(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液分析器を操作する無溶解単一希釈方法であって、該方法が、
（ａ）（ｉ）光源、
（ｉｉ）移動するサンプル流を中に含み、サンプル流とともにサンプル内の粒子が移動するフローセル、
（ｉｉｉ）フローセル内でサンプル流とともに移動する粒子状物質に光源からの光を集束させる少なくとも１つの光学素子、
（ｉｖ）光源からの集束光が、移動するサンプル流を横切って往復して掃引するように集束光を偏向させる走査素子、
（ｖ）走査素子の作用で光ビームに導入される光学的歪みを補正する円柱レンズ、
（ｖｉ）少なくとも１つの検出器チャンネル、および
（ｖｉｉ）信号を処理する回路を有するレーザラスタ走査装置を用意することと、
（ｂ）体液サンプルを用意することと、
（ｃ）体液サンプルを均質化することと、
（ｄ）体液サンプルのある体積を抽出することと、
（ｅ）抽出された体積に、溶解剤を含まない試薬溶液を導入して混合物を形成することと、
（ｆ）（ｅ）の混合物を均質化することと、
（ｇ）結果として生じる均質化された混合物を装置によって分析することとを備える、方法。
【請求項２】
前記フローセルが、複数の粒子が互いに並行して流れることができるサンプル流の形成を可能にするのに十分な断面寸法を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記走査素子が、動的ビーム偏向器である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
装置が、アナログ信号用の調整回路をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの検出器チャンネルが、前置増幅器回路、アナログデジタル変換器およびフィールドプログラマブルゲートアレイからなる群から選択された少なくとも１つの要素を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
デジタル信号処理チップと、計算用の中間値を保持するのに十分なオンボードメモリレジスタと、デジタルアナログ変換器とをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
結果として生じる均質化された混合物の分析が、飛行時間の測定によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記走査素子が、音響光学変調器である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体液が、血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
体液が、髄液、胸膜液、腹膜液、心膜液、滑液、腹水、排液および透析液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
体液サンプルが、反転によって均質化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
体積が、吸引によって抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
吸引が、ダイナミックピペッティングによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
吸引が、せん断弁によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｅ）の混合物の均質化が、渦流混合によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ｅ）の混合物の均質化が、泡混合によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（ｅ）の混合物の均質化が、乱流混合によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
試薬溶液が、生理食塩水希釈液からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
試薬溶液が、球状化試薬をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試薬溶液が、少なくとも１種類の核酸色素をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種類の核酸色素が、ＲＮＡを染色可能である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種類の核酸色素が、ＤＮＡを染色可能である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
試薬溶液が、選択的透過処理剤をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメータおよび血液分析器に関し、特に、光学式フローセルで光散乱技術と蛍光技術を用いて生体細胞をカウントおよび同定する血液分析器に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリは、液流中に浮遊している微粒子をカウントし、検査し、分取する技術である。フローサイトメトリによれば、光学的電子的検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および／または生化学的特性を同時かつ多パラメータで分析することができる。血液分析器で使用される場合は、フローサイトメトリは、光散乱検出および／または蛍光検出の使用に基づいて、ある測定された体積の血液サンプルまたは他の生体液サンプル中の細胞の正確なカウントと同定を行うことができる。本明細書で使用される「フローサイトメトリ」という語句は、フローサイトメータのみならずフローサイトメトリに基づく血液分析器および他の診断機器に使用される技術および装置を指す。
【０００３】
フローサイトメトリでは、光、例えば、単一波長のレーザ光、発光ダイオード（ＬＥＤ）または何らかの他の光源からのより広いスペクトルの性質を有する光などのビームが、粒子を搬送する液体の流体力学的に絞り込まれた流れに、あるいは別の方法で限定されたそのような流れに向けられる。複数の検出器が、流れが光ビームを通過する領域に向けられ、１個以上の検出器は光ビームの線上にあり、一般に複数個の検出器は光ビームと直交して配置される。光ビームの線上にある検出器は、１つ以上の角度円環または角度領域において、前方散乱光または吸光度、または前方散乱光と吸光度の両方を検出する。光ビームと直交して配置された検出器は、側方散乱光、蛍光、または側方散乱光と蛍光の両方を検出する。ビームを通過する各浮遊粒子が、何らかの方法で光を散乱させ、粒子内または粒子上の、粒子に自然に存在しているかあるいはインキュベーション工程時に付加された蛍光性化学物質が、光源より長い波長で発光するように十分励起こされることがある。吸光度、散乱光および蛍光の組合せが、検出器によって検出され、各検出器（一般に、目的の蛍光発光帯ごとに１個の検出器と散乱角の各円環または領域ごとに１個の検出器）で強度の変動を分析することによって、それぞれ個別の粒子の物理的および生化学的構造に関する種々の事実を求めることができる。前方散乱光は、細胞の体積と相関し、側方散乱光は、例えば、細胞核の形、細胞質微粒子の量と種類、細胞膜の粗さなど、粒子の複雑さに依存する。蛍光マーカは、ある特定の種類の細胞上に存在する抗原または特定の病的状態の細胞に選択的に結合する単クローン抗体と結合可能である。細胞質、細胞核または両方の中の核酸に選択的に結合する蛍光色素も採用される場合がある。フローサイトメータを使用する機器の代表的な例は、米国特許第５，０１７，４９７号明細書、５，１３８，１８１号明細書、５，３５０，６９５号明細書、５，８１２，４１９号明細書、５，９３９，３２６号明細書、６，５７９，６８５号明細書および６，６１８，１４３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１４３１１７号明細書に記載されている。これらの文献は、流動する細胞流れと静止ビームを記載している。
【０００４】
サイトメトリの部分領域であるレーザ走査サイトメトリ（ＬＳＣ）は、インタロゲーション域を横切ってレーザビームを走査することを伴う。しかしながら、インタロゲーション域は、固定であり、一般に、細胞が付着された顕微鏡スライドガラスの部分であって、このようなスキームを通じて取得可能な測定レート（すなわち、所定の単位時間に分析される細胞数）は、従来のフローサイトメトリによって得られる測定レートよりはるかに低い。さらに、フローサイトメトリが、大量の細胞を分析する光散乱および蛍光標識方法であるのに対して、ＬＳＣは、比較的限られた数の細胞を詳細に分析するのに適した画像処理方法である。例えば、米国特許第５，０７２，３８２号明細書、５，５２３，２０７号明細書および６，００２，７８８号明細書を参照されたい。ＬＳＣと密接に関連する他の２つの技術は、容量キャピラリサイトメトリ（例えば、米国特許第５，９６２，２３８号明細書および欧州特許第０６８１／７８号明細書を参照）と、マイクロボリュームＬＳＣ（例えば、米国特許第６，６０３，５３７号明細書および６，６８７，３９５号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８０８１７号明細書を参照）である。これらの技術はすべて、制御可能なステージに固定された試料に当たる走査レーザビームと、高分解能画像処理、共焦点走査または分光技術に基づく方法に依拠している。
【０００５】
従来技術のいくつかの教示は、従来の分析器の流量特性を画像処理能力と結合させたイメージングフローサイトメータを記載している。例えば、米国特許第５，０８３，０１４号明細書、５，４４４，５２７号明細書、５，５２１，６９９号明細書、５，６４４，３８８号明細書、５，８２４，２６９号明細書、６，６７１，０４４号明細書および６，９７５，４００号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１４６７３４号明細書および２００２／００５７４３２号明細書を参照されたい。従来技術では、（ａ）レーザまたは他の光源が固定式であって、インタロゲーション域中から情報を収集するために電荷結合検出器（ＣＣＤ）アレイの使用が必要であり、（ｂ）取得される情報は、光散乱の性質ではなく、画像処理の性質を帯びている。この方法によれば、プロセスの実行がフローサイトメトリよりも著しく遅くなる。換言すれば、開示された画像処理戦略を使用して各細胞に関するより詳細な情報を得るために、測定レートが下げられる、すなわち、所定の時間単位で実際に分析される総細胞数が減少される。
【０００６】
画像処理方法の主要な利点の１つは、このような方法が、個々の細胞の詳細を取得する能力を有し、それにより、熟練した専門家が、際どい事例でも確実に同定できるようになるということである。しかしながら、画像処理方法によってより詳細な事項が取得できることは、所定の時間にこの方法により分析可能な総細胞数が減少することによって差し引きされる。散乱に基づく方法では、同定は、細胞全体で平均化される特性（細胞の大きさ、ヘモグロビン含有量、細胞核小葉性など）に基づいている。しかしながら、個々の細胞の詳細を失っても、数秒間に何万もの細胞に関する目的情報を集める能力によって埋め合わせされる。このような情報は、数種類の特性（例えば、大きさ、小葉性など）に従って結果を総合的にグラフ化するために使用され得る。
【０００７】
フローサイトメトリに部分的に基づく機器であるＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）血液分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販）は、標準的な条件下で１時間あたり最低１０５個の全血球数（ＣＢＣ）サンプルを処理する。この性能の態様が機器の処理能力とみなされる。他の市販の血液分析器は、その設計で採用された性能トレードオフの結果として、通常、反射試験率、スライドガラスレビュー率、または反射試験率とスライドガラスレビュー率の両方が高くなるが、１時間あたり１５０個の標準的なＣＢＣサンプルまで処理が可能である。反射試験率とスライドガラスレビュー率を低く維持しながら、同時に１時間あたりの標準的なＣＢＣサンプルの処理量を現在可能な量よりも上げることができるように血液分析器の有効処理能力（すなわち、機械的処理能力と初回通過報告率（ｆｉｒｓｔ−ｐａｓｓ  ｒｅｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ）の両方に相当）を高めることが望ましい。この改良により、できる限り少ないスライドガラスレビューで１日あたりに多数の、標準的で、主として正常なＣＢＣサンプルの処理を必要とする大規模試験所（基準試験所または病院中央検査室）においてこのような分析器を使用することが可能になる。それは、また、分析器が使用される他のどんな研究室環境においてもサンプル処理能力の向上を可能にする。
【０００８】
処理能力の向上には、例えば、サンプルの導入、吸引、分配、希釈、混合、インキュベーション、ステージング、フローセルへの送達、一連のサンプルの連続測定に要する時間など、いくつかの障害がある。これらの障害はボトルネックと考えられ、その場合、最も狭いボトルネックが機器の総処理能力を決定する。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）機器において現在最も狭いボトルネックは、光学式フローセルによる連続測定に要する時間である。現在達成される性能は、同時通過（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）の許容レベルと、結果（細胞の総カウント数）の許容精度と、現在のハードウェア／エレクトロニクスアーキテクチャ、すなわち、ハードウェアおよび電子部品の配置による制約と、試薬および希釈に関する分析戦略による制約との間での妥協を伴う。本明細書で使用される「同時通過」とは、２個以上の細胞が、同種であれ異種であれ、機器によって解像できないほど十分に近く、１個としてカウントされ、１つ以上の検出パラメータで誤って同定される場合を意味すると解釈される。
【０００９】
サンプル流の拡幅、サンプル流の速度上昇、あるいはその両方によってフローセル内の流量を増加させることは、すべて試みられている。サンプル流が静止ビームと交差する従来のフローサイトメータでは、（１秒あたりに分析される細胞数ｎとして定義される）線形領域における測定レートは、以下の式１によって与えられる。
【００１０】
ｎ＝ρｘｓｔｒｅａｍｚｓｔｒｅａｍνｓｔｒｅａｍ  （式１）
ただし、ρはサンプル流内の細胞の濃度、ｘｓｔｒｅａｍはサンプル流の照射部分の横寸法、ｚｓｔｒｅａｍはサンプル流の照射部分の縦寸法、νｓｔｒｅａｍは流速を表す。測定レートを上昇させるために、これらの４つの量のいずれかを上げるように試みることができる。しかしながら、最先端技術において見られる現状では、ρの上昇は、ｘｓｔｒｅａｍやｚｓｔｒｅａｍを増加させる場合と同様、同時通過のイベントの増加をもたらす。νｓｔｒｅａｍの上昇は、結果として生じるサンプル流が静止光ビームの全域で予測不能に揺動または変動するので、乱流または他の種類の流体力学的不安定の発生に関係するリスクをもたらす恐れがあり、測定精度をひどく低下させる可能性がある。
【００１１】
他の選択肢には、測定ハードウェア全体を単純に二重にして、２セットの測定を、並行して別々の光源によってインタロゲートされる別々のフローセルに対して行うことが含まれる。２個の光源が使用される場合もあれば、１個の光源が２つに分割される場合もある。この方法の欠陥は、複雑度の増大、コストの大幅な上昇、追加部品の多さによる信頼度に対するリスクの大幅な上昇、およびサービスコストの上昇である。
【００１２】
参照により全体が本明細書に組み込まれた米国特許出願第１１／９３４，２７７号明細書は、満足のいく形で上記の問題に対処する。すなわち、高い初回通過結果報告率と関連した現在利用可能な望ましい特質を維持しながら、同時通過レベルの上昇を招くことなく、結果の精度を劣化させることなく、ハードウェアおよび／または電子装置を大きく変更すること（従って、同じ制約のほとんどを満たす必要）なく、必ずしも現在使用されている化学的作用と希釈物を変える必要なく、フローサイトメータの処理能力を向上させる。その開示は、現在の分析器のアーキテクチャおよび動作の比較的わずかな変更で、かなりの性能向上を達成することができる方法および装置を記載している。このようなわずかな範囲の設計変化が商業的観点から魅力的で有益であるのに対して、そのことは、また、同じ開示に記載された革新が活用される度合いを制限している。
【００１３】
ヒトの全血からのパラメータを定量（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）することを対象とする血液分析では、細胞数の単純で高速かつ正確な測定に障害をもたらす２つの生理学的要因がある。１つの要因は、一般的なヒトの新鮮末梢全血では、各白血球（ＷＢＣ）につき、約１０００個の赤血球（ＲＢＣ）と約５０個の血小板が存在することである。他の要因は、血小板が、大きさに基づく識別を可能にするほど十分に他の細胞種より一般的に小さく、大部分の白血球（ＷＢＣ）も、大きさに基づく識別を可能にするほど十分にＲＢＣまたは血小板より大きいのに対し、特に２つの細胞種、ＲＢＣと、ＷＢＣの亜型であるリンパ球とが、大きさに基づく識別に大きな誤差を招きやすくするのに十分なほど大きさ分布（ならびにその散乱特徴）で一般的に重なり合うことである。従って、主に大きさ識別によってＲＢＣを定量する場合、ＲＢＣとして誤分類される時折存在するＷＢＣは、目立つ程度にはＲＢＣの測定濃度の精度全体にほぼ影響を与えないので、濃度の非対称がＲＢＣに有利に働く。しかしながら、その逆は真実ではなく、リンパ球の濃度（ひいては、ＷＢＣの総濃度）を求める際には、ＲＢＣからの障害についての不明量が、非常に不正確な結果をもたらすことになる。
【００１４】
その結果、この大きな非対称と大きさの重なり合いとを扱い、許容できる時間フレームで有用な結果をなお提供する方法が従来技術で開発された。従来技術で採用された標準的な方法の１つは、分析される血液サンプルを、ＲＢＣおよび血小板分析向けに１つとＷＢＣ分析向けに１つの少なくとも２つのアリコートに分離することであった。ＷＢＣ分析向けのアリコートは、ＲＢＣの膜を選択的に攻撃する溶解試薬を含む試薬溶液と混合される。損傷のある膜からヘモグロビンが失われることを理由の一部として、また、それに伴う大きさの減少を理由の一部として、結果として生じる溶解ＲＢＣが、リンパ球とそれぞれの散乱特徴に基づいて識別されることができる。従来技術で採用されたもう１つの方法は、核酸色素を用いてＲＢＣとＷＢＣの間で蛍光識別を行うことを伴う。ＷＢＣは、ＤＮＡを含んだ核を含んでいる。これらのＷＢＣが蛍光標識によって標識化されると、成熟過程で核が排出された成熟ＲＢＣから識別されることができる。
【００１５】
これらの方法の両方が欠点を有している。第１に、ＲＢＣを溶解するために使われる溶解試薬は、ＷＢＣをも攻撃して、その完全性を低下させ、結局はＷＢＣも溶解させる可能性がある。これは、何らかの病的状態（例えば、慢性リンパ球性白血病など）のせいでそもそもすでに壊れやすいＷＢＣにとって特に問題である。他方では、当然溶解に対して抵抗し、従って溶解を伴うＷＢＣ分析において干渉物質として存在し続ける傾向があるＲＢＣのタイプ（例えば、新生児に見られるＲＢＣ、サラセミア、鎌状赤血球貧血および肝臓病の患者に見られるＲＢＣ）がある。ＷＢＣの劣化または未溶解ＲＢＣからの干渉（そのいずれかが総ＷＢＣ濃度の測定精度を危うくする）の可能性を下げるために、溶解剤濃度と、温度制御と、インキュベーション時間の注意深い組合せが使用されなければならない。場合によっては、使用者は、さまざまな溶解条件の複数の検査選択肢を提供され、それによって分析を被検患者のサンプルに合わせて調整することができる。しかしながら、この調整は、複雑な解決策であり、患者の状態の事前の知識をさらに必要とするか、標準ＣＢＣの後に反射検査として用いられる必要がある。
【００１６】
ＲＢＣとリンパ球を識別する蛍光に基づく方法に関して、主要な障害は測定レートである。ＷＢＣがＲＢＣおよび血小板と同時に測定される場合、ＲＢＣが存在するために、上限濃度が、容認できないほど高い率で同時通過を招くことなしに分析器内に送出可能な濃度に設定される。このような濃度を達成するのに使用される希釈率によって、今度は、ＷＢＣイベントがカウントされる率が制限され、分析器の期待されるカウント精度を得るために、この比較的低いＷＢＣイベント収集率によって、今度は、長い収集時間が強いられる。例えば、１つのサンプルの血液成分すべてを１回の通過で測定する概念は、米国特許第６，５２４，８５８号明細書に開示されている。その開示に述べられているように、方法は、８８秒のサイクル時間、すなわち約４１ＣＢＣ／時の能力がある。この処理能力は、今日市販されている大部分の自動血液分析器によって達成可能な処理能力よりはるかに低く、その商業的有用性を著しく制限している。別の例として、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）は、ＲＢＣとリンパ球を識別可能にする核酸色素を用いる（ＲＢＣ／血小板分析およびＷＢＣ分析で使用されるサンプルアリコートに加えて、さらにもう１つのサンプルアリコートを必要とする）検査選択肢を現在提供している。この検査選択肢は、色素を使用して、成熟ＲＢＣと、細胞質に色素吸着ＲＮＡを保持する未熟ＲＢＣの部分集合である網状赤血球とを主に区別する。所望の精度を得るようにＷＢＣがＲＢＣまたは網状赤血球と蛍光によって十分に識別されるので、この同じ分析法を用いてＷＢＣをカウントすることは技術的に可能であるが、使用される希釈物中のＷＢＣ濃度が相対的に低いために、要求される統計精度を達成するには非実用的な選択肢になっている。このようなスキームは、約７５秒の収集時間を必要とし、処理能力をたった４８ＣＢＣ／時に制限することになる。従って、この方法は理論的に実行可能であるが、この方法が商業的に実用化されるためには、はるかにより高い処理能力が必要になる。
【００１７】
単一希釈方法は、多くの魅力的な利益を提供する。その１つは、複数のアリコートを省くことである。この特徴は、血液サンプルと試薬溶液とを混合するための（２つ以上の容器の代わりに）ただ１つの容器と、測定および試薬溶液の混合容器への送達のためのただ１つのシステム（例えば、精密計測シリンジ、関連する駆動モータおよび制御用電子部品）しか必要としないので、システムの流体アーキテクチャを劇的に単純化する。それにともなって、弁の数、弁アクチュエータの数、配管の個別部分の数、および所望の分析を実現するために必要な試薬の数と量も削減される。もう１つの利益は、ＲＢＣを溶解する処理を省くことである。この特徴は、溶解に抵抗するＲＢＣおよび溶解が起こりがちなリンパ球に関連する不確実性を劇的に低下させる。すなわち、時間のかかる、デリケートな溶解インキュベーション期間の必要性をなくし、さらに、以前は別々であった検査選択肢が１つの手順に結合されるので、分析器を操作する専用ソフトウェアの大部分を省く。もう１つの利益は、ここで述べた個々の変化に起因して、分析器の複雑度が全体的に低減されることから生じる。
【００１８】
さらに追加的に付随して複雑度が低減される可能性もある。高処理能力を目的として設計された血液分析器は、組み込まれたフローサイトメータサブアセンブリに加えて、例えば、カウント、分級（ｓｉｚｅ）および血球の一部の亜集団の同定を行う１つ以上のインピーダンス変換器、血液のヘモグロビン関連パラメータを定量する比色変換器などの追加の変換器も一般に含む。単一希釈分析器ならば、追加のインピーダンス変換器、ヘモグロビン測定用比色変換器、またはインピーダンス変換器とヘモグロビン測定用比色変換器の両方を、これらの欠失を実用化するのに十分な測定速度を達成可能である場合、不要にすることができる。ヘモグロビン測定用比色変換器は、ＲＢＣの膜を溶解するために強い溶解剤（ＷＢＣ分析用のより穏やかな溶解剤に一般的に追加される溶解剤）の使用を必要とするので、ヘモグロビン測定用比色変換器を省くことで、フローサイトメータサブアセンブリで使用される溶解剤に加えてさらに追加の搭載溶解剤も不要にする。ヘモグロビン測定用の別個の比色変換器、インピーダンス変換器またはその両方を維持しながら、従来技術のフローサイトメータサブアセンブリを単一希釈サブアセンブリと単に置き換えることによってであろうと、あるいはインピーダンス変換器とヘモグロビン測定用比色変換器のすべての機能を単一希釈分析器に追加的に組み込むことによってであろうと、複雑度を低減させることにより、機器の信頼性が大きく向上される。その理由は、故障しやすい部品の数が減少するからであり、有害な熱を発生させる可能性のある部品の数が減少するからである。この信頼性の向上は、単純化された機器アーキテクチャ、すなわち、より少ない部品を有する機器の保守容易度の向上のために、メンテナンス必要性の低下、サービスコール要求の減少、発生するそれらのコールによるコストの低下とともに、機器のサービスプロファイルの大きな向上をさらにもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
これらの利益のすべては、開示された方法の低い処理能力のせいで、従来技術では影が薄くなっている。換言すれば、従来技術で開示された単一希釈の特徴は、上位の分析器の実現可能な要素の１つにすぎない。市販の血液分析器に普通に期待され、大規模環境用に設計された分析器に一般的に期待される処理能力性能をさらに提供するために、単一希釈方法を高い測定レートで向上させることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、無溶解単一希釈方法を用いて血液または他の生体液を分析する方法と組み合わせてレーザラスタ走査の技術を利用することによって、フローサイトメトリに基づく血液分析器の測定レートを上昇させるとともに複雑度を低減させる方法を提供する。レーザラスタ走査は、血液分析器内の流動サンプル流を横切ってレーザビームを掃引することを伴う。
【００２１】
従来のフローサイトメータでは、一般に水平方向に大幅に拡張された静止レーザビームが、比較的細い流動サンプル流と交差し、その中の細胞または他の粒子と相互に作用し、検出可能な散乱、吸光度または蛍光信号を発生させる。同時係属中の米国特許出願第１１／９３４，２７７号に記載され、参照により全体が本明細書に組み込まれている方法によれば、サンプル流が、従来の血液分析器におけるサンプル流より大きい幅を与えられ、それによってフローセルを通過する細胞の流量を増加させている。式１を参照すると、この拡幅操作は、実際には、サンプル流の横寸法ｘｓｔｒｅａｍを増加させ、それによってｎを比例する量だけ上昇させる。しかしながら、この拡幅操作は、同時通過が将来発生する可能性も上昇させる。
【００２２】
同時通過を許容レベルに制限するために、光ビームからの集束光のスポットは、結果として生じるサンプル流の一部のみと交差するように横寸法が低減される。同時通過は、レーザビームによって一度に照射されるサンプル流の体積の大きさによって左右されるから、レーザビームの幅をサンプル流の横断方向水平範囲の一部とのみ交差するように低減させることによって、照射体積の大きさも低減される。このような低減は、同時通過レベルが知られていて許容できる場合には、本来の従来設計における照射体積のサイズに回復させるように判断される。
【００２３】
静止レーザビームの場合、しかしながら、このような構成はサンプル流のかなり大きな部分を「見落とす」ことになる。その理由は、レーザビームが今やサンプル流より細くなっているからである。集束レーザビームの位置を通過して流れる際に、サンプル流の細胞（または粒子）の全てをカウントするために、レーザが「ラスタ走査」、すなわち、左右に掃引される。
【００２４】
従来のラスタスキームでは、スポットは、最初に所定の列を所定の方向に横断させられ、その後、次の列まで下方に移動させられ、その後、最初の列の横断方向と反対の方向に移動させられ、再び次の列まで下方に移動させられる。そして、手順が対象領域の残りの列に対して繰り返される。あるいは、スポットは、どの列でも横断させられた後に、前の列と同じ側で次の列を移動し始めるように、後戻りして横断させられるとともに下方に１列だけ移動させられる。従来のラスタスキームの一例は、標準的な陰極線管テレビジョン画面またはコンピュータモニター上での画像形成である。本明細書に記載された方法では、ラスタ走査は、レーザビームの横断方向の動きと流動サンプル流の垂直方向並進運動の組合せの結果として生じる。換言すれば、流動サンプル流が、ラスタ走査に必要なインタロゲーション体積の垂直方向並進運動を提供するので、レーザビームは、水平方向に掃引されさえすればよい。ラスタ走査は、レーザビームがサンプル流の細胞または粒子の全てと相互に作用できるよう十分に高速で実行され、その結果、測定レートは、式１の総量ρｘｓｔｒｅａｍｚｓｔｒｅａｍνｓｔｒｅａｍの上昇に正比例して上昇される。例えば、ｚｓｔｒｅａｍを低減させるとともにρをそれに比例して上昇させることにより、全体的な同時通過レベルが一定に維持され得ることは、当業者によって容易に理解できる。換言すれば、サンプルの希釈度を所定の値に限定する必要はない。その理由は、コアの流れの形状は、さまざまな希釈度に対応し、同時通過性能を犠牲にすることなくなおも所望の処理能力向上をもたらすように調整可能であるからである。
【００２５】
レーザビームの非一様なプロファイルのさまざまな部分と細胞との相互作用から導出されるさまざまな光散乱強度のために、ラスタ走査速度と流速は、各細胞を複数回インタロゲートして、この測定値の集合からピーク光散乱強度の代表値を得るように調整されることが可能である。
【００２６】
一実施形態では、本発明の装置および方法は、レーザに加えて、（ａ）光ビームの掃引を行う好適な種類の部品として動的ビーム偏向器（例えば、音響光学偏向器（以下「ＡＯＤ」と称する）または音響光学変調器（以下代わりに「ＡＯＭ」と称する））と、（ｂ）各検出器チャンネルごとに、以下の部品、すなわち、高速アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）チャンネル、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）またはその一部、および場合によりデジタル信号処理（ＤＳＰ）チップまたはその一部をそれぞれ１つずつ含む電子モジュールと、（ｃ）計算および記憶用の中間値を保持するのに十分なオンボードメモリレジスタを使用する。アナログとデジタル種類両方の追加の電子部品が、上記の（ｂ）および（ｃ）内の素子によって実行されるデジタル化工程およびデジタル信号処理工程と関連して必要な信号調整工程を提供するために、使用されることもある。これらの部品には、以下に限定されるものではないが、十分な帯域幅を有する前置増幅器回路、ノイズフィルタリング回路、基線復帰回路、ＡＯＤの動作による光強度変化を補正する回路が含まれることができる。これらの部品それぞれは、目的の機能を適切に実行するためにＦＰＧＡ（および場合に応じてＤＳＰ）および他の回路と相互に作用することができる。上述の要素は、実質的に、現在の血液分析器で従来より使用されている要素の付加品または置換品である。上述の要素に加えて、本発明の装置および方法は、現在の血液分析器とフローサイトメータで従来より使用されている対応要素の数の削減を意味する要素を使用する。これらの要素は、（ｄ）ＲＮＡおよびＤＮＡを染色する蛍光色素、またはＲＮＡおよびＤＮＡにそれぞれ選択的に結合する別々の色素を含み、溶解剤を含まない試薬溶液、（ｅ）サンプルの一部分を送給可能なサンプル吸引アセンブリ、（ｆ）このような部分を入れることができ、試薬溶液と混合するための単一の容器、（ｇ）試薬溶液の適量を計量し、サンプルアリコート容器に送達する単一のサブシステム、（ｈ）結果として生じるサンプルアリコートと試薬の溶液を光学式フローセルにステージングする単一のサブシステム、および（ｉ）サンプル流路のすすぎと廃液処理に必要な流体部品である。
【００２７】
本明細書に記載された方法の一実施形態では、分析器は、ラスタ走査フローセルの動作に必要であると先に述べられた部品に加えて、ヘモグロビンの検出および定量化のための比色変換器を、このような変換器上で実行されるヘモグロビン分析を支援するのに必要な溶解剤、適切な流体装置および適切な電子装置とともに保持する。本明細書に記載された方法の別の実施形態では、分析器は、ヘモグロビン測定用の別個の比色変換器（そして支援用の溶解剤、支援用流体装置および支援用電子装置）を所有せず、溶解剤のない単一希釈分析の結果を測定するラスタ走査フローセルの機能にこのような変換器のヘモグロビン定量化機能を組み込んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】レーザビームの観点から従来技術を説明する概略図である。集束されたビームスポットは、相対的に短い縦軸と相対的に長い横軸をもつ楕円形である。レーザビームは、一度に実質的にただ１個の細胞をインタロゲートするように細いサンプル流と交差する。
【図２】従来技術において従来のフローサイトメータの基本的な部品を表す概略図である。
【図３】分析される体積に所定の時間単位でより多くの細胞を流すことができるサンプル流を説明する概略図である。レーザビームの横軸は、通常、一度にただ１個の細胞をインタロゲートするために、従来技術と比較して長さが大きく低減されている。レーザビームは、各細胞がサンプル流中を流れる際に各細胞と交差するように、大きく拡幅されたサンプル流を横切って掃引する。
【図４】本発明にかかるラスタ走査フローサイトメータの基本的な部品を表す概略図である。
【図５】従来技術において従来のフローサイトメータにおける細胞とレーザビームとの相互作用を説明する概略図と、結果として生じる信号のピーク値を確定し、保持することによって、このような相互作用を正規化する従来の方法を示すグラフである。
【図６Ａ】標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、表された相互作用の結果として生じる信号の値とそれより以前の相互作用の値を示す。図６Ａは、細胞との初期接触段階のレーザビームを示す。
【図６Ｂ】標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、表された相互作用の結果として生じる信号の値とそれより以前の相互作用の値を示す。図６Ｂは、細胞と大きく重なり合うレーザビームを示す。
【図６Ｃ】標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、表された相互作用の結果として生じる信号の値とそれより以前の相互作用の値を示す。図６Ｃは、結果として生じる相互作用が最大値である、細胞を中心に置いたレーザビームを示す。
【図６Ｄ】標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、表された相互作用の結果として生じる信号の値とそれより以前の相互作用の値を示す。図６Ｄは、細胞に対して、最大ではないが、大きく重なり合うレーザビームを示す。
【図６Ｅ】標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、表された相互作用の結果として生じる信号の値とそれより以前の相互作用の値を示す。図６Ｅは、細胞と１つの最終接触状態をなすレーザビームを示す。
【図６Ｆ】標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、表された相互作用の結果として生じる信号の値とそれより以前の相互作用の値を示す。図６Ｆは、図６Ａから図６Ｅに説明された相互作用から明らかになる代表値を用いて、信号の強度を時間の関数として示す。
【図７Ａ】細胞がサンプル流中を進むとき、および標準２次元ガウス分布を有するレーザビームが連続ラスタ走査で細胞を複数回横切って掃引するときの、レーザビームと細胞との複数の連続した相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、相互作用の結果として生じる時変信号と、信号の最高値を示す。図７Ａは、レーザビームが最初に細胞と接触する場合の相互作用の結果を示す。
【図７Ｂ】細胞がサンプル流中を進むとき、および標準２次元ガウス分布を有するレーザビームが連続ラスタ走査で細胞を複数回横切って掃引するときの、レーザビームと細胞との複数の連続した相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、相互作用の結果として生じる時変信号と、信号の最高値を示す。図７Ｂは、図７Ａと同じ細胞がさらにサンプル流の中を進んで、レーザビームの中心部の比較的近くで相互作用する場合の相互作用の結果を示す。
【図７Ｃ】細胞がサンプル流中を進むとき、および標準２次元ガウス分布を有するレーザビームが連続ラスタ走査で細胞を複数回横切って掃引するときの、レーザビームと細胞との複数の連続した相互作用を説明する概略図と、グラフである。図の右に位置するグラフは、相互作用の結果として生じる時変信号と、信号の最高値を示す。図７Ｃは、図７Ａおよび図７Ｂと同じ細胞がさらにサンプル流の中を進んで、レーザビームの辺縁と相互に作用する場合の３番目の相互作用の結果を示す。
【図７Ｄ】細胞がサンプル流中を進むとき、および標準２次元ガウス分布を有するレーザビームが連続ラスタ走査で細胞を複数回横切って掃引するときの、レーザビームと細胞との複数の連続した相互作用を説明する概略図と、グラフである。図７Ｄは、走査番号（または時間）によってグラフ上に配置された最高値と、これらの値から数学的に抽出された曲線（例えば、ガウス分布曲線）と、その曲線のピーク値を示す。
【図８Ａ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｂ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｃ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｄ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｅ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｆ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｇ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｈ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｉ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｊ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｋ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｌ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図８Ｍ】サンプル流内を移動するいくつかの細胞と相互に作用するレーザビームのスポットを示す概略図を構成する。図の下方に、そのような相互作用の結果として生じる、代表的な検出器からの信号が表示されている。信号は、連続ラスタ走査に対応して順序づけられた区間に表示されている。
【図９】本発明において信号処理のために使用される電子モジュールの基本的な要素の概略ブロック図である。
【図１０】従来技術のレーザビームによって一度に照射されるサンプル体積の概略図である。同時通過の条件を説明するために利用される寸法および希釈のパラメータを示す。
【図１１】本明細書に記載された方法のための図１０の類似物である。図１１は、寸法および希釈の１つ以上のパラメータが従来技術に対して異なる一方で、照射体積中の平均粒子数が（従って、同時通過レベルも）ほぼ一定に維持され得る様子を説明する。
【図１２Ａ】細胞と相互に作用するレーザビームを説明する概略図である。相互作用が複数のデジタル化測定値を提供する必要条件を説明するために利用される寸法のパラメータを示す。
【図１２Ｂ】細胞と相互に作用するレーザビームを説明する概略図である。相互作用が複数のデジタル化測定値を提供する必要条件を説明するために利用される寸法のパラメータを示す。
【図１２Ｃ】細胞と相互に作用するレーザビームを説明する概略図である。相互作用が複数のデジタル化測定値を提供する必要条件を説明するために利用される寸法のパラメータを示す。
【図１３】５つの連続したラスタ走査の過程で細胞と繰り返し相互に作用するレーザビームを説明する概略図である。細胞がサンプル流内を進む際に、レーザビームが細胞を複数回横切って掃引する必要条件を説明するために利用される寸法のパラメータを示す。
【図１４】従来技術において所定の時間単位にレーザビームによってインタロゲートされるサンプル体積の概略図である。システムの総測定レート（すなわち、所定の時間単位に測定される細胞数）を算出するために利用される寸法、希釈および流動のパラメータを示す。
【図１５】本発明のための図１４の類似物である。寸法、希釈および流動のパラメータの１つ以上が従来技術に対して異なる一方で、所定の時間単位に測定される細胞数が増加され得る様子を説明する。
【図１６】従来技術の血液分析器の基本的な機能的工程を示す概略ブロック図である。
【図１７】本発明のための図１６の類似物である。溶解剤を必要としない無溶解単一希釈分析器において実現可能な方法としてレーザラスタ走査を導入することに付随する、サブシステムの削減と全体的複雑度の低減を説明する。
【図１８】流れの中の近接細胞間の同時通過を解消する能力の向上を証明する、本発明の装置で収集された実際のデータを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書で使用される「レーザラスタ走査」という表現は、本明細書に記載された新規な方法および装置を指す。しかしながら、「レーザ」という用語が本発明での使用に適したいかなる光源をも含むように意図されていることに留意すべきである。そのような光源には、以下に限定されるものではないが、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、アーク灯、プラズマ、その他、十分な明るさと、強度および波長の安定度または再現性、あるいは安定度および再現性の両方と、スペクトル純度とを提供することができるあらゆる光源が含まれる。同様に、以下に続く説明においても、レーザは、他の光源が本発明の説明に含まれていないことを意味することなく、適切な光源の一例であるとみなされる。本明細書で使用される「偏向する」という用語は、光ビームにフローセル内のサンプル流を横断させることを意味する。「偏向する」と本質的に同じ意味を有するように意図される、本明細書で代用される表現には、「走査する」と「掃引する」が含まれる。「ラスタ走査」という用語は、光源からのビームを左右に繰り返して掃引することを意味する。「画像処理方法」という表現は、光散乱方法と異なる方法を意味する。「サンプル流」という表現は、生体サンプル由来の粒子が搬送される、フローセル内の流動する流体を意味する。サンプル流（例えば、血液、場合により生理食塩水または試薬溶液と混合された血液などの体液）は、一般に、フローセル内でサンプル流と並行して流れ、サンプル流をフローセル壁から隔離するとともに、フローセルのより小さい部分に限定する液体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）の鞘によって囲まれる。本明細書で使用される「粒子」という用語は、生体細胞と、主要な寸法、例えば、直径で約０．５μｍから約５０μｍの範囲の大きさの他のあらゆる生物学的または非生物学的物質も含むことが意図されている。以下に続く説明では、細胞は、分析用装置に提供される適切な品目のただの一例であるとみなされる。「粒子」という用語の範囲には、例えば、細胞断片、核、その他の生物学的粒子（例えば、細菌）、非生物学的粒子（例えば、純粋であるか、あるいはコーティング、含有、混合または他の方法によって蛍光物質で増大させられ、未処理の、あるいは高速スクリーニングおよび他の同様の分析に使用される結合単クローン抗体または他の生物学的マーカで処理された、シリカビーズ、ラテックスまたはその他の材料）などの他の品目も含まれる。本明細書で使用される「無溶解単一希釈方法」という用語は、サンプルのただ１つの部分を適切な試薬溶液で希釈すること、結果として生じる混合物を測定装置を介して処理すること、それによって、さもなければ複数の部分、複数回の希釈、および細胞の溶解剤を含む少なくとも１種類の試薬溶液を含む複数の試薬溶液を必要とするようなサンプルに関して複数のパラメータ値を得ることに依拠する、血液分析器で血液または他の生体液の分析を行う方法を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「体液」という表現には、以下に限定されるものではないが、例えば、血液、髄液、腹水、胸膜液、腹膜液、心膜液、滑液、透析液、排液のような生体液が含まれる。
【００３１】
システムは、（１）サンプルの溶液を調製する流体モジュールと、（２）光ビームによるサンプル流の角掃引を行う光学モジュールと、（３）光学モジュールから生成された信号を処理する電子モジュールの、３つの主要モジュールを備えている。流体モジュールは、図１７に概略的に図示されている。本明細書に記載された光学モジュールは、検出器、フィルタおよび他の周辺光学部品を除いて、図４に図示されている。本明細書に記載された装置の構成は、従来技術の装置の構成と対比されている。本発明の光学モジュールは、光路に挿入された光偏向素子、例えば、音響光学偏向器（ＡＯＤ）を含む。本明細書に記載された電子モジュールは、図９に示されており、高速アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および場合によりデジタル信号処理（ＤＳＰ）チップを含む。
【００３２】
図１７に示す流体モジュールは、当業者によく知られているタイプの簡易な流体モジュールを表している。ＡＯＤは、現在使用されている市販の血液分析器に対する付加物である。電子モジュールの部品は、一部は現在使用されている電子部品の置換物であり、一部は現在使用されている電子部品に対する付加物である。
【００３３】
ここで図１を参照すると、従来技術で一般的に使用されているフローサイトメトリ機器からデータを得る方法は、サンプル流１０４とともに移動している細胞１０１、１０２、１０３を静止光ビーム１０５、例えば、レーザビームによって照射することを伴う。図１では、光ビーム１０５、例えば、レーザビームのスポット（焦点）が、相対的に短い縦軸（ｙ）と相対的に長い横軸（ｘ）を有する楕円形であり、さらに、このようなスポットが、ガウス分布曲線によって近似的に描写される（短軸または長軸に沿う）強度プロファイルを一般的に有していることがわかる。
【００３４】
図１に図示する方法は、図２に示す光学モジュールによって実行可能である。図２に示す光学モジュール２００は、光源２０２、光ビーム２０３、レンズまたはレンズ系２０４、フローセル２０６、および検出器（図示せず）を備えている。単純化のため、必要な検出器は図示されていないが、当業者には知られている。鏡、スリット、プリズム、フィルタなど、他の周辺部品やオプションの部品も図示されていない。電子モジュールも図示されていない。
【００３５】
従来技術では、図１に示すように、各細胞１０１、１０２、１０３は、サンプル流１０４の流動方向（縦寸法）に変化する光ビームプロファイルと、サンプル流１０４の幅（横寸法）にわたってほぼ一様な光ビームプロファイル（水平方向における光ビーム１０５がサンプル流１０４よりはるかに幅が広いため）を与えられる。従来技術では、光と細胞との間の相互作用による信号のピークは、縦寸法、すなわち、流動方向に沿って見いだされる。
【００３６】
ここで図３を参照すると、本発明の方法は、光偏向素子によってラスタ走査させられる光ビーム３１１、例えば、レーザビームによって、サンプル流３１０とともに移動する細胞３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９を照射することを伴う。光ビーム、例えば、レーザビームのスポット（焦点）が、従来技術のビームの縦軸（ｙ）に対して長さがほぼ等しい縦軸（ｙ’）と、従来技術のビームの横軸（ｘ）よりかなり短い横軸（ｘ’）をもつ楕円形であることがわかる。図３では、レーザビームのスポット（焦点）は、横軸（ｘ’）に平行な方向に流れを掃引させられる。
【００３７】
図３に図示する方法は、図４に概略的に示す光学モジュールによって実行可能である。図４において、光学モジュール４００の基本的な部品は、光ビーム４０３を提供する光源４０２、光偏向素子４０４、光ビーム４０３の焦点合せを行うレンズまたはレンズ系４０６などの少なくとも１つの光学素子、フローセル４０８、および少なくとも１つの検出器（図示せず）である。単純化のために、検出器は、少なくとも１つが必要であるが、図示されていない。しかし、当業者には知られている。鏡、スリット、プリズム、フィルタなど、他の周辺部品やオプションの部品も図示されていない。電子モジュールも図示されていない。レンズ４０６は、（１）ほぼ平行な光ビーム４０３の焦点をフローセル４０８に合わせること、および（２）光偏向素子４０４によって導入される光ビーム４０３の角掃引を、フローセル４０８のいずれかの部分を横切るビーム４０３の横方向平行移動に変換することの二重の機能を果たす。これらの機能は、レンズ４０６を、光偏向素子４０４からおよそ１焦点距離かつフローセル４０８から１焦点距離離れて配置することによって達成される。フローセルを越える伝搬ビーム（かつあらゆる散乱光ビームまたは発光された蛍光のあらゆるビーム）の位置をできる限りわずかしか変えないようにしながら、フローセルにおけるビームスポットの横断位置を変えるという本質的に同じ効果を達成する他の光学的配置が、両部品の位置変更、または追加部品の挿入、または両部品の位置変更と追加部品の挿入の両方を用いることによって存在する。
【００３８】
本明細書に記載され、図３に描写される発明のスキームでは、光ビーム３１１がサンプル流３１０の幅より小さくなるので、各細胞３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９は、サンプル流３１０の水平方向と垂直方向の両方に変化するプロファイルを与えられる。その後、ピーク強度の定量が２段階で達成される。第１段階では、水平方向の個々のラスタ走査からのピーク群の高速デジタル化と分離によって、ピーク強度が、サンプル流３１０において「水平に」（を横断して）定量される。第２段階では、複数のラスタ走査を分析し、ピーク値列を光ビーム３１１の垂直方向プロファイルを表す曲線に当てはめることと、このような当てはめ曲線のピークを抽出することによって、ピーク強度が、サンプル流３１０において「垂直に」定量される。あるいは、このような曲線とそのピークは、ピーク値列に対して適切なデジタルフィルタリングを施すことによって得ることができる。
【００３９】
光偏向素子４０４は、ＡＯＤである場合もＡＯＭである場合もある。従来技術のシステムの基本的な部品には、光源、レンズまたはレンズ系、フローセルおよび適切な検出器が含まれる。従来技術および本明細書に記載された方法の両方において、光源、レンズおよびレンズ系、フローセル、検出器、およびフローサイトメトリシステムにおけるそれらの機能は、当業者には知られている。例えば、光源、レンズ、フローセルおよび検出器がより詳細に記載されている、米国特許第５，０１７，４９７号明細書、５，１３８，１８１号明細書、５，３５０，６９５号明細書、５，８１２，４１９号明細書、５，９３９，３２６号明細書、６，５７９，６８５号明細書、６，６１８，１４３号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４３１１７号明細書を参照されたい。これら参照文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、参照により本明細書に組み込まれたｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｇｙ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｃｒｌ／ｆｌｏｗ＿ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ＿ｂａｓｉｃ．ｈｔｍｌ、２００６年３月３０日、ページ１−７も参照されたい。本発明での使用に適したレーザ、レンズ、フローセルおよび検出器は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）から商標ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）の名で市販されている機器に使用されている。
【００４０】
音響光学変調器（ＡＯＭ）および音響光学偏向器（ＡＯＤ）は、レーザ物理学および光学技術の分野では知られている。ブラッグセルとしても知られるＡＯＤは、音響光学効果を用いて、音波を（通常無線周波数で）使って光ビームを動的に回折させることによって偏向する。ＡＯＭも、光ビームの周波数を偏移させるために使用可能である。ＡＯＭは、Ｑスイッチ用レーザ、信号変調用の遠隔通信、および分光法で使用される。圧電変換器は、ガラスや石英などの材料に取り付けられる。振動電気信号が変換器を駆動して振動させ、ガラスまたは石英に音波が発生する。これらは、光学媒体の屈折率を変える可動型の周期的な膨張圧縮面であると考えることができる。入射光は、ブラッグ回折と呼ばれるプロセスで結果として生じる周期的な屈折率変調と相互作用して、入射ビーム方向と角度をなして偏向される。ＡＯＭを出る光の特性は、（ａ）偏角、（ｂ）強度、（ｃ）周波数、（ｄ）位相、（ｅ）偏光の５つの方法で制御可能である。ＡＯＭは、傾斜角可変鏡など、一般的な機械的素子よりはるかに高速である。音響光学変調器が出射ビームを変更するのにかかる時間は、音波がビームを横切る経過時間（一般に５から１００マイクロ秒）にほぼ制限される。これは、超高速レーザで能動モード同期を起こすのに十分高速である。注意深い設計により、数百ナノ秒もの短い経過時間が達成可能である。（これがビームを１角度位置からそのすぐ隣接する１角度位置に偏向するのに要する時間ではなく、偏角範囲全体にわたってビームを移動させるのに要する最大時間を表すことは留意されたい。換言すれば、必要な掃引が走査範囲にわたって滑らかである、本発明の場合など特定の用途にとって、任意の角度で真にランダムアクセスの偏向の場合より、かなり高速の性能が得られる。唯一の必要条件は、円柱レンズなど、弱い外部光学素子を用いる場合、高速掃引動作によって光ビームに導入される可能性のある光学的歪み量の補正が必要になるということである）。ＡＯＭは、高速応答、十分な偏向範囲、可動部品がない単純なソリッドステート設計、および相対的に低い電力消費量をもたらす。ＡＯＭの使用により、光ビームは、複数の次数に回折される。高品質正弦波で材料を振動させ、一次回折次数への偏向を最適化するようＡＯＭを方向付けすることによって、最大９０％の偏向効率が達成され得る。
【００４１】
参照により全体が本明細書に組み込まれた同時係属中の米国特許出願第１１／９３４，２７７号に記載されたレーザラスタ走査技術を、サンプルを分析する無溶解単一希釈方法と結合させて使用することにより、測定レートの大幅な向上がもたらされる。本発明のシステムにおいて、適切な光偏向素子は音響光学偏向器である。
【００４２】
以下に続く説明において、光源はレーザである。しかしながら、先述したように、他の光源、例えば、ランプ（例えば、水銀、キセノン）なども使用可能である。レーザには、以下に限定されないが、高出力水冷式レーザ（例えば、アルゴン、クリプトン、色素レーザ）、低出力空冷式ガスレーザ（例えば、ＨｅＣｄ（ＵＶ）、アルゴン（４８８ｎｍ）、赤色ＨｅＮｅ（６３３ｎｍ））、固体レーザおよびダイオードレーザ（紫色、青色、緑色、赤色）などが含まれる。レーザビームは、例えば、ガウス分布など、２方向に変化する強度プロファイルを有するとされている。
【００４３】
ここで図５を参照すると、従来技術では、細胞５０２は、サンプル流内部に沿って搬送される際に、静止光ビームスポット５０４を横切る。細胞５０２がビームスポット５０４のさまざまな強度の部分にさらされると、結果として生じる信号強度５０６の量（最初は散乱光、吸収光または放射蛍光の形、検出後は、電流または電圧の変換された形）が、細胞５０２によって横切られる（この図では縦の）方向にビーム５０４のプロファイルに従って変化する。従来技術では、この信号５０６は、通常、光ビームスポット５０４と細胞５０２との間で変化する相互作用のピーク値５０８を識別して、その値を続くデジタル化のために一般にアナログ形式で記憶する電子回路によってさらに検出される。細胞と光ビームと間の相互作用の値を得るこの方法は、従来技術では「ピークホールド」と呼ばれる。
【００４４】
本明細書に記載された方法のためにここで図３を参照すると、ビームはサンプル流を横切って掃引される。ビームがサンプル流を横切って掃引されると、検出器からの（後述の回路による適切な調整後の）各信号が、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）によって高い周波数でサンプリングされる。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、このプロセスを１つの代表的な検出器チャンネルからの信号について示している。これらの信号は、散乱光、吸収光または放射蛍光によって生成される。細胞との全相互作用から導出された一連の信号のデジタル化されたピーク値が、後の使用のために記憶される。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅは、標準２次元ガウス分布を有するレーザビームがサンプル流内の細胞を横切って掃引する際のレーザビームと細胞との進行する相互作用を説明する概略図と、グラフである。これらの図では、ビームが細胞を横断しているが、（サンプル流内の細胞の流速は、ビームによる走査速度よりはるかに低いため）細胞の位置は実質的に固定されている。図６Ａから図６Ｅのそれぞれにおいて、各概略図の右に位置するグラフは、表された各相互作用の結果として生じるデジタル信号の値とそれ以前の相互作用の値を示す。図６Ａは、細胞６０２と初めて接触するレーザビーム６００を示す。図６Ｂは、細胞６０２と大きく重なり合うレーザビーム６００を示す。図６Ｃは、結果として生じる相互作用が最大値かそれに近い、細胞６０２を中心に置いたレーザビーム６００を示す。図６Ｄは、細胞６０２に対して、最大ではないが、大きく重なり合うレーザビーム６００を示す。図６Ｅは、細胞６０２と１つの最終接触状態をなすレーザビーム６００を示す。図６Ｆは、図６Ａから図６Ｅに部分的に説明された相互作用から明らかになる代表値を用いて、信号の強度を時間の関数として示す。ここで図６Ｃに示されている、この値列の最高のデジタル値は、残りの値から分離されて、作動内部レジスタまたはデジタル信号処理（ＤＳＰ）モジュールの動的記憶装置に記憶される。
【００４５】
次に、レーザビームがサンプル流を連続掃引で走査すると、レーザビームからの光が、図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃに示すように、各個別の細胞と複数回相互に作用する。これら相互作用のそれぞれの結果として、デジタルピーク値が（各検出チャンネルごとに）発生し、先述したように測定および記憶される。相互作用は、ビームプロファイルのさまざまな点で起こるので、実際には、１回のラスタサイクルを完了するのに要する時間によって区切られた離散間隔でビームプロファイルをサンプリングする。ＤＳＰモジュールは、１個の細胞に起因する連続ラスタ走査からのピーク値列を収集し、このような値列を少なくとも１つのアルゴリズムによってレーザビームのプロファイルに相関させる。その後、このようにして当てはめられた曲線のピークは、従来の機器と同様、細胞の同定およびカウントのために下流のアルゴリズムによってさらに処理される。例えば、図７Ａは、レーザビーム７００が細胞７０２と最初に接触する場合の相互作用の結果を示す。図７Ｂは、その直後のラスタ走査時に、図７Ａと同じ細胞７０２がサンプル流の中をさらに進んで、レーザビーム７００の中心部の比較的近くで相互作用する場合の次の相互作用の結果を示す。図７Ｃは、それに続くラスタ走査時に、図７Ａおよび図７Ｂと同じ細胞７０２がサンプル流の中をさらに進んで、レーザビーム７００の肩部と相互作用する場合の次の３番目の相互作用の結果を示す。図７Ｄは、図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃにそれぞれ示す相互作用からのピーク値Ａ、Ｂ、Ｃを走査番号順の値列に配列するプロセスと、そのように順序付けされた値列に対して、主としてレーザビーム７００のプロファイルに垂直方向に依存し、特にレーザビーム７００の幅に依存する相互作用の予測形状を表す曲線７１２を（少なくとも１つのアルゴリズム、少なくとも１つの数式、少なくとも１つの電子技術、またはそれらの何らかの組合せによって）適応させることによって、その値列から推定ピーク値７１０を抽出する追加のプロセスを概略的に示す。ラスタ走査周波数、サンプル流の幅、およびサンプル流の速度は、各細胞が光ビームを過ぎて流れる際に複数回インターセプトされるように設定される必要がある。
【００４６】
本明細書に記載されたレーザラスタ走査方法の描写が、いかにして同時通過を増やすことなく測定レートが上げられるかを説明するために、複数個の細胞を伴って、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、図８Ｇ、図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋ、図８Ｌおよび図８Ｍに見られる。図８Ａから図８Ｍは、サンプル流８０４内で移動している３個の細胞８０１、８０２、８０３の動きを示す。細胞８０１は、サンプル流８０４中でわずかな間隔で細胞８０３に先行し、サンプル流８０４中でより大きな間隔で細胞８０２に先行する。細胞８０１、８０２、８０３は上方へ移動している。サンプル流８０４中の細胞のうちのただの３個に過ぎない細胞８０１、８０２、８０３は、たとえば、ＡＯＤなどの光偏向素子によってラスタ走査される、すなわち、左右に掃引される光ビーム８０５によって照射される。ビームの掃引の動きは、サンプル流８０４中で、細胞が各ラスタ走査の過程のある時点で光ビームによって照射される帯域８０６を描く。サンプル流８０４の下方の、水平ライン０から１２の列は、各走査の特定の時点で各細胞、または複数の細胞によって生成された（例えば、代表的な検出器チャンネルの出力で直接とられた）さまざまな信号のシーケンスを示す。例えば、走査０（図８Ａ）の間に、細胞８０１、８０２、８０３のいずれも、領域８０６でビーム８０５と相互に作用していない。ライン０は、信号ピークの欠如を示している。走査１（図８Ｂ）の間には、細胞８０１が、ビーム８０５の低強度部分と相互に作用するが、細胞８０２および細胞８０３は、ビーム８０５とまだ相互作用していない。ライン１は、ビーム８０５と細胞８０１との相互作用に関して低い信号ピークを示している。走査２（図８Ｃ）の間には、細胞８０１が、ビーム８０５の低強度部分とビーム８０５の高強度部分との間の中間のビーム８０５部分と相互に作用するが、細胞８０２および細胞８０３は、ビーム８０５とまだ相互作用していない。ライン２は、細胞８０１とビーム８０５との相互作用に関して走査１の間に観察されたもの（ライン１）より高い信号ピークを示している。走査３（図８Ｄ）の間には、細胞８０１が、ビーム８０５の高強度部分と相互に作用し、細胞８０３が、ビーム８０５の低強度部分と相互に作用するが、細胞８０２は、ビーム８０５とまだ相互に作用していない。ライン３は、細胞８０１（左に、細胞８０１に関して最高の信号ピーク）および細胞８０３（右に、細胞８０３に関して低い信号ピーク）とビーム８０５との相互作用に関する信号ピークを示している。走査４（図８Ｅ）の間には、細胞８０１が、ビーム８０５の高強度部分とビーム８０５の低強度部分との間の中間のビーム８０５部分と相互に作用し、細胞８０３が、ビーム８０５の低強度部分とビーム８０５の高強度部分との間の中間のビーム８０５部分と相互に作用するが、細胞８０２は、ビーム８０５とまだ相互に作用していない。ライン４は、細胞８０１（細胞８０１に関して中間の信号ピーク）および細胞８０３（細胞８０３に関して中間の信号ピーク）とビーム８０５との相互作用に関する信号ピークを示している。表１は、細胞８０２がビーム８０５による照射領域８０６を去る時点までの、領域８０６を横断するビーム８０５と細胞８０１、８０２、８０３との上述の相互作用と、細胞８０１、８０２、８０３の残りの相互作用の結果を要約している。図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、図８Ｇ、図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋ、図８Ｌおよび図８Ｍは、細胞とビームとの実際の相互作用ではなく、概略的な相互作用を表していることに留意すべきである。表１には、（ａ）ビーム８０５のどの部分も細胞と交差しない相互作用なしの場合、（ｂ）ビーム８０５の低強度部分が細胞と交差する低信号ピークの場合、（ｃ）  ビーム８０５の高強度部分が細胞と交差する高信号ピークの場合、および（ｄ）細胞がビーム８０５の低強度部分とビーム８０５の高強度部分の間の中間のビーム８０５部分と交差する中間信号ピークの場合の４つの相互作用タイプが表されている。これら４つの相互作用タイプも、概略であることが意図されており、本明細書に開示された装置および方法の結果として、たった４つの明確な相互作用レベルしか生じ得ないことを意味しない。実際には、相互作用は、例えば、細胞の相対的な大きさ、レーザビームの強度、システムにおける（光学的であるか、生物学的であるか、電気的であるかにかかわらず）ノイズの存在と程度に依存して、値の非常に大きな集合のうちのどれでもとることができる。
【表１】
0005465180.tif 000002
【００４７】
図８Ａから図８Ｍに示すシーケンスは、光源８０５のビームプロファイルの離散的なサンプリングを構成する。サンプリングされた相互作用と、光ビームの垂直方向のプロファイルを表す曲線との（当てはめ、フィルタリング、他のアルゴリズム、または専用の電子回路による）相関は、デジタル化ラスタ走査に沿い、ゼロ以外のピークが存在するすべての点およびそのすぐ近傍において、リアルタイムに発生する。そのような点は、図８Ａから図８Ｍに破線で図示されている。従って、１個の細胞に属する各独立した検出ピークシーケンスが、そのプロファイルの表現に当てはめられることができる。本明細書に記載されたラスタ走査の技術を使うことにより、細胞８０１、８０２、８０３は、そのうちの２個以上が同時に（あるいは図８Ａから図８Ｍに細胞８０１と細胞８０３によって表されるように、それとは別に細胞８０３と細胞８０２によって表されるように、部分的に同時に）照射領域８０６を通過し得る場合があっても、互いに識別され得る。その理由は、細胞群が各ラスタ走査のそれぞれ異なる点でビーム８０５と相互に作用するからである。従って、ラスタ走査の技術により、フローサイトメータは、同時通過数が許容可能な低いレベルに維持されつつ、単位時間あたりにより多数の細胞を分析することができるようになる。
【００４８】
図９に、図８Ａから図８Ｍに示された相互作用に続く、各検出器からの信号の処理が概略的に示されている。ブロック図９００は、検出器９０２、９０４、・・・の集まりを示す（２個の検出器は、場合によってはより大きな集合の代表例として示されている）。各検出器は、個別の前置増幅器回路９１２、９１４、・・・に接続されている（この場合も、２個の前置増幅器回路が、使用される検出器の数に等しい、場合によってはより大きな集合の代表例として示されている）。様々な検出器用の前置増幅器回路が、同じ電子サブモジュール上に物理的に存在する場合もあれば、各検出器に関する電気的必要条件（例えば、ノイズ分離、電圧供給必要条件、検出器への物理的な近接など）に応じて仕切られる場合もあり、それらの一部が一体化され、一部が別体にされる場合もある。各前置増幅器回路によってそのように増幅された各検出器からの信号は、その後、アナログ信号調整サブモジュール９２０に進む。このサブモジュールの機能には、各信号からの直流オフセットまたは擬似直流オフセットの低減または除去（基線復帰としても知られるプロセス）、ラスタ走査に沿う位置の関数としてのフローセルに送達された光の強度の非一様性の部分的または完全な補正（ＡＯＤ強度補正としても知られるプロセス）、場合によるが、例えば、各信号からの高周波数ノイズを減少または除去するためのフィルタリングなどが含まれる。そのように調整された各チャンネルの信号は、その後、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）サブモジュール９３０へ進む。そこでは、各信号チャンネルが、高周波数で（各チャンネルにつき毎秒１億個のサンプル、すなわち１００ＭＳ／ｓのレベルで）計時される専用のＡＤＣチャンネルと、十分な分解能（約１４ビット）を有する。ＡＤＣサブモジュール９３０の機能は、例えば、図６Ｆに示すように、各検出チャンネルのアナログ信号を離散的な、しかし接近した時間間隔でデジタル値に変換することである。そのようにデジタル化された信号は、その後、デジタル信号処理（ＤＳＰ）サブモジュール９４０へ進む。このサブモジュール９４０は、１個の強力なフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）９４２、またはＤＳＰチップ９４４からなることがある。あるいは、場合により、組み込まれる分析器の特定の用途の速度および計算面の必要条件次第で、複数個のＦＰＧＡ、複数個のＤＳＰチップ、１個のＦＰＧＡと１個のＤＳＰチップの両方、または複数個のＦＰＧＡと複数個のＤＳＰチップの両方からなることもある。さらに、サブモジュール９４０は、好ましくは（ａ）計算用データの任意選択の中間記憶のための、データバスまたは次の処理段階への他の搬送手段での伝送の前にデータをステージングするための、またはデータの中間記憶とステージングの両方のためのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）ユニット９４６と、（ｂ）ＦＰＧＡ９４２、ＤＳＰ９４４、またはＦＰＧＡ９４２とＤＳＰ９４４両方からの入力を取り込み、それらをアナログ信号に変換するデジタルアナログ変換器（ＤＡＣ）ユニット９４８を備えている。これらのアナログ信号は、検出器９０２、９０４、．．．の部分または全体の動作パラメータ（例えば、電源電圧）、前置増幅器サブモジュール９１２、９１４、．．．の動作パラメータ（例えば、利得設定）、アナログサブモジュール９２０の動作パラメータ（例えば、直流オフセットまたは擬似直流オフセットの量）、または検出器、前置増幅器およびアナログサブモジュールの動作パラメータの組合せを動的にまたはプログラムで変更するために使用される。ＤＳＰサブモジュール９４０の機能は、（ａ）１回のラスタ走査時の細胞相互作用から最高デジタル値（または、例えば図８Ｅに示すように、１回のラスタ走査時に１個以上の細胞が存在する場合にはそのような値複数個）を選択すること、（ｂ）場合により、アナログサブモジュール９２０でまだ実行されていない未処理の必要なＡＯＤ強度補正を行うために、そのようにして同定された値に対して、ラスタ走査に沿うその位置に基づいて知られている係数を付与すること、（ｃ）各細胞とレーザビームスポットとの間の相互作用のピーク値を（例えば、図７Ｄおよび図８Ｍに示すように）再構成するために、連続ラスタ走査にわたってそのような最高値を相関させること、（ｄ）検出されたイベントの母集団から、特定の分析の範囲内で最も対象母集団を表す可能性が高いイベント群を選び出すため、かつ残余のイベントを棄却または分別するために、そのように再構成されたピーク値に対して各検出チャンネルに固有の所定の上限閾値、下限閾値または上下限閾値をプログラムで適用すること、および（ｅ）それぞれ個別の検出チャンネルから来て、このようにして構成およびフィルタリングされた情報を、同じ個別の細胞通過イベントに関する測定にかかわる検出チャンネルのそれぞれからの再構成値とともにタイムスタンプ情報を含むデジタルエンティティ（一般に「リストモード」ファイルの１エレメントとよばれる）に統合することである。リストモードイベントの集まりは、その後、例えば、ＲＡＭユニット９４６に一時的に格納可能な１つまたは複数のリストモードバッチにコレートされる。データのバッチは、その後、プログラムによって定められた時間に、（ＲＡＭユニット９４６から、またはＦＰＧＡ９４２から直接に、または、存在する場合ＤＳＰチップ９４０から直接に、例えば、ペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ）バスなどの適切なデータチャンネルを介して）、例えば、細胞を同定し、細胞をカウントし、細胞にフラグを付けるためのアルゴリズムなどのアルゴリズムによる更なる処理のための分析器オペレーティングシステム（ＡＯＳ）９５０に周期的に転送されることができる。ＤＳＰサブモジュール９４０は、場合によりＡＤＣサブモジュール９３０を組み込むことが可能であり、場合によりアナログサブモジュール９２０も組み込むことが可能である。
【００４９】
本明細書に記載された装置および方法は、精度、同時通過および信号対雑音比に関して満足がいく性能を維持する機器を提供する。本発明の方法は、ラスタ走査速度と流れのパラメータを、所望のデジタル化周波数に従うとともに、１個の細胞に対して複数の走査を可能にするように選択することができる。本発明は、市販の部品（例えば、ＡＯＤ、ＡＤＣ、ＦＰＧＡ）で実施されることができる。本明細書に記載された装置および方法は、測定レート（秒当たりに分析される細胞数）のかなりの向上をもたらすことができる。この向上は、結果として、（ａ）標準ＣＢＣを実行するのに必要な時間を低減し、それにより処理能力（ＣＢＣ／時）を向上させ、（ｂ）サンプル走行毎に分析される細胞の総数を増加させ、それにより相対的に希少な細胞イベントの定量、特に、存在、濃度、または存在と濃度の両方の定量の統計精度を向上させ、あるいは（ｃ）処理能力の向上と分析される総細胞数の増加の両方の組合せをもたらす。さらに、本明細書に記載された装置および方法は、分析器の複雑度、標準ＣＢＣに必要な個々の処理工程の数、ＣＢＣを得るのに使用される試薬の数と量、その製造コスト、動作中の故障のリスク、並びに保守およびサービスコストを大幅に低減させる。さらに、本明細書に記載された装置および方法は、ＷＢＣ分析時にＲＢＣを溶解する必要性をなくし、それにより溶解抵抗性ＲＢＣ（例えば、鎌状細胞、標的細胞、新生児由来のＲＢＣを含む）からのＷＢＣカウントまたはＷＢＣ識別分析への干渉を解消する。
【００５０】
本発明の条件付き制約は、次の数学的な関係式によって要約される：
＃１（ピーク信号強度）：
【数１】
0005465180.tif 000003
＃２（積分信号強度）：
【数２】
0005465180.tif 000004
＃３（同時通過）：ρ’ｗ’ｏｘｗ’ｏｙｚ’ｓｔｒｅａｍ≦ρｘｓｔｒｅａｍｗｏｙｚｓｔｒｅａｍ
＃４（細胞にわたる複数のデジタル化）：
【数３】
0005465180.tif 000005
＃５（デジタル化制約）：ｆ’ｄｉｇｉｔｉｚａｔｉｏｎ≦１２５ＭＨｚ
＃６（細胞にわたる複数のラスタ走査）：
【数４】
0005465180.tif 000006
＃７（ラスタ走査制約）：ｆ’ｒａｓｔｅｒ≦１ＭＨｚ
＃８（測定レート必要条件）：ρ’ｘ’ｓｔｒｅａｍｚ’ｓｔｒｅａｍ ν’ｓｔｒｅａｍ≧ρｘｓｔｒｅａｍｚｓｔｒｅａｍνｓｔｒｅａｍ
ただし、Ｐｌａｓｅｒはレーザビーム出力を表し、
ｗｏｘおよびｗｏｙはレーザビームの集束スポット（すなわち、ウエストまたはその近く）の寸法（それぞれ水平方向および垂直方向）を表し、
ｘｓｔｒｅａｍおよびｚｓｔｒｅａｍはサンプル流の寸法（それぞれ幅と奥行）を表し、
νｓｔｒｅａｍはサンプル流の速度を表し、
ｆｄｉｇｉｔｉｚａｔｉｏｎはデジタル化周波数を表し、
ｆｒａｓｔｅｒはラスタ走査の反復周波数を表し、
さらに、ダッシュ付きの符号によって表されるパラメータは、本明細書に記載された装置および方法のパラメータ値を示し、ダッシュなしの符号によって表されるパラメータは、従来技術のパラメータ値を示す。本明細書で使用される「条件付き制約」という表現は、フローサイトメトリ装置および方法の目標動作条件を設定するための数学的な関係式として表現される値を意味する。そのような制約が、例えば、電子部品の速度など、改良された素子の導入によって緩和され得る技術的制限に起因する制約など、実施のために選択される基本的な動作条件を大まかに示しているに過ぎないことは理解されるはずである。さらに、十分に工学設計面の考慮を行ったことによって、製造、動作および試料のばらつきに対する許容限度を有するパラメータ値の採用が推奨されることになる場合には、他の制約が、特定の動作パラメータのための絶対必要最低条件を表す場合もある。
【００５１】
信号強度パラメータについてみると、条件＃１（ピーク信号強度）は次の関係式によって定義される：
【数５】
【００００】
0005465180.tif 000007
この関係式は、細胞における（平均）光子束またはビーム強度のための必要条件を述べており、ビームスポットが小さいほど、所与のパワーの強度が高くなる。信号処理システムが、ピーク信号強度が従来技術のピーク信号強度に匹敵することを保証するために、結果として生じる信号のピーク高さを対象パラメータとして主に記録する（従来技術において散乱信号を処理するための広く普及した方法である）一方で、条件＃１は、より小さいビームスポットについては、それに比例してより低いレーザ出力で十分であることを述べている。
【００５２】
条件＃１は、別の関係式が当てはまる条件＃２（積分信号強度）と比較されるべきである：
【数６】
0005465180.tif 000008
この関係式は、（従来技術の一部の事例における散乱信号の場合、より一般的には従来技術における蛍光信号の場合など）時間積分信号が、記録される対象パラメータである場合に、関連する量には、細胞における光ビームの強度だけではなく、ビームが細胞と相互作用する時間の長さも含まれるということを反映している。レーザラスタ走査システムでは、一般により小さいビームスポットは、従来技術と比較してより高い強度をもたらす（レーザ出力が変化していない場合、自動的に条件＃１を満たしている）が、平均ビーム強度が高くなっても、相互作用の時間が相対的に短いほど、積分信号は小さくなる。従って、積分信号が必要である場合、ラスタ走査を用いない従来技術のシステムからの対応信号と同等に維持するために、いくぶんより高いレーザ出力が必要になる場合がある。
【００５３】
ここで同時通過パラメータについてみると、図１０は従来技術のおおよその照射体積を図示し、図１１は本発明で見られるおおよその照射体積を図示する。次の２つの関係式は、あらゆる瞬間での照射体積中の細胞数を定量するために利用されるパラメータを提供する。「現在の」という用語は従来技術を意味する。「新しい」という用語は本発明を意味する。
Ｎｃｅｌｌｓ＝ρｘｓｔｒｅａｍｗｏｙｚｓｔｒｅａｍ      照射体積中の現在の細胞数
Ｎ’ｃｅｌｌｓ＝ρ’ｗ’ｏｘｗ’ｏｙｚ’ｓｔｒｅａｍ       照射体積中の新しい細胞数
従来技術では、細胞濃度ρは分析によって変わる。細胞濃度は、ＲＢＣおよび血小板分析の場合に最高であり（例えば、このような分析の場合の希釈率が１：２９０であるＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）参照）、ＷＢＣ分析の場合に最低である（希釈率は１：３５であるが、相対的に非常に多数のＲＢＣと血小板が生化学的棄却手段と電子的棄却手段の組合せを使って除外された）。本明細書に記載された装置および方法では、希釈が１回のみであり、それぞれ異なる細胞母集団の濃度は、ヒトの全血中の未希釈の濃度に比例する。しかしながら、同時通過レベルを推定する目的のためには、最も重要である母集団は最も多数の母集団であり、それは、量ρ’が意味するこの母集団の濃度である。これらの取り決めにより、条件＃３（同時通過）は次の関係式によって定義することができる：
ρ’ｗ’ｏｘｗ’ｏｙｚ’ｓｔｒｅａｍ≦ρｘｓｔｒｅａｍｗｏｙｚｓｔｒｅａｍ      条件＃３
【００５４】
ここでデジタル化パラメータについてみると、図１２Ａは、レーザビームスポット１２００と細胞１２０２との相互作用を図示する。図１２Ｂは、時間の関数としての信号強度の仮想プロットを示す。図１２Ｃは、アナログデジタル変換器によって展開されたデジタル化の仮想プロットを示す。次の関係式に基づいて：
【数７】
0005465180.tif 000009
【数８】
0005465180.tif 000010
条件＃４（細胞にわたる複数のデジタル化）は、次の関係式によって定義することができる：
【数９】
0005465180.tif 000011
ただし、数値１０は、１回のラスタ走査の過程でレーザビームと細胞との間の相互作用による信号の変化するプロファイルを十分な精度で取得するために必要なおおよそのデジタル化数を名目上示すように選択されている。
【００５５】
条件＃５（デジタル化制約）に関して、ＡＤＣの機構は、デジタル化周波数と分解能の深さとの間にトレードオフ関係が存在するような機構である。市販の最高速のアナログデジタル変換器は、１２５ＭＨｚにおいて１４ビットの分解能、または１００ＭＨｚにおいて１６ビットの分解能でデジタル化を行うことができる。本明細書に記載された装置および方法のためには、最高可能デジタル化周波数が望ましいが、１４ビットの分解能で十分である。従って、
ｆ’ｄｉｇｉｔｉｚａｔｉｏｎ≦１２５ＭＨｚ      条件＃５
ただし、この条件は、現在利用可能な技術の性能によって課された制約を示すように意図されており、原則として本発明のために望ましい最大デジタル化周波数を示すようには意図されていない。
【００５６】
ここで複数ラスタ走査のパラメータについてみると、図１３の仮想の走査１、走査２、走査３、走査４および走査５は、レーザビーム１３０２の複数の走査の各期間の細胞１３００の位置を図示している。ここで、ｙ’ｓｃａｎは１走査の間に細胞が進んだ距離を表し、ｗ’ｏｙは楕円ビームの縦軸に沿うビームスポットサイズを表す。次の関係式に基づいて：
【数１０】
0005465180.tif 000012
【数１１】
0005465180.tif 000013
ｗ’ｏｙ      縦方向ビームスポットサイズ
条件＃６（細胞にわたる複数のラスタ走査）は、次の関係式によって定義することができる：
【数１２】
0005465180.tif 000014
ただし、数値３は、原則として、複数ラスタ走査の過程におけるレーザビームと細胞との間の相互作用を表すガウス分布曲線の再構成を可能にするために必要な最小限の走査数を示すように選択されている。
【００５７】
条件＃７（ラスタ走査制約）に関して、ＡＯＤの機構は、偏角範囲とラスタ走査周波数との間にトレードオフ関係が存在し得るような機構である。本発明のためには、最高可能ラスタ走査周波数が望ましいが、偏角範囲が相対的に小さくなる可能性がある。この目的のために最適化された市販のＡＯＤは、約１ＭＨｚの最大反復周波数で約１ｍｒａｄから２ｍｒａｄにわたって掃引を行うことができる。従って、
ｆ’ｒａｓｔｅｒ≦１ＭＨｚ      条件＃７
ただし、条件は、現在利用可能な技術の性能によって課された制約を示すように意図されており、原則として本発明のために望ましい最大ラスタ走査周波数を示すようには意図されていない。
【００５８】
ここで測定レートパラメータについてみると、図１４は、所定の時間単位に測定される従来技術のサンプル体積を図示し、図１５は、本明細書に記載された装置および方法に従って同じ時間単位に測定されるサンプル体積を図示しており、その体積は従来技術における体積よりかなり大きくすることができる。差の理由は、従来技術では、単位時間当たりに測定される体積が、照射体積と流れの速度に主に依存する一方、本明細書に記載された装置および方法では、単位時間当たりに測定される体積が、ラスタ走査プロセスにより、照射体積の倍数を含むように増大させられるからである。図１４および図１５に示す測定体積と、従来技術および本明細書に記載された装置および方法のために図１０および図１１にそれぞれ示す、あらゆる瞬間のレーザビームによる照射体積を区別することが重要であり、そのような照射体積は、希釈度が変わらない場合には、本明細書に記載された装置および方法と従来技術においてほぼ同等であるように意図されている。次の２つの関係式は、（単位時間当たりに検出される細胞数として定義される）測定レートを求めるためのパラメータを提供する。ただし、「現在の」という用語は従来技術を意味し、「新しい」という用語は本発明を意味する：
ｎ＝ρｘｓｔｒｅａｍｚｓｔｒｅａｍνｓｔｒｅａｍ      現在の測定レート（細胞／秒）
ｎ’＝ρ’ｘ’ｓｔｒｅａｍｚ’ｓｔｒｅａｍ ν’ｓｔｒｅａｍ      新しい測定レート（細胞／秒）
条件＃８（測定レート必要条件）は、次の関係式によって定義される：
ρ’ｘ’ｓｔｒｅａｍｚ’ｓｔｒｅａｍ ν’ｓｔｒｅａｍ≧ρｘｓｔｒｅａｍｚｓｔｒｅａｍνｓｔｒｅａｍ      条件＃８
上記の関係式群によれば、各パラメータの選択肢を選択し、各条件が満たされること、しかもどのくらいの余裕で満たされるかを確認することできる。以下の概算の選択肢の集合は、本発明での使用に適した実施形態を表す：
Ｐ’ｌａｓｅｒ＝４０ｍＷ
ｗ’ｏｘ＝１０μｍ
ｗ’ｏｙ＝２０μｍ
ｘ’ｓｔｒｅａｍ＝１００μｍ
ｚ’ｓｔｒｅａｍ＝４０μｍ
ν’ｓｔｒｅａｍ＝４ｍ／ｓ
ｆ’ｒａｓｔｅｒ＝１ＭＨｚ
ｆ’ｄｉｇｉｔｉｚａｔｉｏｎ＝１００ＭＨｚ
ただし、レーザ出力の選択肢は、条件＃１および条件＃２の両方を考慮してなされている。この２つの条件のうち、条件＃２はより制約が多い条件である。上記の値は、例えば、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）血液分析器で現在採用されている概算値と対比される：
Ｐｌａｓｅｒ＝１０ｍＷ
ｗｏｘ＝６５μｍ
ｗｏｙ＝２０μｍ
ｘｓｔｒｅａｍ＝５μｍ
ｚｓｔｒｅａｍ＝８０μｍ
νｓｔｒｅａｍ＝８ｍ／ｓ
パラメータの適切な選択により、先述した条件のすべてを満たし、一部をかなりの余裕で満たすことができる。最も重要なことに、条件＃８は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）機器で現在達成される測定レートに対して５倍の向上という劇的な結果を生む。このレベルの測定レート向上が、本発明の範囲内での賢明な工学的選択や利用部品の性能向上によって、かなり増加され得る値を示していることは理解されたい。本発明のパラメータ値の上記の選択が、それにともなって発明の値を大幅に低下させることなく、かなりの変動に対して寛容であることも理解されたい。例えば、測定レートの面で従来技術に比べてかなりの利点をなおも本発明にもたらしながら、工学設計上の必要条件を満たすために、ラスタ走査周波数が若干低下させられたり、サンプル流の寸法が変更されることもあり得る。
【００５９】
従来技術の血液分析器の動作に関連する主要な機能的工程のシーケンス全体が、図１６に概略的に示されている。サンプルは、機械的インタフェースを介して分析器内に導入される（１６０２）。このインタフェースは、一般に、分析器に付属する導入領域に配置された複数のサンプル管からなるラックの集合を扱うことができるサンプル導入システムの形、または、場合により、個々のサンプル管、または複数のサンプル管を含んでいる個々のラックを扱うことができる自動化システムの形をとる。自動化システムでは、個々のサンプル管または個々のサンプル管ラックが、軌道アセンブリ上で搬送される。サンプル管が必要な位置に進むと、サンプル管は、サンプルの均質性を保証するために、サンプル管を複数回反転させる混合アセンブリに移送される（１６０４）。その後、サンプルを含んだ各管は、識別用バーコードラベルまたは無線周波数識別タグ（図示せず）の読み取りができる位置まで移動させられ、サンプル管の蓋、通常、ゴムストッパが、プローブアセンブリによって穿孔される。プローブは、サンプル体積の中に下降し、ある量のサンプルを吸引する（１６０６）。この吸引された体積は、その後、例えば、様々なアリコート用のそれぞれ決まった容積を有するせん断弁に通過させること、または様々なアリコートをダイナミックピペッティングによって直接次の処理段階に移すことなど、種々の手段の１つによって複数のアリコートに分割される（１６０８）。様々なアリコートは、その後、例えば、ＲＢＣおよび血小板分析（１６１０）、ＷＢＣ、ＷＢＣ識別および有核ＲＢＣの任意選択のフラグ付け、同定および定量化のための分析（１６４０）、場合により、網状赤血球分析（１６７０）など、割り当てられるそれぞれの分析に対応する同様の平行経路を進む。図示しないが、図示されたものにほぼ類似の他の分析としては、強い溶解剤と個別のサンプルアリコートを必要とする個別の比色変換器上で一般に実行されるヘモグロビン関連パラメータの定量化のための分析、１つ以上の個別の、インピーダンスに基づく変換器上で一般に実行され、血球の特定の亜集団をカウントおよび分級するための分析がある。これらの各分析のために、各アリコートは適切な容器に移される（１６１４、１６４４、１６７４）。それとは別に、個々の分析に適切なそれぞれの試薬溶液が、一般に、モータ作動シリンジ、膜ポンプ、ぜん動ポンプ、または他の適切な流体操作部品またはサブアセンブリによって正確に計量される（１６１２、１６４２、１６７２）。その後、正確な量の試薬溶液が、サンプルアリコートを入れる同じ容器に送達されるか（１６１６、１６４６、１６７６）、さもなければ、サンプルアリコートとの反応を実行するために、サンプルアリコートに接触させられる。サンプルアリコートと試薬溶液の混合物は、サンプルと試薬溶液を容器に導入するプロセスによって、あるいは、例えば、渦流混合、泡の介在、撹拌、乱流などの手段による積極的な混合によって、個別の分析ごとに均質化される（１６１８、１６４８、１６７８）。その後、分析に応じて、均質化された混合物が、基本的に直ちにステージング用流体セクションに移送される（１６２２、１６８２）か、あるいは最初に混合容器内で、一般に特定の温度で、一定時間インキュベートされた（１６５０）後、ステージング用流体セクションに移送される（１６５２）。この手順は、例えば、ＲＢＣが基本的にこのインキュベーション工程の間に溶解によって除去される従来技術のＷＢＣ分析のために続けられる。その後、このようにして調製されたサンプルと試薬溶液の種々の混合物が、測定のためにフローセルに入る準備が整う。ヘモグロビン測定の場合には、サンプルが溶解剤と混合されて反応した同じ容器内で、反応したサンプルアリコートが比色的に測定可能であり、インピーダンス測定の場合には、反応したサンプルアリコートが、光学式フローセルではなく、インピーダンス変換器に送られる。フローサイトメータは、一般に１個のフローセルを有しており、フローセルは、その後、何らかの順序で種々の調製されたサンプルを受け入れ、そこでフローサイトメトリ測定が連続的に行われる（例えば、１６２４、１６５４、１６８４）。その後、サンプルは、廃棄のために処理され、フローセルは、隣接する測定の間にすすぎにかけられる（１６２６、１６５６、１６８６）。サンプルがフローセルを通過させられる際に、結果として生じる信号は処理され、細胞カウント、同定およびフラグ付けアルゴリズムによる分析のために、分析器のオペレーティングシステムに渡される（１６２８、１６５８、１６８８）。
【００６０】
本明細書に記載された装置および方法のための図１６の類似物が、図１７に概略的に示されている。以下に続く実施形態の説明では、個別のヘモグロビン変換器は存在しない。ラスタ走査用光学式フローセルに加えてそのような変換器を備える実施形態の場合には、そのような変換器の組み込みは、従来技術に開示されたスキームに従っており、ここで図示される必要性はない。サンプル調製の初期段階は、従来技術と同様であり、サンプル導入（１７０２）、サンプル均質化（１７０４）、サンプル吸引（１７０６）という類似の工程を有する。単一のサンプル体積が処理のために使用されるので、サンプルのアリコートを提供する工程は削除される。従来技術の３つ以上の個別の分析が、ただ１つの分析（１７１０）に結合されており、この分析は、従来技術であれば、ＲＢＣおよび血小板パラメータの分析、ＷＢＣ、ＷＢＣ識別および有核ＲＢＣパラメータの分析、網状赤血球パラメータの定量化のための分析、およびヘモグロビン関連パラメータの定量化のための分析を必要とするパラメータを発生させる。サンプル体積は単一の容器に送達され（１７１４）、試薬溶液は計量されて（１７１２）、同じ容器に送達される（１７１６）。結果として生じる混合物は、均質化される（１７１８）が、溶解プロセスの欠如のために、インキュベーションは不要である。その後、サンプルと試薬溶液の混合物は、ステージングされ（１７２２）、直ちにフローセルを通過させられる。フローセルでは、フローサイトメータ測定が行なわれる（１７２４）。連続的に処理される個別のサンプル混合物がないため、サンプルは廃棄に送られ、フローセルはすすぎにかけられて（１７２６）、それにより、別のサンプルがすぐ後に続くことができる。フローセル測定による信号は処理され、アルゴリズムによって分析される（１７２８）。
【００６１】
図１８は、本明細書に記載された装置および方法による実際のデータの集まりの一部である。データは、レーザラスタ走査を伴う無溶解単一希釈方法のいくつかの主要な原理、すなわち、（ａ）レーザビームと細胞との間の高速の相互作用、（ｂ）複数回のラスタ走査にわたるビームと同じ細胞との複数回の周期的相互作用、（ｃ）複数回の相互作用の盛衰の特徴、および（ｄ）単一希釈方法に要求される高い測定レートを可能にする、サンプル流内の近接位置の細胞（同時通過）を識別するレーザラスタ走査の能力を示している。グラフは３つのプロットを示している。すなわち、（１）実線は、１ＭＨｚのラスタ走査周波数と１０４ＭＳ／ｓのデジタル化周波数で動作し、溶解剤にさらされなかったヒトの全血の希釈サンプルに作用する、本明細書に記載されたラスタ走査装置から得られた実際のデータを表し、（２）白丸は、視覚的ガイドであり、データ内の１ピーク列のおおよそのガウス分布包絡線を表し、（３）塗りつぶしの三角は、別の視覚的ガイドであり、データ内の別のピーク列のおおよそのガウス分布包絡線を表す。実際のデータの各ピーク列は、ラスタ走査レーザビームと流れの中の１個の細胞との相互作用の結果である。２つのピーク列は、交錯し、従来技術の分析器であれば未分解（すなわち、同時通過）であったが、本明細書に記載された分析器によって分解されたイベントを示している。収集されたデータシーケンスは、図８Ａから図８Ｍに表された細胞８０１および細胞８０３の概略的シナリオを示すラスタ走査動作の実証である。２つのガウス分布包絡線は、同様の細胞の相互作用シーケンスから予想されるように、２つのピーク列が同様の幅を有することを示している。この場合の２個の細胞はＲＢＣであった。
【００６２】
本明細書に記載された装置および方法は、フローサイトメトリまたはフローサイトメータに基づく血液分析を実行するためのレーザまたは他の適切な光源を使うどのような製品ラインとも一緒に用いられることができる。本発明での使用に適した機器には、以下に限られるものではないが、（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている）ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）と、（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている）ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｒｕｂｙ（Ｒ）がある。
【００６３】
本明細書に記載された装置および方法の１つの利益は、測定レート（１秒当たりに分析される細胞数）の、例えば、およそ５倍の劇的な上昇である。この上昇は、（ａ）データ収集時間（細胞をカウントする時間）の同じ倍率の低減と、それによる処理能力の向上を可能にするか、あるいは（ｂ）総カウント（カウントされる細胞の総数）の同じ倍率の増加と、それによる精度の向上を可能にする。精度の向上は、血球減少症患者において特に重要である。精度と処理能力の両方の向上の組合せも可能である。
【００６４】
本明細書に記載されたレーザラスタ走査と無溶解単一希釈方法との組合せが実際の処理能力（ＣＢＣ／時）に及ぼす具体的な効果は、以下の仮定を行うことによって推定することができる。すなわち、（１）従来の方法のＲＢＣ溶解インキュベーション工程が除去される、（２）従来の方法の複数の分析が１回のみの分析に結合される、（３）従来の分析器の測定レートが、レーザラスタ走査の採用のために５倍上昇される、（４）結合された分析の総カウント時間が、この上昇した測定レート、許容同時通過レベルによって与えられる最高細胞濃度（すなわち、従来のＲＢＣ／血小板分析の希釈率によって与えられる細胞濃度）、および目的ＷＢＣ精度レベルを従来の方法のＷＢＣ分析で達成されるレベルに合わせることに基づいている。
【００６５】
これらの仮定に基づいた方法は、結果として、１回のＣＢＣの測定時間を約１５秒まで低減させる。キャリオーバを減少させるためにフローセルをすすぐための若干の余裕を考慮に入れると、典型的な「準備完了時から準備完了時までの」処理サイクル時間は、２２５ＣＢＣ／時の推定平均処理能力に対応する約１６秒であると推定することができる。これは、従来技術の相対的に高い処理能力を高い初回通過報告度と結合させたＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）の現在の性能（１０５ＣＢＣ／時）、および初回通過報告度が相対的により低い率であるにもかかわらず、１５０ＣＢＣ／時というそのクラスで最高の処理能力とは対照的である。このレベルの有効処理能力の向上は、そのクラスで最高の初回通過報告度とあいまって、商業的見地から極めて重要である。
【００６６】
血液分析器またはフローサイトメータにおいて本明細書に記載された装置および方法の付随する利益は、測定される粒子の大きさと密接に相関する複数のパラメータを独立して定量する能力である。サンプルの中の細胞の大きさを定量することは血液分析器の主要な機能の１つである。フローサイトメータに基づく計測化の従来技術では、細胞の大きさを定量することは、一般に、散乱光検出器、特に前方散乱光検出器の１つ以上からの信号を処理すること、またはインピーダンス測定に基づく細胞分級の原理で動作する１つ以上の追加の専用変換器によって達成される。従来技術のこの散乱機能は、本明細書に記載された装置および方法において利用可能で、変わらない。従来技術で採用された別の方法は、いわゆる「飛行時間（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）」、すなわち、１粒子が静止レーザ光ビームスポットを横断するのにかかる時間を測定することであった。図５、すなわち、従来技術を参照すると、飛行時間は相互作用信号曲線５０６の幅によってほぼ表される。（これは、実際には粒子の大きさとレーザビームスポットの幅との相関関係であり、レーザビームスポットサイズが知られている場合、粒径が定量され得る）。本明細書に記載された装置および方法では、綿密な調査の下で細胞の大きさの飛行時間測定を得るためのいくつかの機会が存在する。第１に、細胞と相互に作用する各ラスタ走査は、場合によりこのような相互作用の幅の値を返すことができる。図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃをみると、各相互作用曲線の幅は、細胞７０２の大きさの独立した測定値を表している。このような複数回の定量が利用可能であることによって、従来技術で使用される１回だけの定量によっては比べようのない、大きさ値の集まりに対する精度の統計的ロバスト性がもたらされる。第２に、図７Ｄをみると、相互作用曲線７１２のピーク値７１０をもたらす複数のラスタ走査にわたる相関関係も、同様に、そのような相互作用の幅を生み出すことができる。この定量は、細胞の大きさの追加的な測定を表し、各ラスタ走査からの定量と結合および相関されて、結果として、散乱情報自体から導出された測定値から独立するのみならず、それを補強する、大きさ関連測定値のロバストな集まりを生じることができる。
【００６７】
本明細書に記載された装置および方法によって導出される大きな利益は、部品数、サブシステム数、試薬数、オペレーティングファームウェア数、オペレーティングソフトウェア数、およびラスタ走査方法と結合された無溶解単一希釈方法によって可能な全体的な設計複雑度の低減である。例えば、本発明の採用によって解消される２つ以上の送達サブシステムのそれぞれは、一般に以下の部品、すなわち、（ａ）精密計量シリンジ、（ｂ）シリンジアセンブリ、（ｃ）シリンジステッパモータ、（ｄ）ステッパモータ駆動基板、（ｅ）複数本の非準拠管状材料、（ｆ）複数本のピンチ弁、（ｇ）ピンチ弁を操作するそれぞれ対応するパイロット弁、または代わりにピンチ弁を操作するソレノイド、（ｈ）パイロット弁またはソレノイドを駆動する電子基板部品、（ｉ）サンプルの１アリコートを、計量された量の試薬と混合するために使用される容器、（ｊ）サンプルアリコートを試薬溶液と混合するために使用されるモータ、（ｋ）ミキサモータ駆動基板、（ｌ）ステッパモータ、ミキサモータ、およびいくつかのパイロット弁またはソレノイドの動作を制御するのに必要なファームウェア、（ｍ）ステッパモータ、ミキサモータ、およびパイロット弁またはソレノイドに電力を供給するために必要な電流容量、および（ｎ）パイロット弁またはソレノイドの動作によるフローパネルからの熱を除去するために必要なファンを備える。例として、フローサイトメトリ測定を支援する３つの試薬送達サブシステム（ＲＢＣ／血小板分析用、ＷＢＣ、ＷＢＣ識別および有核ＲＢＣ分析用、ならびに任意の網状赤血球分析用）が現在使用されているＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｒ）を挙げると、本明細書に記載された装置および方法を採用すれば、これらのサブシステムが、ただ１つの試薬送達サブシステムに削減される。（細胞体積定量のための）インピーダンス測定または（ヘモグロビン定量のための）比色測定を支援するサブシステムが影響される必要がなくなる。しかしながら、無溶解単一希釈方法のために使用される装置および方法が、市販の血液分析器に要求される（平均細胞体積と平均のヘモグロビン含有量を含む）報告可能パラメータのすべてを提供することができるので、これらのサブシステムも、単純さ、信頼性およびコスト面の付加的な利益のために、場合によりすべて完全に削除することができる。
【００６８】
本明細書に記載された装置および方法は、モジュール式の方法の使用を通してさまざまな環境で利用可能である。（ＣＢＣに要する時間の低減に関連する、装置および方法の態様を利用する）非常に高速のバージョンは、場合により単クローン抗体機能なしでの有効処理能力のために最適化された、基準試験所や病院中央検査室での大規模用途のために使用可能である。（所与の時間単位にカウントされる細胞の総数の増加に関連する、装置および方法の態様を利用する）非常に高精度のバージョンは、まれなイベントと血球減少症サンプルに対する性能のために最適化され、単クローン抗体機能を含み、専門治療センターを対象とすることができる。
【００６９】
分析器で使用される試薬は、（ＷＢＣ分析に使用される溶解剤と、それと同時の有核ＲＢＣ分析に使用され、溶解剤に加えられた任意選択の核酸色素と、ＲＢＣ／血小板分析用の任意選択の球状化試薬を含む希釈溶液と、核酸色素、場合により、ヘモグロビン定量化に使用される強い溶解剤も含む、網状赤血球分析に使用される試薬溶液とを含む）従来技術における集合から、希釈液、一般的には、生理食塩水希釈液からなる１種類の試薬溶液に削減される。１種類の試薬溶液は、好ましくは球状化試薬を含む。１種類の試薬溶液は、場合により、網状赤血球および有核ＲＢＣ分析用の１種類または２種類の核酸色素を含む。核酸色素の少なくとも１種類は、ＲＮＡを染色可能である必要があり、核酸色素の少なくとも１種類は、ＤＮＡを染色可能である必要がある。あるいは、少なくとも１種類の核酸は、ＲＮＡとＤＮＡの両方を染色可能であることもある。本明細書に記載された方法で使用される試薬溶液の別の任意選択の成分は、選択的透過処理剤である。１種類の希釈率のみが使用される。細胞カウントおよび同定アルゴリズムは、現在採用されている分析のそれぞれに専用の集合から、実行される単一の分析に適用される単一の集合に結合される。さらに、アルゴリズムは、現在採用されているデータと同じデータ（信号）を採用する。結果の精度は、意図的に自動的に維持することができる。同時通過レベルは、意図的に維持することができる。温度変動によるレーザビームとサンプル流とのずれによって引き起こされる問題は解消可能である。ビームは、ラスタ走査サイクルのたびに、サンプル流に「自動的に位置合せ」し、緩慢な流れを無視できるものとする。レーザビームは、その小さな中央部分だけではなく、範囲全体が使用され、所与の出力レベルに対する効率が高められる。従来技術では、ビームの９０％から９５％が浪費されている。最後に、流速が低減されることにより、システムが乱流閾値から遠ざけられ、流体力学的不安定のリスクが低減される。
【００７０】
本発明の種々の変形および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者にとって明白になる。また、本発明が本明細書に述べる例示的な実施形態に甚だしく制限されるべきではないことが理解されるべきである。
【図１】
0005465180.tif 000015
【図２】
0005465180.tif 000016
【図３】
0005465180.tif 000017
【図４】
0005465180.tif 000018
【図５】
0005465180.tif 000019
【図６Ａ】
0005465180.tif 000020
【図６Ｂ】
0005465180.tif 000021
【図６Ｃ】
0005465180.tif 000022
【図６Ｄ】
0005465180.tif 000023
【図６Ｅ】
0005465180.tif 000024
【図６Ｆ】
0005465180.tif 000025
【図７Ａ】
0005465180.tif 000026
【図７Ｂ】
0005465180.tif 000027
【図７Ｃ】
0005465180.tif 000028
【図７Ｄ】
0005465180.tif 000029
【図８Ａ】
0005465180.tif 000030
【図８Ｂ】
0005465180.tif 000031
【図８Ｃ】
0005465180.tif 000032
【図８Ｄ】
0005465180.tif 000033
【図８Ｅ】
0005465180.tif 000034
【図８Ｆ】
0005465180.tif 000035
【図８Ｇ】
0005465180.tif 000036
【図８Ｈ】
0005465180.tif 000037
【図８Ｉ】
0005465180.tif 000038
【図８Ｊ】
0005465180.tif 000039
【図８Ｋ】
0005465180.tif 000040
【図８Ｌ】
0005465180.tif 000041
【図８Ｍ】
0005465180.tif 000042
【図９】
0005465180.tif 000043
【図１０】
0005465180.tif 000044
【図１１】
0005465180.tif 000045
【図１２Ａ】
0005465180.tif 000046
【図１２Ｂ】
0005465180.tif 000047
【図１２Ｃ】
0005465180.tif 000048
【図１３】
0005465180.tif 000049
【図１４】
0005465180.tif 000050
【図１５】
0005465180.tif 000051
【図１６】
0005465180.tif 000052
【図１７】
0005465180.tif 000053
【図１８】
0005465180.tif 000054