(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞密度１ｍＬ当り５×１０６から１５０×１０６細胞の範囲にある細胞懸濁液からアデノウイルス粒子を精製する方法において、
ａ）前記細胞懸濁液中で細胞を溶解する工程；
ｂ）前記細胞懸濁液中の宿主細胞ＤＮＡを細胞懸濁液に選択的な沈殿剤を添加して選択的に沈殿し、選択的な沈殿剤は、４級アンモニウム化合物、アミン共重合体およびそれらの混合物からなる群から選択されるか、または、
前記細胞懸濁液中の宿主細胞ＤＮＡにヌクレアーゼを添加して、断片化する工程；
ｃ）工程ｂ）から得た細胞懸濁液を接線流濾過して、浄化する対象として、精製されたアデノウイルス懸濁液を得る工程を備える方法であって、
前記細胞懸濁液の細胞密度が、１ｍＬ当り５×１０６から１５０×１０６細胞の範囲であることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｂ）における前記沈殿は、選択的な沈殿剤を添加し、選択的に宿主細胞ＤＮＡをウイルス粒子から沈殿し、実施される、請求項１に記載のアデノウイルス粒子を精製する方法。
【請求項３】
前記選択的な沈殿剤は、臭化ドミフェン（ＤＢ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記臭化ドミフェン（ＤＢ）の濃度は、１．２から５ｍＭの範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞密度は、１ｍＬ当り１０×１０６から３０×１０６細胞の範囲であり、臭化ドミファン（ＤＢ）の濃度は、１．３から２ｍＭの範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記接線流濾過は、膜細孔の大きさ０．１から０．６５μｍの範囲のもので実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記接線流濾過は、中空糸で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記接線流濾過は、ＡＴＦシステムで実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞ＤＮＡ少なくとも８０％は、精製されたアデノウイルス懸濁液から取り除かれた、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス生産分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞懸濁液からアデノウイルス粒子を精製するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンの生産分野における近年の開発において、大量生産が必要とされるようになってきた。感染症に対抗するのに十分な量の（組換え）ワクチン接種を用いて世界を支えるため、安定的に、且つ、高収率で製造する方法が必要である。
【０００３】
感染症に対するワクチンは、組換えアデノウイルス粒子に基づくものである。そのため、細胞を用いたアデノウイルス生産方法の最適化に多大な努力が払われてきた。細胞は、より高い総ウイルス収率を得るため、さらに高い密度で培養され、その後、ウイルス感染させる。このような高細胞密度の方法は、例えばクルセル  ホランド  ベー  ヴェーの国際公開第２０１０／０６０７１９号およびYuk et al. (2004)に開示されている。高濃度の組み換えアデノウイルスの生産方法は、これらに記載されている。この最適化された方法は、細胞当りのウイルス生産数が高い状態で維持された、高細胞密度（例えば１ｍＬ当り５×１０６細胞より高い）の培養物に感染する性能により実現する。このようにして、１つのバイオリアクター内で、高ウイルス濃度の採取ウイルス溶液を得る方法を提供する。前記方法による通常のウイルス粒子（ＶＰ）の収率は、約１．５〜２．５×１０１２ＶＰ／ｍＬである。
【０００４】
細胞を高密度で培養する方法は、多量の細胞残屑および宿主細胞ＤＮＡを蓄積しやすい。この混入物質は、さらなる精製方法を経て処分する必要があり、これは煩わしい操作である。宿主細胞ＤＮＡを採取細胞培養物から除去する方法は、以前の米国特許第７３２６５５５号明細書に開示した。方法は、選択的に宿主細胞ＤＮＡを細胞培養物から沈殿させる工程からなる。選択的な沈殿剤は、宿主細胞ＤＮＡに特異的に結合し、アデノウイルス粒子を沈殿させないまま残す。しかしながら、この参考文献の方法は、低細胞密度の細胞培養に関しての記載であり、細胞残屑および宿主細胞ＤＮＡの量は低量である。
【０００５】
今まで、前記方法が高細胞密度を含む培養物に応用可能か否かは知られていなかった。逆に、前記方法に使用されるような沈殿剤は、高濃度で使用した場合、選択的に宿主細胞ＤＮＡを培養物から沈殿させず、ウイルス粒子を沈殿させることが、従来技術の強い示唆から推定された（Goerket et al. 2004）。
【０００６】
アデノウイルスを含む細胞培養物の採取は、精製されたアデノウイルスを得るため、一般的にさらに処理される。例えば深層濾過および／または接線流濾過（ＴＦＦ）を用いた清澄化工程は、通常、前記精製方法に含まれる。ＴＦＦの使用は、比較的他の物質が混在しない採取物、即ち、含有する宿主細胞ＤＮＡ等の細胞残屑または他の不純物の量が制限されたものに適している。過剰量の前記不純物は、フィルターを閉塞する可能性がある。そのため、ＴＦＦによる清澄化が、さらなる精製手段として、例えば第３または第４の工程として、一般的に使用される。
【０００７】
採取直後のアデノウイルスを含む細胞懸濁液から接線流濾過を用いたアデノウイルスの分離については、例えば欧州特許第１３７１７２３号明細書に記載されている。しかしながら、アデノウイルスは、採取後にバイオリアクター内に残った粘着細胞上に成長する。従って、さらに処理されたウイルスを含む懸濁液は、非常に低濃度の細胞残屑および宿主細胞ＤＮＡを包含する。国際公開第２００６／０５２３０２号には、採取直後のＴＦＦの使用も記載されている。しかしながら、ここに使用したウイルスを含む採取物の細胞密度は、５×１０６細胞／ｍＬより非常に低いものであった。ここに開示するように、採取直後の清澄化工程におけるＴＦＦの使用は、高細胞密度を含む細胞培養には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６０７１９号
【特許文献２】米国特許第７３２６５５５号明細書
【特許文献３】欧州特許第１３７１７２３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００６／０５２３０２号
【特許文献５】国際公開第２００４／０９９３９６号
【特許文献６】国際公開第２００５／０９５５７８号
【特許文献７】国際公開第２００８／００６４９４号
【特許文献８】欧州特許第０８１６８１８１．９号明細書
【特許文献９】国際公開第９８／２２５８８号
【特許文献１０】米国特許第６，５４４，４２４号明細書
【特許文献１１】国際公開第２００５０８０５５６号
【特許文献１２】米国特許第６，４８５，９５８号明細書
【特許文献１３】国際公開第０５／０８０５５６号
【特許文献１４】国際公開第０３／０９７７９７号
【特許文献１５】国際公開第０２／４４３４８号
【特許文献１６】国際公開第９７／０８２９８号
【特許文献１７】国際公開２００６／１０８７０７号
【特許文献１８】欧州特許第０８１６８１８１．９号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，９９４，１２８号明細書
【特許文献２０】欧州特許第１２３０３５４号明細書
【特許文献２１】国際公開第９８／３９４１１号
【特許文献２２】米国特許第５，８９１，６９０号明細書
【特許文献２３】国際公開第９６／２６２８１号
【特許文献２４】国際公開第００／０３０２９号
【特許文献２５】米国特許第６，４９２，１６９号明細書
【特許文献２６】国際公開第０３／１０４４６７号
【特許文献２７】米国特許第６，４９２，１６９号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，５５９，０９９号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，８３７，５１１号明細書
【特許文献３０】米国特許第５，８４６，７８２号明細書
【特許文献３１】米国特許第５，８５１，８０６号明細書
【特許文献３２】米国特許第５，９９４，１０６号明細書
【特許文献３３】米国特許第５，９６５，５４１号明細書
【特許文献３４】米国特許第５，９８１，２２５号明細書
【特許文献３５】米国特許第６，０４０，１７４号明細書
【特許文献３６】米国特許第６，０２０，１９１号明細書
【特許文献３７】米国特許第６，１１３，９１３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cortin V, Thibault J, Jacob D, Gamier A. High-Titer Adenovirus Vector Product  ion in 293S Cell Perfusion  Culture. Biotechnol. Prog. 2004.
【非特許文献２】Goerke A, To B, Lee A, Sagar S, Konz K. Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA. Biotechnology and bioengineering, Vol. 91, No. 1, July 5, 2005.
【非特許文献３】Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusion Cultures of Human Tumor Cells: A Scalable Product ion Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors. Biotechnol. Bioengin. 86: 637〜641 (2004).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞培養方法は大規模化し、かつ、細胞をより高密度で培養するため、工業的に、高細胞密度の懸濁液を処理することができる下流処理の必要性が存在する。これは、特にアデノウイルス生産分野に適用される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アデノウイルス粒子を細胞懸濁液中の細胞溶解物、特に高細胞密度の懸濁液から精製する方法に関する。
【００１２】
高細胞密度の懸濁液からアデノウイルスを既存の方法で精製したところ、本明細書（実験例１）に実証するように、そのウイルス回収率は非常に低いものとなった。採取後得られる前記高細胞密度の懸濁液中の不純物の濃度は、通常、直接アデノウイルスを精製することを許容するには高すぎる。既知の方法を使用した高細胞密度の懸濁液の下流処理は、一般的に複数の工程を必要とする。第１の濾過工程は、大きな沈殿物および細胞残屑を取り除くため、粗い濾過工程からなる。その後、１または２段階のより選択的な濾過工程が、十分に精製されたアデノウイルス懸濁液を得るために必要とされる。
【００１３】
発明者らは、驚くべきことに、アデノウイルスを含む細胞溶解物を調製した直後、宿主細胞ＤＮＡ断片化および／または沈殿を連続的に実施し、接線流濾過（ＴＦＦ）を備えた清澄化を行うことで、高度に精製されたアデノウイルス懸濁液を生じる清澄化ことを見出し、本明細書に開示する。
【００１４】
驚くべきことに、本発明によって、アデノウイルス、多量の細胞残屑、宿主細胞ＤＮＡおよび他の不純物を含む細胞溶解物を処理して、精製アデノウイルスを得ることができる。このようにして、本発明は、大規模なアデノウイルス精製方法において、宿主細胞ＤＮＡを取り除くための新規方法を提供する。
【００１５】
ＤＮＡ断片化または沈殿を精製方法に取り入れることで、ＴＦＦを使用した、単回の清澄化工程で、十分に清澄化されたアデノウイルスを高細胞密度の懸濁液から精製することができた。
【００１６】
本発明は、精製されたアデノウイルス粒子を細胞密度１ｍＬ当り５×１０６〜１５０×１０６細胞の細胞懸濁液から精製する方法を提供し、該方法は、ａ）前記細胞懸濁液中で細胞を溶解する工程；ｂ）前記細胞懸濁液中で宿主細胞ＤＮＡを断片化および／または沈殿する工程；ｃ）工程ｂ）から得た細胞懸濁液を接線流濾過し、清澄化する工程とを備える。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記アデノウイルスは、細胞密度１ｍＬ当り５×１０６〜１５０×１０６細胞、例えば１ｍＬ当り５×１０６〜５０×１０６細胞または１ｍＬ当り１０×１０６〜３０×１０６細胞の細胞懸濁液から精製される。
【００１８】
他の実施形態において、工程ｂ）における前記沈殿は、選択的な沈殿剤を添加し、選択的に宿主細胞ＤＮＡをアデノウイルス粒子から沈殿することによって実施される。
【００１９】
好ましい実施形態において、接線流濾過は、膜細孔のサイズが０．１〜０．６５μｍの膜で実施される。
【００２０】
他の好ましい実施形態において、接線流濾過は中空糸で実施される。また、他の実施形態において、前記接線流濾過は、ＡＴＦシステムで実施される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アデノウイルスの回収率および宿主細胞ＤＮＡの沈殿除去率を、低密度（２．５×１０６〜３．５×１０６ｖｃ／ｍＬ）および高密度（２０×１０６〜３０×１０６ｖｃ／ｍＬ）の細胞懸濁液で、臭化ドミフェン濃度に対してプロットしたグラフである。
【図２】アデノウイルスの回収率および宿主細胞ＤＮＡの沈殿除去率を、低密度（２．５×１０６〜３．５×１０６ｖｃ／ｍＬ）および高密度（１８×１０６〜２５×１０６ｖｃ／ｍＬ）の細胞懸濁液で、臭化ドミフェン濃度に対してプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、アデノウイルス粒子を高細胞密度の懸濁液から精製する方法に関する。本発明の高細胞密度の懸濁液は、高細胞密度まで細胞を培養して得られる。培養方法については、特に制限されるものではないが、例えばバッチ、フェッドバッチまたは潅流モードを使用できる。細胞を高細胞密度まで培養する方法は当業者に既知である。高細胞密度の培養物を得るための特定の方法は、例えば国際公開第２００４／０９９３９６号、第２００５／０９５５７８号、第２００８／００６４９４号、第２０１０／０６０７１９号に開示されている。
【００２３】
本発明において、高細胞密度の懸濁液の細胞密度は、約５×１０６〜１５０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約８×１０６〜１２０×１０６細胞／ｍＬ、約１２×１０６〜１００×１０６細胞／ｍＬ、約２０×１０６〜８０×１０６細胞／ｍＬである。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、前記高細胞密度の懸濁液中の細胞密度は、約１０×１０６〜５０×１０６細胞／ｍＬ、例えば少なくとも約１５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約２０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約２５×１０６細胞／ｍＬ、最高で約３０×１０６細胞／ｍＬ、最高約３５×１０６細胞／ｍＬ、最高約４０×１０６細胞／ｍＬ、最高約４５×１０６細胞／ｍＬである。
【００２５】
本発明において、高細胞密度の培養物にアデノウイルス粒子を感染させて、前記アデノウイルスを細胞培養物中で増殖可能な状態とする。このようにして、単一のバイオリアクター内で、高濃度のアデノウイルスを有する高細胞密度の懸濁液を取得できる。高細胞密度の培養物を感染させる方法は当業者に既知である。高いウイルス濃度で前記高細胞密度の培養物を得るための特定の方法は、欧州特許第０８１６８１８１．９号明細書、Cortin et al. 2004およびYuk et al. 2004に開示されている。これらの参考文献には、数々の組換えアデノウイルスの産生方法が記載されている。これらの方法は、細胞当りの高いアデノウイルス生産能を保持する、高細胞密度の培養物に感染する性能に依存する。このように、本発明は、高アデノウイルス濃度を有する高細胞密度の懸濁液を、１つのバイオリアクター内で得る方法を提供する。従来の方法での通常の収率は、例えば組換えアデノウイルス３５（ｒＡｄ３５）は、約１．５〜２．５×１０１２ＶＰ／ｍＬである。アデノウイルスを細胞培養物中で増殖させた後、大半の細胞をつぶし、アデノウイルス粒子を、本発明に従って、高細胞密度の懸濁液から精製した。
【００２６】
本発明の第１工程としての方法は、高細胞密度の懸濁液に含まれる細胞を溶解する工程を備える。アデノウイルス粒子を感染させた高細胞密度の懸濁液を溶解することで、細胞懸濁液中に多量の細胞残屑および宿主細胞ＤＮＡが蓄積する。この蓄積により、その後、細胞懸濁液の煩わしい下流処理が必要となる。
【００２７】
本発明は、アデノウイルス粒子を高細胞密度の懸濁液の細胞溶解液から精製するのに適した方法を提供する。選択的な沈殿剤を細胞溶解物に添加することによって、多量の宿主細胞ＤＮＡを、高細胞密度の懸濁液中のアデノウイルス粒子から選択的に沈殿除去することができ、宿主細胞ＤＮＡの少なくとも約８０％を、アデノウイルス粒子を含む高細胞密度の懸濁液から沈殿除去することができる。本明細書に開示するように、ＴＦＦでの清澄化後、沈殿工程により、宿主細胞ＤＮＡの少なくとも８０％の減少、好ましくは９０％＞、より好ましくは本明細書に例示する宿主細胞ＤＮＡの約９５％が減少し、混在する宿主細胞ＤＮＡの沈殿除去が可能となる。
【００２８】
＜溶解＞
方法の第１工程は、細胞懸濁液中の細胞を溶解することを備える。細胞膜を溶解するこの第１工程は、感染した高細胞密度の懸濁液から細胞性（細胞内）および非細胞性（細胞外）双方のアデノウイルスを採取することを可能とする。宿主細胞を界面活性剤によりウイルスを含む宿主細胞を溶解する好ましい方法は、機械的でない溶解法（例えば酵素処理）および／または機械的なせん断法（例えば中空糸限外濾過）と置き換えることができ、最大量のアデノウイルスを放出する。活性化された細胞溶解物に使用できる方法は、当業者に既知であり、例えば国際公開第９８／２２５８８号、p. 28〜35に説明されている。この点に関して実用的な方法は、例えば凍結融解、固体せん断、高張および／または低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出し、界面活性剤による溶解、これらの組み合わせ等である。本発明の一実施形態において、細胞は少なくとも１種の界面活性剤を使用して溶解される。溶解用界面活性剤の使用は、それが簡便な方法であり、容易に計量可能であるという利点がある。
【００２９】
使用できる界面活性剤およびそれを用いる方法は、一般的に当業者に既知である。いくつかの例が、例えば国際公開第９８／２２５８８号、p. 29〜33に説明されている。本明細書に使用するような界面活性剤は、陰イオン、陽イオン、両性イオンおよび非イオン界面活性剤を含むが、これらに制限されるものではない。界面活性剤の例としては、例えばＴｒｉｔｏｎおよび／またはポリソルベート８０が挙げられる。一実施形態において、使用する界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。また、ＴＮＢＰ等の溶媒を、これら界面活性剤のそのエンベロープウイルスを不活性にする性能を補助するくらい低濃度で、溶解物または清澄化された溶解物に添加できる。さらに、感染した宿主細胞のその中のアデノウイルスによる自己分解は、多量の細胞内アデノウイルスを放出させることができ、本発明の方法に利用することができる。従って、従来技術において既知の、宿主細胞のあらゆる形態の溶解物を用いて、本明細書に開示した方法に従って最終的な採取するために、細胞内ウイルスを宿主細胞培養物の培地に遊離させることができる。界面活性剤の最適な濃度は、多様であり、例えば約０．１％〜１％（ｗ／ｗ）であることが、当業者に明らかである。
【００３０】
＜断片化および選択的な沈殿＞
溶解後、宿主細胞ＤＮＡは、ウイルスを含む細胞懸濁液から断片化または沈殿することができる。
【００３１】
好ましい実施形態において、宿主細胞ＤＮＡは、選択的な沈殿剤（ＳＰＡ）溶液の添加によって沈殿除去される。この工程は、選択的な宿主細胞ＤＮＡの沈殿を可能とすると同時に、液相中のウイルス粒子を修飾しないまま保持することを可能とする。本明細書に例示するように、この初期段階の沈殿工程により、清澄化後、宿主細胞ＤＮＡは少なくとも約９０％減少する。
【００３２】
本発明を実施するにあたって、実用的なＳＰＡとしては、アミン共重合体、４級アンモニウム化合物およびそれらそれぞれの混合物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。より詳細には、種々のポリエチレン（ＰＥＩ）が、過剰な陰イオン電荷（ＤＮＡ不純物）の中和に非常に有効である。本発明に適宜使用できる許容可能なＳＰＡの一覧は、本明細書に組み込まれる米国特許第７３２６５５５号明細書（列１２、５６〜６７行目および列１３、１〜２８行目）に挙げられている。本発明に使用するのに適したＳＰＡは、以下のクラスおよび市販の製品例を含むが、これらに制限されるものではない：モノアルキルトリメチルアンモニウム塩（市販製品の例としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミドまたはＣＴＡＢとしてクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド（ＴＴＡ）、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミン：クロリドまたはブロミド塩、ドデシルアミンまたはクロリド塩およびセチルジメチルエチルアンモニウムブロミドまたはクロリド）、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩（例としては、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドおよびＢＴＣとしてベンゼトニウムクロリド）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（市販製品としては、臭化ドミフェン（ＤＢ）、ジデシルジメチルアンモニウムハライドおよびオクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリドまたはブロミド）、複素芳香族アンモニウム塩（市販製品としては、セチルピリジウムハライド（ＣＰＣまたはブロミド塩およびヘキサデシルピリジニウムブロミドまたはクロリド）、シス異性体１−［３−クロロアリール］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミドおよびアルキルジメチルナフチルメチルアンモニウムクロリド（ＢＴＣ  １１１０））。多置換の４級アンモニウム塩（市販製品としては、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリンおよびアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファメートを含むが、制限しない）、ビス４級アンモニウム塩（製品例としては、１，１０−ビス（２−メチル−４−アミノキノリウムクロリド）−デカン、１，６−ビス［１−メチル−３−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）−プロピルジメチルアンモニウムクロリド］ヘキサンまたはトリクロビソニウムクロリドおよびBuckman BrochuresによってＣＤＱと称されるビスクアット（bis-quat））およびポリメリック４級アンモニウム塩（ポリイオネン、例えばポリ［オキシエチレン（ジメチルイミノ）エチレン（ジメチルイミノ）エチレンジクロリド］、ポリ［Ｎ−３−ジメチルアンモニオ）プロピル］Ｎ−［３−エチレンオキシエチレンジメチルアンモニオ）プロピル］ユリアジクロリドおよびα−４−［１−トリス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリド］）。米国特許第７３２６５５５号明細書から当業者が理解できるように、この中のいくつかが正常に作用し、当業者は、化合物が選���的にＤＮＡを沈殿する適切な濃度を通常通り見出すことができることを示す。これはＳＰＡの例であり、この開示および本発明に基づいて、本発明に適していることも明らかである。
【００３３】
好ましい実施形態において、陽イオン界面活性剤が、本発明で使用される。さらにより好ましい実施形態において、臭化ドミフェン（ＤＢ）等のジアルキルジメチルアンモニウム塩が、本発明で使用される。様々な潜在的なＳＰＡを本発明の実施に使用できるが、臭化ドミフェンは、主にＧＭＰグレードの原材料としての有用性、およびヒトへの使用を意図する他の製品における現在の使用の有用性から、特に有用性の高いものである。より詳細には、臭化ドミフェンは、口腔衛生製品または局所用抗生物質クリームの有効成分として広範囲で使用されており、この分子は多量に生産され、ｃＧＭＰ条件下で販売されている。
【００３４】
宿主細胞ＤＮＡを細胞懸濁液から沈殿するために、高細胞密度の細胞懸濁液において使用される最適なＳＰＡ濃度を、本発明において測定した。従来技術に基づき、高濃度のＳＰＡと接触して配置した場合、アデノウイルス粒子は、即時に沈殿すると予期されていたが、意外にもアデノウイルス粒子は沈殿せずにとどまった。実際、従来技術、例えば米国特許第７３２６５５５号明細書には、陽イオン界面活性剤の濃度を上昇させた場合、低細胞密度の懸濁液中（最高１×１０６細胞／ｍＬまで）で、アデノウイルス粒子が沈殿することを示した。
【００３５】
本明細書に開示するように、高細胞密度の培養物を溶解して生産されるような懸濁液は、非常に大量の宿主細胞ＤＮＡおよび他の不純物を含み、従って、大量の陽イオン界面活性剤を必要とする（例えば２倍の濃度）。従って、低細胞密度の結果から推定したものに基づくと、この陽イオン界面活性剤濃度の上昇は、懸濁液中に存在するアデノウイルス粒子の総量の沈殿を導くことが予期される。
【００３６】
しかしながら、驚くべきことに、高いＳＰＡ濃度、選択的に混在する宿主細胞ＤＮＡをウイルス粒子を含む高細胞密度の懸濁液から取り除くことは、依然として可能であった。本発明の好ましい実施形態において、ＳＰＡ、好ましくはＤＢが、１．２〜５ｍＭの濃度まで添加される。さらにより好ましい実施形態において、ＳＰＡ、好ましくはＤＢは、１．３〜２．２ｍＭ、例えば１．４〜２ｍＭ，１．４〜１．８ｍＭ、１．５〜１．６ｍＭの濃度で添加される。本開示に基づいて、当業者は、採取時の一定の細胞密度に関する適切なＳＰＡ濃度範囲を決定する方法を知っていることは、明らかである。
【００３７】
アデノウイルスを含む、細胞密度が１０×１０６〜１５０×１０６細胞／ｍＬである高細胞密度の懸濁液を処理するための適切なＤＢの濃度は、約１．２ｍＭ〜５ｍＭである。アデノウイルスを含む、細胞密度が１０×１０６〜５０×１０６細胞／ｍＬの高細胞密度の懸濁液を処理するための適切な濃度のＤＢは、約１．３ｍＭ〜２．２ｍＭである。アデノウイルスを含む、細胞密度が１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｍＬの高細胞密度の懸濁液の採取物を処理するための適切な濃度のＤＢは、約１．３ｍＭ〜２ｍＭ、例えば約１．４〜１．９ｍＭ、１．４〜１．８ｍＭ、約１．４〜１．７ｍＭ、約１．４５〜１．６５ｍＭ、約１．５〜１．５５ｍＭである。
【００３８】
本明細書に開示したＳＰＡとなり得る化合物を試験し、効果的に核酸分子および他の細胞残屑をアデノウイルス粒子から沈殿する化合物を同定することは、本明細書に臭化ドミフェン（ＤＢ）が例示されているように、当業者のなし得る範囲内である。従って、本発明は、アデノウイルス粒子を高細胞密度の懸濁液から精製する方法に関するものである。前記方法は、選択的な沈殿剤を溶解後の宿主細胞培地に添加することによって、選択的に宿主細胞の核酸分子を溶解後の高細胞密度の懸濁液中のアデノウイルス粒子から沈殿させることを備える。
【００３９】
宿主細胞ＤＮＡを細胞懸濁液から取り除く好ましい方法は、選択的な沈殿であるが、本発明は、それに制限されない。宿主細胞ＤＮＡを取り除く他の方法も本発明に含まれる。
【００４０】
従って、一実施形態において、宿主細胞ＤＮＡは断片化され、即ち、断片に切断される。本発明において、溶解後の宿主細胞ＤＮＡの断片化は、ヌクレアーゼを細胞懸濁液中に添加して実施することができる。本発明の使用に適切な典型的なヌクレアーゼとしては、Benzonase（登録商標）、Pulmozyme（登録商標）または他の従来技術の範囲で一般的に使用されるＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、ヌクレアーゼは、Benzonase（登録商標）であり、特定のヌクレオチドの間の内部のホスホジエステル結合を加水分解することによって急速に核酸を加水分解し、そのことによって細胞溶解物の粘度を減少する。Benzonase（登録商標）は、例えばMerck KGaA(コードW214950)から市販されている。
【００４１】
十分な断片化に必要とされるヌクレアーゼの濃度は、即ち宿主細胞密度、温度および反応時間に依存する。当業者は、良好な宿主細胞ＤＮＡの断片化のために必要とされるヌクレアーゼ濃度を測定し、最適化する方法を知っている。
【００４２】
＜清澄化＞
前述の工程から得られたＳＰＡ処理した細胞溶解物は、その後、清澄化し、沈殿した宿主細胞ＤＮＡ、細胞残屑および他の不純物を沈殿して取り除く。
【００４３】
一段階の清澄化手段でアデノウイルスを高細胞密度の懸濁液から直接精製したところ、本明細書（実験例１）に例示するように、ウイルス回収率が低くなる結果となった。採取後に得られた前記高細胞密度の懸濁液中の不純物の濃度は、通常、直接ウイルスを精製することを可能とするには高すぎる。通常は、従来技術にしばしば使用され、推奨され、本明細書に例示されている、少なくとも２つの連続したフィルターの組み合わせが、適切に清澄化するために必要である。
【００４４】
発明者らは、驚くべきことに、ＴＦＦを用いた清澄化工程とＤＮＡの沈殿を組み合わせることで、高細胞密度の懸濁液から高い回収率でウイルス精製ができることを見出し、本明細書に開示する。一段階の接線流濾過工程で、細胞残屑および核酸沈殿物をウイルスを含む懸濁液から十分に取り除くことができた。宿主細胞ＤＮＡの９５％超を沈殿させることができ、かつ、ウイルス回収率は、８０％超であった。それゆえに、本発明において、ＴＦＦを単回の清澄化工程として使用することが可能である。本発明の方法で得られた清澄化されたウイルスを含む懸濁液は、元の溶解物（本方法の工程ａ）で得られるもの）と比較して、宿主細胞ＤＮＡおよび他の不純物が実質的に減少していた。
【００４５】
本発明において、ＴＦＦセットアップに使用するフィルターは、例えばGE HealthcareまたはJM分離からの中空糸フィルターである；他のフィルターとしては、MilliporeまたはSartorius stedium biotechからのフラットスクリーンフィルターが挙げられる。前記ＴＦＦセットアップにおけるウイルス粒子は、透過液中に収集され、一方、細胞残屑、沈殿した宿主細胞ＤＮＡおよび他の不純物は、残液中に残存する。中空糸フィルターは、高細胞密度の懸濁液を処理するのに非常に適切であったことを、本明細書に示す。従って、本発明の好ましい実施形態において、ＴＦＦは、中空糸フィルターで実施される。
【００４６】
本発明において、前記フィルターの細孔のサイズは、好ましくは０．１〜１μｍである。本発明の好ましい実施形態において、細孔のサイズは、０．２〜０．６５μｍである。前記細孔のサイズは、ウイルス粒子が膜を透過することを可能とし、細胞残屑、沈殿した宿主細胞ＤＮＡおよび他の不純物が透過せずに保たれることを可能とする。フィルターモジュールを、製造業者の指示通り、好ましくは水で予め湿らせる。液体は、モジュールを経て管および蠕動ポンプを用いて再循環する。
【００４７】
本発明のある実施形態において、ＴＦＦは、交互接線流濾過（ＡＴＦ）の形態で使用される。ＡＴＦは、接線流濾過の一形態であって、本明細書においてＡＴＦを用いた清澄化は、高濃度の細胞残屑、宿主細胞ＤＮＡおよび他の不純物を含む懸濁液からのウイルス回収に、非常に適していることが見出された。接線流濾過は、当業者に既知の方法および例えば米国特許第６，５４４，４２４号明細書に従って達成することができる。ＡＴＦシステム（例えばＡＴＦシステム、Refine Technology, Co., East Hanover, NJ）を使用する利点は、供給液および残液の流れの方向が、ＡＴＦポンプサイクル（サイクルは加圧および排出モードからなる）ごとに変わることにある。これにより、膜を経た逆流洗浄作用と、膜間圧（ＴＭＰ）の持続的な変化が生じる。排出中、真空が生じ、いくらかの物質が透過液側から残液側に逆流し、これにより膜が浄化される。ＡＴＦの使用は、膜の詰まりを減らし、より高いウイルス回収率をもたらす。当業者は、最適なＡＴＦおよび最高の収率のための透過液流速度を決定することができる。本発明によると、前記ＡＴＦシステムに用いたフィルターは、例えばGE healthcareからの中空糸フィルターである。
【００４８】
ＡＴＦシステムを用いるさらなる利点は、清澄化に使用されるセットアップが、潅流モードにおける培養細胞に初期段階で使用することができることである。実際、ＡＴＦシステムに接続されたバイオリアクターは、最初に高細胞密度まで細胞を培養するために使用することができる。１００×１０６生存細胞／ｍＬ超の非常に高い細胞密度が、ＡＴＦ潅流システム、例えばＰＥＲ．Ｃ６細胞での使用で得られる（例えばYallop et al, 2005および国際公開第２００５／０９５５７８号を参照）。細胞が高細胞密度まで達すると、非常に濃縮されたウイルスを含む細胞懸濁液を得るため、それを感染させることができる。この方法を経て、バイオリアクターに接続されたままのＡＴＦシステムは、その後、ウイルスを前記高細胞密度の懸濁液から精製するために使用することができる。
【００４９】
ＴＦＦによる清澄化と選択的な沈殿との組み合わせにより、採取後に得られる高細胞密度の溶解物に含まれる、宿主細胞ＤＮＡの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは９０％が除去される。
【００５０】
＜さらなる精製方法＞
ある実施形態において、採取したウイルス粒子は、さらに精製される。さらなるウイルスの精製は、例えば本明細書に参考として取り込まれる国際公開第２００５０８０５５６号に記載されたような濃縮、限外濾過、透析濾過またはクロマトグラフィーでの分離を備えるいくつかの工程で実施できる。他の工程、例えば陰イオン交換膜クロマトグラフィー、除菌、逆相吸着、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーも使用できる。これらの工程は、例えば本明細書に参考として完全に取り込まれる米国特許第７３２６５５５号に開示されている。当業者は、各々の精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。また、本明細書に参考として完全に取り込まれる国際公開第９８／２２５８８号には、ウイルス粒子の生産および精製方法に関しても記載されている。
【００５１】
本発明における一実施形態において、清澄化されたアデノウイルス粒子の懸濁液は、限外濾過で処理してもよい。ウイルス懸濁液の濃縮に限外濾過が使用される。懸濁液は、５〜２０倍に濃縮することができ、場合により、ヌクレアーゼで（上記のように）処理することができる。本発明の他の態様においては、その後、透析濾過によって緩衝液の交換を導入する。限外濾過装置を用いた透析濾過または緩衝液交換は、塩、糖類等を除去・交換するための方法である。当業者であれば、緩衝液交換が行われるべき条件およびこの工程に適切な緩衝液を判断できる。
【００５２】
選択される特定の限外濾過膜は、アデノウイルス粒子を保つのに十分に小さいサイズであるが、効率的に不純物を清澄化するのに十分に大きなサイズとされるであろう。製造業者および膜の種類に応じて、表示される分子量カットオフが１０〜１０００ｋＤａのものが適切である。接線流モードを用いた限外濾過が好ましい。前記モードにおいて、工程は逆流する残余液の背圧を伴う、または伴わない固定された直交流の設定、固定膜間圧の設定、または、直交流および透過液フラックスの双方の固定、によって調節することができる。
【００５３】
本発明によると、次の工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。前記工程の間、アデノウイルス粒子は、正電荷物質、例えば膜、カートリッジまたはカラムに結合する。次の溶出工程において、ウイルス粒子の不純物および残存する宿主細胞ＤＮＡからの分離が可能となる。
【００５４】
Mustang Q膜吸収剤でのアデノウイルス精製のため、導入および洗浄用のＮａＣｌ濃度は、ｐＨ７．５における推定濃度として０．３〜０．４Ｍのいずれかにすることができ、ｐＨの変化にしたがって変更することができる。より好ましくは、ＮａＣｌ濃度は０．３５Ｍである。緩衝剤のｐＨは、アデノウイルスが結合できるくらいに十分に高い必要がある（約６．５を超える）。さらに、緩衝剤システムのｐＨもウイルスの不安定性を防ぐのに十分に低い必要がある。使用可能な最高ｐＨの正確な値は、アデノウイルスおよび緩衝成分の特定の安定性によって異なり、特定の用途に応じて、当業者が容易に決定することができる。参考までに、制限するものではないが、ｐＨは実質的に約５〜１０の範囲となる。
【００５５】
緩衝液中に０．１％ＰＳ−８０が含まれると、それがアデノウイルス／ＤＮＡの会合およびアデノウイルス凝集を弱めるため、産物中の残留ＤＮＡレベルを低くするには非常に好ましい。アデノウイルス粒子を他のアデノウイルス並びに様々な細胞混入物質から分離するのに実用的な、より高いか、より低い濃度の界面活性剤または代替の界面活性剤を確立することは、当業者にとって日常の実験範囲内である。当業者が選択的な界面活性剤を加工用の緩衝剤として選択することも、同様に実験範囲内である。かかる代替の界面活性剤の例は、米国特許第７３２６５５５号明細書に見出すことができる。陰イオン交換膜クロマトグラフィーの産物、例えばPall(例えばMustang（商標）シリーズ)およびSartorius (例えばSartobindシリーズ)によるものが、本発明によるウイルス精製に適切である。米国特許第６，４８５，９５８号明細書または国際公開第０５／０８０５５６号には、組換えアデノウイルスの精製に陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することが記載されている。
【００５６】
膜吸収剤、例えばMustang Q（Pall Corporation）にウイルスを結合する性能は、非常に高く、７×１０１３ＶＰ／ｍＬ程度である。この方法におけるアデノウイルス精製に適切な他の膜吸収剤および樹脂は、Source 15QおよびSource 30Q(GE life sciences)、Q-Sepharose XL (GE life sciences)、Fractogel TMAE (EM industries)、Sartobind Q (Sartorius)、Adsept Q (Natrix separations)、CIM QA (BIA separations)が挙げられるが、これらに制限されるものではない。アデノウイルス溶出は、ＮａＣｌを含む緩衝剤を用いて実施することが好ましい。当業者は、ＮａＣｌ濃度を最適化する方法を理解している。
【００５７】
ある実施形態においては、少なくとも１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を使用することが好ましい。陰イオン交換工程の後、アデノウイルスは十分に精製される。しかし、いくつかの実施形態においては、サイズ排除クロマトグラフィー工程をさらに実施し、方法の安定性を上昇させる。この工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前に行っても、後に行ってもよい。当然に、他の精製工程を適切に陰イオン交換クロマトグラフィー工程と組み合わせてもよい。陰イオン交換クロマトグラフィーのアデノウイルス精製への使用は、広範囲に亘って記載されていて、この態様は、従って十分に当業者の実施範囲内である。多種類のクロマトグラフィー担体が、アデノウイルス精製に使用されており、使用に適している。当業者は、前記アデノウイルスを精製するのに最適な陰イオン交換物質を容易に見出すことができる。
【００５８】
本発明のある実施形態において、陰イオン交換産物は、緩衝液中および濾過滅菌器内で透析濾過することができる。或いは、透析濾過の前または後のいずれかで、付加的なクロマトグラフィー工程（例えば陽イオン交換）を加えて、不純物及び／またはウイルス／プリオン清澄化の安定性を改良する可能性を付与することができる。
【００５９】
この段階で、さらに限外濾過工程を実施してもよい。接線流限外濾過は、残余タンパク質および核酸を取り除く際、並びに、アデノウイルスを緩衝液中に、交換する際に有用である。３００ｋＤａ〜５００ｋＤａの膜の選択は、収率と、不純物の清澄化の改良度合いとのバランスをとって決定される。他の膜の形態（例えば中空糸）が、代替として許容可能である。選択した限外濾過膜は、アデノ粒子を保つのに十分に小さいサイズであるが、効率的に不純物を清澄化するのに十分に大きいものとする。製造業者および膜の種類に応じて、表示分子量カットオフ値が１０〜１０００ｋＤａのものが適切である。
【００６０】
濾過滅菌工程を処理工程に含めてもよく、この工程は、生物学的負荷を除く際に有用である。産物は、０．２２ミクロンの修飾したフッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）膜(例えばMillipore, Millipak)を経て濾過することができる。
【００６１】
任意の下流処理工程をこの方法に追加することができる。これらは、例えばサイズ排除クロマトグラフィー工程、逆相吸着工程および／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含む。これらそれぞれの工程に関するさらなる詳細は、例えば米国特許第７３２６５５５号明細書、国際公開第０３／０９７７９７号、第０２／４４３４８号に見出すことができる。
【００６２】
国際公開出願である国際公開第９７／０８２９８号には、あるクロマトグラフィー担体を用いて、ウイルスへの損傷を防ぐアデノウイルスの精製であって、陰イオン交換およびサイズ排除工程を含むものを記載されている。
【００６３】
ある限外濾過方法は、国際公開第２００６／１０８７０７号に開示するように、アデノウイルスの精製にも非常に適している。かかる工程は、あるクロマトグラフィー精製工程に加えて、または、その代わりに実施することができる。
【００６４】
＜細胞培養システムおよび下流処理システムの規模＞
本発明の方法は、大容量化が可能である。本発明に使用した細胞培養物は、小規模培養物（例えば１〜１０リットルで行う）から中規模培養物（例えば２０〜１０００Ｌで行う）、市販の大規模の調製、例えば１０００〜５００００Ｌの生産の実施までの範囲である。初期工程（溶解、深層濾過、限外濾過）は、培養容量に合わせた容量とし、一方で、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびその後の工程は、導入されるアデノウイルス粒子量に応じた容量とする。従って、後の工程の容量は、バイオリアクター生産率の推定量（１ｍＬ当り少なくとも１×１０１２アデノウイルス粒子（ｖｐ／ｍＬ））を基準とする。これら高収率のアデノウイルスは、例えば高細胞密度の培養物を感染して得られる（例えば欧州特許第０８１６８１８１．９号明細書）。これら高濃度のアデノウイルス粒子を含む高密度細胞懸濁液のさらなる精製が、本発明により可能である。多量の細胞残屑および宿主細胞ＤＮＡを含む、これらの懸濁液の処理が可能となることで、懸濁液の容量当たり多量のアデノウイルス粒子の精製が可能となる。本発明の利点は、高濃度のアデノウイルス粒子を有する高細胞密度の細胞内容バッチを処理して、処理容量当たりの収率が非常に高い状態でアデノウイルス粒子を回収することが可能な方法を提供できることである。この方法は、大規模な細胞培養物に適用可能であるが、細胞を小規模で培養し、高細胞密度とすることで効率的に処理可能な高アデノウイルス収率を達成することができる。この方法は、非常に濃縮されたアデノウイルスバッチの処理を可能とすることで、アデノウイルス精製香料の全体にとって、大きな影響を与えるものとなろう。
【００６５】
＜アデノウイルスおよび生産細胞＞
本発明は、アデノウイルスの精製に関する。本発明のアデノウイルスは、野生型の、修飾された、突然変異型のアデノウイルスおよび／または組換えアデノウイルスベクターである。遺伝子ワクチン接種および／または遺伝子治療の応用において、「内部のない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクターを含む、Ｅ１の欠失またはさらなる欠失を有する、第１または第２継体の複製不全アデノウイルスの使用が特に注目される。アデノウイルスゲノムは、一般的にヒトに害のない症状に関連する。ゲノムは、それぞれのベクターを構成するのに用いられる方法によっては、操作に影響を受けやすい。複製不全ウイルス、例えば組換えアデノウイルス３５（ｒＡｄ３５）または２６（ｒＡｄ２６）ベクター（本明細書に例示するもの）は、欠失を補足する生産細胞株を必要とする。
【００６６】
生産細胞（従来技術および本明細書で「パッケージング細胞」、「補完細胞」または「宿主細胞」とも表記される）は、あらゆる生産細胞であって、望ましいアデノウイルスを増殖できる。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルスの欠乏を補足する生産細胞内で行われる。このような生産細胞は、そのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有することが好ましく、このことからＥ１領域を欠失させた組換えアデノウイルスの補足を可能とする。なお、アデノウイルスは、Ａｄゲノムに重要でないＥ３領域に欠失を有するが、このような欠失は補足する必要はない。あらゆるＥ１補足再選細胞、Ｅ１によって不死化したヒト網膜細胞等、例えば９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書参照）、Ｅ１が形質転換された羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書参照）、Ｅ１が形質転換されたＡ５４９細胞（例えば国際公開第９８／３９４１１号、米国特許第５，８９１，６９０号明細書参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11:213〜219）、２９３等が使用できる。ある実施形態において、生産細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、９１１細胞またはＩＴ２９３ＳＦ細胞等である。好ましくは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ECACC, CAMR, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdomで１９９６年２月２９日に寄託されたＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０；米国特許第５，９９４，１２８号明細書参照）またはそれ由来の細胞が、生産細胞として使用される。
【００６７】
複製不全アデノウイルスベクターは、アデノウイルス若しくはキメラアデノウイルスのあらゆる種類、株、サブタイプまたは種類、株、サブタイプの組み合わせをベクターＤＮＡの発生源として用いて生産してもよく、この方法により、例えば特定の望ましい細胞種に感染する性能を有するアデノウイルスベクターの提供が可能となる（例えば国際公開第９６／２６２８１号、第００／０３０２９号参照）。本発明の好ましい実施形態において、ｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６は、アデノウイルスとして使用される。
【００６８】
当業者にとって、例えば米国特許第６，４９２，１６９号明細書または国際公開第０３／１０４４６７号およびその参考文献に開示した方法を用いた特定の宿主細胞の異なる抗原型のアデノウイルスベクターを増殖する可能性は公知である。例えば、Ｅ１欠失ｒＡｄ３５の増殖のため、Ａｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋを発現する特定の生産細胞を、例えば当業者に既知のＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３細胞等のＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する既存の生産細胞（例えば米国特許第６，４９２，１６９号明細書参照）を用いて生産することができる。或いは、かつ好ましくは、例えばＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３は、例えば本明細書に参考として完全に取り込まれる国際公開第０３／１０４４６７号に広範囲に亘って開示されている既存の（Ａｄ５−）補完細胞株、Ａｄ５のＥ４−ｏｒｆ６コーディング配列をｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６ベクターに包含させることによって、Ｅ１欠乏のｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６を増殖するための細胞の修飾がなくても使用することができる。従って、あらゆる抗原型のアデノウイルスベクターの増殖が、当業者に既知の手段および方法を用いて生産細胞において実施できる。アデノウイルスベクター、その構成方法およびその増殖方法は、例えば米国特許第５，５５９，０９９号、第５，８３７，５１１号、第５，８４６，７８２号、第５，８５１，８０６号、第５，９９４，１０６号、第５，９９４，１２８号、第５，９６５，５４１号、第５，９８１，２２５号、第６，０４０，１７４号、第６，０２０，１９１号、第６，１１３，９１３号明細書、Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses"、それぞれChapters 67および68,Virology, B. N. Fields et al, eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)並びに本明細書に述べた他の参考文献において周知である。
【実施例】
【００６９】
本発明は、以下の実施例でさらに詳細に説明されている。実施例は、本発明を何ら制限するものではなく、本発明を明確にする役割を果たすにすぎない。
【００７０】
＜実験例１：直接的なＴＦＦ清澄化は、高細胞密度からの採取を実施できない＞
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を３７℃のバイオリアクター内で培養し、無血清培養培地で３日間、Ａｄ３５を感染させた。細胞密度が２０〜３０×１０６細胞／ｍＬ、かつウイルス力価が１〜１．５×１０１２ＶＰ／ｍＬの状態で細胞を採取した。非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ−８０を、最終濃度がそれぞれ０．１％及び０．０５％となるように添加し、ウイルスを細胞から放出させた。溶解時間は、２〜２４時間とした。溶解後、ウイルスを含む採取物を接線流濾過（ＴＦＦ）によって清澄化した。
【００７１】
清澄化を、０．２μｍ（GE Healthcare, model CFP-2-E-4MA, 0.042m2）または０．６５μｍ（GE Healthcare, model CFP-6-D-4MA, 0.046m2）の中空糸フィルターを用いて実施した。溶解した採取物１Ｌを少なくとも３倍に濃縮した。清澄化後、フィード・アンド・ブリード操作で残液の３倍の容量を用いて洗浄操作を行った・。透過液のフラックスが１５〜４０ＬＭＨとなるよう、濾過実験を実施した。清澄化工程におけるウイルス回収率を測定したところ、以下の表の示す通りとなった。
【００７２】
【表１】
0005465331.tif 000002
【００７３】
清澄化後、ウイルス回収はできていなかった。これは、例えば欧州１３７１７２３号明細書および国際公開第２００６／０５２３０２号に、ＴＦＦの使用がアデノウイルス採取物を良好に清澄化する旨が記載されていたため、予期していなかった。明らかに、従来の方法の高細胞密度は、この工程を妨げ、直接的な清澄化に不適切なＴＦＦを示す。
【００７４】
＜実験例２：高細胞密度の懸濁液中の選択的な宿主細胞ＤＮＡ沈殿＞
細胞密度１×１０６細胞／ｍＬまでの選択的な宿主細胞ＤＮＡ沈殿については、従来技術(Goerke et al (2005)、米国特許第７３２６５５５号明細書)において実施されている。それには、（低細胞密度で）宿主細胞ＤＮＡの少なくとも８０％が、細胞懸濁液からのウイルス粒子収率９０％で、沈殿することができることを示す。しかしながら、高細胞密度の細胞懸濁液は多量の宿主細胞ＤＮＡおよび細胞残屑を含むため、このような選択的な沈殿が可能かどうかは全く知られていなかった。そのため、従来技術のデータが使用するＤＮＡ沈殿剤が高濃度であるとアデノウイルスも沈殿させることを示唆する一方で、より多量のＤＮＡ沈殿剤が必要となるものと予測された。
【００７５】
高細胞密度でのＤＮＡ沈殿の可能性を検討するため、細胞密度３０×１０６細胞／ｍＬまでの小規模な試験管中で、宿主細胞ＤＮＡ沈殿を試験した。選択的なＤＮＡ沈殿が、高細胞密度でも生じるかどうかを試験するために、小規模な試験管のモデルを迅速なスクリーニングツールとして用いた。
【００７６】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞をバイオリアクター内で培養し、アデノウイルス３５（Ａｄ３５）を感染させ、３７℃の無血清培養培地で３日間培養した。細胞を細胞密度２〜３０×１０６細胞／ｍＬおよびウイルス力価８×１０１０〜１．５×１０１２ＶＰ／ｍＬで採取した。非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ−８０を、最終濃度がそれぞれ０．１％および０．０５％となるように添加し、２〜２４時間の細胞溶解を行った。４０ｍＭ  ＮａＣｌ中の高濃度の臭化ドミフェン（ＤＢ）を、溶解した採取物３．５ｍＬに添加し、その後、直ぐに１分間ボルテックスした。沈殿した物質を０．４５μｍフッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）シリンジフィルターで取り除いた。濾液をＡｄ３５と宿主細胞ＤＮＡ濃度について、それぞれＨＰＬＣ−ＡＥＸおよびＱ−ＰＣＲ分析を用いて分析した。
【００７７】
図１は、ウイルス回収率および沈殿した宿主細胞ＤＮＡを、臭化ドミフェンの濃度に対してプロットしたものを示す。三角形で示した曲線は、細胞密度２．５×１０６〜３．５×１０６細胞／ｍＬの細胞培養採取物から得られた。丸で示した曲線は、細胞密度２０×１０６〜３０×１０６細胞／ｍＬの細胞培養採取物から得られた。低細胞密度および高細胞密度でのＣ＊（９０％ウイルス回収を示す臭化ドミフェン濃度）並びに関連する沈殿した宿主細胞ＤＮＡの割合をグラフに示した。
【００７８】
宿主細胞ＤＮＡの９０％超を細胞密度２０×１０６〜３０×１０６細胞／ｍＬで沈殿するために必要とされるＤＢ濃度は、１０倍より低い細胞密度で必要とされるＤＢ濃度と比較して少なくとも２．５倍高かった。驚くべきことに、ＤＢ濃度を高くしても、より低い細胞密度で得られた曲線から予期されるようにウイルス粒子の沈殿は生じなかった。
【００７９】
細胞密度１８×１０６〜２５×１０６細胞／ｍＬの細胞培養採取物についても同様の実験を行った。図２は、ウイルス回収率および宿主細胞ＤＮＡ沈殿率を、臭化ドミフェン濃度に対してプロットしたものを示す。三角形で示した曲線は、細胞密度２．５×１０６〜３．５×１０６細胞／ｍＬの細胞培養採取物から得られた。丸で示した曲線は、細胞密度１８×１０６〜２５×１０６細胞／ｍＬの細胞培養採取物から得られた。低細胞密度および高細胞密度でのＣ＊（９０％ウイルス回収を示す臭化ドミフェン濃度）並びに関連する沈殿した宿主細胞ＤＮＡの割合をグラフ上に示した。
【００８０】
図１および２のグラフから分かるように、高細胞密度の懸濁液に関して９０％ウイルス回収が得られるようなＤＢ濃度（Ｃ＊）は、それぞれの実験で若干異なるが、これは通常の変化の一部である。しかしながら、グラフは、常に、選択的なＤＮＡの沈殿が高細胞密度においても可能であり、ＳＰＡ（ここではＤＢ）の適切な濃度は、低細胞密度培養より著しく高いが、推定したものより非常に低いことを示す。従って、当業者は、選択的な沈殿剤の適切な濃度は、固定的ではなく、むしろ幅があり、本明細書の開示に基づいて、適切な範囲を見出すことができることを認める。例えば、アデノウイルスを含む、細胞密度が約１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｍＬの高細胞密度の懸濁液の採取物を処理するのに適切な濃度のＤＢは、約１．３〜２ｍＭである。
【００８１】
これらの結果に基づいて、当業者は、ＤＮＡ沈殿が、さらにより高い細胞密度、例えば約４０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約５０×１０６細胞／ｍＬ、例えば約１００×１０６細胞／ｍＬ以下、例えば約１５０×１０６細胞／ｍＬ以下のアデノウイルスを含む懸濁液に関して推定でき、このように高細胞密度の懸濁液からのアデノウイルスが本発明の方法を用いて精製できることを認識できるであろう。
【００８２】
従って、本発明に従って、アデノウイルス粒子を高細胞密度の懸濁液から精製する際、選択的なＤＮＡ沈殿を使用することが可能である。
【００８３】
＜実験例３：大容量の高細胞密度の懸濁液における選択的な宿主細胞ＤＮＡ沈殿＞
ＤＮＡ沈殿を０．５Ｌ〜２０Ｌの規模で試験した。ＤＮＡ沈殿のために使用したＤＢ濃度は、上記の実験結果に基づくものである（図２）。小規模の試験管モデルとして測定された濃度Ｃ＊の約８０％を用いた。
【００８４】
潅流モードの際、ＡＴＦシステムを用いて実施した潅流を、細胞添加後４日目、細胞密度約２．５×１０総細胞／ｍＬで開始した。潅流開始１４日後、バイオリアクター内で、新鮮な無血清培地を用いて細胞密度約１３×１０６細胞／ｍＬまで細胞懸濁液を希釈した。その後、バイオリアクターをＡｄ３５ウイルス感染させた。感染５時間後、ＡＴＦシステムを培地交換速度1日当り２容器で開始した。感染３日後、細胞を採取した。採取時の細胞密度（ＣＡＤＨ）を表２に示す。
【００８５】
採取後、非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ−８０を最終濃度がそれぞれ０．１および０．０５％となるように添加することによって、細胞を２〜２４時間溶解した。臭化ドミフェンを、４０ｍＭ  ＮａＣｌ中の溶解した採取物に、最終濃度が０．７２および１．５２ｍＭとなるように添加した。異なる細孔サイズの２つの連続した荷電深層濾過を用いて、沈殿した溶解物を清澄化した。双方のフィルターの推定される細孔サイズは、それぞれ〜１０−〜５μｍ（Millistak +CE20）および〜１〜０．２μｍ（Cuno Zeta plus 50CP）あった。第１のフィルターを使用し、大きな細胞残屑および不純物を取り除いた。前記前濾過後、第２のフィルターを使用し、残存する不純物および沈殿したＤＮＡを、ウイルスを含む懸濁液から取り除いた。一定のフラックス１００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間）で、圧力５ｐｓｉを達するまで清澄化を実施した。
【００８６】
表２は、方法のパラメーターおよび精製方法の結果を示す。容積、採取時の細胞密度（cell density at harvest（ＣＤＡＨ））およびウイルス力価に関して８つの異なる採取物を用いて、溶解、ＤＮＡ沈殿（ＤＮＡ  ｐｔｔ）および清澄化を実施した。採取物を２Ｌまたは１０Ｌのバイオリアクターから抽出した。沈殿工程に亘る沈殿した宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ−ＤＮＡ）およびウイルス回収の割合を測定した。
【００８７】
【表２】
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【００８８】
高細胞密度においても選択的な宿主細胞ＤＮＡの沈殿が高細胞密度で可能であると判断された。実際、ＤＢ濃度は上昇したが（２倍）、ウイルス粒子は沈殿せずに残存し（回収率が７０％を超えている点に注目のこと）、および９８超のＨＣ−ＤＮＡが減少した。
【００８９】
この方法は、高細胞密度の培養物から、ウイルス回収率を落とすことなく宿主細胞ＤＮＡを除去する方法を提供する。このようにして、工業的に必要とされる、大容量の高細胞密度の懸濁液の処理を可能とする。
【００９０】
実用的な理由から、１つのＤＢ濃度（１．５２ｍＭ）が、試験例４〜８における選択的なＤＮＡ沈殿に使用されたことに留意すべきである。前記試験例は、幅広い範囲の細胞密度（９．１×１０６〜２５．８×１０６ｖｃ／ｍＬ）のアデノウイルスを含む懸濁液が、１．５２ｍＭのＤＢで処理できることを示す。これは、適切な濃度の選択的な沈殿剤および細胞密度の間の関係が、十分に固定されたものでなく、変動するという前記概念と一致するため、沈殿剤の濃度の範囲は、一定の細胞密度に適合する。
【００９１】
アデノウイルスを含む、細胞密度が１０×１０６〜５０×１０６細胞／ｍＬの高細胞密度の懸濁液を処理するのに適したＤＢの濃度は、約１．３ｍＭ〜２．２ｍＭである。アデノウイルスを含む、細胞密度が１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｍＬの高細胞密度の懸濁液の採取物を処理するのに適したＤＢの濃度は、約１．３ｍＭ〜２ｍＭである。
【００９２】
高細胞密度でのいくつかの試験例（試験例６および７）は、低細胞密度の採取物と比較して、ウイルス回収率が低く、第２のフィルターに亘るフィルター性能が観測されたことに留意する。なお、に、２つの連続した異なるフィルターの使用は、繁雑で、費用のかかる工程であるといえる。
【００９３】
＜実験例４：選択的な宿主細胞ＤＮＡ沈殿後、ＴＦＦによる高細胞密度のアデノウイルス調製の単一の清澄化工程＞
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を潅流バイオリアクター内で培養し、Ａｄ３５を感染させ、３６℃、無血清培養培地で３日間培養した。細胞密度が２０〜３０×１０６細胞／ｍＬ、かつウイルス力価１〜１．５×１０１２ＶＰ／ｍＬの状態で細胞を採取した。非イオン界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ−８０を最終濃度がそれぞれ０．１および０．０５％となるように添加して、細胞からウイルスを放出させた。溶解時間は、２〜２４時間とした。細胞を溶解した後、清澄化工程の前に、ＤＮＡ沈殿工程を実施した。
【００９４】
４０ｍＭ  ＮａＣｌ中、０．０６３％〜０．０７７％の臭化ドミフェン（ＤＢ）を用いて、ＤＮＡ複製を実施した。ＤＢの添加時間を２時間とし、撹拌速度を０．１７から１．５２ｍ／ｓ−１として、ＤＮＡ沈殿を３時間実施した。０．６５μｍの中空糸フィルター（GE Healthcare, model CFP-6-D-4MA, 0.046m2）での接線流濾過を用いて、清澄化を実施した。溶解し、ＤＮＡ沈殿した採取物１Ｌを少なくとも３倍に濃縮した。清澄化後、フィード・アンド・ブリード操作において残液の３倍の容量で洗浄を行った。透過液フラックスを１５〜４０ＬＭＨとして、濾過実験を実施した。３つの異なる採取物を用いて、溶解後、ＤＮＡ沈殿および清澄化を行った。選択的な沈殿および清澄化後、沈殿した宿主細胞ＤＮＡ、１×１０１１ウイルス粒子当りの宿主細胞ＤＮＡ濃度およびウイルス回収率の割合を測定し表３に示した。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
前記実験例と同様に、予想外に、選択的なＤＮＡ沈殿が高細胞密度においても可能であることが示された。実際に、ＤＢ濃度が上昇したが、ウイルス粒子は沈殿せずに残存し（回収率が８０％より高い点に注目のこと）、９９％超のＨＣ−ＤＮＡが減少した。
【００９７】
実験例１の失敗にも関わらず、この実験例において、接線流濾過を選択的なＨＣ−ＤＮＡ沈殿と組み合わせて使用した場合、高細胞密度の懸濁液を清澄化することを可能としたことを示す。
【００９８】
２つの異なる深層フィルターの組み合わせ（前記に例示する）の代わりに、接線流濾過を使用することは、高細胞密度の懸濁液を１回の清澄化工程で清澄化したアデノウイルス懸濁液とする可能性を提供する。
【００９９】
接線流濾過の使用した選択的なＨＣ−ＤＮＡ沈殿の組み合わせは、高細胞密度の懸濁液の採取物から宿主細胞ＤＮＡを取り除くことを可能とし、驚くべきことに、アデノウイルス回収率を落とすことなく可能である。実際、この方法を用いた完全なアデノウイルスの回収率は、深層濾過を用いた典型的な２工程の清澄化濾過方法を用いたものより高くすることができる。また、本発明は、深層濾過方法と比較して、より簡便で費用のかからない精製過程を要する精製方法を提供する。このようにして、工業的過程に必要とされる大容量の高細胞密度の懸濁液の処理を可能とする。
【図１】
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【図２】
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