(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置において、
可干渉性を有する照射光を少なくとも２つ以上に分離し、分離された前記照射光の少なくとも一の照射光に変調を加える変調手段と、
前記分離された照射光をそれぞれ対物レンズに導くとともに、その焦点付近における前記照射光により生ずる干渉光を生じさせる照射光学系と、
前記焦点付近から反射する光または前記焦点付近から生じる光のうち、前記干渉光に対応する周波数成分の光を抽出するとともに、この抽出された光を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出された光に基づいて画像データを作成する画像作成手段と、
を備え、
分離された前記照射光の個々の前記焦点の位置が互いに異なっていることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
分離された前記照射光の焦点は、それぞれの前記照射光が互いに重なる領域を有しながら、光軸に対し直交する方向にずれていることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
分離された前記照射光の焦点は、それぞれの前記照射光が互いに重なる領域を有しながら、光軸の方向にずれていることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
可干渉性を有する前記照射光は２つに分離され、
前記変調手段はその一方に一定の周波数で変化する位相変調または周波数変調を加えることで前記焦点付近において起こる干渉光に変調周波数で変化する強度変調を起こさせ、
前記検出手段は前記変調周波数成分の光を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記変調手段は、分離された前記照射光の少なくとも２つ以上に互いに異なる周波数の位相変調、強度変調、周波数変調のいずれかを加えることで、前記焦点近傍において起こる干渉光に少なくとも２つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数で変化する強度変調を起こさせ、
前記検出手段は前記少なくとも２つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数成分の光を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記変調手段により分離、変調された前記照明光の光路が、前記対物レンズへの入射位置において互いに重ならないように構成されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記変調手段により分離、変調された前記照明光の前記光路が、前記対物レンズへの入射面において、互いに重ならない放射状に区画された領域に分離されていることを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のレーザ顕微鏡よりも高い解像度を得るための方法として、一つの像を得る為に複数のレーザビームを用いた超解像レーザ走査型顕微鏡が知られている。非特許文献１には、超解像レーザ走査型顕微鏡の原理が開示されている。非特許文献１に示されたものは、ＳＴＥＤ励起蛍光顕微鏡と呼ばれるもので、蛍光発生を抑制するようなエネルギーを持ったビームを、励起レーザスポットの両側に近接させて照射することにより、実質的に蛍光の発生する領域を小さくし、所謂回折限界以下の小さな領域からのみ蛍光を発生させて、超解像を得るというものである。また、米国特許第5,731,588号明細書には、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡に関するものとして、蛍光を発生させる励起用のレーザとその集光位置の近傍に蛍光現象を抑制するための別のレーザビームを照射／集光させることより、実質的に蛍光を発する領域を小さくし超解像を行うものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第5,731,588号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】"Breaking the diff-raction resolution limit by stimulated emission ： stimulated-emission-depletion fluoresceuce microscopy", Stefan W. Hell and Jan Wichmann, Optics Letters, Vol.19(1994), pp.780-782"
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら上記の顕微鏡では、通常の励起用のレーザの他に蛍光発生を抑制するような別の波長のレーザが必要であるため、装置構成が大掛かりになる上に、これらの励起用レーザと蛍光発生を抑制するレーザの組み合わせは、その波長が限定されており、様々な蛍光色素に対応するものではなく、使い勝手が悪いという問題がある。
【０００６】
本発明の目的は、簡易な構成により超解像観察を行うことができる顕微鏡装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の顕微鏡装置は、試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置において、可干渉性を有する照射光を少なくとも２つ以上に分離し、分離された前記照射光の少なくとも一の照射光に変調を加える変調手段と、前記分離された照射光をそれぞれ対物レンズに導くとともに、その焦点付近における前記照射光により生ずる干渉光を生じさせる照射光学系と、前記焦点付近から反射する光または前記焦点付近から生じる光のうち、前記干渉光に対応する周波数成分の光を抽出するとともに、この抽出された光を検出する検出手段と、前記検出手段により検出された光に基づいて画像データを作成する画像作成手段と、を備え、分離された前記照射光の個々の前記焦点の位置が互いに異なっていることを特徴とする。
この顕微鏡装置によれば、可干渉性を有する照明光を分離し、分離された照明光の少なくとも一の照明光に変調を加え、焦点付近における照明光による干渉光を検出するので、簡易な構成により超解像観察を行うことができる。
【０００８】
分離された前記照射光の焦点は、それぞれの前記照射光が互いに重なる領域を有しながら、光軸に対し直交する方向にずれていてもよい。
【０００９】
分離された前記照射光の焦点は、それぞれの前記照射光が互いに重なる領域を有しながら、光軸の方向にずれていてもよい。
【００１０】
可干渉性を有する前記照射光は２つに分離され、前記変調手段はその一方に一定の周波数で変化する位相変調または周波数変調を加えることで前記焦点付近において起こる干渉光に変調周波数で変化する強度変調を起こさせ、前記検出手段は前記変調周波数成分の光を抽出してもよい。
【００１１】
前記変調手段は、分離された前記照射光の少なくとも２つ以上に互いに異なる周波数の位相変調、強度変調、周波数変調のいずれかを加えることで、前記焦点近傍において起こる干渉光に少なくとも２つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数で変化する強度変調を起こさせ、前記検出手段は前記少なくとも２つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数成分の光を抽出してもよい。
【００１２】
前記変調手段により分離、変調された前記照明光の光路が、前記対物レンズへの入射位置において互いに重ならないように構成されていてもよい。
【００１３】
前記変調手段により分離、変調された前記照明光の前記光路が、前記対物レンズへの入射面において、互いに重ならない放射状に区画された領域に分離されていてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の顕微鏡装置によれば、可干渉性を有する照明光を分離し、分離された照明光の少なくとも一の照明光に変調を加え、焦点付近における照明光による干渉光を検出するので、簡易な構成により超解像観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。
【図２】光路分割装置の構成を示すブロック図。
【図３】微動傾きステージの構成を示す断面図。
【図４】焦点位置近傍の光ビームの状態を示す断面図。
【図５】光ビームの強度分布を示す図。
【図６】２つの光の主たる交差領域の位相を合わせた場合の光の強度分布を示す図。
【図７】実施例１における焦点面での２つの光束の位置関係を示す図。
【図８】焦点面に３つの光の焦点を配置する例を示す図。
【図９】焦点面に３つの光の焦点を配置する例を示す図。
【図１０】光路分割装置の構成を示すブロック図。
【図１１】２つの光ビームの強度分布を示す図。
【図１２】２つの光を合わせた光および干渉成分の強度分布を示す図。
【図１３】実施例４の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。
【図１４】実施例５の顕微鏡装置に用いられる光路分割装置の構成を示すブロック図。
【図１５】遮光フィルタの構成を示す図であり、（ａ）は一対の遮光フィルタの構成を示す図、（ｂ）は他の一対の遮光フィルタの構成を示す図。
【図１６】実施例６の顕微鏡装置に用いられる光路分割装置の構成を示すブロック図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明による顕微鏡装置の実施形態について説明する。
【実施例１】
【００１７】
以下、図１〜図６を参照して実施例１の顕微鏡装置について説明する。
【００１８】
図１は、実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図、図２は光路分割装置の構成を示すブロック図である。
【００１９】
図１に示すように、本実施例の顕微鏡装置１は、可視域の波長を有するコリメート光を発するレーザ光源装置２を有し、その光軸上には光路分割装置３が配置されている。
【００２０】
図２に示すように、光分割装置３には、レーザ光源装置２からのレーザ光を受けるビームスプリッタ３０が配置されており、そのビームスプリッタ３０による反射方向にはミラー３１が配置されている。図２においてビームスプリッタ３０により反射された光の光路を破線で、その他の光路を実線で、それぞれ示している。
【００２１】
ミラー３１は微動傾きステージ３２に取り付けられ、その設置角度が調整可能とされている。
【００２２】
図３は微動傾きステージ３２の構成を示す断面図である。
【００２３】
ミラー３１は、図３に示すような微動傾きステージ３２の可動部３２ａに固定されている。図３のように微動傾きステージ３２は、固定部３２ｂが可動部３２ａを弾性支持し、内部にある２本もしくは３本の圧電素子３２ｃによって数ｍｒａｄ程度だけ可動部３２ａが２方向にその傾きを変えられるように構成されている。さらに、ビームスプリッタ３０を通過する光の光路上にはＡＯＭ（音響光学素子）３３が、ミラー３１により折り返された光の光路上にはＡＯＭ３４が、それぞれ配置されている。
【００２４】
ここで、ＡＯＭ３３は、周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで駆動され、ＡＯＭ３４は、周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで駆動されており、それぞれのＡＯＭを通過する光に強度変調（振幅変調）を加えるようになっている。ＡＯＭ３３により変調されたビーム光、およびＡＯＭ３４により変調されミラー３５で折り返されたビーム光は、ビームスプリッタ３６で合成され、進行方向を揃えられる。
【００２５】
図１に示すように、光路分割装置３の先には、レーザの向きを変えるためのダイクロイックミラー４とレーザ光を走査するための走査光学ユニット５とが配置されている。ダイクロイックミラー４はレーザ光の波長を反射し、レーザ光による蛍光を透過させる特性を有する。走査光学ユニット５は、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ａと可変ミラー５ａの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ｂを備えている。
【００２６】
また光を収束させる瞳リレーレンズ６、レーザビームを偏向するミラー７、結像レンズ８および対物レンズ９が光路に沿って順次、配置されている。
【００２７】
また、対物レンズ９の先には、試料１０を載せるステージ１１が設けられる。
【００２８】
一方、試料１０から発生し、ダイクロイックミラー４を透過した蛍光の光路には、蛍光を選択的に透過する蛍光フィルタ１３と、蛍光ビームを収束させるレンズ１４と、ピンホール１５と、ピンホール１５を通過した光を検出する検出器１６とが設けられる。検出器１６からの信号はバンドパスフィルタ１９を介してコントローラ１７に与えられる。
【００２９】
さらにコントローラ１７には表示モニタ１８が接続される。コントローラ１７は光学走査ユニット４の走査制御や、光路分割装置３の制御を実行する。また、表示モニタ１８には検出器１６を介して取得される観察像、その他各種の情報が表示される。
【００３０】
次に、顕微鏡装置１の動作について説明する。
【００３１】
試料１０は、レーザ光源２からの光によって励起される蛍光指示薬が導入されて、ステージ１１上に配置されている。
【００３２】
レーザ光源２からのコリメートされたレーザ光は光路分割装置３に導かれる。光路分割装置３内部で、レーザ光はビームスプリッタ３０を直進する光はＡＯＭ３３を通過することによって、周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで変調される。ビームスプリッタ３０で反射されたレーザ光は、ミラー３１で反射されて、ＡＯＭ３４によって、周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調される。ＡＯＭ３４を通った光はミラー３５によって反射される。これら２つのレーザ光の一部はビームスプリッタ３６によってその進行方向がほぼ同じになるように構成されている。
【００３３】
これらのレーザ光はダイクロイックミラー４によって光走査ユニット５へと導かれ、光走査ユニット５によって任意の方向に走査される。レーザ光はさらに瞳リレーレンズ６、反射ミラー７、結像レンズ８を通過し、対物レンズ９に入射される。対物レンズ９によってこのレーザ光は試料１０の近傍に収束される。
【００３４】
対物レンズ９の瞳は瞳リレーレンズ６によって、光走査ユニット５の位置にリレーされるので、光走査ユニット５で走査される光は、対物レンズ９の瞳位置で光を走査していることと同様になり、これによって、対物レンズ９による焦点は焦点面上を走査される。また、微動傾きステージ３２を駆動することによって光分割装置３で分けられた光の一方の向きを微小移動させることによって、これらの２つの光の焦点位置が微小にずれるように構成されている。
【００３５】
例えば、レーザ光の波長を４０ｎｍ、対物レンズとして倍率１００倍で焦点距離２ｍｍ、ＮＡ１．４のものを用いるとすると焦点のサイズは約０．１７μｍとなる。
【００３６】
ここで微動傾きステージ３２によって２つの光の向きが５０μｒａｄ異なるように調節すると、それぞれの焦点位置は約０．1μｍずれる。図４は、この時の焦点位置近傍の光ビームの状態を示す断面図である。図４に示すように、２つの光ビーム４１，４２は焦点面４３に向かって収束しているが、両者の焦点位置がずれているため、光ビーム４１，４２は図４において互いに左右方向（光軸と直交する方向）にシフトした位置に描かれる。なお、図４においてＺ方向は対物レンズ９の光軸方向を、Ｘ方向は当該光軸方向と直交する方向を示す。
【００３７】
図５は光ビーム４１，４２の強度分布を示す図である。図５において横軸は焦点面４３におけるＸ方向（図４）に対応し、縦軸は各ビームの光ビーム４１，４２の強度を示す。
【００３８】
図６は２つの光の主たる交差領域の位相を合わせた場合の光の強度分布を示す図である。図６の横軸は図５と同様、焦点面４３におけるＸ方向（図４）に対応する。
【００３９】
２つの光の光路長を調節することにより、２つの光の主たる交差領域の位相を合わせると、２つの光を合わせた強度分布は図６の曲線４４として示される。また、このとき２つの光の干渉成分は曲線４５のようになる。この２つの光の干渉成分は、２つの光の変調周波数の差周波数であるｆ１−ｆ２での変調成分を含んでいる。
【００４０】
このようなレーザ光によって試料１０の蛍光指示薬が励起されて、蛍光が発する。この蛍光は対物レンズ９で捕らえられてレーザ光とは逆向きに進み、結像レンズ８、反射ミラー７、瞳リレーレンズ６、光走査ユニット５を介してダイクロイックミラー４へ導かれる。この蛍光はダイクロイックミラー４を透過して、蛍光フィルタ１３によって特定の波長成分が選択的に透過されて、レンズ１４で集光され、ピンホール１５を通過した光が検出器１６で検出される。
【００４１】
蛍光信号の中の、干渉光によって励起された成分はレーザ光と同様にｆ１−ｆ２＝１００kＨｚの変調成分を有し、この１００kＨｚの成分を抽出することによって、干渉光による蛍光を取り出すことができる。
【００４２】
ここで、ピンホール１５は干渉光による蛍光が最大になるように図６の４６に対応する信号のみが通過するように調節されている。検出器１６で検出された光は、バンドパスフィルタ１９に送られ、ここで差の周波数１００ｋＨｚ近傍の周波数のみが抽出されることによって、図６の曲線４５で示す強度分布を有する干渉光で励起された蛍光に相当する信号が得られる。
【００４３】
バンドパスフィルタ１９で抽出された信号はコントローラ１７へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成し、表示モニタ１８上に表示される。また、画像データはコントローラ１７の内部のメモリ（不図示）に記憶される。
【００４４】
ここで、曲線４５で示される干渉光の焦点面におけるＸ方向の半値全幅は、それぞれの励起光（光ビーム４１、４２）の半値全幅よりも４０％程度小さくなる。照明する範囲が小さくなるので、この干渉光による蛍光をピンホールを用いた検出光学系で検出した場合、通常の光学顕微鏡よりもＸ方向の分解能が５０％程度改善される。
【００４５】
また、図示しないアクチュエータによって、対物レンズ９もしくは試料１０を対物レンズ９の光軸方向に移動させて、別の深さの画像を観察することもできる。さらに、光走査ユニット５とアクチュエータを連動させて、任意の断面画像を観察したり、３次元情報を観察したりすることが可能である。さらに、干渉光のＰＳＦ（点像分布関数）を求めて、逆演算を行い、より高分解能な画像を得ることもできる。
【００４６】
このように、本実施形態の顕微鏡装置によれば、単一のレーザ光源装置によって超解像観察を行うことができるので、装置の複雑化を回避できる。また、励起用レーザとの波長を自由に選択できるので、様々な蛍光色素に対応が可能である。
【００４７】
上記実施例では、干渉光が含む周波数の差であるｆ１−ｆ２成分を抽出するようにしたが、これに限らず、周波数の和であるｆ１＋ｆ２の成分を抽出しても同様の効果が得られる。
【００４８】
また、光路分割装置３内部の２つのＡＯＭ３３、３４による変調に代えて、２つのＥＯＭ（電気光学変調素子）によって位相変調もしくは強度変調を加えても、同様の効果が得られる。また、他の方式で強度変調を加えても良い。
【００４９】
さらに、ＡＯＭ３３、３４を周波数シフタとして使用しても構わない。この場合、互いに異なる一定周波数で駆動されるＡＯＭに光を入射し、周波数変調の加わった回折光を用いても同様の効果が得られる。
【００５０】
また、分割された光路のいずれか一方のみに、ＡＯＭもしくはＥＯＭを挿入して、この光路の光に周波数変調もしくは位相変調を加えてもよい。この場合、干渉成分は変調周波数による成分を有するので、この変調周波数成分を抽出しても同様の効果が得られる。
【００５１】
その他、変調手段として任意の構成を採用することができる。
【００５２】
また、光源としてはレーザに限らず干渉光を生じさせる光であれば任意の光源を使用できる。光源として、極短パルスのレーザ光を用いても同様の効果が得られる。
【００５３】
さらに、２つの光の交差領域で変調される励起光によって生じる多光子蛍光を検出しても良く、また、波長が半分になる２次高調波やさらに高次の高調波を検出しても良い。
【００５４】
また、上記実施例では、光を走査する方法として可変ミラーを示したが、走査方法はこれに限らず焦点と試料が相対運動するものであれば良く、試料をステージで移動させるなどの方法でも良い。
【００５５】
またピンホールの開口は任意の大きさや形状のものを選択できる。図６の４７に対応するアパーチャと４８に対応するアパーチャを切り替えて、それぞれの信号を用いて高分解能信号を算出してもよい。
【００５６】
また、本実施例では蛍光を検出する構成としたが、これに限らず照明光の反射光を検出する構成としても良い。
【００５７】
上記実施例によれば、２光束の光の焦点を微小にずらして干渉させ、この干渉光による蛍光を検出しているので、干渉光の半値全幅が小さくなり、従来の共焦点顕微鏡よりも高い分解能を得ることできる。また、変調手段により干渉光を発生させるので、装置の複雑化を避けつつ、光の波長を自由に設定できる。
【実施例２】
【００５８】
以下、図７〜図９を参照して実施例２の顕微鏡装置について説明する。本実施例は、実施例１に対し、ビーム光の個数を増やした構成を示すものである。
【００５９】
図７は実施例１における焦点面での２つの光束の位置関係を示す図である。図７に示すように、対物レンズの光軸をＺ軸とすると、実施例１における焦点面では、２つの光の焦点をＸ方向にずらすことで、Ｘ方向に高分解能な画像を得ている。
【００６０】
これに対し、図８は焦点面に３つの光の焦点を配置する例を示している。互いにＹ方向に焦点位置のずれた光を照射することで、Ｘ方向のみならずＹ方向の分解能も向上させることができる。
【００６１】
この場合、光路分割装置によって光路を３分岐し、それぞれの光を異なる周波数で変調を加える。これらの光の焦点が焦点面において図８に示すような位置関係になるように構成し、光検出装置では光ビーム５１と光ビーム５２の干渉光でＸ方向の分解能が向上する構成とし、さらに光ビーム５１と光ビーム５３の干渉光によってＹ方向の分解能が向上する構成とする。このときＸ方向とＹ方向の干渉光の変調周波数が異なる構成にする。
【００６２】
このような構成で、光を走査して得られた信号から演算を行うことによって、Ｘ方向およびＹ方向共に高い分解能の画像を算出できる。
【００６３】
また、図９に示すように３つの焦点の位置関係を設定してもよい。この場合には、光ビーム５１と光ビーム５２の干渉成分、光ビーム５１と光ビーム５３の干渉成分、および光ビーム５２と光ビーム５３の干渉成分を用いることで、各光ビームのずれ方向の分解能を向上させることができる。この場合もそれぞれの干渉成分が別の変調周波数になる構成とすると、互いの信号を分離することができる。
【実施例３】
【００６４】
以下、図１０〜図１２を参照して実施例３の顕微鏡装置について説明する。
【００６５】
本実施例は実施例１の変形例で、Ｚ方向（対物レンズの光軸方向）の分解能を向上させるものである。
【００６６】
図１０は、本実施例の顕微鏡装置で使用される光路分割装置３Ａの構成を示すブロック図である。他の構成要素は実施例１と同様とされる。図１０において、図２と同一構成要素には同一符合を付し、その説明を省略する。
【００６７】
図１０に示すように、光路分割装置３Ａでは、ビームスプリッタ３０で折り曲げられた光を、微弱な曲率を有する凹面ミラー３７で反射させる。本実施例では光の片側にのみ、ＥＯＭ３８を挿入して位相変調を加える。
【００６８】
実施例１と同じ対物レンズを用いると、Ｚ方向の半値全幅は約０．６μｍとなる。凹面ミラーの局率は焦点位置が光軸方向に０．４μｍ程度ずれるものを用いる。
【００６９】
図１１は２つの光ビームの強度分布を示す図、図１２は２つの光を合わせた光および干渉成分の強度分布を示す図である。
【００７０】
図１１に示すように、このとき２つの光ビーム６１，６２の強度分布は、そのピークがＺ方向（光軸方向）に互いにずれた位置関係となる。
【００７１】
また、図１２において、曲線６３は２つの光を合わせた強度分布を、曲線６４は干渉成分の強度分布を、それぞれ示している。干渉成分はＥＯＭ３８の変調成分を含むので、曲線６４で示す干渉光による蛍光も同様の変調成分を含む。実施例１と同様に、この干渉光の半値全幅はそれぞれの光ビーム６１，６２よりも小さくなるので、この干渉光による蛍光信号を画像化することによってＺ方向の分解能が向上した画像を得ることができる。
【実施例４】
【００７２】
以下、図１３を参照して実施例４の顕微鏡装置について説明する。実施例４の顕微鏡装置は、蛍光ではなく反射、散乱光を検出するものである。
【００７３】
図１３は、実施例４の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。
【００７４】
本実施例の顕微鏡装置１Ａでは、光源としてコリメート光を発する近赤外光のＳＬＤ２Ａを使用する。また、光路分割装置３は実施例１と同様である。また、実施例１におけるダイクロイックミラー４の代わりに偏光ビームスプリッタ６０が用いられ、蛍光フィルタ１３の代わりに偏光フィルタ６２が用いられる。さらに対物レンズ９の前には、１/４波長板６１が挿入されている。
【００７５】
ＳＬＤ２Ａからの光は、直線偏光を有する。この光は光路分割装置３で２つのビームに分けられて、それぞれ変調を加えられた後に、偏光ビームスプリッタ６０で反射された後、実施例１と同様の光路を通り、１/４波長板６１でそれぞれ円偏光へと変換され、対物レンズ９によって焦点を結ぶ。
【００７６】
実施例１と同様、集光点付近ではＸ方向にずれた２つの焦点を形成し、２つの光の干渉領域はそれぞれの光よりも半値全幅が小さくなる。干渉光は差周波数（１００ｋＨｚ）での強度変調を含んでいる。焦点からの反射、散乱光は対物レンズ９で集められて、もう一度１/４波長板６１を通過することにより、入射光とは９０度偏光方向の異なる偏光となり、照明光の光路を逆方向に戻る。さらに偏光ビームスプリッタ６０を透過した後に、偏光フィルタ６２でその偏光成分を選択され、さらに、ピンホール１５を通過して検出器１６で検出される。
【００７７】
光検出器１６からの出力信号は、バンドパスフィルタ１９に送られ、ここで差の周波数１００ｋＨｚ近傍の周波数のみが抽出される。抽出された信号はコントローラ１７へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成し、表示モニタ１８上に表示される。また、画像データはコントローラ１７の内部のメモリ（不図示）に記憶される。
【００７８】
本実施例の顕微鏡装置１Ａによれば、試料を照明する可干渉光を、それぞれ違う周波数で変調を加えて投光し、焦点付近においてそれぞれの光ビームよりも半値全幅の狭い微小な干渉領域を作るように構成し、この干渉領域からの反射、散乱光を検出するようにしたので、通常よりも分解能の高い観察が可能である。本構成は生物用途だけでなく、金属や半導体表面を観察する工業用途でも効果を発揮する。
【実施例５】
【００７９】
以下、図１４〜図１５を参照して実施例５の顕微鏡装置について説明する。本実施例は、実施例１の顕微鏡装置の光路分割装置内に、一対の遮光フィルタを追加した構成を示すものである。本実施例の構成は、光路分割装置以外の他の構成要素については実施例１と同一である。
【００８０】
図１４は、実施例５の顕微鏡装置に用いられる光路分割装置３Ｂの構成を示すブロック図、図１５は遮光フィルタの遮光パターンを例示する図である。図１４において、実施例１の顕微鏡装置と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。
【００８１】
図１４に示すように、光路分割装置３Ｂには、遮光フィルタ３０１および遮光フィルタ３０２が設けられる。図１５（ａ）に示すように、遮光フィルタ３０１は８つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部３０１ａと、光を通過させる透過部３０１ｂとが交互に割当てられている。同様に、遮光フィルタ３０２は８つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部３０２ａと、光を通過させる透過部３０２ｂとが交互に割当てられている。
【００８２】
図１５（ａ）に示す遮光フィルタ３０１および遮光フィルタ３０２を対比すると判るように、それぞれの遮光フィルタにおける遮光部および透過部は、互いに相補的な位置関係にあり、ビームスプリッタ３６を経た２つの光の光路が対物レンズ９に至るまで互いに重ならないという条件を満たしており、これらの光路は、対物レンズ９への入射面について、互いに重なり合わない放射状の領域に分離される。この条件は微動傾きステージ３２により駆動されるミラー３１の角度に依らず満たされる（図１参照）。
【００８３】
このように、本実施例の顕微鏡装置では光路分割装置３Ｂ内に一対の遮光フィルタ３０１，３０２を設けているため、光路分割装置３Ｂにおいて分割された光路の重なりが排除され、対物レンズ９での集光により形成される焦点近傍においてのみ２つの光路が重なり合う。したがって、２つの光の干渉が焦点近傍でしか起こらなくなるため、実施例１の顕微鏡装置と比べて、焦点近傍からの信号をより選択的に抽出することが可能となる。さらに、この効果により、例えば生物組織の表面から離れた深い部位を観察する場合にも、焦点近傍の信号を効率的に抽出できるため、より深部まで観察が可能となる。
【００８４】
また、光フィルタ３０１および遮光フィルタ３０２における遮光部および透過部の領域を放射状に区分しているため、それぞれの光の焦点の大きさは実施例１の顕微鏡装置とほとんど変わらず、２つの光の交差領域の大きさも、ほぼ同等に維持することができる。
【００８５】
図１５（ｂ）は一対の遮光フィルタの別の遮光パターンを例示する図である。
【００８６】
図１５（ｂ）の例では、遮光フィルタ３０３は４つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部３０３ａと、光を通過させる透過部３０３ｂとが交互に割当てられている。同様に、遮光フィルタ３０４は４つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部３０４ａと、光を通過させる透過部３０４ｂとが交互に割当てられている。また、図１５（ａ）に示す一対の遮光フィルタ３０１，３０２と同様、それぞれの遮光フィルタにおける遮光部および透過部は、互いに相補的な位置関係にあり、ビームスプリッタ３６を経た２つの光の光路が対物レンズ９に至るまで互いに重ならない。したがって、図１５（ａ）に示す一対の遮光フィルタと同様の機能を発揮する。
【実施例６】
【００８７】
以下、図１６を参照して実施例６の顕微鏡装置について説明する。本実施例は、実施例３の顕微鏡装置の光路分割装置（図１０）内に、一対の遮光フィルタを追加した構成を示すものである。本実施例の構成は、光路分割装置以外の他の構成要素については実施例３と同一である。
【００８８】
図１６は、実施例６の顕微鏡装置に用いられる光路分割装置３Ｃの構成を示すブロック図である。図１６において、実施例３の顕微鏡装置と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。
【００８９】
図１６に示すように、光路分割装置３Ｃには、図１５（ｂ）に示した遮光パターンを有する遮光フィルタ３０３および遮光フィルタ３０４が設けられる。実施例５の顕微鏡装置と同様、それぞれの遮光フィルタにおける遮光部および透過部は、互いに相補的な位置関係にあり、ビームスプリッタ３６を経た２つの光の光路が対物レンズ９に至るまで互いに重ならないという条件を満たしており、これらの光路は、対物レンズ９への入射面について、互いに重なり合わない放射状の領域に分離される。この条件は、凹面ミラー３７（図１０参照）の効果によって２つの光の焦点が深さ方向に異なるような集光状態である場合にも満たされる。
【００９０】
このように、本実施例の顕微鏡装置では光路分割装置３Ｃ内に一対の遮光フィルタ３０３，３０４を設けているため、光路分割装置３Ｃにおいて分割された光路の重なりが排除され、対物レンズ９での集光により形成される焦点近傍においてのみ２つの光路が重なり合う。したがって、２つの光の干渉が焦点近傍でしか起こらなくなるため、実施例３の顕微鏡装置と比べて、焦点近傍からの信号をより選択的に抽出することが可能となる。さらに、この効果により、例えば生物組織の表面から離れた深い部位を観察する場合にも、焦点近傍の信号を効率的に抽出できるため、より深部まで観察が可能となる。
【００９１】
また、光フィルタ３０３および遮光フィルタ３０４における遮光部および透過部の領域を放射状に区分しているため、それぞれの光の焦点の大きさは実施例３と比べて遮光部分の方向に大きくなるが、２つの光の交差領域の大きさについてはほぼ同等に維持することができる。
【００９２】
本実施例の顕微鏡装置においても、図１５（ｂ）に示す一対の遮光フィルタに替えて、図１５（ａ）に示す遮光パターンを有する一対の遮光フィルタを用いることにより、同等の効果を得ることができる。
【００９３】
以上説明したように、本発明の顕微鏡装置によれば、可干渉性を有する照明光を分離し、分離された照明光の少なくとも一の照明光に変調を加え、焦点付近における照明光による干渉光を検出するので、簡易な構成により超解像観察を行うことができる。
【００９４】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。
【符号の説明】
【００９５】
３      光路分割装置（変調手段）
３Ａ    光路分割装置（変調手段）
９      対物レンズ
１６    検出器（検出手段）
【図１】
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【図２】
0005589374.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005589374.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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