(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための方法であって、前記核酸ライブラリーの各々のエレメントが、第１のヌクレオチドストレッチ、第２のヌクレオチドストレッチおよび第３のヌクレオチドストレッチを含み、前記第１のヌクレオチドストレッチの配列および前記第３のヌクレオチドストレッチの配列が、核酸ライブラリーの各々のエレメントにおいて同一であり、かつ、前記核酸ライブラリーのエレメントが、前記第２のヌクレオチドストレッチの配列において異なり、前記核酸ライブラリーのエレメントの前記第２のヌクレオチドストレッチが、前記エレメント間の唯一の相違であり、前記方法が、
ａ）一本鎖のオーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記一本鎖オーバーハングが、核酸ライブラリーのエレメントの第１または第３のヌクレオチドストレッチの配列に対応する核酸配列を提供し、前記オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、工程と、
ｂ）複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程であって、前記メンバーの各々が、二本鎖構造を有する第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と一本鎖オーバーハングを含み、前記一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して同じであり、かつ、このような一本鎖オーバーハングが、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、前記二本鎖構造が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーとは前記ヌクレオチドストレッチの配列が異なり、かつ、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの前記ヌクレオチドストレッチの配列が核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する、ヌクレオチドストレッチを含む、工程と、
ｃ）第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子を第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各１つのメンバーの１つの分子と、それらの一本鎖オーバーハングを介して連結させ、その結果、第１のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｄ）第１のライゲーション生成物を前記第２のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの核酸配列で生じ、このような切断が、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらす、工程と、
ｅ）短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｆ）複数のメンバーを含む第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程であって、前記メンバーの各々が、二本鎖構造を有する、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、前記第３のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と一本鎖オーバーハングを含み、前記一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して異なり、このような第３のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーが、全てのメンバーにおいて同一であり、核酸ライブラリーのエレメントの第３または第１のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応するヌクレオチドストレッチを二本鎖構造中に含む、工程と、
ｇ）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各々の１つの分子と連結させる工程であって、前記第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドのオーバーハングに実質的に相補的であり、その結果、第２のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｈ）第２のライゲーション生成物を第３のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じ、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらす、工程と、
ｉ）短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｊ）一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記一本鎖オーバーハングが、第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列を提供し、前記オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第４のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、工程と、
ｋ）第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、第４のオリゴヌクレオチドの１つの分子と、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を連結させて第３のライゲーション生成物を形成する、工程と、
ｌ）第３のライゲーション生成物を第４のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じ、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらす、工程と、
ｍ）短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と
を含む方法。
【請求項２】
ｎ）工程ｊ）〜ｍ）を工程ｊａ）〜ｍａ）として反復する工程であって、工程ｊ）の第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、さらにまた、工程ｊａ）の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、工程ｋ）の第３のライゲーション生成物が、さらにまた、工程ｋａ）のライゲーション生成物であり、工程ｌ）の複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｌａ）の複数のさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、かつ、工程ｌ）の短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｌａ）の短縮されたさらなる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである、工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
連結工程ｋａ）の後、さらなるライゲーション生成物が切断され、前記切断がさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列中に生じる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための方法であって、前記核酸ライブラリーの各々のエレメントが、第１のヌクレオチドストレッチ、第２のヌクレオチドストレッチおよび第３のヌクレオチドストレッチを含み、前記第１のヌクレオチドストレッチの配列および前記第３のヌクレオチドストレッチの配列が、核酸ライブラリーの各々のエレメントにおいて同一であり、前記核酸ライブラリーのエレメントが、前記第２のヌクレオチドストレッチの配列において異なり、かつ、前記核酸ライブラリーのエレメントの前記第２のヌクレオチドストレッチが、前記エレメント間の唯一の相違であり、前記方法が、
ａ）一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記一本鎖オーバーハングが、核酸ライブラリーのエレメントの第１または第３のヌクレオチドストレッチの配列に対応するヌクレオチド配列を提供し、前記オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、工程と、
ｂ）複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程であって、前記メンバーの各々が、二本鎖構造を有する第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と一本鎖オーバーハングを含み、前記一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して同じであり、かつ、このような一本鎖オーバーハングが、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、前記二本鎖構造が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーとは前記ヌクレオチドストレッチの配列が異なり、かつ、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの前記ヌクレオチドストレッチの配列が核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する、ヌクレオチドストレッチを含む、工程と、
ｃ）第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子を第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各１つのメンバーの１つの分子と、それらの一本鎖オーバーハングを介して連結させ、その結果、第１のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｄ）第１のライゲーション生成物を前記第２のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの核酸配列で生じ、このような切断が、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらし、このような複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、一本鎖オーバーハングの配列の異なる様々な分子種からなる、工程と、
ｅ）短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｆ）オリゴヌクレオチドの複数のサブグループを含み、各サブグループが複数のメンバーを含む、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程であって、前記メンバーの各々が、二本鎖構造を有する、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、前記第３のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と一本鎖オーバーハングを含み、前記一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのオリゴヌクレオチドの様々なサブグループに関して異なり、前記第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの各１つのサブグループの一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子種の一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーが、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの各サブグループのメンバーにおいて異なり、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応するヌクレオチドストレッチを二本鎖構造中に含む、工程と、
ｇ）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各１つの分子と連結させる工程であって、それらの分子が、基本的に互いに相補的なオーバーハングに連結され、その結果、第２のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｈ）第２のライゲーション生成物を第３のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じ、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらし、このような複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、それらの一本鎖オーバーハングの異なる様々なサブグループからなる、工程と、
ｉ）短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｊ）複数のメンバーを含む第３のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程であって、前記メンバーの各々が、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、前記一本鎖オーバーハングが、第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列およびストレッチ、好ましくは様々なメンバーにおいて同一であり、核酸ライブラリーのエレメントの第３または第１のヌクレオチドストレッチを提供する、前記オーバーハングに隣接するストレッチ、を提供し、前記第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーが、それらの一本鎖オーバーハングにおいて異なり、前記オーバーハングは核酸ライブラリーの第２のストレッチまたはその部分に対応し、前記オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第４のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、工程と、
ｋ）複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各１つの分子を複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子に連結させる工程であって、前記分子が、基本的に互いに相補的なオーバーハングに連結され、その結果、第３のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｌ）第３のライゲーション生成物を第４のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの核酸配列で生じ、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらす、工程と、
ｍ）所望により、短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｎ）一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記一本鎖オーバーハングが、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列を提供し、前記第５のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第５のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、工程と、
ｏ）複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせて、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を第５の少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子に連結させる工程であって、その結果、第４のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｐ）第４のライゲーション生成物を第５のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が、第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じ、複数の第４の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらす、工程と、
ｑ）所望により、短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と
を含む方法。
【請求項５】
ｒ）工程ｎ）〜ｑ）を工程ｎａ）〜ｑａ）として反復する工程であって、工程ｎ）の第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、さらにまた、工程ｎａ）の少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、工程ｏ）の第４のライゲーション生成物が、さらにまた、工程ｏａ）のライゲーション生成物であり、工程ｐ）の複数の第４の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｐａ）の複数のさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、かつ、工程ｐ）の短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｐａ）の短縮されたさらなる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである、工程
をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
連結工程ｏａ）の後、さらなるライゲーション生成物が切断され、前記切断が、さらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１のＩＩＳ型制限酵素が、ＢｐｉＩ、ＢｂｓＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｓｍＢＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、ＢｓａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｂｖＩおよびＢｓｇＩを含む群から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２、第３、第４、第５および任意のさらなるＩＩＳ型制限酵素が、各々個別に、ＥａｒＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、ＳａｐＩ．ＬｇｕＩ、Ｋｓｐ６３２ＩおよびＢｓｐＱＩを含む群から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
核酸が一本鎖核酸であり、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの長さが、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの倍数からなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸が二本鎖核酸であり、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの長さが、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの倍数からなる請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチが、１または複数のアミノ酸をコードしている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、第５およびさらなる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが修飾を含み、このような修飾によりオリゴヌクレオチドの表面への固定化が可能となる請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
修飾が、ビオチン残基、ジゴキシゲニン残基、フルオレセインイソチオシアネート残基、アミノ化合物またはスクシニルエステルを含む群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸ライブラリーが、機能性核酸をコードする核酸分子のライブラリーであり、このような核酸が、アプタマー、プロモーター、リボザイム、およびＲＮＡｉ媒介分子を含む群から選択される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸ライブラリーが、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子のライブラリーである請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が、ペプチドアプタマー、酵素、制限酵素、ＤＮＡ結合ドメイン、ワクチン、抗体、薬学的に活性なタンパク質、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、およびＡｄＮｅｃｔｉｎｅを含む群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸ライブラリーが、ポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーであり、前記ポリペプチドが、１または複数の一定の領域を含むスキャフォールドであり、前記１または複数の可変領域および可変領域の中の１または複数が、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列によりコードされる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
核酸分子ライブラリーを製造するための方法であって、前記核酸分子ライブラリーが複数のエレメントを含み、前記エレメントが、少なくとも１つの一定のストレッチと少なくとも１つの可変性のストレッチを含み、前記少なくとも１つの一定のストレッチが全てのエレメントが同じ核酸配列を含み、前記少なくとも１つの可変ストレッチが、全てのエレメントにおいて異なる核酸配列を含み、前記方法は、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、一本鎖オーバーハングを有し、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含む、少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドか、または複数のエレメントを含む核酸ライブラリーのいずれかであり、前記核酸ライブラリーが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により作製された核酸ライブラリーであり、前記核酸ライブラリーのエレメントが、一本鎖オーバーハングを有し、かつ前記核酸ライブラリーのエレメントが、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含む、工程と、
ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、このような第２のオリゴヌクレオチドが、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーであり、前記核酸ライブラリーが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により作製された核酸ライブラリーであり、前記核酸ライブラリーのエレメントが、工程ａ）で提供されるオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに少なくとも部分的に相補的である一本鎖オーバーハングを有し、前記核酸ライブラリーのエレメントが、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含み、前記核酸ライブラリーのエレメントの第２のＩＩＳ型制限酵素が、工程ａ）で提供されるオリゴヌクレオチドの第１のＩＩＳ型制限酵素とは異なる、工程と、
ｃ）工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により作製された核酸ライブラリーとは異なるという条件下で、工程ａ）のオリゴヌクレオチドの１つの分子を工程ｂ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる工程、または
工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により作製された核酸ライブラリーであるという条件下で、工程ａ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子を工程ｂ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる工程と、
ｄ）所望により、反応しなかった反応体および酵素を除去する工程と、
ｅ）工程ｃ）のライゲーション生成物を、認識配列の外側を切断するＩＩＳ型制限酵素で切断する工程であって、前記切断が伸長された核酸分子のライブラリーをもたらす工程ａ）または工程ｂ）のオリゴヌクレオチドで生じる、工程と、
ｆ）所望により、伸長された核酸分子を反応混合物から分離する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、工程ｅ）で提供される伸長された核酸分子のライブラリーである第３のオリゴヌクレオチドであり、かつ、工程ｂ）のオリゴヌクレオチドが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により作製された核酸ライブラリーであるか、または、一本鎖オーバーハングを有し、認識配列の外側を切断するＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含む、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであるかのいずれかである、第４のオリゴヌクレオチドであり、
前記第３および第４のオリゴヌクレオチドが、各々一本鎖オーバーハングを含み、両方のオーバーハングが少なくとも部分的に互いに相補的であり、
工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの１つの分子を工程ｂ）のオリゴヌクレオチドの１つの分子または核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる場合、工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、工程ｂ）の伸長された核酸分子のライブラリーとは異なっている、または
工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子を工程ｂ）のオリゴヌクレオチドの１つの分子または核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる場合、工程ａ）のオリゴヌクレオチドが伸長された核酸分子のライブラリーであり、かつ
工程ｅ）において、伸長された核酸分子のさらなるライブラリーが得られる、
という条件下で工程ａ）〜ｆ）が反復される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
可変性ストレッチまたはその部分が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載される方法により作製された核酸ライブラリーのエレメントの第２のストレッチにより提供される請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
定常性ストレッチまたはその部分が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載される方法により作製された核酸ライブラリーのエレメントの第１のストレッチおよび／または第３のストレッチにより提供される請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法で用いられるライブラリーの様々なエレメントおよびメンバーの比が等モルである請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法で用いられるライブラリーの様々なエレメントおよびメンバーの比が非等モルであるかまたは偏っている請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための方法およびそのようにして得られる核酸ライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子のデノボ生成は、最適化された特性、例えば、インビボまたはインビトロ系において好適な高レベルのタンパク質発現、をもつ所望のＤＮＡ構築物を作製するために必要な、しばしば非常に複雑なクローニング手順に代わって、生物製剤研究においてますます多く用いられている。このようなＤＮＡ分子を合成するための様々な方法が知られている。実質的にこれらの手順の全ては、一般に１００より大きく数千以下の塩基対からなる、より大きな二本鎖ＤＮＡ分子を構築するために、合成一本鎖オリゴヌクレオチドの合成、アニーリングおよびその後の連結に頼っている。しかし、これらの方法の効率は、複数の要因、すなわち（ｉ）使用するオリゴヌクレオチドの質、（ｉｉ）所望の構築物のサイズ、および（ｉｉｉ）「困難な」配列、例えば、自己相補的領域、高ＧＣ含量、Ｇ四分子、ＤＮＡのよじれまたは反復配列ブロックを含む配列の割合、により制限される。オリゴヌクレオチド構成要素自体に様々な停止生成物および内部欠失が混入している。特に問題のあるものはｎ−１生成物（不完全なキャッピング反応の結果として生じる１つのヌクレオチド欠失を内部に含むオリゴヌクレオチド）であり、それは所望の全長オリゴヌクレオチドから分離することがほとんどできない。多くのオリゴヌクレオチドは、完全な遺伝子を生成するために構築される必要があるため、エラーのないクローン、すなわち、塩基変化または内部欠失の欠陥のあるオリゴヌクレオチドを１つも組み入れていないクローンを得る可能性は０％に近づく。例えば、遺伝子を、各々９０％の純度を有する５０のオリゴヌクレオチドから構築するならば、エラーのない生成物を作り出す可能性はざっと０．９５０＝０．００５である。一般に、１００％エラーのない構築物を得るために退屈なエラー修正手順を用いる必要がある。コード配列中の誤りは、例えば、オープンリーディングフレームのフレームシフトに起因する、短縮された転写もしくは翻訳産物の生成を引き起こす可能性があるため、多くの場合、欠陥のある合成生成物は許容されることができない。最初の２つの問題は非常に高純度のオリゴヌクレオチドの使用により軽減することができるのに対して、合成生成物中に欠失をもたらし得る不要な二次構造の形成は、多くの場合、変更がＤＮＡ配列中で許容される場合にのみ抑制することができる。
【０００３】
先行技術において、合成ＤＮＡを作製するさまざまな方法が公知である。ほぼ３０年前、Ｋｈｏｒａｎａおよび同僚らの先駆的研究（Ｓｅｋｉｙａ  Ｔ，Ｂｒｏｗｎ  ＥＬ，Ｂｅｌａｇａｊｅ  Ｒ，Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ，Ｇａｉｔ  ＭＪ，Ｌｅｅｓ  ＲＧ，Ｒｙａｎ  ＭＪ，Ｋｈｏｒａｎａ  ＨＧ，Ｎｏｒｒｉｓ  ＫＥ．（１９７９），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５４（１３）：５７８１−６，ａｎｄ  ５７８７  −  ８０１）により、アニールされたオリゴヌクレオチドの対の連結を介する、抑制因子ｔＲＮＡ遺伝子の完全なデノボ合成が実証された。この方法および関連する方法では、完全な所望のＤＮＡ配列を含む相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが対でアニールされて二本鎖断片を生じ、それらは相補的な一本鎖オーバーハングによって正確な順番に整列される（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４，６５２，６３９号）。結果として得られる断片は、次に、酵素的にかまたは化学的にかのいずれかで、逐次的にまたはワンチューブ反応のいずれかで連結される（Ｊａｙａｒａｍａｎ，米国特許第５，１３２，２１５号）。精製および／またはクローニングの後、これらの遺伝子断片を結合してより大きいＤＮＡ構築物を形成することができる。このいわゆる「カセット合成」において、アニールされたオリゴヌクレオチドの各対は、制限エンドヌクレアーゼを用いて断片を結合する前に別々にプラスミドベクターにクローニングされる（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０９３，２５１号）。
【０００４】
あるいは、ＤＮＡ構築物は、ハイブリダイゼーション後にＤＮＡポリメラーゼにより補充されなければならない一本鎖ギャップを含む、部分的にアニールされたオリゴヌクレオチドから構築することが、この方法は広く「ギャップフィリング」法と称される。この方法に従って、さまざまな部分的に重複するオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、その後通常２つ一組でまたはサブグループでハイブリダイズされる。ＤＮＡポリメラーゼを用いてそれぞれの向かい合う鎖を合成した後、個々の断片は互いに連結される。このようにして生成された二本鎖のライゲーション生成物は、部分的断片としてクローニングされるか、または末端のオリゴヌクレオチドプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において増幅されるかのいずれかであってよい。しかし、この方法は、頻繁なミスプライミング事象、および二次構造の形成に起因する内部欠失に悩まされる。
【０００５】
両方の方法は、合成される核酸分子の長さの増大に伴って、間違った配列を含む１または複数のオリゴヌクレオチドが最終生成物に組み込まれる可能性が増加するので、使用が限定されている。このようなエラーは、次にＤＮＡポリメラーゼ反応中で複製される。その上、配列エラーもＰＣＲ反応の間に導入される可能性がある。
【０００６】
上記の方法の組み合わせは、標的配列の１本の鎖における隣接領域を表す一連の結合可能なオリゴヌクレオチドが、接続されることになる結合可能なオリゴヌクレオチドの３’または５’末端に相補的な、結合不能なオリゴヌクレオチドでハイブリダイズされる、米国特許第６，４７２，１８４号に記載されている。この方法は比較的単純で直接的であるが、この方法もまた、一本鎖オリゴヌクレオチドを構成要素として用いるあらゆる手順が共有する問題、すなわち双方とも内部欠失を引き起こす、不要な二次構造の形成およびｎ−ｘオリゴヌクレオチドの組込み、に悩まされる。
【０００７】
これらの標準的な手順のほかに、さらなる当分野で公知の、合成ＤＮＡ分子の製造のための方法がある。国際特許出願公開第９８／１５５６７号および米国特許第６，１１０，６６８号により、一本鎖鋳型ＤＮＡに少なくとも部分的に相補的な複数のオリゴヌクレオチドを連結することによる、オリゴヌクレオチドを結合させて合成ＤＮＡ構築物を得る、鋳型に指示される方法が教示され、前記オリゴヌクレオチドの末端は、連続するアニーリング工程および変性工程において正確な順序で連結される。しかし、この方法の適用の前提条件は、デノボ合成でのその使用を除いて、適した鋳型ＤＮＡが事前に存在することである。
【０００８】
国際特許出願公開第９９／４７５３６号により、一本鎖オリゴヌクレオチドが規定された配向に固定化されたスターター分子に逐次連結される、固相遺伝子合成法が開示される。この方法の欠点は、より大きい遺伝子を合成するために多くの工程が必要とされ、収量の減少および欠陥のある配列の濃縮がもたらされることである。また、この方法は、迅速かつ標準化された合成の前提条件である自動化が困難である。
【０００９】
国際特許出願公開第００／７５３６８号により、二本鎖オリゴヌクレオチドのライブラリーを標準化された構成要素として用いる、核酸のコンビナトリアル固相合成が開示される。標準化された構成要素の使用は、各新規な合成のための新規な一組のオリゴヌクレオチドの合成を不要にする。これらの二本鎖ライブラリーオリゴヌクレオチドは、一般に同一の全体構造を共有し、したがって、欠失の導入などのオリゴヌクレオチド構成要素の代替二次構造の形成によって起こる日常的な合成の問題を回避する。１つの好ましいバージョンでは、それらは末端ループ、二本鎖ステムおよび短い一本鎖オーバーハングを含む。ライブラリーオリゴヌクレオチドには２つの異なる種類があり、その種類はそれらの配列中のＩＩＳ型制限酵素の異なる認識部位の存在、および内部修飾の存在もしくは不在またはその種類により特徴付けられる。オーバーハング中のヌクレオチドおよび直接に隣接する領域は、合成されるべき核酸に実際に寄与する可変性の部分を形成する。残りの配列は、一般に同じ種類に属する全てのオリゴヌクレオチドにおいて同一である。
【００１０】
二本鎖核酸を構築するため、その配列は最初に小さな断片に分解される（通常各６〜３０塩基対）。これらのいわゆる伸長ブロックは、次に平行反応で合成される。このような一反応では、各々の種類のうちの１つである、２つの二本鎖ライブラリーオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングのマッチングを介して連結される。そのライゲーション生成物は、その後、ヌクレオチドを提供するオリゴヌクレオチドに特異的なＩＩＳ型制限酵素で切断される。そのような連結／制限サイクルの最終的な効果は、少数の塩基対（一般に１〜５）を出発オリゴヌクレオチドに付加することである。次に、このプロセスを、所望の伸長ブロックの合成が完了するまで反復する。
【００１１】
第２の反応相、いわゆる転位において、合成されるべき核酸中で隣接しているそれらの伸長ブロックは、各ブロックが異なるＩＩＳ型制限酵素で切断された後に一対ずつ連結される。この手順を数回反復することにより転位中間体の長さは各工程で２倍になるが、一方、反応の数は半分に短縮される。よって、定義された核酸分子をほんの少しのサイクルで生成することができる。この方法の利点は、配列非依存性の様式での、合成されるべき核酸分子の断片の混合による対単位の構築にある。任意の所望の伸長ブロックは、したがって定義された数のエレメントを含む標準化された核酸ライブラリーから生成され得る。
【００１２】
そのようなライブラリーのエレメントの数は、個々のＩＩＳ型制限酵素により生成されたオーバーハングの長さ、ならびに各々の伸長サイクルにおいて増大するオリゴヌクレオチドに付加されるヌクレオチドの数に依存する。
【００１３】
この方法は、多数の利点、つまり、それが、大きな遺伝子またはＤＮＡ断片を築くために新しいオリゴヌクレオチドを合成および精製する必要がないので完全に自動化することができること、構成要素が大規模に調製され、供給された分を使い切るまで多くの異なる構築物を組み立てるために用いることができること、したがってオリゴヌクレオチドに関するコストを１〜２桁低下させることができること、を提供する。
【００１４】
しかし、酵素学および抗体に基づく治療法などの様々な分野では、それぞれのタンパク質、すなわち酵素および抗体を個々に最適化する必要性がある。一般に、このような最適化は、このようなタンパク質のアミノ酸配列を変更することにより行われる。前記タンパク質が核酸分子の翻訳産物である場合、このようなコードする核酸分子は、核酸配列の変更に関してこのような最適化の対象であり得る。当技術分野において、このようなタンパク質のアミノ酸配列およびこのようなタンパク質をそれぞれコードする核酸配列を操作するために様々なアプローチが記載されている。しかし、野生型配列を変異させることは、一般に、最適化されたタンパク質をもたらすために十分ではない。むしろ、一連の変異アミノ酸配列、したがってタンパク質（変異タンパク質とも称される）、をもたらす一連の変異配列が、所望の特徴を有する変異タンパク質を特定するために必要とされる。前記タンパク質の標的分子の結晶構造に関するデータがますます多く利用可能であるが、このより発見的なアプローチは、なお有望であり、広く追求されている。それにもかかわらず、それに従ってアミノ酸配列が折り畳まれ、該アミノ酸配列がタンパク質の別個の三次元構造を生成するために必要とされる、コードは、まだなお初期工程である。
【００１５】
先行技術では、このような変異タンパク質は突然変異誘発により生成される。ランダム変異誘発のほかに、部位特異的な変異誘発も行われる。例えばエラープローンＰＣＲによる、ランダム変異誘発は、一般に野生型アミノ酸配列である基本的なアミノ酸配列から出発する少なくともさまざまな変異タンパク質をもたらす強力な手段であるが、ランダム変異誘発の結果はあまり正確に予測されない。特定の位置に制御されたレベルのランダム化を標的とする部位特異的変異誘発法の使用も、このような変異タンパク質の十分定義された変種を提供するために必ずしも適していない（Ｎｅｙｌｏｎ  （２００４），ＮＡＲ，１４４８−５９に概説）。少なくとも、このような変種の生成は骨が折れる。疑いの余地なく、野生型または出発配列と比較して、別個の十分定義された突然変異を有する変異タンパク質のライブラリーの生成は、最も望ましい。それが所望の特徴をもつクローンをその後のスクリーニングプロセスにおいて同定するために必要な努力に直接影響をもたらすからである。さらに、個々の配列の相対的表現の点からこのようなライブラリーの構成物を制御することが望ましい。意図される使用または適用によって、このようなライブラリーは、様々な配列の均等な分布を有してもよいし、偏った分布、すなわち、個々の配列が増加したまたは低下した頻度で存在する分布を有してもよい。
【００１６】
国際特許出願公開第００／７５３６８号に開示される核酸を合成するための方法も、当然、その後対応する変異タンパク質に翻訳される様々な核酸配列を生成する際に有用であり得る。しかし、それぞれのライブラリーは、次に、個々の核酸配列かまたはアミノ酸配列のいずれかをプールすることにより生成する必要がある。このような手順は、特定の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれもたらすが、費用がかかり、プロセスの全体的な収量を減少させ、かなりの数の反応工程を必要とする。さらに、様々なアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ組み合わせる場合、個々の配列の望ましくない偏りが再び起こる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、当技術分野において、少なくとも１つの位置（単一のヌクレオチドであってよいが、アミノ酸配列をコードする核酸の場合にはアミノ酸をコードするヌクレオチドのトリプレットであってよい）でエレメントが異なっている、複数のエレメントを含み、このようにしてコードされるアミノ酸が少なくとも一部のエレメントの間で異なっている、核酸ライブラリーを作製するための方法を提供する必要性がある。より具体的には、核酸ライブラリーが頻度に関してこのような核酸ライブラリーの様々な個々のエレメントの異なった分布を有する、このような種類のライブラリーを作製するための方法が当技術分野で必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この問題およびその他の問題は、独立クレームの主題により解決される。好ましい実施形態は従属クレームから得ることができる。
【００１９】
より具体的には、第１の態様において、本出願の基礎をなす問題は、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための方法により解決され、前記核酸ライブラリーの各々のエレメントは、第１のヌクレオチドストレッチ、第２のヌクレオチドストレッチおよび第３のヌクレオチドストレッチを含み、該第１のヌクレオチドストレッチの配列および該第３のヌクレオチドストレッチの配列は、核酸ライブラリーの各々のエレメントにおいて同一であり、かつ、該核酸ライブラリーの該エレメントは、該第２のヌクレオチドストレッチの配列において異なり、該方法は、
ａ）一本鎖オーバーハングが、核酸ライブラリーのエレメントの第１または第３のヌクレオチドストレッチの配列に対応する核酸配列を提供し、オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
ｂ）メンバーの各々が、二本鎖構造を有する第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、該第２のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分および一本鎖オーバーハングを含み、該一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して同じであり、かつ、このような一本鎖オーバーハングが、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、該二本鎖構造が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーとは前記ヌクレオチドストレッチの配列が異なり、かつ、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの前記ヌクレオチドストレッチの配列が核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する、ヌクレオチドストレッチを含む、複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程と、
ｃ）第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子を第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各１つのメンバーの１つの分子と、それらの一本鎖オーバーハングを介して連結させ、その結果、第１のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｄ）第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの核酸配列中に切断が生じ、このような切断により、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる、第１のライゲーション生成物を前記第２のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｅ）短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｆ）各メンバーが、二本鎖構造を有する、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、該第３のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分および一本鎖オーバーハングを含み、該一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して異なり、かつ、第３のオリゴヌクレオチドのこのような一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、かつ、該第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーが、全てのメンバーにおいて同一であり、核酸ライブラリーのエレメントの第３または第１のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応するヌクレオチドストレッチを二本鎖構造中に含む、複数のメンバーを含む第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程と、
ｇ）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、該複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子と第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各々の１つの分子を連結させる工程であって、該第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドのオーバーハングに実質的に相補的であり、その結果、第２のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｈ）第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列中に切断が生じ、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる、第２のライゲーション生成物を第３のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｉ）短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｊ）一本鎖オーバーハングが、第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列をもたらし、該オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第４のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
ｋ）第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、第４のオリゴヌクレオチドの１つの分子と、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を連結させて第３のライゲーション生成物を形成する工程と、
ｌ）第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列中に切断が生じ、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる、第３のライゲーション生成物を第４のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｍ）短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
を含む。
【００２０】
第１の態様の実施形態では、該方法は、
ｎ）工程ｊ）〜ｍ）を工程ｊａ）〜ｍａ）として反復する工程であって、工程ｊ）の第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、さらにまた、工程ｊａ）の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、工程ｋ）の第３のライゲーション生成物が、さらにまた、工程ｋａ）のライゲーション生成物であり、工程ｌ）の複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｌａ）の複数のさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、かつ、工程ｌ）の短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｌａ）の短縮されたさらなる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである、工程をさらに含む。
【００２１】
第１の態様の実施形態では、連結工程ｋａ）の後、さらなるライゲーション生成物が切断され、該切断はさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列に生じる。
【００２２】
第２の態様において、本出願の基礎をなす問題は、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための方法により解決され、前記核酸ライブラリーの各々のエレメントは、第１のヌクレオチドストレッチ、第２のヌクレオチドストレッチおよび第３のヌクレオチドストレッチを含み、該第１のヌクレオチドストレッチの配列および該第３のヌクレオチドストレッチの配列は、核酸ライブラリーの各々のエレメントにおいて同一であり、かつ、該核酸ライブラリーの該エレメントは、該第２のヌクレオチドストレッチの配列において異なり、該方法は、
ａ）一本鎖オーバーハングが、核酸ライブラリーのエレメントの第１または第３のヌクレオチドストレッチの配列に対応するヌクレオチド配列を提供し、該オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
ｂ）メンバーの各々が、二本鎖構造を有する第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と一本鎖オーバーハングを含み、該一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して同じであり、かつ、このような一本鎖オーバーハングが、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、該二本鎖構造が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーとは前記ヌクレオチドストレッチの配列において異なり、かつ、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの前記ヌクレオチドストレッチの配列が核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する、ヌクレオチドストレッチを含む、複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程と、
ｃ）第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子を第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各１つのメンバーの１つの分子と、それらの一本鎖オーバーハングを介して連結させ、その結果、第１のライゲーション生成物が形成される工程と、
ｄ）切断が、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの核酸配列で生じ、このような切断が、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらし、このような複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、一本鎖オーバーハングの配列において異なる様々な分子種からなる、第１のライゲーション生成物を前記第２のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｅ）短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｆ）メンバーの各々が、二本鎖構造を有する、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、該第３のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と一本鎖オーバーハングを含み、該一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのオリゴヌクレオチドの様々なサブグループに関して異なり、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの各１つのサブグループの一本鎖オーバーハングまたはその部分が、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子種の一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であり、かつ、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーが、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの各サブグループのメンバーにおいて異なり、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する、ヌクレオチドストレッチを二本鎖構造中に含む、複数のオリゴヌクレオチドサブグループを含み、各サブグループが複数のメンバーを含む、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程と、
ｇ）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各１つの分子と連結させる工程であって、それらの分子が、基本的に互いに相補的なオーバーハングに連結され、その結果、第２のライゲーション生成物が形成される工程と、
ｈ）第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列に切断が生じ、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされ、このような複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、それらの一本鎖オーバーハングにおいて異なる様々なサブグループからなる、第２のライゲーション生成物を第３のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｉ）短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｊ）メンバーの各々が、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、該一本鎖オーバーハングが、第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列およびストレッチ（好ましくは、様々なメンバーにおいて同一であり、核酸ライブラリーのエレメントの第３または第１のヌクレオチドストレッチをもたらす、前記オーバーハングに隣接するストレッチ）を提供し、該第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーが、それらの一本鎖オーバーハングにおいて異なり、該オーバーハングが核酸ライブラリーの第２のストレッチまたはその部分に相当し、該オリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第４のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、複数のメンバーを含む第３のオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する工程と、
ｋ）分子が、基本的に互いに相補的なオーバーハングに連結され、その結果、第３のライゲーション生成物が形成される、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせ、第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各１つの分子を複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子に連結させる工程と、
ｌ）第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの核酸配列に切断が生じ、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる、第３のライゲーション生成物を第４のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｍ）所望により、短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｎ）一本鎖オーバーハングが、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列を提供し、第５のオリゴヌクレオチドが、認識配列の外側を切断する第５のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖構造を有する、第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
ｏ）複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドライブラリーを組み合わせて、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各１つの分子を第５の少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子に連結させる工程であって、その結果、第４のライゲーション生成物が形成される、工程と、
ｐ）切断が第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列に生じ、複数の第４の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる、第４のライゲーション生成物を第５のＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｑ）所望により、短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
を含む。
【００２３】
第２の態様の実施形態では、方法は、
ｒ）工程ｎ）の第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、さらにまた、工程ｎａ）の少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、工程ｏ）の第４のライゲーション生成物が、さらにまた、工程ｏａ）のライゲーション生成物であり、工程ｐ）の複数の第４の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｐａ）の複数のさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、かつ、工程ｐ）の短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｐａ）の短縮されたさらなる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである、工程ｎ）〜ｑ）を工程ｎａ）〜ｑａ）として反復する工程をさらに含む。
【００２４】
第２の態様の実施形態では、連結工程ｏａ）の後、さらなるライゲーション生成物が切断され、該切断は、さらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じる。
【００２５】
第１および第２の態様の実施形態では、第１のＩＩＳ型制限酵素は、ＢｐｉＩ、ＢｂｓＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｓｍＢＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、ＢｓａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｂｖＩおよびＢｓｇＩを含む群から選択される。
【００２６】
第１および第２の態様の実施形態では、第２の、第３の、第４の、第５および任意のさらなるＩＩＳ型制限酵素は、各々個別に、ＥａｒＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、ＳａｐＩ．ＬｇｕＩ、Ｋｓｐ６３２ＩおよびＢｓｐＱＩを含む群から選択される。
【００２７】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸は一本鎖核酸であり、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの長さは、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの倍数からなる。
【００２８】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸は二本鎖核酸であり、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの長さは、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの倍数からなる。
【００２９】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチは、１または複数のアミノ酸をコードする。
【００３０】
第１および第２の態様の実施形態では、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、第５およびさらなる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、修飾を含み、このような修飾は表面へのオリゴヌクレオチドの固定化を可能にする。
【００３１】
第１および第２の態様の実施形態では、修飾は、ビオチン残基、ジゴキシゲニン残基、フルオレセインイソチオシアネート残基、アミノ化合物またはスクシニルエステルを含む群から選択される。
【００３２】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸ライブラリーは、機能性核酸をコードする核酸分子のライブラリーであり、このような核酸は、アプタマー、プロモーター、リボザイム、およびＲＮＡｉ媒介分子を含む群から選択される。
【００３３】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸ライブラリーは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子のライブラリーである。
【００３４】
第１および第２の態様の実施形態では、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、ペプチドアプタマー、酵素、制限酵素、ＤＮＡ結合ドメイン、ワクチン、抗体、薬学的に活性なタンパク質、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、およびＡｄＮｅｃｔｉｎｅを含む群から選択される。
【００３５】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸ライブラリーは、ポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーであり、該ポリペプチドは、１または複数の一定の領域を含むスキャフォールドであり、該１または複数の可変領域および可変領域の中の１または複数は、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列によりコードされる。
【００３６】
第１および第２の態様の実施形態では、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチは、前記エレメント間の唯一の相違である。
【００３７】
第３の態様では、本出願の基礎をなす問題は、第１および／または第２の態様に従う方法により得られる核酸ライブラリーによって解決される。
【００３８】
第３の態様の実施形態では、ライブラリーのメンバーは、ヌクレオチド位置において異なり、このようなヌクレオチド位置は、少なくとも１、２、３、４、５、および６ヌクレオチドを含む。
【００３９】
第４の態様では、本出願の基礎をなす問題は、核酸分子ライブラリーを製造するための方法によって解決され、該核酸分子ライブラリーは複数のエレメントを含み、該エレメントは少なくとも１つの一定のストレッチと少なくとも１つの可変性のストレッチを含み、少なくとも１つの一定のストレッチは全てのエレメントにおいて同じヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの可変性のストレッチは、全てのエレメントにおいて異なっているヌクレオチド配列を含み、該方法は、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドが、一本鎖オーバーハングを有し、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含む少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドか、または複数のエレメントを含む核酸ライブラリーのいずれかであり、核酸ライブラリーが、第１、第２および／または第３の態様に従う核酸ライブラリーであり、核酸ライブラリーのエレメントが一本鎖オーバーハングを有し、核酸ライブラリーのエレメントが認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含む、第１のオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
ｂ）このような第２のオリゴヌクレオチドが複数のエレメントを含む核酸ライブラリーであり、該核酸ライブラリーが第１、第２および／または第３の態様のいずれかに従う核酸ライブラリーであり、該核酸ライブラリーのエレメントが工程ａ）で提供されるオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに少なくとも部分的に相補的な一本鎖オーバーハングを有し、該核酸ライブラリーの該エレメントが認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含み、該核酸ライブラリーのエレメントの該第２のＩＩＳ型制限酵素が、工程ａ）で提供されるオリゴヌクレオチドの第１のＩＩＳ型制限酵素とは異なっている、第２のオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
ｃ）工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、第１、第２および／または第３の態様のいずれかに従う核酸ライブラリーとは異なるという条件下で、工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）のオリゴヌクレオチドの１つの分子を工程ｂ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる工程、または
工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、第１、第２および／または第３の態様のいずれかに従う核酸ライブラリーであるという条件下で、工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子を工程ｂ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる工程と、
ｄ）所望により、反応しなかった反応体および酵素を除去する工程と、
ｅ）切断が、伸長された核酸分子のライブラリーを提供する工程ａ）または工程ｂ）のオリゴヌクレオチドで生じる、工程ｃ）のライゲーション生成物を、認識配列の外側を切断するＩＩＳ型制限酵素で切断する工程と、
ｆ）所望により、伸長された核酸分子を反応混合物から分離する工程と、を含む。
【００４０】
第４の態様の実施形態では、工程ａ）〜ｆ）は、
工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、工程ｅ）で提供される伸長された核酸分子のライブラリーであるか、または、一本鎖オーバーハングを有し、認識配列の外側を切断するＩＩＳ型制限酵素の認識部位を含む、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであるかのいずれかである、第４のオリゴヌクレオチドである、
工程ｂ）のオリゴヌクレオチドが、工程ｅ）で提供される伸長された核酸分子のライブラリーである、第３のオリゴヌクレオチドである、
該第３および第４のオリゴヌクレオチドが、各々一本鎖オーバーハングを含み、両方のオーバーハングが少なくとも部分的に互いに相補的である、
工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）のオリゴヌクレオチドの１つの分子を工程ｂ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる場合、工程ａ）のオリゴヌクレオチドが、工程ｂ）の伸長された核酸分子のライブラリーとは異なっている、または
工程ａ）と工程ｂ）のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、工程ａ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子を工程ｂ）の核酸ライブラリーの各１つのエレメントの各１つの分子にそれらの一本鎖オーバーハングを介して連結させる場合、工程ａ）のオリゴヌクレオチドが工程ｂ）の伸長された核酸分子のライブラリーである、かつ
工程ｅ）において、さらなる伸長された核酸分子のライブラリーが得られる、
という条件下で反復される。
【００４１】
第４の態様の実施形態では、可変性ストレッチまたはその部分は、第１、第２および／または第３の態様のいずれかに従う核酸ライブラリーのエレメントの第２のストレッチにより提供される。
【００４２】
第４の態様の実施形態では、定常性ストレッチまたはその部分は、第１、第２および／または第３の態様のいずれかに記載される核酸ライブラリーのエレメントの第１のストレッチおよび／または第３のストレッチにより提供される。
【００４３】
第１、第２および／または第３の態様の実施形態では、任意の当該の方法で用いられるライブラリーの様々なエレメントおよびメンバーの比は、等モルである。
【００４４】
第１、第２および／または第３の態様の実施形態では、任意の当該の方法で用いられるライブラリーの様々なエレメントおよびメンバーの比は、非等モルであるかまたは偏っている。
【００４５】
本発明者らは、驚くことに、様々なエレメントまたは核酸分子が、制御された様式で、１または複数の個別のヌクレオチド位置で異なっている、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための、国際特許出願公開第００／７５３６８号に記載される方法を使用することが可能であることを見出した。好ましくは、ライブラリーは、定義された組成、すなわちライブラリーの個々のエレメントを有する、すなわち、様々な核酸配列が、ライブラリー中に定義された、好ましくは制御された頻度で含まれる。核酸種のように、本明細書において核酸ライブラリーのエレメントとも称される個々の核酸配列が、そのように少なくとも１回、好ましくは数回、ライブラリーに存在することは当然理解される。
【００４６】
その程度において、本発明者らは、単一の定義された核酸配列、したがって、このような核酸配列がコード核酸配列である場合（それが事実であることが好ましい）には、定義されたアミノ酸配列を明示的に提供する国際特許出願公開第００／７５３６８号に記載される方法の根底にある基本的概念から逸脱した。前記方法の細心の配慮を考えると、このような方法を使用および修正して本明細書に定義される核酸ライブラリーを得ることは、本発明者らにとって自明ではなかった。本発明者らが国際特許出願公開第００／７５３６８号に記載される方法を、本発明に従う核酸ライブラリーを作製するような形で修正したことは、本発明者らの利点であり、国際公開公報第００／７５３６８号の方法に固有の利点は、個々の配列、すなわち、ライブラリーの個々のエレメントが、必要とされる細心の配慮とともに提供されると同時に、個々のエレメントおよびより具体的には、個々の核酸種が前記ライブラリー中に存在する頻度に関して、十分に定義され、実際に制御されるライブラリーの組成が提供される限りにおいて、本発明の方法において反映されている。その程度において、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーとして反映される配列多様性がもたらされるにもかかわらず、本発明に従う方法は、合成されるべき核酸配列の質、収量および信頼性に関して、国際特許出願公開第００／７５３６８号に固有の利点を提供する。
【００４７】
本発明に従う方法は、タンパク質の設計およびより具体的にはさまざまな変異タンパク質の中から最適化されたタンパク質種を選択することによるタンパク質の最適化に有利に用いられる。このようなライブラリーおよび変異タンパク質の利用分野は、それぞれ、食料、飼料、バイオ燃料および同類のものの分野における工業用酵素に、ならびに抗体、ナノボディ、スキャフォールド類、例えばアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎおよびＡｄｎＥＣＴＩＮＥ（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２５７−６８に概説）など、ならびに、例えば、Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１，７２−７９，Ａｐｒｉｌ  ２００３  に記載されるペプチドアプタマーのような治療用タンパク質の製造にある。さらなる利用分野は、ワクチンの最適化、バイオ医薬品の最適化および製造、制限酵素の最適化、特異的ＤＮＡ結合ドメインの製造ならびに代謝経路の最適化である。しかし、本発明による方法の用途がそれに限定されないことは、当業者により認識される。
【００４８】
本発明が、このような多様なタンパク質が好ましくは野生型配列である出発物質と比較して１または複数のアミノ酸位置において異なる、さまざまなタンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを作り出す際に特に有利であることは明白であるが、本発明に従って作製された核酸ライブラリーを非コード核酸に使用することができることは本発明の範囲内である。好ましくは、このような非コード核酸は、アプタマー、例えば、欧州特許第０５３３８３８号に記載されるもの、プロモーター、リボザイム、一本鎖および二本鎖ＲＮＡならびにＲＮＡｉ構築物である。
【００４９】
本発明に従う方法の反応生成物が、一般に、伸長生成物、特に国際特許出願公開第００／７５３６８号の意味の伸長生成物であり、それは特に、国際特許出願公開第００／７５３６８号に従う方法の第２の反応相（すなわち、いわゆる転位）において、さらに使用することができることは認識される。好ましくは、本発明による方法によりもたらされる反応生成物は、一対ずつ用いられる核酸分子の対の１つのエレメントであり、このような核酸分子は、少なくとも、前記の２つの分子の連結を可能にする一本鎖オーバーハングにおいて異なる。
【００５０】
本出願による方法に関連して用いられる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドはいずれも、本明細書において明確にそれとは反対に示されない場合、その二本鎖ストレッチがオリゴヌクレオチドの別の部分の上に折り畳まれたオリゴヌクレオチドの一部分により形成される単一のオリゴヌクレオチドからなるか、または２または複数のオリゴヌクレオチドからなり得る。後者の場合、何個の個々のオリゴヌクレオチドが反応に関与しているかにほとんど関係なく、前記オリゴヌクレオチドの二本鎖ストレッチが形成されることで十分である。しかし、前記オリゴヌクレオチドは、相互にアニールされた２本のオリゴヌクレオチドにより、好ましくは、ワトソン−クリック塩基対形成を通じて形成されることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドが分枝したオリゴヌクレオチドにより形成されることも本発明の範囲内である。また、このような分枝オリゴヌクレオチドは、前記方法の工程ａ）で定義される通りの判定基準にそれが合致するならば、本発明の第１の態様による方法での使用に適している。分枝オリゴヌクレオチドは、少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと一本鎖オリゴヌクレオチドを結合させることによるか、あるいは、２または数本の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基対形成のいずれかから生成して、一本鎖の突出部またはオーバーハングを有する前記少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを形成することができる。分岐点はヌクレオチドであり、それは好ましくはループ領域に位置し、さらなるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとの化学的結合を可能にする化学的部分を有する。オリゴヌクレオチドまたは核酸の分枝をそれぞれ可能にする、このような化学的部分は、当業者に公知である。このような化学的部分の例は、それぞれ、Ｈｏａｒｅ  ａｎｄ  Ｋｏｓｈｌａｎｄ  Ｊｒ．（Ｈｏａｒｅ  Ｄ  Ｇ，．Ｋｏｓｈｌａｎｄ  Ｄ  Ｅ，Ｊｒ．（１９６７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２：２４４７−２４５３）およびＪｏｈｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  Ｂ，Ｌｏｆａｓ  Ｓ，Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ  Ｇ．（１９９１），Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−７７．）に記載される、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシルスルホスクシンイミド）で活性化され得るアミノもしくはカルボキシリンカーである。工程ａ）の前記第１のオリゴヌクレオチドは、本明細書において、「左側のスターター」とも称され、一方、工程ｂ）の類似の第１のオリゴヌクレオチドは「右側のスターター」とも呼ばれている。
【００５１】
本明細書に記載される様々なオーバーハングの長さに関して、このような長さは、好ましくは、１ヌクレオチドオーバーハング、２ヌクレオチドオーバーハング、３ヌクレオチドオーバーハング、４ヌクレオチドオーバーハングまたは５ヌクレオチドオーバーハングを含む群から選択される。原則として、オーバーハングの長さは、伸長相、すなわち、核酸の製造のための方法の第１の工程で用いられる制限酵素によって決まる。第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに特異的な制限酵素の切断部位から遠位の隣接ヌクレオチドを加えた該一本鎖オーバーハングのヌクレオチドは、各伸長工程において移動したヌクレオチドを構成する。移動したヌクレオチドの数は、次には可能性のある配列すべてを構築するために必要なオリゴヌクレオチドのライブラリーのサイズを決定する。例として、６ヌクレオチドがそれぞれの工程で移動する場合、可能性のある全ての六量体の順列を表すために４６＝４０９６の異なるオリゴヌクレオチドのライブラリーが必要とされる。本発明の方法に関連して特に好ましいオーバーハングは、３ヌクレオチドから成り、それにより、このような３ヌクレオチドがアミノ酸をコードすることは、認識される。
【００５２】
実施形態では、本発明による方法に関連して用いられるオリゴヌクレオチドの修飾は、特異的相互作用対、例えば、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、エクストラアビジンおよび人工ビオチン結合部位を含む、その任意の変異株もしくは誘導体などの１つのエレメントである。さらなる特異的相互作用対としては、しかしそれに限定されないが、ＦＩＴＣ−抗ＦＩＴＣ抗体（Ｓｅｒｋｅ  Ｓ，Ｐａｃｈｍａｎｎ  Ｋ（１９８８），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１２（２）：２０７−１１）およびジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体（Ｋｅｓｓｌｅｒ  Ｃ，Ｈｏｌｔｋｅ  ＨＪ，Ｓｅｉｂｌ  Ｒ，Ｂｕｒｇ  Ｊ，Ｍｕｈｌｅｇｇｅｒ  Ｋ．（１９９０），Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ．３７１（１０）：９１７−２７）．）が挙げられる。
【００５３】
また、このような修飾が、表面への特異的固定化を可能にするヌクレオチドまたは核酸配列であり得ることも、当業者により認識される。
【００５４】
ＩＩＳ型制限酵素に関連して、以下の組み合わせが原則として本発明を実施するために適している。
【００５５】
本発明の方法に関連して第１のＩＩＳ型制限酵素として用いられることが好ましいＩＩＳ型制限酵素の１つの群は、次の酵素、すなわちＢｐｉＩ、ＢｂｓＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｓｍＢＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、ＢｓａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｂｖＩおよびＢｓｇＩを含む。
【００５６】
本発明の方法に関連して第２、第３、第４、第５およびさらなるＩＩＳ型制限酵素として用いられることが好ましいＩＩＳ型制限酵素のもう１つの群は、次の酵素、すなわちＥａｒＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、ＳａｐＩ．ＬｇｕＩ、Ｋｓｐ６３２ＩおよびＢｓｐＱＩを含む。この群に関連して制限酵素１１０４Ｉが特に好ましい。
【００５７】
さらなる特徴、実施形態および利点を得ることのできる、添付の図面を参照することにより、本発明をこれからさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１（１）】本発明の第１の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような１つの位置は、翻訳の際に１つの異なるアミノ酸をもたらす。
【図１（２）】本発明の第１の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような１つの位置は、翻訳の際に１つの異なるアミノ酸をもたらす。
【図２（１）】本発明の第２の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような位置は、各々アミノ酸をコードする、２つの連続するヌクレオチドのトリプレットを含む。
【図２（２）】本発明の第２の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような位置は、各々アミノ酸をコードする、２つの連続するヌクレオチドのトリプレットを含む。
【図２（３）】本発明の第２の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような位置は、各々アミノ酸をコードする、２つの連続するヌクレオチドのトリプレットを含む。
【図３（１）】本発明の第１の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような１つの位置は、翻訳の際に１つの異なるアミノ酸をもたらし、該可変性の位置は、末端の位置である。
【図３（２）】本発明の第１の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の１つの位置で異なり、このような１つの位置は、翻訳の際に１つの異なるアミノ酸をもたらし、該可変性の位置は、末端の位置である。
【図４（１）】本発明の第２の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の２つの位置で異なり、このような２つの位置は、翻訳の際に２つの異なるアミノ酸をもたらし、該可変性の位置は、２つの連続する末端の位置である。
【図４（２）】本発明の第２の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の２つの位置で異なり、このような２つの位置は、翻訳の際に２つの異なるアミノ酸をもたらし、該可変性の位置は、２つの連続する末端の位置である。
【図４（３）】本発明の第２の態様に従う核酸ライブラリーの作製のための方法の説明図である。核酸ライブラリーのメンバーは、配列の２つの位置で異なり、このような２つの位置は、翻訳の際に２つの異なるアミノ酸をもたらし、該可変性の位置は、２つの連続する末端の位置である。
【図５】本出願の第１の態様に従う方法を用いる核酸ライブラリーの合成において得られるコドン頻度を示す柱状グラフである。
【図６】本出願の第２の態様に従う方法を用いる核酸ライブラリーの合成において得られる、２つの連続する位置のコドン頻度を示す柱状グラフである。
【図７】本出願の第１の態様に従う方法を用いる核酸ライブラリーの合成において得られる、コドンの均等な分布での１つの可変性の位置のコドン頻度を示す柱状グラフである。
【図８】本出願の第１の態様に従う方法を用いる核酸ライブラリーの合成において得られる、コドンの不均等な分布での１つの可変性の位置のコドン頻度を示す柱状グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
下記は、複数のエレメントを含む核酸ライブラリーを作製するための、本発明に従う方法の説明であり、それにより必要不可欠な工程だけがより詳細に説明されることは、当業者に認識される。本発明に従う方法を実施するうえでのさらなる詳細は、本出願の開示、および、国際特許出願公開第００／７５３６８号に定義される方法に基づく、根底にある反応原理を考慮すると当業者に明らかである。
【００６０】
図１に図示される核酸ライブラリーを作製するための方法。
本発明の方法は、図１に示される標的配列の合成に関して説明される。このような標的配列は、一般に５’→３’方向の、左から右に読む４つのトリプレットを含み、第２のトリプレットは、核酸レベルならびに特にアミノ酸レベルの両方で異なる。好ましくはその他の明確に表されないヌクレオチドならびに好ましくは発明に従う方法に従って合成されるトリプレットおよびアミノ酸配列がそうであるように、作製される予定の核酸ライブラリーの様々なエレメントに関して、第１、第３および第４のトリプレットは同じである。
【００６１】
本発明に従う核酸ライブラリーは、複数のエレメントを含み、前記核酸ライブラリーの該エレメントの各々は、第１のトリプレットに対応する第１のヌクレオチドストレッチ、第２のトリプレットに対応する第２のヌクレオチドストレッチおよび第３および第４のトリプレットに対応する第３のヌクレオチドストレッチを含む。第１のヌクレオチドストレッチの配列および第３のヌクレオチドストレッチの配列は核酸ライブラリーの各々のエレメントにおいて同一であり、核酸ライブラリーのエレメントは、第２のヌクレオチドストレッチの配列において異なる。標的配列において、第１のストレッチはしたがってＣＡＣを含むストレッチであり、第３のストレッチは２つのトリプレットＧＡＧおよびＡＣＡを含むストレッチである。第２のストレッチは、したがって、ＡＴＧ、ＴＡＴまたはＧＡＧのいずれかを含むストレッチである。上に概説したように、核酸ライブラリーのエレメントは、少なくとも第２のストレッチに関して異なる。したがって、好ましい実施形態では、本発明によるライブラリーは３つのエレメントを含み、第１のエレメントはＣＡＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡの配列を含み、第２のエレメントはＣＡＣＴＡＴＧＡＧＡＣＡの配列を含み、第３のエレメントは核酸配列ＣＡＣＧＡＧＧＡＧＡＣＡを含む。しかし、第２のストレッチがさらなる代替トリプレットを含み得ること、したがって核酸ライブラリーの複雑さが増すことは当然理解される。
【００６２】
工程１において、二本鎖構造を有する、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが提供される。このような少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングを有し、本明細書においてスプリンカーとも称される。一本鎖オーバーハングは、核酸ライブラリーのエレメントの第１もしくは第３のヌクレオチドストレッチまたはその部分の配列に対応する核酸配列をもたらす。一本鎖オーバーハングが第１もしくは第３のストレッチの部分に対応するならば、このような対応は、第１および第３のストレッチのそれぞれ最も末端の部分に対するものであることが好ましい。本明細書において好ましく用いられる場合、配列が相互に対応するという表現は、配列が、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成に基づいて互いに相補的であり、配列が互いに相補的である、好ましくは、完全に相補的である、すなわち、完全な一致を示すことを意味する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。この場合は、このような第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ＧＴＧを含む一本鎖オーバーハングを有し、したがって、第１のトリプレット、したがって標的配列の第１のストレッチに相補的である。第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、図１（１）に示される実施形態において、ループを形成するように単一のオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの別の部分に対して折り畳まれる構成を含む。しかし、少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、相互に塩基対形成し、したがってこのような少なくとも部分的なオリゴヌクレオチドおよび上記の一本鎖オーバーハングを生成する２本の別個の一本鎖オリゴヌクレオチドにより形成されることも本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、連結に必要とされる一本鎖オーバーハングを提供しない、このような後者の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの末端は、本発明に従う方法のその後の工程で潜在的に可能ないかなる連結または反応も回避するためにブロックされる。
【００６３】
工程２において、複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。前記第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、本明細書において第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドとも称され、二本鎖構造を有する。この二本鎖構造は、第１の少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドに関連するように、上記のようなさらなる修飾を有する２本の一本鎖により形成され得る。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。さらに、このような第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングを提供する。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、同じ一本鎖オーバーハングを有し、このような一本鎖オーバーハングは、本質的にまたは部分的に、該第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに相補的である。この場合は、このような一本鎖オーバーハングは、ＣＡＣである。一本鎖オーバーハングの後に、第２の少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドストレッチを含む二本鎖構造を含み、それによって、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、前記ヌクレオチドストレッチの配列において異なり、前記ヌクレオチドストレッチの配列は、本発明に従う核酸ライブラリーのエレメントの第２のストレッチの配列またはその部分に対応する。したがって、図１（１）に示されるように、一本鎖オーバーハングの後のメンバーの二本鎖部分が、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの対象となる（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｔｏ）様々な配列を含む、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。二本鎖構造が、実施形態では、標的配列のヌクレオチドをさらに含んでも含まなくてもよい、さらなるヌクレオチドを含むことは本発明の範囲内である。図１に示される特定の使用において、これらの配列は、ＡＴＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧであり、それらの相補的配列、すなわち、ＴＡＣ、ＡＴＡおよびＣＴＣ（３’→５’方向に）と塩基対形成し、また、本明細書においてＡＴＧ／ＴＡＣ、ＴＡＴ／ＡＴＡおよびＧＡＧ／ＣＴＣと表すこともできる。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、したがって前記ヌクレオチドストレッチの配列において異なり、第１のヌクレオチドライブラリーのメンバーの前記ヌクレオチドストレッチの配列は、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する。したがって、本発明による方法を用いて作製される核酸ライブラリーの複雑さ（図１の場合では３、すなわち３つの異なるエレメントからなる）は反映され、これも３つの異なるメンバーからなる第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの複雑さと実際に同じであることが好ましい。
【００６４】
さらに、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、修飾を含む。この場合、このような修飾により、様々なメンバーの表面、一般に支持体または担体の表面への固定化が可能となる。固定化は、修飾と、このような修飾の相互作用パートナーとの間の相互作用により特異的に媒介される。この場合は、修飾は、その相互作用パートナーとしてのストレプトアビジンと相互作用するビオチンであり、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーおよびそれを用いるあらゆる連結反応の反応生成物の固定化を可能にする安定な複合体をもたらす。これらのメンバーは、修飾が存在するために、本明細書においてアンカーまたはアンカー分子とも称される。
【００６５】
図１において、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーのＩＩＳ型制限酵素の認識部位は黒色の長方形として示され、この種類の制限酵素に対して、認識部位は切断部位の外側に位置するという事実が図示される。
【００６６】
工程３において、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーおよびそのメンバーがそれぞれ組み合わされる。このような合成において、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子はアニールされ、その後第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの１つのメンバーの１つの分子に、好ましくは、リガーゼまたはリガーゼ活性によって連結される。このような連結は、２種類の分子の一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションによって第１の連結前生成物を生じる際に起こり、このようなオーバーハングは「粘着末端」として働く。連結の反応生成物は、第１のライゲーション生成物と称される。様々なエレメントおよび種を含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーに起因して、連結反応は、それぞれ第１のライゲーション生成物のプールまたは複数の第１のライゲーション生成物となる。また、事実上さらなるライブラリーを構成する、この複数のライゲーション生成物において、メンバーは、少なくとも、かつ好ましくは、本例では、第２のトリプレットに対応する配列、したがって標的配列の第２のストレッチのみが異なり、それに対して、一般に第１のライゲーション生成物の残りの部分は核酸配列に関して、好ましくは様々なエレメントについて同じであり、したがって第１のライゲーション生成物ライブラリーを形成した。複数の第１のライゲーション生成物は、この場合には、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを形成する異なった第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの数により決定される、３つの異なるライゲーション生成物を含む。第１の態様による方法において、第１のライゲーション生成物が、それらの標的配列の第２のストレッチに対応する配列が異なる様々な分子種を含むことは認識される。このような種の核酸配列の多様性は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーによりもたらされる。
【００６７】
工程４において、第１のライゲーション生成物は、ＩＩＳ型制限酵素で切断される。このようなＩＩＳ型制限酵素の認識部位は、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドによりもたらされる認識部位であり、本明細書において第２のＩＩＳ型制限酵素と称される。第１のライゲーション生成物の切断は、第１のライゲーション生成物からなるプールおよびライブラリーのそれぞれで行われる。したがって、第１のライゲーション生成物の切断（ｃｕｔｔｉｎｇ  ｏｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ）は、したがって複数の切断分子を結果としてもたらし、このような切断の反応生成物は、異なる種の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと複数の短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドからなる、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである。
【００６８】
工程３および４の実行が、それぞれ、第１のライブラリーライゲーション生成物からなる第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの固定化または非固定化に関して、それぞれ異なる反応条件下で行うことができることは、認識される。いずれの場合にも、それぞれの分子は修飾をもたらし、その修飾は、上記に概説されるように修飾の相互作用パートナーを含む支持体への分子の固定化を可能にする。したがって、固定化工程に関連するあらゆる配列は、原則として、様々な実施形態において実行することができる。したがって、液相中での工程３を対象とする、すなわち固定化されていない第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーを用いる連結反応を実行することは、本発明の範囲内である。その後、第１のライゲーション生成物の切断が生じてよい。実施形態では、このような切断は、次に、その修飾を介して支持体に固定化されていない第１のライゲーション生成物を含む液相中でも行われる。切断後、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、支持体への結合によるその修飾を介して反応混合物から除去される。あるいは、連結後、第１のライゲーション生成物を表面に固定化することができ、第１のライゲーション生成物の切断は、このような表面に固定化されている第１のライゲーション生成物を用いて行われる。いずれの場合でも、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、その修飾による支持体へのその固定化により最終的に反応から除去される。相互作用パートナー、例えばビオチンとストレプトアビジンなどを用いる特異的相互作用を可能にする修飾により、固定化目的のため、反応物は反応容器、好ましくは、修飾の相互作用パートナー（修飾をビオチンとする本例ではストレプトアビジン）を含む支持体を構成するその壁に移されることは、認識される。ビオチンとストレプトアビジンの高い親和性に起因して、修飾を含む分子の支持体との結合は直ちに起こる。言い換えれば、連結反応などの反応がこのような修飾を有する分子で行われるのであれば、このような反応において有用な反応容器または任意の表面は修飾の相互作用パートナーを含むものではなく、一方、固定化が意図される場合には、反応容器が用いられ、その表面は、反応容器かまたはこのような反応において一般的なその他の表面のいずれかにより、このような修飾の相互作用パートナーを提供する。
【００６９】
言い換えれば、ライゲーション生成物の形成に関する第１の態様による方法の一実施形態では、ライゲーション生成物をそれぞれのＩＩＳ型制限酵素で切断することが可能であり、その認識配列は、ライゲーション生成物の支持体への固定化を可能にする修飾をもたらすそれぞれのオリゴヌクレオチドライブラリーまたは任意のオリゴヌクレオチドにより提供され、該切断により、複数の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされ、前記短縮された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、修飾を介する前記支持体への固定化により反応混合物から除去される。代替実施形態では、ライゲーション生成物の形成に関して、前記ライゲーション生成物は、修飾を介して支持体に固定化され、このようにして固定化されたライゲーション生成物は、ライゲーション生成物の支持体への固定化を可能にする修飾をもたらすそれぞれのオリゴヌクレオチドライブラリーまたは任意のオリゴヌクレオチドによりその認識配列が提供されるＩＩＳ型制限酵素により切断され、該切断により、複数の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされ、前記短縮された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、支持体に結合されるか、または結合されたままである。
【００７０】
工程５の反応は、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの固定化により成されることが好ましい、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの除去からなる。
【００７１】
この反応配列に起因して、反応および好ましくはその上清は、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを含む。一般に工程６である、さらなる工程では、複数のメンバーを含む第２のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。このような第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、二本鎖構造を含む。二本鎖構造は、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドなどのその他の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関して本明細書において概説されるように設計され得る。より具体的には、第３のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と、一本鎖オーバーハングを含む。一本鎖オーバーハングまたはその部分は、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して異なる。このような第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの一本鎖オーバーハングまたはその部分は、伸長された第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的である。本発明の方法の根底にある機構に起因して、複数の伸長された第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの種のオーバーハングが、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの１つのメンバーに相補的であることは、当業者に理解される。また、複数の伸長された第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの様々な種のオーバーハングおよび第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの様々なメンバーのオーバーハングは、全体でみると互いに相補的であるが、様々な第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各オーバーハングは、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各オーバーハングに相補的にならないことも、認識される。第２のオリゴヌクレオチドライブラリーは、したがって、ＡＴＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧそれぞれの一本鎖オーバーハングを提供する。したがって、この場合、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーは３つのメンバーを含む。第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、全てのメンバーにおいて同一であるヌクレオチドストレッチを二本鎖構造中にさらに含み、核酸ライブラリーのエレメントの第３もしくは第１のヌクレオチドストレッチの配列またはその部分に対応する。第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、修飾を含み、このような修飾は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーに関して同じであることが好ましい。
【００７２】
工程７において、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドライブラリーが組み合わされる。オーバーハングの相補性に起因して、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの種の１つの分子は、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの１つのメンバーの１つの分子と連結される。連結されるべき分子のそれぞれの対は、反応対を規定するオーバーハングの相補性により規定される。それらの一本鎖オーバーハングにより規定される対応する２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズされるかまたはアニールされるとすぐに、連結が一般に起こる。このような連結反応のライゲーション生成物は、第２のライゲーション生成物と呼ばれる。この場合は、第２のライゲーション生成物は合計３つの異なる配列、したがって３つの異なる種を含み、それにより、このような種の配列は、少なくともかつ一般に独占的に、標的配列の第２のストレッチに対応する配列において異なる。第２のライゲーション生成物は、再びライブラリーを形成する。
【００７３】
次の工程、すなわち、第３のＩＩＳ型制限酵素で第２のライゲーション生成物を切断し、該切断が、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じる工程８は、第１のライゲーション生成物に関して記載されるものと同じように設計される。これは、固定化による結合および切断および除去それぞれの可能性のある配列に関して特にあてはまる。第２のライゲーション生成物が第３のＩＩＳ型制限酵素で切断される工程８の結果として、合計３つの異なるオリゴヌクレオチドの種を含む複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、および短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる。また、したがって第２のライゲーション生成物から放出される、短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、相互作用パートナー、例えば、修飾および表面に結合した修飾であるビオチンとともにストレプトアビジンなどとのその相互作用により、反応から除去される。
【００７４】
工程９において、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが提供される。この第４の二本鎖のオリゴヌクレオチドは一本鎖オーバーハングを有し、そうでなければ、この第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの設計は、実施形態では、図１に関連して記載されるその他の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関連して記載される実施形態に類似してよい。第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングは、第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列をもたらす。第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、第３のストレッチの第１のトリプレットに対応する前記オーバーハングと同じであり、したがって第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの３つ全ての種に関して同一である。さらに、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第４のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。このような第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングは、図１（２）に示されるように、ＧＡＧであり、したがって第３のストレッチの第１のトリプレットと同一である。このような第４のオリゴヌクレオチドと複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは合わされ、連結される。再び、第４のオリゴヌクレオチドの１つの分子を、両方のオリゴヌクレオチドのオーバーハングの相補性によって、第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子にアニールした。このようにしてアニールされた分子は、次に連結されて第３のライゲーション生成物がもたらされる。その他の反応に関連して、オーバーハングの相補性に起因して、１対１の反応、すなわち反応中に含まれる反応体の各々の種の１つの分子間の反応が起こる。第３のライゲーション生成物は、最終的に図１（１）に示される標的配列を含む。このような第３のライゲーション生成物は、第４のＩＩＳ型制限酵素により切断されてよく、該切断は、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じ、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドをもたらす。また、さらなる反応の配列のデザインは、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドライブラリーに関連して概説されるように変動し得る。
【００７５】
図１に具体的に示される配列に関して理解されるように、切断に使用されるＩＩＳ型制限酵素は、アンカー分子、すなわち、相互作用パートナーとの相互作用、したがって連結によって付加されたかまたは切断により除去されたかもしれない任意の部分を含む、分子の固定化を可能にする修飾をもたらす分子によりもたらされる酵素である。図１に記載される例に関連して用いられる様々なアンカー配列の全てに固有の特異的ＩＩＳ型制限酵素は、Ｅａｍ１１０４Ｉである。
【００７６】
このような第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、上記に概説されるように伸長工程とも称されるさらなる反応工程に供することができる。
【００７７】
また、その代わりに、このようにして得られた標的配列、より具体的には、第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、次に国際特許出願公開第００／７５３６８号に関連して記載される転移工程に用いることができることも、当業者により認識される。
【００７８】
図２に図示される核酸ライブラリーを作製するための方法
そのエレメントが２つの続いて起こるヌクレオチドトリプレットからなる可変性の位置を含む、核酸ライブラリーの作製のための方法に関連して、次の一連の工程が一般に適用される。図２（１）に示される標的配列は、第１のストレッチとしてＣＡＣ、配列が可変性であり、本例では、（５’→３’方向で）ＡＴＧＣＴＣ、ＡＴＧＧＡＧ、ＡＴＧＴＴＴ、ＴＡＴＧＡＧ、ＴＡＴＣＴＣ、ＴＡＴＴＴＴ、ＧＡＧＴＴＴ、ＧＡＧＣＴＣ、またはＧＡＧＧＡＧ、したがって核酸ライブラリーの各々のエレメントに関して異なる核酸配列であるが、どんな場合でも任意の配列よりも既知の核酸配列に規定される配列のいずれかを含む第２のストレッチとして可変性のストレッチおよび第３のストレッチとしてＡＣＡを含む。
【００７９】
第２の可変性ストレッチは、図示される場合において、第２のストレッチの前半および第２のストレッチの後半を含み、該第２のストレッチの前半は次のトリプレット：ＡＴＧ、ＴＡＴ、またはＧＡＧの中の１つを示し、第２のストレッチの後半は、次の異なるトリプレット：ＣＴＣ、ＧＡＧ、またはＴＴＴを含む。
【００８０】
本発明の方法のこの態様の特殊性は、第２のストレッチの前半および第２のストレッチの後半が、異なる反応工程でもたらされるか、または核酸に組み込まれることである。第２のストレッチの前半と第２のストレッチの後半の長さが、用いられるＩＩＳ型制限酵素の切断の特徴によって変動する可能性があることは、認識される。前半と後半の各々の長さが、アミノ酸をコードする３つの連続するヌクレオチドからなる場合が特に好ましい。
【００８１】
第１の工程では、二本鎖構造を有する、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが提供される。このような少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングを有し、本明細書においてスプリンカーとも称される。一本鎖オーバーハングは、核酸ライブラリーのエレメントの第１もしくは第３のヌクレオチドストレッチまたはその部分の配列に対応するヌクレオチド配列を提供する。より具体的には、一本鎖オーバーハング配列は、前記第１もしくは第３のストレッチにそれぞれ相補的である。好ましい実施形態では、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。この場合は、このような第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ＧＴＧを含む一本鎖オーバーハングを有し、したがって標的配列の第１のトリプレットに相補的である。少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、図２（１）に示される実施形態において、オリゴヌクレオチドの別の部分に折り畳まれている一本鎖オリゴヌクレオチドの一部により形成され、したがってループおよび二本鎖構造を形成する。しかし、少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、２本の個別の一本鎖オリゴヌクレオチドのお互いに対する塩基対形成により形成されて、したがって、これも本明細書に記載される、このような少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを生成することも本発明の範囲内である。連結に必要とされる一本鎖オーバーハングをもたらさない上記の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端は、本発明による方法のその後の工程で潜在的に可能ないかなる連結または反応も回避するためにブロックされる。
【００８２】
工程２において、複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。前記第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、本明細書において第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドとも称され、二本鎖構造を有する。この種類の第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、本明細書においてアンカーまたはアンカー分子とも称される。二本鎖構造は、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関して、上記のように、特に図１に示される実施形態に関連して、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの固定化を可能にする修飾を有する２つの一本鎖により形成されてよい。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。さらに、このような第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングをもたらす。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して同じである一本鎖オーバーハングまたはその部分を有し、このような一本鎖オーバーハングは、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的である。この場合は、このような一本鎖オーバーハングはＣＡＣである。一本鎖オーバーハングの後に続いて、二本鎖構造はヌクレオチドストレッチ、より具体的には、二本鎖構造エレメントの二本鎖構造を含み、それにより、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、ヌクレオチド中の前記ストレッチまたは二本鎖構造の配列において異なり、前記ヌクレオチドストレッチの配列は、本発明による核酸ライブラリーのエレメントのヌクレオチドの第２のストレッチの前半の配列またはその部分に対応する。したがって、図２（１）に示されるように、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供され、そのメンバー、すなわち第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングの後に続くメンバーの好ましくは二本鎖部分が、核酸ライブラリーのエレメントのヌクレオチドの第２のストレッチの前半に従属する、様々な配列を含むように特徴付けられる。それに関連して、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの１つのメンバーが、１つのエレメント、すなわち、核酸ライブラリーの対応するエレメントにも含まれる、第２のストレッチの前半の各可能性のある配列の１つを含むことが、認識される。標的配列のさらなるヌクレオチドを、ある実施形態では含むことができ、また異なる実施形態では含むことができない、さらなるヌクレオチドを二本鎖構造が含有することは、本発明の範囲内である。この場合は、各配列は、相補的配列、すなわち第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖構造の（３’→５’方向に）ＴＡＣ、ＡＴＡおよびＣＴＣ形成部分と塩基対形成する、ＡＴＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧである。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、したがって前記ヌクレオチドストレッチの配列において異なり、第１のヌクレオチドライブラリーのメンバーの前記ヌクレオチドストレッチの配列は、核酸ライブラリーのエレメントのヌクレオチドの第２のストレッチの前半の配列またはその部分に対応する。
【００８３】
さらに、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、本明細書に記載されるように、修飾を含み、それは前記修飾の相互作用パートナーを含む担体または表面であってよい支持体に、または支持体上にこのような分子を固定化することを可能にする。このような修飾が存在するという理由から、この種類のオリゴヌクレオチドは、アンカーまたはアンカー分子とも称される。固定化は、修飾とこのような修飾の相互作用パートナーとの間の相互作用により特異的に媒介される。この場合は、修飾は、その相互作用パートナーとしてのストレプトアビジンと相互作用するビオチンであり、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの固定化を可能にする安定な複合体をもたらす。図２において、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーのＩＩＳ型制限酵素の認識部位は黒色の長方形として示され、この種類の制限酵素に対して、認識部位は切断部位の外側に位置するという事実が図示される。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの全てのメンバーが、ＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を有する。
【００８４】
工程３において、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーおよびそのメンバーがそれぞれ組み合わされる。このような組み合わせにおいて、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの１つのメンバーの１つの分子に、好ましくは、リガーゼまたはリガーゼ活性によって連結される。このような連結は、２種類の分子の一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションによって第１の連結前生成物を生じる際に起こり、このようなオーバーハングは「粘着末端」として働く。連結の反応生成物は、第１のライゲーション生成物と称される。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの複雑さ（この場合には３）に起因して、第１のライゲーション生成物は、少なくとも、第２のストレッチの前半に対応する配列において異なる３つの種も含む。一般に第１のライゲーション生成物の残りの部分は核酸配列に関して、好ましくは様々なエレメント、したがって種について同じであり、したがって第１のライゲーション生成物ライブラリーを形成した。
【００８５】
工程４において、第１のライゲーション生成物は、ＩＩＳ型制限酵素で切断される。このようなＩＩＳ型制限酵素の認識部位は、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドによりもたらされる認識部位であり、本明細書において第２のＩＩＳ型制限酵素と称される。第１のライゲーション生成物の切断は、第１のライゲーション生成物で構成されるプールおよびライブラリーのそれぞれで行われる。したがって、第１のライゲーション生成物の切断は、したがってさまざまな切断分子を結果としてもたらし、このような切断の反応生成物は、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、および複数の短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである。複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、一本鎖オーバーハングの配列において異なる様々な分子種からなることが、認識される。
【００８６】
また、工程３および４の実行が、それぞれ、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーおよび第１のライゲーション生成物の固定化または非固定化に関して、それぞれ異なる反応条件下で行うことができることも、認識される。いずれの場合にも、それぞれの分子は修飾をもたらし、その修飾は、上記に概説されるように固定化を可能にする。したがって、固定化工程に関連するあらゆる配列は、原則として、様々な実施形態において実行することができる。したがって、液相中での工程３を対象とする、すなわち固定化されていない第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーを用いる連結反応を実行することは、本発明の範囲内である。その後、第１のライゲーション生成物の切断が生じる。一実施形態では、このような切断は、次に、その修飾を介して支持体に固定化されていない第１のライゲーション生成物を含む液相中で行われる。切断後、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、支持体への結合によるその修飾を介して反応混合物から除去される。あるいは、連結後、第１のライゲーション生成物を支持体にまたは支持体の上に固定化することができ、第１のライゲーション生成物の切断工程は、このような支持体に固定化されている第１のライゲーション生成物を用いて行われる。いずれの場合でも、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、その修飾によってそれを支持体へ固定化することにより反応から除去される。特異的相互作用、例えばビオチンとストレプトアビジンとの間などを可能にする修飾により、固定化目的のため、反応物が反応容器、好ましくは、修飾の相互作用パートナー（修飾をビオチンとする本例ではストレプトアビジン）を有するその壁に移されることは、認識される。ビオチンとストレプトアビジンの高い親和性に起因して、修飾を含む分子と、支持体として働く表面を含むストレプトアビジンの結合は直ちに起こる。言い換えれば、反応がこのような修飾を有する分子で行われるのであれば、このような反応において有用な反応容器または任意の支持体は修飾の相互作用パートナーを含むものではなく、一方、固定化が意図される場合には、反応容器が用いられ、その表面は、反応容器かまたはこのような反応において一般的なその他の表面または支持体のいずれかにより、このような修飾の相互作用パートナーを提供する。
【００８７】
工程５の反応は、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの固定化により成されることが好ましい、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの除去からなる。
【００８８】
この反応配列に起因して、反応および好ましくはその上清は、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを含む。様々な第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、それらの一本鎖オーバーハングにより、オリゴヌクレオチドの様々な種またはサブグループを規定する。この場合では、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは３つの異なる種またはサブグループを含む。各サブグループは、次には様々な種類の分子を含み、その分子は、二本鎖ストレッチまたはその部分を形成するヌクレオチドストレッチに関して異なっていることが好ましく、かつ、標的核酸の第２のヌクレオチドストレッチ、またはその部分に対応する。様々なサブグループが、全体として、二本鎖ストレッチまたはその部分を形成する同じヌクレオチドストレッチを有し、かつ標的核酸の第２のヌクレオチドストレッチ、またはその部分に対応する分子を含むことが好ましいことが、認識される。一般に工程６である、さらなる工程では、複数のメンバーを含む第２のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。このような第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、二本鎖構造を有する。前記二本鎖構造は、好ましくは、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドなどのその他の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関して本明細書において概説されるように設計され得る。より具体的には、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分と、一本鎖オーバーハングを含む。一本鎖オーバーハングまたはその部分は、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに関して異なる。本例において、このようなオーバーハングは、ＡＴＧ、ＴＡＴまたはＧＡＧのいずれかである。第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドのこのような一本鎖オーバーハングまたはその部分は、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的である。第１の伸長された、二本鎖のオリゴヌクレオチドのただ１つの種を第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの種と反応させ、最終的に連結させることができる、つまり、その一本鎖オーバーハングが、好ましくは本質的にまたは部分的に、互いに相補的であることは、当業者に認識される。全体としてのみ考えると、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの様々な種および第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの様々な種のオーバーハングは互いに相補的である。第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの様々なメンバーにおいて異なる、ヌクレオチドストレッチをさらに二本鎖構造中に含む。このストレッチに関する多様性は、標的配列の第２のストレッチの前半および第２のストレッチの後半の組み合わせの可能性の結果起こる。この例では、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの数が３×３、すなわち９つ���異なる分子に必ずなるように、第２のストレッチの前半と第２のストレッチの後半がそれぞれ３つの異なるトリプレットを含む。前半が３つの異なるトリプレットからなり、後半が４つの異なるトリプレットからなる場合、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの複雑さは３×４、すなわち１２となるはずであり、前記ライブラリーは１２の異なる種のオリゴヌクレオチドをもたらす。したがって、この場合には、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーは９つのメンバーからなり、したがって標的配列の第２のストレッチの変動から生じる、より具体的には、このような第２のストレッチが異なる分子による標的配列に寄与する前半および後半からなるという事実から生じる、任意の組み合わせが提供され、このような第１および第２のストレッチの各々は３つの異なる形態または配列を含み、その結果９つの異なる種が得られる。また、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは修飾を含み、このような修飾は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーに関して記載されるものと同じであることが好ましい。
【００８９】
工程７において、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖の、３つの異なる種からなるオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドライブラリーが組み合わされる。上記に概説されるオーバーハングの相補性に起因して、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの複数の各１つの分子、すなわち、３つの異なる種の各１つは、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの１つの分子と連結される。連結されるべき分子のそれぞれの対は、反応対を規定するそれらのオーバーハングの相補性により規定される。対応する２つの分子が、ハイブリダイズされるかまたはアニールされるとすぐに、それぞれのリガーゼ活性の付加または存在で連結が一般に起こる。このようなライゲーション生成物では、標的配列の第２のストレッチの前半および第２のストレッチの後半がライゲーション生成物に既に含まれていて、図２（２）の長方形で表される。９つの異なるライゲーション生成物は、二本鎖ストレッチとして、標的核酸の第２のストレッチの前半および標的核酸の第２のストレッチの後半を既に含む。
【００９０】
この場合、第２のライゲーション生成物は、合計９つの異なる配列を含み、該配列は、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、および本例では、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーにより提供される二本鎖構造の第１のトリプレットにより第２のライゲーション生成物に導入された一本鎖オーバーハングにおいて異なる。その他の実施形態では、ライゲーション生成物のさらなる部分にさらなる差異が存在する可能性があるが、しかし、第２のライゲーション生成物からなるライブラリーの様々なメンバーにおいて上述の２つの差異は他の点では同じであることが好ましい。再び、第２のライゲーション生成物からなるライブラリーの様々なメンバーは、ＩＩＳ型制限酵素認識部位またはその部分を有し、それは、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つに対応する。
【００９１】
次の工程、すなわち工程８は、第３のＩＩＳ型制限酵素での第２のライゲーション生成物の切断からなり、該切断が、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの核酸配列で生じ、原則として、第１のライゲーション生成物に関して記載されるものと同じようにそれぞれ設計され、生成される。これは、固定化による結合および切断および除去それぞれの可能性のある配列に関して特にあてはまる。第２のライゲーション生成物が第３のＩＩＳ型制限酵素で切断される過程で工程８の結果として、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドがもたらされる。また、したがって第２のライゲーション生成物から放出される、短縮された第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、相互作用パートナー、例えば、修飾および表面に結合した修飾であるビオチンとともにストレプトアビジンなどとのその相互作用により、反応から除去される。
【００９２】
このようにして得られた９つの異なる第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを図２（２）に示す。
【００９３】
工程９において、さまざまな第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを含む第３のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。前記第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、それらのオーバーハングにおいて異なる。そうでなければ、この第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの設計は、実施形態では、図１および図２それぞれに関して記載されるその他の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関して記載される実施形態に類似してよい。一本鎖オーバーハングは、様々な第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的なヌクレオチド配列をもたらす。第３のオリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれの種の数は、調製されることになる核酸、およびしたがって様々な第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの第２のストレッチの後半の変動から生じ、それに対応する。このような第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、この場合には、総合すると、３つの異なる一本鎖オーバーハングを有する。より具体的には、これらのオーバーハングは、ＡＡＡ、ＣＴＣ、およびＧＡＧであり、標的核酸の第２のストレッチの後半、つまりＴＴＴ、ＧＡＧ、およびＣＴＣに相補的である。さらに、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第４のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。このような第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、すなわち、本例では３つの異なるこれらのオリゴヌクレオチド、および複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、この場合には９つの異なる種のこのようなオリゴヌクレオチドは、相互に合わされ、それらの相補的な一本鎖オーバーハングによるハイブリダイゼーションにより２つの分子のアニーリングのリガーゼ活性によって連結される。また、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子および様々な第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子は、それらのオーバーハングの相補性によりアニールされた。その程度において、前記３つの異なる第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの中の１つは、原則として、３つの第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと反応性である、つまりその一本鎖がそれぞれの第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖に相補的である。これにより、また、合計９つの異なるオリゴヌクレオチドが得られる。このようにしてアニールされた分子は、次にリガーゼ活性によって連結され、第３のライゲーション生成物をもたらす。このような第３のライゲーション生成物は９つの異なる種のライゲーション生成物からなり、該ライゲーション生成物は、標的核酸の第２のストレッチの前半と後半の両方を含み、このような配列は各々両側を別の群、この場合には３つのヌクレオチドで隣接されている。本出願の方法で用いられるライブラリーおよびオリゴヌクレオチドの複雑さが、調製される核酸の第２のストレッチの前半および後半、またはその増幅産物の変動性の結果直ちに起こり、これに相当することは、認識される。その他の反応に関して、オーバーハングの相補性によって、１対１の反応、すなわち、反応に含まれる反応体の各々の種の１つの分子間の反応が起こる。第３のライゲーション生成物は、したがって最終的に図２（１）に示される標的配列を含む。標的配列の可変性の配列、すなわち、ライゲーション生成物の様々な種において異なる配列は、図２（３）中の長方形で示される。
【００９４】
また、図１の方法に関して記載されるように、このような分子は、ＩＩＳ型制限酵素を用いて第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドにより提供されるそれぞれの認識配列を利用して切断し、上記に概説されるものと同じ反応スキームを用いてさらなる反応に供してもよいし、それとも標的配列の放出を可能にする第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドにより次に提供されるＩＩＳ型制限酵素を用いる切断に供してもよい。後者の代替法では、第３のライゲーション生成物は、したがってその他の分子を用いる転位反応に導入されるように切断されてよく、一般に、国際公開公報第００／７５３６８号に関して記載される転位反応を可能にするように同様の方法で調製される。
【００９５】
図３に図示される核酸ライブラリーを作製するための方法。
本発明による方法およびより具体的には第１の態様による方法のさらなる代替法では、図３（１）に示されるように標的配列が合成され、該第１の位置、すなわち示される例では第１のトリプレットは可変性であり、この場合には３つのヌクレオチドからなる。このような可変性の位置は、第１のストレッチとも称され、一方、その後に続くトリプレットは、それぞれ第２および第３のストレッチと称される。以下に考察される問題を除いて、このような方法で用いられる工程および分子は、あらゆる不要な繰り返しを避けるために参照により本明細書に援用される、本発明の第１の態様に従う方法に関して本明細書に記載されるそれに対応する。
【００９６】
第１の工程において、複数の第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが提供される。このような少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、二本鎖構造および一本鎖オーバーハングを有する。この種類の分子は、本明細書においてスプリンカーとも称される。これらの第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングの配列に関して異なる。一本鎖オーバーハングの多様性は、可変性の位置の多様性に対応し、該第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの様々な種のオーバーハングは、作製される核酸ライブラリーの様々なエレメントの配列に相補的であり、したがって第１のストレッチに相補的である。この例では、オーバーハングは、（３’→５’方向で）ＴＡＣ、ＡＴＡ、またはＣＴＣのいずれかである。実施形態では、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。
【００９７】
第２の工程において、複数のメンバーおよび複数の種をそれぞれ含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。前記第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、本明細書において第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドとも称され、二本鎖構造を有する。この二本鎖構造は、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関連して、上記のさらなる修飾を有する２本の一本鎖により形成されてよく、原則として、このような第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの支持体への固定化を可能にし、このような支持体は、このような修飾に対する相互作用パートナーを有するか、または提供する。好ましい例では、修飾はビオチンであり、このような支持体の相互作用パートナーは、ストレプトアビジンである。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。さらに、このような第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは一本鎖オーバーハングを提供する。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーおよび種はそれぞれ、一本鎖オーバーハングまたはその部分が第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーまたは種とは異なっていて、このような一本鎖オーバーハングが第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに本質的にまたは部分的に相補的である程度に、相互に異なる。この場合は、このような一本鎖オーバーハングは、それぞれＡＴＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧである。また、ライブラリーの複雑さは、調製される核酸の第１のストレッチの可変性により規定される。したがって、複雑さが、本例に示されるように、３つの異なる配列のために３である場合、複数の第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のオリゴヌクレオチドライブラリーは、３となる。一本鎖オーバーハングの後に、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖構造は、ヌクレオチドストレッチを有し、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは同じ配列を有する。オーバーハングを含有するこの３つのヌクレオチドの直後に、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的配列の第２のストレッチの配列に対応するストレッチを有する。しかし、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドにおいて、標的配列のこのような第２のストレッチは、二本鎖形態に存在する。複数の第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドライブラリーおよびそのメンバー、すなわち、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、図３（１）に示す。
【００９８】
第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは修飾を含む。この場合は、このような修飾は、ライブラリーの様々なメンバーの、一般に反応管または壁の表面である支持体への固定化を可能にする。固定化は、修飾と、一般に支持体または担体上に存在するこのような修飾の相互作用パートナーによる相互作用により特異的に媒介される。この場合は、修飾は、その相互作用パートナーとしてストレプトアビジンと相互作用するビオチンであり、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの固定化を可能にする安定な複合体をもたらす。
【００９９】
図１および２に示される方法に関して、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーのＩＩＳ型制限酵素のための認識部位は黒色の長方形として示され、この種類の制限酵素に関して、認識部位が切断部位の外側に位置している事実が図示される。
【０１００】
工程３において、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドライブラリーおよびそのメンバーが組み合わされる。このような組み合わせにおいて、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの１つの分子に、好ましくは、リガーゼまたはリガーゼ活性によって連結される。このような連結は、２種類の分子の一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションによって第１の連結前生成物を生じる際に起こり、このようなオーバーハングは「粘着末端」として働く。連結の反応生成物は、図３（１）に示されるように、全体として第１のライゲーション生成物と称される。図３（１）に示されるように、このような第１のライゲーション生成物は変動し、標的配列の可変性の位置を表す。言い換えれば、第１のライゲーション生成物は、標的配列の可変性の位置を表す位置で異なる、本例では３つの異なる種のライゲーション生成物を含むライブラリー自体を形成する。このようなライゲーション生成物は、さらに標的配列の第２のストレッチを含み、それはこの場合にはＧＡＧである。その程度において、このプールのライゲーション生成物のメンバーは、少なくとも、かつ好ましくは、可変性の位置である、標的配列の第１のトリプレットに相当する配列においてのみ異なり、一方、一般に、核酸配列に関して第１のライゲーション生成物の残部は、好ましくは、このようにして形成された第１のライゲーション生成物ライブラリーの様々なエレメントに関して同じである。
【０１０１】
工程４において、第１のライゲーション生成物は、ＩＩＳ型制限酵素で切断される。このようなＩＩＳ型制限酵素は、その認識部位が、アンカー分子により、すなわち第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドにより提供される制限酵素の１つである。第１のライゲーション生成物の切断は、第１のライゲーション生成物で構成されるプールおよびライブラリーのそれぞれで行われる。したがって、第１のライゲーション生成物の切断の結果、そのように様々な切断分子がもたらされ、このような切断の反応生成物は複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド、および複数の短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである。いずれの場合にも、本例では、そこにそれぞれの分子の３つの異なる種がもたらされる。
【０１０２】
図１および図２の対象となる方法に関して記載されるように、工程４の実行は、第１のライゲーション生成物のメンバーの固定化または非固定化に関して、それぞれ異なるシナリオのもとで行われ得る。それぞれの開示は参照により本明細書に援用される。
【０１０３】
反応のさらなる工程は、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの除去にあり、短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの固定化によってなされることが好ましい。
【０１０４】
反応スキームに起因して、反応、好ましくはその上清は、第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドとも称される複数の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを含有する。このような複数のオリゴヌクレオチドは３つの異なる種から成り、それらの種は一本鎖オーバーハング中に同じ配列を有するが、標的配列に対応する隣接する３つのヌクレオチドの配列が異なり、図３（２）中の長方形で示される。一般に工程６である、さらなる工程では、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが提供される。第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは二本鎖構造を有し、それはその他の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関連して、さらに好ましくは、該第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドとして本明細書において概説されるように、設計され得る。より具体的には、このような第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、認識配列の外側を切断する第３のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分および一本鎖オーバーハングを含む。該一本鎖オーバーハングまたはその部分は、伸長された第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングに相補的である。このため、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ただ１つの種のみからなる。したがって第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、二本鎖構造中に標的配列の第３のストレッチと同一のヌクレオチドストレッチ、すなわち、この場合にはＡＣＡを含む。修飾を有するために、上記のようにその固定化を可能にし、そしてしたがってアンカー分子とも称され得る、この第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、次にライブラリーの３つのメンバーに連結され、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを形成する。また、アニーリングおよび連結は、その他の連結手順に関連して記載される方法に類似の方法で行われる。さらに、このような連結手順は、上に述べている内容に従って変動してよい。言い換えれば、オーバーハングの相補性によって、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの各分子は、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単一の分子と連結される。このようにして形成されたこのような連結反応のライゲーション生成物も第２のライゲーション生成物と称され、図３（２）に長方形で囲まれた標的配列の可変性ストレッチとして示される。このようなライゲーション生成物は、次に標的配列全体を含み、その第１の位置は標的配列の可変性を示し、該第２のライゲーション生成物の異なる種で表される。
【０１０５】
図４に図示される核酸ライブラリーを作製するための方法
本発明による方法の、より具体的にはその第２の態様のもう１つの実施形態では、標的配列は、図４（１）に示される通り、すなわち２つの可変性の位置を含み、第１のストレッチ、より具体的には第１のストレッチの前半と第１のストレッチの後半、および第２のストレッチを形成する。以下に考察される問題を除いて、このような方法で用いられる工程および分子は、あらゆる不要な繰り返しを避けるために参照により本明細書に援用される、本発明の第２の態様による方法に関して本明細書に記載されるものに対応する。
【０１０６】
本例では、第１のストレッチの前半は、３つのトリプレット、ＡＴＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧの中の１つから成り、第１のストレッチの後半は、ＣＴＣ、ＧＡＧまたはＴＴＴのいずれかからなる。第２のストレッチは、ＡＣＡからなる。
【０１０７】
第１の工程において、複数の第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが提供される。図４（１）に示されるこのような複数の第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの３つの異なる種を含む。この種類のライブラリーの異なる種またはメンバーは、少なくとも、かつ好ましくは、一本鎖オーバーハングにおいて異なる。様々な第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、より具体的には、該一本鎖オーバーハングが（３’→５’方向で）ＴＡＣ、ＡＴＡ、およびＣＴＣであり、したがって標的配列の第１のストレッチの前半の可変性配列の様々な配列に相補的であるように異なっている。それとは離れて、この種類の第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法のその他の実施形態に関連して記載される構造に類似または同一な構造、より具体的には、本発明の第２の態様による方法の構造を有し、より具体的には、第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。
【０１０８】
工程２において、複数のメンバーを含む第１のオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。前記第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、本明細書において、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドとも称され、二本鎖構造を有する。二本鎖構造は、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに関するように、上記のようなさらなる修飾を有する２本の一本鎖により形成され得る。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、認識配列の外側を切断する第２のＩＩＳ型制限酵素の認識部位またはその部分を含む。さらに、このような第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングをもたらす。第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、少なくとも、一本鎖オーバーハングまたはその部分が第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーのサブグループに関して同じである程度に相互に異なり、それにより、このような一本鎖オーバーハングは、基本的にまたは部分的に、様々な第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの種の一本鎖オーバーハングに相補的である。言い換えれば、第１のライブラリーの複雑さは、作製されるべき核酸ライブラリーの複雑さによって決定され、第１のストレッチの前半の可変性に第１のストレッチの後半の可変性を乗算することにより計算され得る。したがって、全体として、複数の第１の少なくとも一部分が二本鎖の核の（ｎｕｃｌｅｉｃ）オリゴヌクレオチドの全てのオリゴヌクレオチドがオーバーハングを有し、それはまた全体として、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのオリゴヌクレオチドのオーバーハングに相補的となる。より具体的には、このような一本鎖オーバーハングは、ＡＴＧ（第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングＴＡＣに対応）、ＴＡＴ（第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングＡＴＡに対応）、およびＧＡＧ（第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングＣＴＣに対応）のいずれかである。その程度において、この第１のオリゴヌクレオチドライブラリーは、異なるオーバーハングに関して３つの異なる種を提供する。この種の各々は、その程度において一本鎖オーバーハングの直後に来るということを特徴とする３つのさらなる種を含み、標的配列の第１のストレッチの後半に一致する配列が繰り返される。このようなヌクレオチド配列は、二本鎖構造の一部分である。その程度において、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの第１のサブグループは、ＡＴＧ  ＣＴＧ／ＧＡＧ、ＡＴＧ  ＧＡＧ／ＣＴＣおよびＡＴＧ  ＴＴＴ／ＡＡＡから成り、第２の亜種は、ＴＡＴ  ＣＴＣ／ＧＡＧ、ＴＡＴ  ＧＡＧ／ＣＴＣおよびＴＡＴ  ＴＴＴ／ＡＡＡから成り、第３の亜種は、ＧＡＧ  ＣＴＣ／ＧＡＧ、ＧＡＧ  ＧＡＧ／ＣＴＣおよびＧＡＧ  ＴＴＴ／ＡＡＡから成り、該「／」の後に示されるヌクレオチドは、直後に続く３つのヌクレオチドに相補的な３つのヌクレオチドを示す。その程度において、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーは９つのメンバーからなり、それらは第１のストレッチの後半の変異体で増加した第１のストレッチの前半の可変性により形成される。言い換えれば、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの数は、第１のストレッチの前半の異なる配列の数の、標的核酸の第１のストレッチの後半の異なる配列の数で乗算した積である。
【０１０９】
本発明のその他の実施形態に関連して用いられる第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーに類似して、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドは、それに関連して指定される修飾を含む。
【０１１０】
工程３において、様々な第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドライブラリーおよびそのメンバーがそれぞれ組み合わされる。このような合成において、第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの１つの分子は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの１つのメンバーの１つの分子に、好ましくは、リガーゼまたはリガーゼ活性によって連結される。このような連結は、２種類の分子の対応する一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションによって第１の連結前生成物を生じる際に起こり、このようなオーバーハングは粘着末端として働く。連結の反応生成物は、第１のライゲーション生成物と称される。第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドライブラリーの多様性に起因して、連結反応の結果、この場合、このような第１のライゲーション生成物の９つの異なる種の、第１のライゲーション生成物のプールがもたらされる。このようなライゲーション生成物は、それらの配列が、図４（２）に長方形で示される、標的核酸の第１のストレッチの前半および後半からなる可変性の第２のストレッチを含むという程度において、それらの配列において異なる。これとは別に、事実上さらなるライブラリーを構成するライゲーション生成物は、その程度においてかつ好ましくは、この配列において異なり、一方、一般に、核酸配列に関して第１のライゲーション生成物の残部は、好ましくは、このようにして形成された第１のライゲーション生成物ライブラリーの様々なエレメントに関して同じである。
【０１１１】
工程４において、様々な第１のライゲーション生成物は、ＩＩＳ型制限酵素で切断される。このようなＩＩＳ型制限は、その認識部位が、第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド（図４（１、２）中の黒色の長方形で印されている）により提供される制限酵素の１つである。第１のライゲーション生成物の切断は、第１のライゲーション生成物を含む反応およびライブラリーのそれぞれで行われる。したがって、第１のライゲーション生成物の切断の結果、そのように様々な切断分子がもたらされ、このような切断の反応生成物は、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび複数の短縮された第２の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドである。図１〜３に関連して記載される様々なその他の実施形態において見られるように、このような第２のＩＩＳ型制限酵素はＥａｍ１１０４Ｉである。
【０１１２】
また、本発明による方法のその他の実施形態に関連して記載されるように、工程４の実行は、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの固定化または非固定化に関して、異なるシナリオのもとで行われてよいことは認識される。
【０１１３】
第１のライゲーション生成物の切断に起因して、合計９つの異なる第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが生成される。一般に、このようにして生成された複数のまたは様々な第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの個々の種は、様々な対象標的配列により規定される９つの異なる種を含み、標的配列の第１のストレッチの後半に相補的なそれらの一本鎖オーバーハングにより規定される、３つの異なる分子のサブグループが存在する。より具体的には、本例では、該３つのサブグループは、ＧＡＧの一本鎖オーバーハングにより規定されるもの、ＣＴＣの一本鎖オーバーハングにより規定されるもの、およびＡＡＡの一本鎖オーバーハングにより規定されるものである。各サブグループは、次には、ストレッチおよび特に３つのヌクレオチドがそれぞれ一本鎖オーバーハングの後に続くまたは先行する程度において変動し、かつ、標的配列の第１のストレッチの前半に対応する二本鎖構造の第１の二本鎖ストレッチを形成する、したがって、前記サブグループの各々についてそれぞれＡＴＧ／ＴＡＣ、ＴＡＴ／ＡＴＡ、およびＧＡＧ／ＣＴＣである。
【０１１４】
次の工程では、第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドからなる第２のオリゴヌクレオチドライブラリーが、図４（２）に示されるように加えられる。第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、標的配列の第１のストレッチの後半に対応するそれらの一本鎖オーバーハング、すなわちこの場合、ＣＴＣ、ＧＡＧ、およびＴＴＴに関して異なる。そうでなければ、メンバーは、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーに関連して記載されるものと同じであり、それらは第３のＩＩＳ型制限酵素の認識配列またはその部分を含み、修飾を含む。
【０１１５】
一本鎖オーバーハングの後に続く第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖構造の最初の部分は、全て第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの中で同じであり、標的配列の第２のストレッチ、この場合ＡＣＡ、に対応する。第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドのこのストレッチはこのような第３の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖構造の一部分であるので、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの様々なメンバーにおけるそれぞれの二本鎖構造は、したがってこのような第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーの各々およびいずれかについてＡＣＡ／ＴＧＴである。
【０１１６】
第２のオリゴヌクレオチドライブラリーのメンバーは、次に、一般にアニーリング工程の後、様々な第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドと連結され、その程度において、さらなる工程は、本発明に従う方法のその他の実施形態の各々およびいずれかに関連して記載される工程に対応する。それぞれの反応生成物は、作製される核酸ライブラリーの複雑さによって決定されるように、９つの異なる種からなる第２のライゲーション生成物である。
【０１１７】
様々な少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを個々の反応に加える濃度を変化させることが可能であることは、当業者に当然理解される。相互に対するどんな等モル比も別として、それぞれのオリゴヌクレオチドにより核酸分子に導入される可変性の位置の過剰出現または過少出現をもたらすこの比は偏っていてよい。それに従って、本発明に従う方法により作製される核酸ライブラリーは、様々なエレメントの優勢（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）に関して、アンカー分子として用いられる少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの偏った比を反映する。
【０１１８】
本発明による方法が、二本鎖核酸と同様に一本鎖核酸の調製に用いることができることが、認識される。一本鎖核酸の調製は、一般に二本鎖核酸の調製に基づき、二本鎖核酸が調製されるとすぐ、その二本鎖核酸を変性させてそれぞれの一本鎖核酸がもたらされる。２つの一本鎖の分離は、様々なオリゴヌクレオチドが、各々相互に共有結合していない２つの一本鎖からなる二本鎖核酸の調製に用いられる場合にもたらされ得る。あるいは、二本鎖をもたらす、共有結合した一本鎖を共有結合性の切断により分離してもよい。
【０１１９】
また、本発明による方法は核酸ライブラリーの作製に用いることができ、該核酸ライブラリーのエレメントは特に第２のストレッチ中の配列において異なり、このようなストレッチは、本明細書において示されるように６またはそれ以上のヌクレオチドからなることも、認識される。実際のところ、工程ｎ）の第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、さらにまた工程ｎａ）の少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、工程ｏ）の第４のライゲーション生成物が、さらにまた工程ｏａ）のライゲーション生成物であり、工程ｐの複数の第４の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｐａ）の複数のさらなる伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、かつ、工程ｐ）の短縮された第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドが、工程ｐａ）の短縮されたさらなる少なくとも二本鎖のオリゴヌクレオチドである、個々の工程の反復（すなわち、工程ｎ）〜ｑ）を工程ｎａ）〜ｑａ）として反復すること）は、核酸ライブラリーの様々なエレメントにおいて異なるヌクレオチドの数を制限しない。むしろ本発明による方法は、核酸ライブラリーの作製される目的に応じて、有意に長いストレッチの調製を可能にする。最適化された活性中心をもつ酵素または最適化された結合部位を有する抗体をもたらす場合には、核酸ライブラリーの様々なメンバーで異なるストレッチの長さは、それぞれこのような酵素の活性中心またはこのような抗体の結合部位を形成するアミノ酸配列、およびしたがってコードする核酸に対応する。
【０１２０】
最後に、核酸ライブラリーのエレメントの第２のヌクレオチドストレッチ、またはそれに対応する（好ましくは機能の点でそれに対応する）任意のヌクレオチドストレッチの長さが、原則として任意の長さからなってよいことが、認識される。好ましくは、それは２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチドまたは８あるいは３ヌクレオチドの倍数からなる。
【実施例１】
【０１２１】
単一の可変性の位置を含む核酸ライブラリーの製造
上に概説されるように、本発明は、核酸ライブラリーの合成のための高度に効率的な方法を提供する。図１にも示されるように単一の可変性の位置を含むライブラリーの生成の例が、次により詳細に記載される。可変性の位置は、可能性のある全てのアミノ酸を表す２０個の異なるコドン（図に示されるような３つではない）を網羅し、そのコドン使用頻度は大腸菌に適合させた。
【０１２２】
１）１回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌのスプリンカー分子、すなわち、ＧＴＧオーバーハングを含む第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、反応容器中の２５〜２００μｌ反応バッファー中に準備した。次に、２０〜２００ｐｍｏｌの２０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを添加した。これらのアンカーは、混合物中に等モル量で存在し、全てが、スプリンカー分子のオーバーハングに相補的であるが、２０個の異なるアミノ酸のコドンを表すそれらの隣接する可変部分において異なる、同じ一本鎖オーバーハング（ＣＡＣ、第１のストレッチに対応）を有する（表１参照）。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第１のライゲーション生成物を得た。
【０１２３】
２）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第１のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン部分を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファー（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ／酢酸塩、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、６６ｍＭ、酢酸カリウム、ｐＨ７．９）で３回洗浄することにより除去した。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１２４】
３）２回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌの２０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを、２５〜２００μｌ反応バッファー中の複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに加えた。アンカー分子は、混合物中に等モル量で存在し、複数の第１の伸長されたオリゴヌクレオチドにより提供されるオーバーハングに相補的であるが、隣接部分において全てが同一であるそれらの一本鎖オーバーハング（標的配列の第２のストレッチに対応）において異なる。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第２のライゲーション生成物を得た。
【０１２５】
４）複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第２のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン部分を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１２６】
５）３回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌのアンカー分子、すなわち、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド（ＣＴＣ）により提供されるオーバーハングに相補的なオーバーハング（ＧＡＧ、第３のストレッチの前半に対応）を含む第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、２５〜２００μｌ反応バッファー中の複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに加えた。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第３のライゲーション生成物を得た。
【０１２７】
６）伸長ブロックの合成
第３のライゲーション生成物とストレプトアビジン表面との結合、固定化された生成物のＥａｍ１１０４Ｉによる切断およびこのようにして放出された伸長されたオリゴヌクレオチドと適当なアンカーとの連結を含む伸長サイクルを、工程５の第３のライゲーション生成物から出発して３回繰り返し、伸長ブロックとも称される、複数の第６のライゲーション生成物がもたらされた。各反応工程の条件は上記の通りであった。
【０１２８】
７）最終生成物の合成
このようにして合成された伸長ブロックを、以前に記載した転移法（国際特許出願公開第００／７５３６８号）を介する、その後の完全な遺伝子産物の合成に用いた。
【０１２９】
８）最終生成物の質の評価
最終生成物、すなわち、単一の可変性の位置を有する核酸ライブラリーを、標準的なベクターにクローニングし（ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、９６個の単一のクローンを配列決定した。所望の核酸ライブラリーのエレメントの配列は、それらの特定の可変性の位置を除いて同一であるように見えた。可変性の位置で獲得した２０個の異なるコドンの分布を表１に示す。
【０１３０】
【表１】
0005642939.tif 000002
【０１３１】
それぞれの数字は、その統計分析とともに、単一の順序を変えた位置で獲得したコドン頻度の柱状グラフである図５に示される。９６のサンプル中の２０個のコドンの各々の期待値μは、均等な分布を仮定すると、４．８である。この場合、全てのコドンの９５％より多くが、２標準偏差（μ＋／−２σ）の範囲内にあることが予期される。この実施例では、全ての観察された頻度は、十分に正規分布の２標準偏差の範囲内であり、コドン頻度の均等な分布という仮説を支持する。
【実施例２】
【０１３２】
可変性の位置のストレッチを含む核酸ライブラリーの製造
実施例２は、図２にも示されるように、アミノ酸をコードするトリプレットを形成する、それに続く３つのヌクレオチドをおのおの含む、２つの可変性の位置のストレッチを含むライブラリーの生成のための例であり、以下により詳細に説明される。この可変性の位置は、１０個の異なるコドンを含み、各々が、図２に示される３つの異なるコドンよりも１００（１０×１０）のライブラリーの複雑さを与えている。コドン使用頻度を大腸菌に適合させた。
【０１３３】
１）１回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌのスプリンカー分子、すなわち、ＧＴＧオーバーハングを含む第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、反応容器中の２５〜２００μｌ反応バッファー中に準備した。次に、２０〜２００ｐｍｏｌの１０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを添加した。これらのアンカーは、混合物中に等モル量で存在し、全てが、スプリンカー分子のオーバーハングに相補的であるが、１０個の異なるアミノ酸のコドンを表すそれらの隣接する可変部分において異なる、同じ一本鎖オーバーハング（ＣＡＣ、標的配列の第１のストレッチに対応）を有する（表２参照）。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第１のライゲーション生成物を得た。
【０１３４】
２）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第１のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン部分を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ／酢酸塩、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、６６ｍＭ、酢酸カリウム、ｐＨ７．９）。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１３５】
３）２回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌの１００の異なるアンカー分子の混合物（第２のストレッチが可変性の位置を提供する作製されるべき核酸ライブラリーのストレッチである、第２のストレッチの前半の１０個のトリプレットを第２のストレッチの後半の１０個のトリプレットで乗算したもの）、すなわち、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを、２５〜２００μｌ反応バッファー中の複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに加えた。全てのアンカー分子は、混合物中に等モル量で存在し、複数の第１の伸長されたオリゴヌクレオチドにより提供される１０個の異なるオーバーハングに、ならびにそれらの隣接部分において相補的な、それらの一本鎖オーバーハング（標的配列の第２のストレッチの前半に対応）において異なる。隣接部分においても１０個の異なるコドンが提供され、結果として１００個のアンカーの組み合わせ混合物を導く。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第２のライゲーション生成物を得た。
【０１３６】
４）複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第２のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン部分を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１３７】
５）３回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌの１０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第３のオリゴヌクレオチドライブラリーを、２５〜２００μｌ反応バッファー中の複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに加えた。アンカー分子は、混合物中に等モル量で存在し、複数の第１の伸長されたオリゴヌクレオチドにより提供されるオーバーハングに相補的であるが、標的配列の第３のストレッチを構成する隣接部分において全てが同一であるそれらの一本鎖オーバーハング（標的配列の第２のストレッチの後半に対応）において異なる。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、事実上複数の第３のライゲーション生成物からなる第３のライゲーション生成物を得た。
【０１３８】
６）複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第３のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン残基を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１３９】
７）４回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌのアンカー分子、すなわち、複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチド（ＴＧＴ）により提供されるオーバーハングに相補的なオーバーハング（ＡＣＡ、標的配列の第３のストレッチに対応）を含む第５の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、２５〜２００μｌ反応バッファー中の複数の第３の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに加えた。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、事実上複数の第４のライゲーション生成物からなる第４のライゲーション生成物を得た。
【０１４０】
８）伸長ブロックの合成
ライゲーション生成物とストレプトアビジン表面との結合、固定化された生成物のＥａｍ１１０４Ｉによる切断およびこのようにして放出された伸長されたオリゴヌクレオチドと適当なアンカーとの連結を含む、この伸長サイクルを２回繰り返し、伸長ブロックとも称される、複数の第６のライゲーション生成物がもたらされた。各反応工程の条件は上記の通りであった。
【０１４１】
９）最終生成物の合成
このようにして合成された伸長ブロックを、以前に記載した転位法（国際特許出願公開第００／７５３６８号）を介する、その後の完全な遺伝子産物の合成に用いた。
【０１４２】
１０）最終生成物の質の評価
最終生成物、すなわち、各トリプレットがそれぞれの位置で合計１０の可能性のあるアミノ酸の中の１つをコードする、２つのトリプレットを含む可変性のストレッチを有する核酸ライブラリーを、標準的なベクターにクローニングし、６２個の単一のクローンを配列決定した。これらの配列は、それらの特定の２つの可変性の位置を除いて同一であるように見えた。可変性の位置で獲得した１０個の異なるコドンの分布を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
0005642939.tif 000003
【０１４４】
それぞれの数字は、その統計分析とともに、２つの連続したトリプレットで獲得したコドン頻度の柱状グラフである図６に示される。６２のサンプル中の１０個のコドンの各々の期待値μは、均等な分布を仮定すると、６．２である。両方のトリプレットを等しく調べると、全ての観察された頻度は、十分に正規分布の２標準偏差の範囲内である。この場合、９５％を超える頻度がこの範囲内に存在するはずであるので、この結果は、均等な分布という仮説を支持する。この仮説は、２０の頻度の中の１３が（６５％）均等な分布の１標準偏差の範囲内にあり、それにより均等な分布の統計学的要件に適うという結果により確認される。
【実施例３】
【０１４５】
定義された割合での、単一の可変性の位置を含む核酸ライブラリーの製造
コドンが定義された割合で生じる、単一の可変性の位置を含むライブラリーの生成のための例は、以下により詳細に記載される。その程度において、本例は、本発明の第１の態様による方法の実施形態を説明する。可変性の位置は、１０個の異なるコドンを含む。コドン使用頻度を大腸菌に適合させた。
【０１４６】
１）１回目の連結
第１の反応（Ｒ１）において、２０〜２００ｐｍｏｌのスプリンカー分子、すなわち、ＧＣＣオーバーハング（５’→３’方向、標的配列の第１のストレッチに対応）を含む第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、反応容器中の２５〜２００μｌ反応バッファー中に準備した。次に、２０〜２００ｐｍｏｌの１０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを加えた。これらのアンカーは全て、スプリンカー分子のオーバーハングに相補的であるが、１０個の異なるアミノ酸のコドンを表すそれらの隣接する可変部分において異なる、同じ一本鎖オーバーハング（ＧＧＣ；５’→３’方向）を有する（表１参照）。全てのアンカー分子は等モル量で存在した（各アンカーは総量の１０％）。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第１のライゲーション生成物を得た。
【０１４７】
平行反応（Ｒ２）において、再び２０〜２００ｐｍｏｌのスプリンカー分子、すなわち、ＧＣＣオーバーハング（５’→３’方向、標的配列の第１のストレッチに対応）を含む第１の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、反応容器中の２５〜２００μｌ反応バッファー中に準備した。次に、２０〜２００ｐｍｏｌの１０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドライブラリーを加えた。これらのアンカーも、全てが、スプリンカー分子のオーバーハングに相補的であるが、１０個の異なるアミノ酸のコドンを表すそれらの隣接する可変部分において異なる同じ一本鎖オーバーハング（ＧＧＣ；  ５’→３’方向）を有する（表１参照）。第１の反応と対照的に、今回は１種類のアンカー分子（Ｅａｍ１１０４Ｉでの制限後、ＴＴＴオーバーハングを導く、総量の３０％）が、その他の９種類のアンカー（各々総量の７．８％）に対して過剰に存在する。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第１のライゲーション生成物を得た。
【０１４８】
２）複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第１のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン部分を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ／酢酸塩、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、６６ｍＭ、酢酸カリウム、ｐＨ７．９）。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１４９】
この反応をＲ１とＲ２の両方で平行して実行した。
【０１５０】
３）２回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌの１０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを２５〜２００μｌ反応バッファー中に含む第１の反応（Ｒ１）に加えた。アンカー分子は、複数の第１の伸長されたオリゴヌクレオチドにより提供されるオーバーハングに相補的であるが、隣接部分において全てが同一である、それらの一本鎖オーバーハング（標的配列の第２のストレッチに対応）において異なる。全てのアンカー分子は等モル量で存在した（各アンカーは総量の１０％）。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第２のライゲーション生成物を得た。
【０１５１】
平行して、２０〜２００ｐｍｏｌの１０個のアンカー分子の混合物、すなわち、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーを、複数の第１の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを２５〜２００μｌ反応バッファー中に含む第２の反応（Ｒ２）に加えた。アンカー分子は、複数の第１の伸長されたオリゴヌクレオチドにより提供されるオーバーハングに相補的であるが、隣接部分において全てが同一である、それらの一本鎖オーバーハング（標的配列の第２のストレッチに対応）において異なる。アンカー分子の１つは、複数の第１の伸長されたオリゴヌクレオチドのメンバーにより提供されるオーバーハングに相補的なオーバーハング（ＡＡＡ）を含み、１回目の連結で総量の３０％の量で存在した、そしてこのアンカーはまた、第２のオリゴヌクレオチドライブラリーの３０％の量で存在した。その他の９つのアンカーは、各々７．８％の量で存在した。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第２のライゲーション生成物を得た。
【０１５２】
４）複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドの単離
複数の第２のライゲーション生成物を、室温にて１５分間、そのビオチン部分を介してストレプトアビジンコート容器もしくはウェルに固定化した。未結合材料を、洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した。次に、１０〜１００Ｕの制限酵素、例えば、第２のＩＩＳ型制限酵素であるＥａｍ１１０４Ｉなどを、２５〜２００μｌ反応バッファーに加え、その後、３７℃にて１５〜９０分間インキュベートした。このようにして放出された複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドを、新しい容器またはウェルに移動させた。
【０１５３】
この反応をＲ１とＲ２の両方で平行して実行した。
【０１５４】
５）３回目の連結
２０〜２００ｐｍｏｌの、複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドにより提供されるオーバーハングに相補的なオーバーハングを含み、第４の少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドであるアンカー分子を、２５〜２００μｌ反応バッファー中の複数の第２の伸長された少なくとも一部分が二本鎖のオリゴヌクレオチドに加えた。１０〜５０ＵのＴ４−ＤＮＡ−リガーゼの添加後、分子を２５℃にて６０分間連結し、複数の第３のライゲーション生成物を得た。
【０１５５】
この反応をＲ１とＲ２の両方で平行して実行した。
【０１５６】
６）伸長ブロックの合成
ライゲーション生成物とストレプトアビジン表面との結合、固定化された生成物のＥａｍ１１０４Ｉによる切断、およびこのようにして放出された伸長されたオリゴヌクレオチドの、適当なアンカーとの連結を含む、この伸長サイクルを３回繰り返し、伸長ブロックとも称される、複数の第６のライゲーション生成物がもたらされた。各反応工程の条件は上記の通りであった。
【０１５７】
この反応をＲ１とＲ２の両方で平行して実行した。
【０１５８】
７）最終生成物の合成
このようにして合成された伸長ブロックを、その後の完全な遺伝子産物、すなわち、以前に記載した転位法（国際特許出願公開第００／７５３６８号）を介する、作製される核酸ライブラリーの合成に用いた。
【０１５９】
８）最終生成物の質の評価
最終生成物、すなわち、１０個の異なるコドンが等モル（Ｒ１）で存在し得るか、または非等モルもしくは偏った（Ｒ２）比で存在し得る、単一の可変性の位置を有する核酸ライブラリーを、標準的なベクターにクローニングし、９６個の単一のクローンを各々配列決定した。本明細書において好ましく用いられる場合、偏ったという用語は、１または数種類の分子が、その他の１または数種類の前記様々な種類の分子と比較して、非等モル比で含まれている、様々な種類の分子を含む混合物をさす。配列は、それらの特定の可変性の位置を除いて同一であるように見えた。可変性の位置で獲得した１０個の異なるコドンの分布を表３に示す。
【０１６０】
【表３】
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【０１６１】
それぞれの数字は、その統計分析とともに、単一の可変性の位置で獲得したコドン頻度の柱状グラフである図７および８に示される。図７は、等モル分布（Ｒ１）を有するライブラリー内の異なるコドンの出現を示し、図８は、ＡＡＡトリプレットがその他のコドンに対して３倍過剰に存在する（Ｒ２）ライブラリー内の異なるコドンの出現を示す。
【０１６２】
Ｒ１において、９６のサンプル中の１０個のコドンの各々の期待値μは、均等な分布を仮定すると、９．６である。この場合、全てのコドンの９５％超が２標準偏差（μ＋／−２σ）の範囲内であることが期待される。この実施例では、全ての観察された頻度が正規分布の２標準偏差の範囲内であり、コドン頻度の均等な分布という仮説が支持される。この仮説は、１０の頻度の中の７が（７０％）均等な分布の１標準偏差の範囲内にあり、それによりまた、均等な分布の統計学的要件に適う（１標準偏差の範囲内で６５％超の頻度）という結果により確認される。
【０１６３】
Ｒ２において、９６のサンプル中のＡＡＡコドンの期待値μは、観察された分布が適用された指定に従うと仮定すると、２８．８である。同様に、その他の９つのコドンの期待値は７．５である。指定された分布の場合、全てのコドンの９５％超が２標準偏差（μ＋／−２σ）の範囲内であることが期待される。この実施例では、全ての観察された頻度がそれぞれの期待値から離れて２標準偏差の範囲内であり、コドン頻度の指定された分布の発生という仮説が支持される。この仮説は、１０の頻度の中の８（８０％）が指定された分布の１標準偏差の範囲内にあり、それによりまた、指定された分布の統計学的要件に適う（１標準偏差の範囲内で６５％超の頻度）という結果により確認される。
【０１６４】
本明細書に開示された本発明の特徴、配列リスト、請求項および／または図面は、個別に、かつそれらの任意の組み合わせの両方で、本発明をその様々な形態で実現するための材料であり得る。
【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図２（１）】
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【図２（２）】
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【図２（３）】
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【図３（１）】
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【図３（２）】
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【図４（１）】
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【図４（２）】
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【図４（３）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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