(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０２個の別個の化合物を含む化合物ライブラリーであって、該化合物が、機能性部分の構造を同定するコードオリゴヌクレオチドそれぞれに対応して連結される、２個以上の基礎単位を含む機能性部分を含む、化合物ライブラリーであって、該化合物が、独立して、式：
【化１】
0005646127.tif 000062
の連結成分を有する、式Ｉ：
【化２】
0005646127.tif 000063
［式中：
Ｘは、２個以上の基礎単位を含む機能性部分であり；
Ｚは、その３’末端においてＢに結合するオリゴヌクレオチドであり；
Ｙは、その５’末端においてＣに結合するオリゴヌクレオチドであり；
Ａは、Ｘとの共有結合を形成する官能基であり；
Ｂは、Ｚの３’末端との結合を形成する官能基であり；
Ｃは、Ｙの５’末端との結合を形成する官能基であり；
Ｄ、ＦおよびＥは、それぞれ独立して、二官能性の連結基であり；および
Ｓは、原子または分子骨格であり；
ＹおよびＺは実質的に相補的であり、Ｄ、Ｅ、およびＦは、それぞれ独立して、アルキレン基またはオリゴ（エチレングリコール）基である］
で示される化合物である、化合物ライブラリー。
【請求項２】
前記ライブラリーが、本質的に多数の式Ｉの化合物からなる、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項３】
ＹおよびＺが、ワトソン・クリック塩基対形成および二重鎖形成を適した条件下で可能にするように前記化合物内で配向される、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項４】
ＹおよびＺが同じ長さまたは異なる長さである、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項５】
Ｓが、炭素原子、ホウ素原子、窒素原子、リン原子、または、多原子の骨格である、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項６】
Ｓがリン酸基または環状基である、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項７】
Ｓが、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基である、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項８】
連結成分が、以下の構造：
【化３】
0005646127.tif 000064
［式中：ｎ、ｍおよびｐのそれぞれが独立して、１〜２０の整数である］
である、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項９】
少なくとも１個の基礎単位が、アミノ酸である、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項１０】
Ａがアミノ基であり；
Ｂがリン酸基であり；および
Ｃがリン酸基である、請求項１記載の化合物ライブラリー。
【請求項１１】
ｎ、ｍおよびｐのそれぞれが独立して、２〜８の整数である、請求項８記載の化合物ライブラリー。
【請求項１２】
ｎ、ｍおよびｐのそれぞれが独立して、３〜６の整数である、請求項８記載の化合物ライブラリー。
【請求項１３】
連結成分が、以下の構造：
【化４】
0005646127.tif 000065
である、請求項８記載の化合物ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年１２月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５３０８５４号、２００４年１月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５４０６８１号、２００４年３月１５日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５５３，７１５号および２００４年７月１６日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５８８，６７２号の優先権を主張し、これらのそれぞれの全内容が、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有用な生物学的活性を有する化合物を同定することのより効率的な方法についての探索は、コンビナトリアルライブラリーと呼ばれるコレクションで存在する非常に多数の異なる化合物をスクリーニングするために様々な方法の開発をもたらしている。そのようなライブラリーは１０５以上の別個の化合物を含むことができる。様々な方法が、コンビナトリアルライブラリーを作製するために存在し、また、ペプチド、ペプチドミメティクスおよび小さい有機分子のコンビナトリアル合成が報告されている。
【０００３】
コンビナトリアル法を薬物発見において使用することにおける２つの大きな課題は、十分な複雑性を有するライブラリーの合成、および、使用されたスクリーニングにおいて活性である分子の同定である。ライブラリーの複雑性の程度が大きくなるほど、すなわち、ライブラリーに存在する異なった構造の数が多くなるほど、そのライブラリーが、目的とする活性を有する分子を含有する確率が大きくなることが一般に認められている。従って、ライブラリー合成において用いられる化学は、非常に多数の化合物を合理的な時間枠の範囲内で作製することができなければならない。しかしながら、所与の形式的濃度または全体的濃度のために、ライブラリー内の異なる成分の数を増大させることはいずれかの特定のライブラリー成分の濃度を低下させる。このことは、複雑性が大きいライブラリーからの活性な分子の同定を複雑にしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの障害を克服するための１つの方法が、コードされたライブラリーの開発であり、具体的には、各化合物が増幅可能なタグを含むライブラリーの開発である。そのようなライブラリーには、ライブラリー成分を特定するＤＮＡタグを、分子生物学の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応など）を使用して増幅することができる、ＤＮＡによりコードされたライブラリーが含まれる。しかしながら、非常に大きいライブラリーを作製するためにそのような方法を使用することは未だ実証されておらず、また、そのようなライブラリーを作製するための改善された方法が、薬物発見に対するこの方法の潜在的可能性を実現するために要求されることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、コードオリゴヌクレオチドタグを含む分子のライブラリーを合成する方法を提供する。この方法では、コードオリゴヌクレオチドに連結された第１の基礎単位を含む開始剤を含む溶液を多数の画分に分割（「スプリット」）する「スプリット・アンド・プール」法が利用される。それぞれの画分において、開始剤が、第２の特有の基礎単位と、また、第２の基礎単位を特定する第２の特有のオリゴヌクレオチドと反応する。これらの反応は同時または逐次的であることが可能であり、逐次的である場合、いずれかの反応の前に、他方の反応を行うことができる。画分のそれぞれにおいて作製されたダイマー分子が一緒にされ（「プールされ」）、その後、再び多数の画分に分割される。その後、これらの画分のそれぞれが、第３の特有の（画分特異的な）基礎単位、および、基礎単位をコードする第３の特有のオリゴヌクレオチドと反応させられる。生成物ライブラリーに存在する特有の分子の数は、（１）合成の各工程において使用される異なる基礎単位の数と、（２）プールおよび分割のプロセスが繰り返される回数との関数である。
【０００６】
１つの実施形態において、本発明は、コードオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される機能性部分を含むか、または、そのような機能性部分からなる分子を合成する方法を提供する。この方法は、（１）ｎ個の基礎単位（ｎは１以上の整数である）を含む機能性部分からなる開始剤化合物を提供する工程、この場合、機能性部分は少なくとも１つの反応基を含み、かつ、機能性部分は最初のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される；（２）開始剤化合物を、反応基および相補的な反応基が反応して共有結合を形成するために好適な条件下で、工程（１）の反応基に対して相補的である少なくとも１つの相補的な反応基を含む基礎単位と反応させる工程；（３）最初のオリゴヌクレオチドを、後続オリゴヌクレオチドと最初のオリゴヌクレオチドとを連結するために好適な条件下で、最初のオリゴヌクレオチドと後続オリゴヌクレオチドとの連結を触媒する酵素の存在下、工程（ｂ）の基礎単位を特定する後続オリゴヌクレオチドと反応させる工程を含み、それにより、コードオリゴヌクレオチドに作動可能に連結されるｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分を含むか、または、そのような機能性部分からなる分子を作製する。工程（３）の機能性部分が反応基を含むならば、工程１〜工程３を１回以上繰り返すことができ、それにより、サイクル１からサイクルｉ（ｉは２以上の整数である）までを形成させることができ、この場合、サイクルｓ（ｓはｉ−１以下の整数である）の工程（３）の生成物がサイクルｓ＋１の開始剤化合物になる。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、機能性部分の構造を特定するオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、２つ以上の基礎単位を含む機能性部分を含む化合物のライブラリーを合成する方法を提供する。この方法は、（１）ｍ個の開始剤化合物（ｍは１以上の整数である）を含む溶液を提供する工程、この場合、開始剤化合物は、ｎ個の基礎単位（ｎは１以上の整数である）を含む機能性部分からなり、機能性部分が、そのｎ個の基礎単位を特定する最初のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される；（２）工程（１）の溶液をｒ個の画分（ｒは２以上の整数である）に分割する工程；（３）各画分における開始剤化合物をｒ個の基礎単位の１つと反応させ、それにより、最初のオリゴヌクレオチドに機能的に連結されたｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分からなる化合物を含むｒ個の画分を作製する工程；（４）各画分における最初のオリゴヌクレオチドを、後続オリゴヌクレオチドと最初のオリゴヌクレオチドとの酵素的連結のために好適な条件下で、後続オリゴヌクレオチドと最初のオリゴヌクレオチドとの連結を触媒する酵素の存在下、ｒ個の異なる後続オリゴヌクレオチドからなる１組の中の１つと反応させる工程を含み、それにより、ｎ＋１個の基礎単位をコードする伸長したオリゴヌクレオチドに機能的に連結されたｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分からなる分子を含むｒ個のアリコートを作製する。場合により、この方法は、（５）工程（４）で作製されたｒ個の画分を組換え、それにより、伸長したオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、ｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分からなる化合物を含む溶液を作製する工程をさらに含むことができる。工程（１）〜工程（５）を１回以上行って、サイクル１〜サイクルｉ（ｉは２以上の整数である）を生じさせることができる。サイクルｓ＋１（ｓはｉ−１以下の整数である）において、工程（１）のｍ個の開始剤化合物を含む溶液はサイクルｓの工程（５）の溶液である。同様に、サイクルｓ＋１の工程（１）の開始剤化合物はサイクルｓの工程（５）の化合物である。
【０００８】
好ましい実施形態において、基礎単位は、従来の化学反応を使用して各工程においてカップリングされる。基礎単位は、線状または分枝状のポリマーまたはオリゴマー（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクスおよびペプトイドなど）あるいは非オリゴマー分子（例えば、１つまたは複数のさらなる化学的成分が結合する骨格構造を含む分子など）を作製するためにカップリングすることができる。例えば、基礎単位がアミノ酸残基である場合、基礎単位を、標準的なペプチド合成法（例えば、この分野で知られているような好適な保護／脱保護法を使用する液相合成または固相合成など）を使用してカップリングすることができる。好ましくは、基礎単位は、液相化学を使用してカップリングされる。コードオリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖オリゴヌクレオチドである。コードオリゴヌクレオチドは、好ましくは、基礎単位あたり４塩基または４塩基対〜１２塩基または１２塩基対のオリゴヌクレオチドである。コードオリゴヌクレオチドは、標準的な液相オリゴヌクレオチド合成または固相オリゴヌクレオチド合成の方法論を使用してカップリングすることができるが、好ましくは、液相酵素プロセスを使用してカップリングされる。例えば、オリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼ、リガーゼまたはＤＮＡポリメラーゼを使用して、コードオリゴヌクレオチドの配列がこれらの酵素の１つによる連結のための開始配列を含む場合にはカップリングすることができる。コードオリゴヌクレオチドの酵素的カップリングは下記のような利点をもたらす：（１）標準的な合成的（非酵素的）カップリングと比較して、付加の正確性がより大きいこと；および（２）より簡便な保護／脱保護法の使用。
【０００９】
別の局面において、本発明は下記の式Ｉの化合物を提供する：
【００１０】
【化１３】
0005646127.tif 000002
上記式において、Ｘは、１つまたは複数の基礎単位を含む機能性部分である；Ｚは、その３’末端においてＢに結合するオリゴヌクレオチドである；Ｙは、その５’末端においてＣに結合するオリゴヌクレオチドである；Ａは、Ｘとの共有結合を形成する官能基である；Ｂは、Ｚの３’末端との結合を形成する官能基である；Ｃは、Ｙの５’末端との結合を形成する官能基である；Ｄ、ＥおよびＦはそれぞれが独立して、二官能性の連結基である；かつ、Ｓは原子または分子骨格である。そのような化合物には、本発明の方法を使用して合成される化合物が含まれる。
【００１１】
本発明はさらに、機能性部分の構造をコードするオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、２つ以上の基礎単位を含む機能性部分を含む化合物を含む化合物ライブラリーに関連する。そのようなライブラリーは、約１０２個〜約１０１２個またはそれ以上の別個の成分（例えば、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個または１０１２個またはそれ以上の別個の成分）、すなわち、別個の分子構造を含むことができる。
【００１２】
１つの実施形態において、化合物ライブラリーは、それぞれが下記の式Ｉを有する化合物を含む：
【００１３】
【化１４】
0005646127.tif 000003
上記式において、Ｘは、１つまたは複数の基礎単位を含む機能性部分である；Ｚは、その３’末端においてＢに結合するオリゴヌクレオチドである；Ｙは、その５’末端においてＣに結合するオリゴヌクレオチドである；Ａは、Ｘとの共有結合を形成する官能基である；Ｂは、Ｚの３’末端との結合を形成する官能基である；Ｃは、Ｙの５’末端との結合を形成する官能基である；Ｄ、ＥおよびＦはそれぞれが独立して、二官能性の連結基である；かつ、Ｓは原子または分子骨格である。そのようなライブラリーには、本発明の方法を使用して合成されるライブラリーが含まれる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、生物学的標的に結合する化合物を同定するための方法を提供する。この場合、この方法は下記の工程を含む：（ａ）生物学的標的を本発明の化合物ライブラリーと接触させる工程、この場合、化合物ライブラリーは、機能性部分の構造をコードするオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、２つ以上の基礎単位を含む機能性部分を含む化合物を含む。この工程は、化合物ライブラリーの少なくとも１つの成分が標的に結合するために好適な条件下で行われる；（２）標的に結合しないライブラリー成分を除く工程；（３）標的に結合する化合物ライブラリーの少なくとも１つの成分のコードオリゴヌクレオチドを増幅する工程；（４）工程（３）のコードオリゴヌクレオチドを配列決定する工程；および、工程（５）で決定された配列を使用して、生物学的標的に結合する化合物ライブラリーの成分の機能性部分の構造を決定する工程。
【００１５】
本発明は、所望する性質を有する分子の同定においていくつかの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドタグの存在下で分子を構築するために様々な化学反応を使用することを可能にする。本発明の方法はまた、オリゴヌクレオチドタグをそのように作製された化学構造に取り込む高忠実性の手段を提供する。さらに、本発明の方法は、各成分の非常に多数のコピー体を有するライブラリーの合成を可能にし、それにより、オリゴヌクレオチドタグの増幅および配列決定のための最終ラウンドの後に十分な数の分子を残しながら、生物学的標的に対する多数回の選択を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、化合物およびコンビナトリアル化合物ライブラリーを作製する方法、本発明の方法によって作製される化合物およびライブラリー、ならびに、所望の性質（例えば、所望する生物学的活性など）を有する化合物を同定するために本発明のライブラリーを使用する方法に関連する。本発明はさらに、これらの方法を使用して同定された化合物に関連する。
【００１７】
様々な方法が、コンビナトリアル化学ライブラリーを作製およびスクリーニングするために採用されている。例には、ライブラリーの個々の成分が互いに物理的に分離される方法（例えば、１つの化合物が多数の反応容器のそれぞれにおいて合成されるときなど）が含まれる。しかしながら、このようなライブラリーでは、典型的には、一度に１つの化合物がスクリーニングされるか、または、多くても、一度に数個の化合物がスクリーニングされ、従って、このようなライブラリーは最も効率的なスクリーニング法をもたらしていない。他の方法では、化合物が固体担体上で合成される。そのような固体担体には、特定の化合物が（「位置アドレス指定可能」な）チップまたはメンブランの特定の領域を占めるチップが含まれる。他の方法では、化合物がビーズ上で合成され、この場合、各ビーズが異なる化学構造を含有する。
【００１８】
大きいライブラリーをスクリーニングする際に生じる２つの困難は、（１）スクリーニングされ得る別個の化合物の数；および（２）スクリーニングにおいて活性である化合物の同定である。１つの方法では、スクリーニングにおいて活性である化合物が、最初のライブラリーをさらに一層小さい画分および部分画分に狭めること、それぞれの場合において、活性な化合物を含有する画分または部分画分を選択すること、および、さらに、サブセットのすべての成分を個々に合成し、かつ、所望の活性について評価することができる十分に小さい１組の化合物を含有する活性な部分画分を得るまで部分分割することによって同定される。これは、冗長かつ時間のかかる取り組みである。
【００１９】
コンビナトリアルライブラリースクリーニングの結果を解析する別の方法は、ライブラリー成分が同定用の標識により標識されているライブラリーを利用することである。すなわち、ライブラリーに存在する各標識が、その標識の同定により、標識された分子の構造が明らかになるように、ライブラリーに存在する異なる化合物構造に関連する。標識されたライブラリーに対する１つの方法では、オリゴヌクレオチドタグが利用され、これは、例えば、米国特許第５，５７３，９０５号、同第５，７０８，１５３号、同第５，７２３，５９８号、同第６，０６０，５９６号、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９３／０６１２１、同ＷＯ９３／２０２４２、同ＷＯ９４／１３６２３、同ＷＯ００／２３４５８、同ＷＯ０２／０７４９２９および同ＷＯ０２／１０３００８に記載されるように、また、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９、５３８１〜５３８３（１９９２））、ＮｉｅｌｓｅｎおよびＪａｎｄａ（Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６、３６１〜３７１（１９９４））、ならびに、Ｎｉｅｌｓｅｎ、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＪａｎｄａ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５、９８１２〜９８１３（１９９３））に記載されている（これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。そのようなタグは、タグの多数のコピー体を作製し、配列決定によってタグを同定するために、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅することができる。その後、タグの配列により、結合している分子の構造が特定され、その後、その分子を純粋な形態で合成し、かつ試験することができる。今日まで、大きいライブラリーを調製するための、Ｌｅｒｎｅｒ他によって開示された方法論の使用は報告されていない。本発明は、ＤＮＡによりコードされるライブラリーを作製するための方法における改善を提供し、さらには、機能性部分が液相合成法を使用して合成される、ＤＮＡによりコードされる分子の大きい（成分が１０５以上である）ライブラリーの最初の例を提供する。
【００２０】
本発明は、オリゴヌクレオチドによりコードされるコンビナトリアルライブラリーの容易な合成を可能にし、かつ、そのようなオリゴヌクレオチドタグを非常に大きな分子コレクションの各成分に付加する効率的かつ高忠実性の手段を可能にする方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法は、基礎単位から構成される第１の成分（「機能性部分」）と、第１の成分の構造を特定するオリゴヌクレオチドタグ（すなわち、オリゴヌクレオチドタグにより、どの基礎単位が第１の成分の構築において使用されたか、ならびに、基礎単位が連結された順序が示される）を含む、第１の成分に機能的に連結された第２の成分とを含む二機能性分子を合成するための方法を包含する。一般に、オリゴヌクレオチドタグにより提供される情報は、活性な成分を構築するために使用された基礎単位を決定するために十分である。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドタグの配列は、例えば、ペプチド成分について機能性部分における基礎単位の配置、すなわち、アミノ酸配列を決定するために十分である。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「機能性部分」は、１つまたは複数の基礎単位を含む化学的部分を示す。好ましくは、機能性部分における基礎単位は核酸ではない。機能性部分は線状または分枝状または環状のポリマーまたはオリゴマーあるいは小さい有機分子であり得る。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「基礎単位」は、他の化学的構造ユニットに連結されるか、または、他のそのようなユニットに連結され得る化学的構造ユニットを示す。機能性部分がポリマー状またはオリゴマー状であるとき、基礎単位はポリマーまたはオリゴマーのモノマーユニットである。基礎単位はまた、１つまたは複数のさらなる構造（「周辺基礎単位」）が結合するか、または結合し得る骨格構造（「骨格基礎単位」）を含むことができる。
【００２４】
用語「基礎単位」は、基礎単位が機能性部分に存在し、かつ、機能性部分の合成のために使用される反応性形態でもまた存在するような化学的構造ユニットを示すために本明細書中では使用されることを理解しなければならない。機能性部分において、基礎単位は、基礎単位を機能性部分に取り込むことの結果として失われる基礎単位の任意の一部分を伴うことなく存在する。例えば、結合形成反応により、小分子（下記参照）が放出される場合、基礎単位は、その基礎単位が機能性部分に存在するとき、「基礎単位残基」（すなわち、放出された分子に寄与する原子が喪失した後の、合成で使用された基礎単位の残り部分）である。
【００２５】
基礎単位は、相補的である任意の化学化合物が可能である。すなわち、基礎単位は一緒に反応して、２つ以上の基礎単位を含む構造を形成しなければならない。典型的には、使用される基礎単位のすべてが少なくとも２つの反応基を有する。だが、使用される基礎単位の一部（例えば、オリゴマー状機能性部分における最後の基礎単位）は１つにつき１つだけの反応基を有することが可能である。２つの異なる基礎単位における反応基は相補的でなければならない。すなわち、２つの異なる基礎単位における反応基は一緒に反応して、共有結合を、場合により小分子（例えば、水、ＨＣｌ、ＨＦなど）を同時に失って形成することができなければならない。
【００２６】
本発明の目的のために、２つの反応基が一緒に反応して、共有結合を形成するならば、２つの反応基は相補的である。好ましい実施形態において、結合形成反応は、副生成物の実質的な形成を伴うことなく、周囲条件下で迅速に生じる。好ましくは、所与の反応基が所与の相補的な反応基と正確に１回反応する。１つの実施形態において、２つの基礎単位の相補的な反応基は、例えば、求核置換反応により反応して、共有結合を形成する。１つの実施形態において、１対の相補的な反応基の一方の成分は親電子基であり、その対のもう一方の成分は求核基である。
【００２７】
相補的な親電子基および求核基には、好適な条件下で求核置換により反応して、共有結合を形成する任意の２つの基が含まれる。様々な好適な結合形成反応がこの分野では知られている。例えば、Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９２）、第１０章〜第１６章；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｐｌｅｎｕｍ（１９９０）、第１章〜第１１章；ならびに、Ｃｏｌｌｍａｎ他、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）、第１３章〜第２０章を参照のこと（これらのそれぞれがその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。好適な親電子基の例には、反応性のカルボニル基、例えば、アシルクロリド基、エステル基（カルボニルペンタフルオロフェニルエステル基およびスクシンイミドエステル基を含む）、ケトン基およびアルデヒド基など；反応性のスルホニル基、例えば、スルホニルクロリド基など；および反応性のホスホニル基が含まれる。他の親電子基には、末端のエポキシド基、イソシナート基およびアルキルハリド基が含まれる。好適な求核基には、第一級および第二級のアミノ基、ならびにヒドロキシル基、ならびにカルボキシル基が含まれる。
【００２８】
好適な相補的な反応基が下記に示される。当業者は、本発明の方法において使用することができる他の反応基対を容易に決定することができ、従って、本明細書中に示されるそのような例は限定であることが意図されない。
【００２９】
第１の実施形態において、相補的な反応基には、活性化されたカルボキシル基、反応性のスルホニル基、または反応性のホスホニル基、あるいはそれらの組合せ、および、第一級または第二級のアミノ基が含まれる。この実施形態において、これらの相補的な反応基は好適な条件下で反応して、アミド結合、スルホンアミド結合またはホスホンアミド結合を形成する。
【００３０】
第２の実施形態において、相補的な反応基には、エポキシド基および第一級または第二級のアミノ基が含まれる。エポキシド含有の基礎単位はアミン含有の基礎単位と好適な条件下で反応して、炭素−窒素結合を形成し、β−アミノアルコールをもたらす。
【００３１】
別の実施形態において、相補的な反応基には、アジリジン基および第一級または第二級のアミノ基が含まれる。好適な条件下で、アジリジン含有の基礎単位はアミン含有の基礎単位と反応して、炭素−窒素結合を形成し、１，２−ジアミンをもたらす。第３の実施形態において、相補的な反応基には、イソシナート基および第一級または第二級のアミノ基が含まれる。イソシナート含有の基礎単位はアミン含有の基礎単位と好適な条件下で反応して、炭素−窒素結合を形成し、ウレア基をもたらす。
【００３２】
第４の実施形態において、相補的な反応基には、イソシナート基およびヒドロキシル基が含まれる。イソシナート含有の基礎単位はヒドロキシル含有の基礎単位と好適な条件下で反応して、炭素−酸素結合を形成し、カルバマート基をもたらす。
【００３３】
第５の実施形態において、相補的な反応基には、アミノ基およびカルボニル含有基（例えば、アルデヒド基またはケトン基など）が含まれる。アミンは還元的アミン化によってそのような基と反応して、新しい炭素−窒素結合を形成する。
【００３４】
第６の実施形態において、相補的な反応基には、リンイリド基およびアルデヒド基またはケトン基が含まれる。リンイリド含有の基礎単位はアルデヒド含有またはケトン含有の基礎単位と好適な条件下で反応して、炭素−炭素の二重結合を形成し、アルケンをもたらす。
【００３５】
第７の実施形態において、相補的な反応基は付加環化によって反応して、環状構造を形成する。そのような相補的な反応基の例がアルキンおよび有機アジドであり、これらは好適な条件下で反応して、トリアゾール環構造を形成する。この反応を使用して２つの基礎単位を連結する例が図８に例示にされる。そのような反応のための好適な条件はこの分野では知られており、また、国際特許出願公開ＷＯ０３／１０１９７２（その内容は全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に開示される条件を包含する。
【００３６】
第８の実施形態において、相補的な反応基はアルキルハリドおよび求核基（例えば、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基など）である。そのような基は好適な条件下で反応して、炭素−窒素（アルキルハリド＋アミン）または炭素−酸素（アルキルハリド＋ヒドロキシル基またはカルボニル基）を形成する。
【００３７】
第９の実施形態において、相補的な反応基はハロゲン化ヘテロ芳香族基および求核基であり、基礎単位が芳香族求核置換により好適な条件下で連結される。好適なハロゲン化ヘテロ芳香族基には、塩素化ピリミジン類、塩素化トリアジン類および塩素化プリン類が含まれ、これらは求核剤（例えば、アミンなど）と水溶液中での穏和な条件下で反応する。オリゴヌクレオチド標識されたトリクロロトリアジンとアミンとの反応の代表的な例が図９および図１０に示される。好適な塩素化ヘテロ芳香族基の例が図１１に示される。
【００３８】
機能性部分の合成が、１つの特定のタイプのカップリング反応（例えば、上記で議論された反応のいずれか（これに限定されない）など）によって、または、２つ以上のカップリング反応の組合せ（例えば、上記で議論されたカップリング反応の２つ以上など）によって進行し得ることを理解しなければならない。例えば、１つの実施形態において、基礎単位がアミド結合形成（アミノおよびカルボン酸の相補的な基）および還元アミン化（アミノおよびアルデヒドまたはケトンの相補的な基）の組合せによって連結される。オリゴヌクレオチドの存在と両立するならば、任意のカップリング化学を使用することができる。二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドタグが本明細書中の特定の実施形態において使用されるように、二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖タグよりも化学的に頑強であり、従って、より広範囲の反応条件を許容し、一本鎖タグを用いては不可能である結合形成反応の使用を可能にする。
【００３９】
基礎単位は、機能性部分を形成させるために用いられる反応基（１つまたは複数）に加えて１つまたは複数の官能基を含むことができる。これらのさらなる官能基の１つまたは複数は、これらの官能基の望ましくない反応を防止するために保護することができる。好適な保護基が様々な官能基についてこの分野では知られている（ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）（これは参考として本明細書中に組み込まれる））。特に有用な保護基には、ｔ−ブチルエステルおよびｔ−ブチルエーテル、アセタール、トリチルエーテルおよびアミン、アセチルエステル、トリメチルシリルエーテル、トリクロロエチルエーテルおよびトリクロロエチルエステル、ならびにカルバマートが含まれる。
【００４０】
１つの実施形態において、それぞれの基礎単位は、同じまたは異なり得る２つの反応基を含む。例えば、サイクルｓにおいて付加されるそれぞれの基礎単位は、同じである２つの反応基を含むことができるが、これらは、工程ｓ−１および工程ｓ＋１において付加される基礎単位の反応基に対してともに相補的である。別の実施形態において、それぞれの基礎単位は、自身が相補的である２つの反応基を含む。例えば、ポリアミド分子を含むライブラリーを、２つの第一級アミノ基を含む基礎単位と、２つの活性化されたカルボキシ基を含む基礎単位との間での反応によって作製することができる。得られる化合物において、交互に存在するアミド基は逆の方向性を有するので、Ｎ末端またはＣ末端が存在しない。あるいは、ポリアミドライブラリーを、それぞれがアミノ基および活性化されたカルボキシル基を含む基礎単位を使用して作製することができる。この実施形態において、サイクルの工程ｎにおいて付加された基礎単位は、ｎ−１番目の基礎単位における利用可能な反応基に対して相補的である遊離反応基を有し、一方で、好ましくは、ｎ番目の基礎単位における他の反応基は保護されている。例えば、ライブラリーの成分がＣ末端からＮ末端の方向で合成される場合、付加される基礎単位は、活性化されたカルボキシ基と、保護されたアミノ基とを含む。
【００４１】
機能性部分はポリマー成分またはオリゴマー成分（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、ペプチド核酸またはペプトイドなど）が可能であり、あるいは、機能性部分は、小さい非ポリマー状分子、例えば、中心の骨格を含む構造と、骨格の周辺に配置された構造とを有する分子が可能である。線状ポリマーまたは線状オリゴマーのライブラリーが、２つの反応基を有する基礎単位の使用から得られ、一方、分枝状ポリマーまたは分枝状オリゴマーのライブラリーが、場合により、２つだけの反応基を有する基礎単位との組合せで、３つ以上の反応基を有する基礎単位の使用から得られる。そのような分子は、一般式Ｘ１Ｘ２・・・Ｘｎ（式中、各Ｘは、ｎ個のモノマーユニットを含むポリマーのモノマーユニットであり、ｎは１以上の整数である）によって表すことができる。オリゴマー化合物またはポリマー化合物の場合、末端の基礎単位は２つの官能基を含む必要はない。例えば、ポリアミドライブラリーの場合において、Ｃ末端の基礎単位はアミノ基を含むことができ、しかし、カルボキシル基の存在は随意的である。同様に、Ｎ末端における基礎単位はカルボキシル基を含むことができ、しかし、アミノ基を含有する必要はない。
【００４２】
分枝状のオリゴマー化合物またはポリマー化合物もまた、少なくとも１つの基礎単位が、他の基礎単位と反応し得る３つの官能基を含むならば、合成することができる。本発明のライブラリーは、線状分子、分枝状分子またはそれらの組合せを含むことができる。
【００４３】
ライブラリーはまた、例えば、２つ以上の反応基を有する骨格基礎単位を、１つだけの利用可能な反応基を有する他の基礎単位（例えば、任意のさらなる反応基が保護されているか、あるいは、骨格基礎単位に存在する他の反応基との反応性を有しない場合）との組合せで使用して構築することができる。例えば、１つの実施形態において、合成された分子は一般式Ｘ（Ｙ）ｎ（式中、Ｘは骨格基礎単位であり、各Ｙは、Ｘに連結される基礎単位であり、ｎは少なくとも２の整数であり、好ましくは２〜約６の整数である）によって表すことができる。１つの好ましい実施形態において、サイクル１の最初の基礎単位は骨格基礎単位である。式Ｘ（Ｙ）ｎの分子において、各Ｙは同じまたは異なることが可能であり、しかし、典型的なライブラリーのほとんどの成分において、各Ｙは異なる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のライブラリーはポリアミド化合物を含む。ポリアミド化合物は、２０個の天然に存在するα−アミノ酸（例えば、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、トレオニン（Ｔｈｅ；Ｔ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）など、この場合、各アミノ酸に対する三文字記号および一文字記号が示される）を含めて、任意のアミノ酸に由来する基礎単位から構成され得る。それらの天然に存在する形態において、前記アミノ酸のそれぞれはＬ−立体配置で存在し、これは、別途示されない限り、本明細書中では仮定されるものとする。しかしながら、本発明の方法では、これらのアミノ酸のＤ−立体配置形態もまた使用することができる。これらのＤ−アミノ酸は、本明細書中では、小文字の三文字記号または一文字記号によって、すなわち、ａｌａ（ａ）、ｇｌｙ（ｇ）、ｌｅｕ（ｌ）、ｇｌｎ（ｑ）、ｔｈｒ（ｔ）、ｓｅｒ（ｓ）などによって示される。基礎単位はまた、３−アリールアラニン、例えば、ナフチルアラニン、フェニル置換のフェニルアラニン（これには、４−フルオロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−ブロモフェニルアラニンおよび４−メチルフェニルアラニンが含まれる）など；３−ヘテロアリールアラニン、例えば、３−ピリジルアラニン、３−チエニルアラニン、３−キノリルアラニンおよび３−イミダゾリルアラニンなど；オルニチン；シトルリン；ホモシトルリン；サルコシン；ホモプロリン；ホモシステイン；置換プロリン、例えば、ヒドロキシプロリンおよびフルオロプロリンなど；デヒドロプロリン；ノルロイシン；Ｏ−メチルチロシン；Ｏ−メチルセリン；Ｏ−メチルトレオニンおよび３−シクロヘキシルアラニン（これらに限定されない）をはじめとする他のα−アミノ酸に由来し得る。前述のアミノ酸のそれぞれがＤ−立体配置またはＬ−立体配置のいずれかで使用され得る。
【００４５】
基礎単位はまた、α−アミノ酸でないアミノ酸であり得る：例えば、α−アザアミノ酸；β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸、ε−アミノ酸、およびＮ−置換アミノ酸（例えば、Ｎ−置換グリシンなど）（この場合、Ｎ−置換基は、例えば、置換または非置換のアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基またはヘテロアリールアルキル基であり得る）など。１つの実施形態において、Ｎ−置換基は、天然に存在するα−アミノ酸または天然に存在しないα−アミノ酸に由来する側鎖である。
【００４６】
基礎単位はまた、例えば、ジペプチドミメティク、トリペプチドミメティク、テトラペプチドミメティクまたはペンタペプチドミメティクなどのペプチドミメティク構造であり得る。そのようなペプチドミメティク基礎単位は、好ましくは、これらの基礎単位が成長途中のポリ（アミノアシル）基に付加する化学反応が、他の基礎単位のために使用される化学反応と同じであるか、または類似するように、アミノアシル化合物に由来する。基礎単位はまた、ペプチド骨格修飾を含むペプチドミメティク機能性部分を形成するための、ペプチド結合と等配電子性である結合（例えば、Ψ［ＣＨ２Ｓ］、Ψ［ＣＨ２ＮＨ］、Ψ［ＣＳＮＨ２］、Ψ［ＮＨＣＯ］、Ψ［ＣＯＣＨ２］およびΨ［（Ｅ）または（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］など）を形成することができる分子であり得る。上記で使用された命名法において、Ψはアミド結合の非存在を示す。アミド基に取って代わる構造が括弧内に特定される。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明は、コードオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される機能性部分を含む化合物、またはそのような機能性部分からなる化合物を合成する方法を提供する。この方法は、（１）ｎ個の基礎単位（ｎは１以上の整数である）を含む最初の機能性部分からなる開始剤化合物を提供する工程、この場合、最初の機能性部分は少なくとも１つの反応基を含み、かつ、最初の機能性部分は、ｎ個の基礎単位をコードする最初のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される；（２）開始剤化合物を、反応基および相補的な反応基が反応して共有結合を形成するために好適な条件下で、工程（１）の反応基に対して相補的である少なくとも１つの相補的な反応基を含む基礎単位と反応させる工程；（３）最初のオリゴヌクレオチドを、後続オリゴヌクレオチドと最初のオリゴヌクレオチドとを連結するために好適な条件下で、最初のオリゴヌクレオチドと後続オリゴヌクレオチドとの連結を触媒する酵素の存在下、後続オリゴヌクレオチドと反応させる工程を含み、それにより、コードオリゴヌクレオチドに作動可能に連結されるｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分を含む分子、またはそのような機能性部分からなる分子を作製する。工程（３）の機能性部分が反応基を含むならば、工程１〜工程３を１回以上繰り返すことができ、それにより、サイクル１からサイクルｉ（ｉは２以上の整数である）までを形成させることができ、この場合、サイクルｓ−１（ｓはｉ以下の整数である）の工程（３）の生成物がサイクルｓの工程（１）の開始剤化合物になる。それぞれのサイクルにおいて、１つの基礎単位が成長途中の機能性部分に付加され、１つのオリゴヌクレオチド配列（これは新しい基礎単位をコードする）が成長途中のコードオリゴヌクレオチドに付加される。
【００４８】
好ましい実施形態において、所与のサイクルにおいて付加されたオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列により、同じサイクルにおいて付加された基礎単位が特定されるように、それぞれの個々の基礎単位が別個のオリゴヌクレオチドに関連する。
【００４９】
基礎単位のカップリングおよびオリゴヌクレオチドの連結は、一般には、出発物質および試薬の類似する濃度で行われる。例えば、マイクロモル濃度〜ミリモル濃度の程度（例えば、約１０μＭ〜約１０ｍＭの程度）での反応剤の濃度が、基礎単位の効率的なカップリングを有するために好ましい。
【００５０】
特定の実施形態において、この方法はさらに、工程（２）の後で、何らかの未反応の最初の機能性部分を除く工程を含む。特定のサイクルにおいて何らかの未反応の最初の機能性部分を除くことにより、そのサイクルの最初の機能性部分が、後のサイクルにおいて付加される基礎単位と反応することが防止される。そのような反応は、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応する様々な機能性部分構造を潜在的にはもたらす、１つまたは複数の基礎単位を有しない機能性部分の生成をもたらし得る。そのような除去は、何らかの残っている最初の機能性部分を、工程（２）の反応基と反応する化合物と反応させることによって達成することができる。好ましくは、除去剤化合物は工程（２）の反応基と迅速に反応し、かつ、後のサイクルにおいて付加される基礎単位と反応し得るさらなる反応基を含まない。例えば、工程（２）の反応基がアミノ基である化合物の合成では、好適な除去剤化合物は、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は、各化合物が、オリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、２つ以上の基礎単位を含む機能性部分を含む化合物のライブラリーを作製する方法を提供する。好ましい実施形態において、各分子に存在するオリゴヌクレオチドは、分子内の基礎単位、および、場合により、基礎単位の付加順序を特定するための十分な情報を提供する。この実施形態において、本発明の方法は、機能性部分の構造を特定するオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、２つ以上の基礎単位を含む機能性部分を含む化合物のライブラリーを合成する方法を含む。この方法は、（１）ｍ個の開始剤化合物（ｍは１以上の整数である）を含む溶液を提供する工程、この場合、開始剤化合物は、ｎ個の基礎単位（ｎは１以上の整数である）を含む機能性部分からなり、機能性部分は、そのｎ個の基礎単位を特定する最初のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される；（２）工程（１）の溶液を少なくともｒ個の画分（ｒは２以上の整数である）に分割する工程；（３）各画分をｒ個の基礎単位の１つと反応させ、それにより、最初のオリゴヌクレオチドに機能的に連結されたｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分からなる化合物を含むｒ個の画分を作製する工程；（４）工程（３）のｒ個の画分のそれぞれを、後続オリゴヌクレオチドと最初のオリゴヌクレオチドとの酵素的連結のために好適な条件下で、ｒ個の別個の後続オリゴヌクレオチドからなる１組の中の１つと反応させる工程を含み、それにより、ｎ＋１個の基礎単位をコードする伸長したオリゴヌクレオチドに機能的に連結されたｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分からなる分子を含むｒ個の画分を作製する。場合により、この方法は、（５）工程（４）で作製されたｒ個の画分を組換え、それにより、ｎ＋１個の基礎単位をコードする伸長したオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される、ｎ＋１個の基礎単位を含む機能性部分からなる分子を含む溶液を作製する工程をさらに含むことができる。工程（１）〜工程（５）を１回以上行って、サイクル１〜サイクルｉ（ｉは２以上の整数である）を生じさせることができる。サイクルｓ＋１（ｓはｉ−１以下の整数である）において、工程（１）のｍ個の開始剤化合物を含む溶液はサイクルｓの工程（５）の溶液である。同様に、サイクルｓ＋１の工程（１）の開始剤化合物はサイクルｓの工程（４）の生成物である。
【００５２】
好ましくは、工程（２）の溶液がライブラリー合成の各サイクルにおいてｒ個の画分に分割される。この実施形態において、各画分は特有の基礎単位と反応させられる。
【００５３】
本発明のこれらの方法において、基礎単位および後続オリゴヌクレオチドを加える順序は重要でなく、分子合成の工程（２）および工程（３）、ならびに、ライブラリー合成の工程（３）および工程（４）を逆にすることができる。すなわち、後続オリゴヌクレオチドを、新しい基礎単位が付加される前に、最初のオリゴヌクレオチドに連結することができる。特定の実施形態において、これら２つの工程を同時に行うことが可能である場合がある。
【００５４】
特定の実施形態において、この方法はさらに、工程（２）の後で、何らかの未反応の最初の機能性部分を除く工程を含む。特定のサイクルにおいて何らかの未反応の最初の機能性部分を除くことにより、そのサイクルの最初の機能性部分が、後のサイクルにおいて付加される基礎単位と反応することが防止される。そのような反応は、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応する様々な機能性部分構造を潜在的にはもたらす、１つまたは複数の基礎単位を有しない機能性部分の生成をもたらし得る。そのような除去は、何らかの残っている最初の機能性部分を、工程（２）の反応基と反応する化合物と反応させることによって達成することができる。好ましくは、除去剤化合物は工程（２）の反応基と迅速に反応し、かつ、後のサイクルにおいて付加される基礎単位と反応し得るさらなる反応基を含まない。例えば、工程（２）の反応基がアミノ基である化合物の合成では、好適な除去剤化合物は、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５５】
１つの実施形態において、ライブラリー合成において使用される基礎単位は、ライブラリーの合成のために使用される条件下で適切な相補的な官能基と反応する候補基礎単位の能力を評価することによって、１組の候補基礎単位から選択される。その後、そのような条件下で好適に反応し得ることが示される基礎単位をライブラリーへの組み込みのために選択することができる。所与のサイクルの生成物を、場合により、精製することができる。サイクルが中間のサイクル（すなわち、最終サイクルの前の任意のサイクル）であるとき、これらの生成物は中間体であり、次のサイクルの開始に先だって精製することができる。サイクルが最終サイクルであるならば、サイクルの生成物は最終生成物であり、化合物の何らかの使用に先立って精製することができる。この精製工程では、例えば、未反応の反応剤または過剰な反応剤、および、オリゴヌクレオチド連結のために用いられた酵素を除くことができる。生成物を溶液に存在する他の化学種から分離するために好適である任意の方法を使用することができ、そのような方法には、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）および好適な共溶媒（例えば、エタノールなど）による沈殿化が含まれる。精製のための好適な方法は、生成物の性質および合成のために使用された溶媒系に依存する。
【００５６】
反応は、好ましくは、水溶液（例えば、緩衝化された水溶液など）において行われ、しかし、反応はまた、基礎単位、オリゴヌクレオチド、中間体および最終生成物、ならびに、オリゴヌクレオチド連結を触媒するために使用される酵素の溶解性特性と一致する混合された水性／有機媒体において行うことができる。
【００５７】
上記方法において所与のサイクルによって作製される化合物の理論的数は、サイクルにおいて使用される異なる開始剤化合物の数ｍと、サイクルにおいて加えられる別個の基礎単位の数ｒとの積であることを理解しなければならない。サイクルにおいて作製される別個の化合物の実際の数は、ｒおよびｍの積（ｒｘｍ）と同じくらい大きくなり得るが、特定の基礎単位と、特定の他の基礎単位との反応性の違いを考えると、それよりも小さくなり得る。例えば、特定の基礎単位が特定の開始剤化合物に付加する速度論は、合成サイクルの時間スケールでは、その反応の生成物がほとんど〜全く作製され得ないようであり得る。
【００５８】
特定の実施形態では、共通する基礎単位が、サイクル１に先だって、または、最後のサイクルの後で、または、任意の２つのサイクルの間で加えられる。例えば、機能性部分がポリアミドであるとき、共通するＮ末端封鎖用基礎単位を最終サイクルの後で加えることができる。共通する基礎単位はまた、例えば、機能性部分を、ライブラリー合成後、例えば、環化によって修飾するために利用することができる官能基（例えば、アルキン基またはアジド基など）を付加するために、任意の２つのサイクルの間で導入することができる。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「作動可能に連結される（された）」は、２つの化学的構造が、受けることが予想される様々な操作によって連結されたままであるような方法で一緒に連結される（されている）ことを意味する。典型的には、機能性部分およびコードオリゴヌクレオチドは適切な連結基を介して共有結合的に連結される。連結基は、オリゴヌクレオチドのための結合部位と、機能性部分のための結合部位とを有する二価の成分である。例えば、機能性部分がポリアミド化合物であるとき、ポリアミド化合物を、そのＮ末端において、そのＣ末端において、または、側鎖の１つにおける官能基を介して連結基に結合させることができる。連結基は、ポリアミド化合物およびオリゴヌクレオチドを、少なくとも１個の原子によって、好ましくは、２個以上の原子（例えば、少なくとも２個の原子、少なくとも３個の原子、少なくとも４個の原子、少なくとも５個の原子または少なくとも６個の原子など）によって隔てるために十分である。好ましくは、連結基は、オリゴヌクレオチドとは無関係な様式でポリアミド化合物が標的分子と結合することを可能にするために十分な柔軟性を有する。
【００６０】
１つの実施形態において、連結基はポリアミド化合物のＮ末端およびオリゴヌクレオチドの５’−リン酸基に結合する。例えば、連結基は、活性化されたカルボキシル基を一方の端部に、活性化されたエステルを反対側の端部に含む連結基前駆体に由来し得る。連結基前駆体とＮ末端窒素原子との反応は、連結基をポリアミド化合物またはＮ末端の基礎単位につなぐアミド結合を形成し、一方で、連結基前駆体とオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基との反応は、エステル連結を介した連結基に対するオリゴヌクレオチドの結合をもたらす。連結基は、例えば、ポリメチレン鎖（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−鎖など）またはポリ（エチレングリコール）鎖（例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖など）（式中、両方の場合において、ｎは１〜約２０の整数である）を含むことができる。好ましくは、ｎは２〜約１２であり、より好ましくは、約４〜約１０である。１つの実施形態において、連結基はヘキサメチレン（−（ＣＨ２）６−）基を含む。
【００６１】
基礎単位がアミノ酸残基であるとき、得られる機能性部分はポリアミドである。アミノ酸を、アミド結合の形成のための任意の好適な化学を使用してカップリングすることができる。好ましくは、アミノ酸基礎単位のカップリングが、オリゴヌクレオチドの酵素的連結と適合し得る条件下で、例えば、中性または中性付近のｐＨにおいて水溶液中で行われる。１つの実施形態において、ポリアミド化合物がＣ末端からＮ末端の方向で合成される。この実施形態において、最初の、すなわち、Ｃ末端の基礎単位は、好適な連結基を介して、そのカルボキシル基においてオリゴヌクレオチドにカップリングされる。最初の基礎単位は、活性化されたカルボキシル基および保護されたアミノ基を好ましくは有する２番目の基礎単位と反応させられる。液相アミド結合形成のために好適である任意の活性化基／保護基法を使用することができる。例えば、好適な活性化されたカルボキシル化学種には、アシルフルオリド（米国特許第５，３６０，９２８号、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）、対称的無水物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが含まれる。アシル基はまた、好適な活性化化合物との反応によって、この分野で知られているように、その場で活性化させることができる。好適な活性化化合物には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ｎ−プロパン−ホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）イミド−ホスホリルクロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢｒｏｐ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、Ｃａｓｔｒｏ試薬（ＢＯＰ、ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ）、ジエチルホスホリルシアニド（ＤＥＰＣＮ）、２，５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシ−チオフェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ試薬；ＨＯＴＤＯ）、１，１’−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）および４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）が含まれる。カップリング試薬は単独で使用することができ、または、添加剤との組合せで、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、アザベンゾトリアゾリル−テトラメチルウロニウム塩（ＨＡＴＵ、ＨＡＰｙＵ）または２−ヒドロキシピリジンなどとの組合せで使用することができる。特定の実施形態において、ライブラリーの合成では、構造的に多様な１組の基礎単位の使用を可能にするために、２つ以上の活性化方法の使用が要求される。それぞれの基礎単位について、当業者は適切な活性化方法を決定することができる。
【００６２】
Ｎ末端保護基は、そのプロセスの条件と適合し得る任意の保護基（例えば、液相合成条件のために好適である保護基）が可能である。好ましい保護基はフルオレニルメトキシカルボニル（「Ｆｍｏｃ」）基である。アミノアシル基礎単位の側鎖における潜在的に反応性の官能基はどれもまた、好適に保護する必要がある。好ましくは、側鎖保護基は、Ｎ末端保護基に対して直交する。すなわち、側鎖保護基は、Ｎ末端保護基の除去のために要求される条件とは異なる条件下で除去される。好適な側鎖保護基には、ニトロベラトリル基が含まれ、これは、側鎖カルボキシル基および側鎖アミノ基の両方を保護するために使用することができる。別の好適な側鎖アミノ保護基はＮ−ペンタ−４−エノイル基である。
【００６３】
基礎単位は、機能性部分への組み込みの後、例えば、基礎単位の１つまたは複数における官能基を伴う好適な反応によって修飾することができる。基礎単位の修飾は、最後の基礎単位の付加の後で、または、機能性部分の合成における任意の中間点で、例えば、合成プロセスの任意のサイクルの後で行うことができる。本発明の二機能性分子のライブラリーが合成されるとき、基礎単位の修飾は、ライブラリー全体に対して、または、ライブラリーの一部分に対して行うことができ、それにより、ライブラリーの複雑性の程度を増大させることができる。好適な基礎単位修飾反応には、機能性部分およびコードオリゴヌクレオチドと適合し得る条件下で行うことができるそのような反応が含まれる。そのような反応の例には、アミノ基またはヒドロキシル基のアシル化およびスルホン化、アミノ基のアルキル化、カルボキシル基のエステル化またはチオエステル化、カルボキシル基のアミド化、アルケンのエポキシド化、ならびに、この分野で知られている他の反応が含まれる。機能性部分が、アルキン官能基またはアジド官能基を有する基礎単位を含むとき、アジド／アルキンの付加環化反応を、基礎単位を誘導体化するために使用することができる。例えば、アルキンを含む基礎単位を有機アジドと反応させることができるか、または、アジドを含む基礎単位をアルキンと反応させることができ、これにより、いずれの場合でも、トリアゾール環を形成させることができる。基礎単位の修飾反応を、最後の基礎単位を付加した後で、または、合成プロセスにおける中間点で行うことができ、また、様々な化学的構造（これには、炭水化物、金属結合性部分、および、特定の生体分子または組織タイプを標的化するための構造が含まれる）を機能性部分に付けるために使用することができる。
【００６４】
別の実施形態において、機能性部分は基礎単位の線状の連続体を含み、この線状連続体は、好適な反応を使用して環化される。例えば、線状アレイにおける少なくとも２つの基礎単位がスルフヒドリル基を含む場合、スルフヒドリル基を酸化して、ジスルフィド連結を形成させることができ、それにより、線状アレイを環化することができる。例えば、機能性部分は、２つ以上のＬ−システイン成分もしくはＤ−システイン成分および／またはＬ−ホモシステイン成分もしくはＤ−ホモシステイン成分を含むオリゴヌクレオチドであり得る。基礎単位はまた、一緒に反応して、線状アレイを環化することができる他の官能基（例えば、カルボキシル基およびアミノ基またはヒドロキシル基など）を含むことができる。
【００６５】
好ましい実施形態において、線状アレイにおける基礎単位の１つがアルキン基を含み、線状アレイにおける別の基礎単位がアジド基を含む。アジド基およびアルキン基は、付加環化によって反応するように誘導することができ、それにより、マクロ環構造の形成をもたらすことができる。図９に例示される例において、機能性部分は、プロパルギルグリシン基礎単位をそのＣ末端に含み、かつ、アジドアセチル基をそのＮ末端に含むポリペプチドである。好適な条件下でのアルキン基およびアジド基の反応は、トリアゾール構造をマクロ環内に含む環状化合物の形成をもたらす。ライブラリーの場合、１つの実施形態において、ライブラリーの各成分がアルキン含有の基礎単位およびアジド含有の基礎単位を含み、ライブラリーの各成分をこの方法で環化することができる。第２の実施形態において、ライブラリーのすべての成分がアルキン含有の基礎単位およびアジド含有の基礎単位を含み、しかし、ライブラリーの一部分のみが環化される。第３の実施形態において、特定の機能性部分のみがアルキン含有の基礎単位およびアジド含有の基礎単位を含み、これらの分子のみが環化される。前述の第２および第３の実施形態において、ライブラリーは、付加環化反応の後、環状および線状の両方の機能性部部分を含む。
【００６６】
オリゴヌクレオチドは、酵素的方法を使用して連結される。１つの実施形態において、最初の基礎単位が最初のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される。第２の基礎単位を最初の基礎単位にカップリングする前またはその後で、第２の基礎単位を特定する第２のオリゴヌクレオチド配列が最初のオリゴヌクレオチドに連結される。最初のオリゴヌクレオチド配列および後続のオリゴヌクレオチド配列を連結するための方法が図１および図２に示される。図１において、最初のオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、一方の鎖は、第２のオリゴヌクレオチドの一方の末端に対して相補的であり、かつ、第２のオリゴヌクレオチドを最初のオリゴヌクレオチドと接触させる突出配列を含む。好ましくは、最初のオリゴヌクレオチドの突出する配列および第２のオリゴヌクレオチドの相補的配列はともに少なくとも４塩基であり、より好ましくは、両方の配列はともに同じ長さである。最初のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、好適な酵素を使用して連結することができる。最初のオリゴヌクレオチドが最初の基礎単位に鎖の一方（「上部鎖」）の５’末端に連結される場合、上部鎖に対して相補的である鎖（「下部鎖」）はその５’末端に突出配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドはその５’末端に相補的配列を含む。第２のオリゴヌクレオチドを連結した後、第２のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的であり、突出した相補的配列に対して３’側であり、かつ、さらなる突出配列を含む鎖を加えることができる。
【００６７】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、図２に示されるように伸長される。成長途中の機能的性部分に結合したオリゴヌクレオチド、および後続オリゴヌクレオチドが、最初のオリゴヌクレオチドの３’末端に対して相補的である領域と、後続オリゴヌクレオチドの５’末端に対して相補的である領域とを含む「添え木」配列の使用による連結のために配置される。添え木はオリゴヌクレオチドの５’末端を後続オリゴの３’末端の近傍にもたらし、連結が、酵素による連結を使用して達成される。図２に例示される実施形態において、最初のオリゴヌクレオチドは１６個の核酸塩基からなり、添え木は３’末端においてその６塩基に対して相補的である。後続オリゴヌクレオチドは１２個の核酸塩基からなり、添え木は５’末端においてその６塩基に対して相補的である。添え木の長さおよび相補的領域の長さは重要ではない。しかしながら、相補的領域は、安定なダイマー形成を連結の条件下で可能にするために十分に長くなければならず、しかし、最終的な分子において過度に大きいコードヌクレオチドを生じさせるほど長くあってはならない。相補的領域は長さが約４塩基〜約１２塩基であること、より好ましくは約５塩基〜約１０塩基であること、最も好ましくは約５塩基〜約８塩基であることが好ましい。
【００６８】
１つの実施形態において、最初のオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、２つの鎖が共有結合的に連結される。２つの鎖を共有結合的に連結する１つの手段が図３に示される。図３では、連結成分が、２つの鎖と、機能性部分とを連結するために使用される。連結成分は、基礎単位と反応するために適合する第１の官能基と、オリゴヌクレオチドの３’末端と反応するために適合する第２の官能基と、オリゴヌクレオチドの５’末端と反応するために適合する第３の官能基とを含む任意の化学的構造が可能である。好ましくは、第２の官能基および第３の官能基は、２つの鎖のハイブリダイゼーションを可能にする相対的な配向で２つのオリゴヌクレオチド鎖を配置するように配向している。例えば、連結基は下記の一般式（Ｉ）を有することができる：
【００６９】
【化１５】
0005646127.tif 000004
式中、Ａは、基礎単位との共有結合を形成することができる官能基であり、Ｂは、オリゴヌクレオチドの５’末端との結合を形成することができる官能基であり、Ｃは、オリゴヌクレオチドの３’末端との結合を形成することができる官能基である。Ｄ、ＥおよびＦは、官能基Ａ、官能基Ｂおよび官能基Ｃを、コア原子または骨格であるＳに連結する化学基である。好ましくは、Ｄ、ＥおよびＦは、それぞれが独立して、原子の鎖（例えば、アルキレン鎖またはオリゴ（エチレングリコール）鎖など）であり、Ｄ、ＥおよびＦは同じまたは異なることが可能であり、好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび機能性部分の合成を可能にするために効果的である。１つの実施形態において、三価のリンカーは下記の構造を有する：
【００７０】
【化１６】
0005646127.tif 000005
この実施形態において、ＮＨ基は基礎単位に対する結合のために利用可能であり、一方、末端のリン酸基はオリゴヌクレオチドに対する結合のために利用可能である。
【００７１】
最初のオリゴヌクレオチドが二本鎖である実施形態において、後続オリゴヌクレオチドもまた二本鎖である。図３に示されるように、最初のオリゴヌクレオチドは、突出配列を提供する、もう一方の鎖よりも長い１つの鎖を有することができる。この実施形態において、後続オリゴヌクレオチドは、最初のオリゴヌクレオチドの突出配列に対して相補的である突出配列を含む。これらの２つの相補的な突出配列のハイブリダイゼーションは、後続オリゴヌクレオチドを、最初のオリゴヌクレオチドに対する連結のために所定位置にもたらす。この連結を、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼを使用して酵素的に行うことができる。後続オリゴヌクレオチドおよび最初のオリゴヌクレオチドの突出配列は、好ましくは同じ長さであり、２個以上のヌクレオチド（好ましくは、２個〜約１０個のヌクレオチド、より好ましくは、２個〜約６個のヌクレオチド）からなる。１つの好ましい実施形態において、後続オリゴヌクレオチドは、突出配列を両末端に有する二本鎖のオリゴヌクレオチドである。一方の末端における突出配列は最初のオリゴヌクレオチドの突出配列に対して相補的であり、一方、後続オリゴヌクレオチドおよび最初のオリゴヌクレオチドを連結した後では、反対側の末端における突出配列が次のサイクルの最初のオリゴヌクレオチドの突出配列になる。１つの実施形態において、３つの突出配列はすべてが２ヌクレオチド長〜６ヌクレオチド長であり、後続オリゴヌクレオチドのコード配列は長さが３ヌクレオチド〜１０ヌクレオチド（好ましくは、３ヌクレオチド〜６ヌクレオチド）である。特定の実施形態において、突出配列はすべてが２ヌクレオチド長であり、コード配列は長さが５ヌクレオチドである。
【００７２】
図４に例示される実施形態において、後続の鎖は、両方の鎖の５’末端において突出部を残して、最初のオリゴヌクレオチドの３’末端に対して相補的である領域をその３’末端に有する。５’末端は、例えば、二本鎖の伸長したオリゴヌクレオチドをもたらすＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｖｅｎｔポリメラーゼなど）を使用する際に充填することができる。このオリゴヌクレオチドの下部鎖は除くことができ、さらなる配列を、同じ方法を使用して上部鎖の３’末端に付加することができる。
【００７３】
コードオリゴヌクレオチドタグが、それぞれの連続した基礎単位を特定するオリゴヌクレオチドの連続した付加の結果として形成される。本発明の方法の１つの実施形態において、連続したオリゴヌクレオチドタグを酵素的連結によってカップリングして、コードオリゴヌクレオチドを作製することができる。
【００７４】
オリゴヌクレオチドの酵素触媒による連結を、核酸フラグメントを連結する能力を有する任意の酵素を使用して行うことができる。例示的な酵素には、リガーゼ、ポリメラーゼおよびトポイソメラーゼが含まれる。本発明の具体的な実施形態において、ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ６．５．１．１）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．７）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．６）またはトポイソメラーゼ（ＥＣ５．９９．１．２）が、オリゴヌクレオチドを連結するために使用される。それぞれのＥＣクラスに含まれる酵素を、例えば、Ｂａｉｒｏｃｈ（２０００）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：３０４〜５に記載されるように見出すことができる。
【００７５】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド連結を触媒するために使用される酵素はＤＮＡリガーゼである。連結がリガーゼの存在下で生じるためには、すなわち、ホスホジエステル結合を２つのオリゴヌクレオチドの間で形成させるためには、一方のオリゴヌクレオチドは遊離５’リン酸基を有しなければならず、かつ、もう一方のオリゴヌクレオチドは遊離３’ヒドロキシル基を有しなければならない。本発明の方法において使用することができる例示的なＤＮＡリガーゼには、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ（大腸菌）が含まれる（これらはすべてが、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＭＡ）から入手可能である）。
【００７６】
当業者は、連結のために使用される各酵素が最適な活性を特定の条件（例えば、温度、緩衝液濃度、ｐＨおよび時間）のもとで有することを理解する。これらの条件のそれぞれを、オリゴヌクレオチドタグの最適な連結を得るために、例えば、製造者の説明書に従って調節することができる。
【００７７】
後続オリゴヌクレオチドは任意の望ましい長さを有し得るが、好ましくは、少なくとも３ヌクレオチド長である。より好ましくは、後続オリゴヌクレオチドは長さが４ヌクレオチド以上である。１つの実施形態において、後続オリゴヌクレオチドは長さが３ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドである。本発明のライブラリーにおける分子のオリゴヌクレオチドは、この分野で知られているように、ＰＣＲのためのプライマーとして役立ち得る共通の末端配列を有することが好ましい。そのような共通の末端配列は、ライブラリー合成の最終サイクルにおいて付加される後続オリゴヌクレオチドの末端端部として取り込むことができ、または、ライブラリー合成の後で、例えば、本明細書中に開示される酵素的連結方法を使用して加えることができる。
【００７８】
本発明の方法の好ましい実施形態が図５に示される。このプロセスは、アミノ基で終わるリンカーに対してその５’末端において結合する合成されたＤＮＡ配列とともに開始される。工程１において、この出発ＤＮＡ配列が、Ｔｒｉｓ緩衝液中で、添え木ＤＮＡ鎖、ＤＮＡリガーゼおよびジチオスレイトールの存在下、後続のＤＮＡ配列に連結される。これにより、タグ標識されたＤＮＡ配列がもたらされ、これは、その後、次の工程でそのまま使用することができるか、あるいは、次の工程に進行する前に、例えば、ＨＰＬＣまたはエタノール沈殿を使用して精製することができる。工程２において、タグ標識されたＤＮＡを、保護されている活性化されたアミノ酸（この例では、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸フルオリド）と反応させ、保護されたアミノ酸−ＤＮＡコンンジュゲートを生じさせる。工程３において、保護されたアミノ酸−ＤＮＡコンンジュゲートを、例えば、ピペリジンの存在下で脱保護し、得られた脱保護コンジュゲートを、場合により、例えば、ＨＰＬＣまたはエタノール沈殿によって精製する。脱保護コンジュゲートは最初の合成サイクルの生成物であり、２番目のアミノ酸残基を脱保護コンジュゲートの遊離アミノ基に付加する２番目のサイクルのための出発物質になる。
【００７９】
ＰＣＲが、選択された分子のコードオリゴヌクレオチドを増幅するために使用されることになる実施形態において、コードオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＰＣＲプライマー配列を含む。例えば、ＰＣＲプライマー配列を、合成の最初のサイクルに先だって、最初のオリゴヌクレオチドに含めることができ、または、最初の後続オリゴヌクレオチドとともに含めることができる。コードオリゴヌクレオチドはまた、コード配列が続く封鎖用のＰＣＲプライマー配列を含むことができる。キャッピング配列を、ライブラリー合成の最終サイクルの後でコードオリゴヌクレオチドに連結することができ、または、最終サイクルの後続オリゴヌクレオチドに含めることができる。ＰＣＲプライマー配列が後続オリゴヌクレオチドに含められる場合、これらの後続オリゴヌクレオチドは、コード配列およびＰＣＲプライマー配列の両方を含むので、好ましくは、それ以外のサイクルにおいて付加された後続オリゴヌクレオチドよりも著しく長い。
【００８０】
キャッピング配列が、最後の基礎単位および最後の後続オリゴヌクレオチドを付加した後で加えられる場合、本明細書中に示されるようなライブラリーの合成は、ライブラリー成分の実質的にすべてのオリゴヌクレオチド部分が、ＰＣＲプライマー配列を含む配列で終わるように、キャッピング配列をコードオリゴヌクレオチドに連結する工程を含む。本発明のライブラリーにおいて使用される好適なＰＣＲプライマー配列はこの分野では知られており、好適なプライマーおよび方法が、例えば、Ｉｎｎｉｓ他編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、この内容はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に示される。好ましくは、キャッピング配列は、最終合成サイクルの生成物であるプールされた画分に対する連結によって加えられる。キャッピング配列は、ライブラリーの構築において使用される酵素プロセスを使用して加えることができる。
【００８１】
上記で示されたように、本発明の方法の一部としてのオリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって決定することができる。
【００８２】
オリゴヌクレオチドタグは、本明細書中に記載されるように機能性部分を構成する基礎単位を特定するポリヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドタグの核酸配列は、オリゴヌクレオチドタグを下記のようなＰＣＲ反応に供することによって決定される。適切なサンプルが、事前に選択されたヌクレオチド配列を対のそれぞれの成分が有するＰＣＲプライマー対と接触させられる。ＰＣＲプライマー対は、コードオリゴヌクレオチドタグにおけるＰＣＲプライマー結合部位にハイブリダイゼーションすることによってプライマー伸長反応を開始させることができる。ＰＣＲプライマー結合部位は、好ましくは、コードオリゴヌクレオチドタグの中に設計される。例えば、ＰＣＲプライマー結合部位を最初のオリゴヌクレオチドタグの中に組み込むことができ、また、第２のＰＣＲプライマー結合部位を最後のオリゴヌクレオチドタグの中に組み込むことができる。あるいは、第２のＰＣＲプライマー結合部位を、本明細書中に記載されるようなキャッピング配列の中に組み込むことができる。好ましい実施形態において、ＰＣＲプライマー結合部位は、長さが、少なくとも５ヌクレオチド、７ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２２ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチドである。
【００８３】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対（好ましくは、その所定量）をＰＣＲ緩衝液においてコードオリゴヌクレオチドタグの核酸（好ましくは、その所定量）と混合して、ＰＣＲ反応混合物を形成することによって行われる。混合物は、ＰＣＲ反応生成物の形成のために十分である一定のサイクル数（これは典型的には事前に決定される）について熱サイクル処理される。十分な量の生成物は、ＤＮＡ配列の決定を可能にするために、十分な量で単離することができる量である。
【００８４】
ＰＣＲは、典型的には、下限が約３０℃〜約５５℃であり、かつ、上限が約９０℃〜約１００℃である温度範囲で、ＰＣＲ反応混合物を熱サイクル処理することによって、すなわち、ＰＣＲ反応混合物の温度の上昇および下降を繰り返すことによって行われる。上昇および下降は連続的であり得るが、好ましくは、ポリヌクレオチドの合成、変性およびハイブリダイゼーションのために好都合である温度のそれぞれにおける相対的な温度安定性を有する時間を伴って段階的である。
【００８５】
ＰＣＲ反応は、任意の好適な方法を使用して行われる。一般には、ＰＣＲ反応は、好ましくは、７〜９のｐＨで、緩衝化された水溶液（すなわち、ＰＣＲ緩衝液）において行われる。好ましくは、モル過剰量のプライマーが存在する。大きなモル過剰が、プロセスの効率を改善するために好ましい。
【００８６】
ＰＣＲ緩衝液はまた、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ポリヌクレオチド合成の基質である）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに、ポリメラーゼ（典型的には熱安定性）を、すべて、プライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応のための十分な量で含有する。得られる溶液（ＰＣＲ混合物）は約９０℃〜１００℃に約１分間〜１０分間（好ましくは１分間〜４分間）加熱される。この加熱期間の後、溶液は、プライマーのハイブリダイゼーションのために好ましい５４℃に冷却される。合成反応を、室温から、ポリメラーゼ（誘導因子）がもはや効率的に機能しない温度を超える温度までに及ぶ温度において行うことができる。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが使用される場合、温度は一般に約４０℃を超える。熱サイクル処理が、所望する量のＰＣＲ生成物が作製されるまで繰り返される。例示的なＰＣＲ緩衝液は下記の試薬を含む：５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．００１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゼラチン；２００μＭのｄＡＴＰ；２００μＭのｄＴＴＰ；２００μＭのｄＣＴＰ；２００μＭのｄＧＴＰ；および１００マイクロリットルの緩衝液について２．５ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼＩ。
【００８７】
プライマー配列を伸長させるための好適な酵素には、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および、それぞれの核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物を形成するために適正な様式でヌクレオチドの組合せを容易にする他の酵素（熱安定性酵素を含む）が含まれる。一般に、合成は各プライマーの３’末端において開始され、合成が停止するまでテンプレート鎖に沿って５’方向で進行し、これにより、種々の長さの分子が作製される。
【００８８】
新たに合成されたＤＮＡ鎖およびその相補的な鎖は、合成プロセスの続く工程において使用することができる二重鎖分子を形成する。
【００８９】
ＰＣＲ増幅法が、米国特許第４，６８３，１９２号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号において、また、少なくとも、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ他編、Ａｃａｄｅｍｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０））において詳しく記載される。すべての前述の文書の内容は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９０】
プライマー伸長によって合成されるプライマー、プローブおよび核酸フラグメントまたは核酸セグメントに関連して本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド（好ましくは、３つ以上のデオキシリボヌクレオチド）から構成される分子として定義される。
【００９１】
本明細書中で使用される用語「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件に置かれたとき、すなわち、ヌクレオチドおよび重合用因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）の存在下、好適な温度およびｐＨで核酸合成の開始点として作用することができるポリヌクレオチド（核酸制限消化物から精製されているか、または、合成的に作製されているかのいずれかであっても）を示す。プライマーは、好ましくは、最大限の効率のために一本鎖であり、しかし、代替として、二本鎖形態であってもよい。二本鎖である場合、プライマーは最初に、その相補的な鎖から分離するために処理され、その後、伸長生成物を調製するために使用される。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合用因子の存在下での伸長生成物の合成を可能にするために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマー源をはじめとする多くの要因に依存する。
【００９２】
本明細書中で使用されるプライマーは、増幅されるそれぞれの特定の配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーが、そのそれぞれのテンプレート鎖とランダムにハイブリダイゼーションしないように十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映していることがあり、または反映していないことがある。
【００９３】
ポリヌクレオチドプライマーは、任意の好適な方法を使用して、例えば、Ｎａｒａｎｇ他（１９７９）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０；米国特許第４，３５６，２７０号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，４１６，９８８号、米国特許第４，２９３，６５２号；および、Ｂｒｏｗｎ他（１９７９）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９に記載されるホスホトリエステル法またはホスホジエステル法などを使用して調製することができる。すべての前述の文書の内容は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９４】
コードオリゴヌクレオチドタグが増幅されると、タグの配列、および、究極的には、選択された分子の組成を、核酸配列分析（ヌクレオチド配列の配列を決定するための広く知られている技術）を使用して決定することができる。核酸配列分析は、（ａ）プローブ鎖＋その相補的な標的のハイブリダイゼーションまたは変性に基づく物理化学的技術、および（ｂ）ポリメラーゼを用いた酵素反応の組合せによって行われる。
【００９５】
本発明はさらに、単離された化学種としてであっても、または、化学構造体のライブラリーを形成するためにプールされているとしてであっても、本発明の方法を使用して作製することができる化合物、および、そのような化合物のコレクションに関連する。本発明の化合物は下記の式の化合物を包含する：
【００９６】
【化１７】
0005646127.tif 000006
式中、Ｘは、１つまたは複数の基礎単位を含む機能性部分であり、Ｚは、その３’末端においてＢに結合するオリゴヌクレオチドであり、Ｙは、その５’末端においてＣに結合するオリゴヌクレオチドである。Ａは、Ｘとの共有結合を形成する官能基であり、Ｂは、Ｚの３’末端との結合を形成する官能基であり、Ｃは、Ｙの５’末端との結合を形成する官能基である。Ｄ、ＥおよびＦは、官能基Ａ、官能基Ｂおよび官能基Ｃを、コア原子または骨格であるＳに連結する化学基である。好ましくは、Ｄ、ＥおよびＦは、それぞれが独立して、アルキレン鎖またはオリゴ（エチレングリコール）鎖などの原子の鎖であり、Ｄ、ＥおよびＦは同じまたは異なることができ、好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび機能性部分の合成を可能にするために効果的である。
【００９７】
好ましくは、ＹおよびＺは実質的に相補的であり、かつ、ワトソン・クリック塩基対形成および二重鎖形成を好適な条件下で可能にするように化合物内で配向される。ＹおよびＺは同じ長さまたは異なる長さである。好ましくは、ＹおよびＺが同じ長さであるか、または、ＹおよびＺの一方が他方よりも１塩基〜１０塩基長い。好ましい実施形態において、ＹおよびＺは、それぞれが１０塩基長以上であり、かつ、１０塩基対以上の相補的領域を有する。より好ましくは、ＹおよびＺはそれらの長さ全体を通して実質的に相補的である。すなわち、ＹおよびＺは１０塩基対毎に多くても１つのミスマッチを有する。より好ましくは、ＹおよびＺはそれらの長さ全体を通して相補的である。すなわち、ＹまたはＺにおける任意の突出領域を除いて、鎖は、それらの全長全体においてミスマッチを伴うことなく、ワトソン・クリック塩基対形成によりハイブリダイゼーションする。
【００９８】
Ｓは単原子または分子骨格であり得る。例えば、Ｓは、炭素原子、ホウ素原子、窒素原子またはリン原子、あるいは多原子の骨格（例えば、リン酸基または環状基（例えば、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基など）など）であり得る。１つの実施形態において、リンカーは下記の構造の基である：
【００９９】
【化１８】
0005646127.tif 000007
式中、ｎ、ｍおよびｐのそれぞれが独立して、１〜約２０の整数であり、好ましくは、２〜８の整数であり、最も好ましくは、３〜６の整数である。１つの具体的な実施形態において、リンカーは、下記に示される構造を有する：
【０１００】
【化１９】
0005646127.tif 000008
１つの実施形態において、本発明のライブラリーは、基礎単位から構成される機能性部分からなる分子を含み、この場合、それぞれの機能性部分がコードオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される。コードオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列により、機能性部分に存在する基礎単位が示され、一部の実施形態では、基礎単位の接続性または配置が示される。本発明は、機能性部分を構築するために使用される方法論と、オリゴヌクレオチドタグを構築するために使用される方法論とを、同じ反応媒体において、好ましくは、水性媒体において行うことができ、従って、先行技術における方法と比較して、ライブラリーを調製する方法を簡略化することができるという利点を提供する。オリゴヌクレオチドの連結工程および基礎単位の付加工程をともに水性媒体中で行うことができる特定の実施形態において、それぞれの反応は異なるｐＨ至適を有する。このような実施形態において、基礎単位の付加反応を好適な水性緩衝液において好適なｐＨおよび温度で行うことができる。緩衝液は、その後、オリゴヌクレオチド連結のための好適なｐＨを提供する水性緩衝液に交換することができる。
【０１０１】
本発明の方法の利点の１つは、本発明の方法を使用して、非常に多数の化合物を含むライブラリーを調製することができることである。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの知られている方法を使用してコードオリゴヌクレオチド配列を増幅することができることは、比較的少ないコピー体が回収される場合でさえ、選択された分子を同定することができることを意味する。このことは、その大きな程度の複雑性の結果として、任意の所与のライブラリー成分の比較的少数のコピー体を含むか、または、非常に大きな体積の使用を要求するかのいずれかである非常に大きいライブラリーの実用的な使用を可能にする。例えば、各構造が１ｘ１０１２個のコピー体（約１ピコモル）を有する１０８個の互いに異なる構造からなるライブラリーは１μＭの有効濃度で約１００Ｌの溶液を要求する。同じライブラリーについて、各成分が１，０００，０００コピーによって表されるならば、要求される体積は１μＭの有効濃度で１００μＬである。
【０１０２】
好ましい実施形態において、ライブラリーは約１０３コピー〜約１０１５コピーの各ライブラリー成分を含む。ライブラリー成分間の合成効率の違いを考えると、異なるライブラリー成分が任意の所与のライブラリーにおいて異なる数のコピー体を有することが考えられる。従って、ライブラリーにおいて理論的に存在する各成分のコピー体の数は同じあるかもしれないが、任意の所与のライブラリー成分のコピー体の実際の数は、任意の他の成分のコピー体の数とは無関係である。より好ましくは、本発明の化合物ライブラリーは少なくとも約１０５コピー、１０６コピーまたは１０７コピーの各ライブラリー成分または実質的にすべてのライブラリー成分を含む。「実質的にすべて」のライブラリー成分によって、ライブラリーの成分の少なくとも約８５％、好ましくは、ライブラリーの成分の少なくとも約９０％、より好ましくは、ライブラリーの成分の少なくとも約９５％が意味される。
【０１０３】
好ましくは、ライブラリーは、生物学的標的に対する多数回（すなわち、２回以上）の選択を行うことができる各成分のコピー体の十分な数を含み、結合性分子の十分な量が、残っている分子のオリゴヌクレオチドタグの増幅、および、従って、結合性分子の機能性部分の特定を可能にするために、最終ラウンドの選択の後で残っている。そのような選択プロセスの概略図が図６に例示される。図６において、１および２はライブラリー成分を表し、Ｂは標的分子であり、Ｘは、選択媒体からのＢの除去を可能にするＢに機能的に連結された成分である。この例において、化合物１はＢに結合し、一方、化合物２はＢに結合しない。選択プロセスは、ラウンド１において示されるように、（Ｉ）化合物１および化合物２を含むライブラリーを、Ｂに対する化合物１の結合のために好適な条件下でＢ−Ｘと接触させること；（ＩＩ）結合していない化合物２を除くこと；（ＩＩＩ）化合物１をＢから解離させ、ＢＸを反応媒体から除くことを含む。ラウンド１の結果は、化合物２に対して化合物１が濃縮されている分子のコレクションである。工程Ｉ〜工程ＩＩＩを用いるその後のラウンドは、化合物２に対して化合物１のさらなる濃縮をもたらす。３ラウンドの選択が図６には示されるが、実際には、任意の回数を、非結合性分子に対する結合性分子の所望する濃縮を達成するために用いることができる（例えば、１ラウンド〜１０ラウンド）。
【０１０４】
図６に示される実施形態では、いずれかの選択ラウンドの後で残っている化合物の増幅（そのような化合物のより多くのコピー体の合成）は行われない。そのような増幅は、選択後に残っている化合物の相対的な量と一致しない化合物の混合物をもたらし得る。この不一致は、特定の化合物が他の化合物よりも容易に合成されることがあり、従って、選択後のそれらの存在に比例しない様式で増幅されることがあるという事実に起因する。例えば、化合物２が化合物１よりも容易に合成されるならば、ラウンド２の後に残っている分子の増幅は、化合物１に対して化合物２の不釣り合いな増幅をもたらし、化合物２に対して化合物１の（生じるならば）はるかに低下した濃縮を伴う化合物の混合物をもたらす。
【０１０５】
１つの実施形態において、標的が、任意の知られている固定化技術によって固体担体に固定化される。固体担体は、例えば、クロマトグラフィーカラム内に含有される水不溶性マトリックス、またはメンブランであり得る。コードされるライブラリーを、クロマトグラフィーカラム内に含有される水不溶性マトリックスに加えることができる。その後、カラムは、非特異的な結合体を除くために洗浄される。その後、標的と結合した化合物を、ｐＨ、塩濃度、有機溶媒濃度を変化させることによって、または他の方法（例えば、標的に対する既知のリガンドとの競合など）によって解離させることができる。
【０１０６】
別の実施形態において、標的は溶液中で自由であり、コードされたライブラリーとインキュベーションされる。標的（これは本明細書中では「リガンド」とも呼ばれる）に結合する化合物が、サイズ分離工程（例えば、ゲルろ過または限外ろ過など）によって選択的に単離される。１つの実施形態において、コードされる化合物の混合物および標的生体分子が、任意のリガンド−標的複合体を非結合の化合物から分離するサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ゲルろ過）に通される。リガンド−標的複合体は、リガンドを標的から解離させる逆相クロマトグラフィーカラムに移される。解離したリガンドは、その後、コードオリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅および配列分析によって分析される。この方法は、標的の固定化が活性の喪失をもたらし得る状況では特に好都合である。
【０１０７】
単一リガンドが上記プロセスによって特定されると、様々なレベルの分析を、構造−活性関係の情報を得るために、また、リガンドの親和性、特異性および生物活性のさらなる最適化を導くために適用することができる。同じ骨格に由来するリガンドについては、三次元分子モデル化を、リガンドに共通する重要な構造的特徴を特定し、それにより、標的生体分子上の共通する部位においておそらくは結合する小分子リガンドの様々なファミリーを作製するために用いることができる。
【０１０８】
様々なスクリーニング法を、１つの標的について大きい親和性を有し、しかし、別の近縁の標的についてはそれよりも著しく弱い親和性を有するリガンドを得るために使用することができる。１つのスクリーニング戦略は、並行実験において双方の生体分子についてリガンドを同定し、かつ、続いて相互参照の比較によって共通のリガンドを除くことである。この方法では、それぞれの生体分子に対するリガンドを、上記で開示されたように別々に同定することができる。この方法は、固定化された標的生体分子と、溶液中で遊離状態にある標的生体分子との両方と適合する。
【０１０９】
固定化された標的生体分子について、別の方法は、非標的生体分子に結合するすべてのリガンドをライブラリーから除く予備選択工程を加えることである。例えば、第１の生体分子を、上記のようなコードされたライブラリーと接触させることができる。第１の生体分子に結合しない化合物が、その後、形成している何らかの第１の生体分子−リガンド複合体から分離される。その後、第２の生体分子が、第１の生体分子に結合しなかった化合物と接触させられる。第２の生体分子に結合する化合物を上記のように同定することができ、第２の生体分子に結合する化合物は、第２の生体分子について、第１の生体分子に対するよりも著しく大きい親和性を有し得る。
【０１１０】
上記で開示された方法によって同定される、機能が不明な生体分子に対するリガンドもまた、そのような生体分子の生物学的機能を明らかにするために使用することができる。新しい遺伝子配列が同定され続けているが、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能、ならびに、新薬発見および新薬開発のために標的としてのこれらのタンパク質の妥当性は、明らかにすることが困難であり、また、ゲノム情報を疾患の処置に適用することに対する最も著しい障害をおそらくは表しているので、このことは好都合である。本発明において記載される方法によって得られる標的特異的なリガンドは、標的タンパク質の機能と、治療的介入のための標的タンパク質の妥当性との両方を理解するために、細胞生物学的アッセイ全体において、または適切な動物モデルにおいて効果的に用いることができる。この方法はまた、標的が小分子薬物の発見を特に容易にもたらすことを立証することができる。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明のライブラリーに含まれる１つまたは複数の化合物が特定の生体分子に対するリガンドとして同定される。これらの化合物は、その後、その生体分子に結合する能力についてインビトロアッセイで評価することができる。好ましくは、結合性化合物の機能性部分が、オリゴヌクレオチドタグまたはリンカー部分を伴うことなく合成され、これらの機能性部分が、その生体分子に結合する能力について評価される。
【０１１２】
生体分子の機能に対する、機能性部分が生体分子に結合することの影響もまた、インビトロでの無細胞アッセイまたは細胞型アッセイを使用して評価することができる。既知の機能を有する生体分子については、アッセイは、例えば、活性（例えば、酵素活性など）の直接的な測定によって、または、間接的な計測（例えば、生体分子によって影響を受ける細胞機能）によって、リガンドの存在下および非存在下での生体分子の活性の比較を含むことができる。生体分子が機能不明であるならば、その生体分子を発現する細胞をリガンドと接触させることができ、細胞の生存性、機能、表現型および／または遺伝子発現に対するリガンドの影響が評価される。インビトロアッセイは、例えば、細胞死アッセイ、細胞増殖アッセイまたはウイルス複製アッセイが可能である。例えば、生体分子が、ウイルスにより発現されるタンパク質であるならば、ウイルス感染細胞を、そのタンパク質に対するリガンドと接触させることができる。その後、ウイルス生存性に対する、リガンドがそのタンパク質に結合することの影響を評価することができる。
【０１１３】
本発明の方法によって同定されるリガンドはまた、インビボモデルまたはヒトにおいて評価することができる。例えば、リガンドを、その生体分子を産生する動物または生物において評価することができる。動物または生物の健康な状態における何らかの生じる変化（例えば、疾患の進行）を明らかにすることができる。
【０１１４】
機能が不明な生体分子（例えば、タンパク質または核酸分子など）については、その生体分子を産生する細胞または生物に対する、その生体分子に結合するリガンドの影響は、その生体分子の生物学的機能に関する情報を提供する。例えば、特定の細胞プロセスがリガンドの存在下で阻害されるという観測結果は、そのプロセスが少なくとも部分的にはその生体分子の機能に依存することを示している。
【０１１５】
本発明の方法を使用して同定されたリガンドはまた、リガンドが結合する生体分子に対する親和性試薬として使用することができる。１つの実施形態において、そのようなリガンドは、例えば、１つまたは複数のそのようなリガンドが結合する固相を使用する、その生体分子を含む溶液のクロマトグラフィーによる生体分子のアフィニティー精製を行うために使用される。
【０１１６】
本発明は、限定であるとして解釈すべきではない下記の実施例によってさらに例示される。本出願明細書全体を通して引用されているすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに、図および配列表は、参考として本明細書により組み込まれる。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１：成分がおよそ１０５個であるライブラリーの合成および特長づけ）
およそ１０５個の別個の成分を含むライブラリーの合成を、下記の試薬を使用して達成した。
【０１１８】
化合物１：
【０１１９】
【化２０】
0005646127.tif 000009
一文字の文字はデオキシリボヌクレオチドをコードする：
Ａ＝アデノシン
Ｃ＝シチジン
Ｇ＝グアノシン
Ｔ＝チミジン。
【０１２０】
基礎単位前駆体：
【０１２１】
【化２１】
0005646127.tif 000010
【０１２２】
【化２２】
0005646127.tif 000011
【０１２３】
【化２３】
0005646127.tif 000012
【０１２４】
【化２４】
0005646127.tif 000013
【０１２５】
【化２５】
0005646127.tif 000014
【０１２６】
【化２６】
0005646127.tif 000015
１Ｘリガーゼ緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１０ｍＭジチオスレイトール；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２．５ｍＭ  ＡＴＰ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０１２７】
１０Ｘリガーゼ緩衝液：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１００ｍＭジチオスレイトール；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２５ｍＭ  ＡＴＰ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０１２８】
（サイクル１）
１２個のＰＣＲチューブのそれぞれに、５０μＬの化合物１の水における１ｍＭ溶液；７５μＬのタグ１．１〜１．１２の１つの０．８０ｍＭ溶液；１５μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液および１０μＬの脱イオン水を加えた。チューブを９５℃に１分間加熱し、その後、１０分かけて１６℃に冷却した。それぞれのチューブに、５０μＬの１Ｘリガーゼ緩衝液における５，０００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（２．５μＬの２，０００，０００ユニット／ｍＬ溶液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２））を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。
【０１２９】
連結後、サンプルを１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、２０μＬの５ＭのＮａＣｌ水溶液および５００μＬの冷却された（−２０℃）エタノールにより処理し、−２０℃で１時間保った。遠心分離後、上清を除き、ペレットを−２０℃での７０％水性エタノールにより洗浄した。その後、ペレットのそれぞれを１５０μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解した。
【０１３０】
基礎単位前駆体ＢＢ１〜ＢＢ１２の各１つ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエタノールアミンおよびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートを、それぞれが０．２５Ｍの濃度で含むストック溶液を、ＤＭＦにおいて調製し、室温で２０分間撹拌した。基礎単位前駆体の溶液を上記ペレット溶液のそれぞれに加えて、リンカーに対して１０倍過剰の基礎単位前駆体を得た。得られた溶液を撹拌した。さらに１０当量の基礎単位前駆体を２０分後に反応混合物に加え、４０分後にさらに１０当量を加えた。反応混合物におけるＤＭＦの最終濃度は２２％であった。その後、反応溶液を４℃で一晩撹拌した。反応の進行を、５０ｍＭ酢酸テトラエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ＝７．５）およびアセトニトリル、ならびに、１４分間にわたる２％〜４６％のアセトニトリルのグラジエントを使用するＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。反応を、出発物質（リンカー）の約９５％がアシル化されているとき、停止させた。アシル化の後、反応混合物をプールし、凍結乾燥して乾固した。その後、凍結乾燥物をＨＰＬＣによって精製し、ライブラリー（アシル化生成物）に対応する画分をプールし、凍結乾燥した。
【０１３１】
ライブラリーを２．５ｍｌの０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）に溶解し、０．１ｍｌのピペリジン（４％ｖ／ｖ）をそれに加えた。ピペリジンの添加は濁りをもたらし、これは混合時に溶解しない。反応混合物を室温で５０分間撹拌し、その後、濁った溶液を遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）し、上清を、２００μｌのピペットを使用して取り出し、ペレットを０．１ｍｌの水に再懸濁した。水性洗浄液を上清と一緒にし、ペレットを捨てた。脱保護されたライブラリーを、反応液におけるエタノールの最終濃度を７０％ｖ／ｖにするように過剰な氷冷エタノールの添加によって溶液から沈殿させた。水性エタノール混合物の遠心分離により、ライブラリーを含む白色のペレットを得た。ペレットを冷７０％ａｑ．エタノールにより１回洗浄した。溶媒を除いた後、ペレットを風乾（約５分）して、微量のエタノールを除き、その後、サイクル２において使用した。ラウンド１で使用されたタグおよび対応する基礎単位前駆体を下記の表１に示す。
【０１３２】
【表１】
0005646127.tif 000016
（サイクル２〜５）
これらのサイクルのそれぞれのために、前サイクルから得られる一緒にされた溶液を、それぞれが５０ｕｌの１２個の等量のアリコートに分割し、ＰＣＲチューブに入れた。各チューブに、異なるタグを含む溶液を加え、そして、サイクル３〜５については、サイクル１について記載されるＨＰＬＣ精製工程を省略したことを除いて、連結、精製およびアシル化を、サイクル１について記載されるように行った。サイクル２〜５についてのタグおよび基礎単位前駆体の間の対応を表２に示す。
【０１３３】
サイクル５の生成物を、タグの連結について上記に記載される方法を使用して、下記に示される停止用プライマーと連結した。
【０１３４】
【化２７】
0005646127.tif 000017
【０１３５】
【表２】
0005646127.tif 000018
（結果：）
上記の合成手順は、１２５（約２４９，０００）個の異なる構造を含むライブラリーを作製する能力を有する。ライブラリーの合成を各サイクルの生成物のゲル電気泳動によってモニターした。５サイクルのそれぞれ、および、停止用プライマーを連結した後の最終ライブラリーの結果が、図７に例示される。「先頭断片」と記された化合物は化合物１である。図は、各サイクルが分子量の予想された増大をもたらしていること、および、各サイクルの生成物が分子量に関して実質的に均一であることを示している。
【０１３６】
（実施例２：成分がおよそ１０８個であるライブラリーの合成および特長づけ）
およそ１０８個の別個の成分を含むライブラリーの合成を、下記の試薬を使用して達成した。
【０１３７】
化合物２：
【０１３８】
【化２８】
0005646127.tif 000019
一文字の文字はデオキシリボヌクレオチドをコードする：
Ａ＝アデノシン
Ｃ＝シチジン
Ｇ＝グアノシン
Ｔ＝チミジン。
【０１３９】
基礎単位前駆体：
【０１４０】
【化２９】
0005646127.tif 000020
【０１４１】
【化３０】
0005646127.tif 000021
【０１４２】
【化３１】
0005646127.tif 000022
【０１４３】
【化３２】
0005646127.tif 000023
【０１４４】
【化３３】
0005646127.tif 000024
【０１４５】
【化３４】
0005646127.tif 000025
【０１４６】
【表３−１】
0005646127.tif 000026
【０１４７】
【表３−２】
0005646127.tif 000027
【０１４８】
【表３−３】
0005646127.tif 000028
【０１４９】
【表３−４】
0005646127.tif 000029
【０１５０】
【表３−５】
0005646127.tif 000030
【０１５１】
【表３−６】
0005646127.tif 000031
【０１５２】
【表３−７】
0005646127.tif 000032
【０１５３】
【表４−１】
0005646127.tif 000033
【０１５４】
【表４−２】
0005646127.tif 000034
【０１５５】
【表４−３】
0005646127.tif 000035
【０１５６】
【表４−４】
0005646127.tif 000036
【０１５７】
【表５−１】
0005646127.tif 000037
【０１５８】
【表５−２】
0005646127.tif 000038
【０１５９】
【表５−３】
0005646127.tif 000039
【０１６０】
【表５−４】
0005646127.tif 000040
【０１６１】
【表６−１】
0005646127.tif 000041
【０１６２】
【表６−２】
0005646127.tif 000042
【０１６３】
【表６−３】
0005646127.tif 000043
【０１６４】
【表６−４】
0005646127.tif 000044
【０１６５】
【表６−５】
0005646127.tif 000045
【０１６６】
【表７−１】
0005646127.tif 000046
【０１６７】
【表７−２】
0005646127.tif 000047
【０１６８】
【表７−３】
0005646127.tif 000048
【０１６９】
【表７−４】
0005646127.tif 000049
１Ｘリガーゼ緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１０ｍＭジチオスレイトール；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭ  ＡＴＰ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０１７０】
１０Ｘリガーゼ緩衝液：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１００ｍＭジチオスレイトール；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２０ｍＭ  ＡＴＰ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０１７１】
（化合物２に対する水溶性スペーサーの結合）
４℃に冷却された、ホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）における化合物２の溶液（６０ｍＬ、１ｍＭ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）における４０当量のＮ−Ｆｍｏｃ−１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサオクタデカン酸（Ｓ−Ａｄｏ）（１６ｍＬ、０．１５Ｍ）を加え、その後、水における４０当量の４−（４，６−ジメトキシ［１．３．５］トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド水和物（ＤＭＴＭＭ）（９．６ｍＬ、０．２５Ｍ）を加えた。混合物を４℃で２時間穏やかに撹拌し、その後、さらに４０当量のＳ−ＡｄｏおよびＤＭＴＭＭを加え、４℃でさらに１６時間振とうした。
【０１７２】
アシル化の後、０．１Ｘ体積の５ＭのＮａＣｌ水溶液および２．５Ｘ体積の冷却された（−２０℃）エタノールを加え、混合物を−２０℃で少なくとも１時間放置した。その後、混合物を４℃において１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、白色のペレットを得て、これを冷ＥｔＯＨにより洗浄し、次いで、室温で３０分間、凍結乾燥機において乾燥した。固体を４０ｍＬの水に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製した。二成分移動相グラジエントプロフィルを使用して、生成物を溶出させた（５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液緩衝液（ｐＨ７．５）および９９％アセトニトリル／１％水の溶液を使用した）。精製物を凍結乾燥によって濃縮し、得られた残渣を５ｍＬの水に溶解した。０．１Ｘ体積のピペリジンを溶液に加え、混合物を室温で４５分間穏やかに振とうした。その後、生成物を、上記で記載されたようにエタノール沈殿によって精製し、遠心分離によって単離した。得られたペレットを冷ＥｔＯＨにより２回洗浄し、凍結乾燥によって乾燥して、精製された化合物３を得た。
【０１７３】
（サイクル１）
９６ウエルプレートにおける各ウエルに、化合物３の水における４ｍＭ溶液の１２．５μＬ、表３に示されるようなオリゴヌクレオチドタグ１．１〜１．９６の１つの１ｍＭ溶液の１００μＬを加えた（化合物３対タグのモル比は１：２であった）。プレートを９５℃に１分間加熱し、その後、１０分かけて１６℃に冷却した。各ウエルに、１０μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液、３０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１μＬの３０ユニット／μＬ溶液（ＦｅｒｍｅｎｔａｓＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＥＬ００１３））、７６．５μｌの水を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。
【０１７４】
連結反応の後、２０μＬの５ＭのＮａＣｌ水溶液を各ウエルに直接に加え、その後、５００μＬの冷却された（−２０℃）エタノールを加え、−２０℃で１時間保った。プレートを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓを使用してＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離機において３２００ｇで１時間遠心分離した。上清を、プレートを反転させることによって注意深く除き、ペレットを−２０℃での７０％の冷却された水性エタノールにより洗浄した。その後、ペレットのそれぞれを１ｍＭの濃度にホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に溶解し、４℃に冷却した。
【０１７５】
各溶液に、ＤＭＦにおける４０当量の９６個の基礎単位前駆体の１つ（１３μＬ、０．１５Ｍ）を加え、その後、水における４０当量のＤＭＴ−ＭＭ（８μＬ、０．２５Ｍ）を加え、溶液を４℃で穏やかに振とうした。２時間後、さらに４０当量の各基礎単位前駆体の１つおよびＤＭＴＭＭを加え、溶液を４℃で１６時間穏やかに振とうした。アシル化の後、ＤＭＦにおける１０当量の酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２μＬ、０．２５Ｍ）を各溶液に加え、１０分間穏やかに振とうした。
【０１７６】
アシル化の後、９６個の反応混合物をプールし、０．１体積の５ＭのＮａＣｌ水溶液および２．５体積の冷却された無水エタノールを加え、溶液を−２０℃で少なくとも１時間放置した。その後、混合物を遠心分離した。遠心分離後、できる限り多くの上清をマイクロピペットにより除き、ペレットを冷エタノールにより洗浄し、再び遠心分離した。上清を２００μＬのピペットにより除いた。冷却された７０％エタノールをチューブに加え、得られた混合物を４℃で５分間遠心分離した。
【０１７７】
上清を除き、残留するエタノールを、室温での１０分間の凍結乾燥によって除いた。その後、ペレットを２ｍＬの水に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製した。二成分移動相グラジエントプロフィルを使用して、ライブラリーを溶出させた（５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液緩衝液（ｐＨ７．５）および９９％アセトニトリル／１％水の溶液を使用した）。ライブラリーを含有する画分を集め、プールし、凍結乾燥した。得られた残渣を２．５ｍＬの水に溶解し、２５０μＬのピペリジンを加えた。溶液を４５分間穏やかに振とうし、以前に記載されたように、エタノール沈殿した。得られたペレットを凍結乾燥によって乾燥し、１ｍＭの濃度にホウ酸ナトリウム緩衝液（４．８ｍＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に溶解した。
【０１７８】
溶液を４℃に冷却し、それぞれ４０当量のＤＭＦにおけるＮ−Ｆｍｏｃ−プロパルギルグリシン（１．２ｍＬ、０．１５Ｍ）および水におけるＤＭＴ−ＭＭ（７．７ｍＬ、０．２５Ｍ）を加えた。混合物を４℃で２時間穏やかに振とうし、その後、さらに４０当量のＮ−Ｆｍｏｃ−プロパルギルグリシンおよびＤＭＴ−ＭＭを加え、溶液をさらに１６時間振とうした。その後、混合物を、上記で記載されたようにＥｔＯＨ沈殿および逆相ＨＰＬＣによって精製し、そして、Ｎ−Ｆｍｏｃ基を、前記で記載されたようにピペリジンによる処理によって除いた。ＥｔＯＨ沈殿による最終精製のとき、得られたペレットを凍結乾燥によって乾燥し、次の合成サイクルに持ち込んだ。
【０１７９】
（サイクル２〜４）
これらのサイクルのそれぞれのために、前サイクルから得られた乾燥ペレットを水に溶解し、ライブラリーの濃度を、ライブラリーのＤＮＡ成分の吸光係数に基づいて分光光度法によって求めた（この場合、化合物２の最初の吸光係数は１３１，５００Ｌ／（ｍｏｌ．ｃｍ）である）。ライブラリーの濃度を、その後の連結反応における最終濃度が０．２５ｍＭであるように水を用いて調節した。その後、ライブラリーを９６ウエルプレートにおいて９６個の等量のアリコートに分割した。各ウエルに、異なるタグを含む溶液を加え（ライブラリー対タグのモル比は１：２であった）、連結を、サイクル１について記載されたように行った。サイクル２、サイクル３およびサイクル４で使用されたオリゴヌクレオチドタグを、表４、表５および表６にそれぞれ示す。サイクル１〜４のそれぞれについてのタグと基礎単位前駆体との対応を表７に示す。ライブラリーを、サイクル１について上記で記載されたようにエタノールの添加によって沈殿させ、１ｍＭの濃度にホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に溶解した。続くアシル化および精製を、ＨＰＬＣ精製がサイクル３のときには省略されたことを除いて、サイクル１について記載されたように行った。
【０１８０】
サイクル４の生成物を、タグの連結について上記に示される方法を使用して、下記に示される停止用プライマーと連結した。
【０１８１】
【化３５】
0005646127.tif 000050
（結果：）
上記の合成手順は、９６４（約１０８）個の異なる構造を含むライブラリーを作製する能力を有する。ライブラリーの合成を各サイクルの生成物のゲル電気泳動およびＬＣ／ＭＳによってモニターした。完了したとき、ライブラリーを、いくつかの技術を使用して分析した。図１３ａは、サイクル４の後であるが、停止用プライマーを連結する前のライブラリーのクロマトグラムである；図１３ｂは、同じ合成段階でのライブラリーの質量スペクトルである。平均分子量を負イオンＬＣ／ＭＳ分析によって決定した。イオンシグナルを、ＰｒｏＭａｓｓソフトウエアを使用して解析した。この結果は、ライブラリーの予測された平均質量と一致している。
【０１８２】
ライブラリーのＤＮＡ成分をアガロースゲル電気泳動によって分析した。アガロースゲル電気泳動は、ライブラリー物質の大部分が、正しいサイズの連結された生成物に対応することを示した。ライブラリーのサンプリングに由来するＰＣＲ生成物の分子クローンのＤＮＡ配列分析は、ＤＮＡの連結が、大きい忠実度で、かつ、ほぼ完全に生じていたことを示している。
【０１８３】
（ライブラリーの環化）
サイクル４が完了したとき、ライブラリーの一部を、通常のアシル化条件下でアジド酢酸を使用してＮ末端において封鎖した。ＥｔＯＨ沈殿による精製の後の生成物をリン酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ８）に１ｍＭの濃度に溶解し、それぞれ４当量の水におけるＣｕＳＯ４（２００ｍＭ）、水におけるアスコルビン酸（２００ｍＭ）、および、ＤＭＦにおける下記に示される化合物の溶液（２００ｍＭ）を加えた。その後、反応混合物を室温で２時間穏やかに振とうした。
【０１８４】
【化３６】
0005646127.tif 000051
環化の程度をアッセイするために、ライブラリー環化反応液からの５μＬのアリコートを取り出し、実施例４で記載されるように調製された蛍光標識されたアジドまたはアルキン（１００ｍＭのＤＭＦストック液の１μＬ）により処理した。１６時間後、アルキン標識またはアジド標識はいずれも、５００ｎｍでのＨＰＬＣ分析により、ライブラリーに取り込まれていなかった。この結果は、ライブラリーが、付加環化を行うことができるアジド基またはアルキン基をもはや含有していなかったこと、および、従って、ライブラリーは、環化反応または分子間反応のいずれかによって自身と反応しなければならないことを示していた。環化されたライブラリーを、以前に記載されたように逆相ＨＰＬＣによって精製した。非環化ライブラリーを使用するコントロール実験は上記の蛍光性タグの完全な取り込みを示した。
【０１８５】
（実施例４：環化アッセイのための蛍光性タグの調製）
別個のチューブにおいて、プロパルギルグリシンまたは２−アミノ−３−フェニルプロピルアジド（それぞれ８μｍｏｌ）をｐＨ９．４のホウ酸塩緩衝液（２５０μＬ）においてＦＡＭ−ＯＳｕ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）（１．２当量）と一緒にした。反応を室温で３時間進行させ、その後、一晩凍結乾燥した。ＨＰＬＣによる精製により、所望する蛍光性のアルキンおよびアジドを定量的収率で得た。
【０１８６】
【化３７】
0005646127.tif 000052
（実施例５：アジド／アルキン付加環化反応を使用する個々の化合物の環化）
（アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−ＮＨ２の調製：）
０．３ｍｍｏｌのＲｉｎｋ−アミド樹脂を使用することにより、示された配列を、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸および活性化剤としてのＨＡＴＵを用いて標準的な固相合成技術を使用して合成した（Ｐｒａ＝Ｃ−プロパルギルグリシン）。アジド酢酸を、このテトラペプチドを封鎖するために使用した。ペプチドを、２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを用いて４時間、樹脂から切断した。ＲＰ  ＨＰＬＣによる精製により、生成物を白色の固体として得た（７５ｍｇ、５１％）。
【０１８７】
【化３８】
0005646127.tif 000053
（アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−ＮＨ２の環化：）
【０１８８】
【化３９】
0005646127.tif 000054
アジドアセチルペプチド（３１ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（３０ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１ｍＬ）およびＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（１ｍｇ）を加えた。１．５時間撹拌した後、溶液をエバポレーションし、得られた残渣を２０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏに溶解した。遠心分離して、不溶性の塩を除いた後、溶液を調製用の逆相ＨＰＬＣに供した。所望する環状ペプチドが白色の固体として単離された（１０ｍｇ、３２％）。
【０１８９】
【化４０】
0005646127.tif 000055
（アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−Ｇｌｙ−ＯＨの調製：）
０．３ｍｍｏｌのグリシン−Ｗａｎｇ樹脂を使用することにより、示された配列を、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸および活性化剤としてのＨＡＴＵを使用して合成した。アジド酢酸を、このペンタペプチドを封鎖するために、最後のカップリング工程で使用した。ペプチドの切断を、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭを２時間使用して達成した。ＲＰ  ＨＰＬＣによる精製により、ペプチドが白色の固体として単離された（８３ｍｇ、５０％）。
【０１９０】
【化４１】
0005646127.tif 000056
（アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−Ｇｌｙ−ＯＨの環化：）
ペプチド（３２ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（６０ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）およびＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（１ｍｇ）を加え、溶液を２時間撹拌した。溶媒をエバポレーションし、粗生成物をＲＰ  ＨＰＬＣに供して、二量体および三量体を除いた。環状の単量体を無色のガラス物として単離した（６ｍｇ、２０％）。
【０１９１】
【化４２】
0005646127.tif 000057
イオン源フラグメントによるＥＳＩＭＳ：５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、４８０．４（［Ｍ−Ｇｌｙ］、３０％）、４５２．２（［Ｍ−Ｇｌｙ−ＣＯ］、２５％）、４２４．５（［Ｍ−Ｇｌｙ−２ＣＯ］、１０％、これは環状構造でのみ可能である）。
【０１９２】
（ＤＮＡに対する線状ペプチドの接合：）
化合物２（４５ｎｍｏｌ）を４５μＬのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４；１５０ｍＭ）に溶解した。４℃で、線状ペプチド（ＤＭＦにおける１００ｍＭストック液の１８μＬ；１８０ｎｍｏｌ；４０当量）を加え、その後、ＤＭＴ−ＭＭ（水における５００ｍＭストック液の３．６μＬ；１８０ｎｍｏｌ；４０当量）を加えた。２時間振とうした後、ＬＣＭＳは、反応が完了していることを示した。生成物をエタノール沈殿によって単離した。
【０１９３】
【化４３】
0005646127.tif 000058
（ＤＮＡに対する環状ペプチドの接合：）
化合物２（２０ｎｍｏｌ）を２０μＬのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４；１５０ｍＭ）に溶解した。４℃で、線状ペプチド（ＤＭＦにおける１００ｍＭストック液の８μＬ；８０ｎｍｏｌ；４０当量）を加え、その後、ＤＭＴ−ＭＭ（水における５００ｍＭストック液の１．６μＬ；８０ｎｍｏｌ；４０当量）を加えた。２時間振とうした後、ＬＣＭＳは、反応が完了していることを示した。生成物をエタノール沈殿によって単離した。
【０１９４】
【化４４】
0005646127.tif 000059
（ＤＮＡ連結ペプチドの環化：）
線状ペプチド−ＤＮＡコンジュゲート（１０ｎｍｏｌ）をｐＨ８のリン酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、１５０ｍｍ）に溶解した。室温で、それぞれ４当量のＣｕＳＯ４、アスコルビン酸およびＳｈａｒｐｌｅｓｓリガンドをすべて加えた（２００ｍＭストック液の０．２μＬ）。反応を一晩進行させた。ＲＰ  ＨＰＬＣは、線状ペプチド−ＤＮＡが存在していなかったこと、および、生成物が真の環状ペプチド−ＤＮＡと同時に溶出したことを示した。二量体または他のオリゴマーは微量も認められなかった。
【０１９５】
【化４５】
0005646127.tif 000060
（実施例６：機能性部分の合成に対する芳香族求核置換反応の適用）
（シアヌル酸クロリドによる化合物３のアリール化のための一般的手順：）
化合物２をｐＨ９．４のホウ酸ナトリウム緩衝液に１ｍＭの濃度で溶解する。溶液を４℃に冷却し、その後、２０当量のシアヌル酸クロリドを、ＭｅＣＮにおける５００ｍＭの溶液として加える。２時間後、反応の完了がＬＣＭＳによって確認され、生じたジクロロトリアジン−ＤＮＡコンジュゲートをエタノール沈殿によって単離する。
【０１９６】
（ジクロロトリアジン−ＤＮＡのアミン置換のための手順：）
ジクロロトリアジン−ＤＮＡコンジュゲートをｐＨ９．５のホウ酸塩緩衝液に１ｍＭの濃度で溶解する。室温で、４０当量の脂肪族アミンをＤＭＦ溶液として加える。反応をＬＣＭＳによって追跡し、反応は、通常、２時間後には完了している。生じたアルキルアミノ−モノクロロトリアジン−ＤＮＡコンジュゲートをエタノール沈殿によって単離する。
【０１９７】
（モノクロロトリアジン−ＤＮＡのアミン置換のための手順：）
アルキルアミノ−モノクロロトリアジン−ＤＮＡコンジュゲートをｐＨ９．５のホウ酸塩緩衝液に１ｍＭの濃度で溶解する。４２℃で、４０当量の第２の脂肪族アミンをＤＭＦ溶液として加える。反応をＬＣＭＳによって追跡し、反応は、通常、２時間後には完了している。生じたジアミノトリアジン−ＤＮＡコンジュゲートをエタノール沈殿によって単離する。
【０１９８】
（実施例７：機能性部分の合成に対する還元的アミン化反応の適用）
（第二級アミンを含有するＤＮＡ−リンカーのアルデヒド基礎単位による還元的アミン化のための一般的手順：）
化合物２をＮ末端のプロリン残基にカップリングした。得られた化合物をリン酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ５．５）に１ｍＭの濃度で溶解した。この溶液に、それぞれ４０当量のＤＭＦにおけるアルデヒド基礎単位（８μＬ、０．２５Ｍ）およびＤＭＦにおけるシアノホウ水素化ナトリウム（８μＬ、０．２５Ｍ）を加え、溶液を８０℃で２時間加熱した。アルキル化の後、溶液をエタノール沈殿によって精製した。
【０１９９】
（アルデヒドを含有するＤＮＡ−リンカーのアミン基礎単位による還元的アミン化のための一般的手順：）
アルデヒド基を含有する基礎単位にカップリングされた化合物２をリン酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、２５０ｍＭ、ｐＨ５．５）に１ｍＭの濃度で溶解した。この溶液に、それぞれ４０当量のＤＭＦにおけるアミン基礎単位（８μＬ、０．２５Ｍ）およびＤＭＦにおけるシアノホウ水素化ナトリウム（８μＬ、０．２５Ｍ）を加え、溶液を８０℃で２時間加熱した。アルキル化の後、溶液をエタノール沈殿によって精製した。
【０２００】
（実施例８：機能性部分の合成に対するペプトイド組み立て反応の適用）
（ＤＮＡ−リンカー上でのペプトイド合成のための一般的手順：）
【０２０１】
【化４６】
0005646127.tif 000061
化合物２をホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に１ｍＭの濃度で溶解し、４℃に冷却した。この溶液に、４０当量のＤＭＦにおけるＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセタート（１３μＬ、０．１５Ｍ）を加え、溶液を４℃で２時間穏やかに振とうした。アシル化の後、ＤＮＡ−リンカーをエタノール沈殿によって精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に１ｍＭの濃度で再び溶解し、４℃に冷却した。この溶液に、４０当量のＤＭＦにおけるアミン基礎単位（１３μＬ、０．１５Ｍ）を加え、溶液を４℃で１６時間穏やかに振とうした。アルキル化の後、ＤＮＡ−リンカーをエタノール沈殿によって精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に１ｍＭの濃度で再び溶解し、４℃に冷却した。ペプトイド合成を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセタートの逐次添加、その後のアミン基礎単位の添加によって続ける。
【０２０２】
（実施例９：機能性部分の合成に対するアジド−アルキン付加環化反応の適用）
（一般的手順）
アルキン含有ＤＮＡコンジュゲートをｐＨ８．０のリン酸塩緩衝液に約１ｍＭの濃度で溶解する。この混合物に、１０当量の有機アジド、ならびに、それぞれ５当量の硫酸銅（ＩＩ）、アスコルビン酸およびリガンドのトリス−（（１−ベンジルトリアゾール−４−イル）メチル）アミンをすべて室温で加える。反応をＬＣＭＳによって追跡し、反応は、通常、１時間〜２時間後には完了している。生じるトリアゾール−ＤＮＡコンンジュゲートはエタノール沈殿によって単離することができる。
【０２０３】
（実施例１０：コードされたライブラリー内からのＡｂｌキナーゼに対するリガンドの同定）
ＤＮＡコードライブラリーにおける目的とする分子を、望ましくないライブラリー成分よりも濃縮することができることは、目的とする治療標的に対する規定された性質を有する単一化合物を同定することに優先する。この濃縮能力を明らかにするために、ｒｈＡｂｌキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０７５６３）に対する既知の結合性分子（これはＳｈａｈ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５、３９９〜４０１（２００４）に記載される；これは参考として本明細書中に組み込まれる）を合成した。この化合物を、実施例１および実施例２に記載される方法によって作製される分子と類似する分子（オリゴヌクレオチドに連結された機能性部分）を作製するために標準的な化学方法を使用して、前述の実施例において記載されるリンカーを介して二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合した。実施例２に記載されるように一般に作製されたライブラリー、および、ＤＮＡに連結されたＡｂｌキナーゼの結合体は、両方の化学種のｑＰＣＲ分析を可能にする特有のＤＮＡ配列を伴って設計された。ＤＮＡに連結されたＡｂｌキナーゼの結合体をライブラリーと１：１０００の比率で混合した。この混合物をｒｈＡｂｌｅキナーゼと平衡化させ、酵素を固相表面に捕獲し、結合していないライブラリー成分を除くために洗浄し、結合している分子を溶出した。溶出液におけるライブラリー分子対ＤＮＡ連結Ａｂｌキナーゼ阻害剤の比率は１：１であった。このことは、１０００倍過剰なライブラリー分子における、５００倍を超えるＤＮＡ連結Ａｂｌキナーゼ結合体の濃縮を示している。
【０２０４】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または、そのような等価物を、日常的に過ぎない実験を使用して確認することができる。そのような等価物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、最初のオリゴヌクレオチドが、後続オリゴヌクレオチドの突出部に対して相補的である突出部を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの連結の概略図である。最初の鎖が、非結合であるか、または、アミノヘキシルリンカーにコンジュゲートされているか、または、アミノヘキシルリンカーを介してフェニルアミン残基に接合されているかのいずれかとして表される。
【図２】図２は、添え木鎖を使用するオリゴヌクレオチド連結の概略図である。この実施形態では、添え木は、一本鎖の最初のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖の後続オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する１２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【図３】図３は、最初のオリゴヌクレオチドが、共有結合により連結された鎖を有する二本鎖であり、後続オリゴヌクレオチドが二本鎖であるときの、最初のオリゴヌクレオチドと後続オリゴヌクレオチドとの連結の概略図である。
【図４】図４は、ポリメラーゼを使用するオリゴヌクレオチド伸長の概略図である。最初の鎖が、非結合であるか、または、アミノヘキシルリンカーにコンジュゲートされているか、または、アミノヘキシルリンカーを介してフェニルアミン残基に接合されているかのいずれかとして表される。
【図５】図５は、本発明の１つの実施形態の合成サイクルの概略図である。
【図６】図６は、本発明のライブラリーを使用する多ラウンド選択プロセスの概略図である。
【図７】図７は、実施例１に記載されるサイクル１〜サイクル５のそれぞれの生成物および停止用プライマーの連結後の生成物の電気泳動から得られるゲルである。分子量標準がレーン１に示され、示された量のハイパーラダーが、ＤＮＡ定量のために、レーン９〜１２に示される。
【図８】図８は、アジド−アルキンの付加環化を使用する基礎単位のカップリングの概略図である。
【図９】図９は、塩素化トリアジンにおける求核芳香族置換による基礎単位のカップリングを例示する。
【図１０】図１０は、塩素化トリアジンにおける求核芳香族置換による基礎単位のカップリングを例示する。
【図１１】図１１は、機能性部分の合成において使用される好適な代表的な塩素化ヘテロ芳香族構造を示す。
【図１２】図１２は、アジド／アルキン付加環化反応を使用する線状ペプチドの環化を例示する。
【図１３】図１３Ａは、サイクル４の後での実施例２に記載されるように作製されたライブラリーのクロマトグラムである。図１３Ｂは、サイクル４の後での実施例２に記載されるように作製されたライブラリーの質量スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005646127.tif 000075
【図１１】
0005646127.tif 000076
【図１２】
0005646127.tif 000077
【図１３】
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【配列表】
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