(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
βＧＢＰ単量体からなる、癌の予防又は治療用薬剤であって、
前記癌が、βＧＢＰ単量体による効果が成長の阻害ではない細胞を含み、
前記細胞が、コントロール細胞と比較した場合に、高ＥＲＫレベル、高レベルのａｋｔ遺伝子発現及びリン酸化Ａｋｔタンパクに特徴づけられる細胞である、前記薬剤。
【請求項２】
前記癌の予防又は治療が、分裂促進因子の投与又は同時投与を含むものである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
βＧＢＰ単量体及び分裂促進因子を含む、癌の治療用製品であって、
前記βＧＢＰ単量体及び分裂促進因子が、同時に、別個に、又は逐次的に投与されるように用いられ、
前記癌が、βＧＢＰ単量体による効果が成長の阻害ではない細胞を含む、又は前記癌が、分裂促進刺激を受ける細胞を含む、前記製品。
【請求項４】
前記癌が結腸癌であり、
薬剤の単回用量が、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項５】
前記分裂促進因子が、
ａ）ホルモン、
ｂ）成長因子、
ｃ）エストロゲン若しくはアンドロゲン、
ｄ）チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、又は
ｅ）Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子である、請求項２に記載の薬剤。
【請求項６】
治療有効量のβＧＢＰ単量体及び治療有効量の分裂促進因子を含む医薬組成物。
【請求項７】
個々の単位剤形で製剤され、単回用量が、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
βＧＢＰ単量体からなる、免疫又は炎症状態の予防又は治療用薬剤であって、
前記状態の結果生じる細胞が、βＧＢＰ単量体による効果が成長の阻害ではなく、かつ、コントロール細胞と比較した場合に、高ＥＲＫレベル、高レベルのａｋｔ遺伝子発現及びリン酸化Ａｋｔタンパクに特徴づけられる細胞を含む、前記薬剤。
【請求項９】
前記免疫又は炎症状態の予防又は治療が、分裂促進因子の投与又は同時投与を含むものである、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記状態が免疫状態であり、
前記免疫状態が、自己免疫状態であり、同種免疫状態であり、移植片に対する免疫反応を含み、移植片による免疫反応を含み、過敏性反応を含み、又は、活性化リンパ球の持続的な増殖を含む、請求項８又は９に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記分裂促進因子が、免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であるか、又は、免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基を含む、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１２】
βＧＢＰ単量体及び分裂促進因子を含む、免疫又は炎症状態の治療用製品であって、
前記βＧＢＰ単量体及び分裂促進因子が、同時に、別個に、又は逐次的に投与されるように用いられ、
前記状態の結果生じる細胞が、βＧＢＰ単量体による効果が成長の阻害ではない細胞を含む、又は、
前記状態の結果生じる細胞が、分裂促進刺激を受けるものである、前記製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、療法及び関連する適用で使用するためのβ−ガラクトシド結合タンパク質（βＧＢＰ）及びβＧＢＰを含む組成物に関する。特に、本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態の治療又は予防のためのβＧＢＰの使用及び薬剤の製造に関し、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、βＧＢＰによる効果が成長（ｇｒｏｗｔｈ）の阻害ではない細胞を含む。本発明はまた、βＧＢＰを含む製品及び医薬組成物にも関する。ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３キナーゼ又はＰＩ３Ｋ）を阻害し、ａｋｔ遺伝子の発現を低下させるためのβＧＢＰの使用もまた本発明の一部である。本発明はまた、アポトーシスを誘発する方法、疾患関連細胞分裂が起こる状態を治療又は予防する方法、及び治療薬としてのβＧＢＰの適合性を評価する方法にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
本明細書において言及される文献はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。βＧＢＰは、抗癌特性を有し（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、２００３年）、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生される抗増殖性サイトカインとして最近同定された（Ｂｌａｓｅｒら、１９９８年）負の細胞周期調節因子である（Ｗｅｌｌｓ  Ｖ、Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ  １９９１年）。これはまた、体細胞によっても内因的に放出される。
【０００３】
いくつかの種からのβＧＢＰは、クローニングされ、発現され、精製されてきた。したがって、組換えβＧＢＰ（たとえばヒトＨｕ−ｒ−βＧＢＰ）もまた入手可能である。すべてのタイプのβＧＢＰは、供給源に関係なく、本明細書においてβＧＢＰと単に呼ばれる。
【０００４】
βＧＢＰはまた、正常細胞を傷つけることなく、癌細胞においてプログラム細胞死（アポトーシス）を誘発することが知られている。したがって、βＧＢＰは、正常細胞及び癌細胞において異なる調節機能を実行する。
【０００５】
細胞分裂は、正常な成長の一部である。これはまた、健常な個体における他の状況、たとえば、病原体に対する免疫反応の間のリンパ球のクローン性増殖下で起こる可能性がある。しかしながら、細胞増殖及び細胞成長が不適当にコントロールされる場合、過度の細胞分裂が起こる可能性がある。この過度の、又はその他の形の望ましくない細胞分裂は、疾患関連細胞分裂であると考えうる。そのような細胞分裂は、過剰増殖性の状態の特徴である。
【０００６】
過剰増殖性の状態との用語は、他の状態を包含するが、最もよく知られている過剰増殖性の状態のうちの１つは癌である。これらは、自己免疫応答（自己免疫疾患など）及び移植器官、移植組織、又は移植細胞に対する免疫応答（時に異物反応と称される）を含む。活性化Ｔ細胞の増殖は、望ましくない細胞分裂によって媒介される多くの免疫状態における病状に関与する。
【０００７】
癌は、正常細胞が健常な個体において受ける調節シグナルの複雑なネットワークの崩壊の結果生じうる。正常な生理的条件下で、細胞は、広範囲の刺激、ある促進性増殖、ある阻害性増殖を受けて、それらに応答する。同様に、細胞は、アポトーシス促進性又は抗アポトーシス性の異なる刺激を受けて、それらに応答する。このように、バランスは保たれている。細胞集団は、必要に応じて、補充され、交換され、増殖するが、適切な細胞集団を維持するため、過度の増殖は抑制され、又はアポトーシスが強化される。
【０００８】
この調節の高度に複雑な性質及び関与する多くの異なるエフェクターのおかげで、異なる癌タイプ及び異なる個体における癌の発達は、正常な調節ネットワークに対する種々様々の変化又は妨害の結果生じうる。
【０００９】
癌が発達すると共に、さらなる突然変異が癌細胞中に蓄積し、細胞機能のより重大な調節不全に至る可能性がある。癌細胞が分裂するにつれて、選択圧により、ますます強い増殖性の（又は分裂促進性の）形質及び抗増殖性シグナルに対するより弱い応答がもたらされる傾向がある。さらに、癌細胞が発達し、より侵襲性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）になるにつれて、それらは、集団からそのような細胞を通常、除去するであろうアポトーシス促進性シグナル伝達の増加に打ち勝つ（及び耐える）ために、生存シグナル伝達にますます依存するように強制されうる。
【００１０】
さらに、化学療法薬の存在によって引き起こされる選択圧は、多くの癌において薬剤抵抗性の発達をもたらす。
【００１１】
要約すると、癌は、しばしば細胞の集団における突然変異の蓄積の結果生じる。個々の細胞中の新しい突然変異の発達及び新しい娘細胞によるこれらの突然変異の遺伝は、典型的に、腫瘍又は癌細胞の集団内で多種多様な細胞の表現型及び挙動をもたらす。
【００１２】
これらは、それほど侵襲性ではない表現型（たとえば、より低い速度の分裂、負の成長調節因子及びアポトーシス促進性シグナルなどのような正常な生理刺激に対するより強い感受性）からより侵襲性の表現型（たとえば、より速い速度の分裂、負の成長調節因子及びアポトーシス促進性シグナルなどのような正常な生理刺激に対するより乏しい感受性（又は感受性の欠如）、アポトーシスを回避するための生存シグナル伝達に対する依存、並びに薬剤抵抗性の増加）まで及びうる。
【００１３】
細胞のそのような集団内での選択圧は、さらなる突然変異が細胞中に蓄積するにつれて、ますます多くのより侵襲性の細胞の表現型の発達をもたらす傾向がある。より侵襲性で、より急速に分裂している癌細胞のクローンは、それほど侵襲性ではないクローンを競争で排除する傾向がある。したがって、癌の形質は、時間が経過し、さらなる突然変異が蓄積するにつれ、全体的に、より侵襲性で、そのため、より深刻で、生命を脅かすようになる傾向がある。
【００１４】
癌細胞中で、分裂促進性シグナル伝達を強め、侵襲性疾患及び療法に対する抵抗性の原因となる遺伝子変異は、多くのタイプの癌において存在し、乳癌腫、卵巣癌腫、及び胃癌腫において頻繁なｅｒｂＢ２（ＨＥＲ／ｎｅｕ）遺伝子の増幅並びにすべての腫瘍の約１５〜２０％において共通のｒａｓ遺伝子の点突然変異を含む。
【００１５】
ＥｒｂＢ２は、構成的に活性となることによって、乳癌において過剰発現され得る他のＥｒｂＢメンバーとの好ましいパートナーとして二量体化することによって、及びエンドサイトーシス分解に抵抗することによって、分裂促進性シグナル伝達を強める、ＥｒｂＢ／ＥＧＦチロシンキナーゼ受容体ファミリーのリガンド不在のメンバーである（Ｈｙｎｅｓら、１９９４年、Ｙｕ及びＨｕｎｇ  ２０００年、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＢａｓｅｌｇａ  ２０００年、Ｈａｒａｒｉ及びＹａｒｄｅｎ  ２０００年）。
【００１６】
ＥｒｂＢ２分子の細胞質側末端におけるリン酸化チロシン残基により、Ｓｈｃアダプタータンパク質及びＧｒｂ２アダプタータンパク質のＳＨ２ドメインに対する高親和性結合部位の形成（Ｓｅｇａｔｔｏら、１９９０年、Ｄａｎｋａｒｔら、１９９７年）、Ｇｒｂ２のＳＨ３ドメインへのヌクレオチド交換因子ＳＯＳの結合、活性ＧＴＰ−ＲａｓへのＧＤＰ−Ｒａｓの変換、並びに増殖性、遊走性、及び生存シグナルを伝達するエフェクター経路の活性化（Ｍｉｔｉｎら、２００５年）をもたらす。
【００１７】
単一ミスセンス突然変異を含むＲａｓタンパク質は、Ｒａｆセリン／トレオニンキナーゼを慢性的に活性化し、ＥＲＫ活性及び細胞増殖を増強するリン酸化カスケードを強制することによって、分裂促進性シグナル伝達を強める（Ｂｏｓ  １９８９年、Ｄｏｗｎｗａｒｄ  ２００３年、Ｒｅｐａｓｋｙら、２００４年）。決定的に、クラスＩＡ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａら、１９９４年）及びクラスＩＢ（Ｐａｃｏｌｄら、２０００年、Ｗａｌｋｅｒら、２０００年、及びＤｊｏｄｊｅｖｉｃら、２００２年）ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３キナーゼ又はＰＩ３Ｋ）の触媒サブユニットと相互作用することによって、継続的に活性化されるＲａｓ及び構成的に活性の突然変異Ｒａｓは、生存能力と分裂促進性の入力を共役する一因となり得る。
【００１８】
ホスホイノシチド（４，５）Ｐ２のホスホイノシチド（３，４，５）Ｐ３への変換を触媒することによって、ＰＩ３Ｋは、Ａｋｔが活性化される形質膜へのＡｋｔ／ＰＫＢ動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を可能にする。活性化Ａｋｔによる、Ｂａｄ、カスパーゼ９、フォークヘッド転写因子、及びＩＫＫαなどのような下流の標的のリン酸化は、アポトーシスに対する抵抗性を付与する（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、２００５年）。
【００１９】
ＰＩ３Ｋはまた、侵襲性腫瘍形成の進展に中心的で重要なすべてのプロセスである細胞成長（Ｆｏｕｋａｓら、２００６年）、細胞増殖（Ｗｅｎｎｓｔｒｏｍ及びＤｏｗｎｗａｒｄ  １９９９年）、細胞骨格構成（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａら、１９９７年）、細胞運動、及び細胞遊走（Ｖｉｖａｎｃｏ及びＳａｗｙｅｒｓ  ２００２年）を媒介するシグナル伝達ネットワークを調節する。
【００２０】
ＰＩ３Ｋ及びＲａｓの多数の結合パートナー及び下流のエフェクターの同定は、選択される分子標的を特異的にねらう抗癌薬の設計のための範囲を提供してきたが（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  ２００３年、Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、２００５年、Ｇｉｂｂｓ  Ｃｈａｎｇら、２００３年  Ｌｕｏ  Ｊら、２００３年、及びＢａｓｅｌｇａ  ２００６年）、これらの戦略の治療上の成功が今までのところ限られていることについて可能性として考えられる理由に関して疑問が提起されてきた。関心事としては、個々の遮断（ｂｌｏｃｋ）を統合し、回避するための細胞内シグナル伝達の能力、標的化合物の可能性として考えられる分子の混乱、細胞特異性の欠乏、細胞毒性、及び薬剤抵抗性が含まれる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、２００２年、Ｍａｌｌｕｃｃｉら、２００３年、並びにＭａｌｌｕｃｃｉ及びＷｅｌｌｓ  ２００５年）。
【００２１】
癌と同様に、ある種の免疫反応は、疾患関連、つまり望ましくない細胞分裂を伴う可能性がある。たとえば、そのような細胞分裂は、リンパ球の中で起こる可能性がある。
【００２２】
自己免疫は、Ｔ細胞などのようなリンパ球の望ましくない増殖を伴う、望ましくない免疫反応の一例である。典型的に、これらの細胞は、当該個体内で内因性標的に対する免疫反応を媒介する。そのような自己反応細胞の活性化及び増殖を制限するはずである通例のコントロール機構は、ある理由で自己免疫において崩壊している可能性がある。したがって、病状は、自己を標的とする細胞の増殖性プールの活性の結果生じる。自己免疫状態における増殖性のリンパ球のプールは、侵襲性であると考えられる又は持続的に分裂している細胞を典型的に含むであろう。自己免疫状態の例は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ又は狼瘡としても知られている）である。
【００２３】
同種免疫は、自己免疫に関連する状態である。同種免疫反応において、身体は、それ自体の細胞に対して、外因性の供給源、たとえば同じ種の他の個体から免疫を獲得する。前者の状態において、免疫系は、外因性の物質によって誘発される又は影響を及ぼされることなく、身体自体の細胞を侵襲するので、同種免疫は自己免疫と異なる。
【００２４】
同種免疫は、たとえば、血液若しくは血漿などのような体液を注入したレシピエントにおいて、同種移植（移植）したレシピエントにおいて、又は母系抗体が胎児の中に胎盤を通して移った後の胎児において（たとえば新生児の溶血性疾患若しくは胎児母体間同種免疫性血小板減少症において）起こる可能性がある。同種免疫は、「誘発される自己免疫」であると考えることができる。
【００２５】
他の、しかし機構的に関連する問題が、器官、組織、又は細胞（つまり移植片）などのような生物学的構成要素が、遺伝的に別個の個体の間で移植される場合に起こり、移植片に対する免疫反応がもたらされる。器官全体を移植してもよく、その代わりに、器官の一部分を移植してもよく、又は多量の骨髄（たとえば前駆細胞を含む）を、ドナーからレシピエントに移入してもよい。これはまた、血液などのような体液の輸血の結果として起こる可能性がある。本明細書において使用されるように、「移植片」という用語は、すべてのそのような移植体、輸血、及び移植片に言及するために使用される。
【００２６】
組織適合が実行される場合でさえ、ドナー及びレシピエントが遺伝的に別個である場合、レシピエントの免疫系が、移植片を認識し、それに対する免疫応答を開始するであろうといった危険性が残る。これは、移植拒絶反応として一般に知られている。これは、ドナー及びレシピエントの間のより大きな遺伝的な差異及び結果的な分子の差異のために、組織、器官、又は細胞の移植が異なる種の個体の間で起こる（異種移植）特有の問題でありうる。
【００２７】
免疫抑制薬の使用を通して、拒絶反応の危険性及び結果として生じる免疫応答の重症度を低下させることは標準的な手順である。これらは、免疫系の応答を鎮めるために一般に作用するが、たとえば、感染症又は日和見病原体を撃退するための、移植レシピエントの能力の低下を通しての、病気のいくらかの危険性をそれらにもたらす。
【００２８】
移植片に対する免疫反応には、もちろん通常はＴ細胞が関与する。移植片に由来する分子標的に対して反応性である又はそれを認識するＴ細胞は、活性化されるようになり、増殖するであろう。これらの又は同様の状況下では、移植片が攻撃されるので、そのような状況下でなければ正常な免疫反応（つまり、体内の「外来」標的に対する）により、病状が引き起こされる可能性がある。たとえ免疫系の機能との関連において、それが、異物に対する「正常」反応であっても、そのような拒絶反応は、必然的に、疾患であると考えられる。したがって、望ましくない細胞分裂（移植片を標的とする細胞などのようなリンパ球の増殖）は、移植器官、移植組織、又は移植細胞に対する免疫反応の発達において決定的に重要である。
【００２９】
望ましくない細胞分裂が起こる免疫状態のさらなる例は、骨髄移植（又は輸血）に続く「移植片対宿主疾患」である。混入物としての又は宿主の中に意図的に導入された、移植片中に存在するＴ細胞は、抗原的に外来のものであるとして宿主組織を識別した後に、移植レシピエントの組織を攻撃する。そのＴ細胞は、ＴＮＦα及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）を含む過剰なサイトカインを産生する。広範囲の宿主抗原、とりわけヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、移植片対宿主疾患を起こし得る。しかしながら、ＨＬＡが同一の同胞がドナーである場合でさえ、移植片対宿主疾患は起こり得る。
【００３０】
過敏性反応は、正常免疫系によって産生される、望ましくない（有害で、不快感をもたらし、時に致命的な）反応である。過敏性反応は、前感作された（免疫）宿主を必要とする。４グループの分類は、Ｇｅｌｌ及びＣｏｏｍｂｓによって説明された。
【００３１】
そのため、望ましくない細胞分裂は、癌、自己免疫疾患、移植拒絶反応、及び移植片対宿主疾患などのような健康不良の多くの状態に関係する。これらの状態において、身体の侵襲性反応（又は移植Ｔ細胞の反応）は、細胞の急速に分裂するプール（たとえば活性化リンパ球）によって特徴づけられる可能性がある。増殖性の活性化リンパ球は、本発明の意味内で過剰増殖性であると考えることができる。説明されるすべての状態の間のつながりは、とりわけそのような増殖に対立する多種多様の刺激にもかかわらず、増殖が持続することである。
【００３２】
βＧＢＰは、多くの理由で、有望な治療薬として関心を引いてきた。重要なことには、βＧＢＰは、主として免疫系によって産生される天然の調節分子であり、これは、まさしくその性質及び機能のために、正常細胞を傷つけないであろう。βＧＢＰは、免疫細胞増殖の調節を支配する、天然の機構及びフィードバック回路において役割を果たすと考えられる。さらに、βＧＢＰは、癌の予防及び監視において構成的に役割を果たすと思われる。
【００３３】
低濃度のβＧＢＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞の成長を阻害することが既に知られている（Ｂｌａｓｅｒら、１９９８年）。非常に高い（つまり、マイクロモル）濃度で、βＧＢＰから形成されるホモ二量体（ガレクチン−１又はＧＡＬ−１として知られている、レクチン様の特徴を有する複合体）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、活性化Ｔ細胞における急速なアポトーシスを誘発することができることもまた開示されている。この特性は、ＧＡＬ−１（つまり二量体分子）が形成される高濃度で明らかとなるのみである（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９９年）。
【００３４】
しかしながら、ＧＡＬ−１及びβＧＢＰの知られている活性を区別することは重要である。この区別は、先行技術において、たとえば国際公開第９２／０７９３８号パンフレットにおいて説明され、下記に簡単に要約される。
【００３５】
ＧＡＬ−１は、そのレクチン様の特性を通してそのアポトーシス促進効果を媒介する。高濃度のＧＡＬ−１は、活性化Ｔ細胞におけるアポトーシスを急速に誘発する。ラクトースとの競合は、ＧＡＬ−１のアポトーシス促進効果を阻害し、それらは、細胞表面糖タンパク質の架橋を通して媒介されることを示唆する。
【００３６】
対照的に、βＧＢＰの成長阻害効果は、炭水化物結合部位と無関係（つまり、ＧＡＬ−１型レクチン活性と無関係）である。これは、ラクトースの添加がβＧＢＰ活性を遮断せず、さらに、炭水化物結合部位が多糖類複合体によって遮断されているβＧＢＰの１８０００Ｍｒマウス形態が、十分な成長阻害活性を有するといった事実によって実証される。したがって、βＧＢＰ単量体（レクチン様の特徴を有していない）は、他の作用様式を介してそれらの効果を媒介する。βＧＢＰは、特異的な細胞表面受容体と相互作用し、シグナル伝達事象を誘発すると考えられる。
【００３７】
ＧＡＬ−１のアポトーシス活性の閾値濃度は、４μｇ／ｍｌであることが以前に示された（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９９年、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９８年、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９７年）。二量体分子は、ＧＡＬ−１の生物学的効果（つまりＴ細胞におけるアポトーシスの誘発）に必要であることが以前に示された。しかしながら、アポトーシスの誘発ではなく、細胞分裂の阻害に関するβＧＢＰの生物学的活性は、１ｍｌ当たりナノグラムの範囲において測定される濃度で発揮されることが知られている。したがって、βＧＢＰ（サイトカイン様）及びＧＡＬ−１（レクチン様）の知られている活性及び特性を明確に区別することが可能である。
【００３８】
それは、疾患関連細胞分裂を伴う状態の治療におけるさらなる治療上の選択肢があれば、有用であろう。上記に記載されるように、細胞分裂が、正常なコントロールの崩壊の一部として（たとえば癌若しくは他の過剰増殖性の状態）又は分裂が、「正常である」が、誤って指示された（たとえば自己免疫状態におけるリンパ球増殖）若しくは「正常である」が、不要である（たとえば、移植器官などのような有益である外来組織に対する免疫応答）と見なされうる状況下で起こる可能性があるので、そのような疾患関連細胞分裂は、「望ましくない」細胞分裂としてその代わりに考えることができる。
【００３９】
本発明は、そのような状態の治療において有用な薬剤を提供する又は公衆及び／若しくは医療界に有用な代替物を少なくとも提供することを目的とする。
【００４０】
［発明の概要］
用語が、本明細書において定義される又は説明される場合、その定義又は説明は、他に述べられない限り、用語のすべての使用及び実例に適用されることが意図される。
【００４１】
本発明は、βＧＢＰの特性を利用する。特に、それは、（ｉ）βＧＢＰの成長阻害効果に全く応答しない（つまり、それらは、βＧＢＰによる細胞周期の停止に対して感受性ではないであろう）又は（ｉｉ）分裂促進刺激を受けた細胞に対するβＧＢＰによる効果に基づく。刺激は、それらの増殖又は増殖するための能力が促進される又は増強されるようなものであってもよい。両方のタイプの細胞は、過剰増殖性の細胞であると考えることができる。前者のタイプの例は、βＧＢＰの成長阻害効果にもはや応答しない段階まで発達した癌細胞である。そのような癌細胞は、「侵襲性」又は「浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）」細胞と見なすことができる。後者のタイプの例は、βＧＢＰの成長阻害効果に対するいくらかの感受性を保持する（たとえば分裂促進刺激を受けなかった場合）癌細胞であり、分裂促進刺激は、後者の細胞のタイプにおいて、前者の挙動及び特徴を模倣するように作用する。
【００４２】
「侵襲性」という用語はまた、たとえば、活性化されており、分裂しているリンパ球に適用してもよい。そのようなリンパ球は、持続的に分裂し続け、持続的に分裂する細胞であると考えることができる。そのような持続的な挙動は、「抗原的に外来の」移植片の存在に応答しているＴ細胞などのようなリンパ球（たとえば移植拒絶反応）又は自己免疫状態において参加している細胞に、特に適用してもよい。
【００４３】
負の調節性のシグナル／状態、刺激、又は薬剤にもかかわらず分裂し続けるあらゆる細胞は、持続的に分裂する細胞であると考えることができる。「浸潤性」という用語は、持続的に分裂し、他の隣接する組織に浸潤している又は異なる場所に転移している癌細胞の挙動を記載するために臨床現場において使用されることが多い。
【００４４】
特に、本発明は、βＧＢＰと併用した増殖性の刺激（たとえば分裂促進性の刺激）がアポトーシスを誘発することができるという発見に関する。したがって、βＧＢＰと分裂促進刺激との組合せは、通常アポトーシスを伴ってβＧＢＰに応答しないであろう細胞においてアポトーシスを誘発しうる。さらに、βＧＢＰのこれらの特性は、リンパ球及び特に、疾患関連免疫反応又は望ましくない免疫反応における一部として活性化され、増殖しているＴ細胞などのような、過剰増殖性であると考えることができる他の細胞において適用することができる。
【００４５】
「過剰増殖性の状態」という用語は、過度の細胞成長（又は不十分なアポトーシス）によって特徴づけられるあらゆる状態を包含するように使用される。過剰増殖性の状態の例は、上記に説明されるような癌及び不適切な又は望ましくない免疫応答である。
【００４６】
したがって、βＧＢＰと併用した分裂促進刺激は、癌細胞などのような過剰増殖性の細胞又は活性化され、持続的に分裂しているリンパ球においてアポトーシスを促進するために使用することができる。細胞（それほど侵襲性ではないと考えられ、依然βＧＢＰの成長阻害効果に対するいくらかの感受性を保持し得る癌細胞を含む）の分裂促進刺激は、前記細胞に対するβＧＢＰのアポトーシス促進機能を増強する。分裂促進刺激は、したがって、それほど侵襲性ではない細胞を、βＧＢＰによるアポトーシスの誘発に対して、その後、より感受性となる細胞に変換すると考えることができる。同様に、Ｔ細胞などのようなリンパ球の刺激及び活性化は、それらを、βＧＢＰによるアポトーシスの誘発に対してより感受性にする。
【００４７】
したがって、第１の態様において、本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態の予防又は治療のための薬剤の製造におけるβＧＢＰの使用を提供し、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含み、又は前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、分裂促進刺激を受けるものである。分裂促進刺激は、増殖するための細胞の能力が増強されるようなものであってもよい。
【００４８】
「治療」とは、当状態の少なくとも改善、好ましくは治癒を意味する。治療はまた、治療されることになっている状態を発達させる危険性があると判断される対象における状態の発生又は重症度を予防することをねらった予防的な、つまり防止的な治療を含んでいてもよい。
【００４９】
好ましい実施形態において、状態は、癌、免疫状態又は炎症状態である。
【００５０】
「癌」という用語は、広く解釈されるように意図され、良性又は悪性であるあらゆる新生物を包含してもよい。癌は、上皮性起源又は間葉性起源のものであってもよい。本明細書において使用されるように、癌という用語は、そのため、任意の細胞のタイプに由来する又は任意の重症度の新生物に言及してもよい。したがって、たとえば、癌という用語は、癌腫、リンパ腫若しくは白血病、肉腫、中皮腫、神経膠腫、胚細胞腫、又は絨毛癌に言及してもよい。本発明の使用、薬剤、医薬化合物、及び方法が有用でありうる特定のタイプの癌の例は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、口腔癌、前立腺癌、胃癌、白血病、肺癌、精巣癌、肝臓癌、膵癌、脂肪腫、肉腫、又は他のものを含む。あらゆる癌は、本発明に従って潜在的に治療可能であることが意図される。
【００５１】
「白血病」とは、血液又は骨髄のあらゆる癌を意味する。それは、白血病の急性、慢性、リンパ系、及び骨髄系の形態を包含するように意図される。たとえば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（急性骨髄系白血病又はＡＭＬとしても知られている）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はすべて、白血病の定義によって包含されるように意図される。
【００５２】
βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞の例は、コントロール細胞と比較された場合に、高ＥＲＫレベル、速い増殖速度、並びに高レベルのａｋｔ遺伝子発現及び活性（つまり、リン酸化）Ａｋｔタンパク質によって特徴づけられ得る細胞である。ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞は、そのような細胞の例である。これらの細胞において、βＧＢＰは、分裂促進性シグナル伝達の力に打ち勝つことができない。しかしながら、本明細書において記載されるように、βＧＢＰは、ａｋｔ遺伝子発現を速やかに低下させ、結果Ａｋｔタンパク質を消失させ、それによって、癌細胞生存シグナル伝達を消滅させる。したがって、βＧＢＰにより誘発されるａｋｔ遺伝子発現の消失には、アポトーシスの誘発による、大量の細胞死が続く（２又は３回の複製サイクルの後に）。
【００５３】
当業者は、癌がβＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含むかどうかについて、ルーチンに、決定することができるであろう。体内又は身体から取り出された試料中の癌細胞の形質及び挙動を分析する方法は、当業者らによく知られている。たとえば、そのような方法は、身体からの試料の取り出し及び直接又は培養における試料からの細胞の研究を含んでいてもよい。そのような細胞は、βＧＢＰ又は他の試験物質若しくは試験化合物と容易に接触させることができ、細胞に対する後の効果を決定することができる。
【００５４】
本発明の薬剤は、任意の適している投薬計画のために製剤することができる。さらに好ましい実施形態において、癌は、結腸癌であり、βＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である。癌が結腸癌である特に好ましい実施形態において、βＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜６０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である。その代わりに、５０、４０、３０、２０、１０、又は５μｇ／ｋｇの用量が有用であってもよい。より低い濃度又は用量は、経済的理由で、投与の便宜上、及び他の理由で好ましい可能性がある。
【００５５】
βＧＢＰは、本明細書において提示されるデータから当業者によって決定することができる用量又は濃度の範囲で使用することができる。たとえば、いくつかの実例において、βＧＢＰは、０．１、０．５、１、２、３．５、５、７、１０、１５、２０、３０、３５、４０、又は５０ｎＭの濃度で使用することができる。他の濃度も可能である。
【００５６】
代替の好ましい実施形態において、状態は免疫状態であり、免疫状態は自己免疫状態であり、同種免疫状態であり、移植片に対する免疫反応を含み、移植片による免疫反応を含み、過敏性反応を含み、又は活性化リンパ球の持続的な増殖を含む。
【００５７】
そのような実施形態において、個体を治療するための薬剤の使用は、対象とする免疫反応の関連において、免疫寛容又はその個体における免疫寛容に同等の状態を引き起こすことが可能であり得る。同様に、寛容は、本発明の一部を形成する製品、医薬化合物、使用、又は方法により達成することができる。
【００５８】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、高い内在性の分裂促進能を有する細胞、分裂促進刺激を受ける細胞、急速に分裂する細胞である細胞、又は持続的に分裂する細胞である細胞を含む。
【００５９】
「高い内在性の分裂促進能」とは、当細胞が、コントロール細胞について予想されるであろうものよりも急速に分裂することができることを意味する。同様に、「急速に分裂する細胞」は、同じタイプのコントロール細胞について予想されるものよりも急速に分裂する細胞である。「持続的に分裂する細胞」は、細胞分裂及び細胞成長を妨げる刺激の存在にもかかわらず分裂し続ける細胞である。そのような刺激は、内在性の遺伝的なレベルでの又は自己組織由来供給源からのオートクリン効果若しくはパラクリン効果からの正常な生理刺激又は身体によって用いられる他の正常な生理シグナルを含んでいてもよい。他のそのような刺激は、細胞分裂を予防することをねらう薬剤などのような外因的に提供される因子を含んでいてもよい。
【００６０】
細胞分裂速度は、細胞のタイプ（たとえば組織のタイプ）の間で及び異なる条件下で成長している同じタイプの細胞について変動するので、実験的な用語においてそのような細胞を定義することは可能ではない。したがって、相対的な用語において細胞分裂速度及び分裂促進能について論じることが可能であるのみである。当業者は、もちろん、分裂促進能、細胞分裂の速さ、又は持続の点から、所与のタイプの細胞について予想されるであろうものを評価することができる。当業者は、たとえば、「正常」（つまり、疾患関連ではない細胞又は非刺激細胞）を、たとえば、腫瘍からの生検材料又は疾患に関与するリンパ球のクローンから得られる細胞と比較することができるであろう。そのような評価は、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、又は実験動物においてなされてもよい。
【００６１】
他の好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、過剰増殖性の細胞、新生細胞、癌細胞、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、持続的に分裂するリンパ球、活性化炎症細胞、若しくは活性化内皮細胞である又はそれと疑われる細胞を含む。
【００６２】
さらに好ましい実施形態において、状態の予防若しくは治療は、分裂促進因子の投与若しくは同時投与を含み、又は薬剤は、分裂促進因子をさらに含み、若しくは分裂促進因子との同時投与のための薬剤である。
【００６３】
分裂促進因子は、細胞分裂を促進するために細胞に作用する作用物質である。本発明において、分裂促進因子は、細胞に対して分裂促進性の（つまり、増殖性の）効果を及ぼすように作用する任意の分子である。本発明における使用に適している分裂促進因子は、当業者らに知られているであろう、また、エストロゲン、アンドロゲン、及び関連分子などのようなホルモン、成長因子、並びにリンパ球上の受容体に結合する抗原決定基を含む。
【００６４】
抗原決定基はまた、時に、抗原（この用語は、より通常では、より広い、それほど特異的ではない意味において使用される）、同種抗原、又はエピトープとしても知られている。そのような抗原決定基は、一般に、ペプチドであるが、炭水化物又は核酸などのような他の分子を含んでいてもよい。この文脈における抗原決定基という用語は、適切なリンパ球受容体に結合する特異的な分子又はより大きな分子又は前記抗原決定基を含むタンパク質全体若しくは細胞全体を包含するように意図される。
【００６５】
本発明における使用に適切な抗原決定基は、自己免疫反応を担う、同種免疫反応を担う、移植体、移植片、若しくは輸血に由来する、アレルゲンに由来する、又は活性化リンパ球の増殖を刺激することができるものに相当してもよい。
【００６６】
他の知られている分裂促進因子は、たとえば、サイトカイン、毒素（コレラ毒素Ｂなど）、並びにリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、リポ多糖（ＬＰ）、及びポークウィード（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）分裂促進因子を含む多様な供給源からの他の分子を含む。すべての分裂促進因子が、すべての状況において適しているとは限らない可能性がある。治療上妥当な分裂促進因子は、当業者に明確であろう。他の分裂促進因子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける状況において又は実験的に有用である可能性がある。
【００６７】
分裂促進刺激は、その代わりに、遺伝的な手段を介するものであってもよい。たとえば、突然変異又はＲａｓなどのようなシグナル伝達タンパク質の突然変異形態をコードするものを含む適切な遺伝エレメントを用いるトランスフェクション。
【００６８】
ある種の分子は、ある種の細胞のタイプに対してのみ分裂促進効果を及ぼす。たとえば、エストロゲンは、乳癌細胞などのような乳房組織細胞に対して分裂促進効果を有することが予想されるであろう。逆に、アンドロゲンは、たとえば、前立腺癌細胞などのような前立腺細胞に対して分裂促進効果を有することが予想されるであろう。特に、分裂促進効果は、ホルモン受容体が過剰発現されるところで観察される。エストロゲン及びアンドロゲンは、すべての細胞のタイプに分裂促進性であることが予想されるとは限らないであろう。
【００６９】
したがって、いくつかの場合において、当該細胞のタイプは、どの化合物が分裂促進因子であると考えることができるかに影響を及ぼすであろう。当業者は、所与の化合物が、所与の細胞のタイプに関して分裂促進性の活性を有するかどうかを知っているであろう。しかしながら、所与の化合物の細胞成長に対する効果を評価することは当業者にとって、単に、ルーチンな実験方法の問題であろう。たとえば、個体又は細胞を含む試料は、推定上の分裂促進因子を用いて治療することができる。細胞成長に対する効果をその後評価することができる。細胞成長を評価するための適している方法は、本明細書において開示され、たとえば、直接的な血球計によるカウント、フローサイトメトリー、及び成長している細胞の中へのヌクレオチドなどのような標識分子の取り込みの測定を含む。
【００７０】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモン、成長因子又はリンパ球上の受容体に結合する抗原決定基である。
【００７１】
特に好ましい実施形態において、ホルモンは、エストロゲン又はアンドロゲンである。
【００７２】
「エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）」（代替のつづりエストロゲン（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ））によって、エストロゲンと一般に呼ばれるステロイドホルモン並びにさらに、エストロゲン様活性を持つ類似体及び誘導体の群のうちのいずれか１つが意味される。
【００７３】
天然に存在するエストロゲンの例は、エストラジオール、エストリオール、及びエストロンであり、これらは、アンドロゲンに対する酵素の作用を通して体内において正常状況下で産生される。エストラジオールの例は、１７β−エストラジオール（閉経前の女性における主要なエストロゲン）である。
【００７４】
本発明との関連において使用されるようなエストロゲンという用語はまた、エストロゲン様活性をも持つ天然物質及び合成物質を包含する。そのような活性を有する天然の物質の例は、ダイズなどのような植物に由来するフィトエストロゲンである。ホルモンベースの（たとえば経口）避妊薬において使用されるものなどのような合成エストロゲン類似体及びエストロゲン誘導体もまた使用することができる。例として、エチニルエストラジオールがある。エストロゲン様活性を有するさらなる合成物質を、異質エストロゲン（ｘｅｎｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）と呼ぶこともできる。
【００７５】
他の好ましい実施形態において、分裂促進因子は、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子である。そのような成長因子の例は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、又はＩＧＦである。
【００７６】
その代わりに、分裂促進因子は、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子である。そのような成長因子の例は、バソプレッシン、ボンベシン、トロンボスポンジン、又はブラジキニンである。
【００７７】
他の好ましい実施形態において、分裂促進因子は、リンパ球上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体又はＭＨＣ分子である。
【００７８】
好ましい実施形態において、薬剤は、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞のアポトーシスを促進する。
【００７９】
「アポトーシスを促進する」又は「アポトーシスの促進」とは、βＧＢＰによる効果が、細胞におけるアポトーシスの見込みを増加させることを意味する。たとえば、細胞をβＧＢＰと接触させることは、生存よりもむしろアポトーシスに向くように、細胞に変化をもたらす。当業者は、簡単な様式においてこれを評価することができる。たとえば、適切な時間経過にわたって（たとえば数日）統計的に有意な数の細胞を比較すること及びβＧＢＰの添加が、コントロール細胞について観察される速度と比較して、アポトーシスの増加を生じさせたかどうかを観察することによるものである。
【００８０】
アポトーシスを評価するための適している方法は、当技術分野においてよく知られており、例は、本明細書において別記される。これらは、テトラメチルローダミンエチルエステル染色、形質膜ホスファチジルセリン分析、カスパーゼ３活性評価、及びＴＵＮＥＬ分析を含む。
【００８１】
本発明との関連において、個体又は対象は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであってもよい。
【００８２】
他の態様において、本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態の予防又は治療のための薬剤の製造における分裂促進因子の使用を提供し、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含み、又は前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、分裂促進刺激を受けるものであり、状態の予防若しくは治療は、βＧＢＰの投与若しくは同時投与を含み、又は薬剤は、βＧＢＰをさらに含み、若しくはβＧＢＰとの同時投与のための薬剤である。
【００８３】
分裂促進刺激は、増殖するための細胞の能力が増強されるようなものであってもよい。
【００８４】
好ましい実施形態において、状態は、癌、免疫状態又は炎症状態である。
【００８５】
好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は結腸癌であり、薬剤又は同時投与されるβＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇのβＧＢＰの濃度を達成するのに十分である。
【００８６】
特に好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は結腸癌であり、薬剤又は同時投与されるβＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜６０μｇ／ｋｇのβＧＢＰの濃度を達成するのに十分である。
【００８７】
代替の好ましい実施形態において、状態は免疫状態であり、免疫状態は自己免疫状態であり、同種免疫状態であり、移植片に対する免疫反応を含み、移植片による免疫反応を含み、過敏性反応を含み、又は活性化リンパ球の持続的な増殖を含む。
【００８８】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、高い内在性の分裂促進能を有し、分裂促進刺激を受け、急速に分裂する細胞であり、又は持続的に分裂する細胞である細胞を含む。
【００８９】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、過剰増殖性の細胞、新生細胞、癌細胞、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、持続的に分裂するリンパ球、活性化炎症細胞、活性化内皮細胞である又はそれらのいずれかと疑われる細胞を含む。
【００９０】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモンであり、成長因子であり、免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基である若しくは抗原決定基を含む。
【００９１】
特に好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン若しくはアンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【００９２】
好ましい実施形態において、薬剤は、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞のアポトーシスを促進する。
【００９３】
他の態様において、本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態の予防又は治療で使用するためのβＧＢＰであって、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含み、又は前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、分裂促進刺激を受けるものである、βＧＢＰを提供する。
【００９４】
分裂促進刺激は、増殖するための細胞の能力が増強されるようなものであってもよい。
【００９５】
好ましい実施形態において、状態は、癌、免疫状態又は炎症状態である。
【００９６】
好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は結腸癌であり、βＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である。
【００９７】
特に好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は結腸癌であり、βＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜６０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である。
【００９８】
代替の好ましい実施形態において、状態は免疫状態であり、免疫状態は自己免疫状態であり、同種免疫状態であり、移植片に対する免疫反応を含み、移植片による免疫反応を含み、過敏性反応を含み、又は活性化リンパ球の持続的な増殖を含む。
【００９９】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、高い内在性の分裂促進能を有し、分裂促進刺激を受け、急速に分裂する細胞であり、又は持続的に分裂する細胞である細胞を含む。
【０１００】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、過剰増殖性の細胞、新生細胞、癌細胞、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、持続的に分裂するリンパ球、活性化炎症細胞、若しくは活性化内皮細胞である又はそれと疑われる細胞を含む。
【０１０１】
好ましい実施形態において、状態の予防若しくは治療は、分裂促進因子の投与若しくは同時投与を含み、又は薬剤は、分裂促進因子をさらに含み、若しくは分裂促進因子との同時投与のための薬剤である。
【０１０２】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモンであり、成長因子であり、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基である若しくはそれを含む。
【０１０３】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン若しくはアンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【０１０４】
好ましい実施形態において、薬剤は、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞のアポトーシスを促進する。
【０１０５】
他の態様において、本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態の予防又は治療で使用するための分裂促進因子であって、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含み、又は前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、分裂促進刺激を受けるものであり、状態の予防若しくは治療は、βＧＢＰの投与若しくは同時投与を含み、又は薬剤は、βＧＢＰをさらに含み、若しくはβＧＢＰとの同時投与のための薬剤である、分裂促進因子を提供する。
【０１０６】
分裂促進刺激は、増殖するための細胞の能力が増強されるようなものであってもよい。
【０１０７】
好ましい実施形態において、状態は、癌、免疫状態、又は炎症状態である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は結腸癌であり、薬剤又は同時投与されるβＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇのβＧＢＰの濃度を達成するのに十分である。
【０１０９】
特に好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は結腸癌であり、薬剤又は同時投与されるβＧＢＰの単回用量は、対象において１５〜６０μｇ／ｋｇのβＧＢＰの濃度を達成するのに十分である。
【０１１０】
代替の好ましい実施形態において、状態は免疫状態であり、免疫状態は自己免疫状態であり、同種免疫状態であり、移植片に対する免疫反応を含み、移植片による免疫反応を含み、過敏性反応を含み、又は活性化リンパ球の持続的な増殖を含む。
【０１１１】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、高い内在性の分裂促進能を有し、分裂促進刺激を受け、急速に分裂する細胞であり、又は持続的に分裂する細胞である細胞を含む。
【０１１２】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、過剰増殖性の細胞、新生細胞、癌細胞、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、持続的に分裂するリンパ球、活性化炎症細胞、若しくは活性化内皮細胞である又はそれと疑われる細胞を含む。
【０１１３】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモンであり、成長因子であり、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基である若しくはそれを含む。
【０１１４】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン若しくはアンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【０１１５】
好ましい実施形態において、薬剤は、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞のアポトーシスを促進する。
【０１１６】
本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態の治療で同時に、別個に、又は逐次的に使用するためのβＧＢＰ及び分裂促進因子を含む製品であって、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含み、又は前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、分裂促進刺激を受けるものである、製品をさらに提供する。
【０１１７】
分裂促進刺激は、増殖するための細胞の能力が増強されるようなものであってもよい。
【０１１８】
好ましい実施形態において、状態は、癌、免疫状態又は炎症状態である。
【０１１９】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモンであり、成長因子であり、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基である若しくはそれを含む。
【０１２０】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン若しくはアンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量のβＧＢＰ及び治療有効量の分裂促進因子を含む医薬組成物を提供する。
【０１２２】
「治療有効量」とは、所望の治療効果を生じさせるのに十分な化合物（たとえば、βＧＢＰ及び／又は分裂促進因子）の量を意味する。たとえば、治療有効量は、癌を治療又は予防するのに十分な量である。
【０１２３】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモンであり、成長因子であり、又はリンパ球上の受容体に結合する抗原決定基である若しくはそれを含む。
【０１２４】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン、アンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【０１２５】
好ましい実施形態において、組成物は、個々の単位剤形で製剤され、薬剤の単回用量は、対象において１５〜１５０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である。
【０１２６】
特に好ましい実施形態において、組成物は、個々の単位剤形で製剤され、薬剤の単回用量は、対象において１５〜６０μｇ／ｋｇの濃度を達成するのに十分である。
【０１２７】
βＧＢＰのそのような用量は、医薬組成物が、癌の治療における使用に適している場合に、特に、癌が結腸癌である場合に、特に好ましい可能性がある。
【０１２８】
本発明の薬剤、製品、及び医薬組成物は、任意の数の薬学的に許容できる賦形剤を含んでいてもよい。当技術分野において使用されるそれらの賦形剤は、通常、よく知られており、それらは、増量剤、滑沢剤、着色料、香料、湿潤剤、溶剤、緩衝剤、防腐剤、及びその他同種のものを含む。
【０１２９】
本発明の薬剤、製品、及び医薬組成物は、任意の適している経路によって送達又は投与することができる。典型的に、投与のこれらの経路は、静脈内送達、腹腔内送達、皮下送達、髄腔内送達、脳室内送達、又は局所的送達を含むであろう。
【０１３０】
その代わりに、経口送達、直腸送達、又は腟送達が適切である可能性がある。投与はまた、局所又は全身としてもよい。
【０１３１】
さらなる態様において、本発明は、細胞をβＧＢＰと接触させるステップを含む、ＰＩ３キナーゼ酵素活性を阻害するためのβＧＢＰの使用を提供する。
【０１３２】
ＰＩ３Ｋの阻害は、任意の量によるものであってもよい。特に、コントロール細胞と比較した酵素の活性は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上、低下してもよい。これは、たとえば、ＰＩ３Ｋ活性の直接測定によって又は全細胞ＰＩＰ３（ＰＩＫ３活性の産物）の評価から評価されてもよい。
【０１３３】
細胞をβＧＢＰと接触させるステップを含む、ａｋｔの発現を阻害するためのβＧＢＰの使用もまた提供される。
【０１３４】
発現を低下させることによって、ａｋｔ、ｍＲＮＡ、及び／又はタンパク質のレベル又は数量は、未処理細胞と比較した場合に、βＧＢＰと接触させた細胞において低下することが意味される。ｍＲＮＡのレベルにおける低下は、タンパク質レベルの等価な低下が伴ってもよい。その代わりに、タンパク質レベルは、異なる程度低下してもよく、たとえばタンパク質レベルにおいてそれほど低下せず又は全く低下しなくてもよい。ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルが低下する程度は、変動してもよい。レベルは、たとえば、コントロール細胞において観察されるレベルと比較した場合に、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、低下してもよい。その代わりに、ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルの低下は、たとえばノーザンブロット又はウエスタンブロットなどのような特定の検出方法を使用することによって、検出不可能なレベルまでのものであってもよい（つまり、見かけ上、１００％の低下）。ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルの低下は、前記発現が、本発明によるβＧＢＰによってサイレンシングされたと見なすことができるようなものであってもよい。
【０１３５】
好ましい実施形態において、前記細胞に対するβＧＢＰによる効果は、成長の阻害ではない。
【０１３６】
好ましい実施形態において、使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、又は身体から取り出された試料に対する使用であり、試料は、細胞を含み、この試料又はその一部分は、その後身体に戻される。
【０１３７】
好ましい実施形態において、前記細胞をβＧＢＰと接触させる効果は、アポトーシスの促進である。
【０１３８】
さらなる態様において、本発明は、ＰＩ３キナーゼを阻害する方法であって、細胞をβＧＢＰと接触させるステップを含み、それによって、ＰＩ３キナーゼを阻害する方法を提供する。
【０１３９】
さらなる態様において、本発明は、細胞中のａｋｔの発現を低下させる方法であって、前記細胞をβＧＢＰと接触させるステップを含み、それによって、ａｋｔの発現が低下する方法を提供する。
【０１４０】
他の態様において、本発明は、細胞におけるアポトーシスを促進する方法であって、前記細胞をβＧＢＰと接触させるステップを含み、それによって、アポトーシスが促進される方法を提供する。
【０１４１】
他の態様において、本発明は、疾患関連細胞分裂が起こる状態を治療又は予防する方法であって、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞が、βＧＢＰによる効果が成長の阻害ではない細胞を含み、又は前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞が、分裂促進刺激を受けものであり、それによって状態が治療又は予防される方法を提供する。
【０１４２】
分裂促進刺激は、増殖するための細胞の能力が増強されるようなものであってもよい。
【０１４３】
好ましい実施形態において、状態は、癌、免疫状態又は炎症状態である。
【０１４４】
好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は、結腸癌であり、この方法は、１５〜１５０μｇ／ｋｇの対象における濃度を達成するステップを含む。
【０１４５】
特に好ましい実施形態において、状態は癌であり、癌は、結腸癌であり、この方法は、１５〜６０μｇ／ｋｇの対象における濃度を達成するステップを含む。
【０１４６】
代替の好ましい実施形態において、状態は免疫状態であり、免疫状態は自己免疫状態であり、同種免疫状態であり、移植片に対する免疫反応を含み、移植片による免疫反応を含み、過敏性反応を含み、又は活性化リンパ球の持続的な増殖を含む。
【０１４７】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、高い内在性の分裂促進能を有し、分裂促進刺激を受け、急速に分裂する細胞であり、又は持続的に分裂する細胞である細胞を含む。
【０１４８】
好ましい実施形態において、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞は、過剰増殖性の細胞、新生細胞、癌細胞、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、持続的に分裂するリンパ球、活性化炎症細胞、若しくは活性化内皮細胞である又はそれと疑われる細胞を含む。
【０１４９】
好ましい実施形態において、この方法は、細胞を分裂促進因子と接触させることによる分裂促進刺激を含む。
【０１５０】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、ホルモンであり、成長因子であり、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基である若しくはそれを含む。
【０１５１】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン若しくはアンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【０１５２】
好ましい実施形態において、この方法は、前記疾患関連細胞分裂の結果生じる細胞のアポトーシスを促進する。
【０１５３】
細胞に対するβＧＢＰによる効果は、成長の阻害でなくてもよい。
【０１５４】
さらなる態様において、本発明は、治療薬としてのβＧＢＰの適合性を評価する方法であって、対象から得られる試料をβＧＢＰと接触させるステップであり、前記試料が細胞を含むステップと、βＧＢＰとの接触が、前記細胞に対するアポトーシス促進効果を有するかどうかを決定するステップとを含み、アポトーシス促進効果が観察される場合、βＧＢＰを用いる対象の治療が、アポトーシスをもたらすことが予想される方法を提供する。
【０１５５】
その後、アポトーシスは、試料の細胞と等価である又は同様の細胞において起こることが予想されるであろう。したがって、アポトーシスが試料において観察された場合、βＧＢＰは、たとえば、適切なアポトーシス促進性の治療薬であると考えることができる。さらなる分裂促進刺激が提供される場合のみ、アポトーシスが試料において観察される場合、βＧＢＰは、アポトーシスの誘発ではなく細胞成長を阻止するのにのみ適していると考えることができる。その代わりに、アポトーシスの誘発が好ましい場合、適切な分裂促進刺激に加えたβＧＢＰの投与が指示されるであろう。
【０１５６】
好ましい実施形態において、細胞は、過剰増殖性の細胞、新生細胞、癌細胞、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、持続的に分裂するリンパ球、活性化炎症細胞、若しくは活性化内皮細胞である又はそれと疑われる。
【０１５７】
好ましい実施形態において、前記細胞は、高い内在性の分裂促進能を有し、分裂促進刺激を受け、急速に分裂する細胞であり、又は持続的に分裂する細胞である。
【０１５８】
好ましい実施形態において、この方法は、前記細胞の分裂促進刺激をさらに含む。
【０１５９】
好ましい実施形態において、分裂促進刺激は、細胞をホルモン、成長因子、又はリンパ球上の受容体に結合する抗原決定基と接触させるステップを含む。
【０１６０】
好ましい実施形態において、分裂促進因子は、エストロゲン、アンドロゲンであるホルモンであり、チロシンキナーゼ受容体に結合する成長因子、Ｇタンパク質共役受容体に結合する成長因子、又は免疫細胞上の受容体に結合する抗原決定基であり、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、又はＭＨＣ分子である。
【０１６１】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、又は身体から取り出された試料に対して実行してもよく、試料は、細胞を含み、この試料又はその一部分は、その後に、身体に戻される。
【０１６２】
上記に記載される使用及び方法において、形質転換細胞、不死化細胞、及び新生細胞が言及される。「不死化細胞」は、ランダム突然変異又は計画的な改変のいずれかを通して無限に増殖するための能力を獲得した細胞である。細胞は、たとえばテロメラーゼ遺伝子の人為的な発現によって不死化してもよく、又はランダム突然変異によって自然に不死化してもよい（たとえば、細胞培養において獲得）。「新生細胞」は、新生物に由来する細胞である。上記の新生物及び癌の説明に言及される。
【０１６３】
本発明の化合物、方法、及び使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける状況において適用を見つけてもよいことが意図される。さらなる適用は、上記に説明されるように、身体から取り出された試料（時に、ｅｘ  ｖｉｖｏ試料として記載される）に対して意図される。
【０１６４】
したがって、本発明はまた、形質転換細胞との関連において使用することができる。「形質転換細胞」とは、外因性のＤＮＡ又はＲＮＡの導入によって改変された細胞を意味する。
【０１６５】
本発明の教示は、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて又は身体から取り出され、ある期間、培養において維持される場合に、生物全体及び前記生物の個々の細胞に適用されることが十分に理解されるであろう。試料又は培養細胞を含んでいてもよい試料の一部分は、取り出された後に生物に戻されてもよい。
【０１６６】
その代わりに、本発明の教示は、培養において成長させた細胞株に適用してもよい。そのような培養細胞株は、当業者に知られている任意の種類のもの、たとえば、さらなる改変を任意選択で含む初代細胞培養物又は安定細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）であってもよい。培養細胞株は、特定の癌細胞株を含んでいてもよい。実施例において下記に説明される細胞株に特に言及される。
【０１６７】
本発明の教示は、治療シナリオ及び非治療シナリオに関する。それはまた、美容の状況において適用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ａ及びＣ）Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答。成長曲線における点線は、アポトーシス事象の発生の時間を明示する。値は、３回の培養の平均＋／−ＳＥＭである。
【図１Ｂ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。（図１Ｂ及びＤ）３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰを用いる処理の後のアポトーシス事象の逐次的な発現。左から右：テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）によって評価されるミトコンドリア膜電位の消失；アネキシンＶ染色によって評価される、形質膜でのホスファチジルセリンの配向；カスパーゼ３活性及びＤＮＡ断片化（ＴＵＮＥＬ）。アポトーシス細胞は、円で囲まれたエリアにある。値は、アポトーシス細胞のパーセンテージである。上パネル：コントロール；下パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図１Ｃ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ａ及びＣ）Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答。成長曲線における点線は、アポトーシス事象の発生の時間を明示する。値は、３回の培養の平均＋／−ＳＥＭである。
【図１Ｄ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ｂ及びＤ）３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰを用いる処理の後のアポトーシス事象の逐次的な発現。左から右：テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）によって評価されるミトコンドリア膜電位の消失；アネキシンＶ染色によって評価される、形質膜でのホスファチジルセリンの配向；カスパーゼ３活性及びＤＮＡ断片化（ＴＵＮＥＬ）。アポトーシス細胞は、円で囲まれたエリアにある。値は、アポトーシス細胞のパーセンテージである。上パネル：コントロール；下パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図１Ｅ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ｅ及びＨ）キナーゼアッセイにおいて免疫沈降ＰＩ３Ｋから生成され、競合ＥＬＩＳＡにおいて評価されるＰＩ（３，４，５）Ｐ３として測定される、３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰによるクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋ活性の阻害。値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図１Ｆ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （Ｆ及びＩ）ａｋｔ  ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベル。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図１Ｇ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ｇ及びＪ）リン酸化（Ｓｅｒ  ４７３）Ａｋｔ及び全Ａｋｔタンパク質。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図１Ｈ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ｅ及びＨ）キナーゼアッセイにおいて免疫沈降ＰＩ３Ｋから生成され、競合ＥＬＩＳＡにおいて評価されるＰＩ（３，４，５）Ｐ３として測定される、３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰによるクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋ活性の阻害。値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図１Ｉ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （Ｆ及びＩ）ａｋｔ  ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベル。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図１Ｊ】図１は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された、ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞におけるアポトーシス死に至る事象を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図１Ｇ及びＪ）リン酸化（Ｓｅｒ  ４７３）Ａｋｔ及び全Ａｋｔタンパク質。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ａ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ａ〜Ｃ）Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答。値は、３回の培養物からの平均＋／−ＳＥＭである。
【図２Ｂ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ａ〜Ｃ）Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答。値は、３回の培養物からの平均＋／−ＳＥＭである。
【図２Ｃ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ａ〜Ｃ）Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答。値は、３回の培養物からの平均＋／−ＳＥＭである。
【図２Ｄ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｄ〜Ｆ）播種の３日後にアネキシンＶ染色によって評価されたアポトーシス。アポトーシス細胞は、円で囲まれたエリアにある。値は、アポトーシス細胞のパーセンテージである。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｅ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｄ〜Ｆ）播種の３日後にアネキシンＶ染色によって評価されたアポトーシス。アポトーシス細胞は、円で囲まれたエリアにある。値は、アポトーシス細胞のパーセンテージである。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｆ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｄ〜Ｆ）播種の３日後にアネキシンＶ染色によって評価されたアポトーシス。アポトーシス細胞は、円で囲まれたエリアにある。値は、アポトーシス細胞のパーセンテージである。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｇ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｇ〜Ｉ）図１に記載したように評価された、３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰによるクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋの阻害。値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図２Ｈ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｇ〜Ｉ）図１に記載したように評価された、３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰによるクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋの阻害。値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図２Ｉ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｇ〜Ｉ）図１に記載したように評価された、３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰによるクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋの阻害。値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図２Ｊ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｊ〜Ｌ）ａｋｔ  ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベル。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｋ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｊ〜Ｌ）ａｋｔ  ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベル。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｌ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｊ〜Ｌ）ａｋｔ  ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベル。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｍ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｍ〜Ｏ）リン酸化（Ｓｅｒ  ４７３）Ａｋｔ及び全Ａｋｔタンパク質。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｎ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｍ〜Ｏ）リン酸化（Ｓｅｒ  ４７３）Ａｋｔ及び全Ａｋｔタンパク質。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図２Ｏ】図２は、非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対する応答を示す。すべてのパネルにおいて、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図２Ｍ〜Ｏ）リン酸化（Ｓｅｒ  ４７３）Ａｋｔ及び全Ａｋｔタンパク質。左パネル：コントロール；右パネル：３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰで処理された細胞。
【図３】図３は、内因性の、強化された分裂促進性の入力の反映としてのＥＲＫレベルを示す。分裂促進性の増殖の間の２日目又は３日目に評価したリン酸化ＥＲＫ及び全ＥＲＫタンパク質（ＳＫＢＲ３）。
【図４Ａ】図４は、ＥＲＫ、ａｋｔ遺伝子、ＰＩ３Ｋ、及びβＧＢＰの間の機能的なつながりについての提唱モデルを示す。発明者らは、この点に関して理論によって拘束されることを望まない。  （図４Ａ）強力な分裂促進性シグナル伝達は、ＥＲＫ活性及びａｋｔ遺伝子発現を高め、これは、ＰＩ３Ｋ活性が必要とされるものであり、細胞増殖及び生存を促進する。ＥｒｂＢ２及びＲａｓに加えて、他の癌遺伝子の過剰発現は、同じ効果を誘発するであろうということが予想される。
【図４Ｂ】図４は、ＥＲＫ、ａｋｔ遺伝子、ＰＩ３Ｋ、及びβＧＢＰの間の機能的なつながりについての提唱モデルを示す。発明者らは、この点に関して理論によって拘束されることを望まない。  （図４Ｂ）細胞増殖は、強力な分裂促進性シグナル伝達によって強化され続けるが、βＧＢＰによるＰＩ３Ｋ活性の阻害は、ａｋｔ遺伝子機能の消失及びアポトーシス死に至る。
【図５Ａ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ａ〜Ｃ）ＥＲＫリン酸化、細胞増殖、及びａｋｔ遺伝子発現に対するコレラ毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）の効果。Ｂにおける値は、３回の培養の平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ｂ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ａ〜Ｃ）ＥＲＫリン酸化、細胞増殖、及びａｋｔ遺伝子発現に対するコレラ毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）の効果。Ｂにおける値は、３回の培養の平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ｃ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ａ〜Ｃ）ＥＲＫリン酸化、細胞増殖、及びａｋｔ遺伝子発現に対するコレラ毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）の効果。Ｂにおける値は、３回の培養の平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ｄ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ｄ）ナイーブ細胞及び１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素で処理された細胞における、播種から３時間目に添加された２０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に応じる成長曲線。値は、３回の培養物からの平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ｅ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ｅ〜Ｇ）播種から３時間目に添加された２０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰ、１０ｎＭワートマニン、又は２０ｎＭ  ＬＹ２９４００２で処理されたＭＣＦ−７ＣＴｘ細胞におけるＰＩ３Ｋ活性及びａｋｔ  ｍＲＮＡのレベルのダウンレギュレーションの間の関係。ＰＩＰ３値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ｆ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ｅ〜Ｇ）播種から３時間目に添加された２０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰ、１０ｎＭワートマニン、又は２０ｎＭ  ＬＹ２９４００２で処理されたＭＣＦ−７ＣＴｘ細胞におけるＰＩ３Ｋ活性及びａｋｔ  ｍＲＮＡのレベルのダウンレギュレーションの間の関係。ＰＩＰ３値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ｇ】図５は、高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰでの処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答を示す。  （図５Ｅ〜Ｇ）播種から３時間目に添加された２０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰ、１０ｎＭワートマニン、又は２０ｎＭ  ＬＹ２９４００２で処理されたＭＣＦ−７ＣＴｘ細胞におけるＰＩ３Ｋ活性及びａｋｔ  ｍＲＮＡのレベルのダウンレギュレーションの間の関係。ＰＩＰ３値は、３回の読み取り値の平均＋／−ＳＥＭである。
【図６Ａ】図６は、３つの結腸癌細胞株についての、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答を示す。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図６Ａ）ＳＷ４８０、（図６Ｂ）ＳＷ６２０、及び（図６Ｃ）ＬｏＶｏ。
【図６Ｂ】図６は、３つの結腸癌細胞株についての、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答を示す。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図６Ａ）ＳＷ４８０、（図６Ｂ）ＳＷ６２０、及び（図６Ｃ）ＬｏＶｏ。
【図６Ｃ】図６は、３つの結腸癌細胞株についての、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰに対する細胞増殖の速度及び細胞応答を示す。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、播種の３時間後に添加された。  （図６Ａ）ＳＷ４８０、（図６Ｂ）ＳＷ６２０、及び（図６Ｃ）ＬｏＶｏ。
【０１６９】
［発明の説明］
驚いたことに、βＧＢＰは、ＰＩ３Ｋ活性を阻害し、ａｋｔ遺伝子の発現を低下させることが分かった。予想外に、βＧＢＰで処理される侵襲性癌細胞は、ａｋｔ  ｍＲＮＡのレベルの低下の初期事象に応じて、２〜３回の細胞分裂の後に遅延した大量のアポトーシスを起こす。同様に、βＧＢＰは、Ｔ細胞などのような活性化された、持続的に分裂するリンパ球においてアポトーシスを誘発するが、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）細胞に危害を加えない。興味深いことに、正常様細胞（侵襲性又は過剰増殖性の細胞を人為的に生じさせるため）、それほど侵襲性ではないタイプの癌細胞、又は活性化Ｔ細胞などのようなリンパ球の分裂促進性の形質を増加させると、そのような細胞を、βＧＢＰによって誘発されるアポトーシスに対してより感受性にする。等価な結果は、結腸癌細胞において見られるが、他の癌タイプについてよりもはるかに低用量である。
【０１７０】
アポトーシス：ＰＩ３Ｋ阻害及びａｋｔ遺伝子サイレンシングの間の相関関係
βＧＢＰが、侵襲性癌における内因性分裂促進性シグナル伝達の力に打ち勝つことができるかどうかを決定するために、高レベルのＥｒｂＢ２を発現するＢＴ４７４乳癌細胞及びＳＫＢＲ３乳癌細胞（Ｈｙｎｅｓら、１９８９年）が検査された。βＧＢＰは、２〜３世代サイクルの後まで、細胞複製に対する効果を事実上、有していなかったが、急激な細胞死は、ミトコンドリア膜電位における変化、形質膜の機能的な変化、カスパーゼ３活性化、及びＤＮＡ断片化によって立証される急性の、一連のアポトーシス事象によって引き起こされたことが分かった（図１Ａ〜Ｄ）。ＥＲＫリン酸化における変化はなく、一方で細胞複製は引き続き影響されなかったが、リン酸化Ａｋｔの消失及びＡｋｔタンパク質の消失は、アポトーシスプロセスに先行したことが観察された（図１Ｇ及びＪ）。
【０１７１】
Ａｋｔタンパク質の消失が、転写事象又は転写後事象に帰する可能性があるかどうかを決定するために、ａｋｔ  ｍＲＮＡのレベルが評価された。図１Ｆ及びＩは、βＧＢＰの添加から１日以内に、ａｋｔ  ｍＲＮＡが、事実上、検出不可能になったことを示す。リン酸化Ａｋｔの消失は、１つの考えられる説明として、ＰＩ３Ｋ活性及びＡｋｔ動員の消失を示す可能性があるが、ＰＩ３Ｋ活性が、ａｋｔ遺伝子発現に必要とされない限り及びβＧＢＰが、ＰＩ３Ｋ活性を阻害することができない限り、ａｋｔ  ｍＲＮＡの消失はないことが推論される。
【０１７２】
細胞のホスホイノシチドレベルは、ＰＩ３Ｋ酵素の機能的状態を直接表さないが、ＰＩ３Ｋ活性及びＰＴＥＮ活性の結果であるので、その機能的状態を直接評価するために、クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋを、ｐ８５αアダプターサブユニットの抗体を使用して、免疫沈降によって単離した。そして、共沈されたｐ１１０触媒サブユニット（Ｖａｎｈａｅｓｅｎｂｒｏｅｃｋら、２００１年）の、キナーゼ反応における標準的なホスファチジルイノシトール（４，５）Ｐ２（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール（３，４，５）Ｐ３（ＰＩＰ３）に変換する能力を、競合ＥＬＩＳＡにおいて、生成されたＰＩＰ３を測定することによって評価した。
【０１７３】
図１Ｅ及びＨは、ＰＩ３Ｋ活性のダウンレギュレーションが、βＧＢＰの添加の６時間後に、既に存在する初期事象であり、観察の期間を通じて維持されたことを実証する。時系列内でまとめると、これらの結果は、ＢＴ４７４細胞及びＳＫＢＲ３細胞へのβＧＢＰの添加が、ＰＩ３Ｋ活性のダウンレギュレーション、ａｋｔ遺伝子発現の消失、Ａｋｔ機能の消失、及びアポトーシスをもたらしたことを示す。
【０１７４】
ＥＲＫ、ａｋｔ遺伝子、ＰＩ３Ｋ、及びβＧＢＰは、機能的に関係する
強力な分裂促進性の圧力によって駆動される癌細胞は、βＧＢＰサイトカインの成長阻害効果に対して非応答性であることが示されているが（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、２００３年、Ｗｅｌｌｓ及びＭａｌｌｕｃｃｉ  １９９１年）、図１の証拠は、分裂促進性の入力の上昇に対して、対応する生存シグナル伝達の上昇は、分裂促進性の増殖を保護するであろうが、βＧＢＰが、ＰＩ３Ｋ活性のダウンレギュレーション及びａｋｔ遺伝子機能の結果的な遮断によって中断することができる状態を生じさせる可能性があることを示唆する。
【０１７５】
この仮説の妥当性を試験するために、発明者らは、非癌性細胞における分裂促進性の圧力を実験的に強化した。使用された細胞は、正常様の挙動を示す、自然に不死化されたＭＣＦ１０Ａ乳管細胞（Ｓｏｕｌｅら、１９９０年）、バリン１２で突然変異した構成的に活性のｐ２１Ｒａｓを用いて、安定に形質移入されたＭＣＦＩ０Ａ細胞（Ｓｃｈｕｌｚｅら、２００１年）（ＭＣＦ１０ＡＶ１２Ｒａｓ）、これは、Ｒａｆ−ＥＲＫシグナル伝達を強く活性化する（Ｒｅｐａｓｋｙら、２００４年）、及び分裂促進性の入力がアデニルシクラーゼのアップレギュレーションを介してＥＲＫ活性を増加させる（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００２年）コレラ毒素の添加によって増強されたＭＣＦ１０Ａ細胞（ＭＣＦ１０ＡＣＴｘ）である。
【０１７６】
以下の概念が検査された：分裂促進性の圧力は、増殖速度及びβＧＢＰに対する細胞応答に影響するかどうか；分裂促進性の入力及びａｋｔ  ｍＲＮＡレベルの間に相関関係があるかどうか；βＧＢＰは、ＰＩ３Ｋ活性に影響するかどうか、並びにＰＩ３Ｋ活性及びａｋｔ遺伝子発現の間に相関関係があるかどうか。
【０１７７】
細胞増殖は、Ｖ１２Ｒａｓ及びコレラ毒素によって増大され、βＧＢＰに対する応答、２〜３細胞複製サイクルの後の急激な細胞死は、ナイーブＭＣＦ１０Ａ細胞においてβＧＢＰによって及ぼされた小さな効果とは対照的に、ＢＴ４７４細胞及びＳＫＢＲ３細胞を模倣したことが分かった（図２Ａ〜Ｃ及びＤ〜Ｆ）。ナイーブ細胞において、かろうじて検出可能であるが、Ｖ１２  Ｒａｓ、又はコレラ毒素のいずれにせよ、分裂促進性の入力が高められた場合に、より著しく発現されるようになったａｋｔ  ｍＲＮＡレベルにおける変化によって示されるように、相関関係もまた、分裂促進性の圧力及びａｋｔ遺伝子発現の間で見つかった（図２Ｊ〜Ｌ、左パネル）。
【０１７８】
βＧＢＰが、ＰＩ３Ｋ活性及びａｋｔ遺伝子発現に影響するかどうかの検査は、すべての場合において、βＧＢＰが、分裂促進性の入力にかかわらず、ＰＩ３Ｋ活性を下げ、基本レベルより下に維持し（図２Ｇ〜Ｉ）、パターンは、ＥｒｂＢ２陽性細胞において観察されたものと同様であったが、ａｋｔ  ｍＲＮＡのより遅い消失と一致して、６〜２４時間、遅れ（図２Ｋ、右パネル）、細胞は、Ｖ１２  Ｒａｓによって与えられる強力な分裂促進性シグナル伝達によって駆動されたことを示した。図１の細胞と同様に、すべての上記の細胞において、ＰＩ３Ｋ活性のダウンレギュレーションは、ａｋｔ  ｍＲＮＡの事実上の欠如（図２Ｊ〜Ｌ、右パネル）及びそれに引き続くＡｋｔ機能の消失（図２Ｍ〜Ｏ）をもたらした。明白に、ＰＩ３Ｋ阻害、ａｋｔ  ｍＲＮＡの消失、及びＡｋｔの消失の時系列は、ＢＴ４７４細胞及びＳＫＢＲ３細胞において観察されたパターンにならった。
【０１７９】
低レベルのａｋｔ  ｍＲＮＡを有するナイーブ正常様ＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＰＩ３Ｋ活性の阻害及びａｋｔ遺伝子機能の消失によりアポトーシスに至らなかったことは、生存シグナル伝達の消失が異常な分裂促進性の圧力の非存在下においては有害ではないことが示されるように、治療において特に重要である。理論によって拘束されることを望むものではないが、これは、それらの薬剤抵抗性誘導体を含む癌細胞を殺す一方（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、２００３年、Ｒａｖａｔｎら、２００５年）、正常細胞に対して危害を引き起こさない（Ｗｅｌｌｓ及びＭａｌｌｕｃｃｉ  １９９１年）βＧＢＰの選択的な効果について１つの考えられる説明である。
【０１８０】
上記のデータは、図１のデータと共に、ＥＲＫリン酸化の程度によって表されるような強力な分裂促進性の圧力は、構成的なもの又は誘発されるもののいずれにせよ（図３）、ａｋｔ遺伝子発現の上昇と共役することを示す。まとめると、本明細書において記載される観察は、ＥＲＫ活性の増強が、ＰＩ３Ｋ活性が必要とされるａｋｔ遺伝子発現をアップレギュレートすることによって細胞生存を増強し（図４Ａ）、ＰＩ３Ｋ活性をダウンレギュレートし、ａｋｔ遺伝子機能を打ち消すことによって、βＧＢＰが、生存シグナル伝達に対する癌細胞の依存を中断し、細胞をアポトーシス死に導く（図４Ｂ）モデルを支持する。
【０１８１】
本明細書において提示される観察が、細胞周期促進遺伝子の活性化（Ｋａｒｉｎ及びＨｕｎｔｅｒ  １９９５年）から生存を促進するａｋｔ遺伝子の活性化までＥＲＫの役割を広げる、転写コントロールにおける新しい機能的な側面に注意を向けることは、ＥＲＫ／ａｋｔ遺伝子の関連内で注目に値する。明白に、Ｖ１２Ｒａｓ又はコレラ毒素のいずれにせよ、活性ＥＲＫレベルを高めることが、ＰＩ３Ｋ活性に対していくらかの効果を有したといった証拠は、見つからなかった。
【０１８２】
癌表現型及び細胞脆弱性
ＭＣＦ１０Ａ細胞において、強化された分裂促進性の圧力の結果としての表現型の挙動におけるシフトが、細胞のβＧＢＰに対する応答を、ＳＫＢＲ３癌細胞及びＢＴ４７４癌細胞を模倣するように変化させたという証拠は、癌細胞において、より侵襲性の状態へのシフトは、βＧＢＰに対するそれらの脆弱性を増加させるかどうかといった問題を提起する。
【０１８３】
そのため、ＭＣＦ−７乳癌細胞が検査された。これらの細胞は、低レベルのＥｒｂＢ２を有し、侵襲性の挙動を示さない（Ｋａｒａｎｕｇａｒａｎら、１９９６年）。ＭＣＦ−７細胞は、それらのナイーブ状態において及びコレラ毒素を用いて処理された場合で（ＭＣＦ−７ＣＴｘ）検査された。
【０１８４】
コレラ毒素は、活性ＥＲＫレベルを高め、細胞増殖を加速し、ａｋｔ遺伝子発現を強め、したがって、細胞の表現型の挙動を変化させたことが分かった（図５Ａ〜Ｃ）。βＧＢＰに対するそれらの応答の検査は、以前に報告されたように（Ｒａｖａｔｎら、２００５年）、βＧＢＰがナイーブＭＣＦ−７細胞に及ぼした成長阻害効果を無効にする一方、ＭＣＦ−７ＣＴｘ細胞は、ナイーブ対応物に先立って全死したこと（図５Ｄ）を示し、したがって、ＥＲＫ活性及びａｋｔ遺伝子発現が増強される場合、ａｋｔ遺伝子機能の停止は、より強い細胞脆弱性をもたらすことができるといった原理の証拠が確認された。
【０１８５】
次に、ＭＣＦ−７ＣＴｘ細胞において、ＰＩ３Ｋは、なおまた、βＧＢＰの作用に対する主要なレスポンダーであるかどうか、そして、それであれば、ａｋｔ遺伝子発現の打ち消しは、ＰＩ３Ｋ活性の阻害の結果であるかどうかを調査した。
【０１８６】
そのため、時間尺度実験は、ワートマニン（Ｐｏｗｉｓら、１９９４年）及びＬＹ２９４００（Ｖｌａｈｏｓら、１９９４年）と並行に、βＧＢＰを使用して実行された。両化合物は、ＰＩ３Ｋのｐ１１０触媒サブユニットの薬理学的阻害剤であり（Ｗａｌｋｅｒら、２０００年、Ｗｙｍａｎｎら、１９９６年）、βＧＢＰと同様の効果をもたらす濃度で添加された。
【０１８７】
ＰＩ３Ｋ活性及びａｋｔ  ｍＲＮＡレベルは、異なる時点で評価された。ＰＩ３Ｋ活性は、ａｋｔ遺伝子発現に必須の必要条件であり、基本の又は基本に近い内因性レベルは、十分であることを示す証拠が見つけられた。図５Ｅ〜Ｇは、βＧＢＰが、生理的エフェクター分子の作用に従って、２つの阻害剤と同様の程度まで、ＰＩ３Ｋ活性を下げたが、緩やかな動態であり、ＰＩ３Ｋ活性が、３つの実例すべてにおいて、基本レベルより下の約３５％量、同様に下降した場合、ａｋｔ遺伝子発現が打ち消されたことを示す。
【０１８８】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達カスケードは、癌化におけるその役割についての並びに侵襲性及び療法に対する抵抗性に対するその重大な貢献についての集中的な調査下にある（Ｌｕら、２００３年、Ｃｈｅｎら、２００５年、Ｍｏｒｇｅｎｓｚｔｅｒｎ及びＭｃＣｌｅｏｄ  ２００５年）。本発明者らは、選択的ＰＩ３Ｋ標的作用物質としてβＧＢＰサイトカインを同定した、またＰＩ３Ｋ及びａｋｔ遺伝子の間の機能的依存性の第１の証拠並びに生理的分子によるａｋｔ遺伝子の治療サイレンシングによる、侵襲性癌細胞の有効な治療についての第１の証拠を提供する。
【０１８９】
結論として、本発明者らは、正常細胞（Ｗｅｌｌｓ及びＭａｌｌｕｃｃｉ  １９９１年）及びいくつかの癌細胞（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、２００３年）の両方において、細胞周期進行を阻止するその能力に反して、、βＧＢＰが、強力な分裂促進性の入力によって駆動される細胞における細胞増殖に影響し得なかったことを示した。しかしながら、ＰＩ３Ｋ及びａｋｔ遺伝子の間の機能的なつながりをコントロールすることによって、βＧＢＰは、正常様の挙動を示す細胞を危険にさらすことなく、強力な治療効能を有する。
【０１９０】
発明者らは、ＥＲＫ、ａｋｔ遺伝子、ＰＩ３Ｋ及びβＧＢＰが機構的に関係し、ＰＩ３Ｋが、βＧＢＰが作用する中心的な要素であるといった仮説を立てる。βＧＢＰによるクラスＩＡ  ＰＩ３Ｋのｐ１１０触媒サブユニットの機能的な阻害の後に、ａｋｔ遺伝子発現の抑止及び、その他の場合では高くないが、ＥＲＫ及びａｋｔ  ｍＲＮＡのレベルが高い細胞におけるアポトーシス死が続く。阻害パターン及び阻害作用が有効になるのに必要とされる時間の両方に関して、ワートマニン及びＬＹ２９４００２とβＧＢＰとの効果の類似性は（図５Ｅ〜Ｇ）、２つの阻害剤と同様に、βＧＢＰが、ＰＩ３Ｋのｐ１１０触媒サブユニットの調節ポケット部位の機能的な能力を低下させるであろうコンホメーション変化を誘発する可能性があることを示唆する（Ｗａｌｋｅｒら、２０００年）。
【０１９１】
ＰＩ３キナーゼ及びＲａｓは、機能的に関連している。この関連は、βＧＢＰによって抑制される。ＰＩ３キナーゼのｐ１１０触媒サブユニットは、βＧＢＰによって阻害される。したがって、正常細胞において、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達は、βＧＢＰによって遮断される。ＰＩ３キナーゼ活性は、βＧＢＰによってダウンレギュレートされ、Ｒａｓ−ＧＴＰローディングの抑制、ＭＡＰＫ活性化の結果的な消失を導き、βＧＢＰの成長阻害特性に対する感受性を保持する細胞との関連において、細胞増殖が遮断される。成長の阻害を伴うβＧＢＰに対してもはや応答しない細胞（たとえば、持続的に分裂する細胞などのような、本発明によって標的とされるような細胞）において、ＰＩ３Ｋ活性の阻害の最終的な結果は異なる。むしろ、本発明の持続的に分裂する細胞において、分裂促進性の入力が強すぎるので、Ｒａｓ−ＭＡＰＫローディングに対する効果は見られない。しかしながら、そのような細胞において、ａｋｔ遺伝子発現のサイレンシングは、最終的に、アポトーシスをもたらす。
【０１９２】
本明細書において示される、遺伝子発現のＰＩ３Ｋ活性への依存は、ａｋｔ遺伝子に限られ得ない遺伝子コントロールにおける新しい側面である。
【０１９３】
多くのヒト腫瘍において欠失及び転座を受けるシンテニー群（Ａｕｒｉａｓら、１９８４年、Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌら、１９９８年、Ｂｒｉｄｇｅら、１９９０年、Ｒｅｙら、１９９３年）である、ｓｉｓ／ＰＤＧＦＢ相同領域（ｍｕ染色体１５Ｅ／Ｈｕ染色体２２  ｑ１２〜ｑ１３）（Ｂａｌｄｉｎｉら、１９９３年）におけるβＧＢＰをコードする遺伝子のマッピング（Ｃｈｉａｒｉｏｔｔｉら、１９９１年）は、予期される腫瘍抑制遺伝子としてのβＧＢＰ遺伝子に注目をもたらすことは、ＰＩ３Ｋ阻害及びａｋｔ遺伝子機能の抑制の文脈で興味深い。
【０１９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性及び安全性
βＧＢＰは、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の出現を完全に予防することができる。５×１０６  ＳＴ４（ヒト悪性Ｔ細胞白血病）細胞は、０日目に皮下注射された。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、皮下注射によって、１日目〜１６日目に投与された。結果は、下記の表１において示される。
【０１９５】
【表１】
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【０１９６】
低用量での結腸癌に対するβＧＢＰの有効性
上記に記載されるように、βＧＢＰは、様々な癌タイプからの細胞において、成長を阻害する及び／又はアポトーシスを促進することが分かる。しかしながら、様々な癌タイプにおけるβＧＢＰによる効果をスクリーニングするための実験において、βＧＢＰは、他の癌タイプについて観察されるよりも、はるかに低用量で結腸癌細胞において有効であったことが、驚いたことに、注目された。
【０１９７】
βＧＢＰに対するアポトーシス促進性の応答について試験された乳癌、卵巣癌、口腔癌、前立腺癌及び白血病細胞において、細胞培養における有効量は、１５〜３０ｎＭであった。結腸癌細胞において、βＧＢＰによる効果は、はるかに低い濃度で観察された。
【０１９８】
これらの観察結果を確認するために、３つの結腸癌細胞株、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、及びＬｏＶｏが調査された。細胞は、培養液中で成長させ、様々な濃度のβＧＢＰと共にインキュベートした。結腸癌細胞株はすべて、他の癌細胞株よりもβＧＢＰのアポトーシス促進効果に対してはるかに感受性であったことが分かった。１〜２ｎＭもの低い濃度でも、アポトーシスを誘発するのに有効であることが観察された（図６）。いくつかの状況において、さらに低い濃度のβＧＢＰが有効であり得る。
【０１９９】
初期の成長についての同様の動態、その後に続く細胞数における急激な低下は、ＢＴ４７４細胞及びＳＫＢＲ３細胞（図１Ａ及びＣ）、ＭＣＦ１０ＡＶ１２Ｒａｓ細胞及びＭＣＦ１０ＡＣＴｘ細胞（図２Ｂ及びＣ）、並びにコレラ毒素を用いて処理されたＭＣＦ−７細胞（図５）について以前に観察されたものと同様の様式において、それぞれの結腸癌細胞株について観察された（図６）。これは、βＧＢＰが、他の癌細胞株に対して効果を有するように、結腸癌細胞に対して等価な効果を有するが、濃度が１５〜３０分の１であることを実証する。
【０２００】
この結果は、βＧＢＰによる、他の癌細胞株における、成長効果の阻害又はアポトーシスの誘発についての広く同様の有効濃度の範囲を考慮すれば、予想外である。したがって、治療効果が、はるかに低いβＧＢＰ用量で可能である可能性があるので、βＧＢＰは、結腸癌の治療に特に適しているように思われる。
【０２０１】
要約
そのため、本発明は、いくつかの治療上妥当な態様に関する。第１に、酵素ＰＩ３キナーゼの活性に対する阻害効果は、βＧＢＰについて実証された。
【０２０２】
第１に、分裂促進性の圧力は、内因性のもの又は強化されるもののいずれにせよ、癌細胞を、βＧＢＰサイトカインを用いる治療に対して、高度に脆弱にするという証拠（図１及び５）は、この生理的分子が、侵襲性癌の治療に対する特有の治療関連性を有しうることを示唆する。
【０２０３】
第２に、相対的に低レベルの活性ＥＲＫ及び低レベルのａｋｔ  ｍＲＮＡを有するナイーブＭＣＦ１０Ａ細胞が、βＧＢＰの攻撃によって害を受けないという図２の証拠は、βＧＢＰは、細胞の特有の分子の状況に従ってアポトーシスを選択的に誘発するための能力を有することを示唆する。この特性は、薬理学的化合物とは共有されないものである。有意に、図３の証拠もまた、分裂促進性シグナル伝達の増加が腫瘍形成に至る事象の中の最初の出来事である場合、監視の役割において内因的に産生されるβＧＢＰによって健常生物において発生期の癌細胞を排除することができると思われることを示唆する（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、２００３年）。
【０２０４】
第３に、乳癌（Ｓｊｏｂｌｏｍら、２００６年）において高度な程度の突然変異多重度は、潜在的に相乗的な毒性を有する多数の薬の組合せが必要とされ得るが、我々の発見は、ある単一遺伝子、ａｋｔを、生理的エフェクター分子であるβＧＢＰによって無能にすると、突然変異の複雑性及び化学療法による不利益を回避することができることを示す。したがって、ことによるとβＧＢＰ以外の代替の作用物質を使用して、ａｋｔ遺伝子の発現を低下させることは、癌、特に乳癌の治療のための新しい治療経路となる。
【０２０５】
第４に、結腸癌細胞は、βＧＢＰによって誘発されるアポトーシスに特に感受性である。したがって、結腸癌は、βＧＢＰを用いる治療に特に適している標的である。
【０２０６】
最後に、侵襲性癌におけるβＧＢＰの臨床使用のためのモデルを提供する一方、本発明はまた、望ましくない細胞分裂が起こる他の状態、特に、自己免疫応答（たとえば自己免疫状態）及び移植器官、移植組織、又は移植細胞に対する免疫応答などのような、前記細胞分裂が、侵襲性又は過剰増殖性の挙動によって特徴づけられる状態におけるβＧＢＰの使用のための機構的根拠を提供する。
【０２０７】
［実施例］
実施例１  ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞に対するβＧＢＰによる効果
細胞培養：ＢＴ４７４細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）及び２０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養し、ＳＫＢＲ３細胞は、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＫ）中で成長させた。培養物は、空気中５％のＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃でインキュベートした。
【０２０８】
１×１０５細胞を、２５ｃｍ２フラスコ当たりに播種した又は３×１０５を、７５ｃｍ２フラスコ当たりに播種した。下記に説明されるように、細胞数（つまり成長速度）、アポトーシス、ＰＩ３Ｋ活性、ａｋｔ  ｍＲＮＡレベル、Ａｋｔタンパク質レベル、及びリン酸化Ａｋｔ（Ｐ−Ａｋｔ）タンパク質レベルをモニターする工程で個々のフラスコを消費してもよいように、十分な数のフラスコに並行して播種した。他に示されない限り、それぞれの結果は、１つのフラスコの細胞に対応する。
【０２０９】
成長速度：細胞は、トリプシン処理によってフラスコから取り出し、ＢＴ４７４細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＭＣＦ１０ＡＶ１２Ｒａｓ細胞及びＭＣＦ１０ＡＣＴｘ細胞について１、２、３、４及び５日目の時点で、細胞数を評価するために血球計においてカウントした。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、１、２、３及び４日目にモニターした。細胞数は、トリプリケートでカウントして決定した。
【０２１０】
βＧＢＰ：ヒト組換えβＧＢＰ（Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰ）は、ＰＥＴ２１ａ中で、ｈＧａｌ−１  ｃＤＮＡを使用して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、１９８９年）、ラクトース−アガロース（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって純度を評価した。
【０２１１】
Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、細胞を播種した３時間後に１５ｎＭ又は３０ｎＭの濃度で細胞培養物に添加した。コントロール細胞（０ｎＭ  βＧＢＰ）もまた調製した。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、細胞培養の時間経過を通じて、適切な濃度（それぞれ、０ｎＭ、１５ｎＭ、又は３０ｎＭ）で維持した。
【０２１２】
細胞蛍光定量法：アポトーシスは、下記に概説されるように、４つの基準を使用してモニターした。コントロール細胞（０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰ）は、ＢＴ４７４細胞について３日目及びＳＫＢＲ３細胞について４日目の時点で、３０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰを用いて培養した細胞と比較した。細胞は、洗浄し、トリプシンを使用して、フラスコから放出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。
【０２１３】
テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）染色は、ミトコンドリア膜電位の消失を評価するために使用した。ＰＢＳ中に懸濁した細胞を、４０ｕＭ  ＴＭＲＥ中で２０分間、３７℃でインキュベートし、遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中、５００ｕｌの２００ｎｇ／ｍｌ  ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）中に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって５７５及び４４０ｎｍで分析した。
【０２１４】
形質膜ホスファチジルセリンの再分布は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して評価した。２．５ｕｇ／ｍｌアネキシンＶ−ＦＩＴＣを含む、５００ｕｌ  １０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２中に懸濁した細胞を、２０分間、室温で、暗中においてインキュベートし、２００ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを添加し、細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって５４０ｎｍ及び４４０ｎｍで分析した。
【０２１５】
カスパーゼ３活性を、蛍光産物への非蛍光ＰｈｉＰｈｉＬｕｘの切断（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ、ＭＡ）によって測定した。５００μｌの３０μＭ  ＰｈｉＰｈｉＬｕｘのＰＢＳ溶液中に懸濁した細胞を、６０分間、３７℃でインキュベートし、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、２００ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含む３００μｌ  ＰＢＳ中に再懸濁し、５７５ｎｍ及び４４０ｎｍで分析した。
【０２１６】
鎖切断ＤＮＡ断片化は、メーカー指示に従って、Ａｐｏ−Ｂｒｄｕキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）を使用して、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）によって分析し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０２１７】
ＰＩ３キナーゼアッセイ：競合ＥＬＩＳＡは、播種から０、６、１２、１８、及び２４時間の時点でのＰＩ３キナーゼ活性を評価するために使用した。３０ｎＭ  βＧＢＰは、播種の３時間後に細胞に添加した。アッセイはトリプリケートで行った。
【０２１８】
５×１０６細胞を、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  オルトバナジン酸Ｎａ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）（緩衝液Ａ）を用いて３回洗浄し、氷上で２０分間、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）及び１％ＮＰ４０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充した１ｍｌの同じ緩衝液中に溶解した。溶解物は、不溶性物質を除去するために１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清は−８０℃で保存した。
【０２１９】
６００μｇタンパク質を含有する凍結溶解物を、氷上で解凍し、ＰＩ３キナーゼは、回転輪上で、４℃で、１時間、５μｌ抗ＰＩ３キナーゼｐ８５（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）とのインキュベーションによって免疫沈降し、その後、４℃で、１時間、ＰＢＳ中のプロテインＡアガロース（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）ビーズの５０％のスラリーの６０μｌを添加した。免疫沈降された酵素は、１０秒間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集した。ペレットは、１％ＮＰ４０を加えた緩衝液Ａ中で３回、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．１ｍＭ  バナジン酸Ｎａ中で３回、及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＝ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  バナジン酸Ｎａを用いて２回洗浄した。
【０２２０】
１１０μｌキナーゼ反応緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μＭ  ＡＴＰ）中に再懸濁したペレットは、４０ｐｍｏｌ  ＰＩ（４，５）Ｐ２基質（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）と共に、３７℃で、３時間、水浴中でインキュベートした。反応は、５ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを用いて停止し、反応混合物は、４℃で１３０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０２２１】
上清は、競合ＥＬＩＳＡ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｋ−１０００、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）のためにマイクロタイタープレートに移入して、キナーゼ反応において生成されたＰＩ（３，４，５）Ｐ３を定量した。５０μｌ容量の上清のデュプリケートを、それぞれ、室温で、１時間、５０μｌの抗ＰＩ（３，４，５）Ｐ３抗体と共にインキュベートした。その後、反応混合物は、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を用いてコーティングしたマイクロタイタープレートに移入し、暗中において１時間、インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を加えたＴＢＳを用いる３回の洗浄の後に、抗ＰＩ（３，４，５）Ｐ３に対する１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗体をそれぞれのウェルに添加し、暗中において室温で１時間、インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたＴＢＳを用いるさらなる３回の洗浄の後に、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）を添加し、適切な時間（約２０分間）の後に、反応を、１００μｌ  ０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止した。
【０２２２】
試料の吸光度は、４５０ｎｍで測定し、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３は、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３標準曲線との比較によって定量した。標準曲線を導き出すための読み取り値は、実験試料のＥＬＩＳＡと並行して、ＰＩＰ３標準濃度を使用するＥＬＩＳＡから得た。標準曲線（示さず）は、対数目盛りでプロットした。したがって、実験試料について得られたＰＩ（３，４，５）Ｐ３濃度は、ＰＩＰ３標準曲線に対して直接比較することによって得られた。実験試料は、コントロール細胞からの試料及びβＧＢＰを用いて処理した細胞からの試料を含んだ。
【０２２３】
ノーザンブロット分析：全ＲＮＡは、メーカーの指示に従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を使用して細胞から抽出した。１０μｇ  ＲＮＡを、２．２Ｍホルムアルデヒド−１．２５％アガロースゲル上で実行した。ａｋｔ  ｍＲＮＡは、ａｋｔ遺伝子１、２、及び３を認識するｃＤＮＡプローブ（ＨＡ．Ａｋｔ）を使用して評価した。ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ）は、ＲＮＡのローディングコントロールのために使用した。
【０２２４】
ウエスタンブロット分析：細胞は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２．５μｇ／ｍｌロイペプチン、１％アプロチニン、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）中に溶解した。５０μｇのタンパク質を、１２％ポリアクリルアミドゲルにロードした。リン酸化Ａｋｔは、１：１０００抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して検出し、全Ａｋｔ１／２タンパク質は、１：１０００抗Ａｋｔ１／２（Ｈ１３６）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いてプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）は、１：１０００希釈で使用し、増強された化学発光によって視覚化した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）。アクチン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）は、添加コントロールとして使用した。
【０２２５】
結果を図１に示す。
【０２２６】
実施例２  非癌性細胞における分裂促進性の入力における変化及びβＧＢＰを用いる処理に対する応答
細胞培養：ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＶ１２Ｒａｓ細胞、及びＭＣＦ１０ＡＣＴｘ細胞は、５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＫ）、１０ｕｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、及び２０μｇ／ｍｌ上皮成長因子（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を加え、ＭＣＦ１０ＡＣＴｘ細胞の場合においては１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で成長させた。培養物は、空気中５％のＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃でインキュベートした。
【０２２７】
成長速度：細胞は、トリプシン処理によってフラスコから取り出し、ＭＣＦ１０ＡＶ１２Ｒａｓ細胞及びＭＣＦ１０ＡＣＴｘ細胞について１、２、３、４、及び５日目の時点で、細胞数を評価するために血球計においてカウントした。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、１、２、３、及び４日目にモニターした。細胞数は、トリプリケートで、血球計においてトリプシン処理細胞をカウントすることによって決定した。
【０２２８】
βＧＢＰ：Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、実施例１において記載されるように得て、細胞を播種した３時間後に１５ｎＭ又は３０ｎＭの濃度で細胞培養物に添加した。コントロール細胞（０ｎＭ  βＧＢＰ）もまた調製した。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、細胞培養の時間経過を通じて、適切な濃度（それぞれ、０ｎＭ、１５ｎＭ、又は３０ｎＭ）で維持した。
【０２２９】
細胞蛍光定量法：アポトーシスは、実施例１において記載されるように、アネキシンＶに対する参照によってモニターした。細胞は３日目の時点で分析した。形質膜ホスファチジルセリンの再分布は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して評価した。２．５ｕｇ／ｍｌアネキシンＶ−ＦＩＴＣを含む、５００ｕｌ  １０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２中に懸濁した細胞を、２０分間、室温で、暗中においてインキュベートし、２００ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを添加し、細胞を、５４０ｎｍ及び４４０ｎｍで分析した。
【０２３０】
ＰＩ３キナーゼアッセイ、ノーザンブロット分析、及びウエスタンブロット分析は、実施例１において既に記載されるように、これらの細胞に対して実行した。
【０２３１】
結果を図２に示す。
【０２３２】
実施例３  内因性の、強化された分裂促進性の入力の反映としてのＥＲＫレベル
細胞培養：ＢＴ４７４細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＭＣＦ１０Ａ細胞、ＭＣＦ１０ＡＶ１２Ｒａｓ細胞及びＭＣＦ１０ＡＣＴｘ細胞は、実施例２及び３において記載されるように培養した。βＧＢＰは培地中に含まなかった。播種から３日目に採取したＳＫＢＲ３細胞を除いて、細胞は、播種から２日目に採取した。
【０２３３】
ウエスタンブロット分析：ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の全レベル並びにＥＲＫ１及びＥＲＫ２のリン酸化レベルは、実施例１において記載されるものと同じプロトコールを使用して、ウエスタンブロットによって評価した。
【０２３４】
リン酸化ＥＲＫ１／２は、１：１０００抗ホスホｐ４４  ＥＲＫ１モノクローナル抗体及びｐ４２  ＥＲＫ２モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｓｔｏｎ（ＭＡ））を用いてプローブした。ｐ４４  ＥＲＫ１及びｐ４４  ＥＲＫ２の両方を認識する１：１０００抗ＥＲＫ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いて、非リン酸化ＥＲＫ１／２をプローブした。アクチン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を、ローディングコントロールとして使用した。
【０２３５】
結果を図３に示す。
【０２３６】
実施例４  高められた分裂促進性の入力及びＨｕ−ｒ−βＧＢＰを用いる処理に対するＭＣＦ−７細胞の応答
細胞培養：下記の手順において、ＭＣＦ−７細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を有するＲＰＭＩ培地中で成長させた。ＭＣＦ−７ＣＴｘ細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素を添加して同じ条件下で成長させた。必要とされる場合、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、実施例２に記載されるように得た。
【０２３７】
ＥＲＫレベル：ＥＲＫレベルに対する１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素の効果は、２日後に、評価し、コレラ毒素の非存在下において培養したコントロール細胞と比較した。ウエスタンブロットは、コレラ毒素の存在下又は非存在下において培養し、２日後に採取したＭＣＦ−７細胞に対して実行した。ＥＲＫ１及びＥＲＫ２並びにリン酸化ＥＲＫ１及びリン酸化ＥＲＫ２を検出するためのウエスタンブロットを、実施例１及び３において上記に記載されるように実行した。
【０２３８】
成長速度：細胞数は、４日間の時間経過にわたって測定した。細胞数は、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素の存在下又は非存在下においてインキュベートしたＭＣＦ−７細胞について０、１、２、３、４日目に評価した。細胞数は、実施例１において上記に説明されるように、トリプリケートで血球計カウントによって評価した。
【０２３９】
ノーザンブロット分析：細胞のｍＲＮＡのレベルは、実施例１において上記に説明されるように分析した。ａｋｔ  ｍＲＮＡレベルは、１、２、及び３日目の時点で、ＭＣＦ−７細胞を１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素を用いて培養した後に評価した。ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡは、以前のように、ローディングコントロールとして使用した。結果は、コレラ毒素の非存在下において培養したコントロールＭＣＦ−７細胞と比較した。
【０２４０】
βＧＢＰに応じる成長速度：細胞数は、６日間の時間経過にわたって測定した。細胞数は、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素の存在下又は非存在下においてインキュベートしたＭＣＦ−７細胞について０、１、２、３、４、５、及び６日目に評価した。
【０２４１】
Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、細胞を播種した３時間後に２０ｎＭの濃度でこれらの細胞培養物に添加した。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、細胞培養の時間経過を通じて維持した。
【０２４２】
細胞数は、実施例１において上記に説明されるように、トリプリケートで血球計カウントによって評価した。
【０２４３】
ＰＩ３キナーゼ活性のダウンレギュレーション及びａｋｔ  ｍＲＮＡレベルの間の関係：ＭＣＦ−７細胞は、上記に説明されるように培養した。細胞は、播種から３時間目に添加した２０ｎＭ  Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰ、１０ｎＭワートマニン、又は２０ｎＭ  ＬＹ２９４００２を用いて処理した。
【０２４４】
ＰＩＰ３レベル及びａｋｔ  ｍＲＮＡレベルは、播種から６、１２、１８、及び２４時間の時点でこれらの細胞中で測定した。
【０２４５】
ＰＩＰ３値は、実施例１において記載されるＰＩ３キナーゼアッセイのためのプロトコールに従って、トリプリケートで評価した。細胞のｍＲＮＡのレベルは、実施例１において上記に記載されるノーザンブロットプロトコールに従って分析した。
【０２４６】
結果を図５に示す。
【０２４７】
実施例４  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性及び安全性
メスＳＣＩＤマウスは、標準条件下で収容した。マウスは、４匹の４つのグループに分けた。６週齢で、５×１０６  ＳＴ４（ヒト悪性Ｔ細胞白血病）細胞を皮下注射した（０日目）。
【０２４８】
Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、実施例１において記載されるように得た。
【０２４９】
βＧＢＰは、個々の毎日の皮下注射によって、１日目〜１６日目に投与した。マウスのそれぞれのグループは、異なる用量のβＧＢＰを受けた。０ｎｇ／マウス（コントロール）、２０ｎｇ／マウス、２００ｎｇ／マウス、又は４００ｎｇ／マウス。
【０２５０】
腫瘍サイズは、カリパス測定によって４２日目又は９０日目に評価した。
【０２５１】
結果を表１に示す。
【０２５２】
実施例５  結腸癌細胞に対するβＧＢＰによる効果
細胞培養：ＳＷ４８０結腸癌細胞、ＳＷ６２０結腸癌細胞、及びＬｏＶｏ結腸癌細胞は、３７℃で、密封フラスコ中で、１０％ウシ胎児血清を有するＬｅｉｂｏｗｉｔｚ  Ｌ−１５培地中で成長させた。Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰは、１ｎＭ又は２ｎＭの濃度で細胞を播種した３時間後に添加した。コントロール細胞は、βＧＢＰなしで成長させた。
【０２５３】
成長速度：細胞数は、５日間の時間経過にわたって測定した。細胞数は、Ｈｕ−ｒ−βＧＢＰの存在下においてインキュベートしたそれぞれの細胞のタイプについて０、１、２、３、４、及び５日目に評価した。細胞数は、実施例１において上記に説明されるように、トリプリケートで血球計においてカウントすることによって評価し、βＧＢＰなしで成長させたコントロール細胞についての細胞数と比較した。
【０２５４】
結果を図６に示す。
【０２５５】
参考文献
Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ，  Ｒａｆｆ  Ｍ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｋ，  Ｗａｌｔｅｒ  Ｐ  （２００２）  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  （Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ８４５−８５６．
Ａｕｒｉａｓ  Ａ，  Ｒｉｍｂａｕｔ  Ｃ，  Ｂｕｆｆｅ  Ｄ，  Ｚｕｃｋｅｒ  ＪＭ，  Ｍａｚａｂｒａｕｄ  Ａ  （１９８４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １２：  ２１−２５．
Ｂａｌｄｉｎｉ  Ａ，  Ｇｒｅｓｓ，  Ｔ，  Ｐａｔｅｌ  Ｋ，  Ｍｕｒｅｓｕ  Ｒ，  Ｃｈｉａｒｉｏｔｔｉ  Ｌ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  Ｐ，  Ｂｏｙｄ  Ｌ，  Ｃａｓｃｉａｎｏ  Ｉ，  Ｗｅｌｌｓ  Ｖ，  Ｂｒｕｎｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５：  ２１６−２１８．
Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ  （２００６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：  １１７５−１１７８．
Ｂｌａｓｅｒ  Ｃ，  Ｋａｕｆｍａｎ  Ｍ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｃ，  Ｗｅｌｌｓ  Ｖ，  Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ，  Ｐｉｒｃｈｅｒ  Ｈ  （１９９８）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：  ２３１１−２３１９．
Ｂｏｓ  ＪＬ  （１９８９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：  ４６８２−４６８９．
Ｂｒｉｄｇｅ  ＪＡ，  Ｂｏｒｅｋ  ＤＡ，  Ｎｅｆｆ  ＪＲ，  Ｈｕｎｔｒａｋｏｏｎ  Ｍ  （１９９０）  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ９３：  ２６−３１．
Ｃｈａｎｇ  Ｆ，  Ｌｅｅ  ＪＴ，  Ｎａｖｏｌａｎｉｃ  ＰＭ，  Ｓｔｅｅｌｍａｎ  ＬＳ，  Ｂｌａｌｏｃｋ  ＷＬ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＲＡ，  ＭｃＣｕｂｒｅｙ  ＪＡ  （２００３）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：５９０−６０３．
Ｃｈｅｎ  ＹＬ，  Ｌａｗ  ＰＹ，  Ｌｏｈ  ＨＨ  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ５：  ５７５−５８９．
Ｃｈｉａｒｉｏｔｔｉ  Ｌ，  Ｗｅｌｌｓ  Ｖ，  Ｂｒｕｎｉ  ＣＢ，  Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０８９：  ５４−６０．
Ｄａｎｋａｒｔ  ＤＬ，  Ｗａｎｇ  Ｚ，  Ｂｌａｃｋｍｏｒｅ  Ｖ，  Ｍｏｒａｎ  ＭＦ，  Ｍｕｌｌｅｒ  ＷＪ  （１９９７）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７：  ５４１０−５４２５．
Ｄｊｏｄｊｅｖｉｃ  Ｓ，  Ｄｒｉｓｃｏｌｌ  Ｐ  （２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２７：  ４２６−４３３．
Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  ３：  １１−２２．
Ｆｏｕｋａｓ  ＬＣ，  Ｃｌａｒｅｔ  Ｍ，  Ｐｅａｒｃｅ  Ｗ，  Ｏｋｋｅｎｈａｕｑ  Ｋ，  Ｍｅｅｋ  Ｓ，  Ｐｅｓｋｅｔｔ  Ｅ，  Ｓａｎｃｈｏ  Ｓ，  Ｓｍｉｔｈ  ＡＪ，  Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＤＪ，  Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ  Ｂ  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：  ３６６−３７０．
Ｇｅｏｒｇａｋｉｓ  ＧＶ，  Ｙｏｕｎｅｓ  Ａ  （２００６）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６：  １３１−１４０．
Ｇｉｂｂｓ  ＪＢ  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：  １９６９−１９７３．
Ｈａｒａｒｉ  Ｄ，  Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ  （２０００）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：  ６１０２−６１１４．
Ｈｅｎｎｅｓｓｙ  ＢＴ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｄ  Ｌ，  Ｒａｍ  ＰＴ，  Ｌｕ  Ｙ，  Ｍｉｌｌｓ  ＧＢ  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  ４：  ９８８−１００４．
Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，  Ａｙａｋｉ  Ｈ，  Ｓｏｍａ  Ｇ，  Ｋａｓａｉ，  Ｊ（１９８９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５０：  １６１−１６５．
Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ，  Ｇｅｒｂｅｒ  ＨＡ，  Ｓａｕｒｅｒ  Ｓ，  Ｇｒｏｎｅｒ  Ｂ  （１９８９）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３９：  １６９−１７３．
Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ，  Ｓｔｅｒｎ  ＤＦ  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８：１６５−１８４．
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＲＷ，  Ｒｕｅｆｌｉ  ＡＡ，  Ｌｏｗｅ  ＳＷ  （２００２）．  Ｃｅｌｌ  １０８：  １５３−１６４．
Ｋａｒａｎｕｇａｒａｎ  Ｄ，  Ｔｚａｈａｒ，  Ｅ，  Ｂｅｅｒｌｉ  ＲＲ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔｅｒ  Ｄ，  Ｒａｔｚｋｉｎ  ＢＪ，  Ｓｅｇｅｒ  Ｒ，  Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ，  ＹａｒｄｅｎＹ  （１９９６）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：  ２５４−２６４．
Ｋａｒｉｎ  Ｍ，  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ  （１９９５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：  ７４７−７５７．
Ｌｕ  Ｙ，，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｍｉｌｌｓ  ＧＢ  （２００３）  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ７：  ２０５−２２８．
Ｌｕｏ  Ｊ，  Ｍａｎｎｉｎｇ  ＢＤ，  Ｃａｎｔｌｅｙ  ＬＣ  （２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：  ２５７−２６２．
Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ，  Ｗｅｌｌｓ  Ｖ  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ６：  １２２２８−１２２３３．
Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ，  Ｗｅｌｌｓ  Ｖ，  Ｄａｎｉｋａｓ  Ａ，  Ｄａｖｉｅｓ  Ｄ  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６６：  １５６３−１５６９．
Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，  Ｊ，  Ｂａｓｅｌｇａ，  Ｊ  （２０００）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：  ６５５０−６５６６．
Ｍｉｔｉｎ  Ｎ，  Ｒｏｓｓｍａｎｎ  ＫＬ，  Ｄｅｒｒ，  Ｃ．Ｊ  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １５：  Ｒ５６３−Ｒ５７４．
Ｍｏｒｇｅｎｓｚｔｅｒｎ  Ｄ，  ＭｃＣｌｅｏｄ  ＨＬ  （２００５）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １６：  ７４７−８０３．
Ｐａｃｏｌｄ  ＭＥ，  Ｓｕｉｒｅ  Ｓ，  Ｐｅｒｉｓｉｃ  Ｏ，  Ｌａｒａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｓ，  Ｄａｖｉｓ  ＣＴ，  Ｗａｌｋｅｒ  ＥＨ，  Ｈａｗｋｉｎｓ  ＰＴ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｌ，  Ｅｃｃｌｅｓｔｏｎ  ＪＦ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＲＬ  （２０００）  Ｃｅｌｌ  １０３：  ９３１−９４３．
Ｐｏｗｉｓ  Ｇ，  Ｂｏｎｊｏｕｋｌｉａｎ  Ｒ，  Ｂｅｒｇｇｒｅｎ  ＭＭ，  Ｇａｌｌｅｇｏｓ  Ａ，  Ａｂｒａｈａｍ  Ｒ，  Ａｓｈｅｎｄｅｌ  Ｃ，  Ｚａｌｋｏｗ  Ｌ，  Ｍａｔｔｅｒ  ＷＦ，  Ｄｏｄｇｅ  Ｊ，  ＧｒｉｎｄｌｅｙＧ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：  ２４１９−２４２３．
Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ＧＡ，  Ｄａｌｙ  Ｇ，  Ｄｒｅｊａ  Ｈ，  Ｔａｉｌｏｒ  Ｈ，  Ｒｉｅｒａ  ＣＭ，  Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，  Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ  Ｙ  （１９９９）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９０：  ３８５−３９７
Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ＧＡ，  Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ＭＭ，  Ｍｏｄｅｓｔｉ  ＮＭ，  Ｃａｓｔａｇｎａ  ＬＦ，  Ｔｏｄｅｌ  ＣＷ，  Ｒｉｅｒａ  ＣＭ，  Ｓｏｔｍａｙｏｒ  ＣＥ  （１９９８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０：  ４８３１−４８４０．
Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ＧＡ，  Ｍｏｄｅｓｔｉ  ＮＭ，  Ｃａｓｔａｇｎａ  ＬＦ，Ｌａｎｄａ  ＣＡ，  Ｒｉｅｒａ  ＣＭ，  Ｓｏｔｍａｙｏｒ  ＣＥ  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２２：  ３６５−３６７．
Ｒａｖａｔｎ  Ｒ，  Ｗｅｌｌｓ  Ｖ，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌ，  Ｖｅｔｔｏｒｉ  Ｄ，  Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ，  Ｃｈｉｎ  ＫＶ  （２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：  １６３１−１６３４．
Ｒｅｐａｓｋｙ  ＧＡ，  Ｃｈｅｎｅｔｔｅ  ＥＪ，  Ｄｅｒ  ＣＪ  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：  ６３９−６４７．
Ｒｅｙ  ＪＡ，  Ｂｅｌｌｏ，  ＭＪ，  ｄｅ  Ｃａｍｐｏｓ  Ｊ．Ｍ，  Ｖａｑｕｅｒｏ  Ｊ，  Ｋｕｓａｋ  ＭＥ，  Ｓａｒａｓａ  ＪＬ，  Ｐｅｓｔａｎａ  Ａ  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ６６：  １−１０．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａ  Ｐ，  Ｗａｒｎｅ  ＰＨ  Ｋｈｗａｊａ  Ａ，  Ｍａｒｔｅ  ＢＭ，  Ｐａｐｐｉｎ  Ｄ，  Ｄａｓ  Ｐ，  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ  ＭＤ，  Ｒｉｄｌｅｙ  Ａ，  Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  ８９：  ４５７−４６７．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａ  Ｐ，  Ｗａｒｎｅ  ＰＨ，  Ｄｈａｎｄ  Ｒ，  Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ  Ｂ，  Ｇｏｕｔ  Ｉ，  Ｆｒｙ，ＭＪ，  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，  Ｍ．Ｄ，  Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ．  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：  ５２７−５３２  ．
Ｓｅｇａｔｔｏ  Ｏ，  Ｌｏｎａｒｄｏ  Ｆ，  Ｐｉｅｒｃｅ  ＪＨ，  Ｂｏｔｔａｒｏ  ＤＰ，  Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅ  ＰＰ  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ  ２：  １８７−１９５．
Ｓｈｕｌｚｅ  Ａ，  Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｋ，  Ｊｅｆｆｒｉｅｓ  ＨＢＪ，  ＭｃＭａｈｏｎ  Ｍ，  Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  １５：  ９８１−９８４．
Ｓｊｏｂｌｏｍ  Ｔ，  Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，  Ｗｏｏｄ  ＬＤ，  Ｐａｒｓｏｎｓ  ＤＷ，  Ｌｉｎ  Ｊ，  Ｂａｒｂｅｒ  ＴＤ，  Ｍａｎｄｅｌｋｅｒ  Ｄ，  Ｌｅａｒｙ  ＲＪ，  Ｐｔａｋ  Ｊ，  Ｓｉｌｌｉｍａｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：  ２６８−２７４．
Ｓｏｕｌｅ  ＨＤ，  Ｍａｌｏｎｅｙ  ＴＭ，  Ｗｏｌｍａｎ  ＳＲ，  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＷＤ，  Ｂｒｅｎｚ  Ｒ，  ＭｃＧｒａｔｈ  ＣＭ，  Ｒｕｓｓｏ  Ｊ，  Ｐａｕｌｅｙ  ＲＪ，  Ｊｏｎｅｓ  ＲＦ，  Ｂｒｏｏｋｓ  ＳＣ  （１９９０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０：  ６０７５−６０８６．
Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌ  Ｃ，  Ｄａｌ  Ｃｉｎ  Ｐ，  Ｒａｏ  Ｕ，  Ｋａｒａｋｏｕｓｉｓ  Ｃ，  Ｓａｎｄｂｅｒｇ  ＡＡ  （１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ３０：  １４５−１５０．
Ｖａｎｈａｅｓｅｎｂｒｏｅｃｋ  Ｂ，  Ｌｅｅｖｅｒｓ  Ｓ，  Ａｈｍａｄｉ  Ｋ，  Ｔｉｍｍｓ  Ｊ，  Ｋａｔｓｏ  Ｒ，  Ｄｒｉｓｃｏｌｌ  ＰＣ，  Ｗｏｓｃｈｏｌｓｋｉ  Ｒ，  Ｐａｒｋｅｒ  Ｐ，  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ  ＭＤ  （２００１）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０：  ５３５−６０２．
Ｖｉｖａｎｃｏ  Ｉ，  Ｓａｗｙｅｒｓ  ＣＬ  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：  ４８９−５０１．
Ｖｌａｈｏｓ  ＣＪ，  Ｍａｔｔｅｒ  ＷＴ，  Ｈｕｉ  Ｋ．Ｙ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｆ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：  ５２４１−５２４８．
Ｗａｌｋｅｒ  ＥＨ，  Ｐａｃｏｌｄ  ＭＥ，  Ｐｅｒｉｓｉｃ  Ｏ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｌ，  Ｈａｗｋｉｎｓ  ＰＴ，  Ｗｙｍａｎｎ  ＭＰ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＯ  （２０００）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：  ９０９−９１９．
Ｗｅｌｌｓ  Ｖ，  Ｍａｌｌｕｃｃｉ  Ｌ  （１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６４：  ９１−９７．
Ｗｅｎｎｓｔｒｏｍ  Ｓ，  Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ  （１９９９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９：  ７２７−７３６．
Ｗｙｍａｎｎ  ＭＰ  （１９９６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：  １７２２−１７３３．
Ｙｕ  Ｄ，  Ｈｕｎｇ  ＭＣ  （２０００）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：  ６１１５−６１２１．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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