(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の標的を検出するためのセンサであって、以下の：
（ｉ）第１の電極；
（ｉｉ）前記第１の電極と結合を形成する第１の電子導電分子；
（ｉｉｉ）前記第１の電子導電分子と結合を形成する第１のプローブであって、前記第１のプローブは溶液中の目的の標的に結合するように構成される；及び
（ｉｖ）前記第１のプローブに共役し、前記第１の電子導電分子とは異なる、第２の電子導電分子；
を含む、センサ。
【請求項２】
請求項１に記載のセンサにおいて、前記第１の電子導電分子は前記第１の電極に共有結合する、センサ。
【請求項３】
請求項２に記載のセンサにおいて、前記第１のプローブは前記第１の電子導電分子に共有結合する、センサ。
【請求項４】
請求項１に記載のセンサにおいて、前記センサは、第１の流路を更に有し、その第１の流路は、前記第１の電極に接触し、前記目的の標的を含むサンプルが前記第１の流路を流れ、前記目的の標的が前記第１のプローブに結合すると、第１のシグナルを生成するように構成される、センサ。
【請求項５】
請求項４に記載のセンサにおいて、前記センサは前記第１のシグナルが検出されるように構成されたプロセッサを更に有する、センサ。
【請求項６】
請求項５に記載のセンサにおいて、前記第１のシグナルの検出は前記サンプルが前記目的の標的を含むことを指し示す、センサ。
【請求項７】
請求項１に記載のセンサにおいて、前記センサは、更に第２の電極を有し、前記第２の電極は第３の電子導電分子及び第２のプローブを含み、前記第２のプローブは前記目的の標的に結合せず、前記第３の電子導電分子は前記第１または第２の電子導電分子と同一または異なる、センサ。
【請求項８】
請求項７に記載のセンサにおいて、前記第３の電子導電分子は前記第１の電子導電分子と同一である、センサ。
【請求項９】
請求項７に記載のセンサにおいて、前記第３の電子導電分子は前記第２の電極に共有結合する、センサ。
【請求項１０】
請求項７に記載のセンサにおいて、前記第２のプローブは第４の電子導電分子を含み、前記第４の電子導電分子は前記第３の電子導電分子と同一または異なる、センサ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のセンサにおいて、前記第４の電子導電分子は前記第２の電子導電分子と同一である、センサ。
【請求項１２】
請求項９に記載のセンサにおいて、前記第２のプローブは前記第３の電子導電分子に共有結合する、センサ。
【請求項１３】
請求項１０に記載のセンサにおいて、前記第３の電子導電分子は前記第２の電極に共有結合し、前記第２のプローブは前記第３の電子導電分子に共有結合する、センサ。
【請求項１４】
請求項７に記載のセンサにおいて、前記センサは、第１の流路を更に有し、その第１の流路は、前記第１の電極に接触し、前記目的の標的を含むサンプルが前記第１の流路を流れ、前記標的が前記第１のプローブに結合すると、第１のシグナルを生成するように構成され、かつ、第２の流路を更に有し、その第２の流路は、前記第２の電極に接触し、前記サンプルが前記第２の流路を流れ、第２のシグナルを生成するように構成される、センサ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のセンサにおいて、前記センサは、前記第１のシグナル及び前記第２のシグナルが検出されるように構成されたプロセッサを更に有する、センサ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のセンサにおいて、前記目的の標的は、前記第１及び第２のシグナルに伴う値を所定の値と比較することによって検出され、前記所定の値より大きな値は、目的の標的が前記サンプル中に存在することを指し示している、センサ。
【請求項１７】
請求項１に記載のセンサにおいて、前記第１及び第２の電子導電分子は、芳香族化合物、ピリジン化合物、ポリアセチレンポリマー、チオフェン化合物、アゾール化合物、ポリアニリンポリマー、またはそれらの誘導体から選択される異なる分子同士である、センサ。
【請求項１８】
請求項１０に記載のセンサにおいて、前記第３の電子導電分子及び／又は前記第４の電子導電分子は、芳香族化合物、ピリジン化合物、ポリアセチレンポリマー、チオフェン化合物、アゾール化合物、ポリアニリンポリマー、またはそれらの誘導体である、センサ。
【請求項１９】
請求項７に記載のセンサにおいて、前記第１のプローブ及び／又は前記第２のプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、前記生体分子に結合する能力を有する抗体フラグメント、アプタマー、抗原、またはエピトープである、センサ。
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか一項記載のセンサと標的を含むサンプルとを接触させる工程を有する、目的の標的を検出するための方法であって、
前記標的が前記第1のプローブに結合すると、第1のシグナルが生成され、
前記第1のシグナルの検出は、生体分子が前記サンプル中に存在することを指し示している、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記方法は、前記サンプルが第１の流路を流れるように、且つ前記第１の電極に接触するように、前記サンプルを第１の流路に導入する工程を更に有し、前記第１のシグナルは前記第１の流路で生成される、方法。
【請求項２２】
ピリジン化合物、ポリアセチレンポリマー、アゾール化合物、ポリアニリンポリマー、またはそれらの誘導体から選択される複数の電子導電分子に共役するセンサプローブであって、前記プローブは目的の標的に結合するように構成される、センサプローブ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のセンサプローブにおいて、前記プローブは、電極と第２の共有結合を形成するように構成された前記電子導電分子に共有結合する、センサプローブ。
【請求項２４】
請求項２２に記載のセンサプローブにおいて、前記プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、前記生体分子に結合する能力を有する抗体フラグメント、アプタマー、抗原、またはエピトープである、センサプローブ。
【請求項２５】
請求項２２に記載のセンサプローブを含む電極。
【請求項２６】
請求項２５に記載の電極において、前記プローブは前記電子導電分子に共有結合し、前記電子導電分子は前記電極に共有結合する、電極。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
バイオセンサは、生体分子などの標的分子を検出するための分析装置である。ほとんどのバイオセンサは光バイオセンサである。光バイオセンサは金属からなり、光を吸収して金属表面上に電子波を生じる。電子波は、入射光のある特定の角度および特定の波長で生じ得るので、金属表面に強く依存する。生体分子が金属上に付着すると、測定可能なシグナルが生じ得る。
【０００２】
いくつかのバイオセンサは電気化学バイオセンサである。電気化学バイオセンサでは、通常、プローブに触媒を使用する。しかし、そのシグナルは低いので、このような電気化学バイオセンサの適用には限界がある。目的の標的分子を正確に検出するために、ノイズ比に対してより高い信号を有する新規のバイオセンサが必要である。
【発明の概要】
【０００３】
本開示のいくつかの実施形態は、一般的に、標的検出用のセンサに関する。ある例示されるセンサは、第１の電子導電分子で処理された電極と、第２の電子導電分子と共役したプローブと、を有する。このプローブを、第１の電極に取り付け、標的と結合するように構成する。第１および第２の電子導電分子は異なっていてもよい。
【０００４】
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、一般的に、標的の検出方法に関する。ある例示される方法は、標的含有が疑われるサンプルと上記のセンサとを接触させる工程を有する。この標的がプローブに結合すると、シグナルが生成される。このシグナルが検出された場合、これは、標的がサンプル中に存在することを指し示している。
【０００５】
本開示のさらなる実施形態は、一般的に、電子導電分子に共役する抗体などから成るプローブに関する。このような抗体分子は、明細書内で記載されるセンサにおいて使用される。ある例示される抗体は、ピリジン化合物、ポリアセチレンポリマー、アゾール化合物、ポリアニリンポリマー、またはそれらの誘導体と共役する。電子導電分子に共役したプローブ、例えば、ピリジン化合物、ポリアセチレンポリマー、アゾール化合物、ポリアニリンポリマー、またはそれらの誘導体に共役した抗体を含む電極も提供する。
【０００６】
上記概要は例示のみを目的とし、どのような手法においても制限されるものではない。上記の例示される態様、実施形態、および特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、および特徴は、図面および以下の詳細な説明を参照することから明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】生体分子検出用のセンサを例示する実施形態を示す。
【図２】生体分子の検出方法を例示する実施形態のフローチャートを示す。
【図３Ａ】生体分子検出用のセンサにおける２つの電極を準備する方法を例示する実施形態を示す。
【図３Ｂ】生体分子検出用のセンサにおける２つの電極を準備する方法を例示する実施形態を示す。
【図３Ｃ】生体分子検出用のセンサにおける２つの電極を準備する方法を例示する実施形態を示す。
【図３Ｄ】生体分子検出用のセンサにおける２つの電極を準備する方法を例示する実施形態を示す。
【図３Ｅ】生体分子検出用のセンサにおける２つの電極を準備する方法を例示する実施形態を示す。
【図３Ｆ】生体分子検出用のセンサにおける２つの電極を準備する方法を例示する実施形態を示す。
【図４Ａ】ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）感染症患者サンプルおよび標準サンプルから希釈された種々の濃度において検出された電流を例示する実施形態のチャートを示す。
【図４Ｂ】印加バイアス電圧（約０．０１ボルト）においてコンダクティブ原子間力顕微鏡法によって走査された、ビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）と共役した抗（ＨＰＶ  ＨＲ）モノクローナル抗体を含む電極の導電性画像を示す。
【図４Ｃ】エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）感染症患者サンプルおよび標準サンプルから希釈された種々の濃度において検出された電流を例示する実施形態のチャートを示す。
【図４Ｄ】白血球細胞由来ケモタキシン−２感染症患者サンプルおよび標準サンプルから希釈された種々の濃度において検出された電流を例示する実施形態のチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下の詳細な説明では、明細書の一部である添付の図面を参照する。図面において、文脈がそう述べない限り、典型的には、類似の記号は類似の要素を指し示す。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載の例示される実施形態は、限定されるものではない。本明細書中に示される主題の精神または範囲から逸脱することなしに、その他の実施形態を活用することができ、またその他の変更が可能である。本明細書中に一般的に記載され、且つ図面に示されたような本開示の態様は、広範な種々の異なる構成に配置、置換、組み合わせ、デザインされることができ、その全ては明確に熟考され本開示の一部となることは容易に理解されるであろう。
【０００９】
本開示では、「電子導電分子」という語は、一般的に、電子を導電する化合物を示す。電子導電分子は重複するｐ軌道の領域を有し、隣接するように配列したｐ軌道上でのπ電子の非局在化を可能にする。電子導電分子のコンダクタンスは、コンダクティブ原子間力顕微鏡法によって調べることができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のバイオセンサ用チップにおいて有用な電子導電分子のコンダクタンスは、約０．０１ボルトの印可電圧時で約１μΩ-1〜約１０μΩ-1である。
【００１０】
「プローブ」という語は、一般的に、目的の標的（例えば、生体分子）に結合することができる化合物を示す。例えば、標的へのプローブの結合の親和力は、約１００ピコニュートン〜約５００ピコニュートンとなり得る。限定されないプローブの例としては、抗体、目的の標的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー）、アプタマー、抗原、および酵素が挙げられる。
【００１１】
「標的」という語は、一般的に、本明細書中に記載のバイオセンサによって検出可能な任意の分子をいう。標的には生体分子が含まれるが、これに限定されない。本明細書中に記載のバイオセンサによって検出可能な標的の例としては、生体分子（例えば、ウイルス、タンパク質、核酸、および炭水化物）および脂質、ハプテン、毒素などの他の小分子タイプが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
ここで、プローブは、電子導電分子を含む。プローブの電子移送の挙動は、電子導電分子による重複ｐ軌道によって誘発される。結果として、標的がプローブに結合すると、標的とプローブの結合に伴って電場の変化が増幅され得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、生体分子検出用のセンサは、第１の電極、第１のプローブ、第１および第２の電子導電分子を含む。第１のプローブは、サンプル中の目的の標的を認識して結合する。いくつかの実施形態では、第１および第２の電子導電分子は異なっている。第１の電極は、第１の電子導電分子で処理される。第１の電子導電分子は、第１の電極との第１の化学結合を形成する。第１の化学結合は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、第１のプローブは、第１の電極と化学結合、例えば、共有結合を形成する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１のプローブは、第２の電子導電分子で処理される。いくつかの実施形態では、第２の電子導電分子を、第１のプローブに共役させる、例えば、直接的にまたはリンカー分子を介して第１のプローブに共有結合させる。いくつかの実施形態では、第１のプローブは、第１の電子導電分子と第２の化学結合を形成する。したがって、第１のプローブは、第１の化学結合および第２の化学結合を介して第１の電極に付着し、付着した第２の電子導電分子をも含む。
【００１５】
第１のプローブは、センサによって検出すべき標的とは「錠前と鍵」の関係を形成している。例えば、第１のプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、抗原、または酵素であり得る。いくつかの実施形態では、第１のプローブは抗体であり、標的はその抗体が結合する抗原である。潜在的に標的を含む第１のサンプルをセンサに導入した後、第１の電極上に流すと、第１の電極に伴う第１の電場は、第１のプローブに結合する標的に合わせて変化する。第１の電場の変化に基づいて第１のシグナルが得られる。センサは、第１のシグナルが検出されるように構成されたプロセッサを有する。いくつかの実施形態では、第１のシグナルの検出は、第１のサンプルが標的を含むことを指し示している。第２の電子導電分子を第１のプローブに処理することにより、例えば、第１のプローブへ第２の電子導電分子を付着させることにより、第１のプローブの導電率が増加する。したがって、標的がプローブに結合すると、結合に伴う電場の変化は更に容易に検出されるようになる。ある実施形態では、このセンサは、第１の流路を有し、その第１の流路は、第１の電極に接触し、標的を含む疑いのある第１のサンプルがその流路を流れ、標的が第１のプローブに結合するとその流路でシグナルが生成される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、このセンサは、第３の電子導電分子および第２のプローブを含む第２の電極を有する。第２のプローブは、センサによって検出すべき標的とカップリングしないように構成される。いくつかの実施形態では、第２のプローブの標的に対する結合親和力は、約５０ピコニュートン未満である。第３の電子導電分子は、第１または第２の電子導電分子と同一であるまたは異なっていてもよい。ある実施形態では、第３の電子導電分子は、第１の電子導電分子と同一である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第３の電子導電分子は、第１の電極と第３の化学結合を形成する。この化学結合は共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、第２のプローブは、第１の電極と化学結合を形成する。この化学結合は共有結合であってもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第２のプローブは、第４の電子導電分子を含み、これは、第１または第２の電子導電分子と同一であるまたは異なっていてもよく、第３の電子導電分子と同一であるまたは異なっていてもよい。ある実施形態では、第３の電子導電分子は、第３の化学結合を介して、例えば、共有結合的に第２の電極に付着し、第２のプローブは、第４の化学結合を介して、例えば、共有結合的に第３の認識分子に付着する。第４の電子導電分子は、例えば、共有結合的に第２のプローブに付着する。例えば、第２のプローブは、第３の化学結合および第４の化学結合を介して第１の電極に付着し、付着した第４の電子導電分子をも含む。
【００１９】
第２のプローブは、センサによって検出すべき標的とは異なる生体分子と「錠前と鍵」の関係を形成する。いくつかの限定されない実施形態では、第２のプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、抗原、または酵素であり得る。いくつかの実施形態では、第２のプローブは、検出すべき標的以外の抗原を認識する抗体である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、このセンサは、第１の電極と接触した第１の流路および第２の電極と接触した第２の流路を有する。このセンサは、目的の標的を含む疑いのある第１のサンプルが第１の流路および第２の流路を同時に流れるように構成される、あるいは、第１のサンプルが第１および第２の流路を非同時に流れるように構成される。第１のシグナルは、上記で述べたような第１の流路で生成される。第２の電極に伴う第２の電場は、第１のサンプルに合わせて変化する。第２のシグナルは、第２の電場の変化に基づいて得られる。第１のシグナルおよび第２のシグナルは、さらなる処理のために記録される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、目的の標的を実質的に含まない第２のサンプルを、それぞれ、第１の電極および第２の電極を介してセンサに導入する。第３のシグナルは、第２のサンプルが第１の電極を流れるのに合わせて第１の流路で生成される。第４のシグナルは、第２のサンプルが第２の電極を流れるのに合わせて第２の流路で生成される。第１のシグナルと第３のシグナル間の第１の相違と、第２のシグナルと第４のシグナル間の第２の相違との比に基づいて、このセンサは、標的が第１のサンプル中に存在するかどうかを決定する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの電極を有するバイオセンサであって、一方の電極が少なくとも１つのプローブおよび１つの電子導電分子を含み、他方の電極が少なくとも１つのプローブおよび２つの電子導電分子を含む、バイオセンサを提供する。
【００２３】
ある実施形態では、（ａ）本明細書中に記載の第１のプローブおよび本明細書中に記載の第１の電子導電分子を含み、第１のプローブがサンプル中の目的の標的に結合するように構成された、第１の電極と、（ｂ）第２の電子導電分子および第３の電子導電分子を含む第２のプローブを含み、このプローブが目的の標的に結合せず、第１の電子導電分子は第２または第３の電子導電分子と同一であるまたは異なっている、第２の電極と、を含む、バイオセンサを提供する。上記で述べたように、このようなバイオセンサは、目的の標的分子の検出方法において使用される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または任意の第４の電子導電分子は、芳香族化合物、ピリジン化合物、ポリアセチレンポリマー、チオフェン化合物、アゾール化合物、ポリアニリンポリマー、またはそれら誘導体のうちの１つであり得る。いくつかの例示される電子導電分子には、３−（チオフェン−２−イル）プロパナール（３−（ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、３−フェニルプロパナール（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎａｌ）、３−（１−ピロール−２−イル）プロパナール（３−（１−ｐｙｒｒｏｌ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、３−（ピリジン−２−イル）プロパナール（３−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、（Ｅ）−４−フェニルブト−３−エナール（（Ｅ）−４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（４−（Ｅ）−スチリルフェニル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（４−（Ｅ）−ｓｔｙｒｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（ピリジン−２−イル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（５−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニル）ピリジン−２−イル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（５−（（Ｅ）−２−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｖｉｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−ヘプタ−４，６−ジエナール（（Ｅ）−ｈｅｐｔａ−４，６−ｄｉｅｎａｌ）、（Ｚ）−ヘプタ−４，６−ジエナール（（Ｚ）−ｈｅｐｔａ−４，６−ｄｉｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（シクロヘキサ−２−エニリデン）ブタナール（（Ｅ）−４−（ｃｙｃｌｏｈｅｘ−２−ｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）ｂｕｔａｎａｌ）、２−（ナフタレン−２−イル）アセトアルデヒド（２−（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−２−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）、５’’−フォルマル−５−カルボキシル−２，２’，５’，２’’−トリチオフェン（５’’−ｆｏｒｍａｌ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌ−２，２’，５’，２’’−ｔｒｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ｐ−４’−フォルマル−４−カルボキシル−１，１’−ビベンゼン（ｐ−４’−ｆｏｒｍａｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌ−１，１’−ｂｉｂｅｎｚｅｎｅ）、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、およびそれら誘導体のうちの１つが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
いくつかの実施形態では、標的の検出方法が開示される。本方法は、上記の任意のセンサを、標的を含む疑いのある第１のサンプルと接触させる工程、および標的が第１のプローブと結合すると上記で述べたように第１のシグナルを検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、この第１のシグナルの検出は、標的が第１のサンプル中に存在することを指し示している。任意に、第２のシグナル、第３のシグナル、および第４のシグナルを上記のように検出し、第１、第２、第３、および第４のシグナルを処理して、標的が第１のサンプル中に存在するかどうかを決定する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の電子導電分子で第１の電極を処理する工程、第１のプローブを第２の電子導電分子と共役させる工程、および第１の電極上に第１のプローブを付着させる工程を含む。第１のプローブは、標的に結合するように構成される。
【００２７】
本方法は、更に、同じ第１の電子導電分子で第２の電極を処理する工程、および第２の電極上に第２のプローブを付着させる工程を含む。第２のプローブは、標的に結合しないように構成される。
【００２８】
本方法は、更に、第１の電極および第２の電極を同時に流れるように、標的を潜在的に含む第１のサンプルを導入して、第１のシグナルおよび第２のシグナルをそれぞれ得る工程を含む。本方法は、更に、第１の電極および第２の電極を同時に流れるように、標的を実質的に含まない第２のサンプルを導入して、第３のシグナルおよび第４のシグナルを得る工程を含む。本方法は、更に、上記のように、第１、第２、第３、および第４のシグナルの定量化に基づいて第１のサンプルが標的を含むかどうかを決定する工程を含む。
【００２９】
図１は、目的の標的の検出用センサ１００を例示する実施形態である。センサ１００は、緩衝液タンク１０１、ポンプ１０３、スプリッター１０５、第１のサンプルループ１３０、第２のサンプルルール１４０、バイオチップ１２０、廃液タンク１０９、およびプロセッサ１０８を有する。第１のサンプルループ１３０および第２のサンプルルール１４０は、センサによって検出すべき標的を潜在的に含むサンプルを保存するように構成される。センサが起動された後、ポンプ１０３は緩衝液タンク１０１中に貯蔵された緩衝液を汲み上げて第１のサンプルループ１３０および第２のサンプルルール１４０上を洗い流す。次いで、サンプルを緩衝液と混合し、第１の流路１１１および第２の流路１１３からバイオチップ１２０内に流入させる。バイオチップ１２０は、第１の電極セット１２１および第２の電極セット１２２を有する。サンプルは、バイオチップ１２０内を流れた後、最終的に廃液タンク１０９において回収される。
【００３０】
第１のプローブを第１の電極セット１２１上に付着させ、この第１のプローブは、センサ１００によって検出されるべき標的に結合するように構成される。第２のプローブを第２の電極セット１２２上に付着させ、この第２のプローブは、センサ１００によって検出されるべき標的に結合しないように構成される。
【００３１】
サンプルが第１の電極セット１２１および第２の電極セット１２２を流れると、第１の電極セット１２１および第２の電極セット１２２のそれぞれの電場が変化する。次いで、第１の電極セット１２１および第２の電極セット１２２の電場の変化を反映したシグナルが、さらなる処理のためにワイヤ１２３および１２４を介してプロセッサ１０８に送られる。プロセッサ１０８は、センサによって検出されるべき標的がサンプル中に存在するかどうかを決定するように構成される。
【００３２】
図２は、生体分子の検出方法２００を例示する実施形態のフローチャートを示す。この方法２００は、工程２０１、２０３、および２０５を含む。工程２０１では、電極は、第１の電子導電分子で処理される。第１の電子導電分子は、この電極と共有結合を形成する。この電極は、金属、例えば、金、白金、銅などから成る。いくつかの例示される第１の電子導電分子として、３−（チオフェン−２−イル）プロパナール（３−（ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、３−フェニルプロパナール（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎａｌ）、３−（１−ピロール−２−イル）プロパナール（３−（１−ｐｙｒｒｏｌ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、３−（ピリジン−２−イル）プロパナール（３−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、（Ｅ）−４−フェニルブト−３−エナール（（Ｅ）−４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（４−（Ｅ）−スチリルフェニル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（４−（Ｅ）−ｓｔｙｒｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（ピリジン−２−イル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（５−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニル）ピリジン−２−イル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（５−（（Ｅ）−２−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｖｉｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−ヘプタ−４，６−ジエナール（（Ｅ）−ｈｅｐｔａ−４，６−ｄｉｅｎａｌ）、（Ｚ）−ヘプタ−４，６−ジエナール（（Ｚ）−ｈｅｐｔａ−４，６−ｄｉｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（シクロヘキサ−２−エニリデン）ブタナール（（Ｅ）−４−（ｃｙｃｌｏｈｅｘ−２−ｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）ｂｕｔａｎａｌ）、２−（ナフタレン−２−イル）アセトアルデヒド（２−（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−２−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）、５’’−フォルマル−５−カルボキシル−２，２’，５’，２’’−トリチオフェン（５’’−ｆｏｒｍａｌ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌ−２，２’，５’，２’’−ｔｒｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ｐ−４’−フォルマル−４−カルボキシル−１，１’−ビベンゼン（ｐ−４’−ｆｏｒｍａｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌ−１，１’−ｂｉｂｅｎｚｅｎｅ）、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、およびそれら誘導体のうちの１つが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
工程２０３では、プローブは、第２の電子導電分子と共役する。このプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、抗原、または酵素から成る。第２の電子導電分子は、第１の電子導電分子と異なっていてもよい。いくつかの例示される第２の電子導電分子として、３−（チオフェン−２−イル）プロパナール（３−（ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、３−フェニルプロパナール（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎａｌ）、３−（１−ピロール−２−イル）プロパナール（３−（１−ｐｙｒｒｏｌ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、３−（ピリジン−２−イル）プロパナール（３−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｌ）、（Ｅ）−４−フェニルブト−３−エナール（（Ｅ）−４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（４−（Ｅ）−スチリルフェニル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（４−（Ｅ）−ｓｔｙｒｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（ピリジン−２−イル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（５−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニル）ピリジン−２−イル）ブト−３−エナール（（Ｅ）−４−（５−（（Ｅ）−２−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｖｉｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｕｔ−３−ｅｎａｌ）、（Ｅ）−ヘプタ−４，６−ジエナール（（Ｅ）−ｈｅｐｔａ−４，６−ｄｉｅｎａｌ）、（Ｚ）−ヘプタ−４，６−ジエナール（（Ｚ）−ｈｅｐｔａ−４，６−ｄｉｅｎａｌ）、（Ｅ）−４−（シクロヘキサ−２−エニリデン）ブタナール（（Ｅ）−４−（ｃｙｃｌｏｈｅｘ−２−ｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）ｂｕｔａｎａｌ）、２−（ナフタレン−２−イル）アセトアルデヒド（２−（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−２−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）、５’’−フォルマル−５−カルボキシル−２，２’，５’，２’’−トリチオフェン（５’’−ｆｏｒｍａｌ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌ−２，２’，５’，２’’−ｔｒｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ｐ−４’−フォルマル−４−カルボキシル−１，１’−ビベンゼン（ｐ−４’−ｆｏｒｍａｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌ−１，１’−ｂｉｂｅｎｚｅｎｅ）、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、およびそれら誘導体のうちの１つが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
工程２０５では、このプローブを電極上に付着させる。このプローブは、第１の電子導電分子と共有結合を形成する。プローブと第１の電子導電分子との間の共有結合および第１の電子導電分子と電極との間の共有結合を介して、このプローブを電極上に付着させる。
【００３５】
図３Ａ〜３Ｆは、生体分子検出用センサにおける２つの電極の準備方法を例示する実施形態を示す。図３Ａでは、第１の金電極３０１を、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）で処理している。５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）を電子導電分子として使用し、処理された第１の金電極３０１’と第１の共有結合を形成する。そうすると、処理された第１の金電極３０１’の電子導電率が促進される。いくつかの実施形態では、処理された第１の金電極３０１’は、センサの第１の流路中に配置される。
【００３６】
図３Ｂでは、第２の金電極３０２を、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）で処理している。５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）を電子導電分子として使用し、処理された第２の金電極３０２’と第２の共有結合を形成する。そうすると、処理された第２の金電極３０２’の電子導電率が促進される。いくつかの実施形態では、処理された第２の金電極３０２’は、センサの第２の流路中に配置される。
【００３７】
図３Ｃでは、ビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）が、処理された抗（ＨＰＶ  ＨＲ）抗体３０３’と共役するように、抗（ＨＰＶ  ＨＲ）抗体３０３をビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）で処理する。ビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）を電子導電分子として使用している。処理された抗（ＨＰＶ  ＨＲ）抗体３０３’の電子導電率が促進される。
【００３８】
図３Ｄでは、ビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）が、処理された抗カフェイン抗体３０４’と共役するように、抗カフェイン抗体３０４をビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）で処理している。ビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）を電子導電分子として使用する。処理された抗カフェイン抗体３０４’の電子導電率が促進される。
【００３９】
図３Ｅでは、処理された抗（ＨＰＶ  ＨＲ）抗体３０３’を、処理された第１の金電極３０１’上に付着させている。いくつかの実施形態では、処理された抗（ＨＰＶ  ＨＲ）抗体３０３’のアミン基は、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）と第３の共有結合を形成する。第１および第３の共有結合を介して、処理された抗（ＨＰＶ  ＨＲ）抗体３０３’を、処理された第１の金電極３０１’上に付着させる。
【００４０】
図３Ｆでは、処理された抗カフェイン抗体３０４’を、処理された第２の金電極３０２’上に付着させている。いくつかの実施形態では、処理された抗カフェイン抗体３０４’のアミン基は、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）と第４の共有結合を形成する。第２および第４の共有結合を介して、処理された抗カフェイン抗体３０４’を、処理された第２の金電極３０２’上に付着させる。
【実施例１】
【００４１】
２つの金電極セットを含む裸のセンサチップを、Ｖｓｅｎｓｏｒ（登録商標）Ｖ１１Ａ３センサ（Ｖｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）に取り付けた。このセンサにおいて、第１の流路は第１の金電極セットと交差しており、第２の流路は第２の金電極セットと交差している。センサを起動させた後、ポンプで緩衝液タンクからリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液を汲み上げた。ＰＢＳ緩衝液はｐＨ７．２であり、２０μｌ／分の速度でセンサチップ上に流された。次いで、電子導電分子である１０ｍＭの５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）溶液をセンサに注入し、ＰＢＳ緩衝液で流した。次いで、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）溶液およびＰＢＳ緩衝液を、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に５分間流した。最後に、第１の金電極セットおよび第２の金電極セットを、ＰＢＳ緩衝液でさらに１５分間洗浄した。
【００４２】
２００μｇ／ｍｌの抗（ＨＰＶ  ＨＲ）モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ７５５７４，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）溶液を、ＰＢＳ緩衝液で作成した。別の電子導電分子である、５０％エタノール／５０％水から成る１０ｍＭのビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭｅｒｃｋＳｃｈｕｃｈａｒｄｔ  ＯＨＧ，８．４１２３８．００１０，Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、抗体溶液に添加した。十分に混合した後、共役した抗（ＨＰＶ  ＨＲ）モノクローナル抗体溶液が作成された。
【００４３】
２００μｇ／ｍｌの抗カフェインモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１５２２１，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）溶液を、ＰＢＳ緩衝液で作成した。別の電子導電分子である、５０％エタノール／５０％水から成る１０ｍＭのビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭｅｒｃｋＳｃｈｕｃｈａｒｄｔＯＨＧ，８．４１２３８．００１０，Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、抗体溶液に添加した。十分に混合した後、共役した抗カフェインモノクローナル抗体溶液が作成された。
【００４４】
次いで、共役した抗（ＨＰＶ  ＨＲ）モノクローナル抗体溶液を、第１のサンプルループを介してセンサに注入し、次いで、第１の金電極セット上に流した。次いで、第１の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳ緩衝液の流速は、１０分間で２０μl／分であった。次いで、第１の金電極セットを、再度、ＰＢＳ緩衝液でさらに１０分間洗浄し、この時のＰＢＳ緩衝液の流速は２０μｌ／分に保持された。
【００４５】
共役した抗カフェインモノクローナル抗体溶液を、第２のサンプルループを介してセンサに注入し、次いで、第２の金電極セット上に流した。次いで、第２の金電極セットを、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳ緩衝液の流速は、１０分間で２０μl／分であった。次いで、第２の金電極セットを、再度、ＰＢＳ緩衝液でさらに１０分間洗浄し、この時のＰＢＳ緩衝液の流速は２０μｌ／分に保持された。
【００４６】
ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）感染症患者サンプルを、０．１％、１％、２％、５％、および１０％に希釈した。希釈したサンプルを順にセンサに注入した。各希釈サンプルを、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に同時に流した。
【００４７】
本発明者らは、同一のチップを繰り返し使用して、患者サンプルの各希釈濃度を検討した。この繰り返し使用は、酸性グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ２．５）で関連のＨＰＶ１６を洗い流すことによって行うことができた。
【００４８】
健康なヒト由来のサンプルを、標準グループとして使用した。この標準サンプルも、０．１％、１％、２％、５％、および１０％に希釈した。希釈した標準サンプルを順にセンサに注入した。各希釈標準サンプルを、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に同時に流した。本発明者らはまた、酸性グリシン緩衝液を使用して、２つの注入の合間にチップ上を洗い流した。
【００４９】
各注入に対応してセンサによって検出された電流を、図４Ａに示した。図４Ａでは、患者サンプルの濃度がそれぞれ１％、２％、５％、および１０％である時、ＨＰＶ１６感染症患者サンプルで比較的高い電流が検出された。（ポイントａ−ポイントｂ）／（ポイントｃ−ポイントｄ）の電流値の比を使用して、ＨＰＶ１６抗原が希釈サンプル中に存在するかどうかを決定した。
【００５０】
図４Ｂは、印可バイアス電圧（約０．０１ボルト）におけるコンダクティブ原子間力顕微鏡法によって走査された、ビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）と共役した抗（ＨＰＶ  ＨＲ）モノクローナル抗体を含む電極の導電画像を示す。この画像は、電極表面上のコンダクタンスのプロフィールを示している。Ｘ軸の単位はμｍ、Ｙ軸の単位はμｍである。より明るい部分は、比較的高いコンダクタンス（例えば、約９９．９８ナノアンペア）を示している。より暗い部分は、比較的低いコンダクタンス（例えば、約０ナノアンペア）を示している。
【実施例２】
【００５１】
２つの金電極セットを含む裸のセンサチップを、Ｖｓｅｎｓｏｒ（登録商標）Ｖ１１Ａ３センサ（Ｖｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）に取り付けた。このセンサにおいて、第１の流路は第１の金電極セットと交差しており、第２の流路は第２の金電極セットと交差している。センサを起動させた後、ポンプで緩衝液タンクからリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液を汲み上げた。ＰＢＳ緩衝液はｐＨ７．２であり、２０μｌ／分の速度でセンサチップ上を流れた。次いで、電子導電分子である１０ｍＭの５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）溶液を、サンプルループを介してセンサに注入し、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。次いで、５’−（メチル）チオール−５−フォルマル−２，２’−ビチオフェン（５’−（ｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉｏｌ−５−ｆｏｒｍａｌ−２，２’−ｂｉｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）溶液およびＰＢＳ緩衝液を、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に５分間流した。最後に、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液でさらに１５分間洗浄した。
【００５２】
２００μｇ／ｍｌの抗（ＥＶ７１）モノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，３３２１，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）溶液を、ＰＢＳ緩衝液で作成した。別の電子導電分子である、５０％エタノール／５０％水から成る１０ｍＭのビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭｅｒｃｋＳｃｈｕｃｈａｒｄｔ  ＯＨＧ，８．４１２３８．００１０，Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、抗体溶液に添加した。十分に混合した後、共役した抗（ＥＶ７１）モノクローナル抗体溶液が作成された。
【００５３】
２００μｇ／ｍｌの抗アクロソームモノクローナルタンパク質（Ａｂｃａｍ，ａｂ４５６９，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）溶液を、ＰＢＳ緩衝液で作成した。５０％エタノール／５０％水から成る１０ｍＭのビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭｅｒｃｋＳｃｈｕｃｈａｒｄｔ  ＯＨＧ，８．４１２３８．００１０，Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、抗アクロソームタンパク質溶液に添加した。十分に混合した後、共役した抗アクロソームタンパク質溶液が作成された。
【００５４】
次いで、共役した抗（ＥＶ７１）モノクローナル抗体溶液を、第１のサンプルループを介してセンサに注入し、次いで、第１の金電極セット上に流した。次いで、第１の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳ緩衝液の流速は、１０分間で２０μl／分であった。次いで、第１の金電極セットを、再度、ＰＢＳ緩衝液でさらに１０分間洗浄し、この時のＰＢＳ緩衝液の流速は２０μｌ／分に保持された。
【００５５】
次いで、共役した抗アクロソームタンパク質溶液を、第２のサンプルループを介してセンサに注入し、次いで、第２の金電極セット上に流した。次いで、第２の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳ緩衝液の流速は、１０分間で２０μl／分であった。次いで、第２の金電極セットを、再度、ＰＢＳ緩衝液でさらに１０分間洗浄し、この時のＰＢＳ緩衝液の流速は２０μｌ／分に保持された。
【００５６】
ＥＶ７１感染症患者サンプルを、０．１％、１％、２％、５％、および１０％に希釈した。希釈したサンプルを順にセンサに注入した。各希釈サンプルを、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に同時に流した。
【００５７】
本発明者らは、同一のチップを繰り返し使用して、患者サンプルの各希釈濃度を検討した。この繰り返し使用は、酸性グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ２．５）で関連のＥＶ７１を洗い流すことによって行うことができた。
【００５８】
健康なヒト由来のサンプルを標準グループとして使用した。この標準サンプルも、０．１％、１％、２％、５％、および１０％に希釈した。希釈した標準サンプルを順にセンサに注入した。各希釈標準サンプルを、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に同時に流した。本発明者らはまた、酸性グリシン緩衝液を使用して、２つの注入の合間にチップ上を洗い流した。
【００５９】
各注入に対応してセンサによって検出された電流を、図４Ｃに示した。図４Ｃでは、患者サンプルの濃度がそれぞれ０．１％、１％、２％、５％、および１０％である時、ＥＶ７１感染症患者サンプルで比較的高い電流が検出された。（ポイントａ−ポイントｂ）／（ポイントｃ−ポイントｄ）の電流値の比を使用して、ＥＶ７１抗原が希釈サンプル中に存在するかどうかを決定した。
【実施例３】
【００６０】
２つの金電極セットを含む裸のセンサチップを、Ｖｓｅｎｓｏｒ（登録商標）Ｖ１１Ａ３センサ（Ｖｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）に取り付けた。このセンサにおいて、第１の流路は第１の金電極セットと交差しており、第２の流路は第２の金電極セットと交差している。センサを起動させた後、ポンプで緩衝液タンクからリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液を汲み上げた。ＰＢＳ緩衝液はｐＨ７．２であり、５０μｌ／分の速度でセンサチップ上を流れた。次いで、電子導電分子である１０ｍＭのｐ−４’−フォルマル−４−カルボキシル−１，１’−ビベンゼン（ｐ−４’−ｆｏｒｍａｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌ−１，１’−ｂｉｂｅｎｚｅｎｅ）（ＣＨＯ−（Ｃ6Ｈ4）2−ＣＯＯＨ）溶液を、サンプルループを介してセンサに注入し、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。次いで、ｐ−４’−フォルマル−４−カルボキシル−１，１’−ビベンゼン（ｐ−４’−ｆｏｒｍａｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌ−１，１’−ｂｉｂｅｎｚｅｎｅ）溶液およびＰＢＳ緩衝液を、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上に１８分間流した。最後に、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液でさらに１５分間洗浄した。次いで、４００ｍＭのＥＤＣと１００ｎＭのＮＨＳとの混合物（ＥＤＣの体積／ＮＨＳの体積＝１／１）を注入し、流速２０μｌ／分で１５分間センサチップ上に流した。
【００６１】
２００μｇ／ｍｌの抗（Ｌｅｃｔ２）モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−９９０３６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）溶液を、酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で作成した。別の電子導電分子である、５０％エタノール／５０％水から成る１０ｍＭのビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭｅｒｃｋＳｃｈｕｃｈａｒｄｔ  ＯＨＧ，８．４１２３８．００１０，Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、抗体溶液に添加した。十分に混合した後、共役した抗（Ｌｅｃｔ２）モノクローナル抗体溶液が作成された。
【００６２】
２００μｇ／ｍｌの抗アクロソームモノクローナルタンパク質（Ａｂｃａｍ，ａｂ４５６９，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）溶液を、ＰＢＳ緩衝液で作成した。５０％エタノール／５０％水から成る１０ｍＭのビフェニル−４−カルボアルデヒド（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭｅｒｃｋＳｃｈｕｃｈａｒｄｔＯＨＧ，８．４１２３８．００１０，Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、抗アクロソームタンパク質溶液に添加した。十分に混合した後、共役した抗アクロソームタンパク質溶液が作成された。
【００６３】
次いで、共役した抗（Ｌｅｃｔ２）モノクローナル抗体溶液を、第１のサンプルループを介してセンサに注入し、次いで、第１の金電極セット上に流した。次いで、第１の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳ緩衝液の流速は、１０分間で２０μl／分であった。次いで、第１の金電極セット上を、再度、ＰＢＳ緩衝液でさらに１０分間洗浄し、この時のＰＢＳ緩衝液の流速は２０μｌ／分に保持された。
【００６４】
次いで、共役した抗アクロソームタンパク質溶液を、第２のサンプルループを介してセンサに注入し、次いで、第２の金電極セット上に流した。次いで、第２の金電極セット上を、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳ緩衝液の流速は、１０分間で２０μl／分であった。次いで、第２の金電極セット上を、再度、ＰＢＳ緩衝液でさらに１０分間洗浄し、この時のＰＢＳ緩衝液の流速は２０μｌ／分に保持された。
【００６５】
Ｌｅｃｔ２バイオマーカー分子含有ＨＣＣ（肝細胞癌）患者サンプルを、０．１％、１％、２％、５％、および１０％に希釈した。希釈したサンプルを順にセンサに注入した。流路スイッチによって、各希釈サンプルが、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上を同時に流れるように制御した。
【００６６】
本発明者らは、同一のチップを繰り返し使用して、患者サンプルの各希釈濃度を検討した。この繰り返し使用は、酸性グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ２．５）で関連のＬｅｃｔ２を洗い流すことによって行うことができた。
【００６７】
健康なヒト由来のサンプルを標準グループとして使用した。この標準サンプルも、０．１％、１％、２％、５％、および１０％に希釈した。希釈した標準サンプルを順にセンサに注入した。流路スイッチによって、各希釈標準サンプルが、第１の金電極セットおよび第２の金電極セット上を同時に流れるように制御した。本発明者らはまた、酸性グリシン緩衝液を使用して、２つの注入の合間にチップ上を洗い流した。
【００６８】
各注入に対してセンサによって検出された電流を、図４Ｄに示した。図４Ｄでは、患者サンプルの濃度がそれぞれ０．１％、１％、２％、５％、および１０％である時、Ｌｅｃｔ２バイオマーカー分子含有ＨＣＣ（肝細胞癌）患者サンプルで比較的高い電流が検出された。（ポイントａ−ポイントｂ）／（ポイントｃ−ポイントｄ）の電流値の比を使用して、ＨＰＶ１６抗原が希釈サンプル中に存在するかどうかを決定した。
【００６９】
前述の発明は、理解を明確にするために、図および例を使用してある程度詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、一定の変更および修正を実施することができるということは、当業者にとって明らかであろう。したがって、上記説明は本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００７０】
本明細書中に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、および特許出願が具体的且つ個別に参考として援用されるのと同じように、全ての目的においてその全体が本明細書中で参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ｂ】
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