(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅから莢膜多糖を精製するための方法であって、該方法は、該莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、方法。
【請求項２】
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カーボンフィルターは、マトリックス内に固定化された活性炭を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
付着性フィルターを用いた前記濾過工程の前に、以下の工程：
（ｉ）夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿；ならびに
（ｉｉ）ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行われ、最初のダイアフィルトレーションサイクルと２回目のダイアフィルトレーションサイクルとの間に、該最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液が、酢酸／酢酸ナトリウム溶液で処理される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
付着性フィルターを用いた前記濾過工程の後に、以下の工程：
（ｉｖ）再−Ｎ−アセチル化；および
（ｖ）ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行われ、最初のダイアフィルトレーションサイクルと２回目のダイアフィルトレーションサイクルとの間に、該
最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液が、酢酸／酢酸ナトリウム溶液で処理される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、血清型１ａ、１ｂ、３、４または５から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
付着性フィルターを用いた前記濾過の後に、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過が行なわれる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅから精製された莢膜多糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、またはジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異型である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンジュゲートされたものは、薬学的に許容され得る担体と組み合わせられる、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／００８，９４１号および２００８年１０月８日に出願された英国特許出願第０８１８４５３．３号の利益を主張する。米国仮特許出願第６１／００８，９４１号および英国特許出願第０８１８４５３．３号の両方は、その全体が参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、好ましくは、細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化および新規な精製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
莢膜多糖（ｃｐ）は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている（参考文献１）。
【０００４】
典型的には、莢膜多糖は、複合培地中でのバッチ式培養（Ｂ群連鎖球菌属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、フィードバッチ式培養（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または連続式培養（Ｂ群連鎖球菌属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を用いて生産させる（参考文献２〜７）。ほとんどの研究では、インキュベーション中に増殖速度、栄養素レベルおよび代謝濃度が変化するバッチ式培養系が使用された。かかる系では、１つの要素の変化により、増殖と関連している他の要素の変化がもたらされ、これが、予測不可能に収率に影響することがあり得る。連続式培養では、研究者が、バッチ式培養での増殖中、相互依存性のパラメータ（増殖速度、栄養素および生成物濃度ならびに菌体密度など）を分離および規定することが可能である。連続式培養の際は、新鮮培地が培養物に一定速で添加され、菌体および培地が、一定の培養容量が維持される速度で除去される。連続式培養は、条件に依存性である場合では、莢膜多糖の生産に好ましいものであった（参考文献８）。
【０００５】
Ｂ群連鎖球菌属（ＧＢＳ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）では、菌体増殖速度が莢膜多糖の生産が調節される主要な要素であると報告された。さらに、ＩＩＩ型莢膜多糖の生成は、増殖制限栄養素とは独立して起こり得ることが示された。菌体を高速（０．８、１．４または１．６時間）の質量倍加時間（ｔｄ）で保持した方が、低速の場合（ｔｄ＝２．６または１１時間）よりも高い比収率（約９０ｍｇ／ｇＣＤＷ）が得られた（参考文献８〜１０）。しかしながら、連続式培養は、菌株の安定性の問題および汚染を有する傾向にあり、培地と栄養素を連続的に供給するため、いくぶん費用がかかる。したがって、上記の連続式培養に伴う問題を解決するため、莢膜多糖の高収率生産のための連続式培養の代替法を見い出すことが必要である。
【０００６】
連続式培養の問題点を解決するためのアプローチの一例は、ＷＯ２００７／０５２１６８に例示されている。ｃｐ生産に都合のよい栄養環境および増殖速度を維持するための複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。このプロセスは、バッチ手法の利点と連続式手法の利点を併せ持ち、指数増殖期の長期化および発酵時の基質添加を制御する条件のため、高い菌体密度がもたらされる。しかしながら、この複雑なフィードバッチ式手法では、発酵を管理するための複雑なアルゴリズムを伴うソフトウェアを使用する。さらに、臨床試験をサポートするための物質を作製するためには、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に準拠したロバストで費用効果の高い生産プロセスが必要である。したがって、大規模生産用のフィードバッチ式発酵プロセスを単純化することが差し迫って必要である。
【０００７】
発酵プロトコルの単純化の必要性に加え、発酵後の莢膜多糖の大規模生産に使用され得る単純化された精製プロトコルが必要である。ＷＯ２００７／０５２１６８に例示されたアプローチは、抽出、アルコール沈殿、ダイアフィルトレーション、カチオン系デタージェント処理および再可溶化を含む、ＷＯ２００６／０８２５２７に開示された方法に基づいたものである。この手順は非常に効率的であり、典型的にはおよそ８０％純粋な莢膜多糖の調製がもたらされる。しかしながら、カチオン系デタージェント処理工程で莢膜多糖を沈殿させる。その後の上清みからの沈殿物の分離（例えば、遠心分離による）および再可溶化は困難であり、莢膜多糖のロスが生じることがあり得、それにより収率が低下し得る。また、カチオン系デタージェント処理の効率は莢膜多糖の初期純度に依存し得る。莢膜多糖の初期純度が低いほど、カチオン系デタージェント処理の効率は低くなり得、さらに収率が制限される。したがって、精製工程の複雑さおよび／または費用が少なくて高純度レベルがもたらされる単純化された精製手順が必要である。また、多糖がどのような初期純度であっても良好な収率の莢膜多糖が得られる精製手順が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
開示する実施形態の概要
本発明者らは、製造規模で連鎖球菌属から莢膜多糖（ｃｐ）を生産するための方法を提供することにより、発酵プロトコルの単純化のための必要性を満たした。一部の特定の実施形態において、炭素源の線形添加時のｐＨ平衡化のためのアルゴリズムが排除され、他の実施形態では、培地の不必要な成分が除外された。連鎖球菌属の好ましい種はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは、ランスフィールドのＢ群連鎖球菌属またはＧＢＳ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、もしくはＭ７８１とも称される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および（ｂ）該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のｐＨをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖（ｃｐ）の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
（項目２）
さらに、莢膜多糖を回収する工程（ｃ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記連鎖球菌属菌株が、さらにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅを含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株が０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記播種材料の光学密度（ＯＤ）が約０．６と約１．８の間である、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記培養培地のｐＨが約６．０と約７．５の間である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記ｐＨが約７．３である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記培養培地の温度が約３４℃と約３８℃の間である、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記温度が約３６℃である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記培養が、さらに、ＯＤが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記指定レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記指定レベルが約９．８と約１０．２の間である、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記指定レベルが約１０である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記培養が、さらに、ＯＤが第１および第２の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の２回の即時添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、項目１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記第１および第２の即時添加レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の即時添加レベルが約２．８と約３．２の間である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の即時添加レベルが約３．０である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第２の即時添加レベルが約４．３と約４．７の間である、項目１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の即時添加レベルが約４．５である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。
（項目２４）
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅである、項目２３に記載の培養培地。
（項目２５）
前記リン酸源が、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、またはＮａＣｌからなる、項目２３または項目２４に記載の培養培地。
（項目２６）
前記炭素源がグルコースである、項目２３〜２５のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目２７）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの６種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目２８）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの５種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目２９）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの４種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３０）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの３種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３１）
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３２）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１９種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３３）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１８種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３４）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１７種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３５）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１６種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
（項目３６）
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、項目２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
（項目３７）
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、培養培地。
（項目３８）
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅである、項目３７に記載の培養培地。
（項目３９）
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４０）
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される３種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４１）
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される２種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４２）
前記ビタミン源がビオチンからなる、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４３）
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅから莢膜多糖を精製するための方法。
（項目４４）
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、項目４３または項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、項目４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程：
（ｉ）夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿；ならびに
（ｉｉ）ダイアフィルトレーション
を行なう、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程：
（ｉｖ）再−Ｎ−アセチル化；
（ｖ）ダイアフィルトレーション
を行なう、項目４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
（ａ）莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること；
（ｂ）該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと；
（ｃ）莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること；および
（ｄ）タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成すること
を含む、精製莢膜多糖の生産方法。
（項目５０）
さらに、前記精製莢膜多糖を再−Ｎ−アセチル化する工程（ｅ）を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程（ｆ）を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程（ｇ）を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
工程（ｂ）が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、項目４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記アルコール溶液がエタノールを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記アルコール溶液が、さらにＣａＣｌ２を含む、項目５３または項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記アルコール溶液が約１０％と約５０％の間のエタノール濃度まで添加される、項目５４または項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記アルコール溶液が約３０％のエタノール濃度まで添加される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、項目４９〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【０００９】
一態様により、ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を提供する。一実施形態において、播種材料の光学密度（ＯＤ）は、好ましくは０．６〜１．８であり、これは、播種材料の対数増殖中期である。報告するＯＤ値は５９０ｎｍにおいて測定したものであるが、ＯＤは、所与の実験の吸光度波長に基づいて変換され得る。
【００１０】
別の態様により、発酵による連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。一実施形態において、培養時の培養培地のｐＨは６．０〜７．５、好ましくは約７．３である。別の実施形態において、培養時の培養培地の温度は３４〜３８℃、好ましくは約３６℃である。
【００１１】
別の態様により、酵母抽出物の２回の即時添加後、炭素源の線形添加を含む、連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。線形添加に好ましい炭素源はグルコースである。各添加は、細菌増殖速度を調節することによってｃｐの高容積生産が達成されるように、および最大の血清型特異的ｃｐが生産されるよう微生物を適応させるために選択された指定ＯＤレベルで開始される。
【００１２】
一実施形態において、酵母抽出物の第１の即時添加は、２．８〜３．２、好ましくは約３．０のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、酵母抽出物の第２の即時添加は、４．３〜４．７、好ましくは約４．５のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、炭素源の線形添加は、９．８〜１０．０、好ましくは約１０のＯＤレベルで開始される。
【００１３】
全般的に、アルゴリズムなしでの炭素源の線形添加は、培養培地のｐＨをモニタリングすることにより培養を制御するためアルゴリズムを使用する以前の複雑なフィードバッチ式発酵プロセスと比べた改善点である。
【００１４】
別の態様により、規定培地または複合培地を含む培養培地を提供する。規定培地は、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む。ビタミン源は、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
【００１５】
複合培地は、複合抽出物（好ましくは酵母抽出物）、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む。ビタミン源は、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない（すなわち、５種類のうち４種類は培地に含まれるが、５種類目は、複合抽出物の天然成分として添加されない（ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｔ））。好ましい実施形態において、ビタミン源は３種類以下、２種類以下、またはビオチンのみを有する。
【００１６】
さらに、本発明は、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源で構成された規定培地である培養培地を含む組成物を提供する。この場合もまた、好ましい連鎖球菌属菌株はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である。一実施形態において、リン酸源は、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、またはＮａＣｌからなる。一実施形態において、好ましい炭素源はグルコースである。
【００１７】
別の実施形態において、ビタミン源は、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
【００１８】
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの５種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
【００１９】
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの４種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
【００２０】
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの３種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
【００２１】
別の実施形態では、ビタミン源が、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる。
【００２２】
別の実施形態において、アミノ酸源は、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１９種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
【００２３】
別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１８種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
【００２４】
別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１７種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
【００２５】
別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１６種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
【００２６】
別の実施形態では、アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる。
【００２７】
別の態様により、複合抽出物（好ましくは酵母抽出物）、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源で構成された複合培地である培養培地を含む組成物を提供する。この場合もまた、好ましい連鎖球菌属菌株はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である。
【００２８】
一実施形態において、ビタミン源は、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない。
【００２９】
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される３種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない。
【００３０】
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される２種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない。
【００３１】
別の実施形態では、ビタミン源がビオチンである。
【００３２】
前述の態様および実施形態は、互いに排他的であることを意図せず、互いに組み合わされ得、互いに排他的である範囲（ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｄ）を除き、任意の他の態様または実施形態が本明細書において開示される。
【００３３】
さらに、本発明は、付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、典型的にはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅからの莢膜多糖の精製方法を提供する。付着性フィルターは、莢膜多糖中に存在し得る夾雑物（例えば、タンパク質および／または核酸）と結合するが、莢膜多糖が該フィルターを通過すること可能である。本発明者らは、莢膜多糖を精製するために、ＷＯ２００７／０５２１６８およびＷＯ２００６／０８２５２７に記載のカチオン系デタージェント処理の代わりに、付着性フィルターが使用され得ることを見い出した。付着性フィルターの使用により、カチオン系デタージェントを適用する必要がなくなり、これは、該方法のこの段階において莢膜多糖の沈殿を行なわないことを意味する。これにより、上清みから沈殿物を分離する必要がなくなり、該方法が単純化され、この分離時に起こり得る莢膜多糖のロス（あれば）が抑制される。したがって、付着性フィルターの使用により、精製方法の収率が改善され得る。また、付着性フィルターの効率は、莢膜多糖の初期純度に対する依存性が低い。
【００３４】
当業者には、この方法における使用のための適当な付着性フィルターを特定することが可能である。典型的には、莢膜多糖中の主な夾雑物はタンパク質であり、したがって、付着性フィルターはタンパク質付着性フィルターである。本発明者らは、カーボンフィルターが特に適していることを見い出した。これは、典型的には活性炭（例えば、粒状炭素床として、または圧縮もしくは押出カーボンブラックとして）で構成されており、試料精製のためのフィルターとしての機能を果たす。
【００３５】
当業者には、適当なカーボンフィルター特定することが可能である。典型的には、本発明における使用のためのカーボンフィルターは、マトリックス内に固定化された活性炭を含むものである。マトリックスは、試料に対して透過性である任意の多孔質フィルター媒体であり得る。マトリックスは、支持体物質および／または結合体物質を含むものであってもよい。支持体物質は、合成ポリマーまたは天然起源のポリマーであり得る。好適な合成ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびポリメタクリル酸メチルが挙げられ得、一方、天然起源のポリマーとしては、セルロース、多糖類およびデキストラン、アガロースが挙げられ得る。典型的には、ポリマー支持体物質は、機械的剛性をもたらす繊維網目の形態である。結合体物質は樹脂であり得る。マトリックスは、膜シートの形態を有するものであってもよい。典型的には、マトリックス内に固定化された活性炭は、カートリッジの形態であり得る。カートリッジは、マトリックス内に固定化され、膜シートの形態に作製された粉末活性炭を内包する内蔵式の存在体である。膜シートは、プラスチックの透過性支持体内に保持され、ディスクを形成したものであってもよい。あるいはまた、膜シートをらせん状に巻き上げてもよい。フィルター表面積を大きくするため、いくつかのディスクを互いの上に積層してもよい。特に、互いの上に積層したディスクは、炭素処理された試料をフィルターから回収し、取り出すための中心コアパイプを有する。積層ディスクの構成は、半円筒形であってもよい。カーボンフィルター内の活性炭は、種々の原料、例えば、泥炭、亜炭、木材またはココナッツの殻に由来するものであり得る。当該技術分野で知られた任意の方法（水蒸気処理または化学的処理など）が炭素の活性化に使用され得る。本発明において、マトリックス内に固定化された活性炭をハウジング内に配置し、独立したフィルターユニットを形成してもよい。各フィルターユニットは、個々に精製対象試料の供給口および排出口を有する。本発明において使用され得るフィルターユニットの例は、Ｃｕｎｏ  Ｉｎｃ．（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＵＳＡ）製またはＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌ，ＵＳＡ）製の炭素カートリッジである。
【００３６】
特に、本発明者らは、ＣＵＮＯ  ｚｅｔａｃａｒｂｏｎＴＭフィルターが本発明における使用に適していることを見い出した。このカーボンフィルターは、活性炭粉末が内部に封入され、所定の位置で樹脂に結合されたセルロースマトリックスで構成されている。
【００３７】
本発明のこの態様の方法のための出発材料は、以下の「出発材料」という標題のセクションに記載の出発材料の１つであり得る。この方法には、さらに、以下の「アルコール沈殿およびカチオン交換」、「ダイアフィルトレーション」、「再−Ｎ−アセチル化」、「さらなるダイアフィルトレーション」、「コンジュゲートの作製」および／または「他の工程」という標題のセクションに記載の工程の１つ以上を含めてもよい。したがって、典型的な工程シーケンスは、ｉ）「アルコール沈殿およびカチオン交換」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）；ｉｉ）セクション「ダイアフィルトレーション」に記載の工程（１つまたは複数）；ｉｉｉ）上記の付着性フィルターを用いた濾過工程；ｉｖ）「再−Ｎ−アセチル化」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）；およびｖ）「さらなるダイアフィルトレーション」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）であり得る。次いで、このプロセスの後、「コンジュゲートの作製」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）を続けてもよい。最後に、このプロセスの後、「他の工程」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）を続けてもよい。
【００３８】
該方法には、さらに、以下の「カチオン系デタージェント処理」および「再可溶化」という標題のセクションに記載の工程の１つ以上を含めてもよいが、典型的には、これらの工程は、濾過が本発明の方法において付着性フィルターを用いて行なわれる場合、莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理、およびその後の該多糖の再可溶化が一般的には必要とされないため、省略される。したがって、本発明では、具体的に、付着性フィルターを用いた濾過工程を含み、莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、典型的にはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅからの莢膜多糖の精製方法が想定される。
【００３９】
さらに、本発明はまた、製造規模での連鎖球菌属からの莢膜多糖（ｃｐ）の精製方法を提供する。連鎖球菌属の好ましい種はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは、ランスフィールドのＢ群連鎖球菌属またはＧＢＳ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、もしくはＭ７８１とも称される。
【００４０】
好ましい実施形態において、精製莢膜多糖の生産方法は、以下の工程：（ａ）莢膜多糖を含む粗製分離株を準備する工程；（ｂ）該粗製分離株をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出す工程；（ｃ）莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過する工程；および（ｄ）タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を得る工程の１つ以上を含む。好ましい実施形態において、該方法は前述の工程のすべてを含む。より好ましい実施形態において、方法では、デタージェント沈殿が省略される。
【００４１】
一部の特定の実施形態において、１つ以上のさらなる工程、例えば、（ｅ）精製莢膜多糖を再−Ｎ−アセチル化する工程、（ｆ）精製莢膜多糖を沈殿させる工程；および／または（ｇ）莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程が行なわれ得る。
【００４２】
一部の特定の実施形態において、アルコール溶液は、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度まで添加される。好ましい実施形態において、アルコールはエタノールであり、好ましくは約１０％〜約５０％のエタノール濃度まで、より好ましくは約３０％のエタノール濃度まで添加される。アルコール溶液は、任意選択でカチオン、好ましくは金属カチオン、より好ましくは二価カチオン、最も好ましくはカルシウムを含むものであり得る。
【００４３】
一部の特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔ）において、タンパク質付着性フィルターは活性炭フィルターである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、潜在的なＧＢＳワクチン標的である莢膜多糖を示す。
【図２】図２は、莢膜多糖（ｃｐ）とＧＢＳのＢ群炭水化物の結合の提案モデルの概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｉａ型およびＩｂ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐの分子構造を示す。図３Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐ分子構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ａは、Ｉａ型およびＩｂ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐの分子構造を示す。図３Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐ分子構造を示す。
【図４】図４は、ＧＢＳに対する複合糖質ワクチンの作製プロセスを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
【図６】図６は、（Ａ）０９０菌株の増殖曲線、（Ｂ）０９０菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、水酸化ナトリウムとメタノール中のビオチンと４種類のビタミン；リボフラビンなしの水中のビオチンと３種類のビタミン；ビオチンのみ；およびビタミンなしについて測定した。
【図７】図７は、（Ａ）Ｈ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、水酸化ナトリウムとメタノール中のビオチンと４種類のビタミン；リボフラビンなしの水中のビオチンと３種類のビタミン；およびビオチンのみについて測定した。
【図８】図８は、（Ａ）Ｍ７８１菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｍ７８１菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、水酸化ナトリウムとメタノール中のビオチンと４種類のビタミン；リボフラビンなしの水中のビオチンと３種類のビタミン；およびビオチンのみについて測定した。
【図９】図９は、ＣＪＢ１１１菌株の増殖曲線、ＣＪＢ１１１菌株によるｃｐ濃度、および乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、ビオチン単独について測定した。
【図１０】図１０は、（Ａ）０９０菌株の増殖曲線、（Ｂ）０９０菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度はフィードバッチ手法；ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加；およびバッチ用培地中への全酵母抽出物の添加後、グルコースの線形添加について測定した。
【図１１】図１１は、（Ａ）Ｈ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、フィードバッチ手法；ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加；およびバッチ用培地中への全酵母抽出物の添加後、グルコースの線形添加について測定した。
【図１２】図１２は、（Ａ）Ｍ７８１菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｍ７８１菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、フィードバッチ手法；ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加；およびバッチ用培地中への全酵母抽出物の添加後、グルコースの線形添加について測定した。
【図１３】図１３は、ＣＪＢ１１１菌株の増殖曲線、ＣＪＢ１１１菌株によるｃｐ濃度、および乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加について測定した。
【図１４】図１４は、ＤＯＴ試験の結果を示し、（Ａ）１５％、３０％および６０％におけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
【図１５】図１５は、温度試験の結果を示し、（Ａ）３４℃、３６℃および３８℃におけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
【図１６】図１６は、ｐＨ試験の結果を示し、（Ａ）７．０、７．３および７．５におけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
【図１７】図１７は、圧力試験の結果を示し、（Ａ）０．２および０．５バールにおけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
【図１８】図１８は、（Ａ）１００ｍＬの化学的に規定される培地（０．１ｍＬのｗ．ｓ．）を入れた５００ｍＬ容三角フラスコ、および（Ｂ）２Ｌ容発酵槽におけるＭ７８１菌株の増殖曲線を示す。０．１〜０．７の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
【図１９】図１９は、標準的なバッチ用培地；ビタミンの量の１０倍；アミノ酸とビタミンの量の１０倍；ならびにビタミン、アミノ酸およびカリウムの量の１０倍について、プロットグラフとして、Ｍ７８１菌株の増殖曲線、棒グラフとして、グルコース消費量を示す。
【図２０】図２０は、規定培地でのＧＢＳの菌株Ｍ７８１の増殖に対するアラニン、アスパラギン酸、グルタミンおよびプロリンの除外の効果を示す。
【図２１】図２１は、規定培地でのＧＢＳの菌株Ｍ７８１の増殖に対するビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンの除外の効果を示す。
【図２２】図２２は、研究室規模での３種類の菌株、Ｍ７８１、Ｈ３６ｂおよび０９０の第１の予備試験発酵操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールを示す。
【図２３】図２３は、単純化プロセスを用いた４種類の菌株、Ｍ７８１、Ｈ３６ｂ、０９０およびＣＪＢ１１１の第２の予備試験発酵操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールを示す。第１の単純化では、チアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミドをビタミン溶液から除去した。第２の単純化は、発酵時のフィード相のパラメータの変更とした。
【図２４】図２４は、４種類の菌株、Ｍ７８１、Ｈ３６ｂ、０９０、ＣＪＢ１１１の試験発酵操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールを示す。
【図２５】図２５は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ  Ｉａ型多糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
【図２６】図２６は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ  Ｉｂ型多糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
【図２７】図２７は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
【図２８】図２８は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ  Ｖ型多糖の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
【図２９】図２９は、０．５μｇ／ｍＬにおける多糖試料およびシアル酸標準（灰色線）の溶出プロフィールのオーバーレイを示す。
【図３０】図３０は、多糖試料およびラムノースを添加した多糖試料（灰色線）の溶出プロフィールのオーバーレイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明者らは、製造規模での高収率のｃｐが、任意の連鎖球菌属菌株でフィードバッチ式培養、すなわち、有限容量の新鮮培地中への菌体播種によって開始され、該菌体を培養した後、１回の回収によって終結され、付加的な栄養素は、最初の供給源の栄養素を消費させてから培養物に添加する培養を用いて得られ得ることを見い出した。かかる高収率は、連続式培養を用いて得られるものと同等であるか、またはより良好である。さらに、本明細書において開示した方法は、連続式培養の安定性と汚染の問題を有する傾向がない。さらに、本発明者らは、不純物が有意に改善されるとともに、プロトコルが単純で製造規模が廉価に維持される最適化精製プロトコルを開発した。
【００４６】
本開示により、連鎖球菌属を培養するためのプロセスであって、連鎖球菌属をフィードバッチ式培養で培養するプロセスを提供する。連鎖球菌属の一部の特定の菌株は、培養中に生産されるｃｐが典型的には低レベルであるため、ｃｐの「不良産生菌株（ｂａｄ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ）」であることが知られている。かかる不良産生菌株の例としては、ＧＢＳ菌株ＤＫ２１および２６０３が挙げられる。しかしながら、本明細書において開示した方法を使用すると、ｃｐの生産レベルが低いことがわかっているかかる菌株からでさえも高レベルのｃｐが得られ得る。したがって、本発明は、「不良産生菌株」の場合、バッチ式または連続式培養条件下で、該菌株によって＜３０ｍｇ  ｃｐ／ｇＣＤＷまたは＜１０ｍｇ  ｃｐ／ｇＣＤＷが生産され得る、フィードバッチ式培養において連鎖球菌属を培養することを含む、連鎖球菌属菌株からのｃｐ収率の増大方法を提供する。
【００４７】
好ましくは、本発明は、高収率のｃｐが生産されるフィードバッチ式培養での連鎖球菌属の培養方法を提供する。好ましくは、ｃｐの収率は、不良産生菌株の場合では１０ｍｇ／ｇＣＤＷ以上（好ましくは１５、２０、２５、または３０またはそれ以上）であり、他の菌株の場合では３０ｍｇ／ｇＣＤＷ以上（好ましくは４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００またはそれ以上）である。好ましくは、培養培地からのｃｐの収率は、１０ｍｇ／Ｌ以上（例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００またはそれ以上）である。より好ましくは、培養培地からのｃｐの収率は５０ｍｇ／Ｌ以上（例えば、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０またはそれ以上）である。したがって、本発明により、連続式培養と比べて単位容積あたりの収率がさらに高いｃｐの生産が可能となる。場合によっては、単位容積あたりの収率は、連続式培養を用いて生産される量の少なくとも２倍、より好ましくは連続式培養を用いて生産される量の２．５倍または３倍であり得る。
【００４８】
また、本発明は、酵母抽出物の２回の即時添加後、炭素源の線形添加を含み、好ましくは、ｐＨをモニタリングするためのアルゴリズムの使用を伴わない、発酵による連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。線形添加に好ましい炭素源はグルコースである。各添加は、細菌増殖速度を調節することによってｃｐの高容積生産が達成されるように、および最大の血清型特異的ｃｐが生産されるよう微生物を適応させるために選択される指定ＯＤレベルで開始される。
【００４９】
一実施形態において、酵母抽出物の第１の即時添加は、２．８〜３．２、好ましくは約３．０のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、酵母抽出物の第２の即時添加は、４．３〜４．７、好ましくは約４．５のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、炭素源の線形添加は、９．８〜１０．０、好ましくは約１０のＯＤレベルで開始される。
【００５０】
全般的に、炭素源の線形添加は、培養培地のｐＨをモニタリングすることにより培養を制御するためアルゴリズムを使用する以前の複雑なフィードバッチ式発酵プロセスと比べた改善点である。
【００５１】
培養後、細菌に、ｃｐを精製するため、およびこれを担体タンパク質にコンジュゲートするためのさらなる処理工程を行なってもよい。したがって、本発明は、さらに、細菌からｃｐを精製する工程、および莢膜糖を担体タンパク質にコンジュゲートしてタンパク質−糖コンジュゲートを得る工程（図１〜２参照）を含むものであってもよい。精製ｃｐに、医薬調製物を調製するためのさらなる処理工程を行なってもよい。好ましい実施形態において、精製は、本明細書に開示した改善された精製プロトコルを用いて行なわれる。
【００５２】
連鎖球菌属
用語「連鎖球菌属」は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）およびＳ．ｍｕｔａｎｓから選択され得る細菌をいう。あるいはまた、連鎖球菌属は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＳ．ｌａｃｔｉｓであってもよい。好ましくは、連鎖球菌属はＧＢＳである。使用される連鎖球菌属がＧＢＳである場合、好ましくは、選択される血清型は１ａ、１ｂ、３、４または５である。好ましくは、使用されるＧＢＳ菌株は０９０（１ａ）、７３５７（１ｂ）、Ｈ３６ｂ（１ｂ）、ＤＫ２１（２）、Ｍ７８１（３）、２６０３（５）、またはＣＪＢ１１１（５）である。図３Ａ〜Ｂ参照。使用される連鎖球菌属がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである場合、好ましくは、選択される血清型は、４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの１種類以上または全部である。また、好ましくは血清型１が選択され得る。好ましくは、選択される血清型は、１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの１種類以上または全部である。
【００５３】
さらに、本発明の方法を用いて培養物は均一であってもよく（すなわち、連鎖球菌属の単一の菌種または菌株からなる）、不均一であってもよい（すなわち、連鎖球菌属の２種類以上の菌種または菌株を含む）。好ましくは、培養物は均一である。
【００５４】
使用される連鎖球菌属は、野生型菌株であってもよく、遺伝的に修飾されたものであってもよい。例えば、これは、非天然の莢膜多糖もしくは異種多糖が生産されるように、または収率が増大するように修飾され得る。
【００５５】
生産プロセスの概要
ＧＢＳの生産は、４つの部：（１）各ｃｐの発酵による生産とその一次回収；（２）精密濾過の透過物の精製；（３）乾燥精製ｃｐの構築；および（４）複合糖質生体分子の特性評価に分けられ得る。
【００５６】
第１の工程は、パイロット規模の発酵ホールにおいて最適化され得、発酵によるバイオマスの生産、バイオマスの連続流遠心分離、ペレット（あるいは菌体ペースト）の回収、微生物の不活化とｃｐの放出、および回収透過物と菌体ペーストの最終の精密濾過からなる。発酵は、（１）播種材料の調製、（２）発酵、バイオマスの遠心分離、ペレットの化学的処理およびペレットの精密濾過（図４に表示）からなる。
【００５７】
本発明は製造規模でのｃｐの作製方法を提供し、該方法は、ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備するための方法、該菌株を発酵によって培養するための方法を含む。該培養は、培養培地のｐＨをモニタリングすることにより培養を制御するアルゴリズムとは反対に、ＯＤが指定の添加レベルに達したら、酵母抽出物の２回の即時添加後、培養培地への炭素源の線形添加が促されるような培養培地の光学密度（ＯＤ）のモニタリングからなる。
【００５８】
播種材料の培養
播種材料の培養は、１２１℃でオートクレーブを用いて滅菌した振盪フラスコ内で行なわれ得る。播種材料には、複合培地（酵母抽出物、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、およびグルコース一水和物（中性ｐＨおよそ７．３を有する）からなる）、ビタミン溶液（ＮａＯＨ中に希釈したチアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミドからなる）、およびビオチン溶液が含まれる。好ましい実施形態において、ビタミン溶液は除外され、ビオチン溶液がビタミン補給物として使用される。
【００５９】
好ましい実施形態において、各フラスコには、２．７５±０．２５ｍＬの作業種菌株が播種される。培養物は、およそ３５℃で、およそ２００ｒｐｍでの攪拌下、インキュベータ内におよそ４時間維持される。この期間後、バイオマス濃度を、５９０ｎｍにおけるＯＤを測定し、グラム染色を行なうことをことにより評価した。ＯＤ５９０ｎｍの値がおよそ０．６〜１．８である場合、およびグラム染色によってグラム陽性球菌のみが得られる場合、フラスコの内容物を、発酵槽のインキュベーションラインに接続された熱滅菌したビン内にプールする。
【００６０】
播種材料の調製時、好ましい条件は以下のとおり：培地の初期ｐＨは７．３±０．１であり、作業種菌株の容量は２．５〜３．０ｍＬ／フラスコであり、インキュベーション温度は３５±１℃であり、攪拌速度は２００±１０ｒｐｍである。フラスコ内での培養終了時、好ましい最終ＯＤ５９０ｎｍは０．６〜１．８であり、好ましいグラム染色では、グラム陽性球菌のみが得られる。プールしたビンにおいて、好ましい培養物純度は、夾雑物がないような純度である。最後に、好ましいインキュベーション時間は３〜５時間である。
【００６１】
フィードバッチ式発酵プロセス
本発明は、フィードバッチ式プロセスを用いた製造規模での連鎖球菌属の改善された培養方法を提供する（図６〜１８参照）。フィードバッチ式培養は、固定容量フィードバッチ式または可変容量フィードバッチ式のいずれかであり得る。固定容量フィードバッチ式培養では、限定的基質を、培養物を希釈することなく供給する（例えば、濃縮液もしくはガス状物を使用、または透析の使用による）。可変容量フィードバッチ式培養では、発酵期間において、基質供給量によって容量を変更する。
【００６２】
３００Ｌ容発酵槽内での発酵プロセス中、好ましい条件は以下のとおり：培養温度は３６±１℃に設定、発酵槽内部の過圧はおよそ０．２バールに設定、ｐＨは７．３±０．１に設定し、４Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整、初期攪拌は５０ｒｐｍに設定、初期空気流は２０Ｌ／分に設定、発酵槽内の起泡剤レベルは、可視的にモニタリングし、必要であれば消泡剤ＰＰＧ  ２５００を用いて調整、溶存酸素圧（ｔｅｎｓｉｏｎ）（ＤＯＴ）は３０％に設定し、攪拌（５０〜３５０ｒｐｍ）によってカスケード状に調節、空気の空気流（２０〜１００Ｌ／分、および酸素流（０〜１００Ｌ／分）である。
【００６３】
本発明は、指定のＯＤレベルでの２回の酵母抽出物の即時添加後、培養培地への炭素源の線形添加を提供する。試料は、播種後の２時間の発酵のバッチ相中に採取し、ＯＤ５９０ｎｍを測定する。試料を１５分ごとに、ＯＤ５９０ｎｍが３に達するまで採取し、この時点で最初の即時バッチ添加を、１５０ｇ／Ｌの酵母抽出物溶液を用いて開始する。最初の添加のおよそ４５分後、ＯＤ５９０ｎｍを再度測定する。試料を１５分ごとに、ＯＤ５９０ｎｍが５に達するまで採取し、この時点で、第２の即時バッチ添加を、１５０ｇ／Ｌの酵母抽出物溶液を用いて開始する。ＯＤ５９０ｎｍが１０〜１２に達したら、線形添加を開始する。この線形添加時では、試料を１時間ごとに採取し、ＯＤ５９０ｎｍを測定する。線形添加をおよそ３時間持続させ、この時点で、パラメータの自動制御を停止する。攪拌は１００ｒｐｍに、および温度は３０℃に調節する。
【００６４】
培養培地
連鎖球菌属種の増殖の維持に適した任意の型の液状培養培地が使用され得る。好ましい培地としては、複合培地（コロンビア寒天培地（ｂｒｏｔｈ）、ＬＢ、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ、ＯＣ培地、血液寒天培地またはブレインハートインフュージョンなど）；半規定培地（ＭＣＤＭなど）；連鎖球菌属用の化学的に規定される培地（Ｍ１、ＭＣ、ＦＭＣ（参考文献１１）、またはＣ−４８（参考文献１２）など）；ならびに必要な栄養要求性成分を含む真核生物細胞株の培養のために構成した培地（ＲＰＭＩ、スペント培地、マッコイ培地およびイーグル培地など）が挙げられる。典型的な培養培地には、酵母抽出物、ならびに増殖に不可欠な他の要素、例えば、脂質（リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸）、ステロイド類（コレステロールなど）、プリンおよびピリミジン、ミネラル類、ビタミン類ならびに増殖因子、アミノ酸（Ｌ−および／またはＤ−体）および／または化学元素もしくは無機イオン（Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐおよび／またはＺｎなど）が含まれる。培地の濃度を増大させることによって、より高いＯＤが得られ得、ｃｐの高容積生産がもたらされ得る。したがって、複合培地は、好ましくは、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、ビオチンと、任意選択でナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される１種類以上のビタミンとからなる。
【００６５】
化学的に規定される培地は、好ましくは、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、パントテン酸カルシウムと、ナイアシンアミドと、ビオチン、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される１種類以上のビタミンとからなる。
【００６６】
培養培地には、さらに、１種類以上の抗生物質および消泡剤を含めてもよい。典型的な抗生物質としては、カナマイシン、アンピシリンおよびテトラサイクリンが挙げられる。抗生物質は、抗生物質耐性遺伝子を含む特定の細菌を選択するため、および／またはグラム陽性細菌（例えば、連鎖球菌属）を選択するための選択圧力を加えるために使用され得る。したがって、これは、所望のｃｐを発現している細菌に対する選択圧力を維持するために使用され得る。例えば、抗生物質アズトレオナム（ａｚｔｒｉａｎａｍ）は、グラム陰性に対して有効であるが、グラム陽性細菌に対しては有効でない。消泡剤は当該技術分野で知られており、鉱油、医療用オイル、高配合ポリシロキサングリコールコポリマー、シリコーン化合物およびエマルジョン、オキシアルキル化化合物、鉱油／合成ブレンド、グリコール／エステルブレンドなどが挙げられ得る。
【００６７】
また、培養物には、培養を向上させる種々の他の要素、例えば、脂質（リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸など）、ステロイド類（コレステロールなど）、プリンおよびピリミジン、ビタミンならびに増殖因子、アミノ酸（Ｌ−および／またはＤ−体）および／または化学元素もしくは無機イオン（Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐおよび／またはＺｎなど）の添加を含めてもよい。
【００６８】
培養培地が、動物から採取された添加物（ウシ血清アルブミンなど）を含む場合、これは、培地および最終的にｃｐへの夾雑を回避するため、感染性海綿状脳症のない供給源から採取されたものであるべきである。
【００６９】
炭素源
使用される炭素源の型は必須事項ではない。好ましくは、主な炭素源は、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、イヌリン、グリセロール、植物油（大豆油など）、炭化水素、アルコール（メタノールおよびエタノールなど）、有機酸（酢酸類など）からなる群より選択される。より好ましくは、炭素源は、グルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロースおよび大豆油から選択される。用語「グルコース」は、グルコースシロップ、すなわち、グルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を包含する。炭素源は培養物に、固形物または液状物として添加され得る。好ましくは、炭素源は、細胞に対する浸透圧ストレス（これにより、過剰供給がもたらされることになり得る）が回避されるように制御する。これは、通常、発酵持続期間に必要とされる炭素源すべてを、初期バッチ式培養物に添加しないことにより行なわれる。また、炭素源は、培養制限および色素生成がもたらされ得る枯渇が回避されるように制御する（参考文献１３）。
【００７０】
窒素源
使用される窒素源の型は必須事項ではない。好ましくは、窒素源は、尿素、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど）、他の硝酸塩、アミノ酸（グルタミン酸類およびリシンなど）、酵母抽出物、酵母自己分解物、酵母窒素塩基、タンパク質水解産物（例えば限定されないが、ペプトン、カゼイン水解産物、例えば、トリプトンおよびカザミノ酸）、大豆ミール、Ｈｙ−Ｓｏｙ、トリプシンによる大豆ブロス、綿実粕、麦芽抽出物、コーンスティープリカーならびに糖蜜から選択される。より好ましくは、窒素源は、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウムから選択される。最も好ましくは、窒素源は水酸化アンモニウムである。窒素源としての水酸化アンモニウムの使用は、水酸化アンモニウムが、さらにｐＨ調整剤としての機能を果たし得るという利点を有する。
【００７１】
硫酸アンモニウムおよび／またはリン酸アンモニウムを窒素源として使用する場合、微生物が必要とするイオウおよび／またはリンの少なくとも一部が満たされ得る。
【００７２】
リン源
上記のように、リンを培養培地に添加してもよい。リンは、塩の形態であり得、特に、リン酸塩（上記のようなリン酸アンモニウムなど）またはポリリン酸塩として添加され得る。ポリリン酸塩が使用される場合、これは、ポリリン酸ナトリウムなどのリン酸ガラスの形態であり得る（参考文献１４）。かかるリン酸ガラスは、その可溶性特性が、混合時に沈殿を生じないで栄養素濃縮培地が調製され得るようなものであるため、有用である。
【００７３】
他の可変量
培養温度は３０〜４５℃（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４℃に）維持される。好ましくは、該温度は約３６℃である。したがって、一定の培養温度が維持されるのを確保するため、培養物の入った槽を加熱または冷却することが必要であり得る。該温度は、倍加時間（ｔｄ）を制御するために使用され得、したがって、所与の培養プロセスでは、該温度は、異なる相（すなわち、バッチ相、フィードバッチ相および炭素供給相）において異なり得る。
【００７４】
培養物の酸素供給量は制御され得る。酸素は、空気、富化酸素、純酸素またはその任意の組み合わせとして供給され得る。酸素濃度のモニタリング方法は当該技術分野で知られている。酸素は、特定の供給速度で送達してもよく、または培養物の溶存酸素含有量を測定し、一定の溶存酸素含有量を維持することを意図して相応して供給することにより必要時に送達してもよい。
【００７５】
また、攪拌または曝気の速度も制御され得る。これにより、栄養素と酸素が、培養物の入ったバイオリアクター全体に行き渡ることが確保される。栄養素溶液と個々の細胞との相対速度は、０．５ｍ／秒前後（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０秒）でもよい。
【００７６】
上記のように、培養物のｐＨは、酸またはアルカリの添加によって制御され得る。ｐＨは、典型的には培養中に低下するため、好ましくはアルカリが添加される。適当なアルカリの例としては、ＮａＯＨおよびＮＨ４ＯＨが挙げられる。
【００７７】
このような可変量をすべて、コンピュータ、コンピュータ補助デバイスまたは上記のような制御アルゴリズムによって制御してもよい。このような可変量の変更は、培養物の倍加時間を制御するために使用され得る。
【００７８】
多糖の調製
細菌からの莢膜糖の調製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、参考文献１５、１６、１７などを参照のこと。ＧＢＳの場合では、以下の方法が使用され得る（参考文献１８も参照のこと）。特に、本発明の莢膜多糖の精製方法が使用され得る。上記のように、このような本発明の方法には、以下の工程の１つ以上が含まれ得る。
【００７９】
出発材料
一般的に、細菌の培養中に培養培地中に放出される莢膜多糖は少量であり、したがって、出発材料は、遠心分離した細菌培養物由来の上清みであり得る。しかしながら、より典型的には、出発材料は、莢膜をもつ細菌自体（または細菌ペプチドグリカンを含有する物質）を、莢膜糖が放出されるように処理することによって調製される。ｃｐは細菌から種々の方法によって、例えば、化学的、物理的または酵素的処理によって放出され得る。したがって、多糖の水性調製物を、最初のタンパク質／核酸沈殿反応の前に処理してもよい。
【００８０】
典型的な化学的処理は塩基抽出であり（参考文献１９）（例えば、水酸化ナトリウムを使用）、これにより、莢膜糖とペプチドグリカン主鎖間のホスホジエステル結合が切断され得る。しかしながら、塩基処理により莢膜糖が脱−Ｎ−アセチル化されるため、後に、再−Ｎ−アセチル化が必要であり得る。
【００８１】
典型的な酵素的処理は、ムタノリジンとβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（参考文献２０）の両方の使用を伴うものである。これらは、細菌ペプチドグリカンに対して作用し、本発明での使用のための莢膜糖を放出させるだけでなく、群特異的炭水化物抗原の放出ももたらす。択一的な酵素的処理は、ＩＩ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ２）での処理を伴うものである。ＰＤＥ２酵素により、水酸化ナトリウム（上記参照）の場合と同じリン酸基が切断され得、群特異的炭水化物抗原が切断されることなく、莢膜糖が脱−Ｎ−アセチル化されることなく莢膜糖が放出され得、それにより、下流の工程が単純化される。したがって、ＰＤＥ２酵素は、莢膜糖の調製に好ましい選択肢である。
【００８２】
本発明のプロセスに好ましい出発材料は、脱−Ｎ−アセチル化莢膜多糖であり、これは、ＵＳ  ６２４８５７０（参考文献１９）に記載の塩基抽出によって得られ得る。別の好ましい出発材料は、連鎖球菌属のＰＤＥ２処理生成物である。かかる材料を、後述する沈殿の前に濃縮（例えば、限外濾過）に供してもよい。
【００８３】
出発材料は、後述するように、夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿に供され得る。
【００８４】
アルコール沈殿およびカチオン交換
培養後に得られた連鎖球菌属莢膜糖は、一般的に純粋ではなく、細菌の核酸とタンパク質が夾雑している。このような夾雑物は、逐次、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼおよびプロテアーゼで一晩処理することによって除去され得る。しかしながら、好ましい択一例として、このような夾雑物を酵素的に除去するのではなく、アルコール沈殿が使用され得る。必要であれば（例えば、塩基抽出後）、該物質を、通常、沈殿の前に中和する。
【００８５】
夾雑核酸および／またはタンパク質の沈殿に使用されるアルコールは、好ましくは低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどである。適切なアルコールの選択は、過度な負担なく経験的に試験され得るが、フェノールなどのアルコールよりも、エタノールおよびイソプロパノール（プロパン−２−オール）などのアルコールが好ましい。
【００８６】
アルコールは多糖懸濁液に、好ましくは、最終アルコール濃度が１０％〜５０％（例えば、３０％前後）となるように添加される。最も有用な濃度は、多糖が同時に沈殿されることなく夾雑物の充分な沈殿が達成される濃度である。至適最終アルコール濃度は、多糖が得られた細菌血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。エタノール濃度＞５０％のとき、多糖の沈殿が観察された。
【００８７】
アルコールは、純粋な形態で添加してもよく、混和性の溶媒（例えば、水）で希釈した形態で添加してもよい。好ましい溶媒混合物はエタノール：水混合物であり、好ましい比率は、７０：３０前後および９５：５前後（例えば、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０）である。
【００８８】
また、該糖を水性金属カチオンで処理してもよい。一価および二価の金属カチオンが好ましく、錯体形成により効率的であるため、二価カチオン（例えば、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａなど）が特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、そのため、アルコール混合物は、好ましくは可溶性カルシウムイオンを含むものである。これは、糖／アルコール混合物にカルシウム塩の形態で添加され得、固形または水性形態のいずれかとして添加され得る。カルシウムイオンは、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって供給される。
【００８９】
カルシウムイオンは、好ましくは、１０〜５００ｍＭ（例えば、約０．１Ｍ）の終濃度で存在させる。至適最終Ｃａ濃度は、連鎖球菌属菌株および多糖が得られた血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。
【００９０】
夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿後、莢膜多糖は溶液中に残存する。沈殿物質は多糖から、遠心分離などの任意の適当な手段によって分離され得る。上清みは、後の工程でフィルターを詰まらせ得る粒子（例えば、０．２２μｍより大きい直径を有する沈殿粒子）を除去するために、精密濾過、特にデッドエンド濾過（垂直型濾過）に供され得る。デッドエンド濾過の択一例として、、タンジェンシャル精密濾過が使用され得る。例えば、０．２μｍのセルロース膜を用いたタンジェンシャル精密濾過が使用され得る。タンジェンシャル精密濾過工程の後、典型的には、０．４５／０．２μｍフィルターを用いた濾過が行なわれる。
【００９１】
ダイアフィルトレーション
ダイアフィルトレーション工程が使用されてもよい。例えば、該方法が、上記のアルコール沈殿およびカチオン交換を含む場合、この工程は、タンパク質および／または核酸の沈殿後に行なわれ得る。同様に、該方法が、後述するカチオン系デタージェント処理工程を含む場合、このダイアフィルトレーション工程は、デタージェント媒介性沈殿の前に行なわれ得る。付着性フィルターを用いた濾過（例えば、タンパク質付着性フィルターによる濾過）を含む本発明の方法では、このダイアフィルトレーション工程は、該濾過の前に行なわれ得る。典型的には、ダイアフィルトレーション工程は、タンパク質および／または核酸の沈殿の後であって、デタージェント媒介性沈殿または付着性フィルター（例えば、タンパク質付着性フィルター）を用いた濾過の前に使用される。
【００９２】
ダイアフィルトレーション工程は、塩基抽出またはホスホジエステラーゼが莢膜糖の放出に使用された場合、群特異的糖もまた加水分解され、元の莢膜糖よりもずっと小さな断片が得られるため、特に好都合である。このような小断片は、ダイアフィルトレーション工程によって取り出され得る。
【００９３】
タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが典型的である。したがって、濾過膜は、群特異的抗原の水解産物の通過は可能であるが、莢膜多糖は保持するものであるのがよい。１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲のカットオフが典型的である。群特異的抗原の加水分解断片は、一般的に１ｋＤａ前後（５量体、８量体および１１量体の糖）であるため、小さいカットオフサイズを使用するのがよいが、大きなカットオフは、莢膜糖のロスをもたらすことなく、他の夾雑物の除去を可能にするのに好都合である。
【００９４】
通常、少なくとも５サイクル、例えば、６、７、８、９、１０、１１回以上のタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行なわれる。典型的には、２サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行なわれる。最初のサイクルと２回目のサイクルの間に、最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液を、酢酸／酢酸ナトリウム溶液で処理してもよい。得られた懸濁液を、例えば、０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、沈殿物を除去してもよい。またこの懸濁液を、あるいはさらに、０．２μｍフィルターを用いて濾過してもよい。
【００９５】
ダイアフィルトレーションの後に、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。
【００９６】
カチオン系デタージェント処理
可溶性多糖を沈殿させるための多くの手法が当該技術分野で知られている。該糖は、任意選択で、１種類以上のカチオン系デタージェントを用いて沈殿させてもよいが、精製の好ましい実施形態では、タージェント沈殿を除外する。莢膜糖と群特異的糖の混合物をカチオン系デタージェントで処理すると、莢膜糖の優先的な沈殿がもたらされ、それにより、群特異的糖による夾雑が好都合かつ簡便に最小化される。
【００９７】
本発明のプロセスにおける使用のための特に好ましいデタージェントは、テトラブチルアンモニア塩およびセチルトリメチルアンモニア塩（例えば、臭化物塩）である。臭化セチルトリメチルアンモニア（ＣＴＡＢ）は特に好ましい（参考文献２１）。ＣＴＡＢはまた、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニア、臭化セトリモニウム、ＣｅｔａｖｌｏｎおよびＣｅｎｔｉｍｉｄｅとしても知られている。他のデタージェントとしては、臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニア塩が挙げられる。
【００９８】
デタージェント媒介性沈殿工程は、好ましくは莢膜多糖に対して選択的である。
【００９９】
好都合には、任意選択のデタージェント沈殿は、ＣＴＡＢなどの、糖内のシアル酸残基と例えばシアル酸のカルボキシル基によって相互作用するデタージェントを使用するものであるのがよい。したがって、デタージェントにより、混合集団中のシアル酸含有莢膜糖、特に長鎖の糖が優先的に沈殿され、したがって、抗原として重要なシアル酸が先の処理工程で損傷されているかもしれない糖による夾雑が最小化される。
【０１００】
再可溶化
任意選択のデタージェント沈殿工程が使用される場合、多糖（典型的には、カチオン系デタージェントとの複合体の形態）は、水性媒体またはアルコール系媒体のいずれかに再可溶化され得る。水性再可溶化では、沈殿物中のＣＴＡ−カチオンが、一般的に、金属カチオンで置き換えられ、アルコール系再可溶化では、ＣＴＡ−カチオンは一般的に保持される。水性またはアルコール系の再可溶化の選択は、ＧＢＳ多糖が得られた血清型およびこの段階でなお存在する夾雑物（あれば）に依存し得る。例えば、場合によっては沈殿ペレット中に色素が存在し、これは、アルコール系再可溶化の後、炭素濾過によって有効に除去され得る。
【０１０１】
再可溶化のための典型的な水性媒体は金属カチオンを含むものである。一価および二価の金属カチオンが好ましく、二価カチオン（例えば、Ｍｎ、Ｃａなど）が特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、そのため、再可溶化は、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって供給されるＣａを使用するものである。１０〜５００ｍＭ（例えば、約０．１Ｍ）のＣａ濃度が好ましい。至適最終Ｃａ濃度は、連鎖球菌属多糖が得られた血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。
【０１０２】
再可溶化のための典型的なアルコール系媒体は、エタノール系のものである。核酸および／またはタンパク質の沈殿に使用されるものと同じアルコールが使用され得るが、莢膜糖の沈殿に必要とされる濃度の方が一般的に高く、例えば、アルコールは、好ましくは、最終アルコール濃度が７０％〜９５％（例えば、およそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）となるように添加される。至適最終アルコール濃度は、連鎖球菌属多糖が得られた血清型に依存し得る。高いアルコール濃度を得るためには、水分含有量の少ないアルコール（例えば、９６％エタノール）を添加することが好ましい。
【０１０３】
再可溶化は、典型的には室温で行なう。好ましくは、酸性条件を回避し、再可溶化は、典型的には約ｐＨ７で行なう。
【０１０４】
再可溶化された物質は、沈殿前の懸濁液と比べて高度に精製されたものである。
【０１０５】
該糖の調製のための好ましい方法の一例は、多糖の沈殿後、上記の低級アルコールを用いた沈殿多糖の可溶化を伴うものである。再可溶化後、夾雑物を除去するために、多糖をさらに処理してもよい。
【０１０６】
これは、夾雑が微量であっても許容され得ない（例えば、ヒト用ワクチン作製用）状況では、特に重要である。これは、典型的には、１つ以上の濾過工程を伴い、例えば、デプス濾過、活性炭による濾過が使用され得る（サイズ濾過および／または限外濾過）。濾過して夾雑物を除去したら、多糖を、さらなる処理および／または加工処理のために沈殿させ得る。これは、カチオン交換（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加）によって簡便に行なわれ得る。
【０１０７】
付着性フィルターを用いた濾過
好ましい実施形態において、莢膜多糖の精製は、さらに、タンパク質および／またはＤＮＡ夾雑物を、タンパク質および／またはＤＮＡは付着するが、莢膜多糖は付着しないか、もしくはわずかに弱く付着するフィルター（例えば、タンパク質付着性フィルター）を用いた濾過によって除去する工程を含む。かかるフィルターの好ましい例は、カーボンフィルターである。好適な付着性フィルターは上記のものである。
【０１０８】
付着性フィルターを用いた濾過の後、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。
【０１０９】
再−Ｎ−アセチル化
再−Ｎ−アセチル化工程は、例えば、付着性フィルターを用いた濾過工程後、または実施する場合は、さらなる濾過工程後に行なわれ得る。再−Ｎ−アセチル化は、ＧＢＳ莢膜糖内のシアル酸残基が、例えば上記の塩基処理中に脱−Ｎ−アセチル化された場合、好都合であり得る。再−Ｎ−アセチル化の制御は、例えば、無水酢酸（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏを含む５％重炭酸アンモニウムなどの試薬を用いて簡便に行なわれ得る［Ｗｅｓｓｅｌｓら（１９８９）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５７：１０８９−９４］。
【０１１０】
さらなるダイアフィルトレーション
さらなるダイアフィルトレーション工程は、例えば、再−Ｎ−アセチル化後に行なわれ得る。ダイアフィルトレーションは、「ダイアフィルトレーション」という標題のセクションにおいて上記のようにして行なわれ得る。
【０１１１】
ダイアフィルトレーションの後、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。
【０１１２】
最終物質
多糖は、好ましくは最終的に、コンジュゲーションの準備ができた乾燥粉末として調製される。
【０１１３】
コンジュゲートの作製
細菌の培養および莢膜多糖の調製後、該糖を担体タンパク質（１つまたは複数）にコンジュゲートさせる。一般に、担体との糖の共有結合性コンジュゲーションにより、糖がＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換され、したがって免疫記憶のための初期抗原刺激が可能になるため、糖の免疫原性が増強される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり（例えば、参考文献２２）、よく知られた手法である（例えば、参考文献２３〜３１に概説）。
【０１１４】
好ましい担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの細菌の毒素またはトキソイドである。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異型（参考文献３２〜３４）は、そのままでジフテリアトキソイドであるため、特に好ましい担体である。他の好適な担体タンパク質としては、Ｎ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外側膜タンパク質（参考文献３５）、合成ペプチド（参考文献３６，３７）、熱ショックタンパク質（参考文献３８，３９）、百日咳タンパク質（参考文献４０，４１）、サイトカイン（参考文献４２）、リンホカイン（参考文献４２）、ホルモン類（参考文献４２）、増殖因子（参考文献４２）、種々の病原体由来抗原に由来する多くのヒトＣＤ４  Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（参考文献４３）、例えば、Ｎ１９（参考文献４４）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ（参考文献４５，４６）、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ（参考文献４７）、ニューモリシン（参考文献４８）、鉄取り込みタンパク質（参考文献４９）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のトキシンＡまたはＢ（参考文献５０）、ＧＢＳ  タンパク質（下記参照）（参考文献５１）などが挙げられる。担体との結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質のリシン残基またはアルギニン残基の側鎖内の−ＮＨ２基によるものである。糖が遊離アルデヒド基を有する場合、これは担体内のアミンと反応し、還元的アミノ化によってコンジュゲートを形成し得る。かかるコンジュゲートは、糖内の酸化ガラクトース（アルデヒドが形成される）と、担体またはリンカー内のアミンが関与する還元的アミノ化を用いて作出され得る。また、結合は、例えば、システイン残基の側鎖内の−ＳＨ基によるものであり得る。
【０１１５】
例えば、担体抑制のリスクを低減するために、１つより多くの担体タンパク質を使用することが可能である。したがって、異なる担体タンパク質が異なる連鎖球菌属菌株または血清型に対して使用され得、例えば、ＧＢＳ血清Ｉａ型の糖をＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせ得、一方、血清Ｉｂ型の糖は、破傷風トキソイドにコンジュゲートさせ得る。また、１つより多くの担体タンパク質を特定の糖抗原に対して使用することも可能であり、例えば、血清型ＩＩＩの糖を２つの群に分け、一部をＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせ、他の一部を破傷風トキソイドにコンジュゲートさせてもよい。しかしながら、一般には、すべての糖に対して同じ担体タンパク質を使用することが好ましい。
【０１１６】
単一の担体タンパク質が１つより多くの糖抗原を有していてもよい（参考文献５２、５３）。例えば、単一の担体タンパク質が血清Ｉａ型およびＩｂ型の糖にコンジュゲートされ得る。この目的を達成するため、コンジュゲーション反応前に、異なる糖が混合され得る。しかしながら、一般には、各血清群が別々のコンジュゲートを有し、異なる糖は、コンジュゲーション後に混合されることが好ましい。該別々のコンジュゲートは、同じ担体のものであってもよい。
【０１１７】
タンパク質過剰（例えば、１：５）〜糖過剰（例えば、５：１）の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有するコンジュゲートが好ましい。１：２〜５：１の比が好ましい（ｉｒｅ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）（１：１．２５〜１：２．５の比）。また、１：１〜４：１の比も好ましい。糖鎖が長い場合、糖を重量過剰とするのが典型的である。一般に、本発明は、担体に連結された連鎖球菌属、好ましくはＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖部分を含み、糖：担体の重量比が少なくとも２：１であるコンジュゲートを提供する。
【０１１８】
組成物に含まれる遊離担体は少量であるのがよい。所与の担体タンパク質が、本発明の組成物中に遊離形態とコンジュゲート形態の両方で存在する場合、非コンジュゲート形態は、組成物全体において、好ましくは担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２重量％未満で存在する。
【０１１９】
任意の適当なコンジュゲーション反応が、必要な場合は任意の適当なリンカーとともに使用され得る。
【０１２０】
糖は、典型的には、コンジュゲーション前に活性化または官能性付与される。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１．−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（参考文献５４、５５など））などのシアニル化試薬を伴うものであり得る。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、およびＴＳＴＵを使用するものである（参考文献２９の序論も参照のこと）。
【０１２１】
リンカー基による連結は、任意の既知の手順、例えば、参考文献５６および５７に記載の手順を用いて行なわれ得る。結合の型の一例は、多糖の還元的アミノ化、得られたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一端とのカップリング、次いで、タンパク質とアジピン酸リンカー基の他端とのカップリングを伴うものである（参考文献２７、５８、５９）。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（参考文献６０）、ニトロフェニルエチルアミン（参考文献６１）、ハロゲン化ハロアシル（参考文献６２）、グリコシド結合（参考文献６３）、６−アミノカプロン酸（参考文献６４）、ＡＤＨ（参考文献６５）、Ｃ４〜Ｃ１２部分（参考文献６６）などが挙げられる。リンカーの使用の択一例として、直接結合が使用され得る。タンパク質との直接結合は、多糖の酸化、続いてタンパク質との還元的アミノ化（例えば、参考文献６７および６８に記載）を含み得る。
【０１２２】
糖内へのアミノ基の導入（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２で置き換えることにより）、続いてアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導体化および担体タンパク質との反応を伴うプロセスが好ましい。別の好ましい反応は、プロテインＤ担体でのＣＤＡＰ活性化を使用するものである。
【０１２３】
：コンジュゲーション後、遊離糖とコンジュゲート糖は分離され得る。適当な方法が多数あり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる（参考文献６９および７０なども参照のこと）。
【０１２４】
本発明の組成物が解重合オリゴ糖を含む場合、解重合はコンジュゲーションの前に行なう、例えば、糖の活性化の前であることが好ましい。
【０１２５】
好ましいコンジュゲーション法の一例では、糖をアジピン酸ジヒドラジドと反応させる。血清群Ａでは、この段階でカルボジイミドも添加してもよい。反応期間後、ナトリウムシアノボロヒドリドを添加する。次いで、誘導体化された糖が、例えば限外濾過によって調製され得る。
【０１２６】
次いで、誘導体化された糖を担体タンパク質（例えば、ジフテリアトキソイド）と混合し、カルボジイミドを添加する。反応期間後、コンジュゲートが回収され得る。
【０１２７】
他の工程
上記の工程を含めるとともに、本発明の方法に、さらに、さらなる工程を含めてもよい。例えば、該方法は、莢膜糖を細菌から調製した後であってコンジュゲーションの前に、莢膜糖の解重合工程を含むものであり得る。解重合によって糖の鎖長が短くなり、ＧＢＳには良好でない場合があり得る。連鎖球菌属、特にＧＢＳでは、糖が長鎖であるほど、短鎖のものより免疫原性が大きくなる傾向にある（参考文献７１）。
【０１２８】
コンジュゲーション後、非コンジュゲート担体タンパク質のレベルが測定され得る。この測定を行なう方法の一例は、キャピラリー電気泳動（参考文献７２）（例えば、遊離溶液中）、またはミセル動電クロマトグラフィー（参考文献７３）を伴うものである。
【０１２９】
コンジュゲーション後、非コンジュゲート糖のレベルが測定され得る。この測定を行なう方法の一例は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（参考文献６９）を伴うものである。
【０１３０】
コンジュゲーション後、コンジュゲート糖を非コンジュゲート糖から分離する工程が使用され得る。これらの糖を分離する方法の一例は、一方の成分を選択的に沈殿させる方法の使用である。例えば、デオキシコール酸塩処理によって非コンジュゲート糖を溶液中に残存させるコンジュゲート糖の選択的沈殿が好ましい（参考文献６９）。
【０１３１】
コンジュゲーション後、コンジュゲートの分子サイズおよび／またはモル質量を測定する工程が行なわれ得る。特に、分布が測定され得る。このような測定を行なう方法の一例は、サイズ排除クロマトグラフィーとともに多角度光散乱測光法および示差屈折率測定法による検出（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ／ＲＩ）（参考文献７４）を伴うものである。
【０１３２】
コンジュゲートの組み合わせ
任意の肺炎球菌血清群について、個々のコンジュゲートは上記のようにして調製され得る。
【０１３３】
好ましくは、コンジュゲートは、血清群１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆのうちの１種類以上について調製する。次いで、多価混合物を得るために、個々のコンジュゲートを混合してもよい。
【０１３４】
また、選択した数のコンジュゲートを混合し、２価、３価、４価、５価、６価、７価または１１価の混合物を得ることも可能である（例えば、１＋３＋４＋５＋６Ｂ＋７Ｆ＋９Ｖ＋１４＋１８Ｃ＋１９Ｆ＋２３Ｆ、４＋６Ｂ＋９Ｖ＋１４＋１８Ｃ＋１９Ｆ＋２３Ｆまたは１＋４＋６Ｂ＋９Ｖ＋１４＋１８Ｃ＋１９Ｆ＋２３Ｆを混合など）。
【０１３５】
ＧＢＳでは、コンジュゲートは、好ましくは血清群Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩのうちの１種類以上から調製する。
【０１３６】
コンジュゲートは、これらを個々に緩衝溶液に添加することにより混合され得る。好ましい溶液はリン酸緩衝生理食塩水（終濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム）である。最終混合物中の各コンジュゲートの好ましい濃度（糖として測定）は１〜２０μｇ／ｍｌ、例えば５〜１５μｇ／ｍｌ（８μｇ／ｍｌ前後など）である。任意選択のアルミニウム塩アジュバントは、この段階で添加され得る（例えば、最終Ａｌ３＋濃度を０．４〜０．５ｍｇ／ｍｌにするため）。
【０１３７】
混合後、混合したコンジュゲートは滅菌濾過され得る。
【０１３８】
医薬組成物
本発明の方法によって調製されたコンジュゲートを、薬学的に許容され得る担体と合わせてもよい。かかる担体としては、それ自体は、該組成物を受ける個体に対して有害な抗体生成を誘導しない任意の担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、大型のゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）などである。かかる担体は当業者には充分わかる。また、ワクチンには、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含めてもよい。また、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質を存在させてもよい。滅菌されたパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論考は参考文献７５において入手可能である。
【０１３９】
該組成物には、特に、反復用量形式でパッケージングされる場合、抗菌剤が含まれ得る。
【０１４０】
該組成物に、デタージェント、例えばＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）（ＴＷＥＥＮ  ８０（ＴＭ）など）を含めてもよい。デタージェントは、一般的には低レベル（例えば、＞０．０１％）で存在する。
【０１４１】
該組成物に、張度を付与するためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含めてもよい。１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが典型的である。
【０１４２】
該組成物は、一般的にバッファーを含む。リン酸バッファーが典型的である。
【０１４３】
該組成物には、特に、凍結乾燥される場合、または凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースもしくはトレハロース）が、例えばおよそ１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で含まれ得る。凍結乾燥用組成物のｐＨは、凍結乾燥前に６．１前後に調整され得る。
【０１４４】
コンジュゲートは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。特に、該組成物は、通常、ワクチンアジュバントを含む。本発明の組成物に使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１４５】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはその混合物）などのミネラル塩が挙げられる。本発明は、ミネラル塩、例えば、水酸化物  （例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えば、参考文献７６の第８章および第９章参照）、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、該化合物には、任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど）が採用され、吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい（参考文献７７）。
【０１４６】
リン酸アルミニウムは、特に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ糖抗原を含む組成物において特に好ましく、典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａ１モル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである（０．６ｍｇ  Ａｌ＋３／ｍｌで含む）。
【０１４７】
低用量のリン酸アルミニウムとの吸着、例えば、５０〜１００μｇのＡｌ３＋／コンジュゲート／用量が使用され得る。１つより多くのコンジュゲートが組成物中に存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。
【０１４８】
カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献２５８に開示された「ＣＡＰ」粒子が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、該塩には任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど）が採用される。このような塩への吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい［７７］。アルミニウム塩アジュバントは、より詳細に後述する。
【０１４９】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られているアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣用的であるが、便宜上使用されているものであって、いずれも、存在する実際の化合物の正確な記載ではない（例えば、参考文献７６の第９章参照）。本発明では、一般にアジュバントとして使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。
【０１５０】
「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも一部分が結晶性である。オキシ水酸化アルミニウムは、式ＡｌＯ（ＯＨ）で表されるものであり得、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物とは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１における大きな肩部の存在によって識別され得る［参考文献７６の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半値幅（ＷＨＨ）における回折バンド幅によって反映され、結晶性が不充分な粒子は、微結晶サイズが小さいため、大きく広がったラインを示す。表面積は、ＷＨＨが増大するにつれて増大し、アジュバントは、大きなＷＨＨ値を有するほど大きな抗原吸着能を有することが観察された。繊維状の形態構造（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られる）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは典型的には約１１である、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについて、ｐＨ７．４で１．８〜２．６ｍｇタンパク質／ｍｇ  Ａｌ＋＋＋の吸着能が報告されている。
【０１５１】
「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、これは、多くの場合、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含有している。これは、沈殿によって得られ得、沈殿時の反応条件と濃度は、塩内でヒドロキシルがリン酸基に置換される程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に、０．３〜１．２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は厳密なＡｌＰＯ４とは、ヒドロキシル基の存在によって識別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱した場合）は、ヒドロキシル構造の存在を示す［参考文献７６の第９章］。
【０１５２】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５＋０．１である。リン酸アルミニウムは、一般的に、特にヒドロキシリン酸塩の場合、アモルファスである。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである（０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含む）。リン酸アルミニウムは、一般的に微粒状である（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるようなプレート様形態構造）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントについて、ｐＨ７．４で０．７〜１．５ｍｇタンパク質／ｍｇ  Ａｌ＋＋＋の吸着能が報告されている。
【０１５３】
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルとのリン酸基の置換の程度に反比例し、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件および反応体の濃度に応じて異なり得る。また、ＰＺＣも、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させること（より多くのリン酸イオン＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを添加すること（ＰＺＣがより塩基性となる）により変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【０１５４】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液に、バッファー（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓバッファー）を含めてもよいが、これは必ずしも必要ではない。該懸濁液は、好ましくは滅菌されており、パイロジェンフリーである。該懸濁液は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含むものであり得る。また、該懸濁液は塩化ナトリウムを含むものであってもよい。
【０１５５】
本発明では、ＤＡＲＯＮＲ１ＸＴＭのような、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が使用され得る。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多い方がよく、例えば、重量比は少なくとも２：１、例えば、＞５：１、＞６：１、＞７：１、＞８：１、＞９：１などである。
【０１５６】
患者への投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、＜５ｍｇ／ｍｌ、＜４ｍｇ／ｍｌ、＜３ｍｇ／ｍｌ、＜２ｍｇ／ｍｌ、＜１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は０．３〜ｌｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１５７】
Ｂ．油性乳剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、スクアレン−水乳剤、例えば、ＭＦ５９（参考文献７６の第１０章参照；参考文献７８も参照のこと）（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に構築）が挙げられる。また、完全アジュバントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバントアジュバント（ＩＦＡ）も使用され得る。
【０１５８】
乳剤中の油滴は、一般的に５μｍ未満の直径であり、サブミクロン直径を有する場合でさえあり得、このような小径はマイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定な乳剤が得られる。２２０ｎｍ未満の径を有する液滴は、濾過滅菌に供することができるため好ましい。
【０１５９】
Ｃ．サポニン製剤（参考文献７６の第２２章参照）
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ）から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、ＱＳ２１などの精製製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（ＴＭ）として市販されている。
【０１６０】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されたものである。このような手法が使用された具体的な精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献７９に開示されている。サポニン製剤には、ステロール（コレステロールなど）が含まれることがあり得る（参考文献８０）。
【０１６１】
サポニンとコレステロールの組み合わせは、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される特殊な粒子を形成するために使用され得る（参考文献７６の第２３章参照）。また、ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどなどのリン脂質を含む。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種類以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献８０〜８２にさらに説明されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなるデタージェントを含まないものであり得る（参考文献８３）。
【０１６２】
サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献８４および８５を見るとよい。
【０１６３】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。このような構造体は、一般的に、任意選択でリン脂質と会合または構築されたウイルス由来の１種類以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性であり、非複製性であり、一般的に天然ウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されたものであってもよく、完全体ウイルスから単離されたものであってもよい。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこのようなウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（外被タンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献８６〜９１にさらに論考されている。ビロソームは、例えば参考文献９２にさらに論考されている。
【０１６４】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体などを包含する。
【０１６５】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５または６アシル化鎖との混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は、参考文献９３に開示されている。かかる３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍ膜で滅菌濾過されるのに充分小さい（参考文献９３）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）（参考文献９４，９５）などが挙げられる。
【０１６６】
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献９６および９７に記載されている。
【０１６７】
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンにリン酸結合によって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫賦活性であることが示されている。
【０１６８】
ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／類似体（ホスホロチオエート修飾など）を含むものであってもよく、二本鎖であっても単鎖であってもよい。参考文献９８、９９および１００には、可能な類似置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換え）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１０１〜１０６にさらに論考されている。
【０１６９】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に対するものであり得る（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）（参考文献１０７）。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってもよく（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど）、Ｂ細胞応答に対してより特異的であってもよい（ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど（ｓｕｃｈ  ａ））。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１０８〜１１０に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１７０】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体の認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合させ「イムノマー」を形成してもよい。例えば、参考文献１０７および１１１〜１１３を参照のこと。
【０１７１】
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、そのタンパク質は、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（ＰＴ」）に由来するものである。粘膜経由アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献１１４に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献１１５に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡとＢの両方のサブユニットを含むホロトキシンの形態である。好ましくは、Ａサブユニットは無毒化変異を含む；好ましくは、Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などの無毒化ＬＴ変異型である。アジュバントとしてのＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献１１６〜１２３を見るとよい。アミノ酸置換の数の参照は、好ましくは、参考文献１２４（引用によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）に示されたＡＤＰ−リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づいて行なう。
【０１７２】
Ｆ．ヒト免疫調節因子
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（参考文献１２５）など）（参考文献１２６）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などが挙げられる。好ましい免疫調節因子はＩＬ−１２である。
【０１７３】
Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア（参考文献１２７）または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る（参考文献１２８）。
【０１７４】
Ｈ．ミクロ粒子
ミクロ粒子もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性であり非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物（ａｒｔｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリカプロラクトンなど）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）で形成されたミクロ粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３３μｍの直径、最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）が好ましく、任意選択で処理され、負電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正電荷を有する表面（例えば、カチオン系デタージェント（ＣＴＡＢなど）で）を有する。
【０１７５】
Ｉ．リポソーム（参考文献７６の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１２９〜１３１に記載されている。
【０１７６】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（参考文献１３２）を包含する。かかる製剤は、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（参考文献１３３）、ならびに少なくとも１種類のさらなる非イオン系界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（参考文献１３４）を包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
【０１７７】
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、参考文献１３５および１３６に記載されている。
【０１７８】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１７９】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（ＴＭ）およびその相同物（例えば、レシキモド３Ｍ（ＴＭ））が挙げられ、参考文献１３７および１３８にさらに記載されている。
【０１８０】
また、本発明は、上記において特定したアジュバントの１つ以上の態様の組み合わせを含む。例えば、以下：（１）サポニンと水中油型乳剤（参考文献１３９）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（参考文献１４０）；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２Ｉ）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意選択で＋ステロール）（参考文献１４１）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤（参考文献１４２）との組み合わせ；（６）ＳＡＦ、１０％スクアラン、０．４％ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ含有（サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズしたもの、またはボルテックスして大粒系乳剤にしたもののいずれか）、（７）ＲＩＢＩ（ＴＭ）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、２％スクアレン、０．２  ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群の１種類以上の細菌細胞壁成分含有；好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（ＴＭ））；ならびに（８）１種類以上のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）のアジュバント組成物が本発明において使用され得る。
【０１８１】
免疫賦活剤として作用する他の物質は、参考文献７６の第７章に開示されている。
【０１８２】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、一般的には、抗原をこのような塩に吸着させる。リン酸カルシウムは別の好ましいアジュバントである。
【０１８３】
該組成物は、滅菌および／またはパイロジェンフリーであるのがよい。組成物は、ヒトに関して等張性であるのがよい。
【０１８４】
組成物は、バイアルにて提示してもよく、充填済みシリンジにて提示してもよい。シリンジは、針を取り付けたものであっても、そうでなくてもよい。シリンジは単回用量の組成物を含むものであるが、バイアルは単回用量を含むものであっても反復用量を含むものであってもよい。注射用組成物は、通常、液状の溶液または懸濁液である。あるいはまた、該組成物を、注射前に液状ビヒクルで液剤または懸濁剤にするための固体形態（例えば、凍結乾燥型）で提示してもよい。
【０１８５】
組成物は、単位用量形態または反復用量形態でパッケージングされ得る。反復用量形態には、バイアルが充填済みシリンジよりも好ましい。有効投薬容量は、常套的に確立され得るが、注射用組成物の典型的なヒト用量は０．５ｍｌの容量を有する。
【０１８６】
組成物が使用前に即時調製されるものであり（例えば、成分が凍結乾燥形態で提示される）、キットとして提示される場合、キットは、２つのバイアルを含むものであってもよく、１つの充填済みシリンジと１つのバイアルを含み、シリンジの内容物は、バイアルの内容物を注射前に再活性化させるために使用されるものであってもよい。
【０１８７】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（１種類または複数種）、ならびに必要に応じて任意の他の成分を含む。免疫学的有効量により、単回用量または一連の用量の一部のいずれかでの該量の個体への投与が、処置または予防に有効であるを意図する。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫機構が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、処置担当医による病状の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。この量は、常套的な治験によって決定され得る比較的広い範囲になることが予測され、各連鎖球菌コンジュゲートの典型的な量は、１μｇ〜２０μｇ／コンジュゲート（糖として測定）である（ｉｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ）。
【０１８８】
したがって、本発明は、（ａ）上記のようなコンジュゲートを調製する工程；（ｂ）該コンジュゲートを１種類以上の薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含む、医薬組成物の調製方法を提供する。
【０１８９】
さらに、本発明は、（ａ）上記のようなコンジュゲートを調製する工程；（ｂ）該コンジュゲートと１種類以上の薬学的に許容され得る担体と混合する工程；および（ｃ）コンジュゲート／担体混合物を、バイアルまたはシリンジなどの容器内にパッケージングして医薬製剤を得る工程を含む、医薬製剤の調製方法を提供する。シリンジ内への挿入は、工場または外科処置にて行なわれ得る。
【０１９０】
また、本発明は、コンジュゲートを薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含み、該コンジュゲートが上記のようなコンジュゲーション法のプロセスによって調製されたものである、糖−タンパク質コンジュゲートからの医薬組成物の調製方法を提供する。該コンジュゲーション法および混合工程は、大きく異なる時点で異なる人々によって異なる場所（例えば、異なる国）で行なわれてもよい。
【０１９１】
また、本発明は、糖−タンパク質コンジュゲートを医薬製剤にパッケージングするための方法であって、該コンジュゲートが上記のようなコンジュゲーション法のプロセスによって調製されたものであるを提供する。該コンジュゲーション法およびパッケージング工程は、大きく異なる時点で異なる人々によって異なる場所（例えば、異なる国）で行なわれてもよい。
【０１９２】
医薬用途
また、本発明は、該組成物を患者に投与することを含む、患者の処置方法を提供する。患者は、疾患のリスクがある患者自体であってもよく、妊娠女性（先天性免疫処置）であってもよい。患者は好ましくはヒトである。ヒトは、任意の年齢、例えば、＜２歳、２〜１１歳、１１〜５５歳、＞５５歳などであり得る。
【０１９３】
また、本発明は、治療における使用のための組成物を提供する。また、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造における該組成物の使用を提供する。好ましくは、疾患はインフルエンザまたは肺炎である。
【０１９４】
組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に）、または直腸内、経口、膣内、眼経由（ｏｐｔｉｃａｌ）、経皮、皮内、経眼、経鼻、耳内もしくは他の粘膜投与によって行なわれ得る。筋肉内投与（例えば、大腿または上腕への）が好ましい。注射は針（例えば、皮下注射針）によるものであり得るが、無針注射も択一的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
【０１９５】
本発明は、全身性および／または粘膜免疫を誘起するために使用され得る。
【０１９６】
投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよく、反復用量スケジュールであってもよい。反復用量は、初回刺激免疫処置スケジュールおよび／または追加刺激免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。初回刺激用量スケジュールの後に、追加刺激用量スケジュールが行なわれ得る。初回刺激用量間（例えば、４〜１６週間）、および初回刺激と追加刺激間の好適なタイミングは、常套的に決定され得る。
【０１９７】
細菌感染は、身体の種々の領域を侵すため、該組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は注射用剤として、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。また、液状ビヒクル中の液剤または懸濁剤に適した注射前の固形形態を調製してもよい（例えば、凍結乾燥組成物）。該組成物は、経表面投与のためには、例えば、軟膏、クリーム剤または粉末剤として調製され得る。該組成物は、経口投与のためには、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（任意選択でフレーバーを添加）として調製され得る。該組成物は、肺内投与のためには、例えば、微粉末またはスプレーを用いて吸入剤として調製され得る。該組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。
【０１９８】
該組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のためには、例えば、スプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉末剤として調製され得る（例えば、参考文献１４３および１４４）。注射用組成物が好ましい。
【０１９９】
本発明の組成物のさらなる抗原性成分
本発明の方法はまた、連鎖球菌コンジュゲートを１種類以上の以下の他の抗原：
−  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来糖抗原（例えば、参考文献１４５の第１４章）
−  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ精製由来タンパク質抗原
−  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ由来の外膜調製物
−  Ａ型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、不活化ウイルス（例えば、４６、１４７）
−  Ｂ型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、表面および／またはコア抗原（例えば、１４７、１４８）
−  ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド（例えば、参考文献１４５の第１３章）
−  破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド（例えば、参考文献１４５の第２７章）
−  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来抗原、例えば、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）およびＢ．  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（任意選択で、ペルタクチンおよび／または凝集原２や３との組み合わせも）（例えば、参考文献１４９および１５０；参考文献１４５の第２１章）
−  ポリオ抗原（１種類または複数種）（例えば、１５１、１５２）例えば、ＩＰＶ（参考文献１４５の第２４章）
−  麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原（例えば、参考文献１４５の第１９、２０および２６章）
−インフルエンザ抗原（１種類または複数種）（例えば、参考文献１４５の第１７章）、例えば、血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質
−  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来抗原（例えば、１５３）
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌属）由来タンパク質抗原（例えば、１５４、１５５）
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌属）由来抗原（例えば、１５５、１５６、１５７）
−  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来抗原（例えば、１５８）
と混合する工程を含むものであり得る。
【０２００】
該組成物は、このようなさらなる抗原を１種類以上含むものであってもよい。
【０２０１】
毒性タンパク質抗原は、必要な場合は無毒化され得る（例えば、化学的および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化（参考文献１５０））。
【０２０２】
ジフテリア抗原を組成物に含める場合、破傷風抗原と百日咳抗原もまた含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリアと百日咳の抗原も含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリアと破傷風の抗原も含める（ｉｎｃｌｕｄ６）ことが好ましい。したがって、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０２０３】
組成物中の抗原は、典型的には、各々、少なくとも１ｇ／ｍｌの濃度で存在させる。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、該抗原に対する免疫応答が誘起されるのに充分な濃度である。
【０２０４】
本発明の免疫原性組成物にタンパク質抗原を使用する択一例として、該抗原をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態）が使用され得る。
【０２０５】
抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着させる。
【０２０６】
該組成物中に含めるための好ましい非連鎖球菌抗原は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（Ｈｉｂ）を防御するものである；典型的には、これはＨｉｂ莢膜糖抗原である。Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来糖抗原がよく知られている。
【０２０７】
好都合には、特に小児において免疫原性を高めるため、Ｈｉｂ糖を担体タンパク質に共有結合によりコンジュゲートさせる。一般には、多糖コンジュゲート、特にＨｉｂ莢膜多糖の調製に関して、充分に文献がある。
【０２０８】
本発明では、任意の適当なＨｉｂコンジュゲートが使用され得る。好適な担体タンパク質は上記に記載しており、Ｒｉｂ糖に好ましい担体はＣＲＭ１９７（ＨｂＯＣ）、破傷風トキソイド（ＰＲＰ−Ｔ）およびＮ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（ＰＲＰ−ＯＭＰ）である。
【０２０９】
コンジュゲートの糖部分は多糖（例えば、完全長ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ））であり得るが、多糖を加水分解してオリゴ糖（例えば、分子量約１〜約５ｋＤａ）を形成することが好ましい。
【０２１０】
好ましいコンジュゲートは、アジピン酸リンカーによってＣＲＭ１９７に共有結合によって連結されたＨｉｂオリゴ糖を含むものである（参考文献１５９、１６０）。破傷風トキソイドもまた好ましい担体である。
【０２１１】
Ｈｉｂ抗原の投与により、好ましくは＞０．１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度がもたらされる。
【０２１２】
該組成物がＨｉｂ糖抗原を含む場合、ともに水酸化アルミニウムアジュバントを含まないことが好ましい。組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含む場合、Ｈｉｂ抗原は、アジュバントに吸着させてもよく（参考文献１６１）、非吸着型であってもよい（参考文献１６２）。吸着の抑制は、抗原／アジュバントの混合時の正しいｐＨ、適切な荷電ゼロ点を有するアジュバント、および組成物中の種々の異なる抗原の適切な混合順序（参考文献１６３）を選択することによりなされ得る。
【０２１３】
本発明の組成物は、１種類より多くのＨｉｂ抗原を含むものであってもよい。Ｈｉｂ抗原は、例えば、髄膜炎菌組成物での再構成のための凍結乾燥されたものであってもよい。したがって、Ｈｉｂ抗原は、髄膜炎菌コンジュゲートとは別にパッケージングしてもよく、ともに混合してもよい。
【０２１４】
本発明の組成物に含めるための他の非連鎖球菌抗原は、性感染病（ＳＴＤ）由来のものである。かかる抗原により、クラミジア感染、陰部疱疹、肝炎（ＨＣＶなど）、陰部疣贅、淋病（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、梅毒および／または軟性下疳などのＳＴＤの予防または治療が提供され得る（参考文献１６４）。抗原は、１種類以上のウイルス性または細菌性ＳＴＤに由来するものであってもよい。本発明における使用のためのウイルス性ＳＴＤ抗原は、例えば、ＨＩＶ、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１やＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、および／または肝炎（ＨＣＶ）に由来するものであり得る。本発明における使用のための細菌性ＳＴＤ抗原は、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉまたは大腸菌に由来するものであり得る。
【０２１５】
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が使用される。かかる手法は、文献に充分説明されている。例えば、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＴ  Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  ＳＴ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  ＳＴ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に、第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．  Ｙ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編１９８６），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，第１９版（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓ��，（Ｒｅａｍら編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ  （Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），第２版（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；ならびにＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。
【０２１６】
本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略号を使用する。
【０２１７】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２１８】
実施例
本明細書における方法を例示するため、ＧＢＳ疾患を有する患者から単離したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ０９０、Ｈ３６ｂ、Ｍ７８１、およびＣＢＪ１１１（これらから、４つの代表的な血清型（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶ）が得られる）を試験した。
【０２１９】
実施例１−５リットルおよび２０リットルでの発酵
Ａ）播種材料調製プロセスの開発
３種類のＧＢＳ血清型の培養試験を、１０００ｍＬの播種材料培養物：８ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４二水和物（Ｍｅｒｃｋ）、２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４一水和物（Ｍｅｒｃｋ）、１７ｇ／Ｌの自己分解型酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１ｍｇ／Ｌのビオチン（Ｍｅｒｃｋ）および３３ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（Ｍｅｒｃｋ）を入れた５０００ｍＬ容のバッフルなしの振盪フラスコにおいて行なった。化合物はすべて逆浸透水（ＲＯＷ）に溶解させ、０．２２μｍ孔径膜フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通す濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブ内で１２２℃で３０分間滅菌した５０００ｍＬ容三角フラスコに無菌的に添加した。
【０２２０】
一連の振盪実験の各々について、培地（ｐＨ＝７．３）に、異なる容量の解凍培養物（作業種菌株は、１０％グリセロール中に−７０℃で保存した）を播種し、水平型振盪器の小室（Ｉｎｎｏｖａ  ４３３０、偏心式  １インチ）内で、２００ｒｐｍで攪拌しながら３５℃でインキュベートした。
【０２２１】
培養中の種々の時点で、５９０ｎｍにおける光学密度を測定し（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ｎｏｖａｓｐｅｃＩＩ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、また、光学密度値が０．５以上になったとき、ｐＨ値もモニターした（ｐＨメーターＭｅｔｒｏｈｍ）。対数期の期間中の倍加時間を、増殖曲線の線形部分の回帰解析によって求めた。直線の傾きは、最大比増殖速度μｍａｘ、および式ｔｄ＝ｌｎ２／μによる倍加時間（ｔｄ）に相当する。
【０２２２】
Ｂ）５リットルおよび２０リットル容発酵槽の準備
槽を満たし、培養培地を滅菌する前、発酵槽の計器（ｐＨ電極およびｐＯ２メーター）を、標準的な方法を用いて較正した。
【０２２３】
ＧＢＳは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物（アミノ酸やビタミンなど）を合成する能力をもたない。このため、ＷＯ０７／０５２１６８に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。
【０２２４】
多糖の生産に使用した基本培地は、２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４二水和物（Ｍｅｒｃｋ）、１６．７ｇ／Ｌの自己分解型酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３２ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（Ｍｅｒｃｋ）、１ｍｇ／Ｌのビオチン（Ｍｅｒｃｋ）、０．５ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．５ｍｇ／Ｌのリボフラビン（Ｆｌｕｋａ）、０．５ｍｇ／Ｌのニコチン酸（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）０．５ｍｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン（Ｓｉｇｍａ）および起泡の形成を抑制するための１ｍＬ．Ｌ−１ポリプロピレングリコール（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むものとした。
【０２２５】
空の培養槽の滅菌は可能でないため、発酵槽に、リン酸塩、酵母抽出物およびポリプロピレングリコール（７Ｌ容発酵槽では４．２Ｌ、および３０Ｌ容発酵槽では１６Ｌ）を満たし、１２１℃で３０分間インサイチュ滅菌した。滅菌中、一部液体が蒸発した。蒸発による液体の正確な減損量は培地の高さで経験的に評価されるため、滅菌前に過剰量の水を添加した（７Ｌ容発酵槽では０．５Ｌ、および３０Ｌ容発酵槽では１Ｌ）。
【０２２６】
パラレルで、Ｄ−グルコース一水和物の濃縮溶液（５５０ｇ／Ｌ）とビタミン（塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシンは０．５ｇ／Ｌ、リボフラビンは０．０５ｇ／Ｌ、およびビオチンは０．２ｇ／Ｌ）をＲＯＷに溶解させ、０．２２μｍ孔径膜フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通す濾過によって別々に滅菌し、次いで発酵槽に無菌的に添加し、発酵槽内での適正な終濃度を得た（７Ｌ容発酵槽では：３００ｍＬのＤ−グルコース一水和物、２５ｍＬのビオチン、５ｍＬのビタミン溶液（塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン）および５０ｍＬのリボフラビン；３０Ｌ容発酵槽では：１０００ｍＬのＤ−グルコース一水和物、１００ｍＬのビオチン、１７ｍＬのビタミン溶液および１７０ｍＬのリボフラビン）。
【０２２７】
Ｃ）５Ｌおよび２０Ｌ容発酵槽中での培養
ＧＢＳによるｃｐの発現は、細菌病原体の莢膜内の他のものの場合と同様、構成的ではなく、インビトロでの培養中および種々の感染部位から単離された初代培養物において種々である（参考文献１７３）。かかる観察結果にもかかわらず、ＧＢＳにおけるこの表面発現炭水化物抗原の調節についてはほとんどわかっていない。連続式培養における菌体増殖速度は、既に、莢膜多糖の生産を調節する主要因子であることが報告され、ＩＩＩ型莢膜多糖の増殖速度依存性生産は、増殖制限栄養素とは独立して起こった。実際、ｃｐの生産は、菌体を高速（１．４時間−１）の質量倍加時間で保持した方が、低速（１１時間−１）培養よりも多かった（参考文献１７４）。
【０２２８】
最初に、ＧＢＳでの試験はすべて、増殖速度、栄養素濃度およびｐＨを変化させることを特徴とするバッチ式培養での菌体培養を用いて行なった。バッチ式培養での菌体が受ける増殖パラメータシフトにより、代謝の変化がもたらされ、これは菌体の組成に影響を及ぼす。連続式培養では、安定な基質、生成物およびバイオマス濃度の環境ならびに研究者によって制御される速度において、連続的な対数増殖が可能である。増殖速度条件が維持されている場合、定常状態に達する。しかしながら、連続式培養は、菌株安定性の問題および夾雑を有する傾向にあり、また、培地と栄養素を連続的に供給する必要があるため、製造規模では費用がかかるので、工業用生産では回避するのがよい。
【０２２９】
５Ｌ−および２０Ｌ規模での培養を、それぞれ、全容積６．９Ｌおよび３１Ｌを有するＢｉｏｓｔａｔ  ＣＴ５−２およびＣ２０−３反応器（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において行なった。バイオリアクターには、それぞれ、各々６つのパドルを含む２〜３個の攪拌器を備え付けた。また、溶存酸素濃度（Ｉｎｐｒｏ  ６５００シリーズ２酸素センサー；Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）、ｐＨ（型番Ｐａ／２；Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）、温度（ｐｔ１００電極、Ｍ．Ｋ．  Ｊｕｃｈｌｅｉｍ  ＧｍｂＨ）、起泡（型番Ｌ３００／Ｒｄ．２８；Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を測定するための蒸気滅菌性プローブのためのポートを利用可能にした。操作は、ＭＦＣｓ／ｗｉｎソフトウェアパッケージ（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と組み合わせたＤＣＵ−３デジタル制御ユニットにより制御および記録した。バイオリアクター内に残存する消費ガス中の炭素酸素および酸素の濃度を、１３１０発酵槽モニター（Ｉｎｎｏｖａ）およびＧＭＵＸ−８解析装置（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて測定した。
【０２３０】
培養は、３６℃±１℃で、０．２バールの圧力およびｐＯ２＝３０±１０％飽和（培地中）で行ない、これを、７Ｌ容発酵槽では１００±１０％〜７００±１０％ｒｐｍ、および３０Ｌ容発酵槽では５０±１０％〜５００±１０％ｒｐｍの攪拌速度、ならびに０．１および１．０ｖ／ｖ／ｍ±１０％の曝気速度によって制御した。培地のｐＨは、４Ｍ水酸化ナトリウムの添加の制御によって自動で７３±０．２に維持した。温度、ｐＨおよび攪拌などの種々のパラメータのモニタリングおよび／または制御は、ＰＩＤ制御ユニットにて行なった。起泡は、消泡剤乳剤（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により自動制御した。
【０２３１】
１０００ｍＬの播種材料用滅菌培地に、適応作業種菌株容量の試験対象菌株を播種し、回転式振盪器にて振盪しながら３５℃で所望の期間インキュベートした。フラスコの播種材料が対数増殖中期（ＯＤが０．８〜１．２）に達したら、０．０３２の初期ＯＤが得られるのに充分な容量のこの培養物を、新鮮バッチ用培地（４．７Ｌまたは１７Ｌ）への播種に使用した。
【０２３２】
バッチ相の発酵は、培養物のＯＤ５９０ｎｍが２．５（±０．５）に達するまで進行させることが可能であった。培養物が、このＯＤ値またはその付近になったとき、酵母抽出物培地（１５０ｇ／Ｌ）の最初の対数増殖期フィードバッチ式添加を開始し、４５〜５０分間継続して比増殖速度（ρ）０．１３８時間−１を維持した。０．９２４時間−１のμを維持するための酵母抽出物培地（１５０ｇ／Ｌ）の２回目の対数増殖期フィードバッチ式添加は、最初の部の終了時、ＯＤが４．５±０．５になったときに開始し、４５〜５０分間継続した。このような添加相により、細菌の倍加時間が、バッチ相に典型的な２０〜２５分間から、理想的な多糖生産条件に微生物を適応させることが可能となる４５分間に減弱された。最終的に、生産性を増大させるため、２回目の酵母抽出物の添加終了時、ＯＤが１０．０±２になったとき、濃縮Ｄ−グルコース一水和物（５５０ｇ／Ｌ）のｐＨ調節型供給を用いて培養を３時間継続し、色素生成および莢膜多糖生産低下がもたらされ得る基質の完全な枯渇を回避した。
【０２３３】
５０ｍＬの少量の試料を培養液から、発酵時プロセス期間の度に抜き取り、細菌の培養、グルコース消費量および多糖の生産について解析した。
【０２３４】
Ｄ）ＧＢＳの回収および不活化
増殖速度が一貫して低下するようなったとき（これは、ｐＨ制御グルコース相の開始から３時間後に起こった）、培養物を回収した。培養物を、直ちに、周囲温度で４５分間７７４１×ｇにて遠心分離した（ＡｖａｎｔｉＴＭ遠心分離機Ｊ−２０  ＸＰＩ  Ｂｅｃｋｍａｍ  ｃｏｕｌｔｅｒ）。上清みを除去し、グルコースアッセイ用に−２０℃で保存し、回収重量を測定した。
【０２３５】
ＧＢＳ多糖の精製は、最初に、ｃｐの不活化と加水分解が必要であった。１Ｍの水酸化ナトリウムをペレットに添加し、０．８Ｍの終濃度を得た。反応混合物を３７℃および１２０ｒｐｍで３６時間インキュベートした後、血清型特異的ｃｐの含有量を調べた。
【０２３６】
Ｅ）発酵槽のクリーニング
培養物を回収した後、槽および付属機器を除染した。まず、発酵槽にＲＯＷを満たし、４Ｍ水酸化ナトリウムを手作業で添加することによりｐＨを１２に上げた。水を８０℃まで３０分間加熱し、熱の均一な分散が確保される０．２バールの圧力および２００ｒｐｍでの攪拌を維持することにより消毒を行なった。消毒が終了したら、水酸化ナトリウムを含む水を回収し、ｐＨ値が５〜７の範囲に低下するまで発酵槽をＲＯＷで洗浄した。一般的に、所望のｐＨに達するまで３回の洗浄が必要であった。発酵槽を空にし、プローブおよび付属機器をそのポートから外し、播種および追加栄養素や腐食性薬剤の移送のためのセプタムコネクター、ならびに試料の取り出しおよび保存のためのビンを、オートクレーブ内で３０分間１２２℃にて別々に滅菌した。再度、発酵槽にＲＯＷを満たし、１２１℃で３０分間滅菌した。
【０２３７】
実施例２−２リットルでの発酵
Ａ）菌株および培養培地
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅＩＩＩ型菌株Ｍ７８１（最初に、ＧＢＳ髄膜炎を有する新生児から単離された）を、Ｃａｒｏｌ  Ｊ．  Ｂａｋｅｒ氏によりご提供頂いた。Ｍ７８１菌株細胞は、改変型の化学的に規定される培地（最初は、Ａ群連鎖球菌のために開発（参考文献１７４））中で培養した。バッチ式培養試験に使用した化学的に規定される培地の組成を表１に示す。
【０２３８】
【表１−１】
0005465676.tif 000002
【０２３９】
【表１−２】
0005465676.tif 000003
ｐＨプローブは、２種類の標準溶液（ｐＨ値＝７と４）を用いた２点較正によって較正した。ｐＯ２プローブおよびｐＨプローブを培養槽内に載置した。発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ３Ｌ）にグルコースを満たし、オートクレーブ内で１２２℃にて３０分間滅菌した。他のすべての化合物は、０．２２μｍ孔径膜フィルターに通す濾過によって別々に滅菌し、次いで発酵槽に無菌的に添加した。培地の沈殿を回避するため、濃縮溶液を調製し（２０×リン酸塩、１００×硫酸塩、５０×ナトリウム、２４０×窒素塩基、９０００×ビタミン、３５×アミノ酸含有水および９０×アミノ酸含有水酸化ナトリウム）、各々の適切な容量を、以下の順序：リン酸塩、アミノ酸、ビタミン、硫酸塩および窒素塩基で炭素源に添加し、所望の終濃度を得た。すべての添加を行なったら、ｐＯ２プローブを較正した。「ゼロ」測定では、培養槽に一晩窒素スパージした。培養物を酸素で飽和させた後、操作条件に達したら、電極スロープを１００％に較正した。
【０２４０】
Ｂ）２Ｌ規模での培養
菌株Ｍ７８１による莢膜多糖の発現に関する予備実験を、バッチ式培養において行なった。
【０２４１】
菌体の活性化のため、１００ｍＬの化学的に規定される培地（ｐＨ値＝７．２、６Ｍ塩素酸（ｃｈｌｏｒｈｙｄｒｉｃ  ａｃｉｄ）を用いて調整）（０．２２μｍ孔径膜フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通す濾過によって滅菌済み）を滅菌した５００ｍＬ容三角フラスコ内に入れ、０．１ｍＬのＭ７８１菌株解凍培養物を播種した（作業種菌株は、１０％グリセロール中に−７０℃で保存した）。この種培養物を、３５℃にて２００ｒｐｍで攪拌しながら、水平型振盪器の小室（Ｉｎｎｏｖａ  ４３３０、偏心式１インチ）内で９時間インキュベートした。次いで、種培養物を２．５Ｌ容のジャケット付き発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）内の１．８Ｌの基本培地中に播種し、このとき初期ＯＤは０．４であった。
【０２４２】
発酵は、デジタル測定およびＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製の制御ユニット（Ｂｉｏｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＡＤＩ  １０３０、Ａｐｐｌｉｋｏｎ）によって制御し、データはすべてコンピュータ（ＢｉｏＸｐｅｒｔソフトウェア）によって収集した。温度は、外部サーモスタット（Ｈａａｋｅ）によって３６℃に自動制御した。溶存Ｏ２を滅菌性電極（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ）によって測定し、１５０〜１０００ｒｐｍの攪拌速度（Ｍｏｔｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＡＤＩ  １０１２）および０．１〜１．０ｖ／ｖ／ｍの曝気速度（Ｆｌｏｗ  ｃｏｎｓｏｌｅ  Ａｐｐｌｉｋｏｎ）の自動調整によって３０％より高い空気飽和に維持した。培養物のｐＨは、２Ｍ水酸化ナトリウム（ポンプ送達Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）により、自動滴定によって７．３に維持した。
【０２４３】
未知の増殖制限因子を用いたフィードバッチ式培養試験では、培養をバッチ培養相（１．２Ｌ）で開始した後、フィード相を行なった。最良のフィードバッチ式ストラテジーを開発するため、３つフィードバッチ式手法を各菌体増殖：（１）ｐＨ−ｓｔａｔ、（２）ＤＯＴ−ｓｔａｔ、および（３）対数増殖について試験した。ｃｐ濃度を一定間隔でモニターした。
【０２４４】
ｐＨ−ｓｔａｔ法を用いた基質供給を制御するため、培養培地のｐＨを、培養プロセス中、蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｃｏｎｃｏｄｅ  Ｄｒｉｖｅ）による供給溶液の添加によって７．３に調整した。ｐＨが設定点である７．３を超えた場合は、グルコースを枯渇させた。そのため、補給栄養素を自動添加して、ｐＨを設定点に再調整した。
【０２４５】
ｐＯ２−ｓｔａｔストラテジーでは、ｐＯ２が溶存酸素の設定点４０％より上まで上昇した場合はいつでも、炭素源の供給量を自動添加した。
【０２４６】
対数増殖培養手法では、蠕動ポンプを対数期の終了時に作動させ、莢膜多糖の生産のための至適倍加時間である０．９２時間−１（ｔｄ＝４５分）の比増殖速度を維持した。
供給は、下記の式：
【０２４７】
【数１】
0005465676.tif 000004
に従って行なった。式中、Ｆは供給速度であり、μは比増殖速度であり、（ＶＸ）０は、供給開始時のバイオマスであり、ｔｆは供給を開始した時点であり、Ｓｆ，ｃｏｎｓｔは、供給物の基質濃度であり、ＹＸ／Ｓは、グルコースの菌体収率係数である。
【０２４８】
Ｃ）増殖因子要求量を特定するための振盪フラスコ試験
生物体の増殖因子要求量を、個々の栄養素を規定培地から除外すること、および得られた培地によって増殖が補助され得るかどうかを調べることによって求めた。この試験は、１００ｍＬの化学的に規定される培地（表１参照）を入れた５００ｍＬ容のバッフルなしの振盪フラスコ内で行なった。
【０２４９】
培養培地のｐＨを、６Ｍ塩素酸を用いて７．２に調整した。次いで、培養培地を０．２２μｍ孔径膜フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通す濾過によって滅菌した。一連の振盪実験の各々について、培養培地に、０．１ｍＬのＭ７８１菌株解凍培養物（作業種菌株は、１０％グリセロール中に−７０℃で保存した）を播種し、水平型振盪器の小室（Ｉｎｎｏｖａ  ４３３０、偏心式１インチ）内で、２００ｒｐｍで攪拌しながら３５℃でインキュベートした。１８時間の培養後、５９０ｎｍにおけるＯＤ（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ｎｏｖａｓｐｅｃｌｌ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびｐＨ値（ｐＨメーターＭｅｔｒｏｈｍ）を測定した。
【０２５０】
アミノ酸とビタミンが欠乏した培地における増殖を、すべての化合物を存在させた対照培養と比較した。
【０２５１】
実施例３-解析方法
Ａ）増殖の測定
試料を採取したらすぐに、波長５９０ｎｍにおける培養物のＯＤ読み取ることによってバイオマスの含有量をモニターした（Ｎｏｖａｓｐｅｃ  ＩＩ分光測光器−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｋ）。０．１０〜０．５０の間隔内の吸光度の値を読み取るため、試料の希釈を行なった。
【０２５２】
正確に測定した容量の培養液（３０ｍＬ）を、予め乾燥および重量測定しておいた５０ｍＬ容のポリプロピレン製遠心分離用チューブ内に入れることにより、ｇ／Ｌ化学的に規定される培地で規定される菌体濃度を調べた。菌体を、Ａｖａｎｔｉ−ＴＭ  ＪＡ−２０  ＸＰＩ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ冷蔵型遠心分離機内で、２７，２１７×ｇで４５分間４℃にて遠心分離した。上清みをデカンテーションし、菌体ペレットを８５℃の炉内で２４時間乾燥させ、重量測定した。５９０ｎｍにおけるＯＤとｇＣＤＷ／Ｌ（乾燥菌体重量）バイオマスとの関係を確立した。５９０ｎｍにおける１ＯＤは、０．４４ｇＣＤＷ／Ｌバイオマスであった。
【０２５３】
Ｂ）グラム染色
グラム染色により、２つの主要な細胞壁の型が識別される。少量のペプチドグリカンおよび特徴的にはリポ多糖を含有する細胞壁を有する細菌種はグラム陰性であり、一方、比較的大量のペプチドグリカンを含有し、リポ多糖を含まない細胞壁を有する細菌はグラム陽性である。この方法を、研究室規模とパイロット規模の両方で使用し、種培養物および発酵槽培養物は純粋であるという確証を得た。
【０２５４】
染色手法に関して、顕微鏡スライド上の菌体を熱固定し、塩基性染料であるクリスタルバイオレット（これは、すべての細菌細胞を青色に染色する）で染色した。次いで、菌体をヨウ素−ヨウ化カリウム溶液で処理した。これにより、ヨウ素が菌体内に進入し、クリスタルバイオレット染料とともに水不溶性複合体を形成することが可能であった。菌体を、ヨウ素−クリスタルバイオレット複合体が可溶性となるアルコール溶媒で処理した。溶媒での処理後、グラム陽性菌体のみが染色されたままであった。
【０２５５】
染色手順後、菌体を対比染色剤サフラニンで処理し、脱色されたグラム陰性菌体を可視化した。対比染色されたグラム陰性菌体は赤色になり、一方、グラム陽性菌体は青色のままであった。対比染色剤を洗い流した後、スライドをゆっくりと加温して残留湿分（あれば）を除去した。次いで、スライドを顕微鏡ステージ上に置き、ここで、油に浸漬させたレンズを浸漬油中に沈めた。
【０２５６】
Ｃ）グルコースアッセイ
培養上清み中において、１ｃｍの光路長および３４０ｎｍ（ＮＡＤＰＨ）における溶液の吸光度を測定し、これを、純粋なグルコースのアッセイによって作成した標準曲線と比較することにより、グルコース消費量を比色分析によって調べた。
【０２５７】
Ｄ−グルコースは、酵素ヘキソキナーゼおよびＡＴＰの存在下でＤ−グルコース−６−リン酸にリン酸化されると同時に、ＡＤＰの形成を伴った：
【０２５８】
【化１】
0005465676.tif 000005
酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下では、Ｄ−グルコース−６−リン酸は、ＮＡＤＰによってＤ−グルコン酸−６−リン酸に酸化され、ＮＡＤＰＨの形成を伴った：
【０２５９】
【化２】
0005465676.tif 000006
この反応で形成されたＮＡＤＰＨの量は、Ｄ−グルコースの量に対して化学量論的であった。
【０２６０】
このアッセイ中に存在したＤ−グルコースの量は１μｇ〜５０μｇであった。充分な吸光度の差を得るため、０．０８〜０．５ｇ／ＬのＤ−グルコース濃度が得られるように試料溶液を希釈した。
【０２６１】
酵素反応を止めるために冷蔵庫内で−２０℃で保存していた上清みを、ＲＯＷ中で連続希釈した。５０μＬの希釈上清みを、周囲温度で１５分間、ヘキソキナーゼ（およそ３２０Ｕ）とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（およそ１６０Ｕ）を含み、ＮＡＤＰ、ＡＴＰおよび硫酸マグネシウムを加えたトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ＝７．６）溶液１０μＬとともにインキュベートした。
【０２６２】
使い捨てキュベット（１ｃｍ光路長）内でＲｏｃｈｅ手順に従って試料を調製後、分光測光測定を、室温にて３４０ｎｍで空気に対して行なった。
【０２６３】
Ｄ）莢膜多糖含有量の測定
Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（シアル酸）は、真核細胞の炭水化物構造体（糖タンパク質および糖脂質）の一成分として高頻度に見られる酸性の糖である。原核生物細胞でも、シアル酸は、いくつかの病原性細菌属のｃｐの一構成成分として見い出された［１０］。実際、ＧＢＳの血清型特異的ｃｐは、以下の糖：Ｎ−アセチル−ノイラミン酸あるいはシアル酸、グルコース、ガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンの反復単位を含む。シアル酸は多糖の不可欠な成分であるため、その定量的測定を使用し、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍによる化学的方法の設定（参考文献１７６）に従って血清型特異的ｃｐ生産をモニターした。
【０２６４】
シアル酸の量を測定する前、不活化試料中のｃｐを一部精製し、濃縮した。水酸化ナトリウム中での３６時間の多糖の加水分解後、１．５ｍＬの不活化試料を１５６００×ｇで２５分間遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｒ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、菌体を除去した。上清みをＲＯＷ中で１：１０に希釈し、次いで、セントリコン遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３０再生セルロース）を用いて精製および濃縮した。濃縮は、下記の手順に従い、異方性膜によって希釈試料を限外濾過（ｕｔｒａｆｉｌｔｅｒ）することにより行なった。
【０２６５】
試料レザバーを濾液用バイアル内に挿入した後、試料レザバーに１．５ｍＬの水を２回添加し、２５１９×ｇで２０℃にて２０分間スピンさせ、セントリコンシステムを清浄にした。このシステムの準備ができたら、１．５ｍＬの希釈試料を添加し、２５１９×ｇで３０分間遠心分離した。遠心力により、溶媒と低分子量の溶質は膜を通過して濾液用バイアル内に入った。ｃｐなどの巨大分子は、試料レザバー内部の膜上に保持された。試料容量を少なくすると、保持溶質濃度は増大した。保持液を０．５ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌで３回洗浄して夾雑物を排除し、２５１９×ｇで２０℃にて２０分間遠心分離した。
【０２６６】
回収のため、０．５ｍＬの０．５ｍｏｌ．Ｌ−１  ＮａＣｌを試料レザバーに添加した。ｃｐを保持液用バイアルに、該バイアルを試料レザバー上に置いてこのデバイスを反転させることにより移し、次いで２０５×ｇで１分間遠心分離した。この回収プロセスを２回繰り返し、すべてのｃｐを回収した。
【０２６７】
シアル酸の量を定量するため、レゾルシノール−塩酸を伴う比色分析法を使用した。この定量的アッセイのための試薬は、酸加水分解を確実にするための８０ｍＬの３７％ＨＣｌ、２０ｍＬの水および２０μｍｏｌのＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）を含有する溶液中に０．２ｇのレゾルシノール（Ｍｅｒｃｋ）を含むものとした。
【０２６８】
アッセイは、以下のようにして行なった。５〜２５μｇのシアル酸を含有する１ｍＬの試料を、２ｍＬのレゾルシノール試薬に添加した。試薬の添加後、溶液を混合し、沸騰水浴中で１００℃にて２０分間加熱し、この間、青紫色の発色が見られた。
【０２６９】
チューブを室温で冷却し、Ｎｏｖａｓｐｅｃ  １１分光測光器を用いて５５４ｎｍにおける吸光度を読み取った。光路長１ｃｍおよび容積１ｍＬの使い捨てキュベットを使用した。吸光度は、シアル酸５〜２５μｇの範囲で濃度に正比例した。
【０２７０】
生物学的材料中の非特異的発色を補正するため、対照試料をレゾルシノールなしで操作した。シアル酸の量の計算の前に、ブランク試料の吸光度を試験試料から差し引いた。
【０２７１】
パラレルで、０、５、１０、１５、２０および２５μｇのＮ−アセチルシアル酸の標準溶液を、同じ条件下で調製した。Ｎ−アセチルシアル酸の標準溶液からプログラムＵＶ  ＬＡＭＢＤＡにより誘導した等式を使用し、Ｎ−アセチルシアル酸の量を計算した。
【０２７２】
０９０、Ｈ３６ｂおよびＭ７８１の莢膜多糖は、３１％（ｗ／ｗ）のＮ−アセチルシアル酸を含む。ＣＪＢ１１１の莢膜多糖は、２３％（ｗ／ｗ）のＮ−アセチルシアル酸を含む。したがって、ｃｐ濃度は、この補正因子を用いて確認され得る。ｃｐの容積生産性を単位ｍｇ／Ｌで示し、比ｃｐ生産量を単位ｍｇ／Ｌ．ＯＤで示した。
【０２７３】
実施例４-単純化複合培地および線形添加
Ａ）播種材料調製プロセスの開発
ＧＢＳの血清型特異的ｃｐを生産するための発酵プロセスにおいて、５００ｍＬの培地を入れた２０００ｍＬ容振盪フラスコを播種材料培養物の調製に使用した。しかしながら、このようなフラスコは、パイロット規模および生産規模には適していなかった。したがって、４種類のＧＢＳ菌株（０９０、Ｈ３６ｂ、Ｍ７８１、およびＣＪＢ１１１）の挙動を、パイロット規模に適した播種材料調製プロセスを開発するための新たなフラスコにおいて試験した。次いで、この手順を使用し、ｃＧＭＰに従う第Ｉ相治験前のロットを作製した。
【０２７４】
この実施例の第１の目的は、１０００ｍＬの培地を入れた５０００ｍＬ容三角フラスコにおいて、これらの４種類のＧＢＳ菌株の増殖パラメータを見い出すこと、また、発酵槽内で適当なｐＨ値での指数増殖後期に必要とされる至適培養時間を試験することであった。第２の目的は、菌株の増殖速度に応じて、培養期間が発酵日の前の晩（培養時間は約８時間）または発酵日の早朝（培養時間は約３時間）のいずれかに開始され得るように修正するために、フラスコへの播種に使用される作業種菌株の容量を試験することであった。
【０２７５】
３種類のＧＢＳ血清型の試験を、１０００ｍＬの新鮮滅菌播種材料培地に播種する３ｍＬの作業種菌株を用いて行なった。さらに、再現性を裏付けるため、各実験を２回行なった。しかしながら、得られた増殖曲線および倍加時間は類似していたため、各実験の一方の結果のみを示した。
【０２７６】
０９０菌株では、菌体は指数増殖期を６．５時間維持し、倍加時間は３０分であった（μｍａｘ＝１．４１時間−１）。したがって、６時間は、適当なｐＨ値６．８を用いて指数増殖中期を得るのに充分であった）。この長さの時間は、発酵日の前の晩でのフラスコへの播種に充分でなかったため、この培養時間を長くするため、作業種菌株容量を０．１ｍＬに減らした。この条件下では、細菌は指数増殖期を８．５時間維持し、倍加時間は３５分であった（μｍａｘ＝１．２０時間−１）。したがって、この菌株の播種材料培養物の調製には８時間必要であった。
【０２７７】
Ｈ３６ｂ菌株では、３ｍＬの作業種菌株を用いて１回だけ実験を行なった。菌体は、すぐに指数増殖期に入り、倍加時間は２５分であり（μｍａｘ＝１．６５時間−１）、減速相は４．５時間後に始まった。したがって、６．５前後（７＋０．５）のｐＨ値で０．８〜１．２の範囲のＯＤを得るためには、この菌株の培地には、発酵の４時間前に播種しなければならなかった。
【０２７８】
Ｍ７８１菌株では、実験を２回行ない、最初は、３ｍＬの作業種菌株容量を使用し、次は０．１ｍＬを使用した。３ｍＬの作業種菌株容量を使用すると、培養時間に７．５時間が必要であった。一晩の培養（５倍加時間）を可能にするために培養時間を２．５時間長くするため、０．１ｍＬの作業種菌株容量を使用した。時間差は３０分だけであること、および倍加時間が３１．４分（μｍａｘ＝１．３２時間−１）から２７．５分（μｍａｘ＝１．５１時間−１）に短縮されたことが観察された。したがって、この菌株で０．１ｍＬの作業種菌株容量を使用すると、フラスコには、発酵の８時間前に播種しなければならなかった。
【０２７９】
ＣＪＢ１１１菌株では、３ｍｌの作業種菌株を用いて１回だけ実験を行なった。菌体は、すぐに指数増殖期に入り、倍加時間は２１分であり（μｍａｘ＝１．９８時間−１）、減速相は４．５時間後に始まった。したがって、６．５前後（７．０＋／−０．５）のｐＨ値で０．８〜１．２の範囲のＯＤを得るためには、培地には、発酵の４時間前に播種しなければならなかった。
【０２８０】
この新しい播種材料プロセスがパイロット規模に移行され得る前に、４種類のＧＢＳ菌株の挙動をｃＧＭＰ条件において試験し、播種材料調製プロセスを確認した。医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（第４巻）に報告のとおり：「確認試験は規定の手順に従って行なった。任意の新しい製造方式または調製方法を適合させる場合、常套的なプロセスに対する好適性が実証される工程を採用すべきである。指定の材料および設備機器を使用する規定のプロセスは、一貫して必要量の生成物が得られることが示されたものでなければならない」。各菌株の至適作業種菌株容量を用いて、新しい播種材料調製プロセスを繰り返した。増殖挙動は先の試験と同一であった。０９０菌株では、作業種菌株容量を０．１ｍＬとし、ＯＤが１±０．２でありｐＨが６．５±０．２である所望の範囲が得られる培養時間は８．５０時間であった。Ｈ３６ｂ菌株では、作業種菌株容量を３ｍＬとし、後期対数期が得られる培養時間は４時間であった。Ｍ７８１菌株では、作業種菌株容量を０．１ｍＬとし、所望のＯＤ範囲０．８〜１．２が得られる培養時間は７．５０時間であった。ＣＪＢ１１１菌株では、作業種菌株容量を３ｍＬとし、所望のＯＤが得られる培養時間は４時間であった。
【０２８１】
この播種材料調製プロセスをパイロット規模で使用し、２００Ｌ容発酵槽において０．０３２の初期ＯＤを得るためには、１０００ｍＬの培地を入れたフラスコが４つ必要であった。
【０２８２】
Ｂ）発酵プロセスの開発
ｉ）複合培養培地にビタミン溶液を添加する必要性の確認
ＧＢＳは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物（アミノ酸やビタミンなど）を合成する能力をもたない。このため、ＷＯ０７／０５２１６８に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。この複合培養培地を加熱によって滅菌し、ビオチンと、０．５ｇ／Ｌのチアミン、リボフラビン、ニコチン酸およびピリドキシンを含む０．１Ｍ水酸化ナトリウムとメタノールのビタミン溶液とを添加した。
【０２８３】
ＧＢＳ菌株の培養に使用された酵母抽出物は、生産プロセスおよび酵母自己分解物のプロセッシングに応じて比率が有意に異なることがあり得るが、これらのビタミンを含むものであった（表２）（参考文献１７７）。
【０２８４】
【表２】
0005465676.tif 000007
簡単で費用効果の高い生産プロセスを得るため、複合培養培地に添加したビオチンと４種類のビタミン溶液の役割を、３種類の特定のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株の増殖およびｃｐ生産量に対する効果について評価した。
【０２８５】
ｃｐプロセスをパイロット規模に移行させるための発酵プロセスを開発する前、先の実施例で開発したパラメータを使用し、研究室規模の発酵槽において３つのＧＢＳ血清型の増殖をモニターした。
【０２８６】
この条件では、３時間のグルコース供給後の最終ＯＤは、０９０菌株の１４からＨ３６ｂ菌株の２８．５まで異なり、これらの菌株のｃｐ濃度は３００ｍｇ／Ｌ〜５５０ｍｇ／Ｌであった。
【０２８７】
メタノールは、安全性の理由および水酸化ナトリウム中ではビタミンの特性が低下するので回避すべきであったため、チアミン、ピリドキシンおよびニコチン酸のＲＯＷ溶液を選択した。同時に、プロセスに対して第２の変更を行なった。ビタミンは熱不安定性化合物であるため、酵母抽出物培地は、オートクレーブ処理ではなく、０．２２μｍ孔径膜フィルターに通す濾過によって滅菌し、１２１℃で３０分間のオートクレーブを用いた滅菌ではなく、リン酸塩培地に無菌的に添加した。
【０２８８】
新しい発酵実験は、先に記載され変更を考慮して各菌株について行なった。３つの菌株（ｓｔａｉｎ）の増殖は、先の実施例で確立したプロセスと同等（Ｈ３６ｂ）またはより良好（０９０およびＭ７８１）であったが、培養物の色素沈着が持続した。実際、Ｆｒａｉｌｅらによる論文では、細胞壁内に集積されたオレンジがかった黄色の色素の生成は、ヒト溶血性ＧＢＳの特異な特徴の１つであり、臨床試料からＧＢＳを確認するための培養培地の使用のための基礎に供された（参考文献１７８）。この化学的夾雑（着色）を排除するため、精製プロセスには、Ｚ−炭素表面を使用するさらなる工程が必要であった。
【０２８９】
発酵終了時のｃｐ生産量に関して、該変更により、ｃｐ濃度が、０９０菌株とＨ３６ｂ菌株では約１００ｍｇ／Ｌ、およびＭ７８１菌株では３００ｍｇ／Ｌ増大した。さらに、菌体乾燥重量グラムあたりのｃｐの割合は高くなった。これらの３種類のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株では、酵母抽出物中のビタミン濃度が、これらの菌株の栄養素必要量を満足するのに充分であったため、リボフラビンの添加は必要でなかった。
【０２９０】
培地に添加するビタミン溶液を減らすため、ビオチンのみを用いた実験を行なった。Ｈ３６ｂおよびＭ７８１菌株ではｃｐ濃度はわずかに減少したが、ｃｐ生産量は、先の実施例で確立したプロセスと比べ、依然として改善されていた。複合培養培地へのビタミンの添加は、酵母抽出物中のビタミンが、該３種類の特定のＧＢＳ菌株の栄養素必要量を満足するのに充分であったため（ビオチン以外）、増殖およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅのｃｐ生産に必要でなかった。
【０２９１】
さらに、精製データによれば、ビタミンの非存在下でのｃｐ構造は、先の実施例で確立したプロセスで得られる構造と同等であり、アセチル化は少なく、生成物の純度は許容可能であった。
【０２９２】
また、ビオチンを除去したときの０９０菌株の増殖をモニターした。この実験では、ビオチンの存在下でＯＤが１８から１４に減少したとともに、ｃｐ濃度が１００ｍｇ／Ｌよりも大きく低下した。酵母抽出物中のビオチン濃度は、このＧＢＳ菌株の増殖必要量を満足するのに充分でなかった。実際、酵母抽出物の組成によれば、ビオチンは、その他のビタミン濃度と比べて少ない量（０．２５ｍｇ／１００ｇ）で存在していた。
【０２９３】
結論として、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸およびピリドキシンの除去は、ＧＢＳの増殖およびｃｐ生産量に対してほとんど効果はなかった。このような理由で、該４種類のビタミンを発酵プロセスから除き、そのため、ビオチンのみを複合培養培地に添加した。ＣＪＢ１１１では、ビオチンのみを使用する最終条件を用いた。
【０２９４】
ｉｉ）ＧＢＳの血清型特異的莢膜多糖を得るための複雑なフィードバッチ式プロセス必要性の確認
菌体増殖速度は、以前に、ｃｐ生産を調節する主要因子であることが報告され、ＩＩＩ型ｃｐの増殖速度依存性生産は増殖制限化合物とは独立して起こった（参考文献１７３）。しかしながら、炭素源の枯渇は、色素形成および莢膜多糖生産量低下の原因であることがわかった。栄養環境およびｃｐ生産に有利な増殖速度を維持するため、ＷＯ０７／０５２１６８に記載のような複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。この複雑なフィードバッチ式プロセスは、細菌の倍加時間を低減させる対数増殖手法と、グルコースを使用し、最後の３時間でｃｐ生産性が増大するｐＨ−ｓｔａｔ手法の両方を組み合わせたものである。このプロセスは、バッチ式手法の利点と連続式手法の利点を併せ持つものであった。実際、フィードバッチ式発酵では、指数増殖期の長期化による高い菌体密度および発酵中の基質付加条件に対する制御が達成される。しかしながら、複雑なフィードバッチ式手法の使用には、アルゴリズムにより発酵を管理するソフトウェアの使用が必要とされ、このソフトウェアの使用には、ＧＭＰ基準に準拠するためのアルゴリズムの妥当性確認が必要とされる。したがって、該アルゴリズムの使用を回避するため、発酵プロセスを単純化した。
【０２９５】
先の実施例で確立したプロセスに従い、同じＯＤ値を各供給の開始および即時添加の誘因として使用した。さらに、１５０ｇ／Ｌの酵母抽出物および５００ｇ／Ｌのグルコース（初期バッチ容量の１０％を構成）をバッチに添加した。それぞれ、ＯＤ３および４．５でのこの２回の酵母抽出物の即時添加は、必要とされる総容量の１／５および４／５を構成した。ＯＤが１０に達したとき、濃縮グルコースの線形添加を開始し、ｐＨ−ｓｔａｔ相を置き換えた。この添加の速度は、３時間での複雑なフィードバッチ式プロセスと同じ量のグルコースを加えて計算した。
【０２９６】
発酵は、各菌株について新しいプロセスを用いて行ない、菌体密度およびｃｐ生産量をモニターした。０９０菌株では、単純化プロセスにより、複雑なフィードバッチ式プロセスと同じ結果が得られた。０９０菌株およびＨ３６ｂ菌株ではともに、増殖は複雑なフィードバッチ式手法よりも速く、プロセス終了時のＯＤは、２４から３２に増大した。菌体乾燥重量グラムあたりのｃｐ濃度およびｃｐ量は、それぞれ、およそ３００ｍｇ／Ｌおよび５ｍｇｃｐ／ｇＣＤＷ増大した。Ｍ７８１菌株では、同じ増殖およびｃｐ生産量が観察された。したがって、発酵プロセスは、ｐＨモニタリングなしで、グルコースの線形添加を用いて単純化され得る。ＣＪＢ１１１では、ｐＨモニタリングなしで単純化線形添加を伴う（ｓｉｔｈ）最終プロセスのみを行ない、プロトコルの有効性を確認した。
【０２９７】
２回の酵母抽出物の即時添加およびグルコースの線形添加を使用するこのプロセスは、好ましいパイロット規模での方法であった。この新しいプロセスでは、アルゴリズムの使用または培養培地へのビタミン溶液の添加は必要とされなかった。酵母抽出物、リン酸塩、グルコースおよびビオチンで構成された複合培養培地は、再現性のある増殖挙動およびｃｐ生産量がもたらされる低コストでロバストなプロセスであった。
【０２９８】
Ｃ）発酵プロセスの事前検証
ＧＢＳのｃｐを生産するための以前に開発された発酵プロセスを検証し、最適化した。増殖およびｃｐ生産量をＨ３６ｂ菌株でモニターし、それにより各パラメータを個々に変更し、対照培養と比較した。ＤＯＴ試験、温度およびｐＨを報告した。
【０２９９】
培養は３６℃およびｐＨ７．３で行ない、培地中の溶存酸素は、プロセス全体を通して３０％に維持した。３時間のグルコース供給後、最終ＯＤは２５．３であり、平均生産性は１．８４ｇ／Ｌ．ｈであった。ｃｐ濃度および菌体乾燥重量１グラムあたりのｃｐの量は、それぞれ、５４０ｍｇ／Ｌおよび５９ｍｇｃｐ／ｇＣＤＷであった。
【０３００】
ｉ）溶存酸素レベルの効果
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、酸素が存在する場合、有気呼吸によってＡＴＰを合成する通性嫌気性生物である；しかしながら、嫌気性増殖に切り替えることもできる。
【０３０１】
まず、培地中の溶存酸素を１５％に維持した。平均生産性は、１．８４ｇ／Ｌ．ｈから１．１４ｇ／Ｌ．ｈに低下したが、プロセス終了時、５９０ｎｍにおいて同じＯＤ２３．２が観察された。４０６ｍｇ／Ｌ前後でのｃｐ濃度は低く、乾燥菌体重量グラムあたりの生産ｃｐが少なかった（３９．８ｍｇｃｐ／ｇＣＤＷ）。
【０３０２】
同じ発酵を、溶存酸素を６０％に維持して行なった。この場合、平均生産性は１．１６ｇ／Ｌ．ｈであり、最終ＯＤは２０．５であった。比生産性は４３３ｍｇ／Ｌに低下し、乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐの量は４９ｍｇｃｐ／ｇＣＤＷに減少した。
【０３０３】
このような観察結果に鑑み、３０％の溶存酸素をパイロット規模生産に選択し、５０〜３５０ｒｐｍの攪拌および２０〜１００Ｌ／分の空気流を使用した。ガスとしては高価な酸素は、発酵プロセスの最後の１時間でのみ使用し、それにより製造プロセスのコストダウンを維持した。
【０３０４】
ｉｉ）温度の効果
また、増殖およびｃｐ生産量を、３６℃の標準温度に対して温度を２℃上昇または低下させることによって温度を変更することによりモニターした。
【０３０５】
温度を３４℃に低下させることにより、倍加時間は短くなり、平均生産性は１．８４ｇ／Ｌ．ｈから１．０４ｇ／Ｌ．ｈに低下した。しかしながら、ｃｐ濃度は６０％（３１２ｍｇ／Ｌ）に減少し、この温度で、およそ２０ｍｇｃｐ／ｇＣＤＷが失われた。
【０３０６】
プロセスを３８℃で繰り返すと、１．８４ｇ／Ｌ．ｈから１．４５ｇ／Ｌ．ｈへの平均生産性の低下が観察された。さらに、プロセス終了時、ｃｐ濃度とｃｐの量／グラム乾燥菌体重量両方の有意な低下が観察された（それぞれ、２６７ｍｇ／Ｌおよび３２．１ｍｇｃｐ／ｇＣＤＷ）。
【０３０７】
発酵プロセスの温度を変更すると、ＧＢＳ倍加時間が影響を受け、血清型特異的ｃｐ生産がかなり減少したため、３６℃がＧＢＳ増殖およびｃｐ生産に最適な温度であると確認された。
【０３０８】
ｉｉｉ）ｐＨ値の試験
また、元のｐＨ７．３を７．０〜７．５に変更することにより、ｐＨ値を最適化するための実験も行なった。ｐＨを７．０に維持した場合、最終ＯＤは、２３．５から２８．８に増大し、平均生産性は１．５２ｇ／Ｌ．ｈであった。しかしながら、ｃｐ濃度は５４０ｍｇ／Ｌから４１２ｍｇ／Ｌに低下した。
【０３０９】
同じ発酵プロセスをｐＨ７．５で行なった。ＯＤについては同じ増殖挙動が観察されたが、１．０８ｇ／Ｌ．ｈの平均生産性が観察され、５４０ｍｇ／Ｌのから３２３ｍｇ／Ｌへのｃｐの容積生産性の有意な低下が認められた。したがって、発酵時プロセス中、ｐＨ７．３を維持することが、菌体密度およびｃｐ生産に最適であった。
【０３１０】
ｉｉｉ）圧力値の試験
また、２つの圧力：０．２バールと０．５バールでの発酵プロセスを比較することにより、圧力を最適化するための実験を行なった。圧力を０．５に維持した場合、最終ＯＤは２３．５に維持され、平均生産性は１．５ｇ／Ｌ．ｈであった。しかしながら、ｃｐ濃度は、５４０ｍｇ／Ｌから２７２ｍｇ／Ｌに減少した。
【０３１１】
溶存酸素、温度、ｐＨおよび圧力の効果の試験後、先で確立された条件は、高菌体密度および血清型特異的ｃｐの両方をもたらすための最適条件であることがわかった。
【０３１２】
実施例４-化学的に規定される培地の開発
先の実施例で用いた複合培養培地は、組成が完全に既知のものでない有機系供給源（例えば、酵母抽出物）を含むものであったため、発酵プロセスの性能における変動を観察した。生産性を維持しつつ変動を少なくするためのアプローチの一例は、複合培地を、主に無機化合物からなる化学的に規定される培地に置き換えることである。この置き換えにより、発酵プロセスを制御し、また多糖の精製を単純化することが可能になる。
【０３１３】
以前の試験（参考文献１７９）では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅが、複合培地で得られるものとと同等の増殖速度および増殖量を補助する化学的に規定される培地中で増殖可能であることが示された。この研究の目的は、まず、代表的な血清ＩＩＩ型であるＭ７８１  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株の増殖特性を試験し、増殖因子要求量を調べることであった。バイオマスの収率およびｃｐ生産量を上げるため、単純なフィードバッチ式プロセスを開発した。
【０３１４】
Ａ）化学的に規定される培地でのＧＢＳ増殖試験
フィードバッチ式プロセスの開発では、典型的には、まず、微生物を解析して最良の非生物（ａｂｉｏｔｉｃ）条件、種々の増殖相、消費成分および生産成分、バイオマスと生産物形成との関係、増殖に対する制限基質、ならびに比増殖速度と制限基質濃度との関係を確認しなければならない。しかしながら、ＧＢＳに関する挙動情報は、既に、複合培養培地を開発するために行なわれた試験からわかっていた。複合培養培地でのＧＢＳ増殖に対して先の実施例で開発されたｐＨおよび温度の至適条件を、上記の表１に示す化学的に規定される培地に拡張した。
【０３１５】
ｉ）三角フラスコでのＧＢＳ増殖試験
菌株Ｍ７８１による増殖に関する予備実験を、５００ｍＬ容三角フラスコを用いてバッチ式培養にて行なった。菌体は対数期に８時間維持され、倍加時間は４５分であった（μｍａｘ＝０．９１時間−１）。この最初の増殖相後、比増殖速度は低下し始め、菌体は２時間減速相であった。最終光学密度は１．５前後であり、対数期は、光学密度が０．７前後になったとき終了した。
【０３１６】
ｉｉ）２Ｌ容発酵槽でのＧＢＳ増殖試験
次に、ＧＢＳ増殖を２Ｌ容発酵槽においてモニターした。この条件下では、培養培地のｐＨを、２Ｍ水酸化ナトリウムの自動添加によって一定のｐＨ７．３に維持した。
【０３１７】
菌体の活性化には、フラスコ内の先の培養物を使用した。フラスコの播種材料が指数増殖後期（ＯＤ５９０ｎｍ＝０．５）に達したら、適応容量のこの培養物を１．８Ｌの新鮮培地への播種に使用し、初期ＯＤ０．４が得られた。菌体は、すぐに指数増殖期（３時間）に入り、倍加時間は４２分であった（μｍａｘ＝１．００時間−１）。２時間の減速相の後、ＯＤが２．５６である定常相が続いた。フラスコと発酵槽の両方で同じ倍加時間が観察された。最終ＯＤについてわずかな改善が認められたが、バイオマスの生産収率（０．０５ｇ／Ｌ．ｈ）は低いままであった。発酵槽で観察されたように、ｐＨは７．３に一定に維持された。さらに、グルコースは、菌体が減速相開始に入ったときの利用可能なグルコースが５．７ｇ／Ｌであったため、ＧＢＳに対して制限源ではないことが観察された。
【０３１８】
Ｂ）制限化合物の特定
ほぼ既知の酵母抽出物培地の組成に基づき、複合培地プロセスで使用した栄養源の濃度とバッチ規定培地の組成との比較を行ない、ＧＢＳが１５前後の最終ＯＤに達するのに必要とされる種々の化合物間のおよその比率を調べ、増殖に対する制限化合物を特定した。複合培地を伴いプロセスでは、１７ｇ／Ｌの酵母抽出物をバッチ用培地に含め、供給時は１９ｇ／Ｌを添加した。したがって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは３６ｇ／Ｌが利用可能であった。
【０３１９】
３６ｇ／Ｌの酵母抽出物の組成と規定培地の初期濃度との比較を、ミネラル、グルコース、ビタミンおよびアミノ酸含有量について行なった（表３参照）。ミネラル源については、現行の規定培地に存在するすべての化合物が、ＧＢＳ増殖要求量を満足するのに充分であったが、カリウムは例外であり、これは、複合培地中に６．５倍多く存在した。ビタミンおよびアミノ酸源については、すべての場合において、規定培地を用いたプロセスで観察された濃度は、複合培地を用いたプロセスでの濃度よりも低かった。規定培地中のバッチ濃度と比較したときの酵母抽出物中に存在するビタミンまたはアミノ酸濃度の比率は、該諸分子の性質と比較すると不均一であった。しかしながら、酵母抽出物の正確な組成は充分には規定されない。また、この比較に用いた値は平均値であり、各成分の比率は、生産プロセスおよび酵母抽出物の処理に応じて有意に異なることがあり得る。
【０３２０】
【表３】
0005465676.tif 000008
実施例５−発酵への化学的に規定される培地の拡張
フィードバッチ式発酵は、典型的には、バッチ様式として開始し、一定のバイオマス濃度または基質消費後、発酵槽に制限基質溶液を供給する。そのため、栄養素培地は、単純な組成を有するものでなければならない。この研究の目的は、制限化合物が特定され、かつ増殖速度に影響しないバッチ用培地を開発することであった。
【０３２１】
Ａ）フィードバッチ式プロセスのためのバッチ用培地の開発
フィードバッチ用規定培地を開発するため、制限化合物を１種類ずつ添加し、増殖に対するその効果を評価した。
【０３２２】
まず、表２の各ビタミンの濃度を１０倍に上げた。ビタミンは、ＧＢＳ増殖に非常に重要であることが観察された。菌体は、すぐに対数期に入り、これは４時間持続し、倍加時間は４２分（μｍａｘ＝１．００時間−１）から３３分（μｍａｘ＝１．２６時間−１）に短くなった。３時間後、菌体は減速相（２時間）に入った後、培養５時間後に定常相に入った。最終ＯＤは３．７０であり、これは先の治験より５０％高かった。ビタミンをバッチ用培地に添加するとプラスの効果が観察されたが、これは、唯一の制限化合物ではなかった。指数増殖期は３時間後に終了したが、菌体が減速相に入ったとき、６．３ｇ／Ｌでグルコースはなお利用可能であった。
【０３２３】
同じ試験を、１０×ビタミンと１０×アミノ酸の両方を添加することにより行なった。１０×ビタミンを伴う発酵では、最終ＯＤが高かった（ＯＤ５９０ｎｍ＝４．５）。菌体の指数増殖期は４時間持続した。グルコースは、この場合も菌体が減速相に入ったとき４ｇ／Ｌ存在したため、制限化合物ではないようであった。
【０３２４】
また、１０×のカリウムを初期培地に添加することにより試験を行なった。この場合、菌体が定常増殖相のとき、長い倍加時間（ｔｄ＝４９分）および最終ＯＤの低下（ＯＤ５９０ｎｍ＝２．９）が観察された。初期カリウム濃度を１０倍に上げると、増殖に対してマイナスの効果を有した。したがって、カリウムを阻害レベルまで添加することを回避するため、カリウムは、フィードによって、または小型のバッチにて添加する必要がある。
【０３２５】
この試験に従い、バッチ用培地を、最初の化学的に規定される培地と同じミネラル含有量で構成したが、ビタミンおよびアミノ酸の濃度は１０倍に上げた。リン酸塩および炭素源をフィード培地に添加したが、各成分の濃度を測定するため、複合培地を用いたプロセスとの新たな比較が必要であった。３３ｇ／Ｌのグルコースをバッチ用培地に存在させ、線形添加時に５５ｇ／Ｌを添加したため、同じ比率のグルコースおよび１０×のカリウムを添加するために、フィード培地を、２７５ｇ／Ｌのグルコース、１０．０８ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４および１４．８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４で構成した。５００ｍＬのこの溶液を１．２Ｌのバッチ用培地に添加した。
【０３２６】
Ｂ）フィードバッチ式プロセスの開発
フィードバッチ式発酵のためのストラテジーは、増殖制限基質を、ＧＢＳが基質を消費する速度と同じ速度で供給することであった。
【０３２７】
栄養素供給速度は、微生物の増殖速度ならびに生産物形成および副生成物の最小化のための炭素サイクルの有効性を規定することにより、フィードバッチ式発酵に影響を及ぼす。
【０３２８】
Ｃ）Ｂ群連鎖球菌属の増殖因子要求量
生物には、自己栄養体であれ従属栄養体であれ、増殖のために、該生物が利用可能な栄養素から合成することができない少量の一定の必須有機化合物が必要とされ得る。
【０３２９】
増殖因子は、生合成において特定の役割を果たしているため、少量が菌体に必要とされる。増殖因子の必要性は、細胞内の代謝経路の阻止または欠如のいずれかにより生じる。これは、３つのカテゴリー：（１）核酸合成に必要とされるプリンおよびピリミジン；（２）タンパク質合成に必要とされるアミノ酸；ならびに（３）補酵素およびある種の酵素の官能基として必要なビタミン類に組織化される。
【０３３０】
この研究の目的は、化合物の数を減らすことにより培養培地を単純化するため、および費用効果の高い生産プロセスを確実にするためのＭ７８１  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株の増殖因子要求量を特定することであった。
【０３３１】
Ｄ）Ｍ７８１  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株のアミノ酸要求量
アミノ酸を１種類ずつ培地から除くことにより、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミンおよびＬ−プロリンは不可欠であることがわかった（図２０および表４参照）。これらのアミノ酸は、対照培養では、常に８０％より大きい濁度値をもたらした。しかしながら、任意の他のアミノ酸の非存在下では、培養培地中で増殖は起こらなかった。
【０３３２】
【表４−１】
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【０３３３】
【表４−２】
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１５種類のアミノ酸を存在させた場合、培養培地中で満足な増殖が得られた。Ｍ７８１増殖を必須アミノ酸のみの場合と比較するため、２Ｌ規模での発酵を行なった。増殖は、１９種類のアミノ酸を存在させた場合、ほぼ同じ大きさであった。両方の場合において、ラグ相は観察されなかったが、４種類のアミノ酸を化学的に規定される培地から除くと、６２分間（μｍａｘ＝０．６７２時間−１）から７８分間（μｍａｘ＝０．５３３時間−１）への倍加時間の低減が観察された。
【０３３４】
ＯＤおよびＭ７８１菌株によるｃｐ生産量に対する影響は、これらの４種類のアミノ酸を除いた場合、最終プロセスにおいて決定される。
【０３３５】
Ｅ）Ｍ７８１  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株のビタミン要求量
ビタミンを個々に培養培地から除くことにより、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドは不可欠であることがわかった（表５および図２１）。ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンを除いた実験では、濁度値は６５％よりも大きかった。パントテン酸塩とナイアシンアミドのみを添加すると、対照と同じ最終ＯＤが観察された。
【０３３６】
【表５】
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元の培養培地に基づいたバッチ式発酵を、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドのみを用いて行なった。８時間の培養後、ＯＤは０．２であった。したがって、これらの２種類のビタミンのみを用いた増殖は最適ではなかった。最初の振盪フラスコ試験で必要でないと判定されたビタミンを個々に、既にパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドを補給した培地に添加することにより、新しい試験を５００ｍＬ容三角フラスコにおいて行なった。この試験では、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドのみでの試験で観察されたように、１８時間の培養後の各フラスコの濁度値は対照培養と等しかった。
【０３３７】
発酵槽内でさらに実験を行なうことにより、Ｍ７８１  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株の増殖に必要なビタミンの特定が可能である。
【０３３８】
実施例６-パイロット規模での生産
この実施例により、先の実施例の教示が、連鎖球菌属細菌の血清型特異的莢膜多糖の製造規模生産に適用されることが確認される。
【０３３９】
Ａ）播種材料の培養
ｉ）培養培地
播種材料の培養を、温度（オートクレーブプログラム番号１分／最大４０分間、１２１℃、表６）によって滅菌し、ＩＬの複合培地（１７ｇ／Ｌの酵母抽出物Ｄｉｆｃｏ、８ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および３３ｇ／Ｌの一水和型グルコース、Ｎａｌｇｅｎｅフィルター商品使い捨てシステムを用いた０．２μｍ濾過によって滅菌、３Ｍ  ＮａＯＨ  を用いてｐＨを７．３±０．１に調整）、１０ｍＬのビタミン溶液（チアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミド、各々０．０５ｇ／Ｌ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で希釈、０．２μｍ濾過によって滅菌）ならびに５ｍＬのビオチン溶液（ビオチン０．２ｇ／Ｌ、０．２μｍ濾過によって滅菌）を入れた（播種の直前に添加）４つの５Ｌ容振盪フラスコにおいて行なった。
【０３４０】
【表６】
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ｉｉ）フラスコへの播種および培養条件
各フラスコに、−７０℃の冷凍庫から即時的に解凍した２．７５±０．２５ｍＬの作業種菌株を播種した。培養物は、インキュベータ（ＩＮ−Ｌ０６４１）内で４±１時間、２００±１０ｒｐｍで攪拌しながら３５±１℃で維持した。この期間後、バイオマス濃度を、５９０ｎｍにおけるＯＤを測定すること、およびグラム染色を行なうことにより評価した。ＯＤ５９０ｎｍ値が１．２〜０．６に達したとき、およびグラム染色が一致したとき（グラム陽性球菌のみ）、４つのフラスコの内容物を、３００Ｌ容のＢ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｃｈｅｍａｐ発酵槽（ＩＤ  ＶＳ−Ｌ０５３０）のインキュベーションラインと連結された５Ｌ容の熱滅菌（オートクレーブプログラム番号１分／最大）ビン内にプールした。
【０３４１】
ｉｉｉ）播種材料の調製の重要な可変量
播種材料の調製の重要な可変量を、表７および表８に示す。
【０３４２】
【表７】
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【０３４３】
【表８】
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ｉｖ）滅菌および設備機器のクリーニング
使用後、フラスコおよび５Ｌ容ビンを加熱滅菌し（オートクレーブプログラム番号８、汚れサイクル、表６の仕様参照）、クリーニングした。
【０３４４】
Ｂ）３００Ｌ容発酵槽での培養
ｉ）培地の調製および設備機器
空の３００Ｌ容発酵槽の機械的配管およびガスフィルターを滅菌した（プログラムＳＥＡＬ２およびＥＸＦＣ２）。次いで、プローブを確認し、較正する。ｐＨプローブは、ｐＨ値７および１０を有する２種類のバッファー溶液を用いて較正した。酸素プローブ（ｐｒｏｖｅ）の正確な適用は、０％点で窒素および１００％点で空気の気流を伴ってプローブを水中に入れることにより確認した。その較正は、発酵槽内部で行なった。
【０３４５】
３００Ｌ容発酵槽（プログラムＦＶＥＳ  ２）内で基本培地（１２０Ｌ、２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１２０Ｌの消泡剤「ＰＰＧ  ２５００」に対して１ｍＬ）を配合し、滅菌した。滅菌中、酸素プローブの０％値を確認し、必要であれば再度初期化した。滅菌の冷却相後、培地の温度は３６℃に達し、基本培地を、１７Ｌの酵母抽出物１５０ｇ／Ｌ、９Ｌのグルコース一水和型５５０ｇ／Ｌ、２Ｌのビタミン溶液（チアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミド、各々０．０５ｇ／Ｌ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で希釈）（すべて、０．２μｍ濾過によって滅菌）で完全にした。次いで、培地への酸素供給後、酸素プローブの１００％値を較正した。４Ｌの播種材料を添加した後、最終容量は発酵開始時で１５０Ｌであり、酵母抽出物の終濃度は１７ｇ／Ｌであり、グルコースの終濃度は３３ｇ／Ｌであった。これらの添加は、５５０ｍＬ／分の流速に相当する最大速度（４００ｒｐｍ）で蠕動ポンプを使用し、滅菌ラインにおいて行なった。
【０３４６】
ｉｉ）発酵プロセスおよびプロセス内対照
播種前に、ビオチン溶液（ＩＬ、０．２ｇ／Ｌのビオチン、０．２μｍ濾過によって滅菌）を添加した。次いで、播種材料の４つのフラスコの内容物を入れた５Ｌ容ビンを用いて３００Ｌ容発酵槽への播種を行なった。
【０３４７】
次いで、以下のパラメータの値を確認し、必要であれば調整し、プロセス中、自動制御した。
−  培養温度は３６±１℃に制御した。
−  発酵槽内部の過圧は０．２バールに設定した。
−  ｐＨは７．３±０．１に設定し、４Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整した。ｐＨ値は発酵により自然に低下したため、酸性溶液を用いたｐＨ補正はしなかった。
−  初期攪拌は５０ｒｐｍに設定し、初期空気流は２０Ｌ／分に設定した。
−  発酵槽内の起泡剤レベルを可視的にモニターし、必要であれば、消泡剤ＰＰＧ  ２５００を用いて調整した。
−  溶存酸素圧（ＤＯＴ）は
攪拌（５０〜３５０ｒｐｍの範囲の値）
・  空気流（２０〜１００Ｌ／分の範囲の値）
・  酸素流（０〜１００Ｌ／分の範囲の値）
によって段階的に調節して３０％に設定した
バッチ相の発酵中、播種の２時間後に試料を採取し、ＯＤ５９０ｎｍを測定した。試料は、ＯＤ５９０ｎｍが３に達するまで１５分ごとに採取した。この目標ＯＤの時点で、最初の対数増殖期フィードバッチ式添加を、３．６Ｌの酵母抽出物溶液（１５０ｇ／Ｌ）を用いて開始し、該集団を３００分の倍加時間に維持した。
【０３４８】
最初の添加のおよそ４５分後、ＯＤ５９０ｎｍを測定した。ＯＤ５９０ｎｍが５に達するまで、試料を１５分ごとに採取した。この目標ＯＤの時点で、２回目の対数増殖期フィードバッチ式添加を、酵母抽出物溶液（１５０ｇ／Ｌ）を用いて開始し、５０分の倍加時間に維持した。
【０３４９】
この２回目の対数増殖期フィードバッチ式添加の終了時、ｐＨ−ｓｔａｔフィードバッチ式添加を行なった。ｐＨ値が７．１８を超えたとき、一水和型グルコース溶液（５５０ｇ／Ｌ）を添加した。この添加中、試料を１時間ごとに採取し、ＯＤ５９０ｎｍを測定した。
【０３５０】
発酵は、最後の添加のおよそ３時間後に終了した。次いで、パラメータの自動制御を停止した。攪拌は１００ｒｐｍに、および温度は３０℃に調節した。
【０３５１】
ｉｉｉ）発酵プロセスの重要な可変量
発酵プロセスの重要な可変量を、表９および表１０に示す。
【０３５２】
【表９】
0005465676.tif 000015
【０３５３】
【表１０】
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ｉｖ）設備機器の消毒、滅菌およびクリーニング
バイオマスを３００Ｌ容発酵槽から取り出したら、２００ＬのＲＯＷを発酵槽内に添加することにより消毒を開始した。次いで、３Ｍ  ＮａＯＨを発酵槽内に、ｐＨが１１に達するまで添加した。温度を８０℃に３０分間維持した。周囲温度まで冷却後、発酵槽の内容物を、下側の床面に置いた廃棄物槽内に廃棄した。
【０３５４】
次いで、２００ＬのＲＯＷを添加し、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰ）に従ってプログラム（ＦＶＥＳ  ２）を作動させることにより滅菌を行なった。滅菌の冷却相後、ｐＨプローブと酸素プローブを発酵槽から取り出し、それぞれ、３Ｍ  ＫＣｌ溶液およびＲＯＷ中に保持した。
【０３５５】
発酵槽は、最後に２００Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨを用いて洗浄し、１００ｒｐｍで少なくとも３０分間攪拌した。洗浄後、この２００ＬのＮａＯＨを劇物槽内に入れて空にし、発酵槽の上側がクリーニングされるように、さらに１００ＬのＮａＯＨをスプレーボールによって該槽内に入れた。この１００Ｌを、ローブポンプを用いて最低３０分再循環させた。このクリーニング工程後、ｐＨが５〜７の範囲に低下するまで発酵槽をＲＯＷで洗浄した。
【０３５６】
Ｃ）バイオマスの遠心分離
ｉ）設備機器の準備
生理食塩水（約１００Ｌ、９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２μｍ濾過によって滅菌）を入れた槽を、３００Ｌ容発酵槽をＡｌｆａ−Ｌａｖａｌ遠心分離機（ＩＤ  ＣＴ−Ｌ０５２６）に連結する移送ラインに接続した。遠心分離中、この水をバイオマスペレットの洗浄に使用した。次いで、移送ラインを、バイオマスのセパレータおよび回収槽と同様に加熱滅菌した。発酵が終了した後すぐに遠心分離を開始するため、
発酵の前と後に設備機器の準備を行なった。
【０３５７】
ｉｉ）連続流遠心分離プロセス  
連続流遠心分離プロセスは、以下のサイクルで構成した：
−  １００Ｌ／時の流速での７分間のバイオマス遠心分離（手動調整）。バイオマスを発酵槽から移送ラインを経由して、発酵槽内の過圧力０．６バールでセパレータに移した。
−  １００Ｌ／時の流速で生理学的用水を用いた３分間の洗浄（手動調整）。
−  ペレットの廃棄
このサイクルは、通常、全バイオマスが処理されるまで繰り返した。上清みは収集さず代わりに廃棄物槽に供給した。プロセス中、ペレットを槽（ＶＳ−Ｌ０５３６）内に収集し、次いで、０．３バールの過圧力によって、シリコーン製コネクターを経由して１００Ｌ容化学的処理用廃棄用滅菌バッグに移した。
【０３５８】
ｉｉｉ）遠心分離の重要な可変量
発酵プロセスの重要な可変量を表１１に示す。
【０３５９】
【表１１】
0005465676.tif 000017
モニターした可変量は、廃棄回数および収集したバイオマスの重量であった。
【０３６０】
ｉｖ）設備機器の滅菌およびクリーニング
遠心分離および廃棄用バッグへのペレットの移送後、移送ライン、セパレータおよびバイオマスの回収槽を加熱滅菌し、クリーニングした。移送ラインおよびセパレータは、発酵槽内で周囲温度にて、１００Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨを用いてクリーニングし、次いで、１００Ｌ／時の流速で移送ラインを経由してセパレータに移した。回収槽は、槽の上側がクリーニングされるようにスプレーボールによって、槽内に２０Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨを３０分間循環させることによりクリーニングした。このクリーニング工程後、ｐＨ値が５〜７の範囲に低下するまで槽をＲＯＷで洗浄した。
【０３６１】
Ｄ）菌体ペレットの化学的処理
ｉ）菌体ペレットの不活化
菌体ペレットの化学的処理により、菌体が不活化され、菌体からのｃｐの放出が可能となった。この処理は、理論濃度０．８Ｍ  ＮａＯＨが得られるようにペレットに４Ｍ  ＮａＯＨ溶液を添加すること（蠕動ポンプによりチューブを経由して）を伴った。添加する４Ｍ  ＮａＯＨの重量は、１Ｌの重量は１ｋｇであるため、バイオマスの重量を４で除算することにより得た。この工程は、一体型攪拌器システムを有し、Ｌｅｖｔｅｃｈ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＤ  ＡＧ−１０６４５、サーモスタットによる平衡および攪拌器）内に廃棄される１００Ｌ容の廃棄用バッグ内で行なった。温度は、ペレットが３７℃に維持されるように調節し、次いで、１８０ｒｐｍで指定された時間攪拌した。１２時間で充分、該微生物は不活化された。菌体莢膜からのｃｐの放出には３６時間が適当であった。他の実験では、１時間で充分、該微生物が不活化されることがわかり、菌体莢膜からのｃｐの放出には２４時間が適当であった。したがって、この工程は、合計３６時間または２４時間が適当である。
【０３６２】
ｉｉ）不活化に重要な可変量
発酵プロセスの重要な可変量を表１２に示す。
【０３６３】
【表１２】
0005465676.tif 000018
ｉｉｉ）中和および沈殿
蠕動ポンプとともにシリコーン製チューブを使用し、０．１Ｍである終濃度が得られるように１ＭのＴＲＩＳバッファー溶液を添加する。添加するＴＲＩＳの重量は、不活化するバイオマスの重量を９で除算することにより計算される。この添加の重要性は、中和中のペレットのｐＨ変動を回避することであった。したがって、ｐＨを、廃棄用バッグ内に廃棄されるｐＨプローブを用いて制御した。最終ｐＨ値７．５〜８．５が得られるように６Ｍ  ＨＣｌを添加した。
【０３６４】
２Ｍ  ＣａＣｌ２および９６％エタノール溶液を添加し、タンパク質および核酸をペレット状に沈殿させた。最終のＣａＣｌ２濃度は０．０５Ｍであり、エタノールは３０％であった。添加する２Ｍ  ＣａＣｌ２の重量は、中和するバイオマスの重量を１９で除算することにより得、９６％エタノールの重量は、ＣａＣｌ２で中和するバイオマスの重量を３．１で除算することにより得た。
【０３６５】
Ｅ）処理済みペレットの精密濾過および透析
ＣａＣｌ２と３０％エタノールで化学的に処理したバイオマスに対し、上清み中に放出された多糖を回収するため、および菌体残渣ならびにタンパク質および核酸の沈殿物を除去するために精密濾過を行なった。
【０３６６】
ｉ）設備機器の準備
精密濾過および透析は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  ＩＩ  ｐｌｕｓ  ｈｏｌｄｅｒ（廃棄用収納部を有する）、および４つのＨｙｄｒｏｓａｒｔカセット（０．２２μｍ、０．６ｍ２、これは総表面積２．４ｍ２を提示する）を用いて行なった。このシステムを、９０Ｎｍのトルクレンチを用いて固定した。
【０３６７】
カセットを、２０Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨを用いて消毒し、ローブポンプを用いた０．２μｍ濾過によって滅菌し、システム内の圧力を確保および調節した。次いで、保持液および透過物を、以下の条件で３０分間再循環させた。
−  供給口圧力：２．０±０．２バール
−  透過物の弁を５分間閉鎖し、次いで、広く開放
蒸留水を使用し、ｐＨが５〜７に達するまでシステムを洗浄（ｗａｓ）し、この時点で、システムを２０Ｌの生理食塩水（０．９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２μｍ濾過を用いて滅菌）により、以下の条件でｐＨ５〜７が得られるように洗浄した。
−  供給口圧力：Ｐｉｎ＝２．０±０．２バール
−  透過物圧力：Ｐｐｅｒｍ＝０バール（弁開放）
−  保持液の弁閉鎖
精密濾過の前に、カセットを透析バッファー溶液（３４．７７ｇ／ＬのＮａＣｌ、４．４９ｇ／ＬのＴＲＩＳ、１０．９３ｇ／ＬのＣａＣｌ２、６Ｍ  ＨＣｌを用いて７．８±０．１にｐＨ調整、ＷＦＩ  ｑｓｐ  ７４．４％の最終容量、最終容量まで９６％エタノール、０．２μｍ濾過によって滅菌）により調整した。
【０３６８】
ｉｉ）精密濾過および透析
処理済みバイオマスの入った廃棄用バッグのチューブの排出口を、精密濾過ハウジングの供給口に接続した。このハウジングの保持液排出口を、処理用バイオマスを再循環させるために処理済みバイオマスを内包する廃棄用バッグに接続した。透過物排出口を、２００Ｌ容使い捨て滅菌バッグに接続し、透過物を収集した。
【０３６９】
透過物用の弁は、最初は閉鎖し、ペレットを精密濾過システム内で循環させた。次いで、この弁を開放し、ローブポンプの速度を、以下の条件が得られるように制御した。
−  供給口圧力：Ｐｉｎ＝２．０±０．２バール
−  透過物圧力：Ｐｐｅｒｍ＝０．６±０．１バール
バイオマスを１０倍に濃縮し、保持液を３倍容量のバッファーに対して透析した。精密濾過システム内の循環正確に測定するためには、保持液の重量は、１０ｋｇ未満でなければならない。そのため、保持液を、バイオマスの重量が１０±０．５ｋｇになるまで濃縮した。次いで、透析を連続工程にて行なった。使用するバッファー溶液の重量は、理論濃度係数１０で除算し、所望の透析サイクル数を乗算したＣａＣｌ２−エタノール混合物の重量から計算した。
【０３７０】
ｉｉｉ）透過物の濾過による滅菌
２００Ｌ容廃棄用バッグ内への回収前に、精密濾過システムの排出口の２０００ｃｍ２  Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ  ０．２２μｍフィルターを用いた濾過によって透過物を滅菌した。最終生成物を周囲温度で保持した後、精製部に放出させた。
【０３７１】
ｉｖ）精密濾過および透析の重要な可変量  
精密濾過および透析の重要な可変量を表１３に示す。
【０３７２】
【表１３】
0005465676.tif 000019
モニターした可変量は、透過物流および多糖の量である。
【０３７３】
ｖ）設備機器のクリーニング
精密濾過後、供給口を、１００Ｌの生理食塩水の入った槽に接続し、使い捨てカセットおよびハウジングを洗浄した。次いで、２０Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨを用いてシステムを消毒し、透過物および保持液を、以下の条件を維持したまま、３０分間再循環させるために供給口に接続した。
−  供給口圧力：Ｐｉｎ＝２．０±０．２バール
−  透過物の弁を５分間閉鎖し、次いで、広く開放
次いで、システムおよび配管を空にし、透過物および保持液のｐＨ値が５〜７の範囲になるまで蒸留水で洗浄した。この目標ｐＨで、システムを分解した。
【０３７４】
精密濾過および透析中に透過物の滅菌に使用したＳａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ  フィルターの完全性試験を行なった後、バッチを精製部に放出させた。
【０３７５】
Ｆ）発酵プロフィールの説明
３種類のＧＢＳ菌株、Ｍ７８１（血清型ＩＩＩ）、Ｈ３６ｂ（血清型Ｉｂ）および０９０（血清型Ｉａ）に対応するパイロット規模での実験の発酵プロフィール解析し、Ｈ３６ｂ菌株を用いて同一のプロセスで３０Ｌ容発酵槽（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｓｔａｔ）にて研究室規模で行なった対照発酵と比較した。
【０３７６】
３つのパイロット規模の発酵のＯＤ５９０ｎｍプロフィールは、互いに非常に、ならびに対照発酵と類似していた（図２２参照）。該微生物の増殖の一般的なプロフィールは、以下の様式で説明され得る：バッチ相はおよそ２．５時間持続し、３であるＯＤ５９０ｎｍがもたらされた。酵母抽出物溶液（Ｆ１、１５０ｇ／Ｌ）の最初の対数増殖フィード添加はおよそ４５分間持続し、５であるＯＤ５９０ｎｍがもたらされた。酵母抽出物溶液（Ｆ２、１５０ｇ／Ｌ）の２回目の対数増殖フィード添加はおよそ４５分間持続し、およそ１０であるＯＤ５９０ｎｍがもたらされた。一水和型グルコース（Ｆ３、５５０ｇ／Ｌ）の３回目のｐＨ−ｓｔａｔフィード添加はおよそ３時間持続した。
【０３７７】
Ｇ）増殖速度および集団倍加時間の評価
３回の予備試験操作および対照発酵中、増殖速度（μ）および集団倍加時間（ｔｄ）を評価した。値は図２２ならびに表１４に報告した。
【０３７８】
【表１４】
0005465676.tif 000020
予備試験操作の最初の対数増殖フィード添加中の集団倍加時間は、４３〜７７分の範囲であり、これは少なくとも参照発酵と同等に良好であった。しかしながら、所望の集団倍加時間は３０分であった。予備試験操作の２回目の対数増殖フィード添加中、集団倍加時間は４１〜６４分の範囲であり、これは、参照発酵（５５分間）とほぼ同等であり、理論集団倍加時間（５０分間）に非常に近かった。
【０３７９】
Ｈ）莢膜多糖生産の評価
発酵の終了時、ｃｐのシアル酸化合物の濃度の測定に基づいた比色分析法を用いてｃｐの濃度を評価した。この結果に基づき、培養中に生産されたｃｐ量を、ｃｐ濃度に発酵槽内部の最終容量（参照発酵では２０Ｌ、パイロット規模の発酵槽では２１５Ｌ）を乗算することにより算出した。また、後述する発酵関連解析法に示したようにして、容積生産性および比生産性も計算した。値は表１５に報告した。
【０３８０】
【表１５】
0005465676.tif 000021
Ｉ）初期プロセスの単純化
発酵プロセスは、規模拡大における潜在的な変動を回避するため、および発酵槽内の夾雑のリスクを低減するための２つの様式で単純化した。
【０３８１】
まず、チアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミド（各々０．０５ｇ／Ｌ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中に希釈、０．２μｍ濾過によって滅菌）を含有するビタミン溶液を、播種材料および発酵槽の培地から除いた。実際、研究室の結果では、このようなビタミンの添加は、ＧＢＳの増殖に必要でないことが示され、ｃｐ生産量に対する影響は無視できるものであった。
【０３８２】
第２に、フィード相発酵時のパラメータを変更した。酵母抽出物添加の２つの対数増殖期フィード相を２回の即時添加に置き換え、グルコース添加のｐＨ−ｓｔａｔフィード相を線形添加に置き換えた。最初の即時添加（Ｆ１）は、３．６Ｌの酵母抽出物溶液の添加、１５０ｇ／Ｌ（蠕動ポンプ使用、５５０ｍＬ．ｍｉｎ−１の流速、ＯＤ５９０ｎｍが２．５〜３の範囲のとき）で構成した。２回目の即時添加（Ｆ２）は、１３．４Ｌの酵母抽出物溶液の添加、１５０ｇ／Ｌ（蠕動ポンプ使用、５５０ｍＬ．ｍｉｎ−１の流速、ＯＤ５９０ｎｍが４．５〜５の範囲のとき）で構成した。３回目の線形添加（Ｆ３）は、１７Ｌのグルコース溶液の添加（蠕動ポンプ使用、９５ｍＬ．ｍｉｎ−１の流速、ＯＤ５９０ｎｍが１０〜１２の範囲のとき）で構成した。
【０３８３】
Ｊ）発酵プロフィールの説明および先の操作との比較
この一連の予備試験操作の発酵プロフィールを解析し、最初の一連のものと比較し、
単純化プロセスがパイロット規模においてなんら影響はないことを確認した。
【０３８４】
３つのパイロット規模の発酵のＯＤ５９０ｎｍプロフィールは、互いに、ならびに最初の一連の予備試験操作で観察された一般的なプロフィールと非常に類似していた（図２３参照）。このプロフィール間の類似性により、プロセスの変更が、研究室規模で示された該微生物の増殖に対して影響しないことが強調される。
【０３８５】
Ｋ）増殖速度、集団倍加時間および莢膜多糖生産の評価
この一連の操作の増殖速度および集団倍加時間（表１６）もまた、最初の一連の予備試験操作と非常に類似しており、有意な変動は観察されなかった。
【０３８６】
【表１６】
0005465676.tif 000022
これらの予備試験操作の最終ｃｐ濃度は、先の予備試験操作と整合していた。これは、研究室規模またはパイロット規模いずれかでの変更による有意な差がなかったことを示唆する（表１７参照）。
【０３８７】
【表１７】
0005465676.tif 000023
Ｌ）プロセスの重要な工程およびプロセス検証のための試料採取計画の規定
この２つの一連のパイロット規模試験操作の間、許容基準および関連する試料採取計画により、重要な処理工程の重要なプロセス内対照が規定された。最初のプロセス内対照は播種前のフラスコのＯＤ５９０ｎｍであり、これは、研究室規模で観察されたような発酵槽内での培養開始時の潜在的なラグ相を回避するために好ましくは０．６〜１．８である。以下のプロセス内対照は培養物純度と関連していた。フラスコ培地のグラム染色ならびにプールしたビンおよび発酵槽の培地のプレート上への延展を行ない、この環境に夾雑物はないことを確認した。別のグラム染色および培養の終了時、発酵槽内部の培地のプレート上への延展を行ない、プロセス中に夾雑がないことを確認した。ペレットの不活化は、不活化の３６時間後、０．８Ｍ  ＮａＯＨ中のペレットをプレート上に延展することにより確認した。表１８に示したその他のプロセス内対照を使用し、ｃｐ精製収率を計算した。種々のパラメータ（ＰＯ２、空気流、Ｏ２流速、攪拌、ｐＨ、温度）のプロフィールを開発し、これは、発酵プロセスの再現性の良好な指標であった。
【０３８８】
ｉ）一般的な発酵プロフィールの説明および先の操作との比較
この試験操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールは、互いに、ならびにこの実施例の先の試験操作で観察された一般的なプロフィールと非常に類似していた（図２４参照）。
【０３８９】
この一連の操作の増殖速度および集団倍加時間（表１８）は、予備試験操作と同等であった。より詳しくは、３つの試験操作の添加相の増殖速度は、先に報告した増殖速度の最小値と最大値の間であった。しかしながら、Ｍ７８１の培養中のＦ３相および０９０の培養中のＦ２相の増殖速度は、先に報告した最小値よりもわずかに低かった（それぞれ、０．１５＜０．１８、および０．６２＜０．６５）が、ＯＤ５９０ｎｍ最終値に対しては何も起こらず、先の試験操作時に得られたＯＤ５９０ｎｍの極値間であった（菌株０９０およびＨ３６ｂの最初の予備試験操作で、それぞれ１４および２５．１）。
【０３９０】
【表１８】
0005465676.tif 000024
３つの菌株それぞれの結果を比較すると、試験操作の終濃度およびｃｐの量は、予備試験操作よりも高かった（表１９参照）。Ｈ３６ｂ菌株の値は、その他の菌株で先に得られた値の間（それぞれ、０９０の最初の予備試験操作およびＭ７８１の２回目で得られた０．２６と０．４２の間の０．３５Ｌ−１）であった。菌株Ｍ７８１および０９０で得られた値は予想よりも高かった。そのため、これらの菌株でのバイオマスに対するｃｐ比率は１０％を超え、これは、精製が助長され得ることを示唆した。
【０３９１】
【表１９】
0005465676.tif 000025
重要なプロセス内対照の解析
第１のプロセス内対照は播種前のフラスコのＯＤ５９０ｎｍであり、菌株０９０の０．８０と菌株Ｍ７８１の１．５０の間の範囲であった。発酵槽での培養開始時のラグ相は観察されなかった。フラスコ培養物の純度解析は、グラム染色（グラム陽性球菌のみが示される）ならびに培養の終了時、プールしたビンおよび発酵槽の培地（同様にグラム陽性球菌のみが示される）によって確認した。０．８Ｍ  ＮａＯＨ中のペレットの不活化を、不活化の３６時間後にプレート上に延展した。
【０３９２】
４つの試験操作時の種々のパラメータ（ＰＯ２、空気流、Ｏ２流速、攪拌、ｐＨ、温度）のプロフィールは、予備試験操作で報告した一般的なプロフィールと同等であった。
【０３９３】
【表２０】
0005465676.tif 000026
【０３９４】
【表２１】
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【０３９５】
【表２２】
0005465676.tif 000028
発酵関連解析法
バイオマスの測定。発酵中、バイオマスの含有量は、波長５９０ｎｍにおける培養物の光学密度の測定によってモニターされる。試料の希釈物は、０．３００〜０．６００の範囲内で吸光度の値が読み取れるように調製されなければならない。回収物の湿潤重量は、１６０００×ｇで２５分間の遠心分離後に測定される。
【０３９６】
莢膜多糖含有量の測定。ＧＢＳの血清型特異的莢膜多糖は、以下の糖：ＮＡＮＡ：Ｎ−アセチル−ノイラミン酸またはシアル酸；ＧＬＵＣグルコース；ＧＡＬ：ガラクトースおよびＮＡＧＡ：Ｎ−アセチル−グルコサミンの反復単位で構成されている。シアル酸含有量は、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ（ＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍＬ．，（１９５７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ＡＣＴＡ  ２４：６０４−６１１）によって設定された化学的方法を用いて測定され得る。反復単位の組成は血清型により異なるため、各血清型には異なる補正因子を適用しなければならない。
【０３９７】
【表２３】
0005465676.tif 000029
試料調製
・１０ＯＤ．ｍＬの量を遠心分離（１６０００×ｇ、５分、４℃）  ［標準化］
・ペレットを１ｍＬのＰＢＳで洗浄および遠心分離機（１６０００×ｇ、５分、４℃）  ［洗浄］
・ペレットに５００ｍｃＬのＮａＯＨ（２Ｎ、６５℃、１時間）を添加  ［加水分解］
・１時間後、５００ｍｃＬのＨＣｌ（２Ｎ、４℃）で中和  ［中和］
・菌体残屑を遠心分離（１６０００×ｇ、３０分、４℃）によって除去  ［精製］
・上清みを濾過（０．２２ミクロン）によって滅菌  ［滅菌］
・１００ｍＬを９００ｍＬのＨ２Ｏで希釈  ［希釈］
標準曲線の作成。菌株ＣＯＨ１−１３（莢膜なし）の培養物を試料と同様にして調製する。希釈工程は、既知量のシアル酸ストック溶液を添加して１、５、１０、１５、２０〜３０ｍｇ／ｍＬの終濃度を得ることを特徴とする（１００ｍＬの上清み＋ｘｍＬのシアル酸ＳＳ＋９００〜ｘｍＬのＨ２Ｏ）。
【０３９８】
化学反応。試薬の出発材料：Ａ＝レゾルシノール（２％、Ｈ２Ｏ）；Ｂ＝ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．１Ｍ、Ｈ２Ｏ）。新鮮試薬は以下のとおりに混合する：１０ｍＬのＡ＋０．２５ｍＬのＢ＋Ｈ２Ｏ（Ｖｆｉｎ＝２０ｍＬ）→＋ＨＣｌ（３７％）（Ｖｆｉｎ＝１００ｍＬ）。混合された試薬は、４℃で１週間安定である。１ｍＬの試薬を１ｍＬの希釈試料に添加し、９０℃で４０分間インキュベートし、５６４ｎｍにおける吸光度を読み取る。
【０３９９】
定量。標準曲線を用いて試料中のＮＡＮＡの量を調べる。
・血清型の補正因子を適用  ［比ＣＰ含有量（ｍｇ／ＬＯＤ）］
・培養物のＯＤを乗算［容量容積ＣＰ含有量（ｍｃｇ／ｍＬまたはｍｇ／Ｌ）］
・回収容量を乗算［総生産ＣＰ（ｍｇ）］
実施例６−精製
この実施例では、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされる例示的な精製プロトコルを示す。
【０４００】
ＧＢＳ  Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶ型多糖の単離および精製
天然ＧＢＳ  Ｖ型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
【０４０１】
細菌の発酵：ＧＢＳ  Ｖ型菌株（例えば、ＣＪＢ１１１）を複合培地で培養した。任意の培養方法が使用され得るが、本明細書に開示したような発酵培養が好ましい。
【０４０２】
発酵バイオマスの不活化および多糖抽出（塩基処理）：必要であれば、バイオマスを室温になるまで加熱してもよい。水酸化ナトリウム（４Ｍ）を、回収したバイオマスに終濃度０．８Ｍまで添加し、均一になるまで混合した。続いて、この懸濁液を、混合しながら、３７℃で３６時間インキュベートした。
【０４０３】
バイオマスの中和：塩基処理での抽出後、１Ｍ  ＴＲＩＳ−塩基（１２１．１４ｇ／ｍｏｌ）を、終濃度５０ｍＭまで添加し（５２．６ｍＬ／１Ｌの塩基混合物）、懸濁液を均質になるまで混合した。混合物のｐＨを、ＨＣｌ（６Ｍ）（濃縮酸の１：１希釈物）で７．８に調整した。
【０４０４】
アルコール沈殿：２Ｍ  ＣａＣｌ２を終濃度０．１Ｍまで添加し（５２．６ｍＬ／１Ｌの中和混合物）、懸濁液を均質になるまで混合した。エタノール（９６％（ｖ／ｖ））を終濃度３０％（ｖ／ｖ）エタノール（４２８ｍＬ／１Ｌ）まで添加し、懸濁液を均質になるまで混合した。
【０４０５】
タンジェンシャル精密濾過：アルコール沈殿による上清みを、０．２μｍのセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ０．１ｍ２）上で、ＮａＣｌ（０．５Ｍ）＋ＣａＣｌ２（０．１Ｍ）＋エタノール３０％（ｖ／ｖ）を含む透析バッファー（ｐＨ７．８に緩衝化）に対するタンジェンシャル精密濾過によって回収した。精密濾過では１０透析容量を使用した。透過物は、０．４５／０．２μｍ  フィルターを用いて濾過し、透過物を滅菌した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）。注：択一例として、保持液を遠心分離によって清澄化し（上清み液が保持される）、２〜８℃で保存してもよい。
【０４０６】
タンジェンシャルダイアフィルトレーション３０ｋＤａ：保存中に形成された微粒状物質を排除するため、該物質を０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）で濾過した。該物質を、３０ｋＤａのセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ０．１ｍ２）上で、２５容量のＴＲＩＳ  ５０ｍＭ＋ＮａＣｌ  ０．５Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）に対して、次いで、１０容量のＮａ２ＣＯ２  ０．３Ｍ＋ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）に対してダイアフィルトレーションした。圧力設定：ΔＰ［Ｐｉｎ−Ｐｏｕｔ］＜０．７バール、ＴＭＰ［（Ｐｉｎ＋Ｐｏｕｔ）／２］＞１．０（例えば、Ｐｉｎ＝２バール、Ｐｏｕｔ＝１バール）。保持液は、０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）を用いて濾過滅菌した。次いで、該物質を必要時まで２〜８℃で保存した（最大１５日間）。
【０４０７】
デプス濾過：ＣＵＮＯ  ＢｉｏＣａｐ  ２０００  １３００ｃｍ２上でのデプス濾過膜（または小規模調製ではＣＵＮＯ  Ｚ−Ｃａｒｂｏｎ  Ｒ５２ＳＰ  フィルター）を適用し、残留タンパク質夾雑物を除去した。使用する膜またはフィルターの数は、比率：０．５ｃｍ２／ｍｇ残留タンパク質に基づいて規定した。
【０４０８】
ＣＵＮＯ膜を用いた例：蠕動ポンプを使用し、膜を＞９．０ＬのＮａ２ＣＯ３  ３００ｍＭ＋ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）で、３５０±５０ｍＬ／分の流速で洗浄した。物質の容量が１．６Ｌ未満の場合、懸濁液をＮａ２ＣＯ３  ０．３Ｍ＋ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）で適正な容量に希釈した。該物質を濾過され、続いて、フィルターを２．５ＬのＮａ２ＣＯ３  ０．３Ｍ＋ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）で洗浄した。異なる膜で得られた物質を合わせた。収集された物質を新しい膜（先の数の１／５）上で濾過し、２．５ＬのＮａ２ＣＯ３  ０．３Ｍ＋ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）で洗浄した。該物質を０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）を用いて濾過滅菌した。該物質を必要時まで２〜８℃で保存した（最大１５日間）。
【０４０９】
多糖の再−Ｎ−アセチル化：該物質を、Ｎａ２ＣＯ３（０．３）Ｍ＋ＮａＣｌ（０．３Ｍ）（ｐＨ８．８に緩衝化）で、２ｍｇの多糖／ｍＬ（レゾルシノールシアル酸アッセイによって推定）に希釈した。無水酢酸のストック溶液を、以下の比率：８．３ｍＬの無水酢酸＋８．３ｍＬのエタノール９６％＋９８３．４ｍＬの水で調製した。新鮮無水酢酸ストック溶液を、２ｍｇ／ｍＬに希釈した多糖溶液に、＞２２：１無水酢酸：多糖反復単位の比率まで添加した。該物質を、混合しながら２時間室温でインキュベートした。この２時間の終了時、ｐＨを確認し、約８．８であることを確認した。
【０４１０】
タンジェンシャルダイアフィルトレーション３０ｋＤａによる再−Ｎ−アセチル化多糖の精製：保存中に形成された微粒状物質を排除するため、該物質を０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）で濾過した。注：遠心分離による清澄化も許容され得る。該物質を、３０ｋＤａセルロース膜（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ０．１ｍ２）上で、１３容量の酢酸ナトリウム１０ｍＭに対して、ＡＰ［Ｐｉｎ−Ｐｏｕｔ］＜０．７バール、ＴＭＰ［（Ｐｉｎ＋Ｐｏｕｔ）／２］＞１．０（例えば、Ｐｉｎ＝２バール、Ｐｏｕｔ＝１バール）の圧力設定でダイアフィルトレーションした。該物質を０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）で濾過滅菌した。該物質を必要時まで２〜８℃で保存した（最大１５日間）。
【０４１１】
多糖の回収：ＣａＣｌ２  ２Ｍを終濃度０．１Ｍが得られるように添加し（５２．６ｍＬ／１Ｌの中和混合物）、懸濁液を均質になるまで混合した。エタノール（９６％（ｖ／ｖ））を終濃度８０％（ｖ／ｖ）（４Ｌ／１Ｌの溶液の比率）まで添加し、懸濁液を均質になるまで混合した。沈殿物を新鮮エタノール９６％（各々、約５０ｍＬ）で洗浄した（２〜３回）。沈殿物を、３０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、真空乾燥させて粉末にした。
解析方法
湿式化学的アッセイ：糖含有量を、シアル酸湿式化学的アッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９５７，２４、６０４）によって調べた。試料をＨＣｌ中、８０℃で９０分間加水分解し、ＮａＯＨで中和し、ＤＩＯＮＥＸ（ＴＭ）システム内にインジェクトした。データは、ＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（ＴＭ）ソフトウェアによって処理される。ＰＡ１ガードを有するＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム（流速１．０ｍｌ／分）にて、９０：１０〜６０：４０  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．１Ｍ酢酸Ｎａ：０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．５Ｍ  ＮａＮＯ３の数分間の線形勾配を用いて糖を溶出した。
【０４１２】
遊離シアル酸は、試料を加水分解せずに水中に１．０ｍｇ／ｍｌで可溶化した多糖試料をインジェクトすることにより測定した。このようにして、遊離シアル酸を結合シアル酸から分離することが可能であった。図２９は、０．５μｇ／ｍｌにおける多糖試料および標準品（灰色線）のオーバーレイである。多糖試料では、遊離シアル酸は検出されない。再生工程でのピークは、加水分解されていない多糖であった。遊離シアル酸は、免疫応答と関連しているため、重要なパラメータである。
【０４１３】
残留タンパク質含有量は、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（ＴＭ）市販キット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって調べた。残留核酸含有量は、Ｓｈｅｌｄｏｎ，Ｅ．Ｌ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １９８９，１５６（１）、４７４によって公表された方法に従って測定した。
【０４１４】
残留Ｂ群多糖含有量は、ラムノース残基を測定し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ解析に基づいた方法を使用することにより調べた。ラムノースは、Ｂ群炭水化物の特異的な糖であり、型多糖には見られない。これを用いて、莢膜多糖精製後の夾雑炭水化物残渣の濃度を調べた。アッセイした試料は、図３０の精製ＧＢＳ  ＩＩＩ型多糖であった。試料には、ラムノースピークは存在せず、これは、他の炭水化物夾雑物の非存在を示す。灰色のクロマトグラムは、ラムノース標準品を試料に添加することにより得たものである。試料および標準品は、２Ｎ  ＴＦＡ中で１００℃で３．０時間加水分解させ、次いでＳｐｅｅｄＶａｃにてエバポレーションし、４５０μｌのＨ２Ｏで再構成した。ラムノース標準曲線の範囲は、１．０〜１０．０μｇ／ｍｌである。クロマトグラフィー条件は：ＰＡ１ガードを有するＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム、流速１．０ｍｌ／分のＮａＯＨ  １２ｍＭを１５分間、続いてＮａＯＨ  ５００ｍＭでの５分間の再生、次いで、ＮａＯＨ  １２ｍＭ中で２５分間の再平衡化とした。
【０４１５】
クロマトグラフィー解析：該型の多糖のおおよその分子量を、ＰＢＳで平衡化し、デキストランで較正したＳＵＰＥＲＯＳＥ（ＴＭ）６  ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって推定した。
【０４１６】
ＮＭＲ解析：精製多糖の試料を、この粉末を１ｍＬの重水（Ｄ２Ｏ，Ａｌｄｒｉｃｈ）に均一濃度まで溶解することにより調製した。試料のアリコート（７５０μＬ）を５ｍｍＮＭＲチューブ（Ｗｉｌｍａｄ）に移した。１Ｈ  ＮＭＲ実験を２５℃で、Ｂｒｕｋｅｒ  ６００ＭＨｚ分光測光計において、５ｍｍブロードバンドプローブ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて記録した。データの取得および処理には、ＸＷＩＮＮＭＲソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用した。１−ＤプロトンＮＭＲスペクトルは、３２スキャンによる標準的な１パルス実験を用いて収集した。トランスミッターはＨＤＯ周波数（４．７９ｐｐｍ）に設定した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、定量物質において、各シグナル（５×縦緩和時間Ｔ１）の充分な回収が確保される全再循環時間を用いて取得した。
【０４１７】
２−Ｄホモ−およびヘテロ−相関ＮＭＲスペクトルを記録し、１−ＤプロトンＮＭＲプロフィールに割り当てた（図２５〜２８参照）。また、ピークの割り当てを公表データ（Ｍｉｃｈｏｎ，Ｆ．；Ｃｈａｌｉｆｏｕｒ，Ｒ．；Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｒ．；Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｍ．；Ｋａｓｐｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ｇａｍｉａｎ，Ａ．；Ｐｏｚｓｇａｙ，Ｖ．；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９１，５９，１６９０および関連論文）との比較によって確認した。
【０４１８】
結果および考察
この手順により、該型の多糖を連鎖球菌から精製するための新規で単純な、高速で有効な方法が提供される。該プロセスは、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびプロテアーゼ処理の使用を伴わないことが好都合である。生産物は高収率で回収されるが、主な潜在的な夾雑物（タンパク質、核酸およびＢ群多糖）はすべて１％ｗ／ｗ未満に低減される。この新しい精製方法は、このような莢膜多糖から誘導される臨床用物質および市販用物質の製造に使用され得る。
【０４１９】
生産物の純度は、表２４に報告したとおりに確認された。
【０４２０】
【表２４】
0005465676.tif 000030
サイズ排除クロマトグラフィーによって推定された該型の多糖の平均分子量は、Ｉａ型、Ｉｂ型では約２００ｋＤａ、およびＩＩＩ型とＶ型では約１００ｋＤａであった。ＧＢＳ  Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩＩ型およびＶ型多糖の構造的同一性を、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって確認した（図２５〜２８）。
【０４２１】
実施例７−精製
この実施例は、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされるさらなる例示的な精製プロトコルを示す。
【０４２２】
ＧＢＳ  Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩＩ型およびＶ型多糖の単離および精製
天然ＧＢＳ  Ｖ型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
【０４２３】
細菌の発酵：ＧＢＳ  Ｖ型菌株（例えば、ＣＪＢ１１１）を複合培地で培養した。任意の培養方法が使用され得るが、本明細書に開示したような発酵培養が好ましい。
【０４２４】
発酵バイオマスの不活化および多糖抽出（塩基処理）：必要であれば、バイオマスを室温になるまで加熱してもよい。水酸化ナトリウム（４Ｍ）を、回収したバイオマスに終濃度０．８Ｍまで添加し、均一になるまで混合した。続いて、この懸濁液を、混合しながら、３７℃で３６時間インキュベートした。
【０４２５】
バイオマスの中和：塩基処理での抽出後、１Ｍ  ＴＲＩＳ−塩基（１２１．１４ｇ／ｍｏｌ）を、終濃度５０ｍＭまで添加し（５２．６ｍＬ／１Ｌの塩基混合物）、懸濁液を均質になるまで混合した。混合物のｐＨを、ＨＣｌ（６Ｍ）（濃縮酸の１：１希釈物）で７．８に調整した。
【０４２６】
アルコール沈殿：２Ｍ  ＣａＣｌ２を終濃度０．１Ｍまで添加し（５２．６ｍＬ／１Ｌの中和混合物）、懸濁液を均質になるまで混合した。エタノール（９６％（ｖ／ｖ））を終濃度３０％（ｖ／ｖ）エタノール（４２８ｍＬ／１Ｌ）まで添加し、懸濁液を均質になるまで混合した。
【０４２７】
タンジェンシャル精密濾過：アルコール沈殿による上清みを、０．２μｍのセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ０．１ｍ２）上で、ＮａＣｌ（０．５Ｍ）＋ＣａＣｌ２（０．１Ｍ）＋エタノール３０％（ｖ／ｖ）を含む透析バッファー（ｐＨ７．８に緩衝化）に対するタンジェンシャル精密濾過によって回収した。精密濾過では１０透析容量を使用した。透過物は、０．４５／０．２μｍフィルターを用いて濾過し、透過物を滅菌した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）。注：択一例として、保持液を遠心分離によって清澄化し（上清み液が保持される）、２〜８℃で保存してもよい。
【０４２８】
タンジェンシャルダイアフィルトレーション３０ｋＤａ：保存中に形成された微粒状物質を排除するため、該物質を０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター）で濾過した。該物質は、まず、３０ｋＤａセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ０．６ｍ２）を用いて２０容量のＴＲＩＳ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ（ｐＨ８．８）に対するダイアフィルトレーション工程、次いで１０容量のリン酸Ｎａ  １０ｍＭ（ｐＨ７．２）に対するダイアフィルトレーション工程によって精製した。圧力設定：Ｐｉｎ＝３バール、Ｐｏｕｔ＝１バール）。最初のダイアフィルトレーション工程の保持液を１０ｋｇに希釈し、次いで、ｐＨ４．０の酢酸／酢酸ナトリウム溶液（２Ｌ）で処理した。この処理で得られた懸濁液を、沈殿物を除去するためにＧＦＰｌｕｓ  ０．４５μｍ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて濾過し、次いで、０．２μｍ膜フィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてもう一度濾過した。ｐＨを４．４±０．１の値に維持した。次いで、濾過した生産物を、再度、Ｎａ２ＣＯ３  ０．３Ｍ、ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８）に対してダイアフィルトレーションした。０．４５／０．２フィルターを用いたさらなる濾過後、該物質を必要時まで２〜８℃で（最大１５日間）保存した。
【０４２９】
ＣＵＮＯ膜での付着濾過：ＣＵＮＯ  Ｚ−Ｃａｒｂｏｎ  Ｒ５３ＳＬＰ８  カートリッジを用いて濾過を行なった。蠕動ポンプを使用し、カートリッジを専用ホルダー内に取り付け、次いで、＞２０．０ＬのＷＦＩで流速５８０±４０ｍＬ／分にて洗浄した。次いで、カートリッジを＞２０．０ＬのＮａ２ＣＯ３  ０．３Ｍ、ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８）で同じ流速にて洗浄した。物質の容量が２０Ｌが未満の場合は、Ｎａ２ＣＯ３  ０．３Ｍ、ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８に緩衝化）で所望の容量まで希釈した。次いで、該物質を濾過し、滅菌バッグ内に収集した。ホルダーに、２０ＬのＮａ２ＣＯ３  ０．３  Ｍ５  ＮａＣｌ  ０．３Ｍ（ｐＨ８．８）を満たし、濾過を行なって６Ｌの濾過生産物を収集した。次いで、該物質を、０．４５／０．２μｍフィルターを用いて濾過した。該物質を使用時まで２〜８℃で（最大１５日間）保存した。
【０４３０】
多糖の再−Ｎ−アセチル化：Ｚ−Ｃａｒｂｏｎ濾過物質を、無水酢酸／エタノール溶液で処理し、再−Ｎ−アセチル化させた。１Ｌの多糖溶液で処理する必要がある反応性混合物を、以下の割合：４．１５ｍＬの無水酢酸＋４．１５ｍＬの９６％エタノールを用いて調製した。反応溶液を攪拌下、室温で２時間インキュベートした。この２時間の終了時、ｐＨを確認し、ｐＨを確認し、約７であることを確認した。
【０４３１】
タンジェンシャルダイアフィルトレーション３０ｋＤａによる再−Ｎ−アセチル化多糖の精製：該物質を、３０ｋＤａ  セルロース膜（０．１ｍ２  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ）上で、１３容量のリン酸カリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．２）に対して、ΔＰ［Ｐｉｎ−Ｐｏｕｔ］＜０．７バール、ＴＭＰ［（Ｐｉｎ＋Ｐｏｕｔ）／２］＞１．０（例えば、Ｐｉｎ＝２バール、Ｐｏｕｔ＝１バール）の圧力設定でダイアフィルトレーションした。次いで、該物質を、０．４５／０．２μｍフィルターを用いて濾過した。該物質を必要時まで−２０℃で保存した。
【０４３２】
【数２】
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【０４３３】
【数３】
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【０４３４】
【数４】
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【０４３５】
【数５】
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【０４３６】
【数６】
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【０４３７】
【数７】
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【０４３８】
【数８】
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【０４３９】
【数９】
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【０４４０】
【数１０】
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【０４４１】
【数１１】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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