(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された毛細管血中に含まれる血球を粒子分析装置にて計数する際に、採取された毛細管血を希釈し、血液試料を作成するための血球計数用試薬であって、
クロロキン塩類が、１０ｇ／Ｌ以上含まれ、界面活性剤が１０〜５０ｇ／Ｌ含まれ、電解質が含まれることによって、浸透圧が２００〜６００Ｏｓｍ／ｋｇに調整されてなる水溶液であることを特徴とする血球計数用試薬。
【請求項２】
請求項１に記載の血球計数用試薬において、
界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である血球計数用試薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の血球計数用試薬において、
血球計数用試薬は、
血液試料を粒子分析装置に供した際に得られる白血球容積ヒストグラムにおける、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが重なる分布の谷の相対頻度の最小値を粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲内に位置させるものである血球計数用試薬。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の血球計数用試薬において、
血球計数用試薬には、
更に、抗凝固剤が含まれてなる血球計数用試薬。
【請求項５】
生体から採取された毛細管血中に含まれる血球を粒子分析装置にて計数する血液検査方法であって、
この血液検査方法は、
採取された毛細管血を、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の血球計数用試薬で希釈することによって血液試料を作成する希釈工程と、
血液試料を粒子分析装置に供し、血液試料中の白血球を計数する測定工程と、
を実行することを特徴とする血液検査方法。
【請求項６】
請求項５に記載の血液検査方法において、
測定工程では、粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲の中から、カウント開始容積を決定し、決定されたカウント開始容積以上の容積を有する粒子を白血球としてカウントする血液検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された毛細管血に混合される血球計数用試薬、及び生体から採取された毛細管血中に含まれる血球を粒子分析装置で計数する血液検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血液中の成分を計数する手段として、フローサイトメトリーと称される分析手法を利用した粒子分析装置が用いられている。
【０００３】
血液中の赤血球を計数するにあたっては、採取された血液を生理食塩水にて希釈して血液試料を作成し、この血液試料を粒子分析装置に供し、所定範囲の粒子容積(例えば、３６〜３６０ｆＬ（フェムトリットル：１０-15Ｌ）程度)を有する粒子を逐一カウントする。この際、赤血球とほぼ同等の容積を有する白血球も同時にカウントされるが、通常の血液中の白血球濃度は赤血球濃度に対して０．１〜０．２％程度であることから、白血球を余分にカウントすることによる誤差は無視することができる。
【０００４】
一方、血液中の白血球を計数するにあたっては、採取された血液を溶血試薬にて希釈して血液試料を作成し、この血液試料を粒子分析装置に供し、所定範囲の粒子容積（例えば、２５〜４５０ｆＬ程度）を有する粒子を逐一カウントする。溶血試薬には、血球の細胞膜を破壊する成分が含まれており、赤血球は細胞核が存在しないことから、細胞膜が破壊されるとヘモグロビンが流出し、細胞としての形や大きさを失って崩壊する。一方、白血球は細胞核を有することから、裸核状態の粒子となって血液試料中に分散する。従って、赤血球が崩壊された血液試料を粒子分析装置に供し、所定範囲の粒子容積を有する粒子をカウントすれば、白血球を計数することができる。
【０００５】
ところで、血液検査にあたり、生体から血液を採取する方法としては、皮下静脈から静脈血を採取する方法と、指頭や耳朶から毛細管血を採取する方法との二通りがある。
【０００６】
静脈血を溶血試薬で希釈した血液試料を粒子分析装置にて測定した場合にあっては、図１１の白血球容積ヒストグラムに示すように、血小板や赤血球の崩壊残渣等に起因するノイズ（ゴーストピークＧ）と、白血球に起因するピーク（白血球ピークＷ）とが明確に分かれるため、比較的高精度で白血球を計数することができる。
【０００７】
静脈血の採取は、皮下静脈に注射針を挿入し、血管内から直接血液を採取することによって行われるものであることから、採血直後の血小板の凝集は殆ど認められない。又、静脈血については、採取後、抗凝固剤（抗血小板凝固剤）としてのエチレンジアミン四酢酸塩が配合された溶血試薬で希釈することによって、血液試料中の血小板の凝集を抑制する手段が確立されている（例えば、下記特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平３‐１４４３６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、毛細管血を溶血試薬で希釈した血液試料を粒子分析装置にて測定した場合にあっては、図１２の白血球容積ヒストグラムに示すように、ゴーストピークＧのテーリング部Ｔと白血球ピークＷのリーディング部Ｒが比較的広範囲にわたって重なるため、高精度で白血球を計数することができない。この原因は、血小板が凝集して生じた血小板凝集塊がゴーストピークＧのテーリング部Ｔから白血球ピークＷのリーディング部Ｒにわたって誤カウントされるためである。
【００１０】
毛細管血の採取は、指頭や耳朶などを突針で浅く突き、極少量の血液を採取することによって行われるものであり、簡易且つ迅速に血液を採取できる点において優れるが、採取時に組織液が混入し易いことから、採取後速やかに血小板が凝集する。
【００１１】
エチレンジアミン四酢酸塩は血小板の凝集を抑制する作用を有するものの、既に凝集した血小板凝集塊を解離させる作用を有さない。従って、採取後速やかに血小板が凝集してしまう毛細管血を、エチレンジアミン四酢酸塩が添加された溶血試薬で希釈しても、既に凝集した血小板凝集塊を解離させることはできない。
【００１２】
本発明は、前記技術的課題を解決するために開発されたものであり、生体から採取された毛細管血中の血小板凝集塊を解離させ、高精度で白血球などの血球を計数することができる新規な血球計数用試薬、及び血液検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の血球計数用試薬は、生体から採取された毛細管血中に含まれる血球を粒子分析装置にて計数する際に、採取された毛細管血を希釈し、血液試料を作成するための血球計数用試薬であって、クロロキン塩類が含まれた水溶液であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の血球計数用試薬は、生体から採取された「毛細管血」中に含まれる白血球などの血球を「粒子分析装置」にて計数する際に、採取された毛細管血を希釈し、血液試料を作成するためのものである。ここで、「毛細管血」とは、指頭や耳朶などを突針で突くことによって得られる血液（指頭血や耳朶血）を意味する。又、「粒子分析装置」とは、微細な粒子を流体中に分散させ、その流体を細く流して、個々の粒子を計数するフローサイトメトリーと称される分析手法を利用した粒子分析装置（フローサイトメータやコールターカウンター）を意味する。この粒子分析装置には、光散乱や蛍光等を検出する光学的検出方式によるものと、細孔を粒子が通過するときのインピーダンス変化を検出する電気抵抗検出方式によるものとに大別できるが、電気抵抗検出方式の方が簡便さという点では優れている。
【００１５】
本発明の血球計数用試薬中に含まれる「クロロキン塩類」は、毛細管血中の血小板凝集塊を解離させるものであり、キノリン骨格を有し、クロロ基を導入している化合物を指す。特に、キノリン骨格の７位にクロロ基が導入され、且つ、４位にアミノ基が導入されたクロロキノリン誘導体の塩が好ましい。このクロロキン塩類の具体例としては、クロロキン二リン酸塩（７‐クロロ‐４‐［４‐（ジエチルアミノ）‐１‐メチルブチルアミノ］キノリンジフォスフェート）や、ヒドロキシクロロキン硫酸塩（７‐クロロ‐４‐［４‐Ｎ‐エチル‐Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）アミノ］‐１‐メチルブチルアミノ）キノリンサルフェート）等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の血球計数用試薬においては、クロロキン塩類が、１０ｇ／Ｌ以上含まれてなるものが好ましい態様となる。
【００１７】
通常の白血球の計数においては、生体から採取された血液を試薬で１００〜５００倍程度に希釈する希釈工程が実行されるが、試薬中にクロロキン塩類がごく少量含まれていれば、係る希釈工程の実行によって血小板凝集塊を解離し得ることが確認されている。なお、血小板凝集塊の解離の観点からは、クロロキン塩類の配合割合の上限について特に限定されない。但し、クロロキン塩類の配合割合が多くなると、試薬の原料原価が高くなるため、クロロキン塩類の配合割合としては、１００ｇ／Ｌを上限とすることが好ましい。
【００１８】
本発明の血球計数用試薬は、更に溶血作用を有する「界面活性剤」が含まれてなるものが好ましい態様となる。界面活性剤としては、血液と混合された際に、血球の細胞膜を破壊し、血液中の赤血球を崩壊させると共に白血球を裸核状態にさせる作用を有するものであれば特に限定されるものではない。又、界面活性剤としては、イオン性のものであっても非イオン性のものであっても良い。イオン性の界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤が好ましく、更に、アニオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩類が好ましい。この四級アンモニウム塩類の具体例としては、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムやドデシルトリメチルアンモニウム等の塩化物や臭化物を挙げることができる。一方、非イオン性の界面活性剤の具体例としては、サポニンを挙げることができる。
【００１９】
ところで、本発明の血球計数用試薬においては、単にクロロキン塩類を配合することによって、血小板凝集塊を解離させるだけではなく、界面活性剤の濃度を特定範囲とすることによって、白血球容積ヒストグラムにおける白血球ピークを明確にすることが好ましい。
【００２０】
係る観点より、本発明の血球計数用試薬においては、前記界面活性剤が、１０〜５０ｇ／Ｌ含まれてなるものが好ましい態様となる。
【００２１】
血球計数用試薬中に界面活性剤が１０ｇ／Ｌ以上含まれていれば、係る血球計数用試薬にて希釈工程を実行した際、血球の細胞膜が破壊され、血液中の赤血球を崩壊させると共に白血球を裸核状態にさせることができることが確認されている。一方、血球計数用試薬中に含まれる界面活性剤が５０ｇ／Ｌを超えると、血液試料中の白血球容積が小さくなる。これより、本発明の血球計数用試薬においては、界面活性剤の配合割合を１０〜５０ｇ／Ｌ（より好ましくは２０〜４０ｇ／Ｌ）の範囲とすることが好ましい。
【００２２】
又、同様の観点から、本発明の血球計数用試薬においては、更に「電解質」が含まれることによって、浸透圧が２００〜６００Ｏｓｍ／ｋｇに調整されてなるものが好ましい態様となる。
【００２３】
前記「電解質」としては、水に溶解された際に、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの陽イオンと、塩化物イオン、臭化物イオン、リン酸イオンなどの陰イオンとに電離する性質を有するものであれば特に限定されるものではない。電解質の具体例としては、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等を挙げることができる。
【００２４】
ここで、血球計数用試薬中に含まれる電解質が少なくて、血球計数用試薬における浸透圧が２００Ｏｓｍ／ｋｇ未満となると、白血球の膨張、崩壊を招く。一方、血球計数用試薬中に含まれる電解質が多すぎて、血球計数用試薬における浸透圧が６００Ｏｓｍ／ｋｇを超えると、白血球の体積が減じられて、白血球ピークが低体積側に移行し、ゴーストピークに近接する。これより、本発明においては、前記電解質によって、血球計数用試薬の浸透圧を２００〜６００Ｏｓｍ／ｋｇ（より好ましくは、３００〜４００Ｏｓｍ／ｋｇ）の範囲に調整することが好ましい態様となる。これにより、白血球ピークがゴーストピークに近づきすぎることを防止することができる。
【００２５】
本発明の血球計数用試薬において、血球計数用試薬は、血液試料を粒子分析装置に供した際に得られる白血球容積ヒストグラムにおける、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが重なる分布の谷の相対頻度の最小値を粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲内に位置させものが好ましい態様となる。
【００２６】
粒子分析装置による計数によって得られる白血球容積ヒストグラムにおける、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが重なる分布の谷の相対頻度の最小値を粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲内に位置させれば、白血球ピークが明確になり、又、白血球ピークとゴーストピークとが近づきすぎることが防止でき、もって血小板凝集塊に起因する誤カウントを減少させることができる。これより、高精度で白血球を計数することができる。
【００２７】
本発明の血球計数用試薬においては、更に、「抗凝固剤」が含まれてなるものが好ましい態様となる。
【００２８】
「抗凝固剤」とは、血小板の凝固を抑制する性質を有するものを意味する。本発明の血球計数用試薬においては、抗凝固剤が更に含まれることにより、血液試料中の血小板（クロロキン塩類によって解離された血小板を含む。）が凝集することを抑制することができる。抗凝固剤の具体例としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の塩類（例えば、ＥＤＴＡ‐２Ｎａ（ジナトリウム塩）、ＥＤＴＡ‐２Ｋ（ジカリウム塩）、ＥＤＴＡ‐３Ｎａ（トリナトリウム塩）、ＥＤＴＡ‐３Ｋ（トリカリウム塩）等）や、ヘパリン、アセチルサリチル酸、硫酸マグネシウム等を挙げることができる。抗凝固剤の配合割合としては、特に限定されるものではないが、０．０１〜０．２ｇ／Ｌとすることが好ましい。
【００２９】
本発明の血球計数用試薬は、そのｐＨ（水素イオン濃度指数）を安定させるために緩衝液で希釈することが好ましい。又、表面張力を調整するための非イオン界面活性剤、ｐＨを調整するためのｐＨ調整剤、裸核状態の白血球を安定させる膜保護剤、保存性を高める防腐剤その他の各種添加剤を更に配合することもができる。
【００３０】
「緩衝液」の具体例としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液及びトリス緩衝液等を挙げることができる。「ｐＨ調整剤」の具体例としては、水酸化ナトリウムや塩酸を挙げることができる。
【００３１】
表面張力を調整するための「非イオン界面活性剤」としては、分子内に親水基と疎水基とを有し、血球計数用試薬の表面張力を下げる性質を有するものであれば特に限定されるものではない。非イオン界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルなどの「エーテル型非イオン界面活性剤」、ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル、ソルビタンモノ（又はジ）オレイン酸エステル、ソルビタンモノ（又はジ）ラウリン酸エステル、ソルビタンモノ（又はジ）イソステアリン酸エステルなどの「エステル型非イオン界面活性剤（エーテルエステル型非イオン界面活性剤を含む）」を挙げることができる。
【００３２】
「防腐剤」の具体例としては、アジ化ナトリウム、ナトリウムオマジン、ケーソンＣＧ、ＲＯＣＩＭＡ（商標）５５３、チメロサール等を挙げることができる。「膜保護剤」の具体例としては、イソプロピルアルコール等の低級アルコール類やグルタルアルデヒド、ジメチル尿素、グルコース等を挙げることができる。
【００３３】
本発明の血液検査方法は、生体から採取された毛細管血中に含まれる白血球などの血球を粒子分析装置にて計数する血液検査方法であって、この血液検査方法は、生体から毛細管血を採取する採血工程と、採取された毛細管血を、前記本発明の血球計数用試薬で希釈することによって血液試料を作成する希釈工程と、血液試料を粒子分析装置に供し、血液試料中の白血球を計数する測定工程と、を実行することを特徴とする。
【００３４】
本発明の血液検査方法においては、測定工程では、粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲の中から、カウント開始容積を決定し、決定されたカウント開始容積以上の容積を有する粒子を白血球としてカウントすることが好ましい態様となる。
【００３５】
粒子分析装置による白血球の計数は、血液試料中の所定範囲の粒子容積を有する粒子を白血球とみなし、この範囲内にある粒子を逐一カウントすることによって行う。即ち、前記「カウント開始容積」とは、この所定範囲の下限値を意味する。なお、粒子分析装置による白血球の計数において、前記所定範囲の上限値は単なるカウントの終点であり、別段に重要なファクターとはならない。通常は、３００〜５００ｆＬ程度を上限として、カウントを終了する。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、生体から採取された毛細管血中の血小板凝集塊を解離させることができ、粒子分析装置による白血球などの血球の計数にあたり、高精度にて血球を計数することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、マイクロ血球カウンタにおける測定部を示す平面図である。
【図２】図２は、マイクロ血球カウンタにおける測定部を示す側面図である。
【図３】図３（ａ）は、マイクロ血球カウンタにおける希釈ボトルを示す正面図であり、図３（ｂ）は、その底面図である。
【図４】図４は、マイクロ血球カウンタにおける本体を示す平面図である。
【図５】図５は、マイクロ血球カウンタにおける本体を示す側面図である。
【図６】図６は、マイクロ血球カンウンタにおける本体に測定部（希釈ボトルが取り付けられたもの）を差し込んだ状態を示す斜視図である。
【図７】図７（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施例１、２に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムであり、図７（ｃ）は、比較例１に係る血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。
【図８】図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、それぞれ実施例３、１、４、５に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。
【図９】図９（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ実施例６、１、７に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムであり、図９（ｄ）、（ｅ）は、比較例２、３に係る血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムを示したものである。
【図１０】図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ実施例８、１、９に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムであり、図１０（ｃ）、（ｄ）は、比較例４、５に係る血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。
【図１１】図１１は、静脈血を従来の血球計数用試薬で希釈して作成された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。
【図１２】図１２は、毛細管血を従来の血球計数用試薬で希釈して作成された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明の一実施形態を説明するが、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。
【００３９】
＜粒子分析装置＞
本実施形態において、粒子分析装置は、株式会社堀場製作所社製のマイクロ血球カウンタ（商品名（仮称）：Ｐａｌｍ‐ＬＣ）を用いた。
【００４０】
‐測定部１‐
図１及び図２に、マイクロ血球カウンタにおける測定部１を示す。この測定部１はＰＭＭＡ（アクリル）などの樹脂でカートリッジ化されている。この測定部１の樹脂基板２には、ポンプ接続口１７に一端が接続された外部接続用流路３と、この外部接続用流路３の他端に接続され、壁４、５、６により部分的に仕切られて流路が形成された液溜用セル７と、この液留用セル７に流路８を介して接続された吸光度測定用セル９と、この吸光度測定用セル９に流路１０を介して接続された検出用流路１１と、この検出用流路１１に略Ｓ字状の流路１２を介して接続されたキャピラリー１３と、流路１０と流路１２間に設けられたセンサ取付部１６と、が形成されている。
【００４１】
前記樹脂基板２上の各構成要素は、それぞれ所定の深さと幅で形成されている。図２に示すように、樹脂基板２は樹脂基板２ａと樹脂基板２ｂとからなり、樹脂基板２ａ上には、液留用セル７が例えば深さ４ｍｍ位で形成され、又、吸光度測定用セル９が所定の深さで形成されている。一方、樹脂基板２ｂ上には、外部接続用流路３、流路８、１０、１２と、検出用流路１１と、キャピラリー収容路１８とが、例えば深さ１ｍｍ、幅１ｍｍ位で形成されている。また、樹脂基板２ｂ上にはセンサ取付部１６が形成されている。なお、樹脂基板２ａ、２ｂ上にそれぞれ形成する流路やその他の構成要素の振り分けは、上記に限ることはなく、構成要素の深さ、幅、長さに応じて樹脂基板２ａ、２ｂが有効に利用できるように振り分ければ良い。
【００４２】
このように樹脂基板２ａと樹脂基板２ｂとにそれぞれ所定の構成要素が形成された後、樹脂基板２ａと樹脂基板２ｂとを、例えば、接着剤又は両面テープを用いて、液漏れがないように貼り合わせた後、キャピラリー収容路１８に、例えばガラス製のキャピラリー１３を埋め込み、接着剤などによりキャピラリー１３をキャピラリー収容路１８に固定すると共に、キャピラリー１３の外周面とキャピラリー収容路１８の内周面との間の隙間を塞ぐ。
【００４３】
次に、ボトルガイド１９の中心をキャピラリー１３の中心に合わせた状態で、このボトルガイド１９を樹脂基板２ａ、２ｂの端面に貼り合わせる。そして、外部接続用流路３と接続させた状態で、樹脂基板２ａ、２ｂの端面にポンプ接続口１７を貼り合わせる。センサチップ１４５には、血液試料のインピーダンス変化を検出するための電極１４，１５が設けられている。このセンサチップ１４５を実装したセンサ基板２０を、センサ取付部１６に貼り付けることによってセンサ部が構成され、本マイクロ血球カウンタにおける測定部１が完成する。電極１４、１５は、センサチップ１４５がセンサ基板２０に実装されることにより、リードライン２１、２２にそれぞれ接続され、センサ部からの信号をリードライン２１，２２から取り出すことが可能になる。なお、上記の説明では、センサチップ１４５は、後でセンサ取付部１６に貼り付けたが、樹脂基板２ａまたは樹脂基板２ｂにおいてセンサチップ１４５を成形し、その後、電極１４、１５をスパッタ等を用いてセンサチップ１４５に付けても良い。
【００４４】
‐希釈ボトル２３‐
図３に、希釈液ボトル２３を示す。この希釈液ボトル２３は、血球計数用試薬を収容する容器２４と、この容器２４の上部に設けられた空気孔２７と、空気孔２７を塞ぐシール２６と、容器２４の下部の口に貼り付けられた膜２５と、から構成されている。この希釈ボトル２３は、容器２４内に血球計数用試薬が収容され、シール２６と膜２５により密閉される。
【００４５】
‐本体１００‐
図４、図５に、マイクロ血球カウンタの本体１００を示す。マイクロ血球カウンタの本体１００はケース５１に覆われており、このケース５１内には、三方電磁弁５３，５４、ダイヤフラムポンプ５５、電池５６、５７、５８、５９、ＬＣＤ（液晶ディスプレイ）６１、回路基板６２、およびカートリッジセッティング部６３などが備えられている。又、ケース５１の上面には、ＬＣＤ６１の表示が外部から見ることができるように、窓枠に透明板６０が貼られている。ケース５１の側面から底面にわたって、電池５６、５７、５８、５９を内部にセットしたり交換したりするために開閉される電池蓋６５が設けられている。
【００４６】
ダイヤフラムポンプ５５の加圧側は三方電磁弁５３のコモンポートに接続され、同じくダイヤフラムポンプ５５の減圧側は三方電磁弁５４のコモンポートに接続されている。また、三方電磁弁５３のＮＯポート（通常開のポート）は三方電磁弁５４のＮＣポート（通常閉のポート）に接続され、三方電磁弁５３のＮＣポートは三方電磁弁５４のＮＯポートに接続されている。
【００４７】
そして、三方電磁弁５３のＮＯポートと三方電磁弁５４のＮＣポートとが接続されたラインは、カートリッジ化された前記測定部１がカートリッジセッティング部６３にセットされた際に、測定部１のポンプ接続口１７が接続されるようになっている。三方電磁弁５３、５４、ダイヤフラムポンプ５５、およびＬＣＤ６１などには、電池５６、５７、５８、５９によって動作電源が供給され、三方電磁弁５３、５４、ダイヤフラムポンプ５５、及びＬＣＤ６１などは回路基板６２上の制御回路により制御される。又、検出されたインピーダンス変化を示す信号は、回路基板６２上の演算回路に供給されることにより、血液試料中の血球が測定され、この測定結果がＬＣＤ６１に表示される。
【００４８】
＜本発明の血液検査方法＞
続いて、前記構成を有するマイクロ血球カウンタを用いた本発明の血液検査方法について説明する。
【００４９】
本発明の血液検査方法においては、先ず、生体から毛細管血を採取する採血工程を実行する。本実施形態においては、被検査者（生体）の例えば指先をキャピラリー１３の先端に突き刺し、毛細管現象を利用して、キャピラリー１３内へ毛細管血を採血（１μＬ）することによって採血工程を実行する。
【００５０】
次に、本発明の血液検査方法においては、採取された毛細管血を、本発明の血球計数用試薬で希釈することによって血液試料を作成する希釈工程を実行する。本実施形態においてこの希釈工程は、まず、本発明の血球計数用試薬が入った希釈液ボトル２３をボトルガイド１９に沿ってスライドさせ、キャピラリー１３の先端で希釈ボトル２３の膜２５を破壊することによって、キャピラリー１３の先端を希釈液ボトル２３内に挿入する。この後、希釈液ボトル２３のシール２６を剥がす。これにより、希釈液ボトル２３は、上部に孔が開き、大気開放される。
【００５１】
この測定部１をマイクロ血球カウンタの本体１００に差し込んでセットすれば（図６参照）、ポンプ接続口１７がマイクロ血球カウンタの本体１００に内蔵されたダイヤフラムポンプ５５に連結される。又、センサ基板２０が本体１００側のインピーダンス測定回路に電気的に接続される。そして、前記ダイヤフラムポンプ５５を加圧駆動させ、ポンプ接続口１７から、外部接続用流路３、液留用セル７、流路８、吸光度測定用セル９、流路１０、検出用流路１１、及び流路１２を介してキャピラリー１３内を加圧すると、キャピラリー１３内の毛細管血は、希釈液ボトル２３の中に押し込まれる。この際、希釈液ボトル２３内でバブリングが行なわれて毛細管血と血球計数用試薬とが混合されて、血球計数用試薬によって希釈された血液試料となる（希釈倍率２５１倍）。
【００５２】
前記希釈工程の後、本発明の血液検査方法においては、血液試料中の白血球を計数する測定工程を実行する。本実施形態においてこの測定工程は、まず、前記ダイヤフラムポンプ５５を減圧駆動させ、ポンプ接続口１７から、外部接続用流路３、液留用セル７、流路８、吸光度測定用セル９、流路１０、検出用流路１１、および流路１２を介してキャピラリー１３内を減圧する。これにより、希釈液ボトル２３内の血液試料は、キャピラリー１３および流路１２を介して検出用流路１１に導入される。ここで、この検出用流路１１に設けられた電極１４、１５間にはインピーダンス変化が生じ、マイクロ血球カウンタは、そのインピーダンス変化に基づいて血液試料中の粒子を測定する。
【００５３】
検出用流路１１を通った希釈血液は、流路１０を介して吸光度測定用セル９に流れる。なお、白血球の計数に加えてヘモグロビン量を測定する場合は、吸光度測定用セル９の吸光度を光学センサ（図示せず）で計測することにより、血液試料中のヘモグロビンを測定することができる。更に、吸光度測定用セル９を通った血液試料は、流路８を介して液留用セル７に流れ、廃液として溜められていく。測定工程の終了後、測定部１は、マイクロ血球カウンタの本体から取り外され、液留用セル７に溜められた血液試料とともに廃棄される。
【００５４】
［実施例１］
クロロキン塩類としてのクロロキン二リン酸塩２０ｇ／Ｌと、四級アンモニウム塩としての臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム３６．６ｇ／Ｌを０．５Ｍリン酸緩衝溶液に溶解させ、電解質としての塩化ナトリウムを加えることによって、浸透圧が３９０Ｏｓｍ／ｋｇに調整された本発明に係る血球計数用試薬を作成した。なお、浸透圧は、京都第一科学社製の浸透圧測定装置（商品名：オズモスタットＯＭ−６０２０）にて測定した値である（以下、同様）。
【００５５】
［実施例２］
四級アンモニウム塩として、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（３６．６ｇ／Ｌ）を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、浸透圧が３９０Ｏｓｍ／ｋｇに調整された本発明に係る血球計数用試薬を作成した。
【００５６】
［比較例１］
クロロキン塩類を配合しない以外は、前記実施例１と同様にして、浸透圧が３９０Ｏｓｍ／ｋｇに調整された血球計数用試薬を作成した。
【００５７】
実施例１及び２に係る本発明の血球計数用試薬と、比較例１に係る血球計数用試薬とを、それぞれ別の希釈ボトル２３に封入した。次いで、前記測定部１におけるキャピラリー１３の先端を被検査者の指先の先端に突き刺すことによってキャピラリー１３内に毛細管血を採取し、希釈タンク２３にキャピラリー１３の先端を差し込んだ後、前記測定部１をマイクロ血球カンウンタの本体１００のカートリッジセッティング部６３に差し込むことにより、本発明の血液検査方法を実行した。この検査方法によって得られた白血球容積ヒストグラムを図７に示す。
【００５８】
図７（ａ）及び（ｂ）に示す白血球容積ヒストグラムは、それぞれ実施例１及び２に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定したものである。図７（ａ）及び（ｂ）に示す白血球容積ヒストグラムにおいては、いずれもゴーストノイズＧと白血球ピークＷとが明確に隔離されており、血小板凝集塊による誤カウントの影響が殆ど無いことが確認された。又、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが重なる分布の谷の相対頻度の最小値は、いずれにおいても粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲内に位置していることが確認された。従って、粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲の中から、カウント開始容積を決定し、決定されたカウント開始容積以上の容積を有する粒子を白血球として積算すれば、白血球を高精度に計数できる。
【００５９】
一方、図７（ｃ）に示す白血球容積ヒストグラムは、比較例１に係る血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定したものである。この白血球容積ヒストグラムにおいては、ゴーストピークが相当大きく、そのテーリング部が高容積側に張り出しており、白血球ピークのリーディング部と広範囲にて重なっていた。従って、粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲の中からカウント開始容積を決定しても、血小板凝集塊に起因する誤カウントが生じ、高精度にて白血球を計数することができないことが確認された。
【００６０】
［実施例３〜５］
クロロキン塩類の配合量を、１０ｇ／Ｌ（実施例３）と、４０ｇ／Ｌ（実施例４）と、８０ｇ／Ｌ（実施例５）とに変えた以外は、前記実施例１と同様にして血球計数用試薬を作成した。
【００６１】
前記実施例１に係る血球計数用試薬に加えて、実施例３〜５に係る本発明の血球計数用試薬をそれぞれ用いて、毛細管血の測定を行う本発明の血液検査方法を実行した。得られた白血球容積ヒストグラムを図８に示す。
【００６２】
図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、それぞれ実施例３、１、４、５に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。
【００６３】
図８に示す結果から、血球計数用試薬中のクロロキン塩類の配合量が１０ｇ／Ｌ以上であれば、血小板凝集塊が解離されて、ゴーストピークＧのテーリング部Ｔと白血球ピークＷのリーディング部Ｒとが重なる範囲が小さくなり、誤カウントの影響が殆ど無くなることが確認された。
【００６４】
［実施例６、７］
四級アンモニウム塩の配合量を、１０ｇ／Ｌ（実施例７）と、５０ｇ／Ｌ（実施例８）とに変えた以外は、前記実施例１と同様にして本発明に係る血球計数用試薬を作成した。
【００６５】
［比較例２、３］
四級アンモニウム塩の配合量を、５ｇ／Ｌ（比較例２）と、１００ｇ／Ｌ（比較例３）に変えた以外は、前記実施例１と同様にして血球計数用試薬を作成した。
【００６６】
前記実施例１に係る血球計数用試薬に加えて、実施例６、７及び比較例２、３に係る血球計数用試薬をそれぞれ用いて、毛細管血の測定を行う本発明の血液検査方法を実行した。得られた白血球容積ヒストグラムを図９に示す。
【００６７】
図９（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ実施例６、１、７に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。又、図９（ｄ）、（ｅ）は、比較例２、３に係る血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定した白血球容積ヒストグラムを示したものである。
【００６８】
図９に示す結果から、血球計数用試薬中の四級アンモニウム塩の配合量が１０ｇ／Ｌ未満になると、明確な白血球ピークが得られなくなることが認められた。一方、血球計数用試薬中の四級アンモニウム塩の配合量が５０ｇ／Ｌを超えると、白血球ピークが低容積側に移動し、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが大きく重なっていることが認められた。
【００６９】
これより、血球計数用試薬中の四級アンモニウム塩の配合量が１０〜５０ｇ／Ｌであれば、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが重なる分布の谷の相対頻度の最小値を粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲内に位置させ得ることが確認された。
【００７０】
［実施例８、９］
電解質として配合されるＮａＣｌの配合量を変えることによって、浸透圧を２００Ｏｓｍ／ｋｇ（実施例８）と、６００Ｏｓｍ／ｋｇ（実施例９）とに調整した以外は、前記実施例１と同様にして本発明に係る血球計数用試薬を作成した。
【００７１】
［比較例４、５］
電解質として配合されるＮａＣｌの配合量を変えることによって、浸透圧を１００Ｏｓｍ／ｋｇ（比較例４）と、１０００Ｏｓｍ／ｋｇ（比較例５）とに調整した以外は、前記実施例１と同様にして血球計数用試薬を作成した。
【００７２】
前記実施例１に係る血球計数用試薬に加えて、実施例８、９、及び比較例４、５に係る血球計数用試薬をそれぞれ用いて、毛細管血の測定を行う本発明の血液検査方法を実行した。得られた白血球容積ヒストグラムを図１０に示す。
【００７３】
図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ実施例８、１、９に係る本発明の血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定して得られた白血球容積ヒストグラムである。又、図１０（ｄ）、（ｅ）は、比較例４、５に係る血球計数用試薬で希釈された血液試料を測定した白血球容積ヒストグラムである。
【００７４】
図１０に示す結果から、血球計数用試薬の浸透圧が２００Ｏｓｍ／ｋｇ未満になると、明確な白血球ピークが得られなくなることが認められた。一方、血球計数用試薬の浸透圧が６００Ｏｓｍ／ｋｇを超えると、白血球ピークが低容積側に移動し、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが大きく重なっていることが認められた。
【００７５】
これより、血球計数用試薬の浸透圧が２００〜６００Ｏｓｍ／ｋｇであれば、ゴーストピークのテーリング部と白血球ピークのリーディング部とが重なる分布の谷の相対頻度の最小値を粒子容積３５〜５０ｆＬの範囲内に位置させ得ることが確認された。
【００７６】
なお、本発明は、その精神または主要な特徴から逸脱することなく、他のいろいろな形で実施することができる。そのため、上述の実施例はあらゆる点で単なる例示にすぎず、限定的に解釈してはならない。本発明の範囲は特許請求の範囲によって示すものであって、明細書本文には、なんら拘束されない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変形や変更は、全て本発明の範囲内のものである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、毛細管血中の白血球を高精度で計数することができるものであるが、血小板や赤血球その他の血液成分を検査する際にも利用することができる。
【符号の説明】
【００７８】
１  測定部
２  樹脂基板
３  外部接続用流路
７  液溜用セル
９  吸光度測定用セル
１１  検出用流路
１３  キャピラリー
１６  センサ取付部
１７  ポンプ接続口
１８  キャピラリー収容路
１９  ボトルガイド
１４  電極
１４５  センサチップ
１５  電極
２０  センサ基板
２３  希釈ボトル
２４  容器
２７  空気孔
２５  膜
２６  シール
５１  ケース
５３  三方電磁弁
５４  三方電磁弁
５５  ダイヤフラムポンプ
６１  液晶ディスプレイ
６２  回路基板
６３  カートリッジセッティング部
１００  本体
Ｇ  ゴーストピーク
Ｗ  白血球ピーク
Ｒ  リーディング部
Ｔ  テーリング部
【図１】
0005559096.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005559096.tif 000011
【図１１】
0005559096.tif 000012
【図１２】
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