(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
COMP（cartilage  oligomeric  matrix  protein）及びテトラブラキオンコイルドコア（TBCC）よりなる群から選ばれるコイルドコイル構造を有する多量体タンパク質と、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group  G  ストレプトコッカス（Streptococcus）G148のGタンパク質（SpG）由来のB1ドメイン、ファインゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）由来のLタンパク質および補体系分子C3dよりなる群から選ばれる免疫細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含み、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質が２〜５量体にオリゴマー化した薬物運搬体中の、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質にワクチン分子が結合したワクチン。
【請求項２】
融合タンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とがリンカーを介して結合したものである請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、COMP（cartilage  oligomeric  matrix  protein）である請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
COMP（cartilage  oligomeric  matrix  protein）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、テトラブラキオンコイルドコア（TBCC）である請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
テトラブラキオンコイルドコア（TBCC）が、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項５記載のワクチン。
【請求項７】
免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインである請求項１ないし６のいずれかの項記載のワクチン。
【請求項８】
スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインが、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
配列番号２３で表されるアミノ酸配列または配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチン分子が、節足動物媒介性疾患、寄生虫起因、細菌性またはウイルス性の感染症ワクチン候補抗原である請求項１ないし９のいずれかの項記載のワクチン。
【請求項１１】
ワクチン分子が、日本脳炎ウイルス外殻タンパク質またはマラリア原虫表層タンパク質である請求項１０記載のワクチン。
【請求項１２】
COMP（cartilage  oligomeric  matrix  protein）及びテトラブラキオンコイルドコア（TBCC）よりなる群から選ばれるコイルドコイル構造を有する多量体タンパク質と、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group  G  ストレプトコッカス（Streptococcus）G148のGタンパク質（SpG）由来のB1ドメイン、ファインゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）由来のLタンパク質および補体系分子C3dよりなる群から選ばれた免疫細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含み、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質が２〜５量体にオリゴマー化した薬物運搬体中の、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質にアジュバント分子が結合してなるアジュバント。
【請求項１３】
融合タンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とがリンカーを介して結合したものである請求項１２記載のアジュバント。
【請求項１４】
コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むCOMP（cartilage  oligomeric  matrix  protein）である請求項１２記載のアジュバント。
【請求項１５】
コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むテトラブラキオンコイルドコア（TBCC）である請求項１２記載のアジュバント。
【請求項１６】
免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインである請求項１２記載のアジュバント。
【請求項１７】
スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメインが、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項１６記載のアジュバント。
【請求項１８】
配列番号２３で表されるアミノ酸配列または配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項１２記載のアジュバント。
【請求項１９】
アジュバント分子が、コレラトキシン（CT）、コレラトキシンBサブユニット（CTB）、コレラトキシンAサブユニット（CTA）、百日咳菌毒素（PT）、百日咳菌毒素S1サブユニット（PTS1）、Toll様受容体9（TLR9）リガンド、Toll様受容体4（TLR4）リガンドおよび膜透過性機能を有するカチオン性ペプチドよりなる群から選ばれたものである請求項１２ないし１８のいずれかの項記載のアジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な薬物運搬体に関し、より詳細には、汎用性および安全性が高く、薬剤を効果的に標的細胞または組織に到達させることが可能であり、特にアジュバントやワクチンを搭載することにより、アジュバントの免疫賦活効果やワクチンの免疫原性を向上させることが可能な薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症予防や癌などに対する新たな治療法の確立のために、細胞・組織特異的な薬物運搬システムの開発が行われている。感染症予防に対してこれまで様々なワクチンやアジュバント（免疫賦活機能性物質）が開発されてきた。従来ワクチンは、ウイルスや細菌を弱毒化したり不活化したものが主であったが、近年の遺伝子工学技術の発達により、特定の病原体由来の抗原を大量に生産できるようになり、より安全性の高いコンポーネントワクチンの開発が可能となった。しかしながら、その反面、高純度に精製されたリコンビナントタンパク質の免疫原性が低下するという問題も生じていた。【０００３】
コンポーネントワクチンの免疫原性を向上させるために、抗原と補体４結合タンパク質（C4bp）との融合タンパク質をワクチンとして利用する技術が提案されている（特許文献１）。しかしながら、この技術では抗原を会合させることは可能であるが、抗原を部位特異的に運搬する能力はないという問題があった。【０００４】
また、ワクチンの中でも、特に経口および経鼻などの粘膜ワクチンは粘膜面での免疫応答が低いため、防御効果の高い抗原を見出しても、有効な粘膜アジュバント（免疫賦活機能性物質）なしには十分な効果が得られないのが実情であった。臨床応用可能なアジュバントとしては、アルミニウム塩などが知られているが、粘膜では有効性は示すことができず、さらに副反応誘発の懸念もある。粘膜アジュバントとしてはコレラトキシン（CT）が知られているが、毒素関連分子であり安全性の面から実験的なレベルでの使用にとどまっている。さらに、これらのアジュバントはワクチンと混合投与されているが、このような使用方法ではアジュバントが粘膜のバリアを超えることができず十分な効果が発揮されない場合もあった。【０００５】
一方、コイルドコイル構造を形成するタンパク質と融合させたタンパク質の可溶性や安定性を向上させる技術が提案されており（特許文献２）、コイルドコイル構造タンパク質を用いた新しい機能性物質の創製が期待されている。また、コイルドコイル構造を形成するタンパク質を用いて、コイルドコイルタンパク質に融合させたペプチドによる薬物ターゲッティング及び送達システムの技術が提案されている（特許文献３）。これはコイルドコイルタンパク質を利用したナノ粒子を作製する方法であり、融合させたペプチドを送達させる為の足場として利用する技術である。しかしながら、これは融合させたペプチドを能動的でなく、受動的に送達する技術であるため効率的ではない。能動的に送達するためにはペプチドを標的化機能性物質として用いる必要があるが、ナノ粒子構造の場合は融合させたペプチドが立体構造的な障害によって、標的レセプターへの結合機能を十分に発揮しないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５２８２１０号公報
【特許文献２】特表２００８−５１４５８５号公報
【特許文献３】特表２００６−５１９７８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ワクチンやアジュバント等を標的とする細胞や組織に効率的に到達させるとともに、ワクチンの免疫原性を向上させ得る、またはアジュバントの免疫賦活作用を増強し得る運搬システムの開発が切望されており、本発明はそのような薬物運搬体およびこれを利用したワクチンまたはアジュバントを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ナノ粒子構造を形成せずに、コンパクトな状態のコイルドコイル構造の多量体タンパク質と、立体構造障害を軽減させるデザインで免疫応答細胞レセプターに対するリガンド分子とを融合した担体に、ワクチンやアジュバント分子を搭載することにより、効率的に標的組織または細胞に運搬することが可能であるとともに、優れた免疫賦活効果を示すことを見出し本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち本発明はコイルドコイル構造の多量体タンパク質および免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含む薬物運搬体である。【００１０】
また本発明は、上記薬物運搬体にアジュバント分子が結合してなるアジュバントである。【００１１】
さらに本発明は、上記薬物運搬体にワクチン分子が結合してなるワクチンである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、標的組織または細胞へアジュバントまたはワクチンを有効に到達させることができ、またワクチンの免疫原性あるいはアジュバントの免疫賦活効果を増強することが可能である。さらに、構成する分子群の設計の自由度が高いため汎用性が高く、かつ安全性にも優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例３におけるELISAデータを示す図である。
【図２】実施例４におけるマラリア原虫伝搬阻止解析の結果を示す図である。
【図３】実施例５におけるB細胞への標的化の結果を示す図である。
【図４】実施例８におけるELISAデータを示す図である。
【図５】実施例９におけるマラリア原虫伝搬阻止解析の結果を示す図である。
【図６】実施例１１におけるマラリアメロゾイト期の抗原に対する抗体応答の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の薬物運搬体は、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質および免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含むものである。
【００１５】
コイルドコイル構造の多量体タンパク質としては、種々のものが使用可能であり、例えば「The structure of α-helical coiled coils 」（Adv Protein Chem. 2005;70:37-78 Andrei N.Lupas, Markus Gruberら）に記載のタンパク質が例示できる。多量体タンパク質を構成する単量体の数は特に限定されないが、2〜7量体が好ましく、特に2〜5量体が好ましい。この範囲であると、熱安定性に優れるとともに、免疫担当細胞のレセプターと親和性が向上し免疫原性が増強される。また、アミノ酸残基の数も特に限定されないが、通常20〜80程度であり、好ましくは50〜60である。この範囲であると、安定でコンパクトかつ抗原等を化学的に結合させる際の足場として機能する優位性があるために好ましい。
【００１６】
好ましいコイルドコイル構造の多量体タンパク質として具体的には、COMP（cartilage oligomeric matrix protein、5量体）、好熱菌Staphylothermus marinus由来で130℃までの耐熱性をもつテトラブラキオンコイルドコア（TBCC、4量体）、レオウイルス（Reovirus）由来で粘膜上皮に存在するM細胞接着性を示すσ1タンパク質（3量体）等のパラレル型コイルドコイル構造の多量体タンパク質が例示できる。これらの中でもCOMP、TBCCが好適に用いられる。COMPは、コイルドコイル構造として非常に安定で、熱耐性が高いために好ましい。またTBCCは130℃という極度な熱安定性を保持しているために不安定な分子を組み合わせる場合にさらに好ましい（J.Mol.Biol.1995;245,385-401 Peter J, Nitsch Mら）。一方、アンチパラレル型コイルドコイル構造を持つヘパチチスデルタウイルス（Hepatitis delta virus）由来のヘパチチスデルタ抗原（HDAg、2量体）を使用することもできる。このようなアンチパラレル型コイルドコイル構造はそれ自身がスペーサー的機能を有し、よりコンパクトな状態で免疫担当細胞レセプターとの結合が可能であるため有利である。
【００１７】
配列番号１はCOMP、配列番号２はテトラブラキオン、配列番号３はσ1タンパク質、配列番号４は、ヘパチチスデルタ抗原、配列番号３４はTBCCのアミノ酸配列である。本発明のコイルドコイル構造の多量体タンパク質は、これらのアミノ酸配列のうち、オリゴマー形成ドメイン（OD）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。配列番号５は、COMPのODであり、配列番号６は、そのうちの保存領域である。また、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。さらに上記アミノ酸配列との相同性が、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００１８】
一方、免疫担当細胞レセプターに対するリガンド分子は、種々のポリペプチド、オリゴ糖、核酸、脂質等が使用可能であるが、具体的には、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group G ストレプトコッカス（Streptococcus）G148由来Gタンパク質（SpG）のB1ドメイン(SpG-B)、ファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）（Finegoldia magna(Peptostreptococcus magnus）)由来のLタンパク質、補体系分子C3d、およびエルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシン（Yersinia pseudotuberculosis invasin）等が例示できる。配列番号７はプロテインA由来の抗体結合ドメイン（Zドメイン）、配列番号８はストレプトコッカスG148由来Gタンパク質のB1ドメイン、配列番号９はファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）由来のLタンパク質、配列番号１０は補体系分子C3d、配列番号１１は、エルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシンのアミノ酸配列であり、本明細書において、免疫担当細胞レセプターに対するリガンド分子には、上記特定のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、上記アミノ酸配列との相同性が、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００１９】
これらのうち、スタフィロコッカスプロテインA由来抗体結合ドメインは58アミノ酸残基から構成され、分子量にして約6 kDaのタンパク質であるが、構造は三つのα-helixから成るコンパクトな形状をとり、この中のひとつのα-helixがイムノグロブリンのFc或いはFab領域と相互作用する。またSpGの構成ドメインであるB1ドメイン（SpG-B）は、B細胞レセプター（BCR）との結合力が高い。一方、自然免疫のエフェクター因子のひとつである補体系分子C3dは、B細胞や濾胞状樹状細胞に存在する補体レセプターのひとつCR2(CD21)に結合するとともに、CR2はB細胞の補助レセプター複合体の重要な成分でB細胞の抗原に対する感受性を高めるために、リガンド分子のみならずアジュバントとしても機能するために好ましい。さらに、エルシニア・シュードチュベルキュロシスインベーシンを用いると、M細胞上に発現するβ1インテグリンを標的とすることができる。
【００２０】
本発明の薬物運搬体は、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質と、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とが化学的または遺伝子工学的に結合されたものであるが、中でもコイルドコイル構造を有する分子的安定性の高い多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質を発現させ、それをin vivo或いはin vitroで会合により多量体形成させたものであることが好ましい。融合タンパク質中の２つのドメインの融合化には、N末端、C末端のいずれの位置でもよく、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のN末端またはC末端に融合してもよい。または、単量体タンパク質中の反応性置換基と化学的に結合してもよいが、好ましくは、末端への遺伝子工学的結合である。リガンドタンパク質は、直接あるいはリンカー配列を介して、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質に融合させることができるが、例えば、4〜30個のアミノ酸残基、好ましくは10〜25個のアミノ酸残基を有するペプチドであるリンカー配列を介して融合させることにより、レセプターとの結合において立体構造形成における分子間相互干渉を低減させることができ、またその柔軟性によってレセプターとの結合時において有利に作用するために好ましい。
【００２１】
このようなリンカー配列としては、特に限定されないが、例えばGPGPもしくはGGGGS(G4S)の組み合わせによる配列を用いることができる。また、(G4S)が1〜4回繰り返された配列((G4S)1〜(G4S)3)を用いてリンカーとして使用することもでき、さらにこれにGPGPを組み合わせてもよい。さらに、リンカー配列中に、精製タグを挿入してもよく、例えば、Hisx6（H6）をリンカー配列に挿入することができる。好ましい例として、GPGP(G4S) H6 (G4S)GPGPが例示できる。この配列中、(G4S)部分を繰り返し配列((G4S)1〜3)に変えることも可能である。またGPGPH6GPGPやG4SH6G4Sの配列もリンカー配列として利用可能である。
【００２２】
上記コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質および免疫担当細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含む融合タンパク質は、通常の遺伝子工学的手法によって製造することが可能である。すなわち、上記コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列とを発現ベクター上で連結し、この発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換することにより融合遺伝子の発現産物（目的の融合タンパク質）が得られる。
【００２３】
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられるが、簡便な取り扱いとコストの観点からプラスミドベクターが好ましい。具体的には、例えば、宿主が大腸菌の場合には、pET-22b、pET-21d等が挙げられる。発現ベクターには、遺伝子発現に調節的役割を持つプロモーター、エンハンサー等の調節配列が含まれていてもよい。発現ベクターに融合タンパク質をコードするDNAの塩基配列を連結するには、制限酵素末端連結等の公知方法により行うことができる。
【００２４】
このようにして作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、発現ベクターを含有する形質転換細胞を得ることができる。宿主としては、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞株等の公知のものが挙げられる。大腸菌としては、BL21株、DH5アルファ等が例示できる。酵母としては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）等が挙げられる。
【００２５】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、宿主細胞に応じて公知の方法によって行うことができ、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が例示できる。導入後、選択マーカーを含む培地で培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００２６】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより、融合タンパク質を産生することができる。発現した融合タンパク質は、自発的にオリゴマー化して多量体を形成し、細胞内で蓄積あるいは細胞外へ分泌される。得られたタンパク質は、一般的な精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトフラフィー等各種精製法が挙げられる。
【００２７】
上記のようにして得られる融合タンパク質からなる薬物運搬体として、配列表２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものが例示できる。これはCOMPのオリゴマー形成ドメインの保存領域（配列番号６）とスタフィロコッカスプロテインA由来抗体結合ドメイン（配列番号７）がフレキシブルリンカー(GPGP(G4S)H6(G4S)GPGP)を介して結合したものであり、5量体を形成する。本発明の薬物運搬体には、このアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、上記アミノ酸配列との相同性が、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００２８】
かくして得られた融合タンパク質からなる薬物運搬体には、種々の薬物を搭載することができ、例えば、アジュバント分子、ワクチン分子、生理活性分子（薬物分子）等が例示できるが、特にアジュバント分子またはワクチン分子を搭載することが好ましい。使用可能なアジュバント分子またはワクチン分子としては、特に限定されず、従来公知のものが使用できる。具体的には、アジュバント分子として、コレラトキシン（CT）、コレラトキシンBサブユニット（CTB）、コレラトキシンAサブユニット（CTA）、百日咳菌毒素（PT）、百日咳菌毒素S1サブユニット（PTS1）、Toll様受容体9（TLR9）リガンド、Toll様受容体4(TLR4)リガンド等が例示できる。これらのうち、CTAとPTS1は、NF-κB経路の活性化を誘導できるために好ましい。また、TLR9リガンドとしては、例えば、非メチル化CpGモチーフを有するoligodeoxynucleotides(CpG ODN)等が例示でき、TLR4リガンドとしては、内毒素（endotoxin）の一部であるリピッドAを無毒化したMonophosphoryl lipid A(MPLA)等が例示できる。
【００２９】
これらのアジュバントを利用した場合の作用機構としては、エンドソームを介したMHC class IIによる外来抗原提示ルートが主たる取り込み経路であり、主に抗体応答増強による免疫賦活効果と考えられる。
【００３０】
一方、膜透過性機能を有するカチオン性ペプチドもアジュバント分子として使用でき、具体的には、ポリアルギニン、ポリリジン、Tat49-57ペプチド、ペネトラチン等の膜転位配列、シグナル配列由来ペプチド等が例示できる。これらは細胞性免疫の誘導に対しても有効であり、細胞内寄生性細菌、がん、アレルギー等に有効であると考えられる。
【００３１】
ワクチン分子としては、種々の節足動物媒介性疾患、寄生虫起因、細菌性またはウイルス性の感染症ワクチン候補抗原が利用可能であり、具体的には、日本脳炎ウイルス外殻タンパク質、マラリア原虫表層タンパク質、日本住血吸虫などの病原体由来の抗原が例示でき、これらのエピトープを含むポリペプチドが包含される。これらは抗体産生や細胞性免疫の誘導に対して有効であると考えられる。
【００３２】
このようなアジュバント分子またはワクチン分子は、融合タンパク質である薬物運搬体と直接あるいはリンカー配列を介して化学的または遺伝子工学的に結合される。アジュバント分子またはワクチン分子と運搬体融合タンパク質との結合は、いずれの可能な位置でもよく、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質に対して、免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質と反対のN末端またはC末端に結合してもよく、あるいは、多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質中の反応性置換基に結合してもよいが、好ましくは、末端への融合である。
【００３３】
化学的に結合させる手法としては、クロスリンカーを用いて、タンパク質に存在するアミノ基やチオール基（SH基）、タンパク質に存在する糖鎖のアルデヒド基などを利用して結合させる事ができるが、用いる官能基に制限はない。例えば、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のSH基とアジュバントまたはワクチンタンパク質中のアミノ基とを反応させる方法が例示でき、より具体的には、ジチオトレイトール（DTT）等の還元剤により還元処理した融合タンパク質と、N−スクシニル−3−（2−ピリジルジチオ）プロプリオネート（SPDP)によりピリジルジスルフィド基を導入したアジュバントまたはワクチンタンパク質とをインキュベートすることによって結合させることができる。結合させるアジュバント分子またはワクチン分子は、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質に対して、1分子以上であってもよい。クロスリンカーには化学物質からなるホモファンクショナルタイプ、ヘテロファンクショナルタイプなどが利用でき、その利用に制限はない。さらにビオチン、アビジンなどの生体分子同士の相互作用を利用した結合を利用することで化学的に結合することもできる。
【００３４】
一方、遺伝子工学的に結合させる場合には、上記コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列とを連結させ、発現ベクターにサブクローニングする。また、アジュバントタンパク質またはワクチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列をも連続して連結させることが可能であり、上記と同様にして発現させることにより三部から構成される融合遺伝子全体の遺伝子発現産物として融合タンパク質を得ることができる。発現したアジュバントまたはワクチン−運搬体融合タンパク質も、自己集合して多量体を形成する。
【００３５】
かくして得られた融合体アジュバントまたはワクチンは、経口、経鼻、皮下、静脈内、腹腔内等任意の経路で投与できる。また、アジュバントまたはワクチンの用量は、アジュバントまたはワクチンの種類等によって適宜設定されるが、例えば、三日熱マラリア原虫の伝搬阻止抗原であるPvs25を結合したワクチンの場合、成人１用量あたり、通常5〜100μg程度である。
【００３６】
本発明のアジュバントまたはワクチンは、効率的に標的細胞・組織に到達可能であるとともに、免疫賦活効果または免疫原性を増強させることができるものであるが、これは免疫担当細胞に直接抗原を提示できる能力により、抗原取り込みの効率化を促進し、抗体産生応答及び細胞性免疫を増強するとともに、多量体を形成するため、免疫担当細胞の受容体を凝集、クロスリンクさせることによって、免疫担当細胞に対し効率良く細胞生理学的な刺激を与え、それに続く細胞内シグナル伝達誘導が増強されるためと考えられる。
【実施例】
【００３７】
次に実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。【００３８】
実施例１
COMP-Z運搬体の作製：
（COMP ODのクローニング）
下記の方法によりCOMPのオリゴマー化ドメイン（oligomerization domain：OD）をクローニングした。すなわち、COMP ODの55アミノ酸残基（配列番号５）にスペーサー配列として(G4S)3のアミノ酸配列を付加した産物を得るため、配列番号１２のセンスプライマーと配列番号１３のアンチセンスプライマーを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、サブクローニングした。
COMP ODのサブクローニング完了後、塩基配列を確認し、再度配列番号１４のセンスプライマーおよび配列番号１５のアンチセンスプライマーを用いてPCRでCOMP OD遺伝子を増幅し、制限酵素NcoI, XhoIで処理した後に大腸菌発現ベクターであるpET-22bのNcoI-XhoI部位にサブクローニングし、大腸菌DH5アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換した。さらに、ベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行ない、目的の遺伝子導入クローンを選択した。そのクローンをタンパク質発現大腸菌株であるBL21(DE3)に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換し、アンピシリンによるスクリーニング後、COMP ODの発現コンストラクトを構築した。本発現株は一般的なLB-アンピシリン含有(LB-Amp)培地100ｍｌで37℃一昼夜、前培養し、つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、培養上清を遠心分離し（8,000 rpm、20min、4℃、2times）、0.45マイクロメートルのフィルターで濾過後にHis-tagカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製し、精製タンパク質の一部を15％アクリルアミド濃度SDS-PAGEを行なうことで、COMP OD部分の発現を確認した。【００３９】
さらにCOMP ODの保存領域だけを選択し46アミノ酸配列のよりコンパクトな配列(配列番号６)だけを使用したCOMP ODを以下の方法により発現させた(COMP(Gly27-Gly72))。
COMP(Gly27-Gly72)部分だけを増幅するために先に構築したpET-22b-COMP ODを鋳型にし、配列番号１６のセンスプライマーおよび配列番号１７のアンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、COMP(Gly27-Gly72)部分を増幅し、制限酵素NcoI、XhoIで処理した後に発現ベクターであるpET-22bのNcoI-XhoI部位にサブクローニングし、COMP(Gly27-Gly72)の発現コンストラクトを構築した（pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)）。塩基配列を確認後、発現解析を行い、本コンストラクトは培養上清にCOMP(Gly27-Gly72)を優位に分泌発現することが分かった。【００４０】
（リンカー領域の導入）
次にCOMP(Gly27-Gly72)部分にリンカー領域を導入した。リンカー領域としてGPGPとG4Sを組み合わせ、さらにリンカー領域にタンパク質精製用タグとして使われるHisx6を併用したGPGP(G4S)H6(G4S)GPGP（配列番号１８）からなるリンカー領域をCOMP ODのC末端部分に導入した。具体的なリンカー導入方法としては5’をリン酸化した配列番号１９のセンスプライマーおよび配列番号２０のアンチセンスプライマーを用いてリンカー領域をアニールさせた後、pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)のXhoI部位にサブクローニングして構築を行った(pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)-flexible linker)。塩基配列を確認後、発現解析を行い、本コンストラクトはCOMP(Gly27-Gly72)同様に培養上清にCOMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerを優位に分泌発現することが分かった。【００４１】
（リガンド部分の融合）
上記COMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerに下記方法によりリガンド部分の構築を行なった。リガンドとしてStaphylococcus aureus 由来タンパク質Protein A (SpA)由来のBドメインホモログである抗体結合ドメイン(Zドメイン)を用いた（配列番号７）。このZドメインを先に構築したCOMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerのC末端側に遺伝子工学的に融合させ構築した。具体的には配列番号２１のセンスプライマーおよび配列番号２２のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、Zドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、制限酵素SalI、XhoIで処理した後に、pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerのXhoI部位にサブクローニングして構築を完了させた(pET-22b-COMP-Z)。【００４２】
（COMP-Zタンパク質の培養、発現誘導及び精製方法）
pET-22b- COMP-Zを含有する大腸菌BL21(DE3)株のフリーズストックから10μlを100 mlの LB-Amp培地に植菌し、37℃で一昼夜前培養した。つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、全ての培養液を統一し、遠心分離し（8,000 rpm、20min、4℃、2times）、菌体と培養上清に分離した。その際、培養上清の一部を発現解析用に回収した。つづいて、培養上清を0.45 マイクロメートルのフィルターで濾過し、クロマトアプライ用サンプルとして調整した。COMP-ZのアフィニティークロマトグラフィーにはIgGセファロース樹脂（GEヘルスケア社）10 mlをオープンカラムに詰めて精製カラムを用意した。カラムの平衡化溶液としてカラム容量の2〜3倍量のTST緩衝液(pH 8.0)でpHが8.0になるまで平衡化し、次にカラム容量の2〜3倍量の0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)を流した。これもpHが3.5になるまで平衡化し、このステップを二回繰り返し、最終的にTST緩衝液(pH8.0)でpHが8.0になるまで平衡化した（TST→酢酸→TST→酢酸→TST）。
次に調整したサンプル溶液を自然落下、もしくはペリスタポンプ等でカラムにアプライし、アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
サンプルアプライ終了後、次に洗浄を行なった。10倍量のTST緩衝液(pH 8.0)で洗浄し、次に2倍量の0.5 M酢酸アンモニウム溶液(pH 5.5)で洗浄した。洗浄後、溶出buffer(0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)を用いて50 mlで溶出した。培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15％アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認出来たら、限外濾過膜（Amicon Ultra-4 50K ）にて濃縮し、PBSで置換した。PIERCE社のBCA Protein Assay Reagent (bicinchoninic acid)試薬を用いたBCA法により定量したところ、COMP-Z融合タンパク質の濃度は6 mg/mlであり、総タンパク質量は30mgとなった。【００４３】
（COMP-Zのエンドトキシン除去処理）
大腸菌で作製したリコンビナントはエンドトキシンの混入が考えられるため、免疫実験を行なうにあたってエンドトキシンの除去およびタンパク質溶液のエンドトキシン濃度を検定した。
COMP-Zは高分子量のタンパク質であるのに対し、エンドトキシンは約10 kDaなので50 kDaの透析膜による処理を行なった。透析外液としてはPBSを用い4℃で数時間毎に外液を交換することで最終的に一昼夜透析した（約4〜5回の1LのPBSによって透析した）。
この透析済みサンプルをエンドトキシン除去カラム（PIERCE社；Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel）にアプライし、エンドトキシンを除去した。エンドトキシン除去カラム後のサンプルをBCA定量し、リムルス試験(LAL)によりエンドトキシン濃度を検定した。
すなわち、LALのPyrogen Single Test 25回用を用いて最終容量を0.25 mlに希釈したサンプルを用いて検査した。サンプルの希釈にはエンドトキシンフリー水を用いた。必要濃度に調整したサンプル溶液を注射器でバイアルに注入し、軽く混合し、転倒しないように箱等に入れて37℃で一時間反応させた。反応後、静かに取り出して逆さにし、凝固していたら、エンドトキシン陽性、凝固してないもしくは溶液が一部溶けて落ちてくる場合はエンドトキシン陰性と判断した。陰性になる希釈ポイントの一段階前がエンドポイントと定義されるので、そこからエンドトキシンのUnit数を計算し、500 pg エンドトキシン/μg of proteinのレベル以上であった場合には、再度エンドトキシン除去カラムにアプライし、同様の操作を500 pg エンドトキシン/μg of protein以下となるレベルまで繰り返し行った。【００４４】
実施例２
ワクチン−運搬体融合体の作製（１）：
三日熱マラリア原虫の伝搬阻止抗原であるPvs25をCOMP-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学的結合によってCOMP-Zに融合した。ワクチン抗原Pvs25は酵母Pichia pastorisで発現した均一な立体構造を持つPvs25H Aフォーム(Pvs25H-A)を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下のような反応経路で融合体COMP-Z/Pvs25H-Aを完了させた。
融合に関しては、COMP-Z 5量体 (1 mg; 373 μl;13,793 pmol;) Pvs25H-A (2.84 mg; 499 μl; 137,864.08pmol)で行なった（COMP-Zの分子量は72.5 kDa、Pvs25H-Aの分子量は20.6 kDaであり、COMP-Zが1 molに対してPvs25H-A 10 molである。）
（還元処理）
まずCOMP-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行なった。COMP-Zは大腸菌で発現させた状態のままでも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSHの数を増加させるためである。COMP-Z 1ｍｇを1,379.3 nmolのDTTを加えた後、37℃で30分間反応させた。その後、限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10K；5000 x g 20 min×4 times with PBS）でDTTを除去した。
（融合処理）
使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 45 μlを2.84 mgのPvs25H-A（1.5 mlにPBSで調整）を加え、60分間室温でインキュベートした（Pyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａの作製）。限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10k；5000 x g 20 min×4 times with PBS）を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａ （solution volumeは200μl）に 還元処理済みの1mg COMP-Z（240μl）を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k（5000 x g 20 min×4 times）を使用し、化学反応の副産物（Pyridine 2-thione）を除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質COMP-Z/Pvs25H-Aを得た。【００４５】
（結合パートナー分子の定量）
ワクチン融合運搬体の濃度をBCAで定量した。得られたワクチン融合運搬体（COMP-Zあたりが）100 μgとコントロールとして実施例１で得られたCOMP-Z 100μgについてTotal 300μlにfill upして、IgGセファロース（TSTで平衡化済み、50% スラリー）200μlと反応させ、４℃で2時間ローテーターを用いて吸着させた。遠心し（600 x g 2 min）、上清(500μl)を回収した。つぎにTST 1000μlで洗浄し、遠心し（600 x g 2 min）、洗浄画分１を回収した。さらに0.5 M酢酸アンモニウム溶液(pH 5.5)200μlで洗浄し、遠心し（600 x g 2 min）、洗浄画分２を回収した。最後に0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)100μlで懸濁し、10 min間混合処理を行った後、遠心し（600 x g 2 min）、100μlを回収した。回収した各BCA定量によって算出したタンパク質量から非結合分子量を導きだし、最終的に結合分子量を計算した。
すなわち、上清と洗浄画分に存在するタンパク質はフリーのパートナー分子（ワクチン抗原）だと仮定し、アプライしたタンパク質量から逆算して、結合したパートナー分子の割合を算出した。最初にアプライしたタンパク質量は115.7μgであるので、割合としてはPvs25H-Aは85.5698μgでCOMP-Zは30.1302μgとなる。Pvs25H-A 85.35698μg中の48.82326μg（上清と洗浄画分のタンパク質量）が結合しなかった量になり、つまり36.53338μgが結合していることになる。molで計算すると1773.3 pmolのPvs25H-Aが結合していることになる。30.1μgのCOMP-Zは415.17pmolなので、つまりPvs25H-A:COMP-Z=4.3:1のモル比となる。最終的に1分子のCOMP-Zに4.3分子のPvs25H-Aが結合した融合体として作製できていることが示された。【００４６】
（COMP-Z/Pvs25H-Aの融合確認）
COMP-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、Pvs25H-A特異的ELISA法によってPvs25H-AがCOMP-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96well ELISA plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG(hIgG)を5μg/mlの濃度で各wellに50μlずつアプライし、4℃で一昼夜反応させ、コートさせる。hIgGをコートしたELISAプレートに1% BSA in PBS溶液を150μl/wellで加え、37℃2時間反応させ、ブロッキング反応を行なった。ブロッキング後に各アプライサンプルをCOMP-Zあたり2μg/wellの濃度でCOMP-Z或いはCOMP-Z/Pvs25H-A融合分子を加え、37℃2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体（hIgG）と結合していない可能性のある「フリー」の状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG（5μg/ml）を各wellに50μlずつアプライし37℃2時間反応した。その後、一次抗体として抗Pvs25マウスIgG抗血清（200倍希釈）を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体（3,000倍希釈）を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、Pvs25H-A抗原特異的シグナルを検出した結果、COMP-ZとCOMP-Z/Pvs25H-Aのシグナルの違いからCOMP-ZにPvs25H-Aが結合していることが直接的に証明された。【００４７】
実施例３
免疫原性確認試験：
Balb/cマウス、♀、7週齢（日本SLC）に、Pvs25H-A（S）30μgを皮下（s.c.）、腹腔内（i.p）、静脈内（i.v.）、経鼻（i.n.）で3回（0、2、4週目）投与した（n=7、静脈内投与群のみn=2）。同様にして、Pvs25H-A 30μgとCOMP-Z 10.6μgを混合した試料（M）または実施例2で得られたCOMP-Z/Pvs25H-A（L）40.6μgを投与した。さらに、コレラ毒素（CT;LBL）1μgと試料S、L、MをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを経鼻で投与した（i.n./CT）。またフロイントアジュバント(IFA)を抗原投与容量と同量（ここでは100μl）と試料Sを30μgを混合したものを皮下投与した。さらにIFAの非存在下で、S、M、LをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のPvs25H-Aに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に最終採血を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にPvs25H-A(5μg/ml)を用い、50倍希釈の血清、3000倍希釈のAP conjugate抗マウス抗体を用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図1に示す。【００４８】
この結果から、今回作製した新規ワクチン融合体は一般的なワクチンの効果として考えられるIFA存在下の抗原単独混合群で見られた抗体価以上の応答をIFAの存在なしに達成することができた。つまりこの新規ワクチン融合体は皮下免疫において既存のアジュバントなしに優位に抗体産生を誘導することができ、今回用いたリガンドである抗体結合ドメインがB細胞の表面に存在するイムノグロブリンに作用し、抗体の産生応答が見られたと推測される。【００４９】
実施例４
伝搬阻止解析：
実施例３で得られた血清を各群（s.c./IFA S、s.c.S、s.c.M、s.c.L、i.n.S、i.n./CT S、i.n./CT M、i.n./CT L）で混合し、混合血清をサンプルとした。アッセイは、4名の患者血液（三日熱マラリア原虫生殖母体）を用いた。患者血液180μｌに、混合血清90μｌと正常ヒト血清90μｌを混合した180μｌを添加し、メンブレンフィーダーに入れて蚊（Anopheles dirus）に吸血させた。蚊の中腸におけるオーシスト形成数を顕微鏡観察によって測定した。結果を図２に示す。【００５０】
この結果から、今回作製した新規マラリアワクチン融合分子は抗体産生が優位に上昇した群で、実際の三日熱マラリア原虫を完全に殺傷する能力があることが分かった。さらにS、M 、Lの順番で殺傷能力が上昇していることから、今回作製した分子によって誘導した抗体は実際のマラリア原虫を認識する能力があり、その効果はリガンド付加することでさらに上昇することが証明できた。またMの混合群においてもある程度の効果を示すことから、作製したCOMP-Z分子自身にもアジュバント活性がある可能性が示された。【００５１】
実施例５
細胞標的機能解析：
実施例１で得られたCOMP-Zの細胞標的機能をフローサイトメトリーの手法を用いて解析を行った。すなわち、7週齢のBalb/cマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製する。この得られた脾臓細胞約10５cellsを用いて、標識B細胞マーカーと標識COMP-Zで検出し、標的機能を調べた。B細胞マーカーとしてはFITC標識した抗CD19抗体を0.2 mg/mlの濃度で用いた。COMP-ZはMaleimide-PEO2-Biotin によってビオチン化し、更に0.0001 mg/ml の濃度でPE-Streptavidin（SA-PE）を用いて検出を行った。より具体的には、0.01mgのビオチン化COMP-Zを１％BSA in PBSで懸濁した10５cells/100mlに調製した脾臓細胞と混合し、氷中で30min反応させた。次にマスキングとしてhIgGを50 mg/mlの濃度で加えて、4℃で30min反応させた。更にFc受容体阻害剤としてハムスターイムノグロブリンを加えて、4℃で30min反応させた。その後に遠心分離して（1500 rpm, 5min）上清を捨て、100mlの１％BSA in PBSで懸濁する。次にFITC-抗CD19抗体とSA-PEを加えて、4℃で30min反応させた。その後に遠心分離して（1500 rpm, 5min）上清を捨て、100mlの１％BSA in PBSで懸濁した。つづいて再度、遠心分離して（1500 rpm, 5min）上清を捨て、最終的に1%ホルムアルデヒドで懸濁して、フローサイトメトリー用サンプルとした。リガンドのないサンプルとしてCOMP ODを同時に用いてネガティブコントロールとした。フローサイトメトリー解析はBD社のFACSシステムのマニュアルに準じて行った。結果を図３に示す。【００５２】
この解析から、COMP ODではB細胞とタンパク質が結合していることを示すURには5.25％の割合であったが、COMP-ZではURは13.15％と上昇しており、これはCOMP-ZがB細胞へ結合していることを示している。【００５３】
実施例６
TBCC-Z運搬体の作製：
（TBCC（wt）- flexible linkerのクローニング）
コア分子としてTBCCを用いて融合体を作製した。TBCCは野生型配列（配列番号３４）を用いたものをTBCC (wt)と表記する。
COMP-Zの作製ではflexible linkerはCOMPのクローニング後に導入したが、TBCCの場合は便利性を考えて同時にクローニングを行った。具体的な導入方法としては、まず、最初にTBCC（wt）- flexible linkerのクローニングを行った。すなわち、TBCC（wt）- flexible linkerの７９アミノ残基（配列番号２４）を得るため、配列番号２５のセンスプライマーと配列番号２６のアンチセンスプライマーを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、サブクローニングした。
制限酵素Nco I、Xho Iで処理した後に大腸菌発現ベクターであるpET-21dのNco I-Xho I部位にサブクローニングし、大腸菌DH5アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換した。さらに、ベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行い、目的の遺伝子導入クローンを選択した。そのクローンをタンパク質発現大腸菌株であるBL21(DE3)に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換し、アンピシリンによるスクリーニング後TBCC（wt）-flexible linkerの発現コンストラクトを構築した。本発現株は一般的なLB-amp培地100mlで37℃一昼夜、前培養し、つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、培養上清を遠心分離し、0.45 μmのフィルターで濾過後にHis-tagカラムを用いてアフィニティークロマトグラフティー精製し、精製タンパク質の一部を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEを行うことで、TBCC（wt）-flexible linker部分の発現を確認した。【００５４】
（リガンド部分の融合）
上記TBCC（wt）-flexible linkerに下記方法によりリガンド部分の構築を行った。リガンドとしてStaphylococcus aureus由来タンパク質protein A (SpA)由来のBドメインホモログである抗体結合ドメイン（Zドメイン）を用いた（配列番号７）。このZドメインを先に構築したTBCC（wt）-flexible linkerのC末端側に遺伝子工学的に融合させ構築した。具体的には配列番号２１のセンスプライマーおよび配列番号２２のアンチセンスプライマーの合成オリゴ作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、Zドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、制限酵素Sal I, Xho Iで処理した後に、pET-21d-TBCC（wt）-flexible linkerのXho I部位にサブクローニングし、構築を完了させた（pET-21d-TBCC（wt）-Z）。【００５５】
（Cys残基導入コンストラクトTBCC（Cys）-Zの作製）
TBCC（wt）-Z(配列番号２７)はワクチン抗原等を遺伝子工学的に結合できるが、化学融合の際に利用するシステイン残基を有していないため、システイン残基を導入したコンストラクトであるTBCC（S52C）-Z(配列番号２８)およびTBCC（C60）-Z(配列番号２９)を作製した。TBCC（S52C）-ZはTBCC（wt）-Zの52番目のセリン残基をシステイン残基に置換したコンストラクトである。TBCC（C60）-ZはTBCC（wt）-Z の60番目のアミノ酸にシステイン残基を挿入したコンストラクトである。Cysの導入方法はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit （ストラタジーン社）を用いて行った。具体的にはTBCC（S52C）-ZはTBCC（wt）-Zを鋳型に配列番号３０のセンスプライマーと配列番号３１のアンチセンスプライマーを用い、TBCC（C60）-ZはTBCC（wt）-Zを鋳型に配列番号３２のセンスプライマーと配列番号３３のアンチセンスプライマーを用い、PCR法により目的産物の増幅を行った。得られた各々のPCR増幅産物に対してDpn Iを1μl添加し37℃で1 hrインキュベートした後、大腸菌XLI-Blue株に形質転換を行った。LB-amp培地によってスクリーニングし、得られた各々のクローンを構築し、塩基配列を確認した。その後各々を大腸菌BL21（DE3）株に形質転換した。【００５６】
（各種TBCC-Z（野生型、およびCys導入型）のタンパク質の培養、発現誘導及び精製方法）
各種pET-21d-TBCC-Zを含有する大腸菌BL21（DE3）株のフリーズストックから10μlを100mlのLB-amp培地に植菌し、37℃で一晩培養した。つづいて250ｍｌのLB-Amp培地４本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nｍを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、全ての培養液を統一し、遠心分離し（8,000 rpm、20 min、4℃、2 times）、菌体と培養上清に分離した。培養上清の一部を発現解析用に回収した。
培養上清に最終濃度20 mMとなるようにイミダゾールを添加後、0.45μmフィルターで濾過し、クロマトアプライ用サンプルとして調整した。HisTrapカラム（GEヘルスケア社） 5 mlに、カラムを平衡化するため、洗浄バッファー（20 mM イミダゾール、20 mMリン酸バッファー、pH 7.4）をカラム容量の5倍アプライした。平衡化したカラムに、調整したサンプルに対しペリスタポンプを利用してアプライし、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
サンプルアプライ終了後、次に洗浄および溶出を行った。カラムに対し5倍量の洗浄バッファーで洗浄し、次にカラムに対し5倍量の溶出バッファー（500 mM イミダゾール、20 mMリン酸バッファー、pH 7.4）で溶出した。培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認されたら、限外濾過膜（Amicon Ultra-15 30kDa）にて濃縮し、PBSに置換した。次いで、さらに精製度を上げるために、濃縮されたTBCC-Z溶液に最終濃度50 mM DTTを添加後30分間室温で振とうし、PBSにて10倍に希釈し（最終濃度5 mM DTT）、再度HisTrapカラム（5 ml）にアプライした。そして次に洗浄バッファーをカラムの5倍量アプライし、次にカラムに対し5倍量の溶出バッファーで溶出させた。カラム処理前サンプル、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認されたら、限外濾過膜（Amicon Ultra-15 30kDa）にて濃縮し、PBSに置換した。BCA protein Assay Reagent（bicinchoninic acid）（PIERCE社）を用いてタンパク質の定量を行った結果TBCC-Zタンパク質の濃度はTBCC（wt）-Zが3.1 mg、TBCC（S52C）-Zが14.5 mgそしてTBCC（C60）-Zが10.2mgとなった。TBCC（S52C）-ZおよびTBCC（C60）-ZをまとめてTBCC(Cys)-Zと標記する。【００５７】
（各種TBCC-Zのエンドトキシン除去処理）
大腸菌で作製したリコンビナントはエンドトキシンの混入が考えられるため、免疫実験を行うにあたってエンドトキシンの除去およびタンパク質溶液のエンドトキシン濃度を検定した。
TBCC-Zは分子量が約60 kDaであるのに対し、エンドトキシンは分子量が約10 kDaなので50 kDaの透析膜による限外濾過処理を行った。透析外液はPBSを用い、4℃で数時間毎に外液を交換することで最終的に一昼夜透析を行った。
この透析済みサンプルをエンドトキシン除去カラム（PIERCE社：Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel）にアプライし、素通りした画分を回収した後、BCA定量を行いリムルス試験（LAL）によりエンドトキシン濃度を検定した。すなわち、LALのPyrogen Single Test 25回用を用いて最終容量を0.25 mlに希釈したサンプルを用いて検査した。サンプルの希釈にはエンドトキシンフリー水を用いた。必要濃度に調整したサンプル溶液を注射器でバイアルに注入し、軽く混合し、転倒しないように箱等に入れて37℃で一時間反応させた。
1時間後、振動を与えないようにインキュベーターから取り出し、一度転倒させた。サンプル溶液が凝固したならば、エンドトキシン陽性、凝固していないもしくは、一部だけ溶けて落ちる場合はエンドトキシン陰性と判断した。陰性になる希釈ポイントの一段階前がエンドポイントと定義されるので、そこからエンドトキシンのUnit数を計算し、500 pgエンドトキシン/μg of proteinのレベル以上であった場合には、再度エンドトキシン除去カラムにアプライし、同様の操作を500 pgエンドトキシン/μg of protein以下となるレベルまで繰り返し行った。【００５８】
実施例７
ワクチン−運搬体融合体の作製(２)：
三日熱マラリア原虫の伝播阻止抗原であるPvs25をTBCC(Cys)-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学結合によりTBCC（Cys）-Zに融合した。ワクチン抗原Pvs25は酵母Pichia pastorisで発現した均一な立体構造を持つPvs25H Aフォーム（Pvs25H-A）を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下の反応方法で融合体TBCC-Z/Pvs25H-Aを完了させた。
融合に関しては、TBCC-Z tetramer（2 mg： 1.55 ml： 34 nmol）、Pvs25H-A（2.8 mg：1.46 ml：137.2 nmol）で行った。【００５９】
（還元処理）
まず、TBCC（Cys）-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行った。TBCC(Cys)-Zは大腸菌で発現させた状態でも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSH基の数を増加させるために、還元処理を行った。TBCC（Cys）-Z （4 mg）溶液に最終濃度50 mMのDTTを添加した後、室温で30分間振とうした。その後、限外濾過膜による処理（Amicon Ultra-4 10k；5000×g  20 min×4 times with PBS）でDTTを除去し、BCA定量法によりタンパク質濃度を決定した。【００６０】
（融合処理）
使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 84 μlを5.6 mg/2.8 mlのPvs25H-Aを加え、60分間室温でインキュベートした（Pyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａの作製）。限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10k；5000 x g 20 min×4 times with PBS）を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated Pvs25H-Ａ （2.8 mg/1.46 ml）に 還元処理済みの2 mg TBCC（Cys）-Z（1550 μl）を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k（5000 x g 20 min×4 times）を使用し、化学反応の副産物（Pyridine 2-thione）を  除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質TBCC(Cys)-Z/Pvs25H-Aを得た。【００６１】
（TBCC-Z/Pvs25H-Aの融合確認）
TBCC-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、Pvs25H-A特異的ELISAによってPvs25H-AがTBCC（Cys）-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96 well ELISA Plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG（h IgG）をバイカーボネートバッファーを用いて5 μg/mlの濃度で各wellに50 μlずつアプライし、４℃で一晩反応させ、コートした。hIgGをコートしたELISAプレートに1 % BSA in PBS溶液を150 μl/wellで加え、37℃で2時間反応させ、ブロッキング反応を行った。ブロッキング後に各サンプルTBCC(Cys)-Zあたり2 μg/wellの濃度でTBCC(Cys)-Z或いはTBCC(Cys)-Z/Pvs25H-A融合分子を加え、37℃で2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体（hIgG）と結合していない可能性のある「フリー」状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG（5 μg/ml）を各wellに50 μlずつアプライし37℃で2時間反応させた。その後、一次抗体として抗Pvs25マウスIgG抗血清（200倍希釈）を50 μl/wellでアプライし、37℃で2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体（3,000倍希釈）を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、Pvs25H-A抗原特異的シグナルを検出した結果、TBCC(Cys)-ZとTBCC(Cys)-Z/Pvs25H-Aのシグナルの違いからTBCC(Cys)-ZにPvs25H-Aが結合していることが直接的に証明された。【００６２】
実施例８
免疫原性確認試験：
Balb/cマウス、♀、7週齢（日本SLC）に、Pvs25H-A（S）30μgを皮下（s.c.）、経鼻（i.n.）で3回（0、2、4週目）投与した（n = 7）。同様にして、Pvs25H-A 30μgとTBCC（S52C）-Z 21.4μgもしくはTBCC（C60）-Z 21.4μgを混合した試料（M）または実施例６で得られたTBCC（S52C）-Z/Pvs25H-A（L）もしくはTBCC（C60）-Z/Pvs25H-A（L）51.4μgを投与した。さらに、コレラ毒素（CT；LBL）1μgと試料S、M、Lを混合し、経鼻投与した（i.n./CT）。また、不完全フロイントアジュバント（IFA）もしくはAlumアジュバントを抗原投与容量と同量（ここでは100μl）と試料Sを30μgを混合したものを皮下投与した（s.c./IFA、s.c./Alum）。
さらにIFAの非存在下で、S、M、LをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のPvs25H-Aに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に最終採血を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にPvs25H-A(5μg/ml)を用い、50倍希釈の血清、4000倍希釈のAnti-mouse IgG-APを用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図４に示す。【００６３】
この結果から、今回作製した新規ワクチン融合体は一般的なワクチンの効果として考えられるIFA存在下の抗原単独混合群で見られた抗体価と同等な応答を誘導することが可能であり、更にAlumアジュバントとの混合投与においてより増強させることができた。つまりこの新規ワクチン融合体は皮下免疫においてアジュバントの依存なしに抗体応答を誘導できるが、臨床に用いられているアジュバントを併用するとより効果の高い抗体産生を誘導することが示された。【００６４】
実施例９
伝搬阻止解析：
実施例８で得られた血清を各群（s.c./IFA S、s.c.S、s.c.M、s.c.L、s.c./Alum S、s.c./Alum M、s.c./Alum L、i.n.S、i.n./CT S、i.n./CT L）で混合し、混合血清をサンプルとした。アッセイは、4名の患者血液（三日熱マラリア原虫生殖母体）を用いた。患者血液180μｌに、混合血清90μｌと正常ヒト血清90μｌを混合した180μｌを添加し、メンブレンフィーダーに入れて蚊（Anopheles dirus）に吸血させた。蚊の中腸におけるオーシスト形成数を顕微鏡観察によって測定した。結果を図５に示す。【００６５】
この結果から、今回作製したTBCCをコアとして用いた新規マラリアワクチン融合分子は抗体産生が優位に上昇した群で、実際の三日熱マラリア原虫を完全に殺傷する能力があることが分かった。さらにS、M 、Lの順番で殺傷能力が上昇しているほか、Alumとの併用投与によって、より殺傷能力が高くなることがわかり、既存のアジュバントの効果を増強させる可能性がある。【００６６】
実施例１０
ワクチン−運搬体融合体の作製(３)：
MSP1-19を搭載した融合体を作製し、その抗体応答機能を調べた。MSP1-19はPvs25と同じマラリア抗原ではあるが、メロゾイト期の抗原であり、伝搬阻止抗原であるPvs25は、蚊の中でマラリア原虫が発現するものであるのに対して、MSP1-19は、ほ乳類の中でマラリア原虫が発現する抗原である。
具体的にはMSP1-19をTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学結合によりに融合した。ワクチン抗原MSP1-19は酵母Pichia pastorisで発現した均一な構造を持つMSP1-19 Sフォーム（MSP1-19H-S）を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下の反応方法で融合体TBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sを完了させた。
融合に関しては、TBCC-Z tetramer（750 μg： 625 μl： 12.5 nmol）、COMP-Z pentamer（750 μg： 625 μl： 10.4 nmol）、MSP1-19H-S （3 mg： 1.5ml： 210nmol）で行った。【００６７】
（還元処理）
まず、TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行った。TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zは大腸菌で発現させた状態でも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSH基の数を増加させるために、還元処理を行った。TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z （4 mg）溶液に最終濃度50 mMのDTTを添加した後、室温で30分間振とうした。その後、限外濾過膜による処理（Amicon Ultra-4 10k；5000×g  20 min×4 times with PBS）でDTTを除去し、BCA定量法によりタンパク質濃度を決定した。【００６８】
（融合処理）
使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 84 μlを3 mg/1.5 mlのMSP1-19H-Sを加え、60分間室温でインキュベートした（Pyridyldithiol-activated MSP1-19H-Sの作製）。限外濾過膜（Amicon Ultra-4 10k；5000 x g 20 min×4 times with PBS）を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated MSP1-19H-S （3mg/1.5 ml）に 還元処理済みの0.5 mg TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z（500 μl）を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k（5000 x g 20 min×4 times）を使用し、化学反応の副産物（Pyridine 2-thione）を除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質TBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sを得た。【００６９】
（TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zの融合確認）
TBCC-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、MSP1-19H-S特異的ELISAによってMSP1-19H-SがTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96 well ELISA Plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG（h IgG）をバイカーボネートバッファーを用いて5 μg/mlの濃度で各wellに50 μlずつアプライし、４℃で一晩反応させ、コートした。hIgGをコートしたELISAプレートに1 % BSA in PBS溶液を150 μl/wellで加え、37℃で2時間反応させ、ブロッキング反応を行った。ブロッキング後に各サンプルTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z分子あたり2 μg/wellの濃度でTBCC-Z/MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-S融合分子を加え、37℃で2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体（hIgG）と結合していない可能性のある「フリー」状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG（5 μg/ml）を各wellに50 μlずつアプライし37℃で2時間反応させた。その後、一次抗体として抗MSP1-19マウスIgG抗血清（200倍希釈）を50 μl/wellでアプライし、37℃で2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体（3,000倍希釈）を50 μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、MSP1-19H-S抗原特異的シグナルを検出した結果、TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZとTBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sのシグナルの違いからTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZにMSP1-19H-Sが結合していることが直接的に証明された。【００７０】
実施例１１
免疫原性確認試験：
C57B/6マウス、♀、7週齢（日本SLC）に、MSP1-19H-S（S）30 μgを皮下（s.c.）、で3回（0、2、4週目）投与した。同様にして、MSP1-19H-S 30 μgとTBCC(Cys)-Z またはCOMP-Z 10.6 μgを混合した試料（M）または実施例１０で得られたTBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-S（L）40.6 μgを投与した。さらに、フロイントアジュバント(IFA)を抗原投与容量と同量（ここでは100μl）と試料Sを30 μgを混合したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のMSP1-19H-Sに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に抗体価の解析を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にMSP1-19H-S (5 μg/ml)を用い、50倍希釈の血清3,000倍希釈のAP conjugate抗マウス抗体を用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図６に示す。【００７１】
この結果から、今回作製した抗原を変更した新規マラリアワクチン融合分子についても抗原単独に比べて、有意に免疫応答が高かった。つまりTIPsに搭載した抗原は種類に関わらず免疫原性を増強させることができる可能性がある。TIPsの汎用性を証明する結果となった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の薬物運搬体は、構成する分子群の設計の自由度が高いため汎用性が高く、かつ安全性にも優れるものであり、標的細胞または組織に効率的に薬物を運搬するとともに、薬物の作用を増強し得るものである。したがって、感染症等に対するドラッグデリバリーシステムのプラットフォームとして極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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