(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子分析器内の粒子を分析する方法であって、
該粒子分析器内における分析のための粒子を含有する流体サンプルを調製することと、
電気的または光学的測定デバイスを使用して信号を感知することであって、該信号の各々は、該粒子分析器内の測定領域を通って流れる該流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、ことと、
少なくとも１つの該測定デバイスからの測定パラメータについて、該測定デバイスを使用して、該信号の各々のピークおよびエリアならびに第１の点および第２の点を測定することと、該エリアを閾値と比較することとに基づいて、該１つ以上の事象内の同時発生事象の存在を決定することであって、該第１の点および該第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、ことと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記結果データは、前記同時発生事象を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結果データのプロットを表示することをさらに含み、それによって、該プロットは、同時発生事象ノイズを実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記決定することは、
ａ）前記第１の点と前記第２の点との間の間隔を測定すること、
該間隔を所定閾値と比較すること、および
該間隔が該閾値を超過する場合に、前記同時発生事象の存在を決定すること、
ｂ）該第１の点と該第２の点との間の前記信号の中間点を測定すること、
前記ピークに対する該中間点を含む比率を閾値比率と比較すること、および
該比率が該閾値比率未満である場合に、該同時発生事象の存在を決定すること、または
ｃ）該第１の点と該第２の点との間の該信号の中間点を測定すること、
該ピークに対する該中間点を含む比率を閾値比率と比較すること、および
該比率が該閾値比率未満である場合に、該同時発生事象の存在を決定することであって、該決定することは、該同時発生事象が分岐同時発生事象を含むか非分岐同時発生事象を含むかを決定することをさらに含む、こと、または
ｄ）該第１の点と該第２の点との間の該信号の中間点を測定すること、
前記エリアに対する該中間点を含む比率を該閾値と比較することであって、該閾値は、閾値比率である、こと、および
該比率が該閾値比率未満である場合に、該同時発生事象の存在を決定すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記感知することは、ＤＣ測定パラメータ、無線周波数測定パラメータ、光散乱測定パラメータ、または軸光損失測定パラメータを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子は、生体細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子分析器は、血液分析器またはフローサイトメータである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記結果データは、前記１つ以上の事象の修正された計数を含み、該修正された計数は、前記同時発生事象および前記非同時発生事象に基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
システムであって、
電気的または光学的測定デバイスを使用して信号を検知するように構成される粒子検出器であって、該信号の各々は、該粒子検出器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、粒子検出器と
分析器と
を備え、該分析器は、
少なくとも１つの該測定デバイスからの測定パラメータについて、該測定デバイスを用いて、該信号の各々のピークおよびエリアならびに第１の点および第２の点を測定することと、該エリアを閾値と比較することとに基づいて、該１つ以上の事象内の同時発生事象の存在を決定することであって、該第１の点および該第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、ことと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成することと
を行うように構成される、システム。
【請求項１０】
前記感知することは、ＤＣ、光散乱、軸光損失、または無線周波数のうちの１つである、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記分析器は、
前記信号の第１の点と第２の点との間の時間間隔を所定閾値と比較することに基づいて、前記同時発生事象の存在を決定するようにさらに構成されるか、
該信号の該第１の点と該第２の点との間の中間点および該信号のピークを含む比率を、所定の閾値比率と比較することに基づいて、該同時発生事象の存在を決定するようにさらに構成されるか、または
該信号の該第１の点と該第２の点との間の中間点および該少なくとも１つの検知された信号のエリアを含む比率を該閾値と比較することに基づいて、該同時発生事象の存在を決定するようにさらに構成され、該閾値は、所定の閾値比率である、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
前記結果データを表示するように構成されるディスプレイをさらに備える、請求項９に記載のシステム。
【請求項１３】
コンピュータプログラムコードを記録したコンピュータ可読記憶媒体であって、該コンピュータプログラムコードは、プロセッサによって実行されると、該プロセッサに方法を実施させ、該方法は、
信号を受信することであって、各信号は、粒子分析器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、ことと、
各信号のピークおよびエリアならびに第１の点および第２の点を測定することと、該エリアを閾値と比較することとに基づいて、該１つ以上の事象内における同時発生事象の存在を決定することであって、該第１の点および該第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、ことと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成することと
を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１４】
前記方法は、前記結果データのプロットを表示することをさらに含み、それによって、該プロットは、実質的に同時発生事象ノイズを有しない、請求項１３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本発明は、粒子分析器を使用する粒子の分析に関し、より具体的には、重複する粒子が、粒子分析器によって生成されるデータ内の実質的に同一の時間において、例えば、同時発生で測定されるときの検出および処理ステップに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
粒子分析器は、サンプル内に含有される１種類以上の粒子の計数および／または分布を決定するための生物学的および工業的サンプルを分析するために使用される。医学分野においては、体液を分析または研究するために、血液分析器およびフローサイトメトリを含む、粒子分析器を使用することができる。例えば、血液分析器およびフローサイトメトリは、信号を捕捉および分析することによって、異なる種類の血液細胞を測定およびそれらを識別するために使用される。信号は、血液細胞が小さな開口部または測定領域を通って通過するときにサンプルと相互作用するプローブを使用することによって生成される。一般に、血液サンプルは、測定領域を含むフローセルを通って流れるように方向付けられる前に、液体内で希釈される。１つ以上のセンサまたは検出器は、血液細胞がプローブと相互作用するときに、測定領域を通って通過する血液細胞の種々の特性を検出するように配置される。
【０００３】
測定中、希釈された血液サンプルは、実質的に一定速度でフローセル内に注入される。参照読み取りは、血液細胞がフローセルの測定領域内にないときに入手される。血液細胞が存在するときに、測定領域の物理的特性は、変化する。したがって、信号は、細胞が測定領域内にあるときに各参照信号と異なる。センサ読み取りの偏位は、血液細胞が測定領域の中間点に向かって流れると徐々に増大し、血液細胞が中間点から離れて流れると徐々に減少する。
【０００４】
血液細胞、および１つ以上の測定パラメータ、例えば、コールタ原理に従う直流（ＤＣ）、無線周波数（ＲＦ）、光散乱（ＬＳ）、軸光損失（ＡＬＬ）、超音波等によってもたらされる最大信号（すなわち、ピーク）を収集および分析することは、一般的な実践方法である。一般に、信号のピークは、ある種類の血液細胞と測定パラメータ、すなわちある種類の刺激とセンサとの間の相互作用の明確に定義された関数である。例えば、ＤＣ測定によってもたらされる信号のピークは、細胞の体積を示し、細胞は、体積に基づいて分類されてもよい。細胞は、計数され、細胞の種類は、１つ以上の測定パラメータに基づいて同定される。
【０００５】
上記の関係に基づく適用は、１つずつ測定領域を通って通過する血液細胞に依存する。複数の血液細胞が測定領域を通って同時（すなわち、同時発生）に通過する場合は、捕捉された信号と参照信号との間の最大偏差は、ある種類の血液細胞と測定パラメータとの間の相互作用の明確に定義された関数ではなくなる。その上、重大な同時発生の存在下で、受信された信号から蓄積されたヒストグラムは、歪曲している可能性があり、分析結果が損なわれ得る。
【０００６】
同時発生に対処するための従来のアプローチには、推定される同時発生誤差を補正するために、粒子データ計数およびヒストグラムへの統計的方法の適用が挙げられる。同時発生を検出するための別の方法は、粒子が測定領域を通って通過するときに生成される信号の領域およびピークに基づく。しかしながら、統計的方法は、特有の推定誤差により、正確な同時発生の排除を生じ得ない。また、粒子によって生成される信号のピーク対エリアの比率に依存する方法は、種々の寸法および形状の粒子に対して有意に正確でなくあり得る。エリア対ピークに基づく測定は、また、粒子が種々の配向の測定領域を通って通過するときに非一貫性の結果を生じ得る。
【０００７】
したがって、粒子分析器データ内の同時発生を表すデータの同定および補正するための改善された方法およびシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
粒子分析器から同時発生事象を表すデータを実質的に排除するための方法およびシステムを提示する。一実施形態においては、少なくとも以下のステップを含む、粒子分析器内の粒子を分析する方法を提供する。分析のための粒子を含有する流体サンプルを調製する。電気的または光学的測定デバイスを使用して、信号が感知され、各信号は、粒子分析器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内で検出される、１つ以上の事象に対応する。同時発生事象の存在は、信号の各々のピークならびに第１および第２の点を測定するステップに基づいて決定され、第１および第２の点は、ピークの所定部分に対応する信号値を有する。同定された同時発生事象および非同時発生事象に基づく結果データが生成される。次いで、結果データが分析される。
【０００９】
種々の実施例においては、方法は、多種多様な粒子の分析に適用可能である。また、種々の実施例においては、方法は、血液分析器およびフローサイトメータを含む、粒子分析器に実装することができる。
【００１０】
別の実施形態は、少なくとも粒子検出器および分析器を有するシステムである。粒子検出器は、電気的または光学的デバイスを使用して信号を感知するように構成され、各信号は、粒子検出器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内で検出される事象に対応する。分析器は、信号の各々のピークならびに第１および第２の点の測定に基づいて、同時発生事象の存在を決定するように構成され、第１および第２の点は、同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成するために、ピークの所定部分に対応する信号値を有する。
【００１１】
本発明のさらなる特性および利点、ならびにその種々の実施形態の構造および動作を、付随の図面を参照して下記に詳細に説明する。本発明は、本明細書に説明する特定の実施形態に限定されないことに留意されたい。そのような実施形態は、図示目的のみのために本明細書に提示される。さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて、当業者には明らかであろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
粒子分析器内の粒子を分析する方法であって、
該粒子分析器内における分析のための粒子を含有する流体サンプルを調製することと、
電気的または光学的測定デバイスを使用して信号を感知することであって、該信号の各々は、該粒子分析器内の測定領域を通って流れる該流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、ことと、
少なくとも１つの該測定デバイスからの測定パラメータについて、該測定デバイスを使用して、該信号の各々のピークならびに第１および第２の点を測定することに基づいて、該１つ以上の事象内の同時発生事象の存在を決定することであって、該第１および第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、ことと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成することと
を含む、方法。
（項目２）
上記結果データは、上記同時発生事象を含まない、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記結果データのプロットを表示することをさらに含み、それによって、該プロットは、同時発生事象ノイズを実質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記決定することは、
上記第１と第２の点との間の間隔を測定することと、
該間隔を所定閾値と比較することと、
該間隔が該閾値を超過する場合に、上記同時発生事象の存在を決定することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記決定することは、
上記第１と第２の点との間の上記信号の中間点を測定することと、
上記ピークに対する該中間点を含む比率を閾値比率と比較することと、
該比率が該閾値比率未満である場合に、上記同時発生事象の存在を決定することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記決定することは、上記同時発生事象が分岐同時発生事象または非分岐同時発生事象を含むか否かを決定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記決定することは、
上記第１と第２の点との間の上記信号の中間点を測定することと、
上記領域に対する中心線を含む比率を閾値比率と比較することと、
該比率が該閾値比率未満である場合に、上記同時発生事象の存在を決定することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記感知することは、ＤＣ測定パラメータを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記感知することは、無線周波数測定パラメータを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記感知することは、光散乱測定パラメータを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記感知することは、軸光損失測定パラメータを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記粒子は、生体細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記粒子分析器は、血液分析器またはフローサイトメータである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記結果データは、上記１つ以上の事象の修正された計数を含み、該修正された計数は、上記同時発生事象および上記非同時発生事象に基づいている、項目１に記載の方法。
（項目１５）
システムであって、
電気的または光学的測定デバイスを使用して信号を検知するように構成される粒子検出器であって、該信号の各々は、該粒子検出器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、粒子検出器と
分析器と
を備え、該分析器は、
少なくとも１つの測定デバイスからの測定パラメータについて、該信号の各々のピークならびに第１および第２の点を測定することに基づいて、該１つ以上の事象内の同時発生事象の存在を決定することであって、該第１および第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、ことと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成することと
を行うように構成される、システム。
（項目１６）
上記感知することは、ＤＣ、光散乱、軸光損失、または無線周波数のうちの１つである、項目１５に記載のシステム。
（項目１７）
上記分析器は、上記信号の第１と第２の点との間の時間間隔を所定閾値と比較することに基づいて、上記同時発生事象の存在を決定するようにさらに構成される、項目１５に記載のシステム。
（項目１８）
上記分析器は、上記信号の第１と第２の点との間の中間点および該信号のピークを含む比率を、所定の閾値比率と比較することに基づいて、上記同時発生事象の存在を決定するようにさらに構成される、項目１５に記載のシステム。
（項目１９）
上記分析器は、上記信号の第１と第２の点との間の中間点および該信号のエリアを含む比率を、所定の閾値比率と比較することに基づいて、上記同時発生事象の存在を決定するようにさらに構成される、項目１５に記載のシステム。
（項目２０）
上記結果データを表示するように構成されるディスプレイをさらに備える、項目１５に記載のシステム。
（項目２１）
コンピュータプログラムコードがその上に記録されているコンピュータ可読記憶媒体であって、該コンピュータプログラムコードは、プロセッサによって実行されると、該プロセッサに方法を実施させ、該方法は、
信号を受信することであって、各信号は、粒子分析器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、ことと、
各信号のピークならびに第１および第２の点を測定することに基づいて、該１つ以上の事象内における同時発生事象の存在を決定することであって、該第１および第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、ことと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成することと
を含む、媒体。
（項目２２）
制御論理がその中に記憶されているコンピュータ使用可能媒体を備えるコンピュータプログラム製品であって、該制御論理は、
信号を受信するように構成される第１のモジュールであって、各信号は、粒子分析器内の測定領域を通って流れる流体サンプルのサブサンプル内において検出される１つ以上の事象に対応する、第１のモジュールと、
各信号のピークならびに第１および第２の点を測定することに基づいて、該１つ以上の事象内における同時発生事象の存在を決定するように構成される第２のモジュールであって、該第１および第２の点は、該ピークの所定部分に対応する信号値を有する、第２のモジュールと、
該１つ以上の事象のうちの該同時発生事象および非同時発生事象に基づいて、結果データを生成するように構成される第３のモジュールと
を備える、製品。
（項目２３）
上記制御論理は、上記結果データのプロットを表示するように構成される第４のモジュールをさらに備え、それによって、該プロットは、実質的に同時発生事象ノイズを有しない、項目２２に記載のコンピュータプログラム製品。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明のさらなる特性および利点、ならびにその種々の実施形態の構造および動作を添付図面を参照して下記に詳細に説明する。本発明は、本明細書に説明する特定の実施形態に制限されないことに留意されたい。そのような実施形態は、図示目的のみのために本明細書に提示される。さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の一実施形態に従う、システムである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の一実施形態に従う、測定領域の移行中に粒子によって捕捉される信号のグラフ表示を図示する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の一実施形態に従う、測定領域の移行中に１つ以上の粒子によって実質的に同時に捕捉される信号のグラフ表示を図示する。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定および処理を有さない、およびそれらを有する、散乱パターンをそれぞれ示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定および処理を有さない、およびそれらを有する、散乱パターンをそれぞれ示す。
【図３】図３は、本発明の一実施形態によって達成される結果の比較を表示する棒グラフを図示する。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、本発明の一実施形態に従う、適用された同時発生の同定および処理を有さない、およびそれらを有する散乱プロットをそれぞれ図示する。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、本発明の一実施形態に従う、適用された同時発生の同定および処理を有さない、およびそれらを有する散乱プロットをそれぞれ図示する。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に従う、粒子のサンプルを分析するステップを図示するフローチャートである。
【図６】図６は、本発明の一実施形態において、図５の信号パラメータの決定に関与する処理を説明するフローチャートである。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に従う、粒子の寸法が増大する時に、非同時発生信号における１つの測定（Ｔ５０）の実質的に一定の特性を図示する。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に従う、同時発生の特徴的測定を決定するステップを示すフローチャートである。
【図９】図９、１０、１１および１２は、本発明の一実施形態に従う、粒子パラメータを図示するグラフである。
【図１０】図９、１０、１１および１２は、本発明の一実施形態に従う、粒子パラメータを図示するグラフである。
【図１１】図９、１０、１１および１２は、本発明の一実施形態に従う、粒子パラメータを図示するグラフである。
【図１２】図９、１０、１１および１２は、本発明の一実施形態に従う、粒子パラメータを図示するグラフである。
【図１３】図１３、１４、１５、１６および１７は、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定の種々の効果を図示する散乱プロットである。
【図１４】図１３、１４、１５、１６および１７は、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定の種々の効果を図示する散乱プロットである。
【図１５】図１３、１４、１５、１６および１７は、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定の種々の効果を図示する散乱プロットである。
【図１６】図１３、１４、１５、１６および１７は、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定の種々の効果を図示する散乱プロットである。
【図１７】図１３、１４、１５、１６および１７は、本発明の一実施形態に従う、同時発生の同定の種々の効果を図示する散乱プロットである。
【図１８】図１８は、本発明の一実施形態に従う、分析器モジュールおよびシステムの詳細な図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の特性および利点は、図面と併用されると下記に記載する発明を実施するための形態からより明らかになるであろう。図面において、同様の番号は、一般に、同一、機能的に同様、および／または構造的に同様の要素を示す。一般に、要素が最初に出現する図面は、対応する参照番号の最左の桁によって示される。
【００１４】
本発明は、同時発生事象の検出および処理を対象とする。本仕様書は、本発明の特性を組み込む、１つ以上の実施形態を開示する。開示された実施形態は、単に本発明を例示する。本発明の範囲は、開示された実施形態に制限されない。本発明は、本明細書に添付される請求項によって定義される。
【００１５】
説明する実施形態および「一実施形態」、「実施形態」、「例示的実施形態」等に対する仕様書における参照は、説明する実施形態が特定の特性、構造または特徴を含んでもよいが、すべての実施形態は、特定の特性、構造、または特徴を必ずしも含まなくてもよいことを示す。その上、そのような句は、同一の実施形態に必ずしも言及しない。さらに、特定の特性、構造、または特徴が実施形態に関連して説明される時に、例示的に説明されるか否かに関わらず、他の実施形態に関連してそのような特性、構造、または特徴をもたらすことは、当業者の知識範囲内であることを理解されたい。
【００１６】
本発明の実施形態は、ハードウエア、ファームウエア、ソフトウエア、またはそれらの任意の組み合わせにおいて実施されてもよい。本発明の実施形態はまた、１つ以上のプロセッサによって読み込みおよび実行されてもよい、機械可読媒体上に記憶される命令として実施されてもよい。機械可読媒体は、機械（例えば、コンピューティングデバイス）によって可読可能な形態の情報を記憶または伝達するための任意の機構を含んでもよい。例えば、機械可読媒体は、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、磁気ディスク記憶媒体、光学式記憶媒体、フラッシュメモリデバイス、電気的、光学的、音響的または他の形態の伝播信号（例えば、運搬波、赤外線信号、デジタル信号等）、およびその他を含んでもよい。さらに、ファームウエア、ソフトウエア、ルーティン、命令は、ある動作を実施するものとして本明細書に説明されてもよい。しかしながら、そのような説明は、単に便宜上であり、そのような動作は、実際、ファームウエア、ソフトウエア、ルーティン、命令等を実行するコンピューティングデバイス、プロセッサ、コントローラ、または他のデバイスから生じることを理解されたい。
【００１７】
（概要）
上述のように、同時発生が粒子分析中に生じる時に、例えば、複数の粒子が測定領域内に同時にある時に、粒子計数および粒子分布を表すデータは、歪曲されてもよい。下記に開示する実施形態に従う方法およびシステムは、同時発生事象を排除する、またはさもなければ占めることによって、より正確な粒子分析器データをもたらす。
【００１８】
本発明の実施形態が実践されてもよい例示的環境には、それぞれ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＦＣ５００ＴＭおよびＧｅｎ−ＳＴＭシステム等のフローサイトメトリおよび血液分析器が挙げられる。Ｇｅｎ−ＳＴＭシステムは、例えば、フローセル内の集中細胞を流体力学的に精査するために、Ｃｏｕｌｔｅｒ専有の体積、伝導度、および散乱（ＶＣＳ）および軸光損失（ＡＬＬ）技術を使用する。ＶＣＳは、細胞を精査するために相互に協調して機能する、複数の単独のエネルギー源（体積を測定するための低周波数直流電源、伝導度を測定するための高周波電源、ならびに散乱および軸光損失を測定するためのレーザ光源）を使用する。
【００１９】
体積測定は、全細胞が等張性希釈剤中で置換する体積を物理的に測定するために電気インピーダンスのコールタ原理を使用して実施される。この方法は、光路におけるそれらの配向に関わらず、すべての細胞種類を正確に寸法決定する。無線周波数（ＲＦ）範囲内の交流電流は、化学成分および核体積を含む、細胞の寸法および内部構造に関する情報を収集するために使用される。
【００２０】
レーザおよび多角光散乱センサまたは検出器は、細胞の内部構造、粒度、および表面モルホロジに関する情報を提供する。加えて、ＶＣＳ測定は、伝導度および散乱から細胞寸法に調整される、他の測定を入手するために高度に正確なＤＣ体積測定を使用する。例えば、米国特許第５，６１６，５０１号（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら）は、粒子分析器およびＶＣＳ技術の使用の例示的な詳細な説明を含む。しかしながら、本明細書に説明する教示は、ＶＣＳ技術を使用するデバイスに制限されないことに留意されたい。例えば、本発明の実施形態はまた、ＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒＴＭ３  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）、生体サンプルの分析に加えて多くの用途を有する粒子分析器に適用可能である。
【００２１】
図１Ａは、本発明の一実施形態に従う、粒子分析器１００の構成要素を図示する。図１Ａは、図示目的のみであり、粒子分析器は、図１Ａに示すものよりも多いまたは少ないモジュール、異なるモジュール、および異なる設計を含むことができることを理解されたい。粒子分析器１００は、分析器１２２および粒子検出器１２４を含む。粒子検出器１２４は、サンプルディスペンサ１０２、シース流体ディスペンサ１０４、チャンバ１０６、フローセル１０８、測定デバイス１１０、プローブジェネレータ１１２、センサ１１４、信号プロセッサ１１８、および測定領域１２０を含む。
【００２２】
示す実施例においては、サンプルディスペンサ１０２は、所望の分析または試験の要件に従い調製される粒子サンプル１０３を含む。例えば、血液サンプルは、所定程度の細胞濃度まで希釈剤を用いて希釈されてもよい。希釈剤の種類および希釈の程度は、実施されている試験によって異なり、例えば、白血球細胞（ＷＢＣ）分析は、サンプル内のＷＢＣの数が赤血球（ＲＢＣ）と比較して低いため、赤血球（ＲＢＣ）よりも少ない希釈を必要とする。シース流体ディスペンサ１０４は、例えば、生理食塩水等のシース流体１０５を保持する。シース流体１０５は、希釈された粒子サンプル１０３をフローセル１０８内のシース流体内のフロー軸付近に拘束させる。粒子サンプルディスペンサ１０２からの希釈された粒子サンプル１０３およびシース流体ディスペンサ１０４からのシース流体１０５は、分析のための集中流体サンプルストリームを形成するために、チャンバ１０６内で交わる。サンプルおよびシース流体の組み合わされた流動率は、フローセル１０８内への所定の一定流動率を作成する。例えば、フローセル１０８は、シース流体１０５によって拘束される粒子１０７がそれを通って通過するように設計される、小径の管である可能性がある。測定領域１２０内の個々の粒子１０７の到達時間は、サンプル粒子の直径、サンプル流動率、サンプルおよびシース流体の組み合わされた流動率、ならびにサンプル内の粒子の濃度を含む、多くの要因によって影響される。
【００２３】
この実施例においては、測定デバイス１１０は、フローセル１０８を通って通過する１つ以上のセンサが、粒子１０７を感知するために使用されてもよいように、粒子分析器１００内に位置付けられる。例えば、プローブ１１２および１つ以上のセンサ１１４は、フローセル１０８に対して実質的に横方向に測定デバイス１１０内に位置付けることができる。種々の実施例においては、プローブ１１２およびセンサ１１４は、フローセル１０８内の粒子１０７、具体的には、測定領域１２０を通って流れる粒子を検出するために、電気的または光学的測定デバイスのうちの１つ以上を使用する。例えば、一組の対を成すプローブ１１２およびセンサ１１４は、測定領域１２０を通って通過する粒子１０７の体積を測定するために、ＤＣ測定パラメータを使用することができる。別の組の対を成すプローブ１１２およびセンサ１１４は、測定領域１２０を通って通過する粒子１０７の伝導度特徴を測定するために、ＲＦ測定パラメータを使用することができる。また、別の組のプローブ１１２およびセンサ１１４は、測定領域１２０を通って通過する粒子１０７の光散乱および光損失特徴を測定するために、光測定パラメータを使用することができる。加えて、またはあるいは、本発明の他の実施形態において、プローブ１１２およびセンサ１１４は、例えば、粒子が測定領域１２０を通って通過する時に、粒子１０７の種々の特徴を検出するために、超音波測定パラメータが使用される音響測定デバイスを含むことができる。
【００２４】
さらに、示す実施例においては、センサ１１４は、信号プロセッサ等の処理デバイス１１８に結合される。センサ１１４は、検出された電気的または光学的測定を、信号プロセッサ１１８内で処理することができる、対応する電気信号パルスに変換する。例えば、測定領域１２０を通って通過する各粒子１０７では、一連の測定に対応する電気信号パルスは、例えば、信号プロセッサ１１８内で収集される。これらの電気信号パルスから、完全信号が産生され、それは、粒子が測定領域を通って流れている間に、１つの特定パラメータのために捕捉された測定の図示である（例えば、図１Ｂおよび１Ｃを参照）。信号の持続時間は、粒子が測定領域に進入する時から粒子が測定領域から出る時に基づく。本発明の実施形態においては、信号プロセッサ１１８は、検出された粒子を説明する１つ以上のパラメータを生成するために各信号のさらなる処理を実行してもよい。
【００２５】
この実施例においては、測定領域１２０内の粒子１０７の検出は、事象として称される。また、事象、具体的には、同時発生事象は、１つ以上の粒子１０７が測定領域１２０内に実質的に同時にある時、すなわち、同時発生が生じる時に生成される。したがって、信号プロセッサ１１８は、各検出された事象に対応する生成された信号を分析する。次いで、検出された事象のために分析された信号は、分析器１２２に伝達される。一実施例においては、分析器１２２は、図１８に示す実装等の粒子検出器１２４に結合される、コンピュータ内に配置されてもよい。分析器１２２は、粒子検出器１２４を備える粒子分析器１００の一部である、または粒子分析器１００から遠隔に位置付けられ、かつ、イーサネット（登録商標）またはＷＩＦＩ等に制限されない、有線または無線通信媒体を介して接続することができることに留意されたい。
【００２６】
一実施例においては、信号生成および事象検出は、各アクティブな電気的または光学的測定パラメータのために個別に実施される。例えば、分析器１２２は、アクティブである各測定パラメータに対応する事象データを受信することができる。次いで、分析器１２２は、１つ以上の計数、粒子亜集団、または粒子に対応する他の特徴を決定するために、受信されたデータを分析することができる。本発明の一実施形態においては、分析器１２２は、受信された事象の散乱プロットの表示をもたらす、または制御することができる。
【００２７】
図１Ｂは、本発明の一実施形態に従う、粒子が測定領域の入口から出口に移動する期間中に生じる、捕捉された信号測定に対応する信号１５０のグラフ表示を図示する。粒子が測定領域に進入すると、粒子は、測定デバイスと最小限のみ相互作用し、低強度信号を産生する。信号の値は、徐々に増大し、粒子が測定領域の中間点を通って通過する時に、ピーク１５２に達する。中間点を通って通過した後に、信号の値は、粒子が測定領域から出ると、徐々に減少する。信号１５０の種々の部分は、粒子の特徴、例えば、第１および第２のハーフピーク点１５４および１５６、ハーフピーク線Ｈ５０の中間点、ならびに他の点を決定するために使用することができる。ハーフピーク点１５４と１５６との間の時間間隔Ｔ５０はまた、粒子の特徴の決定要因である。
【００２８】
同時発生粒子は、すなわち、１つ以上の粒子が測定領域１２０内に同時に存在する時に、一般に、対応する信号の歪曲をもたらす。一部の場合において、信号の歪曲は、粒子の特徴に関する誤決定をもたらす可能性がある。同時発生の頻度は、一般に、分析されるサンプル内の粒子の濃度と共に増大する。
【００２９】
理想的には、各個々の粒子１０７は、独立して、一定速度で物理的測定領域１２０の中間点を通って通過し、それによって、対称的モノモーダル信号を生成するであろう。この場合において、信号のピーク測定は、対応する測定パラメータとの粒子の最大の相互作用を表し、いくつかの対応する粒子特性に数学的に関連する。具体的には、ＤＣピーク測定がコールタ原理に従う粒子容積に正比例する場合である。しかしながら、１つ以上の粒子１０７が測定領域１２０内に実質的に存在する、すなわち、同時発生が存在する時に、粒子特徴に対する信号ピーク測定の推定される関係は、混同される。同時発生粒子の観測された信号は、一般に、個々の粒子に対応する信号の重畳であることが理由である。
【００３０】
一実施例においては、同時発生粒子が測定領域を実質的に同時に横断する場合には、個々の信号は、得られる信号がそのピークが個々のピークの合計と同等である対称的モノモーダル信号であってもよいように、重複することができる。
【００３１】
別の実施例においては、２つの同時発生粒子が別々に測定領域を通って通過する場合には、一方は、他方より前に通過するが、両方は、同時に測定領域内にあり、得られる信号は、Ｍ型を有する信号を産生する、モノモーダル（分岐同時発生前）からバイモーダル（分岐同時発生後）の範囲であることができる。
【００３２】
図１Ｃは、本発明の一実施形態に従う、１つ以上の粒子によって、実質的に同時に横断中に捕捉される信号１６０のグラフ表示を図示する。同時発生粒子のうちの最初が測定領域１２０に進入する時間１６８で開始し、信号１６０は、同時発生粒子が測定領域１２０の中間点に近づくと徐々に増大し、粒子が測定領域１２０を出る時間１６９まで、それらが中間点を通って通過した時に徐々に減少する。各同時発生粒子が測定領域１２０の中間点に近づくと、各ピーク（例えば、１６２Ａおよび１６２Ｂ）は、観測することができ、信号１６０にＭ型をもたらす。粒子が完全に同時発生である（すなわち、相互に完全に重複する）場合には、次いで、得られる信号は、いずれかの粒子のみに関連するピークよりも高い値を有する、１つのピークのみを有するであろう。
【００３３】
図１Ｃに見られるように、信号形状の歪曲は、個々の信号特徴の正確な測定を阻害してもよい、同時発生粒子間の時間間隔によって異なってもよい。一般に、同時発生が生じる時に、装置は、より少数の粒子をレジスタし、さらに重要なことには、ピーク測定は、もはや正確ではなくてもよい。その結果、同時発生粒子は、散乱プロットおよびヒストグラム、例えば、５分類の散乱プロットにおいてノイズとして出現する。したがって、粒子濃度が高く、同時発生が一般的である場合において、検出、処理、および分析されたデータに基づく散乱プロットおよびヒストグラムは、実質的に歪曲される可能性がある。歪曲は、誤ったゲート、精度、およびフラッグ結果をもたらしてもよい。
【００３４】
図２Ａおよび２Ｂは、本発明の実施形態を使用して、同時発生検出および処理を用いて、散乱プロットのデータの表示で生じることができる改善を図示する。図２Ａは、同時発生の同定および処理を有さない散乱パターンである。図２Ｂは、同時発生の同定および処理を有する散乱パターンである。この実施例においては、散乱プロットは、９９％のリンパ球を有する高濃度のＷＢＣ検体のＤＣ対ＬＳ測定に対応する。
【００３５】
上述のように、血液分析器は、血液細胞（例えば、粒子）の種類を区別するために、例えば、ＤＣ、ＲＦ、ＬＳおよびＡＬＬに基づく位置情報を使用する。各細胞に対応する信号のピーク測定は、位置情報を回収するために使用することができる。しかしながら、同時発生は、対応する散乱プロットおよびヒストグラム上の不正確な位置にある細胞の表示をもたらすことができる、ピーク測定を歪曲させる。データパターンのこの劣化は、サンプル濃度が増大するとより一般的になる。例えば、より高い粒子濃度を有する、希釈された粒子サンプル１０３は、一般に、より高い比率の同時発生をもたらし、したがって、低粒子濃度を有する、希釈された粒子サンプル１０３よりも歪曲されたデータをもたらすであろう。
【００３６】
図２Ａおよび２Ｂにおいては、印を付けた外接矩形、矩形２０２および２０４はそれぞれ、リンパ球が存在することが予想される位置である。図２Ａは、他の種類のＷＢＣとして容易に誤って分類される可能性のある、矩形２０２の外に不正確に定置される、相当な数のリンパ球を示す。対照的に、図２Ｂにおいては、本発明の実施形態に従う、誤って定置されたリンパ球は、これらの誤って配置されたリンパ球が、実際に、同時発生の同定および処理によって排除される同時発生粒子であったため、顕著に減少される。
【００３７】
図３は、本発明の実施形態によってもたらされた臨床的精度における例示的改善を示すグラフを図示する。例えば、本発明の実施形態に従う、同時発生の同定および処理を有する、および有さない参照データセットに関する手動分類結果への５分類試験の結果の比較を示す。比較は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基級の割合に基づいて、かつ手動分類との相関関係で量子化される。この実施例に見ることができるように、同時発生の同定および処理は、すべての５つの白血球亜集団の精度を改善させる。精度改善に加えて、同時発生の同定および処理は、戻ることを要求とする不確定としてフラッグされるサンプルの数を改善させる。例えば、同一のデータセットにおいては、フラッグされたサンプルの数は、本発明の実施形態に従う、同時発生の同定および処理を適用することにより、３５１から２６５まで２４．５％減少させられる。
【００３８】
図４Ａおよび４Ｂは、本発明の実施形態が、未溶解粒子によってもたらされる同時発生の影響を減少するために使用される時に、結果をグラフ的に図示する。いくつかの血液試験は、分析前にサンプルから不要な粒子を排除するために、粒子サンプルの溶解を必要とする。例えば、５分類試験は、白血球細胞の亜型を正確に発生し、区別するために、優勢な赤血球細胞の排除を必要とする。しかしながら、いくつかの異常なサンプルは、溶解に対して耐性であり、５分類散乱プロットにおいて過剰な未溶解破片をもたらす。これらのサンプル中の赤血球細胞と白血球細胞との間の濃度の比較的大きい差異のため、未溶解破片は、しばしば、同時に測定領域を通って通過する。したがって、本発明の実施形態を使用して、実質的に排除される同時発生粒子は、未溶解破片によってもたらされる誤差を減少することができる。例えば、本発明の実施形態に従う、同時発生の同定および処理を参照データセットに適用することによって、白血球細胞に関する未溶解破片の割合の平均は、９５％〜６４％に減少される。
【００３９】
図４Ａおよび４Ｂにおいては、未溶解破片を有するサンプルのためのＤＣ対ＬＳ散乱プロットを示す。適用される同時発生の同定および処理が存在しないときに、未溶解破片は、リンパ球と干渉し、リンパ球として４８％の細胞の誤分類を引き起こす。例えば、図４Ａにおいて、赤血球細胞およびリンパ球集団は、エリア４０１において明確な分離を伴わずに出現する。一方、図４Ｂは、リンパ球と破片との間のゲートが実質的に改善される、例えば、赤血球細胞４０２およびリンパ球４０３が明確に分離されるように、有意な量の未溶解破片を排除する、同時発生の同定および処理を使用するときの結果をグラフ的に示す。この実施例においては、同時発生の同定および処理は、９％の参照に非常に近い、７．２％のリンパ球をもたらす。
【００４０】
（同時発生粒子を決定する方法）
図５は、本発明の実施形態に従う、同時発生粒子を検出し、処理するための方法５００のフローチャートである。例えば、方法５００は、下記の方法５００の説明に参照される、図１Ａのデバイスを使用して実施することができる。
【００４１】
ステップ５０２において、サンプルは、粒子分析器内の分析のために調製される。例えば、上述のように、血液分析において、血液サンプルは、白血球細胞のための５分類試験の前に、赤血球細胞を排除するために溶解されてもよい。調製ステップはまた、フローセル、例えば、フローセル１０８を通るサンプルの流れを促進するために、サンプルに希釈剤を、およびシース流体の支給量を添加するステップを含んでもよい。
【００４２】
ステップ５０３において、調製された粒子サンプルは、一定速度で、フローセル内に注入される。例えば、これは、ほぼ一定の流体速度を保証し、フローセルを介してシース流体内に拘束するために、流体力学的収束等のプロセスを使用して行うことができる。
【００４３】
ステップ５０４において、測定領域内の粒子が、検出される。例えば、ステップ５０２で調製された粒子サンプルのサブサンプルは、フローセルの測定領域を通って流れ、一連の信号パルスは、測定領域、例えば、フローセル１０８の測定領域１２０内の１つ以上の粒子の感知に基づいて生成される。一実施例においては、粒子の感知は、対応するプローブおよびセンサ、例えば、プローブ１１２およびセンサ１１４を含む、１つ以上の電気的または光学的測定デバイスに基づく。例えば、電気測定デバイスを考慮すると、ＤＣ測定パラメータまたは電気抵抗測定パラメータは、粒子の体積を検出するために使用することができる、および／またはＲＦ測定パラメータは、粒子の多くの特徴に対応してもよい。図１Ａに関して説明するレーザ源および対応する検出器は、光学的測定デバイスを備えることができ、ＬＳおよびＡＬＬを含む、測定パラメータに基づいて、粒子特徴を決定するために使用することができる。別の実施形態においては、音響測定デバイスが、使用されてもよい。例えば、超音波源および対応するセンサは、音響測定デバイスを備えてもよい。本明細書の下記の説明は、主にＤＣ測定パラメータを使用する検出に焦点を置くが、他の測定スキームは、本発明の範囲内に含まれる。
【００４４】
ステップ５０６において、測定領域内の粒子の存在に対応する信号は、例えば、粒子が測定領域を通って通過するときに、粒子を感知することによって生成される、一連の信号パルス測定を使用して産生される。図１Ｂまたは１Ｃに示す信号は、このステップにおいて産生される信号を表す可能性がある。
【００４５】
ステップ５０８において、種々のパラメータが、生成された信号に基づいて決定される。例えば、図１Ｂに示すように、信号のピーク１５２が決定される。本発明の一実施形態においては、ピーク値の所定部分に対応する値を有する信号１５０上の第１および第２の点が決定され、第１の点は、信号１５０の上昇部分上にあり、第２の点は、信号１５０の減少部分にある。より正確には、第１の点は、ピーク値の所定部分に対応する信号１５０の一時的に第１に生じる上昇部分上に位置し、第２の点は、ピーク値の所定部分に対応する信号１５０の一時的に最後に生じる減少部分上に位置する。例えば、第１および第２の点は、信号１５０のハーフピーク点１５４および１５６、または信号１６０のハーフピーク点１６４および１６６であってもよい。第１および第２の点に基づいて、第１と第２の点との間の時間間隔（Ｔ５０）の中間点（Ｈ５０）における信号の値に対応する中心点が決定される。別の実施形態においては、信号のエリアが決定される。具体的には、測定領域内の粒子の全体の持続時間を示す信号によって表されるエリアが決定される。例えば、図６に示し、下記に詳細に説明する例示的ステップを言及したパラメータを決定するために説明する。フローセル内におけるその存在の持続時間における１つ以上の粒子を表す例示的信号を、図１Ｂおよび１Ｃに提供する。信号を使用して決定されるパラメータを、図１Ｂ、１Ｃ、および７に関して詳細に説明する。
【００４６】
ステップ５１０において、サブサンプルの同時発生特徴が決定される。例えば、事象データ、すなわち、ステップ５０８において検出された粒子および信号に基づいて決定された、他のパラメータに対応するデータが、信号プロセッサ１１８から分析器１２２において受信される。次いで、分析器１２２は、受信されたデータに基づいて、サブサンプルの同時発生特徴を決定することができる。しかしながら、信号パラメータの決定および同時発生の決定は、信号プロセッサ１１８と分析器１２２との間で異なって分布される可能性があることを理解されたい。
【００４７】
例えば、信号、ピーク、および信号の中心点、ならびに第１および第２の点のうちの１つまたは両方から決定されたパラメータに基づいて、サブサンプルが同時発生粒子を含むか否かが決定される。ステップ５１０に関与する詳細な処理ステップを図示するフローチャートを、図８に表す。サブサンプルが同時発生事象を含むか否かの決定を、図８に関して詳細に説明する。
【００４８】
ステップ５１２において、結果データが、同時発生事象および非同時発生事象（すなわち、同時発生事象以外の事象）に基づいて生成される。一実施形態においては、同時発生事象のデータ特徴が破棄される。したがって、結果データは、同時発生として検出された任意の事象を含まないであろう。別の実施形態においては、各検出された同時発生事象では、粒子数は、同時発生を占めるために調整される。例えば、同時発生を有すると検出された各サブサンプルは、２つの粒子同時発生を有するとみなされてもよく、事象数または粒子数は、適宜に増分されてもよい。この方法で粒子数を調整するステップは、同時発生サンプルを破棄するステップと比較したときに、計数の誤差を低減することができる。
【００４９】
ステップ５１４において、全体のサンプルが測定されているか否かが決定される。決定されていない場合には、方法５００は、ステップ５０３に戻る。さもなければ、収集される結果データは、ステップ５１４において分析される。
【００５０】
一実施形態においては、結果データは、ディスプレイ、例えば、結果データに対応する散乱プロットを生成するために使用されてもよい。散乱プロットは、同時発生事象が実質的に低減されるため、増加した精度および少ないノイズを有するであろう。同時発生事象が排除された例示的散乱プロットを２Ｂに示し、それは、同時事象が排除されていないときと比較することができ、それを図２Ａに示す。
【００５１】
別の実施形態においては、結果は、方法５００を使用して決定された同時発生事象の計数に従い調整される事象または粒子数として報告されてもよい。
【００５２】
さらに別の実施形態においては、結果データは、記憶および／またはその後の分析のために、記憶デバイスが挙げられるがそれに限定されない、別のデバイスに伝送されてもよい。
【００５３】
図６は、本発明の実施形態に従う、プロセス６００、例えば、ステップ５０８の処理に関与するサブステップを図示する。ステップ６０２において、信号のピーク、例えば、信号１５０のピーク１５２が検出される。上述のように、ピーク測定は、粒子特徴を表すと見なすことができる。例えば、単一の粒子がＤＣ測定領域を通って通過する場合には、コールタ原理に従い、記録されたピークは、粒子の物理的体積に比例する。通常、ピーク値自体が粒子のある特徴を説明するために十分であるため、いくつかの血液分析器において、ピーク測定のみが捕捉される。同時発生粒子が存在しないときに、信号は、一般に単一ピークを有する。しかしながら、図１Ｃに関して上述のように、信号は、同時発生粒子がサブサンプルにおいて検出されるときに１つ以上のピークを有してもよい。信号１６０は、２つのピーク１６２Ａおよび１６２Ｂを有し、それは、同時発生粒子が存在してもよいことを示す。ピーク１６２Ａ、より具体的には、信号１６０の最大ピークは、信号の最大値の記録を付けることによって決定することができる。
【００５４】
ステップ６０４において、２つの点、ピークの所定部分に対応する信号値を有する第１および第２の点が決定される。例えば、ピークの所定部分は、５０％であってもよく、２つのハーフピーク点は、図１Ｃに関して説明するように、第１のハーフピーク点１６４がピーク１６２Ａの前であり、第２のハーフピーク点１６６が１６２Ａの後になるように、確認することができる。第１と第２のハーフピーク点との間の時間間隔は、Ｔ５０と称される。
【００５５】
ステップ６０６では、第１と第２の点との間の中心点１６７が決定される。第１および第２のハーフピーク点の中心点１６７における信号値は、Ｈ５０と称される。図１Ｂに示すように、同時発生が存在しないときに、ハーフピーク点１５４および１５６の中心点は、ピーク１５２と重複することができることに留意されたい。
【００５６】
図７は、本発明の実施形態に従う、粒子の寸法が増大するときの非同時発生信号における１つの測定（Ｔ５０）の実質的に一定特性を図示する。先述のように、Ｔ５０は、信号上の２つのハーフピーク点の間の時間間隔である。信号上の各点は、測定領域内の対応する位置における測定パラメータ（例えば、ＤＣ）および粒子の相互作用の強度を表す。粒子体積がＤＣ測定領域体積と比較して小さいときに、強度は、粒子体積にほぼ比例する。より大きい粒子が測定領域を通って通過するときに、信号上の各点は、比例的に増大し、ハーフピーク点は、振幅がより小さい粒子と比較して拡大される一方、同一の時間点に留まる。言い換えると、Ｔ５０は、粒子が同時発生を伴わず独立して測定領域を通って通過するかぎり、粒子寸法に関わらず、実質的に一定のままである。プロット７００は、Ｔ５０が、同時発生を伴わない種々の寸法の粒子では、一時的に実質的に一定のままであることを示す。種々の単一非同時発生粒子のＴ５０の実質的に一定特性は、同時発生粒子を同定するために閾値Ｔ５０値の決定を可能にする。
【００５７】
Ｈ５０測定は、信号形状の対称性に大きく依存する。信号が対称かつモノモーダルである場合には、そのＨ５０は、そのピークと同等である。信号がモノモーダルであるが対称ではない場合には、そのＨ５０は、そのピーク未満である。信号がバイモーダルである場合には、そのＨ５０は、通常、バイモーダル信号内の中間谷領域に位置し、そのＨ５０は、有意にピーク未満である。２つ以上の粒子が同時に測定領域を通って流れるときに起こる可能性がある、信号がマルチモーダルである場合には、状況は、より複雑かつ予測不可能である。しかしながら、この状況において、Ｈ５０がピーク未満である確立が非常に高く存在する。また、２つ以上の粒子の同時発生は、粒子サンプルをフローセル内に注入するために流体力学的集束を使用することができる血液分析器およびフローサイトメータにおいて比較的低頻度であり、一般に無視することができる。
【００５８】
参照の簡略化のために、用語Ｔ５０は、第１および第２の点がピーク値の一部分に対応する任意の所定値を有すると選択されるときに、第１と第２の点との間の時間距離を指すために使用されることに留意されたい。同様に、用語Ｈ５０は、Ｔ５０領域の中間点における信号値を指すために使用される。
【００５９】
ステップ６０８において、信号のエリアが決定される。例えば、粒子が測定領域内、具体的には、粒子が測定領域１６８に進入するときからそれが出るとき１６９までの時間間隔にある全体の持続時間に対応する信号１６０のエリアである。一実施例においては、エリアは、信号１６０の積分として決定することができる。より大きい粒子が測定領域を通って通過する場合には、信号上の各点は、比例的に増大する。１つ以上の粒子が開口部を通過する場合には、重畳信号のエリアは、すべての個々の信号のエリアの合計に等しい。しかしながら、信号エリアは、それが測定領域を通って通過するときに、粒子の形状および粒子の配向に敏感であってもよい。信号のエリアと比較して、信号のＴ５０は、分析される粒子のさらなるロバスト表示を提供する。完全な同時発生粒子を除き、ピークは、さらなる特性を有さないことにも留意されたい。
【００６０】
図８は、本発明の実施形態に従う、例えば、ステップ５１０において同時発生特徴を決定するためのプロセス８００を示すフローチャートである。ステップ８０２では、Ｔ５０パラメータは、所定のＴ５０閾値と比較される。Ｔ５０値が所定のＴ５０閾値を上回る場合には、次いで、信号は、同時発生を含むとみなされる。Ｔ５０閾値は、参照粒子サンプルの分析に基づいて、各粒子分析器および関連する試験条件のために事前に決定することができる。
【００６１】
図９、１０、１１および１２は、本発明の実施例に従う、粒子パラメータの特徴を図示するグラフである。例えば、線は、正規化された規模の０．２〜０．８の範囲の寸法を上回る、非同時発生粒子の信号測定を表す。丸および点線は、その分離がわずかな時間増分によって調整される、２つの０．４寸法の同時発生粒子の信号測定を表す。これらの２つの粒子が相互にごく接近して測定領域を通って通過するため、観測されたピークは、波形重畳により、必ずしも０．４ではない。丸は、２つの同等に寸法設定された、分岐前の粒子の信号測定を表す。点線は、分岐後の信号測定を表す。
【００６２】
図９は、本発明の実施形態に従う、Ｔ５０対ピークプロット９００を示す。単一粒子信号は、寸法の違いに関わらず、単一粒子を示す水平線によって図示する、一定のＴ５０を有する。丸で示す分岐前の同時発生パルスは、それらが依然としてユニモーダルであるにも関わらず、上昇したＴ５０を呈する。これは、２つの個々の信号の重畳によって信号が歪曲されるためである。同時発生が分岐後になると、Ｔ５０は、点線で図示するように劇的に増大する。上記の観測は、Ｔ５０が、分岐前および分岐後の同時発生事象の両方を、非同時発生事象と区別することが可能であることを示す。Ｔ５０閾値は、分析される粒子の寸法に基づいて、単一粒子の値（プロット９００における線）を上回る、および対応する同時発生値の値（プロット９００における点線または丸の下）を下回るとして決定することができる。
【００６３】
ステップ８０４において、ピークに対するピーク点の第１および第２の部分の中心点の比率（すなわち、Ｈ５０対ピーク比）が、決定または計算される。次いで、Ｈ５０対ピーク比が、所定の閾値Ｈ５０対ピーク比と比較される。Ｈ５０対ピーク比が閾値より少ない場合には、次いで、信号が、分岐後の同時発生を示すために決定される。閾値Ｈ５０対ピーク比は、参照粒子サンプルの分析に基づいて各粒子分析器および関連する試験条件のために事前に決定することができる。
【００６４】
図１０のＨ５０対ピークプロット１０００において、Ｈ５０およびピークが単一粒子信号で同等のままであるため、斜線が存在する。丸は、２つの同等の寸法の分岐前の同時発生粒子が対称のユニモーダル信号を形成し、同一のＨ５０およびピークを有するときはいつでも線と重複する。これは、Ｈ５０が、分岐前の同時発生および非同時発生信号を区別することができないことを意味する。しかしながら、点線は、線と明確に分離され、Ｈ５０が分岐後の同時発生信号を非同時発生信号と区別するために使用することができることを意味する。２つの異なる寸法の分岐前の同時発生粒子の場合では、２つの粒子の重畳は、非対称レベルを作成し、したがって、Ｈ５０測定をピーク測定と異ならせる。しかしながら、この差異は、通常、有意ではない。
【００６５】
ステップ８０６では、エリアに対するピーク点の第１および第２の点の中心点の比率（すなわち、Ｈ５０対エリアの比率）が、決定または計算される。次いで、Ｈ５０対エリアの比率は、所定の閾値Ｈ５０対エリアの比率と比較される。Ｈ５０対エリアの比率が閾値未満である場合には、次いで、信号は、分岐後の同時係数を示すために決定される。閾値Ｈ５０対エリアの比率は、参照粒子サンプルの分析に基づいて、各粒子分析器および関連する試験条件のために事前に決定することができる。
【００６６】
図１１のＨ５０対エリアプロット１１００において、Ｈ５０対エリアの比率が単一粒子信号で一定のままであるため、直線の斜線が存在する。丸および点線は、２つの粒子同時発生信号のエリアが一定のままであることを示す。これは、２つの粒子のエリアが、これらの２つの粒子が同時に測定領域を通って通過する限り、各粒子のエリアの合計と同等であるという事実によって説明することができる。したがって、すべての単一粒子は、エリア対エリアの散乱プロット上の基点を通る斜線を形成し、一定のＨ５０対エリアの比率を有する一方、同時発生粒子は、散乱プロット上の単一粒子線の右およびその下に位置し、それらのＨ５０対エリアの比率は、減少される。これは、Ｈ５０対エリアの比率が、同時発生パルス（分岐前および分岐後タイプの両方を含む）と非同時発生パルスを区別するために使用することができることを意味することができる。
【００６７】
ステップ８０８では、エリア対ピーク比が、決定される。エリア対ピークの比率が所定の閾値を上回るか否かに基づいて、この信号は、分岐前または分岐後同時発生信号のいずれかである。閾値エリア対ピーク比は、参照粒子サンプルの分析に基づいて、各粒子分析器および関連する試験条件のために事前に決定することができる。
【００６８】
図１２に示す、エリア対ピークプロット１２００において、単一粒子信号のエリア（線で示す）は、ピークに対して比例的に増大する。一方、分岐前（丸で示す）または分岐後（点線で示す）に関わらず、２つの粒子同時発生信号のエリアは、一定のままであり、それは、０．４ピーク信号のエリアの２倍である。これは、２つの粒子のエリアが、これらの２つの粒子が同時に測定領域を通って通過する限り、各粒子のエリアの合計と同等であるという事実によって説明することができる。したがって、すべての単一粒子は、エリア対ピークの散乱プロット上の基点を通る斜線を形成し、一定のエリア対ピークの比率を有する一方、同時発生粒子は、散乱プロット上の単一粒子線の左およびその上に位置し、それらのエリア対ピークの比率は、上昇する。これは、エリア対ピークの比率が同時発生パルス（分岐前および分岐後タイプの両方を含む）と非同時発生パルスを区別するために使用することができることを意味することができる。
【００６９】
本発明の他の実施形態は、上述の同時発生事象を決定する方法のうちの１つ以上を使用することができることに留意されたい。一般に、所定閾値とのＴ５０の比較は、最大ロバスト結果を提供する。しかしながら、いくつかの実施形態はまた、決定の信頼性を増大させるために、Ｈ５０対ピークおよび／またはエリア対ピークを介する同時発生決定を含んでもよい。
【００７０】
（５分類試験への適用例）
図１３、１４、１５、１６および１７は、本発明の１つ以上の実施形態に従う、種々の寸法の血液細胞を含有する、血液検体上の同時発生の同定を図示する。検体は、正常な白血球細胞濃度を有し、それは、比較的低いレベルの同時発生を意味する。図１３において、ＤＣピークおよびＬＳピークに対応する軸を有する５分類散乱プロット１３００を示す。この真の検体上の大半のＴ５０値は、一定であり、図１４において直線の水平線を形成する。残り（矩形１４０２内に位置する）は、分岐前または分岐後の同時発生信号として同定される信号に対応する、より大きい不規則なＴ５０値を有する。図１４は、Ｔ５０対ピーク（図９）の模擬結果に対応する。
【００７１】
図１５は、Ｔ５０で同定される同時発生信号が、ＤＣＨ５０対ピークの間隙に突出するときに得られる散乱プロット１５００を示す。Ｔ５０で同定される同時発生パルスの大半は、対応するピークと比較してより小さいＨ５０を呈し、それは、これらが分岐後の同時発生パルスであることを示す。Ｔ５０で同定される同時発生パルスのうちのいくつかは、等価のＨ５０およびピークを有する。これらは、分岐前の同時発生パルスであり、それは、Ｈ５０ではなくＴ５０またはエリア対ピークの比率で差別することができる。
【００７２】
図１６に示すＤＣＨ５０対ＤＣエリアの散乱パターン１６００は、基点および斜線の下の他の散乱した点を通る斜線を形成する事象から成る。前者は、非同時発生の白血球細胞を表す。後者は、より低いＨ５０対エリアの比率で「クラウド」を形成し、かつ同時発生粒子を表してもよい（１６０２）。
【００７３】
ＤＣエリア対ピークの散乱パターン１７００が、基点および斜線の上の散乱した点を通る斜線から成る、図１７においても確認することができる。前者は、非同時発生の白血球細胞を表す。後者は、より高いエリア対ピーク比で「クラウド」を形成し、かつ同時発生粒子を表してもよい。図１４の同時発生点（１４０２）が、図１７の同時発生点（１７０２）と比較される場合には、Ｔ５０閾値化およびエリア対ピークの比率の閾値化からの結果が相互に一致することを確認することができる。
【００７４】
（他の実施形態例）
本発明の別の実施形態においては、複数の測定パラメータのそれぞれは、同時発生事象を決定するために独立して使用されてもよい。複数の測定パラメータを使用して独立して決定された同時発生を有する結果は、最終決定に到達するために相互に関連付けられてもよい。そのような方法は、種々の条件において同時発生事象を検出する上で各測定パラメータの敏感性の影響が低減される、同時発生事象のよりロバスト決定を提供してもよい。例えば、同時発生の最終決定は、測定パラメータのうちの少なくとも１つによって同時発生としてフラッグされる事象のために行われてもよい。
【００７５】
図１８は、本発明の別の実施形態を示す。本発明の実施形態に従うシステム１８００には、分析器１２２に結合される粒子検出器１２４が挙げられる。分析器１２２はまた、ディスプレイ１８２０および記憶装置１８２１に結合されてもよい。粒子検出器１２４は、１つ以上の測定パラメータを使用して粒子事象を検出し、測定領域内のその粒子の持続時間を表す各粒子事象のための信号を構築するために、検出された測定パラメータを処理する信号プロセッサ１１８を含む。先述のように、信号プロセッサ１１８は、各信号のために、ピーク、ならびに信号エリアまたはＴ５０およびＨ５０パラメータのうちの１つ以上を決定する。測定領域内の粒子の持続時間に対応する信号の組立ておよびその信号に対応するパラメータの決定の命令は、ハードウエア記述言語（ＨＤＬ）、アセンブリ、ＣおよびＣ＋＋を含む、任意の好適なプログラミング言語で実施することができ、かつハードウエア、ファームウエア、またはソフトウエア構成要素のうちの１つ以上を含んでもよい。一実施形態においては、信号の組み立て、ならびにピーク、Ｈ５０、Ｔ５０、およびエリア等の信号パラメータの決定は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）で実施することができ、同時発生のための閾値比較は、ソフトウエアで実施することができる。
【００７６】
図１に関して上述のように、分析器１２２は、粒子分析器１００内に位置する、または通信媒体１８４０を介して粒子検出器１２４に個別に結合されて位置してもよい。分析器１２２は、粒子検出器１２４によって検出される各粒子によって生成される信号に対応する事象データを受信する。事象データは、位置データならびに対応する信号のためのピーク、信号エリア、Ｔ５０およびＨ５０測定を含む計算されたパラメータを含むことができる。
【００７７】
分析器１２２は、プロセッサ１８０２、メモリデバイス１８０３、記憶デバイス１８０４、入力デバイス１８０５、出力デバイス１８０６、同時発生モジュール１８０７および通信デバイス１８０８を含む、構成要素を含む。プロセッサ１８０２は、任意のマイクロプロセッサまたは処理命令を実行することが可能な他のプロセッサである可能性がある。メモリデバイス１８０３は、ランダムアクセスメモリを含むことができる。記憶デバイス１８０４は、フラッシュメモリまたはハードディスク等の持続的記憶媒体を含む。プロセッサ１８０２は、粒子分析器から事象データを受信し、受信したデータを処理し、処理した結果データを出力するための命令を実行する。メモリデバイス１８０３および記憶デバイス１８０４は、プロセッサ１８０２の任意の一時的または永久的メモリおよび必要な記憶を提供する。通信デバイス１８０８は、分析器１２２の構成要素を互いに相互接続し、かつペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ）バスまたは拡張業界標準アーキテクチャ（ＥＩＳＡ）バスが挙げられるが、それらに限定されない、通信媒体を含んでもよい。入力デバイス１８０５は、接続デバイス１８４０を介する粒子分析器１００への接続および粒子分析器１００から事象データを含むデータを受信する能力を含むことができる。接続１８４０は、イーサネット（登録商標）等のネットワーク接続デバイス、またはＰＣＩもしくはＥＩＳＡバス等の内部接続デバイスである可能性がある。
【００７８】
同時発生モジュール１８０７は、各事象における同時発生を決定するために、位置データを含む事象データ、および粒子検出器１２４から受信される対応する信号パラメータを処理するための機能性を含む。例えば、上述のように、ピーク、信号エリア、Ｔ５０およびＨ５０パラメータのうちの１つ以上は、粒子サンプルの対応するサブサンプル内の同時発生事象の存在を決定するために、同時発生モジュール１８０７によって使用することができる。いくつかの実施形態においては、同時発生モジュール１８０７は、複数の測定パラメータを使用して独立して決定される信号パラメータを受信し、かつ対応する事象における同時発生に関する最終決定に到達するために異なる決定を相互に関連付けることができる。
【００７９】
出力モジュール１８０６は、適用に適切な方法で同時発生事象を処理するための機能性を含む。一実施形態においては、出力モジュールは、同時発生事象を占めることによって、１つ以上の粒子数を調整することができる。例えば、各同時発生事象は、対応する粒子数が１ではなく２ほど増分させてもよい。別の実施形態においては、出力モジュール１８０６は、同時発生と決定される事象を排除することができる。例えば、結果データは、同時発生として検出される事象のうちのいずれかを除き、生成することができる。入力モジュール１８０５、同時発生モジュール１８０７および出力モジュール１８０６の機能性を達成するための命令は、ハードウエア、ファームウエア、ソフトウエア、またはそれらの組み合わせを使用して実施することができる。
【００８０】
出力モジュール１８０６は、通信デバイス１８５０を使用してディスプレイ１８２０および／または記憶デバイス１８２１に結合される。通信媒体１８５０は、イーサネット（登録商標）等のネットワーク接続またはＰＣＩもしくはＥＩＳＡバス等のデバイス内部接続方法を含むことができる。出力モジュール１８０６からの結果データは、オペレータによって表示および分析される、ディスプレイ１８２０に送達される。例えば、ディスプレイ１８２０は、散乱プロットの形態の結果データを図示してもよい（その実施例を図２Ｂに図示する）。別の実施形態においては、結果データは、その後の処理および分析のために、外部記憶デバイス１８２１内に単に記憶されてもよい。
【００８１】
この開示において、事象の検出において生じる同時発生事象の同定および処理を介して、血液サンプル分析を含む、正確な粒子分析を改善することができる方法およびシステムを開示した。開示する方法およびシステムは、現在の方法およびシステムよりも実質的な改善をもたらし、粒子分析器データの分析において有意な改善につながることができる。当業者は、本明細書に開示する技術が多くの生物学的または工業的粒子に適用可能である可能性があり、かつ電気的、光学的、または音響的測定デバイスを使用して多くの検出方法にも適用可能であることを理解するであろう。
【００８２】
本発明の先述の説明は、図示および説明目的で提示されている。本発明を開示する正確な形態に徹底される、または制限されることを意図せず、他の修正および変化は、上記の教示を考慮して可能であってもよい。実施形態は、本発明の目的およびその実践的適用を最もよく説明し、それによって、当業者が意図する特定の使用に適するとして、種々の実施形態および種々の修正に最もよく使用することを可能にするために本発明を選択し、説明した。付属の請求項は、先行技術によって限定される範囲を除く、本発明の他のさらなる実施形態を含むように構成されることを意図する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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