(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤としてＳＲＰＩＮ３４０を、有効成分として含む、
哺乳類の患者の異常な脈管形成または血管新生促進ＶＥＧＦアイソフォームの過剰生成に関連する病気または障害の治療用または予防用の薬剤。
【請求項２】
哺乳類の患者の異常な脈管形成または血管新生促進ＶＥＧＦアイソフォームの過剰生成に関連する病気または障害の治療または予防の方法における使用のための、組成物であって、
前記組成物は、有効量の、請求項１で定義された前記ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤を、生理学的に許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤と共に、または混合物として含む、組成物。
【請求項３】
請求項１で定義された、前記ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤の、哺乳類の患者の抗血管新生治療用薬剤の製造における使用。
【請求項４】
請求項１に記載の薬剤であって、
前記病気または前記障害が、血管疾患、悪性および良性の組織異常増殖、腫瘍転移、炎症性障害、糖尿病、糖尿病性網膜症およびその他の糖尿病合併症、トラコーマ、水晶体後過形成、新生血管緑内障、加齢黄斑変性症、血管腫、移植角膜組織の免疫拒絶、眼球外傷または感染に関連する角膜血管新生、オスラー・ウェバー症候群、心筋血管新生、創傷肉芽化、血管拡張症、血友病、血管線維腫、血管拡張症乾癬強皮症、血管拡張性肉芽腫、冠状動脈副行、虚血肢脈管形成、皮膚潮紅、肥満、炎症性関節腫脹、血球新生、脈管形成、歯肉炎、アテローム性動脈硬化、子宮内膜症、新生内膜過形成、乾癬、男性型多毛、並びに、増殖性網膜症から選択される、薬剤。
【請求項５】
請求項２に記載された使用のための組成物であって、治療される前記病気または前記障害が、加齢黄斑変性症、悪性の組織異常増殖、腫瘍転移、腎臓疾患、または糖尿病性網膜
症である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生促進および抗血管新生治療およびそれらに使用される組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明において参照する刊行物の内容は、本発明の理解および実施に関連するあらゆる点に関して本願明細書に援用する。
【０００３】
血管新生（形成）は、西欧諸国におけるヒトおよびその他の哺乳動物の主要な病気の多くにおける重要な病理学的プロセスである。癌に加えて、例えば、血管新生は、血管疾患（アテローム斑の発生には脈管の脈管の増殖が必要である）、糖尿病、慢性関節リウマチ、増殖性網膜症の顕著な特徴である。臨床病理学における血管新生の優位性および（細胞分裂と比較して）通常の生理機能における比較的限定的な役割は、抗血管新生治療が、限定されないが特に生死にかかわる病気に罹患した患者において有効かつ一般に許容された治療法であり得るという提案を支持するものである。
【０００４】
ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体は８種類のエクソンから特異的にスプライスされ、血管新生促進性親透過性血管拡張因子として広く研究され、認められた少なくとも６種類のタンパク質をコードするｍＲＮＡを形成する（３８）。最も研究されているＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体は最終的な構造に１６５個のアミノ酸を有し、ＶＥＧＦ１６５と呼ばれている。２００２年には、ＶＥＧＦ遺伝子（図１Ａを参照）のエクソン８の３’ＵＴＲにおける特異的なスプライス受容部位選択によって生成された別のアイソフォーム（ＶＥＧＦ１６５ｂ）が同定され（２および国際公開第ＷＯ  ０３／０１２１０５号）、エクソン６の命名法を踏まえてエクソン８ａ（それ以前はエクソン８と呼ばれる）およびエクソン８ｂ（それ以前はエクソン９と呼ばれる）という２つのサブエクソンとなった（２４）。エクソン８ｂのスプライス受容部位への遠位スプライシングにより、１８個の塩基のオープンリーディングフレームが得られている。エクソン８ａおよび８ｂのオープンリーディングフレームは６個のアミノ酸をコードするものである（Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（エクソン８ａ）およびＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（エクソン８ｂ））。この選択的スプライシングにより、多種タンパク質としてヒトの細胞および組織で発現する（既存のアイソフォームと相補的な）ＶＥＧＦアイソフォームファミリーが予測された。現在は、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、およびＶＥＧＦ１８９ｂが同定されている（４２）。このファミリーはＶＥＧＦｘｘｘｂ（ｘｘｘはアミノ酸の数である（図１Ｂを参照））と呼ばれる。このＣ末端により、ＶＥＧＦ１６５ｂはＶＥＧＦ１６５によって誘発される血管内膜増殖、上皮移動、血管拡張（２）、生体内血管新生、腫瘍成長（５４）を抑制することができる。ＶＥＧＦ１６５ｂは線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）に誘発された内皮細胞成長または増殖に影響を与えないため、これらの効果はＶＥＧＦに特有のものと証明された。また、その他のあらゆるＶＥＧＦアイソフォームとは異なり、現在までに研究されている癌においてＶＥＧＦ１６５ｂはダウンレギュレートされている（腎細胞癌（２）、前立腺癌（５４）、結腸癌（５２）、悪性黒色腫（４４）を含む）。また、ＶＥＧＦスプライス変異発現は、増殖性眼病および子癇前症の血管形成性微小血管表現型において異なる（３、４２）。ＶＥＧＦ１６５ｂには受容体結合領域が存在しており、ＶＥＧＦ１６５ｂはＶＥＧＦ１６５の競合阻害剤として機能する。ＶＥＧＦ１６５ｂは受容体に結合するが、ＶＥＧＦ１６５によって活性化されたＶＥＧＦＲの完全なチロシンリン酸化を生じさせることはない（４、５４）。したがって、このアイソフォームは特異スプライシングによって形成された内因性抗血管新生剤であるように思われる。
【０００５】
本願明細書では、近位スプライス部位に隣接し、アミノ酸配列ＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）をコードするエクソン８の部分をエクソン８ａと命名し、遠位スプライス部位に隣接し、アミノ酸配列ＳＬＴＲＫＤ（配列番号２）をコードするエクソン８の部分をエクソン８ｂと命名する上述したＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８の選択的スプライス変異体の命名法を、例えば国際公開第ＷＯ  ０３／０１２１０５号（図４ａを参照、この参照によって開示に含まれるものとする）に使用されている従来の命名法（配列番号１をコードするエクソンをエクソン８と命名し、配列番号２をコードするエクソンをエクソン９と命名している）の代わりに使用する。
【０００６】
選択的スプライシングは、特定のエクソンを導入または置換したり、単一のコード配列から構造的および機能的に異なるタンパク質を生成することを可能とする特異的遺伝子発現メカニズムである（２７、４８）。従来の血管新生促進ファミリーを生じさせるＶＥＧＦの選択的スプライシングはその生体利用性の調節に重要であり、ヘパリン結合領域を含むエクソン６および７の有無は拡散型タンパク質の生成に影響を与えることが広く認められている（２４）。また、ＶＥＧＦ遺伝子の発現は、低酸素血症（４７）、成長因子およびサイトカイン（１８）（２９）（４０）（１）、ホルモン（４９、８）、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子（４５、３７）を含む様々な因子によって転写的に調節される。血管新生促進および抗血管新生ＶＥＧＦアイソフォームは様々な病状において血管新生の切り替えを調節するために重要であるが、ｍＲＮＡ  ＶＥＧＦ転写の調節とは異なり、ＶＥＧＦの選択的スプライシング、特にＣ’末端スプライシングを調節する分子および細胞経路についてはほとんど知られていない。これまでに刊行された１万８千を超えるＶＥＧＦに関する刊行物のうち、３つの刊行物のみがスプライシングの調節（制御）について調べている（３０、９、１２）。
【０００７】
ｍＲＮＡスプライシングは、スプライソソームを形成するスプライシングタンパク質（５）の媒介による転写（３６）時に発生する。しかしながら、スプライシングはスプライシング調節因子（ＳＲＦ）によって調節される。スプライシング調節因子としては、ｍＲＮＡ中のエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）への結合を調節するセリン／アルギニン残基（ＳＲ）タンパク質（例えば、９Ｇ８、ＳＦ２／ＡＳＦ、Ｓｒｐ４０、Ｓｒｐ５５）が挙げられる（５）。
【０００８】
一般的なスプライシングメカニズムは遺伝子的に調節することができる。すなわち、転写における塩基配列はスプライシング因子親和性に影響を与え（３３）、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼ１のＣ末端ドメインへのスプライシング因子の選択的なリクルートメントによって選択的スプライシングに影響を与える（２３）。現在では、シグナル伝達経路は環境信号に対応して選択的スプライシングに影響を及ぼすことができることが分かっている（１３、２６）。腫瘍における配列の突然変異は、理論的には異なるスプライシングをもたらし得る。しかしながら、ＶＥＧＦ１６５からＶＥＧＦ１６５ｂへのスプライシングは糸球体上皮細胞の分化によって示されており（１１）、このようなスプライシングは突然変異によるものではないと思われる。
【０００９】
ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＲＦスプライシングエンハンサーおよびサイレンサーに結合するイントロン配列およびエクソン配列を有する（２２）。エクソンのスプライシングは、ＳＦ２／ＡＳＦ、Ｓｒｐ４０、Ｓｒｐ５５、および９Ｇ８を含むＳＲタンパク質の活性バランスに依存する。また、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）等の成長因子はＶＥＧＦの発現を増加させることが示されているが、末端エクソンスプライス部位選択に対するそれらの作用は知られていなかった（１６、１８、３１、３４）。
【００１０】
我々は、ＶＥＧＦ末端エクソンスプライシングにおけるＳＲスプライシング因子、キナーゼ、および成長因子の潜在的な役割について調べた。
【００１１】
一態様において、本発明は、ＶＥＧＦのエクソン８の遠位スプライス部位（ｄｉｓｔａｌ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ（ＤＳＳ））選択に有利に作用する物質（（国際公開第ＷＯ０３／０１２１０５号の図１および図４ａおよび本願の図１を参照）が抗血管新生ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームに有利に選択的スプライシングを調節する際に重要な役割を果たすことができ（現在までに研究されている全てのＶＥＧＦアイソフォームに共通すると思われる作用）、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーおよび／またはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ（近位スプライス部位（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ））阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターが、抗血管新生治療において重要な治療活性を有するという知見に基づくものである。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦのエクソン８のＰＳＳ選択に有利に作用する物質（（国際公開第ＷＯ０３／０１２１０５号の図１および図４ａおよび本願の図１を参照）が血管新生促進ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームに有利に選択的スプライシングを調節する際に重要な役割を果たすことができ（現在までに研究されている全てのＶＥＧＦアイソフォームに共通すると思われる作用）、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサーおよび／またはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターが、血管新生促進治療において重要な治療活性を有するという知見に基づくものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
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【発明の概要】
【００１４】
第１の態様において、本発明は、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者に対して血管新生促進または抗血管新生治療を選択的に行う方法であって、ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時に、スプライシング制御剤を使用して選択的スプライシングを部位選択的に制御することを含み、前記プロセッシングにおいて近位スプライス部位（ＰＳＳ）スプライシングに有利に作用する１以上の制御剤を前記血管新生促進治療において使用し、前記プロセッシングにおいて遠位スプライス部位（ＤＳＳ）スプライシングに有利に作用する１以上の制御剤を前記抗血管新生治療において使用する方法を提供する。
【００１５】
ＰＳＳスプライシングは、ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン８ａによってコードされた配列番号１のアミノ酸配列の発現ＶＥＧＦのＣ末端領域への導入に有利に作用し、ＶＥＧＦの血管新生促進アイソフォームが通常発現する。
【００１６】
ＤＳＳスプライシングは、ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン８ｂによってコードされた配列番号２のアミノ酸配列の発現ＶＥＧＦのＣ末端領域への導入に有利に作用し、ＶＥＧＦの抗血管新生アイソフォームが通常発現する。
【００１７】
ＰＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤は、必要に応じて、ＤＳＳスプライシングを抑制または阻害する１以上の他の制御剤と共に使用することができる。
【００１８】
ＤＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤は、必要に応じて、ＰＳＳスプライシングを抑制または阻害する１以上の他の制御剤と共に使用することができる。
【００１９】
本発明に使用される制御剤は、必要に応じて、血管新生促進および抗血管新生治療の切り換えのために治療中に調節することができる。切り換えは血管新生促進治療から抗血管新生治療または抗血管新生治療から血管新生促進治療のいずれであってもよく、治療中に必要に応じて一度または繰り返して切り換えることができる。
【００２０】
血管新生促進および抗血管新生治療の切り換えを含む血管新生促進および／または抗血管新生治療の制御は、制御剤の一部に作用するか、制御関連プロセスを起こすか、制御剤と競合して制御剤の活性および／またはスプライス部位選択性を制御する補助剤または二次剤を使用して容易に行うことができる。あるいはまたは同時に、血管新生促進および／または抗血管新生治療の制御は、プロセスのために制御剤を選択することによって行うことができる。制御剤は、さらなる制御のために少なくとも１つの活性化または不活性化ドメインを含むことができる。さらなる詳細については、「制御剤」の節を参照されたい。
【００２１】
血管新生促進治療は、特にＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、およびＶＥＧＦ１８９の１以上（特にＶＥＧＦ１６５）の生成に有利に作用する。抗血管新生治療は、特にＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８３ｂ、およびＶＥＧＦ１８９ｂの１以上（特にＶＥＧＦ１６５ｂ）の生成に有利に作用する。
【００２２】
一実施形態において、治療は、従来の投与経路によって、抗血管新生治療を必要とする患者に、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターおよびそれらの組み合わせから選択される１以上の制御剤を有効な量で投与することによって行うことができる。投与経路は、例えば、経口投与、静脈内投与（ＩＶ）、筋肉内投与（ＩＭ）、腹腔内投与（ＩＰ）、動脈内投与、胸膜腔または膀胱等の腔への投与および眼または脳脊髄液（ＣＳＦ）への投与から選択することができる。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者の抗血管新生治療方法において使用される、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターまたはそれらの組み合わせを提供する。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者の抗血管新生治療方法において使用される組成物、例えば薬剤であって、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターまたはそれらの組み合わせを、生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共にまたは混合物として含む組成物を提供する。
【００２５】
第４の態様において、本発明は、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターまたはそれらの組み合わせの、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者の抗血管新生治療用薬剤の製造における使用を提供する。
【００２６】
本発明の第２、第３、第４の態様に関連して上述した制御剤の例としては、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β１、ＴＧＦ−βＲ１、ＳＲＰＫ１および／またはＳＲＰＫ２特異的阻害剤（例えば、ＳＲＰＩＮ３４０、ＳＲＰＫ１およびＳＲＰＫ２キナーゼの特異的阻害剤）、Ｔ細胞細胞内抗原−１（ＴＩＡ−１）、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６−活性化ＭＡＰキナーゼ（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ）、Ｃｄｃ２０様（Ｃｌｋ）ファミリーキナーゼＣｌｋ１／ｓｔｙ、Ｃｌｋ２、Ｃｌｋ３、Ｃｌｋ４、ＳＲスプライシング因子ＳＲｐ５５、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクター、ｍＲＮＡ前駆体のエクソン８ａのＰＳＳに結合するか、および／またはスプライシング調節タンパク質が結合するｍＲＮＡ前駆体の領域に結合して近位スプライシングを阻害する転写／翻訳ブロッキング剤（例えば、モルフォリノまたはその他の合成ブロッキング剤、共役ペプチド、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリおよびオリゴヌクレオチドブロッキング剤（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ））、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（例えば、ビスインドリルマレイミド（ＢＩＭ）、その他の機構的に類似するＰＫＣ阻害剤、特にＰＫＣ触媒領域で結合する阻害剤）またはそれらの組み合わせが挙げられる。本願明細書では、発現ベクターを含むそのような物質を「制御剤」と呼ぶ。さらなる詳細については、「制御剤」の節を参照されたい。
【００２７】
抗血管新生治療は、好ましくは、異常な脈管形成または血管新生促進ＶＥＧＦアイソフォーム（ＶＥＧＦｘｘｘ）の過剰生成に関連する病気および障害の治療または予防を含む。そのような病気および障害の例としては、血管疾患（例えば、血管収縮、血管収縮によって特徴付けられる障害、心臓血管疾患）、悪性および良性の組織異常増殖（例えば、脈管形成依存型癌（例えば、腫瘤型癌）、腫瘍転移、炎症性障害、糖尿病、糖尿病性網膜症およびその他の糖尿病合併症（例えば、糖尿病性血管新生）、トラコーマ、水晶体後過形成、新生血管緑内障、加齢黄斑変性症、血管腫、移植角膜組織の免疫拒絶、眼球外傷または感染に関連する角膜血管新生、オスラー・ウェバー症候群、心筋血管新生、創傷肉芽化、血管拡張症、血友病、血管線維腫、血管拡張症乾癬強皮症、血管拡張性肉芽腫、冠状動脈副行、虚血肢脈管形成、皮膚潮紅、肥満、炎症性関節腫脹（例えば、慢性関節リウマチ）、血球新生、脈管形成、歯肉炎、アテローム性動脈硬化、子宮内膜症、新生内膜過形成、乾癬、男性型多毛、増殖性網膜症が挙げられる。本発明に係る抗血管新生治療は、例えば化粧を目的として血管発達を阻害するために健康な患者に対して行われる非治療的な処置を含むことができる。
【００２８】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、治療は、従来の投与経路によって、血管新生促進治療を必要とする患者に、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターおよびそれらの組み合わせから選択される１以上の制御剤を有効な量で投与することによって行うことができる。
【００２９】
第５の態様において、本発明は、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者の血管新生促進治療方法において使用される、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターまたはそれらの組み合わせを提供する。
【００３０】
第６の態様において、本発明は、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者の血管新生促進治療方法において使用される組成物、例えば薬剤であって、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターまたはそれらの組み合わせを、生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共にまたは混合物として含む組成物を提供する。
【００３１】
第７の態様において、本発明は、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサー、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクターまたはそれらの組み合わせの、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者の血管新生促進治療用薬剤の製造における使用を提供する。
【００３２】
本発明の第５、第６、および第７の態様に関連して上述した制御剤の例としては、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−Ｒ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、選択的スプライシング因子／スプライス因子２（ＡＳＦ／ＳＦ２）、Ｓｒｐ４０、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体、上記物質を生体内において発現させるための発現ベクター、スプライシング調節タンパク質が結合するｍＲＮＡ前駆体のエクソン８ａのＤＳＳおよび／またはｍＲＮＡ前駆体の領域に結合して遠位スプライシングを阻害する転写／翻訳ブロッキング剤（例えば、モルフォリノまたはその他の合成ブロッキング剤、共役ペプチド、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリおよびオリゴヌクレオチドブロッキング剤（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ））、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはそれらの組み合わせが挙げられる。ＴＧ００３およびＳＢ２０３５８０等のＤＳＳを優先する制御剤の特異的阻害剤も、本発明の第５、第６、および第７の態様に関連して上述した制御剤として機能する。本願明細書では、発現ベクターを含むそのような物質を「制御剤」と呼ぶ。さらなる詳細については、「制御剤」の節を参照されたい。
【００３３】
血管新生促進治療は、好ましくは、脈管形成の異常減少または血管新生促進ＶＥＧＦアイソフォーム（ＶＥＧＦｘｘｘ）の異常な生成不足に関連する病気および障害の治療または予防を含む。そのような病気および障害の例としては、子癇前症、心筋梗塞、血管傷害、冠状動脈病、末動脈血行不全、虚血（実質臓器虚血を含む）、虚血性発作、口峡炎、脳血管損傷（例えば、卒中および頭部損傷）が挙げられる。また、血管新生促進治療は、例えば、代謝障害（例えば、糖尿病）、末梢血圧損傷（例えば、床ずれ）、外科手術（例えば、組織移植または補綴移植）を含む損傷後の損傷治療または組織培養法（例えば、外科手術で使用する皮膚シートの培養または移植のための組織修復用材料の製造）における血管再生を促進するために使用することもできる。また、血管新生促進治療は、哺乳動物（ヒトまたは家畜）の生殖（例えば排卵、受精、卵子着床、子宮内膜・卵巣機能および乳汁分泌）を治療的または非治療的に支援するために使用することもできる。哺乳動物の生殖を支援するための本発明の非治療的な使用の例としては、畜産および農業に関連する、排卵、受精および乳汁分泌の制御が挙げられる。本発明に係る血管新生促進治療は、例えば、運動競技およびスポーツにおける耐久力または運動能力を向上させたり、化粧を目的として血管新生を促進したりするために、ヒトに対して非治療的に使用することができる。
【００３４】
第８の態様において、本発明は、哺乳類の患者、限定されないが特にヒトの患者における血管形成に関連する症状または障害の診断または予後を容易化する方法であって、患者の身体組織または体液から標本を得、標本に対して試験を行うことにより、ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時にＰＳＳスプライシングに有利に作用するよう制御剤およびＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時にＤＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤の標本における、相対的な有無または相対的な有無の可能性を決定することを含む方法を提供する。標本における制御物質の有無は質的または量的に決定することができる。
【００３５】
標本において検出される制御剤は、上述したＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたは阻害剤、ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサーまたは阻害剤、それらの生体内活性剤、アップレギュレータ、増強剤、一次活性またはその作用の制御に有用な二次機能を有する上記物質の修飾体のいずれかであってもよい。標本における制御剤の相対的な有無の可能性は、例えば、制御剤の変異体（低活性または不活性）とは異なり、患者における自然発生物質の発現に影響を及ぼし得る患者における遺伝子突然変異体の分析によって検出することができる。
【００３６】
身体組織または体液の標本は、例えば、体毛、皮膚、侵襲的に得た生検組織、非侵襲的に得た生検組織、便、乳、血液、血清、唾液、脳脊髄液、粘液（例えば、口壁、舌または頚部等の粘膜から得た塗抹標本）、痰、尿または涙であってもよい。
【００３７】
標本の試験は、検出対象の制御剤に好適なアッセイ系を使用して行うことができる。好適なアッセイ系としては、例えばＥＬＩＳＡ等、サンドイッチ免疫測定法または競合免疫測定法等のイムノアッセイが挙げられ、特に、検出対象の標的物質に特異的なモノクローナル抗体を使用したイムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイでは、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、化学発光標識および導電率によって検出可能な標識から選択される検出可能な標識を通常は使用する。あるいはまたはさらに、検出対象の標的物質は、後述する特定の実験において詳述するように、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含むリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および／またはウェスタンブロッティングを使用して測定することができる。
【００３８】
本発明の第８の態様に係る方法に続いて、必要に応じて、患者の生化学の相対的な血管新生促進または抗血管新生傾向を評価するためにデータを使用することができ、症状または障害の進展、再発、進行または広がりの可能性を評価することができる。
【００３９】
本発明の第８の態様に係る方法は、例えば、本発明の第１〜７の態様の１以上に関連して上述した症状のいずれかの診断または予後を容易化するために使用することができる。特に、妊娠、損傷治療、子癇前症、癌（例えば、腫瘍状癌）、癌の転移、排卵不良、乳汁分泌、視力障害、関節破壊に関連した診断または予後が挙げられる。
【００４０】
本発明の第８の態様に係る方法に続いて、診断または予後に基づいて患者の症状を治療するように設計された治療計画を行うことができる。治療計画では、本発明の第８の態様に係る方法を必要に応じて繰り返して治療の進捗を監視および／または診断または予後を更新することができる。治療計画は、例えば、患者への従来の抗血管新生剤の投与または本発明の第１〜７の態様の１以上の適用またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００４１】
本発明の第８の態様に係る方法によれば、容易化する診断または予後は、例えば、抗血管新生薬、特にＶＥＧＦ遮断薬による患者の現在または今後の治療を考慮に入れることができる。本発明の第８の態様に係る方法が、ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時にＰＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤（ａ）およびＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時にＤＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤（ｂ）から選択される１以上の特異的自然発生制御剤の有無または有無の可能性を決定するための標本をターゲットとし、方法の結果が、患者が制御剤（ａ）の高いレベル、制御剤（ｂ）の高いレベル、制御剤（ａ）の１種以上の制御剤（ｂ）に対する比較的高いレベル、制御剤（ｂ）の１種以上の制御剤（ａ）に対する比較的高いレベルまたはその可能性を有することを示すものである場合には、抗血管新生薬、特にＶＥＧＦ遮断薬による患者の現在または今後の治療の有効性を予測することができる。
【００４２】
例えば、自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤が患者または組織において自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤よりも優位を占めている場合には、（抗血管新生）ＶＥＧＦｘｘｘｂを発現しやすい患者の体質を示すことになる。そのような患者は、抗血管新生ＶＥＧＦ遮断薬を使用した血管形成に関連する症状の治療に比較的抵抗力を有すると思われる。そのようなＶＥＧＦ遮断薬としては、例えば、乳癌、結腸癌、直腸癌等のある種の癌を治療するために使用され、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。
【００４３】
自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤が患者または組織において自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤よりも優位を占めている場合には、（血管新生促進）ＶＥＧＦｘｘｘを発現しやすい患者の体質を示している可能性がある。そのような患者は、抗血管新生ＶＥＧＦ遮断薬を使用した血管形成に関連する症状の治療に比較的影響を受けやすいと思われる。そのようなＶＥＧＦ遮断薬としては、例えば、乳癌、結腸癌、直腸癌等のある種の癌を治療するために使用され、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。
【００４４】
そのため、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β  Ｒ１、ＳＲＰＩＮ３４０、ＴＩＡ−１、ｐ３８  ＭＡＰＫ、Ｃｌｋ１／Ｓｔｙ、Ｃｌｋ２、Ｃｌｋ３、Ｃｌｋ４、ＳＲｐ５５、それらの自然発生活性剤、アップレギュレータ、増強物質から選択される１以上の自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤の遺伝子を有し、通常のタンパク質の発現が発生してＶＥＧＦｘｘｘの発現に有利に作用する患者は、癌およびヒト化抗ＶＥＧＦ抗体等のＶＥＧＦ遮断薬を使用する血管新生に関連するその他の病気および症状の治療に比較的抵抗力を有すると予想される。患者における遺伝子突然変異の調査が１以上の自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤の発現能力の欠陥を示す場合には上記予測は強固なものとなる。
【００４５】
一方、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β  Ｒ１、ＳＲＰＩＮ３４０、ＴＩＡ−１、ｐ３８  ＭＡＰＫ、Ｃｌｋ１／Ｓｔｙ、Ｃｌｋ２、Ｃｌｋ３、Ｃｌｋ４、ＳＲｐ５５、それらの自然発生活性剤、アップレギュレータ、増強物質から選択される１以上の自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤の遺伝子を有し、タンパク質の活性の低いまたは不活性な変異体が発現が発生してＶＥＧＦｘｘｘｂの発現に有利に作用する患者は、癌およびヒト化抗ＶＥＧＦ抗体等のＶＥＧＦ遮断薬を使用する血管新生に関連するその他の病気および症状の治療に比較的影響を受けやすいと予想される。患者における遺伝子の調査が１以上の自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤の通常の発現能力を示す場合には上記予測は強固なものとなる。
【００４６】
（ａ）ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時にＰＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤および（ｂ）ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時にＤＳＳスプライシングに有利に作用する制御剤から選択される１以上の特異的自然発生制御剤をコードする遺伝子の突然変異に関する試験は、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡハイブリダイゼーション等の従来の遺伝子型判定方法を使用して行うことができる。遺伝子型判定は、患者から切除した生検または腫瘍標本または患者から採取したその他の組織または体液標本に対して好適に行われる。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦ遮断薬（ベバシズマブ等）による患者の現在または将来の治療を考慮に入れ、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β  Ｒ１、ＳＲＰＩＮ３４０、ＴＩＡ−１、ｐ３８  ＭＡＰＫ、Ｃｌｋ１／Ｓｔｙ、Ｃｌｋ２、Ｃｌｋ３、Ｃｌｋ４、ＳＲｐ５５、それらの自然発生活性剤、アップレギュレータ、増強物質から選択される１以上の自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたはＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤（好ましくはＴＩＡ−１）に関連する患者の遺伝子変異の有無を調べて、前記１以上の自然発生ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサーまたは前記ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤に関連する患者の遺伝子変異の有無から治療に対する患者の感受性または抵抗性の可能性を決定することにより、例えば、乳癌、結腸癌、および直腸癌から選択される患者の癌の予後を容易化するために使用される。そのような方法により、無駄な医療サービスを回避すると共に、十分または全く治療に反応しない患者に対する効果がない治療を回避することができる。
【００４８】
また、本発明は、潜在的病巣または症状の血管新生促進または抗血管新生治療方法に対する感受性に関連する診断用薬剤および方法を開発するための原理を提供する。血管新生促進または抗血管新生スイッチは、例えば、糖尿病性網膜症（４２）および結腸癌（５２）等の同じ臨床的症状を有する患者において均一ではないことが分かっている。したがって、ＶＥＧＦｘｘｘ／ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォーム発現バランスを詳細に分析することにより、個々の患者の病巣または症状の治療または特定の治療に対する感受性を予測したり、個々の患者に合わせて治療を調製したりすることができ、治療有効性を増加させ、副作用または患者の副作用または治療の特定の結果（特に、その患者に関連する不耐、アレルギーまたは禁忌）を減少させることができる。
【００４９】
本発明の１以上の態様に関連して上述し、本発明の１以上の態様に関連して以下に説明および例示する詳細、例示および好ましい選択は、本発明の全ての態様に等しく適用される。
【００５０】
疑義を避けるため、本発明に使用される制御剤は、必要に応じて、ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシングにおけるＰＳＳまたはＤＳＳに有利に作用するか、ＰＳＳまたはＤＳＳを阻害する。したがって、本願明細書において使用される「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサー」、「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサー」、「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤」、および「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤」という用語は、成熟し、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを細胞質に導入する前に核においてＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端エクソン８から転写されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング（転写後修飾）に直接作用する制御剤を意味する。周知のように、核における転写後修飾は、選択的スプライシングの制御メカニズムに従った転写されたイントロンの除去およびエクソンの再連結を通常は含む。本発明におけるそのような制御メカニズムは、核スプライシング調節タンパク質および核においてプロセッシングを行うｍＲＮＡ材料に対する直接的な作用を含むと考えられる。
【００５１】
したがって、核の外で成熟ｍＲＮＡのみに作用する制御剤は、本発明に関連して使用する「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳエンハンサー」、「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳエンハンサー」、「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＰＳＳ阻害剤」、「ＶＥＧＦ−エクソン−８−ＤＳＳ阻害剤」とはみなされない。
【００５２】
［薬剤（ａｇｅｎｔ）］
スプライシング因子である薬剤の機能的に活性な類縁体および機能的に活性なフラグメントは、例えば、タンパク質結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメインまたはこれらのドメインの双方を含むことができる。そのような類縁体またはフラグメントは、必要に応じて１以上の他の活性分子（例えば、スプライシングアップレギュレータまたはダウンレギュレータ、あるいはＤＳＳとＰＳＳとの間で一方向または双方向にスプライシングを指示する分子）に共役していてもよい。そのような分子は、例えば、他のスプライシング因子またはＲＮＡ分解分子（ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含むことができる。
【００５３】
スプライシング因子である薬剤の機能的に活性な類縁体および機能的に活性なフラグメントは、例えば、タンパク質を活性化または不活性化することができるリン酸化ターゲットドメインを含むことができる。これにより、本発明を実施する際に薬剤をさらにある程度制御することができる。リン酸化ターゲットドメインは、例えば、一時的または永久的に活性化を防止するために、前記ドメインに対する特異結合パートナーによって永久的または可逆的に遮断されていてもよく、リン酸化ターゲットドメインを含む二次化合物が例えば過剰に存在してリン酸化のための主剤と競合し、主剤の活性化を効果的に制限してもよい。
【００５４】
キナーゼである薬剤の機能的に活性な類縁体および機能的に活性なフラグメントは、例えば、キナーゼ調節ドメイン、活性ドメインまたはこれらのドメインの双方を含むことができる。そのような類縁体またはフラグメントは、必要に応じて１以上の他の活性分子（例えば、スプライシングアップレギュレータまたはダウンレギュレータ、あるいはＤＳＳとＰＳＳとの間で一方向または双方向にスプライシングを指示する分子）に共役していてもよい。そのような分子は、例えば、他のスプライシング因子またはＲＮＡ分解分子を含むことができる。
【００５５】
当業者には明らかなように、本発明に使用される薬剤の所望の機能または機能の組み合わせを可能とするための補助剤または二次剤が、必要に応じて主剤と共に存在していてもよい。
【００５６】
スプライシング調節タンパク質が結合するｍＲＮＡ前駆体のエクソン８ａのＤＳＳまたはＰＳＳおよび／またはｍＲＮＡ前駆体の領域に結合して遠位または近位スプライシングをそれぞれ阻害する転写／翻訳ブロッキング剤としては、例えば、モルフォリノまたはその他の合成ブロッキング剤、共役ペプチド、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリおよびオリゴヌクレオチドブロッキング剤（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ））、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００５７】
エクソン８ａのＰＳＳを遮断するための好適なモルフォリノは、エクソン８ａの５’末端の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基数が２２〜２７のホスホロジアミデートモルホリノオリゴである。このようなモルフォリノの塩基配列は、例えば、３’−ＣＡＡＡＡＧＧＴＡＡＡＧＧＧＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＧ−５’（配列番号３）であってもよく、そのような配列と十分な相同性（例えば、少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％）の相同性）を有し、エクソン８ａ  ＰＳＳにおいてＶＥＧＦ遺伝子にハイブリダイズするものであってもよい。エクソン８ａのＤＳＳを遮断するための好適なモルフォリノは、エクソン８ａの３’末端の塩基配列と相補的な塩基配列を有する２２〜２７塩基のホスホロジアミデートモルホリノオリゴである。このようなモルフォリノの塩基配列は、例えば、３’−ＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＧＴＧＧ−５’（配列番号４）であってもよく、そのような配列と十分な相同性（例えば、少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％）の相同性）を有し、エクソン８ａ  ＤＳＳにおいてＶＥＧＦ遺伝子にハイブリダイズするものであってもよい。
【００５８】
本願明細書において使用する「モルフォリノ」という用語は、ｍＲＮＡ前駆体配列の一部にハイブリダイゼーションによる立体遮断を与えるが、非複製型ヌクレオチドの合成ブロッキング類縁体を意味する。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴはそのようなブロッキング剤のよく知られた例だが、「モルフォリノ」という用語はそのようなブロッキング剤に限定されるものではなく、合成分子骨格がＤＳＳまたはＰＳＳにおいてＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体にハイブリダイズすることができる塩基配列の基礎を提供し、本発明に係る選択的スプライシングメカニズムを調節する類似の非複製型ブロッキング剤も含むものである。
【００５９】
ＤＳＳまたはＰＳＳにおいてＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体にハイブリダイズして本発明に係る選択的スプライシングメカニズムを調節することができる好適なヌクレオチドブロッキング剤は、例えばｓｉＲＮＡであってもよい。
【００６０】
図１０Ｃは、本発明に係るＤＳＳスプライシングまたはＰＳＳスプライシングの選択を達成および制御する制御経路をまとめたものである。例えば、図１０Ｃに示すＳＲＰＩＮ３４０、ＳＢ２０３５８０、およびＴＧ００３を含む制御剤の阻害剤は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ前駆体のプロセッシング時の活性化およびスプライシングの方向を制御するために使用することができる。Ｃｌｋ／Ｓｔｙは遠位スプライシングに有利に作用し、近位スプライシングを阻害する。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β  Ｒ１、ｐ３８ＭＡＰＫ、Ｃｌｋ／Ｓｔｙ、およびＳＲｐ５５を介して遠位スプライシングに至る経路が判明している。ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−Ｒ、ＳＲＰＫ１、およびＡＳＦ／ＳＦ２を介して近位スプライシングに至る経路も判明している。ＳＲＰＩＮ３４０はＳＰＲＫ１を阻害する。ＴＧ００３はＣｌｋ／Ｓｔｙを阻害する。ＳＢ２０３５８０はｐ３８ＭＡＰＫを特異的に阻害する。図６に示すように、ＴＧＦ−β１に誘発されたＶＥＧＦｘｘｘｂの発現は、ＰＤ９８０５９によるｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼリン酸化の阻害の影響を受けず、ＴＧ００３（スプライシング因子のリン酸化によるスプライシング制御に関係するキナーゼのＣｌｋファミリーの阻害剤）はＴＧＦ−β１に誘発されたＶＥＧＦｘｘｘｂの発現を阻害した。これらの結果は、ＴＧＦ−β１はｐ３８  ＭＡＰＫおよびＣｌｋキナーゼを介してＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームの合成を促進することを示している。
【００６１】
機能的なフラグメントおよび類縁体を含む本発明において使用する非ベクター薬剤は、従来の方法によって適当な宿主細胞のトランスフェクションによってゲノム外因性ＤＮＡ、適当なプロモーターおよび必要に応じてその他の制御配列を導入し、適当な増殖培地内で細胞を培養し、発現したタンパク質を回収することによって好適に得ることができる。そのような方法の一例を以下に説明する。非ベクター薬剤のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は知られており、様々な分子ドメインの機構および機能性は十分に立証されているため、本願明細書の教示にしたがって本発明に使用する薬剤を選択することは容易である。発現した分子の活性についての試験は、後述する実施例に示す方法で簡単に行うことができる。
【００６２】
ベクター薬剤は、ゲノム外因性ＤＮＡ、適当なプロモーターおよび必要に応じてその他の制御配列を含む組換ウイルスとして調製し、一般に知られている方法によって既知のヌクレオチドおよびアミノ酸配列から再び開始する。さらなる詳細については、「遺伝子療法」の節を参照されたい。
【００６３】
［組成物および投与］
本発明に係る活性物質は、活性物質および適当な追加成分を含む組成物として投与することができる。組成物は、例えば、非経口投与（例えば、注射、埋込または注入）に適した医薬組成物（薬剤：ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）であってもよい。あるいは、組成物は、例えば、食品、サプリメント食品、飲料またはサプリメント飲料であってもよい。
【００６４】
本発明において使用する「医薬組成物」または「薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）」という用語は、活性物質と、１種以上の薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を意味する。組成物は、投与形態に応じて、希釈剤、助剤、賦形剤、保存剤、充填剤、分解剤、保湿剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、調味料、香料、抗菌剤、抗かび剤、潤滑剤、および調合剤から選択される成分をさらに含むことができる。組成物は、例えば、錠剤、糖剤、粉末、エリキシル剤、シロップ、懸濁液、噴霧剤、吸入剤、錠剤、トローチ、エマルション、溶液、カシェ剤、細粒、カプセル、および坐剤を含む液状製剤、リポソーム製剤を含む注射用液状製剤であってもよい。製薬方法および処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版に記載されている。
【００６５】
液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルションを含む。例えば、水または非経口注入用の水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。また、液状製剤はポリエチレングリコール水溶液中の溶液であってもよい。
【００６６】
また、使用直前に経口投与または非経口投与のために液体製剤とする固体製剤も挙げられる。そのような液体製剤は、溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。これらの特定の固体製剤は単位用量で調製され、一回の液体単位用量となるように使用される。あるいは、液体の形態に変換させた後に、注射器、ティースプーンまたはその他の容器または装置を使用して所定量の液体の製剤を測定することによって複数回分の液体単位用量を得るように十分な量の固体製剤とすることもできる。液体化する固体製剤は、活物物質に加えて、香味剤、着色剤、安定化剤、緩衝剤、人工または天然甘味剤、分散剤、増粘剤、溶解剤等を含むことができる。液体形態の製剤を調製するために使用する液体は、水、等張水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール等またはそれらの混合物であってもよい。使用する液体は、投与経路を考慮して選択する（例えば、大量のエタノールを含有する液状製剤は非経口投与には適していない）。
【００６７】
本願明細書において使用する「食品」、「サプリメント食品」、「飲料」、および「サプリメント飲料」という用語は、これらの用語の通常の意味を有し、薬剤に限定されるものではない。また、その他の形態の組成物も本発明の範囲に含まれる。例えば、純粋または実質的に純粋な化合物、水和可能な粉末等の食品前駆体、水、牛乳またはその他の液体に分散可能な粉末等の飲料前駆体が挙げられる。
【００６８】
用量は、患者の状態、治療する症状の深刻度、および使用する化合物に応じて変更することができる。特定の状況のための適切な用量の決定は当業者の能力の範囲内である。通常、化合物の最適な量より少ない用量で治療を開始する。次に、最適な効果が得られるまで用量を少しずつ増加させる。必要に応じて、１日の用量を分割して投与することができる。
【００６９】
［遺伝子療法］
本発明は、遺伝子療法を使用して実施することもできる。遺伝子療法は当技術分野において知られており、本発明はそのような公知の方法で好適に実施することができる。以下に概要を説明する。
【００７０】
遺伝子療法は、生体内療法（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）療法に大きく分類される。生体内遺伝子療法は、治療遺伝子を体内に直接導入することを含み、生体外遺伝子療法は、生体外で標的細胞を培養し、遺伝子を細胞に導入し、遺伝子組み換え細胞を体内に導入することを含む。
【００７１】
遺伝子導入技術は、ウイルスを担体として使用するウイルスベクター導入法、合成リン脂質または合成カチオン性ポリマーを使用する非ウイルス導入法、およびエレクトロポレーションまたは一時的な電気刺激を細胞膜に与えることによって遺伝子を導入する物理的な方法に大別される。
【００７２】
これらの遺伝子導入技術のうち、ウイルスベクター導入法が遺伝子療法に好ましいと考えられる。これは、治療遺伝子を置換した遺伝子を有し、複製能の一部または全てを失ったベクターを使用して遺伝因子を効率的に導入することができるためである。ウイルス担体またはベクターとして使用されるウイルスの例としては、ＲＮＡウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）およびＤＮＡウイルスベクタ（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）が挙げられる。また、単純ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター等も例として挙げられる。これらのうち、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターは特に盛んに研究されている。
【００７３】
宿主細胞のゲノムに組み込まれるレトロウイルスの特徴は、人体に無害であることだが、組み込みによって正常細胞の機能を阻害することができる。また、レトロウイルス様々な細胞を感染させ、迅速に増殖し、外来遺伝子の約１〜７ｋｂを受容することができ、複製欠乏性ウイルスを製造することができる。しかし、レトロウイルスは、有糸核分裂後に細胞を感染させにくく、生体内で遺伝子を導入することが難しく、体細胞組織を常に生体内で増殖させることが必要であるという欠点を有する。また、レトロウイルスはプロトオンコジーン（がん原遺伝子）に組み込むことができるため、突然変異のリスクを有し、細胞壊死を引き起こす場合がある。
【００７４】
一方、アデノウイルスはクローニングベクターとして使用するための様々な利点がある。すなわち、アデノウイルスは適度な大きさを有し、細胞核内で複製でき、臨床的に無毒である。また、アデノウイルスは外来遺伝子が導入されても安定であり、遺伝子の再編成または損失を引き起こさず、真核生物を形質転換させることができ、宿主細胞の染色体に組み込まれた場合でも非常に安定して発現する。アデノウイルスに適した宿主細胞は、ヒトの血液生成、リンパ腫、および骨髄腫を引き起こす細胞である。しかし、これらの細胞は直鎖ＤＮＡであるため、増殖は困難である。また、感染したウイルスを回収することは容易ではないと共にこれらの細胞は低いウイルス感染率を有する。また、導入された遺伝子の発現は１〜２週間後に最も高くなり、いくつかの細胞では発現は約３〜４週間しか維持されない。さらに、免疫抗原性が高いという問題がある。
【００７５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は上述した問題を克服することができると共に遺伝子治療薬として使用する場合に多くの利点を有し、最近は好ましいと考えられている。ＡＡＶ（一本鎖プロウイルス）は複製のためにアシスタントウイルスを必要とし、ＡＡＶゲノムは、４６８０ｂｐのサイズを有し、被感染細胞の第１９染色体のあらゆる部位に挿入することができる。形質転換遺伝子は、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびシグナル配列のそれぞれの１４５ｂｐに連結されたプラスミドＤＮＡに挿入される。この遺伝子は、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現させる別のプラスミドＤＮＡによって感染させ、アデノウイルスをアシスタントウイルスとして添加する。ＡＡＶは、遺伝子を導入する宿主細胞の範囲は広く、繰り返し投与による免疫副作用がほとんどなく、遺伝子発現時間が長いという利点を有する。また、ＡＡＶゲノムが宿主細胞の染色体に組み込まれた場合でも安定しており、宿主細胞における遺伝子発現の変異または再編成を引き起こさない。ＣＦＴＲ遺伝子を含むＡＡＶベクターは、１９９４年に嚢胞性繊維症の治療のためにＮＩＨによって承認されて以来、様々な病気の臨床治療に使用されている。血液凝固因子であるＩＸ因子の遺伝子を含むＡＡＶベクターは血友病Ｂの治療に使用されており、ＡＡＶベクターを有する血友病治療薬の開発が現在行われている。また、様々な抗ガン性遺伝子を含むＡＡＶベクターは腫瘍ワクチンとして認可されている。
【００７６】
遺伝子の導入および発現によって病気を治療する方法である遺伝子療法は、薬物療法とは異なり、ある遺伝子を調節するために使用される。遺伝子療法の目的は、生きた遺伝子を組み換えることによって有用な治療効果を得ることである。遺伝子療法は、病気部位への遺伝因子の正確な導入、生体内での遺伝因子の完全な分解、毒性および免疫抗原性がないこと、ならびに遺伝因子の長期間にわたる安定な発現という利点を有しているため、本発明に関連して潜在的に好適な治療経路として注目される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】（Ａ）ヒトＶＥＧＦ遺伝子のエクソンマップおよび（Ｂ）異なるＶＥＧＦアイソフォームをもたらすエクソンスプライシングパターンを示す。
【図２】（Ａ）網膜色素性上皮（ＲＰＥ）細胞および（Ｂ）腎糸球体上皮細胞（有足細胞）におけるＶＥＧＦｘｘｘｂおよびＶＥＧＦｘｘｘタンパク質の発現に対するＩＧＦ−１の作用を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図３】ＲＰＥ細胞における（Ａ）ＶＥＧＦ１６５ｂおよび（Ｂ）ＶＥＧＦ１６５の発現に対するＩＧＦ−１の作用を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図４】（Ａ）各タンパク質の有足細胞溶解物のＥＬＩＳＡ分析および（Ｂ）溶解物の非還元ウェスタンブロッティングによる有足細胞におけるＶＥＧＦｘｘｘｂおよびＶＥＧＦｔｏｔａｌの発現に対するＴＧＦ−β１の作用を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図５】（Ａ）ＴＧＦ−β１によるＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームのアップレギュレーションがない場合および（Ｂ）ＴＧＦ−β１によるＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームのアップレギュレーションがある場合の、ｐ３８−ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０による処理後のＶＥＧＦｘｘｘｂのための有足細胞溶解物のＥＬＩＳＡ分析による有足細胞のＶＥＧＦ末端エクソンにおける遠位スプライス部位選択に対するｐ３８−ＭＡＰＫの作用を示す（（Ｃ）は溶解物の還元ウェスタンブロッティング）（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図６】（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ、（Ｂ）ウェスタンブロッティング、（Ｃ）ＥＬＩＳＡ分析による有足細胞におけるｐ３８−ＭＡＰＫ、ｐ４２／ｐ４４−ＭＡＰＫ、ｃｌｋ−１／４による遠位スプライス部位選択の調節を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図７】ＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端におけるエクソンスプライシングエンハンサ（ＥＳＥ）コンセンサス配列の分布を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図８】（Ａ）細胞溶解物のウェスタンブロッティングおよび各スプライシング因子について測定する細胞溶解物（上清）のＥＬＩＳＡ分析によるＲＰＥ細胞における、ＶＥＧＦアイソフォームの生成に対するある種のスプライシング因子の過剰発現の作用、（Ｂ）生成した総ＶＥＧＦアイソフォームの変化、（Ｃ）生成したｂアイソフォームの変化、および（Ｄ）コントロールと比較したＶＥＧＦｘｘｘｂに対する全ＶＥＧＦの割合を示す（（Ｃ）は溶解物の還元ウェスタンブロッティング）（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図９】（Ａ）図８ＡおよびｐｃＤＮＡ３コントロールのウェスタンブロッティングおよび（Ｂ）対照と比較したＶＥＧＦ１６５ｂに対するＶＥＧＦ１６５の割合を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１０】（Ａ）図に示す所定の処理後において、有足細胞におけるコントロールと比較したＶＥＧＦｘｘｘｂの生成（ＥＬＩＳＡ）、（Ｂ）図に示す異なる濃度におけるＩＧＦによる所定の処理および１００ｎＭ  ＩＧＦおよびＳｅｒｐｉｎ  ３４０を用いた治療による処理後において、有足細胞におけるコントロールと比較したＶＥＧＦｘｘｘｂの生成（ＥＬＩＳＡ）、（Ｃ）観察されたスプライシング選択パターンを生じさせる活性化および阻害効果を示す図である（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１１】分化有足細胞におけるＳＲＰＫ１およびＶＥＧＦ１６５ｂのレべルのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１２】ＩＧＦによる処理後の有足細胞における近位スプライシングの程度のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１３】ＩＧＦによる処理後の有足細胞における近位スプライシングの程度のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１４】エクソン８のＶＥＧＦスプライス部位選択の調節に対する有足細胞のＳＲｐ５５トランスフェクションおよびＳＲｐ５５を標的とするｓｉＲＮＡの作用を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１５】ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡに対する結腸癌細胞のＴＩＡ−１トランスフェクションの作用を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１６】ＰＳＳおよびＤＳＳモルフォリノの標的となるエクソン８ａおよび８ｂの部分を示す（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１７】ＶＥＧＦ１６５ｂの発現に対するヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞のＤＳＳ標的モルフォリノ処理の作用を示し、（ａ）はモルフォリノの作用位置を示す配列図であり、（ｂ）はＲＴ−ＰＣＲを使用して調べたモルフォリノの作用の結果であり、（ｃ）はＶＥＧＦ１６５に対するＶＥＧＦ１６５ｂの割合に関する（ｂ）の定量結果である（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１８】ＶＥＧＦ１６５ｂの発現に対するＨＥＫ細胞のＰＳＳ標的モルフォリノ処理の作用を示し、（ａ）はモルフォリノの作用位置を示示す配列図であり、（ｂ）はＲＴ−ＰＣＲを使用して調べたモルフォリノの作用の結果であり、（ｃ）はＶＥＧＦ１６５に対するＶＥＧＦ１６５ｂの割合に関する（ｂ）の定量結果である（詳細は説明文および後述の説明を参照）。
【図１９】様々なヒト胚組織におけるＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームの発現の顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
図面を参照して本発明の実施形態について説明する。
【００７９】
以下の説明では、実施例には番号を付けていない。材料および方法について最初に説明した後、図面に示す結果について考察する。
【００８０】
図面に含まれる説明文は以下の説明の一部をなすものであり、適宜参照する。それらの説明文の内容は本願明細書の一部をなすものである。
【００８１】
［序］
異なる生体利用性および活性を有する１２種類のＶＥＧＦのスプライス変異体がこれまでに同定されているが（図１）、ＶＥＧＦのｍＲＮＡスプライシングのメカニズムについてはほどんど研究が行われていない。
【００８２】
これは、Ｃ’末端ＶＥＧＦスプライシングに対する公知のスプライシング因子およびその他の制御剤の作用および組織の血管形成性表現型に深く影響を及ぼし得る過程を考察する最初の研究である。
【００８３】
［材料］
研究では、ヒト網膜色素性上皮細胞（ＲＰＥ細胞）およびヒト増殖型条件的不死化有足細胞（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ（ＰＣＩＰ））を使用した。これらの細胞は、構成的にＶＥＧＦｘｘｘおよびＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームを形成することが知られている（１１）。
【００８４】
公知のスプライシング因子（ＳＲｐ４０、ＡＳＦ／ＳＦ２、ＳＲｐ５５、９Ｇ８）およびその他の環境的な刺激（ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ）に対するこれらの細胞の応答について試験を行い、これらの制御剤および刺激がＶＥＧＦｘｘｘおよびＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームファミリーの相対（特異）発現に影響を与え得るという仮説について調べた。
【００８５】
図１５に関連する研究では１０ＣおよびＬＳ１７４ｔヒト結腸癌細胞を使用した。通常、これらの細胞は比較的低いレベルのＶＥＧＦ１６５ｂアイソフォームを発現する。
【００８６】
図１６〜１８に関連する研究ではＨＥＫ細胞を使用した。
【００８７】
図１９に関連する研究では、１４週間のヒト胚（皮膚の場合には８週間および１６週間）から得た以下の組織を使用した（図において、左上の写真から右下の写真の順（上から下へ、各行において左から右へ）：脊椎、前角、後根神経節、頚静脈、頚静脈、脳（後部）、リンパ節、リンパ内皮、皮膚、骨（矢印で示す骨膜と造骨細胞）、食道、気管、脈絡集網、眼、網膜色素性上皮。
【００８８】
［方法］
（網膜色素性上皮（ＲＰＥ）細胞の培養）
｛調製｝
ヒトのドナーの眼を死後１０〜３０時間以内にブリストルアイバンク（ブリストル、イギリス）から入手した。眼球から切除した脈絡膜ＲＰＥを少量のダルベッコ変性イーグル培地中で断片化した（ハムＦ１２混合物（ＤＭＥＭ：Ｆ１２）（１：１）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（ギブコ）およびＲＰＥ細胞を０．３ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（ギブコ）による消化（３７℃、１５分間）によって単離）。ＲＰＥ細胞は最初に２．５％ｖ／ｖ胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ギブコ）の存在下で５日間培養して線維芽細胞の増殖を防止し、細胞培養液を得た。細胞培養液をＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）内で保持し、１０％ｖ／ｖ  ＦＢＳおよび抗生物質／抗真菌性溶液（シグマ）を添加した。細胞は均質であり、抗サイトケラチンモノクローナル抗体（シグマ）を使用した免疫組織化学測定によればＲＰＥのみを含んでいた。ＲＰＥの培養液をトリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ、シグマ）によって二次培養した。３〜４回目のＲＰＥ細胞をペトリ皿（１２．５ｃｍ２）（ヌンク）に入れ、７０〜８０％の密集度に達するまで放置した。
【００８９】
｛試験｝
アゴニストの作用を調べるために、アゴニストの刺激前に、ＦＢＳの非存在下でＲＰＥ細胞を新たに取り替えた培地内で２４時間培養した。ＩＧＦ−１（シグマ）およびＴＮＦ−α（シグマ）を無血清培地内で調製し、２ｍｌを様々な濃度で添加した（以下の説明を参照）。刺激後の細胞の視覚化時には細胞形態の変化は見られなかった。２４時間後、全ての実験処理における馴化培地を回収し、スピンダウンして砕片を除去し、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法を行うまで−８０℃とした。ＲＰＥ細胞は氷冷ＰＢＳによって３回洗浄し、ウェスタンブロッティング法のためにＬａｅｍｍｌｉバッファに溶解させた。
【００９０】
（有足細胞培養）
｛調製｝
不死化ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）  Ｔ抗原の温度感受性突然変異体を用いて正常ヒト有足細胞から条件的に形質転換した細胞株から増殖型条件的不死化有足細胞（ＰＣＩＰ）を得た。３３℃の許容温度においてＳＶ４０  Ｔ抗原は活性であり、細胞は急速に増殖することができる（４６）。Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）内において、ＲＰＭＩ−１６４０（登録商標）培地（シグマ）（１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清）、１％ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）（シグマ）、０．５％ＰＳＳ（ペニシリンストレプトマイシン溶液）（シグマ））でＰＣＩＰを培養し、９５％の密集度まで成長させた。細胞を６ウェルプレートに分け（１×１０４細胞／ウェル）、９５％の密集度まで成長させた。
【００９１】
｛試験｝
また、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が培養したＰＣＩＰからのＶＥＧＦアイソフォームの産生に与える時間・用量依存的な作用について調べた。処理の２４時間前に、培地を１％ＩＴＳ（シグマ）および０．５％ＰＳＳ（シグマ）を含む無血清ＲＰＭＩ−１６５４培地（シグマ）と交換した。次に、培地を、１％（シグマ）および０．５％ＰＳＳ（シグマ）を含み、ＩＧＦ−１（シグマ）またはＴＧＦ−β１（シグマ）または４０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ（シグマ）の濃度を増加させた無血清ＲＰＭＩ−１６５４新鮮培地（シグマ）と交換した。馴化培地を、刺激（ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β１）から２４または４８時間後および４８時間後（ＰＤＧＦ）に回収した。
【００９２】
（スプライシング因子侯補のトランスフェクションに続くタンパク質生成の評価）
ＲＰＥ細胞を６ウェルプレート（３×１０５細胞／ウェル）内で成長させ、リポフェクトアミン（インビトロジェン）を使用して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＳＲｐ４０、ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＦ／ＳＦ２、ｐｃＤＮＡ３−ＳＲｐ５５、ｐｃＤＮＡ３−９Ｇ８または空の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３を使用してトランスフェクトした。３７℃で４８時間培養後、馴化培地を回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１．５％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖグリセリン、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含むバッファに細胞を溶解した。細胞溶解物内においてＶＥＧＦアイソフォームを測定するか、馴化培地をＥＬＩＳＡ法を使用して測定し、ウェスタンブロッティング法によってタンパク質生成を評価した。
【００９３】
（馴化培地ＶＥＧＦ測定）
ＲＰＥ馴化培地における総ＶＥＧＦ濃度は、ＤｕｏＳｅｔ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）を使用してメーカーの指示にしたがって測定した。ＶＥＧＦｘｘｘｂは、組替えヒトＶＥＧＦ１６５ｂ（Ｒ＆Ｄ）を用いたこのアッセイ系構築のための標準曲線を使用して、ＶＥＧＦ１６５ｂの９個の末端アミノ酸に対するモノクローナルビオチン化マウス抗ヒト抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＭＶＲＬ５６／１）を捕捉するために使用する同様のサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。ＭＶＲＬ５６／１抗体は、市販されているアフィニティー精製したマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体であり、特性分析されている（４２、５４）。ＭＶＲＬ５６／１抗体は組換えＶＥＧＦ１６５ｂに結合し、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９ｂ、ＶＥＧＦ１２１ｂ  ＶＥＧＦ１８３ｂ、ＶＥＧＦ１４５ｂ（ＶＥＧＦｘｘｘｂ）の発現を示すが、ＶＥＧＦ１６５の発現は示さない。ウェスタンブロッティング法により、この抗体によって認識された全てのタンパク質がＶＥＧＦ１６５に対する市販の抗体によって認識されることが示されており、この抗体はＶＥＧＦｘｘｘｂに特異的であることを示している（５４）。
【００９４】
ＲＰＥ細胞の上清内の遊離ＶＥＧＦｘｘｘｂのレベルは比較的低いため、ＶＥＧＦｘｘｘｂのＥＬＩＳＡでは馴化培地内の全タンパク質をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させた。このために、２５０μｌの氷冷した２４％ＴＣＡおよび６．２５μｌの２％デオキシコール酸ナトリウムを７００μｌの馴化培地に添加し、氷上で１５分間放置した。５０００ｘｇで１０分間遠心分離を行った後、ペレットを回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１．５％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖグリセリン、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含むバッファに懸濁させた。ペレット化試料のｐＨは１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）によって７．４に調節した。ペレットの総タンパク質含有量はビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（シグマ）を使用して従来の方法によって測定した。
【００９５】
（ウェスタンブロッティング）
タンパク質試料をＬａｅｍｍｌｉバッファに溶解し、３〜４分間沸騰させ、２０，０００ｇで２分間遠心分離して不溶性物質を除去した。１レーン当たり１５μｇのタンパク質を硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）（１２％）によって分離し、０．２μｍのニトロセルロース膜に移した。膜は、ｐａｎＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ２９３、１：５００）、ＶＥＧＦｘｘｘｂ（インハウスクローン、５６／１；１：２５０）、β−チューブリン（シグマ、１：２０００）に対する抗体を使用して一晩（４℃）プローブした。次に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役抗体でインキュベートし、免疫反応バンドを促進化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して視覚化した。ｐａｎＶＥＧＦおよびＶＥＧＦｘｘｘｂに対応する免疫反応バンドを画像分析によって定量化し、β−チューブリンの免疫反応バンドに正規化した。
【００９６】
（統計分析）
フリードマン試験（ダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ））を使用して生データに対して統計分析を行い、０．５未満のｐ値が統計的に有意であるとみなした。値は±ＳＥ（標準誤差）として表す。全てのデータにおいて、ｎは異なるドナーに由来する個別のＲＰＥ細胞集団の数を表す。
【００９７】
（結果）
｛ＩＧＦ−１およびＴＮＦ−αによる抗血管新生ＶＥＧＦアイソフォームから血管新生促進ＶＥＧＦアイソフォームへのスプライシング切り替え｝
ＩＧＦ−１、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１等の成長因子はＶＥＧＦの発現を増加させることが示されているが、末端エクソンスプライス部位選択に対するそれらの作用は知られていなかった（１６、１８、３１、３４）。試験を行った両方の上皮細胞（ＲＰＥ細胞および有足細胞）において、ＩＧＦ−１による処理によって総ＶＥＧＦ発現が大きくアップレギュレートされたが、アップレギュレーションは血管新生促進ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームに限られていた（図２）。ＲＰＥ細胞では、１００ｎＭ  ＩＧＦ−１において総タンパク質含有量ＶＥＧＦｔｏｔａｌが、２１７±１１２ｐｇ／ｍｇタンパク質から１６５６±４４８ｐｇ／ｍｇタンパク質に用量に依存して増加した（Ｎ＝６、ｐ＜０．０５  ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１直線傾向の試験、図２Ａ）。このような増加は、１３８±１１７ｐｇ／ｍｇタンパク質から１５９２ｐｇ／ｍｇタンパク質へのＶＥＧＦｘｘｘのアップレギュレーションおよび７８±１２ｐｇｍｇタンパク質から６４±１４ｐｇ／ｍｇタンパク質へのＶＥＧＦｘｘｘｂのダウンレギュレーションによるものである。そのため、ＶＥＧＦの８０±３２％をＶＥＧＦｘｘｘｂとして生成していた細胞が、ＩＧＦ−１処理後にはＶＥＧＦの５±２０％のみをＶＥＧＦｘｘｘｂとして生成するように、ＩＧＦが発現切り替えを引き起こした。
【００９８】
同様の作用は、別の上皮細胞である有足細胞でも見られた。これらの細胞は、コントロールと比較して、ＶＥＧＦ１６５ｂレべルの減少および総ＶＥＧＦレべルの有意な増加を示した（図２Ｂ）。ウェスタンブロッティング法を使用して、ＩＧＦ−１がそれぞれのファミリーのＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１６５ｂアイソフォームの調節を変化させたか否かを決定した。図３Ａは、１００ｎＭ  ＩＧＦがＲＰＥ細胞（図３Ａ）におけるＶＥＧＦ１６５ｂをダウンレギュレートしたことを示しており（図３Ａ）、ローディング管理（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して総ＶＥＧＦが増加している（α−アクチン、図３Ｂ）。他のサイトカインによってアイソフォームの切り替えが引き起こされるか否かを決定するために、ＲＰＥ細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α内で培養し、タンパク質を回収した。ＴＮＦ−αにより、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームのアップレギュレーション（１８２±８３ｐｇ／ｍｇタンパク質から８２５±３６６ｐｇ／ｍｇタンパク質（ｐ＜０．０５、平均増加：４．５±２．０倍（ｎ＝３））が生じた。一方、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αでは、ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームは（ｐ＜０．０５）は９９±２６ｐｇ／ｍｇから４２±１３ｐｇ／ｍｇタンパク質へと大きくダウンレギュレートされた（４６±３％の減少）。
【００９９】
｛ＴＧＦ−βによる抗血管新生ＶＥＧＦアイソフォームの切り替え｝
ＴＧＦ−β１は、他の遺伝子のスプライシングの調節に関与することが分かっている（例えば、テネイシン（５６）、プロコラーゲンII型（５０））。したがって、ＴＧＦ−β１がＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのスプライシングに影響を与えるか否かを調べた。
【０１００】
ＩＧＦ−１およびＴＮＦ−αと比較して、ＴＧＦ−β１（０．５ｎＭ、１ｎＭ）によって４８時間培養した場合には、ＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質レべル（２．９±１．４倍および７．２±４．７倍、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１、ダネット検定）および総ＶＥＧＦタンパク質発現（それぞれ２．２５±０．６５倍および４．６３±０．６１倍、ｐ＜０．００１、ダネット検定、図４）が大きく増加した。そのため、１ｎＭ  ＴＧＦ−βでＶＥＧＦｘｘｘ発現レベルが７０±７％低下した。アイソフォームがＶＥＧＦ１６５ｂアイソフォームおよびＶＥＧＦ１６５アイソフォームによって変化したか否かを決定するために、細胞溶解物に対してウェスタンブロッティング法を行った。図４Ｂは、やや還元性の条件において、ＶＥＧＦ１６５ｂおよびＶＥＧＦ１２１ｂアイソフォームが０．５ｎＭおよび１ｎＭ  ＴＧＦ１−β１によってアップレギュレートされたことを示している。また、ＶＥＧＦ１２１ｂのアップレギュレーションの証拠も示している。
【０１０１】
｛ＶＥＧＦ１６５ｂスプライシングがサイトカインによって調節される細胞内メカニズム｝
ＴＧＦ−β１は、スプライシングの調節に関与するｐ３８−ＭＡＰＫ経路（２１）を活性化することが分かっている（例えば５１および３２）。この経路がＴＧＦ−βによるスプライシングの調節に関与するか否かを決定するために、有足細胞をｐ３８−ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０と共に培養した。ＳＢ２０３５８０による処理によって、ＶＥＧＦ１６５ｂの発現が８５０±５０ｐｇ／ｍｇタンパク質から４５０±８０ｐｇ／ｍｇまで大きくダウンレギュレートされたが（図５Ａ）、ＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの発現は増加せず、この実験では未処理細胞またはＳＢ２０３８２０処理細胞において検出限界未満だった。また、ＴＧＦ−βは、ＳＢ２０３８２０処理細胞の存在下においてＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームまたはＶＥＧＦｘｘｘアイソフォームの発現を増加させなかった（図５Ｂ）。ウェスタンブロッティング法により、ＴＧＦ−β１でアップレギュレートされた主要なアイソフォームがＶＥＧＦ１６５ｂであり、ＳＢ２０３８２０によって阻害されたことが示された（図５Ｃ）。
【０１０２】
ＴＧＦ１−β１による変化がｍＲＮＡレベルであり、阻害剤の作用がｍＲＮＡレベルで発現したことを確認するために、近位スプライスアイソフォーム（ＶＥＧＦｘｘｘ、１３５ｂｐバンド）および遠位スプライスアイソフォーム（ＶＥＧＦｘｘｘｂ、７４ｂｐバンド）の両方を検出するプライマーを使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。有足細胞からのｍＲＮＡの増幅により、ＴＧＦ−β１による処理（１ｎＭ）によってＶＥＧＦｘｘｘｂバンドの相対密度が上昇したことが確認された（図５Ａ）。強度の上昇はＳＢ２０３８２０によって阻害されたが、ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰＫ阻害剤ＰＤ９８０５９によっては阻害されなかった。興味深いことに、ｃｄｃ４２キナーゼｃｌｋ１／ｓｔｙを阻害する別のキナーゼ阻害剤であるＴＧ００３も、ＴＧＦ−β１によるＶＥＧＦｘｘｘｂバンドの強度上昇を阻害した。これらの知見は、ウェスタンブロッティング法（図５Ｂ）およびＥＬＩＳＡこれらの（図５Ｃ）によって確認された。
【０１０３】
｛既知のスプライシング因子を用いたＲＰＥ細胞のトランスフェクションは、ＡＳＦ／ＳＦ２、９Ｇ８、特にＳＲｐ５５等のスプライシング因子がＶＥＧＦ遺伝子のＣ’末端選択的スプライシングを調節することを示している。｝
Ｃｌｋ／Ｓｔｙは、３つのスプライシング因子（選択的スプライシング因子／スプライシング因子２（ＡＳＦ／ＳＦ２）、ＳＲｐ５５、ＳＲｐ４０）のリン酸化を引き起こすことが示されている。ＥＳＥ  Ｆｉｎｄｅｒから生成されたＶＥＧＦ遺伝子のＣ末端における、これらのスプライシング因子の既知のＥＳＥコンセンサス配列の分布を図７に示す。遠位スプライス部位の遠位におけるＳＲｐ５５結合部位の強いクラスターおよび近位スプライス部位に近接したＡＳＦ／ＳＦ２およびＳＲｐ４０部位の強いクラスターが見られる。これらのスプライシング因子がＶＥＧＦ末端エクソンスプライス部位選択を調節することができるか否かを決定するために、ｐｃＤＮＡ３ベクターにおいてスプライシング因子ｃＤＮＡを用いて網膜色素性上皮（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ：ＲＰＥ）細胞をトランスフェクトさせ、総タンパク質含有量および回収した馴化培地をウェスタンブロッティング法（自動濃度測定、図８Ａ）およびＥＬＩＳＡ法（図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ）によって分析した。ＡＳＦ／ＳＦ２は細胞溶解物内のＶＥＧＦ１６５ｂの量を有意に増加させなかったが、ＶＥＧＦｔｏｔａｌを増加させた（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、４１．４％±６．９％  ｐ＜０．０５、図８Ａ）。ＳＲタンパク質９Ｇ８は、細胞溶解物におけるＶＥＧＦｘｘｘｂレベル（７８．６％±４．７％、ｐ＜０．０１）およびＶＥＧＦｔｏｔａｌレベル（１３．７％±２．９％、ｐ＜０．０５）を大きく増加させた（図８Ａ）。ＳＲｐ５５はＶＥＧＦｘｘｘｂの量を増加させたが（１０４．５％±１８．０％、ｐ＜０．０１）、ＶＥＧＦｔｏｔａｌ（例えば、図８Ａ）は増加させなかった。ＳＲｐ４０は、ＶＥＧＦｔｏｔａｌまたはＶＥＧＦｘｘｘｂタンパク質を変化させなかった（図８Ａ）。分泌ＶＥＧＦレべルが同様に変化したか否かを決定するために、細胞上清をＥＬＩＳＡ法によって分析した。未処理のＲＰＥ細胞ＡＳＦ／ＳＦ２と比較して、ＳＲｐ５５およびＳＲｐ４０は、培地内で検出されたＶＥＧＦｔｏｔａｌタンパク質をそれぞれ１２．８％±４．８％、７０．９％±３．６％、３４．１％±４．６％減少させた（図８Ｂ）。９Ｇ８はＶＥＧＦｔｏｔａｌのレべルに影響を与えなかった（図８Ｂ）。一方、ＳＲｐ５５の過剰発現によって培地中のＶＥＧＦｘｘｘｂ濃度は有意に上昇した。総合的な相対発現レベルに与えるこれらの変化の影響を決定するために、培地中のＶＥＧＦｔｏｔａｌに対するＶＥＧＦｘｘｘｂの濃度を計算した（図８Ｄ）。ＳＲｐ５５により、抗血管新生ＶＥＧＦアイソフォームへのスプライシングの有意な切り替えが生じた。これらの結果は、ＡＳＦ／ＳＦ２、９Ｇ８、特にＳＲｐ５５等のスプライシング因子がＶＥＧＦ遺伝子のＣ’末端選択的スプライシングを調節することを示している（図９および図１０）。
【０１０４】
そのため、同じ遺伝子から得られたＶＥＧＦｘｘｘ（血管新生促進）およびＶＥＧＦｘｘｘｂ（抗血管新生）ファミリーのバランスは、血管新生の制御に重要な役割を果たすように思われ、バランスが崩れると病的な血管新生が生じ得る（図１０Ｃ）。したがって、ＶＥＧＦｘｘｘｂファミリーの特性、発現、および制御を理解することは、癌、血管疾患、炎症性関節腫脹、糖尿病、腎臓疾患、乾癬等の様々な病気における広範囲の治療的意義を有する可能性がある。
【０１０５】
血管新生を阻害する療法は、癌およびＡＭＤにおける主要な第ＩＩＩ相臨床試験後に承認されている（１９、２５）。最近の第ＩＩ相および第ＩＩＩ第試験は、抗ＶＥＧＦ療法の結腸癌（２５、３５）、腎細胞腫（５５）、加齢黄斑変性症（１４）における顕著な有効性を示している。
【０１０６】
本願明細書に記載された抗血管新生および血管新生促進アイソフォームをもたらすＶＥＧＦ遺伝子の選択的スプライシングに関する研究は、各アイソフォームファミリーのバランスを制御・理解することが最適な治療の選択肢および投薬を定義するために非常に重要であるかもしれないことを示唆している。我々は、遠位Ｃ’末端スプライシングを優先的に選択することができるスプライシング因子（特にＳＲｐ５５）および成長因子類（特にＴＧＦ−β）を見出した。
【０１０７】
スプライシング因子は、直接的（ｃｌｋ１またはＳＲＰＫ等のＳＲタンパク質キナーゼ）または間接的（ＭＡＰＫおよびＰＫＣ）に、特異的シグナルリング分子によって調節される。ＳＲＰＫはＳＦ２／ＡＳＦをリン酸化し、近位スプライシングに有利に作用する（図１０Ｃ）。ＳＲＰＫ１の準定量的ＲＴ−ＰＣＲによれば、腫瘍の進行が示唆されるＳＲＰＫは、有足細胞の分化時にダウンレギュレートされ（２０）、このダウンレギュレーションはＶＥＧＦ１６５からＶＥＧＦ１６５ｂへのスプライシングの変化を模擬するものである（図１１）。
【０１０８】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって実証されるように、ＩＧＦを用いた有足細胞の処理によってＰＳＳが増加する。この増加は、ＰＫＣ阻害剤ＢＩＭおよびＳＲタンパク質キナーゼ阻害剤ＳＥＲＰＩＮ３４０によって阻害される（図１２および図１３）。
【０１０９】
ＳＲｐ５５はエクソン８におけるＶＥＧＦスプライス選択を調節する。ＳＲｐ５５感染有足細胞は、非常に増加したＳＲｐ５５発現と比較して、ＶＥＧＦ１６５ｂの発現をわずかに増加させる。ＳＲｐ５５を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ＳＲｐ５５およびＶＥＧＦ１６５ｂの発現をダウンレギュレートする（図１４Ａ、図の左側はイムノブロット法、図の右側はｓｈＲＮＡ干渉の定量）。ＲＮＡは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の３つの認識配列を含むＭＳ２  ＲＮＡ結合配列で終端する３つの構造からの生体内転写によって生成された。構造Ｘは、エクソン８ｂオープンリーディングフレームの周囲に８８個のヌクレオチドを含む。構造Ｙは、停止コドンの下流の３５ｂｐの欠失を含む。構造ＺはＭＳ２配列のみを含む。これらのＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞（陽性コントロール）からの細胞核抽出物とＭＳ２とで培養し、マルトースカラムで精製した。マルトースはＭＳ２−ＭＢＰタンパク質に結合する。結合フラクションおよび非結合フラクションを回収し、ＳＲｐ５５についてイムノブロットした。５５ｋＤａバンドは構造Ｘ  ＲＮＡに結合したフラクションで観察され、他の構造では示されなかったが、陽性コントロールとしての細胞核抽出物では、エクソン８ｂの停止コドンの下流においてＳＲｐ５５が３５ｂｐ領域に結合していることが示された。非結合フラクションは全ての試料においてＳＲｐ５５を含んでいた（図１４Ｂ、上部は３つの構造におけるエクソン８のコード領域の配置を示し、下部は結合フラクション（上）および非結合フラクション（下）のイムノブロットを示す）。
【０１１０】
通常はわずか（１０Ｃ）またはほとんどＶＥＧＦ１６５ｂを発現しない結腸癌細胞（１０ＣおよびＬＳ１７４ｔ）を、空のベクターまたはＴＩＡ−１  ｃＤＮＡでトランスフェクトさせた。ＴＩＡ−１は１０Ｃ細胞において変異するＲＮＡ結合タンパク質である（未発表データ）。ＲＮＡを抽出し、エクソン７のフォワードプライマーおよびＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのリバースプライマーを使用してＰＣＲを行った（図１５；下側のバンドは遠位スプライス部位（ＤＳＳ）選択の結果であり（ＶＥＧＦ１６５ｂ）、上側のバンドは近位スプライス部位（ＰＳＳ）選択の結果である（ＶＥＧＦ１６５））。これは、ＴＩＡ−１活性化は潜在的な抗血管新生治療方法であるかもしれないことを示している。
【０１１１】
ＨＥＫ細胞のモルフォリノ（ＭＯ）処理により、モルフォリノがＤＳＳ（図１７）またはＰＳＳ（図１８）のいずれを標的とするかに応じて、ＶＥＧＦ１６５に対する発現したＶＥＧＦ１６５ｂの割合を用量依存的に制御して割合を減少（図１７）または増加（図１８）させることができることが示されている（図１８）。各図において、上部（Ａ）はモルフォリノ位置を示す配列図を示し（配列の詳細については図１６を参照）、中央部（Ｂ）はモルフォリノ濃度を増加させる作用を示すＲＴ−ＰＣＲバンドを示し、下部（Ｃ）は濃度測定によるＶＥＧＦ１６５ｂ：ＶＥＧＦ１６５比の定量を示している。
【０１１２】
ヒト胚組織に対して免疫組織学研究を行い、ヒト胚ではＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームの発現が広範囲であることが分かった（図１９）。顕微鏡写真において、ＶＥＧＦ１６５ｂは脊椎（特に前角と後根神経節）において多く発現している。ＶＥＧＦ１６５ｂは、内皮細胞、例えば、頚静脈、頚動脈、脳（均一に発現していないが）、およびリンパ組織において発現している。興味深いことに、発現は８〜１６週間の間で皮膚においてアップレギュレートされている。ＶＥＧＦ１６５ｂは骨の造骨細胞および骨膜において発現しているが、この段階においては軟骨芽細胞では発現していない。ＶＥＧＦ１６５ｂは、上皮細胞、例えば、食道および気管、脈絡集網および眼等のＣＮＳの特定の領域で広範に強く発現している。ＶＥＧＦ１６５ｂの発現の広範な分布は、本発明の基礎となる原理、すなわち、スプライス部位選択は体内の様々な部位における組織の血管新生促進および抗血管新生治療において重要な臨床的利点を提供することができ、本発明による制御システムが広範囲の組織において機能的であると予想されることを裏付けるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、哺乳動物、限定されないが特にヒトにおけるＶＥＧＦ遺伝子の発現の近位（エクソン８ａ−血管新生促進）よりも遠位（エクソン８ｂ−抗血管新生）スプライス部位選択を促進するために、変質していないプロモーターの活性に関連してスプライシング制御の操作のための制御剤およびターゲットを提供する。
【０１１４】
このような新規かつ予測不可能な知見により、例えば癌において腫瘍への栄養補給の停止を促進する療法が可能となる。ＶＥＧＦ遺伝子発現の転写調節における低酸素症の作用を考慮すると（４７）、腫瘍がより低酸素性になれば、この治療的切り替えはより効果的になると思われる。
【０１１５】
特に、ＩＧＦおよびＴＮＦ−αによる処理はＰＳＳ（ＶＥＧＦｘｘｘ）に有利に作用するように発現を変化させ、ＴＧＦ−β１はＤＳＳに有利に作用してＶＥＧＦｘｘｘｂレべルを増加させた。ＴＧＦ−β１誘発ＤＳＳはｐ３８ＭＡＰＫの阻害およびスプライシング因子キナーゼｃｌｋ／ｓｔｙの阻害によって阻止されるが、ＥＲＫ１／２の阻害によっては阻止されない。Ｃｌｋ／ｓｔｙは、ＡＳＦ／ＳＦ２、ＳＲｐ４０、Ｓｒｐ５５等のＳＲタンパク質スプライシング因子をリン酸化することが示されている。ＳＲスプライシング因子がＶＥＧＦスプライシングを変化させることができたか否かを決定するために、それらを上皮細胞において過剰発現させ、特異的アイソフォームの生成を評価した。ＡＳＦ／ＳＦ２およびＳｒｐ４０はＰＳＳに有利に作用するが、ＳＲｐ５５は、ＳＲｐ５５を標的とするｓｉＲＮＡによって阻害されたようにＶＥＧＦｘｘｘ（ＤＳＳ）に対してＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォームをアップレギュレートした。ＰＫＣ阻害剤ＢＩＭおよびＴＩＡ−１もＶＥＧＦ１６５ｂに有利に作用した。これらの結果は、成長因子およびスプライシング因子によるスプライシングの調節が、ＶＥＧＦアイソフォームの相対的な血管新生促進／抗血管新生発現を決定する際に重要であり、ｐ３８ＭＡＰＫ−ｃｌｋ／ｓｔキナーゼがＴＧＦ−β１誘発遠位スプライス部位選択に関与しているかもしれないことを示唆している。
【０１１６】
これらの知見により、血管新生に関連する症状の診断および／または予後を容易化し、それらの症状のその後の治療を患者の症状の生化学に合わせて調節することを可能とする方法が可能となる。
【０１１７】
また、本発明は、潜在的病巣または症状の血管新生促進または抗血管新生治療方法に対する感受性に関連する診断用薬剤および方法を開発するための原理を提供する。すなわち、我々は、抗血管新生から血管新生促進への切り替えが同じ臨床的症状（例えば糖尿病性網膜障害および結腸癌）の患者において均一ではないことを見出している。したがって、ＶＥＧＦｘｘｘ／ＶＥＧＦｘｘｘｂアイソフォーム発現バランスを詳細に分析することにより、個々の患者の病巣または症状の治療または特定の治療に対する感受性を予測したり、個々の患者に合わせて治療を調製したりすることができ、または、個々の患者における治療有効性の増加および副作用の減少を可能にする特定の治療の調整を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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