(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受領番号:FERM ABP-10873として寄託された、ハイブリドーマ。
【請求項２】
受領番号:FERM ABP-10874として寄託された、ハイブリドーマ。
【請求項３】
受領番号:FERM ABP-10875として寄託された、ハイブリドーマ。
【請求項４】
受領番号:FERM ABP-10876として寄託された、ハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリドーマが産生する抗ヒトBMP4抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患の新規予防および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎疾患は、一次的にまたは二次的に腎臓に障害が起こる疾患である。腎疾患に対しては、食事療法、運動療法、薬剤による治療が行われるが、症状の進行によっては透析療法や腎移植が必要となる場合もあり、より有効な治療薬の登場が待たれている。
【０００３】
進行性の糸球体障害の病理的特徴として、メサンギウム細胞の増殖と糸球体硬化が挙げられる。糖尿病性腎症では、発症早期から糸球体基底膜の肥厚および糸球体サイズの軽度増加が認められ、発症後数年でびまん性にメサンギウム基質の拡大が認められる。この現象はIV型、I型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックスの異常増加によると考えられている。また、IgA腎症、アルポート症候群などの腎疾患においても、糸球体メサンギウム細胞による異常マトリックスリモデリング現象が観察され、最終的には糸球体硬化に至る事が知られている。このようにメサンギウム基質の異常増加は、糸球体硬化を伴う疾患と密接に拘わっている。
【０００４】
糖尿病性腎症において、メサンギウム基質タンパク質のひとつIV型コラーゲンの過剰産生のメカニズムについては複数の経路が報告されており、多種の分子が上記過剰産生に関与しているものとみられている。TGF-β（transforming growth factor-β）は、I型受容体であるALK （activin receptor-like kinase）5を介してSmad2およびSmad3を活性化し、α1IV型コラーゲンをはじめとする細胞外マトリックスを過剰産生させる（非特許文献１）。一方、Smad1は、IV型コラーゲンの過剰産生に直接関わっていることが明らかにされた（特許文献１）。Smad1はBMP （Bone Morphogenetic Protein）シグナル伝達系のメンバーであることが知られている。BMPはI型受容体であるALK2,3,6を介してSmad1を活性化し、標的遺伝子転写を調節する（非特許文献2）。またSmad1の他に、Smad5およびSmad8もBMPシグナルに関与する。一方、Smad1は、内皮細胞および造血細胞等において、ALK1を介してTGF-βシグナルを伝達し、標的遺伝子の転写調節に関与する（非特許文献3）。
【０００５】
メサンギウム基質過剰産生の抑制は、糖尿病性腎症を始めとする腎疾患の改善につながるものと考えられる。しかしながら、上記のとおり、IV型コラーゲンをはじめとするメサンギウム基質過剰産生のメカニズムは複雑であり、どのメンバーの組み合わせによる経路が、メサンギウム基質過剰産生に寄与しているのかについては、これまで全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2005/026344
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Li JH. et al., Kidney International, 63, 2003, 2010-2019
【非特許文献２】Zwijsen A. et al., FEBS Letters 546, 2003, 133-139
【非特許文献３】Goumans MJ. et al., EMBO J., 2002, Apr 2, 21(7), 1743-53
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、腎疾患の新規治療薬の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意努力した。本発明者らは、メサンギウム基質異常増殖に関与する物質の中からBMPに着目し、BMPシグナルの遮断が、メサンギウム基質産生に与える影響を検討した。具体的には、ヒトBMP存在下で培養したヒトメサンギウム不死化細胞株に抗ヒトBMP抗体を投与し、該細胞株によって産生されたメサンギウム基質のひとつであるIV型コラーゲン産生量をELISA法によって測定した。その結果、抗ヒトBMP抗体は、メサンギウム細胞によるIV型コラーゲン産生量を著しく抑制した。IV型コラーゲンをはじめとするメサンギウム基質異常増殖には、複数のシグナル伝達経路が関与しているため、そのうちの一つのみを遮断したとしてもメサンギウム基質異常増殖を実際に抑制できるかどうかは全く予想できないことであったが、本発明者らによって、抗BMP抗体によってBMPシグナル伝達を遮断することがメサンギウム基質の異常増殖抑制に著しく効果的であることが初めて明らかになった。したがって、抗BMP抗体はメサンギウム基質の異常増殖に起因する疾病の予防および治療のための新規医薬品となりうる。すなわち本発明は抗BMP抗体の利用に関し、具体的には以下の発明を提供するものである。
【００１０】
（１）BMPに対する中和活性を有する抗体またはその断片を有効成分として含有する、腎疾患の予防および／または治療剤、
（２）BMPがヒトBMPである、上記（１）に記載の予防および／または治療剤、
（３）BMPがBMP2またはBMP4である、上記（１）または（２）に記載の予防および／または治療剤、
（４）抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の予防および／または治療剤、
（５）抗体が組換え抗体である、上記（１）から（４）のいずれかに記載の予防および／または治療剤、
（６）組換え抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、上記（５）に記載の予防および／または治療剤、
（７）腎疾患が、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、ループス性腎炎、間質性腎炎および腎硬化症（良性、悪性）からなる群から選ばれるいずれか1以上の疾患である、上記（１）から（６）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
（８）抗体が、受領番号:FERM ABP-10873として寄託されたハイブリドーマが産生する抗体、受領番号:FERM ABP-10874として寄託されたハイブリドーマが産生する抗体、受領番号:FERM ABP-10875として寄託されたハイブリドーマが産生する抗体、および受領番号:FERM ABP-10876として寄託されたハイブリドーマが産生する抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上の抗体である、請求項１から４および７のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
（９）受領番号:FERM ABP-10873として寄託された、ハイブリドーマ。
（１０）受領番号:FERM ABP-10874として寄託された、ハイブリドーマ。
（１１）受領番号:FERM ABP-10875として寄託された、ハイブリドーマ。
（１２）受領番号:FERM ABP-10876として寄託された、ハイブリドーマ。
（１３）請求項９から１２のいずれかに記載のハイブリドーマが産生する抗ヒトBMP4抗体。
（１４）BMPに対する中和活性を有する抗体またはその断片を投与することを特徴とする、腎疾患の予防および／または治療方法。
（１５）腎疾患の予防および／または治療用医薬品の製造のための、BMPに対する中和活性を有する抗体またはその断片の利用。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗ヒトBMP抗体がメサンギウム細胞におけるIV型コラーゲン産生を抑制することを示す図である。BMP2またはBMP4で刺激したヒトメサンギウム細胞株に抗ヒトBMP抗体を投与すると、該細胞株のIV型コラーゲン産生量はBMP刺激がない場合とほぼ同様のレベルまで抑制された。
【図２】抗ヒトBMP抗体の腎疾患に対する薬効を示すグラフである。ハイブリドーマBF1009が産生する抗体およびハイブリドーマBF1066が産生する抗体を慢性糸球体腎炎モデルラットに投与すると、尿中アルブミン排泄量が低下する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、BMPに対する中和活性を有する抗体またはその断片を有効成分として含有する、腎疾患の予防および／または治療剤に関する。本発明者らは、抗BMP2/4抗体がメサンギウム細胞におけるメサンギウム基質の産生を顕著に抑制することを見出した。
【００１３】
BMPは、TGF-β、アクチビン、インヒビン、ミュラー管抑制因子等によって形成されるTGF-βスーパーファミリーのメンバーである。当初は骨形成を誘導するタンパク質として発見されたが、その後、発生期における四肢の発生や、神経系の分化に関与していることが明らかにされている。また近年では、BMPが後腎の発生の調節に関わるとの報告もされている。現在では、20種類近くのBMPアイソフォームが報告されており、BMPファミリーメンバーとして、BMP-6、BMP-5、BMP-7/OP-1、BMP-8b/OP-3、BMP-8a/OP-3、60A、DPP、BMP-2、BMP-4、GDF-5/CDMP-1、GDF-6/CDMP-2/BMP-13、GDF-7/CDMP-3/BMP-12、GDF-1、GDF-3、BMP-9、BMP-3、GDF-10が知られている。
【００１４】
BMP-2および4は、他のTGF-βスーパーファミリーメンバーと同様、前駆体タンパク質として合成された後、保存された7個のシステインを含むC末端側が切断され、分子量約30kDaの糖タンパク質がジスルフィド結合によって二量体を形成した構造をとる。BMP-2と4は、BMPファミリーの中でも、構造的により類似した関係にある。BMP-2,4の配列はいずれも公知であり、GenBankにおいて、ヒトBMP-2はAccession No.：M22489、ヒトBMP-4はAccession No.：M22490、マウスBMP-2はAccession No.：NM_007553、マウスBMP-4はAccession No.：NM_007554として配列が開示されている。ラットBMP-4のAccession No.はNM_012827である。なお、ラットBMP-4とマウスBMP-4のアミノ酸配列は同一である。また、切断されたC末端側において、ヒトBMP-4とラットBMP-4では、116アミノ酸のうち2アミノ酸が異なるのみである。
【００１５】
BMPは、BMP受容体を介してシグナルを伝達する。BMPと結合するBMP受容体（BMPR）には、I型とII型の存在が知られており、これまでに哺乳類では、I型BMPRとして、ALK-3（BMPR-IA）、ALK-6（BMPR-IB）、ALK-2（ActR-I）の3種類、II型受容体として、BMPR-II、ActR-II、ActR-IIBの3種類の存在が報告されている。I型受容体およびII型受容体のいずれも膜貫通領域を一つ有するセリン／スレオニンキナーゼ型受容体である。I型受容体は、膜貫通領域の直下にGSドメインと呼ばれる、グリシンとセリンが繰り返してみられる特徴的なアミノ酸配列を有するが、II型受容体にはGSドメインは見られない。BMPのBMP受容体を介したシグナルは、SmadやMAPKを活性化することが知られている。BMPとBMP受容体との結合を妨げてBMP受容体活性化を抑制することにより、BMPシグナル伝達を妨げる物質が報告されている。このようなBMPアンタゴニストの例として、noggin、chordin、follistatinが同定されており、さらに、DAN、cerberus、sclerostin、ectodinといったCANファミリーがBMPアンタゴニスト活性を有することが報告されている。
【００１６】
本発明におけるBMPは、BMP受容体を介してメサンギウム基質の過剰発現を促進可能な限りどのBMPでもよく、特に種類を問わないが、好ましくはBMP2、BMP4である。またBMPの由来動物についても特に問わない。例えば、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、ラット等）、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、イヌ、ネコ、チンパンジー、オランウータン、ヒト等の由来でありうる。好ましくはヒト由来である。ヒトBMP2のアミノ酸配列を配列番号：1に、ヒトBMP-4のアミノ酸配列を配列番号：2に示す。
【００１７】
本発明において「BMPに対する中和活性を有する抗体」とは、BMPに結合することにより、そのレセプターを介した細胞内シグナル伝達を遮断し、細胞の生理的活性を喪失させるまたは抑制する抗体を意味する。ここで生理的活性としては、例えば、生理活性物質（例えば、ケモカイン、炎症性サイトカインなど）の産生誘導活性、産生抑制活性、分泌促進活性、分泌抑制活性、増殖活性、増殖誘導活性、生存活性、分化活性、分化誘導活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。本発明の「BMPに対する中和活性を有する抗体」は、本発明のBMPのいずれかに中和活性を有する限り、複数種のBMPを認識してもよく、または複数種のBMPに対し中和活性を有してもよい。例えば、ヒトBMP4とラットBMP4の双方に結合してもよい。本発明における「BMPに対する中和活性を有する抗体」はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましい態様としてはモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１８】
BMPに対する中和活性を有するモノクローナル抗体は、たとえば、ヒトやマウス等の哺乳動物に由来するBMPまたはその断片ペプチドを免疫原として、公知方法によって抗BMPモノクローナル抗体を調製した後、得られた抗BMPモノクローナル抗体の中からBMP中和活性を有する抗体を選別することにより、得ることが出来る。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫する。得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって、抗BMPモノクローナル抗体を作製することが可能である。免疫される動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物を用いることができる。抗原の調製は、公知BMP遺伝子配列を用い、公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（WO98/46777など）等に準じて行うことができる。または、市販の抗BMPモノクローナル抗体の中からBMP中和活性の有無を検出して選抜することにより、調製してもよい。
【００１９】
ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行ってもよい。
【００２０】
本発明のBMPに対する中和活性を有する抗体の好ましい態様として、ヒトBMPに対する中和活性を有するモノクローナル抗体が挙げられる。本発明者らは、実施例に示すとおり、ヒトBMPに対する中和活性を有するモノクローナル抗体を、具体的に見出した。ヒトBMPに対する中和活性を有するモノクローナル抗体は、市販の抗ヒトBMPモノクローナル抗体であってもよく、上述した方法によって調製された抗体であってもよい。
【００２１】
ヒトBMPに対する中和活性を有するモノクローナル抗体を作製するための免疫原としては、ヒトBMPに対する中和活性を有する抗体を作製できる限り、特に限定されない。例えばヒトBMPには複数のアイソフォームの存在が知られるが、ヒトBMPに対する中和活性を有する抗体を作製できる限り、いずれのアイソフォームを免疫原としてもよく、または、ヒトBMPの断片ペプチドや、ヒトBMP配列に人為的な変異を加えたものを免疫原としてもよい。ヒトBMP2およびBMP4は、本発明のBMPに対する中和活性を有する抗体を作製するうえで、好ましい免疫原の一つである。
【００２２】
このような抗体の具体例として、ハイブリドーマBF1009が産生するモノクローナル抗ヒトBMP抗体およびハイブリドーマBF1066が産生するモノクローナル抗ヒトBMP抗体を挙げることができる。ハイブリドーマBF1009およびBF1066は、実施例にて後述するように、本願発明者等によってヒトBMP4をマウスに投与して調製された。また、ハイブリドーマBF1009およびBF1066が産生する抗体は、腎疾患モデル動物の尿中アルブミン排泄量を低下させ、腎疾患改善効果を有することが確認された。ハイブリドーマBF1009が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、H鎖はIgG2b、L鎖はκである。また、ハイブリドーマBF1066が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、H鎖はIgG1、L鎖はκである。
【００２３】
ハイブリドーマBF1009は、2007年7月18日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する情報を記載する。
（i) 寄託機関の名称および住所
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６  郵便番号305-8566
（ii) 寄託日：平成１９年（２００７年）７月１８日
（iii) 寄託者が付した識別のための表示：BF1009-1
（iv) 受領番号：FERM ABP-10873
【００２４】
ハイブリドーマBF1009は、2007年7月18日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する情報を記載する。
（i) 寄託機関の名称および住所
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６  郵便番号305-8566
（ii) 寄託日：平成１９年（２００７年）７月１８日
（iii) 寄託者が付した識別のための表示：BF1009-2
（iv) 受領番号：FERM ABP-10874
【００２５】
ハイブリドーマBF1066は、2007年7月18日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する情報を記載する。
（i) 寄託機関の名称および住所
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６  郵便番号305-8566
（ii) 寄託日：平成１９年（２００７年）７月１８日
（iii) 寄託者が付した識別のための表示：BF1066-1
（iv) 受領番号：FERM ABP-10875
【００２６】
ハイブリドーマBF1066は、2007年7月18日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する情報を記載する。
（i) 寄託機関の名称および住所
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６  郵便番号305-8566
（ii) 寄託日：平成１９年（２００７年）７月１８日
（iii) 寄託者が付した識別のための表示：BF1066-2
（iv) 受領番号：FERM ABP-10876
【００２７】
ここで、本発明の上記抗体は、BMPに対する中和活性を有するものであれば特に限定されず、キメラ（chimeric）抗体、ヒト化（humanized）抗体、ヒト抗体などの組換え抗体も含まれる。キメラ抗体とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体である。キメラ抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。例えば、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入することによって行うことが可能である（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、ハイブリドーマ（例えば、本発明のハイブリドーマBF1009、BF1066）のmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望のヒト抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、ヒト抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、キメラ抗体を発現させることができる。
【００２８】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAを、ヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００２９】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
【００３０】
さらに、ヒト抗体ファージライブラリーを用いて、パニング法によりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388などを参考にすることができる。
【００３１】
重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、BMPに対する中和活性を有する限り、BMPに対する中和活性が確認された抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されており、BMPに対する中和活性を有する重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and  Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）などを用いて、BMPに対する中和活性を有する抗体（例えば、本発明のハイブリドーマBF1009、BF1066が産生する抗体）の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、BMPに対する中和活性を有する抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域と機能的に同等な変異体を調製することができる。このように、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域において、1もしくは複数のアミノ酸が変異しており、BMPに対する中和活性を有する重鎖可変領域又は軽鎖可変領域もまた本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に含まれる。
【００３２】
アミノ酸残基を改変する場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662-6； Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13）。このような変異体は、本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、そして、最も好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となった重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。アミノ酸配列の同一性は、上述の方法により決定することができる。
【００３３】
また、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されており、BMPに対する中和活性を有する重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、該重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸から得ることも可能である。重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を単離するための、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSC、37℃の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSC、42℃の条件を用いれば、より相同性の高い核酸の単離を期待することができる。単離した核酸の配列の決定は、後述の公知の方法によって行うことが可能である。単離された核酸の相同性は、塩基配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。
【００３４】
上記ハイブリダイゼーション技術を利用する方法にかえて、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用して、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を単離することも可能である。
【００３５】
塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10）。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（NCBI (National Center for Biotechnology Information) の BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) のウェブサイトを参照；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００３６】
また本発明における抗体は、低分子化抗体であってもよい。本発明の低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、BMPへの中和活性を有する限り特に限定されない。本発明の低分子化抗体は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましく、特に好ましくはVHとVLの両方を含む低分子化抗体である。
【００３７】
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
【００３８】
本発明における低分子化抗体の一つとして、scFv抗体を挙げることができる。scFv抗体は、重鎖可変領域（［VH］）及び軽鎖可変領域（［VL］）をリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 及び Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))。結合される重鎖可変領域と軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［VH］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VH］
【００３９】
重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
【００４０】
本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。
【００４１】
本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
【００４２】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：16）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：17）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：18）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：19）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：20）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：21）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：22）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：23）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n（配列番号：24）
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n（配列番号：25）
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。
【００４３】
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
【００４４】
本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
【００４５】
本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。
【００４６】
本発明のscFvは当業者に公知の方法により作製することができる。例えば、BMPを認識する抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可能である。具体的には、BMPを認識する抗体の配列を基にscFvをコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００４７】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【００４８】
また、ベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００４９】
大腸菌以外にも、例えば、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００５０】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００５１】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００５２】
これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
【００５３】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
【００５４】
また本発明は、上記本発明の抗体の断片及び／又はその修飾物を有効成分として含有する、腎疾患の予防または治療剤を提供する。本発明の抗体の断片及び／又はその修飾物は、本発明の抗体（全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)、組換え抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等）、低分子化抗体（例えばscFv抗体等））の一部が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は／及び軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、VH又は/及びVLの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等を挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００５５】
また本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US5057313、US5156840）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【００５６】
抗体のBMPに対する結合活性の測定は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【００５７】
本発明のBMPに対する中和活性を有する抗体を調製するには、上記のように調製した抗BMP抗体の中から、BMP中和活性を有する抗体を選別する。BMP中和活性を有する抗体の選別は、例えば、実施例において後述するように、メサンギウム細胞または細胞株に候補の抗体を添加したときの、該細胞株によるIV型コラーゲン産生量を測定することにより、該抗体がBMP中和活性を有する抗体であるか判定することができる。上記方法においてメサンギウム細胞または細胞株のIV型コラーゲン産生量を抑制する抗体は、BMPに対する中和活性を有する抗体であると考えられる。
【００５８】
不死化ヒトメサンギウム細胞株は、例えば、次のようにして調製することができる。
【００５９】
ヒトメサンギウム細胞の培養
初代ヒトメサンギウム細胞（MC）（Cambrex社（Walkersville, MD）から入手可能）
を37℃にて95％空気と5％の二酸化炭素ガスの環境下、MsGM増殖培地（Cambrex）中で培養する。
【００６０】
組換えレンチウイルスの調製
293FT細胞をInvitrogen社（Carlsbad, CA）より入手し、10%のウシ胎児血清（HyClone社, Logan, UT以下、FBS）、1%の非必須アミノ酸溶液及び1%のペニシリンとストレプトマイシン溶液（100 U/ml and 100 μg/mL）を加えたダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium、以下DMEM）にて培養する。細胞培養の全製品は特に記載がなければInvitrogen社（Grand Island, NY）より入手できる。
【００６１】
組換えレンチウイルスはViraPower Lentiviral Expression System（Invitrogen社, Carlsbad, CA）を製造者の使用説明書に従って用いて調製できる。全長のSV40T抗原（SV40 TAg; Genbank NC_001669, 配列番号:3, 塩基番号の2691-5163番）を、293FT細胞のゲノムDNAから、センスプライマーとして5'-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATC（配列番号:4）を、アンチセンスプライマーとして5'-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTG（配列番号:5）を用いてPCRにより増幅し、pLenti6/V5-D TOPOベクターへ挿入し、pLenti6-Tagを調製する。コザックモチーフを使用説明書に従い設計する。次にtsA58点変異を、PCR突然変異法を用いて挿入する。最初にpLenti6-TAgから5'-AAGCGGGTTGATAGCCTACA（センスA；配列番号:6）と5'- ATTCAAGCAAAACAGCTGCTAATG（アンチセンスA；配列番号:7）とのプライマーの組み合わせにより、そして5'-CATTAGCAGCTGTTTTGCTTGAAT（センスB；配列番号:8）と5'-TTACAAATCTGGCCTGCAGT（アンチセンスB；配列番号:9）とのプライマーの組み合わせにより二つの断片を増幅する。次に該二断片をアニールし、センスＡプライマーとアンチセンスＢプライマーを用いて再増幅する。得られた点変異が導入された断片をHpaIとPstIにより消化し、pLenti6-TAgの同一サイトに再構成して、温度感受性のTAgプラスミド（pLenti6-tsTAg）を得る。
【００６２】
全長ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム１（hTERT; Genbank NM_003219；配列番号:10）を、結腸癌細胞株の全RNAよりPCRにより増幅する。第一鎖DNAをhTERTの3'非コードプライマーである5'-TGACAGGGCTGCTGGTGTCTG（配列番号:11）とReverTra Ace逆転写システム（TOYOBO社, Osaka）を用いて合成する。hTERTのアミノ末端側の半分のcDNA（NM_003219の1-2304番目）を 5'-CACCATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGA（センスプライマー；配列番号:12）と5'-GCCTTCTGGACCACGGCATACCGA（アンチセンスプライマー；配列番号:13）とを用いて、カルボキシル末端側の半分のcDNA（NM_003219の1977-3399番目）を5'-CACCGGCACTGTTCAGCGTGCTCAACTACGAG（センスプライマー；配列番号:14）と5'-TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTC （アンチセンスプライマー；配列番号:15）とを用いて、それぞれ増幅する。各cDNAをpLenti6/V5-D TOPOベクターにライゲートする。コザック配列を使用説明書に従い導入する。 次に、ベクター中のSpeIとアミノ末端側の半分由来のEcoRVサイト間の断片をカルボキシル末端側の半分由来の同じサイト中に再クローニングして全長hTERTプラスミドを得る（pLenti6-hTERT）。
【００６３】
次にpLenti6-tsTAg又は pLenti6-hTERTを、ほぼコンフレントな293FT細胞にヘルパープラスミド（pLP1、pLP2そしてpLP/VSVG）と共にトランスフェクトし、それぞれtsTAg（LtV-tsTAg）又はhTERT（LtV-hTERT）をコードするレンチウイルスを生成する。37℃において二日間のインキュベーションの後、レンチウイルスを生成する293FT細胞の馴化培地を回収し、4℃にて15分間3000rpmにて遠心分画する。上清を試験管に分画して使用するまで-80℃にて保存する。各レンチウイルスの希釈試料をHT1080繊維芽細胞に感染させて、ブラストシジン（10 μg/mL）耐性コロニー数を計測することにより、各ウイルスの収量（TU:形質導入単位/mL）を決定することができる。
【００６４】
ヒトメサンギウム細胞の不死化
不死化のために0.5-1.0 x 105個の初代ヒトメサンギウム細胞を6穴プレートにて終夜培養し、第2継代の段階で3 x 104 TUのLtV-tsTAgとなるよう調節した6 μg/mlのポリブレン(Sigma社, St Louis, MO) を含む1 mLウイルス上清に感染させる。培養液に32℃にて2 μg/mLのブラストシジンを添加することにより、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択する。次に限界希釈クローン化を行い、単クローン細胞株を取得する。11から13継代時にLtV-hTERT（1 x 104 TU）を用いて更に感染させ、限界希釈クローニングを再び行い、拡大培養したクローンを保存する。これらの細胞株は、5%のFBS、2 mMのグルタミン、1%のペニシリン、ストレプトマイシン及び2 μg/mLブラストシジンを添加したMCDB-131培地中、32℃、95％空気と5%二酸化炭素中で維持する。
【００６５】
不死化ヒトメサンギウム細胞の選択
上記のようにして得られたクローンから、(a) tsTAg発現の32℃から37℃への温度シフトにおける制御、(b) 32℃及び37℃におけるマーカータンパク質の発現、及び(c) TGF-βに応答して培養液中でのPAI-1又はCOL4の発現を指標として不死化ヒトメサンギウム細胞を選択することができる。以下に、その具体的方法を示す。
【００６６】
（１）TGF-βに対する応答とマーカータンパク質のウエスタンブロッティングによる検出
不死化したメサンギウム細胞は32℃にて培養し、次に37℃にて6日間培養して、分化誘
導する。刺激試験では、該細胞を0.5% FBSを含有する培地で血清飢餓下、24時間後に32℃又は37℃にて各実施例で示す量のTGF-β（R&D Systems社, Minneapolis, MN）を加え、培養する。メサンギウム細胞を1 mMのフェニルメタンスルフォニル・フルオライド（Cell Signaling社, Beverly, MA、以下PMSF）を含む1倍濃度の溶解バッファー（Cell Signaling社, Beverly, MA）にて氷上溶解し、全タンパク質を抽出する。培養皿より溶解物を剥離し、超音波破砕機を用いて（アウトプット１、TOMY社, Tokyo）5秒間超音波処理する。超音波処理物を4℃にて15000rpmで10分間遠心処理を施して、上清中のタンパク質含量をブラッドフォードタンパク質アッセイ（Bio-Rad社, Hercules, CA, USA）を用いて測定する。2-メルカプトエタノールを含有するLDSサンプルバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）（以下、LDS-2ME）中でタンパク質還元処理後、標品は使用するまで-80℃にて保存する。細胞培養培地も同バッファーを加え-80℃にて保存する。
【００６７】
電気泳動前に標品を70℃にて10分間インキュベートする。次に、同量の全タンパク量を含む細胞溶解液又は同量の培養液を4-12% NuPAGE Bis-Trisゲル（Invitrogen社, Carlsbad, CA）にロードして、NuPAGE MOPS-SDS running buffer（Invitrogen社, Carlsbad, CA）を用いて電気泳動を行う。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド（以下、PVDF）膜（Immobilon-P; Millipore社, Bedford, MA）に転写した後に、0.1％トゥイーン20を含有するトリス緩衝生理食塩水（以下、TBS-T）中、5％無脂肪ドライミルクにて冷室にて終夜ブロッキングする。次に該調製膜を抗PAI-1一次抗体（1:1000希釈、マウスモノクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）、抗COL4一次抗体（1:5000希釈、ウサギポリクローナル、abcam社, Cambridge, UK）、抗FN一次抗体（1:3000希釈、マウスモノクローナル、Sigma社, St. Louis, MO）、抗SV40 TAg 一次抗体（1:2000希釈、ウサギポリクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）、hTERT（1:1000希釈、ヤギポリクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）又は抗β−アクチン一次抗体（1:3000希釈、ヤギポリクローナル、Santa Cruz社, Santa Cruz, CA）と室温にて1時間、TBS-T中でインキュベートする。膜をTBS-Tにて3回洗浄し、更にワサビペルオキシダーゼ（以下、HRP-）をコンジュゲートした、抗マウス二次抗体、抗ウサギ二次抗体（1:10000希釈、Amersham Bioscience社, Little Chalfont Buckinghamshire, UK）又は抗ヤギ二次抗体（1:10000希釈、Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA）の何れかとともにTBS-T中で室温にて1時間インキュベートする。次に膜を洗浄して、高感度化学発光ECLプラスシステム（Amersham Bioscience社, Little Chalfont Buckinghamshire, UK）とLumiImager（Roche Diagnostics社, Penzberg, Germany）を用いて可視化する。これにより、上記のとおり調製したヒトメサンギウム細胞がT抗原およびhTERTを発現するかどうか、またメサンギウム細胞の分化型形質を示すかどうかについて、確認することができる。
【００６８】
（２）マーカータンパク質の免疫染色
上述のウエスタンブロッティングの結果を、更に別の試験法である免疫染色により確認することもできる。メサンギウム細胞株、HuVEC細胞及びHepG2細胞を96穴又は24穴細胞培養プレートで培養して、免疫蛍光染色により調べる。不死化メサンギウム細胞株は32℃にて培養し、37℃で6日間培養することにより分化誘導する。HepG2細胞とHuVECはAmerican Type Culture Collection (ATCC)から得ることができ、それぞれ、10%のFBSと1%のペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM培地、及び, 10%のFBS、50 μg/mLのヘパリン（Sigma社, St Louis, MO）と30 μg/mLの内皮細胞成長添加物（endothelial cells growth supplement）（BD Bioscience社, Bedford MA、以下ECGS）を添加したRPMI 1640培地にて培養する。HepG2細胞とHuVECは37℃にて、95％空気5％二酸化炭素中で培養する。培養後、細胞を-20℃にて１０分間、メタノールアセトン（4:1）で固定する。リン酸緩衝生理食塩水（以下、PBS）にて洗浄後、細胞を4℃にて10%FBSを含有するPBSでブロッキングする。固定させた細胞をウサギ抗COL4抗体（1:500希釈、abcam社, Cambridge, MA）、マウス抗FN抗体（1:500希釈, Sigma社, St. Louis, MO）、マウス抗α平滑筋アクチン（以下、αSMA）抗体（1:500希釈, Dako社, Glostrup, Denmark）、ウサギ抗フォンビルブラント因子抗体（1:500希釈, Dako社, Glostrup, Denmark）、マウス抗サイトケラチン18抗体（1:200希釈, Chemicon社, Temecula, CA）あるいはマウス抗サイトケラチン19抗体（1:200希釈, Chemicon社, Temecula, CA）のいずれかを含有する、10%FBSを含むPBSにてインキュベートする。PBSで洗浄後、細胞をAlexa 488ラベルした抗ウサギ二次抗体（1:500希釈, Molecular Probes社, Eugene, OR）又はCy3ラベルした抗マウス二次抗体（1:500希釈, Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡BZ-8000（Keyence社, Osaka）を使用して各マーカーの発現を調べる。これらの検討結果に基づき、メサンギウム細胞の形質を保持したクローンを得ることができる。このようにして調製されたクローンは、初代メサンギウム細胞株と同等の生育速度を示し、かつ長期にわたり連続して培養することが可能である。
【００６９】
本発明のBMPに対する中和活性を有する抗体は、腎疾患の予防または治療剤に用いることが出来る。本発明者らは、BMPに対する中和抗体をメサンギウム細胞に投与し、メサンギウム基質のひとつIV型コラーゲン産生が抑制されることを実証した。メサンギウム基質の過剰産生は、糖尿病性腎症を始めとする糸球体硬化を伴う腎疾患に深く関与していることが知られている。したがって、BMP中和抗体を投与することにより、腎疾患を予防または治療することが可能になると考えられ、すなわち、ヒトBMPに対する中和抗体は、メサンギウム基質の過剰産生抑制を通じて各種腎疾患の予防および治療に有効であると考えられる。
【００７０】
本発明において腎疾患とは、一次的または二次的に腎臓に障害が起こる疾患である。腎疾患に含まれる各種腎疾患のうち、糸球体腎炎としては、巣状分節状糸球体硬化症、びまん性糸球体腎炎（膜性腎炎、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎）が含まれ、他の疾患に伴う糸球体疾患として、ループス性腎炎、IgA腎症、紫斑病性腎炎、グッドパスチャー症候群、血栓性微小血管症、腎硬化症（良性、悪性）、強皮症腎、糖尿病性腎症、アミロイド腎症、アルポート症候群、HIV関連腎症、間質性腎炎などの疾患が含まれる。
また、本発明のBMPに対する中和活性を有する抗体を適用する疾患の好ましい例としては、糸球体腎炎、ループス性腎炎、IgA腎症、紫斑病性腎炎、グッドパスチャー症候群、HIV関連腎症、腎硬化症（良性、悪性）、糖尿病性腎症、間質性腎炎、特に好ましい例としては、糸球体腎炎、ループス性腎炎、IgA腎症、腎硬化症（良性、悪性）、糖尿病性腎症が挙げられる。しかし本発明の腎疾患は、上記疾患のみに制限されるものではなく、上記定義を満たすあらゆる疾患が含まれる。
【００７１】
本発明の腎疾患の予防または治療剤は、上述のBMPに対する中和活性を有する抗体を有効成分として含有することを特徴とする。BMPに対する中和活性を有する抗体を「有効成分として含有する」とは、BMPに対する中和活性を有する抗体を活性成分の少なくとも１つとして含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明の腎疾患の予防または治療剤は、BMPに対する中和活性を有する抗体と合わせて腎疾患の予防または治療を促進する他の成分を含有してもよい。
【００７２】
本発明のBMPに対する中和活性を有する抗体は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。さらに、必要に応じ、医薬的に許容される担体及び/または添加物を供に含んでもよい。例えば、界面活性剤（PEG、Tween等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（EDTA等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含むことができる。しかしながら、本発明の腎疾患の予防または治療剤は、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜含んでいてもよい。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等の蛋白質、並びに、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、BMPに対する中和活性を有する抗体を、例えば、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液に溶解する。補助薬としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、HCO-50）等と併用してもよい。
【００７３】
また、必要に応じBMPに対する中和活性を有する抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、BMPに対する中和活性を有する抗体に適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers(1983)22:547-56;EP第133,988号）。
【００７４】
本発明の腎疾患の予防または治療剤は、経口または非経口のいずれでも投与可能であるが、好ましくは非経口投与される。具体的には、注射及び点滴により患者に投与される。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、1回につき体重1kgあたり活性成分が0.0001 mg〜100 mgの範囲で選ぶことが可能である。または、例えば、ヒト患者に投与する場合、患者あたり活性成分が0.001〜10000 mg/bodyの範囲を選ぶことができ、1回当たり投与量としては、例えば、BMPに対する中和活性を有する抗体が0.01〜2000 mg/body程度の量が含まれることが好ましい。しかしながら、本発明の腎疾患の予防または治療剤は、これらの投与量に制限されるものではない。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００７６】
［実施例１］BMP2,4によるヒトメサンギウム細胞のIV型コラーゲン産生アッセイ
１．細胞培養
本アッセイでは、ヒトメサンギウム細胞株：クローン#130hT-9を使用した。この細胞株（#130hT-9）は、別途特許出願済（特願2006-064802、出願日2006年3月9日）であり、FERM BP-10478としてブダペスト条約に従い細胞寄託されている。
細胞は、5% Fetal Bovine Serum(FBS)(GIBCO社製), 10 mM L-グルタミン(L-Gln、SIGMA社製）、１％ 容量Antibiotic-Antimycotic (AA) (GIBCO社製)を含むMCDB131培地（GIBCO社製）中で、33℃、5% CO2の条件で培養した。
アッセイは、培地を0.5% FBS, 10 mM L-Gln, AA, 100 μg/ml アスコルビン酸（和光純薬社製）を含むMCDB131に交換し、細胞を24 hr低血清状態にしてから行った。
【００７７】
２．BMP処理
12-well plate(costar)に1×10４cells/cm2となるように細胞を播種し33℃でインキュベートし、細胞が定着したのを確認した後、38℃のインキュベータ内に24 hr、低血清状態で静置した。その後、50 ng/mL Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2(BMP-2)あるいはRecombinant Human Bone Morphogenetic Protein 4(BMP-4) (R&D社製)と1μg/mL のmouse 抗human BMP-2/4抗体(R&D社製、cat# MAB3552)含む低血清培地と交換し、72 hr培養後、上清（CM）を回収した。
【００７８】
３． IV型コラーゲン(ColIV) ELISA
96-well clear plate, high bond(Nunc社製, MaxiSorp)の各ウェルにCoating Buffer (PIERCE社製) を用いて5 μg/mlに希釈したrabbit anti-ColIV polyclonal 抗体(Rockland社製)を100μLずつ加え4℃、O/Nでコーティングした。各ウェルをWash Buffer (0.05% Tween20 in PBS)で3回洗浄した後、Blocking Buffer(1% BlockAce(大日本製薬社製) in PBS)を300μL加え、室温で2時間以上ブロッキングした。ブロッキング終了後、Wash Bufferで3回洗浄し、このplateに先に回収したCMを加え、2 hr以上室温で反応させた。2時間後、Wash Bufferで3回洗浄し、Blocking Buffer で1 μg/mlに希釈したmouse monoclonal 抗体(CHEMICON社製)を100μL加えさらに2 hr室温に放置した。Wash Bufferで3回洗浄後、Blocking Buffer で1000倍希釈したAP-conjugate anti-mouse 抗体(Zymed社製)を加え1 hr、室温で反応させた。1時間後 Wash Bufferで三回洗浄後、p-Nitrophenyl Phosphate Tablet Sets（SIGMA社製)を使添付のプロトコールに従い調製し、各ウェルに100 μL加え、室温、遮光下で20 minから90 min振とうした。経時的にWALLEC  ARBO-HTS Multilabel counter（Perkin Elmer社製）で405 nmの吸光度を測定し,その吸光度で上清中のColIVの量を見積もった。結果を図１に示す。BMP2またはBMP4存在下で培養された細胞はColIVを高濃度で産生するが、該産生は抗BMP2/4抗体の添加により、著しく抑制された。
【００７９】
［実施例２］抗ヒトBMP-4抗体の作製および該抗体の薬効評価
１．抗ヒトBMP-4抗体産生ハイブリドーマの作成
（１）ハイブリドーマの作製
MRL-lpr/lprマウス（雌、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー）2匹に、ヒトBMP-4（R&D Laboratories）を以下の通り免疫した。初回免疫としてフロイント完全アジュバント（FCA）でエマルジョン化した抗原を50μg/head皮下投与した。2週間後にフロイント不完全アジュバント（FIA）でエマルジョン化した抗原を50μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行った。抗原に対する血清抗体価の上昇を、下記（３）に示すELISAで確認後、最終免疫としてPBS（-）に希釈した抗原を10μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓細胞とP3U1とを、PEG1500を用いた常法に従い細胞融合した。融合細胞、すなわちハイブリドーマは、10%FBS/RPMI1640にて培養した。
【００８０】
（２）ハイブリドーマの選抜
融合の翌日に、融合細胞を半流動培地（StemCells）に懸濁し、ハイブリドーマの選択培養を行うと共に、ハイブリドーマのコロニー化を実施した。
融合後9日目または10日目にハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地（10%FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate（大日本製薬）,5 vol% BM-Condimed H1（Roche Diagnostics））の入った96-ウェルプレートに、1ウェル当り1 コロニーを播種した。3〜4日培養後、各ウェルの培養上清を回収し、下記（３）に示すELISAにより、ヒトBMP-4に対する結合活性を基に、ハイブリドーマを選択した。
結果、ヒトBMP-4に結合する抗体を産生するクローンとして、BF1009及びBF1066を得た。
各モノクローナル抗体のアイソタイプは、Iso StripTMマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュダイアグノスティックス、1 493 027）を用いて決定した。ハイブリドーマBF1009が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、H鎖はIgG2b、L鎖はκであった。また、ハイブリドーマBF1066が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、H鎖はIgG1、L鎖はκであった。
【００８１】
（３）ELISA
ヒトBMP-4をCoating buffer （0.1M NaHCO3 （pH9.6）, 0.02% NaN3）にて0.1〜0.5μg/mLに希釈し、Immuno-plateに100μL/well添加し、4°C、一晩以上インキュベーションすることによりコーティングした。上清を捨て、あるいはプレートウォッシャーを用いて、300μL/wellのRinse buffer （0.05% Tween 20, PBS-）にて3回プレートを洗った後、200μL/well のDiluent buffer （Blocking One, ナカライテスク）を加え、室温で2時間以上、または4°C、一晩インキュベーションすることによりブロッキングした。
上清を捨て、Diluent bufferにて適当量に希釈した血清、または培養上清、精製抗体などを100μL/well添加し室温で1時間インキュベーションした。プレートウォッシャーを用いて、300μL/wellのRinse bufferにて3回プレートを洗った。次に、Diluent bufferにて1000〜5000倍に希釈しペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスFab抗体を100μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。プレートウォッシャーを用いて、300μL/wellのRinse bufferにて5回プレートを洗った。Peroxidase Substrate（Kirkegaad & Perry Laboratories）を100μL/well添加した後、室温で10-60分間発色し、発色停止液（Kirkegaad & Perry Laboratories）をさらに100μL/well添加した。吸光度計にてA405nmを測定して比色した。
【００８２】
２．ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
上記で得られたハイブリドーマを、ローラーボトルを用い、Hybridoma-SFM（Invitrogen）にて培養した。遠心により、細胞と培養上清とを分離した。Protein G Sepharose Fast Flowカラム（アマシャム）を平衡化・吸着バッファー（0.15M NaCl/PBS（-））で洗浄後、培養上清をアプライし、再度、平衡化・吸着バッファーで洗浄した。溶出バッファー（100mMグリシン-HCl、pH2.7）にて抗体を溶出し、直ちに中和Buffer （2 M Tris-HCl、pH9.0）で中和した。精製抗体は、限外ろ過にて、PBS（-）への緩衝液置換及び濃縮を行い、0.22μmの滅菌フィルター（Millipore）にて滅菌した。
３．抗体スクリーニング
抗体のスクリーニングは、BMP応答エレメントを利用したレポータージーンアッセイ、ヒト不死化メサンギウム細胞を使った基質産生アッセイを使って行った。
BMP応答エレメントを利用したレポータージーンアッセイを用い、前述のハイブリドーマより取得したBMP4結合抗体の中からBMP4に対する中和能を有する抗体を選択した。すなわち、HepG2細胞を96well plateに1x10e5/mLで播種し、一晩37℃、5%CO2中で放置した後Lipofectamine2000（invitrogen）を用い、添付のプロトコールに従い100ngのレポータージーン（pGL3-BRE）と1ngのコントロール遺伝子（pRL-SV40、プロメガ）を導入した。遺伝子導入後、一晩37℃、5%CO2中で放置した後、10ng/mL BMP4と1/10容量のハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに一晩放置した。一晩放置後、Dual-Luciferase Repoter Assay System（プロメガ）を使い添付のプロトコールに従い、レポーター遺伝子luciferaseの活性を測定した。化学発光の検出にはARVO HTS 1420 Multilabel Counterを使用した。
中和活性を有していたクローンは、ラット、ヒト間で配列の異なる、N末端のペプチドをGSTに融合させて発現させたペプチドを使ったELISAにより、ラットBMP4への交差性を確認した。すなわち、市販のcDNAライブラリーよりPCRクローニングにより取得したラットあるいはヒトBMP4を鋳型にして、ラットは配列番号26，27に記載の配列を、ヒトは配列番号28，29に記載の配列をプライマーとして、N末端のペプチドをコードする遺伝子を、PCRにより増幅した。
配列番号26：5’-GGGATCCCCAGTCCCAAGCATCACCCACAG-3’
配列番号27：5’-CTCGAGTTAGTTCTTATTCTTCTTCCTGGA-3’
配列番号28：5’-GGGATCCCCCAAGCCAAACACAAACAGCGG-3’
配列番号29：5’-CTCGAGTTAGCTGGACTTAAGGCGTTTCCG-3’
増幅したPCR産物を制限酵素BamH I/Xho Iで切断し、同じ酵素であらかじめ切断しておいた、pGEX5X-2（アマシャム−ファルマシア）に挿入した。得られたプラスミドの配列をDNAシークエンサーで確認した後、このプラスミドを使い、大腸菌DH5αを形質転換した。形質転換した大腸菌を使い、GST融合N末端ペプチドを調製した。常法に従い、大腸菌をLB-Ampでミッドログフェイズまで培養したところで、終濃度1mMのIPTGを添加し、蛋白発現を誘導した。IPTG添加後2時間培養し、大腸菌を遠心により回収した。回収した大腸菌をBug Buster Protein Extraction Reagent（Novagen）を使い溶解し、発現したタンパク質を回収した。回収したタンパク質より、グルタチオンカラムを使いGST融合ペプチドを精製した。
精製したGST融合ペプチドを1ug/mLに希釈し100uL/wellずつ加え室温に1時間放置し、イムノプレートに固相化した。3% BSA/PBSでブロッキングした後、1ug/mLのそれぞれの抗体溶液を加え、室温に1時間放置した。PBS-0.05%Tween20で洗浄した後、5000倍希釈したHRP-anti mouse IgG（Zymed）を加え、さらに室温で1時間放置した。PBS-0.05%Tween20で洗浄した後、TMB溶液を加え反応性を検討し、ラットとヒトのBMP4ペプチド双方に結合する抗体BF1009とBF1066を選択した。
この2抗体は前述の方法で不死化メサンギウム細胞の基質産生抑制作用があることを確認した。
【００８３】
４．片腎摘出Thy1腎炎モデルにおける抗BMP抗体の薬効評価
（１）片腎摘出Thy1腎炎モデルの作製
片腎摘出Thy1腎炎モデルは、メサンギウム増殖性腎炎の病態を呈する慢性糸球体腎炎モデルであり、糸球体硬化、尿細管間質障害などを経て腎機能廃絶にいたるモデルである。
7週齢のラット（Slc:Wistar、雄性）の左腎を摘出し、抗Thy1抗体（Anti-Rat CD90（Thy1.1）Monoclonal Antibody-Ascites（Cedarlane、Code No. CL005A））を1mg/kg尾静脈より投与して腎炎モデルを作製した。
【００８４】
（２）抗BMP抗体の薬効評価
モデル作製2週間後から、抗BMP抗体（BF1009、BF1066）を1mg/kg、10mg/kgの2用量、それぞれ15匹に対して尾静脈から投与した。投与頻度は、投与開始10週目までは2週間に1回、以降は1週間に1回とした。投与開始から2週間おきに代謝ケージに収容して24時間尿を採取した。得られた尿に含まれるアルブミンを日立7170形自動分析装置で測定し、尿量で補正して24時間の尿中アルブミン排泄量を算出した。そのうち、コントロール（NC）、疾患コントロール（DC）、及び抗BMP抗体を10mg/kg投与した群（BF1009-10及びBF1066-10）の経過について図2に示した。
その結果、抗体投与開始後8週時を境に、各抗体投与群とコントロール群との間に尿中アルブミン量の変化が認められた。この結果は、抗BMP抗体が腎疾患に対して有効であることを示している。さらに、12週時における各抗体投与群とコントロール群との間の尿中アルブミン量の差が大きくなっていることから、投与間隔を短くすることで更に高い薬効が得られることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によって、腎疾患に対する新規予防および治療薬が提供された。腎疾患の薬物療法には、降圧薬（ACE阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬、Ca拮抗薬）、利尿薬（サイアザイド薬、ループ利尿薬）などによる対症療法があるが、腎臓の障害を直接的に防ぐものではない。また、ステロイド療法は、糖尿病性腎症には用いることができない。本発明の治療薬は、糖尿病性腎症を含む腎疾患に対し、従来の治療薬とは全く異なるメカニズムによるため、腎疾患患者に対し、治療方法の新たな選択肢の提供を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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