(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子を充填した粒子状無機材料を作製する方法であって、セラミック材料から選択される前記粒子状材料を、ｐＨが４と５の間の酸性範囲の水性緩衝液中で成長因子により少なくとも３０分間にわたって処理し、次いで該粒子状材料を該水性緩衝液から分離し、成長因子を含まない同じ量の該緩衝液により少なくとも１回洗浄し、
前記粒子状材料が、ヒドロキシルアパタイト、トリカルシウムホスフェート、炭酸カルシウム、酸化アルミニウムまたはそれらの混合物からなる、
方法。
【請求項２】
前記粒子状材料を、該成長因子を含まない水性緩衝液による洗浄ステップの後乾燥する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥ステップが、凍結乾燥を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水性緩衝液が、４．３〜４．７のｐＨ値を有する、請求項１、２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記水性緩衝液が、４．５のｐＨ値を有する、請求項１、２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記粒子状材料が、１０〜５００μｍの範囲の粒径および相互接続細孔構造を有する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
化学的に活性化された表面を有する粒子状材料を使用する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記化学的に活性化された表面を有する粒子状材料が、該粒子状材料を活性化剤で処理することによって得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性化剤がシランの群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７が、成長因子として使用される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法によって得ることができる粒子状材料。
【請求項１２】
骨成長促進のための医薬組成物を作製するための、請求項１１に記載の粒子状材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長因子の充填された粒子材料（粒子）を製造する方法、かくして得られた粒子、および骨物質中へのインプラント材料、特に、人工骨、関節、歯科インプラントならびにマイクロインプラント等のインプラントのために使用される金属材料またはセラミック材料の成長を改良するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工関節または人工骨のインプラントは、最近数年間に、例えば、関節異形成または関節脱臼を治療するためならびに関節位置異常による関節の磨耗に基づく疾患に対して重要度を増した。インプラントおよびその作製のために使用されるチタンもしくは金属合金などの金属ならびにセラミックスまたはテフロン（登録商標）もしくはポリラクチド等のプラスチック材料を含む材料の機能は、絶え間なく改良されてきており、その結果、インプラントは、治癒過程の成功した後は９０〜９５％の場合で１０年まで使用期間を提供することができる。
【０００３】
これらの利点および改善された外科プロセスにもかかわらず、埋め込みは、特にかかる埋め込みがインプラントに対して長く続く治癒過程と関わり、リハビリテーション処置を含む診療所および保養地における長く続く滞在を含むとき、依然として困難でありストレスを感じる診療行為である。苦痛以外に、治療の長さならびに住み慣れた環境からの孤立は、関わりをもつ患者にとっては重いストレスである。その上長く続く治癒過程は、必要な集中治療のためにサービスおよび治療法に対する高いコストの原因となる。
【０００４】
インプラントの内殖を成功させるために必要である分子レベルのプロセスについての理解は、過去数年にわたって次第に広がってきている。構造適合性ならびに表面適合性は、インプラントの組織適合性に対して決定的に重要である。より狭い意味で生体適合性は、もっぱら外観を条件とする。タンパク質は、すべてのレベルの一体化に対して重要な役割を果たす。後述のように、それらは、埋め込み手術の間に既に最初の細胞が吸着性タンパク質層上に定着するその初期層の形成によるインプラントの内殖のさらなるプロセスについて決定する。
【０００５】
生体材料とも呼ばれるインプラントと組織との間の分子の相互作用については、著しく階層的に構造化されたように見える複数の反応が起こる。最初の生物学的反応として、生体材料の表面でタンパク質の吸着が起こる。かくして形成されたタンパク質層中で、単一のタンパク質分子がその後、例えば、構造変化によって表面に存在するシグナル伝達物質に転化するか、またはタンパク質小片が触媒（タンパク質分解）反応によってシグナル伝達物質（分子合図）として供給される。
【０００６】
前記分子合図によって誘発されて、白血球、マクロファージ、免疫細胞のような複数の細胞を含み、最後に組織細胞（線維芽細胞、線維性嚢胞、骨芽細胞、骨細胞）を含む細胞の定着が、次の段階において起こる。この段階において、さらなるシグナル伝達物質のいわゆるメディエーター、例えば、サイトカイン、ケモカイン、形態遺伝子、組織ホルモンおよび実のホルモン等が重要な役割を果たす。生体適合性が得られる場合、インプラントの完全な生命体への一体化が起こり、理想的には恒久的なインプラントが得られる。
【０００７】
過去数年間になされた分子レベルの骨形成についての研究を考慮すると、シグナル伝達化学物質、いわゆる骨の成長に影響のある「ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：骨形態形成タンパク質」（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１５）が、重要性を増している。ＢＭＰ（特に、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７）は、前駆細胞の増殖および分化をして骨芽細胞にすることを達成することによって骨形成および骨折治癒機転を刺激する骨誘導性タンパク質である。さらに、それらは、アルカリ性ホスファターゼ、ホルモン受容体、タイプ１コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン等の骨特異物質の形成を発生することを助け、最後にミネラル化を助ける。
【０００８】
該ＢＭＰ分子は、それぞれの前駆細胞の３つの重要な反応、走化性、有糸分裂および分化を制御する。さらに、ＢＭＰは、骨およびその他の組織の胚形成、器官形成において重要な役割を果たし、そのために、骨芽細胞、軟骨芽細胞、筋芽細胞および血管平滑筋細胞は、標的細胞（ＢＭＰ−２による増殖の阻止）として知られる。
【０００９】
その一方で、複数のイソ型を含む１５のＢＭＰが知られている。ＢＭＰ−１を除いて、すべてのＢＭＰは、「ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ：形質転換成長因子β」（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの一部であり、それぞれの細胞の表面に特異受容体が見出されている。ラット、イヌ、ウサギおよびサルに対する欠陥治癒過程についての実験において組換え型ＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−７を上手く利用することによって示すことができたように、種に対する特異性の存在は見られない。
【００１０】
最近の技術において、骨質の成長を促進するために使用される充填材料および粒子の場に関する多数の実験が知られている。ＢＭＰ−２のヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）に対する結合についての報告は、ＢＭＰがヒドロキシルアパタイト・カラムによりクロマトグラフィーで精製できることが１９８４年にＵｒｉｓｔによって見出されたときのＢＭＰ研究の初期にさかのぼる。その同じ年に既にＵｒｉｓｔは、マウスにおいて軟骨の形成を誘発するＢＭＰとＴＣＰの凝集体について記載した（米国特許第４，５９６，５７４号）。その後２０年の内に、リン酸カルシウム（ヒドロキシルアパタイト、トリカルシウムホスフェート）のＢＭＰ−２との組合せの使用についての複数の報告が公表された。とりわけ、ＢＭＰ−２は、規定量のコラーゲンまたはヒドロキシルアパタイトと共に混合し、次にその混合物を直ちに凍結乾燥させ、凍結乾燥後に使用することが述べられた。さらなる報告においては、尿素等の変性剤の存在下で変性したｒｈ−ＢＭＰ−２のヒドロキシルアパタイトへの吸着が研究されている。そのような徹底した条件下でさえもヒドロキシルアパタイトに結合したＢＭＰ−２はほんの少量である。
【００１１】
現在のところ、ＢＭＰ−２は、「吸収性コラーゲンスポンジ」によるＩｎｄｕｃｔ  Ｏｓ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ社製）としてか、またはＯｓｓｉｇｒａｆｔ（登録商標）（Ｓｔｒｙｋｅｒ社製）の形態かのいずれかで治療的に応用される。それらの材料に共通しているのは、容積単位当たりに使用されるＢＭＰの濃度が比較的低い、すなわち、必要な容積約２ｍｌの粒子またはスポンジに対してそれぞれ１ｍｇのＢＭＰ−２であることである。アルカリ性または酸性の極端なｐＨ値あるいは中性範囲における洗剤の存在下等の非生理的条件下でのみ、より多量のＢＭＰ−２は溶解する。これらの量は、多くの場合、大きな創傷に適合させて、骨の成長に最適な刺激を与えるためのＢＭＰ−２の適用には、特に追加の骨置換物質の存在下では不十分である。ＢＭＰ−２が、このような適用形態によって生命体に供給されることは、コラーゲンへの不十分な結合と、同時に単一の早過ぎる送達相（「バースト相」）が原因となって妨げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４,５９６,５７４号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Spassova, E., Gintenreiter, S., Halwax, E., Moser, D., Schopper, C., & Ewers, R. (2007) Chemistry, 「海藻類から誘導した単相及び二相構成の骨形成材料の化学組成，超組織及び気孔率」，Materialwiss. Werkstofftech., 38, 1027-1034.
【非特許文献２】Lichtinger, T.K., Muller, R.T., Schurmann, N., Wiemann, M., Chatzinikoleidou,「遺伝子組み換え体骨形成蛋白２(rhBMP-2)の付加によるチタニウム・インプラントのオッセオインテグレンーション」 Materialwiss. Werkstofftech., 32, 937-941.
【発明の概要】
【００１４】
下記の本発明は、粒子材料、特に無機骨置換材料、例えば、ヒドロキシルアパタイト、トリカルシウムホスフェート、炭酸カルシウム、酸化アルミニウムまたはそれらの混合物、特にそれらの二相性または三相性混合物などに、ＢＭＰ−２を吸着させることによって、吸着ステップが管理されたｐＨ値において十分に長い時間にわたって行われる場合には、上記の材料と比較して、体積部分当たり増加した量のＢＭＰ、特に該固相上のＢＭＰ−２を得ることができるという観察結果に基づいている。吸着ステップの後、第２のステップが、使用した固相の体積と比較して少なくとも１０倍の液体体積による大規模な洗浄として好ましくは行われる。これによって、その液相中で溶解する多量のＢＭＰ−２を除去することを保証することができる。それによって、いわゆるバースト相の吸着したＢＭＰ−２の量の１〜２％までの大幅な減少を達成することができる。かくして、小さい区画において高用量のＢＭＰ−２を適用する選択を獲得することができる。水性緩衝液中の表面のコーティングは、ｐＨ４〜５の範囲、特にｐＨ４．５の酸性範囲か、またはｐＨ９と１１の間でｐＨ１０が好ましい弱アルカリ性の範囲のいずれかで行うことができる。さらに、その特定の材料は、生体吸収性材料である場合に有利である。
【００１５】
本発明の方法によって、その粒子から洗い落とすことができない骨成長因子の増加した量が化学結合の形としての吸着によってその表面に吸着され、それは、以下の事柄と区別しなければならない：
・ＨＡＰまたはＴＣＰとの混合／組合せ（＝混合物）、
・例えば、細孔中の包含／取込み、
・例えば、液体の凍結乾燥およびその材料中の沈殿による取込み、
・例えば、粒子または成形体がＢＭＰ溶液中に浸され、その溶液を除去するための乾燥ステップに直ちにかけられる場合に与えられる金属またはセラミックのコーティング［そのＢＭＰ−２は、表面の層として乾燥される（＝吸着ではなく接着）］。
さまざまなヒドロキシルアパタイトに対するＢＭＰ−２の結合の調査（表１）において、ＢＭＰ類、特にＢＭＰ−２は、大きな量での広い範囲にわたってリン酸カルシウムに直線的に結合し得ることが本発明者らによって見出された。
【００１６】
【表１】
0005596548.tif 000002
【００１７】
表１において、ｐＨ４．５（２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５）での吸着実験の結果が示されており、ここで、吸着／インキュベーションは、少なくとも３０分間（ｔ1/2＝１６ｄ）、好ましくは少なくとも１〜２時間（ｔ1/2＝１９ｄ）、特に好ましくは少なくとも４〜６時間（ｔ1/2＝２０ｄ）にわたって行われた。最も長い半減期の値は、１５〜１７時間（ｔ1/2＝２３ｄ）にわたるインキュベーションに対して観察された。アルカリ性範囲におけるコーティングは、ＳＤＳ等の洗剤の存在下で好ましくは行うことができる（緩衝液：１２５ｍＭホウ酸塩／０．０６６％ＳＤＳ、ｐＨ１０．０）。吸着ステップの後、その洗剤は、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５  ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4）による１０倍の材料容積中で５回洗浄することによって除去する。
【００１８】
ＢＭＰ−２の粒子材料への吸着後、その脱着を測定する。かくして、試料はそれぞれ２ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に移す。所定の間隔の後、その試料を取り出し、３×２ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、γカウンター中でカウントする。次に、それらを次の遊離間隔のために２ｍｌの新たな緩衝液中に移す。固定化したＢＭＰ−２の量は、125ヨウ素放射能標識したタンパク質を用い、γカウンター中でカウントすることにより測定する。
【００１９】
すべての骨置換材料を２０ｍＭのｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液中で所定濃度のＢＭＰ−２と共に室温で１５時間インキュベートした。脱着は、５０ｍｌのトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で測定した。ＢＭＰ−２の吸着された量のわずか１〜２％が関与するいわゆる「バースト相」における遊離の半減期時間は、０．４〜１．１日の間（図示せず）であった。ＡＰＳ：アミノプロピルトリエトキシシラン；Ａｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）（密度約０．６３ｇ／ｃｍ3；約１．３×１０4粒子／ｇ）およびＡｌｇｉｓｏｒｂ（登録商標）（密度約０．６３ｇ／ｃｍ3；約１．３×１０4粒子／ｇ）、Ａｌｇｏｓｓ  ＧｍｂＨ社、Ｗｉｅｎ；Ｂｏｎｉｔ（登録商標）Ｃｏｍｐａｎｙ  ＤＯＴ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｓｔｏｃｋ；ＮｕＯｓｓ（登録商標）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ  ＡＣＥ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏ．（Ｂｒｏｃｋｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）。
【００２０】
本発明を、添付の図面を用いてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】石灰岩石灰藻から得られたＡｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）粒子の超微細構造を示す（単位は、１０μｍに相当する。Ａｌｇｉｓｏｒｂ（登録商標）は、同じ構造を有する。（「Ｂｏｎｅ  Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌｏｇｙ」、Ｋｈｏｕｒｙ，Ｆ．ら、３４９頁、２００７年、Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｚ  Ｖｅｒｌａｇｓ−ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎから引用）。
【００２２】
【図２Ａ】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞による細胞培養におけるＡｌｇｉｓｏｒｂに吸着したｒｈＢＭＰ−２の生物活性の証拠を示すために、Ａｌｇｉｓｏｒｂを陰性対照（媒体中に可溶性ｒｈＢＭＰ−２がない）として示す。
【図２Ｂ】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞による細胞培養におけるＡｌｇｉｓｏｒｂに吸着したｒｈＢＭＰ−２の生物活性の証拠を示すために、Ａｌｇｉｓｏｒｂを陽性対照（媒体に５０ｎＭの可溶性ｒｈＢＭＰ−２を添加）として示す。
【図２Ｃ】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞による細胞培養におけるＡｌｇｉｓｏｒｂに吸着したｒｈＢＭＰ−２の生物活性の証拠を示すために、Ａｌｇｉｓｏｒｂに吸着したｒｈＢＭＰ−２（１ｇのＡｌｇｉｓｏｒｂ当たり約０．５ｍｇのｒｈＢＭＰ−２）（湿気保持）を示す。
【図２Ｄ】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞による細胞培養におけるＡｌｇｉｓｏｒｂに吸着したｒｈＢＭＰ−２の生物活性の証拠を示すために、Ａｌｇｉｓｏｒｂに吸着したｒｈＢＭＰ−２（１ｇのＡｌｇｉｓｏｒｂ当たり約０．５ｍｇのｒｈＢＭＰ−２）（乾燥）を示す。
【００２３】
【図３Ａ】ｒｈＢＭＰ−２の親水性および疎水性吸着を示す。
【図３Ｂ】ｒｈＢＭＰ−２の遊離（一次反応）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１は、その他の多孔性のヒドロキシルアパタイトと比較して大幅に改善された治癒および再吸収挙動を有する石灰岩石灰藻（Ｃｏｍｐ．ＡｌｇＯｓｓ、Ｗｉｅｎ）から得られた微細構造化したＡｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）の電子顕微鏡写真を示す。赤い石灰岩コクレアリア・オフィキナリス（Ｃｏｃｈｌｅａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の元のＣａＣＯ3が、元の微細構造は維持しながらヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）（Ａｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標））またはトリカルシウムホスフェート（ＴＣＰ）（Ａｌｇｉｓｏｒｂ（登録商標））に置き換えられる［１］。
【００２５】
図２に示されているように、Ａｌｇｉｓｏｒｂに吸着されたｒｈＢＭＰ−２の生物活性の証明は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞による細胞培養において成功であった。それにより、５×１０5個の新たにトリプシン化したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を無菌状態下で４８マイクロタイタープレートのウェル中の底部側にフィブリン接着剤により固定したＡｌｇｉｓｏｒｂ粒子上に播種し、１０％のＦＣＳを含むα−ＭＥＭ媒体（Ｇｉｂｃｏ）中でインキュベートした。６〜１２時間後、該プレート上で集密的に成長した細胞の媒体は、１％のＦＣＳを含む新しいα−ＭＥＭ媒体により置き換え、その細胞は対照のＡｌｇｉｓｏｒｂまたは吸着したＢＭＰ−２を含むＡｌｇｉｓｏｒｂ（ＡＰＳによる機能付加はしてない）上で６日間にわたって成長した。６日後、細胞が定植したそのＡｌｇｉｓｏｒｂ粒子をダルベッコのリン酸塩緩衝液で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにより固定した。アルカリ性ホスファターゼ（緑色の蛍光染料）を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００、１０  Ｍｅｇａｐｉｘｅｌ  Ｃａｍｅｒａ、Ｎｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ、励起波長３４５ｎｍ、発光波長５３０ｎｍ）を用いてホスファターゼ検出キットＥＬＦ−９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）により撮影し、測定した。
【００２６】
図３に示されているように、次のことを本発明による高密度の固相ＢＭＰ−２の特性に対して見ることができる。６．７ｍｇ／ｇのｒｈＢＭＰ−２の充填で粒子数が１ｇのＡｌｇｉｓｏｒｂ当たり約１．３×１０4個であることから、１個の粒子当たり０．５μｇのｒｈＢＭＰ−２が結合していることを計算することができる。これは、ヒツジの実験において２個の粒子（＝１μｇ）が顕著な骨誘導を生じるのに十分であることを意味する［２］。
【００２７】
本発明者らの知見によれば、そのＡｌｇｉｐｏｒｅの改良された特性は、一面で、相互関連している細孔系およびＢｉｏ−Ｏｓｓ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ社）における高度に結晶性のヒドロキシルアパタイトとは対照的な等方性（非結晶質）のヒドロキシルアパタイト粒子の存在に基づいている。トリカルシウムホスフェートを含有する種類の石灰岩石灰藻のＡｌｇｉｓｏｒｂ（登録商標）は、したがって、本研究によればＡｌｇｉｐｏｒｅと比較してさらに改良された再吸収挙動を有する。
【００２８】
その結合挙動は、ＡｌｇｉｐｏｒｅおよびＡｌｇｉｓｏｒｂのみに示されるのではなく同様の挙動がその他のヒドロキシルアパタイトにも見出すことができる。ＡｌｇｉｐｏｒｅおよびＡｌｇｉｓｏｒｂに対する特異性は、結合量が、１〜２ｍｇ／ｇ以上の範囲にあることである。そのような量は、今までの最新技術において知られていない。本発明の方法を使用することにより、粒子当たり７ｍｇＢＭＰ−２／ｇを超えるもの（２．８〜４．４ｍｇ／ｃｍ3）（高密度固相ＢＭＰ−２）を得ることが可能である。
【００２９】
本発明において使用される材料のＡｌｇｉｐｏｒｅおよびＡｌｇｉｓｏｒｂに対する情報は、参考文献［１］から得ることができる。したがって、Ａｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）：９８％ヒドロキシルアパタイトＨＡ−単相、およびＡｌｇｉｓｏｒｂ（登録商標）：８０％トリカルシウムホスフェートβ−ＴＣＰ、１９．３％ＨＡ、０．７％カルサイトＣａＣＯ3−二／三相、を本発明に従って使用することができる。後者についてはβ−ＴＣＰとＨＡのすべての二／三相の種類を、同じ電子顕微鏡構造であれば使用することができる。カルサイトは、０．３〜０．７％で存在する。
【００３０】
発明の高密度固相ＢＭＰ−２の特性に関する発明者らの研究により、６．７ｍｇ／ｇのｒｈＢＭＰ−２の充填で粒子数が１ｇのＡｌｇｉｓｏｒｂ当たり約１．３×１０4個である（図１）ことから、１個の粒子当たり０．５μｇのｒｈＢＭＰ−２が結合していると計算できることがさらに明らかになった。これは、ヒツジの実験において２個の粒子（＝１μｇ）が顕著な骨誘導を生じるのに十分であることを意味する［２］。かくして、ｒｈＢＭＰ−２は、本発明の方法の中で、インビトロでおよび臨床的に合理的かつ拡散損失なしで適用することができる。
【００３１】
本発明の高密度の固相ＢＭＰ−２の製造に関して、単位容積当たりのＢＭＰ−２含量は、水溶液中で得ることができる濃度より高い範囲でそれは生じる。好ましくは、本発明によるＢＭＰの緩衝溶液は、好ましくはＢＭＰ−２が、緩衝溶液１ｍｌ当たり０．１〜１．５ｍｇ、好ましくは緩衝溶液１ｍｌ当たり０．５〜１．５ｍｇの濃度で使用される。そのように濃縮されたＢＭＰ含有緩衝溶液が、粒子１ｇ当たりのＢＭＰのｍｇ数の意図した充填が達せられる量で該粒子に加えられる。例えば、１ｇの粒子当たり２．５ｍｇのＢＭＰの充填が意図される場合は、１ｍｌ当たり１ｍｇのＢＭＰを含有する５ｍｌの緩衝溶液を２ｇの粒子に加える。試験容積が、正味重量に関して４倍増加する場合は、１ｇの粒子当たり１０ｍｇではなく１ｇの粒子当たり７ｍｇが結合する。
【００３２】
さらに、本発明者らの未だ終了していない研究によれば、より高い量（粒子１ｇ当たり４〜５ｍｇのＢＭＰ乃至８〜１０ｍｇのＢＭＰ）を得ることができることが示されている。したがって、濃度に関して予め決めたＢＭＰ含有緩衝溶液の一定量（ｍｌでの）を使用することができる。それ故、骨成長因子を充填した本発明の粒子を適用する場合、その適用中に、ほんの数粒のＢＭＰ−ＨＡＰ組成物が適用されれば（例えば、インプラントと一緒に、または上顎洞の骨の増大中に）、骨誘導を再生するにはそれで十分である。本発明者らのインビトロでの研究は、ＨＡＰに結合したＢＭＰ−２が、生物学的に活性であることを示している。ヒツジに関しての本発明者らのさらなる研究が現在進行中である。
【００３３】
その上、意外なことに、骨置換材料としてのヒドロキシルアパタイトと組み合わせて使用され、上記のＡｌｇｉｓｏｌｂ（登録商標）中でほぼ８０％の構成要素となっているトリカルシウムホスフェートは、アミノプロピルトリエトキシシラン等の活性化剤による活性化反応を受けることができ、それによってＢＭＰ−２の粒子表面への吸着のさらなる増加が少なくとも２つの因子によってもたらされることが本発明者らによって見出された。
【００３４】
したがって、本発明者らは、１グラム当たり、約８０％のＴＣＰおよび約２０％のＨＡＰ（Ａｌｇｉｓｏｒｂ）からなる粒子材料は、９８％ＨＡＰ（Ａｌｇｉｐｏｒｅ）についてと同じ量を結合できることを示した。このことは、熟練者であれば、ＨＡＰを反応させるだけである場合、９８％のＨＡＰを有するＡｌｇｉｐｏｒｅと比較して追加の２０％のＢＭＰのみ（＝Ａｌｇｉｓｏｒｂ中のＨＡＰの分量）が結合され得ることを期待するはずであるのでより意外なことである。本発明者らは、結合したＢＭＰ−２の付加的な６０〜７０％は、変性されたＴＣＰによって結合されているものと想定している。したがって、本発明は、該粒子状材料が、骨成長因子を吸着する前の活性化手段を用いる処理によって活性化されることも開示している。前記の活性化剤は、シランの群から選択することができ、アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノアルキルアルコキシシランの使用が好ましい。かかる活性化処理は、該骨置換材料（表１参照）を、加熱したガラス装置中の５０ｍｌの乾燥トルエン中の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）の５％（ｖ／ｖ）溶液混合物中、不活性ガス雰囲気（窒素５．０）下で沸騰するまで加熱し、３．５時間還流させることによって通常は達成される。その反応が終了した後、その試料を冷却し、それぞれ１０ｍｌのクロロホルム中で３回、アセトン中で３回およびメタノール中で３回別々に洗浄する。
【００３５】
その後、そうして活性化した、特にＴＣＰ、ＨＡＰまたはそれらの混合物からなる粒子材料（表１参照）は、ｐＨ４と５の間の酸性範囲のｐＨ４．５（２０ｍＭ酢酸ナトリウムの緩衝液、ｐＨ４．５）の中、またはｐＨ９と１１の間の弱アルカリ性範囲の、ｐＨ１０（１２５ｍＭのホウ酸塩、０．０６６％のＳＤＳでｐＨ１０．０）が好ましい中のいずれかで、好ましくはＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７の骨成長因子の緩衝溶液を、少なくとも３０分（ｔ1/2＝２６ｄ）、好ましくは少なくとも４時間（ｔ1/2＝３６ｄ）および特に好ましくは１５時間（ｔ1/2＝４３ｄ）の間処理することができる。このために、その粒子状材料は、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）による化学修飾の後、水で洗浄し、その後、１．０ｍｌのＢＭＰ−２溶液が、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中、または１２５ｍＭホウ酸塩／０．０６６％ＳＤＳ緩衝液、ｐＨ１０．０中のいずれかにそれぞれ存在する小さい（２ｍｌ）反応容器中に移す。ｒｈＢＭＰ−２のその材料への吸着に対して、３つの異なるタンパク質濃度、０．１、０．２および０．３ｍｇ／ｍｌを使用する。固定されたＢＭＰ−２の量は、125ヨウ素により放射能標識したタンパク質を用いて測定する。
【００３６】
バースト相、例えば、粒子の表面に吸着されないで単にそこに留まっている過剰の骨成長因子の遊離を防ぐため、その粒子は、好ましくは、吸着ステップの後、好ましくは３回の洗浄ステップの中で、それぞれ、骨成長因子を含まない緩衝溶液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５または１２５ｍＭホウ酸塩、０．０６６％のＳＤＳ、ｐＨ１０．０）の粒子材料の１０倍の容積により洗浄する。その後、ＰＢＳ−緩衝液、ｐＨ７．４（１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）中の５回の洗浄を行った。
【００３７】
本発明の高密度の固相ＢＭＰを実現することによって、特にｒｈＢＭＰ−２を、インビボでおよび臨床的に新たな方式で合理的かつ拡散損失なしで適用することが可能である。高密度の固相ＢＭＰは、凍結乾燥後、活性度を何ら失うことなく数週間貯蔵することができることが示されている（図２に照らして）。本発明者らの最初の調査は、本発明の高密度固相ＢＭＰの貯蔵性は、１〜２年間にわたって延ばすことができることを示している。それによって、ＢＭＰの生物学的活性が維持されるが、それは、本発明者らによると、材料が無菌状態の下で好ましくは使用されることによるものとすることができる。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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