(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細孔を有するタンパク質保持基材の、当該細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配した状態でタンパク質を当該固体酸触媒に接触させ、水の存在下加熱することにより当該タンパク質を加水分解する、タンパク質の加水分解方法であって、
上記固体酸触媒はスルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体であり、かつ、上記タンパク質保持基材はポリビニリデンジフルオライドである、タンパク質の加水分解方法。
【請求項２】
上記タンパク質の加水分解は、１００℃以上でかつ２２０℃以下の温度範囲内で行われる、請求項１に記載のタンパク質の加水分解方法。
【請求項３】
上記タンパク質保持基材と固体酸触媒とを接触させて、上記細孔の内表面の少なくとも一部に当該固体酸触媒が配された複合基材を得る工程と、
次いで、上記複合基材にタンパク質を接触させる工程とを含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の加水分解方法。
【請求項４】
上記タンパク質保持基材と上記タンパク質とを接触させて、当該タンパク質保持基材にタンパク質を保持させる工程（１）と、
次いで、タンパク質を保持した上記タンパク質保持基材と、上記固体酸触媒を含む溶液とを接触させて、上記細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配した状態で当該タンパク質と固体酸触媒とを接触させる工程（２）とを含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の加水分解方法。
【請求項５】
上記工程（１）は、ゲル電気泳動後のタンパク質を、当該ゲルから上記タンパク質保持基材に転写する工程である、請求項４に記載のタンパク質の加水分解方法。
【請求項６】
タンパク質を含む溶液を供給する試料供給手段と、
タンパク質保持基材が有する複数の細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒が配された複合基材を備えた加水分解手段と、
上記試料供給手段と加水分解手段とを連結する流路と、
上記加水分解手段を加熱する加熱手段と、を備え、
上記固体酸触媒はスルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体であり、かつ、上記タンパク質保持基材はポリビニリデンジフルオライドである、タンパク質の加水分解装置。
【請求項７】
タンパク質を含む溶液を供給する試料供給手段と、
タンパク質保持基材が有する複数の細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒が配された複合基材を備えた加水分解手段と、
上記試料供給手段と加水分解手段とを連結する流路と、
上記加水分解手段を加熱する加熱手段と、
上記加水分解手段の後段に、タンパク質の加水分解産物を分析する分析手段と、を備え、
上記固体酸触媒はスルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体であり、かつ、上記タンパク質保持基材はポリビニリデンジフルオライドである、タンパク質の加水分解産物の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の加水分解方法、加水分解装置、及びタンパク質の加水分解産物の分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の加水分解産物であるペプチドやアミノ酸を分析することで、当該タンパク質の重要な性質であるアミノ酸組成並びにタンパク質量、及びアミノ酸の翻訳後修飾等について情報が得られる。【０００３】
タンパク質を加水分解する方法として、例えば、酵素を触媒として用いた加水分解方法が数多く開発されている。しかし、酵素による分解は基質特異性があり、完全にアミノ酸まで分解できないため、当該方法は用途が限定されるという問題を有する。【０００４】
また、一般に、タンパク質などの生体高分子は、加熱下で、水を加えた有機または無機の強酸（塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸など）、或いは強アルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）と混合することで加水分解され、オリゴマーやモノマー（タンパク質においてはペプチドやアミノ酸、多糖においてはオリゴ糖、単糖）を生じることが知られている（非特許文献１）。この知見に基づき、強酸または強アルカリ水溶液を用いたタンパク質の加水分解方法もまた数多く開発されている。【０００５】
上記の強酸または強アルカリ水溶液による加水分解は、分解産物であるアミノ酸が更に分解されてしまうという問題を有しており、現時点で、タンパク質の完全な加水分解方法が確立されているわけではない。しかし、これらの方法の中では、（１）減圧封管した試験管内で、定沸点塩酸（約６Ｎ塩酸）を用いて、２０時間から７２時間、１１０度に加熱する加水分解方法（非特許文献２）、及び、（２）塩酸からの汚染物質の混入を防ぎ、微量試料を扱うために、定沸点塩酸を封管試験管内で直接蒸留する変法（気相加水分解法）が、最もよく用いられている。【０００６】
ところで、上記（１）（２）の方法は、操作が煩雑で熟練した技術が必要であり、特に、タンパク質の微量分析では、人の操作に際して混入するタンパク質が分析結果に与える影響が大きくなる。そのため、より簡便な操作を実現し、かつ操作中のタンパク質の混入を防止する目的で、当該方法を自動化する試みもなされている。【０００７】
例えば、上記試みの一例として、定沸点塩酸を用いた加水分解工程、及び誘導体化工程（プレラベルPTC（フェニルチオカルバミル）アミノ酸誘導体化法）まで自動化した装置が開発された（特許文献１）。しかし、当該装置では、塩酸によるバルブの腐食が原因の故障が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本生化学会編  生化学実験講座１タンパク質の化学II一次構造決定法  ３０頁−４０頁、及び９６頁−１０１頁  東京化学同人（発行日１９７６年８月）
【非特許文献２】“The amino acid composition of ribonuclease”, Hirs, C.H.W., Stein, W.H., Moore, S. , J. Biol. Chem. 211, 941-950 (1954)
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許５，１０６，５８３号(特許日１９９２年４月２１日)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
すなわち、上記従来の定沸点塩酸を用いたタンパク質の加水分解方法では、１）タンパク質の加水分解産物であるアミノ酸が酸化によりさらに分解され易く、減圧封管などの極めて煩雑な操作が必要となること、２）装置の自動化に不向きであること、等の問題を有する。【００１１】
本願発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来の定沸点塩酸を用いた方法と比較してより簡便にタンパク質を加水分解する新規な方法、当該方法が適用された加水分解装置、及び加水分解産物の分析装置を提供することにある。また、必要に応じて反応を自動化可能なタンパク質の加水分解方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者等は上記課題を解決するために、定沸点塩酸を用いない新たな加水分解法について鋭意検討をおこなった。その結果、本願発明に先立ち、陽イオン交換樹脂などの固体酸触媒とタンパク質とを接触させた状態で加熱すれば、当該タンパク質をアミノ酸に加水分解できることを初めて見出した。本願発明者等は、さらに鋭意検討を行い、複数の細孔を有するタンパク質保持基材と、固体酸触媒とを複合することにより、当該固体酸触媒の触媒活性が有意に引き出されることを見出し、本願発明を完成させるに至った。【００１３】
すなわち、本発明に係るタンパク質の加水分解方法は、上記の課題を解決するために、複数の細孔を有するタンパク質保持基材の、当該細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配した状態でタンパク質を当該固体酸触媒に接触させ、水の存在下加熱することにより当該タンパク質を加水分解することを特徴としている。【００１４】
上記の方法によれば、タンパク質の加水分解反応に対する固体酸触媒の触媒活性が有意に引き出され、固体酸触媒を単独で用いる場合と比較して、より良好にタンパク質を加水分解することができるという効果を奏する。その結果、従来の定沸点塩酸を用いた方法等と比較してより簡便にタンパク質を加水分解することが可能になる。また、従来の方法と比較して、タンパク質の加水分解方法の自動化がより容易になる。【００１５】
本発明に係るタンパク質の加水分解装置は、上記の課題を解決するために、タンパク質を含む溶液を供給する試料供給手段と、タンパク質保持基材が有する複数の細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒が配された複合基材を備えた加水分解手段と、上記試料供給手段と加水分解手段とを連結する流路と、上記加水分解手段を加熱する加熱手段と、を備えることを特徴としている。【００１６】
また、本発明に係るタンパク質の加水分解産物の分析装置は、上記の課題を解決するために、上記の加水分解装置における加水分解手段の後段に、さらに、タンパク質の加水分解産物を分析する分析手段を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、固体酸触媒を用いたタンパク質の加水分解として新規なものを提供することができる。さらに、当該加水分解方法を採用した加水分解装置、及び加水分解産物の分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係るタンパク質の加水分解装置／加水分解産物の分析装置の一例を説明する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
【００２０】
〔本発明に係るタンパク質の加水分解方法の概要〕
本発明に係る方法は、複数の細孔を有するタンパク質保持基材の、当該細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配した状態でタンパク質を当該固体酸触媒に接触させ、水の存在下加熱することにより当該タンパク質を加水分解するものである。本願発明者らは、既に、強陽イオン交換樹脂等の固体酸触媒を単独で用いてタンパク質の加水分解を行う試みをなしていたが、本発明の方法を採用することで、タンパク質の加水分解反応に対する固体酸触媒の触媒活性が有意に引き出されると考えられる。その結果、本発明に係る方法では、固体酸触媒を単独で用いる場合と比較して、さらに良好にタンパク質を加水分解することができる（後述する実施例・比較例も参照のこと）。
【００２１】
加えて、本発明に係る方法は、定沸点塩酸等を用いた従来の加水分解方法と比較して、加水分解装置に損傷を与えることがない。また、加水分解反応に用いる固体酸触媒及びタンパク質保持基材の回収が容易であり、従来の方法と比較して環境負荷もより少なくなる。
【００２２】
本発明において「タンパク質保持基材」は、複数の細孔を有する基材（すなわち多孔質基材）であって、タンパク質を吸着、又は付着等することにより保持できるものであれば特に限定されない。その材質は、特に限定されないが、多孔質ニトロセルロース担体、多孔質ナイロン担体、多孔質ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）担体、多孔質シリカ担体、多孔質ポリエーテルスルホン担体、多孔質ポリカーボネート担体、多孔質ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）担体、多孔質セルロース混合エステル担体、又はこれら材質の複数種からなる複合担体、等が挙げられ、タンパク質の保持量を向上させるために疎水化処理、又は親水化処理等の処理が施されていてもよい。中でも、タンパク質の保持力に優れ、かつ耐熱性に優れるという観点からは、多孔質ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）担体がより好ましい。なお、タンパク質保持基材におけるタンパク質の保持量は、特に限定されないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の保持量として、５０μｇ／ｃｍ2〜２５０μｇ／ｃｍ2の範囲内であることが好ましく、１００μｇ／ｃｍ2〜２５０μｇ／ｃｍ2の範囲内であることがより好ましい。ここで、「タンパク質保持量」は、例えば、放射性同位体ラベル法により測定される。
【００２３】
タンパク質保持基材の形状は、特に限定されず、例えば、膜状、ロッド状、粒状、などである。膜状の場合、その膜厚は特に限定されないが、２０〜１０００μｍの範囲内であることが好ましく、８０〜２００μｍの範囲内であることがより好ましい。なお、膜状のタンパク質保持基材として、タンパク質ブロット用の膜、限外ろ過膜、等が例示され、複数の膜を積層膜化したものであってもよい。
【００２４】
タンパク質保持基材が有する細孔の平均細孔径は、特に限定されないが、大多数のタンパク質を対象として、当該タンパク質の全体又はその一部領域を細孔内に保持するために、０．０１μｍ〜０．７５μｍの範囲内であることが好ましく、０．０５μｍ〜０．６μｍの範囲内であることがより好ましい。なお、「平均細孔径」は電子顕微鏡観察により測定することができる。
【００２５】
また、タンパク質保持基材が膜状の場合、上記細孔の少なくとも一部は、膜の一方面から他方面に貫通する貫通孔であることが好ましい。貫通孔を有すれば、タンパク質保持基材の膜の一方面側からタンパク質を含む溶液を供給して加水分解を行い、アミノ酸等の加水分解産物を膜の他方面側から回収できる。
【００２６】
本発明において「固体酸触媒」は、酸として機能しうる固体触媒であれば特に限定されるものではないが、加水分解効率の観点から、メタンスルホン酸基、ビニルスルホン酸基のような飽和炭化水素スルホン酸基、不飽和炭化水素スルホン酸基、ジフルオロメタンスルホン酸のようなハロゲン化飽和炭化水素スルホン酸基、ハロゲン化不飽和炭化水素スルホン酸基、（これらの炭化水素スルホン酸基には複素環炭化水素スルホン酸基も含む）、或いはトルエンスルホン酸基等の芳香族スルホン酸基を含むスルホン酸型陽イオン交換体；ピクリン酸基などを含むフェノール型陽イオン交換体；モノ、ジクロロ酢酸基、モノ、ジフルオロ酢酸基などのハロゲン化酢酸基、サリチル酸基、ニトロ安息香酸基、クロロ安息香酸基、フタル酸基、ヘミメリット酸基、ピロメリット酸基などの芳香族カルボン酸基、ピルビン酸基、アセトピルビン酸基、マロン酸基、アコニット酸基等のカルボン酸基を含むカルボン酸型イオン交換体；含フッ素または塩素スルフィン酸基、トルエンスルフィン酸基、ニトロベンゼンスルフィン酸基、ハロゲン化ベンゼンスルフィン酸基、ベンゼンスルフィン酸基等を含むスルフィン酸型イオン交換体；含フッ素または塩素スルフェン酸基を含むスルフェン酸型イオン交換体；飽和炭化水素リン酸基、不飽和炭化水素リン酸基、ハロゲン化飽和炭化水素リン酸基、ハロゲン化不飽和炭化水素リン酸基、（これらの炭化水素リン酸基には複素環炭化水素リン酸基も含む）、グリセロリン酸基、ヘキソースリン酸基、芳香族リン酸基、芳香族アリルリン酸基、アリルリン酸基およびハロゲン化アリルリン酸基などのリン酸基を含むリン酸型陽イオン交換体；からなる群から選ばれる少なくとも一種類であることが好ましい。固体酸触媒は、一種のみ用いてもよく、又は二種以上を組合わせて使用することもできる。
【００２７】
上記スルホン酸型陽イオン交換体とは、上記の通りスルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）を含む陽イオン交換能を有するイオン交換体であり、好ましい形態として、スルホン酸基を含む陽イオン交換樹脂を挙げることができる。スルホン酸型陽イオン交換体は、例えば、プロトン以外のカウンターイオンを有する（−ＳＯ3Ｘ（Ｘはカウンターイオンを表す））場合、プロトン型に置換した後に使用する。上記陽イオン交換樹脂としては、特に限定されないが、後述するタンパク質の加水分解を比較的高温かつ迅速に行う目的では、耐熱性に優れたスルホン酸型イオン交換基を有する（導入された）ポリテトラフルオロエチレン（共）重合体がより好ましい。なお、スルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体の一例として、パーフルオロスルホン酸／ポリテトラフルオロエチレン共重合体の一例たるナフィオン（（Nafion）登録商標）等が挙げられる。なお、本発明において「（共）重合体」とは、一種のモノマーを重合してなる単独重合体、及び二種以上のモノマーを重合してなる共重合体の何れも包含する概念である。
【００２８】
さらに、タンパク質の加水分解を比較的高温かつ迅速に行う目的では、特に好適な「タンパク質保持基材」と「固体酸触媒」との組合わせとして、具体的には例えば、ＰＶＤＦと、ナフィオン等のスルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体との組合わせが挙げられる。
【００２９】
ナフィオンは固体高分子電解質として古くから知られ、その耐久性と化学的安定性から最先端材料、特に燃料電池材料として様々な用途に用いられている。ナフィオンは、膜状に加工されたものや、粉末やペレット、懸濁液などが入手可能であり、懸濁液を用いたキャスト膜の物性に関する報告もなされている（“Density and Solubility of Nafion: Recast, Annealed, and Commercial Films”, Zook, L. A., Leddy J., Anal. Chem., 68, 3793-3796 (1996)）。またマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）を用いたタンパク質の質量分析の研究例（“Diffusive transfer to membranes as an effective interface between gel electrophoresis and mass spectrometry”, Ogorzalek Loo, R. R., Mitchell, C., Stevenson, T. I., Loo, J. A., Andrews, P. C., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 169/170, 273-290 (1997)）では、様々な膜からのイオン化が研究されており、ナフィオン膜についてはキャスト膜ではなく、ＰＶＤＦ膜上にナフィオンを展開した複合膜を作製している。
【００３０】
しかしながら、上記の複合膜をタンパク質の加水分解用途に用いたのは、本願発明者らがはじめてであり、１）当該加水分解を比較的高温かつ迅速に行うことができ、さらに、２）当該複合膜を用いることで、ナフィオンのキャスト膜と比較して、極めて優れた回収アミノ酸量を実現することができる、という効果を奏する（後述する実施例・比較例も参照）。
【００３１】
なお、いうまでもないが、比較的耐熱性を有する「固体酸触媒」と「タンパク質保持基材」との組合わせを任意に選択しても、必ずしも加水分解をより迅速に行うことが出来るとは限らない。確かに、加水分解の反応速度は温度が上昇するにつれて速くなる。しかし、温度が上昇するほど、反応系内のタンパク質、分解産物（アミノ酸等）、固体酸触媒、及びタンパク質保持基材との間で、不所望な副反応が生じる虞も高まり、分解産物の回収量や組成に悪影響を及ぼしうる。したがって、タンパク質の加水分解をより迅速に行うためには、「固体酸触媒」及び「タンパク質保持基材」の組合わせにおける耐熱性以外の要素も重要である。本願発明者らは、試行錯誤の結果、ＰＶＤＦと、ナフィオン等のスルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体との組合わせが、タンパク質の加水分解をより迅速に行うに非常に適していることを見出した。
【００３２】
本発明において「タンパク質保持基材の、当該細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配する」とは、少なくともタンパク質保持基材が有する細孔の内表面の一部又は全体に固体酸触媒が付されていること（表面に浸潤している状態も含む）、より好ましくは、当該内表面の一部又は全体が固体酸触媒にて被覆されていることを指す。なお、上記細孔の内表面に固体酸触媒が配されている限りにおいて、タンパク質保持基材の表面（内表面以外の表面）の一部又は全体にも固体酸触媒が付されていてよい。
【００３３】
なお、タンパク質保持基材に固体酸触媒を配する方法は特に限定されないが、例えば、１）固体酸触媒を適当な溶媒に溶解又は懸濁した溶液を、タンパク質保持基材に供する（塗布等）、２）当該溶液中にタンパク質保持基材を浸漬する、３）タンパク質保持基材に固体酸触媒を蒸着する、等の方法が挙げられる。これら例示の中では、操作が容易かつ確実であるとの観点から、１）又は２）の方法が好ましい。
【００３４】
タンパク質保持基材に配される固体酸触媒の量は特に限定されないが、当該固体酸触媒が配されるタンパク質保持基材の、内表面を除く、外寸法から算出される表面積あたり、０．１ｍｇ／ｃｍ2〜１００ｍｇ／ｃｍ2の範囲内であることが好ましく、０．４ｍｇ／ｃｍ2〜２ｍｇ／ｃｍ2の範囲内であることがより好ましい。
【００３５】
本発明では、タンパク質は、上記タンパク質保持基材に配された固体酸触媒に接触させて、水の存在下加熱して加水分解される。ここで、タンパク質を固体酸触媒に接触させる方法として、（Ａ）タンパク質保持基材と固体酸触媒とを接触させて、タンパク質保持基材が有する細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒が配された複合基材を得て、次いで、当該複合基材にタンパク質を接触させる方法、或いは、（Ｂ）タンパク質保持基材とタンパク質とを接触させて、当該タンパク質保持基材にタンパク質を保持させ、次いで、タンパク質を保持した上記タンパク質保持基材と、上記固体酸触媒を含む溶液とを接触させて、上記細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配した状態で当該タンパク質を固体酸触媒に接触させる方法、が挙げられる。
【００３６】
ここで、上記（Ａ）の方法で「複合基材」として膜状のものを用いれば、例えば、本発明を以下の用途に応用することができる。（１）この複合基材はカラムに組み込むことが可能なため、自動加水分解装置を用いたタンパク質の自動加水分解が可能となる。（２）市販の９６穴ドットブロット装置などの既存フォーマットと親和性が高く、それらと併用することにより、多量のサンプル（タンパク質試料）を並行処理することが容易となる。（３）通常、タンパク質の分離には各種クロマトグラフィーの他に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が比較的分離能が良いため多用される。しかし、アミノ酸組成分析を行う場合、分析対象のタンパク質を含むゲルを直接加水分解しアミノ酸を得る方法では多量のアンモニアが発生するなどし、その後の分析に支障をきたす。また、ＳＤＳやギ酸を用いてタンパク質を溶出しても、加水分解を妨害する物質を除去するのは難しい。そこで、従来は、ゲルからブロッティング用の膜（タンパク質保持基材）に電気的に転写し、染色およびバックグラウンドの脱染色をしてタンパク質のバンドを確認し、切り抜き、洗浄し加水分解するという方法をとっている。しかし、このような煩雑な操作が増えるほど、操作する人間からの汚染が分析を邪魔する危険性が増す。一方、本発明に従い、膜状の上記複合基材を組み込んだカラムを用いれば、電気泳動後のゲルから溶出したタンパク質溶液を添加し、洗浄後に、加熱することで加水分解からアミノ酸回収まで行えるため、タンパク質溶出のためにＳＤＳやギ酸を加えたとしても微量分析を阻害する環境からの汚染を極力抑えることが可能となる。
【００３７】
また、上記（Ｂ）の方法の具体例として、特に限定されないが、ゲル電気泳動後のタンパク質を、当該ゲルから上記タンパク質保持基材（ブロッティング用の膜）に転写し、次いで、タンパク質保持基材と固体酸触媒とを接触させる方法が挙げられる。通常、加水分解に供されるタンパク質試料は、目的外のタンパク質その他の夾雑物を含む混合物であるから、加水分解前に、ゲル電気泳動などにより分離操作がなされる。上記（Ｂ）の方法によれば、電気泳動後のゲルからタンパク質保持基材に転写されたタンパク質に対して、直接、固体酸触媒を作用させて加水分解を行うことができる。
【００３８】
さらに、上記（Ｂ）の方法の他の具体例として、特に限定されないが、限外ろ過膜（タンパク質保持基材）などでタンパク質を含む溶液をろ過し、次いで、限外ろ過膜と固体酸触媒とを接触させる方法が挙げられる。市販の限外ろ過膜またはＰＶＤＦ膜を付した９６穴もしくは３８４穴などのフィルタープレートプレートを用いることで、多検体の加水分解処理が可能になる。
【００３９】
本発明において、加水分解の対象となる「タンパク質」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により連結してなるものであれば、その種類、由来、大きさ等は、特に限定されない。ただし、一般的には、１００以上で２０００以下のアミノ酸残基からなるタンパク質が好ましい。
【００４０】
本発明において、「タンパク質の加水分解」とは、水の存在下、ペプチド結合が加水分解されて、より短いタンパク質（ペプチド）及び／又は構成アミノ酸、に分解される反応を指す。当該加水分解の反応条件は、分解反応が進行し、かつ、固体酸触媒及びタンパク質保持基材の分解が実質的に起らない限りにおいて特に限定されない。反応温度は、固体酸触媒及びタンパク質保持基材の分解が実質的に起らない限りにおいて、１００℃以上で２２０℃以下の温度範囲内が好ましく、１１０℃以上でかつ１６０℃以下の温度範囲内がより好ましい。特に好ましくは１４０℃以上でかつ１６０℃以下の温度範囲である。なお、ＰＶＤＦと、スルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体との組合わせは、ここで例示した温度範囲内において特筆すべき加水分解能の劣化などを起こさない。
【００４１】
また、加水分解の反応時間は反応温度に依存するが、５分〜１週間程度が好ましく、１０分〜２４時間の範囲内がより好ましい。特に好ましくは１０分〜２時間程度の範囲内である。
【００４２】
さらに、本発明に係る加水分解反応において、反応の基質となるタンパク質重量と固体酸触媒重量との量比は反応が円滑に進む限りにおいて特に限定されないが、タンパク質量と固体酸触媒量とが、１：１０００〜１：１の範囲内であることが好ましい。
【００４３】
なお、本発明に係る方法で得られたタンパク質の加水分解産物の用途は、特に限定されない。例えば、食品添加物やサプリメント等を含む各種工業製品の原材料として用いることもでき、また、タンパク質の構成アミノ酸分析の用途に供することもできる。
【００４４】
〔タンパク質の加水分解装置、及び加水分解産物の分析装置〕
本発明に係るタンパク質の加水分解装置は、１）タンパク質を含む溶液を供給する試料供給手段と、２）タンパク質保持基材に固体酸触媒が配された複合基材を備えた加水分解手段と、３）上記試料供給手段と加水分解手段とを連結する流路と、４）洗浄液および加水分解後の加水分解産物を溶出する溶出液を送液する送液手段と、５）上記加水分解手段を加熱する加熱手段と、を備える。さらに、必要に応じて、６）加水分解手段の後段側に、加水分解産物の回収手段、及び加水分解手段と当該回収手段とを連結する流路、を備える。
【００４５】
上記試料供給手段は、加水分解の対象となるタンパク質を加水分解手段に供給するものであり、例えば、公知のサンプルインジェクター等で構成することができる。また、公知のオートサンプラーを用いて、タンパク質を含むサンプルを自動供給する構成としてもよい。
【００４６】
上記の加水分解手段は、本発明に係るタンパク質の加水分解方法を実行する手段であり、具体的には、タンパク質保持基材に固体酸触媒が配された複合基材を備えてなる。特に限定されないが、加水分解手段は、粒状の複合基材を充填したカラム、又は膜状の複合基材が流路に配されたカラム、の何れかであることが好ましい。当該カラムを備えれば、試料供給手段から供された、加水分解の対象となるタンパク質がカラムに保持される一方で、加水分解産物はカラムの下流側にて回収可能となる。よって、加水分解装置の自動化が行いやすく、また加水分解産物と未分解のタンパク質との分離が比較的容易となる。
【００４７】
なお、上記カラムの下流側に加水分解産物を送り出す方法は特に限定されないが、加水分解反応後に、例えば、適当な溶出液を当該カラムに送液して加水分解産物を溶出する方法等が挙げられる。なお、溶出液としては、ホウ酸溶液、トリエチルアミン水溶液等の塩基性緩衝溶液；塩化ナトリウム等の高塩濃度溶液（例えば、０．１Ｍ〜２Ｍの濃度）；トリフルオロ酢酸水溶液等の酸性溶液；等、タンパク質の加水分解産物用の溶出液として知られたものを適宜利用することができる。
【００４８】
上記の加熱手段は、加水分解手段を所望の温度に加熱して、タンパク質の加水分解反応を促進するための手段であり、例えば、公知の電気炉等で構成することができる。また、上記の回収手段は、タンパク質の加水分解産物（アミノ酸等）を回収する手段であり、加水分解手段の後段側に設けられる。
【００４９】
また、特に限定されないが、加水分解装置は、加水分解対象物以外の混入を防止するため、流路も含めて閉鎖系であることが好ましい。さらに、上記の各手段の動作を自動制御する制御手段を設けて、自動運転が可能な加水分解装置とすることが好ましい。
【００５０】
本発明に係るタンパク質の加水分解産物の分析装置は、上記の加水分解装置における加水分解手段の後段に、タンパク質の加水分解産物であるペプチド及び／又はアミノ酸を分析する分析手段をさらに備えたものである。なお、分析手段には、公知のペプチド及び／又はアミノ酸分析装置を用いればよい。また、公知のフラクションコレクターによってアミノ酸を回収し、誘導体化後、別途分析してもよい。
【００５１】
ここで、本発明に係るタンパク質の加水分解装置／加水分解産物の分析装置２１の具体的な一例は、図１に示すように、洗浄液を貯蔵する洗浄液槽１；溶出液を貯蔵する溶出液槽２；流路を介して洗浄液槽１及び溶出液槽２に接続された送液ポンプ（送液手段）３；それぞれが異なるタンパク質溶液を保持する複数のサンプル管４から任意のサンプル管４を選択し、当該タンパク質溶液を後述の加水分解用カラム（加水分解手段）８に供給するオートサンプラー（試料供給手段）５；オートサンプラー５と流路を介して連結された複数の加水分解用カラム８；複数の加水分解用カラム８を収容し、これら加水分解用カラム８を加熱する電気炉（加熱手段）９；加水分解用カラム８と流路を介して連結された分解産物回収部（分解産物回収手段）１０；加水分解用カラム８と流路を介して連結された分解産物分析部（分析手段）１１；および、装置全体の動作制御を行う制御部（制御手段）１２；を備えて構成される。
【００５２】
複数の加水分解用カラム８は、その流路上に、タンパク質保持基材が有する複数の細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒が配された膜状の複合基材（後述する実施例のNafion-PVDF膜に相当）が設けられている。また、複数の加水分解用カラム８は、流路切り替えバルブ（流路切り替え手段）７を介して、その前段側に配されたオートサンプラー５、その後段側に配された分解産物回収部１０及び分解産物分析部１１、に連結されている。これにより、使用する加水分解用カラム８を適宜切り替えながら、タンパク質の加水分解を行う。
【００５３】
また、制御部１２は、送液ポンプ３、オートサンプラー５、バルブコントローラ６を介して流路切り替えバルブ７、分解産物回収部１０、及び分解産物分析部１１の動作をそれぞれ自動的に制御する。
【００５４】
図１に示す加水分解装置／加水分解産物の分析装置を用いたタンパク質の加水分解／加水分解産物の分析は、例えば、次のように行う。
（１）まず、洗浄液槽１に貯蔵したＭｉｌｌｉＱ水を装置全体に通液し、加水分解用カラム８を平衡化する。
（２）次いで、オートサンプラー５を介して、加水分解等の対象となるサンプル管４中のタンパク質溶液を加水分解用カラム８に通液する。これにより、加水分解用カラム８に導入されたタンパク質は、当該カラム８内に配された複合基材に保持される。
（３）次いで、洗浄液槽１に貯蔵したＭｉｌｌｉＱ水を加水分解用カラム８に通液して洗浄した後、電気炉９により加水分解用カラム８を加熱する。これにより、上記複合基材に保持されたタンパク質が、本発明にかかる方法に従いペプチド又はアミノ酸まで加水分解される。
（４）次いで、電気炉９による加熱を停止し、放冷した後、溶出液槽２中に貯蔵された溶出液を加水分解用カラム８に通液する。これにより、加水分解産物であるペプチド又はアミノ酸が、当該加水分解用カラム８の後段側に溶出する。
（５）次いで、溶出したペプチド又はアミノ酸は、分解産物回収部１０にて回収され、分解産物分析部１１での分析などの用途に供される。或いは、溶出したペプチド又はアミノ酸は、直接（すなわち分解産物回収部１０を介さずに）、分解産物分析部１１での分析に供される。
【００５５】
以上説明のように、本発明に係るタンパク質の加水分解方法は、上記固体酸触媒はスルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体であり、かつ、上記タンパク質保持基材はポリビニリデンジフルオライドであることが好ましい。さらに、この場合、タンパク質の加水分解は、１００℃以上でかつ２２０℃以下の温度範囲内で行われることが好ましい。
【００５６】
スルホン酸型イオン交換基を有するポリテトラフルオロエチレン（共）重合体と、ポリビニリデンジフルオライドとの組合わせは、耐熱性に優れるだけではなく、タンパク質の加水分解反応を触媒する特性にも優れている。したがって、上記の方法によれば、例えば、１００℃以上でかつ２２０℃以下、より好ましくは１１０℃以上でかつ１６０℃以下の温度範囲内という高温下で、タンパク質の加水分解を迅速かつ良好に行うことが出来る。
【００５７】
本発明に係るタンパク質の加水分解方法は、タンパク質保持基材と固体酸触媒とを接触させて、タンパク質保持基材が有する細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒が配された複合基材を得る工程と、次いで、上記複合基材にタンパク質を接触させる工程とを含むものであってもよい。
【００５８】
或いは、本発明に係るタンパク質の加水分解方法は、タンパク質保持基材とタンパク質とを接触させて、当該タンパク質保持基材にタンパク質を保持させる工程（１）と、次いで、タンパク質を保持した上記タンパク質保持基材と、上記固体酸触媒を含む溶液とを接触させて、タンパク質保持基材が有する細孔の内表面の少なくとも一部に固体酸触媒を配した状態で当該タンパク質と固体酸触媒とを接触させる工程（２）とを含むものであってもよい。さらに、この場合、上記工程（１）は、ゲル電気泳動後のタンパク質を、当該ゲルから上記タンパク質保持基材に転写する工程であってもよい。
【００５９】
上記の方法によれば、例えば、電気泳動後のゲルからタンパク質保持基材に転写されたタンパク質に対して、直接、固体酸触媒を作用させて加水分解を行うことができる。
【００６０】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６１】
次に、実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。はじめに、実施例及び比較例にて用いた「蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」の方法について、以下に説明する。【００６２】
（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析
6−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）の合成、およびＡＱＣを用いたアミノ酸の蛍光誘導体化（プレラベル化）は公知文献（S.A. Cohenら,Anal. Biochem. 211. p279-287(1993)）の記載に従って行った。【００６３】
このように調製したアミノ酸の蛍光誘導体をＨＰＬＣにより分離した。ＨＰＬＣによる分離は、逆相カラムを用い、イオンペア試薬を含む緩衝溶液系を用いた濃度勾配溶出法により実施した。下記条件を用いて、ＡＱＣにより蛍光誘導体化した１７種のアミノ酸およびアンモニウムを含有する標準アミノ酸混合物またはタンパク質の加水分解産物を分離した。
＜条件＞
ａ）ＨＰＬＣ装置：Agilent社の１１００シリーズ（真空デガッサーG1379A、バイナリーポンプG1312A、オートサンプラーG1367A、カラム恒温槽G1330B/G1316A、ダイオードアレイ検出器G1315B、蛍光検出器G1321Aを含む）
ｂ）カラム： Inertsil ＯＤＳ−３(４．６×１５０ｍｍ，３μｍ)、ＧＬサイエンス社製 
ｃ）移動相：A:95 % 5mM テトラブチルアンモニウムブロミド、30mM リン酸緩衝液（pH 7.3）, 5 % アセトニトリル；B : 50 % アセトニトリル / 30mM リン酸緩衝液（pH 7.3）
ｄ）濃度勾配： 0−3−40分の間に移動相B濃度を2−7.3−72.3 %に変えた。
ｅ）流速：0.5ml 毎分
ｆ）温度：40℃
ｇ）蛍光励起波長（Ex）、およびモニター波長（Em）：Ex=250nm、Em=395nm
標準アミノ酸溶液として、ピアス社製のAmino Acid Standard H（２．５μｍｏｌ／ｍｌ）から調製した１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を用いた。その標準アミノ酸溶液５μｌ（５０ｐｍｏｌ）をＡＱＣにより蛍光誘導体化し、１／１０量を注入した時の分析値をもとにタンパク質の加水分解産物の定量を行った。【００６４】
〔参考例１：ナフィオン膜の作成〕
約１ｍｌの５ｗｔ％ Nafion resin solution in IPA(イソプロパノール)-water mixture (15-20% water, Aldrich 274704)（以下、「ナフィオン懸濁液」と称する）をウェインボート上に展開し、ドラフト内で乾燥させた。その後、シリカゲルを入れた真空デシケーター中で２日間放置した。得られた膜をウェインボートからはがしとり、マッフル炉中、１４０℃で１時間加熱（アニール）後、放冷し、１０ｍｌ程度の濃硝酸に浸した。２４時間後、上清が中性になるまで膜を水洗した後、当該膜を２４時間蒸留水に浸け置いた。その後、真空デシケーター中で十分に乾燥し、加水分解用のナフィオン膜とした。【００６５】
〔実施例１：Nafion-PVDF膜の作成、及びタンパク質の加水分解〕
(Nafion-PVDF膜の作成)
ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ProBlott PVDFメンブレン、アプライドバイオシステムズ社400994）をグローブボックス内で５ｍｍ角程度にメスで切り、参考例１に記載のナフィオン懸濁液を１０μｌ／ｃｍ2の量（触媒重量として約０．４ｍｇ／ｃｍ2）でＰＶＤＦ膜に滴下した。乾燥後、ＰＶＤＦ膜の裏面にも同様にナフィオン懸濁液を滴下し、再度乾燥させて加水分解用膜のNafion-PVDF膜（複合基材の膜）を得た。【００６６】
(Nafion-PVDF膜を用いたタンパク質の加水分解)
得られたNafion-PVDF膜をアセトニトリルで湿らせた後、当該膜に、０．２μｇ／μｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma製A-7638）水溶液５μｌを添加した。この膜を６×３２ｍｍの小試験管に入れ、ＭｉｌｌｉＱ水を１０μｌ加えた。この小試験管を２５ｍｌねじ口バイアルにいれ、ＭｉｌｌｉＱ水を２５μｌ加えた後密栓した。このバイアルを１１０℃で２０時間加熱し、ＢＳＡの加水分解を行った。バイアルを放冷後、小試験管をとりだし、小試験管に１０μｌのアセトニトリルを加えて膜を湿らし、２０μｌの２０ｍＭ塩酸を加えて撹拌後、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）を５０μｌ、ＡＱＣ溶液を２０μｌ加え、上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。【００６７】
表１に、加水分解の結果として、回収アミノ酸総量（回収アミノ酸量（ｐｍｏｌ））、及び、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。なお、参考として、同量のＢＳＡ水溶液を定沸点塩酸気相加水分解した結果も、表１に併せて示す（表中、「gas-phase」として示す）。【００６８】
ここで、定沸点塩酸気相加水分解は、次のように行った。すなわち、０．２μｇ／μｌのＢＳＡ水溶液を６×３２ｍｍの小試験管に５μｌ入れ乾固した。次いで、この小試験管を、定沸点塩酸２００μｌにフェノール結晶を加えた２５ｍｌねじ口バイアルにいれ、MininertValveを用いて脱気後密栓した。そして、このバイアルを１１０℃で２０時間加熱し、ＢＳＡの加水分解を行った。次いで、気相加水分解後の小試験管に２０μｌの２０ｍＭ塩酸を加えて撹拌後、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）を６０μｌ、ＡＱＣ溶液２０μｌを加え、上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。【００６９】
〔比較例１：ナフィオン膜を用いたタンパク質の加水分解〕
Nafion-PVDF膜に代えて、参考例１で得たナフィオン膜をグローブボックス内で５ｍｍ角程度にメスで切ったものを用いた以外は、上記実施例１に記載の方法に従いＢＳＡの加水分解、及びアミノ酸の定量を行った。表１に、回収アミノ酸総量（回収アミノ酸量（ｐｍｏｌ））、及び、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。【００７０】
【表１】
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【００７１】
表１に示すように、本発明の加水分解法を気相法による加水分解法と比較すると、回収アミノ酸総量についてほぼ同等の結果が得られた。一方、ナフィオン膜を用いた場合には回収アミノ酸総量の低下が見られた（比較例１）。このことから、ナフィオンとＰＶＤＦとを複合したNafion-PVDF膜では、タンパク質の加水分解反応に対するナフィオンの触媒活性が有意に引き出されたことが判る。なお、回収アミノ酸量（％）は、Nafion-PVDF膜を用いた場合と気相法とでほぼ一致し、非常に良好な結果が得られた。【００７２】
〔実施例２：Nafion-PVDF膜を用いた種々のタンパク質の迅速加水分解〕
実施例１と同様の方法で１ｃｍ角のNafion-PVDF膜を作成し、当該膜をメスで１ｍｍ幅の短冊状に切った。これをアセトニトリルで湿らせた後、当該膜に、１μｇ／μｌのＢＳＡ水溶液、オブアルブミン(ＯＶＡ, Sigma製A-5503)水溶液、又はヒストンＨ３（Ｈ３, Roche製 1034758）水溶液を１μｌ添加し、６×３２ｍｍの小試験管にそれぞれ入れた。この小試験管をＭｉｌｌｉＱ水２００μｌにフェノール結晶を加えた２５ｍｌネジ口バイアルにいれ、MininertValveを用いて脱気後密栓した。このバイアルを１５０℃で２時間加熱し、各タンパク質の加水分解を行った。【００７３】
次いで、加水分解後の小試験管それぞれに１０μｌのアセトニトリルを加えて膜を湿らし、２０μｌの２０ｍＭ塩酸を加えて撹拌後、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）を５０μｌ、ＡＱＣ溶液２０μｌを加え、上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。【００７４】
表２〜４に、順に、ＢＳＡ、ＯＶＡ、Ｈ３を加水分解した結果としての、回収アミノ酸総量（回収アミノ酸量（ｐｍｏｌ））、及び、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。なお、参考として、同量のタンパク質水溶液を定沸点塩酸気相加水分解した結果も、表２〜４に併せて示す（表中、「気相法」として示す）。【００７５】
ここで、定沸点塩酸気相加水分解は、次のように行った。すなわち、１μｇ／μｌのＢＳＡ水溶液、ＯＶＡ水溶液、又はＨ３水溶液を６×３２ｍｍの小試験管に１μｌ入れ乾固した。次いで、この小試験管を定沸点塩酸２００μｌにフェノール結晶を加えた２５ｍｌねじ口バイアルにいれ、MininertValveを用いて脱気後密栓した。そして、このバイアルを１１０℃で２０時間加熱し、各タンパク質の加水分解を行った。次いで、気相加水分解後の小試験管に２０μｌの２０ｍＭ塩酸を加えて撹拌後、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）を６０μｌ、ＡＱＣ溶液２０μｌを加え、上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。【００７６】
【表２】
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【００７７】
【表３】
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【００７８】
【表４】
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【００７９】
本発明の加水分解法を気相法による加水分解法と比較すると、回収アミノ酸総量について、ＢＳＡでは気相法の９６％、ＯＶＡでは７４％、Ｈ３では７７％と、非常に良好な結果が得られた。また、回収アミノ酸量（％）も気相法とほぼ一致し、非常に良好な結果が得られた。【００８０】
すなわち、耐熱性がありタンパク質保持力に優れた多孔性のＰＶＤＦ膜に、耐熱性があり酸性残基をもつナフィオンを塗布したNafion-PVDF膜（タンパク質にとって十分な大きさの細孔（ポア）と酸点とを併せ持つ）とタンパク質水溶液とを封管し加熱することで、タンパク質の構成要素であるアミノ酸に加水分解することができた。さらに、従来の１１０℃で２０時間という加水分解時間で得られるアミノ酸と同等量のアミノ酸を、１５０℃で２時間という短時間で回収することが可能となり、スループットが飛躍的に向上した。【００８１】
〔実施例３：エレクトロブロットした膜上での加水分解〕
０．８７μｇ相当のＢＳＡを含む標準分子量マーカー（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社、LMW Marker Kit, 17-0446-01）を、ポリアクリルアミドゲルにアプライし、ＢＳＡのゲル電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜（ProBlott PVDFメンブレン、アプライドバイオシステムズ社400994）にエレクトロブロッティングした。この膜をクマシーブルー染色し、検出されたＢＳＡのバンドを切り抜いた。次いで、このバンドに対応したＰＶＤＦ膜にNafion懸濁液を塗布し乾燥させた。これにより、ＰＶＤＦ膜の表面及びその細孔の内表面にNafionが付された状態とした。また、参考のため、実施例１と同様の方法で作成したNafion-PVDF膜を、切り抜いた上記バンドと同等の大きさに切り、そこに１μｇ／μｌのＢＳＡ水溶液を１μｌ添加した。【００８２】
次いで、これらをそれぞれ６×３２ｍｍの小試験管に入れ、ＭｉｌｌｉＱ水２００μｌにフェノール結晶を加えた２５ｍｌネジ口バイアルにいれ、MininertValveを用いて脱気後密栓した。このバイアルを１５０℃で２時間加熱し、ＢＳＡの加水分解を行った。バイアルを放冷後、小試験管をとりだし、小試験管に１０μｌのアセトニトリルを加えて膜を湿らし、２０μｌの２０ｍＭ塩酸を加え撹拌後、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）を５０μｌ、ＡＱＣ溶液を２０μｌ加え、得られたアミノ酸を上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。【００８３】
表５に、加水分解の結果として、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。表中、「blotted PVDF-Nafion」と示すのがエレクトロブロッティングしたＰＶＤＦ膜にナフィオンを塗布した場合の結果であり、実施例１に準じたNafion-PVDF膜を用いた結果とほぼ同等であることが判る。【００８４】
【表５】
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【００８５】
〔実施例４：Nafion-PVDF膜をカラムに組み込んでの加水分解〕
Nafion-PVDF膜に、５μｇ／μｌのＢＳＡ水溶液を２μｌ（ＢＳＡ量で１０μｇ）添加して、ＢＳＡが塗布されたNafion-PVDF膜を用意した。そして、Upchurch Scientific社製プレカラムフィルターアセンブリーＡ−３１８に、フリットＡ−７００とフリットＡ−７０１との間に上記Nafion-PVDF膜を挟み込んだものを取り付けてプレカラムを組み立てた。プレカラムにＭｉｌｌｉＱ水を０．２ｍｌ／ｍｉｎで１分間通液した後、ＰＥＥＫ製エンドプラグ（東ソー0017791）でプレカラムの両端を密栓した。このプレカラムを１５０℃で２時間加熱し、Nafion-PVDF膜上のＢＳＡを加水分解した。Nafion-PVDF膜からの加水分解産物の抽出は、下記（ａ）（ｂ）の２通りの方法で行い、得られたアミノ酸を上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。
（ａ）プレカラムからNafion-PVDF膜を取り出し、アセトニトリルで湿らせた後、０．２Ｍのホウ酸緩衝液で加水分解産物を抽出する。表６に、加水分解の結果として、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。
（ｂ）プレカラムに０．２Ｍのホウ酸緩衝液を０．０５ｍｌ／ｍｉｎの流速で通液し、フラクションコレクターで１ｍｉｎ／ｔｕｂｅで加水分解産物を回収する。表７に、加水分解の結果として、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。【００８６】
表６及び７に示すように、Nafion-PVDF膜をカラムに組み込んだ場合もＢＳＡが加水分解されていることが判る。なお、一部のアミノ酸の回収アミノ酸量（％）では、理論値から外れているものが見受けられるが、これは、ＢＳＡが加水分解なされていないことを示すものではない。すなわち、カラムの設計、分解産物たるアミノ酸の溶出条件等を最適化することにより、より理論値に近い回収アミノ酸量（％）を実現できると考えられる。【００８７】
【表６】
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【００８８】
【表７】
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【００８９】
〔実施例５：Nafion-PVDF膜をカラムに組み込んでの加水分解（自動でタンパク質導入）〕
Upchurch Scientific社製フリットＡ−１００の外枠とＡ−７０２のフィルター部分とを組み合わせＰＥＥＫ素材のみで形成したフリットを作成し、作成したフリットの間にNafion-PVDF膜を挟み込んだものを、プレカラムフィルターアセンブリーＡ−３１８に取り付けてプレカラムを組み立てた。プレカラムに、まず、アセトニトリルを導入し膜を湿らせ、次いで２μｇ／μｌのＢＳＡ水溶液を５μｌ（ＢＳＡ量で１０μｇ）、オートサンプラーを用いて自動で導入した後、ＭｉｌｌｉＱ水を０．０５ｍｌ／ｍｉｎで１０分間通液した。このプレカラムを１５０℃で２時間加熱し、Nafion-PVDF膜上のＢＳＡを加水分解した。Nafion-PVDF膜からの加水分解産物の抽出は、下記（ａ）（ｂ）の２通りの方法で行い、得られたアミノ酸を上記「（１）蛍光誘導体化によるアミノ酸分析」に示す方法に従い蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。
（ａ）プレカラムからNafion-PVDF膜を取り出し、アセトニトリルで湿らせた後、０．２Ｍのホウ酸緩衝液で加水分解産物を抽出する。表８中の「ＢＳＡ手動溶出」の項目に、加水分解の結果として、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。
（ｂ）プレカラムに０．２Ｍのホウ酸緩衝液を０．０５ｍｌ／ｍｉｎの流速で通液し、フラクションコレクターで１ｍｉｎ／ｔｕｂｅで加水分解産物を回収する。すなわち、（ｂ）は、全工程（カラム前処理、試料注入、洗浄、加熱、溶出、回収）を自動化した実施例に相当する。表８中の「ＢＳＡ自動溶出」の項目に、加水分解の結果として、回収アミノ酸総量に対する各アミノ酸の割合（回収アミノ酸量（％））を示す。【００９０】
表８に示すように、Nafion-PVDF膜をカラムに組み込み、自動でＢＳＡを導入した場合もＢＳＡが加水分解されていることが判る。なお、一部のアミノ酸の回収アミノ酸量（％）では、理論値から外れているものが見受けられるが、これは、ＢＳＡが加水分解なされていないことを示すものではない。すなわち、カラムの設計、分解産物たるアミノ酸の溶出条件等を最適化することにより、より理論値に近い回収アミノ酸量（％）を実現できると考えられる。【００９１】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、従来法と比較して、より簡便、迅速、かつ自動化が可能なタンパク質の加水分解方法、加水分解装置、及び加水分解産物の分析装置を提供することができる。
【符号の説明】
【００９３】
５      オートサンプラー（試料供給手段）
８      加水分解用カラム（加水分解手段）
９      電気炉（加熱手段）
１１    分解産物分析部（分析手段）
２１    加水分解装置／加水分解産物の分析装置
【図１】
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