(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶＲによる損傷に対する対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定するための方法であって、
（ａ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常を検出する工程；および
（ｂ）メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上を検出する工程を包含しており、
上記異常は、ｍｔＤＮＡゲノムの５４６〜４４４４ヌクレオチドに広がる３８９５塩基対（ｂｐ）の欠失であり、
上記バリアントの１つ以上は、Ｄ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｈ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０Ｌ、またはＶ９２Ｍであり、
上記ｍｔＤＮＡの異常およびメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上は、対象からの皮膚試料において検出され、
上記ｍｔＤＮＡの異常およびメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上の両方が検出された場合に、上記対象の皮膚状態は悪化しており、かつ対象のＵＶＲ損傷の遺伝的な素因は高いと判断される、方法。
【請求項２】
上記皮膚試料が、非侵襲的または低侵襲的な皮膚の回収手法から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記皮膚試料が、消毒綿、コットンチップスワップ、皮膚組織の微小核を回収するための小さな内径の針、またはこれらの組合せを含んでいる皮膚の回収手法から得られている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記皮膚試料が、上記対象の真皮または上皮の層から得られている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記皮膚試料が、踵、鼻、内腕、耳、口、頭皮、胸部、肩部、殿部、背中、顔面、首の項部、手、頭部またはこれらの組合せから得られている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常を検出し；かつ
（ｂ）メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上を検出する診断用のキットであって、
上記異常は、ｍｔＤＮＡゲノムの５４６〜４４４４ヌクレオチドに広がる３８９５塩基対（ｂｐ）の欠失であり、
上記バリアントの１つ以上は、Ｄ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｈ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０Ｌ、またはＶ９２Ｍであり、
上記ｍｔＤＮＡの異常およびメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上は、対象からの皮膚試料において検出され、
上記ｍｔＤＮＡの異常およびメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上の両方が検出された場合に、上記対象の皮膚状態は悪化しており、かつ対象のＵＶＲ損傷の遺伝的な素因は高いと判断され、
上記キットは、
（ｉ）組織試料を回収するための器具；ならびに
（ｉｉ）ｍｔＤＮＡの異常およびＭＣ１Ｒのバリアントの検出の実施に適したプライマー、プローブ、および試薬を備えている、診断用のキット。
【請求項７】
ｍｔＤＮＡ検出用の上記プライマーが、配列番号５および配列番号６から選択される配列によって示される、請求項６に記載の診断用のキット。
【請求項８】
ＭＣ１Ｒのバリアント検出用の上記プライマーが、配列番号９および配列番号１０から選択される配列によって示される、請求項６に記載の診断用のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本出願は、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１７９０号（出願日：２００７年１０月１１日）および米国特許出願第６０／９９９，０７４号（出願日：２００７年１０月１５日）に基づいて優先権を主張するものである。これらの特許出願の内容の全体が、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、皮膚の状態および皮膚疾患を予測し、診断し、監視する方法に関する。特に、本発明は、ミトコンドリアの変異およびメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントを決定するアッセイと、皮膚の試料を回収する非侵襲的な技術を組み合わせる方法に関する。上記変異およびバリアントは、疾患、光老化、および紫外線照射（ＵＶＲ）損傷を予測し、監視する包括的なツールとして使用される。また、上記方法は、治療剤、スキンケア製品および処置計画の有効性、ならびに当該治療剤、スキンケア製品および処置計画に対する評価にとって有用である。
【０００３】
〔発明の背景〕
皮膚疾患は、現代の世界における保健医療の主要な問題を代表している。皮膚がんと診断される新患者が米国において年に百万人を超えており（米国国立がん研究所、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）、皮膚疾患の予測および診断は、皮膚疾患を管理する重要な側面である。現在の診断方法は、主に視覚的な観察および生検に依存している。しかし、視覚的な観察に依存する検出方法は、皮膚の状態または皮膚疾患の診断にとって必ずしも有効ではなく、臨床的な症状が現れるまで危険性または疾患を検出できない。さらに、侵襲的な方法、例えば生検は、試験される対象に外傷を与えるたけでなく、感染の可能性を増大させる。また、上記侵襲的な方法は、安全に実施されるために、医師によってなされなければならない。また、典型的に反応にとって一般に必要とされる細胞である、皮膚の表面における細胞を多く含む試料は、侵襲的な方法によって得られない。
【０００４】
したがって、皮膚の状態および皮膚疾患の診断および監視の非侵襲的な方法は、患者の管理、ならびに既存および新規の治療剤、スキンケア製品およびスキンケア手順の有効性の評価にとって重要なツールである。さらに、これらの方法は、対象の皮膚の状態の元になっている特定の遺伝的な変化、および対象が皮膚疾患にかかる遺伝的な素因に関する重要な情報を提供し得る。これらの遺伝的な変化の同定によって、見込みのある薬剤の標的および防止策が特定される。そして、特定の治療用薬剤、スキンケア製品、または計画に対してある人が実際に反応するか否かの決定において、これらの遺伝的な変化は重要であり得る。さらに、検出方法および診断方法は、このような治療法、製品および手段の安全性の評価に重要である。
【０００５】
紫外線照射（ＵＶＲ）による損傷
紫外線照射（ＵＶＲ）によって生じる皮膚の損傷には、未知の要因または十分に定量化できない要因がしばしば寄与する。既知の要因としては、種々のものが挙げられるが、とりわけ皮膚の色、ＵＶＲばくろの頻度および強度、メラニン生成、フェオメラニンに対するユーメラニンの割合、ならびに日焼け止めの使用などが挙げられる。行動性の要因は、ＵＶＲによる皮膚への損傷の重症度および度合いに大きな役割を果たしているが、当該要因が自己申告の正確さ、および患者の日光に関する生活習慣の誤認識にしばしば依存するので、当該要因は、臨床的に評価することが極めて困難である。また、日焼け止めを日常的に使用する多くの人は、十分な量を塗布するか、または推奨される使用間隔の間にふたたび塗布することを怠り、ＵＶＲへのばくろの増加を導き得る誤った認識をもたらして、日焼け止めを不適切に使用している。
【０００６】
とりわけこれらの要因は、予防手段および治療法の成果および適切さを厳密に監視するためのツールの利用を必要とする。当該予防手段および治療法は、早期の光老化から皮膚がんの危険性の増大までの種々の結果をともなう、ＵＶＲによる皮膚に対する損傷を予防するために助言されるものである。個体の皮膚の状態、ならびにその結果として生じる光老化および皮膚がんのリスクを十分に評価するための試みにおいて、保健医療の熟練者が、患者の危険因子を理解し、伝えるために可能な限りの見識を有していることは必須である。したがって、ＵＶＲによる損傷の影響、および個体の日光に関する特有の生活習慣に関連する危険因子の同定に対する個々の遺伝的な素因を評価する診断方法があることが望ましい。
【０００７】
そのような方法は、ＵＶＲによる損傷の指標であるミトコンドリアバイオマーカーの定量化、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）の遺伝子型同定のために個体の皮膚の上皮または真皮の層からＤＮＡ試料を回収して、メラニン形成の制御に関与するバリアントを特定することを含み得る。両方の試験を組み合わせて使用することによって、光老化またはがんに対する患者の遺伝的な素因、ならびに患者の、紫外線照射に対する継続的なばくろの結果の両方を考慮して、患者を監視し、患者に助言し、患者を処置する包括的なツールが、保健医療提供者に提供される。
【０００８】
ＵＶＲに関連したミトコンドリアにおける欠失
ヒトの皮膚組織は非常に複雑であり、多くの細胞種を含んでいる。したがって、ヒトの皮膚細胞のバイオマーカーの同定は、特に重要である。ヒトの皮膚おける、ＵＶＲへの蓄積するばくろに対する信頼性の高いマーカーを決定するために、発明者らは、ＵＶによって誘導されるＤＮＡ損傷のバイオマーカーとして、核内ＤＮＡではなく、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を利用する新規な着想を検討している（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４、Ｂｅｒｎｅｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７、Ｂｉｒｃｈ−Ｍａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、およびＢｉｒｃｈ−Ｍａｃｈｉｎ，  ２０００）。
【０００９】
ヒトの皮膚における蓄積的な日光に対するばくろに関するバイオマーカーとして、ｍｔＤＮＡ損傷を使用することは、比較的に新しい研究領域であり、これまでの研究では、日光から保護された皮膚と日光にさらされた皮膚とを識別するために、ｍｔＤＮＡ損傷を単純に比較している（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４、Ｂｅｒｎｅｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７、およびＢｉｒｃｈ−Ｍａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。この手法には限界がある。これは、非黒色腫皮膚がん（ＮＭＳＣ）が、日光に“ときおり”さらされる体の部位とは対照的に、屋外にいるときに“たいてい”日光にさらされる部位に、主に形成されるからである（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  ２００４）。
【００１０】
本願出願人の同時係属ＰＣＴ出願（国際公開第ＷＯ／０６／１１１０２９号、その内容のすべてが参照によって本明細書援用される）では、ヒトのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）における３８９５ｂｐの欠失が、ＵＶによって誘導されるＤＮＡ損傷のバイオマーカーとして同定された。この欠失は、５４７番目から４４４３番目までのヌクレオチドにまたがるマイナーａｒｃにおいて同定された。この欠失は、これまでカーンズ・セイヤー症候群および慢性進行性外眼筋麻痺と関連付けられてきた（Ｍｏｒａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。
【００１１】
国際公開第第ＷＯ／０６／１１１０２９号の実施例において、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失の発生頻度が、日光に“たいてい”さらされる体の部位と“ときおり”さらされる部位との間において大きく異なることについて証明されている。さらに、上記実施例において、ＵＶＡ＋ＵＶＢ光源から致死線量に満たない線量の繰返しの照射を用いて、インビトロにおける３８９５ｂｐの欠失を誘導することによって、３８９５ｂｐの欠失の原因と日光のＵＶＲ成分との間の関連性を実証した。
【００１２】
重要なことに、国際公開第０６／１１１０２９号において分析された皮膚試料は、日光による損傷および皮膚がんの危険性に対する個体の遺伝的な素因について評価されなかった。また、これらの試料は、当該分野に公知の痛みをともなう皮膚の回収方法によって得られた。
【００１３】
メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）の遺伝子型同定
メラノコルチン−１受容体遺伝子（ＭＣ１Ｒ）は、メラニン合成の要になる膜結合型受容体タンパク質をコードしている。ＭＣ１Ｒのコード領域は高い多形性を有し、色素沈着の表現型を有するバリアントとの関連、ならびに黒色腫および非黒色腫皮膚がんに対する危険性が報告されている（Ｒｅｅｓ，  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．  １３（３），  １３５〜１４０（６），  ２０００年６月、およびＫａｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．  １３，  ８０８〜８１９，  ２００４年５月）。黒色腫の発生率は、日光に感受性の高い白い肌の人において最も高い。このことは、メラニンの合成が増大することによってＵＶばくろに応答する能力が、黒色腫の予防における重要な要因であることを示唆している。同種の研究によって、白い肌の赤毛の人が、ＭＣ１Ｒの対立遺伝子の両方に機能的に重要な変化を有していることが示された。対立遺伝子であるＤ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｈ、およびＤ２９４Ｈは、赤毛および白い肌に対して高い浸透度を有している。また、浸透度のより低い２つの対立遺伝子（Ｖ６０Ｌ、Ｖ９２Ｍ）も、黒色腫の危険性についての一般的な要因である。
【００１４】
したがってＭＣ１Ｒは、日光に対する感受性の主要な決定因子および皮膚がんに対する遺伝的な危険因子である。より積極的な監視および処置手段を必要としている、非常に危険性の高い患者を特定するためのツールが、日光に対する感受性の増大、ＤＮＡ損傷を受けやすいこと、および皮膚がんのリスクの増大に関連する特定のバリアントが存在するか否かを同定するために、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）遺伝子のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列を評価することによって提供される。日光に対する感受性のみに関連する表現型の特性の評価では、この増大した危険性を説明できないであろう。
【００１５】
疾患（例えば皮膚がん）の診断または性質決定において使用する現状の皮膚試料回収方法としては、試験される個体に相当な不快を与え得る、浸襲性の方法または痛みをともなう方法が挙げられる。皮膚試料を回収する現状の方法の例としては、パンチ生検、テープリフト（ｔａｐｅｌｉｆｔ）、および外科的切除などが挙げられる。また、現状の皮膚回収方法によって生じる不快感に加えて、これらの方法は、安全に実施されるためには医師によって実施されなければならない。
【００１６】
このような侵襲的な手法には、他の欠点（感染の危険性、試料回収の不便さならびに回収された試料を紛失または誤認する可能性）がある。感染の危険性および不便さは、試料の回収が頻繁または定期的に必要な状況（例えば、ＵＶＲに対するばくろを監視する措置および長期治療の評価）において高まる。さらに、これらの侵襲的な試験方法に関する時間およびコストによって、個体の大きな集団に関して迅速に遺伝子型を同定し、ＤＮＡ損傷を評価することが困難になる。したがって、家庭、臨床、または美容の環境において容易く迅速に実施され得る、非侵襲的なまたは低侵襲的な皮膚回収の方法を提供することが望ましい。
【００１７】
この背景に関する情報は、出願人が本発明に関連する可能性があると考える情報を明らかにするという目的によって与えられている。上記情報のいずれもが、本発明に対する先行技術を構成していると自認することを必ずしも意図されるものではないし、そのように解釈されるべきでもない。
【００１８】
〔発明の概要〕
本発明の目的は、皮膚試料中のＭＣ１Ｒのバリアントおよびミトコンドリアマーカーをアッセイする方法を提供することである。本発明の一態様によれば、ＵＶＲによる損傷に対する対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定する診断の方法であって、
（ａ）対象から組織試料を回収する工程；
（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常に関して、第１の皮膚試料をアッセイする工程；
（ｃ）メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上に関して、第２の皮膚試料をアッセイする工程；および
（ｄ）皮膚試料におけるｍｔＤＮＡの異常およびＭＣ１Ｒのバリアントの検出に基づいて、ＵＶＲによる損傷に対する上記対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を判定する工程を包含している、方法が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、光老化、ＵＶＲによる損傷、または皮膚疾患を予測するための、本発明の方法の使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、光老化、ＵＶＲによる損傷または皮膚がんの予防または寛解のための予防処置または治療処置を決定するための、本発明の方法の、使用が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、光老化、ＵＶＲによる損傷、または皮膚疾患を監視する非侵襲的な方法であって、
（ａ）非侵襲的な皮膚試料の回収手法を用いて、対象から皮膚試料を回収する工程；
（ｂ）所定の期間にわたって一定の間隔をおいて、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常に関して上記皮膚試料をアッセイする工程；
（ｃ）上記所定の期間にわたって、同定されたｍｔＤＮＡの異常における任意の変化を決定する工程を包含している、方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、光老化、ＵＶＲによる損傷または皮膚疾患に関する予防または治療の処置に対する対象の反応を監視する方法であって、
（ａ）対象から第１の皮膚試料を回収する工程；
（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常に関して、第１の皮膚試料をアッセイする工程；
（ｃ）メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントの１つ以上に関して、第１の皮膚試料をアッセイする工程；
（ｄ）第１の皮膚試料におけるｍｔＤＮＡの異常およびＭＣ１Ｒのバリアントの検出に基づいて、ＵＶＲによる損傷に対する、上記対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定する工程；
（ｅ）光老化、ＵＶＲによる損傷または皮膚疾患に関する予防処置または治療処置を施す工程；
（ｆ）対象から第２の皮膚試料を回収する工程；
（ｇ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常に関して、上記第２の皮膚試料をアッセイする工程；
（ｈ）所定の期間にわたって一定の間隔をおいて、工程（ｆ）および（ｇ）を繰り返す工程；および
（ｉ）上記第１の皮膚試料と、ｍｔＤＮＡの異常における変化を検出するために一定の間隔をおいて取られた皮膚試料との間における、ｍｔＤＮＡの異常のレベルを比較して、上記処置の有効性を監視する工程；ならびに
（ｊ）必要に応じて、上記対象の遺伝的な素因、および検出されたｍｔＤＮＡ異常における変化に基づいて、上記処置を調節する工程を包含している、方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、光老化、ＵＶＲによる損傷、または皮膚疾患の処置に有効な治療剤または美容剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）対象から第１の皮膚試料を回収する工程；
（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常に関して、上記第１の皮膚試料をアッセイする工程；
（ｃ）上記治療剤または美容剤を用いて上記対象を処置する工程；
（ｄ）所定の期間の後に対象から第２の皮膚試料を回収する工程；
（ｅ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の異常に関して、上記第２の皮膚試料をアッセイする工程；ならびに
（ｆ）上記第１の皮膚試料と第２の皮膚試料との間の、対照に対するｍｔＤＮＡの異常のレベルを比較して、上記治療剤または美容剤の有効性を決定する工程を包含している、方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、対象の光損傷のレベルを決定する方法であって、
（ａ）対象から皮膚試料を回収する工程；
（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の欠失に関して、上記皮膚試料をアッセイする工程；
（ｃ）上記皮膚試料のｍｔＤＮＡの欠失のレベルを、年齢コホートにしたがって分類されるｍｔＤＮＡの欠失の集団に対して比較し、上記対象に光老化度を割り当てる工程；および
（ｄ）割り当てられた光老化度と対象の実年齢を比較することによって、上記対象の光損傷のレベルを決定する工程を包含している、方法が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、ＵＶＲによる損傷に対する、対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定するための診断用のキットであって、
（ａ）組織試料を回収するための器具；ならびに
（ｂ）ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定およびｍｔＤＮＡ異常の検出の実施に適したプライマー、プローブ、および試薬を備えている、キットが提供される。
【００２６】
〔図面の簡単な説明〕
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照してなされる以下の詳細な説明においてより明確になる。
【００２７】
図１は、本発明の方法を用いて鼻および踵から回収された皮膚試料における、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルに関連するリアルタイムＰＣＲのデータを示す。
【００２８】
図２は、本発明の方法を用いて体の様々な部位から回収された皮膚細胞における、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルに関連するリアルタイムＰＣＲのデータを示す。
【００２９】
図３は、本発明の方法を用いて体の様々な部位から回収された皮膚細胞における、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルに関連するリアルタイムＰＣＲのデータを示す。
【００３０】
図４は、種々の非侵襲的な皮膚の回収方法によって回収された試料に存在する増幅産物の存在を示すゲルである。
【００３１】
図５は、種々の非侵襲的な皮膚の回収方法によって回収された試料に存在する増幅産物の存在を示すゲルである。
【００３２】
図６〜図１１は、対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【００３３】
図１２は、対立遺伝子バリアントＲ１６０Ｈについて試験するアッセイの結果を与えるゲルを示す。
【００３４】
図１３は、年齢コホートに分類された集団の３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルを示すグラフを示する。
【００３５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、皮膚の状態および皮膚疾患を予測し、診断し、監視する方法を提供する。上記方法は、ミトコンドリアの変異およびメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）のバリアントを決定するアッセイと、非侵襲的な皮膚試料の回収手法を組み合わせることを包含している。この点において、上記方法は、疾患、加齢、および紫外線照射（ＵＶＲ）損傷と関連した遺伝的な素因および危険因子を評価する、包括的なツールを提供する。また、上記方法は、治療剤、スキンケア製品、および処置計画に対する患者の反応の評価も可能にする。
【００３６】
本明細書において使用される技術用語および学術用語のすべては、特に断りがないかぎり、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００３７】
本明細書において使用されるとき、用語“約”は、記載された数値におよそ＋／−１０％の変動を指す。特に言及があるか否かに関わらず、このような変動が、本明細書に与えられている所定の数値に常に含まれていることを理解すべきである。
【００３８】
本明細書において使用されるとき、“対立遺伝子”は、染色体上の特定の位置を占める、所定のＤＮＡ配列のいくつかの代替可能な形態のうちの一つを意味する。
【００３９】
本明細書において使用されるとき、“サイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）”（ＣＴ）は、シグナル（例えば蛍光シグナル）によって示されるような、核酸配列の対象の増幅がバックグラウンドを超えて上昇する点である。ＣＴは、調査されている配列の量と反比例の関係にある。
【００４０】
本明細書において使用されるとき、“診断の”または“診断”は、疾患の診断または管理におけるパラメータとして、一つの変異または複数の変異の組合せの存在または非存在を利用することを意味する。一つまたは複数の変異の検出は、疾患の診断における工程であり得る。
【００４１】
本明細書において使用されるとき、“欠失”は、ＤＮＡまたはｍｔＤＮＡのある領域を、近接する核酸配列から除去することを意味する。欠失は、１塩基から数千塩基またはそれ以上のサイズに及び得る。
【００４２】
本明細書において使用されるとき、“ミトコンドリアＤＮＡ”または“ｍｔＤＮＡ”は、ミトコンドリア内に存在するＤＮＡである。
【００４３】
本明細書において使用されるとき、“変異”は、野性型の配列からの核内ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡの任意の修飾または変化を包含している。当該修飾または変化としては、点変異、塩基転位、挿入、塩基転換、転座、欠失、反転、重複、組換え、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。配列の修飾または変化は、単一の塩基変更からＤＮＡ断片の全体の付加または除去までにわたる。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、用語“試料”は、対象の皮膚に由来する任意の調製物を指す。例えば、本明細書に記載の非侵襲的な方法を用いて得られた細胞の試料は、本発明の方法にとってのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはミトコンドリアＤＮＡの単離に使用され得る。本発明にとっての試料は、真皮または表皮から典型的に採取される。試料は、本明細書に記載の非侵襲的または低侵襲的な皮膚試料の回収方法を用いて表皮から好ましく採取される。
【００４５】
本明細書において使用されるとき、用語“皮膚”は、身体の外部の保護的な被膜を指す。当該被膜は、真皮および表皮からなり、汗腺および皮脂腺とともに毛包構造を含んでいると理解される。一実施形態において、皮膚は、哺乳類（好ましくはヒト）の皮膚である。
【００４６】
本明細書において使用されるとき、用語“皮膚の状態”は、日光に対するばくろ、日焼け用ベッド、またはＵＶＲに関連する疾患などに起因して蓄積されるＵＶＲによる損傷の量に関する皮膚の状態を指す。
【００４７】
本明細書において交換可能に使用されるような、用語“治療”および“処置”は、対象の状態を改善する意図のもとに実施される介入を指す。改善は主観的または客観的であり得、皮膚疾患、皮膚障害もしくは皮膚の状態の症状に関連する寛解、当該症状の予防、または当該症状の変化に関する。このように、治療および処置という用語は、最も広義の意味に使用され、疾患、障害または状態の種々の段階における予防（ｐｒｅｖｅｍｔｉｏｎ）（予防（ｐｒｏｈｙｌａｘｉｓ））、緩和、減退、および治癒を包含している。また、対象の状態の悪化を予防することが上記用語に包含される。したがって、治療／処置を必要とする対象としては、上記疾患、障害または状態にすでになっている対象のほかに、上記疾患、障害または状態になりやすいか、またはなる危険性がある対象、ならびに上記疾患、障害、または状態が予防されるべき対象が挙げられる。
【００４８】
（皮膚の状態を決定するアッセイ、および皮膚疾患に対する遺伝的な素因の評価）
本発明の方法は、個体の、皮膚疾患に対する遺伝的な素因、およびＵＶＲに対するばくろに関連した危険因子の同定に有効なアッセイと、非侵襲的な皮膚の回収方法を組み合わせることを包含している。上記アッセイは、単独に実施され得るか、または他のアッセイと組み合わせて実施され得る。複数のアッセイを組み合わせて使用することによって、遺伝的な危険因子および日光に関する生活習慣を同時に評価する独自の能力が提供されて、光老化、ＵＶＲによる損傷、または皮膚疾患になりやすいか、またはなっている患者を良好に監視し、患者に良好に助言し、患者を良好に処置する診断ツールを保健医療の専門家に提供する。
【００４９】
ミトコンドリアの変異を検出するアッセイ
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の動態は、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡにおける変異は、しばしば、かかっている疾患の初期の指標であり、発病に関連する危険因子の指標になるバイオマーカーとして機能し得る。また、核内ＤＮＡと比べてミトコンドリアＤＮＡの細胞当たりのコピー数が多いことから、ミトコンドリアＤＮＡは、極めて微量の核酸に頼るアッセイにとってより強力な標的である。したがって、本発明の方法は、ヒトのミトコンドリアのゲノムにおいて変異を検出するアッセイと、皮膚試料を回収する非侵襲的技術を組み合わせる。
【００５０】
本明細書に記載のように、皮膚試料においてミトコンドリアＤＮＡの異常のレベルを測定することによって、日光に対するばくろおよびＵＶＲによる損傷の蓄積関して患者の皮膚の状態が同定され得る。さらに、一定の間隔（例えば２週間または１ヶ月間）においてｍｔＤＮＡを測定することによって、ＵＶＲに起因する皮膚損傷の予防における処置の有効性を決定するために、処置の提案に対する比較のための、実時間の定量的な監視ツールが、保健医療専門家に提供される。
【００５１】
したがって、本発明は、ＵＶＲによる損傷の蓄積に関する患者の皮膚の状態を決定する方法を提供し、当該方法は、ミトコンドリアの異常を検出するアッセイと、非観血的皮膚回収法を組み合わせることを包含している。本発明の一実施形態によれば、ミトコンドリアの変異は、欠失、置換および挿入からなる群より選択される。本発明の別の一実施形態によれば、上記変異は、ｍｔＤＮＡの欠失である。本発明のさらに別の一実施形態によれば、上記変異は、国際公開第ＷＯ／０６／１１１０２９号に特定されている３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡの欠失である。本発明のさらに別の一実施形態によれば、上記変異は、配列番号１に記載の３８９５ｂｐの欠失である。本発明のさらにまた別の実施形態によれば、ｍｔＤＮＡの変異は、配列番号２に記載の配列に対応する。
【００５２】
非侵襲的に皮膚試料を回収し、ミトコンドリアの変異をアッセイする例示的な方法は、実施例の項に示されている。試料からのｍｔＤＮＡ抽出は、任意の適した公知の方法を用いて実施され得る。当該技術分野において公知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００７）に記載のように、、ｍｔＤＮＡ抽出は、ミトコンドリアのゲノムのすべてまたはある領域の増幅に先立って実施され、ミトコンドリアのゲノムの配列決定を含み得る。同様に、ｍｔＤＮＡにおける変異の存在を検出する方法は、当業者にとって公知の適切な技術から選択され得る。例えば、ｍｔＤＮＡの分析は、ｍｔＤＮＡの配列決定、ＰＣＲによるｍｔＤＮＡの増幅、（サザンブロット、ノザンブロット、ウエスタンブロット、またはサウス−ウェスタンブロットによる）ハイブリダイゼーション、変性ＨＰＬＣ、（マイクロアレイ、バイオチップ、または遺伝子チップに対する）ハイブリダイゼーション、分子マーカー分析、バイオセンサ、融解温度プロファイリング、または以上のものの任意の組合せを包含し得る。
【００５３】
ミトコンドリアＤＮＡの配列を決定するために、好適な任意の手法が使用され得る。ｍｔＤＮＡは、配列決定の前にＰＣＲによって増幅されることが好ましい。ＰＣＲの方法は、当業者にとって公知であり、Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，  １９８７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５５：  ３３５に記載のように実施され得る。ＰＣＲ産物は、直接的に配列決定され得るか、またはベクターにクローン化され、それから細菌宿主に入れられ得る。ＤＮＡ配列決定法の例は、Ｂｒｕｍｌｅｙ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｊｒ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｌ．Ｍ．，  １９９１、  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４１２１〜４１２６、およびＬｕｃｋｅｙ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１８：  １５４〜１７２に記載されている。ｍｔＤＮＡのＰＣＲおよび配列決定の組合せの使用について、Ｈｏｐｇｏｏｄ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｔＤＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８２〜９２、およびＴａｎａｋａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｔＤＮＡ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６４：  ４０７〜４２１に記載されている。
【００５４】
メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）の遺伝子型の同定
上記メラノコルチン１受容体は、メラニン形成における重要な制御点であり、皮膚における色素の蓄積量を決定する。皮膚の色素が、発がん性のＵＶＲに対する個体の自然保護の程度を決定することを考えれば、ＭＣ１Ｒの遺伝子型を同定することによって、ＵＶＲに対するばくろに起因するＤＮＡ損傷受けやすさが決定され得、皮膚がんに関する危険因子が評価され得る。したがって、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）遺伝子のＤＮＡまたはアミノ酸配列を評価して、特定のバリアントが、日光に対する感受性およびＵＶＲによる損傷の受けやすさの増大と関連するか否かを特定することによって、疾患にかかる危険性が非常に高い個体であり、より積極的な監視および処置の手法を必要とし得る個体を特定するための、有益なツールが提供される。
【００５５】
本発明の上記方法は、ＭＣ１Ｒの遺伝子型を同定するアッセイと、非侵襲的な皮膚の回収方法を組み合わせる。皮膚試料から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、１つ以上のＭＣ１Ｒのバリアントの対立遺伝子の同定に使用され得る。例えば、黒色腫になる高い危険性と関連するＤ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｈ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０ＬおよびＶ９２Ｍの７つの対立遺伝子のバリアントに関して、同時に試験され得る。代替的に、皮膚がんになる高い危険性と最も一般的に関連する５つの対立遺伝子のバリアント（つまり、Ｄ８４Ｅ、Ｒ１５１Ｃ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０ＬおよびＶ９２Ｍ）に関するＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定が実施され得る。上記ＭＣ１Ｒ遺伝子（バリアントが挙げられる）が、配列番号３に記載されている。さらに、上記ＭＣ１ＲのＲＮＡ配列が、配列番号４に記載されている。
【００５６】
したがって、本発明は、皮膚の損傷またはがんに対する個体の遺伝的な素因を決定する方法を提供し、当該方法は、皮膚試料内における１つ以上のＭＣ１Ｒのバリアントの存在を確認するアッセイと、非侵襲的な皮膚の回収手法を組み合わせることを包含している。本発明の一実施形態によれば、試験される上記ＭＣ１Ｒのバリアントは、対立遺伝子のバリアントＤ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｈ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０ＬおよびＶ９２Ｍからなる群より選択される。本発明の別の一実施形態によれば、試験される上記ＭＣ１Ｒのバリアントは、Ｄ８４Ｅ、Ｒ１５１Ｃ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０ＬおよびＶ９２Ｍからなる群より選択される。
【００５７】
非侵襲的に皮膚試料を回収し、ＭＣ１Ｒの遺伝子型を同定する例示的な方法は、実施例に示されている。当業者であれば、ＵＶＲに対するばくろの傾向の結果として個体の生涯を通して変化し得るｍｔＤＮＡ変異の検出とは異なり、ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定から得られる結果は個体の生涯を通して変化しないことを正しく理解するであろう。したがって、ＭＣ１Ｒは、所望の場合に、患者の生涯のうちに一度だけ試験され得る。
【００５８】
ＭＣ１Ｒ遺伝子の配列は遺伝性であり、生涯を通して変化しないので、遺伝子型を同定するアッセイ（例えばＭＣ１Ｒのバリアントを評価するために使用されるアッセイ）は、いずれの体組織が試料であるのかに関わらず、ある個体において同一の結果を生じる。当業者であれば、試料は、非侵襲的な回収方法によって皮膚から得られるが、任意の他の体組織から回収して、同じ遺伝子型を得られることを理解できるであろう。本発明の方法における使用に好適な組織の回収は、当該技術分野においてよく理解されており、当該組織としては、頬側組織、筋組織、神経組織といった非限定的な例が挙げられ得る。これは、組織特異的な体細胞変異であるミトコンドリアのアッセイには当てはまらない。したがって、本発明の一実施形態によれば、皮膚組織以外の組織試料を対象から回収することを包含している方法が提供される。本発明の別の一実施形態によれば、頬側の試料である組織を対象から回収することを包含している方法が提供される。
【００５９】
試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの抽出は、任意の適切な公知の方法を用いて実施され得る。特定の対立遺伝子の検出は、例えばＡＢＩのａ  ｑＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｓｓａｙ法（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ｄｉｒｅｃｔ／）などの、当該分野において認識されている手法を用いて行われ得る。同様に、特別なプライマーおよびプローブの調製方法が、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹを参照）。
【００６０】
代替的に、対立遺伝子バリアントの評価は、ＭＣ１Ｒ遺伝子のアミノ酸配列の評価に基づいて行われ得る。アミノ酸分析を実施する手法は、当該技術分野においてよく理解されており、当該手法としては、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。
【００６１】
皮膚タイプおよび皮膚がんリスクの判定
本発明の方法は、対立遺伝子のバリアントの存在について個体を評価するために使用され得るだけでなく、個体のフィッツパトリックの光反応性の分類（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｐｈｏｔｏｔｙｐｅ）が近い皮膚の分類を決定するために使用され得る。この点において、ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定の結果によって、がんについての関連する危険性によって特徴付けられる特定の皮膚の分類に、さらに分けることが可能になる。
【００６２】
これらの皮膚の分類は、以下のように規定される。
皮膚の分類１は、個体が、皮膚がんの危険性と関連が最も高い４つの対立遺伝子のバリアントのうちの２つ以上を有していることを特徴とする。
皮膚の分類２は、個体が、皮膚がんの危険性と関連が最も高い４つの対立遺伝子のバリアントのうちの１つを有していることを特徴とする。
皮膚の分類３または４以上は、個体が、皮膚がんの危険性と関連が最も高い４つの対立遺伝子のバリアントを１つも有していないことを特徴とする。
【００６３】
したがって、一実施形態によれば、個体の皮膚の分類および皮膚がんの危険因子を、ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定に基づいて特定する方法が提供される。
【００６４】
本発明は、遺伝子型の同定または診断上の試験のために皮膚試料を回収する、非侵襲的または低侵襲的な手法を提供する。本発明の内容に即して、“低侵襲的な”は、皮膚の１つ以上の層を貫通するが、ほとんどまたはまったく出血が生じない手法を指す。皮膚試料の回収に使用される非侵襲的または低侵襲的な手法の非限定的な例としては、これらに限定されないが、外科用テープを使ったテープリフト、８％マンデル酸を含ませた消毒綿（ｓｗａｂ）、蒸留水を含ませた消毒綿、ワックス条片（ｗａｘ  ｓｔｒｉｐ）、コットンチップスワップ（ｃｏｔｔｏｎ  ｔｉｐ  ｓｗａｐ）、滅菌したメスを用いた皮膚の掻き取り、木製のスクレーパをを用いた皮膚の掻き取り、粘着パッド（ＣａｐＳｕｒｅ（登録商標）Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）の粘着面、ＬＣＭ  ＭａｃｒｏＣａｐ（登録商標）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ社）のフィルム、ＬＣＭ  ＭａｃｒｏＣａｐ（登録商標）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ社）の加熱フィルム、および小さな内径の針（例えば、２８ゲージ（ｇａｕｇｅ））を用いた皮膚組織の微小核（ｍｉｃｒｏ  ｃｏｒｅ）の回収が挙げられる。
【００６５】
上記試料は、皮膚の真皮または上皮の層から回収され得、例えば、踵、鼻、腕の内側、耳、口、頭皮、胸部、肩部、殿部、背中、顔面、うなじ、手、および／または頭などの身体の部位から回収され得る。上記試料は、回収元から得られたままの状態において直接に使用され得るか、または試料の特性を調節するための前処置の後に使用され得る。したがって、皮膚試料は、例えば防腐剤または試薬などを用いて、使用前に処理され得る。
【００６６】
当業者であれば、２つ以上の回収手法が一度に使用され得ることを理解するであろう。さらに、複数回の回収の過程が必要な場合（例えば、皮膚の状態を経時的に監視するために）、同じかまたは異なる手法が、試験期間を通して単独または一緒に使用され得る。この点において、皮膚回収は、１回のみか、または一定の間隔（例えば、２週間または１ヶ月間）をおいて実施され得る。
【００６７】
また、当業者であれば、特定の回収方法によって、核内ＤＮＡを標的とするアッセイにとって有効ではない、極めて微量（およそ０．１ｎｇ）の核酸がもたらされるが、はるかに多量に存在する（およそ１０００倍以上）ミトコンドリアのＤＮＡの標的は、極めて収量の低いこのような回収手法に極めて適していることを理解するであろう。以下の例によっては、本発明の非侵襲的な方法によって回収された皮膚細胞が、これまでに使用されている皮膚の回収方法を介して得られるｍｔＤＮＡに匹敵する結果を得るために充分なｍｔＤＮＡを提供することが示される。
【００６８】
本発明の特定の方法に関する一実施形態において、消毒綿（例えば、頬側細胞の回収に使用される消毒綿またはコットンチップスワップ）の使用に関する、非侵襲的な回収手法が提供される。消毒綿が包装から取り出され、所望の皮膚の部位に擦りつけられる。好ましくは、遺伝子型の同定または診断のために充分な数の皮膚細胞を確保するために、上記部位がおよそ１５回にわたって拭き取られる。本発明は、特定の例について以下に説明されるが、上記方法はまた、疾患、老化、または紫外線照射へのばくろの診断または性質決定、ならびにこれらと関連する変異の同定用の皮膚試料を回収するために使用さ得る。
【００６９】
皮膚の拭き取りの後、無菌の消毒面は滅菌チューブに挿入される。チューブに入っている遺伝子材料（つまりＤＮＡ）の完全な状態を維持するために、必要に応じて、緩衝液がをチューブに加えられ得る。それから当該ＤＮＡは、当該技術分野において周知の方法を用いて抽出される。
【００７０】
本発明の別の一実施形態において、非常に小さな内径の針（２８ゲージまたは２９ゲージ）を用いた低侵襲的な手法が、遺伝子研究用の皮膚細胞を回収するために使用される。本実施形態において、皮膚細胞は、ほとんどまたはまったく出血がないように、テントのように摘み上げられた（ｔｅｎｔｅｄ）皮膚の層を貫通させることによって、対象の真皮および表皮から回収されるが、非常に微量な真皮組織および上皮組織は、針の内部の中空に付着する。皮膚は、例えば指、ピンセット、またはクランプの他の形態を用いて皮膚を引き上げることによって、テントのように摘み上げられ得る。皮膚の材料は、さらなる処理のために抽出（すなわちＤＮＡ抽出）されるまで、針に納めれている。皮膚試料を針から送り出すために、リン酸緩衝生理食塩水が、針のカラムに入れられ、それからプランジャーを用いて滅菌チューブに押し出される。ＤＮＡは、当該技術分野において周知の方法を用いて抽出される。以下の例によって示されるように、皮膚試料を回収するためのこの低侵襲的な方法は、例えばＵＶの照射に起因するＤＮＡまたはｍｔＤＮＡの損傷を評価するために充分なＤＮＡまたはｍｔＤＮＡをもたらす。上述の実施形態と同様に、皮膚試料を得るこの方法は、安全かつ無痛である。さらに、以下に示されるように、正確なアッセイを実施するために充分なＤＮＡまたはｍｔＤＮＡを回収できる。
【００７１】
（皮膚の状態の診断および監視、ならびに疾患を関連する遺伝的な危険因子の検出）
本明細書に記載のように、本発明のアッセイは、例えば、皮膚の状態もしくは遺伝的な危険性を評価するために単独にか、または皮膚疾患に対する遺伝的な素因および個体の特定の生活様式と関連する因子の同定の両方を評価するために、組み合わせて使用され得る。以下に説明するように、これらの要因の同定および監視は、ＵＶＲによる損傷、光老化、および皮膚疾患に対する有効な予防手段および処置手段の決定に重要である。
【００７２】
皮膚の状態の診断および監視
スキンケア製品（例えば日焼け止めおよび日焼け止めクリーム（ｓｕｎｂｌｏｃｋ））を日常的に使用する多くの個体は、製品を不適切に使用している。すなわち、多くの個体は、十分な量の製品を塗布すること、または推奨される使用間隔の間にふたたび塗布することを怠り、ＵＶＲへのばくろの増加を導き得る誤った認識をもたらしている。さらに、最近まで、日光にさらされるときに個体によって日常的に塗布される日焼け止めおよび日焼け止めクリームには、ＵＶＢの変異生成作用を一般に保護するが、ＵＶＡ照射の有害作用に関する薬剤が含まれていなかった。
【００７３】
とりわけこれらの要因は、ＵＶＲによる損傷に関する初期の皮膚の状態および研究の過程を経た皮膚の状態の両方を決定するためのツールを利用可能なことが必要とされる。当該ツールによって、皮膚に対するＵＶＲによるさらなる損傷を予防するために助言しられる予防手段および治療法の成果および適切さが監視される。一定の間隔（例えば２週間または１ヶ月間（または他の任意の適切な間隔））をおいて、非侵襲的に皮膚試料を回収して患者の皮膚におけるミトコンドリアＤＮＡの欠失のレベルを測定することによって、ＵＶＲに起因する皮膚損傷の予防における処置の有効性を決定するために、処置の提案に対する比較に関する実時間の定量的な監視ツールが、保健医療専門家に提供される。この回収方法は、なんら副作用または不快感をともなわずに、定期的な試料採取を可能にし、必要に応じて家庭において実施され得る。驚くべきことに、皮膚試料を回収するための手法（例えば拭き取り）がｍｔＤＮＡの変異の検出に極めて適している。これは、このような分析の実施には、拭き取りによって得られるＤＮＡであればごく微量しか必要ではないからである。
【００７４】
つぎに、実施例を参照すると、本発明の一実施形態において、上記方法が使用されて、ＵＶ照射に起因する損傷に関するバイオマーカーを定量化するために、皮膚の細胞を回収する（実施例１を参照）。より詳細には、本発明の方法が使用されて、ヒトミトコンドリアのゲノムにおける欠失（すなわち、上述の３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡの欠失）について試験するための皮膚試料を回収する。実施例は、本発明の非侵襲的な方法を介して回収された皮膚細胞が、従来の皮膚の回収方法を介して得られるｍｔＤＮＡに匹敵する結果を得るために充分なｍｔＤＮＡを提供することを示している。
【００７５】
当業者であれぱ、光老化および皮膚がんといった結果を生じないように、ＵＶＲを関連する皮膚損傷およびＤＮＡ損傷の予防のための処置計画および推奨される生活習慣の有効性を監視する方法が、ミトコンドリアＤＮＡの標的を定量化するためにヒトの皮膚の上皮または真皮の層からＤＮＡ試料を上記のように非侵襲的に回収することによって、保健医療従事者に提供されることを理解するであろう。
【００７６】
また、当業者であれば、日光に関する悪い習慣、または効果的ではない保護方法を特定する際に、保健医療提供者によって用いられるｍｔＤＮＡ分析の有用性を理解できるであろう。このような有用性は、実施例６において証明されている。本発明の一実施形態にしたがって、実施例６において、日焼け止めの使用の結果が、年齢および肌の色の近い２人の個体について分析されて、日光からの保護計画の有効性を評価した。
【００７７】
光老化の判定
ミトコンドリアマーカーの同定と組み合わせられた低侵襲的な試料の回収手順を利用する、本発明の付加的な診断方法は、光老化の決定である。実施例の項に記載のように、この方法の目的は、個体の顔もしくは頭部の皮膚組織を低侵襲的な皮膚の回収手法を用いて試料を回収すること、およびＵＶＲによる損傷（例えばｍｔＤＮＡの欠失）と関連するミトコンドリアの標的の量を測定することによって、当該個体のＵＶＲに対するばくろを評価することである。それから、この結果は、同じ方法によって得られた結果のデータベースに照して比較され、上記個体は検出されたｍｔＤＮＡの欠失のレベルに基づいて年齢コホートに分類される。光老化度を割り当てるために、個体のｍｔＤＮＡの分析結果がその個体の実年齢と比較されて、当該個体が、同年齢のグループの他の個体より、高い光損傷または低い光損傷を有するか否かを決定する。
【００７８】
このように、ミトコンドリアＤＮＡマーカーの分析用の皮膚組織の微小核を回収するために、低侵襲的な手法を利用することによって、保健医療提供者は、個体の光老化を同定し得、該個体の光老化が実年齢と一致するのか、または一致しないのかを決定し得る。したがって、光老化の決定によって、光老化、ＵＶＲによる損傷または皮膚疾患に有効である予防法および処置法をより適切に指示するための手段が、保健医療の専門家に提供される。
【００７９】
疾患に対する遺伝的な素因の判定
光老化および皮膚がんの、個体の危険性を十分に評価するためには、患者の危険因子を理解し、伝えるために、できるだけ多くの情報を保健医療提供者に提供するが必須である。ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定を利用することによって、ＵＶＲに対するばくろに起因する個体のＤＮＡ損傷の受けやすさ、および皮膚がんになる危険性の高まりやすさに寄与するだけではなく、より積極的な監視および処置手段を潜在的に必要とする、非常に高い危険性を有する患者を特定するための有用なツールが提供される。
【００８０】
したがって、本発明は、ＭＣ１Ｒの遺伝子型を同定するためのＤＮＡ試料を回収する非侵襲的な方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、本発明の方法によって回収された細胞から抽出されたＤＮＡが、増大した黒色腫の危険性と関連する１つ以上の対立遺伝子のバリアントを同定するために使用され得る。該方法が使用されて、これらのバリアントついて個体を評価し得、個体の皮膚の分類を付加的に決定し得る。したがって、ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定の結果によって、がんについての関連する危険性によって特徴付けられる特定の皮膚の分類に、個体を分けることが可能になる。
【００８１】
組合せ分析
ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定およびｍｔＤＮＡ分析を組み合わせた使用は、遺伝的な素因および日光に関する生活習慣の最終的な結果の両方を考慮して、患者を監視し、患者に助言し、よりよく患者を処置するためのツールを、保健医療の専門家に提供する。複数のアッセイの組合せのこの使用によって、危険因子および結果を同時に評価する特有の能力を提供する。重要なことに、ＭＣ１Ｒの試験は、ｍｔＤＮＡ試験のための非侵襲的な回収を用いた繰返し試験から一時的に除外され得、タンデムに（ｉｎ  ｔａｍｄｅｍ）使用され得る。上述のように、これが可能であるのは、ＭＣ１Ｒ試験から得られる情報が個体の生涯を通して変化しないが、ミトコンドリアＤＮＡの欠失の測定によって解明されるＤＮＡの損傷のレベルは、ＵＶＲに対するばくろ傾向の結果として変化するためである。
【００８２】
注目すべきことは、ＵＶＲに起因する皮膚の損傷が多因子性の過程であることである。したがって、ＭＣ１Ｒのバリアントを有している個体が、ＭＣ１Ｒのバリアントを有していない個体より多くの損傷をつねに被るとは仮定され得ないし、日常的な日焼け止めの使用を申告する個体が、日焼け止めの不使用を申告する個体に比べて、少ない損傷を必ずしも有していない場合がある。このように、ＭＣ１Ｒ遺伝子型同定をｍｔＤＮＡ分析に組み合わせることによって、保護においてより詳しい情報に基づいて、個体に推奨するために必要な特異な見識が、保健医療従事者に提供される。
【００８３】
治療用薬剤およびスキンケア用品の評価
本発明の方法は、さらに医薬および美容薬の両方の目的について広範な皮膚のスクリーニングに使用され得る。本発明の方法は、遺伝子型の同定、および／または皮膚がん（非黒色腫皮膚がんおよび黒色腫の両方）と関連する種々のバイオマーカーの測定のために使用され得る。任意の時点において、任意の解剖学的な外部の部位に由来する、個体の皮膚におけるＵＶ照射に起因するのＤＮＡ損傷のレベルを評価する能力は、皮膚の健康に関する特有の有益なスクリーニング試験のための基礎であって、既存および新規の治療剤、スキンケア製品およびスキンケア手順の安全性および有効性を評価するための基礎を提供する。さらに、対象の皮膚疾患または皮膚の状態の背景にある、特定の遺伝的な変化を同定することによって、特定の治療剤、スキンケア製品、または手順に患者が反応するか否か、または反応する程度を容易に決定し得る。
【００８４】
キット
本発明の方法に使用される回収器具は、消費者用または医療用のキットの中に、所望の用途に応じて梱包されて、臨床的環境において使用され得る。該キットは、１つ以上の試料回収手段（例えば、滅菌の消毒綿、コットンチップスワップまたは針）だけでなく、遺伝子型の同定および／またはｍｔＤＮＡの変異の同定に必要な他の材料を備え得る。
【００８５】
上記キットは、診断用のアッセイの実施必要な試薬（例えば、緩衝液、塩および検出試薬など）を、必要に応じて備え得る。また、他の構成要素（例えば試験試料の単離および／または処理のための緩衝液および溶液）が、キットに備えられ得る。キットの構成要素の１つ以上が凍結乾燥され得、キットがさらに、凍結乾燥された構成要素の再構成に適した試薬をさらに備え得る。
【００８６】
また、上記キットは、反応容器、混合容器および試験試料の調製を容易にする他の構成要素を必要に応じて含み得る。また、上記キットは、紙の形態またはコンピュータ−読み取り可能な形態（例えば、ディスク、ＣＤまたはＤＶＤなど）において提供され得る取扱説明書を、必要に応じて備え得る。
【００８７】
本明細書に記載の本発明がさらに理解されるように、以下に実施例を説明する。これらの実施例が、本発明の例証となる実施形態について説明することを意図しており、本発明の範囲の限定をなんら意図してないことが理解されるであろう。
【００８８】
〔実施例〕
（実施例１：３８９５ｂｐのヒトｍｔＤＮＡの欠失の分析）
本発明の方法を用いて、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ／０６／１１１０２９号に示されている３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡの欠失を分析した。ｍｔＤＮＡの回収および抽出は、以下のように実施した。
１．皮膚試料は、滅菌の消毒綿を用いて皮膚の部位をおよそ１５回にわたって拭き取ることによって回収された。皮膚試料は、踵（ｎ＝４１）、鼻（ｎ＝４３）、腕の内側（ｎ＝２０）、耳（ｎ＝５）、肩部（ｎ＝５）、殿部（ｎ＝５）および背中（ｎ＝５）から回収された。
２．ｍｔＤＮＡは、市販のキット（ＱｉａＡＭＰ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ、製品番号５６３０４、Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡ）を用いて、製造業者のプロトコルにしたがって抽出された。
３．二本鎖ＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）蛍光光度計（製品番号Ｑ３２８５７）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）に対して、ＨＳ−ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔ−ｉｔ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （製品番号Ｑ３２８５１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を用いて定量化された。
４．それから、３８９５ｂｐの欠失レベルは、ｉＱ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）（製品番号１７０−８８８２、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）、および以下のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）によって定量化した。
フォワード  ５’−ＣＴＧＣＴＡＡＣＣＣＣＡＴＡＣＣＣＣＧＡＡＡＡＴＧＴＴＧ−３’（配列番号５）；
リバース  ５’−ＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴＴＧＣＧＴＧＡＧ  −３’（配列番号６）。
【００８９】
本実施例において、増幅プライマー対は、３８９５ｂｐの欠失の存在を示す標的の領域を増幅するために使用された。フォワードプライマーは、３８９５ｂｐ配列の欠失が生じた後のｍｔＤＮＡのスプライシング領域（つまり、ｍｔＤＮＡゲノムの５４７と４４４３との間の位置におけるスプライシング）と重複する。したがって、正しいサイズの増幅産物を生じる重複するプライマーの伸長は、３８９５ｂｐの部分が欠失している場合にのみ生じ得る。
【００９０】
３８９５ｂｐの欠失を定量化する工程において、ＲＴ−ＰＣＲ反応は以下のよう調整された。
１２．５ｕｌのｉＱ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）；
３５０ｎｍｏｌのフォワードプライマー（配列番号５）；
３５０ｎｍｏｌのリバースプライマー（配列番号６）；
５ｕｌの鋳型（およそ０．５ｎｇのｄｓＤＮＡ）；
水（２５ｕｌになるまで）；
サイクルに関するパラメータ：
ステップ１．９５℃において３分間
ステップ２．９５℃において３０秒間
ステップ３．６７．５℃において３０秒間
ステップ４．７２℃において３０秒間
ステップ５．プレートの読み取り
ステップ２〜ステップ５を４５サイクル
５５〜１１０℃の融解曲線において３秒ごとに１℃単位の読み取り
１０℃において１０分間にわたって維持する。
【００９１】
これらのアッセイの結果は、図１〜図３に示されており、日光／ＵＶ照射にまれにさらされる領域（つまり、踵および殿部）から取られた皮膚のスワブ（ｓｗａｂ）と、たいていさらされている領域（つまり、鼻および耳）の皮膚のスワブの間にある明らかな差異を証明している。３８９５ｂｐの欠失レベルは、ＵＶ照射から通常は保護されている領域（例えば、踵および殿部）と比較すると、より高いレベルのＵＶ照射を受ける領域（例えば、鼻および肩部）において、大幅に上昇した。
【００９２】
図１および図２に示されるように、３８９５ｂｐの欠失のリアルタイムＰＣＲのサイクル閾値（ＣＴ）は、ＵＶ照射にまれにさらされる皮膚の部位（踵または殿部）と比べて、ＵＶ照射にたいていさらされている皮膚の部位（鼻または耳）、またはＵＶ照射にときおりさらされる皮膚の部位（肩部または背中）において、欠失の発生頻度が高いことを示している。
【００９３】
図３は、ＵＶ照射にたいていさらされている部位（例えば鼻または耳）から得られた皮膚細胞から回収されたｍｔＤＮＡが、ＵＶ照射にまれにさらされる部位（例えば踵または腕の内側）から得られた皮膚細胞から回収されたｍｔＤＮＡと比べると、３８９５ｂｐの欠失マーカーの増大したレベルによって特徴付けられることを示している。
【００９４】
また、これらの結果は、アッセイの実施にとって充分なｍｔＤＮＡを得るために、本発明にしたがった皮膚試料の回収の有効性を示している。したがって、本発明の非侵襲的な皮膚の回収技術は、分析用のｍｔＤＮＡを得ることに関して、侵襲的な方法（例えば、本発明と同一出願人の国際公開第ＷＯ／０６／１１１０２９において使用される方法）と同様に有効である。
【００９５】
（実施例２：皮膚の回収方法の比較）
５つの異なる非侵襲的皮膚の回収方法が、定量的リアルタイムＰＣＲといった分子分析の実施に充分な量および質の核酸をもたらすことを（もしそうであれば）確認するために、試験された。試験された５つの方法は、：
・外科用テープを使ったテープリフト；
・ビオレ（登録商標）粘着性のストリップ；
・８％マンデル酸を含ませた滅菌の消毒綿；
・蒸留水を含ませた無菌スワブ；および
・ワックスストリップ
であった。
【００９６】
７０％のイソプロパノールを塗布して皮膚の表面を消毒した後に、テープリフト、ビオレストリップ、およびワックスストリップを、当該表面に使用した。しっかりと圧力を加え、それからテープまたはストリップを素早く外した。７０％のイソプロパノールを用いて消毒した後に、スワブは、まず、８％のマンデル酸または蒸留水の滅菌溶液に浸され、それから所望の皮膚の部位をしっかりと擦りつけられた。
【００９７】
３人の個体から皮膚細胞を回収した後に、回収媒体のを２００ｕｌのリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）に浸し、５６℃において一晩にわたってインキュベートした。
【００９８】
つぎに、ＱｉａｇｅｎのＱｉａＡＭＰ（商標）  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（製品番号５１３０４）を頬側のスワブのプロトコルにしたがって用いて、試料のすべてが核酸抽出に供された。精製した試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）  ＮＤ−１０００  分光光度計を用いて定量化して、抽出手順が成功であったか否かを確認した。
【００９９】
【表１】
0005646998.tif 000002
【０１００】
核酸の濃度および試料の純度の両方を考慮すると、水もしくはマンデル酸のいずれかを湿潤薬剤として使用したスワブの試料、またはワックス試料について、最も一貫性を有する結果が得られた。
【０１０１】
つぎに、すべての試料がＰＣＲにかけられて、増幅の阻害物質の有無、または処理中に試料の顕著な分解が生じたか否かを確認した。試料は、以下の条件にしたがって増幅された。
【０１０２】
【表２】
0005646998.tif 000003
【０１０３】
使用されたプライマーは、以下に示される配列：
１２ｓプライマー配列、フォワード  ５’−ＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号７）
１２ｓプライマー配列、リバース  Ｒ５’−ＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＴ−３’（配列番号８）
を有するミトコンドリアＤＮＡプライマーであった。
【０１０４】
増幅反応は、以下のプロトコル：反復した。
１．２分間にわたって９４℃
２．３０秒間にわたって９４℃
３．３０秒間にわたって６４℃
４．３０秒間にわたって７２℃
５．ステップ２〜４を３９回にわたって繰り返す
６．４℃に維持
にしたがって、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において繰り返された。
【０１０５】
それから、増幅産物は、２％のアガロースゲルにおいて電気泳動にかけられ、臭化エチジウムを用いて染色された。増幅の結果は図４に示されている。ここで、ゲルの上半分には以下のもの：
レーン１  ５００ｎｇの、１００ｂｐのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  ＳＭ０３２３（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
レーン２  個体１由来のビオレ
レーン３  個体１由来の、水を用いたスワブ
レーン４  個体１由来の、マンデル酸を用いたスワブ
レーン５  個体１由来の外科用テープ
レーン６  個体１由来のワックス
レーン７  個体２由来のビオレ
レーン８  個体２由来の、水を用いたスワブ
レーン９  個体２由来の、マンデル酸を用いたスワブ
レーン１０  個体２由来の外科用テープ
レーン１１  個体２由来のワックス
レーン１２  空
レーン１３  増幅の陰性対照
レーン１４  増幅の陽性対照
レーン１５〜１８  空
を含んでいる。
そして、ゲルの下半分は以下のもの：
レーン１  個体３由来のビオレ
レーン２  個体３由来の水を用いたスワブ
レーン３  個体３由来のマンデル酸を用いたスワブ
レーン４  個体３由来の外科用テープ
レーン５  個体３由来のワックス
レーン６  ５００ｎｇの、１００ｂｐのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  ＳＭ０３２３（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
レーン７  ビオレの抽出物の陰性対照
レーン８  水を用いたスワブの抽出物の陰性対照
レーン９  マンデル酸を用いたスワブの抽出物の陰性対照
レーン１０  外科用テープの抽出物の陰性対照
レーン１１  ワックスの抽出物の陰性対照
レーン１２  空
レーン１３  増幅の陰性対照
レーン１４  増幅の陽性対照
レーン１５〜１８  空
を含んでいる。
【０１０６】
（結果）
上記ビオレストリップを用いて回収された皮膚細胞から回収されたｍｔＤＮＡからは、ｍｔＤＮＡが増幅されなかった。水およびマンデル酸の両方に関するスワブは、増幅したが、水のスワブはより明らかに増幅した。外科用テープは散発的に増幅した。ワックスは明らかに増幅したが、ゲルの下半分のレーン１１の抽出物の陰性対照には狭雑物が混入しており、これはワックスに関連する非滅菌性または取り扱い困難さから生じたと思われる。
【０１０７】
すべての要因を考慮すると、本実施例は、滅菌のスワブの使用が、好ましい非侵襲的な皮膚試料の好ましい回収方法であることを示している。スワブは、乾燥状態であり得るか、または試料の回収もしくは緩衝化を容易にするための種々の液体を含ませられ得る。
【０１０８】
（実施例３：付加的な皮膚の回収方法の比較）
本実施例では、皮膚試料を非侵襲的に回収する付加的な５つの方法が、定量的リアルタイムＰＣＲといった分子分析を実施に充分な量および質の核酸をもたらすことを（もしそうであれば）確認するために、試験された。
【０１０９】
以下の方法：
滅菌したメスを用いた皮膚を掻き取り
木製のスクレーパを用いた皮膚の掻き取り
粘着パッドの粘着面（ＣａｐＳｕｒｅ（商標）  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）
ＬＣＭ  ＭａｃｒｏＣａｐ（商標）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）のフィルム・ＬＣＭ  ＭａｃｒｏＣａｐ（商標）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）の加熱フィルム
を用いて、皮膚の試料は、単一の個体から２回にわたって回収された。
【０１１０】
皮膚は、最初に７０％のイソプロパノールを含む拭き取り繊維を用いて清潔にすることによって準備された。木製のスクレーパおよびメスを、皮膚の表面上をしっかりと移動させて、皮膚細胞をはがし、それから遠心分離チューブに入れられた。粘着パッドおよびフィルムは、皮膚を擦らずに皮膚にしっかりと押しつけられて、皮膚細胞を回収した。
【０１１１】
複数の回収物を、２つの異なる核酸抽出法を用いて処理した。第１のセットは、当該分野において周知であるプロテイナーゼＫ消化を用いて抽出され、第２のセットは、ＱｉａＡＭＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、５１３０４）を用いて抽出された。
【０１１２】
Ｑｉａｇｅｎのキットを用いて処理された試料は、それからＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を用いて定量化された。ＰＫ消化のセット中の試料は、この種の定量化を容易にするために十分に不要なものが除去されなかったままではなかった。
【０１１３】
【表３】
0005646998.tif 000004
【０１１４】
試料は、実施例２に示したプロトコルにしたがって増幅された。
【０１１５】
それから、増幅産物は、２％のアガロースゲルにおいて電気泳動にかけれら、臭化エチジウムを用いて染色された。結果は図５に示されている。ここで、ゲルは以下のもの：
レーン１  ５００ｎｇの、１００ｂｐのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（ＳＭ０３２３）
レーン２  増幅の陰性対照
レーン３  正の増幅制御増幅の陽性対照
レーン４  ＰＫバッファ、木を用いた掻き取り
レーン５  ＰＫバッファ、メスを用いた掻き取り
レーン６  ＰＫバッファ、ＣａｐＳｕｒｅパッド
レーン７  ＰＫバッファ、ＭａｃｒｏＣａｐ
レーン８  ＰＫバッファ、加熱したＭａｃｒｏＣａｐ
レーン９  ＰＫバッファ、木を用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン１０  ＰＫバッファ、メスを用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン１１  ＰＫバッファ、ＣａｐＳｕｒｅ、抽出の陰性対照
レーン１２  ＰＫバッファ、ＭａｃｒｏＣａｐ、抽出の陰性対照
レーン１３  ＰＫバッファ、加熱したＭａｃｒｏＣａｐ、抽出の陰性対照
レーン１４  ＱｉａＡＭＰ、メスを用いて掻き取り
レーン１５  ＱｉａＡＭＰ、ＣａｐＳｕｒｅパッド
レーン１６  ＱｉａＡＭＰ、木を用いて掻き取り
レーン１７  ＱｉａＡＭＰ、メスを用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン１８  ＱｉａＡＭＰ、ＣａｐＳｕｒｅパッド、抽出の陰性対照
レーン１９  ＱｉａＡＭＰ、木を用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン２０  ＱｉａＡＭＰ、試薬の陰性対照
を含んでいる。
【０１１６】
メスを用いた掻き取りおよびＭａｃｒｏＣａｐ（商標）は、ＰＫバッファを用いて増幅された。一方、ＣａｐＳｕｒｅ（商標）パッドは、ＱｉａＡＭＰ（商標）キットを用いて良好に増幅された。皮膚の拭き取りと比較すると、本実施例において試験された方法を用いて、回収されたｍｔＤＮＡの量、および得られた増幅産物の量は、有効であるとは認められなかった。
【０１１７】
（実施例４：針を使った皮膚試料回収）
針を用いて、９人の個体の５箇所の異なる部位から皮膚試料を回収した。当該部位は、眉、耳朶、うなじ、手、および踵を含む。
【０１１８】
上述のように針を用いるとき、試料回収者の手の親指と人差し指との間に皮膚を挟むか、またはテントのように摘み上げた。針を皮膚に通したが、ほとんどまたはまったく出血しなかった。皮膚試料は、リン酸緩衝生理食塩水を針のカラムに入れ、それからプランジャー針から滅菌チューブに押し出すことによって、針から抽出された。それから、ＱｉａＡＭＰ（商標）  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、製品番号５１３０４）を用いて、皮膚組織を含有しているこの容量から、ＤＮＡを抽出した。
【０１１９】
それから、上記試料を、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失を同定するために増幅した。本実施例の反応条件およびサイクルパラメータは、上述の実施例１の反応条件およびサイクルパラメータと同じであった。結果を表３に示されている。
【０１２０】
【表４】
0005646998.tif 000005
【０１２１】
この回収方法を介して得られた物質が、リアルタイムＰＣＲといった分子分析にとって充分であることは明らかである。具体的には、表３に示されているように、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失を示す増幅産物がが検出され、定量化されている。したがって、針を用いた皮膚試料の回収方法は、この種のアッセイにおける使用に充分なＤＮＡをもたらす。
【０１２２】
（実施例５：ＭＣ１Ｒのバリアント検出）
頬側の試料を、３人の対象から回収した。対象のそれぞれは、水道水または瓶詰めの水を用いて口を漱ぎ、水を吐き出した。消毒綿を保護包装から取り出して、その柄を掴んだ。消毒綿の柄を掴んだまま、綿製の先端を対象の口内に入れて、綿製の先端によって頬の内側を３０秒間にわたって擦った。消毒綿を滅菌チューブに入れて、さらに処理をするために密閉した。
【０１２３】
特定の対立遺伝子を、ＡＢＩのａ  ｑＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰ遺伝子型同定アッセイを用いて検出して確認した。対象のそれぞれは、７つの対立遺伝子バリアントＤ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｈ、Ｄ２９４Ｈ、Ｖ６０Ｌ、およびＶ９２Ｍについて試験された。
【０１２４】
Ｄ８４Ｅ、Ｒ１４２Ｈ、Ｒ１５１Ｃ、Ｖ６０Ｌ、およびＶ９２Ｍの遺伝子型を、ＡＢＩのアッセイ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ｄｉｒｅｃｔ／）を用いて、以下のように同定した：
Ｖ６０Ｌ−アッセイ法＃Ｃ７５１９０５４１０
Ｄ８４Ｅ−アッセイ法＃Ｃ７５１９０５５２０
Ｖ９２Ｍ−アッセイ法＃Ｃ２０３３４０５２０
Ｒ１４２Ｈ−アッセイ法＃Ｃ２７５４１６３４１０
Ｒ１５１Ｃ−アッセイ法＃Ｃ２０３３４０４２０。
【０１２５】
以下に記載の注文に応じて作製された以下のプライマーおよびプローブ：
フォワードプライマー  ＭＣ１Ｒ−２９４：ＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＴＧ  配列番号９；
リバースプライマー  ＭＣ１Ｒ−２９４：ＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＴＡＧＡＴ  配列番号１０；
プローブ１  ＭＣ１Ｒ−２９４Ｖ１  ＶＩＣ：ＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＣＴ  配列番号１１；
プローブ２  ＭＣ１Ｒ−２９４Ｍ１  ＦＡＭ：ＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＴ  配列番号１２
が、Ｄ２９４Ｈの対立遺伝子のバリアントの検出に使用された。
【０１２６】
すべてのアッセイにのために使用され反応条件は、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｔａｑｍａｎ（商標）  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに概要が記述されている通りであった。
【０１２７】
Ｒ１６０Ｈ対立遺伝子バリアントは、Ｓａｃ  ＩＩ消化を用いて試験された。プライマーは、ＭＣ１Ｒ遺伝子のＤＮＡの標的領域を増幅するために使用された。それから、増幅産物は、Ｓａｃ  ＩＩ消化された。ゲルのレーン１〜４（図１２を参照）は、３人の試験対象および対照試料の結果を示している。これらの４つの試料のすべては、ホモ接合体の野性型であった。この対立遺伝子の部位に対してホモ接合体の野性型を示す増幅産物のサイズは、４３６ｂｐである（Ｓａｃ  ＩＩ消化後には３２７ｂｐの産物を生じる）。ホモ接合体のバリアントにおいて、消化が起こらないので、ＰＣＲの増幅産物は４３６ｂｐのサイズを維持している。
【０１２８】
試験結果は、図６〜図１２に示す。各個体に対して２つの試験を実施し、対照試料も試験を２回実施した。対照試料の遺伝子型は、Ｖ６０Ｌについてヘテロ接合体であって、Ｖ９２Ｍについてホモ接合体バリアントであって、残りの対立遺伝子ついて野性型であった。試験された第１の個体は、タイプ３の皮膚を有すると判定された（ＭＣ１Ｒのバリアントが見つからなかった）。試験された第２の個体は、タイプ３の皮膚を有すると判定された（ＭＣ１Ｒのバリアントが見らからなかった）。試験された第３の個体は、タイプ２の皮膚を有すると判定された（バリアントＶ６０ＬおよびＲ１５１Ｃについてホモ接合体、Ｒ１４２Ｈについてヘテロ接合体）。
【０１２９】
この回収方法を介して得られる物質が、ＭＣ１Ｒの遺伝子型の同定にとって充分であることは明らかである。具体的には、頬側を拭き取る回収方法を介して得られたＤＮＡ試料の回収物は、この種のアッセイにおける使用に充分なＤＮＡをもたらす。
【０１３０】
（実施例６：日焼け止め使用手順の有効性の分析）
背景：
ＵＶＢは、ＵＶへの過剰なばくろの発生を示す視覚的な手がかりである紅斑（日焼け）を引き起こす、ＵＶＲのスペクトルである。紅斑の頻度および重症度は、日光から保護する個体の習慣の成果の指標としてしばしば使用される。しかし、現在、ＵＶＡが皮膚損傷およびＤＮＡ損傷にの原因になることが知られているが、日焼け止めおよび日焼け止めクリームにＵＶＡを遮断するための薬剤が含められたのは、最近のことである。したがって、日焼け止めを使っている個体は、紅斑を誘導するＵＶＢの作用から自身を保護しているが、個体が他の方法を有するときよりも、ＵＶＡの変異誘発作用に対してはるかに長くばくろを受けているのであろう、という状況が考えられる。この状態の個体は、日焼け止めを使用していることを自己申告するだろうし、保健医療の提供者は、その患者がＵＶＡから実際に保護されておらず、根本的な危険性が依然として非常に高くあり得る場合に、ＵＶＲによる損傷を防止するための対策が取られたと誤って評価するだろう。
【０１３１】
実施例１において実施されたように、消毒綿を用いて一定の間隔（例えば２週間または１ヶ月間）をおいて回収された表皮における、３８９５ｂｐのミトコンドリアＤＮＡの欠失のレベルを測定することによって、ＵＶＲに起因する皮膚損傷の予防における処置の有効性を決定するために、処置の提案に対する比較に関する実時間の定量的な監視ツールが、保健医療の提供者に提供される。
【０１３２】
この回収方法は、あらゆる副作用または不快感なしに、定期的な試料回収を可能にする。消毒綿は、極めて微量の核酸（およそ０．１ｎｇ）をもたらす。このような微量の核酸は核内ＤＮＡを標的とするアッセイには有用ではない。しかし、ミトコンドリアＤＮＡの標的（例えば３８９５ｂｐの欠失）は、はるかに多量に存在し（およそ１０００倍以上）、収量が極めて少ないこのような回収方法に非常に適している。
【０１３３】
研究：
日光に関する望ましくない習慣、または有効ではない保護方法を特定における、ｍｔＤＮＡの欠失の分析の有用性が、年齢および肌の色の近い２人の個体の結果によって示される。患者２０２は日焼け止めを全く使用しなかった。一方で、患者２２５は、日焼け止めを効果的に使用した。２人の損傷のレベルはこの行動を反映しており、患者２０２は、患者２２５と比べて３８９５ｂｐの欠失がおよそ１０倍の量であり、ＵＶＲへのばくろによる高いレベルのＤＮＡ損傷を示している（ＣＴの３の差は、標的の量における１０倍の差に等しい）。これらの２人の個体の表現型は、ＵＶＲに関連する皮膚損傷に対する危険性が同等であるか、または等しいことを示しているが、３８９５ｂｐの欠失を非侵襲的な消毒綿による回収と組み合わせると、行動の差（例えば日焼け止めの使用）におそらく起因する、患者２０２がより大きな危険性を有していることを実証できる。
【０１３４】
【表５】
0005646998.tif 000006
【０１３５】
（実施例７：日光の保護計画の有効性を予測するための、ＭＣ１ＲのバリアントおよびｍｔＤＮＡの欠失の分析）
日光の保護計画の有効性を評価する代理物としてＵＶＲと関連する３８９５バイオマーカー用いたＤＮＡ損傷の監視、およびＭＣ１Ｒのバリアントの状態の決定の監視を組み合わせた有用性を以下に示す。以下に示されているのは、同様に日焼け止めを使用している、年齢および肌の色の近い２人の患者が、おそらく異なるＭＣ１Ｒ遺伝子型の副産物として、異なるレベルのＤＮＡ損傷を受けている場合である。患者３００は、ＵＶＲの皮膚への損傷作用の受けやすさの増大に関連するバリアントを有していない。一方、患者３０３は、９２位アミノ酸に１つのバリアントを有している。これらの患者は表現の上では非常に近く、フィッツパトリックの光反応性の分類の段階について同程度を記録する（分類３）が、増大した作用の受け易さが、ＭＣ１Ｒのバリアントを有している患者において、ＭＣ１Ｒのバリアントを有していない患者と比べて、ＤＮＡの損傷レベルが３倍になって反映されている（ＣＴの１の差は、標的の量においておよそ３倍である）。
【０１３６】
【表６】
0005646998.tif 000007
【０１３７】
上述のように、ＵＶＲに起因する皮膚損傷は、多因子性の過程であり、したがって、ＭＣ１Ｒのバリアントを有している個体が、ＭＣ１Ｒのバリアントを有していない個体と比べて、より多くの損傷をつねに被ると仮定され得ないし、日常的な日焼け止めの使用を申告する個体が、日焼け止めの不使用を申告する個体と比べて、少ない損傷を必ずしも有していない場合があある。これらの２つの試験を組み合わせることによって、保護において個体に、より詳しい情報に基づいて推奨するために必要な特異な見識が、保健医療提供者に提供される。
【０１３８】
以下の２つの表は、バリアントを有する個体とバリアントを有しない個体とが、ＤＮＡ損傷の範囲の全体にわたっておおむね等しく現れているように、この点を示している。
【０１３９】
【表７】
0005646998.tif 000008
【０１４０】
危険性の表現型に一般に関連しないバリアントのみを考慮する場合、つぎの２つの表に例外が見られる。６０位および９２位のアミノ酸におけるこれらのバリアントは、損傷程度が低い集団にはあまり現れていない。これは、ＭＣ１Ｒのバリアントの結果として生じる損傷の受けやすさの特定の組合せが、視覚的な手がかり（例えば、白い肌または赤髪など）がないことと関連していたことをおそらく示している。これは、増大した危険性が、これらのバリアントの保有者におけるより高いレベルの損傷を生じることを示している。
【０１４１】
【表８】
0005646998.tif 000009
【０１４２】
（実施例８：光老化判定のための針による試料採取）
ＵＶＲに対するばくろを評価するためのミトコンドリアマーカーと組み合わせた低侵襲的な試料の回収手順を利用する、付加的なツールが提供される。当該ツールは、顔または頭（例えば、眉隆線の周辺または耳朶）の皮膚組織を小さな内径の針（２８ゲージ）を用いて回収すること、微小核を溶液中に排出させること、核酸の抽出を実施すること、およびＵＶＲによる損傷（例えば３８９５ｂｐの欠失）と関連するミトコンドリア標的の量を測定することによって提供される（実施例１を参照）。それから、この結果は、複数の結果のデータベースと比較され、３８９５ｂｐの欠失レベルに基づいて年齢コホートに分類される。データベースは、０歳から８０歳までを５年の区間に分けた複数の個体において、３８９５ｂｐの欠失レベルを測定すること、各間隔に対するクラスタまたは平均値を見出だすこと、異常値を除去すること、および３８９５ｂｐの欠失レベルの範囲を年齢の範囲に関連付けることによって作製される。例えば、２１．５〜２３．５のＣＴ値は、４５歳〜６５歳の年齢の範囲に関連し得る。それから、個体の試験の結果は、実年齢と比較されて、当該結果がそれらの年齢の範囲における他の個体より高い光損傷または低い光損傷を有するか否かを決定し、それらの結果に基づいて光老化度を試験の結果に割り当てる。
【０１４３】
このデータベースを作製するために、２８９の個体からその耳朶および眉隆線の両方において微小核を回収した。図１３に示すように、ＤＮＡ抽出および３８９５ｂｐの欠失レベルの定量化につづいて、互いに有意差のある（ｐ＜０．０１）３グループに年齢コホートを分類して、データベースを上述のようにして作製した。
【０１４４】
本発明は、特定の実施形態を参照して説明されているが、これらの種々の変形は、当業者にとって明らかであり、本発明の精神および範囲から逸脱しない。当業者にとって明らかであるような、このような変形のすべては、以下の特許請求の範囲のの範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明の方法を用いて鼻および踵から回収された皮膚試料における、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルに関連するリアルタイムＰＣＲのデータを示す。
【図２】本発明の方法を用いて体の様々な部位から回収された皮膚細胞における、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルに関連するリアルタイムＰＣＲのデータを示す。
【図３】本発明の方法を用いて体の様々な部位から回収された皮膚細胞における、３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルに関連するリアルタイムＰＣＲのデータを示す。
【図４】種々の非侵襲的な皮膚の回収方法によって回収された試料に存在する増幅産物の存在を示すゲルを示す。
【図５】種々の非侵襲的な皮膚の回収方法によって回収された試料に存在する増幅産物の存在を示すゲルを示す。
【図６】対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【図７】対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【図８】対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【図９】対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【図１０】対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【図１１】対立遺伝子バリアントについて試験された対象の、遺伝子型の同定結果を示す。
【図１２】対立遺伝子バリアントＲ１６０Ｈについて試験するアッセイの結果を与えるゲルを示す。
【図１３】年齢コホートに分類された集団の３８９５ｂｐのｍｔＤＮＡ欠失レベルを示すグラフを示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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