(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、アミノ酸ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）をコードする核酸配列を含む単一のベクターを含むレンチウイルスベクターシステムを含んでなる、パーキンソン病被験体における経口Ｌ−Ｄｏｐａ投与に関連するジスキネジアの改善のための医薬組成物。
【請求項２】
ベクターシステムは、一以上の下記の特徴、
（ｉ）少なくとも一つの核酸配列が、Ｎ末端タグを欠いている、
（ｉｉ）少なくとも一つの核酸配列が、コドン最適化されている、
（ｉｉｉ）ベクター系が３シストロン性カセットを含む場合、３シストロン性カセット中の遺伝子の順序が、ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１である、
（ｉｖ）ｇａｇの少なくとも一つの潜在的ＡＴＧ開始コドンが、ＡＴＴＧに変更されている、
（ｖ）Ｎｅｏ発現カセットが、ｇａｇの下流に挿入されている、及び
（ｖｉ）ベクター系が３シストロン性カセットを含む場合、発現を強化するためにウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が３シストロン性カセットの３’末端に挿入されている、
を有する請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病の予防および／または治療で使用するためのドーパミン補充遺伝子療法のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミン作動系の補充は、現在使用されているパーキンソン病（ＰＤ）に対する最も効果的な治療方法であると考えられている。最初に、ＰＤの患者は、ドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡを用いる薬理学的治療から優れた恩恵を経験する。しかし、慢性的なＬ−ＤＯＰＡ摂取により、ほとんどのＰＤ患者は薬物に対する運動応答に変動を示し、ジスキネジアと呼ばれる異常な不随意性運動を起こす。多くの場合、患者は、支障をきたすジスキネジアにより悪化する薬物服用（ＯＮ−ｄｒｕｇ）期間と、患者が運動不能である薬物非服用（ＯＦＦ−ｄｒｕｇ）期間の間を循環する。ジスキネジアおよび運動の変動は、少なくとも一部分、Ｌ−Ｄｏｐａの間欠的な経口摂取およびその後の線条体ドーパミン受容体の拍動性刺激に起因すると考えられる。この概念は、ドーパミンの連続送達が、線条体におけるドーパミン作動性緊張を回復することによって、ジスキネジアを阻止し得ることを示唆する。
【０００３】
連続的なドーパミン産生を線条体において実現させる一つの方法は、胎児の組織または幹細胞の細胞移植を使用することである。しかし、幹細胞の黒質への移植は限られた成果しか挙げていない（Ｌｉｎｄｖａｌｌ  Ｏ．＆Ｂｊｏｅｒｋｌｕｎｄ  Ａ．（２００４）ＮｅｕｒｏＲｘ  １：３８２−３９３；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４：５０４−５０６；Ｌｉ  Ｊ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４：５０１−５０３；Ｂｒａａｋ  Ｈ．＆Ｄｅｌ  Ｔｒｅｄｉｃｉ  Ｋ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４：４８３−４８５）。従って、線条体におけるドーパミン作動性緊張を回復させるかまたは維持するが、胎児組織／幹細胞アプローチに付随する問題を回避する、パーキンソン病の治療法に対する必要性がある。
【０００４】
経口Ｌ−Ｄｏｐａ処置に関連する第２の種類の合併症は、認知障害である。ＰＤは、背側線条体（「運動」線条体）におけるドーパミン枯渇を主な特徴とするが、その一方で腹側線条体（「認知」線条体）および同様に前頭前皮質におけるドーパミン機能は、比較的無傷であるかまたはさらにアップレギュレートされる。薬理学的なＬ−Ｄｏｐａ処置は、全ての脳のドーパミン作動系を刺激するため、それは、無傷の腹側線条体および皮質に非常に「過剰投与」され、関連する認知機能を損なう。この機構も、全身性のＬ−Ｄｏｐａ処置のその他の副作用、例えば精神病性の症状または病的賭博などの原因となり得る。よって、ＰＤにおける主な課題は、緊張性および局所性の両方の線条体ドーパミンレベルを背側線条体まで回復させることである。
【０００５】
本発明者らは、ドーパミン補充遺伝子療法戦略を使用し、ＰＤの非ヒト霊長類モデルにおいてその生化学的および機能的効力を実証した。
【０００６】
驚くことに、インビボの霊長類データは、遺伝子治療によるドーパミン補充の多くの予期せぬ利点を示し、それは下に示すように、インビトロまたはげっ歯類モデルデータから予測することができなかった。
（ｉ）ドーパミン補充遺伝子療法は、緊張性および局所性の両方の線条体のドーパミンレベルを背側線条体間で回復させる。Ｌ−Ｄｏｐａ処置とは違って、ドーパミン補充遺伝子療法は、腹側（「認知」）線条体または前頭前皮質に過剰投与することなく、背側の（「運動」）線条体においてドーパミンを増加させる。このことは、腹側線条体に関連する認知機能の障害を回避する。
（ｉｉ）ドーパミン補充遺伝子療法は、線条体においてドーパミン作動性緊張を回復することによりジスキネジアを予防する一方で、幹細胞移植に付随する問題を回避する。本発明者らは、任意のドーパミン補充戦略の成功の主要な要因の一つが、線条体を神経支配する黒質のドーパミン作動性末端で発現されるドーパミン能動輸送体（ＤＡＴ）の不在であることを見出した。幹細胞／胎児組織戦略は通常、ドーパミン作動性細胞を患者の黒質に移植することを伴う。ＤＡＴのレベルは、移植組織において比較的高い。理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、ＤＡＴの存在が、移植細胞により産生される細胞外ドーパミンを隔離し、それによりドーパミン作動性緊張を回復させる治療法に対する能力を低下させるものと予測する。本発明で使用されるドーパミン補充遺伝子療法において、ベクターは、ドーパミン合成に関与する遺伝子を線条体に送達する。線条体におけるドーパミン作動性末端の数、および従ってＤＡＴレベルは、パーキンソン病の患者において低下するため、従ってドーパミン産生がより効果的である。
（ｉｉｉ）本発明において用いられるドーパミン補充遺伝子療法戦略は、パーキンソン病に関連する運動機能障害を矯正する。この治療法は、淡蒼球内節（ＧＰｉ）などの出力核の異常な活動亢進を正常化することが見出された。ＧＰｉにおけるニューロン発火のパターンの分析により、本発明において用いられるドーパミン補充遺伝子療法戦略が、バースト当たりのスパイクの数およびバースト事象の数を非ＰＤ対照に観察されるものと同様のレベルまで低下させることが明らかとなった。本発明において用いられるドーパミン補充遺伝子療法戦略はまた、視床下核（ＳＴＮ）の代謝活性を正常化した。ＳＴＮにおけるニューロンの活動亢進は、ＰＤ被験体において検出可能な代謝活性の増加を引き起こすＰＤの病態生理学的特徴である。
（ｉｖ）本発明において用いられるドーパミン補充遺伝子療法戦略は、線条体において産生される生理学的レベル以下（ｓｕｂ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｅｖｅｌｓ）のドーパミンを引き起こす。しかし、これは、ドーパミン作動性緊張を回復させるため、運動障害を矯正するため、薬物誘発ジスキネジアを防ぐため、かつ主要な基底核出力核の正常な生理機能を回復させるために十分であった。及び、
（ｖ）本発明において用いられるドーパミン遺伝子補充戦略は、経口Ｌ−ＤＯＰＡ投与に関連するジスキネジアを寛解することができる。このことは、遺伝子に基づくアプローチが、長期のＬ−Ｄｏｐａ処置により既にジスキネジアを発症しているＰＤ患者において治療効力をもたらし、かつ、ジスキネジア生理学的機構を逆転させる、両方の可能性があり、従ってＬ−Ｄｏｐａ処置法の後に続いて起こる事態を防ぐことを意味する。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、被験体の背側および腹側の両方の線条体において一定の生理学的ドーパミン作動性緊張を維持するかまたは回復させるための、ドーパミン補充遺伝子療法を使用することにより認知障害を引き起こすことなく、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するための方法を提供する。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、ドーパミン補充遺伝子療法のためのベクター系を被験体に投与することによる、パーキンソン病被験体の基底核および／または視床下核においてニューロンの電気的活動を正常化するための方法を提供する。
【０００９】
ベクター系の投与は、ＧＰｉにおけるニューロン発火のパターンにおけるバースト当たりのスパイクの数および／またはバースト事象の数のＰＤに関連する増加を低下させる、正常化させる、または防ぐことができる。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、ドーパミン補充遺伝子療法のためのベクター系を被験体に投与することによる、パーキンソン病被験体において経口Ｌ−ｄｏｐａ投与に関連するジスキネジアを治療および／または予防するための方法を提供する。
【００１１】
第４の態様において、本発明は、自発運動活性を維持するために必要なＬ−Ｄｏｐａの一日量を減少させるための方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、
（ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）によるドーパミンの隔離を回避することによる、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するためのドーパミン補充遺伝子療法の効力を増大させるための、
（ｉｉ）被験体の背側および腹側の両方の線条体において一定の生理学的ドーパミン作動性緊張を維持するかまたは回復させるために、ドーパミン補充遺伝子療法を使用することにより認知障害を引き起こすことなく、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するための、
（ｉｉｉ）パーキンソン病被験体の基底核および／または視床下核においてニューロンの電気的活動を正常化するための、
（ｉｖ）ドーパミン補充遺伝子療法のためのベクター系の被験体への投与によりパーキンソン病被験体において経口Ｌ−ｄｏｐａ投与に関連するジスキネジアを治療および／または予防するための、
ベクター系も提供する。
【００１３】
本発明はまた、医薬組成物の製造において、
（ｉ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）による細胞外ドーパミンの隔離を回避することによる、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するためのドーパミン補充遺伝子療法の効力を増大させるための、
（ｉｉ）被験体の背側および腹側の両方の線条体において一定の生理学的ドーパミン作動性緊張を維持するかまたは回復させるために、ドーパミン補充遺伝子療法を使用することにより認知障害を引き起こすことなく、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するための、
（ｉｉｉ）パーキンソン病被験体の基底核および／または視床下核においてニューロンの電気的活動を正常化するための、
（ｉｖ）ドーパミン補充遺伝子療法のためのベクター系の被験体への投与によりパーキンソン病被験体において経口Ｌ−ｄｏｐａ投与に関連するジスキネジアを治療および／または予防するための、
本明細書に定義されるベクター系の使用も提供する。
【００１４】
本発明はまた、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）による細胞外ドーパミンの隔離を回避するステップを含む、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するためのドーパミン補充遺伝子療法の効力を増大させるための方法も提供する。
【００１５】
ドーパミン補充遺伝子療法において、例えば、細胞外ドーパミンの隔離は、重要なＤＡＴ発現が欠けている組織、例えばパーキンソン病線条体などに該ベクター系を投与することにより回避される。
【００１６】
あるいは、またはそれに加えて、ドーパミンの隔離は、被験体におけるＤＡＴ発現および／または活性の抑制によって回避され得る。
【００１７】
上記の態様に関連して、ドーパミン補充遺伝子療法に使用されるベクター系は、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１をコードする核酸配列を含んでよく、かつ、次の特徴のうちの一つ以上を有する。
（ｉ）少なくとも一つの核酸配列が、Ｎ末端タグを欠いている。
（ｉｉ）少なくとも一つの核酸配列が、コドン最適化されている。
（ｉｉｉ）ベクター系が３シストロン性カセットを含む場合、３シストロン性カセット中の遺伝子の順序が、ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１である。
（ｉｖ）ｇａｇの少なくとも一つの潜在的ＡＴＧ開始コドンが、ＡＴＴＧに変更されている。
（ｖ）Ｎｅｏ発現カセットが、ｇａｇの下流に挿入されている。及び
（ｖｉ）ベクター系が３シストロン性カセットを含む場合、発現を強化するためにＷＰＲＥが３シストロン性カセットの３’末端に挿入されている。
【００１８】
ドーパミン補充遺伝子療法に使用されるベクター系は、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１をコードする核酸配列を有する単一のベクターを含んでよい。
【００１９】
ベクター系は、例えば、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのベクター系であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】＜Ｌｅｎｔｉ  ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１が、パーキンソン症を矯正する＞  ＭＰＴＰで処置したマカクザル（黒色線、ｎ＝１８）は、それらの対照のＭＰＴＰ前の状態と比較して著しく障害を受け、重度のパーキンソン症を示した（ａ、ｂ）。早くもレンチウイルス注入後２週で、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１をコードするＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を投与された動物（青色線、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）は、Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺを投与されたＭＰＴＰ動物（赤色線、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）またはウイルス注入されていない動物（灰色線、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）と比較して、無動症（ａｋｉｎｅｓｉａ）（ｂ）に有意な改善があった。行動性の利益は、ＭＰＴＰおよびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ対照動物（ａ、ｂ）と比較して、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入後９ヶ月まで持続した。１頭のＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物を、レンチウイルス注入後３０ヶ月間追跡し、その動物は安定した運動矯正を示した。（ｗ、遺伝子導入後の週数；Ｍ、遺伝子導入後の月数）＊＊ｐ＜０．０１  正常なＭＰＴＰ病変前の状態と比較、＊Ｐ＜０．０５  ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺおよびＭＰＴＰ−長期動物と比較。全てのデータは平均値±標準誤差で表す。
【図２】＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１ウイルスベクターの線条体送達後の導入遺伝子の発現＞  正常な病変のない動物（Ａ、Ｅ、Ｉ）と比較して、低倍率で（Ａ−Ｃ、Ｅ−Ｇ、Ｉ−Ｋ）、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１の免疫反応性は、特にＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ動物の線条体の背側の面（Ｂ、Ｆ、Ｊ）において、大いに低下した。その一方、ＴＨ（Ｃ）、ＡＡＤＣ（Ｇ）およびＣＨ１（Ｋ）の免疫反応性の顕著な増加が、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を注入された動物の交連および後交連被殻において針トラックの近傍で見られた。それよりも高い倍率のＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入領域の顕微鏡写真は、被殻の神経網およびＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１に陽性のニューロン（Ｄ、Ｈ、Ｌ）の至るところに免疫反応性線維を示す。矢印は、針トラックを示す。線条体は図Ｆ、Ｊ、Ｋ中で輪郭が描かれている。（Ｐ、被殻；Ｃｄ、尾状核；図Ａ中のバー・スケールは、Ｄ、Ｈ、Ｌを除く全ての図に適用される；図Ｄ中のバー・スケールは、図Ｄ、ＨおよびＬに適用される）。
【図３】＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１が、線条体のドーパミン作動性緊張を回復させる＞  ａ＜死後の全組織ドーパミン［ＤＡ］ｗｔ＞被殻から採取したパンチにおいて測定されたドーパミン濃度の図表示。試料を、死後のＬｅｎｔｉ−ｌａｃＺ注入（赤色棒）ＭＰＴＰマカクザルおよびＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入（青色棒）ＭＰＴＰマカクザルから採取した。＊は、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ対照と比べてドーパミンレベルの有意な増加を表す（ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。  ｂ＜インビボ細胞外ドーパミン［ＤＡ］ｅｃ＞正常霊長類（病変のない、遺伝子導入されていないもの、白色棒）、およびＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１、青色棒）、Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ、赤色棒）を投与されたかまたは無処置（ＭＰＴＰ−長期、灰色棒）のＭＰＴＰ霊長類における、細胞外ドーパミンレベル。微小透析プローブを、微小透析手順に従うインビボＴ２＊ＭＲＩイメージングにより示される、各々の動物の後交連被殻に設置した。ベースラインドーパミンレベルは、ＭＰＴＰ動物の正常ドーパミンレベルの２６％に低下し、この動物での重度のドーパミン枯渇が示される。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺではない）は、処置動物において線条体の細胞外ドーパミンレベル［ＤＡ］ｅｃを有意に増加させた（それぞれ正常な霊長類の６０％および２３％、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  ｐ＜０．０５）。  ｃ  Ｌ−ＤＯＰＡ曝露の後、細胞外ドーパミンレベルは、ＭＰＴＰ−長期動物の１．１７倍と比較してＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物において２．２５倍増加し、Ｌ−ＤＯＰＡとＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１との間の相互作用を許容する可能性が示唆される。  ｄ  Ｌ−ＤＯＰＡ曝露の後、線条体における細胞外Ｌ−ＤＯＰＡレベルは、Ｌ−ＤＯＰＡ注入の後にＭＰＴＰ−長期およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ群においてのみ増加した。注入されたＬ−ＤＯＰＡの大部分は正常動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物においてＤＡに変換されたことが示唆される。
【図４】＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１が、正常な基底核機能を回復させる＞  ａ、ｂ、ｃ  正常動物、ＭＰＴＰ動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物における単一記録（Ｕｎｉｔａｒｙ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）（＞２０ＧＰｉニューロン）。  ａ  大脳基底核出力（ＧＰｉ）内の２秒の基底休息（ｂａｓａｌ  ｒｅｓｔ）単一ニューロン活動の説明図。対照と比較して薬物にナイーブな非処置ＭＰＴＰマカクザルにおける、ＧＰｉニューロンの平均発火率の大幅な増加、およびより大きなバースト活性に注意されたい。レンチウイルスドーパミン遺伝子治療は、ＭＰＴＰ  ＧＰｉニューロンにおいて異常な高い発火率を大幅に低下させ、この構造において正常な発火率を回復し  ｂ、正常なバースト率を回復した  ｃ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  正常な病変のない動物と比較＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１  ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物と比較  ｄ、ｅ、ｆ、ｇ  ３Ｄ［１４Ｃ］２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）イメージングから明らかな、ＭＰＴＰ処置霊長類の運動性線条体へのＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の注入後の視床下核（ＳＴＮ）内の代謝活性の正常化。  ｄ  右および左のＳＴＮを、３Ｄ再構築後にニッスル染色された脳切片について手で分割した（一つのＳＴＮ当たり１０〜１３切片）。これらの２つの関心領域（ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＶＯＩ）を、対応するオートラジオグラフによる同じ位置合わせをした（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）領域の上に直接マッピングした  ｅ。  ｆ  １頭の対照霊長類由来のＳＴＮと同じレベルで撮影した個々の左脳半球のオートラジオグラフィー画像、一つはＭＰＴＰ処置霊長類、一つはイメージング調査の５２週前にＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１５２を注入したＭＰＴＰ処置霊長類。シグナル強度は、同じグルコース使用の定量的スケールに従って色分けされる（右）。ｇ  ＭＰＴＰ処置霊長類（正常対照の＋２８．６％）で観察される、ＳＴＮの代謝亢進が、単一用量のＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（正常対照の＋１０．９％）により正常化されたことに注意されたい。
【図５】＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１が、ジスキネジアを予防する＞  ａ＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１は、薬物非投与時の（ＯＦＦ−ｄｒｕｇ）ジスキネジアを誘導しない＞Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１は、ドーパミンにより媒介される運動行動を全身のＬ−ＤＯＰＡ（図Ｓ１２）により得られるものと同じレベルまで矯正するが、長期（９ヶ月）でジスキネジアを誘導しなかった。  ｂ＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１は、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発ジスキネジアを予防する＞ドーパミン作動系の薬理学的処置を使用して、本発明者らは、ドーパミンの内因性レベルと外因性ドーパミン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の相互作用を研究した。Ｌ−ＤＯＰＡの急性全身投与により、薬物にナイーブなＭＰＴＰ動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ動物において、舞踏病および失調症などの運動障害性の動作が誘発された。それに反して、ＭＰＴＰ  Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物のような、正常な病変のない動物は、運動障害性の動作の証拠を少しも示さなかった。
【図６】＜インビトロでのレンチウイルスドーパミン産生＞  ｐＯＮＹ８．１ＴＳＩＮは、前のラット実験で使用したベクターであった（Ａｚｚｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０３０２−１０３１２）。本実験で使用した新しいベクターｐＯＮＹ８．９．４ＴＹ（Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１）は、コドン最適化された遺伝子を有し、Ｎ末端ペプチドタグがなく、遺伝子の順序が変えられている点で上のベクターとは異なるが、使用されるＩＲＥＳ配列（格子の四角形（ｂｌｏｃｋｅｄ  ｂｏｘｅｓ））は同じ状態のままである。その上、ベクター主鎖は、５’ｎｅｏ遺伝子および３’ＷＰＲＥを含む。その上、ｇａｇ領域の全てのＡＴＧはＡＴＴＧに変異された（太い斜線の四角形）。これらの変化は、インビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して２ログのドーパミン産生の増加をもたらした。
【図７】＜立ち上がり行動＞  ＭＰＴＰで処置したマカクザル（黒色線、ｎ＝１８）は、それらの対照のＭＰＴＰ前の状態と比較して著しく障害を受け、重度のパーキンソン症を示した（ａ、ｂ）。早くもレンチウイルス注入後２週で、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１をコードするＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を投与された動物（青色線、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）は、Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺを投与されたＭＰＴＰ動物（赤色線、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）またはウイルス注入されていない動物（灰色線、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）と比較して、立ち上がりに有意な改善があった。行動性の利益は、ＭＰＴＰおよびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ対照動物と比較して、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入後９ヶ月まで持続した。１頭のＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物を、レンチウイルス注入後３０ヶ月間追跡し、その動物は安定した立ち上がり矯正を示した。ｗ、遺伝子導入後の週数Ｍ、遺伝子導入後の月数＊＊ｐ＜０．０１  正常なＭＰＴＰ病変前の状態と比較、＊Ｐ＜０．０５  ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺおよびＭＰＴＰ−長期動物と比較。全てのデータは平均値±標準誤差で表す。
【図８】＜神経毒ＭＰＴＰの全身投与の後の黒質緻密部（ＳＮｐｃ）の神経変性＞  正常なマカクザルと比較して、ＭＰＴＰマカクザルは、そのＳＮｐｃ（クレシルバイオレット）の深刻な細胞喪失を有した。これはドーパミン作動性ＴＨ−ｉｒニューロン（ＴＨ−ｉｒ）の大量の喪失を示し、［１４Ｃ］−２−デオキシグルコース（［１４Ｃ］−２ＤＧ）機能的イメージングにより評価されるように代謝機能低下をもたらす。
【図９】＜ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）免疫反応性＞  Ｃｄ：尾状核；Ｐｕｔ：被殻と比較した、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ動物における劇的かつ同等の背外側線条体除神経を示す、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）免疫活性の顕微鏡写真。
【図１０】＜ＥＩＡＶレンチウイルスベクターの向神経性＞  （ａ）ＮｅｕＮ、（ｂ）β−Ｇａｌおよび（ｃ）複合材料画像に対して染色された被殻を通しての共焦点顕微鏡画像。Ｃ中の黄色く見える細胞に注意されたい。この細胞は、β−ＧａｌおよびＮｅｕＮを共発現する細胞を示し、レンチウイルスがこれらのニューロンを形質導入したことを示す。
【図１１】＜死後の全組織ドーパミン［ＤＡ］ｗｔ＞被殻に関連する脳領域から採取したパンチで測定されるドーパミン濃度の図表示である。試料は、Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺを注入した（灰色棒）およびＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を注入した（青色棒）ＭＰＴＰマカクザルから死後に採取した。［＊は、対照と比較したドーパミンレベルの大幅な増加を表す（ｐ＜０．０５、ｎ＝３）］。
【図１２】＜Ｔ２＊ＭＲＩを用いる微小透析プローブのインビボ局在性＞
【図１３】＜ＭＰＴＰ中毒後のＳＮｐｃニューロンの立体解析学的カウント＞  ＳＮｐｃニューロンの立体解析学的カウントの図表示は、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１群（青色棒）とＬｅｎｔｉ−ｌａｃＺ群（灰色棒）との間に統計的有意差を示さなかった（ｎ＝３；ＫＷ  ｐ＜０．００１；Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  ｐ＜０．００１）。［ＳＮｐｃ：黒質緻密部；ＶＴＡ、腹側被蓋野、Ｒｎ：赤核；ｎｓ：統計上有意でない］。
【図１４】＜ＭＲＩにガイドされる線条体の注入の後の針トラック＞  ａ  インビボＴ２＊ＭＲＩ実験  ｂ  Ｎｉｓｓｌ組織学的解析（矢印）を用いる、交連後（ｐｏｓｔｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ）、背側、「運動」線条体内の針トラックの死後分析
【図１５】＜遺伝子導入の安全性：遺伝子導入の後の炎症マーカー＞
【図１６】＜遺伝子導入の安全性：インビボＭＲＩ実験＞
【図１７】＜薬理学的曝露の後の移動距離＞  ドーパミン作動系の薬理学的処置を用いて、ドーパミンの内因性レベルと外因性ドーパミン作用薬との間の相互作用を研究した（Ｌ−Ｄｏｐａまたはアポモルヒネ）。  Ｌ−Ｄｏｐａの全身投与とＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の注入（Ｌ−Ｄｏｐａを加えない）の両方は、薬物にナイーブなＭＰＴＰ霊長類において、運動活性を正常な霊長類の活性のレベルまで大幅に改善した。経口Ｌ−ｄｏｐａをＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入動物に添加することは、正常な病変のない動物と同様に、それらの運動行動をあまり変えなかった。  ａ  運動障害促進性の短時間作用型Ｄ１／Ｄ２ドーパミン受容体刺激薬（アポモルヒネ）の急性全身投与は、薬物にナイーブなＭＰＴＰ動物において多数の舞踏病および失調症などの運動障害性の動作を伴う多動行動を誘導した。それに反して、ＭＰＴＰ  Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物のような、正常な病変のない動物は、運動障害性の動作の証拠を少しも示さなかった。  Ｓｐｏｎｔ、薬物投与をせずに測定される自発的運動活性。Ａｐｏ、アポモルヒネ投与。矢印は、アポモルヒネを曝露したＭＰＴＰ動物における過剰な運動活性を示し、それはこれらの動物におけるジスキネジア誘導と相互に関連する。＊＊ｐ＜０．０１  アポモルヒネ投与後のＭＰＴＰ動物の運動活性と比較、＊Ｐ＜０．０５  ＭＰＴＰ動物における自発的運動活性と比較。Ｎ．Ｓ．、統計上有意でない
【図１８】＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１で処置したＭＰＴＰ霊長類におけるＬ−ＤＯＰＡにより誘導されたジスキネジアの回復＞
【図１９】＜Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（ｐＯＮＹ８．９．４ＴＹ）の部分配列＞  ＥＩＡＶ  Ｒ領域の始めからＳＩＮ  ＬＴＲの末端までのｐＯＮＹ８．９．４ＴＹのヌクレオチド配列。下に線の引かれた配列は、ｇａｇの変更を示す。これらはＡＴＧからＡＴＴＧに変化している。Ｎｅｏは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＯＲＧを示す；ＣＭＶｐは、ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーターを示す；ｔＴＨは、末端切断型のコドン最適化されたチロシンヒドロキシラーゼＯＲＦを示す；ＡＡＤＣは、コドン最適化された芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼＯＲＦを示す；ＣＨ１は、コドン最適化されたＧＴＰシクロヒドロラーゼ１ＯＲＦを示す；ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを示す；ＳＩＮＬＴＲは、自己不活化ＥＩＡＶ  ＬＴＲを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜パーキンソン病＞
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質線条体経路の喪失を特徴とする神経変性障害である。パーキンソン病の原因は不明であるが、それはドーパミン作動性（チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性）中脳ニューロンの進行性の死に関連し、運動機能障害を誘発する。パーキンソン病の特徴的な症状は、ＴＨ陽性黒質線条体ニューロンの７０％までが変性した時に現れる。
【００２２】
現在、パーキンソン病のための満足のゆく治療法はない。疾患に関連する運動機能障害の対症療法は、ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の経口投与を含む。Ｌ−ＤＯＰＡは、血液脳関門を通過して輸送されてドーパミンに変換され、一部分は残りのドーパミン作動性ニューロンにより、運動機能の実質的な改善がもたらされる。しかし、数年後に、ドーパミン作動性ニューロンの変性が進行し、Ｌ−ＤＯＰＡの効果が低下し、副作用が現れる。
【００２３】
治療のための代替戦略は、線条体に移植される細胞から供給されるドーパミンが、失った黒質線条体細胞の代わりになり得るという考えに基づく神経移植である。臨床試験により、ヒト胚死体（中絶胎児）から得た中脳ＴＨ陽性ニューロンがパーキンソン病の患者の脳内で生存し機能し得ることが示された。しかし、機能回復はほんの一部分であった。そしてその手順の有効性および再現性は限られている（Ｌｉｎｄｖａｌｌ  Ｏ．＆Ｂｊｏｅｒｋｌｕｎｄ  Ａ．（２００４）ＮｅｕｒｏＲｘ  １：３８２−３９３；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４：５０４−５０６；Ｌｉ  Ｊ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４：５０１−５０３；Ｂｒａａｋ  Ｈ．＆Ｄｅｌ  Ｔｒｅｄｉｃｉ  Ｋ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １４：４８３−４８５）。
【００２４】
治療法のためのさらなる代替戦略は、遺伝子治療である。遺伝子治療は、次の２つの方法、すなわち、Ｌ−ＤＯＰＡまたはドーパミン合成を担う酵素（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）を導入することにより罹患した線条体中のドーパミンを置き換える、および、ＴＨ陽性ニューロンが死滅するのを防ぐか、損傷を受けた黒質線条体系において再生および機能回復を刺激することのできる潜在的な神経保護分子を導入する、ことによりパーキンソン病に使用することができると示唆されている（Ｄｕｎｎｅｔ  Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｂｊｏｅｒｋｌｕｎｄ  Ａ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９  Ａ３２−Ａ３９）。
【００２５】
＜遺伝子治療＞
遺伝子治療は、予防もしくは治療遺伝子を被験体に導入、置換、変更、または補充することによる疾患の予防および／または治療である。
【００２６】
遺伝子治療は、部位特異的な方法で中枢神経系に連続的にタンパク質を送達する強力な手段である。
【００２７】
本発明は、ドーパミン合成を担うかまたはドーパミン合成に関連する一つ以上の遺伝子を被験体に導入する、ドーパミン遺伝子治療に関する。
【００２８】
インビボで、ドーパミンは２つの酵素、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）および芳香族アミノ酸ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）によってチロシンから合成される。本発明のドーパミン遺伝子治療法では、ベクター系は、ＴＨおよびＡＡＤＣをコードする核酸配列を送達する能力があることが好ましい。両遺伝子の配列は入手可能である。それぞれ、受託番号Ｘ０５２９０およびＭ７６１８０である。
【００２９】
本発明で使用されるベクター系は、制御ドメインを欠くＴＨ遺伝子の末端切断型を含んでもよい。末端切断型ＴＨは、ドーパミンによる最終生成物のフィードバック抑制を回避する（Ｗｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９２）２６７：２５７５４−２５７５８）。チロシンヒドロキシラーゼの機能活性は、その補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の利用可能性によって決まる。補因子のレベルは、除神経した線条体において低い可能性があり、ベクター系がＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）も送達する能力があるならば、Ｌ−ＤＯＰＡの十分なレベルを確保するために、ＢＨ４合成の経路で律速段階を触媒する酵素がインビボで産生されることが好ましいと思われる。ＣＨ１遺伝子の配列も入手可能である。受託番号Ｕ１９５２３である。
【００３０】
また、ベクター系は小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２−受託番号Ｌ２３２０５．１）をコードする核酸配列も送達する能力を有してもよい。
【００３１】
そのため、ドーパミン補充遺伝子療法は、遺伝子ＴＨ、ＡＡＤＣ、ＣＨ１および／またはＶＭＡＴ２の１以上をコードする遺伝子を被験体に送達するためのベクター系の使用を含んでもよい。ベクター系は、例えばＴＨ、ＡＡＤＣ、およびＣＨ１をコードする遺伝子を被験体に送達することができる。そのようなベクター系は、国際公開第０２／２９０６５号において望ましい。
【００３２】
ベクターは、黒質線条体系における変性を遮断または抑制する能力のある増殖因子をコードする遺伝子をも含んでもよいし、または該遺伝子を別法として含んでもよい。そのような増殖因子の一例は、神経栄養因子である。例えば、この遺伝子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、パーセフィン増殖因子、アルテミン増殖因子、またはニュールツリン増殖因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）および／または汎親和性ニューロトロフィンをコードすることができる。
【００３３】
ベクターは、神経保護因子をコードする遺伝子をも含んでもよいし、または該遺伝子を別法として含んでもよい。特に、ＮＯＩは、ＴＨ陽性ニューロンが死滅するのを防ぐかまたは損傷を受けた黒質線条体系において再生および機能回復を刺激する分子をコードしてもよい。
【００３４】
＜ベクター系＞
本発明のドーパミン補充遺伝子療法では、ドーパミン合成に関与する遺伝子は、ベクター系、例えばウイルスベクター系などにより被験体に送達される。
【００３５】
本発明の状況において、用語「ベクター系」、「ベクター」および「ベクター粒子」は、標的細胞に一つ以上の対象のヌクレオチド（ＮＯＩ）を形質導入する能力のある実体を意味するために同義的に使用される。
【００３６】
ウイルスベクターを遺伝子治療に使用する概念は、周知である（Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２）。
【００３７】
ベクター系は、レトロウイルス、例えば、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ならびにレンチウイルスを含むあらゆるその他のレトロウイルス類に基づく。
【００３８】
本発明の方法で使用するベクター系は、レンチウイルスに基づくものでもよい。レンチウイルスは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を感染させることができる利点がある。
【００３９】
霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症状群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、原型「遅発性ウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）そしてより最近に記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。
【００４０】
本発明で用いるためのレトロウイルスベクター粒子は、プロデューサー細胞、例えば、必要な遺伝子が「三重トランスフェクション」法により導入されている細胞により作製されてよい。このアプローチでは、レトロウイルスベクター粒子を生成するために必要な３つの異なるＤＮＡ配列、すなわち、ｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列および一つ以上のＮＯＩを含有する（例えば、ドーパミン合成に関与する一つ以上の酵素をコードする能力のある）不完全レトロウイルスゲノムを、一時的トランスフェクションにより同時に細胞に導入する。国際公開第９４／２９４３８号には、この複数のＤＮＡの一時的トランスフェクション法を使用する、インビトロでのプロデューサー細胞の産生が記載されている。
【００４１】
Ｇａｇ−ｐｏｌ配列は、プロデューサー細胞において使用するためにコドン最適化されてもよい（下記参照）。
【００４２】
プロデューサー細胞にトランスフェクトされるヌクレオチド配列によりコードされるｅｎｖタンパク質は、同族のレトロウイルスまたはレンチウイルスｅｎｖタンパク質であってもよい。あるいは、それは、異種のｅｎｖ、または非レトロもしくはレンチウイルス由来のｅｎｖであってもよい（下の「シュードタイプ化」を参照）。
【００４３】
本発明の方法で使用するベクター系は、自己不活化（ＳＩＮ）ベクター系であってもよい。
【００４４】
例として、自己不活化レトロウイルスベクター系は、３’ＬＴＲのＵ３領域中の転写エンハンサーまたはエンハンサーとプロモーターを欠失させることによって構築されている。一連のベクター逆転写および組込みの後、これらの変更は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写的に不活性のプロウイルスが生成される。しかし、かかるベクターにおけるＬＴＲに対して内部にある任意のプロモーターは、なお転写的に活性であることになる。この戦略は、ウイルスＬＴＲ中のエンハンサーおよびプロモーターの、内部に配置された遺伝子からの転写への影響をなくすために用いられた。かかる影響には、転写の増加または転写の抑制が含まれる。また、この戦略を用いて、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流転写を排除することもできる。これは、内在性がん遺伝子の偶発的な活性化を防ぐことが重要であり得るヒト遺伝子治療において特に興味深い。
【００４５】
プロデューサー細胞からの高力価調節されたベクターの生成を促進する、リコンビナーゼ補助機構（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を使用してよい。
【００４６】
本明細書において、用語「リコンビナーゼ補助機構」には、限定されるものではないが、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ／ｌｏｘＰ認識部位、または３４ｂｐ  ＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）間の組換え事象を触媒するＳ．セレビシエの部位特異的ＦＬＰリコンビナーゼを使用する系が挙げられる。
【００４７】
３４ｂｐ  ＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）間の組換え事象を触媒するＳ．セレビシエの部位特異的ＦＬＰリコンビナーゼは、リコンビナーゼ補助組換え事象を用いて高レベルのプロデューサー細胞株を生成するために、ＤＮＡ構築物の中に設定されてきた。バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ／ｌｏｘＰ認識部位を用いる同様の系が開発されている。これは、高力価レンチウイルスプロデューサー細胞株が生成されるように、レンチウイルスゲノムの中に設定された。
【００４８】
プロデューサー／パッケージング細胞株を使用することにより、例えば、目的の部位（例えば成人脳組織など）のその後の形質導入のために、（例えば、適した力価のレトロウイルスベクター粒子を調製するために）多量のレトロウイルスベクター粒子を増殖および単離することが可能である。プロデューサー細胞株は、通常、大規模生成またはベクター粒子に有利である。
【００４９】
高力価ウイルス調製物を、脳などの組織での形質導入に使用することが望ましい。ウイルス力価を増加させる技法には、上に考察されるようなｐｓｉプラスパッケージングシグナルおよびウイルスストックの濃度を使用することが含まれる。
【００５０】
プロデューサー／パッケージング細胞のための高力価ウイルス調製物は、通常、１ｍｌ当たり約１０５〜１０７レトロウイルス粒子のものである。脳の形質導入には、非常に少量を使用する必要があるので、ウイルス調製物を超遠心分離により濃縮させる。限外濾過またはマトリックスとの結合およびマトリックスからの溶出などのその他の濃縮方法を使用してもよい。
【００５１】
中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と称される配列の存在は、非分裂細胞への遺伝子送達の効率を改善し得る。このｃｉｓ活性化エレメントは、例えば、ＥＩＡＶポリメラーゼコード領域エレメントに位置する。本発明で使用されるベクター系のゲノムは、ｃＰＰＴ配列を含んでもよい。
【００５２】
さらに、または別法として、ウイルスゲノムは、翻訳エンハンサーを含んでもよい。
【００５３】
ＮＯＩは、一つ以上のプロモーター／エンハンサーエレメントに作動可能なように連結されていてよい。一つ以上のＮＯＩの転写は、ウイルスＬＴＲまたは代替的なプロモーター−エンハンサーエレメントの制御下であってよい。好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶなどの強力なウイルスプロモーターであるか、または、ＰＧＫ、β−アクチンまたはＥＦ１αなどの細胞の構成的プロモーターである。プロモーターは、制御されているかまたは組織特異的であってもよい。かかるプロモーターは、ニューロフィラメント、ネスチン、パーキン、ドーパミン受容体、チロシンヒドロキシラーゼなどの遺伝子から選択されてよい。また、かかるプロモーターは、μオピオイド受容体遺伝子に見出される配列などの神経拘束性抑制配列（ｎｅｕｒｏｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、グリア特異的またはニューロン特異的であってもよい。発現の制御は、外部の薬剤（この例では、テトラサイクリンまたはその類似体）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフに切り換えるテトラサイクリン系などの系を使用することにより達成することもできる。
【００５４】
本発明のベクター系は、異種ｅｎｖタンパク質、例えば狂犬病Ｇタンパク質またはＶＳＶ−Ｇタンパク質の少なくとも一部でシュードタイプされてもよい。シュードタイプレトロウイルスベクターに使用することのできるその他のエンベロープとしては、ロスリバーウイルスエンベロープ、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質、ならびにモコラ、エボラ、４０７０Ａおよびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）由来のエンベロープが挙げられる。
【００５５】
レンチウイルス最小系をＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶウイルスから構築することができることは実証されている。そのような系は、ベクター生成かまたは分裂および非分裂細胞の形質導入のいずれのためにも追加の遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆのいずれも必要としない。また、ベクター生成かまたは分裂および非分裂細胞の形質導入のいずれのためにもＳ２を必要としないＥＩＡＶ最小ベクター系を構築することができることも実証されている。追加の遺伝子の欠失は、非常に有利である。第１に、それはレンチウイルス（例えばＨＩＶ）感染における疾患病理に関連する遺伝子、例えばｔａｔなどを含まないベクターの生成を許容する。第２に、追加の遺伝子の欠失は、ベクターがより多くの異種ＤＮＡをパッケージングすることを許容する。第３に、機能の不明な遺伝子、例えばＳ２などを除外することができ、従って望ましくない作用を引き起こす危険性を低下させることができる。最小レンチウイルスベクターの例は、国際公開第Ａ９９／３２６４６号および国際公開第Ａ９８／１７８１５号に開示されている。
【００５６】
本発明で使用される送達系は、そのために少なくともｔａｔおよびＳ２を（それがＥＩＡＶベクター系である場合）、そして場合によりｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕおよびｎｅｆも欠いている。本発明の系はまた、ｒｅｖを欠いている。Ｒｅｖは、これまでは一部のレトロウイルスゲノムにおいて効率的なウイルス生成に必須であると考えられていた。例えば、ＥＩＡＶの例では、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列が含められるべきであると考えられていた。しかし、ｒｅｖおよびＲＲＥの必要性は、コドンの最適化によって、またはＭＰＭＶ系などのその他の機能的に同等の系による置き換えによって、低減または排除することができることが見出された。コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌの発現は、ＲＥＶに依存しないので、ＲＲＥをｇａｇ−ｐｏｌ発現カセットから除去することができ、従ってベクターゲノム中に含まれるいずれかのＲＲＥとの組換えの可能性を除去することができる。
【００５７】
本発明で使用されるベクター系のウイルスゲノムは、そのためにＲｅｖ応答配列／応答エレメント（ＲＲＥ）を欠いていてよい。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明で使用される系は、追加の遺伝子の一部または全部が除去されているいわゆる「最小」系に基づく。
【００５９】
ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１をコードする遺伝子を送達する能力のある、本発明で使用されるベクター系は、次の特徴の一つ以上を有してよい。
（ｉ）少なくとも一つの核酸配列が、Ｎ末端タグを欠いている。
（ｉｉ）少なくとも一つの核酸配列が、コドン最適化されている。
（ｉｉｉ）ベクター系が３シストロン性カセットを含む場合、３シストロン性カセット中の遺伝子の順序が、ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１である。
（ｉｖ）ｇａｇの少なくとも一つの潜在的ＡＴＧ開始コドンが、ＡＴＴＧに変更されている。
（ｖ）Ｎｅｏ発現カセットが、ｇａｇの下流に挿入されている。
（ｖｉ）ベクター系が３シストロン性カセットを含む場合、発現を強化するためにＷＰＲＥが３シストロン性カセットの３’末端に挿入されている。
【００６０】
これらの特徴は、下でより詳細に説明される。
【００６１】
＜Ｎ末端タグ＞
ポリヒスチジンタグまたはＦＬＡＧ（商標）タグのようなタグは、タンパク質精製、またはタグ特異的抗体を用いるタンパク質の検出を助けるためにタンパク質のＮ末端で一般的に使用される。タグは、タンパク質をコードするＤＮＡを、そのタグをコードする配列を含むベクターに挿入することにより付加されてもよく、タグは自動的にコード配列の中に含められる。あるいは、タグをコードする配列を開始コドンに隣接して有するプライマーを用いてＰＣＲを行ってもよい。
【００６２】
ドーパミン補充遺伝子療法に関して、コードされるドーパミン合成酵素がＮ末端タグを有する必要はない。Ｎ末端タグの存在は、そのために、不必要にゲノムの長さを増大させる。
【００６３】
＜コドンの最適化＞
コドンの最適化は、国際公開第９９／４１３９７号に既に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンの偏りは、細胞種中の特定のｔＲＮＡの相対存在量の偏りに相当する。配列中のコドンを変更して、コドンを対応するｔＲＮＡの相対存在量に一致するように作り変えることにより、発現を増加させることができる。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞種において希少であることが公知のコドンを意図的に選択することにより、発現を低下させることができる。よって、さらなる翻訳の程度の制御が可能である。
【００６４】
遺伝子治療系ならびにベクター系の成分により送達される遺伝子は、コドン最適化されてもよい。
【００６５】
ＨＩＶおよびその他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の希少コドンを使用し、これらを一般的に用いられる哺乳類コドンに対応するように変えることにより、哺乳類プロデューサー細胞中のパッケージング成分の発現の増加を実現することができる。コドン使用頻度は、哺乳類細胞に関して、ならびに多様なその他の生物に関して当技術分野で公知である。
【００６６】
＜ｇａｇ  ｐｏｌのコドンの最適化＞
コドンの最適化は、その他の利点も多くある。プロデューサー細胞／パッケージング細胞においてウイルス粒子の構築に必要なウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、配列を変更することによって、ＲＮＡ不安定配列（ＩＮＳ）を配列から除去する。同時に、パッケージング成分のためのアミノ酸配列コード配列は保持されるので、その配列にコードされるウイルス成分は同じままであるか、またはそのパッケージング成分の機能が損なわれない程度に少なくとも十分に類似している。また、コドンの最適化により、搬出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性が克服され、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。また、コドンの最適化により、ベクター系内の異なる構築物間の（例えばｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレーム中の重複部分の領域間）相同組換えが減少する。したがって、コドンの最適化の全体的な効果は、ウイルス力価の顕著な増加および安全性の向上である。
【００６７】
一実施形態では、ＩＮＳに関連しているコドンだけが、コドン最適化される。あるいは、フレームシフト部位を包含する配列を除いて、配列全体にコドンの最適化を行ってもよい。
【００６８】
Ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、それぞれｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。両タンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトによって決まる。このフレームシフトは、翻訳中のリボソームの「翻訳スリップ」の結果として起こる。この翻訳スリップは、少なくとも一部分、リボソームを停止させる（ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｓｔａｌｌｉｎｇ）ＲＮＡの二次構造により引き起こされると考えられる。そのような二次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶに関して、重複領域は、ｇａｇの始端の下流のヌクレオチド１２２２から（ここで、ヌクレオチド１がｇａｇ  ＡＴＧのＡである）ｇａｇの終端（ｎｔ１５０３）にかけて伸びている。結果的に、フレームシフト部位および２つのリーディングフレームの重複領域にまたがる２８１ｂｐ断片は、コドンの最適化を行わないことが好ましい。この断片を保持することは、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現を可能にすることになる。
【００６９】
ＥＩＡＶに関して、重複の開始はｎｔ１２６２とされている（この場合、ヌクレオチド１は、ｇａｇ  ＡＴＧのＡである）。重複の終わりは１４６１ｂｐである。フレームシフト部位およびｇａｇ−ｐｏｌ重複部分が保存されることを確保するために、ｎｔ１１５６から１４６５までの野生型配列が保持されている。
【００７０】
例えば、便宜な制限部位を提供するために、最適なコドン使用からの誘導を行ってよく、保存的アミノ酸変化をｇａｇ−ｐｏｌタンパク質に導入することができる。
【００７１】
遺伝子コードの縮重性により、熟練作業者により多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列を得ることができることは当然理解される。また、コドンを最適化したｇａｇ−ｐｏｌ配列を作製する出発点として使用することのできる多くのレトロウイルス変異体が記載されている。レンチウイルスゲノムは非常に変異性であってよい。例えばＨＩＶ−１にはなお機能性である多くの擬似種がある。これはＥＩＡＶの例にも当てはまる。これらの変異体を用いて形質導入プロセスの特定の部分を促進することができる。ＨＩＶ−１変異体の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖに見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ＮＣＢＩデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに見出すことができる。
【００７２】
コドンを最適化したｇａｇ−ｐｏｌ配列の戦略は、あらゆるレトロウイルスに関して使用することができる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む、全てのレンチウイルスに当てはまり得る。その上、この方法を用いて、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶならびにその他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増大させることができ得る。
【００７３】
コドンの最適化により、ｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にさせることができる。しかし、レトロウイルスベクターにおいて抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター生成系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にさせることが必要であり得る。従って、ゲノムも改変する必要がある。これは、ベクターゲノム成分を最適化することにより実現される。有利には、これらの改変もまた、プロデューサーおよび形質導入細胞の両方において全ての追加のタンパク質の存在しない、より安全な系の産生を導く。
【００７４】
上記のように、レトロウイルスベクターのパッケージング成分には、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の発現産物が含まれる。その上、効率的なパッケージングは、ｇａｇおよびｅｎｖ由来の部分配列がその後に続く、４つのステムループの短い配列によって決まる（「パッケージングシグナル」）。従って、レトロウイルスベクターゲノム中の除去されたｇａｇ配列の組込みは、（パッケージング構築物上の全ｇａｇ配列に加えて）ベクター力価を最適化することになる。これまで、効率的なパッケージングは、ｅｎｖ配列をなお保持するベクター中に２５５〜３６０ヌクレオチドのｇａｇを必要とするか、または約４０ヌクレオチドのｇａｇをスプライスドナー突然変異、ｇａｇおよびｅｎｖ欠失の特定の組合せにおいて必要とすることが報告されている。驚くことに、Ｎ末端の３６０前後のヌクレオチドを除く全てのヌクレオチドを欠失すると、ｇａｇのベクター力価の増大をもたらすことが見出された。従って、好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムには、一つ以上の欠失を含むｇａｇ配列が含まれる、より好ましくは、ｇａｇ配列は、Ｎ末端から得られる約３６０のヌクレオチドを含む。
【００７５】
＜Ｇａｇ中の潜在的開始コドンの改変＞
翻訳が正確な開始コドン（ＡＴＧ）から始まることを確保するために、ｇａｇの上流の開始コドンを操作してもよい。便宜的には、当技術分野で公知の技法によって上流の開始コドンを置換により、例えばＡＴＧをＡＣＧに、または挿入により、ＡＴＧをＡＴＴＧに変異させる。
【００７６】
これは、標的細胞中の成熟ｍＲＮＡの最初に利用可能なＯＲＦが、治療遺伝子のためのＯＲＦであることになるのを確実にする。
【００７７】
本発明の状況において、ｇａｇの少なくとも一つの潜在的開始コドン、好ましくは全ての潜在的開始コドンが変異される。
【００７８】
＜Ｎｅｏ発現カセットの挿入＞
オープンリーディングフレーム、またはその一部分を、ウイルスＬＴＲの下流および内部プロモーターの下流に挿入することは、ｒｅｖの不在下でウイルス力価を高めることが示されている（国際公開第０３／０６４６６５号に記載される通り）。従って好ましい実施形態では、Ｎｅｏ発現カセットがｇａｇの下流に挿入される。
【００７９】
＜ＷＰＲＥ＞
ウイルスゲノムは、翻訳後調節エレメントを含むことができる。例えば、ゲノムはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などのエレメント、例えば米国特許出願公開第２００５／０００２９０７号に記載されるものなどを含むことができる。
【００８０】
ベクター系は、各々がドーパミン合成に関与する酵素をコードする遺伝子を送達する能力のある、複数のベクターを含むことができる。
【００８１】
代替戦略は、単一のベクターを用いて３つの遺伝子全てを標的細胞に送達することである。
【００８２】
＜レンチウイルスベクター系＞
国際公開第０２／２９０６５号には、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、およびＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）をコードする遺伝子を宿主細胞に送達する能力のある３シストロン性レンチウイルスベクターが記載されている。培養細胞において３つの酵素の発現が、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡおよびＤＯＰＡＣの産生を引き起こし、パーキンソン病のげっ歯類モデルに対して治療上有効であることが示される。
【００８３】
＜アデノ随伴ベクター＞
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も、ドーパミン合成に関連する遺伝子を脳に送達するために使用されている。２または３つの重要な遺伝子を送達するために別々のＡＡＶベクターを使用することは、ＰＤのラットおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおいていくらかの行動上の利点があることが実証された（Ｋｉｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：４７０８−  ４７１３；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：３４５−３５４）。
【００８４】
これまで、単一のＡＡＶベクターを用いる３つの遺伝子（例えばＡＡＤＣ、ＴＨおよびＧＣＨ−１をコードする遺伝子）の線条体細胞への送達は、これらのベクターのパッケージング制限のために達成可能できないと考えられていた（Ｋｉｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ａｓ  ａｂｏｖｅ；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ａｓ  ａｂｏｖｅ；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１５０９−１５１９；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５：１１７７−１１９６；Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｒａｉｎ  １２８：５５９−５６９）。
【００８５】
しかし、最近の報告により、特定のＡＡＶベクターが大きなロード量（８．９ｋｂまで）を効率的に組み込むことができることが実証されている。これらのベクターのうちの最も効率的なものは、ＡＡＶ５キャプシッドおよびＡＡＶ２  ＩＴＲを有することが見出された（Ａｌｌｏｃｃａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（２００８）１１８：１９５５−１９６４）。
【００８６】
＜配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）＞
本発明で使用されるベクター系のウイルスゲノムは、２つまたはそれ以上のＮＯＩを含む。両方のＮＯＩを発現させるために、一つのＮＯＩごとに一つの、２つまたはそれ以上の転写単位がベクターゲノム内に存在してよい。レトロウイルスベクターは、それらが遺伝子的に単純な状態が保たれるのであれば、最大力価および最も強力な遺伝子発現特性を達成する、そのため、ポリシストロン性メッセージにおいて第２の（そしてその後の）コード配列の翻訳を開始するためには配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することが好ましい。
【００８７】
ＩＲＥＳエレメントのレトロウイルスベクターへの挿入は、レトロウイルス複製周期に適合し、単一のプロモーターから複数のコード領域の発現を許容する。ＩＲＥＳエレメントは、それらがウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進する、ピコルナウイルスの非翻訳５’末端で最初に見出された。ＲＮＡ中のオープンリーディングフレーム間に位置する場合、ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳエレメントでのリボソームの進入の促進、それに続いて下流の翻訳開始の促進により、下流オープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
【００８８】
いくつかの異なるＩＲＥＳ配列が公知であり、それには、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）；ＢｉＰタンパク質；ショウジョウバエのアンテナペディア遺伝子（エキソンｄおよびｅ）ならびにポリオウイルス（ＰＶ）由来の配列が挙げられる。
【００８９】
国際公開第Ａ９７／１４８０９号によれば、ＩＲＥＳ配列は、一般に遺伝子の５’非コード領域に見出される。この文献に記載されるものに加えて、ＩＲＥＳ配列は、発現に影響を及ぼす遺伝子配列を探し、次いでその配列がＤＮＡに影響を及ぼすか（すなわち、プロモーターまたはエンハンサーとして作用するか）、またはＲＮＡだけに影響を及ぼすか（ＩＲＥＳ配列として作用するか）を判定することによって、経験的に見出すことができる。
【００９０】
用語「ＩＲＥＳ」には、ＩＲＥＳとして作用するかまたはＩＲＥＳの機能を向上させるあらゆる配列または配列の組合せが含まれる。
【００９１】
ＩＲＥＳは、ウイルス起源のもの（例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ＰＶ  ＩＲＥＳ、またはＦＭＤＶ  ２Ａ−様配列など）であってもよいし、細胞起源のもの（例えば、ＦＧＦ２  ＩＲＥＳ、ＮＲＦ  ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ  ２  ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４  ＩＲＥＳなど）であってもよい。
【００９２】
ＩＲＥＳが各々のＮＯＩの翻訳を開始する能力を有するためには、ＩＲＥＳはベクターゲノムにおいてＮＯＩの間またはＮＯＩよりも前に位置しているべきである。例えば、ｎ個のＮＯＩを含有するマルチシストロン性配列に関して、ゲノムは次の通りであり得る。
［（ＮＯＩ１−（ＩＲＥＳ１］．．．ＮＯＩｎ  ｎ＝１→ｎ
２シストロン性配列および３シストロン性配列に関して、順序は次の通りであり得る。
ＮＯＩ１−ＩＲＥＳ１−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＩＲＥＳ１−ＮＯＩ２−ＩＲＥＳ２−ＮＯＩ３
ＩＲＥＳおよびＮＯＩの代替配置を利用することもできる。例えば、ＩＲＥＳおよびＮＯＩを含有する転写物は、必ずしも同じプロモーターに由来する必要はない。
【００９３】
この配列の一例は、
ＩＲＥＳ１−ＮＯＩ１−プロモーター−ＮＯＩ２−ＩＲＥＳ２−ＮＯＩ３
であってよい。
【００９４】
１またはそれ以上のＩＲＥＳおよびＮＯＩを有する内部カセットを利用するあらゆる構築物において、ＩＲＥＳは、異なる起源であってもよい、つまり、相互に異種であってよい。例えば、一つのＩＲＥＳはＥＭＣＶ由来であり、もう一つのＩＲＥＳはポリオウイルスでもよい。
【００９５】
ＩＲＥＳは、ＡＡＶおよびアデノウイルスベクターとともに使用するのにも適している。
【００９６】
＜医薬組成物＞
本発明で使用されるドーパミン補充遺伝子療法のためのベクターは、医薬組成物中に存在してもよく、その組成物は、予防的上または治療上有効な量のベクターを含む。
【００９７】
本発明の方法は、被験体においてパーキンソン病を治療および／または予防するために使用することができる。
【００９８】
本明細書において「治療する」とは、疾患の症状を寛解させる、治癒するまたは減少させるか、あるいは疾患の進行を低下または停止させるための、疾患を有する被験体の治療をさす。例えば、本発明の方法は、運動機能を改善または回復させ、および／またはジスキネジアを減少させることができる。本明細書に記載されるドーパミン補充遺伝子療法で処置される患者は、Ｌ−ｄｏｐａで処置され続けてもよく、それはドーパミン補充療法の前に投与された量まで減らした用量であってもよい。
【００９９】
用語「予防する」は、疾患の罹患を防ぐ、遅延させる、妨害するまたは邪魔することをさすものである。例えば、本発明の方法は、中脳ニューロンの進行性の死を遅延または停止させることができ、従って運動機能障害を防ぐことができる。本発明の方法は、ジスキネジアの可能性を低下させ得る。
【０１００】
医薬組成物は、所望により、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでよい。
【０１０１】
組成物は、注入により投与されてもよい。例えば、組成物は、尾状核の被殻の中に注入することにより投与されてもよい。本明細書に記載される例では、組成物は、各々の運動被殻への両側注入により投与される。
【０１０２】
ベクター系は、ベクターを脳に投与するために使用する針および／またはカテーテルと一緒にキットの形態で提供されてもよい。
【０１０３】
本発明ドーパミン補充遺伝子療法は、ドーパミン治療と併用して使用してもよい。本明細書に示される実施例に示されるように、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１を発現しているレンチウイルスベクターを用いる遺伝子治療は、Ｌ−Ｄｏｐａ処置との相乗作用を示す。
【０１０４】
Ｌ−Ｄｏｐａは、任意の便宜な手段、例えば経口的注入または筋肉内注入などにより投与されてもよく、その注入は、ドーパミン補充遺伝子療法よりも前であっても、同時期であってもよい。
【０１０５】
＜ジスキネジア＞
ジスキネジアは随意運動能力の機能障害であり、結果として断片的または不完全な運動を生じる。
【０１０６】
ジスキネジアは、慢性的なＬ−Ｄｏｐａ摂取の一般的な副作用である。多くの例では、患者は、随意運動の異常（ジスキネジア）を併発している薬物服用（ＯＮ−ｄｒｕｇ）期間と、患者が運動不能（筋硬直）である薬物非服用（ＯＦＦ−ｄｒｕｇ）期間の間を循環する。
【０１０７】
ジスキネジアは、少なくとも一部分、Ｌ−Ｄｏｐａの間欠的な経口摂取、および結果として起こる線条体ドーパミン受容体の拍動性刺激に起因すると考えられている。
【０１０８】
本発明で使用されるベクター系は、遺伝子療法によってドーパミンを補充するので、線条体において一定のドーパミン作動性緊張を維持するかまたは回復させる、ドーパミンの連続送達が実現されるべきである。
【０１０９】
そのために、被験体における線条体緊張度の異常に関連するジスキネジアは、回避することができるはずである。
【０１１０】
ドーパミン作動性緊張は、生理学的レベルまたは生理学的レベル以下で実現されてよい（下記参照）。
【０１１１】
驚くことに、ドーパミン補充遺伝子療法は、Ｌ−Ｄｏｐａ処置に関連するジスキネジアを回避することができるだけでなく、長期のＬ−Ｄｏｐａ処置から既にジスキネジアを発症した患者のための治療法を提供することができることが示された。従って、ドーパミン補充遺伝子療法は、経口Ｌ−Ｄｏｐａ処置の後に、続いて起こるジスキネジアの発生を防ぐことができる。
【０１１２】
従って、本発明は、ドーパミン補充遺伝子療法のためのベクター系を被験体へ投与することによる、パーキンソン病被験体において経口Ｌ−ＤＯＰＡ投与に関連するジスキネジアを治療および／または予防するための方法も提供する。
【０１１３】
遺伝子治療の後のドーパミンレベル
本発明で使用される遺伝子治療戦略は、非処理ＰＤ線条体に関連するレベルよりも高いが、非ＰＤ線条体に関連するレベルよりも低いドーパミンのレベルが実現されるように、線条体においてドーパミン合成を誘導することができる。ベクター系は、線条体において生理学的レベル以下のドーパミンの産生を引き起こすことができる。
【０１１４】
生理学的レベル以下のドーパミンの産生は、ＰＤの霊長類モデルにおいて治療上有効であることが本発明者らにより示された。ドーパミンの「過剰投与」は有害であり得るので（例えば、それはジスキネジアを誘導する可能性があるので）、生理学的レベル以下の産生は、超生理学的レベルの産生より好ましい。また、ドーパミン産生酵素の過剰産生も宿主細胞にとって有害であり得る。
【０１１５】
また、より低レベルの酵素の産生は、遺伝子治療用ベクター系のより少量の投与、コストの低減および治療に関連するあらゆる有害作用の最小化を必要とする。
【０１１６】
＜ドーパミン輸送体＞
ドーパミン輸送体またはドーパミン能動輸送体（Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）（ＤＡＴ）は、黒質のドーパミン作動性ニューロンのシナプス終末の血漿膜に局在する内在性膜タンパク質であり、線条体に位置する。ＤＡＴは、シナプス間隙からリサイクル（ｒｅｃｙｃｌｅｓ）ドーパミンを除去し、ドーパミンシグナルを終了させる。
【０１１７】
ＤＡＴのレベルの増加は、鬱病、およびＡＤＨＤなどのその他の疾患に関係している。
【０１１８】
理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、ドーパミン合成を誘導するための黒質での幹細胞／胎児組織移植の失敗の原因の一つが、移植組織にＤＡＴが存在していることであると予測する。ＤＡＴは、その生理的作用を行うことができないように、移植組織から放出された細胞外ドーパミンを隔離するように働く可能性がある。
【０１１９】
本発明の第一の態様の方法は、ＤＡＴによるドーパミンの隔離を回避することによりドーパミン遺伝子治療の有効性を増大させることを伴う。
【０１２０】
ＤＡＴによるドーパミンの隔離は、遺伝子治療用のベクター系を重要なＤＡＴ発現が欠けている組織に投与することにより便宜に回避させることができる。
【０１２１】
ＤＡＴのレベルが、ドーパミン補充遺伝子療法戦略により産生されるドーパミンをあまり妨害しない程度に十分に少ないならば、組織は、「重要なＤＡＴ発現が欠けている」と見なされる。
【０１２２】
ＤＡＴレベルは、治療の予防および／または治療効果をもたらす程度までドーパミンを隔離するならば、ドーパミン補充遺伝子療法戦略を著しく妨害する。
【０１２３】
ＤＡＴレベルは、パーキンソン病の患者の線条体において低下している。そのため、ＤＡＴによるドーパミンの隔離は、パーキンソン病の患者の線条体においてドーパミン合成に関与する酵素を発現することにより回避することができる。
【０１２４】
＜ＤＡＴ抑制剤＞
ＤＡＴが少ないかまたはＤＡＴを含まない組織への投与への代替アプローチまたはさらなるアプローチは、一つ以上のＤＡＴ抑制剤を使用することによってＤＡＴによるドーパミンの隔離を抑制することである。
【０１２５】
ＤＡＴ抑制剤は、ＤＡＴの発現または活性を抑制することができる。
【０１２６】
ＤＡＴの遺伝子は、染色体５ｐ１５に位置する。この遺伝子のタンパク質コード領域の長さは６４ｋｂを超え、１５のエキソンからなる。
【０１２７】
多くのドーパミン関連遺伝子を調節する核内受容体であるＮｕｒｒ１は、この遺伝子のプロモーター領域に結合して発現を誘導することができる。このプロモーターはまた、転写因子Ｓｐ−１の標的でもあり得る。
【０１２８】
ＤＡＴの発現は、当分野で公知の様々な方法で、例えばＤＡＴ遺伝子またはＮｕｒｒ１に対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ技術により、抑制することができる。
【０１２９】
例えば、ＤＡＴ抑制剤は、ＤＡＴ配列に特異的なアンチセンス核酸分子または抑制ＲＮＡを含み得る。また、抑制剤は、ＤＡＴ遺伝子の標的配列に結合し、それによってＤＡＴの発現を防ぐマイクロＲＮＡであってよい。
【０１３０】
転写因子は、どの細胞がＤＡＴを発現するかを制御するが、このタンパク質の機能調節は、主にキナーゼにより達成される。ＭＡＰＫとＰＫＣの両方は、輸送体がドーパミンを移動させるかＤＡＴの内部移行をもたらす速度を調節することができる。
【０１３１】
ＤＡＴの機能は、そのため、一つ以上のキナーゼ酵素の発現および／または活性の調節によって抑制され得る。
【０１３２】
メチルフェニデート、コカイン、ブプロピオンおよびリタリンを含む、いくつかのＤＡＴ抑制剤が公知である。
【０１３３】
本発明の状況において、ＤＡＴ抑制剤は、ドーパミン補充遺伝子療法の前に、または同時に被験体に投与されてよい。
【０１３４】
ベクター系およびＤＡＴ抑制剤（またはそのインビボ産生系）は、被験体への別々の、順次の、併用または同時投与のためのキットの形態で提供され得る。また、本発明のベクター系は、ドーパミン補充療法に関与する酵素に加えて抑制ＲＮＡを送達することもでき得る。
【０１３５】
＜ｓｉＲＮＡ／マイクロＲＮＡ＞
ベクター系は、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは調節されたマイクロもしくはｓｈＲＮＡを含むかまたはコードすることができる（Ｄｉｃｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：  １２８９−１２９５，Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：１２８１−１２８８）。
【０１３６】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により媒介される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾンまたはウイルスなどのエレメントのランダム組込みは、相同一本鎖ｍＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられている。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知である（Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：４２９−４３３）。ＲＮＡｉの機構は、長いｄｓＲＮＡを、約２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡの二本鎖にプロセシングすることを伴う。これらの産物は、低分子干渉もしくはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれ、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターである。分化した哺乳類細胞において、３０ｂｐより大きいｄｓＲＮＡは、タンパク質合成および非特異的ｍＲＮＡ分解のシャットダウンをもたらすインターフェロン応答を活性化させることが見出された（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８））。しかし、この応答は、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を用いることにより迂回させることができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１））、培養哺乳類細胞において遺伝子機能を分析することを可能にする。
【０１３７】
マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生された小さいＲＮＡからなる非常に大きなグループであり、その少なくとも一部が標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの最初のメンバーは、ｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４である。ｌｅｔ−７遺伝子は、虫の発達の間に内因性タンパク質コード遺伝子の発現を調節する、小型の高度に保存されたＲＮＡ種をコードする。活性のあるＲＮＡ種は、最初に約７０ｎｔの前駆体として転写され、その前駆体は転写後に成熟した約２１ｎｔの形態にプロセシングされる。ｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４の両方は、ヘアピンＲＮＡ前駆体として転写され、それはダイサー酵素によりプロセシングされてそれらの成熟形態となる。
【０１３８】
＜認知障害＞
経口Ｌ−Ｄｏｐａ処置は、認知障害に関連する可能性がある。
【０１３９】
パーキンソン病は、主に背側線条体におけるドーパミンの枯渇を特徴とする。腹側または「認知」線条体および前頭前皮質におけるドーパミン機能は、通常影響を受けない。Ｌ−ｄｏｐａの経口投与は全ての脳のドーパミン作動系を刺激する、つまりそれは認知線条体に「過剰投与」し、関連する認知機能を損なう。
【０１４０】
驚くことに、ドーパミンを補充するための遺伝子治療を用いることにより、局所性ドーパミンレベルおよび緊張性ドーパミンレベルの両方が回復されることが見出された。言い換えれば、ドーパミン補充遺伝子療法は、認識線条体においてドーパミンレベルを過剰に上昇させることなく背側線条体においてドーパミンレベルを増加させる。
【０１４１】
本発明の方法は、そのため、認知障害を引き起こすことなくパーキンソン病を治療および／または予防する。
【０１４２】
＜運動機能障害＞
パーキンソン病に関連する運動機能障害は、運動を制御する脳深部構造である大脳基底核の機能障害から生じると考えられている。
【０１４３】
淡蒼球内節（ＧＰｉ）などの出力核の異常活動亢進が原因であると考えられている。
【０１４４】
驚くことに、ドーパミン補充遺伝子療法は、基底核出力核でのニューロン活動を正常化することができ、ＰＤのＧＰｉニューロンの異常な高い発火率を低下させ、ニューロン発火パターンにおけるバースト当たりのスパイクの割合およびバースト事象の数を低下させることが見出された。
【０１４５】
また、ドーパミン補充遺伝子療法は、視床下核（ＳＴＮ）においてもニューロンの活動亢進を低下させる。これは、ＳＴＮの代謝活性の低下を見ることにより検出可能である。
【０１４６】
本発明は、ドーパミン補充遺伝子療法のためのベクター系を被験体に投与することによる、パーキンソン病被験体の基底核および／または視床下核においてニューロンの電気的活動を正常化するための方法を提供する。
【０１４７】
この文脈において、用語「正常化すること」とは、ＰＤに関連するＳＴＮにおけるＧＰｉニューロンの平均発火率の増加および／またはニューロンの活動亢進が低下することを意味する。平均発火率および／またはニューロン活動は、正常な非ＰＤレベルで維持されてもよいし、非ＰＤレベルまで低下していてもよいし、または非ＰＤ個体と比較してなお上昇しているが、治療を行わない個体に予期され得るレベルよりもなお低い程度に低下していてもよい。
【０１４８】
ニューロン発火のパターンを見ると、ベクター系の投与によって、ＧＰｉにおけるバースト当たりのスパイクの数および／またはバースト事象の数は低下する。
【０１４９】
患者が症状の発症の前に治療される場合、ベクター系は、バースト当たりのスパイクの数および／またはバーストの数が上昇しないかまたは治療の不在下で起こり得るのと同じ程度まで上昇しないように、バースト当たりのスパイクの数および／またはバーストの数を正常化することができる。
【０１５０】
本発明を実施例によってさらに説明する。実施例は本発明を実行する際に当業者を補助する働きをするためのものであり、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１５１】
＜長期運動行動の回復＞
パーキンソン症を矯正するためのＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１の遺伝子導入の可能性を調査するため、ＰＤのＭＰＴＰ霊長類モデルで長期実験を行った。ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１の遺伝子をコードする３シストロン性レンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１）を設計した。ＭＰＴＰ中毒状態の休止後１〜８週、１８頭のＭＰＴＰ処置マカクザルを３つの行動的に等しい群に割り当てた。第１群（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１、ｎ＝６）は、各々の運動被殻にＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を両側注入した。第２群（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺ、ｎ＝６）は、ＬａｃＺレポーター遺伝子をコードする対照ＥＩＡＶベクターを投与した。第３群（ＭＰＴＰ−長期、ｎ＝６）には外科的介入は行わなかったが、ＭＰＴＰモデルの安定性を評価するための追加対照として含めた。全ての動物は、実験の間中Ｌ−Ｄｏｐａまたはドーパミン作用薬を用いる処置を行わずに維持された。
【０１５２】
Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１で処置された動物は、対照と比較して、ベクター注入後早くも第２週に無動症および姿勢に有意な改善を示した（フリードマン  Ｐ＜０．００１、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  ＭＰＴＰ−長期、ｐ＜０．０５、ＭＰＴＰ−ＬａｃＺ  ｐ＜０．０５）（図１、図７）。臨床所見も、ウイルス注入後早くも第６週に対照と比較して、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１群の国際的な臨床評定尺度の有意な改善（低下）を示した（フリードマン  Ｐ＜０．００１、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  ＭＰＴＰ−長期  ｐ＜０．０５、ＭＰＴＰ−ＬａｃＺ  ｐ＜０．０５、図１ａ）。ＭＰＴＰ  Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１で処置した動物は、さらなるドーパミン作動薬の摂取を行わずに無動症および姿勢の機能障害から徐々に回復し続け、レンチウイルス注入後９ヶ月まで、正常状態に対して全移動距離の８５％（図１ｂ）および立ち上がり行動の１００％（図７）に達した。動物は実験の間の様々な時点で補完分析のために屠殺された。追跡時点の最も長いＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１処置動物は、レンチウイルス処置後３０ヶ月間実験を継続され、期間全体にわたって運動性の改善の維持を実証した。対照ＭＰＴＶ−長期動物は、全ての時点でひどく障害を受けたままであった（図１）。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１で処置しなかった動物は、観察期間の間に行動改善の反転を実証した。
【実施例２】
【０１５３】
＜運動性線条体における局所および連続ドーパミン産生＞
インビボ遺伝子導入およびレンチウイルス媒介性ドーパミン産生を調べるため、導入遺伝子発現の組織学的解析を行って実験動物の線条体において局所ドーパミンレベルを測定した。Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺで処置した動物は、注入された被殻あたり平均５４９４７の形質導入細胞を有し、それは大部分がニューロンであったことを実証した（ＮｅｕＮ−ｉｒ陽性＞９０％、図１０）。また、組織学的解析は、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１陽性ニューロンがＭＰＴＰ  Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１処置動物において被殻の注入部位の近傍において明らかであったが、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ対照では明らかでないことも実証した（図２）。
【０１５４】
被殻におけるレンチウイルス媒介性ドーパミン産生を定量的に測定するために、２つの指数を適用した。（１）全組織ドーパミンレベル［ＤＡ］ｗｔ、線条体のパンチの死後分析により測定される。この指数は、細胞内ドーパミン含量（シナプス前の黒質のドーパミン作動性末端）と細胞外ドーパミン含量の両方を数量化する。（２）細胞外ドーパミンレベル［ＤＡ］ｅｃ、インビボ微小透析により測定される。この指数は、細胞外環境内で放出されたドーパミンを具体的に数量化する。［ＤＡ］ｗｔを測定するために、新鮮な脳のパンチを屠殺の時点で各々の動物から採取した。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１は、Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺと比較して、背側の被殻における［ＤＡ］ｗｔを有意に増加させた（図３ａ）。病変のないマカクザルから得た被殻パンチにおける［ＤＡ］ｗｔの比較（ＭＰＴＰ処置なし  ｎ＝２、図３ａ）により、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入被殻におけるドーパミン補充のレベルは正常レベルの１〜４％であることが明らかとなった。低いとはいえ、［ＤＡ］ｗｔの測定に基づくドーパミン補充の程度は、線条体内部のシナプス前のドーパミンプールを低下させる黒質の神経変性を反映する（図３）。ドーパミンの未制御放出が遠位脳領域、例えば皮質、淡蒼球および尾状核において観察されなかったので、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の効果は、被殻領域に特異的であった（図１１）。このことは、この遺伝子治療アプローチの臨床適用に関して重要な安全性の問題に対処する。
【０１５５】
線条体内のドーパミン作動性緊張を評価するため、正常（病変なし  ｎ＝６）、ＭＰＴＰ−長期（ｎ＝７）、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ（ｎ＝５）およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（ｎ＝３）霊長類において［ＤＡ］ｅｃレベルを測定した。微小透析プローブは、各々の動物に対して後交連被殻に設置した（方法の項、図１２参照）。有意な［ＤＡ］ｅｃ差が群間で示された（ＫＷ  ｐ＜０．００１）。ＭＰＴＰ−長期動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ動物において、ベースライン［ＤＡ］ｅｃは、それぞれ正常ドーパミンレベルの２６％および２３％に低下し、これらの動物における重度のドーパミン枯渇が示された（Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  Ｐ＜０．００１、図３ｂ）。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１は、ＭＰＴＰ−長期およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺの両方と比較して、有意にベースライン［ＤＡ］ｅｃを増加させ、交連後被殻において正常レベルの６０％に達した（Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  Ｐ＜０．０５、図３ｂ）。内因性ドーパミンと外因性ドーパミンとの間の劇的な相互作用を評価するため、Ｌ−Ｄｏｐａの筋肉内投与の後に［ＤＡ］ｅｃを各々の動物において測定した。ドーパミンレベルが、ＭＰＴＰ長期動物の１６９７ｐｇ／ｍｌから１９９１ｐｇ／ｍｌ（１．１７倍）への増加と比較して、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物において３９１８ｐｇ／ｍｌから８８４３ｐｇ／ｍｌ（２．２５倍）に増加したので、結果は、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１処置が、Ｌ−Ｄｏｐａ処置との相乗作用であると思われることを示す（図３ｃ）。このことは、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１遺伝子導入により媒介される被殻におけるＡＡＤＣの増加により説明され得る。この仮定に一致して、線条体におけるＬ−Ｄｏｐａのレベルは、Ｌ−Ｄｏｐａ注入の後にＭＰＴＰ−長期およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ群でのみ増加し、注入されたＬ−Ｄｏｐａの大部分が、正常な対照動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物においてＤＡに変換されることを示唆した（図３ｄ）。
【０１５６】
ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物において観察された行動効果は、より効率の低い黒質線条体の病変形成の結果ではなかった。黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるドーパミン作動性ニューロンの立体解析の数値は、正常動物と比較して、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１群およびＭＰＴＰ−ＬａｃＺ群の両方のＴＨ−ｉｒニューロンの数の劇的な低下を示した（ＫＷ  Ｐ＜０．００１；Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  Ｐ＜０．００１、図１３）。さらに、２つの病変ＭＰＴＰ群のＴＨ−ｉｒニューロンの数の間に差は認められなかった（Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＭＷ  Ｐ＝０．５１、図Ｓ８）。
【実施例３】
【０１５７】
＜基底核活性の回復＞
Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１が運動機能障害を矯正した機構を決定するため、基底核系内のニューロン活動を調査した。ＰＤにおける基底核機能障害の現行モデルは、淡蒼球内節（ＧＰｉ）などの出力核の異常な活動亢進が、この疾患において観察される運動症状の主な原因となることを示唆している。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＡＤＣ−ＣＨ１が基底核出力核におけるニューロンの電気的活動を正常化することがあり得るかどうかを決定するため、正常およびＭＰＴＰ処置したマカクザルにＧＰｉでの単一記録を受けさせた。これまでの報告に一致して、対照と比較して、薬物にナイーブな非処置ＭＰＴＰマカクザルにおいて、ＧＰｉニューロンの平均発火率の有意な増加（５２％、ＭＷ；ｐ＜０．０１）が見出された（図４ａ）。興味深いことに、線条体のＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＡＤＣ−ＣＨ１投与は、異常な高い発火率を有意に低下させ、ＧＰｉニューロンの発火率を正常な（病変のない）レベルに回復させた（図４ａ）。
【０１５８】
ＧＰｉにおけるニューロン発火のパターンも、ＰＤの病態生理学において重要であり、そのため記録したＧＰｉニューロンのバースト活性も分析した。パターン分析により、バーストあたりのスパイクの割合およびバースト事象の数は、対照動物と比較して（それぞれ３．８％および１．７事象／細胞／分；ＭＷ、Ｐ＜０．０５）、ＭＰＴＰ霊長類において有意に増加した（それぞれ、１５．９％および９．７事象／細胞／分）ことが明らかとなった。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＡＤＣ−ＣＨ１による処置は、ＧＰｉニューロンのバーストあたりのスパイクの割合およびバースト事象の数を、正常な病変のない動物において観察されるものに非常に類似するレベルまで、有意に低下させた（それぞれ５．３％および１．６事象／細胞／分；ｐ＜０．０５）（図４ａ）。
【０１５９】
視床下核（ＳＴＮ）におけるニューロンの活動亢進は、ＰＤのもう一つの重要な病態生理学的特徴であり、その電気的神経調節は、ＭＰＴＰマカクザルとＰＤ患者の両方において治療上成功してきた。ＰＤ患者と黒質線条体変性の霊長類モデルの両方における基底核の代謝研究により、皮質基底核ループの変化が実証された。［１４Ｃ］２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）（空間分解能１５０μｍ）機能的イメージングを用いて、ＭＰＴＰ対照マカクザルのＳＴＮが正常マカクザルと比較して代謝活性の増加を示したことが見出された（図４ｂ）。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＡＤＣ−ＣＨ１による処置後３６週で、左右両方のＴＮの代謝活性は正常化され、病変のない動物の代謝活性に非常に似ていた（図４ｂ）。
【実施例４】
【０１６０】
＜ジスキネジア実験＞
ＰＤにおける主な課題は、運動障害性の動作を何ら誘導することなくドーパミン作動性機能を回復させることである。線条体の組織学的異常はジスキネジアを誘導する可能性があるので、遺伝子導入の後の形態変化を調査した。全ての針トラックは被殻に位置していたが（図１４）、ニューロンマーカー（Ｎｅｕ−Ｎ）は、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を注入した動物において異常を示さなかった。ＧＦＡＰおよびＣＤ６８免疫活性のわずかな増加がＬｅｎｔｉ−ＬａｃＺ動物およびＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物の両方で観察された。しかし、これは、針トラックを取り囲む領域に限定された（図１５）。局所的な脳病理の検出のための感受性の高い方法であるＴ２＊強調ＭＲＩを用いて、神経画像研究を行った。被殻および残りの脳領域には何ら異常なＴ２＊シグナルのないことが見出された（図１６）。
【０１６１】
Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の臨床適用に対する一つの重要な問題は、ベクターがＰＤ患者においてジスキネジアを誘導する可能性である。標準化されたプロトコールを用いて、観察されるビデオシーケンスの間にあらゆる種類の運動障害性の動作を連続的に評価するビデオ・ジスキネジア分析（ＶＤＡ）に基づくジスキネジアの定量化のための新規な方法を用いて、上記の有効性研究においてジスキネジアの評価を行った。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１は、ＭＰＴＰ霊長類において３０ヶ月まで運動障害性の動作を何も誘導せず、対照ＭＰＴＰ動物の経口Ｌ−Ｄｏｐａ摂取とは対照的であった（ｎ＝５）（図５）。その上、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を投与されたＭＰＴＰ霊長類は、ＭＰＴＰ霊長類およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ霊長類と比較してオフ状態のジストニアの減少を提示した（ＭＷ、ｐ＜０．０５）（図５）。
【０１６２】
臨床状態を模倣するため、これらの薬物にナイーブな動物をＬ−Ｄｏｐａの急性全身投与によって、その後、運動障害促進性の短時間作用型のＤ１／Ｄ２ドーパミン受容体刺激薬（アポモルヒネ）によってさらに曝露した。経口Ｌ−Ｄｏｐａ摂取およびアポモルヒネ注入は両方とも、ＭＰＴＰ長期およびＭＰＴＰ−ＬａｃＺ霊長類の自発運動活性を正常な霊長類のものと同様のレベルまで改善したが（ＭＷ、ｐ＜０．０５）（図１７）、薬物にナイーブな正常な霊長類およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１霊長類の自発運動活性には変化がなかった。さらに、正常動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物は、標準的な用量のＬ−Ｄｏｐａおよびアポモルヒネの後にジスキネジアがなかったが、ＭＰＴＰ−長期動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ動物は、衰弱性の舞踏病様運動およびジストニー運動を提示した（ＭＷ、Ｐ＜０．０５）（図５）。
【０１６３】
ドーパミン遺伝子治療のジスキネジアを予防する能力が実証されたので、その次にこのアプローチをＬ−Ｄｏｐａ誘発ジスキネジア（ＬＩＤ）の霊長類モデルで試験して、ＰｒｏＳａｖｉｎ治療が動物モデルにおいて既に確立されたジスキネジアを逆転させることがあり得るかどうかを確かめた。
【０１６４】
６頭のＭＰＴＰ−処置霊長類の群を、各々の個体に対して調節した、毎日２０ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の経口Ｌ−Ｄｏｐａで、動物が持続性かつ重度のＬＩＤを発症するまで繰り返し処置した（ＬＩＤ−ＭＰＴＰ動物）（ｎ＝６）。次に、これらの動物は、運動性線条体（ＭＰＴＰで処置し薬物にナイーブな霊長類で実施されるものと同じ）へのＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（ｎ＝３）かまたはＬｅｎｔｉ−ＬａｃＺ（ｎ＝３）のいずれかの両側注入を受けた。ＬＩＤ  ＰＤ患者における臨床試験の状況を厳密に模倣するため、次に、本発明者らは、（ＭＰＴＰ−ＬａｃＺおよびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１群の）それぞれの個々の動物に対して一日量のＬ−Ｄｏｐａ処置を調節して、毎日の自発運動活性をそのＭＰＴＰ病変形成前の値で維持した。従って、毎日のＬ−Ｄｏｐａ処置の用量の変化は、薬物「オフ」の運動状態（ＶＭＡにより評価）だけに基づいた。このアプローチは、現在、脳深部刺激電極を移植した患者において最適なＬ−Ｄｏｐａ用量を見つけるために使用されている（Ｂｅｊｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４７：６５５−６５８）。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の線条体注入の後、ＬＩＤ−ＭＰＴＰ動物は、そのＬ−Ｄｏｐａオフ状態のパーキンソン症から徐々に回復した。従って、この処置管理プロトコールは、ベクター注入後６ヶ月で７０ｍｇ／ｋｇ／日から３０ｍｇ／ｋｇ／日までのＬＩＤ−ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物における平均Ｌ−ＤＯＰＡ摂取量の段階的減少をもたらしたが、ＬＩＤ−ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺでは行動上の回復が観察されなかったため毎日のＬ−Ｄｏｐａ処置は６７ｍｇ／ｋｇ／日で安定していた。
【０１６５】
Ｌ−Ｄｏｐａオン状態で（４０ｍｇ／ｋｇのＬ−ｄｏｐａの設定用量による周期的曝露）、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１処置動物におけるジスキネジアのレベルは低下し、その初期レベルの２５％未満に達した（図１８）。それに対して、Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺを投与されたＬＩＤ−ＭＰＴＰ霊長類は著しく損なわれたままであり、実験全体にわたってＬ−ＤＯＰＡ曝露に応答して一定レベルのジスキネジアを示し続けた（図１８）。
【０１６６】
これらの結果は、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１による治療が、長期のＬ−Ｄｏｐａ処置から既にジスキネジアを発症しているＰＤ患者において治療効力をもたらすだけでなく、ジスキネジアの生理学的機構を逆転させ、それによってＬ−Ｄｏｐａ治療の後に続いて起こる発生を防ぐ可能性を有することを示す。
【０１６７】
＜考察＞
ＰＤにおけるジスキネジアの発症に対する主な機構的仮説は、ジスキネジア発症が、黒質の線条体路のドーパミン作動性ニューロンの広範な変性と合わせて、線条体の後シナプス受容体の間欠的な拍動性ドーパミン作動性刺激の結果であるというものである。ここに、レンチウイルスによるドーパミンの線条体への連続送達が、運動障害の長期の矯正（３０ヶ月まで）を媒介し、反復Ｌ−Ｄｏｐａ処置とは対照的に、ジスキネジアの発生をもたらさなかったことが実証される。このことは、薬物誘発ジスキネジアを引き起こすのが、黒質の変性自体の程度ではなく、むしろ線条体における一定のドーパミン作動性緊張の不在であることを示す。
【０１６８】
これらの観察結果の最も可能性の高い説明は、遺伝子治療が線条体におけるドーパミン作動性緊張を維持するために十分な量のドーパミンを回復したこと、およびこれがＧＰｉニューロン活動およびＳＴＮ代謝の正常化により実証されるように、大脳基底核ネットワークの正常な機能を回復させることである。別の仮定を支持し得るその他のいかなる神経学的または解剖学的変化も見出されなかった。本明細書に記載される治療効果は、生理学的レベル以下のドーパミンを生成する中程度かつ局所の遺伝子導入によって達成された。マイクロ透析によって得られたスナップ写真が細胞表面／細胞外間隙の活性ドーパミン濃度を反映すると仮定すると、本発明者らの遺伝子治療手順は、被殻におけるドーパミン濃度を正常レベルの約５０％まで回復させる。どうしたら５０％のドーパミン補充が劇的な行動矯正の説明となり得るのか。この結果は、６０％より多いドーパミン作動性ニューロンが変性すると運動症状が観察されるヒトのパーキンソン病の所見に一致する。そのため、線条体におけるドーパミンの中程度の補充は治療効果をもたらすものと予測された。その上、この実験で観察される行動の改善は、正常以下のレンチウイルスによるドーパミン産生、および、シナプス前のシナプス性ドーパミン作動性末端の数の減少による、パーキンソン病様線条体のドーパミン輸送体（ＤＡＴ）のレベルの低下の組合せも反映し得る。ＤＡＴは、放出ドーパミンの空間的および時間的活動を制御すると考えられ、より低いレベルは、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１形質導入線条体ニューロンから放出されたドーパミンの活性および／または分布を増加させる可能性がある（Ｇｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：６０６−６１２）。
【０１６９】
現在有効であると認証されているＰＤに対する外科的治療は、ＳＴＮまたはＧＰｉの電気刺激を伴い、これにより核内部の正常な電気的活動を回復することによってＬ−Ｄｏｐａ誘導性運動合併症を防ぐ。遺伝子治療が、ＳＴＮの非運動領域の不要な電気刺激により観察される神経心理学的副作用なしにこれらの治療効果をもたらす可能性がある。
【０１７０】
線条体において連続的なドーパミン産生を達成するための代替アプローチは、胎児の組織または幹細胞の細胞移植を使用することである。しかし、移植誘発ジスキネジアおよび移植された細胞におけるＰＤ病理の発生の問題はまだ解決されていない。本明細書に提示されるデータは、ドーパミン受容体の局所および連続的刺激の可能なＰＤ治療法を開発する医学の挑戦がここに達成されたことを示す。
【０１７１】
＜方法の概要＞
＜レンチウイルスベクター技術＞
ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１の遺伝子をコードする３シストロン性レンチウイルスベクターを設計した（Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１）。ベクター媒介性のドーパミン産生を改善するため、ｐＯＮＹ８．１ＴＳＩＮと呼ばれる３シストロン性カセットを発現した元のＥＩＡＶベクターゲノムにいくつかの変更を行った（Ａｚｚｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０３０１−１０３１２）。これらの変更により、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入後にインビトロで評価した時に、統合されたゲノム当たり少なくとも２ログのドーパミン産生の増加がもたらされた（図６）。
【０１７２】
＜動物モデルにおける局所ドーパミン枯渇＞
非ヒト霊長類において進行型ＰＤをモデル化するため、無動症、屈曲姿勢、平衡機能障害および振戦を含む、重度の安定した両側性パーキンソン病様症状群となるまで、成体カニクイザルに選択的神経毒ＭＰＴＰを全身投与した。ＭＰＴＰ処置の前に、全ての霊長類は臨床評定尺度（ＣＲＳ）で０を得た。ＭＰＴＰ後であるが、レンチウイルス注入の前にマカクザルは、対照ＭＰＴＰ前状態と比較して（正常状態）、最大の能力障害スコア（最大値＝１４）に接近するＣＲＳの大幅な増加を示した（図１ａ）。定量的ビデオ運動分析を用いて運動機能障害の重篤度をさらに定量化した。すると、正常状態と比較して、ＭＰＴＰマカクザルは顕著な無動症（移動距離＝正常状態の３．７％；図１ｂ）および姿勢機能障害（立ち上がり行動＝正常状態の５％；図Ｓ２）を示したことが見出された。ＭＰＴＰ誘発パーキンソン症の重篤度は、対照ＭＰＴＰ動物において実験全体にわたって安定していた（図１および７）。神経病理学的分析により、黒質緻密部における、構造的損失と機能的損失の両方を含む、選択的黒質線条体変性（図８）ならびに線条体におけるＴＨおよびＡＡＤＣ免疫反応性線維の劇的な減少（図２）が実証された。ＴＨ（図２）およびドーパミン輸送体（ＤＡＴ）免疫反応性（図９）により評価される線条体の除神経は、ＰＤにおいて観察されるものに似た異質なパターンの変性を示し、被殻は尾状核よりも多く罹患し、かつ、被殻の背外側部分（「運動」被殻）はその腹側部分（「認識」被殻）よりも多く罹患していた。
【０１７３】
レンチウイルスベクターの構築および生成は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ社が行った。レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶから誘導され、同じポリシストロン性ベクター中にＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１をコードするか（Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１）、または対照としてＬａｃＺをコードした（Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ）。２６頭の成体雄カニクイザルを使用した。合成剤１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、インビボでＭＰＰ＋に形質転換される神経毒であり、ドーパミン作動性ニューロンに高い親和性と高い毒性の両方を有する。ＭＰＴＰマカクザルは、ＰＤの臨床前の実験モデルの中でも最も予測可能であると考えられている。ＭＰＴＰ中毒の亜慢性プロトコールを使用した（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）。客観的行動分析を使用して、いつＭＰＴＰ処置を停止するべきかを決定した。霊長類が進行型ＰＤモデルに相当する行動判定基準に達するとすぐに、ＭＰＴＰ処置を中止した。特にＭＰＴＰ病変形成の後に、特別な注意を払って動物に食物を与えて養育した。レンチウイルスベクターをＭＰＴＰマカクザルの運動被殻に注入した。全ての外科的手順に、個々のＭＲＩに基づく定位脳手術を使用した。行動分析に、自動化定量的ビデオアプローチと、厳密な盲検法の条件下で行われた定性的な臨床評価の両方を使用した。標準的な技法を用いて免疫組織化学および立体解析学を行った。ドーパミン産生は、インビボ微小透析試料および死後脳組織のＨＰＬＣ分析により評価した。Ｌ−Ｄｏｐａは、筋肉内注射される微小透析実験の間を除いて経口投与された。アポモルヒネは筋肉内注射された。標準的な技法を用いて単一細胞の電気生理学記録を行った。［１４Ｃ］−２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）４３、４４を使用して局所脳グルコース利用の評価により機能イメージングを行った。データは、クラスカル・ウォリス（ＫＷ）またはフリードマン検定（反復測定ＡＮＯＶＡのノンパラメトリック同等物）によって、その後、個々の時点でマン・ホイットニー（ＭＷ）ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によって分析し、多重比較について補正した。
【０１７４】
＜動物＞全ての動物実験は、動物保護のための欧州協定（８６〜４０６）および米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った。２６頭の成体雄カニクイザル、秤量５〜７ｋｇをこの実験に含めた。動物は、個別に１２／１２時間の明／暗サイクルで飼育した。レンチウイルスベクター注入に続いて、レベルＩＩＩのバイオセーフティー手順（ＢＳＬ３）を用いて実験を行った。
【０１７５】
＜実験デザイン＞神経毒ＭＰＴＰを最初に２３頭のマカクザルに、重度のパーキンソン症を発症するまで投与し、次にこれらを以降の実験に従って実験群に分割した。
【０１７６】
１．第１の実験では、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１により媒介される局所および連続的なドーパミン系産生の長期効果を調べた。１８頭のＭＰＴＰ非ヒト霊長類を無作為化して３つの群に割り当てた。Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の線条体注入（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１群、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）、Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺの線条体注入（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）または無処置（ＭＰＴＰ−長期群、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）。次に、動物を２ヶ月から３０ヶ月まで観察した。これらの霊長類のサブセットを、組織学、微小透析、電気生理学、および代謝研究に含めた。
【０１７７】
２．第２の実験では、ドーパミン遺伝子治療を受けたパーキンソン病様霊長類におけるジスキネジアの発生率を調査した（ＭＰＴＰ  Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１、８週までｎ＝６、その後９ヶ月までｎ＝３）。ジスキネジア発生率を、経口の薬理学的ドーパミン作動薬治療を受けたパーキンソン病様霊長類に観察されるものと比較した。後者の群に関して、５頭のＭＰＴＰマカクザルに、毎日経口Ｌ−Ｄｏｐａを１２週間投与した（ＭＰＴＰ−Ｌ−Ｄｏｐａ群、ｎ＝５）。
【０１７８】
３．第３の実験では、ＭＰＴＰマカクザルにおけるジスキネジア誘導の可能性を、短時間作用型Ｄ１／Ｄ２ドーパミン作動性アゴニスト、アポモルヒネで、次に急性経口用量のＬ−Ｄｏｐａで曝露することにより研究した。ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１群（ｎ＝３）、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ群（ｎ＝３）、ＭＰＴＰ−長期群（ｎ＝３）、または正常な病変のないマカクザル（ｎ＝３）からの動物を、ＭＰＴＰ投与の停止から３２週後、かつ遺伝子導入の２４週後（ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１長期動物に関して）に、アポモルヒネおよびＬ−Ｄｏｐａで曝露し、動物が表したジスキネジアの数を、特異的ソフトウェア（Ｔｈｅ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｎｏｌｄｕｓ）で計数した。
【０１７９】
４．第４の実験では、薬物で刺激した運動障害ＭＰＴＰ動物においてＬＩＤ発現を低下させるためのＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１に媒介される連続的なドーパミン作動性刺激の可能性を研究した。毎日の経口Ｌ−Ｄｏｐａ摂取により運動障害にされた（ジスキネジア指数の最大スコア）３頭のＭＰＴＰ霊長類のサブセットに、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１（ｎ＝２）またはＬｅｎｔｉ−ＬａｃＺ（ｎ＝１）の運動被殻注入を投与した。次に、動物をＬ−Ｄｏｐａで曝露し、ジスキネジアの数を特異的ソフトウェア（Ｔｈｅ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｎｏｌｄｕｓ）で評価した。
【０１８０】
全てのＭＰＴＰ処置動物に関して、完全な研究は、毎日の臨床評価に加えて一連の行動分析を含んだ。１頭の正常な非ＭＰＴＰ処置動物を、免疫組織化学および生化学研究のために含めた。２頭のＭＰＴＰ処置動物と２頭の病変のない動物を、イメージングおよび電気生理学的研究に含めた。オートラジオグラフィー画像研究は、ＧＰｉの電気生理学的記録の１ヶ月後の実験の最終段階で行った。
【０１８１】
＜ウイルス生成＞ベクターに媒介されるドーパミン産生を向上させるため、ｐＯＮＹ８．１ＴＳＩＮと呼ばれる３シストロン性カセットを発現した元のＥＩＡＶベクターゲノムにいくつかの変更を行った（図９）。この構築物は、次の３つの遺伝子、すなわち、ヒト芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ、受託番号Ｍ７６１８０）、ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ｈＴＨ−２、受託番号Ｘ０５２９０）およびヒトＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１、受託番号Ｕ１９５２３）の触媒イソ型を含む。これらの３つの遺伝子には全て異なるＮ末端ペプチドタグでタグを付けた。新規構築物であるｐＯＮＹ８．９．４ＴＹは、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１の配列のコドンを最適化し、全てのＮ末端タグを除去することにより生成された。これは、Ｏｐｅｒｏｎ社（現在Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ９１３５５）により実施された。３シストロン性カセット中の遺伝子の順序も、ＴＨオープンリーディングフレームが最初でＡＡＤＣおよびＣＨ１がそれに続くように変更した（Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１）。使用したプロモーターおよびＩＲＥＳ配列は、両方ともｐＯＮＹ８．１ＴＳＩＮ中にあるのと同じように保持された（図９）。その上主鎖を次のように変更した。ｇａｇ中の全ての潜在的ＡＴＧ開始コドンをＡＴＴＧに変更し、Ｎｅｏ発現カセットをｇａｇの下流に挿入し、ＷＰＲＥを３シストロン性カセットの３’末端に挿入して発現を促進した。図１９は、ｐＯＮＹ８．９．４ＴＹの配列を示す。これらの変更により、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入後にインビトロで評価した時に、統合されたゲノム当たり少なくとも２ログのドーパミン産生の増加がもたらされた（図９）。このベクターのＬａｃＺコード版（ｐＯＮＹ８．９ＮＣＺ）を対照として使用した。ｐＯＮＹ８．９ＮＣＺ（Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ）は、３シストロン性カセットの代わりにＬａｃＺ  ＯＲＦを含む。
【０１８２】
＜ウイルスベクターの生成＞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０層のセルファクトリーにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳに４．４×１０４ｃｍ−２の密度で播種した。翌日、細胞に、ｐＥＳＹＮＧＰ（ＥＩＡＶコドンを最適化したｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物）、ｐＲＶ６７（ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミド）およびＥＩＡＶ−ＬａｃＺ（ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーターの制御下でＬａｃＺ、またはＦｕ遺伝子−６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１を発現しているＥＩＡＶベクターゲノム）をトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、細胞を１０ｍＭ酪酸ナトリウムで６時間処理し、次に培地を酪酸の不十分な培地（ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）に交換した。トランスフェクションの４０時間後に、培地を回収し、１０００ｘｇで５分間遠心し、０．４５μｍフィルターユニットに通して濾過した。ベクターを、低速遠心分離（４℃にて１６時間、６０００ｘｇ）それに続いて超遠心分離（４℃にて９０分間、５００００ｘｇ）により濃縮した。ベクターを、塩化ナトリウム（１００ｍＭ）、トリス、ｐＨ７．３（２０ｍＭ）、スクロース（１０ｍｇ．ｍｌ）およびマンニトール（１０ｍｇ．ｍｌ）からなるＴＳＳＭバッファーに再懸濁し、等分し、−８０℃で貯蔵した。ベクター力価は、ＤＮＡ組込みアッセイを実施することによって得た。手短に言えば、これは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にウイルスベクターを形質導入し、この細胞を約１０日間継代することを含む。Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺの力価は、３．５×１０９ＴＵ／ｍｌであり、Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の力価は、１．０〜２．７×１０８ＴＵ／ｍｌであった。
【０１８３】
＜行動＞全ての動物を、その全身の臨床状態について栄養状態に特別の注意を払って毎日評価した。同時に、各々のマカクザルの全身の神経学的状態をレンチウイルス注入前および注入後の両方ともに評価した。本発明者らの神経学的所見を客観的に定量化するため、ＭＰＴＰ病変形成前およびウイルス注入の後に規則的な間隔で動物を３０分間ビデオテープに録画した。次に、これらのビデオを、実験条件を知らせない試験者がオフラインで分析した。臨床評定尺度は、ＰａｐａおよびＣｈａｓｅのＭＰＴＰ霊長類パーキンソン病様尺度から適合させた（姿勢  ０〜２、歩行  ０〜２、振戦  ０〜２、全身の移動度  ０〜４、手の動き  ０〜２、よじ登り  ０〜４；０のスコアは正常なサルに相当）。ジスキネジアの定量分析により、ビデオ記録時間の間に所定の動き（運動障害性の動作に関する上肢および下肢、胴、顔および首の舞踏病および失調症）を計数することが可能となる、モーション・カウント・ソフトウェア（Ｔｈｅ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  ７、Ｎｏｌｄｕｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行った。ビデオによる動作分析は、ビデオ記録時間の間に総移動距離（移動距離、ｃｍ）、最大速度（最大速度、ｃｍ／秒）および立ち上がり行動の頻度（立ち上がり、事象の数）の客観的測定を可能にする、モーション・トラッキング・ソフトウェア（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ３、Ｎｏｌｄｕｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行った。
【０１８４】
＜ＭＰＴＰ病変＞全ての霊長類は、毎日０．２ｍｇ／ｋｇの筋肉内用量のＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を、それらが重度の安定した両側性パーキンソン病様症状群となるまで投与された。最後のＭＰＴＰ注入の１週間後に行ったビデオ記録セッションにより評価して、動物が、１０以上の臨床評定尺度の増加、および５００ｃｍ／３０分以下の移動距離の減少、５ｃｍ／秒／３０分以下の最大速度、５／３０分以下の立ち上がりに達した時にＭＰＴＰ投与を停止した。次に、パーキンソン病様症状群の安定性を、最後のＭＰＴＰ注入の後の８週の間に、同じ行動判定基準を用いてチェックした。
【０１８５】
＜ウイルス注入手順＞ケタミンとキシラジンの混合物による全身麻酔下（毎時１５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）、９頭のパーキンソン病様ＭＰＴＰマカクザルは、５回のＬｅｎｔｉ−ＬａｃＺまたはＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の定位固定注入を無菌条件下、交連（１０μｌ）および後交連被殻（１０μｌ×４）の両側に受けた（１回の注入あたり１０μｌ、すなわち５０μｌ／被殻および１頭の動物あたり合計１００μｌ）。目標座標は、ニューロナビゲーション法を用いるＭＲＩガイダンス（１．５−ＴＭＲ磁石、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｕｋｅｓｈａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）に基づいていた。第１の注入は、被殻の交連レベルを目標とし、その後に、前交連から２ｍｍ尾側に２回の注入の群（第２および第３の注入、１ｍｍ離れている）が続き、その後に前交連から５ｍｍ尾側に２回の注入の第２の群（第４および第５の注入、１ｍｍ離れている）が続く。全ての注入は、被殻の背外側部分に行われた。レンチウイルスベクターは、１μｌ／分の速度で１０μｌハミルトンシリンジを介して、１０の定位的トラックの各々で、手作業で注入された。針はさらに２分間原位置に残された。全ての針トラックは、ニッスル染色および免疫組織化学研究により観察されるように、被殻の両側に位置した（図１４）。
【０１８６】
＜免疫組織化学＞レンチウイルスベクター注入後８週に、６頭のマカクザルをケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）で深く麻酔し、ペントバルビタールの過量投与（１００ｍｇ／ｋｇ、静脈内；Ｓａｎｏｆｉ、Ｆｒａｎｃｅ）により安楽死させ、冷生理食塩水で経心的に灌流した。直ちに脳を取り出し、正中線矢状切断により半切除し、サル脳スライサーでスラブ化した。右被殻を通るスラブを、円柱状脳パンチャー（内部直径１．５ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ研究のためにパンチした。パンチの長さは約１ｍｍであった。次に、これらの組織スラブを冷４％パラホルムアルデヒド固定液に６日間浸漬し、一連の段階的な冷スクロース溶液中で４日間洗浄し、凍結ミクロトームによって冠状面で切片を形成した（切片厚さ４０μｍ）。免疫組織化学標識用の切片をまず、室温にて４８時間または４℃にて７２時間、０．５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２％ウシ血清アルブミン、３．５％正常血清および適切な希釈の一次抗体として、抗ＴＨを１：１０００希釈（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｂｏｙ，Ｒｅｉｍｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗ＡＡＤＣを１：２５０希釈（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）、抗ドーパミンを１：１０００希釈（ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＣＨ１を１：３０００（Ｅｒｎｓｔ  Ｗｅｒｎｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋからのご寄贈）、抗β−Ｇａｌを希釈１：２０００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）、抗ＮｅｕＮを希釈１：５０００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）、抗ＤＡＴを希釈１：７５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）、抗ＧＦＡＰを希釈１：３００００（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、抗ＣＤ６８を希釈１：１００（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、含有するリン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートした。一次抗血清中でのインキュベーションの後、切片をアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法で加工した。本レンチウイルスベクター中で用いるＴＨ導入遺伝子は、ヒトＴＨイソ型２（ｈＴＨ２）の末端切断型（ｔｒｕｎｃ−ＴＨ２）である。線条体トランスジェニックＴＨの発現を研究するため、ｈＴＨ２のＮ末端制御ユニットおよびＣ末端触媒ユニットの両方を認識するＴＨ抗体を使用した。
【０１８７】
＜二重標識免疫蛍光手順＞ＥＩＡＶベクターによって形質導入される細胞種を同定するため、間接免疫蛍光二重標識法を用いた。間接免疫蛍光二重標識法を用いてＥＩＡＶ−ＬａｃＺ注入動物の線条体のβＧａｌ陽性細胞を、神経細胞マーカー（ＮｅｕＮ）およびグリア細胞マーカー（ＧＦＡＰ）で標識した。各々の実験に対して、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中、４．５％正常ヤギ血清および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．４）中で室温にて１時間のインキュベーションによってバックグラウンド染色を抑制した。次に、切片を、βＧａｌに対する一次ウサギポリクローナル抗体（ＡｂＣａｍ、１：１０００）中で室温にて一晩インキュベートした。洗浄後、切片を、蛍光マーカーＡｌｅｘａ  ４８８と結合した二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００）中で１時間インキュベートした。洗浄後、切片を、一次抗体として、マウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；１：１０００）、マウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ；１：３０００）のうちの一つの中で室温にて一晩インキュベートした。二次抗体（ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ  １：２００）中、室温にて１時間のインキュベーションの後、切片をフルオロリンクＣｙ３標識ストレプトアビジン（１：１０００）の中に室温にて１時間入れた。全ての蛍光画像をアルゴンレーザーおよびＨｅ−Ｎｅレーザーを装備したツァイス共焦点Ｆｌｕｏｒｏｖｉｅｗ顕微鏡で分析した。
【０１８８】
＜立体解析学的分析＞立体解析学的分析を細胞の計数に使用した。線条体内のＥＩＡＶ陽性細胞の総数、すなわち、形質導入細胞の数を評価するため、代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）切片をβ−ガラクトシダーゼ免疫活性（βＧａｌ−ｉｒ）について染色し、陽性細胞をＬｅｎｔｉ−ＬａｃＺ注入動物の線条体全体にわたって計数した。黒質内の残留ドーパミン作動性細胞の総数を評価するため、チロシンヒドロキシラーゼ免疫活性に対して染色した代替切片（ＴＨ−ｉｒ細胞）を、病変のない正常対照動物、ＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ注入動物およびＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１注入動物のＳＮｐｃ全体にわたって計数した。細胞の立体解析学的計数値を、オリンパス立体解析学ソフトウェアＣ．Ａ．Ｓ．Ｔ．−Ｇｒｉｄ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｄｅｎｍａｒｋ，Ａｌｂｅｒｔｓｌｕｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ならびに、ビデオカメラ（ＨＡＤ  Ｐｏｗｅｒ  ３ＣＣＤ５  Ｓｏｎｙ）およびコンピュータ制御のモニター化された試料台（ｍｏｔｏｒｉｚｅｄ  ｓｔａｇｅ）を装備するＯｌｙｍｐｕｓ  Ｐｒｏｖｉｓ顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｒｕｎｇｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に連結されているコンピュータ支援画像解析システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩ）を用いて加工した。立体解析学的分析は、光学分別（ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ）手順を使用した、これは、組織収縮を受けずに、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）基準空間の既知の部分（ｋｎｏｗｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の構造の総数を推定するための、設計に基づく立体解析学的方法である。
【０１８９】
線条体のＥＩＡＶ陽性細胞の計数に関して、推定による、０．１０より小さい誤差係数を受け入れた。ＳＮｐｃ  ＴＨ−ｉｒ細胞に関して、それよりも大きい誤差係数（＜０．３５）を受け入れた。これは、ＭＰＴＰ中毒後のＴＨ−ｉｒ細胞の数の劇的な低下に関係し、計数する対象がほとんど残らなかった。
【０１９０】
＜Ｌ−Ｄｏｐａ投与＞Ｌ−Ｄｏｐａ群の動物は、平均経口一日量が２０ｍｇ／ｋｇのＬ−Ｄｏｐａおよびベンセラジド（４：１比、Ｍｏｄｏｐａｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で慢性的に処置された（以降「Ｌ−Ｄｏｐａ」と証する）。ＭＰＴＰ、Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺおよびＬｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１の薬物で刺激していない霊長類のＬ−Ｄｏｐａ曝露の間、動物は単一経口用量の２０ｍｇ／ｋｇのＬ−Ｄｏｐａおよびベンセラジドを受けた（４：１比、Ｍｏｄｏｐａｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）。微小透析実験の間、霊長類を単一用量の筋肉内Ｌ−Ｄｏｐａおよびベンセラジド４０ｍｇ／ｋｇ（４：１比、メチル−エステル（ｅｓｔｈｅｒ）−Ｌ−Ｄｏｐａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に曝露した。
【０１９１】
＜短時間作用型Ｄ１／Ｄ２アゴニスト投与＞アポモルヒネ（Ａｇｕｅｔｔａｎｔ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、短時間作用型非選択的Ｄ１／Ｄ２アゴニストを、ＭＰＴＰ処置マカクザルにおいてジスキネジアを誘導することが分かっている用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）で全身に投与した。
【０１９２】
＜微小透析＞霊長類をケタミンおよびキシラジンで麻酔し（毎時１５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）定位固定枠に置いた。体温は、サーモスタット・ブランケットを用いる実験の間中３７℃で安定していた。微小透析プローブ（ＣＭＡ／１２、膜長５ｍｍ、カットオフ２０ｋＤａ；ＣＭＡ  Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を線条体の両側に埋め込んだ。微小透析プローブを、４頭の病変のない正常な動物、４頭のＭＰＴＰ動物、３頭のＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＬａｃＺ動物、および２頭のＭＰＴＰ−Ｌｅｎｔｉ−ＴＨ−ＡＡＤＣ−ＣＨ１動物の後交連被殻の中に入れた。プローブをＣＳＦ（単位ｍＭ：１４７ＮａＣｌ、２．７ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ２、および０．８５ＭｇＣｌ２）で２μｌ／分の速度で灌流した。微小透析液を１５分おきに冷却フラクションコレクターに収集し、分析まで−８０℃で凍結させた。各々のプローブを霊長類脳に移植した後、微小透析試料を、手続き上の心的外傷に起因する神経伝達物質放出の一過性の増加からも回復する２時間の安定化期間にわたって取り出した。次に、ベースライン試料を、その次の１時間にわたって取り出した。次に、ベースライン試料の収集に続いて、動物を急性ドーパミン（ドーパミン４０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）またはＬ−ＤＯＰＡ曝露（Ｌ−ＤＯＰＡメチルエステル、４０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）とし、さらなる微小透析試料を２時間にわたって連続的に採取した。微小透析セッションの終わりまでに、被殻からのプローブの除去の後に既知ドーパミン濃度（１μＭ）の溶液中で微小透析を３０分間行うことにより、さらなる対照試料を生成した。これは、各々のプローブの効率の計算を可能にし、被殻における実際のドーパミン濃度の推定できることになる。各々の実験の後、Ｔ２＊強調ＭＲＩを用いてプローブの位置をチェックした。
【０１９３】
＜死後のドーパミンの測定：全組織ドーパミンレベル［ＤＡ］ｗｔ＞電気化学的検出を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して脳パンチおよび微小透析試料中のカテコールアミンの線条体のレベルを測定した。手短に言えば、脳パンチを、均質化バッファー（プロテアーゼ抑制剤を添加した、１．２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、ｐＨ７．２）中でホモジナイズした。組織ホモジネートを１０分の１の容積の抽出バッファー（０．４Ｍ過塩素酸、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）と混合することによりカテコールアミンを抽出した。次に、上清を遠心し、濾過した。微小透析試料を６分の１の容積の０．２Ｍ過塩素酸で処理した。上清または微小透析試料を、ＥＳＡ  Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩ電気化学的検出器（ＥＳＡ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を装備したＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００）に適用した。脳ホモジネートから得たカテコールアミンを、ＨＲ−８０カラム（ＥＳＡ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）およびＣａｔ−Ａ−Ｐｈａｓｅ移動相（ＥＳＡ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を１．５ｍｌ／分の流速で用いて分離し、次いで電気化学的に検出した。
【０１９４】
＜インビボでのドーパミンの測定：細胞外ドーパミンレベル［ＤＡ］ｅｃ＞ＨＰＬＣ系の感受性を、カテコールアミン標準品ＨＰＬＣおよび検出系に流すこと、ならびに出力トレースの評価により検証した。１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲内のＬ−Ｄｏｐａ、ＤＯＰＡＣ、ＨＶＡおよびドーパミンを含有する標準液を、微小透析試料と同じバックグラウンドシグナルを確保するために、１：５人工ＣＳＦの標準希釈剤中溶液中に形成した。１００マイクロリットルの各々の標準液（０．５〜１００ｐｇの各々のカテコールアミン）を、ＨＰＬＣ系に流し、各々の代謝産物に対する出力を分析した。各々の代謝産物に対する検量線を、これらのデータから生成し、微小透析試料中のカテコールアミンの濃度を、これらの曲線から算出した。
【０１９５】
微小透析試料を解凍し、５μｌの０．２Ｍ過塩素酸をＨＰＬＣ分析の前に各々の試料に添加した。５の標準希釈剤（ＥＳＡ）中１の割合で試料を希釈し、各々の分析のために１００μｌを注入した。残った試料を使用するＬ−ＤｏｐａおよびＨＶＡレベルの分析のためにはさらなる希釈（１／１０）が必要であった。試料をＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ機に流し、ＭＤ−１５０カラム（ＥＳＡ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）およびＭＤ−ＴＭ移動相（ＥＳＡ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を０．６ｍｌ／分の流速で用いて分離し、次いでＣｏｕｌｃｈｅｍ  ＩＩ  電気化学的検出器（ＥＳＡ）を用いて電気化学的に検出した。ドーパミン検出の効率を向上させるため、特殊化した微小透析細胞（５０１４Ｂ、ＥＳＡ）を検出器と併せて使用して、低レベル（＜１ｐｇ）のドーパミンの検出を可能にした。
【０１９６】
＜電気生理学＞一定にモニターされるケタミン／キシラジン麻酔下（１５ｍｇ／１．５ｍｇ／ｋｇ）、安定した心拍数、呼吸頻度、およびＣＯ２呼気流が観察される時間の間だけ単一ユニット活性を記録した。ガラスコートタングステン微小電極を、ＭＲＩガイダンスのもと、淡蒼球内節に定位的に埋め込んだ。記録位置は、電極トラックの組織学的再構築により確認した。シグナルを増幅し、Ｌｅａｄｐｏｉｎｔ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてバンドパスフィルターに通した（３００〜５０００Ｈｚ）。単一細胞活動電位は、最初の閾値または抽出鋳型であり、十分に単離された単位だけがさらなる分析に選択された。２０秒のスパイク列を記録し、オフライン分析のために保存した。閾値または鋳型マッチング・アルゴリズム（Ｄａｔａｖｉｅｗ４．５；ＷＪ．Ｈｅｉｔｌｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を用いてニューロン活動を抽出し、平均発火率を算出した。バースト検出のポアソン「サプライズ」法を用いてバースト放電を定量化し、ポアソンサプライズ値は＞１０であった。各々の細胞に関してサンプリングしたスパイクの総数と比較した、バースト放電におけるスパイクの割合を決定した。
【０１９７】
＜［１４Ｃ］−２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）を用いる局所脳グルコース代謝率（ＬＣＧＵ）＞マカクザルのＬＣＧＵを、マカクザルが屠殺された日に測定した。実験は、プロポフォールで麻酔された動物で行った。体温を直腸でモニターし、サーモスタット制御加温パッドを用いて３７℃に維持した。ポリエチレンカテーテルを、その後の２−ＤＧの静脈内投与および動脈血のサンプリングのために大腿静脈および動脈に挿入した。１００μＣｉ／ｋｇ  ２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの静脈内パルスの注入により手順を開始した（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；比放射能５０〜５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）。時刻を決めた動脈血試料（０．２５、０．５、０．７５、１、２、５、７．５、１０、１５、２５、３５、および４５分）を、その後動脈の２−［１４Ｃ］デオキシグルコースおよびグルコース濃度の経時的推移を規定するために十分なスケジュールで引き出した。動脈血試料を直ちに遠心した。血漿１４Ｃ濃度を、液体シンチレーション計数（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）により決定し、血漿グルコース濃度を、グルコメータ（ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｉｓｓｙ−ｌｅｓ−Ｍｏｕｌｉｎｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて評価した。トレーサー注入の４５分後、動物をペントバルビタールナトリウム（１５０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）の静脈内過量投与により屠殺した。脳を素早く取り出してイソペンタン（−４５℃）中で凍結させ、後のオートラジオグラフィー処理のために−８０℃で貯蔵した。線条体全体を覆う冠状脳切片（厚さ２０μｍ）、運動前野および前頭前皮質（５０切片）を、クライオミクロトームを用いて−２０℃で得、スーパーフロストスライドに載せ、瞬時に乾燥させ、較正された［１４Ｃ］標準品（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いてオートラジオグラフィーフィルム（ＫＯＤＡＫ  ＢｉｏＭａｘ  ＭＲ）の上に７〜１０日間曝露した。次に、同じ脳切片をクレシルバイオレットで染色し、これらの切片から得た光学画像を３Ｄボリューム空間に再構成した。オートラジオグラムをデジタル化し、コンピュータによる画像解析システム（ＭＣＩＤ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて分析した。次に、オートラジオグラムから得た光学画像を、同じ位置合わせをした（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）３Ｄ解剖学的空間と一緒に整列させて、解剖学的および機能的ボリュームを得た。オートラジオグラム上のＳＴＮ中で決定される光学密度（１０〜１３切片／ＳＴＮ）を放射能に変換し、次いで［１４Ｃ］標準品およびソコロフの修正運用方程式（ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いてグルコース消費値に変換した。
【０１９８】
＜統計分析＞値は、平均±標準誤差である。データは、クラスカル−ウォリス（ＫＷ）またはフリードマン検定（反復測定ＡＮＯＶＡのノンパラメトリック同等物）によって、その後、個々の時点でマン−ホイットニー（ＭＷ）ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によって分析し、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて多重比較について補正した。
【０１９９】
上の明細書で言及した全ての刊行物は、参照することより本明細書に組み込まれるものとする。記載される本発明の方法および系の様々な変更形態および改変形態は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されたが、特許請求される本発明はかかる具体的な実施形態に過度に限定されるものでないことは当然理解されるべきである。実際に、フローサイトメトリーを使用する細胞研究または関連分野の当業者には明らかな、本発明を実行するための記載様式の様々な変更形態は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ．ｂ】
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【図３ｃ．ｄ】
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【図４ａ−ｃ】
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【図４ｄ−ｇ】
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【図５ａ．ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図１９−７】
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