(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３９から得られる抗体。
【請求項２】
細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３９から得られた抗体を採用する、イムノアッセイを用いた試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体の免疫学的測定のための方法。
【請求項３】
細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３９から得られた抗体を採用する、イムノアッセイを用いた試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体の免疫学的測定のための方法。
【請求項４】
イムノアッセイが、捕捉抗体、トレーサー抗体および検出抗体を含み、該捕捉抗体が、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲーションした、細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３９から得られた、アミロイドβペプチドに対する抗体に対するビオチン化抗イディオタイプ抗体であり、該トレーサー抗体が、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３９から得られた、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体であり、該検出抗体が、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項５】
イムノアッセイが、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドと、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３９から得られた、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体と、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体とを含むことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項６】
イムノアッセイが、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、該捕捉抗体が、結合対の第１部分にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体であり、該トレーサー抗体が、検出可能なラベルにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項７】
イムノアッセイが、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドと、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体と、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体とを含むことを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項８】
イムノアッセイが、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、該捕捉抗体が、固相にコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの該抗体を含む混合物であり、該トレーサー抗体が、検出可能なラベルとコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの該抗体を含む該抗体の混合物であることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ａβ抗体に結合する抗イディオタイプ抗体、および抗Ａβ抗体上の同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する抗体を検出するためのアッセイに関する。
【０００２】
発明の背景
認知症の全症例の約７０％は、認知に重要な脳領域および神経回路の選択的損傷に関連するアルツハイマー病が原因である。アルツハイマー病は、特に海馬錐体ニューロンにおける神経原線維タングルならびに主にアミロイド沈着の高密度核および拡散したハローを有する多数のアミロイド斑を特徴とする。
【０００３】
細胞外の老人斑（neuritic plaque）は、「アミロイドβ」、「Ａ−β」、「Ａβ４」、「β−Ａ４」または「Ａβ」と呼ばれる多量の主に原線維性のペプチドを含有する（例えばSelkoe, D.J., Ann. Rev. Cell Biol. 10 (1994) 373-403; Koo, E.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 9989-9990；米国特許第４，６６６，８２９号；またはGlenner, G.G., Biochem. Biophysic. Res. Commun. 122 (1984) 1131-1135参照）。このアミロイドβペプチドは、「アルツハイマー前駆タンパク質／β−アミロイド前駆タンパク質」（ＡＰＰ）から得られる。ＡＰＰは、内在性膜糖タンパク質であり（例えばSisodia, S.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 6075-6079参照）、形質膜プロテアーゼであるα−セクレターゼによってＡβ配列内でタンパク質内分解的に切断される（例えばSisodia (1992)、上記引用参照）。その上、さらなるセクレターゼ活性、特にβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ活性は、３９個のアミノ酸（Ａβ３９）、４０個のアミノ酸（Ａβ４０）、４２個のアミノ酸（Ａβ４２）または４３個のアミノ酸（Ａβ４３）のいずれかを含むアミロイド−β（Ａβ）の細胞外放出を導く（例えばSinha, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 11049-11053; Price, D.L., Science 282 (1998) 1079-1083；国際公開公報第００／７２８８０号；またはHardy, J., Trends in Neuroscience (1997) 154-159参照）。
【０００４】
Ａβにいくつかの天然型があることに注目すべきであり、ヒト型は、上記のＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と呼ばれる。最も顕著な型であるＡβ４２は、アミノ酸配列（Ｎ−末端から始まる）：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号：１３）を有する。Ａβ４１、Ａβ４０、Ａβ３９では、それぞれＣ−末端のＡ、ＩＡおよびＶＩＡが欠如している。Ａβ４３型では、上記配列のＣ−末端に追加的にトレオニン残基が含まれる。
【０００５】
抗体を用いた標準的な固相イムノアッセイは、固相に吸着／固定化された抗体（捕捉抗体）と、抗原と、酵素または検出可能なラベルにコンジュゲーションした、抗原の別のエピトープに対する抗体（トレーサー抗体）との間の複合体の形成を伴う。そのアッセイでは、サンドイッチ、すなわち固相／捕捉抗体／抗原／トレーサー抗体が形成する。とりわけサンドイッチにより触媒される反応では、抗体とコンジュゲーションした酵素の活性は、インキュベーション培地中の抗原濃度に比例する。捕捉抗体とトレーサー抗体とが同じ抗原の異なるエピトープに結合することから、標準的なサンドイッチ法は、また、二重抗原架橋イムノアッセイと呼ばれる。Hoesel, W.ら（J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110）は、アミノ基に結合した固定化ｒｈＥＰＯと、糖質基に結合したｒｈＥＰＯとの混合物を使用した抗ＥＰＯ二重抗原架橋アッセイを報告している。二重抗原架橋ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイは、薬物抗体に対する患者の免疫原性応答の研究によくみられる種類のアッセイである。Mire-Sluis, A.R.ら（J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16）は、バイオテクノロジー産物に対するホスト抗体の検出を用いたイムノアッセイの設計および最適化のための提案を要約している。抗薬物抗体アッセイは、例えば国際公開公報第２００５／０４５０５８号および国際公開公報第９０／００６５１５号に言及されている。抗イディオタイプ抗体アッセイは、例えば米国特許第５，２１９，７３０号；国際公開公報第８７／００２７７８号；EP 0139389；およびEP 0170302に言及されている。Wadhwa, M.ら（J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17）は、治療用生物学的製剤によって誘導される、望まれない抗体の検出、測定およびキャラクタリゼーションのための戦略を報告している。US 2007/0093415に、アミロイド特異的ペプチドおよびその使用が報告されている。抗イディオタイプ抗体の製造方法は、EP 1917854に報告されている。
【０００６】
発明の概要
本発明の第１の局面は、アミロイドβペプチドに対する抗体に結合する抗イディオタイプ抗体に加えて、本発明によるアッセイにおけるその使用である。一態様では、該抗体は、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体と同じまたはオーバーラップするエピトープに結合することを特徴とする。別の態様は、該抗体が、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体であることである。
【０００７】
本発明の他の局面は、イムノアッセイを用いた試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体の免疫学的測定のための方法、およびイムノアッセイを用いた試料中の、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体の免疫学的測定のための方法である。
【０００８】
試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体の免疫学的測定のための方法の態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体、トレーサー抗体および検出抗体を含み、ここで、捕捉抗体は、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲーションした、アミロイドβペプチドに対する抗体に対するビオチン化抗イディオタイプ抗体であり、トレーサー抗体は、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体であり、検出抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体である。
【０００９】
試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体の免疫学的測定のための方法のさらなる態様では、イムノアッセイは、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドと、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体と、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体とを含む。
【００１０】
一態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体は、寄託細胞系DSM ACC2939から得られた抗体と同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する。別の態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体は、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体である。
【００１１】
試料中の、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体の免疫学的測定のための方法の一態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、ここで、捕捉抗体は、結合ペアの第１部分にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体であり、トレーサー抗体は、検出可能なラベルにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体である。一態様では、イムノアッセイは、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体を含む。
【００１２】
試料中の、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体の免疫学的測定のための方法のさらなる態様では、イムノアッセイは、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチド、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体を含む。
【００１３】
本発明による方法の一態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、ここで、捕捉抗体は、固相にコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの抗体を含む混合物であり、トレーサー抗体は、検出可能なラベルにコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの抗体を含む混合物である。
【００１４】
一態様では、抗体と、そのコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲーションは、薬物抗体のアミノ酸主鎖のＮ−末端および／もしくはε−アミノ基（リシン）、別のリシンのε−アミノ基、カルボキシ−、スルフヒドリル−、ヒドロキシル−および／もしくはフェノール官能基ならびに／または薬物抗体の糖質構造の糖アルコール基を介して化学結合することによって行われる。別の態様では、捕捉抗体混合物は、アミノ基を介して、および糖質構造を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲーションした抗体を含む。
【００１５】
一態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体は、国際公開公報第０３／０７０７６０号に報告されたような抗体である。別の態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体は、配列番号：１、２および３より選択される重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：４、５および６より選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらなる態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体は、配列番号：７、８および９より選択される重鎖可変ドメインならびに／または配列番号：１０、１１および１２より選択される軽鎖可変ドメインを含む。
【００１６】
さらなる態様では、捕捉抗体混合物および／またはトレーサー抗体混合物は、少なくとも二つの異なるアミノ基を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲーションした抗体を含む。異なるアミノ基を介したそのような結合は、第１段階でε−アミノ基の部分を化学保護剤でアシル化することにより、例えばシトラコニル化することにより、行うことができる。第２段階では、コンジュゲーションは、残りのアミノ基を介して行う。続いてシトラコニル化を除去し、抗体は、残りの遊離アミノ基を介してコンジュゲーションパートナーにコンジュゲーションする、すなわち得られた抗体は、シトラコニル化によって保護されなかったアミノ基を介してコンジュゲーションパートナーにコンジュゲーションする。適切な化学保護剤は、保護されていない側鎖アミンで結合を形成し、Ｎ−末端でのそれらの結合よりも安定性が低く、それらの結合と異なる。多数のそのような化学保護剤が公知である（例えばEP 0651761参照）。一態様では、化学保護剤には、無水マレイン酸または無水シトラコニル酸のような無水環状ジカルボン酸が含まれる。
【００１７】
一態様では、捕捉抗体は、受動吸着により固相にコンジュゲーションする結果として、少なくとも二つの異なる抗体部位で固相にコンジュゲーションされる。受動吸着は、例えばButler, J.E., "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225およびDiamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (Editors), "Immunoassays" (1996) Academic Press (San Diego)に記載されている。
【００１８】
一態様では、トレーサー抗体混合物は、アミノ基および糖質構造を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲーションした抗体を含む。
【００１９】
別の態様では、捕捉抗体のトレーサー抗体に対する比は、１：１０〜５０：１（比は、抗体分子のモル比を意味し、異なりうるコンジュゲートの分子量とは無関係）である。なおさらなる態様では、そのような混合物におけるアミノにコンジュゲーションした抗体（トレーサー抗体または捕捉抗体のいずれか）の、糖質にコンジュゲーションした抗体（トレーサー抗体または捕捉抗体のいずれか）に対する比は、１：１０〜１０：１（比は、抗体分子のモル比を意味し、異なりうるコンジュゲートの分子量に無関係）である。
【００２０】
本発明の一態様では、捕捉抗体は、特異的結合ペアを介してコンジュゲーション（固定化）されている。そのような結合ペア（第１構成要素／第２構成要素）は、一態様では、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996参照）、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモンレセプター、酵素／基質、ＩｇＧ／プロテインＡおよび／またはＧなどより選択される。一態様では、捕捉抗体は、ビオチンにコンジュゲーションされ、固定化は、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して行う。
【００２１】
別の態様では、トレーサー抗体は、検出可能なラベルとコンジュゲーションさせる。一態様では、トレーサー抗体は、ジゴキシゲニンおよびジゴキシゲニンに対する抗体を介して検出可能なラベルにコンジュゲーションされる。または、トレーサー抗体は、ルテニウムビスピリジル錯体のような電気化学発光ラベルにコンジュゲーションされる。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明による「アミロイドβペプチドに対する抗体」という用語は、個体に投与することができる抗体であって、結果として投与後に該個体の試料が該抗体を含むと推測される抗体を意味する。本発明による一つのアッセイ内で、捕捉抗体およびトレーサー抗体は、「同じ」抗体分子、例えば、同じ発現ベクターを用いてリコンビナント産生された、同じアミノ酸配列を含む抗体分子を含む。アミロイドβペプチドに対する抗体は、例えば、米国特許第７，２５６，２７３号、米国特許第７，１８９，８１９号、米国特許第７，１７９，８９２号、米国特許第７，１９５，７６１号、US 2008/0281082、US 2008/0221306、US 2008/0131422、US 2008/0050367、US 2007/0238154、US 2007/0154480、US 2007/0110750、US 2006/0280743、US 2006/0292152、US 2006/0165682、US 2006/0057701、US 2006/0057702、US 2006/0039906、US 2005/0249725、US 2005/0169925、US 2005/0118651、US 2005/0009150、US 2004/0171816、US 2004/0171815、およびUS 2004/0192898に記載されている。
【００２３】
「抗イディオタイプ抗体」は、治療用抗体の相補性決定領域のような抗原結合部位に対する、すなわち可変領域に対して向けられている。そのような抗イディオタイプ抗体は、患者の免疫原性反応物として抗体治療の間に生成することがある（例えばPan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49参照）。一態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する該抗イディオタイプ抗体は、アミロイドβペプチドに対する抗体の一つまたは複数のＣＤＲに結合する。
【００２４】
本発明の第１の局面は、アミロイドβペプチドに対する抗体に結合する抗イディオタイプ抗体である。本発明のこの局面に関する例示的な抗体は、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体である。本発明によるアッセイにおけるこの抗体およびその使用もまた、本発明の局面である。一態様では、該抗イディオタイプ抗体は、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体と同じまたはオーバーラップするエピトープに結合することを特徴とする。固定化抗体および可溶性抗原（またはその逆）を、２０〜５０nMの濃度の問題となるエピトープ及び、エピトープのオーバーラップを検出しなければならない濃度１００nMの抗体と共に使用した表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより、５０％以上、一態様では７５％以上のシグナル減少が検出される場合に、二つのエピトープはオーバーラップする。または、競合試験系の助けを借りて、同じ抗原に結合する二つの抗体のエピトープのオーバーラップを測定する方法を使用することができる。このために、エピトープのオーバーラップを検出しなければならない抗体が固定化抗原との結合を他の抗体と競合するかどうかは、例えばリコンビナント抗原エピトープを発現している細胞を採用した細胞ベースの酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の助けを借りて試験する。このために、ラベル化形態の抗体およびエピトープのオーバーラップを測定しなければならない過剰の抗体と共に、固定化抗原をインキュベーションする。エピトープのオーバーラップは、結合したラベルの検出によって容易に確認することができる。公知の抗体を基準にして、エピトープのオーバーラップを測定しなければならない抗体が、同濃度で７０％を超える、一態様では８０％を超えるシグナル減少が測定された場合、またはより高濃度で、場合によると１０５倍過剰で、８０％を超える、一態様では９０％を超える置換が測定された場合に、エピトープの同一性またはオーバーラップが存在し、両抗体は、同じ抗原の同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する。本発明による抗イディオタイプ抗体は、アミロイドβペプチドのアミノ酸配列、例えば一態様では配列番号：１３のアミノ酸残基に特異的に結合する抗体に対して向けられている。
【００２５】
異なるイムノアッセイの原理は、例えばHage, D.S.(Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R)により記載されている。Lu, B.ら（Analyst 121 (1996) 29R-32R）は、イムノアッセイに使用するための抗体の配向された固定化を報告している。アビジン−ビオチン−介在性イムノアッセイは、例えばWilchek, M.およびBayer, E.A.によりMethods Enzymol. 184 (1990) 467-469に報告されている。
【００２６】
モノクローナル抗体およびそれらの定常ドメインは、表面、タンパク質、ポリマー（例えばＰＥＧ、セルロースまたはポリスチロール）、酵素または結合ペアのメンバーなどの結合パートナーと結合するための多数の反応性側鎖をタンパク質として有する。抗体の化学反応基は、例えばアミノ基（リシン、α−アミノ基）、チオール基（シスチン、システイン、およびメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、および糖−アルコール基である。そのような方法は、例えばAslam M.およびDent, A.によって、"Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50-100に記載されている。
【００２７】
タンパク質の最も一般的な反応基の一つは、アミノ酸リシンの脂肪族ε−アミンである。一般に、ほぼ全ての抗体は、豊富なリシンを有する。リシン性アミンは、ｐＨ８．０超で適度に良好な求核剤である（ｐＫａ＝９．１８）ことから、多様な試薬と容易かつ正確に反応して安定な結合を形成する。アミン反応性試薬は、主にタンパク質のリシンおよびα−アミノ基と反応する。反応性エステル、特にＮ−ヒドロキシ−スクリンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミン基の改変のために最も一般的に採用される試薬に含まれる。水性環境における反応の至適ｐＨは、ｐＨ８．０〜９．０である。イソチオシアネートは、アミン改変試薬であり、タンパク質とチオ尿素結合を形成する。イソチオシアネートは、水溶液（最適にはｐＨ９．０〜９．５）中でタンパク質性アミンと反応する。アルデヒドは、温和な水性条件で脂肪族および芳香族アミン、ヒドラジン、ならびにヒドラジドと反応してイミン中間体（シッフ塩基）を形成する。シッフ塩基を中または強還元剤（水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウム）で選択的に還元して、安定なアルキルアミン結合を得ることができる。アミンを改変するために使用されている他の試薬は、酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）は、二つのアミン反応性無水基を有する二官能性キレート剤である。それは、タンパク質のＮ−末端およびε−アミン基と反応して、アミド結合を形成することができる。無水環が開環すると、配位複合体中の金属と堅固に結合できる多価の金属キレートアームが生じる。
【００２８】
抗体における別の一般的な反応基は、含硫アミノ酸シスチンおよびその還元生成物システイン（または半シスチン）からのチオール残基である。システインは、アミンよりもより求核性で、かつ一般にタンパク質の中で最も反応性の高い官能基である遊離チオール基を有する。チオールは、一般に中性ｐＨで反応性であることから、アミンの存在下で他の分子に選択的に結合することができる。遊離のスルフヒドリル基は、比較的反応性であるので、これらの基を有するタンパク質は、多くの場合に、ジスルフィド基またはジスルフィド結合としてその酸化型でスルフヒドリル基と共存する。そのようなタンパク質で反応性遊離チオールを産生させるには、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの試薬によるジスルフィド結合の還元が必要である。チオール反応性試薬は、タンパク質上のチオール基と結合してチオエーテル結合生成物を形成する試薬である。これらの試薬は、微酸性〜中性ｐＨで迅速に反応することから、アミン基の存在下で選択的に反応させることができる。文献には、反応性アミノ基を介して複数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方法を提供する、Traut試薬（２−イミノチオラン）、スクシンイミジル（アセチルチオ）アセテート（ＳＡＴＡ）、およびスルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）などのいくつかのチオール化架橋試薬の使用が報告されている。ハロアセチル誘導体、例えばヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成することから、チオール改変用の試薬でもある。さらに有用な試薬は、マレイミドである。マレイミドとチオール反応性試薬との反応は、本質的にヨードアセトアミドと同じである。マレイミドは、微酸性から中性ｐＨで迅速に反応する。
【００２９】
抗体における別の一般的な反応基は、カルボン酸である。タンパク質は、Ｃ−末端位に、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖内にカルボン酸基を有する。カルボン酸が水中で相対的に低い反応性であることから、通常、タンパク質および他の生体分子を選択的に改変するためにこれらの基を使用することが困難になる。これを行う場合、通常は水溶性カルボジイミドの使用によりカルボン酸基を反応性エステルに変換し、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンなどの求核性試薬と反応させる。さらにより高塩基性のリシンのε−アミンの存在下で活性化カルボン酸と選択的に反応させて安定なアミド結合を形成させるために、アミン含有試薬は弱塩基性であるべきである。ｐＨを８．０よりも上げると、タンパク質の架橋形成が起こるおそれがある。
【００３０】
過ヨウ素酸ナトリウムは、抗体に結合した糖鎖内の糖のアルコール部分を酸化してアルデヒドにするために使用することができる。各アルデヒド基は、カルボン酸について記載したのと同様にアミン、ヒドラジド、またはヒドラジンと反応させることができる。糖鎖は主に抗体の結晶性フラグメント（Ｆｃ）領域に見られることから、コンジュゲーションは、抗原結合部位から離れた糖質の部位特異的改変により達成することができる。シッフ塩基中間体が形成され、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（穏やかで選択的）または水素化ホウ素ナトリウム（強い）水溶性還元剤を用いたその中間体の還元によって、それをアルキルアミンに還元することができる。
【００３１】
「試料」という用語には、非限定的に、生物またはかつての生物に由来する任意の量の物質が含まれる。そのような生物には、非限定的に、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が含まれる。そのような物質には、非限定的に、個体からの全血、血清、または血漿が含まれ、これらは、臨床日常業務に最も広く使用される試料源である。
【００３２】
「固相」という用語は、非液状物質を意味し、この用語には、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックなどの材料から作られた粒子（マイクロパーティクルおよびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどのゲル状物質；ポリマー、金属、ガラス、および／またはセラミック製でありうるキャピラリー；ゼオライトおよび他の多孔質物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブまたは他の分光計用試料容器が含まれる。「固相」が、捕捉薬物抗体と相互作用させることを意図する少なくとも一つの部分をその表面に有する点で、アッセイの固相構成要素は、そのアッセイが接触しうる不活性固体表面と区別される。固相は、チューブ、ストリップ、キュベットもしくはマイクロタイタープレートなどの静止構成要素でありうるか、またはビーズもしくはマイクロパーティクルなどの非静止構成要素でありうる。タンパク質および他の物質を非共有または共有結合させる多様なマイクロパーティクルを使用することができる。そのような粒子には、ポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリレート）などのポリマー粒子；金ナノパーティクルおよび金コロイドなどの金粒子；ならびにシリカ、ガラス、および酸化金属粒子などのセラミック粒子が含まれる。例えばMartin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A、またはButler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23を参照されたい。
【００３３】
一態様では、色素原（蛍光または発色基および色素）、酵素、ＮＭＲ−活性基、金属粒子、またはジゴキシゲニンなどのハプテンから、検出可能なラベルが選択される。検出可能なラベルは、また、光で活性化されうる架橋基、例えばアジドまたはアジリン基でありうる。電気化学発光により検出できる金属キレートは、また、一態様でシグナル発生基であり、特にルテニウムキレート、例えばルテニウム（ピスピリジル）３２＋キレートが好ましい。適切なルテニウムラベル基は、例えば、EP 0580979、国際公開公報第９０／０５３０１号、国際公開公報第９０／１１５１１号、および国際公開公報第９２／１４１３８号に記載されている。
【００３４】
本発明は、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含むイムノアッセイを用いた、試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体の免疫学的測定のための方法を提供する。一態様では、イムノアッセイは、抗原架橋イムノアッセイである。別の態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、ここで、その捕捉抗体は、固相にコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの抗体を含む、アミロイドβペプチドに対する抗体の混合物であり、トレーサー抗体は、検出可能なラベルにコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの抗体を含む、アミロイドβペプチドに対する抗体の混合物である。
【００３５】
通例／一般に採用されるアッセイは、試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体の定量および／または測定に関して限界があり、これは、例えばアミロイドβペプチドへのアミロイドβペプチドに対する抗体の結合性の変化に起因する。イムノアッセイに本発明によるアミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗体（抗−抗Ａβ抗体抗体）を使用することによって、これらの限界を克服できることが見出された。
【００３６】
本発明による方法に有用な捕捉抗体は、固相にコンジュゲーションされる。コンジュゲーションは、一態様では、抗体のアミノ酸主鎖のＮ−末端および／またはε−アミノ基（リシン）、別のリシンのε−アミノ基、カルボキシ−、スルフヒドリル−、ヒドロキシル−および／もしくはフェノール官能基ならびに／または抗体の糖質構造の糖アルコール基を介した化学結合により行う。本発明による方法に有用な捕捉抗体は、一態様では、固相にコンジュゲーションした少なくとも二つの抗体の混合物であり、ここで、固相にコンジュゲーションした少なくとも二つの抗体は、固相にコンジュゲーションされる部位で異なる。例えば、固相にコンジュゲーションした少なくとも二つの抗体の混合物は、抗体のアミノ酸主鎖のアミノ酸を介して固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体と、抗体の糖質構造の糖アルコール基を介して固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体とを含みうる。また、例えば、固相にコンジュゲーションした少なくとも二つの抗体の混合物は、それらのアミノ酸主鎖の別のアミノ酸残基を介して固相にコンジュゲーションした抗体を含みうる。「別のアミノ酸残基」という表現は、リシンおよびアスパラギン酸、またはチロシンおよびグルタミン酸などの二つの異なる種類のアミノ酸、または、抗体のアミノ酸配列の位置で異なるアミノ酸主鎖の二つのアミノ酸残基の一方を意味する。後者の場合に、アミノ酸は、同じ種類または異なる種類でありうる。「抗体部位（部位）で異なる」という表現は、例えば抗体が固相にコンジュゲーションされる部位の種類、例えばアミノ酸もしくは糖アルコール基、またはアミノ酸主鎖のアミノ酸の数のいずれかが異なることを示す。逆に、本発明による方法に有用なトレーサー抗体に同じことが当てはまる。
【００３７】
本発明の一態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号：１、２、または３より選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。さらなる態様では、該アミロイドβペプチドに対する抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号：４、５、または６より選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。さらなる態様では、アミロイドβペプチドに対する抗体は、配列番号：７、８、または９より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。なおさらなる態様では、該アミロイドβペプチドに対する抗体は、配列番号：１０、１１、または１２より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００３８】
本発明による方法の一態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体としてビオチン化され、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対するモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントと、トレーサー抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたヒト免疫グロブリンＧに対するポリクローナル抗体とを含む。
【００３９】
本発明による抗体の別の態様では、イムノアッセイは、二重抗原架橋イムノアッセイである。
【００４０】
本発明による方法のさらなる態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体、トレーサー抗体および検出抗体を含み、ここで、捕捉抗体は、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲーションしたビオチン化アミロイドβペプチドに対する抗体であり、トレーサー抗体は、ジゴキシゲニンにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体であり、検出抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体である。
【００４１】
本発明による方法の別の態様では、イムノアッセイは、捕捉抗体、トレーサー抗体および検出抗体を含み、ここで、捕捉抗体は、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲーションした、アミロイドβペプチドに対する抗体に対するビオチン化抗イディオタイプ抗体であり、トレーサー抗体は、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体であり、検出抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体である。
【００４２】
本発明による方法の別の態様では、イムノアッセイは、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドと、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体と、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体とを含む。
【００４３】
本発明によるマウス−マウスハイブリドーマ細胞系であるハイブリドーマ細胞系MAK<Mab31>M-1.5.74は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づきDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH  （ＤＳＭＺ）（ドイツ）に２００８年７月２９日に寄託番号DSM ACC2939で寄託された。
【００４４】
本発明の理解を助けるために、以下の実施例、配列リストおよび図面を提供するが、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示す。本発明の精神から逸脱せずに、示された手順に改変を加えることができることが了解されている。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】抗イディオタイプ抗ヒトＡβ抗体抗体の選択。
【図２】交叉反応性を評価するアッセイ。
【図３】抗ヒトＡβ抗体の定量。
【図４】抗ヒトＡβ抗体の定量のための代替アッセイ。
【図５】抗−抗ヒトＡβ抗体抗体（ＡＤＡ）の検出。
【図６】抗−抗ヒトＡβ抗体中和抗体の検出。
【００４６】
実施例
実施例１
アミロイドβペプチドに対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの調製
例えば、例示的なアミロイドβペプチドに対する抗体（抗Ａβ抗体）およびそれに対応する核酸配列は、国際公開公報第２００３／０７０７６０号またはUS 2005/0169925または配列番号：１〜１２に報告されている。
【００４７】
抗Ａβ抗体を１００mMクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．６）中でペプシン（５μｇペプシン/mg抗体）と共にインキュベーションした。フラグメンテーションは、分析用ゲル濾過によって分析し、リン酸カリウムでｐＨを７．０に調整することによって５０分後に停止させた。３００mM塩化ナトリウムを含有する５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）でその混合物を透析後に、調製物を約２０mg/mlに濃縮し、ゲル濾過カラム（Superdex 200）に適用した。回収した画分を分析用ゲル濾過によって分析し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含有する画分を、ヒトＦｃγに対するポリクローナル抗体を固定化したアフィニティーマトリックスに適用し、微量のＦｃγ含有フラグメントを除去した。通過液をプールし、最終的に約２０mg/mlに濃縮した。
【００４８】
実施例２
モノクローナル抗イディオタイプ抗体の産生
ａ）マウスの免疫処置
それぞれ８〜１２週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃまたはＮＭＲＩマウスに、実施例１に概要したように得られた、配列番号：７〜９より選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号：１０〜１２より選択される軽鎖可変ドメインを含む、モノクローナル抗Ａβ抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント１００μｇをＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）と混合したものを腹腔内に初回免疫処置した。続いて４、７、および１０週間後に、マウス１匹あたり１００μgの上記Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをＩＦＡ（フロイント不完全アジュバント）と混合したものを適用する３回の腹腔内免疫処置段階をさらに行った。続いてＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中にそれぞれ２５〜１００μgのＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いて、それぞれ静脈内または腹腔内追加免疫を行い。３日後に融合させた。
【００４９】
ｂ）融合およびクローニング
ａ）により免疫処置されたマウスの脾臓細胞由来細胞、骨髄腫細胞との融合を、Galfre, G.およびMilstein, C.（Galfre, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46）により行った。約１×１０８個の脾臓細胞を２×１０７個の骨髄腫細胞（P3x63-Ag8.653, ATCC CRL1580）と混合し、遠心分離（１０分間、３００×ｇ、４℃）した。その後、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）不含培地ＲＰＭＩ１６４０で細胞を１回洗浄し、５０ml尖形バイアルに入れて４００×ｇで再度遠心分離した。その後、１mlのＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量４０００g/mol）を添加した。ピペッティングにより混合を行った。３７℃の水浴中で１分後に、５mlのＦＣＳ不含ＲＰＭＩ１６４０を滴加した。この懸濁液を混合し、ＦＣＳを１０％(v/v)含有するＲＰＭＩ１６４０で５０mlに調整し、その後遠心分離した。ＦＣＳを１０％含有するＲＰＭＩ１６４０に沈降細胞を再懸濁し、成長因子インターロイキン６（ＩＬ−６、１００U/ml）を含有するヒポキサンチン−アザセリン選択培地（ＦＣＳを１０％含有するＲＰＭＩ１６４０中の１００mmol/lのヒポキサンチン、１μg/mlのアザセリン）に蒔いた。約１０日後に、特異的抗体合成について初代培養物をアッセイした（実施例３参照）。上記Ｆ（ａｂ’）２フラグメントに結合性を示すが、ヒトＩｇＧと交叉反応を示さず、抗イディオタイプであることが示された初代培養物は、成長因子インターロイキン６（１００U/ml）を含有する培地と共にフローサイトメーター（FACSAria, BD Biosciences）を使って９６ウェル細胞培養プレートに単一細胞堆積により個別化した。このプロトコールに従うことにより、寄託クローン１．５．７４を作出した（表１）。本発明に有用な細胞系をDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （ＤＳＭＺ）（ドイツ）に寄託した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの製造
作出されたハイブリドーマ細胞系を、ＦＣＳ１０％補充ＲＰＭＩ１６４０培地１mlあたり１．０×１０５個細胞の最初の細胞密度で接種し、スピナー培養で増殖させた。そこから細胞を、ＦＣＳ１０％補充ＲＰＭＩ１６４０培地１mlあたり２．４×１０６個細胞の最初の細胞密度（生細胞）でMinipermユニットに接種し、増殖させた。回収した培養上清に１．２mg/mlのモノクローナル抗体濃度を達成した。培養上清からの抗体の精製は、標準的なタンパク質化学法、例えばBruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587- 596により行った。
【００５２】
実施例３
抗イディオタイプ抗体の検出のためのスクリーニングアッセイ
ａ）薬物抗体に結合する抗体についての一次スクリーニング
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を測定するために、リコンビナントストレプトアビジンを予備コーティングしたＭＴＰ（マイクロタイタープレート）（MicroCoat, Bernried, Germany）に、それぞれ１．０％(w/v)のＢＳＡフラクションＩＩを補充したＰＢＳ中に２００ng/mlのビオチン化モノクローナル抗Ａβ抗体、または２μg/mlのビオチン化ヒトＩｇＧをコーティングした（１００μl/ウェル、振盪しながら外界温度で６０分間インキュベーション）。続いて０．０５％(w/v)Tween（登録商標）20を含有する０．９％(w/v)塩化ナトリウム溶液でウェルを３回洗浄した。次の段階で、ウェル１個あたり１００μlのアッセイされるべき抗体溶液（培養上清）を添加し、振盪しながら外界温度で６０分間インキュベーションした。ウェルあたり０．９％(w/v)ＮａＣｌ／０．０５％Tween（登録商標）20で３回の洗浄段階を行った後で、ヒツジポリクローナル抗マウスＦｃγ抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（１００μl）を添加し、振盪しながら外界温度で６０分間インキュベーションした。続いて、洗浄を上記のように行った。最終的にウェルあたり１００μlのABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH, Germany、カタログ番号1684302）を添加した。外界温度で３０分間インキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダーで吸光度（光学密度ＯＤ）を４０５および４９２nm［４０５／４９２］で測定した。このスクリーニングは、モノクローナル抗Ａβ抗体ＩｇＧに良好に結合し、ヒトＩｇＧに低い交叉反応性だけを、または無交叉反応性さえも示す抗体の選択を導いた。この抗体選択物をさらにアッセイｂ）に供した。
【００５３】
ｂ）抗イディオタイプ抗体の選択
一次スクリーニングａ）の抗体選択物から、抗イディオタイプである抗体を同定するために、以下に記載したアッセイを行った。リコンビナントストレプトアビジンを予備コーティングされたＭＴＰ（MicroCoat, Bernried, Germany）に、ＰＢＳ中の２５０ng/mlのビオチン化Ａβペプチド（０．５％のＢＳＡフラクションＩＩ含有）をコーティングし（１００μl/ウェル、振盪しながら外界温度で６０分間インキュベーション）、続いて０．９％(w/v)ＮａＣｌ／０．０５％Tween（登録商標）20で３回洗浄した。次の段階に、ウェル１個あたりモノクローナル抗Ａβ抗体のジゴキシゲニンラベル化Ｆａｂフラグメント（５０μl、２．５〜１５ng/ml）、および５０μlのＰＢＳ（参照シグナル）または５０μlの候補抗体（培養上清；アッセイシグナル）をそれぞれ添加し、外界温度で６０分間振盪しながらインキュベーションした。結合したヒトモノクローナル抗Ａβ抗体−ジゴキシゲニンコンジュゲートを検出するために、ウェルあたり０．９％(w/v)ＮａＣｌ／０．０５％Tween（登録商標）20で３回の洗浄段階を行った後に、ヒツジポリクローナルジゴキシゲニンに対する抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化Ｆａｂフラグメント（１００μl）を添加し、外界温度で振盪しながら６０分間インキュベーションした。続いて、上記のように洗浄を行った。最終的に、ウェルあたり１００μlのABTS（登録商標）(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号1684302）を添加した。外界温度で３０分間インキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダーで吸光度を［４０５／４９２］nmで測定した。関連する参照シグナルと比較して大きく減少したアッセイシグナルを示す抗体を、さらなる使用のための候補として選択した。
【００５４】
ｃ）ヒトＩｇＧに最低の交叉反応性を有する抗体の選択
スクリーニングｂ）の候補からヒトＩｇＧに最低の交叉反応性を示すものを同定するために、以下に記載するアッセイを行った。リコンビナントストレプトアビジンで予備コーティングされたＭＴＰ（MicroCoat, Bernried, Germany）に緩衝液中のビオチン化モノクローナル抗Ａβ抗体ＩｇＧ（５０ng/ml）をコーティングし（１２５μl/ウェル、振盪しながら外界温度で３０分間インキュベーション）、続いて、０．９％(w/v)ＮａＣｌ／０．０５％Tween（登録商標）20で３回洗浄した。次の段階に、１００μlのそれぞれの候補抗体（培養上清）、１００μlのヒトＩｇＧ（最大７３mg/mlの濃度）、および２００μlのジゴキシゲニンラベル化モノクローナル抗Ａβ抗体−Ｆａｂフラグメントの混合物をウェルあたり１００μl添加し、振盪しながら外界温度で６０分間インキュベーションした。結合したモノクローナル抗Ａβ抗体−Ｆａｂ−ジゴキシゲニンコンジュゲートを検出するために、ウェルあたり０．９％(w/v)ＮａＣｌ／０．０５％Tween（登録商標）20で３回の洗浄段階を行った後で、ヒツジポリクローナルジゴキシゲニンに対する抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化Ｆａｂフラグメント（１００μl）を添加し、振盪しながら外界温度で６０分間インキュベーションした。続いて、上記のように洗浄を行った。最終的に、ウェルあたり１００μlのABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号1684302）を添加した。外界温度で３０分間インキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて［４０５／４９２］nmで吸光度を測定した。ヒトＩｇＧを添加しない場合に比べて、ヒトＩｇＧの添加によるアッセイシグナルの最小の減損を示す抗体をさらなる使用のために選択した。
【００５５】
実施例４
モノクローナル抗Ａβ抗体に対するマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体の精製
モノクローナル抗Ａβ抗体ＩｇＧに対する抗体の発酵上清を約１０倍濃縮し、２０mM Ｔｒｉｓ、１Ｍ硫酸アンモニウムを有する緩衝液（ｐＨ９．０）に移し、プロテインＡ−セファロースに適用した。０．２Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．２Ｍ硫酸アンモニウムを有するｐＨ５．５の溶出液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。ウシＩｇＧの混入物（発酵ブロス中のＦＣＳから）をウシＩｇＧに対する固定化抗体で免疫吸着することによって分離した。
【００５６】
実施例５
モノクローナル抗Ａβ抗体に対するビオチン化抗体の調製
モノクローナル抗Ａβ抗体−ＩｇＧに対する抗体を、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で約１５mg/mlのタンパク質濃度に調整した。Ｄ−ビオチノイル−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをＤＭＳＯに溶解させ、それをその溶液に１：５のモル比で添加した。６０分後にＬ−リシンを添加することにより反応を停止させ、１５０mM塩化ナトリウムを有する２５mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた透析およびゲル濾過により、過剰のラベル化試薬を除去した。
【００５７】
実施例６
モノクローナル抗Ａβ抗体に対するジゴキシゲニル化抗体の調製
モノクローナル抗Ａβ抗体−ＩｇＧに対する抗体を、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で約１５mg/mlのタンパク質濃度に調整した。ジゴキシゲニン３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをＤＭＳＯに溶解させ、１：５のモル比で抗体溶液に添加した。６０分後にＬ−リシンを添加することにより反応を停止させ、１５０mM塩化ナトリウムを有する２５mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた透析およびゲル濾過により、過剰のラベル化試薬を除去した。
【００５８】
実施例７
モノクローナル抗Ａβ抗体の定量アッセイ
ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジン−マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を用いてヒト血漿中のモノクローナル抗Ａβ抗体を定量測定するためのアッセイである。較正用標準および試料を、モノクローナル抗Ａβ抗体のイディオタイプに対するビオチン化抗イディオタイプ抗体およびジゴキシゲニル化抗イディオタイプ抗体（−ＩｇＧ−Ｂｉおよび−ＩｇＧ−Ｄｉｇ）と共に予備インキュベーションする。３０分間の予備インキュベーション後に、その混合物をマイクロタイタープレートに移す。サンドイッチ−ＥＬＩＳＡは、ABTS（登録商標）基質の呈色反応を触媒するペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたヒツジジゴキシゲニンに対する抗体で検出する。シグナルをＥＬＩＳＡリーダーにより測定する。抗−ＤＩＧ  ｐＡｂ−Ｆａｂ−ＰＯＤ（ｐＡｂ＝ポリクローナル抗体）と共にインキュベーションする前後に洗浄段階を行う。全ての較正用標準および試料は、１０％のヒト血漿を含む。
【００５９】
実施例８
モノクローナル抗Ａβ抗体に対する抗薬物抗体を検出するためのアッセイ
第１段階で、ビオチン化モノクローナル抗Ａβ抗体を、ストレプトアビジンをコーティングされたマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）のウェルにコンジュゲーション（結合）させた。ユニバーサル緩衝液で洗浄することによって、コンジュゲーションしていない（未結合の）抗体を除去した。その後、試料および参照標準（５％ヒト血清に添加されたモノクローナル抗イディオタイプ抗Ａβ抗体抗体）をウェル中でインキュベーションした。抗−抗Ａβ抗体抗体は、固定化モノクローナル抗Ａβ抗体に結合した。未結合の物質を洗浄除去後に、結合した抗−抗Ａβ抗体抗体をジゴキシゲニル化モノクローナル抗Ａβ抗体で検出し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化ジゴキシゲニンに対する抗体と共にインキュベーションした（図１参照）。抗体−酵素コンジュゲートは、ABTS（登録商標）基質の呈色反応を触媒した。シグナルは、ＥＬＩＳＡリーダーにより４０５nm（参照波長：４９０nm）で測定した。各血清試料の吸光値を３重で繰り返しで測定した。
【００６０】
実施例９
モノクローナル抗Ａβ抗体を定量するための代替アッセイ
ＥＬＩＳＡは、アミノ酸１−４０を含むアミロイドβタンパク質（Ａβ（１−４０））をコーティングされたマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を用いてヒト血漿中のモノクローナル抗Ａβ抗体を定量測定するためのアッセイである。較正用標準および試料は、Ａβ（１−４０）でコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルの中でインキュベーションし、Ａβ（１−４０）でコーティングされた表面に結合したモノクローナル抗Ａβ抗体の量は、モノクローナル抗Ａβ抗体のイディオタイプに対するジゴキシゲニル化抗イディオタイプ抗体（−ＩｇＧ−Ｄｉｇ）とABTS（登録商標）基質との呈色反応を触媒するペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体を用いて検出する。シグナルは、ＥＬＩＳＡリーダーにより測定する。
【００６１】
全てのインキュベーションサイクルの間に洗浄段階を行う。マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）にＡβ（１−４０）をコーティング後に、追加的なブロッキング段階が必要である（インキュベーション緩衝液を用いる）。全ての較正用標準および試料は、１０％のヒト血漿を含む。全てのインキュベーション段階は室温で行う。
【００６２】
実施例１０
モノクローナル抗Ａβ抗体に対する抗薬物中和抗体を検出するためのアッセイ
治療用モノクローナル抗Ａβ抗体の相補性決定領域に対する抗薬物中和抗体を分析するために、競合ＥＬＩＳＡを開発した。血漿試料または標準としてモノクローナル抗Ａβ抗体に対する抗イディオタイプ抗体をモノクローナル抗Ａβ抗体−ＤＩＧコンジュゲートと共に予備インキュベーションする。残りの遊離モノクローナル抗Ａβ抗体−ＤＩＧコンジュゲートは、Ａβでコーティングしたマイクロタイタープレートに捕捉し、ペルオキシダーゼラベル化ジゴキシゲニンに対する抗体、その後ＡＢＴＳを用いた呈色反応で検出する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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