(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも２つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも２つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素であって、該血球凝集素濃度は１株につき＞１２μｇ／ｍｌである、血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は＜１９ｍｇ／ｍｌであり、該スクアレンの１用量について最小限の量は０．５ｍｇである、アジュバントとを含む、≦５歳の患者における免疫応答を高めることでの使用のためのインフルエンザウイルスワクチンであって、該インフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株を含む、インフルエンザウイルスワクチン。
【請求項２】
前記血球凝集素は、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原の形である、請求項１に記載の使用のためのインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項３】
０．５ｍＬの単位投与容量を有する、請求項１または２に記載の使用のためのインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項４】
（ａ）（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株、および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素を含む；
（ｂ）１株あたりの血球凝集素の濃度が少なくとも２５μｇ／ｍｌである；
（ｃ）スクアレンの濃度が＜１０ｍｇ／ｍｌであり、該スクアレンの１用量について最小限の量は０．５ｍｇである；ならびに／または
（ｄ）前記ワクチンにおける血球凝集素に対するスクアレンの重量比が２０〜１８０の範囲にある、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項５】
（ａ）１株につき３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、９．７５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および０．５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンであるか；あるいは
（ｂ）１株につき３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、４．８８ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および０．５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項６】
（ａ）１株につき３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、９．７５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンであるか；あるいは
（ｂ）１株につき３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、４．８８ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
【請求項７】
≦５歳の患者において免疫応答を高めるための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００９年２月１０日に出願された米国仮特許出願６１／２０７，３８５からの優先権を主張し、上記米国仮特許出願の全容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
この発明は、インフルエンザウイルス感染から保護するためのワクチン、特に、市販ワクチンと比較して少ない量のスクアレンを含むワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）およびＦＬＵＡＤＴＭ製品（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）を除いて、インフルエンザワクチンは一般にアジュバントを含まない。
【０００４】
一価の流行前季節性ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭワクチンのアジュバントは、水中油型エマルジョンである。抗原およびエマルジョンアジュバントは、使用時に１：１の容量比で混合するために、別々の１０用量バイアルで供給される。製品データシートは、各用量が０．５ｍＬの容量を有し、３．７５μｇのＨＡを１０．６８ｍｇのスクアレンおよび４．８５ｍｇのポリソルベート８０と一緒に含むことを示す。
【０００５】
三価の季節性ＦＬＵＡＤＴＭワクチンのアジュバントは、水中油型エマルジョンである。抗原およびエマルジョンアジュバントは、充填済み（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ）注射器中のプレミックスフォーマットで供給される。製品データシートは、各用量が０．５ｍＬの容量を有し、１株につき１５μｇの血球凝集素（ＨＡ）を９．７５ｍｇのスクアレンおよび１．１７５ｍｇのポリソルベート８０と一緒に含むことを示す。参考文献１（Ｍｉｎｕｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：９９−１０４）に開示されるように、ワクチンは、１：１の容量比で２×のエマルジョンを２×の抗原溶液と混合し、１×濃度のエマルジョンおよび抗原の最終溶液を与えることによって作製される。この１：１の混合比は、参考文献７５（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ）  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５  （ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ））の第１０章でさらに説明される。この混合の改変形態は、参考文献２（特許文献１）で開示される。
【０００６】
ＦＬＵＡＤＴＭ製品と比較して、参考文献３（特許文献２）は、より少ない量のＨＡ（３×５μｇ  ＨＡ／用量）およびより少ない量のスクアレン（５．３５ｍｇ／用量）による三価インフルエンザワクチンを開示する。このワクチンはチオメルサール保存剤を含み、０．５ｍＬ用量としてヒトに投与された。
【０００７】
本発明の目的は、アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）インフルエンザワクチン、特に季節性インフルエンザワクチンのさらに改良された処方物を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５２１５５号
【特許文献２】国際公開第２００８／０４３７７４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
一実施形態では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素であって、濃度が１株につき≧１２μｇ／ｍｌである血球凝集素と、（ｉｉ）スクアレンを含むサブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレン濃度が≦１９ｍｇ／ｍｌであるアジュバントとを含むインフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）スクアレンを含むサブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレン濃度が≦１９ｍｇ／ｍｌであるアジュバントとを含む、水銀を含まないインフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、０．２〜０．３ｍＬの単位投与容量を有するインフルエンザウイルスワクチンであって、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）スクアレンを含むサブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレン濃度が≦１９ｍｇ／ｍｌであるアジュバントとを含むワクチンを提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）スクアレンを含むサブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレン濃度が９．７５ｍｇ／ｍＬまたは４．８８ｍｇ／ｍＬであるアジュバントとを含むインフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、０．２〜０．３ｍＬの単位投与容量を有するインフルエンザウイルスワクチンであって、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）スクアレンを含むサブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレン濃度が１９．５ｍｇ／ｍＬ、９．７５ｍｇ／ｍＬまたは４．８８ｍｇ／ｍＬであるアジュバントとを含むワクチンを提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）少なくとも２つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも２つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）スクアレンを含むサブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレン濃度が≦１９ｍｇ／ｍＬであるアジュバントとを含むインフルエンザウイルスワクチンを提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ｉ）少なくとも２つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも２つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は＜１９ｍｇ／ｍＬである、アジュバントとを含む、インフルエンザウイルスワクチン。
（項目２）
（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素であって、該血球凝集素濃度は１株につき＞１２μｇ／ｍｌである、血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は＜１９ｍｇ／ｍｌである、アジュバントとを含む、インフルエンザウイルスワクチン。
（項目３）
（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は＜１９ｍｇ／ｍｌである、アジュバントとを含む、水銀を含まないインフルエンザウイルスワクチン。
（項目４）
（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は９．７５ｍｇ／ｍＬまたは４．８８ｍｇ／ｍＬである、アジュバントとを含む、インフルエンザウイルスワクチン。
（項目５）
０．５ｍＬの単位投与容量を有する、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目６）
０．２〜０．３ｍＬの単位投与容量を有するインフルエンザウイルスワクチンであって、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は＜１９ｍｇ／ｍｌである、アジュバントとを含む、ワクチン。
（項目７）
０．２〜０．３ｍＬの単位投与容量を有するインフルエンザウイルスワクチンであって、（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素と、（ｉｉ）サブミクロンの油滴を有する水中油型エマルジョンアジュバントであって、スクアレンを含み、該スクアレン濃度は１９．５ｍｇ／ｍＬ、９．７５ｍｇ／ｍＬまたは４．８８ｍｇ／ｍＬである、アジュバントとを含む、ワクチン。
（項目８）
上記血球凝集素が、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原の形である、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目９）
（ｉ）Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス株、（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株、および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株からの血球凝集素を含む、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１０）
１株あたりの血球凝集素の濃度が少なくとも２５μｇ／ｍｌである、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１１）
スクアレンの濃度が＜１０ｍｇ／ｍｌである、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１２）
本発明の組成物中の血球凝集素に対するスクアレンの重量比が２０〜１８０の範囲にある、前述の項目のいずれかに記載のワクチン。
（項目１３）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約１９．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株による三価不活化インフルエンザワクチンである、項目４から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１４）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約９．７５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株による三価不活化インフルエンザワクチンである、項目２から５または項目８から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１５）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約１９．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、項目１または５または７から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１６）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約９．７５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、項目１から５または８から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１７）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約９．７５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株による三価不活化インフルエンザワクチンである、項目２から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１８）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約４．８８ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株による三価不活化インフルエンザワクチンである、項目２から５または８から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１９）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約９．７５ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、項目１から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目２０）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約４．８８ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、項目１から５または８から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目２１）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約４．８８ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株による三価不活化インフルエンザワクチンである、項目２から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目２２）
１株につき約３０μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度、約４．８８ｍｇ／ｍｌのスクアレン濃度および約０．２５ｍｌの単位投薬容量を有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統のインフルエンザＢウイルス株、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のインフルエンザＢウイルス株による四価不活化インフルエンザワクチンである、項目１から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目２３）
患者の免疫応答を高める方法であって、前述の項目のいずれかに記載のワクチンを該患者に投与するステップを含む、方法。
【００１５】
（ワクチン調製物）
様々な形のインフルエンザウイルスワクチンが今日利用でき、ワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに一般に基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形で提示されてもよい。本発明は、これらの種類のワクチンのいずれかと共に用いることができるが、一般的に不活化ワクチンと共に用いられる。
【００１６】
不活化ウイルスが用いられる場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原（血球凝集素を含み、ノイラミニダーゼも通常含む）を含むことができる。ウイルスを不活化する化学的手段には、以下の作用物質、すなわち界面活性剤、ホルムアルデヒド、βプロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはそれらの組合せの１つまたは複数の有効量による処理が含まれる。ウイルス不活化の非化学的方法は、例えばＵＶ光またはガンマ照射など、当技術分野で公知である。
【００１７】
ビリオンは、ウイルスを含有する流体から様々な方法によって収集することができる。例えば、精製方法は、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む線形ショ糖勾配溶液を用いる、ゾーン遠心分離法を含むことができる。次に任意選択の希釈の後、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。
【００１８】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割工程を含めて、精製されたビリオンを界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、トリトンＸ−１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を生成することによって得られる。インフルエンザウイルスを分割する方法は当技術分野で周知であり、例えば参考文献４〜９などを参照されたい。ウイルスの分割は、感染性または非感染性の全ウイルスを、分割剤の破壊濃度で破壊または分断することによって一般的に実施される。破壊はウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化を生じさせ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）の界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ヘカメグ（Ｈｅｃａｍｅｇ）、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチル臭化アンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００またはトリトンＮ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分割方法はデオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的作用を用い、分割は初期のビリオン精製中に（例えばショ糖密度勾配溶液で）起こることができる。したがって、分割工程は、ビリオン含有物質の浄化（非ビリオン物質を除去するため）、収集されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を用いる）、非ビリオン物質からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含むショ糖勾配を用いる）での分割剤を用いるビリオンの分割、次に望ましくない物質を除去するためのろ過（例えば限外ろ過）を含むことができる。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液に有効に再懸濁することができる。ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ、ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチンである。
【００１９】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原血球凝集素および、一般的にノイラミニダーゼも含む。精製された形のこれらのタンパク質を調製する方法は、当技術分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＦＬＵＡＤＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品が例である。
【００２０】
不活化インフルエンザ抗原の別の形は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  ＶＴＭおよびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品の場合のように、ビロゾーム［１０］（無核酸ウイルス様リポソーム粒子）である。ビロゾームは、界面活性剤によるインフルエンザウイルスの可溶化と、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって調製することができる。ビロゾームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、それらの膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを与えることを含む。
【００２１】
（株の選択）
本発明のワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株および少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する血球凝集素を含む。異なる株は一般的に別々に増殖させられ、その後、ウイルスが収集され、抗原が調製された後に混合される。したがって、本発明の方法は、１を超えるインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含むことができる。
【００２２】
本発明で用いられる株は、野生型ウイルスで見出される天然のＨＡまたは改変ＨＡを有することができる。例えば、ウイルスを鳥類の種で高病原性にする決定因子（例えばＨＡ１／ＨＡ２切断部位のあたりの超塩基性領域）を除去するために、ＨＡを改変することが公知である。本発明で用いられるインフルエンザＢウイルスの血球凝集素は、好ましくはアミノ酸１９７にＡｓｎを有し、これはグリコシル化部位を提供する［１１］。
【００２３】
本発明で用いられるインフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であってもよく、リバースジェネティクス技法によって得られたものでもよい。リバースジェネティクス技法［例えば１２〜１６］は、プラスミドまたは他の人工ベクターを用いて、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスをインビトロで調製することを可能にする。一般的に、それは、細胞内の両種のＤＮＡの発現が完全な無傷の感染性ビリオンのアセンブリーをもたらすように、（ａ）例えばｐｏｌＩプロモーターまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターから所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現させること、および（ｂ）例えばｐｏｌＩＩプロモーターからウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現させることを含む。ＤＮＡは好ましくはウイルスのＲＮＡおよびタンパク質のすべてを提供するが、ＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを用いることも可能である。各ウイルスＲＮＡを生成するために別々のプラスミドを用いる、プラスミドに基づく方法を用いることができ［１７〜１９］、これらの方法は、ウイルスタンパク質のすべてまたは一部（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質だけ）を発現させるためのプラスミドの使用も含み、一部の方法では最高１２個のプラスミドが用いられる。必要なプラスミドの数を減少させるために、１つの手法［２０］は、同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のため）（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８個のインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）を、別のプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有するタンパク質コード領域と組み合わせる（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８個のインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）。参考文献２０の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡコード領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミド上の全８個のｖＲＮＡコードセグメントを含む。１つのプラスミドの上にＮＡおよびＨＡセグメントを含み、別のプラスミドの上に他の６つのセグメントを含むことも、事を促進することができる。
【００２４】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを用いることの代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを用いることが可能である［２１］。例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターを、都合よく用いることができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）により便利であることができるが、細胞は、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってもトランスフェクトされなければならない。
【００２５】
他の技術では、単一の鋳型からウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡについて同時にコードするために、二重のｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを用いることが可能である［２２、２３］。
【００２６】
したがって、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むことができる（一般的に、６個のセグメントはＡ／ＰＲ／８／３４に由来し、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株に由来する、すなわち６：２のリアソータント）。それは、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス、またはワクチン調製物のためにリアソータントウイルスを生成するために有用な任意の他のウイルス株からの、１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むこともできる。インフルエンザＡウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０）からの６個未満（すなわち、０、１、２、３、４または５個）のウイルスセグメントを含むことができる。インフルエンザＢウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６）からの６個未満（すなわち、０、１、２、３、４または５個）のウイルスセグメントを含むことができる。一般的に、本発明は、ヒトからヒトへの感染が可能な株から保護し、したがってその株のゲノムは、哺乳動物（例えばヒト）のインフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを通常含む。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含むことができる。
【００２７】
その抗原が組成物に含まれてもよい株は、抵抗性流行株を含め、抗ウイルス療法に抵抗性であってよい（例えば、オセルタミビル［２４］および／またはザナミビルに抵抗性）［２５］。
【００２８】
特に有用な株は、患者からの単離から細胞培養系での複製までの間のいかなる段階においても卵を経ていないものである。ＭＤＣＫ細胞は、単離からウイルス複製までのすべての工程で排他的に用いることができる。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明で用いる株は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合優先を有する血球凝集素を有する。ヒトインフルエンザウイルスはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースに対するα−２，６連結シアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵およびＶｅｒｏ細胞はＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。ＭＤＣＫなどの細胞でのヒトインフルエンザウイルスの増殖は、卵経由と異なって、本来のＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合性を維持するように血球凝集素に選択圧を加える。
【００３０】
ウイルスが、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合優先を有するかどうかを判定するために、様々なアッセイを用いることができる。例えば、参考文献２６は、親和定数の高感度な定量測定を与える、インフルエンザウイルス受容体結合性活性についての固相酵素結合アッセイを記載している。参考文献２７は、２つの異なるシアリル糖タンパク質へのウイルスの結合性が調査された（Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定因子を有するオボムコイド、およびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定因子を有するブタα２−マクログロブリン）固相アッセイを用い、さらに、２つの受容体類似体である遊離のシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に対してウイルスの結合性が調査されたアッセイを記載する。参考文献２８は、α２，３またはα２，６結合についての受容体優先を明らかに区別することができたグリカンアレイを用いるアッセイを報告する。参考文献２９は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌを含むように酵素で改変されたヒト赤血球の凝集に基づくアッセイを報告する。アッセイの種類によって、ウイルス自体を用いて直接に実施すること、またはウイルスから精製された血球凝集素を用いて間接に実施することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明で用いるインフルエンザ株は、卵由来のウイルスと異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（血球凝集素を含む）を有する。したがって、糖タンパク質は、鶏卵で見られないグリコフォームを含む。
【００３２】
インフルエンザＡウイルスは、１６個のＨＡサブタイプ、すなわちＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６を現在提示する。本発明は、これらのサブタイプの１つまたは複数から保護することができる。本発明は、インフルエンザＡウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１つまたは複数から保護することができる。本明細書でのワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス株からの抗原を含み、一般的には少なくとも２つのインフルエンザＡウイルス株、例えば２つまたは３つのインフルエンザＡウイルス株からの抗原を含む。２つのインフルエンザＡウイルス株が含まれる場合、これらは通常Ｈ１株およびＨ３株である。３つのインフルエンザＡウイルス株が含まれる場合、これらは通常Ｈ１株、Ｈ３株および流行関連株である。一部の実施形態では、Ｈ３株は、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する。他の実施形態では、Ｈ３株は、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する。参考文献３０は、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｈ５Ｎ１およびＢ抗原を含むワクチンを開示する。
【００３３】
流行関連インフルエンザ株の特性は、以下の通りである：（ａ）現在循環しているヒト株の血球凝集素と比較して新しい血球凝集素、すなわち１０年超の間ヒト集団で明らかでなかったもの（例えばＨ２）、またはヒト集団でそれ以前に全く見られていないもの（例えば、鳥集団だけで一般に見出されているＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）を含み、したがってワクチンのレシピエントおよび一般ヒト集団はその株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである、（ｂ）ヒト集団で水平伝播することができる、および（ｃ）ヒトに病原性である。本発明と使用するための流行関連インフルエンザウイルス株は、一般的にＨ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のサブタイプ、例えばＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１またはＨ７Ｎ７を有する。Ｈ５Ｎ１株が好ましい。流行株は、Ｈ１サブタイプ（例えばＨ１Ｎ１）を有することができ、例えば、ＨＡはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９株と免疫学的に交差反応を起こしてもよい。
【００３４】
インフルエンザＢウイルスは異なるＨＡサブタイプを現在提示しないが、インフルエンザＢウイルス株は２つの異なる系統に分類される。これらの系統は１９８０年代後期に出現し、抗原的および／または遺伝的に互いから区別することができるＨＡを有する［３１］。現在のインフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様である。これらの株は通常抗原的に区別されるが、２つの系統を区別するためにアミノ酸配列の差も記載されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列と比較して番号付けられたアミノ酸残基１６４に欠失を有するＨＡタンパク質をしばしば（常にではなく）有する［３２］。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、単一のインフルエンザＢウイルス株からの抗原を含み、この株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様であってよい。しかし他の実施形態では、本発明の組成物は、２つのインフルエンザＢウイルス株からの抗原を含み、これらは一般的にＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株を含む。
【００３６】
本発明の好ましいワクチンは、２つのインフルエンザＡウイルス株および２つのインフルエンザＢウイルス株からの抗原を含む（「ＡＢＢＡ」ワクチン）。したがって、本発明の好ましいＡＢＢＡワクチンは、以下からの血球凝集素を含む：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株、および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。
【００３７】
一部のＡＢＢＡ実施形態では、インフルエンザＢウイルス株の少なくとも２つは異なる血球凝集素を有することができ、関連ノイラミニダーゼを有することができる。例えば、それら両方は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼを有することができ［３３］、または、両方はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有することができる。例えば、２つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼの両方は、以下の配列特性の１つまたは複数を有することができる：（１）残基２７にセリンでなく、好ましくはロイシン、（２）残基４４にグルタミン酸でなく、好ましくはリジン、（３）残基４６にスレオニンでなく、好ましくはイソロイシン、（４）残基５１にプロリンでなく、好ましくはセリン、（５）残基６５にアルギニンでなく、好ましくはヒスチジン、（６）残基７０にグリシンでなく、好ましくはグルタミン酸、（７）残基７３にロイシンでなく、好ましくはフェニルアラニン、および／または（８）残基８８にプロリンでなく、好ましくはグルタミン。同様に、一部の実施形態では、ノイラミニダーゼは残基４３に欠失を有すること、またはスレオニンを有することができる。ＮＡ遺伝子のトリヌクレオチド欠失から生じる残基４３の欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特徴として報告されているが、最近の株はＴｈｒ−４３を取り戻している［３３］。反対に、当然、例えばＳ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３および／またはＰ８８など、反対の特性を２つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼが共有することができる。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列と比較して番号付けられる［３４］。したがって、ＡＢＢＡワクチンは、ＨＡに関して抗原的に異なる（１つはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、１つはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）が、ＮＡに関して関連する（両方ともＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、または両方ともＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）２つのＢ株を用いることができる。
【００３８】
本発明は、３価および４価のワクチンに限定されず、５価、６価、７価などのワクチンを包含する。５価ワクチンの例は、３つのインフルエンザＡ株（例えば上記の１つのＨ１株および２つのＨ３株）と２つのインフルエンザＢ株を含むことができる。例えば、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下からの血球凝集素を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株、（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株、および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。別のＡ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下からの血球凝集素を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株、（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株、および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、以下からの血球凝集素を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株、（ｉｖ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株、および（ｖ）インフルエンザＢウイルス株。Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、以下からの血球凝集素を含むことができる：（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株、（ｉｖ）Ｈ５Ｎ１株などのＨ５インフルエンザＡウイルス株、（ｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株、および（ｖｉ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株。
【００３９】
（血球凝集素の投与）
血球凝集素（ＨＡ）は現在の不活化インフルエンザワクチンでの主な免疫原であり、ワクチンの用量は、一般的にＳＲＩＤで測定されるＨＡレベルを参考にして標準化される。既存のワクチンは０．５ｍＬ用量に１株につき約１５μｇのＨＡを一般に含有するが、例えば小児のために（同じＨＡ濃度で一般的に０．２５ｍｋＬ用量）、または流行の状況で、またはアジュバントを用いる場合は、より低い用量を用いることができる。より高い用量（例えば３×または９×用量［３５，３６］）が用いられるのと同様に、１／２（すなわち１株につき７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８などの分割用量が用いられている。
【００４０】
一般に、１用量あたりのＨＡの量は、１株につき０．１〜１５０μｇの範囲、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどであってよい。特定の用量には、１株につき例えば約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５μｇなどが含まれる。本発明の一部の実施形態では、組成物中の１株あたりのＨＡの濃度は、少なくとも１２μｇ／ｍｌである（すなわち、０．５ｍＬ容量に１株につき少なくとも６μｇであり、参考文献３で用いられる濃度よりも高い）。通常、濃度は、≧１５μｇ／ｍｌ、例えば≧２０μｇ／ｍｌ、≧２５μｇ／ｍｌ、≧３０μｇ／ｍｌまたはそれを超える。１株につき１５μｇ／ｍｌ、または１株につき３０μｇ／ｍｌの濃度が一般的である。
【００４１】
通常、ＨＡの濃度は、組成物中の各株につき同じである。しかし一部の実施形態では、濃度はすべて最低濃度の整数倍である。例えば、特定の株の最低ＨＡ濃度が１５μｇ／ｍｌである場合、組成物中の他のＨＡ濃度は、１５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌまたは６０μｇ／ｍｌである。
【００４２】
上記のように、本発明は不活化ワクチンと通常用いられる。しかし一部の実施形態では、それを生ワクチンと用いることができる。ＨＡ含有量に関して標準化されるのではなく、生ワクチンの投薬は、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定される。１株につき１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が一般的である。インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。インフルエンザウイルスは温度感受性であってもよい。インフルエンザウイルスは低温順応化されてもよい。
【００４３】
（細胞系）
本発明と用いるためのワクチンの製造では、ウイルス増殖のための培養基としてＳＰＦ卵を用いることができ、その場合、ウイルスは鶏卵の感染尿膜腔液から収集される。しかし代わりに、インフルエンザウイルスの複製を補助する細胞系を用いてもよい。細胞系は、一般的に哺乳動物起源である。適する哺乳動物細胞起源には、それらに限定されないが、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）ならびにイヌの細胞が含まれるが、霊長類細胞の使用は好ましくない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの、様々な細胞型を用いることができる。適するハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称の細胞系である。適するサル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞系の場合のように、例えば腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である［３７〜３９］。適するイヌ細胞は、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系の場合のように、例えば腎臓細胞である。
【００４４】
したがって、適する細胞系には、それらに限定されないが、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＣＬＤＫ、ＨＫＣＣ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６［４０］、ＦＲｈＬ２、ＷＩ−３８などが含まれる。適する細胞系は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４１］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４２］から、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、目録番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、目録番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００４５】
最も好ましい細胞系は、哺乳動物型のグリコシル化を有するものである。哺乳動物細胞系へのあまり好ましくない代替形態として、カモ（例えばカモ網膜）または雌鶏に由来する細胞系を含む鳥類の細胞系でウイルスを増殖させることができる［例えば、参考文献４３〜４５］。鳥類の細胞系の例には、鳥類の胚性幹細胞［４３、４６］およびカモ網膜細胞［４４］が含まれる。適する鳥類の胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４が含まれる［４７］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を用いてもよい。しかし鳥類の細胞を用いずに、哺乳動物の細胞を用いることは、ワクチンが鳥類のＤＮＡおよび卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）を含まないようにすることができ、それによってアレルゲン性を低減させることを意味する。
【００４６】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞系は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌの腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞系である［４８〜５１］。もともとのＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の派生株および他のＭＤＣＫ細胞系を用いることもできる。例えば、参考文献４８は、懸濁培養での増殖に順応させたＭＤＣＫ細胞系を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託されている「ＭＤＣＫ３３０１６」）。同様に、参考文献５２は、無血清培養での懸濁物で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞系を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託されている「Ｂ−７０２」）。参考文献５３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献５４は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞系を開示する。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれかを用いることができる。
【００４７】
ウイルスは、接着培養物または懸濁物における細胞上で増殖させることができる。微粒子キャリア培養を用いることもできる。一部の実施形態では、細胞をこのように懸濁物での増殖のために順応させることができる。
【００４８】
細胞系は、好ましくは無血清培地および／またはタンパク質非含有培地で増殖させる。本発明において、ヒトまたは動物起源の血清からの添加物がない培地は無血清培地と呼ばれる。そのような培養で増殖する細胞は当然それら自身のタンパク質を含む。タンパク質非含有培地は、細胞の増殖（例えば感染前の）が、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質なしで起こるものを意味すると理解されているが、ウイルス増殖のために必要かもしれないトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を任意選択で含むことができる。
【００４９】
インフルエンザウイルスの複製を補助する細胞系は、ウイルス複製中、好ましくは３７℃未満で増殖させる［５５］（例えば３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）。
【００５０】
培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させる方法は、細胞培養物に増殖させる株の接種材料を接種するステップ、ウイルス増殖のために所望の時間、例えばウイルス力価または抗原発現の決定に従って（例えば接種後の２４〜１６８時間）、感染細胞を培養するステップ、および増殖させたウイルスを収集するステップを一般に含む。培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定）対細胞比で接種される。ウイルスは細胞懸濁物に加えられるかまたは細胞の単層に加えられ、ウイルスは、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で少なくとも６０分間、しかし通常３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間、細胞の上で吸収される。収集された培養上清のウイルス含有量を増加させるために、感染した細胞培養物（例えば単層）を凍結融解または酵素作用によって除去することができる。収集された流体は、次に不活化または凍結保存される。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞を約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染後３０〜６０時間で収集することができる。好ましくは、細胞は、感染後３４〜４８時間で収集される。さらにより好ましくは、細胞は、感染後３８〜４０時間で収集される。ウイルス放出を可能にするために細胞培養の間、プロテアーゼ（一般的にトリプシン）が一般に加えられ、プロテアーゼは、培養中の任意の適する段階で、例えば接種前、接種と同時、または接種後に加えることができる［５５］。
【００５１】
一部の実施形態では、特にＭＤＣＫ細胞では、細胞系はマスターワーキング細胞バンクから４０集団倍加レベルを越えて継代培養されない。
【００５２】
ウイルス接種材料およびウイルス培養物は、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルスおよび／またはパルボウイルスが好ましくは含まれない（すなわち、それによる汚染について検査され、陰性の結果である）［５６］。単純ヘルペスウイルスの非存在が、特に好ましい。
【００５３】
（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスを細胞系で増殖させた場合、ＤＮＡのあらゆる発癌活性を最小にするために、最終ワクチンに残留する細胞系ＤＮＡの量を最小にすることが標準慣行である。
【００５４】
したがって、好ましくは本発明によって調製されるワクチン組成物は、１用量につき１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留性宿主細胞ＤＮＡを含むが、極微量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。
【００５５】
０．２５ｍｌ容量につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンのように、１５μｇの血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが好ましい。０．５ｍｌ容量につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンのように、５０μｇの血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンがより好ましい。
【００５６】
任意の残留性宿主細胞ＤＮＡの平均長が、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【００５７】
混入ＤＮＡは、標準の精製手順、例えばクロマトグラフィーなどを用いて、ワクチン調製中に除去することができる。残留性宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼによる処理、例えばＤＮアーゼを用いることによって増強することができる。先ずウイルス増殖の間用いることができるＤＮアーゼ（例えばベンゾナーゼ）を用い、次にビリオン破壊の間用いることができる陽イオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を用いる二段階処理を含む、宿主細胞ＤＮＡの混入を減らすための便利な方法が、参考文献５７および５８に開示されている。βプロピオラクトン処理による除去を用いることもできる。
【００５８】
残留性宿主細胞ＤＮＡの測定は、今では生物学的製剤にとっては慣例的規制要件で、当業技術者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡの測定に用いられるアッセイは、一般的には検証済みのアッセイである［５９、６０］。検証済みのアッセイの性能特性は、数学的および定量化可能な用語で記載することができ、その考えられるエラーソースは特定されている。そのアッセイは、正確度、精度、特異性などの特性について、一般に検査されている。アッセイが較正され（例えば宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）、検査されると、定量的なＤＮＡ測定を日常的に実施することができる。ＤＮＡ定量化のための３つの主な技術を用いることができる：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション方法［６１］、ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ系などのイムノアッセイ方法［６２］、および定量的ＰＣＲ［６３］。これらの方法のすべては当業技術者によく知られているが、各方法の正確な特性は、問題の宿主細胞によって決まるかもしれない（例えばハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓからのＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ系は、総ＤＮＡのピコグラムレベルの定量アッセイであり、生物薬剤中の混入ＤＮＡレベルを監視するために用いられている［６２］。一般的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合性タンパク質、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体およびＤＮＡの間での、反応複合体の非配列特異的形成を含む。すべてのアッセイ構成要素は、製造業者から入手可能な完全なＴｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに含まれる。様々な民間製造業者は、例えばＡｐｐＴｅｃＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、残留性宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入の測定についての、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと総ＤＮＡ  ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ系の比較を、参考文献６４に見ることができる。
【００５９】
（医薬組成物）
本発明と用いるためのワクチンは、インフルエンザ抗原に加えて成分を通常含み、例えばそれらは１つまたは複数の薬用キャリアおよび／または賦形剤を一般的に含む。そのような成分の詳細な議論は、参考文献６５で入手可能である。多くの実施形態では、アジュバントが含まれてもよい。
【００６０】
組成物は、投与時には一般に水性の形である。
【００６１】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含むことができる。しかし一部の実施形態では、ワクチンは、ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品と異なって、水銀物質を実質的に含むべきではなく、例えばチオメルサールを含むべきではない［８、６６］。水銀を含有していないワクチンがより好ましく、水銀化合物に代わるものとしてα−トコフェロールスクシネートが含まれてもよい［８］。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【００６２】
張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むのが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在することができる。存在することができる他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムおよび／または塩化マグネシウムなどが含まれる。アジュバントが抗原とは別の容器にある場合、塩化ナトリウムは両方の容器に存在することができる。
【００６３】
組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、おそらく２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有することができる。
【００６４】
組成物は、１つまたは複数の緩衝剤を含むことができる。一般的な緩衝剤には、以下が含まれる：リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントと一緒に）、またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、一般的に５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００６５】
組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．１であり、より一般的には６．０〜８．０、例えば６．５および７．５、または７．０〜７．８である。
【００６６】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば１用量につき＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的尺度）、好ましくは１用量につき＜０．１ＥＵしか含まない。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００６７】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）、オクトキシノール（例えばオクトキシノール−９（トリトンＸ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、または、特にスプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。界面活性剤は、極微量だけ存在してもよい。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々の１ｍｇ／ｍｌ未満を含むことができる。極微量の他の残りの成分は、抗生物質（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。アジュバントが抗原とは別の容器にある場合、この界面活性剤は抗原を含有する容器に通常存在する（例えば、抗原とポリソルベート８０およびオクトキシノール１０）。
【００６８】
組成物は１回の免疫のための材料を含むことができ、または複数回の免疫のための材料を含むことができる（すなわち、「多用量」キット）。多用量の準備では、保存剤の含有が好ましい。多用量組成物に保存剤を含むことの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、材料の取り出しのための無菌アダプターを有する容器に含まれてもよい。
【００６９】
ヒトインフルエンザワクチンは、一般的に約０．５ｍｌの単位投薬容量で、筋肉内注射によって投与される。しかし本発明の一部の実施形態では、この容量の半分（すなわち約０．２５ｍｌ）の単位用量を用いることができる。この減少させた投薬容量は、特に小児に有用である。さらにより低い用量（例えば０．１ｍｌまたは０．２ｍｌ）は、例えば皮内注射に役立つことができる。
【００７０】
ワクチンは、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは、冷凍されるべきでない。それらは、理想的には直射光が入らないようにされるべきである。
【００７１】
ワクチンは、即時投与のために、または投与前即席混合のための部品キットとして、例えば別々の抗原およびアジュバント成分として（ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品の場合のように）処方して、任意の適する容器で供給することができる。適する容器には、バイアル、注射器（例えば使い捨て注射器）、鼻内噴霧などが含まれる。これらの容器は無菌であるべきである。組成物／成分がバイアル内に置かれる場合、バイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック製の材料で作製される。バイアルは、好ましくは組成物がそれに加えられる前に滅菌される。ラテックス感受性患者の問題を回避するために、バイアルは好ましくはラテックスを含まないストッパーで密封され、すべてのパッケージング材料にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、ワクチンの単一用量を含むことができ、またはそれは１より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば１０用量を含むことができる。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。バイアルは、注射器をそのキャップに挿入することができるように改造されたキャップ（例えばルアーロック）を有することができる。バイアルは、特に複数用量バイアルの場合、その内容物の無菌取り出しを可能にするキャップを有することができる。成分が注射器にパッケージされる場合、注射器はそれに装着される針を有することができる。針が装着されない場合、アセンブリーおよび使用のために別の針を注射器と一緒に供給してもよい。そのような針は、ケースに入れてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージ針が一般的である。記録の保守を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ時期および内容物の有効期限を印刷することができる剥離式ラベルを注射器に添付してもよい。吸引の間、プランジャーが偶発的に抜けることを予防するために、注射器のプランジャーは、好ましくはストッパーを有する。注射器は、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有することができる。使い捨て注射器は、１回用量のワクチンを含む。注射器は針の装着前に先端を密封するための先端キャップを一般に有し、先端キャップは好ましくはブチルゴム製である。
【００７２】
例えば小児への送達を容易にするために、半用量の容量を示す印を容器に付けてもよい。例えば、０．５ｍｌの量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示すマークを有することができる。したがって、ワクチンは０．５ｍｌの単位投与容量でパッケージすることができるが、０．２５ｍｌの単位投与容量として投与することができ、この半量投与は容器の印によって容易になる。
【００７３】
ガラス容器（例えば注射器またはバイアル）を用いる場合、ソーダ石灰ガラス製ではなくホウ珪酸ガラス製の容器を用いるのが好ましい。
【００７４】
容器は、ワクチンの詳細、例えば投与の説明、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットとパッケージ（例えば同じボックスに）してもよい。説明書は、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応などの場合に容易に利用できるアドレナリン溶液を常備することなどの警告を含むこともできる
（アジュバント）
使用時に、有利には、本発明のワクチンは、組成物を投与される患者で誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する働きをすることができるアジュバントを含むことができる。水中油型エマルジョンアジュバント（特にスクアレンを含むもの）の存在は、季節性［６７］および流行性［６８、６９］インフルエンザワクチンの免疫応答の株交差反応性を増強することがわかっている。
【００７５】
本発明と使用するための水中油型エマルジョンは、一般的に少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、（１つまたは複数の）油および界面活性剤は、生物分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に直径５μｍ未満であり、サブミクロンの直径でさえも有することができ、これらの小さいサイズは、安定したエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴はろ過滅菌にかけることができるので好ましい。
【００７６】
本発明は、動物（例えば、魚）または植物供給源からのものなどの油と一緒に用いることができる。植物油の供給源には、ナッツ、種子および穀類が含まれる。最も一般的に入手可能である落花生油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、ナッツ油の例である。ホホバ油を用いることができ、例えばホホバ豆から得ることができる。種子油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが含まれる。穀類群では、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦などの他の穀物粒の油を用いることもできる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油において天然に存在しないが、ナッツおよび種子油から始まる適当な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物のミルクからの油脂は代謝可能であり、したがって、この発明の実施で用いることができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化の手順および他の手段は、当技術分野で周知である。
【００７７】
ほとんどの魚は、容易に回収することができる代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、鮫肝油および鯨蝋などの鯨油は、本明細書で用いることができる魚油のいくつかの例である。５炭素イソプレン単位でいくつかの分枝鎖油が生化学的に合成され、テルペノイドと一般に呼ばれている。鮫肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知である、分枝状不飽和テルペノイドを含む。スクアレンの飽和類似体スクアランを用いることもできる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、民間の供給業者から容易に入手できるか、または当技術分野で公知である方法によって得ることができる。スクアレンが好ましい。
【００７８】
スクアレンを含有するエマルジョンは、ＦＬＵＡＤＴＭおよびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品にすでに含まれている。ＦＬＵＡＤＴＭワクチンでは、ＨＡの総量は４５μｇ（３×１５μｇ）であり、スクアレンの総量は、０．５ｍｌの投薬容量中に９．７５ｍｇである（すなわち、１９．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン）。ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭワクチンでは、ＨＡの総量は３．７５μｇ（一価）であり、スクアレンの総量は同じく０．５ｍｌの投薬容量中に１０．６８ｍｇである（すなわち、２１．４ｍｇ／ｍｌのスクアレン）。本発明の多くの実施形態では、スクアレン濃度は１９ｍｇ／ｍｌ未満であるがまだアジュバント効果を保持しており、濃度は、≦１０ｍｇ／ｍｌ、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦２．５ｍｇ／ｍｌであってもよい。１用量につき０．５ｍｇスクアレンの最小限の量が有用である（例えば、参考文献３を参照）。１用量あたりの量の例には、５．３ｍｇ、４．９ｍｇ、２．７ｍｇ、２．４ｍｇ、１．２ｍｇなどが含まれる。
【００７９】
他の有用な油はトコフェロールであり、ビタミンＥは高齢患者（例えば、６０歳以上）で免疫応答に対して正の影響を有することが報告されているので、それらは、有利にはこの患者群で使用するためのワクチンに含まれる［７０］。それらは、エマルジョンの安定化を助けることができる抗酸化特性も有する［７１］。様々なトコフェロールが存在する（α、β、γ、δ、εまたはξ）が、αが通常用いられる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンに適合し、水銀化合物に代わる有用な保存剤であることが公知である［８］。
【００８０】
油の混合物、例えばスクアレンおよびα−トコフェロールを用いることができる。２〜２０％（容積で）の範囲の含油率が一般的である。
【００８１】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水／親油性均衡）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが以下を含む界面活性剤と用いることができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が異なることができるオクトキシノール、オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズなどの、ノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびに、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（通常、ＳＰＡＮとして公知である）。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンに混ぜるのに最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ８０）である。
【００８２】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびオクトキシノールの組合せも適する。別の有用な組合せは、ラウレス９に加えてポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００８３】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０など）０．０１〜１％、より詳細には約０．１％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトンＸ−１００、またはトリトンシリーズの他の界面活性剤）０．００１〜０．１％、より詳細には０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、より詳細には０．１〜１％、または約０．５％である。
【００８４】
スクアレンを含有する水中油型エマルジョン、特にポリソルベート８０を含むものが好ましい。スクアレン：ポリソルベート８０の重量比は、１〜１０、例えば２〜９、例えば約２．２または約８．３であってよい。本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントには、それらに限定されないが以下のものが含まれる。
【００８５】
・スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの組成は、容量で約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であってよい。重量では、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。参考文献７５の第１０章および参考文献７６の第１２章でさらに詳細に記載されるように、このアジュバントは「ＭＦ５９」［７２〜７４］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にはクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【００８６】
・スクアレン、トコフェロールおよびポリソルベート８０のサブミクロンのエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のポリソルベート８０を有することができ、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１（例えば０．９０）であり、この比が、より安定したエマルジョンを提供することができる。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容量比、または約１１：５の重量比で存在することができる。そのようなエマルジョンの１つは、ＰＢＳにＴｗｅｅｎ８０を溶解させて２％溶液を与え、次にこの溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次にこの混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。生じるエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロンの油滴を有する。エマルジョンは、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含むこともできる。この型の別の有用なエマルジョンは、ヒトの１用量につき０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロールおよび０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含むことができる［３］。
【００８７】
・スクアレン、トコフェロールおよびトリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬを含むこともできる（下記参照）。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含むことができる。
【００８８】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、トリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）およびトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌトリトンＸ−１００および１００μｇ／ｍｌα−トコフェロールスクシネート）で含むことができ、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。エマルジョンは、スクアレンを含むこともできる。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬを含むこともできる。水相は、リン酸緩衝液を含むことができる。
【００８９】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で処方することができる。このエマルジョンはムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいて、スレオニル−ＭＤＰと用いられている［７７］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバント［７８］（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）の場合のように、それはＴｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【００９０】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」）を含むエマルジョン。エマルジョンは好ましくは温度可逆的であり、および／または少なくとも９０％（容量で）の、２００ｎｍ未満のサイズの油滴を有する［７９］。エマルジョンは、以下の１つまたは複数を含むこともできる：アルジトール；凍結保護剤（例えば糖、例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；ならびに／またはアルキルポリグリコシド。エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含むことができる［８０］。そのようなエマルジョンは、凍結乾燥してもよい。
【００９１】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［８１］。アジュバント添加ワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【００９２】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献８２に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【００９３】
・非代謝性油（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（グルクロン酸のカルボキシル基を通してのデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの添加によって生成される、参考文献８３に記載のＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤が含まれてもよい。
【００９４】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）がらせんミセルとして結合するエマルジョン［８４］。
【００９５】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［８５］。
【００９６】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［８５］。
【００９７】
エマルジョンは、ワクチンの製造の間に（１つまたは複数の）抗原と組み合わせること、または送達の時に（ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸＴＭ製品の場合のように）、別個の抗原含有成分と即席で混合するための別々の成分として供給することができる。これらの２つの成分が液体である場合、混合するための２つの液体の容量比は異なることができる（例えば５：１〜１：５の間で）が、一般的に約１：１である。
【００９８】
抗原とアジュバントを混合した後、血球凝集素抗原は水溶液に一般に残るが、油／水界面の周辺に分布することがある。一般に、あるとしても少量しかない血球凝集素は、エマルジョンの油相に入る。
【００９９】
本発明の組成物中の血球凝集素（総量）に対するスクアレンの重量比は、２０〜１８０の範囲、例えば２５〜３０、５０〜６０、１０５〜１１５であってよい。
【０１００】
（処置およびワクチン投与の方法）
本発明の組成物はヒト患者への投与に適し、本発明は、患者の免疫応答を高める方法であって、本発明の組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０１】
本発明は、医薬としての使用のための本発明の組成物も提供する。
【０１０２】
本発明は、インフルエンザ疾患に対する能動免疫化のための組成物の製造における、少なくとも１つのインフルエンザＡウイルス抗原、少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス抗原およびスクアレン（例えば水中油型エマルジョンの形）の使用も提供し、ここで、組成物は上記特性を有するワクチンである。
【０１０３】
これらの方法および使用は、一般に抗体応答、好ましくは防御抗体応答を起こさせるために用いられる。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を調査するための方法は、当技術分野で周知である。ヒト試験は、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清試料血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染からの約５０％の防御を与える）［８６］。抗体応答は、血球凝集阻害、微量中和、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血（ＳＲＨ）によって一般的に測定される。これらのアッセイ技術は、当技術分野において周知である。
【０１０４】
本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は筋肉内注射（例えば腕や脚）によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、皮内注射［８７、８８］、鼻腔内［８９〜９１］、経口［９２］、口内、舌下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［９３］などが含まれる。
【０１０５】
本発明によって調製されるワクチンは、小児および成人の両者を処置するために用いることができる。インフルエンザワクチンは、６カ月の年齢以上の、小児および成人の免疫化で使用することが現在推奨されている。したがって、患者は、１歳未満、６〜＜３６カ月齢、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチン投与に好ましい患者は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳および好ましくは≧６５歳）、年少者（例えば≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍部および軍隊の人員、妊娠女性、慢性病患者、免疫不全患者、ワクチン投与の前７日間に抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルまたはザナミビル化合物、下記参照）を投与された患者、卵アレルギーのある者および外国旅行者である。しかしワクチンは、これらの群のためだけに適するのではなく、集団でより一般に用いることができる。
【０１０６】
本発明の好ましい組成物は、効能のＣＰＭＰ基準の１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は以下の通りである：（１）≧７０％血清防御、（２）≧４０％セロコンバージョン、および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は以下の通りである：（１）≧６０％血清防御、（２）≧３０％セロコンバージョン、および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加。これらの基準は、少なくとも５０人の患者の非盲検試験に基づく。
【０１０７】
処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによることができる。複数用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加抗原免疫化スケジュールで用いることができる。複数用量スケジュールでは、同じであるかまたは異なる経路で、例えば非経口で一次および粘膜で追加抗原、粘膜で一次および非経口で追加抗原などによって様々な用量を与えることができる。免疫学的にナイーブな患者、例えばインフルエンザワクチンをこれまで投与されたことのない人々、または新しいＨＡサブタイプを含むワクチンについて、１より多い用量（一般的に、２用量）の投与が特に有用である。複数用量は、一般的に少なくとも１週間離して（例えば約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１２週、約１６週など）で投与される。
【０１０８】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同じ時間に（例えば医療専門家またはワクチン接種施設への同じ医療相談または訪問の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合ワクチン（四価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合ワクチンなどと実質的に同じ時間に、患者に投与されてもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同じ時間の投与は、高齢患者で特に有益である。
【０１０９】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに有効な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同じ時間に（例えば医療専門家への同じ医療相談または訪問の間に）患者に投与されてもよい。これらの抗ウイルス薬には、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼインヒビターが含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）であり、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である。
【０１１０】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから排他的になることも、または別のものを含むこと、例えばＸ＋Ｙであることもできる。
【０１１１】
単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略されてもよい。
【０１１２】
数値ｘに関しての用語「約」は、任意選択で用いられ、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１１３】
特記されていない場合、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合のいかなる特定の順序も要求しない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合、２つの成分を互いと組み合わせ、次にその組合せを第三の成分と組み合わせること、などができる。
【０１１４】
動物（特にウシ）の材料を細胞の培養で用いる場合、それらは、伝染性の海綿状脳症（ＴＳＥ）が存在しない、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が存在しない供給源から得るべきである。全体として、動物由来の物質が完全に存在しない中で細胞を培養することが好ましい。
【０１１５】
リアソートメントまたはリバースジェネティクス手順のために、またはウイルス増殖のために細胞の培養基を用いる場合、好ましくはそれは、例えばＰｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ第５．２．３章にあるように、ヒトワクチンの製造での使用が承認されているものである。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
（発明を実施するための様式）
５９５人の患者（男児および女児、６〜＜３６カ月）を、各々３５人の１７群に分ける。各群に、三価（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ）または四価（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ）のインフルエンザワクチンを投与する。ワクチンは、０．５ｍＬ容量（１５μｇ／用量／株；全体で４５μｇまたは６０μｇ）、または０．２５ｍＬ容量（７．５μｇ／用量／株；全体で２２．５μｇまたは３０μｇ）で投与される。群の１つは、既存の市販の三価不活化ワクチンの小児用量を投与される。ワクチンは筋肉内注射によって与えられ、充填済み注射器またはバイアルで提供される。３つの異なるアジュバント量（希釈によって達成される）を検査する。
【０１１７】
三価ワクチンは、北半球でインフルエンザ時期２００８〜２００９年について推奨されたインフルエンザ株を含む：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７様、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様ウイルス、およびＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６様。Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６様ウイルスは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統であり、したがって四価のワクチンは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統であるＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４様ウイルスからの抗原をさらに含んでいた。
【０１１８】
被験体は１日目および２９日目に２用量のワクチンを投与され（１日目に単一用量を投与される２群を除いて）、ベースライン（ワクチン接種前）、２８日目、および５０日目に採取される血液を分析することによって、インフルエンザ特異的免疫応答が調査される。血清試料は、同種および異種改変株を含むインフルエンザ株Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢに対する株特異的血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイによって調査される。
【０１１９】
したがって、１７群は以下の通りである。
【０１２０】
【表１】
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さらなる試験では、３５７人の患者（男性および女性、＞６５歳）を８群に分ける。各群は、水中スクアレンエマルジョンと一緒にまたはそれなしで、筋肉内注射（０．５ｍＬ）によって三価インフルエンザワクチン（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ）を投与される。ワクチンは、充填済み注射器で提供される。３つの異なるアジュバント量（希釈によって達成される）が検査される。
【０１２１】
インフルエンザ株は、北半球でインフルエンザ時期２００８〜２００９年について推奨された通りである：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７様、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様ウイルス、およびＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６様。
【０１２２】
被験体は単一用量を投与され、ベースライン（ワクチン接種前）、ワクチン接種の７日後（８日目）、および２１日後（２２日目）に採取される血液を分析することによって、インフルエンザ特異的免疫応答を調査する。血清試料は、インフルエンザ株Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢに対する株特異的血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイによって調査される。細胞媒介免疫アッセイも、実施される。
【０１２３】
したがって、８つの群は以下の通りである。
【０１２４】
【表２】
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両方のインフルエンザＡ株について、患者群Ｃ〜Ｈ（すなわちアジュバント添加ワクチン）で全３つのＣＨＭＰ基準が満たされる。
【０１２５】
インフルエンザＢ株については、４．８８ｍｇスクアレンまたは９．７５ｍｇスクアレンを投与される群で全３つのＣＨＭＰ基準が満たされる。アジュバント非添加ワクチンを投与される群では、ＣＨＭＰ基準のわずか１つが満たされるが、２．４４ｍｇスクアレンを投与される群では、３つのＣＨＭＰ基準の２つが満たされる。
【０１２６】
したがって、ワクチン中の低い用量のスクアレンでさえ、インフルエンザＡおよびＢの株に対する免疫防御を増加させることができる。
【０１２７】
本発明は、ほんの一例として説明されたにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲に留まりながら修正を加えることができることが理解される。
【０１２８】
（参考文献）
【０１２９】
【数１】
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【０１３０】
【数２】
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【０１３１】
【数３】
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