(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物を培養して得られる培養物と下記化合物（１）とを有効成分として含有するマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物であって、前記化合物（１）の投与量が終濃度で１０μＭ以上である、前記サイトカイン産生促進組成物；
【化１】
0005559173.tif 000007
【請求項２】
前記アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物は、アウレオバシジウム プルランス Ｍ−１（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１５）またはアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４）である、請求項１に記載のマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ細胞は貪食能を有し、このマクロファージ貪食能が、病原菌などの異物を呑み込んで分解し排除するなどの自然免疫を可能にしたり、マクロファージ細胞表面に抗原情報を提示してＴリンパ球に伝達して特異抗体の産生に導くなどの獲得免疫を可能にしたりすることが知られている。また、マクロファージは各種のサイトカインを産生し、産生されたサイトカインは炎症反応や免疫応答を調節し、アポトーシスを誘導し、あるいは造血因子や成長因子として作用するなど、種々の作用を奏することが知られている。したがって、マクロファージの貪食能やマクロファージにおけるサイトカイン産生を活性化することは、動物の免疫の亢進などにつながり、これに有効な物質は、新たな免疫賦活剤、免疫調節剤、抗癌剤、抗アレルギー剤、抗体産生用アジュバンドなどの有効成分として有用である。特に自然免疫や細胞性免疫が関与する免疫賦活剤、免疫調整剤、抗癌剤、抗アレルギー剤として有用である。【０００３】
マクロファージ貪食能の活性化に有効な物質については、例えば下記特許文献１乃至２に、分子量１，５００から１５０，０００のＰＬＧＡを含むＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体）によってマクロファージの貪食活性を亢進することが記載されている。また、サイトカインの産生を促進する物質については、例えば下記特許文献３に、アルギン酸ナトリウムから調製したアルギン酸オリゴマーがサイトカインの産生を促進することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−６３２８７号公報
【特許文献２】特許第３９４７９９９号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００７／０６９４６８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来、マクロファージ貪食能活性化組成物やマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物として、天然物由来の有効成分を利用することはほとんど行われていなかった。【０００６】
本発明の目的は、天然物由来の有効成分を利用するマクロファージ貪食能活性化組成物やマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物であって、優れた効果を有するものを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。【０００８】
［１］アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物を培養して得られる培養物を有効成分として含有することを特徴とするマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物。【０００９】
［２］さらに、下記化合物（１）または化合物（２）を有効成分として含有する上記［１］記載のマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物。
【化１】
0005559173.tif 000002
【化２】
0005559173.tif 000003
【００１０】
［３］前記アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物は、アウレオバシジウム  プルランスＭ−１（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１５）またはアウレオバシジウム  プルランスＭ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４）である上記［１］または［２］記載のマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物。【００１１】
［４］マクロファージ貪食能活性化組成物である場合において下記（１）または（２）の細胞の貪食のために適用される、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載のマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物；
（１）癌細胞、
（２）抗がん剤により損傷を受けまたは死滅した細胞。【００１２】
［５］前記抗がん剤が５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である上記［４］に記載のマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物によれば、有効成分として用いられるアウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物を培養して得られる培養物が、マクロファージ貪食能を活性化することができ、また、マクロファージにおけるサイトカインの産生を促進することができる。特に、マクロファージ貪食能活性化組成物である場合においては、癌細胞や、抗がん剤により損傷を受けまたは死滅した細胞に対する貪食能を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＴＨＰ−１細胞（Ａ）およびＴＨＰ−１細胞が分化したマクロファージ様細胞（Ｂ）の顕微鏡写真である。
【図２】５−ＦＵによるＪｕｒｋａｔ細胞の障害測定を示す図表である。
【図３】初期アポトーシス細胞と後期アポトーシス細胞のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖおよびヨウ化プロピジウム(ＰＩ)の関係を示す図表である。
【図４】５−ＦＵ作用Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるホスファチジルセリン(ＰＳ)の露出を示す図表であり、(Ａ)は図の見方の説明図、(Ｂ)は正常なＪｕｒｋａｔ細胞を示す図、(Ｃ)は２５０μＭの５−ＦＵを２４時間作用させアポトーシス誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を示す図、(Ｄ)は５００μＭの５−ＦＵを２４時間作用させアポトーシス誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を示す図、(Ｅ)は(Ａ−Ｃ)のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ(＋)、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）(−)をフローサイトメーターで解析し定量化した図である。
【図５】マクロファージ様細胞のアポトーシス性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する貪食能を示す図表であり、(Ａ)は何も添加せずに初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間貪食させた図、(Ｂ)は５００倍希釈したアウレオバシジウム培養液を７時間作用させ、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間貪食させた図、(Ｃ)は(Ａ−Ｂ)のＣＤ１４とＴＡＭＲＡのダブルポジティブの領域をフローサイトメーターで解析し定量化した図、(Ｄ)はＦＡＣＳ解析図の見方を示す図である。
【図６】マクロファージ様細胞のポリスチレンビーズに対する貪食能を示す図表である。
【図７】マクロファージ様細胞からのＴＮＦ−α分泌を示す図表である。
【図８】アウレオバシジウム培養液、化合物１、もしくはアウレオバシジウム培養液および化合物１を添加したマクロファージ様細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果を示す図である。
【図９】マクロファージ様細胞のアポトーシス性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する貪食能を示す図表であり、（Ａ）は無添加のマクロファージに初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間貪食させた図、（Ｂ）はアウレオバシジウム培養液の１０００倍希釈を合計７時間作用させたマクロファージに、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間貪食させた図、（Ｃ）は化合物１の１μＭを合計７時間作用させたマクロファージに、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間貪食させた図、（Ｄ）はアウレオバシジウム培養液の１０００倍希釈に化合物１の１μＭを添加し、合計７時間作用させたマクロファージに、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間貪食させた図、（Ｅ）はＡ−Ｄを定量化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において用いられるアウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物を培養して得られる培養物（以下、「アウレオバシジウム培養物」という。）としては、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物（以下、「アウレオバシジウム微生物」という。）を培養した培養液そのもの、その培養液の濃縮液、その培養液の希釈液、あるいはその培養液から水分を除いた固形物などを用いることができるが、好ましくは培養液そのもの、またはその培養液の濃縮液もしくは希釈液が用いられる。
【００１６】
本発明において用いられる上記アウレオバシジウム培養物には、上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンをそのまま含有させることができる。その場合のβ−グルカンの含有量は、培養液そのものの質量１００ｇに対する含有量に換算して、５０〜２０００ｍｇ含有するものであることが好ましく、１００〜２０００ｍｇ含有するものであることがより好ましく、１００〜８００ｍｇ含有するものであることが最も好ましい。
【００１７】
なお、上述のβ−グルカンの含有量の決定は、例えば次のような方法で行うことができる。すなわち、培養液にアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼなどを用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルランなどのα−グルカンを除き、エタノール沈殿を行う。さらに、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンでさらに洗浄し、硫酸を加え、加水分解を行う。加水分解後、中和し、そのろ液を採取して、グルコースオキシダーゼ法によりブドウ糖を定量し、下記数式１に基づいて計算した値をβ−グルカン量とする。
【００１８】
数式１：β−グルカン（ｇ／１００ｇ）＝ブドウ糖（ｇ／１００ｇ）×０．９
【００１９】
また、β−グルカンの含有量の決定は、いわゆる糖鎖含有高分子物質（多糖）量として決定することもできる。この場合は、培養液にアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼなどを用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルランなどのα−グルカンを除き、エタノール沈殿を行う。さらに、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンでさらに洗浄したものの重量を測定することで糖鎖含有高分子物質（多糖）量とする。
【００２０】
なお、このようにして定量されるβ−グルカンは、硫酸基、リン酸基などの官能基を有するものとして定量される。したがって、このように広義の糖鎖含有高分子物質（多糖）としてβ−グルカンを定量した場合には、上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンのアウレオバシジウム培養物における含有量は、培養液そのものの質量１００ｇに対する含有量に換算して、７０〜３０００ｍｇ含有するものであることが好ましく、１４０〜３０００ｍｇ含有するものであることがより好ましく、１４０〜１１００ｍｇ含有するものであることが最も好ましい。
【００２１】
本発明において用いられる上記アウレオバシジウム微生物としては、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物であればよいが、例えば、アウレオバシジウム プルランス Ｍ−１（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−１、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１５）や、アウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４）が好適に用いられる。なお、これらの菌株が産生するβ−グルカンは、ＮＭＲ測定（１３ＣＮＭＲ：Ｖａｒｉａｎ社ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ５００型、１ＨＮＭＲ：Ｖａｒｉａｎ社ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ６００型）による構造解析で、グルコースがβ−１，３結合した主鎖からβ−１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するβ−１，３−１，６−グルカンであることが明らかとなっている。
【００２２】
上記アウレオバシジウム微生物の培養は、公知の方法（特開昭５７−１４９３０１号公報など参照）に準じて行うことができる。すなわち、炭素源（ショ糖）０．５〜５．０質量％、Ｎ源０．１〜５．０質量％、その他微量物質（例えば、ビタミン類、無機質）を加えた培地（ｐＨ５．２〜６．０）に菌を接種し、温度２０〜３０℃で２〜１４日間通気培養、好ましくは通気撹拌培養すればよい。上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンをそのまま含有させる場合、β−グルカンが生成されるにしたがって培養液の粘度が上昇し、粘性の高いジェル状になる。このようにして得られる培養液には、通常、０．６〜１０質量％の固形分が含まれており、その固形分中にはβ−グルカンが５〜８０質量％含まれている。また、β−グルカン以外にも、例えば、グルカンの作用を助ける成分であるリン、カリウム、マグネシウム、ビタミンＣなどの他の有用成分も含まれているので、β−グルカンやリン、カリウム、マグネシウム、ビタミンＣなどのアウレオバシジウム培養物の成分が調和して、本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物として、あるいは本発明に係るマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物としての効果を発揮する他、リンやカリウム、マグネシウム、ビタミンＣなどの有効成分により、β−グルカンの有する生理活性効果を効率よく発揮できる。
【００２３】
本発明においては、上記の培養によって得られる培養液をそのまま加熱または加圧加熱殺菌して用いてもよく、遠心分離などにより菌体を分離除去した後殺菌して用いてもよい。また、必要に応じて濃縮したもの、さらには乾燥したものを用いることもできる。さらに、β−グルカンなどの成分を選択的に抽出して用いることもできる。なお、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物の培養物は、増粘安定剤などの食品添加物として使用されているものであり安全性が高い。
【００２４】
本発明において、サイトカインとは、細胞が産生するタンパク質の一種であって、細胞間情報伝達を担う一群の液性因子を意味し、微量で特異的な細胞表面レセプターに作用し、細胞の増殖、分化、機能発現の調節を行う。サイトカインとしては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、トランスフォーミング成長因子およびケモカインなどを挙げることができ、具体的には、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ（ｇｌａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）−ＣＳＦ、Ｍ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）−ＣＳＦなどを、ケモカインとしては、例えば、ＣＸＣケモカイン［ＫＣ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：ＣＸＣＬ８）など］、ＣＣケモカイン｛ＭＣＰ（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１（ＣＣＬ２）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、Ｅｏｔａｘｉｎ（ＣＣＬ１１）など｝、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカインなどを、インターロイキン（ＩＬ）としては、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）、ＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などを、インターフェロン（ＩＦＮ）としては、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）としては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどを挙げることができる。なお、本発明に係るマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物が産生を促進するサイトカインは特に限定されないが、特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１８などの炎症性サイトカインの産生を促進する。
【００２５】
本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、ジェル剤、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏、クリームなどの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００２６】
その適用の方法としては、経口投与剤として調製されたものは、例えば、これを経口的に摂取して体内からその生理活性効果を発揮させることができる。また、皮膚外用剤として調製されたものは、例えば、これを患部に塗布してその生理活性効果を発揮させることができる。
【００２７】
投与すべき量は、治療目的または予防目的のちがい、投与形態、症状の強弱、患者の年齢・投与方法・投与回数・投与時期などによって適宜決定することができる。一般的な有効投与量を例示すれば、例えば、経口的に摂取する場合には、β−グルカン量換算で１日およそ０．０６〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で摂取する。
【００２８】
食品添加物として用いられる場合は、その形態は適宜選択することができ、例えば、本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物をそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。また、食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。
【００２９】
本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物は、上記アウレオバシジウム培養物以外の有効成分として、さらに、下記化合物（１）（４−Ａｍｉｎｏ−２−（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ａ，ａ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｏｌ）、または下記化合物（２）（イミキモド；１−（２−Ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ−４−ａｍｉｎｅ）を有効成分として含有するものであってもよい。
【００３０】
また、下記化合物はいずれも、自然免疫受容体の一つであるＴＬＲ７を受容体とすることがわかっており、ＮＦ−κＢを介して炎症性サイトカインの産生を促している（Ｈｉｒｏａｋｉ Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３巻、第２号、第１９６−２００頁、２００２年）が、本発明に係るアウレオバシジウム培養物は、後述の実施例で示すように、下記化合物とは異なる機構でマクロファージ貪食能を活性化し、また、下記化合物とは異なる機構でマクロファージにおけるサイトカインの産生を促進する。このことから、本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物および／またはマクロファージにおけるサイトカイン産生促進組成物がアウレオバシジウム培養物と下記化合物とを含有する場合は、マクロファージ貪食能活性化作用やサイトカイン産生促進作用において相乗的な効果を得ることができる。
【００３１】
【化３】
0005559173.tif 000004
【００３２】
【化４】
0005559173.tif 000005
【００３３】
上記化合物（１）または化合物（２）としては、市販のものを入手して用いることができる（例えば和光純薬工業株式会社製など）。投与すべき量は、治療目的または予防目的のちがい、症状の強弱、患者の年齢・投与方法・投与回数・投与時期などによって適宜決定することができる。一般的な有効投与量を例示すれば、例えば、経口的に摂取する場合には、１日およそ１〜５ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で摂取する。
【００３４】
本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物の一形態においては、癌細胞や、抗がん剤により損傷を受けまたは死滅した細胞の貪食のために適用される。具体的には、本発明に係るマクロファージ貪食能活性化組成物を抗がん剤治療中もしくは治療後の患者に投与する。これにより、自然免疫系におけるＴＬＲなどのレセプターが刺激され、その結果、マクロファージが活性化される。活性化されたマクロファージでは、癌細胞が有する表面糖鎖やタンパク質に結合するレセプターの発現が上昇する。このことで、癌細胞に対する貧食能が上がり、癌細胞減少の効果を得ることができる。
【００３５】
癌細胞としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、胆道系癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、脳腫瘍、骨肉種、頭頸部癌、神経芽細胞種などを起こす癌細胞が挙げられる。
【００３６】
抗がん剤としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、イホスファミド（イホマイド)、塩酸ニムスチン（ニドラン、シクロホスファミド（エンドキサン）、ダカルバジン（ダカルバジン）、メルファラン（アルケラン）、ラニムスチン（サイメリン）、塩酸ゲムシタビン（ジェムザール）、エノシタビン（サンラビン）、シタラビン オクホスファート（スタラシド）、シタラビン製剤（キロサイド）、テガフール・ウラシル（UFT）、テガフール・ギネスタット・オタスタットカリウム配合（ティーエスワン）、ドキシフルリジン（フルツロン）、ヒドロキシカルバミド（ハイドレア）、メトトレキサート（メソトレキセート）、メルカプトプリン（ロイケリン）、塩酸イダルビシン（イダマイシン）、塩酸エピルビシン（ファルモルビシン）、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン）、塩酸ドキソルビシン（アドリアシン）、塩酸ピラルビシン（テラルビシン）、塩酸ブレオマイシン（ブレオ）、硫酸ペプロマイシン（ペプレオ）、塩酸ミトキサントロン（ノバントロン） 、マイトマイシンＣ（マイトマイシンＳ）、エトポシド（ベプシド、ラステット）、塩酸イリノテカン（カンプト）、酒石酸ビノレルビン（ナベルビン）、ドセタキセル  水和物（タキソテ−ル）、パクリタキセル（タキソール）、硫酸ビンクリスチン（オンコビン）、硫酸ビンデシン（フィルデシン）、硫酸ビンブラスチン（エクザール）、オキサリプラチン（エルプラット）、ベバシズマブ（アバスチン）、トラツズマブ（ハーセプチン）などを例示できる。特に５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）であることが好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【００３８】
［製造例１］（アウレオバシジウム培養液の調製）
下記のようにしてアウレオバシジウム プルランスＭ−１（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１５）の培養液を調製した。【００３９】
アウレオバシジウム プルランスＭ−１の前培養液を、ショ糖１％、アスコルビン酸０．１％、米糠０．１％を含む液体培地（ｐＨ５．３）に適量接種して、２５℃、７２〜９６時間（製造バッチによって異なる）、通気撹拌培養を行った。培養終了後、この培養液を１２１℃、１５分間殺菌した。得られた殺菌後の培養液は、固形分およそ１．２質量％を含み、該固形分１００ｇ中のβ−グルカン含量は１６．７ｇであった。また、培養液そのものの質量１００ｇ中に含まれる含有量に換算して、０．２ｇ／１００ｇ含有するものであった。この培養液を０．２２μｍのフィルター(Ｍｉｎｉｓａｒｔ  Ｒ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ)で濾過滅菌し以下の試験に用いた。【００４０】
［試験例１］（ヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ−１のマクロファージ様細胞への分化方法）  以下の試験例では、ヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ−１およびヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０ 培地(１０％牛胎児血清(ＦＢＳ)、７５ｍｇ／Ｌカナマイシン、３．５μＬ／Ｌ２―メルカプトエタノール入り)で培養し、３７℃、５％、ＣＯ２の下でインキュベートを行った。【００４１】
２４穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）にＴＨＰ−１細胞（図１（Ａ）参照）を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬずつ播種し、終濃度を１６０ｎＭとなるように各穴にホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩(ＰＭＡ）（Ｗａｋｏ)を添加し、３７℃、５％、ＣＯ２の下で７２時間インキュベートすることでマクロファージ様細胞を得た（図１（Ｂ）参照）。インキュベーション後、未分化なＴＨＰ−１細胞を取り除くために滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な培地を加えて実験に供した。【００４２】
［試験例２］（５−ＦＵによる細胞障害試験）
５−ＦＵによるＪｕｒｋａｔ細胞への細胞傷害を検討するため、５−ＦＵをＭＴＴ法で検討した。２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＪｕｒｋａｔ細胞を９６穴プレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ)に入れた。そこに、５−ＦＵを終濃度０、１０、１００、１０００μＭになるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間作用させた。２３時間作用させた時点で、３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔ−ｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ(ＭＴＴ溶液) (Ｗａｋｏ)を１０μＬずつ各穴に添加し、３７℃で１時間作用させた。作用後、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、ＤＭＳＯを１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍの吸光度で測定した。テトラゾリウム塩であるＭＴＴは、細胞に取り込まれると、ミトコンドリアにある脱水素酵素の反応によって、ＭＴＴとＮＡＤＨの間に酸化還元反応が起こり、ＮＡＤＨはＮＡＤ＋に酸化され、ＭＴＴはホルマザンに還元される。このホルマザンは非水溶性であり、生成後は沈殿する。そのため、ＤＭＳＯを加えホルマザン沈殿物を溶解し、この溶液における吸光度である５７０ｎｍで測定した。細胞が生きていれば、ホルマザンが生成されるので、５７０ｎｍで測定される。その結果、図２に示すグラフが得られ、そのＩＣ５０は４５０μＭであった。【００４３】
［試験例３］（アポトーシス性Ｊｕｒｋａｔ細胞のホスファチジルセリンの露出）
５−ＦＵによるＪｕｒｋａｔ細胞の細胞傷害がアポトーシスによるものかどうかを検討した。初期アポトーシスでは、細胞膜の内側に局在していたホスファチジルセリン（ＰＳ）が外側に露出してくる。ＰＳは、マクロファージによるアポトーシス細胞の認識と貪食にも関係する分子である。このＰＳ露出を測定することで、初期アポトーシスの誘導を確認することができる。また、アポトーシス後期では、細胞膜が壊れ、内部成分が外部に漏出する。そこで、膜不透過化性の蛍光色素、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と合わせて細胞を標識することで、後期アポトーシス細胞と初期アポトーシス細胞を明確に分離することができる（図３参照）。５−ＦＵの作用濃度を２５０μＭと５００μＭで２４時間作用させた結果、２５０μＭ作用の際に多くのＰＳ露出を起こすこと、すなわち初期アポトーシスを誘導することが確認された(図４参照)。【００４４】
［試験例４］（マクロファージ様細胞の初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞に対する貪食能  その１）
試験例１の方法でマクロファージ様細胞に分化させたＴＨＰ−１細胞を２４穴プレートに用意した。そこに、アウレオバシジウム培養液を５００倍希釈になるように添加し、合計７時間インキュベーションした。【００４５】
一方、試験例２乃至３により初期アポトーシスを誘導することが明らかとなった濃度２５０μＭで、５−ＦＵをＪｕｒｋａｔ細胞に２４時間作用させ、この初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳで二回遠心洗浄した。その後４９．５μＬのＰＢＳを加え、さらに０．５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ ５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ） (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、２０分間暗室で反応させた。なお、このＴＡＭＲＡは、細胞膜と結合することによりＪｕｒｋａｔ細胞を標識することができる。【００４６】
反応後、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行い、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地を０．５ｍＬ加え懸濁した。その２５０μＬずつを、上記に用意した、アウレオバシジウム培養液を４時間作用させたマクロファージ様細胞を調製した穴に加え、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間インキュベートさせた。作用後、貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を取り除くために、各穴を滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。その後、接着しているマクロファージ様細胞を剥がすため、Ｔｒｙｐｓｉｎ処理液（ＰＢＳ−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ）を０．５ｍＬ加えて、スクレーパーを用いて剥がした。Ｔｒｙｐｓｉｎの作用をとめるために、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地を０．５ｍＬ加えた。その後、ＰＢＳで２回遠心洗浄し、９７μＬのＰＢＳを加え懸濁し、３μＬの抗ＣＤ１４抗体−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、６０分暗室で反応させた。なお、この抗ＣＤ１４抗体−ＦＩＴＣは、マクロファージ様細胞の細胞表面に発現する膜蛋白であるＣＤ１４に結合することにより、マクロファージ様細胞を特異的に標識することができる。【００４７】
反応後、ＰＢＳで２回洗浄した後、０．５ｍＬのＰＢＳを加え懸濁し、フローサイトメーターを用いて解析した。すなわち、５００倍希釈アウレオバシジウム培養液を合計７時間作用させ活性化させたマクロファージ様細胞と、何も加えていないマクロファージ様細胞とで比較した。その結果、５００倍希釈アウレオバシジウム培養液を加え活性化させたマクロファージ様細胞では、コントロールに比べ、約６倍の貪食能を示した。この結果から、５００倍希釈アウレオバシジウム培養液を加えマクロファージ様細胞を活性化させることにより、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞に対する貪食能が向上することが示された(図５参照)。【００４８】
［試験例５］（マクロファージ様細胞のポリスチレンビーズに対する貪食能）
アウレオバシジウム培養液のマクロファージ活性化能を相乗的に増強させる化合物を探索した。ここでは、マクロファージに存在する糖鎖認識受容体ＴＬＲ−７（Ｔｏｌｌ様受容体）に結合する、イミダゾキノリン誘導体である下記化合物（４−Ａｍｉｎｏ−２−（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ａ，ａ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｏｌ）（和光純薬工業株式会社製)（以下、「化合物１」という。）を検討した。【００４９】
【化５】
0005559173.tif 000006
【００５０】
試験例１の方法でマクロファージ様細胞に分化させたＴＨＰ−１細胞を２４穴プレートに用意した。そこに、終濃度５００倍希釈、１０００倍希釈したアウレオバシジウム培養液をそれぞれ添加し、４時間インキュベーションした。また、化合物１を、１ｍＭになるようにＤＭＳＯで調製し、終濃度１μＭ、１０μＭでそれぞれ添加し、４時間インキュベーションした。【００５１】
その後、各穴に終濃度２μＬ／ｍＬの直径１０μｍビーズ（商品名「Ｐｏｌｙｂｅａｄｓ ｄｙｅｄ ｖｉｏｌｅｔ」、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、３時間インキュベーションを行い、細胞にビーズを貪食させた。インキュベーション後、貪食されなかったビーズを除くために、各穴を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、２．５％ｐ−ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅを各穴に５００μＬずつ添加して４ ℃上で３０ｍｉｎ放置し、細胞を固定した。マクロファージ様細胞に貪食されたビーズの数は位相差顕微鏡で測定した。結果は Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ（ＰＩ：細胞１００個あたりで貪食したビーズの数、貪食したビーズ／マクロファージ数)で表した。【００５２】
図６に示すように、アウレオバシジウム培養液を５００、１０００倍希釈にして添加したものと、化合物１を終濃度１μＭ、１０μＭで添加したもので、ポリスチレンビーズの貪食能を測定した。その結果、５００倍希釈アウレオバシジウム培養液では、Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ（ＰＩ）が無添加のものと比べて、２．５倍の貪食能を示した。また、１μＭの化合物１でも、５００倍希釈アウレオバシジウム培養液と同様の貪食能を示した。作用濃度では、アウレオバシジウム培養液添加では、５００倍希釈について貪食能が高く、化合物１添加では１μＭについて貪食能が高くなった。【００５３】
［試験例６］（マクロファージ様細胞からのＴＮＦ−α分泌）
アウレオバシジウム培養液または化合物１によるマクロファージ様細胞貪食能の向上は、マクロファージ様細胞が活性誘導を受けた結果であると推察されたので、これを確認した。具体的には、活性誘導を受けたときに放出されるサイトカインの一種のＴＮＦ−αに関し、これがアウレオバシジウム培養液、化合物１、もしくはアウレオバシジウム培養液および化合物１を添加したマクロファージ様細胞の培養液中にどの程度分泌されるかを、常法に従いＥＬＩＳＡで測定した。【００５４】
その結果、図７に示すように、アウレオバシジウム培養液または化合物１をそれぞれ単独で添加した場合、およびアウレオバシジウム培養液ならびに化合物１を併用して添加した場合、何も添加しない場合と比較して多量のＴＮＦ−αが分泌され、マクロファージ様細胞が活性化されることが示された。特に、５００倍希釈アウレオバシジウム培養液と１０μＭの化合物１とを併用して添加した場合、および１０００倍希釈アウレオバシジウム培養液と１０μＭの化合物１とを併用して添加した場合は、顕著に多量のＴＮＦ−αが分泌されることが示された。【００５５】
［試験例７］（マクロファージ様細胞におけるサイトカイン遺伝子発現）
マクロファージ様細胞が活性誘導を受けたときに放出されるサイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８に関し、アウレオバシジウム培養液、化合物１またはアウレオバシジウム培養液および化合物１を添加したマクロファージ様細胞においてこれらのｍＲＮＡがどの程度発現するかを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲで測定した。    【００５６】
具体的には、まず、試験例１の方法でマクロファージ様細胞に分化させたＴＨＰ−１細胞をＰＢＳで２回洗浄して未分化のＴＨＰ−１細胞を取り除いた後、９群に分けてａ群、ｂ群、ｃ群、ｄ群、ｅ群、ｆ群、ｇ群、ｈ群およびｉ群とした。続いて、各群に下記のとおりの終濃度になるようアウレオバシジウム培養液および化合物１を添加して、７時間インキュベーションした。【００５７】
ａ群（コントロール）：何も添加せず
ｂ群：化合物１  １μＭ
ｃ群：化合物１  １０μＭ
ｄ群：アウレオバシジウム培養液    ５００倍希釈
ｅ群：アウレオバシジウム培養液  １０００倍希釈
ｆ群：アウレオバシジウム培養液    ５００倍希釈  ＋  化合物１    １μＭ
ｇ群：アウレオバシジウム培養液  １０００倍希釈  ＋  化合物１    １μＭ
ｈ群：アウレオバシジウム培養液    ５００倍希釈  ＋  化合物１  １０μＭ
ｉ群：アウレオバシジウム培養液  １０００倍希釈  ＋  化合物１  １０μＭ【００５８】
次に、各群をＰＢＳで洗浄した後、それぞれに１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えてよく懸濁し、５分間室温で放置した。その後、１．５ｍＬ用エッペンドルフチューブに移し、クロロホルム（Ｗａｋｏ）を２００μＬ加え、２０秒間激しく攪拌した。２分間室温で放置した後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。遠心終了後、上層を４００μＬ取り、新しい１．５ｍＬ用エッペンドルフチューブに移し、２−プロパノール（Ｗａｋｏ）を５００μＬ加え、攪拌後、室温で５分間放置した。その後、２００μＬのクロロホルムを加え、２０秒間激しく攪拌した。２分間室温で放置した後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。遠心終了後、上層を４００μＬ取り、新しい１．５ｍＬ用エッペンドルフチューブに移し、２−プロパノール（Ｗａｋｏ）を５００μＬ加え、攪拌後、室温で５分間放置した。その後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。遠心終了後、上層を捨て、沈殿に７５％エタノールを加え、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。遠心終了後、上層を捨て、２０μＬのｍｉｌｌｉＱ水で懸濁することにより、ｔｏｔａｌ ｍＲＮＡを回収した。【００５９】
続いて、各群のｔｏｔａｌｍＲＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ３．０（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、各サンプルの鋳型ｃＤＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液組成およびＲＴ−ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。【００６０】
ＲＴ反応溶液組成；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μＬ、ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ  ３．７５μＬ、１ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ  １μＬ、１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．２５μＬ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ  ０．５μＬ、ｏｌｉｇｏ ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ）  ０．５μＬ、回収したｔｏｔａｌ ｍＲＮＡ  １μＬ（０．５μｇ）
ＲＴ反応条件；４２℃で３０分の反応の後、９５℃で５分、５℃で５分の各反応を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏ Ｆｌｕｘ）を用いて１サイクル行った。【００６１】
続いて、各群の鋳型ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１８およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｃＤＮＡをそれぞれ増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。【００６２】
ＴＮＦ−αのｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＴＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣ−３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー；５’−ＡＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴ−３’（配列番号２）
ＩＬ−６のｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＴ−３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー；５’−ＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣ−３’（配列番号４）
ＩＬ−１２ＢのｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＴ−３’（配列番号５）
アンチセンスプライマー；５’−ＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号６）
ＩＬ−１８のｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号７）
アンチセンスプライマー；５’−ＴＣＧＧＡＴＴＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号８）
ＧＡＰＤＨのｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号９）
アンチセンスプライマー；５’−ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲ反応溶液組成；５×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬ、ｍｉｌｌｉＱ  ２８．７５μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ  ０．２５μＬ、センスプライマー  ０．５μＬ、アンチセンスプライマー  ０．５μＬ、各サンプルの鋳型ｃＤＮＡ  全量
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分の各反応を１サイクルとして３５サイクル行った。【００６３】
その後、定法に従いアガロースゲル電気泳動を行ってＰＣＲ反応産物の量を確認することにより、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１８およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現量を確認した。【００６４】
その結果、図８に示すように、ｂ群ではＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現量が、ｃ群ではＩＬ−６、ＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現量が、ｄ群ではＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現量が、ならびにｅ群ではＴＮＦ−αおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現量が、ａ群（コントロール）と比較して増加することが示された。また、ｆ群およびｇ群ではＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現が、ならびにｈ群およびｉ群ではＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ＢおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ発現が、ａ群（コントロール）、ｂ群、ｃ群、ｄ群およびｅ群と比較して増加することが示された。【００６５】
これらの結果から、アウレオバシジウム培養液および化合物１は、いずれもマクロファージ様細胞におけるサイトカインの産生を促進することが示された。また、アウレオバシジウム培養液および化合物１を併用した場合は、アウレオバシジウム培養液または化合物１を単独で使用した場合と比較して、より多くの種類のサイトカインの産生を促進し、また、サイトカインの産生量もより大きくなることが示された。すなわち、アウレオバシジウム培養液と化合物１とは、それぞれ異なるサイトカインの産生促進機構を有しており、併用することにより相乗効果が得られることが示された。【００６６】
［試験例８］（マクロファージ様細胞の初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞に対する貪食能  その２）  
試験例１の方法でマクロファージ様細胞に分化させたＴＨＰ−１細胞を２４穴プレートに用意した。そこに、アウレオバシジウム培養液を１０００倍希釈、また化合物１を１μＭ、さらに、アウレオバシジウム培養液１０００倍希釈および化合物１が１μＭになるように、それぞれ添加し、４時間インキュベーションした。【００６７】
一方、試験例２乃至３により初期アポトーシスを誘導することが明らかとなった濃度２５０μＭで、５−ＦＵをＪｕｒｋａｔ細胞に２４時間作用させ、この初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳで２回遠心洗浄した。その後４９．５μＬのＰＢＳを加え、さらに０．５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ ５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、２０分間暗室で反応させた。なお、このＴＡＭＲＡは、細胞膜と結合することによりＪｕｒｋａｔ細胞を標識することができる。【００６８】
反応後、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行い、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地を０．５ｍＬ加え懸濁した。その２５０μＬずつを、上記に用意した、アウレオバシジウム培養液を４時間作用させたマクロファージ様細胞を調製した穴に加え、初期アポトーシスを誘導したＪｕｒｋａｔ細胞を３時間インキュベートさせた。作用後、貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を取り除くために、各穴を滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。その後、接着しているマクロファージ様細胞を剥がすため、Ｔｒｙｐｓｉｎ処理液（ＰＢＳ−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ）を０．５ｍＬ加えて、スクレーパーを用いて葉がした。Ｔｒｙｐｓｉｎの作用をとめるために、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地を０．５  ｍＬ加えた。その後、ＰＢＳで２回遠心洗浄し、９７μＬのＰＢＳを加え懸濁し、３μＬの抗ＣＤ１４抗体−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇ)を加え、６０分暗室で反応させた。なお、この抗ＣＤ１４抗体−ＦＩＴＣは、マクロファージ様細胞の細胞表面に発現する膜蛋白であるＣＤ１４に結合することにより、マクロファージ様細胞を特異的に標識することができる。【００６９】
反応後、ＰＢＳで２回洗浄した後、０．５ｍＬのＰＢＳを加え懸濁し、フローサイトメーターを用いて解析した。その結果、１０００倍希釈アウレオバシジウム培養液に１μＭの化合物１を添加したマクロファージ様細胞では、アウレオバシジウム培養液のみ添加したマクロファージ様細胞や化合物１のみ添加したマクロファージ様細胞よりも高い貪食能を示す結果になった(図９参照)。すなわち、アウレオバシジウム培養液と化合物１とは、それぞれ異なるマクロファージの貪食能活性化機構を有していることから、これらを併用することにより、マクロファージ貪食能活性作用において相乗的な効果が得られることが示された。
【図１】
0005559173.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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