(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の免疫系の病的反応を、前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防及び／又は治療するために適合された粘膜付着性組成物であって、病的反応に関与する前記少なくとも１つの抗原で負荷されたキトサン粒子を含み、負荷されたキトサン粒子のサイズが１μｍ〜３μｍであり、キトサン粒子が、粘度が少なくとも８００ｃＰであるキトサンで作られている、上記粘膜付着性組成物。
【請求項２】
負荷されたキトサン粒子のゼータ電位が、２．５ｍＶより大きい請求項１に記載の粘膜付着性組成物。
【請求項３】
負荷されたキトサン粒子のゼータ電位が、６〜９ｍＶである請求項１又は２に記載の粘膜付着性組成物。
【請求項４】
抗原が、アレルゲン、自己抗原及び移植片特異的抗原からなる群より選択される請求項１から３までのいずれか一項に記載の粘膜付着性組成物。
【請求項５】
抗原がアレルゲンである請求項１から４までのいずれか一項に記載の粘膜付着性組成物。
【請求項６】
前記アレルゲンが、花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、昆虫アレルゲン、動物の体毛及びふけアレルゲン、並びに食物アレルゲンからなる群より選択される請求項５に記載の粘膜付着性組成物。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項で定義される粘膜付着性組成物を、医薬的に許容され得る担体とともに含む免疫治療組成物。
【請求項８】
懸濁剤、ゲル剤、散剤、錠剤、カプセル剤又はｌｙｏｃの形態の請求項７に記載の免疫治療組成物。
【請求項９】
抗原特異的寛容誘導を増進するためのアジュバントをさらに含む請求項７又は８に記載の免疫治療組成物。
【請求項１０】
個体の免疫系の病的反応を、前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防及び／又は治療するための医薬品として用いるための、個体の免疫系の病的反応を、前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防及び／又は治療するために適合された粘膜付着性組成物であって、病的反応に関与する前記少なくとも１つの抗原で負荷されたキトサン粒子を含み、負荷されたキトサン粒子のサイズが８００ｎｍより大きい上記粘膜付着性組成物、又は該粘膜付着性組成物を薬学的に許容される担体とともに含む免疫治療組成物。
【請求項１１】
病的反応が、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片拒絶から選択される請求項１０に記載の粘膜付着性組成物又は免疫治療組成物。
【請求項１２】
医薬品が、粘膜経路により投与される請求項１０又は１１に記載の粘膜付着性組成物又は免疫治療組成物。
【請求項１３】
医薬品が、口腔粘膜経路により投与される請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の粘膜付着性組成物又は免疫治療組成物。
【請求項１４】
医薬品が、舌下経路により投与される請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の粘膜付着性組成物又は免疫治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的免疫寛容を誘導するための粘膜付着性製剤、及びそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
舌下免疫療法（ＳＬＩＴ）は、Ｉ型呼吸器系アレルギーの非侵襲性で効果的な治療である（Ｃａｎｏｎｉｃａ＆Ｐａｓｓａｌａｃｑｕａ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００６；６１：２０−２３、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００５；６０：４−１２）。しかし、例えば治療期間及び投与計画に関して最適化される余地がある。この関係において、適切な送達系が同定されて、舌下経路による寛容誘導が改善されている。粘膜付着性及び／又は粒子状の製剤は、（ｉ）粘膜との接触期間を増加させ、よって、舌下粘膜に浸透するアレルゲンの量を改善し、（ｉｉ）寛容を誘導する傾向がある口腔粘膜内の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にする目的について特に見込みがあるようである（Ｍｏｉｎｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００６；６１：１５１−１６５、Ｎｏｖａｋ＆Ｂｉｅｂｅｒ  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１２１：Ｓ３７０−４）。
【０００３】
キトサンは、キチンの脱アセチル化により導かれるポリカチオン多糖である。キトサンは、甲殻類、昆虫、キノコ及び微生物に天然に存在する。これは、生分解性で、生体適合性で、良好な耐性を示し、刺激性又は感作性を示さないので、ヒトへの使用についてＦＤＡにより承認されている（Ｊａｙａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００７；４０：１７５−１８１）。
【０００４】
キトサンベースの製品は、医療、化粧品、健康補助食品及び環境の産業において既に用いられている。最も顕著には、キトサンベースポリマーの可能な形態のうち、キトサン粒子は、それらの粘膜付着性を担うポリカチオン性の性質と、ＡＰＣによる取り込み及び二次リンパ器官への輸送を促進する粒子状の形態とを理由として、抗原を粘膜ＤＣに向けるための興味深い送達系の候補である（Ｏ’Ｈａｇａｎ＆Ｖａｌｉａｎｔｅ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００３；２：７２７−７３５）。抗原特異的寛容誘導の分野において、いくつかの研究が、ほとんどは鼻腔内又は経口経路による遺伝子送達系としてのキトサン粒子の効果について調べている（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９；５：３８７−３９１；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２００３；１：３；Ｃｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３；２１：２７２０−２７２９））。キトサンを用いるペプチド送達に関して、送達系としてのキトサンの可能性に関して従来技術から実質的な教示を導くことはできない。つまり、Ｐｏｒｐｏｒａｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１６：４３３−４４１は、ＩＩ型コラーゲンとの低分子量キトサンの経口投与が、授乳後すぐの抗炎症性環境を促進することを報告している。Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；１００：８８３−８９は、アレルゲンとのキトサンの鼻腔内投与は、気道炎症を低減することを示す。逆に、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２００７  １１６、（Ａｂｓｔｒ）は、キトサンとのアレルゲンの舌下投与は、肺炎症の非特異的低減を導き、これはアレルゲンを単独で投与した場合に観察されるものより優れるものではないことを示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、大きいサイズのキトサン粒子の有する抗原特異的免疫寛容を誘導する能力が、より小さいサイズのキトサン粒子と比較した場合に、増進されるという本発明者らによる予期せぬ知見から生じる。
【０００６】
よって、本発明は、個体の免疫系の病的反応を、特に前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防及び／又は治療するために適合された粘膜付着性組成物であって、病的反応に関与する前記少なくとも１つの抗原で負荷されたキトサン粒子を含み、負荷されたキトサン粒子のサイズ又は直径が８００ｎｍより大きい粘膜付着性組成物に関する。
【０００７】
本発明は、上記で定義される粘膜付着性組成物を、医薬的に許容され得る担体とともに含む免疫治療組成物にも関する。
【０００８】
本発明は、医薬品としての応用における上記で定義される粘膜付着性組成物若しくは上記で定義される免疫治療組成物、又は上記で定義される粘膜付着性組成物若しくは上記で定義される免疫治療組成物の、個体の免疫系の病的反応を、特に前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防及び／若しくは治療することを意図する医薬品の製造のための使用にも関する。本発明は、さらに、個体の免疫系の病的反応を、特に前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防及び／又は治療するために、特に医薬品として用いるための上記で定義される粘膜付着性組成物若しくは上記で定義される免疫治療組成物にも関する。
【０００９】
本発明は、個体の免疫系の病的反応を、特に前記病的反応に関与する少なくとも１つの抗原に対する特異的寛容を誘導することにより予防又は治療する方法であって、前記個体に、上記で定義される粘膜付着性組成物の予防又は治療有効量を投与することを含む方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
抗原
本明細書で意図する場合、「個体の免疫系の病的反応に関与する抗原」は、その抗原に対して特異的に指向された免疫系の反応を誘導しやすく、個体、特に個体の細胞、組織又は器官に対する免疫反応の開始又は維持を担う化合物に関する。
【００１１】
抗原は任意のタイプであってよい。特に、抗原は、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのような核酸、又はウイルス、特に組換えウイルスであり得る。しかし、抗原は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが好ましい。本明細書で意図する場合、「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含むと理解される。
【００１２】
抗原は、アレルゲン、自己抗原及び移植片特異的抗原からなる群より選択されてよい。
【００１３】
好ましい実施形態において、抗原はアレルゲンである。「抗原」は、罹患した個体においてＩｇＥ抗体の生成を惹起する物質、通常はタンパク質と定義される。同様の定義が、以下の参考文献にある：Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ｎｏ．２６、ｐｐ．４９４−５１６（１９９６）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｅｄ．Ｒ．Ｂｕｓｈ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｕｇｕｓｔ  １９９６）。
【００１４】
好ましくは、抗原は、タンパク質アレルゲン、すなわち約６〜２０アミノ酸の短いペプチド、ポリペプチド又は全長タンパク質を含むアレルギー応答を引き起こすのに適当な任意のアミノ酸鎖である。
【００１５】
アレルゲンの限定しない例は、花粉アレルゲン（例えば樹木、薬草、雑草及び牧草の花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（例えば吸入、唾液及び毒液アレルゲン、例えばゴキブリ及び小昆虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン）、ダニアレルゲン、動物の体毛及びふけアレルゲン（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどから）並びに食物アレルゲンを含む。
【００１６】
例えば、タンパク質アレルゲンは、ヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲン；ネコ（Ｆｅｌｉｓ）属のタンパク質アレルゲン；ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ）属のタンパク質アレルゲン；ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）属のタンパク質アレルゲン；スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属のタンパク質アレルゲン；アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属のタンパク質アレルゲン；ハンノキ（Ａｌｄｅｒ）属のタンパク質アレルゲン；カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）属のタンパク質アレルゲン；ブロミア（Ｂｌｏｍｉａ）属のタンパク質アレルゲン；カシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ）属のタンパク質アレルゲン；オレア（Ｏｌｅａ）属のタンパク質アレルゲン；ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）属のタンパク質アレルゲン；オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ）属のタンパク質アレルゲン；ヒカゲミズ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）属のタンパク質アレルゲン；イヌ（Ｃａｎｉｎｅ）属のタンパク質アレルゲン；チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ）属のタンパク質アレルゲン；ミツバチ（Ａｐｉｓ）属のタンパク質アレルゲン；クプレサス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）属のタンパク質アレルゲン；クロベ（Ｔｈｕｙａ）属のタンパク質アレルゲン；カマエキパリス（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ）属のタンパク質アレルゲン；ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）属のタンパク質アレルゲン；アグロピロン（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）属のタンパク質アレルゲン；ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）属のタンパク質アレルゲン；コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属のタンパク質アレルゲン；シノロドン（Ｃｙｎｏｒｈｏｄｏｎ）属のタンパク質アレルゲン；ビャクシン（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）属のタンパク質アレルゲン；カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）属のタンパク質アレルゲン；ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ）属のタンパク質アレルゲン；イチゴツナギ（Ｐｏａ）属のタンパク質アレルゲン；カラスムギ（Ａｖｅｎａ）属のタンパク質アレルゲン；ホルクス（Ｈｏｌｃｕｓ）属のタンパク質アレルゲン；アントサンテム（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）属のタンパク質アレルゲン；アレナテルム（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）属のタンパク質アレルゲン；アグロスチス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）属のタンパク質アレルゲン；アワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ）属のタンパク質アレルゲン；ファラリス（Ｐｈａｌａｒｉｓ）属のタンパク質アレルゲン；スズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ）属のタンパク質アレルゲン；及びモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属のタンパク質アレルゲンからなる群より選択してよい。
【００１７】
上記で定義される属のいくつかに由来する種々の既知のタンパク質アレルゲンの例は、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）  Ｂｅｔ  ｖ  Ｉ；Ｂｅｔ  ｖ  ＩＩ；ブロミアＢｌｏ  ｔ  Ｉ；Ｂｌｏ  ｔ  ＩＩＩ；Ｂｌｏ  ｔ  Ｖ；Ｂｌｏ  ｔ  ＸＩＩ；シノロドンＣｙｎ  ｄ  Ｉ；ヒョウヒダニ（ヤケヒョウヒダニ又はコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ又はｆａｒｉｎａｅ））Ｄｅｒ  ｐ  Ｉ；Ｄｅｒ  ｐ  ＩＩ；Ｄｅｒ  ｐ  ＩＩＩ；Ｄｅｒ  ｐ  ＶＩＩ；Ｄｅｒ  ｆ  Ｉ；Ｄｅｒ  ｆ  ＩＩ；Ｄｅｒ  ｆ  ＩＩＩ；Ｄｅｒ  ｆ  ＶＩＩ；ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）Ｆｅｌ  ｄ  Ｉ；ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ）Ａｍｂ  ａ  Ｉ．１；Ａｍｂ  ａ  Ｉ．２；Ａｍｂ  ａ  Ｉ．３；Ａｍｂ  ａ  Ｉ．４；Ａｍｂ  ａ  ＩＩ；ドクムギ（ホソムギ（Ｌｏｌｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））Ｌｏｌ  ｐ  Ｉ；Ｌｏｔ  ｐ  ＩＩ；Ｌｏｌ  ｐ  ＩＩＩ；Ｌｏｔ  ｐ  ＩＶ；Ｌｏｌ  ｐ  ＩＸ（Ｌｏｌ  ｐ  Ｖ又はＬｏｌ  ｐ  Ｉｂ）；スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）Ｃｒｙ  ｊ  Ｉ；Ｃｒｙ  ｊ  ＩＩ；イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）Ｃａｎ  ｆ  Ｉ；Ｃａｎ  ｆ  ＩＩ；ビャクシン（サビナ又はエンピツビャクシン（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ又はｖｉｒｇｉｎｉａｎａ））Ｊｕｎ  ｓ  Ｉ；Ｊｕｎ  ｖ  Ｉ；ビャクシン（ジュニペルス・アシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ））Ｊｕｎ  ａ  Ｉ；Ｊｕｎ  ａ  ＩＩ；カモガヤ（オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））Ｄａｃ  ｇ  Ｉ；Ｄａｃ  ｇ  Ｖ；イチゴツナギ（ポア・プレテンシス（Ｐｏａ  ｐｒｅｔｅｎｓｉｓ））Ｐｏａ  ｐ  Ｉ；Ｐｈｌ  ｐ  Ｉ；Ｐｈｌ  ｐ  Ｖ；Ｐｈｌ  ｐ  ＶＩ及びモロコシ（ジョンソングラス（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））Ｓｏｒ  ｈ  Ｉを含む。
【００１８】
食物アレルゲンは、乳及び乳製品、卵、豆果（ピーナッツ及び大豆）、樹木の堅果、小麦、甲殻類、魚類及び軟体動物に由来し得る。特に、食物アレルゲンはオボアルブミン又はグルテンであってよい。
【００１９】
さらに、アレルギーと同様に、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症及び関節リウマチのような自己免疫疾患は、自己免疫疾患の場合に自己抗原、すなわち体自体の組織に属する抗原である抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞媒介応答の結果と一般的に考えられる。抗原がおそらく別の個体又は別の種の動物にさえ由来する移植片組織に属する移植片拒絶の現象にも同じことがあてはまる。
【００２０】
別の実施形態において、抗原は、自己免疫疾患又は移植片拒絶に関与する。
【００２１】
いくつかの抗原（すなわち自己抗原）が、糖尿病、関節リウマチ及び多発性硬化症のような自己免疫疾患における症状を引き起こすことが見出されている（すなわちインスリン；ミエリン塩基性タンパク質；ｒｈ因子；アセチルコリン受容体；甲状腺細胞受容体；基底膜タンパク質；甲状腺タンパク質；ＩＣＡ−６９（ＰＭ−１）；グルタミン酸脱炭酸酵素（６４Ｋ又は６５Ｋ）；プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、コラーゲン（ＩＩ型）、熱ショックタンパク質及びカルボキシペプチダーゼＨのような自己抗原）。
【００２２】
さらに、移植片特異的抗原は、最終的に移植片の拒絶を導き得る移植片対宿主疾患を惹起し得る。
【００２３】
キトサン粒子
キトサンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルコサミンの単位で構成される多糖であり、これらの単位はβ−１−６結合により一緒に結合している。通常、キトサンは、β−１−６結合により一緒に結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のホモ多糖であるキチンの脱アセチル化により生じる。キチンは、甲殻類の殻又は植物性の供給源で特に見出される。
【００２４】
好ましくは、多糖中の単位の合計数に対する多糖のアセチル化単位の数である、本発明のキトサン粒子に存在するキトサン多糖のアセチル化パーセンテージは、２５％未満である。
【００２５】
好ましくは、本発明のキトサン粒子は、平均分子量が好ましくは３００ｋＤａより高いか又は粘度が好ましくは少なくとも８００ｃＰ（粘度は、１％酢酸中の１％キトサン多糖溶液を用いる周知のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ法に従って測定されるのが好ましい）であるキトサン多糖である高分子量キトサンで作られる。
【００２６】
負荷されたキトサン粒子のサイズは、８００ｎｍより大きく、好ましくは１μｍ〜３μｍの範囲である。
【００２７】
負荷されたキトサン粒子のゼータ電位は、好ましくは２．５ｍＶより大きく、より好ましくは６ｍＶ〜９ｍＶ、最も好ましくは約７．３ｍＶである。
【００２８】
粒子のゼータ電位は、粒子の表面電荷を反映する。これは、粒子が存在する分散媒体と、粒子の周囲のイオンの密な層との間の電荷の差に相当する。ゼータ電位は、特に、Ｖｅｒｏｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２；１７８：１４４−１５４により定義される。
【００２９】
本発明の負荷されたキトサン粒子のサイズ及びゼータ電位は、任意の適切な方法により測定できる。好ましくは、これらは、以下の装置を用いて測定される：Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）。
【００３０】
抗原は、本発明のキトサン粒子に、任意の適切な方法に従って負荷できる。しかし、抗原は、本発明のキトサン粒子に架橋されるのが好ましい。抗原をキトサン粒子に架橋するための多数の周知の方法は、抗原の性質に応じて、当業者に利用可能である。抗原がタンパク質である場合、例えばトリポリホスフェート若しくはゲニピンを用いるイオン性架橋、又は例えばグルタルアルデヒド、ＮａＯＨ若しくはエチレングリコールジグリシジルエーテルを用いる化学架橋（例えばＫｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２００２；２４９：１６５−１７４により用いられたような）を特に挙げることができる。
【００３１】
例えば、本発明の負荷されたキトサン粒子は：
−高分子量キトサン（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから参照番号４１９４１９の下で入手可能）を酢酸水溶液に溶解するステップと；
−抗原を溶液に加えるステップと；
−抗原をキトサンに架橋するステップと
を含む方法により調製できる。
【００３２】
免疫治療組成物、医薬品及び抗原特異的様式で免疫系の病的反応を予防又は治療する方法
本明細書で意図する場合、「個体の免疫系の病的反応」は、該免疫系を有する生物の組織又は細胞を標的にする免疫反応に関する。
【００３３】
このような病的反応は、特に、喘息のようなアレルギー、自己免疫疾患又は移植片拒絶からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の関係において、アレルギーは、喘息又は上記で定義されるアレルゲンによるアレルギーに関する。
【００３５】
本発明の関係において、自己免疫疾患は、特に、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、及び上記で定義される自己抗原による疾患に関する。
【００３６】
本明細書で意図する場合、用語「免疫治療」は、免疫系の病的反応を予防又は治療する物質の能力に関する。
【００３７】
本発明の関係において、用語「治療する（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療」は、免疫系の病的反応又は１若しくは複数のその症状の経過を逆行、緩和又は阻害することを意味する。
【００３８】
本発明の関係において、用語「予防する（ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、免疫系の病的反応又は１若しくは複数のその症状の開始を妨げることを意味する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「個体」は、好ましくは、げっ歯類、ネコ、イヌ及び霊長類のような哺乳類のことをいう。好ましくは、本発明による個体は、ヒトである。
【００４０】
「医薬的に」又は「医薬的に許容され得る」は、動物又は適切であればヒトに投与されたときに、有害、アレルギー性又はその他の不適当な反応を生じない分子性物質及び組成物のことをいう。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「医薬的に許容され得る担体」は、任意のそして全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含む。このような媒体及び剤の、医薬有効物質のための使用は、当該技術において周知である。いずれかの通常の媒体又は剤が本発明による負荷されたキトサン粒子に適合しない場合を除いて、本発明による免疫治療組成物中で、医薬品中で、又は個体における免疫系の病的反応を予防若しくは治療する方法を行うためのその使用が企図される。補助的有効成分も、組成物中に組み込むことができる。
【００４２】
本発明の負荷されたキトサン粒子の特定の免疫治療特性は、そのサイズ及び正電荷により生じると考えられ、これらは、予期せぬことにそして著しく、この粒子がそれで負荷されている抗原の、粘膜、特に口腔粘膜、より著しくは樹状細胞のような舌下細胞による取り込み及びプロセシングに好ましいものであり、よって抗原特異的寛容誘導に好ましいものである。
【００４３】
さらに、本発明のキトサン粒子は、粘膜付着性である。粘膜付着性は、粘膜、特に口腔の粘膜、より著しくは舌下粘膜との密接で持続性の接触を可能にし、よって抗原特異的寛容誘導を増進する。
【００４４】
好ましくは、本発明の負荷されたキトサン粒子、免疫治療組成物又は医薬品は、粘膜経路、より好ましくは口腔粘膜経路、最も好ましくは舌下経路により投与される。それ自体で、免疫治療組成物及び医薬品は、好ましくは、このような投与経路に適合する方法で処方される。
【００４５】
粘膜投与とは、製剤の一部分又は全体が粘膜と接触する任意の投与方法のことをいう。粘膜とは、体の内腔の内壁の上皮組織のことをいう。粘膜表面は、鼻、頬側、口腔、膣、眼、耳、肺気道、尿道、消化管及び直腸の表面からなる群より選択され得る。
【００４６】
口腔粘膜投与は、製剤の一部分又は全体が患者の口腔及び／又は咽頭の粘膜と接触する任意の投与方法を含む。
【００４７】
口腔粘膜投与は、特に、舌下、経舌（すなわち舌粘膜を通して）及び経口投与を含む。
【００４８】
本発明による負荷されたキトサン粒子、免疫治療組成物又は医薬品は、分散された形態、例えば懸濁剤若しくはゲル剤、又は乾燥形態、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、ｌｙｏｃ、又は定量投与デバイスでの投与に適する形態のような種々の形態で投与できる。
【００４９】
免疫系の病的反応を予防又は治療する方法の構成において、本発明による免疫治療組成物又は医薬品は、抗原特異的寛容誘導を増進するためのアジュバントをさらに含んでよい。熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、重合リポソーム、変異毒素、生細菌、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質を含むワクチン接種のための任意の通常の又は試験的な、合成又は生物学的アジュバントを本発明による負荷されたキトサン粒子と付随させて、抗原特異的寛容誘導を増進できる。口腔粘膜投与について、アジュバントは、好ましくは、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び乳酸菌から選択される細菌、或いはコルチコステロイドとビタミンＤ３又は後者の任意の代謝物若しくは類縁体との組み合わせであり得る。
【００５０】
本発明による免疫系の病的反応を予防若しくは治療する方法、免疫治療組成物又は医薬品の構成において、投与計画は、６週間未満から３年までの期間で反復してよい。
【００５１】
さらに、予防又は治療は、複数の異なる抗原を用いて行ってよい。このことは、複数の抗原で負荷された１種類の本発明のキトサン粒子、又はそれぞれ１若しくは複数の抗原を含有する複数の本発明のキトサン粒子のいずれかを用いて達成してよい。
【００５２】
好ましくは、本発明による免疫系の病的反応を予防若しくは治療する方法、免疫治療組成物又は医薬品の構成において、本発明の負荷されたキトサン粒子に含まれるアレルゲンの用量は、０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。
【００５３】
本発明は、以下の図面及び実施例の観点でさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】キトサン粒子中に処方されたＯＶＡは、特異的抗体によって良好に認識される。可溶性ＯＶＡ又は高ＭＷ若しくは中ＭＷのキトサン処方ＯＶＡを、ＯＶＡ免疫化マウスからの血清を用いるＥＬＩＳＡ（阻害試験）により検出した。
【図２】両方のキトサン粒子は、ＢＭＤＣによるＯＶＡ取り込み及びプロセシングを改善するが、高ＭＷキトサン粒子のみが、口腔ＤＣによるＯＶＡプロセシングを改善する。取り込み研究のために、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ又は高ＭＷキトサン処方ＦＩＴＣ−ＯＶＡ（図２）を、ＢＭＤＣと１５、６０又は２４０分間、３７℃又は４℃にてインキュベートした。次いで、ＦＣ５００フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。
【図３】両方のキトサン粒子は、ＢＭＤＣによるＯＶＡ取り込み及びプロセシングを改善するが、高ＭＷキトサン粒子のみが、口腔ＤＣによるＯＶＡプロセシングを改善する。取り込み研究のために、中ＭＷキトサン処方ＦＩＴＣ−ＯＶＡ（図３）を、ＢＭＤＣと１５、６０又は２４０分間、３７℃又は４℃にてインキュベートした。次いで、ＦＣ５００フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。
【図４】両方のキトサン粒子は、ＢＭＤＣによるＯＶＡ取り込み及びプロセシングを改善するが、高ＭＷキトサン粒子のみが、口腔ＤＣによるＯＶＡプロセシングを改善する。プロセシングアッセイのために、ＤＱ−ＯＶＡ又は高ＭＷキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡを、ＢＭＤＣ（図４）と、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にて３時間、３７℃又は４℃にてインキュベートした。次いで、ＦＣ５００フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。
【図５】両方のキトサン粒子は、ＢＭＤＣによるＯＶＡ取り込み及びプロセシングを改善するが、高ＭＷキトサン粒子のみが、口腔ＤＣによるＯＶＡプロセシングを改善する。プロセシングアッセイのために、ＤＱ−ＯＶＡ又は中ＭＷキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡを、ＢＭＤＣ（図５）と、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にて３時間、３７℃又は４℃にてインキュベートした。次いで、ＦＣ５００フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。
【図６】両方のキトサン粒子は、ＢＭＤＣによるＯＶＡ取り込み及びプロセシングを改善するが、高ＭＷキトサン粒子のみが、口腔ＤＣによるＯＶＡプロセシングを改善する。プロセシングアッセイのために、ＤＱ−ＯＶＡ又は高ＭＷキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡ又は中ＭＷキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡを、精製口腔ＤＣ（図６）と、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にて１時間、３７℃又は４℃にてインキュベートした。次いで、ＦＣ５００フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。
【図７】高ＭＷキトサン粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞増殖及びＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０分泌を増加させる。ＤＯ１１．１０マウスからのＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球をＣＦＳＥで標識し、ＢＭＤＣ及びＯＶＡ（１．５又は１５μｇ／ｍｌ）、高ＭＷ若しくは中ＭＷのキトサン処方ＯＶＡ（１．５又は１５μｇ／ｍｌ）、又はキトサン製剤単独のいずれかとともに共培養した。３日後に細胞を採集し、ＰＥ−ＫＪ１．２６ｍＡｂで染色し、ＣＦＳＥ含量を、レスポンダーＴ細胞においてＦＣ５００フローサイトメーターを用いて分析した（図７）。
【図８】高ＭＷキトサン粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞増殖及びＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０分泌を増加させる。ＤＯ１１．１０マウスからのＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球をＣＦＳＥで標識し、ＢＭＤＣ及びＯＶＡ（１５μｇ／ｍｌ）、高ＭＷ若しくは中ＭＷのキトサン処方ＯＶＡ（１５μｇ／ｍｌ）、又はキトサン製剤単独のいずれかとともに共培養した。３日後に細胞を採集し、ＩＦＮ−γ（図８）を、ＣＢＡアッセイにより、細胞培養上清中で測定した。
【図９】高ＭＷキトサン粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞増殖及びＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０分泌を増加させる。ＤＯ１１．１０マウスからのＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球をＣＦＳＥで標識し、ＢＭＤＣ及びＯＶＡ（１５μｇ／ｍｌ）、高ＭＷ若しくは中ＭＷのキトサン処方ＯＶＡ（１５μｇ／ｍｌ）、又はキトサン製剤単独のいずれかとともに共培養した。３日後に細胞を採集し、ＩＬ−１０（図９）を、ＣＢＡアッセイにより、細胞培養上清中で測定した。
【図１０】高ＭＷキトサン粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞増殖及びＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０分泌を増加させる。ＤＯ１１．１０マウスからのＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球をＣＦＳＥで標識し、ＢＭＤＣ及びＯＶＡ（１５μｇ／ｍｌ）、高ＭＷ若しくは中ＭＷのキトサン処方ＯＶＡ（１５μｇ／ｍｌ）、又はキトサン製剤単独のいずれかとともに共培養した。３日後に細胞を採集し、ＩＬ−５（図１０）を、ＣＢＡアッセイにより、細胞培養上清中で測定した。
【図１１】高ＭＷキトサン粒子は、頚部ＬＮにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞プライミングを増進する。精製ＣＦＳＥ標識ＤＯ１１．１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに第０日にて養子移植する。２４時間後に、舌下経路により、可溶性ＯＶＡ又はキトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）でマウスを処理した。対照動物は、滅菌ＰＢＳ又はキトサン製剤単独のいずれかで処理した。第１０日に、頚部ＬＮを回収した。増殖細胞をフローサイトメーターにより検出した（群あたり３〜５匹のマウスの代表データ）。
【図１２】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。
【図１３】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。ＡＨＲは、全ての群のマウスのＰｅｎｈインデックスを測定することにより決定した（図１３）（−＝平均）。＊ＰＢＳ脱感作マウスと比較したｐ＜．０５、ＮＳ：有意でない。ｎ＝７〜８。
【図１４】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。組織構造について（図１４）、ＰＢＳ、ＯＶＡ、高ＭＷキトサン処方ＯＶＡ又はキトサン単独のいずれかで脱感作したマウスからのＨＥＳ染色された代表的なパラフィン肺切片を示す（倍率１００倍）。
【図１５】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。好酸球を、ＰＢＳ、ＯＶＡ、高ＭＷキトサン処方ＯＶＡ又はキトサン単独で処理したマウスから回収したＢＡＬ中で計数した（図１５）。平均＋／−ＳＥ。ｎ＝７〜８。＊ＰＢＳ脱感作マウスと比較したｐ＜．０５、ＮＳ：有意でない。
【図１６】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、次いで、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。ＬＮ応答分析について、縦隔（図１６）のＬＮにおけるＩＬ−１３分泌をＣＢＡアッセイにより測定した。平均＋／−ＳＥ。ｎ＝６〜８。
【図１７】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、次いで、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。ＬＮ応答分析について、縦隔（図１７）のＬＮにおけるＩＬ−１０分泌をＣＢＡアッセイにより測定した。平均＋／−ＳＥ。ｎ＝６〜８。
【図１８】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、次いで、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。ＬＮ応答分析について、縦隔（図１８）のＬＮにおけるＩＬ−５分泌をＣＢＡアッセイにより測定した。平均＋／−ＳＥ。ｎ＝６〜８。
【図１９】中ＭＷキトサン処方ＯＶＡではなく高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いる治療用ＳＬＩＴが、確立されたＡＨＲ、肺炎症及び縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する。全てのマウスを、ＯＶＡ／ミョウバンの腹腔内注射及びその後のエアロゾル攻撃により感作した（図１２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、次いで、ＰＢＳ、ＯＶＡ、キトサン処方ＯＶＡ（高ＭＷ又は中ＭＷ）又はキトサン単独で舌下処理した。ＯＶＡエアロゾル攻撃の後に、ＡＨＲ、肺炎症及び細胞性応答を調べた。ＬＮ応答分析について、頚部（図１９）のＬＮにおけるＩＬ−１０分泌をＣＢＡアッセイにより測定した。平均＋／−ＳＥ。ｎ＝６〜８。
【実施例】
【００５５】
動物、培養培地、試薬及び製剤
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ＯＶＡを含まない食餌で飼育した。そのＣＤ４＋Ｔ細胞のおよそ５０％がＯＶＡのペプチド３２３〜３３９フラグメントに特異的なＴＣＲを発現するＤＯ１１．１０  ＯＶＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニック雌性マウス（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０；２５０：１７２０−１７２３）を、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ｅｔ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｆｏｎｃｔｉｏｎｎｅｌｌｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を繁殖させた。動物操作についての倫理基準の国際レベルを適用した。
【００５６】
ＬＮ細胞培養、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）、口腔樹状細胞（ＤＣ）及びＤＯ１１．１０マウスからのＯＶＡ特異的Ｔ細胞のための完全培地は、１０％胎児ウシ血清、１％Ｌ−グルタミン、２００Ｕ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから）を補ったＲＰＭＩ１６４０で構成された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４は、Ｇｅｎｔａｕｒ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びミョウバンは、それぞれＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。内毒素低含量のグレードＶのＯＶＡは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、以前に記載された（１０）ようにして内毒素除去ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）でさらに精製した。Ｅｎｄｏｃｈｒｏｍ−Ｋアッセイ（Ｒ１７０８Ｋ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）により決定した残存内毒素濃度は、常に０．１ＥＵ／μｇタンパク質未満であった。
【００５７】
以下において、平均の比較は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。ｐ値＜０．０５を統計的有意とみなした。
【００５８】
（例１）
キトサン粒子の特徴決定
粒子を、高ＭＷ及び中ＭＷの両方のキトサンから調製したが、これらはポリマー鎖長が異なる。
【００５９】
簡潔に、ＯＶＡ負荷キトサン粒子を調製するために、高分子量又は中分子量（ＭＷ）（それぞれＳｉｇｍａからの４１９４１９又は４４８８７７）を有するキトサン０．０５ｇを、２５ｍｌ酢酸水溶液（１％）に溶解した。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ１８ホモジナイザー（Ｉｋａ、Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を９５００ｒｐｍにて２分間用いて懸濁物を均質化し、ＮａＯＨの１Ｎ溶液を用いてｐＨを５に調整した。次いで、３０ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ溶液を、磁気撹拌下に０．７５ｍｌ／分で室温にて加え、１０ｍｌの０．１％トリポリホスフェート水溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えた後に架橋を行った。
【００６０】
キトサン粒子のサイズ及び電荷（ゼータ電位）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて分析した。高ＭＷキトサン−及び中ＭＷキトサン−ＯＶＡ粒子のサイズは、それぞれ１．０〜３．０μｍ及び３００〜８００ｎｍであった。高ＭＷキトサン−及び中ＭＷキトサン−ＯＶＡ粒子は、それぞれ７．３＋／−０．９ｍＶ及び１．８＋／−０．６ｍＶのゼータ電位を示した。
【００６１】
キトサン中に処方されたＯＶＡの抗原性を検証するために、ＯＶＡ単独又はキトサン処方ＯＶＡがＯＶＡ特異的抗体に結合する能力を、ＯＶＡ免疫化マウスからの血清を用いるＥＬＩＳＡ阻害試験を用いて測定した。
【００６２】
精製ＯＶＡ（０．２μｇ）を、４℃にて一晩、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上にコートした。洗浄及びブロッキングのステップの後に、ＯＶＡ免疫化マウスからの血清（１／５０００）及びＯＶＡ又はキトサン処方ＯＶＡの希釈物（１／２〜１／８０００００）を加え、室温にて２時間３０分インキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（希釈１／１０００、Ｓｉｇｍａ）を３７℃にて１時間加え、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を基質として用いた（Ｓｉｇｍａ）。２Ｍ硫酸を用いて反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを４９２ｎｍにて用いて光学密度を決定した（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）。
【００６３】
図１に示すように、高ＭＷ又は中ＭＷのいずれかのキトサン粒子中に処方されたＯＶＡは、特異的抗体により良好に認識されたままであった。
【００６４】
（例２）
キトサン粒子は樹状細胞によるＯＶＡ取り込み及びプロセシングを改善する
アレルゲン取り込みに対するキトサン粒子の影響を調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＯＶＡ及びキトサン処方ＦＩＴＣ−ＯＶＡを用いて行った。
【００６５】
ＢＭＤＣは、以前に記載されたようにして６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスからの大腿骨及び脛骨から作製し（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９２；１７６：１６９３−１７０２）、ＣＤ１１ｃ（＞９０％の純度で）を発現することをフローサイトメトリー分析により確認した（ＦＣ５００フローサイトメーター、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。抗原取り込みアッセイのために、細胞を５×１０４／ｍｌにて完全培地中に懸濁した。ＦＩＴＣ標識ＯＶＡ又はキトサン処方ＦＩＴＣ−ＯＶＡを、２５μｇ／ｍｌの最終濃度で加え、細胞を１５分間、１時間又は４時間、３７℃又は４℃にてインキュベートした。
【００６６】
図２及び３に示すように、高ＭＷ及び中ＭＷのキトサン粒子はともに、可溶性ＯＶＡと比較した場合に、ＢＭＤＣによるＯＶＡの取り込みを劇的に増進した。注目すべきことには、同様の蛍光が、４℃でのキトサン処方ＦＩＴＣ−ＯＶＡで検出された。
【００６７】
ＢＭＤＣによるｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセシングアッセイは、タンパク質切断後に蛍光を発するＤＱ−ＯＶＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡを用いて行った。簡潔に、５×１０４／ｍｌ細胞を完全培地中に懸濁し、１０μｇ／ｍｌのＤＱ−ＯＶＡ又はキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡを３時間、３７℃又は４℃にて加えた。次いで、両方の実験について、細胞を冷ＨＢＳＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。結果は、平均蛍光強度として表した。
【００６８】
図４及び５に示すように、両方のキトサン粒子は、可溶性ＯＶＡと比較した場合に、ＢＭＤＣによるＯＶＡのプロセシングを著しく改善した。
【００６９】
ＡＰＣによるキトサン処方ＯＶＡ取り込みをさらに調べるために、本発明者らは、口腔組織から単離された骨髄性ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−マウスＤＣを用いた。
【００７０】
簡潔に、頬底及び舌の組織をナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスから回収し、４５分間、３７℃にてＲＰＭＩ中の４００Ｕ／ｍｌ  ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）及び２Ｕ／ｍｌジスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。残存酵素活性をＰＢＳ中の５ｍＭ  ＥＤＴＡで遮断した後に、口腔組織をＰＢＳ中に解離させた。単細胞懸濁物を、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ１１ｂ抗体及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ１１ｃ抗体（ともにＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡから）で標識した。口腔樹状細胞の主なサブセットを代表するＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−細胞を、ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）セルソーターを用いて単離した。細胞は、フローサイトメトリー分析により評価して、９９％を超えて純粋であった。口腔ＤＣ（１００μｌ完全培地中に１０４／ウェル）を、最終濃度１０μｇ／ｍｌにてＤＱ−ＯＶＡ又はキトサン処方ＤＱ−ＯＶＡのいずれかとインキュベートした。３７℃又は４℃にて１時間の後に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。結果を平均蛍光強度として表した。
【００７１】
図６に示すように、高ＭＷキトサン処方ＯＶＡのみが口腔ＤＣによるＯＶＡプロセシングを増進した。
【００７２】
（例３）
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞増殖及びＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０分泌を増進する
ＤＣによるキトサン処方ＯＶＡの優れた取り込みがその後のＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を改善するかを決定するために、ＤＯ１１．１０マウスからのＯＶＡ特異的ＣＤ４＋ナイーブＴリンパ球を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＢＭＤＣ及び培地単独、ＯＶＡ、キトサン単独又はキトサン処方ＯＶＡのいずれかとともに共培養した。
【００７３】
簡潔に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＤＯ１１．１０マウスの脾臓から、マウスＣＤ４ネガティブ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の使用説明に従って用いる磁気ビーズ分離により精製した。得られたＴ細胞調製物は、９５〜９９％のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む（その後、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞と命名した）。ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞を、１μＭ  ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃にて５分間、ＰＢＳ中で標識し、２回洗浄した。次いで、ＣＦＳＥ標識ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞を、ＢＭＤＣ及びＯＶＡ（１．５又は１５μｇ／ｍｌ）、キトサン処方ＯＶＡ（１．５又は１５μｇ／ｍｌ）、又はキトサン単独のいずれかととともに３日間（２重に）インキュベートした。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を、抗クローン形質ＰＥ−ＫＪ１．２６ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、増殖Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ関連蛍光が減少する細胞として、フローサイトメトリー分析により評価した。
【００７４】
ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを、培養上清中で（１５μｇ／ｍｌ  ＯＶＡ濃度に相当）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｆｌｅｘキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。測定は、再構成した凍結乾燥標準物質の系列希釈により得られる１０点標準曲線と比較して行った。試薬混合物は、１０μｌの各マウス捕捉ビーズ懸濁物を混合することにより得た。この混合物を激しくボルテックスし、暗所で室温にて９０分間、試験試料又は標準物質希釈物のいずれかとインキュベートした。次いで、５０μｌのフィコエリスリン（ＰＥ）標識検出試薬を各ウェルに加え、暗所で室温にて２時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、２００μｌのバッファー中に再懸濁し、製造者の使用説明に従ってフローサイトメトリーにより分析した。
【００７５】
図７に示すように、高ＭＷキトサン処方ＯＶＡを用いてＤＣを標的にすることにより、ＯＶＡ単独と比較してＴ細胞増殖が増進された。このことは、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ（図８）及びＩＬ−１０（図９）の分泌の劇的な増加と関連したが、ＩＬ−５分泌に対する影響は観察されなかった（図１０）。中ＭＷキトサン処方ＯＶＡとのインキュベーションは、可溶性ＯＶＡと比較した場合に、より低いＴ細胞増殖（図７）を誘導し、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０分泌をほとんど誘導しなかった（図８及び９）。ＩＬ−５分泌の検出可能な変化は観察されなかった（図１０）。ＤＯ１１．１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞の非存在下ではサイトカイン分泌は検出されなかった。
【００７６】
（例４）
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡの舌下投与後に頚部ＬＮにおいてＴ細胞プライミングが生じる
キトサン−ＯＶＡ粒子が、舌下投与後に、流入領域ＬＮにおけるＴ細胞プライミングを増進できるかを評価するために、上記のようにしてＣＦＳＥ標識したＯＶＡ特異的ＤＯ１１．１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＳＬＩＴ前にＢＡＬＢ／ｃマウスに養子移植した。
【００７７】
簡潔に、５×１０６細胞を、第０日にてＢＡＬＢ／ｃマウスに後眼窩静脈内注射により養子移植した。２４時間後に、マウス（群あたり３〜５匹のマウス）を、舌下経路により可溶性ＯＶＡ又はキトサン処方ＯＶＡ（用量あたり５００μｇ  ＯＶＡ）のいずれかで処理した。対照動物は、滅菌ＰＢＳ又はキトサン製剤単独のいずれかで処理した。頚部ＬＮを第１０日に回収した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を、抗クローン形質ＰＥ−ＫＪ１．２６ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、増殖細胞を、蛍光が減少する細胞として、フローサイトメトリー分析により評価した。
【００７８】
図１１に示すように、Ｔ細胞増殖は、ＰＢＳ、高ＭＷキトサン又は中ＭＷキトサンのいずれかで舌下処理したマウスの頚部ＬＮにおいてほとんど検出できず、それぞれ６．８％、６．３％及び５．７％のみの増殖Ｔ細胞であった。対照的に、ＯＶＡの舌下投与は、３４．５％の範囲で、頚部ＬＮにおいて容易に検出可能なＴ細胞増殖を誘導した。興味深いことに、高ＭＷキトサン処方ＯＶＡの使用は、Ｔ細胞増殖を強く増進したが（４６．７％までの増殖Ｔ細胞）、中ＭＷキトサン処方ＯＶＡは、ＯＶＡ単独と比較した場合により低い（１５．８％）Ｔ細胞増殖を誘導した。
【００７９】
（例５）
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡの舌下治療処理は、確立されたＡＨＲを低減する
キトサン粒子が抗原をＤＣに向けるために用いることができるという証拠に鑑みて、これらを、ＯＶＡで感作したマウスに依るマウスＳＬＩＴモデルにおいて試験した（Ｒａｚａｆｉｎｄｒａｔｓｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；１２０：２７８−２８５）。これらのマウスは、高い細胞浸潤と粘液過剰生成とを特徴とする肺の炎症である重度の気道過敏（ＡＨＲ）と、全身性ＯＶＡ特異的Ｔｈ２免疫応答とを示す。
【００８０】
簡潔に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの感作を、２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により１４日間隔で、１００μｌの容量で投与する２ｍｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸着させた１０μｇ  ＯＶＡを用いて行った。その後、１％ｗ／ｖ  ＯＶＡの２０分間のエアロゾル攻撃を４日間連続で、エアロゾル送達システム（Ｂｕｘｃｏ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を用いて行った。マウスを、次いで、２ヶ月間、週２回、嚥下を防ぐために動物を背面で保持しながら（１分間）舌の下に溶液（ＯＶＡ又はキトサン処方ＯＶＡ、用量あたり５００μｇ）を塗布することにより舌下処理した（図１２）。対照動物は、滅菌ＰＢＳ又はキトサン製剤単独で偽脱感作した。処理の２日後に、マウスにＯＶＡエアロゾル（１％ｗ／ｖ）を２日連続で攻撃した。
【００８１】
ＡＨＲの測定は、最後の攻撃の２４時間後に、別記（Ｈａｍｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １９９７；１５６：７６６−７７５）のようにして全身プレチスモグラフィー（Ｂｕｘｃｏ）により行った。気道抵抗は、エンハンストポーズ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ）（Ｐｅｎｈ）として表した。ベースライン気道抵抗に対する増加として表されるＰｅｎｈインデックスは、１００ｍｇ／ｍｌの吸入メタコリンへの曝露後に測定したＰｅｎｈを、噴霧ＰＢＳの吸入後に測定したＰｅｎｈで除することにより得た。
【００８２】
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡ処理は、ＡＨＲを劇的に低減し（図１３）、Ｐｅｎｈインデックスの値を、健常非感作マウスからのものと同等にしたが、可溶性ＯＶＡ処理は、ＡＨＲに対して中程度の影響を有した。逆に、中ＭＷキトサン処方ＯＶＡでの処理は、ＡＨＲに対する有益な効果を有さなかった。注目すべきことには、ＯＶＡと同時投与したキチン粒子は、ＯＶＡ単独より大きくＡＨＲを低減しなかった。
【００８３】
（例６）
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡでの舌下治療処理は、気管支炎症を低減する
気管支炎症を、その後、全ての群において評価した。
【００８４】
組織構造について、肺を回収し、リン酸緩衝ホルマリン−亜鉛中で固定し、パラフィンワックス中に包埋した。切片を、細胞浸潤を決定するためにヘマトキシリン、エオシン及びサフラン（ＨＥＳ）で染色した。血管周囲、気管支周囲及び肺胞の炎症の半定量的評価を、コード化試料に対して行った。
【００８５】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の炎症細胞の分析のために、最後のＯＶＡ攻撃の２４時間後に、マウスをペントバルビタール溶液のｉ．ｐ．注射により麻酔にかけた（体重１ｋｇあたり５０ｍｇ）。次いで、ＢＡＬを６００μｌ  ＰＢＳを用いて行った。ＢＡＬ流体を、８００ｇにて１０分間、４℃で遠心分離した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、細胞遠心分離によりガラススライド上にスピンし、次いで固定し、メイ−グリュンワルドギムザ染色（Ｒｅａｃｔｉｆｓ  ＲＡＬ、Ｍａｒｔｉｌｌａｃ、Ｆｒａｎｃｅ）の後に視覚化した。好酸球を、×２００の倍率にて光学顕微鏡により計数した。
【００８６】
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡでの処理後のＡＨＲの観察された減少は、肺組織切片の分析により示されるように、気管支炎症及び細胞浸潤の低減と関連した（図１４及び表１）。
【表１】
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【００８７】
気管支炎症のこの低減は、ＯＶＡ単独での処理と比較したＢＡＬ中の好酸球計数の著しい低減と関連した（図１５）。
【００８８】
（例７）
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡでの舌下治療処理は、縦隔ＬＮにおけるＯＶＡ特異的Ｔｈ２応答を低減する
縦隔及び頚部ＬＮにおける免疫応答を、その後、全ての群において評価した。
【００８９】
Ｔ細胞応答評価のために、縦隔及び頚部ＬＮを回収し、細胞を単離し、ウェルあたり３×１０５細胞で播種し、ＯＶＡ（１００μｇ／ｍｌ）又は培地単独で刺激した。プレートを、３７℃にて７２時間、５％ＣＯ２／９５％空気中でインキュベートした。ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを、培養上清中で、上記のようにしてＣＢＡ  Ｆｌｅｘキットを用いて測定した。
【００９０】
高ＭＷキトサン処方ＯＶＡで処理したマウスは、ＯＶＡ単独と比較して、わずかにより低いＯＶＡ特異的ＩＬ−１３（図１６）、ＩＬ−１０（図１７）及びＩＬ−５（図１８）生成を縦隔ＬＮにおいて示した。対照的に、より高いＩＬ−１０レベルが頚部ＬＮで検出されたが、Ｔｈ２サイトカインのいずれにおいても変動は観察されなかった（図１９）。ＩＦＮ−γ分泌及び血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥ又はＩｇＧ抗体における変化は、いずれの群においても観察されなかった（データは示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１１】
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【図１４】
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