(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列で表されるペプチドを含む癌の予防又は治療用組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、N-末端及びC-末端に含まれるキャッピングモチーフ（capping  motif）により、高い塩濃度でも安定した活性を維持する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
薬学的に許容可能な担体を更に含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記癌が皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、直腸癌、前立腺癌、又は血液悪性腫瘍である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
癌の予防又は治療用組成物の製造のための配列番号１又は２のアミノ酸配列で表されるペプチドの用途。
【請求項６】
N-末端及びC-末端に含まれるキャッピングモチーフ（capping  motif）により、高い塩濃度でも安定した活性を維持する請求項５に記載の用途。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体を更に製造する請求項５に記載の用途。
【請求項８】
前記癌が皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、直腸癌、前立腺癌、又は血液悪性腫瘍である請求項５に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防又は治療用組成物に関するものであり、より詳細は下記の一般式（I）のアミノ酸配列で表したペプチドを含む癌の予防又は治療用組成物、上記ペプチドを個体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法、及び癌の予防又は治療用組成物の製造のための前記ペプチドの用途に関するものである。
(I) APKAMX1LLX2X3LLX4LQKKGI
ここで、X1,X2,X3X4は各々独立的にR又はKである。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、抗癌活性を有するペプチドに関するものである。具体的には、本発明は、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、直腸癌、及び前立腺癌をはじめとする各種癌腫（carcinoma）だけでなく、悪性血液疾患にも高い抗癌活性を示すペプチドに関するものである。
【０００３】
現在使用されている抗癌剤の大部分は、化学療法によって開発されたもので、癌の種類によって薬理作用が多様で（The pharmacological Basis of therapeutics、18:1202、1986）、抗癌剤の毒性による副作用も多いことが癌治療時の中心的問題点となっている（Wonkwang Medical Sci.3 :13-34、1987）。また、抗癌剤は、癌細胞の成長を効果的に抑制するが、時には正常組織にも浸透して正常組織、特に細胞分裂が活発な組織の細胞にも損傷を与えてしまうため、骨髄機能低下、胃腸障害、脱毛症を誘発したり、癌細胞が成長、増殖及び転移する過程で変異しながら抗癌剤に対する抵抗力が生ずる等、癌治療において深刻な問題を引き起こしている。従って、抗癌剤が持つ正常細胞に対する毒性と癌細胞の薬物抵抗性の深刻な問題を解決することの出来る効果的な抗癌剤の開発が急がれている。
【０００４】
抗生ペプチド標的物質を用いた抗癌剤の場合、既存の抗癌剤と目標物質が異なり、抗癌剤の細胞内伝達を高め、その薬効を高めることが出来るという意味で、他の抗癌剤との併用が効果的である。現在、抗癌剤市場は年間63億ドルを超えており、これに対する研究費も年間15億ドルに達している。製薬市場分析の専門機関であるデータモニターによると、2010年の治療用ペプチド/タンパク質の年間売上高は590億ドルに達する展望で、これは2001年の2倍に相当するものである。このような肯定的な展望にもかかわらず、抗菌ペプチドを用いた抗癌剤は、未だ研究段階にあり製品化されていない。従って、抗癌剤としての抗菌ペプチドの開発は、新しい抗癌剤市場を先占することが出来るものと期待される。
【０００５】
病原菌の侵入に対する自然防御機能に加えて、最近では抗菌ペプチドの別の機能も明らかになっている。特に、BMAP-28、HNP-1（β-defensin）、ラクトフェリシンB（Lactoferricin B）、LL-37、マガイニン２（magainin 2）、メリチン（Melittin）、タキプレシンI（Tachyplesin I）等の細胞膜における抗癌活性については、数多くの報告がなされている。韓国ではGaegurin 5、Gaegurin  6、Kaisin I、Kaishin II等の抗菌ペプチドが生体内で癌細胞の成長を抑制すると報告されている。これまでの報告によると、癌細胞が成長しつつある生物に抗菌ペプチドを注入した場合、癌細胞と正常細胞を区別できないという致命的な問題点があった。小型で優れた抗癌活性を有する抗菌ペプチドの抗癌剤としての使用は、新たな抗癌剤開発の到来を告げるものと期待されている。従って、癌細胞と正常細胞を選別して癌細胞のみに作用することができる抗菌ペプチド開発の必要性が継続的に求められてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、グラム陽性菌と陰性菌及びカビ菌に至る広範囲の微生物に対して高い塩濃度でも抗菌活性を維持し、その抗菌活性の程度が大韓民国登録特許第0836596号に示された従来の抗菌ペプチドより優れた抗菌ペプチドを開発した。
また、本発明者はこれらの抗菌ペプチド誘導体から癌細胞と正常細胞を選別して、通常の哺乳動物の細胞には影響を与えず、癌細胞のみを選別して作用するペプチドを究明した。具体的には、本開発者は皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、直腸癌、前立腺癌をはじめとする各種癌腫（carcinoma）だけでなく、悪性血液疾患にも優れた抗癌活性を示すペプチドの存在を確認することにより、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、下記の一般式（I）のアミノ酸配列で表されるペプチドを含む癌の予防又は治療用組成物を提供することにある。
(I) APKAMX1LLX2X3LLX4LQKKGI
ここで、X1,X2,X3及びX4は各々独立的にR又はKである。
【０００８】
本発明の別の目的は、前記ペプチドを個体に投与する段階を含む、癌の予防又は治療方法を提供するものである。
【０００９】
本発明の、更に別の目的は、癌の予防や治療用組成物の製造のための一般式（I）のアミノ酸配列で表されるペプチドの用途に関するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗癌ペプチドを含む癌の予防又は治療用組成物は、正常細胞の生存には如何なる影響も与えずに癌細胞の生存能力を低下させる優れた細胞選択性を示すため、より安全な抗癌剤の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、ペプチドの処理濃度に応じたFSF細胞の生存率を表すグラフである。
【図２】図2は、ペプチドの処理濃度に応じたHaCat細胞の生存率を表すグラフである。
【図３】図3は、ペプチドの処理濃度に応じた赤血球の生存率を表すグラフである。
【図４】図4は、ペプチドの処理濃度に応じたSK-MEL-5細胞株の生存率を表すグラフである。
【図５】図5は、ペプチドの処理濃度に応じたHeLa細胞株の生存率を表すグラフである。
【図６】図6は、ペプチドの処理濃度に応じたHCT-116細胞株の生存率を表すグラフである。
【図７】図7は、ペプチドの処理濃度に応じたNCI-H23細胞株の生存率を表すグラフである。
【図８】図8は、ペプチドの処理濃度に応じたK-562細胞株の生存率を表すグラフである。
【図９】図9は、ペプチドの処理濃度に応じたPC3細胞株の生存率を表すグラフである。
【図１０】図10は、本発明のペプチドの細胞選択性について、蛍光顕微鏡で見た写真である。
【図１１】図11は、本発明のペプチドが処理濃度に応じて正常細胞に及ぼす影響を表したグラフである。
【図１２】図12は、本発明のペプチドが処理濃度に応じて癌細胞に及ぼす影響を表したグラフである。
【図１３】図13は、ガングリオシド（ganglioside）の処理濃度に応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフである。
【図１４】図14は、フォスファチジルセリン（phosphatidylserine）の処理濃度に応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフである。
【図１５】図15は、ヘパリン（heparine）の処理濃度応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフである。
【図１６】図16は、ガングリオシドが欠如した癌細胞における、各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフである。
【図１７】図17は、本発明のペプチドNKCがガングリオシドの処理濃度に応じて、癌細胞に及ぼす影響を表すグラフである。
【図１８】図18は、本発明のペプチドNRCがガングリオシドの処理濃度に応じて、癌細胞に及ぼす影響を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一つの様態として、本発明は、下記の一般式（I）のアミノ酸配列で表されるペプチドを含む癌の予防又は治療用組成物に関するものである。
(I) APKAMX1LLX2X3LLX4LQKKGI
ここで、X1,X2,X3及びX4は各々独立的にR又はKである。
【００１３】
本発明で使用される用語、「ペプチド」とは、アミド結合（またはペプチド結合）を介して併せて接合されるアミノ酸のポリマーを意味する。本発明の目的上、癌細胞に対して高い選択性および強力な抗癌活性を有するペプチドを意味する。
好ましくは、本発明の抗癌ペプチドは、前記の一般式（I）を有し、ここにX1,X2,X3及びX4は各々独立的に塩基性アミノ酸のR又はKである。前記の一般式（I）は、X-LL-Xであるモチーフを含み、これは基本構造としてα-helix構造を有するモチーフである。またX1LLX2X3LLX4はこのモチーフが繰り返され、拡張されたα-helix構造に該当する。より好ましくは、本発明の抗癌ペプチドはアミノ酸配列がAPKAMKLLKKLLKLQKKGI-アミドの配列番号１で表されるペプチド又はアミノ酸配列がAPKAMRLLRRLLRLQKKGI-アミドの配列番号２で表されるペプチドであっても良い。
【００１４】
本発明のペプチドは、標的配列、タグ（tag）、標識残基、若しくは半減期又はペプチドの安定性を改善する等、特定の目的のために考案されたアミノ酸配列を更に含んでも良い。また、本発明のペプチドは、エフェクター分子、薬物、プロドラッグ、毒素、ペプチド、担体分子等の結合パートナーと連結されても良い。
【００１５】
本発明のペプチドは、当分野で広く公知された諸方法により調製することが出来る。詳細には、本発明のペプチド遺伝子組換えタンパク質発現システムを用いて製造するか、或いはペプチド合成のような化学的合成により試験管内で合成する方法、及び無細胞タンパク質合成法等によって製造することが出来る。
【００１６】
本発明のペプチドは、薬学的に許容可能な塩類の形態で製造することが出来る。具体的には酸、例えば、無機酸（例えば、塩酸、ハイドロ臭素酸、リン酸、硝酸、硫酸等）、有機カルボン酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸等のハロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸等）、及び酸性サッカライド、（グルクロン酸、ガラクッロン酸、グルコン酸及びアスコルビン酸）、酸性多糖類（例：ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルギニン酸）、コンドロイチン硝酸等の硫酸砂糖エステルを含む有機スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸）等を付加して塩類を形成することが出来る。
【００１７】
本発明の癌の予防又は治療用組成物に含まれる前記ペプチドは、N-末端とC-末端に含まれるキャッピングモチーフ（capping motif）により高い塩濃度でも安定した活性を維持することが出来る。即ち、配列番号1及び配列番号2で表される本発明の抗癌ペプチドは、キャッピングモチーフとして予め決められた配列を有するN-末端断片（APKAM）及びC-末端断片（LQKKGI）を含むものである。従って、前記キャッピングモチーフにより周辺の塩濃度に関係なく、ペプチド全体の二次構造の構造的安定を図ることが出来る。これらの特徴は、抗菌ペプチドが生体内で容易に分解してしまうという構造的脆弱性を補完出来るため、生理活性ペプチドの製剤化においては非常に有利であると言える。よって、本発明者は継続的な研究を通じて、優れた抗癌活性を示しつつ、正常細胞には影響を及ぼさない抗癌ペプチドを発見するに至った。配列番号1又は配列番号2で表される抗癌ペプチドを本発明では、各々NKC又はNRCと命名した。
【００１８】
本発明で使用される用語、「癌」とは、肺癌、膀胱癌、乳癌、膓癌、腎臓癌、直腸癌、肝臓癌、脳腫瘍、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、皮膚癌 （扁平上皮癌を含む）、血液悪性疾患;繊維肉腫及び横紋筋肉腫を含む癌腫;中枢神経及び末梢神経の腫瘍、神経髄芽腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む、星状細胞腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫(グリオーマ)及び神経鞘腫；悪性黒色腫（メラノーマ)、精上皮腫（セミノーマ)、奇形腫 (テラトーマ)、骨肉腫、色素乾皮症、角化棘細胞腫（ケラトアカントーマ）、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫を含むその他の腫瘍を指すことが出来る。好ましくは、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、直腸癌及び前立腺癌や血液悪性疾患を指すことが出来る。
【００１９】
本発明において使用される用語、「予防」とは、組成物の投与により癌を抑制するか、又は発症を遅延させるあらゆる行為を意味する。
【００２０】
本発明において使用される用語、「治療」とは、組成物の投与により癌を好転させるか、又は癌を好ましく変形させ得る全ての行為を意味する。
【００２１】
本発明の組成物はヒトに使用することが好ましいが、炎症性疾患又は癌が発生して本発明のペプチドの投与により癌を抑制したり、又は減少させることが出来る牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、アンテロープ（羚羊）、犬又は猫等の家畜に使用しても良い。
【００２２】
前記本発明の組成物は、下記の一般式（I）のアミノ酸配列で表されるペプチドを一個以上含むことが出来る。
(I) APKAMX1LLX2X3LLX4LQKKGI
ここで、X1,X2,X3及びX4は各々独立的にR又はKである。
【００２３】
前記ペプチドは、糖鎖化合物、脂質化合物、核酸化合物、他の種類のペプチド又はタンパク質等を含んでも良い。例えば、脂質化合物には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（POPG）、ホスファチジルグリセロール（PG）、C18飽和脂肪酸、C16不飽和脂肪酸、C18不飽和脂肪酸等がある。
【００２４】
具体的な一実施形態に従って、実験室内（in vitro）においてNKC及びNRCが正常細胞に及ぼす毒性をテストするためにMTT試験を実施した。その結果、既に抗癌活性が報告されているブホリンIIb（buforinIIb）が正常細胞に毒性を示す一方、NKC及びNRCは、正常細胞にほとんど毒性を示さないことが確認された（図1ないし図3）。また、NKC及びNRCが実験室内において各種癌細胞に及ぼす抗癌活性をMTT試験を実施して確認した。その結果、NKC及びNRCは実験室内において皮膚癌細胞、子宮頸癌細胞、肺癌細胞、直腸癌細胞、前立腺癌細胞、血液悪性細胞等を含む各種癌細胞の組織に対して非常に高い抗癌活性を示すことが確認された（図4ないし図9）。従って、NKC又はNRCを含む組成物が抗癌剤の有効成分として効果的に使用出来ることが確認された。
【００２５】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む組成物であっても良い。
【００２６】
本発明において使用される用語、「薬学的に許容可能」とは、治療効果を示すことが出来る十分な量であり、かつ副作用を起こさない程度であることを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、患者の薬剤感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、薬物の配合又は同時使用など、医学分野で公知されている要素に応じて、当業者が容易に決定出来るものである。一般的に、活性物質は１日に約5mg/kgないし10mg/kg の量を投与することが出来る。経口投与の場合は、5ないし10mg/kgの範囲が適当で、1日1回、又はそれ以上投与することが出来る。
【００２７】
本発明で使用される用語、「担体」とは、生物体を著しい刺激を与えず、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体、賦形剤、又は希釈剤をいう。
【００２８】
本発明の組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、オキシ安息香酸メチル、ヒビロキシプロピル・ベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油を挙げることが出来る。
【００２９】
本発明の組成物を投与する方法に適合した製剤は公知されており、概して膜全体を通じて薬物の移動を容易にする界面活性剤を含むことが出来る。これらの界面活性剤は、ステロイド誘導体、N-[1−（2,3−ジオレオイル）プロピル-N、N、N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）等のカチオン性脂質、又はコレステロール・ヘミスクシネート等を含む。
【００３０】
詳細には、本発明の組成物は、一般的な医薬品製剤の形態で使用することが出来る。非経口投与用の製剤としては、殺菌した水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶液、懸濁剤としては、プロピレングリコール、エチルオレエート、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、注射可能なエチルオレエート等を使用しても良い。坐剤の基剤としては、ウイテップゾ−ル（witepsol）、マクロゴール、ツイン61（tween61）、カカオバター、ラウリン脂、グリセロゼラチン等を使用しても良い。また、前記ペプチドは、生理食塩水又は有機溶剤のような薬学的に許容可能な担体と混合して使用することが出来る。また、ペプチドの安定性や吸収性を向上させるためにグルコース、蔗糖又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸又はグルタチオン等の抗酸化剤、キールレーティング剤、低分子タンパク質又はその他の安定化剤を使用しても良い。更に、本発明の組成物のペプチドは、細胞内でペプチドが生成されるように、ペプチドをコード化する核酸を含んでも良い。
【００３１】
他の様態として、本発明は、前記組成物を固体に投与して癌を予防又は治療する方法を提供する。
【００３２】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体と併せて適切な製剤に剤形化され、様々な経路で投与される。本発明において使用される用語、「投与」とは、患者に何らかの適切な方法で所定量の物質を導入することを意味し、前記組成物は所望の組織に到達できるように、一般的に如何なる経路を通じた投与も可能である。その経路とは、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、局所、鼻腔内、肺内、直腸内等を含むが、本発明はここに挙げられた経路に限定されるものではない。しかし、経口投与の場合ペプチドが消化がされるため、経口投与用の組成物は活性薬剤でコーティングされるか、胃の中での分解から保護されるように剤形化するのが好ましい。また、それらの薬学的組成物は、活性物質を標的細胞に到達させるために任意の手段により投与することが出来る。好ましい投与方法及び製剤は、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射、点滴注射等である。注射剤は、生理食塩水、リンゲル液等の水性溶剤、又は植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、エチルオレイン酸等）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール又はグリセリン）の非水性溶剤を基本にすることが出来る。また、防腐性安定剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、BHA、トコフェロール、EDTA等）、乳化剤、pH調節用緩衝剤及び/又は抗菌性の防腐剤（例えば、硝酸フェニール水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコール等）の薬学的に許容可能な担体を含むことが出来る。
【００３３】
更に別の様態として、本発明は、癌の予防又は治療剤の製造における、前記の一般式（I）のアミノ酸配列で表されるペプチドの用途を提供するものである。
【００３４】
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を例示することをその目的としており、本発明は下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
NKC及びNRCペプチドの合成及び実験室内での正常細胞の生存に及ぼす影響
【００３６】
まず、下記のアミノ酸配列を有するNKC及びNRCペプチドを合成した：
NKC：APKAMKLLKKLLKLQKKGI-アミド（配列番号1）
NRC：APKAMRLLRRLLRLQKKGI-アミド（配列番号2）
【００３７】
前記の合成されたNKC及びNRCペプチドが正常細胞上で毒性を表わすかどうかをテストするため、各々培養されたヒト繊維芽細胞（human embryo fibroblastは、FSF）、ヒトケラチン生成細胞（human keratinocyte、HaCat）及びヒト赤血球細胞（human erythrocyte）に前記の合成されたペプチドを処理した後、各細胞の生存率を測定した。
【００３８】
具体的には、1×104個のFSF及びHaCat細胞を、各々96ウェルプレートに分取し、24時間培養した。その後、前記の合成された各ペプチド、抗癌活性を有することで知られているペプチドであるブホリンIIb及び毒性がないことで知られているペプチドであるマガイニン2を各々10、25、50、100、又は200μg/mlの濃度で加え、さらに4日間培養した。次に、MTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を加えた。また、 生存細胞の数を測定するために分光光度計を用いて発色の程度を検出し、これに基づいて各細胞の生存率を算出した（図1および1b）。この時、対照群としてはPBSのみを処理した実験群を使用した。
【００３９】
一方、ヒト血液から得られた赤血球にPBSを加えて血液濃度の1,000倍に希釈し、これに前記の合成された各ペプチド、抗癌活性を有することで知られているペプチドのブホリンIIb及び毒性がないことで知られているペプチドのマガイニン2を各々10、25、50、100、又は200μg/mlの濃度で加え、30分経過した後に、赤血球の破壊の程度を質量分光測定法を用いた吸光度の差によって測定した（図3）。この時、対照群にはPBSのみを処理した実験群を使用した。
【００４０】
図1は、各ペプチドの処理濃度に応じたFSF細胞の生存率を表すグラフで、図2は、各ペプチドの濃度処理に応じたHaCat細胞の生存率を表すグラフで、図3は、各ペプチドの処理濃度による赤血球の生存率を示すグラフで、上記図1ないし図3において、（●）は、NKCを示し、（▲）は、NRCを示し、（■）は、ブホリンIIbを示し、（▼）は、マガイニン2を示し、（◆）は、PBSを示す。図1ないし図3に示されるように、所定の濃度以上の場合、各細胞の生存率を著しく低下させたブホリンIIとは異なり、本発明のペプチドは、200μg/mlの濃度においてもFSF細胞、HaCat細胞及び赤血球の生存に影響を及ぼさず、正常細胞の生存には如何なる影響も及ぼさないことが確認できる。
【実施例２】
【００４１】
NKC及びNRCペプチドが実験室内で各種癌細胞の生存に及ぼす影響
【００４２】
正常細胞の生存には如何なる影響も及ぼさないことが確認された本発明のペプチドが、癌細胞には毒性を示すかどうかをテストするために、ヒト皮膚癌細胞株（SK-MEL-5）、ヒト子宮頸癌細胞株（HeLa）、ヒト大腸癌細胞株（HCT-116）、ヒト肺癌細胞株（NCI-H23）、ヒト血液癌細胞株（K-562）及びヒト前立腺癌細胞株（PC3）に、本発明のペプチドを処理した後、各細胞の生存率を測定した。
【００４３】
具体的には、1×104個のSK-MEL-5細胞株、HeLa細胞株、HCT-116細胞株、NCI-H23細胞株、K-562細胞株及びPC3細胞株を、各々96ウェルプレートに分取し、24時間培養した後、前記の合成された各ペプチド、ブホリンIIb及びマガイニン2を各々10、25、50、100、又は200μg/mlの濃度で加え、細胞を4日間培養した。次に、MTTを加えて発色の程度を分光光度計で検出して、生存している細胞数を測定し、これに基づいて各細胞の生存率を算出した（図4ないし図9）。この時、対照群としてはPBSのみを処理した実験群を使用した。
【００４４】
図4は処理された各ペプチドの濃度に応じたSK-MEL-5細胞株の生存率を表すグラフで、図5は処理された各ペプチドの濃度に応じたHeLa細胞株の生存率を表すグラフで、図6は処理された各ペプチドの濃度に応じたHCT-116細胞株の生存率を示すグラフで、図7は、処理された各ペプチドの濃度に応じたNCI-H23細胞株の生存率を示すグラフで、図8は、処理された各ペプチドの濃度に応じたK-562細胞株の生存率を示すグラフで、図9は、処理された各ペプチドの濃度に応じたPC3細胞株の生存率を示すグラフで、前記図4ないし図9において（●）は、NKCを示し、（▲）は、NRCを示し、（■）は、ブホリンIIbを示し、（▼）は、マガイニン2を示し、（◆）は、PBSを示す。図4ないし図9に示されるように、本発明のペプチドは、すべての細胞株にIC50  5〜40μg/mlの濃度で処理される場合、全ての細胞を死滅させることが出来る。
【００４５】
従って、本発明のペプチドは、正常細胞に対しては細胞毒性を示さず、癌細胞に対しては細胞毒性を示す細胞選択性を有することがわかる。
【実施例３】
【００４６】
癌細胞に対するNKC及びNRCペプチドの細胞選択性
【００４７】
本発明のペプチドの細胞選択性を再度確認するために、各々2×105個の正常細胞であるFSF細胞及びHaCat細胞、癌細胞のSM-MEL-5細胞株、HeLa細胞株及びHCT-116細胞株を37℃で一晩培養し、これにFITC（フルオロセインチオイソシアネート）で標識された各ペプチド、ブホリンIIb及びマガイニン2を20μg/mlの濃度で加えた後1時間培養した。前記の各細胞又は細胞株をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した（図10）。
【００４８】
図10は、本発明のペプチドの細胞選択性を表すもので、蛍光顕微鏡で観察した写真である。図10に示されるように、本発明のペプチドは、正常細細胞のFSF細胞及びHaCat細胞からは殆ど検出されず、癌細胞のSM-MEL-5細胞株、HeLa細胞株及びHCT-116細胞株からは、大量に検出されたのに対し、ブホリンIIbは正常細胞のFSF細胞からは殆ど検出されず、他の正常細胞のHaCat細胞からは一定のレベルで検出され、癌細胞のSM-MEL-5細胞株、HeLa細胞株及びHCT-116細胞株からは大量に検出された。マガイニン2は、すべての正常細胞と癌細胞からは全く検出されなかったことが確認され、細胞選択性が弱いか、或いは全く有さないブホリンIIb及びマガイニン2に比べて、本発明のペプチドは、癌細胞に対する優れた細胞選択性を有することが確認された。
【実施例４】
【００４９】
NKC及びNRCペプチドの抗癌活性の濃度依存性
【００５０】
上記実施例3の結果から、本発明のペプチドは、癌細胞の細胞選択性を有することが確認された。ここでは本発明のペプチドが濃度依存的に抗癌活性を示すかどうかを確認することにする。
【００５１】
具体的には、各々1×105個の正常細胞であるFSF細胞及び癌細胞のK-562細胞株を、24時間培養してFITC（フルオロセインチオイソシアネート）で標識された前記の合成された各ペプチド及びブホリンIIbを各々0、10、または20μg/mlの濃度で加えた後、更に1時間培養し、培養された各細胞又は細胞株をフローサイトメトリーで分析した（図11および図12）。
【００５２】
図11は、本発明のペプチドが、その処理濃度に応じて正常細胞に及ぼす影響を表したグラフで、図12は、本発明のペプチドが、その処理濃度に応じて癌細胞に及ぼす影響を表したグラフである。図11および図12に示されるように、正常な細胞のFSF細胞は、本発明のペプチドの処理濃度が変化しても如何なる影響も受ないが、これに反して、癌細胞のK-562細胞株は、本発明のペプチドの処理濃度が高まるにつれて、癌細胞の反応がより強くなる。従って、本発明のペプチドは、濃度依存的に癌細胞の抗癌活性を示すことが確認された。
【実施例５】
【００５３】
NKC及びNRCペプチドの抗癌活性に影響を及ぼす細胞表面分子
【００５４】
実施例3の結果に示されるように、本発明のペプチドは、癌細胞の細胞選択性を有する。このような細胞選択性を検証するために多くの研究がなされ、その結果、細胞選択性が本発明のペプチドの電荷と癌細胞の表面電荷により成されることが予測される。 具体的には、 本発明のペプチドが全体的に陽性電荷を帯び、正常細胞の細胞膜表面は全体的に中性電荷を帯びている一方、癌細胞の細胞膜表面には、陰性電荷を有する細胞表面物質であるガングリオシド（ganglioside）、フォスファチジルセリン（phosphatidylserine）、ヘパリン（heparin）などが正常細胞の細胞膜表面よりも多く分布しており、癌細胞の細胞膜表面は全体的に陰性電荷を帯びるようになる。よって、本発明者は、両性電荷を持つ本発明のペプチドが、通常の電荷を帯びた細胞膜表面を有する正常細胞に比べ、陰性電荷を帯びた細胞膜表面を有する細胞に細胞選択性を示すことを提示する。
【００５５】
従って、癌細胞培養培地に外部からガングリオシド、フォスファチジルセリン、ヘパリン等を付加すると、本発明のペプチドは、癌細胞の細胞膜表面と培養培地に存在する外部から付加された陰性電荷を帯びた物質に分散されて、結果的には、外部から付加される物質の濃度に依存的に抗癌活性が減少すると予測される。これを確認するためガングリオシド、フォスファチジルセリン又はヘパリンを用いた競合結合測定（competitive binding assay）を遂行した。
【００５６】
具体的には、癌細胞のK-562細胞株を96ウェル−プレートに各々1×104個ずつ分取して、前記各ウェルに1ないし100μg/mlのヘパリン、フォスファチジルセリン又はガングリオシド、及び10μg/mlの本発明のペプチド、ブホリンIIbとマガイニン2を処理した後、48時間培養し、実施例1と同じ方法（MTT分析法）で細胞生存率を測定した（図13ないし図15）。
【００５７】
図13はガングリオシドの処理濃度に応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフで、図14は、フォスファチジルセリンの処理濃度に応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフで、図15はヘパリンの処理濃度に応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフで、上記図13ないし図15における（●）は、NKCを示し、（▲）は、NRCを示し、（■）はブホリンIIbを示し、（▼）は、マガイニン2を示す。図13ないし図15に示されるように、外部から付加されたガングリオシド、フォスファチジルセリン又はヘパリンによって、本発明のペプチド及びブホリンIIbを処理した癌細胞が、高いレベルの細胞生存率を示すことが確認された。
【００５８】
これらの図13ないし図15の結果から、本発明のペプチドの癌細胞に対する細胞選択性が本発明のペプチドの電荷と癌細胞の細胞膜の表面電荷によるものであるという仮定が妥当であると言える。
【実施例６】
【００５９】
ガングリオシドの合成が抑制された癌細胞に対するNKC及びNRCペプチドの抗癌活性
【００６０】
前記の実施例5の結果から、本発明のペプチドの癌細胞に対する細胞選択性が本発
明のペプチドの電荷に起因することが確認されたが、その電荷は癌細胞表面の電荷に起因することが以下の実験によって明らかになった。
【００６１】
前記の結果は、本発明のペプチドの癌細胞に対する細胞選択性が、ガングリオシド等の癌細胞の表面に存在する細胞表面分子が直接その原因となることを示唆している。従って、前記癌細胞の表面でガングリオシドが存在しない場合には、本発明のペプチドが効果的な抗癌活性を示さないと仮定することができる。この仮定を検証するために、ガングリオシド生合成の抑制剤であるPMPP（1-フェニル-2-パルミトイルアミノ-3-モノホリノ- 1-プロパノール）を用いた競合結合測定を実施した。
【００６２】
具体的には、K-562癌細胞株を96ウェル−プレートに1×104個ずつ分取して、前記各ウェルにガングリオシド生合成の抑制剤であるPMPPを各々0、2及び4μMの濃度で処理した後、10μg/mlの本発明のペプチド、ブホリンIIb及びマガイニン2を処理した後48時間培養し、実施例1と同じ方法（MTT分析法）で細胞生存率を測定した（図16）。
【００６３】
図16はガングリオシドが欠乏した癌細胞におけるPMPPの処理濃度に応じた各ペプチドの抗癌活性の変化を表すグラフで、（●）は、NKCを示し、（▲）は、NRCを示し、（■）は、ブホリンIIbを示し、（▼）は、マガイニン2を示す。図16に示されるように、ガングリオシド生合成抑制剤の濃度が増すことによって癌細胞内のガングリオシド生合成が抑制され、それに伴って本発明のペプチド及びブホリンIIbを処理した癌細胞の生存率が上昇した。これは、癌細胞の細胞膜に存在するガングリオシドの含有量が減少するに従い、本発明のペプチド又はブホリンIIbの細胞選択性が低下し、結果的に抗癌活性が低下することを示唆するものである。
【００６４】
従って、本発明のペプチドの癌細胞に対する細胞選択性が、本発明のペプチド電荷と癌細胞の細胞膜の表面電荷によって成されることは明らかである。
【実施例７】
【００６５】
NKCおよびNRCペプチドの抗癌活性に対するガングリオシドの抑制効果
【００６６】
実施例5及び6の結果から、本発明のペプチドの抗癌活性は、癌細胞の細胞膜表面に存在するガングリオシドが直接影響することが確認されたが、フローサイトメリー（flow cytomerty）を利用して、再度これを確認した。
【００６７】
具体的には、1×105個のK-562癌細胞株を各々24時間培養し、これにFITC（フルオロセインチオイソシアネート）で標識された本発明のペプチド（20μg/ml）と0、5、または20μg/mlのガングリオシドを処理した後、更に1時間培養し、培養された各細胞株をフローサイトメリーで分析した（図17及び図18）。この時、対照群として、本発明のペプチド及びガングリオシドを処理せずに、培養した細胞株を使用した。
【００６８】
図17は、本発明のペプチドNKCがガングリオシドの処理濃度に応じて、癌細胞に及ぼす影響を表したグラフで、図18は、本発明のペプチドNRCがガングリオシドの処理濃度に応じて癌細胞に及ぼす影響を示表したグラフである。図17及び図18に示されるように、付加されたガングリオシドの処理濃度が増すにつれて、本発明のペプチドの抗癌活性がより抑制されることがわかる。これらの結果は、癌細胞の細胞膜に存在するガンリオシド及び外部から付加されたガングリオシドが、本発明のペプチドに競争的に作用し、それに応じて本発明のペプチドの抗癌活性が外部から付加されたガングリオシドの濃度に依存的に減少することを示している。
【００６９】
従って、本発明のペプチドの抗癌活性が、癌細胞の細胞膜表面に存在するガングリオシドから直接影響を受けていることが再度確認出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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