(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする、アディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択方法。
（Ａ）被験物質を実験動物に投与する工程
（Ｂ）実験動物に睡眠障害を負荷する工程
（Ｃ）血液中のアディポネクチン濃度を測定し、その変化を評価する工程
【請求項２】
睡眠障害の負荷がレム睡眠阻害である請求項１記載の方法。
【請求項３】
レム睡眠阻害がプラットホーム法による睡眠阻害である請求項２記載の方法。
【請求項４】
実験動物がラット又はマウスである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチン(adiponectin)は、主に脂肪細胞から分泌される因子（アディポカイン）であるが、近年インスリン抵抗性改善作用や抗動脈硬化作用があることが報告されている（非特許文献１）。アディポネクチン以外のアディポカインとして、TNF-α、レジスチン、遊離脂肪酸などが知られているが、これらはいずれもインスリン抵抗性を惹起することが明らかとなっている。アディポネクチンは多くのアディポカインとは異なりインスリン抵抗性を改善する善玉アディポカインであることから、最近、非常に注目されている。
【０００３】
アディポネクチンはその作用だけではなく、血中アディポネクチン量の低下が糖尿病発症の予知マーカーになることも臨床データとして示されている（非特許文献２）。また、血中アディポネクチン量は肥満度と逆相関を示すことが報告されており（非特許文献３）、肥満によるインスリン抵抗性、糖尿病、循環器疾患の発症、増悪においてアディポネクチンの低下が重要な役割を果たしていると推察されている。従って、アディポネクチンの分泌を促進する物質は、これら各疾病の予防・改善に有用であると考えられている。
【０００４】
アディポネクチン発現量を評価するin vitro 試験系はいくつか確立されており、例えば、脂肪前駆細胞株である3T3-L1細胞を分化させた系を用いて、TNF-α(tumor necrosis factor α)、insulin、dexamethasonなどの添加でアディポネクチン発現量が低下することが報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
また、腹部の手術の際に摘出された脂肪細胞を用いた試験系でもアディポネクチン発現量が評価されている（非特許文献５）。また、アディポネクチンのエンハンサーエレメントとレポータージーンを保持した細胞を用いることにより、アディポネクチン発現誘導剤のin vitroスクリーニングが可能であることも報告されている(特許文献１）。
【０００６】
一方、in vivoでの試験系では、KKAyマウス（非特許文献６）、db/dbマウス（非特許文献７）、ob/obマウス（非特許文献８）、C57BL/6マウス（非特許文献９）、Zucker fatty（非特許文献１０）などの肥満糖尿病モデル動物が、高脂肪食下で肥満、インスリン抵抗性、高中性脂肪血症などを起こし、肥満にともなって血中アディポネクチン量が低下することから、当該肥満糖尿病モデル動物を用いてアディポネクチン分泌能等が評価されている。
しかしながら、血中アディポネクチン量が低下するまでに高脂肪食下で少なくとも数週間飼育する必要があり、アディポネクチン分泌量の変化を評価するためには多大な時間を要するという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９４８６６号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kadowaki, T.et al.:J. Clin. Invest., 116:1784.1792 (2006).
【非特許文献２】Spranger, J. et al.: Lancet., 361:226-228 (2003).
【非特許文献３】Arita, Y. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 257:79-83 (1999).
【非特許文献４】Fasshauer. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 290:1084-1089 (2002).
【非特許文献５】Halleux, CM. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 288:1102-1107 (2001).
【非特許文献６】Tsuchida A et al.: Diabetes.; 54(12):3358-3370 (2005).
【非特許文献７】Fujita H et al.: Endocrine J.; 52:427-433 (2005).
【非特許文献８】Haluzik M et al.: Endocrinology .;145:3258-3264, (2004).
【非特許文献９】Araki K et al.: Hypertension.;48:51-57, (2006).
【非特許文献１０】Galisteo M et al.: J. Nutr. 135: 2399-2404, (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、in vivoで、アディポネクチン分泌調節剤を簡易且つ迅速に評価又は選択する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、動物を用いたスクリーニング系を検討したところ、意外にも睡眠障害モデルにおいて、血中アディポネクチン濃度が、睡眠障害負荷後、短期間で低下することを見出し、当該モデルを用いることによりアディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択が可能となることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記の１）〜４）に係るものである。
１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする、アディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択方法。
（Ａ）被験物質を実験動物に投与する工程
（Ｂ）実験動物に睡眠障害を負荷する工程
（Ｃ）血液中のアディポネクチン濃度を測定し、その変化を評価する工程
２）睡眠障害の負荷がレム睡眠阻害である上記１）の方法。
３）レム睡眠阻害がプラットホーム法による睡眠阻害である上記２）の方法。
４）実験動物がラット又はマウスである上記１）〜３）のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アディポネクチン分泌調節剤を簡易且つ迅速に評価又は選択することができる。従って、本発明は、糖質代謝異常、脂質代謝異常等の代謝異常症候群及びそれに起因する各種疾患の予防又は改善剤の簡易なスクリーニング法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】レム睡眠阻害による血漿アディポネクチンの低下を示すグラフ。*P<0.05(Dunnet検定、vs 休息群）
【図２】レム睡眠阻害による血漿アディポネクチン低下に対するクロロゲン酸の効果を示すグラフ。*P<0.05 (Fisher's PLSD検定)
【発明を実施するための形態】
【００１４】
後記実施例に示すとおり、睡眠障害を誘発した動物モデルにおいて、血中アディポネクチン濃度が睡眠障害負荷後、短期間で低下していた。そして、当該血中アディポネクチン濃度の低下が、アディポネクチン分泌促進作用を有すること（特開２００５−２３２０５９号公報）、in vivoでインスリン抵抗性改善効果、コレステロール及びトリグリセリド低下作用を有すること（Journal of Nutritional Biochemistry 13(2002),717-726）が報告されているクロロゲン酸の投与によって抑制された。従って、睡眠障害モデル系を用いることによりアディポネクチンの分泌を促進又は抑制するようなアディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択が可能である。
以下に、本発明のアディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択方法について説明する。
【００１５】
本発明において用いられる実験動物としては、睡眠障害のモデルとして使用可能な実験小動物であればよいが、例えばマウス、ラット、モルモット等げっ歯類であるのが好ましい。
【００１６】
本発明において、動物に付加される「睡眠障害」としては、睡眠の生体における意義を検討する目的で考案されている公知の睡眠障害方法によって誘発される睡眠障害が挙げられ、このうちレム睡眠を阻害するものが好ましい。
公知の睡眠障害方法としては、以下に示すような方法が挙げられるが、中でもプラットホーム法を用いるのが好ましい。
１）プラットホーム法（Youngblood BD et al. Physiol Behav. 67(5) 643-649,(1999)）プラットホーム法は、フラワーポット法とも呼ばれ、代表的な睡眠阻害方法である。
この方法は睡眠のなかでもレム睡眠を比較的特異的に阻害できる方法である。
この方法は、ケージの中に水を張り、実験動物がのることができる小さな円柱の台（プラットホーム）を設置するものである。動物はプラットホーム上で休むことができるが、レム睡眠に入ると筋肉が弛緩するため体勢が崩れ水面に体が触れることから、動物はノンレム睡眠をとることはできるが、レム睡眠をとることができない状態になる。
具体的には、直径6-7cmのステンレス製の円柱をラット飼育用アクリル樹脂性ケージに入れ、円柱の上部より1-2cm下まで水を張る。これに、250〜400gのラットを1匹ずつ入れ、飼育する。このときラットが餌と飲用水を自由に摂取することができるようにする。
【００１７】
２）トレッドミル又はディスク法（Guzman-Marin R et al. Eur J Neurosci. 22(8):2111-2116 (2005)、Everson CA et al. Am J Physiol Endocrinol Metab. 286:1060-1070 (2004).）。
この方法は、これはケージの中に、トレッドミル又は回転するディスクを入れておき、定期的にトレッドミルまたはディスクを稼動させることにより、睡眠を阻害する方法である。
【００１８】
３）飼育中に騒音を出して睡眠を阻害する方法（ Rabat A et al. Brain Res. 1059:82-92 (2005)）
この方法は、振動数が20-300ヘルツで強さが70-80デシベルの音を不定期にスピーカーより流し、睡眠を阻害するものである。
【００１９】
４）動物に対するハンドリングにより睡眠を阻害する方法（Toru M et al. Pharmacol Biochem Behav. 20(5):757-761 (1984)）
この方法は、動物が睡眠に入ろうとするときに手で触ることにより睡眠を阻害するものである。
【００２０】
睡眠障害負荷の期間は、睡眠障害の方法によっても異なり、通常１日〜５日程度であるが、プラットホーム法を用いた場合、血中アディポネクチン濃度の低下は、睡眠障害負荷後１日で有意に低下することから、１〜２日程度であればよい。
【００２１】
被験物質の投与時期は、目的に応じて適宜選択すれば良く、実験動物に睡眠障害を負荷する前でも後でもよく、或いは睡眠障害の負荷と並行して行うことでも良い。
投与方法は、経口投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、尾静脈投与、腹腔内投与等の何れでもよいが、好ましくは経口投与である。
【００２２】
血清または血漿中のアディポネクチンの測定は、ELISA(酵素抗体)法、ラジオイムノアッセイ法、ウエスタンブロッティング法などにより行うことができる。
具体的には、ラットadiponectin ELISAキット(AdipoGen社)等を用いて行うことができる。
【００２３】
以上より、血中のアディポネクチン濃度に基づき、アディポネクチンの分泌調節物質を評価又は選択することができるが、この場合、例えばその濃度が、被験物質を投与しない対照の濃度と比較して統計的に有意に高ければ、該被験物質をアディポネクチン分泌促進剤として評価又は選択することができる。
ここで、アディポネクチン分泌促進剤としては、アディポネクチンの発現を増強する等して、低アディポネクチン状態を改善する物質が挙げられる。斯かるアディポネクチン分泌促進剤は、低アディポネクチン状態によって引き起こされる疾患又は症状、例えば、低アディポネクチン血症、耐糖能障害、糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、糖尿病合併症、高血糖症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、脳血管障害、血管狭窄、末梢血管疾患、動脈瘤、高脂血症、高コレステロール血症、肥満等の予防、治療又は改善のための医薬品又は食品となり得るものである。
【実施例】
【００２４】
1．方法
ＳＤラット（♂、１０〜１１週齢）を体重が等しくなるように群分けした。ケージの中にラットが休息できる直径6.0cm高さ2.5cmの円柱プラットホームを設置し、プラットホームの1cm下まで水を張った。このケージで1〜4日間飼育（１匹/1ケージ）した。休息群は通常の床敷を入れたケージで飼育した（各群N=4）。クロロゲン酸を投与する実験では、30時間レム睡眠阻害のためのケージで飼育し、クロロゲン酸(5-CQA, sigma社)投与群は150mg/kg(300mg/kg/day)の用量で12時間毎に３回ゾンデによる経口投与を行った。コントロール群には蒸留水を投与し、休息群は通常の床敷を入れたケージで飼育し、蒸留水を投与した（各群N=6）。レム睡眠阻害終了後、直ちにフォーレン（大日本製薬）麻酔下で、腹大動脈より血液をベノジェクト真空採血管に採取し、得られたヘパリン血漿は使用まで-80℃で保存した。血漿アディポネクチンはラットadiponectin ELISAキット(AdipoGen社)により測定を行った。血漿はキット中の希釈バッファーで1000倍に希釈された後、キットプロトコールに従ってアディポネクチン濃度を測定した。
【００２５】
２．結果
（１）レム睡眠阻害が血漿アディポネクチンに与える影響
レム睡眠阻害1日後においてすでに血漿アディポネクチンは休息群に比べて有意に低下し、レム睡眠阻害2,4日後においても血漿アディポネクチンは休息群に比べて有意に低下した。しかしながら、血漿アディポネクチンの低下はレム睡眠阻害の期間には依存せずレム睡眠阻害1〜４日で低下の度合いは同等であった(図１)。
【００２６】
（２）レム睡眠阻害による血漿アディポネクチン低下に対するクロロゲン酸の効果
レム睡眠阻害により、血漿アディポネクチンは有意に低下し、レム睡眠阻害による血漿アディポネクチンの低下をクロロゲン酸(CQA)は、有意に抑制した(図２)。
以上より、レム睡眠障害系は非常に短期間で血中アディポネクチンを低下させることができるため、この系を用いれば効率良くアディポネクチン分泌調節剤をスクリーニングすることが可能となる。
【図１】
0005432567.tif 000002
【図２】
0005432567.tif 000003