(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸生産能を有するパラクロレラ属微細藻類、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ｂｉｎｏｓ）。
【請求項２】
以下の特徴を有する、請求項１記載の微細藻類。
形態：単細胞、球形、大きさ１０μm〜１５μm
生殖様式：内生胞子形成四分裂型又は内生胞子形成八分裂型
ルテニウムレッド染色性：陽性
【請求項３】
無機III培地で培養した場合、大きさ１２μm〜１５μmであり、生殖様式が内生胞子形成四分裂型である、請求項２記載の微細藻類。
【請求項４】
Ｏｇｂｏｎｎａ培地で培養した場合、大きさ１０μm〜１２μmである、請求項２記載の微細藻類。
【請求項５】
細胞中のクロロフィルａ及びクロロフィルｂの含量が、１：１〜２．５：１である、請求項１〜４のいずれか１項記載の微細藻類。
【請求項６】
配列番号１で表される１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の微細藻類。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９）を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の微細藻類。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の微細藻類を培養し、培養物又は培地からアルギン酸又はアルギン酸塩を回収することを特徴とする、アルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法。
【請求項９】
前記培養工程が、中性の培地を用いて行われる、請求項８記載のアルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法。
【請求項１０】
前記培養工程が、中性の培地を用いた後にアルカリ性の培地を用いて前記微細藻類を培養する工程を含む、請求項９記載のアルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法。
【請求項１１】
前記培養工程が、前記微細藻類を開放系で培養する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか１項記載のアルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸産生能を有する新規微細藻類及びその利用方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、クロレラ属として分類されていた単細胞の藻類は、近年の分子系統学的解析の結果、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）とトレボキシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）とにまたがる多系統群であったことが示された（非特許文献１：Ｆｒｉｅｄｌ，１９９５及び非特許文献２：Ｈｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。さらに、Ｕｓｔｉｎｏｖａら（非特許文献３）は、１８Ｓ  ｒＤＮＡ及び１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いた分子系統学的解析を行うことにより、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）はトレボキシア藻綱の中でも他のクロレラとは別のグループを形成することを示した。そのため、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の設立が提唱され、それに伴ってクロレラ・ケスレリの学名は、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）に変更された。パラクロレラ属に属する藻類としては、他にクロステリオプシス・アキキュラリス（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ  ａｃｉｃｕｌａｒｉｓ）があるが、これは形態学的にはパラクロレラ・ケスレリとは似ていないといわれている。緑藻類全般の分類体系については、非特許文献４（Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄ  ａｎｄ  Ｌｅｌｉａｅｒｔ）を参照されたい。
アルギン酸は、褐藻類の細胞間及び細胞壁や、一部の紅藻に含まれる粘性多糖類である。アルギン酸又はその塩は、増粘安定剤、ゲル化剤として、食品添加物、医薬品、化粧品、歯科用材料等に広く利用されている。また、アルギン酸は食物繊維の一種であり、近年注目されている。さらに、アルギン酸、特に、アルギン酸オリゴ糖とも呼ばれるアルギン酸分解物（オリゴマー）又は低分子量のアルギン酸は、種々の生理活性を有することが報告されている。
トレボキシア藻綱に属する藻類については、アルギン酸ナトリウムが含有又は代謝されていた例は報告されていない。
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｌ，１９９５（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３１：６３２−６３９）
【非特許文献２】Ｈｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３５：５８７−５９８）
【非特許文献３】Ｕｓｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：３４１−３５１）
【非特許文献４】Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｄｅｒｉｋ  Ｌｅｌｉａｅｒｔ，″Ｃｈａｐｔｅｒ  ７  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ：ｃｏｎｆｌｉｃｔ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｒｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，″ｉｎ  Ｊｕｌｉｅｔ  Ｂｒｏｏｄｉｅ  ａｎｄ  Ｊａｎｅ  Ｌｅｗｉｓ  ｅｄｓ．，″Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｌｇａｅ：ｔｈｅ  ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｌｇａｌ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ″，（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，２００７）
【非特許文献５】地域研究開発促進拠点支援事業（ＲＳＰ事業）可能性試験研究成果報告書「アルギン酸分解物の食品および薬品素材への応用の可能性の検索」、渡邉正己ほか、２０００年
【非特許文献６】Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０（１２）：３０５４−３０５７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、有用な新規パラクロレラ属微細藻類及びその利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、自然界から単離されたパラクロレラ属微細藻類が、新規であり、アルギン酸産生能、特に比較的低分子量のアルギン酸を産生する能力を有することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、
〔１〕  アルギン酸生産能を有するパラクロレラ属微細藻類、パラクロレラ・バイノス（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ｂｉｎｏｓ）；
〔２〕  以下の特徴を有する、前記〔１〕記載の微細藻類；
形態：単細胞、球形、大きさ約１０μｍ〜約１５μｍ
生殖様式：内生胞子形成四分裂型又は内生胞子形成八分裂型
ルテニウムレッド染色性：陽性；
〔３〕  後述する無機ＩＩＩ培地で培養した場合、大きさ約１２μｍ〜約１５μｍであり、生殖様式が内生胞子形成四分裂型である、前記〔２〕記載の微細藻類；
〔４〕  後述するＯｇｂｏｎｎａ培地で培養した場合、大きさ約１０μｍ〜約１２μｍである、前記〔２〕記載の微細藻類；
〔５〕  細胞中のクロロフィルａ及びクロロフィルｂの含量が、約１：１〜約２．５：１である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の微細藻類；
〔６〕  配列番号１で表される１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の微細藻類；
〔７〕  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９）を有する、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の微細藻類；
〔８〕  前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の微細藻類を培養し、培養物又は培地からアルギン酸又はアルギン酸塩を回収することを特徴とする、アルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法；
〔９〕  前記培養工程が、中性の培地を用いて行われる、前記〔８〕記載のアルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法；
〔１０〕  前記培養工程が、中性の培地を用いた後にアルカリ性の培地を用いて前記微細藻類を培養する工程を含む、前記〔９〕記載のアルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法；
〔１１〕  前記培養工程が、前記微細藻類を開放系で培養する工程を含む、前記〔８〕〜〔１０〕のいずれか１項記載のアルギン酸又はアルギン酸塩の生産方法；
〔１２〕  前記〔８〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法により生産されたアルギン酸又はアルギン酸塩
を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、新規な有用微細藻類及びその応用が提供される。本発明のパラクロレラ属微細藻類は、一般的な環境下で容易に増殖させることができ、アルギン酸ナトリウムを分泌するので、アルギン酸及びその塩の生産などに利用することができる。
本発明の微細藻類は、クロロフィル含量が多く、特に、水深の深いところまで届く青色光を吸収するクロロフィルｂの含量が多い。したがって、本発明の微細藻類は、水深の深い培養容器中で細胞数の多い過密な培養条件下でも、効率よく光合成を行うことができる。
また、本発明の微細藻類は内生胞子形成四分裂型又は内生胞子形成八分裂型の分裂様式を行う。すなわち、分裂後すぐに母細胞壁を脱ぎ捨て、未成熟な娘細胞の細胞壁のみからなる、プロトプラストに近い状態を経て、分裂が終了した後に細胞壁を形成する。したがって、細胞内容物の抽出、さらには遺伝子導入を用いた形質転換、遺伝子組換え又はＲＮＡｉを用いた品種改良を行う場合にも好都合である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１−１は、パラクロレラ・ケスレリ株及び本発明の株の顕微鏡写真を示す図である。パネルＡはパラクロレラ・ケスレリ、２１５２株；パネルＢ〜Ｅはパラクロレラ・ケスレリ、２１５３株；パネルＦ及びＧはパラクロレラ・ケスレリ、２１５４株；パネルＨは本発明の株である。パネルＤ及びＨについては蛍光顕微鏡、それ以外は光学顕微鏡を用いた。
図１−２は、パラクロレラ・ケスレリ株及び本発明の株の顕微鏡写真を示す図である。パネルＡはパラクロレラ・ケスレリ、２１５２株；パネルＢ〜Ｅはパラクロレラ・ケスレリ、２１５３株；パネルＦ及びＧはパラクロレラ・ケスレリ、２１５４株；パネルＨは本発明の株である。パネルＤ及びＨについては蛍光顕微鏡、それ以外は光学顕微鏡を用いた。
図１−３は、パラクロレラ・ケスレリ株及び本発明の株の顕微鏡写真を示す図である。パネルＡはパラクロレラ・ケスレリ、２１５２株；パネルＢ〜Ｅはパラクロレラ・ケスレリ、２１５３株；パネルＦ及びＧはパラクロレラ・ケスレリ、２１５４株；パネルＨは本発明の株である。パネルＤ及びＨについては蛍光顕微鏡、それ以外は光学顕微鏡を用いた。
図１−４は、パラクロレラ・ケスレリ株及び本発明の株の顕微鏡写真を示す図である。パネルＡはパラクロレラ・ケスレリ、２１５２株；パネルＢ〜Ｅはパラクロレラ・ケスレリ、２１５３株；パネルＦ及びＧはパラクロレラ・ケスレリ、２１５４株；パネルＨは本発明の株である。パネルＤ及びＨについては蛍光顕微鏡、それ以外は光学顕微鏡を用いた。
図２は、本発明の株の透過型電子顕微鏡写真像（１０，０００倍）を示す図である。図中、「Ｃ」は葉緑体、「Ｎ」は核を表す。
図３は、本発明の株の微分干渉顕微鏡像（４００倍）を示す図である。丸で囲んだ部分は本発明の株の細胞、点線で囲んだ部分はアルギン酸ナトリウム層及び共生菌を表す。
図４は、本発明の細胞溶解物及びアルギン酸ナトリウム標準品のＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定の結果（スペクトル）を示す図である。
図５は、１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて作製した、本発明の株及び近縁種を含む分子系統樹を示す図である。左下のスケールは０．０１遺伝距離を表す。
図６は、異なるｐＨの培地で培養された本発明の株によるアルギン酸産生量を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．本発明の微細藻類の単離法
本発明の微細藻類は、野外で採集した淡水サンプルから、継代培養により単離することができる。具体的には、例えば、少量のサンプルを液体培地（２．５ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、７．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１７．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、２．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の各溶液１０ｍＬ及び蒸留水９４０ｍＬに、１滴の１％ＦｅＣｌ３及び２ｍＬのＡｒｎｏｎｓ  Ａ５溶液（組成：蒸留水中、２．８６ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ４、１．８１ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２２２ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０７９ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）５Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ）を添加したもの、ｐＨ６．５；以下「無機ＩＩＩ培地」ということがある）で培養し、この培養液を１００μＬ採取して、上記液体培地に１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天を加えた平板培地（以下「平板培地」という）に塗り広げて同様に培養し、緑色のコロニーを選択する。この操作をコロニーが均一になるまで繰り返した後、ＬＢ平板培地（５ｇ  ペプトン、２．５ｇ  イーストエキストラクト、０．５ｇ  ＮａＣｌを蒸留水１，０００ｍＬに溶解し、１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天を加えたもの、ｐＨ６．５）で細菌汚染がないことを確認する。
本発明の微細藻類は、淡水又はＬＢ培地等の一般的な培地中で、好気的又は嫌気的のいずれの条件下でも生育可能であるが、上記の液体培地中で、室温〜３０℃、明条件、好気（振とう培養）の条件下で特によく増殖・生育する。本発明の微細藻類は、光要求性（最低７００Ｌｕｘ、好ましくは約２，０００〜約２０，０００Ｌｕｘ程度、最も好ましくは約３，０００〜約８，０００Ｌｕｘ）である。
継代培養条件は、約２週間〜約１カ月程度の間隔で継代することが望ましい。
後述する実施例１において記載した単離株は、２００８年２月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５１３が付与され、２００８年５月２３日付でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９として「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」下の国際寄託に移管され、受託された。
２．本発明の微細藻類の藻類学的性質
Ａ．形態学的特徴
本発明の微細藻類は、単細胞で、球形であり、大きさは約１２μｍ〜約１５μｍ程度である。クロロフィル量が多く、緑色であり、ミトコンドリアを複数有することもある。吸光光度法により測定した場合、総クロロフィル量は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の約２倍程度であり、藻類の乾燥重量１００ｇあたり約８００〜１，０００ｍｇに達する。また、クロレラではクロロフィルａが総クロロフィル量の７５〜９０％程度を占めるのに対し、本発明の微細藻類では、クロロフィルｂの割合が多く、クロロフィルａ：クロロフィルｂの含量の比は約１：１〜約２．５：１程度（約５０％対約５０％〜約７１％対約２９％）である。
細胞の大きさは、培養条件によって変動することがあり、Ｏｇｂｏｎｎａ培地（５００ｍｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、１８００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２５０ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、Ａｒｎｏｎｓ  Ａ５溶液  １ｍＬ／Ｌ及びグルコース５ｇ／Ｌ；ｐＨ７．５）で培養した場合、無機ＩＩＩ培地で培養した場合よりも小さくなりうる（約１０μｍ〜約１２μｍ）ことが判明した。
Ｂ．生殖様式
トレボキシア藻綱には、内生胞子形成型と呼ばれるタイプが多い。本発明の微細藻類の分裂様式は、顕微鏡観察に基づき、内生胞子形成四分裂型であると判断された。
なお、Ｏｇｂｏｎｎａ培地で培養した場合、内生胞子形成八分裂型の分裂様式をとることがあることが判明した。
Ｃ．生理学的・生化学的性状
微細藻類は、非常に高いＣＯ２固定能力を有し、光合成産物としてデンプンを合成することが知られている。しかし、本発明の微細藻類は、ヨウ素デンプン反応に陰性であることが判明した。
また、本発明の微細藻類は、ルテニウムレッド染色によりいくつかの個体が赤く染色される。したがって、本発明の微細藻類自身がウロン酸を含有する物質を分泌すると考えられる。特に、本発明の微細藻類は、粘性多糖類様物質としてアルギン酸を分泌することができる。生育環境によっては、このアルギン酸によって、微生物がトラップされた、バイオフィルムのような共生微生物群集を作ることがある（図３）。
３．本株の分類学上の位置
１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づく分子系統学的研究から、本発明の微細藻類は、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属し、既知種パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）と近縁であることが明らかとなった。本発明の株及び近縁種を含む分子系統樹を図５に示す。
本発明の株の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。
４．本発明の微細藻類を用いたアルギン酸生産法
上記のとおり、本発明の微細藻類は、アルギン酸を産生するので、本発明の微細藻類を培養し、その培養物又は培養液からアルギン酸を回収することにより、アルギン酸を得ることができる。
具体的には、例えば、本発明の微細藻類を上記の液体培地（無機ＩＩＩ培地）又はＯｇｂｏｎｎａ培地のようなその他の培地で大量培養し、その培養液からろ過によってアルギン酸を分離・回収することができる。培養は、中性（例えばｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５）の培養液で行うことが増殖速度の点で有利である。培養中雑菌の混入といった刺激を与えることにより、アルギン酸の分泌が促進される。したがって、例えば、本発明の微細藻類が充分に増殖した培養の最後の段階で、単に開放系で数十分〜数時間程度さらに培養することにより、アルギン酸の分離・回収が容易になる。また、培養液のｐＨをアルカリ性とすることにより、アルギン酸分泌量が増大し、特に、比較的低分子量の（重合度の低い）アルギン酸が多量に産生されることが判明した。したがって、本発明の微細藻類の培養は、上記のように液体培地（無機ＩＩＩ培地）又はＯｇｂｏｎｎａ培地のようなその他の培地を用いて行うことができるが、培養液中に分泌されたアルギン酸の分離・回収前にアルカリ性の培養液で培養することが有利である。培養の最後の段階での開放系での培養及びアルカリ性培養液での培養は、いずれか一方を行なってもよく、両方を行なってもよい。
また、褐藻からのアルギン酸抽出に使用されている方法を、本発明の微細藻類について応用することもできる。この場合、本発明の微細藻類を乾燥・粉砕した後、アルカリ（水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなど）を加えて、アルギン酸ナトリウム塩（ゲル状）として細胞から溶出させ、ろ過して回収することができる。
【実施例】
【０００８】
特に記載しない限り、すべての培地・器具は、１２１℃（オートクレーブ）又は８０％（Ｖ／Ｖ）エタノールにより滅菌したものを用いた。
１．本株の単離・選抜
岐阜県内の工場排水処理場より採取した水溶液サンプルを用いて、希釈による光照射液体継代培養を行い、微細藻類を単離した。
本実験で用いた「液体培地」（無機ＩＩＩ培地）は、以下のようにして調製した。２．５ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、７．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１７．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、２．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、及び２０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の各水溶液を１０ｍＬずつ、９４０ｍＬの蒸留水に添加し、１％（Ｗ／Ｖ）ＦｅＣｌ３を１滴及びＡｒｎｏｎｓ  Ａ５溶液を２ｍＬ添加し、ｐＨを６．５に調整した後、１２１℃、１５分間、オートクレーブにかけた。固体培地は、ｐＨ調整前に上記液体培地に１．５％（Ｗ／Ｖ）濃度となるように寒天を加えて作製した（平板培地）。
「ＬＢ（液体）培地」は、５ｇ  ペプトン、２．５ｇ  イーストエキストラクト、０．５ｇ  ＮａＣｌを蒸留水１，０００ｍＬに溶解し、ｐＨ６．５に調整した後、１２１℃、１５分間、オートクレーブにかけた。固体培地は、ｐＨ調整前に上記液体溶液に１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天を加えて作製した（ＬＢ固体培地）。
水溶液サンプルを１００μＬ計り取り、液体培地で培養した。培養条件は、室温又は３０℃、明条件、スターラーを用いた攪拌、を基本とし、１週間培養した。この培養液を１００μＬ計り取り、平板培地に塗布し、基本的に上記と同じ培養条件下で培養した。
この平板培地上に形成されたコロニーのうち、緑色を呈するコロニーをピックアップし、液体培地に入れ、基本的に上記と同じ培養条件下で培養した。
上記の液体培養及び平板培養のサイクルを、平板培地上に緑色のコロニー以外のものが出現しなくなるまで、繰り返した。
上記サイクルを２回繰り返した後（サイクル２）及び３回繰り返した後（サイクル３）の液体培養及び平板培地の顕微鏡観察の結果、これらのサンプルには緑色の微生物以外の雑菌が数種類確認された。この中には運動性をもつ微生物も含まれていた。
そこで、上記サイクルを３回以上繰り返した後に得たコロニーを、液体培地中で、３０℃、明条件で１０日間培養した。この培養液（５ｍＬ）にイソジン（商品名、ポピヨンヨード  ７００ｍｇ／Ｌ溶液）を１０μＬ添加し、よく攪拌した後、３０℃、嫌気、明条件下で２４時間静置した。この液体培地１００μＬを５ｍＬの液体培地に加え、１４日間、３０℃、好気、明条件下で培養した。
次に、この培養液に、０．０１％（Ｖ／Ｖ）次亜塩素酸ナトリウムを添加して３時間静置した後、培養液を平板培地及びＬＢ平板培地に塗布し、３０℃、好気、明条件下で１０〜１２日間培養した。
その結果、雑菌を含まない単一のコロニーを単離することができた。このコロニーは、３０℃で３日間の培養により、液体培地にて、好気の条件にて増殖した。
この株（パラクロレラ・バイノス；以下、「バイノス」と略称することがある）は、２００８年２月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５１３が付与され、２００８年５月２３日付でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９として「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」下の国際寄託に移管され、受託された。
２．顕微鏡観察、染色性等
ｉ）  ヨウ素デンプン反応
上記で得られた株及びクロレラ（クロレラ工業社製、生クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））をサンプルとして、酵素法によりデンプンを定量した。具体的には、サンプルに５０％エタノールを用いて低分子等を抽出洗浄し、不溶物を加熱糊化して、グルコアミラーゼ処理した後、ろ過して得たろ液のブドウ糖を、「ＣＩＩテストワコー」（商品名）を使用して定量した。この結果から、ブドウ糖（％）×０．９＝デンプン（％）としてデンプン量を算出したところ、デンプン量として、本発明の株については０．２％、クロレラについては０．９％の結果を得た。しかし、この方法ではブドウ糖が構成成分であり、かつデンプンと異なる結合の多糖を測定対照とする可能性があることから、確認のため、各サンプル（本発明の株については、色が濃く、そのままでは判定困難であるため、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過した後の液体を用いた）についてヨウ素デンプン反応を行ったところ、いずれもヨウ素デンプン反応陰性であった。
ｉｉ）  ルテニウムレッド染色
上記で得られた株を、そのまま又はルテニウムレッド染色した後、顕微鏡（ライカ社製、「ＬＥＩＣＡ  ＤＭ１  ６０００Ｂ」）観察した。ルテニウムレッド染色は、微生物サンプルを遠心（３，０００ｒｐｍ、５分）して集め、ルテニウムレッド水溶液（ナカライテスク社製）を加え、室温にて１時間ほど静置した後、蒸留水にて微生物を洗浄することにより行った。
ｉｉｉ）  顕微鏡観察
独立行政法人国立環境研究所微生物系統保存センターに保存されている９種類のパラクロレラ・ケスレリ株のうち、３株（２１５２、２１５３及び２１５４）を入手して同様の観察を行い、本発明の株と比較した。なお、これらのケスレリ株については、遺伝的にどのくらい離れているかなどの情報はない。
顕微鏡観察の結果を図１−１〜１−４に示す。観察の結果、これらの３株すべてが、何らかの粘性多糖類らしきものを分泌していることがわかった。これらの３株のうちで２１５２株は、外見上、本発明のパラクロレラ・バイノスに最もよく似ているが、バイノスと比較して一回り細胞体が小さく（図１−１、パネルＡ）、ルテニウムレッド染色陰性であった。２１５３株は、本発明の株（図１−４、パネルＨ）と同様ルテニウムレッド染色に陽性であったため、分泌物はアルギン酸のようなウロン酸を含む化合物であると考えられる（図１−１、パネルＢ〜図１−３、パネルＥ）。しかし、本発明の株が内生胞子形成四分裂型であるのに対し、２１５３株は内生胞子形成八分裂型であった。２１５４株は、細胞体が本発明の株よりも大きい個体も見受けられるが、細胞に含まれる葉緑体が明らかに少ないため、透き通って見えた。葉緑体が少ないことは蛍光顕微鏡を用いた観察からも明らかであった（図１−３、パネルＦ及び図１−４、パネルＧ）。また、ルテニウムレッド染色陰性である点でも本発明の株と異なっていた。
これらの特徴をまとめると、以下のとおりである。
【表１】
0005559690.tif 000002
ｉｖ）  電子顕微鏡観察
本発明の株については、透過型電子顕微鏡（日立製作所製、「ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｈ−７０００」）による観察も行った。電子顕微鏡写真像（１０，０００倍）を図２に示す。図中、「Ｃ」は葉緑体、「Ｎ」は核である。視野面積の約７０％が葉緑体であり、本発明の株が大量の葉緑体を蓄えていることが示された。なお、細胞の外周を取り囲む色の薄い層は、アルギン酸と考えられる。
ｖ）  本発明の微細藻類を含む微生物群集の観察
開放系で培養した本発明の株を、微分干渉顕微鏡（ライカ社製、「ＬＥＩＣＡ  ＤＭ１  ６０００Ｂ」、拡大倍率４００倍）で観察した。その結果を図３に示す。本発明の株が分泌した粘性多糖類によって窒素固定細菌を含む少なくとも４種の微生物がトラップされ、バイオフィルムのような共生微生物群集を作り上げていることが判明した。
３．分泌物の同定
上記のようにして液体培地で培養したパラクロレラ・バイノス（２，０００ｍｇ／Ｌ）に対して、Ｎａ２ＣＯ３を終濃度で２％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し、細胞を溶解させた。この溶解物を３，０００ｒｐｍで１０分遠心して不純物を沈降させ、上澄み液を０．４μｍフィルターにて濾過した。フィルターに残った残渣を、１Ｎ塩酸及び１Ｎ  ＮａＯＨで洗浄し、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定に供した。
この分析の結果を図４に示す。アルギン酸ナトリウム標準品についてのスペクトルと比較したところ、本発明のパラクロレラ・バイノスから分泌されている多糖類はアルギン酸であることが強く示唆された。
４．クロロフィル含量の測定
上記のようにして培養したパラクロレラ・バイノス及びクロレラ（クロレラ工業社製、生クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））をサンプルとして、日本食品分析センターに依頼して吸光光度法によりクロロフィル量を測定した。
結果を表２に示す。
【表２】
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バイノスは、クロレラと比較して総クロロフィル量、クロロフィルａ量及びクロロフィルｂ量がいずれも有意に高く、総クロロフィル量及びクロロフィルａ量やクロレラの約２倍程度であり、クロロフィルｂはクロレラの約７倍であった。また、クロロフィルａとクロロフィルｂとの比も、クロレラでは約９：１であったのに対し、本発明の株では約２：１であった。
５．１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析
鋳型として本発明のパラクロレラ・バイノスから抽出したゲノムＤＮＡを用い、ユニバーサル１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子用プライマーを用いて、ＰＣＲ法により目的遺伝子を増幅した後、アガロースゲル電気泳動を行ってゲルから目的遺伝子を切り出し、ＴＡベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、商品名「Ｐ−ＧｅｍＴ」）にライゲーションさせた。その後、このプラスミドで大腸菌をトランスフォームさせ、ブルーホワイトセレクションによるスクリーニングの後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。次いで、株式会社バイオマトリックス研究所に委託し、このプラスミドのｓｐ６及びｔ７サイトより塩基配列を解析した。
塩基配列データは、ＮＣＢＩに登録されている近縁種の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列とともに、公開されている多重整列プログラム「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」を用いてアラインメントさせ、系統樹（近隣結合法）を構築した。
結果を図５に示す。この結果、本発明の株は、パラクロレラ・ケスレリと近縁の新種であることが判明した。
また、上記の解析により得られた本発明の株の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
６．異なるｐＨの培地中でのパラクロレラ・バイノスによるアルギン酸の産生
無機ＩＩＩ培地中で２５℃、１週間以上培養し、細胞濃度が１０６個／Ｌとなったパラクロレラ・バイノスを、３つの容器に分注した。各容器の培養液のｐＨを、塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５、ｐＨ７、及びｐＨ１０に調整した。これを暗所で２５℃で培養し、１、２、３、６、８日目にサンプリングして、アルギン酸産生量の指標として不揮発性有機炭素（ｎｏｎ−ｐｅｒｇｅａｂｌｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ；ＮＰＯＣ）量を測定した。
ＮＰＯＣ量の測定は、具体的には以下のように行った。各時点で採取したパラクロレラ・バイノスを含む培養液０．５ｍＬを、１６，５００×ｇで１分間遠心分離し、細胞を沈降させた。上澄み液を採取し、等量のイソプロパノールを加えた後、１６，５００×ｇで１０分間遠心分離した。得られたペレットを滅菌蒸留水に溶解したものをサンプルとして使用した。島津製作所製ＴＰＯＣ−ｖを用いて、酸性化・通気処理による測定法（ＪＩＳ−Ｋ０５５１、ＡＳＴＭ−Ｄ２５７９にしたがい、各サンプル中のＮＰＯＣ量を測定した。
結果を図６に示す。図６において、菱形（◆）はｐＨ５、四角（■）はｐＨ７、三角（▲）はｐＨ１０を表す。図６から明らかなように、本発明の株は、アルカリ性条件下で培養することにより、酸性又は中性条件下の場合よりも大量のアルギン酸を分泌することが判明した。
７．パラクロレラ・バイノス分泌物の特徴づけ
この実験では、無機ＩＩＩ培地にて１週間以上２５℃にて培養し、細胞濃度が１０６個／Ｌ以上になったパラクロレラ・バイノスを用いた。このパラクロレラ・バイノスを含む培養液０．５ｍＬを、１６，５００×ｇにて１分間遠心し、細胞を沈降させた。この上澄み液に等量のイソプロパノールを加えた後、１６，５００×ｇにて１０分間遠心した。得られたペレットを滅菌蒸留水に溶解させたものをサンプルとし、限外ろ過膜（アズワン社、商品名「Ｖｉｖａｓｐｉｎ」）を用いて分画した。各画分に含まれるアルギン酸量を、上記６．に記載した方法でＮＰＯＣを計測することにより測定した。
その結果、サンプル中のアルギン酸は、すべて分画分子量１０万の限外ろ過膜を通過した。一方、分画分子量１万の限外ろ過膜を用いた場合は、一部がトラップされたが、残りは通過した。
したがって、パラクロレラ・バイノス分泌物のアルギン酸は、概ね分子量１０万以下であり、大部分は分子量２万以下であって、分子量１万以下のものを含むと考えられる。
８．異なる培地でのパラクロレラ・バイノスの培養
以下の培地を用いて本発明のパラクロレラ・バイノスを培養した。「Ｏｇｂｏｎｎａ培地」は、以下のようにして調製した。５００ｍｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、１８００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２５０ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡを蒸留水に添加し、Ａｒｎｏｎｓ  Ａ５溶液を１ｍＬ及びグルコース５ｇを添加し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に調整した後、１２１℃、２０分間、オートクレーブにかけた。この培地は、Ｏｇｂｏｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．によるＪ．ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４，ｐｐ．３５９−３６６（１９９７）を参考にして組成した。上述の液体培地の代わりにこの培地を用いたこと以外は上記１．と同じ条件（３０℃、好気、明条件）で７日間培養した。
上記２．と同様にして顕微鏡観察を行った。この培地で培養した場合、パラクロレラ・バイノスは、
形態：単細胞、球形、大きさ約１０〜１２μｍ
生殖様式：内生胞子形成八分裂型
であった。
この出願は、平成２０年８月２８日出願の日本特許出願、特願２００８−２２０２１３に基づくものであり、特願２００８−２２０２１３の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
［配列表］
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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