(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光ビーム（２４）を発する照明ユニット（１２，１５）と、画像形成されるべき試料（４０）に細長い照明焦点（６２）を生成する対物レンズ（３４）と、上記照明光ビーム（２４）が上記対物レンズ（３４）の入射ひとみ（３６）に入射する入射方向を変更することによって、上記試料（４０）の照明されるべきターゲット領域にわたって上記照明焦点（６２）を動かす走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）と、を有する走査型顕微鏡において、
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）が、上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対し上記照明焦点（６２）を傾けるために、上記照明光ビーム（２４）を上記入射ひとみ（３６）の、ひとみ中心からずれた部分領域に向け、上記部分領域の範囲内で上記照明光ビーム（２４）の入射方向を変更し、それにより上記照明焦点（６２）を上記ターゲット領域にわたって動かし、上記ターゲット領域を照明するライトシート（４２）を生成することを特徴とする、走査型顕微鏡（１０）。
【請求項２】
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）が、照明焦点（６２）を動かすことによって形成されるライトシート（４２）を生成するために、上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対し平行にずれている入射平面の範囲内で照明光ビーム（２４）の入射方向を変更することを特徴とする、請求項１に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項３】
上記照明光ビーム（２４）が通過する上記入射ひとみ（３６）の部分領域が上記入射ひとみ（３６）の全範囲のほぼ０．１％〜５０％を占め、上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対する入射平面の平行ずれが上記入射ひとみ（３６）の半径のほぼ４〜９６％に等しいことを特徴とする、請求項２に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項４】
上記走査装置（２０，２２、２６，２８，３０，３８，５８）が、上記照明光ビーム（２４）のライトパスで上記照明ユニット（１２，１５）と上記対物レンズ（３４）の間に配置された光学ずらし要素（２０，２２，５８，５９）を備えて構成され、これによって上記照明光ビーム（２４）の入射平面が上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対し平行にずらされることを特徴とする、請求項２又は３に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項５】
上記光学ずらし要素（５９）がウェッジ形状に構成されていることを特徴とする、請求項４に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項６】
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）が、上記光学ずらし要素（２０，２２，５８，５９）を上記照明光ビーム（２４）のライトパスに導入し、また上記光学ずらし要素（２０，２２，５８，５９）を上記照明光ビーム（２４）のライトパスから取り去るための位置決め要素（３８，６０）を備えて構成されることを特徴とする、請求項４又は５に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項７】
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）が、上記照明ユニット（１２，１５）から発せられる上記照明光ビーム（２４）を上記入射ひとみ（３６）の、ひとみ中心からずれた部分領域に反射する少なくとも１つの可動ミラー（２６）を備えて構成され、さらに上記照明光ビーム（２４）の入射方向を変更するために上記ミラー（２６）を動かす駆動装置を備えて構成されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項８】
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）の上記ミラーが上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対してずれて配置されていることを特徴とする、請求項７に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項９】
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）が、上記照明ユニット（１２，１５）から発せられる上記照明光ビーム（２４）のビーム径を変更する光学ビーム調整要素であって、上記照明ユニット（１２，１５）と上記対物レンズ（３４）の間で上記照明光ビーム（２４）のライトパスに配置された光学ビーム調整要素を備えて構成されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項１０】
上記照明光ビーム（２４）が、上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）に入る前に互いに重ね合わされる励起光ビーム（１４）と逆励起光ビーム（１６）とから組み合わされていて、上記対物レンズ（３４）が、上記励起光ビーム（１４）から励起焦点（６４）を、上記逆励起光ビーム（１６）から逆励起焦点（６６）を生成し、これらが上記照明焦点（６２）を生じるために互いに重ね合わされていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項１１】
上記逆励起焦点（６６）が、ライトシート（４２）を生成するために励起焦点（６４）と逆励起焦点（６６）から組み合わされた上記照明焦点（６２）が動かされる平面（６８）にて最小値を有し、その平面（６８）の両側に夫々最大値を有する空間光度分布を有することを特徴とする、請求項１０に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項１２】
上記励起焦点（６４）に重ね合わされた上記逆励起焦点（６６）の空間強度分布を調整するために、上記逆励起光ビーム（１６）のライトパスに配置された位相板（１８）を有することを特徴とする、請求項１１に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項１３】
上記照明焦点（６２）が上記ターゲット領域にわたって動かされる走査期間の範囲内で上記照明光ビーム（２４）の強度を変更するための要素を有することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項１４】
傾いた照明焦点（６２）によって照らされたターゲット領域の、上記対物レンズ（３４）によって生成された画像を中間撮像するための第１の部分光学系（４６）と、上記第１の部分光学系（４６）によって生成された中間画像（４８）を、中間画像（４８）に対し平行に配置された検出表面（５４）上に画像形成するための第２の部分光学系（５０）とを有する検出光学系（４４）を設け、上記ターゲット領域の画像が、第１の部分光学系（４６）の光軸（Ｏ’）に対し傾斜して配置されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡（１０）。
【請求項１５】
試料（４０）を光学検鏡画像形成するための方法であって、
照明光ビーム（２４）を発するステップと、
対物レンズ（３４）によって画像形成されるべき試料（４０）に細長い照明焦点（６２）を生成するステップと、
走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）によって、上記照明光ビーム（２４）が上記対物レンズ（３４）の入射ひとみ（３６）に入射する入射方向が変更されることにより上記試料（４０）の照らされるべきターゲット領域にわたって上記照明焦点（６２）が動かされるステップと
を有する方法において、
上記走査装置（２０，２２，２６，２８，３０，３８，５８）によって、上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対して上記照明焦点（６２）を傾かせるために、上記照明光ビーム（２４）が上記入射ひとみ（３６）の、ひとみ中心からずれた部分領域に向けられ、その部分領域の範囲内で上記照明光ビーム（２４）の入射方向が変更され、それにより上記照明焦点（６２）が上記ターゲット領域にわたって動かされ、上記ターゲット領域を照明するライトシート（４２）が生成されることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
照明焦点（６２）を動かすことによって形成されるライトシート（４２）を生成するために、上記対物レンズ（３４）の光軸（Ｏ）に対し平行にずれた入射平面の範囲内で、上記照明光ビーム（２４）の入射方向が変更されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記照明光ビーム（２４）が励起光ビーム（１４）と逆励起光ビーム（１６）とから組み合わされ、励起焦点（６４）が上記励起光ビーム（１４）から生成され、逆励起焦点（６６）が上記逆励起光ビーム（１６）から生成され、これら両焦点は上記照明焦点（６２）を生じるために互いに重ね合わされることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ライトシート（４２）を生成するために上記励起焦点（６４）と上記逆励起焦点（６６）から組み合わされた上記照明焦点（６２）が動かされる平面（６８）にて最小値を有し、その平面（６８）の両側で夫々最大値を有するように、上記逆励起焦点（６６）の空間強度分布が調整されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記照明焦点（６２）が上記ターゲット領域にわたって動かされる走査期間の範囲内で上記照明光ビーム（２４）の強度が変更されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
上記励起光ビーム（１４）と上記逆励起光ビーム（１６）が交互に切り換えられて出し入れされることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、照明光ビームを発する照明ユニットと、画像形成されるべき試料に細長い照明焦点を生成する対物レンズと、照明光ビームが対物レンズの入射ひとみに入射する入射方向を変更することによって照明されるべき試料のターゲット領域にわたって照明焦点を動かす走査装置とを有した走査型顕微鏡に関する。本発明はさらに、光学顕微鏡を使用して試料を撮像／画像形成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば調査対象の試料を画像形成するため検出器によって感知される蛍光放射線を発するレーザ光で染料を励起する蛍光顕微鏡検査において使用される走査型顕微鏡は、従来技術から公知である。共焦点の走査型顕微鏡が、特に顕微鏡検査のこの部門において使用されており；在来の光顕微鏡と異なり、それは特定の時点で試料全体を照明せず、むしろ光スポットを、一般に試料が点毎に走査される回折制限された光スポットを生成する。個々の試料点において検出器によって感知された光信号は試料の全体の画像にまとめられる。
【０００３】
この種の共焦点顕微鏡は通常、照明ユニットによって搬送された照明光ビームを顕微鏡の対物レンズの入射ひとみに導く走査装置として所謂点スキャナを備える。顕微鏡の対物レンズは、その入射ひとみに入射する照明光ビームを、以下で「照明焦点」と称する集束した光分布に形作る。照明焦点の形とサイズは対物レンズの光学特性、特に開口数（開口率）に依存する。照明光ビームが中心にかつ垂直に、即ち、光軸に沿って、対物レンズの入射ひとみに入射するならば、対物レンズは細長い照明焦点（光軸に対し横向きの寸法が光軸に沿った寸法よりも短い）を生じる。そして照明焦点は、試料を走査するために、例えば可動ミラー装置として点スキャナが、対物レンズの入射ひとみに照明光ビームが入射する入射角を加減するという事実によって、光軸に対し横向きに動かされる。
【０００４】
したがって、共焦点顕微鏡により３次元撮像を実行するために、上記したように試料は逐一走査されなければならない。これは比較的複雑なので、文献において選択的平面照明顕微鏡検査（ＳＰＩＭ）と称された顕微鏡検査法が最近文献に提案された。この方法は、互いに９０度に配置された照明対物レンズ（illumination objective）と検出対物レンズ（detection objective）で実施される。照明対物レンズは、その前に配置された円柱レンズと協働して、照明対物レンズの光軸に沿って試料を通過するほぼ平坦な照明光分布を生じる。この種の光分布はしばしば「ライトシート（light sheet）」又は「ライトプレーン（light plane）」とも称される。このライトシートによって照らされた試料のターゲット領域は、光軸がライトシートに対し垂直である検出対物レンズによって、検出表面、例えばＣＣＤ上に画像形成される。照明するライトシートが画像形成されるべき試料の範囲内で動かされるならば、試料の層状の画像はこの配置で取得可能である。
【０００５】
可能な限り薄いライトシートを生じるために、照明対物レンズは対応して高い開口数を有さなければならず、検出対物レンズとの衝突を避けるために、照明対物レンズのクリアな作動距離が対応して大きくなければならない。したがって、照明対物レンズの開口数はライトシートの厚みを画定し、それゆえ検出対物レンズの光軸に沿った光学分割を画定する。
【０００６】
特許文献１に記載された修正ＳＰＩＭ法において、照明と検出は同じ対物レンズで起こる。このため、対物レンズの入射ひとみは中心をずれて不完全照明される。即ち、照明光ビームは、光軸に対し横向きにずれた入射ひとみの一部を通過する。対物レンズの前に配置された円柱レンズは試料に、対物レンズの光軸に対して傾いた照明するライトシートを生じる。そして、このライトシートによって照らされた試料のターゲット領域は対物レンズを通って画像形成される。
【０００７】
上記した装置は各々、試料の所望傾斜照明を達成するために、円柱レンズを有して作動する。しかしながら、そのような円柱レンズは不利な点を有する。例えば、それらの装置は専らライトシートを用いた傾斜照明のために設計され、それから逸脱する使用、例えば、逐一の共焦点走査をすることができない。また、傾斜照明のために生じたライトシートの光度（光の強さ）の空間分布を変更可能とすることも望ましいであろう。これは円柱レンズでは可能でない。
【０００８】
特許文献２は、照明焦点を傾けるために、対物レンズの入射ひとみの、ひとみ中心からずれた部分領域（Teilbereich、sub-region）に照明光ビームを向けた走査型顕微鏡を開示する。
【０００９】
特許文献３は、ライトシートがスキャナによって生成される顕微鏡を開示する。
追加文献として、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２が参照される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2010/012980 A1
【特許文献２】DE 10 2005 007 756 A1
【特許文献３】DE 10 2007 045 897 A1
【特許文献４】DE 10 2005 027 077 A1
【特許文献５】DE 44 16 558 C2
【特許文献６】US 5,952,668
【特許文献７】WO 2006/127692 A2
【特許文献８】DE 10 2006 021 317 B3
【特許文献９】WO 2007/128434 A1
【特許文献１０】US 2009/0135432 A1
【特許文献１１】DE 10 2008 024 568 A1
【特許文献１２】US 2008/0032414 A1
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】A. H. Voie等の「Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens」、Journal of Microscopy 170、２２９〜２３６（１９９３）
【非特許文献２】J. Huisken、J. Swoger、F. Del Bene、J. Wittbold、E. H. K. Stelzerの「Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy」、Science 305、１００７（２００４）
【非特許文献３】F. Fahrbach、A. Rohrbachの「Microscopy with non-diffracting beams」、FOM 2009、Cracow
【非特許文献４】C. Dunsbyの「Optically sectioned imaging by oblique plane mirror microscopy」、Optics Express １６巻、２５（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、画像形成されるべき試料のフレキシブルな照明を簡単に可能にする走査型顕微鏡、特に共焦点の走査型顕微鏡を記載することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はこの目的を、先に挙げた様式の走査型顕微鏡において、対物レンズの光軸に対して照明焦点を傾けるために、走査装置が照明光ビームを入射ひとみの、ひとみ中心からずれた部分領域に向け、上記部分領域の範囲内で照明光ビームの入射方向を変更し、それにより照明焦点を照明対象ターゲット領域にわたって動かし、上記ターゲット領域を照明するライトシートを生成することで、達成する。
【００１４】
本発明によって、一方で、ひとみ中心からずれた対物レンズの入射ひとみの部分領域に照明光ビームを向けることによって、照射光ビームで入射ひとみを中心ずれで不完全照明することがもたらされる。入射ひとみの不完全照明（Unterleuchtung、underillumination）、即ち、照射光ビームが入射ひとみの全範囲を通過せず、それゆえ全開口を利用しないことを引き起こす作用は、縦方向と横方向の両方で（先に細長くされた）照明焦点の拡張を生じる。さらに照明光ビームが入射ひとみに偏心して入射されるので、照明焦点は対物レンズの光軸に対して傾けられる。
【００１５】
このようにして拡張され傾けられた照明焦点は、ターゲット領域を照らすライトシートを連続して作り上げるのに用いられることができる。このために、対物レンズの入射ひとみにおいて照明光ビームの対応する走査動作をもたらす走査装置が用いられる。この走査動作は入射ひとみの領域に位置する傾き点回りの照明光ビームの傾動に対応する。これは、数学的観念におけるビームでなく光ビームの束である照明光ビームが入射ひとみの領域に（少なくとも殆ど）静止したままである一方、入射ひとみから離れたところで走査装置に向かう方向において光軸に対し平行に位置した基準方向に対して或る種の旋回運動を実施することを意味する。対物レンズは、照明光ビームのこの傾け動作又は旋回運動を、光軸に対し横向きの傾斜照明焦点の対応する動きに変換する。試料における照明焦点の動きの実際の大きさは、対物レンズの特定の構造に依存する。しかしながら、本発明にしたがって、走査装置によって生じる照明光ビームの傾動が試料のターゲット領域の範囲内で照明焦点を動かすのに用いられること、それゆえ、いわばターゲット領域を照らすライトシートを作り上げるのに用いられることが基本である。
【００１６】
ライトシートを生じるために円柱レンズで作動する従来技術で知られたアプローチと異なり、本発明に係る走査型顕微鏡で、ライトシートは走査期間内でターゲット領域にわたって照明焦点を動かすことによって走査装置を用いて連続して作り上げられる。それゆえ、ライトシートを生じるために、本発明に係る走査型顕微鏡は、現在の走査装置が作動可能である走査期間が通例用いられる光検出器の検出サイクルをかなり下回るように、該走査期間が短いことを利用する。ライトシート生成の場合にただ１本のライン（Ｘ方向あるいはＹ方向において）が生じるので、完全なライトシートのための全照明期間は、照明スキャナの、即ち、走査装置の走査速度（scan rate）に依存する。スキャナタイプに応じて、これは１Ｈｚから数十キロＨｚの範囲であり得る。したがって光検出器（主としてエリア検出器、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＡＰＤアレイ等）は、動く照明焦点を時間に関して、したがって空間に関して未定であると「見る」。代わりに、ライトシートの形態をした中断されていない光分布を見る。一例として、走査期間が検出時間よりも短いことが確実である場合、走査期間の値が十万分の数秒（a few hundredth of a millisecond）から１秒の範囲である一方、（検出器解像度に応じて、例えば５１２×５１２画素）全ライトシート面（entire light sheet plane）のための検出時間は例えば数ミリ秒と数秒の間である。
【００１７】
照明光ビームを動かす走査装置が少なくとも、在来の共焦点走査型顕微鏡に設けられるので、本発明は、照明するライトシートの特に効率的な生成を可能にする。異なった用途のために実質的に同じ顕微鏡の構成を提供することが特に可能である。例えば、ライトシートを用いて試料の傾斜照明を行う本発明にしたがった用途を実行するために、それ自体として標準的な構成の共焦点の走査型顕微鏡において、対物レンズの入射ひとみの中心をはずれた不完全照明が必要なだけである。これは例えば、照明光ビームのライトパス（light path）に導入される光学要素を用いて生じ得る。そして走査型顕微鏡が改めてポイント式照明で作動することが必要ならば、光学要素は単純に照明光ビームのライトパスから改めて取り除かれることが必要である。
【００１８】
本発明に係る走査型顕微鏡によって、試料の高解像度断面画像を取得することが可能となる。このために、試料はライトシートを用いて徐々に走査される。この走査は、対物レンズと試料を光軸に沿って相対的に動かすことによって、なされる。
【００１９】
走査装置は好ましくは、対物レンズの光軸に対し平行にずれた入射面の範囲内で照明焦点を動かすことによって形成されるライトシートを生成するために、照明光ビームの入射方向を変更する。入射ひとみが円形の形態であると仮定すると、前記入射面は、入射ひとみ上の平面図において、ひとみの周縁によって画定された円を、その円の中心点を横切ることなく、２つの異なる地点で横断する直線（割線のように）を形成する。上に規定された平面図において、照明光ビームはその割線に沿って傾き動作を実行する。対物レンズはこの傾き動作を、上記割線に対し平行に延びる直線に沿った照明焦点の対応する動きに変換する。ターゲット領域を照らすための所望のライトシートはそれによって簡単に生成可能である。
【００２０】
更なる有利な実施形態において、走査装置は照明ユニットと対物レンズの間で照明光ビームのライトパスに配置された光学ずらし要素を備えて構成され、この光学ずらし要素で、照明光ビームの入射面は対物レンズの光軸に対し平行にずらされる。この光学ずらし要素は例えばガラスウェッジ（glass wedge）、平行平面板（plane-parallel plate）、光学結晶若しくは光子結晶（photonic crystal）、空間光変調器（ＳＬＭ）、マイクロミラーアクチュエータ（デジタルマイクロミラーデバイス、ＤＭＤ）等である。代替的に、照明光ビームが入射ひとみに所望のように中心をはずれて入射するように、対物レンズの入射ひとみに対して走査装置を配置することも可能である。例えば絞りを用いて走査装置の前のライトパスにおいて一方の側に照明光ビームを調整して、入射ひとみの中心をはずれた所望の照明を達成することも可能である。更なる代替的な実施形態において、少なくとも既に走査型顕微鏡にある光学要素が所望のビームずれを生じるために使用可能である。例えば、走査型顕微鏡に通例あり照明光ビームを対物レンズに向かって通過させ試料から出る検出光を光検出器の方向に反射する取り出しビームスプリッタが、通例数ミリメートルの範囲である所望のビームずれ（例えば対応して被覆された）を生じさせるような厚みを有するガラス基板から構成可能である。
【００２１】
走査装置は好ましくは、光学ずらし要素を照明光ビームに導入し該光学要素を照明光ビームから取り去る位置決め要素を備えて構成される。そのような位置決め要素を用いて、光学ずらし要素は所望のように照明光ビーム路に導入され、あるいはそこから取り去られ、それによって例えば通例の共焦点照明と本発明に係る傾斜照明の間でライトシートを用いて切り替えられる。さらに、そのような位置決め要素を用いて、（例えばウェッジ形状の構成の）光学ずらし要素を照明光ビームのライトパスへ増分的に変位して、それによって対物レンズに関して照明光ビームの所望の中心ずれを生じさせることが可能である。
【００２２】
さらに好適な実施形態において、走査装置は、照明ユニットから発せられた照明光ビームのビーム径を変更する光学ビーム調整要素であって、照明ユニットと対物レンズの間で照明光ビームのライトパスに配置された光学ビーム調整要素を備えて構成される。必要により照明焦点の径を所望のようにするために、光学ビーム調整要素によって、照明光ビームのビーム径を、それゆえ対物レンズの入射ひとみの不完全照明を調整することが可能になる。しかしながら、代替的な実施形態も考えられる。例えば、共焦点の走査型顕微鏡はしばしば、照明ユニットによって送出される照明光ビームを拡張して、対物レンズの入射ひとみを完全に照明し、したがって最大限の開口を用いるために、ビーム拡張光学系を備えて構成される。そのような光学系が少なくとも走査型顕微鏡にあるならば、それは入射ひとみの本発明に係る不完全照明をもたらすためにビーム径を対応して減らすために用いることもできる。上に挙げた実施形態は勿論、単なる例示であると理解されるべきである。例えば、絞りや他の光学要素も所望のビーム径を確立するために使用可能である。
【００２３】
特に好適な実施形態において、照明光ビームは、走査装置に入る前に互いに重ね合わされる励起光ビームと逆励起光ビームとから組み合わされる。対応して、対物レンズは励起光ビームから励起焦点を生じ、逆励起光ビームから逆励起焦点を生じる。これらは照明焦点をもたらすために互いに重ね合わされる。蛍光顕微鏡の分野において、この種の逆励起光ビームは、例えば所謂ＳＴＥＤ法にしたがって、回折限界を超えて空間解像度（spatial resolution）を増すために使用可能である。ＳＴＥＤ法において、試料の個々の領域をマーキングするのに用いられる蛍光染料は、解像度の性能を増すために、逆励起光ビームによって制御されたように、且つそれ自体既知のように逆励起（エネルギー準位の低い方への遷移）され、それゆえ、いわばスイッチオフされる。本発明に係る走査型顕微鏡において、ＳＴＥＤ法を用いることによって、照明焦点の有効性は解像度を増すために狭めることが可能で、逆励起光ビームが励起光ビームに重ね合わされることによって、結果としてのライトシートはそれゆえ薄められ得る。走査装置に到達する前に逆励起光ビームが励起光ビームに重ね合わせられるので、互いに重ね合わされた２つの光ビームは対物レンズの入射ひとみにおいて走査装置によって一緒に傾けられる。
【００２４】
逆励起焦点は好ましくは、ライトシートを生成するために励起焦点と逆励起焦点から組み合わされた照明焦点が動かされる平面において最小値を有し、その平面の両側に夫々最大値を有する空間光度分布を有する。ＳＴＥＤ法の従来の適用で逆励起焦点が環状形状の断面を有するのに対して、ここで挙げられた実施形態は、断面（ライトシートを生成するために照明焦点が動かされる平面の上下）で２つの最大強度とこれら最大値の間に最小値を有した逆励起焦点を規定する。この断面強度の形は好ましくは、等しい大きさの２つの最大値とそれらの間に位置する最小値としてのゼロ点を有する相称的な形態である。
【００２５】
有利な実施形態は、ライトシートを生成するために照明焦点が動かされる平面においてＳＴＥＤ逆励起が必要でなく、実際に望ましくない事実を利用する。本発明に係るアプローチで、可能な最大範囲を有すると同時にできるだけ薄いライトシートを生成して、高い空間解像度の断面光学画像を取得する意図である。ここでライトシートの範囲は動く照明焦点の長さによって画定される一方、シート厚は、照明焦点が動く平面を横切る照明焦点の寸法によって画定される。上記した逆励起焦点は、縦の焦点寸法の方向でなく、横の焦点寸法の方向においてのみ励起焦点の励起有効性を増すように、明確に形作られる。
【００２６】
励起焦点上に重ね合わされる逆励起焦点を生成するために、例えば逆励起焦点の所望形状に合わせて逆励起光ビームの空間強度分布を調整する位相板が、逆励起光ビームのライトパスに配置される。逆励起焦点のこの所望形状は、逆励起焦点が環状の構成でなければならないＳＴＥＤ法の通例の適用での場合に比べて、単純な位相板の形状において、少ない技術的出費で、生成可能である。位相板は、逆励起ビームのライトパスに、好ましくは走査装置の前に配置される。しかしながら、対物レンズの入射ひとみの直前に、例えば対物レンズの前に配置された取り出しビームスプリッタ上に、形成することも可能である。対物レンズに直接、位相板を配置することも同様に可能である。
【００２７】
本発明に係る走査型顕微鏡は好ましくは、照明焦点がターゲット領域にわたって動かされる走査機関の範囲内で照明光ビームの強度を変更するための要素を含む。この構成は、ターゲット領域を照らすライトシートが動く照明焦点によって連続して広げられるという事実を利用する。それによってターゲット領域の調整された照明又は体系化された照明を実行することが可能である。このために、照明光ビームの強度は、照明焦点がターゲット領域を走査する走査期間の範囲内で変更される。それゆえ、照明光ビームの強度は、走査期間のいかなる時点でも、それゆえターゲット領域のいかなる位置でも所望のように調整可能である。音響光学式波長可変フィルタ（ＡＯＴＦ）、音響光学式変調器（ＡＯＭ）、電気光学式変調器（ＥＯＭ）が例えば走査期間の範囲内で照明光ビームの強度を変更する要素として使用可能である。
【００２８】
更なる好適な実施形態において、走査型顕微鏡は、傾いた照明焦点によって照らされたターゲット領域の、対物レンズによって生成された画像を中間撮像するための第１の部分光学系と、第１の部分光学系によって生成された中間画像を、中間画像に対し平行に配置された検出表面上に画像形成するための第２の部分光学系とを有する検出光学系を含む。ターゲット領域の画像は、第１の部分光学系の光軸に対し傾斜して配置されている。２つの部分光学系によって、傾斜した照明のもと、対物レンズによって画像形成されたターゲット領域の立ち上がり（Aufrichtung）が保証される。しかしながら、そのような画像の立ち上がりはまた、別のやり方で、例えば所謂シャインプルーフ（Scheimpflug）配置を用いて可能である。ＣＣＤ、ｓＣＭＯＳ、或いはＡＰＤアレイのような他のエリア検出器が例えば、ターゲット領域の立ち上がった画像を最後に生じる検出表面として使用可能である。
【００２９】
本発明の更なるアスペクトによれば、請求項１５の特徴を有した、試料の光学検鏡画像形成のための方法がもたらされる。
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、照明光ビームの強度は、照明焦点がターゲット領域にわたって動かされる走査期間の範囲内で変更される。特に、励起光ビームと逆励起光ビームを交互に切り換えて出し入れすること（Zuschaltung/Abschaltung）によって、異なる観察量を画像形成することが可能である。マイクロ秒程度で励起光ビームと逆励起光ビームが切り換えられて出し入れされるならば、例えば光検出器での適切な同期化によって異なる量が列毎に検出可能である（光検出器の検出表面が行と列で成り立っていると仮定して）。
【００３０】
本発明に係る方法が位置測定検鏡（localization microscopy）において使用可能であるのが有利である。切り換え可能な蛍光発光たんぱく質、ＡＴＴＯ、Alexa、ローダミン誘導体、フルオレセイン誘導体、ナノ結晶（nanocrystals）等のような蛍光染料が蛍光染料として適切である。傾いた照明を用いて、蛍光発光する成分は活性化され得るか、飽和状態に進められ得る。計量された照明（metered illumination）は、単分子検出が可能であることを保証する。蛍光染料の箇所は、検出光子の中心点を決定することによって決定可能である。
【００３１】
本発明に係る方法は、特に小動物撮像、例えば魚の蛍光撮像に役立って使用可能である。なぜならば、この場合に用いられる試料が容易に利用可能だからである。
本発明を、図面を参照して以下にさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】第１の実施例としての共焦点走査型顕微鏡を示す。
【図２】第２の実施例としての、図１の走査型顕微鏡と比較して部分修正した実施形態を示す。
【図３】第３の実施例としての、図２の走査型顕微鏡と比較して部分修正した実施形態を示す。
【図４】在来の共焦点走査型顕微鏡に用いられる、照明光ビームで対物レンズの入射ひとみを照明する様子を示した概念図である。
【図５】在来の共焦点走査型顕微鏡に用いられる、照明光ビームで走査する様子を示した概念図である。
【図６】照明光ビームで用いた入射ひとみの、本発明にかかる不完全照明をする様子を示した概念図である。
【図７】入射ひとみを不完全照明する照明光ビームを傾けることによって本発明に係る走査をする様子を示した概念図である。
【図８】励起焦点に照明焦点を本発明にしたがって重ね合わす様子を示した概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図１は、第１の実施例としての、共焦点走査型顕微鏡１０の概念図である。本発明のサブジェクトマターの理解にとって必須でない走査型顕微鏡１０の構成要素が図１の描写から省略されたことに留意されたい。
【００３４】
走査型顕微鏡１０は、それ自体公知のＳＴＥＤ法を用いて回折限界を超えた空間解像度を達成するよう設計された共焦点蛍光顕微鏡を構成する。したがって走査型顕微鏡１０は、第１レーザ光源（以下、励起光源という）１２、並びに第２レーザ光源（以下、逆励起光源という）１５を含んでいる。励起光源１２は、適用可能な検鏡方法に用いられる蛍光染料が蛍光放射線を発するよう刺激される波長が選択された励起光ビーム１４を発する。他方、逆励起（deexcitation）光源１５は、以下に記載するように励起光ビーム１４に重ね合わされることになる逆励起光ビーム１６を発する。逆励起光ビームの波長は、励起光ビームによって照らされた蛍光染料が刺激された放射によって逆励起されることになり、それによっていわばスイッチオフされるように、選択される。逆励起光源１５によって発せられた逆励起光ビーム１６は、逆励起光ビーム１６の所望の強度プロフィール（intensity profile）を確立するのに供せられる位相板１８を通過する。
【００３５】
励起光ビーム１４はミラー２０に入射し、ここでビームスプリッタ２２の方へ反射する。ビームスプリッタ２２は、励起光ビーム１４を通過可能とする一方で、入射する逆励起光ビーム１６を反射するように、形成される。このようにして、励起光ビーム１４と、位相板１８によって強度プロフィールの点で作用された逆励起光ビーム１６とは、互いに重なり合わされる。互いに重ね合わされた２つの光ビーム１４，１６から形成された光ビームは、以下、照明光ビーム２４と称される。
【００３６】
照明光ビーム２４は、図１でまったく概略的に描かれたガルバノミラー装置（galvano mirror arrangement）２６に当たる。ガルバノミラー装置は、照明光ビームが以下でさらに詳細に記載される走査動作を実行するように、照明光ビームを偏向するのに供される。そして照明光ビーム２４は走査レンズ２８、管レンズ（tube lens）３０、そしてビームスプリッタ３２を通過して、最後に対物レンズ３４に当たる。
【００３７】
図１に概略的に描かれた照明光ビーム路が表すように、対物レンズ３４に入る照明光ビーム２４は、対物レンズ３４の入射ひとみ（図１の符号３６を付した部分）を完全にくまなく照らすわけではない。これは、照明光ビーム２４が入射ひとみ３６の部分領域（Teilbereich, sub-region）のみを通過し、それゆえ対物レンズ３４の全開口（volle Apertur, full aperture）を用いるのではないことを意味する。さらに、対物レンズ３４に入る照明光ビーム２４は光軸（図１の符号Ｏを付した部分）に関しずれている（片寄り）。それゆえ、中心をずれて入射ひとみ３６を不完全照明するように、照明光ビーム２４は対物レンズ３４に導かれる。
【００３８】
照明光ビーム２４による入射ひとみ３６の中心をずれたこの不完全照明は、本実施例では、ガルバノミラー装置２６から反射する照明光ビーム２４が走査レンズ２８の縁領域に、光軸Ｏに対する平行ずれで入射することによって、達成される。この平行ずれの結果として、走査レンズ２８から出る照明光ビーム２８は先ず、光軸Ｏを横切り、そして管レンズ３０の縁領域（この縁領域は光が通過する走査レンズの縁領域とは光軸Ｏの反対側に位置している）に入射する。そして管レンズ３０から照明光ビーム２４は、光軸Ｏに対して平行にずれて、対物レンズ３４の入射ひとみ３６に入る。管レンズ３０は、照明光ビーム２４が光軸Ｏに対して平行にずれて対物レンズ３４の入射ひとみ３６に入射するように、照明光ビーム２４を偏向する。
【００３９】
図１に示された実施例において、ミラー２０とビームスプリッタ２２は、励起光ビーム１４と逆励起光ビーム１６から組み合わされた照明光ビーム２４がガルバノミラー装置２６に光軸Ｏに対して平行にずれて入射することを、既にもたらしている。この平行ずれは調整要素３８によって調整可能である。このため、調整要素３８はミラー２０とビームスプリッタ２２をユニットとして光軸Ｏを横切って変位する。
【００４０】
上で説明された構成要素２０，２２，２６，２８，３０及び３８は、以下で詳細に記載するように、対物レンズ３４の入射ひとみ３６において照明光ビーム２４を傾けるのに供される走査装置を構成する。対物レンズ３４は、入射ひとみ３６に入る照明光ビーム２４を、照明焦点（図１に図示せず）に形を変える。この照明焦点は、画像形成されるべき試料４０のターゲット領域にわたって走査装置の走査期間内で、照明光ビーム２４の傾き動作によって動かされる。照明焦点の動きによって、対物レンズ３４の入射ひとみ３６に照射光ビーム２４が中心をずれて入るために光軸Ｏに関して傾くライトシート（Lichtblatt）が生成される。このライトシートは図１の概略描写において符号４２で示されている。
【００４１】
そして、試料４０の、ライトシート４０で照らされたターゲット領域に由来する蛍光放射線は、対物レンズ３４によって捕捉される。蛍光放射線はビームスプリッタ３２で反射して、図１で符号４４として大まかに示された検出光学系の方へ進む。検出光学系４４は、２つの管レンズ４９，５１から構成された管レンズ系４７の後方に位置する第１検出用対物レンズ４６を含む。管レンズ４９が対物レンズ３４に付設されている一方、管レンズ５１は第１検出用対物レンズ４６に付設されている。管レンズ４９は、対物レンズ３４との相互作用において、第１の中間画像５３を生成する。第１検出用対物レンズ４６の光軸（図１で符号Ｏ’で示す）は、対物レンズ３４の光軸Ｏに対し垂直に延在する。ライトシート４２で照らされたターゲット領域は対物レンズ３４の光軸Ｏに関して傾いて配置されているので、第１の中間画像５３も第１検出用対物レンズ４６の光軸Ｏ’に関して傾斜して位置している。第１検出用対物レンズ４６は、管レンズ５１と相互作用して、第１の中間画像５３を、同様に光軸Ｏ’に関して傾いて配置された第２の中間画像４８に、画像形成する。
【００４２】
検出光学系４４はさらに、第２の中間画像４８を、管レンズ５２を介して光検出器５５の検出表面５４に画像形成する第２の検出用対物レンズ５０を含む。第２検出用対物レンズ５０の光軸（Ｏ”で示す）は第２の中間画像４８に対し垂直で、検出表面５４に対し垂直である。２つの検出用対物レンズ４６，５０の相互作用のため、ライトシート４２で照らされ、試料４０の傾いたターゲット領域のまっすぐな画像はしたがって、検出表面５４上に、おおむね収差なく、生成され得る。
【００４３】
試料４０の一連の高解像度断面画像を得るために、本実施例において、試料４０が載置された試料用スライド５６が光軸Ｏに沿って、あるいは光軸Ｏを横切って連続的に動かされる。試料４０の高解像度３次元画像がこのようにして作られ得る。
【００４４】
図２は、第２の実施例として、部分変更した実施形態を示す。この第２の実施例において、入射ひとみ３６に入る前の対物レンズ３４の光軸Ｏに対する照明光ビーム２４の平行なずれは、第１の実施例の場合とは異なるように、生じる。図２に係る実施形態において、照明光ビーム２４はビームスプリッタ５８まで光軸Ｏ上を伝播する。図１のビームスプリッタ３２と異なって、ビームスプリッタ５８は、照明光ビーム２４の通過に関して光軸Ｏに対する所望の平行ずれをもたらす比較的厚く平行平面な基板から構成される。ビームスプリッタ５８は平行ずれを変えるために位置決め要素６０を介して光軸Ｏを横切って変位され得る。
【００４５】
図３は、第３の実施例を示す。第３の実施例は、平行平面な基板から構成されるビームスプリッタ５８がくさび形状のビームスプリッタ５９によって置き換えられているという点で、図２に示した実施形態と相違する。この実施例においても、ビームスプリッタ５９は、照明光ビーム２４の所望の平行ずれを生じるために、位置決め要素６０によって変位可能である。
【００４６】
ライトシート４２が本発明にしたがって生み出される様子は、図４〜８を参照して以下に詳細に説明される。これに関連して図４〜８は本発明の理解を容易にすることを意図した全く概略的な描写であることに留意されたい。さらに理解を容易にするため、先ず図４〜７に示された状況では、照明光ビーム２４が励起光ビーム１４によってのみ構成されること、即ち、逆励起光ビーム１６との重ね合わせがまだ起こっていないことが前提である。
【００４７】
図４は先ず、在来の共焦点の点状走査にとって典型的な場合を示しており、照明光ビーム２４によって形成された光線束は対物レンズ開口全部を用い、即ち、光線束は対物レンズ３４の入射ひとみ３６の全範囲を通過する。図４において、照明光ビーム２４は光軸Ｏに対し平行に向けられている。この場合、対物レンズ３４は、集束した光分布を生じる。光軸Ｏに沿ったその寸法は光軸Ｏに対し横向きの寸法よりも大きい。本願において「照明焦点」と称するこの光分布は図４に符号６２で示されている。
【００４８】
引き続いての説明では、夫々、Ｘ軸が紙面において水平に向き、Ｚ軸が紙面において垂直に向き、Ｙ軸が紙面の外へ向く座標系に関する。この定義で、入射ひとみ３６はＸＹ平面に対し平行に配置され、光軸ＯはＺ軸に対し平行に延びる。図４ではさらに、Ａで、Ｚ軸の方向における照明焦点６２の平面図を描いている。この在来の配置において、照明焦点６２は平面図において円形である。
【００４９】
図５は、入射ひとみ３６での照明光ビーム２４が上述した走査装置によって傾けられる場合に、照明焦点６２の位置がどのように変化するかを示している。図５に示された状況では、照明光ビーム２４によって形成された光線束の主ビームがＸＺ面に対し平行である入射面において傾けられることが前提である。さらに、照明光ビーム２４が何はともあれ入射ひとみ３６の全範囲を通過していること、即ち、入射ひとみ３６を完全に照明していることが前提である。
【００５０】
照明光ビーム２４は、その入射方向を光軸Ｏに対して変更するように、入射面において傾けられる。この入射方向の変更は、対物レンズ３４によって、光軸Ｏに対し横向きの照明焦点６２の変位に変換される。図５に示された状況において、この動きはＸ軸に沿って起こる。照明光ビーム２４が何はともあれ入射ひとみ３６の全範囲を通過しているので、照明焦点６２はその縦方向寸法で光軸Ｏに対し平行に向けられたままである。これはまた、図５においてＢで示された平面図（照明焦点６２は何はともあれ円形である）で明らかである。
【００５１】
図６は、入射ひとみ３６の、本発明に係る不完全照明（Unterleuchtung）を描写する。図６から明白なように、照明光ビーム２４は入射ひとみ３６の部分領域のみを通過する。この部分領域は中心をずれて（dezentral）配置されて、即ち、光軸Ｏに対し横向きに入射ひとみの中心からずれている。入射ひとみ３６における照明光ビーム２４のこの中心からのずれによって、照明焦点６２は光軸Ｏに対し傾斜する。これはまた、Ｃで示された平面図（照明焦点６２はもはや円形でなく、Ｙ軸の方向よりもＸ軸の方向の方が長い）で明白である。加えて、照明光ビーム２４の不完全照明によって、照明焦点６２の拡張が引き起こされ、即ち、照明焦点６２は、入射ひとみ３６が完全に照らされる場合よりも全体で大きい。
【００５２】
図７は、中心をずれて入射ひとみ３６を不完全照明している照明光ビーム２４が入射ひとみ３６において傾けられる状況を示す。図７に示された状況では、照明光ビーム２４を形成する光線束の主ビームが光軸Ｏに対し平行でＸＺ面に対し平行である入射面において傾けられることが前提である。これは、図７の照明光ビーム２４が紙面から出て、あるいは入って傾けられることを意味する。
【００５３】
照明光ビーム２４のこの傾きは、対物レンズ３４によって、Ｙ軸に沿った傾斜した照明焦点６２の対応する変位に変換される。それゆえ照明焦点６２は、図７の紙面から出て、あるいは入って変位される。これは、図７にＤで再び描かれている。
【００５４】
図７にＤで示された照明焦点６２の動作シーケンスは、走査期間内で照明焦点６２を動かすことによってライトシート４２がどのように築き上げられるかをはっきりと示している。このための前提条件は、照明焦点６２がターゲット領域全体にわたって動かされる走査期間が、光検出器５４が画像生成のために動く検知時間よりも、短いことである。それによって、光検出器５４は、照明焦点６２の動きを時間的に、したがって空間的に未定であると、感知する。むしろ、ライトシート４２の形状をした中断しない光分布或いは連続的な光分布を感知する。
【００５５】
図８は、照明光ビーム２４が励起光ビーム１４と逆励起光ビーム１６の重ね合わせから形成される状況を示す。対応して対物レンズ３４は励起焦点６４と逆励起焦点６６を生成し、その重ね合わせの結果が照明焦点６２である。励起焦点６４は形状に関して図５，６に示された照明焦点６２に対応する。
【００５６】
逆励起焦点６６は、図８にＥで再びＸＺ面に対し平行な断面において描かれている。この描写から特に明らかなように、逆励起焦点６６は、励起焦点６４と逆励起焦点６６から構成される照明焦点６２が動かされる面において光度が零に等しくその面の両側でそれぞれ最大を示す空間的な光度分布を有する。上に挙げられた動作面は図８において符号６８を付されている。これは、Ｙ軸を含みＸＺ面に交差する線がＸ軸と角度を形成する面に対し平行である。上記角度は、使用される対物レンズ３４の最大開口角に依存し、また照明光ビーム２４の広がりと中心からのずれに依存する。
【００５７】
励起焦点６４が前記動作面６８の上下で逆励起焦点６６によって覆われていることによって、励起焦点６２の励起有効性が動作面６８の上下で減じられる。励起に有効な励起焦点の部分は図８にＥでハッチングを付して表されている。
【００５８】
励起焦点６２がいわば収縮される方向は図８において線７０によって表されている。この収縮方向７０は動作面６８に対し垂直である。励起焦点６４と逆励起焦点６６の重ね合わせによって、空間解像度が増加する結果を伴って、励起有効なライトシート４２がいわば薄くなる。
【００５９】
上記したようなライトシート４２の生成は、試料４０のターゲット領域の調節され若しくは構造化された照明をもたらす可能性を提供する。それゆえ、例えばＡＯＴＦ（図面に示さず）を用いて所望のように走査期間内で励起光ビーム１４及び／又は逆励起光ビーム１６の光度を変更することが可能である。交互に励起光ビーム１４及び／又は逆励起光ビーム１６を切り換えて出し入れすること（点灯・消灯）によって、異なる観察容量を画像形成することが可能である。励起光ビーム１４及び／又は逆励起光ビーム１６がマイクロ秒スケールで切り換え出し入れされるならば、光検出器５５との適切な同期性によって、例えば列毎に異なる容量要素を検出可能である（光検出器５５の検出表面５４が行と列から成り立っている限り）。
【符号の説明】
【００６０】
１０  走査型顕微鏡
１２  励起光源
１４  励起光ビーム
１５  逆励起光源
１６  逆励起光ビーム
１８  位相板
２０  ミラー
２２  ビームスプリッタ
２４  照明光ビーム
２６  ガルバノミラー装置
２８  走査レンズ
３０  管レンズ
３２  ビームスプリッタ
３４  対物レンズ
３６  入射ひとみ
３８  位置決め要素
４０  試料
４２  ライトシート
４４  検出光学系
４６  第１検出用対物レンズ
４７  管レンズ系
４８  中間画像
４９  管レンズ
５０  第２検出用対物レンズ
５１  管レンズ
５２  管レンズ
５３  中間画像
５４  検出表面
５５  光検出器
５６  試料用スライド
５８  ビームスプリッタ
６０  位置決め要素
６２  照明焦点
６４  励起焦点
６６  逆励起焦点
６８  動作面
７０  収縮方向
Ｏ，Ｏ’，Ｏ”  光軸
【図１】
0005642301.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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