(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる工程と、
（２）工程（１）で得られた混合液の濁りを検出する工程と
を含む、塩基性ペプチドの検出方法。
【請求項２】
前記変性アルブミンが、熱変性アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合液における変性アルブミンの終濃度が、0.2〜0.6 w/v％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（２）が、前記混合液に光を照射して光学的情報を得る工程である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記光学的情報が、吸光度である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
変性アルブミンを含む塩基性ペプチド検出用試薬。
【請求項７】
前記変性アルブミンが、熱変性アルブミンである、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記変性アルブミンが、血清アルブミン、オボアルブミンまたはラクトアルブミンから得られる、請求項６または７に記載の試薬。
【請求項９】
前記変性アルブミンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドに対して５〜220μＭの解離定数を有する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１０】
前記変性アルブミンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドに対して１より大きく11より小さいヒル係数を有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基性ペプチドの検出方法に関する。より詳細には、塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合し、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体により生じた濁りを検出することにより塩基性ペプチドを検出する方法に関する。また、本発明は、該検出方法に用いられる塩基性ペプチド検出用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の病態にある生体においては、特定の塩基性ペプチドの血中濃度が、健常時とは異なることが知られている。このような塩基性ペプチドとしては、グレリン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ブラジキニンなどがあり、臨床検査の分野においてこれらの塩基性ペプチドは疾患のマーカーとして有用視されている。例えば、重症の心不全やカヘキシーの強い症例の胃癌の患者においては、塩基性ペプチドであるグレリンの血漿中濃度が低下することが知られている。また、ＢＮＰの血中濃度は心不全の臨床的指標として重要であり、ＢＮＰは検査マーカーとして用いられている。【０００３】
これらの塩基性ペプチドは、現在、酵素免疫測定法、電気化学発光免疫測定法などの免疫学的手法を用いて測定されている。このような免疫学的手法においては、上記の塩基性ペプチドを特異的に認識して結合する抗体を用いて測定が行われている。この方法では、抗体と塩基性ペプチドとの複合体を検出するために、該複合体に標識物質を結合させる工程が必要となるので、操作が煩雑となる【０００４】
一方、DennisらやLowenthalらは、免疫測定法とは異なり、標識物質を結合させる工程を省略できる塩基性ペプチドの検出方法を報告している。しかしながら、彼らの方法はいずれも、高額で大型の質量分析器や表面プラズモン共鳴分析器などを必要とするので、汎用で普及可能な方法とは言い難い。【０００５】
また、DennisらやLowenthalらは、病態指標の発見、薬理作用の解明またはドラッグデリバリーシステムの開発などのために、天然に存在するアルブミン（未変性のアルブミン）と塩基性ペプチドとの間の結合について研究している。
アルブミンとは、天然中、例えば卵白、血清または乳汁などに含まれるタンパク質である。血清アルブミンを例にとれば、その生理機能として、血液の浸透圧を調節することや、脂肪酸、ヘマチン、ビリルビンなどの血液中の代謝産物、薬剤などの化合物、特殊なペプチドなどと結合して血中を循環することなどが知られている。
例えば、Baczynskyjらは、血中のホルモンとしても知られているブラジキニンがＢＳＡと結合する可能性を示唆している。また、Muramotoらは、血中ホルモンペプチドのＡＣＴＨがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合することを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Muramoto K.ら，Biochemistry. vol. 20，3380-3385（1981）
【非特許文献２】Baczynskyj L.ら，Rapid Commun. Mass Spectrom. vol. 8，280-286（1994）
【非特許文献３】Dennis MSら，J. Biol. Chem. vol. 277，35035-35043（2002）
【非特許文献４】Lowenthal MSら，Clin. Chem. vol. 51，1933-1945 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、熱力学平衡論の立場から、塩基性ペプチドと未変性のアルブミンとの結合、特に両者が結合を通じて相互に与え得る分子構造変化のメカニズムの解明を遂行してきた。ここで、熱力学平衡論とは、溶液で実際に生じている分子同士の結合を、結合の強弱（親和性）を表す解離定数（Ｋｄ値）および結合に伴うアロステリック構造変化を反映する協同性（ヒル係数）という明確な数値で記述することである。【０００８】
この研究の過程において、本発明者らは、上記のLowenthalらが報じたとおり、塩基性ペプチドと未変性のアルブミンとが結合することを認めた。なお、Lowenthalらの検出方法は、質量分析器に依存した機械物理学的なものである。該検出方法では、塩基性ペプチドと未変性のアルブミンとの混合物を、質量分析器の試料固定用高分子基板上に一旦固着し、展開している。すなわち、該検出方法では、塩基性ペプチドおよび未変性のアルブミンの両者は、実際の溶液平衡から逸脱した状態にあり、一部の分子集団のみが検出される。【０００９】
一方、本発明者らは、塩基性ペプチドおよび未変性のアルブミンを溶液中に終始静置し、それら自身による自然な結合、すなわち、実際の溶液平衡を追跡した。本発明者らは、上記の先行技術とは異なり、この溶液平衡を利用して、塩基性ペプチドまたは塩基性ペプチドと未変性のアルブミンとの複合体を検出する方法を検討した。【００１０】
しかしながら、上記の検討の過程で本発明者らが明らかにしたことは、先行技術では未報告であったが、塩基性ペプチドと未変性アルブミンとの結合の親和性が本来弱いことであった。その結果として、この検出方法では、その検出感度は満足できるものではなかった。
したがって、上記の複合体を検出するためには、標識物質を利用した検出工程などを別途行うか、または上記の溶液平衡における結合の親和性を増進させる工夫が必要であった。【００１１】
本発明の特徴の一つは、上記のような必要性に応えたものである。したがって、本発明は、標識物質の結合などの煩雑な操作を必要とせず、簡便かつ迅速に塩基性ペプチドを検出できる方法を提供することを目的とする。また、その検出方法に用いられる塩基性ペプチド検出用試薬を提供することも、本発明の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、塩基性ペプチドを含む試料と変性されたウシ血清アルブミン溶液とを混合すると、変性されたアルブミンと塩基性ペプチドが結合して複合体を形成し、混合液中に濁りを生じること、およびこの濁りの度合が試料中の塩基性ペプチドの濃度に依存して上昇することを見出して、本発明を完成した。【００１３】
よって、本発明は、
（１）塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる工程と、
（２）工程（１）で得られた混合液の濁りを検出する工程と
を含む、塩基性ペプチドの検出方法を提供する。【００１４】
また、本発明は、変性アルブミンを含む塩基性ペプチド検出用試薬を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、標識物質の結合などの煩雑な操作を必要とせず、簡便かつ迅速に塩基性ペプチドを検出できる方法および該方法に用いる試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】未変性ＢＳＡ溶液と、熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬とを用いて、ＡＣＴＨ部分ペプチドを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図２】０、５、15、60および120分間熱変性されたＢＳＡ溶液を試薬として用いて、ＡＣＴＨ部分ペプチドを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図３】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、核酸を含む試料および含まない試料におけるＡＣＴＨ部分ペプチドを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図４−１】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、α−エンドルフィンの検出を試みた場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図４−２】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、ダイノルフィンＡ部分ペプチドを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図５−１】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、キニノーゲンのフラグメントを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図５−２】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、ＩＴＩＨ４のフラグメントを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図６】熱変性されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む本発明の試薬および熱変性されたオボアルブミン（ＯＡ）を含む本発明の試薬を用いて、ＡＣＴＨ部分ペプチドを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図７−１】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、Fibrinogenαの検出を試みた場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図７−２】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、Ｃ３ｆの検出を試みた場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図７−３】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、Factor XIIIの検出を試みた場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図７−４】図１のプロットと図７−１〜７−３のプロットとを重ねた、ＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【図８】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬と、ＡＣＴＨ部分ペプチドを含む試料との混合液についての蛍光強度−ペプチド濃度のプロットである。
【図９】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬と、ＡＣＴＨ部分ペプチドを含む試料との混合液ついての、該混合液中の凝集物数−ペプチド濃度のプロットである。
【図１０】熱変性されたＢＳＡを含む本発明の試薬を用いて、血清を含む試料および血清を含まない試料中のＡＣＴＨ部分ペプチドを検出した場合のＯＤ測定値−ペプチド濃度のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法は、以下の工程を含む、塩基性ペプチドの検出方法である。
（１）塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で得られた混合液の濁りを検出する工程。
【００１８】
本明細書において、「塩基性ペプチド」とは、等電点（pI）が塩基性の範囲内であり、かつ短鎖のペプチドを意味する。そのようなペプチドとしては、好ましくはpIが8.0以上、より好ましくはpIが8.5以上であり、かつ長さが好ましくは10〜100アミノ酸、より好ましくは10〜60アミノ酸、さらに好ましくは10〜40アミノ酸のペプチドである。
なお、ペプチドのpIは当業者に公知の方法により測定することができるが、ペプチドのアミノ酸配列が既知である場合は、例えば、ExPASyプロテオミクス サーバ コンピュート プロットパラム ツール（http://expasy.ch/tools/protparam.htmlから利用可能）などのアルゴリズムまたはプログラムにより、ペプチドの理論上のpIを知ることができる。
【００１９】
本発明の方法において、検出対象の塩基性ペプチドは、上記の塩基性ペプチドの定義に該当するものであれば特に限定されず、天然起源の塩基性ペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。また、検出対象の塩基性ペプチドは、特定の病態にある生体から得られる検体中の濃度が健常時の濃度とは異なることが知られている塩基性ペプチド（例えば、ＡＣＴＨ、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびグレリン、ならびに次のタンパク質のフラグメント：Ｌ‐ｍｙｃ‐１癌原遺伝子タンパク質、転写因子ＳＯＸ−３、フィブリノーゲンα、インターαトリプシンインヒビター重鎖サブユニット４（ＩＴＩＨ４）、α２-ＨＳ-グリコプロテイン、プロトロンビンおよびキニノーゲン）も含む。
【００２０】
本明細書において、「検出対象の塩基性ペプチドを含む疑いのある試料」とは、上記の検出対象の塩基性ペプチドを含んでいる可能性がある試料を意味する。そのような試料は、生体から得られる検体、例えば、血液（全血、血漿、血清を含む）、尿、唾液、生体組織抽出物、髄液、胸水、リンパ液などを含む。
【００２１】
本発明の方法により検出される試料は、検出対象の塩基性ペプチド以外に、夾雑物（例えば、タンパク質や核酸など）を含んでいてもよいが、検出感度を向上させるために、これらの夾雑物を予め除去した試料、または検出対象の塩基性ペプチドを予め精製および／または濃縮した試料であることが好ましい。このような夾雑物の除去、ならびに塩基性ペプチドの精製および濃縮は、当業者に公知の方法により行うことができる。
【００２２】
本発明の実施形態においては、高塩濃度の試料中の塩基性ペプチドを検出する場合、該試料から塩を予め除去することが好ましい。このような塩の除去は、当業者に公知の方法により行うことができる。なお、本発明の実施形態において、試料中の塩濃度としては、電気伝導率に換算して０〜２mS/cm相当の塩濃度（例えば、10 mM以下のリン酸カリウム緩衝液や10 mM以下のTris-HCl）が好ましく、さらに好ましくは電気伝導率に換算して０〜160μS/cm相当の塩濃度（例えば、900μM以下のリン酸カリウム緩衝液）である。
【００２３】
本明細書において、「アルブミン」とは、生物学の分野において一般に知られている用語と同じ意味を有し、動物および植物の細胞や体液中に含まれる、一群の可溶性タンパク質の総称である。
動物起源のアルブミンとしては、血清に含まれる血清アルブミン、卵白に含まれるオボアルブミン、乳汁に含まれるラクトアルブミンなどが知られている。植物起源のアルブミンとしては、コムギやオオムギなどに含まれるロイコシン、エンドウやダイズなどの種子に含まれるレグメリン、ヒマ種子に含まれるリシンなどが知られている。
【００２４】
本発明の実施形態においては、好ましくは動物起源のアルブミン、より好ましくは血清アルブミン、オボアルブミンまたはラクトアルブミン、さらに好ましくは血清アルブミンから得られる、変性されたアルブミンを含む試薬を用いる。
【００２５】
本明細書において、「変性されたアルブミン」（以下、「変性アルブミン」ともいう）とは、物理的または化学的原因により、生理的条件における固有の高次構造が破壊されたアルブミンを意味する。そのような物理的原因としては、例えば、加熱、加圧、凍結、超音波破砕などによる処理が挙げられる。化学的原因としては、変性剤、例えばＳＤＳなどの界面活性剤、尿素、塩酸グアニジンなどによる処理が挙げられる。
本発明の実施形態においては、そのような処理により変性されたアルブミンを含む試薬、好ましくは、熱変性されたアルブミンを含む試薬を用いる。
【００２６】
本発明の方法の工程（１）では、検出対象の塩基性ペプチドを含む疑いのある試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合して、塩基性ペプチドと変性アルブミンとの複合体を形成させる。
【００２７】
具体的には、変性アルブミンを含む試薬と上記の試料との混合液における変性アルブミンの終濃度が、0.2〜0.6 w/v％、好ましくは0.2 w/v％となるように試薬と試料を混合する。なお、この混合する工程は４〜50℃で行うことが好ましく、10〜40℃で行うことがより好ましい。
上記の試薬と試料とを混合すると、変性アルブミンと塩基性ペプチドが結合して複合体を形成する。さらに、該複合体同士が凝集することにより混合液中に濁りが生じる。
【００２８】
次いで、本発明の方法の工程（２）では、上記の工程（１）で得られた混合液の濁りを検出する。
【００２９】
本明細書において、「濁りを検出する」とは、混合液の濁りの有無を検出することと、濁りの度合（以下、「濁度」という）を測定することを含むことを意図する。濁りの有無の検出は、肉眼や顕微鏡による目視または濁度測定装置を用いて行うことができる。濁度の測定は、濁度測定装置を用いて行うことができる。
本発明の方法は、変性アルブミンと塩基性ペプチドとの複合体により生じた濁りを検出する方法であるので、従来の方法のように標識物質および抗体を必要とせず、変性アルブミンを含む試薬のみを用いて塩基性ペプチドの検出を行うことができる。
【００３０】
濁度の測定は、上記の混合液に光を照射して光学的情報を得ることにより行うことができる。そのような光学的情報としては、例えば、吸光度、散乱光強度、反射光強度、回折光強度、蛍光強度、りん光強度、偏光状態、屈折率、旋光性などが挙げられる。それらの中でも、簡便な装置で測定できることから、吸光度が好ましい。吸光度を測定する装置としては、例えば、分光光度計UV-2500PC（島津製作所）が挙げられる。濁度の測定は、可視光の波長である400〜700 nmの波長で行うことが好ましく、500〜600 nmの波長で行うことがより好ましい。
【００３１】
また、本発明の方法は、濁度の測定値から試料中の検出対象の塩基性ペプチドの濃度を定量することができる。該濃度は、濃度既知の検出対象の塩基性ペプチドの溶液を用いて作成した検量線から定量される。
【００３２】
上記の検量線は、次のようにして作成できる。まず、種々の濃度の検出対象の塩基性ペプチドの溶液（以下、「検量線作成用試料」という）を調製する。次いで、検量線作成用試料と変性アルブミンを含む試薬とを混合し、得られた混合液の濁度を測定する。そして、縦軸を濁度の測定値、横軸を塩基性ペプチドの濃度として、各検量線作成用試料について測定値をプロットする。なお、上記の検量線作成用試料は、検出対象の塩基性ペプチドを含まない溶液（ブランク溶液）から段階的に濃度を上げ、測定される濁度がプラトーに達したことを確認できるまでの濃度の溶液を調製する。
【００３３】
ここで、プロットした濁度の測定値と塩基性ペプチドの濃度との関係は、次式（Ｉ）のヒルの式（Hill equation）に従うことが、今回、見出された。したがって、式（Ｉ）または該式の両辺の対数をとって次式（ＩＩ）の直線化式を得ることにより、検量線を作成することができる。
【００３４】
ヒルの式：θ＝Ｃn／（Ｃn＋Ｋｄn）      （Ｉ）
直線化式：ｌｏｇ｛θ／（１−θ）｝＝ｎｌｏｇＣ−ｎｌｏｇＫｄ      （ＩＩ）
（式中、θは濁度の測定値、Ｃは塩基性ペプチドの濃度、Ｋｄは解離定数、ｎはヒル係数（Hill coefficient）を示す。）
本明細書において、解離定数とは、変性アルブミンが検出対象の塩基性ペプチドで５０％飽和される場合の該ペプチドの濃度を意味する。
また、本明細書において、ヒル係数は、検出対象の塩基性ペプチドと変性アルブミンとの結合（複合体形成）における協同性の指標である。すなわち、ヒル係数が１より大きい場合は、両者の結合に正の協同性（アロステリック効果）があることを示し、塩基性ペプチドの濃度が高いほど、該ペプチドと変性アルブミンとの結合は促進される。
なお、Ｋｄおよびｎの値は、上記の検量線作成用試料の塩基性ペプチド濃度および濁度の測定値から算出される。
【００３５】
上記の式（Ｉ）および式（ＩＩ）は、濁度の測定値と塩基性ペプチドの濃度との関数であるので、作成した検量線を用いれば、検出対象の塩基性ペプチドを含む疑いのある試料の濁度の測定値から、該試料中の検出対象の塩基性ペプチドの濃度を取得することができる。
【００３６】
本発明の方法において、上記の変性アルブミンと塩基性ペプチドとを混合することにより濁りが生じる理由は、完全には明らかになっていないが、以下のようなことが考えられる。まず、正電荷を有する塩基性ペプチドに対して、静電的な相互作用によって変性アルブミンが結合し、複合体を形成する。そして、該複合体同士が凝集することにより濁りが生じる。
なお、上記の結合の様式は、イオン結合であることが考えられる。該結合様式がイオン結合であることは、本発明の方法が、低塩濃度の条件下では塩基性ペプチドの検出感度が向上することからも示唆される。低塩濃度の条件下では、存在するイオンが少ないので、変性アルブミンと塩基性ペプチドとのイオン結合が促進されると考えられるからである。
【００３７】
上記の結合様式がイオン結合である場合、変性アルブミンと検出対象の塩基性ペプチドとの結合は、該ペプチドのアミノ酸配列および立体構造に依存しないと考えられる。
したがって、本発明の方法は、様々な塩基性ペプチドの検出に汎用し得ると考えられる。
【００３８】
また、本発明の方法は、変性アルブミンを含む試薬と塩基性ペプチドを含む試料とを混合してから、変性アルブミンと塩基性ペプチドとの複合体による濁りが発生するまでの期間が短時間（例えば20秒以下、好ましくは瞬時）であるという利点を有する。
したがって、本発明の方法は、試料中に含まれる塩基性ペプチドを迅速に検出することができる。
【００３９】
本発明の方法は、生体から得た検体中に含まれる疾患マーカーである塩基性ペプチドの検出もできるので、本発明の方法は、特定の疾患を判定する方法としても利用できる。例えば、被験者から得た血液を検体として用いた場合、まず、特定の疾患マーカーである検出対象の塩基性ペプチドを該血液から精製および／または濃縮し、次いで、本発明の方法により該ペプチドの濃度を定量し、得られた値を健常時の値と比較することにより、該被験者が該疾患に罹患しているか否かを判定することができる。
【００４０】
上記の本発明の方法に用いられる「変性アルブミンを含む試薬」も、本発明の一つである。すなわち、本発明の試薬は、変性アルブミンを含む塩基性ペプチド検出用試薬である。
【００４１】
本発明の試薬は、次のようにして得ることができる。まず、動物起源のアルブミン、好ましくは血清アルブミン、オボアルブミンもしくはラクトアルブミン、またはこれらの混合物、より好ましくは血清アルブミンを適切な溶媒に溶解して、アルブミン溶液を調製する。該溶液のアルブミン濃度は、0.2〜5.0 w/v％、好ましくは0.2〜0.6 w/v％である。
溶媒は、変性アルブミンと塩基性ペプチドとの複合体形成を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、超純水、10 mＭ Tris-HCl（pH5.5〜7.5）、10 mＭ リン酸カリウム緩衝液（pH5.5〜7.5）などの緩衝液が挙げられる。それらの中でも、超純水が好ましい。なお、本明細書において、「超純水」とは、25℃における比抵抗値が18 MΩ・cm以上の水を意味する。そのような超純水としては、Milli-Q（登録商標）水が好ましい。
【００４２】
次いで、得られたアルブミン溶液に、物理的変性処理または化学的変性処理を施す。物理的変性処理としては、例えば、加熱、加圧、凍結、超音波破砕などが挙げられる。化学的変性処理としては、例えば、ＳＤＳなどの界面活性剤、尿素、塩酸グアニジンまたはこれらの混合物などの変性剤による処理が挙げられる。
【００４３】
加熱処理による方法としては、例えば、上記のアルブミン溶液を100〜130℃、好ましくは110〜120℃の温度で、５〜120分間、好ましくは10〜60分間加熱する。
ＳＤＳと尿素との混合物を用いて変性させる方法としては、例えば、上記のアルブミン溶液にＳＤＳ（終濃度１〜30 w/v％）および尿素（終濃度500 mM〜５M）を添加し混合する方法が挙げられる。
【００４４】
本発明の試薬は、好ましくは熱変性されたアルブミン、またはＳＤＳと尿素との混合物により変性されたアルブミンを含む試薬、より好ましくは熱変性されたアルブミンを含む試薬である。また、本発明の試薬は、溶液の形態にあることが好ましい。
【００４５】
上記のようにして得られた本発明の試薬を、塩基性ペプチドを含む試料と混合すると、変性アルブミンと塩基性ペプチドとがイオン結合を介して複合体を形成すると考えられる。また、該複合体により生じる濁度と塩基性ペプチドの濃度との関係は、上記の式（Ｉ）のヒルの式に従うことが見出されている。
したがって、本発明の試薬に含まれる変性アルブミンは、その構造の詳細は明らかではないが、塩基性ペプチドと静電的に結合する部位を複数有し、塩基性ペプチドとの結合に正の協同性が認められるアロステリックタンパク質であると考えられる。
【００４６】
本発明の試薬は、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドと、５〜220μMの解離定数で結合する変性アルブミンを含む。
また、本発明の試薬は、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドと、１より大きく11より小さいヒル係数で結合する変性アルブミンを含む。
なお、解離定数およびヒル係数は、濁度の測定値および塩基性ペプチドの濃度が既知であれば、上記の式（Ｉ）のヒルの式から決定できる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＡＣＴＨのＮ末端側の１位〜24位の配列である。
【００４７】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）変性されたＢＳＡおよび未変性ＢＳＡを用いた塩基性ペプチドの検出
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液および未変性ＢＳＡ溶液の調製
ＢＳＡ（Sigma-Aldrich社）をMilli-Q（登録商標）水（Millipore社）に溶解して、ＢＳＡ溶液（1.0 w/v％）を調製した。このＢＳＡ溶液を二等分し、一方を未変性ＢＳＡ溶液とし、他方をオートクレーブにより110℃で15分間加熱して、熱変性されたＢＳＡ（以下、「熱変性ＢＳＡ」ともいう）の溶液とした。【００４９】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ＡＣＴＨの１位〜24位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社ペプチド研究所）を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００５０】
（３）検出用試薬と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した熱変性ＢＳＡ溶液50μlと上記（２）で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの混合液（熱変性ＢＳＡの終濃度：0.2 w/v%）を調製した。なお、この調製においては、混合液中のＡＣＴＨ部分ペプチドの終濃度が０〜150μMとなる量で、上記の試料を混合した。また、この混合液の調製において、熱変性ＢＳＡ溶液に代えて未変性ＢＳＡ溶液を用いて、比較用の混合液も調製した。【００５１】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度（ＯＤ550）を、分光光度計UV-2500PC（島津製作所）により測定した。結果を図１に示す。また、得られた結果について、カレイダグラフ（ヒューリンクス社）を用いてヒルプロット解析をすることで、熱変性ＢＳＡおよび未変性ＢＳＡのＫｄ値およびヒル係数を算出した。各数値を表１に示す。【００５２】
【表１】
0005632391.tif 000002
【００５３】
２．結果
図１より、未変性ＢＳＡ溶液を用いた場合は、ＯＤ550に顕著な変化は見られなかった。これは、未変性ＢＳＡとＡＣＴＨが結合してもすぐに解離したか、または結合しても濁りを生じないことが原因ではないかと考えられる。
一方、熱変性ＢＳＡ溶液を用いた場合は、塩基性ペプチドの濃度依存的なＯＤ550の上昇が見られた。また、熱変性ＢＳＡ溶液を用いた場合、吸光度と塩基性ペプチド濃度との間には、下記のヒルの式に従う関係が認められた。
ＯＤ＝（塩基性ペプチド濃度）n／｛（塩基性ペプチド濃度）n + Ｋｄn｝【００５４】
熱変性ＢＳＡおよび未変性ＢＳＡのＫｄ値を比較すると、熱変性ＢＳＡの方が低い値を示した。このことから、塩基性ペプチドであるＡＣＴＨに対して熱変性ＢＳＡの方が未変性ＢＳＡよりも非常に高い親和性を有することがわかる。【００５５】
さらに、熱変性ＢＳＡおよび未変性ＢＳＡのヒル係数を比較すると、未変性ＢＳＡは１であるのに対し、熱変性ＢＳＡでは８であった。ここで、ヒル係数が１より大きい場合は、正の協同性（アロステリック効果）があることを示し、該係数が１である場合は、協同性がないことを示す。つまり、未変性ＢＳＡとＡＣＴＨとの間には協同性がないので、未変性ＢＳＡとＡＣＴＨは、混合液中のＡＣＴＨ濃度とは無関係に結合する。
他方、熱変性ＢＳＡとＡＣＴＨの結合には正の協同性があるので、試料中のＡＣＴＨ濃度が高いほど、熱変性ＢＳＡとＡＣＴＨの結合は促進される。
よって、変性されたアルブミンは、塩基性ペプチドのわずかな濃度変化を吸光度の変化として示すことができるので、本発明の方法は、塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量に利用できることがわかる。【００５６】
（実施例２）ＢＳＡの熱変性時間の検討
１．実験方法
（１）熱変性時間を変化させた変性ＢＳＡ溶液の調製
ＢＳＡ（Sigma-Aldrich社）をMilli-Q（登録商標）水（Millipore社）に溶解して、ＢＳＡ溶液（1.0 w/v％）を調製した。このＢＳＡ溶液を５等分し、１つを未変性ＢＳＡ溶液（熱変性時間０分）とし、残りの４つをオートクレーブにより110℃で、それぞれ５、15、60および120分間加熱して、熱変性ＢＳＡ溶液とした。【００５７】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ＡＣＴＨの１位〜24位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社ペプチド研究所）を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００５８】
（３）各熱変性時間の変性ＢＳＡ溶液と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した各熱変性時間の変性ＢＳＡ溶液および上記（２）で調製した試料を用いて、実施例１と同様にして混合液を調製した。【００５９】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液のＯＤ550を、実施例１と同様にして測定した。結果を図２に示す。また、各熱変性時間のＢＳＡのＫｄ値およびヒル係数を算出した。各数値を表２に示す。【００６０】
【表２】
0005632391.tif 000003
【００６１】
２．結果
図２より、熱変性時間が０分のＢＳＡ溶液を用いた場合はＯＤ550に変化は見られなかったが、熱変性時間が５、15、60および120分間のＢＳＡ溶液を用いた場合は、いずれも塩基性ペプチドの濃度依存的なＯＤ550の上昇が見られた。
表２より、熱変性時間が０分のＢＳＡ溶液では高いＫｄ値を示したが、熱変性時間が５、15、60および120分間のＢＳＡ溶液ではいずれも低いＫｄ値を示した。ヒル係数についても、熱変性時間が０分のＢＳＡ溶液では１であったが、熱変性時間が５、15、60および120分間のＢＳＡ溶液では４〜８の範囲であった。
他方、熱変性時間が５、15、60および120分間のＢＳＡ溶液の間では、Ｋｄ値およびヒル係数に顕著な差がなかった。このことから、上記のいずれの熱変性時間であっても、熱変性ＢＳＡ溶液は、ＡＣＴＨ部分ペプチドに対して同様の親和性および正の協同性を有することがわかる。【００６２】
（実施例３）塩基性ペプチドの検出における核酸の影響の検討
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【００６３】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ＡＣＴＨの１位〜24位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社ペプチド研究所）を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００６４】
（３）検出用試薬と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した各熱変性時間の変性ＢＳＡ溶液および上記（２）で調製した試料を用いて、実施例１と同様にして混合液を調製した。また、混合液に、核酸としてサケ精子ＤＮＡ（商品名：Sonicated Salmon Sperm DNA、BioDynamics Laboratory Inc社）をさらに添加した比較用の混合液（核酸の終濃度10μＭ）も調製した。【００６５】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液のＯＤ550を、実施例１と同様にして測定した。結果を図３に示す。また、各混合液についてのＫｄ値およびヒル係数を算出した。各数値を表３に示す。【００６６】
【表３】
0005632391.tif 000004
【００６７】
２．結果
図３より、混合液中に核酸が含まれる場合も、核酸が含まれない場合と同様に塩基性ペプチドの濃度依存的なＯＤ550の上昇が見られた。また、表３より、混合液中に核酸を含む場合と含まない場合とにおいて、Ｋｄ値およびヒル係数に顕著な差がないことがわかる。
したがって、本発明の方法は、用いる試料に核酸が含まれていても、塩基性ペプチドの検出に影響をほとんど受けないことがわかる。【００６８】
（実施例４）塩基性ペプチドおよび中性ペプチドの検出
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【００６９】
（２）検出対象のペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ダイノルフィンＡの１位〜13位のアミノ酸からなるダイノルフィンＡ部分ペプチド（配列番号２；株式会社ペプチド研究所）を用いた。また、比較用の検出対象として、中性ペプチドであるα−エンドルフィン（配列番号３；株式会社ペプチド研究所）を用いた。これらのペプチドを超純水に溶解して、それぞれのペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００７０】
（３）検出用試薬と各試料との混合液の調製
上記（１）で調製した変性ＢＳＡ溶液50μlを、上記（２）で調製した各試料に混合した後、それぞれに超純水を加えて、全量250μlの各ペプチドを含む混合液を調製した。なお、この調製において、各混合液中のペプチドの終濃度が０〜150μMとなる量で、上記の試料を混合した。【００７１】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液のＯＤ550を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４に示す。なお、ダイノルフィンＡの部分ペプチドを含む試料についてのＫｄ値は30であり、ヒル係数は８であった。【００７２】
２．結果
中性ペプチドであるα−エンドルフィンを用いた場合は、ＯＤ550に変化は見られなかった（図４−１参照）。これは、熱変性ＢＳＡとα−エンドルフィンとが結合しなかったか、または結合してもすぐに解離したことが原因ではないかと考えられる。
一方、塩基性ペプチドであるダイノルフィンＡの部分ペプチドを用いた場合は、該ペプチドの濃度依存的なＯＤ550の上昇が見られた（図４−２参照）。
また、得られたＫｄ値から、熱変性ＢＳＡが塩基性ペプチドであるダイノルフィンＡに対して非常に高い親和性を有することがわかる。さらに、熱変性ＢＳＡのヒル係数は８であったことから、熱変性ＢＳＡとダイノルフィンＡとの結合には正の協同性があることがわかる。
以上から、本発明の方法は、塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量に特異的に利用できることがわかる。【００７３】
（実施例５）癌転移マーカーである塩基性ペプチドの検出
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【００７４】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、癌転移マーカーとして知られるキニノーゲンのフラグメント（４３９位〜４５７位（配列番号４）；株式会社バイロジカにより合成）およびＩＴＩＨ４のフラグメント（６１１〜６４２位（配列番号５）；株式会社バイロジカにより合成）を用いた。これらのペプチドを超純水に溶解して、それぞれのペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００７５】
（３）検出用試薬と各試料との混合液の調製
上記（１）で調製した変性ＢＳＡ溶液50μlを、上記（２）で調製した各試料に混合した後、それぞれに超純水を加えて全量を250μlとして、各ペプチドを含む混合液を調製した。なお、この調製において、各混合液中のペプチドの終濃度が０〜80μMとなる量で、上記の試料を混合した。【００７６】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した混合液のＯＤ550を、実施例１と同様にして測定した。結果を図５−１および図５−２に示す。また、それぞれの試料についてのＫｄ値およびヒル係数を算出した。各数値を表４に示す。【００７７】
【表４】
0005632391.tif 000005
【００７８】
２．結果
キニノーゲンのフラグメントを含む試料の場合、そのフラグメントの濃度依存的なＯＤ550の上昇が見られた（図５−１参照）。また、Ｋｄ値およびヒル係数より、熱変性ＢＳＡがキニノーゲンのフラグメントに対して高い親和性を有し、熱変性ＢＳＡとキニノーゲンのフラグメントとの結合には正の協同性があることがわかる。
同様に、ＩＴＩＨ４のフラグメントを含む試料の場合も、そのフラグメントの濃度依存的なＯＤ550の上昇が見られた（図５−２参照）。また、Ｋｄ値およびヒル係数より、熱変性ＢＳＡがＩＴＩＨ４のフラグメントに対して高い親和性を有し、熱変性ＢＳＡとＩＴＩＨ４のフラグメントの結合には正の協同性があることがわかる。
以上から、本発明の方法は、癌マーカーである塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量に利用できることがわかる。【００７９】
（実施例６）  熱変性されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および熱変性されたオボアルブミン（ＯＡ）を用いた塩基性ペプチドの検出
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＨＳＡ溶液および変性されたＯＡ溶液の調製
ＨＳＡ（Wako社）を超純水に溶解してＨＳＡ溶液（1.0 w/v％）を調製した。このＨＳＡ溶液をオートクレーブにより115℃で15分加熱して、熱変性されたＨＳＡ（以下、「熱変性ＨＳＡ」ともいう）の溶液を得た。また、ＯＡ（Worthington社）を超純水に溶解して、ＯＡ溶液（1.0 w/v％）を調製した。このＯＡ溶液のpHを５〜７になるように水酸化ナトリウムで調整し、オートクレーブにより115度で15分加熱して、熱変性されたＯＡ（以下、「熱変性ＯＡ」ともいう）の溶液を得た。【００８０】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ＡＣＴＨの１位〜24位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社  バイオロジカ）を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００８１】
（３）各検出用試薬と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した熱変性ＨＳＡ溶液50μlと上記（２）で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの混合液（熱変性ＨＳＡの終濃度：0.2 w/v%）を調製した。なお、この調製において、混合溶液中のＡＣＴＨ部分ペプチドの終濃度が０〜80μMとなる量で、上記の試料を混合した。また、上記の混合液の調製において、熱変性ＨＳＡ溶液に代えて、熱変性ＯＡ溶液を用いた混合液（熱変性ＯＡの終濃度：0.2 w/v%）も調製した。【００８２】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度（OD550）を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。結果を図６に示す。また、得られた結果について、カレイダグラフ（ヒューリンクス社）を用いてヒルプロット解析をすることで、熱変性ＨＳＡおよび熱変性ＯＡのKd値ならびにヒル係数を算出した。各数値を表５に示す。
【表５】
0005632391.tif 000006
【００８３】
結果
図６より、熱変性ＨＳＡおよび熱変性ＯＡ溶液を用いた場合、塩基性ペプチドの濃度依存的なOD550の上昇が見られた。また、表５より、Ｋｄ値は比較的低い値を示した。さらに、ヒル係数についても、３または11となった。よって、上記のＨＳＡおよびＯＡのいずれの試薬も、それらを熱変性させることにより、ＡＣＴＨ部分ペプチドに対して親和性および正の協同性を有することがわかる。
以上から、変性されたＨＳＡおよび変性されたＯＡを用いた試薬であっても、塩基性ペプチドの存在の検出および濃度の定量を行うことができる。【００８４】
（実施例７）ペプチド検出における検出用試薬の濃度の検討
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
ＢＳＡ（Sigma-Aldrich社）超純水に溶解して、ＢＳＡ溶液（5.0 w/v％）を調製した。このＢＳＡ溶液をオートクレーブにより115℃で15分加熱して、熱変性ＢＳＡ溶液を得た。【００８５】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ＡＣＴＨの１位〜２４位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社  バイオロジカ）を用いた。このペプチドを超純水に溶解して、検出対象の塩基性ペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００８６】
（３）各検出用試薬と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した熱変性ＢＳＡ溶液と、上記（２）で調製した試料30μlおよび60μlとを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの混合液を調製した。なお、この調製において、混合液中の検出用試薬の終濃度が0.1〜５％となる量で、検出用試薬（熱変性ＢＳＡ溶液）と上記の各試料とを混合した。【００８７】
（４）混合液の濁度評価
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度（OD550）を、分光光度計UV-2500PC(島津製作所)により測定した。濁度が認められた場合を「Y」とし、認められない場合を「N」として、表６に示す。
【表６】
0005632391.tif 000007
【００８８】
２．結果
表６より、混合液における検出用試薬の終濃度が0.1〜５%（変性ＢＳＡの終濃度として、0.005〜0.25 w/v%）のいずれの場合でも、塩基性ペプチドを検出することができた。【００８９】
（実施例８）変性されたＢＳＡ溶液を用いた中性ペプチドおよび酸性ペプチドに対する検出能の評価
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【００９０】
（２）検出対象のペプチドを含む試料の調製
塩基性ペプチド以外の比較用の検出対象として、中性ペプチドFibrinogenα（配列番号６；株式会社  バイオロジカ）、ならびに酸性ペプチドＣ３ｆ（配列番号７；株式会社  バイオロジカ）およびFactor XIII（配列番号８；株式会社  バイオロジカ）を用いた。これらのペプチドを超純水に溶解して、それぞれのペプチドを含む試料（1.0 mg/ml）を調製した。【００９１】
（３）検出用試薬と各試料との混合液の調製
上記（１）で調製した変性ＢＳＡ溶液 50μLを、上記（２）で調製した各試料に混合した後、それぞれに超純水を加えて、全量250μlの各ペプチドを含む混合液を調製した。なお、この調製において、各混合液中のペプチドの終濃度が０〜80μMとなる量で、熱変性ＢＳＡ溶液と上記試料とを混合した。【００９２】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液のOD550を、実施例１と同様にして測定した。結果を図７−１〜図７−４に示す。【００９３】
２．結果
中性ペプチドであるFibrinogenαを用いた場合はOD550に変化は見られなかった（図７−１参照）。これは、熱変性ＢＳＡとFibrinogenαが結合しなかったか、または結合してもすぐに解離したことが原因ではないかと考えられる。
また、酸性ペプチドであるＣ３ｆを用いた場合もOD550に変化は見られず（図７−２参照）、Factor XIIIを用いた場合もOD550に変化は見られなかった（図７−３参照）。これらの場合でも、熱変性ＢＳＡとＣ３ｆ、および熱変性ＢＳＡとFactorXIIIが結合しなかったか、または結合してもすぐに解離したことが原因ではないかと考えられる。
ここで、上記結果と、実施例１の塩基性ペプチドを検出した結果とを合わせたグラフを、図７−４に示す。このグラフから明らかなように、本発明の方法は、酸性ペプチドや中性ペプチドに対して検出能を有さず、塩基性ペプチドにのみ特異的な検出能を発揮することがわかる。【００９４】
（実施例９）熱変性ＢＳＡ溶液のペプチド検出におけるペプチド濃度限界（ＬｏＤ）の検討
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【００９５】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む試料の調製
上記の実施例６と同様にして、塩基性ペプチドを含む試料を調製した。【００９６】
（３）各検出用試薬と試料との混合液の調製
上記の（１）で調製した熱変性ＢＳＡ溶液600μlと上記の（２）で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量３mlの混合液（熱変性ＢＳＡの終濃度：0.2 w/v%）を調製した。なお、この調製において、混合液中のＡＣＴＨ部分ペプチドの終濃度が０〜1.6μMとなる量で、熱変性ＢＳＡ溶液と上記の試料とを混合した。【００９７】
（４）混合液の蛍光強度測定および顕微鏡観察による凝集体の個数をカウント
上記で調製した各混合液を二分割し、一方の各混合液の励起波長510 nmにおける520 nmの蛍光強度を、分光蛍光光度計 F-7000（株式会社日立ハイテクノロジーズ）により測定した。結果を図８に示す。得られた結果について、カレイダクラフ（ヒューリンクス社）を用いてヒルプロット解析することにより、ペプチド濃度限界（ＬｏＤ）を評価した。また、他方の各混合液をプランクトン計算板（松浪硝子工業株式会社）に滴下し、顕微鏡(×400  オリンパス社)により、843μm×843μm内に存在する凝集物をカウントした。結果を図９に示す。また、得られた結果について、カレイダクラフ（ヒューリンクス社）を用いてヒルプロット解析することで、ペプチド濃度限界（ＬｏＤ）を評価した。【００９８】
２．結果
図８より、ペプチド濃度が数百nMオーダー領域おいて、塩基性ペプチドの濃度依存的な蛍光強度の上昇が見られた。また、蛍光強度と塩基性ペプチド濃度との間には、ヒルの式に従う関係が認められた。
図９より、顕微鏡による凝集体のカウント数においても、塩基性ペプチドの濃度依存的な蛍光強度の上昇が見られた。また、カウント数と塩基性ペプチド濃度との間には、ヒルの式に従う関係が認められた。
以上から、本発明の方法は、塩基性のペプチドの濃度が数百nMであっても、該ペプチドの存在の検出および濃度の定量に利用することができる。【００９９】
（実施例１０）血清を含む検体中の塩基性ペプチドに対する検出能の評価
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【０１００】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む血清溶液の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ＡＣＴＨの１位〜２４位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社  バイオロジカ）を用いた。このペプチドを超純水に溶解した後、USA健常者（女性, 16 age）の血清（SUNFCO社）と混合して、検出対象の塩基性ペプチドおよび血清を含む試料を調製した。なお、この試料において、ＡＣＴＨ部分ペプチドの濃度および血清濃度は、それぞれ、次の（３）に示される終濃度となるように調製した。【０１０１】
（３）検出用試薬と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した熱変性ＢＳＡ溶液50μlと、上記（２）で調製した試料とを混合した後、超純水を加えて、全量250μlの血清を含む混合液（以下、「血清溶液」という）を調製した。なお、この調製において、混合液中のACTH部分ペプチドの終濃度が０〜80μMとなる量で、血清の終濃度が100倍希釈となる量で上記の試料を混合した。また、比較実験用の混合液として、血清を含まない混合液（以下、「対照液」という）を調製した。【０１０２】
（４）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC（島津製作所）により測定した。結果を図１０に示す。また、得られた結果について、カレイダグラフ（ヒューリンクス社）を用いてヒルプロット解析することで、熱変性ＢＳＡのＫｄ値およびヒル係数、ＨＳＡ濃度（ＣHSA）、ＨＳＡとＡＣＴＨの解離定数（Ｋｉ値）を算出した。各数値を表７に示す。【０１０３】
【表７】
0005632391.tif 000008
【０１０４】
２．結果
図１０より、実施例１〜９のような検出対象の塩基性ペプチドのみが含まれる純粋な検体ではなく、被験者から採取した実際の検体のように血清を含む検体であっても同様に塩基性ペプチドを検出できることが明らかとなった。
また、図１０において、所定のＯＤ値に対応する血清溶液および対照液のＡＣＴＨ部分ペプチドの濃度を比較すると、血清溶液では対照液の約２倍のＡＣＴＨ部分ペプチド量であることがわかる。これは、血清中のＨＳＡによる競合阻害の影響であると考えられる。血清溶液の場合は、血清中のＨＳＡとＡＣＴＨ部分ペプチドの解離定数を考慮する必要があり、吸光度と塩基性ペプチド濃度との間には、下記のヒルの式に従う関係が認められる。
ＯＤ＝（ペプチド濃度）n／［(ペプチド濃度)n+[Ｋｄ×(1+CHSA／Ｋｉ)]n］
（式中、ＫｄはＡＣＴＨ部分ペプチドと熱変性ＢＳＡの解離定数、ＣHSAはＨＳＡの濃度、ＫｉはＡＣＴＨ部分ペプチドとＨＳＡの解離定数、nはヒル係数を示す。）【０１０５】
表７より、検出試薬自体の検出能に関係するファクターであるKd値およびヒル係数nは、対照液と血清溶液との間で比較すると、ほぼ同等の値を示しているのに対して、ＣHSAは両者の間で互いに異なる値を示している。このことから、検出用試薬自体の検出能が低下したのではなく、血清中のＨＳＡがＡＣＴＨ部分ペプチドの一部を捕獲して、実際の溶液中に存在する遊離ペプチド量が減少していることは明らかである。
以上から、本発明の方法は、実検体中でも塩基性ペプチドの検出および濃度の定量を簡便に行うことができる。【０１０６】
ここで、塩基性ペプチドの検出感度を上昇させるために、本発明の方法においては、前処理としてペプチドを濃縮するプロセスを追加することもできる。そのプロセスを次の実施例に示す。【０１０７】
（実施例１１）血清を含む検体中の塩基性ペプチドの濃縮プロセスと濃縮塩基性ペプチドの検出
１．実験方法
（１）検出用試薬としての変性されたＢＳＡ溶液の調製
上記の実施例１と同様にして、熱変性ＢＳＡ溶液を調製した。【０１０８】
（２）検出対象の塩基性ペプチドを含む実検体血清溶液の調製
検出対象の塩基性ペプチドとして、ACTHの１位〜24位のアミノ酸からなるＡＣＴＨ部分ペプチド（株式会社  バイオロジカ）を用いた。このペプチドを超純水に溶解した後、USA健常者（女性, 16age）血清（SUNFCO社）と混合して、検出対象の塩基性ペプチドを含む実検体血清試料を調製した。なお、この試料において、ＡＣＴＨ部分ペプチドの濃度および血清濃度は下記（３）の濃度に合うように調製した。【０１０９】
（３）検出対象の塩基性ペプチドを濃縮した試料溶液の調製
Glycerol溶液(Agilent technologies社)６mlおよびOFFGEL Buffer（Agilent technologies社）600μlを混合した後、超純水を加えて、全量50 mlのpH3-10ペプチドbuffer溶液(×1.25)を調製した。この溶液と上記（２）の試料を混合して、ＡＣＴＨ部分ペプチドの濃度20μMおよび血清1000倍希釈ペプチドbuffer溶液（×１）を調製した。この溶液とpH 3-10 Fraction用High Resolution IPG ゲルを用いて、OFFGEL分画装置（Agilent technologies社）にて分画操作を行った。その後、ＡＣＴＨ部分ペプチドが含まれているFraction（陰極部が接している溶液）を回収し、超純水100μlを添加した溶液を、塩基性ペプチド濃縮試料とした。【０１１０】
（４）検出用試薬と試料との混合液の調製
上記（１）で調製した熱変性ＢＳＡ溶液50μlと上記（３）で調製した試料とを混合した後、MES-HCl buffer（pH5.0）と超純水を加えて全量250μl（MES  終濃度50μM）とし、pHを調整して、混合液を調製した。また、熱変性ＢＳＡ溶液を含まない溶液を、比較用混合液として調製した。【０１１１】
（５）混合液の吸光度の測定
上記で調製した各混合液の波長550 nmにおける吸光度(OD550)を、分光光度計UV-2500PC（島津製作所）により測定した。結果を表８に示す。【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
２．結果
熱変性BSAが含まれている試料では濁度上昇が確認できることから、OFFGEL分画した後の溶液においても、本発明の検出用試薬を用いてＡＣＴＨ部分ペプチドを検出できることが明らかとなった。
以上から、本発明の方法は、前処理としてOFFGEL分画装置で塩基性ペプチドを濃縮することで、実検体中の極微量の塩基性ペプチドを検出することができる。【０１１４】
本出願は、２００９年１２月１０日に出願された日本国特許出願  特願２００９−２８０９３５号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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