(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはペプチドに付着したＦ−１８金属錯体を含む、Ｆ−１８標識化タンパク質またはペプチドからなる、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の画像化剤であって、前記金属が、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテチウムおよびタリウムからなる群から選択される、画像化剤。
【請求項２】
前記タンパク質またはペプチドがキレート部分を含み、該キレート部分に前記Ｆ−１８金属錯体が付着している、請求項１に記載の画像化剤。
【請求項３】
前記キレート部分が、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）である、請求項２に記載の画像化剤。
【請求項４】
前記ペプチドが、ＩＭＰ４４９（ＮＯＴＡ−ＩＴＣベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の画像化剤。
【請求項５】
前記金属は、アルミニウムである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の画像化剤。
【請求項６】
前記Ｆ−１８標識化タンパク質またはペプチドは、水溶液中で安定である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の画像化剤。
【請求項７】
抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンストラクトを使用して関心部位に標的化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の画像化剤。
【請求項８】
二重特異性抗体を使用して関心部位に標的化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の画像化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２００７年１月１１日出願の米国暫定特許出願第６０／８８４，５２１号の利益を主張する。
本発明は、ある実施形態においては、生体内画像化に役立つ、ペプチドをＦ−１８で標識化する単純な方法に関する。Ｆ−１８標識化ペプチドの好ましい比活性度は、患者への投与時において１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌから２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。１００Ｃｉ／ｍｍｏｌから数万Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲にある比活性度も役立つ。好ましくは、Ｆ−１８標識化は、標識化ペプチドから非標識化ペプチドを分離するための精製ステップを必要とすることなく達成される。
【背景技術】
【０００２】
陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化は、高分解能およびＰＥＴ画像からの定量を提供する。ペプチドまたは他の小分子は、陽電子放出体、例を挙げると１８Ｆ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、９４ｍＴｃ、８６Ｙ、および１２４Ｉ等で標識化され得る。同位体の核から放出される陽電子は、使用される同位体に依存して異なるエネルギーをもって射出される。陽電子が電子と反応すると、２本の５１１ｋｅＶガンマ線が反対方向に放出される。射出された陽電子のエネルギーは、電子にぶつかることにより消滅する前に陽電子が移動する平均距離を左右する。射出エネルギーが高いほど、陽電子は電子との衝突の前により遠くまで移動する。ＰＥＴカメラにより画像化される２本の５１１ｋｅＶガンマ線を生成する前に陽電子が標的部位から移動する距離を最小化するためには、ＰＥＴ同位体の低い射出エネルギーが望ましい。陽電子を放出する多くの同位体は、その崩壊系列においてガンマ線、アルファ粒子またはベータ粒子等の他の放出も有する。いかなる線量測定の問題も最小化されるように、純粋な陽電子放出体であるＰＥＴ同位体を有することが望ましい。
【０００３】
同位体の半減期もまた重要であるが、これは、半減期が、同位体を標的分子に付着させ、生成物を分析し、患者に注入し、生成物を局在化させ、非標的組織からなくなり、次いで画像化するために十分長くなければならないからである。半減期が長すぎると、鮮明な画像のための十分な光子を得るのに比活性度が十分高くない可能性があり、半減期が短すぎると、製造、商業的流通および生体内分布に必要な時間が十分でない可能性がある。Ｆ−１８（β＋  ６３５ｋｅＶ  ９７％、ｔ１／２  １１０分）は、その低い陽電子放出エネルギー、サイドエミッションの欠如、および適切な半減期のために、最も広く使用されているＰＥＴ放出同位体の１つである。Ｆ−１８は、高い比活性度をもって生成される。Ｆ−１８が２−フルオロ−２−デオキシグルコース（ＦＤＧ）等の非常に吸収性の高い分子に付着された場合、比活性度はそれ程重要ではない。しかしながら、標識化ペプチドを有する受容体を標的としている、または免疫ＰＥＴ事前標的化試験を行っている場合、比活性度は重要である。
【０００４】
ペプチドの従来のＦ−１８標識化は、高い比活性度での試薬の標識化と、次いでＦ−１８標識化試薬のペプチドへの共役を含む。１つの例は、Ｐｏｅｔｈｋｏら（Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２００４；  ４５：  ８９２−９０２）の標識化方法であり、４−［１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒドをまず合成および精製し（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．  １９９０；  ＸＸＶＩＩＩ：  １１８９−１１９９）、次いでペプチドに共役させる。次いでペプチド複合体を、共役の完了を促進するために用いられた過剰のペプチドを除去するためにＨＰＬＣにより精製する。Ｆ−１８が長い半減期を有していれば２つの反応および精製は課題とはならない。しかしながら、Ｆ−１８の半減期はたった２時間であるため、Ｆ−１８をペプチドに付着させるために必要な操作のすべてが大きな負担となる。
【０００５】
これらの方法を行うのは面倒であり、標識化生成物を生成するために特別設計された機器の使用および／または専門化学者の努力を必要とする。それらは、臨床状況において日常的に使用され得るキット製剤ではない。
【発明の概要】
【０００６】
フッ化物は、事実上他のすべての元素に結合し、それらの結合の一部は比較的安定である。金属結合配位子を有するペプチドは、安定して、また非常に高い比活性度で放射性金属に結合することが知られている。本方法において利用される手法は、まずＦ−１８を金属に結合させ、次いでＦ−１８金属錯体をペプチド上の配位子にキレートすることであった。ここで、問題は、どの金属（またはホウ素等の他の元素）を選択するかということである。即座に文献を調べてみた結果、ＩＩＩＡ族元素（ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム）が第１の選択肢であった。
【０００７】
代替として、まず原子をペプチドに付着させ、次いでＦ−１８を加えることができる。第２の手法は、硼素フッ化物連結にはより有効となり得る。
【０００８】
フッ化アルミニウム錯体は、生体外で安定であることが報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９９；  ３８：  ４７６５−４６６０、Ａｎｔｏｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９２；  ２６７：  ６７１０−６７１８）。フッ化アルミニウムは、骨および歯のエナメル質に取り込まれるため、錯体は生体内でも安定となり得る（Ｌｉ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２００３；  １４：  １００−１１４）。
【０００９】
当業者は、送達分子と細胞または組織標的受容体との間の配位子−受容体結合相互作用に影響することなく修飾され得る誘導体化可能な基を含有している限り、画像化目的でＦ−１８を付着させるために実質上いかなる送達分子も使用可能であることを理解するであろう。以下の実施例はＦ−１８標識化ペプチド部分に関連するが、他の多くの種類の送達分子、例えばオリゴヌクレオチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子、抗血管新生因子、免疫賦活剤、タンパク質、核酸、抗体、抗体フラグメント、薬剤、インターロイキン、インターフェロン、オリゴ糖、多糖類、脂質等がＦ−１８標識化され、画像化目的に利用され得る。同様に、画像化され得る疾患または健康状態の種類は、その疾患または健康状態と関連した細胞または組織を標的とする送達分子の利用可能性によってのみ制限される。例えば、腫瘍の画像化の場合、腫瘍関連抗原に結合するいかなる抗体フラグメントも、Ｆ−１８標識化され、腫瘍の画像化に利用され得る。
【００１０】
以下のある実施例において、例示的なＦ−１８標識化ペプチドは、二重特異性または多重特異性抗体または抗体フラグメントを利用した事前標的化方法における標的化可能なコンストラクトとして、画像化目的に役立つことができる。この場合、抗体またはフラグメントは、腫瘍関連抗原、または、ウイルス、細菌、真菌または他の微生物等の病原生物により生成または露呈された抗原等の、疾患または健康状態と関連した標的に対する、１つ以上の結合部位を含む。第２の結合部位は、標的化可能なコンストラクトに特異的に結合する。二重特異性または多重特異性抗体を使用した事前標的化のための方法は、当技術分野において周知である（例えば、参照により本明細書に全体の内容が組み入れられる米国特許第６，９６２，７０２号を参照）。同様に、標的化可能なコンストラクトに結合する抗体またはそのフラグメントは、ＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）に結合する６７９モノクローナル抗体等、当技術分野において周知である（同上）。一般に、事前標的化方法では、まず二重特異性または多重特異性抗体を投与し、細胞または組織標的抗原に結合させる。結合していない抗体が循環からなくなるのに適正な時間経過した後、例えばＦ−１８標識化された標的化可能なコンストラクトを患者に投与し、標的細胞または組織に局在化した抗体に結合させ、次いで、例えばＰＥＴスキャンにより撮像される。
【００１１】
例示的な実施形態において、アスコルビン酸等の非ペプチド受容体標的化剤をＤＯＴＡに共役させ、次いで、例えば、ＤＯＴＡに結合するＦ−１８金属錯体で標識化することができる。そのような非ペプチド受容体標的化剤は、例えば、インテグリンαｖβ３受容体の非ペプチド拮抗薬であるＴＡ１３８（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  １４：１０５２−５６）を含み得る。Ｆ−１８金属錯体に対するＤＯＴＡ、ＮＯＴＡまたは他のキレート剤に共役され得る当技術分野において知られた類似の非ペプチド標的化剤を、請求される方法において利用することができる。ソマトスタチン受容体標的化剤Ｉｎ−ＤＴＰＡオクトレオチド（ＴＹＣＯ（登録商標））等、他の受容体標的化剤も当技術分野において知られている。後述するように、Ｆ−１８−インジウム錯体は、潜在的にＤＴＰＡを使用してキレートされ、画像化目的に使用され得る。金属キレートを使用した受容体標的化画像化の他の方法が、当技術分野で知られており、請求される方法の実践において利用され得る（例えば、Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８８：１−６；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  Ｃｈｅｍ．  ３９：１３６１−７１を参照）。
【００１２】
ＰＥＴスキャンによるＦ−１８画像化のための画像化技術および装置もまた当技術分野において周知であり（例えば、米国特許第６，３５８，４８９号、第６，９５３，５６７号、Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２１  ：９１１−９１９，  １９９４、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５５：５３２３−５３２９，  １９９５、Ｚａｌｕｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．，  ３３：５７５−５８２，  １９９２を参照）、そのような既知のＰＥＴ画像化技術または装置のいずれも利用可能である。
【００１３】
以下の図は、本発明の具体的な実施形態を例示することを意図し、請求される対象の範囲を制限することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１１０℃で１５分間加熱された後、逆相ＨＰＬＣにより分析されたＦ−１８＋ＩＭＰ２７２＋ＡｌＣｌ３。
【図２】１１０℃で１５分間加熱された後、逆相ＨＰＬＣにより分析されたＦ−１８＋過剰ＩＭＰ２７２＋ＡｌＣｌ３。
【図３】室温で９０分間のＰＢＳ中でのリン酸塩チャレンジ。１１０℃で１５分間加熱され、逆相ＨＰＬＣにより分析されたＦ−１８＋過剰ＩＭＰ２７２＋ＡｌＣｌ３のアリコート。
【図４】Ｈ２Ｏ中のＡｌ−１８Ｆ  ＩＭＰ２７２の安定性、逆相ＨＰＬＣ。ＨＬＢカラム精製直後のＦ−１８標識化ＩＭＰ２７２。
【図５】蒸留水中、２５℃で４０分後の精製されたＦ−１８標識化ＩＭＰ２７２。
【図６】免疫反応性試験に使用されたＡｌ−１８Ｆ  ＩＭＰ２７２粗反応混合物の逆相ＨＰＬＣ。
【図７】Ａｌ−１８Ｆ  ＩＭＰ２７２の免疫反応活性、サイズ排除ＨＰＬＣ、Ｆ−１８  Ａｌ  ＩＭＰ２７２粗反応混合物  ＳＥＣ  ７９％収率。
【図８】Ｆ−１８  Ａｌ  ＩＭＰ２７２粗反応混合物  ＳＥＣ＋ｈＭＮ−１４×７３４  ８１％収率
【図９】Ｆ−１８  Ａｌ  ＩＭＰ２７２粗反応混合物  ＳＥＣ＋ｈＭＮ−１４×６７９  ７８％収率
【図１０】Ｆ−１８によるＩＭＰ２７２の標識化、他の金属に結合、逆相ＨＰＬＣ。冷インジウムによるＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化。
【図１１】冷ガリウムによるＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化。
【図１２】冷ジルコニウムによるＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化。
【図１３】冷ルテチウムによるＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化。
【図１４】冷イットリウムによるＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化。
【図１５】水中のＡｌ−１８Ｆ  ＩＭＰ３７５の安定性、逆相ＨＰＬＣ。水中のＦ−１８  ＩＭＰ３７５、粗標識化ペプチド（９７．５％）。
【図１６】水中、２５℃で５時間後のＦ−１８  ＩＭＰ３７５（９５．４％）
【図１７】ヒト血清中、２５℃でのＡｌ−１８Ｆ  ＩＭＰ３７５の安定性、逆相ＨＰＬＣ。ヒト血清中約４．５分Ｆ−１８  ＩＭＰ３７５（８３．５％）。
【図１８】ヒト血清中１．５時間Ｆ−１８  ＩＭＰ３７５（０％）
【図１９Ａ】ヒト血清中における、インキュベーションからゼロ時間後のＦ−１８標識化ＩＭＰ４４９の安定性。
【図１９Ｂ】ヒト血清中における、インキュベーションから１時間後のＦ−１８標識化ＩＭＰ４４９の安定性。
【図１９Ｃ】ヒト血清中における、インキュベーションから２時間後のＦ−１８標識化ＩＭＰ４４９の安定性。
【図１９Ｄ】ヒト血清中における、インキュベーションから４時間後のＦ−１８標識化ＩＭＰ４４９の安定性。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の説明において、数多くの用語が使用され、以下の定義は、本明細書における開示の理解を容易とするために提供される。明示的に定義されていない用語は、それらの明白な通常の意味に従い使用される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、単数形は、１つ以上の項目を意味し得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「および」および「または」という用語は、接続語または離接語のいずれかを意味するように使用され得る。つまり、両方の用語は、特に指定されない限り、「および／または」と等しいものとして理解されたい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「約」は、ある数のプラスまたはマイナス１０パーセント以内を意味する。例えば、「約１００」は、９０と１１０の間の任意の数を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、２個から１００個の間のアミノ酸残基長、より好ましくは２個から１０個の間、より好ましくは２個から６個のアミノ酸長の自然発生的または非自然発生的アミノ酸のいかなる配列をも指す。「アミノ酸」は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣体であることができる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「病原体」という用語は、真菌、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、猫白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルスおよびブルータングウイルス等）、寄生虫ならびに細菌（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチア、レジオネラ・ニューモフィリア、ストレプトコッカス・ピオゲネス、大腸菌、ナイセリア・ゴノレー、ナイセリア・メニンギティディス、肺炎球菌、ヘモフィリスインフルエンザＢ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、結核菌およびクロストリジウム・テタニ等）を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
標的化可能なコンストラクトペプチド
ある実施形態においては、Ｆ−１８標識化部分は、ペプチドまたは他の標的化可能なコンストラクトを含み得る。そのような標的化可能なコンストラクトは、多様な構造のものとなり得、十分な免疫応答を顕現させるためだけでなく、事前標的化方法および二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体内で使用される場合は、速やかな生体内除去のために選択される。強力な免疫応答を顕現させるためには疎水性物質が最も良く、一方、速やかな生体内除去のためには親水性物質が好ましい。したがって、疎水性および親水性の間の特性のバランスが確立される。これは、部分的には、親水性キレート剤を使用して多くの有機部分の本質的な疎水性を相殺することにより達成され得る。また、例えば、いくつかは疎水性、いくつかは親水性であるアミノ酸を含有するペプチド等、反対の溶液特性を有する標的化可能なコンストラクトのサブユニットを選択することができる。ペプチドとは別に、炭水化物が使用され得る。
【００２２】
わずか２個のアミノ酸残基を有する、好ましくは、２個から１０個の残基を有するペプチドが使用され得、またキレート剤等の他の部分に連結され得る。リンカーは、キレート内に金属イオンを含む、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する、低分子量複合体であるべきである。より一般的には、抗原ペプチドは、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号１）等、４個以上の残基を有し、ここで、ＤＯＴＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧは、ヒスタミンスクシニルグリシン基である。代替として、ＤＯＴＡは、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）部分で置き換えられ得る。
【００２３】
標的化可能なコンストラクトはまた、生体内でのペプチドの安定性を増加させるために、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸を骨格構造に含み得る。代替の実施形態において、非天然アミノ酸およびペプトイドから構築されるもの等の他の骨格構造を含み得る。
【００２４】
免疫原として使用されるペプチドは、固相支持体および反復垂直型脱保護および連結の標準的技術を使用した、自動ペプチド合成器上で簡便に合成される。後にキレート共役に使用されるペプチドにおける遊離アミノ残基は、Ｂｏｃ基等の標準的な保護基で有利にブロックされ、一方Ｎ−末端残基は、血清安定性を増加させるためにアセチル化される。そのような保護基は、当業者に知られる。Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  １９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ｂｓＡｂ系内での後の使用のためにペプチドが調製されたら、それらは、生体内でのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、樹脂から有利に開裂されて対応するＣ−末端アミドを生成する。
【００２５】
免疫原のハプテンは、免疫原性認識部分、例えば化学ハプテンを含む。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを使用して、抗体に対するリンカーの高い特異性が発現される。これは、ＨＳＧハプテンに対し惹起される抗体が知られており、適切な二重特異性抗体に容易に組み込むことができるためである。したがって、付着したヘプタンとのリンカーの結合は、抗体または抗体フラグメントに対し極めて特異的となる。
【００２６】
キレート部分
一部の実施形態においては、Ｆ−１８標識化分子は、金属イオンに結合することができ、また速やかな生体内除去を確実とすることを補助し得る、１つ以上の親水性キレート部分を含み得る。キレート剤は、その特定の金属結合特性により選択することができ、または容易に交換可能である。
【００２７】
特に有用な金属−キレートの組み合わせは、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体である。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）等の大環状キレート剤もまた、潜在的にＦ−１８共役のリガンドとして使用され得る様々な金属とともに用いられる。
【００２８】
配位子がカルボキシレートまたはアミン基等の硬い塩基のキレート官能基を含む、ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型キレート剤は、硬い酸のカチオン、特にＩＩａ群およびＩＩＩａ群金属カチオンのキレート化に最も効果的である。そのような金属−キレート錯体は、対象となる金属に対し環サイズを調整することにより非常に安定化させることができる。大環状ポリエーテル等の他の環型キレート剤は、安定して核種を結合させるための関心対象である。ポルフィリンキレート剤は、数多くの金属錯体と使用することができる。１種類を超えるキレート剤を担体に共役させて複数の金属イオンを結合させることができる。米国特許第５，７５３，２０６号に記載されているもの等のキレート剤、特にチオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニル−アセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤が、柔らかい塩基のリガンドに強固に結合するＴｃ、Ｒｅ、Ｂｉおよび他の遷移金属、ランタニド、ならびにアクチニドの柔らかい酸のカチオンを結合させるために有利に使用される。１種類を超えるキレート剤をペプチドに連結させることが有用となり得る。ｄｉ−ＤＴＰＡハプテンに対する抗体が知られており（Ｂａｒｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２５６，３９５号）、また容易に標的抗体に連結されてｂｓＡｂを形成するので、事前標的化プロトコルにおいてＦ−１８錯体を結合させるために、ペプチドハプテンを冷ｄｉＤＴＰＡキレート剤および他のキレート剤とともに使用することが可能である。そのようなペプチドの一例は、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号２）である。ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ等の他の硬い酸のキレート剤は、ＤＴＰＡおよび／またはＴｓｃｇ−Ｃｙｓ基と置換可能であり、それらに特異的なＭａｂを、抗−ｄｉ−ＤＴＰＡ  Ｍａｂを生成するために使用されるものと類似した技術を使用して生成することができる。
【００２９】
他の有用なキレート剤は、例えばＣｈｏｎｇら（Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｍｏｄａｌ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，電子出版１２−７−０７，参照により本明細書に組み入れられる）に開示される、ＮＯＴＡ型部分を含み得る。Ｃｈｏｎｇらは、ＮＯＴＡ構造に基づく二官能性Ｃ−ＮＥＴＡ配位子の生成および使用を開示しており、これは１７７Ｌｕまたは２０５／２０６Ｂｉで錯化されると最長１４日間の血清中での安定性を示した。
【００３０】
カチオンの異なるサイズ、キレート環の配置、およびカチオンの好ましい錯イオン構造に起因して、２つの異なる硬い酸または柔らかい酸のカチオンに選択的に結合させるために、例えば異なるキレート環サイズを有する２つの異なる硬い酸または柔らかい酸のキレート剤を、標的化可能なコンストラクトに組み込むことが可能であることが理解される。これにより、その一方または両方がＦ−１８に付着し得る２つの異なる金属が、事前標的化ｂｓＡｂによる最終的な捕獲のために標的化可能なコンストラクトに組み込まれることが可能となる。
【００３１】
投与方法
様々な実施形態において、二重特異性抗体および標的化可能なコンストラクトは、正常または疾患組織および器官の画像化に使用され得る（例えば、米国特許第６，１２６，９１６、６，０７７，４９９号、第６，０１０，６８０号、第５，７７６，０９５号、第５，７７６，０９４号、第５，７７６，０９３号、第５，７７２，９８１号、第５，７５３，２０６号、第５，７４６，９９６号、第５，６９７，９０２号、第５，３２８，６７９号、第５，１２８，１１９号、第５，１０１，８２７号、および第４，７３５，２１０号を参照）。
【００３２】
ｂｓＡｂおよびＦ−１８標識化された標的化可能なコンストラクトの投与は、標的化可能なコンストラクトの投与の所定時間前にｂｓＡｂを投与することにより行うことができる。試薬の用量およびタイミングは、当業者により容易に考案され得、使用される試薬特定の性質に依存する。最初にｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ´）２誘導体が与えられる場合、標的化可能なコンストラクトの投与前２４〜７２時間の待機時間が適切である。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ｂｓＡｂ複合体が主要な標的ベクターである場合、標的化可能なコンストラクトの投与前、３〜１０日の範囲のより長い待機期間が必要である。ｂｓＡｂが疾患組織に標的化するのに十分な時間が経過した後、Ｆ−１８標識化された標的化可能なコンストラクトを投与する。標的化可能なコンストラクトの投与に続いて、画像化を行うことができる。
【００３３】
ある実施形態は、米国仮特許出願第６０／２２０，７８２号に記載のような、少なくとも３つの異なる標的結合部位を有する多価標的結合タンパク質の使用に関する。多価標的結合タンパク質は、化学リンカーを介していくつかのＦａｂ様フラグメントを架橋することにより作製されている。米国特許第５，２６２，５２４号、第５，０９１，５４２号およびＬａｎｄｓｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６：  ６７９−８３（１９８６）を参照されたい。多価標的結合タンパク質はまた、いくつかの単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合させて単一ポリペプチドを形成することにより作製されている。米国特許第５，８９２，０２０号を参照されたい。基本的にｓｃＦｖ分子の凝集体である多価標的結合タンパク質は、米国特許第６，０２５，１６５号および第５，８３７，２４２号に開示されている。３つのｓｃＦｖ分子を備える三価標的結合タンパク質は、Ｋｒｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １０（４）：  ４２３−４３３（１９９７）に記載されている。
【００３４】
ｂｓＡｂと標的化可能なコンストラクトの投与の間に与えられる除去剤が使用され得る。新規な機構的作用の除去剤、すなわち、ｂｓＡｂの疾患標的アームに対し標的化されたグリコシル化抗イディオタイプＦａｂ´フラグメントを使用することができる。一実施例において、抗ＣＥＡ（ＭＮ  １４  Ａｂ）×抗ペプチドｂｓＡｂが与えられ、疾患標的において最大限まで増大される。残留ｂｓＡｂを除去するために、ＷＩ２と称されるＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂが、好ましくはグリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして与えられる。キレート剤は一価としてｂｓＡｂに結合し、一方その付加されたグリコシル残基は錯体全体を肝臓に誘導し、そこで急速な代謝が行われる。次いで患者にＦ−１８標識化された標的化可能なコンストラクトを与える。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２  Ａｂは、高い親和性を有し、その除去機構は、ＷＩ２−Ｆａｂ’は一価部分であるため架橋を含まないことから、他の開示された機構（Ｇｏｏｄｗｉｎら、同書）と異なる。
【００３５】
抗体の惹起方法
ペプチド骨格に対するＡｂは、Ａｂ生成の周知の方法により生成され得る。例えば、免疫正常動物に対する、完全フロイントアジュバント中の（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（式中、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンであり、ｎ＝１〜３０である）等の免疫原の注射、次いで、不完全フロイントアジュバント中に懸濁した同じ免疫原の続く２回の注射を、脾臓細胞収集により、抗原のｉ．ｖ．ブーストの３日後に行う。次いで収集された脾臓細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させ、得られたクローンの培養上清を、直接結合ＥＬＩＳＡを使用して抗ペプチド反応性について分析する。生成されたＡｂの特異性は、元の免疫原のペプチドフラグメントを使用して分析することができる。これらのフラグメントは、自動ペプチド合成器を使用して容易に調製することができる。Ａｂ生成のために、酵素欠乏ハイブリドーマを単離して融合細胞系の選択を可能とする。この技術は、標的化可能なコンストラクトを含む１つ以上のキレート、例えばＩｎ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡキレートに対する抗体を惹起するためにも使用可能である。Ｉｎ（ＩＩＩ）−ｄｉ−ＤＴＰＡに対するモノクローナルマウス抗体が知られている（Ｂａｒｂｅｔ’３９５、上記参照）。
【００３６】
使用される標的抗体は、マーカー物質として、様々な細胞表面または細胞内腫瘍関連抗原に特異的となり得る。これらのマーカーは、腫瘍により生成される物質であることができ、あるいは、腫瘍細胞表面上、または細胞質、核もしくは様々な細胞小器官、または下位細胞組織内に関わらず、腫瘍細胞内の腫瘍部位に蓄積する物質であることができる。そのような腫瘍関連マーカーには、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，  “Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，  ｉｎ  Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｄ．，  “Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，  ｐａｇｅ  ３４７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  １９７９）および米国特許第４，１５０，１４９号、第４，３６１，５４４号、および第４，４４４，７４４号により開示されるものがある。
【００３７】
腫瘍関連マーカーは、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ（同上）により、腫瘍胎児抗原、胎盤抗原、発癌性または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモンおよび正常抗原またはその変異体を含む、数多くのカテゴリーに分類されている。時折、より高い腫瘍特異性を有する抗体を惹起するために、米国特許第４，３６１，６４４号および第４，４４４，７４４号に開示されるような、非腫瘍物質に対する交差反応性が大きく低減された抗体の生成を刺激する、腫瘍関連マーカーのサブユニット、例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のベータサブユニットまたは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のガンマ領域等が有利に使用される。
【００３８】
関心対象となる他のマーカーは、膜透過性活性化因子およびＣＡＭＬ−相互作用因子（ＴＡＣＩ）である。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １  ：２５２−２５６（２０００）を参照されたい。簡潔には、ＴＡＣＩはＢ細胞悪性腫瘍（例えばリンパ腫等）のマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子ホモログ−増殖含有配位子（ＡＰＲＩＬ）により結合されることが知られている。ＡＰＲＩＬは、原発性Ｂ細胞およびＴ細胞の生体外増殖を刺激し、生体内でのＢ細胞の蓄積により脾臓重量を増加させる。ＡＰＲＩＬはまた、受容体結合に関しＴＡＬＬ−Ｉ（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも称される）と競合する。可溶性ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩは、特異的にＡＰＲＩＬの結合を防止し、原発性Ｂ細胞のＡＰＲＩＬ刺激増殖を阻止する。ＢＣＭＡ−Ｆｃはまた、マウスにおけるキーホールリンペットヘモシアニンおよびＰｎｅｕｍｏｖａｘに対する抗体の生成を阻害し、これは、液性免疫の生成には、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介したＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−Ｉシグナリングが必要であることを示唆している。したがって、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−ＩおよびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩは、ＢおよびＴ細胞機能の刺激に関与する２配位子−２受容体経路を形成する。
【００３９】
悪性疾患、循環器疾患、感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、または神経疾患等の様々な疾患または健康状態の画像化のための使用における例示的な標的抗原は、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、Ｉｉ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓｌ００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ−１、壊死抗原、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、またはこれらの抗原の組み合わせを含み得る。特に、抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、テネイシン、上皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、血管内皮増殖因子受容体、ガングリオシド、ＨＥＲ／２ｎｅｕ受容体およびこれらの抗原の組み合わせを含み得る。
【００４０】
免疫原に対する抗体の最初の惹起後、抗体を配列決定し、続いて組み換え技術により調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域を、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖からヒト可変ドメインに導入し、次いでマウス相当物のフレームワーク領域においてヒト残基を置換することにより生成される。ヒト化モノクローナル抗体から得られる抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性と関連した潜在的問題を排除する。マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般的技術は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：  ３８３３（１９８９）の出版物により説明されている。ヒト化Ｍａｂの生成のための技術は、例えば、それぞれ参照することによりその全体が組み入れられる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１  ：  ５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：  ３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  １５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  ４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １２：  ４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．，  １５０：  ２８４４（１９９３）により説明されている。
【００４１】
代替として、形質転換非ヒト動物から完全なヒト抗体を得ることができる。例えば、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １５：  １４６−１５６（１９９７）、米国特許第５，６３３，４２５号を参照されたい。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有する形質転換マウスからヒト抗体を回収することができる。マウスの液性免疫システムは、内因性免疫グロブリン遺伝子を不活性化してヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は極めて複雑であり、合わせてヒトゲノムのほぼ０．２％を占有する多数の不連続セグメントを備える。形質転換マウスが適正なレパートリーの抗体を生成可能であることを確実とするために、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖細胞系列構成におけるヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から始まる、段階的プロセスで達成される。各挿入は、サイズが約１Ｍｂであるため、ＹＡＣの構築には、免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組み換えが必要である。１つは重鎖遺伝子座を含有し、１つは軽鎖遺伝子座を含有する２つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストのマウス胚幹細胞との融合を介して別個にマウスに導入する。次いで、胚幹細胞クローンを、マウス胚盤胞に微量注入する。得られるキメラのオスを、その生殖細胞系列を通してＹＡＣを透過させる能力に関してスクリーニングし、マウス抗体生成に欠陥をもつマウスで繁殖させる。一方はヒト重鎖遺伝子座を含有し、他方はヒト軽鎖遺伝子座を含有する２つの形質転換系の繁殖は、免疫化に応じてヒト抗体を生成する後代を形成する。
【００４２】
再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子もまた、微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ）を介してマウス胚幹細胞に導入することができる。例えば、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６：  １３３（１９９７）を参照されたい。この手順において、ヒト染色体を含有する微小細胞がマウス胚幹細胞と融合される。導入された染色体は安定に維持され、成体キメラは適切な組織特異的発現を呈する。
【００４３】
代替として、抗体または抗体フラグメントを、組み換え免疫グロブリンライブラリから単離されたヒト抗体フラグメントから得ることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＥＴＨＯＤＳ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：  １１９（１９９１）、およびＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １２：  ４３３（１９９４）を参照されたい。Ｂ細胞不死化によるモノクローナル抗体の生成に関連した困難性の多くは、ファージ提示法を使用した大腸菌における抗体フラグメントの操作および発現により克服することができる。
【００４４】
高親和性ｓｃＦｖを得るために、類似の戦略を使用することができる。例えば、Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １４：  ３０９−３１４（１９９６）を参照されたい。大きなレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリを、すべて既知のＶＨ、ＶｋａｐｐａおよびＶ８０遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを使用して、非免疫化ヒトドナーからＶ遺伝子を単離することにより構築することができる。増幅後、ＶｋａｐｐａおよびＶｌａｍｂｄａプールを組み合わせて１つのプールを形成する。これらのフラグメントは、ファージミドベクターに連結される。次いで、ｓｃＦｖリンカー、（Ｇｌｙ４，Ｓｅｒ）３が、ＶＬフラグメント上流のファージミドに連結される。ＶＨおよびリンカー−ＶＬフラグメントは、増幅され、ＪＨ領域でアセンブルされる。得られるＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントは、ファージミドベクターに連結される。ファージミドライブラリは、上述のように、フィルタを使用して、またはイムノチューブ（ＮＵＮＣ（登録商標）、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標））を使用してパニングすることができる。免疫化されたウサギのリンパ球または脾臓細胞から組み合わせ免疫グロブリンライブラリを構築することにより、またＰ．パストリスにおいてｓｃＦｖコンストラクトを発現させることにより、類似の結果を達成し得る。例えば、Ｒｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １３：  ２５５−  ２６０（１９９５）を参照されたい。さらに、適切なｓｃＦｖの単離後、より高い結合親和性およびより遅い解離速度を有する抗体フラグメントを、ＣＤＲ３突然変異生成およびチェーンシャフリング等の親和性成熟プロセスにより得ることができる。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ７８：  １８１−１８８（１９９８）、Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２：  １８１−１９６（１９９６）を参照されたい。
【００４５】
抗体フラグメントの他の形態は、単一ＣＤＲのペプチドコーディングである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象となる抗体のＣＤＲを符号化する遺伝子を構築することにより得られる。そのような遺伝子は、例えば、抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６（１９９１）；  Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，  “Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，  Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）を参照されたい。
【００４６】
ｂｓＡｂは、当技術分野で知られた技術により調製することができ、例えば、抗ＣＥＡ腫瘍Ａｂおよび抗ペプチドＡｂはともに、ペプシンによりそれぞれのＦ（ａｂ’）２フラグメントに別個に消化される。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）２は、システインにより還元されてＦａｂ’モノマー単位を生成し、これはさらに架橋剤ビス（マレイミド）ヘキサンと反応してＦａｂ’−マレイミド部分を生成する。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２は、システインにより還元され、精製され回収された抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨは、抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’−マレイミドと反応してＦａｂ’×Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを生成する。代替として、抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨフラグメントは、抗ＣＥＡ  Ｆ（ａｂ’）２と連結してＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’コンストラクトを生成し得るか、または抗ＣＥＡ  ＩｇＧと連結してＩｇＧ×Ｆａｂ’二重特異性コンストラクトを生成し得る。一実施形態においては、ＩｇＧ×Ｆａｂ’コンストラクトは、過ヨウ素酸塩酸化され、続いて市販のヒドラジド−マレイミド架橋剤との反応により活性されている抗ＣＥＡ  ＩｇＧ重鎖炭水化物に抗ペプチドＦａｂ’チオール基を付着させることにより、部位特異的に調製され得る。使用される成分Ａｂは、既知の技術によりキメラ化またはヒト化することができる。キメラ抗体は、げっ歯類抗体から得られる可変ドメインおよび相補性決定領域を含有する、組み換えタンパク質であり、抗体分子の残りは、ヒト抗体から得られる。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および軽鎖からヒト可変ドメインに導入された組み換えタンパク質である。
【００４７】
キメラＡｂは、マウスの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを符号化するｃＤＮＡフラグメントを、ヒト抗体からのＣドメインを符号化するフラグメントに連結することにより構築される。Ｃドメインは抗原結合には寄与しないため、キメラ抗体は元のマウスＡｂと同じ抗原特異性を維持するが、配列においてヒト抗体により近い。しかしながら、キメラＡｂはまだいくつかのマウス配列を含有し、まだ免疫原性であり得る。ヒト化Ａｂは、抗原を認識するために必要なそれらのマウスアミノ酸のみを含有する。この生成物は、ヒト抗体フレームワーク内に、マウス相補性決定領域からアミノ酸を組み込むことにより構築される。
【００４８】
ｂｓＡｂを生成するための他の最近の方法は、より一般的な免疫グロブリンイソタイプよりも強固に架橋するように追加的なシステイン残基を有する、操作された組み換えＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  １０：１２２１−１２２５，  １９９７を参照されたい。他の手法は、必要とされる二重特異性を有する２つ以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントセグメントを連結する、組み換え融合タンパク質を設計することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １５：１５９−１６３，  １９９７を参照されたい。分子工学を使用して、様々な二重特異性融合タンパク質を生成することができる。１つの形態において、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、１つの抗原に対する単一の結合部位を有するｓｃＦｖ、および第２の抗原に対する単一の結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。別の形態において、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原に対する２つの結合部位を有するＩｇＧ、および第２の抗原に対する２つの結合部位を有する２つのｓｃＦｖからなる。
【００４９】
ジアボディとも称される、機能性二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）は、組み換え方法を使用して哺乳類細胞において生成することができる。例えば、Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ９２：  ７０２１−７０２５，  １９９５を参照されたい。
【００５０】
好ましい二重特異性抗体はＭＡｂ  Ｍｕ９のＦｖおよびＭＡｂ６７９のＦｖまたはＭＡｂ  ＭＮ１４のＦｖおよびＭＡｂ６７９のＦｖ、ならびにそれらのヒト、キメラ化、またはヒト化相当物を組み込んだものである。ＭＮ１４、およびそのキメラ化およびヒト化相当物は、米国特許第５，８７４，５４０号に開示されている。また、Ｍｕ９または６７９のＣＤＲの１つ以上を組み込んだ二重特異性抗体も好ましい。抗体は、クラスＩＩＩ抗ＣＥＡ抗体および６７９のＦｖを組み込んだ融合タンパク質または二重特異性抗体であることができる。クラスＩＩＩ抗ＣＥＡを含むクラスＩＩＩ抗体は、米国特許第４，８１８，７０９号に詳細に記載されている。
【００５１】
ある実施形態においては、上述のｂｓＡｂ  Ｆ−１８標識化された標的化可能なコンストラクトは、米国特許第６，０９６，２８９号に記載のように、術中、血管内、および内視鏡的腫瘍および病変検出、生検、ならびに治療において使用することができる。
【００５２】
（実施例１）ペプチドＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化
使用した第１のペプチドは、以下のＩＭＰ２７２であった。
ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２
ＭＨ＋  １５１２
【００５３】
酢酸塩緩衝溶液−酢酸１．５０９ｇを水約１６０ｍＬに希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨの添加によりｐＨを調節し、次いで２５０ｍＬに希釈してｐＨ４．０３の０．１Ｍ溶液を得た。
【００５４】
酢酸アルミニウム緩衝溶液−ＡｌＣｌ３六水和物０．１０２８ｇを脱イオン水４２．６ｍＬに溶解することにより、アルミニウムの溶液を調製した。アルミニウム溶液の４ｍＬアリコートを、ｐＨ４の０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ溶液１６ｍＬと混合し、２ｍＭ  Ａｌ原液を得た。
【００５５】
ＩＭＰ２７２酢酸塩緩衝溶液−ペプチド、０．００１１ｇ、７．２８×１０−７モルＩＭＰ２７２を０．１Ｍ、ｐＨ４の酢酸塩緩衝溶液３６４μＬに溶解し、ペプチドの２ｍＭ原液を得た。
【００５６】
ＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化−アルミニウム原液の３μＬアリコートをＲＥＡＣＴＩＶＩＡＬ（商標）に入れ、５０μＬのＦ−１８（未処理）および３μＬのＩＭＰ２７２溶液と混合した。加熱ブロック中で溶液を１１０℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣトレース（図１）は、９３％が遊離Ｆ−１８で、７％がペプチドに結合していることを示した。追加のＩＭＰ２７２溶液１０μＬを反応に加え、再び加熱して逆相ＨＰＬＣにより分析した（図２）。ＨＰＬＣトレースは、８％のＦ−１８が空隙容量にあり、活性の９２％がペプチドに付着していることを示した。ペプチド溶液の残りを、室温で約１時間１５０μＬ  ＰＢＳでインキュベートし、次いで逆相ＨＰＬＣにより検査した。ＨＰＬＣトレース（図３）は、５８％のＦ−１８が結合しておらず、４２％がまだペプチドに付着していることを示した。データは、Ｆ−１８−Ａｌ−ＤＴＰＡ錯体がリン酸塩との混合に不安定である可能性があることを示している。
【００５７】
逆相ＨＰＬＣ−逆相ＨＰＬＣ分析は、以下の条件下で行った。
カラム：ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＸＴＥＲＲＡ（商標）ＭＳ  Ｃ１８  ５μｍ、４．６×２５０ｍｍ
流量：１ｍＬ／分
勾配緩衝液：緩衝液Ｃ、脱イオン水中０．１％ＮＨ４ＯＡｃ（酢酸アンモニウム）、緩衝液Ｄ、９０％アセトニトリル、１０％水および０．１％ＮＨ４ＯＡｃ（酢酸アンモニウム）
勾配：１００％緩衝液Ｃから１００％緩衝液Ｄまで、３０分にわたる直線勾配を使用
実行時間：３０分
【００５８】
サイズ排除ＨＰＬＣ−以下の条件下でサイズ排除ＨＰＬＣを行った。
カラム：ＢＩＯＲＡＤ（登録商標）ＢＩＯ−ＳＩＬ（商標）ＳＥＣ２５０、３００×７．８ｍｍ
勾配：定組成
溶離緩衝液：０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ６．８
流量：１ｍＬ／分
実行時間：３０分
【００５９】
本明細書において図示されるすべてのトレースは、Ｆ−１８の放出を監視するためにＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ（登録商標）６１０Ｔｒを使用した放射トレースである。表１〜３は、それぞれ、図１〜３に示されたデータを表形式で示したものである。
【００６０】
【表１】
0005646701.tif 000002
【００６１】
【表２】
0005646701.tif 000003
【００６２】
【表３】
0005646701.tif 000004
【００６３】
標識化ペプチド溶液を１ｃｃ（３０ｍｇ）ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラム（部品番号１８６００１８７９）に導入し、水３００μＬで洗浄して結合していないＦ−１８を除去することにより標識化ペプチドを精製した。２×１００μＬ  １：１  ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏでカラムを洗浄することによりペプチドを溶離した。精製したペプチドを水中で２５℃でインキュベートし、逆相ＨＰＬＣにより分析した（図４、図５）。ＨＰＬＣ分析は、Ｆ−１８標識化ＩＭＰ２７２が水中では不安定であることを示していた（図４、図５）。図４と図５を比較すると、水中での４０分のインキュベーション後、約１７％のＦ−１８がペプチドから解放されることが示される。
【００６４】
（実施例２）Ｆ−１８  ＩＭＰ２７２の免疫反応活性
ペプチド（１６μＬ  ２ｍＭ  ＩＭＰ２７２、４８μｇ）をＦ−１８で標識化し、抗体結合についてサイズ排除ＨＰＬＣで分析した（放射トレース、図６から図９）。サイズ排除ＨＰＬＣは、ペプチドｈＭＮ−１４×６７９に結合したが、無関係な二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×７３４には結合しなかったことを示した（図８対図９）。
【００６５】
（実施例３）他の金属でのＩＭＰ２７２  Ｆ−１８標識
金属原液（６×１０−９モル）の約３μＬアリコートをポリプロピレン製円錐型バイアルに入れ、７５μＬのＦ−１８（未処理）と混合し、室温で約２分間インキュベートし、次いで、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ  （酢酸アンモニウム）ｐＨ４緩衝液中の２ｍＭ（４×１０−８ｍｏｌ）ＩＭＰ２７２溶液２０μＬと混合した。加熱ブロック中で溶液を１１０℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。インジウム（図１０）、ガリウム（図１１）、ジルコニウム（図１２）、ルテチウム（図１３）、およびイットリウム（図１４）でのＩＭＰ２７２の標識化について結果を示す。
【００６６】
（実施例４）Ａｌ−１８Ｆ結合のための他のペプチドのスクリーニングに使用される標準的Ｆ−１８ペプチド標識化条件
２ｍＭアルミニウム原液の３μＬアリコートをポリプロピレン製円錐型バイアルに入れ、５０μＬのＦ−１８（未処理）と混合し、室温で約２分間インキュベートし、次いで０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（酢酸アンモニウム）ｐＨ４緩衝液中の２ｍＭペプチド溶液１６〜２０μＬと混合した。加熱ブロック中で溶液を１１０℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣ（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（商標）、ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）、５μ、Ｃ−１８、１１０Ａ、２５０×４．６ｍｍ  ＨＰＬＣカラム）により分析した。
【００６７】
被験ペプチド
ＩＭＰ２７２  ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５１２
【化１】
0005646701.tif 000005
【００６８】
ＩＭＰ２８８  ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４５３
【化２】
0005646701.tif 000006
【００６９】
ＩＭＰ３２６  ＤＴＰＡ−ＩＴＣ−ＮＨ−ＮＨ−Ｐｈｅ−ＣＯ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４７７
【化３】
0005646701.tif 000007
【００７０】
ＩＭＰ３２９  デフェロキサミン−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−ＮＨ−Ｐｈ−ＣＯ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １８０４
【化４】
0005646701.tif 000008
【００７１】
ＩＭＰ３３１  ＮＴＡ−ｉＡｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １２４０
【化５】
0005646701.tif 000009
【００７２】
ＩＭＰ３３２  ＥＤＴＡＤｐｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−ＤＬｓｙ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １３２７
【化６】
0005646701.tif 000010
【００７３】
ＩＭＰ３３３  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １８４５
【化７】
0005646701.tif 000011
【００７４】
ＩＭＰ３３４（Ｈ２Ｏ３Ｐ）２−Ｃ（ＯＨ）−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｄ−ＬｙＳ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−ＬｙＳ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １１９２
【化８】
0005646701.tif 000012
【００７５】
ＩＭＰ３３７  Ａｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １２９１
【００７６】
ＩＭＰ３３８  Ａｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １１２６
【００７７】
ＩＭＰ３４５  ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４５９
【００７８】
ＩＭＰ３４９  ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｃｙｓ（（Ｈ２Ｏ３Ｐ）２−ＣＨ−ＣＨ２−Ｓ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５８３
【化９】
0005646701.tif 000013
【００７９】
ＩＭＰ３６１  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（ＢｒＣＨ２ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４９８
【００８０】
ＩＭＰ３６６  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｐｈ−Ｓ−ＣＨ２ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５２８
【００８１】
ＩＭＰ３６８  Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １２９２
【化１０】
0005646701.tif 000014
【００８２】
ＩＭＰ３６９  Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｂｒ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ２−ＣＯＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５１７
【００８３】
ＩＭＰ３７０  Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｏ２Ｎ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ２−ＣＯ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４８４
【００８４】
ＩＭＰ３７１  ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｏ２Ｎ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ２−ＣＯ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４８４
【００８５】
ＩＭＰ３７２  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｓｅｒ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＤＡｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４６５
【００８６】
ＩＭＰ３７３  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １７５３
【００８７】
ＩＭＰ３７４  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｃｌ−ＣＨ２ＣＯ−Ｃｙｓ（Ｅｔ）−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５８５
【００８８】
ＩＭＰ３７５  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−Ｂｒ−Ｐｈｅ−ＣＨＮＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １６０３
【化１１】
0005646701.tif 000015
【００８９】
ＩＭＰ３７６  ＤＴＰＡ−Ｃｙｓ（ＨＯ３Ｓ−Ｓ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５５８
【００９０】
ＩＭＰ３７９  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４９７
【００９１】
ＩＭＰ３８２  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｈ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １３７８
【００９２】
ＩＭＰ３８３  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｇｌａ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５０７
【００９３】
ＩＭＰ３８４  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−ＨＯ−Ｐｈｅ−ＣＨＮＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５４１
【化１２】
0005646701.tif 000016
【００９４】
ＩＭＰ３８５  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｄｐｒ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＤＡｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４６４
【００９５】
ＩＭＰ３８６  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−ピリジル−ＣＨ２−ＣＨＮＨ２−ＣＯ−）−ＤＡｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５２６
【化１３】
0005646701.tif 000017
【００９６】
ＩＭＰ３８７  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｄ−９−アンスリルアラニン）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １６２５
【００９７】
ＩＭＰ３８９  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−カルボキシピペリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４９０
【化１４】
0005646701.tif 000018
【００９８】
ペプチド標識化スクリーニング試験の結果
ＤＴＰＡ誘導体のほとんどは、ＩＭＰ２７２の標識化に匹敵する標識化を示した。例外があり、システイン側鎖にビスホスホネート基を有するＩＭＰ３４９は非常に標識化に乏しかった。ＤＯＴＡ配位子はＡｌ−１８Ｆに結合しなかった。ＩＭＰ３２６のＩＴＣ  ＤＴＰＡ配位子は、ＤＴＰＡと同様に、Ａｌ−１８Ｆに結合しなかった。ＩＭＰ３３１のＮＴＡ配位子は、Ａｌ−１８Ｆに結合しなかった。ＩＭＰ３３２のＥＤＴＡ配位子は、ＤＴＰＡとは異なり、Ａｌ−１８Ｆに結合した。対称ＤＴＰＡ配位子はＡｌ−１８Ｆに結合しなかった。試験されたホスホネートおよびホスフェート基は、試験された条件下ではＡｌ−１８Ｆに良好に結合しなかった。スクリーニングは、ＤＴＰＡの近くに付着した基が、Ａｌ−１８Ｆ−ＤＴＰＡ錯体の安定性に影響し得ることを示した。スクリーニングは、ＩＭＰ３７５がより良好に標識化され、ＩＭＰ２７２よりも著しく安定な錯体を形成することを示した。ＩＭＰ３７５は良好に標識化され、水中で安定であった（図１５、図１６）が、生体内での使用のためには血清安定性が改善されなければならない（図１７、図１８）。
【００９９】
ペプチド標識化スクリーニング試験は、Ａｌ−１８Ｆの結合のみを考慮した。Ａｌ−１８Ｆで良好に標識化されなかった一部のペプチドは、Ｆ−１８に結合する他の金属でより良好に標識化される可能性がある。
【０１００】
ペプチド合成
Ｆｍｏｃ戦略を使用した固相ペプチド合成によりペプチドを合成した。差別的脱保護を可能とするために、Ｆｍｏｃ／Ａｌｏｃ保護基を使用してジアミノアミノ酸の側鎖に基を付加した。Ａｌｏｃ基は、Ｄａｎｇｌｅｓら（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８７，  ５２：４９８４−４９９３）の方法により除去したが、ただし、使用した酢酸にピペリジンを１：１の比で添加した。非対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを、ＭｃＢｒｉｄｅら（米国特許出願公開番号ＵＳ２００５／０００２９４５  Ａ１、出願番号第１０／７７６，４７０号、公開日２００５年１月６日）に記載のように作製した。トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ、対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡおよびＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡは、ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＳ（登録商標）から得た。Ａｌｏｃ／ＦｍｏｃリシンおよびＤａｐ（ジアミノプロピオン酸誘導体（Ｄｐｒとも））は、ＣＲＥＯＳＡＬＵＳ（登録商標）またはＢＡＣＨＥＭ（登録商標）から得た。Ｓｉｅｂｅｒ  Ａｍｉｄｅ樹脂は、ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）から得た。残りのＦｍｏｃアミノ酸は、ＣＲＥＯＳＡＬＵＳ（登録商標）、ＢＡＣＨＥＭ（登録商標）、ＰＥＰＴＥＣＨ（登録商標）またはＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）から得た。
【０１０１】
ＩＭＰ２７２は、記載の通り（ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許出願公開番号２００４０２４１１５８  Ａ１、出願番号第１０／７６８，７０７号、２００４年１２月２日）合成した。ＩＭＰ２８８は、記載の通り（ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．，  ２００６，  ４７：１６７８−１６８８）作製した。
【０１０２】
ＩＭＰ３２６  ヒドラジンペプチド（ＩＭＰ３１９）は、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨおよび４−（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＮＨ−）Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈをこの順番で使用して作製した。４−（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＮＨ−）Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈは、Ｂｏｃジカーボネートをジオキサン水酸化ナトリウム溶液中の４−ヒドラジノ安息香酸に添加することにより作製した。
【０１０３】
Ｂｏｃ−ヒドラジドの添加後、側鎖Ａｌｏｃ基を除去し、リシンの側鎖にトリチル−ＨＳＧ−ＯＨ基を付加した。次いでペプチドをＴＦＡで樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣで精製して所望のヒドラジンビス−ＨＳＧペプチドＩＭＰ３１９（ＭＨ＋  １２０１）を得た。次いで、ヒドラジドペプチド（０．０９１４ｇ）を、３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．２中のＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡ０．０６５０ｇと混合した。溶液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで調節し、ｐＨ８．２にｐＨを維持した。ペプチドとＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡとの間の反応が完了した後、ペプチド複合体をＨＰＬＣで精製した。
【０１０４】
ＩＭＰ３２９  メシル酸デフェロキサミン１．０４２２ｇ（１．５９×１０−３ｍｏｌ）を１：１メタノール／水１０ｍＬ中でチオカルボニルジイミダゾール０．２８３５ｇ（１．５９×１０−３ｍｏｌ）と混合することにより、デフェロキサミンイソチオシアネートを調製した。トリエチルアミン０．２３ｍＬを添加し、２．５時間後に反応物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、デフェロキサミンイソチオシアネートＭＮａ＋  ６２５を得た。
【０１０５】
ヒドラジンペプチド、ＩＭＰ３１９（０．０５３３ｇ、４．４×１０−５ｍｏｌ、ＭＨ＋  １２０１）を、リン酸ナトリウム緩衝液中で、デフェロキサミンイソチオシアネート０．０２９１ｇとｐＨ８．１で２時間混合し、次いでＨＰＬＣで精製して所望のＭＨ＋  １８０４を得た。
【０１０６】
ＩＭＰ３３１  以下のアミノ酸をＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）に、示された順番で付着させた。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＤＴｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨをリシンの側鎖に付加した。Ｆｍｏｃを除去し、次いでＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＢｕｔをこの順番で付加した（樹脂０．５ｇ）。Ｆｍｏｃを除去し、Ａｓｐの窒素を、ブロモ酢酸ｔ−ブチル３ｍＬおよびＮＭＰ３．４ｍＬ中ジイソプロピルエチルアミン３．６ｍＬで、一晩アルキル化した。次いでペプチドをＴＦＡで樹脂から開裂させ、逆相ＨＰＬＣで精製して所望のペプチドＭＨ＋  １２４０を得た。
【０１０７】
ＩＭＰ３３２  ペプチドをＳｉｅｂｅｒアミド樹脂３ｇ上で作製した（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）。以下のアミノ酸を、この順番で樹脂に添加した。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ。樹脂を後の合成のためにいくつかの部分に分割した。１グラムの樹脂を取り出し、ジアミノプロピオン酸からＦｍｏｃ基を除去した。ペプチドをブロモ酢酸ｔ−ブチル３ｍＬ、ジイソプロピルエチルアミン３．６ｍＬおよびＮＭＰ３．４ｍＬで一晩アルキル化した。次いで側鎖Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基を付加した。次いでペプチドを樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣで精製して生成物ＭＨ＋  １３２７を得た。
【０１０８】
ＩＭＰ３３３  ペプチドを、ＩＭＰ３３２の作製に使用された同じ樹脂１ｇで作製した。ＤＴＰＡテトラ−ｔ−ブチルエステル（米国特許公開番号第２００５０００２９４５号）を、Ｄｐｒ基の両方のアミンに添加した。次いでＡｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧＯＨを付加した。次いでペプチドを開裂させ、ＨＰＬＣで精製して所望の生成物ＭＨ＋  １８４５を得た。
【０１０９】
ＩＭＰ３３４  ペプチドを、Ｒｉｎｋアミド樹脂１ｇ上（０．７ｍｍｏｌ／ｇ）で以下のアミノ酸を示された順番で添加して作製した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｉｔｙｌ−ＨＳＧ−ＯＨを付加した。ペプチドをＴＦＡで樹脂から開裂させた。粗ペプチドをエーテルからの沈降により収集し、乾燥させた。過ヨウ素酸ナトリウム０．３３ｇを水１５ｍＬに溶解させた。粗ペプチドを１ｍＬの０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．６、３ｍＬの水および１ｍＬの過ヨウ素酸塩溶液に溶解させた。さらに３ｍＬの過ヨウ素酸塩を、１ミリリットルの増分で約２時間かけて添加した。次いで混合物を逆相ＨＰＬＣにより精製して凍結乾燥し、無水ＩＭＰ２８９  ＨＣＯ−ＣＯ−Ｄ−ＬｙＳ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  ９５９を得た。アレンドロン酸塩（０．０２９５ｇ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））を１５０μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４に溶解させた。ペプチド、ＩＭＰ２８９（０．０５００ｇ）を水中１３％イソプロパノール１００μＬに溶解させた。シアノボロ水素化ナトリウムを添加して混合物をＨＰＬＣで精製し、所望の生成物ＭＨ＋  １１９２を得た。
【０１１０】
ＩＭＰ３３７およびＩＭＰ３３８  ペプチドを、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、以下のアミノ酸を使用して示された順番で添加して作製した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、およびＡｃ２Ｏ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基をリシンの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣで精製して所望の生成物であるＩＭＰ３３７  ＭＨ＋  １２９１およびＩＭＰ３３８  ＭＨ＋  １１２６を得た。
【０１１１】
ＩＭＰ３４５  ペプチドを、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、以下のアミノ酸を使用して示された順番で添加して作製した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基をリシンの側鎖に付加した。次いでペプチドを樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣで精製して所望の生成物ＩＭＰ３４５  ＭＨ＋１４５９を得た。
【０１１２】
ＩＭＰ３４９  ペプチドＩＭＰ３４７  ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、以下のアミノ酸を使用して示された順番で添加して作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ、Ａｌｏｃを開裂、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加、Ａｌｏｃを開裂、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを添加。ペプチドを樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣで精製して所望の生成物ＩＭＰ３４７  ＭＨ＋１３９５を得た。ペプチド、ＩＭＰ３４７の０．０４４６ｇ（３．２×１０−５ｍｏｌ）を水３ｍＬの０．４６０５ｇ（２．４×１０−３ｍｏｌ）のエテニリデンビス（ホスホン酸）（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８６，  ５１  ：３４８８−３４９０）と混合し、１Ｍ  ＮａＯＨを滴下により添加して溶液をｐＨ６．５に調節した。反応物を一晩撹拌し、反応液を過剰のエテニリデンビス（ホスホン酸）の添加によりｐＨ１．４９に調節した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いでＨＰＬＣで精製して所望のペプチドＩＭＰ３４９  ＭＨ＋  １５８３を得た。
【０１１３】
ＩＭＰ３６１  ペプチドを、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、以下のアミノ酸を使用して示された順番で添加して作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ、Ａｌｏｃを開裂、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加、Ａｌｏｃを開裂、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨおよびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを添加。Ｄａｐの側鎖上のＡｌｏｃを除去し、ブロモアセチルをブロモ酢酸無水物と添加した。粗生成物をＨＰＬＣで精製して所望のペプチドＩＭＰ３６１（ＭＨ＋  １４９８）を得た。
【０１１４】
ＩＭＰ３６６  ペプチドを、ＩＭＰ３６１と同じ方法により、最後にフェニルチオ酢酸を添加して作製した。粗生成物をＨＰＬＣで精製し、生成物ＩＭＰ３６６  ＭＨ＋  １５２８を得た。
【０１１５】
ＩＭＰ３６８  ペプチドは、ＩＭＰ３４９について説明された通りであり、ただしシステイン残基は付加されず、非対称ＤＴＰＡの代わりに対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ（ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＳ（登録商標））を使用し、精製後に所望の生成物ＩＭＰ３６８  ＭＨ＋  １２９２を得た。
【０１１６】
ＩＭＰ３６９  ペプチドを、ＩＭＰ３４９について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸をＤ−Ｃｙｓの代わりに添加し、対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを非対称バージョンのＤＴＰＡテトラ−ｔ−ブチルエステルの代わりに添加した。粗ペプチドを精製して所望の生成物ＭＨ＋  １５１７を得た。
【０１１７】
ＩＭＰ３７０  ペプチドを、ＩＭＰ３６９について説明された通り作製したが、ただしＦｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸をブロモの代わりに使用した。ＨＰＬＣによる精製後に、所望の生成物ＭＨ＋  １４８４を得た。
【０１１８】
ＩＭＰ３７１  ペプチドを、ＩＭＰ３７０について説明された通り作製したが、非対称−ｔ−ブチルＤＴＰＡを対称バージョンの代わりに使用した。ＨＰＬＣによる精製後に、所望の生成物ＭＨ＋  １４８４を得た。
【０１１９】
ＩＭＰ３７２  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを使用してＳｅｒをＤａｐ側鎖に付着させた。Ｆｍｏｃを除去し、ペプチドを樹脂から開裂させて精製し、所望の生成物ＭＨ＋  １４６５を得た。
【０１２０】
ＩＭＰ３７３  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、対称テトラ−ｔ−ブチルエステルＤＴＰＡを使用してＳｙｍ−ＤＴＰＡをＤａｐ側鎖に付着させた。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １７５３を得た。
【０１２１】
ＩＭＰ３７４  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｓ−エチルシステインをＤａｐ側鎖に付加した後、クロロ酢酸無水物を介してクロロアセチル（システイン窒素上）を付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １５８５を得た。
【０１２２】
ＩＭＰ３７５  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸をＤａｐ側鎖に付加した後、Ｆｍｏｃ基を開裂させた。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １６０３を得た。
【０１２３】
ＩＭＰ３７６  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、第２のアラニンの後Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを付加した後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｈ）およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １５５８を得た。
【０１２４】
ＩＭＰ３７９  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｂｏｃ−２−Ａｂｚ−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １４９７を得た。
【０１２５】
ＩＭＰ３８２  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、ＡｌｏｃをＤａｐの側鎖から除去した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １３７８を得た。
【０１２６】
ＩＭＰ３８３  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯＢｕｔ）２−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋−ＣＯ２  １５０７を得た。
【０１２７】
ＩＭＰ３８４  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｂｏｃ−Ｓ−３−アミノ−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸をＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １５４１を得た。
【０１２８】
ＩＭＰ３８５  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １４６４を得た。
【０１２９】
ＩＭＰ３８６  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｂｏｃ−Ｄ−２−ピリジルアラニン−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １５２６を得た。
【０１３０】
ＩＭＰ３８７  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−９−アンスリルアラニン−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １６２５を得た。
【０１３１】
ＩＭＰ３８９  ペプチドを、ＩＭＰ３６１について説明された通り作製し、ビス−Ｂｏｃ−ピペラジン−２−カルボキシレートをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して所望の生成物ＭＨ＋  １６６４を得た。
【０１３２】
（実施例５）生体内試験
ＧＷ−３９ヒト結腸異種移植片腫瘍を有するヌードマウス（１００〜５００ｍｇ）に、二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×ｍ６７９（１．５×１０−１０ｍｏｌ）を注射した。抗体を、Ｆ−１８標識化ペプチド（８．８μＣｉ、１．５×１０−１１ｍｏｌ）の注射の前に、除去のために２４時間放置した。注射から３時間、２４時間および４８時間後に動物を撮像した。異種移植片腫瘍は、ｈＭＮ−１４の腫瘍抗原への結合により腫瘍に局在化した二重特異性ｈＭＮ−１４×ｍ６７９に結合したＦ−１８標識化ペプチドのＰＥＴスキャン検出により明確に画像化された。
【０１３３】
（実施例６）血清安定Ｆ−１８標識化ペプチドの生成および使用
ＩＭＰ４４９  ＮＯＴＡ−ＩＴＣベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４５９
【０１３４】
ペプチド、ＩＭＰ４４８  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １００９を、Ｓｉｅｂｅｒ  Ａｍｉｄｅ樹脂上で、以下のアミノ酸を示された順番で樹脂に添加することにより作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ、Ａｌｏｃを開裂、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ、Ａｌｏｃを開裂、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、最後にＦｍｏｃを開裂させて所望のペプチドを作製。次いでペプチドを樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣで精製してＩＭＰ４４８を生成し、次いでこれをＩＴＣ−ベンジルＮＯＴＡに連結させた。ペプチド、ＩＭＰ４４８の０．０７５７ｇ（７．５×１０−５ｍｏｌ）を０．０５０９ｇ（９．０９×１０−５ｍｏｌ）のＩＴＣベンジル  ＮＯＴＡと混合し、水１ｍＬに溶解させた。次いで、無水炭酸カリウム０．２１７１ｇを、撹拌したペプチド／ＮＯＴＡ溶液にゆっくりと添加した。すべての炭酸塩を添加した後、反応液はｐＨ１０．６であった。反応物を室温で一晩撹拌した。１４時間後反応を慎重に１Ｍ  ＨＣｌで停止し、ＨＰＬＣで精製して、４８ｍｇの所望の生成物ＩＭＰ４４９を得た。
【化１５】
0005646701.tif 000019
【０１３５】
ＩＭＰ４４９のＦ−１８標識化
ペプチド０．００２ｇ（１．３７×１０−６ｍｏｌ）を、６８６μＬ（２ｍＭペプチド溶液）の０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．０２に溶解した。ｐＨ４酢酸塩緩衝液中の２ｍＭ  Ａｌ溶液３マイクロリットルを、１５μＬ、１．３ｍＣｉのＦ−１８と混合した。次いで溶液を２０μＬの２ｍＭ  ＩＭＰ４４９溶液と混合し、１０５℃で１５分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析では、３５％（室温約１０分）の活性がペプチドに付着し、６５％の活性がカラムの空隙容量で溶出（３．１分）したことが示され、これは活性がペプチドとは関連していないことを示唆していた。粗標識化混合物（５μＬ）をプールヒト血清と混合し、３７℃でインキュベートした。１５分後にアリコートを取り出し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣは、活性の９．８％がまだペプチドに付着していることを示した（３５％から低下）。１時間後に別のアリコートを取り出し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣは、活性の７．６％がまだペプチドに付着していることを示し（３５％から低下）、これは本質的には１５分トレースと同じであった。
【０１３６】
高用量Ｆ−１８標識化
精製されたＩＭＰ４４９を用いたさらなる試験は、Ｆ−１８標識化ペプチドがヒト血清中３７℃で少なくとも１時間は極めて安定（９１％、図１９Ｂ）であり、ヒト血清中３７℃で少なくとも４時間は部分的に安定（７６％、図１９Ｄ）であることを実証した。これらの結果は、本明細書で開示されたＦ−１８標識化ペプチドが、Ｆ−１８画像化試験に使用する上で、近似的な生体内条件下で十分な安定性を示すことを示している。
【０１３７】
水約４００μＬ中のＦ−１８約２１ｍＣｉを、９μＬの０．１Ｍ  ｐＨ４  ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）中２ｍＭ  ＡｌＣｌ３と混合した。ペプチド、ＩＭＰ４４９の６０μＬ（０．０１Ｍ、０．５ＮａＯＨ  ｐＨ４．１３中６×１０−７ｍｏｌ）を添加し、溶液を１１０℃で１５分間加熱した。次いで、反応液を１ｃｃ  Ｗａｔｅｒｓ  ＨＬＢカラムのバレル内に入れて水で溶離して結合していないＦ−１８を除去し、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離して溶離液Ｆ−１８標識化ペプチドを除去することにより、粗標識化ペプチドを精製した。粗反応液をカラムに通して廃棄用バイアルに引き出し、カラムを水１ミリリットルのフラクションで３回洗浄した（１８．９７ｍＣｉ）。次いでＨＬＢカラムを新たなバイアル上に設置し、２回の２００μＬ  １：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離し、標識化ペプチド（１．８３ｍＣｉ）を収集した。溶離のすべてが完了した後、カラムは０．１ｍＣｉの活性を保持していた。精製されたＦ−１８標識化ペプチドのアリコート（２０μＬ）を、プールヒト血清２００μＬと混合し、３７℃で加熱した。アリコートを（上述の通り）逆相ＨＰＬＣで分析した。結果は、ヒト血清中での０時間（図１９Ａ）、１時間（図１９Ｂ、９１％標識化ペプチド）、２時間（図１９Ｃ、７７％標識化ペプチド）および４時間（図１９Ｄ、７６％標識化ペプチド）のインキュベーションのＦ−１８標識化された精製ＩＭＰ４４９の３７℃での相対安定性を示す。また、Ｆ−１８標識化ＩＭＰ４４９が、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの間時折使用されるＴＦＡ溶液中で安定であることが観察された。本明細書で説明された例示的なＦ−１８標識化分子について、ＴＦＡ中での安定性とヒト血清中での安定性との間に一般的な相関関係が見られると考えられる。
【図１】
0005646701.tif 000020
【図２】
0005646701.tif 000021
【図３】
0005646701.tif 000022
【図４】
0005646701.tif 000023
【図５】
0005646701.tif 000024
【図６】
0005646701.tif 000025
【図７】
0005646701.tif 000026
【図８】
0005646701.tif 000027
【図９】
0005646701.tif 000028
【図１０】
0005646701.tif 000029
【図１１】
0005646701.tif 000030
【図１２】
0005646701.tif 000031
【図１３】
0005646701.tif 000032
【図１４】
0005646701.tif 000033
【図１５】
0005646701.tif 000034
【図１６】
0005646701.tif 000035
【図１７】
0005646701.tif 000036
【図１８】
0005646701.tif 000037
【図１９Ａ】
0005646701.tif 000038
【図１９Ｂ】
0005646701.tif 000039
【図１９Ｃ】
0005646701.tif 000040
【図１９Ｄ】
0005646701.tif 000041
【配列表】
0005646701000001.app