(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）成熟肝細胞が死に、そして類上皮形態を有する生存細胞の集団が選択されるまで、成体肝臓由来ヒト成熟肝細胞を細胞培養培地中にて培養する工程；
（ｉｉ）ｈＥＧＦ（ヒト上皮増殖因子）およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を加えた、哺乳動物の細胞の増殖に必要な通常の無機塩、アミノ酸およびビタミンを含む血清含有グルコース含有培養培地中で培養することによって類上皮形態を有する生存細胞の集団を増殖させる工程；および
（ｉｉｉ）細胞培養培地から細胞を分取する工程
を含む、馴化培地の製造方法。
【請求項２】
成熟肝細胞を凍結保護剤の存在下にて血清含有培養培地中で冷凍し、次いで、工程（ｉ）による培養の前に解凍することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培養培地がＧＭＰグレードヒトアルブミンを加えたアルファＭＥＭを含むことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞を含有しないことを特徴とする、非卵形ヒト肝臓多能性前駆細胞株の培養により得られる馴化培地であって、少なくとも肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の混合物をさらに含むことを特徴とする、馴化培地。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項記載の方法によって得られることを特徴とする、請求項４記載の馴化培地。
【請求項６】
請求項４または５記載の馴化培地の医薬上有効量を含む医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも５倍濃縮されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１０倍濃縮されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも２０倍濃縮されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも２５倍濃縮されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも５倍希釈されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１０倍希釈されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１３】
少なくとも２０倍希釈されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも２５倍希釈されていることを特徴とする、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１５】
臓器損傷または臓器不全の治療のための請求項６〜１４いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１６】
臓器が肝臓または腎臓であることを特徴とする、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
０.０１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の用量、０.０１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲のインターロイキン６（ＩＬ−６）の用量、０.０１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲のインターロイキン８（ＩＬ−８）の用量を投与するのに適しており、０.０１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の用量を投与するのに適していてもよい薬剤として調製されることを特徴とする、請求項１５または１６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的医薬品および再生医学の分野のものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞調製物は、ヒトまたは動物の組織に対して再生効果を発揮することが判明した。劇症肝不全（ＦＨＦ）の治療におけるバイオ人工肝臓の支援の有効性を試験する臨床試験からはいくつかの有望な結果が得られているが、現行の医療機器は、主に機能的に安定なヒト肝細胞源がないことが原因で、十分な効力および日常的な使用のための信頼性が立証されていない（非特許文献１）。肝臓幹細胞はもちろん、他の組織由来の幹細胞でさえ、代替ヒト肝細胞源を与える可能性がある。幹細胞は、骨髄に加えて、肝臓および中枢神経系のような成体組織に存在し、以前に知られていたものよりも非常に大きな適応性を有する。
【０００３】
特許文献１に記載のヒト肝臓多能性前駆細胞／幹細胞は、様々な組織細胞型に分化すること、および臓器再生効果を発揮することが判明した。これらの細胞は、肝細胞マーカーを発現する非卵形ヒト肝臓多能性前駆細胞株由来のものである。
【０００４】
特許文献１には、また、
（ｉ）成熟肝細胞が死に、そして類上皮形態を有する生存細胞の集団が選択されるまで、細胞培養培地中で成体肝臓由来ヒト成熟肝細胞を培養する工程；
（ｉｉ）ｈＥＧＦ（ヒト上皮増殖因子）およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を加えた、哺乳動物の細胞の増殖に必要な通常の無機塩、アミノ酸およびビタミンを含む血清含有グルコース含有培養培地中で培養することによって類上皮形態を有する生存細胞の集団を増殖させる工程
を含む、様々な細胞型に分化する能力を有する上記ヒト肝臓多能性前駆細胞／幹細胞を単離する方法であって、特に成熟肝細胞を凍結保護剤の存在下にて血清含有培養培地中で冷凍し、次いで、工程（ｉ）による培養の前に解凍することを特徴とする方法が開示されている。
【０００５】
特許文献１のヒト多能性前駆細胞（本明細書中でＨＬＳＣと表す）およびその調製方法は、出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する。
【０００６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の調製物は、組織に対して再生効果を発揮することが判明した。例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、可溶性細胞外マトリックス糖タンパク質、サイトカインおよび増殖因子を包含する多くの栄養分子を分泌することによって造血を自然に支えていることが知られている。
【０００７】
しかしながら、幹細胞調製物は、投与した場合に免疫反応を引き起こすという主要な欠点を有する。いくつかの幹細胞調製物は、癌を引き起こす可能性さえある。
【０００８】
Parekkadanら（非特許文献２）は、最初に、人工重篤肝臓損傷のラットモデルにおいてそれらの効力を試験するために馴化培地（ＣＭ）の送達のような様々なＭＳＣ処理を評価した。この文献では、ラットに、Ｄ−ガラクトサミン（Ｇａｌ−Ｎ）の注射を合計２回腹腔内投与した。Parekkadanのグループは、次なる研究（非特許文献３）で、ＭＳＣ−ＣＭの全身注入が、詳しくは細胞死の阻害および修復プログラムの刺激によって、急性損傷肝臓における肝保護反応を引き起こすことができるかを研究した。このグループは、致死量以下Ｄ−ガラクトサミン誘導療法を使用して、有意な延命効果およびＭＳＣ−ＣＭ処置後の肝臓酵素放出の予防を立証した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２６２３６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kobayashi N, Okitsu T, Tanaka N. Cell choice for bioartificial livers. Keio J Med. 2003;52(3):151-7
【非特許文献２】Parekkadan B, van Poll D, Suganuma K, Carter EA, Berthiaume F, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoS ONE. 2007 Sep 26;2(9):e941
【非特許文献３】Van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, Berthiaume F, Nahmias Y, Tilles AW, Yarmush ML. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology. 2008 Jan 24;47(5):1634-1643
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記した幹細胞治療の欠点を考慮すると、再生医療分野において非常に有効な従来の調製物が通常細胞を含有しているということは、克服されるべき技術的課題である。
【００１２】
かくして、本発明の目的は、再生医療分野において医薬組成物として有効であるが、細胞を含まないことによって細胞（特に、幹細胞）を含有している従来技術の調製物が引き起こす欠点を回避する、調製物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、再生医療分野において有効であるが、細胞を含まないことによって細胞（特に、幹細胞）を含有している従来技術の調製物が引き起こす欠点を回避している、医薬組成物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの目的のおよび他の目的は、特許請求の範囲の独立項にて定義されている調製物および方法によって達成される。特許請求の範囲の従属項は、本発明の好ましい実施態様を対象とする。従属項および独立項のどちらの主題も本明細書の不可欠な部分を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
（原文に記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
劇症肝不全（ＦＨＦ）のマウスモデルを使用して、肝臓前駆細胞株（例えば、国際公開第２００６／１２６２３６号に記載の非卵形ヒト肝多能性前駆細胞株）を培養することによって生産される無細胞馴化培地（無細胞ＣＭ）は、肝臓に対する再生効果を発揮することが本願発明者らによって示された。肝臓前駆細胞株の培養によって生産された無細胞馴化培地（無細胞ＣＭ）は、臓器不全の治療、特に肝不全および腎不全の治療に有効であることが示された。驚くべきことに、肝臓前駆細胞株−ＣＭは、同一条件下で調製された間葉系幹細胞−ＣＭよりも有意に効果的であることが判明した。
【００１７】
特に、本明細書の実施例１に記載する研究において、６〜７週齢の雄性ＳＣＩＤマウスにＬＰＳ  ０.１２５μｇおよびＤ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）１８ｍｇを含有する生理食塩水５００μＬを腹腔内注射してＦＨＦを誘発させた。ＬＰＳおよびＧａｌＮ投与の３０分後、１時間後および３時間後に、マウスに、回転式バイオリアクター中にて培養したＨＬＳＣ由来の馴化培地３ｍｌを腹腔内注射した。馴化培地の予備的分析により、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子の大部分が明らかになった。アラニントランスアミナーゼおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼの血清中濃度は、損傷誘発後に顕著に増加し、馴化培地処置を伴う注射の６日後には有意に減少した。他方、ＢｒｄＵ、ＰＣＮＡおよびタネルアッセイによって評価された肝組織の病理組織学的分析により、アポトーシスおよび壊死のインデックスの低下ならびに組織形態の回復が明らかになった。
【００１８】
これらの研究は、炎症状態の治療および臓器再生におけるＨＬＳＣ由来馴化培地の可能な治療用途の最初の実験的証拠をもたらした。
【００１９】
かくして、本発明の第１の態様は、肝臓前駆細胞株、好ましくは非卵形ヒト肝臓多能性前駆細胞株、より好ましくは国際特許出願国際公開第２００６／１２６２３６号（出典明示により本明細書の一部を構成する）に記載の非卵形ヒト肝臓多能性細胞株を培養することにより得ることができる無細胞馴化培地からなる調製物である。
【００２０】
上記で定義した調製物の有効量を含む医薬組成物もまた本発明の範囲内である。
【００２１】
以下、本発明の主題をなす肝臓前駆細胞株由来の無細胞馴化培地は、「無細胞ＨＬＳＣ−ＣＭ」と記す。
【００２２】
「ＨＬＳＣ」なる用語は、肝臓多能性前駆細胞／幹細胞株をいう。好ましくは、「ＨＬＳＣ」なる用語は、非卵形肝臓多能性細胞株をいい、より好ましくは国際公開第２００６／１２６２３６号に記載の肝臓多能性前駆細胞／幹細胞株をいう。よさらに好ましくは、ＨＬＳＣ細胞株は、国際公開第２００６／１２６２３６号の請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されている特徴および／または国際公開第２００６／１２６２３６号の第７頁の表１に集約されている特徴を有する。このような特徴は、出典明示により本明細書の一部を構成する。
【００２３】
本発明の主題をなす無細胞ＨＬＳＣ−ＣＭは、そのままでまたは濃縮形態で医薬組成物としての使用に適している。濃縮形態は、例えば、少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、さらに好ましくは約２５倍濃縮されている。
【００２４】
好ましくは、本発明の無細胞ＨＬＳＣ−ＣＭは、当業者に知られているＧＭＰ条件下で培養された、肝臓多能性前駆細胞／幹細胞、好ましくは国際公開第２００６／１２６２３６号に記載のＨＬＳＣ細胞株から得られる。別法として、当業者に知られているＢＡＬ（人工肝臓）系中で培養された、肝臓多能性前駆細胞／幹細胞、好ましくは国際公開第２００６／１２６２３６号に記載のＨＬＳＣ細胞株から得ることができる。
【００２５】
肝臓多能性前駆細胞／幹細胞の増殖およびその無細胞馴化培地（ＣＭ）の回収のためのＧＭＰ条件の一例を以下に記載する。
【００２６】
肝臓多能性前駆細胞／幹細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（好ましくは約１０％の濃度）、ｈＥＧＦ（ヒト上皮増殖因子）およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）の存在下で前駆幹細胞を培養することにより増殖工程が行われる国際公開第２００６／１２６２３６号に記載の方法によって単離される。ＦＣＳ、ｂＦＧＦおよびｈＥＧＦは、好ましくは、ＧＭＰグレード、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のものである。
【００２７】
ＦＣＳはヒトへの注射に適さない異種タンパク質であるので、ＧＭＰ条件下の馴化培地を回収するために培養物からＦＣＳを除去する。そのためには、細胞を洗浄し、例えばＧＭＰグレードヒトアルブミンを添加したアルファＭＥＭからなる回収用培地中にて２４時間培養する。アルブミンの濃度は、好ましくは、約０.０５％である。次いで、遠心分離または濾過により無細胞馴化培地を回収する。
【００２８】
上記のインビボ実験において、劇症肝不全（ＦＨＦ）の動物モデル（ＳＣＩＤマウス）への本発明の無細胞ＨＬＳＣ−ＣＭの投与が、ＭＳＣ−ＣＭで処置したＳＣＩＤマウスよりも有意な生存利益を提供することが示された。
【００２９】
かくして、本発明の別の態様は、肝臓前駆細胞株、好ましくは非卵形ヒト肝臓多能性前駆細胞株、より好ましくは国際特許出願国際公開第２００６／１２６２３６号に記載の非卵形ヒト肝臓多能性細胞株を培養することにより得られる、医薬として用いるための無細胞馴化細胞培養培地である。
【００３０】
好ましい実施態様によると、該薬剤は、臓器の不全および／または損傷、好ましくは肝臓および／または腎臓の不全および／または損傷の治療のためのものである。
【００３１】
また、本発明者らは、上記ＨＬＳＣの培養により生産されるＣＭの臓器再生能を少なくとも一部模倣する能力を有するタンパク質混合物からなる単純医薬組成物を提供するために、これらのタンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子および／または他のタンパク質）を同定するために、上記ＣＭの有益な効果に有意に関与すると考えられる本発明の無細胞ＨＬＳＣ−ＣＭの組成物を分析した。
【００３２】
かくして、本発明の別の態様は、少なくとも肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン８（ＩＬ−８）の混合物の医薬上有効量を含む単純医薬組成物である。
【００３３】
好ましい実施態様では、該単純医薬組成物は、少なくとも肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の混合物の医薬上有効量を含む。
【００３４】
別の実施態様では、該単純医薬組成物は、少なくとも肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）およびマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）および任意の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の混合物の医薬上有効量を含む。
【００３５】
さらに別の実施態様では、該単純医薬組成物は、上記定義の実施態様のいずれかによるタンパク質混合物の医薬上有効量、およびアクチビンＣ、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＣＲ４）、システインリッチ膜貫通ＢＭＰ制御因子１（コーディン様）（ＣＲＩＭ）、デコリン、エクトジスプラシンＡ２（ＥＤＡ−Ａ２）、エンドセリン、線維芽細胞増殖因子受容体様１（ＦＧＦ  Ｒ５）、グリピカン３、増殖関連腫瘍性タンパク質（ＧＲＯ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ−６）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インターロイキン２０受容体、アルファ（ＩＬ−２０  Ｒ  アルファ）、クリングル含有膜貫通タンパク質２（Ｋｒｅｍｅｎ−２）、潜在型トランスフォーミング増殖因子ベータ結合タンパク質１（潜在型ＴＧＦ−ベータｂｐ１）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ−２）、ＭＳＰベータ鎖、オステオプロテジェリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ｂ）、可溶性ｇｐ１３０（ｓｇｐ１３０）、分泌タンパク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）（ＳＰＡＲＣ）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるタンパク質を含む。
【００３６】
本発明の単純医薬組成物における好ましいサイトカイン濃度範囲は、以下のとおりである:
ＨＧＦ：  １〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜６５ｎｇ／ｍｌ；
ＩＬ−６：  １０〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは３０〜５０ｎｇ／ｍｌ；
ＩＬ−８：  ≧３５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０-６００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１００-３００ｎｇ／ｍｌ；
ＶＥＧＦ（存在する場合）：  １０〜４００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜２５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは３５〜１７５ｎｇ／ｍｌ；
ＭＳＰ（存在する場合）：  １〜１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは５〜８０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜６５ｐｇ／ｍｌ。
【００３７】
しかしながら、本発明の範囲は、また、単純医薬組成物の希釈形態または濃縮形態も含む。濃縮形態は、例えば少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、さらにより好ましくは約２５倍濃縮されている。希釈形態は、例えば少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、さらにより好ましくは少なくとも約２５倍希釈されている。
【００３８】
本発明の単純医薬組成物は、薬剤、特に臓器の不全および／または損傷、好ましくは肝臓および／または腎臓の不全および／または損傷の治療のための薬剤として使用するのに適している。好ましい実施態様によると、当該医薬組成物は、以下のサイトカイン投与量を投与するように処方される：
ＨＧＦ：  ０.０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０３〜０.８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.１〜０,５ｍｇ／ｋｇ；
インターロイキン６（ＩＬ−６）：  ０.０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０３〜０.８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.０５〜０.５ｍｇ／ｋｇ；
インターロイキン８（ＩＬ−８）：  ０.０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０２〜０.８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.０３〜０,５ｍｇ／ｋｇ；
ＶＥＧＦ（存在する場合）：  ０.０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０２〜０.８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.０４〜０.５ｍｇ／ｋｇ；
ＭＳＰ（存在する場合）：  ０.０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０２〜０.８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.０８〜０.５ｍｇ／ｋｇ。
【００３９】
特に好ましい実施態様では、これらのサイトカイン投与量は、１日１回投与される。
【００４０】
当然のことながら、上記定義の単純医薬組成物は、単に、上記のＨＬＳＣ培養により得られるＣＭの臓器再生能を少なくとも一部模倣する能力を有する単純医薬組成物の非限定的な例として提供される。
【００４１】
本発明のさらなる目的および利点は、単に例証として提供される以下の実施例から明らかになるであろう。
【００４２】
また、当然のことながら、本発明の医薬組成物および方法のさらなる実施態様は、本発明の範囲を逸脱することなく、以下の実施例に基づいて予想され得る。
【実施例】
【００４３】
実施例１  予備インビボ研究
ＨＬＳＣおよびＭＳＣ細胞培養物の調製
国際公開第２００６／１２６２３６号の記載に従って、ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）を単離した。該細胞を６０％〜７０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、０.０５％ヒト血清アルブミン（ＧＭＰ生産）を添加した無血清アルファＭＥＭ培地１０ｍＬ中にて培養した。既報のとおり骨髄穿刺液からヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、増殖させ、特徴付けた。ＭＳＣの増殖をサポートするように特に処方された低血清（２％ＦＣＳ）培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM培地中にてＭＳＣを培養した。
【００４４】
馴化培地の調製
無細胞馴化培地は、ＭＳＣおよびＨＬＳＣの培養の２４時間後に遠心分離によりこの無細胞馴化培地を回収することによって調製した。実験は、２×１０6細胞の細胞マスを用いて行った。次いで、３ｋＤａ分子量カットオフを有する限外濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−ＰＬ  ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、培地を約２５倍濃縮した。合計２５０μｌの馴化培地を得た。この濃縮培地をα−ＭＥＭ（ＦＣＳ不含）３ｍｌで最終容量３ｍｌに希釈した。肝臓損傷誘発の３０分後、１時間後および３時間後に馴化培地１ｍｌを腹腔内投与した。
【００４５】
ＦＨＦインビボモデル
劇症肝不全（ＦＨＦ）の誘発のために、既述（Lehmann V, Freudenberg MA, Galanos C. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice. J Exp Med. 1987;165(3):657-63）のとおりＤ−ガラクトサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース）による動物の処置時にリポ多糖（ＬＰＳ）の致死毒性を生じさせた。簡潔には、ＳＣＩＤマウス１０匹のグループにＤ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）（６００ｍｇ／ｋｇ）および動物１匹につきＬＰＳ  ０.１２５μｇを腹腔内投与した。本発明者らは、予め、ＧａｌＮ（６００ｍｇ／ｋｇ）およびＬＰＳ（動物１匹につき０.１２５μｇ）で処置したマウスに８時間以内に１００％の致死率がもたらされたことを測定した。ＧａｌＮおよびＬＰＳはパイロジェンフリーＮａＣｌ溶液５００μｌ中の混合物として投与した。注射の２４時間後まで死亡を記録した。ＬＰＳおよびＧａｌＮ注射の３０分後、１時間後および３時間後、マウスにＨＬＳＣおよびＭＳＣ濃縮馴化培地１ｍＬを３回腹腔内投与した。図１に示されるように、ＨＬＳＣ由来ＣＭを注射したマウス５匹のうち４匹が生存していたが、ＭＳＣ由来ＣＭで処置したマウスは全く生存しなかった。
【００４６】
ＨＬＳＣおよびＭＳＣ馴化培地のサイトカイン組成
上記のＨＬＳＣおよびＭＳＣを培養することにより得られた馴化培地の組成を研究するために、マルチプルＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｃｌａｒｍａ）により３１種類のサイトカインを測定した。１０％ＦＣＳを含有する培地中にて両方の細胞型を培養した。培養の２４時間後に馴化培地を回収した。培地だけのサイトカイン組成物も測定した。結果を下記表１に示す。
【００４７】
【表１】
0005632833.tif 000002
【００４８】
実施例２  Ｔ−フラスコ培養物から得られたＨＬＳＣおよびＭＳＣ−ＣＭの効果ならびに（ＦＨＦ）のＤ−ガラクトサミン／エンドトキシンインビボモデルにおけるタンパク質混合物の効果
劇症肝不全（ＦＨＦ）のインビボモデル（ＳＣＩＤマウス）における以下の実験を行った。
【００４９】
１）第１の実験プロトコールは、ＨＬＳＣ  Ｔ−フラスコ培養物から得られた２５倍濃縮上清１ｍｌの腹腔内注射からなっていた。２５倍濃度は、３ＫＤ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて達成された。使用前に該上清を超遠心分離にかけた。Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ注射によるＦＨＦ誘発の３０分後、１時間後および３時間後に該注射液を投与した。合計２０匹のＳＣＩＤマウスを処置した。
【００５０】
２）第２の実験プロトコールは、サイトカイン混合物の注射からなっていた。合計１０匹のＳＣＩＤマウスに以下の組換えサイトカイン混合物を注射した。ＨＧＦ：  ８７０,７５ｎｇ／ｍｌ×３０ｍｌのアルファＭＥＭ（静脈注射）＝２６μｇ  ＩＬ−６：  ３４０,５ｎｇ／ｍｌ×３０（静脈注射）＝１０,４μｇ  ＩＬ−８：  ２６１ｎｇ／ｍｌ×３０（静脈注射）＝８μｇ  ＶＥＧＦ：  ２０２ｎｇ／ｍｌ×３０（静脈注射）＝６μｇ。合計１０匹のＳＣＩＤマウスに混合物３ｍｌを投与するためにこの混合物３０ｍｌを調製した。ＧＡＬＮ／ＬＰＳ腹腔内注射の３０分後、１時間後および３時間後、各ＳＣＩＤマウスにこのサイトカイン混合物１ｍｌを注射した。各ＳＣＩＤマウスは以下の投与を受けた：  [ＨＧＦ]：  ２,５９μｇ、[ＩＬ−６]：  １,０２μｇ、[ＩＬ−８]：  ０,７９μｇ、[ＶＥＧＦ]：  ０,６μｇ。この混合物をＭＩＸ  ４と称する。
【００５１】
３）第３の実験プロトールは、ＭＩＸ  ４＋ＭＳＰ−１の注射からなっていた。合計５匹のＳＣＩＤマウスに注射した。各ＳＣＩＤマウスに以下のものを投与した：  [ＨＧＦ]：  ２,５９μｇ、[ＩＬ−６]：  １,０２μｇ、[ＩＬ−８]：  ０,７９μｇ、[ＶＥＧＦ]：  ０,６μｇ（ＢＡＬ実験から得られたサイトカインの濃縮物）＋[ＭＳＰ−１]：  ２ｕｇ。
【００５２】
４）第４の実験プロトコールは、ＭＳＣ−ＣＭまたはＨＬＳＣ−ＣＭの注射からなっていた。ＭＳＣ−ＣＭを得るために、ＭＳＣを集密度９０％に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＭＳＣ）、完全に洗浄し、２％ＦＣＳ培養培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM  １０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて２５倍濃縮した。ＨＬＳＣ−ＣＭを生産するために、ＨＬＳＣを集密度６０％〜７０％に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、０.０５％ヒト血清アルブミン（ＧＭＰ生産）を添加した無血清アルファＭＥＭ培地１０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて２５倍に濃縮した。
【００５３】
これらの実験で使用したＳＣＩＤマウスの平均体重は約２５ｇであった。
【００５４】
材料および方法
ＦＨＦインビボモデル。ＦＨＦ注射のために、既述（Lehmann V, Freudenberg MA, Galanos C. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice. J Exp Med. 1987;165(3):657-63）のとおりＤ−ガラクトサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース）による動物の処理時にリポ多糖（ＬＰＳ）の致死毒性を生じさせた。簡潔には、ＳＣＩＤマウスにＤ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）（６００ｍｇ／ｋｇ、動物１匹につき１８ｍｇ）および動物１匹につきＬＰＳ  ０.１２５μｇを腹腔内注射した。本発明者らは、予め、ＧａｌＮ（６００ｍｇ／ｋｇ）およびＬＰＳ（動物１匹につき０,１２５μｇ）で処置したマウスに８時間以内に１００％の致死率がもたらされたことを測定した。ＧａｌＮおよびＬＰＳはパイロジェンフリーＮａＣｌ溶液５００μｌ中の混合物として投与した。注射の２４時間後まで死亡を記録した。３０分後、ＬＰＳおよびＧａｌＮ注射の１時間後および３時間後、マウスにＨＬＳＣ−馴化培地、ＭＳＣ−馴化培地またはサイトカイン混合物１ｍＬを腹腔内注射した。
【００５５】
細胞培養。既報のとおりヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を骨髄穿刺液から単離し、増殖させ、特徴付けた。ＭＳＣの増殖をサポートするように特に処方された低血清（２％ＦＣＳ）培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM培地中にてＭＳＣを培養した。細胞は３〜５継代の間実験に使用された。
【００５６】
ＭＳＣ−馴化培地（ＣＭ）調製。既述のとおりヒトＭＳＣを培養し、表面マーカー発現ならびに脂肪生成性および骨形成性分化能について特徴付けた。ＭＳＣ−ＣＭを得るために、細胞を９０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、２％ＦＣＳ培養培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM  １０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して２５倍に濃縮した。
【００５７】
ＨＬＳＣ−ＣＭ調製。凍結ヒト肝細胞からヒトＨＬＳＣを得た。既述のとおりＨＬＳＣを培養し、表面マーカー発現および分化能について特徴付けた。ＨＬＳＣ−ＣＭを得るために、細胞を６０％〜７０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、０.０５％ヒト血清アルブミン（ＧＭＰ生産）を添加した無血清アルファＭＥＭ培地１０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して２５倍濃縮した。
【００５８】
馴化培地の濃度：  培養の２４時間後にＴ−フラスコから上清を回収した。次いで、該上清を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの３ｋＤａ分子量カットオフを有する限外濾過ユニットを使用して約２５倍濃縮した。
【００５９】
組織学的分析：  Ｈ＆Ｅ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）、増殖（ＰＣＮＡ染色）およびタネル（アポトーシス細胞）を介して肝臓の壊死を分析した。
【００６０】
生化学的分析。標準的な臨床自動分析機器を使用して、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルを測定した。
【００６１】
ウエスタンブロット：  ＢＡＸおよびＢｃｌＸＳ／Ｌの検出のためにウエスタンブロットを行った。肝臓をホモジナイズし、溶解バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０μｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｍｏｌ／Ｌロイペプチン、および１００Ｕ／ｍｌアプロチニン）中にて４℃で１時間溶解し、１５,０００ｇで遠心分離した。ブラッドフォード法により上清のタンパク質含有量を測定した。肝臓溶解物のタンパク質２００μｇを含有するアリコートを還元条件下で１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースメンブランフィルター上にエレクトロブロットした。該ブロットを２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ＋０.１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ）中５％脱脂乳でブロックした。次いで、該メンブランを適当な濃度の関連する一次抗体で４℃にて一夜イムノブロットした。ＴＢＳ−Ｔで何回も洗浄した後、該ブロットをペルオキシダーゼ結合アイソタイプ特異的二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ＥＣＬ検出試薬で１分間展開させ、Ｘ−Ｏｍａｔフィルムに暴露した。以下の抗体を使用した：  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの抗ＢＡＸモノクローナル抗体および抗ＢｃｌＸＳ／Ｌポリクローナル抗体。
【００６２】
結果
得られた結果を図２〜４に示す。
【００６３】
図２は、ＨＬＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２２；生存率７３％）、ＭＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５；生存率０％）またはサイトカイン混合物（サイトカイン：  ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＨＧＦ；ｎ＝１０；生存率４０％）、およびサイトカイン混合物＋ＭＳＰ−１（サイトカイン*：  ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＨＧＦ＋ＭＳＰ−１；ｎ＝５；生存率１００％）で処理したＧａｌＮ／ＬＰＳ損傷ＳＣＩＤマウスの生存率（％）を示す。
【００６４】
図３は、対照、ＧａｌＮ／ＬＰＳ処置マウス、ＦＨＦ誘導の６日後にＨＬＳＣ−ＣＭを注射したＧａｌＮ／ＬＰＳ処置マウスのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）血清濃度を示す。
【００６５】
図４は、ＦＨＦ誘発の３日後および６日後にＨＬＳＣ−ＣＭを注射したＧａｌＮ／ＬＰＳ処置ＳＣＩＤマウスのＨ＆ＥおよびＰＣＮＡ染色を示す写真である。
【００６６】
実施例３  ＨＬＳＣ−およびＭＳＣ−馴化培地（ＣＭ）ならびにサイトカイン混合物を使用するインビトロ実験
この実験プロトコールでは、ヒト初代肝細胞においてアポトーシスを直接阻害することができるＨＬＳＣ−ＣＭの能力を研究した。アポトーシスのインビトロアッセイを使用して、ＨＬＳＣ由来の馴化培地が肝細胞死に対する直接阻害効果を発揮することを示した。このインビトロ活性をＭＳＣ−ＣＭのインビトロ活性と比べた。該細胞によって産生される馴化培地中に存在する６つのヒト組換えサイトカインの効果をヒト肝細胞アポトーシスアッセイで研究した。
【００６７】
材料および方法
細胞培養。既報のとおり骨髄穿刺液からヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、増殖させ、特徴付けた。ＭＳＣの増殖をサポートするように特に処方された低血清（２％ＦＣＳ）培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM培地中にてＭＳＣを培養した。細胞は３〜５継代の間実験に使用された。ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）を既述のとおり単離し、４ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦおよびｈＦＧＦを添加した１０％ＦＣＳ（ＧＭＰ；ウシ胎仔血清）を含有するアルファＭＥＭ／ＥＢＭ（３：１）中にて培養した。
【００６８】
ＭＳＣ−馴化培地（ＣＭ）。既述のとおりヒトＭＳＣを培養し、表面マーカー発現ならびに脂肪生成性および骨生成性分化能について特徴付けた。ＭＳＣ−ＣＭを得るために、細胞を９０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、２％ＦＣＳ培養培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM  １０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、超遠心分離し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して２５倍濃縮した。
【００６９】
ＨＬＳＣ−ＣＭ。凍結ヒト肝細胞からヒトＨＬＳＣを得た。既述のとおりＨＬＳＣを培養し、表面マーカー発現および分化能について特徴付けた。ＨＬＳＣ−ＣＭを得るために、細胞を６０％〜７０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、０.０５％ヒト血清アルブミン（ＧＭＰ生産）を添加した無血清アルファＭＥＭ  １０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、超遠心分離し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して２５倍濃縮した。
【００７０】
インビトロ肝細胞アポトーシス（タネル）。肝細胞を、フィブロネクチン被覆プレート中にて３００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中にて１日培養した。濃度５ｍＭのガラクトサミン−Ｄを２４時間添加し、次いで、異なる量の既述のとおり得られたＨＬＳＣおよびＭＳＣ由来の馴化培地（０,５％〜１６％）、４つのサイトカインの混合物（ＭＩＸ  ４はＩＬ−８、ＩＬ−６、ＨＧＦ、ＶＥＧＦである）を添加した。結果は、８種類の実験の平均値±ＳＤとして表した。
【００７１】
サイトカイン濃度。インビトロ実験において使用されたヒト組換えサイトカインの濃度は、２５倍濃縮されたフラスコ培養条件下で２４時間後にＨＬＳＣにより生産された濃度から選択された。ＭＳＰの場合、ＢＡＬ培養条件下で得られた濃度を使用した。最初の濃度は、馴化培地の貯蔵物と同じであると考えられ、次いで、細胞を、インビトロで使用した馴化培地の最高濃度を表す１６％の各貯蔵濃度で刺激した。
【００７２】
ＩＬ−６＝５６,５ｎｇ／ｍｌ、使用した最終濃度＝９ｎｇ／ｍｌ
ＩＬ−８＝２１０ｎｇ／ｍｌ、使用した最終濃度＝３３,６ｎｇ／ｍｌ
ＨＧＦ＝２５９ｎｇ／ｍｌ、使用した最終濃度＝４１,４ｎｇ／ｍｌ
ＶＥＧＦ＝４４,８ｎｇ／ｍｌ、使用した最終濃度＝７,２ｎｇ／ｍｌ
ＭＣＰ−１＝２５,７ｎｇ／ｍｌ、使用した最終濃度＝４,１ｎｇ／ｍｌ
ＭＳＰ＝６０ｎｇ／ｍｌ、使用した最終濃度＝９,６ｎｇ／ｍｌ
【００７３】
結果を図５〜１０に示す。
【００７４】
図５は、低濃度のＨＬＳＣ−ＣＭによるインビトロでの肝細胞アポトーシス阻害を示す。初代ヒト肝細胞をフィブロネクチン被覆プレート中にて培養した。Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）によりアポトーシスを誘発した。ＧａｌＮへの暴露の間、肝細胞を、０.５；２；８または１６％の２５倍濃縮ＨＬＳＣ−ＣＭ（ＧＭＰ生産）を添加した細胞培養培地中にて培養した。１ウェルにつき４つの画像をデジタル画像解析して細胞死を定量化した。示されたデータは、８つの実験の平均値±ＳＤである。Ｐ＜０.０５。
【００７５】
図６は、ＧａｌＮ処置ヒト肝細胞のタネルアッセイの代表的な顕微鏡写真を示す。（Ａ）２４時間後の５ｍＭ  ＧａｌＮ処置肝細胞および（Ｂ）２４時間後に２％ＨＬＳＣ−ＣＭで刺激した５ｍＭ  ＧａｌＮ処置肝細胞。
【００７６】
図７は、低濃度のＭＳＣ−ＣＭによるインビトロでの肝細胞アポトーシス阻害を示す。初代ヒト肝細胞をフィブロネクチン被覆プレート中にて培養した。Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）によりアポトーシスを誘発した。ＧａｌＮへの暴露の間、肝細胞を、０.５；２；８または１６％の２５倍濃縮ＭＳＣ−ＣＭを添加して細胞培養培地中にて培養した。１ウェルにつき４つの画像をデジタル画像解析して細胞死を定量化した。示されたデータは、８つの実験の平均値±ＳＤである。Ｐ＜０.０５。
【００７７】
図８は、種々のサイチカイン混合物によるインビトロでの肝細胞アポトーシス阻害を示す。ヒト肝細胞をＤ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ；５ｍＭ）の存在下で２４時間培養した。ＧａｌＮ処置肝細胞に対するＭＩＸ４＋ＭＳＰの使用により、２４時間後にアポトーシス阻害がもたらされた。ＧａｌＮで処置した肝細胞を、ＭＩＸ４＋ＭＣＰ−１またはＭＩＸ４＋ＭＳＰ＋ＭＣＰ−１の組み合わせと一緒に培養した。１ウェルにつき４つの画像をデジタル画像解析して細胞死を定量化した。示されたデータは、８つの実験の平均値±ＳＤである。*Ｐ＜０.０５。
【００７８】
実施例４  マルチプレックスおよび酵素結合免疫吸着測定法によるＣＭ組成分析
【００７９】
ヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）により培養培地中に生産された可溶性サイトカインは、肝臓治癒を増強することが示されている。関与するメカニズムをさらに解明するために、ＨＬＳＣにより放出されるサイトカインを測定し、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）により生産されるサイトカインと比べた。分泌されたサイトカインのプロファイルの分析は回転ビン、正常酸素圧条件下のＴ−フラスコ、および低酸素条件下のＴ−フラスコのような異なる細胞培養条件下での馴化培地の生産によって拡張された。ＭＳＣの場合、正常酸素圧条件下のＴ−フラスコ中においてのみ細胞を培養した。合計１６種類の馴化培地を得た。分析は、全て、ＨＬＳＣおよびＭＳＣによる２４時間培養で生産された馴化培地のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ系（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて行われ、合計３１種類のタンパク質と共に、多量の、とりわけ、ＨＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ１のようなサイトカインおよびケモカインの存在を示した。Ｂｉｏ−Ｒａｄヒトマルチプレックスアッセイに使用したいくつかの抗体をＥＬＩＳＡにより評価した（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ１およびＭＳＰ１）。ＥＬＩＳＡは、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡキットを製造者の使用説明書に従って行った。本発明者らは、また、マルチプレックスおよび酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を比較評価した。比較は、生産した１６種類の馴化培地中に存在する６つのサイトカインの測定値に基づいて行った。異なるキットによって測定されたサイトカイン濃度は、類似の傾向を示したが、測定した絶対濃度は異なっていた。
【００８０】
材料および方法
細胞培養
ＨＬＳＣ。既述のとおりヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）を単離し、４ｎｇ／ｍｌのｒｈＥＧＦおよびｒｈＦＧＦを添加した１０％ＦＣＳ（ＧＭＰ；ウシ胎児血清）を含有するアルファＭＥＭ／ＥＢＭ（３：１）中にて培養した。
【００８１】
２４時間培養したＨＬＳＣを用いて行われた実験の全てにおいて馴化培地（ＣＭ）回収のための初回細胞シーディングおよび培地組成は、以下に記載されるとおりであった。
【００８２】
回転ビン中で培養した３継代目の細胞を用いる２つの実験：  １００ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中で培養した２０×１０6ＨＬＳＣ
回転ビン中で培養した１０継代目の細胞を用いる２つの実験：  １００ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中にて培養した２０×１０6ＨＬＳＣ
正常酸素圧条件下のＴ−フラスコ中で培養した３継代目の細胞を用いる３つの実験：１０ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中で培養した２×１０6ＨＬＳＣ
正常酸素圧条件下のＴ−フラスコ中で培養した１０継代目の細胞を用いる３つの実験：  １０ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中にて培養した２×１０6ＨＬＳＣ
低酸素圧条件下のＴ−フラスコ中で培養した３継代目の細胞を用いる２つの実験：  １０ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中にて培養した２×１０6ＨＬＳＣ
低酸素圧条件下のＴ−フラスコ中で培養した１０継代目の細胞を用いる２つの実験：  １０ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中にて培養した２×１０6ＨＬＳＣ
【００８３】
ｈＭＳＣ。既報のとおりヒト骨髄穿刺液からヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を単離し、増殖し、特徴付けた。ＭＳＣの増殖をサポートするように特に処方された低血清（２％ＦＣＳ）培地であるＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳTM培地中にてＭＳＣを培養した。細胞は３継代の間実験に使用された。
【００８４】
２４時間培養されたｈＭＳＣを用いて行われた実験の馴化培地（ＣＭ）回収のための初回細胞シーディングおよび培地組成は、以下に記載されるとおりであった。
【００８５】
正常酸素圧条件下のＴ−フラスコ中で培養した３継代目の細胞を用いる２つの実験：  １０ｍｌのＲＰＭＩ＋０,０５％ヒトアルブミン中の２×１０6
【００８６】
ＣＭの調製。Ｔ−フラスコ中にて２×１０6の濃度の細胞をシーディングし、それらをインキュベーター中にて一夜インキュベートすることによってＨＬＳＣ由来ＣＭを得た。翌日、細胞を完全に洗浄し、０,０５％のヒトアルブミンの存在下にてＲＰＭＩ（フェノールレッド不含）１０ｍＬ中にて培養した。２４時間後にＣＭ培地を回収し、各実験から得たアリコートの全てを−２０℃で冷凍した。ＣＭを、孔径３ｋＤａカットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅの限外濾過ユニットを用いて４℃にて２７００ｇで１、３０時間遠心分離することによって濃縮した。
【００８７】
９０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、０,０５％のヒトアルブミンの存在下にてＲＰＭＩ（フェノールレッド不含）１０ｍＬ中にて培養することによってｈＭＳＣ由来ＣＭを得た。２４時間後に馴化培地を回収し、各実験から得たアリコートの全てを−２０℃で冷凍した。ＣＭを、孔径３ｋＤａカットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅの限外濾過ユニットを用いて４℃にて２７００ｇで１、３０時間遠心分離することによって濃縮した。
【００８８】
ＣＭの回収後、細胞を回収し、トリパンブルー染料排除によって細胞生存率を評価して実験の全てにおいて９５％を超える生存率を得た。
【００８９】
全タンパク質量子化。以下の製造者のプロトコールに従ってブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によりＣＭ中の全タンパク質濃度を測定した。標準的基準を作成するためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。各試料から得た５μｌを、蒸留水で１〜５に希釈したブラッドフォード試薬からの染料１ｍｌに添加し、混合した。室温で５分間インキュベートした後、５９５ｎｍの光での吸光度を蛍光光度計で検出した。各試料からのタンパク質能を直線化ＢＳＡ吸光度曲線に従って算出した。
【００９０】
ＥＬＩＳＡ。ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＭＣＰ１およびＭＳＰ１の定量的測定のためのＲａｙＢｉｏ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を使用した。このアッセイは、９６ウェルプレート上に被覆された、上記ヒトサイトカインに対して特異的な抗体を使用する。ウェルに標準および試料をピペットで添加し、試料中のサイトカインを固定化抗体によってウェルに結合させる。該ウェルを洗浄し、ビオチン化抗ヒトサイトカイン抗体を添加する。洗浄して未結合ビオチン化抗体を除去した後、該ウェルにＨＲＰ結合ストレプトアビジンをピペットで添加した。該ウェルを再度洗浄し、該ウェルにＴＭＢ基質溶液を添加し、結合したサイトカインの量に比例して発色した。停止液の色が青色から黄色へ変わり、色の強度が４５０ｎｍで測定される。
【００９１】
Ｂｉｏｃｌａｒｍａアッセイ。標的タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体と結合した蛍光色素染色マイクロスフェアを含有する、Ｂｉｏ−ｒａｄからのマルチプレックスバイオメトリックイムノアッセイを、製造者の使用説明書に従ってサイトカイン測定に使用した（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｓｓａｙ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。以下のサイトカインをアッセイした：ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ランテス、ＶＥＧＦ、エオタキシン、ｂＦＧＦ、ＩＰ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４）、ＭＩＰ−１αおよびＴＮＦ−α。
【００９２】
簡潔には、未希釈ＣＭ  ２５０μｌを抗体結合ビーズと一緒にインキュベートした。複合体を洗浄し、次いで、ビオチン化検出抗体と一緒にインキュベートし、最後に、ストレプトアビジン−フィコエリトリンと一緒にインキュベートした後、サイトカイン濃度価を評価した。１.９５〜４０,０００ｐｇ／ｍｌの範囲の組換えサイトカインを使用して、標準曲線を作成し、感度およびアッセイダイナミックレンジを最大にした。ＬｕｍｉｎｅｘTM  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍからのマルチプレックスアレイリーダーを使用してサイトカインレベルを測定した。製造者によって提供されたソフトウエアを使用して濃度を算出した。得られた結果を表２〜８に示す。
【００９３】
【表２】
0005632833.tif 000003
【００９４】
【表３】
0005632833.tif 000004
【００９５】
【表４】
0005632833.tif 000005
【００９６】
【表５】
0005632833.tif 000006
【００９７】
【表６】
0005632833.tif 000007
【００９８】
【表７】
0005632833.tif 000008
【００９９】
【表８】
0005632833.tif 000009
【０１００】
ＨＬＳＣ馴化培地からのＭＳＰ−１の免疫沈降およびウエスタンブロット
免疫沈降およびウエスタンブロットによってＨＬＳＣ培養上清中のＭＳＰ−１を測定した。２４時間培養後の培養上清１５ｍＬを４℃にて４０００×ｇで７０分間遠心分離し、Ａｍｉｃｏｎ  ３ＫＤ限外濾過膜で２５０μＬに濃縮した。タンパク質沈殿のために、濃縮上清２５０μＬに冷（−２０℃）純粋エタノール１ｍｌを添加し、−８０℃で一夜インキュベートした。１,２００ｇで遠心分離した後、沈殿したタンパク質を回収し、ＲＩＰＡバッファー５００μｌで溶解した。プロテインＡ−セファロースと架橋結合した抗ＭＳＰ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して免疫沈降法を１８時間行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、ペレットを２−β−メルカプトエタノール４０μＬに懸濁し、１００℃で加熱した。タンパク質を８％アクリルアミドゲル中にてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中５％脱脂粉乳で１時間ブロッキングした後、該膜を２μｇ／ｍｌの抗ヒトＭＳＰ抗体と一緒に４℃で一夜インキュベートし、３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシターゼ（ＢｉｏＲａｄ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧと一緒に室温で１時間インキュベートした。化学ルミネッセンス試薬で膜を顕現させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃで分析した。
【０１０１】
結果を、３種類の継代（１、２、５）でのＨＬＳＣの馴化培地からのＭＳＰの免疫沈降を示している図９に示す。８５ＫＤａバンドは単量体ＭＳＰ（ｐｒｏ−ＭＳＰ）を表し、５５ＫＤａバンドは、二量体（活性）ＭＳＰのα鎖を表す。
【０１０２】
実施例５  Ｒａｙｂｉｏ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＡｒｒａｙによるＣＭ組成分析
ＨＬＳＣおよびＭＳＣ  ＣＭ由来の５０７個のヒト標的タンパク質の発現レベルを同時に検出した。タンパク質アレイプロトコールにおいて記載したとおり０.２％ＦＣＳを添加したαＭＥＭの存在下で１×１０6細胞の４８時間培養後にＣＭを回収した。分子のパネルは、細胞培養上清中のサイトカイン、ケモカイン、アディポカイン、増殖因子、血管新生因子、プロテアーゼ、可溶性受容体、可溶性接着分子、および他のタンパク質を含んでいた。
【０１０３】
材料および方法
ＣＭの調製。ＨＬＳＣおよびＭＳＣ  ＣＭを調製するために、１００ｍｍ組織培養皿中に細胞を１皿につき１×１０6細胞の密度でプレーティングした。次いで、完全培養培地を用いて細胞を２４〜４８時間培養した。その後、培地を低血清（０,２％ＦＣＳ）培地と取り換え、次いで、細胞をさらにもう１回４８時間培養した。ＣＭを回収し、１０００ｇで遠心分離した。ビオチン標識工程前に両方の細胞型由来のＣＭを透析した。単純なプロセスを介して、試料中のタンパク質の一級アミンをビオチン化し、次いで、透析して遊離ビオチンを除去した。ここから、アレイ膜上に新しくビオチン化した試料を添加し、室温でインキュベートした。ＨＲＰ−ストレプトアビジンと一緒にインキュベートした後、化学ルミネッセンスによりシグナルを可視化した。このアレイにおいて、ビオチン標識および抗体アレイを含むプロセス全体をモニターするために内部対照を使用した。ＲａｙＢｉｏ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙの解析のために特別の設計されたプログラムであるＲａｙＢｉｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌを用いて結果を解析した。このアッセイのさらなる詳細は、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｉ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌに見ることができる。
【０１０４】
図１０は、ＨＬＳＣ（Ａ）およびＭＳＣ−由来の上清（Ｂ）からのＲａｙＢｉｏ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌベースヒトアレイマップを示す。
【０１０５】
ＲａｙＢｉｏ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙアッセイの完全な結果は下記表９に集約される。
【０１０６】
【表９−１】
0005632833.tif 000010
【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【０１０７】
２.５以上のＨＬＳＣ／ＭＳＣ比に基づいて、合計２５個のタンパク質をＣＭの活性に寄与する可能性が最も高いものであると同定した。このようなタンパク質は、表９において灰色の行で表示されている。
【０１０８】
実施例６  インビボＦＨＦモデルに対するＨＬＳＣ−およびＨＬＳＣ−ＣＭ処置の効果の比較
急性毒性致死性肝炎のＤ−ガラクトサミン／エンドトキシンインビボモデル
ガラクトサミンの肝毒性作用の根底にあるメカニズムは、肝臓ＵＴＰの欠乏を引き起こす肝臓におけるＵＤＰ−ガラクトサミン誘導体の高い蓄積に起因して起こる。その結果、巨大分子（ＲＮＡ、タンパク質、糖タンパク質、グリコーゲンなど）の生合成が停止する。これらの変化は、この反応の広範段階で血液中の肝臓酵素の増加および組織学によって同定され得る最終的な細胞損傷および細胞死を引き起こす。同時に、エンドトキシンが大規模な肝細胞アポトーシスを発症する腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）の生産を誘発した。本発明者らは、この致死性インビボ系の作用を研究するためにＳＣＩＤマウスにおけるこのインビボモデルを開発した。
【０１０９】
方法
動物および実験プロトコール。６〜７週齢の雄性ＳＣＩＤマウスを飲食自由の動物施設内で飼育した。これらの動物に、ＬＰＳ  ０.１２５μｇおよびＧａｌＮ  １８ｍｇを含有する生理食塩水５００μＬを腹腔内注射した。Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ注射の２時間後、これらのマウスに３０×１０6のＨＬＳＣを腹腔内注射した。
【０１１０】
ＳＣＩＤマウスの第２のグループに、ＬＰＳおよびＧａｌＮの注射と同時、３０分後および２時間後に生理食塩水中ＨＬＳＣの上清１ｍｌを腹腔内接種した。対照マウスには、ＬＰＳおよびＧａｌＮの混合物を注射した。
【０１１１】
Ｔ−フラスコ中でのＨＬＳＣからの上清の生成：  ＨＬＳＣからのＣＭ（ＣＭ−ＨＬＳＣ）の生成のために、細胞を６０％〜７０％の集密度に増殖させ（７５ｃｍ2フラスコ１個につき約２×１０6ＨＬＳＣ）、完全に洗浄し、０.０５％ヒト血清アルブミン（ＧＭＰ生産）を添加した無血清アルファＭＥＭ培地１０ｍＬ中にて培養した。２４時間後に馴化培地を回収し、３ｋＤａカットオフを有する限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して２５倍濃縮した
【０１１２】
組織学的分析：  Ｈ＆Ｅ染色、増殖（ＰＣＮＡ染色）およびタネル（アポトーシス細胞）により肝臓の壊死を分析した。
【０１１３】
ウエスタンブロット：  ＢＡＸおよびＢｃｌＸＳ／Ｌの検出のためにウエスタンブロットを行った。肝臓をホモジナイズし、溶解バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０μｍｏｌ／Ｌ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｍｏｌ／Ｌ  ロイペプチン、および１００Ｕ／ｍｌ  アプロチニン）中にて４℃で１時間溶解し、１５,０００ｇで遠心分離した。ブラッドフォード法によりＣＭのタンパク質含有量を測定した。肝臓溶解物のタンパク質２００μｇを含有するアリコートを還元条件下で１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースメンブランフィルターにエレクトロブロットした。２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ＋０.１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ）中５％脱脂乳でブロックした。次いで、該メンブランを適当な濃度の関連する一次抗体で４℃にて一夜イムノブロットした。ＴＢＳ−Ｔで何回も洗浄した後、該ブロットをペルオキシダーゼ結合アイソタイプ特異的二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ＥＣＬ検出試薬で１分間展開させ、Ｘ−Ｏｍａｔフィルムに暴露した。以下の抗体を使用した：  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの抗ＢＡＸモノクローナル抗体および抗ＢｃｌＸＳ／Ｌポリクローナル抗体。
【０１１４】
結果
エンドトキシン（ＬＰＳ）およびＧａｌＮを投与したマウスの致死率に対するＨＬＳＣの有益な効果の可能性を評価するために、６匹のマウスを使用して生存研究を行った。ＬＰＳ  ０,１２５μｇおよびＧａｌＮ  １８ｍｇならびに３０×１０6のＨＬＳＣを注射した動物の生存率％は７５％であった。ＬＰＳおよびＧａｌＮ  １８ｍｇの注射と同時、３０分後および２時間後に生理食塩水中ＨＬＳＣの濃縮上清１ｍｌを注射した動物の生存率％は７０％であった（ｎ＝１７）。ＨＬＳＣ注射の７日後に、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清中濃度は２７３Ｕ／Ｌから５７Ｕ／Ｌに低下し、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度は１６９３Ｕ／Ｌから２９１Ｕ／Ｌに低下した。ＣＭ−ＨＬＳＣ注射の６日後に、ＡＳＴの濃度は１６９３Ｕ／Ｌから１０００Ｕ／Ｌに低下した。
【０１１５】
ＨＬＳＣ注射の７日後の肝臓切片の組織学的分析は、アポトーシスおよび壊死のインデックスの低下を示した。
【０１１６】
上清処置の３日後および６日後の肝臓切片の組織学的分析は、アポトーシス（タネル）および壊死のインデックスの低下を示した。大規模な組織再生が観察された。これらの知見は、組織増殖インデックスの増加（ＰＣＮＡ染色）と相関していた。ウエスタンブロットにより、ＧａｌＮ／ＬＰＳだけで処置した動物においてはアポトーシス促進タンパク質ＢＡＸのアップレギュレーションがあり、異なる時点で濃縮上清でも処置した動物においてはダウンレギュレーションがあったことを示した。アポトーシス促進タンパク質ＢｃＬＸ／Ｌの発現の場合、濃縮上清で処置した動物においてはこのタンパク質のアップレギュレーションが見られ、ＧａｌＮ／ＬＰＳだけで処置した動物においては該発現のダウンレギュレーションが見られた。
【０１１７】
上記の結果を図１１〜１３に示す。
【０１１８】
図１１ａは、ＨＬＳＣを注射したＬＰＳ／ＧａｌＮ致死モデル（ｎ＝６）におけるマウスの生存率を示す。
【０１１９】
図１１ｂは、ＨＬＳＣ濃縮物を注射したＬＰＳ／ＧａｌＮ致死モデル（ｎ＝１７）におけるマウスの生存率を示す。
【０１２０】
図１２は、肝不全誘発（ＧａｌＮ／ＬＰＳ）の３日後および６日後にＴ−フラスコから精製したＨＬＳＣ由来ＣＭ濃縮物を注射したＧａｌＮ／ＬＰＳ処置ＳＣＩＤマウスのＨ＆ＥおよびＰＣＮＡ染色を示す。
【０１２１】
図１３は、アポトーシス肝細胞を評価するためのタネルアッセイの結果を示す。アポトーシス促進タンパク質ＢＡＸおよび抗アポトーシスタンパク質ＢｃｌＸの存在をウエスタンブロット分析により評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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