(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩を含有する、β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌検出用培地。
【請求項２】
β−グルクロニダーゼ含有飲食品が、魚類、軟体動物、貝類及び昆虫類から選ばれる１種以上を含む飲食品である請求項１記載の大腸菌検出用培地。
【請求項３】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩を０．１g/L〜１g/L含有する請求項１又は２記載の大腸菌検出用培地。
【請求項４】
さらに、１種類以上の緩衝剤を10g/L〜20g/L含有する請求項１〜３の何れか１項記載の大腸菌検出用培地。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項記載の培地に、β−グルクロニダーゼ含有飲食品を接種して培養した後、当該培地の発色の有無を観察することを特徴とする、β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌を正確かつ簡便に検出することができる培地及びこれを用いた大腸菌検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲食品から大腸菌が検出された場合は、飲食品が直接または間接的に比較的新しい糞便汚染があり、飲食品が非衛生的な取り扱いを受けたことが推測され、腸管系病原菌の汚染も受けている可能性も高いと推測される。従って、大腸菌は、食品衛生の分野における糞便あるいは腸管系病原菌の汚染指標菌となっている。
【０００３】
大腸菌の検査は、糞便系大腸菌群の確認に44.5±0.2℃の厳密な温度管理が要求され、さらにＩＭＶｉＣ試験と進むため、多くの時間と手間を要していた（非特許文献１）。
そのため、現在では、簡便なβ−グルクロニダーゼ活性を指標とした酵素基質培地を用いる検査法が汎用されている（非特許文献１）。この方法は、酵素基質を加えた培地で大腸菌を培養すると、大腸菌がβ−グルクロニダーゼを産生して、基質に結合させた呈色物質あるいは紫外線下で蛍光を発する物質を遊離させて発色あるいは発光する現象を利用したものである。この方法によれば、酵素反応は数分から数時間で終了し、しかも反応が特異的であり、これらの培地を使用すれば飲食品中の大腸菌の実測値を迅速かつ容易に知ることができる。大腸菌の95％以上の菌株にみられるβ−グルクロニダーゼ(glucuronidase)は、腸内細菌の中で一部のサルモネラ、赤痢菌、エルシニアに認められるが、原則として大腸菌のみが産生し、他の腸内細菌がそれに陽性を示すのは0.1％以下である。したがって、β−グルクロニダーゼによる大腸菌の検出は、多少の例外があるとはいえ、乳糖分解性やＩＭＶｉＣ反応による従来法よりも簡易でしかも的確であり、腸管系病原菌の汚染指標であることから問題は少ないと思われる。なお、約５％の大腸菌に本酵素が存在しないことは検査上の問題点となりうるが、このような例外は乳糖発酵性にもみられ、１０％以上の大腸菌は乳糖を遅れて発酵し、また約５％は乳糖非発酵性であることから、従来の検査でも大腸菌陰性と判定されている。
すでに、このような酵素基質培地の大腸菌検査への適用は、多くの研究者による従来法との比較研究の結果、検査成績は従来法とほとんど異ならないことが証明されている。酵素基質培地を使用する方法は、24時間以内にほとんどの飲食品中の大腸菌の存在が確認できる利点があり、また、食品中の大腸菌群および大腸菌の菌数を単独または同時に容易かつ迅速に測定することができる。
【０００４】
従って、酵素基質を用いた多くの大腸菌検査用の液体および固形培地が市販されており、これら酵素基質培地としては、液体培地ではラウリル硫酸トリプトースブイヨン培地・BGLB培地・EC培地、固形培地ではバイオレット・レッド胆汁酸塩寒天培地などの在来の選択培地を基礎培地としたもの、これらとは異なる組成の新たに開発された基礎培地に酵素基質を添加した培地があり、それぞれの製品の指示に従って調製して使用することができる。そして、在来の酵素基質培地では、酵素基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドあるいは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加することが主流であった（特許文献１）。
【０００５】
しかし、魚類、軟体動物、貝類、昆虫類等にはそれ自体の細胞内にβ−グルクロニダーゼが存在し、それらを上記酵素基質培地に加えると大腸菌擬陽性の判定となるという問題があった。従って、これを含む食材の大腸菌検査に酵素基質法を用いるときは、メンブランフィルター法を用いるか、擬陽性の発現をあらかじめチェックしておくことが必要となり、操作が煩雑であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１７６６４０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】食品微生物検査  改訂版  培地マニュアル  日水製薬株式会社
【非特許文献２】食品衛生検査指針  微生物編  2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、元来β−グルクロニダーゼを含有し、それらを酵素基質培地に加えると大腸菌の存在が無くとも大腸菌擬陽性となるような飲料や食品等の検体から、正確かつ簡便に大腸菌を検出できる培地および検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
斯かる実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、全く意外にも、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩を含有する培地を用いれば、β−グルクロニダーゼを含有する飲食品中の大腸菌を正確かつ簡便に検出し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩を含有する、β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌検出用培地を提供するものである。
また、本発明は、この培地に、β−グルクロニダーゼ含有飲食品を接種して培養した後、当該培地の発色の有無を観察することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の培地を用いれば、元来β−グルクロニダーゼが存在する飲食品中の、汚染指標菌として重要な大腸菌を正確かつ簡便に検出できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、発色基質として６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩を使用することが重要である。大腸菌の発色基質として用いられることの多い４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドや５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドでは、それ自体の細胞内にβ-グルクロニダーゼが存在する飲食品を加えると、大腸菌擬陽性となる場合がある。
本発明に用いる基質、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドはその塩であってもよい。このような塩としては、シクロヘキシルアンモニウム塩が好ましい。６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩の濃度は、検出時0.1g/L〜１g/Lが好ましく、特に0.5g/L〜1g/Lが好ましい。
【００１３】
本発明の培地には、大腸菌群の発育向上の点から、さらに、栄養成分、糖類、無機塩類を含有せしめることが好ましい。このような栄養成分としては、各種のペプトン、酵母エキス、ビタミン類等が好ましい。糖類としては、ショ糖、乳糖等各種糖類が配合可能であるが、乳糖を配合した場合には、乳糖を分解することによるガス産生の有無により大腸菌群の存在を確認することが可能であるので好ましい。無機塩類としては、塩化ナトリウム、硝酸カリウム等の無機塩が挙げられる。
【００１４】
本発明の培地には、緩衝剤を添加することが好ましい。緩衝剤としては、例えば、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ニ水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ニ水素カリウム、MOPS、Bis-Tris、HEPESが挙げられ、このうち、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ニ水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ニ水素カリウムが好ましい。緩衝剤の濃度は、検出時1g/L〜20g/Lが好ましく、特に10g/L〜20g/Lが好ましい。
【００１５】
本発明の培地には、更に、ピルビン酸ナトリウム等の有機酸塩、選択的抑制物質、界面活性剤等を配合することもできる。選択的抑制物質としては、グラム陽性菌の発育を阻害する、胆汁酸塩やラウリル硫酸ナトリウム（ティーポル）等が好ましい。界面活性剤としては、テトラデシル硫酸ナトリウム（Tergitol４）、ヘプタデシル硫酸ナトリウム（Tergitol７）等が挙げられる。
更に、本発明の培地には、大腸菌検出培地に通常用いられている成分を、本発明の効果を損なわない限り添加してもよい。
【００１６】
本発明培地の形態は特に限定されず、液体、半流動、固形等のいずれの形態も採りうるが、比較的多量の検体を試験することができる液体の形態が望ましい。
【００１７】
本発明方法は、本発明培地に、検体たるβ−グルクロニダーゼ含有飲食品を接種して培養した後、当該培地の発色の有無を観察する方法であるが、本発明の培地を用いることにより、β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌の検出が可能となる。
β−グルクロニダーゼ含有飲食品としては、魚類、軟体動物、貝類、昆虫類を含有する飲食品が挙げられ、特に貝類含有食品が好ましい。生食用かきに代表される生鮮貝類は、β−グルクロニダーゼを多く含むため、従来の酵素基質含有大腸菌検出用培地は使用できなかったのに対し、本発明培地を用いれば正確な大腸菌検出が可能となる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
培地の作製
ペプトン20g、ラクトース5g、リン酸水素二カリウム2.75g、リン酸ニ水素カリウム2.75g、塩化ナトリウム5g、ラウリル硫酸ナトリウム0.1g及び６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド シクロヘキシルアンモニウム塩0.5g/Lを1リットルの精製水に加え、121℃、15分間高圧蒸気滅菌し、本発明の大腸菌検出用培地を作製した。
また、ペプトン20g、ラクトース5g、リン酸水素二カリウム2.75g、リン酸ニ水素カリウム2.75g、塩化ナトリウム5g、ラウリル硫酸ナトリウム0.1g及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド0.5g/Lを1リットルの精製水に加え、121℃、15分間高圧蒸気滅菌し、対照試験用培地とした。
【００１９】
試験例１
供試菌株はトリプトソイブイヨンで24時間前後培養したものを用い、これを滅菌生理食塩水で希釈した。検体はカキおよび食肉製品を公定法に基づいて処理をした。培地に検体と希釈した菌液を加え、35℃で24〜48時間培養した。
結果を表１及び表２に示す。
【００２０】
【表１】
0005639791.tif 000002
【００２１】
【表２】
0005639791.tif 000003
【００２２】
表１に示すように、本発明培地では、カキなどのそれ自体にβ−グルクロニダーゼが存在する飲食品を検体として用いても、大腸菌を接種した場合は発色が検出され、大腸菌を接種しなかった場合は発色が検出されなかった。一方、対照試験用培地では、カキを用いて大腸菌を検出すると、大腸菌を接種した場合と接種しなかった場合の両方で発色が検出された。これらの結果から本発明培地を用いれば、検体βが−グルクロニダーゼが存在する飲食品中の大腸菌を正確かつ簡便に検出できることがわかる。