(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織工学（ＴＥ）足場を作製する方法であって、
（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を備える第１の弾性管状エレメントを提供するステップと；
（ｂ）前記第１の管状エレメントを第２の直径に拡張するステップと；
（ｃ）引っ張りエレメント、外側表面、およびステップ（ｂ）の前記拡張された第１の管状エレメントの表面上の内側管腔表面を備える第２の引っ張り波形管状エレメントを提供するステップと；
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記拡張された第１の管状エレメントおよび前記第２の管状エレメントを結合するステップと；
（ｅ）ＴＥ足場を形成するために、前記第１の管状エレメントの前記第２の直径を、ステップ（ａ）の前記第１の直径に減少させるステップと
を含み、ここで、
前記組織工学足場は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする、
方法。
【請求項２】
前記第２の引っ張り波形管状エレメントが、繊維ネットワークを含み、前記繊維の方向が円周方向に配向している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）の前記提供するステップが、マンドレル上にエレクトロスピニングするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）の前記提供するステップが、マンドレル上にエレクトロスピニングするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｃ）の前記提供するステップが、ステップ（ｂ）の前記拡張された第１の弾性管状エレメント上に予め形成された第２の引っ張り波形管状エレメントを配置するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記弾性エレメントが、第１の弾性率を有する弾性成分を含み、前記引っ張りエレメントが、前記第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の弾性率が前記第１の弾性率より少なくとも１桁大きい、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記弾性エレメントが天然弾性成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記弾性エレメントが合成弾性成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記弾性エレメントが天然弾性成分および合成弾性成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記天然弾性成分が、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される、請求項８または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記合成弾性成分が、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記引っ張りエレメントが合成引っ張り成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記天然引っ張り成分がコラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンである、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記合成引っ張り成分が、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然血管の生体力学的挙動を模倣する組織工学足場、ならびにこれを製造する方法および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管組織工学における主要な問題は、天然血管に相応する、適当な、持続性の生体力学的特性を有する血管移植片の構築である。動脈の置換は、すべての血管に共通の周期的負荷のため、一方さらに、これらの血管に要求されるより高い動作圧のために、特別な課題を提起する。研究者は、様々な合成および有機材料、様々な構築様式（例えば、エレクトロスピニングおよび注型）、ならびに多数の複合体設計を通じてこの問題にアプローチしている。例えば、ドナー移植片、天然成分、および合成成分の様々な組合せを使用して血管移植片を作り出す試みが行われた（例えば、Ｚｉｌｌａら、特許文献１；Ｆｌｕｇｅｌｍａｎ、特許文献２；Ｓｈｉｍｉｚｕ、特許文献３；Ｍａｔｓｕｄａら、特許文献４；およびＲｈｅｅら、特許文献５を参照）。ポリ（エステル（ｅｓｔｅｒ）ウレタン）尿素（ＰＥＵＵ）（非特許文献１）からなる他の足場、およびＰＥＵＵ／コラーゲン（非特許文献２）からなる他の足場は、組織様機能的特性を示すと報告されている。しかし、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（エチレンテレフタレート）およびＰＴＦＥ（テフロン（登録商標））などの合成材料は、大きな直径の血管に対して使用されて成功しているが、小さな直径（例えば、内径６ｍｍ未満）の血管移植片に対して利用されて成功している合成材料はない。５ｍｍ未満の内径を有する、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（エチレンテレフタレート）およびＰＴＦＥからなる血管移植片は、急性血栓形成、ならびに慢性の吻合部過形成および／または内膜過形成により臨床的に容認できないことが見出された（非特許文献３）。小さな直径の血管移植片が成功しづらいのは、インビボで機械的特性に適切にマッチすることができないことを含む要因に部分的に起因し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１３１５２０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０１９００３７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１３６，０２４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７１８，７２３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２９２，８０２号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｏｕｒｔｎｅｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．（２００６年）２７巻：３６３１〜３６３８頁
【非特許文献２】Ｇｕａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００６年）１５巻  補遺１；Ｓ１７〜Ｓ２７頁
【非特許文献３】Ｗａｌｐｏｔｈら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｄｅｖ．（２００５年）２巻（６号）：６４７〜５１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然血管の生体力学的特性は、広範に特徴づけられている。応力および歪に対するその応答は、重要な特徴であることが明らかになった（Ｒｏａｃｈら（１９５７年）  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５巻：６８１〜６９０頁；Ｇｏｓｌｉｎｅ  ＆  Ｓｈａｄｗｉｃｋ  （１９９８年）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．  ８６巻：５３５〜５４１頁）。「Ｊ字型」曲線として公知である応力−歪曲線を示す材料は、血管足場などの組織工学足場において使用するのに適する場合がある候補であり、天然血管の応力および歪に対する機械的応答に類似する機械的応答が望ましい。エラスチン、コラーゲン、および合成のポリマーのブレンドから作製される、様々な加工された足場の機械的特性が報告されている（Ｌｅｅら（２００７年）Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  Ａ．、１２月１５日；８３巻（４号）：９９９〜１００８頁；Ｓｍｉｔｈら（２００８年）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  Ｊａｎ；４巻（１号）：５８〜６６頁；Ｌｅｌｋｅｓら  米国公開出願第２００６／０２６３４１７号）。しかし、Ｊ字型曲線挙動を繰り返すことができる組織工学足場、およびそのような足場を作製するための方法の必要性が依然として残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、天然血管において観察される、同じ型の応力および歪に対する応答、すなわちＪ字型応力／歪曲線を示す組織工学足場、ならびにこれを使用する方法、および作製する方法を提供する。
【０００７】
本発明は、組織工学足場、およびこれを作製する方法に関する。
【０００８】
一態様では、本発明は、２つ以上の異なる管状エレメントを含む組織工学足場を作製する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を有する第１の管状エレメントを提供するステップと；（ｂ）第１の管状エレメントを第２の直径に拡張するステップと；（ｃ）引っ張りエレメント、外側表面、およびステップ（ｂ）の拡張された管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を有する第２の管状エレメントを提供するステップと；（ｄ）ステップ（ｂ）の拡張された第１の管状エレメントの外側表面を、第２の管状エレメントの内側管腔表面と結合するステップと；（ｅ）第１の管状エレメントの第２の直径を、ステップ（ａ）の第１の直径に減少させるステップとを含む。
【０００９】
一実施形態では、ステップ（ａ）の第１の管状エレメントおよび／またはステップ（ｃ）の第２の管状エレメントは、エレクトロスピニングによって形成される。別の実施形態では、ステップ（ａ）の第１の管状エレメントは、表面上に材料をエレクトロスピニングすることによって形成される。他の実施形態では、ステップ（ｃ）の第２の管状エレメントは、拡張された第１の管状エレメントの外側表面上に材料をエレクトロスピニングすることによって、または拡張された第１の管状エレメントの外側表面上に予め形成された第２の管状エレメントを配置することによって形成される。さらに別の実施形態では、ステップ（ａ）の第１の管状エレメントは、エレクトロスピニングによって形成され、ステップ（ｃ）の第２の管状エレメントは、拡張された第１の管状エレメントの外側表面上に予め形成された第２の管状エレメントを配置することによって提供される。
【００１０】
他の一実施形態では、（ｄ）の結合するステップは、第２の管状エレメントの内側表面を、拡張された第１の管状エレメントの外部表面に接着させるステップを含む。別の実施形態では、結合するステップ（ｄ）は、第２の管状エレメントが拡張された第１の管状エレメントの外側表面上にエレクトロスピニングされた後、または拡張された第１の管状エレメントの外側表面上に、予め形成された第２の管状エレメントを配置した後に実施され、第２の管状エレメントの外側表面上に材料の追加の層を塗布することによって、第１の管状エレメントと材料の追加の層との間に第２の管状エレメントを接着サンドイッチさせるステップを含む。別の実施形態では、追加の層は、第１の管状層を形成するのに使用された同じ種類の材料であり、またはこの材料を含有する。
【００１１】
別の実施形態では、上記ステップ（ｃ）の第２の管状エレメントの外側層または表面は波形をつけられている（ｃｏｒｒｕｇａｔｅｄ）。一実施形態では、波形をつけられた第２の管状エレメントは、繊維方向が円周方向に配向している繊維ネットワークを有する。他の実施形態では、第３、第４、第５などの管状エレメントの外側層または表面は、波形をつけられており、かつ／または繊維方向が円周方向に配向している繊維ネットワークを有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、（ａ）の提供するステップおよび／または（ｃ）の提供するステップは、マンドレル上に材料をエレクトロスピニングするステップを含む。別の実施形態では、（ｃ）の提供するステップは、ステップ（ｂ）の拡張された第１の管状エレメント上に、予め形成された第２の管状エレメントを配置するステップを含む。他の一実施形態では、（ａ）の提供するステップは、第１の管状エレメントを形成するために、マンドレル上に材料をエレクトロスピニングするステップを含み、（ｃ）の提供するステップは、ステップ（ｂ）の拡張された第１の管状エレメント上に予め形成された第２の管状エレメントを配置するステップを含む。
【００１３】
他の実施形態では、追加の管状エレメントの形成は、マンドレル上へのエレクトロスピニング、または既存の管状エレメント層上への追加の予め形成された管状エレメントの配置を含む。
【００１４】
他の実施形態では、ステップ（ａ）および（ｃ）は注型技法を含む。他の一実施形態では、ステップ（ａ）は、第１の直径に対応する型の使用を伴い、ステップ（ｃ）は、第２の直径に対応する型の使用を伴う。他の実施形態では、追加の管状エレメントの形成は、ステップ（ｃ）の第２の直径より大きい、または小さい直径に対応する型の使用；および／またはステップ（ａ）の第１の直径より大きい、または小さい直径に対応する型の使用などによる注型を含む。
【００１５】
すべての実施形態では、本発明の方法は、第２の管状エレメント構造内に引っ張りエレメントの連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）または硬化物質（ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ）の連続体を提供するステップを含むことができる。一実施形態では、連続体は、第２の管状エレメント材料内の繊維の様々な形態に起因する。
【００１６】
すべての実施形態では、管状エレメントを提供するステップは、以下のもの、すなわち、注型、予め形成された管状エレメントの使用、およびエレクトロスピニング技法のうちの１つまたは複数の使用を企図する。
【００１７】
すべての実施形態では、本発明の方法は、第１および第２の管状エレメント上への追加の管状エレメント、例えば、第３の管状エレメント、第４の管状エレメント、第５の管状エレメントなどの提供を企図する。すべての実施形態では、各追加の管状エレメントは、１つまたは複数の弾性エレメントおよび／または１つまたは複数の引っ張りエレメントを含むことができる。当業者は、それだけに限らないが、本明細書に記載されたものを含めた、追加の管状エレメントを提供するための様々な技法を理解するであろう。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、弾性エレメントは、第１の弾性率を有する弾性成分を含み、引っ張りエレメントは、第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含む。好適な実施形態では、第２の弾性率は、第１の弾性率より少なくとも１桁大きい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、弾性エレメントは、天然弾性成分、合成弾性成分、または天然弾性成分と合成弾性成分を含む。一実施形態では、天然弾性成分はエラスチンである。他の実施形態では、天然弾性成分は、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される。別の実施形態では、合成弾性成分は、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ｐｏｌｙｄｉａｘａｎｏｎｅ）（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択することができる。
【００２０】
他の実施形態では、引っ張りエレメントは、天然引っ張り成分、合成引っ張り成分、または天然引っ張り成分と合成引っ張り成分を含む。一実施形態では、天然引っ張り成分はコラーゲンである。他の実施形態では、天然引っ張り成分は、コラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンからなる群から選択される。別の実施形態では、合成引っ張り成分は、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、天然血管の特性を模倣する特性、またはこれに実質的に同様の特性を有する、本明細書に記載される方法によって作製される組織工学足場を提供する。一実施形態では、本発明は、天然血管による応答と実質的に同様の、応答および歪に対する機械的応答を有する組織工学足場であって、（ａ）弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を有する第１の管状エレメントと；（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を有する第２の管状エレメントとを有し、組織工学足場の応力および歪に対する機械的応答は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする組織工学足場を提供する。
【００２２】
すべての実施形態では、本発明の足場は、第１および第２の管状エレメントを伴った、１つまたは複数の追加の管状エレメントを企図する。いくつかの実施形態では、追加の管状エレメント（複数も）は、第２の管状エレメントの外側表面上に形成される。
【００２３】
別の実施形態では、天然血管による応答と実質的に同様の、応力および歪に対する機械的応答を有する組織工学足場は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を有する第１の管状エレメントと；（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を有する第２の管状エレメントとを有し、この組織工学足場は、（ｉ）約０．１ＭＰａ〜約０．５ＭＰａの円周方向管弾性率１、（ｉｉ）約３．０ＭＰａ〜約６．０ＭＰａの円周方向管弾性率２；および（ｉｉｉ）約０．５７から約１．１２の円周方向弾性率の移行部を有する。
【００２４】
他の実施形態では、組織工学足場の応力および歪に対する機械的応答は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組織工学足場の応力および歪に対する機械的な応答は、第１の管状エレメントの弾性エレメントと、第２の管状エレメントの引っ張りエレメントとの相乗作用に起因する。さらに別の実施形態では、弾性エレメントは組織工学足場に弾性を付与し、引っ張りエレメントは組織工学足場に相乗的に剛性を付与する。
【００２６】
別の実施形態では、組織工学足場の第２の管状エレメントは波形をつけられている。一実施形態では、波形をつけられた第２の管状エレメントは、繊維方向が円周方向に配向している繊維ネットワークを有する。他の一実施形態では、波形の軸は、足場の軸方向に平行につけられている。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、１つまたは複数の追加の管状エレメント、例えば、第３、第４、第５などの管状エレメントなどを企図し、第３、第４、第５などの管状エレメントの外側層または表面は、波形をつけられており、かつ／または繊維方向が円周方向に配向している繊維ネットワークを有する。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態は、弾性エレメントが第１の弾性率を有する弾性成分を含有し、引っ張りエレメントが第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含有する組織工学足場を提供する。好適な実施形態では、第２の弾性率は、第１の弾性率より少なくとも１桁大きい。
【００２８】
さらに別の実施形態では、本発明は、弾性エレメントが天然弾性成分、合成弾性成分、または天然弾性成分と合成弾性成分を有する組織工学足場を提供する。一実施形態では、天然弾性成分はエラスチンである。他の実施形態では、天然弾性成分は、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される。他の実施形態では、合成弾性成分は、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、（ｉ）２つ以上の異なる種類の天然弾性成分；および／または（ｉｉ）２つ以上の異なる種類の合成弾性成分を含む。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、引っ張りエレメントが天然引っ張り成分、合成引っ張り成分、または天然引っ張り成分と合成引っ張り成分を有する組織工学足場を提供する。一実施形態では、天然引っ張り成分はコラーゲンである。他の実施形態では、天然引っ張り成分は、コラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンからなる群から選択される。別の実施形態では、合成引っ張り成分は、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、足場の引っ張りエレメントは、（ｉ）２つ以上の異なる種類の天然引っ張り成分；および／または（ｉｉ）２つ以上の異なる種類の合成引っ張り成分を含む。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の組織工学足場は、以下のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）孔径が、第２の管状エレメントの外側表面での約１００ミクロンから、第１の管状エレメントの内側表面での約５〜約１５ミクロンに徐々に減少する孔勾配；（ｉｉ）約０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の円周方向管靭性；（ｉｉｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向管靭性；（ｉｖ）約０．０５〜約０．３のタンジェントδ；および（ｖ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの貯蔵弾性率。一実施形態では、孔勾配は、ＴＥ足場についての細胞播種の能力の増強に寄与する。別の実施形態では、軸方向靭性および／または円周方向靭性は、足場を破損または断裂に対して耐性にすることに寄与する。他の一実施形態では、ＴＥ足場の粘弾性は、タンジェントδおよび／または貯蔵弾性率の値によって特徴づけられる。
【００３１】
すべての実施形態では、本発明のＴＥ足場は、第１および第２の管状エレメントに加えて管状エレメントを含むことができる。当業者は、それだけに限らないが、本明細書に記載されたものを含めて、追加の管状エレメント中に含まれ得る様々な成分を理解するであろう。
【００３２】
追加の実施形態では、本発明は、組織工学による足場を作製する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を備える第１の管状エレメントを提供するステップと；（ｂ）第１の管状エレメントを第２の直径に拡張するステップと；（ｃ）引っ張りエレメント、外側表面、およびステップ（ｂ）の第１の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える第２の管状エレメントを提供するステップと；（ｄ）提供するステップ（ａ）を完了した後、提供するステップ（ｃ）を完了するステップと；（ｅ）ステップ（ｂ）の拡張された管状エレメントとステップ（ｃ）の第２の管状エレメントを結合するステップと；（ｅ）第１の管状エレメントの第２の直径を、ステップ（ａ）の第１の直径に減少させるステップとを含む。別の実施形態では、組織工学足場は、第１の管状エレメントと第２の管状エレメントの界面でゾーングラデーションを備える。別の実施形態では、ゾーングラデーションは、第１の管状エレメントの弾性エレメントおよび第２の管状エレメントの引っ張りエレメントを備える不均質性の移行ゾーンを備える。
【００３３】
他の一実施形態では、組織工学による足場を作製する方法は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を備える第１の管状エレメントを提供するステップと；（ｂ）第１の管状エレメントを連続的な速度で第２の直径に拡張するステップと；（ｃ）拡張するステップ（ｂ）の間に、引っ張りエレメント、外側表面、およびステップ（ｂ）の第１の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える第２の管状エレメントを提供するステップと；（ｅ）ステップ（ｂ）の拡張された管状エレメントとステップ（ｃ）の第２の管状エレメントを結合するステップと；（ｅ）第１の管状エレメントの第２の直径を、ステップ（ａ）の第１の直径に減少させるステップとを含む。別の実施形態では、第２の管状エレメントは、引っ張りエレメントの連続体、または硬化物質の連続体を含む。他の一実施形態では、引っ張りエレメントの連続体は、様々な歪値で噛み合う（ｅｎｇａｇｅ）。別の実施形態では、結合するステップ（ｄ）は、第２の管状エレメントの繊維を第１の管状エレメントに結合させ、それによって連続体を提供するステップを含む。一実施形態では、提供するステップ（ｃ）の前に、第２の管状エレメントの繊維は連結される。別の実施形態では、繊維は、よじれの程度に応じて、歪に対して様々な間隔で噛み合う。一実施形態では、よじれの量がより多い繊維の前に、よじれの量が少なくない繊維がまっすぐになり、噛み合う。別の実施形態では、繊維の噛み合いは、応力／歪曲線の段階的な丸め（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）に導き、それによって天然血管と同様の機械的特性をもたらす。
【００３４】
別の実施形態では、この方法は、（ｆ）外側表面、および第２の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える第３の管状エレメントを提供するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、（ｇ）外側表面、および第３の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える第４の管状エレメントを提供するステップをさらに含む。他の一実施形態では、この方法は、（ｈ）外側表面、および第４の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える第５の管状エレメントを提供するステップをさらに含む。一実施形態では、この方法は、外側表面、および内側管腔表面を備える１つまたは複数の追加の管状エレメントであって、各追加の管状エレメントの内側管腔表面が、最外側の管状エレメントに接触している追加の管状エレメントを提供するステップをさらに含む。一実施形態では、追加の管状エレメント（複数も）は弾性エレメントを備える。一実施形態では、追加の管状エレメント（複数も）は引っ張りエレメントを備える。別の実施形態では、結合するステップ（ｅ）は、弾性エレメント、外側表面、および第２の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える追加の管状エレメントを提供するステップを含む。他の一実施形態では、
他の実施形態では、本発明は組織工学足場を提供する。一実施形態では、組織工学足場は、天然血管による応答と実質的に同様の応力および歪に対する機械的応答を有し、この足場は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面を備える第１の管状エレメント；および（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える第２の管状エレメントを備え、組織工学足場は、（ｉ）約０．１ＭＰａ〜約０．５ＭＰａの円周方向管弾性率１、（ｉｉ）約３．０ＭＰａ〜約６．０ＭＰａの円周方向管弾性率２；および（ｉｉｉ）約０．５７ＭＰａから約１．１２ＭＰａの円周方向弾性率の移行部；（ｉｖ）孔径が、第２の管状エレメントの外側表面での約１００ミクロンから、第１の管状エレメントの内側表面での約５〜約１５ミクロンに徐々に減少する孔勾配；（ｖ）０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の円周方向管靭性；（ｖｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向管靭性；（ｖｉｉ）約０．０５〜約０．３のタンジェントδ；および（ｖｉｉｉ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの貯蔵弾性率、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、組織工学足場の応力および歪に対する機械的応答は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする。一実施形態では、組織工学足場は細胞にアクセス可能である。別の実施形態では、組織工学足場は破損に耐性である。さらに別の実施形態では、組織工学足場は粘弾性である。
【００３５】
他の一実施形態では、本発明は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第１の管状エレメントと；（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える、波形をつけられた第２の管状エレメントとを備える組織工学足場を提供する。
【００３６】
なおさらなる実施形態では、本発明は組織工学による血管（ＴＥＢＶ）を提供する。一実施形態では、ＴＥＢＶは、（ａ）（ｉ）弾性エレメント、（ｉｉ）外側表面、（ｉｉｉ）内側管腔表面を備える第１の管状エレメント；（ｂ）（ｉ）引っ張りエレメント（ｉｉ）外側表面、（ｉｉｉ）第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える第２の管状エレメント、および（ｃ）第１の細胞集団を備え、ＴＥＢＶの応力および歪に対する機械的応答は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする。別の実施形態では、ＴＥＢＶは、（ａ）（ｉ）弾性エレメント、（ｉｉ）外側表面、（ｉｉｉ）内側管腔表面を備える第１の管状エレメント；（ｂ）（ｉ）引っ張りエレメント、（ｉｉ）外側表面、（ｉｉｉ）第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える第２の管状エレメント、および（ｃ）第１の細胞集団を備え、ＴＥＢＶは、（ｉ）約０．１ＭＰａ〜約０．５ＭＰａの円周方向管弾性率１（ｉｉ）約３．０ＭＰａ〜約６．０ＭＰａの円周方向管弾性率２；および（ｉｉｉ）約０．５７ＭＰａから約１．１２ＭＰａの円周方向弾性率の移行部；（ｉｖ）孔径が、第２の管状エレメントの外側表面での約１００ミクロンから、第１の管状エレメントの内側表面での約５〜約１５ミクロンに徐々に減少する孔勾配；（ｖ）約０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の円周方向管靭性；（ｖｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向管靭性；（ｖｉｉ）約０．０５〜約０．３のタンジェントδ；および（ｖｉｉｉ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの貯蔵弾性率のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、ＴＥＢＶは、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする。一実施形態では、ＴＥＢＶの応力および歪に対する機械的応答は、第１の管状エレメントの弾性エレメントと第２の管状エレメントの引っ張りエレメントとの相乗作用に起因する。別の実施形態では、弾性エレメントはＴＥＢＶに弾性を付与し、引っ張りエレメントはＴＥＢＶに相乗的に剛性を付与する。他の実施形態では、第２の管状エレメントは波形をつけられている。別の実施形態では、波形をつけられた第２の管状層は、繊維ネットワークを含み、繊維の方向が円周方向に配向している。別の実施形態では、弾性エレメントは、第１の弾性率を有する弾性成分を含み、引っ張りエレメントは、第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含む。他の実施形態では、第２の弾性率は、第１の弾性率より少なくとも１桁大きい。別の実施形態では、弾性エレメントは天然弾性成分を含む。他の実施形態では、弾性エレメントは合成弾性成分を含む。別の実施形態では、弾性エレメントは天然弾性成分および合成弾性成分を含む。一実施形態では、天然弾性成分は、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される。別の実施形態では、合成弾性成分は、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。一実施形態では、引っ張りエレメントは天然引っ張り���分を含む。一実施形態では、引っ張りエレメントは合成引っ張り成分を含む。一実施形態では、引っ張りエレメントは天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む。一実施形態では、天然引っ張り成分はコラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンからなる群から選択される。一実施形態では、合成引っ張り成分は、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。一実施形態では、第１の細胞集団は、第２の管状エレメント内および／または第２の管状エレメントの外側表面上にある。一実施形態では、第１の細胞集団は平滑筋集団である。一実施形態では、管状足場は第２の細胞集団をさらに含む。別の実施形態では、第２の細胞集団は、第１の管状エレメントの内側管腔表面上および／またはこの表面内にある。一実施形態では、第２の細胞集団は内皮細胞集団である。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）（ｉ）弾性エレメント、（ｉｉ）外側表面、（ｉｉｉ）内側管腔表面を備える第１の管状エレメント；（ｂ）（ｉ）引っ張りエレメント、（ｉｉ）外側表面、（ｉｉｉ）第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える、波形をつけられた第２の管状エレメント、および（ｃ）第１の細胞集団を備えるＴＥＢＶを提供する。
【００３８】
なおさらなる実施形態では、本発明は、組織工学による血管（ＴＥＢＶ）を作製する方法であって、（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を備える第１の管状エレメントを提供するステップと；（ｂ）第１の管状エレメントを第２の直径に拡張するステップと；（ｃ）第２の管状エレメントであって、引っ張りエレメント、外側表面、第２の管状エレメントの外側表面上および／または第２の管状エレメント内の第１の細胞集団、ステップ（ｂ）の第１の管状エレメントの外側表面上の内側管腔表面を備える第２の管状エレメントを提供するステップと；（ｄ）ステップ（ｂ）の拡張された管状エレメントとステップ（ｃ）の第２の管状エレメントを結合するステップと；（ｅ）ＴＥＢＶを提供するために、第１の管状エレメントの第２の直径を、ステップ（ａ）の第１の直径に減少させるステップと；（ｆ）ＴＥＢＶを培養するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、ステップ（ｃ）の第２の管状エレメントは波形をつけられている。一実施形態では、波形をつけられた第２の管状エレメントは、繊維ネットワークを含み、繊維の方向が円周方向に配向している。一実施形態では、（ａ）の提供するステップは、マンドレル上に弾性成分をエレクトロスピニングするステップを含み、（ｃ）の提供するステップは、（ｉ）マンドレル上に引っ張り成分をエレクトロスピニングするステップと、（ｉｉ）マンドレル上に第１の細胞集団をエレクトロスプレーするステップとを含む。一実施形態では、（ｉ）のエレクトロスピニングするステップ、および（ｉｉ）のエレクトロスプレーするステップは、同時に実施される。一実施形態では、この方法は、ステップ（ａ）の内側管腔表面に第２の細胞集団を播種するステップ（ｆ）をさらに含む。一実施形態では、第２の細胞集団は内皮細胞集団である。一実施形態では、弾性エレメントは、第１の弾性率を有する弾性成分を含み、引っ張りエレメントは、第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含む。一実施形態では、第２の弾性率は、第１の弾性率より少なくとも１桁大きい。一実施形態では、弾性エレメントは天然弾性成分を含む。一実施形態では、弾性エレメントは合成弾性成分を含む。一実施形態では、弾性エレメントは天然弾性成分および合成弾性成分を含む。一実施形態では、天然弾性成分はエラスチンである。一実施形態では、合成弾性成分は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。一実施形態では、引っ張りエレメントは天然引っ張り成分を含む。一実施形態では、引っ張りエレメントは合成引っ張り成分を含む。一実施形態では、引っ張りエレメントは、天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む。一実施形態では、天然引っ張り成分はコラーゲンである。一実施形態では、合成引っ張り成分は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される。一実施形態では、この方法は、ステップ（ｆ）の前またはステップ（ｆ）の後に、ステップ（ｅ）のＴＥＢＶを少なくとも１つの追加の細胞集団と接触させるステップをさらに含む。一実施形態では、培養するステップ（ｆ）は、バイオリアクター内で拍動性流および／または定常流によってコンディショニングするステップを含む。
【００３９】
なおさらなる実施形態では、本発明は、本明細書に開示される方法、または任意の他の適当な方法によって作製される組織工学足場（ＴＥ足場）または組織工学による血管（ＴＥＢＶ）であって、第１の管状エレメントと第２の管状エレメントの界面でゾーングラデーションを有するＴＥ足場またはＴＥＢＶを対象とする。他の実施形態では、ゾーングラデーションは、第１の管状エレメントの弾性エレメントからの材料、および第２の管状エレメントの引っ張りエレメントからの材料を含む、不均質性の移行ゾーンを備える。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される方法、または任意の他の適当な方法によって作製される組織工学足場（ＴＥ足場）または組織工学による血管（ＴＥＢＶ）であって、ＴＥ足場またはＴＥＢＶの第２の管状エレメントは、引っ張りエレメントの連続体または硬化物質の連続体を有するＴＥ足場またはＴＥＢＶを対象とする。他の実施形態では、引っ張りエレメントの連続体は、様々な歪値で噛み合う。一実施形態では、連続体は、第２の管状エレメント材料の個々の繊維の様々な形態に起因する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、組織工学足場（ＴＥ足場）または組織工学による血管（ＴＥＢＶ）は、第１の管状エレメントと第２の管状エレメントの界面でゾーングラデーションを有し、第２の管状エレメントは引っ張りエレメントの連続体を有する。他の実施形態では、ゾーングラデーションは、第１の管状エレメントの弾性エレメントからの材料、および第２の管状エレメントの引っ張りエレメントからの材料を含む、不均質性の移行ゾーンを備え、かつ／または引っ張りエレメントの連続体は、様々な歪値で噛み合う。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
組織工学（ＴＥ）足場を作製する方法であって、
（ａ）弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を備える第１の管状エレメントを提供するステップと；
（ｂ）上記第１の管状エレメントを第２の直径に拡張するステップと；
（ｃ）引っ張りエレメント、外側表面、およびステップ（ｂ）の上記拡張された第１の管状エレメントの表面上の内側管腔表面を備える第２の管状エレメントを提供するステップと；
（ｄ）ステップ（ｂ）の上記拡張された第１の管状エレメントおよび上記第２の管状エレメントを結合するステップと；
（ｅ）ＴＥ足場を形成するために、上記第１の管状エレメントの上記第２の直径を、ステップ（ａ）の上記第１の直径に減少させるステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記第２の管状エレメントが波形をつけられている、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記波形をつけられた第２の管状エレメントが、繊維ネットワークを含み、上記繊維の方向が円周方向に配向している、項目２に記載の方法。
（項目４）
（ａ）の上記提供するステップが、マンドレル上にエレクトロスピニングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
（ｃ）の上記提供するステップが、マンドレル上にエレクトロスピニングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
（ｃ）の上記提供するステップが、ステップ（ｂ）の上記拡張された第１の管状エレメント上に予め形成された第２の管状エレメントを配置するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記弾性エレメントが、第１の弾性率を有する弾性成分を含み、上記引っ張りエレメントが、上記第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記第２の弾性率が上記第１の弾性率より少なくとも１桁大きい、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記弾性エレメントが天然弾性成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記弾性エレメントが合成弾性成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記弾性エレメントが天然弾性成分および合成弾性成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記天然弾性成分が、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される、項目９または１１に記載の方法。
（項目１３）
上記合成弾性成分が、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１４）
上記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記引っ張りエレメントが合成引っ張り成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記天然引っ張り成分がコラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンである、項目１４または１６に記載の方法。
（項目１８）
上記合成引っ張り成分が、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１９）
天然血管による応答と実質的に同様の応力および歪に対する機械的応答を有する組織工学足場であって、（ａ）弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第１の管状エレメントと；（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および上記第１の管状エレメントの上記外側表面に接触した内側管腔表面を備える第２の管状エレメントとを備え、応力および歪に対する上記組織工学足場の機械的応答がＪ字型応力／歪曲線を特徴とする組織工学足場。
（項目２０）
天然血管による応答と実質的に同様の応力および歪に対する機械的応答を有する組織工学足場であって、（ａ）弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第１の管状エレメントと；（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および上記第１の管状エレメントの上記外側表面に接触した内側管腔表面を備える第２の管状エレメントとを備え、
（ｉ）約０．１ＭＰａ〜約０．５ＭＰａの円周方向管弾性率１
（ｉｉ）約３．０ＭＰａ〜約６．０ＭＰａの円周方向管弾性率２；および
（ｉｉｉ）約０．５７から約１．１２の円周方向弾性率移行部
のうちの少なくとも１つを有する組織工学足場。
（項目２１）
Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする、項目２０に記載の組織工学足場。
（項目２２）
上記第２の管状エレメントが波形をつけられている、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目２３）
上記波形をつけられた第２の管状エレメントが、繊維ネットワークを含み、上記繊維の方向が円周方向に配向している、項目２２に記載の組織工学足場。
（項目２４）
上記弾性エレメントが第１の弾性率を有する弾性成分を含み、上記引っ張りエレメントが上記第１の弾性率より大きい第２の弾性率を有する引っ張り成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目２５）
上記第２の弾性率が上記第１の弾性率より少なくとも１桁大きい、項目２４に記載の組織工学足場。
（項目２６）
上記弾性エレメントが天然弾性成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目２７）
上記弾性エレメントが合成弾性成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目２８）
上記弾性エレメントが天然弾性成分および合成弾性成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目２９）
上記天然弾性成分が、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される、項目２６または２８に記載の組織工学足場。
（項目３０）
上記合成弾性成分が、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される、項目２７または２８に記載の組織工学足場。
（項目３１）
上記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目３２）
上記引っ張りエレメントが合成引っ張り成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目３３）
上記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
（項目３４）
上記天然引っ張り成分が、コラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンからなる群から選択される、項目３１または３３に記載の組織工学足場。
（項目３５）
上記合成引っ張り成分が、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）からなる群から選択される、項目３２または３３に記載の組織工学足場。
（項目３６）
以下、すなわち
（ｉ）孔径が、上記第２の管状エレメントの上記外側表面での約１００ミクロンから、上記第１の管状エレメントの上記内側表面での約５〜約１５ミクロンに徐々に減少する孔勾配；
（ｉｉ）約０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の円周方向管靭性；
（ｉｉｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向管靭性；
（ｉｖ）約０．０５〜約０．３のタンジェントδ；および
（ｖ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの貯蔵弾性率
のうちの少なくとも１つを有する、項目１９または２０に記載の組織工学足場。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、天然血管、コラーゲンのない天然血管（「エラスチン」と表示）、およびエラスチンのない天然血管（「コラーゲン」と表示）の応力／歪関係を示す図である。
【図２】図２は、２つの異なる弾性率に関係する２つの線形領域を区別することによって近似した「Ｊ」字型曲線を示す図である。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、エレクトロスピニングおよび注型からの管状構造体の作製を例示する図である。
【図４Ａ】図４はエレクトロスピニングによる管状構造体の作製を例示する図である。図４Ａ〜Ｂは、組織工学による足場を提供するためのエレクトロスピニング技法を例示する。
【図４Ｂ】図４はエレクトロスピニングによる管状構造体の作製を例示する図である。図４Ａ〜Ｂは、組織工学による足場を提供するためのエレクトロスピニング技法を例示する。
【図４Ｃ】図４はエレクトロスピニングによる管状構造体の作製を例示する図である。図４Ｃは、ラミナ間の突然の移行（上）、および層の移行の混合（下）を例示する。
【図４Ｄ】図４はエレクトロスピニングによる管状構造体の作製を例示する図である。図４Ｄは、組織工学足場においてゾーングラデーションを実現するためのエレクトロスピニング技法を例示する。
【図４Ｅ】図４はエレクトロスピニングによる管状構造体の作製を例示する図である。図４Ｅは、拡大するマンドレルプロセスの代替の実施形態を表す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、回転する間に直径を連続的に変化させることができる、拡大するマンドレルを例示する図である。
【図６】図６は、拡大された弾性ラミナ上への薄い伸張性のあるメッシュの適用を例示する図である。
【図７】図７は、フェルト材料からの繊維形態を例示する図である。
【図８】図８は、ラテックス／ＰＤＯ構造の応力／歪関係を示す図である。
【図９】図９は、ラテックス／Ｖｉｃｒｙｌ構造の応力／歪関係を示す図である。
【図１０】図１０は、ＰＤＯおよびＶｉｃｒｙｌの応力／歪関係を示す図である。
【図１１】図１１は、ラテックスの応力／歪関係を示す図である。
【図１２】図１２は、ＰＧＡおよび／またはＰＵを含有する管の応力／歪関係を示す図である。
【図１３】図１３は、ＰＵおよびＰＧＡを含有する管、ならびに天然のブタ頸動脈の応力歪関係を示す図である。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、ラテックス管の周囲に縫合された材料の代表的な管状足場を示す図である。
【図１５】図１５Ａ〜Ｂは、代表的な波形をつけられた足場を示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、代表的な波形をつけられた足場の断面を示す図である。
【図１７】図１７は、ＰＬＣＬ／ＰＧＡおよびＰＵ／ＰＧＡを含有する管の応力／歪関係を示す図である。
【図１８】図１８は、ＰＬＣＬ／ＰＧＡおよびＰＵ／ＰＧＡを含有する管の圧力／体積関係を示す図である。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｃは、管状足場の調整力の概念を表す図である。Ａ−引っ張りエレメントの破損および弾性エレメントの破損が同時発生する。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜Ｃは、管状足場の調整力の概念を表す図である。Ｂ−引っ張りエレメントの破損前の弾性エレメントの破損。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜Ｃは、管状足場の調整力の概念を表す図である。Ｃ−弾性エレメントの破損前の引っ張りエレメントの仮想の破損。
【図２０】図２０は、管状足場の組織化学を示す図である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、細胞播種およびバイオリアクターコンディショニングの後の管状足場のセグメントの細胞染色を示す図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、細胞播種およびバイオリアクターコンディショニングの後の管状足場のセグメントの細胞染色を示す図である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、細胞播種およびバイオリアクターコンディショニングの後の管状足場のセグメントの細胞染色を示す図である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、細胞播種およびバイオリアクターコンディショニングの後の管状足場のセグメントの細胞染色を示す図である。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、細胞播種およびバイオリアクターコンディショニングの後の管状足場のセグメントの細胞染色を示す図である。
【図２２】図２２は、細胞播種し、バイオリアクターでコンディショニングした管状足場の全血凝固アッセイの結果を示す図である。
【図２３】図２３は、管状足場をコンディショニングするのに使用されるバイオリアクターの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、組織工学（ＴＥ）足場、およびこれを作製する方法に関する。特に、本発明は、天然血管の特性と実質的に同様の特性を有するＴＥ足場を提供する。例えば、本発明のＴＥ足場は、天然血管の応答と実質的に同様である、応力および歪に対する機械的応答、すなわちＪ字型応力／歪曲線を示す。
【００４４】
１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４５】
当業者は、本明細書に記載されるものと同様または等価な多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明の実践において使用することができる。実際に、本発明は、記載される方法および材料に限定されることは決してない。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００４６】
他の関連情報は、組織工学の分野における教科書、例えば、Ｐａｌｓｓｏｎ，  Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｏ．、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ、２００４年、およびＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３版（Ｒ  Ｌａｎｚａ、Ｒ  Ｌａｎｇｅｒ、＆  Ｊ  Ｖａｃａｎｔｉ編）、２００７年などから入手可能である。
【００４７】
用語「組織工学足場」または「ＴＥ足場」は、本明細書で使用する場合、積層されており、または多層状であり、かつ天然血管と実質的に同様の様式で応力および歪に応答する能力を特徴とする管状構造を指す。例えば、足場の応力および歪に対する機械的応答は、好ましくはＪ字型応力／歪曲線を特徴とする。本発明の足場の特性は、この足場を、血管足場のためのフレームワークとして使用するのに適当にする。
【００４８】
用語「組織工学による血管」または「ＴＥＢＶ」または「血管足場」は、本明細書で使用する場合、さらに操作されることによって、必要のある哺乳動物対象に移植するのに適当になった、上記に定義し、本明細書に記載される組織工学足場を指す。例えば、ＴＥＢＶは、組織工学足場を操作して、本明細書に記載される方法、または任意の他の適当な方法により１つまたは複数の細胞集団を添加することによって形成することができる。当業者は、本発明は、限定することなく、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、鎖骨下静脈、頸静脈、腎静脈、腸骨静脈、大静脈を含めた多くの種類の血管に関係することを理解するであろう。さらに、本発明のＴＥＢＶは、動静脈シャント（ＡＶシャント）、または位置間（ｉｎｔｅｒ−ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）血管移植片とすることもできる。
【００４９】
用語「弾性エレメント」は、完全に回復可能で繰り返し可能である大規模の変形を伴う応力に応答するその能力を特徴とする材料を指す。弾性エレメントは、天然成分、合成成分、または天然成分と合成成分の混合物を含むことができる。
【００５０】
用語「引っ張りエレメント」は、応力をかけられたときに伸長する能力が非常に小さいことを特徴とする材料を指す。引っ張りエレメントは、天然成分、合成成分、または天然成分と合成成分の混合物を含むことができる。
【００５１】
用語「合成成分」は、本明細書で使用する場合、通常自然において存在しない成分を指す。一般に、合成成分は、天然血管において通常存在しないが、それにもかかわらず、力学および細胞挙動に対して天然血管のような特性を示す可能性を有する。合成成分は、本明細書に記載されるように、組織工学足場および／またはＴＥＢＶの一部とすることができ、これは、天然成分（以下に定義するような）を場合により含むことができる。合成成分は、本質的に弾性であっても伸張性であってもよい。
【００５２】
用語「天然成分」は、本明細書で使用する場合、自然において存在し、またはその調製の様式にかかわらず、自然において存在する物質に由来する物質を指す。したがって例えば、「天然成分」は、その天然源から単離および精製した、または組換え手段および／もしくは合成手段によって生成された天然ポリペプチドとすることができる。天然成分は、天然血管中に存在する場合があり、したがって機械的および細胞挙動に対して天然血管のような特性を示す可能性を有する。ある特定の実施形態では、天然成分は、本質的に弾性であっても伸張性であってもよい。
【００５３】
用語「波形をつけられた」は、本明細書で使用する場合、表面の１つまたは複数上の波形、うねり、および／またはよじれを特徴とする、引っ張り成分を含有する構造を指す。この構造は一般に、薄層（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ）、または繊維方向が円周方向に一般に配向している繊維ネットワークで構成されたラミナの形態である。さらに、波形の軸は、構造、例えば、管状組織工学足場の軸方向に平行であるように構成される。
【００５４】
用語「機械的応答」または「生体力学的応答」は、本明細書で使用する場合、応力および歪にかけられたとき、天然血管、血管足場、または組織工学足場によって示される挙動を指す。応力および歪に曝されたときの挙動は、好ましくは以下のうちの１つまたは複数を特徴とする：（ｉ）Ｊ字型応力／歪曲線；（ｉｉ）粘弾性；および（ｉｉｉ）断裂または破損に対する耐性。
【００５５】
用語「天然血管と実質的に同様の」は、本明細書で使用する場合、天然血管の機械的特性を細密に模倣し、またはこれに類似する機械的特性を有する足場を指す。当業者は、この実質的な類似性を実証するために、いくつかのパラメータを特徴づけ、測定することができることを理解するであろう。Ｊ字型応力／歪曲線を含めた、天然血管と実質的に同様である機械的挙動を有する本発明の組織工学足場を提供するための重要なパラメータは、足場の円周方向管弾性率１、円周方向管弾性率２、および円周方向管弾性率の移行部である。好適な実施形態では、他のパラメータは、応力および歪に対する足場の所望の機械的挙動もしくは応答ならびに／または血管移植片として機能を果たすその能力に寄与し、限定することなく、コンプライアンス、ヤング率または弾性率、破裂圧力、壁厚、多孔度、孔径、孔勾配、繊維直径、破断歪（軸方向および／または円周方向の）、破断応力（軸方向および／または円周方向）、靭性（軸方向および／または円周方向の）、軸方向管弾性率１および２、軸方向管弾性率の移行部、ならびに特定のタンジェントδ（ｔａｎ  δ）および貯蔵弾性率値によって実証されるものなどの粘弾性特性を含む。
【００５６】
用語「Ｊ字型曲線」は、本明細書で使用する場合、応力（材料の単位面積当たりの力または圧力）がｙ軸上にプロットされ、歪（元の長さに対する長さの変化または変位）がｘ軸上にプロットされる曲線の形状を指す。Ｊ字型曲線は、図１に表したように、コラーゲンとエラスチンの相乗的相互作用から生じる、天然動脈に固有な、応力および歪に対する機械的応答である。
【００５７】
用語「コンプライアンス」は、本明細書で使用する場合、圧力（ｘ軸）／体積（ｙ軸）曲線上の式Ｃ＝Δ（δ）Ｖ／Δ（δ）Ｐ（傾き）によって定義される。これは、材料における「軟度」の尺度であり、「スチフネス」の逆数である。一般に、Ｃは、ｍＬ／ｍｍＨｇであり、Ｖは体積（ｍＬ）であり、Ｐは圧力（ｍｍＨｇ）である。
【００５８】
用語「ヤング率」または「弾性率」は、本明細書で使用する場合、スチフネスに関するパラメータとして定義される。これは、応力（ｙ軸）／歪（ｘ軸）曲線の傾きから導出される。非線形の「Ｊ」字型曲線の場合、弾性率は、第１の傾きが最初の擬似直線セグメント（弾性率１）から導出され、第２の傾きが後の擬似直線セグメント（弾性率２）から導出される、２つの別々の交差する傾きとしてモデル化することができる。図２は、この概念を例示する。
【００５９】
用語「弾性率（ｅｌａｓｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｕｓ）１から弾性率２の移行部」、または「弾性率（ｍｏｄｕｌｕｓ）１から弾性率２の移行部」、または「弾性率（ｅｌａｓｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｕｓ）の移行部」は、本明細書で使用する場合、弾性率１の傾きが、弾性率２の傾きに移行または変化する範囲を指す。このパラメータについての表現の単位は、傾きが発生する歪値である。これは図２中に例示されており、ここで弾性率（傾き）１および弾性率（傾き）２によって表される直線が交差する。天然血管における応答を示す曲線では、移行部は、弾性率（傾き）１から弾性率（傾き）２への変化を示す曲線のセグメントによって例示される。
【００６０】
用語「コンプライアンスミスマッチ」は、本明細書で使用する場合、異なる程度の軟度／スチフネス（すなわち、コンプライアンス／ヤング率または弾性率）を有する２種の材料の結合を指す。
【００６１】
用語「多孔度」は、本明細書で使用する場合、足場の全体積に対する足場の孔体積の比として定義され、パーセント多孔度として表すことができる。あるいは、多孔度は、足場の総面積に対する足場中の孔面積のパーセント比とすることができる。
【００６２】
用語「破裂圧力」は、本明細書で使用する場合、足場の少なくとも部分的な崩壊が起こる前に足場が耐え得る、管状足場の内側と外側の圧力の差として定義される。
【００６３】
用語「壁厚」は、本明細書で使用する場合、管状足場の外側表面からその内側管腔表面までの深さまたは範囲として定義される。
【００６４】
用語「孔径」は、本明細書で使用する場合、本発明の足場内の孔の平均直径として定義される。
【００６５】
用語「孔勾配」は、本明細書で使用する場合、一表面から別の表面までの孔径サイズの線形変化として定義される。孔径サイズは、管状エレメントの層内で徐々に減少する。例えば、サイズは、管状エレメントの外膜表面または外側表面などの一表面から、管状エレメントの管腔表面または内側表面などの別の表面にわたって減少する場合がある。
【００６６】
用語「繊維直径」は、本明細書で使用する場合、本発明の足場の繊維の平均直径として定義される。
【００６７】
用語「破断歪」は、本明細書で使用する場合、材料が破損する時点での歪として定義される。
【００６８】
用語「破断応力」は、本明細書で使用する場合、材料が破損する時点での応力として定義される。
【００６９】
用語「靭性」は、本明細書で使用する場合、材料を破損させるのに必要なエネルギー、破損までの計算された応力／歪曲線下面積として定義される。
【００７０】
用語「タンジェントδ」は、本明細書で使用する場合、管状足場中で貯蔵され、失われるエネルギーの相対量の指標として定義され、分子緩和を特徴づけ、流体力学的な変形を特定するのに一般に使用される。
【００７１】
用語「貯蔵弾性率」は、本明細書で使用する場合、材料の、機械的エネルギーを貯蔵する能力として定義され、分子緩和を特徴づけるのに一般に使用される。
【００７２】
用語「よじれ半径」は、本明細書で使用する場合、曲げられた管状構造内でよじれが形成する半径として定義される。
【００７３】
用語「ゾーングラデーション」は、本明細書で使用する場合、２つの異なる層を有する積層構造における段階的な勾配として定義され、各層は異なる種類の材料を含有し、勾配は層同士間に存在し、異なる材料のどちらをとるかといえば不均質性のゾーンである。例えば、不均質性のゾーンは、弾性エレメントからの材料および引っ張りエレメントからの材料を含有することができる。
【００７４】
用語「平滑筋細胞」は、本明細書で使用する場合、空洞臓器（例えば、膀胱、腹腔、子宮、胃腸管、脈管構造など）の壁内に見出される非横紋筋を構成し、かつ収縮し、弛緩する能力を特徴とする細胞を指す。血管平滑筋細胞は、環状に配列された弾性繊維および結合組織を含有する中膜（血管の最も厚い層）全体にわたって見出される。以下に記載するように、平滑筋細胞集団は、様々な供給源から単離することができる。
【００７５】
用語「内皮細胞」は、本明細書で使用する場合、内側管腔表面、または足場内で、本発明の足場に播種するのに適した細胞を指す。内皮細胞は、天然血管の内側表面または管腔表面を覆い、それだけに限らないが、血栓症の予防、ならびに組織内殖および望まれない細胞外基質産生の予防を含めた複数の機能を果たす。以下に記載するように、本発明の足場上に播種するための内皮細胞集団は、限定することなく、血管実質（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）、循環内皮細胞、および骨髄前駆細胞などの内皮細胞前駆体、末梢血幹細胞および胚性幹細胞を含めた、様々な供給源から単離することができる。
【００７６】
用語「細胞集団」は、本明細書で使用する場合、適当な組織源、通常哺乳動物から直接単離し、引き続いてインビトロで培養することによって得られる多数の細胞を指す。当業者は、本発明を用いて使用するための細胞集団を単離および培養するための様々な方法、および本発明で使用するのに適した細胞集団中の様々な数の細胞を理解するであろう。
【００７７】
用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園動物、競技動物または、ペット動物、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびフェレットなどを含む。本発明の好適な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００７８】
用語「非ヒト動物」は、本明細書で使用する場合、それだけに限らないが、例えば、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに非げっ歯類動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバなどの哺乳動物が含まれる。これには、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）も含まれる。用語「非霊長類動物」は、本明細書で使用する場合、霊長類以外の哺乳動物を指し、それだけに限らないが、上記に具体的に列挙した哺乳動物を含む。
【００７９】
「心血管疾患」または「心血管障害」は、心臓または血管（動脈および静脈）の機能の異常性を特徴とし、心血管系に影響する哺乳動物における障害または状態、特にアテローム性動脈硬化症に関係する疾患を指すのに、広い、一般的な意味において本明細書で使用される。そのような疾患または障害は、バイパス血管移植片として本明細書に記載されるＴＥＢＶを使用する治療に特に適している。そのような移植片は、限定することなく、冠動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）、末梢バイパス移植片、または動静脈シャントが含まれる。心血管障害の例は、限定することなく、心筋虚血、心臓発作、発作、壁内もしくは非壁内心筋梗塞、急性心筋梗塞、末梢血管疾患、冠動脈疾患、冠動脈性心疾患、不整脈、突然心臓死、脳卒中などの脳血管障害、うっ血性心不全、生命を危うくする律動異常、心筋症、一過性脳虚血発作、急性虚血性症候群、または狭心症（ａｎｇｉｎａ  ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ）、急性冠動脈ステント失敗（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｔｅｎｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、またはこれらの組合せによって生じる状態が含まれる。そのような障害の他の例には、限定することなく、血栓状態、例えば肺塞栓症、冠動脈の急性血栓症、心筋梗塞、脳動脈（脳卒中）または他の器官の急性血栓症などが含まれる。
【００８０】
２．Ｊ字型曲線応力／歪応答
図１はＪ字型曲線を表し、これは、２つの主要な構造的なタンパク質、すなわちコラーゲンおよびエラスチンの相乗的相互作用から生じる、天然動脈に固有の応力および歪に対する機械的応答である（Ｒｏａｃｈら（１９５７年）  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５巻：６８１〜６９０頁）。天然血管の力学は非線形であり、コラーゲンおよびエラスチンの相乗的相互作用から生じる力（応力）／変位（歪）の図で「Ｊ」字型曲線を特徴とする（図２）。動脈中にコラーゲンとエラスチンの両方が存在することにより、動脈に大きい非線形挙動が与えられる。天然動脈が、残りの主要な構造タンパク質としてコラーゲンを残してそのエラスチンを抽出される場合、機械的な応答ははるかに滑らかでなくなる。反対に、天然動脈が処理されてコラーゲンが除去される場合、支配的な構造タンパク質はエラスチンであり、力学は線形の弾性特徴を反映する。天然動脈の「Ｊ」字型曲線は、動脈中に存在する主要な構造タンパク質である、コラーゲンおよびエラスチンの両方の合わせた効果から生じる非線形挙動である（Ｇｏｓｌｉｎｅ  ＆  Ｓｈａｄｗｉｃｋ  （１９９８年）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．  ８６巻：５３５〜５４１頁）。
【００８１】
この生物学的複合体において、コラーゲンは、高スチフネス、低弾性成分として挙動する一方で、エラスチンは高弾性、低スチフネスエレメントとして挙動する。コラーゲンは、応力がかけられたとき伸長する能力が非常に小さい引っ張りエレメントであり、したがって、腱および靭帯などの組織における役割に特に適している。しかしエラスチンは、完全に回復可能であり、繰り返し可能である大規模の変形を伴った、応力に対して応答する能力を特徴とする。エラスチンのこれらの特徴により、何らかの跳ね返りまたは復元力を必要とする組織、例えば、皮膚、動脈、および肺などが適したものになる。
【００８２】
血管移植片における開存性の喪失に関連する１つの重要な失敗の様式は、縫合線での組織内植を特徴とする内膜過形成（ＩＨ）である。ＩＨは、非常に異なる機械的特性の２つの血管セグメント間で生じる界面のコンプライアンスミスマッチによって生じることが公知である（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら（１９８４年）  Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  １巻：１３６〜１４８頁；Ｓａｙｅｒｓら（１９９８年）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ８５巻：９３４〜９３８頁；Ｓｔｅｐｈｅｎら（１９７７年）  Ｓｕｒｇｅｒｙ．  ８１巻：３１４〜３１８頁；Ｔｅｅｂｋｅｎ  ら（２００２年）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｅｎｄｏｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２３巻（６号）：４７５〜８５頁；Ｋａｎｎａｎら（２００５年）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｂ  −  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  ７４Ｂ巻（１号）：５７０〜８１頁；Ｗａｌｐｏｔｈら（２００５年）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｄｅｖ．  ２巻（６号）：６４７〜５１頁））。この界面ゾーンは、段階を病的過程および移植片の最終的な閉塞（開存性の喪失）にする不自然な流体力学状態を発生させる。
【００８３】
コンプライアンスマッチングは重要であると認識されているが、天然動脈の非線形挙動を考慮すると、ただ１つの傾き（機械的応答曲線の一部）を指定して有意なマッチが起こり得ることはありそうにない。コンプライアンス（およびスチフネス）を求めるための一般的な傾向は、各グラフからの最初の擬似線形セグメントのみの考察を通じてであるように思われる（Ｓａｎｄｅｒｓら  米国公開特許出願第２００３／０２１１１３０号（図１６）；Ｌｅｅら（２００７年）  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．  ［印刷前の電子出版ＰＭＩＤ：１７５８４８９０］；Ｓｍｉｔｈら（２００７年）  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  ［印刷前の電子出版、ＰＭＩＤ：１７８９７８９０］）。しかし、この最初の擬似線形セグメント後に起こる事を無視することによって、重要な情報が失われる。図１に示すように、「Ｊ」字型曲線は非線形であり、したがって、交差する２つの別々の傾きとしてモデル化することができる。図２は、２つの異なる弾性率（スチフネス）に関係する２つの線形領域を近似的に区別することによって、１つの「Ｊ」字型曲線を示してこの概念を例示する。同じ手法は、コンプライアンスについて圧力／体積グラフ上で使用することができる。したがって、コンプライアンスが関係する場合、本発明は、応力／歪グラフ上の最初の擬似線形セグメントの間に取られる測定だけでなく、この最初のセグメント後に取られる測定も考慮する。
【００８４】
曲線の「Ｊ」字型は、天然血管の構築において使用される材料の特定の選択から生じる偶然の機械的挙動を単に表すのではない。むしろ、形状自体は、動脈瘤の形成に対する特定の耐性を表す（Ｓｈａｄｗｉｃｋ（１９９８年）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．  ８６巻：５３５〜５４１頁）。さらに、天然血管の機械的挙動を模倣することにより、巨視的な利点、すなわち、コンプライアンスミスマッチの調節がもたらされる。他の研究者らは、多くの様々な種類の細胞は、これらが播種される微視的な機械的環境に敏感であることを示した。これには、細胞が播種される基質の機械的特性、ならびに圧縮などの、組織に影響する因子を介して細胞に付与される応力（例えば、膝関節中の軟骨）、周期性の歪（例えば、拍動性の流れを受けている血管）などが含まれる（Ｇｅｏｒｇｅｓら（２００６年）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ９０巻（８号）：３０１２〜１８頁；Ｅｎｇｌｅｒら（２００４年）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３；１６６巻（６号）：８７７〜８７頁；Ｒｅｈｆｅｌｄｔら（２００７年）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  １１月１０日；５９巻（１３号）：１３２９〜３９頁；Ｐｅｙｔｏｎら（２００７年）  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ４７巻（２号）：３００〜２０頁）。例えば、血管平滑筋細胞は、血管組織におけるある特定の歪の型に敏感である（Ｒｉｃｈａｒｄら（２００７年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２巻（３２号）：２３０８１〜８頁）。さらに、腱、骨、および実質的に体のあらゆる組織中の細胞は、これらが存在する微視的な機械的環境に精巧に調整されており、これは、天然組織の挙動を細密に模倣するさらに別の説得力のある理由を提供する。予期された機械的な特性からの逸脱は、細胞を異なる発生経路、または最終的に、ネクローシスまたはアポトーシスを伴う致死経路に送ることができる。
【００８５】
３．組織工学（ＴＥ）足場
天然血管は多層構造または積層構造を有する。例えば、動脈は３つの層、すなわち、管腔表面を裏打ちする大血管性内皮細胞を含む、内膜と呼ばれる最内側層、複数のシートの平滑筋細胞を含む、中膜と呼ばれる中央層、ならびに疎性結合組織、より小さい血管、および神経を含有する、外膜と呼ばれる外側層を有する。内膜と中膜は、基底膜によって分離されている。
【００８６】
天然血管における特殊化された構成的な特徴（うねり、波形、よじれ）は、異なる歪で異なる程度に機械的に噛み合っているコラーゲンおよびエラスチンラミナの並列の配置を促進する。天然動脈は、円周方向に同心円状に配列された弾性ラミナを有する。そのようなラミナは波形をつけられている。理論では、弾性ラミナの波形は、周囲のコラーゲン層を同調（ｅｎｔｒａｉｎ）させ、これらに同様の形状を付与することができるが、これは一般に観察されない。さらに、組織構造は、弾性ラミナが一般に、集中したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）によって囲まれていることを示す。例えば、Ｄａｈｌらによる２００７年の報告では、組織工学による血管と天然動脈の比較が報告され、この中で波形をつけられたエラスチンラミナは、代表的なＭｏｖａｔ染色およびＶｅｒｈｅｏｆｆ−Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色を使用して、それぞれ明らかに視覚化された（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００７年３月；３５巻（３号）：３４８〜５５頁）。したがって、天然動脈における一般的な知見は、弾性ラミナ中の波形であるが、周囲のコラーゲン層には波形がまったくない。これに対する例外は、ナガスクジラにおいて記録を残された普通でない構造であり、この場合新規の結合組織デザインが存在し、偶然引っ張りエレメントになるコラーゲン性成分は、高度に波形をつけられている（Ｇｏｓｌｉｎｅ  １９９８年  上記を参照）。
【００８７】
本明細書に記載されるように、本発明は組織工学足場、およびこれを作製する方法に関し、これは、天然動脈において一般に見られるのと逆の手法をとり、すなわち足場の引っ張り層は波形を有するが、弾性層は波形を有さない。この手法は、弾性層中に波形を付与するより、引っ張り層内に波形を付与する方が容易であるため有利である。
【００８８】
本発明の組織工学足場は、多層構造または積層構造を有する。一実施形態では、足場は、（ａ）弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を含有する第１の管状エレメントと；（ｂ）引っ張りエレメント、外側表面、および第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を含有する第２の管状エレメントとを含む。
【００８９】
別の実施形態では、第２の管状エレメントは波形をつけられている。本明細書に記載される組織工学足場に存在する波形は、図１５Ａ〜Ｂによって例示され、足場の外側表面上にその外見を示している。
【００９０】
他の実施形態では、波形をつけられた第２の管状エレメントは、繊維方向が円周方向に配向している繊維ネットワークを有する。図１６Ａ〜Ｂは、円周方向に均一な性質の波形の断面図を示す。
【００９１】
追加の管状エレメントを第１および第２の管状エレメント上に加えることができる。
【００９２】
第１の管状エレメントの内側管腔表面、および第２の管状エレメントの外側表面はともに、例えば、ＴＥＢＶの形成などにおいてさらに操作するためにアクセス可能である。以下に記載するように、本発明の組織工学足場は、足場中に１つまたは複数の細胞集団を組み込むことによって、組織工学による血管（ＴＥＢＶ）を作製するのに使用することができる。足場の積層構築物は、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞などの細胞集団の期待される分配を促進する場合がある、より自然な血管形態を提供する。
【００９３】
本明細書に記載される足場の弾性エレメントは、完全に回復可能であり、繰り返し可能である大規模の変形を伴った、応力に対して応答する能力を足場に付与する。弾性エレメントは、天然成分、合成成分、１つを超える天然成分の混合物、１つを超える合成成分の混合物、天然成分と合成成分の混合物、またはこれらの任意の組合せであってもよい弾性成分を有する。一般に、有機成分または天然成分は、通常、天然組織構造中に存在し、または天然組織構造から得ることができ、またはタンパク質および／またはそのアミノ酸配列をコードする公知の核酸配列に基づいて組換えまたは合成で生成することができるタンパク質である。例えば、エラスチンは動脈中に天然に存在し、本発明の血管足場において天然成分として利用することができる。天然成分は、本明細書に記載されるように、合成成分も含むか、また含まないＴＥ足場および／またはＴＥＢＶの一部とすることができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、第１の管状エレメントの弾性エレメントは、限定することなく、エラスチン、グルテン、グリアジン、アブダクチン、クモの糸（ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ）、およびレシリンまたはプロレシリンを含めた弾性タンパク質などの有機成分または天然成分を含む（Ｅｌｖｉｎら（２００５年）  Ｎａｔｕｒｅ．  １０月１２日：４３７巻（７０６１号）：９９９〜１００２頁）。当業者は、本発明の足場に使用するのに適することができる他の天然弾性タンパク質を理解するであろう。
【００９５】
天然材料の使用は、無傷の血管足場が、組織工学による血管を構築する目的のためにさらなる操作にかけられる場合、利点をもたらす。例えば、特定の細胞集団が足場上に培養または播種される場合、足場内に存在する天然エラスチンタンパク質は、足場との適切な細胞相互作用を促進する。
【００９６】
他の実施形態では、弾性エレメントは合成成分を含む。合成弾性成分の例には、限定することなく、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）が含まれる。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、弾性エレメントが天然弾性成分および合成弾性成分を含む、第１の管状エレメントを企図する。
【００９８】
本明細書に記載される足場の引っ張りエレメントは、足場が応力に応答した伸長に抵抗することを可能にする剛性または張力を足場に付与する。引っ張りエレメントは、天然成分、合成成分、１つを超える天然成分の混合物、１つを超える合成成分の混合物、天然成分と合成成分の混合物、またはこれらの任意の組合せであってもよい引っ張り成分を有する。
【００９９】
別の実施形態では、第２の管状エレメントの引っ張りエレメントは、限定することなく、コラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンを含めた繊維タンパク質などの有機成分または天然成分を含む。当業者は、本発明の足場に使用するのに適することができる他の天然繊維タンパク質を理解するであろう。他の実施形態では、引っ張りエレメントは合成成分である。合成引っ張り成分の例には、限定することなく、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタン尿素）（ＰＥＵＵ）が含まれる。一実施形態では、本発明は、引っ張りエレメントが天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む、第２の管状エレメントを企図する。
【０１００】
足場の弾性エレメントおよび引っ張りエレメントは、天然成分と合成成分の異なる組合せを含有することができる。例えば、足場は天然弾性成分および／または天然引っ張り成分、ならびに合成弾性成分および／または合成引っ張り成分を含有することができる。
【０１０１】
本発明の一態様では、ＴＥ足場は、上述したような、第１の管状エレメント上に第２の管状エレメントを有する２層構造に限定されない。いくつかの実施形態では、足場は追加の管状エレメント、例えば、第２の管状エレメント上の第３の管状エレメント、第３の管状エレメント上の第４の管状エレメント、第４の管状エレメント上の第５の管状エレメントなどを含む。さらに、本明細書に記載されるように、追加の管状エレメントは、弾性エレメント（複数も）（例えば、天然および／または合成）、または引っ張りエレメント（複数も）（例えば、天然および／または合成）を含有することができる。追加の管状エレメントは、本明細書に記載される技法によって結合することができる。
【０１０２】
一態様では、弾性エレメント中に含まれる弾性成分、および引っ張りエレメント中に含まれる引っ張り成分は、それぞれ異なる弾性率を有する。一実施形態では、弾性エレメントの弾性成分の弾性率は第１の弾性率を有し、引っ張りエレメントの引っ張り成分は第２の弾性率を有する。好適な実施形態では、第２の弾性率は第１の弾性率より少なくとも約１桁大きい。一実施形態では、第２の弾性率は、第１の弾性率（ｍｏｄｕｌｅ）より約１桁、約２桁、約３桁、約４桁、またはそれ以上の桁大きい。例えば、実施例１は、弾性成分ラテックスの０．３ＭＰａ〜０．５ＭＰａの弾性率と比較した場合、引っ張り成分ＰＤＯおよびＶｉｃｒｙｌが、それぞれ３ＧＰａおよび９〜１８ＧＰａの弾性率を有することを示す（図１０および１１も参照）。
【０１０３】
別の態様では、本発明のＴＥ足場は、天然血管において見出される特性と実質的に同様の構造的および機能的特性を示す。天然血管では、２つの主要なタンパク質成分であるコラーゲンおよびエラスチンの相乗的相互作用は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする応力および歪に対する機械的応答を生ずる（Ｒｏａｃｈら（１９５７年）Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５巻：６８１〜６９０頁）。当業者は、限定することなく、応力および歪に対する応答、コンプライアンス、ヤング率、多孔度、強度などを含めた、本発明の足場が天然血管を模倣し、またはこれに細密に類似することを実証するのに使用することができる多数のパラメータを理解するであろう。一実施形態では、本発明の足場は、応力および歪に対して異方性の様式で機械的に応答する能力を有することを特徴とする。
【０１０４】
当技術分野においてよく認識されたいくつかのパラメータは、組織工学足場の挙動を特徴づけるのに有用である。表１は、これらのパラメータの一部についての報告値の例（およびそのそれぞれの刊行物の引用）を提供する。
【０１０５】
【表１】
0005632749.tif 000002
【０１０６】
【数１】
0005632749.tif 000003
【０１０７】
【数２】
0005632749.tif 000004
表２は、天然血管と実質的に同様である機械的特性をＴＥ足場またはＴＥＢＶにもたらすことを目的とする、表１に引用された文献に基づく特徴づけの基準を提供する。
【０１０８】
【表２】
0005632749.tif 000005
これらのパラメータは、本発明の組織工学足場の機械的挙動を特徴づけることにおいて、特に、足場が天然血管の特性と実質的に同様の特性を示すかどうかを判定することにおいて有用である。本発明は、表２の値によって特徴づけられ、天然血管の機械的特性と実質的に同様の機械的特性、好ましくは、（ｉ）Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする応力および歪に対する機械的応答；（ｉｉ）破損に対する耐性；（ｉｉｉ）粘弾性；または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す組織工学足場を対象とする。さらに、足場は、ＴＥＢＶを形成するための細胞播種の目的のための様々な細胞型へのアクセスのしやすさを特徴とする。
【０１０９】
一実施形態では、本発明の組織工学足場によって示されるＪ字型応力／歪曲線の特徴は、（ｉ）約０．１ＭＰａ〜約０．５ＭＰａの円周方向管弾性率１（ｉｉ）約３．０ＭＰａ〜約６．０ＭＰａの円周方向管弾性率２；および（ｉｉｉ）約０．５７〜約１．１２の円周方向弾性率移行部、ならびにこれらの任意の組合せに起因する。別の実施形態では、円周方向管弾性率１は、約０．１ＭＰａ、０．１３ＭＰａ、約０．１５ＭＰａ、約０．１７ＭＰａ、約０．２ＭＰａ、約０．２２ＭＰａ、約０．２５ＭＰａ、約０．２７ＭＰａ、約０．３ＭＰａ、約０．３２ＭＰａ、約０．３５ＭＰａ、約０．３７ＭＰａ、約０．４ＭＰａ、約０．４２ＭＰａ、約０．４５ＭＰａ、約０．４７ＭＰａ、または約０．５ＭＰａである。別の実施形態では、円周方向管弾性率２は、約３．０ＭＰａ、約３．２ＭＰａ、約３．５ＭＰａ、約３．７ＭＰａ、約４．０ＭＰａ、約４．２ＭＰａ、約４．５ＭＰａ、約４．７ＭＰａ、約５．０ＭＰａ、約５．２ＭＰａ、約５．５ＭＰａ、約５．７ＭＰａ、または約６．０ＭＰａである。別の実施形態では、円周方向弾性率移行部は、約０．５７、約０．５９、約０．６１、約０．６３、約０．６５、約０．６７、約０．６９、約０．７１、約０．７３、約０．７５、約０．７７、約０．７９、約０．８１、約０．８３、約０．８５、約０．８７、約０．８９、約０．９１、約０．９３、約０．９５、約０．９７、約０．９９、約１．０１、約１．０３、約１．０５、約１．０７、約１．０９、約１．１１、または約１．１２である。
【０１１０】
別の実施形態では、破損に対する耐性に好都合な特性は、（ｉ）約０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の円周方向管靭性；（ｉｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向管靭性；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。バイオマテリアルの靭性は、破損に対するその耐性を判定するのに役立つ１つのパラメータである。明らかに、破損または断裂に対する耐性は、ＴＥ足場における所望の特徴であり、その理由はこれが、ＴＥ足場から派生する任意のＴＥＢＶまたは血管移植片の開存性を保証するのに役立つためである。天然血管は、流体の周期的負荷の応力および歪に応答して変形を受けやすい。したがって、これらは縦方向もしくは軸方向に、および／または円周方向に分裂または破損の危険性がある。天然血管と同様に、本発明のＴＥ足場およびＴＥＢＶから派生する血管移植片も破損の危険性がある。本発明は、特定の軸方向靭性および／または特定の円周方向靭性は、破損または断裂に対して耐性であるＴＥ足場に寄与するという発見に関係する。一実施形態では、円周方向管靭性は、約０．４５ＭＪ／ｍ３、約０．５０ＭＪ／ｍ３、約０．５５ＭＪ／ｍ３、約０．６０ＭＪ／ｍ３、約０．６５ＭＪ／ｍ３、約０．７０ＭＪ／ｍ３、約０．７５ＭＪ／ｍ３、約０．８０ＭＪ／ｍ３、約０．８５ＭＪ／ｍ３、約０．９０ＭＪ／ｍ３、約０．９５ＭＪ／ｍ３、約１．０ＭＪ／ｍ３である。別の実施形態では、軸方向管靭性は、約０．１ＭＪ／ｍ３、約０．１５ＭＪ／ｍ３、約０．２０ＭＪ／ｍ３、約０．２５ＭＪ／ｍ３、約０．３０ＭＪ／ｍ３、約０．３５ＭＪ／ｍ３、約０．４０ＭＪ／ｍ３、約０．４５ＭＪ／ｍ３、または約０．５０ＭＪ／ｍ３である。別の実施形態では、本発明のＴＥ足場は、ｉ）Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする応力および歪に対する機械的応答を有する足場；ｉｉ）破損耐性の足場；およびｉｉｉ）粘弾性の足場の１つまたは複数を特徴とする。
【０１１１】
別の実施形態では、ＴＥ足場の粘弾性特性は、（ｉ）約０．０５〜約０．３のタンジェントδ；（ｉｉ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの貯蔵弾性率；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せを特徴とする。粘弾性材料は、変形に対する応答において粘性および弾性の特徴の両方を示す。粘性材料は、応力がかけられるとき、時間とともに直線的に歪に抵抗する一方で、弾性材料は応力に応答して瞬時に歪み、応力が除かれるとその元の状態に急速に戻る。粘弾性材料は、応力に応答して時間に依存する歪を示し、これは一般に、非晶質材料内の原子または分子の拡散を伴う。天然血管は、流体の周期的負荷に対処するための粘弾性を示し、この特徴は、ＴＥＢＶまたは血管移植片を作り出すのに使用される本発明のＴＥ足場にとって望ましい。本発明は、本発明のＴＥ足場の粘弾性は、特定のタンジェントδ値および／または特定の貯蔵弾性率値によって特徴づけられるという発見に関する。一実施形態では、タンジェントδは、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、または約０．３０である。他の実施形態では、貯蔵弾性率は、約４００ＭＰａ、約３５０ＭＰａ、約３００ＭＰａ、約２５０ＭＰａ、約２００ＭＰａ、約１５０ＭＰａ、約１００ＭＰａ、約９０ＭＰａ、約８０ＭＰａ、約７０ＭＰａ、約６０ＭＰａ、約５０ＭＰａ、約４０ＭＰａ、約３０ＭＰａ、約２０ＭＰａ、約１０ＭＰａ、約９ＭＰａ、約８ＭＰａ、約７ＭＰａ、約６ＭＰａ、約５ＭＰａ、約４ＭＰａ、約３ＭＰａ、約２ＭＰａ、約１ＭＰａ、約０．９ＭＰａ、約０．８ＭＰａ、約０．７ＭＰａ、約０．６ＭＰａ、約０．５ＭＰａ、約０．４ＭＰａ、約０．３ＭＰａ、約０．２ＭＰａ、約０．１９ＭＰａ、約０．１８ＭＰａ、約０．１７ＭＰａ、約０．１６ＭＰａ、約０．１５ＭＰａ、約０．１４ＭＰａ、約０．１３ＭＰａ、または約０．１２ＭＰａである。
【０１１２】
本発明の足場にとって望ましい特性を同定し、特徴づけるのに適した、当業者に周知のいくつかの技法がある。これらの技法には、限定することなく、破裂圧力試験；円周方向における準静的機械的検査（別名引っ張り試験）（応力／歪図においてもたらされる結果）；多孔度および孔サイズの決定（例えば、水銀圧入ポロシメトリーによる）；細胞結合アッセイ；および分解速度；移植片のコンプライアンスを測定するための圧力／体積曲線が含まれる。
【０１１３】
４．ＴＥ足場を作製する方法
本発明の方法は、天然血管に相応する、適当な、持続性の生体力学的特性を有するＴＥ足場の構築に関する。一態様では、本発明の方法は、積層構造、すなわち、弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第１の管状エレメントと；引っ張りエレメント、外側表面、および第１の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える第２の管状エレメントとを有する血管足場を作製する方法を提供する。図３に例示するように、第１の管状エレメント４は、限定することなく、エレクトロスピニング２（図３Ａ）および注型３（図３Ｂ）、ならびにこれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の技法によって、マンドレル１上に形成することができる。エラスチンおよび／または弾性ポリマーなどの弾性エレメントは、少なくともインビボ用途に必要な名目上のサイズである第１の直径を有する第１の管状エレメントを形成するのに使用することができる。エレクトロスピニングは、（ｉ）１つまたは複数の弾性天然成分および／もしくはより多くの弾性合成成分のうちの１つを含有し；かつ／または（ｉｉ）１つまたは複数の引っ張り天然成分および／もしくはより多くの引っ張り合成成分のうちの１つを含有する溶液を塗布することによって実施することができる。エレクトロスピニングは、弾性エレメントの繊維を円周方向に配置する利点を提供し、したがって血管の強度を増大させる。
【０１１４】
形成されると、弾性エレメントを含有する第１の管状エレメントは、限定することなく、可変直径を有するマンドレルの利用、またはより大きいマンドレル上での第１の管状エレメントの取り出しおよび配置を含めた、当技術分野で公知の技法によって第２の直径に拡張される。可変直径を有するマンドレルの使用は、摩擦によって問題となり得る、マンドレルからの第１の管状エレメントの取り出しを回避するという利点を有する。第１の管状エレメントの第２の直径への拡張は、動脈が通常の機能の間に受ける生理的歪の範囲、すなわち、約５％〜約３５％を考慮するために意図される。
【０１１５】
一実施形態では、第１の管状エレメントは、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、または約１０ｍｍの第１の直径を有するように、本明細書に記載される技法によって形成される。好適な実施形態では、第１の直径は約３ｍｍ〜約８ｍｍ、より好ましくは約４ｍｍ〜約７ｍｍ、最も好ましくは約５ｍｍ〜約６ｍｍである。
【０１１６】
別の実施形態では、第１の管状エレメントが本明細書に記載される技法によって拡張される第２の直径は、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、約１０ｍｍ、約１１ｍｍ、約１２ｍｍ、約１３ｍｍ、約１４ｍｍ、約１５ｍｍ、または約１６ｍｍである。好適な実施形態では、第２の直径は、約５ｍｍ〜約１０ｍｍ、より好ましくは約６ｍｍ〜約９ｍｍ、最も好ましくは約７ｍｍ〜約８ｍｍである。
【０１１７】
第２の直径に拡張されると、第２の管状エレメントは、限定することなく、注型またはエレクトロスピニングを含めた、当技術分野で公知の技法によって、第１の管状エレメントの外側表面上に形成または層状化される。コラーゲンおよび／または伸張性ポリマーなどの引っ張りエレメントを、第２の管状エレメントを形成するのに使用することができる。第２の管状エレメントを提供または形成する方法としてのエレクトロスピニングは、様々な長さの伸張性繊維を形成する能力のために有利である。
【０１１８】
第１の管状エレメント上に第２の管状エレメントを形成した後、当業者に公知の様々な技法によって層を結合することができる。そのような技法には、限定することなく、フィブリンに基づくものなどの外科的接着剤の使用；または様々な割合の存在する任意の合成ポリマーとの溶媒相互作用の使用が含まれる。
【０１１９】
一実施形態では、結合するステップは、第２の管状エレメントが第１の管状エレメント上に形成または配置された後に実施され、第１の管状エレメントと材料の追加の層との間で第２の管状エレメントの接着サンドイッチを可能にするために、第２の管状エレメントの外側表面上に材料の追加の層を塗布するステップを含む。別の実施形態では、追加の層は、第１の管状層を形成するのに使用された同じ種類の材料を含有する。別の実施形態では、結合は、弾性エレメント（例えば、以下に記載されるような天然／合成弾性材料混合物を含有する、例えば溶液１）を含有する追加の層をエレクトロスピニングで塗布して実現される。
【０１２０】
当業者は、層内および層間の両方で架橋結合するのに他の技法を使用することができることを理解するであろう。例えば、熱処理は、縮合反応に基づいて引っ張りエレメント（例えば、コラーゲン）内に架橋を形成することを示した。他の生体適合性の化学的架橋処理も、同様にこの領域で有効であることが示された。
【０１２１】
図４Ａは、本明細書に記載される新規の足場構造を作製するエレクトロスピニング法を例示する。例えば、天然／合成弾性材料混合物を含有する溶液１が、回転しているマンドレル２上にスピニング１されることによって、第１の直径Ｄｏ３を有する第１の管状エレメントが作製される。次いで、マンドレルの直径は、天然血管における生理的な歪に相応する値である第２の直径Ｄｆ４に増大され（あるいは、足場がより大きい直径のマンドレル上に配置され）、例えば、天然／合成引っ張り材料混合物を含有する溶液２が、溶液１を用いて作製された第１の管状エレメント上にエレクトロスピニング５されることによって、第２の直径Ｄｆ６を有する第１の管状エレメント上に第２の管状エレメントが形成される。これは、予め応力がかけられた積層構造の形成をもたらす。図４Ｂに示した最終ステップは、マンドレルを第１の直径Ｄｏ３に戻し、今度は第１および第２の管状エレメントの両方を含む足場７を取り出すステップを伴う。溶液２でできた外側積層品の構造分析は、円周方向での繊維構造における波形８を明らかにし、これは図４Ｂの引き伸ばされた部分に示されている。
【０１２２】
図４Ｅは、拡大するマンドレルプロセスの代替の実施形態を表す。第１の管状エレメントは、上述したように溶液１から形成１されることによって、第１の直径Ｄｏ３を有する第１の管状エレメントが作製される（Ａ）。マンドレルの直径は第２の直径Ｄｆに増大され（Ｂ）、この時点で天然／合成引っ張り材料を含有する第２の管状エレメント６が、第１の管状エレメント３が拡大されたマンドレル４上にある間に第１の管状エレメント３上に配置される（Ｃ）。第２の管状エレメント６を配置した後、溶液１の追加の薄層７を、第２の管状エレメント６の頂部にエレクトロスピニングすることによって、溶液１のそれぞれの層の間に第２の管状エレメント６の接着サンドイッチを可能にすることができる（Ｄ）。溶液１の薄層７を塗布した後、拡大されたマンドレルに直径は、第１の直径Ｄｏ２に戻される（Ｅ）。第１の管状エレメントの収縮は第２の管状エレメントを同調させ、波形をつけられた、またはよじれた均一な表面の特徴を生じる。一実施形態では、第２の管状エレメントはメッシュの形態である。
【０１２３】
上述したように、血管移植片が天然血管に結合している界面でのコンプライアンスミスマッチは、内膜過形成に導く場合があり、これは、血管移植片の開存性の喪失に関連する重要な失敗様式であることが周知である。そのような内膜過形成は、動脈瘤形成および移植片の拡張に導き得ることが公知である。それぞれのラミナが異なるコンプライアンスを有する多積層構造において生じる問題は、層間剥離である。これは、ラミナ間に突然の移行部があり、したがって、対応して高い応力集中の可能性がある構造において特に問題となり得る。これに対抗するために、ラミナ間の突然の移行部は、各連続的な層が不均質性のゾーンを有し、そこでこれが次の連続的なゾーンに突き当たることを確実にすることによって和らげることができる。
【０１２４】
図４Ｃはこの概念を例示する。層同士間の移行部が接近するにつれて、隣接する層を含む２つの材料間で混合して、段階的な勾配が存在する。このゾーングラデーションは、いくつかの方法で実現することができるが、最も明確には、複数のシリンジおよび溶液勾配を使用して実現することができる。
【０１２５】
図４Ｄは、ゾーングラデーションを実現するためのエレクトロスピニング法を例示する。この方法は、２つのスピナレット、２つの材料溶液、および２つの材料から構築されるラミナ間に段階的な移行部を作製するために連続した塗布（重なりを伴って）を使用する。例えば、天然／合成弾性材料混合物を含有する溶液１が、回転しているマンドレル上にスピニング１されることによって、第１の直径Ｄｏ２を有する第１の管状エレメント３が作製されるが（Ａ）、溶液１の塗布が完了する前に、マンドレルが第２の直径Ｄｆ４に拡大され、例えば、天然／合成引っ張り材料混合物を含有する溶液２が塗布５されることによって（Ｂ）、第１の管状エレメント上に第２の管状エレメント６が形成される（Ｃ）。溶液２の塗布５は、溶液１の塗布１の終了付近で始まることが好ましい。溶液１および溶液２の塗布は、溶液１の塗布が完了するまで同時に続く（Ｂ）。こうして、溶液１中の材料と溶液２中の材料の段階的なブレンドが、第１および第２の管状エレメントの間のゾーンで作られる。これにより、ゾーングラデーションを有する、予め応力がかけられた積層構造が形成される。
【０１２６】
一実施形態では、ゾーングラデーションを備える本発明の組織工学による足場は、弾性エレメントを含有する第１の管状エレメント、第１の管状エレメントの外側に接触した、引っ張りエレメントを含有する第２の管状エレメント、および第１の管状エレメントの弾性エレメントと第２の管状エレメントの引っ張りエレメントの段階的な移行部または勾配混合物のゾーンから構成されている。別の実施形態では、組織工学による足場のゾーングラデーションは、第１および第２の管状エレメントからの材料を有する不均質性の移行ゾーンを備える。
【０１２７】
上述したように、本発明は、マンドレルの直径が、第１の直径（Ｄｏ）から別個の第２の直径（Ｄｆ）に増大され、次いで引き続いて第１の直径（Ｄｏ）に戻される方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、マンドレル直径が、第１の直径（Ｄｏ）から第２の直径（Ｄｆ）に増大され、その間、エレクトロスピニングの間に直径が連続して増大する方法を提供する。直径の連続した増大を実現するために、第１の管状エレメント上に第２の管状エレメントを形成するための溶液２のエレクトロスピニングの間に、直径が、連続的な速度で、第１の直径（Ｄｏ）から第２の直径（Ｄｆ）に増大するようにマンドレルをプログラムすることができる。この手法は、２層のラミナ構造が円周方向に広がる間に、外側の引っ張り層が様々な歪値で噛み合うことを保証し、かつより自然な「Ｊ」字型曲線に関連したより段階的な曲率を保証する。
【０１２８】
図５は、回転する間に直径を連続的に変化させることができる拡大するマンドレルデバイスを例示する。図５Ａは、マンドレルの直径を収縮させることによって、エレクトロスピニングされた管を容易に取り出すことができるほぼ最小の直径を示す。図５Ｂは、最大直径の構成でのマンドレルを示す。マンドレルセクションは、予めプログラムされた速度で、スピニングの間に連続的な移動を可能にする、スクリューで動かされる軌道内にある。
【０１２９】
一実施形態では、新規の足場構造の直径を増大および減少させるステップは、エレクトロスピニングするステップと並行して実施される。好適な実施形態では、例えば、天然／合成弾性材料混合物を含有する溶液１から形成された第１の管状エレメントの第１の直径Ｄｏは、第１の管状エレメント上に、例えば、天然／合成引っ張り材料混合物を含有する溶液２を同時にエレクトロスピニングしながら、安定な連続的速度で第２の直径Ｄｆに増大する。最終結果は、弾性エレメントを含有する第１の管状エレメント上への、引っ張りエレメントを含有する第２の管状エレメントの堆積であり、その結果、引っ張りエレメントは、引っ張り繊維の連続体として新規の足場構造内に存在する。新規の足場構造を通じて徐々に増加する体積の流体が循環すると、第１の管状エレメントの第１の直径Ｄｏは、それに応答して、第１の管状エレメント中に含まれる弾性エレメントにより徐々に増大し、この第１の直径が増大するので、第２の管状エレメント中に存在する引っ張り繊維の連続体は、第１の直径Ｄｏが、流体の循環により第２の直径Ｄｆに徐々に増大するにつれて、連続体上に噛み合う。したがって、本発明の方法によって作られた引っ張り繊維の連続体は、通過する流体の体積が増加するにつれて、引っ張り繊維の段階的な噛み合いの特性を新規の足場構造に浸透させる。そのような特性は、本発明の組織工学足場によって示される天然血管との実質的な類似性にさらに寄与する。
【０１３０】
上述したように、本発明の方法は、第１の管状エレメント上に第２の管状エレメントを作製するためにエレクトロスピニングを使用することができる。一実施形態では、第２の管状エレメントはエレクトロスピニングによって形成されないが、むしろ第１の管状エレメント上に配置することができる、モノフィラメント（径方向に厚い１つのフィラメント）の編まれた、織られた、またはメッシュ構造である。この実施形態では、第１の管状エレメントは、第１の管状エレメントを囲む位置に、編まれた／織られた／メッシュの第２の管状エレメントを移動させる前に、作製され、選択された歪値を伴った所望の直径に拡大される。編まれた／織られた／メッシュの第２の管状エレメントのサイズは、図６中に示したように所望の拡大サイズの第１の管状エレメントにぴったりと収めるために予め選択することができる。配置した後、第２の管状エレメントを、上述した結合技法によって第１の管状エレメントに固定することができる。
【０１３１】
本明細書に記載されるように、血管足場は、外側表面、および内側管腔表面を備える第１の管状エレメントと、外側表面、および内側管腔表面を備える第２の管状エレメントとを含む。結合した後、第１の管状エレメントの外側表面は、第２の管状エレメントの内側管腔表面に接触している。第１の管状エレメントの内側管腔表面、および第２の管状エレメントの外側表面はともに、さらに操作するためにこの時点でアクセス可能である。
【０１３２】
結合が完了した後、第１の管状エレメントの第２の直径は、その第１の、かつ元の直径に減少される。これは、可変マンドレルを第１の直径に低減することによって、または注型の場合、単純により大きいマンドレルから足場を取り出すことによって実施することができる。第１の管状エレメントが収縮してその第１の直径に戻ることにより、引っ張りエレメントを含有する第２の管状エレメントの繊維に一連の波形が付与される。
【０１３３】
他の一実施形態では、本発明の方法は、様々な程度のよじれを有する第１の管状エレメント（弾性エレメントを含有する）に繊維、特に、固有の程度のよじれを有する引っ張りフィラメントを塗布するステップを含む。そのような繊維は、例えば、膀胱置換足場の形成に使用されるような不織フェルトから分離することができる。これらの繊維は、直径が１２〜１８μｍ（長さ：約２ｃｍ）であり、不織りフェルト形成における針縫いプロセスのために、この形状にとって必須の必要性に基づいたよじれた形態を有する。
【０１３４】
図７は、フェルト材料から実現することができる繊維形態を例示する。様々な形態は、第１の管状エレメント（弾性エレメントを含有する）が拡大されるにつれて、硬化物質の連続体に寄与する。一実施形態では、これらの非連続的な繊維は、その所望の拡大サイズでの第１の管状エレメントに付着され、場合により一般に円周方向に配向している。塗布されると、この繊維は、上述した結合技法の１つを適用することによって、第１の管状エレメント中に封じ込め、またはこれに結合することができる。別の実施形態では、図７に例示したように、繊維間連結が材料自体内にもたらされることによって、様々な異なる程度の個々の繊維形態に基づいて、硬化物質の連続体が付与される。この繊維間連結は、結合の前に実施することができる。機械的には、これらの繊維を適用することの有利な効果は（第１の管状エレメントに連結し、かつ／または結合したら）、歪ませると、最小量のよじれを有する繊維が最初にまっすぐになり、噛み合うものである。適用される繊維におけるよじれの程度が連続しているので、歪が増大するにつれて、繊維は様々な間隔で噛み合い、応力／歪図の段階的な丸めに導き、天然材料にはるかにより類似した応答を提供する。
【０１３５】
好適な実施形態では、組織工学による血管足場を作製する方法は、（ａ）外側表面、内側管腔表面、および第１の直径を備える弾性管状エレメントを提供または形成するステップと；（ｂ）弾性管状エレメントを第２の直径に拡張するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の弾性管状エレメントの外側表面上に、外側表面および第２の直径を備える引っ張り管状エレメントを提供または形成するステップと；（ｄ）引っ張り管状エレメントを弾性管状エレメントの外側表面に結合するステップと；（ｅ）弾性管状エレメントの第２の直径を、第１の直径に減少させるステップとを含む。
【０１３６】
一態様では、本明細書に提供される方法は、当業者に、ＴＥ足場の作製において、高度の調整力を実行することを可能にする。この方法の様々な異なる態様によって、本明細書に記載される機械的特性は、当業者によって望まれる様式で調整される。一実施形態では、機械的特性の調整は、以下のうちの１つまたは複数の変更を含む：管状足場を提供するのに使用される材料の選択、管状エレメントの拡大の直径、エレクトロスピニングの間の針とマンドレルの間の距離、および使用される管状エレメント厚さ。別の実施形態では、調整は、上記の表２に列挙された１つまたは複数のパラメータの変更を含む。当業者は、ＴＥ足場の機械的特性を調整するのに変更することができる他のパラメータを理解するであろう。
【０１３７】
５．組織工学による血管（ＴＥＢＶ）
別の態様では、本発明は、本発明のＴＥ足場から得られる組織工学による血管（ＴＥＢＶ）を提供する。天然血管との実質的な類似性を考慮すると、足場は、改変してＴＥＢＶを作製するのに特に適用でき、これはさらには心血管障害を治療するための血管バイパス移植片として使用することができる。血管バイパス移植片には動静脈（ＡＶ）シャントが含まれる。好適な実施形態では、本発明の足場は、心血管障害を治療するのに使用するために、一般に６ｍｍ未満の小直径を有するＴＥＢＶを作製するのに使用することができる。
【０１３８】
本明細書で論じられるように、ある特定の実施形態のＴＥ足場は、様々な弾性率および弾性率移行部、ならびにこれらの任意の組合せに起因するＪ字型応力／歪曲線を特徴とする、応力ならびに歪に対する機械的応答を示すことが示されている。弾性率パラメータに加えて、血管移植片の作製において使用するのにＴＥ足場を魅力的にする、ＴＥ足場によって示される他の特性がある。一態様では、本発明のＴＥ足場は、まず第一にＴＥＢＶまたは血管移植片を作製すること、および血管移植片が、移植されたら開存性を保持することを保証することについて、本発明のＴＥ足場を特に適したものにする、ある特定の特性を示す。そのような特性には、限定することなく、足場上の細胞の播種を可能にするもの、足場の破損に対して耐性をもたらすもの、および足場に粘弾性をもたらすものが含まれる。
【０１３９】
一実施形態では、ＴＥ足場上の細胞の播種を有利にする特性は、管状エレメントの外膜側または外側での約１００ミクロンから、管腔側または内側での約５〜約１５ミクロンに孔径が徐々に減少する孔勾配に起因する。孔径が、ＴＥ足場上またはＴＥ足場内への細胞の播種に成功するための重要な要因であることは、当技術分野で周知である。例えば、孔径は、様々な細胞型が足場の表面に、かつ足場を通って遊走するために十分大きくなければならず、その結果、これらの細胞型は、インビボで観察される様式と同様の様式で他の遊走性細胞と相互作用することができる。本発明は、特定の孔勾配が、細胞の播種の成功に寄与するという発見に関する。一実施形態では、孔勾配は、ＴＥ足場を細胞にアクセス可能にし、それによって細胞播種のためのその能力を増強する。別の実施形態では、孔勾配は、約１００ミクロン（外側）から約５ミクロン（内側）、約１００ミクロン（外側）から約６ミクロン（内側）、約１００ミクロン（外側）から約７ミクロン（内側）、約１００ミクロン（外側）から約８ミクロン（内側）、約１００ミクロン（外側）から約９ミクロン（内側）、または約１００ミクロン（外側）から約１０ミクロン（内側）である。
【０１４０】
一態様では、孔勾配は、ＴＥ足場の管腔の、内側上への細胞播種、およびＴＥ足場の外側の、外膜側上への細胞播種に有利な構造を提供する。一実施形態では、管腔の、内側表面上のより小さい孔は、内側表面上および内側表面内への内皮細胞の播種に適しており、外側の、外膜側上のより大きい孔サイズは、外側表面上および外側表面内への平滑筋細胞の播種に適している。別の実施形態では、内皮細胞が、ＴＥ足場の内側の、管腔表面上およびこの表面内に播種されて単層もしくは平らなシート様構造を形成し、かつ／または平滑筋細胞が、ＴＥ足場の外側の外膜表面上および／もしくはこの表面内に播種される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＴＥ足場の内側の、管腔表面上およびこの表面全体にわたって播種された内皮細胞は、ある特定の孔サイズを越えて、外側の、外膜表面に向けて遊走することができない。好適な実施形態では、孔サイズは約１５〜約２０ミクロンである。別の好適な実施形態では、孔サイズは約１５ミクロン、約１６ミクロン、約１７ミクロン、約１８ミクロン、約１９ミクロン、または約２０ミクロンである。
【０１４２】
別の実施形態では、破損に対する耐性に有利な特性は、（ｉ）約０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の円周方向管靭性；（ｉｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向管靭性；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである。バイオマテリアルの靭性は、破損に対するその耐性を判定するのに役立つ１つのパラメータである。
【０１４３】
別の実施形態では、ＴＥ足場の粘弾性に有利な特性は、（ｉ）約０．０５〜約０．３のタンジェントδ；（ｉｉ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの貯蔵弾性率；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＴＥ足場から得られる組織工学による血管（ＴＥＢＶ）を提供する。結果として、ＴＥＢＶは、天然血管に見出されるものと実質的に同様の、構造的および機能的特性を示す。上記に論じたように、血管における２つの主要なタンパク質成分、すなわちコラーゲンおよびエラスチンの相乗的相互作用は、Ｊ字型応力／歪曲線を特徴とする、応力および歪に対する機械的応答を生じる（Ｒｏａｃｈら（１９５７年）  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５巻：６８１〜６９０頁）。一実施形態では、本発明のＴＥＢＶは、応力および歪に対して異方性の様式で機械的に応答する能力を有することを特徴とする。別の実施形態では、ＴＥＢＶは、（ｉ）足場の破損に対する耐性に有利な特性；および／または（ｉｉ）足場の粘弾性に有利な特性を有する。
【０１４５】
別の態様では、本発明の組織工学による血管（ＴＥＢＶ）は、移植後に観察されてきた、血管移植片に関連するある特定の合併症を調節することができる。一実施形態では、ＴＥＢＶは、移植後のコンプライアンスミスマッチを調節する。別の実施形態では、調節には以下のうちの１つまたは複数が含まれる：動脈瘤形成に対する耐性、拡張に対する耐性、破損に対する耐性、血栓症に対する耐性、吻合部過形成に対する耐性、および内膜過形成に対する耐性。当業者は、ＴＥＢＶによって調節を受けやすい追加の要因を理解するであろう。
【０１４６】
一実施形態では、本発明のＴＥＢＶは、本明細書に記載されるように、ＴＥ足場を備える。本発明のＴＥ足場は、さらに操作されることによって、必要のある哺乳動物への移植に適したものとなるＴＥＢＶを形成することができる。例えば、ＴＥ足場は、本明細書に記載される方法により、１つまたは複数の細胞集団を添加することによって操作することができる。当業者は、本発明が、限定することなく、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、鎖骨下静脈、頸静脈、腎静脈、腸骨静脈、大静脈を含めた多くの種類の血管に関係することを理解するであろう。
【０１４７】
一実施形態では、ＴＥＢＶは、ＴＥＢＶの第２の管状エレメント内、および／または第２の管状エレメントの外側表面上に第１の細胞集団をさらに含む。好適な実施形態では、第１の細胞集団は平滑筋細胞集団である。当業者は、限定することなく、ヒト大動脈平滑筋細胞、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞、ヒト肺動脈平滑筋細胞、ヒト冠動脈平滑筋細胞、ヒト気管支平滑筋細胞、ヒト橈骨動脈平滑筋細胞、およびヒト伏在静脈または頸静脈平滑筋細胞を含めた、様々な種類の平滑筋細胞（ＳＭＣ）が、本発明において使用するのに適したものであり得ることを理解するであろう（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＢｅｒｔｒａｍらの米国公開出願第２００７０１９００３７号を参照）。Ｂｅｒｔｒａｍらの米国公開出願第２００７０１９００３７号に記載されているように、ＳＭＣは、例えば、生存対象からの生検、および死体からの全臓器回収（ｗｈｏｌｅ−ｏｒｇａｎ  ｒｅｃｏｖｅｒ）を含めた、様々な供給源から単離することができる。単離される細胞は、レシピエントであることが意図された対象からの生検によって得られた自己細胞であることが好ましい。
【０１４８】
別の実施形態では、ＴＥＢＶは、ＴＥＢＶの内側表面または管腔表面上に第２の細胞集団を含む。好適な実施形態では、第２の細胞集団は内皮細胞集団である。当業者は、限定することなく、動脈および静脈の内皮細胞（ＥＣ）、例えば、ヒト冠動脈内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト臍帯動脈内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト頸静脈内皮細胞、ヒト橈骨動脈内皮細胞、およびヒト内胸動脈内皮細胞などを含めた、様々な種類のＥＣが、本発明において使用するのに適したものであり得ることを理解するであろう（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国公開出願第２００７０１９００３７号を参照）。ＥＣは、限定することなく、血管実質、循環内皮細胞、ならびに内皮細胞前駆体、例えば、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞、および胚性幹細胞などを含めた、様々な供給源から単離することができる（そのそれぞれの全体が参照により組み込まれている、Ｂｉｓｃｈｏｆｆらの米国公開出願第２００４００４４４０３号、およびＲａｆｆｉらの米国特許第６，８５２，５３３号を参照）。
【０１４９】
当業者は、本明細書に記載される１つまたは複数の細胞集団の播種または堆積は、様々な当技術分野で公知の様々な方法によって実現することができることを理解するであろう。例えば、バイオリアクターインキュベーションおよび培養（Ｂｅｒｔｒａｍら  米国公開出願第２００７０２７６５０７号；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら  米国特許第７，１１２，２１８号；Ａｕｇｅｒら  米国特許第５，６１８，７１８号；Ｎｉｋｌａｓｏｎら  米国特許第６，５３７，５６７号）；圧力に誘導された播種（Ｔｏｒｉｇｏｅら（２００７年）  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１６巻（７号）：７２９〜３９頁；Ｗａｎｇら（２００６年）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ５月；２７巻（１３号）：２７３８〜４６頁）；および静電気的な播種（Ｂｏｗｌｉｎら  米国特許第５，７２３，３２４号）を使用することができる。さらに、エレクトロスピニングされる繊維を、細胞のエアロゾルとともに同時にコートする最近の技法は、播種または堆積に適することができる（Ｓｔａｎｋｕｓら（２００７年）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２８巻：２７３８〜２７４６頁）。
【０１５０】
一実施形態では、細胞の堆積は、管状足場を細胞付着増強（ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）タンパク質と接触させるステップを含む。別の実施形態では、増強タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数である：フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）、コラーゲン、およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）。他の一実施形態では、管状足場は、細胞付着増強タンパク質がない。別の実施形態では、細胞の堆積は、管状足場を１つまたは複数の細胞集団と接触させた後、培養するステップを含む。さらに別の実施形態では、培養は、バイオリアクター内で拍動性流および／または定常流によってコンディショニングするステップを含むことができる。
【０１５１】
一態様では、本発明は、心血管疾患または障害の治療を必要とする対象において、これらを治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、必要とする対象を同定するステップを含む。別の実施形態では、この方法は、対象から１つまたは複数の生検試料を得るステップを含む。他の一実施形態では、この方法は、ＴＥＢＶを提供するために、試料から１つまたは複数の細胞集団を単離し、ＴＥ足場上でこの１つまたは複数の細胞集団を培養するステップを含む。別の実施形態では、培養するステップは、バイオリアクター内で、細胞を播種したＴＥＢＶ足場をコンディショニングするステップを含む。一実施形態では、コンディショニングは、バイオリアクター内で、定常流および／または拍動性流を含む。別の実施形態では、この方法は、心血管疾患または障害を治療するために、その必要のある対象に、細胞を播種し、コンディショニングしたＴＥＢＶを移植することを含む。
【０１５２】
当業者は、本発明の方法によって治療するのに適した様々な心血管障害を理解するであろう。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、必要とする対象において心血管障害を治療するのに有用な薬剤を調製するための、本明細書に記載されるＴＥ足場および／またはＴＥＢＶの使用を提供する。
【０１５４】
以下の実施例は、例示的な目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することが意図されることはまったくない。
【０１５５】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および文献参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１５６】
（実施例１）−ラテックス管上の縫合ラップ（ｓｕｔｕｒｅ  ｗｒａｐ）
２成分管状構造における「Ｊ」字型機械的応答の生成。
【０１５７】
２成分システムにおける「Ｊ」字型機械的挙動の生成が可能である、いくつかの方法が存在する。堅い外側層（引っ張りエレメント）に結合した弾性内側層の組合せからの結果を以下に示す。この場合、内側層はラテックスであり、外側層は、ラップされたポリジオキサンノン（ＰＤＯ）、または縫われたＶＩＣＲＹＬ（商標）（９０：１０  ＰＬＧＡ）のいずれかの縫合糸である。図１４Ａ〜Ｂは、ラテックス管の外側円周の周囲に縫合されたＶＩＣＲＹＬ（商標）から作製された足場を示す。縫合は、ラテックス管がより大きい直径に拡大されている間に施した。ラテックス管をその静止直径で撮影した。これが、より大きい直径で施された縫合が、ラテックス管の円周の周囲にループを形成している理由である。スケールバーは０．５ｃｍである。Ａ）軸方向図  Ｂ）側面図。
【０１５８】
方法
内径３．１７５ｍｍ（Ｄ１）を有する薄肉のラテックス管（Ｐｒｉｍｅｌｉｎｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を、外径８．０ｍｍ（Ｄ２）を有するマンドレル上で伸ばし、円周方向の長さを１５１％増加させた。この新しい、より大きい円周で、ＰＤＯ縫合糸（１．０メートル、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を、ラテックス管の長さにわたってらせん状に手で巻いた。縫合糸の頂部に液体ラテックス（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）の薄層を塗布することによって、ＰＤＯ縫合糸を適所に固定した。
【０１５９】
室温および標準気圧（大気圧）で硬化させた後、複合体をマンドレルから取り出し、この時点で直径を最初の直径（Ｄ１）に戻した。次いでＭＴＳ  Ｂｉｏｎｉｘ引っ張り試験システム（ＭＴＳ，  Ｉｎｃ．）で標準的に実行してこの複合体を試験した。簡単に言えば、管を特別に束縛して取り付け、破損が起こるまで５ｍｍ／秒の速度で歪をかけた。
【０１６０】
同じ薄肉のラテックス管（Ｄ１）を、より大きい直径（Ｄ２）のマンドレル上で伸ばし、円周方向の長さを１５１％増加させた。この新しい円周で、管壁の厚さの半分を超えて貫入しないで、らせん状に管の円周の周囲に、Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸材料（１．５メートル、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を手で縫合した。接着剤のコーティングは必要でなかった。先に述べたように、破損するまで試験を実施した。
【０１６１】
結果
これらの試験試料のそれぞれの引っ張り負荷は、最初の低弾性率（スチフネス）領域、その後の最初の弾性率から１桁以上増加した弾性率への鋭い上昇を特徴とする「Ｊ」字型曲線をもたらした。図８は、ラテックス／ＰＤＯ構造の得られた挙動を示す。最初の弾性率および最終的な弾性率の計算値は、それぞれ０．３ＭＰａおよび２ＭＰａである。図９は、ラテックス／Ｖｉｃｒｙｌ構造の得られた挙動を示す。この試料の弾性率は、曲線の最初の領域および最終的な領域のそれぞれについて、２ＭＰａおよび２０ＭＰａであると計算された。図１０は、ＰＤＯおよびＶｉｃｒｙｌのそれぞれの応力／歪挙動を実証し、これらはそれぞれ、３ＧＰａおよび９ＧＰａ〜１８ＧＰａの弾性率を有する。図１１は、ラテックスの応力／歪関係を実証し、これは、０．３ＭＰａ〜０．５ＭＰａの弾性率を有する。
【０１６２】
これらの結果は、引っ張り成分を堆積する前に、弾性成分を伸ばすことを伴う主要な要因を用いて「Ｊ」字型の機械的挙動を生成するために、２成分システムを使用することの実現可能性を例示する。層堆積における他の変形も可能である。例えば、ラッピング、注型、エレクトロスピニング、またはこれらの任意の組合せによって作製された１つまたは複数の層。
【０１６３】
材料選択も、一方の材料が低弾性率を伴って高度に弾性であり、他方の材料が高弾性率（他の材料より最低でも１桁大きい）および低弾性である限り、利用可能な材料に基づく広範囲の組合せに開かれている。材料についての可能な選択は、本明細書に記載されている。
【０１６４】
様々な材料、様々な予歪値、および様々な層の厚さの選択を用いて、足場設計における「Ｊ」字型機械的挙動に対して、高度の調整力（ｔｅｎａｂｉｌｉｔｙ）が利用可能である。
【０１６５】
（実施例２）
堅い外側層（引っ張りエレメント）に結合した弾性内側層の組合せも試験した。内側層はエレクトロスピニングしたポリウレタン（ＰＵ）であり、外側層はエレクトロスピニングしたポリグリコール酸（ＰＧＡ）である。
【０１６６】
方法
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中の１０％ＰＵ、およびＨＦＩＰ中の１０％のＰＧＡが、エレクトロスピニングにおいて使用したベース溶液であった。標準的なエレクトロスピニング手順を利用して、５ｍｍのＯＤのマンドレル上に１０％のＰＵ約２ミリリットルをエレクトロスピニングした。完了した後、ＰＵ管を、５ｍｍのＯＤのマンドレルから回転して外し、８ｍｍのＯＤのマンドレル上に回転して取り付けた。５ｍｍのＯＤおよび８ｍｍのＯＤのマンドレルの使用は、円周方向の長さの６０％の増加に匹敵する。
【０１６７】
次いで拡張したＰＵ管の表面上に、完全にコーティングされるまで、１０％のＰＧＡをエレクトロスピニングし、これはＰＧＡ溶液約１ｍｌの全体積に匹敵した。コーティングした後、層間剥離を最小限にするように注意を払いながらハイブリッド管を取り出した。
【０１６８】
サブサンプルを純粋なＰＵから取り、ＭＴＳ  Ｂｉｏｎｉｘ引っ張り試験システム（ＭＴＳ，  Ｉｎｃ．）で標準的に実行して、ＰＧＡ管を、積層ハイブリッドとともに試験した。簡単に言えば、管を特別に束縛して取り付け、破損が起こるまで５ｍｍ／秒の速度で歪をかけた。
【０１６９】
結果
図１２は、純粋なＰＧＡおよび純粋なＰＵから構築した管の応力／歪挙動、ならびに上述したように構築した両材料のハイブリッドから得られた応力／歪挙動の両方を例示する。ハイブリッドの引っ張り負荷は、最初の低弾性率（スチフネス）領域、その後の最初の弾性率の約２倍の弾性率（０．５ＭＰａ対０．２４ＭＰａ）までの鋭い上昇を特徴とする「Ｊ」字型曲線をもたらした。
【０１７０】
図１３は、天然のブタ頸動脈と比較した、ＰＵ／ＰＧＡハイブリッドの得られた応力／歪挙動を示す。
【０１７１】
これらの結果は、引っ張り成分を堆積する前に、弾性成分を伸ばすことを伴う重要な要因を用いて「Ｊ」字型の機械的挙動を生成するために、少なくとも２成分システムを使用することの実現可能性を支持する。２成分システムの他の繰り返しは、材料選択の変化、および追加の層の堆積を包含する。例えば、両層は、予め形成された層として提供することができ、またはラッピング、注型、エレクトロスピニング、およびこれらの任意の組合せによって形成することができる。
【０１７２】
（実施例３）−拡大するマンドレルを使用した足場形成
ここでは、本発明者らは、多成分の構成的な改変を通じて、天然血管の複雑な応力／歪挙動を反復することに成功する新規の方法を記載する。さらに、この方法は、材料選択と形成プロセスの変形の組合せを通じて、これらの複雑な生体力学的特性を「調整」するための機会を提示する。Ｔｅｃｏｔｈａｎｅ  １０７４またはポリ（Ｌ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン、およびポリグリコール酸で編まれたメッシュ管で作製された管状足場は、０．５ＭＰａ〜３．９７ＭＰａの弾性率、および平均１６７６ｍｍ−Ｈｇの破裂圧力を有する、天然血管に特徴的な応力／歪挙動を生じた。
【０１７３】
１０％のポリウレタン（ＰＵ：Ｔｅｃｏｔｈａｎｅ  １０７４、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ，  Ｉｎｃ．）および１２％のポリ（Ｌ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ：Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）を、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ：Ｓｉｇｍａ）中に原液として維持した。これらの材料の長さ１２ｃｍの管（内径４ｍｍ〜６ｍｍ、約４〜５ｍｌの原液）を、他で記載したようにエレクトロスピニングによって形成した（Ｄａｈｌ  ２００７年  上記を参照）。ＰＵおよびＰＬＣＬについてのエレクトロスピニングパラメータを表３に示す。
【０１７４】
【表３】
0005632749.tif 000006
エレクトロスピニングの後、受託開発のマンドレルを管中に挿入する。この受託開発のマンドレルは、円形断面を維持しながら、エンドウェッジによって離された複数のセクションからなる（図５に例示した）。この様式では、ポリマー管を短時間でより大きい内部／外部直径にすることができる。例えば、このマンドレルは、６ｍｍの内径（ＩＤ）を有する管について最大１６０％、または４ｍｍのＩＤを有する管について最大２５０％、管の内径を増加させる。ＩＤを増加させた後、マンドレルをその元の設定値に戻すことによって、管をその元の直径に弾性的に後退させることができる。
【０１７５】
ＰＵまたはＰＬＣＬの６ｍｍのＩＤの管を、８ｍｍのＩＤのポリグリコール酸（ＰＧＡ）で編まれたメッシュ管（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ）中に挿入した後、その元の直径の１４０％（新しい直径）に拡大した。この新しい直径で、ＰＵまたはＰＬＣＬ管を、編まれたメッシュＰＧＡ管によってしっかりと結合させた。この時点で、合成物（ＰＵまたはＰＬＣＬ）のそれぞれの層の間で、メッシュの接着サンドイッチを可能にする様式で、メッシュおよび管の頂部に、ＰＵまたはＰＬＣＬの追加の薄層（ポリマー溶液約１ｍｌ）をエレクトロスピニングした。ＰＵまたはＰＬＣＬ管／ＰＧＡメッシュ複合体を、最初に利用したＰＵまたはＰＬＣＬ管の元の直径に戻させた。下にある管の収縮は、メッシュ管を同調させ、波形をつけられた（よじれた）均一な表面特徴を生じる。この「拡大するマンドレル」プロセスの図解を図４Ｅに示す。
【０１７６】
足場形成
図１５Ａ〜Ｂは、拡大するマンドレル技法を使用して構築される足場に一般的な肉眼像を例示する。このＰＵ／ＰＧＡ足場の長さを伝わる波形が、低拡大率Ａ）、および大拡大率Ｂ）で眼で見える。足場の大きさは約１２ｃｍである。
【０１７７】
図１６Ａ〜ＢはＰＵ／ＰＧＡ足場の５倍の断面図を示し、拡大するマンドレル技法の結果として形成された円周方向に均一な波形をさらに例示する。図１５Ａに示したスケールバーは７００μｍである。図１６Ａにおいて、ＰＧＡは存在しないが、形成プロセスはＰＧＡメッシュが存在する図１６Ｂにおいて行った形成プロセスと同じままである。両画像において、この形成プロセスの結果として波形を見ることができ、メッシュの存在の結果として図１６Ｂにおいて波形が強調されている。図１６Ａにおいて波形の程度が小さいのは、ＰＵ管の拡大後に塗布したＰＵの追加の層のためである。足場の壁厚および長さは、一般にそれぞれ７００μｍおよび１２ｃｍの程度である。
【０１７８】
（実施例４）−機械的検査
破裂圧力試験
社内製の破裂試験装置は、高圧シリンジポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）、ステンレス鋼の２０ｍｌシリンジ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）、および較正された最大１００ｐｓｉの液体／ガス圧力計（Ｏｍｅｇａ）からなっていた。このシステムは、Ｌａｂｖｉｅｗ  ｖ８．５、およびコンパクトフィールドポイント（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して制御した。試験の間に確実に漏れがないようにするために、管状足場の内側管腔を、円筒形の５ｍｍのＩＤの標準的なラテックスバルーン（Ｕｎｉｑｕｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）で裏打ちした。破損が起こるまで、液体体積を１ｍｌ／分の定常速度で足場に送達した。機械的破損直前の最大値が、報告される破裂圧力値である。
【０１７９】
円周方向の試験（環試験）：次いで、ＭＴＳ  Ｂｉｏｎｉｘ引っ張り試験システム（ＭＴＳ，  Ｉｎｃ．）で標準的に実行して足場を試験した。簡単に言えば、足場を特別に束縛して取り付け、破損が起こるまで５ｍｍ／秒の速度で変位をかけた。試験した足場の寸法（厚さ、開始長、幅）を慎重にマイクロメートル測定して、得られた未処理の力／変位データを応力／歪プロットに変換した。
【０１８０】
結果
試験した管状足場は、２成分システムに相応した応力／歪挙動を常に生じた（図１７）。すべての足場は、機械的破損の前に３７４±２２９％の移行歪で高スチフネスゾーン（Ｅ＝３．９７±１．６ＭＰａ）を生じる、最初の低スチフネス挙動（Ｅ＝０．５±０．２４ＭＰａ）からなる機械的挙動を実証する。図１８は、管状足場の破裂圧力試験からの結果を例示する。全破裂圧力は１６７６±６７６ｍｍ−Ｈｇであった。要約データを表４に示す。
【０１８１】
【表４】
0005632749.tif 000007
足場調整力：管状足場は、形成パラメータ、例えば利用される拡大するマンドレルの最終直径、ＰＧＡメッシュの伸び、およびエレクトロスピニングされる層の厚さなどに関係する様々な程度の自由を有する多成分システムである。図１９は、これらの足場の構築の可能な様々な要素である全体的な機械的特性のばらつきの一部を示す。これは、管状足場の機械的特性が調整可能であることを示す。図１９Ａは、ＰＧＡメッシュ管の破損が、合成のエレクトロスピニングされた管の破損と同時に起こる、好都合な力学を表す。
【０１８２】
図１９Ｂは、補強ＰＧＡメッシュ管が噛み合う前のエレクトロスピニングされた弾性管の破損を表す。この場合、拡大されたマンドレル上で、第１の管状エレメント上にはめられるとき、第２の管状エレメント上に施されるＰＵまたはＰＬＣＬの薄層は、通常の距離の約半分のマンドレル／針の距離、すなわち、ＰＵについて約５ｃｍ〜約７ｃｍ、およびＰＬＣＬについて約６ｃｍ〜約８ｃｍでエレクトロスピニングされる。針により近く近接していることは、通常の距離でのエレクトロスピニングと比較して、ＰＵ／ＰＬＣＬ溶液が、針から第２の管状エレメントの表面に移動する際に空気に曝される時間が減少し、これにより、より多くの量の溶媒が、第２の管状エレメントおよび下にある第１の管状エレメントに接触することを意味する。溶媒の接触が増大すると第１の管状エレメントの融解が生じ、これは第１の管状エレメントをより脆性にする。
【０１８３】
図１９Ｃは、内側のエレクトロスピニングされた管が破綻する前のＰＧＡメッシュ管の仮想の噛み合いおよび破損を表す。
【０１８４】
（実施例５）−エレクトロスピニングされたＰＬＣＬまたはＰＵとの細胞相互作用
ガラスカバーガラスをエレクトロスピニングされたＰＬＣＬまたはＰＵの薄層でコーティングし、その後細胞外基質タンパク質でコーティングした。フィブロネクチンコーティングについては、ＰＢＳ中の５ｕｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチンＩ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＦＣ０１０）中に、４Ｃで一晩足場を浸漬した。低濃度コラーゲンコーティングについては、０．１％の酢酸中の５０ｕｇ／ｍｌのラット尾コラーゲンＩ（ＢＤ３５４２３６）中に、ＲＴで１時間、足場を浸漬した後、ＰＢＳで簡単に洗浄した。低濃度コラーゲン足場は、播種する前に空気乾燥した。高濃度コラーゲン足場は、３ｍｇ／ｍｌのラット尾コラーゲンＩ（ＢＤ  ３５４２３６）の薄層を塗布し、次いで閉じたチャンバー内で３分間足場をアンモニア蒸気に曝すことによって調製した。次いで高濃度コラーゲン足場を水で簡単に洗浄し、その後ＰＢＳ中で一晩洗浄した。最後に、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングについては、足場を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（ＢＤ３５６２３４）の薄層で覆い、３７Ｃで３０分間インキュベートすることによって、タンパク質重合を可能にした。
【０１８５】
播種の前に、フィブリン接着剤（Ｑｕｉｘｉｌ）を用いて、すべての足場を６ウェル細胞培養皿の底部に接着させた。ヒト大動脈内皮細胞（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｉｓ、Ｃ−００６）を成長培地２５０ｕＬ中に再懸濁させ、１ｃｍ２当たり４０，０００個の細胞の密度で足場表面上に直接播種した。播種された足場を３７Ｃ、５％のＣＯ２で３時間インキュベートすることによって、十分な細胞結合を可能にした。次いで、ＬＳＧＳキット成分（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓ−００３）で補充したＭｅｄｉａ２００（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｍ−２００）３ｍｌでウェルを満たした。播種された足場は、培地の交換を３日毎に行って１４日間培養した。
【０１８６】
播種された足場をＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒド中で、４Ｃで一晩固定した。細胞を、２ｕｇ／ｍｌのＣＤ３１（Ｄａｋｏ  Ｍ０８２３）一次抗体で染色し、その後に２ｕｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８ヤギ抗−マウスＩｇＧ１二次抗体で染色した。最後に、核を３ｕＭのＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０１８７】
図２０は、静置培養における、管状足場において内側構造として使用した２つの合成物（ＰＵ／ＰＬＣＬ）上での細胞結合および細胞の拡散を例示する。細胞付着増強タンパク質、すなわち、フィブロネクチン、コラーゲン、およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）で処理した後に、この試験において使用した、エレクトロスピニングされた合成ポリマーの組織化学が示されている。いずれのコーティングもない場合、ＰＬＣＬはＰＵより多くの細胞を保持する。３つのコーティング、すなわち、フィブロネクチン、コラーゲン１、およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）のうちで、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）およびコラーゲン１（用量依存応答）は、最高数の細胞を保持するように思われた。さらに、コラーゲン１およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングの場合では、ＣＤ３１について強い染色があり、コンフルエンシーが明白であった。
【０１８８】
（実施例６）−細胞播種およびバイオリアクターコンディショニング
ＰＬＣＬおよびＰＧＡメッシュから、以前に述べたように２つの管状足場を構築し、これらはそれぞれの長さが６ｃｍおよび１０ｃｍであり、それぞれ短い、および長いと呼んだ。
【０１８９】
細胞播種：主要なヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃ−００６）を、２％のウシ胎児血清、１ｕｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｕｇ／ｍｌのヘパリン、および１倍濃度のゲンタマイシン／アンホテリシンＢ溶液（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓ−００３）で補充したＭｅｄｉｕｍ  ２００（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｍ−２００）中に維持した。足場に播種するために、５〜１０の継代の細胞を、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、２５３００）を用いてトリプシン処理し、１ｍｌ当たり１２ｘ１０６個で、補充されたＭ−２００中に再懸濁させた。すべての管腔表面を覆うのに十分な体積を用いて、遠位ポートを通じて細胞懸濁液を管バイオリアクター中に注入した。すべての管を密閉した後、バイオリアクターをローラーボトル装置に移し、０．２ｒｐｍで、３７Ｃで２時間回転させた。このステップの後、バイオリアクターチャンバーを、以下に記載される流れ回路に無菌的に接続した。
【０１９０】
バイオリアクターコンディショニング：図２３に例示するように、バイオリアクターシステムを、拍動性の流れを付与することができる、受託開発で設計した制御システムを用いて社内で作製した。リザーバ（Ａ）からの流れは蠕動ポンプ（Ｂ）を通過し、逆行する流れを制限するための一方向チェックバルブ（Ｄ）を有するパルス緩衝装置（Ｃ）に入る。足場が保持されているバイオリアクターチャンバー（Ｆ）の前方の圧力トランスデューサー（Ｅ）の後に、後方の圧力トランスデューサー（Ｇ）が続き、リザーバに戻る前にピンチバルブ（Ｈ）へと続く。（図示せず：コンパクトフィールドポイントによるコンピューター制御）。
【０１９１】
播種された構築物を生理的な拍動性および剪断力に徐々に慣れされるために設計されたプロトコール（表５）に基づいて、８日の過程にわたってコンディショニングを行い、こうして細胞結合および組込みのための機会を最大にした。
【０１９２】
【表５】
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８日のコンディショニングプロトコールの後に、一連の細胞アッセイを利用することによって、構築物との細胞相互作用を評価した。
【０１９３】
（実施例７）−コンディショニングした足場の細胞アッセイ
生／死（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ）染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３２２４）：各導管の遠位および近位セクションからの１つの代表的な断片を、蛍光染色のために確保した。構築物セクションを過剰のＤＰＢＳ中で洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、調製した染色剤２．５ｍｌで置換した。（ＤＰＢＳ  １０ｍｌ、カルセインＡＭ（緑色）２０μｌ、エチジウムホモ二量体−１（赤色）５μｌ）。１０分インキュベーションした後、足場セクションを、倒立蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。断片は著しい程度の湾曲を維持しており、視覚化をかなり困難にした。ウェル内で、構築物セクションの頂部に円形のカバースリップを置くことによって、断片を平らにするのに役立てた。
【０１９４】
図２１は、実験で利用した播種密度で、細胞は、大部分はコンフルエントであり、能動的細胞死の徴候はわずかであったことを実証する（Ａ−短い近位；Ｂ−短い近位；Ｃ−長い近位；Ｄ−長い遠位；Ｅ−短い遠位）。長いセグメントの試料では、細胞は丸みを帯びており、無傷の内皮の明らかな形成はまったくない。短いセグメントの試料は、足場上に拡散し、細胞間結合を明らかに作っており、痕跡の内皮を示している細胞を示す。
【０１９５】
バイオリアクター内で細胞播種およびコンディショニングした後の、長い、および短いＰＬＣＬ／ＰＧＡメッシュの血管状（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｂｕｌａｒ）足場からの近位および遠位のセグメント（流れの入口および出口に対して）の生／死染色を示す。いずれの非生細胞も赤色で強調されている。
【０１９６】
全血凝固アッセイ：ＡＣＤ全血４．２５ｍｌを、塩化カルシウム（０．１Ｍ）４２５μｌを添加することによって活性化した。十分混合した活性化された血液のアリコート１０μｌを、対照または足場表面上に置き、様々な長さの時間インキュベートした。所定の時点で蒸留水３００μｌを添加し、これは、血餅中に組み込まれなかったＲＢＳを溶解する。得られる水／ヘモグロビン溶液の吸光度を読み、これは凝固の量に反比例する。ガラスカバースリップは、凝固に対する陽性対照表面として機能を果たし、ＣｏＳｔａｒ  Ｌｏｗ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ６ウェルプレートは、陰性対照表面として機能を果たした。
【０１９７】
図２２は、対照と比較した、播種された移植片足場についての時間の関数としての凝固発生を示す。播種された、コンディショニングされた足場セグメント、陽性および陰性対照、ならびに播種されていない／コンディショニングされていない足場材料上の全血凝固が示されている。陽性対照は、３５分で最大付近の凝固（８５％）を発生し、４５分でそれほど増大しない。播種されていない対照では、３５分と４５分の時点の間で、４０％の凝固から最大の凝固（約７５％）への上昇が見られる。陰性対照は、実験の開始時点で痕跡の凝固を示すが、すべての残りの時点について、一貫して凝固をまったく示さない。最後に、播種された移植片は、１５分の時点で最大の凝固（約３０％）を示すが、４５分までに約１０％の凝固に減少した。
【０１９８】
ｅＮＯＳ検出：ｅＮＯＳ産生は、健康な、無傷の内皮を示す。製造者のプロトコールに従って、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのｅＮＯＳ  ＥＬＩＳＡシステムを使用して、細胞に関連するｅＮＯＳを定量化した。足場断片、すなわち各構築物からの４断片（２つの遠位および２つの近位）を、細胞溶解緩衝液１５０μｌとともに微小遠心管中に入れた。次いでこれらの溶解産物を、アッセイするまで−８０Ｃで凍結した。解凍して溶解産物を遠心分離することによって細胞の残骸を除去すると、各試料から１００μｌがアッセイに利用可能であった。
【０１９９】
表６は、播種およびコンディショニングされた移植片管状足場からのｅＮＯＳ産生の結果を示す。長い、および短い、播種され、コンディショニングされた管状足場の両方から単離されたセグメント中のｅＮＯＳ産生の検出が示されている。ｅＮＯＳは、移植片の表面積に対して正規化されている。短い移植片では、大量のｅＮＯＳ（約５００ｐｇ  ｅＮＯＳ／０．２５ｃｍ２）が両試料中で検出された。短い足場では、０．２５ｃｍ２当たり６２．５ｐｇ未満のｅＮＯＳが各試料中で検出され、報告している正のｅＮＯＳについての閾値未満の短いグラフを占めている。
【０２００】
【表６】
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代謝分析：各足場は、その８日のインキュベーション／コンディショニングのために９００ｍｌの培地を有した。短いおよび長い足場に関して、グルコースおよび乳酸において検出された全体的な変化は同等であったが、グルコースの使用は、長い足場の方が短い足場と比較してわずかに少なく（それぞれ０．０７ｇ／Ｌおよび．００８ｇ／Ｌ）、乳酸産生は、各移植片について０．０５３ｇ／Ｌであった。アンモニア産生は、長い移植片の方が短い移植片と比較した場合わずかに高かった（それぞれ０．８８０ｍｍｏｌ／Ｌ対０．７８３ｍｍｏｌ／Ｌ）。
【０２０１】
表７は、消費されたバイオリアクター培地の代謝分析を示す。各バイオリアクターから確保された培地を、Ｎｏｖａ  ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ４００で分析し、結果を新鮮な培地対照と比較した。
【０２０２】
【表７】
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実施例１〜７は、天然血管を連想させる「Ｊ」字型の機械的挙動を生成するために、多成分システムを使用することの実現可能性を例示し、引っ張り成分（ＰＧＡメッシュ管）を堆積する前に、弾性成分（ＰＵ、またはＰＬＣＬ）が伸ばされる。この技法は、血管において見られる様式と同様の様式で機能する（たとえより大きいスケールにおいてでも）、波形をつけられた／よじれた構造を提供する。
【０２０３】
管状足場の機械的試験は、天然血管において一般に見られる弾性率１と弾性率２の１桁の差を実証した（図１参照）。さらに、天然血管において見られる値を正確に一致させるために、引っ張り材料としてＰＧＡを選択し、弾性材料としてＰＬＣＬまたはＰＵを選択した（表１）。実際に、管状足場を提供または形成するための技法は、一方の材料が低弾性率を伴って非常に弾性であり、他方の材料が高弾性率であり（他方の材料より最低でも桁で大きい）、低弾性である限り、合成であっても天然であっても、多くの材料選択肢に適用することができる。
【０２０４】
平均の変曲点の位置（すなわち、弾性率１から弾性率２への移行が起こる歪）は、約３７４％の歪単位であった。一般に、天然血管では、この移行部は約１００％の染色単位付近で見られる（表１）。この値についての説明は、実験において利用される、編まれたＰＧＡメッシュ管の静止直径および特性、ならびに対応して、拡大するマンドレルの直径を増加させる能力に関係する。例えば、管状足場における変曲点をより低い値にシフトさせるためには、繊維が負荷に遭遇し始める前に、編まれた管がその静止直径を超えてどの程度拡大するかを理解しなければならない。負荷の前の編まれたメッシュの拡大特性およびその静止内径を調整する能力を用いて、どの歪でメッシュが噛み合い、結果としてこの値で内側の弾性管を結合するかを選択することができる。
【０２０５】
ＰＧＡメッシュはかなりの量の負荷に耐えることができる。実際にこれは、１６７６ｍｍ−Ｈｇという平均の生理的に妥当な破裂圧力を観察することができるという知見によって実証される。しかしこの方法は、メッシュに限定されない。上述したように、様々な材料を利用することができるが、引っ張り外側層（ならびに内側弾性層）を塗布するための様々な技法も扱うことができる。例えば、後の繰り返しは、ラップされる層、注型される層、エレクトロスピニングされる層、またはこれらの任意の組合せを包含し得る。
【０２０６】
細胞播種実験およびバイオリアクターコンディショニング実験は、管状足場がどのようにインビボで機能するかについての洞察を提供した。図２０に示したように、コラーゲン１、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、またはフィブロネクチンで足場をプレコーティングすることなどの、細胞結合を増強するための標準的な処理は、合成材料との細胞：細胞および細胞：バイオマテリアル相互作用の両方において著しい改善を示す。細胞結合を増強するための他の方法には、それだけに限らないが、この試験で利用されるバルクの合成ポリマーの化学修飾が含まれる。
【０２０７】
コンディショニングされた足場の生／死アッセイは、非生細胞の存在をほとんど示さなかった。実際に、長い移植片および短い移植片の両方は、細胞密度において同じ有効範囲を有するように思われた。しかし長い移植片上で、細胞形態において明らかな差があった。図２２中に一まとめにされた凝固結果は、移植片上の細胞の存在に対して利点を明らかに示すが、長い足場においてｅＮＯＳ（表６）が欠けていた。ｅＮＯＳ産生は、健康な、無傷の内皮を示すことが公知であり、細胞は、長い移植片上に明らかに存在するが、これらは短い足場に見られる様式と同じ様式で拡散しておらず、隣接する細胞と結合を形成していない。これらの２つの足場は同じ材料であり、同じ様式で作製されたことを考慮すると、これは、これらの足場のコンディショニングがどういうわけか異なっていたことを示す。実際に、両移植片に同じコンディショニングプロトコールを与えたが、１つの可能な説明は、幾何学的な考慮事項が、異なる足場内の流れの差に導いた場合があることである。流体力学的要因への細胞感度を考慮すると、これは、乱流状態が、長い足場において見られる丸みを帯びた形態の細胞、およびこれらの結果として起こるｅＮＯＳ発現の欠如に導いたということである場合がある。さらに、ｅＮＯＳ発現に見られる不一致は、８日のコンディショニングプロトコールの過程の間で、長い足場と短い足場の間のグルコース消費におけるわずかな変化（長い足場がわずかに少なく消費する）を示す代謝データ（表７）において示されている場合がある。長い移植片によるｅＮＯＳ産生の欠如とともに、この知見は、長い移植片中の細胞の活性の低い表現型をおそらく示すものである。
【０２０８】
天然血管の複雑な力学を模倣する能力を有する多成分管状足場を形成するための新規の構造的技法が本明細書に記載される。技法および材料選択の両方の融通性により、血管特性のかなり正確な調整、したがって正確なマッチングが可能になる。将来、血管移植片環境におけるコンプライアンスミスマッチを最小限にし、または取り除く長期の利点を評価するためのインビボ動物実験を実施することができる。
【０２０９】
（実施例８）−足場上の播種された細胞の保持
インビボ移植後の、ＴＥＢＶ上に播種された細胞の保持は、Ｆｌｕｇｅｌｍａｎの米国公開特許出願第２００７０１９００３７号の実施例２６の改良版で評価することができる。
【０２１０】
本発明の組織工学による血管（ＴＥＢＶ）は、管腔側上の組織工学による足場に内皮細胞を播種し、外膜側上に平滑筋細胞を播種することによって調製される。
【０２１１】
ウサギに麻酔をし、次いで挿管した。実験の間のモニタリングシステムには、血圧測定、パルス酸素飽和度測定、およびＥＣＧが含まれる。移植片移植のためにＴＥＢＶを露出し、準備した後、全身抗凝固のためにヘパリンを静脈内に注射する。手順の間に定期的に血液試料を採取して（例えば、３０分毎）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を測定することによってヘパリン処置の有効性を評価する。
【０２１２】
次いでＴＥＢＶを頸動脈および大腿動脈中の端側に（ｅｎｄ  ｔｏ  ｓｉｄｅ）、両側に移植する。移植したＴＥＢＶを血流に曝して３０分後、かつ回収する前に、直接の触診、ドップラー流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した流量測定によって、および選択的な血管造影を実施することによってＴＥＢＶの開存性を評価する。
【０２１３】
大腿および頸動脈の移植したＴＥＢＶを移植して２時間後に回収する。回収したＴＥＢＶの内側表面上の細胞保持を蛍光顕微鏡観察によって分析する。
【０２１４】
（実施例９）−インビボ動静脈シャント（Ａ−Ｖシャント）
本発明のＴＥＢＶのインビボの有効性は、Ｃｏｒｔｅらの米国特許第７，４５９，５６４号に記載されている、「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｒｔｅｒｉｏ−Ｖｅｎｏｕｓ  Ｓｈｕｎｔ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｍｏｄｅｌ」の改良版で試験することができる。
【０２１５】
適切な体重のウサギを麻酔する。本発明の食塩水で満たしたＴＥＢＶを、大腿動脈カニューレと大腿静脈カニューレの間に接続する。血液は、動静脈シャント（ＡＶ−シャント）として作用するＴＥＢＶを介して大腿動脈から大腿静脈へと流れる。ＴＥＢＶの開存性は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して、このモデルを使用してインビボで評価することができる。例えば、著しい狭窄を伴わずに移植片を通る血流の存在、および目詰まりの非存在が評価される。超音波技法を移植したＴＥＢＶを観察するのに使用することができる。ＴＥＢＶの、針穿刺から回復する能力も、開存性を試験するのに使用される。試験の最後に動物を屠殺し、移植したＴＥＢＶを取り出して、ＴＥＢＶ上の細胞の数、および播種した細胞がインビボの間に再生プロセスを開始した範囲などをさらに検査する。さらに、ＴＥＢＶの機械的特性を評価し、天然の血管移植片および／または移植前のＴＥＢＶの機械的特性と比較する。
【０２１６】
同じタイプのＡＶ−シャントモデルを、位置間血管移植片に使用されるＴＥＢＶの開存性を試験するのに使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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