(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖システム内で試料中の核酸を増幅する方法であって、以下の：
容器を提供するステップであって、前記容器は、
増幅ブリスターを含む流体接続された複数の反応ブリスター；
増幅ブリスターに流体接続された追加の第２段階増幅チャンバのセットであって、追加の第２段階増幅チャンバはそれぞれ、試料中に存在し得る特定の核酸をさらに増幅するように構成される；及び
前記反応ブリスターに流体接続されて前記容器の外部から反応ブリスターへの進入のみを可能にする１以上の密閉可能ポート；
を有する；
前記密閉可能ポートの第１の密閉可能ポートを介して前記容器に前記試料を注入し、さらに、前記試料の注入後に前記第１のポートを密閉するステップ；
前記試料から核酸を抽出し、さらに、前記抽出された核酸を前記増幅ブリスターに移動させるステップ、ここで、前記抽出ステップは、試料を溶解粒子に接触させることにより試料内に含まれる細胞を溶解させて溶解物を生じさせることを含む； 
前記核酸を前記増幅ブリスター中で増幅条件に付すステップ；
増幅核酸の一部を追加の第２段階増幅チャンバそれぞれに流体的に移動させるステップ；並びに
追加の第２段階増幅チャンバ内で第２段階増幅を行うステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記第２段階増幅チャンバがそれぞれ１対のプライマーを含み、前記核酸を増幅条件に付すステップ及び第２段階増幅がＰＣＲ増幅のためのサーマルサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸を増幅条件に付すステップが、ログ段階に到達する前に停止して、前記第２段階増幅が、ログ段階に進行する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抽出ステップが、以下の：
溶解物を生成するために前記試料内に含まれる細胞を溶解するステップ；
核酸が磁気ビーズと結合するのを可能にするために、核酸結合磁気ビーズと前記溶解物を混合してインキュベートするステップ；
前記複数のブリスターの１つの中に前記磁気ビーズを包含させるために、そのブリスターに隣接して磁石を配置するステップ；及び
前記溶解物の残留物を前記複数のブリスターの別の１つに移動させるステップ；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
溶解するステップが、高速衝突を起こすように容器の外面に繰り返し衝突させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸を増殖条件に付すステップが、前記試料中の核酸の増幅を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
核酸を増幅条件に付すステップが複数の標的に対しての多重増幅であり、追加の第２段階増幅チャンバそれぞれが前記標的の１つに対する１対のプライマー含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第２段階増幅チャンバ内のプライマーのそれぞれの対が、核酸を増殖条件に付すステップに使用されるプライマー内にネスティングされるように構成された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２段階増幅チャンバがアレイ内に提供されており、第２段階増幅を行うステップが１つの加熱／冷却装置を用いるアレイをサーマルサイクルすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
溶解するステップが試料を溶解粒子に接触させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
溶解するステップが、試料と溶解粒子とのあいだに強い衝撃の衝突を起こすように容器の外面に繰り返し衝突させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１以上の第２段階増幅チャンバが対照核酸を増幅させるためのプライマー対を含み、第２段階増幅を行うステップが対照核酸の増幅をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
第２段階増幅の反復が複数の第２段階増幅チャンバで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第１のポートが試料注入後に熱密閉される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第２段階増幅を行うステップが試料中の核酸を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第２段階増幅がリアルタイムで検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸の検出が、第２段階増幅中の第２段階増幅チャンバの蛍光モニタリングを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
コンピュータを用いて蛍光データを集める、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２段階増幅が増幅後分析により検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
増幅後分析が核酸融解曲線分析である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
増幅の検出が、第２段階増幅産物の増幅後融解曲線分析中の第２段階増幅チャンバの蛍光モニタリングを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
コンピュータを用いて蛍光データを集める、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
反応成分を水和させるための第２の密閉可能ポートへ流体を注入し、前記第２のポートを密閉することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の核酸を増幅させる方法であって、以下の：
容器を提供するステップであって、前記容器は、
溶解粒子を含有する溶解ブリスター、磁気ビーズを含有する核酸調製ブリスター、及び増幅ブリスターを含む流体接続された複数の反応ブリスター、
増幅ブリスターに流体接続された追加の第２段階増幅チャンバのアレイであって、追加の第２段階増幅チャンバはそれぞれ、試料中に存在し得る特定の核酸をさらに増幅するためのプライマーを含む、及び
反応ブリスターに流体接続された、容器の外部から反応ブリスターへの進入のみを提供する１以上の密閉可能ポート、
を有する；
第１の密閉可能ポートを介して試料を容器へ注入し、試料注入後に第１のポートを密閉するステップ；
試料と溶解粒子とのあいだに高速衝突を起こすことにより、溶解ブリスター内で細胞を溶解するステップ；
磁気ビーズを用いて試料から核酸を抽出し、抽出した核酸を増幅ブリスターへ移動させるステップ；
増幅ブリスター内の核酸を増幅条件に付すステップ；
核酸の一部を、アレイ中の追加の第２段階増幅チャンバそれぞれに流体的に移動させるステップ；及び
追加の第２段階増幅チャンバ内で第２段階増幅を行うステップ；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（特許に係る政府の権利）
本発明は、付与番号Ｕ０１ＡＩ０６１６１１及びＲ４３ＡＩ０６３６９５の下で国立衛生研究所から授与された政府の助成を受けてなされたものである。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
米国、カナダ及び西ヨーロッパにおいて、感染症は死亡者数の約７％を占めるが、一方で、発展途上地域においては、感染症は死亡者数の４０％以上を占めている。感染症は、様々な臨床症状の原因となる。広く公然に発現しているものの中には、熱病、肺炎、脳膜炎、下痢、及び、血液を含んだ下痢がある。身体的に発現しているものは病原菌を示唆し、その病原体として他を排除するが、さまざまな潜在的な病原菌の原因菌として残るものもあり、明確な診断結果のため、しばしば様々なアッセイを行うことを要する。病原菌を分析するための従来の微生物学手法は、数日又は数週間の日数を要する場合があり、しばしば適切な治療方針を遅らせる。
【０００３】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、病原菌の迅速な分析のための最適な方法になっている。ＰＣＲは、感染症を分析するための迅速で、高感度及び特効性のある手段である。分析の主要な手段としてＰＣＲを使用することの課題は、原因の可能性がある生物の種類が多く、いくつかの病理学的標本に存在する生物の数が少ないことである。１つの可能性のある各生物に対してそして大部分は陰性になることが予想されるＰＣＲアッセイのための大規模なパネルを行うことはしばしば非実用的である。病原菌の核酸が低濃度であり、反応鋳型を十分に採集するために大量の試料が必要となる場合に、問題はさらに悪化する。可能性のあるすべての原因菌をアッセイするための試料が不十分になる場合もある。１つの解決法は、「多重化ＰＣＲ」を行うことであり、この「多重化ＰＣＲ」では、試料が１回の反応で複数の標的に対して同時にアッセイされる。多重化ＰＣＲは、いくつかのシステムにおいてその価値が認められているが、高レベルの多重反応でのローバスト性及び複数の生成物に対して明瞭な分析が困難であるという問題が存在する。これらの問題を解決するために、アッセイはその後複数の二次ＰＣＲに分けることができる。二次反応を一次生成物を用いてネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）することにより、ローバスト性が向上する。しかし、この追加的な操作は高価になることがあり、さらに雑菌混入又は他の問題を引き起こす可能性がある。
【０００４】
同様に、免疫ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（「ｉ−ＰＣＲ」））は、多種多彩な抗原に対して高感度な検出を行う可能性がある。しかし、従来のＥＬＩＳＡ技術がｉＰＣＲに適用されていることから、ｉＰＣＲでは、雑菌混入というＰＣＲベースの検出方法の使用に問題となる事象がしばしば起こる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生物学的分析における種々の雑菌混入問題に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、生物を含む複数の生物学的物質に対して分析を同時に行う、迅速で、高感度なアッセイが提供される。内蔵型システムは、例示的には内蔵形態の安価な使い捨てプラスチックポーチ使用し、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ及び他の手段で生体分子を特定することが可能になるが、例示的には雑菌混入を最小にして堅調な増幅を可能にする。
【０００７】
そのため、本発明の一側面では、閉鎖式システム内の試料で２段階の増幅を行うための容器が提供され、この容器は、試料の第１段階の増幅に対して構成される第１段階の反応ブリスターを含む第１段階の反応領域と、第１段階の反応ブリスターに流体接続されてさらに試料に付加液を供給するように構成された追加的なリザーバと、第１段階の反応領域に流体接続され、試料のさらなる増幅のために構成された１対のプライマーをそれぞれが含む複数の第２段階の反応チャンバを含む第２段階の反応領域とを含む。例示的な一例では、第１段階の反応領域は、第１段階のＰＣＲ増幅領域である。別の例示的な例では、第１段階の反応領域は、免疫ＰＣＲのための抗原結合領域であり、試料内に存在する抗原が特定の核酸セグメントと結合してそれに連結する。第２段階の反応領域は核酸増幅領域である。別の例示的な例では、容器が、試料内にある細胞又は胞子を溶解するための粒子を含む細胞溶解領域と、核酸を精製するための成分を含む核酸生成領域とを含む。例示的には、ブリスターは可撓性材料を含み、個々のブリスターにかかる圧力がブリスターを壊して中身をブリスターから押し出す。
【０００８】
本発明の別の側面では、複数のチャネルを介して流体接続された複数のブリスター及びそれぞれが反応成分を含みさらに複数のブリスターの少なくとも１つと流体接続されている複数のリザーバを含む可撓性部と、複数のブリスターの１つと流体接続されて試料を受け取るように構成された密閉可能ポートとを含む容器が提供される。例示的な一態様では、反応成分は乾燥形態であり、容器は、複数のリザーバのそれぞれに流体接続される第２の密閉可能ポートをさらに含み、このポートは、反応成分を再水和するための水を受け取るように構成される。
【０００９】
さらに、本発明の一側面では、試料内の細胞を溶解するための方法が提供され、この方法は、細胞溶解ブリスターを含む可撓性容器を提供することと、細胞を細胞溶解ブリスターに導入することと、粒子及び試料を動かして高速の衝突を起こして溶解物を得るためにブリスターに力を印加することとを含む。
【００１０】
本発明の別の側面では、核酸の存在について試料を分析するための装置が提供され、この装置は、その中に本発明の容器を収容し、複数のアクチュエータが容器の種々のブリスターに対応して配置され、各アクチュエータが容器の対応するブリスターに圧力を印加するように構成され、第１の加熱／冷却装置が１つのブリスターの中身をサーマルサイクルさせるように構成されており、第２の加熱／冷却装置が第２段階のチャンバをサーマルサイクルさせるように構成されている。
【００１１】
本発明の別の側面では、複数の方法が提供される。１つの例示的な方法では、核酸が増幅される。１つの例示的な方法では、免疫ＰＣＲを使用して抗原が検出される。
当業者であれば、ほどなく理解される本発明の実施のための最良の形態を例示する好適な態様の以下の詳細な説明を考察すれば、本発明の他の特徴が明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書に記載される内蔵型核酸分析ポーチは、種々の生物学的物質の、例示的には抗原及び核酸配列の存在について試料を例示的には単一の閉鎖式システム内でアッセイすることに用いることができる。一態様では、ポーチは、複数の病原菌をアッセイするのに使用される。例示的には、場合によっては、使い捨てポーチ内で種々のステップが行われてよく、これらの種々のステップは、核酸作製、多量の１次多重化ＰＣＲ、１次増幅生成物の希釈、並びに、２次ＰＣＲを含み、リアルタイム検出、及び／又は、融解曲線分析などの増幅後の分析で完了する。しかし、病原菌検出は１つの例示的な使用法であり、ポーチは、他の核酸分析、又は、ペプチド、毒素及び小分子を含むがこれらに限定されない他の物質の検出に使用されてよいことを理解されたい。さらに、種々のステップが本発明のポーチ内で行われてよいが、いくつかの使用法に対しては１つ又は複数のステップが省略されてよく、それに応じてポーチ構成が変更されてよいことを理解されたい。
【００１３】
図１に、例示的な内蔵型核酸分析ポーチ１０を示す。ポーチ１０には、細胞溶解領域２０、核酸作製領域４０、第１段階の増幅領域６０、及び第２段階の増幅領域８０がある。核酸を含有する試料は、試料注入ポート１２を介してポーチ１０内に導入される。ポーチ１０は、様々なサイズの種々のチャネル及びブリスターを含み、試料がシステムを通って流れるように配置される。試料は種々の領域を通過して、しかるべく処理される。
【００１４】
試料処理は、ポーチ１０内に配置される種々のブリスター内で行われる。種々のチャネルが、複数の処理領域の中及びそれらの間で試料を移動させるために設けられており、一方で、別のチャネルが、流体及び試薬を試料に供給するために、あるいはそれらの流体及び試薬を試料から除去するために設けられる。例示的には、ポーチ１０内の液体は、例示的には以下に記載した空気圧の圧力によりブリスター間を移動させられるが、ポーチ内で物質を移動させる別の方法も考慮される。
【００１５】
別の容器が使用されてよいが、例示的には、ポーチ１０は、２層の可撓性プラスチックフィルムから形成され、あるいは、ポリエステル、ポリエチレンテレフタート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリル酸、及びこれらの混合物などの他の可撓性材料から形成され、この混合物は、押出し成形、プラズマ昇華、及びラミネート加工を含む当技術分野で既知の任意の加工で製造されることができる。アルミニウム積層を有する金属箔又はプラスチックも使用されてよい。当技術分野で既知の他のバリア材料を一体に封着してブリスター及びチャネルを形成してよい。プラスチックフィルムが使用される場合、層は、例示的には熱封着により一体に接着されてよい。例示的には、金属の核酸結合能は低い。
【００１６】
蛍光モニタリングを使用する態様に対しては、実施される波長において、吸光度及び自己蛍光が十分に低いプラスチックフィルムが好ましい。そのような材料は、異なるプラスチック、並びに、異なる可塑剤及び合成比に加えて、異なる厚さのフィルムを試すことによって特定されることができる。アルミニウム又は他の箔積層を用いたプラスチックに対しては、蛍光検出装置によって読み込まれるポーチの部分に箔を用いなくてよい。例えば、蛍光が、ポーチ１０の第２段階増幅領域８０のブリスター８２の中でモニタされる場合、ブリスター８２の１つ又は複数の層に箔は用いられない。ＰＣＲの実施例において、約０．１２１９ｍｍ（０．００４８インチ）の厚さのポリエステル（Ｍｙｌａｒ、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）社、デラウェア州ウィルミントン、米国）及び０．０２５〜０．０７６ｍｍ（０．００１〜０．００３インチ）の厚さのポリプロピレンフィルムからなるフィルム薄片が良好に機能する。例示的には、ポーチ１０は、入射光の約８０％〜９０％を透過することができる透明な材料で製造される。
【００１７】
例示的な態様では、物質は、例示的には空気圧の圧力をブリスター及びチャネル上に印加することにより、ブリスター間を移動させられる。それに応じて、空気圧を使用する態様では、例示的には、ポーチ材料は、空気圧を許容するための十分な可撓性があり、これにより所望の効果が得られる。「可撓性」という用語は、本明細書では、ポーチの材料の物理的特性を説明するのに使用される。「可撓性」という用語は、本明細書では、亀裂、破断、細かなひびなどが発生せずに、本明細書で使用されるレベルの空気圧により容易に変形させられるものとして定義される。例えば、アルミニウム箔などの薄い金属箔に加えてＳａｒａｎ（商標）ラップ及びＺｉｐｌｐｃ（登録商標）バッグなどの薄いプラスチックシートは可撓性である。しかし、空気圧を使用した態様でさえ、ブリスター及びチャネルのいくつかの領域だけは可撓性でなければならない。さらに、ブリスター及びチャネルが容易に変形する限り、ブリスター及びチャネルの一方側のみが可撓性でなければならない。ポーチ１０の他の領域は剛性材から作られてよく、あるいは剛性材を用いて補強されてよい。
【００１８】
例示的には、ポーチ１０に対してプラスチックフィルムが使用される。例示的にはアルミニウムの金属のシート、又は他の適切な材料は、圧延機にかけられ、さもなければ切削されて、突起した表面のパターンを有するダイスを形成してよい。ダイスが空気プレス（例示的には、Ａ−５３０２−ＰＤＳ、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ  Ｔｏｏｌ  Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州ミルトン、米国）にはめ込まれると、空気プレスは、例示的には１９５℃の温度で作動されるように調節されて印刷機のように動作して、ダイスがフィルムに接触する場合にのみプラスチックフィルムの接着表面を溶解する。ＰＣＲプライマー（例示的には、フィルム上にスポッティングされて乾燥している）、抗原結合物質、磁気ビーズ、及びケイ酸ジルコニウムビーズなどの種々の成分が、ポーチ１０が形成されるときに、種々のブリスター内で密閉されてよい。試料処理用の試薬は、接着の前にフィルム上に集合的にあるいは分離スポッティングされてよい。一態様では、ヌクレオチドトリリン酸（ＮＴＰ）が、ポリメラーゼ及びプライマーから分離してフィルム上にスポッティングされており、水性試料によって反応が水和されるまではポリメラーゼの活性を本質的に除去する。水性試料が水和の前に加熱されている場合は正確なホットスタートＰＣＲのための条件は満たされ、ホットスタート用の高価な化学成分の必要性が低下あるいは排除する。この分離のスポッティングを図５ｂに関して以下でさらに考察するが、このスポッティングが、本明細書で考察される任意の態様で使用されてよいことを理解されたい。
【００１９】
ポーチ１０内の物質を移動させるのに空気圧が使用される場合、一態様では「ブラダ」が使用されてよい。一部分が図２ａ示されるブラダ組立体７１０は、ポーチを製造するための加工と同様の加工で製造されてよいが、ブラダ組立体７１０内の個々のブリスターは、ブラダ組立体７１０内で個々のブラダが圧縮ガス源によって加圧されるようにする空気圧式取付具（例示的には、取付具７２４ａ）を含む。ブラダ組立体が圧縮ガスを受けさらに複数回使用されてよいことから、ブラダ組立体は、ポーチより丈夫で厚い材料から製造される。
【００２０】
ポーチ１０が機器の中に配置されるとき、空気圧式ブラダ組立体７１０はポーチ１０の１つの面に押圧されるので、それにより膨張させられる場合は、圧力によりポーチ１０内の対応するブリスターから液体が外に押し出される。ポーチ１０の多数のブリスターに対応する空気圧式ブラダに加えて、ブラダ組立体は、ブラダ又は空気圧駆動ピストンなどの追加の空気圧式アクチュエータをポーチ１０の種々のチャネルに対応して有してよい。これらの追加の空気圧式アクチュエータは、作動されたときにピンチ弁を形成して、対応するチャネルをはさんで閉じる。ポーチ１０の特定のブリスター内に液体を閉じ込めるために、ピンチ弁空気圧式アクチュエータは、ブリスターまで通じてさらにそこから延びているチャネルの全体にわたって膨張して、アクチュエータがチャネルをはさんで閉じるためのピンチ弁として機能するようにする。例示的には、異なるブリスター内の２つの液体を混合するために、連結チャネルに接着しているピンチ弁空気圧式アクチュエータは減圧されて、ブリスターに面している空気圧式ブラダが交互に加圧され、これにより、ブリスターを連結するチャネルを通って液体が往復させられてその中で液体が混合される。ピンチ弁空気圧式アクチュエータは、種々の形状及びサイズでよく、２つ以上のチャネルを同時にはさむように構成されてよい。このようなピンチ弁をピンチ弁１６として図１に例示的に示しており、これらは、すべての注入ポートを閉じるのに使用されてよい。本明細書では空気圧が考察されているが、直線型ステッパモータ、モータ駆動カム、空気圧又は液圧又は電磁力によって駆動される剛性パドル、ローラ、ロッカアーム、又はいくつかの場合は反ったばねなどの種々の電気機械アクチュエータを含む、ポーチに圧力を与える他の方法が考慮されていることを理解されたい。さらに、チャネルの軸に垂直に圧力を印加する方法に加えて、可逆的又は不可逆的にチャネルを閉じる様々の方法がある。これらには、チャネルを横切るたるみをねじること、熱融着、アクチュエータを回転させること、並びに、ちょう形弁及びボール弁などのチャネル内に封着される種々の物理弁が含まれる。さらに、小型のペルチェ装置又は他の温度調整器がチャネルに隣接して配置され、流体を凍結させるのに十分な温度に設定され、効果的に密閉を形成する。また、図１の設計は、それぞれのブリスター及びチャネルを通して配置されるアクチュエータ素子を特徴とする自動機器に適合しているが、アクチュエータが静止したままで、ポーチが一次元あるいは二次元的に移動されて、試料破壊、核酸捕捉、第１及び第２段階ＰＣＲ、並びに、免疫アッセイ及び免疫ＰＣＲなどのポーチの他の用途を含む複数の処理ステーション対して、少数のアクチュエータが使用されるようにすることができる。チャネル及びブリスターに作用するローラは、ポーチがステーション間で移動される構成では特に有用であることが立証されるであろう。したがって、空気圧式アクチュエータが、現在開示されている態様で使用される一方で、「空気圧式アクチュエータ」という用語が本明細書で使用されているときは、ポーチ及び機器の構成に応じて、圧力を与える他のアクチュエータ及び他の方法が使用されてよいことを理解されたい。
【００２１】
図１を参照すると、核酸抽出及び多重化ＰＣＲ用に構成された例示的な試料ポーチ１０が示されている。試料は、付属部品９０内の試料注入ポート１２を介してポーチ１０に入る。注入ポート１２は、可撓性シール、一方向弁、又は他の入口ポートでよい。ポーチ１０の内側からの真空が、試料をポーチ１０内に引き込むのに使用されてよく、あるいは、注射器又は他の圧力が、試料をポーチ１０内に押し込むのに使用されてよく、あるいは、注入ポート１２を介してポーチ１０内に試料を誘導する他の手段が使用されてよい。試料はチャネル１４を介して細胞溶解領域２０の３箇所突出ブリスター（ｔｈｒｅｅ−ｌｏｂｅｄ  ｂｌｉｓｔｅｒ）２２まで移動し、そこで、試料内の細胞が溶解される。試料が３箇所突出ブリスター２２に入ると、ピンチ弁１６が閉まる。既に閉じているピンチ弁３６と共に、ピンチ弁１６が閉じて３箇所突出ブリスター２２内に試料を密閉する。細胞溶解は、すべての試料に必要ではないことを理解されたい。そのような場合の試料に対しては、細胞溶解領域は省略されてよく、あるいは試料が次の領域に直接移動されてよい。しかし、多くの試料では、細胞溶解は必要である。一態様では、ビード切削が細胞の溶解に使用される。
【００２２】
ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ３４などの溶解粒子の存在下で試料を振動させるあるいは攪拌することによるビード切削は、溶解物を形成するのに効果的な方法である。本明細書で使用される「溶解させる」、「溶解する」、及び「溶解物」などの用語は、細胞を破裂させることに限定されず、これらの用語が、ウィルスなどの細胞構造がない粒子の破壊を含むことを理解されたい。図２に、細胞溶解領域２０の一態様を示しており、ここでは、集束流により高速でビーズが衝突して溶解物を生成する。例示的には、３箇所突出ブリスター２２の２つの下側ローブ２４、２６がチャネル３０を介して連結されおり、上側ローブ２８が、チャネル３０の対向側３１で下側ローブ２４、２６に連結される。図２に、ポーチ１０の細胞溶解領域２０に接触するブラダ組立体７１０の対応部分を示している。ポーチ１０が機器内に配置されるとき、ブラダ組立体７１０内の対応する空気圧式ブラダ７２４、７２６、７２８が、ポーチ１０の各ローブ２４、２６、２８に隣接する。「隣接」という用語が、ポーチ内のブリスター又はチャネルとそれらに対応する空気圧式アクチュエータとの関係を示すときは、それらは、ポーチが機器内に配置されるときにおけるブリスター又はチャネルとそれらに対応する空気圧式アクチュエータとの関係を示すことを理解されたい。一態様では、下側ローブ２４、２６に隣接する下側空気圧式ブラダ７２４、７２６の空気圧式付属部品７２４ａ、７２６ａは一体にはんだで封じられる。空気圧式付属部品７２４ａ、７２６ａ、及び、上側ローブ２８に隣接する上側空気圧式ブラダ７２８の空気圧付属部品７２８ａは、複動式の空気圧式シリンダを駆動させるように構成された電気作動式弁の対向側に対してはんだで封じられる。このように構成すると、上側空気圧式ブラダ７２８と２つの下側空気圧式ブラダ７２４、７２６との間に交互に圧力がかけられる。弁が交互に切り替えられると、ポーチ１０内の液体は、チャネル３０内の狭い連結部３２を通って下側ローブ２４，２６と上側ローブ２８との間を移動させられる。２つの下側ローブ２４、２６が同時に加圧されると、流れは集束して上側ローブ２８内に流れ込む。ローブの幾何形状に応じて、連結部３２でのビード３４の衝突速度は少なくとも１２ｍ／ｓｅｃでよく、強い衝撃の衝突をもたらすことが溶解につながる。例示的な３箇所突出システムでは、有効な細胞破壊及び構造的ローバスト性が見込まれる一方で、サイズ及び空気ガスの消費が最小になる。ＺＳビーズが溶解粒子として使用されるが、この選択は単に例示的なものであり、別の形状の他の物質及び粒子が使用されてよいことを理解されたい。また、細胞溶解領域２０の別の構成も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【００２３】
３箇所突出ブリスターが細胞溶解のために使用されるが、他の複数箇所突出の構成も本発明の範囲内にあることを理解されたい。例えば、例示的にはクローバー葉パターンの４箇所突出ブリスターが使用されることができ、この場合、両側のブリスターが同時に加圧されて、溶解粒子に互いに向かうように力を加えて、それによりそれらが残りの２つのローブに向かい、それらが一体に加圧されるようにすることができる。この４箇所突出ブリスターは、両方向で高速衝撃が起こるという利点がある。さらに、単一箇所突出ブリスターが使用されてよく、この場合、溶解粒子が単一箇所突出ブリスターの一部分から他の部分へ迅速に移動することも考慮している。例えば、単一箇所突出ブリスターのいくつかの領域を封鎖して、残りの領域に一時的に複数箇所突出ブリスターを形成するために、空気圧式アクチュエータが使用されてよい。また、一時的に複数箇所突出ブリスターを形成することなく、単一箇所突出ブリスター内で溶解を行うのに十分な速さで試料及び溶解粒子を移動させることができる場合もある。これらの他の一態様では、図２ｂに示すように、電動モータ１９に取り付けられた回転ブレード又はパドル２１をポーチに衝突させることにより攪拌が行われてよい。ブレード２１は溶解ブリスターの位置でポーチに衝突してよく、あるいは、溶解ブリスター近傍で、例示的には溶解ブリスターに隣接する縁部１７の位置でポーチに衝突してよい。これらの一態様では、溶解ブリスターは１つ又は複数のブリスターがあってもよい。装置のローブ上に作用する、モータ、空気圧、液圧、又は電磁駆動パドルなどの他の作動方法が使用されてもよい。例示的には、再循環手段が上側ローブと下側ローブとの間に設けられおり、アクチュエータが蠕動性ポンプ作用を施す場合は、ローラ又は回転パドルが、流体を図２の連結部３２の位置で一体に移動させるために使用されることができる。他の構成も本発明の範囲内にある。
【００２４】
また、図２ａに、空気圧式付属部品７１６ａを有する空気圧式ブラダ７１６、及び空気圧式付属部品７３６ａを有する空気圧式ブラダ７３６を示す。ポーチ１０がブラダ組立体７１０に接触して配置される場合、ブラダ７１６がチャネル１２と一列に並んでピンチ弁１６を完成させる。同様に、ブラダ７３６がチャネル３８と一列に並んでピンチ弁３６を完成させる。空気圧式ブラダ７１６及び７３６の作動により、ピンチ弁１６及び３６が開いたり閉じたりすることが可能になる。ブラダ組立体７１０の、細胞溶解領域に隣接する部分のみを示しているが、ブラダ組立体７１０が、同様の配置の空気圧式ブラダを備えて、ポーチ１０の残りの領域の全体にわたって流体の移動を制御していることを理解されたい。
【００２５】
従来技術の他の機器については、密閉された可撓性容器内でのＰＣＲが教示されている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６６４５７５８号明細書及び第６７８０６１７号明細書並びに同時継続米国特許出願１０／４７８４５３を参照されたい。しかし、特に、分析される試料が生物学的有害物質を含んでいる可能性がある場合、密閉されたＰＣＲ容器内に細胞溶解領域を包含することにより、使い易さと安全性が向上される。本明細書で示す態様では、細胞溶解並びに他のすべてのステップからの廃物が、密閉されたポーチ内に残留する。しかし、ポーチの中身はさらに次の分析のために除去されうることを理解されたい。
【００２６】
細胞が溶解されると、ピンチ弁３６が開いて、溶解物がチャネル３８を通って図３で最も分かりやすく示される核酸生成領域４０まで移動して、その後、ピンチ弁３６が閉じて試料を核酸生成領域４０内に密閉する。図３に示す態様では、核酸の精製に、ビード切削を用い、さらにシリカベース磁気ビーズ５６に対して親和結合を使用し、ビーズをエタノールで洗浄し、並びに、水又は他の流体を用いて核酸を溶離させて、細胞溶解物から核酸を精製する。核酸抽出のために必要な個々の成分は、例示的にはブリスター４４、４６、４８内に存在し、これらのブリスターがチャネル４５、４７、４９により連結されているので試薬の混合が可能となる。溶解物は、チャネル３８からブリスター４４に入る。ブリスター４４は、磁気ビーズ５６と、例示的には１−２−３Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ユタ州ソルトレークシティー、米国）の緩衝液など高塩濃度緩衝液といった適切な結合緩衝液を備えてよく、これらの成分の一方又は両方は、ブリスター４４に連結された１つ又は複数のチャネルを順番に通って供給されてよい。核酸がビーズ５６上に捕捉され、次いでピンチ弁５３が開いて、溶解物及びビーズ５６がブリスター４４及び５８に交互にかかる弱い圧力によって混合され、その後、例示的にはブラダ組立体７１０の対応する空気圧式ブラダによって供給される空気圧を介してブリスター５８に移動させられる。磁気ビーズ５６は、機器内でブリスター５８に隣接して配置される格納式の磁石５０によってブリスター５８内で捕捉され、廃物は、廃物用リザーバに移動されてよく、あるいは、ブリスター５８に圧力を印加することによりブリスター４４に戻されてよい。次に、ピンチ弁５３が閉じられる。ピンチ弁５５が解放されると、磁気ビーズ５６は、ブリスター４６から供給されるエタノール、イソプロパノール、あるいは、有機又は無機の他の洗浄溶液で洗浄される。場合によっては、磁石５０が収納され、それにより、ブリスター４６及び５８に交互に圧力を加えることによりビーズが洗浄されるようにしてよい。ビーズ５６は、ブリスター５８内で磁石５０によって再度捕捉され、溶解物の非核酸部分がビーズ５６から洗い流され、ブリスター４６に戻されてさらにピンチ弁５５によって留められてよく、あるいはリザーバを洗浄するために別のチャネルを介して洗い流されてよい。磁気ビーズが洗浄されると、ピンチ弁５７が開き、水（例示的には緩衝用水）又は他の核酸溶離液をブリスター４８から放出する。再度、磁石５０が収納され、それにより、例示的にはブリスター４８及び５８に交互に圧力を加えることにより水及びビーズ５６が最大限に混合されるようにしてよい。ビーズ５６を集めるために、磁石５０が再度使用される。ピンチ弁５９が解放されて、溶離された核酸がチャネル５２を介して第１段階の増幅領域６０まで移動させられる。次に、ピンチ弁５９が閉じて、それにより試料が第１段階の、増幅領域６０内に留められる。
【００２７】
図３に示した並びに上記の核酸生成領域４０の構成は単に例示的なものであり、本開示の範囲内で他の種々の構成が可能であることを理解されたい。
本明細書で使用されるエタノール、水、及び他の流体は、種々の方法でブリスターに供給されてよい。流体はブリスター内に保管されてよく、ブリスターのネックは、試料生成シークエンスの適切な時間に開かれてよい種々のピンチ弁又は脆性部分によってはさまれてよい。別法として、流体は、図５のポーチ１１０で示されるポーチのリザーバ内に、あるいは図６のポーチ２１０に関連して考察される付属部品内に保管されてよく、必要に応じてチャネルを介して移動させられる。別の態様では、流体は、特にエタノール注入ポート４１、８８及びプランジャ６７、６８、６９に関連して図１に示される外部供給源から導入されてよい。例示的には、プランジャ６７、６８、６９は、例示的にはより剛性の材料の付属部品９０内に挿入されてよく、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願１０／５１２２５５のように、プランジャの作動に応じて調整された量の流体を供給してよい。この調整される量は、それぞれのプランジャに対して同じでよく、あるいは異なってよい。最後に、別の態様では、ポーチは、１つ又は複数のブリスター内に保管される調整された量の流体が供給されてよく、この場合、流体はブリスター内に収容されて、例示的にはブリスター内の小型の密閉ポーチに供給されてブリスター内に有効にブリスターを形成する。適切な時間に、密閉ポーチは例示的には空気圧によっては破裂させられてよく、それにより、ポーチのブリスター内に流体を放出する。作動中に機器が汚染されるのを防止するために、流体の移動が一方向弁によってしっかりと調整されていることを条件として、機器は、機器と付属部品又はポーチ器具との間の流体連結部を通して一部あるいはすべての試薬を直接供給するように構成されてもよい。さらに、ポーチ又はその付属部品は、汚染ＤＮＡがポーチから漏れないようにするために、作動後に密閉されることが所望される場合がしばしばある。注射器ポンプなどの、必要に応じて試薬を供給するための種々の手段、並びに、逆刺付き取付具又はＯ−リングシールなどの、流体と付属部品又はポーチとを一時的に接触させるための種々の手段が知られている。流体を適切なブリスターに導入するこれらの任意の方法が、本明細書で考察するポーチの任意の態様に対して使用されてよく、これは、特定の用途の必要性によって必然的に決定されることを理解されたい。
【００２８】
上記のように、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲは、２つの段階で行われる標的増幅を含む。第１段階では、標的は、例示的にはゲノム鋳型又は逆転写の鋳型から増幅される。第１段階の増幅は、所望により、プラトー期前に終了されてよい。二次反応では、第１段階の単位複製配列が希釈されてよく、二次増幅では、同一のプライマーが使用され、あるいは例示的には、第１段階の生成物のプライマーに対して内部的に水和するネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーが使用される。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲの利点としては：ａ）最初の反応生成物が、二次反応での高忠実度を確実なものとする均質で特定の鋳型を形成し、この場合、比較的低い効率の第１段階の反応でも、堅調な第２段階の反応に対応するのに適切な鋳型を生成すること；ｂ）第１段階の反応からの非特異性生成物は、第２段階の反応に有意に干渉せず、異なるネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーが使用され、元の増幅鋳型（例示的には、ゲノムＤＮＡ又は逆転写生成物）がある程度まで希釈されて二次増幅でのその重要性が低減されること；及びｃ）ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲが、高次反応の多重化を可能にすることがあげられる。第１段階の反応は、複数の固有の増幅生成物のためのプライマーを含むことができる。しがって、これらの生成物は、第２段階の反応で特定される。しかし、第１段階の多重及び第２段階のシングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）は単に例示的なものであり、別の構成が可能であることを理解されたい。例えば、第１段階は、一対のプライマーを使用して関連する様々な単位複製配列を増幅させることができ、第２段階は、例示的には融解曲線分析を使用して単位複製配列の差異を標的にするのに使用されてよい。
【００２９】
図１を参照すると、核酸試料は、チャネル５２を介して第１段階の増幅領域６０に入り、ブリスター６１に送られる。ポリメラーゼ（例示的にはＴａｑポリメラーゼ）と、ｄＮＴＰと、例示的には多重増幅用の複数の対のプライマーのプライマーとを含むＰＣＲ混合物は、ブリスター６１に供給されてよく、あるいは上記のように種々の手段を介してブリスター６１内に導入されてよい。別法として、乾燥試薬が、ポーチ１０の組立体上のブリスター６１の位置上にスポッティングされてよく、水又は緩衝液が、例示的には図１に示すようにプランジャ６８を介してブリスター６１に導入されてよい。図４で最も分かり易く示したように、次に、試料は、ピンチ弁５９及び７２によりブリスター６１内に留められて、例示には機器内に配置されてブリスター６１に接触するように構成された熱ブロック又はペルチェ装置によって３つ以上の温度の間でサーマルサイクルされる。しかし、ブリスター６１内に収容されている試料を加熱及び冷却するための、当技術分野で知られている他の手段は、本発明の範囲内にあることを理解されたい。サーマルサイクルのための代替の加熱／冷却装置の非限定的な実施例は、ブラダ内に空気循環ブリスターを有することを含み、この空気循環ブリスターでは、ブリスター６１に隣接する空気圧式ブリスター内の空気が、３つ以上の温度の間で循環される、あるいは、例示的には、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願１０／４７８４５３のように複数の空気プレスを使用することにより、あるいは、軸上のポーチ１０を移動することにより又は固定温度の熱領域間の中身を移動させるためにポーチ１０に回転具及び回転ポーチ１０を設けることにより、ブリスター６１内の試料を温度領域まで移動させて、固定された温度の熱領域の間を中身が移動するようにする。
【００３０】
病原菌からの核酸は、しばしば、かなりの量の宿主の核酸と相互分離する。これらの宿主由来の核酸は、しばしば、プライマーと相互作用して所望ではない生成物を増幅させ、これが、プライマー、ｄＮＴＰ及びポリメラーゼの活性を除去して、可能性としては供給源の所望の生成物を不足させる。病原生物由来の核酸は概して少量であり、所望でない生成物は潜在的問題である。領域６０の第１段階反応でのサイクルの数は、特定の生成物を最大にして不特異性の生成物を最小にするために最適化することができる。サイクルの最適な数は約１０から約３０サイクルの間であり、例示的には約１５から約２０サイクルの間であると予想されるが、サイクルの数は、特定の標的、宿主、及びプライマー配列に応じて変化してよいことを理解されたい。
【００３１】
第１段階の多重増幅に続いて、第１段階の増幅生成物は、二次反応部位への流体の移動の前に、例示的には不完全なＰＣＲマスターミックス内で希釈される。
図４に、３つのステップで試料を希釈する例示的な態様を示す。第１のステップでは、ピンチ弁７２が開き、ブリスター６１内の試料と、ブリスター６２からのその同量の水又は緩衝液とを混合させることにより試料の倍数希釈が行われる。これらの同量の水又は緩衝液は、上で考察するように、ブリスター６２、並びに、ブリスター６４及び６６に供給される。ブリスター６１、６２の間を往復するようにその流体を圧迫することにより、十分な混合が行われる。上記のように、混合は、ブラダ７１０内に設けられてブリスター６１、６２に隣接して配置された空気圧式ブラダによって行われてよい。空気圧式ブラダは交互に加圧されてよく、流体を往復させるように力を加える。混合の間、ピンチ弁７４は、隣接するブリスター内に流体の流れが入るのを防止する。混合が終了すると、希釈された試料は領域７０内で捕捉されて、ピンチ弁７２が閉まって希釈された試料を領域７０内に密閉する。ピンチ弁７４が開いて、ブリスター６３、６４の一方又は両方に供給される水又は緩衝液により試料がさらに希釈される。上記のように、ブリスター６３、６４の間を往復させるようにその流体を圧迫することにより、混合が行われる。次に、ピンチ弁７４が閉まり、さらに希釈された試料が領域７１内に密閉される。最後の希釈は、例示的には、ブリスター６５、６６の一方又は両方に供給される緩衝液又は水を使用して上記のように混合することよって行われる。例示的には、この最後の希釈は、不完全なＰＣＲマスターミックス（例えば、プライマーを除いたすべてのＰＣＲ試薬を包含する）を流体として使用して行われる。第２段階の増幅の前のブリスター６６の中身の任意の加熱は、高価な抗体又は酵素が必要ないというホットスタート増幅の利点をもたらす。しかし、水又は他の緩衝液は、第２段階の増幅領域８０内に供給される追加のＰＣＲ成分と共に最後の希釈に使用されてよいことを理解されたい。例示的な態様は３段間の希釈を使用したが、任意の段階数の希釈が、好適な水準の希釈を行うために使用されてよいことを理解されたい。また、領域７０及び７１内で捕捉される試料の量を調整することにより希釈の量が制御されてよく、この場合、領域７０及び７１で捕捉される試料の量が少ないと、希釈される量は増加し、あるいは、ピンチ弁７２及び７４、並びに／又はピンチ弁７４及び７６を繰り返し開閉することにより領域７０及び／又は７１で捕捉される追加のアリコートが、希釈の量を減少させるのに使用されてよいことを理解されたい。約１０-2から約１０-5の希釈が多くの用途に対して適当であることが予想される。
【００３２】
二次ＰＣＲ反応の結果は、多重である第１段階の反応で生成される鋳型に依存する。典型的には、ＰＣＲは高純度のＤＮＡを使用して行われる。フェノール抽出器具又は商用のＤＮＡ抽出器具などの方法で、高純度のＤＮＡが得られる。ポーチ１０を通って処理された試料は、純度の低い生成物を補償するための調整が行われる必要がある場合がある。障害物となる可能性があるＰＣＲは、生物学的試料の成分によって抑制されることができる。例示的には、ホットスタートＰＣＲ、高濃度のＴａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ2濃度の調整、プライマー濃度の調整、及びアジュバント（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ又はグリセロールなど）の付加が、低純度の核酸を補償するために場合によっては使用されてよい。純度の問題は、その多くが第１段階の増幅に関連する傾向があるが、第２段階の増幅でも同様の調整が行われてよいことを理解されたい。
【００３３】
第１段階のＰＣＲ及び希釈に続いて、試料は、チャネル７８を介して、二次ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲのための複数の低容積ブリスター８２まで移動させられる。例示的な一態様では、第２段階ブリスターに供給された乾燥プライマーは、入ってくる水性物質によって再懸濁されて反応混合液が完成する。場合によっては、二重らせん構造の核酸を検出するために使用されるＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ユタ州ソルトレークシティー、米国）などの蛍光染料が各ブリスターに供給されてよく、あるいは一連の希釈の最後で得られた不完全なＰＣＲマスターミックスに付加されてよいが、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓは単に例示的なものであり、当技術分野で知られる他の染料が使用可能であることを理解されたい。別の態様では、各特定の単位複製配列のための乾燥蛍光性標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、それぞれの乾燥プライマーと共に第２段階の各ブリスターにそれぞれ供給されてよい。さらに、ポーチ１０は、雑菌混入を減らすためにすべての反応及び操作を収容するように設計されるが、ある状況においては、次の分析を行うために増幅生成物を各ブリスター８２から除去することが望ましい場合もある。当技術分野で知られている第２段階の単位複製配列を検出するための別の手段は、本発明の範囲内にある。試料がブリスター８２に移動されると、ピンチ弁８４及び８６が作動してブリスター８２を封鎖する。このとき、各ブリスター８２は、特定の標的の増幅のために必要なすべての試薬を収容する。例示的には、各ブリスターは、固有の１対のプライマーを収容してよく、あるいは、複数のブリスター８２は、複数の複製増幅をもたらすために複数の同一のプライマーを収容してよい。
【００３４】
本明細書で開示する態様は、第２段階の増幅のためのブリスターを使用しており、これらのブリスターは、他の可撓性部分と同一又は類似のプラスチックフィルムで形成されていることを留意されたい。しかし、多くの態様において、第２段階のブリスターの中身は第２段階のブリスターから決して除去されないので、したがって、第２段階の反応が可撓性ブリスター内で行われる必要はない。第２段階の反応は、ブリスターに流体接続された複数の剛性チャンバ、半剛性チャンバ、又は可撓性チャンバ内で行われてよいことを理解されたい。この実施例では、チャンバは、チャンバを連結する可撓性チャネルに圧力を印加することによって密閉されることができ、あるいは、他の方法により、例示的には熱封着又は一方向弁の使用により、密閉されてよい。本明細書で考察する種々の態様は、廃物を集めるために単独で設けられたブリスターを含む。廃物は完全には除去されないので、廃物は、剛性チャンバ、半剛性チャンバ、あるいは可撓性チャンバ内に集められることができる。
【００３５】
第１段階の増幅で使用されたプライマーと同一のプライマーを用いて第２段階の増幅を行うことは本発明の範囲内にある（米国特許第６６０５４５１号明細書を参照されたい）。しかし、第１段階の生成物に内在するプライマーを第２段階の反応で利用することがしばしば有利であり、それにより、第１段階及び第２段階のプライマーの結合部位の間で重なり合う部分がなくなる又は最小限になる。第１段階の生成物の希釈は、主に、元の鋳型ＤＮＡ及び第１段階の試薬の第２段階の反応に対する寄与を排除する。さらに、例示的には、第１段階で使用されるプライマーよりも高い溶解温度を有する第２段階のプライマーが、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）増幅を強めるために使用されてよい。例示的には、第２段階の生成物は、約１００から約１４０の間の塩基対であり、溶解温度値が６５℃＋／−２℃である。溶解温度が約６５℃であることにより、有効な２の温度での増幅が可能になる。第２段階の増幅では、０〜５秒間に対しての９４℃が１５秒間に対しての６５℃に移行する例示的なパラメータが予想される。プライマーは、著しいヘアピン形状、ヘテロ／ホモ二量体、及び望ましくないハイブリダイゼイーションを避けるように設計されてよい。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）フォーマットのために、第２段階のプライマーは、単一のステップでゲノムＤＮＡからの標的を増幅させるのに使用されるプライマーよりはるかに有害性のある相互作用に耐性がある。場合によっては、ホットスタートが第２段階の増幅で使用される。
【００３６】
蛍光染料が、例示的には当技術分野で知られているｄｓＤＮＡ結合染料として又は蛍光性プローブの一部として第２段階の増幅に含まれる場合、提供された光学素子が、１つ又は複数の試料の増幅を監視するために使用されてよい。場合によっては、増幅曲線の形状の分析が、各試料が陽性又は陰性であるかを識別するために行われてよい。試料を識別する例示的な方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６７３０５０１号明細書で考察されている。別法として、交差閾値を利用した方法が使用されてよい。コンピュータが、機器の外部又はその中に設けられてよく、この方法を実施するために、並びに第２段階の増幅の有無に基づいて試料が陽性又は陰性であるかを識別するために構成されてよい。しかし、当技術分野で知られている他の方法が各試料を識別するために使用されてよいことを理解されたい。他の分析は、蛍光性情報をもとに行われてよい。そのような１つの非限定的な実施例は、溶解曲線分析を使用して、単位複製配列に固有の溶解特性（例えば、溶解温度、溶解プロファイル形状）を示すことである。提供された光学素子が、一度にすべてのブリスター８２の画像を捕らえるように構成されてよく、あるいは個々の光学素子が個々のそれぞれブリスター用に提供されてよい。他の構成は本発明の範囲内にある。
【００３７】
図５に代替のポーチ１１０を示す。この態様では、種々の試薬が付属部品１９０を介してポーチ１１０内に送られる。図５ａに、１つ又は複数のプランジャ１６８を有する付属部品１９０の断面を示す。図５ａは、図５に示した態様の入口チャネル１１５ａを通る断面を示すが、１２個の入口チャネルが存在しており（入口チャネル１１５ａから１１５ｌ）、これらのそれぞれが、付属部品１９０内で使用される独自のプランジャ１６８を有してよいが、この特定の構成では、入口チャネル１１５ｃ、１１５ｆ及び１１５ｉは使用されていない。１２個の入口チャネルを有する構成は単に例示的なものであり、任意の数の入口チャネル及び関連するプランジャが使用されてよいことを理解されたい。この例示的な態様では、付属部品１９０の場合によっては真空ポート１４２は、付属部品１９０の第１の表面１９４通ってチャンバ１９２と連結するように形成される。場合によっては真空ポート１４２は、真空又は真空チャンバ（図示せず）と連絡するように設けられてよく、ポーチ１１０内から空気を引き出してチャンバ１９２及び種々のブリスター、並びにポーチ１１０のチャンバ内に真空を生成する。次に、プランジャ１６８は、真空ポート１４２を密閉するためにチャンバ１９２内に十分な距離で挿入される。チャンバ１９２は、例示的には所定の量の真空下に設けられ、それを使用して所望の量の流体がチャンバ１９２内に引き込まれる。チャンバ１９２の調整に関する追加の情報は、既に参照によって組み込まれている米国特許出願１０／５１２２５５で見られる。
【００３８】
例示的な付属部品１９０は、付属部品１９０の第２の表面１９５に形成された注入ポート１４１をさらに含む。例示的には、注入ポート１４１は、図５ａに示すように、真空ポート１４２より、ポーチ１１０のプラスチックフィルム部分のさらに近傍に配置され、プランジャ１６８が、真空ポート１４２を密閉するのに十分な距離まで挿入されるが、一方で、注入ポート１４１を介してのチャンバ１９２への進入は可能なままである。図示のように、プラスチックフィルム部分１１７の第２の表面１１９は、チャンバ１９２と周囲空気との注入ポート１４１を介した連絡を防止するための貫通可能なシール１３９を備える。しかし、第２の表面１１９は、場合によっては、注入ポート１４１まで延在しなくてもよく、他の種々のシールが使用されてよいことを理解されたい。さらに、シールに対して、例えば、付属部品１９０の第１の表面１９４上といった別の配置が所望される場合、注入ポート１４１は付属部品１９０上のその位置にチャネルを有してよい。参照によって既に組み込まれている米国特許出願１０／５１２２５５に種々の構成が示されており、これらでは、シールは注入ポートから遠く離れて配置され、シールはチャネルを介してチャンバに連絡している。米国特許出願１０／５１２２５５はまた、種々の構成を示しており、これらでは、チャネルが単一のシールと複数のチャンバとを連結させている。単一の注入ポートと複数のチャンバとの連結と共にシール配置の変更は、本発明の範囲内にある。場合によっては、シール１３９は脆性であり、カニューレ（図示せず）が挿入されると破られてよく、それにより、流体試料がカニューレの中からチャンバ１９２内へと引き込まれるあるいは押し出されてよい。
【００３９】
ポーチ組立体１１０の例示的なプランジャ１６８は、円筒形状であり、直径が約５ｍｍであり、チャンバ１９２内に圧入されてよい。プランジャ１６８は、第１の端部１７３及び反対側の第２の端部１７５を含む。図５ａに示すように、プランジャ１６８のノッチ１６９が、第２の端部１７５内に形成される。使用においては、第２の端部１７５は、チャンバ１９２内へ途中まで挿入され、ノッチ１６９が注入ポート１４１に位置合わせされ、これにより、プランジャ１６８がかなり十分に挿入されてさらにさもなければプランジャ１６８が注入ポート１４１を塞ぐことになる場合でも、流体試料がチャンバ１９２内に引き込まれるあるいは注入されることが可能になる。
【００４０】
例示的には、流体は、注入ポート１４１内に挿入されてその中のシール１３９を穿刺することができるカニューレが挿入された先端を含む注射器を有する容器（図示せず）内に入れられる。空気が抜かれたポーチ組立体１１０を使用する場合、シール１３９が穿刺されたとき、流体が、チャンバ１９２内が周囲気圧に対しての負圧であるために容器から引き出される。次に、流体は、ポート１４１を通ってチャンバ１９２を満たす。このとき、流体は、通常、ポーチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７内へ流れない。最後に、プランジャ１６８がチャンバ１９２内に挿入されて、プランジャ１６８の第２の端部１７５がチャンバ１９２の底部１９１に接近して、調整された量の試薬又は試料をプラスチックフィルム部分１１７内へ押し込める。図示のように、プランジャ１６８は、完全に挿入されたときに、第２の端部１７５がチャンバ１９２の底部１９１に接触しないように構成される。残りの空間は、気泡を抜き出すのに有用であり、これにより、プラスチックフィルム部分１１７に入る気泡の数を減少させる。しかし、いくつかの態様では、プランジャ１６８が完全に挿入されたときに、第２の端部１７５が底部１９１に接触することが望ましい場合がある。図５に示す態様では、入口チャネル１１５ａ、１１５ｂ、１１５ｄ、１１５ｅ、１１５ｇ、１１５ｈ、１１５ｊ、１１５ｋ、及び１１５ｌのすべてが反応領域又はリザーバブリスターにつながっている。入口チャネル１１５ａに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試料が３箇所突出ブリスター１２２内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｂに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０１内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｄに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０２内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｅに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０３内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｇに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０４内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｈに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０５内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｊに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０６内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｋに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０７内へ押し込まれ、入口チャネル１１５ｌに連結されたプランジャが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター１０８内へ押し込まれることを理解されたい。
【００４１】
図５ａに示す態様で示されるように、ノッチ１６９を含むプランジャの設計が使用された場合、プランジャ１６８は、下げられる前に回転させられてよく、ノッチ１６９をオフセットして、チャンバ１９２との連絡から注入ポート１４１を封鎖して、その中の中身を密閉する。これは、注入ポート１４１を通って周囲空気までの流体の任意の潜在的な逆流を最小限にするように作用し、これは、プランジャを完全に挿入することを遅らせることが望ましい時は特に有用である。ノッチ１６９は、プランジャ１６８に関連して上で示されて説明されたが、例えば、チャンバ１９２の底部へのプランジャ１６８の押し下げ、熱融着、一方弁、又は、自己密封式ポートなどの他の手段により流体試料をチャンバ１９２内に分配した直後に注入ポート１４１を封鎖することは、本開示の範囲内にある。密閉方法として熱融着が使用される場合、シールバーが機器内に含まれてよく、ポーチが機器内に挿入されるとすべてのチャンバが熱融着される。
【００４２】
例示的な方法では、使用者が、入口チャネル１１５ａに連結された注入ポート１４１に試料を注入して、他の種々の注入ポートに水を注入する。水は、それぞれの入口チャネル１１５ｂ、１１５ｄ、１１５ｅ、１１５ｇ、１１５ｈ、１１５ｊ、１１５ｋ、及び１１５ｌに連結するチャンバ１９２内であらかじめ凍結乾燥された試薬を再水和する。水は、１つの単一シールを通って注入されることができ、以下で図６に示すように、チャネルを介してそれぞれのチャンバに分配され、あるいは、水は、それぞれのチャンバに独立して注入されることができる。別法として、乾燥された試薬を再水和するために水を注入する以外に、溶解試薬、核酸抽出試薬、及びＰＣＲ試薬などの湿性の試薬が、付属部品１９０の適切なチャンバ１９２内に注入されてもよい。
【００４３】
入口チャネル１１５ａに連結されたプランジャ１６８が作動すると、試料は、チャネル１１４を介して３箇所突出ブリスター１２２に直接送られる。使用者はまた、残りのプランジャ１６８を押して、付属部品１９０のチャンバ１９２のそれぞれから中身を押し出して１０８を介してリザーバブリスター１０１に入れる。この時点で、ポーチ１１０は、処理用の機器内に装入される。図８に示す機器８００は、図６のポーチ２１０用に構成されているが、機器８００のブラダの構成の修正形態が、機器８００を、ポーチ１１０又は他の構成のポーチと共に使用するのに適したものにすることを理解されたい。
【００４４】
例示的な一実施例では、プランジャ１６８が押し下げられると、この時点でリザーバブリスター１０１が、イソプロパノール内にＤＮＡ結合磁気ビーズを収容し、この時点でリザーバブリスター１０２が、第１の洗浄溶液を収容し、この時点でリザーバブリスター１０３が、第２の洗浄溶液を収容し、この時点でリザーバブリスター１０４が、核酸溶離緩衝液を収容し、この時点でリザーバブリスター１０５が、第１段階の多重化プライマーを含む第１段階ＰＣＲ試薬を収容し、この時点でリザーバブリスター１０６が、プライマーがない第２段階のＰＣＲ試薬を収容し、この時点でリザーバブリスター１０７が、プライマーがなく鋳型がない陰性対照ＰＣＲ試薬を収容し、この時点でリザーバブリスター１０８が、鋳型を含む陽性対照ＰＣＲ試薬を収容する。しかし、これらの試薬は単に例示的なものであり、所望される反応及び最適条件に応じて別の試薬が使用されてよいことを理解されたい。
【００４５】
ポーチ１１０が機器８００内に配置され、試料が３箇所突出ブリスター１２２に移動されると、試料は、ＺＳ又はセラミックビーズなどの溶解粒子を用いて試料をかき混ぜることにより分裂させられてよい。溶解粒子は、３箇所突出ブリスター１２２に供給されてよく、あるいは、試料と共に３箇所突出ブリスター１２２内に注入されてよい。図５の３箇所突出ブリスター１２２は、図１の３箇所突出ブリスター２２と全く同じ方法で作動されて、２つの下側ローブ１２４、１２６が一体で圧力を受けて、圧力が上側ローブ１２８と２つの下側ローブ１２４、１２６の間で交互にかかる。しかし、図示のように、下側ローブ１２４、１２６は、下側ローブ２４、２６よりかなり丸みがあり、それにより、チャネル１３０までのビーズの流れが円滑になって、連結部３２で三角形の流れ分離部がなくても高速衝突が可能になる。３箇所突出ブリスター２２と同様に、図５の３箇所突出ブリスター１２２では、試料内の微生物、細胞、及びウィルス粒子の効果的な溶解又は破壊が見込まれる。約３〜４ｍｍの幅の、例示的には約３．５ｍｍの幅の、チャネル１３０は、溶解の間で比較的ビーズが少ないままであり、高速衝突を行うには効果的であることが分かっている。
【００４６】
溶解後、核酸結合磁気ビーズは、リザーバブリスター１０１に面して配置されたブラダに圧力をかけることにより、チャネル１３８を介して上側ローブ１２８内に注入される。磁気ビーズが、例示的には溶解の間よりも穏やかに３箇所突出ブリスター１２２の中身と混合され、溶液が例示的には約１分間インキュベートされると、核酸がビーズと結合することが可能になる。
【００４７】
次に、溶液がチャネル１４３を介して「８の字形」のブリスター１４４内に送り込まれて、そこで、ビーズが、機器内に収容された例示的には空気圧で駆動される引込み式の磁石によって捕捉される。ビード捕捉処理は、ビード切削装置１２２のすべてのローブ１２４、１２６及び１２８を加圧することにより開始される。これにより、１２２の液体の中身の大部分がチャネル１４３を通してブリスター１４４に押し込まれる。磁石は、ブリスター１４４の下側部分１４４ｂと接触するように導かれて試料が数秒間インキュベートされると、磁石が溶液からビーズを捕捉することが可能になり、次に、ブリスター１２２に隣接するブラダが減圧されて、ブリスター部分１４４ａ及び１４４ｂに隣接するブラダが減圧されて、液体がブリスター１２２内に押し戻される。１回の移動ですべてのビーズが捕捉されるわけではないので、この処理は、ブリスター１４４内の実質的にすべてのビーズを捕捉するために１０回まで繰り返されてよい。次に、液体はブリスター１４４から押し出されて、磁気ビーズと捕捉された核酸のみが残り、２回の連続する洗浄で洗浄試薬がブリスター１４４内に導入される（それぞれ、リザーバブリスター１０２及び１０３からチャネル１４５及び１４７を介して）。各洗浄で、洗浄試薬を収容するリザーバブリスターに面して配置されたブラダが加圧されて、ブリスター１４４へ中身を押し込む。磁石が収納されると、磁気ビーズを含むペレットが、ブリスター１４４のそれぞれのローブ１４４ａ及び１４４ｂを覆う２つのブラダにそれぞれ交互に加圧することにより分裂させられる。上側ローブ１４４ａが圧縮されると、液体成分は下側ローブ１４４ｂに押し込まれて、下側ローブ１４４ｂが圧縮されると、中身は上側ローブ１４４ａに押し込まれる。上側ローブ１４４ａと下側ローブ１４４ｂと間でブリスター１４４内の溶液を混ぜることにより、磁気ビーズの不純物は効果的に洗浄される。かき混ぜが不十分である間は均衡が維持され、ビーズのペレットはかき乱されることはなく、過度にかき混ぜると、ビーズの表面から核酸を洗浄してしまい、洗浄試薬と共にそれらが失われてしまう可能性がある。それぞれの洗浄サイクル後に、磁気ビーズはブリスター１４４内の磁石を介して捕捉され、洗浄試薬が、例示的には次いで廃物用容器として働く３箇所突出ブリスター１２２内に押し込まれる。しかし、使用されたリザーバブリスターが廃物用容器として働いてもよく、あるいは、他のブリスターが廃物用容器として特定に設けられてもよいことを理解されたい。
【００４８】
次に、リザーバブリスター１０４からの核酸溶離緩衝液が、チャネル１４９を介してブリスター１４４内に注入されて、試料が再度かき混ぜられて、磁石の使用により磁気ビーズが再捕捉される。ここでは、ブリスター１４４内の流体混合物は、元の試料からの核酸を含んでいる。ブリスター１４４にかかる圧力が、核酸試料をチャネル１５２を介して第１段階のＰＣＲブリスター１６１に移動させて、そこで、試料が複数のプライマーセットを含む第１段階のＰＣＲマスターミックスに混合される。このＰＣＲマスターミックスはリザーバブリスター１０５からチャネル１６２を介して供給される。所望される場合、試料及び／又は第１段階のＰＣＲマスターミックスは混合の前に加熱されてよく、この場合ホットスタートの利点をもたらされる。以下に示すように、図５のポーチ１１０は１０個までのプライマーセット用に構成されているが、この構成が変更されて任意の数のプライマーセットが使用されてよいことを理解されたい。ブリスター１６１に面して配置されたブラダが低圧力で加圧されて、ブリスター１６１の中身が、ブリスター１６１の他の面上に密接に接触している例示的にはペルチェ素子の加熱／冷却素子内に押し込まれる。ブリスター１６１にかかる圧力は、加熱／冷却素子との適切な接触を確実なものにするために十分であるべきであるが、ブリスター１６１から流体が押し出されないように十分に穏やかでべきである。加熱／冷却素子は、例示的には約６０℃から約９５℃の間で温度サイクルされる。例示的には、温度サイクルは、約１５〜２０サイクルで行われて、存在する１つ又は複数の核酸標的の増幅が行われる。また、例示的には、温度サイクルはプラトー期の前に終了し、さらに、対数期中あるいは対数期前に終了してよい。一実施例では、最小レベルの検出に達することなく、単に試料の所望の単位複製配列を多くすることが望ましい場合もある。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６６０５４５１号明細書を参照されたい。
【００４９】
次に、増幅された試料は、場合によっては、試料の大部分をチャネル１５２を介してブリスター１４４に押し戻すことにより希釈され、ブリスター１６１内に少量（例示的には約１〜５％）の増幅された試料だけを残して、第２段階のＰＣＲマスターミックスがリザーバブリスター１０６からチャネル１６３を介して供給される。試料は、例示的にはチャネル１６３を介してブリスター１０６と１６１との間を往復させられることにより完全に混合される。所望の場合、反応混合液は第２段階の増幅の前に加熱されてよい。次に、試料はチャネル１６５を通して第２段階の増幅領域１８０の中心にある低容積ブリスター１８２のアレイ内に押し込まれる。例示的には１０個の低容積ブリスター１８２のそれぞれが、異なるプライマー対を含んでよく、第１段階の増幅のプライマー対の１つと本質的に同じである、あるいは、縮められた単位複製配列を増幅するための第１段階のプライマー対の中でネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）されたもののいずれかである。この時点で試料によって水和されるプライマーは増幅混合液を完成させる。また、陽性及び陰性対照試料が、リザーバブリスター１０７及び１０８の中身をそれぞれ加圧することにより導入されて、標的ＤＮＡのないＰＣＲマスターミックスをチャネル１６６を介してリザーバブリスター１０７から押し出す、あるいはコントロールＤＮＡのあるＰＣＲマスターミックスをチャネル１６７を介してリザーバブリスター１０８から押し出す。図示のように、５つのそれぞれの陽性対照ブリスター１８３及び陰性対照ブリスター１８１があり、これらは２倍に多重化されてよく、第２段階の異なる１０回の増幅反応のために必要なコントロールを実現する。この構成は単に例示的なものであり、任意の数の第２段階のブリスターが提供されてよいことを理解されたい。
【００５０】
例示的には、第２段階の増幅に使用されるＰＣＲマスターミックスにはプライマーが不足しているが、それは別の方法でそろえることができる。しかし、「不完全な」ＰＣＲマスターミックスは他のＰＣＲ成分も不足している場合がある。一実施例では、第２段階のＰＣＲマスターミックスは水及び緩衝液のみであり、これは、次に、場合によっては希釈された第１段階のＰＣＲ増幅生成物と混合される。この混合液は、残りの成分のすべてがあらかじめ供給されている小容量のＰＣＲ反応ブリスターに移動させられる。所望の場合、残りの成分のすべては一体に混合されてよく、単一の混合液として小容量のＰＣＲ反応ブリスター内にスポッティングされてよい。別法として、図５ｂに示すように、この成分のそれぞれが、小容量のＰＣＲ反応ブリスター１８２の分離した領域にスポッティングされてよい。図５ｂに示すように、例示的には、ｄＮＴＰがスポッティングされる領域１８２ａ、プライマーがスポッティングされポリメラーゼがスポッティングされる領域１８２ｃ、マグネシウム化合物がスポッティングされる領域１８２ｄの４つの領域が存在する。成分を分離してスポッティングして、成分を水和する前に試料混合液を加熱することにより、非特異反応を最小限に抑えることができる。任意の組合せの成分がこのようにしてスポッティングされることができ、ブリスターの１つ又は複数の領域内に成分をスポッティングするこの方法は、本発明の任意の態様と共に使用されてよいことを理解されたい。
【００５１】
小容量のＰＣＲ反応ブリスター１８１、１８２及び１８３まで通じるチャネル１６５，１６６及び１６７は密閉されて、空気圧式ブラダが、サーマルサイクルのために、例示的にはペルチェ素子の加熱／冷却素子に対するアレイに弱い圧力を与える。サイクルパラメータは、第２段階のサーマルサイクル用に独立して設定されてよい。例示的には、反応は、例示的には青色光（４５０〜４９０ｎｍ）の励起光源の焦点をアレイ上に合わせ、例示的には５１０ｎｍを超えて得られる蛍光発光を撮像することにより監視される。
【００５２】
上記実施例では、ピンチ弁は考察されていない。しかし、１つのブリスター内に試料を収容することが望ましい場合は、特定のブリスターまで通じてさらにそこから延びているチャネルに面して配置される空気圧式アクチュエータが加圧されて、ピンチ弁を形成してチャネルを封鎖することを理解されたい。逆に、１つのブリスターから試料を移動させることが望ましい場合は、適切な空気圧式アクチュエータが減圧されて、試料がチャネル内を流れるのを可能にする。
【００５３】
上記の図５のポーチは、１０８が通る試薬リザーバブリスター１０１を含み、使用者は、例示的にはポーチ１１０を機器に挿入する前に、ポーチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７内の１０８を通して付属部品１９０から試薬リザーバブリスター１０１に試薬を注入する。図５の試薬リザーバブリスターを使用することは、種々のブリスターの中身を異なる温度に維持することができることを含む利点を有するが、他にいくつかの不利な点もある。操作者が、付属部品１９０から１０８を通してリザーバブリスター１０１まで試薬を移動させることに関与することで、さらに、これが、このときにピンチ弁を作動させることなく機械の外部でしばしば行われることから、試薬が、時々、リザーバブリスターから作動中のブリスターに漏れる場合がある。リザーバブリスター内の試薬は、生成及び装填の間に露出される。それらが、圧力を受けたり、圧迫を受けたり、あるいはさらに軽い衝撃を受けた場合、試薬は有効なチャネルを通って漏れる可能性がある。試薬の損失がかなりの量の場合、反応は完全に失敗する可能性がある。さらに、作動中に、１０８を通ってリザーバブリスター１０１から押し出される試薬の量に変化の可能性があると、矛盾した結果につながる。付属部品１９０への試薬の導入及び付属部品１９０から１０８を通って試薬リザーバブリスター１０１までの試薬の移動の自動化は、これらの問題の多くを解決し、さらに、これは本発明の範囲内にある。
【００５４】
図６のポーチ２１０は、直接噴射手法の使用により、違った方法でこれらの多くの問題に対処し、この手法では、機器自体が例示的には空気圧式ピストンを介してプランジャ２６８を動かし、試薬が必要とされるときに、試薬を種々の作動中のブリスター内に押し込む。図５の１０８を通してリザーバブリスター１０１内の試薬を保管するのではなく、図６の態様では、試薬は、付属部品２９０の種々のチャンバ２９２内へ導入されて、必要になるまでそこに維持される。適切な時間のピストン２６８の空気圧式による作動により、調整された量の試薬を適切な反応ブリスターに導入される。上記の多くの問題に対処することに加えて、ポーチ２１０は、よりコンパクトな形状を有し、それにより小型の機器設計が可能になり、さらにポーチ２１０はより短いチャネルを有し、それにより良好な流体の流れが可能になりチャネル内での試薬の損失が最少になる。
【００５５】
図６の例示的な一態様では、試験される試料（１００μｌ）及び溶解緩衝液（２００μｌ）を含む３００μｌの混合液が注入ポート２４１ａ内に注入される。水もシール２３９ｂを介して付属部品２９０に注入され、最大１１個までの異なる試薬を水和し、それらのそれぞれは、チャネル２９３（斜線で図示）を介して２９２ｌを通じてチャンバ２９２ｂ内に乾燥形態であらかじめ供給される。これらの試薬は、例示的には、乾燥凍結ＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、免疫測定試薬、又は他の化学物質を含んでよい。図６の実施例では、試薬は、核酸抽出、第１段階の多重化ＰＣＲ、多重反応の希釈、第２段階のＰＣＲ試薬の精製、及びコントロール反応用である。図６に示す態様では、注入される必要があるすべてのものは、ポート２４１ａ内の試料及びポート２４１ｂ内の水である。
【００５６】
図６に示すように、シール２９３ｂを介して注入される水が、チャネル２９３を介して種々のチャンバに分配される。この態様では、試料及び水だけがポーチ２１０内へ注入される必要がある。しかし、水は独立して各チャンバ２９２内に注入されることができることを理解されたい。さらに、種々のチャンバ２９２に乾燥試薬を供給して水の注入により水和するのではなく、特定の湿った試薬が、必要に応じてそれぞれのチャンバに注入されることができることを理解されたい。加えて、１つ又は複数のチャンバ２９２は水のみが供給され、必要な試薬は乾燥されて適切な反応ブリスター内に供給されてよいことを理解されたい。特定の反応の必要性によって必然的に決定される上記種々の組合せは、本発明の範囲内にある。
【００５７】
図６に示すように、場合によっては突出部２１３は、付属部品２９０の底表面２９７に設けられる。図示のように、突出部２１３は、それらのそれぞれの入口チャネル２１５内に配置される。しかし、他の構成が可能である。突出部２１３は、入口チャネル２１５を開くのを助け、プランジャ２６８が押し下げられたときには、入口チャネル２１５をはさんで底表面２９７が別の平面と係合するのを防止して、プランジャ２６８の作動による逆流を防止するのを助ける。この突出部は、本発明のよる任意の種々のポーチ上で使用されてよい。
【００５８】
水がポーチ内に注入されて付属部品内の複数のチャンバ内の複数の乾燥試薬を水和をする態様では、注入ポートと多くのチャンバとの間のチャネルを閉じる手段が所望される。チャネルが閉じないと、各プランジャの作動によりそれらそれぞれのチャンバの中身の一部がチャネル内へと押し戻されて、可能性として近傍のチャンバを汚染して、チャンバ内に含まれそこから送出される量が変更される場合がある。上記のように切り欠きのあるプランジャ２６８を回転させると、チャネルを覆うプラスチックフィルムを熱封着してそれによりチャネルを恒久的に閉じることと、ピンチ弁としてチャネルに圧力を印加することとを含むこのチャネルを閉じるいくつかの方法が使用されている。例示的には一方向弁といった付属部品内に形設される弁などの他の閉鎖方法も使用されてよい。
【００５９】
流体がチャンバ２９２内に装填されて、ポーチ２１０が機器内に装入される後で、プランジャ２６８ａが、例示的には空気圧式ピストンの作動を介して押し下げられて、試料のバランス（ｂａｌａｎｃｅ）をチャネル２１４を介して３箇所突出ブリスター２２０内へ押し込む。図１及び５に示す態様のように、３箇所突出ブリスター２２０のローブ２２４、２２６、及び２２８は、図７〜９に示すブラダ組立体８１０の作動ブラダ８２４、８２６及び８２８を介して順番に圧縮されて、ローブの間の狭い連結部２３２を通して流体を押し込んで、高速で衝突させて、試料をせん断して、例示的には、開くことが困難な胞子、バクテリア及び菌類からの核酸を含む核酸を遊離させる。細胞溶解は適切な時間続き、例示的には０．５〜１０分間続く。
【００６０】
細胞が十分に溶解されると、プランジャ２６８ｂが作動されて、チャンバ２９２ｂ内に保管される核酸結合磁気ビーズがチャネル２３６を介して３箇所突出ブリスター２２０の上側ローブ２２８内に注入される。試料は磁気ビーズと混合されて、混合液が適切な時間インキュベートされることが可能になり、例示的には約１０秒から１０分インキュベートされる。
【００６１】
試料及びビーズの混合液が、ブラダ８２６の作用を介してチャネル２３８を通してブリスター２４４内へ押し込まれて、次に、ブラダ８４４の作用を介してチャネル２４３を通してブリスター２４６内に押し込まれ、そこでは、図８に示すように機器８００内にブリスター２４５に隣接して配置された引込み式の磁石８５０が、溶液から磁気ビーズを捕捉して、ブリスター２４６の内側表面に対してペレットを形成する。次に、ブリスター２４６に面して配置される空気圧式ブラダ８４６が、ブリスター２４６から流体を押し出してブリスター２４４を通してここでは廃物用容器として使用されるブリスター２２２内へ戻す。しかし、図５に関連して上で考察したように、他の廃物用容器も本発明の範囲内にある。プランジャ２６８ｃ、２６８ｄ、及び２６８ｅの１つが作動されて、チャネル２４５を介してブリスター２４４に洗浄溶液を供給して、次に、チャネル２４３を介してブリスター２４６に供給してよい。場合によっては、磁石８５０が収納されて、磁気ビーズが、ブラダ８４４及び８４６に交互に加圧することにより、ビーズをブリスター２４４と２４６との間でチャネル２４３を介して往復して移動させられることにより洗浄される。磁気ビーズが洗浄されると、磁気ビーズは磁石８５０の作動によりブリスター２４６内で再捕捉されて、次に、洗浄溶液がブリスター２２２に移動させられる。この処理は、核酸結合磁気ビーズから溶解緩衝液及び試料破片を洗い出すために必要なだけ繰り返されてよい。例示的には、３回の洗浄が行われ、それぞれの１回に、チャンバ２９２ｃ、２９２ｄ、及び２９２ｅ内の試薬を使用する。しかし、より多くの又は少ない回数の洗浄も本発明の範囲内にあることを理解されたい。より多くの洗浄が所望される場合、より多くのチャンバ２９２が提供されてよい。別法として、各チャンバ２９２がより大量の流体を保持し、プランジャの作動により、各作動においてチャンバからわずかな量だけが押し出されるようにしてよい。
【００６２】
洗浄後、チャンバ２９２ｆに保管される溶離緩衝液が、チャネル２４７を介してブリスター２４８に移動させられて、磁石が収納される。溶液は、チャネル２５２を介してブリスター２４６と２４８との間を循環させられて、ブリスター２４６内の磁気ビーズのペレットが壊されて、捕捉された核酸がビーズから解離して溶液に入ることが可能になる。磁石８５０が再び作動して、ブリスター２４６内の磁気ビーズを捕捉して、溶離された核酸溶液がブリスター２４８内に押し込まれる。
【００６３】
プランジャ２６８ｈが押し下げられると、チャンバ２９２ｈからの第１段階のＰＣＲマスターミックスが、ブリスター２４８内の核酸試料と混合される。場合によっては、その混合液は、ブラダ８４８及び８６４の交互の作動によりチャネル２５３を介して２４８と２６４との間を移動させられて混合される。数サイクルの混合の後、溶液はブリスター２６４内に収容されて、そこで、第１段階の多重化ＰＣＲが行われる。所望の場合、混合の前に、試料はブリスター２４６内に保持されてよく、一方、例示的には第１段階のＰＣＲマスターミックスをブリスター２６４内に移動させることにより、あるいはブリスター２４８に隣接して加熱器を設けることにより、第１段階のＰＣＲマスターミックスは予熱される。上で考察したように、この予熱により、ホットスタートＰＣＲの利点がもたらされ得る。図８に示す機器８００は、試料を加熱／冷却するペルチェベースのサーマルサイクル８８６及び８８８を特徴とする。しかし、上で考察したように他の加熱／冷却装置が使用されてよいことを理解されたい。温度サイクルは、例示的には１５〜２０サイクル行われるが、上で考察したように、用途に応じて、他のレベルの増幅が所望されてもよい。以下に示すように、第２段階の増幅領域２８０は、１８回の第２段階の反応で増幅を検出するように構成される。したがって、１８個の異なるプライマー対が、ブリスター２６４内でのＰＣＲ反応に含まれてもよい。
【００６４】
第１段階のＰＣＲが所望の回数のサイクルを進行した後、試料は、図５の態様について上で考察したように、試料の大部分をブリスター２４８に押し戻すことによって希釈されてよく、少量のみが残り、チャンバ２９２ｉから第２段階のＰＣＲマスターミックスが付加される。別法として、２９２ｉからの希釈緩衝液が、チャネル２４９を介してブリスター２６６に移動させられてよく、次に、流体がブリスター２６４と２６６の間を往復して移動させられることによりブリスター２６４内の増幅された試料と混合される。混合後、希釈された試料の一部はブリスター２６４内に残り、この時点では廃物用容器の３箇所突出ブリスター２２２へ押し出される。所望の場合、チャンバ２９２ｊ及び２９２ｋからの希釈緩衝液を使用し、次いで、チャンバ２９２ｇからの第２段階のＰＣＲマスターミックスを増幅された希釈試料の一部又はすべてに付加することにより、希釈は数回繰り返されてよい。希釈のレベルは、希釈ステップの回数を変更することにより、あるいは、希釈緩衝液又は第２段階のＰＣＲマスターミックスとの混合の前に廃棄される試料の割合を変更することにより調整されることができることを理解されたい。所望の場合、試料と第２段階のＰＣＲマスターミックスとの混合液は、第２段階の増幅用の第２段階のブリスター２８２に移動させられる前にブリスター２６４内で予熱されてよい。
【００６５】
例示的な第２段階のＰＣＲマスターミックスは不完全であり、プライマー対が欠けており、１８個の第２段階のブリスター２８２のそれぞれには、特有のＰＣＲプライマー対があらかじめ装填される。所望の場合、第２段階のＰＣＲマスターミックスは、他の反応成分を欠いてよく、この場合、これらの成分も、第２段階のブリスター２８２内で予熱されてよい。前の実施例を用いて上で考察したように、各プライマー対は、第１段階のＰＣＲプライマー対と同一でよく、あるいは、第１段階のプライマー対内に組み込まれてよい。ブリスター２６４から第２段階のブリスターへの試料の移動により、ＰＣＲ反応混合物が完成する。チャンバ２９２ｌからのコントロール試料も、チャネル２６７を介してコントロールブリスター２８３に移動させられる。コントロール試料は、必要に応じて陽性対照又は陰性対照でよい。例示的には、各ポーチは、この処理の各ステップの作用を有効にし、あらかじめ増幅された核酸の自己汚染からの陽性結果ではないことを実証するコントロール反応を含む。しかし、これは、多くのプロトコルにおいて、特に高次の多重反応において、実用的でない。適切な制御を実現する１つの例示的な方法には、試料にパン酵母などの種を加えることが含まれる。当該の核酸が他の核酸と共に酵母から抽出される。第１及び第２段階のＰＣＲ反応は、酵母ゲノムからのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ標的を増幅させる。例示的には、接合された前駆体ｍＲＮＡから生まれるｍＲＮＡ配列は、イントロンをつなぐプライマー配列を配置することによりＲＮＡ特異標的配列を生成するために使用されることができる。参照標準に対する酵母コピー数の定量分析により、システムの各成分が働いていることを実質的に確認することが可能になる。それぞれの多くの第２段階のアッセイに対する陰性対照反応は、より問題である。コントロール反応を並行してあるいは独立してのどちらかで行うことが望ましい場合がある。
【００６６】
ブラダ組立体８１０のブラダ８８２の作動により、第２段階のブリスター２８２、２８３にそれぞれ試料が密閉され、ブラダ８８０の作動により、第２段階のブリスター２８２、２８３に弱い圧力がかかり、第２段階のブリスター２８２、２８３が加熱／冷却装置に接触させられる。窓８９７が、第２段階の増幅領域２８０に面して配置されて、ＰＣＲの間に及び反応生成物のＤＮＡの融解曲線分析の間にアレイを蛍光モニタリングすることが可能になる。
【００６７】
図６のポーチ２１０は、非密閉領域２５５、非密閉領域２５６などのいくつかの非密閉領域を有することに留意されたい。これらの非密閉領域は、この例示的な態様の任意の反応に関連しないブリスターを形成する。逆に、これらの非密閉領域は、作動中のブリスター及びチャネルの間の空間に設けられる。すべての非使用空間内が密閉されるポーチと比較して、２５５及び２５６などの非密閉領域が設けられている場合の方が漏れが少ないことが分かっており、これは、フィルム材料での問題のあるしわが減少することによると推測される。このような非密閉領域は任意のポーチの態様に設けられてよい。
【００６８】
図８に、ポーチ２１０と共に使用されることができる例示的な機器８００を示す。機器８００は、ケーシングの壁を形成することができるあるいはケーシング内に取り付けられることができる支持部材８０２を含む。機器８００はまた、支持部材８０２に対して移動可能であってよい第２の支持部材８０４を含み、これによりポーチ２１０の挿入及び引き抜きが可能になる。移動可能な支持部材８０４は、トラック上に取り付けられてよく、あるいは任意の種々の方法で支持部材８０２に対して移動させられてよい。例示的には、ポーチ２１０が機器８００内に挿入されると蓋８０５がポーチ２１０の上にはめ込まれる。
【００６９】
例示的には、ブラダ組立体８１０及び空気圧式弁組立体８０８が移動可能部材８０２に取り付けられて、一方、加熱器８８６及び８８８が支持部材８０２に取り付けられる。しかし、この構成は単に例示的なものであり、別の構成が可能であることを理解されたい。ブラダ組立体８１０及び空気圧式弁組立体８０８が移動可能支持部材８０４に取り付けられるとき、これらの空気圧式アクチュエータはポーチ２１０の向きに移動させられることができ、これらの空気圧式アクチュエータがポーチ２１０に接触して配置されるようになる。ポーチ２１０が機器８００内に挿入されるとき並びに移動可能な支持部材８０４が支持部材８０２に向けて移動させられるとき、ポーチ２１０の種々のブリスターが、ブラダ組立体８１０の種々の空気圧式ブラダ及び空気圧式弁組立体８０８の種々の空気圧式ピストンに隣接する位置にあり、これらの空気圧式アクチュエータの作動が、ポーチ２１０の１つ又は複数のブリスターから流体を押し出してよく、あるいはポーチ２１０の１つ又は複数のチャネルにピンチ弁を形成してよい。ポーチ２１０のブリスター及びチャネルと、ブラダ組立体８１０及び空気圧式弁組立体８０８の空気圧式アクチュエータとの関係は、図９及び１０に関連して以下でさらに詳細に考察する。
【００７０】
各空気圧式アクチュエータは１つ又は複数の空気圧式付属部品を有する。例えば、ブラダ組立体８１０のブラダ８２４は、空気圧式付属部品８２４ａを有し、空気圧式ピストン８４３は、それに連結する空気圧付属部品８４３ａを有する。例示的な態様では、ブラダ組立体８１０のそれぞれの空気圧式付属部品が、移動可能な支持部材８０４内の通路８１６を通って延在し、ホース８７８が弁８９９を介して各空気圧式付属部品と圧縮空気源８９５とを連結する。例示的な態様では、通路８１６は圧縮空気源８９５への進入路を設けるだけでなく、ブラダ組立体８１０の様々な構成要素の位置合わせをするのにも役立ち、それにより、ブラダがポーチ２１０のブリスターに正確に位置合わせされる。
【００７１】
同様に、空気圧式弁組立体８０８は、また、移動可能な支持部材８０４に取り付けられるが、他の構成が可能であることを理解されたい。例示的な態様では、空気圧式弁組立体８０８上のピン８５８が、移動可能な支持部材８０４の取付開口８５９内に取り付けられ、空気圧式ピストン８４３、８５２、８５３及び８６２が、移動可能な支持部材８０４内の通路８１６を通って延在し、ポーチ２１０に接触する。図示のように、ブラダ組立体は、移動可能な支持部材８０４の第１の側８１１に取り付けられるが、空気圧式弁組立体８０８は、移動可能な支持部材８０４の第２の側８１２上に取り付けられる。しかし、空気圧式ピストン８４３、８５２、８５３及び８６２が通路８１６を通って延在しているので、空気圧式弁組立体８０８の空気圧式ピストン及びブラダ組立体８１０の空気圧式ブラダは、一体に作動して、ポーチ２１０に対して必要な空気圧式アクチュエータを形成する。
【００７２】
上で考察したように、ブラダ組立体８１０及び空気圧式弁組立体８０８のそれぞれの空気圧式アクチュエータは、連結される空気圧式付属部品を有する。図８にはいくつかのホース８７８のみを示すが、各空気圧式付属部品が、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に連結されていることを理解されたい。圧縮ガス源８９５は圧縮機でよく、あるいは別法として、圧縮ガス源８９５は、二酸化炭素シリンダなどの圧縮ガスシリンダでよい。圧縮ガスシリンダは、可搬性が所望される場合に特に有用である。他の圧縮ガス源は本発明の範囲内にある。
【００７３】
機器８１０の他のいくつかの構成要素も、圧縮ガス源８９５に連結される。支持部材８０２の第１の側８１３に取り付けられる磁石８５０は、例示的にはホース８７８を介して圧縮ガス源８９５からのガスを利用して使用及び収納されるが、磁石８５０を移動させる他の方法は、当技術分野では既知である。磁石８５０は、支持部材８０２内の凹部８５１に位置する。凹部８５１は、支持部材８０２を通る通路であってよく、磁石８５０がポーチ２１０のブリスター２４６に接触できるようにしてよいことを理解されたい。しかし、磁石８５０が使用されるときに、磁石８５０がブリスター２４６に十分な磁場を形成するために十分に接近し、さらに、磁石８５０が収納されているときに、磁石８５０がブリスター２４６に存在するいかなる磁気ビーズにも有意に影響を及ぼさない限りにおいて、支持部材８０２の材料に応じて、凹部８５１が支持部材８０２のすべてを通って延在する必要がないことを理解されたい。引込み式の磁石８５０を参照したが、電磁石が使用されて、電磁石を通る電気の流れを制御することにより電磁石を活性化及び不活性化してよいことを理解されたい。しがたって、この仕様では、磁石を引っ込めるあるいは収納することを考察しているが、これらの用語は、磁場を撤回する他の方法を組み込むのに十分に広義であることを理解されたい。
【００７４】
支持体８０２に取り付けられる空気圧式ピストンアレイ８６９の種々の空気圧式ピストン８６８も、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に連結される。圧縮ガス源８９５に空気圧式ピストン８６８を連結する２本のホース８７８のみを示しているが、空気圧式ピストン８６８のそれぞれが圧縮ガス源８９５に連結されていることを理解されたい。１２個の空気圧式ピストン８６８を示す。ポーチ２１０が機器８００内に挿入されるとき、１２個の空気圧式ピストン８６８は、ポーチ２１０の１２個のそれぞれのプランジャ２６８を作動させるように配置される。ポーチ２１０を覆って蓋８０５が閉じているとき、蓋８０５のリップ８０６が付属部品２９０に対する支持体を形成し、空気圧式ピストン８６８が作動されるときに蓋８０５が付属部品２９０を定位置に保持するようにする。付属部品２９０に対する他の支持体は本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【００７５】
例示的にはペルチェ加熱器の１対の加熱／冷却装置は、支持体８０２の第２の側８１４に取り付けられる。第１段階の加熱器８８６は、第１段階のＰＣＲのためにブリスター２６４の中身を加熱及び冷却するように位置される。第２段階の加熱器８８８は、第２段階のＰＣＲのためにポーチ２１０の第２段階のブリスター２８２及び２８３の中身を加熱及び冷却するように位置される。しかし、これらの加熱器は他の加熱目的のために使用されてもよく、特定の用途に適切な他の加熱器を含んでよいことを理解されたい。
【００７６】
所望の場合、試料が特定のブリスターに実際に押し込まれているかどうかに関するフィードバックを提供するためのフィードバック機構（図示せず）が機器８００内に含まれてよい。例示的なフィードバック機構は、温度又は圧力センサを含み、あるいは、特に蛍光性又は有色染料が含まれる場合は光学検出器を含む。このようなフィードバック機構は、例示的には、支持部材８０２又は８０４のどちらかに取り付けられてよい。例えば、圧力センサが、ブリスター２６４に隣接する位置で支持体８０２に取り付けられてよい。試料が推定上ではブリスター２６４に移動されるとき、圧力センサが押し下げられる場合、試料処理の継続が可能になる。しかし、圧力センサが押し下げられない場合、試料処理が停止される可能性があり、あるいは、エラーメッセージがスクリーン８９２上に表示される場合もある。ブリスターの任意の又はすべての組合せにより、ポーチを通る試料の適切な移動に関するフィードバックを提供するフィードバック機構を形成することができる。
【００７７】
蛍光検出が所望される場合、光学素子アレイ８９０が提供されてよい。図８に示すように、光学素子アレイ８９０は、例示的には、フィルタ付きＬＥＤ光源、フィルタ付き白色光、又はレーザ照射の光源８９８、及びカメラ８９６を含む。移動可能な支持体８０４を通る窓８９７が、ポーチ２１０の第２段階の増幅領域２８０への進入路を有する光学素子アレイ８９０を備える。例示的には、カメラ８９６は、それぞれかポーチ２１０の第２段階のブリスター２８２、８２３に対応する複数の光検出器を有する。別法として、カメラ８９６は、第２段階のブリスター２８２、２８３の中身のすべての画像を撮ってよく、画像は、第２段階のブリスター２８２、２８３のそれぞれに対応する分離領域に分割されてよい。構成に応じて、光学素子アレイ８９０は静止してよく、あるいは、光学素子アレイ８９０は、１つ又は複数のモータに取り付けられた移動体に配置されてよく、個々の第２段階のブリスター２８２、２８３のそれぞれから信号を取得するために移動させられる。別の配置が可能であることを理解されたい。
【００７８】
図示のように、コンピュータ８９４は、圧縮空気源８９５の弁８９９を制御し、したがって、機器８００の空気圧のすべてを制御する。コンピュータ８９４はまた、加熱器８８６及び８８８、並びに光学素子アレイ８９０を制御する。これらの構成要素はそれぞれ、例示的にはケーブル８９１を介して電気的に接続されているが、他の物理的接続あるいは無線接続は、本発明の範囲内にある。コンピュータ８９４は機器８９０内に収容されてよく、あるいは機器８９０の外部にあってよいことを理解されたい。さらに、コンピュータ８９４は、構成要素の一部又はすべてを制御する内蔵型の回路基板を含んでよく、また、光学アレイからのデータを受信及び表示するためのデスクトップ又はラップトップＰＣなどの外部コンピュータを含んでよい。例示的にはキーボードインターフェースのインターフェース８９３が設けられてよく、これは、温度、サイクル回数などの情報及び変数を入力するためのキーを含む。例示的には、ディスプレイ８９２も設けられる。ディスプレイ８９２は、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ又は他のディスプレイでよい。
【００７９】
図９に、機器８００の作動中のブラダ組立体８１０とポーチ２１０との関係を示す。ブラダ組立体は、副組立体８１５、８１７、８１８、８１９及び８２２を含む。ブラダ副組立体８１５のブラダ８０９は大きいので、ブラダ副組立体８１５は、例示的には２つの空気圧式付属部品８１５ａ及び８１５ｂを有する。ブラダ８０９は、ポーチ２１０のプラスチックフィルム部分２１７からチャンバ２９２（図６に示す）を封鎖するのに使用される。１つのプランジャ２６８が押し下げられると、空気圧式付属部品８１５ａ及び８１５ｂの１つ又は両方によりブラダ８０９が収縮するのが可能になる。チャンバ２９２の１つからの流体が通過した後、ブラダ８０９は再び加圧されて、チャネル２１４、２３６、２４５、２４７及び２４９を密閉する。例示的なブラダ副組立体８１５は１つのブラダ８０９のみを有するが、他の構成は可能であり、例示的には、チャネル２１４、２３６、２４５、２４７及び２４９のそれぞれが、それらに連結する独自のブラダ又は空気圧式ピストンを有することを理解されたい。ブラダ副組立体８２２は、例示的には、３つのブラダ８２４、８２６及び８２８を含む。上で考察したように、ブラダ８２４、８２４及び８２８は細胞溶解用の３箇所突出ブリスター２２２を駆動する。図示のように、ブラダ８２４、８２６及び８２８はそれらに対応するブリスター２２４、２２６、２２８よりわずかに大きい。膨張すると、ブラダの表面はある程度ドーム形状になることができ、わずかに大きいブラダを使用することにより、対応するブリスターの表面全体を覆うように適度に接触することが可能になり、より均一な圧力及びより良好なブリスターの排気が可能になることが分かっている。ブラダ副組立体８１７は４つのブラダを有する。ブラダ８３６は、チャネル２３６用のピンチ弁として機能し、一方、ブラダ８４４、８４８及び８６６は、ブリスター２４４、２４８及び２６６のそれぞれに圧力を加えるように構成される。ブラダ副組立体８１８は２つのブラダ８４６及び８６４を有し、これらは、ブリスター２４６及び２６４のそれぞれに圧力を加えるように構成される。最後に、ブラダ副組立体８１９は、第２段階の増幅領域２８０を制御する。ブラダ８６５は、チャネル２６５及び２６７用のピンチ弁として作用し、一方、ブラダ８８２は、第２段階のブリスター２８２及び２８３に弱い圧力を加えて、第２段階のブリスターを加熱器８８８に密接に接触させる。ブラダ組立体８１０は５つの副組立体を備えるが、この構成は単に例示的なものであり、任意の数の副組立体が使用されることができ、あるいは、ブラダ組立体８１０が単一の統合組立体として設けられることができることを理解されたい。
【００８０】
同様に、図１０に、機器８００の作動中の空気圧式弁組立体８０８及びポーチ２１０の関係を示す。ブラダ以外に、空気圧式弁組立体８０８は４つの空気圧式ピストン８４２、８５２、８５３及び８６２を有する。これらの空気圧式ピストン８４２、８５２、８５３及び８６２はそれぞれ圧縮空気によって駆動されて、チャネル２４２、２５２、２５３及び２６２上に圧力を直接加える。ビストンの直径はかなり小さいので、これらのピストンは、ブラダ副組立体８１７とブラダ副組立体８１８との間に適合することができ、チャネル２４２、２５２、２５３及び２６２用のピンチ弁を形成することができ、それにより、チャネル２４２、２５２、２５３及び２６２をかなり短くすることが可能になる。しかし、所望の場合、空気圧式ピストン８４２、８５２、８５３及び８６２はブラダと取り替えられてよく、これらは、ブラダ組立体８１０に包含されてよく、空気圧式弁組立体８０８の必要性を取り除く。ブラダ及び空気圧式ピストンの任意の組合せは、本発明の範囲内にあることを理解されたい。当技術分野で知られている、ポーチ２１０のチャネル及びブリスターに圧力を加える他の方法は、本発明の範囲内にあることも理解されたい。
【実施例１】
【００８１】
（ネスティッド（ＮＥＳＴＥＤ）多重化ＰＣＲ）
機器８００に類似するがポーチ１１０用に構成された機器において、１セットの反応を図５のポーチ１１０内で行った。細胞溶解及び２段階の核酸増幅の効果を示すために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅの対数期の生きた培養菌のそれぞれ５０μＬを、健康なドナーからの鼻咽頭吸引液の試料１００μＬと混合して試料を生成して、次に２００μＬの溶解緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、３Ｍ酢酸ナトリウム）を混合した。溶解緩衝液内の４００μＬの試料のうち３００μＬをポーチ１１０のチャンバ１９２ａ内に注入した。
【００８２】
ポーチ１１０は、３箇所突出ブリスター１２２内に０．２５ｇのＺＳビーズを密閉して製造された。以下で考察する第２段階のプライマーも、ポーチ１１０の製造の間にブリスター１８１及び１８２内にスポッティングされた。ポーチ１１０に以下のものを装填した：
１１５ａ  上記の試料及び溶解緩衝液
１１５ｂ  溶解緩衝液内の磁気ビーズ
１１５ｄ〜ｅ  洗浄緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム）
１１５ｇ  溶離緩衝液（１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）
１１５ｈ  第１段階のＰＣＲ緩衝液
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
０．３μＭ  各プライマー
Ｓｃ１：ＲＮＡ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅのＭＥＸ６７ｐと結合するＹＲＡ１核タンパク質の一部を増幅させるように構成されるプライマー。このプライマーは、ｃＤＮＡ（Ｍ−ＭＬＶを介して逆転写したｍＲＮＡ）の増幅により１８０ｂｐの単位複製配列を生成するために１つのイントロン全体を増幅させるように構成される。
【００８３】
Ｓｃ２：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅのＭＲＫ１グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）の同族体のｃＤＮＡの１２１ｂｐの領域を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｃ３：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅのＲＵＢ１ユビキチン様タンパク質のｃＤＮＡの２１３ｂｐの領域を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｐ１：Ｓ．ｐｏｍｂｅのｓｕｃ１−サイクリン依存性タンパク質キナーゼ調節サブユニットのｃＤＮＡの２００ｂｐの領域を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｐ２：Ｓ．ｐｏｍｂｅのｓｅｃ１４−サイトゾル因子ファミリーのｃＤＮＡの１８０ｂｐの領域を増幅させるように構成されるプライマー
３ｍＭのＭｇＣｌ2を含有するＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡなし）
５０ユニットのＭ−ＭＬＶ
４．５ユニットのＴａｑ抗体
１００ユニットのＲＮＡｓｅＯｕｔ
１１５ｊ〜ｋ  第２段階のＰＣＲ緩衝液
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
１ＸＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
２ｍＭのＭｇＣｌ2を含有するＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡあり）
４．５ユニットのＴａｑ
１１５ｌ  第１段階の単位複製配列の試料を含有する第２段階のＰＣＲ緩衝液。
【００８４】
製造の間に、第２段階のブリスター１８１及び１８２に第２段階のネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーがスポッティングされる。各ブリスターに、第２段階のＰＣＲ緩衝液で一度再水和されて最終濃度が約０．３μＭの量の１つのプライマー対がスポッティングされる。第２段階のネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーは以下のものである。
【００８５】
Ｓｃ１：第１段階の単位複製配列のＳｃ１のｃＤＮＡの８０ｂｐの断片を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｃ２：第１段階の単位複製配列のＳｃ１のｃＤＮＡの１２１ｂｐの断片を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｃ３：第１段階の単位複製配列のＳｃ１のｃＤＮＡの９３ｂｐの部分を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｐ１：第１段階の単位複製配列のＳｃ１のｃＤＮＡの９９ｂｐの部分を増幅させるように構成されるプライマー
Ｓｐ２：第１段階の単位複製配列のＳｃ１のｃＤＮＡの９６ｂｐの部分を増幅させるように構成されるプライマー
任意の標的に対して第１段階のプライマー対と第２段階のプライマー対の間に重なり合う部分はない。プライマーの各対は、１つの陰性対照ブリスター１８１内及び２つの第２段階のブリスター１８２にスポッティングされて、それぞれの第２段階の増幅は複製で行われ、各複製は陰性対照をともなう。
【００８６】
装填後、入口チャネル１１５ａに連結されたプランジャの作動により試料が３箇所突出ブリスター１２２に移動させて、入口チャネル１１５ｂに連結されたプランジャを作動させて磁気ビーズをリザーバ１０１に移動させて、入口チャネル１１５ｄ〜ｅに連結されたプランジャを作動させて洗浄緩衝液をリザーバ１０２及び１０３に移動させて、入口チャネル１１５ｇに連結されたプランジャを作動させて溶離緩衝液をリザーバ１０４に移動させて、入口チャネル１１５ｈに連結されたプランジャを作動させて第１段階のＰＣＲ緩衝液をリザーバ１０５に移動させて、入口チャネル１１５ｊ〜ｋに連結されたプランジャを作動させて第２段階のＰＣＲ緩衝液をリザーバ１０６及び１０７に移動させて、入口チャネル１１５ｌに連結されたプランジャを作動させて陽性対照（あらかじめ精製された第１段階の単位複製配列の試料を含む第２段階のＰＣＲ緩衝液）をリザーバ１０８に移動させた。この実施例では、ポーチ１１０を機器内に装入する前に入口チャネル１１５ａ及び１１５ｂに連結されたプランジャを押し下げた。他のすべてのプランジャは、作動中に機器内で順番に押し下げて、必要なときに１０８を通して流体をリザーバ１０２に移動させた。
【００８７】
ポーチ１１０が機器内に配置して、上記のようにＺＳビーズの存在下で、１０分間ビーティングを行った。細胞溶解が完了すると、リザーバ１０１を圧縮して、リザーバ１０１から核酸結合磁気ビーズを３箇所突出ブリスター１２２に押し込んで、そこで、インキュベートするために５分間ゆっくり混合した。
【００８８】
次に、試料ビーズ混合液をブリスター１４４に移動させて、そこで、磁石を作用させて磁気ビーズを捕捉した。磁石を使用すると、ブリスター１４４に隣接するブラダが加圧されて、流体が３箇所突出ブリスター１２２に戻された。次に、捕捉されたビーズを、上記のようにリザーバ１０２及び１０３からの洗浄溶液を使用して洗浄した。洗浄後、ビーズをブリスター１４４内で磁石の作用で再度捕捉して、リザーバ１０４に保管されている溶離緩衝液をブリスター１４４に移動させて、そこで２分間インキュベートして、ビーズから溶離した核酸を上記のようにブリスター１６１に移動させた。
【００８９】
ブリスター１６１では、核酸試料をリザーバ１０５からの第１段階のＰＣＲマスターミックスと混合する。次に、試料を１０分間（この間にＭ−ＭＬＶがｍＲＮＡをｃＤＮＡ変換する）に４０℃に維持し、次いで、２分間９４℃に維持する（Ｍ−ＭＬＶを不活性化して、Ｔａｑから抗体を除去する）。次に、９４℃で１０秒間と６５℃で２０秒間のサーマルサイクルを２０サイクル行う。
【００９０】
第１段階の増幅に続いて、リザーバ１０６からの第１段階のＰＣＲマスターミックスを使用して試料を約１００倍希釈する。次に、上記のようにあらかじめ第２段階のプライマーがスポッティングされているブリスター１８２に試料を移動させる。第２段階のＰＣＲ緩衝液をリザーバ１８１から陰性対照ブリスター１８１に移動させて、陽性対照混合液をリザーバ１０８からブリスター１８３に移動させた。試料を９４℃で３０秒間変性させて、次いで、９４℃で５秒間と６９℃で２０秒間の４５サイクルで増幅させた。
【００９１】
図１３に見られるように、すべての標的単位複製配列及び陽性対照が増幅を示し、一方、陰性対照は全く増幅を示さなかった。各試料を複製した。各複製は同様の増幅を示した（データは示さない）。
【００９２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅ標的は単に例示的なものであり、他の標的は本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【実施例２】
【００９３】
（免疫ＰＣＲ）
別の実施例では、本発明のポーチ及び機器は、免疫ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（「ｉ−ＰＣＲ」））用に使用されてよい。免疫ＰＣＲは、ＥＬＩＳＡの抗体特異性とＰＣＲの感度及び多重化の能力を組み合わせたものである。ｉＰＣＲは診断及び毒素検出に適用されてきたが、おそらく、ＰＣＲ鋳型の雑菌混入問題が開存性のＥＬＩＳＡフォーマットには深刻であるという理由から、ｉＰＣＲは広範囲の商用的適用に使用されてこなかった。本発明のポーチフォーマットは密閉環境を提供することから、本発明のポーチはｉＰＣＲに有利に適している。
【００９４】
従来のＥＬＩＳＡ検出方式を図１１に示す（「ＥＬＩＳＡ」と表示）。参照により本明細書に組み込みこまれる１９９２年の「Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ」（Ｓａｎｏ，  Ｔら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年２５８（５０７９）、１２０−２頁）でＥＬＩＳＡの基本技術の修正形態（図１１に示されており、捕捉抗体Ｃ−Ａｂを使用しない「免疫ＰＣＲ  Ｉ」方式に類似している）が説明されており、ここでは、特定信号を生成するために使用される酵素が、ストレプトアビジン−プロテインＡキメラなどの二官能性結合部Ｓを介して間接的にレポーター抗体Ｒに付着する固有のＤＮＡ断片に取り替えられる。そのＤＮＡ断片はその後ＰＣＲによって検出される。ＰＣＲ検出では、相当するＥＬＩＳＡアッセイに比べての免疫ＰＣＲアッセイの感度のめざましい向上を実現することができ、感度の向上は一般には１０2から１０4倍であることが知られている。定量的なリアルタイムＰＣＲ法の進歩は、免疫ＰＣＲの速度及び定量化を向上させてきた。レポーター抗体（Ｒ−Ａｂ）とＤＮＡ鋳型タグ（図１１、「免疫ＰＣＲＩＩ」方式）の直接のカップリングは、アッセイ感度を１０2から１０3倍向上させ、多重化免疫ＰＣＲアッセイの発展を可能にした。この方法では、それぞれの異なる抗体が異なるオリゴヌクレオチドを用いてタグを付けられ、したがって、各抗原が固有の増幅生成物と関連性をもつ。
【００９５】
ＥＬＩＳＡに対してこれらの利点があるにもかかわらず、ｉＰＣＲは、最初に報告されてから１３年間は、商用で幅広く採用されることはなかった。これは、一部には、任意の開管でのＰＣＲ分析法に固有の汚染の危険性のためである。従来技術のｉＰＣＲプロトコルはＥＬＩＳＡアッセイに由来しており、多くの洗浄ステップを必要として、これにより、作業域を増幅された物質で汚染する可能性が増す。ワークフロー汚染による偽陽性の深刻な危険性は、診断評価におけるｉＰＣＲの回避の一因となった。
【００９６】
単位複製配列の汚染の問題は、ホモジニアス（すなわち、「閉管」）ＰＣＲアッセイが広まるまで、人の遺伝子状態又は感染症の診断でのＰＣＲ自体の広範囲における使用を遅らせた。閉管システムにおいて分析の読出しを可能にすることにより、単位複製配列の分散をかなり削減される。同様に、閉鎖式システムフォーマットが利用可能になれば、ｉＰＣＲがより広く使用されることも考えられる。本システムでは、試料は、必要な試薬をすべて含んだポーチに注入される。抗体の捕捉、洗浄、レポーター抗体結合、洗浄、及び、その後のＰＣＲ検出のステップは、完全にポーチの中で行われることができる。例示的には、核酸はポーチから出ることがなく、ポーチと共に処分される。
【００９７】
本発明の任意のポーチが、ｉＰＣＲのために使用されてよい。例えば、例示的には、図６のポーチ２１０が以下のように適合されてよい。２９２ｌを通るチャンバ２９２ａが以下の成分で充填される。例示的には、精製されていない及び／又は修正されていない抗原（例えば毒素）を含む試料が注入ポート２４１ａを通してチャンバ２９２ａに注入される。磁気ビーズ（Ｃ−Ａｂ）に結合した捕捉抗体がチャンバ２９２ｂに供給される。複数の標的が検査される場合、特異性を有する複数の捕捉抗体が複数の抗原に対して使用されてよいことを理解されたい。場合によっては予備洗浄緩衝液がチャンバ２９２ｃ内に提供されてよい。オリゴヌクレオチド鋳型（Ｒ−Ａｄ−ＤＮＡ）と結合したレポーター抗体が、チャンバ２９２ｄに供給される。捕捉抗体及びレポーター抗体は、モノクローナル又はポリクローナルでよいことを理解されたい。検出される抗原が複数の場合、捕捉抗体及びレポーター抗体は、ポリクローナル抗体のみ、モノクローナル抗体のみ、あるいは１つの抗原に対して特異性を有するポリクローナル抗体及び別の抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体の任意の組合せを包含してよい。レポーター抗体がポリクローナルの場合、たとえ、その組内の種々の抗体の間で特異性が異なっていても、特定の抗原に対して特異性を示すすべてのレポーター抗体が、１つの特定の配列を有するオリゴヌクレオチド鋳型と結合することを理解されたい。オリゴヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖でよい。複数のＲ−Ａｂ−ＤＮＡが、それぞれが固有のオリゴヌクレオチドと結合する、異なる抗体を有する複数の抗原を検出するために提供されてよい。洗浄緩衝液が、２９２ｈを通ってチャンバ２９２ｅに供給されてよい。上記のように、第１段階のＰＣＲマスターミックスはチャンバ２９２ｉに供給される。希釈緩衝液はチャンバ２９２ｊに供給される。上記のように、第２段階のＰＣＲマスターミックスはチャンバ２９２ｋに供給される。上記のように、試薬は、２９２ｌを通ってチャンバ２９２ｂに乾燥されて供給されてよく、使用前にシール２３９を通した水の注入により水和されてよく、あるいは湿状態で注入により個々のチャンバ２９２それぞれに各試薬をそれぞれ供給されてよい。これらの組合せが考慮される。
【００９８】
試料及び試薬が装填されると、ポーチ２２０が機器８００内に挿入される。次に、プランジャ２６８ａが押し下げられて、試料が３箇所突出ブリスター２２２に移動させられる。また、プランジャ２６８ｂが押し下げられると、磁気ビーズと結合した捕捉抗体（図１１にＣとして示す）も３箇所突出ブリスター２２２に移動させられる。試料及びＣ−Ａｂが、ブラダ８２４、８２６からの圧力で交互に切り替わるブラダ８２８からの圧力により混合される。混合することが所望されるので、ブラダ８２４、８２６、８２８からの圧力は、上記の溶解物のための圧力よりかなり弱い圧力でよい。例示的には、緩やかな混合が行われる。試料及びＣ−Ａｂは、十分な時間、捕捉抗体に対してインキュベートされて、試料（Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体形成）内で抗原Ｔと結合し、この時間は、例示的には、約５分間だが、他のインキュベート時間が望ましい場合がある。ｉＰＣＲの場合、インキュベートを約３７℃に維持するために、機器８００内に追加的な加熱器を含むことが望ましい場合がある。
【００９９】
試料内に存在する抗原が捕捉のために十分にインキュベートされると、試料はブリスター２４６に移動させられ、磁石８５０が使用されて、ブリスター２４６内の捕捉抗体を捕捉する。次に、試料の結合されていない部分は、ここでは廃物用リザーバとして機能する３箇所突出ブリスター２２２に戻される。本明細書に記載する実施例では、磁気ビーズが拘束抗体を拘束するのに使用されるが、場合により捕捉抗体をブリスターの内部表面と架橋結合させることさえある固体支持体を含む他の拘束機構が使用されてよいことを理解されたい。
【０１００】
所望の場合、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体は、チャンバ２９２ｃからの予備洗浄緩衝液を使用して洗浄されてよい。予備洗浄緩衝液は、チャネル２４５を介してブリスター２４４内に移動させられ、磁石が収納されてＣ−Ａｂ−Ｔ複合体を解放すると、ビーズは緩やかにブリスター２４４と２４６との間を移動する。次に、ビーズは、磁石８５０の作用により再捕捉されて、残りの流体は３箇所突出ブリスター２２２に移動させられる。この予備洗浄が、バックグラウンドの陰性信号から陽性信号を識別することを向上させる場合があると予想されるが、その差異は微々たるものである場合がある。所望の場合、追加的な予備洗浄が行われることがある。
【０１０１】
プランジャ２６８ｄが押し下げられると、オリゴヌクロオチド鋳型（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ、図１１に示すＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ  ＩＩ方式の核酸が付着したＲとして）に結合した１つ又は複数のレポーター抗体Ｒ−Ａｂを包含する混合液がブリスター２４６に移動させられる。磁石が収納されると、混合液は、ブリスター２４４と２４６との間を移動することにより緩やかに混合される。他のインキュベート時間が所望される場合もあるが、例示的には約５分間のインキュベートにより、図１１のＩｍｍｕｒｏ−ＰＣＲＩＩに示すように三重複合体Ｃ−Ａｂ−Ｔ−Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡの形成が可能になる。磁石８５０の作用により、ブリスター２４６内の３重複合体の捕捉が可能になり、残りの流体は３箇所突出ブリスター２２２に移動させられる。
【０１０２】
プランジャ２６８ｅが押し下げられると、洗浄緩衝液がチャンバ２９２ｅからブリスター２４６に移動させられる。上記の予備洗浄において磁気ビーズ−３重複合体は洗浄されて、磁気ビーズ−３重複合体はブリスター２４６内で再捕捉されて、残りの流体は３箇所突出ブリスター２２２に移動させられる。チャンバ２９２ｆ、２９２ｇ及び２９２ｈからの洗浄緩衝液を使用して洗浄が複数回繰り返され、ブリスター２４４又はチャネル２４３内に存在する可能性がある結合されていないＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体を再導入するのを避けるために、ブリスター２４６と２４８との間で混合することは除かれる。この例示的な態様では４回の洗浄を記載しているが、例示的には付属部品２９０内のチャンバの数を変更することによりあるいはチャンバの容積を増大させることにより、並びに各洗浄に対してチャンバ内の洗浄緩衝液の一部のみを使用することにより、任意の回数の洗浄が使用されてよいことを理解されたい。また、多数回の洗浄を行っても、結合されていないＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体をすべて除去することは極めて困難であることを理解されたい。さらに、試料内に存在しない抗原の場合、それらの抗原に対して特異性を有する結合されていないＲ−Ａｂ−ＤＮＡ又は非特異的に結合しているＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体の存在により、増幅信号が生成される場合がある。したがって、洗浄ステップの理想的な目標値は、抗原に特異性を有するすべてのＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体を除去することであるが、１つの例示的な目標値は、十分な数のそのようなＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体を除去して、オリゴヌクレオチドの増幅曲線を遅延させて、陽性試料の増幅曲線と区別できるようにすることである。例示的には、洗浄の回数を増加させると、より多くの結合されていないＲ−Ａｂ−ＤＮＡを除去することになり、検出限界を下げることになるが、洗浄回数の増加には、解離による所望の３重複合体の損失、又は磁石によって捕捉されていない磁気ビーズの損失のおそれがある。洗浄が完了した後、所望の場合、捕捉された３重複合体は加熱されるあるいは酵素的（例示的には、パパイン、プロテイナーゼＫ、あるいは、付加的なチャンバによって供給された他の適切な酵素を用いて）に処理されてよく、ＰＣＲの前にＤＮＡを解放する。このような処理は、第１段階のＰＣＲの効率を向上させる可能性がある。このような処理は、本明細書で考察するｉＰＣＲの任意の実施例で使用されてよいことを理解されたい。
【０１０３】
洗浄が完了すると、プランジャ２６８ｉ押し下げられて、上述するように第１段階のＰＣＲマスターミックスがブリスター２４６に移動させられる。第１段階のＰＣＲマスターミックスは所望される標的すべてのプライマー対を含む。磁石８５０が解除されると、ブリスター２４６と２４８との間の場合によっては混合が３重複合体を再懸濁するため使用されてよい。混合液はブリスター２６４に移動させられて、そこで、上記のように第１段階のサーマルサイクルが行われる。複合されたオリゴヌクレオチドが十分なレベルまで増幅されると、上記のように、増幅混合液は、チャンバ２９２ｊに供給される希釈緩衝液を使用して場合によっては希釈される。第１段階の増幅混合液の一部又はすべては、チャンバ２９２ｋから供給される第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合されてよく、次に、この混合液は、上記のように第２段階のプライマーが供給される１８個の第２段階のブリスター２８２に移動させられる。所望の場合、第２段階のブリスター２８２の１つは、陰性対照用に使用されてよく、そこでは、試料内に抗原が存在しないことは既知であるが、Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡがチャンバ２９２ｄから供給されて、陰性対照の第２段階のブリスター２８２には適切なプライマーが供給される。種々の洗浄にもかかわらず、少量のこの特殊なＲ−Ａｂ−ＤＮＡは第１段階ＰＣＲに存在する場合があり、したがって、少量の第１段階の増幅生成物は、この第２段階のブリスター２８２に供給されてよいことが予想される。しかし、その量が極めて少量の場合、交差点は、陽性試料の交差点を十分に過ぎて遅延される。また、所望の場合、第２段階のブリスターの１つは陽性対照用に使用されてよく、そこでは、試料には、そうでない場合には検査されない抗原が加えられて、その対応するＲ−Ａｂ−ＤＮＡと結合することが推測され、次に、第１段階のＰＣＲで増幅される。最後に、コントロールブリスター２８３は、この例示的な態様では使用されない。しかし、わずかに再構成することにより、ブリスター２８３はブリスター２６６に連結されてよく、６つの付加的な第２段階の反応が行われてよい。別法として、ブリスター２８３が、特定の用途において所望される他のコントロール用に使用されてよい。
【０１０４】
上で考察したように、結合されていないＲ−Ａｂ−ＤＮＡ又は非特異的に結合しているＲ−Ａｂ−ＤＮＡ複合体をすべて除去するのは困難であるため、陰性試料も一部に増幅を示す場合がある。リアルタイムでの増幅の分析は、閾値交差の点のサイクル数の差異（あるいは、増幅が５０％に到達した時点のサイクル数などの、等価のサイクル閾値の測定値）を介して陰性から陽性を区別することが可能になることが予想される。
【０１０５】
第１段階の多重増幅は、ｉＰＣＲの検出に、さらには複数の抗原の検査の場合にも、必要でないことがあることを理解されたい。しかし、第１段階の多重増幅は、より高い感度を有する。
【実施例３】
【０１０６】
（免疫ＰＣＲ仕様のポーチを使用した免疫ＰＣＲ）
上の実施例では、図６のポーチ２１０をｉＰＣＲ用に適合させる方法を示している。しかし、図１２に、例示的にはｉＰＣＲ用に構成されたポーチ３１０を示す。付属部品３９０が、１５個のチャンバ３９２及びプランジャ３６８を有することを除いて、付属部品１９０及び２９０に類似している。各チャンバ３９２（例示的には、試料が注入されるチャンバ３９２ａ）が、独自の注入ポートを有してよく、あるいは複数のチャンバが連結チャネルを有し、１つの注入ポートを共有してよい（例示的には、それぞれが洗浄緩衝液を含む、３９２ｋを通る３９２ｅ）。上記の付属部品のように、注入ポート及びチャネルの任意の組合せは本発明の範囲内にある。ポーチ３１０は、基本的な部分で図６のポーチ２１０と異なる。ｉＰＣＲでは、通常、細胞溶解は必要ではないので、３箇所突出ブリスター２２２は、１つの大型の廃物リザーバ３２２に取り替えられてよい。ｉＰＣＲでは、複数回の洗浄が所望されるので、廃物リザーバ３２２は、使用された複数の緩衝液を保持するために、例えば、用途及び反応の大きさに応じて２〜５ｍｌの大きな容量を有する。機器８００は、ポーチ３９０を収容するためにある程度再構成される必要がある可能性があることを理解されたい。
【０１０７】
機器に挿入される前に、図１２のポーチ３９０は、チャンバ３９２内に以下の成分を有する。検査される試料が、チャンバ３２９ａに注入される。磁気ビーズに結合した捕捉抗体（Ｃ−Ａｂ）が、チャンバ３９２ｂに供給される。場合によっては予備洗浄緩衝液が、チャンバ３９２ｃに供給される。それぞれのオリゴヌクレオチド鋳型と結合したレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）が、チャンバ３９２ｄに供給される。上で考察した、複数のＲ−Ａｂ−ＤＮＡが、固有のオリゴヌクレオチドと結合したそれぞれ異なる抗体を用いて複数の抗原を検出するために供給される。洗浄緩衝液が、３９２ｋを通してチャンバ３９２ｅに供給される。第１段階のＰＣＲマスターミックスがチャンバ３９２ｌに供給される。希釈緩衝液が、チャンバ３９２ｍ及び３９２ｎに供給される。第２段階のＰＣＲマスターミックスがチャンバ３９２ｏに供給される。
【０１０８】
まず、プランジャ３６８ａ及び３６８ｂが押し下げられて、試料及び捕捉抗体Ｃ−Ａｂがチャネル３４３を通ってブリスター３４４内に移動させられる。試料及びＣ−Ａｂは、例示的にはチャネル３４５を介してブリスター３４４と３４６との間を移動させられることにより緩やかに混合されて、上記のようにインキュベートされる。Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体を形成するのに十分な時間後、混合液はチャネル３３８を介してブリスター３４６に移動させられて、そこで、機器内に収容されている磁石３５０が使用されて、混合液中の複合されたビーズが捕捉される。残りの流体は、チャネル３３９を介して廃物用リザーバ３２２に移動させられる。場合によっては、チャンバ３９２ｃからの予備洗浄緩衝液が、チャネル３４５を介してブリスター３４６に移動させられて、磁石３５０が収納されて、流体がブリスター３４４と３４６との間を移動させられることにより、磁気ビーズが緩やかに洗浄される。磁石３５０が再度使用されて、ビーズがブリスター３４６内で再度捕捉される。
【０１０９】
次に、プランジャ３６８ｄが押し下げられて、核酸鋳型に結合したレポーター抗体（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）がブリスター３４６に移動させられて、磁石３５０が収納されて、Ｃ−Ａｂ−Ｔ及びＲ−Ａｂ−ＤＮＡが、例示的にはチャネル３４５を介してブリスター３４４と３４６と間を移動させられることにより緩やかに混合されて、上記のようにインキュベートされる。３重複合体（Ｃ−Ａｂ−Ｔ−Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）の形成後、磁石３５０が再度使用されて、ブリスター３４６内の３重複合体を捕捉し、残りの流体が廃物用ブリスター３２２に移動させられる。
【０１１０】
次に、上記の予備洗浄用のチャンバ３９２ｅからの洗浄緩衝液を使用して、３重複合体が洗浄される。磁石３５０が再度使用されて、ブリスター３４６内の３重複合体を捕捉し、残りの流体が廃物用ブリスター３２２に移動させられる。３９２ｋを通してのチャンバ３９２ｆからの洗浄緩衝液を使用して、洗浄が複数回繰り返される。ここで、図１２の例示的な態様では、７回の洗浄が完了する。しかし、上で考察するように、特定の用途に応じて、これより多い又は少ない回数の洗浄が所望される場合がある。
【０１１１】
図１１に示す免疫ＰＣＲＩＩ方式に示すように、レポーター抗体は核酸鋳型に直接結合される。本明細書で考察する任意の態様のレポーター抗体は、直接的又は間接的な供給結合又は非共有結合を含む任意の様々な方法で核酸鋳型に結合されることができることを理解されたい。また、レポーター抗体は、例えば、図１１の免疫ＰＣＲＩ方式に示すような二次抗体の使用による手法などを含む種々の構造を介して核酸に結合されることができる。二次抗体又は他の間接的なカップリング構造が使用される場合、追加的なポート及びさらなる洗浄ステップを追加することが望ましい場合がある。
【０１１２】
上記の第１段階のＰＣＲマスターミックスは、次に、プランジャ３６８ｋの作動を介してブリスター３４６で使用され、磁石３５０は再度収納される。緩やかな混合が所望される場合、流体は、チャネル３４７を介してブリスター３４６と３６４との間を移動させられる。前のようにブリスター３４６と３４４との間で混合が行われることができるが、この例示的な態様ではブリスター３４６と３６４との間で混合が行われる。これが、ブリスター３４４内に存在する可能がある結合されていないレポーター抗体複合体の再導入を減らす働きをする。次に、試料はブリスター３６４に移動させられる。３６４に面して位置するブラダが緩やかに押し下げられて、ブリスター３６４をペルチェ装置などの加熱／冷却装置に接触させるように移動させて、第１段階のＰＣＲに対して上で考察したように、試料がサーマルサイクルされる。前の実施例で考察したように、第１段階のＰＣＲは、現在説明しているｉＰＣＲでは必要ではない場合があり、ブリスター３６４及びそれに関連する加熱器が排除される場合があり、すべての洗浄は、例示的にはブリスター３４４と３４６との間の混合により行われることができる。第１段階のＰＣＲが省略される場合、以下で考察する希釈も省略されてよい。
【０１１３】
増幅された試料の大部分は廃物用ブリスター３２２に移動させられて、ブリスター３６４内に残された一部の増幅された試料が希釈される。空間的制約また他の理由によりブリスター３２２のサイズが限定される場合、ブリスター３４４及び３４６が残りの廃物を収容するために使用されてよいことを理解されたい。残りの少量の増幅された試料は、チャンバ３９２ｍからチャネル３４９を介してブリスター３６６に移動させられる希釈緩衝液と混合される。試料及び希釈緩衝液は、チャネル３５５を介してブリスター３６４及び３６６との間で緩やかに混合されてよい。さらなる希釈が所望される場合、チャンバ３９２ｎからの希釈緩衝液を使用して希釈が繰り返されてよい。最後に、希釈された試料の一部が、廃物用リザーバ３２２に移動させられて、残りの希釈された試料が、チャンバ３９２ｏからの第２段階のＰＣＲマスターミックスと混合される。混合された後、試料は、上で考察したように第２段階のプライマーが供給される種々の低容量の第２段階ブリスター３８２に移動させられる。この構成では、前のｉＰＣＲの実施例で考察したように、ブリスター３８３は陰性対照用に使用されてよく、ブリスター３８４は陽性対照用に使用されてよい。第２段階のＰＣＲ及び分析は、前のｉＰＣＲの実施例で考察したように行われる。
【実施例４】
【０１１４】
（ＰＣＲ及び免疫ＰＣＲの組合せ）
ある場合では、抗原及び核酸の検査が１つ反応セットで行われることが望ましい場合がある。例えば、テロ攻撃では、複数の人々を殺すために様々な抗原を使用する場合がある。その攻撃に対処する際に、病原体が、ウィルス、バクテリア、又は他の生物であるのかが不明である、あるいは病原体が毒素であるのかが不明である場合がある。本発明のポーチの閉鎖式環境システムは、このような用途に有利に適している。本明細書で開示する態様では、ＰＣＲ及びｉＰＣＲの両方が単一のポーチ内で行われてよく、それにより、種々の生物学的及び抗原性の病原体の同時の検出が可能になる。
【０１１５】
図１３に、図６のポーチ２１０に類似のポーチ４１０を示す。例示的なポーチ４１０は、ポーチ２１０のすべてのブリスターを有しているが、ブリスター４３０、４３１、４３２及び４３３も有する。ポーチ４１０はまた、２０個の対応するプランジャ４６８と共に２０個のチャンバ４９２を有する大型の付属部品４９０を有する。上記のように、付属部品は、それぞれのチャンバに対して分離した注入ポートを含んでよく、あるいは種々のチャンバが連結するチャネルを有してよい。これらの様々な組合せは、本発明の範囲内にある。ポーチ４１０用の機器は、ブリスター４３０、４３１、４３２及び４３３と、チャネル４３６、４５７、４７３、４８６、４８７及び４８８とのために追加的な空気圧式アクチュエータが必要となり、並びに、ブリスター４３３及び４３１にそれぞれ隣接する追加的な収納式磁石４５１及び４５４が必要となることを除いて、機器８００に類似する。
【０１１６】
この例示的な態様では、チャンバには以下のものが装填される。ｉＰＣＲ洗浄緩衝液が、４９２ｅ及び４９２ｊを介してチャンバ４９２ａに提供される。検査される試料がチャンバ４９２ｆ内に注入される。磁気ビーズに結合した捕捉抗体（Ｃ−Ａｂ）がチャンバ４９２ｇ内に供給される。場合によっては予備洗浄緩衝液がチャンバ４９２ｈ内に供給される。それぞれのオリゴヌクレオチド鋳型（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）に結合したレポーター抗体がチャンバ４９２ｉ内に供給される。細胞溶解緩衝液がチャンバ４９２ｋ内に供給される。核酸結合磁気ビーズがチャンバ４９２ｌ内に供給される。核酸洗浄緩衝液がチャンバ４９２ｍ及び４９２ｎ内に供給される。核酸溶離緩衝液がチャンバ４９２ｏ内に供給される。第１段階のＰＣＲマスターミックスがチャンバ４９２ｐ内に供給される。希釈緩衝液がチャンバ４９２ｑ及び４９２ｒ内に供給される。第２段階のＰＣＲマスターミックスがチャンバ４９２ｓ内に供給される。図６に関連して上で考察したコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌｓ）がチャンバ４９２ｔ内に供給される。この配置は例示的なものであり、他の構成が可能であることを理解されたい。また、上で考察した他の実施例のように、１つ又は複数の成分が乾燥された状態でポーチ４１０の１つ又は複数のブリスター内に供給されてよい。
【０１１７】
試料がチャンバ４９２ｆ内に装填されて、ポーチ４１０が機器内に装入されると、プランジャ４６８ｆ及び４６８ｇが押し下げられて、試料及びＣ−Ａｂがチャネル４３６を通ってブリスター４３０まで移動させられる。試料及び捕捉抗体は、ブリスター４３０と４３１との間を緩やかに移動させられることにより混合されて、上記のようにインキュベートされてＣ−Ａｂ−Ｔ複合体の形成が促進される。試料はブリスター４３１に移動させられて磁石４５４が作動すると、その中でＣ−Ａｂ−Ｔ複合体が捕捉される。次に、この時点で、毒素又は標的となる他の抗原がブリスター４３１内で捕捉される。この例示的な態様では、捕捉抗体に結合される磁気ビーズの磁気ビード部分の表面が、核酸結合磁気ビーズの表面と異なっており、捕捉抗体に結合される磁気ビーズは例示的には核酸と結合するように構成されていないことに留意されたい。次に、残りの流体はチャネル４７３を介して３箇所突出ブリスター４２２に移動させられる。次に、この流体は処理されて、標的核酸の存在について分析される。標的となる抗原が、ＰＣＲ検出の標的である生物の表面抗原である場合、この部分の試料は問題を含む可能性がある。このような状況では、その生物に対して、抗原検出及び核酸検出からどちらを選択し、あるいは、ＰＣＲ及びｉＰＣＲ用の分離ポーチを使用することが望ましい場合がある。別法として、抗体捕捉の前にその試料を溶解してよい。溶解物が抗体捕捉の障害となる場合、例えば、抗原の配列を変化させることにより、試料は分離されることができ、抗体捕捉の前に試料の一部分のみを溶解させることができる。Ｃ−Ａｂ−Ｔの予備洗浄が所望される場合、プランジャ４６８ｈが作動されて、チャンバ４９２ｈからの予備洗浄緩衝液がブリスター４３１内に移動させられる。磁石４５４が収納されると、流体はブリスター４３０と４３１との間で混合されて、磁石４５４が再度使用されると、ブリスター４３１内でＣ−Ａｂ−Ｔ複合体が捕捉される。この時点で捕捉後に残された細胞を含んでいる可能性がある洗浄緩衝液は、捕捉されていない残りの物質と共に、３箇所突出ブリスター４２２に移動させられる。
【０１１８】
分離処理のために、この時点で、試料が２つに分割されることを理解されたい。試料内に存在する抗原は、この時点で、ブリスター４３１内でＣ−Ａｂ−Ｔ複合体の中に捕捉され、一方、試料内に存在する細胞、ウィルス、及び遊離核酸は、この時点で、３箇所突出ブリスター４２２内に移動させられて溶解されるのを待つ。２つの試料は、両方の第１段階ＰＣＲの準備ができるまで分離して処理される。これらの処理は、任意の順番あるいは同時に行われる可能性がある。しかし、この態様では、細胞溶解は、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体の本質的な処理の前に行われて、その結果、３箇所突出ブリスターが廃物用リザーバとして機能できるようにしなければならない。分離した廃物用リザーバが使用される場合、所望ならば、細胞溶解は、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体が処理された後に遅らせることができる。
【０１１９】
チャンバ４９２ｋからの溶解緩衝液は、チャネル４３６を介して３箇所突出ブリスター４２２に移動させられる。３箇所突出ブリスター４２２のブリスターに隣接するブラダは、図６に関連して上で説明したように加圧されて、高速衝突を起こして試料をせん断して核酸を遊離させる。細胞が十分に溶解されると、プランジャ４６８ｌが作動されて、チャンバ４９２ｌ内に保管されている核酸結合磁気ビーズが、チャネル４３６を介して３箇所突出ブリスター２２０内に注入される。試料は磁気ビーズと混合されて、その混合物はインキュベートされる。図６のポーチに関連して上で説明したように、この後、この処理は続く。試料とビーズの混合物は、チャネル４３８を介してブリスター４４４内に押し込まれて、次に、チャネル４４３を介してブリスター４４６内に押し込まれて、そこで、収納式磁石４５０が溶液から磁気ビーズを捕捉する。次に、捕捉されていない液体は、ブリスター４４６から押し出されてブリスター４４４を通ってこの時点では廃物用容器として使用されるブリスター４２２内に戻される。プランジャ４６８ｍが作動されて、洗浄溶液をチャネル４４５を介してブリスター４４４に供給してよく、次いで、チャネル４４７を介してブリスター４４６に供給してよい。磁石４５０が収納されて、磁気ビーズがブリスター４４４から４４６まで往復するように移動させられて、磁気ビーズが洗浄される。磁気ビーズが洗浄されると、磁気ビーズはブリスター４４６内で磁石４５０の作用によって再捕捉されて、次いで、洗浄溶液がブリスター４２２に移動させられる。この処理は、チャンバ４９２ｎ内の洗浄試薬を使用して繰り返される可能性がある。しかし、より多い回数の又はより少ない回数の洗浄は、本発明の範囲内であることを理解されたい。洗浄後、チャンバ４９２ｏ内に保管されている溶離緩衝液が、チャネル４４７を介してブリスター４４８に移動させられて、磁石４５０が収納される。溶液は、チャネル４５２を介してブリスター４４６と４４８との間を循環させられ、ブリスター４４６内の磁気ビーズのペレットを壊して、捕捉された核酸が溶液に入る。磁石４５０が再度作動されると、ブリスター２４６内の磁気ビーズが捕捉され、溶離された核酸溶液がブリスター４４８内に移動させられる。
【０１２０】
ブリスター４３１に戻ると、Ｃ−Ａｂ−Ｔ複合体はその中で捕捉される。プランジャ４６８ｉが押し下げられると、核酸鋳型（Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）に結合したレポーター抗体がブリスター４３０に導入され、磁石４５４が収納され、例示的にはブリスター４３０と４３１との間を移動させることによりＣ−Ａｂ−ＴとＲ−Ａｂ−ＤＮＡとが緩やかに混合されて、上記のようにインキュベートされる。３重複合体（Ｃ−Ａｂ−Ｔ−Ｒ−Ａｂ−ＤＮＡ）の形成後、磁石４５４が再度使用されて、ブリスター４３１内の３重複合体を捕捉し、残された流体がこの時点では廃物用リザーバとして使用されるブリスター４２２へと移動させられる。
【０１２１】
次に、３重複合体は、予備洗浄に関して上記のように、チャンバ４９２ｊからの洗浄緩衝液を使用して洗浄される。磁石４５４が再度使用されて、ブリスター４４６内の３重複合体を捕捉して、残された流体がブリスター４２２へと移動させられる。チャンバ４９２ａからの追加的な洗浄緩衝液が、チャネル４８６を介してブリスター４３２内に注入され、磁石４５４が収納され、３重複合体が流体ブリスター４３１及び４３２を混合することにより再懸濁される。次に、流体は、チャネル４８７を介してブリスター４３３に移動させられて、その中で、３重複合体が磁石４５１の作用により捕捉される。次いで、廃物流体は、ブリスター４３３及び４３２を通ってブリスター４２２に戻される。追加的な洗浄緩衝液が、チャンバ４９２ｂからブリスター４３２内に導入されて、ブリスター４３２と４３３との間で混合することにより洗浄が繰り返される。チャンバ４９２ｅを通してのチャンバ４９２ｃからの洗浄緩衝液を使用して数回洗浄が繰り返される。ここで、図１３の例示的な態様では、６回の洗浄が完了する。しかし、上で考察したように、特定の用途に応じて、これより多いあるいは少ない洗浄が所望される場合がある。ブリスター４３２及び４３３は前の洗浄からの汚染を最小限にするために使用されることを理解されたい。所望の場合、ブリスター４３２及び４３３は省略されてよく、チャンバ４９２ｅを通してチャンバ４９２ａ内に含まれる洗浄緩衝液は、ブリスター４３０又は４３１のどちらかに直接供給されてよく、ブリスター４３０と４３１との間で混合される。
【０１２２】
洗浄された抗体３重複合体は、この時点で、ブリスター４３３内で捕捉されて、溶離された核酸は、この時点では、ブリスター４４８内にある。抗体３重複合体及び溶解された核酸は、分離した複数の組の第２段階のＰＣＲブリスターまで通されて、ＰＣＲによって独立した反応で処理されてよいことに留意されたい。しかし、この態様では、抗体３重複合体及び溶離された核酸は、ＰＣＲ分析のために組み合わせられる。第１段階のすべてのプライマーを含有する第１段階のＰＣＲマスターミックスは、チャンバ４９２ｐからブリスター４４８に注入される。次いで、核酸試料は、チャネル４５３を介してブリスター４４８と４６４との間で混合される。第１段階のＰＣＲにおいてｉＰＣＲ成分が所望される場合、核酸試料はその後ブリスター４３３に移動させられて、磁石４５１が収納されて、再結合された試料が、例示的にはブリスター４３３と４６４との間で混合される。次いで、試料はブリスター４６４に移動させられて、そこで、試料は上記のようにサーマルサイクルされる。次に、増幅された試料は、チャンバ４９２ｑ及び４９２ｒからの希釈緩衝液を使用して１回又は複数回希釈されてよい。それぞれの希釈の前に、増幅された試料の大部分が、チャネル４４７又はチャネル４８８のどちらかを介してブリスター４６４から除去される。希釈緩衝液を１回ごとに付加することにより、試料はチャネル４６２を介してブリスター４６４と４６６との間で混合される。希釈後、試料のすべて又は一部が、上の実施例で記述したようにチャンバ４９２ｓからの第２段階のＰＣＲマスターミックスと混合される。
【０１２３】
次に、試料は、チャネル４６５を介してブリスター４６６から第２段階の増幅領域４８０内のブリスター４８２に移動させられる。それぞれのブリスター４８２には、あらかじめプライマー対が供給されており、一部のプライマー対は標的核酸に対して特異性を示し、一方他のプライマー対はレポーター抗体と結合したオリゴヌクレオチドに対して特異性を示す。所望の場合、２つのブリスター４８２は、上記のようにｉＰＣＲコントロール専用であってよい。ブリスター４８３は、図６のブリスター２８３に関連して上記のように、ＰＣＲコントロール用に使用されてよい。１８個のブリスター４８２を示すが、任意の数のブリスター４８２が使用されてよいことを理解されたい。第２段階のＰＣＲ増幅は、図６に関連して上記のように進行する。ＰＣＲ分析では、増幅曲線、溶解曲線、又はそれらの組合せを使用してよく、一方、ｉＰＣＲ分析では、上記のように交差閾値を使用してよいことを理解されたい。他の分析方法は本発明の範囲内である。
（参考文献）
【０１２４】
【表１】
0005432522.tif 000002
【０１２５】
【表２】
0005432522.tif 000003
【０１２６】
【表３】
0005432522.tif 000004
【０１２７】
【表４】
0005432522.tif 000005
【０１２８】
本明細書ではＰＣＲ及びｉＰＣＲに対して参照が行われるが、本明細書で開示される装置及び方法は、当技術分野で知られている他の核酸増幅又は他の生物学的処理方法と共に使用されるのに適していてよく、特に、第１段階の多重反応及び第２段階の個々の反応から利益が得られる方法と共に使用されるのに適していてよいことを理解されたい。例示の非限定的な第２段階の反応は、対立遺伝子特異的プライマー伸長を含むプライマー伸長と、１つ又は複数のジデオキシヌクレオチドの取り込み；及び蛍光又は非蛍光標識の取り込みよる終結を含む伸長終結と、反応混合物成分の変化又は成分比率の変化を必要とする非対称ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、インベーダアッセイ、及び、他の等温増幅又は検出作用などの、他の酵素反応とを含む。
【０１２９】
好適な態様を参照して本発明を詳細に説明したが、変更形態と修正形態は、特許請求の範囲で記載及び定義する本発明の範囲及び精神内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の一態様による可撓性ポーチを示す図である。
【図２】図１による可撓性ポーチの細胞溶解領域の態様を示す図である。
【図２ａ】図２ａは、図２に示す細胞溶解領域に対応するブラダの一部分の態様を示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、他の攪拌機構を有する、図１による可撓性ポーチの細胞溶解領域の態様を示す図である。
【図３】図１による可撓性ポーチの核酸生成領域の態様を示す図である。
【図４】図１による可撓性ポーチの第１段階の増幅領域の態様を示す図である。
【図５】ポーチの他の態様を示す以外は、図１と同様の図である。
【図５ａ】図５ａは、図５のポーチの付属部品の断面図である。
【図５ｂ】図５ｂは、図５のポーチの一部分の拡大図である。
【図６】ポーチの別の他の態様の斜視図である。
【図６ａ】図６ａは、図６のポーチの付属部品の断面図である。
【図７】図６のポーチと共に使用するための例示的なブラダの構成要素を示す図である。
【図８】図６のポーチを含む、図６のポーチと共に用いるための機器の分解斜視図である。
【図９】斜線で示した図６のポーチを用いた、図７のブラダの構成要素を含む、図８の機器の部分断面図である。
【図１０】ピンチ弁及び図６のポーチ用の種々のブラダを含む、図８の機器の部分断面図である。
【図１１】ＥＬＩＳＡ及び免疫ＰＣＲのスキーム、二次抗体（Ａ）；捕捉抗体（Ｃ）；酵素（Ｅ）；レポーター抗体（Ｒ）；二官能性結合部分（Ｓ）；及び抗原（Ｔ）を示す図である。
【図１２】免疫ＰＣＲのために構成されたポーチを示す以外は、図６と同様の図である。
【図１３】ＰＣＲ及び免疫ＰＣＲの両方のために構成されたポーチを示す以外は、図６と同様の図である。
【図１４】図５のポーチ内で溶解及び増幅された試料の第２段階の増幅の増幅曲線を示す図である（「破線」陽性対照；「一点鎖線」Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ標的１；「細線」Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ標的２；「太線」Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ標的３；「短い二点鎖線」Ｓ．ｐｏｍｂｅ標的１；「長い二点鎖線」Ｓ．ｐｏｍｂｅ標的２；「短い波線」陰性対照）。
【図１】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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