などにより、体内に投与される。
その一回投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞を有意に誘導できる量から有意な数の非感染細胞が傷害を受けない量の間にて設定することができる。
【００５３】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例１】
【００５４】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
具体的に、本実施例における予測・実験・評価の手順は、ＷＯ２００６／００４１８２号公報に記載された能動学習実験計画に基づいて行い、全体として次のステップを繰り返してルールを構築した。ここで用いた能動学習実験計画の模式図を図１に示す。
【００５６】
（１）後述する下位学習アルゴリズムの試行１回分を行う。すなわち、蓄積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、ランダムに発現された質問候補点（ペプチド）に対する予測値の分散が最も大きい点を、実験すべき質問点として選ぶ。
【００５７】
（２）選ばれた質問点のペプチドを、後述する合成・精製法により製造し、実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。
【００５８】
このような能動学習法を行うことにより、本来ならば、９アミノ酸残基からなるペプチドについて、ＨＬＡ結合性ペプチドの全候補物質５０００億（＝２０９）通り以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。
【００５９】
以上説明したようなルールにより、配列番号１〜１４に示したアミノ酸配列を抽出した。
【００６０】
＜ペプチド合成と精製＞
配列番号１から１４のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸を用い、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ精製をし、９５％以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて行った（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＲＰ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）。ペプチドの定量は、ＢＳＡを標準蛋白質としてＭｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）にて行った。
【００６１】
＜ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４型分子への結合実験＞
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ２４型分子への、配列番号１から１４のアミノ酸配列を有するペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ２４型分子を発現するＣ１Ｒ−Ａ２４細胞（熊本大学、滝口雅文教授作成のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。）を用いて行った。
【００６２】
まず、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞をｐＨ３．３の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に元来結合している内因性ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に共通して会合している軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞に精製β２ｍを添加し、ペプチドの希釈列に加えて、氷上４時間インキュベートした。この間に再会合したＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子、ペプチド、β２ｍの３者の会合体（ＭＨＣ−ｐｅｐ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体１７Ａ１２を用いて染色した。
【００６３】
その後、個々のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞当たりのＭＨＣ−ｐｅｐ数（上記蛍光抗体の蛍光強度に比例する）を、蛍光細胞解析装置ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて定量測定した。１細胞当たりの平均蛍光強度から、論文（Ｕｄａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５１、  ８１６−８２８、  ２０００）に発表した方法にて、ＨＬＡ−Ａ２４型分子とペプチド間の結合解離定数Ｋｄ値を算出した。
【００６４】
＜結合実験の評価結果＞
その結果、上記表１に示した予測結果および実験結果が得られた。
【００６５】
表１の配列番号１から３の配列、配列番号８の配列および配列番号１１から１４の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質の全長配列（配列番号１５）および同じくＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質の全長配列（配列番号１６）の両方に共通して含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。
【００６６】
また、配列番号４から７の配列および配列番号９の配列は、前記ＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質の全長配列（配列番号１５）にのみ含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。また、配列番号１０は、前記ＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質の全長配列（配列番号１６）にのみ含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。
【００６７】
なお、ＨＣＶのＤ９０２０８株の所定のゲノムタンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号１５（ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡＲＲＰＥＧＲＴＷＡＱＰＧＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧＭＧＷＡＧＷＬＬＳＰＲＧＳＲＰＳＷＧＰＴＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡＬＬＳＣＬＴＩＰＡＳＡＹＥＶＲＮＶＳＧＩＹＨＶＴＮＤＣＳＮＳＳＩＶＹＥＡＡＤＭＩＭＨＴＰＧＣＶＰＣＶＲＥＳＮＦＳＲＣＷＶＡＬＴＰＴＬＡＡＲＮＳＳＩＰＴＴＴＩＲＲＨＶＤＬＬＶＧＡＡＡＬＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶＦＬＶＳＱＬＦＴＦＳＰＲＲＹＥＴＶＱＤＣＮＣＳＩＹＰＧＨＶＳＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＴＡＬＶＶＳＱＬＬＲＩＰＱＡＶＶＤＭＶＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＬＡＹＹＳＭＶＧＮＷＡＫＶＬＩＶＭＬＬＦＡＧＶＤＧＨＴＨＶＴＧＧＲＶＡＳＳＴＱＳＬＶＳＷＬＳＱＧＰＳＱＫＩＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬＱＴＧＦＩＡＡＬＦＹＡＨＲＦＮＡＳＧＣＰＥＲＭＡＳＣＲＰＩＤＥＦＡＱＧＷＧＰＩＴＨＤＭＰＥＳＳＤＱＲＰＹＣＷＨＹＡＰＲＰＣＧＩＶＰＡＳＱＶＣＧＰＶＹＣＦＴＰＳＰＶＶＶＧＴＴＤＲＦＧＡＰＴＹＳＷＧＥＮＥＴＤＶＬＬＬＳＮＴＲＰＰＱＧＮＷＦＧＣＴＷＭＮＳＴＧＦＴＫＴＣＧＧＰＰＣＮＩＧＧＶＧＮＮＴＬＶＣＰＴＤＣＦＲＫＨＰＥＡＴＹＴＫＣＧＳＧＰＷＬＴＰＲＣＭＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＶＦＫＶＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬＮＡＡＣＮＷＴＲＧＥＲＣＤＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷＱＩＬＰＣＳＦＴＴＬＰＡＬＳＴＧＬＩＨＬＨＲＮＩＶＤＶＱＹＬＹＧＩＧＳＡＶＶＳＦＡＩＫＷＥＹＩＬＬＬＦＬＬＬＡＤＡＲＶＣＡＣＬＷＭＭＬＬＩＡＱＡＥＡＴＬＥＮＬＶＶＬＮＡＡＳＶＡＧＡＨＧＬＬＳＦＬＶＦＦＣＡＡＷＹＩＫＧＲＬＶＰＧＡＡＹＡＬＹＧＶＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＰＲＡＹＡＭＤＲＥＭＡＡＳＣＧＧＡＶＦＶＧＬＶＬＬＴＬＳＰＹＹＫＶＦＬＡＲＬＩＷＷＬＱＹＦＩＴＲＡＥＡＨＬＱＶＷＶＰＰＬＮＶＲＧＧＲＤＡＩＩＬＬＴＣＡＶＨＰＥＬＩＦＤＩＴＫＬＬＬＡＩＬＧＰＬＭＶＬＱＡＧＩＴＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡＣＭＬＶＲＫＶＡＧＧＨＹＶＱＭＡＦＭＫＬＡＡＬＴＧＴＹＶＹＤＨＬＴＰＬＲＤＷＡＨＡＧＬＲＤＬＡＶＡＶＥＰＶＶＦＳＤＭＥＴＫＬＩＴＷＧＡＤＴＡＡＣＧＤＩＩＳＧＬＰＶＳＡＲＲＧＫＥＩＬＬＧＰＡＤＳＦＧＥＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬＴＧＲＤＫＮＱＶＤＧＥＶＱＶＬＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＶＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＭＴＰＣＴＣＧＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＶＰＶＲＲＲＧＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧＧＰＬＬＣＰＳＧＨＶＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴＲＧＶＡＫＡＶＤＦＩＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹＭＳＫＡＨＧＩＥＰＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴＴＧＧＰＩＴＹＳＴＹＣＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＴＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬＡＴＡＴＰＰＧＳＩＴＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹＧＫＡＩＰＩＥＡＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫＬＴＧＬＧＬＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴＬＰＱＤＡＶＳＲＡＱＲＲＧＲＴＧＲＧＲＳＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴＫＱＡＧＤＮＬＰＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨＰＩＴＫＹＩＭＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶＴＳＴＷＶＬＶＧＧＶＬＡＡＬＡＡＹＣＬＴＴＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＲＰＡＶＩＰＤＲＥＶＬＹＱＥＦＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＩＥＱＧＭＱＬＡＥＱＦＫＱＫＡＬＧＬＬＱＴＡＴＫＱＡＥＡＡＡＰＶＶＥＳＫＷＲＡＬＥＶＦＷＡＫＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡＩＡＳＬＭＡＦＴＡＳＩＴＳＰＬＴＴＱＮＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱＬＡＰＰＳＡＡＳＡＦＶＧＡＧＩＡＧＡＡＶＧＳＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫＶＭＳＧＥＭＰＳＴＥＤＬＶＮＬＬＰＡＩＬＳＰＧＡＬＶＶＧＶＶＣＡＡＩＬＲＲＨＶＧＰＧＥＧＡＶＱＷＭＮＲＬＩＡＦＡＳＲＧＮＨＶＳＰＴＨＹＶＰＥＳＤＡＡＡＲＶＴＱＩＬＳＳＬＴＩＴＱＬＬＫＲＬＨＱＷＩＮＥＤＣＳＴＰＣＳＧＳＷＬＫＤＶＷＤＷＩＣＴＶＬＳＤＦＫＴＷＬＱＳＫＬＬＰＲＬＰＧＬＰＦＬＳＣＱＲＧＹＫＧＶＷＲＧＤＧＩＭＱＴＴＣＰＣＧＡＱＩＴＧＨＶＫＮＧＳＭＲＩＶＧＰＫＴＣＳＮＴＷＨＧＴＦＰＩＮＡＹＴＴＧＰＣＴＰＳＰＡＰＮＹＳＲＡＬＷＲＶＡＡＥＥＹＶＥＶＴＲＶＧＤＦＨＹＶＴＧＭＴＴＤＮＶＫＣＰＣＱＶＰＡＰＥＦＦＴＥＶＤＧＶＲＬＨＲＹＡＰＶＣＫＰＬＬＲＥＥＶＶＦＱＶＧＬＮＱＹＬＶＧＳＱＬＰＣＥＰＥＰＤＶＡＶＬＴＳＭＬＴＤＰＳＨＩＴＡＥＴＡＫＲＲＬＡＲＧＳＰＰＳＬＡＳＳＳＡＳＱＬＳＡＰＳＬＫＡＴＣＴＴＨＨＤＳＰＤＡＤＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧＧＮＩＴＲＶＥＳＥＮＫＶＶＩＬＤＳＦＤＰＩＲＡＶＥＤＥＲＥＩＳＶＰＡＥＩＬＲＫＰＲＫＦＰＰＡＬＰＩＷＡＲＰＤＹＮＰＰＬＬＥＳＷＫＤＰＤＹＶＰＰＶＶＨＧＣＰＬＰＳＴＫＡＰＰＩＰＰＰＲＲＫＲＴＶＶＬＴＥＳＴＶＳＳＡＬＡＥＬＡＴＫＴＦＧＳＳＧＳＳＡＶＤＳＧＴＡＴＧＰＰＤＱＡＳＤＤＧＤＫＧＳＤＶＥＳＹＳＳＭＰＰＬＥＧＥＰＧＤＰＤＬＳＤＧＳＷＳＴＶＳＧＥＡＧＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣＡＡＥＥＳＫＬＰＩＮＰＬＳＮＳＬＬＲＨＨＳＭＶＹＳＴＴＳＲＳＡＳＬＲＱＫＫＶＴＦＤＲＬＱＶＬＤＤＨＹＲＤＶＬＫＥＭＫＡＫＡＳＴＶＫＡＲＬＬＳＩＥＥＡＣＫＬＴＰＰＨＳＡＫＳＫＦＧＹＧＡＫＤＶＲＳＬＳＳＲＡＶＮＨＩＲＳＶＷＥＤＬＬＥＤＴＥＴＰＩＤＴＴＩＭＡＫＮＥＶＦＣＶＱＰＥＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹＤＶＶＳＴＬＰＱＡＶＭＧＰＳＹＧＦＱＹＳＰＧＱＲＶＥＦＬＶＮＴＷＫＳＫＫＣＰＭＧＦＳＹＤＴＲＣＦＤＳＴＶＴＥＮＤＩＲＴＥＥＳＩＹＱＣＣＤＬＡＰＥＡＲＱＡＩＲＳＬＴＥＲＬＹＶＧＧＰＬＴＮＳＫＧＱＮＣＧＹＲＲＣＲＡＳＧＶＬＴＴＳＣＧＮＴＬＴＣＹＬＫＡＴＡＡＣＲＡＡＫＬＱＤＣＴＭＬＶＮＧＤＤＬＶＶＩＣＥＳＡＧＴＱＥＤＡＡＡＬＲＡＦＴＥＡＭＴＲＹＳＡＰＰＧＤＰＰＱＰＥＹＤＬＥＬＩＴＳＣＳＳＮＶＳＶＡＨＤＡＳＧＫＲＶＹＹＬＴＲＤＰＴＴＰＬＡＲＡＡＷＥＴＶＲＨＴＰＶＮＳＷＬＧＮＩＩＭＹＡＰＴＬＷＡＲＭＩＬＭＴＨＦＦＳＩＬＬＡＱＥＱＬＥＫＡＬＤＣＱＩＹＧＡＣＹＳＩＥＰＬＤＬＰＱＩＩＥＲＬＨＧＬＳＡＦＳＬＨＳＹＳＰＧＥＩＮＲＶＡＳＣＬＲＫＬＧＶＰＰＬＲＶＷＲＨＲＡＲＳＶＲＡＫＬＬＳＱＧＧＲＡＡＴＣＧＫＹＬＦＮＷＡＶＫＴＫＬＫＬＴＰＩＰＡＡＳＱＬＤＬＳＧＷＦＶＡＧＹＮＧＧＤＩＹＨＳＬＳＲＡＲＰＲＷＦＭＬＣＬＬＬＬＳＶＧＶＧＩＹＬＬＰＮＲ）に示す。
【００６８】
また、ＨＣＶのＤ８９８１５株の所定のゲノムタンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号１６（ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡＲＲＰＥＧＲＴＷＡＱＰＧＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧＬＧＷＡＧＷＬＬＳＰＲＧＳＲＰＳＷＧＰＮＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡＬＬＳＣＬＴＩＰＡＳＡＹＥＶＲＮＶＳＧＩＹＨＶＴＮＤＣＳＮＳＳＩＶＹＥＡＡＤＶＩＭＨＡＰＧＣＶＰＣＶＲＥＮＮＳＳＲＣＷＶＡＬＴＰＴＬＡＡＲＮＡＳＶＰＴＴＴＬＲＲＨＶＤＬＬＶＧＴＡＡＦＣＳＡＭＹＶＧＤＬＣＧＳＶＦＬＩＳＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＥＴＶＱＤＣＮＣＳＩＹＰＧＨＶＳＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬＶＶＳＱＬＬＲＩＰＱＡＶＭＤＭＶＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＬＡＹＹＳＭＶＧＮＷＡＫＶＬＩＶＭＬＬＦＡＧＶＤＧＨＴＲＶＴＧＧＶＱＧＨＶＴＳＴＬＴＳＬＦＲＰＧＡＳＱＫＩＱＬＶＮＴＮＧＳＷＨＩＮＲＴＡＬＮＣＮＤＳＬＫＴＧＦＬＡＡＬＦＹＴＨＫＦＮＡＳＧＣＰＥＲＭＡＳＣＲＳＩＤＫＦＤＱＧＷＧＰＩＴＹＡＱＰＤＮＳＤＱＲＰＹＣＷＨＹＡＰＲＱＣＧＩＶＰＡＳＱＶＣＧＰＶＹＣＦＴＰＳＰＶＶＶＧＴＴＤＲＦＧＡＰＴＹＮＷＧＤＮＥＴＤＶＬＬＬＮＮＴＲＰＰＨＧＮＷＦＧＣＴＷＭＮＳＴＧＦＴＫＴＣＧＧＰＰＣＮＩＲＧＶＧＮＮＴＬＴＣＰＴＤＣＦＲＫＨＰＤＡＴＹＴＫＣＧＳＧＰＷＬＴＰＲＣＬＶＤＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣＴＶＮＦＴＩＦＫＶＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲＬＤＡＡＣＮＷＴＲＧＥＲＣＤＬＥＤＲＤＲＡＥＬＳＰＬＬＬＳＴＴＥＷＱＩＬＰＣＳＹＴＴＬＰＡＬＳＴＧＬＩＨＬＨＱＮＩＶＤＩＱＹＬＹＧＩＧＳＡＶＶＳＩＡＩＫＷＥＹＶＶＬＬＦＬＬＬＡＤＡＲＶＣＡＣＬＷＭＭＬＬＩＡＱＡＥＡＡＬＥＮＬＶＶＬＮＡＡＳＶＶＧＡＨＧＭＬＰＦＦＭＦＦＣＡＡＷＹＭＫＧＲＬＶＰＧＡＡＹＡＦＹＧＶＷＰＬＬＬＬＬＬＡＬＰＰＲＡＹＡＭＤＲＥＭＶＡＳＣＧＧＧＶＦＶＧＬＡＬＬＴＬＳＰＹＣＫＶＦＬＡＲＬＩＷＷＬＱＹＦＩＴＫＡＥＡＨＬＱＶＳＬＰＰＬＮＶＲＧＧＲＤＡＩＩＬＬＭＣＡＶＨＰＥＬＩＦＤＩＴＫＬＬＬＳＩＬＧＰＬＭＶＬＱＡＳＬＩＲＶＰＹＦＶＲＡＱＧＬＩＲＡＣＭＬＶＲＫＡＡＧＧＨＹＶＱＭＡＦＶＫＬＡＡＬＴＧＴＹＶＹＤＨＬＴＰＬＱＤＷＡＨＶＧＬＲＤＬＡＶＡＶＥＰＶＶＦＳＡＭＥＴＫＶＩＴＷＧＡＤＴＡＡＣＧＤＩＩＳＧＬＰＶＳＡＲＲＧＫＥＩＬＬＧＰＡＤＳＦＥＧＱＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥＧＥＶＱＶＶＳＴＡＫＱＳＦＬＡＴＣＶＮＧＡＣＷＴＶＦＨＧＡＧＳＫＴＬＡＡＡＫＧＰＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＬＴＰＣＴＣＧＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧＧＰＬＬＣＰＳＧＨＶＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴＲＧＶＡＫＡＶＤＦＩＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰＱＴＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＭＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹＭＳＫＡＨＧＩＤＰＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴＴＧＡＰＩＴＹＳＴＹＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＶＧＡＲＦＶＶＬＡＴＡＴＰＰＧＳＩＴＦＰＨＰＮＩＥＥＶＰＬＡＮＴＧＥＩＰＦＹＡＫＴＩＰＩＥＶＩＲＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＫＫＣＤＥＬＰＡＫＬＳＡＬＧＬＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩＰＡＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴＶＰＱＤＡＶＳＲＴＱＲＲＧＲＴＧＲＧＲＲＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥＲＰＳＡＭＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴＫＱＡＧＤＮＦＰＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＫＡＰＰＰＳＷＤＱＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨＰＩＴＫＹＩＭＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶＴＳＴＷＶＬＶＧＧＶＬＡＡＬＡＡＹＣＬＴＴＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＲＰＡＶＩＰＤＲＥＶＬＹＱＥＦＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＩＥＱＧＭＱＬＡＥＱＦＫＱＫＡＬＧＬＬＱＴＡＴＫＱＡＥＡＡＡＰＶＶＥＳＫＷＲＡＬＥＴＦＷＡＫＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡＩＡＳＬＭＡＦＴＡＳＩＴＳＰＬＡＴＱＹＴＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶＡＡＱＬＡＰＰＳＡＡＳＡＦＶＧＡＧＩＡＧＡＡＶＧＳＩＧＬＧＫＶＬＶＤＩＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫＶＭＳＧＤＭＰＳＴＥＤＬＶＮＬＬＰＡＩＬＳＰＧＡＬＶＶＧＶＶＣＡＡＩＬＲＲＨＶＧＰＧＥＧＡＶＱＷＭＮＲＬＩＡＦＡＳＲＧＮＨＶＳＰＴＨＹＶＰＥＳＤＡＡＡＲＶＴＱＩＬＳＮＬＴＩＴＱＬＬＫＲＬＨＱＷＩＮＥＤＣＳＴＰＣＳＧＳＷＬＲＤＶＷＤＷＩＣＴＶＬＡＤＦＫＴＷＬＱＳＫＬＬＰＲＬＰＧＶＰＦＦＳＣＱＲＧＹＫＧＶＷＲＧＤＧＩＭＹＴＴＣＰＣＧＡＱＩＴＧＨＶＫＮＧＳＭＲＩＶＧＰＲＴＣＳＮＴＷＨＧＴＦＰＩＮＡＹＴＴＧＰＣＴＰＳＰＡＰＮＹＳＲＡＬＷＲＶＡＡＥＥＹＶＥＶＴＲＶＧＤＦＨＹＶＴＧＭＴＴＤＮＶＫＣＰＣＱＶＰＡＰＥＦＦＴＥＬＤＧＶＲＬＨＲＹＡＰＡＣＫＰＬＬＲＤＥＶＴＦＱＶＧＬＮＱＹＴＶＧＳＱＬＰＣＥＰＥＰＤＶＴＶＶＴＳＭＬＴＤＰＳＨＩＴＡＥＡＡＲＲＲＬＡＲＧＳＰＰＳＬＡＧＳＳＡＳＱＬＳＡＬＳＬＫＡＴＣＴＴＨＨＧＡＰＤＴＤＬＩＥＡＮＬＬＷＲＱＥＭＧＧＮＩＴＲＶＥＳＥＮＫＩＶＩＬＤＳＦＥＰＬＲＡＥＥＤＥＲＥＶＳＡＡＡＥＩＬＲＫＴＲＫＦＰＡＡＭＰＶＷＡＲＰＤＹＮＰＰＬＬＥＳＷＫＮＰＤＹＶＰＰＶＶＨＧＣＰＬＰＰＴＫＡＰＰＩＰＰＰＲＲＫＲＴＶＶＬＴＥＳＴＶＳＳＡＬＡＥＬＡＴＫＴＦＧＧＳＧＳＳＡＶＤＳＧＴＡＴＧＰＰＤＱＡＳＡＥＧＤＡＧＳＤＡＥＳＹＳＳＭＰＰＬＥＧＥＰＧＤＰＤＬＳＤＧＳＷＳＴＶＳＥＥＡＳＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬＩＴＰＣＡＡＥＥＳＫＬＰＩＮＡＬＳＮＰＬＬＲＨＨＮＭＶＹＳＴＴＳＲＳＡＳＬＲＱＫＫＶＴＦＤＲＭＱＶＬＤＤＨＹＲＤＶＬＫＥＭＫＡＫＡＳＴＶＫＡＫＬＬＳＶＥＥＡＣＫＬＴＰＰＨＳＡＫＳＫＦＧＹＧＡＫＤＶＲＳＬＳＳＲＡＶＮＨＩＲＳＶＷＫＤＬＬＥＤＴＤＴＰＩＱＴＴＩＭＡＫＮＥＶＦＣＶＱＰＥＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫＭＡＬＹＤＶＶＳＴＬＰＱＡＶＭＧＳＳＹＧＦＱＹＳＰＫＱＲＶＥＦＬＶＮＴＷＫＡＫＫＣＰＭＧＦＳＹＤＴＲＣＦＤＳＴＶＴＥＮＤＩＲＶＥＥＳＩＹＱＣＣＤＬＡＰＥＡＲＱＡＩＲＳＬＴＥＲＬＹＩＧＧＰＭＴＮＳＫＧＱＮＣＧＹＲＲＣＲＡＳＧＶＬＴＴＳＣＧＮＴＬＴＣＹＬＫＡＡＡＡＣＲＡＡＫＬＱＤＣＴＭＬＶＣＧＤＤＬＶＶＩＣＤＳＡＧＴＱＥＤＡＡＳＬＲＶＦＴＥＡＭＴＲＹＳＡＰＰＧＤＰＰＱＰＥＹＤＬＥＬＩＴＳＣＳＳＮＶＳＶＡＨＤＡＳＧＫＲＶＹＹＬＴＲＤＰＴＴＰＬＡＲＡＡＷＥＴＡＲＨＴＰＶＮＳＷＬＧＮＩＩＭＹＡＰＴＬＷＡＲＭＩＬＭＴＨＦＦＳＩＬＬＡＱＥＱＬＥＫＡＬＤＣＱＩＹＧＡＴＹＳＩＥＰＬＤＬＰＱＩＩＱＲＬＨＧＬＳＡＦＳＬＨＳＹＳＰＧＥＩＮＲＶＡＳＣＬＲＫＬＧＶＰＰＬＲＶＷＲＨＲＡＲＳＶＲＡＫＬＬＳＱＧＧＲＡＡＴＣＧＫＹＬＦＮＷＡＶＫＴＫＬＫＬＴＰＩＰＥＡＳＱＬＤＬＳＧＷＦＶＡＧＹＳＧＧＤＩＹＨＳＬＳＲＡＲＰＲＷＦＭＷＣＬＬＬＬＳＶＧＶＧＩＹＬＬＰＮＲ）に示す。
【００６９】
＜細胞傷害性Ｔ細胞の誘導実験＞
以下の実験を、ヒトの採取血液を用いて行った。
（１）細胞傷害性Ｔ細胞の活性化
あらかじめインフォームドコンセントを得たＣ型肝炎患者または健常人から血液を採取した。
９６ウェルプレートにまいた血液細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）に対し、配列番号１から１４のペプチドを１μＭの最終濃度となるように１週間ごとに５回添加し、１０％ＦＣＳと５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を添加した培地中で細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させて、Ｔ細胞サンプルとした。
【００７０】
（２）５１Ｃｒ標識した細胞の処理
Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞、およびＴ２−Ａ２４細胞（ＴＡＰペプチドトランスポーターを持たず、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を発現させたヒトＢ／Ｔ培養細胞株：大阪大学医学部坪井博士より供与いただいた）に対し、５１Ｃｒのナトリウム塩（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ）を３７℃あるいは２６℃で１時間添加することにより、細胞を５１Ｃｒで標識した。そこに、配列番号１から１４のペプチドを、１μＭの最終濃度となるように添加し、細胞表面に各ペプチドを結合した標的細胞を作成した。
【００７１】
（３）標識細胞の傷害
上記で調製した細胞傷害性Ｔ細胞と標的細胞とを、Ｅ／Ｔ比（ｅｆｆｅｃｔｅｒ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ）が１０〜２０となるように混合して３７℃で３．５時間静置したのち、培養上清中に遊離した５１Ｃｒの放射活性を測定した。細胞傷害性Ｔ細胞の作用に依存しない非特異的な活性の影響を除き、標識細胞の傷害活性として算出した。
【００７２】
＜誘導実験の結果＞
図２、図３に、それぞれ別々の培地で培養されたＴ細胞サンプルでの、各アミノ酸配列のペプチドの細胞傷害性Ｔ細胞の誘導実験の結果を示す。図中、８人（または７人）のそれぞれ由来の血液についてのデータを「系列１」から「系列８（または系列７）」にて示している。
配列番号１から１３の配列については、８人のうち、いずれかの者由来の血液について、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能が示された。逆に、配列番号１４の配列については、いずれの血液についても細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能が示されなかった。この傾向は、図２、図３の両方において共通していた。
【００７３】
図２、図３ともに、配列番号１から１３のアミノ酸配列が、８人全ての血液について、同じような細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能が示されなかった理由としては、ＨＬＡ分子の結合には個人間で差がないが、個人ごとのＴ細胞レパートリーが、個人の遺伝背景や過去の感染履歴によって異なるため、ペプチド反応性に個人差が出た可能性などが考えられる。
したがって、図２、図３により、多くの患者に対応するためという観点からは、複数種類のアミノ酸を一度に使用することが好ましいということが示唆される。
【実施例２】
【００７４】
＜ＨＣＶ発現細胞を標的とした傷害活性＞
（１）ＨＣＶゲノム発現細胞の準備
ＲｚＭ６細胞は、ＨＣＶ１ｂのフルゲノム（ＡＹ０４５７０２）の発現をＣｒｅの存在下でコンディショナルに誘導できるように改変したＨＣＶ遺伝子を、ヒト肝細胞株であるＨｅｐＧ２にトランスフェクトさせたものである（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＫ１−ＣＤＫ−Ｒｂ−Ｅ２Ｆ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｆｕｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、１４５３１−１４５４１、２００４、ＲｚＭ６は都臨床研小原道法先生より供与を受けた）。
ＨＣＶの発現方法は、同じＲｚＭ６細胞にＣｒｅ遺伝子をＴａｍｏｘｉｆｅｎ誘導性プロモーターの下流に配したｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ発現カセットを重複してトランスフェクトさせてあるので、タモキシフェンを添加することにより、Ｃｒｅの発現を誘導し、その結果、ＨＣＶ遺伝子の発現が誘導できるようになっている。ＨＣＶ遺伝子を発現誘導したＲｚＭ６細胞をＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と同様の方法により５１Ｃｒで標識し、標的細胞を作成した。
【００７５】
（２）ＨＣＶゲノム発現細胞の傷害
上記で調整した細胞傷害性Ｔ細胞と、ＲｚＭ６標的細胞あるいはＨＣＶを導入していないＨｅｐＧ２細胞をコントロールとして、Ｅ／Ｔ比が１０となるように混合して３７℃で３時間静置したのち、培養上清中に遊離した５１Ｃｒの放射活性を測定した。細胞傷害性Ｔ細胞の作用に依存しない非特異的な活性の影響を除き、標的細胞の傷害活性として算出した。
【００７６】
＜ＨＣＶゲノム発現細胞に対する傷害実験の結果＞
図４に、別々の人から末梢血Ｔ細胞を取り、各アミノ酸配列のペプチドで刺激して反応性Ｔ細胞を増やした細胞株の、ＨＣＶゲノム発現細胞ＲｚＭ６に対する細胞傷害実験の結果を示す。グラフのそれぞれの棒は、異なる人から取った細胞株の傷害活性を示す。
配列番号１、２、４、５、７、８、９、１０、１２、１３の配列については、いずれかの患者由来の血液について、細胞傷害性Ｔ細胞によるＨＣＶ発現細胞特異的な傷害活性が示された。
【実施例３】
【００７７】
＜用いる動物モデル＞
ＨＣＶは、ヒト及びチンパンジー以外では複製しないという性質を持つ。しかし動物モデルとしてチンパンジーを用いた場合には、一部が慢性肝炎に移行するものの、急性肝炎で治癒する傾向があり、ヒトと同じ病態を示すわけではない。さらに、膨大な費用を必要とし慢性肝炎の発症までに１年以上がかかる上に、使用後のチンパンジーは倫理的に屠殺処理が難しく、通常の研究機関における感染実験は事実上不可能である。そこで、代わりとなる動物モデルとして、ＨＣＶ遺伝子が発現するように改良を加えた発現ベクターを用いて、マウスなどの小動物に感染させる系が利用されている。
【００７８】
＜実験材料＞
（１）ＨＣＶトランスジェニックマウス（ＣＮ２−２９）
東京都臨床医学総合研究所の小原道法先生が作成された、ＨＣＶゲノムの前３分の１に当たる部分（ｎｔ：２９４−３４３５）だけをコンディショナルに発現するトランスジェニックマウスを用いる（参考論文：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃＤＮＡ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ９００１−９００６，  １９９８．）。
【００７９】
（２）Ｔ細胞誘導が良好に起こるマウス（ＣＢＦ１）
ＣＮ２−２９マウスはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）背景であり、Ｋｄ，  Ｄｄ，  Ｌｄ結合性ペプチドが標的エピトープとなる。これらの結合性ペプチドを用いてマウスを免疫しＴ細胞の誘導を試みたが、弱い細胞傷害活性が誘導されるのみであった。Ｄｂ結合性ペプチドには良好にＴ細胞を誘導するものが見つかったので、ＣＮ２−２９マウスをＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６と略、Ｈ−２ｂ）マウスとかけ合わせて作製したＦ１マウス（ＣＢＦ１）をホストとすれば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞傷害活性を調べることが可能である。
【００８０】
（３）ＥＧＦＰトランスジェニックマウス
Ｂ６マウスの遺伝背景を持ち、全身にＥＧＦＰ（クラゲ由来の蛍光遺伝子）を発現するトランスジェニックマウスである。
【００８１】
（４）Ｃｒｅ発現ベクター（ＢＣｒｅ）
ＢＣＭＧＳｎｅｏというウシｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓを基盤にした発現ベクター（参考文献：Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２，３，４  ｏｒ  ５，  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８，９７−１０４，１９８８）にＣｒｅ遺伝子を組み込んだ発現ベクターである。このベクターは細胞内でエピソームとしてマルチコピーで存在するので、１細胞あたりのＣｒｅ遺伝子のコピー数を高くすることが可能になる。また、エピソームとして増えるので、クロマチン構造に影響されずに発現する。
【００８２】
（５）マウスのＨＣＶ特異的Ｔ細胞抗原ペプチド
高知大学の宇高らが開発したマウスＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ結合性ペプチド予測プログラム（参考論文：Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｕｄａｋａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５１，８１６−８２８，２０００．）を用いて、ＨＣＶ特異的なＤｂ結合性ペプチドを探索したところ、ＣＤ６４９  （ｌｏｇ  Ｋｄ  ＝−７．５８）がＣＢＦ１マウスにおいて良好に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導した。
【００８３】
（６）百日咳菌全菌体ワクチン
ヒト向けとして用いられている百日咳菌ワクチンには、菌体の精製品と全菌体ワクチンがあるが、このうち全菌体ワクチンについてはインドネシアのＢｉｏ  ｆａｒｍａ社から入手可能であるが、この全菌体ワクチンをペプチドと同時に投与すると、マウスの免疫誘導能が格段に上昇することを確認している。
（７）ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＨＤＩ）法
麻酔したマウスへ、プラスミドＤＮＡを溶かした大容量の生理的溶液（１．５ｍＬ程度）を５秒程度で静脈注射することにより、一時的に高い静脈圧にしてプラスミドの取り込み効率を上昇させる方法である。肝臓や脾臓のように静脈血が鬱滞しやすい組織では静脈圧が特に高くなり、物理的に細胞膜が一部破れるため、あるいはピノサイトーシスで外からの溶液の取り込みが盛んになるため、肝細胞の細胞質にプラスミドが効率よく取り込まれる。
【００８４】
＜肝炎発症実験＞
ＣＢＦ１マウスをＣＤ６４９と百日咳菌全菌体ワクチンで毎週１回、合計４回皮内注射し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導をはかった後、ＨＤＩ法を用いてＣｒｅ遺伝子の発現を行い、ＣＢＦ１マウスが持つＨＣＶ遺伝子の発現誘導を起こさせる。このマウスにて、肝臓組織の観察と血清ＡＳＴ、ＡＬＴ酵素（壊された肝臓細胞から遊離される酵素群）値を測定することにより、自然に肝炎が発症しているかどうかを調べる。また組織検査をしてリンパ球浸潤や組織破壊の程度を調べる。
【００８５】
＜ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬ浸潤実験＞
ＥＧＦＰトランスジェニックマウスをＣＤ６４９と百日咳菌全菌体ワクチンで毎週１回、合計４回皮内注射し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導をはかった後、脾臓から免疫細胞を取り出して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２回ペプチド刺激をしてＣＤ６４９特異的なＣＴＬの割合を増やす。上記の肝炎発症実験の方法によりＨＣＶ遺伝子を発現誘導させたＣＢＦ１マウスに対してこのＣＴＬを静脈注射し、数日後に肝臓を蛍光顕微鏡で観察し、ＥＧＦＰ陽性細胞が肝臓に浸潤している数を、空ベクターを静脈注射したマウスと比較する。
【００８６】
＜ｉｎ  ｖｉｖｏ組織傷害の観察実験＞
Ｃｒｅ遺伝子とともにＥＧＦＰを同時発現するベクターを作成し、ＨＣＶ遺伝子を発現誘導した肝細胞のみがＥＧＦＰの蛍光を発するよう準備する。上記の肝炎発症実験においてこのＣｒｅ−ＥＧＦＰ発現ベクターを用いることにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の肝臓内への浸潤とともに、ＥＧＦＰ発現細胞（すなわちＨＣＶ遺伝子発現細胞）が優先的に破壊されている組織像などを観察する。
【００８７】
＜ペプチド免疫治療の安全性の確認＞
マウスをＣＤ６４９ペプチドと百日咳菌全菌体で過免疫した場合でも、正常組織への攻撃が起こらないことの確認をする。次に、ＨＣＶの発現誘導をしたＣＮ２−２９マウスにおいて、ＣＴＬによる攻撃が肝不全を来たさないかを調べる。
【００８８】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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