(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカータンパク質の発現を指標とすることにより、哺乳動物の皮膚組織から角化細胞、線維芽細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞、毛包細胞又は色素細胞への分化能を有する幹細胞を分離する方法であって、マーカータンパク質がＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、及びＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６であることを特徴とする幹細胞の分離方法。
【請求項２】
マーカータンパク質の発現を指標とすることにより、哺乳動物の皮膚組織における角化細胞、線維芽細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞、毛包細胞又は色素細胞への分化能を有する幹細胞を検出する方法であって、マーカータンパク質がＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、及びＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６であることを特徴とする幹細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の皮膚組織における幹細胞の分離・検出方法、ならびに当該細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる多能性を有した細胞（以下、「幹細胞」と記す）や周囲の細胞が大きな役割を果たしている。特に、幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。近年、このような幹細胞を応用した、次世代の医療として再生医療に期待が高まっている。
【０００３】
哺乳動物のあらゆる臓器には、幹細胞が存在し、各臓器の恒常性維持に大きく関与していると考えられている。例えば、骨髄、肝臓、膵臓、脂肪などの組織に幹細胞が存在することが証明されている（非特許文献１〜５）。
【０００４】
また、皮膚組織においては、表皮幹細胞、上皮系幹細胞、色素幹細胞、及びＳＫＰ細胞（ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）の存在が報告されている（非特許文献６）。表皮組織は、最下層から順に基底層、有棘層、顆粒層、角層の４つの異なる細胞層からなり、基底層に存在する細胞が分化し、順に上層へと移動していく。この基底層に、ケラチノサイトの起源となる表皮幹細胞が存在することが示され、表皮のターンオーバーに重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献７）。毛包組織のバルジ領域には、ＣＤ３４やインテグリン−α６を発現し、毛包組織を作り出す上皮系幹細胞や、毛髪へ色素細胞を供給する色素幹細胞が存在することが見出されている（非特許文献８、９）。また、真皮組織に存在するＳＫＰ細胞は、末梢神経系や間葉系に分化する能力があることが報告されている（非特許文献１０）。
【０００５】
今後、それぞれの組織に存在する幹細胞を再生医療へ応用するためには、これらの組織から治療目的に合った幹細胞を分離しなくてはならない。最も単純な幹細胞の分離方法として、遠心分離による組織幹細胞の分離方法がある（非特許文献１１）。この方法により、脂肪組織から分離した幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び筋肉細胞へ分化することが示されているが、血液細胞や血管内皮細胞などの混入を避けることはできず、幹細胞の効率的な分離方法としては、満足のいくものではなかった。
【０００６】
このような問題点を解決するために、より効率の高い幹細胞の分離方法の開発が進められてきた。近年の報告から、幹細胞は各臓器に存在する幹細胞は、特殊なタンパク質をそれぞれ合成していることが明らかにされている。この特殊なタンパク質は、マーカータンパク質と呼ばれ、各臓器の幹細胞に特異的なものであり、これを利用することで、幹細胞を検出し、分離する技術の検討が行われている。
【０００７】
例えば、骨髄や脂肪組織から、マーカータンパク質としてｐ７５ＮＴＲを利用することで、脂肪、骨芽、軟骨、及び神経細胞への分化誘導能の高い幹細胞を効率的に分離する方法や、血液や骨髄から、ＣＤ３４をマーカータンパク質として、造血細胞や上皮細胞への分化誘導能を持った細胞を分離する方法がある（特許文献１、２）。その他にも、毛包皮脂腺の直下付近に存在するバルジ領域と呼ばれる部位から、ニューロン、平滑筋細胞、及び脂肪細胞などへの分化誘導能を有した幹細胞を、ネスチンをマーカータンパク質として分離する方法や、毛嚢含有頭皮より、ＣＤ３４をマーカータンパク質として、毛嚢幹細胞を分離し、移植することにより、毛嚢組織を再生する手法も開発されている（特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２３０２３５
【特許文献２】特表２００７−５１４４３４
【特許文献３】特開２００９−３９１２５
【特許文献４】特表２００９−５０９５２６
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  Ｍ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９９，  ２８４，  １４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ  Ｍ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １９９７，  ３，  １３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｓｕｌｅｗｓｋｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２００１，  ５０，  ５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２０００，  ３２，  １２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ  Ｐ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２００１，  ７，  ２１１−２２８
【非特許文献６】大沢匡毅，  再生医療，  Ｖｏｌ．８，  Ｎｏ．２，  １５７−１６８
【非特許文献７】Ｃｌａｙｔｏｎ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００７，  ４４６，  １８５−１８９
【非特許文献８】Ｂｌａｎｐａｉｎ  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２００４，  １１８，  ６３５−６４８
【非特許文献９】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｅ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００２，  ４１６，  ８５４−６６０
【非特許文献１０】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｋ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２００４，  ６，  １０８２−１０９３
【非特許文献１１】Ｚｕｋ  Ｐ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  ２００２，  １３，  ４２７９−４２９５
【００１０】
しかし、幹細胞におけるマーカータンパク質は、各臓器によって異なり、その分化能も違うことから、その治療目的に合った幹細胞を得ることが重要である。
例えば、再生医療による治療が期待されている疾病として、白皮症、ワーデンバーグ症候群、まだら症などの色素異常症がある。これらの疾病は、色素細胞において色素（メラニン）生成に関わる酵素であるチロシナーゼや、発生過程で色素細胞への分化に関わるＰＡＸ３、ＳＯＸ１０及びＭＩＴＦ、色素細胞の移動や生存に関わるＫＩＴなどの遺伝子に、先天的な異常が認められるため、正常な色素細胞の分布、色素合成が行えないために症状が生じる。これらの疾病を根本的に治療するためには、正常な色素細胞を移植などにより供給するか、生体内に存在する幹細胞を直接、色素細胞へ分化誘導する必要がある。いずれにしても、治療用の色素細胞が必要となるが、これに対して幹細胞は試験管レベルでの培養が可能なこと、また色素細胞への分化誘導についても期待できることから、治療用の色素細胞を確保するために最適な細胞であると考えられている。しかし、現在のところ、色素細胞への分化誘導能を持った幹細胞の分離方法は確立されておらず、色素異常症の治療へ応用するための幹細胞を確保するためには、色素細胞への分化誘導能が高い幹細胞を検出できるマーカータンパク質を発見し、分離技術の開発が必須である。
【００１１】
生体組織から分離した色素細胞への分化能の高い幹細胞や、幹細胞から分化させて得た色素細胞は、色素異常症や白髪の治療用や美白用の医薬品、医薬部外品、化粧品、及び飲食品の開発における有効成分のスクリーニングに応用することが出来る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術に関する問題点を解決し、哺乳動物の皮膚組織から、色素細胞への高い分化能を持つ幹細胞を効率よく検出し、分離培養及び分化誘導する方法を開発することで、幹細胞から効率よく色素細胞を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような事情により、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、生体の発生過程に関わると考えられているＷｎｔシグナル、Ｎｏｔｃｈシグナル、ＢＭＰシグナル、ＴＧＦシグナル、ＦＧＦシグナル、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナルなど、多様なシグナルの中でも、Ｗｎｔシグナルの受容体である、Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５（以下、「Ｌｒｐ５」と記す）及びＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６（以下、「Ｌｒｐ６」と記す）が、色素細胞への分化能を持つ幹細胞において特異的に合成されていることを偶然にも見出した。また、これらをマーカータンパク質とすることで、色素細胞への分化能を持つ幹細胞の効率的な検出及び分離培養方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
【００１５】
（１）マーカータンパク質の発現を指標とすることにより、哺乳動物の皮膚組織から多能性幹細胞を分離する方法であって、マーカータンパク質がＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、及びＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６から１種又は２種選択されることを特徴とする多能性幹細胞の分離方法。
（２）マーカータンパク質の発現を指標とすることにより、哺乳動物の皮膚組織における多能性幹細胞を検出する方法であって、マーカータンパク質がＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、及びＬｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６から１種又は２種選択されることを特徴とする多能性幹細胞の検出方法。
（３）請求項１記載の分離方法により分離することを特徴とする幹細胞。
（４）請求項１記載の分離方法により分離された幹細胞を分化させることを特徴とする色素細胞。
【００１６】
本発明で用いることのできる哺乳動物は、発生、幹細胞の分化の方向性及び分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等が用いることができる。
【００１７】
また、哺乳動物の幹細胞を得る方法としては、マーカータンパク質を指標として、フローサイトメーターなどの機器を利用する方法、磁気細胞分離法、パニング法などが挙げられる。
【００１８】
哺乳動物の幹細胞を検出する方法としては、マーカータンパク質を指標として、フローサイトメーターなどの機器を利用する方法、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法などが挙げられる。
【００１９】
本発明に用いるマーカータンパク質としては、Ｗｎｔシグナルの受容体として知られているＬｒｐ５、Ｌｒｐ６、Ｋｒｅｍｅｎ１、Ｋｒｅｍｅｎ２、Ｒｏｒ２、Ｒｙｋ、ＦＲＬ１のうち、Ｌｒｐ５、Ｌｒｐ６が好ましく、これらを組み合わせると、色素細胞などの各種細胞への分化能が極めて高い幹細胞を検出及び分離することが出来る。
【００２０】
幹細胞を培養する培養液としては、以下のものが使用できる。
【００２１】
具体的には、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＳＣＦ）、の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、増殖速度を増大させるために、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｌ−グルタミン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメントが含有されても良い。また、必要に応じて、抗生物質が含有されても良い。
【００２２】
また、上記培養液には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００２３】
市販品としては、シグマ社製のＳｔｅｍｌｉｎｅ（商標）神経幹細胞増殖培地、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（商標）間葉幹細胞増殖培地、ＤＳファーマメディカルバイオサイエンス社製の間葉系幹細胞葉無血清培地ＳＴＫ２、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ−ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地
インビトロジェン製の間葉系幹細胞用培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地などを用いることが出来る。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、哺乳動物の皮膚組織から、色素細胞への高い分化能を持つ幹細胞を効率よく検出でき、高い純度で幹細胞を分離回収することが可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
幹細胞としての多分化能の評価
皮膚組織からＬｒｐ５及びＬｒｐ６をマーカータンパク質として分離した細胞について、幹細胞の能力である多分化能を評価するため、角化細胞、線維芽細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞、毛包細胞へと分化誘導し、その分化誘導効率を下記の方法にて評価した。
【００２７】
皮膚組織からの細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（生後１日齢）の皮膚組織を無菌的に摘出し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。皮膚組織を１ｃｍ角程度に切断し、０．２５％トリプシン溶液に浸し、４℃で一昼夜インキュベートした。その後、ピンセットで剥がした表皮組織を０．０２％ＥＤＴＡ溶液に浸し、３７℃で１０分間インキュベートした。この溶液を、５０ｍＬ容の遠沈管にセルストレーナー（ＢＤ社製）を通しながら移し、表皮組織を濾過した。５分間遠心後、上清を除去し、ＰＢＳ（−）を加えて細胞を分散させ、洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。
【００２８】
フローサイトメトリーによる細胞の単離回収及び解析
皮膚組織から調製した細胞を、５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で、それぞれ抗Ｌｒｐ５ポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、抗Ｌｒｐ６ポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、抗ＣＤ３４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）と３０分間氷中にて反応させた。反応後、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＰＥ、又はＡＰＣで標識した抗ＩｇＧモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と３０分間氷中にて反応させた。最後に、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、ＰＢＳ（−）中に細胞を懸濁した。これら蛍光標識した細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ社製）にて解析した。ゲートの設定は、ネガティブコントロールを指標にした。まず、前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）、側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）により、残存する赤血球、細胞の残骸、細胞の凝集塊を除いた部分にゲート（Ｐ１）をかけた。次に、ゲート（Ｐ１）内のＬｒｐ５＋及びＬｒｐ６＋細胞を解析し、さらに、染色の組み合わせによりＬｒｐ５＋のみ、及びＬｒｐ６＋のみ、あるいは、Ｌｒｐ５＋に加えてＬｒｐ６＋（以下、Ｌｒｐ５＋／Ｌｒｐ６＋）の組み合わせで細胞に回収ゲートを設定し、それぞれのマーカータンパク質を合成している細胞を回収した。
【００２９】
なお、ゲート（Ｐ１）内のＣＤ３４＋のみで回収ゲートを設定し、回収した細胞を従来の方法とした。
【００３０】
角化細胞への分化誘導及び確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより回収した細胞を、角化細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）に角化細胞増殖因子（ＫＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ社製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は、３日毎に新鮮な角化細胞用培養液に交換した。角化細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（ケラチン）により、ケラチンが染色された細胞の数を指標に行った。
【００３１】
線維芽細胞への分化誘導及び確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより回収した細胞を、線維芽細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ社製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は、３日毎に新鮮な角化細胞用培養液に交換した。線維芽細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（フィブロネクチン）により、フブロネクチンが染色された細胞の数を指標に行った。
【００３２】
皮脂腺細胞への分化誘導及び確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより回収した細胞を、皮脂腺細胞用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ＭｅｄｉｕｍとＦ−１２培養液の１：１混合培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ社製）、テストステロン（シグマ社製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は、３日毎に新鮮な皮脂腺細胞用培養液に交換した。皮脂腺細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（ＰＰＡＲγ）により、ＰＰＡＲγが染色された細胞の数を指標に行った。
【００３３】
脂肪細胞への分化誘導及び確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより回収した細胞を、脂肪細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）にインスリン（シグマ社製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は、３日毎に新鮮な角化細胞用培養液に交換した。角化細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、オイルレッドＯ染色により、脂肪滴が赤く染色された細胞の数を指標に行った。
【００３４】
毛包細胞への分化誘導及び確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより回収した細胞を、毛包細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）にアスコルビン酸マグネシウム（シグマ社製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は、３日毎に新鮮な角化細胞用培養液に交換した。毛包細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（ヘアーケラチン）により、ヘアーケラチンが染色された細胞の数を指標に行った。
【００３５】
各マーカータンパク質をもとに分離した細胞の分化誘導効率（％）の比較
皮膚組織から、それぞれのマーカータンパク質をもとに分離した細胞を、それぞれ色素細胞、角化細胞、線維芽細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞及び毛包細胞へ分化誘導した後、各細胞の染色を行い、顕微鏡観察にて単一細胞数（５００個）当たりの分化した細胞数を計測した。その結果をもとに分化誘導効率（計測した細胞（５００個細胞）中の分化した細胞数の割合％）を算出し、各マーカータンパク質をもとに分離した細胞の分化誘導効率を比較し、表１に示した。
【００３６】
その結果、従来の方法（ＣＤ３４＋をマーカーとした場合）で分離した幹細胞と比較して、Ｌｒｐ５をマーカータンパク質として分離した幹細胞は、角化細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、及び毛包細胞への分化誘導能が、Ｌｒｐ６をマーカータンパク質として分離した幹細胞は、線維芽細胞、皮脂腺細胞、及び脂肪細胞への分化誘導能が、それぞれ優れていた。さらに、Ｌｒｐ５及びＬｒｐ６を組み合わせて分離した細胞は、従来の方法で分離した細胞と比較して、角化細胞、線維芽細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞、及び毛包細胞への分化誘導能が、顕著に優れていた。
【００３７】
【表１】
0005642372.tif 000002
【実施例２】
【００３８】
色素細胞への分化能の評価
皮膚組織からＬｒｐ５及びＬｒｐ６をマーカータンパク質として分離した細胞について、色素細胞へと分化誘導し、その分化誘導効率を下記の方法にて評価した。
【００３９】
皮膚組織からの細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（生後１日齢）の皮膚組織を無菌的に摘出し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。皮膚組織を１ｃｍ角程度に切断し、０．２５％トリプシン溶液に浸し、４℃で一昼夜インキュベートした。その後、ピンセットで剥がした表皮組織を０．０２％ＥＤＴＡ溶液に浸し、３７℃で１０分間インキュベートした。この溶液を、５０ｍＬ容の遠沈管にセルストレーナー（ＢＤ社製）を通しながら移し、表皮組織を濾過した。５分間遠心後、上清を除去し、ＰＢＳ（−）を加えて細胞を分散させ、洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。
【００４０】
フローサイトメトリーによる細胞の単離回収及び解析
皮膚組織から調製した細胞を、５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で、それぞれ抗Ｌｒｐ５ポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、抗Ｌｒｐ６ポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）、抗ＣＤ３４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）と３０分間氷中にて反応させた。反応後、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＰＥ、又はＡＰＣで標識した抗ＩｇＧモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と３０分間氷中にて反応させた。最後に、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、ＰＢＳ（−）中に細胞を懸濁した。これら蛍光標識した細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ社製）にて解析した。ゲートの設定は、ネガティブコントロールを指標にした。まず、前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）、側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）により、残存する赤血球、細胞の残骸、細胞の凝集塊を除いた部分にゲート（Ｐ１）をかけた。次に、ゲート（Ｐ１）内のＬｒｐ５＋及びＬｒｐ６＋細胞を解析し、さらに、染色の組み合わせによりＬｒｐ５＋のみ、及びＬｒｐ６＋のみ、あるいは、Ｌｒｐ５＋に加えてＬｒｐ６＋（以下、Ｌｒｐ５＋／Ｌｒｐ６＋）の組み合わせで細胞に回収ゲートを設定し、それぞれのマーカータンパク質を合成している細胞を回収した。
【００４１】
なお、ゲート（Ｐ１）内のＣＤ３４＋のみで回収ゲートを設定し、回収した細胞を従来の方法とした。
【００４２】
色素細胞への分化誘導及び確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより回収した細胞を、色素細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）にｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ、シグマ社製）及びエンドセリン（１００ｎｇ／ｍＬ、シグマ社製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は、３日毎に新鮮な色素細胞用培養液に交換した。色素細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、フォンタナ・マッソン染色により、メラニンが染色された細胞の数を指標に行った。
【００４３】
各マーカータンパク質をもとに分離した細胞の分化誘導効率（％）の比較
皮膚組織から、それぞれのマーカータンパク質をもとに分離した細胞を、色素細胞へ分化誘導した後、細胞の染色を行い、顕微鏡観察にて単一細胞数（５００個）当たりの分化した細胞数を計測した。その結果をもとに分化誘導効率（計測した細胞（５００個細胞）中の分化した細胞数の割合％）を算出し、各マーカータンパク質をもとに分離した細胞の分化誘導効率を比較し、表２に示した。
【００４４】
その結果、従来の方法（ＣＤ３４＋をマーカーとした場合）で分離した幹細胞と比較して、Ｌｒｐ５、又はＬｒｐ６をマーカータンパク質として分離した細胞は、いずれも色素細胞への分化誘導能が、それぞれ優れていた。さらに、Ｌｒｐ５及びＬｒｐ６を組み合わせて分離した細胞は、従来の方法で分離した細胞と比較して、色素細胞への分化誘導能が、顕著に優れていた。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
以上より、Ｌｒｐ５及びＬｒｐ６をマーカータンパク質とすることで、分化誘導能の優れた幹細胞を分離回収できた。さらに、Ｌｒｐ５及びＬｒｐ６を組み合わせることで、分化誘導能がより優れた幹細胞を分離できることを発見した。また、これらマーカータンパク質を指標とすることで、生体組織における幹細胞の検出が可能であることを確認した。ヒト皮膚を用いた評価においても、同様な結果が得られた。本発明で明らかにした、これらのマーカータンパク質の組み合わせは、生体組織からの幹細胞の分離にきわめて優れており、今後の幹細胞研究に大きく貢献できるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の活用例として、再生医療への応用が期待される。例えば、本発明により、従来に比べて皮膚組織から分化誘導能の高い幹細胞を分離培養することが可能になった。特に、本発明により分離した幹細胞は、色素細胞への高い分化能を保持していることから、色素異常症の治療に用いる幹細胞としては最適である。
本発明により分離した幹細胞は、その他の細胞への分化能も高いことから、その他の難治性疾患の根本的な治療として、本幹細胞の移植治療や、本幹細胞より分化誘導後の各細胞の皮膚移植などへの応用が期待される。
また、本発明は、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品開発への応用も期待される。従来より分化誘導能の高い幹細胞を用いることで、より広範囲のスクリーニングが可能になり、目的の機能を示す化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品における有効成分あるいは原料開発への応用が期待される。