(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量で０．５％〜５％のヒアルロン酸と生理学的に許容可能なキャリヤー流体とを含んでなる、単相ヒドロゲルの形態で皮下または皮内注射可能な移植片混合物であって、
ヒアルロン酸の５０重量％〜９５重量％が架橋ゲルの形態であり、
ヒアルロン酸の５重量％〜５０重量％が遊離形態またはヒアルロン酸の生理学的に許容可能な１種の塩の形態であり、分子質量が５００〜２８００ｋＤａであり、
生理学的に許容可能なキャリヤー流体が非発熱性の滅菌等張緩衝液であり、架橋ヒアルロン酸ゲルの重量と、遊離ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の生理学的に許容可能な１種の塩の重量の比が１：１〜１：０．０５であることを特徴とする、移植片混合物。
【請求項２】
架橋ヒアルロン酸から構成されるゲルの粘度が、２００〜２０００Ｐａ・ｓである、請求項１に記載の注射可能な移植片混合物。
【請求項３】
架橋ゲルを構成するヒアルロン酸の分子質量が、１０００〜６０００ｋＤａである、請求項１または２に記載の注射可能な移植片混合物。
【請求項４】
分子質量が２〜８０ｋＤａであるコンドロイチン硫酸を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物。
【請求項５】
遊離ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の生理学的に許容可能な１種の塩が、架橋ヒアルロン酸ゲルの内部に均質に分布している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物。
【請求項６】
皮膚化粧品で用いられる少なくとも１種類の他の活性物質を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物。
【請求項７】
皮膚化粧用の活性物質が、ビタミン、酸化防止剤、無機塩、防腐剤およびコンドロイチン硫酸から選択される、請求項６に記載の注射可能な移植片混合物。
【請求項８】
酸化防止剤がマンニトールである、請求項７に記載の注射可能な移植片混合物。    
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含んでなる、薬剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含んでなる、皺、小皺、皮膚陥凹および／または瘢痕を塞ぐことに使用するための薬剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含んでなる、皮膚の酸化防止活性を刺激しおよび／または皮膚老化を防止することに使用するための薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の移植片混合物を含んでなる、コラーゲンＩＩＩ／コラーゲンＩ比をより若い組織で測定した値に維持しおよび／または回復することに使用するための薬剤。
【請求項１３】
注射器形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含む、キット。
【請求項１４】
１）ヒアルロン酸を塩基性流体に添加し、
−  膨潤し、低速攪拌下で均質化し、熱架橋し、
−  ｐＨ約７の緩衝液中で等張化剤（iso-osmolarizing agent）を添加することによって架橋ゲルを中和および膨潤し、
−  架橋剤を除去する
工程によって架橋ゲルを調製し、
２）ｐＨ約７の等張性（iso-osmolar）緩衝液にヒアルロン酸を添加し、
−  膨潤させる
ことによって遊離ヒアルロン酸ゲルを調製し、
３）工程１）で得た架橋ゲルと、工程２）で得た遊離ヒアルロン酸ゲルとを混合し、
４）任意に脱気し、および場合によってはボトルまたは注射器へ包装し、次いで滅菌する
の工程を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮下または皮内に注射可能なヒアルロン酸を基剤とする移植片（implant）に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸形態または塩形態（ヒアルロン酸塩）でのヒアルロン酸（ＨＡ）は、細胞外マトリックスの主要成分である。これは、特に軟骨のような「硬質」と呼ばれる組織に存在するコンドロイチン硫酸のようなグリコサミノグリカンとは異なり「軟質」と呼ばれる結合組織に含まれている。ヒアルロン酸は、このように皮膚にかなりの量が見出される。
【０００３】
ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコースアミンの反復単位から構成される線状の非硫酸化グリコサミノグリカンである（Tammi R., Agren U.M., Tuhkanen A.L., Tammi M. 「皮膚におけるヒアルロナン代謝（Hyaluronan metabolism in skin）」. Progress in Histochemistry & Cytochemistry. 29(2): 1-81, 1994）。
【０００４】
正常な皮膚では、ＨＡは、本質的には皮膚の繊維芽細胞と表皮のケラチノサイトによって合成される（Tammi R., 上記引用）。負電荷を有する残基により、ＨＡは、揚水ポンプの役割を行い、皮膚の弾力性を保持することができる。ＨＡは、結合組織の栄養分、ホルモン、ビタミンおよび無機塩の拡散の制御および炎症反応を誘発することができる代謝廃棄物の浄化に主要な役割を有する。年齢と共に、ＨＡの量およびその重合度は減少し、結合組織に保持される水の量は減少する。次いで、皮膚は老化過程をたどり、繊維症の増加と弾性繊維含量の低下をきたす。正常なヒトの皮膚では、ＨＡは高分子量ポリマーの形態で存在する（６００，０００〜１，０００，０００Ｄａ）。皮膚におけるＨＡの生理学的分解は、（ｉ）ケラチノサイトによるインターナリゼーション、および（ｉｉ）ヒアルロニダーゼによる中程度断片（６０，０００〜３００，０００Ｄａ）への細胞内断片化、によって起こる。断片化したＨＡはケラチノサイトによって放出され、基底膜を通り、直接リンパ管に放出される（Tammi R. et al., 上記引用）。
【０００５】
皮膚科学におけるヒアルロン酸（ＨＡ）の役割は、創傷治癒および水分補給の役割など多くの分野で周知である。ヒアルロン酸は、大抵は結合タンパク質、特に膜貫通受容体ＣＤ４４とのその相互作用を介して作用する（Tool B.P. 2001, Sem. Cell. Devel. Biol. 12: 79-87, Liao Y-H., Stuart A.J., Drug Delivery, 12: 327-342, 2005）。この受容体の活性化は、形態発生、細胞増加および増殖、脈管形成および細胞移動における役割を介して発現される（G. Weindl, M. Schaller, Skin Pharm. Physiol. 2004; 17; 207-213）。文献に記載のデータは、これらの様々な作用が細胞環境、ヒアルロン酸の分子量およびその濃度によって変化することを示唆している。例えば、高分子量は脈管形成を阻害するが、オリゴ糖はそれを刺激する。
【０００６】
日本国特許出願である特開平１１−２７９０４２号明細書には、皮膚の弾力性を保持しかつ角質化を回避することができる硫酸化ヒアルロン酸断片（ＨＡＦ）（分子質量１〜５０ｋＤａ）の関連作用が示されている。
【０００７】
ＨＡ断片（分子質量５０〜７５０ｋＤａ）について行った最近の研究は、ケラチノサイトによるヒアルロン酸合成の増加が関連的に示されている（フランス国特許出願第2 865 651号明細書、ＷＯ２００５／０８２３２７号）。この増殖活性は精確な分子量のＨＡＦによって誘発され、これより高いまたは低い分子量では活性は見られない。
【０００８】
化粧品学の分野では、ヒアルロン酸を基剤とする多数の注射可能な製品が存在している。メソセラピーでは、ビタミン、酸化防止剤、無機塩またはヒアルロン酸の溶液が用いられている。ビタミンは、細胞代謝を刺激して維持するために存在しており、従ってコラーゲン産生を高め、酸化防止剤は老化と闘い、無機塩は細胞の酵素活性には必須である。ヒアルロン酸の役割は、皮膚の容積と水分補給を維持し、フリーラジカルによる分解に対して防御スクリーンの創出を可能にすることである（H. Trommer, S. Wartewig, Int. Journ. Of Pharm. 254 (2003) 223-234）。十分な濃度では、ヒアルロン酸は細胞増殖とコラーゲンの改良合成に最適な環境をもたらす。
【０００９】
皮膚および表皮においてフリーラジカルを生成する酸化的ストレスは、皮膚老化や皺、小皺および組織の弛みの出現に関与している。
【００１０】
その上、フリーラジカルはイン・シテューでの（その場での(in situ））ヒアルロン酸の解重合にも関与しており、これは組織の弛みや未成熟な老化の一因ともなっていることも示されている（Mendoza G., et al, Carbohydrate Research 342, 2007, 96-102）。
【００１１】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、組織の構造および調節的役割を有する動的構造である。ＥＣＭはコラーゲンおよびエラスチン基本媒質（主として、水、無機塩およびプロテオグリカン）からもなっている。このマトリックスは、皮膚に緊張状態と、堅さ、弾力性および張性の機械的特性を与える。
【００１２】
コラーゲン高分子は、共有および水素結合によって連結された３本のポリペプチド鎖から形成された繊維タンパク質である。１９種類のコラーゲンから知られており、これらの半数は皮膚に存在する。皮膚コラーゲンの大多数は、繊維性コラーゲンＩ、IIIおよびＶ型に属する。
【００１３】
十代後半の若者（young adult）では、皮膚の組成は８０％のＩ型コラーゲンと２０％のIII型コラーゲンであるが、この比率は老化の結果として年齢と共に変化する。
【００１４】
エラスチンは皮膚中の繊維に組織化されたタンパク質であり、それらは皮膚に弾力性と柔軟性の性質を与える。これらのエラスチンは、疎水性のアミノ酸に富んでいる。
【００１５】
ＥＣＭの分解は、創傷治癒、胚発生または脈管形成などのいくつかの生理学的過程中、並びに関節炎、アテロームまたはアテローム性硬化症および実際に転移の形成を伴う腫瘍進行期中にある役割を演じている（Fisher et al, 1997. N. England J. Med., 337, 1419-28; Shapiro, 1998. Current Oponions in Cell Biology, 10, 602-608）。
【００１６】
ＥＣＭの成分は、主としてマトリックスメタロプロテイン（matrix metalloproteins）またはＭＭＰと呼ばれるエンドペプチダーゼ酵素によって分解される。これらのＭＭＰは創傷治癒過程に積極的に寄与し、皮膚の弛緩および皮膚老化の最初の徴候である皺の出現の一因でもある。ＭＭＰファミリーは約２２の酵素から構成され、それらが分解する基質に関する特異性によって識別される。
【００１７】
ＭＭＰ−１または間質コラゲナーゼは、主にIII型繊維性コラーゲンだけでなく、Ｉ、II、ＶII、ＶIIIおよびＸ型コラーゲンのトリプルへリックスを分解する。
【００１８】
ＭＭＰ−３は、フィブロネクチンおよびラミニンのような糖タンパク質、いくつかのプロテオグリカン、エラスチン、ゼラチンおよびコラーゲンＩＶおよびＶを分解する。これらの２種類のＭＭＰは、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞のいずれによっても発現される。
【００１９】
皺塞ぎ（filling of wrinkles）の分野では、化学的に架橋したＨＡゲルを皮内に注射して、皺によって生じた陥凹を塞ぐ。架橋により、皮膚内部の生成物の持続性を増加させることができる。従って、生成物をそれぞれのヒトの遺伝子プロフィールに従って精確に投与すると、生成物は４−６または８ヶ月で充填することができる。次いで、これは真皮に完全に再吸収される。
【００２０】
ＨＡまたは架橋ＨＡに基づくこのようなゲルは、皺から生じる皮膚の陥凹における機械的充填効果によってこの皺を減少させることができる。これらの生成物はこの機械的効果を付与されているだけであり、弾力性および堅さのような皮膚の機械的特性の保持に本質的な皮膚老化およびＥＣＭの分解に関する予防的または治癒的な任意の治療にはいずれにしても寄与しない。このような移植片が皺または小皺を根絶することができる場合には、それらは効果を生じるが、この効果は経時的に制限され、かつＥＣＭによって表されるその維持構造に関しては皮膚の本質的老化の影響を部分的にしか遮断しない。
【００２１】
これまでに、いくつかの生成物がこの同じ用途に用いられてきた。ゲルまたはシリコーン油は用いやすいが、注入点の直ぐ下に位置している組織に移行する不都合をもたらす。このようにして、慢性的炎症現象またはアレルギー反応が生じている。更に、シリコーンは生物分解性ではなく、肝臓のようなある種の臓器に蓄積する。ポリマー粒子の様々な懸濁液も提案されてきたが、ほとんどは拒絶反応、感染症または炎症を引き起こした。最後に、コラーゲン懸濁液は、近年に提供されてきた。しかしながら、コラーゲンは比較的速やかに再吸収され（１〜３ヶ月）、一般にウシまたはブタ起源であったその起源により、ある種のアレルギー反応を引き起こした。
【００２２】
皺の充填作用を行い、真皮および表皮を活性化し、上記の不利益を提供しないまたは遙かに目立たないやり方で皮膚老化に伴う細胞老化の過程の制限に寄与することができ、全体的に実行が簡単で一層容易な注射可能な移植片を有する必要がある。
【００２３】
本発明は、重量で０．５％〜５％、好ましくは０．５％〜４％、更に好ましくは２％のヒアルロン酸を含んでなる、単相ヒドロゲル（monophasic hydrogel）の形態で皮下または皮内注射可能な移植片であって、
ヒアルロン酸の５０％〜９５％、好ましくは６０％〜９０％、更に一層好ましくは８５重量％が架橋ゲルの形態であり、
ヒアルロン酸の５％〜５０％、好ましくは１０％〜３０％、更に一層好ましくは１５重量％が遊離形態またはＨＡの生理学的に許容可能な塩の１つの形態であり、分子質量が５００〜２８００ｋＤａであり、好ましくは７５０〜２６００ｋＤａであり、更に好ましくは８００〜２５００ｋＤａであり、更に一層好ましくは１０００〜１５００ｋＤａであり、
生理学的に許容可能なキャリヤー流体において、架橋ヒアルロン酸ゲルの重量と遊離ヒアルロン酸の重量の比が１：１〜１：０．０５であることを特徴とする、移植片に関する。
【００２４】
本発明の特定の態様では、移植片は、約８０％の架橋ヒアルロン酸と約２０％の遊離ヒアルロン酸を含んでなることがあり、これは主として小皺の治療の目的で本発明による移植片の応用に関してである。深い皺の治療の場合には、架橋ヒアルロン酸の量は、好ましくは約８５％であり、遊離ヒアルロン酸の量は約１５％となる。
【００２５】
本発明に関して、ヒアルロン酸またはＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの反復単位から構成される非硫酸化線状グリコサミノグリカンとして定義される。
【００２６】
単相ヒドロゲルは、単一の均質相のヒドロゲルを表す。
【００２７】
生理学的に許容可能なヒアルロン酸塩は、詳細にはナトリウムおよびカリウム塩、並びにそれらの混合物を表す。好都合には、その塩はナトリウム塩である。
【００２８】
好都合には、本発明による架橋ヒアルロン酸からなるゲルは、粘度が２００〜２０００  Ｐａ・ｓであり、更に詳細には５００〜１８００Ｐａ・ｓであり、更に一層詳細には１０００〜１８００Ｐａ・ｓである。
【００２９】
深い皺の治療を目的とする、すなわち８５％の架橋ヒアルロン酸を含んでなる移植片の場合には、後者の粘度は約１０００〜１５００Ｐａ・ｓであり、詳細には約１２００Ｐａ・ｓである。主として軽度の皺用の移植片の場合には、従って、架橋ヒアルロン酸は少なめに加えられ、約８０％の架橋ヒアルロン酸が用いられ、このような移植片の粘度は約２００〜５００Ｐａ・ｓ、更に詳細には約３５０Ｐａ・ｓに設定される。
【００３０】
本発明において、上記粘度は、０．０１ｓ−１の剪断速度に対して測定した値に対応する。
【００３１】
好都合には、本発明によるゲルを構成する架橋ヒアルロン酸は、分子質量が１０００〜６０００ｋＤａであり、更に好都合には１０００〜４０００ｋＤａである。
【００３２】
本発明の好都合な態様によれば、注射可能な移植片はコンドロイチン硫酸をも含む。
【００３３】
好都合には、コンドロイチン硫酸の量は、総重量の０．０５％〜５重量％である。
【００３４】
好都合には、コンドロイチン硫酸は、分子質量が２〜８０ｋＤａであり、更に好都合には２０〜５０ｋＤａである。
【００３５】
本発明による移植片は、様々な通常の添加剤を含むことがある。例えば、色素、着色含量、植物油、増粘剤、ｐＨ調節剤、および浸透圧調節剤を挙げることができる。
【００３６】
遊離ヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩は、好都合には架橋ヒアルロン酸ゲル中に均質に分布している。
【００３７】
キャリヤー流体は、好都合には非発熱性の滅菌等張緩衝液である。
【００３８】
本発明による注射可能な移植片は、好都合には皮膚化粧品に用いられる少なくとも1種類の他の活性物質をも含む。
【００３９】
好都合には、皮膚化粧用の活性物質は、ビタミン、酸化防止剤、無機塩、防腐剤およびコンドロイチン硫酸から選択される。
【００４０】
本発明の特定の態様では、注射可能な移植片は、皮膚のレベルで酸化防止剤として作用し、酸化性ストレスにより皮膚内部に生じたフリーラジカルによって誘発される解重合からＨＡを保護するのに寄与するマンニトールを含んでいる。実際に、マンニトールとＨＡの会合は、フリーラジカルによって誘発された損傷からの保護を向上させるものとして報告されている（Belda et al, 2005, J. Cataract Refract. Surg., 31: 1213-1218）。従って、本発明の一態様は、上記で定義されかつマンニトールを酸化防止剤として含む注射可能な移植片を提供することである。
【００４１】
本発明のもう一つの態様は、本発明による注射可能な移植片内でマンニトールを用い、皮膚をフリーラジカルから保護しおよび／またはそこに含まれるヒアルロン酸の解重合を制限することである。
【００４２】
従って、本発明は、皮膚をフリーラジカルから保護しおよび／または皮膚のヒアルロン酸の解重合を制限しおよび／または皮膚老化を予防することを目的とする移植片を製造するための、マンニトールのような酸化防止剤の存在下における分子質量が５００〜２８００ｋＤａ、好ましくは７５０〜２６００ｋＤａ、更に好ましくは８００〜２５００ｋＤａ、更に一層好ましくは１０００〜１５００ｋＤａの遊離形態またはその生理学的に許容可能な塩の１つの形態のヒアルロン酸の使用にも関する。
【００４３】
本発明による移植片は、皮膚表面、中間または深層に注入される。
【００４４】
この移植片は、注入時に、細胞増殖およびコラーゲン新合成を促進することによって繊維芽細胞の増加を引き起こすことができる利点を有する。次いで、繊維芽細胞の活性化によって、細胞外マトリックスの改造に関与する機構が調節され、これは皮膚の活性化によって発現される。
【００４５】
本発明による移植片は、皮膚の陥凹を機械的に塞ぐことによって皺を減少させる直接および即時効果、およびコラーゲン合成の刺激およびＭＭＰの調節による細胞再生の長期間にわたる間接的効果を得るという二重の利点を有する。
【００４６】
架橋ヒアルロン酸は機械的充填効果に直接的に寄与し、その架橋した性質により、非架橋HAより長期間にわたって続く方法でこのような効果を得ることかできる。
【００４７】
その上、本発明による移植片に含まれるＨＡは、ＭＭＰ−１の過剰発現並びにコラーゲンIIIの過剰発現を阻害する。ＭＭＰ−１についてのこの調節作用の他に、遊離ヒアルロン酸は、皮膚の堅さおよび弾力性の機械的特性の維持に本質的な構造であるＥＣＭの構造喪失および破壊に寄与する。
【００４８】
更に、コラーゲンIII／コラーゲンＩ比は皮膚老化中に増加することも示されている（Weber et al, 1984, J. Invest. Dermatol, 82, 156-60）。本発明に関連して、本発明による移植片で用いられる遊離ＨＡの小部分がＩ型コラーゲンの発現に影響することなくIII型コラーゲンの発現を阻害することが観察されたことを知れば、本発明による移植片はコラーゲンIII／コラーゲンＩ比を若い組織で測定した比に回復することができることが合理的に考えられる。
【００４９】
従って、本発明の目的は、コラーゲンIII／コラーゲンＩ比を保持しおよび／または若い組織で測定した比に回復することを目的とする薬剤を製造するための本発明による移植片の使用である。
【００５０】
分子質量が５００〜２８００ｋＤａの遊離ＨＡが架橋ＨＡと会合すると、直接的に皮膚が水和し、容積が保持される。更に、主として遊離ＨＡの存在による皮膚の繊維芽細胞増加が誘発され、この繊維芽細胞増加は架橋ＨＡゲルのイン・ビボでの分解が進行するに従って経時的に延長される。
【００５１】
本発明による移植片は、繊維芽細胞の刺激を誘発し、ＭＭＰの阻害によるＥＣＭの分解を阻害し、後者を若い組織で見られるものに相当する状態へ指定することによりコラーゲンの合成を調節することができる遊離ＨＡ分子を含む架橋ＨＡからなる三次元メッシュとして表すことができる。
【００５２】
これらの遊離ＨＡは、注入後の数週間および数ヶ月間の架橋ＨＡマトリックスの経時的分解によるだけ受動拡散によってこの三次元架橋ＨＡマトリックスから徐々に放出される。この連続的放出により、数週間にわたる上記マトリックス内の生物学的分解から保護し、このようにして単独で注入したときより長期間にわたってその作用を発揮することができるこれらの遊離ＨＡ分子を介してイン・シテューでの細胞刺激によるこの若返り作用が可能になる。
【００５３】
従って、本発明は、皺を塞ぎ、皮膚の細胞活性を高めおよび／または皮膚の堅さおよび弾力性の機械的特性を維持することを目的とする皮下移植片を製造するための、架橋ヒアルロン酸ゲル中に分布した分子質量が５００〜２８００ｋＤａ、好ましくは７５０〜２６００ｋＤａ、更に好ましくは８００〜２５００ｋＤａ、更に一層好ましくは１０００〜１５００ｋＤａの遊離形態またはその生理学的に許容可能な塩の１つの形態のヒアルロン酸の使用にも関する。
【００５４】
従って、本発明による移植片は、膨張して皺を新しい形にする架橋ゲルの機械的効果と遊離ＨＡの生物学的作用を併せ持っている。
【００５５】
本発明は、上記したような注射可能な移植片を含む注射器の形態をしたキットにも関する。
【００５６】
本発明は、薬剤としての上記した移植片にも関する。
【００５７】
本発明は、このような移植片の皮下注射を含んでなる、皺、小皺、皮膚陥凹および／または瘢痕を塞ぐための上記した注射可能な移植片の使用にも関する。
【００５８】
本発明による注射可能な移植片は、表皮および真皮の代謝を刺激しおよび／または表皮の細胞活性を高めることを目的とした薬剤の調製に用いることができる。
【００５９】
本発明による注射可能な移植片は、真皮の酸化防止活性を刺激しおよび/または皮膚老化を防止することを目的とした薬剤の調製にもちいることができる。
【００６０】
本発明は、本発明による少なくとも１種類の注射可能な移植片を注入することを含んでなる、皺および／または小皺を塞ぐための化粧方法にも関する。
【００６１】
本発明は、上記した注射可能な移植片の調製方法にも関する。これは、当業者に知られている任意の手法によって、例えば、ジエポキシ、詳細にはブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）または１，２，７，８−ジエポキシ−オクタンによって調製することができる。塩基性媒質での架橋によれば、例えば４５〜５５℃の水浴中１．５〜６時間の架橋については、ジエポキシ濃度はヒアルロン酸に関して５〜１５％の間で変化することができる。次いで、架橋ゲルを、当業者の古典的手法、すなわち脱イオン水浴、アルコール沈澱、透析などによって精製して、微量の残留架橋剤を除去する。この精製ゲルに、適当な緩衝液中で予め水和した適当な分子量のＨＡを加える。完成した生成物を最終的に脱気し、注射器または任意の他の適当な容器に入れ、オートクレーブ処理によって滅菌する。
【００６２】
本発明による好都合な手順は、
１）ヒアルロン酸を塩基性流体に添加し、
−  膨潤し、低速攪拌下で均質化し、熱架橋し、
−  ｐＨ約７の緩衝液中で等張化剤（iso-osmolarizing agent）を添加することによって架橋ゲルを中和および膨潤し、
−  架橋剤を除去する
工程によって架橋ゲルを調製し、
２）ｐＨ約７の等張性（iso-osmolar）緩衝液にヒアルロン酸を添加し、
−  膨潤させる
ことによって遊離ヒアルロン酸ゲルを調製し、
３）工程１）で得た架橋ゲルと、工程２）で得た遊離ヒアルロン酸ゲルとを混合し、
４）任意に脱気し、および場合によってはボトルまたは注射器へ包装し、次いで滅菌する
工程を含んでなる。
【００６３】
好都合には、滅菌後のゲルのｐＨは約７であり、浸透圧モル濃度（osmolarity）は約２５０〜３５０ｍＯｓｍであり、好ましくは３００〜３２０ｍＯｓｍである。
【実施例】
【００６４】
本発明を、下記の実施例によって非制限的に説明する。
【００６５】
実施例１：
健康な繊維芽細胞と、
老化繊維芽細胞（Ｈ２Ｏ２による酸化的ストレスによる）
についての様々な分子質量のＨＡ活性の特性決定
ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）は、コラーゲンＩおよびIIIのような繊維性コラゲナーゼのトリプルへリックスを分解する間質コラゲナーゼである。皮膚では、それは繊維芽細胞とケラチノサイトによって発現され、分泌される。ＭＭＰ−１は老化に関与している。実際に、老化の際のその過剰発現は堅さおよび弾力性の喪失および皺の出現に関係している可能性がある。老化がＨ２Ｏ２によって誘発されるときには、繊維芽細胞においてＭＭＰ−１の大きな増加が見られる。従って、この過剰産生を減少させることができる積極的な原理物質は、「老化防止」（anti-aging）特性を有する。
【００６６】
繊維芽細胞は、若い患者の手術室における残りの皮膚から得た。試料を、ＰＢＳとエタノールで洗浄した。皮膚を小片状に切り分け、培養皿に振り分け、繊維芽細胞の増殖に好ましい培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＳＶＦ）に浸漬した。プリモシンをこの培地に加えた。後者は、抗生物質、抗真菌性および抗マイコプラズマ薬である。培養皿をインキュベーターに入れた。
【００６７】
老化現象を誘発するため、繊維芽細胞を培養皿に播種した。２４時間後、試験を行う活性物質を適当な濃度でＤＭＥＭに加える。２４時間のインキュベーションの後、細胞に酸化ストレスを施す。７５μＭ  Ｈ２Ｏ２  ＰＢＳ溶液中で、３７℃にて２時間インキュベーションした。細胞の老化現象を誘発する急性ストレスが伴う。次に、繊維芽細胞を、完全ＤＭＥＭ−１０％ＳＶＦに戻す。ストレスを加え終わってから７２時間後に、繊維芽細胞は老化に戻る。
【００６８】
１．１．  インキュベーションプロトコル
老化繊維芽細胞については、ＨＡを最終濃度１μｇ／ｍｌに加え、Ｈ２Ｏ２ストレス中、すなわち、２４時間のインキュベーション中放置する。
【００６９】
健康な繊維芽細胞についても、ＨＡを１μｇ／ｍｌで２４時間インキュベーションする。
【００７０】
１．２．  実験終了時（５日目、すなわち７２時間のストレス後）のＲｎｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって総ＲＮＡを抽出した。
【００７１】
１．３．  総ＲＮＡのアッセイ
総ＲＮＡの定性的および定量的アッセイを、RNA 6000 Nano LabChipアッセイキットとBioanalyseur 2100装置（Agilent）によって行う。これは、ナノチップにおける試料の電気泳動による移動の原理に基づいている。２８Ｓ／１８ＳリボソームＲＮＡの比を計算すると、ＲＮＡの完全性の評価に対する情報が与えられる。更に、ゲノムＤＮＡに関するＲＮＡの純度を評価する。
【００７２】
１．４．  同時ＰＣＲによる転写速度の分析
【００７３】
即時ＰＣＲにより、細胞溶解物に含まれる遺伝子ｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡの増幅によって、目的とする遺伝子の転写発現レベルを定量することができる。反応混合物は、ｃＤＮＡ、および目的とするプライマーのカップルと、とりわけTaq PolymeraseとＤＮＡダブルへリックスの小さな溝の挿入剤、すなわちSybr Green（蛍光挿入剤）を含むiQ SybrGreen Supermix (Biorad)の溶液との混合物から構成されている。反応を、Icycler IQサーモサイクラー(Biorad)中で行い、一連の変性／ハイブリダイゼーション／伸張サイクルが伴う。
【００７４】
１．４．１．  逆転写：  総ＲＮＡを、Reverse Transcription System(Promega)とGene Amp PCR System 2400(Perkin Elmer)によってｃＤＮＡに「逆転写」する。
【００７５】
１．４．２．  目的とする遺伝子の転写速度の測定：  目的とする遺伝子の発現レベルを、老化によってほとんど変動しない参照遺伝子の発現レベルによって規格化する。目的とする遺伝子の発現レベルを、式２（ＣＴｍｉｎ−ＣＴ）に準じて計算し、ＣＴは「閾値サイクル」を意味する。
【００７６】
計算「２（ＣＴｍｉｎ−ＣＴ）／規格化因子」に準じて選択した３つの参照遺伝子の発現に対して規格化する。
【００７７】
１．５．  ＭＭＰ−１の発現についての結果
Ｈ２Ｏ２とインキュベーションすることによって老化した繊維芽細胞は、正常な繊維芽細胞の２．１４倍のＭＭＰ−１を発現し（従って、老化が適正に誘発された）。ビタミンＥ（ポジティブコントロール）の存在下では、老化繊維芽細胞によるＭＭＰ−１の過剰発現は、４０％だけ減少した。
【００７８】
ＭＭＰ−１の過剰発現は、ＨＡ４５０ｋＤａ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下では４０％減少し、ＨＡ８００ｋＤａ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下では７５％減少し、ＨＡ１５００ｋＤａ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下では７１％減少し、ＨＡ２６００ｋＤａ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下では８３％だけ減少した。
【００７９】
１．６．  Ｉ型およびIII型コラーゲンの発現についての結果
Ｈ２Ｏ２とインキュベーションすることによって老化した繊維芽細胞について、Ｉ型コラーゲンの様々な転写の阻害を測定したが、このような阻害はドナーによって変化すると思われた。Ｉ型の転写がＨ２Ｏ２ストレスによって２４％阻害されたドナーの１人について、様々なサイズの様々なＨＡはコラーゲンの合成を回復しなかった。
【００８０】
老化した繊維芽細胞では、III型コラーゲンの転写の＋１６３％〜＋３０４％の増加を測定した。III型コラーゲンの転写がＨ２Ｏ２ストレスによって＋３０４％刺激されるドナーに対は、様々なサイズの遊離ＨＡはコラーゲン合成を阻害する。４５０ｋＤａのＨＡは約２５％だけ阻害するが、８００ｋＤａを上回る質量のＨＡは転写を約１００％阻害し、若い繊維芽細胞に近いレベルに戻す。
【００８１】
１．７．  結論
この実験の結論は、老化を誘導したこのモデルでは、ＨＡは抗ＭＭＰ−１活性を有する（従って、酸化防止剤は老化防止活性を潜在的に有する）と思われることである。一層高分子質量のＨＡ（８００、１５００および２６００ｋＤａ）は、４５０ｋＤａのＨＡより有効であると思われる。
【００８２】
本発明の実験条件下では、分子質量４５０ｋＤａのＨＡはＭＭＰ−１に対して活性である。分子質量が８００ｋＤａを上回るＨＡは、−７５〜−８３％の過剰発現を阻害するので一層活性である。
【００８３】
一方、これらの結果は、様々な遊離ＨＡはＩ型コラーゲンの合成に作用しないことを示している。
【００８４】
最後に、遊離ＨＡはIII型コラーゲンの過剰発現を阻害し、これは分子質量が８００ｋＤａ以上のＨＡについて特に顕著であり、過剰発現を−１１８〜−９３％阻害する。
【００８５】
従って、本発明による移植片に含まれる遊離ＨＡは、ＭＭＰ−１の調節作用の他に、ＥＣＭの破壊および構造喪失の制限に寄与する。更に、コラーゲンIII／コラーゲンＩの比が老化中に増加したことが示されていることを知れば、本発明による移植片に含まれるＨＡは若い組織で測定した比を回復することができる。
【００８６】
実施例２：  本発明による移植片の調製
２．１．架橋ＨＡの調製
分子質量が１．６ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウム５ｇを、１％水酸化ナトリウム（３５．６ｇ）に加えた。混合物を、断続的に１時間３０分ホモジナイズする。次いで、ＢＤＤＥ  ３１５ｍｇをホモジナイズしたＨＡ／ＮａＯＨ混合物に加えて、ホモジナイズを中止し（closed）、次いで５０℃の水浴に２時間入れた。混合物を、１Ｎ  ＨＣｌ  ５ｇを添加して中和した。
【００８７】
こうして得たゲルを、等張性（iso-osmolarity）並びに安定な中性ｐＨを保持するＥＤＩおよび塩を添加することによって所望な濃度で添加し、ＨＡにおいて２０ｍｇ／ｇのゲルを得た。
【００８８】
２．２．移植片の調製
この精製したゲルに、リン酸緩衝液で予め水和した１．２ＭＤａのＨＡを加えた。濃度が２０ｍｇ／ｇのＨＡゲル１．２ＭＤａ６０ｇを、得られた架橋ゲル２２６ｇに加える。２種類のゲルを、標準的ブレードミキサーで１−２時間ホモジナイズする。
【００８９】
完成生成物を最後に脱気し、注射器に詰め、例えば、１２５℃で７分間、１２７℃で４分間または１３０℃で３分間のサイクルを行うことによるスチームオートクレーブ処理によって滅菌することができる。
【００９０】
滅菌後の生成物のｐＨは７．１であり、浸透圧モル濃度は３２０ｍＯｓｍであり、レオロジー特性決定では弾性率Ｇ’は１Ｈｚの周波数で４５Ｐａ・ｓとなった。ゲルの最終濃度は、予想濃度が２０ｍｇ／ｇであるのに対して１９．８ｍｇ／ｇとなった（欧州薬局方の方法に準じるカルバゾールを用いる方法）。
本発明の一つの面によれば、以下の発明が提供される。
（１）重量で０．５％〜５％、好ましくは０．５％〜４％、更に好ましくは２％のヒアルロン酸を含んでなる、単相ヒドロゲルの形態で皮下または皮内注射可能な移植片であって、
ヒアルロン酸の５０％〜９５％、好ましくは６０％〜９０％、更に一層好ましくは８５重量％が架橋ゲルの形態であり、
ヒアルロン酸の５％〜５０％、好ましくは１０％〜３０％、更に一層好ましくは１５重量％が遊離形態またはその生理学的に許容可能な塩の１つの形態であり、分子質量が５００〜２８００ｋＤａであり、好ましくは７５０〜２６００ｋＤａであり、更に好ましくは８００〜２５００ｋＤａであり、更に一層好ましくは１０００〜１５００ｋＤａであり、
生理学的に許容可能なキャリヤー流体において、架橋ヒアルロン酸ゲルの重量と遊離ヒアルロン酸の重量の比が１：１〜１：０．０５であることを特徴とする、移植片。
（２）架橋ヒアルロン酸から構成されるゲルの粘度が、２００〜２０００Ｐａ・ｓ、好ましくは１０００〜１８００Ｐａ・ｓである、上記（１）に記載の注射可能な移植片。
（３）架橋ゲルを構成するヒアルロン酸の分子質量が、１０００〜６０００ｋＤａであり、好ましくは１０００〜４０００ｋＤａである、上記（１）または（２）に記載の注射可能な移植片。
（４）分子質量が２〜８０ｋＤａであり、好ましくは２０〜５０ｋＤａであるコンドロイチン硫酸を更に含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の注射可能な移植片。
（５）遊離ヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩の１つが、架橋ヒアルロン酸ゲルの内部に均質に分布している、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の注射可能な移植片。
（６）キャリヤー流体が非発熱性の滅菌等張緩衝液である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の注射可能な移植片。
（７）皮膚化粧品で用いられる少なくとも１種類の他の活性物質を更に含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の注射可能な移植片。
（８）皮膚化粧用の活性物質が、ビタミン、酸化防止剤、無機塩、防腐剤およびコンドロイチン硫酸から選択される、上記（７）に記載の注射可能な移植片。
（９）酸化防止剤がマンニトールである、上記（８）に記載の注射可能な移植片。
（１０）薬剤としての、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の注射可能な移植片。
（１１）注射器形態で提示されかつ上記（１）〜（９）のいずれかに記載の注射可能な移植片を含む、キット。
（１２）皮膚をフリーラジカルから保護しおよび／または皮膚のヒアルロン酸の解重合を制限することを目的とした移植片を製造するための、マンニトールのような酸化防止剤の存在下における分子質量が５００〜２８００ｋＤａ、好ましくは７５０〜２６００ｋＤａ、更に好ましくは８００〜２５００ｋＤａ、更に一層好ましくは１０００〜１５００ｋＤａの遊離形態のヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩の１つの形態の使用。
（１３）注射可能な移植片の皮下注射を含んでなる、皺、小皺、皮膚陥凹および／または瘢痕を塞ぐための、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の注射可能な移植片または上記（１１）に記載のキットの使用。
（１４）皮膚の酸化防止活性を刺激しおよび／または皮膚老化を防止する薬剤を調製するための、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の注射可能な移植片の使用。
（１５）コラーゲンＩＩＩ／コラーゲンＩ比をより若い組織で測定した値に維持しおよび／または回復する薬剤を製造するための、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の移植片の使用。
（１６）皺を塞ぎ、皮膚の細胞活性を高めおよび／または皮膚の堅さおよび弾力性の機械的特性を維持しおよび／または表皮および真皮の代謝を刺激しおよび／または真皮の酸化防止活性を刺激しおよび／または皮膚老化を防止することを目的とする皮下移植片を製造するための、架橋ヒアルロン酸のゲル中に分布した分子質量が５００〜２８００ｋＤａ、好ましくは７５０〜２６００ｋＤａ、更に好ましくは８００〜２５００ｋＤａ、更に一層好ましくは１０００〜１５００ｋＤａの遊離形態のヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩の１つの形態の使用。
（１７）少なくとも１種類の上記（１）〜（９）のいずれかに記載の注射可能な移植片を投与することを含んでなる、皺および／または小皺を塞ぐ化粧方法。
（１８）
１）ヒアルロン酸を塩基性流体に添加し、
−  膨潤し、低速攪拌下で均質化し、熱架橋し、
−  ｐＨ約７の緩衝液中で等張化剤（iso-osmolarizing agent）を添加することによって架橋ゲルを中和および膨潤し、
−  架橋剤を除去する
工程によって架橋ゲルを調製し、
２）ｐＨ約７の等張性（iso-osmolar）緩衝液にヒアルロン酸を添加し、
−  膨潤させる
ことによって遊離ヒアルロン酸ゲルを調製し、
３）工程１）で得た架橋ゲルと、工程２）で得た遊離ヒアルロン酸ゲルとを混合し、
４）任意に脱気し、および場合によってはボトルまたは注射器へ包装し、次いで滅菌する
の工程を含んでなる、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の注射可能な移植片の調製方法。