(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の断片またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含有することを特徴とする、血管新生促進用組成物。
【請求項２】
前記遺伝子は、配列番号７または配列番号８で表示される塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の血管新生促進用組成物。
【請求項３】
前記遺伝子は、ベクターに挿入されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の血管新生促進用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の血管新生促進用組成物を有効成分として含むことを特徴とする、狭心症、動脈硬化、脳卒中、脳血管性痴呆、慢性潰瘍、または創傷の予防または治療用組成物。
【請求項５】
配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の部位に結合するポリペプチド、および抗体からなる群より選択された１種以上を含有することを特徴とする、血管新生抑制用組成物。
【請求項６】
前記結合組織成長因子蛋白質の部位を暗号化する遺伝子は、配列番号７または配列番号８の塩基配列からなることを特徴とする、請求項５に記載の血管新生抑制用組成物。
【請求項７】
請求項５および６のいずれか１項に記載の血管新生抑制用組成物を有効成分として含有することを特徴とする、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療用組成物。
【請求項８】
（ａ）配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子を含む細胞に候補化合物を処理するステップと、（ｂ）前記遺伝子の発現程度を測定するステップとを含み、
前記候補化合物を処理した細胞の遺伝子の発現程度が候補化合物を処理していない細胞に比べて減少した場合、前記候補化合物を血管新生抑制剤として決定することを特徴とする、血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記（ｂ）ステップの遺伝子の発現程度は、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびＲＴ−ＰＣＲからなる群より選択された方法で測定するものであることを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記血管新生抑制剤は、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療に使用するためのものであることを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の部位に結合するポリペプチド、および抗体からなる群より選択された１種以上の血管新生抑制剤製造のための用途。
【請求項１２】
前記結合組織成長因子蛋白質の部位を暗号化する遺伝子は、配列番号７または配列番号８で表示される塩基配列からなることを特徴とする、請求項１１に記載の用途。
【請求項１３】
前記血管新生抑制剤は、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療に使用されるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合組織成長因子を用いた血管新生関連薬学的組成物に関し、前記結合組織成長因子を含有する血管新生促進または結合組織成長因子に結合するポリペプチド、抗体、および化合物からなる群より選択されたものを含有する血管新生抑制用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、既存の微細血管から新たな毛細血管が形成される過程であって、血管新生が正常に起こる場合は、胚発生（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、組織再生および傷治療、周期的な女性の生殖器系の変化である黄体が発達する時であり、この場合にも厳格に調節されて進行する（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６，ｐｐ２０７−２４８，１９７６）。
【０００３】
成人の場合、血管内皮細胞は非常に遅く育ち、他の種類の細胞に比べて相対的によく分裂しない。血管新生が起こる過程は、一般的に、血管新生促進因子の刺激により、プロテアーゼによる血管基底膜の分解、血管内皮細胞の移動、増殖および血管内皮細胞の分化による管腔の形成で血管が再構成され、新たな毛細血管が生成されることによって行われる。
【０００４】
血管新生が自律的に調節されずに病的に成長することによってもたらされる疾患がある。病理学的状態で現れる血管新生に関連する疾患には、血管腫、血管繊維腫、血管奇形および心血管疾患の動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症があり、血管新生による眼科疾患には、角膜移植性血管新生、血管新生性緑内障、糖尿病性網膜症、新生血管による角膜疾患、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎などがある。
【０００５】
関節炎のような慢性炎症性疾患、乾癬、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、にきびのような皮膚科疾患、アルツハイマーおよび肥満も血管新生に関連性があり、癌の成長と転移は必ず血管新生に依存する（Ｄ’Ａｍａｔｏ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１０２（９），ｐｐ１２６１−１２６２，１９９５；Ａｒｂｉｓｅｒ  ＪＬ，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，３４（３），ｐｐ４８６−４９７，１９９６；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９３（４），ｐｐ６７２−６８２，１９９６；Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８６，ｐｐ３５３−３６４，１９９６）。
特に、癌の場合、血管新生は癌細胞の成長と転移に重要な役割を果たす。腫瘍は、新生血管を通して成長と増殖に必要な栄養と酸素の供給を受け、また、腫瘍まで浸透した新生血管は移転する癌細胞が血液循環系に入る通路を提供することにより、癌細胞が転移するようにする（Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｙｌｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｓ．Ｂ．Ｄａｙ  ｅｄ．）Ｒａｖｅｎ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ９４−１０３，１９７７；Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，６（３），ｐｐ２３０−２４７，１９９５）。
【０００６】
反面、過剰な血管形成は疾病悪化の主因になったりもするが、血管の未形成も深刻な疾病の原因となっている。血管新生は、傷治癒や組織再生に必須の現象といえるが、例えば、血管形成が未発達の胎盤は流産の重要な原因となり、血管の未形成による壊死、潰瘍および虚血の場合、組織や器官の機能異常を誘発したり、死亡の原因となり得る。また、動脈硬化症、心筋梗塞および狭心症のような疾病も円滑でない血液供給が原因となっている。したがって、血管の未形成による低酸素状態または低栄養状態の誘発による組織損傷を低減させ、円滑な組織再生のために新たな血管形成を誘導したり促進させようとする治療法の開発が必要になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、炎症性サイトカインの一種である血管内皮細胞成長因子−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ）とＦＰＲＬ１（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ１）が関与する血管新生において、結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）がＦＰＲＬ１と結合することによって血管新生が誘導されることと、特に、ＣＴＧＦがＦＰＲＬ１と結合する部位を明らかにし、前記部位を通して血管新生が誘導されることを確認することによって本発明に至った。
【０００８】
したがって、本発明の一例は、ＣＴＧＦ内のＦＰＲＬ１との結合部位に相当する蛋白質断片および／またはこれを暗号化する遺伝子を含有する血管新生促進用薬学的組成物；ＣＴＧＦ内のＦＰＲＬ１との結合部位に相当する蛋白質断片および／またはこれを暗号化する遺伝子の血管新生促進剤製造のための用途を提供することを目的とする。
【０００９】
他の例は、ＣＴＧＦ内のＦＰＲＬ１との結合部位に相当する蛋白質断片および／またはこれを暗号化する遺伝子の抑制剤を含有する血管新生抑制用薬学的組成物；ＣＴＧＦ内のＦＰＲＬ１との結合部位に相当する蛋白質断片および／またはこれを暗号化する遺伝子の抑制剤の血管新生抑制および／または血管新生抑制剤製造のための用途を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに他の例は、ＣＴＧＦ内のＦＰＲＬ１との結合部位をターゲットとして用い、血管新生抑制剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的のために、本発明の一例は、配列番号５（ＷＶＣＤＥＰＫＤＱＴＶＶＧＰＡＬＡＡＹＲＬＥＤＴＦＧＰＤＰＴＭＩＲＡＮＣＬＶ）または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の断片を含有する血管新生促進用薬学的組成物；前記結合組織成長因子蛋白質の断片の血管新生促進剤製造のための用途を提供する。
【００１２】
他の例は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子を含有する血管新生促進用薬学的組成物；前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子の血管新生促進剤製造のための用途を提供する。
【００１４】
さらに他の例は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の部位に結合するポリペプチド、および抗体からなる群より選択された１種以上を含有する血管新生抑制用薬学的組成物；前記結合組織成長因子蛋白質の部位に結合するポリペプチド、抗体および化合物の血管新生抑制剤製造のための用途を提供する。
【００１５】
さらに他の例は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の部位の発現抑制剤を有効成分として含む血管新生抑制用薬学的組成物；結合組織成長因子蛋白質の部位の発現抑制剤の血管新生抑制剤製造のための用途を提供する。例えば、前記発現抑制剤は、配列番号５のアミノ酸配列を暗号化する遺伝子の塩基配列（配列番号７）で表示される塩基配列からなり得る。
【００１７】
さらに他の例は、（ａ）配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子を含む細胞に候補化合物を処理するステップと、（ｂ）前記遺伝子の発現程度を測定するステップとを含み、前記候補化合物を処理した細胞での前記遺伝子の発現程度が候補物質を処理していない細胞に比べて減少した場合、前記候補化合物を血管新生抑制剤として決定することを特徴とする、血管新生抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の血管新生促進用組成物は、配列番号９のアミノ酸配列の中において、配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片を含有することを特徴とする。
【００１９】
前記結合組織成長因子蛋白質（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）の全長アミノ酸配列は、ヒト由来のもの（例えば、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＣＡＧ４６５５９．１）であり得、配列番号９で表示され得る。従来の炎症性サイトカインの一種である血管内皮細胞成長因子−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ）とＦＰＲＬ１（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ１）が関与する血管新生において、前記結合組織成長因子蛋白質がＦＰＲＬ１と結合することによって血管新生が誘導できる。具体的には、前記結合組織成長因子は、ＦＰＲＬ１に特異的なＥＲＫリン酸化を誘導する活性があり（実験結果２参照）、ＶＥＧＦ−Ａによって発現が誘導される蛋白質であって（実験結果３参照）、ＦＰＲＬ１と結合することによって血管新生が誘導される（実験結果１１参照）。
【００２０】
特に、前記結合組織成長因子蛋白質がＦＰＲＬ１と結合する部位は、結合組織成長因子蛋白質の全長アミノ酸配列である配列番号９の１６４番目のアミノ酸から２０１番目のアミノ酸までの部位で、配列番号５のアミノ酸配列で表示できる（実験結果４参照）。
したがって、本発明の血管新生促進用薬学的組成物の有効成分である結合組織成長因子蛋白質の断片は、前記結合組織成長因子蛋白質の全長配列である配列番号９のアミノ酸配列の中において、前記配列番号９の１６４番目のアミノ酸から２０１番目のアミノ酸までの部位である配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含むものであり得る。前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、これに限定されないが、より好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列（ＥＷＶＣＤＥＰＫＤＱＴＶＶＧＰＡＬＡＡＹＲＬＥＤＴＦＧＰＤＰＴＭＩＲＡＮＣＬＶ）で表示されたものであり得る。
【００２１】
前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、ＦＰＲＬ１と結合する部位で（実験結果５参照）、ＦＰＲＬ１に特異的なＥＲＫリン酸化を効果的に誘導し（実験結果６参照）、ＦＰＲＬ１を活性化して細胞内のＣａ２＋濃度を上昇させ（実験結果７参照）、最終的に血管生成を効果的に誘導する活性がある（実験結果９参照）。
【００２２】
また、本発明の血管新生促進用薬学的組成物は、配列番号９のアミノ酸配列の中において、配列番号５のアミノ酸配列を含み、連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子を含有するものであり得る。前記遺伝子は、これに限定されないが、好ましくは、結合組織成長因子蛋白質の全長アミノ酸配列において、１６４〜２０１番目の部位である配列番号５のアミノ酸配列を暗号化するものであるか、前記配列番号５のアミノ酸配列が含まれている配列番号６のアミノ酸配列を暗号化するものであり得る。前記遺伝子は、より好ましくは、前記配列番号５のアミノ酸配列を暗号化する配列番号７の塩基配列（１６４−ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ−２０１）で表示され得、前記配列番号６のアミノ酸配列を暗号化する配列番号８で表示される塩基配列（１６３−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ−２０１）であり得る。
【００２３】
前記遺伝子は、これに限定されないが、ベクター、好ましくは、組み換え発現ベクターに挿入されたものであり得、前記組み換え発現ベクターは、前記遺伝子およびこれと作動可能に連結されたプロモーターなどの発現調節因子を含むものであり得る。例えば、前記組み換え発現ベクターは、例えば、ＥｃｏＲ  Ｉ−ＩＮＳＥＲＴ−Ｘｂａ  Ｉ  ｉｎ  ｐＡＢ−ｂｅｅＴＭ−ＦＨ  ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ＆ｆｌａｇ  ｔａｇ）であり得るが、これに限定されるものではない。
具体的には、前記ベクターは、１つの細胞から他の細胞にＤＮＡ切片を伝達する核酸分子に対して使用されるもので、これに限定されないが、プラスミド、バクテリオファージ、および植物または動物ウイルスからなる群より選択されたものに由来できる。
【００２４】
前記発現ベクターは、目的とする暗号化配列および特定の宿主有機体で作動的に連結された、暗号化配列の発現に必要な適した核酸配列を含む組み換えＤＮＡを言及し、原核細胞での発現に必要な核酸配列は、一般的に、他の配列と共に、プロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソーム結合部位を含むことができ、真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および終結およびポリアデニル化シグナルを用いるものであり得、これに対する事項は当業界において公知である。
【００２５】
前記組み換え発現ベクターは、適当な宿主細胞で目的蛋白質、本発明では、結合組織成長因子の断片を製造できる前記遺伝子が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構造体であり得る。
【００２６】
前記「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を果たすように核酸発現調節配列と目的とする蛋白質を暗号化する核酸配列が機能的に連結されていることをいう。例えば、プロモーターと蛋白質またはＲＮＡを暗号化する核酸配列が作動可能に連結され、暗号化配列の発現に影響を与えることができる。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野においてよく知られた遺伝子組み換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野において一般的に知られた酵素などを使用する。
【００２７】
好適な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーのような発現調節エレメントなどを含み、目的に応じて多様に製造できる。開始コドンおよび終結コドンは、遺伝子作製物が投与された時、個体で必ず作用を示さなければならず、暗号化配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）になければならない。
【００２８】
前記血管新生促進用薬学的組成物は、これに限定されないが、血管新生が抑制されて発生する疾患、または血管新生が促進されることによって治癒可能な疾患の治療用として使用でき、例えば、狭心症、動脈硬化、虚血性脳卒中、脳血管性痴呆、慢性潰瘍、または創傷の治療用として使用できる。したがって、本発明の他の例は、前記血管新生促進用薬学的組成物を有効成分として含む狭心症、動脈硬化、虚血性脳卒中、脳血管性痴呆、慢性潰瘍、または創傷の予防および／または治療用組成物を提供する。
【００２９】
一方、本発明の血管新生抑制用薬学的組成物は、配列番号９のアミノ酸配列の中において、配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するポリペプチド、抗体、および化合物からなる群より選択された１種以上を含有することを特徴とする。
【００３０】
前記記載の通り、結合組織成長因子の全長蛋白質のアミノ酸配列である配列番号９において、配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片は、ＦＰＲＬ１と結合することによって血管新生を誘導する活性があるため、前記結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するポリペプチド、抗体および化合物からなる群より選択されたものは、血管新生を効果的に抑制する活性がある。
【００３１】
前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、前記結合組織成長因子蛋白質の全長配列である配列番号９のアミノ酸配列の中において、１６４〜２０１番目の部位である配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含むものであり得、より好ましくは、前記配列番号５のアミノ酸配列が含まれている配列番号６のアミノ酸配列で表示されたものであり得る。
【００３２】
前記結合組織成長因子蛋白質の断片がＦＰＲＬ１と結合する部位を含むため、前記結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するポリペプチド、抗体または化合物は、前記結合組織成長因子蛋白質がＦＰＲＬ１と結合することを遮断し、血管新生を効果的に抑制することができる。
【００３３】
前記ポリペプチド、抗体または化合物は、前記結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するものであれば、これに限定されないが、好ましくは、配列番号６、または配列番号５のアミノ酸配列と結合するものであり得、結合対象である結合組織成長因子蛋白質の断片のアミノ酸配列に従って当業者が容易に製造することができる。
【００３４】
また、本発明の血管新生抑制用薬学的組成物は、配列番号９のアミノ酸配列の中において、配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子またはそのｍＲＮＡ、例えば、前記ｍＲＮＡのうち連続する１５〜３０個、好ましくは、連続する２０〜２５個の塩基からなる塩基配列に相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）および短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）から構成された群より選択されたものを含有することを特徴とする。
【００３５】
前記ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖と相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、これら２つの鎖は、標準ワトソン−クリック塩基対の相互作用によって互いに結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）し、前記センス鎖は、標的ｍＲＮＡ内の標的配列に同一の核酸配列を含む。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択可能な技術は、例えば、文献（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ等、「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｏｃｔ．１１，２００２）に記述されている。
【００３６】
前記ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２つの相補的かつ単一鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）のＲＮＡ分子を含むか、２つの相補的な部分が塩基対を形成し、単一鎖の「ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）」領域によって共有結合された単一分子を含むことができる。前記後者の場合をｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）と呼び、前記ｓｈＲＮＡは単一鎖で、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）上でステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造をなしている。前記ｓｈＲＮＡは、一般的に、インビボ上でポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）から相補的なＤＮＡシークエンス（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の転写によって合成される。Ｐｏｌ−ＩＩＩで誘導された転写は、明確な開始部位（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）から始まって、４個以上のチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）からなる線上（−ＴＴＴＴ−）の二番目残基（ｓｅｃｏｎｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）で終結し、ノン−ポリ（Ａ）転写産物（ｎｏｎ−ｐｏｌｙ（Ａ）ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を生成する。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、全ての細胞で活性となり、ｓｈＲＮＡの発現が可能である。転写後、ｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによってループが切断され、ｓｉＲＮＡのようにＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と作用する（参照、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｃｅｌｌ１１０（５）：５６３−７４）。
【００３７】
前記ｓｉＲＮＡは、本発明の属する分野において通常の知識を有する者に知られた多くの技術を利用して取得できる。例えば、ｓｉＲＮＡは、本発明の属する分野において知られた方法を用いて化学的に合成されたり組み換え方法によって生産できる。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）と従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を用いて化学的に合成できる。ｓｉＲＮＡは、相補的かつ分離された２つのＲＮＡ分子または２つの相補的な領域を有する１つのＲＮＡ分子として合成できる。他の方法として、ｓｉＲＮＡはまた、適切なプロモーターを用いて組み換えＤＮＡプラスミドから発現できる。プラスミドから前記ｓｉＲＮＡを発現させるのに適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列および巨大細胞ウイルスプロモーターを含む。また、前記組み換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現させるために、誘導性または調節可能なプロモーターを含むことができる。
【００３８】
前記ｓｉＲＮＡは、組み換えプラスミドから相補的かつ分離された２つのＲＮＡ分子または２つの相補的な領域を有する１つのＲＮＡ分子として発現できる。本発明のｓｉＲＮＡを発現させるのに適切なプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現させるための核酸配列をプラスミド内に挿入する方法、および組み換えプラスミドを目的とする細胞に伝達する方法は、本発明の属する分野における技術範囲内にある。例えば、文献［Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６−４４８］；［Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ等（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３］；［Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ等（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００］；［Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ等（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｌｅｅ  ＮＳ等（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５］；および［Ｐａｕｌ  ＣＰ等（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８］を参考にすればよく、前記文献は、本発明において参考文献として記載されている。
【００３９】
例えば、本発明の一実現例においては、ＦＰＲＬ１のｓｉＲＮＡとしてターゲット部位をＡＡＵＵＣＡＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＵ（配列番号１０）とする二重鎖ＲＮＡ分子（例えば、Ｓｅｎｓｅ：ＵＵＣＡＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＵｄＴｄＴ（配列番号３）およびＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ：ＡＵＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡＵＧＵＧＡＡｄＴｄＴ（配列番号４））を使用することができる。
【００４０】
本発明の血管新生抑制用薬学的組成物は、血管新生に関連する疾病の予防および／または治療に使用できる。前記血管新生に関連する疾病は、例えば、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性膜網症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症などからなる群より選択された疾患または症状であり得る。したがって、本発明の一例は、前記血管新生抑制用薬学的組成物を有効成分として含有する、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症などからなる群より選択された疾患または症状の予防または治療用組成物を提供する。
【００４１】
本発明の血管新生促進用薬学的組成物または血管新生抑制用薬学的組成物は、投与のために、前記記載した有効成分のほか、追加的に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームおよびこれら成分のうちの１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用できるように標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。ひいては、当該技術分野における適正な方法により、またはレミントンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を用い、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００４２】
本発明の血管新生促進用薬学的組成物または血管新生抑制用薬学的組成物は、経口、局所、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮などの投与を目的として製造できる。好ましくは、注射可能な形態で使用できる。
これにより、特に処理される領域には、直接的な注入のために、注射可能な組成物のための任意の薬学的に許容される媒介体と混合できる。本発明の組成物は、特に、等張滅菌溶液または滅菌水または適切な生理食塩水の添加によって注射可能な溶液の組成を可能にする凍結乾燥組成物を含むことができる。患者の腫瘍への直接的な注入は、治療効率を感染した組織に集中させるようにするため有利である。使用される投与量は、多様なパラメータ、特に、遺伝子、ベクター、使用される投与方式、問題視される疾病または代案的に要求される治療期間によって調節できる。また、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。１日投与量は、約０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｋｇであり、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００４３】
一方、本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング方法は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列の中において、配列番号５のアミノ酸配列を含む連続する３８個以上、例えば、連続する３８個〜１４０個（例えば、１０３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、連続する３８個〜１００個（例えば、１０３番目から２０２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、または連続する３８個〜８０個（例えば、１６３番目から２４２番目のアミノ酸までの部位の中から選択）、好ましくは、連続する３８個〜３９個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子を含む細胞に候補化合物を処理するステップと、（ｂ）前記遺伝子の発現程度を測定するステップとを含み、前記候補化合物を処理した細胞での前記遺伝子の発現程度が候補物質を処理していない細胞に比べて減少した場合、前記候補化合物を血管新生抑制剤として決定することを特徴とする。
【００４４】
前記（ａ）ステップにおいて、結合組織成長因子蛋白質の断片は、例えば、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列で表示され得る。前記候補化合物は、これに限定されないが、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、または動物組織抽出物であり得、新規な物質のみならず、広く知られたものであってもよい。前記（ａ）ステップにおける細胞は、前記遺伝子を含む組み換え発現ベクターで形質転換された細胞であり得、このような形質転換方法は、当業界において幅広く公知されている。
【００４５】
前記（ｂ）ステップにおいて、遺伝子の発現程度は、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびＲＴ−ＰＣＲから構成された群より選択されたいずれか１つで測定することが好ましいが、これに限定されない。前記遺伝子の発現程度は、これに限定されないが、好ましくは、前記発現に伴う蛋白質の量を確認する方法として抗体を用いる場合には、標的蛋白質に特異的かつ検出可能な標識に連結された第２抗体を添加することができ、検出はまた、第２抗体を添加した後、第２抗体に対する結合親和度を有し、検出可能な標識に連結された第３抗体を添加することもできる。第２抗体または第３抗体に検出可能な標識は、適切な発色性基質と培養時に発色を示す酵素が使用できる。検出可能な部分は、分光学的、酵素的、光化学的、生化学的、生体電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段で検出可能な組成物を含むことができ、例えば、蛍光マーカーおよび染料、磁性標識、連結された酵素、質量分光タグ、スピン標識、電子伝達供与者および受容者などがあるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
前記候補化合物を処理した細胞での前記遺伝子の発現程度が候補化合物を処理していない対照群に比べて減少した場合、前記候補化合物は、血管新生抑制剤として選別できる。前記血管新生抑制剤は、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性膜網症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、癌、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症などからなる群より選択された疾患の予防または治療に使用されるものであり得るが、これに限定されない。
【００４７】
前記本発明のスクリーニング方法を用いる場合、短時間に前記メカニズムに関与する治療剤を選別し、これを立証する実験を通し、血管新生による疾患の予防および／または治療を必要とする患者に有用な予防剤および／または治療剤を提供することができる。
本発明で明らかにした結合組織成長因子蛋白質の断片は、ＦＰＲＬ１と結合する部位で、ＦＰＲＬ１に特異的なＥＲＫリン酸化を効果的に誘導し、ＦＰＲＬ１を活性化して細胞内のＣａ２＋濃度を上昇させ、最終的に血管生成を効果的に誘導する活性があり、これにより、結合組織成長因子蛋白質の断片は、血管新生促進用薬学的組成物に有用に使用でき、反面、前記結合組織成長因子蛋白質の断片と結合するポリペプチド、抗体または化合物は、血管新生抑制用薬学的組成物に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＶＥＧＦ−Ａを処理して得られたＨＵＶＥＣｓの条件培地が、ＦＰＲＬ１が過発現したＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導するか否かを確認するために、免疫ブロットを行った結果である。
【図２】条件培地、ＶＥＧＦ−Ａおよび陽性対照群（ＷＫＹＭＶｍ）がＦＰＲＬ１を過発現するＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でのみＥＲＫリン酸化が誘導されることを確認した実験結果である。
【図３】条件培地のＨＰＬＣ分画物をＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞に処理し、ＥＲＫリン酸化の有無を確認した結果である。
【図４】条件培地のＢ１２分画物に対してＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果である。
【図５】ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓにおいて細胞溶解物または条件培地でのＣＴＧＦの発現程度をＶＥＧＦ−Ａの処理時間に応じて分析した結果である。
【図６】ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓにおいて細胞溶解物または条件培地でのＣＴＧＦの発現程度をＶＥＧＦ−Ａの処理量に応じて分析した結果である。
【図７】ＶＥＧＦ−Ａ受容体に対する抗体を投与した場合、ＣＴＧＦの発現が顕著に減少することを確認した結果である。
【図８】ＦＰＲＬ１に対するＣＴＧＦ結合部位を決定するための方法を示す概略図である。
【図９】全長ＣＴＧＦ蛋白質またはその一部の欠失蛋白質がＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導するか否かを確認した結果である。
【図１０】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドがＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でのみ結合するか否かを確認した結果である。
【図１１】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドがｒｈＣＴＧＦに似た水準でＥＲＫリン酸化を誘導し、これはＦＰＲＬ１拮抗剤（ＷＲＷ４）によって減少することを確認した結果である。
【図１２】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドが処理されたＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＣａ２＋濃度が上昇するか否かを確認した結果である。
【図１３】ＨＵＶＥＣｓ細胞で配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドがＦＰＲＬ１に結合するか否かを確認した結果である。
【図１４】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドをＨＵＶＥＣｓに処理した場合、ＥＲＫリン酸化が効果的に誘導されることを確認した結果である。
【図１５】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドをＨＵＶＥＣｓに処理した場合、濃度依存的に細胞内のＣａ２＋濃度が増加することを確認した結果である。
【図１６】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドがＨＵＶＥＣｓの増殖には大きく影響しないことを確認した結果である。
【図１７】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドが濃度依存的にＨＵＶＥＣｓの移動を誘導することを確認した結果である。
【図１８】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドが濃度依存的にＨＵＶＥＣｓの管構造の形成を誘導することを確認した結果である。
【図１９】配列番号６のＣＴＧＦリンカーポリペプチドがインビボで濃度依存的に血管生成を誘導することを確認した結果である。
【図２０】ＶＥＧＦ−ＡがＨＵＶＥＣｓ細胞でＦＰＲＬ１の発現を誘導するか否かを培養時間に応じてＲＴ−ＰＣＲまたはフローサイトメトリー分析を行って確認した結果である。
【図２１】ＶＥＧＦ−ＡがＨＵＶＥＣｓ細胞でＦＰＲＬ１の発現を誘導するか否かを処理量に応じてＲＴ−ＰＣＲまたはフローサイトメトリー分析を行って確認した結果である。
【図２２】ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されたＨＵＶＥＣｓの増殖がＦＰＲＬ１拮抗剤（ＷＲＷ４）によって大きく減少しないことを確認した実験結果である。
【図２３】ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されたＨＵＶＥＣｓの移動がＦＰＲＬ１拮抗剤（ＷＲＷ４）によって大きく減少することを確認した実験結果である。
【図２４】ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されたＨＵＶＥＣｓの管形態構造の形成がＦＰＲＬ１拮抗剤（ＷＲＷ４）によって大きく減少することを確認した実験結果である。
【図２５】ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣｓに処理した結果、ＦＰＲＬ１の発現が抑制されることを確認した結果である。
【図２６】ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣｓに処理した場合、ＶＥＧＦ−Ａによって誘導された細胞の移動が抑制されることを確認した結果である。
【図２７】ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣｓに処理した場合、ＶＥＧＦ−Ａによって誘導された管形態構造の形成が抑制されることを確認した結果である。
【図２８】ＦＰＲＬ１拮抗剤（ＷＲＷ４）がＶＥＧＦ−Ａによる血管生成を抑制することを確認した結果である。
【図２９】ＶＥＧＦ−Ａによって発現したＣＴＧＦとＦＰＲＬ１が互いに結合して誘導する血管新生機序を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
下記の実施例において、全てのデータは、平均±標準偏差で表現し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔにより統計比較し、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意なものと考慮した。
【００５０】
＜実験方法＞
１．実験材料
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびＥＲＫ１／２抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）社から購入し、Ｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦ抗体および抗フラッグ（ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ）抗体をそれぞれＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）社から購入した。組み換えｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦをＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｃ．（Ｂｒｎｏ、Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）社から購入した。組み換えｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ−Ａ  ｍＡｂ、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦＲ−１  ｍＡｂ、およびａｎｔｉ−ＶＥＧＦＲ−２  ｍＡｂはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）社から入手した。
ＦＰＲＬ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ：ＵＵＣＡＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＵｄＴｄＴ（配列番号３）、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ：ＡＵＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡＵＧＵＧＡＡｄＴｄＴ（配列番号４））およびルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に対するｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ：ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ（配列番号１１）、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ：ＵＣＧＡＡＧＵＡＵＵＣＣＧＣＧＵＡＣＧｄＴｄＴ（配列番号１２））をＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）社で合成した。また、ＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）、ＷＲＷＷＷＷ（配列番号２、ＷＲＷ４）、およびｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＷＫＹＭＶｍはＡ＆ＰＥＰ  Ｉｎｃ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で合成し、純度が９５％を超えた。ｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦリンク部位のアミノ酸配列が含まれているリンカーポリペプチド（ＥＷＶＣＤＥＰＫＤＱＴＶＶＧＰＡＬＡＡＹＲＬＥＤＴＦＧＰＤＰＴＭＩＲＡＮＣＬＶ（配列番号６）−ＮＨ２）はＡｎｙｇｅｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｇｗａｎｇｊｏｏ、Ｋｏｒｅａ）で合成し、純度が９９．１％程度であった。
【００５１】
２．細胞培養
ヒトの臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ、ＨＵＶＥＣｓ）を従来公知の方法（Ｆｅｒｒｅｒｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＣＤ３４＋ＣＤ１４＋  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ＰＥＣＡＭ−１  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｋｔ／ＰＫＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１０１，１８６−１９３，２００３）によってコラーゲン分解酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を処理し、臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ）（ＳＴ．ＭＡＲＹ’Ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から分離した。前記分離されたＨＵＶＥＣｓを、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）（１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０％（ｖ／ｖ）の熱で非活性化されたウシ胎仔血清が含有されている）を用い、０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチンがコーティングされたディッシュ（ｄｉｓｈ）で培養した。
本実験のために、各細胞は飽和（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）状態に達するように培養し、３継代（ｐａｓｓａｇｅｓ）〜５継代のものを使用した。ＦＰＲＬ１を発現するｒａｔ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＲＢＬ）−２Ｈ３（ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ）細胞、ＦＰＲを発現するＲＢＬ−２Ｈ３（ＦＰＲ／ＲＢＬ）細胞、およびＲＢＬ−２Ｈ３（ｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬ）細胞（ＦＰＲＬ１またはＦＰＲ  ｒｅｃｅｐｔｏｒがｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎしない細胞）（以上、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０％（ｖ／ｖ）の熱で非活性化されたウシ胎仔血清およびＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（５００ｕｇ／ｍｌ）が追加された高濃度のブドウ糖が含まれているＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に維持させた。前記細胞を、３７℃にて、５％ＣＯ２で培養した。
【００５２】
３．条件培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が含まれていないＭｅｄｉｕｍ１９９で培養されたＨＵＶＥＣｓ（３継代〜５継代）から条件培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉａ）を収得した。前記条件培地を遠心分離して残存細胞を除去し、使用時まで−８０℃にて保管した。
【００５３】
４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬ細胞、ＦＰＲ／ＲＢＬ細胞、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞、およびＨＵＶＥＣｓを飽和するまで培養し、血清を枯渇（ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ）させた。前記刺激された細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ）をＰＢＳで２回水洗し、サンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３  ＶＯ４、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、および１μｇ／ｍｌロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ））１ｍｌに溶かし、９５℃にて３０秒間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してから、ニトロセルロース膜に移した。Ａｎｔｉ−ホスホ−ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ−ＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ−ＣＴＧＦ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、またはａｎｔｉ−Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）抗体で免疫ブロットを行った後、前記膜を化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）基質で視角化した。
【００５４】
５．ＦＰＲＬ１（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ１）活性化蛋白質の同定
ＨＵＶＥＣから収得した条件培地（ＣＭ）をＨＬＢカートリッジ（ｗａｔｅｒｓ）にローディングし、逆相カラム（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ（ＲＰ）Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ）を用いて分離した。ＲＰＣ１８ＨＰＬＣカラム（２１８ＴＰ５２１５；２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）を、水（ｗａｔｅｒ）／０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡで均一化（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ）した。ＡＣＮ／０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡを、０％（ｗ／ｖ）から１００％（ｗ／ｖ）まで濃度勾配をおいて１５０ｕｌの分画物を収得した。前記得られた活成分画物にトリプシンを処理し、３７℃にて一晩中培養した。
【００５５】
前記活成分画物のＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータを収得するために、ナノＥＳＩソース（ｎａｎｏ−ＥＳＩ  ｓｏｕｒｃｅ）が用意されたＵｌｔｉｍａｔｅ  ＨＰＬＣシステム（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ）およびａ  ＱＳＴＡＲ  ＰＵＬＳＡＲ  Ｉ  ｈｙｂｒｉｄ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ／ＰＥ  ＳＣＩＥＸ）から構成されたナノ（ｎａｎｏ）−ＬＣ  ＭＳを使用した。前記ＱＳＴＡＲを、２４時間、一定の質量で、８０００〜１００００の解像度で作動させた。スプレーチップ（ｓｐｒａｙ  ｔｉｐ）を、電圧を２３００Ｖに設定し、ＱＳＴＡＲによって感知された全ての質量数値は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）社から提供されたＡｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェアを用いて測定した。ＭＳ／ＭＳ分析のために、質量数値スペクトル（ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｓｓ  ｖａｌｕｅｓ  ｓｐｅｃｔｒａ）を、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ＭＡＳＣＯＴ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ１．７、ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）を用い、非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）データベースを通して分析して配列情報を収得した。前記のように収得したＭＡＳＣＯＴ結果は、ランダムマッチ（ｒａｎｄｏｍ  ｍａｔｃｈ）によって指示されたものより高いＭＯＷＳＥ数値を有するようにした（ｐ＜０．０５）。
【００５６】
６．プラスミドの製造、形質感染および蛋白質の精製
Ａｌａ４１までのコーディン信号ペプチド（ｃｈｏｒｄｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）以降に、フラッグタグ（Ｆｌａｇ−ｔａｇ）配列が含まれているｐＣＳ２＋発現ベクターに挿入されたジェノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＣＴＧＦの全長および欠失変異体を、Ｅ．Ｍ．Ｄｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）から提供された（ＥｃｏＲＩ−Ｃｈｏｒｄｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２０Ｎ．ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＡＡｓ  ｏｆ  ｃｈｏｒｄｉｎ−ＦＬＡＧ  ｅｐｉｔｏｐｅ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）−Ｘｈｏ  Ｉ−ＩＮＳＥＲＴ−Ｘｂａ  Ｉ  ｉｎ  ｐＣＳ２＋）（Ａｂｒｅｕ，Ｊ．Ｇ．，Ｋｅｔｐｕｒａ，Ｎ．Ｉ．，Ｒｅｖｅｒｓａｄｅ，Ｂ．＆Ｄｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓ，Ｅ．Ｍ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ−ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ＢＭＰ  ａｎｄ  ＴＧＦ−［ｂｅｔａ］．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ４，５９９−６０４，２００２）。前記欠失変異体は、ＣＴＧＦ／Ｉ−ＩＩ−Ｌ、ＣＴＧＦ／ＩＩ−Ｌ、ＣＴＧＦ／ＩＩ、ＣＴＧＦ／Ｌ、ＣＴＧＦ／Ｌ−ＩＩＩ−ＩＶ、およびＣＴＧＦ／Ｉ−Ｌ−ＩＩＩ−ＩＶと命名し、その具体的な欠失内容は図８に示した（欠失した部位は点線で表示する）。
【００５７】
前記フラッグタグ（Ｆｌａｇ−ｔａｇ）された分泌蛋白質は、製造会社の指示に従って、リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を核酸伝達感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることによって収得した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から全長および欠失変異体Ｆｌａｇ−ＣＴＧＦを、抗フラッグＭ２アフィニティ（ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｆｆｉｎｉｔｙ）ゲルカラムを用いて親和精製し、製造会社の指示に従ってＦｌａｇペプチドを溶離した。前記蛋白質の純度は、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｐｌｕｓキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、銀染色によって決定した。
【００５８】
７．ビオチン化およびフローサイトメトリー分析
ｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦのリンク部位に対応してリンカーポリペプチドの結合程度を評価するために、製造会社の指示に従って、ＥＺ−リンクマイクロスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用い、リンカーポリペプチドを標識した。リンカーポリペプチドは、常温にて１時間、ＰＢＳに９ｍ  Ｍスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）と共に培養した。ビオチン化する間、ｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬ  ｃｅｌｌｓ、ＦＰＲ／ＲＢＬ  ｃｅｌｌｓ、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ  ｃｅｌｌｓ、またはＨＵＶＥＣｓをトリプシン処理し、収集した後、常温にて３０分間、ウサギ血清を処理した。氷で３０分間ビオチン化したリンカーポリペプチドを培養した後、前記細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ  ＰＢＳに氷で短く水洗し、ａｎｔｉｈｕｍａｎ  ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で培養した後、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ  ＰＢＳで水洗し、１％ホルムアルデヒド溶液で固定した。以降、従来知られた方法によってＣｅｌｌＱｕｅｓｔおよびＷｉｎＭＤＩ２．９ソフトウェアでＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析した。（Ｈｅ，Ｒ．，Ｓａｎｇ，Ｈ．＆Ｙｅ，Ｒ．Ｄ．Ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＬ−８  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＰＲＬ１／ＬＸＡ４Ｒ．Ｂｌｏｏｄ１０１，１５７２−１５８１，２００３）
【００５９】
８．Ｃａ２＋測定
ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ、ｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬまたはＦＰＲ／ＲＢＬ細胞を、３７℃にて１時間、０．０３％（ｗ／ｖ）ｐｌｕｔｏｎｉｃ  Ｆ−１２７が含有されているｆｌｕｏ−３−ＡＭ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で培養した。この時、ｆｌｕｏ−３−ＡＭの最終濃度は２０ｕＭ／Ｌとなるようにした。前記培養後、細胞でｆｌｕｏ−３−ＡＭ蛍光がｈｉｇｈ−ｐｏｗｅｒ  Ａｒ＋レーザによって４８８ｎｍで発し、放出バンドをｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒによって５３０ｎｍで測定した。蛍光信号をニコンＥ−６００エクリプス顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅ−６００  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）が備えられた共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて感知した。蛍光強度は、ＣＴＧＦの追加前（Ｆ０）および追加後（Ｆ）の両方とも特定した。細胞内のＣａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉの変化はＦ／Ｆ０比率で表現した。各細胞から５０〜１２０個のイメージをスキャンした。
【００６０】
９．血管生成分析（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ）
増殖度分析（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）のために、ＨＵＶＥＣｓを、ゼラチンでコーティングされた２４ウェル培養ディッシュに２×１０４細胞／ウェルで平板培養し、一晩中接着されるようにした。血清が枯渇した４時間後に、前記細胞に多様なマイトジェン（ＣＴＧＦリンカーポリペプチド、ＣＴＧＦ）を４８時間処理した。［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、培養最後の６時間前に各ウェルに添加した。挿入された［３Ｈ］−チミジンを、３７℃にて１時間、０．２Ｍ  ＮａＯＨおよび０．１％ＳＤＳ溶液から抽出した。液体閃光計数器（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて放射能を測定し、その結果を３回繰り返して１分あたり平均±標準偏差で表現した。
ＨＵＶＥＣｓの傷移動（ｗｏｕｎｄｉｎｇ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）およびチューブ形成活性を下記のように確認した。
【００６１】
具体的には、６０−ｍｍ培養ディッシュ上に飽和状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で接種されたＨＵＶＥＣｓをピペットの端で傷付け、１％血清と１ｍＭ  チミジンが追加されたＭｅｄｉｕｍ１９９で、これにリンカーポリペプチド（１０−１〜１０２ｎＭ）または組み換えＣＴＧＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦ、ｒｈＣＴＧＦ；ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  Ｒ＆Ｄ、ＮＣ、ＵＳＡ）（１０１または１０２ｎＭ）を処理した。１６時間培養した後、参照線（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｌｉｎｅ）を越えて移動した細胞を数えて移動程度を定量化し、前記細胞を５０倍に拡大して撮影した。
【００６２】
一方、チューブ形成分析のために、従来重合されたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）層に、ＨＵＶＥＣｓを一定量のリンカーポリペプチド、ｒｈＣＴＧＦまたはＶＥＧＦ−Ａ１６５と共に接種した。１８時間培養後、細胞形態を位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を通して観察し、４０倍に拡大して撮影した。ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｖ４．５（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用い、各ウェルで５回ランダムに選択されたＬＰＦ（ｌｏｗ−ｐｏｗｅｒ  ｆｉｅｌｄｓ）でチューブの長さを測定することにより、チューブの形成程度を定量化した。
【００６３】
１０．ＣＡＭ（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）分析
インビボでのＣＡＭ分析は、従来公知の方法によって行った（Ｌｅｅ，Ｍ．−Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｙｒｕｖｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６１，３２９０−３２９３，２００１）。
受精した卵を、３７℃にて一定の湿度に設定されたエッグブリーダー（ｅｇｇ  ｂｒｅｅｄｅｒ）で培養した。培養後３日目に、皮で発現したＣＡＭを切り離すために、１８ゲージの皮下針で約２ｍｌの卵アルブミンを抽出した。６日間追加培養した後、サンプルの入ったｔｈｅｒｍａｎｏｘ  ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ（Ｎｕｎｃ）を空気中で乾燥させ、これをリンカーポリペプチドまたはｒｈＣＴＧＦによる新生血管形成活性を試験するために、ＣＡＭの表面に適用した。３日後、１−２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）脂肪乳剤（Ｉｎｔｒａｌｉｐｏｓｅ）を漿尿膜（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｓ）に注入し、顕微鏡でこれを観察した。
【００６４】
１１．ＦＰＲＬ１の転写に対するｓｉＲＮＡの製造および形質感染
ｓｉＲＮＡを用いてｈｕｍａｎ  ＦＰＲＬ１の転写を抑制するために、ＦＰＲＬ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ：ＵＵＣＡＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＵｄＴｄＴ（配列番号３）、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ：ＡＵＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡＵＧＵＧＡＡｄＴｄＴ（配列番号４））を使用した。前記ｓｉＲＮＡ配列をＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈした結果、データベース上のいかなる他の配列とも有意な類似性がないことを確認した。前記オリゴヌクレオチドは、類似の結果を示した。ＨＵＶＥＣｓをｓｉＲＮＡ形質感染過程に使用した。前記細胞を最終濃度２０ｎＭ  ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡ（配列番号３および配列番号４）または対照群としてルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｓｉＲＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）で形質感染した。この時、製造会社の指示に従って、リポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。前記細胞を無血清培地で水洗し、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する培地が追加された形質感染混合物で４．５時間培養した。前記細胞を培養して２４時間および４８時間後に収集し、ＦＰＲＬ１の発現程度をＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した。
【００６５】
１２．ＲＴ−ＰＣＲ分析
製造会社の指示に従って、商業的に利用可能なＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用い、前記形質感染したＨＵＶＥＣｓで全てのＲＮＡを分離した。３ｕｇの各ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料およびｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５とＭｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用い、製造会社の指示に従ってｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。以降、１ｘＰＣＲバッファー、２００ｕＭ  ｄＮＴＰｓ、１０ｕＭの各特異的プライマ−（ｓＦＰＲＬ１：５’−ＧＡＣＣＴＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＴＣ−３’（配列番号１３）、ａｓＦＰＲＬ１：５’−ＧＧＡＴＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１４）、ｓＣＴＧＦ：５’−ＴＴＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＣＡ−３’（配列番号１５）、ａｓＣＴＧＦ：５’−ＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１６））、および１．２５ｕｎｉｔｓ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）が含有されている５０ｕｌの反応溶液で同量のｃＤＮＡを増幅した。増幅産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して赤外線透視で現像化した。
【００６６】
＜実験結果＞
１．ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓの条件培地によるＥＲＫリン酸化の誘導活性
炎症性サイトカインの一種である血管内皮細胞成長因子−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ）は、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の調節において、Ｇ−蛋白質連結受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＦＰＲＬ１（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ１）と多くの細胞機能を共有する。しかし、ＶＥＧＦ−ＡとＦＰＲＬ１が具体的にどのように相互作用するかについては知られていない。
【００６７】
本発明者らは、これを確認するために、ＶＥＧＦ−Ａが処理されたヒトの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から条件培地（ＣＭ）を収得し、これをＦＰＲＬ１−過発現する細胞のＦＰＲＬ１／ＲＢＬに１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌで８時間処理した。この時、陽性対照群としてＦＰＲＬ１の作用ペプチド（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＷＫＹＭＶｍ（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｍｅｔ、配列番号１）を１０ｎＭで処理した。
【００６８】
前記処理後、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）１／２およびａｎｔｉ−ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）でニトロセルロース膜に移された細胞溶解物に対して免疫ブロットを行った後、前記膜を化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）基質で視角化した結果を図１に記載した。
前記図１に記載したように、ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓから収得した条件培地は、濃度依存的にＥＲＫリン酸化を増加させることが分かる。
【００６９】
一方、前記条件培地またはＶＥＧＦ−Ａを、前記記載したｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬ、ＦＰＲ／ＲＢＬ、またはＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞に１０ｎｇ／ｍｌで８時間それぞれ処理し、また、陽性対照群として作用ペプチド（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＷＫＹＭＶｍ（配列番号１）を１０ｎＭ処理した。以降、前記と同様の方法で免疫ブロットを行い、その結果を図２に記載した。
前記図２に記載したように、条件培地、ＶＥＧＦ−Ａおよび陽性対照群は、いずれもＦＰＲＬ１を過発現させるＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でのみＥＲＫリン酸化を増加させることが分かる。したがって、前記条件培地によるＥＲＫリン酸化は、ＦＰＲＬ１に特異的であることが分かる。
【００７０】
２．条件培地でＥＲＫリン酸化誘導活性がある蛋白質の同定
前記＜実験方法５＞に記載したように、前記条件培地のＨＰＬＣ分画物４０ｕｇをＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞に５分処理し、前記＜実験結果１＞のようにＥＲＫリン酸化の有無を確認した結果を図３に記載した。
前記図３に記載したように、Ｂ１２〜Ｃ４が含まれている分画物がＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導することが分かり、Ｂ１１からＣ４までの各分画物の活性ピークを調べた結果、Ｂ１２、Ｃ３分画物でのみピークが観察されることが分かる。
【００７１】
前記結果から、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導できる活性のある蛋白質はＢ１２に含有されていると仮定し、前記Ｂ１２分画物に対して前記＜実験方法５＞に記載されたＭＳ／ＭＳ分析を実施し、その結果を図４に記載した。
前記図４に記載したように、ヒトの結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ−ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）のアミノ酸配列と一致する５個のポリペプチド配列（図４の下線部分）が検出された。
したがって、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導できる活性のある蛋白質は、ＣＴＧＦであることが分かる。
【００７２】
３．ＶＥＧＦ−ＡによるＣＴＧＦの発現誘導
前記＜実験結果２＞を通し、本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓから分泌した条件培地でＣＴＧＦがＦＰＲＬ１と結合し、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導できる活性があるものと考えた。
【００７３】
これを確認するために、本発明者らは、前記実験方法に記載したＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を実施した。具体的には、ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓにおいて細胞溶解物または条件培地でのＣＴＧＦの発現程度をＶＥＧＦ−Ａの処理時間に応じて分析した結果、またはＶＥＧＦ−Ａの処理量に応じて分析した結果を、それぞれ図５および図６に記載した。
【００７４】
前記図５に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲ分析結果、ＶＥＧＦ−ＡをＨＵＶＥＣｓに処理して０．５時間が経過した時からＣＴＧＦ  ｍＲＮＡが増加することが分かり、ウェスタンブロット分析結果、細胞溶解物では２時間経過した時からＣＴＧＦ数値が増加し、さらに、条件培地では４時間経過した時からＣＴＧＦ数値が増加することが分かる。
また、図６に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析結果、ＶＥＧＦ−Ａの処理量に比例してＣＴＧＦ数値が増加することが分かる。
【００７５】
一方、本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａ受容体がＣＴＧＦの合成に関与するか否かを追加的に確認した。具体的には、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＶＥＧＦＲ−１）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２（ＶＥＧＦＲ−２）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）の中和抗体、そして、対照群としてＩｇＧ抗体をＨＵＶＥＣｓに５ｕｇ／ｍｌで３０分間処理し、ＶＥＧＦ−Ａを２０ｎｇ／ｍｌ処理した。２時間経過後、細胞溶解物を収得し、抗−ｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦ抗体で免疫ブロットを行い、その結果を図７に記載した。
前記図７に記載したように、ＶＥＧＦ−Ａ受容体に対する抗体を投与した場合、ＣＴＧＦの発現が顕著に減少することが分かる。したがって、前記結果に基づき、ＶＥＧＦ−ＡによるＣＴＧＦの発現誘導は、受容体カップリングによって調節されることが分かる。
【００７６】
４．ＦＰＲＬ１に対するＣＴＧＦ結合部位の決定
本発明者らは、ＦＰＲＬ１に対するＣＴＧＦ結合部位を決定するために、前記＜実験方法６＞に記載した方法で、図８に記載したように、全長ＣＴＧＦ蛋白質またはその一部の欠失蛋白質を暗号化する遺伝子が、ＣＴＧＦ／Ｉ−ＩＩ−Ｌ、ＣＴＧＦ／ＩＩ−Ｌ、ＣＴＧＦ／ＩＩ、ＣＴＧＦ／Ｌ、ＣＴＧＦ／Ｌ−ＩＩＩ−ＩＶ、およびＣＴＧＦ／Ｉ−Ｌ−ＩＩＩ−ＩＶが挿入されたプラスミドを製造し、これをＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）に形質感染し、これによって各蛋白質を精製した。
前記精製された蛋白質がＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でＥＲＫリン酸化を誘導するか否かを、前記＜実験結果１＞のように免疫ブロットを行い、その結果を図９に記載した。
【００７７】
前記図９に記載したように、ＣＴＧＦ／ＩＩを除いては、全てＥＲＫリン酸化を誘導することが分かる。前記結果に基づき、ＣＴＧＦ／ＩＩを除いた欠失蛋白質の共通部位を導き出すことにより、全長ＣＴＧＦ蛋白質（ＭＴＡＡＳＭＧＰＶＲＶＡＦＶＶＬＬＡＬＣＳＲＰＡＶＧＱＮＣＳＧＰＣＲＣＰＤＥＰＡＰＲＣＰＡＧＶＳＬＶＬＤＧＣＧＣＣＲＶＣＡＫＱＬＧＥＬＣＴＥＲＤＰＣＤＰＨＫＧＬＦＣＤＦＧＳＰＡＮＲＫＩＧＶＣＴＡＫＤＧＡＰＣＩＦＧＧＴＶＹＲＳＧＥＳＦＱＳＳＣＫＹＱＣＴＣＬＤＧＡＶＧＣＭＰＬＣＳＭＤＶＲＬＰＳＰＤＣＰＦＰＲＲＶＫＬＰＧＫＣＣＥＥＷＶＣＤＥＰＫＤＱＴＶＶＧＰＡＬＡＡＹＲＬＥＤＴＦＧＰＤＰＴＭＩＲＡＮＣＬＶＱＴＴＥＷＳＡＣＳＫＴＣＧＭＧＩＳＴＲＶＴＮＤＮＡＳＣＲＬＥＫＱＳＲＬＣＭＶＲＰＣＥＡＤＬＥＥＮＩＫＫＧＫＫＣＩＲＴＰＫＩＳＫＰＩＫＦＥＬＳＧＣＴＳＭＫＴＹＲＡＫＦＣＧＶＣＴＤＧＲＣＣＴＰＨＲＴＴＴＬＰＶＥＦＫＣＰＤＧＥＶＭＫＫＮＭＭＦＩＫＴＣＡＣＨＹＮＣＰＧＤＮＤＩＦＥＳＬＹＹＲＫＭＹＧＤＭＡ）の１６４〜２０１番目の部位（太い文字で表示、配列番号５）がＦＰＲＬ１に対するＣＴＧＦ結合部位であることが分かる。
【００７８】
５．ＣＴＧＦリンカーポリペプチドのＦＰＲＬ１の結合の有無確認
本発明者らは、前記＜実験結果４＞で確認したＣＴＧＦ結合部位が含まれているリンカーポリペプチド（配列番号６、ＥＷＶＣＤＥＰＫＤＱＴＶＶＧＰＡＬＡＡＹＲＬＥＤＴＦＧＰＤＰＴＭＩＲＡＮＣＬＶ、配列番号５のＮ末端側のアミノ酸１個（Ｅ）を追加的に含む）１０ｎＭを、＜実験方法７＞のようにビオチン化し、これをＦＰＲＬ１／ＲＢＬ、ｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬまたはＦＰＲ／ＲＢＬ細胞と共に培養した後、フローサイトメトリー分析を実施し、その結果を図１０に記載した。
【００７９】
前記図１０に記載したように、前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドは、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞にのみ結合することが分かる。また、図１に記載したように、ＦＰＲＬ１拮抗剤のＷＲＷ４（配列番号２）１０ｕＭを、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ、ｖｅｃｔｏｒ／ＲＢＬまたはＦＰＲ／ＲＢＬ細胞に処理し、３０分間培養した場合、ＦＰＲ／ＲＢＬ細胞で前記リンカーポリペプチドの結合が阻害されることが分かる。
したがって、前記結果に基づき、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドがＦＰＲＬ１に特異的に結合することが分かり、これにより、前記リンカーポリペプチドがＦＰＲＬ１によるＥＲＫのリン酸化やＣａ２＋濃度を上昇できることが分かる。
【００８０】
６．ＣＴＧＦリンカーポリペプチドによるＥＲＫリン酸化の促進
ＣＴＧＦリンカーポリペプチドがＥＲＫリン酸化を効果的に誘導するか否かを組み換えＣＴＧＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＴＧＦ、ｒｈＣＴＧＦ）と比較した。具体的には、ＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞にＣＴＧＦリンカーポリペプチドとｒｈＣＴＧＦを５分間多様な濃度で処理してＥＲＫリン酸化の有無を測定し、その結果を図１１に記載した。
前記図１１に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドがｒｈＣＴＧＦに似た水準でＥＲＫリン酸化を誘導することが分かる。
また、前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドまたはｒｈＣＴＧＦ１０ｎＭをＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞に添加する時、ＷＲＷ４を１０ｕＭ添加するか添加しない場合、ＥＲＫリン酸化程度を比較して図１１に記載した。
前記図１１に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチド（ＬＫと表示）は、ｒｈＣＴＧＦ（ＣＴＧＦと表示）に似た水準でＥＲＫリン酸化を誘導することが分かり、特に、ＦＰＲＬ１拮抗剤のＷＲＷ４を処理した場合、ＥＲＫリン酸化が抑制されることが分かる。
【００８１】
７．ＣＴＧＦリンカーポリペプチドによるＣａ２＋濃度の上昇
ＦＰＲＬ１が活性化されると、細胞内のＣａ２＋濃度が上昇するため、本発明者らは、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドによってＦＰＲＬ１が活性化され、最終的に細胞内のＣａ２＋濃度が上昇するか否かを＜実験方法８＞を通して確認し、その結果を図１２に記載した。
【００８２】
前記図１２に記載したように、共焦点顕微鏡で調べた結果、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドが処理されたＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞でのみＣａ２＋濃度が上昇することが分かる。さらに、実際にＦＰＲＬ１／ＲＢＬ細胞内のＣａ２＋濃度を測定した結果、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドに濃度依存的に増加することが分かり、このような活性は、ｒｈＣＴＧＦより効果的で陽性対照群であるＦＰＲＬ１の作用剤のＷＫＹＭＶｍ（Ｗｍと表示）と類似することが分かる。また、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４を１０ｕＭを投与した結果、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドによる細胞内のＣａ２＋濃度の増加程度が減少することが分かる。
前記結果に基づき、ＣＴＧＦは、前記リンカー部位を通してＦＰＲＬ１と直接結合し、これによってＦＰＲＬ１を活性化させることが分かる。
【００８３】
８．ＨＵＶＥＣｓでＣＴＧＦリンカーポリペプチドのＦＰＲＬ１結合および活性化の確認
本発明者らは、ヒトの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）でＦＰＲＬ１を多量発現するため、ＶＥＧＦ−Ａが処理されたＨＵＶＥＣｓからＣＴＧＦを分泌するか否かを確認し、これによって血管新生の有無を調べた。
【００８４】
ＨＵＶＥＣｓ細胞で前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドがＦＰＲＬ１に結合するか否かを前記＜実験方法７＞のように調べ、その結果を図１３に記載した。具体的には、ＨＵＶＥＣｓ細胞に前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドを１０ｎＭで処理し、３０分間培養した後、前記＜実験方法７＞のようにフローサイトメトリー分析を実施した。この時、１０ｕＭのＷＲＷ４を共に処理した。
前記図１３に記載したように、ＨＵＶＥＣｓに前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドを処理した場合、処理しなかった場合（ｖｅｈｉｃｌｅのみを処理した場合）に比べて、平均数値が右側に移動することが分かる。しかし、ＦＰＲＬ１拮抗剤であるＷＲＷ４を処理した場合、このような移動は観察されなかった。
【００８５】
一方、前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドまたはｒｈＣＴＧＦを多様な濃度でＨＵＶＥＣｓに５分間処理し、細胞溶解物を収得した後、前記記載したように、抗−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＥＲＫ１／２抗体で免疫ブロットを行い、その結果を図１４に記載した。
前記図１４に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドをＨＵＶＥＣｓに処理した場合にも、ＥＲＫリン酸化が効果的に誘導され、ＦＰＲＬ１の拮抗剤のＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理すると、ＥＲＫリン酸化が抑制されることが分かる。
【００８６】
また、前記ＣＴＧＦリンカーポリペプチドまたはｒｈＣＴＧＦを多様な濃度でＨＵＶＥＣｓに１時間処理し、前記記載したように、細胞内のＣａ２＋濃度が増加するか否かを確認し、その結果を図１５に記載した。
前記図１５に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドは、濃度依存的に細胞内のＣａ２＋濃度を増加させるが、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理した場合、そうでないことが分かる。
【００８７】
前記結果から、ＣＴＧＦは、リンカー部位を通してＨＵＶＥＣｓでもＦＰＲＬ１と特異的に結合し、これによってＨＵＶＥＣｓを活性化させることが分かる。
【００８８】
９．ＣＴＧＦリンカーポリペプチドの血管生成誘導効果
血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が進行すると、内皮細胞の増殖、既存血管の発芽に伴う移動および管形態の構造が形成されるため（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．＆Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ４０７、２４９−２５７、２０００）、本発明者らは、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドが前記のような血管生成を誘導するか否かを＜実験方法９＞を通して確認し、その結果を図１６〜図１８に記載した。
【００８９】
前記図１６に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドが濃度依存的にＨＵＶＥＣｓの増殖を誘導するが、その程度が統計学的には意味があるわけではなかった。
また、前記図１７に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドは、濃度依存的にＨＵＶＥＣｓの移動を組み換えＣＴＧＦより効果的に誘導することが分かり、さらに、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理した場合、このような細胞の移動を誘導しないことが分かる。
なお、前記図１８に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドは、ＨＵＶＥＣｓの管形態構造の形成を組み換えＣＴＧＦより効果的に誘導することが分かり、さらに、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理した場合、このような管形態構造の形成を誘導しないことが分かる。
このような結果を通し、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドが細胞の増殖よりは移動および管形態の構造を全長ＣＴＧＦより効果的に誘導するため、血管生成を促進することが分かる。
【００９０】
そこで、本発明者らは、このような結果に基づき、インビボで血管生成活性があるか否かを＜実験方法１０＞を通して確認し、その結果を図１９に記載した。
前記図１９に記載したように、ＣＴＧＦリンカーポリペプチドは、インビボでも濃度依存的に血管生成を非常に強く誘導することが分かり、その結果として、いわゆる車輪状形態の血管が形成されることが分かる。しかし、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理した場合、このような血管形成が誘導されないことが分かる。
したがって、ＣＴＧＦは、リンカー部位を通してＦＰＲＬ１に結合し、これによってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびインビボで血管生成を誘導することが分かる。
【００９１】
１０．ＶＥＧＦ−ＡのＦＰＲＬ１の発現促進効果
本発明者らは、前記のような結果に基づき、血管生成過程でＣＴＧＦ／ＦＰＲＬ１結合体がＶＥＧＦ−Ａの活性を仲裁できるものと考えた。
そこで、ＶＥＧＦ−ＡがＨＵＶＥＣｓ細胞でＦＰＲＬ１の発現を誘導するか否かを確認した。具体的には、ＨＵＶＥＣｓに２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ−Ａを処理し、多様な時間培養した後、前記＜実験方法１２＞によってＲＴ−ＰＣＲを行ってＦＰＲＬ１の発現程度を測定し、その結果を図２０に記載した。また、＜実験方法７＞によってフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図２０に記載した。
さらに、ＨＵＶＥＣｓに多様な濃度でＶＥＧＦ−Ａを処理し、培養した後、前記＜実験方法１２＞によってＲＴ−ＰＣＲを行ってＦＰＲＬ１の発現程度を測定し、その結果を図２１に記載した。また、＜実験方法７＞によってフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図２１に記載した。
前記図２０および図２１に記載したように、ＶＥＧＦ−ＡがＨＵＶＥＣｓで濃度依存的にＦＰＲＬ１の発現を誘導することが分かる。
【００９２】
１１．ＶＥＧＦ−ＡのＣＴＧＦ／ＦＰＲＬ１結合体を通した血管生成誘導効果
本発明者らは、ＦＰＲＬ１拮抗剤のＷＲＷ４によってＶＥＧＦ−Ａによる血管生成が抑制されるか否かを追加的に確認した。これにより、ＶＥＧＦ−Ａによる血管形成にＦＰＲＬ１の活性化が関与することが分かった。
まず、ＨＵＶＥＣｓにＶＥＧＦ−Ａを２０ｎｇ／ｍｌで投与し、前記＜実験方法９＞を通し、細胞の増殖程度、細胞の移動、または管形態構造の形成の有無を確認し、その結果を図２２〜図２４に記載した。この時、ＦＰＲＬ１拮抗剤であるＷＲＷ４を追加的に添加した。
前記図２２に記載したように、ＶＥＧＦ−ＡがＨＵＶＥＣｓの増殖を誘導することが分かるが、ＶＥＧＦ−ＡによるＨＵＶＥＣｓの増殖にＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４が統計学的な意味を有するほどの抑制能を示していなかった。
【００９３】
また、前記図２３に記載したように、ＶＥＧＦ−Ａは、ＨＵＶＥＣｓの移動を誘導することが分かり、さらに、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理した場合、このような細胞の移動を誘導しないことが分かる。
【００９４】
なお、前記図２４に記載したように、ＶＥＧＦ−Ａは、ＨＵＶＥＣｓの管形態構造の形成を誘導することが分かり、さらに、ＦＰＲＬ１の拮抗剤であるＷＲＷ４（１０ｕＭ）を処理した場合、このような管形態構造の形成を誘導しないことが分かる。
【００９５】
一方、前記＜実験方法１１＞に記載したように、ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡを用いてＦＰＲＬ１の発現を抑制し、前記＜実験方法１２＞によってＲＴ−ＰＣＲを行ってＦＰＲＬ１の発現程度を測定し、その結果を図２５に記載した。
前記図２５に記載したように、ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣｓに処理した結果、ＦＰＲＬ１の発現が抑制されることが分かり、対照群としてルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｓｉＲＮＡを処理した場合は、そうでないことが分かる。
【００９６】
これにより、前記ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣｓに処理した場合、ＶＥＧＦ−Ａによる細胞の移動や管形態構造の形成が抑制されるか否かを確認し、その結果を図２６および図２７に記載した。
前記図２６および図２７に記載したように、前記ＦＰＲＬ１  ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣｓに処理した場合、対照群のルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｓｉＲＮＡを処理した場合に比べて、ＶＥＧＦ−Ａによる細胞の移動や管形態構造の形成が抑制されることが分かる。
【００９７】
また、インビボでＦＰＲＬ１拮抗剤（１０ｕｇ／ＣＡＭ）を処理した場合、ＶＥＧＦ−Ａ（２５ｎｇ／ＣＡＭ）による血管生成活性が抑制されるか否かを＜実験方法１０＞を通して確認し、その結果を図２８に記載した。
前記図２８に記載したように、ＦＰＲＬ１拮抗剤は、ＶＥＧＦ−Ａによる血管生成を非常に抑制することが分かる。
【００９８】
前記結果を通し、ＦＰＲＬ１がＶＥＧＦ−Ａによる血管生成に重要な因子であることが分かり、ＦＰＲＬ１の活性化を誘導するためには、ＣＴＧＦが重要な因子であることが分かる。つまり、ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されたＣＴＧＦとＦＰＲＬ１は、これらの間の結合によって血管内皮細胞の移動と管構造の形成を促進することにより、ＶＥＧＦ−Ａによる新生血管形成に関与することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１５】
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【図３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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