(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
Ｘｍ−Ｇ−ＣＬｎ
の化合物もしくは以下の一般式：
【化１Ａ】
0005596731.tif 000018
の化合物、またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩であって、ここで：
Ｇは、サイクラム環構造、ならびにアミド結合、エステル結合および／またはエーテル結合からなる足場構造であり；
ＣＬは、金属配位中心を有するキレーター基であって、該キレーター基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ポルフィリン系、サリチル酸誘導体、１，２−ジアミノエチル二酢酸、ジアミノエチル三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、およびそれらの塩または組み合わせからなる群より選択され、スペーサー基Ａが、ＣＬとＧとの間に配置され、該スペーサー基Ａは、ポリ（エチレングリコール）、オリゴ（エチレングリコール）、ペプチド、ｎが１〜８である（ＣＨ２）ｎおよびオリゴプロリンからなる群より選択され；
Ｘは、ＮＨＲからなる群より選択されることによって特徴付けられる官能基であって、Ｒは、Ｈ、アルキルもしくはアリール、ＣＯＯＨ、ｎが整数である（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、ＳＨ、マレイミド、アセトアミド、イソチオシアネートまたはシアネートからなる群より選択される官能基であり；
ｍは、整数であり、そして少なくとも１であり；そして
ｎは、整数であり、そして少なくとも２である、
化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩であって、該化合物は、金属イオンが、キレーター基の各々に結合されることを特徴とする、化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項３】
前記金属イオンが、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、および全てのランタニドイオンからなる群より選択される、請求項２に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項４】
前記キレーター基の反応基が、保護基を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項５】
Ａが、直鎖状であるか、または分枝状である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩であって、該化合物は、前記キレーター基が、アミド結合、エステル結合またはエーテル結合を介して前記足場構造に結合されることによって特徴付けられる、化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項７】
ｎは３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項８】
以下：
【化１】
0005596731.tif 000019
またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩であって、該化合物は、プローブＦまたは官能性のユニットＦが、カップリング基Ｘにおいて結合されることを特徴とする、化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項１０】
請求項９に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩であって、該化合物は、前記プローブＦまたは官能性のユニットＦが、フルオロフォア、ＦＲＥＴ−フルオロフォア、蛍光消光剤、リン光化合物、発光化合物、吸収性化合物、ポリマー、ＰＥＧ、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ビオチン、ハプテン、ペプチド、タンパク質、酵素、架橋剤、オリゴエチレングリコール、脂質、ナノ粒子、電子密度増幅因子、金クラスター、金属クラスター、量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項１１】
以下：
【化２】
0005596731.tif 000020
【化３】
0005596731.tif 000021
【化３Ｂ】
0005596731.tif 000022
【化３Ｃ】
0005596731.tif 000023
から選択される化合物、またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物、またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項１２】
前記プローブＦまたは官能性のユニットＦと、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩とを含む結合体であって、該プローブＦまたは官能性のユニットＦは、該化合物のカップリング基Ｘに結合している、結合体。
【請求項１３】
前記プローブＦまたは官能性のユニットＦが、フルオロフォア、ＦＲＥＴ−フルオロフォア、蛍光消光剤、リン光化合物、発光化合物、吸収性化合物、ポリマー、ＰＥＧ、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ビオチン、ハプテン、ペプチド、タンパク質、酵素、架橋剤、オリゴエチレングリコール、脂質、ナノ粒子、電子密度増幅因子、金クラスター、金属クラスター、量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されることによって特徴付けられる、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
【化２Ａ】
0005596731.tif 000024
【化２Ｂ】
0005596731.tif 000025
および
【化２Ｃ】
0005596731.tif 000026
から選択される、請求項１２または１３に記載の結合体、またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩を生成するための方法であって、該方法は、前記足場構造の合成後か、または合成の間において、少なくとも２つのキレーター基を該足場構造に対してカップリングする工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記キレーター基が、保護されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合体を含む、標的分子におけるアフィニティータグへの結合のための組成物であって、該アフィニティータグは、金属−キレーター錯体に結合する、組成物。
【請求項１８】
前記アフィニティータグは、４個〜１５個のヒスチジンおよび０個〜４個の塩基性アミノ酸を含む４個〜１５個のアミノ酸を含むペプチドタグである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物もしくはタンパク質模倣物、またはペプチド改変ポリマーもしくはペプチド改変デンドリマーである、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合体を含む、改変、カップリング、オリゴマー化、検出、モニタリング、分析のため、またはインビトロ、生細胞もしくは脂質小胞における標的分子の検出のための組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合体を含む標的分子の固定化のための組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物であって、前記化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩が、表面結合または脂質単一層もしくは脂質二重層に含まれることを特徴とする、組成物。
【請求項２３】
前記表面は、ガラス型表面、金、銀、ＤＡＰＥＧで改変したガラス、ＰＥＧポリマーで改変したガラスもしくはＰＥＧポリマーで改変した金、ＧＯＰＴＳでシラン処理したガラス、脂質単一層もしくは脂質二重層、セレン化金属、テルル化金属、および硫化金属を備えるガラス型表面および金表面から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合体を含む自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の生産のための組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合体を含む、官能性のマイクロ構造表面および官能性のナノ構造表面の生産ならびに／またはプロテインアレイの生産のため組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその互変異性体、異性体、無水物、酸もしくは塩、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合体を含む、標的分子の精製のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の説明）
本発明は、多価キレーター（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）化合物、多価キレーター化合物の生成のための方法、ならびに金属−キレーター錯体に結合するアフィニティータグを有する標的分子の改変および／または固定化のための多価キレーター化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
分光学的もしくは微視的なプローブまたは（生）化学的な官能性のユニットを用いた、組換えタンパク質の選択的な非共有結合性の改変は、プロテオーム分析および生物工学用途に関する中心的な課題である。原理において、このような改変は、いわゆるアフィニティータグ（すなわち、遺伝子工学によってタンパク質中に導入される短いペプチド配列）の手段による部分的な特異性を用いて実現される。これらのアフィニティータグは、（生）化学的な認識単位によって特異的に認識される。精製のためには、数種のアフィニティータグが非常に首尾よく利用されたが、溶液中かつ表面への、分光学的もしくは微視的なプローブおよび他の生化学的な官能性のユニットの結合のためのアフィニティータグの使用は、その錯体が十分な安定性を示さないので、多くの場合、批判的である。
【０００３】
１９７０年代半ば以来、キレーターイミノ二酢酸（ＩＤＡ）は、既に、タンパク質を精製するために、数種の金属イオンと組み合わせて使用されている（非特許文献１）。
【０００４】
１９８０年代半ばにおいて、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）は、タンパク質を精製するためのキレーターとして記載された（特許文献１、特許文献２）。さらに、（累積した）ヒスチジンタグは、組換えタンパク質の一般的な精製のために記載された（非特許文献２；特許文献３、特許文献４を参照のこと）。現在、圧倒的に最も一般的に使用されるアフィニティータグは、ヒスチジンタグによるものであり、そしてキレーターに結合した金属イオンとの相互作用に依存する最も多様なマトリックスおよび検出技術が、記載されている（非特許文献３）。それにもかかわらず、個々のＮｉ−ＮＴＡ−オリゴヒスチジン相互作用の結合親和性は、安定でありかつ化学量論的に定義された結合のためには低すぎる。部分的に安定な結合は、親和性マトリックス、または平面における高密度のＮＴＡ基によって達成され得る（例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）。それにもかかわらず、多くの用途（特に、溶液またはインビボ（例えば、生細胞）におけるタンパク質の操作）のために、分子レベルにおける高い結合安定性が必要とされる。
【０００５】
第１に、アフィニティータグと金属キレーターとの間の結合を改良するために、このアフィニティータグを操作することは、１つの可能性である。したがって、一方では、一般的な６個のヒスチジン残基の代わりに１０個のヒスチジン残基を使用する伸長されたヒスチジンタグが、例えば、Ｇｕｉｇｅｔらによって記載される（非特許文献８）。それにもかかわらず、この様式において、化学量論的に定義てもいないし、安定でもない錯体しか得ることができない。他方では、２つのヒスチジンタグを有し、したがってＮｉ−ＮＴＡ−チップの表面に、より安定に結合するタンパク質およびタンパク質錯体が、記載されている（非特許文献９）。それにもかかわらず、全てのタンパク質に対して、その生物学的機能に大きく影響することなく、末端に１つより多いアフィニティータグが提供され得るとは限らない。
【０００６】
結合を上昇させるための他の可能性は、キレーター基自体を改良することからなる。したがって、特許文献５（および非特許文献１０）においてＥｂｒｉｇｈｔおよびＥｂｒｉｇｈｔは、例えば、フルオロフォアのような検出可能な基によるタンパク質のインサイチュにおける標識のための、二価キレーター錯体を記載している。これらの錯体は、一価の錯体と比較して、Ｈｉｓタグに対する改良された親和性を示す。それにもかかわらず、この２つのキレーター基（ＮＴＡ）は、検出可能な基に直接結合され、このことがこの２つのキレーター基を広範な合成には利用しづらくしている。むしろ、それらの生成についての可能性は、常に、選択された検出可能な基の、合成に対する適合性に依存する。
他の二官能性のカルボキシメチル置換キレーターが、Ｋｌｉｎｅらによって記載される（非特許文献１１）。これらのキレーターは、標的タンパク質に共有結合し得、そして触媒活性を有する金属錯体を用いた標識のために開発された。
標的タンパク質の安定かつ選択的な標識または改変が、Ｇｒｉｆｆｉｎらによって記載される（非特許文献１２）。４個のシステインを含む組換えタンパク質中の特定のモチーフ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を特異的に認識する二ヒ素錯体（ｂｉ−ａｒｓｅｎｉｃ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が、開示される。この二ヒ素錯体は、フルオロフォアのような検出可能な基を含み得、それによって標的タンパク質を改変するか、または標識する。この技術はまた、特許文献６においてＴｓｉｅｎらによって記載され、そして特許文献７においてＥｂｒｉｇｈｔおよびＥｂｒｉｇｈｔによって記載される。それにもかかわらず、これらの二ヒ素錯体の使用は、それぞれの二ヒ素誘導体の困難な合成、ならびに特定のフルオロフォアおよび発色団のみが可能であるという事実によって制限される。さらに、必要とされるような、システインが豊富なアフィニティータグまたはモチーフは、遊離のチオール基の高い反応性に起因して、多くの使用に関して不利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第０２５３３０３Ｂ１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，８７７，８３０号明細書
【特許文献３】欧州特許第０２８２０４２Ｂ１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，２８４，９３３号明細書
【特許文献５】国際公開第０３／０９１６８９号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，００８，３７８号明細書
【特許文献７】国際公開第０３／１０７０１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ｊ、Ｏｌｓｓｏｎ  Ｉ、Ｂｅｌｆｒａｇｅ  Ｇ、「Ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、第２５８巻、第５５３６号、ｐ．５９８−９
【非特許文献２】Ｈｏｃｈｕｌｉ  Ｅ、Ｄｏｂｅｌ  Ｈ、Ｓｃｈａｃｈｅｒ  Ａ、「Ｎｅｗ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、１９８７年、第４１１巻、ｐ．１７７−８４
【非特許文献３】Ｕｅｄａ  ＥＫ、Ｇｏｕｔ  ＰＷ、Ｍｏｒｇａｎｔｉ  Ｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、２００３年、第９８８巻、第１号、ｐ．１−２３
【非特許文献４】Ｄｏｒｎ  Ｉ．Ｔ．、Ｐａｗｌｉｔｓｃｈｋｏ  Ｋ．、Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒ  Ｓ．Ｃ．、Ｔａｍｐｅ  Ｒ．、「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  ｃｈｅｌａｔｏｒ  ｌｉｐｉｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第３７９巻、第８号〜第９号、ｐ．１１５１−９
【非特許文献５】Ｆｒｅｎｚｅｌ  Ａ、Ｂｅｒｇｅｍａｎｎ  Ｃ、Ｋｏｈｌ  Ｇ、Ｒｅｉｎａｒｄ  Ｔ、「Ｎｏｖｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ６ｘＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、２００３年、第７９３巻、第２号、ｐ．３２５−９
【非特許文献６】Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ＬＲ、Ｄｕｎｎ  ＫＥ、Ｇｉｂｂｓ  ＣＳ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ＪＰ、「Ａ  ｎｉｃｋｅｌ  ｃｈｅｌａｔｅ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｉｘ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９６年、第２３４巻、第１号、ｐ．６０−５
【非特許文献７】Ｌａｕｅｒ  ＳＡ、Ｎｏｌａｎ  ＪＰ、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉ−ＮＴＡ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２００２年、第４８巻、第３号、ｐ．１３６−４５
【非特許文献８】Ｇｕｉｇｎｅｔ  ＥＧ、Ｈｏｖｉｕｓ  Ｒ、Ｖｏｇｅｌ  Ｈ、「Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｓｉｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００４年、第２２巻、第４号、ｐ．４４０−４
【非特許文献９】Ｎｉｅｂａ  Ｌ、Ｎｉｅｂａ−Ａｘｍａｎｎ  ＳＥ、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ａ、Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ  Ｍ、Ｅｄｅｂｒａｔｔ  Ｆ、Ｈａｎｓｓｏｎ  Ａ、Ｌｉｄｈｏｌｍ  Ｊ、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｋ、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ＡＦ、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  Ａ、「ＢＩＡＣＯＲＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＮＴＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９７年、第２５２巻、第２号、ｐ．２１７−２８
【非特許文献１０】Ｋａｐａｎｉｄｉｓ  ＡＮ、Ｅｂｒｉｇｈｔ  ＹＷ、Ｅｂｒｉｇｈｔ  ＲＨ、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ（Ｎｉ（２＋）：ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ（ｎ）−ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、第４８号、ｐ．１２１２３−５
【非特許文献１１】Ｋｌｉｎｅ  ＳＪ、Ｂｅｔｅｂｅｎｎｅｒ  ＤＡ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＫ、「Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒｓ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｙｌ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ３−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−３−ａｚａｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ、３，１２−ｔｏ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−６，９−ｄｉｏｘａ−３，１２−ｄｉａｚａｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ、ａｎｄ  １，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、１９９１年、第２巻、第１号、ｐ．２６−３１
【非特許文献１２】Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＢＡ、Ａｄａｍｓ  ＳＲ、Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｓｉｄｅ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第２８１巻、第５３７４号、ｐ．２６９−７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、当該分野において公知であり、そして広く使用されるアフィニティータグ（例えば、オリゴヒスチジンタグ）に結合するための多価キレーターを提供することであり、この多価キレーターは、化学量論的で、安定したアフィニティータグとの相互作用を示し、そして転換可能かつ可逆的に標的分子と相互作用する。これによって、標的分子は、一般的に、多数のプローブおよび他の生化学的に官能性のユニットを用いて、選択的かつ位置特異的な様式で改変され得る。さらに、この多価キレーターは、制御されかつ普遍的な、多数のプローブおよび他の生化学的に官能性のユニットとの結合体化のような方法で、合成的に利用しやすい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に従って、この目的は、一般式：
Ｘｍ−Ｇ−ＣＬｎ
の化合物であって、ここで：
Ｇは、足場構造であり；
Ｘは、プローブＦまたは官能性のユニットＦに対するカップリング基であり；
ＣＬは、少なくとも１つの金属配位中心を有するキレーター基であり；
ｍは、整数でありかつ少なくとも１であり；そして
ｎは、整数でありかつ少なくとも２である、
化合物、ならびにその互変異生体、異性体、無水物、酸および塩を提供することによって解決される。
【００１１】
好ましい実施形態において、足場構造Ｇは、２個〜２５個の炭素原子、好ましくは２個〜２０個の炭素原子、およびさらに好ましくは５個〜１６個の炭素原子を有する飽和炭水化物鎖を含む。さらに、上記足場構造は、アミド結合、エステル結合および／またはエーテル結合を含む。
【００１２】
上記足場構造は、直鎖状であっても、分枝状であっても、閉じていてもよい。好ましい閉じた足場構造は、サイクラム環（ｃｙｃｌａｍ  ｒｉｎｇ）構造によって表される。好ましい足場構造は、アミノ酸エレメントを含む。
【００１３】
好ましい実施形態において、少なくとも１種の金属イオンが、本発明に従う化合物のキレーター基の各々に結合される。それに関して、上記金属イオンは、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、および全てのランタニドイオンからなる群より選択される。
【００１４】
上記キレーター基は、好ましくは、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ポルフィリン系の全ての改変体、サリチル酸誘導体、１，２−ジアミノエチル二酢酸、ジアミノエチル三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、およびそれらの塩または組み合わせ、ならびに当業者に公知である他のキレーター基からなる群より選択される。好ましい実施形態において、上記キレーター基の反応基は、保護基を有する。例えば、カルボキシル基（例えば、ＮＴＡのカルボキシル基）は、ＯｔＢｕ基によって保護され得る。当業者に公知である全ての一般的な保護基が、使用され得る。
【００１５】
さらなる実施形態において、スペーサー基Ａが、上記キレーター基と上記足場構造との間に配置される。上記スペーサー基Ａは、直鎖状であっても、分枝状であってもよい。当業者に公知である通常のスペーサー基が、使用され得る。好ましいスペーサー基は、ポリ（エチレングリコール）、オリゴ（エチレングリコール）、ペプチド、ｎが１〜８である（ＣＨ２）ｎ、オリゴプロリンを含む。
【００１６】
上記キレーター基は、アミド結合、エステル結合またはエーテル結合を介して上記足場構造に結合されることが、好ましい。
【００１７】
本発明に従って、足場構造Ｇ自体は、プローブまたは別の検出可能な基でないことが、好ましい。好ましくは、Ｇは、上記キレーター基およびプローブまたは官能性のユニットが結合される構造である。
【００１８】
好ましくは、本発明に従う化合物は、以下：
【００１９】
【化４】
0005596731.tif 000002
ならびにその互変異生体、異性体、無水物、酸および塩から選択される。
【００２０】
好ましいカップリング基Ｘは、ＮＨＲからなる群より選択され、Ｒは、Ｈ、アルキル残基またはアリール残基、ＣＯＯＨ、ｎが整数である（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、ＳＨ、マレイミド（ｍａｌｅｉｎｉｍｉｄｅ）、ヨードアセトアミド、イソチオシアネートまたはシアネ−トである。
【００２１】
好ましい実施形態において、プローブＦまたは官能性のユニットＦは、本発明に従う化合物のカップリング基Ｘにおいて結合される。上記プローブＦまたは官能性のユニットＦは、好ましくは、フルオロフォア、ＦＲＥＴ−フルオロフォア、蛍光消光剤、リン光化合物、発光化合物、吸収性化合物（ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、ポリマー、ＰＥＧ、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ビオチン、ハプテン、ペプチド、タンパク質、酵素、架橋剤、オリゴ（エチレングリコール）、脂質、ナノ粒子、電子密度増幅因子、金クラスター、金属クラスター、量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２２】
プローブとして適切であるフルオロフォアおよび発色団の例は、Ｈａｕｇｈｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．、１９９６、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、第６版（Ｓｐｅｎｃｅ，ＭＴＺ編）に見出され得る。
【００２３】
好ましくは、本発明に従う化合物は、以下：
【００２４】
【化５】
0005596731.tif 000003
【００２５】
【化６】
0005596731.tif 000004
ならびにその互変異生体、異性体、無水物、酸および塩から選択され、（Ａ）は、ビス−ＮＴＡであり、（Ｂ）および（Ｃ）は、トリス−ＮＴＡであり、そして（Ｄ）は、テトラキス−ＮＴＡである（図１も参照のこと）。
【００２６】
一般的に、上記多価キレーターは、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のような数個の（独立した）キレーター基（それでもなお、好ましくは２個〜４個）が分子足場（足場Ｇ）に結合し得る一方で、同時に、官能基（カップリング基Ｘ）がプローブＦまたは官能性のユニットＦにカップリングするために提供されるという点で特徴付けられ得る。プローブまたは官能性のユニットに対する結合の重要な必要条件は、キレーター基の官能基（例えば、ＮＴＡの場合における３つのカルボキシル基）に対するこのカップリング基Ｘの化学的な直交性である。図１に示されるような多価キレーターの場合において、これは、カルボキシル基における保護基によって達成された（図２を参照のこと）。ここで、さらなる官能基（Ｘ）における選択的カップリング反応は、上記キレーター基に影響することなく行われ得る。
【００２７】
さらに、上記目的は、本発明に従う化合物を生成するための方法を提供することによって解決される。この方法は、上記足場構造の合成後か、または合成の間における、少なくとも２つのキレーター基のその足場構造に対するカップリングを包含し、上記キレーター基は、適切な様式で保護され得る。本発明に従う方法の間、上記カップリング基Ｘはまた、適切に保護され得る。
【００２８】
本発明に従う上記足場構造の合成は、１種または数種の出発化合物（特に、アミノ酸（例えば、リジン）、オルニチン、１，３−ジアミノ酪酸、１，２−ジアミノプロピオン酸、グルタメートもしくはアスパルテートおよび／またはそれらの保護された誘導体（例えば、Ｚ−Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＢｚｌ、Ｚ−Ｇｌｕ−ＯＨ））からの足場構造の合成を包含する。
【００２９】
さらに好ましい出発化合物は、ブロモ酢酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ＢＯＣ−ε−アミノカプロン酸および大環状ポリアミン（例えば、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン）である。
【００３０】
好ましい中間体は、Ｎα，Ｎα−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）メチル］−Ｌ−リジン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（「Ｌｙｓ−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ」、図２５の化合物３）である。
【００３１】
本発明に従う生成のための方法は、好ましくは、第１に上記足場構造の合成を包含する。次いで、上記キレーター基は、その足場構造とカップリングする。したがって、上記キレーター基は、適切な保護基を有し得る。したがって、上記足場構造は、好ましくは、環状足場構造（例えば、サイクラム環構造）である。
【００３２】
本発明に従う生成のための方法は、上記足場構造が保護アミノ酸またはアミノ酸から誘導される化合物から構成され得ることを含む。このことのために、既に上記足場構造の合成の間に、保護キレーター基が含まれることが好ましい。上記足場構造のための出発化合物は、当業者に公知であるペプチド合成の代表的な出発産物を構成し得る。このことのために、好ましい足場構造は、直鎖状であるか、または分枝状（すなわち、デンドリマー状（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ））である。
【００３３】
カルボキシル官能化された足場構造が、アミノ官能化された保護キレーター基によって改変されるか、またはアミノ官能化された足場構造が、カルボキシル官能化された保護キレーター基によって改変されることが、好ましい。
【００３４】
スキームＩにおいて、好ましい合成経路の概略図が、見出され得る。（Ａ）において、アミノ官能化された保護キレーターエレメントによってカルボキシルベースの足場が、改変される（図３Ａも参照のこと）。上記保護された官能基（カップリング基）Ｘ−Ｐは、選択的（Ｉ）か、または上記キレーター基と一緒（ＩＩ）に脱保護され、次いでプローブＦまたは官能性のユニットＦとカップリングされ得る。（Ｂ）は、カルボキシル官能化された保護キレーターエレメントによって改変されるアミノ官能化された足場についての類似する合成経路を示す（図３Ｂも参照のこと）。次に、中間体１または２が、合成の第１工程においてキレーターエレメントとして使用され得る（実施例９も参照のこと）。
【００３５】
（スキームＩ）
【００３６】
【化７】
0005596731.tif 000005
ここで：
Ｘは、カップリング基であり；
Ｐは、保護基であり；
Ｆは、プローブまたは官能性のユニットであり；そして
ＣＬは、キレーター基である。
【００３７】
２個、３個および４個の金属配位中心を有する多価キレーターが、デンドリマー状の足場および環状の足場（すなわち、化学的な基本足場）に基づいて合成された（図１および実施例を参照のこと）。
【００３８】
ビス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ、テトラキス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕおよびビス−ＮＴＡ−脂質の生成のために、実施例９および図２５に示されるような合成の工程が、好ましい。
【００３９】
トリス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕおよび異なるフルオロフォア（特に、フルオロフォアＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、ＡＴＴＯ  ５６５、ＦＥＷ−Ｓ０３８７（これについては、図１４も参照のこと）を含む）を有するそれらの誘導体の生成のために、実施例９および図２６に示されるような合成の工程が、好ましい。
【００４０】
さらに、上記目的は、アフィニティータグが金属−キレーター錯体に結合する、標的分子上のアフィニティータグに結合するための本発明に従う化合物の使用によって解決される。
【００４１】
好ましくは、上記アフィニティータグは、４個と１５個との間のアミノ酸を含むペプチドタグである。この４個〜１５個のアミノ酸の場合において、これらは、好ましくは４個〜１５個のヒスチジンである。さらに、０個〜４個の塩基性アミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）が、上記ペプチドタグに含まれ得る。
【００４２】
好ましいアフィニティータグは、（Ｈｉｓ）ｎタグであり、ｎは、４と１５との間の整数である。
【００４３】
好ましい標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ならびにペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）およびタンパク質模倣物、ならびにペプチド改変ポリマーもしくはペプチド改変デンドリマーを含む。これに関して、タンパク質またはペプチドによって、翻訳後に修飾されたタンパク質またはペプチドがまた、認識される。ペプチド模倣物およびタンパク質模倣物は、ペプチドまたはタンパク質のような類似する側鎖官能性を含むが、骨格の組成においてペプチドまたはタンパク質と異なる化合物を含む。上記骨格の可能なバリエーションは、骨格原子の改変（骨格模倣物）、二環式ジペプチドアナログの導入、および非オリゴマー鎖構造中の官能基の配置（足場模倣物）を含む。例えば、オリゴ−Ｎ−アルキルグリシン（ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ））は、骨格模倣物に属し、これは、側鎖の結合点においてペプチドまたはタンパク質と異なる（Ｃαの代わりにＮである）。
【００４４】
好ましくは、本発明に従う化合物は、改変、固定化、カップリング、精製、検出、モニタリング、分析、またはインビトロ、インビボ、インサイチュ、固定細胞および生細胞もしくは脂質小胞における標的分子の検出のために使用され得る。
【００４５】
本発明に従う化合物のさらに好ましい使用は、標的分子（特に、タンパク質）の上記分子の官能性のユニットとの、制御されかつ可逆的な二量化またはオリゴマー化である。
【００４６】
本発明に従う化合物は、当該分野において公知である多くのインビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて使用され得る。好ましいアッセイ法は、分光学的方法（例えば、吸収分光法、蛍光分光法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光退色（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）（フォトブリーチング後の蛍光回復（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）、ＦＲＡＰ）、反射率測定干渉分光法（ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＲＩｆＳ）、表面プラスモン分光法（表面プラズモン共鳴）／ＢＩＡＣＯＲＥ、光走査カップリング（ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、水晶発振子マイクロバランス（ｑｕａｒｔｚ−ｍｉｃｒｏ  ｂａｌａｎｃｅ）、弾性表面波（ＳＡＷ）、ｘ／ｙ−蛍光スキャニング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｉｎｇ））、および顕微鏡的方法（例えば、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、反射顕微鏡、コントラスト増強顕微鏡（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡）を含むが、他の方法（例えば、磁気共鳴法、顕微鏡による断層撮影（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、インピーダンス分光法、電界効果トランジスタ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光標示式の細胞または粒子の分取（ＦＡＣＳ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、オートラジオグラフィー、分析用ゲル濾過、ストップトフロー技術、熱量測定、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）、アレイ技術およびチップ技術（例えば、プロテインアレイ））も含む。
【００４７】
標的分子の固定化のための本発明に従う化合物の使用が、さらに好ましい。
【００４８】
このことのために、本発明の化合物は、表面上に結合されることもできるし、脂質単一層または脂質二重層中に含まれることもできる。したがって、上記表面は、好ましくは、ガラス型表面（例えば、メタロイド酸化物、金属酸化物および全てのガラス型／ガラス、金、銀、ＤＡＰＥＧで改変したガラス、ＰＥＧポリマーで改変したガラスもしくはＰＥＧポリマーで改変した金、ＧＯＰＴＳでシラン処理したガラス、脂質単一層もしくは脂質二重層、セレン化金属、テルル化金属、および硫化金属を備えるガラス型表面ならびに貴金属表面から選択される。
【００４９】
ガラス表面によって、ガラス型表面が、ガラスに加えて、水晶、雲母、金属酸化物、メタロイド酸化物もまた含むことが理解されるべきである。
【００５０】
貴金属表面上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を生成するための本発明に従う使用が、好ましい。ＳＡＭは、好ましくは、表面プラスモン分光法、インピーダンス分光法、走査型プローブ顕微鏡および水晶発振子マイクロバランスに基づく方法において使用される。
【００５１】
さらに、本発明の化合物は、官能性のマイクロ構造表面および官能性のナノ構造表面の生産ならびに／またはプロテインアレイの生産のために使用され得る。
【００５２】
多価キレーター（ＭＣＨ）を介するいくつかの規模によってタンパク質とキレーターとの結合の安定性を増加させるために、過剰量のオリゴヒスチジンタグを使用することが、本発明の基本的な概念である。
【００５３】
金属−キレーター錯体に対するオリゴヒスチジンタグの結合は、一般的に、キレーターによって錯体化され、それによって一部、配位的に飽和されるＮｉ２＋における空いている（ｆｒｅｅ）配位位置に対するオリゴヒスチジンタグのイミダゾール残基のＮ原子の配位結合によって起こる。Ｎｉ−ＮＴＡ錯体の場合において、Ｎｉ２＋の全部で６個の配位位置のうちの４個は、２個のヒスチジン残基の結合に対する２個の空いている配位位置が残るように、ＮＴＡによって飽和される（図４Ａ）。したがって、この錯体形成は、以下の２つの工程を必要とする（図４Ｂ）：（１）（例えば、Ｎｉ２＋のような）金属イオンの結合によるキレーターの活性化、および（２）空いている配位位置に対するオリゴヒスチジンタグのヒスチジン残基の結合。過度な遊離のイミダゾールの添加によって、Ｎｉ（ＩＩ）−キレーター錯体に対するオリゴヒスチジンタグの結合は、タンパク質とキレーターとの結合が可逆的であり、そして転換可能であるように無効にされ得る。さらに、上記キレーターは、ＥＤＴＡを使用してキレート錯体からＮｉ２＋の除去することによって非活性化され得る（図４Ｂ）。
【００５４】
２個だけのヒスチジン残基による金属キレート錯体に対する上記オリゴヒスチジンタグの結合は、比較的不安定である（実施例４および実施例８を参照のこと）。金属キレーターが高密度で固定化される場合、上記オリゴヒスチジンタグの数個のヒスチジン残基は、数個の金属−キレートユニットに対して同時に結合して、より強い結合を生じ得る（図５Ｂ）。１分子中に数個の金属−キレートユニットを含む多価キレーターの使用によって、分子レベルでのオリゴヒスチジンタグに対する安定な結合が、達成され得る。上記キレーターに対するさらなる官能性のユニットのカップリングによって、オリゴヒスチジンタグを含むタンパク質は、安定であるが、可逆的かつ転換可能に改変され得る（図５Ｃ）。
【００５５】
以下の図面および実施例において記載される実験は、多価キレーター化合物がアフィニティータグ（例えば、ヒスチジンタグ）に対する、化学的な、高い親和性（ｈｉｇｈｌｙ−ａｆｆｉｎｅ）の転換可能な認識構造を表すことを示す。したがって、それらは、伝統的なキレーターの改良を表すだけでなく、主に、使用の新規の領域を公開する。それらは、ほとんどの任意の化合物と連関され得るので、これらのキレーターに関して、ほとんどの任意の種類の分光学的もしくは微視的なプローブまたは官能性のユニットが、位置特異的かつ可逆的に、標的分子（例えば、組換えタンパク質）に結合し得る。また、例えば、オリゴ糖類、ＰＥＧまたは他の生物学的な官能性のユニットは、このような方法で標的分子を改変するために、標的分子に可逆的に対して結合され得る。次に、ＭＣＨはまた、分子足場上に配置され得、そしてこのような方法によって、例えば、タンパク質のような標的分子を二量体構造または多量体構造で立体的に組織化する。再びここで、可変性の転換性能（ｓｗｉｔｃｈａｂｉｌｉｔｙ）は、中心的な特徴である。さらなる可能性は、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡとのカップリングから生じる。したがって、ＤＮＡマイクロアレイの多重化の実現性は、プロテインアレイの生産のために使用され得る。
以下の略語が、使用される：
ＡＵ：吸光度単位
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（保護基）
Ｂｚｌ：ベンジル（保護基）
ＤＡＰＥＧ：α，ω−ジアミノポリ（エチレングリコール）
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＬ：フルオレセイン
ＦＲＥＴ：蛍光共鳴エネルギー転移
Ｇｌｕ：グルタミン酸
ＧＯＰＴＳ：グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン
Ｈ１０：デカ−ヒスチジン
Ｈ６：ヘキサ−ヒスチジン
ＩＤＡ：イミノ二酢酸
Ｉｆｎａｒ２：１型インターフェロンレセプター２の細胞外ドメイン
ＩＦＮα２、ＩＦＮβ：Ｉ型インターフェロンα２およびＩ型インターフェロンβ
ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質
ＭＣＨ：多価キレーター
ＮＴＡ：ニトリロ三酢酸
ＯＧ：Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８（登録商標）
ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）
ＰＮＡ：ペプチド核酸
ＲＩｆＳ：反射率測定干渉分光法
ＲＴ：室温
ＳＡＭ：自己組織化単分子膜
ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ｔＢｕ：三級ブチル（保護基）
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル（保護基）
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
一般式：
Ｘｍ−Ｇ−ＣＬｎ
の化合物、ならびにその互変異生体、異性体、無水物、酸および塩であって、ここで：
Ｇは、２個〜２０個の炭素原子を有する飽和炭水化物鎖を含み、アミド結合、エステル結合および／またはエーテル結合をさらに含む足場構造であり；
Ｘは、プローブＦまたは官能性のユニットＦに対するカップリング基であり；
ＣＬは、金属配位中心を有するキレーター基であり；
ｍは、整数であり、そして少なくとも１であり；そして
ｎは、整数であり、そして少なくとも２である、
化合物。
（項目２）
項目１に記載の化合物であって、該化合物は、金属イオンが、キレーター基の各々に結合されることによって特徴付けられる、化合物。
（項目３）
前記金属イオンが、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、および全てのランタニドイオンからなる群より選択される、項目２に記載の化合物。
（項目４）
項目１〜３のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物は、前記キレーター基が、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ポルフィリン系、サリチル酸誘導体、１，２−ジアミノエチル二酢酸、ジアミノエチル三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、およびそれらの塩または組み合わせからなる群より選択されることによって特徴付けられる、化合物。
（項目５）
前記キレーター基の反応基が、保護基を有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
（項目６）
項目１〜５のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物は、スペーサー基Ａが、ＣＬとＧとの間に配置されることによって特徴付けられる、化合物。
（項目７）
Ａが、直鎖状であるか、または分枝状である、項目６に記載の化合物。
（項目８）
項目１〜７のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物は、前記キレーター基が、アミド結合、エステル結合またはエーテル結合を介してＧに結合されることによって特徴付けられる、化合物。
（項目９）
項目１〜８のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物は、Ｇが、直鎖状であるか、分枝状であるか、または閉じられることによって特徴付けられる、化合物。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載の化合物、ならびにその互変異生体、異性体、無水物、酸および塩であって、該化合物は、以下：
【化１】
0005596731.tif 000006
から選択される、化合物。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物は、カップリング基Ｘが、ＮＨＲからなる群より選択されることによって特徴付けられ、Ｒは、Ｈ、アルキルもしくはアリール、ＣＯＯＨ、ｎが整数である（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、ＳＨ、マレイミド、アセトアミド、イソチオシアネートまたはシアネートである、化合物。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物は、プローブＦまたは官能性のユニットＦが、カップリング基Ｘにおいて結合されることによって特徴付けられる、化合物。
（項目１３）
項目１２に記載の化合物であって、該化合物は、前記プローブＦまたは官能性のユニットＦが、フルオロフォア、ＦＲＥＴ−フルオロフォア、蛍光消光剤、リン光化合物、発光化合物、吸収性化合物、ポリマー、ＰＥＧ、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ビオチン、ハプテン、ペプチド、タンパク質、酵素、架橋剤、オリゴエチレングリコール、脂質、ナノ粒子、電子密度増幅因子、金クラスター、金属クラスター、量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されることによって特徴付けられる、化合物。
（項目１４）
項目１〜１３のいずれか１項に記載の化合物であって、該化合物が、以下：
【化２】
0005596731.tif 000007
【化３】
0005596731.tif 000008
から選択される、化合物、ならびにその互変異生体、異性体、無水物、酸および塩。
（項目１５）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物を生成するための方法であって、該方法は、前記足場構造の合成後か、または合成の間において、少なくとも２つのキレーター基を該足場構造に対してカップリングする工程を包含する、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、該方法は、保護されたまたは保護されていないアミノ酸およびアミノ酸誘導体、Ｚ−Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＢｚｌ、Ｚ−Ｇｌｕ−ＯＨ、大環状ポリアミン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、ブロモ酢酸−ＯｔＢｕ、ＢＯＣ−ε−アミノカプロン酸からなる群より選択される１種以上の出発化合物から足場構造を合成する工程を包含する、方法。
（項目１７）
前記キレーター基が、保護されている、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
標的分子におけるアフィニティータグへの結合のための項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用であって、該アフィニティータグは、金属−キレーター錯体に結合する、使用。
（項目１９）
前記アフィニティータグは、４個〜１５個のヒスチジンおよび０個〜４個の塩基性アミノ酸を含む４個〜１５個のアミノ酸を含むペプチドタグである、項目１８に記載の使用。
（項目２０）
前記標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物もしくはタンパク質模倣物、またはペプチド改変ポリマーもしくはペプチド改変デンドリマーである、項目１８または１９に記載の使用。
（項目２１）
改変、カップリング、オリゴマー化、検出、モニタリング、分析のため、またはインビトロ、インビボ、インサイチュ、生細胞もしくは脂質小胞における標的分子の検出のための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２２）
標的分子の固定化のための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２３）
項目２２に記載の使用であって、該使用は、前記化合物が、表面結合または脂質単一層もしくは脂質二重層に含まれることによって特徴付けられる、使用。
（項目２４）
前記表面は、ガラス型表面、金、銀、ＤＡＰＥＧで改変したガラス、ＰＥＧポリマーで改変したガラスもしくはＰＥＧポリマーで改変した金、ＧＯＰＴＳでシラン処理したガラス、脂質単一層もしくは脂質二重層、セレン化金属、テルル化金属、および硫化金属を備えるガラス型表面および金表面から選択される、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の生産のための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２６）
官能性のマイクロ構造表面および官能性のナノ構造表面の生産ならびに／またはプロテインアレイの生産のための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２７）
標的分子の精製のための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（図面および実施例）
本発明は、添付の図面に関した以下の実施例によってさらに明らかにされるが、それにかかわらず、本発明は、これらの実施例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、多価キレーター（ＭＣＨ）の構造式および多価キレーターの主な組成を示す。それぞれ、ＮＴＡ基は、薄い灰色で影付けされ、そしてカップリング基は、濃い灰色で影付けされる。
【図２】図２は、多価キレーターの組成を示す。（Ａ）ＯｔＢｕ−保護ＮＴＡ基を有するモノ−ＮＴＡ（１）、ビス−ＮＴＡ（２）およびトリス−ＮＴＡ（３）。自由な官能基（カップリング基Ｘ）は、灰色で影付けされる。（Ｂ）ＰＥＧプローブに対するこの官能基のカップリングおよびＮＴＡ残基のカルボキシル基の脱保護の後の、（Ａ）にあるものと同じキレーター。
【図３】図３は、特に、スキームＩで使用されるような、好ましい保護されたアミノ官能化キレーターエレメント（Ｘ−ＣＬ−Ｐ）（Ａ）、または好ましい保護されたカルボキシ官能化キレーターエレメント（Ｘ−ＣＬ−Ｐ）（Ｂ）を示す。
【図４】図４は、オリゴヒスチジンの金属−キレーター錯体との、転換可能な、可逆的な相互作用の原理を示す。（Ａ）Ｎｉ（ＩＩ）−ＮＴＡ錯体の２個の自由な配位位置に対する２個のヒスチジン残基の配位。（Ｂ）金属イオンによるキレーターの活性化およびヒスチジンタグ化タンパク質に対する結合；競合剤（例えば、イミダゾール）による解離、および例えば、ＥＤＴＡを使用したキレーターの非活性化。
【図５】図５は、多価キレーターの概念を示す。（Ａ）固定化された金属キレーター（例えば、Ｎｉ：ＮＴＡのような）とヒスチジンタグ化タンパク質との、一時的な一価の相互作用。（Ｂ）２個以上の固定化された金属キレーター（例えば、親和性マトリックスのような）との安定な多価の相互作用。（Ｃ）多価キレーターによる官能性のユニットに対する安定なカップリング。
【図６】図６は、ＤＡＰＥＧで改変された表面に対するＭＣＨのカップリングの略図を示す（実施例１を参照のこと）。
【図７】図７は、官能化ガラス表面に対するタンパク質の固定化を示す。（Ａ）ＧＯＰＴＳでシラン処理されたガラス表面に対する、ＰＥＧポリマー層（ＰＥＧ２０００）を介するトリス−ＮＴＡの結合の略図。（Ｂ）Ｎｉ（ＩＩ）イオンによるキレーターのロード前（破線）およびロード後（実線）におけるｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の結合。
【図８】図８は、キレーターで改変された水晶表面上の固定化されたタンパク質の（ＲＩｆＳによって検出された）官能性を示す。Ｎｉ（ＩＩ）イオンによるキレーターのロード後におけるｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の固定化および固定化されたｉｆｎａｒ２−Ｈ１０とそのリガンドＩＦＮα２との相互作用についての結合曲線。
【図９】図９は、金表面上へのヒスチジンタグ化タンパク質の固定化を示す。（Ａ）混合型の自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の生成のために使用されるアルキルチオールの構造式。（Ｂ）Ｎｉ（ＩＩ）イオンによる表面結合型キレーターのロード前（破線）およびロード後（実線）におけるｉｆｎａｒ２−Ｈ６の結合（１）、ＩＦＮα２との相互作用（２）ならびに２００ｍＭのイミダゾール（３）および２００ｍＭのＥＤＴＡ（４）による再生（表面プラスモン共鳴による検出）。
【図１０】図１０は、高濃度（３０μＭ）のＭＢＰ−Ｈ１０と異なるキレーターとの相互作用の比較を示す。（Ａ）モノ−ＮＴＡに対する３０μＭのＭＢＰ−Ｈ１０の会合および解離。（Ｂ）モノ−ＮＴＡ、ビス−ＮＴＡおよびトリス−ＮＴＡ（実線）について比較した解離。
【図１１】図１１は、イミダゾールの異なる濃度における、固定化されたＭＢＰ−Ｈ１０の誘導された解離を示す。（Ａ）イミダゾールの異なる濃度における、モノ−ＮＴＡ表面のｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の解離動態の比較、および結合モデルの適合。（Ｂ）モノ−ＮＴＡ、ビス−ＮＴＡ、およびトリス−ＮＴＡについて比較した、イミダゾールの濃度の関数としての平衡−ロードの依存性。
【図１２】図１２は、トリス−ＮＴＡに対するＭＢＰ−Ｈ６およびＭＢＰ−Ｈ１０の結合の安定性の比較（Ａ）を示す。（Ｂ）モノ−ＮＴＡに対するＭＢＰ−Ｈ１０の結合の安定性と、トリス−ＮＴＡに対するＭＢＰ−Ｈ６の結合の安定性との比較。
【図１３】図１３は、キレーターで改変された表面に対するタンパク質の非特異的な結合を示す。（Ａ）高い表面密度を有するモノ−ＮＴＡに対するｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の固定化の前（破線）および後（実線）におけるＩＦＮβの結合。（Ｂ）ＩＦＮβ低い表面密度を有するトリス−ＮＴＡに対するＩＦＮβの結合（実線）、ＭＢＰ−Ｈ１０を用いた表面のブロッキング後のＩＦＮβの結合（破線）、およびｉｆｎａｒ２−Ｈ１０を固定化し、次いでＭＢＰ−Ｈ１０によってブロッキングした後のＩＦＮβの結合（実線）。
【図１４】図１４は、トリス−ＮＴＡによる溶液中のヒスチジンタグのブロッキングを示す。（Ａ）トリス−ＮＴＡで改変された表面上への、１００ｎＭのトリス−ＮＴＡを伴わない５０ｎＭのｉｆｎａｒ１−Ｈ１０の結合（破線）および１００ｎＭのトリス−ＮＴＡを伴う５０ｎＭのｉｆｎａｒ１−Ｈ１０の結合（実線）（Ｂ）それぞれ２００ｎＭのトリス−ＮＴＡ−フルオレセインを伴う１００ｎＭのｉｆｎａｒ１−Ｈ１０  ｗｔ（実線）および１００ｎＭのｉｆｎａｒ１−Ｈ１０  Ｗ１２９Ａ（破線）の固定化されたＩＦＮβに対する結合。
【図１５】図１５は、脂質膜に対するヒスチジンタグ化タンパク質の結合のためのキレーター−脂質結合体を示す。（Ａ）合成されたビス−ＮＴＡ脂質結合体の構造。（Ｂ）小胞融合による固体に支持された脂質二重層の構築、ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の固定化およびリガンドＩＦＮα２との相互作用。
【図１６】図１６は、固体に支持された脂質二重層にＦＲＡＰを介して結合された蛍光標識ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の側方拡散の試験を示す。（Ａ）円形断面の退色（ｌｅａｃｈｉｎｇ）前、および円形断面の退色（ｌｅａｃｈｉｎｇ）後の異なる時点における蛍光画像。（Ｂ）時間の関数としての、退色（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）スポット（実線）における強度および参照スポット（破線）での強度。
【図１７】図１７は、トリス−ＮＴＡと、異なるフルオロフォア（Ａ：Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８；Ｂ：ＡＴＴＯ  ５６５；Ｃ：ＦＥＷ−Ｓ０３８７）との結合体を示す。
【図１８】図１８は、蛍光標識、およびゲル濾過による結合アッセイを示す。（Ａ）リガンドＩＦＮα２の添加前（実線）および添加後（破線）における、トリス−ＮＴＡ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎを用いて標識されたｉｆｎａｒ２−Ｈ１０のクロマトグラム（２８０ｎｍ（タンパク質）または４９０ｎｍ（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）における吸収）。（Ｂ）金属イオンを用いたロード前（実線）およびロード後（破線）、ならびにｉｆｎａｒ２−Ｈ１０に対する結合後（実線）のトリス−ＮＴＡ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎの蛍光スペクトル。
【図１９】図１９は、トリス−ＮＴＡとＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８（Ｉ）との結合体、トリス−ＮＴＡとＡＴＴＯ５６５（ＩＩ）との結合体およびトリス−ＮＴＡとＦＥＷ−Ｓ０３８７（ＩＩＩ）との結合体の分光学的特性を示す。これらの結合体の標準化された蛍光スペクトル（実線）、Ｎｉ（ＩＩ）イオンの錯体化後のこれらの結合体の標準化された蛍光スペクトル（破線）、およびｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の結合後のこれらの結合体の標準化された蛍光スペクトル（実線）。
【図２０】図２０は、モノ−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体（Ａ）、ビス−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体（Ｂ）、トリス−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体（Ｃ）、およびテトラキス−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体（Ｄ）を示す。
【図２１】図２１は、異なるＭＣＨ（（Ａ）モノ−ＮＴＡ；（Ｂ）ビス−ＮＴＡ；（Ｃ）トリス−ＮＴＡ；（Ｄ）テトラキス−ＮＴＡ（フルオレセイン結合体））を用いたＭＢＰ−Ｈ６（左側）およびＭＢＰ−Ｈ１０（右側）の非共有結合性の蛍光標識の、分析用ゲル濾過による試験を示す（２８０ｎｍ（タンパク質）または４９０ｎｍ（フルオレセイン）における吸収）。
【図２２】図２２は、蛍光消光による会合動態の試験を示す。Ｈ１０−フルオレセインを伴うモノ−ＮＴＡ（実線）、およびＨ６−フルオレセインを伴うモノ−ＮＴＡ（破線）についての結合曲線の比較。
【図２３】図２３は、解離動態の試験を示す。（Ａ）５ｍＭのモノ−ＮＴＡ−Ｈ１０−フルオレセイン錯体の１０倍希釈におけるフルオレセインの変化。（Ｂ）Ｈ１０−フルオレセインを伴う異なるＭＣＨおよびＨ６−フルオレセインを伴う異なるＭＣＨについての、平衡−振幅に対して標準化された解離動態の比較。
【図２４】図２４は、モノ−ＮＴＡおよびＭＣＨについての錯体形成定数の比較を示す。（Ａ）乖離速度定数。（Ｂ）平衡解離定数。
【図２５】図２５は、ビス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（６）、テトラキス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（８）およびビス−ＮＴＡ−脂質（１２）を提供するための合成についてのスキームを示す。
【図２６】図２６は、トリス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（１７および１８）および３種の異なるフルオロフォアを有する誘導体（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８（２１）、ＡＴＴＯ  ５６５（２２）、ＦＥＷ−Ｓ０３８７（２３））を提供するための合成についてのスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
（実施例１：表面に対するＭＣＨの結合）
表面上へのヒスチジンタグ化タンパク質の固定化のために、上記キレーターを、ガラス表面および金表面上に共有結合させた。このことのために、異なるストラテジーを使用した。第１に、金表面を、α，ω−ジアミノ−ポリ（エチレングリコール）（ＤＡＰＥＧ、２０００ｇ／ｍｏｌ）の単一層によって保護した。これを、Ｐｉｅｈｌｅｒら、２０００年（Ｐｉｅｈｌｅｒ  Ｊ、Ｂｒｅｃｈｔ  Ａ、Ｖａｌｉｏｋａｓ  Ｒ、Ｌｉｅｄｂｅｒｇ
Ｂ、Ｇａｕｇｌｉｔｚ  Ｇ、２０００、  Ａ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｐｏｌｙｍｅｒ  ｂｒｕｓｈ  ｆｏｒ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ−ｔｙｐｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１５（９−１０）：４７３−４８１）によって記載された、非特異的なタンパク質結合に対するプロトコルにしたがって行った。
【００５８】
これらの表面に対する上記キレーターの化学的結合を、図６に概略的に示す。カルボキシル官能化されたキレーターの先端（図２Ａを参照のこと）を、上記表面の濃度がカップリングの持続期間によって変化する、ＤＡＰＥＧの空いているアミノ基に直接カップリングさせた（図６、経路ＩＩＩ）。アミノ官能化されたキレーターのカップリングのために、上記表面を、最初に、グルタル酸アルデヒドによって再度官能化した（図６、経路Ｉ）。カルボキシル基の表面の濃度を、無水酢酸を同時に添加することによって変化させた（図６、経路ＩＩ）。上記ＭＣＨを、そのようにして生成されたカルボキシル基にカップリングさせた。その後、保護基を、トリフルオロ酢酸によって除去した。
【００５９】
（実施例２〜５：ＭＣＨによるタンパク質の固定化）
（実施例２：特異的な固定化および官能性）
ヒスチジンタグ化タンパク質と、実施例１において生成されるような表面との相互作用を、反射率測定干渉分光法（ＲＩｆＳ）によって詳細に特徴付けた。この方法を使用して、表面に対するタンパク質の結合を、ＰｉｅｈｌｅｒおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、２００１年（Ｐｉｅｈｌｅｒ  Ｊ、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｇ．、２００１、Ｆａｓｔ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｉｎ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｂｙ  ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９（２）：１７３−１８６）に記載されるように、リアルタイムで定量化し得る。
【００６０】
トリス−ＮＴＡで改変された表面に対する、Ｃ末端にデカ−ヒスチジンタグを有するｉｆｎａｒ２の細胞外ドメイン（ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０）の固定化（図７Ａ）を、図７Ｂに示す。結合は、Ｎｉ（ＩＩ）イオンによる表面にカップリングされるキレーターのロード前に検出可能ではなかったが、その後、約１．５ｎｇ／ｍｍ２のタンパク質の全体的な結合が観察され、この結合はまた、リンスの間、安定に固定され続けた。それにもかかわらず、このタンパク質は、競合剤としての２００ｍＭのイミダゾールによって定量的に除去され得る。
【００６１】
上記固定化されたタンパク質の官能性を、リガンドインターフェロンα２（ＩＦＮα２）の結合によって調べた（図８）。したがって、９０％より多くの固定化されたｉｆｎａｒ２−Ｈ１０が活性であり、そして上記リガンドとの特異的で可逆的な相互作用を示したことが、見出され得る。
【００６２】
（実施例３：ＭＣＨを有する自己組織化単分子膜（ＳＡＭ））
金表面上で、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の技術（Ｓｉｇａｌ  ＧＢ、Ｂａｍｄａｄ
Ｃ、Ｂａｒｂｅｒｉｓ  Ａ、Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ  Ｊ、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  ＧＭ、１９９６、Ａ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏ  ｌａｙｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、６８：４９０−７）を使用した。
【００６３】
このことのために、ビス−ＮＴＡ先端基を有するアルキルチオールを、合成した（図９Ａ）。上記官能化表面との非特異的なタンパク質相互作用を最小化するために、オリゴ（エチレングリコール）残基を、上記先端基とアルキル基との間に導入した。このビス−ＮＴＡ−チオールを、ＭＣＨの異なる表面の濃度によってＳＡＭをもたらすために、ＭＣＨの先端基を有さないマトリックスチオールと混合した（図９Ａ）。ｉｆｎａｒ２−Ｈ６の特定の可逆的な固定化および上記固定化されたタンパク質に対するリガンドＩＦＮα２の特異的な結合が、検出できる（図９Ｂ）。
【００６４】
（実施例４：ＭＣＨを介する結合の安定性）
表面におけるモノ−ＮＴＡの結合の比較的低い安定性は、上記キレーターの高い表面濃度によって部分的に補填され得る。一価のキレーターとは対照的に、ＭＣＨは、低い表面濃度においても、表面に対するヒスチジンタグ化タンパク質の安定な結合を可能にし、このことは、本使用に対する一連の利益を提供する。図１０Ａは、主に、モノ−ＮＴＡ官能化された表面に対するＭＢＰ−Ｈ１０の結合を示す。
【００６５】
タンパク質（ＭＢＰ−Ｈ１０）による上記表面の最初の完全なロード後に、顕著な解離が観察された：４００秒後に、最初に結合したタンパク質の５０％より多くが、上記表面から解離する。観察された解離動態は、モノ−ＮＴＡを介する結合について代表的である表面における再結合効果および配位効果によって説明され得る。
【００６６】
このことと比較して、上記ＭＣＨの場合においては、同じ期間において、非常に安定な結合を観察することができ、そして有意な解離は観察することができなかった（図１０Ｂ）。ＭＣＨについては、解離は観察できなかったために、上記結合安定性をイミダゾールによって減少させた。
【００６７】
図１１Ａにおいて、イミダゾールの異なる濃度におけるモノ−ＮＴＡ表面のＭＢＰ−Ｈ１０の解離を示す。平衡ロードＲｅｑを、結合モデルの適合によって決定した。
【００６８】
モノ−ＮＴＡ、ビス−ＮＴＡ、およびトリス−ＮＴＡについて、イミダゾール濃度に由来するＲｅｑの依存性を、図１１Ｂに比較して示す。より高いイミダゾール濃度への顕著なシフトは、多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｅ）の関数として、結合安定性の増加を示す。さらに、勾配がより急激な変化が観察され、このことは、モノ−ＮＴＡの表面協同性と対照的に、分子協同性への変化を示唆する。
【００６９】
同じ方法を使用することによって、さらに、異なるヒスチジンタグによる結合の安定性を説明した。このことのために、Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグ（ＭＢＰ−Ｈ６）を有するマルトース結合タンパク質およびＣ末端にデカ−ヒスチジンタグを有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｈ１０）を、使用した。図１２Ａは、トリス−ＮＴＡで改変された表面のこれらのタンパク質について、イミダゾール誘導性の解離の比較を示す。上記結合安定性における違いは著しいので、３０ｍＭのイミダゾールにおける定量的な区別が可能である。モノ−ＮＴＡとＭＢＰ−Ｈ１０との間の相互作用と比較して、顕著に勾配がより急激な変化は、ここでも、分子協同性を示す（図１２Ｂ）。
【００７０】
（実施例５：非特異的な結合）
タンパク質とキレーターとの非特異的な結合（静電気的かまたは配位した金属イオンを介するかのいずれか）は、タンパク質の固定化のためのキレーターの使用における中心的な問題である。なぜなら、モノ−ＮＴＡによる安定な固定化は、非常に過剰なＮＴＡ基を必要とするからである。この効果を、図１３Ａに示す。
【００７１】
高い程度までのリガンドＩＦＮβが、モノ−ＮＴＡによって高度に官能化された表面に対して非特異的に結合し、その結果、妥当ではない結合動態が、示され得る。トリス−ＮＴＡに関して、既に、顕著に低い非特異的な結合が、低いキレーター濃度に起因して認識され得る（図１３Ｂ）。中性のタンパク質（ＭＢＰ−Ｈ１０）による結合部位のブロッキングによって、上記非特異的な結合を、完全に排除し、それによってひずみのない結合動態を測定する。上記表面における配位部位は、定量的にブロックされ得るので、この様式において、ヒスチジンタグ化タンパク質との特異的相互作用がまた、説明され得る。
【００７２】
ＭＣＨの結合の高い安定性のさらなる利点は、溶液中に、金属イオンがロードされたＭＣＨを添加することによって、ヒスチジンタグ化タンパク質と、キレーターで改変された表面との結合を効率的にブロックする可能性において見出される。したがって、ヒスチジンタグ化タンパク質との特異的相互作用は、ヒスチジンタグ化タンパク質が、上記表面にて必要以上のキレーターと結合することなく説明され得る。これを、図１４に示す。溶液中のあまり過剰ではないトリス−ＮＴＡによって、トリス−ＮＴＡで改変された表面に対するｉｆｎａｒ１−Ｈ１０の結合は、ほぼ完全に抑制され得る（図１４Ａ）。
【００７３】
この原理に基づいて、結合アッセイを行った。このことのために、最初に、ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０を、トリス−ＮＴＡで改変された表面上に固定化した。ＭＢＰ−Ｈ１０を用いた過剰なキレーターのブロッキングの後、ｉｆｎａｒ２の結合部位を、ＩＦＮβによって飽和させた。トリス−ＮＴＡ−フルオレセインによって提供されるｉｆｎａｒ１−Ｈ１０とのその後の結合アッセイ（下の実施例８を参照のこと）を、図１４Ｂに示す。排他的な特異的相互作用を検出した一方で、ＩＦＮβの結合部位における（不活性な）変異Ｗ１２９Ａについては、結合は観察されなかった。
【００７４】
（実施例６：脂質との結合体）
脂質膜に対するタンパク質の結合のために、図１５Ａに示すビス−ＮＴＡの脂質アナログ結合体を、合成した。
【００７５】
この脂質を、ガラス表面上で、固体に支持された流動性の脂質二重層を自発的に形成するステアロイル−オレオイル−ホスファチジルコリンの単層の小胞中に組み込んだ（図１５Ｂ）。ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０は、これらの膜において特異的に固定され得、結合活性が、完全に妨げられた（図１５Ｂ）。膜に固定されたｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の側方拡散を、蛍光退色（フォトブリーチング後の蛍光回復、ＦＲＡＰ）によって分析した（図１６）。それによって、１μｍ２／秒の拡散定数を、決定した。
【００７６】
（実施例７および実施例８：フルオロフォアとの結合体）
（実施例７：異なるフルオロフォアおよび分光学的特性）
溶液におけるヒスチジンタグ化タンパク質の非共有結合性の蛍光標識のために、トリス−ＮＴＡと以下の３種の異なるフルオロフォアとの結合体を合成した（図１７）：Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、ＡＴＴＯ  ５６５、ＦＥＷ−Ｓ０３８７。
【００７７】
Ｎｉ（ＩＩ）イオンを用いたロードの後、ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０を、これらの結合体に添加し、そして過剰の結合体を、ゲル濾過によって分離した。
【００７８】
ｉｆｎａｒ２−Ｈ１０の安定な標識が、全ての結合体について観察され：第２のゲル濾過の実行において、遊離の色素は、検出できなかった（図１８Ａ）。上記リガンドの添加の際に、さらに、より高い波長へのシフトが観察され（図１８Ａ）、このことによって、上記タンパク質の機能がこの位置特異的な標識によって保存されたことを確認した。この標識は、完全に可逆的であった：上記ＭＣＨ−フルオロフォア結合体は、イミダゾールの添加によって完全に分離され得る。
【００７９】
上記ＭＣＨ−フルオロフォア結合体の異なる状態を、蛍光量子収量によって追跡し得る（図１８Ｂ）。Ｎｉ（ＩＩ）イオンによるキレーター基のロードの後、約５０％までの蛍光の顕著な減少が観察され、そして上記タンパク質に対する結合後に、約４０％までの蛍光の顕著な減少が観察された。この効果はまた、他の蛍光色素において観察され得、そしてさらに、蛍光色素ＡＴＴＯ  ５６５において、より明確ですらあった（図１９）。
【００８０】
（実施例８：溶液中の結合安定性）
溶液中の結合安定性の試験のために、モノ−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体、ビス−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体、トリス−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体、およびテトラキス−ＮＴＡとフルオレセインとの結合体を合成し、そしてＮｉ（ＩＩ）イオンをロードした（図２０）。これらの結合体と、ヘキサ−ヒスチジンタグ化タンパク質およびデカ−ヒスチジンタグ化タンパク質との相互作用を、分析用ゲル濾過、等温滴定熱量測定、および蛍光分光法の手段によって、熱力学的および動力学的に特徴付けた。
【００８１】
（（Ａ）分析用ゲル濾過）
分析用ゲル濾過の手段による試験のために、ＭＢＰ−Ｈ６およびＭＢＰ−Ｈ１０を、化学量論的に過剰の結合体で提供し、そしてこれらの混合物を、ゲル濾過カラム上にロードし、そしてその吸光度を、このカラムの出口において、２８０ｎｍ（タンパク質）および４９０ｎｍ（フルオレセイン）にて同時にモニタリングした。これらのシグナルの比を使用して、標識のレベル、したがって結合安定性が、推定され得る。このクロマトグラムを、図２１にまとめる。モノ−ＮＴＡ（図２１Ａ）（ＭＢＰ−Ｈ６およびＭＢＰ−Ｈ１０）について、結合した結合体は、ほとんど検出できなかった。ビス−ＮＴＡ（図２１Ｂ）について、ＭＢＰ−Ｈ６と比較して、ＭＢＰ−Ｈ１０の著しくより安定な結合が、検出できた。トリス−ＮＴＡおよびテトラキス−ＮＴＡ（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）について、標識の化学量論的なレベル、およびＭＢＰ−Ｈ６とＭＢＰ−Ｈ１０との間の小さな違差異が、検出できた。
【００８２】
これらの結果は、トリス−ＮＴＡおよびテトラキス−ＮＴＡと、ヘキサ−ヒスチジンタグおよびデカ−ヒスチジンタグとの相互作用の安定性が非常に高いので、安定かつ化学量論的な蛍光標識が達成され得ることを示す。さらに、これらの結果は、伝統的なモノ−ＮＴＡと比較して、ヒスチジンタグ化タンパク質との相互作用の安定性の観点から、ＭＣＨの優位性を印象的に示した。
【００８３】
（（Ｂ）蛍光分光法）
ＭＣＨとヒスチジンタグとの間の相互作用の動態を、蛍光分光法によって試験した。このことのために、フルオレセイン標識オリゴヒスチジンペプチドを使用した。上記ＭＣＨに対するこれらのペプチドの結合において、強い蛍光消光が観察された。蛍光の変化を、高い需要時限において、ストップフロー技術によってモニタリングした（図２２を参照のこと）。これらの曲線から、１．５〜５・１０５Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数を、曲線のあてはめによって決定した。それらによると、デカ−ヒスチジンに対する上記速度定数は、ヘキサ−ヒスチジンに対するものより顕著に高かった。
【００８４】
同じ蛍光消光効果をまた、解離動態の試験のために使用した。このことのために、最初に、高濃度の化学量論的な錯体を生成し、そして（モノ−ＮＴＡに対する）緩衝液または（ＭＣＨに対する）１０倍過剰のＭＢＰ−Ｈ１０のいずれかによって希釈した。図２３Ａにおいて、モノ−ＮＴＡ  Ｈ１０−フルオレセイン錯体の希釈において観察された蛍光シグナルを示す。この曲線から、１．５ｓ−１の解離速度定数を算出した。これは、分子のＮｉ：モノ−ＮＴＡ−ヒスチジンタグ錯体の非常に低い安定性を証明している。
【００８５】
ＭＣＨ−オリゴヒスチジン錯体の安定性は、顕著に高く、その結果、解離を観察するために競合剤を必要とした。そのようにして得た解離曲線を、図２３Ｂに示す。これらの曲線から、顕著に低い解離速度定数を、モノ−ＮＴＡについて得た（図２４Ａ）。得られた平衡−解離定数を、図２４Ｂに示す。このことは、モノ−ＮＴＡ（約１０μＭ）と比較してほぼ５倍（＜１ｎＭまで）の、ＭＣＨの結合親和性の増加を印象的に支持する。
【００８６】
（実施例９：合成についての教授）
（（Ａ）Ｌｙｓ−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（３）の合成（図２５も参照のこと））
ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．５９ｍｌ；１０．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．３０ｍｌ；１３．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２５ｍｌ）中のＮε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンｔｅｒｔ−ブチルエステル（１）（１．００ｇ；２．７ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応フラスコを、窒素でリンスし、次いで５５℃にて一晩攪拌する。揮発性成分を、６０℃にて真空中で取り除く。残留物を、シクロヘキサン／酢酸エチル（３：１、１５ｍｌ）中に再溶解し、取り除き、そして沈殿物を、同じ溶媒で３回洗浄する（３×１０ｍｌ）。濾液を、濃縮し、そして溶出相としてシクロヘキサン／エチルアセテート（３：１）を用いてシリカカラム上で精製した。収量：１．３ｇ（２．３ｍｍｏｌ）のＮα，Ｎα−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル）メチル］−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンｔｅｒｔ−ブチルエステル（２）、８５％ｏ．ｔｈ．。ＴＬＣ：シクロヘキサン／酢酸エチル（３：１）においてＲｆ＝０．５。
【００８７】
【化８】
0005596731.tif 000009
メタノール（５０ｍｌ）中の１．００ｇ（１．８ｍｍｏｌ）の２の溶液を、窒素でリンスし、次いで２０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを添加する。反応混合物を、水素雰囲気下で室温にて６時間激しく攪拌する。Ｐｄ／Ｃを、セライトを通した濾過によって除去し、そして揮発性成分を、真空中で取り除く。収量：０．７４ｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＮα，Ｎα−ビス［（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）メチル］−Ｌ−リジンｔｅｒｔ−ブチルエステル（３）、理論の９４％。ＴＬＣ：クロロホルム／メタノール（３：１）においてＲｆ＝０．３。
【００８８】
【化９】
0005596731.tif 000010
（（Ｂ）ビス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（６）の合成（図２５も参照のこと））
３（１．００ｇ；２．３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、そして４（０．２９ｇ；１．０ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．９６ｇ；２．９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．６ｍｌ；３．５ｍｍｏｌ）を添加する。得られたスラリーを、窒素でリンスし、そして室温にて一晩攪拌する。次いで揮発性成分を、真空中で除去し、残留物を、ジクロロメタン（１００ｍｌ）でスラリーにし、そしてＭＱ水で３回洗浄（各３０ｍｌ）する。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空中で濃縮する。油状の残留物を、溶離剤としてシクロヘキサン／酢酸エチル（３：１）を用いてシリカカラム上で精製する。収量：０．９９ｇ（０．９ｍｍｏｌ）Ｚ−ビス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（５）、理論の９０％。ＴＬＣ：シクロヘキサン／酢酸エチル（３：１）においてＲｆ＝０．３
【００８９】
【化１０】
0005596731.tif 000011
５（１．００ｇ；０．９０ｍｍｏｌ）のＺ−保護基を、２について上で記載される通り
、加水分解して除去する。収量：０．８３ｇ（０．８５ｍｍｏｌ）のビス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（６）、理論の９４％。ＴＬＣ：クロロホルム／メタノール（５：２）においてＲｆ＝０．３。
【００９０】
【化１１】
0005596731.tif 000012
（（Ｃ）テトラキス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（８）の合成（図２５も参照のこと））
６（１．００ｇ；１．０３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、次いで４（１３０ｍｇ；０．４６ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（１．４０ｍｍｏｌ；４５０ｍｇ）、およびＤＩＰＥＡ（０．４４ｍｌ；２．６ｍｍｏｌ）を、添加する。得られた反応混合物を、窒素でリンスし、そして室温にて一晩攪拌する。次いで揮発性成分を、真空中で除去し、残留物を、ジクロロメタン（１００ｍｌ）でスラリーにし、そしてＭＱ水で３回洗浄（各３０ｍｌ）する。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空中で濃縮する。油状の残留物を、溶離剤として酢酸エチルを用いてシリカカラム上で精製する。収量：０．７０ｇ（０．３２ｍｍｏｌ）のＺ−テトラキス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（７）、７０％ｏ．ｔｈ．。ＴＬＣ：酢酸エチルにおいてＲｆ＝０．３。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ１１１Ｈ１８９Ｎ１１Ｏ３２）；ＭＨ＋２１８９
７（１．００ｇ；０．４６ｍｍｏｌ）のＺ−保護基を、２について上で記載される通り、加水分解して除去する。収量：０．８６ｇ（０．４２ｍｍｏｌ）、９１％。テトラキス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（８）、理論の９１％。ＴＬＣ：クロロホルム／メタノール（５：３）においてＲｆ＝０．３。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ１０３Ｈ１８３Ｎ１１Ｏ３０）；ＭＨ＋２０５５。
【００９１】
（（Ｄ）トリス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕの合成（１７または１８）（図２６も参照のこと））
ブロム酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．９ｍｌ；４０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（８．６ｍｌ；５０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（７５ｍｌ）中のＨ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＢｚｌ  １３（３．３ｇ；１０ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応フラスコを、窒素でリンスし、次いで５５℃にて一晩攪拌する。揮発性成分を、６０℃にて真空中で取り除く。残留物を、酢酸エチル（２０ｍｌ）においてスラリーにし、濾別し、そしてシクロヘキサン：酢酸エチルで３回洗浄する（３：１、３×４０ｍｌ）。濾液を、真空中で濃縮し、そして溶離剤としてシクロヘキサン：酢酸エチル（３：１）を用いてシリカカラム上で濾過した。収量：４．６ｇ（８．８ｍｍｏｌ）のＢｚｌ−Ｇｌｕ−ＮＴＡ（１４）、８８％
ｄ．Ｔｈ．。ＴＬＣ：シクロヘキサン：酢酸エチル（３：１）においてＲｆ＝０．６。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ２８Ｈ４３ＮＯ８）；ＭＨ＋５２２。
【００９２】
１４（１．００ｇ；１．９ｍｍｏｌ）のＢｚｌ−保護基を、２のＺ−保護基の除去について上で記載される通り、加水分解して除去する。収量：０．７６ｇ（１．７６ｍｍｏｌ）Ｇｌｕ−ＮＴＡ（１５）、９２％  ｄ．Ｔｈ．。ＴＬＣ：クロロホルム／メタノール（３：２）においてＲｆ＝０．４
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ２１Ｈ３７ＮＯ８）；ＭＨ＋４３１。
【００９３】
１５（４３１ｍｇ；１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、次いで１６（６７ｍｇ；０．３３ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（４１７ｍｇ；１．３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．３ｍｌ；１．７５ｍｍｏｌ）を、添加する。得られた反応混合物を、窒素でリンスし、そして室温にて一晩攪拌する。次いで揮発性成分を、真空中で取り除き、残留物を、ジクロロメタン（５０ｍｌ）でスラリーにし、そしてＭＱ水で３回洗浄（各１５ｍｌ）する。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空中で濃縮する。油状の残留物を、カラムの５容量のメタノールにおける１００％酢酸エチルから５０％酢酸エチルまでの勾配を用いてシリカカラム上で精製する。
収量：０．３７ｇ（０．２６ｍｍｏｌ）のトリス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（１７）、７９％  ｏ．ｔｈ．ＴＬＣ：酢酸エチル／メタノール（３：１）においてＲｆ＝０．５。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ７３Ｈ１２９Ｎ７Ｏ２１）；ＭＨ＋１４４１。
【００９４】
１７（１．４４ｇ；１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥クロロホルム（３０ｍｌ）に溶解し、そして無水コハク酸（３００ｍｇ；３．０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．７ｍｌ；５．０ｍｍｏｌ）を、添加する。得られた反応混合物を、窒素でリンスし、そして室温にて一晩撹拌する。次いで揮発性成分を、真空中で取り除き、残留物を、ジクロロメタン（１２０ｍｌ）でスラリーにし、そしてＭＱ水で３回洗浄（各４０ｍｌ）する。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空中で濃縮する。油状の残留物を、カラムの５容量のメタノールにおける１００％酢酸エチルから５０％酢酸エチルまでの勾配を用いてシリカカラム上で精製する。収量：１．４ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）のトリス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ−ＣＯＯＨ（１８）、９１％  ｏ．ｔｈ．ＴＬＣ：酢酸エチル／メタノール（３：１）においてＲｆ＝０．４。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ７６Ｈ１３３Ｎ７Ｏ２４）；ＭＨ＋１５４１。
【００９５】
（（Ｅ）トリス−ＮＴＡ蛍光結合体の合成（図２６も参照のこと））
１７（１．４４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、次いでＢＯＣ−Ｄ−アミノカプロン酸（２３０ｍｇ；１．０ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（４５０ｍｇ；１．４０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．３３ｍｌ；１．９ｍｍｏｌ）を、添加する。反応混合物を、窒素でリンスし、そして室温にて１２時間撹拌する。次いで揮発性成分を、真空中で取り除き、残留物を、ジクロロメタン（７０ｍｌ）でスラリーにし、そしてＭＱ水で３回洗浄（各２５ｍｌ）する。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空中で濃縮する。油状の残留物を、カラムの５容量のメタノールにおける１００％酢酸エチルから１０％酢酸エチルまでの勾配を用いてシリカカラム上で精製する。ＴＬＣ：収量：１．４ｇ（０．８４ｍｍｏｌ）のトリス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ−アミノカプロン酸−ＢＯＣ（１９）、８４％  ｏ．ｔｈ．。酢酸エチルにおいてＲｆ＝０．３。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ８４Ｈ１４８Ｎ８Ｏ２４）；ＭＨ＋１６５４。
【００９６】
１９（５００ｍｇ；０．３ｍｍｏｌ）を、１０％のＴＦＡおよび１％の１，２−エタンジチオールを含むジクロロメタンに溶解し、そして１時間撹拌する。次いで、生成物を、エーテルで沈殿させる。収量：３００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のトリス−ＮＴＡ−アミノカプロン酸（２０）、９５％  ｏ．ｔｈ．。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、Ｃ４３Ｈ６８Ｎ８Ｏ２２）；ＭＨ＋１０４９。
【００９７】
２０（１０ｍｇ；０．０５ｍｍｏｌ）を、１００μｌのＤＭＦに溶解し、そして対応する蛍光色素の化学量論的な量のＮＨＳ−活性エステルを得る。１２時間後、生成物を、最初に分取用薄層クロマトグラフィーによって精製し、次いでアニオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
【００９８】
【化１２】
0005596731.tif 000013
（（Ｆ）ビス−ＮＴＡ脂質結合体（１２）の合成（図２５も参照のこと））
オクタデシルアミン（２．７ｇ；１０ｍｍｏｌ）、１−ブロモ−ｃｉｓ−９−オクタデセン（３．３ｇ；１０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（７ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）を、混合する。反応フラスコを、窒素でリンスし、そして５５℃にて２日間撹拌する。粗生成物を、クロロホルム（２００ｍｌ）に溶解し、そして水で３回洗浄する（各５０ｍｌ）。有機相を、濃縮し、そしてカラムの５容量のメタノールにおける１００％クロロホルムから６０％クロロホルムまでの勾配を用いてシリカカラム上で精製する。収量：２．１ｇ（４．０５ｍｍｏｌ）のステロイル−オレオイル−アミン（ＳＯＡ（９））、４０％  ｏ．ｔｈ．。
【００９９】
【化１３】
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無水コハク酸（０．６０ｇ；６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２．５ｍｌ；１８ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（５０ｍｌ）中の９（１．０４ｇ；２ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応フラスコを、窒素でリンスし、そして室温にて一晩撹拌する。粗生成物を、ＭＱ水（４×４０ｍｌ）で洗浄する。有機相を、乾燥し、濃縮し、そしてアセトンで沈殿させる。収量：１．１８ｇ（１．９ｍｍｏｌ）のＳＯＡ−ＣＯＯＨ（１０）、９５％  ｏ．ｔｈ．。
【０１００】
【化１４】
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１０（５３０ｍｇ；０．８５ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、次いで６（８３４ｍｇ；０．８６ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（４１３ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．３ｍｌ、１．７６ｍｍｏｌ）を、添加する。反応溶液を、窒素でリンスし、そして室温にて１２時間撹拌する。次いで揮発性成分を、真空中で除去し、そして残留物を、ジクロロメタン（３０ｍｌ）で回収する。ＭＱ水（３×３０ｍｌ）で洗浄した後、有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。次いで揮発性成分を、真空中で除去し、そして残留物を、クロロホルム／酢酸エチル（３：２）を用いてシリカカラム上で精製する。収量：０．９７ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）のＳＯＡ−ビス−ＮＴＡ−ＯｔＢｕ（１１）、７１％  ｏ．ｔｈ．。ＴＬＣ：クロロホルム／酢酸エチル（３：２）においてＲｆ＝０．６。
【０１０１】
【化１５】
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１１（５００ｍｇ；０．３２ｍｍｏｌ）を、１０％のＴＦＡおよび１％の１，２−エタンジチオールを含むジクロロメタンに溶解し、そして１時間撹拌する。次いで、生成物を、エーテルで沈殿させる。収量：３７０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＳＯＡ−ビス−ＮＴＡ（１２）、９４％  ｏ．ｔｈ．。
【０１０２】
【化１６】
0005596731.tif 000017
【図１】
0005596731.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0005596731.tif 000044
【図１９】
0005596731.tif 000045
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
0005596731.tif 000049
【図２４】
0005596731.tif 000050
【図２５】
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【図２６】
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