(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、且つ鎖置換活性を呈し、且つ配列番号１に示されるサーモデスルファテーター・インディクス（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆａｔａｔｏｒ ｉｎｄｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるか、又は当該アミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２】
ループ媒介等温増幅（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）等の、等温増幅反応の実施に適する、及び／又は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の、熱サイクル増幅反応の実施に適する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号３２である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｃｒｅｎ７エンハンサードメインをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
配列番号３又は配列番号３３のヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の核酸、又は請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、及び／又は請求項５に記載の組成物、及び／又は請求項６又は７に記載の単離核酸、及び／又は請求項８に記載のベクター、及び／又は請求項９に記載の宿主細胞を、その包装材料と一緒に含んでなる、キット。
【請求項１１】
熱サイクル反応を用いる標的核酸の配列を増幅する方法であって、
（１）前記標的核酸を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させるステップ：及び
（２）前記標的核酸を、当該標的核酸を増幅させる熱サイクル反応条件下、前記ポリペプチドと一緒にインキュベートするステップ、
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
等温反応を用いる標的核酸の配列を増幅する方法であって、
（１）前記標的核酸を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させるステップ；及び
（２）前記標的核酸を、当該標的核酸を増幅させる等温反応条件下、前記ポリペプチドと一緒にインキュベートするステップ、
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する新規なポリペプチド、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ修復及び複製において、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で必要とされるが、分子生物学者のためのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での診断及び分析の重要なツールとなっている。遺伝子「ＤＮＡ ｐｏｌＡ」によりコードされるＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩは、１９５６年に発見され、１９７０年代初期にクローニング及び特性決定された。当該酵素は、ニックトランスレーション、ｃＤＮＡクローニングにおける第二鎖ｃＤＮＡ合成、及びＤＮＡ配列決定によりＤＮＡ標識等の様々な用途を有する。いわゆるＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの「クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）」又は「ラージ（Ｌａｒｇｅ）」フラグメントは、元々プロテアーゼ酵素サブチリシンによる未変性酵素の切断で作製された巨大な（ｌａｒｇｅ）タンパク質フラグメントである。このラージフラグメントは、５'→３'ポリメラーゼ活性、及び３'→５'エキソヌクレアーゼ・プルーフリーディング活性を有するが、前記未変性酵素におけるＤＮＡ修復の間に、ニックトランスレーションを媒介する５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損する。
【０００３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発見されているため、ＤＮＡポリメラーゼＩ様酵素は、多くの原核生物において、特性決定されているが、非Ｅ．ｃｏｌｉ対応物は、３'→５'エキソヌクレアーゼ・プルーフリーディング機能を常に有するわけではない。様々な好熱性真正細菌、例えば、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・ブロッキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕs ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルベンス（Ｔｈｅｒｍｕs ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）及びサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩ様酵素が、熱安定性であり、約４５℃〜１００℃でポリメラーゼ活性を維持することがわかっている。
【０００４】
一般的に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の熱サイクル増幅反応によるか、又は鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）、及びループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ；Ｎｏｔｏｍｉ等、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：ｅ６３を参照されたい）等の等温増幅反応による、核酸配列の増幅のための方法において幅広い用途が発見されている。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性、鎖置換活性、フィデリティ（エラー率）及びテンプレートＤＮＡ及び／又は遊離ヌクレオチドへの結合親和性等の様々な特性を有するため、典型的に、増幅反応の様々なタイプに適する。
【０００５】
等温増幅反応には、強力な鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼが必要であり、且つＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント及びＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント等のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素は、ＬＡＭＰ等の反応に適している（Ｎｏｔｏｍｉ等、２０００、上記を参照されたい）。
【０００６】
一方で、ＰＣＲ等の熱サイクル増幅反応には、使用されるサイクル温度（典型的には、最大９４℃）で適切な処理能力及び熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼが必要である。ＰＣＲのための市販のＤＮＡポリメラーゼの多くは、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠如するが、プルーフリーディング３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ様酵素である（例えば、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｐｗｏ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ，９Ｎ７、Ｔｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）。いくつかのＤＮＡポリメラーゼＩ酵素（典型的には、サーモトガ及びサーマス種由来のもの、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）がＰＣＲで使用されるが、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、等温増幅反応において十分に機能するよう、不十分な鎖置換活性を有する。
【０００７】
ＷＯ２００７／１２７８９３は、サーモトガ・ナフトフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎａｐｈｔｈｏｐｈｉｌａ）及びサーモトガ・ペトフェリア（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｅｌｌｉａ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを開示する。
【０００８】
Ｍｏｕｓｓａｒｄ等（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ＆Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）５４：２２７−２３３）は、当該タイプの種として、サーモデスルファテーター・インディクスが属する、サーモデスルファテーター属の発見を開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸増幅反応等のＤＮＡポリメラーゼ活性を必要とする反応における使用のための、新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＩ及びそのラージフラグメントを提供する。当該ポリメラーゼ、特にそのラージフラグメントは、驚くべきことに、且つ有利なことに、熱サイクル及び等温増幅反応の両方において有用であることがわかっている。熱安定性及びＤＮＡ複製能を維持する様々な突然変異体（欠失及び置換）が、本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
本発明の特に非限定的な実施態様を、以下の図に関してここで記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の１つの実施態様による、サーモデスルファテーター・インディクス由来の新規なＤＮＡポリメラーゼのクローニングの際に使用した遺伝子ウォーキング法を示す図である。
【図２】図２は、Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのクローニングにおいて使用される新規なｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳ領域の構造を示す図である。
【図３】図３は、クローン化Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントの発現を示すＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。レーン１は、サイズマーカー、レーン２は、インサートなしのｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳベクターでの誘導コントロール、レーン３は、１００μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメント、レーン４は、１００μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグのないラージフラグメント、レーン５は、２０μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメント、レーン６は、２０μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグのないラージフラグメント、レーン７は、５μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメント、レーン８は、５μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグのないラージフラグメント、レーン９は、単一ステップキレーティングセファロース精製を介して精製した、５０ｕのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメント、及びレーン１０は、１２．５ｕのＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。容量は、誘導Ｅ．ｃｏｌｉＫＲＸ培養物の容量からロードしたタンパク質の量を表す。
【図４】図４は、クローン化Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼの全長の実施態様の発現を示すＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。レーン１は、サイズマーカー、レーン２は、インサートなしのｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳベクターでの誘導コントロール、レーン３は、１００μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有する全長、レーン４は、１００μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグのない全長、レーン５は、２５ｕのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼである。容量は、誘導Ｅ．ｃｏｌｉＫＲＸ培養物の容量からロードしたタンパク質の量を表す。
【図５】図５は、クローン化Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼを用いるラムダ（λ）ＤＮＡの増幅を示すＰＣＲ反応サンプルのアガロースゲルである。レーン１は、ラムダＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIサイズマーカーであり、レーン２は、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、２７５ｂｐ、２２５ｂｐ及び１７５ｂｐのサイズマーカーであり、レーン３は１．２５ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅産物を示し、レーン４は、２μｌの誘導Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグなしのラージフラグメントを示し、レーン５は、２μｌの誘導Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメントを示し、レーン６は、単一ステップキレーティングセファロース精製を介して精製した、８μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメントを示し、レーン７は、１０μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有する全長を示し、及びレーン８は、インサートを欠損する誘導ｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳベクターを用いた増幅産物を示す（ネガティブコントロール）。容量は、誘導Ｅ．ｃｏｌｉＫＲＸ培養物の容量からロードしたタンパク質の量を表す。
【図６】図６は、クローン化Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅結果を示すＬＡＭＰ反応サンプルのアガロースゲルである。レーン１は、ラムダＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIサイズマーカーであり、レーン２は、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、２７５ｂｐ、２２５ｂｐ及び１７５ｂｐのサイズマーカーであり、レーン３は、８ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントを用いる増幅産物を示し、レーン４は、２μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグなしのラージフラグメントを示し、レーン５は、２μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメントを示し、レーン６は、単一ステップキレーティングセファロース精製を介して精製した、８μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有するラージフラグメントを示し、レーン７は、１０μｌのＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ＨＩＳタグを有する全長を示し、及びレーン８は、インサートを欠如する誘導ｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳベクターを用いた増幅産物を示す（ネガティブコントロール）。容量は、誘導Ｅ．ｃｏｌｉＫＲＸ培養物の容量からロードしたタンパク質の量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のある態様によれば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、且つ配列番号１に示されるサーモデスルファテーター・インディクス（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆａｔａｔｏｒ ｉｎｄｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｌａｒｇｅ）（又は「クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）」）フラグメントと、少なくとも５１％同一、例えば少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％も同一であるアミノ酸配列を含んでなるか、又は当該アミノ酸配列からなる、ポリペプチドが提供される。好ましくは、当該ポリペプチドは単離される。
【００１３】
Ｔ.インディクスＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントは、以下のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
ＭＧＬＬＫＥＬＰＡＴＫＴＬＳＭＴＲＹＥＬＶＬＤＰＤＫＶＫＥＩＶＥＫＡＫＧＡＥＶＶＡＩＤＬＥＳＤＴＫＤＰＭＲＧＫＩＶＧＶＳＬＣＦＮＰＰＫＡＹＹＦＰＦＲＨＥＧＬＥＡＱＫＱＬＰＷＥＡＦＴＨＬＡＳＬＩＥＤＰＳＶＫＫＩＧＨＮＩＫＹＤＬＩＩＬＡＲＹＧＶＴＬＫＧＬＥＧＤＴＭＬＡＳＹＬＬＤＰＴＲＲＴＨＧＬＤＥＬＡＥＥＶＬＧＨＴＭＩＦＹＫＥＶＴＫＥＬＡＫＧＥＳＦＡＲＶＰＬＥＫＡＫＶＹＡＣＥＤＡＨＶＴＹＬＬＹＱＹＦＷＰＫＬＫＥＥＳＬＷＫＶＦＴＥＩＤＲＰＬＩＥＶＬＡＨＭＥＭＶＧＩＫＩＤＴＡＹＬＲＧＬＳＲＥＭＡＥＫＬＫＥＬＥＥＫＩＹＴＬＡＧＥＫＦＮＩＮＳＳＫＱＬＧＱＩＬＦＥＫＬＫＬＰＴＶＫＫＴＰＫＫＴＡＹＳＴＤＮＥＶＬＥＥＬＳＡＶＨＥＬＰＲＬＩＬＥＹＲＴＬＡＫＬＫＳＴＹＶＤＡＬＰＫＭＶＮＰＥＴＧＲＬＨＴＳＦＮＱＴＶＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＧＥＥＧＬＫＩＲＱＡＦＶＰＥＥＩＦＡＡＤＹＴＱＩＤＬＲＶＬＡＨＹＳＧＤＥＴＬＩＫＡＦＷＱＧＥＤＩＨＲＲＴＡＡＥＩＦＧＩＰＰＥＥＶＴＰＥＭＲＲＭＡＫＴＩＮＦＧＩＶＹＧＭＳＰＹＧＬＡＫＥＬＫＩＧＲＲＥＡＫＡＦＩＥＲＹＦＥＲＹＰＧＶＫＲＹＭＥＱＩＶＡＥＡＲＥＫＧＹＶＥＴＬＦＧＲＫＲＰＬＰＤＩＮＳＰＮＲＴＡＲＥＦＡＥＲＴＡＩＮＴＰＩＱＧＴＡＡＤＩＩＫＬＡＭＩＫＩＨＲＩＦＫＥＫＧＦＧＴＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＩＦＥＡＰＫＥＩＥＥＩＱＰＩＶＲＱＩＭＥＧＶＶＥＬＫＶＰＬＫＶＮＬＡＩＧＫＮＷＡＥＡＫＡ（配列番号１）
【００１５】
さらなる、そして改善された配列解析により確認された、Ｔ.インディクスＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントについての別のアミノ酸配列は、以下の配列番号３２である。
【００１６】
ＭＧＬＬＫＥＬＰＡＴＫＴＬＳＹＤＱＹＥＬＶＬＤＰＤＫＶＫＥＩＶＥＫＡＫＧＡＥＶＶＡＩＤＬＥＳＤＴＫＤＰＭＲＧＫＩＶＧＶＳＬＣＦＮＰＰＫＡＹＹＦＰＦＲＨＥＧＬＥＡＱＫＱＬＰＷＥＡＦＴＨＬＡＳＬＩＥＤＰＳＶＫＫＩＧＨＮＩＫＹＤＬＩＩＬＡＲＹＧＶＴＬＫＧＬＥＧＤＴＭＬＡＳＹＬＬＤＰＴＲＲＴＨＧＬＤＥＬＡＥＥＶＬＧＨＴＭＩＦＹＫＥＶＴＫＥＬＡＫＧＥＳＦＡＲＶＰＬＥＫＡＫＶＹＡＣＥＤＡＨＶＴＹＬＬＹＱＹＦＷＰＫＬＫＥＥＳＬＷＫＶＦＴＥＩＤＲＰＬＩＥＶＬＡＨＭＥＭＶＧＩＫＩＤＴＡＹＬＲＧＬＳＲＥＭＡＥＫＬＫＥＬＥＥＫＩＹＴＬＡＧＥＫＦＮＩＮＳＳＫＱＬＧＱＩＬＦＥＫＬＫＬＰＴＶＫＫＴＰＫＫＴＡＹＳＴＤＮＥＶＬＥＥＬＳＡＶＨＥＬＰＲＬＩＬＥＹＲＴＬＡＫＬＫＳＴＹＶＤＡＬＰＫＭＶＮＰＥＴＧＲＬＨＴＳＦＮＱＴＶＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＧＥＥＧＬＫＩＲＱＡＦＶＰＥＥＩＦＡＡＤＹＴＱＩＤＬＲＶＬＡＨＹＳＧＤＥＴＬＩＫＡＦＷＱＧＥＤＩＨＲＲＴＡＡＥＩＦＧＩＰＰＥＥＶＴＰＥＭＲＲＭＡＫＴＩＮＦＧＩＶＹＧＭＳＰＹＧＬＡＫＥＬＫＩＧＲＲＥＡＫＡＦＩＥＲＹＦＥＲＹＰＧＶＫＲＹＭＥＱＩＶＡＥＡＲＥＫＧＹＶＥＴＬＦＧＲＫＲＰＬＰＤＩＮＳＰＮＲＴＡＲＥＦＡＥＲＴＡＩＮＴＰＩＱＧＴＡＡＤＩＩＫＬＡＭＩＫＩＨＲＩＦＫＥＫＧＦＧＴＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＬＦＥＶＰＥＫＥＩＥＥＩＱＰＩＶＲＱＩＭＥＧＷＥＬＫＶＰＬＫＶＮＬＡＩＧＫＮＷＡＥＡＫＡ（配列番号３２）
【００１７】
この配列は、配列番号１と９９％同一である。
【００１８】
配列番号３２に示される、６１３アミノ酸残基のＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントの予測分子量は、約69,990ダルトンである。配列番号１に示される、６１２アミノ酸残基の予測分子量は、約69,820ダルトンである。
【００１９】
本発明によるポリペプチドに加わるためのアミノ酸配列は、配列番号３２に示される配列と、少なくとも５１％同一、例えば、少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％も同一であるアミノ酸配列であってよい。
【００２０】
配列同一性割合は、ベース配列として配列番号１又は３２を用い、ＢＬＡＳＴＰコンピュータプログラムを用いて決定することができる。これは、必要に応じて、配列番号１又は３２が、それに対して同一性割合が決定される配列であることを意味する。ＢＬＡＳＴソフトウェアは、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi（２００９年２月１１日にアクセス可能）で一般に利用可能である。
【００２１】
Ｔ．インディクスは、深海の熱水噴出口から単離された好熱性無機独立栄養性硫酸塩還元細菌であり、５５〜８０℃の生育温度範囲、及び７０℃の至適生育温度が報告されている（Ｍｏｕｓｓａｒｄ等、２００４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２２７−２３３を参照されたい）。本発明者等は、Ｔ．インディクス由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩをコードするＤＮＡポリメラーゼＡ（ｐｏｌＡ）遺伝子及びそのラージフラグメントをクローニングする、洗練された遺伝子ウォーキング技術を用いている。配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するラージフラグメントは、ＰＣＲ及びＬＡＭＰ増幅反応の両方で、これらの反応について様々な好ましいＤＮＡポリメラーゼと比較した場合、驚くほど有効であることが示されている。９４℃付近まで温度上昇するＰＣＲにおいて機能する、十分に熱安定なＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントの能力は、この細菌の至適生育温度が７０℃であることによっては予測できないはずである。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、鎖置換活性を呈してもよい。したがって当該ポリペプチドは、ＬＡＭＰ等の等温増幅反応の実施に適していてもよい。
【００２３】
当該ポリペプチドは、追加的に、又は代替的に、ＰＣＲ等の熱サイクル増幅反応の実施に適していてもよい。
【００２４】
本明細書に記載のポリペプチドは、約６１３アミノ酸残基長、例えば、約６１０〜約６２０、約６００〜約６３０、約５５０〜約６５０、又は約５００〜約７５０アミノ酸残基長であってよい。
【００２５】
当該ポリペプチドは、配列番号１又は３２のアミノ酸配列、又は当該ポリペプチドの任意の部分に付加されるか、又は当該部分から除去される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約２５０、約２６０、約２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７又は２８８の連続アミノ酸、及び／又はＮ末端領域及び／又はＣ末端領域に付加されるか、又は当該領域から除去される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約２５０、約２６０、約２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７又は２８８アミノ酸を有する配列番号１又は３２のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的に当該アミノ酸配列からなってもよい。
【００２６】
ある実施態様によれば、本発明のポリペプチドがＮ末端Ｈｉｓタグを含む場合、全長は、６１９アミノ酸残基であってもよい。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、配列番号２に示されるＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩと、少なくとも５５％同一、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％も同一であるアミノ酸配列を含んでなるか、又は基本的にこれらからなってよい。好ましくは、本発明の本態様によるポリペプチドは、本発明の第一の態様によるポリペプチドであり、したがって、配列番号１に示されるＴ．インディクスＤＮＡＩラージフラグメントと少なくとも５１％同一である。
【００２８】
Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩは、以下の全長アミノ酸配列を有する。
【００２９】
ＭＡＱＫＳＬＦＰＫＫＬＰＦＫＤＤＫＤＰＩＦＶＩＤＧＳＳＦＶＹＲＡＹＹＡＩＲＧＨＬＳＮＲＫＧＬＰＴＫＡＶＦＧＦＴＱＭＬＬＫＬＬＲＥＭＮＰＥＹＷＶＣＦＤＡＫＧＰＴＦＲＨＥＭＹＫＥＹＫＡＮＲＰＰＭＰＤＤＬＳＶＱＩＰＹＩＫＥＶＴＲＡＦＧＶＰＩＬＥＩＥＧＦＥＡＤＤＬＩＡＡＩＡＴＲＭＥＲＰＩＶＩＶＧＧＤＫＤＬＦＰＬＩＳＥＫＶＶＭＷＤＰＭＫＤＥＬＩＤＥＳＷＩＫＫＲＦＧＩＥＰＫＫＬＬＤＶＲＡＬＡＧＤＳＩＤＮＶＰＧＶＰＧＩＧＥＫＴＡＬＲＬＩＫＥＹＧＳＬＥＥＶＬＮＨＡＥＥＩＫＱＫＲＬＲＥＮＬＩＫＨＡＧＤＡＬＩＳＫＫＬＶＥＬＥＡＫＡＰＩＰＬＥＰＤＦＹＲＫＲＰＬＮＡＬＫＬＲＥＬＦＬＥＬＥＦＫＫＬＬＫＥＬＰＡＴＫＴＬＳＭＴＲＹＥＬＶＬＤＰＤＫＶＫＥＩＶＥＫＡＫＧＡＥＶＶＡＩＤＬＥＳＤＴＫＤＰＭＲＧＫＩＶＧＶＳＬＣＦＮＰＰＫＡＹＹＦＰＦＲＨＥＧＬＥＡＱＫＱＬＰＷＥＡＦＴＨＬＡＳＬＩＥＤＰＳＶＫＫＩＧＨＮＩＫＹＤＬＩＩＬＡＲＹＧＶＴＬＫＧＬＥＧＤＴＭＬＡＳＹＬＬＤＰＴＲＲＴＨＧＬＤＥＬＡＥＥＶＬＧＨＴＭＩＦＹＫＥＶＴＫＥＬＡＫＧＥＳＦＡＲＶＰＬＥＫＡＫＶＹＡＣＥＤＡＨＶＴＹＬＬＹＱＹＦＷＰＫＬＫＥＥＳＬＷＫＶＦＴＥＩＤＲＰＬＩＥＶＬＡＨＭＥＭＶＧＩＫＩＤＴＡＹＬＲＧＬＳＲＥＭＡＥＫＬＫＥＬＥＥＫＩＹＴＬＡＧＥＫＦＮＩＮＳＳＫＱＬＧＱＩＬＦＥＫＬＫＬＰＴＶＫＫＴＰＫＫＴＡＹＳＴＤＮＥＶＬＥＥＬＳＡＶＨＥＬＰＲＬＩＬＥＹＲＴＬＡＫＬＫＳＴＹＶＤＡＬＰＫＭＶＮＰＥＴＧＲＬＨＴＳＦＮＱＴＶＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＧＥＥＧＬＫＩＲＱＡＦＶＰＥＥＩＦＡＡＤＹＴＱＩＤＬＲＶＬＡＨＹＳＧＤＥＴＬＩＫＡＦＷＱＧＥＤＩＨＲＲＴＡＡＥＩＦＧＩＰＰＥＥＶＴＰＥＭＲＲＭＡＫＴＩＮＦＧＩＶＹＧＭＳＰＹＧＬＡＫＥＬＫＩＧＲＲＥＡＫＡＦＩＥＲＹＦＥＲＹＰＧＶＫＲＹＭＥＱＩＶＡＥＡＲＥＫＧＹＶＥＴＬＦＧＲＫＲＰＬＰＤＩＮＳＰＮＲＴＡＲＥＦＡＥＲＴＡＩＮＴＰＩＱＧＴＡＡＤｐａｉＫＬＡＭＩＫＩＨＲＩＦＫＥＫＧＦＧＴＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＩＦＥＡＰＥＫＥＩＥＥＩＱＰＩＶＲＱＩＭＥＧＷＥＬＫＶＰＬＫＶＮＬＡＩＧＫＮＷＡＥＡＫＡ（配列番号２）
【００３０】
全長Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩについて、さらなる且つ向上した配列解析により識別される代替のアミノ酸は、以下の配列番号３４である。
【００３１】
ＭＡＱＫＳＬＦＰＫＫＬＰＦＫＤＤＫＤＰＩＦＶＩＤＧＳＳＦＶＹＲＡＹＹＡＩＲＧＨＬＳＮＲＫＧＬＰＴＫＡＶＦＧＦＴＱＭＬＬＫＬＬＲＥＭＮＰＥＹＶＷＣＦＤＡＫＧＰＴＦＲＨＥＭＹＫＥＹＫＡＮＲＰＰＭＰＤＤＬＳＶＱＩＰＹＩＫＥＶＴＲＡＦＧＶＰＩＬＥＩＥＧＦＥＡＤＤＬＩＡＡＩＡＴＲＭＥＲＰＩＶＩＶＧＧＤＫＤＬＦＰＬＩＳＥＫＷＭＷＤＰＭＫＤＥＬＩＤＥＳＷＩＫＫＲＦＧＩＥＰＫＫＬＬＤＶＲＡＬＡＧＤＳＩＤＮＶＰＧＶＰＧＩＧＥＫＴＡＬＲＬＩＫＥＹＧＳＬＥＥＶＬＮＨＡＥＥＩＫＱＫＲＬＲＥＮＬＩＫＨＡＧＤＡＬＩＳＫＫＬＶＥＬＥＡＫＡＰＩＰＬＥＰＤＦＹＲＫＲＰＬＮＡＬＫＬＲＥＬＦＬＥＬＥＦＫＫＬＬＫＥＬＰＡＴＫＴＬＳＹＤＱＹＥＬＶＬＤＰＤＫＶＫＥＩＶＥＫＡＫＧＡＥＶＶＡＩＤＬＥＳＤＴＫＤＰＭＲＧＫＩＶＧＶＳＬＣＦＮＰＰＫＡＹＹＦＰＦＲＨＥＧＬＥＡＱＫＱＬＰＷＥＡＦＴＨＬＡＳＬＩＥＤＰＳＶＫＩＯＧＨＮＩＫＹＤＬＩＩＬＡＲＹＧＶＴＬＫＧＬＥＧＤＴＭＬＡＳＹＬＬＤＰＴＲＲＴＨＧＬＤＥＬＡＥＥＶＬＧＨＴＭＩＦＹＫＥＶＴＫＥＬＡＫＧＥＳＦＡＲＶＰＬＥＫＡＫＶＹＡＣＥＤＡＨＶＴＹＬＬＹＱＹＦＷＰＫＬＫＥＥＳＬＷＫＶＦＴＥＩＤＲＰＬＩＥＶＬＡＨＭＥＭＶＧＩＫＩＤＴＡＹＬＲＧＬＳＲＥＭＡＥＫＬＫＥＬＥＥＫＩＹＴＬＡＧＥＫＦＮＩＮＳＳＫＱＬＧＱＩＬＦＥＫＬＫＬＰＴＶＫＫＴＰＫＫＴＡＹＳＴＤＮＥＶＬＥＥＬＳＡＶＨＥＬＰＲＬＩＬＥＹＲＴＬＡＫＬＫＳＴＹＶＤＡＬＰＫＭＶＮＰＥＴＧＲＬＨＴＳＦＮＱＴＶＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＧＥＥＧＬＫＩＲＱＡＦＶＰＥＥＩＦＡＡＤＹＴＱＩＤＬＲＶＬＡＨＹＳＧＤＥＴＬＩＫＡＦＷＱＧＥＤＩＨＲＲＴＡＡＥＩＦＧＩＰＰＥＥＶＴＰＥＭＲＲＭＡＫＴＩＮＦＧＩＶＹＧＭＳＰＹＧＬＡＫＥＬＫＩＧＲＲＥＡＫＡＦＩＥＲＹＦＥＲＹＰＧＶＫＲＹＭＥＱＩＶＡＥＡＲＥＫＧＹＶＥＴＬＦＧＲＫＲＰＬＰＤＩＮＳＰＮＲＴＡＲＥＦＡＥＲＴＡＩＮＴＰＩＱＧＴＡＡＤＩＩＫＬＡＭＩＫＩＨＲＩＦＫＥＫＧＦＧＴＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＬＦＥＶＰＥＫＥＩＥＥＩＱＰＩＶＲＱＩＭＥＧＶＶＥＬＫＶＰＬＫＶＮＬＡＩＧＫＮＷＡＥＡＫＡ（配列番号３４）
【００３２】
この配列は、配列番号２と９９.４４％同一である。
【００３３】
配列番号３４に示される、９００アミノ酸残基のＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩの予測分子量は、約102,900ダルトンである。配列番号２に示される９００アミノ酸残基配列の予測分子量は、約102,850ダルトンである。
【００３４】
本発明によるポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号３４に示される配列と、少なくとも５１％同一、例えば少なくとも５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％も同一であるアミノ酸配列であってよい。
【００３５】
配列同一性割合は、ベース配列として配列番号２又は３４を用い、ＢＬＡＳＴＰコンピュータプログラムを用いて決定することができる。これは、必要に応じて、配列番号２又は３４が、それに対して同一性割合が決定される配列であることを意味する。
【００３６】
ポリペプチドは、配列番号２又は３４のアミノ酸配列、又は当該ポリペプチドの任意の部分に付加されるか、又は当該部分から除去される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約２５０、約２６０、約２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７又は２８８の連続アミノ酸、及び／又はＮ末端領域及び／又はＣ末端領域に付加されるか、又は当該領域から除去される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約２５０、約２６０、約２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７又は２８８アミノ酸を有する配列番号１又は３２のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれらからなってもよい。
【００３７】
本発明の本態様によるポリペプチドは、Ｔ．インディクスから得られ、且つ約102,500〜103,500ダルトン（好ましくは、約102,900又は約103,000ダルトン）の分子量を有する単離熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＩ、又はその酵素活性フラグメントであってよい。「酵素活性フラグメント」なる用語は、Ｔ．インディクスからえら得られ、且つ全長ポリメラーゼのものと比較して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の酵素活性を有するようなポリメラーゼのフラグメントを意味する。所与の活性は、任意の標準的測定、例えば、所与の時間内に複製できるテンプレート配列のヌクレオチド塩基数により決定してもよい。当業者は、当該特性及び活性を定常的に決定することができる。
【００３８】
配列番号１に示されるＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントの残基３〜６１２は、配列番号２に示される全長ＤＮＡポリメラーゼＩの残基２９０〜９００に対応した。配列番号の残基１〜２は、配列番号２の配列と比較して、宿主細胞においてラージフラグメントのインビトロ発現をさせるため、人工的に導入される（以下の実施例参照）。同様に、配列番号３２に示されるＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントの残基３〜６１３は、配列番号３４に示される全長ＤＮＡポリメラーゼＩの残基２９０〜９００に対応した。
【００３９】
本発明によるポリペプチドは、本発明のさらなる態様によって、それが追加の機能的又は構造的ドメイン、例えば、親和性精製タグ（Ｈｉｓ精製タグ等）、又はＤＮＡポリメラーゼ活性向上ドメイン、例えばアーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来の増殖細胞核抗原ホモログ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼチオレドキシン結合ドメイン、スルホロブス・ソルファタリカス由来のＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｏ７ｄ、Ｓｓｏ７ｄ様タンパク質、もしくはその突然変異体、又はＤＡＮトポイソメラーゼＶ由来のヘリックス・ヘパリン・ヘリックスモチーフ等を含んでなる場合、サイズがより大きくてもよい。ＤＮＡポリメラーゼ活性向上ドメインは、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅａｌ微生物由来の高度に保存されたタンパク質ドメインが、ＤＮＡポリメラーゼの特性を向上させるために有用であることを開示する、同時継続の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００００６３に定義され且つ例示される、Ｃｒｅｎ７エンハンサードメイン又はその変異体でもよい。国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００００６３は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を必要とする１又は複数の反応、例えば、ニックトランスレーション、ｃＤＮＡクローニングにおける第二鎖ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ等の熱サイクル増幅反応、及び等温増幅反応、例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）、及びＬＡＭＰからなる群の１又は複数の使用に適していてもよい。
【００４１】
本発明によれば、熱安定性５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有し、且つ配列番号２又は３４に示されるＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩの残基１〜２８９と、少なくとも５５％、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％も同一であるポリペプチドも提供する。
【００４２】
既知のＤＮＡポリメラーゼとの配列比較に基づくと、ある態様によれば、本発明のポリペプチドは、３'→５'エキソヌクレアーゼ・プルーフリーディング活性を有する。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、ポリペプチドは、熱サイクル増幅反応（例えばＰＣＲ）の間、高フィデリティのポリメラーゼ活性を呈する。高フィデリティは、ＰＣＲエラー率が、３００×１０6増幅ヌクレオチド当たり１ヌクレオチド未満、例えば、２５０×１０6、２００×１０6、１５０×１０6、１００×１０6又は５０×１０6増幅ヌクレオチド当たり１ヌクレオチド未満と定義することができる。あるいは、ポリペプチドのエラー率は、１０6増幅ヌクレオチド当たり１〜３００ヌクレオチドの範囲、例えば、１０6増幅ヌクレオチド当たり１〜２００、１〜１００、１００〜３００、２００〜３００、１００〜２００又は７５〜２００ヌクレオチドでもよい。エラー率は、Ｋｕｎｋｅｌ等（１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４８６５−４８６９）により定義されるオパール復帰アッセイを用いて決定できる。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載のポリペプチドを含んでなる組成物が提供される。当該組成物は、例えば、緩衝剤、反応（ＤＮＡ増幅反応、例えばＰＣＲ又はＬＡＭＰ等）を実行するための大半又は全ての成分、安定化剤（熱安定性向上のための、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｒｏＥＬタンパク質）、及び／又の化合物を含んでもよい。
【００４５】
本発明は、Ｔ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントと同一性を有するポリペプチドをコードする単離核酸をさらに提供する。例えば、当該核酸は、以下に示される配列を有してよい。
【００４６】
（５'→３'）：ａｔｇｇｇｃｃｔｃｔｔａａａｇｇａａｃｔｔｃｃａｇｃｔａｃｔａａａａｃｃｃｔｔｔｃｇａｔｇａｃｃａｇａｔａｃｇａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｇｇａｔａａａｇｔａａａａｇａａａｔｔｇｔａｇａａａａｇｇｃｃａａａｇｇｇｇｃｃｇａａｇｔｇｇｔｇｇｃｔａｔｔｇａｃｃｔｔｇａａａｇｔｇａｔａｃｇａａａｇａｃｃｃｃａｔｇｃｇｔｇｇｇａａａａｔａｇｔａｇｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｔｔｇｔｔｔｔａａｃｃｃｇｃｃｃａａａｇｃｃｔａｔｔａｔｔｔｃｃｃｔｔｔｔａｇａｃａｔｇａａｇｇｃｃｔｔｇａｇｇｃｃｃａａａａｇｃａｇｃｔｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｔｔｔａｃｔｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｔｇａａｇａｃｃｃｃｔｃａｇｔｔａａａａａｇａｔａｇｇｃｃａｃａａｔａｔｃａａｇｔａｔｇａｃｔｔｇａｔｔａｔｔｃｔｔｇｃｔｃｇｃｔａｃｇｇｃｇｔａａｃｔｔｔａａａｇｇｇｃｃｔｔｇａａｇｇｇｇａｔａｃｃａｔｇｃｔｇｇｃｔｔｃｇｔａｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｃｃａａｃａｃｇｔｃｇｔａｃｃｃａｃｇｇｃｃｔｔｇａｔｇａｇｃｔｇｇｃｃｇａａｇａｇｇｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｔａｃｃａｔｇａｔｔｔｔｔｔａｃａａｇｇａａｇｔｇａｃｔａａａｇａａｃｔｇｇｃｃａａａｇｇａｇａｇａｇｃｔｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｃｃｃｔｃｔｔｇａａａａｇｇｃａａａａｇｔｔｔａｃｇｃｃｔｇｔｇａａｇａｃｇｃｃｃａｃｇｔｔａｃｃｔａｔｃｔｇｃｔｔｔａｔｃａａｔａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｃａａａｃｔｃａａａｇａｇｇａａａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｔｔａｃｇｇａａａｔｔｇａｔｃｇａｃｃｔｔｔａａｔａｇａａｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃａｃａｔｇｇａａａｔｇｇｔａｇｇｔａｔｔａａｇａｔｔｇａｃａｃｃｇｃｃｔａｔｃｔｔａｇａｇｇａｃｔｔｔｃｇｃｇａｇａａａｔｇｇｃｔｇａａａａｇｔｔａａａｇｇａｇｃｔｔｇａａｇａａａａａａｔｔｔａｃａｃｃｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇａａａａａｔｔｔａａｔａｔｃａａｔｔｃｃａｇｃａａａｃａａｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇｃｔａａａａｃｔｃｃｃｔａｃｇｇｔｔａａａａａｇａｃｃｃｃａａａａａａａａｃｇｇｃｃｔａｔｔｃａａｃｇｇａｔａａｃｇａａｇｔａｔｔａｇａｇｇａａｃｔｔｔｃｔｇｃｇｇｔｃｃａｃｇａａｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｇａｔａｃｔｔｇａｇｔａｔａｇａａｃｔｃｔｇｇｃｔａａａｃｔｃａａａｔｃｔａｃｔｔａｔｇｔｔｇａｔｇｃｃｃｔｃｃｃｇａａｇａｔｇｇｔｔａａｔｃｃｔｇａａａｃｔｇｇｔｃｇｔｃｔｔｃａｔａｃｔｔｃｃｔｔｔａａｃｃａｇａｃｇｇｔｔａｃｇｇｃｃａｃｔｇｇａａｇａｃｔｔｔｃａａｇｃａｇｔｇａｃｃｃｔａａｔｃｔｔｃａａａａｔａｔｔｃｃｔｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇａａｇａｇｇｇｇｃｔｔａａｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇｃｃｇｇａｇｇａｇＡｔｔｔｔｔｇｃｔｇｃｃｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇａｔｃｇａｔｃｔｇｃｇａｇｔｔｔｔａｇｃｃｃａｔｔａｃｔｃｇｇｇａｇａｔｇａａａｃｃｔｔｇａｔｔａａｇｇｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇｇｇｇｇａａｇａｃａｔｔｃａｃｃｇｇｃｇｃａｃｇｇｃｔｇｃａｇａａａｔｔｔｔｔｇｇｔａｔｃｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇｔａａｃｔｃｃｔｇａｇａｔｇｃｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃａａｇａｃｔａｔａａａｃｔｔｔｇｇｃａｔｔｇｔｔｔａｃｇｇｃａｔｇａｇ���ｃｃｔｔａｃｇｇｔｃｔｇｇｃｇａａａｇａａｃｔｃａａａａｔｔｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇａｇｇｃｃａａｇｇｃｃｔｔｔａｔｔｇａｇｃｇｃｔａｔｔｔｔｇａａｃｇｃｔａｃｃｃａｇｇｔｇｔｇａａａｃｇｃｔａｔａｔｇｇａａｃａａａｔｃｇｔｇｇｃｔｇａａｇｃｃｃｇａｇａａａａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｇａｇａｃｃｃｔｔｔｔｃｇｇａｃｇｃａａａａｇｇｃｃｔｃｔｔｃｃｔｇａｃａｔｃａａｔａｇｃｃｃｔａａｔｃｇｔａｃｇｇｃｇｃｇｃｇａｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｃｇｃａｃｇｇｃｔａｔａａａｃａｃｔｃｃｔａｔｔｃａｇｇｇｇａｃａｇｃｃｇｃｔｇａｔａｔｔａｔｃａａｇｃｔｃｇｃｃａｔｇａｔａａａａａｔｔｃａｃｃｇｇａｔｔｔｔｔａａａｇａａａａａｇｇｃｔｔｔｇｇｇａｃａａｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｔｃａｇｇｔｇｃａｔｇａｃｇａｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｇａａｇｃｇｃｃａａａａｇａｇａｔｔｇａａｇａａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｔｇｔｃｃｇａｃａａａｔｃａｔｇｇａａｇｇａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔｇａａｇｇｔｔｃｃｔｃｔａａａａｇｔａａａｃｃｔｇｇｃａａｔａｇｇｇａａａａａｔｔｇｇｇｃａｇａｇｇｃａａａｇｇｃａｔａａ（配列番号３）
【００４７】
配列番号３のヌクレオチドは、以下の配列番号１のＴ．インディクスＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントをコードする。
【００４８】
【化１】
0005617075.tif 000002
【００４９】
【化２】
0005617075.tif 000003
【００５０】
【化３】
0005617075.tif 000004
【００５１】
あるいは、核酸は、以下に示す配列を有する。
【００５２】
（５'→３'）：ａｔｇｇｇｃｃｔｃｔｔａａａｇｇａａｃｔｔｃｃａｇｃｔａｃｔａａａａｃｃｃｔｔｔｃｇｔａｔｇａｃｃａｇｔａｃｇａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｇｇａｔａａａｇｔａａａａｇａａａｔｔｇｔａｇａａａａｇｇｃｃａａａｇｇｇｇｃｃｇａａｇｔｇｇｔｇｇｃｔａｔｔｇａｃｃｔｔｇａａａｇｔｇａｔａｃｇａａａｇａｃｃｃｃａｔｇｃｇｔｇｇｇａａａａｔａｇｔａｇｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｔｔｇｔｔｔｔａａｃｃｃｇｃｃｃａａａｇｃｃｔａｔｔａｔｔｔｃｃｃｔｔｔｔａｇａｃａｔｇａａｇｇｃｃｔｔｇａｇｇｃｃｃａａａａｇｃａｇｃｔｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｔｔｔａｃｔｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｔｇａａｇａｃｃｃｃｔｃａｇｔｔａａａａａｇａｔａｇｇｃｃａｃａａｔａｔｃａａｇｔａｔｇａｃｔｔｇａｔｔａｔｔｃｔｔｇｃｔｃｇｃｔａｃｇｇｃｇｔａａｃｔｔｔａａａｇｇｇｃｃｔｔｇａａｇｇｇｇａｔａｃｃａｔｇｃｔｇｇｃｔｔｃｇｔａｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｃｃａａｃａｃｇｔｃｇｔａｃｃｃａｃｇｇｃｃｔｔｇａｔｇａｇｃｔｇｇｃｃｇａａｇａｇｇｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｔａｃｃａｔｇａｔｔｔｔｔｔａｃａａｇｇａａｇｔｇａｃｔａａａｇａａｃｔｇｇｃｃａａａｇｇａｇａｇａｇｃｔｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｃｃｃｔｃｔｔｇａａａａｇｇｃａａａａｇｔｔｔａｃｇｃｃｔｇｔｇａａｇａｃｇｃｃｃａｃｇｔｔａｃｃｔａｔｃｔｇｃｔｔｔａｔｃａａｔａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｃａａａｃｔｃａａａｇａｇｇａａａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｔｔａｃｇｇａａａｔｔｇａｔｃｇａｃｃｔｔｔａａｔａｇａａｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃａｃａｔｇｇａａａｔｇｇｔａｇｇｔａｔｔａａｇａｔｔｇａｃａｃｃｇｃｃｔａｔｃｔｔａｇａｇｇａｃｔｔｔｃｇｃｇａｇａａａｔｇｇｃｔｇａａａａｇｔｔａａａｇｇａｇｃｔｔｇａａｇａａａａａａｔｔｔａｃａｃｃｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇａａａａａｔｔｔａａｔａｔｃａａｔｔｃｃａｇｃａａａｃａａｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇｃｔａａａａｃｔｃｃｃｔａｃｇｇｔｔａａａａａｇａｃｃｃｃａａａａａａａａｃｇｇｃｃｔａｔｔｃａａｃｇｇａｔａａｃｇａａｇｔａｔｔａｇａｇｇａａｃｔｔｔｃｔｇｃｇｇｔｃｃａｃｇａａｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｇａｔａｃｔｔｇａｇｔａｔａｇａａｃｔｃｔｇｇｃｔａａａｃｔｃａａａｔｃｔａｃｔｔａｔｇｔｔｇａｔｇｃｃｃｔｃｃｃｇａａｇａｔｇｇｔｔａａｔｃｃｔｇａａａｃｔｇｇｔｃｇｔｃｔｔｃａｔａｃｔｔｃｃｔｔｔａａｃｃａｇａｃｇｇｔｔａｃｇｇｃｃａｃｔｇｇａａｇａｃｔｔｔｃａａｇｃａｇｔｇａｃｃｃｔａａｔｃｔｔｃａａａａｔａｔｔｃｃｔｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇａａｇａｇｇｇｇｃｔｔａａｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇｃｃｇｇａｇｇａｇａｔｔｔｔｔｇｃｔｇｃｃｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇａｔｃｇａｔｃｔｇｃｇａｇｔｔｔｔａｇｃｃｃａｔｔａｃｔｃｇｇｇａｇａｔｇａａａｃｃｔｔｇａｔｔａａｇｇｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇｇｇｇｇａａｇａｃａｔｔｃａｃｃｇｇｃｇｃａｃｇｇｃｔｇｃａｇａａａｔｔｔｔｔｇｇｔａｔｃｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇｔａａｃｔｃｃｔｇａｇａｔｇｃｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃａａｇａｃｔａｔａａａｃｔｔｔｇｇｃａｔｔｇｔｔｔａｃｇｇｃａｔｇａｇ���ｃｃｔｔａｃｇｇｔｃｔｇｇｃｇａａａｇａａｃｔｃａａａａｔｔｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇａｇｇｃｃａａｇｇｃｃｔｔｔａｔｔｇａｇｃｇｃｔａｔｔｔｔｇａａｃｇｃｔａｃｃｃａｇｇｔｇｔｇａａａｃｇｃｔａｔａｔｇｇａａｃａａａｔｃｇｔｇｇｃｔｇａａｇｃｃｃｇａｇａａａａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｇａｇａｃｃｃｔｔｔｔｃｇｇａｃｇｃａａａａｇｇｃｃｔｃｔｔｃｃｔｇａｃａｔｃａａｔａｇｃｃｃｔａａｔｃｇｔａｃｇｇｃｇｃｇｃｇａｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｃｇｃａｃｇｇｃｔａｔａａａｃａｃｔｃｃｔａｔｔｃａｇｇｇｇａｃａｇｃｃｇｃｔｇａｔａｔｔａｔｃａａｇｃｔｃｇｃｃａｔｇａｔａａａａａｔｔｃａｃｃｇｇａｔｔｔｔｔａａａｇａａａａａｇｇｃｔｔｔｇｇｇａｃａａｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｔｃａｇｇｔｇｃａｃｇａｃｇａａｃｔｔｃｔｔｔｔｔｇａａｇｔｇｃｃｔｇａａａａａｇａｇａｔｔｇａａｇａａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｔｇｔｃｃｇａｃａａａｔｃａｔｇｇａａｇｇａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔｇａａｇｇｔｔｃｃｔｃｔａａａａｇｔａａａｃｃｔｇｇｃａａｔａｇｇｇａａａａａｔｔｇｇｇｃａｇａｇｇｃａａａｇｇｃａｔａａ（配列番号３３）
【００５３】
配列番号３３のヌクレオチドは、以下の配列番号３２のＴ．インディクスポリメラーゼＩラージフラグメントをコードする。
【００５４】
【化４】
0005617075.tif 000005
【００５５】
【化５】
0005617075.tif 000006
【００５６】
本発明は、Ｔ．インディクス全長ＤＮＡポリメラーゼＩと同一性を有するポリペプチドをコードする単離核酸をさらに提供する。例えば、当該核酸は、以下に示す配列を有してよい。
【００５７】
（５'→３'）：ａｔｇｇｃｇｃａｇａａａａｇｃｔｔｇｔｔｔｃｃｔａａａａａａｔｔａｃｃａｔｔｔａａａｇａｔｇａｔａａａｇａｃｃｃｃａｔｃｔｔｃｇｔｔａｔｔｇａｃｇｇｇａｇｔｔｃｔｔｔｔｇｔｔｔａｃｃｇｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｃｃａｔａａｇａｇｇｇｃａｔｃｔａｔｃａａａｃｃｇｃａａａｇｇｇｃｔｃｃｃａａｃｃａａｇｇｃｇｇｔｃｔｔｔｇｇｇｔｔｔａｃｃｃａｇａｔｇｃｉｔｔｔａａａｇｃｉｆｆｉｇｃｇｔｇａｇａｔｇａａｃｃｃｔｇａｇｔａｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｔｇａｃｇｃｃａａａｇｇｇｃｃｔａｃｔｔｔｔｃｇｃｃａｃｇａｇａｔｇｔａｃａａａｇａａｔａｃａａａｇｃｃａａｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃａｔｇｃｃａｇａｔｇａｔｃｔｔｔｃｃｇｔｃｃａｇａｔｔｃｃｃｔａｔａｔｃａａａｇａｇｇｔａａｃｃａｇｇｇｃｃｔｔｔｇｇａｇｔｃｃｃｔａｔｔｃｔｔｇａａａｔａｇａａｇｇｃｔｔｔｇａａｇｃｔｇａｃｇａｔｃｔｃａｔｃｇｃｃｇｃｔａｔｔｇｃｃａｃｔｃｇｔａｔｇｇａａａｇａｃｃａａｔｔｇｔｃａｔｃｇｔｔｇｇｔｇｇａｇａｔａａａｇａｔｔｔｇｔｔｃｃｃｃｃｔｔａｔｔｔｃａｇａｇａａａｇｔｔｇｔｃａｔｇｔｇｇｇａｃｃｃｃａｔｇａａａｇａｃｇａａｃｔｇａｔｔｇａｃｇａａａｇｃｔｇｇａｔａａａｇａａａｃｇｔｔｔｔｇｇｃａｔｔｇａａｃｃｔａａａａａｇｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔａａｇｇｇｃｃｃｔｔｇｃｃｇｇｃｇａｔａｇｃａｔｔｇａｔａａｃｇｔｇｃｃａｇｇｇｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｔｔｇｇｔｇａａａａａａcｇｇｃｃｃｔａａｇｇｃｔｃａｔａａａａｇａａｔａｃｇｇｔｔｃｃｃｔｔｇａａｇａａｇｔｃｃｔｔａａｃｃａｔｇｃｃｇａａｇａａａｔａａａａｃａａａａｇｃｇｃｔｔｇｃｇｔｇａａａａｃｃｔｃａｔｃａａａｃａｃｇｃｃｇｇａｇａｃｇｃｃｃｔｔａｔｔｔｃｃａａａａａａｃｔｇｇｔｔｇａｇｃｔｔｇａｇｇｃｃａａａｇｃｃｃｃａａｔｃｃｃｃｃｔｔｇａｇｃｃｔｇａｔｔｔｔｔａｃｃｇｃａａａｃｇｇｃｃａｔｔａａａｔｇｃｃｃｔａａａａｃｔａａｇｇｇａａｃｔｃｔｔｃｃｔｔｇａｇｃｔｔｇａａｔｔｔａａａａａｇｃｔｃｔｔａａａｇｇａａｃｔｔｃｃａｇｃｔａｃｔａａａａｃｃｃｔｔｔｃｇａｔｇａｃｃａｇａｔａｃｇａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｇｇａｔａａａｇｔａａａａｇａａａｔｔｇｔａｇａａａａｇｇｃｃａａａｇｇｇｇｃｃｇａａｇｔｇｇｔｇｇｃｔａｔｔｇａｃｃｔｔｇａａａｇｔｇａｔａｃｇａａａｇａｃｃｃｃａｔｇｃｇｔｇｇｇａａａａｔａｇｔａｇｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｔｔｇｔｔｔｔａａｃｃｃｇｃｃｃａａａｇｃｃｔａｔｔａｔｔｔｃｃｃｔｔｔｔａｇａｃａｔｇａａｇｇｃｃｔｔｇａｇｇｃｃｃａａａａｇｃａｇｃｔｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｔｔｔａｃｔｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｔｇａａｇａｃｃｃｃｔｃａｇｔｔａａａａａｇａｔａｇｇｃｃａｃａａｔａｔｃａａｇｔａｔｇａｃｔｔｇａｔｔａｔｔｃｔｔｇｃｔｃｇｃｔａｃｇｇｃｇｔａａｃｔｔｔａａａｇｇｇｃｃｔｔｇａａｇｇｇｇａｔａｃｃａｔｇｃｔｇｇｃｔｔｃｇｔａｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｃｃａａｃａｃｇｔｃｇｔａｃｃｃａｃｇｇｃｃｔｔｇａｔｇａｇｃｔｇｇｃｃｇａａｇａｇｇｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｔａｃｃａｔｇａｔｔｔｔｔｔａｃａａｇｇａａｇｔｇａｃｔａａａｇａａｃｔｇｇｃｃａａａｇｇａｇａｇａｇｃｔｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｃｃｃｔｃｔｔｇａａａａｇｇｃａａａａｇｔｔｔａｃｇｃｃｔｇｔｇａａｇａｃｇｃｃｃａｃｇｔｔａｃｃｔａｔｃｔｇｃｔｔｔａｔｃａａｔａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｃａａａｃｔｃａａａｇａｇｇａａａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｔｔａｃｇｇａａａｔｔｇａｔｃｇａｃｃｔｔｔａａｔａｇａａｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃａｃａｔｇｇａａａｔｇｇｔａｇｇｔａｔｔａａｇａｔｔｇａｃａｃｃｇｃｃｔａｔｃｔｔａｇａｇｇａｃｔｔｔｃｇｃｇａｇａａａｔｇｇｃｔｇａａａａｇｔｔａａａｇｇａｇｃｔｔｇａａｇａａａａａａｔｔｔａｃａｃｃｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇａａａａａｔｔｔａａｔａｔｃａａｔｔｃｃａｇｃａａａｃａａｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇｃｔａａａａｃｔｃｃｃｔａｃｇｇｔｔａａａａａｇａｃｃｃｃａａａａａａａａｃｇｇｃｃｔａｔｔｃａａｃｇｇａｔａａｃｇａａｇｔａｔｔａｇａｇｇａａｃｔｔｔｃｔｇｃｇｇｔｃｃａｃｇａａｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｇａｔａｃｔｔｇａｇｔａｔａｇａａｃｔｃｔｇｇｃｔａａａｃｔｃａａａｔｃｔａｃｔｔａｔｇｔｔｇａｔｇｃｃｃｔｃｃｃｇａａｇａｔｇｇｔｔａａｔｃｃｔｇａａａｃｔｇｇｔｃｇｔｃｔｔｃａｔａｃｔｔｃｃｔｔｔａａｃｃａｇａｃｇｇｔｔａｃｇｇｃｃａｃｔｇｇａａｇａｃｔｔｔｃａａｇｃａｇｔｇａｃｃｃｔａａｔｃｔｔｃａａａａｔａｔｔｃｃｔｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇａａｇａｇｇｇｇｃｔｔａａｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇｃｃｇｇａｇｇａｇａｔｔｔｔｔｇｃｔｇｃｃｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇａｔｃｇａｔｃｔｇｃｇａｇｔｔｔｔａｇｃｃｃａｔｔａｃｔｃｇｇｇａｇａｔｇａａａｃｃｔｔｇａｔｔａａｇｇｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇｇｇｇｇａａｇａｃａｔｔｃａｃｃｇｇｃｇｃａｃｇｇｃｔｇｃａｇａａａｔｔｔｔｔｇｇｔａｔｃｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇｔａａｃｔｃｃｔｇａｇａｔｇｃｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃａａｇａｃｔａｔａａａｃｔｔｔｇｇｃａｔｔｇｔｔｔａｃｇｇｃａｔｇａｇｔｃｃｔｔａｃｇｇｔｃｔｇｇｃｇａａａｇａａｃｔｃａａａａｔｔｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇａｇｇｃｃａａｇｇｃｃｔｔｔａｔｔｇａｇｃｇｃｔａｔｔｔｔｇａａｃｇｃｔａｃｃｃａｇｇｔｇｔｇａａａｃｇｃｔａｔａｔｇｇａａｃａａａｔｃｇｔｇｇｃｔｇａａｇｃｃｃｇａｇａａａａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｇａｇａｃｃｃｔｔｔｔｃｇｇａｃｇｃａａａａｇｇｃｃｔｃｔｔｃｃｔｇａｃａｔｃａａｔａｇｃｃｃｔａａｔｃｇｔａｃｇｇｃｇｃｇｃｇａｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｃｇｃａｃｇｇｃｔａｔａａａｃａｃｔｃｃｔａｔｔｃａｇｇｇｇａｃａｇｃｃｇｃｔｇａｔａｔｔａｔｃａａｇｃｔｃｇｃｃａｔｇａｔａａａａａｔｔｃａｃｃｇｇａｔｔｔｔｔａａａｇａａａａａｇｇｃｔｔｔｇｇｇａｃａａｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｔｃａｇｇｔｇｃａｔｇａｃｇａｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｇａａｇｃｇｃｃｔｇａａａａａｇａｇａｔｔｇａａｇａａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｔｇｔｃｃｇａｃａａａｔｃａｔｇｇａａｇｇａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔｇａａｇｇｔｔｃｃｔｃｔａａａａｇｔａａａｃｃｔｇｇｃａａｔａｇｇｇａａａａａｔｔｇｇｇｃａｇａｇｇｃａａａｇｇｃａｔａａ（配列番号４）
【００５８】
配列番号４のヌクレオチドは、以下の配列番号２のＴ．インディクス全長ＤＮＡポリメラーゼＩをコードする。
【００５９】
【化６】
0005617075.tif 000007
【００６０】
【化７】
0005617075.tif 000008
【００６１】
【化８】
0005617075.tif 000009
【００６２】
あるいは、核酸は以下に示す配列を有する。
【００６３】
（５'→３'）：ａｔｇｇｃｇｃａｇａａａａｇｃｔｔｇｔｔｔｃｃｔａａａａａａｔｔａｃｃａｔｔｔａａａｇａｔｇａｔａａａｇａｃｃｃｃａｔｃｔｔｃｇｔｔａｔｔｇａｃｇｇｇａｇｔｔｃｔｔｔｔｇｔｔｔａｃｃｇｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｃｃａｔａａｇａｇｇｇｃａｔｃｔａｔｃａａａｃｃｇｃａａａｇｇｇｃｔｃｃｃａａｃｃａａｇｇｃｇｇｔｃｔｔｔｇｇｇｔｔｔａｃｃｃａｇａｔｇｃｔｔｔｔａａａｇｃｔｔｔｔｇｃｇｔｇａｇａｔｇａａｃｃｃｔｇａｇｔａｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｔｇａｃｇｃｃａａａｇｇｇｃｃｔａｃｔｔｔｔｃｇｃｃａｃｇａｇａｔｇｔａｃａａａｇａａｔａｃａａａｇｃｃａａｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃａｔｇｃｃａｇａｔｇａｔｃｔｔｔｃｃｇｔｃｃａｇａｔｔｃｃｃｔａｔａｔｃａａａｇａｇｇｔａａｃｃａｇｇｇｃｃｔｔｔｇｇａｇｔｃｃｃｔａｔｔｃｔｔｇａａａｔａｇａａｇｇｃｔｔｔｇａａｇｃｔｇａｃｇａｔｃｔｃａｔｃｇｃｃｇｃｔａｔｔｇｃｃａｃｔｃｇｔａｔｇｇａａａｇａｃｃａａｔｔｇｔｃａｔｃｇｔｔｇｇｔｇｇａｇａｔａａａｇａｔｔｔｇｔｔｃｃｃｃｃｔｔａｔｔｔｃａｇａｇａａａｇｔｔｇｔｃａｔｇｔｇｇｇａｃｃｃｃａｔｇａａａｇａｃｇａａｃｔｇａｔｔｇａｃｇａａａｇｃｔｇｇａｔａａａｇａａａｃｇｔｔｔｔｇｇｃａｔｔｇａａｃｃｔａａａａａｇｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔａａｇｇｇｃｃｃｔｔｇｃｃｇｇｃｇａｔａｇｃａｔｔｇａｔａａｃｇｔｇｃｃａｇｇｇｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｔｔｇｇｔｇａａａａａａｃｇｇｃｃｃｔａａｇｇｃｔｃａｔａａａａｇａａｔａｃｇｇｔｔｃｃｃｔｔｇａａｇａａｇｔｃｃｔｔａａｃｃａｔｇｃｃｇａａｇａａａｔａａａａｃａａａａｇｃｇｃｔｔｇｃｇｔｇａａａａｃｃｔｃａｔｃａａａｃａｃｇｃｃｇｇａｇａｃｇｃｃｃｔｔａｔｔｔｃｃａａａａａａｃｔｇｇｔｔｇａｇｃｔｔｇａｇｇｃｃａａａｇｃｃｃｃａａｔｃｃｃｃｃｔｔｇａｇｃｃｔｇａｔｔｔｔｔａｃｃｇｃａａａｃｇｇｃｃａｔｔａａａｔｇｃｃｃｔａａａａｃｔａａｇｇｇａａｃｔｃｔｔｃｃｔｔｇａｇｃｔｔｇａａｔｔｔａａａａａｇｃｔｃｔｔａａａｇｇａａｃｔｔｃｃａｇｃｔａｃｔａａａａｃｃｃｔｔｔｃｇｔａｔｇａｃｃａｇｔａｃｇａｇｃｔｇｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｇｇａｔａａａｇｔａａａａｇａａａｔｔｇｔａｇａａａａｇｇｃｃａａａｇｇｇｇｃｃｇａａｇｔｇｇｔｇｇｃｔａｔｔｇａｃｃｔｔｇａａａｇｔｇａｔａｃｇａａａｇａｃｃｃｃａｔｇｃｇｔｇｇｇａａａａｔａｇｔａｇｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｔｔｇｔｔｔｔａａｃｃｃｇｃｃｃａａａｇｃｃｔａｔｔａｔｔｔｃｃｃｔｔｔｔａｇａｃａｔｇａａｇｇｃｃｔｔｇａｇｇｃｃｃａａａａｇｃａｇｃｔｔｃｃｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｔｔｔａｃｔｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｔｇａａｇａｃｃｃｃｔｃａｇｔｔａａａａａｇａｔａｇｇｃｃａｃａａｔａｔｃａａｇｔａｔｇａｃｔｔｇａｔｔａｔｔｃｔｔｇｃｔｃｇｃｔａｃｇｇｃｇｔａａｃｔｔｔａａａｇｇｇｃｃｔｔｇａａｇｇｇｇａｔａｃｃａｔｇｃｔｇｇｃｔｔｃｇｔａｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｃｃａａｃａｃｇｔｃｇｔａｃｃｃａｃｇｇｃｃｔｔｇａｔｇａｇｃｔｇｇｃｃｇａａｇａｇｇｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｔａｃｃａｔｇａｔｔｔｔｔｔａｃａａｇｇａａｇｔｇａｃｔａａａｇａ���ｃｔｇｇｃｃａａａｇｇａｇａｇａｇｃｔｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｃｃｃｔｃｔｔｇａａａａｇｇｃａａａａｇｔｔｔａｃｇｃｃｔｇｔｇａａｇａｃｇｃｃｃａｃｇｔｔａｃｃｔａｔｃｔｇｃｔｔｔａｔｃａａｔａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｃａａａｃｔｃａａａｇａｇｇａａａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｔｔａｃｇｇａａａｔｔｇａｔｃｇａｃｃｔｔｔａａｔａｇａａｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃａｃａｔｇｇａａａｔｇｇｔａｇｇｔａｔｔａａｇａｔｔｇａｃａｃｃｇｃｃｔａｔｃｔｔａｇａｇｇａｃｔｔｔｃｇｃｇａｇａａａｔｇｇｃｔｇａａａａｇｔｔａａａｇｇａｇｃｔｔｇａａｇａａａａａａｔｔｔａｃａｃｃｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇａａａａａｔｔｔａａｔａｔｃａａｔｔｃｃａｇｃａａａｃａａｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇｃｔａａａａｃｔｃｃｃｔａｃｇｇｔｔａａａａａｇａｃｃｃｃａａａａａａａａｃｇｇｃｃｔａｔｔｃａａｃｇｇａｔａａｃｇａａｇｔａｔｔａｇａｇｇａａｃｔｔｔｃｔｇｃｇｇｔｃｃａｃｇａａｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｇａｔａｃｔｔｇａｇｔａｔａｇａａｃｔｃｔｇｇｃｔａａａｃｔｃａａａｔｃｔａｃｔｔａｔｇｔｔｇａｔｇｃｃｃｔｃｃｃｇａａｇａｔｇｇｔｔａａｔｃｃｔｇａａａｃｔｇｇｔｃｇｔｃｔｔｃａｔａｃｔｔｃｃｔｔｔａａｃｃａｇａｃｇｇｔｔａｃｇｇｃｃａｃｔｇｇａａｇａｃｔｔｔｃａａｇｃａｇｔｇａｃｃｃｔａａｔｃｔｔｃａａａａｔａｔｔｃｃｔｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇａａｇａｇｇｇｇｃｔｔａａｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇｃｃｇｇａｇｇａｇａｔｔｔｔｔｇｃｔｇｃｃｇａｔｔａｃａｃｔｃａｇａｔｃｇａｔｃｔｇｃｇａｇｔｔｔｔａｇｃｃｃａｔｔａｃｔｃｇｇｇａｇａｔｇａａａｃｃｔｔｇａｔｔａａｇｇｃｃｔｔｃｔｇｇｃａｇｇｇｇｇａａｇａｃａｔｔｃａｃｃｇｇｃｇｃａｃｇｇｃｔｇｃａｇａａａｔｔｔｔｔｇｇｔａｔｃｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇｔａａｃｔｃｃｔｇａｇａｔｇｃｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃａａｇａｃｔａｔａａａｃｔｔｔｇｇｃａｔｔｇｔｔｔａｃｇｇｃａｔｇａｇｔｃｃｔｔａｃｇｇｔｃｔｇｇｃｇａａａｇａａｃｔｃａａａａｔｔｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇａｇｇｃｃａａｇｇｃｃｔｔｔａｔｔｇａｇｃｇｃｔａｔｔｔｔｇａａｃｇｃｔａｃｃｃａｇｇｔｇｔｇａａａｃｇｃｔａｔａｔｇｇａａｃａａａｔｃｇｔｇｇｃｔｇａａｇｃｃｃｇａｇａａａａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｇａｇａｃｃｃｔｔｔｔｃｇｇａｃｇｃａａａａｇｇｃｃｔｃｔｔｃｃｔｇａｃａｔｃａａｔａｇｃｃｃｔａａｔｃｇｔａｃｇｇｃｇｃｇｃｇａｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｃｇｃａｃｇｇｃｔａｔａａａｃａｃｔｃｃｔａｔｔｃａｇｇｇｇａｃａｇｃｃｇｃｔｇａｔａｔｔａｔｃａａｇｃｔｃｇｃｃａｔｇａｔａａａａａｔｔｃａｃｃｇｇａｔｔｔｔｔａａａｇａａａａａｇｇｃｔｔｔｇｇｇａｃａａｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｔｃａｇｇｔｇｃａｃｇａｃｇａａｃｔｔｃｔｔｔｔｔｇａａｇｔｇｃｃｔｇａａａａａｇａｇａｔｔｇａａｇａａａｔｃｃａｇｃｃａａｔｔｇｔｃｃｇａｃａａａｔｃａｔｇｇａａｇｇａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔｇａａｇｇｔｔｃｃｔｃｔａａａａｇｔａａａｃｃｔｇｇｃａａｔａｇｇｇａａａａａｔｔｇｇｇｃａｇａｇｇｃａａａｇｇｃａｔａａ（配列番号３５）
【００６４】
配列番号３５のヌクレオチドは、以下の配列番号３４のＴ．インディクス全長ＤＮＡポリメラーゼＩをコードする。
【００６５】
【化９】
0005617075.tif 000010
【００６６】
【化１０】
0005617075.tif 000011
【００６７】
【化１１】
0005617075.tif 000012
【００６８】
【化１２】
0005617075.tif 000013
【００６９】
以下に規定するような核酸の変異体も、本発明に包含される。
本明細書に記載される単離核酸を含んでなるベクターがさらに提供される。
本発明の核酸又はベクターで形質転換された宿主細胞が、さらに提供される。
宿主細胞由来の組換えポリペプチド発現も、本発明に包含される。
【００７０】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載のポリペプチド、及び／又は本明細書に記載の組成物、及び／又は本明細書に記載の単離核酸、及び／又は本明細書に記載のベクター、及び／又は本明細書に記載の宿主細胞を、包装材料と一緒に含んでなるキットを提供する。当該キットは、例えば、ＰＣＲ又はＬＡＭＰ等、ＤＮＡポリメラーゼ活性を必要とする反応を行うためのポリペプチドを含む成分を含んでよい。
【００７１】
本発明は、例えばＰＣＲ等の熱サイクル反応を用いる標的核酸の配列を増幅する方法であって、
（１）前記標的核酸を、本明細書に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドと接触させるステップ：及び
（２）前記標的核酸を、当該標的核酸を増幅させる熱サイクル反応条件下、前記ポリペプチドと一緒にインキュベートするステップ、
を含んでなる方法を提供する。
【００７２】
本発明の別の態様は、等温反応、例えばＬＡＭＰを用いる標的核酸の配列を増幅する方法であって、
（１）前記標的核酸を、本明細書に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドと接触させるステップ；及び
（２）前記標的核酸を、当該標的核酸を増幅させる熱サイクル反応条件下、前記ポリペプチドと一緒にインキュベートするステップ、
を含んでなる方法を包含する。
【００７３】
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドの構造的変異体も包含する。本明細書で使用する場合、「変異体」なる用語は、ポリペプチドであって、ここでアミノ酸配列は、それが由来するベース配列とは、配列内の１又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている点で異なるポリペプチドを意味する。アミノ酸置換は、あるアミノ酸が広義で類似する特性を有する異なるアミノ酸で置き換えられる場合、「保存的」であるとみなされる。非保存的置換は、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置き換えられる場合のことを言う。
【００７４】
「保存的置換」は、同じクラスの別のアミノ酸によるアミノ酸置換を意味し、ここで当該クラスは、以下の通りに定義される。
【００７５】
【表１】
0005617075.tif 000014
【００７６】
当該技術分野における当業者に周知であるように、保存的置換によりペプチドの一次構造を変更することは、ペプチドの活性を実質的に変更させなくてもよい。それは、配列に挿入されるアミノ酸側鎖が、置換されたアミノ酸側鎖と類似する結合及び接触を形成できる可能性があるためである。これは、当該置換がペプチド立体配座の決定において決定的な領域内にある場合であっても、そうである。
【００７７】
ＤＮＡ結合ドメインポリペプチドの機能を干渉しない非保存的置換を提供することができる。
【００７８】
概して、ポリペプチドの生物学的活性を変更することなしに、より少ない非保存的置換が可能となるはずである。任意の置換（及び、実際には、任意のアミノ酸の欠失又は挿入）の効果の決定は、変異体ポリペプチドが、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を保持するかを容易に決定できる当業者の、完全に定常的能力の範囲内である。例えば、ポリペプチドの変異体が本発明の範囲内であるかを決定する場合、当業者は、当該変異体が、酵素活性（すなわち、ポリメラーゼ活性）を、非変異体ポリペプチドの、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％保持するかを決定するはずである。活性は、例えば、所与の時間で複製できるテンプレート配列の塩基数等の、任意の標準的測定により測定できる。
【００７９】
好適には、変異体は、配列番号１、２、３２又は３４のいずれかの配列と、少なくとも５５％同一、６０％同一、６５％同一、例えば、少なくとも７０％又は７５％同一、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％も同一である配列を有することができる。
【００８０】
例えば、本発明には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、且つ配列番号１、２、３２又は３４のアミノ酸配列と共に、Ｎ−又はＣ−末端から削除された最大約３分の１のアミノ酸を含んでなるか、もしくは基本的にそれらからなる、又はかかる配列と少なくとも５５％配列同一性を有するポリペプチドを包含する。例えば、最大約３００アミノ酸が、配列番号２又は３４のＮ−又はＣ−末端のいずれかから除去されてもよく；最大約２０５アミノ酸が、配列番号１又は３２のＮ−又はＣ−末端のいずれかから除去されてもよい。
【００８１】
標準的な遺伝子コード、さらにポリペプチドをコードする核酸を用いることは、当業者に容易に想到且つ製造されることができる。当該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、それがＤＮＡ分子である場合、例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでもよい。
【００８２】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする変異体核酸を包含する。核酸配列との関連で「変異体」なる用語は、基本配列によりコードされるポリペプチドと、少なくとも同じ特性を呈するポリヌクレオチドによりコードされる得られたポリペプチド配列を提供するポリヌクレオチド配列からの、１又は複数の核酸の任意の置換、変動、改変、置き換え、欠失、又は当該配列への１又は複数の核酸の付加を意味する。したがって、当該用語には、対立遺伝子変異体が含まれ、そしてまた、本発明のポリヌクレオチド配列と実施的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。当該ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシーと高ストリンジェンシー条件で、又はその間で発生してよい。一般的な用語では、低ストリンジェンシー条件は、洗浄ステップが、０．３３０〜０．８２５Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液中、プローブ配列の計算又は実際の融解温度（Ｔｍ）（例えば、およそ環境実験室温度から約５５℃）未満である約４０〜４８℃の温度で行い、一方、高ストリンジェンシー条件では、洗浄は、０．０１６５〜０．０３３０Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液中、プローブの計算又は実際のＴｍ（例えば、約６５℃）未満である約５〜１０℃の温度での洗浄が必要である。緩衝溶液は、例えば、ＳＳＣ緩衝剤（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍ ｔｒｉｓ−クエン酸ナトリウム）でよく、低ストリンジェンシー洗浄は、３×ＳＳＣ緩衝剤で行い、且つ高ストリンジェンシー洗浄は、０．１×ＳＳＣ緩衝剤で行う。核酸配列のハイブリダイゼーションに必要なステップは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ）に記載がある。
【００８３】
典型的には、変異体は、本発明の核酸配列と同様に、ヌクレオチドの５５％以上、典型的には、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、又はさらに９０％、９５％、９８％、又は９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。
【００８４】
本発明の変異体核酸は、特定の宿主細胞における発現のために最適化コドンであってよい。
【００８５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ及び核酸は、従来の合成器を用いて合成的に調製できる。あるいは、これらを、組換えＤＮＡ技術を用いて調製しても、又は所望の場合は、任意の化学修飾を行った天然の供給源から単離してもよい。これらの場合、キメラタンパク質をコードする核酸は、その後好適な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物細胞を形質転換するために使用される好適な発現ベクターに組み込まれる。当該形質転換宿主細胞は、培養され、そしてタンパク質がそれから単離される。このタイプのベクター、細胞及び方法は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００８６】
ヌクレオチドとアミノ酸配列との間の配列同一性は、当該配列のアラインメントを比較することにより決定できる。比較される配列における同等の位置が同じアミノ酸又は塩基で占められると、当該分子はその位置で同一である。同一性割合としてアラインメントのスコア付けは、比較される配列によって共有される位置での同じアミノ酸又は塩基の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアラインメントは、配列における可能な挿入及び欠失を考慮するため、１又は複数の配列に導入されるギャップを必要としてよい。配列比較法は、比較される配列における同一分子の同数について、２つの比較配列間のより高い同系性を反映する、可能な限り小数のギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有するものよりもより高いスコアに到達するような、ギャップペナルティを使用できる。最大の同一性割合の計算には、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの作製が必要である。
【００８７】
上記のＢＬＡＳＴＰプログラムに加え、配列比較を行うためのさらに好適なコンピュータプログラムが、市販及び公開の部門において広く利用可能である。例には、ＭａｔＧａｔプログラム（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ等、２００３，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ４：２９）、Ｇａｐプログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３−４５３）及びＦＡＳＴＡプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）がある。ＭａｔＧＡＴ バージョン２．０３は、ウェブサイトhttp://bitincka.com/ledion/matgat/（２００９年２月１１日にアクセスした）から無料で利用可能であり、且つこれは、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＩＵＢＩＯ Ａｒｃｈｉｖｅ）へ公共配布として提出されてもいる。Ｇａｐ及びＦＡＳＴＡは、以前からＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ パッケージとして知られている、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧパッケージ バージョン１１．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）の一部として利用できる。あるいは、ＦＡＳＴＡプログラムは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（http://www.ebi.ac.uk/fasta）（２００９年２月１１日にアクセスした）及びＵｎｉｂｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ（http://fasta.biotech.virginia.edu/fasta_www/cgi 又は http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_list2.shtml、２００９年２月１１日にアクセスした）へ一般にアクセス可能である。ＦＡＳＴＡは、所与の配列を有する配列データベースを調査するか、又は２つの所与の配列を比較するために使用できる（http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_frm2.cgiを参照されたい、２００９年２月１１日にアクセスした）。典型的には、配列を比較する場合、コンピュータプログラムにより設定されるデフォルトパラメータを使用すべきである。当該デフォルトパラメータは、比較される配列のタイプと長さによって変化させてもよい。ＭａｔＧＡＴプログラムを用いる配列比較は、ＤＮＡについて、スコアリング・マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ５０、ファースト・ギャップ＝１６、エクステンディング・ギャップ＝４、及びタンパク質について、スコア・マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ５０，ファースト・ギャップ＝１２．エクステンディング・ギャップ＝２のデフォルトパラメータを使用してよい。ＦＡＳＴＡプログラムを用いる比較は、Ｋｔｕｐ＝２、スコアリング・マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ５０、ギャップ＝−１０及びｅｘｔ＝−２のデフォルトパラメータを使用してよい。
【００８８】
本発明のある態様によれば、配列同一性は、上記のデフォルトパラメータを用いるＭａｔＧＡＴプログラムバージョン ２．０３を用いて決定される。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡポリメラーゼ」は、テンプレート等のＤＮＡ等の核酸を用いるヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単位の付加により、ポリヌクレオチド合成を触媒する任意の酵素のことを言う。当該用語には、遺伝子的改変によるか、又は化学的修飾によるか、又は他の当該技術分野で既知の方法によるかにかかわらず、天然の核酸ポリメラーゼの任意の変異体及び組換え機能的誘導体が含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「熱安定性」ＤＮＡポリメラーゼ活性は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの非熱安定性状態と比較して、比較的に熱に対して安定であり、且つ例えば、４５〜１００℃、好ましくは５５〜１００℃、６５〜１００℃、７５〜１００℃、８５〜１００℃又は９５〜１００℃の高温で機能するＤＮＡポリメラーゼ活性を意味する。
【実施例】
【００９１】
サーモデサルファテーター・インディクスの寒天プレート培養物を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；受託番号ＤＳＭ １５２８６)から入手した。以下に記載の通り、当該培養物からｇＤＮＡの抽出及び増幅後、以下に概説する遺伝子ウォーキング法を用い、ＤＮＡポリメラーゼＡ遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼＩをコードする「ＤＮＡ ｐｏｌＡ」）の予想される５'開始及び３'停止に到達した。ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（又はクレノウ）フラグメントは、ＰＣＲ及びＬＡＭＰの両反応において非常に有効であることがわかった。
【００９２】
実施例１  ゲノムＤＮＡ抽出
Ｔ．インディクス培養物からのゲノムＤＮＡ抽出のための方法は、Ｇｏｔｚ等（２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１３４９−１３５９）に基づくが、これは、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９４；Ｇｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載される方法の修正法である。
【００９３】
細胞ペレットを、５６７μｌの１×ＴＥ緩衝剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）、７．５％ Ｃｈｅｌｅｘ １００（Ｓｉｇｍａ）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び２００μｇ プロテイナーゼＫ中に再懸濁し、そして５０℃で１時間、低速回転でインキュベートした。Ｃｈｅｌｅｘを遠心分離により除去した。その後、１００μｌの５Ｍ ＮａＣｌ及び０．７Ｍ ＮａＣｌ中の８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）臭化セチルトリメチルアンモニウムを、当該細胞溶解物に添加し、このサンプルを６５℃で３０分インキュベートした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、イソプロパノール沈殿をし、そして当該ＤＮＡを水に再懸濁した。ＤＮＡ濃度は、１％アガロースゲルで見積もった。
【００９４】
実施例２  ＤＮＡ ｐｏｌＡ遺伝子の初期スクリーニング
スクリーニング方法は、Ｓｈａｎｄｉｌｙａ等（２００４，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ ８：２４３−２５１）に基づいた。
【００９５】
縮重ｐｏｌＡプライマーＰｏｌＡＴＦ１及びＰｏｌＡＴＲ（以下を参照されたい）を用いて、〜５７０ｂｐのフラグメントを、１０ｎｇのＴ．インディクスｇＤＮＡから増幅した。
【００９６】
ＰｏｌＡＴＦ１プライマーは、以下の配列を有する：
５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＡｙｗｓｎｃａｒａｔｈｇａ−３’（配列番号５）；及び
ＰｏｌＡＴＲプライマーは以下の配列を有する：
５’−ＡＡＣＣＧＣＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴｙｒａｇｙａｇｙａｃ−３’（配列番号６）。
【００９７】
ＰＣＲ反応ミックスは以下の通りである。
【００９８】
【表２】
0005617075.tif 000015
【００９９】
ＰＣＲサイクル条件は、９４℃で４分の初期変性、その後、９４℃で１０秒の変性、４２℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長、を４５サイクル行った。７２℃で７分の最終伸長を行い、４℃に保った。
【０１００】
〜５７０ｂｐ増幅産物を、ＴＡクローニングし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＲ２．１キット、カタログ番号Ｋ２０００−０１）、そしてＭ１３順方向プライマー（５'−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３'）（配列番号７）及び逆方向プライマー（５'−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ−３'）（配列番号８）を用いて、ＡＢＩ−３１００ＤＮＡシーケンサーで配列決定した。配列決定データから、当該フラグメントがＤＮＡポリメラーゼＡ（ＤＮＡ ｐｏｌＡ）遺伝子であることを確認した。
【０１０１】
実施例３  ＤＮＡ ｐｏｌＡ遺伝子ウォーキング
実施例２で得られた増幅産物から、Ｔ．インディクスｇＤＮＡが「歩行し（ｗａｌｋ ａｌｏｎｇ）」、ＤＮＡ ｐｏｌＡ遺伝子の５'開始及び３'停止に到達するよう、プライマーを設計した。
【０１０２】
１０ｎｇ ｇＤＮＡを、１０μｌ反応容量中の５ｕの様々な６塩基対−カッター制限エンドヌクレアーゼで個別に消化し、そして３７℃で３時間インキュベートした。各々に特有の６−カッター制限酵素（ＲＥ）を用い、１２の個別の消化反応を行った。その後、５μｌ消化テンプレートを、５０μｌ反応容量中１２．５ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１μｌ １０×リガーゼ緩衝剤を用いて、１６℃でインキュベーションし、セルフライゲーションさせた。
【０１０３】
その後、セルフライゲーションしたＤＮＡを、ＰＣＲの２つのラウンドでテンプレートとして使用した。図１に示すように、ＰＣＲの第一ラウンドは、プライマー２及び３（以下を参照されたい）を使用し、第二ラウンド（ネスト化ラウンド）は、プライマー１及び４（以下を参照されたい）を使用し、増幅に特異性を与えた。
【０１０４】
第一ラウンドＰＣＲ：
第一ラウンドＰＣＲ反応ミックスは、以下の通りとした。
【０１０５】
【表３】
0005617075.tif 000016
【０１０６】
サイクル条件は、９４℃で４分の初期変性、その後、９４℃で１０秒の変性、５５℃で１０秒のアニーリング、７２℃で５分の伸長、を３５サイクル行った。７２℃で７分の最終伸長を行い、４℃に保った。
【０１０７】
プライマー２［１５２８６＿２＿（ｐｏｓ．２０８５）］は、以下の配列を有する：
５’−ＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣＣＧ−３'（配列番号９）；及び
プライマー３［１５２８６＿３＿（ｐｏｓ．２４５３）］は、以下の配列を有する：
５’−ＴＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＧＣＴＧ−３’（配列番号１０）。
【０１０８】
第二ラウンド（ネスト化）ＰＣＲ：
第二ラウンドＰＣＲ反応ミックスは、以下の通りとした。
【０１０９】
【表４】
0005617075.tif 000017
【０１１０】
サイクル条件は、９４℃で４分の初期変性、その後、９４℃で１０秒の変性、５５℃で１０秒のアニーリング、７２℃で５分の伸長、を２５サイクル行った。７２℃で７分の最終伸長を行い、４℃に保った。
【０１１１】
プライマー１［１５２８６＿１＿（ｐｏｓ．２０６３）］は、以下の配列を有する：
５’−ＴＡＡＴＧＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＧＣＡＧ−３’（配列番号１１）；及び
プライマー４［１５２８６＿４＿（ｐｏｓ．２５２１）］は、以下の配列を有する：
５'−ＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号１２）。
【０１１２】
増幅ＰＣＲフラグメントを、ＥｘｏＳＡＰ処理し、ネスト化プライマーを用いて配列決定を行い、そこから新規な遺伝子ウォーキングプライマーを設計できるＤＮＡ ｐｏｌＡ配列データをさらに明らかにした。Ｔ．インディクスＤＮＡ ｐｏｌＡ遺伝子の開始及び停止に到達するフラグメントを作製するために、遺伝子ウォーキングの２つのさらなる別々のステップを必要とした。
【０１１３】
さらなる遺伝子ウォーキングステップ１：
プライマー２及び３（上記の通り）を用いる第一ラウンドＰＣＲの後、プライマー１及び４（上記の通り）を用いるネスト化ＰＣＲを行った。
【０１１４】
〜１．５ｋｂｐと〜２．５ｋｂｐとの間のＰＣＲフラグメントを、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、及びＥｃｏＲＶ消化／セルフライゲーション反応テンプレートから得た。
【０１１５】
これらのフラグメントを、ネスト化プライマー（プライマー１及び４）を用いて配列決定した。フラグメントの配列決定は、ＤＮＡ ｐｏｌＡのＣ末端ストップコドンに到達し、そしてＮ末端に対する配列データのさらなる〜１１００ｂｐを与えた。新規な遺伝子ウォーキングプライマーを、Ｎ末端に対して歩行するように設計した。
【０１１６】
さらなる遺伝子ウォーキングステップ２：
プライマー６及び７（以下を参照されたい）を用いる第一ラウンドＰＣＲの後、プライマー５及び８（以下を参照されたい）を用いるネスト化ＰＣＲを行った。
【０１１７】
プライマー５［１５２８６＿５＿（ｐｏｓ．１０３６）］は、以下の配列を有する：
５’−ＴＣＴ ＣＧＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＴＡ ＡＣＣ Ｃ−３’（配列番号１３）；
プライマー６［１５２８６＿６＿（ｐｏｓ．１０１３）］は、以下の配列を有する：
５’−ＣＡＴ ＧＣＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＧＴ Ａ−３’（配列番号１４）；
プライマー７［１５２８６＿７＿（ｐｏｓ．１００８）］は、以下の配列を有する：
５’−ＡＣＴ ＴＴＡ ＴＣＣ ＧＧＧ ＴＣＡ ＡＧＡ ＡＣ−３’（配列番号１５）；及び
プライマー８［１５２８６＿８＿（ｐｏｓ．９４１）］は、以下の配列を有する：
５’−ＴＴＴ ＣＧＴ ＡＴＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＴＣ−３’（配列番号１６）。
【０１１８】
〜７５０ｂｐと〜２ｋｂｐとの間のＰＣＲフラグメントを、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、及びＫｐｎＩ消化／セルフライゲーション反応テンプレートから得た。
【０１１９】
これらのフラグメントを、ネスト化プライマー（プライマー５及び８）を用いて配列決定した。この配列データは、当該フラグメントが、ＤＮＡ ｐｏｌＡのＮ末端ＡＴＧ開始コドンに到達することを示した。
【０１２０】
実施例４  全長（「ＦＬ］）及びラージ（クレノウ）フラグメント（「ＬＦ］）ＤＮＡ ｐｏｌＡの増幅
実施例３に記載の遺伝子ウォーキングプロトコールから得た配列データに基づき、ラージ（クレノウ）フラグメントについての開始及び停止が予測でき（既知のＤＮＡ ｐｏｌＡ配列を有するアラインメント、例えばＴａｑ ＫｌｅｎＴａｑフラグメントに基づき）、全体のラージフラグメント遺伝子（〜１．７ｋｂ）を増幅する特異的プライマーの設計が可能となった。
【０１２１】
これらの特異的プライマーは：
１５２８６＿ＦＬ＿上流（ＮｄｅＩ）
５’−ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡ−３’（配列番号１７）；
１５２８６＿ＬＦ＿上流（ＮｄｅＩ）
５’−ＣＴＴ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＡＣ−３’（配列番号１８）；及び
１５２８６＿下流（ＳａｌＩ）
５’−ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＴＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＴＣ ＴＧＣ−３’（配列番号１９）である
【０１２２】
上記の通り、発現ベクターへのクローニングを促進するために、ＮｄｅＩ又はＳａｌＩの制限部位（上記のプライマー配列中の下線部）を、当該プライマーに組み込んだ。
【０１２３】
遺伝子産物を、高フィデリティのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて増幅した。
【０１２４】
ＰＣＲ反応ミックスは以下の通りである。
【０１２５】
【表５】
0005617075.tif 000018
【０１２６】
ＰＣＲサイクル条件は、９８℃で３０秒の初期変性、その後、９８℃で３秒の変性、５５℃で１０秒のアニーリング、７２℃で１．５分の伸長、を２５サイクル行った。７２℃で７分の最終伸長を行い、４℃に保った。
【０１２７】
実施例５  ｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳベクター構築
ｐＥＴ２４ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を改変し、ＮｄｅＩ部位の上流に６×ＨＩＳタグを付加した（図２を参照されたい）。当該ＨＩＳタグは、以下の通り、ＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位との間に挿入された。
【０１２８】
重複プライマー対は、その上流プライマー（ＸＢＡＩ）が以下の配列を有し：
５’−ＴＴＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＡＡ ＣＴＴ ＴＡＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＴＡ ＴＧ ＣＡＣ ＣＡ−３’（配列番号２０）、及び
その下流プライマー（ＢａｍＨＩ）が以下の配列を有する：
５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＡＴ ＡＧＴ ＡＴＡ ＴＣＴ ＣＣＴ Ｔ−３’（配列番号２１）。
【０１２９】
当該重複プライマーは、ＰＣＲにより増幅され、ＲＥ消化され、そしてｐＥＴ２４ａ（＋）へライゲーションされた。当該ライゲーション反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ'（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、カナマイシンを加えたＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈプレートに播菌した。コロニーをＰＣＲによりスクリーニングし、Ｔ７配列決定プライマーを用いて配列決定により評価した。Ｔ７配列決定プライマーは以下の通りである。
Ｔ７＿プロモーター：５’−ＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号２２）、
Ｔ７＿ターミネーター：５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号２３）。
【０１３０】
実施例６  全長及びラージフラグメントＤＮＡ ｐｏｌＡのクローニング
実施例４からのＰＣＲ産物を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ 精製キットを用いて精製し、その後ＮｄｅＩ／ＳａｌＩを用いてＲＥ消化を行った。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、そして水に再懸濁した。その後、全長（「ＦＬ」）及びラージフラグメント（「ＬＦ」）配列を、各々ｐＥＴ２４ａ（＋）及びｐＥＴ２４ａ（＋）ＨＩＳに、ＮｄｅＩとＳａｌＩとの間にライゲーションし、ＫＲＸ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）にエレクトロポレート処理した。ベクター特異的Ｔ７プライマーを用いて、コロニーをＰＣＲによりスクリーニングした。
【０１３１】
実施例７  全長及びラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼの発現
実施例６から得た組換えコロニーを、５ｍｌのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（カナマイシン／クロラムフェニコールを含有する）中で一晩増殖させた。５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈバッフル付振とうフラスコに、一晩培養物の１／１００希釈物を接種した。培養物を、２７５ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ600〜１まで増殖させ、その後２４℃まで低下させ、終濃度０．１％のＬ−ラムノース、及び終濃度１０ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を２７５ｒｐｍ、２４℃でさらに１８時間インキュベートした。その後、１０ｍｌの培養物を、５０００×ｇで１０分間遠心分離により回収し、そして細胞を１ｍｌの溶解緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、氷上で３０秒、２バーストで超音波粉砕した（４０ｖ）。サンプルを５０００×ｇで５分間遠心分離し、７０℃で２０分間熱溶解させ、バックグラウンドＥ．ｃｏｌｉタンパク質を変性させた。サンプルを遠心分離し、上清の一定量を８％ＳＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画した。
【０１３２】
図３に示されるように、Ｔ．インディクスラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩを、予測値〜７０ｋＤａで発現した。
【０１３３】
図４は、Ｔ．インディクス全長ＤＮＡポリメラーゼＩが予測値〜１０３ｋＤａで発現されたことを示す。
【０１３４】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、予測されるよりもわずかに速く泳動することが知られているため、その見かけの分子量は、予測よりも小さくなる。
【０１３５】
実施例８  ＰＣＲ活性アッセイ
実施例７で得られたサンプルのＰＣＲ活性を、５００ｂｐのλＤＮＡ ＰＣＲアッセイで試験した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５ｕ）をポジティブコントロールとして使用した。
【０１３６】
ＰＣＲ溶液は以下のものを含む。
【０１３７】
【表６】
0005617075.tif 000019
【０１３８】
上流λプライマーは以下の配列を有する：
５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号２４）、
一方、下流プライマーは以下の配列を有する：
５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３'（配列番号２５）。
【０１３９】
ＰＣＲは、９４℃で３秒の変性、５５℃で１０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長、を３５サイクル行った。７２℃で７分の最終伸長を行い、４℃に保った。
【０１４０】
反応産物の一定量を１．５％アガロースゲルに供し、結果を図５に示す。使用したＰＣＲ条件下では、Ｔ．インディクスラージフラグメントは、Ｎ末端ＨＩＳタグを有する場合でもなしの場合でも、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと同等のＰＣＲ活性を示す（レーン３）が、Ｔ．インディクス全長ＤＮＡポリメラーゼは、検出可能なＰＣＲ産物が作製されなかった（レーン７）。ここで使用されるＰＣＲアッセイ条件下では、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、検出可能なＰＣＲ産物を何ら作製しなかった（データは示さない）。
【０１４１】
実施例９  ＬＡＭＰ活性アッセイ
実施例７で得られたサンプルを、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）活性についても試験した。
【０１４２】
使用したＬＡＭＰプライマー（Ｎａｇａｍｉｎｅ等、２００２を参照されたい）は以下の通りである：
ラムダ−ＦＩＰ−ＬＡＭＰ（「ＦＩＰ」）
５’−ＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＧＣＴＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２６）；
ラムダ−ＢＩＰ−ＬＡＭＰ（「ＢＩＰ」）
５’−ＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＧＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＴ−３'（配列番号２７）；
ラムダ−Ｆ３−ＬＡＭＰ（「Ｆ３」）
５’−ＧＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＣＧＴＴ−３'（配列番号２８）；
ラムダ−Ｂ３−ＬＡＭＰ（「Ｂ３」）
５’−ＧＧＡＣＧＴＴＴＧＴＡＡＴＧＴＣＣＧＣＴＣＣ−３'（配列番号２９）；
ラムダ−ｌｏｏｐＦ−ＬＡＭＰ（「ｌｏｏｐＦ」）
５’−ＣＴＧＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＧＴＣＴ−３’（配列番号３０）；及び
ラムダ−ｌｏｏｐＢ−ＬＡＭＰ（「ｌｏｏｐＢ」）
５’−ＡＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣ−３’（配列番号３１）。
【０１４３】
ＬＡＭＰは、各々０．８μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、各々０．２μＭのＦ３及びＢ３、各々０．４μＭのｌｏｏｐＦ及びｌｏｏｐＢのプライマー、１．６ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｍ ベタイン（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１×Ｂｓｔ緩衝剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ｎｇ λＤＮＡ、及び８ｕのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）もしくは１μｌの試験サンプル（実施例７から）のいずれかを含有し、水で容量を調整した、総量２５μｌの反応混合物中で行われた。当該混合物を、６５℃で１時間インキュベートし、増幅の検出のための臭化エチジウムで染色した、一定量を１％アガロースゲルに供した。
【０１４４】
ＬＡＭＰアッセイの結果を図６に示す。使用されるＬＡＭＰ条件下、Ｔ．インディクスラージフラグメントは、Ｎ末端のＨＩＳタグを有する場合でもなしの場合でも、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントと同等のＰＣＲ活性を示す（レーン３）が、Ｔ．インディクス全長ＤＮＡポリメラーゼは、検出可能なＬＡＭＰ産物を作製しなかった（レーン７）。これらのＬＡＭＰ条件下では、全長ＤＮＡポリメラーゼが、任意のＬＡＭＰ増幅産物を破壊する５’→３'エキソヌクレアーゼ活性を有する可能性がある。ここで使用されるＬＡＭＰアッセイ条件下で、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、何ら検出可能なＬＡＭＰ産物を作製しなかった（データは示さない）。
【０１４５】
実施例１０  熱安定性アッセイ
Ｔ．インディクスラージフラグメントの熱安定性を、実施例７に記載の通り、５００ｂｐ λＤＮＡ ＰＣＲアッセイを用いて試験した。誘導したラージフラグメントのサンプルを、９５℃で、０、２、４、６、８、１０、１５又は２０分インキュベートし、その後、５００ｂｐ λＤＮＡ ＰＣＲアッセイで使用した。使用した条件下で、ラージフラグメントは、９５℃で最大４分のインキュベーションまで無影響であることがわかり、６分のインキュベーション後、ＰＣＲ活性の低減を示し、そして８分のインキュベーション後は、検出可能なＰＣＲ産物は作製されなかった（データは示さない）。
【０１４６】
このサンプルは、Ｔ．インディクスラージフラグメントが、ＰＣＲで有効な十分な期間、熱安定性であるが、９５℃の変性温度でのインキュベーションの延長は、ＤＮＡポリメラーゼ活性に影響を及ぼすことを実証している。
【０１４７】
本発明は、好ましいか又は例示的な実施態様に関して記載しているが、当該技術分野の当業者は、本発明の思想及び範囲を逸脱することなく、同じものに対する様々な改変及び変更を達成でき、且つ当該改変は、本明細書で明確に熟慮されていることを理解するはずである。本明細書に開示され、且つ添付の請求の範囲に明記される、特定の実施態様については限定する意図はなく、またいずれの類推をされるべきものでもない。
【０１４８】
本明細書で引用される全ての文書は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
0005617075.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005617075.tif 000025
【配列表】
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