(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間群Ｐ４３２１２と、ａ＝９３．５Å、ｂ＝９３．５Åおよびｃ＝１７５．２Åであるユニットセル寸法を有する、野生型ヒトＭｎｋ−１キナーゼの残基３７−３４１からなる断片である、結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ。
【請求項２】
前記ヒトＭｎｋ−１キナーゼがキナーゼドメインを含む、請求項１記載の結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ。
【請求項３】
前記ヒトＭｎｋ−１キナーゼが不活性形態である、請求項１又は２に記載の結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ。
【請求項４】
単結晶である、請求項１から３のいずれかに記載の結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ。
【請求項５】
表２に示す構造配座によって決定される三次元構造を有する、請求項１から４のいずれかに記載の結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ。
【請求項６】
不活性なヒトＭｎｋ−１キナーゼの結晶構造を有する、請求項３に記載の結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ。
【請求項７】
（ｉ）細胞中のヒトＭｎｋ−１キナーゼを発現すること、
（ｉｉ）粗Ｍｎｋ−１キナーゼ調製物を回収するために細胞を溶解すること、
（ｉｉｉ）粗Ｍｎｋ−１キナーゼ調製物を精製すること、
（ｉＶ）精製したヒトＭｎｋ−１キナーゼを結晶化すること、
を含み、前記結晶が拡散蒸着によって成長される、請求項１から６のいずれかに記載の結晶ヒトＭｎｋ−１キナーゼ調製物の製造方法。
【請求項８】
前記ヒトＭｎｋ−１キナーゼがアミノ酸残基３７−３４１を有するＭｎｋ−１キナーゼフラグメントであることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記Ｍｎｋ−１キナーゼが、大腸菌中の融合タンパク質として発現される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｍｎｋ−１キナーゼが、融合タグに結合するカラムを用いて精製される、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ヒトＭｎｋキナーゼの結晶構造データを生成するための、請求項１から６のいずれかに記載のまたは請求項７から１０のいずれかに記載の方法によって得られたヒトＭｎｋ−１キナーゼの結晶調製物の使用。
【請求項１２】
配位子、基質および／または阻害因子の結合部位を決定するための、請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶Ｍｎｋ−１タンパク質ならびにＭｎｋ−２タンパク質に関し、より詳細には、Ｍｎｋ−１およびＭｎｋ−２キナーゼ領域の結晶構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいては、５００を超えるキナーゼが知られており、それらはヌクレオチドからタンパク質基質までのリン酸基の伝達に介在する。タンパク質キナーゼによる基質識別、制御ならびに触媒作用の詳細な理解は、高度に多様な生物学的経路の完全なイメージを描くための基本であり、それらの多くは広範囲に及ぶ疾病に直接関連している。ｃＡＭＰ依存性キナーゼの結晶構造は、タンパク質キナーゼの分子構造の第１の高解像度画像を提供した（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ等、Ｓｉｃｅｎｃｅ  ２３５（５０１８）（１９９１）４０７−４１４）。
【０００３】
他のヒトのタンパク質キナーゼの結晶構造により、貴重な触媒および調節メカニズムへの識見が提供され、特定の阻害因子の設計が助成される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｎｉｇｈｔｏｎ等、Ｓｉｃｅｎｃｅ  ２３５（５０１８）（１９９１）４０７−４１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明の主題は、結晶ヒトＭｎｋ−２タンパク質と結晶ヒトＭｎｋ−１、およびそれらの調製方法と用途に関するものである。
【０００６】
第１の実施態様において、本発明は、ヒトのセリン−トレオニンキナーゼマイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰ）相互作用性キナーゼ−２に関するものであり、これはＭｎｋ−２タンパク質とも称される。ヒトにおいて４つのＭｎｋタンパク質が発見されており、すなわち、２つのアイソフォームＭｎｋ−１とＭｎｋ−２であり、後者は２つのスプライスバリアントＭｎｋ−２ａとＭｎｋ−２ｂとして存在する。スプライスバリアントＭｎｋ−１ｂもまた開示されている。Ｍｎｋ−２ａとＭｎｋ−２ｂのキナーゼのドメインは同一である。Ｍｎｋタンパク質がＭＡＰキナーゼファミリーの１つによって活性化できることが示されている。具体的には、ストレス誘発ｐ３８タンパク質と、マイトジェン活性化Ｅｒｋ１／２タンパク質が、この機能を果たすことができる。Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２は、同様の経路を経て活性化され、同様の基質特異性を呈する。キナーゼドメイン内におけるそれらのアミノ酸配列は、ほぼ同じであり、かつ、以下に記載のアミノ酸と同一である。そのため、Ｍｎｋキナーゼは、これら２つのＭＡＰキナーゼ経路の集合点を構成し得る。
【０００７】
Ｍｎｋタンパク質は、タンパク質キナーゼのＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫＡＰＫ）ファミリーのサブファミリーであり、これらタンパク質キナーゼは、Ｃａ／カドミウム調節キナーゼ（ＣＡＭＫ）グループに属する。
【０００８】
Ｍｎｋは、３つのＭＡＰＫカスケードのうちの２つ、すなわち、成長因子誘導Ｒａｓ細胞外信号調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）１／２およびストレス誘発ｐ３８経路（福永等のＥｍｂｏ  Ｊ．（１６）（１９９７）１９２１−１９３３；Ｅｍｂｏ  Ｊ．（１６）（１９９７）１９０９−１９１０）によるリン酸化によって活性化される。２つのほ乳類ＭｎｋアイソフォームであるＭｎｋ−１とＭｎｋ−２は、真核細胞開始因子４Ｅ（ｅｌＦ４Ｅ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化する（シェパー（Ｓｃｈｅｐｅｒ）等のＥｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２６９）（２００１）５３５０−５３５９、上田等のＭｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２４）（２００４）６５３９−６５４９、ヴァスキエヴィッツ（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ）等のＭｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９）（１９９９）１８７１−１８８０）。ｅｌＦ４Ｅは、翻訳開始複合体の必須成分であり、真核細胞のメッセンジャーＲＮＡのＣＡＰ構造を結合する（マルコトリジアーノ（Ｍａｒｃｏｔｒｉｇｉａｎｏ）等のＣｅｌｌ（８９）（１９９７）９５１−９６１）。Ｍｎｋ介在性ｅｌＦ４Ｅリン酸化により、例えばＲＦＬＡＴ−１やウィルス性転写の特定のｍＲＮＡの翻訳が刺激されることは明らかである（ニコルシェバ（Ｎｉｋｏｌｃｈｅｖａ）等のＣｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１１０）（２００２）１１９−１２６、ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）等のＧｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１８（２００４）６６０−６７２）。さらに、Ｍｎｋ１は、ｈｎＲＮＰＡ１による腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の翻訳を減じるため、炎症性疾患において役割を果たす（バクセード（Ｂｕｘａｄｅ）等のＩｍｍｕｎｉｔｙ  ２３，１７７−１８９）。脂質代謝、炎症ならびにウィルス性翻訳におけるＭｎｋの改善により、製薬的介入のためのターゲットとしてそれらは定義される。
【０００９】
ＣＡＭＬグループのその他の部分と一列に並ぶ配列は、Ｍｎｋタンパク質の無比のいくつかの特徴を明らかにした。構造的および機能的見地におけるこの観察の結果を明らかにするため、Ｍｎｋ−２に対する結晶学的な研究が行われた。本発明により、Ｍｎｋ−２のキナーゼドメインの２．１Å結晶構造が得られた。その結果、Ｍｎｋ−２のＡｐｏ酵素が、活性ループとＰ＋１ループのＣ末端を含む、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）のスキームのサブドメインＸＩＩＩに対応するセグメントの例外的な開放高次構造を示すことが示されている（ハンクス（Ｈａｎｋｓ）等のＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００（１９９１）３８−６２）。Ｐ＋１ループは、基質結合に対して重要であることが知られている。
【００１０】
ＤＦＤとしてＭｎｋタンパク質中で保存される、マグネシウム結合ＤＦＧモチーフの同等物は、ＡＴＰ結合ポケット中に突出し、ヌクレオチド結合を妨害する。したがって、活性化ループの開始時に保存されたＤＦ（Ｇ／Ｄ）は、ＡＴＰ結合を阻害する立体配座を受け入れる（ＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＯＵＴ立体配座と称す）。これはヌクレオチド結合を調節する阻害メカニズムが、ＡＴＰ結合の割り接ぎが、非リン酸化ａｐｏ酵素中で可能であるＣＡＭＫグループの既知の構造の他のキナーゼ（ＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＩＮ立体配座）とは対照的であることを明らかにしている。これは、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼアポ酵素中におけるＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＯＵＴ立体配置の第１の観察である。
【００１１】
さらに、タンパク質キナーゼにおいては開示しなかったが、Ｃループ中の亜鉛配位モチーフが発見された。Ｍｎｋ−２キナーゼドメインは、Ｍｎｋタンパク質中の長さと配列中に保存されるが他のキナーゼでは欠けている、Ｃループ中に１５の残基の挿入を包含している。この挿入中の４つの保存されたシステインは、ここで開示するＭｎｋ−２構造によって明らかにされるように、亜鉛イオン結合部位として機能する。
【００１２】
したがって本発明のＭｎｋ−２構造は、キナーゼアーキテクチャと調節の新規な態様を明らかにするものであり、これは論理的な阻害設計に用いることができる。
【００１３】
特に好ましくは、本発明は、結晶ヒトＭｎｋ２ａまたはＭｎｋ−２ｂタンパク質に関するものである。Ｍｎｋ−２ａは、真核細胞開始因子４ｅ（ｅｌＦ４Ｅ）のリン酸化による翻訳機構をターゲットとする、ヒトタンパク質キナーゼである。
【００１４】
トランスリン酸化反応中に包含されることが知られている残基は、ＣＡＭＫキナーゼグループ内で保存される（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）等の、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（５）（１９９４）３４５−３５５、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）等の、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１（４８６１）（１９８８）４２−５２）。これらの残基は、
（Ａ）Ｌｙｓ１１３と、
（Ｂ）推定受容体ベースＡｓｐ２０５を含有する触媒ループ（残基２０５−２１０）と、
（Ｃ）γリン酸の活性に必要なマグネシウムイオンを配位する、ＤＦ（Ｇ／Ｄ）モチーフの第１のＡｓｐ２２６と、
である。
【００１５】
しかしながら、Ｍｎｋタンパク質を他のタンパク質キナーゼから区別するいくつかの特徴がある。すなわち、活性ループのＤＦＧモチーフＮ末端中に保存されたグリシンは、全てのＭｎｋタンパク質中のアスパルテートで置換され、その結果、ＤＦＤモチーフ中に存在する（ＤＦ（Ｇ／Ｄ）と称される）。この単一のアミノ酸置換は、その他のＣＡＭＫグループ中には見られない。さらには、Ｍｎｋタンパク質は、全て長さが保存される３つの異なる箇所アミノ酸挿入部を含む。１０個のアミノ酸の第１の挿入部（ｌ１）は、ＤＦＤモチーフに続く活性化セグメントのＮ末端に位置する。第２の挿入部（ｌ２）は、ヘリックスＦの上流にあり、おおよそ５つのアミノ酸を含む。挿入部３（ｌ３）は、１５のアミノ酸のストレッチであり、Ｍｎｋのサブファミリー内に高度に保存されたパターンを呈し、ＣローブのＧとＨのヘリックスを接続するループのＮ末端に位置する。４つのシステインのクラスタは、全てのＭｎｋにおいては不変のｌ３内に存在する。
【００１６】
一実施態様においては、本発明による、結晶ヒトＭｎｋ−２タンパク質、特に結晶Ｍｎｋ−２ａタンパク質は、完全なタンパク質である。他の実施態様では、これもまた好ましく、フルレングスタンパク質ではなく一部欠失形、特に、少なくともアミノ酸残基７２−３８５を含む一部欠失形であり、キナーゼドメイン（ＫＤ）を含む。数字は、エントリーＡＡＧ２６３３７（Ｍｎｋ−２ｂ）とＡＡＧ２６３３６（Ｍｎｋ２ａ）を示す。特に好ましくは、２０Åより良好な、より好ましくは１０Åより良好な、さらに好ましくは３Å未満より良好な解像度を有するＸ線構造解析が可能な結晶が関連する。
【００１７】
本発明による結晶調合物は、空間群Ｐ３２２１と、ａ＝１０４．５Å±３Å、ｂ＝１０４．５Å±３Åおよびｃ＝７２．３５Å±３Åであるユニットセル寸法を有することが好ましい。本発明によれば、２Åに対して回折可能な結晶が調製され、それによって、その構造は、分子置換によって溶解されて０．２１（Ｒｆｒｅｅ＝０．２５）のＲ因子に改良することができた。特に好ましいのは、本発明により不活性形態のヒトＭｎｋ−２タンパク質の結晶が検討されることである。
【００１８】
さらに好ましいのは、非リン酸化Ａｐｏ配座のＭｎｋ−２結晶ドメインが検討されることである。
【００１９】
本発明によりわかるように、活性化セグメントとそのＣ末端のヘリックスαＦ（αＦ：残基２７０−２９０）までの延長部は、異常なオープン構造にある（Ｍｎｋ−２アミノ酸残基のナンバリングは、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｅｎｔｒｙ  ＡＡＧ２６３３６命名法に対応する）。この領域はサブドメインＸＩＩＩ分類に該当する。活性化セグメントは、活性キナーゼのリン酸化ターゲットである残基を担持し、１９−３２残基とは独立した、２つの保存モチーフであるＤＦ（Ｇ／Ｄ）とＡＰＥの間に配置される領域として定義されている。
【００２０】
従来開示のキナーゼ構造との際だって対照的に、ヒトＭｎｋ−２タンパク質のサブドメインＸＩＩＩは、キナーゼコアから突き出ている。サブドメインＸＩＩＩは、リン酸化部位Ｔｈｒ２４９とＡＰＥモチーフとの間に位置するＰ＋１ループを含む。Ｐ＋１ループは、触媒作用のためにペプチド基質の位置を決める。
【００２１】
サブドメインＸＩＩＩの突出部は、基質認識、基質位置決め、および活性化体機構に影響を与えるＭｎｋタンパク質中の位相転位に向いている。
【００２２】
さらには、ＡＴＰ加水分解に関連する残基とリン酸塩転移とは、タンパク質キナーゼ中で十分に不変である。触媒活性に関連する領域は、Ｌｙｓ１１３、Ｇｌｕ１２９、Ａｓｐ２０５、およびＡｓｎ２１０を含む。本発明によって得られる構造データから確認できるように、結晶ヒトＭｎｋ−２タンパク質構造は、ＡＴＰまたは関連する化合物の影響を受けない。したがって、本発明による結晶は、不活性形態のヒトＭｎｋ−２タンパク質の結晶体にあって好ましい。本発明のＭａｋキナーゼ中のＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＯＵＴ立体配座と一致するＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＯＵＴ立体配座ｐ３８が、一定の化学物質によって誘導されることが示されている（パーゲリス（Ｐａｒｇｅｌｌｉｓ）等、ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｒｕａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｎｏ．４（２００２）２６８−２７２）。ＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＯＵＴ配座により、ＡＴＰ結合クレフトをターゲットとする化合物に加え、ジアリール尿素阻害剤などの代替物質クラスの使用を包含する広範な薬理学的用途を伴う新規なアロステリック結合部位が提供される。さらには、ＤＦ（Ｇ／Ｄ）ＯＵＴ配座の安定化により、酵素が阻害される。
【００２３】
したがって、本明細書で提供されるデータにより、Ｍｎｋ−２ａのＤＦＤモチーフが、基質のリン酸化が要求される際に、得られるＡＴＰ結合、すなわちＡＴＰ結合と不適合である配座を呈することができることが示される。すなわち、それは、非リン酸化Ｍｎｋ−２が、ＡＴＰと結合できないか、あるいは、ＡＴＰ結合を可能にするためにＤＦＤモチーフ中での配座変化をまず生じさせなければならないことから生じる。Ｍｎｋ−２の決定された配座は、該タンパク質（ＤＦＧモチーフに代わるＤＦＤモチーフ）の特定の配列に起因して、その他全てのキナーゼとは異なる。この情報により、Ｍｎｋ−２の阻害物質ならびに異性体、および非生産的ＤＦＤ配座を認識して安定化するその他のタンパク質キナーゼを特定することができる。この上方により、Ｍｎｋ−２の阻害因子ならびにアイソフォームおよび非生産性ＤＦＤ立体配座を認識して安定化する、他のタンパク質キナーゼを特定することができる。また、これはＭｎｋ−２、Ｍｎｋ−２キナーゼドメインそれぞれに特異な阻害因子を提供することができるが、他のキナーゼは認識しない。これは、ＤＦＧモチーフを呈するその他のキナーゼが異なる配列を有するために可能である。
【００２４】
したがって、とりわけ、ＡＴＰ結合ポケット（ここでは、ＤＦＤＯＵＴポケットとも称する）ならびに他のポケット（ここでは、ＤＦＤＩＮポケットとも称する）は、本発明による構造データによって決定することができる。活性形態において、ＡＴＰポケットは、ＡＴＰの結合部位を提供する。該ポケットは、特に、アミノ酸残記Ｇｌｕ１２９とＡｓｐ２０５、ならびにアミノ酸残記Ｌｙｓ１１３とＡｓｎ２１０によって定義される。認識され得る第２のポケットは、本発明により特に関心の対象となるものである。該第２のポケット、すなわちＤＦＤＩＮポケットは、ＤＦＤモチーフのＰｈｅが活性構造中で位置する部位である。不活性形態において、ＡＴＰポケットは、少なくとも部分的にＤＦＤモチーフ、特にＤＦＤモチーフのＰｈｅによって占められている。この不活性形態は、ＤＦＤＩＮポケットを占有すること、特に、活性化セグメントまたはその他の分子、特に、阻害因子として機能する小さい分子でＤＦＤＩＮポケットを占有することによってロックすることができる。ＤＦＤＩＮポエットを占有することにより、ＡＴＰが、この形態においては少なくとも部分的にＤＦＤモチーフによって占有されているＡＴＰポケットにアクセスできないため、キナーゼ活性の阻害因子が作用する。ＤＦＤＩＮポケットは、特に、アミノ酸残記Ｌｕｅ１３３、Ｈｉｓ２０３、Ｉｌｅ１４２、およびＩｌｅ２２４によって定義される。該ＤＦＤＩＮポケットをブロッキングすることによって、不活性構造がロックされる。したがって、本発明の主題は、前記ポケットを占有することができることにより、Ｍｎｋの選択的阻害因子の役割を果たす分子を提供することである。すなわち、そのようなＤＦＤＩＮポケット内へ結合することができる阻害因子が、本発明のその他の主題を提供する。Ｍｎｋにおいて、活性セグメント、特に活性化セグメントの挿入部１２、より詳細にはアミノ酸残基Ｐｈｅ２６５は、ＤＦＤＩＮポケットをブロックするため、適当な阻害因子は、例えば、小さい活性化セグメントの少なくとも部分的な配列を有するペプチドである。活性化セグメントは、アミノ酸Ａｓｐ２２６〜Ｃｙｃ２７５からなり、特に、アミノ酸２６３〜２６７まで延在する挿入部１２を含む。したがって、Ｍｎｋの適当ペプチド阻害因子は、活性セグメントの配列または少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは８つのアミノ酸を有するその連続的なフラグメントを有するペプチドである。そのような阻害因子の例とは、（２５８）ＡＰＥＶＶＥＡＦＳＥＥＡ（２６９）または（２６０）ＥＶＶＥＡＦＳ（２６６）である。
【００２５】
本発明によって提供される、アロステリックな結合部位に対抗する阻害因子を提供する可能性により、さらには、顕著に改善された選択性を有する阻害因子が得られる。キナーゼのＡＴＰ結合部位に対抗する標準的なキナーゼ阻害因子は、キナーゼの高い相互ホモロジーに起因した大きなクロス反応可能性を有する。したがって、ＡＴＰ結合部位に対抗する阻害因子は、通常、わずかな選択性しか有さないため、強力に阻害して選択的阻害因子の発達を制限する。しかしながら、本発明によれば、Ｍｎｋのアロステリック結合部位における選択的な阻害因子の結合を提供することが可能となる。
【００２６】
本発明により用いることが可能な阻害因子の１つは、ＢＩＲＢ７９６（パーゲリス（Ｐａｒｇｅｌｌｉｓ）等の、ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｎｏ．４（２００２），２６８−２７２）である。その他の阻害因子は、ジアリール尿素ベースの阻害因子（１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素）である。
【００２７】
さらに、Ｍｎｋタンパク質は、Ｍｎｋタンパク質をその他のＣＡＭＫグループのキナーゼから区別する４つのシステインの不変クラスタを含むαＦとαＧとの間に挿入部を有する。分子のフレキシブルループ中のこれら４つのシステインクラスタは、亜鉛結合部位を形成する。そのため、この挿入部は亜鉛のフィンガー状構造、タンパク質キナーゼの特異的なフィンガープリントをマークする。さらに、４つの保存されたグリシンは、この挿入部中に存在しており（Ｇｌｙ２９７、Ｇｌｙ３００、Ｇｌｙ３０４およびＧｌｙ３０８）、これらは、このヘアピン状モジュールに折りたたむのに必要な領域にねじれフレキシビリティを与える。亜鉛フィンガーモジュールは、変化を有する核酸またはタンパク質結合モジュールであることが知られている（クリシュナ（Ｋｒｉｓｈｎａ）等の、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１（２）（２００３）５３２−５５０）。このドメインは、その他のタンパク質、特に、基質や調整器のアダプタモジュールである。本発明による結晶ヒトＭｎｋ−２キナーゼはまた、変異体、好ましくは、天然Ｍｎｋ−２キナーゼの少なくとも１つのアミノ酸、特に、少なくとも２つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置き換えられたタンパク質を含んでなる。そのような変異体の結晶は、特に、機構学的研究ならびに結合ポケットの研究および配位子、基質あるいは阻害因子との相互作用を研究するのに遊離に用いることができる。この結果、適切に、結合能に対する相互作用または影響が推定あるいは予測される位置にある個々のアミノ酸を選択的に変化させる。この目的のため、例えば、２０までの、好ましくは１０までの、より好ましくは５までの、さらにこのましくは最大１つの突然変異を有する結晶ヒトＭｎｋ−２キナーゼは好ましいものとなり得る。結晶ヒトＭｎｋ−２キナーゼ変異Ｄ２２８Ｇが特に好ましい。さらに好ましい実施態様において、配位子、基質および／または阻害因子、特に、阻害因子スタウロスポリンとの組み合わせた結晶ヒトＭｎｋ−２キナーゼ変異Ｄ２２８Ｇが考慮される。
【００２８】
好ましい変異体は、位置Ａｓｐ２２６，Ｐｈｅ２２７またはＡｓｐ２２８で交換させたアミノ酸を有する。
【００２９】
本発明は、さらに、表１に示す構造的配位の全てのまたは選択された部分で決定される三次元構造を有する結晶ヒトＭｎｋ−２タンパク質に関する。この表１に示す配位は、ここで説明する例のように得られたものである。
【００３０】
一実施態様において、本発明は、同属のタンパク質キナーゼ阻害因子スタウロスポリンと共結晶されたヒトＭｎｋ−２−Ｄ２２８Ｇ変異体の結晶構造をさらに提供する。この構造において、ＤＦＧ／ＤＩＮ配座中へのＤＦＧモチーフフリップにより、ＡＴＰ結合ポケット内におけるその同属の結合部位においてスタウロスポリンを結合させることができる。この配座は表３に示す。阻害因子のいずれも有さない、特に、阻害因子スタウロスポリンを有さない、ヒトＭｎｋ−２キナーゼＤ２２８Ｇ変異体の結晶構造がさらに提供される。その配剤は表１ａに示す。
【００３１】
本発明による結晶ヒトＭｎｋ−２タンパク質の特徴は、例えば、
ｉ．細胞、例えば大腸菌中におけるヒトＭｎｋ−２タンパク質の発現；
ｉｉ．Ｍｎｋ−２タンパク質祖調製物を回収するための細胞を溶解すること；
ｉｉｉ．Ｍｎｋ−２タンパク質祖調製物を、例えば、親和性タグクロマトグラフィーによって精製すること；および
ｉｖ．精製されたヒトＭｎｋ−２タンパク質を、例えば、拡散蒸着によって結晶化すること、
によって調製することができる。ヒトＭｎｋ−２タンパク質、特に、本発明による、ヒトＭｎｋ−２ａタンパク質またはＭｎｋ−２ｂタンパク質、より好ましくは、ヒトＭｎｋ−２ａタンパク質のキナーゼドメインの結晶化方法は、ヒトＭｎｋタンパク質の結晶構造データの生成に特に用いることができる。特に、配位子、特に阻害因子や基質との結合部位または相互作用部位がそれによって得られる。さらには、タンパク質を活性または不活性形態に維持するために結合部位を特定することができる。さらに、ここで得られるＭｎｋ−２タンパク質の結果により、Ｍｎｋ−１などのＭｎｋ−２のアイソフォームの配位子、特に阻害因子や基質もまた特定することができる。本発明による結晶化方法は、好ましくは単結晶であり、より好ましくは少なくとも１μｍ、さらに好ましくは少なくとも１０μｍ、最も好ましくは少なくとも５０μｍの端長を有する結晶である。結晶は、Ｘ線構造解析を実施可能な方法で配置することが好ましい。したがって、本発明のその他の主題は、ヒトＭｎｋ−２タンパク質、特に、表１、表１ａまたは表３に示す構造配座の全てまたは選択されたタンパク質によって決定されるヒトＭｎｋ−２ａタンパク質の結晶構造である。好ましくは、不活性ヒトＭｎｋ−２ａタンパク質の結晶構造が考慮される。結晶構造は、５０Å以上の分解能、より好ましくは１０Å以上、さらに好ましくは３Å以上の分解能を有することが望ましい。
【００３２】
結晶ヒトＭｎｋ−２タンパク質と結晶構造のそれぞれを用いることにより、Ｍｎｋ−２タンパク質配位子を設計、同定または調製することができる。さらには、タンパク質キナーゼ、ならびに上述したようにＭｎｋ−２のアイソフォームのタンパク質キナーゼの調節機構を同定することができる。配位子または調節機構を同定するために、特にコンピュータ支援モデル化プログラムが用いられる。
【００３３】
適した配位子は、例えば、ヒトＭｎｋ−２タンパク質の相互作用部位と相補的な三次元構造を有する分子を作製することによって同定することができる。特に好ましい配位子は少なくともアミノ酸Ａｓｐ２２６，Ｐｈｅ２２７，Ａｓｐ２２８の少なくとも１つと相互作用する。さらに好ましい配位子は、少なくとも１つの原子が、ＤＦＤモチーフの原子のいずれかまでの所定の距離内、好ましくは７Åの距離内、さらに好ましくは６Å、特に５Åの距離内にある少なくとも１つのアミノ酸と相互作用する。
【００３４】
配位子を同定するためのコンピュータ支援スクリーニングによれば、ＷＯ０３／０３７３６２号公報に開示の方法が、実際に配位子を同定して照合するのに好ましく適用される。
【００３５】
表１、表１ａまたは表３で与えられるヒトＭｎｋ−２タンパク質の結晶構造の構造的配位はまた、ヒトＭｎｋ−２タンパク質の結晶構造の三次元表現を作成するのに用いることができる。そして、そのような三次元構造に形成された相互作用ポケットは、それらの三次元構造により、対応する配位子を同定するのに用いることができる。
【００３６】
表１、表１ａまたは表３に示される、本発明によって提供される構造的配位は、その他のタンパク質の結晶構造を決定するのにも用いることができ、それにより、構造的配位は分子置換に用いられる。
【００３７】
ここで提供するデータは、コンピューターで読み取り可能な保存媒体に保存し、適当に提供することが好ましい。
【００３８】
本発明は、さらに、Ｍｎｋ−２タンパク質のアイソフォーム、ならびに結晶化法または結晶構造を用いて得たその他のタンパク質キナーゼの配位子、特に基質または阻害因子に関する。そのような配位子は、好ましくは、薬剤組成物中における活性剤である。そのような薬剤組成物は、処置、特にＭｎｋ−２タンパク質の阻害が必要な、例えば、肥満、糖尿病およびメタボリック症候群ならびに癌などの代謝障害などの病気を治療するのに用いることができる。さらに実施態様において、本発明は、結晶ヒトＭｎｋ−１タンパク質に関する。
【００３９】
Ｍｎｋ−１キナーゼ領域（Ｍｎｋ−１−ＫＲ）の結晶構造は、Ｍｎｋ−２−ＫＲ異なる立体配座を取るが、触媒ドメインのアミノ酸配列は７８％一致する。Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２の構造データの組み合わせにより、Ｍｎｋサブファミリーメンバーの活性化に不随する機械的事象のダイナミックな像を描くことができるようになる。
【００４０】
また、この実施態様においては、ヒトＭｎｋ−１タンパク質の突然変異体は、特に、交換させた少なくとも１つの、特に少なくとも２つのアミノ酸を有する突然変異体に包含される。上記で説明したように、そのような突然変異体は、機構学研究に特に用いることができる。好ましくは、突然変異体は≦２０、より好ましくは≦１０、さらに好ましくは≦５、最も好ましくは最大１の交換アミノ酸を有する。Ｍｎｋ−１の場合における交換アミノ酸の好ましい部位は、位置Ａｒｇ９０またはＡｒｇ９３、およびＡｒｇ１９１，Ｐｈｅ１９２またはＡｒｇ１９３である。
【００４１】
本発明は、Ｎ末端ローブ、マグネシウム結合ループ、および活性化セグメントが、徹底的な構造転位を受け、完全活性状態まで自動阻害されることによって得られるＭｎｋ活性化モデルにも関する。本発明のさらなる態様は、活性化セグメント介在の官能要素の位置移動によって自動阻害を得るためにＭｎｋを用いることである。
【００４２】
その他のタンパク質キナーゼの多くに見られるそのカノニカルな立体配座において、活性化セグメントのＣ末端部分は折り返され、ショートヘリックスα−ＥＦと基質結合Ｐ＋１ループは、ヘリックスαＦ，αＧおよび触媒ループによって与えられる環境中でキナーゼコア内に埋没する（ナイトン（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ）等の、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２５３）（１９９１）４１４−４２０；ノレン（Ｎｏｌｅｎ）の、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ（１５）（２００４）６６１−６７５）。
【００４３】
しかしながら、Ｍｎｋ−１−ＫＲにおいては、α−ＥＦは解かれてペプチド結合溝内へ崩壊するため、Ｎ末端ローブ配座と活性部位残基が変化する（図９）。特に、αＣヘリックス（Ａｒｇ９０：Ｇｌｕ２２５；Ａｒｇ９３：Ｇｌｕ２２８）との相互作用が引き上げ力を与えて、αＣとＮローブの残部を置き換え、それによりローブは終了する（図９Ａ）。相互作用残基Ａｒｇ９０とＡｒｇ９３に対応する残基は、活性状態のタンパク質キナーゼ中のリン酸部分に結合することが知られている（クリュパ（Ｋｒｕｐａ）等の、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（３３９）（２００４）１０２５−１１３９）。そのため、再構築された活性化セグメントは、活性部位の配座を変更する分子スイッチとして機能するよう予定されている。ナンバリングは、オログレン・エー（Ｏ‘Ｌｏｇｈｌｅｎ，  Ａ．）、ゴンザレス・ヴィー・エム（Ｇｏｎｚｌｅｚ，Ｖ．Ｍ．）、ピネイロ・ディー（Ｐｉｎｅｉｒｏ，Ｄ．）、プレッツモルガード・エム・アイ（Ｐｒｅｚ−Ｍｏｒｇａｄｏ，Ｍ．Ｉ．）およびマーティン・エム・イー（Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｅ．）（２００４）、Ｍｎｋ１ｂの同定および分子特徴付け、ヒトＭＡＰキナーゼ相互作用キナーゼＭｎｋ１のスプライス異体、ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ２９９，３４３−３５５に相当する。
【００４４】
この活性化セグメントの「ウェッジ」形態のさらなる効果は、リン酸部位の到達可能性を促進し得る、活性化ループをさらすことである。ローブの終了は、Ｍｎｋ−２構造によって示すように、活性化セグメントと調節Ｃヘリックスとの間の相互作用が途絶える場合に逆戻りさせることができる（図９Ｂ）。Ｍｎｋ−２において、分子本体から突出しているため、活性化セグメントは全く異なる形態を取る。その結果、活性化セグメント：Ｃヘリックス相互作用は緩和されてＮローブは突然回復する（図９Ｂ）。
【００４５】
Ｍｎｋ−１と比較した場合、Ｍｎｋ−２のＮローブは、おおよそ１０°傾き、キナーゼのＡＴＰ結合口を開く（図９Ｃ）。
【００４６】
Ｍｎｋ−１の延長、再構築された活性化セグメントは、その他のＣＡＭＫグループメンバーのほとんどには存在しない２つのアミノ酸挿入部を有する。
【００４７】
内部ローブ溝における活性化セグメントの新規な配置の結果、Ｐｈｅ２３０は、Ｌｅｕ９８とＴｈｒ９７出発配座αＣ，Ｃループの上流のＨｉｓ１６８，Ｉｌｅ１０７，Ｉｌｅ１８９およびＬｅｕ１６１によって与えられる構造的に保存されたポケット内に存在することになる（Ｍｎｋ−１アミノ酸残基のナンバリングは、ＥｎｔｒｅｚＥｎｔｒｙＣＡｌ１４７６４に対応する）。
【００４８】
後者のポケットが、活性状態のキナーゼにおいてＤＧＧ／Ｄモチーフのフェニルアラニンの結合部位として機能することが発見された（図１０）。この活性ＤＦＧ／Ｄモチーフ配座は、ＤＦＧ／ＤＩＮ配座と見なされ、その対応する結合部位は、今後、ＤＦＧ／ＤＩＮポケットと称する。Ｍｎｋ−１においては、しかしながら、Ｐｈｅ２３０のＤＦＧ／ＤＩＮポケットにおける存在は、ＤＦＧ／Ｄモチーフのアクセスを制限し、ＡＴＰ結合部位を立体的にブロックする阻害ＤＦＧ／ＤＯＵＴを誘導する（次の段参照）。そのため、再構築された活性化セグメント、特にＰｈｅ２３０は、Ｍｎｋ固有の調節機構の重要な役割を果たす自動阻害要素を構成する。
【００４９】
これまで、自動阻害戦略という意味でのＤＦＧ／ＤＩＮポケットの障害は、ｃ−ＫＩＴおよびＦｌｔ３に見られ、これら２つはタイプＩＩＩレセプターチロシンキナーゼと非常に関連性が高い。ｃ−ＫＩＴおよびＦｌｔ３は、ＤＦＧ／ＤＯＵＴの誘導により「ｉｎ  ｔｒａｎｓ」で自動阻害するキナーゼのＮ末端に位置する傍膜（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ；ＪＭ）ドメインを含む（グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）等の、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（１３）（２００４）１６９−１７８；モル（Ｍｏｌ）等の、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｍｅ．  （２７９）（２００４ａ）３１６５５−３１６６３）。いずれのケースにおいても、ＪＭドメインから出発する残基（Ｆｌｔ３中のＬｅｕ５７６およびｃ−ＫＩＴ中のＴｒｐ５５７）は、ＤＦＧ／ＤＩＮポケット内へプランジされ、これはＤＦＧ／Ｄモチーフを強制的に阻害ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座にする（図１０Ａ、図１０Ｂ）。その結果、Ｍｎｋ−１は、ｃ−ＫＩＴとＦｌｔ３と類似するが、異なる構造要素を利用する自動阻害機構を達成する（図１０Ｃ）。Ｍｎｋ−１は、ＪＭドメインの代わりに、その活性が静まるようその再構築された活性化セグメントとＰｈｅ２３０とを採用し、これは、ｃ−ＫＩＴとＦｌｔ３内で、ＤＦＧ／ＤＩＮポケットの関与が維持されるよう生じる（図１０Ｃ）。
【００５０】
また、Ｍｎｋ−１の場合、本発明によって提供されるデータにより、ＤＦＤＩＮポケットの定量が可能となる。このポケットは、上述したように、特に、Ｌｅｕ９８とＴｈｒ９７、Ｈｉｓ１６８、Ｉｌｅ１０７、Ｉｌｅ１８９とＬｅｕ１６１によって決定される。上記ＤＦＤＩＮポケットを用いることにより、ＤＦＤモチーフは、少なくとも部分的にＡＴＰポケット内に位置されるため、ＭｎｋによりＡＴＰ結合を阻害することができる。そのため、ＤＦＤｉｎポケットをブロックすることにより、キナーゼ活性が阻害される結果となる。したがって、本発明のさらなる態様とは、ＤＦＤｉｎポケットに結合し、それによりＭｎｋを阻害する分子を提供することである。活性化セグメントによるＭｎｋ−１の自動阻害が、特に、活性化セグメントのＤＦＤＩＮポケット内へのｌ２挿入部のＰｈｅ２３０の位置によって生じるため、適切な阻害因子は、アミノ酸１９１〜２４０からなるＭｎｋ−１の活性化セグメントの全配列または部分的配列からなり、特に、アミノ酸２２８〜２３２からなる挿入部ｌ２の配列からなる。適切なペプチドは、例えば、（２２３）ＡＰＥＶＶＥＶＦＴＤＱＡ（２３４）または（２２５）ＥＶＶＥＶＦＴ（２３１）である。
【００５１】
タンパク質キナーゼの広大な大部分は、インターローバルクレフトにおいてタンパク質キナーゼのＡＴＰ結合「口」の「唇」を形成する、活性化セグメント（サブドメインＶＩＩ）の開始時にＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（ＤＦＧ）モチーフを担持する（ハンクス（Ｈａｎｋｓ）の、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（４）（２００３）１１１；ハンクスの、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２４１）（１９８８）４２−５２）；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）の、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２）（１９９４）３４５−３５５）。このモチーフの第１のアスパラートは、触媒活性タンパク質キナーゼ間で不変であり、リン酸転位に必須のマグネシウムイオンと配位することが知られている（図１１Ａ）（アダムス（Ａｄａｍｓ）の、Ｃｈｍｅ．  Ｒｅｖ．（１０１）（２００１）２２７１０２２９０）。そのため、ＤＦＧモチーフはマグネシウム結合ループと称される。
【００５２】
しかしながら、Ｍｎｋは、配位位置でＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＤＦＤ）モチーフを担持する。ＤＦＧ／ＤＩＮポケットがＰｈｅ２３０でブロックされた結果、Ｍｎｋ−１のＤＦＧ／Ｄモチーフは阻害ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座に適合する（図１１Ｂ）。ＤＦＤモチーフは、活性状態のタンパク質キナーゼのＤＦＧ／ＤＩＮ配座に対して、Ａｓｐ１９１のΦ角度（ΦＡｓｐ１９１＝−１２０）について〜１８０°だけ回転される（例えば、ＤＡＰＫ１ΦＡｓｐ１６１＝５５°、図１１Ａ）。その結果、Ｐｈｅ１２０は、Ｖａｌ６３、Ｌｅｕ１０８、Ｐｈｅ１２４（ゲートキーパー残基）および、Ｌｕｅ１７７で与えられる、通常、ＡＴＰのアデノシル部分を受容する疎水性ポケットを占める。ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座は、Ｍｎｋ−２に関する説明において上述した。
【００５３】
すなわち、Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２の両方がこの特徴を示すため、ＤＦＧ／ＤＯＵＴの適合は、不活性Ｍｎｋキナーゼの初期（ｄｅｆａｕｌｔ）状態であり、活性ＤＦＧ／ＤＩＮ配座を呈するその他のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの多くと、それらの縛られない配座において区別される。
【００５４】
Ｍｎｋ−１において、ＤＦＤモチーフは、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座に対する選択性を説明するイオンネットワークに関与する。不変Ａｓｐ１９１とＭｎｋ固有Ａｓｐ１９３の両方は、活性部位残基との緊密な酸−酸側鎖相互作用に関与する（図１１Ｂ）。
（ｉ）Ａｓｐ１９１はＧｌｕ９４に結合し；
（ｉｉ）Ａｓｐ１９３はＡｓｐ１７０に結合する。
【００５５】
Ｇｌｕ９４とＡｓｐ１７０は、触媒活性タンパク質キナーゼ間で不変の残基に対応する（ハンクスの、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２４１）１９８８）４２−５２。Ｇｌｕ−９４は、調節ヘリックスαＣから出発し、ＡＴＰ結合の生成に必要なＬｙｓ８９−Ｇｌｕ９４とイオン対を形成することが知られている（アダムスの、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．（１０１）（２００１）２２７１−２２２０）。この対形成は、ＤＦＧ／ＤモチーフのＡｓｐ１９１がＧｌｕ９４と（ＯＤ−Ａｓｐ１９１：ＯＥ−Ｇｌｕ９４）さらには、Ｌｙｓ７８（Ｏ−Ａｓｐ１９１：Ｎｚ−Ｌｙｓ７８）と相互作用するため、Ｍｎｋ−１中で妨害される。Ａｓｐ１９３と相互作用するＡｓｐ１７０は、Ｃループの触媒アスパラートに相当する。
【００５６】
酸−酸側鎖相互作用は一見して異常に見えるが、酸側鎖間の相互作用は、タンパク質構造中で観察される場合が多々あり、酵素の触媒中心内で特に多い（フロッコ（Ｆｌｏｃｃｏ）の、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２５４）（１９９５）９６−１０５）。その結晶化条件のｐＨ（ｐＨ５．６）は、これら相互作用の安定化に都合良いが、これらは塩基性環境においても観察され、局所的なｐＫａの強い変動を示唆する（同じくフロッコ等）。２つのカルボン酸基間のＯ−Ｏ距離は、おおよそ２．６Åと２．５Åにあり、これは、非酸性水素供与／アクセプター対間のＯ−Ｏ距離よりも著しく短い。後者の観察は、陽子共有結合モードによるものである（同じくフロッコ等）。その他のそのような酸−酸相互作用を説明すると、Ａｓｐ１９１：Ｇｌｕ９４ならびにＡｓｐ１９３：Ａｓｐ１７０が、アミン（Ｌｙｓ７８）またはアミド（Ａｓｎ１７５）それぞれによって安定化される（比較として、例えば、（ワーテン（Ｗｅｒｔｅｎ）の、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２７７）（２００２）４５５０２−４５５０９）参照）。
【００５７】
活性化セグメントはタンパク質キナーゼドメインの構造要素を具体化し、強い立体配座的可塑性を示し、上流部調節によって構造的に修飾される場合が多々ある（ヒューズ（Ｈｕｓｅ）の、Ｃｅｌｌ（１０９）（２００２）２７５−２８２）。タンパク質キナーゼの多くにおいて、活性化セグメントのフレキシブル部分は、活性化ループと呼ばれるストレッチに制限されており、ＤＦＧ／Ｄモチーフ間に位置するため、Ｐ＋１ループと呼ばれる（ノレン（Ｎｏｌｅｎ）の、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ（１５）（２００４）６６１−６７５）。Ｐ＋１ループは、基質ペプチドのリン酸化部位に隣接する残基と相互作用することが知られているため、基質ペプチド配置において重要な役割を果たす（ナイトン（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ）の、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２５３）（１９９１）４１４−４２０）。
【００５８】
Ｍｎｋサブファミリー内では、しかしながら、活性化セグメントは、２つのアミノ酸挿入部によってその他のＣａＭＫグループキナーゼに対して延長され（図８）、立体配座的可塑性にさらされるストレッチは強く拡張される。フレキシブル部分は、活性化ループだけでなくＰ＋１ループも含むため、該領域はショートヘリックスα−ＥＦとα−ＥＦ／αＦループに対応する。活性化セグメント、Ｐ＋１ループとα−ＥＦの両方は、報告されたタンパク質キナーゼ構造の非常に大部分の保存された部位を占める。Ｍｎｋにおいては、しかしながら、この領域は折りたたまれておらず、Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２との間で異なる、延長された形態に適合する。そのため、Ｍｎｋサブファミリー内の活性化セグメントは拡張され、マグネシウム結合ＤＦＤモチーフ（他のキナーゼではＤＦＧ）からヘリックスαＦまでの領域に広がるフレキシブル４５アミノ酸ストレッチを包含する（図８Ｂ）。
【００５９】
自動阻害は、タンパク質キナーゼ制御の卓越した戦略であり、個々のケースにおいて別個に導入され、分子の様々な機能部位に影響を与え得る。タンパク質キナーゼのコアの外側の領域に位置する調節ドメインは、例えば、ＣａＭＫＩ（ゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）の、Ｃｅｌｌ（８４）（１９９６）８７５−８８７）、Ｔｗｉｔｃｈｉｎ（Ｋｏｂｅ，Ｅｍｂｏ  Ｊ．（１５）（１９９６）６８１０−６８２１）、およびｃ−ＫＩＴ（Ｍｏｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２７９）（２００４ａ）３１６３５−３１６６３）において採用される。
【００６０】
ｃ−ＫＩＴとＦｌｔ−３のケースの場合、２つのタイプＩＩＩレセプターチロシンキナーゼ、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座の誘導によりＮ末端ＪＭドメインは自動阻害するため、ＡＴＰ結合をブロックすることができる。Ｍｎｋ−１は、同様に、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座の誘導により自動阻害される。しかしながら、ｃ−ＫＩＴとＦｌｔ３とは対照的に、ＪＭドメインが自動阻害を「ｉｎ  ｔｒａｎｓ」で緩和する場合、Ｍｎｋ−１は、再構築された活性化セグメントを介してＤＦＧ／ＤＯＵＴを誘導し、Ｐｈｅ２３０をＤＦＧ／ＤＩＮポケット内へ挿入し、これは通常ＤＦＧ／Ｄ−Ｐｈｅを適応する。そのため、Ｍｎｋ−１の活性化セグメントは、ｃ−ＫｉｔとＦｌｔ−３のＪＭドメインのアナロジーにおいて内部自動阻害ドメインとして機能する。Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２の構造は、タンパク質キナーゼ調節のためのＤＦＧ／Ｄモチーフの重要性を強調する。今日では、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座は、〜５０タンパク質キナーゼのフラクション中でのみ観察されており、その構造的データは入手可能である。
【００６１】
留意すべきは、タンパク質キナーゼ阻害因子の開発のため、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座は重要である。ある小さい分子阻害因子キナーゼ錯体構造において、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座は安定化されおよび／またはＢｉｒｂ７９６：ｐ３８（パルゲリス（Ｐａｒｇｅｌｌｉｓ）の、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（９）（２００２）（２００２）２６９−２７２）、Ｃｌｅｅｖｅｃ：ｃ−Ａｂｌ（ナガール（Ｎａｇａｒ）の、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（１５）２００４（６６１−６７５）、およびＡＡＬ−９９３：ＶＥＧＦＲ−２（マンレイ（Ｍａｎｌｅｙ）の、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１６７９）（２００４）１７−２７）などに誘導され、それにより、酵素が活性化される。Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２の構造は、ＤＦＧ／ＤＯＵＴの適合性が、キナーゼ調節の共通する戦略であるということを証明するものであり、一定の系統グループに制限されるものではない。
【００６２】
本発明はさらに、４つの状態を含むＭｎｋ活性化のモデルに関連する。
（Ｉ）阻害された状態；
（ＩＩ）中間状態；
（ＩＩＩ）プライム化状態；および
（ＩＶ）活性状態（図１２）。
【００６３】
理論で縛られるのを望むことなく、状態ＩとＩＩは、Ｍｎｋ−１とＭｎｋ−２の構造にそれぞれ示されており、状態ＩＩＩは、Ｍｎｋ−２の突然変異構造に基づいてモデル化することができ、その他の活性状態のキナーゼと状態ＩＶは仮説である（図１２）。配列的な相互転換には、活性化セグメント、ＮローブおよびＡＴＰ結合部位に影響を与える明白な位相的転位が要求される。状態Ｉの特徴は、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座の誘導であり、さらに再構築された活性化セグメントの新規な配置によって誘導されるローブクロージャとαＣ置換である。状態ＩＩは、活性化セグメントの隆起によって可能となり、主にヘリックスαＣの再配置によってローブ内クレフトを開放し、その結果、必須Ｌｙｓ−Ｇｌｕイオン対を形成する。しかしながら、状態ＩＩは、不活性状態のキナーゼ、例えば、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座のいくつかの特徴を示すため、さらなる構造的再配置を必要とする。
【００６４】
活性化セグメントの内部スイッチは、例えば、触媒ベースアスパルテート（Ａｓｐ−１７０）の、Ｐ＋１ループ（Ｓｅｒ２１８）からのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基との相互作用など、保存された分子内接触の形成を可能にするのに必要である。さらに、マグネシウム結合ループは、ＤＦＧ／ＤＩＮポケット内へスイッチし、Ｍｎｋ−２突然変異構造に見られるようにＡＴＰポケット阻害を除外しなければならない。Ｍｎｋ−２の構造は、さらに、Ｍｎｋが、同属のα−ＥＦヘリックスとＰ＋１ループ、Ｍｎｋ−１中で完全に解かれる領域を折りたたむ可能性の損失がないことを証明している。上流キナーゼ（同じくワスキーウィッツ（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ））によってターゲットとされる２つのリン酸化部位を担持するＭｎｋの活性化ループは、多くのキナーゼで見られるようにリン酸化によってほぼ安定化される（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）の、Ｃｅｌｌ（８５）（１９９６）１４９−１５８；ノレン（Ｎｏｌｅｎ）の、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（１５）（２００４）６６１−６７５）。
【００６５】
その他の例と同様の、主要なリン酸化は、塩基性ＲＤポケットと相互作用させることによって活性化ループ形態を安定化させることができ、それにより、中性化され、ＲＤ−ＡｒｇとＡｓｐ−２３８（Ｍｎｋ−２においてはＡｓｐ−２７３）の相互作用を中断し、これは、活性化セグメントのより先端部分の開放形態を不安定化させる。続いて、二次的リン酸化により、活性化ループ形態がさらに変化されて、状態Ｉに類似しているが、阻害ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座のない、ＡＴＰ結合クレフトに近いＧｌｕ−Ｌｙｓイオン対の誘導によってローブクロージャが誘導される。その結果、新たに誘導された二次Ｐ部位の陰電荷は、ウェッジ状態のＧｌｕ２２５とＧｌｕ２２８のために、Ａｒｇ９０およびＡｒｇ９３などの塩基性残基と置換基との相互作用による引き上げ力を提供し、その場でαＣヘリックスを保持した。要するに、状態ＩＩ／ＩＩＩおよび／またはＩＩＩ／ＩＶとの間における転換にはリン酸化が必要である。第一リン酸塩は、例えば、ＲＤ−Ａｒｇとの相互作用によって処理された状態ＩＩＩを安定化し、第二リン酸化により、活性化セグメント形態を受容する基質をさらに安定化し、αＣヘリックスとの相互作用によってローブの再封鎖を促進する。
【００６６】
ヘリックスα−ＥＦとＰ＋１ループは、Ｍｎｋ−１内で解かれて活性化セグメントの完全な再構築物となる。Ｍｎｋ−１は、いくつかのレベルに対して自動阻害される。活性化セグメントは、２つの構造的変化のクロストーキングシリーズによるこの不活性を必要とする。第一に、これは、ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座の誘導によるＡＴＰポケット遮断を誘導するため、間接的にＬｙｓ−Ｇｌｕ対とＮ−ローブとを伝達させる。第二に、これは、ヘリックスαＣとの相互作用によりＮ−ローブの偽活性閉鎖形態を誘導する。
【００６７】
本発明のＭｎｋ−１構造は、したがって、キナーゼアーキテクチャの新規な態様と、合理的な阻害設計に使用可能な制御を明らかにする。
【００６８】
特に好ましくは、本発明は、結晶ヒトＭｎｋ−１タンパク質キナーゼに関する。Ｍｎｋ−１は、真核細胞阻害因子４Ｅ（ｅｌＦ４Ｅ）のリン酸化による翻訳機構をターゲットとするヒトタンパク質キナーゼである。
【００６９】
本発明はまた、表２に示す構造配位の全てまたは選択された部分によって定義される三次元構造を有する結晶ヒトＭｎｋ−１タンパク質に関する。表２に示す配位は、ここにおける例で説明するように得られたものである。
【００７０】
【表１】
0005559217.tif 000002
【００７１】
本発明による結晶ヒトＭｎｋ−１タンパク質調製物は、例えば、以下によって調製できる。
ｉ．例えば大腸菌などの細胞中でヒトＭｎｋ−１タンパク質の発現；
ｉｉ．粗Ｍｎｋ−１タンパク質調製物を回収するために細胞を溶解する；
ｉｉｉ．粗Ｍｎｋ−１タンパク質調製物を、例えば、タグクロマトグラフィなどにより精製する；および
ｉｖ．例えば拡散蒸着などにより、精製したヒトＭｎｋ−１タンパク質を結晶化する。
【００７２】
ヒトＭｎｋ−１タンパク質の結晶調製物、特に、本発明によるヒトＭｎｋ−１タンパク質のキナーゼ領域は、ヒトＭｎｋタンパク質の結晶構造データの生成に用いることができる。特に、阻害因子や基質などの配位子との結合部位または相互作用部位、がそれによって得られる。さらには、タンパク質を活性形態または不活性形態に維持するための結合部位を特定することが可能である。特に、ここでＭｎｋ−１に対して与えられる結果により、配位子の同定が可能となる。
【００７３】
本発明による結晶調製物は、単結晶であることが好ましく、より好ましくは、少なくとも１μｍ、さらに好ましくは少なくとも１０μｍ、最も好ましくは５０μｍのエッジ長さを有する結晶であることが好ましい。結晶は、Ｘ線構造解析を行えるようなに配置されていることが好ましい。したがって、本発明のさらなる主題は、表２に示す構造配位の全てまたは選択された部分で定義されるヒトＭｎｋ−１タンパク質の結晶構造である。
【００７４】
結晶ヒトＭｎｋ−１タンパク質と、結晶構造とをそれぞれ用いることにより、Ｍｎｋ−１タンパク質配位子を設計、同定または調製することができる。また、上述のようにタンパク質キナーゼの制御機構を特定することもできる。配位子または制御機構を特定するために、特に、コンピュータ支援モデル化プログラムを用いる。
【００７５】
配位子を同定するコンピューター支援のスクリーニングに加えて、ＷＯ０３／０３７３６２号公報に開示される方法を実際の配位子同定および確認に適用することが好ましい。
【００７６】
本発明はさらに、特に、Ｍｎｋ−１タンパク質のアイソマー、ならびに結晶調製物や結晶構造を用いて得られたその他タンパク質キナーゼの基質や阻害因子などの配位子に関する。そのような配位子は、薬剤組成物中で活性剤であることが好ましい。そのような薬剤組成物は、Ｍｎｋ−１の操作または特に阻害が必要な、例えば、肥満、糖尿病およびメタボリック症候群ならびに癌などの代謝障害の場合などの病気の治療に用いることができる。
【００７７】
ここで提供する結果およびデータは、ＤＦＧ／ＤＩＮポケット（Ｍｎｋ−１中のＰｈｅ２３０を含む）が、汎用的な阻害因子結合部位として機能可能であることを示している。阻害因子は、Ｍｎｋに制限されない。したがって、阻害因子はまた、ＤＦＧ／Ｄｉｎポケットからなる阻害因子結合部位に関する。
【００７８】
本発明はさらに、添付の図面ならびに以下に与えられる例によって例示される。
図１：Ｍｎｋ２の組織と配列アライメント
（Ａ）（ラベルを付したように）機能ドメインの配置を示す、ヒトＭｎｋ２の２つのスプライス変異体の概略的な比較図。ここで調査する領域（Ｍｎｋ２キナーゼ領域、Ｍｎｋ２−ＫＲ）は四角で囲まれている。代替的なスプライスは、Ｎ末端にもキナーゼドメイン、ＮＬＳ核局在信号、ｅｌＦ４Ｇ真核細胞阻害因子４Ｇ、翻訳阻害複合体の足場タンパク質に影響を与えず、Ｍｎｋ１とＭｎｋ２に結合する（１９９９年のパイロネット（Ｐｙｒｏｎｎｅｔ）等、２００１年のシェーパー（Ｓｃｈｅｐｅｒ）等）
（Ｂ）ヒトＭｎｋ１とＭｎｋ２のキナーゼドメインの配列アライメント、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓＭｎｋ遺伝子座（Ｌｋ６とＲ１６６．５のそれぞれ）および既知構造の３つのヒトＣａＭＫ群キナーゼ（ＭＡＰＫＡＰ−ＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ）Ｍｎｋ２のナンバリングは、最近報告された配列に基づく（２０００年のスレンツ−ケスラー（Ｓｌｅｎｚ−Ｋｅｓｌｅｒ）等）。Ｍｎｋ２−ＫＲ中に見いだされた二次構造要素は、以下の配列に示される。星印は、リン酸化部位を示している（２００１年のシェーパー（Ｓｃｈｅｐｅｒ）等）。触媒ループ（ｉ）ＤＦＤモチーフ（その他のキナーゼ中のＤＦＧ）；と（ｉｉ）Ｐ＋１ループとは、（ｉｉｉ）着色されたバーでマークされている。Ｍｎｋの挿入部の特徴は四角でかんでいる（ｌ１−ｌ３）。白抜きの円は、グリシンリッチループのＧｌｙ９１とＧｌｙ９３、ＡＴＰ結合に重要であることが知られているＬｙｓ１１３とＧｌｕ１２９（１９９４年のテイラーとラッジオ−アンゼルム（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｒａｄｚｉｏ−Ａｎｄｚｅｌｍ））、黒塗りの円は、Ｎ末端ローブとＣ末端ローブを分離するヒンジ領域のＧｌｙ１６３とＧｌｙ１６５を示す。
図２：  Ｍｎｋ−２キナーゼの全位相。キナーゼドメインのコアの外側の構造的部分は削除された。ＣＡＭＫ１（ａ，１ａ０６．ｐｄｂ）、ＤＡＰＫ１（ｂ，１ｊｋｓ．ｐｄｂ）およびＭＡＫＰＫＡＰＫ２（ｃ；１ｋｗｐ．ｐｄｂ）のアポ酵素の構造は、Ｍｎｋ−２（ｂ）上に重ねられ、同様の配向上に示されている。電子密度でトレースできない部分は点線で示されている。
図３：活性化セグメントの開放形態。赤と青で着色された２つの対称性等価Ｍｎｋ−２分子は、（ａ）に示される。同分子は、９０°だけ回転された、上から示されている。（ｃ）は、１σで着色された２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度とＤＡＰＫ１の同じ領域（黒）を示している。
図４：ＡＴＰ結合ポケットの形態。Ｍｎｋ−２（青）、ＭＡＰＫＡＰ２（赤）、ＣａＭｋ１（緑）およびＤＡＰＫ１（黒）からの触媒作用の重要性を有する領域が示されている。（ａ）は、Ｌｙ１１３とＧｌｕ１２９（Ｍｎｋ−２ナンバリング）を示す。（ｂ）において、Ｃループのバックボーンと、Ａｓｐ２０５とＡｓｎ２１０の側鎖とは、ＭＡＰＫＡＰ２／ＡＤＰ共構造（１ｎｙ３．ｐｄｂ）由来のＡＤＰ（黄）と一緒に示されている。（ｃ）は、ＤＦＧ（ＤＦＤ）モチーフ周囲のバックボーンを示しており、（ｄ）はこの領域と（ｂ）由来のＡＤＰの側鎖を包含している。
図５：亜鉛結合部位。（ａ）Ｍｎｋ−２中の推定状の亜鉛部位の領域が、１σ（青）で描かれた２Ｆｏ−Ｆｃマップと、５σで描かれたＤＡＮＯマップとともにバックボーンプロットとして示されている。領域は、我々の結晶中で高度にフレキシブルであり、Ｔｒｐ３０５からＧｌｕ３０９までの領域は鮮明なバックボーン密度を欠いている。（ｂ）Ｉ＝ＺｎＫα線、ＩＩ＝ＺｎＫベータ、ＩＩＩコンプトン散乱、ＩＶ弾性散乱に対応するピークを有する、天然Ｍｎｋ−２結晶のＸ線放射スペクトル。
図６：Ｍｎｋ−２キナーゼドメインとｐ３８との比較
Ａ．同じ配向のＭｎｋ−２キナーゼドメイン（左）とｐ３８（右；ＰＤＢ  ＩＤ１ＫＶ１）のリボンプロット。分子はＮ末端（青）からＣ末端（赤）まで七色に着色されており、その他のタンパク質キナーゼでも観察されるように、全て同じ構造的構成を示している。
Ｂ．２つのタンパク質の最適グローバルアライメント後のＤＦＤ／ＤＦＧ領域の空間プロット。Ｍｎｋ−２−石灰；ｐ３８−コムギ。ＤＦＤ／ＤＦＧモチーフは、スティック形状で示されており、原子型でカラーコードされている（炭素（Ｍｎｋ−２）−石灰；炭素（ｐ３８）−コムギ；酸素−赤；窒素−青）。Ｍｎｋ−２のアスパルテート２２６と２２８は、ポリペプチド鎖の方向を示すようラベルを付されている。周囲を取り囲む構造要素はリボンで示されている。ｐ３８の非定型型ＤＦＧ形態は、尿素ジアリール型の阻害因子の結合によって誘導される（図示せず；ＰＤＢ  ＩＤ１ＫＶ１と１ＫＶ２）。Ｍｎｋ−２は、本発明の結晶中で自然に同じ形態に適合する。阻害因子の尿素ジアリールクラスはｐ３８のＤＦＧモチーフとヘリックスとの間で結合し、ヘリックスはバックグラウンド中に表れた。Ｍｎｋ−２のＤＦＤモチーフは、阻害因子結合ポケットに向かってさらに置き換えられ、阻害因子によって本発明の形態中に同様に捉えることができることを示唆している。
図７：Ｍｎｋ−２キナーゼドメインに結合する阻害因子のモデル
Ａ．ジアリール尿素ベースの阻害因子（１−（５−ｔブチル−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素；ＢＭＵ；ＰＤＢ  ＩＤ  １ＫＶ１）との錯体であるＭｎｋ−２キナーゼドメインの外観。Ｍｎｋ−２は、その二次構造要素（ヘリックス−赤、ストランド−青、ループ−グレイ）に従って示される。阻害因子１（炭素−オレンジ）、ＤＦＤモチーフ（炭素−ピンク）とその他の薬（炭素−シアン）に接触するＭｎｋ−２残基は、スティック形状で示される。モデルは、ｐ３８−ＢＭＵ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ１ＫＶ１）のＣα原子位置と、Ｍｎｋ−２キナーゼドメインのＣα配位との最適なスーパーポジションによって作製される。ＭＮＵ配置は、続いて、手動により示されたＭｎｋ−２キナーゼドメインの結合ポケットに適合させた。いくつかのＭｎｋ−２残基の側鎖形態も同様に不良接触を排除するよう適合させた。
Ｂ．Ｍｎｋ−２キナーゼドメインのヌクレオチド結合ポケット中に配置されたＤＡＰＫ１（ＰＤＢ  ＩＤ  １ｌＧ１）の共晶構造由来の、ＡＴＰアナログ（ＡＭＰＰＮＰ）の詳細な空間図。モデルは、Ａで説明したような２つのタンパク質分子の最適なスーパーポジションによって作製された。標準結合モデル中のＡＭＰＰＮＰ分子が、本発明の形態のＭｎｋ−２のＤＦＤモチーフと立体的に干渉するように見える。この発見は、生産的なＭｎｋ−２へのＡＴＰ結合がＤＦＤモチーフ内での再配置を必要とすることを示唆する。その結果、本発明の形態において、Ｍｎｋ−２は、ＡＴＰ結合内において不活性であることが導き出される。別の分子とモチーフは、原子型ごとにカラーコードされている。炭素（ＡＭＰＰＮＰ）−オレンジ；炭素（ＤＦＤ）−ピンク；窒素−青；酸素−赤；亜リン酸−石灰。Ａ中に二次構造要素。
Ｃ．Ｍｎｋ−２−ＢＭＵ複合体モデルの詳細な空間図。ＢＭＵは、疎水性ポケットでｔ−ブチル基と結合し、Ｐｈｅ２２７（ＤＦＤモチーフ由来）とＰｈｅ１５９の芳香環の間のｐクロロフェニル環をスライドさせる場合がある。別の分子とモチーフは、原子型ごとにカラーコードされている：炭素（ＢＭＵ）−オレンジ；炭素（ＤＦＤ）−ピンク；炭素（疎水性ポケット）−シアン；窒素−青；酸素−赤；塩素−緑。Ａ中のような二次構造要素。
図８：立体的表現（ａ）と主要配列（ｂ）におけるＭｎｋ−１の全構造。他に示さない限り、着色法は以下のスタイルに維持される。Ｎローブ：グレイ；Ｃローブ：黒；Ｃループ：黄；ＤＦＧ／Ｄモチーフ：オレンジ；αＣヘリックスとＬｙｓ−Ｇｌｕ対：シアン；活性化セグメント：緑。（ｂ）ＡＴＰと相互作用すると知られている残基をカラーコードでマークし、ＤＦＧ／Ｇｉｎポケットからなる残基：緑の白抜きの円；ＤＦＧ／ＤＯＵＴポケットからなる残基：赤の白抜きの円。Ｍｎｋ固有のアミノ酸挿入部は、四角で囲まれ、官能性の適合性の高いＭｎｋ固有残基は、赤い矢印でハイライトしている。リン酸化部位は星印で示している。
図９：活性化セグメントにより誘導されたＮローブ移動。Ｍｎｋ−１（ａ）とＭｎｋ−２（ｂ）の全構造。残基を含むＭｎｋ−１（ａ）は、ＮローブαＣ相互作用、Ｐｈｅ２３９とＤＦＤモチーフに包含された。スティックで表されたＰｈｅ。Ａｒｇ９０とＡｒｇ９３は、亜リン酸アミノ酸と相互作用することが知られている残基に対応した（クリュッパ（Ｋｒｕｐａ）等の、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（３３９）（２００４）１０２５−１０３９）。Ｍｎｋ−２（ｂ）中で対応する残基は、Ｐｈｅ２６５、Ａｒｇ１２３とＡｒｇ１２５である。
図１０：ｃ−ＫＩＴ（ａ，ｂ）とＭｎｋ−１(C)における自動阻害ｃ−ＫＩＴの自動阻害ＪＭドメインは赤で着色されている。
図１１：（ａ）ＤＡＰＬ１（１ｉｇ１；（テレスコ（Ｔｅｒｅｓｈｋｏ）等の、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（８）（２００１）８９９−９０７））；（ｂ）Ｍｎｋ−１；Ｍｎｋ−２のＡＴＰ結合ポケット。分子は図８のように同じ配向にあり、ＡＴＰ結合領域が拡大されている。（ａ）は活性状態のＣａＭＫ群のタンパク質キナーゼを例示し、非クリーブ化ＡＴＰアナログＡＮＰ−ＰＮＰと、Ｍｇ２＋の代わりに官能部位においてＭｎ２＋を含む。マグネシウム結合ＤＦＧモチーフの許容可能なＤＦＧ／Ｄｉｎポケット形態に留意。Ｍｎｋ−１（ｂ）とＭｎｋ−２のＡＴＰ部位遮断は、阻害ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座によって得られる。Ｍｎｋ−１（ｂ）は、酸−酸側鎖の相互作用がＭｎｋ−２中に存在しないことを示している。
図１２：Ｍｎｋ活性化カスケードモデル。
図１３：ＤＦＤモチーフの近傍
（Ａ）ＤＦＤ領域とＡＴＰ結合クレフトの拡大空間図。野生型Ｍｎｋ２−ＫＲのＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座は、左上にＡｓｐ２２６、Ｐｈｅ２２７とＡｓｐ２２８に関して、Ｐｈｅ２２７とＡｓｐ２２８とがＡＴＰ結合クレフト内に突き出した状態でスティックにより示されている（炭素、シアン）。ＤＦＧ／ＤＩＮ配座（右下；炭素、緑）は、Ｍｎｋ２−ＫＲのＡｓｐ２２８Ｇｌｙ突然変異体について観察されるように、その他のキナーゼに見られるＤＦＧ／ＤＩＮ配座に従ってモデル化された。Ｍｎｋ２−ＫＲのバックボーントレースは、半透明なグレイのチューブで示される。ＤＦＧ／ＤＩＮまたはＯＵＴ配座いずれかにおけるＤＦＤモチーフ周囲の径４Å内の残基は、スティックで示されている（炭素、グレイ）。ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座を安定化する、タンパク質マトリックスとの直接的な相互作用は、点線で示されている。Ｐｈｅ２２７は、２つの異なる疎水性ポケット中に２つの異なる配座で存在するようになる。ＤＦＧ／ＤＩＮ配座の適合に対する障害は見えない。
（Ｂ）（（Ａ）におけるのと同様にカラーコードされている）スティックで示されたＤＦＤモチーフの２つの配座をともなう、静電ポテンシャルごとにカラーコードされたＭｎｋ２−ＫＲの分子構造の空間図（青、正電荷；赤、負電荷）。ＡＴＰ結合クレフトが指摘されている。いずれかの配座にあるＡｓｐ２２８は、水溶性溶媒を良好に利用可能である。ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座は、ＡＴＰ結合クレフト中にＰｈｅ２２８とＡｓｐ２２８を位置するだけでなく、このクレフトの前からのアクセスを遮断する。分子は、ＤＦＤポケット中への遮断されていない図を得るために、水平軸（Ｎ末端ローブから後ろ）について、（Ａ）に対して３０°回転されている。
（Ｃ）ＤＡＰＫ１との共晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＩＧ１）に見られるようにスーパーインポーズされた、非加水分解性のＡＴＰアナログ（アデノシン５’−［β，γ−イミド］三リン酸［ＡＭＰＰＮＰ］）；炭素、ベージュ、亜リン酸、紫）による（Ａ）におけるのと同じ図。ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座において、アデノシン塩基はＰｈｅ２２７の側鎖とクラッシュし、リン酸基はＡｓｐ２２８の側鎖とクラッシュする。
（Ｄ）ＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座のみが示された、（Ａ）と（Ｃ）におけるのと同じ図。ｐ３８−ＢＭＵ阻害複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＫＶ１）のＤＦＧ領域は、タンパク質構造のグローバルスーパーポジション後に見られるように、比較目的で示されている（マジェンタ色のチューブ；スティックで示されたＤＦＧ；炭素、マジェンタ色）。ＢＭＵ阻害因子（炭素、ベージュ；塩素、緑）は、ＤＦＧ／ＤＩＮ結合ポケットの部分をふさぎ、ｐ３８中にＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座を誘導する。
表１：ヒトＭｎｋ−２の原子配位を示す。
表１ａ：ヒトＭｎｋ−２突然変異Ｄ２２８Ｇの原子配位を示す。
表２：ヒトＭｎｋ−１の原子配位を示す。
表３：ヒトＭｎｋ−２キナーゼ突然変異Ｄ２２８Ｇと一般的なタンパク質キナーゼ阻害因子スタウロスポリンとの共結晶の原子配位を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、Ｍｎｋ２の組織と配列アライメントを示している。
【図２】図２は、Ｍｎｋ−２キナーゼの全位相を示している。
【図３】図３は、活性化セグメントの開放形態を示している。
【図４】図４は、ＡＴＰ結合ポケットの形態を示している。
【図５】図５は、亜鉛結合部位を示している。
【図６】図６は、Ｍｎｋ−２キナーゼドメインとｐ３８との比較を示している。
【図７】図７は、Ｍｎｋ−２キナーゼドメインに結合する阻害因子のモデルを示している。
【図８】図８は、立体的表現（ａ）と主要配列（ｂ）におけるＭｎｋ−１の全構造を示している。
【図９】図９は、活性化セグメントにより誘導されたＮローブ移動を示している。
【図１０】図１０は、ｃ−ＫＩＴ（ａ，ｂ）とＭｎｋ−１(C)における自動阻害を示している。
【図１１】図１１は、（ａ）ＤＡＰＬ１（１ｉｇ１；（テレスコ（Ｔｅｒｅｓｈｋｏ）等の、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（８）（２００１）８９９−９０７））；（ｂ）Ｍｎｋ−１；Ｍｎｋ−２のＡＴＰ結合ポケットを示している。
【図１２】図１２は、Ｍｎｋ活性化カスケードモデルを示している。
【図１３】図１３は、ＤＦＤモチーフの近傍を示している。
【図１４】図１４は、原子配置を示す。
【実施例】
【００８０】
実施例１
Ｍｎｋ−２とＭｎｋ−１キナーゼ領域のクローニングと精製
従来既知の技術を用いて、アミノ酸残基７２〜３８５に対応し、キナーゼドメイン（ＫＤ）を包含するヒトＭｎｋ−２のｃＤＮＡフラグメントを、Ｆ（ｆｏｒｗａｒｄ）／Ｒ（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー対5’CGGGATCCACCGACAGCTTCTCGGGCAGG / 5’ACGCGTCGACCTACCTCTGCAGGACCATGGGAG （利用した限定部位は下線部）を用いて増幅し、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１のＢａｍＨｉとＳａｌｌ部位中にクローン化した（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の、スウェーデン、ｃａｔ．ｎｏ．２７−４５８０−０１）。この構築により、Ｎ末端を有する融合タンパク質、トロンビンクリーブ可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグとしてのＭｎｋ−２キナーゼ領域（ＫＲ）の原核細胞発現が可能となる。
【００８１】
アミノ酸置換Ｄ２２８Ｇは、製造元の指示にしたがう、Stratagene Quik Change Site Directed Mutagenesisキットを採用して、ＧＳＴ−Ｍｎｋ−２ＫＲ構造中に導入された。突然変異誘発オリトヌクレオチドは、5’GAAGATCTGT GACTTCGGC CTGGGCAGCG GCATCAAACT Cおよび5’GAGTTTGATG CCGCTGCCCA GGCCGAAGTC ACAGATCTTCであった。Ｍｎｋ−２ＫＲＤ２２８Ｇの精製は、Ｍｎｋ−２ＫＲに関して説明したように実施した。
【００８２】
アミノ酸残基３７〜３４１に対応し、キナーゼドメイン（ＫＤ）を包含するヒトＭｎｋ−１のｃＤＮＡフラグメントは、Ｆ／Ｒプライマー対5’CGGGATCCACTGACTCCTTGCCAGGAAAG/ 5’ACGCGTCGACCTATCCCTTTTCTGGAGCTTGCCを用いて（利用した限定部位は下線部）を用いて増幅し、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１のＢａｍＨｉとＳａｌｌ部位中にクローン化した（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の、スウェーデン、ｃａｔ．ｎｏ．２７−４５８０−０１）。この構築により、Ｎ末端を有する融合タンパク質、トロンビンクリーブ可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグとしてのＭｎｋ−２キナーゼ領域（ＫＲ）の原核細胞発現が可能となる。
【００８３】
ＧＳＴ−Ｍｎｋ−２ＫＲまたはＧＳＴ−Ｍｎｋ−１ＫＲの発現は、大腸菌ＢＬ２１（Merck Biosciences, Germany, cat. no. 69449）中である。細胞は、バッフル付の５リットルフラスコ内で、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）の、ドイツ、cat. no. A-9518）で補ったＬＢブイヨン中（メルク（Merck）のドイツ、cat. no. 1.10285）で、３７℃、毎分１３０回転（ｒｐｍ）で成長させた。培地が、０．８のＡ６００に相当する密度に達したとき、同容量の氷温のＬＢ／アンピシリンを加え、培地を２５℃にして、１ｍＭのイソプロピルチオガラクトースで誘導した（ロス（Ｒｏｔｈ）の、ドイツ、cat. no. 2316.4）。細胞を遠心分離で採取した。細胞ペレットは、その湿潤重量１ｇあたり１０ｍｌのリーシスバッファ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（シグマ（Sigma）の、ドイツ、cat. no. T-5941）、ｐＨ７．５、２００ｍＭＮａＣｌ（シグマ（Sigma）の、ドイツ、cat. no. S-7653）、５ｍＭＤＴＴ（ロス（Roth）の、ドイツ、 cat. no. 6908.2））で再希釈した。ＭＳ７２プローブ付のＢａｄｅｌｉｎ  ｓｏｎｏｐｌｕｓ  ｓｏｎｉｆｉｅｒによる細胞の崩壊（バデリン（Badelin）の、ドイツ、cat. no. HD207）と、後続のＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ロータ（ソルボール（Sorvall）、ドイツの、cat. no. 28020）中における１８０００ｒｐｍ／４５分／４℃での除去によりライセートを調製した。ライセートは、直列に接続した、リーシススバッファで平衡した２つのＧＳＴＰｒｅｐＦＦ１６／１０カラム（アマーシャム（Amersham）の、スウェーデン、cat. no. 17-5234-01）に適用した。洗浄液は、３カラム容量（ＣＶ）ウォッシュバッファ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）、２ＣＶのＡＴＰバッファ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭＫＣｌ（ロス（Roth）の、ドイツ、 6781.1））、２０ｍＭＭｇＣｌ２（シグマ（Sigma）の、ドイツ、cat. no. M-2670）、５ｍＭＡＴＰ（シグマ（Sigma）の、ドイツ、cat. no. A-7699））、およびさらに３ＣＶウォッシュバッファ）であった。Ｍｎｋ−２ＫＤは、続いて、ＧＳＴタグ由来のオンカラムのトロンビン開裂によって溶出した。簡単にいうと、１０００ユニットのトロンビン（アマーシャム（Amersham）のスウェーデン、cat. no. 27-0846-01）を、６０ｍｌウォッシュバッファに溶解して、２つのカラムにわたって８℃で一晩循環させた。溶出物を、ウォッシュバッファをカラムに適用しながらループを開くことによって回収した。
【００８４】
トロンビン溶出物は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に１：５に希釈し、直列に接続した５ｍｌのＱセファロースＨＰカラム（アマーシャム（Amersham）の、スウェーデン、cat. no. 17-1154-01）に適用した。溶出物は、塩化ナトリウムの直線上の勾配を有するものであった（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０−１ＭＮａＣｌ）。フラクションは、１０．０００ダルトン分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮器中で（ビバサイエンス（VivaScience）、ドイツ、cat. no. VS0403）、おおよそ１６ｍｇ／ｍｌまで精製かつ濃縮してプールした。濃縮物は、ＰＤ１０カラム（アマーシャム（Amersham）、cat. no. 17-0851-01）へのゲルろ過により、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ中に移した。典型的な最終タンパク質濃度は、おおよそ１２ｍｇ／ｍｌであった。アリコートは、液体窒素内でショック凍結させ、−８０℃で保存した。タンパク質生成量は、細胞ペレット湿潤重量１ｇ当たりのおおよそ２ｍｇのＭｎｋ−２キナーゼドメインであった。ＥＲＫ２によって活性化した後、対応するＭｎｋキナーゼ領域と完全長のＭｎｋタンパク質とは、ｅｌＦ４ｅ（Ｓｅｒ２０９）リン酸化に基づくキナーゼアッセイにおいて同一の活性を示す。
２．結晶化とデータ収集
初期結晶スクリーニングは、１００μｌ貯留溶液と、２００ｎｌ〜１μｌの範囲の液滴寸法とを用いる９６ウェルフォーマット中でＭｉｃｒｏＳｙｓ  ＳＱシリーズ４０００／４１００（デカルト分配システム（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））により実施した。回折研究に用いた結晶は、２０℃で懸滴または座滴のいずれかを用いて拡散蒸着によって成長させた。タンパク質溶液は、タンパク質溶液の１０倍を超える量までの貯留バッファ（１００ｍＭＮａ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．８、２２％ポリアクリル酸５１００と２％２，３−メタンペンタジオール（ＭＰＤ））と混合した。結晶は、液体窒素中で凍結させた。回折データは、Ｍａｒ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ノルデステット（Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ）、ドイツ）ＣＣＤ検出器の１００Ｋおよびλ＝１．０５で、ＨＡＳＹＬＡＢビームラインＢＷ６（ＤＥＳＹ、ドイツハンブルグ）上に回収し、ＨＫＬパッケージ（オトウィノスキ・ゼット（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ）とマイナー・ダブリュー（Ｍｉｎｏｒ，Ｗ）の、オシレーションモードにおけるＸ線開設データの処理、Methods Enzymol. 167, 307-326, 1997年9月）で処理した。
３．構造決定と精製
初期相は、研究モデル（ＰＤＢ  ＩＤ：１ｌＧ１）として死亡関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）を用いたＣＣＰ４パッケージ（Collaborative Computational Project, The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst. D 50, 760-763, Dec 1994年）からのＭｏｌＲｅｐ自動化分子置換ルーチンを用いて得た。相情報を有するｍｔｚ形式のファイルを、ＲＥＦＭＡＣ（Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Lebedev, A., Wilson, K. S.とDodson, E. J.のＦＦＴを用いた効率的な分子構造の異方性精製、Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 247-255,1999年1月）中で剛性体精製を用いて作製し、ａｒｐ／ｗａｒｐによる自動化モデルの構築（Morris, R. J., Perrakis, A.とLamzin, V. S. ARP/wARPとタンパク質電子密度マップの自動翻訳；Methods Enzymol. 374, 229-244 (2003年)）に用いた。得られたモデルは、Ｘフィット（McRee, D. E.の、原子座と電子密度を操作するためのXtalView/Xfit-Aバーサタイルプログラム；J. Struct. Biol. 125(2-3), 156-165, 1999年4月）を用いて手動でさらに変更した。精製は、ＣＮＳ（Brunger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J. S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson, T.およびWarren, G. L.の、結晶学とＮＭＲシステム：マクロ分子構造決定に適した新しいソフトウェア、Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54 (Pt 5), 905-921, 1998年9月）とＲＥＦＭＡＣ（Murshudov, G. N.等, 1999年、上記参照）を用いて実施した。
４．ゲルろ過と光散乱
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＰＣ３．２／３０カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を用いてＳＭＡＲＴシステムによりゲルろ過クロマトグラフィを実施した。実験は、バッファＡ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）中で０．０４ｍｌ／分の流速において室温で行った。Ｍｎｋ−２ＫＤの分子量は、基準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて推定した。マルチアングルレーザ光散乱を、ＵＶ分光計と、ドーンとオプチラブ（Ｄａｗｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｌａｂ）計器ＸＹ（ワイアットテクノロジー社（Wyatt Technology Corp.））に接続したＨＲ−１０／３０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００サイズの排除カラム（アマーシャム）で行った。３０μｍのＭｎｋ−２ａ溶液を、バッファＡ中で、６３２．８ｎｍ、９０度におけるＵＶ吸収、光散乱で、クロマトグラフィによって分離し、溶出プロファイルの屈折差はＡＳＴＲＡソフトウェアパッケージ（Wyatt, P.のマクロ分子の光散乱と絶対化学分析：Anal. Cim. Acta 272, 1-40 (1993年)）で監視し、分析した。
【００８５】
実施例２
Ｍｎｋ−２特異阻害因子設計のために誘導されたｐ３８−ジアリール尿素阻害因子共晶構造
タンパク質キナーゼｐ３８の構造は、全体的に、Ｍｎｋ−２キナーゼドメインの構造に非常に類似している（図１Ａ）。ｐ３８は、ＡＴＰ結合ポケット中の典型的なＤＦＧ配列モチーフを特徴付ける。ジアリール尿素足場に基づくｐ３８特定の阻害因子を設計し、ｐ３８のこれら２つの阻害因子（ＢＭＵとＢＩＲＢ７９６、（Pargellis et al. (2002年), Nat. Struct. Biol. 9, 268-272））との共晶構造を解明した（PDB Ids 1KV1と1KV2のそれぞれ）。これらの阻害因子は、ｐ３８の非カノニカル形ＤＦＧ配座（ＤＦＧＯＵＴと称す）を誘導し、この配座においては、フェニルアラニンは疎水性ポケットにおけるその標準位置から置き換えられており（ＤＦＧＩＮと称す）、アポ酵素とその他タンパク質キナーゼ構造中に存在する（図１Ｂ）。ＤＦＧモチーフのＤＦＧＯＵＴ配座は、立体障害により生産的ＡＴＰ結合と干渉する。
【００８６】
Ｍｎｋ−２キナーゼ領域は、ＤＦＧモチーフに代わりＤＦＤを呈する（残基２２６−２２８、図１参照）。非活性化アポ酵素の構造において、このＤＦＤモチーフは、ｐ３８の非カノニカル形ＤＦＧＯＵＴ配座に類似する配座に適合する（図１Ｂ）。Ｍｎｋ−２のＰｈｅ２２７は、クレフト中へ突出し、この場合、ｐ３８内はジアリール型阻害因子で占有することができる（図２Ａ）。置換は、ｐ３８−阻害因子複合体よりも厳密であるが、Ｍｎｋ−２キナーゼ領域の結晶化には阻害因子は用いられない（図１Ｂ）。Ｍｎｋ−２キナーゼ領域結晶構造中に見られるＤＦＤ配座はまた、立体障害のためにカノニカル形ＡＴＰ結合とは共存しない（図２Ｂ）。観察により、本発明の結晶構造に観察されるＤＦＧ／ＤＯＵＴ配座中のＤＦＤモチーフの捕捉が、Ｍｎｋ−２を不活性にし、リン酸化状態を無視させることが示唆される。
【００８７】
ジアリール型阻害因子ＢＭＵがＭｎｋ−２キナーゼ領域を結合可能であるかどうかを調査した。ｐ３８−ＢＭＵ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＫＶ１）のＭｎｋ−２キナーゼ領域上への全体的なスーパーポジション後、ＢＭＵ位置におけるわずかな手動調整と、いくつかのＭｎｋ−２側鎖配座におけるわずかな再調整とを行い、Ｍｎｋ−２−ＢＭＵ複合体モデルを得た（図２Ａと図Ｃ）。阻害因子は、Ｐｈｅ２２７とＰｈｅ１５９の環の間に挟まれたそのｐクロロフェニル環と結合することが見られた（図２Ａと図Ｃ）。そのｔブチル部分は、Ｍｎｋ−２の疎水性ポケットに収容可能であった（図２Ａと図Ｃ）。Ｍｎｋ−２の異常なＡｓｐ２２８は、このモデル中のＢＭＵ分子からかけ離れているが、ｐ３８中のその他の領域（ｐ３８の、１ＫＶ２構造のＢＩＲＢ７９６の延長された足場と１ＫＶ１構造のＢＭＵとの比較）で示したように、さらなる改質された阻害因子上の化学基によってターゲットとすることができた。この方法において、ＤＦＤモチーフへの特異性（Ｍｎｋ−２のフィンガープリント；その他のキナーゼのＤＦＧに代わり）が達成され得る。Ｍｎｋ−２に対する特異で強力な結合は、Ｍｎｋ−２の特異的な結合に対する新規な阻害因子に適合させるためのＢＭＵのｐクロロフェニルとｔブチル基のさらなる改質によって支持することができた。
【００８８】
実施例３
Ｍｎｋ−１−ＫＲの構造決定および全構造
野生型Ｍｎｋ１−ＫＲの針状結晶を、タンパク質溶液を等容量の２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０と０．２Ｍ硫酸アンモニウムと０．１Ｍクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ５．４の貯留溶液とを混合後の拡散蒸着により、２０℃で成長させた。結晶は、２０％のグリコールで補った貯留溶液中で凍結させた（液体窒素）。回折データを、ビームラインＰＸＩＩ（ＳＬＳ、ビリンゲン（Ｖｉｌｌｉｎｇｅｎ）、スイス）に対して、ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ（ノルダーシュテット（Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ）、ドイツ）ＣＣＤ検出器における１００Ｋで収集し、ＨＫＬパッケージ（オトウィノスキ・ゼット（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ）とマイナー・ダブリュー（Ｍｉｎｏｒ，Ｗ）、1997年）で処理した（表２参照）。
【００８９】
Ｍｎｋ−２−ＫＲの密度変更後の切頭型モデルを用いた分子置換後、翻訳可能な電子密度を得て、モデルを２３．５／２８．０％のＲ／Ｒｆｒｅｅ因子に精製することができた（表２）。非対称ユニットは、非クリスタルグラフィックの２倍軸で関連づけられる２つのＭｎｋ−１−ＫＲ分子を含む。分子Ａは、いくつかの領域においてより低温の因子とクリアラ電子密度を呈する。機能的に重要な領域は、しかしながら、分子Ａと分子Ｂとの間で実際上同一である。最終モデルは、Ｍｎｋ−１のキナーゼドメインの範囲にわたり、残基３９−３３５を含む。Ｍｎｋ−１−ＫＲは、バイロバル（ｂｉｌｏｂａｌ）構築を含むキナーゼアーキテクチャのいくつかの広域な特徴を保存する。Ｎ末端ローブは、グリシンリッチループやＬｙｓ−Ｇｌｕイオン対などのＡＴＰ結合に必要な重要な要素を担持し、５本撚りのねじれたβシートと調製ヘリックスαＣの形態にされる（図８）。大型で優勢なαらせんＣ末端ローブは、触媒ループ（Ｃループ）、マグネシウム結合ループ（ＤＦＤモチーフ）、および活性化セグメントなどの、基質結合および亜リン酸転移に必要な要素を含む（図８）。Ｍｎｋ−１−ＫＲ内のセグメントは、強い、配座的なフレキシビリティを呈し、そのため、電子密度では痕跡をたどることはできず、活性化セグメントのコアはＰ＋１ループ（残基１９７−２２２）と、ヘリックスαＧ（残基２６１−２９０）を包含するＭｎｋ特異システインクラスタとを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−４】
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【図１４−１８９】
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【図１４−１９０】
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【図１４−１９１】
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【配列表】
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