(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ該細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない検査薬を同定する方法であって、
ａ．少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備え、
前記異種核酸によってコードされたＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントが、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有し、
前記方法はさらに、
ｂ．前記細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を測定する工程と、
ｃ．細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、
前記細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、
前記細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、
前記細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、合衆国法典第３５巻§１１９（ｅ）の元、米国仮出願第６０／９５９，０２３号（出願日２００７年７月１０日）の利益を主張するものであり、その内容全体を本出願に引用して援用する。
【０００２】
本出願は、国立衛生研究所によって付与された認可番号ＧＭ０７５２５６（ＮＩＨ／ＮＩＧＭＳ）、ＡＩ４０１２７（ＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ）及びＲ０１ＡＩ０６６１２８（ＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ）の元、政府支援を受けている。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、液体、血漿タンパク質、及び白血球の局所的蓄積に対する一般的な用語であり、細胞群又は有機体がＤＮＡ損傷、感染、又は局所免疫反応等の物理的損傷による圧迫を受けた時に生じる。これは、炎症反応としても知られている。炎症反応が生じている組織に広がる免疫細胞は、多くの場合、炎症細胞又は炎症性浸潤と称され、細胞又は有機体が圧迫に応じてそれら状態を改善するのに役立つ。炎症は、器官又は患部組織内の細胞死を招くことができる。炎症は、生体内における正常免疫反応又は防御システムの一環である。
【０００４】
免疫細胞の活性化、増殖、及び分化、並びに結果として生じる炎症反応は、生体内で高度に制御されている。炎症反応は、病原体及び病原体由来化合物等の異物へと暴露された時に誘発されるものであり、サイトカインによって、開始及び持続される（非特許文献１）。関与するサイトカインは、インターロイキン−１（Ｉｌ−１）、Ｉｌ−２、Ｉｌ−３、Ｉｌ−４、Ｉｌ−５、Ｉｌ−６、Ｉｌ−１０、Ｉｌ−１２、Ｉｌ−１３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＴＧＦ、リンホトキシン、及びヒスタミンを含む。炎症反応は、宿主由来物質によって誘発されるべきではなく、また異常サイトカイン産生によって持続されるべきでもない。しかしながら、炎症の脱制御が起こることがあり、炎症性の病気を引き起こす。炎症は、発赤、熱、圧痛／痛み、及び腫れを含む４つの公知の症状を引き起こし、これらは非常に多くの一般的な病気及び疾患を特徴付けるものである。慢性炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、及び１型糖尿病等は、５億人近い人々が罹っている。これら病気の多くは、我々の高齢化社会において、弱体化の要因であり、急速に一般的なものとなっている。
【０００５】
免疫細胞の刺激は、小胞体（ＥＲ：endoplasmic reticulum）ストアからのＣａ２＋の枯渇を引き起こす。これにより、ストア作動性Ｃａ２＋放出活性化Ｃａ２＋（ＣＲＡＣ：Ca2+ release-activated Ca2+）チャネルを経由した持続Ｃａ２＋流入を誘発し、これは、リンパ球活性化及び増殖のための必須信号である。最近示された証拠によると、ＣＲＡＣ電流の活性化は、ＳＴＩＭタンパク質によって開始される。ＳＴＩＭタンパク質は、ＥＲ内腔に配されるＥＦハンドを通ったＥＲのＣａ２＋レベルを感知し、ストア枯渇の際に原形質膜に密接に関連した点状に再度局所化する。ショウジョウバエのＯｒａｉ及びヒトのＯｒａｉ１（ＴＭＥＭ１４２Ａとも称される）は、ＳＴＩＭのストア作動性Ｃａ２＋流入の下流における必須成分である。ショウジョウバエの細胞においてＯｒａｉ及びＳｔｉｍが合わせて過剰に発現する、又は哺乳類の細胞においてＯｒａｉ１とＳｔｉｍ１が合わせて過剰に発現する場合、ＣＲＡＣ電流において著しい増加がもたらされる。
【０００６】
ヒト及びマウスのＳＴＩＭ１は、初めは、腫瘍及び骨髄基質における成長調節因子の候補として発見された。そして、その構造的に関連した脊椎動物ファミリーメンバー、ＳＴＩＭ２、及びショウジョウバエ相同体Ｄ−Ｓｔｉｍが、続いて同定された。ＳＴＩＭタンパク質は、普遍的発現１型１回膜貫通タンパク質であり、それらポリペプチド配列内に構造モチーフの固有の組み合わせを有する。細胞外領域は、非定型グリコシル化ＳＡＭドメイン近傍のＮ末端不対ＥＦ−ハンドＣａ（２＋）結合モチーフを有する。その一方、細胞質領域は、膜貫通型領域近傍のＥＲＭドメインと相同性を有する領域内にαヘリカルコイルドコイルドメインを含み、Ｃ末端の近くにリン酸化プロリンリッチドメインを含む。ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、及びＤ−Ｓｔｉｍは、コイルドコイル／ＥＲＭドメインへのそれら構造のＣ末端においてのみ、有意に相違する。ＳＴＩＭの構造ドメインは、Ｃａ（２＋）結合と同様に、ＳＴＩＭタンパク質とその他のタンパク質との間の相互作用を媒介する機能も有するとして予測されていた。そして、同型ＳＴＩＭ１−ＳＴＩＭ１と異型ＳＴＩＭ１−ＳＴＩＭ２の相互作用は、生化学的に示されていた。しかしながら、ＳＴＩＭ１とそのドメイン構造の細胞局在の機能的意義は、ＳＴＩＭ１が細胞内へのストア作動性カルシウム（ＳＯＣ：store-operated calcium）流入の重要な調節因子（キーレギュレーター）として同定された最近の飛躍的な研究後に明らかになったばかりである。現在では、ＳＴＩＭ１は、小胞体（ＥＲ）内腔におけるＣａ（２＋）枯渇のセンサーであるとともに、細胞膜におけるＯｒａｉ１含有ＳＯＣチャネルの活性化因子であることが明らかになっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Frontiers in BioSciences, 2: 12-26, Carol, A., et. al., 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
サイトカイン産生は、慢性炎症における炎症反応を維持するために極めて重要であり、また、ＳＯＣチャネルを介したＣａ２＋の流入は、活性化免疫細胞におけるサイトカイン産生を持続するのに必要である。このため、生体内の免疫細胞及びその他の細胞へのＣａ２＋の流入を制御及び調節する新規の方法を発見及び開発することにより、炎症、自己免疫、及びＣａ２＋ホメオスタシス関連疾患と疾病の治療法を提供することが可能となる。現在のところ、このような発見や開発に役立つツールの必要性が未だ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態では、ＳＴＩＭ遺伝子のホモ接合体破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスが示される。ホモ接合体マウスは、非機能的ＳＴＥＭタンパク質を示す。
【００１０】
本発明の実施形態では、ＳＴＩＭ遺伝子のヘテロ接合体破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスが示される。このマウスは、その他のトランスジェニックマウスと交配することにより、ＳＴＩＭ遺伝子のホモ接合体破壊を含むゲノムを有するマウスを作製することができる。ホモ接合体マウスは、非機能的ＳＴＩＭタンパク質を示す。
【００１１】
破壊されたＳＴＩＭ遺伝子は、ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２の両方であることができる。ＳＴＩＭ遺伝子破壊は、構成的（コンスティチューティブ）又は条件的（コンディショナル）であることができる。ここで、破壊は、正常成熟後、及びダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）段階中の胸腺細胞においてのみ発生するものである。したがって、本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞及び成熟Ｔリンパ球におけるＳＴＩＭ遺伝子のホモ接合体破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスを提供する。
【００１２】
本発明には、ＳＴＩＭ遺伝子（即ち、ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２の両方）のホモ接合体破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス由来の組織、単離細胞、及び細胞株が含まれる。あるいは、ＳＴＩＭ遺伝子（即ち、ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２の両方）のホモ接合体破壊を含む胸腺細胞ゲノムを有するトランスジェニックマウス由来の組織、単離細胞、及び細胞株が含まれる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、ＳＴＩＭ遺伝子（即ち、ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２の両方）のヘテロ接合体破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス由来の組織、単離細胞、及び細胞株を提供する。
【００１４】
一実施形態では、単離細胞は、Ｔリンパ球及びマウス胎児線維芽細胞である。不死化Ｔリンパ球及びマウス胎児線維芽細胞の細胞株、即ちＳＴＩＭ１−／−、ＳＴＩＭ２−／−、又はＳＴＩＭ１−／−とＳＴＩＭ２−／−の両方、が提供される。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２の細胞型特異的なコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。非ヒトトランスジェニック動物は、マウスである。Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２のコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子を有する細胞型は、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、神経細胞、又は胎児線維芽細胞である。Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２のコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子は、コンディショナルに欠失している。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２の細胞型特異的なコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞を提供する。ここで、細胞はＴ細胞、制御性Ｔ細胞、神経細胞、又は胎児線維芽細胞であることができる。Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２のコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子は、コンディショナルに欠失している。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない方法を提供する。この方法は、細胞を、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量の選択的Ｓｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備える。細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる、選択的Ｓｔｉｍ２インヒビターは、Ｓｔｉｍ１と比較してＳｔｉｍ２を選択的に抑制する。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法を提供する。この方法は、細胞を、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こすのに効果的な量の選択的Ｓｔｉｍ１インヒビターに接触させる工程を備える。細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。選択的Ｓｔｉｍ１インヒビターは、Ｓｔｉｍ２と比較してＳｔｉｍ１を選択的に抑制する。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法を提供する。この方法は、細胞を、Ｓｔｉｍ１インヒビター及びＳｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備える。これらインヒビターの量は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量である。細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。制御性Ｔ細胞は腫瘍を有する被験者に存在し、インヒビターの量は腫瘍に対する免疫反応の増加に有効である。Ｓｔｉｍ１インヒビターとＳｔｉｍ２インヒビターは、同じ化学構造を有する。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない検査薬を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備える。異種ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントは、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有する。本方法はさらに、（ｂ）細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を測定する工程と、（ｃ）細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備える。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、被験者内の腫瘍に対する免疫反応を増大させる検査薬を同定する方法を提供する。本方法は、（ａ）少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ１タンパク質又はその機能性フラグメント、及びＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備える。異種ＳＴＩＭ１タンパク質又はその機能性フラグメントは、ヒトＳＴＩＭ１タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有し、異種ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントは、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有する。そして、細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備える。本方法はさらに、（ｂ）検査薬を異種ＳＴＩＭ１タンパク質の単離形態に接触させ、検査薬の単離異種ＳＴＩＭ１タンパク質への結合性を測定する工程と、（ｃ）検査薬を異種ＳＴＩＭ２タンパク質の単離形態に接触させ、検査薬の単離異種ＳＴＩＭ２タンパク質への結合性を測定する工程とを備える。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、細胞内カルシウム流動を調節する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、ＳＴＩＭタンパク質が欠損している細胞の使用を含む。この薬剤は、ＳＴＩＭタンパク質に関与しない機構（即ち、非ＳＴＩＭ依存性経路又は機構）によって細胞内カルシウム流動を調節することができ、あるいは、ＳＴＩＭタンパク質に関与する（即ち、ＳＴＩＭ依存性経路に関与する）機構によって細胞内カルシウム流動を調節することもできる。使用されるＳｔｉｍ欠損細胞は、ＳＴＩＭ１−／−、ＳＴＩＭ２−／−、又はＳＴＩＭ１−／−ＳＴＩＭ２−／−両方であることができる。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、細胞内カルシウム流動を調節する薬剤の作用機序を評価する方法を提供する。本方法は、Ｓｔｉｍタンパク質が欠損している細胞を使用することを含む。薬剤は、ＳＴＩＭタンパク質に関与しない機構（即ち、非ＳＴＩＭ依存性経路又は機構）によって細胞内カルシウム流動を調節することができ、あるいは、ＳＴＩＭタンパク質に関与する（即ち、ＳＴＩＭ依存性経路に関与する）機構によって細胞内カルシウム流動を調節することもできる。使用されるＳｔｉｍ欠損細胞は、ＳＴＩＭ１−／−、ＳＴＩＭ２−／−、又はＳＴＩＭ１−／−ＳＴＩＭ２−／−両方であることができる。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、任意のその他のＳＴＩＭ相同体が存在しない時にＳＴＩＭタンパク質又は変異ＳＴＩＭタンパク質の細胞機能を調査するための方法を提供する。本方法は、Ｓｔｉｍ１とＳｔｉｍ２の両方が欠損した細胞を使用することを含む。
【００２５】
一実施形態において、本発明は、ＳＴＩＭインヒビター又はＳＴＩＭモジュレーターの効果及び／又は有効性を調査する方法を提供する。本方法は、ＳＴＩＭタンパク質が欠損した細胞を使用することを含む。ここで使用されるＳｔｉｍ欠損細胞は、ＳＴＩＭ１−／−、ＳＴＩＭ２−／−、又はＳＴＩＭ１−／−ＳＴＩＭ２−／−両方であることができる。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、ＳＴＩＭ以外の標的に対するインヒビターの作用に起因する副作用又は毒性に関して、ＳＴＩＭインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。本方法は、ＳＴＩＭ遺伝子（即ち、ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２の両方）のヘテロ接合体又はホモ接合体破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの使用、又は、ＳＴＩＭタンパク質が欠損した細胞の使用を含む。ここで使用されるＳｔｉｍ欠損細胞は、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方であることができる。また、ＳＴＩＭ遺伝子（即ち、ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２の両方）のホモ接合体破壊を含む胸腺細胞のゲノムを有するトランスジェニックマウスの使用も、構想されている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】同腹仔コントロール（Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ)（黒）、及びＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅ(グレー)のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入であって、示される如く０．２又は２ｍＭの細胞外Ｃａ２＋の存在下で、タプシガルギン（ＴＧ、１μＭ）に反応（左）、又はＣＤ３架橋結合に続いてイオノマイシン（iono、１μＭ）に反応（右）したものである。
【図１ｂ】細胞内サイトカイン染色によって測定されたＩＬ−２産生を示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＭＡとイオノマイシンで６時間刺激された。実線：コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ）であり、点線：Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅである。
【図１ｃ】野生型（ＷＴ、黒）及びＳｔｉｍ２―／―（グレー）マウス（どちらもＳｔｉｍ２＋／−ＣＭＶ−Ｃｒｅ−マウスの交雑により得たもの）からのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞において、１μＭのＴＧに反応（左）、又はＣＤ３架橋結合に続いて１μＭのイオノマイシンに反応（中、右）したストア作動性Ｃａ２＋流入を示す。
【図１ｄ】細胞内サイトカイン染色によって測定されたＩＬ−２産生を示す。これは、ＰＭＡとイオノマイシンによって６時間刺激されたナイーブ野生型（ＷＴ、実線）及びＳｔｉｍ２−/−（点線）ＣＤ４＋Ｔ細胞によるものである。
【図１ｅ】７日間インビトロで分化させたコントロール(Ｓｔｉｍ２＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ又はＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ)（黒）及びＳｔｉｍ２−／−(グレー)のＴＨＮ細胞の典型的な［Ｃａ２＋］ｉ反応であって、図示する如く、高濃度（１μＭ）もしくは低濃度（１０ｎＭ）のＴＧ、又は抗ＣＤ３続いてイオノマイシンに反応したものである。
【図１ｆ】７日間インビトロで分化させた後に６時間ＰＭＡとイオノマイシンで再刺激を加えた野生型（ＷＴ、黒）及びＳｔｉｍ２−／−(グレー)のＴＨＮ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅマウスからのＴ細胞は、初期実験の野生型マウスからのＴ細胞と比較されることにより、Ｃｒｅ発現がＣａ２＋流入及びサイトカイン発現に対する毒性又はその他の悪影響を有さないことを確認した。次に続く実験では、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ及びＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスが代わりにコントロールとして用いられた。
【図２ａ】左側は、２０ｍＭのＣａ２＋を含むリンゲル液において１μＭのＴＧで刺激を加えた野生型（黒）、Ｓｔｉｍ−／−（ダークグレー）、及びＳｔｉｍ２−／−（ライトグレー）ＭＥＦにおけるＣａ２＋流入を示す。右側は、Ｓｔｉｍ−／−ＭＥＦ内へのＭｙｃ標識ＳＴＩＭ１（黒）又はＳＴＩＭ２（ダークグレー）のレトロウイルス形質導入によるストア作動性Ｃａ２＋流入の再構築を示す。空ベクターはライトグレーである。ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを含む発現ベクターとＧＦＰ＋細胞のみが分析された。
【図２ｂ】(図２Ｃ-１及び２Ｃ-２)コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ）及び、空レトロウイルスベクター又はＭｙｃ標識ＳＴＩＭ１もしくはＳＴＩＭ２をコードするレトロウイルスベクターが形質導入されたＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４-ＣｒｅＴＨＮ細胞において、１μＭのＴＧを用いた処置に反応したＣａ２＋流入を示す。ＧＦＰ＋細胞のみが分析された。
【図２ｃ】表示のレトロウイルスベクター（右欄）が形質導入された表示の遺伝子型（ドットプロット上）の細胞におけるサイトカイン産生を示す典型的なドットプロット（左）及び平均データ（右）を示す。ＧＦＰ＋細胞のみが分析された。エラーバーは、標準偏差を示す。データは、３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅマウスが最初に用いられ、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ及びＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスの両方が用いられた。
【図３ａ】コントロール（ｎ＝８）（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ２＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）、又はＳＴＩＭ２欠損（ｎ＝７）（ＳＴＩＭ２−ＫＯ；Ｓｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４-Ｃｒｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞における平均ピーク、定常状態（刺激６０分後）の［Ｃａ２＋］ｉ、及び［Ｃａ２＋］Ｉの初速度を示す。これらは、ヘルパーＴ非分極条件下で５時間分化され、Ｆｕｒａ−ＰＥ３で標識付けされ、ＰＭＡとイオノマイシンで刺激されたものである（「方法」を参照）。エラーバーは標準誤差（s.e.m.）であり、Ｐ値は、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【図３ｂ】刺激後の表示時間点における、核ＮＦＡＴ１に関するＣＴＲＬ又はＳｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ細胞のパーセントを示す（平均±標準偏差）。少なくとも３００細胞／ウェルが各時間点において分析された。エラーバーは、標準偏差（ｓ.ｄ.）である。
【図３ｃ】刺激後の表示時間点における、核ＮＦＡＴ１に関するＣＴＲＬ又はＳｔｉｍ２＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅのパーセントを示す（平均±標準偏差）。少なくとも３００細胞／ウェルが各時間点において分析された。エラーバーは、標準偏差である。
【図３ｄ】ＣＴＲＬ又はＳｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ細胞におけるＩＬ−２及びＩＦＮ−γ発現を示す。データは、３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅマウスが最初に用いられ、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ及びＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスの両方が用いられた。
【図３ｅ】ＣＴＲＬ又はＳｔｉｍ２＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ細胞におけるＩＬ−２及びＩＦＮ−γ発現を示す。データは、３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅマウスが最初に用いられ、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ及びＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスの両方が用いられた。
【図４ａ】細胞外２０ｍＭ［Ｃａ２＋］ｏ及びＤＶＦ溶液において記録された電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示し、これは、表示マウス由来の分化ＣＤ４＋Ｔ細胞によるものである。ＴＧ（１μＭ）によって誘発されたＣａ２＋電流（左パネル）及び一価陽イオン電流（右パネル）を示す。
【図４ｂ】２０ｍＭＣａ２＋リンゲル液（黒のバー）を二価遊離（ＤＶＦ:divalent free）溶液（オープンバー）に置き換えることによって誘発された脱増強Ｎａ＋電流の単一記録を示す。電流は、−１００ｍＶへの過分極パルスを１秒ごとに印加する間、測定された。
【図４ｃ】表示条件下で記録されたピーク電流密度の要約を示す。エラーバーは、標準誤差を示し、ｎは、分析細胞数を示す。ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ、又はＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌであり、ＳＴＩＭ１−ＫＯ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４-Ｃｒｅであり、ＳＴＩＭ２−ＫＯ；Ｓｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅであり、ＤＫＯ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅマウスが最初に用いられ、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅとＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスの両方が用いられた。
【図５ａ】ストア作動性Ｃａ２＋流入を示す。左側において、同腹仔コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ、黒）及びＤＫＯ（Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４-Ｃｒｅ、グレー）マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、公称Ｃａ２＋遊離リンゲル液において、ＴＧで刺激され（上部）、又は抗ＣＤ３で刺激後に続いてストレプトアビジンで架橋結合され（ＳＡ；下部）、続いて２ｍＭのＣａ２＋遊離リンゲル液でかん流されることにより、Ｃａ２＋流入を誘導した。中側は、２ｍＭのＣａ２＋リンゲル液中のピーク［Ｃａ２＋］Ｉの定量化である。
【図５ｂ】コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）、又はＰＭＡとイオノマイシンで６時間刺激されたＤＫＯマウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２とＴＮＦ産生を示す。
【図５ｃ】コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４-Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）、又は抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８で刺激されなかった又は１６時間刺激されたＤＫＯマウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５とＣＤ６９の発現を示す。
【図５ｄ】ＣＦＳＥ標識によって評価されたコントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）又はＤＫＯマウスからのナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を示す。細胞は、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８で７２時間刺激された。オープンヒストグラムは刺激細胞であり、シェードヒストグラムは非刺激細胞である。
【図５ｅ】表示数の細胞分裂（図５ｄ内のデータより得たもの）が生じた細胞のパーセンテージを示す。データは２回の独立した実験を代表するものである。コントロールとしては、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅが最初に用いられ、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅとＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスの両方が用いられた。
【図６ａ】５−６週齢（左）又は３ヶ月齢（右）のコントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）及びＤＫＯマウスからの胸腺細胞と脾細胞が、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＦｏｘｐ３染色された。ゲート上の数字は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。
【図６ｂ】５−６週齢（左）のコントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）又はＤＫＯマウスの胸腺と脾臓における全細胞数（左）とＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞数（右）を示す（ｎ＝３；平均±標準偏差）。
【図６ｃ】コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）又はＤＫＯマウスから単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞において、ＣＤ３架橋結合（左）又は１μＭのＴＧを用いた処置（右）によって誘導されたストア作動性Ｃａ２＋流入を示す。測定は、リンゲル液において２ｍＭのＣａ２＋で実施された。データは、３回（抗ＣＤ３）及び２回（ＴＧ）の独立した実験を代表するものであり、これら実験において、夫々、１１０−１７０の細胞が分析された。Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅマウスがコントロールとして最初に用いられることにより、Ｃｒｅ発現が毒性又はその他の副作用を引き起こさないことが確かめられた。続いて、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスが用いられることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、及び繁殖環境が制御された。
【図７ａ】ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２欠損によるＴｒｅｇ細胞発生の障害を示す。亜致死的に放射線を浴びたＲａｇ１−／−マウスは、Ｔｈｙ−１．２＋コントロール同腹仔（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）単独から、Ｔｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス（３×１０６細胞）単独から、又はＴｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス（３×１０６細胞）とコンジェニックＢ６Ｔｈｙ１．１＋野生型マウス（１．５×１０６細胞）両方からのＴ細胞枯渇骨髄細胞を用いて再構築された。再構築の１０−１２週後、胸腺からの細胞は、抗ＣＤ４、抗Ｔｈｙ１．１、及び抗Ｔｈｙ１．２で、抗ＣＤ２５と抗Ｆｏｘｐ３とともに染色された。象限にある数は、その象限内の細胞のパーセンテージを示す。データは、２回の独立した実験からの３匹の混合キメラマウスから得られた結果を代表するものである。事前の実験においてＣｒｅ毒性が観察されなかったため、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスがコントロールとして用いられることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、及び繁殖環境が制御された。
【図７ｂ】ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２欠損によるＴｒｅｇ細胞発生の障害を示す。亜致死的に放射線を浴びたＲａｇ１−／−マウスは、Ｔｈｙ−１．２＋コントロール同腹仔（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）単独から、Ｔｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス（３×１０６細胞）単独から、又はＴｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス（３×１０６細胞）とコンジェニックＢ６Ｔｈｙ１．１＋野生型マウス（１．５×１０６細胞）両方からのＴ細胞枯渇骨髄細胞を用いて再構築された。再構築の１０−１２週後、リンパ節からの細胞は、抗ＣＤ４、抗Ｔｈｙ１．１、及び抗Ｔｈｙ１．２で、抗ＣＤ２５と抗Ｆｏｘｐ３とともに染色された。象限にある数は、その象限内の細胞のパーセンテージを示す。データは、２回の独立した実験からの３匹の混合キメラマウスから得られた結果を代表するものである。事前の実験においてＣｒｅ毒性が観察されなかったため、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスがコントロールとして用いられることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、及び繁殖環境が制御された。
【図８ａ】受容マウスにおける脾臓及びリンパ節細胞の数を示す。野生型Ｔｒｅｇ細胞の養子移植は、ＤＫＯマウスのリンパ球増殖表現型を抑制する。野生型マウスからの３×１０５のＣＤ４＋ＣＤ２５＋又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔｈｙ１．１＋Ｔ細胞は、２週齢のＴｈｙ１．２＋ＤＫＯマウスに移入され、その後８週間で分析された。エラーバーは、標準偏差を示し、Ｐ値は対応スチューデントのｔ検定を用いて算出した。データは、２回の独立した実験からの３匹のマウスから得られた結果を代表するものである。
【図８ｂ】脾臓及びリンパ節からの細胞は、表示抗体で染色された。ゲート上の数字は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。データは、２回の独立した実験からの３匹のマウスから得られた結果を代表するものである。
【図８ｃ】ドナー細胞移植を示す。細胞は、Ｔｈｙ１．１、Ｔｈｙ１．２、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＦｏｘｐ３に対する抗体で染色された。ＣＤ２５−又はＣＤ２５＋Ｔ細胞を受容するマウスにおける内因性（Ｔｈｙ１．２＋、ダークグレー）及び移入（Ｔｈｙ１．１＋、ライトグレー）Ｔｒｅｇ細胞の数がプロットされた。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図８ｄ】ＤＫＯのＴｒｅｇ細胞の抑制機能を示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）又はＤＫＯマウスから精製され、ＣＦＳＥ標識されたレスポンダーＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と１：１の割合で、マイトマイシンＣ処理されたＴ細胞枯渇脾細胞と０．３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３の存在下、７２時間共培養された。データは、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。Ｃｒｅ毒性が事前の実験において観察されなかったため、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスがコントロールとして用いられることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、繁殖環境が調整された。
【図９ａ】Ｓｔｉｍ１遺伝子のコンディショナルな欠失に対するターゲティング戦略を示す概略図である。Ｓｔｉｍ１遺伝子のＥＦハンドモチーフをコードするエクソン２の両側を、ｌｏｘＰ組換え部位（三角）が挟んでいる。ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）遺伝子の両側を、Ｆｒｔ組換え部位（六角形）が挟んでいる。これらエクソンの欠失によって、各事例では、次のエクソンで未成熟終止コドンを生じさせるフレームシフトがもたらされることが予測される。
【図９ｂ】Ｓｔｉｍ２遺伝子のコンディショナルな欠失に対するターゲティング戦略を示す概略図である。Ｓｔｉｍ２遺伝子のＥＦハンドへの配列Ｃ末端をコードするエクソン３の両側を、ｌｏｘＰ組換え部位（三角）が挟んでいる。ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）遺伝子の両側を、Ｆｒｔ組換え部位（六角形）が挟んでいる。これらエクソンの欠失によって、各事例では、次のエクソンで未成熟終止コドンを生じさせるフレームシフトがもたらされることが予測される。
【図９ｃ】ＰＣＲによる遺伝子型決定の典型的な結果を示す。プライマーは矢印で示されている。
【図９ｄ】表示された細胞型におけるＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２発現を示す。ＳＴＩＭ１検出のために、２５μｇのタンパク質がＳＤＳポリアクリルアミドゲルの各レーンにロードされた。ＳＴＩＭ２検出のために、５００万細胞由来のタンパク質（約８０μｇ）が各レーンにロードされた。ＳＴＩＭ２に対応するバンドは、矢じりで示されている。ＢＭＭＣは骨髄由来マスト細胞であり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞である。
【図１０ａ】Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅとコントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅ又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ）のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４とＴＣＲβの発現を示す。データは、２回の独立した実験を代表するものである。
【図１０ｂ】抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８で刺激後１６時間経過した後のＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−ＣｒｅとコントロールＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５とＣＤ６９活性マーカーの発現を示す。
【図１０ｃ】ＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞は、正常ストア枯渇を示す。左側において、コントロール（ＣＴＲＬ）（黒）とＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅ（ＳＴＩＭ１−ＫＯ、グレー）同腹仔からのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ビオチン化抗ＣＤ３、ストレプトアビジン（ＳＡ）、及びタプシガルギン（ＴＧ）を用いて、公称Ｃａ２＋流離リンゲル液、続いて２ｍＭのＣａ２＋を含むリンゲル液内で、連続してかん流されることにより、示される如く、Ｃａ２＋流入を誘導した。中側では、左側パネルのｙ軸が拡大されることにより、ストア枯渇が視覚化されている。右側において、ピーク［Ｃａ２＋］Ｉの定量化は、０と２ｍＭのＣａ２＋を含むリンゲル液中で、夫々ストア枯渇（左）及び流入（右）が示された。データは、２回（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ）と３回（Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅ）の独立した実験を代表するものである。
【図１０ｄ】インビトロで７日間分化され、抗ＣＤ３で６時間再刺激を与えた表示マウスからのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生を示す。データは、３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅマウスからのＴ細胞が初期実験の野生型マウスからのＴ細胞と比較され、これによりＣｒｅ発現がＣａ２＋流入及びサイトカイン発現に対して毒性又はその他の悪影響を有さないことを確認した。次に続く実験では、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅとＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスが、コントロールと置き換えて使用された。データは、３つの独立した実験を代表するものである。
【図１０ｅ】インビトロで７日間分化され、抗ＣＤ２８で６時間再刺激を与えた表示マウスからのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生を示す。データは、３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅマウスからのＴ細胞が初期実験の野生型マウスからのＴ細胞と比較され、これによりＣｒｅ発現がＣａ２＋流入及びサイトカイン発現に対して毒性又はその他の悪影響を有さないことを確認した。次に続く実験では、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅとＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスが、コントロールと置き換えて使用された。データは、３つの独立した実験を代表するものである。
【図１１ａ】活性化Ｔ細胞におけるＳＴＩＭ２タンパク質レベルの上方調節を示す。表示マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８を用いて、１、２、又は３日間刺激された、あるいは、ＴＨＮ、ＴＨ１、又はＴＨ２条件下で７日間分化した。２５μｇの全細胞溶解液が各レーンにロードされた。矢じりは、特定のバンドを示す。
【図１１ｂ】表示マウスからの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを含むレトロウイルスベクター（右欄に記載される如く、空である、又はＭｙｃ標識ＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２をコードする）で形質導入された。形質導入の効率性は、ＧＦＰ発現で判断したところ（データ図示せず）、全てのレトロウイルス（〜４０％）で類似していた。細胞は、溶解され、免疫ブロッティングされた。ここで、ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌであった。データは、３回の独立した実験を代表するものである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅマウスが最初に用いられ、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅとＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスの両方が用いられた。
【図１２ａ】細胞外２０ｍＭ［Ｃａ２＋］ｏと、その後に２５μＭＬａ３＋を追加した時の野生型マウスＴ細胞内の電気生理学未加工電流を示す。Ｌａ３＋存在下の電流は、漏れに起因したものである。
【図１２ｂ】２０μＭのＣａ２＋を用いて〜５０％でブロックされた野生型マウスＴ細胞内のＮａ＋ＣＲＡＣ電流を示す。この２０μＭＣａ２＋は、ジャーカットＴ細胞におけるＣａ２＋阻害のＩＣ５０に類似する。
【図１２ｃ】野生型マウスＴ細胞におけるＩＣＲＡＣであって、高速不活性化、続いて−１００ｍＶまでの過分極工程を示した。
【図１２ｄ】表示されたマウス由来のＴ細胞における２−アミノエトキシジフェニルホウ酸（２−ＡＰＢ）によるＩＣＲＡＣの増強と阻害を示す。タプシガルギンで前処理された細胞は、２−ＡＰＢ（４０μＭ、グレーバー）に暴露された。左側は、−１００ｍＶへの１００ｍｓ工程終点における電流を示す。右側は、次に続く２−ＡＰＢ（矢印）への暴露の前及びその直後のＩ−Ｖ曲線の例を示す。２−ＡＰＢを適用した後に続く電流振幅の増加は、コントロールでは２６±６％（ｎ＝４）であり、ＳＴＩＭ２欠損Ｔ細胞では３０±７％（ｎ＝５）であった。ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌである。コントロールとして、Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅマウスが最初に使用され、その後Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−ＣｒｅとＳｔｉｍｆｌ／ｆｌマウスの両方が使用された。
【図１３ａ】ＤＫＯのＴ細胞における２０ｍＭのＣａ２＋リンゲル液（黒バー）、又は二価遊離ＤＶＦ溶液（オープンバー）におけるＩＣＲＡＣを示す。電流は、−１００ｍＶへの過分極パルス（１秒ごとに印加）中に測定された。
【図１３ｂ】ＤＫＯマウス由来の分化ＣＤ４＋Ｔ細胞からの細胞外２０ｍＭ［Ｃａ２＋］ｏ及びＤＶＦ溶液において記録された電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。ストア枯渇はタプシガルギン（１μＭ）によって誘導された。左側は、Ｃａ２＋電流であり、右側は、一価陽イオン電流である。
【図１４ａ】Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅマウス由来の末梢リンパ細胞の表現型の特徴を示す。４ヶ月齢マウスの代表的な脾臓（上）とリンパ節（下）である。
【図１４ｂ】表示されたマウスからの脾細胞が、ＣＤ４とＣＤ８発現に関してフローサイトメトリーで分析された。ＣＤ４＋細胞は、ゲート付けられ、さらにＣＤ４４とＣＤ６２Ｌ発現に関して分析された。
【図１４ｃ】ゲート付けされたＢ２２０＋Ｂ細胞のうち、胚中心Ｂ細胞（ＣＤ９５＋ＣＤ３８ｌｏｗ）と分化したＣＤ１９＋ＩｇＥ＋Ｂ細胞を示す。
【図１４ｄ】右側では、脾細胞が、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１２５（ＩＬ−５Ｒ）染色された。ＣＤ１１ｂ＋ＩＬ−５Ｒ＋ポジティブ細胞は、好酸球及び好塩基球に対応する。左側では、大型の活性化又は粒状化した細胞が、ＦＣＳ／ＳＳＣプロットにゲート付けされた。ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅ、又はＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌであり、ＳＴＩＭ１−ＫＯ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅであり、ＳＴＩＭ２−ＫＯ；Ｓｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅであり、ＤＫＯ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅである。データは、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。Ｓｔｉｍ＋／＋ＣＤ４−Ｃｒｅマウスは、最初にコントロールとして用いられることにより、Ｃｒｅ発現が毒性又はその他の副作用を引き起こさないことが確認された。続いて、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスが用いられることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、及び繁殖環境が制御された。
【図１５ａ】コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ）とＤＫＯマウス由来の末梢Ｔ細胞の遺伝子型を示す。左側は、ＰＣＲによって得られた遺伝子型の典型的な結果を示す。右側は、ＰＣＲに用いられるＣＤ４＋Ｔ細胞の純度（〜９５％）を示す。２５−は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−の従来Ｔ細胞であり、２５＋は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の制御性Ｔ細胞である。データは、２回の独立した実験を代表するものである。
【図１５ｂ】ＤＫＯマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞における低下したストア作動性Ｃａ２＋流入を示す。コントロール（ＣＴＲＬ；黒）とＤＫＯ（グレー）マウスからのＴｒｅｇ細胞は、抗ＣＤ３（ストレプトアビジン（ＳＡ）で架橋結合される）（上）、又はタプシガルギン（ＴＧ、下）のいずれかを用いて刺激される。この刺激は、公称Ｃａ２＋遊離リンゲル液中、続いて２ｍＭのＣａ２＋リンゲル液でかん流することによってなされ、これによりＣａ２＋流入を誘導する。データは、３回（抗ＣＤ３）と２回（ＴＧ）の独立した実験を代表するものであり、各実験で１１０乃至１７０の細胞が分析された。Ｃｒｅ毒性が事前の実験で観察されなかったため、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスがコントロールとして用いられることによって、その他の因子、例えば性別、年齢、及び繁殖環境が制御された。
【図１６ａ】野生型Ｔｒｅｇ細胞によるリンパ球増殖表現型の抑制を示す。亜致死的に放射線を受けたＲａｇ１−／−受容マウスからの脾臓（上）とリンパ節（下）から得られた脾臓（上）とリンパ節（下）の代表的な写真であって、このマウスは、Ｔｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス単独（左）から、又はＴｈｙ１．２＋ＤＫＯとコンジェニックＢ６Ｔｈｙ１．１＋野生型マウスの両方（右）からのＴ細胞枯渇骨髄細胞で再構築されたものである。データは、２回の独立した実験からの３匹の混合キメラマウスから得られた結果を代表するものである。
【図１６ｂ】野生型Ｔｒｅｇ細胞をＤＫＯマウスに養子移植した後８週間後、ＰＢＳ、ＣＤ４＋ＣＤ２５−、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が注入されたコントロールマウスとＤＫＯマウスからの脾臓とリンパ節の典型的な写真を示す。Ｃｒｅ毒性は事前の実験で観察されなかったため、我々は、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスをコントロールとして用いることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、及び繁殖環境を調節した。
【図１７】Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅｒｅｇ細胞の低下した抑制活性を示す。コントロール（ＣＴＲＬ；Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌ；左側）又はＤＫＯ（右側）マウスから精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＦＳＥ標識レスポンダーＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と表示割合で７２時間、マイトマイシンＣ処理Ｔ細胞枯渇脾細胞と０．３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３の存在下で共培養された。エラーバーは、標準偏差を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均である。Ｃｒｅ毒性が事前の実験において観察されなかったため、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌマウスがコントロールとして用いられることにより、その他の因子、例えば性別、年齢、繁殖環境が調整された。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
＜定義＞
本明細書で使用される際、用語「ＳＴＩＭタンパク質」は、ＳＴＩＭ１タンパク質、ＳＴＩＭ２タンパク質、又はＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２タンパク質の両方を意味する。ＳＴＩＭタンパク質の例は、全て哺乳類のＳＴＩＭタンパク質を含み、例えば、ヒトＳＴＩＭ１タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質受入番号Q13586、NP-003147、AAC51627）、ヒトＳＴＩＭ２（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質受入番号Q9P246、NP-065911、AAK82337）、マウスＳＴＩＭ１（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質受入番号NP-033313）、及びマウスＳＴＩＭ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質受入番号P83093、NP-001074572、AAK82339、CAN36430）が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用される際、用語「ＳＴＩＭ遺伝子」は、ＳＴＩＭ１タンパク質又はＳＴＩＭ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。ＳＴＩＭ遺伝子の例は、全ての哺乳類のＳＴＩＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、ヒトＳＴＩＭ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号NM_003156、gi2264345、gi2264346）、ヒトＳＴＩＭ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号NM_020860、AF328905）、マウスＳＴＩＭ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号NM_009287）、及びマウスＳＴＩＭ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号NM_001081103、AM712359、AF328907）が挙げられる。
【００３０】
ノックアウトにおいて、ターゲット遺伝子発現は、検出不可能である又は有意ではないことが好ましい。ＳＴＩＭ遺伝子のノックアウトとは、各ＳＴＩＭタンパク質機能の大幅な減少のために、発現が検出不可能である又は有意でないレベルにおいてのみ存在することを示す。このことは、多様な機構によって実現可能であり、例えば１以上の停止コドンの挿入やＤＮＡフラグメントの挿入等によるコード配列の破壊の導入、コード配列の欠失、コード配列に関する停止コドンの置換等を含む。ある事例では、外因性トランスジーン配列が最終的にゲノムから欠失され、天然配列の純変化のみを残すこともある。異なるアプローチ法が用いられることによって、「ノックアウト」が実現される。これは、ゲノム遺伝子の全て又は一部の染色体欠失を含むこともでき、非コード領域（特にプロモーター領域、３’調節配列、エンハンサー）の欠失又はＳＴＩＭ遺伝子の発現を活性化する遺伝子の欠失を含む。また機能的なノックアウトは、天然遺伝子の発現を阻害するアンチセンスコンストラクトの導入によって実現可能である（例えば、Li and Cohen (1996) Cell 85:319-329を参照）。「ノックアウト」はまた、コンディショナルなノックアウトを含み、例えば、ターゲット遺伝子変化の促進物質に動物を暴露させた時のターゲット遺伝子の変化、ターゲット遺伝子部位における組換え促進酵素の導入（例えばＣｒｅ−ｌｏｘシステムにおけるＣｒｅ）、又は生後のターゲット遺伝子変化を指示するその他の方法を含む。
【００３１】
本明細書で使用される際、用語「ＳＴＩＭ１遺伝子の欠損」又は「ＳＴＩＭ１欠損」とは、ＳＴＩＭ１遺伝子の破壊のために機能的ＳＴＩＭ１タンパク質が産生されないことを意味する。本明細書で使用される際、用語「ＳＴＩＭ２遺伝子の欠損」とは、ＳＴＩＭ２遺伝子の破壊のために機能的ＳＴＩＭ２タンパク質が産生されないことを意味する。本明細書で使用される際、用語「ＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２遺伝子の欠損」又は「ＳＴＩＭタンパク質の欠損」とは、ＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２遺伝子両方の破壊のために機能的ＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２タンパク質が産生されないことを意味する。
【００３２】
用語「遺伝子」とは、核酸配列を意味し、適切な調節配列に操作可能にリンクされた時にインビトロ又はインビボでＲＮＡに転写される（ＤＮＡ）。遺伝子は、コード領域の前後領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）もしくは「リーダー」配列、及び３’ＵＴＲもしくは「トレーラー」配列）と同様に、個別のコード領域（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでもよく含まなくてもよい。
【００３３】
本明細書で使用される際、用語「機能的ＳＴＩＭタンパク質」とは、小胞体中のＣａ２＋ストアの枯渇を感知可能なＳＴＩＭタンパク質を意味し、これは、原形質膜におけるＣａ２＋活性化放出カルシウムチャネルを開く引き金であり、外部から細胞内へとＣａ２＋の流入を可能にする。
【００３４】
本発明のマウスについて、用語「組織」は任意の組織を含み、例えば、脾臓、骨髄、リンパ節、膵島等の内分泌組織、脳下垂体、膵外分泌部等の外分泌組織、胃腺、小腸腺、ブルンネル腺、唾液腺、乳腺等、及びそれらの腺房が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
細胞又は動物が２つの同一又は実質的に類似した遺伝子対立遺伝子を有する時、「ホモ接合体」であると言われる。対照的に、細胞又は動物が２つの実質的に異なる対立遺伝子を有する時、その遺伝子は「ヘテロ接合体」であると言われる。
【００３６】
本明細書で使用される際、用語「トランスジーン」は、核酸配列を意味し、その核酸配列が導入されるトランスジェニック動物又は細胞に対して、部分的又は全体的に異種である（即ち、外来性である）核酸配列、あるいは、その核酸配列が導入されるトランスジェニック動物又は細胞の内在性遺伝子に対して相同であるが、その核酸配列が挿入された細胞のゲノムを変更するような方法で動物のゲノム内に挿入されるよう設計されている又は挿入されている（例えば、トランスジーンが天然遺伝子とは異なる位置において導入される、又はその挿入がノックアウトを引き起こすものである）核酸配列である。トランスジーンは、１以上の転写調節配列及び任意の他の核酸（例えばイントロン等）に操作可能にリンク可能であるが、これは選択核酸の最適発現に必要となる可能性がある。本発明の例示トランスジーンは、例えば、ＳＴＩＭエクソン２とＣｒｅリコンビナーゼ酵素とを融合したネオマイシン耐性遺伝子をコードする。その他の例示トランスジーンは、ＳＴＩＭ遺伝子のゲノム配列を用いた相同的組換えによってＳＴＩＭ遺伝子を破壊することを対象にする（図９参照）。
【００３７】
本明細書で使用される際、ＳＴＩＭタンパク質機能に関連する「調節」は、Ｃａ２＋結合、Ｃａ２＋感知、及び／又は、Ｏｒａｉ１活性化における任意の変化又は調整を意味する。Ｏｒａｉ１とは、細胞内への／細胞内からの／細胞内でのカルシウムの動き又は流動の変化を最終的に引き起こすものである。調節は、例えば、増加、上方制御、誘発、刺激、阻害緩和、減少、阻害、下方制御、及び抑制を含む。
【００３８】
本明細書で使用される際、細胞内カルシウムに関連する「調節」は、細胞内カルシウムにおける任意の変化を意味し、細胞質内及び／又は細胞内カルシウム貯蓄オルガネラ（例えば小胞体）におけるカルシウム濃度の変化、及び細胞内への／細胞内からの／細胞内でのカルシウムの動き又は流動の振幅又は速度の変動を含むが、これらに限定されない。調節は、例えば、増加、上方制御、誘発、刺激、増強、阻害緩和、減少、阻害、下方制御、及び抑制を含む。
【００３９】
本明細書で使用される際、「薬剤」は、細胞内カルシウムを調節可能な任意物質を意味する。薬剤の例は、有機小分子、有機大分子、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び任意の二重鎖又は一本鎖型の核酸）、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖タンパク質、無機イオン（例えば、Ｇｄ３＋、鉛、及びランタン）を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用される際、「を備える、を含む（comprising）」は、定義された成分が存在することに加えて、その他の成分も存在可能であることを意味する。「を備える、を含む（comprising）」の使用は、制限を意味するよりむしろ、含有を示すものである。
【００４１】
本明細書で使用される際、用語「異種核酸」は、細胞内で自然に生じない核酸配列を意味する。例えば、Ｓｔｉｍ遺伝子がバクテリア又はウイルスのゲノムに挿入されたときに、バクテリアとウイルスのゲノムは本来Ｓｔｉｍ遺伝子を有さないため、Ｓｔｉｍ遺伝子は受容バクテリア又はウイルスに対して異種である。
【００４２】
本明細書で使用される際、用語「異種タンパク質」は、細胞内で自然に発現しないタンパク質を意味する。このような「異種タンパク質」は、細胞内に「トランスジーン」として組み込まれた「異種核酸」から発現する。
【００４３】
本明細書で使用される際、用語「機能的フラグメント」は、本明細書に記載されているポリペプチドのアミノ酸残基配列よりも短いアミノ酸残基配列を有する任意の対象ポリペプチドを意味する。ＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２タンパク質の「機能的フラグメント」は、短くなっている又は切断されているが、それにも関わらずＣａ２＋流動、相乗作用変化、及び／又はＣＲＡＣ電流の活性を検知する能力を有している。「機能的フラグメント」のポリペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端切断、及び／又は内部欠失をも有することが可能である。
【００４４】
本明細書で使用される際、用語「被験者」は、哺乳動物を意味し、好ましくはヒトである。
【００４５】
本明細書で使用される際、「同一性」は、配列のアラインメントによって配列のマッチングを最大限にした（即ち、ギャップと挿入を考慮）時に、２以上の配列の対応位置における同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、既知の方法によって容易に算出可能であり、（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ea., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and - 14 Genome Projects, Smith, D. W., ea., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 及び Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 及び Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)）に記載される方法を含むが、これらに限定されない。同一性を決定する方法は、検査される配列間で最も広くマッチングするように設計されている。さらに、同一性を決定する方法は、ＢＬＡＳＴＰ等の公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。
【００４６】
２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一な」又はパーセント「同一性」とは、以下に記載する初期設定パラメータで、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定される、又は、手動アラインメント及び目視検査によって測定された時に、同一である、又は同一なアミノ酸残基又はヌクレオチドを特定の割合有する（即ち、比較ウィンドウ又は指定領域において最大の一致が得られるように比較及びアラインメントされたときに、特定領域（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列又は本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列等）において、約６０％同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い同一性である）２以上の配列又は部分配列を意味する。そして、このような配列は、「実質的に同一である」といわれる。この用語は、試験配列の相補体（compliment）を意味する又は適用可能である。この用語はまた、欠失及び／又は付加、同様に置換を有する配列を含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも長さが約２５アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって、より好ましくは長さが５０−１００アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって、存在する。
【００４７】
配列の比較において、典型的には、１つの配列は参照配列として作用し、これと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを用いる時、試験及び参照配列がコンピュータ内に入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。好ましくは、初期設定プログラムパラメータが使用可能であり、別のパラメータもまた指定可能である。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００４８】
本明細書で使用される際、「比較ウィンドウ」は、２０−６００、通常は約５０−約２００、より一般的には約５０−約２００、より一般的には約１００−約１５０からなる群から選択される連続位置数の任意の領域を意味し、その配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ連続位置数の参照配列と比較されることが可能である。比較のための配列アラインメントの方法は、技術的に公知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48: 443, 1970 の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988 の類似法の調査によって、これらアルゴリズムのコンピューター化実装 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)によって、又は、手動アラインメントと目視検査 (例えば Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照)によって実施可能である。
【００４９】
アラインメントを検索するプログラムは、技術的に公知であり、例えば、ＢＬＡＳＴ等である。例えば、標的種がヒトである場合、このようなアミノ酸配列又は遺伝子配列（生殖細胞系列、又は再配置された抗体配列）のソースは、任意の好適な参照データベースで発見可能である。データベースとしては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＣＢＩタンパク質データバンク(http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、ＶＢＡＳＥ、ヒト抗体遺伝子のデータベース(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)、及び免疫グロブリンのKabatデータベース (http://www.immuno.bme.nwu.edu)又はこれらの翻訳産物が挙げられる。アラインメントがヌクレオチド配列に基づいてなされた場合、その後、選択された遺伝子は分析される必要がある。これにより、サブセットのどの遺伝子が、由来する種の抗体に対して最も近いアミノ酸相同性を有しているかが決定される。データベース内のその他の配列と比較してより高い相同性に達するアミノ酸配列又は遺伝子配列が、本明細書に記載の手順に基づいて使用及び操作可能であることが予測される。さらに、より低い相同性を有するアミノ酸配列又は遺伝子は、これらアミノ酸配列又は遺伝子が、本明細書に記載の手順に基づいて操作及び選択された時に既定の標的抗原に対する特異性を発揮する産物をコードする場合には、使用可能である。特定の実施形態では、相同性の許容範囲は、約５０％を超える。標的種は、ヒト以外でも可能であることは理解されるべきである。
【００５０】
パーセント配列同一性と配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977、及び Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990に、それぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書に記載のパラメータとともに用いられることによって、本発明の核酸とタンパク質のパーセント配列同一性が決定される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて好適に利用可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.pov/)。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワード（word）とアラインメントした時に、ある正の値の閾値スコアＴに一致する又は満たすＷ長の短いワードをクエリー配列内に同定することによって、ハイスコアリング配列ペア（ＨＳＰｓ；high scoring sequence pairs）を同定することに関与する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）を意味する。これらの最初の隣接ワードヒット（wordhit）は、これらを含むより長いＨＳＰｓを検索するための検査を開始する際に種となるものである。ワードヒットは、累計的なアラインメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両側に伸ばされる。累計スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致残基ペアへのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを用いて、累計スコアを計算する。ワードヒットの両側への伸長は、累計アラインメントスコアが得られている最大値からＸ分だけ低下した時；累計スコアが、一つ以上の負のスコア化残基アライメントの蓄積によってゼロ以下になった時；又は、どちらかの配列端部に到達した時、に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列対象）は、初期設定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定値としてワード長３、及び期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989 参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ=５、Ｎ=−４、および両鎖の比較を使用する。
【００５１】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、変動可能であることは理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としたものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明の範囲は、請求項によってのみ定義される。
【００５２】
実施例の操作以外、又は記載以外にも、本明細書に記載される成分又は反応条件の量を表現する全ての数値は、全例において用語「約」に変更可能であると理解されるべきである。パーセンテージに関連して用語「約」が使用される場合には、平均±１％であることができる。
【００５３】
単数の用語である「a」「an」及び「the」は、複数の指示対象を含む（文脈が、明らかにそうではないと示している場合を除く）。類似して、単語「or（又は）」は、「and（及び）」を含むことを意図したものである（文脈が、明らかにそうではないと示している場合を除く）。さらに理解されるべきことは、核酸又はポリペプチドに与えられる、全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量（molecular weight 又はmolecular mass）値は、概算であり、説明を目的としたものである。本明細書に記載されたものと類似する又は同一である方法及び材料は、本開示の実施又は検査に用いられることができ、好適な方法及び材料は、以下に記載される。用語「comprises（を備える、を含む）」は、「include（含む）」を意味する。省略形「e.g.（例えば）」はラテン語のexempli gratia由来であり、本明細書では、非制限的な例を示すのに用いられる。したがって、省略形「e.g.（例えば）」は、「for example（例えば）」と同義である。
【００５４】
特定された全ての特許及びその他の刊行物は、説明及び開示を目的とし、引用することにより本願に明確に援用する。例えば、そのような刊行物に記載された手法が本発明に関連して使用されることが可能である。これら刊行物は、本出願の出願日前の開示を目的として単に提供されている。この観点のいずれにおいても、発明者らが、先願発明の価値又はその他の理由によって、このような開示に先行する権利がないことを承認したものとして解釈されてはならない。これら書類の日付に関する全提示、又は内容に関する説明は、出願人が利用可能な情報に基づくものであって、これら書類の日付又は内容の正確さに関する何らかの承認からなるものではない。
【００５５】
説明が他になされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じである。免疫学、トランスジェニックマウス、及び分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy 18版, Merck Research Laboratories出版, 2006 (ISBN 0-911910-18-2)」;Robert S. Porter et al. (eds.)The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及び Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8); The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149)， Crowther J. R.著 (2000); Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays，Jeffrey Travis著, 1979, Scientific Newsletters; Immunology，Werner Luttmann著, Elsevier出版, 2006，において、見ることができる。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, Jones & Bartlett Publishing出版, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及び Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において、見ることができる。
【００５６】
他に記載されない限り、本発明は、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); 又は Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987), Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.),  Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) 及び Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney,出版社: Wiley-Liss; 第5版 (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes編集, Academic Press, 第1版, 1998)に記載されたように標準手順を用いて実施され、これらを引用することによりその全内容を本願に援用することとする。
【００５７】
本発明は、機能的ＳＴＩＭ１、ＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２タンパク質が欠如したノックアウトトランスジェニックマウスを提供する。本明細書に記載されるＳＴＩＭ欠損ノックアウト哺乳動物は、組織、細胞、及び細胞株の源を提供し、これらは、（１）Ｔリンパ球等の細胞内におけるＣａ２＋流動及びＣａ２＋シグナル伝達に影響を与える能力に関する薬剤の同定及び／又は評価をする方法（ここで、Ｃａ２＋は、Ｔ細胞増殖、活性化、及び持続免疫反応において重要な機能を果たす）；（２）細胞内カルシウム流動を調節する薬剤の作用機序を評価する方法；（３）任意のその他のＳＴＩＭ相同体がない場合に、ＳＴＩＭタンパク質又は変異ＳＴＩＭタンパク質の細胞機能を検査する方法；（４）ＳＴＩＭインヒビター又はＳＴＩＭモジュレーターの効果及び／又は有効性を検査する方法；（５）ＳＴＩＭ以外の標的におけるインヒビターの作用に起因する副作用又は毒性に関してＳＴＩＭインヒビターをスクリーニングする方法；（６）ＳＴＩＭタンパク質活性を阻害する薬剤（例えば、治療薬）を同定する方法；（７）ＳＴＩＭタンパク質活性を模倣する薬剤を同定する方法；及び（８）Ｃａ２＋流動に関連する又はＣａ２＋流動によって制御される病気又は疾患を治療する方法を実施するのに有用である。
【００５８】
本発明に含まれるＳＴＩＭ欠損ノックアウトトランスジェニックマウス（Ｓｔｉｍ１−／−；Ｓｔｉｍ２−／−；Ｓｔｉｍ１−／−，Ｓｔｉｍ２−／−）は、カルシウムホメオスタシスにおけるＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２タンパク質の生理的役割を直接的に同定するためのツールとしての役割を果たすことができる。また、コンディショナルなＳＴＩＭ欠損ノックアウトマウスは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、多発性嚢胞腎、常染色体優性低カルシウム血症、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、新生児重症副甲状腺機能亢進症等のカルシウムホメオスタシス関連疾患の病因の研究に有用なモデル動物を提供する。
【００５９】
したがって、本発明に含まれるのは、ＳＴＩＭ１遺伝子がホモ接合体欠損であることにより機能的ＳＴＩＭ１が産生されないトランスジェニックマウス；ＳＴＩＭ２遺伝子がホモ接合体欠損であることにより機能的ＳＴＩＭ２が産生されないトランスジェニックマウス；及び、ＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２遺伝子両方がホモ接合体欠損であることにより機能的ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２タンパク質が産生されないトランスジェニックマウスである。ＳＴＩＭタンパク質の発現は、典型的にはウエスタンブロット分析によって分析され、機能的ＳＴＩＭタンパク質は、ＥＲ（小胞体）Ｃａ２＋枯渇の刺激の際に、Ｆｕｒａ−２／ＡＭ又はＦｕｒａ−２アセトキシメチルエステルを用いた蛍光Ｃａ２＋測定によって決定される。これらの方法は、技術的に公知である。本発明は、さらにＳＴＩＭ１遺伝子、ＳＴＩＭ２遺伝子、又はＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２遺伝子の両方が、ヘテロ接合体欠損であるマウスを提供する。このマウスは、ＳＴＩＭ遺伝子欠損に関してホモ接合体であるマウスの繁殖手段として用いられることができ、これは、それらの異種交配及び夫々のＳＴＩＭ遺伝子産物の存在／非存在を調べることを通じて実現される。
【００６０】
一実施形態では、トランスジェニックマウスは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞においてのみ、ＳＴＩＭ遺伝子のコンディショナルな欠失を有する。ＳＴＩＭ欠損マウスは高確率で周産期致死性を示し、ＳＴＩＭ２遺伝子欠損マウスは誕生直後に高い死亡率を示したために、コンディショナルノックアウト戦略が使用された。器官及び組織に特異的なノックアウトは、関心組織又は器官（例えば、胸腺又は骨髄、又は筋細胞等）においてのみＣＲＥレコンビナーゼ遺伝子を発現するプロモーターを使用して作り出された。これは、ノックアウト遺伝子が要求される組織又は器官においてのみ活性であるプロモーターを用いて実現される。Ｃｄ４エンハンス／プロモーター／サイレンサー（ＣＤ４−Ｃｒｅ）の制御下におけるＣｒｅトランスジーンを用いたＳＴＩＭ遺伝子のコンディショナルな破壊によって、胸腺細胞のダブルポジティブ（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）選択段階においてのみ破壊が発生することが可能となる。したがって、正常Ｔ細胞の成熟が生じることが可能となる。このコンディショナルなノックアウトマウスは、非機能的ＳＴＩＭタンパク質を含む正常成熟Ｔ細胞を提供する。
【００６１】
本発明は、また、ＳＴＩＭ遺伝子の欠損に関するホモ又はヘテロ接合体である、あるいは、ＳＴＩＭ遺伝子の欠損に関するコンディショナルなホモ又はヘテロ接合体であるマウス組織を提供する。このような組織は、例えば、脾臓、リンパ節であり、ＳＴＩＭ欠損胎児の胚組織を含み、インビトロ細胞培養研究及び細胞株作成のためにＳＴＩＭ欠損細胞を採取するのに用いられることが可能である。不死化細胞株は、単離細胞にＳＶ４０ラージＴ抗原をトランスフェクトすることによって作製されることが可能である。組織から単離された細胞から細胞株を作製するその他の方法は、米国特許第４，９５０，５９８号、第６，１０３，５２３号、第６，４５８，５９３号、及び国際公開公報第ＷＯ２００２／０７２７６８号に記載されており、その全体を本出願に引用して援用する。
【００６２】
ＳＴＩＭタンパク質の機能は、細胞内のＣａ２＋流動の変化を測定することによって決定可能である。細胞内Ｃａ２＋流動はカルシウム結合色素を用いて検出され、幾つか例を挙げると、Ｆｌｕｏ３、Ｉｎｄｏ−１、及びＦｕｒａ等である。これらの色素は、Ｃａ２＋と結合すると蛍光を発する。これにより、周囲のＣａ２＋量のセンサーとしての機能を果たす。蛍光変化は時間の経過とともに監視される、又は、細胞は技術的に公知であるフローサイトメトリーで分析されることが可能である。カルシウム測定のその他の方法は、A Cushing, et. al, 1999, J Neurosci Methods 90: 33-6; S Vernino, et. al., 1994, Journal of Neuroscience, 14:5514-5524; 及び Lajos Gergely, et. al., 1997, Clin. Diag. Lab. Immunol. 4: 70-74, 及び米国特許第２００７／００３１８１４号に記載されており、これらを本出願に引用して援用する。細胞内カルシウムを調節する薬剤及び分子をスクリーニング又は同定する方法の特定の実施形態において、本方法は、ストア作動性カルシウム流入が生じることが可能な条件下で実施される。このような条件は、本明細書に記載され、また技術的に公知である。検査薬は、ＳＴＩＭ欠損の細胞と接触し、該細胞内の細胞内カルシウムの任意の調節についてアッセイが実施可能である。
【００６３】
例えば、原形質膜を通過するカルシウムのストア作動性輸送を検出する又は監視するための一方法において、細胞は、細胞内カルシウムストアのカルシウムレベルを減少させるように処理された後、それに応答したイオン（特に陽イオン、例えばカルシウム）流入の痕跡が分析されることが可能である。細胞内ストアのカルシウムレベルを減少させる技術とイオン（特に陽イオン、例えばカルシウム）流入の痕跡に関して細胞を分析する技術は、技術的に公知である。
【００６４】
その他の方法において、拡散性信号が、ストア作動性カルシウム流入を検出及び監視する方法においてストア作動性カルシウム流入を活性化させるのに用いられることができる。このような信号の１つは、カルシウム流入因子（ＣＩＦ；calcium influx factor）と称されており（例えば、Randriamam-pita and Tsien (1993) Nature 364:809-814; Parekh et al. (1993) Nature 364:814-818; Csutora et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:121-126)を参照）、小さい（〜＜５００Ｄ）リン酸塩含有陰イオンであることができる。タプシガルギン処理されたジャーカット（Jurkat）細胞からのＣＩＦ活性は、カルシウムポンプ欠損酵母からの類似活性と同様に、アフリカツメガエル卵母細胞（Xenopus oocyte）及びジャーカット細胞におけるカルシウム流入を活性化可能である。抽出物は、ジャーカット細胞の全細胞パッチクランプ中におけるパッチピペットに含まれる時、ＩＣＲＡＣに類似する内向き電流を活性化する。
【００６５】
他の方法では、細胞分離された原形質膜パッチ、又は外膜のみを用いた（outside-out membrane）小胞を通過する電流の電気生理学的分析は、ストア作動性チャネル電流（例えば、ＩＣＲＡＣ等）を検出又は監視するのに用いられることができる。
【００６６】
特定された全ての特許及びその他の刊行物は、説明及び開示を目的とし、引用することにより本出願に明確に援用する。例えば、そのような刊行物に記載された手法は、本発明に関連して使用されることが可能である。これら刊行物は、本出願の出願日前の開示を目的として単に提供されたものである。この観点のいずれにおいても、発明者らが、先願発明の価値又はその他の理由によって、このような開示に先行する権利がないことを承認したものとして解釈されてはならない。これら書類の日付に関する全提示、又は内容に関する説明は、出願人が利用可能な情報に基づくものであって、これら書類の日付又は内容の正確さに関する何らかの承認からなるものではない。
【００６７】
＜間質相互作用分子（ＳＴＩＭ；Stromal Interacting Molecule）タンパク質＞
ＳＴＩＭタンパク質は、細胞質ドメインから細胞外部分を分離する単一膜貫通領域を備えるＩ型膜貫通型リンタンパク質である。脊椎動物は２種のＳＴＩＭタンパク質であるＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２を有する一方で、無脊椎動物は、１つの遺伝型のみ、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ではＤ−ＳＴＩＭを有する。脊椎動物と無脊椎動物のＳＴＩＭタンパク質を比較すると、保存されたゲノム構築が示され、脊椎動物で発見される２つのＳＴＩＭ遺伝子は、１つの先祖遺伝子から発生したと推定されることが示されている(Williams et al. (2001) Biochem. J. 357: 673-685)。
【００６８】
各ＳＴＩＭタンパク質は、いずれか片側がタンパク質のＮ末端及びＣ末端部に隣接するタンパク質の開始１／３から１／２の領域に位置する膜貫通領域を含む。ＳＴＩＭのＮ末端部は細胞質に存在する細胞外領域を形成し、その一方、Ｃａ２＋結合ＥＦハンドを含むＣ末端部はＥＲ（小胞体）内腔に存在する。ＥＲのＣａ２＋ストアの枯渇は、Ｃａ２＋結合ＥＦハンドによって感知され、その後細胞質領域に導入される。このことは、最終的にはＣＲＡＣチャネルのＯｒａｉ１の活性化、チャネルの開口、及び外側からのＣａ２＋の流入を引き起こす。
【００６９】
ＳＴＩＭタンパク質は、翻訳後修飾を受ける。ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２は、Ｎ結合型グリコシル化、及び大部分がセリン残基に生じるリン酸化反応によって修飾される。ＳＴＩＭ２のリン酸化の異なるレベルは、タンパク質の２つの分子量のアイソフォーム（約１０５と１１５ｋＤａ）を説明することができる。対照的に、ＳＴＩＭ１の分子量は、約９０ｋＤａであり、Ｎ結合グリコシル化がツニカマイシンによって阻害されると、約８４ｋＤａまで減少する。Ｄ−ＳＴＩＭ（約６５ｋＤａタンパク質）は、ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２と同様に、移動度シフト実験からも明らかな如く、Ｎ結合グリコシル化によって修飾される(Williams et al. (2001) Biochem. J. 357: 673-685)。
【００７０】
＜ノックアウトマウスの作製＞
ノックアウトマウスの作製、並びに、ＥＳ細胞の調製と遺伝子ターゲティング、エレクトロコーポレーション、及びクローン選択等の手順の作成についての詳細な説明は、以下の書籍: Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F. and Lacy, E. (1994) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory;  Porter et al., Eur. J. Biochem., vol. 218, pp. 273-281 (1993); Bradley, A. (1991) "Modifying the mammalian genome by gene targeting" Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829; Capecchi, M., "The New Mouse Genetics: Altering the Genome by Gene Targeting," Trends in Genetics, vol. 5, No. 3, 70-76 (1989); 米国特許番号:第6100445号, 第6060642号, 第6365796号, 第6747187号, 及び第7166764号、において入手でき、これらを引用することにより本出願に明確に援用する。
【００７１】
＜本発明の使用＞
本発明の実施形態は、ＳＴＩＭ１タンパク質が欠損した細胞、ＳＴＩＭ２タンパク質が欠損した細胞、又はＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２タンパク質両方が欠損した細胞である。Ｃｄ４エンハンス／プロモーター／サイレンサー（ＣＤ４−Ｃｒｅ）の制御下でＣｒｅトランスジーンを使用することにより、胸腺細胞のダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）選択段階においてのみＳＴＩＭ遺伝子の破壊が発生可能となる。したがって、正常Ｔ細胞の成熟が生じることが可能となる。これは、Ｓｔｉｍ１及び／Ｓｔｉｍ２の細胞型特異的なコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子の一例である。Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方のＴリンパ球を有する生存マウスは、このコンディショナルノックアウト戦略を用いて得ることができる。Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方のＴリンパ球は、脾臓又はリンパ節から、本明細書に記載の方法によって分離され、分化及び／又は活性化された後、インビトロ研究に使用するために培養されることが可能である。
【００７２】
その他の実施形態では、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方の非コンディショナルなノックアウトマウスの胚が使用されることにより、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方の細胞が提供され、インビトロ細胞培養研究に用いられる。ノックアウトマウス胚の発生段階の中期から後期（Ｅ１３−Ｅ１９）は、多様な組織タイプ（例えば、筋肉、心臓、脾臓、肝臓等）に関する詳細分析が可能であり、組織は浸軟され、酵素は消化（例えばトリプシン又はコラゲナーゼ）され、粉砕され、そして単一細胞が微細メッシュを通って濾過されることにより単離される。これらの単離初代細胞は、その後、技術的に公知である細胞型特異的表面マーカーに基づく特異的細胞型に関して選択される。初代細胞を単離する一般的な方法は、www.tissuedissociation.com/techniques.htmlに見つけることが可能である。例えば、マウス胎児線維芽細胞の単離は、Hertzog PJ. 2001, Methods Mol Biol. 158:205-15; Linda C. Samuelson and Joseph M. Metzger in CSH Protocols; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4482に記載されており、これらを本出願に引用することにより援用する。単離細胞は、少なくとも９５％純粋であるはずであり、即ち細胞の９５％が、選択された細胞型であるはずである。例えば、脾臓又はリンパ節から精製されたＣＤ４＋細胞の単離サンプルは、少なくとも９５％のＣＤ４＋細胞を有するはずである。
【００７３】
一実施形態では、単離細胞は、例えば、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方であるマウス胎児線維芽細胞又はＣＤ４＋細胞であり、不死化されることによって、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方である細胞株を作り出すことができ、インビボ細胞研究において使用される。細胞を不死化する方法は、本明細書に記載される。
【００７４】
Ｓｔｉｍ２−／−である細胞株及びＣＤ４＋細胞は、Ｓｔｉｍ１インヒビター又はＳｔｉｍ１モジュレーターの効果及び／又は有効性を研究するために使用されることができる。同様に、Ｓｔｉｍ１−／−である細胞株及びＣＤ４＋細胞は、Ｓｔｉｍ２インヒビター又はＳｔｉｍ２モジュレーターの効果及び／又は有効性を研究するために使用されることができる。Ｓｔｉｍ１とＳｔｉｍ２の両方が、異なるレベルにおいてではあるがＳＯＣ  ＣＲＡＣチャネルを介したＣａ２＋流入の一因となるため、一方のＳＴＩＭタンパク質の欠失により、その他のＳＴＩＭタンパク質を阻害又は調節する薬剤の実験及び評価が可能となる。例えば、化合物Ｘが細胞におけるＣａ２＋流入を阻害するとして公知である場合には、Ｓｔｉｍ２−／−又はＳｔｉｍ１−／−細胞を用いて化合物Ｘを試験することにより、この化合物ＸがＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２タンパク質の阻害を介してＣａ２＋流入を阻害するかどうかが評価できる。あるいは、化合物ＹがＳＴＩＭ１を阻害するとして公知である場合には、Ｓｔｉｍ１−／−の細胞は、化合物ＹもまたＳＴＩＭ２タンパク質を阻害するかどうかを評価するのに用いられることが可能である。本明細書で使用されている如く、「阻害する（inhibit）」は、ＳＴＩＭタンパク質のＣａ２＋検出、Ｃａ２＋結合、Ｏｒａｉ１活性化能、Ｃａ２＋流入促進活性、及び／又は細胞内のＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を、妨害し、停止させ、減少させ、減らし、遅らせることを意味する。このような細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、又は胎児線維芽細胞であることができる。インヒビター非存在下のＣａ２＋流入と比較して、インヒビター存在下のＣａ２＋流入量は少なくとも５％減少するはずである。本方法は、ＳＴＩＭインヒビターをＳＴＩＭ欠損細胞に接触させる工程と、その細胞のＣａ２＋流入を評価する工程と、処理細胞内にＣａ２＋流入減少が観察された場合にＳＴＩＭインヒビターが有用であると決定する工程とを含む。
【００７５】
Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方である細胞株とＣ４＋細胞は、細胞内Ｃａ２＋含有量を調節する薬剤を研究するのに用いることができる。薬剤は、ＳＴＩＭタンパク質を介して、故にＳＴＩＭ依存経路、又は特定のその他の機構又は経路を介して、細胞内Ｃａ２＋含有量を調節することができる。Ｓｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方である細胞株とＣ４＋細胞は、薬剤が、ＳＴＩＭ依存経路又は特定の他の経路に作用することによってＣａ２＋を調節するか否かを決定するのに用いられる。本方法は、薬剤を、Ｓｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−細胞に接触させる工程と、その細胞のＣａ２＋流入を評価する工程と、処理及び非処理Ｓｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−細胞で観察されるＣａ２＋流入において有意な変動がない時に、薬剤が、ＳＴＩＭタンパク質に対する影響を介して細胞内Ｃａ２＋を調節していることを決定する工程とを備える。
【００７６】
Ｓｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方である細胞株とＣ４＋細胞は、個別ＳＴＩＭタンパク質又は変異ＳＴＩＭタンパク質の細胞機能を研究するのに用いられることができ、例えば、変異ＳＴＩＭは、Ｃａ２＋結合、Ｃａ２＋検出、又はＣＲＡＣチャネルの活性化に欠損を有する場合がある。ＳＴＩＭ遺伝子の発現ベクターと変異体の構築は、技術的に公知である。標識又は標識変異ＳＴＩＭタンパク質である組換え野生型ＳＴＩＭタンパク質をコードする遺伝子は、検査されるＳＴＩＭタンパク質に応じて、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方である細胞内に導入されることができる。ＳＴＩＭタンパク質の個別領域の機能は、ＳＴＩＭヌルバックグラウンド（即ち、両方のＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−細胞）において検査され、Ｃａ２＋流動及び／又はＯｒａｉ１との相互作用が分析された。ＳＴＩＭタンパク質の標識化は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｍｙｃ又はＨＡによって実施され、これは、ＳＴＩＭタンパク質の位置付けと検出に有用であり、実験中のタンパク質機能分析に役立つものである。
【００７７】
細胞内のＣａ２＋媒介性サイトカイン発現は、持続Ｃａ２＋流入に依存する。持続Ｃａ２＋流入は、ストア作動性Ｃａ２＋放出活性化Ｃａ２＋（ＣＲＡＣ）チャネルを通過し、これはリンパ球活性化と増殖に関する必須信号である。ＣＲＡＣ電流の活性化は、ＳＴＩＭタンパク質によって開始される。したがって、Ｓｔｉｍ２特異的であってＳｔｉｍ１特異的ではない阻害は、細胞内へのストア作動性Ｃａ２＋流入を大幅に変動させない。この一方で、Ｓｔｉｍ１特異的であってＳｔｉｍ２特異的ではない阻害は、細胞内へのストア作動性Ｃａ２＋流入を大幅に変動させる。
【００７８】
本明細書に提示される一実施形態は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない方法であって、細胞を、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量の選択的Ｓｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備える方法である。一実施形態において、細胞はリンパ球である。その他の実施形態において、細胞はＴ細胞である。その他の実施形態において、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞である。その他の実施形態において、選択的Ｓｔｉｍ２インヒビターは、細胞内においてＳｔｉｍ１と比較してＳｔｉｍ２を選択的に抑制し、この細胞とは、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。一実施形態では、細胞サイトカインに発現するＣａ２＋媒介性サイトカインは、細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入に大幅な減少がない場合、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。この際、細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、ストア作動性Ｃａ２＋流入における大幅な減少がないということは、コントロール（インヒビター非存在下）と比較して、インヒビター存在下では、ストア作動性Ｃａ２＋流入の減少が２％以下であることを意味する。
【００７９】
本明細書に提示される一実施形態は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法であって、細胞を、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こすのに効果的な量の選択的Ｓｔｉｍ１インヒビターに接触させる工程を備える。この細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。一実施形態において、選択的Ｓｔｉｍ１インヒビターは、細胞内においてＳｔｉｍ２と比較してＳｔｉｍ１を選択的に抑制し、この細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができ、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こすことを目的とする。一実施形態では、細胞に発現するＣａ２＋媒介性サイトカインは、細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少がある場合、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。この際、細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞である。
【００８０】
本明細書で提示される一実施形態は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法であって、細胞を、Ｓｔｉｍ１インヒビター及びＳｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備える。これらインヒビターの量は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量である。この細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。一実施形態では、Ｓｔｉｍ１インヒビターとＳｔｉｍ２インヒビターは、同じ化学構造を有する。一実施形態では、細胞に発現するＣａ２＋媒介性サイトカインは、細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少がある場合、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。この際、細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞である。
【００８１】
本明細書で提示される一実施形態は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法であって、細胞を、Ｓｔｉｍ１インヒビター及びＳｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備える。これらインヒビターの量は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量である。この細胞は、腫瘍を有する被験者に存在する制御性Ｔ細胞であり、インヒビターの量は、腫瘍に対する免疫反応の増加に有効である。
【００８２】
ストア作動性Ｃａ２＋流入は、本明細書に記載されるＣａ２＋流入を測定及び監視する方法、及び技術的に公知であるその他の方法によって決定されることが可能である。その他の方法とは、例えば、米国特許公報第２００７／００３１８１４号に記載されており、その全体を本出願に引用して援用する。
【００８３】
ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマ等のＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を決定する方法は、本明細書に記載される特定の抗体を用いた免疫染色法及びＦＡＣ選別法、そしてＥＬＩＳＡ法、及び定量的リアルタイムＰＣＲ法を含むがこれに限定されない。
【００８４】
本明細書に提示される一実施形態は、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現
を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない検査薬を同定する方法であって、（ａ）少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備え、異種ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントは、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有する。本方法はさらに、（ｂ）細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を測定する工程と、（ｃ）細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備える。本明細書に記載される検査薬を同定する方法で使用されるこの細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。一実施形態では、細胞内において発現するＣａ２＋媒介性サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択される。この際、細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞である。
【００８５】
細胞膜を介するイオン流動電流又は膜電位を測定する方法は、当業者にとって公知であり、そして本明細書にも記載されている。
【００８６】
本明細書で記載されるその他の実施形態は、被験者内の腫瘍に対する免疫反応を増大させる検査薬を同定する方法であって、（ａ）少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ１タンパク質又はその機能性フラグメント、及びＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備える。異種ＳＴＩＭ１タンパク質又はその機能性フラグメントは、ヒトＳＴＩＭ１タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有し、異種ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントは、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有する。そして、細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備える。この方法は、さらに、（ｂ）検査薬を異種ＳＴＩＭ１タンパク質の単離形態に接触させ、検査薬の単離異種ＳＴＩＭ１タンパク質への結合性を測定する工程と、（ｃ）検査薬を異種ＳＴＩＭ２タンパク質の単離形態に接触させ、検査薬の単離異種ＳＴＩＭ２タンパク質への結合性を測定する工程とを備える。本明細書に記載される腫瘍に対する免疫反応を増大させる検査薬を同定する方法に用いられる細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、又は制御性Ｔ細胞であることができる。
【００８７】
本明細書に使用される際、用語「組換え細胞」は、自然に発生するゲノムにトランスジーンが組み込まれている細胞を意味する。また、「組換え細胞」は、本明細書に記載されるＳｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２の細胞型特異的なコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞も意味する。このような「組換え細胞」は、リンパ球、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、胎児線維芽細胞、又はその不死化細胞株であることができる。
【００８８】
ヒトＳＴＩＭタンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有する異種ＳＴＩＭタンパク質又はその機能性フラグメントを発現する組換え細胞と、細胞ベースのアッセイに好適な細胞型（即ち、細胞内ストア及び／又は発現Ｃａ２＋媒介性サイトカインからのカルシウムイオンがあると、放出に影響を及ぼすことができるシグナル伝達及びメッセンジャーシステムの要素を含む細胞）と、そして、細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備える方法とは、米国特許公報第２００７／００３１８１４号に記載される及び／又はこれに基づき実施可能であり、その全体を本出願に引用して援用する。
【００８９】
一実施形態において、本発明は、ＳＴＩＭタンパク質に関与しない細胞内カルシウム流動を調節する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、Ｓｔｉｍタンパク質が欠損している細胞を使用することを含む。本方法は、Ｓｔｉｍ欠損細胞を薬剤と接触させる工程と、Ｓｔｉｍ欠損細胞内におけるＣａ２＋流入に対する薬剤の影響を評価する工程と、薬剤が、細胞内Ｃａ２＋に影響を及ぼす場合に細胞内Ｃａ２＋を調節する薬剤として同定する工程とを備える。細胞内Ｃａ２＋への影響は、細胞内Ｃａ２＋含有量又は流動における任意の変動であることができる。使用されるＳｔｉｍ欠損細胞は、Ｓｔｉｍ１−／−、Ｓｔｉｍ２−／−、又はＳｔｉｍ１−／−Ｓｔｉｍ２−／−両方であることができる。このようにして同定された薬剤は、カルシウムホメオスタシス関連疾患の治療の開発に有用となりうる。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、ＳＴＩＭ依存性経路を介して細胞内カルシウム流動を調節する薬剤の作用機序を評価する方法を提供する。本方法は、Ｓｔｉｍタンパク質が欠損している細胞の使用を含む。使用されるＳｔｉｍ欠損細胞は、ＳＴＩＭ１−／−、ＳＴＩＭ２−／−、又はＳＴＩＭ１−／−ＳＴＩＭ２−／−の両方であることができる。この方法は、Ｓｔｉｍ欠損細胞を薬剤と接触させる工程と、Ｓｔｉｍ欠損細胞内のＣａ２＋流入における薬剤の影響を評価する工程と、非Ｓｔｉｍ欠損細胞におけるＣａ２＋流入に対する薬剤の影響と比較する工程と、及び薬剤がＳｔｉｍ欠損細胞における細胞内Ｃａ２＋流入に対する影響において少なくとも５％の減少を有する場合には、その薬剤を、Ｓｔｉｍ依存性経路を介して細胞内Ｃａ２＋を調節する薬剤として決定する工程を備える。例えば、Ｓｔｉｍ１欠損細胞が薬剤Ｚを評価するのに用いられた場合、薬剤Ｚは、通常のＳｔｉｍ１レベルを発現する細胞と比較してＣａ２＋流入の影響がＳｔｉｍ１欠損細胞において３０％減少している際、Ｓｔｉｍ１依存性経路を介してＣａ２＋を調節する薬剤として同定される。同様に、Ｓｔｉｍ２欠損細胞が薬剤Ｐを評価するのに用いられた場合、薬剤Ｐは、通常のＳｔｉｍ２レベルを発現する細胞と比較してＣａ２＋流入の影響がＳｔｉｍ２欠損細胞において３０％減少している際、Ｓｔｉｍ２依存性経路を介してＣａ２＋を調節する薬剤として同定される。
【００９１】
一実施形態において、トランスジェニック動物及びトランスジェニック動物由来の細胞は、ＳＴＩＭ自体以外の標的（例えば、その他のＳＴＩＭ様タンパク質等）に対するインヒビターの作用に起因する副作用又は毒性に関して、ＳＴＩＭインヒビターをスクリーニングするのにも使用可能である。例えば、ＳＴＩＭインヒビターは、ＳＴＩＭ１、又はＳＴＩＭ２、又はＳＴＩＭ１／ＳＴＩＭ２とホモ接合体であるコンディショナルなノックアウトマウスに投与され、得られる影響が監視されることにより、インヒビターの副作用又は毒性が評価される。動物は、標的組織／細胞における各ＳＴＩＭインヒビターの正常標的がないために、インヒビターをＳＴＩＭ１−／−、ＳＴＩＭ２−／−、又はＳＴＩＭ１−／−とＳＴＩＭ２−／−マウスに投与した時に観察される影響は、その他の標的におけるＳＴＩＭインヒビターの副作用、又はその他の組織及び細胞におけるＳＴＩＭタンパク質機能を抑制する有害作用に起因する可能性がある。同様に、ＳＴＩＭタンパク質欠損細胞は、その他の細胞機能におけるＳＴＩＭインヒビターの副作用又は毒性を検査するのに用いられることができる。したがって、本発明のトランスジェニック動物、組織、細胞、及び細胞株は、これら副作用を、ＳＴＩＭ活性に対するインヒビターの直接的な影響から識別するのに有用である。
【００９２】
一実施形態では、本発明は、特異的なＳＴＩＭタンパク質活性を抑制する薬剤（例えば治療薬）の同定方法を提供する。本方法は、ＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２タンパク質欠損細胞の使用を含む。Ｓｔｉｍ１−／−細胞は、ＳＴＩＭ２を特異的に阻害する薬剤を、故にＳＴＩＭ２依存性経路を介して細胞内Ｃａ２＋流動を調節する薬剤を、スクリーニングする及び同定するのに有用である。同様に、Ｓｔｉｍ２−／−細胞は、ＳＴＩＭ１を特異的に阻害する薬剤を、故にＳＴＩＭ１依存性経路を介して細胞内Ｃａ２＋流動を調節する薬剤を、スクリーニングする及び同定するのに有用である。本発明は、Ｓｔｉｍ欠損細胞を薬剤に接触させる工程と、Ｓｔｉｍ欠損細胞内のＣａ２＋流入に対する薬剤の影響を評価する工程と、非Ｓｔｉｍ欠損細胞内のＣａ２＋流入に対する薬剤の影響と比較する工程と、薬剤が、Ｓｔｉｍ欠損細胞における細胞内Ｃａ２＋に対する影響において少なくとも５％の減少を有する場合には、その薬剤を、各ＳＴＩＭを阻害する薬剤として決定する工程を備える。
【００９３】
その他の実施形態では、本発明は、ＳＴＩＭタンパク質活性を模倣する薬剤を同定する方法を提供する。本方法は、ＳＴＩＭタンパク質欠損細胞の使用を含む。Ｓｔｉｍ１−／−細胞は、ＳＴＩＭ１を特異的に模倣する薬剤をスクリーニング及び同定するのに有用である。Ｓｔｉｍ２−／−細胞は、ＳＴＩＭ２を特異的に模倣する薬剤をスクリーニング及び同定するのに有用である。本方法は、Ｓｔｉｍ欠損細胞を薬剤に接触させる工程と、Ｓｔｉｍ欠損細胞内のＣａ２＋流入に対する薬剤の影響を評価する工程と、コントロール（非処理Ｓｔｉｍ欠損細胞）におけるＣａ２＋流入に対する薬剤の影響と比較する工程と、薬剤が、コントロールのものよりもＳｔｉｍ欠損細胞における細胞内Ｃａ２＋に少なくとも５％の増加を引き起こす場合、その薬剤がＳＴＩＭ活性を模倣するとして決定する工程を備える。
【００９４】
検査薬又はインヒビターは、生体分子を含むがこれに限定されず、生体分子は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び任意の二重鎖又は一本鎖型の核酸及び誘導体、並びにその構造類似体を含む）、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、炭水化物、脂質、リポタンパク質、及び糖タンパク質を含むがこれらに限定されない。このような生体分子は、実質的に精製されることができ、あるいは、細胞抽出物又は上清等の混合物中に存在することができる。検査薬は、さらに合成又は天然化合物を含み、例えば、単純又は複雑な有機分子、金属含有化合物、及び無機イオン等である。さらに含まれるのは、選択的に化学修飾（例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等）を直接的又はランダムに受けることが可能である薬理化合物であり、これにより構造類似体が生成される。
【００９５】
本方法に好適に使用される検査薬は、選択的に化合物ライブラリに含まれることができる。各種多様な有機化合物及び生体分子をランダム又は直接的に合成することによって化合物ライブラリを生成する方法は、技術的に公知であり、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む。細菌、菌、植物及び動物の抽出物形態での天然化合物の生成方法は、技術的に公知である。さらに、合成的生成又は天然化合物、及び化合物ライブラリは、従来の化学、物理学、及び生化学手段によって容易に修飾されることにより、コンビナトリアルライブラリを作成することができる。化合物ライブラリは、商業的供給源からも利用可能である。
【００９６】
本明細書に提示された方法を用いて同定された検査薬は、悪性腫瘍の治療に関連して用いられることも可能である。悪性腫瘍とは、リンパ網内系由来の腫瘍、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、及び直腸癌を含むがこれらに限定されない。ストア作動性カルシウム流入は、癌細胞内の細胞増殖において重要な役割を有することができる(Weiss et al. (2001) International Journal of Cancer 92 (6):877-882)。Ｔ制御性細胞は、腫瘍に対する免疫反応を制限することができる。本明細書に記載される実験は、Ｔ制御性細胞が他のＴ細胞よりもＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２の同時消失（欠失）に対して感受性が高いことを示している。本明細書に記載の方法に基づき同定される検査薬は、Ｔ細胞の量の減少により癌に対する免疫反応を増大させることによって、癌治療に有用であることができる。本明細書で用いられる際、用語「腫瘍」は、組織の異常増殖に起因する組織成長の塊を意味する。
【００９７】
本発明は、下記の番号付の項のいずれかによって定義されることが可能である。
［Ａ］細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない方法であって、細胞を、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量の選択的Ｓｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備える方法。
［Ｂ］細胞が、リンパ球であることを特徴とする項［Ａ］記載の方法。
［Ｃ］細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｂ］記載の方法。
［Ｄ］Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｃ］記載の方法。
［Ｅ］選択的Ｓｔｉｍ２インヒビターが、Ｓｔｉｍ１と比較してＳｔｉｍ２を選択的に抑制することを特徴とする項［Ａ］乃至［Ｄ］いずれかに記載の方法。
［Ｆ］サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択されることを特徴とする項［Ａ］乃至［Ｅ］いずれかに記載の方法。
［Ｇ］細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ該細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法であって、細胞を、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こすのに効果的な量の選択的Ｓｔｉｍ１インヒビターに接触させる工程を備える方法。
［Ｈ］細胞が、リンパ球であることを特徴とする項［Ｇ］記載の方法。
［Ｉ］細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｈ］記載の方法。
［Ｊ］Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｉ］記載の方法。
［Ｋ］選択的Ｓｔｉｍ１インヒビターが、Ｓｔｉｍ２と比較してＳｔｉｍ１を選択的に抑制することを特徴とする項［Ｇ］乃至［Ｉ］いずれかに記載の方法。
［Ｌ］サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択されることを特徴とする項［Ｇ］乃至［Ｋ］いずれかに記載の方法。
［Ｍ］細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ該細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こす方法であって、細胞を、Ｓｔｉｍ１インヒビター及びＳｔｉｍ２インヒビターに接触させる工程を備え、これらインヒビターの量が、細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制するのに効果的な量であることを特徴とする方法。
［Ｎ］細胞が、リンパ球であることを特徴とする項［Ｍ］記載の方法。
［Ｏ］細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｏ］記載の方法。
［Ｐ］Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｐ］記載の方法。
［Ｑ］Ｓｔｉｍ１インヒビターとＳｔｉｍ２インヒビターが、同じ化学構造を有することを特徴とする項［Ｍ］乃至［Ｐ］いずれかに記載の方法。
［Ｒ］サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択されることを特徴とする項［Ｍ］乃至［Ｑ］いずれかに記載の方法。
［Ｓ］制御性Ｔ細胞が、腫瘍を有する被験者に存在し、インヒビターの量が、腫瘍に対する免疫反応の増加に有効であることを特徴とする項［Ｐ］に記載の方法。
［Ｔ］細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を抑制し且つ該細胞内においてストア作動性Ｃａ２＋流入の大幅な減少を引き起こさない検査薬を同定する方法であって、（ａ）少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備え、異種ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントが、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有し、方法はさらに、（ｂ）細胞内においてＣａ２＋媒介性サイトカイン発現を測定する工程と、（ｃ）細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備えることを特徴とする方法。
［Ｕ］細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｔ］記載の方法。
［Ｖ］サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−ガンマから選択されることを特徴とする項［Ｔ］記載の方法。
［Ｗ］被験者内の腫瘍に対する免疫反応を増大させる検査薬を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの検査薬を、ＳＴＩＭ１タンパク質又はその機能性フラグメント、及びＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントをコードする異種核酸を含む組換え細胞に接触させる工程を備え、異種ＳＴＩＭ１タンパク質又はその機能性フラグメントが、ヒトＳＴＩＭ１タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有し、異種ＳＴＩＭ２タンパク質又はその機能性フラグメントが、ヒトＳＴＩＭ２タンパク質と少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有し、そして、細胞膜を介するイオン流動もしくは電流又は膜電位の変化を測定する工程か、細胞からの蛍光信号の変化を検出する工程か、細胞からの発光信号の変化を検出する工程か、細胞の膜電位の変化を測定する工程のいずれかとを備え、方法はさらに、
（ｂ）検査薬を異種ＳＴＩＭ１タンパク質の単離形態に接触させ、検査薬の単離異種ＳＴＩＭ１タンパク質への結合性を測定する工程と、
（ｃ）検査薬を異種ＳＴＩＭ２タンパク質の単離形態に接触させ、検査薬の単離異種ＳＴＩＭ２タンパク質への結合性を測定する工程とを備えることを特徴とする方法。
［Ｘ］細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする項［Ｗ］記載の方法。
［Ｙ］Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２の細胞型特異的なコンディショナルにターゲティングされた対立遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物。
［Ｚ］動物がマウスであることを特徴とする項［Ｙ］記載の非ヒトトランスジェニック動物。
［ＡＡ］細胞型がＴ細胞であることを特徴とする項［Ｚ］に記載のトランスジェニックマウス。
［ＢＢ］細胞型が神経細胞であることを特徴とする項［Ｚ］に記載のトランスジェニックマウス。
［ＣＣ］細胞型がマウス胎児線維芽細胞であることを特徴とする項［Ｚ］に記載のトランスジェニックマウス。
［ＤＤ］ターゲティングされた対立遺伝子が、コンディショナルに欠失していることを特徴とする項［Ｙ］乃至［ＣＣ］のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
［ＥＥ］項［Ｙ］乃至［ＤＤ］のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の単離細胞。
【００９８】
本発明は、以下に示す実施例においてさらに示されるが、実施例は制限的なものとして解釈されるべきではない。本出願の図や表を含む全てにおいて引用された全ての参照文献の内容を本出願に引用して援用する。
【００９９】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、変動可能であることは理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としたものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明の範囲は、請求項によってのみ定義される。
【０１００】
実施例の操作以外、又は記載以外にも、本明細書に記載される成分又は反応条件の量を表現する全ての数値は、全例において用語「約」に変更可能であると理解されるべきである。パーセンテージに関連して用語「約」が使用される場合には、平均±１％であることができる。
【０１０１】
［実施例］
＜導入＞
Ｃａ２＋放出活性化カルシウム（ＣＲＡＣ：Ca2+ release-activated calcium）チャネルを経由したストア作動性Ｃａ２＋流入は、刺激を受けた免疫細胞内における細胞内Ｃａ２＋増加の主要な機構である(Parekh, A.B. & Putney, J.W., Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005))。ＣＲＡＣチャネルは、小胞体（ＥＲ；endoplasmic reticulum）Ｃａ２＋ストアがＩＰ３受容体に結合するイノシトール三リン酸（ＩＰ３）によって枯渇した後、開く。持続Ｃａ２＋流入は、Ｔ細胞分化及びサイトカイン発現を含む免疫細胞の多様な機能を引き起こす(Lewis, R.S., Annu. Rev. Immunol. 19, 497-521 (2001); Feske, S.,et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 1117-1132 (2003); Gallo, E.M., et. al., Nature Immunol. 7, 25-32 (2006))。ショウジョウバエ（Drosophila）におけるゲノム全体のＲＮＡｉスクリーニングによって、ＣＲＡＣチャネル活性を制御する２つのキー分子が同定された。これら２つのキー分子とは、ＥＲのＣａ２＋センサーであるＳｔｉｍ(Roos, J. et al., J. Cell Biol. 169, 435-445 (2005); Liou, J. et al., Curr. Biol. 15, 1235-1241 (2005))と、ＣＲＡＣチャネルのポアサブユニットであるＯｒａｉ(Feske, S. et al., Nature 441, 179-185 (2006); Vig, M. et al.,  Science 312, 1220-1223 (2006); Zhang, S.L. et al.,. Proc. Natl Acad. Sci. U S A 103, 9357-9362 (2006))である。ショウジョウバエＳｔｉｍ及びその哺乳類相同体Ｓｔｉｍ１とＳｔｉｍ２(Roos, J. et al., J. Cell Biol. 169, 435-445 (2005); Liou, J. et al., Curr. Biol. 15, 1235-1241 (2005))は、ＥＲ内腔内に配されたＣａ２＋結合ＥＦハンドを通ってＥＲのＣａ２＋レベルを感知すると考えられている１回膜貫通タンパク質である(Taylor, C.W., Trends Biochem. Sci. 31, 597-601 (2006); Lewis, R.S., Nature 446, 284-287 (2007); Putney, J.W., Jr., Cell Calcium (2007))。Ｓｔｉｍ１は、ストア作動性Ｃａ２＋流入における確立した正の調節因子である(Zhang, S.L. et al., Nature 437, 902-905 (2005); Spassova, M.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. U S A 103, 4040-4045 (2006); Luik, R.M., et. al., J. Cell Biol. 174, 815-825 (2006); Wu, M.M., et. al., J. Cell Biol. 174, 803-813 (2006); Baba, Y. et al. Proc. Natl Acad. Sci. U S A 103, 16704-16709 (2006))が、Ｓｔｉｍ２の機能は議論中である(Roos, J. et al., J. Cell Biol. 169, 435-445 (2005); Liou, J. et al., Curr. Biol. 15, 1235-1241 (2005); Soboloff, J. et al., Curr. Biol. 16, 1465-1470 (2006); Soboloff, J. et al., J. Biol. Chem. 281, 20661-20665 (2006))。Ｓｔｉｍ１とＳｔｉｍ２の生理的役割を調査するために、変異マウスが、Ｓｔｉｍ１とＳｔｉｍ遺伝子のコンディショナルな欠失により作製された。ここで、本発明者らは、Ｓｔｉｍ１が、ナイーブＴ細胞及びマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ；mouse embryonic fibroblasts）においてストア作動性Ｃａ２＋流入の主要エフェクターであり、その欠損は、Ｔ細胞サイトカインの発現を著しく損なうことになることを示す。対照的に、Ｓｔｉｍ２は、ナイーブＴ細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入に対して影響が殆どないものの、ＭＥＦｓにおけるストア作動性Ｃａ２＋流入、及び分化したＴ細胞による、もしくは部分的にＮＦＡＴ核局在化の後期を持続することによるサイトカイン発現に対して大きな要因となる。このようにして、Ｓｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２は、いずれも、分化したＴ細胞においてＣａ２＋依存性サイトカイン発現の正の調節因子である。より大量なＳｔｉｍ１が反応開始に必須であるが、適量のＳｔｉｍ２がＳｔｉｍ１の機能を増強するのに重大な役割を有する。
【０１０２】
＜方法＞
（コンディショナルな遺伝子ターゲティング）
Ｓｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２遺伝子の遺伝子ターゲティングが、既述の如く(Muljo, S.A. et al. J. Exp. Med. 202, 261-269 (2005))、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＢｒｕｃｅ−４ＥＳ細胞における相同的組換えによって実施された。ターゲティングされたＳｔｉｍ対立遺伝子を有するキメラマウスは、ヘテロ接合体Ｓｔｉｍ１ｎｅｏ／＋又はＳｔｉｍ２ｎｅｏ／＋ＥＳ細胞クローンの胚盤胞注入（blastcyst injection）によって作製された（図９参照、ネオ＝ネオマイシン耐性遺伝子）。Ｓｔｉｍ１−／−又はＳｔｉｍ２−／−マウスは、ＣＭＶ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅディレーター（deleter）)トランスジェニックマウスと交配させた後、ファウンダーＳｔｉｍ１ｎｅｏ／＋マウスの後代を交雑させることによって作製された(Schwenk, F., et. al. Nucleic Acids Res 23, 5080-5081 (1995))。Ｃｒｅトランスジーンを含まずにＳｔｉｍ１＋／−又はＳｔｉｍ２＋／−マウスを構築するために、Ｓｔｉｍ＋／−ＣＭＶ−Ｃｒｅ＋マウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた。コンディショナルなＳｔｉｍ１ｆｌ／＋又はＳｔｉｍ２ｆｌ／＋対立遺伝子を作成するために、ファウンダーＳｔｉｍｎｅｏ／＋キメラマウスをＦｌｐディレータートランスジェニックマウスと交配させ(Rodriguez, C.I. et al., Nat Genet 25, 139-140 (2000))、これによりターゲティングされたＳｔｉｍ対立遺伝子からネオマイシン耐性カセットを取り除いた。Ｒａｇ１−／−及びＢ６．Ｃｇ（Ｉｇｈａ,Ｔｈｙ１．１、Ｇｐｉ１ａ）マウスがJackson laboratoryから購入された。Ｓｔｉｍ遺伝子のＴ細胞特異的破壊を有するマウスを作製するために、ＣＤ４−Ｃｒｅトランスジェニックマウス(Lee, P.P. et al. Immunity 15, 763-774 (2001))を各ファウンダーＳｔｉｍｆｌ／＋マウスと交配させ、後代を交雑させた。全てのマウスは、ハーバード・メディカル・スクールにおいて特異的無菌バリア設備内に維持され、ハーバード・メディカル・スクールにおける動物資源及び比較医学センターによって承認された手続きに基づき、使用された。
【０１０３】
（Ｔ細胞分化、レトロウイルス導入及び刺激）
脾臓及びリンパ節からのＣＤ４＋Ｔ細胞の精製、ＴＨ分化の導入、１０ｎＭのＰＭＡ及び１μＭイオノマイシン、又はプレート結合抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８を用いた刺激、及び細胞内染色及びフローサイトメトリー分析によるサイトカイン産生の評価が、既述の如く実施された(Ansel, K.M. et al., Nature Immunol. 5, 1251-1259 (2004))。Ｆｏｘｐ３発現は、抗Ｆｏｘｐ３（eBioscience）を用いて、製造業者のプロトコルに基づき細胞内染色で評価され、フローサイトメトリーで分析された。レトロウイルス形質導入が、既述の如く(Wu, Y. et al., Cell 126, 375-387 (2006))、ＫＭＶレトロウイルス発現プラスミドを用い、空の又は含有Ｓｔｉｍ１又はＳｔｉｍ２ｃＤＮＡのいずれか、その後にＧＦＰのｃＤＮＡで、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ；internal ribosome entry site）の支配下で実施された。これらのＣａ２＋流入欠損にもかかわらず、ＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞は、通常通り、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ−α鎖）を上方制御した。したがって、分化培養物がＩＬ−２で維持されていたために、略同等数の細胞が回復した（７日間、分化したＳＴＩＭ欠損細胞の全細胞数は野生型の細胞数の６０−７０％であった）。そして、ＳＴＩＭ欠損細胞は、野生型細胞と同じ効率性で、レトロウイルス形質導入されることが可能であった。
【０１０４】
（ＭＥＦ細胞株の構築）
Ｓｔｉｍ１−／−及びＳｔｉｍ２−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）は、Ｓｔｉｍ１＋／−又はＳｔｉｍ２＋／−マウスのいずれかを交雑させることによって得られるＥ１４．５胚から、標準プロトコルを用いて構築された。ＭＥＦｓは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を運ぶプラスミド内にＳＶ４０ラージＴ抗原でレトロウイルス形質導入されることによって不死化され、続いてハイグロマイシン選択された。
【０１０５】
（抗体及びウエスタンブロット）
細胞をＰＢＳ内で再懸濁することによって、細胞抽出物が調製された。その後、それらを、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール（最終濃度）を含む緩衝液で溶解した。タンパク質濃度が、ＢＣＡタンパク質試薬キット（Pierce）を用いて決定され、その後、２−メルカプトエタノールが最終濃度１００μＭへと追加され、サンプルは煮沸された。ウエスタンブロットが標準プロトコルに基づき実施された。ＳＴＩＭ１ポリクローナル抗体は、ヒトＳＴＩＭ１(CDNGSIGEETDSSPGRKKFPLKIFKKPLKK-COOH, (SEQ. ID. No.１、Ｎ末端のシステインが、ペプチドを担体タンパク質と結合させることを目的として導入されている箇所)のＣ末端ペプチドに対して生成され(Open Biosciences)、１：２０００で使用された。アフィニティー精製ポリクローナル抗体は、ヒトＳＴＩＭ２(CKPSKIKSLFKKKSK, (SEQ. ID. No. 2)、Ｎ末端のシステインが、ペプチドを担体タンパク質と結合させることを目的として導入されている箇所)のＣ末端ペプチドに対して生成され、２μｇ／ｍｌで使用された。アクチンに対するポリクローナル抗体(I-19; SC-1616; Santa Cruz)は、１：５００で使用された。ｍｙｃエピトープ標識に対するモノクローナル抗体は、９Ｅ１０ハイブリドーマ細胞株の上澄みから精製された。ＦＡＣＳ分析に用いられる全ての下記の蛍光共役抗体は、eBioscience又はBD Pharmingenから購入した。Pacific Blue-CD4 (RM4-5), FITC-CD8 (53-6.7), FITC-Thy1.1 (HIS51), FITC-IgE (R35-72), FITC-CD11c (M1/70), PE-IL-2 (JES6-5HA), PE-IL-4 (11B11), PE-Foxp3 (FJK-16s), PE-CD19 (1D3), PE-CD125 (T21.2), PE-CD44 (IM7), PE-CD95 (Jo2), PerCP-B220 (RA3-6B2), PsrCPCy5.5-CD4 (RM4-5), PECy7-Thy1.2 (53-2.1), APC-IFNγ (XMG1.2), APC-IL-10 (JES5-16E3), APC-TNFα (MP6-XT22), APC-CD25 (PC61.5), APC-TCRb (H57-597), APC-CD38 (90), APC-CD62L (MEL-14), bio-CD5 (53-7.3), bio-CD69 (H1.2F3) 及び PE-ストレプトアビジン。
【０１０６】
（単一細胞［Ｃａ２＋］ｉイメージング）
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、既述の如く(Ansel, K.M. et al., Nature Immunol. 5, 1251-1259 (2004))、分離され、一晩ローディング培地(RPMI1640 10% FBS)で培養され、１μＭのｆｕｒａ−２／ＡＭ（Invitrogen）を、３０分間２２−２５℃且つ１×１０６細胞／ｍｌ濃度でローディングした。測定前に、Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたカバースリップに１５分間付着させた。抗ＣＤ３を刺激するために、Ｔ細胞は、５μｇ／ｍｌのビオチン共役抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、BD pharmingen）とともに、１５分間２２−２５℃で培養された。そして、抗ＣＤ３架橋結合が、１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Pierce）を用いて細胞をかん流することによって実現された。長期間のＣａ２＋イメージングのために、分化したＣＤ４＋Ｔ細胞が、１μＭのｆｕｒａ−ＰＥ３でローディングされた後、１０ｎＭのＰＭＡ及び０．５μＭのイオノマイシンで、２％ウシ胎仔血清が補充された２ｍＭＣａ２＋を含むリンゲル液中で刺激された。画像を獲得する間、細胞は、３７℃に暖められた緩衝液で絶えずかん流された。［Ｃａ２＋］ｉの測定は、既述された如く(Feske, S. et al., Nature 441, 179-185 (2006))、実施及び分析された。Ｃａ２＋流入速度は、０．２乃至２ｍＭ細胞外Ｃａ２＋において、細胞内Ｃａ２＋濃度（ｄ[Ｃａ２＋]ｉ／ｄｔ）内の初期上昇の最大速度によって推論され、割合「ｄ[Ｃａ２＋]ｉ／ｄｔ」として表現される。ここで、ｄ[Ｃａ２＋]ｉとは、細胞外Ｃａ２の再追加とＣａ２流入反応のピークとの間の２０秒の時間間隔(ｄｔ)にわたる[Ｃａ２＋]ｉの極大差である。各実験では、１００−１５０の個別Ｔ細胞又は少なくとも３０の個別ＭＥＦｓが、Igor Pro分析ソフトウェア(Wavemetrics)を用いて、３４０／３８０の比率で分析された。
【０１０７】
（ＮＦＡＴ１核移行アッセイ）
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非分極条件下で培養され、５日後に採取された。そして、表示時間の間９６ウェルプレートにおける２００μｌ内１×１０５細胞／ウェルで、１０ｎＭのＰＭＡと１μＭイオノマイシンを用いて、様々な時間刺激された。そして、１４９×Ｇで３分間遠心分離することによって、３８４ウェルプレート（５０００−８０００細胞／ウェル；３ウェル／サンプル）内のポリ−Ｌ−リジン−コーティングされたウェルに付着させた。細胞は、３％（vol/vol）のパラホルムアルデヒドに固定された後、抗−ＮＦＡＴ１（ＮＦＡＴ１の６７．１ペプチドに対する精製ウサギポリクローナル抗体）（Ho, A.M.,et. al., J. Biol. Chem. 269, 28181-28186 (1994)）、及びインドカルボシアニン共役抗ウサギ二次抗体で染色された。そして、ＤＮＡ挿入色素ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色された。画像は、２０倍対物レンズを備えるImageXpress Micro 自動イメージングシステム（Molecular Devices）を用いて取得され、MetaXpressソフトウェアバージョン６．１（Molecular Devices）の移行アプリケーションモジュールを用いて分析された。核移行への細胞質性は、抗ＮＦＡＴ１−Ｃｙ３染色とＤＡＰＩとの間の強度相関関係を算出することによって評価された。Ｔ細胞は、ＮＦＡＴ１−インドカルボシアニン染色の＞９０％が、ＤＮＡ挿入色素ＤＡＰＩからの蛍光信号と関係がある場合に、核ＮＦＡＴ１を有しているとして得点付けされた。各データポイントは、ウェルあたり少なくとも３００の個別細胞の平均を示す。
【０１０８】
（ＨＥＫ２９３細胞におけるｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン）
０．６×１０６のＨＥＫ２９３細胞は、一晩、６ウェルプレート上にプレーティングされ、次の日、製造業者のプロトコルに基づき、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて、ヒトＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２に対するｓｉＲＮＡｓ(Dharmacon, Inc., Lafayette, CO)がトランスフェクトされた。トランスフェクションの手順は、４８時間後に繰り返されることにより、ノックダウンの効率を増大させた。細胞は、７２時間後に、免疫ブロット分析又は[Ｃａ２＋]ｉ測定のために採取された。ノックダウンの程度を監視するために、ＳＴＩＭ１の免疫ブロット法が、ヒトＳＴＩＭ１に対するポリクローナル抗体（M. Dziadek から親切にも贈与されたもの(U Auckland, New Zealand)）を１：１０００の希釈において用いた第２のトランスフェクションの後、７２時間後に実施された。ＳＴＩＭ２の転写レベルは、スクランブルコントロールｓｉＲＮＡ (ｓｉＣ２)、ｓｉＳＴＩＭ１、及びｓｉＳＴＩＭ２がトランスフェクトされた細胞において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定された。ＳＴＩＭ２の閾値サイクル(ＣＴ)は、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子発現レベル（ΔＣＴ）に標準化され、０．５ΔＣｔ＊１０６（任意ユニット）としてプロットされた。ここで用いられるｓｉＲＮＡ配列は、ＳＴＩＭ１: AGGUGGAGGUGCAAUAUUA (SEQ. ID. No. 3) ; ＳＴＩＭ２＃１: UAAACCUCCUGGAUCAUUA (SEQ. ID. No. 4); ＳＴＩＭ２＃２: CUUUAAGCCUCGAGAUAUA (SEQ. ID. No. 5)であった。
【０１０９】
（パッチクランプ測定）
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非極性条件下で培養され、５日後に採取された。パッチクランプ記録は、ＩＴＣ−１８入力／出力ボード(Instrutech)及びｉＭａｃのＧ５コンピュータに連動するAxopatch 200増幅器(Axon Instruments)を用いて実施された。電流は、１ｋＨｚで４極ベッセルフィルタを用いてフィルターされ、５ｋＨｚでサンプリングされた。記録電極は、１００μｌピペットから引き出され、シルガード（Sylgard）でコーティングされ、熱研磨され、最終抵抗２−５ＭΩであった。刺激及びデータ取得と分析は、Igor Pro platform (Wavemetrics)において開発された社内ルーティーンを用いて実施された。全データは、バス内のリンゲル液（１０ｍＶ）と比較したピペット液の液間電位、及び２０ｍＭ［Ｃａ２＋］Ｏ＋２５μＭのＬａ３＋に集められたリーク電流について修正された。標準細胞外リンゲル液が含有したのは（ｍＭあたり）、：１３０ＮａＣｌ、４．５ＫＣｌ、２０ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２２、１０Ｄ−グルコース、及び５Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ(ｐＨ７．４)であった。ある実験では、２ｍＭのＣａＣｌ２が標準細胞外溶液に使用され、ＮａＣｌ濃度は１５０ｍＭまで上がった。標準二価遊離（ＤＶＦ：divalent-free）リンゲル液が含有したのは（ｍＭあたり）、１５０ＮａＣｌ、１０ｍＭ四酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ(ｐＨ ７．４)であった。２５ｎＭのカリブドトキシン(Sigma)が全ての細胞外溶液に添加されることにより、Ｋｖ１．３チャネルからの汚染を排除した。標準内部溶液が含有したのは（ｍＭあたり）、１４５ｍＭのＣｓアスパラギン酸、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ＢＡＰＴＡ(１，２−ビス(o-アミノフェノキシ)エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸) 及び１０ｍＭのＣｓ−Ｈｅｐｅｓ(ｐＨ ７．２)であった。平均結果とは、平均値±標準誤差を示す。曲線当てはめは、Igor Pro 5.0において組込関数を用いた最小二乗法を用いて実施した。Ｎａ＋の浸透性に対するＣｓ＋の浸透性は、以下の関係［数１］を用いた生体工学の逆転電位から計算された。
【０１１０】
【数１】
0005559049.tif 000002
【０１１１】
ここで、ＰＣｓ及びＰＮａは、Ｃｓ（テストイオン）及びＮａ＋それぞれの浸透性である。［Ｃｓ］ｉと［Ｎａ］Ｏはイオン濃度である。Ｅｒｅｖは逆転電位である。Ｒは気体定数(８．３１４ Ｊ Ｋ−１ ｍｏｌ−１)である。Ｔは絶対温度であり、Ｆはファラデー定数(９６４８ Ｃ ｍｏｌ−１)である。
【０１１２】
（ヘマトキシリン及びエオシン染色）
組織は、３−４ヶ月齢のマウスから採取され、１０％ホルマリンで固定された。ヘマトキシリン及びエオシン染色が、標準手順に基づき実施された。
【０１１３】
（Ｔｒｅｇ細胞の精製及び養子移植）
Ｔｈｙ１．１＋コンジェニックマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がDynabeadsマウスＣＤ４及びDETACHaBEADマウスＣＤ４(Invitrogen)によって精製された後、FACSVantageによって選別された。野生型Ｔｈｙ１．１＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（３×１０５）が、２週齢のマウスの腹腔内に注入された。注入されたマウスは、養子移植後の８週間後に分析された。
【０１１４】
（混合骨髄移植）
Ｔｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス(３×１０６細胞)からのＴ細胞枯渇骨髄細胞は、Ｔｈｙ１．１＋ＤＫＯコンジェニック野生型マウス(１．５×１０６細胞)からのＴ細胞枯渇骨髄細胞と混合され、後眼窩洞を介して、亜致死的放射を受けたＲａｇ１−／−マウス(４５０ラド)内に注入された。再構築されたマウスは、骨髄移植後１０−１２週間後に分析された。
【０１１５】
（増殖及びインビトロ抑制アッセイ）
ＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖後に、MACS CD25 マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いて正に選択された。精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（２×１０７／ｍｌ）は、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルジエステル）（１．２５μＭ）を用いて１０分間３７℃で培養された。細胞は、７２時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激され、細胞分裂数がフローサイトメトリーで評価された。インビトロ抑制アッセイは、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（５×１０４）と、表示割合のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とを共培養することにより実施された。このＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、コントロール同腹子又はＤＫＯマウスから精製されたものである。この共培養は、丸底型プレートにおいて、３７℃で７２時間、マイトマイシンＣ処理されたＴ細胞枯渇脾細胞（５×１０４）と０．３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（２Ｃ１１）存在下で実施された。
【０１１６】
（実施例１．Ｓｔｉｍ１又はＳｔｉｍ２のコンディショナルな除去）
ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２の両方がインビボで普遍的に発現する(Williams, R.T. et al., Biochem. J. 357, 673-685 (2001))ため、Ｓｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２のloxP-で挟まれた対立遺伝子を有するマウスが作製された（図９）。これらのマウスを、ＣＭＶ−Ｃｒｅディレーター株と交配させる(Schwenk, F., Baron, U. & Rajewsky, K. Nucleic Acids Res 23, 5080-5081 (1995))ことにより、全組織でＳｔｉｍ１とＳｔｉｍ２欠損の影響を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンドにおけるＳＴＩＭ１欠損マウスは、Ｅ１８．５において予想されるメンデル比で生存していたが、周産期致死性を示した。これは、７５％が死産であり、残りの子も２日以内に死亡した。対照的に、ＳＴＩＭ２が欠如したマウスは、産後４週間まで生存したが、僅かな発達遅延を示し、４−５週齢で死亡した（表１ａ及び１ｂ）。ＳＴＩＭ１欠損マウスの周産期致死性を「レスキュー」するために、これらのマウスを、非近交系ＩＣＲマウス株と交配させた。周産期致死性はまだ高い（３８％）ものの、非近交系ＳＴＩＭ１欠損子孫の半分は、重度の発達遅延を伴い２日生存し、次の２週間以内に原因不明で死亡した（表１ｃ）。
【０１１７】
Ｔ細胞におけるＳＴＩＭ欠損の影響を検査するために、loxPで挟まれたＳｔｉｍ１又はＳｔｉｍ２を有するマウスは、胸腺細胞成熟のダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）期において欠失を引き起こすＣｄ４エンハンサー−プロモーター−サイレンサーカセット(ＣＤ４−Ｃｒｅ)の条件下でＣｒｅトランスジーンを発現するマウスと交配された(Lee, P.P. et al., Immunity 15, 763-774 (2001))。胸腺細胞性及びＴ細胞成熟は、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌ ＣＤ４−Ｃｒｅ＋及びＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅ＋マウスにおいて正常に見え（データ示さず）、末梢ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の分析が可能であった（図１）。そうではないことが記載されなければ、本紙におけるＴ細胞実験は、Ｓｔｉｍ１及び／又はＳｔｉｍ２がＣＤ−４Ｃｒｅでコンディショナルに欠失しているマウスからのＴ細胞を用いて実施された。一方で、線維芽細胞実験は、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅ＋及びＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅ＋マウスからのマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いて実施された。
【０１１８】
（実施例２．ＳＴＩＭタンパク質がストア作動性Ｃａ２＋流入を制御する）
ＳＴＩＭ１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞は、筋小胞体ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプのインヒビターであるタプシガルギン（ＴＧ）を用いたＥＲのＣａ２＋ストアの受動枯渇後、又は抗ＣＤ３とのＴＣＲ架橋結合後、殆どＣａ２＋流入を示さなかった（図１ａ）。静止コントロール及びＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞は、抗ＣＤ３、又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８での刺激を受けた際に、表面ＣＤ３及びＴＣＲβの類似発現を示し、ＥＲのＣａ２＋ストアの類似枯渇と活性化マーカーＣＤ２５とＣＤ６９の発現を示した（図１０ａ−ｃ）。ＳＴＩＭ１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＭＡとイオマイシン（図１ｂ）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８(図１０ｄ)による刺激後、ＩＬ２の産生に失敗した。全体として、これらの結果は、ＳＴＩＭ１が初代マウスＴ細胞においてストア作動性Ｃａ２＋流入及びＣａ２＋依存性サイトカイン産生を制御するという最初の遺伝学的証拠を提供する。
【０１１９】
対照的に、Ｓｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅ＋マウスから得られたＳＴＩＭ２欠損初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、タプシガルギン、イオマイシン、又は抗ＣＤ３を用いた処置に応答し、コントロールＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣａ２＋流入又はＩＬ２産生を殆ど又は全く示さなかった（図１ｃ、ｄ）。ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２間の矛盾において考えうる原因は、ＳＴＩＭ２がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞においてＳＴＩＭ１よりもかなり低い量だけ発現することである（図１１ａ）。Ｔ細胞の活性化は、ＳＴＩＭ２発現において実質的な増加をもたらし、これはＴヘルパー１型（ＴＨ１）又はＴＨ２分化後３−７日間維持されていたにもかかわらず、ＳＴＩＭ２の量は、このような増加によっても、全体的なＳＴＩＭタンパク質のごく一部（３−１０％）でしかない（補足的に図３ａ、ｂ、オンライン）。分化したＴ細胞においてさえ、ＳＴＩＭ２は全体的なＳＴＩＭタンパク質のうちほんの一部分を構成するという事実と一致して、非分極（ＴＨＮ）条件下で１週間分化したＳＴＩＭ２欠損Ｔ細胞は、急性の低用量タプシガルギン又は抗ＣＤ３の刺激に応答して、Ｃａ２＋流入の穏やかな増加を見せた（図１ｅ）。しかしながら、これら細胞は、ＰＭＡ及びイオノマイシン（図１ｆ）、又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８（図１１ｅ）を用いた持続的刺激を受けた際にＩＬ−２及びＩＦＮ−γを産生する能力において大幅な減少をみせた。同様に、ＳＴＩＭ２欠損Ｔｈ１及びＴｈ２細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮγの産生において減少を示した（データ示さず）。
【０１２０】
さらに、ストア作動性Ｃａ２＋流入は、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅ＋、及びＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅ＋マウスからのＭＥＦｓにおいて、検査された。タプシガルギン処置された野生型ＭＥＦｓにおけるＣａ２＋流入は、タプシガルギン処置されない場合にＣａ２＋流入が観察されなかった（データ示さず）ために、ＥＲのＣａ２＋ストア枯渇に起因するものであることが確認された。Ｔ細胞において、ＳＴＩＭ欠損はＣａ２＋流入を抑止した。さらに、ＭＥＦｓでは、ＳＴＩＭ２欠損もまた、明らかにＣａ２＋流入を減少させた（図２ａ）。これら実験を合わせると、ＳＴＩＭ１欠損は、Ｔ細胞及び線維芽細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋流入の全損を結果として示した。この一方で、ＳＴＩＭ２欠損は、影響がより少なかった、
【０１２１】
ＳＴＩＭ２が機能的なＥＲのＣａ２＋センサであることを確かめるために、ＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞及びＭＥＦｓがＭｙｃ標識ＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２で再構築され、その後Ｃａ２＋流入及びサイトカイン産生が検査された（図２ａ、ｂ）。安定した低いタンパク質発現が可能なレトロウイルスベクターを用いることにより、過剰発現に起因する人為的影響を避けた。導入されたＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２は、抗Ｍｙｃを用いた免疫ブロット分析で示される如く（図１１ｂ及びデータ示さず）、両方の細胞型で類似量、発現した。ＳＴＩＭ１は、ＳＴＩＭ１欠損ＭＥＦｓにおいて確実にストア作動性Ｃａ２＋流入を再構築し（図２ａ）、ＳＴＩＭ１欠損ヘルパーＴ細胞は、非分極条件下において１週間分化し、タプシガルギンで処理された（図２ｂ）。対照的に、より弱いＣａ２＋流入が、ＳＴＩＭ２で再構築された細胞内で観察された（図２ａ、ｂ）。それにもかかわらず、ＳＴＩＭ２は、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いて刺激されたＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞に対して、サイトカイン発現を回復することに驚くほど効果的であった（図２ｃ）。これら結果を合わせると、内因性ＳＴＩＭ２は、その他の研究(Soboloff, J. et al., Curr. Biol. 16, 1465-1470 (2006))で提示されていたようなＳＴＩＭ１機能のインヒビターよりむしろ、これら２つの細胞型におけるＣａ２＋信号の正の調節因子であるということが示されている。
【０１２２】
（実施例３．中断されたＣａ２＋流入及びＮＦＡＴ核移行）
ＳＴＩＭ２欠損Ｔ細胞で観察された相対的にかなり低いサイトカイン発現によるストア作動性Ｃａ２＋流入の少量の減少を調整するために、Ｃａ２＋流入が、細胞質内によく保持されたカルシウム指示薬であるＦｕｒａＰＥ−３を備える細胞をローディングすることによって、より長い時間スケールにおいて検査された(Vorndran, C., et. al., Biophys J 69, 2112-2124 (1995))。ＳＴＩＭ２欠損Ｔ細胞は、野生型Ｔ細胞と比較して減少したストア作動性Ｃａ２＋流入を示し、２０分後、維持細胞内遊離Ｃａ２＋濃度([Ｃａ２＋]i)のより低い横ばい状態を維持した（図３ａ）。Ｃａ２＋シグナル伝達がＳＴＩＭ２欠損細胞において減少していることを確認するために、Ｃａ２＋依存性転写因子ＮＦＡＴ１８の核移行が監視された。核移行は、MetaXpressプログラム（データ示さず）を用いて定量化され、野生型、ＳＴＩＭ１欠損及びＳＴＩＭ２欠損マウスからのヘルパーＴ細胞を、非分極条件下、その後ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いた刺激した条件下で（サイトカインアッセイに用いられるものと同じ条件）、１週間分化させた。これにより、ＮＦＡＴ１核移行（３ｂ、ｃ）及びサイトカイン発現(図３ｄ、ｅ)が直接的に比較可能となった。
【０１２３】
この結果は、生理的条件下で、ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２の両方が、サイトカイン遺伝子の高発現に必要である持続Ｃａ２＋流入及びＮＦＡＴ核移行(Hogan, P.G.,et. al., Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003))の一因となることを明らかに示した。非分極条件下で１週間分化したＳＴＩＭ１欠損ヘルパーＴ細胞において、ＮＦＡＴは、ＥＲのＣａ２＋ストア欠損を伴うＣａ２＋(［Ｃａ２＋］ｉ)における一時的上昇から推定されるように、一時的に核内に運び込まれる。しかしながら、ＮＦＡＴは、細胞の分画内においてのみ核内に運び込まれ、急速に再度運び出された（図３ｂ）。対照的に、コントロール細胞と略同じ位に多くのＳＴＩＭ２欠損（７０−７５％対８５−９５％）が、１０分の時点で、核ＮＦＡＴ１を示した。しかしながら、この反応は、コントロールで持続されたが、ＳＴＩＭ２欠損細胞では持続されなかった（図３ｃ）。これらの結果は、Ｔ細胞信号伝達におけるＳＴＩＭ２の主要な役割を指し示し、ＳＴＩＭ２欠損Ｔ細胞におけるサイトカイン発現の実質的な減少を説明するものである（図１ｆ、３ｅ）。
【０１２４】
（実施例４．ＣＲＡＣ電流はＳＴＩＭ１欠損細胞において低下する）
全細胞パッチクランプ記録法は、ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２の欠失がＣＲＡＣ電流（ＩＣＲＡＣ）に影響を与えるか否かを決定するために用いられた。タプシガルギン（ＴＧ）によるＥＲのＣａ２＋ストア枯渇に応答して、コントロールマウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞におけるＩＣＲＡＣの特性に類似した特性を有するＣａ２＋電流を示した（図４）。これらの特性は、２０ｍＭのＣａ２＋（図４ａ）存在下における非常にポジティブな逆転電位を備える内向き整流性の電流−電圧関係、２０ｍＭＣａ２＋における高速不活性化（図１２ｃ）、二価陽イオン遊離（ＤＶＦ）溶液におけるＮａ＋電流の非増強作用（図４ｂ）、低いＣｓ＋透過性（Ｃｓ＋透過性／Ｎａ＋透過性＝０．２±０．０４；ｎ＝１４サンプル）、細胞外Ｃａ２＋のマイクロモル濃度によるＮａ＋電流の遮断（図１２ｂ）、及び低及び高濃度の２−ホウ酸アミノエトキシジフェニルによる相乗作用と阻害(Prakriya, M. & Lewis, R.S., J. Physiol. 536, 3-19 (2001))を含んでいた（とはいっても、マウス細胞における２−ホウ酸アミノエトキシジフェニルによる相乗作用は、ジャーカット又はヒトＴ細胞におけるもの程は強く現れなかった；図１２ｄ、データ示さず）。さらに、１０ｍＭカルシウム特異的ＢＡＰＴＡをパッチピペットに含むことは、２０ｍＭ[Ｃａ２＋]ｏ内の内向き電流の発生の遅延、続いて全細胞の破壊、ストア枯渇に反応するＩＣＲＡＣの発生の示唆を引き起こした（データ示さず）。全体として、これらの結果は、マウスＴ細胞が、ＩＣＲＡＣの特性と区別がつかない特性を有するＣａ２＋電流を有していることを示した。
【０１２５】
Ｃａ２＋イメージング結果と一致して、ＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞は、２０ｍＭＣａ２＋又は二価陽イオン遊離（ＤＶＦ）培地のいずれにおいても検出可能なＩＣＲＡＣを示さなかった。対照的に、ＳＴＩＭ２欠損細胞は、ＩＣＲＡＣの大きさにおいて僅かな減少を示したが、検査した細胞数において統計的有意性には達さなかった（図４ｃ）。ＩＣＲＡＣの特性は、Ｃａ２＋とＣｓ２＋の選択性、高速不活性化、非相互作用、及び低及び高濃度の２−ホウ酸アミノエトキシジフェニルへの応答性に関しては、ＳＴＩＭ２欠損Ｔ細胞において変化しなかった（図１２、及びデータ示さず）。これら結果は、内因性ＳＴＩＭ１が、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＣＲＡＣに必要であることを示している。しかしながら、内因性ＳＴＩＭ２は、同じ条件下で、記録ＩＣＲＡＣの一因となることは殆どない又は全くなく、これは恐らく、分化Ｔ細胞においてさえも全ＳＴＩＭタンパク質のうち非常に低い比率を構成するためである（図１１ｂ）。
【０１２６】
（実施例５．ダブルノックアウトの複合表現型）
Ｔ細胞においてインビボでＳｔｉｍ１とＳｔｉｍ２の欠失が組み合わされた影響を分析するために、Ｓｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ４−Ｃｒｅ＋「ダブルノックアウト」（短縮形ＤＫＯ：double knockout）マウスが作製された。これらのマウスは、胸腺細胞性、並びにＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、及びＣＤ４＋及びＣＤ８＋シングルポジティブ（ＳＰ）細胞の数及び比率を評価したところ、従来の胸腺成熟においては欠損を示さなかった（データ示さず）。２つの可能性のある説明としては、ＳＴＩＭタンパク質が長寿命であることにより、残りのＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２タンパク質は、遺伝子欠失がＤＰ段階で生じた後、又は胸腺細胞が末梢Ｔ細胞によって使用されたものとは異なるＳＴＩＭ独立Ｃａ２＋流入機構を用いた後に、存在可能である及び機能的に良好であることができる。Ｔ細胞成熟及び胸腺選択におけるＳＴＩＭタンパク質の役割は、Ｃｒｅ発現がＴ細胞又は造血細胞成熟の早期に開始されたマウスを用いて、別個の研究の一環として調査されている。
【０１２７】
ＳＴＩＭ１欠損Ｔ細胞の重度の有害な表現型から予測すると、ＳＴＩＭタンパク質を両方欠如している末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞は、タプシガルギン又は抗ＣＤ３を用いた刺激に応答するＣａ２＋流入を本質的に示さない（図５ａ、図１３）。少量の残存流入は、正常Ｃａ２＋流入（図５ａ）とＩＣＲＡＣ（データ示さず）に示される少数の個別細胞に起因するＣａ２＋流入及び少量の残存ＩＣＲＡＣの平均曲線において見られる。検査した１５のダブルノックアウト細胞のうち、２つは記録において正常なＩＣＲＡＣを有していたが、残りの細胞はＩＣＲＡＣを有していなかった。これらは、精製手順を通じて入ってきた非ＣＤ４＋Ｔ細胞を汚染すること、又はＳＴＩＭ１もしくはＳＴＩＭ２のＣｒｅ媒介性欠失を逃れた少量のＣＤ４＋Ｔ細胞を汚染することのいずれかを示す（以下参照、図１５）。ＤＫＯのＴ細胞は、初回刺激に反応して低量の腫瘍壊死因子を産生したものの、殆どＩＬ−２を産生しなかった（図５ｂ）。これは、正常にＤＫＯ細胞において行われたＰＭＡ誘発ＮＦ−κＢ活性化(M.O.,未発表データ)に起因するものである可能性がある。ＤＫＯのＴ細胞は、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を上方制御し、そして、ＴＣＲ刺激の後に、（有意に減少した量ではあるが）増殖した（図５ｄ、ｅ）。
【０１２８】
意外にも、８週齢以上のＤＫＯマウスは、脾腫、リンパ節症、皮膚炎、及び眼瞼炎の明確な表現型を発達させた（図１４ａ、データ示さず）。組織学的分析は、肺及び肝臓を含む複数器官への白血球浸潤を示した（図６ａ、データ示さず）。ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＳＴＩＭ１のみを欠如したマウスは、軽度のリンパ球増殖表現型を示した（図１４ａ、データ示さず）。ＤＫＯマウスは、メモリー又はエフェクター状態の表面表現型特性を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の増加(CD62LloCD44hiCD69hiCD45RBloCD5hi)、脾臓における胚中心（ＧＣ）の数の増加、ＧＣ表現型を備えるＢ細胞の数の増加(CD95hiCD38lo)、及び分化したＩｇＥ＋Ｂ細胞の数の増加、多数のＣＤ１１ｂ＋ＩＬ−５Ｒ＋の好酸球又は好塩基球、及び非常に高まったＩｇＧ１の血清濃度（図１４ｂ−ｄ、オンライン及びデータ示さず）を含んでいた。ＤＫＯマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いた刺激に反応して、ＩＬ−５を産生したがＩＬ−４は産生しなかった（データ示さず）。とりわけ、ＤＫＯマウスの表現形は、Ｔ細胞膜貫通アダプターＬＡＴ内の変異（Ｙ１３６Ｆ）を備えるマウスの表現型と類似しているが同一ではない。この変異は、ＰＬＣγ１のドッキング部位を取り除き、ＴＣＲ架橋結合に反応するＣａ２＋流入の低下を引き起こすものである(Sommers, C.L. et al., Science 296, 2040-2043 (2002); Aguado, E. et al., Science 296, 2036-2040 (2002)).  。
【０１２９】
（実施例６．Ｔｒｅｇ細胞分化及び機能におけるＳＴＩＭ）
ＬＡＴ（Ｙ１３６Ｆ）変異マウスの自己反応性表現型は、自己反応性Ｔ細胞が末梢部に逃げることを可能とする低下した陰性選択(Sommers, C.L. et al. , J Exp Med 201, 1125-1134 (2005)、及びＴｒｅｇ細胞の数の減少(Koonpaew, S., Shen, S., Flowers, L. & Zhang, W. LAT-mediated signaling in CD4+CD25+ regulatory T cell development. J Exp Med 203, 119-129 (2006))に起因したものであった。胸腺細胞の陽性及び陰性選択におけるＳＴＩＭタンパク質の役割の直接的な検査は、Ｌｃｋ−Ｃｒｅを用いてＴ細胞成熟の初期段階においてＳｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２が除去されたマウスを必要とする。そして、これらマウスをＨＹ−ＴＣＲトランスジェニックマウスと交配させた。その一方で、５−６週齢のＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＤ−Ｃｒｅマウスの胸腺、脾臓、及びリンパ節におけるＴｒｅｇ細胞数の明確な減少（図６ｃ、ｄ、データ示さず）が記録された。ＤＫＯマウスの脾臓及びリンパ節におけるＴｒｅｇ細胞の比率は、加齢に伴い増加したが、それにもかかわらず、コントロールマウスの比率の１０−２０％間にとどまった（図６ｃ）。これらの増加は、末梢リンパ器官の大きさに年齢依存的に増加した結果であると推定された。ＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２のいずれかが欠如したマウスは、正常な数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を含んでいた（データ示さず）。Ｔｒｅｇ細胞のその他のマーカーであるＧＩＴＲを発現する細胞数は、ＤＫＯマウスでも減少した（データ示さず）。また、さらに留意されるべきは、より加齢（８週）のＤＫＯマウスからのＣＤ２５−及びＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるＳｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２の完全な欠失であった（図１５ａ）。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と同様に、ＤＫＯマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、タプシガルギン又は抗ＣＤ３を用いた処置に反応して、低下したＣａ２＋流入を示した（図６ｅ及び図１５ｂ）。
【０１３０】
ＤＫＯマウスにおけるＴｒｅｇ細胞のパーセンテージと絶対数の著しい減少は、欠損Ｔｒｅｇ細胞の成熟、末梢部における生存、又はこれら両方を反映したものであるといえる。ＤＫＯのＴ細胞が殆どＩＬ−２を産生しないという事実を鑑みて、一つの可能性は、Ｔｒｅｇ細胞成熟が、「バイスタンダー」Ｔ細胞によって産生されたＩＬ−２の欠如に起因して、部分的に欠損したと考えられた(Setoguchi, R., et. al., J Exp Med 201, 723-735 (2005); Fontenot, J.D.,et. al., Nat Immunol 6, 1142-1151 (2005); D'Cruz, L.M. & Klein, L. Nat Immunol 6, 1152-1159 (2005))。これらの可能性に取り組むために、混合骨髄キメラが作製された。亜致死的に放射され、組換え活性化遺伝子１が欠損したＲａｇ１−／−受容マウス（Ｒａｇ１−／−マウス）は、Ｔｈｙ１．２＋コントロールマウス単独から、もしくはＴｈｙ１．２＋コントロールマウスとＴｈｙ１．２＋ＤＫＯマウスから得られるＴ細胞枯渇骨髄、又はＴｈｙ１．２＋ＤＫＯマウス又はＴｈｙ１．１＋野生型マウスから得られる骨髄が、２：１の比率で混合されたものを用いて、再構築された。予測される如く、ＤＫＯ骨髄のみが与えられたマウスは、胸腺及びリンパ節の両方において、コントロール骨髄（図７）を用いて再構築されたマウスと比較して、有意に少ないＴｒｅｇ細胞を含んでいた。また、未操作ＤＫＯマウスと同等の重度のリンパ球増殖表現型を発現した（図１６ａ）。対照的に、ＤＫＯと野生型骨髄の両方を用いて再構築された混合キメラは、リンパ増殖性疾患のどんな兆候も示さず、コントロールキメラマウスと同様に健康なままであった（図１６ａ）。これらのキメラマウスにおいて、野生型骨髄は末梢Ｔｒｅｇ細胞の正常数まで上昇し、その一方で、ＤＫＯ前駆体は、胸腺及び末梢部どちらにおいても、さらに少ないＴｒｅｇ細胞を産生した（図７）。全体として、これらの結果は、ＤＫＯマウスがＴｒｅｇ細胞成熟における細胞固有欠損を有しており、これは、野生型骨髄由来の「バイスタンダー」Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２(Setoguchi, R., et. al., J Exp Med 201, 723-735 (2005); Fontenot, J.D.,et. al., Nat Immunol 6, 1142-1151 (2005); D'Cruz, L.M. & Klein, L. Nat Immunol 6, 1152-1159 (2005))によって修復されないものであることを示した。
【０１３１】
次に、ＤＫＯマウスにおけるリンパ球増殖表現型の開始は、幼若マウスに、野生型マウスからのＴｒｅｇ細胞を注入することによって防止された。２週齢のＤＫＯマウスに野生型Ｔｒｅｇ細胞を注入することは、８週間後のリンパ節腫及び脾腫の成長を防ぎ、この一方で、リン酸緩衝食塩水又は非Ｔｒｅｇ細胞を用いた注入は、これを防がなかった（図８ａ及び図１６ｂ）。ＤＫＯマウスは内因性Ｔｒｅｇ細胞を殆ど含まないため、３×１０５の野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみが、各ＤＫＯマウスに導入された。注入されたマウスは、注射の８週間後、Ｔｒｅｇ細胞を殆ど含まないままであった（図８ｂ）。導入された野生型Ｔｒｅｇ集団由来のＴｈｙ１．１＋Ｔｒｅｇ細胞は、フローサイトメトリーを用いて内因性Ｔｈｙ１．２＋Ｔｒｅｇ細胞と区別された（図８ｂ、ｃ）。予測される如く、内因性Ｔｈｙ１．２＋Ｔｒｅｇ細胞は、野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５−が注入されたＤＫＯマウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の大部分を占め、１０週齢においてリンパ節症及び脾腫を示した。対照的に、野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞が注入され且つリンパ球増殖表現型が治癒したマウスは、Ｔｈｙ１．１＋ドナー及びＴｈｙ１．２＋内因性細胞と略等しく由来するＴｒｅｇ細胞を含んでいた（図８ｃ）。これらのデータは、幾らかのＴｒｅｇ細胞がＤＫＯマウス内で成熟していたとしても、野生型マウスからのＴｒｅｇ細胞と比較して、（仮にあったとしても）その機能が乏しい。さらに、内因性Ｔｒｅｇ細胞の数は、導入されたＴｒｅｇ細胞の存在下で減少した（図８ｃ、左パネルと右パネルの比較）。これは、ＤＫＯマウスからのＴｒｅｇ細胞が、インビボで競争上不利であることを意味している。ＤＫＯマウスにおける残存Ｔｒｅｇ細胞の欠損機能の確認は、インビボ抑制アッセイを実施することによってなされた（図８ｄ及び図１７）。同時に、データは、ＳＴＩＭ１及びＳＴＩＭ２両方の損失がＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の成熟と機能を損なうことを、強く示唆している。
【０１３２】
要約すると、Ｓｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２の両方がＣａ２＋シグナル伝達のポジティブ調節因子であることが証明された。２つのＳｔｉｍタンパク質のうちの１つが欠如しているが、その他のタンパク質が生理学的レベルで発現しているＴ細胞及び胎児線維芽細胞は、ストア作動性Ｃａ２＋進入及びＣａ２＋依存性シグナル伝達において大幅な欠損を示す。これらの欠損は、Ｓｔｉｍ１又はＳｔｉｍ２のいずれかによって、部分的に又は全体的に再構築されることができる。しかしながら、Ｔ細胞では、Ｓｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２の相対的な重要性は、分化状態に依存する。ナイーブＴ細胞において、Ｓｔｉｍ１は、ストア作動性Ｃａ２＋進入とサイトカイン発現の重要なエフェクターである。対照的に、Ｓｔｉｍ２は、低レベルにおいてのみ存在し、本発明に記載されたアッセイ条件下ではＣａ２＋シグナル伝達の一因とはならない。分化したＴ細胞において、Ｓｔｉｍ１は、Ｃａ２＋依存性サイトカイン発現に重要なままであるが、Ｓｔｉｍ２は、上方制御され且つＳｔｉｍ１を補完し、ストア作動性Ｃａ２＋進入及びサイトカイン発現を促進する。
【０１３３】
分化したヘルパーＴ細胞におけるＳｔｉｍ２の主要機構は、Ｓｔｉｍ２又は全Ｓｔｉｍタンパク質いずれかのレベルが増加したことによる単なる結果ではない。それよりもむしろ、Ｓｔｉｍ２は、全体的なＣａ２＋シグナル伝達に影響を与え、この全体的なＣａ２＋シグナル伝達とは、分化したヘルパーＴ細胞におけるレベルに不均衡である。分化したＳｔｉｍ１−／−分化ヘルパーＴ細胞において、Ｓｔｉｍ２単独では、ストア作動性Ｃａ２＋を支持せず、上方制御の後でさえ、Ｓｔｉｍ２レベルは、全体的なＳｔｉｍタンパク質と比較して低いままである。ＮＦＡＴ経路において、Ｓｔｉｍ２の機能は、効果的なサイトカイン産生に必要である持続ＮＦＡＴ核局在化において明らかである。ＮＦκＢ経路において、この存在は、刺激後１時間は顕著であるｐ６５の核内輸送のＣａ２＋依存成分の一因となる。これら結果の最も簡単な説明は、Ｔ細胞における生理学的レベルにおいて、Ｓｔｉｍ２が、Ｓｔｉｍ１の活性化によって開始されるＣａ２＋経路における信号を強化することである。コンディショナルなＳｔｉｍ１及びＳｔｉｍ２欠損マウスが利用できることによって、多様な異なる細胞型のストア作動性Ｃａ２＋進入において、これら必須のタンパク質の役割の詳細評価が可能となる。
【０１３４】
（表１）ＳＴＩＭ欠損マウスは、致死である。
ａ.胚性と生後段階両方において、Ｃ５７ＢＬ／６(Ｂ６)バックグラウンドにおけるＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅマウスの生存能力
ｂ.Ｂ６バックグラウンドにおけるＳｔｉｍ２ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅマウスの生存能力
ｃ.非近交系ＩＣＲマウス株と交配した後の、混合バックグラウンドのＳｔｉｍ１ｆｌ／ｆｌＣＭＶ−Ｃｒｅマウスの生存能力。新生ＳＴＩＭ１−ヌルマウスは、生後１日を過ぎて生存したものはいなかった。丸括弧内の数字は、目視検査をして生存していたマウスの数である。
【０１３５】
【表１】
0005559049.tif 000003
【０１３６】
【表２】
0005559049.tif 000004
【０１３７】
【表３】
0005559049.tif 000005
【０１３８】
ここで明細書全体を通じて引用された文献は、その全体を本出願に引用して援用する。
【図１ａ】
0005559049.tif 000006
【図１ｂ】
0005559049.tif 000007
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ−１】
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【図２ｃ−２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【配列表】
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