(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核初期化転写因子のそれぞれをコードする複数のＤＮＡを、細胞中の内在酵素によって切断されるペプチドをコードする介在ＤＮＡ配列を介してポリシストロニックに連結してなる発現カセットであって、
介在ＤＮＡ配列が２ＡペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むものであり、
複数の核初期化転写因子が、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、およびＯｃｔ４であり、
Ｓｏｘ２をコードするＤＮＡ、Ｋｌｆ４をコードするＤＮＡ、ｃＭｙｃをコードするＤＮＡ、およびＯｃｔ４をコードするＤＮＡを、５’末端から３’末端に向けてこの順番で含んでなる、発現カセット。
【請求項２】
請求項１に記載の発現カセットを作動可能な形で含んでなる、発現ベクター。
【請求項３】
レトロウイルスベクターである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項２または３に記載の発現ベクターを含んでなる、細胞。
【請求項５】
細胞をリプログラミングする方法であって、該細胞に、請求項１に記載の発現カセットまたは請求項２もしくは３に記載の発現ベクターを導入する工程を含んでなる、方法。
【請求項６】
前記細胞に、１種の核初期化転写因子をコードするＤＮＡを含む第二の発現カセットまたは該発現カセットを作動可能な形で含む第二の発現ベクターを導入する工程をさらに含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第二の発現カセットまたは第二の発現ベクターに含まれる前記ＤＮＡが、Ｏｃｔ４をコードするものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ｉＰＳ細胞が得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
リプログラミングされた細胞の製造方法である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００８−２３４８２３号（出願日：２００８年９月１２日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞再生医療分野における複数の転写因子の発現制御による治療用細胞・組織の分化誘導および製造に関する。より具体的には、本発明は、複数の転写因子の制御された発現を可能とする発現カセット、ならびに該発現カセットを用いた体細胞リプログラミングおよび分化多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）の誘導に関する。
【０００３】
背景技術
ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell）とは、生体の組織・臓器を構成する分化した体細胞を、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４などの転写因子により人工的に初期化して得られる、三胚葉分化能および個体発生能をもつ胚性幹細胞（ＥＳ細胞）様の分化多能性幹細胞である。
【０００４】
ｉＰＳ細胞の定義には、まず、終末分化した体細胞と比べて、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子が発現していることが含まれる。このような遺伝子としては、例えば、マウスにおいてはＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ｆｂｘ−１５などの転写因子や、細胞表面抗原ＳＳＥＡ−１などが挙げられる。さらに、ｉＰＳ細胞は、インビトロ分化誘導系において三胚葉系細胞への分化能を有する必要があり、また、免疫不全マウスに皮下注射した場合に三胚葉由来組織を含む奇形種を形成する必要がある。さらに、ｉＰＳ細胞は、個体発生能を有する必要がある。例えば、マウスｉＰＳ細胞は、マウスの胚盤胞へ注入すると、キメラマウスの発生に寄与することが知られている。
【０００５】
ｉＰＳ細胞を誘導する方法としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４の４種の転写因子をレトロウイルス（ＲＶ）ベクターにより線維芽細胞などの体細胞へ導入することにより、細胞をリプログラミングする方法が知られている（Takahashi et al., Cell, 2006, 126: 663-676）。ｉＰＳ誘導は、現在までに上記４種の転写因子のうちの２種または３種でも可能であることが示されているが、いずれも複数の遺伝子を必要とする。従来の方法では、遺伝子１種につき１種のＲＶまたはレンチウイルス（ＬＶ）ベクターが用いられ、従って、合計２〜４種のウイルスベクターが導入される（例えば、Kim et al., Nature, 2008, 454: 646-650）。ＲＶベクターやＬＶベクターは目的の遺伝子を宿主染色体中へランダム挿入するため、そのコピー数を制御できず、従って、従来の方法では遺伝子導入された細胞における各因子の発現量比を制御できない。このため、従来の方法では、ｉＰＳ誘導効率が非常に低く、得られる細胞のリプログラム状態が不均一であるという問題がある。
【０００６】
複数遺伝子の発現制御の方法には、各遺伝子を独立したプロモーターの制御下に配置し、遺伝子と同じ数の発現ユニットを並べる方法の他に、各遺伝子を介在配列を介して連結し、単一プロモーターを用いるポリシストロニックな一つの発現カセットに統合する方法がある。
【０００７】
単一プロモーターによるポリシストロニックな発現では、ＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列を介して複数の遺伝子を連結する方法が知られている。しかし、このＩＲＥＳ配列を用いた場合には、その前後に配置された遺伝子の間でその発現量が異なる（de Felipe, Current Gene Therapy, 2002, 2: 355-370）。近年、ＧＦＰなどの遺伝子をＩＲＥＳ−ＧＦＰなどの形で３ユニット連結した発現カセットが報告されているが、各ユニット間の発現量比は明らかとされていない（Bouabe et al., Nucleic Acids Research, 2008, 36: e28, doi: 10.1093/nar/gkm1119；Sasaki et al., Journal of Biotechnology, 2008, in press, doi: 10.1016/j-jbiotec.2008.06.007）。また、単一の二方向性プロモーターの利用により複数遺伝子の発現が可能となるが（de Felipe, Current Gene Therapy, 2002, 2: 355-370；Hartenbach et al., Journal of Biotechnology, 2005, 120: 83-98）、この方法によっても複数遺伝子の発現量比の制御には至っていない。
【０００８】
上記介在配列の一つに２Ａペプチド配列がある。２Ａペプチドは、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、細胞に内在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）により認識され、Ｃ末端から１残基の位置で切断される（de Felipe, Current Gene Therapy, 2002, 2: 355-370；Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2005, 5: 627-638）。２Ａペプチドにより一つのユニットに連結された複数遺伝子は、一つのユニットとして転写翻訳された後、２Ａぺプチダーゼで切断される。
【０００９】
２Ａペプチドは、これまでに、蛍光マーカー（Hasegawa et al., Stem Cells, 2007,25: 1707-1712）、およびＴ細胞表面抗原（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2005, 5: 627-638）の発現に利用されている。さらに、２Ａペプチドとfurinプロテアーゼ消化配列との組合せによって抗体を製造する方法も報告されている（Fang et al., Nature Biotechnology, 2006, 23: 584-590）。これらの文献では、一つの転写ユニットに最大３つの遺伝子をシストロニックに搭載しているが、４つ以上の遺伝子を連結した例は報告されていない。転写因子を発現させた例としては、ホメオボックス遺伝子であるＨｏｘＢ４を、蛍光マーカーであるｅＧＦＰおよび細胞質内酵素であるＭＧＭＴとともに、２Ａペプチド配列およびＩＲＥＳ配列を介して連結した発現カセットが報告されている（Chnnasamy et al., Virology Journal, 2006, 3: 14, doi: 10.1186/1743-422X-3-14）。しかし、この報告では、ＨｏｘＢ４の発現は確認されているものの、その転写因子活性や他の２つの遺伝子との発現量比は明らかとされていない。さらに、複数の転写因子のみを上記２Ａペプチドを介して連結した発現システムはこれまでに報告されていない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、細胞中で切断されるペプチドをコードする介在ＤＮＡ配列を介して複数の核初期化転写因子の遺伝子を連結し、得られたＤＮＡ構築物を細胞に導入することにより、効率よく細胞をリプログラミングできることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明の目的は、細胞のリプログラミングに好適に用いられる核初期化転写因子の発現カセットを提供することにある。
【００１２】
そして、本発明による発現カセットは、複数の核初期化転写因子のそれぞれをコードする複数のＤＮＡを、細胞中の内在酵素によって切断されるペプチドをコードする介在ＤＮＡ配列を介してポリシストロニックに連結してなる、発現カセットである。
【００１３】
本発明によれば、単一の発現カセットまたは発現ベクターを細胞に導入することにより、体細胞や生殖細胞を効率よくリプログラミングすることが可能となる。また、本発明によれば、リプログラミングされた細胞を均質な細胞集団として取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、４因子連結カセットの概略図である。
【図２】図２は、Ｆｕ−Ｔ２ＡおよびＦｕ−Ｅ２Ａの塩基配列を示す。それぞれの配列において、枠で囲まれているのがFurinの配列であり、その他がＴ２ＡまたはＥ２Ａの配列である。
【図３】図３は、２種のＳＫＭＯ連結コンストラクトの概略図である。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｃは、ＳＫｔＭＯ連結カセットの全塩基配列を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｃは、ＳＫｔＭＯ連結カセットの全塩基配列を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｃは、ＳＫｔＭＯ連結カセットの全塩基配列を示す。
【図５】図５は、ＳＫｔＭＯ群のＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞およびコロニー形成を示す顕微鏡写真である。矢印は、ＥＳ細胞様のコロニーを示す。ＲＶベクター感染後の培養日数は各写真の上に示されている。
【図６】図６は、ＲＶベクター感染後１３日目のＳＫｔＭＯ群およびＮｏ ｔａｇ群の培養ウェル中の細胞を示す顕微鏡写真である。  連結４因子ＳＫｔＭＯ群（下段）は、Ｎｏ ｔａｇ群（各遺伝子のＯＲＦを有するｐＭＸｓベクター４種を導入した群：上段）と比べて、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陰性細胞の出現が顕著に少ない。写真は、明視野（左）とＧＦＰ蛍光視野（右）を示す。
【図７】図７は、ＳＫｔＭＯ群およびＮｏ ｔａｇ群の細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す。図７（ａ）は、連結４因子ＳＫｔＭＯによりｍＢＭＭＮＣをリプログラムして得られたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞が解析細胞中の１０．５％であり、従来法であるＮｏ ｔａｇ群の場合（２．６％）と比べて約４倍に増加・濃縮しており、効率よく分画・分取できたことを示す。図７（ｂ）は、リプログラム細胞（Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞）が、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陰性細胞とは大きさ・形態（ＦＳＣ，ＳＳＣ）に関してより均質な細胞群として分離されたことを示す。解析した全生細胞（Ｐ５＋Ｐ６）のプロットを左に、解析生細胞中のＯｃｔ４−ＧＦＰ陰性細胞（Ｐ６画分）のみのプロットを中央に、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞（Ｐ５画分）のみのプロットを右に表示した。上段はＳＫｔＭＯ群を、下段はＮｏ ｔａｇ群の結果を示す。
【図８】図８は、ＲＶベクター感染後４日目におけるＳＫｔＭＯ＋Ｏｃｔ４群およびＮｏ ｔａｇ群の培養ウェル中の細胞を示す顕微鏡写真である。連結４因子ＳＫｔＭＯとＯｃｔ４との組み合わせを用いることにより、ＳＫｔＭＯのみの場合と比べて９日早く細胞リプログラミングが達成されたことが示されている。
【図９】図９は、ＣＨＯ細胞における連結４因子の発現プロセシングを確認するための電気泳動写真である。Ｆｕ−２Ａ連結型では５’側から１〜３番目の遺伝子にＦｕ−２Ａ配列が付加すること、ＩＲＥＳ連結型では５’側から１番目と３番目の遺伝子にＦｕ−２Ａ配列が付加することが確認された。電気泳動は、８／１６％グラジェントゲルを使用し、全タンパク量１０μｇ／レーンで行った。実線の矢印はＦｕ−２Ａ配列付加なしの予測バンドサイズを、点線矢印はＦｕ−２Ａ付加ありの予測バンドサイズを示す。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本明細書において「リプログラミング」または「リプログラム」とは、細胞分化とは逆のプロセス、すなわち、分化した細胞がかつて保持していた未分化状態を再度獲得することをいう。特に、細胞のリプログラミングによって、その細胞が三胚葉形成能および個体発生能を有する分化多能性を獲得した場合には、このプロセスを「核初期化」または「初期化」といい、得られた細胞を「ｉＰＳ細胞」（induced pluripotent stem cell）という。この「核初期化」または「初期化」は、典型的には、体細胞の核が受精卵の状態に戻ることをいう。
【００１６】
本発明による発現カセットは、複数の核初期化転写因子のそれぞれをコードする複数のＤＮＡを、介在配列を介してポリシストロニックに連結してなるものである。ここで用いられる介在配列は、該発現カセットが細胞中に導入され、発現したときに、その細胞の内在酵素によって切断されるペプチド断片をコードするＤＮＡ配列である。
【００１７】
介在ＤＮＡ配列は、発現カセットを導入しようとする細胞の内在酵素によって認識され、切断されるペプチド断片をコードするＤＮＡ配列である。このようなＤＮＡ配列は、当業者により適宜選択されるものであるため、特に制限されないが、好ましくは２ＡペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むものとされる。
【００１８】
２Ａペプチドは、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、細胞に内在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）により認識され、Ｃ末端から１残基の位置で切断される。２Ａペプチドにより一つのユニットに連結された複数の遺伝子は、一つのユニットとして転写・翻訳された後、２Ａぺプチダーゼで切断される。２Ａペプチドの好ましい例としては、Ｔ２ＡペプチドおよびＥ２Ａペプチドを挙げることができ、これらをコードするＤＮＡ配列は配列番号１（Ｔ２Ａ）および配列番号２（Ｅ２Ａ）に示されている。
【００１９】
介在ＤＮＡ配列は、さらに他の配列を含んでいてもよい。このような他の配列は、連結されたコード配列の発現を妨げない限りにおいていかなる配列であってもよく、当業者であれば適宜選択することができる。他の配列の好ましい例としてはFurin配列を挙げることができ、そのＤＮＡ配列は配列番号３に示されている。このFurin配列は、例えば、上述のＴ２ＡペプチドまたはＥ２ＡペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側に連結させることができ、そのように連結された配列を配列番号４（Furin−Ｔ２Ａ）および配列番号５（Furin−Ｅ２Ａ）に示す。
【００２０】
細胞リプログラミングに用いられる核初期化転写因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の各遺伝子産物が知られている（ＷＯ２００７／０６９６６６）。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、前記複数の核初期化転写因子は、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質、Ｍｙｃファミリータンパク質、およびＯｃｔファミリータンパク質からなる群から選択される２以上の転写因子とされ、より好ましくはこれら全ての転写因子、すなわち、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質、Ｍｙｃファミリータンパク質、およびＯｃｔファミリータンパク質とされる。これらファミリーに属する好ましい転写因子の具体例としては、ＳｏｘファミリーについてはＳｏｘ２が挙げられ、ＫｌｆファミリーについてはＫｌｆ４が挙げられ、ＭｙｃファミリーについてはｃＭｙｃが挙げられ、ＯｃｔファミリーについてはＯｃｔ４が挙げられる。よって、本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記複数の核初期化転写因子は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、およびＯｃｔ４とされる。
【００２１】
前記複数の核初期化転写因子のそれぞれをコードする複数のＤＮＡを連結するときの順番は、発現カセット中に含まれる全てのコード配列が良好に発現され、それぞれの発現産物が良好に機能する限り、特に制限されない。一般に、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加配列が存在すると、そのタンパク質の活性が低減されることがある。本発明においては、介在ＤＮＡ配列によりコードされるペプチド断片が転写因子のＮ末端またはＣ末端に付加することによりその転写因子の活性が低減される場合には、そのような転写因子と介在ＤＮＡ配列の配置を避けるように設計することが好ましい。例えば、Ｏｃｔ４タンパク質のＣ末端に上記のFurin−Ｔ２Ａが付加すると、Ｏｃｔ４の転写因子としての活性が低減することが分かっている。よって、介在ＤＮＡ配列がFurin−Ｔ２Ａ配列を含む場合には、Ｏｃｔ４のＣ末端にFurin−Ｔ２Ａが付加しないよう、Ｏｃｔ４をコードするＤＮＡを発現カセット中の最も３’側に配置することが好ましい。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による発現カセットは、Ｓｏｘ２をコードするＤＮＡ、Ｋｌｆ４をコードするＤＮＡ、ｃＭｙｃをコードするＤＮＡ、およびＯｃｔ４をコードするＤＮＡを、５’末端から３’末端に向けてこの順番で含んでなるものとされる。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、本発明による発現カセットは、５’−［Ｓｏｘ２をコードするＤＮＡ］−［Furin−Ｔ２Ａ］−［Ｋｌｆ４をコードするＤＮＡ］−［Furin−Ｔ２Ａ］−［ｃＭｙｃをコードするＤＮＡ］−［Furin−Ｅ２Ａ］−［Ｏｃｔ４をコードするＤＮＡ］−３’の構造を有するものとされ、その具体的なヌクレオチド配列は配列番号６および図４に示されている。
【００２３】
本発明による発現カセットは、複数の核初期化転写因子のコード配列をポリシストロニックに連結した単一のユニットからこれら転写因子を発現させるため、その発現量比を制御することが可能となる。特に、介在ＤＮＡ配列として２Ａペプチドのコード配列を用いる場合には、複数の転写因子の発現量比は全て等比に制御することが可能となる。また、細胞のリプログラミングに必要な複数の核初期化転写因子を単一の発現ベクターで細胞に導入できる点も有利である。
【００２４】
本発明による発現カセットは、典型的には、発現ベクターによって細胞中に導入される。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による発現カセットを作動可能な形で含んでなる発現ベクターが提供される。
【００２５】
本明細書において「作動可能な形で含んでなる」とは、本発明による発現ベクターがリプログラミングの対象となる細胞に導入されたときに、本発明による発現カセットがプロモーターなどの適切な発現エレメントの制御下に置かれ、発現することを意味する。このような発現エレメントは、発現ベクター中に存在していてもよいし、対象とする細胞中に存在していてもよい。
【００２６】
本発明による発現カセットを挿入するベクターは、外来遺伝子を挿入可能なベクターであればよく、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＳＶベクター、プラスミドベクター、ＰＡＣベクター、ＢＡＣベクター等が挙げられる。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による発現ベクターはウイルスベクターとされ、さらに好ましくはレトロウイルスベクターとされる。
【００２７】
本発明による発現ベクターは、細胞内においてその貯蔵および複製を行うことができる。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による発現ベクターを含んでなる細胞が提供される。この細胞は、本発明による発現ベクターの導入によってリプログラミングされた細胞をも含むものとする。
【００２８】
本発明による発現カセットおよび発現ベクターは、細胞のリプログラミングに用いることができる。従って、本発明の他の態様によれば、細胞をリプログラミングする方法が提供され、該方法は、前記細胞に、本発明による発現カセットまたは本発明による発現ベクターを導入する工程を含んでなる。この方法によりリプログラミングされた細胞が製造されるため、該方法はリプログラミングされた細胞の製造方法でもある。
【００２９】
本発明による細胞のリプログラミングは、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、本発明による方法では、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載の方法において、核初期化因子を細胞に導入するための複数のベクターに代えて、本発明による発現カセットまたは発現ベクターを用いればよい。
【００３０】
本発明においてリプログラミングの対象とする細胞は、胎仔線維芽細胞、成体線維芽細胞、胃上皮細胞、肝上皮細胞、神経細胞、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞などの体細胞または生殖細胞である。本発明の好ましい実施態様によれば、リプログラミングの対象とする細胞は骨髄細胞とされる。本発明において「骨髄細胞」とは、血球細胞や間質細胞など、骨髄中に含まれる細胞を意味する。本発明において「血球細胞」とは、生体内の血流中に存在しうる血液細胞と同等の細胞群を意味し、必ずしも末梢血液細胞に限られるものではなく、例えば骨髄中や臍帯血中に存在するものであってもよい。本発明のさらに好ましい実施態様によれば、前記骨髄細胞は骨髄由来単核球細胞とされる。また、本発明においてリプログラミングの対象とする細胞は、いかなる動物に由来するものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来の細胞、より好ましくはマウスまたはヒトに由来する細胞とされる。本発明において用いられる核初期化転写因子のコード配列を、対象とする細胞に由来する配列とすること、さらには、発現ベクターや細胞培養培地をその細胞に適合するように選択することは、当業者の知識の範囲内である。
【００３１】
本発明による発現カセットまたは発現ベクターの細胞導入法は特に制限されるものではなく、動物細胞への遺伝子導入に用いられる一般的な方法、例えば、ウイルスベクターを用いる場合にはそれを細胞に感染させる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＨＶＪリポソーム法等を用いることができる。
【００３２】
本発明による方法では、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質、Ｍｙｃファミリータンパク質、およびＯｃｔファミリータンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡのうち、２種類を連結した発現カセットと他の２種類を連結した発現カセットを組み合わせて用いてもよく、あるいは、１種類を連結した発現カセットと他の３種類を連結した発現カセットを組み合わせて用いてもよいが、好ましくはこれら全４種のＤＮＡを連結した発現カセットが用いられる。
【００３３】
本発明による方法では、本発明による発現カセットまたは発現ベクターに加えて、１種の核初期化転写因子をコードするＤＮＡを含む発現カセットまたは発現ベクターを同時に細胞中に導入することにより、細胞リプログラミングの効率を向上させることができる。従って、本発明の他の態様によれば、細胞をリプログラミングする方法であって、該細胞に、（ａ）請求項１〜６に記載の発現カセットまたは請求項７もしくは８に記載の発現ベクター；ならびに（ｂ）１種の核初期化転写因子をコードするＤＮＡを含む第二の発現カセットまたは該発現カセットを作動可能な形で含む第二の発現ベクターを導入する工程を含んでなる方法が提供される。
【００３４】
特に、本発明による方法では、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質、Ｍｙｃファミリータンパク質、およびＯｃｔファミリータンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡの全てを連結した本発明による発現カセットと、Ｏｃｔファミリータンパク質をコードするＤＮＡのみを含む発現カセットとの組み合わせを用いることにより、細胞リプログラミングの効率を顕著に向上させることができる。従って、本発明の一つの好ましい実施態様によれば、第二の発現カセットまたは第二の発現ベクターに含まれる前記ＤＮＡは、Ｏｃｔファミリータンパク質、より好ましくはＯｃｔ４をコードするものとされる。
【００３５】
さらに、上述の本発明による発現カセットとＯｃｔファミリータンパク質（好ましくはＯｃｔ４）をコードするＤＮＡを含む発現カセットとの組み合わせ物、本発明による発現ベクターとＯｃｔファミリータンパク質（好ましくはＯｃｔ４）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとの組み合わせ物、ならびにこれらの組み合わせ物を含む細胞リプログラミング用組成物は、本発明の別の態様を構成する。
【００３６】
本発明による方法により、細胞のリプログラミングが効率よく行われ、よって、体細胞または生殖細胞からｉＰＳ細胞を製造することも可能である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による方法においてｉＰＳ細胞が得られる。さらに、本発明の他の態様によれば、体細胞または生殖細胞からｉＰＳ細胞を製造する方法が提供され、該方法は、前記体細胞または生殖細胞に、本発明による発現カセットまたは本発明による発現ベクターを導入する工程を含んでなる。前記体細胞または生殖細胞は、好ましくは上述の骨髄細胞とされ、より好ましくは骨髄由来単核球細胞とされる。
【００３７】
以上のようにしてリプログラミングした細胞の用途としては、まず、治療用細胞としての利用が可能である。このような治療用細胞としては、組織幹細胞やその前駆細胞の分化状態にリプログラミングした細胞が挙げられる。すなわち、リプログラミングされた細胞は疾患の治療に用いることができ、具体的には、組織幹細胞やその前駆細胞の分化状態にリプログラミングされた細胞を用いて各種疾患の治療を行うことができる。
【００３８】
例えば、血球系細胞をリプログラミングして造血幹細胞を得た場合には、造血幹細胞移植への利用が可能となる。具体的には、得られた造血幹細胞を点滴またはカテーテルなどを用いて移植することにより、白血病やリンパ腫、あるいは自己免疫疾患、あるいはリソソーム病やペルオキシソーム病を含む先天性代謝異常症(例えばムコ多糖症、Gaucher病、Fabry病、Pompe病、副腎白質ジストロフィー、I-cell病、異染性ロイコジストロフィー、GM1ガングリオドーシスなど)などへ適用できる。また、骨髄球系またはリンパ球系前駆細胞を得た場合には、それらの細胞そのもの、または更に赤血球または好中球または好塩基球または好酸球または血小板または樹状細胞または制御性T細胞へ分化誘導した後に、直接注射するか点滴で移植することにより、造血幹細胞移植後や抗ガン化学療法後の免疫回復、抗ガン細胞治療、自己免疫疾患細胞治療、リューマチ治療、多発性硬化症治療、再生不良性貧血などの貧血治療、血小板減少症治療、外傷治療などへ利用できる。また、間葉系幹細胞を得た場合には、点滴かカテーテルなどを用いて移植することにより、移植片対宿主病（GvHD）の治療、あるいは関節障害の治療などへ利用できる。
【００３９】
同様に、神経系では、例えば体細胞からのリプログラミングによりドーパミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどを用いて移植することによりパーキンソン病治療へ利用できる。また、例えばオリゴデンドロサイト前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより脊髄損傷治療などへ利用できる。また、例えばニューロン前駆細胞やアストロサイト前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより運動神経障害の治療などへ利用できる。また、例えばNestinやMusashiなどの分化マーカー発現で識別できる神経幹細胞や神経前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより脳梗塞や脳出血治療などへ利用できる。
【００４０】
同様に、動静脈などの血管・リンパ管系、心筋・平滑筋・骨格筋・オーバル細胞などの筋組織系、膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系、表皮・真皮・毛髪などの皮膚系、角膜などの視覚系、内耳などの聴覚系などにおける治療用細胞を得ることもできる。
【００４１】
例えば、腸系では、クリプト細胞などの腸前駆細胞を得た場合には、これをカテーテルなどを用いて移植することにより、潰瘍性大腸炎、クローン病、短腸症などの治療へ利用できる。
【００４２】
視覚系では、例えば体細胞からリプログラミングにより網膜前駆細胞や網膜色素上皮細胞や視細胞を得た場合には、これを直接注入あるいは細胞シート化して移植することにより加齢黄斑変性症や網膜色素変性症の治療へ利用できる。
【００４３】
膵臓系では、例えばβ細胞やインスリン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどを用いてあるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。
【００４４】
肝臓系では、例えばアルブミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどを用いてあるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療などへ利用できる。また、例えば血液凝固因子産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどを用いてあるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療や血友病などの先天性遺伝病などへ利用できる。
【００４５】
体細胞をリプログラミングしてｉＰＳ細胞を得た場合には、上記と同様に、インビトロ分化系などにより目的の治療用細胞の製造に利用することができる。以上、例えば、高橋ら、実験医学 vol.26 No.5（増刊）、2008年（羊土社）；再生医療  第７巻  第３号  2008年（メディカルレビュー社）；および医学のあゆみ  vol.229 No.9 2009年（医歯薬出版株式会社）を参照のこと。
【００４６】
本発明に従ってリプログラミングした細胞はまた、治療用再生組織、器官、臓器の材料としての利用が可能である。例えば、体細胞をリプログラミングして組織幹細胞やその前駆細胞、あるいはｉＰＳ細胞を得た場合には、これらの細胞を用いてインビトロまたはインビボにおいて目的の治療用組織または器官を誘導・構築し、これを移植に用いることができる（例えば、高橋ら、実験医学 vol.26 No.5（増刊）、2008年（羊土社）；再生医療  第７巻  第３号  2008年（メディカルレビュー社）；および医学のあゆみ  vol.229 No.9 2009年（医歯薬出版株式会社）を参照のこと）。
【００４７】
例えば、心筋細胞、あるいはislet-1遺伝子などを発現する心筋前駆細胞やnkx-2.5遺伝子、gata-4遺伝子などの心筋分化関連マーカー因子を発現する細胞を誘導し、これをカテーテルなどを用いて直接移植する他、誘導した心筋細胞などをシート化・積層化して移植することにより、心筋梗塞などの心不全や拡張型心筋症などの心臓疾患に適用することができる。細胞のシート化・積層化は、例えば温度感受性培養皿などを利用して行うことができる。また、誘導した心筋細胞に加えて血管内皮細胞を混合して細胞シート化・積層化することにより、血管網が再構築された細胞積層シートを作ることができる。
【００４８】
同様に、例えば脂肪細胞や骨髄細胞や血球細胞などの体細胞から間葉系幹細胞を得た場合、軟骨細胞を誘導し、これをカテーテルなどを用いて直接移植する他、誘導した軟骨細胞などを高分子支持担体とともに移植することにより、軟骨や骨組織を再構築や関節障害の治療へ適用できる。
【００４９】
同様に、例えば膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系、表皮・真皮・毛髪などの皮膚系、内耳などの聴覚系などにおける治療用組織を高分子支持担体などを利用して培養することにより得ることもできる。
【００５０】
例えば、肝臓組織を誘導して得た場合は、肝癌、肝硬変、急性肝不全や、ヘモクロマトーシスなどの肝代謝障害の治療へ利用できる。
【００５１】
平滑筋・骨格筋などの筋組織系を誘導して得た場合には、これを直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより、筋ジストロフィー治療などへ利用できる。
【００５２】
肺細胞組織を得た場合、これを患部へ移植することにより嚢胞性線維症や喘息などの肺呼吸器疾患治療へ利用できる。
【００５３】
腎臓系では、メサンギウム細胞や尿細管上皮細胞、糸球体細胞など含む組織を得た場合、これを直接移植することにより、腎不全や腎炎の治療や透析治療などへ利用できる。
【００５４】
動静脈などの血管・リンパ管系では、細胞シート化または高分子支持担体などを用いて血管を構築し、これを直接移植することにより、冠動脈大動脈バイパス移植などの心臓疾患治療、下肢虚血性疾患治療、虚血性心疾患治療などへ利用できる。
【００５５】
さらに、本発明に従ってリプログラミングした細胞は、創薬研究ツールとしての利用が可能である。例えば、ヒト体細胞をリプログラミングしてヒト組織幹細胞やその前駆細胞、あるいはｉＰＳ細胞を得た場合には、これらの細胞を用いて目的の分化状態の細胞、または組織もしくは器官を誘導し、これを被検物質の薬効・毒性評価や作用メカニズムの解明、あるいは生物現象メカニズムの解析に用いることが可能である（例えば、高橋ら、実験医学 vol.26 No.5（増刊）、2008年（羊土社）；再生医療  第７巻  第３号  2008年（メディカルレビュー社）；および医学のあゆみ  vol.229 No.9 2009年（医歯薬出版株式会社）を参照のこと）。
【００５６】
また、本発明は、遺伝子組換え体製剤を製造する細胞への応用も可能である。すなわち、本発明のリプログラミング法により、ホルモン、代謝酵素などを産生する細胞を得た場合、これを治療用タンパク質の製造細胞とすることができる。例えば、肝臓系の、物質代謝が可能な細胞を得ることにより、アルブミン産生細胞、血液凝固因子産生細胞、α１アンチトリプシンなどの代謝酵素産生細胞を作製し、産生した代謝酵素を直接注射するか点滴投与することにより、これらのタンパク質の欠乏症の治療に用いることができる。例えばβ細胞などの、物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、インスリン産生細胞を作製し、産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。さらに、得られた細胞へ所望の外来遺伝子を導入することにより、遺伝子組換え体を付加する治療用タンパク質製剤の製造細胞とすることができる。同様に、産生タンパク質に機能付加したり分泌能力を高める機能遺伝子を細胞に導入することにより、該細胞の物質生産能力を高めることができる。
【００５７】
さらに、本発明に従ってリプログラミングした細胞は、遺伝子治療への利用が可能である。例えば、ヒト体細胞をリプログラミングしてヒト組織幹細胞やその前駆細胞、あるいはｉＰＳ細胞を得た場合には、これら細胞へ治療用遺伝子を導入し、目的の分化状態の細胞、または組織もしくは器官を誘導し、カテーテル、免疫遮断デバイス、点滴などを用いて移植することにより、疾患の治療が可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞またはヒト皮膚前駆細胞を得た場合には、血液凝固第８因子の遺伝子を導入し、得られた細胞を血友病治療に適用できる。この場合、治療できる疾患は、単一遺伝子病（例えば、HUMAN GENE TRANSFER PROTOCOLS Last updated: 11-18-08 (NIH遺伝子治療臨床プロトコール一覧)p150、Monogenic diseasesの項を参照のこと）、あるいはその他の疾患（例えば、HUMAN GENE TRANSFER PROTOCOLS Last updated: 11-18-08 (NIH遺伝子治療臨床プロトコール一覧)p150、other diseases/disordersの項#1〜#23、およびCancerの項#1〜#13を参照のこと）である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５９】
実施例１：４因子連結ベクターの構築
（１）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４の遺伝子の連結
図１に示す７種類の４因子連結カセット：ＳＫｔＭＯ、ＭＫｔＳＯ、ＭＫｉｒｅｓＳＯ、ＳＯｉｒｅｓＭＫ、ＳＫｉｒｅｓＭＯ、ＭＯｉｒｅｓＳＫ、およびＭＫｔＯＳを以下の手順で作製した。【００６０】
各遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、Takahashi et al., Cell, 2006, 126:663-676の記載に従ってＰＣＲクローニングした。ｃＭｙｃとしては、活性化型であるｃＭｙｃＴ５８Ａを採用した。遺伝子ＯＲＦの連結のための介在配列としては、ｃＭｙｃとＫｌｆ４の間およびｃＭｙｃとＯｃｔ４の間では、細胞内プロテアーゼであるFurinの認識配列の３’側にＥ２Ａ配列をつなげた配列（以下「Ｆｕ−Ｅ２Ａ」という）を用い、その他の因子間では、Furinの３’側にＴ２Ａ配列をつなげた配列（以下「Ｆｕ−Ｔ２Ａ」という）を用いた（図２）。【００６１】
例として、ＳＫｔＭＯおよびＳＫｉｒｅｓＭＯ連結カセットの概要を図３に、ＳＫｔＭＯ連結カセットの全塩基配列を図４に示す。【００６２】
ＳＫｔＭＯ連結カセットの場合、５’側から１番目（ｓｏｘ２）と２番目（Ｋｌｆ４）の遺伝子は、１番目のＯＲＦから終止コドンを削除し、その３’側にインフレームでＦｕ−Ｔ２Ａを連結し、Ｆｕ−Ｔ２Ａの３’側にＢｇｌＩＩ部位を付加し、２番目のＯＲＦの５’側にＢａｍＨＩ部位を付加し、これらの制限酵素で消化し、得られた断片を結合させることによりインフレームで連結した。３番目（ｃＭｙｃ）と４番目（Ｏｃｔ４）の遺伝子の連結も、Ｆｕ−Ｔ２Ａの代わりにＦｕ−Ｅ２Ａを用いて同様に行い、Ｏｃｔ４のＯＲＦの３’末端には終止コドンを配置した。２番目と３番目のＯＲＦ間は、図３に示すとおりに連結した。以上により、４遺伝子のＯＲＦをインフレームで連結した。【００６３】
ＳＫｉｒｅｓＭＯ連結カセットの場合、１番目と２番目のＯＲＦの連結および３番目と４番目のＯＲＦの連結は、ＳＫｔＭＯ連結カセットと同様に行った。ただし、２番目のＯＲＦの３’末端には終止コドン−ＮｏｔＩ部位を配置した。ＩＲＥＳとの連結は、上記終止コドンの３’側のＮｏｔＩ部位およびＩＲＥＳの５’側に配置したＸｈｏＩ部位を平滑末端化して行った。その他は、図３に示すとおりに連結した。【００６４】
他の５種の４因子連結カセットについても、ＳＫｔＭＯおよびＳＫｉｒｅｓＭＯ連結カセットの場合と同様にして作製した。ＩＲＥＳ配列はＥＭＣＶ由来ＩＲＥＳ（インビトロジェン社）を参照して作製した。【００６５】
次いで、上記で作製した連結カセットをｐLN1EPOｗｂベクター中にサブクローニングした。ｐLN1EPOｗｂベクターは、ｐLN1EPO（Kakeda et al., Gene Therapy, 2005, 12: 852-856）にＷＰＲＥ（Woodchack post transcriptional regulatory element）配列を挿入し、ＳＶ４０ポリＡ配列（ｐＡ）をＢＧＨｐＡに置換することにより作製した。サブクローニングにより得られたベクターを、それぞれｐｍＳＫｔＭＯ、ｐｍＭＫｔＳＯ、ｐｍＭＫｉｒｅｓＳＯ、ｐｍＳＯｉｒｅｓＭＫ、ｐｍＳＫｉｒｅｓＭＯ、ｐｍＭＯｉｒｅｓＳＫ、およびｐｍＭＫｔＯＳと命名した。【００６６】
（２）４因子連結カセットを導入したレトロウイルス（ＲＶ）ｐＭＸｓベクターの作製
実施例１（１）で作製した４因子連結カセットベクターをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化することにより、４因子連結カセットを調製し、ｐＭＸｓベクター（東京大学北村俊雄教授より供与；Takahashi et al., Cell, 2006, 126: 663-676）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位間へ挿入した。得られたベクターを、それぞれｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯ、ｐＭＸｓ−ＳＫｉｒｅｓＭＯ、ｐＭＸｓ−ＭＯｉｒｅｓＳＫ、ｐＭＸｓ−ＭＫｔＳＯ、ｐＭＸｓ−ＭＫｉｒｅｓＳＯ、ｐＭＸｓ−ＳＯｉｒｅｓＭＫ、およびｐＭＸｓ−ＭＫｔＯＳと命名した。【００６７】
一方で、コントロール用として、各因子のＯＲＦのみをｐＭＸｓベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位間へ挿入したベクターを作製した。また、レトロウイルス（ＲＶ）ベクターの導入効率をみるために、ＩＲＥＳ−ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＬａｃＺをｐＭＸｓベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位間へ挿入したベクターを作製した。【００６８】
実施例２：レトロウイルス（ＲＶ）ベクターによるマウス骨髄単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣ）のリプログラミング
（１）連結４因子ＳＫｔＭＯによるｍＢＭＭＮＣのリプログラミング
細胞のリプログラミングは、実施例１（２）で作製した７種の連結４因子導入ｐＭＸｓベクターのうち、ｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯを導入した場合にのみ成功した。この実験の詳細を以下に示す。【００６９】
上記７種の連結４因子導入ｐＭＸｓベクターを、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス由来ｍＢＭＭＮＣ（要時調製）１×１０５個へ、レトロネクチン（タカラバイオ社）を用いて感染・導入し、マウスＥＳ細胞の培養法に準じて培養し、細胞リプログラムを試みた。細胞リプログラムの進行は、細胞質のＧＦＰ発現を指標とし、蛍光顕微鏡により検出・判定した。ＲＶベクター感染から、フィーダー細胞であるマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）上へ播種するまでのレトロネクチンコートプレート中での培養は、サイトカイン（マウス幹細胞因子：ｍＳＣＦ、マウスインターロイキン−３：ｍＩＬ−３、ヒトトロンボポエチン：ｈＴＰＯ、各１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で行った。また、ＳＫｔＭＯ ＲＶベクター感染後１２日目において、ＭＥＦを培養ウェル中へ再添加した。その他の方法の詳細を以下に示す。【００７０】
ｍＢＭＭＮＣの調製は、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（１０〜２４週齢）（横浜市立大学 大保和之准教授より供与；K. Ohbo et al., Dev. Biol., 258,  pp.209-225, 2003）の大腿骨内の骨髄を採取し、比重遠心法により行った。【００７１】
遺伝子導入用のＲＶベクター濃縮サンプルは、次のとおり調製した。コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュに５×１０６個のＲＶパッケージング用細胞：ＰＬＡＴ−Ｅ細胞（東京大学北村俊雄教授より供与；S.Morita et al., Gene Therapy, 7, pp.1063-1066, 2000）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、各連結因子およびコントロール用ＲＶベクター１種のそれぞれについて、１００ｍｍディッシュ１枚を用い、プラスミド９μｇをＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入することにより、ＲＶベクターの導入を行った。
遺伝子導入の約４８時間後に培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過後、ｍＢＭＭＮＣへのＲＶベクター１感染反応あたり培養上清の３分の２量を分注し、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心した。コントロールは、各因子４種の培養上清を分注する際に混合し、遠心調製した。ペレットをＲＶベクター１感染反応あたり０．７５ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁し、これをＲＶベクター濃縮サンプルとした。マウスＥＳ細胞用培地としては、２０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に１／１００容の２-メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）、１０００ ＩＵ／ｍｌマウスＬＩＦ（１／１００００容のＥＳＧＲＯ；フナコシ社）を添加したものを用いた。【００７２】
その後、ｍＢＭＭＮＣへのＲＶベクター感染のために、レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの１ウェルに上記ＲＶベクター濃縮サンプルを添加し、１０００×ｇ、１８℃で２時間遠心した後、マウスＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびマウスＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む新たなマウスＥＳ細胞用培地０．２５ｍｌに懸濁したｍＢＭＭＮＣ１×１０５個を添加した。これを室温で５分間遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。【００７３】
ＲＶベクターの導入効率は、ＲＶベクター感染後２日目において、コントロール用ＲＶベクターのＧＦＰ発現を指標とするＦＡＣＳ解析によって調べた。その結果、ｐＭＸｓ−ｉｒｅｓＧＦＰベクター（タグなし単因子対照用）で４７％、ｐＭＸｓ−ＧＦＰｉｒｅｓＬａｃＺベクター（連結４因子対照用）で８．７％であった。【００７４】
ｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯベクターをＯｃｔ４−ＧＦＰマウス由来ｍＢＭＭＮＣへ導入した連結４因子ＳＫＭＯ導入群では、感染後１３日目においてＯｃｔ４−ＧＦＰ発現が確認された（図５）。さらに培養を継続した結果、感染後１５日目においてＥＳ細胞様のコロニー形成が確認された（図５）。【００７５】
また、ｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯベクター感染後１３日目において、連結４因子ＳＫＭＯ導入群では、従来法であるタグなし単因子ＲＶベクターを４種類調製し、混合して遺伝子導入したコントロール群（以下「Ｎｏ ｔａｇ群」という）と比べて、ウェル中のＧＦＰ陰性細胞が顕著に低減した（図６）。さらに、これらウェル中の細胞をＦＡＣＳ解析し、ソーテイングした結果、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞は、解析細胞中の１０．５％であり、従来法であるＮｏ ｔａｇ群の場合（２．６％）と比べて約４倍（ＦＡＣＳ解析）に増加・濃縮し、効率よく分画・分取できた（図７ａ）。さらに、リプログラムされた細胞（Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞）は、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陰性細胞とは大きさ・形態（ＦＳＣ，ＳＳＣ）でより均質な細胞群として分離された（図７ｂ）。【００７６】
以上の結果より、(i)連結４因子ＳＫｔＭＯは、１種のＲＶベクターｐＭｘ−ＳＫｔＭＯにより、ＥＳ細胞様のコロニー形成能を保持する、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ発現する細胞リプログラミングできること、ならびに(ii)連結４因子ＳＫｔＭＯによりリプログラムされたＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞は、ＦＡＣＳ上で均質な細胞集団として分離され、従来法であるＮｏ ｔａｇ群と比べて４倍の効率で分画・分取できることが示された。【００７７】
（２）連結４因子ＳＫｔＭＯとＯｃｔ４との組合せによるｍＢＭＭＮＣのリプログラミング
ｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯベクターに加えて、さらに１遺伝子ＯＲＦのｐＭＸｓベクターを用いた遺伝子導入による細胞リプログラムを試みた。方法は、実施例２（１）に従い、独立に３セットの実験を行った。その結果、全ての実験回において、ｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯベクターとｐＭＸｓ−Ｏｃｔ４ベクターとの組み合わせを用いることにより、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞はＲＶベクター感染後３日目から出現し、増殖した。さらに、感染後１６日目からＥＳ様コロニー形成が確認された。ｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯベクターのみを用いた場合は、感染後４日目においてもＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞を殆ど検出できなかった。感染後４日目の写真を図８に示す。【００７８】
一方で、Ｏｃｔ４に換えて他の因子：Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４のＯＲＦを各々導入したｐＭＸｓベクターのそれぞれをｐＭＸｓ−ＳＫｔＭＯと組み合わせた場合には、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性細胞の誘導促進は認められなかった。ＲＶベクター感染後２日目におけるコントロール用ＲＶベクターの導入効率は、ｐＭＸｓ−ｉｒｅｓＧＦＰベクター（単因子対照用）で５２．４±４．４５％、ｐＭＸｓ−ＧＦＰｉｒｅｓＬａｃＺベクター（連結４因子対照用）で５．６１±１．４８％であった。【００７９】
以上より、連結４因子ＳＫｔＭＯとＯｃｔ４との組み合わせを用いることにより、ＳＫｔＭＯのみの場合と比べて９日早く細胞リプログラミングを達成できることが明らかとなった。【００８０】
実施例３：ＣＨＯ細胞における連結４因子の発現プロセシングの確認
連結４因子の発現プロセシングを確認するために、実施例１（１）で作製した連結４因子ベクター：ｐｍＳＫｔＭＯ、ｐｍＭＫｔＳＯ、ｐｍＭＫｉｒｅｓＳＯ、ｐｍＳＯｉｒｅｓＭＫ、ｐｍＳＫｉｒｅｓＭＯおよびｐｍＭＯｉｒｅｓＳＫを、ＣＨＯ細胞で一過的に発現させ、ウェスタンブロット解析を行った。【００８１】
ベクター導入は、Lipofectamine2000（インビトロジェン社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。培養は、１２穴プレートを用いて２．４×１０５個のＣＨＯ細胞をトランスフェクションの前日に播種して行った。【００８２】
ベクター導入後４８時間で細胞を回収し、ＤＴＴを含む１×ＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。タンパク質濃度をＥＺＱ Protein Quantitationキット（R33200：インビロトジェン社）により定量し、各サンプル１０μｇを用いてウエスタンブロット解析を行った。ブロッテイングはセミドライ法により行った。検出１次抗体としては、抗Ｏｃｔ３／４（Ｈ−１３４）ウサギポリクロナール抗体（SC-9081：Santa Cruz Biotechnology社）、抗Ｓｏｘ２ウサギポリクロナール抗体（AB5603：Chemicon International社）、抗ｃＭｙｃウサギポリクロナール抗体（PA1-25363：Affinity BioReagents社）、抗Ｋｌｆ４ヤギポリクロナール抗体（AF3158：R&D systems社）を用いた。２次抗体としては、検出１次抗体作製動物由来のＩｇＧに対するＨＲＰ標識抗体を使用した。シグナル検出には、ECL plus（ＧＥヘルスケア社）を使用した。【００８３】
その結果、全てのコンストラクトにおいて予測されるバンドパターンが検出された（図９）。例えば、ＳＫｔＭＯでは、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４についてはＦｕ−２Ａ配列が付加されたサイズのバンドが検出され、Ｏｃｔ４についてはＦｕ−２Ａ配列が付加されていないサイズのバンドが検出された。これらのことから、連結４因子の発現プロセシングが正しく行われていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図７】
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【図５】
0005557288.tif 000009
【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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