(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供する方法であって、
（ａ）第１のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にてキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性遺伝子座を同定する工程；および
（ｂ）同定したキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性遺伝子座を第２のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に移行させ、それによって、該第２のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性を与える工程
を含み、該キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性遺伝子座は、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにて、配列番号１および配列番号２の分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用した場合の２４６ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって特徴付けられる、
方法。
【請求項２】
キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供するためのキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性遺伝子座の移行を検出するための、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカーの使用であって、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにて、配列番号１および配列番号２の分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用した場合の２４６ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって特徴付けられる、使用。
【請求項３】
キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性遺伝子座を補充したキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）感受性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）変種の遺伝子型を含むキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）であって、該キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性遺伝子座は、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにて、配列番号１および配列番号２の分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用した場合の２４６ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって特徴付けられる、キュウリ植物。
【請求項４】
請求項３記載の植物の種子、植物の部分または果実。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トバモウイルス、特に、商業上重要な２つの病原性トバモウイルス、すなわち、キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）に対する一般的な抵抗性を与えるキュウリ植物(Cucumis sativus L.)のゲノム中の遺伝子座に遺伝学的に関連し、かつ、該遺伝子座を同定し得る分子マーカーに関する。
【０００２】
本発明はさらに、トバモウイルス、特に、商業上重要な２つの病原性トバモウイルス、すなわち、キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（cucumber green mottle mosaic virus、ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（cucumber fruit mottle mosaic virus、ＣＦＭＭＶ）に対する抵抗性を有するキュウリ植物（Cucumis sativus L.）、植物の部分および果実を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
キュウリ植物（すなわち、植物の種Cucumis sativus L.の植物）は、メロンおよびカボチャのような科のメンバーを含むウリ科（Cucurbitaceae）に属する。
【０００４】
植物の可食な果実は、一般にキュウリといわれる。キュウリは通常、円柱状で緑色の表面の果実であり、約９６％の水を含む。以前から栽培されてきたキュウリ植物（Cucumis sativus L.）は、世界的に重要な園芸作物である。キュウリは、熟していないスタジアム（stadium）にて一般に収穫され、漬け物産業または生鮮市場のために使用され得る。
【０００５】
ウリ科植物に感染するトバモウイルスは、２つのサブグループに分けられ得る：文献にて、キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ、ＣＶ３、ＣＶ４、ＣＧＭＭＶ−Ｗ、ＣＧＭＭＶ−ＳＨおよびＣＧＭＭＶ−Ｉｓ株を含む）といわれる株および単離物を含むサブグループＩ；および、キュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）、キュリ緑色斑点モザイクウイルス（Kyuri green mottle mosaic virus、ＫＧＭＭＶ）およびＣＧＭＭＶのＹｏｄｏ株（ＫＧＭＭＶに密接に関連し、その株と考えられている）を含むサブグループＩＩ（Antigus, 2001）。
【０００６】
キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）は、ウリ科植物のいくつかの疾患を引き起こすトバモウイルス属のＲＮＡウイルスである。
【０００７】
ＣＧＭＭＶの株は、英国および欧州からまず報告された(Ainsworth, 1935)。ウイルスは全ての器官に存在し（Hollings, 1975）、ウイルスは労働者の手、衣類、ナイフ、および他の道具にすばやく伝染し、また、種子伝染性である。種子のウイルス汚染を制御するために、種子の加熱処理が一般に使用される（Kim, 2003）。ＣＧＭＭＶはまた、表面の水を介して拡散し得る（Drost, 1988）。
【０００８】
葉の黄ばみ、斑点形成および下方への屈曲の症状が報告されているが、最も重要なものは、穏やか−重篤な果実の斑点形成および歪みであるだろう。果実のそのような斑点形成および歪みは、感染した作物を即座に商品にならないものにするだろう。
【０００９】
キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）は、おそらく、最も広範かつ有名な、キュウリ作物に感染するトバモウイルスである。ＣＧＭＭＶは、オランダ、スペイン（Celix, 1996）、ギリシャ(Varveri, 2002)およびインド(Rashmi, 2005)のようなキュウリ生産地域にて世界的な問題である。収穫高の減少は、１５％であり得る(Fletcher, 1962)。ＣＧＭＭＶへのキュウリの抵抗性を見出す試みがなされており(Hsiao, 1993)、アジア起源の無症状の変種が見出されている(Kooistra, 1968)。
【００１０】
ＣＦＭＭＶは、キュウリ植物（Cucumis sativus L）への深刻な経済的損害を引き起こすトバモウイルスの別の科のメンバーである。キュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）感染の症状は、一般にまず、それぞれの進んだ成長段階の果実およびアピカルリーフ（apical leaves）において認識される。葉の症状としては、重度のモザイク、葉脈バンド形成および黄色斑点が挙げられる。いくつかの場合、完全に成長した植物は、植物の虚脱を引き起こす重度の立ち枯れ症状を示す。温室内での急速なウイルスの広がりは、深刻な作物の減少を引き起こし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】EP 0 534 858 A1
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ainworth, G.C. 1935. Mosaic disease of cucumber. Ann Appl. Biol.22:55 67.
【非特許文献２】Antignus, Y. 2001. Biological and Molecular Characterization of a New Cucurbit Infecting Tobamovirus. Phytopathology Vol.91, No6, 2001 565 571.
【非特許文献３】Rashmi, C.M. 2005. Natural occurrence of Cucumber green mottle mosaic virus on gherkins (Cucumis anguria L.) Evironment and Ecology. 2005; 23S(special 4):781 784.
【非特許文献４】Varveri, V. 2002. Characterization and detection of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus in Greece.
【非特許文献５】Dorst, H.J.M. van. 1988. Surface water as a source in the spread of cucumber green mottle mosaic virus. Netherlands Journal of Agricultural Science. 1988;36(3):291 299.
【非特許文献６】Hsiao, C.H. 1993. Screening and breeding for resistance to viruses in cucurbits. Plant Pathology Bulletin. 1993;2(4):241 248.
【非特許文献７】Fletcher. 1962; Plant Pathology 18;16.
【非特許文献８】Hollings, M. 1975. Cucumber green mottle mosaic virus. Description of Plant viruses No.154.
【非特許文献９】Celix, A. 1996. First report of cucumber green mottle mosaic tobamovirus infecting greenhouse grown cucumber in Spain. Plant Disease. 1996;80(11):1303.
【非特許文献１０】Kim SangMin 2003. Destruction of green mottle mosaic virus by heat treatment and rapid detection of virus inactivation by TR PCR. Molecules and Cells. 2003;16(3):338 342.
【非特許文献１１】Kooistra E. Significance of the non appearance of visible disease symptoms in cucumber (Cucumis sativus L.) after infection with Cucumis virus 2. Euphytica 17 (1968): 136 140.
【非特許文献１２】Vos, P., Hogers, R, Bleeker, M., et al. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research  23(21): 4407 4414.
【非特許文献１３】Zabeau, M and P. Vos. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
キュウリ植物（Cucumis sativus L）におけるトバモウイルス、特に、その変種を含むＣＧＭＭＶおよびＣＦＭＭＶによって引き起こされる経済的な損害を考慮すると、トバモウイルスに対する抵抗性遺伝子座または質的形質遺伝子座（Qualitative Trait Locus、ＱＴＬ）に遺伝学的に関連し、かつ同定し得る遺伝学的マーカーを提供すること、および、経済的に重要なCucumis sativus L変種にこのトバモウイルス抵抗性を移行させることは、かなり望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そのため、本発明の目的は、そのような遺伝学的マーカーを提供することにある。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
第１の態様によれば、本発明は、トバモウイルス抵抗性キュウリ植物（Cucumis sativus L.）を提供する方法であって、
（ａ）第１のキュウリ植物（Cucumis sativus L.）にてトバモウイルス抵抗性遺伝子座を同定する工程；および
（ｂ）同定したトバモウイルス抵抗性遺伝子座を第２のキュウリ植物（Cucumis sativus L.）に移行させ、それによって、該第２のキュウリ植物（Cucumis sativus L.）にトバモウイルス抵抗性を与える工程
を含み、トバモウイルス抵抗性遺伝子座は、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにて、配列番号１および配列番号２の分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用した場合の２４１〜２５１ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって特徴付けられる、方法に関す。
【００１６】
本発明によれば、配列番号１のプライマーは、ヌクレオチド配列５−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ−３’を含み、配列番号２のプライマーは、ヌクレオチド配列５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’を含む。
【００１７】
本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座に遺伝学的に関連し、かつ同定し得る分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）のマーカーはまた、本願明細書にて、マーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６（配列番号１および２のプライマーを使用する場合、核酸ＡＦＬＰ増幅フラグメントのサイズ：２４１〜２５１ｂｐ、好ましくは２４５〜２４７ｂｐ、最も好ましくは２４６ｂｐ）として示す。
【００１８】
本発明による第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)は、上記の核酸増幅フラグメントの存在によって同定し得る遺伝子座（マーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６）によって付与される、トバモウイルス、特に、ＣＧＭＭＶおよびＣＦＭＭＶに対して抵抗性表現型を有する任意のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)であり得る。
【００１９】
核酸増幅フラグメントまたは分子ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６の存在、およびそれによって本発明の抵抗性を付与する遺伝子座は、核酸増幅産物を分析するための任意で適切な分子生物学技術（例えば、ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション、アフィニティークロマトグラフィー、蛍光など）を使用して確立され得る。
【００２０】
特に好ましい態様において、フラグメントは、当該分野にて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）と名付けられた核酸増幅および検出技術を使用して同定される（ＡＦＬＰ, Zabeau, 1993, and Vos, 1995)。
【００２１】
増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）ベースの遺伝学的フィンガープリンティング技術であり、１９９０年代にKeygeneによって開発された。ＡＦＬＰは、ゲノムＤＮＡを切断するために制限酵素を、続いて、制限フラグメントの末端への相補的な二本鎖アダプターのライゲーションを使用する。制限フラグメントのサブセットは、次いで、アダプターおよび制限部位フラグメントに相補的なプライマー対を使用して増幅される。フラグメントは、変性アクリルアミドゲルにて、オートラジオグラフィーまたは蛍光を使ったやり方によって可視化される。
【００２２】
これは、一般的に、異なるサイズの複数の核酸増幅フラグメントをもたらす。例えば、感受性および抵抗性植物から得た核酸増幅フラグメントを比較することによって、両方の表現型の間で、識別のための核酸増幅フラグメントを同定し、また、マーカーとして指定することができる。
【００２３】
本願発明の場合、ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６として指定され、本発明の抵抗性遺伝子座に関連し、かつ同定し得る特定のＡＦＬＰマーカーが、２４１〜２５１ｂｐ、好ましくは２４５〜２４７ｂｐ、最も好ましくは２４６ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって同定された。このマーカーは、多数の非判別性の他のＡＦＬＰ増幅フラグメントのうち、抵抗性の個体において存在し、感受性の個体では存在していない。
【００２４】
配列番号１および２のＡＦＬＰプライマーを使用するキュウリ植物(Cucumis sativus L.)のＡＦＬＰ分析は、第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)でトバモウイルス抵抗性遺伝子座を同定するために、２ｂｐのＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６を用いて、異なるサイズを有する第２の核酸増幅フラグメントを生じ得る。本発明によれば、このより大きな（２ｂｐ）核酸増幅フラグメントは、本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座に遺伝学的に関連しておらず、同定し得ない。
【００２５】
すなわち、本発明の第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)は、ＡＦＬＰおよび配列番号１および２のＡＦＬＰプライマーを使用して分析される場合、意図したサイズのＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６を生じなければならないが、さらに、大きなサイズ（２ｂｐ）の第２の核酸増幅フラグメントをも生じ得る。
【００２６】
第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)、すなわち、ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６のみを生じるか、または、ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６に加えて第２のやや大きな（２ｂｐ）フラグメントをも生じるもの両方が本発明に含まれる。しかしながら、第２のやや大きな（２ｂｐ）フラグメントのみを生じる第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)は、本発明に含まれない。
【００２７】
以上を考慮すると、第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)の選択は、本質的に、分子生物学技術を使用する、この植物におけるトバモウイルス抵抗性遺伝子座の検出を含む。本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座が遺伝学的にＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６に関連していることから、このことは、従来の育種技術に共通する表現型ベースの選択のみを使用しても、確立され得ない。
【００２８】
すなわち、第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)においてトバモウイルス抵抗性遺伝子座を同定することは、従来の選択プロセスを使用することのみに関連するわけではない。
【００２９】
第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)における、本発明によるトバモウイルス抵抗性遺伝子座の同定の後、遺伝子座は第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)に移行し、それによって、当該第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)にトバモウイルス抵抗性が付与される。
【００３０】
好ましくは、本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座を移行させることは、第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)の第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)との従来の交配および続く第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)との１回または複数回の戻し交配といった従来の育種方法を含む。しかしながら、そのような従来の育種方法は、好ましくは、分子生物学技術で支援され、第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)における抵抗性遺伝子座の維持が確立される。
【００３１】
従来の育種技術と比べると、本発明によるＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６の提供は、各戻し交配後の適切なトバモウイルス耐性子孫の迅速な選択を可能にし、それによって、各世代にて、ウイルス感染などの労力を要し、かつ高価なスクリーニング法を避け、耐性の表現型を確立して、適切なトバモウイルス耐性子孫を同定することができる。
【００３２】
好ましい実施態様において、第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)は、トバモウイルスに感受性の商業的な変種である。本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座を当該植物に移行させることで、商業上有益な他の高い品質の遺伝子型および表現型特徴を維持する一方で、経済的価値が高められたキュウリ植物(Cucumis sativus L.)が提供される。
【００３３】
最も好ましい実施態様において、本発明の方法は、第１のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)のトバモウイルス抵抗性遺伝子座が補充された第２のキュウリ植物(Cucumis sativus L.)の遺伝子型を有するキュウリ植物(Cucumis sativus L.)を提供する。
【００３４】
そのため、本発明はまた、第２の態様によれば、トバモウイルス抵抗性遺伝子座を補充したトバモウイルス感受性のキュウリ植物（Cucumis sativus L.）変種の遺伝子型を含むキュウリ植物（Cucumis sativus L.）であって、トバモウイルス抵抗性遺伝子座は、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにて、配列番号１および配列番号２の分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用した場合の２４１〜２５１ｂｐ、好ましくは２４５〜２４７ｂｐ、最も好ましくは２４６ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって特徴付けられるキュウリ植物に関する。
【００３５】
トバモウイルス抵抗性、本発明によるトバモウイルス抵抗性遺伝子座は、好ましい実施態様において、少なくともキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）に対する抵抗性を付与する。
【００３６】
第３の態様によれば、本発明は、トバモウイルス抵抗性キュウリ植物（Cucumis sativus L.）を提供するためのトバモウイルス抵抗性遺伝子座の使用に関し、トバモウイルス抵抗性遺伝子座は上記のとおり特徴付けられる。
【００３７】
本発明の第３の態様によれば、トバモウイルス抵抗性は、キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性を含む。
【００３８】
第４の態様によれば、本発明は、分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにて配列番号１および配列番号２の分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用した場合の２４１〜２５１ｂｐの核酸増幅フラグメントの存在によって特徴付けられるトバモウイルス抵抗性遺伝子座に関する。
【００３９】
好ましくは、本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座は、２４５〜２４７ｂｐのＡＦＬＰ核酸増幅物によって特徴付けられる。
【００４０】
最も好ましくは、本発明のトバモウイルス抵抗性遺伝子座は、２４６ｂｐのＡＦＬＰ核酸増幅物によって特徴付けられる。
【００４１】
配列番号１および２の増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーを使用して、ＡＦＬＰ核酸増幅フラグメントによってのみ示される遺伝子座（上記フラグメントの比較において、やや大きい（２ｂｐ））は、本発明に含まれない。
【００４２】
本発明の第４の態様によれば、トバモウイルス抵抗性は、好ましくは、キュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性を含む。
【００４３】
以下の実施例において、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例Ｉ：感受性および抵抗性植物（Cucumis sativus L.）の同定
序論
以下のプロトコルを使用して、キュウリ植物（Cucumis sativus L.）をキュウリ緑色斑点モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）感染に対して感受性または抵抗性に分類した。少なくともオランダでは分析を実施する最も良い期間は、９月〜４月である。
【００４５】
植物材料
試験する植物（Cucumis sativus L.）（抵抗性および感受性両方）を中型のバーミキュライトに植え付け、２４℃で育て、小型のバーミキュライトで覆った。（ちょうど子葉が広がった）４〜５日後、苗をロックウールブロックに移し、２日後、植物を隔離温室に移した。
【００４６】
４０個の感受性コントロールＴｙｒｉａ  Ｆ１（Ｅｎｚａ  Ｚａｄｅｎの商業Ｆ１キュウリ変種、オランダ）の各ブロックを感受性コントロールとして置いた後で、好ましくは、隔離温室へ植物を入れてから４日後に、苗を子葉に接種した。
【００４７】
病原体
ＣＧＭＭＶおよびＣＦＭＭＶの単離物を調製した。すなわち、接種材料を調製するために、新たなリン酸緩衝液（０．１Ｍ  リン酸溶液、ｐＨ７．７）を調製した。感染したキュウリ植物（Cucumis sativus L.）（症状が最近発展したもの）由来の葉材料を採取した。茎を含まず、明らかな症状を有する若い葉組織を採取した。約１ｇの葉材料を、５ｍｌの緩衝液について使用した。葉材料を破砕し、それによって、ウイルス単離物を得た。
【００４８】
感染のために、晴天時、感染１日前に上記栽培した植物を覆いで遮光した。感染１日後、覆いを除去してもよい。しかしながら、光量が高い場合、覆いはもう一日そのままにしておくべきである。湿度が低い場合、感染後に灰色のトレイを直接湿らせることで、湿度を上げて、感染のダメージに起因する子葉の萎縮を予防してもよい。温度管理体制は、夜間で１８〜２０℃であり、日中で２２〜２５℃であった。
【００４９】
二重のチーズクロスで植物にカーボランダムをわずかに振りかけた。スポンジを接種材料に浸し、両方の子葉の表面全体を２度拭き取った。ウイルスは安定していたが、感染時間は１時間より短くあるべきである。
【００５０】
評価
キュウリ植物の最初の２つの葉は（感受性植物および抵抗性植物において）症状を示さなかった。３〜４番目の葉の段階から、感受性または抵抗性を記録しやすくなるだろう。
【００５１】
実施例２：トバモウイルス抵抗性ＱＴＬを同定するためのＡＦＬＰマーカーの同定
序論
この実施例において、質的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を、バルクＱＴＬ分析（ＢＱＡ）の使用によって、抵抗性キュウリ植物（Cucumis sativus L.）にて同定した（Ｋｅｙｇｅｎｅ  Ｎ．Ｖ．（ワーゲニンゲン、オランダ）が実施した）。トバモウイルス抵抗性のためのマーカー開発のために、９８個の個体の集団を選択した。９６個のＡＦＬＰプライマーの組合せ全てを、トバモウイルス抵抗性について「極端な表現型」を示す個体を含む２つのプールにてスクリーニングした。続いて、５つのマーカー候補を、１２個の抵抗性および１２個の感受性個体にて検証した。
【００５２】
マーカーの同定および検証
１３０個の植物の葉材料を得た：処理すべき集団を提供するための９８個の個体のＣｕｃ１８７９  ０１ｘＯＫ５６１集団、ドナー親Ｃｕｃ１８７９  ０１の３０個の自殖株および集団の親株。ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩテンプレートを得た。１３０個の植物の試験フィンガープリントを、プライマーの組合せＥ１４／Ｍ５９を使用して得た。
【００５３】
ＢＳＡおよび個体での検証
９６個のＡＦＬＰプライマーの組合せ全てを、１０個の「極端な抵抗性」の個体を含むプール、および１０個の「極端な感受性」の個体を含むプールにてスクリーニングすることによって、ＢＱＡを実施した。このスクリーニングによって、以下のマーカー候補の同定がもたらされた：
−Ｅ１４／Ｍ５８  Ｆ  １６９  Ｐ２  
−Ｅ２２／Ｍ４８  Ｆ  ２４８／２４６（両アレル）
続いて、これらのマーカーを２４個の個体（１２個の抵抗性の個体および１２個の感受性の個体）にて検証した。この検証に基づいて、同定したマーカー候補がトバモウイルス抵抗性と関連していることが判明した。
【００５４】
集団でのマーカー候補の検証
９６個のプライマーの組合せのスクリーニングおよび続くマーカーの検証の後で、１つの推定ＱＴＬを得るだろう。同定したＱＴＬが離れたＱＴＬであるかどうか決定するために、関連の分析を実施した。
【００５５】
マーカー（Ｅ１４／Ｍ５８  Ｆ  １６９  Ｐ２および両アレルマーカーＥ２２／Ｍ４８  Ｆ  ２４８／２４６）を、９８個の個体集団由来の４６個のさらなる個体にてスクリーニングした。
【００５６】
マーカーデータセットを得て、２４個の個体での検証のマーカーデータセットと組み合わせた。この分析に基づいて、４つのマーカーが１つのＱＴＬに関連しているとの結論を得ることができた。
【００５７】
ＷｉｎＱＴＬＣａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを使用したマーカーの分析
表現型および遺伝子型との間の相関関係を決定するために、ソフトウェアパッケージＷｉｎＱＴＬＣａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを使用して、マーカーデータセットを分析した。単一マーカー分析（ＳＭＡ）のために、ＬＯＤ値１２を算出した。インターバルマッピング（Interval Mapping）について、表現型に対して１０００回の並べ替え（permutation）を実施することによって、９５％の信頼性のある閾値を算出し、ＬＯＤ０．９として決定した。ＬＯＤ値およびパーセンテージで説明された分散を、このＱＴＬのために算出した（ＬＯＤ：９；Ｅｘｐ．Ｖａｒ．：４９．５）。
【００５８】
結論
トバモウイルス抵抗性についてのＱＴＬを同定するために、ＢＱＡを実施した。９６個のプライマーの組合せ全てを、１０個の「極端な抵抗性」の個体を含むバルク、および１０個の「極端な感受性」の個体を含むバルクにてスクリーニングした。マーカー候補（そのうち１つは両アレル）を、１２個の「極端な抵抗性」および１２個の「極端な感受性」個体および集団の４８個の他の個体において検証した。ＱＴＬ領域を、ＢＱＡアプローチを使用することによって同定した。このＱＴＬは、〜５０％の分散を説明した。ＴｅｓｔＰＣ（〜５つのマーカー）に基づいて、抵抗性ドナー親Ｃｕｃ１８７９  ０１の３０個の自殖株では不均一性は同定されなかった。
【００５９】
実施例３：分子マーカーにより支援された、トバモウイルス抵抗性キュウリ植物（Cucumis sativus L.）の同定
分子分析
感受性、すなわち、ウイルス感染の１つまたはそれ以上の上記症状を示すウイルス抵抗性キュウリ植物（Cucumis sativus L.）、およびウイルス抵抗性キュウリ植物（Cucumis sativus L.）両方から、標準的なプロトコルを使用してゲノム材料を単離した。
【００６０】
続いて、適切な制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ）を使用して、このゲノム材料を消化し、アダプターのライゲーションの後で、プライマー対配列番号１  ５−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ−３’および配列番号２  ５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’またはプライマー対配列番号３  ５’−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ−３’および配列番号４  ５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  Ｔ−３’を使用して、ＡＦＬＰ核酸増幅に供した。
【００６１】
サイズ決定のために、得られた増幅産物をゲル電気泳動によって分離した。各キュウリ植物（Cucumis sativus L.）のゲノム中のＡＦＬＰマーカーの存在を、欠如（−）または存在（＋）として検出した。
【００６２】
詳細には、ＡＦＬＰマーカーＥ１４／Ｍ５８−Ｆ−１６９（本発明に含まれない、配列番号３および４）が存在する場合、約１６９ｂｐのバンドが観察され；ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４８（本発明に含まれない、配列番号３および４）が存在する場合、約２４８ｂｐのバンドが観察された。約２４８ｂｐの予測されたサイズを有するＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４８（本発明に含まれない、配列番号３および４）は、抵抗性表現型と相関した。
【００６３】
結果を表１にまとめる。
【００６４】
【表１−１】
0005587789.tif 000002
【００６５】
【表１−２】
0005587789.tif 000003
【００６６】
表１では、ＣＧＭＭＶおよびＣＦＭＭＶに対する抵抗性が、分子ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６の存在と遺伝学的に関連している試験した全てのキュウリ植物（Cucumis sativus L.）にあることを示している。そのため、このマーカーを検出することは、トバモウイルス抵抗性遺伝子座またはＱＴＬの存在を示している。
【００６７】
引用文献
Ainworth, G.C. 1935. Mosaic disease of cucumber. Ann Appl. Biol.22:55 67.
Antignus, Y. 2001. Biological and Molecular Characterization of a New Cucurbit Infecting Tobamovirus. Phytopathology Vol.91, No6, 2001 565 571.
Rashmi, C.M. 2005. Natural occurrence of Cucumber green mottle mosaic virus on gherkins (Cucumis anguria L.) Evironment and Ecology. 2005; 23S(special 4):781 784.
Varveri, V. 2002. Characterization and detection of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus in Greece.
Dorst, H.J.M. van. 1988. Surface water as a source in the spread of cucumber green mottle mosaic virus. Netherlands Journal of Agricultural Science. 1988;36(3):291 299.
Hsiao, C.H. 1993. Screening and breeding for resistance to viruses in cucurbits. Plant Pathology Bulletin. 1993;2(4):241 248.
Fletcher. 1962; Plant Pathology 18;16.
Hollings, M. 1975. Cucumber green mottle mosaic virus. Description of Plant viruses No.154.
Celix, A. 1996. First report of cucumber green mottle mosaic tobamovirus infecting greenhouse grown cucumber in Spain. Plant Disease. 1996;80(11):1303.
Kim SangMin 2003. Destruction of green mottle mosaic virus by heat treatment and rapid detection of virus inactivation by TR PCR. Molecules and Cells. 2003;16(3):338 342.
Kooistra E. Significance of the non appearance of visible disease symptoms in cucumber (Cucumis sativus L.) after infection with Cucumis virus 2. Euphytica 17 (1968): 136 140.
Vos, P., Hogers, R, Bleeker, M., et al. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research  23(21): 4407   4414.
Zabeau, M and P. Vos. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting.  European Patent Office, publication 0 534 858 A1, bulletin 93/13.
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