(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷後の脊髄の神経保護及び再結合を促進するためのインプラントを製造するための、ポリピロールとポリエチレングリコールとをプラズマ合成した共重合体の使用方法。
【請求項２】
人体内で一時的又は永久的に使用される、損傷後の脊髄の神経保護及び再結合を促進するためのインプラントの生体適合性を高めるための、ポリピロールとポリエチレングリコールとをプラズマ合成した共重合体の使用方法。
【請求項３】
損傷後のいずれかの時期に移植可能な、損傷後の脊髄の神経保護及び再結合を促進するためのインプラントを製造するための、ポリピロールとポリエチレングリコールとをプラズマ合成した共重合体の使用方法。
【請求項４】
損傷後の脊髄の神経保護及び再結合を促進するためのインプラントであって、それを必要としている患者に施したときに、組織の統合を改善すること、及び脊髄における炎症反応を低減することが可能なインプラントを製造するための、ポリピロールとポリエチレングリコールとをプラズマ合成した共重合体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷後の脊髄の神経保護及び再結合を促すインプラントを製造するための、プラズマ合成ピロール誘導重合体及び非生分解性物の使用方法を提案する。
【背景技術】
【０００２】
外傷性の脊髄損傷（ＳＣＩ）は、高い死亡率（Ｄｒｙｄｅｎ  ＤＭ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＬＤ，Ｒｏｗｅ  ＢＨ，Ｍａｙ  ＬＡ，Ｙｉａｎｎａｋｏｕｌｉａｓ  Ｎ，Ｓｖｅｎｓｏｎ  ＬＷ，Ｓｃｈｏｐｆｌｏｃｈｅｒ  ＤＰ，Ｖｏａｋｌａｎｄｅｒ  ＤＣ．「カナダ国アルバータ州における外傷性脊髄損傷の疫学」Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２００３；３０：１１３−１２１）と、身体障害及び長期間高額なリハビリテーション治療に至る厳しい結果を伴う公衆衛生上の課題である。
【０００３】
社会的及び経済的に高度な影響があることに加え、合衆国、カナダ、豪州、イタリア及びメキシコにおいて、最新のＳＣＩ年間患者数は百万人当たり１８〜５５人の範囲であると報告されている（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ＢＡ，Ｂａｒｏｎ  ＲＣ．「病院ベースの登録を用いた非致死性脊髄損傷の報告」Ａｍ．Ｊ．Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．１９９４；１０：１０−１４、Ｄｒｙｄｅｎ  ＤＭ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＬＤ，Ｒｏｗｅ  ＢＨ，Ｍａｙ  ＬＡ，Ｙｉａｎｎａｋｏｕｌｉａｓ  Ｎ，Ｓｖｅｎｓｏｎ  ＬＷ，Ｓｃｈｏｐｆｌｏｃｈｅｒ  ＤＰ，Ｖｏａｋｌａｎｄｅｒ  ＤＣ．「カナダ国アルバータ州における外傷性脊髄損傷の疫学」Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２００３；３０：１１３−１２１、Ｏ’−Ｃｏｎｎｏｒ  Ｐ．「豪州における脊髄損傷の発生率及びパターン」Ａｃｃｉｄ．Ａｎａｌ．Ｐｒｅｖ．２００２；３４：４０５−４１５、Ｐａｇｌｉａｃｃｉ  ＭＣ，Ｃｅｌａｎｉ  ＭＧ，Ｚａｍｐｏｌｉｎｉ  Ｍ，Ｓｐｉｚｚｉｃｈｉｎｏ  Ｌ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  Ｍ，Ｂａｒａｔｔａ  Ｓ，Ｆｉｎａｌｉ  Ｇ，Ｇａｔｔａ  Ｇ，Ｐｅｒｄｏｎ  Ｌ；脊髄損傷の疫学研究イタリアグループ「イタリアにおける外傷性脊髄損傷の調査。脊髄損傷の疫学研究イタリアグループの研究」Ａｒｃｈ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ．２００３；８４：１２６６−１２７５、Ｐａｒｄｉｎｉ  ＭＣ．「メキシコ連邦直轄区における外傷性脊髄損傷の疫学」メキシコ保健省の学術博士論文（ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔａｒiａ  ｄｅ  Ｓａｌｕｂｒｉｄａｄ  ｙ  Ａｓｉｓｔｅｎｃｉａ）１９９８）。
【０００４】
ＳＣＩを患う罹患者には、現在、長期間の身体悪化を抑えるよう設計した救済及び機能回復訓練のプログラムがある（Ｈｏｕｌｅ  ＪＤ、Ｔｅｓｓｌｅｒ  Ａ．「慢性脊髄損傷の治療法」Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００３；１８２：２４７−２６０）。しかし、これら患者達は、自律機能を回復でき、神経障害による苦痛を軽減しつつ、歩行能力を回復できる治療法を待ち望んでいる。本疾病は重要課題であるため、幾つかの世界的機関が設立され、年間数億ドルを支払い本件に関する研究を支援しているが、今日まで、効果的な治療法はない（Ｈｏｕｌｅ  ＪＤ、Ｔｅｓｓｌｅｒ  Ａ．「慢性脊髄損傷の治療法」Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００３；１８２：２４７−２６０）。
【０００５】
病理学的事象たる損傷は、神経組織の自己破壊過程から始まり、損傷箇所付近での再生と治癒を阻止する（Ａｌｄｓｋｏｇｉｕｓ  Ｈ，Ｋｏｚｌｏｖａ  ＥＮ．「求心路遮断された脊髄の修復に対する戦略」Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．２００２；４０：３０１−３０８)。急性期の間、虚血の経過が観察され、これは血液の微小循環が損なわれたことによるものであり、エネルギーの欠乏を起こし、次々にイオン調節の喪失と浮腫に翻訳され、これらはＫ+やＮａ+などの１価カチオン及びＣａ2+などの２価カチオンの可動化により起こるものであり、脊髄ショック症に至る（Ｈｕｌｓｅｂｏｓｃｈ  ＣＥ．「脊髄損傷の病理生理学及び治療法における最近の進歩」Ａｄｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｄｕｃ．２００３；２６：２３８−２５５）。
【０００６】
これら全経過の結果は、損傷箇所及び抹消の両方において損傷した組織の治療プロセスを実施するのに非常に好ましくない環境であり（Ｂｅａｔｔｉｅ  ＭＳ，Ｆａｒｏｏｑｕｉ  ＡＡ，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  ＪＣ．「脊髄損傷後のアポトーシスについての最近の検証結果に関する概説」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２０００，１７：９１５−９２５）、アストログリアの傷跡によって囲まれた空洞が生成し、発展して、軸索の再生を阻止する物理的、化学的な障害として作用する多葉の嚢胞性空洞となる（Ｈｏｕｌｅ  ＪＤ、Ｔｅｓｓｌｅｒ  Ａ．「慢性脊髄損傷の治療法」Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００３；１８２：２４７−２６０；Ｐｒｏｆｙｒｉｓ  Ｃ，Ｃｈｅｅｍａ  ＳＳ，Ｚａｎｇ  Ｄ，Ａｚａｒｉ  ＭＦ，Ｂｏｙｌｅ  Ｋ，Ｐｅｔｒａｔｏｓ  Ｓ．「脊髄損傷を支配する変質及び再生メカニズム」Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．２００４；１５：４１５−４３６）。
【０００７】
長年、組織又は細胞の移植を実施して、ＳＣＩ後の軸索成長、脊髄の再生及びそれによる機能回復を促進してきた（Ｚｏｍｐａ  ＥＡ，Ｃａｉｎ  ＬＤ，Ｅｖｅｒｈａｒｔ  ＡＷ，Ｍｏｙｅｒ  ＭＰ，Ｈｕｌｓｅｂｏｓｃｈ  ＣＥ．「移植療法：脊髄損傷後の機能回復」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１９９７；１４：４７９−５０６；Ｔａｏｋａ  Ｙ，Ｏｋａｊｉｍａ  Ｋ．「ラットの脊髄損傷」Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９９８；５６：３４１−３５８）。胚性又は胎児性の神経幹細胞及び多分化能前駆細胞を用いた損傷箇所での移植を実施してきており（Ｓｔｏｋｅｓ  ＢＴ，Ｒｅｉｅｒ  ＰＪ．「胎児性移植組織により成熟ラットの脊髄打撲損傷後の慢性的行動的な予後が変わる」Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９２，１１６：１−１２，ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＪＷ，Ｌｉｕ  ＸＺ，Ｑｕ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ｓ，Ｍｉｃｋｅｙ  ＳＫ，Ｔｕｒｅｔｓｋｙ  Ｄ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ＤＩ，Ｃｈｏｉ  ＤＷ．「移植した胚性幹細胞がラットの損傷した脊髄内で生き延び、分化し及び回復を促進する」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９，５：１４１０−１４１２）、胎児性細胞又は胎児性脊髄組織の移植（Ｚｏｍｐａ  ＥＡ，Ｃａｉｎ  ＬＤ，Ｅｖｅｒｈａｒｔ  ＡＷ，Ｍｏｙｅｒ  ＭＰ，Ｈｕｌｓｅｂｏｓｃｈ  ＣＥ．「移植療法：脊髄損傷後の機能回復」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１９９７；１４：４７９−５０６、Ｃｏｕｍａｎｓ  ＪＶ，Ｌｉｎ  ＴＴ，Ｄａｉ  ＨＮ，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ  Ｌ，ＭｃＡｔｅｅ  Ｍ，Ｎａｓｈ  Ｃ，Ｂｒｅｇｍａｎ  ＢＳ．「ラットでの完全な脊髄切断後に時間をおいて移植とニュートロフィリンを施す処置による軸索再生及び機能回復」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００；２１：９３３４−９３４４)や、末梢神経及びシュワン細胞の移植（Ｍｅｎｅｉ  Ｐ，Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｍｅｎｅｉ  Ｃ，Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ  ＳＲ，Ｂｕｎｇｅ  ＲＰ，Ｂｕｎｇｅ  ＭＢ．「シュワン細胞を隠れたヒトＢＤＮＦで遺伝子工学的に改変し、切断された成熟ラットの脊髄を横切って力強く軸索が再成長するのを促進する」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９８，１０：６０７−６２１）を実施してきた。髄鞘再形成を促進するためのオリゴデンドロサイトの移植は（Ｊｅｆｆｅｒｙ  ＮＤ，Ｃｒａｎｇ  ＡＪ，Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＭＴ，Ｈｏｄｇｅ  ＳＪ，Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ  ＷＦ．「ラットの脊髄内で試験的に髄鞘再形成している損傷へのオリゴデンドロサイト原型細胞の移植による行動性の推移」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９９；１１：１５０８−１５１４）、軸索成長を抑制する分子が発現するため、再生に関してはネガティブな効果であるという結果である（Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＣＳ．「展望：神経生物学。進行禁止ゾーンでの再生」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００  ２８７：８１３−８１４)。さらに、再生と髄鞘再形成を促進し、神経膠傷跡の形成を減少させるために、未分化又は非反応型星状膠細胞を使用して移植を行ってきている（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＲＪ，Ｃｒａｎｇ  ＡＪ，Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ  ＷＦ．「移植した１型星状膠細胞が成熟ラットの脊髄内でのホストオリゴデンドロサイトによる脱髄性損傷を修復するのを促進する」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ  １９９１，２０：４２��−４３０）。マイクログリアからの細胞を移植してきており（Ｒａｂｃｈｅｖｓｋｙ  ＡＧ，Ｗｅｉｎｉｔｚｅｎ  ＪＭ，Ｃｏｕｌｐｉｅｒ  Ｍ，Ｆａｇｅｓ  Ｃ，Ｔｉｎｅｌ  Ｍ，Ｊｕｎｉｅｒ  ＭＰ．「星膠症の誘導物質としてのトランスフォーミング増殖因子アルファの役割」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９８，１８：１０５４１−１０５５２）、嗅球のグリア細胞からの細胞を移植して、再生を許容する環境を創出してきており（Ｋｅｙｖａｎ−Ｆｏｕｌａｄｉ  Ｎ，Ｌｉ  Ｙ，Ｒａｉｓｍａｎ  Ｇ．「いかにして移植した嗅覚嗅神経鞘細胞が機能回復するか？」Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．２００２；４０：３２５−３２７）、さらに幹細胞までもが使われてきており、遺伝子工学的にマニピュレートした又はしていない幹細胞を使い、特定のタンパク質、例えばニューロトロフィン、神経伝達物質、酵素、細胞外マトリックス分子や表面接着分子など、の合成を誘発したが、機能回復の面ではよい結果が得られなかった（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＪＷ，Ｌｉｕ  ＸＺ，Ｑｕ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ｓ，Ｍｉｃｋｅｙ  ＳＫ，Ｔｕｒｅｔｓｋｙ  Ｄ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ＤＩ，Ｃｈｏｉ  ＤＷ．「移植した胚性幹細胞がラットの損傷した脊髄内で生き延び、分化し及び回復を促進する」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９，５：１４１０−１４１２；Ｂａｒａｍｉ  Ｋ，Ｄｉａｚ  ＦＧ．「細胞移植及び脊髄損傷」Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２０００；４７：６９１−７００）。
【０００８】
このような治療学的な試みにも関わらず、ＳＣＩ治療で使った移植物のほとんどが失敗しており、神経機能喪失を有意義に回復できず、ついにバイオ材料の使用によって脊髄修復を試みるという新しい戦略を展開するに至っている。世界に向けた最初の報告において、炭素フィラメント製インプラントの使用が、ラットの脊髄内で損傷した軸索の成長のための橋架けとして作用することが示された。Ｋｈａｎらは(Ｋｈａｎ  Ｔ，Ｄａｕｚｖａｒｄｉｓ  Ｍ，Ｓａｙｅｒｓ  Ｓ．「炭素フィラメント製インプラントにより切断したラットの脊髄を横断して軸索が成長することが促進された」Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９１；５４１：１３９−１４５)、ラット内に炭素フィラメント製インプラントを埋め込み、脊髄の完全な切断モデルとし、フィラメント上及びフィラメント間での軸索成長を観察して、炭素フィラメントは、おそらく機械的ガイドとして機能するだけでなく、成長している軸索を好適に結合する表面として機能できると結論付けた。
【０００９】
微粒子を用いる手法は、１９９９年にＣａｏとＳｈｏｉｃｈｅｔによって開発されたバイオエンジニアリング技術であり、該粒子は神経成長因子（ＮＧＦ）を含み、卵白アルブミン中にカプセル化されており、損傷箇所に置かれた生分解性ポリマーに結合して（Ｃａｏ  Ｘ，Ｓｃｈｏｉｃｈｅｔ  ＭＳ．「中枢神経系の病気に適応するための生分解性微粒子からの向神経活性分子の送達」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．１９９９，２０：３２９−３３９）、軸索の再生過程を促進する。ＰＣ１２細胞内でこの技術を試験し、ＮＧＦ放出の生理活性が測定された。その結果は、ＮＧＦの生理活性が９１日間続いたことを示した。
【００１０】
ポリ［Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド］(poly[N-(2-hydripropil)metacrilamida]、poly[N-(2-hydripropil)methacrylamide])（ＰＨＰＭＡ）の生体適合性ハイドロゲルで、フィブロネクチンの細胞結合領域のＡｒｇ−Ｇｌｙ及びＡｓｐ配列を持つものが、Ｗｏｅｒｌｙらによって合成され、レオロジー構造及び誘電特性が明らかにされた(Ｗｏｅｒｌｙ  Ｓ，Ｐｉｎｅｔ  Ｅ，ｄｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓ  Ｌ，Ｖａｎ  Ｄｉｅｐ  Ｄ，Ｂｏｕｓｍｉｎａ  Ｍ．「ＲＧＤペプチドを含むＰＨＰＭＡハイドロゲル（ニューロゲル）を用いた脊髄修復」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００１；２２：１０９５−１１１１)。このバイオ材料をスプラーグドーリーラットにおける片側切断した脊髄損傷モデルにおいて試験した。ハイドロゲルを脊髄内に挿入した。その結果は、ハイドロゲル重合体が損傷領域を貫通した三次元構造及び連続性をもたらし、細胞の遊走及び再組織化を促進することを示した。再構築された脊髄セグメント内の脊髄上位領域への軸索成長だけでなく、血管新生及び軸索成長も、該ゲル上の微細構造及び新生組織内において観察され、その上、ハイドロゲルが存在することによりネクローシス及び空洞形成が減っており、その理由を著者らはこの重合体が損傷した脊髄の修復に役立つからであると指摘する。
【００１１】
チューブに似た構造の重合体を用いて、成長する軸索を案内し、遷移ゾーン間を橋架けする方法は、Ｏｕｄｅｇａらによって用いられた方法論である（Ｏｕｄｅｇａ  Ｍ，Ｇａｕｔｉｅｒ  ＳＥ，Ｃｈａｐｏｎ  Ｐ，Ｆｒａｇｏｓｏ  Ｍ，Ｂａｔｅｓ  ＭＬ，Ｐａｒｅｌ  ＪＭ，Ｂｕｎｇｅ  ＭＢ．「成熟ラットの脊髄における、再吸収性のポリ（アルファ−ヒドロキシ酸）製案内チャンネル内のシュワン細胞移植片への軸索再生」Ｂｉｏ-ｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００１；２２：１１２５-１１３６)。ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ５０)とポリ（Ｌ−乳酸）(ＰＬＡ１００/１０)のオリゴマーを１０％混ぜた高分子量ポリ（Ｌ−乳酸）との共重合体から作製した再吸収性重合体を、脊髄を完全に切断し傷ついた成熟フィッシャー系ラットの神経組織内に埋め込んで、本研究では４ヶ月の経過観察を行った。その結果は、２週間以降、チューブが脊髄性神経組織と血管を有することを示した。ほとんどの有髄化した軸索が、移植後１ヶ月で見られた。上記報文では、脊髄内に２ヶ月静置されたＰＬＡ１００/１０重合体製インプラント内で、有髄の線維が成長したと結論づけられた。しかしながら、４ヵ月後にこの現象が減少したという証拠があり、そのため、著者らがさらにこの技術を最適化する研究を推奨する理由となっている。
【００１２】
ＳＣＩ後の再生過程を促進し軸索成長を案内するように作製されたもう一つの生分解性材料は、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）及びフィブロネクチンアルギネート＋ハイドロゲルで作られたフィラメントである。Ｎｏｖｉｋｏｖらが実施した研究において(Ｎｏｖｉｋｏｖ  ＬＮ，Ｎｏｖｉｋｏｖａ  ＬＮ，Ｍｏｓａｈｅｂｉ  Ａ，Ｗｉｂｅｒｇ  Ｍ，Ｔｅｒｅｎｇｈｉ  Ｇ，Ｋｅｌｌｅｒｔｈ  ＪＯ．「脊髄損傷後の神経細胞救護及び再生のための新規な生分解性インプラント」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００２；２３：３３６９-３３７６)、脊椎骨Ｌ１部位にて赤核脊髄路の切開を行い、ＰＨＢのインプラントにより細胞死が５０％減少することが観察された。分離した成分を用いても、神経細胞の生存に対して効果がない。また、新生児のシュワン細胞をＰＨＢの移植に加えると、インプラント内及び神経組織を通じて軸索の再生が観察されることから、これらバイオ材料とシュワン細胞との併用が、ＳＣＩ後の再生の増大を伴う神経細胞の支えとして作用しうることを示唆している。
【００１３】
ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート−ｃｏ−メチルメタクリレート)（ｐ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＭＡ））製のヒドロゲルチューブを、中枢神経系内での潜在的な軸索成長の案内経路として使用することは、脊髄障害を回復させるもうひとつのアプローチである。これらのチューブの特徴は、化学処方により制御された層間を相互接続したマクロ孔を有するゲルと同様の柔軟性と屈曲性を有することである（Ｄａｌｔｏｎ  ＰＤ，Ｆｌｙｎｎ  Ｌ，Ｓｈｏｉｃｈｅｔ  ＭＳ．「神経の案内経路として用いるポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート−ｃｏ−メチルメタクリレート)ヒドロゲルチューブの製造」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００２；２３：３８４３-３８５１)。
【００１４】
しかしながら、重合体のいくつかは免疫学的に不活性で、特に神経系内では耐性があるが、重合体の分解が炎症反応を引き起こしうることが示された（Ｍａｒｃｈａｎｔ  ＲＥ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＭ，Ｄｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ＥＯ「Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける生体適合性の研究ＶＩＩ  ポリエチレン及び細胞障害性のポリビニルクロライドに対する炎症応答」Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．１９８６；２０：３７-５０；Ｇａｕｔｉｅｒ  ＳＥ，Ｏｕｄｅｇａ  Ｍ，Ｆｒａｇｏｓｏ  Ｍ，Ｃｈａｐｏｎ  Ｐ，Ｐｌａｎｔ  ＧＷ，Ｂｕｎｇｅ  ＭＢ，Ｐａｒｅｌ  ＪＭ．「脊髄内で応用するためのポリ（アルファ−ヒドロキシ酸）：成熟ラットのシュワン細胞及び脊髄での再吸収性及び生体適合性」Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８；４２：６４２-６５４)。他の著者らはいくつかの重合体ではこれら成分への軸索の付着力が乏しいと報告しているが、しかし、Ｒａｎｇａｐｐａらは(Ｒａｎｇａｐｐａ  Ｎ，Ｒｏｍｅｒｏ  Ａ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＫＤ，Ｅｂｅｒｈａｒｔ  ＲＣ，Ｓｍｉｔｈ  ＧＭ．「指向性配向を与えたときに頑強な神経成長を誘発するラミニンで被覆したポリ（Ｌ−乳酸）フィラメント」Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；５１：６２５−６３４)、ラミニンをマトリックスとして被覆した網を用いるとマトリックスへの軸索の付着力が増加し得ると報告している。もうひとつの戦略は、徐放性のカプセル化されたペプチド（栄養性因子、薬剤など）と結合する能力を有するバイオ材料の開発である（Ｐｅｃｈａｒ  Ｍ，Ｕｌｂｒｉｃｈ  Ｋ，Ｓｕｂｒ  Ｖ，Ｓｅｙｍｏｕｒ  ＬＷ，Ｓｃｈａｃｈｔ  ＥＨ．「抗がん剤ドキソルビシンの運搬体としてのポリ（エチレングリコール）マルチブロックコポリマー」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０００；１１：１３１−１３９)が、しかし、満足すべき結果は得られていない。コラーゲン繊維単独又は他の材料との組み合わせることで、軸索成長のための案内及び支持体として働き、再生を誘発する（Ｈｅｆｆｎｅｒ  ＣＤ，Ｌｕｍｓｄｅｎ  ＡＧ，Ｏ'Ｌｅａｒｙ  ＤＤ．「哺乳類の脳内での側枝伸張及び指向性軸索成長を標的とした制御」Ｓｃｉｅｎｃｅ.１９９０；２４７：２１７−２２０；Ｔｏｎｇ  ＸＪ，Ｈｉｒａｉ  Ｋ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｈ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｙ，Ｉｚｕｍｉ  Ｔ，Ｔｏｄａ  Ｎ，Ｙｕ  Ｐ．「ラットでのラミニン−フィブロネクチン二重被覆生分解性コラーゲン移植片が案内した坐骨神経の再生」Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９４；６６３：１５５−１６２)。生体適合性材料を使用して、損傷した神経組織を回復させることが急速に進歩しており、脊髄修復のため橋架けとして機能する材料が開発されているが、しかしながら、これら重合体は従来の化学的方法又は電気化学的重合法で合成されており（Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｎｅｏｈ  ＫＧ，Ｋａｎｇ  ＥＴ．「化学的に合成された及びプラズマ重合されたピロールチオフェン薄膜の比較研究」Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  ２００４；４４６：２０５−２１７)、それら重合体の分解が炎症反応を引き起こすことが示されたため、その有用な効果を妨害しうる。
【００１５】
Ｓｃｈｍｉｄｔら(米国特許第６，６９６，５７５号Ｂ２，２００４)は、分解を促進するために、柔軟な脂肪族エステル鎖を持つピロールとチオフェンのセグメントの混合物及び結合物から合成した生分解性重合体を記載しており、それらは、組織工学の技術領域における代替措置として提案されており、それらの化学的及び電気的特性が示されている。これらの材料は、柔軟であり、その化学構造により鎖間で電子の自由な運動が許容されるため、電導性が増す。上記特許では、他の組織（骨、筋肉など）と同様に脊髄の抹消神経組織の再生を促進するバイオ材料として提案されている。しかし、その用途を裏付ける証拠はない。
【００１６】
プラズマを用いて、導電性重合体フィルムを得ることは、重合体合成のために使われてきたもうひとつの方法論である。合成過程中、モノマーは進行中のガス相中で反応し、反応中、化学的な媒介物を要さない。本方法による重合体の化学的構造は、化学的合成法で観察されるものとは相違しており、より純度が高く、接着性がより大きく、架橋度及び伸展度が増していることが示されている（Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｎｅｏｈ  ＫＧ，Ｋａｎｇ  ＥＴ．「化学的に合成した及びプラズマ重合したピロールとチオフェン薄膜の比較研究」Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  ２００４；４４６：２０５-２１７)。Ｃｒｕｚらは（Ｃｒｕｚ  ＧＪ，Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｊ，Ｏｌａｙｏ  Ｒ．「ピロールをプラズマ重合して得られたフィルム」Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  １９９９；３４２：１１９-１２６）、ピロール誘導体材料のプラズマ合成方法を報告しており、それらの中には、ヨウ素ドープしたものが見出せる。これらの材料は生分解性ではなく、神経系で使われた理由は、炎症応答を減らし、高い治癒率を与えるからであり、数件の研究が指摘するように、炎症応答が損傷の周辺に位置する神経組織を破壊する二次的な障害の機構の１つだからである。
【００１７】
導電性重合体は、交互に又は共役した二重結合を持つ炭化水素の長い鎖で形成された、金属の電気的特性とプラスチックの機械的特性を兼ね備える材料である。その伝導性は、主として他の化学製品の所定量添加（ドーピング）によるが、共役二重結合が存することによっても電子流が移動できるようになる。ドーピング技術は、電気的に陰性な原子の添加が必要である。これらの原子は、自由電子を高分子結合に提供し、又は、正電荷を生じるのと同等な電子を引き抜く働きをする。両方の場合に、高分子鎖は、電気的に不安定になり、電位差をつけると、電子が重合体内を動く（Ｃｒｕｚ  ＧＪ，Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｊ，Ｏｌａｙｏ  Ｒ．「ピロールのプラズマ重合により得られたフィルム」Ｔｈｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｆｉｌｍｓ  １９９９；３４２：１１９−１２６）。しかし、重合体を導電体に変える物理的なメカニズムは良く知られておらず、重合体の純度や構成がたいへん重要な役割をしているようである。それゆえ、重合体の構造的な構成が改質されれば、電気伝導性も改善されうる。導電体として使われる重合体は、他の重合体と同じように、主として炭素及び水素原子から構成され、モノマー単位の繰返しで配列されている。一般に、これらの単位には、窒素や硫黄などの異原子がたいていある。Ｃ原子は、単結合や二重結合の交互の組(・・・＝Ｃ−Ｃ＝Ｃ−Ｃ＝Ｃ−・・・)によって相互に連結しており、つまり、超共役結合を示しており、これは全ての電導性重合体に共通する性質である。電気の導通は、電子（ｅ-）の運動による。材料中をｅ-が自由に動くことが必要である。固体の伝導体中では、ｅ-は（完全な固体結晶ネットワークへの分子軌道理論の拡張から生じた）バンドと呼ばれる不連続のエネルギー状態を通じて動き回る。最低位のバンドが半分充満している場合（良導体又は金属伝導体）、又、もし空位でも、エネルギー的に最低位の充満帯に近い（半導体）場合にのみ、固体は電気を伝導できる。もし充満バンドから→空位バンドへの飛翔に大きなエネルギーが要る場合には、これを絶縁体であると考えうる（Ｃｒｕｚ  ＧＪ，Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｊ，Ｏｌａｙｏ  Ｒ．「ピロールのプラズマ重合により得られたフィルム」Ｔｈｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｆｉｌｍｓ  １９９９；３４２：１１９−１２６）。
【００１８】
ポリピロール（ＰＰｙ）は導電性重合体で、正に帯電した化学構造を有しており、その化学構造に多種の化学物質（ドーパント）が結合でき、重合体の電気的特性を変える。ＰＰｙはその生体適合性ゆえに、血液中のグルコースを検出するバイオセンサーとして使用されてきた（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ  Ｅ，Ｌｉｖａｃｈｅ  Ｔ，Ｍａｒｃｈａｎｄ  Ｊ，Ｇｒｅｎｉｅｒ  Ｊ．「ポリピロールＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション法によるＫ−ｒａｓ突然変異の検出」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００１； ４７： １８６−１９４)。さらに、その導電性ゆえに、ＰＰは神経細胞の増殖を刺激する能力があることが（Ｋｏｔｗａｌ  Ａ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＣＥ．「電気的刺激によって、タンパク質吸着及び神経細胞の導電性バイオ材料との相互作用が変わる」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００１；２２：１０５５−１０６４）、クロマフィン細胞（Ａｏｋｉ  Ｔ，Ｔａｎｉｎｏ  Ｍ，Ｓａｎｕｉ  Ｋ，Ｏｇａｔａ  Ｎ，Ｋｕｍａｋｕｒａ  Ｋ．「ポリピロールフィルム上で培養されたアドレナリンクロマフィン細胞の隠れた作用」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．１９９６；１７：１９７１−１９７４）や、内皮細胞（Ｇａｒｎｅｒ  Ｂ，Ｇｅｏｒｇｅｖｉｃｈ  Ａ，Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＡＪ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＧＧ．「内皮細胞成長のための刺激応答性基材としてのポリピロール−ヘパリン複合材料」Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，４４：１２１−１２９）において報告された。Ｓｃｈｍｉｄｔらは（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＣＥ，Ｓｈａｓｔｒｉ  ＶＲ，Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．「電気伝導性重合体を用いた神経突起生長への刺激」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９７；９４：８９４８−８９５３)、電気的な刺激が、ＰＰフィルム上のＰＣ−１２細胞内での神経突起生長を増大させることを示した。最近の研究によればＰＰの生体適合性が、生体外（Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｒｏｙ  Ｒ，Ｄｕｇｒｅ  ＦＪ，Ｔｅｓｓｉｅｒ  Ｄ，Ｄａｏ  ＬＨ．「電気伝導性ポリピロール被覆したポリエステルのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生体的合成の研究」Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１，５７：６３−７１）及び生体内（Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｍａｒｏｉｓ  Ｙ，Ｔｒａｏｒｅ  Ａ，Ｔｅｓｓｉｅｒ  Ｄ，Ｄａｏ  ＬＨ，Ｇｕｉｄｏｉｎ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ．「ポリピロール被覆したポリエステル織物に対する組織反応：ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究」Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００２；８：６３５−６４７）の両方で許容できるものであることが証明されており、この背景に支えられて、いくつかのバイオ医療及び組織工学の用途にＰＰｙ及びその誘導体が使われている。この情報に基づいて、ポリエチレングリコールとのポリピロール共重合体（ＰＰｙ／ＰＥＧ）及びヨウ素ドープされたポリピロール（ＰＰｙ／Ｉ）重合体という２種類の半導性重合体をラットの脊髄を完全に切断したモデルに使用することに決めた。
【発明の概要】
【００１９】
（ポリピロール／ポリエチレングリコール共重合体及びヨウ素ドープポリピロールの合成）
重合体の薄膜形状での合成を、ステンレス鋼製フランジを有する直径９ｃｍ及び３０ｃｍ長のガラス管状反応器中での閃光の電気ショック手段により行った。重合開始圧力は１．５×１０-2Ｔｏｒｒであり、化学反応の発展圧力は５×１０-2Ｔｏｒｒである。電場の発振周波数は１３．５ＭＨｚとした。ステンレス鋼電極は直径７ｃｍである。電極の一方を接地し、他方をＲＦ信号に接続し、電極間距離を９ｃｍとした。モノマーとドーパントを別々の容器中に配置し、反応器と容器間の圧力差によりそれらの少量の気体流を反応器に導き、両者を反応器内で混合した。反応物の温度は約２０℃であった。重合時間は３００分であった。反応は主として気体相中で進行し、重合体の分子量が増加した時に固相中で終結する。出発試薬の簡略化された化学式は：Ｃ4Ｈ5Ｎである。
【化１】
0005587177.tif 000002
【００２０】
アセトンでの湿潤と乾燥を数サイクル施した後に、重合体を反応器の表面から分離する。２又は３サイクル後、重合体をスパチュラで機械的に回収し、その後、それらを粉砕し、試験材料の脊髄内でインプラントとして用いるタブレットを作製した。比較のためヨウ素ドープポリピロール（ＰＰｙ／Ｉ）及びポリピロールとポリエチレングリコールの共重合体（ＰＰｙ／ＰＥＧ）の誘導体からタブレットを調製した。
【００２１】
（プラズマ合成重合体の物理化学的特性）
（赤外分光法による構造分析）
図１Ａのスペクトルは、ＰＰｙ／ＰＥＧ共重合体に対応する３本の複雑な吸収バンドを示す。第一は４００及び１２００ｃｍ-1間、第二は１２００及び２０００ｃｍ-1間、第三は２４００及び３６００ｃｍ-1間である。４００及び１２００ｃｍ-1間の範囲に及ぶ幅広いピークはアルケンに相当する多数の吸収を含んでいる。ピーク幅はＰＰｙ環の間での分岐、架橋及び相互作用を示している。最大強度のピークはＰＰｙの振動に相当する。
【００２２】
図１ＢはＰＰｙ／Ｉ試料の透過スペクトルを示し、プラズマ合成重合体に特有な２本の複雑な幅広い振動のバンドが見られる。第一は２４００及び３６００ｃｍ-1間、他方は５００及び１８００ｃｍ-1間である。３６００及び２４００ｃｍ-1間の区域は、異なる立体配置のＮ-Ｈ、Ｏ-Ｈ及びＣ-Ｈ結合の吸収を示し、３３４９ｃｍ-1に一級アミン類（Ｃ−Ｎ）の振動が強く見えるのみならず、２９３２ｃｍ-1に飽和脂肪族鎖の振動が強く見える。第二の複雑なバンドでは、１６３９ｃｍ-1に第一級、第二級及び第三級アミンに相当する振動が強く見える。メチル基（Ｃ−Ｈ）の変角振動が１４５２ｃｍ-1にある。７４７ｃｍ-1にはＣ−Ｃ結合に相当する振動が見える。
【００２３】
（電気特性）
ＰＰｙ／ＰＥＧは、ＧΩの電気抵抗を呈し、半導体重合体と考えられる。ＰＰｙ／Ｉは、１．３ＭΩの電気抵抗を呈し、４５．９４ＭΩ−ｃｍの抵抗率及び概算２１ｎＳ／ｃｍの電気伝導率であった。
【００２４】
（形態）
図２Ａに、走査電子顕微鏡で撮影したＰＰｙ／ＰＥＧ共重合体の表面の画像を示し、該画像には、海綿状の外観である表面を持つ均質な構造が観察される。図２Ｂに、ＰＰｙ／Ｉ重合体に相当する画像を示し、表面に約５〜１０μｍの寸法の小さな凝集塊が見える。
【００２５】
ＰＰｙ／ＰＥＧ共重合体は極微小な薄膜の形態で得られ、一方、ＰＰｙ／Ｉ重合体は微粉で得られ、引き続き固めてタブレットを形成した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（Ａ）ポリピロール／ポリエチレングリコール共重合体のＦＴ−ＩＲスペクトル；（Ｂ）ヨウ素ドープポリピロール重合体のＦＴ−ＩＲスペクトル
【図２】埋設したバイオ材料の走査電子顕微鏡写真である。（Ａ）ポリエチレングリコールとのポリピロール共重合体。（Ｂ）ヨウ素ドープポリピロール。目盛線は５０μｍに相当する。
【図３】脊髄の完全切断後、損傷の初日（Ｄ１）から４週間（Ｓ）のＢＢＢスケール（Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ及びＢｒｅｓｎａｈａｎ）により評価した運動麻痺回復結果を示す図である。
【図４】脊髄を完全切断し、インプラントを施していない動物における損傷後１ヶ月の脊髄の縦断面図である。（Ａ）損傷ゾーン及び保存された組織（２．５倍）；（Ｂ）遷移ゾーンの詳細（５倍）；（Ｃ）損傷ゾーンにおける細胞構築の喪失（２０倍）；（Ｄ）炎症細胞の存在（４０倍）。ヘマトキシリン／エオシン技術による。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＣＩ：炎症細胞。
【図５】脊髄を完全切断し、ポリピロール／ポリエチレングリコール共重合体製のインプラントを施した動物における損傷後１ヶ月の脊髄の縦断面図である。（Ａ）神経組織とのインプラント統合を示す像の画像（２．５倍）；（Ｂ）遷移ゾーンの詳細（５倍）；（Ｃ）損傷ゾーン（２０倍）；（Ｄ）炎症細胞の存在（４０倍）。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＣＩ：炎症細胞。ヘマトキシリン／エオシン技術による。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＰＰｙ／ＰＥＧ：ポリピロールポリエチレングリコール共重合体製の移植片、ＭＭ：改変したマクロファージ。
【図６】脊髄を完全切断し、ハロゲンをドープしたポリピロール製のインプラントを施した動物における損傷後１ヶ月の脊髄の縦断面図である。（Ａ）神経組織とのインプラント統合を示す像の画像（２．５倍）；（Ｂ）遷移ゾーンの詳細（５倍）；（Ｃ）損傷ゾーン（２０倍）；（Ｄ）炎症細胞の存在（４０倍）。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＣＩ：炎症細胞。ヘマトキシリン／エオシン技術による。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＰＰｙ／Ｉ：ヨウ素ドープポリピロール製の移植片、ＣＧＣＥ：異物巨細胞。
【図７】本研究の終了時における動物の全体的な健康及び機能回復を表す図である。（Ａ）インプラントを施していない対照の動物；（Ｂ）ポリピロール／ポリエチレングリコール共重合体製のインプラントを施した動物及び（Ｃ）ポリピロール／ヨウ素製のインプラントを施した動物。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（プラズマ合成ピロール誘導重合体の神経再結合効果の評価）
ラットの脊髄を完全に切断したモデルにおける神経機能の神経保護物質及び神経再生物質としてプラズマ合成重合体を評価した。
【００２８】
以下のように各々３匹の動物により３実験群を形成した：Ａ）対照群。第九胸椎部位（Ｔ９）にて脊髄を完全に切断した動物、Ｂ）ＰＰｙ／ＰＥＧ群。脊髄を完全に切断し、ＰＰｙ／ＰＥＧ製インプラントを埋め込んだ動物、Ｃ）ＰＰｙ／Ｉ群、上記の外科的手法が施され、ＰＰｙ／Ｉタブレットが埋め込まれた動物。全ての実験群はラット３匹ずつで形成した。
【００２９】
体重１ｋｇ当たり７７．５ｍｇのケタミンと１２．５ｍｇの塩酸キシラジンとの混合物を筋肉内注射して動物を麻酔した。動物を麻酔し外科部位を洗浄した後、皮膚を矢状に切開し、続いて脊髄の突起の傍脊椎筋の解剖を行った。
【００３０】
２つの脊髄の突起をＴ９〜Ｔ１０から除去し、これら脊椎におけるラミナ突起を観察した。最後に、２レベルの椎弓切除を行い、椎間関節面突起まで両側に拡張する処理を行った。髄膜は無傷で残った。椎弓切除を完了して、髄膜内を長軸方向に約５ｍｍ切開し、切開部の両側を９−０（ポリアミド６モノフィラメント）の縫合糸の単結節縫合で差し向けつつ、引き続き完全に脊髄を横切断し、顕微手術のフックによってまだつながっている神経経路がないことを確証した。
【００３１】
ラットでの脊髄の完全な切断による損傷プロセスを完了した後すぐに、まさにその切断部位に直径約３ｍｍの重合体製タブレットの１片を横行するように差し込んだ。移植後、髄膜を通して単純結節縫合法によって９−０縫合糸で縫合した。最終的に、外科的な切開部位は、筋肉筋膜と皮膚という２平面で単純結節連続縫合法により、別々に、５−０縫合糸（ポリプロピレンのモノフィラメント）を使って縫合された。
【００３２】
手術後、室温にした１つの檻中で、３．２ｇ／１００ｍＬ（１０ｍＬを２Ｌの水で希釈し、飲料水中にて７２時間投与した）の濃度のパラセタモール鎮痛薬と混ぜた市販の食糧及び水の常用飼料を欲するままに与え、また、２５０μＬ／２５０ｇ質量（１回分の服用量として１，２００，０００Ｉ．Ｕ．）のベンザチンペニシリンを筋肉内に投与して、動物を観察した。
【００３３】
（重合体による再生効果の評価）
バイオ材料のもつ再生に関する誘導体効果を測定するため、下記のＢＢＢスケール（Ｂａｓｓｏ，Ｂｅｔｔｉｅ及びＢｒｅｓｎａｈａｎ）（Ｂａｓｓｏ  ＤＭ，Ｂｅａｔｔｉｅ  ＭＳ，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  ＪＣ．「生態観察と比較したＮＹＵ荷重落下装置を用いた脊髄挫傷後のグレード分けした組織学的及び歩行運動における予後」Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６；１３９：２４４-２５６)を用いて、脊髄の切断後４週間の動物における運動機能回復により評価した。
【００３４】
（ＢＢＢスケール）
グレード０
後肢（ＥＰ）で主要な動作が観測されない。
グレード１
１又は２の関節での制限された動作（ａｒｃ＜５０％）、通常臀部及び／又は膝
グレード２
他の部位の制限された動作と一緒の又は一緒でない関節の広範な動作（ａｒｃ＞５０％）
グレード３
２関節の広範な動作
グレード４
ＥＰ（臀部、膝及び足首）の３関節の制限された動作
グレード５
２関節の制限された動作及び第三関節の広範な動作
グレード６
２関節の広範な動作及び第三関節の制限された動作
グレード７
ＥＰ（臀部、膝及び足首）の３関節の広範な動作
グレード８
体重支持なしでのＥＰと両足の律動的な（協調した）動作又は体重支持なしでの足底接地
グレード９
非歩行時に体重支持された足底接地、又は足底の支持なしに、背側の体重支持された時々の（＜０＝５０％）、しばしば（５１％〜９４％）又は絶え間ない（９５％〜１００％）ステップ
グレード１０
前肢（ＥＡ）とＥＰ間の協調しない足底体重支持された時々のステップ
グレード１１
ＥＡとＥＰ間の協調しない足底体重支持されたしばしば又は絶え間ないステップ
グレード１２
ＥＡとＥＰ間で時々協調した足底体重支持されたしばしば又は絶え間ないステップ
グレード１３
ＥＡとＥＰ間でしばしば協調した足底体重支持されたしばしば又は絶え間ないステップ
グレード１４
足底体重支持されて常にステップする、ＥＳとＥＩ間で常に協調し、主に床への接地時又は離地時に両足の内旋又は外旋がある。また、しばしばの足裏ステップ、ＥＡとＥＰ間の常なる協調及び時々の背側のステップ
グレード１５
常にＥＡとＥＰ間で協調した足裏のステップ。足を前に進めるとき、つま先を離さない又は時々しか離さない。床に接地するとき、足の胴体に対する平行配列が優先的である。
グレード１６
行進中、常に足裏及びＥＡとＥＰ間で協調したステップ。足を前に進めるとき、しばしばつま先を離す。床と接地するとき、足の胴体に対する平行配列が優先的であるが、足を持ち上げると、配列が回転する
グレード１７
行進中、常に足裏及びＥＡとＥＰ間で協調したステップ。足を前に進めるとき、しばしばつま先を離す。床と接地するとき、足の胴体に対する平行配列が優先的であるが、足を持ち上げても、配列が保たれる（回転しない）
グレード１８
行進中、常につま先を離す。床と接地するとき、足の胴体に対する平行配列が優先的であるが、足を持ち上げると、配列が回転する
グレード１９
行進中、常に足裏及びＥＡとＥＰ間で協調したステップ。行進中、常につま先を離す。床と接地するとき、足の胴体に対する平行配列が優先的である。尾を時々又は始終引きずる
グレード２０
足裏ステップ、協調した歩行及び常につま先を離す。床と接地するとき、足の胴体に対する平行配列が優先的である。常に持ち上げた尾及び不安定な胴体
グレード２１
同様であるが、胴体が常に安定している。
【００３５】
（重合体による神経保護作用の評価）
神経保護作用及び重合体の統合が、損傷から１月後に組織学的なセクションにおいて見ることができた。動物を心臓内経路により灌流した。灌流に続いて、脊椎の尾側のセグメント及び頭部のセグメントまでの中心損傷領域から１．５ｃｍのセグメントを得るため、脊髄を取り去った。組織を固定液に５日間静置し、その後パラフィン中に包埋した。１０μｍ厚の連続した縦切片をマイクロトームで作製し、１０セクションの範囲から切片を選択し、４試料を得た。選択した切片を４５℃の湯浴で浮遊させてくぐらせ、ガラスプレートに固定して、ヘマトキシリン及びエオシンを用いるハリス法によって染色した
【００３６】
（統計的分析）
正規分布及び均一な分散を示す場合に、パラメトリック統計を用いて結果を分析した。ダネット検定を伴った反復測定ＡＮＯＶＡ検定を用いた。
【００３７】
統計的な有意性の限界値を決める値としてｐ＜０．０５を採用した。
【００３８】
（結果）
機能評価の結果を図３に示す。本研究では、ＰＰｙ／ＰＥＧをインプラントした動物では対照群と比べて５倍の回復が観察され、さらに、ＰＰｙ／Ｉ群の回復は対照群と比べて１０倍高かった（ｐ＜０．０５）。インプラントを受けた両群における機能回復から、動物が自発的な神経の機能を有することが示された。ＰＰｙ／ＰＥＧを使った動物で観察されたＢＢＢスケールでのグレード４は後肢（臀部、膝及び足首）の３関節の制限された動作があると評価され、一方、ＰＰｙ／Iを使った動物で平均グレード７に達したことで、後肢（臀部、膝及び足首）の３関節の広範な動作まで発達したことが示されたからである。図面での略号は：Ｓｅｃｔｉｏｎ：移植をしない脊髄の完全な切断、Ｓｅｃｔｉｏｎ＋ＰＰ／ＰＥＧ：脊髄の完全な切断＋ポリピロールポリエチレングリコール共重合体の移植、脊髄の完全な切断＋ヨウ素ドープポリピロールの移植に符合する。結果を平均値±群ごとの３動物の標準誤差で表わした。結果は、ダネット検定を伴った反復測定ＡＮＯＶＡ検定で分析した。*ｐ＜０．０５。
【００３９】
組織学的な結果を図４，５及び６に示す。対照群では、神経組織の広範な破壊及び増加した炎症細胞の存在が観察された。ＰＰｙ／ＰＥＧ群では、より軽度の神経組織の破壊が観察され、異物巨細胞はなかったが、海綿状のマクロファージ、炎症細胞及びＴリンパ球が存在した。ＰＰｙ／Ｉ群では、埋め込まれた重合体が脊髄の神経組織を接合しており、炎症細胞、Ｔリンパ球及び異物巨細胞と呼ばれる改変したマクロファージも観察された。写真中に示した略称は：図４では、（Ａ）損傷ゾーン及び保存された組織（２．５倍）；（Ｂ）遷移ゾーンの詳細（５倍）；（Ｃ）損傷ゾーンにおける細胞構築の喪失（２０倍）；（Ｄ）炎症細胞の存在（４０倍）、ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＣＩ：炎症細胞を表わす。図５では、（Ａ）神経組織とのインプラント統合を示す画像（２．５倍）が観察でき；（Ｂ）遷移ゾーンの詳細（５倍）；（Ｃ）損傷ゾーン（２０倍）；（Ｄ）炎症細胞の存在（４０倍）を表わす。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＣＩ：炎症細胞を表わす。ヘマトキシリン／エオシン技術による。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＰＰｙ／ＰＥＧ：ポリピロールポリエチレングリコール共重合体製の移植片、ＭＭ：改変したマクロファージを表わす。図６では、（Ａ）神経組織とのインプラント統合を示す画像（２．５倍）が観察でき；（Ｂ）遷移ゾーンの詳細（５倍）；（Ｃ）損傷ゾーン（２０倍）；（Ｄ）炎症細胞の存在（４０倍）を表わす。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＣＩ：炎症細胞。ヘマトキシリン／エオシン技術による。ＳＢ：白色物質、ＳＧ：灰色物質、ＺＬ：損傷ゾーン、ＰＰｙ／Ｉ：ヨウ素ドープポリピロール製の移植片、ＣＧＣＥ：異物巨細胞を表わす。
【００４０】
動物の全体的な健康状態の週ごとの観察結果を図７に示す。これらの画像から、皮膚感染症に罹っていないことが観察できる。同様に、診査分析より、経過観察中に呼吸疾患や腎臓疾患は観察されなかったと確認できる。最後に、本研究において、生存率１００％における有害作用やバイオ材料の拒絶反応は見られなかった。図中のパネルは：（Ａ）インプラントを施していない対照の動物；（Ｂ）ポリピロール／ポリエチレングリコール共重合体製のインプラントを施した動物及び（Ｃ）ポリピロール／ヨウ素製のインプラントを施した動物を示す。
【００４１】
結果が示すように、プラズマ合成した重合体は、ラットでの完全な切断により障害を受けた後の脊髄の、深刻な副作用がない、神経保護物質及び神経再生物質として有効である。
【００４２】
本発明を説明したが、損傷後の脊髄の神経保護及び再結合を促進するためのインプラントの製造へのプラズマ合成ピロール誘導重合体の使用は、新規なものと考えられる。また、ポリピロールとポリエチレンエングリコールの共重合体のプラズマ合成法も、考慮される。そのため、以下の特許請求の範囲の内容を財産として請求する。
【図１Ａ】
0005587177.tif 000003
【図１Ｂ】
0005587177.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005587177.tif 000009
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
0005587177.tif 000011
【図５】
0005587177.tif 000012
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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