(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１×１０５のヒトｉＰＳ細胞あたり１０以上のネット様構造物を産生する能力を有するｉＰＳ細胞クローンを選択し、該ｉＰＳ細胞クローンが産生するネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法。
【請求項２】
前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ存在下、７〜９日間培養することである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＨｅｐａｒｉｎ存在下、７〜９日間培養することである請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）から血小板を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増幅し、供給することは極めて重要なことである。このため、これまで多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞の効率的な増幅が試みられてきた。血球細胞の中でも、巨核球は、血小板前駆細胞（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）、さらには、血小板を産生する細胞であり、治療上、重要な位置を占めている。
血球細胞のなかでも血小板は血液凝固（止血）に必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて、血小板の需要は極めて高い。これまでに、血小板は、ドナーからの献血により採取する方法により供給されてきた。しかし、ドナーからの献血により採取する方法では、慢性的なドナー不足や、採取した血小板を凍結することができないことなどから、安定に血小板を供給することが困難である。また、ドナーからの献血により採取する方法以外に、ＴＰＯを患者に投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法などが試みられたが、ＴＰＯを患者に投与する方法は、ＴＰＯの投与後ＴＰＯに対する無力化抗体が産生されてしまうため、この方法は、実用化には至っていない。さらに、臍帯血又は骨髄細胞からの巨核球分化による方法も、巨核球のソースとなる造血幹細胞を極めて少数しか得ることができないため、安定した血小板の提供に適した方法ではない。【０００３】
近年、血小板を生体外で調製する方法として、ＥＳ細胞から誘導した造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に巨核球及び血小板へ分化させる方法などが報告されている。Ｅｔｏらは、マウスＥＳ細胞をＯＰ９ストローマ細胞と共培養することで巨核球へ分化誘導することを明らかにした（非特許文献１）。Ｆｕｊｉｍｏｔｏらは、Ｅｔｏらと同様の方法を用いて血小板の誘導を確認したとの報告を行っている（非特許文献２）。また、サルのＥＳ細胞から巨核球の分化誘導に成功したとの報告（非特許文献３）、ヒトのＥＳ細胞から巨核球の分化誘導に成功したとの報告（非特許文献４）もある。しかし、いずれも、血小板の放出を確認していない。また、ＥＳ細胞からの血小板の取得方法が、臨床的上利用し得る程度に確立した場合であっても、ＥＳ細胞から誘導した血小板を輸血により患者に適用する場合（特に初回輸血では問題視されないが、同一患者が、頻回に輸血を受けるような場合には）、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の適合性の問題は依然として残ることになる。【０００４】
ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称され、線維芽細胞などの体細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。
マウスのｉＰＳ細胞は、Ｙａｍａｎａｋａらによって、分化万能性の維持に重要なＮａｎｏｇ遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された（非特許文献５）。その後も同様の方法によるマウスｉＰＳ細胞の樹立が報告されている（非特許文献６、非特許文献７）。さらに、ｉＰＳ細胞の癌化の問題を克服するために、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）のみでも、ｉＰＳ細胞の樹立が可能であることが報告された（非特許文献８）。
一方、ヒトのｉＰＳ細胞に関しては、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、ヒトの線維芽細胞にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８を導入してヒトｉＰＳ細胞を樹立した（非特許文献９）。また、Ｙａｍａｎａｋａらは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣをヒトの線維芽細胞に導入して、同じくｉＰＳ細胞を樹立した（非特許文献１０）。【０００５】
【非特許文献１】Ｅｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２，９９：１２８１９−１２８２４．
【非特許文献２】Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，Ｂｌｏｏｄ  ２００３，１０２：４０４４−４０５１．
【非特許文献３】Ｈｉｒｏｙａｍａら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００６，３４：７６０−７６９．
【非特許文献４】Ｇａｕｒら，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５，４：４３６−４４２．
【非特許文献５】Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４４８：３１３−３１７．
【非特許文献６】Ｗｅｒｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４４８：３１８−３２４．
【非特許文献７】Ｍａｈｅｒａｌｉら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７，１：５５−７０．
【非特許文献８】Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８，２６：１０１−１０６．
【非特許文献９】Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７，３１８：１９１７−１９２０．
【非特許文献１０】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ  ２００７，１３１：８６１−８７２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、すでにＥＳ細胞から効率的に巨核球及び血小板を取得する方法を確立しているが、ＥＳ細胞を使用した場合には、使用するＥＳ細胞毎に巨核球及び血小板の誘導効率が異なっている。巨核球及び血小板の誘導効率の優れたＥＳ細胞の選定を早期に行うことができれば、巨核球及び血小板の取得効率の安定化、効率の一層の向上を図ることが可能になるが、現状では最終的に巨核球、血小板を得るまで優れたＥＳ細胞を見極めるのが難しかった。
そこで、本発明者らは、上記事情に鑑み、第一にｉＰＳ細胞から巨核球及び血小板を取得する方法を確立することを課題とし、さらには、巨核球及び血小板の取得効率を安定化し得る方法を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今回、発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、ｉＰＳ細胞から巨核球及び血小板の誘導を試み、その誘導方法を確立した。その試みの中でｉＰＳ細胞では、同じロット由来の細胞がヘテロな特徴を有していることを見出し、このヘテロな細胞集団から、早期に効率のよい巨核球及び血小板の誘導し得る細胞を選択することをも試みた。その結果、一定の特徴を示す細胞クローン、例えば、ネット様構造をより多く形成するクローンが巨核球、血小板の誘導効率に優れていることを見出し、当該細胞を選別し、分化誘導を行うことにより、安定的に効率よく巨核球又は血小板の誘導し得ることが可能になった。
すなわち、本発明は、ｉＰＳ細胞から巨核球及び血小板を調製する方法に関し、具体的には、以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「ヒト由来のｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、ＶＥＧＦ存在下、１４〜１７日間培養することである上記（１）に記載のネット様構造物」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記フィーダー細胞がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、又はＯＰ９細胞であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のネット様構造物」である。
（４）本発明の第４の態様は、「上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のネット様構造物の産生能力の高いｉＰＳ細胞クローンを選択し、該ｉＰＳ細胞クローンが産生するネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする上記（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ存在下、７〜９日間培養することである上記（５）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＨｅｐａｒｉｎ存在下、７〜９日間培養することである上記（５）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「上記（５）乃至（７）のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び／又は血小板」である。
（９）本発明の第９の態様は、「上記（５）乃至（７）のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「マウス由来のｉＰＳ細胞を液体培養することで、胚様体の内部に造血前駆細胞を形成させ、該胚様体をさらに培養して、血球細胞を産生する方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする上記（１０）に記載の方法」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「前記胚様体をさらに培養する期間が、５〜７日間である上記（１０）又は（１１）に記載の方法」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「前記胚様体をさらに培養する条件が、ＴＰＯ及びＳＣＦの存在下、３〜５日間培養することである上記（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の方法」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「上記（１０）乃至（１３）のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び／又は血小板」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「上記（１０）乃至（１３）のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤」である。
（１６）本発明の第１６の態様は、「上記（４）乃至（７）及び上記（１０）乃至（１３）のいずれかに記載の方法により血小板を調製するためのキット」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のｉＰＳ細胞（特に、ヒトｉＰＳ細胞）からの巨核球及び血小板の誘導方法を使用することで、ＥＳ細胞を使用した場合よりも、安定的に効率よく巨核球及び血小板を誘導することが可能となる。【０００９】
本発明の方法によれば、輸血等を必要とする患者の遺伝的特徴を保持した、患者専用の血球細胞を調製することができるため、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の適合性の問題を克服することが可能となる。また、臨床現場で問題となっている自己以外のＨＬＡ型血液の混入による抗血小板抗体の産生を回避することができる。【００１０】
また、発明の方法を用いると、生体外において所望の血球を効率的に取得することができる。特に、ヒトに関し、特定個人専用の血小板の産生を、比較的大量かつ効率的に行うことができる。【００１１】
さらに、本発明の方法を用いると、血小板を有効成分とする血液製剤の安定的な供給を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウスｉＰＳ細胞から血小板を誘導する過程を模式的に示した図である。
【図２】マウスｉＰＳ細胞由来の培養１０日目の血小板前駆細胞である巨核球細胞をサイトスピン後、ギムザ染色（Ａ）、及びＡｌｅｘａ  ４８８−ファロイジン、ＤＡＰＩ、抗ＣＤ４１抗体及び抗ＧＰＩｂα抗体による免疫染色（Ａｌｅｘａ６４７による２次染色法）（Ｂ）を行った結果を示す。（Ｂ）のＣＤ４１はＣＤ４１陽性細胞の、ＧＰＩｂαはＧＰＩｂα陽性細胞の染色像であることを示す。
【図３】マウスｉＰＳ細胞由来の培養１４日目の血小板前駆体の位相差顕微鏡像（Ａ）及びＡｌｅｘａ  ４８８−ファロイジン、抗ＣＤ４１抗体及び抗ＧＰＩｂαによる免疫染色（Ｂ）をＡｌｅｘａ６４７により２次染色した結果を示す。（Ｂ）のＣＤ４１／Ｆ−ａｃｔｉｎは抗ＣＤ４１抗体（Ａｌｅｘａ６４７，赤）／Ａｌｅｘａ  ４８８（緑）−ファロイジンによる二重染色の結果を、ＧＰＩｂα／Ｆ−ａｃｔｉｎは抗ＧＰＩｂα抗体（Ａｌｅｘａ６４７，赤）／Ａｌｅｘａ  ４８８（緑）−ファロイジンによる二重染色の結果を示す。
【図４】マウスｉＰＳ細胞から培養１４日目に誘導された血小板の電子顕微鏡像を示す。
【図５】マウスｉＰＳ細胞由来の培養１０日目（上図）及び培養１４日目（下図）の細胞を、フローサイトメーターにより解析した結果を示す。
【図６】トロンビンに対するマウスｉＰＳ細胞由来血小板の形態変化を観察した。培養１４日目の上清を回収し、フィブリノーゲンでコートしディッシュに添加した後、血小板活性刺激薬（トロンビン）を加えて刺激を行った（上図）。トロンビンにより、ｉＰＳ細胞から作製した血小板はきれいに伸展して安定血栓に寄与できうる形態を示した（下図）。結果は、抗αＩＩｂ抗体（Ａｌｅｘａ６４７による２次染色）及びＡｌｅｘａ  ４８８−ファロイジンによる染色像を示した（下図）。
【図７】ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ６株）からＳａｃ構造物を形成させ、さらに、巨核球及び血小板を誘導する過程を示す。上図は、培養の経過を模式的に示し、下の各写真は、培養過程で誘導される、ｉＰＳ−Ｓａｃ、巨核球を示す。下の写真は、左から、培養０日目の未分化状態のｉＰＳ細胞（位相差顕微鏡による観察像）、ｉＰＳ細胞から誘導したｉＰＳ−Ｓａｃ（培養後１７日目の観察像）、巨核球（培養２３〜２４日目、ギムザ染色後の観察像）を各々示す。
【図８】ｉＰＳ−ｓａｃの免疫染色像を示す。  ｉＰＳ−ｓａｃは、ＥＳ−ｓａｃ同様ＣＤ３１陽性、ＶＥＧＦ−Ｒ２陽性の内皮細胞により構成されていた。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞クローン間でのｉＰＳ−ｓａｃの誘導効率を比較した結果を示す。  培養１５日目の血球前駆細胞を含むＳａｃの数（グラフ縦軸）を計測した。同じロット皮膚由来のヒトｉＰＳ細胞株（ＴｋＤＡ３−１、２、４、５、９、２０）でも分化能力に差を認めた。ＴｋＤＡ３−１、２、４、５、９、２０（東京大学で樹立）は同じ皮膚細胞由来の４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）から作成されたヒトｉＰＳ細胞、ＴｋＤＮ４−Ｍ（東京大学で樹立）は皮膚細胞由来の３因子（ｃ−Ｍｙｃ以外）から作成されたヒトｉＰＳ細胞、２０１Ｂ６、２０１Ｂ７（京都大学で樹立）は皮膚細胞由来の４因子から作成されたヒトｉＰＳ細胞、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４（京都大学で樹立）は皮膚細胞由来の３因子から作成されたヒトｉＰＳ細胞である。また、ＫｈＥＳ−３はコントロールとして用いた血球分化能力の高いヒトＥＳ細胞株である。
【図１０】図９に示されるｉＰＳ細胞の中からＳａｃ形成能の異なるクローンを用いて、血小板誘導能を解析した結果を示す。
【図１１】ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来造血前駆細胞の表面抗原解析結果。  ヒトＥＳ細胞（上段）由来血液前駆細胞と分化能力の高いＴｋＤＮ４−Ｍ（３因子；中段）、ＴｋＤＡ３−４（４因子；下段）由来の血液前駆細胞を比較した。未分化な血液／血管内皮の共通マーカーとされるＣＤ３１陽性／ＣＤ３４陽性細胞の頻度や巨核球前駆細胞のマーカーとされるＣＤ３４陽性／ＣＤ４１ａ陽性細胞はＥＳ細胞同様に発現していた。
【図１２】ヒトｉＰＳ細胞由来血球コロニーの解析。  ＴｋＤＮ４−Ｍ（３因子）、ＴｋＤＡ３−４（４因子）由来の血液前駆細胞の血球分化能をメチルセルロース半固形培地に播いて比較した。左図は代表的な各血球系のギムザ染色像である。右図はコロニー形成細胞の頻度を示す（縦軸は、１×１０４血球前駆細胞由来のコロニー数）。ＴｋＤＡ３−４のみ芽球様（左図の右下パネル）コロニーを形成したが、他の血球への分化能は同様であった。
【図１３】培養後１７〜１８日目の培養液中の浮遊細胞成分を、フローサイトメーターで解析した結果を示す。Ｘ軸はＣＤ４１ａ、Ｙ軸はそれぞれＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ９。左からＫｈＥＳ−３（ヒトＥＳ細胞）、２５３Ｇ４（３因子ヒトｉＰＳ細胞）、ＴｋＤＮ４−Ｍ（３因子ヒトｉＰＳ細胞）、ＴｋＤＡ３−４（４因子ヒトｉＰＳ細胞）を示す。成熟巨核球のマーカーとされるＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂはヒトＥＳ細胞由来巨核球と同様に発現していた。
【図１４】ヒトｉＰＳ細胞由来血小板の表面抗原解析結果を示す。  培養２４日目に培養上清中に放出される血小板を、フローサイトメーターを用いて解析した。Ｘ軸はＣＤ４１ａ、Ｙ軸はそれぞれＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ９。左からヒト末梢血血小板、ＫｈＥＳ−３（ヒトＥＳ細胞）由来血小板、２５３Ｇ４（３因子ヒトｉＰＳ細胞）由来血小板、ＴｋＤＮ４−Ｍ（３因子ヒトｉＰＳ細胞）由来血小板、ＴｋＤＡ３−４（４因子ヒトｉＰＳ細胞）由来血小板を示す。血小板の重要な機能分子であるＣＤ４１ａやＣＤ４２ａ、ＣＤ９は末梢血由来血小板同様に発現していた。一方、ＣＤ４２ｂに関してはヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来血小板は一部で発現が低下していた（上段パネル）。
【図１５】巨核球からの血小板放出形態の観察像を示す。培養後１７〜１８日目の浮遊細胞を、Ａｌｅｘａ  ４８８結合抗ＣＤ４１ａ抗体で染色し蛍光顕微鏡により観察した（右図）。左図は、微分干渉法を使用した明視野による観察像である。
【図１６】ヒト末梢血、ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来の血小板とヒトｉＰＳ細胞由来の巨核球の電子顕微鏡像を示す。  ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来の血小板では、様々な血小板の生理活性化物質を含む顆粒や血小板の微小管構造は末梢血と同様に保持していた。
【図１７】ヒトｉＰＳ細胞由来の血小板の機能解析（インサイドアウトシグナル）結果を示す。  上パネル；代表的なＦＡＣＳ像。ヒトｉＰＳ細胞由来血小板（下段）はヒトＥＳ細胞由来血小板（上段）同様、生体内の重要な血小板活性化物質ＡＤＰによりインテグリンの活性化（ＰＡＣ１抗体陽性血小板の増加）を認めた。  下パネル；ヒトＥＳ細胞由来血小板（白い棒グラフ）同様、ヒトｉＰＳ細胞由来血小板（黒い棒グラフ）は低濃度のＡＤＰ（５μＭ）から反応し、用量依存的に反応が増加した。他の活性化物質であるトロンビンへの反応も確認できた。ｎｏ  ａｇｏｎｉｓｔ；ＡＤＰなしの結果。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施形態の１つは、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に播き、造血系細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物（ｓａｃ）である。該ネット様構造物には、造血前駆細胞が濃縮されて存在しているため、各種血球細胞を生体外において効率的に分化誘導することができる。ここで「ネット様構造物」とは、ＥＳ又はｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に血液前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造物の詳細については、例えば、ＴＡＫＡＹＡＭＡら，ＢＬＯＯＤ  ２００８，１１１：５２９８−５３０６、を参照のこと。ここで「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称され、線維芽細胞などの体細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。ここで、分化多能性の獲得に必要な転写因子遺伝子としては、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８などが知られている。これらの遺伝子のうち、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの組合せ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８の組合せ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４の組合せで、選択した遺伝子を線維芽細胞などの体細胞に導入することにより、ｉＰＳ細胞の樹立が可能となる。本発明で使用するｉＰＳ細胞は、その樹立の手法は問わず、上記の遺伝子を導入する手法で樹立された細胞以外にも、上記と異なる遺伝子の導入による樹立方法、タンパク質や低分子化合物などを用いた樹立方法によるｉＰＳ細胞であってもよい。
また、「フィーダー細胞」として、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の分化誘導に寄与する細胞であればいずれも使用可能であり、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞などを用いることができる。「フィーダー細胞」を用いるときには、例えば、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。【００１４】
ｉＰＳ細胞の培養条件としては、ネット様構造物（以下、ｉＰＳ−Ｓａｃとも記載する。）を調製するために適した条件を選択することができる。この培養条件は、用いるｉＰＳ細胞の生物種によって異なる。一例を挙げるならば、ヒト由来のｉＰＳ細胞の場合、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ヒト由来のｉＰＳ細胞からネット様構造物を効率的に形成させるためには、例えば、ＶＥＧＦを、０〜１００ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。また、培養の環境としては、用いるｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、用いるヒトｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、フィーダー細胞上に播いてから、１４〜１７日後くらいにその存在を確認することができる。【００１５】
形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、中胚葉細胞のマーカーの一つであるＦｌｋ１（ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  １）、ＣＤ３１、ＣＤ３４、又はＵＥＡ−Ｉレクチン（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ．ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−１）陽性細胞によって隔壁が構成されている。このネット様構造物の内部には、造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞から各種血球細胞を分化誘導する場合には、隔壁を構成している細胞などから造血前駆細胞を分離する必要がある。この分離は、物理的な手段により行うのが望ましい。例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、隔壁細胞と造血前駆細胞を分離することができる。【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、ネット様構造物から分離した造血前駆細胞から各種血球細胞を産生する方法である。得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、所望の血球細胞の分化誘導に適した条件で培養を行う。ここで「血球細胞の分化誘導に適した条件」とは、目的の血球細胞の種類に応じて、例えば、ＴＰＯ、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、Ｈｅｐａｒｉｎなどのいずれか又はこれらのうちの２つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。巨核球及び血小板を分化誘導する場合には、例えば、ＴＰＯ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、あるいは、ＴＰＯ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）、ＳＣＦ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）及びＨｅｐａｒｉｎ（１０〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２５Ｕ／ｍｌ程度)の存在下で、７〜１５日間程度培養することができる。培養環境としては、生体外で血球細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施する。
また、ｉＰＳ細胞、特にヒト由来のｉＰＳ細胞から巨核球、血小板を産生させる場合、上記ネット様構造物の産生効率がｉＰＳ細胞クローンによって異なるため、ネット様構造物の産生効率の高いｉＰＳ細胞クローンを予め選択し、該ｉＰＳ細胞クローンの産生するネット様構造物から、巨核球や血小板などの各種血球細胞を産生することで、より効率的に多くの血球細胞を調製することができる（図９を参照のこと）。ここで、ネット様構造物の産生効率の「高い」ｉＰＳ細胞クローンとして、ネット様構造物の形成数が、例えば、１×１０５細胞あたり１０以上、好ましくは１５以上のクローンを選択することができる。【００１７】
本発明の他の実施形態は、マウス由来のｉＰＳ細胞から胚様体（分化誘導した中胚葉系未分化細胞を含む細胞集団）を形成させ、さらに巨核球及び血小板を誘導する方法である。マウスＥＳ細胞の場合、ＯＰ９細胞などのフィーダー細胞との共培養を行わなくても胚様体を形成し、中胚葉系未分化細胞へ分化誘導させることが可能である。マウスｉＰＳ細胞の場合にも、マウスＥＳ細胞の場合と同様の条件で中胚葉系未分化細胞を誘導することが可能である。この場合の培養条件としては、例えば、培地としては、用いるｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、ＦＢＳ、ヒトトランスフェリンなどを添加したＩＭＤＭを用い、その他適宜サプリメント等を加えたものを使用することができる。また、培養の環境としては、用いるｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。胚様体が形成されるまでの培養期間は、用いるｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、６〜９日後くらいにその存在を確認することができる。【００１８】
次に、胚様体を血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、巨核球及び血小板を誘導することができる。ここで「血球細胞の分化誘導に適した条件」とは、例えば、ＴＰＯ、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、Ｈｅｐａｒｉｎなどのいずれか又はこれらのうちの２つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。巨核球及び血小板を分化誘導する場合には、例えば、ＴＰＯ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１〜２００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度）、ＩＬ−１１（１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度）などを、単独又は適宜組合せて、適切な時期に培地に添加する。胚様体からの培養後、３〜５日後くらいに巨核球が誘導され、７〜９日後くらいに血小板が誘導される。培養環境としては、生体外で血球細胞の分化誘導を行うにために適した環境であればよいが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施する。【００１９】
さらに、本発明の実施形態には、血小板を調製するためのキットが含まれる。当該キットには、細胞培養のための培地、血清、増殖因子などのサプリメント（例えば、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｈｅｐａｒｉｎ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１など）、抗生物質などが含まれる。その他、例えば、ヒト由来の血小板の調製用に、ネット様構造物に存在するマーカーを確認するための抗体（例えば、Ｆｌｋ１、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＵＥＡ−Ｉレクチンなどに対する抗体）なども含まれる。キット中に含まれる試薬、抗体等は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。【００２０】
血小板は、白血病、骨髄移植、抗ガン剤治療の際の血小板減少の予防又は改善に有効であるため、本発明により得られたヒト血小板を製剤の形態で安定的に供給することも可能である。本発明の方法によって産生される血小板は、巨核球から放出されて血小板が豊富に存在する培養液の画分（例えば、ヒト由来の血小板の場合、ｉＰＳ細胞の培養後２２〜２８日目程度）を回収し、白血球除去フィルター（例えば、テルモ社、旭化成メディカル社などから購入可能）などを使用して巨核球、その他の血液細胞の除外を行うことにより、血小板以外の成分を除去して、調製することができる。血液製剤を調製するにあたっては、血小板が保存に対して不安定であることなどを考慮して、血小板の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。血小板を安定化させる条件は、当該技術分野の専門家において周知の方法を選択することが可能である。より具体的には、取得した血小板（ヒトＥＳ細胞由来洗浄血小板）は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。
ＡＣＤ−Ａ液：ＦＦＰ（ｆｒｅｓｈ  ｆｒｏｚｅｎ  ｐｌａｓｍａ；献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含む）を１：１０の比率で調整し、１５−５０Ｇｙの放射線照射後に２０−２４℃にて振とうしながら保存する。ＡＣＤ−Ａ液；クエン酸ナトリウム２２ｇ／クエン酸８ｇ／ブドウ糖２２ｇを注射用水で全体を１Ｌとするように調整する。
以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、１×１０９血小板／ｍＬ程度が望ましい。
また、ＧＭ６００１（ａ  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸやＧＰＶＩの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスＥＳ細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒ  Ｒｅｓ  ９５：６７７−６８３，２００４及び  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＥＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５：１５３０−１５３７，２００７を参照のこと。
なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。【００２２】
１．マウスｉＰＳ細胞からの巨核球及び血小板の誘導
１−１．マウスストロマ細胞株ＯＰ９細胞の培養
ＯＰ９細胞は１５％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加した、α−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）で継代培養した。培地は一日ごとに交換し、細胞の形質を変化させない為に、初代培養から継代培養数３０回以内の細胞を実験に用いた。【００２３】
１−２．マウスＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞の培養
Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ，４４８，３１３−３１７（２００７））（京都大学、山中伸弥博士より供与を受けた）を、１５％  ＦＢＳ、３００μｇ／ｍＬ  ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．５ｍＭ  モノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）を用いてペトリ皿（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ、米国）で培養した。１０ｃｍペトリ皿に１０ｍＬの培養液に対して２×１０５個の細胞数で培養を開始し、胚様体形成を試みた。【００２４】
１−３．巨核球、血小板の誘導
培養６〜７日目に産生された胚様体は０．２５％  トリプシンで処理した後、コンフルエントなＯＰ９細胞上に、1×１０５個／ウェルとなるように播き直し、２０ｎｇ／ｍｌ  マウス  ＴＰＯ（ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦを添加したαＭＥＭ中で培養を行った（図１）。
培養１０日後には、ＣＤ４１＋ＧＰＩｂα＋の成熟巨核球が誘導され（図２及び図５上図）、さらに、培養を継続した培養１４日後には、ＣＤ４１＋ＧＰＩｂα＋の血小板が誘導された（図３及び図５下図）。このようにして誘導された血小板は、末梢血由来の血小板と同様の形態的特徴を有していた（図４）。【００２５】
ここで得られた血小板の機能について検討を行った。フィブリノーゲンでコートしたディッシュに血小板が放出された培養上清を添加し、トロンビンで刺激を行ったところ（図６上図）、血小板に特徴的な細胞伸展を示した（図６下図）。この結果から、本発明方法により、マウスｉＰＳ細胞から、生体内の血小板と同じ特徴を備えた血小板を誘導できることが明らかとなった。【００２６】
２．ヒトｉＰＳ細胞からの巨核球及び血小板の誘導
２−１．ネット様構造物（ｉＰＳ−Ｓａｃｓ）の調製
本実施例で使用した細胞株、２０１Ｂ６（皮膚細胞にＯｃt３／４，Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２及びｃ−Ｍｙｃを導入したもの、Ｃｅｌｌ，１３１，８６１−８７２（２００７））及び２５３Ｇ１（皮膚細胞にＯｃt３／４，Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２を導入したもの、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．,２６，１０１−１０６（２００８））は、京都大学、山中伸弥博士より供与を受けた。さらに、ＴｋＤＡ３−１、ＴｋＤＡ３−２、ＴｋＤＡ３−４、ＴｋＤＡ３−５、ＴｋＤＡ３−９、ＴｋＤＡ３−２０（東京大学で新しく樹立した株で（皮膚細胞にＯｃｔ３／４，Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２及びｃ−Ｍｙｃを導入したもの）及びＴｋＤＮ４−Ｍ（皮膚細胞にＯｃｔ３／４，Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２を導入したもの；東京大学樹立）を使用した。また、フィーダー細胞は、マウス胎児由来細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株をつくば理研ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｅｒより供与を受けて使用し、又はＯＰ９細胞株を大阪大学医学部、仲野徹教授から供与を受けて使用した。分化実験を行う前日に、０．１％  ゼラチンコート化ディッシュにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を６×１０５／１０ｃｍ  ディッシュの密度となるように播き、分化実験の当日に、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の増殖を止めるため５０Ｇｙの放射線照射を行い、フィーダー細胞として用いた。また、ＯＰ９細胞株をフィーダー細胞として使用する場合には、分化実験の前日に５０Ｇｙの放射線照射を行い、播き直しを行った後に使用した。【００２７】
ヒトｉＰＳ細胞は、１５％  ＦＢＳ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）中、ＯＰ９細胞又はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上に播いて培養した。
培養後、１５〜１７日前後に内部に血球様細胞を含んだネット様構造物が多数確認された（図７、ｉＰＳ−Ｓａｃ）。
ｉＰＳ細胞株クローンは、例えば、４因子を使用して樹立しているにもかかわらず、ヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）な細胞株であることから、同一の皮膚細胞から作成しても分化能力は様々であった。従って、ヒトｉＰＳ細胞の場合、事前のスクリーニング（例えば、より多くのネット様構造物を形成するクローンを選択するなど）により分化に適したクローンを選択することが可能で、より効率的に血球系細胞を分化誘導するクローンを容易に選択することが可能となる（図９参照）。実際に、図９に示されるｉＰＳ細胞の中からＳａｃ形成能の異なるクローンを選択して血小板誘導能を比較した。具体的には、ｉＰＳ細胞（ＴｋＤＡ３−４、ＴｋＤＮ４−Ｍ及び２５３Ｇ１）及びＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）を１×１０５細胞用い、最終的に得られる血小板の数を計測した（図１０）。図１０より、Ｓａｃ形成能の高いｉＰＳ細胞（ＴｋＤＡ３−４、ＴｋＤＮ４−Ｍ）は、血液前駆細胞を多く含むＳａｃを形成しやすく、最終的な血小板数も増えることが示唆された。【００２８】
２−２．コロニーアッセイ
ネット様構造物中の造血前駆細胞の細胞表面分子について調べたところ、未分化な血液／血管内皮の共通マーカーとされるＣＤ３１陽性／ＣＤ３４陽性細胞の頻度がＥＳ細胞と同様であり、巨核球前駆細胞のマーカーとされるＣＤ３４陽性／ＣＤ４１ａ細胞についても、ＥＳ細胞の場合と同様に発現していることが分かった(図１１)。また、コロニー形成能については、ヒトＥＳ細胞と同様であり（図１２）、４因子によるヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＡ３−４では芽球様コロニー（ｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ、図１２）が観察され、ガン化（白血病化）の危険が示唆された。【００２９】
２−３．巨核球／血小板の誘導
次に、Ｐ−１０００  ピペットを用いて、位相差顕微鏡下でネット様構造物をピックアップし、７０μｍ  セルストレイナーを用いて、血球細胞とネット様構造物を分離した。新たに、６ウェルプレートに用意した放射線照射済みのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（６×１０５／６ウェルプレート１枚）上に血球細胞を２〜３×１０４／ウェルで播き、１５％  ＦＢＳ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ及び２５Ｕ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎを添加したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）中でさらに培養し、巨核球／血小板を誘導した（図７、図８及び図１５）。【００３０】
２５３Ｇ１（京都大学株）、２０１Ｂ６（京都大学株）、ＴｋＤＡ３−４（東京大学株）、ＴｋＤＮ４−Ｍ（東京大学株）細胞株の培養後２３〜２４日目の浮遊細胞成分をフローサイトメーターで解析し、細胞表面抗原の特徴を調べたところ、巨核球、血小板特異的な表面分子抗原であるヒトＣＤ４１ａ（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ）及びヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）、ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）、ＣＤ９陽性細胞が観察された（図１３；巨核球、図１４；血小板）。また、巨核球から血小板が放出される際に示される形態的な特徴も確認された（図１５及び図１６）。
次に、血小板活性化物質によるインテグリンの活性化について検討したところ、ヒトｉＰＳ細胞由来血小板(図１７上パネル、下段)は、ヒトＥＳ細胞由来血小板(図１７下パネル、上段)同様、生体内の重要な血小板活性化物質ＡＤＰによりインテグリンの活性化（ＰＡＣ１抗体陽性血小板の増加）を認めた。また、ヒトＥＳ細胞由来血小板（図１７下パネル、白い棒グラフ）同様、ヒトｉＰＳ細胞由来血小板（図１７下パネル、黒い棒グラフ）は低濃度のＡＤＰ（５μＭ）から反応し、用量依存的に反応が増加した。さらに、他の活性化物質であるトロンビンへの反応も確認できた（図１７下パネル、６）。これらの結果から、ｉＰＳ細胞から作製された血小板は、ヒトＥＳ細胞由来血小板と同様に機能性を発揮することが明らかとなった。
以上の結果から、本発明の方法により、ヒトｉＰＳ細胞から巨核球及び血小板を効率的に誘導できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によれば、ＨＬＡ適合性の問題を克服可能な血小板を提供することができる。従って、輸血が必要な患者専用の血小板の供給が可能となることから、抗血小板抗体の産生による血小板の破壊などの問題も解決することができる。
【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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