(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｃ：
【化２４】
0005639073.tif 000036
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体
（式中、
Ｒ２は、水素またはヒドロキシルであり、
Ｒ４は、非置換アルキルであり、
Ｒ１６は、ヒドロキシルまたはアルコキシである）。
【請求項２】
式Ｄ：
【化２５】
0005639073.tif 000037
を有する請求項１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体。
【請求項３】
式Ｅ：
【化２６】
0005639073.tif 000038
を有する請求項１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体。
【請求項４】
式Ｆ：
【化２７】
0005639073.tif 000039
を有する請求項１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体。
【請求項５】
化合物１０
【化２９】
0005639073.tif 000040
である、請求項１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体。
【請求項６】
以下
【化３０】
0005639073.tif 000041
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体。
【請求項７】
【化３１】
0005639073.tif 000042
である、請求項６に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸抱合体。
【請求項８】
薬学的に許容される塩である、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項１０】
疾患を治療または予防する方法における使用のための組成物であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物または請求項９に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項１１】
前記疾患は、代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
被験体に、経口的、非経口的、静脈内、または局所的に投与される、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記被験体がヒトである、請求項１２に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年１１月１９日出願の、欧州特許出願第０８１６９４６０．６号に対して優先権を主張し、その内容が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＴＧＲ５を調節する化合物、ならびに疾患の治療および予防のための方法において有用なこのような化合物を含有する組成物に関する。具体的には、本発明の化合物は、Ｃ−１６位において置換基を有するケノデオキシコール酸の類似体である。
【背景技術】
【０００３】
ＴＧＲ５受容体は、胆汁酸（ＢＡ）に応答する細胞表面受容体として同定されてきたＧタンパク質共役受容体である。ＴＧＲ５の一次構造および胆汁酸へのその応答性は、ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、およびマウスにおいてＴＧＲ５中で高度に保存されていることが見出されており、したがって、ＴＧＲ５は重要な生理機能を有することが示唆されている。ＴＧＲ５は、リンパ組織だけでなく、他の組織において広範に分布していることが見出されてきた。高レベルのＴＧＲ５ｍＲＮＡは、胎盤、脾臓、および単球／マクロファージにおいて検出されてきた。胆汁酸は、細胞膜から細胞質へのＴＧＲ５融合タンパク質の内部移行を誘発することが示されてきた。非特許文献１。ＴＧＲ５は、ｈＧＰＣＲ１９と同一であることが見出されてきた（非特許文献２による報告）。
【０００４】
ＴＧＲ５は、多様な細胞型において広範に発現しているｃＡＭＰの細胞内蓄積と関連している。マクロファージにおけるこの膜受容体の活性化は、炎症性サイトカイン生成を減少させる一方（非特許文献１）、脂肪細胞および筋細胞におけるＢＡによるＴＧＲ５の刺激は、エネルギー支出を増大させる（非特許文献３）。この後者の作用は、２型ヨードチロニン脱ヨード酵素（Ｄ２）のｃＡＭＰ−依存性誘発を伴い、これはＴ４をＴ３に局所的に変換することによって、甲状腺ホルモン活性の増加をもたらす。エネルギー代謝の制御におけるＴＧＲ５の役割と一致して、雌性ＴＧＲ５ノックアウトマウスは、高脂肪食に曝露されたときに体重増加を伴う有意な脂肪蓄積を示し、これは、ＴＧＲ５の欠乏がエネルギー支出を減少させ、肥満症を誘発することを示す（非特許文献４）。エネルギー恒常性におけるＴＧＲ５の関与に加えて、およびそれと一致して、膜受容体の胆汁酸活性化によってまた、マウス腸内分泌細胞系におけるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の生成が促進されることが報告されてきた（非特許文献５）。上記の観察全てに基づいて、ＴＧＲ５は、代謝性疾患、例えば、肥満症、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、異脂肪血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ならびに代謝症候群の治療のための魅力的な標的である。
【０００５】
僅かな例のＴＧＲ５アゴニストが、今までに文献において記載されてきた。最近、ケノデオキシコール酸の２３−アルキル−置換および６，２３−アルキル−二置換誘導体（下記に示す６α−エチル−２３（Ｓ）−メチル−ケノデオキシコール酸など）は、ＴＧＲ５の強力および選択的なアゴニストとして報告されてきた（非特許文献６）。
【０００６】
【化１】
0005639073.tif 000002
特に、天然ＢＡのＣ２３−（Ｓ）位におけるメチル化は、ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）活性化よりも、顕著な選択性をＴＧＲ５に与え、一方では、６α−アルキル置換は、両方の受容体において作用強度を増加させる。他のＴＧＲ５アゴニストには、６−メチル−２−オキソ−４−チオフェン−２−イル−１，２，３，４−テトラヒドロ−ピリミジン−５−カルボン酸ベンジルエステル（特許文献１、武田薬品工業株式会社、日本、２００４年）およびオレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる（非特許文献７；Ｉｔｏ，  Ｆ．；  Ｈｉｎｕｍａ，  Ｋ．；  Ｋａｎｚａｋｉ，  Ｎ．；  Ｍｉｋｉ，  Ｔ．；  Ｋａｗａｍａｔａ，  Ｙ．；  ０ｉ，  Ｓ．；  Ｔａｗａｅａｉｓｈｉ，  Ｔ．；  Ｉｓｈｉｃｈｉ，  Ｙ．；  Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，  Ｍ．、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｒｉｎｇ−ｆｕｓｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｓ  ＴＧＲ５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ．  ＰＮ：特許文献１、２００４年。より最近では、鏡像異性のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびリトコール酸（ＬＣＡ）の初めての合成によって、天然ＢＡとＴＧＲ５との相互作用の特異性の評価が可能となった（非特許文献８）。
【０００７】
これらの化学ツールはＢＡの遺伝子性対非遺伝子性作用の薬理学的差異を初めて提供する一方、それらのいくつかは、最初の構造活性相関研究を描くことをまた可能にし、ＴＧＲ５における付属結合ポケットの存在は、リガンド選択性の決定において極めて重要な役割を果たす（非特許文献６）。これに関連して、より強力および選択的なＴＧＲ５モジュレーターを利用できることは、受容体活性化に影響を与えるさらなる特徴をさらに同定し、この受容体の生理および薬理作用を特性決定するのに必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第００４０６７００８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｗａｍａｔａ，  Ｙ．；  Ｆｕｊｉｉ，  Ｒ．；  Ｈｏｓｏｙａ，  Ｍ．；  Ｈａｒａｄａ，  Ｍ．；  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．；  Ｍｉｗａ，  Ｍ．；  Ｆｕｋｕｓｕｍｉ，  Ｓ．；  Ｈａｂａｔａ，  Ｙ．；  Ｉｔｏｈ，  Ｔ．；  Ｓｈｉｎｔａｎｉ，  Ｙ．；  Ｈｉｎｕｍａ，  Ｓ．；  Ｆｕｊｉｓａｗａ，  Ｙ．；  Ｆｕｊｉｎｏ，  Ｍ．、Ａ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｏ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００３年、２７８号、９４３５〜９４４０頁
【非特許文献２】Ｔａｋｅｄａら、２００２年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５２０号、９７〜１０１頁
【非特許文献３】Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｍ．；  Ｈｏｕｔｅｎ，  Ｓ．  Ｍ．；  Ｍａｔａｋｉ，  Ｃ．；  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｏｌｅｔｅ，  Ｍ．  Ａ．；  Ｋｉｍ，  Ｂ．  Ｗ．；  Ｓａｔｏ，  Ｈ．；  Ｍｅｓｓａｄｄｅｑ，  Ｎ．；  Ｈａｒｎｅｙ，  Ｊ．  Ｗ．；  Ｅｚａｋｉ，  ０．；  Ｋｏｄａｍａ，  Ｔ．；  Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，  Ｋ．；  Ｂｉａｎｃｏ，  Ａ．  Ｃ．；  Ａｕｗｅｒｘ，  Ｊ．、Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２００６年、４３９号、４８４〜４８９頁
【非特許文献４】Ｍａｒｕｙａｍａ，  Ｔ．；  Ｔａｎａｋａ，  Ｋ．；  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｊ．；  Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｈ．；  Ｈａｒａｄａ，  Ｎ．；  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．；  Ｍｉｙａｍｏｔｏ，  Ｙ．；  Ｋａｎａｔａｎｉ，  Ａ．；  Ｔａｍａｉ，  Ｙ．、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  （Ｇｐｂａｒｌ／ＭＢａｒ）  ｉｎ  ｍｉｃｅ、Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２００６年、１９１号、１９７〜２０５頁
【非特許文献５】Ｋａｔｓｕｍａ，  Ｓ．；  Ｈｉｒａｓａｗａ，  Ａ．；  Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｇ．、Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＧＲ５  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＳＴＣ−１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００５年、３２９号、３８６〜３９０頁
【非特許文献６】Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ，  Ｒ．；  Ｓａｔｏ，  Ｈ．；  Ｇｉｏｉｅｌｌｏ，  Ａ．；  Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，  Ｇ．；  Ｍａｃｃｈｉａｒｕｌｏ，  Ａ．；  Ｓａｄｅｇｈｐｏｕｒ，  Ｂ．  Ｍ．；  Ｇｉｏｒｇｉ，  Ｇ．；  Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，  Ｋ．；  Ａｕｗｅｒｘ，  Ｊ．、Ｎｏｎｇｅｎｏｍｉｃ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２３−ａｎｄ  ６，２３−ａｌｋｙｌ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＧＲ５、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、２００７年、５０号、４２６５〜４２６８頁
【非特許文献７】Ｓａｔｏ，  Ｈ．；  Ｇｅｎｅｔ，  Ｃ．；  Ｓｔｒｅｈｌｅ，  Ａ．；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．；  Ｌｏｂｓｔｅｉｎ，  Ａ．；  Ｗａｇｎｅｒ，  Ａ．；  Ｍｉｏｓｋｏｗｓｋｉ，  Ｃ．；  Ａｕｗｅｒｘ，  Ｊ．；  Ｓａｌａｄｉｎ，  Ｒ．、Ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＴＧＲ５  ａｇｏｎｉｓｔ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００７年、３６２号、７９３〜７９８頁
【非特許文献８】Ｋａｔｏｎａ，  Ｂ．  Ｗ．；  Ｃｕｍｍｉｎｓ，  Ｃ．  Ｌ．；  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，  Ａ．  Ｄ．；  Ｌｉ，  Ｔ．；  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｄ．  Ｒ．；  Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，  Ｄ．  Ｊ．；  Ｃｏｖｅｙ，  Ｄ．  Ｆ．、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、２００７年、５０号、６０４８〜６０５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
疾患の治療および予防のためのＴＧＲ５モジュレーターを開発することが必要とされている。本発明は、Ｃ−１６位において置換基を有するケノデオキシコール酸類似体である化合物、および疾患を治療するためにこれらの化合物を使用する方法を同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＴＧＲ５受容体の調節に関与する疾患（代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患など）を治療および予防するための化合物、ならびにそれらの使用に関する。具体的には、本発明の化合物は、下記に示すようにＤ環のＣ−１６位において置換されているケノデオキシコール酸の類似体である。
【００１２】
【化２】
0005639073.tif 000003
一態様において、本発明には、式Ａ：
【００１３】
【化３】
0005639073.tif 000004
を有する化合物、または塩、溶媒和物、水和物、もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ２は、水素またはヒドロキシであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、
Ｒ１１は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、
Ｒ１２は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、あるいは一緒になってＲ１１およびＲ１２は、カルボニルを形成し、
Ｒ１６は、ヒドロキシル、アルコキシ、およびハロゲンであり、ただし、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ１２が水素であり、Ｒ１およびＲ１１がＯＨであるとき、Ｒ１６はアルファＯＨではない。
【００１４】
別の態様において、本発明には、式Ｂ：
【００１５】
【化４】
0005639073.tif 000005
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１６は、本明細書に記載されている通りである。
【００１６】
別の態様において、本発明には、式Ｃ：
【００１７】
【化５】
0005639073.tif 000006
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ１６は、本明細書に記載されている通りである。
【００１８】
別の態様において、本発明には、式Ｄ：
【００１９】
【化６】
0005639073.tif 000007
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ１６は、本明細書に記載されている通りである。
【００２０】
別の態様において、本発明には、式Ｅ：
【００２１】
【化７】
0005639073.tif 000008
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２およびＲ１６は、本明細書に記載されている通りである。
【００２２】
別の態様において、本発明には、式Ｆ：
【００２３】
【化８】
0005639073.tif 000009
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２およびＲ１６は、請求項１に記載されている通りである。
【００２４】
本発明には、Ｒ１がＯＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ７がＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ２がＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ２がアルファ−ＯＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ２がベータ−ＯＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ４が非置換アルキルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ４がエチルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ１１がヒドロキシルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ１２が水素である、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ１６がアルファヒドロキシルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、Ｒ１６がベータヒドロキシルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。
【００２５】
本発明には、化合物が化合物１０である化合物、
【００２６】
【化９】
0005639073.tif 000010
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。本発明には、化合物が薬学的に許容される塩である、化合物が含まれる。
【００２７】
本発明には、本発明の化合物と少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物が含まれる。本発明には、疾患を治療または予防する方法において使用するための化合物または組成物が含まれ、この方法は、本発明の化合物を投与することを含む。本発明には、疾患を治療または予防する方法のための医薬の製造における本発明の化合物の使用が含まれる。
【００２８】
本発明には、疾患を治療または予防するための医薬の製造における、式Ａ：
【００２９】
【化１０】
0005639073.tif 000011
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体の使用が含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ２は、水素またはヒドロキシであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、Ｒ１１は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり；Ｒ１２は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、あるいは一緒になってＲ１１およびＲ１２は、カルボニルを形成し、Ｒ１６は、ヒドロキシル、アルコキシ、およびハロゲンであり、ただし、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ１２が水素であり、Ｒ１およびＲ１１がＯＨであるとき、Ｒ１６はアルファＯＨではない。本発明には、被験体に、式Ａを有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体を投与することによって疾患を治療する方法が含まれる。
【００３０】
本発明には、疾患が代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される、使用が含まれる。本発明には、化合物または組成物が被験体に経口的、非経口的、静脈内、または局所的に投与される、使用が含まれる。本発明には、被験体がヒトである、使用が含まれる。
【００３１】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
式Ａ：
【化２２】
0005639073.tif 000012
を有する化合物、または塩、溶媒和物、水和物、もしくはアミノ酸抱合体
（式中、
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ２は、水素またはヒドロキシであり、
Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシであり、
Ｒ１１は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、
Ｒ１２は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、あるいはＲ１１およびＲ１２は一緒になって、カルボニルを形成し、
Ｒ１６は、ヒドロキシル、アルコキシ、およびハロゲンであり、ただし、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ１２が水素であり、Ｒ１およびＲ１１がＯＨであるとき、Ｒ１６はアルファＯＨではない）。
（項目２）
式Ｂ：
【化２３】
0005639073.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１６は、項目１に記載の通りである）を有する項目１に記載の化合物、
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体。
（項目３）
式Ｃ：
【化２４】
0005639073.tif 000014
（式中、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ１６は、項目１に記載の通りである）を有する項目１に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体。
（項目４）
式Ｄ：
【化２５】
0005639073.tif 000015
（式中、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ１６は、項目１に記載の通りである）を有する項目２に記載の化合物、
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体。
（項目５）
式Ｅ：
【化２６】
0005639073.tif 000016
（式中、Ｒ２およびＲ１６は、項目１に記載の通りである）を有する項目１に記載の化合物、
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体。
（項目６）
式Ｆ：
【化２７】
0005639073.tif 000017
（式中、Ｒ２およびＲ１６は、項目１に記載の通りである）を有する項目５に記載の化合物、
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体。
（項目７）
化合物１０
【化２８】
0005639073.tif 000018
である、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体。
（項目８）
薬学的に許容される塩である、項目１から７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目９）
項目１から８のいずれか一項に記載の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
（項目１０）
疾患を治療または予防する方法において使用するための化合物または組成物であって、該方法は、項目１から９のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む、化合物または組成物。
（項目１１）
前記疾患は、代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される、項目１０に記載の化合物または組成物。
（項目１２）
被験体に、経口的、非経口的、静脈内、または局所的に投与される、項目１０から１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物。
（項目１３）
前記被験体がヒトである、項目１０から１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物。
上記の説明は、下記のその詳細な記載を理解するために、および当技術分野に対する本発明の貢献をより認識するために、本発明のより重要な特徴を広く記載する。本発明の他の目的および特徴は、実施例と併せて考慮すれば、下記の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ベクター単独（Ｖ）またはＴＧＲ５発現ベクター（ＴＧＲ５）で過渡的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して化合物１０（図１Ａ）およびＬＣＡ（図１Ｂ）を使用した、ＦＲＥＴアッセイの結果を示す一連の２つのグラフ（Ａ〜Ｂ）である。
【図２】図２は、ＴＧＲ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した、化合物１０およびＬＣＡ（陽性対照）についてのトランス活性化アッセイ（ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター）結果を示す一連の２つのグラフ（Ａ〜Ｂ）である。
【図３】図３は、腸ＮＣ１−Ｈ７１６細胞および陽性対照としてＬＣＡを使用した、化合物１０についてのＴＧＲ５標的遺伝子発現アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図４】図４は、ヒト腸（ＮＣＩ−Ｈ７１６）を使用した４時間の刺激の後のＡＴＰ−放出を測定する化合物１０についてのインビトロの細胞毒性試験の結果を示す一連の３つのグラフ（Ａ〜Ｃ）である。ＬＣＡは、陽性対照である。
【図５】図５は、肝臓（ＨｅｐＧ２）細胞系を使用した４時間の刺激後のＡＴＰ−放出を測定する化合物１０についてのインビトロの細胞毒性試験の結果を示す一連の３つのグラフ（Ａ〜Ｃ）である。ＬＣＡは、陽性対照である。
【図６】図６は、ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）中の化合物１０（ｍＭ）の濃度の対数に対してプロットした表面張力を示すグラフである。
【図７】図７は、化合物１０を使用して行った十二指腸注入実験についての胆汁流のチャートである。
【図８】図８は、化合物１０を使用して行った大腿部注入実験についての胆汁流のチャートである。
【図９】図９は、化合物１０を使用して行った大腿部および十二指腸注入実験における時間に対する分泌速度を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０は、静脈内実験における質量分析法を使用した胆汁内で同定された化合物１０およびその主要な代謝物を示す一連のグラフである。データは絶対面積値として報告する。
【図１０Ｂ】図１０は、静脈内実験における質量分析法を使用した胆汁内で同定された化合物１０およびその主要な代謝物を示す一連のグラフである。データは絶対面積値として報告する。
【図１０Ｃ】図１０は、静脈内実験における質量分析法を使用した胆汁内で同定された化合物１０およびその主要な代謝物を示す一連のグラフである。データは絶対面積値として報告する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
１つまたは複数の本発明の実施形態の詳細を、下記の付随的な記載において記載する。本明細書に記載されているものと同様または等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、方法および材料をこれから記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載から明らかであろう。明細書において、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、単数形にはまた複数が含まれる。他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書が優先する。
【００３４】
一態様において、本発明には、式Ａ：
【００３５】
【化１１】
0005639073.tif 000019
の化合物、または塩、溶媒和物、水和物、もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、
Ｒ２は、水素またはヒドロキシルであり、Ｒ４は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはハロゲンであり、Ｒ７は、水素、置換もしくは非置換アルキル、またはヒドロキシルであり、Ｒ１１は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、Ｒ１２は、ヒドロキシル、ＯＳＯ３Ｈ、ＯＳＯ３−、ＯＣＯＣＨ３、ＯＰＯ３Ｈ、ＯＰＯ３２−、ＯＣ６Ｈ８Ｏ６−、または水素であり、あるいは一緒になってＲ１１およびＲ１２は、カルボニルを形成し、Ｒ１６は、ヒドロキシル、アルコキシ、またはハロゲンである。一態様において、本発明には、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ１２が水素であり、Ｒ１およびＲ１１がＯＨであり、Ｒ１６がアルファＯＨである、化合物が含まれない。別の態様において、本発明は、式Ａの化合物または塩、溶媒和物、水和物、もしくはアミノ酸抱合体を提供し、ただし、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ１２が水素であり、Ｒ１およびＲ１１がＯＨであるとき、Ｒ１６はアルファＯＨではない。別の態様において、本発明には、化合物
【００３６】
【化１２】
0005639073.tif 000020
が含まれない。
【００３７】
一態様において、本発明には、式Ｂ：
【００３８】
【化１３】
0005639073.tif 000021
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１６は、上記の通りである。
【００３９】
一態様において、本発明には、式Ｃを有する化合物、
【００４０】
【化１４】
0005639073.tif 000022
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ１６は、上記の通りである。
【００４１】
一態様において、本発明には、式Ｄ：
【００４２】
【化１５】
0005639073.tif 000023
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ１６は、上記の通りである。
【００４３】
一態様において、本発明には、式Ｅ：
【００４４】
【化１６】
0005639073.tif 000024
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２およびＲ１６は、上記の通りである。
【００４５】
一態様において、本発明には、式Ｆ：
【００４６】
【化１７】
0005639073.tif 000025
を有する化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれ、式中、Ｒ２およびＲ１６は、上記の通りである。
【００４７】
一態様において、本発明には、Ｒ１がＯＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。一態様において、本発明には、Ｒ７がＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。一態様において、本発明には、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ７がＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。
【００４８】
一態様において、本発明には、Ｒ２がＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。一態様において、本発明には、Ｒ２がアルファ−ＯＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。一態様において、本発明には、Ｒ２がベータ−ＯＨである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。
【００４９】
一態様において、本発明には、Ｒ４が非置換アルキルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。一態様において、本発明には、Ｒ４がエチルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。
【００５０】
一態様において、本発明には、Ｒ１１がヒドロキシルである、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。一態様において、本発明には、Ｒ１２が水素である、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。
【００５１】
一態様において、本発明には、化合物１０、
【００５２】
【化１８】
0005639073.tif 000026
またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体が含まれる。
【００５３】
一態様において、本発明には化合物が含まれ、化合物は、薬学的に許容される塩である。
【００５４】
一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体と、少なくとも１種の賦形剤とを含む組成物が含まれる。一態様において、本発明には、化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物もしくはアミノ酸抱合体と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物が含まれる。
【００５５】
一態様において、本発明には、被験体において疾患を治療または予防するための医薬の製造における本発明の化合物または組成物の使用が含まれる。別の態様において、本発明には、本発明の化合物または組成物を投与することによって、被験体において疾患を治療または予防する方法が含まれる。一態様において、本発明には、被験体に投与される治療有効量の本発明の化合物または組成物が含まれる。一態様において、本発明には、投与される予防的有効量の本発明の化合物または組成物が含まれる。
【００５６】
一態様において、本発明には、被験体において、ＴＧＲ５受容体の調節が関与する疾患を治療または予防するための医薬の製造における本発明の化合物または組成物の使用が含まれる。本発明には、本発明の化合物または組成物を投与することによって、被験体においてＴＧＲ５受容体の調節が関与する疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００５７】
一態様において、本発明には、疾患が代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される、使用が含まれる。本発明には、代謝性疾患、炎症性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心臓疾患、腎臓疾患、癌、および胃腸疾患から選択される疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００５８】
一態様において、本発明には、疾患が肥満症、糖尿病、代謝症候群、インスリン抵抗性、高血圧症、および異脂肪血症から選択される代謝性疾患である、使用が含まれる。本発明には、肥満症、糖尿病、糖尿肥満、代謝症候群、インスリン抵抗性、前糖尿病性インスリン抵抗性、高血圧症、および異脂肪血症から選択される代謝性疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００５９】
一態様において、本発明には、疾患がアレルギー、骨関節炎、虫垂炎、気管支喘息、膵炎、アレルギー性皮疹、および乾癬から選択される炎症性疾患である、使用が含まれる。本発明には、アレルギー、骨関節炎、虫垂炎、気管支喘息、膵炎、アレルギー性皮疹、および乾癬から選択される炎症性疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００６０】
一態様において、本発明には、疾患が関節リウマチ、多発性硬化症、およびＩ型糖尿病から選択される自己免疫疾患である、使用が含まれる。本発明には、関節リウマチ、多発性硬化症、およびＩ型糖尿病から選択される自己免疫疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００６１】
一態様において、本発明には、疾患が炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、短腸症候群（照射後大腸炎）、顕微鏡的大腸炎、過敏性腸症候群（吸収不良）、および細菌過剰繁殖から選択される胃腸疾患である、使用が含まれる。本発明には、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、短腸症候群（照射後大腸炎）、顕微鏡的大腸炎、過敏性腸症候群（吸収不良）、および細菌過剰繁殖から選択される胃腸疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００６２】
一態様において、本発明には、疾患が糖尿病性腎症、慢性腎不全、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および多発性嚢胞腎疾患から選択される腎臓疾患である、使用が含まれる。本発明には、糖尿病性腎症、慢性腎不全、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および多発性嚢胞腎疾患から選択される腎臓疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００６３】
一態様において、本発明には、疾患が結腸直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、胆管癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、およびインスリノーマから選択される癌である、使用が含まれる。本発明には、結腸直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、胆管癌、腎臓癌、胃癌、膵臓が癌、前立腺癌、およびインスリノーマから選択される癌を治療または予防する方法が含まれる。
【００６４】
一態様において、本発明には、疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、慢性ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、薬剤誘発性肝炎、血色素症、胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、門脈高血圧症、胆汁不飽和、ゴーシェ病、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、完全非経口栄養（ＴＰＮ）、胆石症、ＴＰＮに関連する胆汁鬱滞および敗血症から選択される肝疾患である、使用が含まれる。本発明には、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、慢性ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、薬物誘発性肝炎、血色素症、胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、門脈高血圧症、胆汁不飽和、ゴーシェ病、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、完全非経口栄養（ＴＰＮ）、胆石症、ＴＰＮに関連する胆汁鬱滞および敗血症から選択される肝疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００６５】
一態様において、本発明には、心臓疾患がうっ血性心不全、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、狭心症、動脈硬化症および脳血管疾患（出血、脳卒中、脳血管性梗塞）から選択される、使用が含まれる。本発明には、うっ血性心不全、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、狭心症、動脈硬化症および脳血管疾患（出血、脳卒中、脳血管脳性梗塞）から選択される心臓疾患を治療または予防する方法が含まれる。
【００６６】
一態様において、本発明には、ＴＧＲ５受容体の調節が関与する疾患が含まれる。一態様において、本発明には、ＴＧＲ５アゴニストである化合物が含まれる。一態様において、化合物は、ＦＸＲアクチベーターよりも選択的ＴＧＲ５アゴニストである。
【００６７】
一態様において、本発明の化合物または組成物を経口的、非経口的、静脈内、または局所的に被験体に投与する。一態様において、被験体はヒトである。
【００６８】
定義
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語を、ここに集める。
【００６９】
「治療する」という用語は、本明細書において使用する場合、病態または状態を軽減、緩和、減少、解消、モジュレート、または寛解、すなわち退行をもたらすことを意味する。
【００７０】
「予防する」という用語は、本明細書において使用する場合、特に、患者または被験体が病態または状態にかかりやすい、あるいは病態または状態を罹患する危険性があるときに、患者または被験体において病態または状態が起こることを完全にもしくは殆ど完全に阻止することを意味する。予防にはまた、例えば、病態または状態が既に存在し得るとき、病態または状態を抑制し、すなわちその発生を抑止し、病態または状態を軽減または寛解、すなわち退行をもたらすことを含むことができる。
【００７１】
本明細書において使用する場合、「アミノ酸抱合体」という用語は、任意の適切なアミノ酸を有する本発明の式の化合物の抱合体を意味する。そのような本発明の式の化合物の適切なアミノ酸抱合体は、胆汁または腸液において増強された完全性という追加された優位性を有するであろう。適切なアミノ酸には、これらに限定されないが、グリシンおよびタウリンが含まれる。したがって、本発明は、本発明の化合物のいずれかのグリシンおよびタウリン抱合体を包含する。
【００７２】
本明細書において使用する場合、「ＢＡ」とは、胆汁酸および胆汁酸誘導体を意味する。胆汁酸は、コレステロール由来のステロイドカルボン酸である。一次胆汁酸は、コール酸およびケノデオキシコール酸である。体内で、これらの酸は、胆汁中に分泌される前に、グリシンまたはタウリンと抱合する。
【００７３】
「アルキル」には、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル）、分岐鎖アルキル基（例えば、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル）、シクロアルキル（例えば、脂環式）基（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含めた飽和脂肪族基が含まれる。特定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格中に６個またはより少ない炭素原子を有する（例えば、直鎖についてＣ１〜Ｃ６、分岐鎖についてＣ３〜Ｃ６）。いくつかの例において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格中に４個またはより少ない炭素原子を有する。さらに、シクロアルキルは、それらの環状構造中に３個から８個の炭素原子を有する。
【００７４】
「置換アルキル」という用語は、炭化水素骨格の少なくとも１個または複数の炭素上の１個または複数の水素原子と置き換えた置換基を有するアルキル部分を意味する。このような置換基には、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含めた）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含めた）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは芳香族複素部分を含むことができる。
【００７５】
「アリール」には、０個から４個のヘテロ原子を含み得る５員および６員の「非共役」または単環の芳香族基、および少なくとも１個の芳香環を有する「共役」または多環式系を含めた、芳香族性を有する基が含まれる。アリール基の例には、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが含まれる。さらに、「アリール」という用語には、多環式アリール基、例えば、三環式、二環式、例えば、ナフタレン、ベンゾオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナプトリジン（ｎａｐｔｈｒｉｄｉｎｅ）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、またはインドリジンが含まれる。環状構造中にヘテロ原子を有するそれらのアリール基はまた、「アリール複素環」、「複素環」、「ヘテロアリール」または「複素環式芳香族化合物」と称し得る。芳香環は、上記のような置換基（例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含めた）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含めた）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは芳香族複素部分）で、少なくとも１つの環位置において置換されていてもよい。アリール基はまた、多環式系（例えば、テトラリン、メチレンジオキシフェニル）を形成するために、芳香族ではない脂環または複素環と縮合または架橋することができる。
【００７６】
炭素の数が他に特定されない限り、「低級アルキル」には、上記定義のようなアルキル基が含まれるが、その骨格構造中に１〜１０個、例えば、１〜６個の炭素原子を有する。
【００７７】
「エステル」という用語には、カルボニル基の炭素に結合している酸素原子に結合している炭素またはヘテロ原子を含有する化合物および部分が含まれる。「エステル」という用語には、アルコキシカルボキシ基（メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルなど）が含まれる。アルキル、アルケニル、またはアルキニル基は、上記定義の通りである。
【００７８】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語には、−ＯＨまたは−Ｏ−を有する基が含まれる。
【００７９】
「ハロゲン」という用語には、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などが含まれる。「ペルハロゲン化」という用語は一般に、全ての水素がハロゲン原子で置き換えられている部分を意味する。
【００８０】
「アニオン基」とは、本明細書において使用する場合、生理的ｐＨにおいて負に帯電している基を意味する。アニオン基には、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、スルフィナート、スルファメート、テトラゾリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、またはホスホロチオエートまたはその機能的等価物が含まれる。アニオン基の「機能的等価物」は、生物学的同配電子体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）、例えば、カルボン酸基の生物学的同配電子体を含むことを意図する。生物学的同配電子体は、古典的な生物学的等価性同等物および非古典的な生物学的等価性同等物の両方を包含する。古典的および非古典的な生物学的同配電子体は、当技術分野において公知であえる（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｒ．  Ｂ．、Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．、１９９２年、１９〜２３頁を参照されたい）。別のアニオン基は、カルボキシレートである。
【００８１】
「不安定な官能性」という用語は、不安定な連結、例えば、生理条件下の加水分解または切断の影響を受けやすい官能性または結合を含有する置換パターンを意味する（例えば、中性ｐＨ範囲の水溶液）。不安定な官能性の例には、アセタールおよびケタールが含まれる。
【００８２】
さらに、本発明の化合物、例えば、化合物の塩は、水和もしくは非水和（無水）形態で、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在することができる。水和物の非限定的例には、一水和物、二水和物などが含まれる。溶媒和物の非限定的例には、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが含まれる。
【００８３】
「溶媒和物」とは、化学量論量または非化学量論量の溶媒を含有する溶媒付加形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶性固体の状態の固定モル比の溶媒分子を捕捉する傾向を有し、したがって溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合、形成された溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールであるとき、形成された溶媒和物はアルコラートである。水和物は、水の１個または複数の分子と、水がその中でＨ２Ｏとしてその分子状態を保持する物質の１つとの組合せによって形成され、このような組合せは、１種または複数の水和物を形成することができる。
【００８４】
本発明の化合物のいくつかの構造には、不斉炭素原子が含まれることが注目される。したがって、このような不斉性から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）は、他に示さない限り本発明の範囲内に含まれることが理解される。このような異性体は、古典的な分離技術によって、および立体化学的に制御された合成によって実質的に純粋な形態で得ることができる。エナンチオマー（Ｒ−およびＳ−配置）は、Ｒ．Ｓ．Ｃａｈｎ、Ｃ．Ｉｎｇｏｌｄ、およびＶ．Ｐｒｅｌｏｇによって開発された系によって命名される。
【００８５】
さらに、本出願において議論されている構造および他の化合物には、その全てのアトロプ異性体が含まれる。アトロプ異性体は、２種の異性体の原子が空間において異なって配置されている立体異性体の１タイプである。アトロプ異性体は、それらの存在が、中心的結合の周りの大きな基の回転障害によってもたらされる束縛回転に負っている。このようなアトロプ異性体は典型的には、混合物として存在するが、クロマトグラフィー技術における最近の進歩の結果、選択した場合において２種のアトロプ異性体の混合物を分離することが可能となった。
【００８６】
「安定的な化合物」および「安定的な構造」とは、反応混合物からの有用な程度の純度への単離、および効果的な治療剤への製剤の後で残存するのに十分に頑強な化合物を示すことを意味する。
【００８７】
本明細書において使用する場合、「類似体」という用語は、他のものと構造的に同様であるが、組成が僅かに異なる化合物を意味する（異なる元素の原子による１個の原子の置換え、または特定の官能基の存在下、または別の官能基による１個の官能基の置換えなど）。したがって、類似体は、機能および外観が参照化合物と同様である、または相当する化合物である。
【００８８】
本明細書に定義されているように、「誘導体」という用語は、例えば、「胆汁酸誘導体」という用語において、共通の中核の４員環状構造を有し、本明細書に記載されているような様々な基で置換されている化合物を意味する。
【００８９】
「生物学的同配電子体」という用語は、原子または原子の群と、別の大まかに同様な原子または原子の群との交換から得られる化合物を意味する。生物学的等価性の置換えは、物理化学的または位相幾何学的に基づいていてもよい。カルボン酸の生物学的同配電子体の例には、アシルスルホンイミド、テトラゾール、スルホネート、およびホスホネートが含まれる。例えば、ＰａｔａｎｉおよびＬａＶｏｉｅ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、９６号、３１４７〜３１７６頁（１９９６年）を参照されたい。
【００９０】
「併用療法」（または「同時療法」）には、これらの治療剤（すなわち、本発明の化合物および少なくとも１種の第２の薬剤）の相互作用からの有益な効果を提供することを意図する特定の治療計画の一部として、本発明の化合物および少なくとも第２の薬剤の投与が含まれる。組合せの有益な効果には、これらに限定されないが、治療剤の組合せから得られる薬物動態学的または薬力学的相互作用が含まれる。組合せにおけるこれらの治療剤の投与は典型的には、確定した期間（通常、選択した組合せによって、数分、数時間、数日または数週間）に亘って行う。「併用療法」とは、偶発的および任意に本発明の組合せをもたらす別々の単独療法の一部として、これらの治療剤の２つ以上の投与を包含することを意図し得るが、一般にそうではない。「併用療法」は、順次の態様でのこれらの治療剤の投与（すなわち、各治療剤が異なる時間で投与される）、ならびに実質的に同時の態様でのこれらの治療剤、または治療剤の少なくとも２つの投与を包含することを意図する。実質的同時投与は、例えば、被験体に、一定の比率の各治療剤を有する単一のカプセル剤、または治療剤の各々について複数の単一のカプセル剤を投与することによって達成することができる。各治療剤の連続的または実質的同時投与は、これらに限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋内経路、および粘膜組織を通した直接吸収を含めた任意の適当な経路によって達成できる。治療剤は、同じ経路によって、または異なる経路によって投与することができる。例えば、選択した組合せの第１の治療剤は、静脈内注射によって投与してもよく、一方組合せの他の治療剤は、経口的に投与してもよい。代わりに、例えば、全ての治療剤を経口的に投与してもよく、または全ての治療剤を静脈内注射によって投与してもよい。治療剤が投与される順序は、厳密には決定的ではない。
【００９１】
「併用療法」はまた、他の生物活性のある成分および非薬物療法（例えば、手術または機械的処置）とのさらなる組合せにおける、上記のような治療剤の投与を包含する。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、非薬物治療は、治療剤および非薬物治療の組合せの相互作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適切な時間で行い得る。例えば、適当な場合、非薬物治療が治療剤の投与から一時、恐らく数日または数週間除かれるとき、有益な効果は依然として達成される。
【００９２】
「非経口投与」および「非経口的に投与する」という用語は、本明細書において使用する場合、通常注射による経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これらだけに限定されないが、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【００９３】
本発明の化合物、または化合物の組合せの「治療有効量」は、化合物（または化合物（複数可））の量（含量または濃度）である。一実施形態において、治療有効量の化合物が治療を必要としている被験体に投与されるとき、疾患から生じる症状は、直ちに、または１回もしくは複数回の化合物の投与後に寛解する。被験体に投与される化合物の量は、特定の障害、投与方法、同時投与される化合物（もしあれば）、および被験体の特徴（身体全体の健康、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、体重および薬物耐性など）によって決まる。当業者であれば、これらおよび他の要因によって適当な投与量を決定することができるであろう。
【００９４】
「予防的有効量」という用語は、疾患の危険性を予防または減少させるために投与される本発明の化合物、または化合物の組合せの量（含量または濃度）、すなわち、予防または防止作用を実現するのに必要な量を意味する。被験体に投与される本化合物の量は、特定の障害、投与方法、同時投与される化合物（もしあれば）、および被験体の特徴（身体全体の健康、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、体重および薬物耐性など）によって決まる。
【００９５】
「危険性を減少させる」という用語は、本明細書において使用する場合、特に、患者または被験体が中枢神経系疾患、炎症性疾患および／または代謝性疾患を発生させる傾向があるときに、患者においてこのような発生する見込みまたは可能性が減少することを意味する。
【００９６】
本発明の化合物の「塩」は、イオン結合を含有する化合物の生成物であり、化合物を、酸または塩基と反応させることによって典型的には生成される。
【００９７】
「薬学的に許容される塩」とは、被験体に投与するのに適した塩である。
【００９８】
「組成物」は、本発明の化合物を、被験体に投与するのに適した形態で含有する製剤である。別の実施形態において、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、エアゾール吸入器上の単一のポンプ、またはバイアルを含めた種々の形態のいずれかである。組成物の単位用量中の活性成分（例えば、本発明の化合物またはその塩の製剤）の含量は有効量であり、関連する特定の治療によって変化する。患者の年齢および状態によって投与量に対して通常の変動を行うことが必要なときがあることを当業者であれば認識するであろう。投与量はまた、投与経路によって決まる。経口、肺、直腸、非経口、経皮的、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内などを含めて種々の経路が意図される。本発明の化合物の局所的または経皮的投与のための剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入剤が含まれる。別の実施形態において、活性化合物を、無菌状態下にて、薬学的に許容される担体と共に、および必要とされる任意の保存剤、緩衝液、または噴射剤と共に混合する。
【００９９】
「フラッシュドーズ（ｆｌａｓｈ  ｄｏｓｅ）」という用語は、急速に分散する剤形である化合物の製剤を意味する。
【０１００】
「即時放出」という用語は、相対的に短期間、一般に約６０分までの、剤形からの化合物の放出と定義される。「調節放出」という用語には、遅延放出、徐放、およびパルス放出が含まれると定義される。「パルス放出」という用語は、剤形からの薬物の一連の放出と定義される。「持続放出」または「徐放」という用語は、長期間に亘る剤形からの化合物の連続放出と定義される。
【０１０１】
「被験体」には、哺乳動物、例えば、ヒト、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ、鳥など）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、鳥など）が含まれる。典型的には、被験体は、ヒトである。
【０１０２】
本発明の化合物にはまた、プロドラッグまたは生理的に同等の誘導体が含まれる。「プロドラッグ」または「生理的に同等の誘導体」には、インビボで代謝的に変換され、活性薬物を生成する薬物の前駆体形態が含まれる。本発明は、本発明の方法において使用されるＴＧＲ５モジュレート化合物にインビボで変換されるプロドラッグの使用をさらに意図する（例えば、Ｒ．  Ｂ．  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、１９９２年、「Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第８章を参照されたい）。このようなプロドラッグを使用して、ＴＧＲ５モジュレート化合物の体内分布（例えば、典型的には血液脳関門を通過しない化合物を、血液脳関門を通過させることを可能にする）または薬物動態を変化させることができる。例えば、アニオン基、例えば、カルボキシレート、スルフェートまたはスルホネートを、例えば、アルキル基（例えば、メチル基）またはフェニル基でエステル化し、エステルを生じさせることができる。エステルが被験体に投与されるとき、エステルは、酵素的または非酵素的に、還元的または加水分解的に切断され、アニオン基が示される。このようなエステルは、環状、例えば、環状スルフェートもしくはスルホンでよく、または２つ以上のアニオン部分が、連結基によってエステル化されてもよい。アニオン基は、部分（例えば、アシルオキシメチルエステル）でエステル化することができ、その部分は切断され、中間体であるＴＧＲ５モジュレート化合物が示され、中間体であるＴＧＲ５モジュレート化合物は引き続いて分解され、活性ＴＧＲ５モジュレート化合物を生じさせる。一実施形態において、プロドラッグは、カルボキシレート、スルフェートまたはスルホネートの還元された形態、例えば、アルコールまたはチオールであり、プロドラッグは、インビボでＴＧＲ５モジュレート化合物に酸化される。さらに、アニオン部分は、インビボで能動的に輸送され、または標的器官によって選択的に取り込まれる基へとエステル化することができる。
【０１０３】
「ＴＧＲ５モジュレーター」という用語は、ＴＧＲ５受容体と相互作用する任意の化合物を意味する。相互作用は、ＴＧＲ５受容体のアンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニスト、またはインバースアゴニストとして作用する化合物に限定されない。一態様によれば、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体のアンタゴニストとして作用する。別の態様において、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体のアゴニストとして作用する。別の態様において、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体の部分アゴニストとして作用する。別の態様において、本発明の化合物は、ＴＧＲ５受容体のインバースアゴニストとして作用する。伝統的には、リガンドのプロファイルは、内因性であれまたは合成であれ、Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔによって１９６６年に最初に記載されたその内在的有効性「ｅ」によって特性決定される。内在的有効性は、異なるリガンドが同じ数の受容体を占有する一方で、様々な生物学的反応を生じさせる程度を表すために使用される。一般に、「アゴニスト」という用語は、別の分子または受容体部位の活性を増強する化合物を意味する。アゴニストとは、古典的な定義によって、オルソステリック、アロステリック、インバースまたはコアゴニストであろうとなかろうと、受容体に結合し、その受容体の状態を変化させ、生物学的作用をもたらす特性を有する。結果的に、アゴニズムは、生物作用を生じさせるアゴニストまたはリガンドの特性として定義される。これと対照的に、「アンタゴニスト」は、同じ受容体巨大分子に対する高親和性を有するが、非常に少ないまたは無視できる内在的有効性を有する本質的アゴニストであり、したがってアゴニストの生物学的作用を立体的に妨げる。特性として、アンタゴニズムは、機能的または生理学的であってよく、アゴニストは、前者において受容体部位についての直接競合を有し、後者において異なる受容体−メッセンジャー系を介する拮抗作用を有する。さらに具体的には、ＴＧＲ５アゴニストは、ＴＧＲ５に結合し、受容体を発現している細胞において環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の濃度を少なくとも２０％増加させる受容体リガンドまたは化合物である。逆に、ＴＧＲ５アンタゴニストは、アゴニストの活性をアンタゴナイズまたは遮断し、それによってｃＡＭＰの濃度の減少をもたらす化合物であろう。
【０１０４】
本発明は、ＴＧＲ５受容体モジュレート活性を有する化合物、ならびに肥満症およびインスリン感受性などの代謝性疾患を治療および予防するためのそれらの使用に関する。
【０１０５】
本発明の化合物を下記に示す。
【０１０６】
【化１９】
0005639073.tif 000027
【０１０７】
【化２０】
0005639073.tif 000028
本明細書において引用した全ての公開資料および特許文献は、このような公開資料または文献の各々が明確に個々に参照により本明細書中に組み込まれていることが示されたように参照により本明細書中に組み込まれている。公開資料および特許文献を引用することは、いずれかが関連する従来技術であることを認めることを意図せず、それらの内容または日付についての何らかの承認を構成しない。本発明を書面による説明によってこれまで記載してきたが、本発明が種々の実施形態で実施することができ、上記の記載および下記の実施例が、例示の目的のためであり、下記の特許請求の範囲を限定するものではないことを当業者であれば認識するであろう。
【実施例】
【０１０８】
（実施例１）
ＴＧＲ５モジュレーターの合成
本発明の化合物、および関連する誘導体は、当業者に公知の方法によって合成することができる。
【０１０９】
【化２１】
0005639073.tif 000029
メチル３α、７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オエート（２）
１（４．１ｇ、９．７６ｍｍｏｌ）のメタノール（１２０ｍｌ）溶液に、ｐＴＳＡ（０．４１ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０℃で２時間超音波処理した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３（１５０ｍｌ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（２×１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）およびブライン（１００ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させ、メチルエステル２（３．９５ｇ、９．１ｍｍｏｌ、９３％）を白色の固体として得て、それをそれ以上精製することなく次のステップのために使用した。
【０１１０】
メチル３ａ−アセトキシ−７ａ−ヒドロキシ−６ａ−エチル−５β−コラン−２４−オエート（３）
２（３．９ｇ、８．９８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍｌ）（蒸留したばかりである）溶液に、無水酢酸（１５．２９ｍｌ、１６１．７５ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１５．０９ｇ、１７９．７２ｍｍｏｌ）を加え、このように得られた混合物を一晩還流させた。混合物を室温に冷却し、水（１２０ｍｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×８０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を水（２×１００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させ、所望のアセチル化化合物３（４．２５ｇ、８．９２ｍｍｏｌ、９９％）を白色の固体として得て、それをそれ以上精製することなく次のステップのために使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．６５  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８４−０．９３  （９Ｈ，  ｍ，  １９−ＣＨ３  ＋  ２１−ＣＨ３−２１，  ２６−ＣＨ３），  １．１１−１．９１  （２６Ｈ，  ｍ），  ２．００  （３Ｈ，  ｓ，  ３−ＣＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ３），  ２．２８−２．３６  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６５  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ３．７０  （１Ｈ，  ｂｓ，  ７−ＣＨ），  ４．４８−４．５９  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ）．
メチル３α−アセトキシ−６α−エチル−７α−（３’−ヨードベンゾイル）オキシ−５β−コラン−２４−オエート（４）
３−ヨード安息香酸（３．９３ｇ、１５．ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）に懸濁し、混合物が溶解するまで（約１時間）、２滴のＤＭＦの存在下で室温にて塩化オキサリル（３．２１ｍｌ、３６．１ｍｍｏｌ）で処理した。揮発性物質を減圧下除去し、このように得られた塩化アシルを１５０ｍｌのトルエンに溶解させ、撹拌した３（４．２ｇ、８．８２ｍｍｏｌ）のトルエン（１５０ｍｌ）溶液に加えた。上記の溶液に、ＣａＨ２（２．６６ｇ、６３．５ｍｍｏｌ）およびＢｎＥｔ３Ｎ＋Ｃｌ−（０．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を４８時間還流させた。次いで、反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３（２００ｍｌ）に懸濁し、濾過した。有機濾液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（２×１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を、石油エーテル中の５〜１０％のＥｔＯＡｃを使用したフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３．５４ｇ（５．０１ｍｍｏｌ、５７％）の４および１．２３ｇ（２．５８ｍｍｏｌ）の未処理の出発材料（変換収率８０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．６７  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８８−０．９２  （６Ｈ，  ｍ，  ２１−ＣＨ３，  ２６−ＣＨ３），  １．１３−１．３２  （１５Ｈ，  ｍ），  １．７−１．７４  （５Ｈ，  ｍ），  １．８９−１．９１  （５Ｈ，  ｍ），  ２．０５  （３Ｈ，  ｓ，  ３−ＣＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ３），  ２．１８−２．３０  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６３  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ４．６０−４．６２  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ），  ５．４１  （１Ｈ，  ｂｓ，  ７−ＣＨ），  ７．２３  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ１  ＝  ６．５Ｈｚ，  Ｊ２＝  ６．７  Ｈｚ，  ５’−Ｈ  ），  ７．９４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．７  Ｈｚ，  ４’−Ｈ），  ８．０４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６’−Ｈ）；  ８．３７  （１Ｈ，  ｓ，  ２’−Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    １１．６，  １１．７，  １８．２，  ２０．７，  ２１．７，  ２２．２，  ２３．１，  ２３．９，  ２６．８，  ２７．９，  ２９．６，  ３０．８  （ｘ２），  ３４．４，  ３５．１  （２ｘ），  ３５．５，  ３９．２，  ３９．３，  ４１．３，  ４２．９，  ４４．６，  ５０．６，  ５１．４，  ５５．３，  ７４．２，  ７４．５，  ９３．９，  １２８．９，  １３０．１，  １３２．４，  １３８．６，  １４１．６，  １６４．５，  １７０．３，  １７４．６．
メチル３α−アセトキシ−６α−エチル−７α−（３’−ヨードベンゾイル）オキシ−１７ａ−クロロ−５β−コラン−２４−オエート（５）
０．３ＭのｔＢｕＯＨ（８．２ｍｌ）を含有する４（３．５ｇ、４．９５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２８０ｍｌ）溶液に、ジクロロヨードベンゼン（３．３８ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）を加えた。乾燥Ｎ２で泡立てることによって、混合物を３分間脱酸素化した。次いで、タングステンランプ（２００Ｗ）を使用して、混合物を０℃で１時間光分解した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（８：２、ｖ／ｖ）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによってすばやく精製し、３．３５ｇ（４．５２ｍｍｏｌ、９２％）の１７−クロロ誘導体５を白色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．８１  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．９１  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  １．０  （６Ｈ，  ｍ，  １９−  ＣＨ３  ＋  ２６−ＣＨ３），  １．１２−１．９３  （２４Ｈ，ｍ），  ２．０３  （３Ｈ，  ｓ，  ３−ＣＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ３），  ２．１８−２．２５  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６５  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ４．５７−４．６２  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ），  ５．４０  （１Ｈ，  ｂｓ，  ７−ＣＨ），  ７．２２  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７９  Ｈｚ，  ５’−  Ｈ），  ７．９１  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７６  Ｈｚ，  ４’−Ｈ），  ８．０２  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  ６’−Ｈ），  ８．３８  （１Ｈ，  ｓ，  ２’−Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    １１．６，  １４．４，  １４．５，  ２０．７，  ２１．６，  ２２．２，  ２３．１  （ｘ２），  ２６．７，  ２８．６，  ２９．４，  ３１．７，  ３４．２  （ｘ２），  ３５．１，  ３５．４，  ３９．６，  ４０．４，  ４１．１，  ４１．３，  ４４．６，  ４５．２，  ４９．９，  ５１．５，  ７４．１，  ７４．４，  ９２．９，  ９３．９，  １２８．８，  １３０．１，  １３２．３，  １３８．６，  １４１．７，  １６４．９，  １７０．７，  １７４．１．
メチルＡ１６３α−アセトキシ−６α−エチル−７α−（３’−ヨードベンゾイル）オキシ−５β−コラン−２４−オエート（６）
１７−クロロ誘導体５（３．３ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１３０ｍｌ）に溶解させ、一晩還流させた。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（８：２）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、２．２４ｇ（３．１８ｍｍｏｌ、７２％）の所望のオレフィンを白色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．７５  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８９  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  ０．９８  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２６−ＣＨ３），  １．０３  （Ｈ，  ｓ，  １９−ＣＨ３），  １．１１−２．０２  （２２Ｈ，ｍ），  ２．０５  （３Ｈ，  ｓ，  ３−ＣＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ３），  ２．２２−  ２．３０  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６５  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ４．５８−４．６２  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ），  ５．２０  （１Ｈ，  ｂｓ，  ７−ＣＨ），  ５．５１  （１Ｈ，  ｓ，  １６−ＣＨ），  ７．２１  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  ５’−Ｈ），  ７．９０  （１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ１  ＝  ７．９  Ｈｚ，  Ｊ２  ＝  １．１  Ｈｚ，  ４’−Ｈ），  ８．０２  （１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ１  ＝  ７．９  Ｈｚ，  Ｊ２  ＝  １．１  Ｈｚ，  ６’−Ｈ），  ８．３７  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  １．３  Ｈｚ，  ２’−Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    １１．６，  １５．９，  ２０．６，  ２１．７，  ２１．８，  ２２．１，  ２３．１，  ２６．７，  ２９．６，  ３０．９，  ３１．１，  ３１．７，  ３２．２，  ３４．５，  ３４．９，  ３５．０，  ３５．７，  ３７．９，  ４１．３，  ４４．８，  ４７．５，  ５１．４，  ５１．７，  ７４．１，  ７４．７，  ９３．９，  １２１．４，  １２８．９，  １３０．１，  １３２．３，  １３８．６，  １４１．７，  １５８．５，  １６４．６，  １７０．７，  １７４．４．
３α，７α，１６α，２４−テトラヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン（７）
オレフィン６（０．３ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を０℃でＢＨ３−ＴＨＦ（ＴＨＦ中１０．６ｍｌ、１Ｍ）に溶解させ、次いで室温で２時間撹拌した。この時間の後、反応物を０℃で冷却し、４ＭのＮａＯＨ水溶液（２０ｍｌ）およびＨ２Ｏ２（２０ｍｌ）の混合物を滴下で添加し、このように得られた混合物をこの温度で３時間撹拌した。反応物を１ＮのＨＣｌで酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×６０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下蒸発乾固させた。油性残渣をトルエン（５２ｍｌ）に溶解させ、ＭｅＯＨ（７ｍｌ）中の５％ＫＯＨを加え、このように得られた混合物を一晩還流させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を水（２５ｍｌ）に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下蒸発乾固させた。残渣を、ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ（９５：５、ｖ／ｖ）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、０．０８５ｇ（０．２ｍｍｏｌ、４７％）の所望のテトラオールを白色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．６４  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８５−０．９１  （６Ｈ，  ｍ，  １９−ＣＨ３  ＋  ２６−ＣＨ３），  ０．９２  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  １．２１−１．９１  （２１Ｈ，ｍ），  ３．３３−３．３５  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ），  ３．５４−３．６１  （３Ｈ，  ｍ，  ７−ＣＨ  ＋  ２４−ＣＨ２），  ３．９４  （１Ｈ，  ｂｓ，  １６−ＣＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    １１．７，  １３．１，  １４．１，  １８．８，  ２０．４，  ２１．９，  ２２．４，  ２３．１，  ２８．７，  ３０．４，  ３１．８，  ３３．１，  ３３．５，  ３４．０，  ３５．４  （ｘ２），  ３５．５，  ３５．８，  ３９．５，  ３９．９，  ４１．３，  ４３．９，  ４５．３，  ４７．４，  ６２．６，  ６６．１，  ７０．６，  ７２．０．
メチル３，７，１６−トリオキソ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オエート（８）
ジョーンズ試薬（２ｍｌ）を、撹拌したテトラオール７（０．１９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍｌ）溶液に０℃にて滴下で添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、メタノール（８ｍｌ）を加え、酸化生成物をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下蒸発乾固させた。残渣をＭｅＯＨ（８０ｍｌ）に溶解させ、ｐＴＳＡを加え、混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３（５０ｍｌ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（２×５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）およびブライン（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を、石油エーテル中の２０〜３０％ＥｔＯＡｃを使用したフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、メチルエステル８（０．１１５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ、５８％）を白みがかった固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：    ０．８２  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３）；  ０．８５  （３Ｈ，  ｍ，  ２６−ＣＨ３）；  １．０  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２１−  ＣＨ３）；  １．３７  （３Ｈ，  ｓ，  １９−ＣＨ３）；  １．５５−２．３５  （２３Ｈ，ｍ）；  ２．６３−２．８７  （２Ｈ，  ｍ）．
メチル３α，７α，１６β−トリヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オエート（９）
トリケトエステル８（０．１ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍｌ）溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルアミン−ボラン錯体（０．１ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を一晩還流させた。反応物を室温に冷却し、３ＮのＨＣｌを加え、このように得られた混合物を３０分間撹拌した。有機層を分離し、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣（７−ケトンは還元されていなかった）を、Ｈ２Ｏ／ＴＨＦの１：４ｖ／ｖ混合物（５ｍｌ）に溶解させ、ＮａＢＨ４を０℃で加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで水（５ｍｌ）および３ＮのＨＣｌ（５ｍｌ）を加えた。混合物をＥｔＯＡｃ（４×３０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下蒸発乾固させた。少なくとも２種の成分からなる残渣を、ＣＨＣｌ３中の１〜４％ＭｅＯＨを使用したフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、０．０３６ｇ（０．０８ｍｍｏｌ、３６％）の所望の化合物９を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （アセトン−ｄ６）  δ：    ０．８７−０．９０  （６Ｈ，  ｍ，  １８−ＣＨ３  ＋  ２６−ＣＨ３），  ０．９２  （３Ｈ，  ｓ，  １９−ＣＨ３），  ０．９８  （３Ｈ，  ｄ，  ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  １．１９−１．５８  （１０Ｈ，  ｍ），  １．７５−２．０５  （７Ｈ，  ｍ），  ２．３４−２．４１  （２Ｈ，  ｍ）  ３．２８−３．３０  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ），  ３．６２  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＯＯＣＨ３），  ３．６４  （１Ｈ，  ｂｓ，  ７−ＣＨ），  ４．３７  （１Ｈ，  ｂｓ，  １６−ＣＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （アセトン−ｄ６）  δ：    １１．１，  １２．５，  １７．４，  ２０．４，  ２２．３，  ２２．８，  ３０．１，  ３０．４，  ３０．５，  ３０．６，  ３３．１，  ３３．７，  ３５．４，  ３５．６  （ｘ２），  ３９．７，  ４０．０，  ４１．６，  ４２．２，  ４５．７，  ４８．３，  ５０．８，  ６１．７，  ６９．５，  ７１．３，  ７１．４，  １７４．８．
３α，７α，１６β−トリヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸ナトリウム塩（１０）
エステル９（３５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ中の５％ＮａＯＨ（８ｍｌ）に溶解させ、このように得られた混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下蒸発させ、このように得られた固体はＨ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ（１：１）の混合物中にあり、ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：５〜７：３）の混合物を移動相として使用して逆相クロマトグラフィー（カラムＲＰ−１８  ｌｏｂａｒ  Ａ）によって精製し、所望のナトリウム塩１０（１５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、４３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  δ：    ０．８６  （３Ｈ，  ｓ，  １８−ＣＨ３），  ０．８８−０．９３  （６Ｈ，  ｍ，  １９−ＣＨ３  ＋  ２６−ＣＨ３），  ０．９９  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ２１−ＣＨ３），  １．０６−１．４１  （９Ｈ，  ｍ），  １．４６−１．９  （１１Ｈ，  ｍ），  １．９７−２．０４  （２Ｈ，  ｍ），  ２．２３−２．２５  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３０−２．３５  （１Ｈ，  ｍ），  ３．２８−３．３５  （１Ｈ，  ｍ，  ３−ＣＨ），  ３．６７  （１Ｈ，  ｂｓ，  ７−ＣＨ），  ４．４９−４．５２  （１Ｈ，  ｍ，  １６−  ＣＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ）  δ：    １２．０，  １３．３，  １８．７，  ２１．６，  ２３．５，  ２３．７，  ２９．５，  ３１．２，  ３１．３，  ３３．４，  ３４．４，  ３４．５，  ３５．３，  ３５．５，  ３６．６，  ３６．７，  ４１．２，  ４３．１，  ４３．４，  ４６．７，  ６３．８，  ７１．１，  ７３．２，  ７３．４．
（実施例２）
インビトロのＴＧＲ５およびＦＸＲ活性
（実施例２Ａ）
ＴＧＲ５およびＦＸＲ受容体結合
ＴＧＲ５受容体に対する本発明の化合物の作用強度および有効性は、インビトロアッセイを使用して評価する。表１は、ＦＸＲおよびＴＧＲ５受容体に対する本発明の化合物の作用強度および有効性を要約する。
【０１１１】
【表１】
0005639073.tif 000030
ＦＲＥＴアッセイ（細胞内ｃＡＭＰレベルの検出）
受容体結合アッセイは、ＦＲＥＴアッセイを使用してサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベルを測定することによって行った。ヒト腸細胞系（ＮＣＩ−Ｈ７１６）を、使用の直前に、メーカーの指示に従って０．７５ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした９６ウェルプレートに、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中に１２×１０３細胞／ウェルの濃度で蒔き、２４時間培養し、それによってプレートの底への細胞接着が可能となった。細胞をＰＢＳで２度洗浄し、培地をｃＡＭＰアッセイ培地［０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＯＰＴＩＭＥＭ］と交換した。３７℃で６０分間のインキュベーション後、細胞を、ユウロピウムキレート−ストレプトアビジンおよびＡＬＥＸＡ  Ｆｌｕｏｒ６４７−抱合抗体抗ｃＡＭＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する刺激緩衝液（ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）中の５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ）中で１時間室温にて、増加する濃度の化合物１０で処理した。細胞内ｃＡＭＰのレベルを、Ｌａｎｃｅキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で決定した。リトコール酸（Ｌｉｔｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を、対照リガンドとして使用した。Ｚ’因子を使用して、アッセイを検証した。非線形回帰曲線は、制約なしに、４パラメーター式およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．）を使用することによって行い、ＥＣ５０値を得た。
【０１１２】
Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイ
ＦＸＲに対する活性を、コアクチベーターリクルート作用アッセイにおいてＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ技術を使用することによってアッセイした。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、生体分子相互作用を研究するために使用するビーズをベースとする化学アッセイである。ビーズ上に捕獲された分子の結合は、１つのビーズから他のビーズへのエネルギー移動をもたらし、最終的に発光シグナルを生じさせる。パートナーが相互作用するとき、化学エネルギーはドナービーズからアクセプタービーズに移動し、シグナルが生じる。胆汁酸刺激によって、ＧＳＴ−ＦＸＲ−ＬＢＤは、Ｓｒｃ−１ペプチドと相互作用する。抗ＧＳＴ−コーティングされたアクセプタービーズを使用して、ＧＳＴ−融合ＦＸＲ−ＬＢＤを捕獲し、一方では、ビオチン化−ＳＲＣ−１ペプチドは、ストレプトアビジンドナービーズによって捕獲した。６８０ｎｍでの照明によって、化学エネルギーは、複合体ストレプトアビジン−ドナー／Ｓｒｃ−１−ビオチン／ＧＳＴＦＸＲ−ＬＢＤ／抗ＧＳＴ−アクセプターを介してドナービーズからアクセプタービーズに移動し、シグナルが生じる。アッセイは、１０ｎＭの最終濃度の精製したＧＳＴ標識ＦＸＲ−ＬＢＤタンパク質、３０ｎＭのビオチン化Ｓｒｃ−１ペプチド、２０μｇ／ｍｌの抗ＧＳＴアクセプタービーズおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する２５μｌの最終容量を使用して、低容量の白色３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で行った。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％ＢＳＡ、および１ｍＭのＤＴＴを含有した。１μｌのリガンド（１００％ＤＭＳＯ中で可溶化した）による刺激時間を、室温にて３０分に固定した。各ウェル中のＤＭＳＯの濃度を、４％の最終濃度で維持した。検出ミックス（アクセプタービーズおよびドナービーズ）を加えた後、プレートを、室温にて暗中４時間インキュベートし、次いでＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレート分析器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。用量反応曲線を３連で行い、Ｚ’因子を使用して、アッセイを検証した。非線形回帰曲線は、制約なしに、４パラメーター式およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．）を使用することによって行い、ＥＣ５０値を得た。
【０１１３】
細胞培養、トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＰＧ２およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各々、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（高グルコース）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＥ−ＭＥＭおよびＤＭＥＭ中で培養した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２中で増殖させた。全てのトランスフェクションは各々、５：２のＦｕｇｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬（μｌ）とＤＮＡ（μｇ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２細胞を、各々１０，０００または１５，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。一過性トランスフェクションを、１００ｎｇのレポーターベクターｐＧＬ４．２９［ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）、トランスフェクション効率性についての内部対照として４０ｎｇのｐＧＬ４．７４（Ｒｅｎｉｌｌａ）、および１０ｎｇの発現プラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ｈＴＧＲ５、ＮＩＨ哺乳動物遺伝子コレクションクローンＭＧＣ：４０５９７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ｐＧＥＭベクターを加え、各アッセイにおいてトランスフェクトされたＤＮＡの量（２μｇ）を正規化した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、増加する濃度の化合物１０で１８時間刺激した。対照培養物は、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）単独を摂取した。次いで、細胞／ウェルを含有する７５μｌの培地に７５μｌのＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることによって、細胞を溶解させた。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、多量のＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ試薬および最初の培地を加えることによって測定した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ単位とウミシイタケルシフェラーゼ単位の比として表した。各データポイントは、３連のアッセイの平均である。各実験は、少なくとも３回繰り返した。
【０１１４】
５０％有効濃度（ＥＣ５０）および有効性の決定
ＴＧＲ５アゴニスト研究のために１０μＭのＬＣＡ値の割合、およびＦＸＲアゴニスト研究のために１０μＭのＣＤＣＡ値の割合を各々計算することによって有効性を決定した。基本（ビヒクル処理）条件の平均値を引いた後、値をＥＣ５０および／または有効性決定に適用した。平均ＥＣ５０の計算および異なる化合物の間のＥＣ５０の比較を、対数変換の後に行った。
【０１１５】
（実施例２Ｂ）
化合物１０のＴＧＲ５標的遺伝子発現アッセイ
腸ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞におけるＡＣＣおよびＡＭＰＫ遺伝子発現のレベルを、化合物１０および陽性対照としてＬＣＡを使用して測定した。ＴＧＲ−５標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴＰＣＲ）によって測定した。総ＲＮＡを、５μＭの化合物１０で１８時間刺激したＮＣＩ−Ｈ７１６から単離した（Ａｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ＢｉｏＲａｄ）。ＲＮＡは、ＩＳＣＲＩＰＴ  ｃＤＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＫＩＴ（ＢｉｏＲａｄ）で２０μｌの反応容量にてランダムに逆転写した。１０ｎｇのテンプレートを、０．３μＭの各プライマーおよび１０μｌの２Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭＩＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有するリアルタイムＰＣＲの２０μｌの最終容量の反応において使用した。全ての反応は三連で行い、熱サイクル条件は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５機器（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において、９５℃で３分、続いて９５℃で１０秒間の４５サイクル、および６０℃の３０秒間であった。各試料についての複写物の平均値を計算し、サイクル閾値として表した（ＣＴ：各ＰＣＲ反応が所定の蛍光閾値に達するサイクル数、全ての反応の線形範囲内に設定）。次いで、遺伝子発現の量を、標的遺伝子についての試料のＣＴ値と、内在性対照β２−ミクログロブリンについてのその試料の平均ＣＴ値との間の差異（ΔＣＴ）として計算した。相対的発現を、各標的遺伝子についての試験試料および対照試料（ＷＴ）のΔＣＴ値の間の差異（ΔΔＣＴ）として計算した。相対的定量化値を表し、２−ΔΔＣＴとして示した。全てのＰＣＲプライマーを、ＮＣＢＩデータベースからの発表された配列データ上でソフトウェアＢｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用してイントロンを挟むようにデザインした。結果を図３に示す。
【０１１６】
（実施例２Ｃ）
ヒト腸および肝細胞系における化合物１０のインビトロでの細胞毒性
細胞生存率を、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ＡＴＰ−Ｌｉｔｅ１ＳＴＥＰを使用して測定した。ＡＴＰは、全ての代謝的活性細胞において存在し、細胞が壊死またはアポトーシスを起こすときに、濃度が非常に急速に減少するため、細胞生存率についてのマーカーである。ヒトＮＣＩ−Ｈ７１６またはＨｅｐＧ２細胞（１×１０４）を９６ウェルプレートに播種し、１ｎＭ〜３００μＭの化合物１０による１０倍希釈で３７℃にて４時間刺激した。プレートを室温で１０分間平衡化させ、１００μｌのＡＴＰ−Ｌｉｔｅ１ＳＴＥＰ試薬を、細胞を含有する１００μｌの培地に加えた。発光をＶｉｃｔｏｒ  Ｌｉｇｈｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。実験シグナルを、バックグラウンドから差し引いた。タモキシフェンを細胞毒性の陽性対照として使用し、一方未処理細胞は陰性対照の機能を果たした。結果を図４および５に示す。
【０１１７】
（実施例３）
食餌誘発性肥満症マウスモデルにおける本発明の化合物の代謝活性
研究のゴールは、ＴＧＲ５アゴニスト（オレアノール酸（ＯＡ）または本発明の化合物（例えば、「試験化合物」））が、肥満症および関連するインスリン抵抗性の発生をインビボで修正するかを明らかにすることである。この可能性を試験するために、事前に１０週間高脂肪食に供した雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに、食物投与によってＯＡ／試験化合物を１６週間投与する。
【０１１８】
ＩＩ−プロトコル
前の研究において、ＯＡは、食物嫌悪をもたらさない選択的ＴＧＲ５アゴニストとして観察された。しかし、１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量のＯＡで処理した動物は、毒性のいくつかの徴候を示した一方、より低い用量は耐容性良好であった。したがって、この研究において、ＯＡは５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する。
【０１１９】
インビトロ研究において、本発明の化合物を強力および選択的なＴＧＲ５リガンドとして同定した。約５０分の１の低い濃度で投与する本発明の化合物について、毒性の問題は予想されない。
【０１２０】
この研究のために、４８匹の雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス（５週齢）を、２つの群に分ける。１０週間の期間、２４匹（１、２および３群）の動物の１群は固形飼料食を摂取し、一方、他の２４匹の群は高脂肪食を摂取する（４、５および６群）。次いで、１６週間の期間、動物を分析する。１０匹の動物の５群を、下記のように割り当てる。
１：固形飼料食
２：固形飼料食＋ＯＡ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）
３：固形飼料食＋試験化合物（例えば、３０ｍｇ／ｋｇ／日）
４：高脂肪食
５：高脂肪食＋ＯＡ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）
６：高脂肪食＋試験化合物（例えば、３０ｍｇ／ｋｇ／日）
全研究の間に、体重および食物摂取を週に２回モニターする。
第２週：全ての群について、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｄｅｘａスキャン）によって体組成を分析する。
第１週：トランスアミナーゼ、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清レベルを、全ての群において１２時間の絶食期間の後に測定し、次いでマウスに示したような食事を供する（０日目）。
第２週：トランスアミナーゼ、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清レベルを、全ての群において１２時間の絶食期間の後に測定する（１４日目）。
第４週：全ての動物を腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）に供することによって、耐糖能を決定する。動物は、この試験の前に１２時間絶食させる。
１、４、５および６群（固形飼料食、高脂肪食および高脂肪食ＯＡ／試験化合物）の夜間のエネルギー支出を、間接熱量測定によって測定する。
第８週：全ての群について、ｄｅｘａスキャンによって体重組成を再び分析する。
トランスアミナーゼ、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃおよびインスリンの血清レベルを、全ての群において１２時間の絶食期間の後に測定する（５６日目）。
第９週：４、５および６群（高脂肪食摂食マウス）の概日活動を、３０時間の期間研究する。
第１０週：血圧および心拍数の測定を、４、５および６群に行う。
第１１週：全ての動物の直腸の温度を、１０：００ａｍに室温で測定する。
概日活動の測定を、１、２、３および４群について行う。
第１２週：４、５および６群に腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行うことによって、耐糖能を分析する。ＩＰＧＴＴの間、血液をまた集め、インスリンレベルを分析する。これらの試験の前に動物を１２時間絶食させる。
全ての群において、２４時間の期間に亘り糞便を集め、糞便の脂質含量を、測定する。
第１６週：全ての動物において、４℃に曝した動物の体温を測定することによって、寒冷試験を行う。
【０１２１】
３日後、動物を屠殺する。屠殺時に、血液を集め、血漿脂質（ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬ−Ｃ、ＦＦＡ）；肝機能（ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、アルカリＰａｓｅ、γ−ＧＴ）；グルコースおよびインスリン；血漿の選択した群のリポタンパク質プロファイルについて分析する（サイズ排除クロマトグラフィー）。
【０１２２】
肝臓、小腸、脂肪組織（ＷＡＴおよびＢＡＴ）、膵臓、心臓および筋肉を集め、秤量し、標準的組織学的検査（ＨＥ染色、コハク酸デヒドロゲナーゼ染色、オイルレッド−Ｏ染色および細胞形態）；組織脂質含量；ミトコンドリアを分析するためのＢＡＴおよび筋肉に対する電子顕微鏡検査；定量的ＲＴ−ＰＣＲによる代謝およびエネルギー恒常性に関与する選択した遺伝子の発現研究のためのＲＮＡ単離；対象タンパク質（例えば、ＰＧＣ−１α）のアセチル化などの翻訳後修飾の研究のためのタンパク質抽出を含めたさらなる分析のために保存する。
【０１２３】
ＩＩＩ−詳細な手順
Ａ−動物手順および食事
動物の収容および取扱い
マウスは、欧州共同体の基準によって、温度（２０〜２２℃）および湿度を制御した動物飼養場中で、１２時間：１２時間（７：００に点灯）の明暗サイクルで、特定の無菌条件において群で収容する（５匹の動物／ケージ）。動物に水および食物を自由に摂取させる。
【０１２４】
飲料水
水道水の化学組成を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄ’Ｈｙｄｒｏｌｏｇｉｅ、ＵＬＰ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇにおいて、定期的に分析し、潜在的な有毒物質がないことを確認する。飲料水をＨＣｌおよびＨＣｌＯ４で処理し、ｐＨを５〜５．５に、および塩素濃度を５〜６ｐｐｍに維持する。
【０１２５】
食事
標準的げっ歯類用固形飼料食はＵＡＲから入手し、高脂肪食はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔから入手する。マウスに、固形飼料食（１６％タンパク質、３％脂肪、５％繊維、５％灰分）、または高脂肪食（２０％タンパク質、２０％炭水化物、６０％脂肪）を摂食させる。オレアノール酸および試験化合物を、粉末状固形飼料食または粉末状高脂肪食と下記の割合で混合した。５０ｍｇ／ｋｇ／日処理について０．５ｇのＯＡ／ｋｇ（食物）、および１０ｍｇ／ｋｇ／日処理について０．０８ｇの試験化合物／ｋｇ（食物）。次いで、ペレットを再構成する。対照群は、試験化合物またはＯＡなしで食物ペレットを摂取する。高脂肪食の粘稠性によって、ＯＡとの混合において水は加えない。再構成することがより難しい固形飼料食の場合、最少量の水を粉末に加え、ペレットを再構成し、それを次いで空気乾燥させる。新しいバッチの食物を毎週調製する。
【０１２６】
採血
麻酔下で後眼窩洞から、または尾静脈から血液を集める。
【０１２７】
麻酔
ｄｅｘａスキャニング実験のために、動物を腹腔内注射によって投与したケタミン（２００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（Ｘｙｌａｓｉｎｅ）（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔する。静脈穿刺のために、動物をイソフルラン−Ｏ２混合物の吸入によって麻酔する。
【０１２８】
Ｂ−生化学
試験は、市販の試薬（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用してＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ−４００自動化実験室ワークステーションで行う。
【０１２９】
脂質およびリポタンパク質の分析
酵素アッセイによって、血清トリグリセリド、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールを決定する。血清ＨＤＬコレステロール含量は、リンタングステン酸／Ｍｇ（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるａｐｏ  Ｂ−含有リポタンパク質の沈殿後に決定する。遊離脂肪酸レベルは、和光純薬（例えば、Ｎｅｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのキットによって供給者によって明記されているように決定する。
【０１３０】
代謝および内分泌の調査
血液グルコース濃度を、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  Ｐｒｅｃｉｓ電極（例えば、Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を使用してＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄ分析器（例えば、Ｍｅｄｉｓｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）によって測定する。この方法は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄ分析器の値を古典的なグルコース測定と比較することによって検証する。最少量の血液を必要とし、したがってＩＰＧＴＴの間など複数の測定のために用いることができるため、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｑ．Ｉ．Ｄ法を選択した。血漿インスリン（例えば、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、メーカーの仕様書に従ってＥＬＩＳＡによって決定する。
【０１３１】
Ｃ−代謝試験
リポタンパク質プロファイル
リポタンパク質プロファイルは、３種の主要なリポタンパク質のクラスであるＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬの分離を可能にする高速タンパク質液体クロマトグラフィーから得る。
腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）−経口グルコース負荷試験
ＩＰＧＴＴは、一晩（１２時間）絶食したマウスで行う。マウスに、無菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中の２０％グルコースの溶液を、２ｇグルコース／ｋｇ体重の用量で腹腔内（ＩＰＧＴＴ）に注射する。グルコースおよびインスリンのモニターのために、グルコース溶液の投与前および投与の１５分、３０分、４５分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分後に、血液を尾静脈から集める。グルコース上昇曲線下面積を、インスリン感受性の尺度として計算する。一方、相当するインスリンレベルは、インスリン分泌貯蔵を示す。
【０１３２】
エネルギー支出
エネルギー支出を、Ｏｘｙｍａｘ装置（例えば、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）で１２時間の間の酸素消費を測定することによって間接熱量測定によって評価する。このシステムは、オープンサーキットからなり、空気がプラスチックケージを出入りする（ケージ毎に１匹のマウス）。動物に食物および水を自由に摂取させる。非常に正確なＣＯ２およびＯ２センサーによって、両方の空気量におけるＯ２およびＣＯ２濃度の差異を測定し、これによって、ケージに入ってくる空気の気流が一定である場合の、一定の期間において消費された酸素量を得る。装置から出力されるデータを連結したコンピューターで処理し、分析し、エクスポート可能なＥｘｃｅｌファイルで示す。値は、ＶＯ２として通常公知であるｍｌ．ｋｇ−１．ｈ−１として表す。
【０１３３】
Ｄｅｘａスキャニングによる体脂肪含量の決定
Ｄｅｘａ分析は、超高分解能ＰＩＸＩＭＵＳシリーズデンシトメーター（０．１８×０．１８ｍｍピクセル、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって行う。骨塩密度（ＢＭＤ、ｇ／ｃｍ２）および体組成は、ＰＩＸＩＭＵＳソフトウェア（バージョン１．４ｘ、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって決定する。
【０１３４】
Ｄ−非侵襲性血圧測定および脈拍
Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  ＢＰ−２０００血圧分析システムは、オペレーターの介入なしに４匹の覚醒しているマウスに対して同時に複数の測定をするために使用するコンピューターによる自動化されたテイルカフ（ｔａｉｌ’ｃｕｆｆ）システムである。マウスを加熱したプラットフォーム上の個々の暗いチャンバー中に収容し、それらの尾をテイルカフに通す。システムは、カフ圧力を決定することによって血圧を測定し、そこでは尾への血流が除去される。光電センサーによって、標本の脈拍を検出する。システムは、頸動脈において同時に測定される平均動脈内圧力と密接に一致することが示されてきた結果をもたらす。これによって、収縮期血圧および心拍数の再現性のある値を得ることが可能となる。これは、システム中での１週間の動物の訓練を必要とする。
【０１３５】
Ｅ−概日活動
自発的運動活性は、各々がスライディングフロア、取り外し可能なケージで構成され、移動性の運動活性および後ろ足で立つことを測定することを可能にする赤外線キャプターを備えた個々の箱を使用して測定する。電子インターフェース（例えば、Ｉｍｅｔｒｏｎｉｃ、Ｐｅｓｓａｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、箱をコンピューターに連結する。装置への慣れ、ならびに夜間および昼間の活動を測定するために、マウスを３２時間試験する。消費した水の含量を、自動式リックメーターを使用して試験期間の間に測定する。
【０１３６】
（実施例４）
物理化学的性質
水溶性
固体ＢＡを、５ｍｌのＨＣｌ（０．１Ｍ）に懸濁させた。１週間のインキュベーションおよび穏やかな混合後、飽和溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．２２μｐｍ）で濾過し、ＢＡの濃度を、Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２ｍｍ、皮内、４μｍ）および移動相（１５ｍＭの酢酸（ｐＨ５）およびアセトニトリルを含有する水）を使用して、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。流量は１５０μｌ／分であった。質量分析の取得は、負のイオン化のＥＳＩ源を使用して多段反応モニタリングモードで行った。水溶性は、μｍｏｌ／リットルとして表した。
【０１３７】
水溶性を、カルボキシル化された胆汁酸の不溶性プロトン化種についてｐＨ１で測定した。化合物１０の水溶性は、１２０μＭであった（表２を参照されたい）。
【０１３８】
化合物１０において１個のヒドロキシルの異なる位置（１６位）は、従来の３，７，１２トリヒドロキシ胆汁酸コール酸に関して溶解性を減少させた。水溶性はｐＨを増加させることによって増加し、ｐＨ７で化合物１０は高水溶性であった。表２におけるデータは、カルボキシル化された類似体である化合物１０が、その酸形態で投与されたときに、胃内容物中において低ｐＨで不溶性であり、十二指腸中に排出されると膵液および十二指腸液のより高いｐＨによって、溶解して塩（アニオン）を形成することを示す。胆汁中で、この化合物は溶液中に残り、最終的に高濃度でミセルを形成する。
【０１３９】
【表２】
0005639073.tif 000031
ａＷｓ：水溶性とはプロトン化種としてのＢＡを意味し、したがって高度に可溶性（ｈｓ）であるＴＣＤＣＡおよびＴＵＤＣＡについて評価しない。
ｂＣＭＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液中で決定した臨界ミセル濃度。
ｃＳＴＣＭＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液中のＣＭＣでの表面張力。
ｄＬｏｇＰＡ：イオン化種として研究した胆汁酸の１−オクタノール−水分配係数。
＊：文献からの値。
【０１４０】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
界面活性、すなわちミセルを形成する傾向を、ナトリウム塩として水中で可溶性である全ての荷電分子について評価した（ｐＫａまで２単位）。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、静的方法と同様に、潜在的な不純物によって僅かに影響される表面張力値を与える最大気泡圧力法を使用して、表面張力（ＳＴ）測定によって決定した。張力計は、窒素源と連結した２本のガラス製プローブ（０．５ｍｍおよび４．０ｍｍの直径）を備えたＳｅｎｓａｄｙｎｅ６０００（Ｃｈｅｍ−Ｄｙｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）であった。気泡の発生頻度は、２６℃にて蒸留水中で１気泡／秒であり（Ｐ＝２．７ａｔｍ）、較正を再蒸留水およびメタノールで行った。ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）中のＢＡナトリウム塩溶液の表面張力を、０．１０〜５０ｍＭの範囲内で様々な濃度で測定した。表面張力値は、胆汁酸塩濃度の対数に対してプロットした。曲線の２つの部分（単量体およびミセル相）に相当する回帰線を、最小二乗法を使用して計算し、線の交差点をＣＭＣ値として取った。ＳＴ対濃度曲線から、ＣＭＣにおける表面張力の値（単量体および多量体種の間の平衡）をまた計算し、関連する表面張力低下能力を有するミセルのサイズと関連する界面活性力についての情報を得た。
【０１４１】
ＣＭＣは、非平衡条件、すなわち不純物が表面張力の結果に僅かに影響する条件において表面張力測定によって評価した（図６）。表２は結果を示す。化合物１０は、低い表面張力低下能力を伴う高ＣＭＣを示したが、これはこの化合物が穏やかな界面活性剤であり、ミセルは非常に低い凝集数を有することを示した。Ｃ−１６ベータ位におけるヒドロキシル基の存在は、ミセルを形成させる尾部間相互作用に関与する疎水性領域を減少させ、したがって、ミセルは小さく乏しい界面活性剤である。この特性は、所与の体液または器官において蓄積されたときに、分子に低毒性を与える。
【０１４２】
オクタノール／水分配係数
カルボキシル基の完全なイオン化を確実にするために、イオン化形態の分子についてオクタノール／水分配係数を測定し、したがってカルボキシ類似体を相対的に高ｐＨ（８から９）で研究した。１−オクタノール／水分配係数（ｌｏｇ  Ｐ）を、従来の振盪フラスコ手順を使用して評価した。実験は、０．１Ｍのリン酸緩衝液によってｐＨ８で緩衝化した０．１ｍＭの胆汁酸塩溶液で行い、ＢＡの完全なイオン化を確実にした。ｌｏｇ  Ｐ値は、プロトン化種ではなくイオン化形態のＢＡを意味し、各ＢＡの最初の濃度は、それ自体のＣＭＣ値より低かった。水性緩衝液は事前に１−オクタノールで事前飽和させ、水で事前飽和させた５ｍｌの１−オクタノールを次いで加え、試料を連続撹拌しながら室温で２週間平衡化させた。遠心分離後、２つの相を注意深く分離した。水相中のＢＡ濃度は、Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２ｍｍ、皮内、４μｍ）および、移動相として、１５ｍＭの酢酸（ｐＨ５）およびアセトニトリルを含有する水を使用して、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで測定した。流量は１５０μａｌ／分であり、カラムを４５℃に維持した。質量分析取得は、負のイオン化のＥＳＩ源を使用して多段反応モニタリングモードで行った。
【０１４３】
表２は結果を示す。３α、７αおよび１６β位において３個のヒドロキシル基を有するカルボキシル化された化合物１０は、Ｃ−６位におけるエチルの存在によって、天然類似体ＣＡに対して僅かにより高い親油性を示した。１２−アルファ位が界面活性特性において主要な役割を果たしていないようであることを考慮すれば、１６−ベータヒドロキシル基の普通でない位置によって差異がある可能性が高い。
【０１４４】
アルブミン結合
アルブミン結合の程度を、固定したＢＡ−アルブミン比で平衡透析によって評価した。各ＢＡを１００μＭの濃度で５％ウシ血清アルブミン−食塩溶液（ｐＨ７．２）に溶解させ、２５℃で２４時間静置した。２ミリリットルのこの溶液を、２５ｍｌの食塩溶液に対して１２，０００〜１４，０００ダルトンの分画分子量を有するセルロースサック中で透析した。２５℃にて７２時間の穏やかな撹拌によって系を平衡化させた。透析した溶液（遊離の非結合画分に相当する）および開始溶液のＢＡ濃度を、前の分析と同じ条件でＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。
【０１４５】
アルブミン結合の割合を、当初のＢＡ濃度からおよび透析した画分中の非結合濃度から計算した。データを、表２に報告する。
【０１４６】
化合物１０の結合割合は、側鎖におけるメチル基の結果として、ＣＡよりも高い。化合物１０は、天然ＢＡと同様に、相対的に速い肝臓取込みと適合するアルブミン結合を示す。
【０１４７】
（実施例５）
ヒト糞便培養物中のインビトロの代謝安定性
腸内細菌に対する安定性
７ａ−脱ヒドロキシル化
ホモジナイズした新鮮なヒト糞便（５００ｍｇ）を、無菌バイアルに移し、それに５ｍＬの殺菌した肉の細切れ−グルコース培地（Ｓｃｏｔｔ  Ｌａｂ．、Ｆｉｓｋｖｉｌｌｅ、ＲＩ）を加えた。次いで、ＢＡを０．０５ｍＭの最終濃度で加えた。バイアルを３７℃でインキュベートし、次いでＢＡの添加の０時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後および２４時間後に、１５０μＬの３０％ＫＯＨによって反応を停止させた。試料を、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清から、ＢＡをＣ−１８固相抽出によって単離し、ＴＬＣおよびＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１４８】
シリカゲルの０．２５ｍｍ厚さのプレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、第１のスクリーニング試験として用いた。抱合ＢＡの分離のために使用した溶媒系は、プロピオン酸／酢酸イソアミル／水／Ｎ−プロパノール（３：４：１：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；溶媒Ｉ）からなり、非抱合ＢＡの溶媒系は、酢酸／四塩化炭素／イソプロピルエーテル／酢酸イソアミル／水／Ｎ−プロパノール／ベンゼン（１：４：６：８：２：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；溶媒ＩＩ）であった。分離したＢＡが、５％ホスホモリブデン酸エタノール溶液と共に示された。
【０１４９】
化合物１０は、ヒト糞便培養物中でインキュベートされたときに非常に安定的であり、２４時間後でさえ、化合物の８５％超は無修飾で回収された。これに反して、参照天然類似体ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）はほぼ１時間の半減期時間を示し、８時間のインキュベーション後に、殆ど完全に代謝（７−脱ヒドロキシル化）され、リトコール酸を形成した。また、長時間のインキュベーション後、７−オキソ誘導体の７−脱ヒドロキシル化および中間体形成は実際に消失した。
【０１５０】
側鎖の安定性
第１の結果によると、側鎖は、腸内細菌酵素活性によって修飾されなかった。これらのデータは、Ｃ−６位におけるエチル基の存在が、立体障害によって、酸化または除去に対して７−ヒドロキシル基を保護していることを示唆する。さらに、化合物１０はまた、側鎖代謝について非常に安定的である。
【０１５１】
（実施例６）
胆汁瘻ラットにおける十二指腸（皮内）および大腿部（静脈内）投与後の化合物１０の胆汁分泌および代謝
目的および原理
新規のＢＡ類似体の構造的修飾は、それらの肝臓取込み、肝臓の輸送および分泌および腸管吸収に影響する可能性がある。したがって、静脈内および皮内投与の両方の後の胆汁分泌に関する知識は、それらの代謝に関する知識と共に、さらなる研究のための候補選択における要点である。
【０１５２】
腸管吸収の機序および効率性を評価するために、化合物１０を、同じ用量で静脈内（大腿部注入）および経口的（十二指腸注入）の両方で投与し、その胆汁分泌速度を胆汁瘻ラットモデルにおいて評価した。胆汁生成に対する胆汁分泌作用をまた評価した。静脈内および皮内投与の間の時間に対する胆汁分泌の曲線下面積（ＡＵＣ）における差異は、その腸管吸収を説明し、そのバイオアベイラビリティーについての情報を与える。さらに、肝臓および腸の代謝はまた非常に異なる可能性があり、したがって、化合物１０およびその主要な（腸管の）肝代謝物の胆汁分泌を決定した。
【０１５３】
胆汁分泌作用
−十二指腸注入
胆汁瘻ラットモデルは、ボローニャ大学実験室施設で発育した。化合物を、ラット群に十二指腸注入（皮内）によって１μｍｏｌ／ｋｇ／分の用量で投与した（１時間の注入）。ラットは、注入の前および間に異なる時間で胆汁試料を集める胆汁瘻を有する。十二指腸注入実験のために、６匹のラット（２５０±１０ｇ）を処理した。胆汁試料を１５分毎に４時間集めた。さらに、３匹の対照ラットを、時間およびサンプリングについて同じ条件下にて食塩溶液で処理した（十二指腸対照ラット）。
【０１５４】
図７は、試料捕集の間の胆汁流を示す（１匹の動物）。十二指腸注入は、３０分のベースライン胆汁収集の後に開始し、１時間続ける。化合物１０は胆汁分泌促進性ではなく、胆汁流は、対照群と同様である。
【０１５５】
−静脈内注入
大腿部注入実験のために、６匹のラット（体重２５０±１０ｇ）を、１μｍｏｌ／分／ｋｇにて化合物１０で処理した。図８は、研究の間の胆汁流を示す。大腿部注入は、７５分の定常状態の後に開始し、６０分間続ける。胆汁試料を１５分毎に４時間集めた。さらに、時間およびサンプリングについて同じ条件下で３匹のラットを食塩溶液で処理した（大腿部対照ラット）。
【０１５６】
３％ＢＳＡ食塩水ビヒクル（対照、ｎ＝１）の静脈への注入の間の胆汁流は、実験の全期間に４０〜８０μＬ／分／ｋｇの範囲の値を維持した。図８は、参照化合物としてＣＤＣＡの静脈への注入後の胆汁流を報告する。対照実験に対して有意差は観察されず、最大流量は対照ケースよりほんの僅かに高かった（８０対７０μＬ／分／ｋｇ）。
【０１５７】
投与された類似体の胆汁分泌
静脈内および皮内実験の間に集めた胆汁試料を分析し、投与された類似体およびその代謝物の胆汁分泌を決定した。ＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ分析：各化合物の純粋な結晶性粉末は、ペルージャのＲ．Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉの試験施設から入手した。メタノール中のストック溶液（１ｍｍｏｌ／Ｌ）（化合物１０（３５０μｍｏｌ／Ｌ）を除く）を調製し、処理用溶液は、適当な容量の一次溶液を希釈することによって調製した。メタノールおよびアセトニトリル（ａｃｅｔｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）は、ＨＰＬＣグレードの純度のものであった。アンモニアは３０％、酢酸は９９．８％であった。全ての試薬は、Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  Ｒｅａｇｅｎｔｓから入手した。ＨＰＬＣグレードの水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムによって調製した。
【０１５８】
試料の調製
ラット胆汁試料を室温にし、短時間撹拌し、１５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）：アセトニトリル＝７０：３０（ｖ／ｖ）で１：１００ｖ／ｖ（十二指腸注入からの胆汁試料）および１：１００または１：２００ｖ／ｖ（大腿部注入からの胆汁試料）に希釈した。最終溶液をオートサンプラーバイアル中に移し、１０μＬをクロマトグラフィーカラム中に注入した。
【０１５９】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法
ラット胆汁試料は、負のイオン化モードのエレクトロスプレー（ＥＳＩ）源を使用して、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。液体クロマトグラフィーのために、オートサンプラーと連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５分離モジュールを使用した。オートサンプラーを７℃に維持した。ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  ＯＤＳ、４×２．０ｍｍ、皮内、プレカラムによって保護されているＳｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  Ｃ１８カラム（１５０×２．０ｍｍ、皮内、４μｍの粒径）（両方ともＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘから供給されている）上で分離を行った。１５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝５．００）を移動相Ａとして、アセトニトリルを移動相Ｂとして使用して、分析物を溶出させた。移動相Ｂを３０％から６４％に１０分で増加させ、次いで１０分で１００％にし、１０分間一定に保った。流量は１５０μＬ／分であり、カラムは４５℃に維持した。カラム流出液を、多段反応モニタリング（ＭＲＭ）取得モードで作動するトリプル四重極質量分析計（Ｑｕａｔｔｒｏ−ＬＣ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に連結しているＥＳＩ源に導入した。窒素を、９０Ｌ／時間の流量でネブライザーガスとして、および９３０Ｌ／時間で脱溶媒和ガスとして使用した。イオン源遮断および脱溶媒和温度を、各々８０℃および１８０℃に設定した。キャピラリー電圧は３．０ｋＶであった。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．０を、データ収集および処理のために使用した。さらに、シングルＭＳまたはタンデムＭＳ／ＭＳ配置の両方における質量分析法を使用して実験を行い、代謝物を同定した。
【０１６０】
定量化
５点検量線を毎日調製し、２連で注入した。較正試料は、移動相中で調製する０．１〜２５μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲内で得た。線形検量線パラメーターは、最小二乗回帰分析を使用して、分析物ピーク面積対分析物濃度のプロットから得た（重量＝１／ｘ２）。相関係数は、≧０．９８９であった。
投与された類似体の薬物動態（胆汁分泌）：静脈内対皮内の比較
データは、１μｍｏｌ／Ｋｇ／分の用量での十二指腸のおよび大腿部注入の後に、胆汁中にそれ自体として回収された類似体の分泌速度を意味する。主要および微量な代謝物を、後で報告する。
【０１６１】
表３は、十二指腸注入（１時間、７５分〜１３５分の範囲）の間に集めたラット胆汁試料から得た化合物１０についての濃度および分泌値を示す。
【０１６２】
【表３】
0005639073.tif 000032
表４は、大腿部注入（１時間、７５分〜１３５分の範囲）の間に集めたラット胆汁試料から得た化合物１０の濃度および分泌値を示す。
【０１６３】
【表４】
0005639073.tif 000033
ａ−：計算せず    ｂ  ｎ．ｄ．：検出せず
静脈への注入後の化合物１０の胆汁分泌は効率的ではなく、最大分泌速度は低い（図９）。化合物は代謝され、タウリン抱合体を形成し、これはその回収を僅かに改善する一因となる。皮内投与後の胆汁分泌は静脈内実験より非常に低く、これは分子の乏しい腸管吸収を示唆する。
【０１６４】
肝代謝
化合物１０は、天然ＢＡのように肝代謝を受ける。静脈内投与後、胆汁中にそれ自体としておよび主としてタウリンと抱合して分泌される。ラクトンおよびモノグルクロニド代謝物などの微量な代謝物がまた見出された。皮内投与後、分子はそれ自体として回収され、主として代謝され、タウリン抱合体を形成する。図１０ａ：静脈内実験における質量分析法を使用した胆汁中で同定された化合物１０およびその主要な代謝物。データは絶対面積値として報告する。
図１０ｂ：図１０ａの拡大表示。
図１０ｃ：実験において質量分析法を使用して胆汁において同定された化合物１０およびその主要な代謝物。データを絶対面積値として報告する。
【０１６５】
化合物１０は、低い界面活性を伴って、中程度に親水性である。肝臓取込みは効率的であり、腸管吸収もまた効率的である。化合物は、胆汁中にそれ自体として、および主としてタウリン抱合体として分泌され、胆汁における回収はほぼ完全である。
【０１６６】
（実施例７）
ＨｅｐＧ２細胞に対するインビトロの毒性
本発明の化合物を、ＨｅｐＧ２細胞アッセイを使用してインビトロの毒性について評価した。ＡＴＰ減少をモニターすることによってＨｅｐＧ２細胞の細胞毒性を決定し、カスパーゼ−３活性化をモニターすることによってＨｅｐＧ２細胞アポトーシスを決定した。結果を表５に示す。
【０１６７】
細胞毒性
細胞生存率を、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ＡＴＰ−Ｌｉｔｅ１ＳＴＥＰを使用して測定した。ＡＴＰは、全ての代謝的に活性な細胞において存在し、細胞が壊死またはアポトーシスを起こすときに非常に急速に濃度が減少するため、細胞生存率についてのマーカーである。ヒトＮＣＩ−Ｈ７１６またはＨｅｐＧ２細胞（１×１０４）を９６ウェルプレートに播種し、１ｎＭ〜３００μＭの化合物１０を１０倍希釈で３７℃にて４時間刺激した。プレートを室温で１０分間平衡化させ、１００μｌのＡＴＰ−Ｌｉｔｅ１ＳＴＥＰ試薬を、細胞を含有する１００μｌの培地に加えた。発光を、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｌｉｇｈｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｒ）で読み取った。実験シグナルを、バックグラウンドから差し引いた。タモキシフェンを細胞毒性の陽性対照として使用し、一方陰性対照は非処理細胞であった。
【０１６８】
アポトーシス
カスパーゼは、アポトーシスの分子制御に関与し、ＴｒｕＰｏｉｎｔカスパーゼ−３基質は、カスパーゼ−３活性の感受性で強固で均一な時間分解蛍光アッセイを可能にする。ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）を、ピルビン酸ナトリウムを有さないＨｅｐＧ２培地と共に９６ウェルプレートに播種した（１×１０４）。１ｎＭ〜３００μＭの試験化合物の段階希釈によって、３連で細胞を３７℃で４時間刺激した。スタウロスポリンを、アポトーシス細胞の陽性対照として使用した。陰性対照は、１．無刺激細胞；２．細胞を含まない培地単独；３．カスパーゼ基質を有さずにインキュベートした細胞であった。溶解緩衝液およびカスパーゼ−３基質を細胞に加え、１時間および２４時間後、ＥｎＶｉｓｉｏｎで蛍光を測定した。
【０１６９】
壊死
ＰｒｏｍｅｇａのＣｙｔｏＴｏｘ  ＯＮＥ均質膜完全性アッセイを使用して壊死細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔａｔｏ  ＤｅＨｙｄｒｏｘｅｇｅｎａｓｅ）（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、細胞壊死を分析した。ヒト肝細胞（１×１０４）を９６ウェルプレート中に播種した。１８時間のインキュベーション後、ピルビン酸ナトリウムを有さない新鮮な培地および無血清を置き換え、化合物１０を０．１μＭ〜５００μＭの用量反応で加えた。Ｔｒｉｔｏｎ（１％）を、最大ＬＤＨ放出対照として使用した。タモキシフェンを、壊死誘導物質として使用した。蒔いた細胞を、インキュベーター中にさらに４時間戻した。上清を新しいプレートに移し、同じ用量のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ試薬をプレートに加えた。１時間のインキュベーション後、蛍光をＥｎＶｉｓｉｏｎ多標識プレートリーダーによって５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で読み取った。
【０１７０】
【表５】
0005639073.tif 000034
ｎ．ｄ．：検出せず。
【０１７１】
（実施例８）
ＮＲ選択性アッセイ
本発明の化合物の選択性を、当技術分野において公知のアッセイ方法を使用して評価した。具体的には、下記のアッセイ法を使用した。
ＦＸＲおよびＬＸＲ：コアクチベーターのリクルート作用（ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）
ＴＧＲ５：ヒト腸細胞系（ＮＣＩ−Ｈ７１６）上のｃＡＭＰレベル
ＰＸＲ：リガンド競合アッセイ（結合アッセイ）
ＣＡＲ：コアクチベーターのリクルート作用（Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ）
表６は、これらのアッセイの結果を示す。
【０１７２】
ＴＲ−ＦＲＥＴコアクチベーターアッセイ
Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、核内受容体選択性アッセイのために使用した。キットは、テルビウム標識抗ＧＳＴ抗体、フルオレセイン標識コアクチベーターペプチド、および均一なミックス−アンド−リードアッセイフォーマット中のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によってタグを付けられたＮＲリガンド結合ドメインを使用する。アッセイは、３８４マイクロウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で行った。２０μｌの総アッセイ反応物には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給されたアッセイ緩衝液中の５ｎＭのＧＳＴ標識したＮＲ、１２５ｎＭのコレギュレーターペプチド、５ｎＭのＴＢ−抗ＧＳＴ標識した抗体（テルビウム−抗グルタチオンＳトランスフェラーゼ標識）、５ｍＭのＤＴＴおよび様々な濃度の化合物１０が含まれた。陰性対照は化合物１０を欠いていたが、アゴニストウェル中に含有されるその他の全てを含有した。暗中での１時間のインキュベーションに続いて、ＴＲ−ＦＲＥＴ測定をＥｎｖｉｓｉｏｎ中で行った。放出率５２０／４９５を、様々なリガンド濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用し、可変の勾配を有するＳ字状曲線式を使用してデータを分析し、ＥＣ５０値を得た。
【０１７３】
【表６】
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他の実施形態
本発明をその詳細な記載と併せて記載してきたが、上記の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図し、限定することを意図しない。他の態様、利点、および変形形態は、下記の特許請求の範囲内である。添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変化をその中で行い得ることは当業者であれば理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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