(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
略平行に対向した上面及び下面とこれらの面に連続する側面とからなる柱体形状に成形され、上面及び下面の少なくとも一方に識別パターンが形成され、かつ、検出対象物質に親和性を有する物質が表面に固相化されたマイクロビーズを解析する方法であって、
表面が凹凸処理された測定基板に前記マイクロビーズを上面又は下面が接触する状態で載置する手順と、
測定基板面に対向して配設された画像取得手段によってマイクロビーズの蛍光像を取得し、前記検出対象物質と前記検出対象物質に親和性を有する物質との相互作用に起因してマイクロビーズ表面において検出される蛍光を、前記上面及び前記下面のうち前記識別パターンが形成されていない領域と、輪郭領域と、を含み、前記識別パターンが形成されている領域を含まない領域から検出する手順と、を含むマイクロビーズ解析方法。
【請求項２】
さらに、前記画像取得手段によって前記識別パターンを含むマイクロビーズの透過像を取得し、該透過像から識別パターンを検出する手順を含む請求項１に記載のマイクロビーズ解析方法。
【請求項３】
さらに、前記マイクロビーズを前記検出対象物質と混合する手順を含む請求項１又は２に記載のマイクロビーズ解析方法。
【請求項４】
略平行に対向した上面及び下面とこれらの面に連続する側面とからなる柱体形状に成形され、上面及び下面の少なくとも一方に識別パターンが形成され、かつ、検出対象物質に親和性を有する物質が表面に固相化されたマイクロビーズの解析に供されるマイクロビーズ解析装置であって、
表面に凹凸処理がなされている測定基板と、
前記測定基板と対向して配設されている、マイクロビーズの透過像及び蛍光像を撮像する画像取得手段と、
透過像から識別パターンを検出する手段と、
蛍光像において、前記マイクロビーズの上面及び下面のうち識別パターンが形成されていない領域と、輪郭領域と、を含み、前記識別パターンが形成されている領域を含まない領域からの蛍光を検出する手段と、を備えるマイクロビーズ解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロビーズ解析方法及びマイクロビーズ解析装置に関する。より詳しくは、個々のビーズを画像識別するためのパターンが形成されたマイクロビーズを用いたマイクロビーズ解析等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸やタンパク等を対象とした生化学分析において、従来、「マイクロビーズ」と称される粒子状担体が用いられている。例えば、核酸分析においては、ターゲット核酸鎖に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸鎖を表面に固相化したマイクロビーズを用い、ターゲット核酸鎖をプローブ核酸鎖との相互作用に基づいて分離することが行われている。また、タンパク分析では、ターゲットタンパクに対する抗体を表面に固相化したマイクロビーズを用いて、同様にターゲットタンパクを分離することが行われている。
【０００３】
マイクロビーズ表面に捕捉、分離されたターゲット核酸鎖あるいはターゲットタンパクは、これらを予め蛍光物質で標識しておくことによって光学的に検出することができる。また、ビーズ表面の蛍光強度を測定すれば、分離されたターゲット物質を定量することもできる。ターゲット物質が核酸鎖である場合には、ターゲット核酸鎖とプローブ核酸鎖の相互作用によって形成されるハイブリッド鎖間に取り込まれて蛍光を発するインターカレータを用いて、分離されたターゲット核酸鎖を光学的に検出することも行われている。
【０００４】
近年、これらのマイクロビーズを用いた生化学分析では一層のハイスループット化が求められており、分析の高速化を図るための技術が種々開発されてきている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、「試料内の多数の分析物であり、それぞれの分析反応物によって認識される分析物を検出する方法であって、ａ）集団のそれぞれが異なる蛍光シグナル及び異なる分析反応物を有する蛍光粒子の集団であり、前記分析反応物が特異的に試料内の１つの分析物に結びつき、前記各蛍光粒子がそれぞれの蛍光染料で標識された少なくとも１つのナノ粒子を表面に有してなる蛍光粒子の集団を多数、試料と接触させ、ｂ）標識試薬へ前記試料を加え、ｃ）前記標識を検出することにより、前記分析反応物が分析物に結びついたことを示す前記蛍光粒子を分析し、同時に、ｄ）前記各集団に関連付けられた前記異なる蛍光シグナルの機能から、それぞれの分析物と結びついた前記蛍光粒子の集団を決定すること、を含んでなる方法。」（請求項２３参照）が開示されている。
【０００６】
この技術に基づきLuminex社が提供する「Suspension Array Technology」では、２種類の蛍光色素を発光の色味に変化を持たせてマイクロビーズに標識することにより、最大１００種類のマイクロビーズを識別することが可能である。「Suspension Array Technology」によれば、１００種類のマイクロビーズにそれぞれ異なるプローブ核酸鎖や抗体を固相化することによって、一回の分析で100種類の異なるターゲット核酸鎖やターゲットタンパクを同時に分析することができる。
【０００７】
また、上記文献には、「前記蛍光粒子の集団がさらに、それらのサイズと形状によって決定される」（請求項２５参照）と記載され、マイクロビーズを識別するための追加的なパラメータとして、ビーズのサイズや形状を採用できる旨が開示されている（当該文献段落００３７等参照）。
【０００８】
これに関連して、非特許文献１には、マイクロビーズに画像識別可能なドットコードを形成する技術が開示されている。この技術によれば、１００万種類を超える超多型状のマイクロビーズを作製することができる。この文献には、流路中でのフォトリソグラフィーを用いて、ビーズの楕円表面の半分にドットコードを形成し、もう半分にプローブ核酸鎖を固相化したマイクロビーズを作製したことが記載されている（当該文献図１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３４６８７５０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】“Multifunctional encoded particles for high-throughput biomolecule analysis.” Science, 2007, Vol.315, No.5817, p.1393-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ドットコードのような識別パターンを形成したマイクロビーズでは、ビーズ表面に分離されたターゲット物質に標識された蛍光物質やインターカレータから発生する蛍光を検出する際に、識別パターンそのものから蛍光が発生することがある。このような識別パターンに起因した蛍光は、ビーズ表面の蛍光強度に基づいてターゲット物質の量を測定しようとするときに、ノイズ蛍光となり測定誤差の要因となる。
【００１２】
さらに、各マイクロビーズにはパターン形状の異なる多数の識別パターンを形成しているため、パターン形状の違いによって各ビーズで発生するノイズ蛍光の強度にばらつきが生じる場合がある。この場合には、ビーズごとにノイズ蛍光の影響を補正して、ターゲット物質の量を算出する処理が必要となり、解析速度が低下する原因となる。
【００１３】
非特許文献１に開示されるマイクロビーズでは、ドットコードを形成する領域とプローブ核酸鎖を固相化する領域をビーズの楕円表面の半分ずつに分けて設けている。このマイクロビーズでは、プローブ核酸鎖が固相化された領域のみからの蛍光を検出することで、識別パターンに起因したノイズ蛍光の影響を受けることなく、ターゲット核酸鎖に標識された蛍光物質からの蛍光を検出できる可能性もある。ただし、当該文献には、この可能性についての言及はなされていない。
【００１４】
しかしながら、このようなドットコード形成領域とプローブ核酸鎖固相化領域とを分けたマイクロビーズを形成するためには、非常に複雑な作製工程が必要となる。すなわち、ドットコード形成領域となるモノマー層流とプローブ核酸鎖固相化領域となる層流を接触させた状態で流路に流し、ドットコード形成領域のモノマー層流に紫外線を照射してフォトリソグラフィーを行う工程が必要である（当該文献図１参照）。また、ドットコード形成領域とプローブ核酸鎖固相化領域とを作り分けることによって、マイクロビーズ全体のサイズが大きくなってしまうという問題もある。
【００１５】
そこで、本発明は、複雑な作製工程を要さず、ターゲット物質に標識された蛍光物質等からの蛍光を、識別パターンに起因したノイズ蛍光の影響を排除して高精度に検出できるマイクロビーズ解析方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題解決のため、本発明は、略平行に対向した上面及び下面とこれらの面に連続する側面とからなる柱体形状に成形され、上面及び下面の少なくとも一方に識別パターンが形成され、かつ、検出対象物質に親和性を有する物質が表面に固相化されたマイクロビーズを解析する方法であって、表面が凹凸処理された測定基板に前記マイクロビーズを上面又は下面が接触する状態で載置する手順と、測定基板面に対向して配設された画像取得手段によってマイクロビーズの蛍光像を取得し、前記検出対象物質と前記検出対象物質に親和性を有する物質との相互作用に起因してマイクロビーズ表面において検出される蛍光を、前記上面及び前記下面のうち前記識別パターンが形成されていない領域と、輪郭領域と、を含み、前記識別パターンが形成されている領域を含まない領域から検出する手順と、を含むマイクロビーズ解析方法を提供する。
上記領域からの蛍光を検出することにより、識別パターンに起因した蛍光ノイズを排除して高い強度の蛍光を検出することができる。
また、マイクロビーズを上記のように方向付けして測定基板上に保持することで、画像取得手段により撮像される透過像に確実に識別パターンが含まれるようにできる。
さらに、前記マイクロビーズ解析方法は、前記画像取得手段によって前記識別パターンを含むマイクロビーズの透過像を取得し、該透過像から識別パターンを検出する手順を含んでいてもよく、前記マイクロビーズを前記検出対象物質と混合する手順を含んでいてもよい。
マイクロビーズを前記測定基板上に載置することで、干渉縞の発生がない透過像及び蛍光像を取得することができる。
【００１７】
本発明は、併せて、略平行に対向した上面及び下面とこれらの面に連続する側面とからなる柱体形状に成形され、上面及び下面の少なくとも一方に識別パターンが形成され、かつ、検出対象物質に親和性を有する物質が表面に固相化されたマイクロビーズの解析に供されるマイクロビーズ解析装置であって、表面に凹凸処理がなされている測定基板と、前記測定基板と対向して配設されている、マイクロビーズの透過像及び蛍光像を撮像する画像取得手段と、透過像から識別パターンを検出する手段と、蛍光像において、前記マイクロビーズの上面及び下面のうち識別パターンが形成されていない領域と、輪郭領域と、を含み、前記識別パターンが形成されている領域を含まない領域からの蛍光を検出する手段と、を備えるマイクロビーズ解析装置をも提供する。
【００１８】
本発明において、「識別パターン」とは、マイクロビーズに形成される所定の形状であって、ＣＣＤカメラ及び画像解析ソフトウェア等から構成される汎用の画像識別手段によって識別可能な形状をいう。識別パターンは、個々のマイクロビーズを他と区別して認識するための形状であり、具体的な形や大きさ等は特に限定されない。識別パターンの具体例としては、いわゆるドットコートやバーコードなどが挙げられる。
【００１９】
また、本発明において、「検出対象物質」は、マイクロビーズを用いた生化学分析において従来分析対象とされている核酸やタンパク、ペプチド等の化合物を広く含むものとする。検出対象物質は、例えば、ステロイドホルモンやカテコールアミンなどの生体内小分子や、小胞体やミトコンドリア等の細胞内小器官や、ウイルス、細菌や哺乳類細胞等の各種細胞などとすることもできる。
「検出対象物質に親和性を有する物質」には、検出対象物質と相互作用し、検出対象物質に親和性をもって結合し得る核酸やタンパク、ペプチド、糖鎖、各種合成化合物あるいは天然化合物等の化合物が広く包含されるものとする。
【００２０】
検出対象物質と検出対象物質に親和性を有する物質の組み合わせとしては、例えば「核酸−核酸」、「タンパク（あるいはペプチド）−タンパク（抗体も含む）」、「タンパク（あるいはペプチド）−核酸（アプタマー）」、「タンパク−糖鎖」が挙げられる。「核酸−核酸」の組み合わせの場合、「相互作用」とは、相補的な塩基配列を有する核酸間の二本鎖形成である。また、「タンパク−タンパク」の組み合わせの場合、「相互作用」とは、例えば受容体タンパクとリガンドタンパクとの結合や、抗原タンパクと抗体との結合のようなタンパク質間結合である。
【００２１】
なお、糖鎖とは、単糖の結合鎖やこの結合鎖に脂質やタンパク質がさらに結合したものを意味し、オリゴ糖や糖脂質、糖タンパク質などを含む。また、核酸には、DNAやRNAの他、これらのリボース部分やリン酸バックボーン部分の構造を改変して得られる核酸類似体（例えば、LNA（Locked Nucleic Acid）やPNAなど）等も含み得るものとする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、複雑な作製工程を要さず、標的物質に標識された蛍光物質等からの蛍光を、識別パターンに起因したノイズ蛍光の影響を排除して、高精度に検出できるマイクロビーズ解析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に係るマイクロビーズ解析方法で用いられるマイクロビーズの一例を説明する模式図である。（A）は上面図、（B）は側面図である。
【図２】マイクロビーズのコード領域に形成された識別パターンを説明する模式図である。
【図３】マイクロビーズの表面に固相化されたプローブ物質を説明する模式図である。
【図４】識別パターンが形成されたマイクロビーズの透過像及び蛍光像の一例を説明する図面代用写真である。（Ａ）は透過像、（Ｂ）は蛍光像である。
【図５】本発明に係るマイクロビーズ解析装置（第１例）の概略構成を説明する模式図である。
【図６】本発明に係るマイクロビーズ解析装置の測定基板の構成を説明する模式図である。
【図７】蛍光検出手段による蛍光検出領域を説明する模式図である。
【図８】本発明に係るマイクロビーズ解析装置（第２例）の概略構成を説明する模式図である。
【図９】識別パターンが形成されたマイクロビーズの透過像及び蛍光像の他の例を説明する図面代用写真である。（Ａ）は透過像、（Ｂ）は蛍光像である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．マイクロビーズ
（１）識別パターン
（２）プローブ物質
（３）マイクロビーズの作製方法
（i）製膜工程
（ii）成形工程
（iii）剥離工程
（iv）プローブ物質固相化工程
２．マイクロビーズ解析方法（第１例）
（１）マイクロビーズ解析方法の概要
（２）マイクロビーズ解析装置（第１例）
（３）マイクロビーズ解析方法の具体的手順
（i）反応手順
（ii）保持手順
（iii）検出手順
（a）識別パターンの検出
（b）蛍光の検出
３．マイクロビーズ解析方法（第２例）
（１）マイクロビーズ解析装置（第２例）
（２）マイクロビーズ解析方法の具体的手順
（i）通流手順
（ii）検出手順
（a）識別パターンの検出
（b）蛍光の検出
【００２５】
１．マイクロビーズ
（１）識別パターン
本発明に係るマイクロビーズ解析方法では、表面に、識別パターンが形成され、検出対象物質に親和性を有する物質が固相化されたマイクロビーズを用いる。図１に、本発明に係るマイクロビーズ解析方法で用いられるマイクロビーズの一例を示す。図１（Ａ）は、上面模式図、図１（Ｂ）は側面模式図である。
【００２６】
図１中、符号１で示すマイクロビーズは、略平行に対向した上面１１及び下面１２とこれらの面に連続する側面１３とからなる柱体形状に成形されている。ここでは、上面１１及び下面１２を上方視円形として、マイクロビーズ１全体を円柱形状とした場合を例に説明するが、本発明で用いられるマイクロビーズは、三角柱形状や四角柱形状あるいはその他の多角柱形状であってよい。ただし、後述する方法に従って識別パターンを含む透過像を取得するため、上面１１及び下面１２が略平行に対向する柱体形状に成形されていることが必要である。
【００２７】
マイクロビーズ1の厚みＨ及び上面１１（あるいは下面１２）の径Ｄは、適宜設定され得るが、厚みＨを径Ｄより小さく設定してマイクロビーズ１全体を盤形状とすることが好ましい。
【００２８】
マイクロビーズ１の上面１１及び下面１２の少なくとも一方（図１では上面１１）には、個々のビーズを画像識別するためのパターンが形成されるコード領域１１１が設けられている。上面１１のコード領域１１１以外の領域は、識別パターンが形成されていない非コード領域１１２とされている。コード領域１１１は、下面１２、あるいは上面１１と下面１２の両方に設けてもよい。
【００２９】
図２は、マイクロビーズ１のコード領域１１１に形成された識別パターンを説明する上面模式図である。ここでは、マイクロビーズ１を、異なる識別パターンを形成した３種類のマイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃから構成されるビーズセットであるものとして説明する。
【００３０】
図２（Ａ）〜（Ｃ）に示すマイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃのコード領域１１１には、ビーズの上面１１から下面１２へ貫通する貫通孔２が複数形成されている（図中、ドットパターン塗り円参照)。貫通孔２は、コード領域１１１に縦横５列ずつの計２５箇所形成され得るものであり、マイクロビーズ１を識別するための識別パターンを構成している。すなわち、マイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃでは、貫通孔２がこれら２５箇所のいずれの位置に形成されているかによって、各マイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃを識別することが可能である。
【００３１】
具体的には、図２（Ａ）に示すマイクロビーズ１Ａでは、２５箇所のうち９箇所に貫通孔２が形成されている。図中、貫通孔２が形成されている箇所はドットパターンの塗り円で、形成されていない箇所は白抜き円で示す。図２（Ｂ）に示すマイクロビーズ１Ｂでは、同じく９箇所に貫通孔２が形成されているが、その形成位置がマイクロビーズ１Ａと異なっている。従って、この貫通孔２の形成位置の違いに基づけば、マイクロビーズ１Ａとマイクロビーズ１Ｂとを識別することが可能である。
【００３２】
また、図２（Ｃ）に示すマイクロビーズ１Ｃでは、貫通孔を１０箇所に形成している。従って、この貫通孔２の形成数の違いに基づけば、マイクロビーズ１Ｃとマイクロビーズ１Ａあるいはマイクロビーズ１Ｂとを識別することが可能である。
【００３３】
コード領域１１１内に形成する貫通孔２は、０以上２５以下の任意数であってよく、２５箇所から選択される任意の位置に形成される。このように、マイクロビーズ１では、貫通孔２の形成数及び形成位置を任意に設定することで、各ビーズのコード領域１１１に異なるパターンを形成することができる。そして、このパターンを画像識別手段により検出することによって、最大で２の２５乗の種類のマイクロビーズを識別することが可能とされている。
【００３４】
なお、ここで説明した識別パターンは一例に過ぎない。本発明に用いられるマイクロビーズに形成される識別パターンは、従来公知の画像識別手段によって識別可能な形状であれば、具体的な形や大きさ等は限定されない。
【００３５】
（２）プローブ物質
マイクロビーズ１の表面には、検出対象物質に親和性を有する物質が固相化されている。図３に、マイクロビーズ１の表面に固相化された検出対象物質に親和性を有する物質を模式的に示す。以下、検出対象物質を「ターゲット物質」と、検出対象物質に親和性を有する物質を「プローブ物質」というものとする。
【００３６】
図３（Ａ）に示すマイクロビーズ１Ａの表面には、符号ＰＡで示すプローブ物質が固相化されている。プローブ物質ＰＡは、ターゲット物質に応じて、所定の塩基配列の核酸や所定のアミノ酸配列のタンパク又はペプチド、あるいは糖鎖等の化合物とされる。プローブ物質ＰＡは、マイクロビーズ１Ａ表面のうち、コード領域１１１及び非コード領域１１２の双方を含む上面１１と側面１３に少なくとも固相化されており、これらに加えて下面１２に固相化されていてもよい。なお、識別パターンを下面１２にも形成する場合には、下面１２についてもコード領域及び非コード領域の両方にプローブ物質ＰＡが固相化されていてよい。
【００３７】
プローブ物質ＰＡは、ターゲット物質を核酸とする場合には、ターゲット核酸鎖に対して相補的な塩基配列を有する核酸鎖とされる。これにより、サンプル中のターゲット核酸鎖を、プローブ物質ＰＡとのハイブリダイズ（二本鎖）形成によってマイクロビーズ１Ａ上に捕捉し、分離することができる。なお、この場合のプローブ物質ＰＡの塩基数（長さ）は任意であり、ターゲット核酸鎖の塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有し、所定のハイブリダイゼーション反応条件下で二本鎖形成が可能な限りにおいて、塩基数は特に限定されない。通常、プローブ物質ＰＡの塩基数は、数塩基〜数十塩基であり、好ましくは１０塩基〜３０塩基程度である。
【００３８】
また、プローブ物質ＰＡは、ターゲット物質をタンパクとする場合には、ターゲットタンパク（例えば、レセプタータンパク）と相互作用し得るペプチド（例えば、リガンドタンパクの一部アミノ酸配列）や抗体等とされる。これにより、サンプル中のターゲットタンパクを、プローブ物質ＰＡとの相互作用によってマイクロビーズ１Ａ上に捕捉し、分離することができる。
【００３９】
他方、図３（Ｂ）、図３（Ｃ）に示すマイクロビーズ１Ｂ，１Ｃの表面には、それぞれ符号ＰＢ，ＰＣで示すプローブ物質が固相化されている。プローブ物質ＰＢ，ＰＣも、ターゲット物質に応じて、所定の塩基配列の核酸や所定のアミノ酸配列のタンパク又はペプチド、あるいは糖鎖等の化合物とされる。マイクロビーズ１Ｂ，１Ｃにおいても、これらのプローブ物質は、コード領域１１１及び非コード領域１１２の双方を含む上面１１と側面１３に少なくとも固相化されている。
【００４０】
マイクロビーズ１Ａ表面に固相化するプローブ物質ＰＡとマイクロビーズ１Ｂ，１Ｃ表面に固相化するプローブ物質ＰＢ，ＰＣを、異なるターゲット物質に対して親和性を発揮する物質とされる。これにより、それぞれのマイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃ表面に異なるターゲット物質（ＴＡ，ＴＢ，ＴＣ）を捕捉、分離することができる。この場合、プローブ物質ＰＡ、ＰＢ，ＰＣは、例えば、配列を互いに異にする核酸やタンパク又はペプチド、あるいは抗原性の異なる抗体などとされる。
【００４１】
ターゲット物質を捕捉したマイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃは、プローブ物質ＰＡ，ＰＢ，ＰＣとターゲット物質ＴＡ，ＴＢ，ＴＣとの相互作用に基づいて蛍光を発するようになる。この蛍光は、例えば、ターゲット物質に標識された蛍光物質や、プローブ物質とターゲット物質との間に取り込まれたインターカレータから発せられるものとできる。本発明に係るマイクロビーズ解析方法は、これらの蛍光を検出すると同時に、各マイクロビーズに形成された識別パターンを画像識別手段によって識別することで、複数種類のターゲット物質を同時に分析する。
【００４２】
（３）マイクロビーズの作製方法
本発明に係るマイクロビーズ解析方法で用いられるマイクロビーズは、例えば以下の工程により作製することができる。
【００４３】
（i）製膜工程
まず、マイクロビーズの材料となる薄膜を基板上に製膜する。基板には、例えば、ガラス基板やシリコン基板などが用いられる。基板の材質は特に限定されず、通常のフォトリソグラフィー技術に用いられる材質を適宜採用し得る。
【００４４】
これらの基板に、各種のポリマーや二酸化珪素、金属（アルミニウムやクロム、金、銀など）の薄膜を製膜する。製膜は、薄膜の材料に応じて、スピンコーターやスリットコーター、吹き付け等による塗布、又は物理蒸着（ＰＶＤ）や化学蒸着（ＣＶＤ）による蒸着などの従来公知の手法によって行うことができる。薄膜の製膜厚は、作製するマイクロビーズの厚み（図１中、符号Ｈ参照）によって適宜設定される。
【００４５】
薄膜の材料には、ＳＵ−８などのエポキシ系レジストや、ポリイミド系レジスト、アクリル系レジスト、ノボラック系レジストなどのフォトレジストを好適に採用できる。ポリマーフォトレジスト薄膜を用いることで、二酸化珪素薄膜や金属薄膜に比して、低コストにマイクロビーズを作製することができ、かつ、低比重のマイクロビーズを得られる。分析時、マイクロビーズはターゲット物質を含むサンプルと混合され、液相中に分散される。このとき、マイクロビーズの比重が大きいと、液相中での分散状態を長く維持することができない。
【００４６】
さらに、ポリマーには、ＳＵ−８を採用することが特に好適となる。ＳＵ−８は、化学増幅型のエポキシベースのネガ型フォトレジストである。ＳＵ−８は、レジストの超薄膜形成技術とフォトリソグラフィー技術とを組み合わせて微細構造を形成するための材料として、米ＩＢＭ社によって開発された。
【００４７】
ＳＵ−８はスピンコートによる製膜で簡単に厚みを調整することができる。また、ＳＵ−８は高い光透過性を有し、各種溶媒や酸、アルカリに対する耐溶性と耐温性を備えている。従って、このＳＵ−８を用いることにより、様々な厚みのマイクロビーズを簡便に作製することが可能である。また、マイクロビーズの作製工程及びマイクロビーズを用いた分析工程において、安定したパフォーマンスを得ることができる。
【００４８】
（ii）成形工程
次に、製膜した薄膜をフォトリソグラフィーによって所定の形状に成形する。マイクロビーズの材料としてＳＵ−８のようなレジストを製膜した場合には、薄膜を必要に応じて加熱し固化する（プリベーク）。次に、マイクロビーズの全体形状及び識別パターン形状を描いたフォトマスク（以下、単に「マスク」ともいう）を用いて露光を行う。露光した基板を現像液に浸し、余分な部分の薄膜を除去する。さらに、リンス液（イソプロピルアルコール：IPA）ですすぎ、不要部分を完全に除去する。その後、ポストベークを行うと、基板上に残された薄膜にマイクロビーズの形状が現れる。
【００４９】
このとき、作製するマイクロビーズの識別パターン形状に応じて、マスクの形状を設計することにより、基板上に任意の識別パターン形状を有するマイクロビーズを成形することが可能となる。また、露光は、マスクレス露光機を用いて行ってもよい。
【００５０】
また、マイクロビーズの材料として二酸化珪素や各種金属を製膜した場合には、薄膜の表面に、通常使用されるレジストをスピンコートし、必要に応じてプリベークを行う。次に、上記と同様のマスクを用いて露光を行う。露光した基板を現像液に浸し、余分な部分のレジストを除去する。さらに、リンス液(主に超純水）で数回すすぎ、不要部分を除去し、ポストベークを行う。その後、薄膜をエッチングによりパターニングした後、レジストを完全に除去する。これにより、基板上に残された薄膜にマイクロビーズの形状が現れる。
【００５１】
（iii）剥離工程
成形後の薄膜を基板から剥離する。薄膜の剥離は、例えば、基板をアルカリ性又は酸性の剥離液に浸漬することにより行うことができる。また、浸漬と同時に、超音波処理を行うことで剥離を進行させてもよい。
【００５２】
剥離されたマイクロビーズは、薄膜に由来して略平行に対向する２つの面を備えた柱体形状を有する。略平行に対向する２つの面間の距離、すなわちマイクロビーズ厚み（図1中、符号Ｈ参照）は、製膜厚を調整することによって任意に設定できる。
【００５３】
（iv）プローブ物質固相化工程
続いて、薄膜を剥離して得られたマイクロビーズの表面に、プローブ物質を固相化するための官能基修飾を行う。
【００５４】
修飾する官能基は、例えば、ヒドロキシル基や、アミノ基、カルボキシル基、イソチオシアネート基、エポキシ基、マレインイミド基などであってよい。官能基による修飾は、従来、DNAチップやプロテインチップの製造において、基板表面に核酸鎖やペプチドを固相化するためのリンカーを導入するために行われている。本発明においても、同様の手法を採用し得る。
【００５５】
具体例として、ビーズ表面にヒドロキシ基を修飾する場合について説明する。この場合、まず、ビーズ表面をアミノプロピルトリエトキシシラン処理した後、ビーズをγ−バレロラクトンを溶解したジメチルホルムアミド（DMF）に浸漬し、反応させることにより、ヒドロキシル基修飾を行うことができる。又は、ビーズ表面をグリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理した後、ビーズをテトラエチレングリコールに少量の濃硫酸を添加した混合液中に浸漬し、反応させることにより行うこともできる。
【００５６】
最後に、官能基修飾を行ったビーズ表面にプローブ物質を固相化する。例えば、プローブ物質として核酸やペプチドを固相化する場合、ビーズ表面にヌクレオシド溶液又はアミノ酸溶液（以下、「モノマー溶液」と総称する）を滴下し、ビーズ上でのステップ合成によって固相化を行うことができる。
【００５７】
核酸又はペプチドのステップ合成は、所望の塩基配列又はアミノ酸配列に従って、マイクロビーズとなる部分の薄膜上に順次対応する塩基又はアミノ酸を含むモノマー溶液を滴下し、結合反応させる合成サイクルを繰り返すことによって行うことができる。
【００５８】
例えば、核酸を固相化する場合、まず、ヌクレオシドを含むモノマー溶液をピペットで滴下し、続けて5-エチルチオテトラゾール溶液を滴下して反応させる。洗浄・乾燥後、酸化溶液を滴下し、反応させて、ヌクレオシド亜リン酸トリエステルをヌクレオシドリン酸トリエステルに転化する。洗浄後、無水酢酸/テトラヒドロフラン混合溶液を滴下し反応させて、官能基修飾により導入された未反応ヒドロキシル基をキャップ化する。さらに、洗浄・乾燥後、ジクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液を滴下し、ビーズに連結されたヌクレオシドの5'-ヒドロキシル基からジメトキシトリチル保護基を除去する。この後、洗浄・乾燥を行い、以上の(a)ヌクレオシド連結、(b)洗浄、(c)酸化、(d)洗浄、(e)ジメトキシトリチル保護基の除去及び(f)洗浄の各工程を繰り返し、最後に核酸塩基部の脱保護を行う。これにより、所望の塩基配列の核酸を固相化することができる。
【００５９】
また、ペプチドを固相化する場合には、例えば、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を含むモノマー溶液を滴下し、各種縮合方法に従いビーズ上で縮合させる工程を繰り返し、最後に各種保護基を除去する。これにより、所望のアミノ酸配列のペプチドを固相化できる。
【００６０】
核酸又はペプチドの固相化は、予め合成した核酸又はペプチドを含む溶液を、マイクロビーズ上に滴下して、導入した官能基と結合させることにより、固相化することもできる。
【００６１】
モノマー溶液、及び予め合成した核酸又はペプチド溶液の滴下は、ピペットやマイクロディスペンサーによるスポッティングや、インクジェット式のスポッティングにより行うことができる。なお、上述した剥離工程はプローブ物質の固相化工程後に行ってもよい。この場合、成形工程により基板上に形成されたマイクロビーズとなる部分の薄膜表面にプローブ物質を固相化した後、薄膜を剥離しマイクロビーズを得る。
【００６２】
２．マイクロビーズ解析方法（第１例）
（１）マイクロビーズ解析方法の概要
本発明に係るマイクロビーズ解析方法では、上記で説明したマイクロビーズ１のような表面に識別パターンが形成され、プローブ物質が固相化されたマイクロビーズを用いて、蛍光検出と識別パターン検出を行う。そして、これにより、複数種類のターゲット物質を同時に分析する。
【００６３】
具体的には、例えば、マイクロビーズ１を用いて一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism: SNP）分析を行う場合、プローブ物質ＰＡの塩基配列を一のＳＮＰに対応する塩基配列とし、プローブ物質ＰＢ，ＰＣの塩基配列をそれぞれ他のＳＮＰに対応する塩基配列とする。このマイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃからなるビーズセットを蛍光標識したサンプル核酸と混合し、各プローブ物質とのハイブリダイゼーション反応を行なう。そして、反応後、各マイクロビーズ表面の蛍光強度の測定と識別パターンの検出を行うことにより、サンプル核酸中に含まれる各ＳＮＰ型の量を測定する。
【００６４】
このように、表面に形成された識別パターンと固相化されたプローブ物質が一対一に対応されたマイクロビーズを用いた解析では、蛍光検出と識別パターン検出によって、複数のターゲット物質を同時に分析できる。しかし、一方で、ターゲット物質に標識された蛍光物質やインターカレータから発生する蛍光を検出する際に、識別パターンそのものからノイズ蛍光が発生するという問題がある。
【００６５】
図４に、識別パターンが形成されたマイクロビーズの透過像及び蛍光像の一例を示す。図４は、プローブ物質に蛍光物質を直接標識して固相化したマイクロビーズ1をサンプルホルダー上に分散させて載置し、上方から撮影した画像を示している。図４（Ａ）は透過像、図４（Ｂ）は蛍光像である。
【００６６】
図４（Ｂ）に示す蛍光像では、マイクロビーズ1に形成された識別パターンから強い蛍光が発生していることが確認される。なお、プローブ物質に標識された蛍光物質からの蛍光は、ビーズの輪郭に沿って強く検出されていることに注意を要する（詳しくは後述する）。
【００６７】
このような識別パターンに起因した蛍光は、ビーズ表面の蛍光強度に基づいてターゲット物質の量を測定しようとするときに、ノイズ蛍光となり、測定誤差の要因となる。さらに、各マイクロビーズにはパターン形状の異なる識別パターンが形成されており（図２、マイクロビーズ１Ａ，１Ｂ，１Ｃ参照）、パターン形状の違いによって各ビーズで発生するノイズ蛍光の強度にばらつきが生じる場合がある。この場合には、各マイクロビーズ間でノイズ蛍光の影響を補正して、ターゲット物質の量を算出する処理が必要となり、解析速度が低下する原因となる。
【００６８】
また、図４（Ａ）に示す透過像では、干渉縞（ニュートンリング）の発生が確認される。このような干渉縞は、部材同士（ここでは、マイクロビーズとサンプルホルダー）が密着する際に両者の間に生じる隙間（空気層）が一定間隔以下の場合に発生する。干渉縞の発生は、画像識別手段による透過像からの識別パターンの検出を困難とし、また蛍光像に蛍光強度のムラを生じさせる原因ともなる。
【００６９】
本発明に係るマイクロビーズ解析方法では、識別パターンに起因したノイズ蛍光や干渉縞を排除して、ターゲット物質に標識された蛍光物質等からの蛍光を検出するために、次のような手順を採用する。以下、本発明に係るマイクロビーズ解析方法に用いられるマイクロビーズ解析装置の概略構成の第１例を示す図５、図６も参照しながら、上記のマイクロビーズ１を用いる場合を例に、マイクロビーズ解析方法の具体的手順を説明する。
【００７０】
（２）マイクロビーズ解析装置（第１例）
始めに、マイクロビーズ解析装置の構成概略を説明する。図５中、符号３２は、測定基板３１上に載置されたマイクロビーズ１の透過像を取得するための光源を、符号３３は蛍光像を取得するための光源を示す。光源３２にはハロゲンランプや水銀灯などが、光源３３には半導体レーザーなどが用いられる。光源３２からマイクロビーズ１に照射されて反射、透過等した光は、レンズ３４によって画像取得手段３５に集光される。同様に、光源３３からのレーザー光照射によって、マイクロビーズ１表面に分離されたターゲット物質に標識された蛍光物質等から発生する蛍光は、レンズ３４によって画像取得手段３５に集光される。画像取得手段３５は、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子によって構成でき、マイクロビーズ１の透過像と蛍光像を撮像して、それぞれ画像識別手段３６及び蛍光検出手段３７に出力する。符号３８は、画像識別手段３６及び蛍光検出手段３７から検出された識別パターンと蛍光強度の出力を受けて、これらを統合して解析結果を提示する解析手段を示す。なお、図５では、画像識別手段３６及び蛍光検出手段３７、解析手段３８を別体に構成した場合を示しているが、これらは汎用のコンピューターとプログラム、ディスプレイ等によって一体に構成してもよい。
【００７１】
測定基板３１の表面には、干渉縞の発生を防止するため、凹凸処理が施されている（図６参照）。干渉縞は、測定基板３１とこれに保持されたマイクロビーズ１との間に一定間隔以下の間隙（空気層）が存在する場合に発生する。測定基板３１の表面に形成された凹凸構造３１１は、凸部によってマイクロビーズ１を支持して、凹部とマイクロビーズ１との間隙を一定間隔以上に維持することによって干渉縞の発生を防止する。測定基板３１の凹凸処理は、表面をサンドブラストであらしたり、表面にアンチニュートンリング性フィルムを積層したりすることによって行うことができる。アンチニュートンリング性フィルムには、部材上に無機顔料を分散した塗布液を塗布することなどにより部材の片面あるいは両面を凹凸処理したフィルムを用いることができる。アンチニュートンリング性フィルムは、ガラスビーズや樹脂粒子などをバインダに分散した塗布液により凹凸を有する塗膜を形成した透明性に優れたフィルムを用いることが好ましい。
【００７２】
（３）マイクロビーズ解析方法の具体的手順
（i）反応手順
まず、マイクロビーズ１を、ターゲット物質を含むサンプルと混合し、ビーズ表面に固相化されたプローブ物質とターゲット物質とを相互作用させ、ビーズ表面にターゲット物質を捕捉する。
【００７３】
マイクロビーズ１とサンプルの混合は、ターゲット物質を蛍光物質で標識した後に行うか、ターゲット物質とプローブ物質の相互作用によって形成される複合体に取り込まれて蛍光を発するインターカレータの存在下で行う。
【００７４】
（ii）保持手順
次に、マイクロビーズ１を回収し、必要に応じて洗浄を行ってビーズに吸着したターゲット物質以外の物質（夾雑物）を取り除いた後、マイクロビーズ解析装置の測定基板３１上にマイクロビーズ１を分散させて載置する（図６参照）。
【００７５】
測定基板３１上に分散されたマイクロビーズ１は、略平行に対向する２つの面（上面１１及び下面１２）のいずれかが測定基板面に接触するように方向付けされ、測定基板３１上に保持される。この方向にマイクロビーズ１を保持することで、測定基板面に対向して配設された画像取得手段３５により、上面１１及び／又は下面１２のコード領域に形成された識別パターンを撮像することが可能となる。
【００７６】
この測定基板３１上でのマイクロビーズ１の方向付けは、マイクロビーズ1の厚みＨを、上面１１（あるいは下面１２）の径Ｄより小さく設定してマイクロビーズ１全体を盤形状とすることで、より確実に行われるようにすることができる。
【００７７】
（iii）検出手順
（a）識別パターンの検出
続いて、測定基板３１上に保持されたマイクロビーズ１に対して、光源３２，３３からの光を照射し、画像取得手段３５によってマイクロビーズ１の透過像及び蛍光像を撮像する。
【００７８】
このとき、上記保持手順において、マイクロビーズ１を上面１１又は下面１２のいずれかが測定基板面に接触するように方向付けして測定基板３１上に保持したことで、画像取得手段３５により撮像される透過像に確実に識別パターンが含まれるようにできる。また、測定基板３１の表面に凹凸構造３１１を形成したことによって干渉縞のない透過像と、蛍光強度にムラのない蛍光像を取得できる。
【００７９】
画像取得手段３５によって撮像された透過像は、画像識別手段３６に出力される。画像識別手段３６は、透過像から識別パターンを検出し、電気的信号として解析手段３８に出力する。識別パターンの検出は、汎用の画像解析プログラム又はこれを適宜改良したものを用いて行うことができる。
【００８０】
なお、干渉縞の発生は、液体中においてマイクロビーズ１を測定基板３１上に載置する方法によっても防止することができる。干渉縞は、測定基板３１とこれに保持されたマイクロビーズ１との間に一定間隔以下の間隙（空気層）が存在する場合に発生する。このため、マイクロビーズ１を液体中において測定基板面上に載置すれば、測定基板３１とマイクロビーズ１との間に空気層が入り込むことがなくなり、干渉縞の発生を防止できる。
【００８１】
具体的には、マイクロビーズ１を液体に懸濁された状態で測定基板３１に滴下し、測定基板３１上に載置する。滴下した液体が乾燥により失われるおそれがある場合には、適宜液体を追加滴下し、ビーズが常時液体中に含まれた状態で測定基板３１上に載置されているようにする。なお、ここで使用される液体は、マイクロビーズ１と同じ屈折率の液体であることが好ましいが、上記反応手順で用いられる緩衝液やそれよりも塩濃度を高めにした緩衝液が望ましい。
【００８２】
（b）蛍光の検出
画像取得手段３５によって取得された蛍光像は、蛍光検出手段３７に出力される。蛍光検出手段３７は、この蛍光像の所定領域からの蛍光を検出して、蛍光強度を電気的信号に変換して解析手段３８に出力する。
【００８３】
図７に、蛍光検出手段３７による蛍光検出領域（図中、符号Ｌ参照）を示す。
【００８４】
既に説明したように、マイクロビーズ１は、上面１１又は下面１２のいずれかが測定基板面に接触するように方向付けして測定基板３１上に保持される。このため、測定基板面に対向して配設された画像取得手段３５により取得される蛍光像は、図に示すように、上面１１あるいは下面１２方向から撮像された画像となる。
【００８５】
蛍光検出手段３７は、この蛍光像のうち、上面１２又は下面１３のうち識別パターンが形成されていない領域（非コード領域１１２）からの蛍光を検出する。識別パターンが形成されたコード領域１１１を含まない領域からの蛍光を検出することで、コード領域１１１に形成された識別パターンから発生するノイズ蛍光（図４（Ｂ）参照）を排除して蛍光の検出を行うことができる。
【００８６】
さらに、蛍光検出手段３７は、蛍光像のうち、マイクロビーズ１の輪郭領域からの蛍光をも同時に検出する。マイクロビーズ1の輪郭領域では、側面１３からの蛍光が集積されて強い蛍光が検出される（図４（Ｂ）参照）。そのため、輪郭領域からの蛍光を同時に検出することで、Ｓ／Ｎ比を大きくして解析手段３８への信号出力を高めることが可能となる。
【００８７】
蛍光検出手段３７による蛍光検出領域Ｌの設定は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００８８】
まず、蛍光像から任意の色配列を取り出すことによって、あるいは色情報から再計算することよって、蛍光像をモノクロ画像として算出し、画像の２値化を行う。次に、所定の輝度を閾値として０，１に２値化する。続いて、輝度が０から１又は１から０に変化する点を計算し、エッジ（輪郭）を抽出する。
【００８９】
次に、予め記憶されたコード領域１１１の大きさを参照して、エッジ内の領域のうち非コード領域１１２を特定する。そして、エッジを含む周領域（輪郭領域）を設定し、その周幅ｗを該領域に非コード領域１１２が含まれ、かつコード領域１１１が含まれない幅にまで拡張し、蛍光検出領域Ｌとして設定する。
【００９０】
蛍光検出領域Ｌは、コード領域１１１を含まず、輪郭領域を含む領域であればよく、図に示したように、輪郭領域の全部と非コード領域１１２の一部を含む場合に限られず、輪郭領域の全部と非コード領域１１２の全部、あるいは両領域のそれぞれ一部を含む領域であってもよい。また、蛍光検出領域Ｌの設定は、上記方法に限られず、使用するマイクロビーズの形状（三角柱形状や四角柱形状等の多角柱形状）に応じて適切な方法によって設定され得るものとする。
【００９１】
以上のように、本発明に係るマイクロビーズ解析方法では、マイクロビーズの非コード領域と輪郭領域からの蛍光を検出することで、コード領域に形成された識別パターンから発生するノイズ蛍光を排除して高い強度の蛍光を検出することができる。そのため、この方法によれば、ターゲット物質の分析を高感度に行うことができ、高精度な定量を行うことが可能である。
【００９２】
以上は、蛍光像を上面１１あるいは下面１２方向から撮像する場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９３】
３．マイクロビーズ解析方法（第２例）
（１）マイクロビーズ解析装置（第２例）
図８は本発明に用いるマイクロビーズ解析装置の第２例を示している。なお、上述した第１例のマイクロビーズ解析装置と同じ部材には同じ符号を付して説明する。
【００９４】
第２例のマイクロビーズ解析装置では、図５、６のように、測定基板３１上のマイクロビーズ１を撮像してもよいが、図８のように流路６１を設け、該流路６１内のマイクロビーズ１を撮像することもできる。
【００９５】
流路６１は特に限定されないが、ガラス、石英、透明樹脂等の可視光及び蛍光が透過可能な透明材料をエッチングして流路６１を形成したもの、或いは成型加工して流路６１を形成したもの、或いは透明材料の管を用いることが望ましい。流路６１の構造や、流路６１に液体を送りこむポンプ等の設定は特に限定されないが、流路６１内でのマイクロビーズ１の向きを、後述する光源や画像取得手段に対して固定する手段を設けることが望ましい。
【００９６】
固定手段としては、例えば、マイクロビーズが通過しない程度の間隔で配置されたピラー構造を設けて堰き止めたり、マイクロビーズの厚みHより浅く、かつ、マイクロビーズより一回り大きいディンプル構造を設け、そこに流し込んで固定したり、あるいは、いわゆるフローサイトメーターのようにマイクロビーズを１つずつ流して、流路６１内でのマイクロビーズ１の向きを方向付けても良い。
【００９７】
光源３２、３３からの光を、流路６１内又は測定基板３１上のマイクロビーズ１に照射し、画像取得手段６５、６６によって透過像及び蛍光像を撮像する。画像取得手段６５、６６はCCDやCMOS等のエリア撮像素子により構成することができる。また、第１例のマイクロビーズ解析装置と同様に、レンズ６３、６４によって集光した光を、撮像することが望ましい。
【００９８】
透過像を取得するための画像取得手段６５と、蛍光像を取得するための画像取得手段６６は別々に設けることができる。例えば、透過像用の画像取得手段６５はマイクロビーズ１の上面１１又は下面１２と対面し、上面１１又は下面１２から反射、透過等した光を取得し、上面１１又は下面１２の透過像を撮像する。また、蛍光像用の画像取得手段６６はマイクロビーズ１の側面１３と対面し、その側面１３から放出された蛍光を取得して、側面１３の蛍光像を撮像する。
【００９９】
なお、画像取得手段６５、６６の設置場所は特に限定されない。例えば、反射鏡等の反射により、上面１１又は下面１２の透過像と、側面１３の蛍光像を撮像可能であれば、透過像用の画像取得手段６５を上面１１、下面１２のいずれとも対面しない位置に配置してもよく、蛍光像用の画像取得手段６６を側面１３と対面しない位置に配置してもよい。
【０１００】
次に、第２例のマイクロビーズの解析装置を用いた解析方法の具体的手順について説明する。
（２）マイクロビーズ解析方法の具体的手順
例えば、上記「２．マイクロビーズ解析方法（第１例）」の「(i)反応手順」と同様の方法でマイクロビーズ１にターゲット物質を捕捉させ、そのマイクロビーズ１を検出作業に用いる。
【０１０１】
（i）通流手順
マイクロビーズ１を液体と懸濁した状態で流路６１内を流し、画像取得手段６５、６６により撮像される撮像位置を通過させる。この液体は、マイクロビーズ１と同じ屈折率であることが好ましいが、ターゲット物質捕捉の際に用いた緩衝液やそれよりも塩濃度を高めにした緩衝液のように、ターゲット物質を変性・解離させず、ターゲット物質の保持に適した液体が望ましい。また、流路６１内に空気等の泡が入り込まないようにすることが望ましい。
【０１０２】
（ii）検出手順
（a）識別パターンの検出
流路６１の撮像位置を通るマイクロビーズ１に光源３２、３３からの光を照射し、画像取得手段６５、６６により、透過像及び蛍光像を撮像する。透過像用の画像取得手段６５が、直接又は光学手段（レンズ６３、反射鏡等）を介して識別パターンが形成された領域と対面していれば、撮像される透過像には確実に識別パターンが含まれる。
【０１０３】
第１例のマイクロビーズ解析装置の場合と同様に、撮像された透過像は画像識別手段３６に出力され、解析手段３８で識別パターンを検出することができる。
【０１０４】
（b）蛍光の検出
蛍光像用の画像取得手段６６は、直接又は光学手段（レンズ６４、反射鏡等）を介してマイクロビーズ１の側面１３とは対面するが、上面１１又は下面１２とは対面しない。すなわち、蛍光用の画像取得手段６６は識別パターンが形成された面と対面せず、識別パターンに起因した蛍光が入射しないから、ノイズ蛍光を排除して蛍光の検出を行うことができる。
【０１０５】
図９（Ａ）、（Ｂ）はマイクロビーズ１の側面１３を撮影した蛍光像であり、図９（Ａ）は相補的なターゲット物質を作用させたもの（フルマッチ）、図９（Ｂ）は非相補的なターゲット物質を作用させたもの（ミスマッチ）である。
【０１０６】
蛍光物質からの蛍光は、マイクロビーズ１の輪郭部分、即ち、マイクロビーズ１の側面１３で集光され、強く放出されるから、図９（Ａ）、（Ｂ）に示すように、側面１３からの蛍光像は、フルマッチとミスマッチの差が顕著になる。すなわち、側面１３から蛍光像を撮像することで、Ｓ／Ｎ比を大きくして、蛍光検出手段３７から解析手段３８への信号出力を高めることが可能となる。
【０１０７】
なお、識別パターンをより高精度に検出するには、透過像用の画像取得手段６５の光軸を上面１１又は下面１２に対して垂直にし、上面１１又は下面１２に垂直な方向から透過像を撮影することが望ましく、また、Ｓ／Ｎ比を高めるためには、蛍光像用の画像取得手段６６の光軸を側面１３に対して垂直にし、側面１３に垂直な方向から蛍光像を撮影することが望ましい。ここで、画像取得手段６５、６６の光軸とは、例えばその受光部を構成するレンズの光軸のことである。
【０１０８】
以上説明した通り、本発明のマイクロビーズ解析装置及びマイクロビーズ解析方法は、Ｓ／Ｎ比が大きいから、高感度に蛍光を評価できる。また、マイクロビーズ１の側面１３から蛍光像を撮影する場合、上面１１又は下面１２に非コード領域１１２を形成する必要が無いため、マイクロビーズ１の小型化が可能であり、スループット（単位時間当たりの処理能力）を高くすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明に係るマイクロビーズ解析方法は、ターゲット物質に標識された蛍光物質等からの蛍光を、識別パターンに起因したノイズ蛍光の影響を排除して、高精度に検出できるため、マイクロビーズを用いた各種生化学分析の一層のハイスループット化・高速化に寄与し得る。
【符号の説明】
【０１１０】
１，１Ａ，１Ｂ，１Ｃ  マイクロビーズ
１１  上面
１２  下面
１３  側面
１１１  コード領域
１１２  非コート領域
２  貫通孔
ＰＡ，ＰＢ，ＰＣ  プローブ物質
３１  測定基板
３１１  凹凸構造
３２，３３  光源
３４、６３、６４  レンズ
３５  画像取得手段
３６  画像識別手段
３７  蛍光検出手段
３８  解析手段
６１  流路
６５  透過像用の画像取得手段
６６  蛍光像用の画像取得手段
Ｌ  蛍光検出領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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