(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の触媒活性を制御するための方法であって、当該方法が：
（ａ）２つの別々の隣接した媒質の貯留、一方の貯留から他方の貯留に一度に１つの一本鎖のポリヌクレオチドのみを通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する前記２つの貯留間の界面を準備するステップと；
（ｂ）一本鎖部分がある部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素活性を有する酵素を準備するステップと；
（ｃ）第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体であり、前記ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり、前記第１のポリヌクレオチドが、前記第２のポリヌクレオチドと適合せず、かつ前記第１のポリヌクレオチドに結合する際に前記酵素の触媒活性を阻害する阻止プライマーを更に含むポリヌクレオチド複合体を準備するステップと；
（ｄ）前記２つの貯留のうちの１つに前記ポリヌクレオチド複合体を導入するステップと；
（ｅ）前記酵素をステップ（ｃ）の前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記貯留に導入するステップと；
（ｆ）前記２つの貯留間に電位差を印加することによって１の極性を生成させ、前記チャネルを通して前記ポリヌクレオチド複合体の一本鎖部分を移動させ、該複合体から阻止プライマーを解離することによって、前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体にある前記酵素の触媒活性を制御するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法が：
前記２つの貯留間の電流を測定するステップと；
前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップと；
を更に具えることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法が：
前記２つの貯留間の電流を測定するステップと；
前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後に取得された電流値と比較するステップと；
を更に具えることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記阻止プライマーの不適合部分がペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル基、及び蛍光化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記酵素がＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法が：
酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；
前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記貯留に前記試薬を導入するステップと；
適温で前記貯留をインキュベートするステップと；
を更に具えることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記試薬がデオキシリボヌクレオチド及び補助因子からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記デオキシリボヌクレオチドが前記補助因子を導入する前に前記貯留に導入されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記補助因子がＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記媒質が導電性であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記媒質が水溶液であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、下記の優先権及び利益を請求する：２００７年４月４日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｔｏ  Ｌｉｍｉｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔｏ  Ｏｎｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ」と題する米国特許仮出願第６０／９２１，７８７号、２００７年５月２１日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ」と題する米国特許仮出願第６０／９３１，１１５号、２００７年７月３０日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ａｔ  Ａ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｉｔｅ」と題する米国特許仮出願第６０／９６２，５３０号、２００７年９月４日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ｖｅｒｙ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ａｒｒａｙｓ  Ｏｆ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」と題する米国特許仮出願第６０／９６７，５３９号、及び２００８年１月２５日に出願された「Ｆｅｅｄｂａｃｋ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆ  Ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  Ｉｎ  Ａ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｏ  Ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する米国特許仮出願第６１／０６２，３９１号、これらの全ては、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国立ヒトゲノム研究所助成金番号ＨＧ００３７０３−０１及びＨＧ００４０３５−０１、並びに米国立総合医科学研究所助成金番号ＧＭ０７３６１７−０１Ａ１からの資金を部分的に使用してなされたものである。米国連邦政府は、本発明に対する特定の権利を有する。
【０００３】
本明細書中で開示されている本発明は、混合物中の個々のポリマーが別の化合物、例えば酵素により作用される時間を制御できるデバイス及び方法を提供する。本発明は、分子生物学、構造生物学、細胞生物学、分子スイッチ、分子回路、及び分子計算デバイス、並びにそれらの製造の分野に特に有用である。本発明は、被検体が癌、自己免疫性疾患、細胞周期障害、又は他の障害に感受性があるかどうかを診断するために本組成物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
本発明は、ポリヌクレオチド及び他のポリマーを特徴付けるための組成物、方法、及び装置の分野に関する。
【０００５】
ＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオチド配列を迅速な様式で決定することは、バイオテクノロジー、特に生物の全ゲノム配列取得を探究するプロジェクトの研究者の主な目的である。加えて、ポリヌクレオチド配列を迅速に決定することは、個体及び個体の集団における遺伝子突然変異及び多型性の同定にとって重要である。
【０００６】
ナノポア配列決定は、ポリヌクレオチド分子の配列を迅速に決定する１つの方法である。ナノポア配列決定は、個々のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）内の個々のヌクレオチド（又はヌクレオチド環境における物理変化（即ち、例えば、電流））を、それがナノポア開口部を通過する際に物理的に感知するという特性に基づく。原理的には、ポリヌクレオチド配列は単一分子から決定できる。しかしながら、実際には、ポリヌクレオチド配列は、同一分子の複数の通過又は同一ポリヌクレオチド配列を有する複数分子の通過から得られたデータの統計的平均から決定されることが好ましい。ポリヌクレオチド分子が小さなイオンチャネルを通り抜ける際に上記分子を特徴付けるための膜チャネルの使用は、一本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡ分子を、脂質二重層膜中の直径１．５ナノメートルのナノポア開口部（例えば、イオンチャネル）を通過させるための電場を使用することにより、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１３７７０−１３７７３，１９９６、参照により本明細書中に組み込まれる）により研究されている。ナノポア開口部の直径は、任意の所定時間に一本鎖ポリヌクレオチドのみがナノポア開口部を横切ることを可能にした。上記ポリヌクレオチドがナノポア開口部を通過する際に、上記ポリヌクレオチドは、ナノポア開口部を部分的に封鎖し、イオン電流の一時的な減少に帰着する。電流減少の時間は、ポリヌクレオチドの長さに正比例するため、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら（１９９６年）は、イオン電流の変化を測定することによりポリヌクレオチドの長さを実験的に決定することができた。
【０００７】
Ｂａｌｄａｒｅｌｌｉら（米国特許第６，０１５，７１４号）及びＣｈｕｒｃｈら（米国特許第５，７９５，７８２号）は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチドをモノマー毎に特徴付けるためのナノポアの使用を記述している。特に、Ｂａｌｄａｒｅｌｌｉらは、ナノポア開口部からポリヌクレオチドを通過させることにより、ポリヌクレオチドを特徴付け、配列決定した。ナノポア開口部は、２つの媒質を隔てる構造物又は界面に埋め込まれる。ポリヌクレオチドがナノポア開口部を通り抜ける際に、ポリヌクレオチドは、ナノポア開口部を封鎖することによりイオン電流を変化させる。個々のヌクレオチドがナノポア開口部を通り抜ける際、各塩基／ヌクレオチドは、一時的にナノポア開口部を封鎖するヌクレオチドの同定を可能にする様式でイオン電流を変更し、それによりポリヌクレオチドのヌクレオチド組成を特徴付けること、及び恐らくはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することが可能になる。
【０００８】
従来のナノポア分析技術の１つの欠点は、標的ポリヌクレオチドを分析する速度の制御である。Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら（１９９６年）により記述されているように、ナノポア分析は、ポリヌクレオチドの長さ決定を実施するための有用な方法である。しかしながら、移動速度はヌクレオチド組成に依存し、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら（１９９６年）により概説された測定条件下では、毎秒１０５個から１０７個のヌクレオチドに及ぶ場合がある。したがって、任意の所定のポリヌクレオチドの長さとその移動時間とを相関させることは、簡単ではない。移動速度が相当に低減されれば、ポリヌクレオチド内の組成と、ヌクレオチド単位間の空間的関係との両方に関するより高度な分解能が取得できることも予想される。
【０００９】
現在、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含むポリマーの特徴付け、並びに疾患及び障害の診断及び予後に使用できる組成物及び方法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、薄膜デバイス及びそれを使用するための方法を提供する。対象デバイスは、電気的連通手段により接続されたシス及びトランスチャンバーを含む。シス及びトランスチャンバーは、少なくとも１つの細孔又はチャネルを含む薄膜により隔てられる。１つの好ましい実施形態では、薄膜は、疎水性領域及び親水性領域を有する化合物を含む。より好ましい実施形態では、薄膜はリン脂質を含む。デバイスは、シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための手段を更に含む。細孔又はチャネルは、ポリマーを通過させるのに好適な寸法を有する形状及び大きさに作られる。１つの好ましい実施形態では、細孔又はチャネルは、ポリマーの全てではなく一部分を収納する。１つの他の好ましい実施形態では、ポリマーはポリヌクレオチドである。代替的な好ましい実施形態では、ポリマーはポリペプチドである。本発明により提供される他のポリマーには、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、及びポリケチドが含まれる。
【００１１】
１つの実施形態では、薄膜は、ポリマーへの結合親和性を有する化合物を更に含む。１つの好ましい実施形態では、結合親和性（Ｋａ）は、少なくとも１０６ｌ／ｍｏｌｅである。より好ましい実施形態では、Ｋａは、少なくとも１０８ｌ／ｍｏｌｅである。更に別の好ましい実施形態では、化合物は、少なくとも１つの細孔に隣接している。より好ましい実施形態では、化合物はチャネルである。更により好しい実施形態では、チャネルは生物活性を有する。最も好ましい実施形態では、化合物は細孔を備える。
【００１２】
１つの実施形態では、化合物は酵素活性を備える。例えば、酵素活性は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼ等の酵素活性であり得るが、それらに限定されない。より好ましい実施形態では、酵素活性は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、リボソーム、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、又はアセチラーゼ等の酵素活性であり得る。
【００１３】
別の実施形態では、細孔は、活性化因子の通過を可能にするように大きさ及び形状が作られており、活性化因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、エイコサノイド（ｅｉｃｏｓｉｎｏｉｄ）、レチノイン酸、カルシフェロール、アスコルビン酸、神経ペプチド、エンケファリン、エンドルフィン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、カテコールアミン、アセチルＣｏＡ、Ｓ−アデノシルメチオニン、及び任意の他の生物学的活性化因子からなる群から選択される。
【００１４】
更に別の実施形態では、細孔は、補助因子の通過を可能にするように大きさ及び形状が作られており、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及び任意の他の生物学的補助因子からなる群から選択される。
【００１５】
好ましい実施形態では、細孔又はチャネルは、細孔分子又はチャネル分子であり、生体分子、又は合成の修飾分子、又は改変された生体分子、又はそれらの組み合せを含む。例えば、そのような生体分子には、イオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、ＧＰＣＲ等のような膜貫通受容体、核膜孔、合成変異体、又はキメラ変異体等であるが、それらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、生体分子はα溶血素である。
【００１６】
代替的には、化合物は非酵素性生物活性を備える。例えば、非酵素性生物活性を有する化合物には、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、糖、脂質、グリコホスホイノシトール（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ）、又はリポポリサッカリド等であり得るが、それらに限定されない。化合物は、抗原性活性を有する場合がある。化合物は、選択的な結合特性を有する場合があり、それによりポリマーは、特定の制御された環境条件下では化合物に結合するが、環境条件が変化すると結合しない。そのような条件は、例えば、［Ｈ＋］の変化、環境温度の変化、ストリンジェンシーの変化、疎水性の変化、又は親水性の変化等であり得るが、それらに限定されない。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、ある化合物を提供し、その化合物はリンカー分子を更に含み、そのリンカー分子はチオール基、スルフィド基、リン酸基、硫酸基、シアノ基、ピペリジン基、Ｆｍｏｃ基、及びＢｏｃ基からなる群から選択される。
【００１８】
１つの実施形態では、薄膜は複数の細孔を含む。１つの実施形態では、デバイスは複数の電極を備える。
【００１９】
ポリマー
別の実施形態では、本発明は、ポリマーに対する酵素の結合を制御するための方法であって、２つの別々の隣接した媒質の貯留と、一方の貯留から他方の貯留に一度に１つのモノマーのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する２つの貯留間の界面とを準備すること；ポリマーに対する結合活性を有する酵素を準備すること；２つの貯留の１つにポリマーを導入すること；２つの貯留の１つに酵素を導入すること；２つの貯留間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成させること；最初に電位差を反転させ、第２の極性を生成させること；２度目に電位差を反転させて第１の極性を生成し、それによりポリマーに対する酵素の結合を制御することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップと；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値（Ｉ１）を、第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値（Ｉ２）と比較するステップと；Ｉ１及びＩ２間の差を決定し、それにより差値ｄＩを取得するステップとを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップと；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値（Ｉ１）を、後で取得された電流値（Ｉ２）と比較して、Ｉ１及びＩ２間の差を決定し、それにより差値ｄＩを取得するステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼからなる群から選択される。別の代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと；適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、活性化因子及び補助因子からなる群から選択される。更により好ましい実施形態では、活性化因子は、補助因子を導入する前に貯留に導入される。更にまた好ましい実施形態では、活性化因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、エイコサノイド、レチノイン酸、カルシフェロール、アスコルビン酸、神経ペプチド、エンケファリン、エンドルフィン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、カテコールアミン、アセチルＣｏＡ、及びＳ‐アデノシルメチオニンからなる群から選択される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、及びＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。別のより好ましい実施形態では、ポリマーは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、及びポリケチドからなる群から選択される。１つの実施形態では、酵素は、ポリマーと同じ貯留に導入される。代替的な実施形態では、酵素は、反対側の貯留に導入される。
【００２０】
ポリヌクレオチド
別の実施形態では、本発明は、部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御するための方法であって、２つの別々の隣接した媒質の貯留と、一方の貯留から他方の貯留に一度に１つのポリヌクレオチドのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する２つの貯留間の界面とを準備すること；部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する結合活性を有する酵素を準備すること；第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体であり、ポリヌクレオチド複合体の一部は二本鎖であり、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと適合しない部分を更に含むポリヌクレオチド複合体を準備すること；２つの貯留の１つにポリヌクレオチド複合体を導入すること；２つの貯留の１つに酵素を導入すること；２つの貯留間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成させること；最初に電位差を反転させて第２の極性を生成させること；２度目に電位差を反転させて第１の極性を生成し、それにより部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。好ましい実施形態では、上記部分は、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。より好ましい実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。別の代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと；適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、デオキシリボヌクレオチド及び補助因子からなる群から選択される。更により好ましい実施形態では、デオキシリボヌクレオチドは、補助因子を導入する前に貯留に導入される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、及びＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。１つの実施形態では、酵素は、ポリヌクレオチドと同じ貯留に導入される。代替的な実施形態では、酵素は、反対側の貯留に導入される。
【００２１】
ポリペプチド
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって、２つの別々の隣接した媒質の貯留と、一方の貯留から他方の貯留に一度に１つのポリペプチドのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する２つの貯留間の界面とを準備すること；ポリペプチドに対する結合活性を有する酵素を準備すること；修飾可能なアミノ酸残基を含むポリペプチドを準備すること；２つの貯留の１つにポリペプチドを導入すること；２つの貯留の１つに酵素を導入すること；２つの貯留間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成させること；最初に電位差を反転させ、第２の極性を生成させること；２度目に電位差を反転させて第１の極性を生成し、それによりポリペプチドに対する酵素の結合を制御することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。好ましい実施形態では、上記部分は、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。より好ましい実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。別の代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと；適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、活性化因子及び補助因子からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、活性化因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、アセチルＣｏＡ、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される。更により好ましい実施形態では、活性化因子は、補助因子を導入する前に貯留に導入される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、及びＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。１つの実施形態では、酵素は、ポリペプチドと同じ貯留に導入される。代替的な実施形態では、酵素は、反対側の貯留に導入される。
【００２２】
本明細書中で開示されている本発明は、混合物中の個々のポリマーが別の化合物、例えば酵素により作用される速度を調節することができるデバイス及び方法を提供する。本デバイス及び方法は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列を決定するためにも使用される。本発明は、分子生物学、構造生物学、細胞生物学、分子スイッチ、分子回路、及び分子計算デバイス、並びにそれらの製造の分野に特に有用である。
【００２３】
１つの代替的な実施形態では、本発明は、部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御するための方法であって、その結果ポリヌクレオチド配列の同定に帰着する方法であり、媒質を含む２つの別々の隣接した貯留、チャネルのシス側からチャネルのトランス側に１度に１つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する貯留間の界面を準備するステップ；部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する結合活性を有する酵素を準備するステップ；保護が保護部分の使用を含む少なくとも１つの保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ；アニーリング剤を準備するステップ；第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体であり、ポリヌクレオチド複合体の一部は二本鎖であり、一部は一本鎖であるポリヌクレオチド複合体を準備するステップ；２つの貯留の１つにポリヌクレオチド複合体を導入するステップ；２つの貯留間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成させ、第１の極性がポリヌクレオチドの一本鎖部分をチャネルを通してトランス側に移動させるステップ；酵素及び保護デオキシリボヌクレオチドを同じ貯留に導入するステップ；アニーリング剤を他方の貯留に導入するステップ；アニーリング剤が一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；酵素及び保護デオキシリボヌクレオチドがポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；保護デオキシリボヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれることを可能にするステップ；最初に電位差を反転させ、それにより第２の極性を生成させるステップ；保護デオキシリボヌクレオチドが保護部分を遊離させ、脱保護化するのを可能にするステップ；保護部分の存在量を測定するステップ；２度目に電位差を反転させ、第１の極性を生成させるステップ；上記ステップのいずれか１つを繰り返し、それにより二本鎖ポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御し、ポリヌクレオチドの配列を決定するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水性媒質である。１つの好ましい実施形態では、上記部分は、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル基、蛍光化合物、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。１つの代替的な実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の代替的な実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電���値と比較するステップを更に含む。また更なる代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと；酵素活性を維持するのに十分な温度で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。好ましい実施形態では、試薬は補助因子である。より好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、保護デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む。別のより好ましい実施形態では、試薬は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＵＴＰからなる群から選択される。更に他の好ましい実施形態では、少なくとも１つの貯留の水性媒質は、アニーリング剤を含む。より好ましい実施形態では、アニーリング剤は、相補的オリゴヌクレオチド及びストレプトアビジンからなる群から選択される。
【００２４】
本発明は、細孔に対する分子の位置を感知するための方法であって、２つの別々の隣接した媒質の貯留と、イオン透過性細孔を有する２つの貯留間の構造物とを準備すること；ポリイオンを準備すること；ポリイオンに対する結合活性を有する分子を準備すること；２つの貯留の１つにポリイオンを導入すること；同じ貯留に分子を導入すること；２つの貯留間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成させること；２つの貯留間の第１の電流を測定し、それにより細孔に対する分子の位置を感知することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、上記分子は巨大分子であり、巨大分子は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、膜貫通受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ受容体、及び核内受容体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、媒質は導電性である。より好ましい実施形態では、媒質は水溶液である。別の好ましい実施形態では、上記構造物は、ある化合物を更に含み、その化合物は、チオール基、スルフィド基、リン酸基、硫酸基、シアノ基、ピペリジン基、Ｆｍｏｃ基、及びＢｏｃ基、窒化ケイ素、二官能性硫化アルキル、及び金からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、ポリイオンは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、及びポリケチドからなる群から選択される。代替的な実施形態では、上記方法は、最初に電位差を反転させ、それにより第２の極性を生成させるステップ；２度目に電位差を反転させて第１の極性を生成し、２つの貯留間の第２の電流を測定して、それにより細孔に対する分子の位置を感知するステップを更に含む。別の代替的な実施形態では、上記方法は、２つの貯留間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。また更なる代替的な実施形態では、上記方法は、酵素活性を開始させる試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含む貯留に試薬を導入するステップと；適温で貯留をインキュベートするステップとを更に含む。より好ましい実施形態では、試薬は、活性化因子及び補助因子からなる群から選択される。別のより好ましい実施形態では、活性化因子は、補助因子を導入する前に貯留に導入される。更により好ましい実施形態では、活性化因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、エイコサノイド、グリコシルホスファチジルイノシトール、グリコホスホイノシトール、リポポリサッカリド、レチノイン酸、カルシフェロール、アスコルビン酸、神経ペプチド、エンケファリン、エンドルフィン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、カテコールアミン、アセチルＣｏＡ、及びＳ‐アデノシルメチオニンからなる群から選択される。別の更により好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、及びＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。
【００２５】
好ましい実施形態では、細孔又はチャネルは、生体分子、又は合成された修飾若しくは改変生体分子を含む。例えば、そのような生体分子は、α溶血素等のイオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、ＧＰＣＲ及び受容体チロシンキナーゼ等の膜貫通受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ受容体、ステロイドホルモン受容体又は核膜孔等の核内受容体であるが、それらに限定されない。
【００２６】
代替的な実施形態では、上記化合物は、非酵素性生物活性を備える。非酵素性生物活性を有する化合物は、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、糖、脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール、グリコホスホイノシトール、又はリポポリサッカライド等であり得るが、それらに限定されない。上記化合物は、抗原性活性を有する場合がある。上記化合物は、リボザイム活性を有する場合がある。上記化合物は、選択的な結合特性を有する場合があり、それによりポリマーは、特定の制御された環境条件下では化合物に結合するが、環境条件が変化すると結合しない。例えば、そのような条件は、［Ｈ＋］の変化、環境温度の変化、ストリンジェンシーの変化、疎水性の変化、又は親水性の変化等であり得るが、それらに限定されない。
【００２７】
１つの実施形態では、巨大分子は酵素活性を備える。例えば、酵素活性は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼ等の酵素活性であり得るが、それらに限定されない。より好ましい実施形態では、酵素活性は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等の酵素活性であり得る。代替的な実施形態では、巨大分子は、１つを越える酵素活性、例えば、シトクロムＰ４５０酵素の酵素活性を備える場合がある。別の代替的な実施形態では、巨大分子は、１つを越える種類の酵素活性、例えば、哺乳動物脂肪酸シンターゼを備える場合がある。別の実施形態では、巨大分子はリボザイム活性を備える。
【００２８】
代替的な実施形態では、巨大分子は、非酵素性生物活性を備える。例えば、非酵素性生物活性を有する巨大分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、糖、リン脂質、脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール、グリコホスホイノシトール、又はリポポリサッカライド等であり得るが、それらに限定されない。巨大分子は、これらに限定されないがリボソーム又はヌクレオソーム等のように、ポリヌクレオチド結合活性及び／又はポリペプチド生合成活性を有する場合がある。巨大分子は、抗原活性を有する場合がある。巨大分子は、選択的な結合特性を有する場合があり、それによりポリマーは、特定の制御された環境条件下では巨大分子に結合するが、環境条件が変化すると結合しない。例えば、そのような条件は、［Ｈ＋］の変化、環境温度の変化、ストリンジェンシーの変化、疎水性の変化、又は親水性の変化等であり得るが、それらに限定されない。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、ある化合物を提供し、その化合物はリンカー分子を更に含み、そのリンカー分子は、チオール基、スルフィド基、リン酸基、硫酸基、シアノ基、ピペリジン基、Ｆｍｏｃ基、及びＢｏｃ基からなる群から選択される。別の実施形態では、上記化合物は、二官能性硫化アルキル及び金からなる群から選択される。
【００３０】
１つの実施形態では、薄膜は複数の細孔を含む。１つの実施形態では、デバイスは複数の電極を備える。
【００３１】
単一チャネル薄膜デバイス、システム、及びそれを使用するための方法が提供される。対象デバイス又はシステムは、電気的連通手段により接続されたシス及びトランスチャンバーを備える。電気的連通手段のシス端には、単一ナノポア又はチャネルを含む薄膜で密閉された水平方向の円錐形開口部がある。デバイスは、シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための手段を更に備える。対象デバイスは、ナノポア又はチャネルを通るイオン電流がモニターされる応用に使用を見出し、そのような応用例には、天然イオンチャネルの特徴付け、及びポリマー化合物の特徴付け等が含まれる。
【００３２】
本発明は、単一巨大分子を、使用者が指定する定義されたナノスケール部位に送達するための方法も提供する。
【００３３】
本発明は、単一巨大分子を、使用者が指定する定義されたナノスケール部位に結合させるための方法も提供する。
【００３４】
本発明は、ナノスケールの細孔を通るイオン電流を使用して、単一巨大分子（又は単一分子の組み合わせ）の機能をモニターするための方法も提供する。
【００３５】
本発明は、少なくとも２つの化合物の結合を検出するためのデバイス又はシステムであって、混合信号半導体ウェーハと、少なくとも１つの電気化学的層であり、電気化学的層が半導体材料を含み、半導体材料が表面改質剤を更に含み、電気化学的層が複数のオリフィスを定義し、オリフィスがチャンバー及び頚部を含み、オリフィスのチャンバーが混合信号半導体ウェーハの金属被膜組成物と共局在し、オリフィスの一部が金属で塞がれており、金属が金属被覆組成物と電気的に連通しており、オリフィスが薄膜を更に含み、薄膜がオリフィスの頚部で溶媒不透過性の密閉を形成し、薄膜が細孔を更に含み、細孔が細孔開口部を更に含む電気化学的層とを含むデバイス又はシステムも提供する。好ましい実施形態では、化合物は生体化合物である。より好ましい実施形態では、生体化合物は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、ポリケチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、半導体材料は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、窒化ケイ素（ＳｉＮ）、金属酸化物、及び金属ケイ酸塩からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、半導体材料は二酸化ケイ素である。別の好ましい実施形態では、表面改質剤は炭化水素である。より好ましい実施形態では、金属被膜組成物は、ニッケル、金、銅、及びアルミニウムからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、金属は銀である。好ましい実施形態では、薄膜は分子二重層である。より好ましい実施形態では、薄膜はリン脂質二重層である。１つの代替的な実施形態では、オリフィスは、大きさが０．５から３μｍである。好ましい実施形態では、オリフィスは、大きさが１から２μｍである。最も好ましい実施形態では、オリフィスは、大きさが１．２５から１．５μｍである。別の好ましい実施形態では、細孔は生体分子である。より好ましい実施形態では、生体分子は、イオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、膜貫通受容体、及び核膜孔からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、生体分子はα溶血素である。好ましい実施形態では、細孔開口部は、大きさが約１から１０ｎｍである。より好ましい実施形態では、細孔開口部は、大きさが約１から４ｎｍである。最も好ましい実施形態では、細孔開口部は、大きさが約１から２ｎｍである。代替的な最も好ましい実施形態では、細孔開口部は、大きさが約２から４ｎｍである。
【００３６】
本発明は、ポリマーに対する分子の結合を検出及び制御するために使用できる有限状態機械を提供する。１つの実施形態では、分子はタンパク質である。好ましい実施形態では、タンパク質は酵素である。１つの実施形態では、有限状態機械は、ナノポアを通るポリマー化合物の移動を阻害する構造エレメントを有するポリマー化合物を検出できる。１つの好ましい実施形態では、有限状態機械は、ナノポアにあるＤＮＡヘアピン構造を含むポリマー化合物を検出することができ、検出後であるがヘアピン又はＤＮＡ二本鎖構造が解体する前に、ＤＮＡヘアピン又はＤＮＡ二本鎖構造を含む化合物をナノポアから押し出すことができる。代替的な実施形態では、ポリマー化合物は誘導体化核酸を含む。更に代替的な実施形態では、ポリマー化合物はペプチド核酸を含む。
【００３７】
１つの実施形態では、有限状態機械は、ポリマーに対する分子の結合を、約５Ｈｚから２０００Ｈｚの速度に制御することができる。有限状態機械は、ポリマーに対する分子の結合を、例えば約５Ｈｚに、約１０Ｈｚに、約１５Ｈｚに、約２０Ｈｚに、約２５Ｈｚに、約３０Ｈｚに、約３５Ｈｚに、約４０Ｈｚに、約４５Ｈｚに、約５０Ｈｚに、約５５Ｈｚに、約６０Ｈｚに、約６５Ｈｚに、約７０Ｈｚに、約７５Ｈｚに、約８０Ｈｚに、約８５Ｈｚに、約９０Ｈｚに、約９５Ｈｚに、約１００Ｈｚに、約１１０Ｈｚに、約１２０Ｈｚに、約１２５Ｈｚに、約１３０Ｈｚに、約１４０Ｈｚに、約１５０Ｈｚに、約１６０Ｈｚに、約１７０Ｈｚに、約１７５Ｈｚに、約１８０Ｈｚに、約１９０Ｈｚに、約２００Ｈｚに、約２５０Ｈｚに、約３００Ｈｚに、約３５０Ｈｚに、約４００Ｈｚに、約４５０Ｈｚに、約５００Ｈｚに、約５５０Ｈｚに、約６００Ｈｚに、約７００Ｈｚに、約７５０Ｈｚに、約８００Ｈｚに、約８５０Ｈｚに、約９００Ｈｚに、約９５０Ｈｚに、約１０００Ｈｚに、約１１２５Ｈｚに、約１１５０Ｈｚに、約１１７５Ｈｚに、約１２００Ｈｚに、約１２５０Ｈｚに、約１３００Ｈｚに、約１３５０Ｈｚに、約１４００Ｈｚに、約１４５０Ｈｚに、約１５００Ｈｚに、約１５５０Ｈｚに、約１６００Ｈｚに、約１７００Ｈｚに、約１７５０Ｈｚに、約１８００Ｈｚに、約１８５０Ｈｚに、約１９００Ｈｚに、約９５０Ｈｚに、及び約２０００Ｈｚに制御できる。好ましい実施形態では、有限状態機械は、ポリマーに対する分子の結合を、約２５Ｈｚから約２５０Ｈｚの速度に制御することができる。より好ましい実施形態では、有限状態機械は、ポリマーに対する分子の結合を、約４５Ｈｚから約１２０Ｈｚの速度に制御できる。最も好ましい実施形態では、有限状態機械は、ポリマーに対する分子の結合を、約５０Ｈｚの速度に制御できる。
【００３８】
本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用できる。本発明は、ポリヌクレオチドとの結合に関する酵素の相対的親和性を決定し、それにより本発明を使用してポリヌクレオチドに結合する新規の酵素化合物を同定するためにも使用できる。
【００３９】
１つの実施形態では、対象デバイス又はシステムは、電気的連通手段により接続されたシス及びトランスチャンバーを備える。シス及びトランスチャンバーは、少なくとも１つの細孔又はチャネルを含む薄膜により隔てられている。１つの好ましい実施形態では、薄膜は、疎水性領域及び親水性領域を有する化合物を含む。より好ましい実施形態では、薄膜はリン脂質を含む。デバイスは、シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための手段を更に備える。デバイスは、シス及びトランスチャンバー間の電流を検出するための手段を更に備える。細孔又はチャネルは、ポリマーを通過させるのに好適な寸法を有する形状及び大きさに作られている。１つの好ましい実施形態では、細孔又はチャネルは、ポリマーの相当な部分を収納する。更により好ましい実施形態では、細孔又はチャネルは生物活性を有する。別の好ましい実施形態では、ポリマーはポリヌクレオチドである。
【００４０】
１つの実施形態では、薄膜は、ポリマーに対する結合親和性を有する化合物を更に含む。１つの好ましい実施形態では、結合親和性（Ｋａ）は、少なくとも１０６ｌ／ｍｏｌｅである。より好ましい実施形態では、Ｋａは、少なくとも１０８ｌ／ｍｏｌｅである。更に別の好ましい実施形態では、化合物は、少なくとも１つの細孔に隣接している。より好ましい実施形態では、化合物はポリペプチドを含む。
【００４１】
１つの実施形態では、化合物は酵素活性を備える。例えば、酵素活性は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼ等の酵素活性であり得るが、それらに限定されない。より好ましい実施形態では、酵素活性は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、又はアセチラーゼ等の酵素活性であり得る。
【００４２】
別の実施形態では、細孔又はチャネルは、活性化因子の通過を可能にするように形状及び大きさが作られており、活性化因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及び任意の他の生物学的活性化因子からなる群から選択される。
【００４３】
更に別の実施形態では、細孔又はチャネルは、補助因子の通過を可能にするように大きさ及び形状が作られており、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及び任意の他の生物学的補助因子からなる群から選択される。
【００４４】
好ましい実施形態では、細孔又はチャネルは、生体分子、又は合成された修飾若しくは改変生体分子を含む。例えば、そのような生体分子は、イオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、ＧＰＣＲ等のような膜貫通受容体、又は核膜孔等であるが、それらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、生体分子はα溶血素である。
【００４５】
代替的には、化合物は非酵素性生物活性を備える。例えば、非酵素性生物活性を有する化合物は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、糖、脂質、グリコホスホイノシトール、又はリポポリサッカライド等であり得るが、それらに限定されない。化合物は、抗原活性を有する場合がある。化合物は、選択的な結合特性を有する場合があり、それによりポリマーは、特定の制御された環境条件下では化合物に結合するが、環境条件が変化すると結合しない。例えば、そのような条件は、［Ｈ＋］の変化、環境温度の変化、ストリンジェンシーの変化、疎水性の変化、又は親水性の変化等であり得るが、それらに限定されない。
【００４６】
更に別の実施形態では、本発明は、電圧フィードバック制御を使用してポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって、ポリヌクレオチドによる酵素の捕捉及び解離の繰り返しに帰着する方法であり、媒質を含む２つの別々の隣接した区画、チャネルのシス側からチャネルのトランス側に一度に１つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する２つの区画間の界面を準備するステップ；ポリヌクレオチドに対する結合活性を有する酵素を準備するステップ；保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物を準備するステップ；ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり一部が一本鎖であるポリヌクレオチド複合体を準備するステップ；ポリヌクレオチド複合体を２つのチャンバーの１つに導入するステップ；２つのチャンバー間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成し、第１の極性がポリヌクレオチドの一本鎖部分を、チャネルを通してトランス側に移動させるステップ；保護デオキシリボヌクレオチドを同じチャンバーに導入するステップ；酵素を同じチャンバーに導入するステップ；酵素がポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；保護デオキシリボヌクレオチドがポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチドに対する酵素及び保護デオキシリボヌクレオチドの結合を検出するステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物を２つのチャンバーの他方に導入するステップ；最初に電位差を減少させ、それにより第２の極性を生成させるステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物が一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；電位差を反転させ、それにより第３の極性を生成させるステップ；二度目に電位差を反転させるステップ；チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチド単独を、又は酵素及び保護デオキシリボヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドを検出するステップ；上記ステップのいずれか１つを繰り返し、それによりポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、上記方法は、２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第１の極性が二度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド結合性化合物は、ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、媒質は導電性である。別の好ましい実施形態では、媒質は水性媒質である。別の好ましい実施形態では、保護デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ＵＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００４７】
上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含むチャンバーに試薬を導入するステップと；酵素活性を維持するのに十分な温度でチャンバーをインキュベートするステップとを更に含んでいてもよい。好ましい実施形態では、試薬は補助因子である。より好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、試薬は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＵＴＰからなる群から選択される。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、本発明は、電圧フィードバック制御を使用してポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって、ポリヌクレオチド配列の同定に帰着する方法であり、媒質を含む２つの別々の隣接したチャンバー、チャネルのシス側からチャネルのトランス側に一度に１つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する２つのチャンバー間の界面を準備するステップ；ポリヌクレオチドに対する結合活性を有する酵素を準備するステップ；保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物を準備するステップ；ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり一部が一本鎖であるポリヌクレオチド複合体を準備するステップ；ポリヌクレオチド複合体を２つのチャンバーの１つに導入するステップ；２つのチャンバー間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成し、第１の極性がポリヌクレオチドの一本鎖部分を、チャネルを通してトランス側に移動させるステップ；保護デオキシリボヌクレオチドを同じチャンバーに導入するステップ；酵素を同じチャンバーに導入するステップ；酵素がポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；保護デオキシリボヌクレオチドがポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチドに対する酵素及び保護デオキシリボヌクレオチドの結合を検出するステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物を２つのチャンバーの他方に導入するステップ；最初に電位差を減少させ、それにより第２の極性を生成させるステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物が一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；電位差を反転させ、それにより第３の極性を生成させるステップ；二度目に電位差を反転させるステップ；チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチド単独、又は酵素及び保護デオキシリボヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドを検出するステップ；上記ステップのいずれか１つを繰り返し、それによりポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、上記方法は、２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、第１の極性が二度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、上記方法は、２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド結合性化合物は、ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、媒質は導電性である。別の好ましい実施形態では、媒質は水性媒質である。別の好ましい実施形態では、保護デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ＵＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００４９】
上記方法は、酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；ポリヌクレオチド複合体を含むチャンバーに試薬を導入するステップと；酵素活性を維持するのに十分な温度でチャンバーをインキュベートするステップとを更に含んでもよい。好ましい実施形態では、試薬は補助因子である。より好ましい実施形態では、補助因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、試薬は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＵＴＰからなる群から選択される。
【００５０】
１つの実施形態では、薄膜は複数の細孔を含む。１つの実施形態では、デバイスは複数の電極を備える。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ポリヌクレオチドへの酵素結合が阻止プライマーにより妨げられる本発明の実施形態を例示する図である。
【図２】ポリヌクレオチドに対する酵素触媒活性が阻止プライマーにより妨げられる本発明の実施形態を例示する図である。
【図３】ポリヌクレオチドに対する酵素触媒活性が、ナノポアを横切るＭｇ２＋の注入により活性化される本発明の実施形態を例示する図である。
【図４】単一ポリヌクレオチド分子を配列決定するための方法を示す本発明の実施形態を例示する図である。
【図５】単一ポリヌクレオチド分子を配列決定するための代替的方法を示す本発明の実施形態を例示する図である。
【図６】定義された部位に単一分子を位置決めするための方法を示す本発明の実施形態を例示する図である。
【図７】定義された部位に単一分子を位置決めするための代替的方法を示す本発明の実施形態を例示する図である。
【図８】定義された部位に単一分子を位置決めするための別の代替的方法を示す本発明の実施形態を例示する図である。
【図９】２つのアレイエレメントの側面断面図を示し、本発明がどのように製造できるかの典型的な実施形態を例示する図である。
【図１０】本発明の４つの隣接エレメントの一部を示す本発明の上から見た透視図を例示する図である。
【図１１】本発明の１つの実施形態のシステムを開示するフローチャートを例示する図である。
【図１２】脂質二分子膜に挿入された単一α溶血素タンパク質チャネル（キノコ形状）を例示する図である。加印電位（トランス側が正）下では、Ｋ＋イオンはシス側に流れ、Ｃｌ−イオンはトランス側に流れる。細孔チャネルの前庭及び基部が示されている。
【図１３】ナノポア及びＤＮＡの模式図（上段）と、１８０ｍＶの加印電圧下での２０塩基対ヘアピンＤＮＡ移動事象中の代表的なイオン電流信号のプロット（下段）とを例示する図である。（Ｉ）１８０ｍＶでは、ＫＣｌイオンは開口チャネルを通過し、約６４ｐＡの電流に帰着する。（ＩＩ）ＤＮＡ分子の一本鎖末端が細孔のシス開口に捕捉されると、イオンの流れは約２０ｐＡに低減される。（ＩＩＩ）約５ミリ秒後、この電圧はヘアピンを解体し、ｓｓＤＮＡが細孔を通ってトランスチャンバーに移動し、測定された封鎖事象を完了する。事象の継続時間は滞留時間と呼ばれる。
【図１４】ナノポアデバイスでＤＮＡ、ＤＮＡ／ＫＦ複合体、又はＤＮＡ／ＫＦ／ｄＮＴＰ複合体を区別することを例示する図である。横列（ａ）は、ナノポアを通るＤＮＡ単独の移動を図示し（３６ヌクレオチドの５’突出及び２’−３’ジデオキシシチジン末端を有する１４ｂｐヘアピン、ｎ＝０のテンプレート塩基はＣである）、ＫＦとの複合体、又はＫＦ及びｄＧＴＰとの複合体からの１４ｂｐｈｐの移動が、それぞれ横列（ｂ）及び（ｃ）に示されている。各横列には、結合した複合体を有するナノポア（縦列Ｉ）、電流トレース（縦列ＩＩ）、及び滞留時間事象プロット（縦列ＩＩＩ）の図が表されている。縦列（ＩＶ）には、滞留時間データを底が１０の対数にした確率ヒストグラムが、黒塗りで示されている。ｃ、縦列ＩＩＩの事象プロットを綿密に検討すると、ほとんどの長期滞留時間事象が２２から２４ｐＡ内にあることが明らかになる。２２から２４ｐＡ内の事象についての白抜きバーサブセットヒストグラムは、確率ヒストグラム（ｃ）に重ねられており、選択された範囲では、長期滞留時間事象が大多数であることを示している。
【図１５】トランス側プライマーのアニーリングによる、捕捉されたＤＮＡオリゴマーの係留を例示する。ａ）有限状態機械（ＦＳＭ）は、移動事象の開口チャネル電流をモニターする。ｂ）捕捉された分子は電流の減衰を引き起こし、ＦＳＭは、閾値［１５．７５、２６．７５］ｐＡに基づいて、事象（ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＫＦ／ｄＧＴＰ）を判断する。ｃ）事象判断の際に、ＦＳＭは、印加電圧を５０ｍＶに２０秒間低減させ、その時間内に２０ｍｅｒプライマーは５’末端にアニーリングする。絵図は、トランスチャンバーにある５’末端及び２０ｍｅｒプライマーと共に、ナノポアの下半分の拡大図を示す。
【図１６】係留ＤＮＡ実験におけるイオン電流信号の時間的経過を例示する図である。最初の２秒は、トランスチャンバーの５’末端プライマーがアニーリングするための、２０秒間の係留待機期間（５０ｍＶを印加）の終わりを示す。ｔｆｉｓｈ＝５秒のフィシング時間が使用され、９つのプローブ事象が示されている。５番目のプローブ事象は、酵素結合事象の詳細を示すために、最終ステップ、その後に続く１．１３ミリ秒後の最終ステップ判断と共に拡大されている。酵素結合事象は約１００ミリ秒続くため、制御論理は、この実験では主としてフィッシングモードである。
【図１７】ナノポアにおける係留ＤＮＡ分子のフィッシング及びプローブを例示する図である。ａ）ｔｆｉｓｈ＝０．５２１秒でのフィッシングモード。ｂ）ＤＮＡ単独事象が閾値［７．５、１５．５］ｐＡで判断されるまで、ＦＳＭが１５０ｍＶを印加するプローブモード。図示された事象では、酵素がＤＮＡに結合せずに、過渡現象が収束するとすぐに、ＤＮＡ単独が判断され、フィッシングモードが再開される。ｃ）フィッシングモード。
【図１８】ナノポアにおける係留ＤＮＡ分子のフィッシング及びプローブの別の方法を例示する図である。ａ）ｔｆｉｓｈ＝０．５２１秒でのフィッシングモード。ｂ）ＤＮＡ単独事象が判断されるまで、ＦＳＭが１５０ｍＶを印加するプローブモード。図示された事象では、酵素結合ＤＮＡが判断され、ＦＳＭは、フィルタリングされた振幅をモニターし続ける。ｃ）［７．５、１５．５］ｐＡ閾値を使用して、最終ステップが判断され、フィッシング局面が再開される。ｄ）フィッシングモード。
【図１９】ＤＮＡ／ＫＦ二元複合体及びＤＮＡ／ＫＦ／ｄＧＴＰ三元複合体がナノポアを通って転位置する提案機序を例示する図である。ａ）三元複合体が存在する場合の典型的な電流トレースを示す。部分ａ（ｉ）、ａ（ｉｉ）、及びａ（ｉｉｉ）は、信号の各区分のシステム構成を例示する。ｂ）及びｃ）は、それぞれ１４ｂｐｈｐ単独、及び三元複合体事象に存在する最終ステップの滞留時間事象プロットを示す。２つのプロットの滞留時間の類似性は、最終ステップがＫＦ解離の結果であるという認識を支持する。ｄ）及びｅ）は、ｂ）及びｃ）と同じであるが、２０ｂｐｈｐににおける事象を示す。ｆ）はＤＮＡ単独事象ｆ（ｉ）及びＤＮＡ／ＫＦ二元事象ｆ（ｉｉ）を並べて示す。酵素結合事象と比較した際、ＤＮＡ単独事象では最終ステップが存在しないこと留意されたい。
【図２０】ＦＰＧＡ制御下での代表的な三元複合体事象を例示する図である。ａ（ｉ）ＦＰＧＡは、検出範囲［１７．２ｐＡ、２２．８ｐＡ］の酵素事象を判断した。ａ（ｉｉ）ＦＰＧＡは、電流をモニターし続けて、電流が少なくとも２０ミリ秒間検出範囲内に留まったことを保証した。２０ミリ秒より長く続く事象は、ＤＮＡ／ＫＦ／ｄＧＴＰ三元複合体事象と判断された。ａ（ｉｉｉ）三元複合体の判断に際し、ＦＰＧＡは、電圧を５ミリ秒間−５０ｍＶに反転させ、複合体を細孔から押し出した。その後、１８０ｍＶの捕捉電圧が回復された。ｂ）ＦＰＧＡ制御をした（赤色の合計５２７事象）、及びＦＰＧＡ制御をしなかった（青色の合計１５５事象）、２４±２．８ｐＡ事象の滞留時間確率ヒストグラム。
【図２１】ＦＳＭ制御を使用した、２０塩基対ヘアピン（ｂｐｈｐ）滞留時間の調節を例示する図である。（Ｉ）赤色の電流信号は、５ｋＨｚでローパスフィルタリングされ、青色の信号は、フィルタリングされた電流の平均であり、赤色の電圧信号は命令された電圧である。ａ）１８０ｍＶの定電圧下、ｂ）滞留時間延長制御下、及びｃ）滞留時間凝集制御下の典型的な事象及び対応する電圧信号。（ＩＩ）各事象の平均振幅対滞留時間を示すＤＮＡ事象の事象プロット。（ＩＩＩ）全ての事象（黒塗りバー）、及び１３から１８ｐＡ範囲のサブセット事象（白抜きバー）についての、滞留時間を底が１０の対数にした確率ヒストグラム。
【図２２】単一ポリヌクレオチドオリゴマーを使用した、ＫＦ結合事象の繰り返しを例示する図である。ａ）１８０ｍＶで捕捉されたヘアピン又はＫＦと結合したヘアピン。ｂ）ヘアピンは、トランス側プライマーがアニーリングするために、５０ｍＶで前庭に保持された（２０秒）。ｃ）−２０ｍＶで５秒間ＫＦをフィッシングした。ｄ）１８０ｍＶを印加し、ＫＦの存在を検査した。酵素結合が生じない場合、裸ＤＮＡが直ちに細孔で検出された。そうでなければ、ＦＳＭは、ＫＦが解離するのを待ち、前庭にヘアピンが残される（２０ｐＡ最終ステップ）。両方の場合、いったん裸ＤＮＡが細孔に存在すると、ヘアピンが解体して別のＫＦをフィッシングする前に、ＦＳＭは電圧を反転する（−２０ｍＶ）。ステップｃ）からｄ）は、ヘアピンが移動するまで繰り返された。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本書類中で開示されている実施形態は例示及び典型であり、本発明を制限することを意図していない。他の実施形態が利用可能であり、本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく、構造的変更をなすことができる。
【００５３】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈がそうではないと明白に指示していない限り、複数の参照が含まれる。したがって、例えば、「ａ  ｎａｎａｏｐｏｒｅ（ナノポア）」への参照は、複数のそのようなナノポアを含み、「ａ  ｓｉｇｎａｌ（信号）」への参照は、１つ又は複数の信号及びその等価物等への参照である。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」とは、あらゆる天然、合成、又は修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ヌクレオチドには、これらに限定されないが、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ＵＴＰ、ＴＴＰ、ｄＵＴＰ、５−メチル−ＣＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰ、ＩＴＰ、ｄＩＴＰ、２−アミノアデノシン−ＴＰ、２−アミノ−デオキシアデノシン−ＴＰ、２−チオチミジン三リン酸、ピロロ−ピリミジン三リン酸、２−チオシチジン、並びに上記の全てのアルファチオ三リン酸及び上記の全塩基の２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド三リン酸が含まれる。修飾塩基には、これらに限定されないが、５−Ｂｒ−ＵＴＰ、５−Ｂｒ−ｄＵＴＰ、５−Ｆ−ＵＴＰ、５−Ｆ−ｄＵＴＰ、５−プロピニルｄＣＴＰ、及び５−プロピニル−ｄＵＴＰが含まれる。
【００５５】
「輸送特性」とは、ポリマー運動中に測定可能な、ナノポアに関する特性を意味する。輸送特性は、例えば、溶媒、ポリマー、ポリマー上の標識、他の溶質（例えば、イオン）、又はナノポアと溶媒若しくはポリマーとの相互作用の関数であり得る。
【００５６】
「ヘアピン構造」は、約６から約１００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を有し、そのヌクレオチド配列の前半がその後半に対して少なくとも部分的に相補的であり、それによりポリヌクレオチドがそれ自体に折り重なり、ヘアピン二次構造を形成するオリゴヌクレオチドとして定義される。
【００５７】
「ヘアピン型前駆体」は、マイクロプロセッサー複合体（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に、その後ダイサー酵素複合体により処理されて、長さが約１６から約２４ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを産出するヘアピン構造として定義される。
【００５８】
「同一性」又は「類似性」は、２つのポリヌクレオチド配列間、又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指し、同一性はより厳密な比較である。「パーセント同一性」及び「％同一性」という語句は、複数のポリヌクレオチド配列又は複数のポリペプチド配列を比較した際に見出される配列類似性の割合を指す。「配列類似性」は、複数のポリヌクレオチド配列間の塩基対配列（任意の好適な方法により決定された）におけるパーセント類似性を指す。複数の配列は、０〜１００％類似性までのいずれかであってよく、又はその間の任意の整数値であってよい。同一性又は類似性は、比較目的のためにアラインメントできる各配列のある位置を比較することにより決定できる。比較された配列における位置が、同じヌクレオチド塩基又はアミノ酸により占められている場合、分子はその位置では同一である。ポリヌクレオチド配列間の類似性又は同一性の度合いは、ポリヌクレオチド配列により共有された位置における同一の又は一致するヌクレオチドの数の関数である。ポリペプチド配列の同一性の度合いは、ポリペプチド配列により共有された位置における同一アミノ酸の数の関数である。ポリペプチド配列の相同性又は類似性の度合いは、ポリペプチド配列により共有された位置における同一アミノ酸の数の関数である。
【００５９】
「不適合」という用語は、２つの分子又はそれらの一部分が、物理的に、化学的に、又はその両方で、互いに相互作用できない分子の化学的特性を指す。例えば、ヌクレオチドを含むポリマーの一部分は、ヌクレオチドと、例えばペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、又はヌクレオチド異性体等のような別の化学的部分とを含むポリマーの一部分と不適合であり得る。別の例では、アミノ酸残基を含むポリマーの一部分は、アミノ酸残基と、例えば硫酸基、リン酸基、アセチル基、シアノ基、ピペリジン基、蛍光基、シアル酸基、又はマンノース基等のような別の化学的部分とを含むポリマーの一部分と不適合であり得る。
【００６０】
「アラインメント」は、共通の構成要素（ヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基等）が視覚的に及び容易に同定できるように、多数のＤＮＡ又はアミノ酸配列が、長さに沿った比較により整列されることを指す。共通の構成要素の割合又はパーセントは、配列間の相同性又は同一性に関連付けられる。アラインメントは、保存された領域及びそれらの領域内の関連性を同定するために使用されてもよい。アラインメントは、ＭＡＣＶＥＣＴＯＲソフトウェア（１９９９年）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、米国カリフォルニア州）等の、当技術分野で公知のコンピュータプログラムにより好適に決定できる。
【００６１】
「高度にストリンジェントな」又は「高度にストリンジェントな条件」という用語は、その配列が高度に相補的なＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にする条件であり、それらの同じ条件が著しくミスマッチなＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外する条件を指す。ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列は、例えば、対立遺伝子変異体若しくはスプライス変異体、又は現在開示されているポリペプチドのオルソログ若しくはパラログをコードする配列を含む、開示されているポリヌクレオチド配列の変異体であってよい。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法は、Ｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４０２−４０４、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）により；並びにＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）により詳細に開示されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
一般的に、ストリンジェンシーは、インキュベーション温度、溶液のイオン強度、並びにハイブリダイゼーション及び洗浄手順で使用される変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度により決定される（ストリンジェンシーの確立及び決定に関するより詳細な記述については、下記を参照されたい）。２つの核酸が種々のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする度合いは、それらの類似性の程度と相関する。したがって、ある生物のゲノム内（パラログの場合のように）、又は類似の機能を果たし得る別の生物から（オルソログの場合のように）等の様々な供給源に由来する類似のポリヌクレオチド配列は、公知のペプチドコード配列とハイブリダイズするそれらの能力に基づいて単離することができる。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションを実施して、当技術分野で公知の配列と類似性を有する配列を単離できる条件及び方法には、数多くの変動が可能であり、明示的に本明細書中で開示されたものに制限されない。そのような手法は、例えば、開示されている配列と６０％の同一性、又はより好ましくは約７０％を越える同一性、最も好ましくは７２％以上の同一性を有する配列等の、開示されている配列と種々の度合いの類似性を有するポリヌクレオチド配列を単離するために使用することができる。
【００６３】
単一チャネル薄膜デバイス及びそれを使用するための方法が提供される。対象デバイスは、電気的連通手段により接続されたシス及びトランスチャンバーを備える。電気的連通手段のシス端には、単一ナノポア又はチャネルを含む薄膜で密閉された水平方向の円錐形開口部がある。デバイスは、シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための手段を更に含む。対象デバイスは、ナノポア又はチャネルを通るイオン電流がモニターされる応用に使用を見出し、そのような応用例には、天然イオンチャネルの特徴付け、及びポリマー化合物の特徴付け等が含まれる。現行の配列決定法は、約１キロベースの解読長に限られているが（１０００塩基対が同定される）、本明細書中で開示されている本発明は、従来のバルク配列決定法と比較して、ずっと長い解読長の可能性を有する（Ｍｅｔｚｋｅｒ（２００５）Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓ．１５：１７６７−１７７６；Ｒｈｅｅ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｓ（２００６）ＴＩＢＳ２４：５８０−５８６）。
【００６４】
本発明の方法を実行するために使用できるデバイスは、例えば米国特許第５，７９５，７８２号、米国特許第６，０１５，７１４号、米国特許第６，２６７，８７２号、米国特許第６，７４６，５９４号、米国特許第６，４２８，９５９号、及び米国特許第６，６１７，１１３号に記載されており、これらの各々はこれらの全体がこれによって参照により組み込まれる。本発明は、本明細書中で開示されている例及び方法により最もよく理解される。
【００６５】
混合物中の個々のポリマーについて酵素活性が開始される時点を制御する手段が有利であろうことは、今では理解されている。即ち、そのような制御がなければ、酵素活性の開始（例えば、酵素及びＤＮＡを含有する槽へのＭｇ２＋補助因子の添加による）は直ちに始まるであろうし、酵素−ポリヌクレオチド複合体は、時系列でナノポアにより捕捉された際に、標的鎖に沿った多数の地点で必然的に存在するだろう。少なくとも５つの方法が、これらの潜在的な多重相互作用を克服するために使用できる：
ａ）マイクロフルイディクス。酵素活性を誘導する因子は、酵素−ポリヌクレオチド複合体が細孔により捕捉された後でのみ添加することができる。そのポリヌクレオチドが処理された後で槽を洗い流すことができ、添加されたポリヌクレオチド標的の新しい集団は、誘導因子を欠如する。その後、このサイクルが繰り返される。
ｂ）タンパク質工学。酵素を細孔に共有結合で結合するによって、システムに酵素を１つのみ有することが可能であり得るし、酵素は細孔に直接隣接するであろう（これを達成するための幾つかの方法は、米国出願第１０／７３９，５８５号明細書に明示されている）。
ｃ）複合体をナノポアに捕捉することによってのみ遊離される作用剤を使用して、バルク相の酵素活性を阻止する。これは、図面中（図１及び２）の例によって例示され、本明細書中で記述されている。
【００６６】
必要な全てのｄＮＴＰ（それぞれ約２００μＭの）、Ｍｇ２＋（約５ｍＭの）、及び前進型ＤＮＡポリメラーゼ（約１μＭの）を含有する溶液中のＤＮＡプライマー−テンプレート対（約１μＭの）を仮定する。上記溶液は、負に荷電したＤＮＡが細孔に引き込まれるような印加電圧で、単一ナノポア（例えば、α溶血素）と接触している。各プライマー−テンプレート対は、プライマー鎖に加えられるであろう最初の塩基（位置ｎ＝０）で（又はその付近で）、配列特定的分子にもアニーリングする。この分子は、多数の構造のいずれを有していてもよいが、初期の試みでは、ＰＮＡ又は２’−Ｏ−メチル置換ＤＮＡである可能性が高いであろう。この阻止分子は、開始部位におけるポリメラーゼの結合を阻害するか（図１）、又は結合を可能にするが鎖合成を妨げる（図２）。阻止分子は、ナノポアに進入できないほど十分に大きいループを含む。したがって、ＤＮＡ鎖が印加電圧下で細孔に引き込まれる際に、このループは細孔オリフィスに引っかかる。これにより、プライマーテンプレート阻止物の解体が開始され、阻止プライマーは解離する。ポリメラーゼ結合及びポリメラーゼ触媒性鎖合成を続けることができる。この方法のポイントは、ナノポアにより捕捉された鎖だけが、検査されるべき瞬間に阻止プライマーから開放されるということである。最適化された場合、１μＭのＤＮＡプライマー／テンプレートを含有する１００μｌ容積は、合計６×１０１３個の分子中の１つのナノポア活性化分子を表す。
ｄ）トランス側からシス側（酵素を含有する）へと、細孔を通して補助因子を送達する。これにより、細孔に直接隣接している容積に対し、必要とされる因子を有効に制限することができる。一例は、Ｍｇ２＋である。これは、図面中（図３）の例により例示され、本明細書中で記述されている。
【００６７】
この手法の一例は、図３に例示されている。Ｍｇ２＋は、ポリヌクレオチドポリメラーゼを含む多くのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ修飾酵素による触媒活性に不可欠な補助因子である。このシナリオでは、ミリモル濃度を越える濃度のＭｇ２＋が、トランス区画に添加される。シス区画は、触媒に必要な他の全ての試薬、酵素、及び基質を含む。シス区画は、シス側の遊離［Ｍｇ２＋］がバルク相中で事実上ゼロであることを保証するために、微量濃度のＥＤＴＡ（約０．１ｍＭの）も含む。Ｍｇ２＋は生理的条件下で二価陽イオンであるため、ポリヌクレオチドをナノポアに引き付ける印加電圧（トランス側＋）は、シス区画に向かって反対方向にＭｇ２＋を推進させるであろう。したがって、細孔開口部に直接隣接している容積（媒質の区域）では、遊離［Ｍｇ２＋］は、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡにより錯体化したＭｇ２＋の割合を差し引き、ナノポア開口部に隣接している容積（媒質の区域）から遠ざかるＭｇ２＋の拡散速度を差し引いた、ナノポアを横切るトランス側からシス側への電圧推進性流束の関数である。バルク容積中の［Ｍｇ２＋］は、事実上ゼロのままであり、二価金属（複数可）のＥＤＴＡ錯体生成が圧倒的である。
ｅ）ｓｓＤＮＡテンプレートを、トランス側から、酵素を含有するシス側へと細孔を通して送達する。これにより、テンプレートの酵素処理を、細孔に捕捉された分子に効果的に制限することができる。他の全てのテンプレート鎖は、チャネルを支える不透過層（例えば、二重層）により酵素から隔離される。
【００６８】
ポリヌクレオチドと相互作用する酵素は当業者に公知であり、これらに限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ大断片（クレノー断片）、ファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、及びＨＩＶ−１逆転写酵素から選択されるＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、及び大腸菌ＲＮＡポリメラーゼから選択されるＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼ、並びにエキソヌクレアーゼラムダ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ＥｘｏＩＩＩ、ＲｅｃＪ１エキソヌクレアーゼ、ＥｘｏＩ、及びＥｘｏＴ等のエキソヌクレアーゼが含まれ得る。
【００６９】
合成によるナノポア共役配列決定
これは、単一ＤＮＡ分子を配列決定するための技術である。この技術は、合成による従来の配列決定法（ＳＢＳ）の特徴を、電子的及び生化学的フィードバック制御下での単一ＤＮＡ分子の新規なナノポア分析と組み合せる。この技術は、３’ターミネーター技術、特に可逆的なターミネーター技術に依存する。
【００７０】
基本的な戦略は、単一ナノポアについて図４に概説されている。本発明者らの実験室では、４００，０００個までの細孔を有するチップ上でこの分析を実施するための戦略を開発した。そのようなチップの設計及び製作は、下記で開示される。
【００７１】
図４に例示されているように、二本鎖及び一本鎖セグメントの両方を有するＤＮＡ分子が、印加電圧下（トランス側が正）でナノスケール細孔に捕捉される（ステップａ：図４）。この性質のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ又はＢＡＣクローン等に由来する制限断片の時限的エキソヌクレアーゼ消化により生成することができる。ナノポアは、ｓｓＤＮＡ断片の移動を可能にするほど十分に大きいが、二本鎖セグメントは、その直径が大きすぎて細孔の最狭部をすり抜けることができないため、移動できない。α溶血素細孔は、これに理想的であり、したがってこの技術を例示するために使用される。鎖の捕捉及び二本鎖セグメントの細孔前庭への進入は、電流振幅に基づいて確認することができる。いったんこれが達成されると、電圧はフィードバック制御下で低減される（ステップｂ：図４）。この時点で、幾つかの技術のいずれかより、二本鎖末端を検査及び同定することができる。例えば、本実験室からの初期特許により、ＤＣ電流インピーダンスだけに基づいて二本鎖末端を同定できることが実証された。同時に、チャネルのトランス側にあるｓｓＤＮＡの５’末端は、細孔中の鎖を無期限に保持する作用剤（例えば、相補的オリゴヌクレオチド又はストレプトアビジン）にアニーリングする。
【００７２】
いったんＤＮＡ鎖が捕捉され末端が同定されると、シス区画は、Ｍｇ２＋、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片（ＫＦ））、及び個別の可逆的ターミネーター又は同一の可逆的ターミネーターにより保護された４種のｄＮＴＰの各々を含有する緩衝液で灌流される（ステップｃ：図４）。その後膜電位は反転され、したがって標的鎖の二本鎖末端を、ポリメラーゼ及び基質を含有するシス区画に推進させる（ステップｃ：図４）。その後、正しい保護ｄＮＴＰが標的に追加されるのに十分な時間の余裕を持たせる（ステップｅ：図４）。その時間が過ぎた時、電圧がもう一度反転される（トランス側；正；ステップｆ：図４）。二本鎖末端は、追加されたヌクレオチドの同一性が確立される細孔の限界開口部の隣りに引き込まれる。保護ヌクレオチドが追加されなければ、信号はステップｂと同じであろう。その場合は、ステップｄからｆは、正しいヌクレオチドが追加及び同定されるまで繰り返される。保護ヌクレオチドの付加が確認された後、シス区画は灌流され、脱保護緩衝液が添加される（ステップｇ：図４）。或いは、本発明者らは、灌流の必要性を排除するであろう本発明者らの制御下で、ナノポア付近のみに位置する脱保護剤が活性化又は不活化されるシナリオを起想する。脱保護剤は、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、光、又は溶質（例えば、脱アリル化を触媒するパラジウム）であり得る。灌流後、トランス側の負電位が確立され、可逆的ターミネーターが除去され得るシス区画に二本鎖末端を推進させる（ステップｈ：図４）。この反応の後、トランス側の正電位が再確立され、脱保護の達成が成功したかどうかの決定、及び最終塩基の同一性の確認が検査され得る限界開口部に、二本鎖末端を引き戻す（ステップｉ：図４）。脱保護が成功していない場合、ステップｈ及びｉが繰り返される。脱保護が成功した場合、このサイクルは、ステップｂで繰り返される。
【００７３】
図５に例示されているシナリオは、エキソヌクレアーゼ消化がチャネルのトランス側で起こり、ＤＮＡが図４と比較して逆向きに捕捉されることを除いて、図４に例示されているシナリオと類似している。この戦略では、テンプレート鎖は、鎖合成がそこから始まるプライマーにより、シス側で適所に保持される。このシナリオの利点は、ナノポアに送り込まれたｓｓＤＮＡが、トランス区画における一連の時限的エキソヌクレアーゼ消化によって、一括して生成されることである。したがって、ほとんどのテンプレートはｄｓＤＮＡとして存在するだろう。例えば、エキソヌクレアーゼが、１塩基につき１０ミリ秒（平均して）で切断すれば、２０ｋｂのｄｓＤＮＡ標的の末端に１０００塩基の突出を生成することができる。約１０００塩基がナノポア結合ＳＢＳによって成功裏に補充されると、エキソヌクレアーゼ（又は必要な補助因子）をトランス区画に再度添加し、更に１０秒間反応を可能にすることができた。新しく生成されたｓｓＤＮＡは、上記のようにシス区画で塩基毎に補充されるだろう。およそ２巡の１０００塩基でこれを繰り返すと、２０ｋｂの断片が完成するであろう。
【００７４】
細孔開口部は寸法が異なっていてもよく、例えば、大きさが約０．５ｎｍから１０ｎｍの直径を有していてよい。例えば、直径は、約０．５ｎｍ、１ｎｍ、１．２５ｎｍ、１．５ｎｍ、１．７５ｎｍ、２ｎｍ、２．２５ｎｍ、２．５ｎｍ、２．７５ｎｍ、３ｎｍ、３．５ｎｍ、４ｎｍ、４．５ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、又はそれらの間の任意の寸法であってよい。
【００７５】
合成によるナノポア共役配列決定は、従来のＳＢＳと比べて幾つかの利点を有するが、主な利点はこれらである：
１）ヌクレオチド付加及び可逆的ターミネーター除去は、個々の標的鎖上で直接測定することができる。
２）このシステムは、ヌクレオチド付加及び脱保護ステップは、それらが成功するまで、迅速に繰り返すことができるように、電気的及び生化学的の両方で制御される。
３）非常に長いＤＮＡ分子を、無期限の間細孔に捕捉、操作、及び定量的に保持することができる。
４）使用される試薬の容積を非常に小さくすることができ（約１００μｌのオーダー）、所定の容積を何百回も再利用できる可能性がある。更に開発を続ければ、ナノポアオリフィスでの脱保護ステップの活性化及び不活性化を制御することが可能であり得る。これは、灌流の必要性を完全に排除するだろう。
【００７６】
従来のＳＢＳでもそうであるように、このアッセイは並行して実施できる。本発明者らは、従来のリソグラフィーを使用して製造できる、１ｃｍ×１ｃｍのチップ上の４００，０００個もの独立してアドレス可能な細孔を起想する（別途の下記開示を参照されたい）。
【００７７】
ここで本発明者らは、巨大分子及び他のポリアニオン／ポリカチオンをナノポア開口部に配置及び結合させるために使用できるポリヌクレオチドを提案する。そのような巨大分子及びポリマーは、例えば、ナノポアオリフィスにおけるポリヌクレオチドポリメラーゼ等のポリヌクレオチド結合性タンパク質であり得るが、これらに限定されない。ナノポアは、使用者により指定できる定義された部位に、事実上あらゆる所望の巨大分子構造物を導く有用な特性を有する。ナノポア部位に配置された後、使用者は多様な方法で巨大分子機能をモニターすることができる。この方法は、これらに限定されないが、酵素、受容体タンパク質、リボザイム、及びリボソーム等の巨大分子に適用できる。この方法は、生物学的細孔、又は薄い無機膜に製造された固体細孔のいずれかに適用できる。
【００７８】
本発明の基盤は、イオン化されたポリマーの十分に長い鎖を、共有結合又は非共有結合のいずれかで所望の巨大分子に結合できることである。その後、ポリマーは、膜を横切って印加された電気的電圧によりナノポアを通して引き込まれる。幾つかの応用では、細孔を横切って作用する電圧を変動させることにより、巨大分子に対する力を調節することが必要な場合がある。その結果、巨大分子は、サブナノメートルの精度で細孔の部位に配置される。その後、巨大分子は、膜貫通電圧により生成された電気的な力、又は巨大分子と、細孔若しくは細孔に隣接した表面との間に設計された共有結合のいずれかにより、細孔部位に維持される。必要に応じて、１つを超える巨大分子を直列に結合できる。
【００７９】
その後、単一巨大分子の機能は、細孔に生成された電気的効果によりモニターできる。例えば、細孔を通るイオン電流を測定することができ、分子機能は電流の変調として検出される。或いは、カーボンナノチューブ等の電極が細孔を横切って配置され、分子機能はナノチューブを通る電子流の変調により検出される。
【００８０】
本発明の典型的な使用
（１）ナノポアデバイスは、ＤＮＡ配列決定に重要な応用を有するエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ等の酵素のターンオーバーをモニターするために使用することができる。
【００８１】
（２）ナノポアデバイスは、酵素基質又はシグナル伝達分子等の可溶性物質間の相互作用をモニターするためのバイオセンサーとして機能し得る。例としては、グルコース、尿酸、及び尿素等の血液成分、ステロイド及びサイトカイン等のホルモン、及び受容体分子と結合することによりそれらの機能を発揮する医薬作用剤が含まれる。
【００８２】
（３）ナノポアデバイスは、リボソーム等の重要な生物学的構造物の機能をリアルタイムでモニターし、この働きを単一機能単位で実施することができる。
【００８３】
図６から８は、本発明の典型的な実施形態を示す。
【００８４】
図６
図６Ａは、細孔開口部に隣接して結合した化合物（３）を有する基材又は構造物（２）中に細孔開口部（１）を含むナノポアデバイスを例示し、基材又は構造物はシス側及びトランス側を定義する。図６Ａは、分子又は巨大分子（４）がポリマー（５）と結合して巨大分子／ポリマー複合体を生成し、ポリマーは、不完全に合成された部分（６）を更に含むことを更に示す。
【００８５】
図６Ｂにより例示されているように、電圧勾配がデバイスに印加され、基材又は構造物のシス側に巨大分子／ポリマー複合体を引き込む。不完全に合成された部分（６）は、細孔開口部を通り抜けるのに十分な寸法を有する。また、シス側に存在するモノマー（７）が例示されている。巨大分子／ポリマー複合体の位置の変化は、細孔開口部を横切る電流（矢印；δＩ）の変化により測定することができる。その後、巨大分子は、モノマーをポリマーに組み込み、図６Ｃに示されているように完全に合成されたポリマー（８）を生成する。
【００８６】
その後、電圧勾配が反転され、図６Ｃに例示されているように、完全に合成されたポリマーが巨大分子から遊離し、それにより電流（δＩ）の変化が更に生成される。これは、巨大分子としてＤＮＡポリメラーゼを使用することにより例証できる。
【００８７】
代替的には、図６Ｄに例示されているように、巨大分子は、不完全に合成された部分をポリマーから切除し、それにより不完全に合成された部分（６）を巨大分子／ポリマー複合体から遊離させる。その後、電圧勾配が反転され、ポリマー（５）は巨大分子から遊離する。これらの事象も、電流（矢印；δＩ）の変化により測定することができる。これは、巨大分子としてエンドヌクレアーゼ酵素を使用することにより例証できる。
【００８８】
図７
図７Ａは、細孔開口部に隣接して結合した化合物（３）を有する基材又は構造物（２）中に細孔開口部（１）を含むナノポアデバイスを例示し、基材又は構造物はシス側及びトランス側を定義する。図７Ａは、分子又は巨大分子（４）がポリマー（５）と結合して巨大分子／ポリマー複合体を生成し、巨大分子は、リガンド（１０）に対する高親和性結合部位（９）を更に含むことを更に示す。
【００８９】
図７Ｂにより例示されているように、電圧勾配がデバイスに印加され、巨大分子／ポリマー複合体を基材又は構造物のシス側に引き込む。その後、ポリマー（５）は、化合物（３）に共有結合で結合し、それにより細孔開口部（１）に隣接するように導かれる。巨大分子／ポリマー複合体の位置変化は、細孔開口部を横切る電流（矢印；δＩ）の変化により測定することができる。
【００９０】
その後、リガンド（１０）は、高親和性結合部位（９）への結合が可能になり、それにより図７Ｃ例示されるように電流（矢印；δＩ）の変化を更に生成する。これは、巨大分子としてステロイドホルモン受容体を使用し、ポリマーとしてポリアスパラギン酸を使用することにより例証できる。
【００９１】
代替的には、図７Ｄに例示されているように、巨大分子は、リガンドを２つの産生物（１１）に代謝し、それにより産生物を巨大分子／ポリマー複合体から遊離させる。その後、電圧勾配が反転され、産生物は巨大分子から遊離される。これらの事象も、電流（矢印；δＩ）の変化により測定することができる。これは、巨大分子としてグルコースオキシダーゼ酵素又はプロテインフォスファターゼ酵素を使用することにより例証できる。
【００９２】
図８
図８Ａは、細孔開口部に隣接して結合した化合物（３）を有する基材又は構造物（２）中に細孔開口部（１）を含むナノポアデバイスを例示し、基材又は構造物はシス側及びトランス側を定義する。図８Ａは、分子又は巨大分子（４）が第一のポリマー（５）と結合して、巨大分子／ポリマー複合体を生成することを更に示す。
【００９３】
図８Ｂにより例示されているように、電圧勾配がデバイスに印加され、巨大分子／ポリマー複合体を基材又は構造物のシス側に引き込む。また、シス側に存在する第２のポリマー（１２）及びトランス側に存在するモノマー（７）が例示されている。代替的には、モノマー（７）がシス側にあってもよい（示されていない）。その後、ポリマー（５）は、化合物（３）に共有結合で結合し、それにより細孔開口部（１）に隣接するように導かれる。巨大分子／ポリマー複合体の位置変化は、細孔開口部を横切る電流（矢印；δＩ）の変化により測定することができる。
【００９４】
図８Ｃに例示されているように、第２のポリマー（１２）は、巨大分子（４）と結合し、電位差により開口部を通ってトランス側に引き込まれる。第２のポリマーが引き込まれると共に、巨大分子は、モノマー（７）を使用して第３のポリマー（１３）を協調的に合成し、それにより細孔開口部を横切る電流の変化を生成する（図８Ｄを参照）。代替的には、第３のポリマー（１３）は、シス側で合成することができる（示されていない）。これらの事象も、電流（矢印；δＩ）の変化により測定することができる。これは、巨大分子としてリボソームを使用し、第１のポリマーとしてメッセンジャーＲＮＡを使用することにより例証できる。代替的には、リボソームを巨大分子として、ポリアスパラギン酸を第３のポリマーとして使用してもよい。
【００９５】
単一チャンネル薄膜デバイスの製造
単一チャネル薄膜デバイス及びそれを使用するための方法が提供される。対象デバイスは、混合信号半導体ウェーハと、少なくとも１つの電気化学的層であり、電気化学的層が二酸化ケイ素等のような半導体材料を含み、半導体材料が、炭化水素等の表面改質剤を更に含み、電気化学的層が複数のオリフィスを定義し、オリフィスがチャンバー及び頚部を含み、オリフィスのチャンバーが混合信号半導体ウェーハの第１の金属組成物と共局在し、オリフィスの一部が第２の金属、例えば銀で塞がれており、第２の金属が第１の金属と電気的に連通しており、オリフィスがリン脂質二重層等の薄膜を更に含み、薄膜がオリフィスの頚部で溶媒不透過性の密閉を形成し、薄膜が細孔を更に含み、オリフィスが水相及びガス相を取り囲む電気化学的層とを含む。好ましい実施形態では、金属被膜層は、それらに限定されないが、ニッケル、金、銅、及びアルミニウム等の金属又は金属合金を含む。
【００９６】
図９は、本発明の側面断面透視図を例示する。
【００９７】
図１０は、本発明の４つの隣接エレメントの一部を示す本発明の頭上からの透視図を例示する。
【００９８】
図１１は、製造された本発明の使用方法を開示するフローチャートを例示する。
【００９９】
生物学的ナノポアは、ポリヌクレオチドの配列決定に有用性を有するが、使用される電流が低いため（およそ数十ピコアンペア）、単一ナノポア配列決定デバイスのハイスループットを使用する検出は、毎秒およそ１０００塩基対に限定される場合がある。集積回路の非常に大きなアレイの製造に使用されるような、互いに独立して機能し得る生物学的ナノポアのアレイを製造すると、ナノポアの非常に大規模なアレイは、何百万もの生化学反応及び分析をたった１秒で実施できる。
【０１００】
アレイエレメントは、集積回路上のトランジスタ製造と同じように、段階的な並列様式で製造することができる。各アレイエレメントの類似層の全て又はほとんどは、アレイエレメントの全体又はほとんどで同時に起こる単一の加工ステップの連続で生成される。
【０１０１】
生物学的試薬の個別分子の活性を同期させる簡単な方法はないと考えられており、したがってアレイの各エレメントは、他のエレメントと独立して作用できるべきである。これは、生物学的ナノポアに結合した単一（又は複数）分子の複合体の生化学状態を制御及び感知する有限状態機械を実装する単一の生物学的ナノポアを各々有するデジタル論理回路を含むことにより達成できる。有限状態機械は、生物学的ナノポアに結合した分子の複合体を低遅延で制御すること可能にし、同時に、別の機会に回収するために収集された情報を格納することができる。
【０１０２】
何十万もの生物学的ナノポアエレメントの各々が、最小数の有線接続を使用して互いに情報伝達できるために、シリアルインターフェース及びアドレス可能な論理を使用して、アレイを出入りする大量のデータを多重伝送できる（図１１のフローチャートを参照）。
【０１０３】
図９は、製造されたアレイの略図を例示する。製造の典型的な方法は、本明細書に開示されている。使用されるべきアナログ及びデジタル回路を備える市販の混合信号半導体ウェーハ（１５）は、基層としての機能を果たす。その後、電気化学的層（複数可）（１６）で、上部を覆うことができる。金属（１９）、例えば銀を、露出した金属被膜（１８）上に蒸着し、同時にナノポアシステムの電極の全て又は大部分を生成する。当業者に周知であるように、酸化物（２）を、電極の上の区域を占めるであろう液体の容積のそれと等しい容積を封入するのに十分な厚さに増大させる。酸化物の表面を化学的に修飾し（１６、３）、オリフィスの湿潤を可能にし、脂質二重層（薄膜、２０）の密閉耐性を向上させる。少量のガス（２１）、例えば窒素ガスを、化学的に修飾されていない電極に隣接した区域に閉じ込める。化学的に修飾されていない酸化物は水（又は水溶液）をはじくため、ガスが閉じ込められる。閉じ込められたガス（２１）を使用して、その下の電子回路からの制御された熱を除去することにより、二重層（２０）の任意の１つに吸引力を適用することができる。金属被膜及び金属の高い熱伝導性により、電子回路からの制御された熱は、閉じ込められたガスに伝導する。
【０１０４】
化学的に修飾された酸化物上の単層（２２）及びオリフィス（１７）を横切る二重層の両方を含む脂質層（複数可）は、化学的に修飾されたウエハーを、一方の表面上が脂質で被膜されたテフロン膜に圧着させることにより適用される。これは、チャンバー又はウェル（２４）に存在する液体又は水溶液（２３）内で生じる場合がある。その上を覆うテフロン膜を除去すると、図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃに示されているように、第１の溶液（２３）を覆う脂質層（複数可）（２０、２２）が残される。
【０１０５】
上述の方法及び手順に従っても、アレイエレメントの全てが、それらのそれぞれのオリフィスを横切る薄膜又は二重層を有するとは限らない場合があることに留意すべきである。有限状態機械により測定される、オリフィスに存在する脂質のキャパシタンスを使用すると、機能を果たさないアレイエレメントの存在を検出することができる。アレイエレメントが薄膜又は二重層を欠如する割合が、好ましい割合と比較してより大きいことがその後決定されれば、テフロン膜の被覆及び脂質被膜のステップを繰り返すことができる。
【０１０６】
図９Ａに示されているように、第２の溶液（２５）は、使用される任意の生化学試薬及び約０．１Ｍから約５ＭのＫＣｌ又は他の好適な塩を含む支援電解質のｐＨを安定させる緩衝液を含んでいてもよい。第２の溶液（２５）は、完全な液滴としてアレイエレメントを覆っている。電極、例えばアースされた巨視的ＡｇＣｌ電極は、第２の溶液（２５）に接触して配置される。二重層が、全ての機能的オリフィスを横切って適所に位置決めされると、イオン電流は第２の溶液（２５）から第１の溶液（２３）へと流れないであろう。細孔分子又はチャネル分子（１４）、例えばα溶血素トキシン等の所定量が、第２の溶液（２５）に添加される。細孔分子又はチャネル分子（１４）の濃度は、例えばおよそ１５分で、薄膜又は二重層のいずれかに単一のチャネルを形成するのに十分な程度である。そのようなチャネルを形成する時間は、例えば３０秒から１時間であり、例えば約３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、７分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、又はその間の任意の時間であり得る。形成時間は、幾つかの要因又はパラメーター、例えば、周囲温度又はインキュベーション温度の上昇又は低下、第２の溶液（２５）又は第１の溶液（２３）の塩濃度の増加又は減少、細孔又はチャネル分子を薄膜又は二重層に向かって引き付ける、第１の溶液及び第２の溶液間の電位差の印加、又は当業者に公知の任意の方法による操作によって変更できる。有限状態機械は、回路を通る電流（イオン）の流れに反応することにより、その対応する二重層における単一チャネルの形成を検出及び／又は感知することができ、回路は、巨視的電極、第２の溶液、単一ナノポア又はチャネル分子、第１の溶液、及び任意の所定のアレイエレメント用の金属（１９）電極を含む。
【０１０７】
生物学的チャネルの形成は、確率論的過程である。いったん単一チャネルが所定のアレイエレメント二重層で形成されれば、第２のチャネルがそこにそのように形成される機会が低減又は好ましくは排除されることが好ましい。第２のチャネル挿入の確率は、二重層を横切る印加電圧、即ち電位差で調節することができる。単一チャネルを感知すると、有限状態機械は、金属電極の電位を調整して、同じ二重層への第２のチャネル挿入の可能性を減少させる。
【０１０８】
上記のステップ（複数可）で取られた予防措置にもかかわらず、第２のチャネルが所定の二重層に形成される場合がある。有限状態機械は、第２のチャネルの形成を検出することができる。オリフィス直下の窒素ガスからの吸引パルスは、１つ又は複数のチャネルを二重層から押し出すことができる。発熱エレメントが、加熱に使用されるガスの近位に含まれており、それにより制御された条件下でガスを膨張させることができる。正確に制御された低圧力のパルスは、２つのチャネルのうち１つのチャネルを押し出し、単一チャネルを二重層に埋め込んでおくことを可能にする。有限状態機械は、発熱エレメントの不活性化により、二重層から１つ又は複数のチャネルを除去することができ、それはガスの収縮に帰着し、二重層に吸引力を適用する。
【０１０９】
生化学的な作働及び検出のために生物学的ナノポアを使用中に、細孔が恒久的に閉塞される場合がある。有限状態機械は、この閉塞された状態を検出及び感知することができ、加熱エレメントを不活性化し、それにより吸引力（減圧）を二重層に適用することにより、封鎖されたチャネルを二重層から除去することができる。
【０１１０】
代替的な実施形態では、各アレイエレメントは、オリフィスを取り囲む金電極（２６）を備えていてもよい。この金電極は、還元又は酸化反応を使用して化学的試薬を活性化する役目を果たすことができ、それは特定のオリフィスの位置で特異的に作用させることができる。例えば、図１０は、４つのアレイエレメントの一部の垂直図を例示し、本発明の構成要素及びエレメントの幾つか、オリフィス（１７）、自由選択的な金電極（２６）、及び基材又は構造（２）の近似的な間隔及び配置を示す。
【０１１１】
有限状態機械は、例えば、Ｔａｉｗａｎ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（台湾）から商業的に入手可能な、最先端の６５ｎｍ加工技術を使用して生成することができる。ナノポアの６００×６００アレイは、３６０，０００回の生化学反応及び検出／感知ステップを１０００Ｈｚの速度で実施することができる。これにより、例えば、半導体ウェーハから切り出された１ｃｍ×１ｃｍ押型につき毎秒３億６０００万塩基の速度で、ポリヌクレオチドの配列決定が可能になり得る。
【０１１２】
シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための典型的な手段は、例えば、浸漬正電極及び浸漬負電極を備えた、電圧供給源に接続されている電極である。そのような電極は、例えば、塩化銀又は類似の物理的及び／又は化学的特性を有する任意の他の化合物で作ることができる。
【０１１３】
検出
ナノポア開口部の時間依存的な輸送特性は、任意の好適な技術により測定することができる。輸送特性は、ポリヌクレオチドを輸送するために使用される媒質、液体中の溶質（例えばイオン）、ポリヌクレオチド（例えば、モノマーの化学構造）、又はポリヌクレオチド上の標識の関数であり得る。典型的な輸送特性には、電流、コンダクタンス、抵抗、キャパシタンス、電荷、濃度、光学特性（例えば、螢光及びラマン散乱）、及び化学構造が含まれる。望ましくは、輸送特性は電流である。
【０１１４】
シス及びトランスチャンバー間の電流を検出するための典型的な手段は、国際公開第００／７９２５７号、米国特許第６，７４６，５９４号、第６，６７３，６１５号、第６，６２７，０６７号、第６，４６４，８４２号、第６，３６２，００２号、第６，２６７，８７２号、第６，０１５，７１４号、及び第５，７９５，７８２号、並びに米国公開２００４／０１２１５２５、２００３／０１０４４２８、及び２００３／０１０４４２８に記載されており、これらに限定されないが、細孔開口部の又はその付近のチャネル又は細孔に直接結合された電極、シス及びトランスチャンバー内に配置された電極、及び絶縁ガラス微小電極が含まれ得る。電極は、それらに限定されないが、２つのチャンバーを横切るイオン電流差、又は細孔開口部若しくはチャネル開口部を横切る電子トンネル電流を検出可能であり得る。別の実施形態では、輸送特性は、開口部の直径を横切る電子の流れであり、ナノポア周面に隣接又は近接して設置された電極によりモニターできる。そのような電極は、信号増幅用のＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器に接続することができる。
【０１１５】
本明細書中で開示されている本発明の応用及び／又は使用には、下記が含まれるがそれらに限定されない：
１．ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びｔＲＮＡによって示されるような相対的又は絶対的な遺伝子発現レベルのアッセイ。これには、天然、変異、及び病原性核酸並びにポリヌクレオチドが含まれる。
２．対立遺伝子発現のアッセイ。
３．染色体内の多ＳＮＰのハプロタイプアッセイ及びフェージング。
４．ＤＮＡメチル化状態のアッセイ。
５．ｍＲＮＡ選択的スプライシング及びスプライス変異体レベルのアッセイ。
６．ＲＮＡ輸送のアッセイ。
７．ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びＤＮＡのタンパク質核酸複合体のアッセイ。
８．ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、又はｍＲＮＡによる、食物及び環境試料中の微生物又はウイルス内容物の存在アッセイ。
９．ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、又はｍＲＮＡによる、食物及び環境試料中の微生物又はウイルス内容物の同定。
１０．植物、ヒト、微生物、及び動物のＤＮＡ、ｒＲＮＡ、又はｍＲＮＡによる病理の同定。
１１．医学的診断における核酸のアッセイ。
１２．定量的核流出アッセイ。
１３．免疫応答に見出される遺伝子再編成を含むがそれに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡレベルにおける遺伝子再編成のアッセイ。
１４．微生物、ウイルス、及びミトコンドリアにおける遺伝子移入のアッセイ。
１５．遺伝的進化のアッセイ。
１６．法医学的アッセイ。
【０１１６】
有限状態機械を使用した適応最終ステップ検出（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｔｅｐ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）用のフィルタリングされた導関数（Ｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）
ＤＮＡ単独、並びにＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片（ＫＦ）、及び相補的ｄＮＴＰを用いた定電圧実験は、最終ステップ、即ちＤＮＡからのＫＦ／ｄＮＴＰの解離を検出するために使用される閾値を決定するために使用できる。イオン電流振幅のフィルタリングされた導関数は、フィルタリングされた振幅（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）に加えて、最終ステップを検出するために使用できる。実際上、フィルタリングされた振幅は、本明細書中に開示されたように閾値化され、フィルタリングされた導関数は、設定閾値を越えた偏向（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）についてモニターされる。指数加重平均フィルタ（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍｅａｎ  ｆｉｌｔｅｒ）を使用した予備分析では、フィルタリングされた振幅に適用されたフィルタリングされた導関数が、最終ステップの存在下で１オーダー分だけ偏向することが示された。フィルタリングされた振幅及びフィルタリングされた導関数の両方を使用した実験が実施され、ＫＦ解離の頑健な検出を保証するために導関数フィルタ及び偏向閾値を調整した。
【０１１７】
導関数の偏向は、共通した（最小の）偏向閾値を使用して、最終ステップレベル偏向を、原理的には任意の印加電圧を、リアルタイムにモニターできる。この手法では、フィルタリングされた導関数のみを使用し、フィルタリングされた振幅の閾値化を使用しない最終ステップ検出が試験される。フィルタリングされた導関数のみを使用する頑健な検出は、ＫＦ結合についてＤＮＡをプローブするために使用できる電圧の範囲を、各プローブ電圧のフィルタリングされた電流振幅範囲の同定を必要とせずに増加させることができる。フィルタリングされた導関数を偏向についてモニターすることに加えて、フィルタリングされた振幅を、あらかじめ設定された閾値を使用せずに相対的な振幅変化についてモニターする論理が開発される。目的は、フィルタリングされた振幅及び／又はフィルタリングされた導関数を使用して、現在の振幅閾値に依存せずに、広範囲の（恐らくは変動する）プローブ電圧でＫＦ解離を頑健に検出できる、より順応性のあるイオン電流フィルタリング論理である。
【０１１８】
他のポリヌクレオチドに相同的なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下又は高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイゼーションさせることにより同定できる。一本鎖ポリヌクレオチドは、水素結合、溶媒排除、及び塩基スタッキング等の、十分に特徴付けられた多様な物理化学的力に基づいて結合する場合、ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ストリンジェンシーが高度であればあるほど、２つのポリヌクレオチド鎖がより類似するというように、関与する核酸の配列同一性の度合いを反映する。ストリンジェンシーは、上記で引用された参考文献でより詳細に記述されているように、温度、ハイブリダイゼーション及び洗浄溶液に存在する塩濃度及び組成、有機及び非有機添加物、溶媒等、並びにインキュベーション（及びその数）を含む多様な要因により影響を受ける。
【０１１９】
ＤＮＡ二本鎖の安定性は、塩基組成、長さ、及びミスマッチ塩基対の度合い等の要因に影響される。ハイブリダイゼーション条件は、異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリダイズ可能なように調整することができる。融解温度（Ｔｍ）は、二本鎖分子の５０％がそれらの構成一本鎖に解離する際の温度として定義される。ハイブリダイゼーション緩衝液が変性剤としてホルムアミドを包含する、完全に一致した二本鎖の融解温度は、下記の等式により推定できる：
（Ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６２（％ホルムアミド）−５００／Ｌ
（ＩＩ）ＤＮＡ−ＲＮＡ：Ｔｍ（℃）＝７９．８＋１８．５（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）＋０．１２（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５（％ホルムアミド）−８２０／Ｌ
（ＩＩＩ）ＲＮＡ−ＲＮＡ：Ｔｍ（℃）＝７９．８＋１８．５（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）＋０．１２（％Ｇ＋Ｃ）２−０．３５（％ホルムアミド）−８２０／Ｌ
式中、Ｌは形成された二本鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション又は洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッドにおける（グアニン＋シトシン）塩基のパーセントである。不完全に一致したハイブリッドの場合、融解温度を下げるためには、各１％のミスマッチにつき、およそ１℃が必要とされる。
【０１２０】
ハイブリダイゼーションの比率は、ハイブリダイゼーション緩衝液に使用される可能性の高いイオン強度ではｐＨにほとんど依存しないが、ハイブリダイゼーション実験は、一般的にｐＨ６．８から７．４のｐＨの緩衝液中で実施される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９８５）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ．”Ｉｎ：Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，７３−１１１）。加えて、下記の１つ又は複数を使用して、非特異的ハイブリダイゼーションを低減することができる：超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ又は別の非相補的ＤＮＡ、ウシ血清アルブミン、ピロリン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリビニルピロリドン、フィコール、及びデンハルト溶液。硫酸デキストラン及びポリエチレングリコール６０００は、溶液からＤＮＡを排除するように作用し、したがって効果的なプローブＤＮＡ濃度及びハイブリダイゼーション信号を所定の単位時間内に上昇させる。幾つかの例では、さらに高いストリンジェンシー条件が、非特異的及び／又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減するために望ましい、又は必要である場合がある。これらの条件は、より高温、より低イオン強度、及びホルムアミド等のより高濃度の変性剤の使用で生成されてもよい。
【０１２１】
ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物に由来する相同配列等の中程度に類似した断片、又は近縁の生物に由来する機能的酵素を複製する遺伝子等の高度に類似した断片をスクリーニングするために調整できる。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションステップ中、又はハイブリダイゼーション後の洗浄のいずれでも調整することができる。塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度、ホルムアミド濃度、ハイブリダイゼーション温度、及びプローブの長さは、ストリンジェンシーを変更するために使用できる変数である（上記の式により記述されているように）。一般的なガイドラインとして、二本鎖＞１５０塩基対の場合、高度なストリンジェンシーは、典型的にはＴｍ−５℃からＴｍ−２０℃で実施され、中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍ−２０℃からＴｍ−３５℃で実施され、低ストリンジェンシーは、Ｔｍ−３５℃からＴｍ−５０℃で実施される。ハイブリダイゼーションは、低から中程度のストリンジェンシー（Ｔｍより２５〜５０℃低い）で実施し、その後ストリンジェンシーを増加させてハイブリダイゼーション後の洗浄を続けることができる。溶液中でのハイブリダイゼーションの最大比率は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の場合はＴｍ−２５℃、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の場合はＴｍ−１５℃で生じることが実験的に決定されている。自由選択的には、解離の度合いを各洗浄ステップ後に評価し、その後により高度なストリンジェンシー洗浄ステップが必要かどうかを決定してもよい。
【０１２２】
高度なストリンジェンシー条件は、開示されている配列に対して同一性の度合いが高いポリヌクレオチド配列を選択するために使用できる。１００個を越える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについて、サザンブロット又はノーザンブロット等の膜に基づく方法で取得されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、定義されたイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低い。ハイブリダイゼーションに使用される条件には、約５０℃から約７０℃のハイブリダイゼーション温度における、約０．０２Ｍから約０．１５Ｍの塩化ナトリウム、約０．５％から約５％のカゼイン、約０．０２％のＳＤＳ又は約０．１％のＮ−ラウリルサルコシン、約０．００１Ｍから約０．０３Ｍのクエン酸ナトリウムが含まれる。より好ましくは、高度なストリンジェンシー条件は、約５０℃の温度における、約０．０２Ｍの塩化ナトリウム、約０．５％のカゼイン、約０．０２％のＳＤＳ、約０．００１Ｍのクエン酸ナトリウムである。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子は、典型的には、全ＤＮＡ分子又はＤＮＡの選択された部分、例えば固有の部分配列のいずれかに基づくプローブにハイブリダイズするだろう。
【０１２３】
ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。更にストリンジェントな条件は、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌ及び５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムを用いて取得でき、いっそう高いストリンジェンシーは、約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムを用いて取得できる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で取得でき、その一方で高度なストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で取得できる。ホルムアミドが存在する場合、ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、及び最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれるであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及びイオン強度等の追加的パラメーターを変動させることは、当業者に周知である。種々のレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれら種々の条件を組み合せることにより達成される。
【０１２４】
ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップも、ストリンジェンシーが異なっていてよく、ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップは、主としてハイブリダイゼーション特異性を決定し、最も重要な要因は、最終の洗浄溶液の温度及びイオン強度である。洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることにより、又は洗浄温度を上昇させることにより増大させることができる。洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、及び最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。
【０１２５】
したがって、存在する転写因子をコードするポリヌクレオチド配列又はそれらの相補体に対する相同性が所望未満であるポリヌクレオチドの結合及び除去に使用できるハイブリダイゼーション及び洗浄条件には、例えば以下が含まれる：
６５℃での６ＸＳＳＣ；
４２℃での５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣ；又は
６５℃での０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで；
例えば各１０〜３０分の洗浄ステップを２回行う。これらの条件についての有用な変異は、当業者であれば容易に明白であろう。
【０１２６】
上記の式の中で表された高度にストリンジェントな条件は構造的に類似したポリヌクレオチドを産出するため、当業者であれば、本発明の範囲内に包含されたポリヌクレオチド種の中に本質的な変異を期待しないだろう。
【０１２７】
必要に応じて、６５℃での約０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、及び各洗浄ステップが約３０分である２回の洗浄、又は６５℃での約０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、及び約３０分間の２回の洗浄を含む、さらにより高度なストリンジェンシーの洗浄ステップを使用してもよい。洗浄溶液の温度は、通常少なくとも約２５℃であり、より高度なストリンジェンシーの場合、少なくとも約４２℃であろう。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、洗浄温度を約３℃から約５℃上昇させ、ハイブリダイゼーションステップと同じ条件を使用することによって更に増大させることができ、ストリンジェンシーは、洗浄温度を約６℃から約９℃上昇させることを除き、同じ条件を使用することにより、いっそう更に増大させることができる。それほど近縁ではない相同体の同定の場合、洗浄ステップは、より低温、例えば５０℃で実施することができる。
【０１２８】
低ストリンジェンシー洗浄ステップの一例では、３０分を越えた少なくとも２５℃の３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳの溶液及び条件が使用される。より高いストリンジェンシーは、３０分を超えた４２℃の１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳで取得できる。いっそうより高度なストリンジェンシー洗浄条件は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳの溶液で、６５℃から６８℃で取得される。洗浄手順では、少なくとも２回の最終洗浄ステップが一般的に使用されるだろう。これらの条件の追加的な変異は、当業者であれば直ちに明白であろう（例えば、米国特許出願２００１００１０９１３）。
【０１２９】
ストリンジェンシー条件は、コード化オリゴヌクレオチドに完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、本出願の申請日の時点で公知の転写因子をコードするポリヌクレオチドに対して完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの比率より、少なくとも約５〜１０倍高い信号雑音比で、コード化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように選択することができる。より高い信号雑音比、即ち１５倍以上が取得されるように、特定のアッセイの条件を選択することが望ましい場合がある。したがって、対象ポリヌクレオチドは、公知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するコード化オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと比較して、少なくとも２倍以上高い信号雑音比で、固有のコード化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするだろう。特定の信号は、関連アッセイで使用される標識、例えば蛍光標識、比色標識、又は放射性標識等に依存するだろう。関連ポリヌクレオチド配列検出用の標識ハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブは、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、又は標識ヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅により産生することができる。
【０１３０】
種々のストリンジェンシー条件下でポリヌクレオチド及びその断片にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が、本発明により包含される（例えば、Ｗａｈｌ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７、及びＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７−５１１）。当業者であれば十分に理解するように、相同性の推定は、ストリンジェンシー条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれかにより提供される（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒｓ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物に由来する相同配列等の中程度に類似した断片から近縁の生物に由来する機能的酵素を複製する遺伝子等の高度に類似した断片までをスクリーニングするために調整できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。
【０１３１】
本発明の特徴付け及び使用
配列決定
１つの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドの配列分析を実施するために使用できる。上記分析は、単一の分析が単一の部位で実施できるという点で、従来技術及び現行技術より優れており、それにより試薬、基質、及びリポーター分子等の相当なコスト削減に帰着する。追加的な重要性は、配列決定反応及び信号生成の迅速性であり、それにより従来技術の向上に帰着する。
【０１３２】
核酸を配列決定するための他の方法は、当技術分野で周知であり、本発明のあらゆる実施形態を実行するために使用できる。これらの方法では、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、及び耐熱性Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ピスカタウエイ、米国ニュージャージー州）等の酵素、又はＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ゲーサーズバーグ、米国メリーランド州）に見出されるもののような、ポリメラーゼ及びプルーフリーディングエキソヌクレアーゼの組み合せが使用される。好ましくは、配列調製は、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーヴェール、米国カリフォルニア州）、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ社、リーノー、米国ネバダ州）、及びＤＮＡ  ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＰＴＣ２００；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ウォータータウン、米国マサチューセッツ州）等の機械で自動化される。配列決定に使用される機械には、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００、３７７、又は３７３型ＤＮＡ配列決定システム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及びＭＥＧＡＢＡＣＥ１０００型ＤＮＡ配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）等が含まれる。配列は、当技術分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７；  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，  ｕｎｉｔ  ７．７）及びＭｅｙｅｒｓ（１９９５；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．  ８５６−８５３）に記述されている多様なアルゴリズムを使用して分析できる。
【０１３３】
ショットガン配列決定法は、複数の供給源に由来するクローニングインサートから、より多くの配列を生成するために使用される。ショットガン配列決定法は、当技術分野で周知であり、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び対象のポリヌクレオチド分子を隣接する代表的領域から選択されるプライマーを使用する。不完全な組立配列（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、当技術分野で周知の種々のアルゴリズム又はＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ  （１９９８）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ８：  １９５−２０２）等のプログラムを使用して、同一性を調査する。ベクター又はキメラ配列若しくは欠失配列を含む夾雑配列を、それぞれ除去又は回復して、不完全な組立配列を最終配列へと編成することができる。
【０１３４】
ポリヌクレオチド配列の伸長
本発明の配列は、当技術分野で公知の種々のＰＣＲに基づく方法を使用して伸長できる。例えば、ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ネステッドプライマー、市販のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーを使用して、ポリヌクレオチド配列を伸長できる。ＰＣＲに基づく方法の場合は全て、プライマーは、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、プリマス、米国ミネソタ州）等の市販のソフトウェアを使用して、長さが約２２から３０個のヌクレオチドであり、約５０％以上のＧＣ含量を有し、約５５℃から約６８℃までの温度で標的分子にアニーリングするように設計できる。配列を伸長して調節エレメントを回収する場合は、ｃＤＮＡライブラリーではなくゲノムを使用するのが好ましい。
【０１３５】
本発明でのポリヌクレオチドの使用
ハイブリダイゼーション
ポリヌクレオチド及びその断片は、種々の目的のために、ハイブリダイゼーション技術に使用することができる。プローブは、５’調節領域等の固有の領域から、又は受容体シグネチャー（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）等の保存されたモチーフから設計又は誘導することができ、ポリヌクレオチドタンパク質、対立遺伝子変異体、又は関連分子をコードする天然分子を同定するための手順に使用できる。プローブはＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、通常は一本鎖であり、ポリヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも５０％の配列同一性を有すべきである。ハイブリダイゼーションプローブは、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、又は標識ヌクレオチドの存在下でのＰＣＲ増幅を使用して産生することができる。ポリヌクレオチド又はその断片を含有するベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び標識ヌクレオチドの添加により、ｍＲＮＡプローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するために使用できる。これらの手順は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社により提供されるキット等の市販キットを使用して実施できる。
【０１３６】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブのＧ＋Ｃ含量、塩濃度、及び温度により決定される。特に、ストリンジェンシーは、塩濃度を低減することにより、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させることにより増加できる。幾つかの膜に基づくハイブリダイゼーションに使用される溶液では、ホルムアミド等の有機溶媒を添加すると、より低温で反応を起こすことが可能になる。ハイブリダイゼーションは、６０℃の１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を有する５×ＳＳＣ等の緩衝液を用いて低ストリンジェンシーで実施することができ、幾つかのミスマッチを含有するポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション複合体の形成が可能になる。その後の洗浄は、４５℃（中程度のストリンジェンシー）又は６８℃（高度なストリンジェンシー）のいずれかで、０．１％ＳＤＳを有する０．２×ＳＳＣ等の緩衝液を用いて、より高度なストリンジェンシーで実施される。高度なストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、ポリヌクレオチドが完全に相補的である場合のみ安定を維持するだろう。幾つかの膜に基づくハイブリダイゼーションでは、好ましくは３５％、又は最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に添加して、ハイブリダイゼーションを実施する温度を低下させることができ、バックグラウンド信号は、サルコシル又はトリトンＸ−１００等の他の界面活性剤及び変性サケ精子ＤＮＡ等の阻止剤の使用により低減することができる。ハイブリダイゼーション用の成分及び条件の選択は、当業者に周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  ＮＹ）に概説されている。
【０１３７】
マイクロアレイは、当技術分野で公知の方法を使用して調製及び分析できる。オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイのプローブ又は標的のいずれにも使用できる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために、並びに遺伝的変異、突然変異、及び一塩基多型を同定するために使用することができる。そのような情報は、遺伝子機能を決定するために；健康状態、疾患、又は障害の遺伝的基盤を理解するために；健康状態、疾患、又は障害を診断するために；及び治療薬の活性を開発及びモニターするために使用できる。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９５年）米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９；Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら（１９９５年）ＰＣＴ９５／２５１１１６；Ｓｈａｌｏｎら（１９９５年）ＰＣＴ９５／３５５０５；Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：２１５０−２１５５；及びＨｅｌｌｅｒら（１９９７年）米国特許第５，６０５，６６２号参照）
【０１３８】
ハイブリダイゼーションプローブは、天然ゲノム配列のマッピングにも有用である。プローブは、以下とハイブリダイズできる：（ａ）特定の染色体、（ｂ）染色体の特定の領域、又は（ｃ）ヒト人工染色体（ＨＡＣ）等の人工染色体構築物、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１構築体、若しくは単一染色体ｃＤＮＡライブラリー等の人工染色体構築体。
【０１３９】
アッセイ用分子の標識化
多種多様な標識及び抱合技術が、当業者に公知であり、種々の核酸、アミノ酸、及び抗体アッセイに使用できる。標識分子の合成は、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、又はＣｙ５−ｄＣＴＰ等の標識ヌクレオチド、又は３５Ｓ−メチオニン等のアミノ酸の組み込み用のＰｒｏｍｅｇａ社製（マディソン  米国ウィスコンシン州）又はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のキットを使用して達成できる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＢＩＯＤＩＰＹ又はＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン  米国オレゴン州）等の試薬を使用して、蛍光物質、化学発光物質、又は発色性物質等を含む多様な物質を用いて、アミン、チオール、及び分子に存在する他の基に化学的に抱合させることにより直接標識できる。
【０１４０】
ポリマー結合性巨大分子を繰り返してプローブするための単一係留ポリマーのフィードバック制御
この節では、クレノー断片（ＫＦ）ポリメラーゼの基本的機序、及びそのＤＮＡテンプレートからのＫＦの解離が、細孔電流振幅及び事象滞留時間をモニターすることで、どのように検出できるのかについて説明する。更に、ＫＦにより付加される次の塩基の同一性は、長滞留時間事象（例えば、＞２０ミリ秒等であるが、それに制限されない）の存在を介して判別することができる。その後、長滞留時間事象は、有限状態機械（ＦＳＭ）を使用し、動的な電圧制御を使用して、検出及び反応させることができる。
【０１４１】
ナノポアに捕捉されたＤＮＡヘアピンに結合したＫＦは、電流振幅に基づきＤＮＡヘアピン単独と区別できることが示されている。また、ＤＮＡヘアピンに追加される次の塩基の同一性は、事象滞留時間に基づいて同定することができる。様々なＤＮＡ／酵素構成を検出及び反応し、ＫＦにより触媒される塩基を同定する能力は、更なる検出及び精度制御が必要であるが、酵素機能の制御及びナノポアに基づく配列決定法の開発の強い動機である。
【０１４２】
ナノポアシステムを使用した単一ＤＮＡヘアピン分子の自動検出及び制御を、これから記述する。単一ＤＮＡ分子の正確な制御は、ナノポアに基づく配列決定に使用されるであろう多連続塩基同定を行うために必要である。ＤＮＡヘアピン事象が検出され、それらの滞留時間を制御できることが示される。提示された結果は、ナノポアに捕捉された単一片ＤＮＡとの酵素結合事象の繰り返しを調節するのに必要な制御レベルを実証する。
【０１４３】
個々のＤＮＡヘアピンは、ナノポア電流信号の振幅に基づき検出及び制御できることが示される。ＤＮＡヘアピンの滞留時間は、細孔中のヘアピンを検出した際に印加電圧を低減させることにより、延長することができる。滞留時間が長いほど、機械学習法を使用してヘアピンの末端塩基対を同定するために使用きる信号をより多く提供する（例えば、Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９（３）：２４８−２５２；及びＡｋｅｓｏｎ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１：１３１１−１３１８を参照）。次章で示されるように、ここで実証された制御の延長は、複数の酵素を捕捉するために単一ＤＮＡヘアピンを使用することを可能にする。
【０１４４】
実施例ＸＸからＸＸＸでは、単一ＤＮＡヘアピンを用いた酵素捕捉の繰り返しが実証される。複数酵素実験は、迅速に実施することができ、測定する分子に手動で結合させることが必要な原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）及び光ピンセット法（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｗｅｅｚｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）と比較して、より高度なスループットを提供する（Ｅｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３８（７０６７）：４６０−６５；及びＧｒｅｅｎｌｅａｆ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３（５７８８）：８０１を参照）。ＤＮＡ／酵素相互作用を迅速にプローブする能力は、ナノポアに基づく配列決定を求める更なる動機を提供する。
【０１４５】
ＫＦを繰り返して捕捉するための単一ＤＮＡヘアピンの基本的な検出及び制御が実証される。酵素解離のリアルタイム検出は、二元及び三元複合体移動事象のナノポア電流信号に存在する最終ステップを認識することにより行うことができる。単一片のＤＮＡを使用して繰り返し酵素をプローブすることにより、ナノポアを使用して長配列のＤＮＡを素早く解読するために必要な機械的動作が達成される。ＫＦによる単一塩基付加を調節するためには、より多くの研究を行う必要があり、それはナノポアを使用して配列決定するためにも必要である。ここで提示された最終ステップ検出法は、良好な結果を提供するが、酵素フィッシングを使用する配列決定が実用的であるためには、誤検出をより少なくすることが必要である。
【０１４６】
酵素フィッシング機序の向上が提案される。指数加重移動平均フィルタは、従来から使用されている移動平均フィルタリングを置換し、計算上の複雑さを低減し、信号平滑化を向上させる。各検出された酵素事象が新しい酵素結合事象であることを確実にするために、裸ＤＮＡヘアピンを用いて、フィッシングを確認できる酵素解離検査を実施する。モデルは新しい酵素結合事象を仮定するため、配列決定に統計的モデルを使用することが重要である。より高い信号対雑音は、より高い制御電圧の使用を可能にするだろうより長いＤＮＡヘアピンの使用により達成できる。ＤＮＡ／酵素解離の信頼できる検出及び反応により、酵素事象の繰り返しデータから正確な塩基同定が可能になるだろう。
【０１４７】
診断
ポリヌクレオチド、断片、オリゴヌクレオチド、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、並びにＰＮＡは、遺伝子発現の変化、ｍＲＮＡ発現の非存在／存在対過剰を検出及び定量するために、又は治療介入中のｍＲＮＡレベルをモニターするために使用することができる。発現の変化に関連した健康状態、疾患、又は障害には、特発性肺動脈高血圧症、二次性肺高血圧、細胞増殖障害、特に退形成希突起神経膠腫、星状細胞腫、乏突起星状細胞腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経節腫、ニューロン新生物、多発性硬化症、ハンチントン病、乳腺癌、前立腺腺癌、胃腺癌、転移性神経内分泌癌、非増殖性線維嚢胞性乳腺疾患及び増殖性線維嚢胞性乳腺疾患、胆嚢の胆嚢炎及び胆石症、変形性関節症、並びに関節リウマチ；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック‐東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、変形性関節症、骨粗しょう症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、血液透析、体外循環、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生虫性、原生動物性、及び蠕虫性感染；プロラクチン産生疾患、卵管疾患、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜又は卵巣腫瘍、子宮類線維症、自己免疫障害、子宮外妊娠、及び奇形発生；乳癌、線維嚢胞性乳腺疾患、及び乳汁漏出症；精子形成障害、異常な精子生理、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペロニー病、インポテンス、女性化乳房症；光線性角化症、動脈硬化症、滑液嚢炎、肝硬変、肝炎、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、癌合併症、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、及び特に副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。
【０１４８】
ポリヌクレオチド、断片、オリゴヌクレオチド、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、並びにＰＮＡ、又はそれらの断片は、遺伝子発現の変化、ｍＲＮＡの非存在、存在、又は過剰発現を検出及び定量するために、又は治療介入中にｍＲＮＡレベルをモニターするために使用することができる。発現の変化に関連する障害には、静座不能症、アルツハイマー病、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、運動失調症、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、色素性網膜炎、統合失調症、季節性感情障害、老人性痴呆症、脳卒中、トゥーレット症状群、並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が含まれる。これらのｃＤＮＡは、上記の疾患、並びに数日から数か月に及ぶ期間にわたる他の脳障害、健康状態、及び疾患に対する治療効能のマーカーとしても使用できる。診断アッセイでは、遺伝子発現の変化を検出するために、患者由来の生体試料中の遺伝子発現を標準試料と比較するためにハイブリダイゼーション又は増幅技術が使用できる。この比較を行うための定性的又は定量的方法は、当技術分野で周知である。
【０１４９】
診断アッセイでは、遺伝子発現の変化を検出するために、患者由来の生体試料中の遺伝子発現を標準試料と比較するためにハイブリダイゼーション又は増幅技術が使用できる。この比較を行うための定性的又は定量的方法は、当技術分野で周知である。
【０１５０】
例えば、ポリヌクレオチド又はプローブを、標準的方法により標識し、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で患者由来の生体試料に添加することができる。インキュベーション期間後、試料を洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に結合した標識（又は信号）の量を定量化し、標準値と比較する。患者試料中の標識量が、標準値と比較して著しく変化している場合、関連する健康状態、疾患、又は障害の存在が示される。
【０１５１】
遺伝子発現に関連する健康状態、疾患、又は障害の診断の基盤を提供するために、正常又は標準発現特性が確立される。これは、ハイブリダイゼーション又は増幅条件下で、正常披検体、動物又はヒトのいずれかから採取された生体試料をプローブと混合することにより達成できる。標準ハイブリダイゼーションは、正常披検体を使用して取得される値を、実質的に精製された標的配列の既知量が使用される実験からの値と比較することにより定量化することができる。このようにして取得される標準値は、特定の健康状態、疾患、又は障害に徴候的な患者に由来する試料から取得される値と比較することができる。標準値から特定の健康状態の関連値に近づいていく逸脱が、その健康状態を診断するために使用される。
【０１５２】
そのようなアッセイは、動物研究、及び臨床試験において特定の治療的な治療計画の効能を評価するために、又は個々の患者の治療をモニターするために使用できる。いったん健康状態の存在が確立され、治療プロトコールが開始されると、診断アッセイは、患者の発現レベルが正常披検体で観察されるレベルに接近し始めるかどうかを判断するために定期的に繰り返すことができる。連続したアッセイから取得される結果は、数日から数か月までに及ぶ期間にわたる治療効能を示すために使用できる。
【０１５３】
リガンドの精製
ポリヌクレオチド又はその断片は、試料からリガンドを精製するために使用できる。ポリヌクレオチド又はその断片を使用してリガンドを精製する方法は、特異的結合を可能にする条件下でポリヌクレオチド又はその断片を試料と混合すること、特異的結合を検出すること、結合したタンパク質を回収すること、及び適切な作用剤を使用して、精製されたリガンドからポリヌクレオチドを分離することを伴うであろう。
【０１５４】
追加的な実施形態では、新しい技術が、トリプレット遺伝子コード及び特定の塩基対相互作用等の特性を含むがそれらに限定されない、現在知られているポリヌクレオチド特性に依存する限り、ポリヌクレオチドは、これから開発される任意の分子生物学的技術で使用することができる。
【０１５５】
参照番号
１．細孔又は細孔開口部
２．基材又は構造物
３．化合物
４．巨大分子
５．第１のポリマー
６．不完全に合成されたポリマーの一部
７．モノマー
８．実質的に完全に合成されたポリマー
９．高親和性結合部位
１０．リガンド
１１．産生物
１２．第２のポリマー
１３．第３のモノマー
１４．細孔分子又はチャネル分子
１５．混合信号ウェーハ
１６．電気化学的層
１７．オリフィス
１８．金属被膜組成物
１９．金属
２０．薄膜又は脂質二重層
２１．閉じ込められたガス（例えば窒素）
２２．脂質単層
２３．液体又は水溶液（第１）
２４．チャンバー又はウェル
２５．液体又は水溶液（第２）
２６．金電極（自由選択的）
【０１５６】
本発明者らの知る限りでは、本発明者らは、ナノポア中の複合体を制御及び測定するためにＦＰＧＡを使用する最初の研究者である（Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．４：３１５−３１７を参照）。本発明者らは、類似の機能性が、適切なマイクロプロセッサを用いて達成できると確信している。ＦＳＭ論理は、ＤＮＡヘアピンの平滑末端の末端塩基対を同定するために使用される機械学習手法の一部として使用されている（Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９（３）：２４８−２５２；Ｗｉｎｔｅｒｓ−Ｈｉｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，８４（２）：９６７−９７６を参照）。これは、その主要な役割が機械学習モデルをオフラインで訓練するためであったＦＳＭの非常に異なる応用であり、本発明者らのＦＳＭ機能性は、オンライン電圧制御用に使用される。
【０１５７】
ナノポア（酵素無し）中のｓｓＤＮＡの直接制御は実証されており（Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８４：２３６６−２３７２）、ＤＮＡ検出は、未処理振幅を閾値レベルと対比させてモニターすることに基づいている。Ｗｉｌｓｏｎら（（２００８）  ｉｂｉｄ）で使用されたものに匹敵する電圧レベル変化が、ｓｓＤＮＡ−細孔相互作用に対するゼロ及び低電圧効果を探究するために命令された。未処理のイオン電流振幅を閾値化することとは対照的に、本発明者らの手法は、リアルタイムで電流をフィルタリングする（詳細は実施例で示す）。
【０１５８】
単一分子を感知し操作するための代替的な方法には、光ピンセット法及び原子間力顕微鏡法が含まれる（Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２１：４２３−４２７を参照）。例えば、光トラッピング法（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｐｐｉｎｇ）は、前進型酵素をポリスチレンビーズに結合させることによるＤＮＡ配列決定に使用されている（Ａｂｂｏｎｄａｎｚｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３８（２４）：４６０−４６５；及びＧｒｅｅｎｌｅａｆ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：８０１）。現在、ナノポアを用いてよりも、より優れた単一ＤＮＡ分子重合の空間的及び時間的分離能が、達成されている。しかしながら、これらの方法は、一般的により多くの調製ステップを必要とし、同じ期間中に遥かに少数の分子しか分析できない。
【０１５９】
本発明者らの発明は、個々のＤＮＡ結合酵素の捕捉及びその後の解離を繰り返すために、ナノポアに保持された単一係留ＤＮＡ分子のフィードバック制御を使用する。本発明者らの実施には２つの局面がある。
【０１６０】
最初に、一本鎖及び二本鎖セグメントを有する単一ＤＮＡ分子は、一本鎖末端で捕捉され、その後一本鎖セグメントをトランス側で二本鎖にすることにより係留される。この構成では、ＤＮＡは、十分な電圧力がシス又はトランス側からの二本鎖セグメントを解体するまで、チャネルのシス及びトランス側の両方の二本鎖セグメントと共に、チャネルに留まるだろう。チャネル中の一本鎖セグメントの長さは、負電圧下で、シスチャンバーにある一本鎖と二本鎖との（ｓｓ−ｄｓ）接合部の露出が、ＫＦの結合に十分利用可能であるように選択される。
【０１６１】
第２の局面では、係留ＤＮＡは、ナノポアのシスチャンバーにあるＫＦ酵素の捕捉及び解離の繰り返しのために使用される。魚釣りに例えると、ＤＮＡは釣り糸及び餌（針としてｓｓ−ｄｓ接合部位を有する）であり、酵素は魚（一度に１匹しか釣ることができない）である。本発明者らの設定、制御論理、文献にある関連手法、及びナノポア中の係留ＤＮＡ分子とのＫＦ結合の繰り返しに関する本発明者らの最初の実証についての詳細をこれから記述する。
【０１６２】
係留ＤＮＡ能力の影響及び改良
ＤＮＡ又はＲＮＡに結合又は修飾する酵素（エキソヌクレアーゼ、キナーゼ、及び他のポリメラーゼ）と、ナノポアに捕捉されたＤＮＡ又はＲＮＡとの相互作用を探究する目的について、本発明者らは、本明細書中で開示されている本発明が、以下の技術的な影響を有するであろうと考える：
＊データスループットの相当な増加。係留構成では、負電圧がフィッシングモードで使用され、正電圧はプローブモードに使用される。プローブモードでは、イオン電流に含有されている全ての情報は、任意の所望のプローブ電圧で、ポリマー単独又はポリマー−酵素相互作用の特徴付けに使用できる。非係留構成では、独立事象（捕捉、ナノポアの封鎖、及び最終的なポリマーの移動を含む）は、ポリマー単独又はポリマー−酵素相互作用の分析に関する情報を含有する。十分な電圧が各分子の捕捉に必要であり、事象間の時間は制御可能ではなく、より低い捕捉電圧は事象間の時間を増加させる。したがって、係留構成は、同じ期間中に分析可能な事象の数を増加させることにより、及びプローブ電圧の範囲を増加させることにより、分析可能なデータのスループットを増加させる。
＊分析不能なデータの低減。プローブモードでは、イオン電流は、係留ポリマー単独又は係留ポリマーに結合した酵素の相互作用に関する情報を含有する。非係留構成では、実験で記録された事象の５０％までは、対象の動力学と無関係である場合がある。例えば、ＤＮＡヘアピンのｄｓ末端がプローブのシス側と接触することにより引き起される短時間の封鎖は、非係留構成のデータには含まれるが、係留構成のデータには含まれないだろう。
＊シスチャンバーにおける生物学的成分の付加をリアルタイムで検出するナノポアセンサーの感度の相当な増加。実験後の分析により、Ｍｇ２＋補助因子及びＫＦの相補的ｄＮＴＰの存在を検出するためのナノポアセンサーの感度が実証される。両方の場合、検出は、二元／三元事象のＫＦ結合部分の滞留時間の増加に基づく。事象のＫＦ結合部分の滞留時間をリアルタイムでモニターすることにより、係留構成は、Ｍｇ２＋及び相補的ｄＮＴＰ構成要素のシスチャンバーへの添加をオンライン検出するための新しい能力を提供する。同じ能力は、他の酵素及びそれらの対応する事象感受性構成要素を用いても利用できる。ＫＦを用いる本発明者らの今後の係留ＤＮＡ実験では、リアルタイム検出能力は、フィッシング時間、ｄＮＴＰ濃度、Ｍｇ２＋濃度、及びプローブ電圧の関数として探究されるだろう。
【０１６３】
本発明は、限定としてではなく、単に本発明のある態様及び実施形態の例示目的で含まれている以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるだろう。
【実施例】
【０１６４】
巨大分子及びポリアニオン又はポリカチオンを測定する能力を実証する幾つかの例を本明細書中に記述する。
【０１６５】
実施例Ｉ：酵素結合は阻止プライマーにより妨げられる。
この方法に関する例示については、図１（ａ）から図１（ｇ）を参照されたい。（ａ）このシナリオでは、阻止プライマーは、バルク相でプライマー／テンプレートに結合している。三元複合体の構造は、第１のヌクレオチドが組み込まれるであろう、標的ＤＮＡのｄｓＤＮＡとｓｓＤＮＡセグメントとの間の結合部に対する酵素の結合を妨げる。（ｂ）阻止されたプライマー／テンプレートを印加電圧（トランス側が正）下で捕捉すると、ｓｓＤＮＡが細孔に係留され、ｄｓＤＮＡが前庭上部に留められる。阻止プライマーの末端のループは、大きすぎて前庭に進入できない。電流はこの状態で複合体の捕捉を報告する。（ｃ）印加電圧下で、ｓｓＤＮＡセグメントは、トランス側に向かって細孔を前進し、阻止プライマー及びテンプレート間の塩基対を徐々に解体する。各塩基対を個別に遊離させるエネルギーコストは少なく（約２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、したがって力を加えると遊離は急速に進行する。この解体過程の間、電流は、ｄｓＤＮＡセグメントが前庭に進入できないため（ｂ）と同じである。（ｄ）解体後、阻止プライマーは遊離する。阻止プライマーが存在しない場合、標的ＤＮＡのｄｓＤＮＡセグメントは、細孔前庭に進入することができる。これは、阻止プライマーの遊離及び標的ＤＮＡ活性化の信号を送る電流の測定可能な低減に帰着する。（ｅ）電圧反転により、酵素結合用の活性化ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡ接合部位が露出する。電圧を反転することにより、負に荷電しているＤＮＡはシス区画へ押し返される。（ｆ）阻止プライマーが存在しない場合、酵素は、標的位置（この例では、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡ接合部位）でＤＮＡに結合することができる。（ｇ）結合した酵素又はＤＮＡ修飾をプローブする。定義された長さの時間（典型的には、数百マイクロ秒から数秒）の後、その元の極性にもう一度電圧を反転させ、それによりＤＮＡをナノポアに引き戻すことができる。電流測定値を使用して、酵素が結合したか（示されている）又はＤＮＡ二本鎖末端が修飾されたかどうか（示されていない）を決定することができる。結果が陰性の場合、ステップ（ｅ）〜（ｇ）を繰り返すことができる。
【０１６６】
実施例ＩＩ：酵素触媒作用は阻止プライマーにより妨げられる。
この方法に関する例示については、図２（ａ）から図２（ｇ）を参照されたい。（ａ）このシナリオでは、阻止プライマーは、バルク相でプライマー／テンプレートに結合している。三元複合体の構造は、酵素が標的ＤＮＡに結合することを可能にするが、テンプレートに沿った触媒及びプロセシングを妨げる。（ｂ）阻止されたプライマー／テンプレートが印加電圧（トランス側が正）下で捕捉すると、ｓｓＤＮＡが細孔に係留され、ｄｓＤＮＡが前庭上部に留められる。これは、阻止プライマーの末端のループが大きすぎて前庭に進入できないために起こる。電流はこの状態で複合体の捕捉を報告する。（ｃ）印加電圧下で、ｓｓＤＮＡセグメントはトランス側に向かって細孔を前進し、阻止プライマー及びテンプレート間の塩基対を徐々に解体する。各塩基対を個別に遊離させるエネルギーコストは少なく（約２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、したがって力を加えると遊離は急速に進行する。解体過程中、電流は、ｄｓＤＮＡセグメントが前庭に進入できないため（ｂ）と同じである。（ｄ）解体後の阻止プライマーの遊離は複合体の活性化に帰着する。図１で開示されたシナリオと異なり、標的ＤＮＡのｄｓＤＮＡセグメントは、結合した酵素が大きすぎて進入できないため、阻止物が解離しても細孔前庭に進入できない。したがって、平均電流は変化しない。（ｅ）印加電圧の低減は、酵素が前進することを可能にする。分析に十分なイオン電流は残存する。（ｆ）テンプレート鎖は完成に複製される。（ｇ）複合体は解離し、ナノポアは、この時点で別のＤＮＡ標的を捕捉及び活性化するための準備が整っている（ステップａを参照）。
【０１６７】
実施例ＩＩＩ：酵素触媒作用は、ナノポアを横切るＭｇ２＋の注入により活性化される。
この方法に関する例示については、図３（ａ）から図３（ｃ）を参照されたい。（ａ）この例のシナリオでは、シス区画は、Ｍｇ２＋を除き、ＤＮＡポリメラーゼ活性に必要な成分を全て含有している。したがって、触媒作用は起こらない。（ｂ）電圧が印加されると（トランス側＋）、Ｍｇ２＋は細孔を横切ってシス区画に推進される。（ｃ）ＤＮＡ−ポリメラーゼ複合体が細孔で捕捉される際には、細孔に直接隣接している容積中のＭｇ２＋濃度は十分に高く、Ｍｇ２＋が酵素の触媒部位の２つの重要位置を占有するのを可能にする。その後、複製された鎖の重合が起こりえる。バルク相の三元複合体は、細孔から遠位のＭｇ２＋濃度が本質的にゼロであるため、ＤＮＡ合成を触媒できない。このシナリオは、ＤＮＡ合成に必要であり、制御された条件下でナノポアを透過できるほど十分に小さい他の物質に適用できる。
【０１６８】
実施例ＩＶ：生物学的ナノポア、α溶血素を使用したポリメラーゼ活性の測定
ＤＮＡポリメラーゼＩのポリメラーゼ活性は、クレノー断片と呼ばれるより小さな構造物に大部分が含有されている。この応用では、クレノー断片は、定義された塩基配列のプライマーと相補的塩基対合を起こしたＤＮＡの一方の鎖（テンプレート）に結合することが可能である。このタンパク質は細孔に引き込まれ、細孔を通るイオン電流はそれにより低減される。２つの異なる酵素機能をモニターすることができる。１）タンパク質が、プライマー−テンプレート複合体上のその結合部位から遊離すると、イオン電流の特徴的な一時的低減が引き起こされる。２）適切なｄＮＴＰ基質が酵素に供給されると、酵素の細孔滞留時間の特徴的な延長が引き起こされる。不正なｄＮＴＰ基質は、滞留時間を変化させない。
【０１６９】
実施例Ｖ：受容体タンパク質に対するリガンド結合の検出
架橋剤により産生される共有結合等の適切な共有結合の形成により、細胞質エストラジオール受容体を、ポリアスパラギン酸の１００ｍｅｒに共有結合で連結する。受容体を、その負イオン形態のポリアスパラギン酸に作用する電場により、３ｎｍ直径の窒化ケイ素細孔に位置決めする。細孔は、細孔上の金層に付着された二機能性硫化アルキルの単層を有する。位置決めの後、細孔のアルキル基と受容体のシステイン基とのジスルフィド結合の形成により、受容体を細孔に共有結合で結合させる。エストラジオールが存在する場合、それは受容体の高親和性部位に結合し、細孔を通るイオン電流を変化させ、それにより単一分子の感度でこのステロイドホルモンを検出する手段を提供する。
【０１７０】
実施例ＶＩ：グルコースオキシダーゼ活性の検出
実施例２において概説された手順に従って、グルコースオキシダーゼ分子を、窒化ケイ素の細孔に結合させる。グルコースが存在する場合、グルコースが活性部位に結合、酸化、及び産生物を遊離するにつれて、酵素作用は、細孔を通るイオン電流に検出可能な一時的変化を作り出す。
【０１７１】
実施例ＶＩＩ：リボソーム機能のモニター
リボソーム調製物を、大腸菌の細胞質ゾル抽出物等の、一般的に使用される翻訳系の存在下で特定のｍＲＮＡと接触させる。この系は、リボソーム機能を阻害するために０℃近くで維持する。或いは、リボソームは、伸長因子又はｔＲＮＡ等の必要な補助因子の除外により不活性化してもよい。単一リボソームは、ｍＲＮＡに結合すると、１００ｍＶ以上の膜貫通電圧の作用により細孔を通してｍＲＮＡを引き込むことによって、細孔に位置決めされる。その後、タンパク質合成又は必要な補助因子の付加を開始させるために、混合物を２５℃に急速に暖める。その後、タンパク質合成の個々のステップを、ｍＲＮＡがリボソーム作用により細孔を通して引き込まれることにより作り出されるイオン電流と、翻訳ステップの進行に伴うリボゾームの周期的な立体構造変化とに対する複合効果によりモニターする。
【０１７２】
実施例ＶＩＩＩ：固体細孔におけるα溶血素チャネルの位置決め
七量体形態のアルファ溶血素チャネルを、リポソーム膜中に構築する。構築が完了した後、１つの末端に１つのストレプトアビジン分子を有するＤＮＡ１００ｍｅｒを添加し、リポソーム膜を横切って内部が正になるように一時的な膜電位を作り出す。これを行う１つの方法は、溶血素チャネルを透過できる正イオンと、その大きさのため不透過性の負イオンとを有する塩を添加することである。膜電位により、ヘアピンの遊離末端が細孔に引き込まれる。ストレプトアビジン構造のため、ＤＮＡは細孔を通り抜けることができないが、その代り溶血素との複合体を形成する。その後、ＤＮＡ鎖が結合した七量体を、公開されている手順により単離し、５ｎｍの細孔を有する窒化ケイ素膜のシス側に添加する。１００ｍＶ以上の電圧を印加し、電気泳動により、溶血素七量体の幹部から突き出ているＤＮＡ鎖を細孔に引き込む。その後、実施例に記述されているように、溶血素七量体を細孔に共有結合で結合する。その後、印加電圧の極性を反転することによりガイドＤＮＡ鎖を除去し、その後、溶血素−窒化ケイ素膜を、高解像度ナノポアとしてバイオセンサー応用に使用することができる。
【０１７３】
実施例ＩＸ：ＤＮＡ結合酵素を繰り返しプローブするためにナノポアに保持された単一係留ＤＮＡ分子のフィードバック制御
生物学的ナノポア構成では、平面状の脂質二重層を、ＫＣｌ溶液中で５０〜１００μｍのテフロン開口部を横切って生成し、単一α溶血素タンパク質チャネルを平面状脂質に自己挿入させる。チャネル（細孔）は、長さが１５ｎｍであり、直径は様々である。細孔のシス開口は、幅が２．６ｎｍであり、基部始まりで１．５ｎｍの限界幅に狭くなる前に３．６ｎｍの前庭へと開口している。トランス開口までの基部の残りは、幅が２ｎｍである。前庭は十分に大きくて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が進入するが、限界基部は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）がちょうどの通り抜けるほどの広さである。ＡｇＣｌ電極を使用して、細孔を通るイオン電流を生成する電位を、二重層を横切って印加する（図１２）。この電圧により生成された電場は、ｓｓＤＮＡ又はＲＮＡの負に荷電したリン酸骨格を細孔を通して引き込み、トランス側電圧が正である細孔のシス側からトランス側に通過させる。分子が移動すると共に、細孔は、移動する分子により部分的に封鎖され、電流の低下を引き起こす。これらの移動事象は、減衰した（遮断された）電流の振幅と、滞留時間として定義される、分子が細孔で費やす時間とにより特徴付けることができる。ナノポアシステム及び例示的なＤＮＡ移動事象の模式図を図１３に示す。図１３に示されているＤＮＡは、二本鎖セグメントが２０塩基対ヘアピン（２０ｂｐｈｐ）である一本鎖及び二本鎖セグメントを有する。ＤＮＡは、一本鎖の末端でナノポアに捕捉され、いったん電圧場力により前庭内でヘアピンが解体すると移動する。この構成は、本発明の一部に対して有用性を有する。手短かに言えば、二本鎖セグメントの有用性は、電圧がセグメントを一本鎖ＤＮＡへとせん断しＤＮＡが移動するまで、二本鎖セグメントがＤＮＡの滞留時間（移動を停止させることによる）を延長するということである。更に、より長い二本鎖セグメントは、所定の電圧においてより長い滞留時間を生み出す。対照的に、ｓｓＤＮＡ又はＲＮＡの場合、移動の速度は、捕捉レベルの電圧下では移動の際に停止せずに、２ヌクレオチド／μ秒にまで達する。
【０１７４】
本発明者らは、二本鎖セグメントが、代替的には、相補的塩基を有するプライマーＤＮＡセグメントを、一本鎖ＤＮＡ末端へアニーリングすることにより形成できることに留意する。重要なことは、本発明者らの構成では、捕捉されたＤＮＡ分子が、一本鎖及び二本鎖セグメントを有しなければならないということである。この構造は捕捉及び保持を容易にする：一本鎖末端が捕捉され、二本鎖末端が滞留時間を増加させ、保持レベルを維持するために電圧を低減することにより、捕捉を検出及び反応するための時間を提供する（下記でより詳細に説明する）。このＤＮＡ構造を使用する別の重要な理由は、本発明者らが提案した手法に利用される酵素が、ＤＮＡの一本鎖と二本鎖との接合部でＤＮＡに正確に結合するということである。
【０１７５】
実施例Ｘ：ナノポア及び酵素
最近、本発明者らは、生物学的ナノポアを使用して、捕捉されたＤＮＡ分子と酵素との相互作用をプローブした。印加電圧下では、酵素結合ＤＮＡのｓｓＤＮＡ末端はナノポアに捕捉され、ナノポアの上部に居留する酵素は大きすぎてナノポアを通って転位置できない。ｓｓＤＮＡに結合する大腸菌エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）の動力学は、ナノポアに基づく力分光法の電圧勾配を使用して定量化した。具体的には、ｓｓＤＮＡの捕捉を検出すると、電圧が自動化されて、ｓｓＤＮＡ−ＥｘｏＩ複合体を短時間保持し、その後Ｅｘｏｌが解離し、ｓｓＤＮＡが細孔を通って転位置するまで電圧勾配を実施する。次いで、印加電圧勾配下の解離時間を、結合速度定数を推定するために使用する。
【０１７６】
以前に（Ｂｅｎｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２：  ７１８−７２４を参照）、本発明者らは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ＫＦ）とＤＮＡとの相互作用を探究した。ＫＦの非存在下では、一定１８０ｍＶにおいて１４ｂｐｈｐが捕捉され、その後解体すると、２０ｐＡの平均振幅及び１ミリ秒の滞留時間中央値での封鎖が明らかになる（図１４ａ）。２μＭのＫＦを添加すると、より高い平均振幅（２３ｐＡ）を有する、二元複合体（ＤＮＡ／ＫＦ）に起因する事象の新集団が生み出され、より長い滞留時間（全事象の中央値３ミリ秒）を有する事象プロットに帰着した（図１４ｂＩＩ）。２００μＭのデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ＫＦ触媒部位のＤＮＡテンプレート塩基に相補的なｄＮＴＰを添加すると、三元複合体（ＤＮＡ／ＫＦ／ｄＧＴＰ）内のより高い安定性結合に起因して、新集団の滞留時間が中央値１３３ミリ秒まで延長された。
【０１７７】
次節に記述されている本発明者らの係留ＤＮＡ構成は、ＫＦ結合ＤＮＡ事象により示される顕著な構造的特徴（相補的ｄＮＴＰ有り又は無し、即ち二元又は三元複合体）を活用する。二元及び三元複合体封鎖をより綿密な調査すると、それぞれ９０％及び９７％を越える封鎖で２ステップパターンが明らかになった。第１ステップは２３ｐＡの平均振幅を有し、その後、最終ステップと呼ばれる、２０ｐＡ平均振幅での短時間（中央値１ミリ秒の滞留時間）の第２ステップが続く。ステップ１からステップ２への転移は、ＫＦがＤＮＡから解離することに帰着し（二元及び三元複合体の場合）、その後ヘアピンは、転位置が起こるまで細孔前庭に入り込むことが実証された。したがって、最終ステップの動力学は、まさにＤＮＡ二本鎖解体の動力学である。
【０１７８】
酵素結合ＤＮＡ事象内に最終ステップが一貫して存在することは、本発明者らの発明にとって機構的に重要である。特に、定電圧下でナノポアに捕捉された酵素結合ＤＮＡ複合体の場合、最終ステップは、酵素がＤＮＡから解離したことを、振幅の変化（本発明者らの最近の研究では、１８０ｍＶにおいて２３ｐＡから２０ｐＡまで）に基づいてリアルタイムで検出することを可能にする。
【０１７９】
実施例ＸＩ：ナノポア中のＤＮＡ及びＫＦ結合ＤＮＡの検出及び制御
この手法では、電圧制御論理は、Ｌａｂ  ＶＩＥＷ  ８ソフトウェア内で有限状態機械（ＦＳＭ）を使用してプログラムし、ＦＳＭ論理は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ−ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇａｔｅ  ａｒｒａｙ、ＦＰＧＡ）ハードウェアシステムに実装する。ＦＳＭ／ＦＰＧＡ電圧制御の本発明者らの第１の実装は、特徴的な２３ｐＡの振幅及び少なくとも２０ミリ秒の滞留時間に基づいた、個々の三元複合体の効果的な自動検出を実証した。２１．２〜２６．８ｐＡの閾値範囲内に２０ミリ秒間続いた全事象の場合、酵素の解離及びＤＮＡのトランス側への転位置を待つのではなく（中央値１００ミリ秒より長い滞留時間）、電圧を反転させて複合体をシスチャンバーに押し返す。この制御論理は、検出された三元複合体事象の滞留時間を、ＦＳＭ／ＦＰＧＡ制御を用いない１２３ミリ秒（２３５ミリ秒の四分位範囲（ＩＱＲ））の中央値滞留時間から、ＦＳＭ／ＦＰＧＡ制御を用いた２３ミリ秒（０．３ミリ秒のＩＱＲ）の中央値滞留時間に集中させる効果を有した。ＤＮＡ及び二元事象の２％未満が２０ミリ秒より長かったため、２０ミリ秒の待機期間は、ほぼ全ての制御された事象が三元複合体であることを保証した。
【０１８０】
ＦＳＭ／ＦＰＧＡ電圧制御の本発明者らの第２の実装では、本発明者らは、特徴的な２０ｐＡ振幅に基づく個々のＤＮＡ複合体（シスチャンバーにＫＦ酵素は存在しない）の効率的な自動検出を実証した（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＢＩＯＤＥＶＩＣＥＳ）、マデイラ、ポルトガルで公開された、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒａｐｉｄ  ｆｉｎｉｔｅ  ｓｔａｔｅ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．）。２０±２．８ｐＡの閾値範囲内に入域する全ての事象で、電圧を速やかに低減させ、ＤＮＡ滞留時間を延長した。第２の実験では、約２０ｐＡレベルの閾値内に入域する全てのＤＮＡ事象で、電圧を速やかに反転させ、移動する前にＤＮＡをシスチャンバーへ押し返した。両実装（酵素結合ＤＮＡ事象を検出及び反応すること、並びに無酵素ＤＮＡ事象を検出及び反応すること）は基礎的な成果であり、本発明者らは、両タイプの事象間を個々に及びリアルタイムに検出及び見分けることを試みるよう促された。
【０１８１】
実施例ＸＩＩ：装置
パッチクランプ増幅器、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製ＡｘｏＰａｔｃｈ  ２００Ｂにより、印加電圧を調節し、チャネルを通るイオン電流を測定する。データは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａデジタイザを使用して記録し、５０ｋＨｚでサンプリングし、４極ベッセルフィルタ（ｆｏｕｒ−ｐｏｌｅ  Ｂｅｓｓｅｌ  ｆｉｌｔｅｒ）を用いて５ｋＨｚでローパスフィルタリングした。本発明者らの装置の１つでは、異なるパッチクランプ、Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製モデル２４００を使用する。
【０１８２】
実施例ＸＩＩＩ：制御論理：ハードウェア及びソフトウェア
電圧制御論理は、Ｌａｂ  ＶＩＥＷ  ８ソフトウェア内で有限状態機械（ＦＳＭ）を使用してプログラムする。ＦＳＭ論理は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）ハードウェアシステム、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製ＰＣＩ−７８３１Ｒに実装する。ＦＰＧＡは、迅速な測定及び電圧反応時間（１μｓｅｃ出力サンプリング時間）を可能にする再編成可能なハードウェアプラットフォームである。ＦＳＭは、プログラム実行が一連の個々の状態に分割される論理構築体である。各状態はそれに関連するコマンドを有し、状態間の転移はシステム測定の関数である。細孔電流の測定は、入力として処理されＦＳＭに渡される。必要に応じてＦＳＭ制御論理の変更を行なうが、ＦＰＧＡ上で実行するために設計を再コンパイル及び迂回させる必要はない。これは、システムが１マイクロ秒オーダーで事象に反応することが可能になる一方、必要に応じて実験間で制御論理を再構成することも可能になることによって、速度と柔軟性とのバランスを達成する。
【０１８３】
実施例ＸＩＶ：イオン電流のフィルタリング及び閾値化
本発明者らの制御論理は、ＤＮＡ単独又はＫＦ結合ＤＮＡに起因するイオン電流遮断（事象）の効率的な検出を必要とする。更に、この論理は、これら２つの事象タイプ間を効率的に区別できなければならない。１８０ｍＶでは、ＤＮＡ単独及びＫＦ結合ＤＮＡの平均振幅は、それぞれ２０ｐＡ及び２３ｐＡであり、差は３ｐＡである。ＤＮＡ単独とＫＦ結合ＤＮＡ事象をリアルタイムに区別するために、ＦＰＧＡ上の入力電流信号をフィルタリング及び閾値化する。
【０１８４】
閾値レベルは、生物学的構成要素がシスチャンバーで検出される定電圧実験により、経験的に決定される。ＫＦを用いた本発明者らの実験では、ＫＦ結合事象又は無ＫＦ事象と一致する振幅閾値を、１８０ｍＶ及び１５０ｍＶで同定した。例えば、１８０ｍＶでは、ＤＮＡ単独事象を検出するために同定及び使用された閾値は、２０±２．８ｐＡであり、ＫＦ結合ＤＮＡ事象を検出するために同定及び使用された閾値は、２４±２．８ｐＡだった。現在まで、本発明者らの実験では、１つ又は２つの閾値を同時に実装している。将来の研究では、異なることが知られている複数の巨大分子状態を、減衰した振幅に基づいて区別するために、２つを越える閾値を同時に使用してもよい。
【０１８５】
雑音を軽減するために、フィルタリングを使用する。イオン電流のピーク間雑音は１８０ｍＶで定常的に３ｐＡを越えるため、ＤＮＡ単独及びＫＦ結合ＤＮＡ事象を、未処理の電流振幅をモニターすることにより信頼性をもって区別することは可能ではないだろう。電流振幅をフィルタリングすることにより、本発明者らは、ＤＮＡ単独事象及びＫＦ結合ＤＮＡ事象のリアルタイム検出を実証した。節２．３に示されている本発明者らの発明の初期実証を含み、本発明者らの実験では、窓平均フィルタ（ｗｉｎｄｏｗｅｄ  ｍｅａｎ  ｆｉｌｔｅｒ）をこれまで使用してきた。最近、より優れた指数加重平均フィルタが同定されており、新しい実験で使用されるだろう。２つのフィルタに関する詳細は下記に示す。
【０１８６】
実施例ＸＶ：移動平均フィルタ（Ｍｏｖｉｎｇ  Ａｖｅｒａｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ）
ＦＰＧＡは、５．３μｓｅｃ毎にイオン電流をサンプリングし、０．７５ミリ秒の窓サイズを使用して窓平均振幅を計算する。平均が選択された閾値範囲に入域すると、ＦＰＧＡは入力を検出し、平均をモニターし続け、０．２ミリ秒毎に閾値を再検査する。平均が連続４回の検査で閾値範囲内に留まると、ＦＳＭ論理は、この遮断を、選択された閾値と一致することが知られている事象タイプとして判断する。
【０１８７】
電圧変化がない場合、事象の開始及び事象の判断間の期待される時間遅延は１．３５ミリ秒；最初に閾値に入域する窓平均に０．７５ミリ秒、更なる３回の確認検査に０．６ミリ秒である。実際には、判断時間は１．１から２．５ミリ秒まで及ぶ。平均フィルタは、本発明者らの発明の初期実証に実装した（詳細は下記）。
【０１８８】
実施例ＸＶＩ：指数加重移動平均フィルタ
実験後の分析により、本発明者らの平均フィルタは、三元事象内の最終ステップを誤検出することが示された。具体的には、ＦＳＭ／ＦＰＧＡは、三元レベル振幅を検出し、検出最終ステップまで待機し、最終ステップを検出すると、電圧を反転させて未結合ＤＮＡをシスチャンバーに押し出すようにプログラムされていた。データを検討すると、三元事象における最終ステップの存在は、電圧反転がないと高いが（９７％）、最終ステップが明らかに存在しなかった多数の事象で電圧反転が示された。
【０１８９】
最終ステップの誤検出に対するＦＳＭの頑健性を向上させるため、今では、平均フィルタを置換するために指数加重移動平均（ＥＷＭＡ）フィルタが探究されている。ＥＷＭＡフィルタは、電気工学的応用における信号平滑化に一般に使用されるアナログＲＣフィルタのデジタル実装を表す。このフィルタは、過去のサンプリングにより少ない有意性を課し、フィルタリングされた信号が実信号をより良好に追跡することを可能にする。ＥＷＭＡフィルタリングはまた、その再帰的実装によって単純移動平均より効率的に信号平滑化を実施する：
0005646987.tif 000002
0005646987.tif 000003
それぞれフィルタリングされていない電流信号及びフィルタリングされた電気信号であり、ｔはサンプリング数である。最終ステップ検出実験からのデータを、α＝０．９を用いてオフラインでフィルタリングすることにより、誤検出に対する頑健性が平均フィルタより相当に向上することが示された。平均フィルタを用いた場合のように、閾値検査間で０．２ミリ秒待機して、連続４回の閾値検査を事象判断に使用するだろう。
【０１９０】
電圧変化がない場合、事象の開始及び事象の判断間の期待される時間遅延は、０．７ミリ秒；最初に閾値に入域するＥＷＭＡに０．１ミリ秒、更なる３回の確認検査に０．６ミリ秒である。ＥＷＭＡ検出時間のより厳密な評価は、本発明者らの進行中の研究の一部であろう。
【０１９１】
実施例ＸＶＩＩ：電圧場力を変化させるための時間尺度
膜を横切る電圧の振幅が変化する際に、容量性遷移現象を、測定されたイオン電流に重ね合わせる。電圧変化を伴うα溶血素ナノポア研究全てに存在する遷移現象（例えば、上記のＢａｔｅｓら（２００３年）を参照）は、各事象の定義された扱いやすいセグメントについて測定された電流における幾つかの情報を、必然的に覆い隠す。本発明者らの発明では、遷移現象が意味するのは、電圧変化後に事象タイプを判断するように制御論理がプログラムされている場合、フィルタリングされた電流振幅は、遷移現象が十分に収束するまで、事象判断用に選択された閾値（複数可）には入域しないだろうということである。
【０１９２】
遷移現象の収束時間は、電圧の純変化に比例する。電圧制御実験では、印加電圧の変化は、１８０ｍＶから−５０ｍＶまで、及び−５０ｍＶから１８０ｍＶである。２３０ｍＶ（絶対値）の純変化の場合、本発明者らは、遷移現象の９８％が、２．５ミリ秒後には正確な閾値化に十分なほど減衰することを観察した。本発明者らの初期係留ＤＮＡ実験では、電圧変化は２００ｍＶ及び１７０ｍＶ（絶対値）だった。電圧変化に起因する遷移現象は、図１７〜１８において観察可能である。
【０１９３】
電圧変化が存在する場合、事象の判断（ＤＮＡ事象又は酵素結合ＤＮＡ事象としての）に必要な時間は、電圧遷移現象収束時間と一致すると予期される。これは、遷移現象収束時間が典型的には、フィルタリングされた振幅が測定されたイオン電流信号に収束するのに必要な時間より長いためである。したがって、判断時間は、２３０ｍＶ（絶対値）の電圧変化の場合は長くとも２．５ミリ秒、より小さな電圧変化の場合は２．５ミリ秒未満であると予期される。
【０１９４】
実施例ＸＶＩＩＩ：係留ＤＮＡの構成
本発明者らの初期係留ＤＮＡ実験では、単一ＤＮＡ２０ｂｐｈｐを細孔に捕捉し、電圧制御下で細孔を前後に通り抜けさせて、ＫＦをシスチャンバーのｓｓ−ｄｓ接合部位に繰り返して結合及び解離させた。この実験では、１μＭの１００ｍｅｒＤＮＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２μＭのＫＦ、及び２００μＭのｄＧＴＰが、細孔のシスウェルに存在した。したがって、各事象は、ナノポアに捕捉されたＤＮＡ単独又は三元複合体に起因する。
【０１９５】
ＤＮＡオリゴマーを係留用に設計する。具体的には、３’末端は２０塩基対ヘアピンへと形成され、２μＭの５’末端に相補的な２０ｍｅｒプライマーは、トランスチャンバーに存在する。５’末端捕捉の際には、ＤＮＡを細孔に保持するが前庭の３’末端ヘアピンが解体しないように、（未結合ＤＮＡ分子が捕捉された場合）、又はｓｓ−ｄｓ接合部位からＫＦ／ｄＧＴＰを解離させるために（三元複合体が捕捉された場合）、電圧を低減させる。十分な期間後、２０ｍｅｒプライマーは５’末端にアニーリングし、細孔のトランス側で２０ｍｅｒ二本鎖を生成する。本発明者らの初期実験の詳細は、これから提供する。
【０１９６】
この実験では、１８０ｍＶの印加電圧を使用して各ＤＮＡ分子を細孔に捕捉し、５’末端をトランスチャンバーに転位置させた。ＤＮＡ事象（［１５．７５、２１．２５］ｐＡの閾値）又はＫＦ結合ＤＮＡ事象（［２１．２５、２６．７５］ｐＡの閾値）を平均フィルタを使用して判断した際、細孔に分子を保持するがヘアピンを解体しないように、又はＫＦ／ｄＧＴＰを解離させるために、ＦＳＭは電位を５０ｍＶに低減させた。５０ｍＶの保持電圧を、２０ｍｅｒのプライマーがトランスチャンバーでＤＮＡの５’末端にアニーリングするのに十分な時間である２０秒間印加した。捕捉されたＤＮＡ分子の初期係留局面を図１５に示す。
【０１９７】
２０秒後、ＦＳＭは、−２０ｍＶに電圧を反転させ、５’二本鎖をチャネルのトランス側末端に隣接させるのに十分な力で、ＤＮＡを細孔のシス側に向かって押し出し、３’末端ヘアピンのｓｓ−ｄｓ接合部位をシスチャンバーにぶら下げる。−２０ｍＶの電圧は十分に小さく、５’末端プライマー二本鎖を解体しないことを見出した。−２０ｍＶ電圧での時間の長さを、フィッシング時間ｔｆｉｓｈと呼び、秒で測定する。−２０ｍＶをｔｆｉｓｈ秒間印加することを、制御論理のフィッシングモードと呼ぶ。
【０１９８】
−２０ｍＶでｔｆｉｓｈ＝５秒後、ＦＳＭは、１８０ｍＶに電圧を変化させ、その後フィルタリングされた振幅の平均をモニター（閾値化）し、細孔にある分子の同一性を、ＤＮＡ単独又は酵素結合ＤＮＡのいずれかとして判断する。未結合ＤＮＡが判断された場合（［１５．７５及び２１．２５］ｐＡ閾値）、電圧を−２０ｍＶに反転させてフィッシングモードを再開させた。そうでなければ、ＦＳＭは、フィルタリングされた振幅をモニターし続けた。ＫＦ／ｄＧＴＰ結合事象内では、最終ステップを判断した際に（［１５．７５、２１．２５］ｐＡ閾値）、電圧を−２０ｍＶに反転させてフィッシングモードを再開させた。
【０１９９】
未結合ＤＮＡが判断されるまで（ＤＮＡ単独により又は酵素結合事象の最終ステップに達することにより）１８０ｍＶを印加することを、制御論理のプローブモードと呼ぶ。係留ＤＮＡ実験内での、フィッシング−プローブ動作の最初の９回分を、図１６に表示する。いったんＤＮＡが係留され、ＦＳＭ論理がフィッシング−プローブサイクルを始めれば、未結合ＤＮＡ閾値だけを、酵素結合ＤＮＡ事象内での未結合ＤＮＡ又は最終ステップの判断に使用する。ＦＳＭ論理は、係留ＤＮＡ分子が細孔を通り抜けて移動し、開口チャネル電流を検出するまで、フィッシングモードその後プローブモードのサイクルを繰り返す。３’末端ヘアピンが解体するか又は５’末端二本鎖が解体すれば、ＤＮＡは移動する。１８０ｍＶでの解体がＤＮＡ事象判断より速く起こり得るため、本発明者らは、ＤＮＡ転位置が３’末端ヘアピンの解体により起こる可能性が最も高いことを予期する。他方では、−２０ｍＶの電圧は、数分オーダーのフィッシング時間でさえ、５’末端二本鎖を解体する可能性は少ない。実験後の分析を使用して、プローブモード対フィシングモードでＤＮＡ移動の頻度を決定することができる。係留ＤＮＡが移動し、電流が開口チャネル値に復帰すると、ＦＳＭは、別の事象が新しいＤＮＡ分子を係留するために電流を再設定及びモニターする。
【０２００】
第２の実験では、１５０ｍＶのより低い捕捉及びプローブ電圧を使用し、より迅速なフィッシング時間ｔｆｉｓｈ＝０．５２１秒を使用した。一定１５０ｍＶでＤＮＡ単独並びにＫＦ及びｄＧＴＰを有するＤＮＡを用いた実験に基づき、未結合ＤＮＡ閾値を［７．５、１５．５］ｐＡに設定し、ＫＦ／ｄＧＴＰ結合ＤＮＡ閾値を［１９、２７］ｐＡに設定した。プローブがＤＮＡ単独事象を明らかにする図１７に、フィッシング及びプローブモードを示す。プローブが酵素結合ＤＮＡ事象を明らかにする図１８にも、フィッシング及びプローブモードを示す。ＦＳＭは、８つの独立したＤＮＡ分子を捕捉及び係留した。合計で３３７回の酵素結合ＤＮＡ事象が、３８０秒の期間にわたってプローブモードにおいて生じた。データ分析により、ＦＳＭ／ＦＰＧＡは、これらの事象における最終ステップをその回数の７２％で正確に判断したことが示されている。残りの２８％では、フィッシングは、最終ステップが実際に酵素結合ＤＮＡ事象で生じる前に再開された（偽陽性と呼ぶ）。オフライン分析により、ＥＷＭＡフィルタは、このデータではゼロ偽陽性に帰着したことが示された。将来の係留ＤＮＡ実験におけるＥＷＭＡフィルタのオンライン実装は、偽陽性に対するフィルタの頑健性を評価及び向上させるために使用されるだろう。偽陽性を除外／最小限にするために、「未結合ＤＮＡ検査」機序を探究することができる。この機序は以下のように作用する：各プローブモードの終わりで、短すぎてシスチャンバーのｓｓ−ｄｓ接合部位を露出できない期間フッシングし、その後ＤＮＡが結合していないことを保証するため再プローブする；未結合の場合、ｔｆｉｓｈの期間フィシングする；結合している場合、最終ステップを検出するまで待機する。ＤＮＡが結合していないことを確認するために使用される短時間のフィッシング期間の同定は、本発明者らの進行中の研究の一部であろう。
【０２０１】
実施例ＸＩＸ：ナノポア中の個々のＤＮＡ及び酵素結合ＤＮＡ分子の迅速な検出及び制御
生物学的ナノポア構成では、平面状脂質二分子膜は、ＫＣｌ溶液中で２０μｍのＴＥＬＯＮ開口部を横切って生成する。単一α溶血素タンパク質チャネルを平面状脂質に挿入する。チャネル（細孔）は、長さが１５ｎｍであり、直径は様々である。細孔のシス開口は、幅が２．６ｎｍであり、幹部の始まりで１．５ｎｍの限界幅に狭くなる前に３．６ｎｍの前庭へと開口している。トランス開口までの基部の残りは、幅が２ｎｍである。前庭は十分に大きく、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は進入するが、限界基部は、ｓｓＤＮＡがちょうどの通り抜けるほどの幅である。ＡｇＣｌ電極を使用して、細孔を通るイオン電流を生成する電位を、二重層を横切って印加する（図１２）。この電圧により生成された電場は、ｓｓＤＮＡ又はＲＮＡの負に荷電したリン酸骨格を細孔を通して引き込み、トランス側電圧が正である細孔のシス側からトランス側に通過させる。分子が移動すると共に、細孔は、移動する分子により部分的に封鎖され、電流の瞬間的低下を引き起こす。これらの移動事象は、封鎖電流の振幅と、滞留時間として定義される、分子が細孔で費やす時間とにより特徴付けることができる。ここで提示された実験で使用されたＤＮＡは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡセグメントで構成される。具体的には、本明細書中で開示された非ＦＰＧＡ実験の場合、合計の長さが６７ヌクレオチドの１４塩基対ヘアピン（１４ｂｐｈｐ）を使用した。残りの実験では、２０ｂｐｈｐを有する合計の長さが７９ヌクレオチドであるＤＮＡオリゴマーを使用した。ヘアピンは、それ自体に３’末端を折り重ねることにより形成され、１４又は２０塩基対を生成した。したがって、ヘアピンは、１４及び２０ｂｐｈｐの両方の場合、一本鎖セグメントが３５ヌクレオチドの長さである二本鎖セグメントである（４個の不対塩基が二本鎖末端ループにある）。ｓｓＤＮＡ末端が捕捉されると、ヘアピンは細孔前庭に進入し、ヘアピンが解体するまで留まる。ナノポアシステムの模式図及び例示的な２０ｂｐｈｐ移動事象を、図１３に例示する。
【０２０２】
イオン電流振幅と、細孔を通って移動する個々のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の特徴との相関を、α溶血素ナノポアを使用した種々のアッセイにより示した。細孔を通って通過する分子の数と、電流低下の回数とのほぼ直接的な相関を実証した。ｓｓＤＮＡのホモポリマー及びＲＮＡの阻止コポリマーも、封鎖電流振幅又は動力学における測定可能な差に基づいて区別可能である。しかしながら、既存の生物学的ナノポアを使用して不均質な一本鎖ポリマーの個々のヌクレオチドを配列決定するには、移動速度が迅速すぎる（２個のヌクレオチド／μｓｅｃまで）。ここでは及び他の研究では、一本鎖及び二本鎖セグメントを有するＤＮＡを使用して、ナノポアにおけるヌクレオチドの滞留時間を増加させる（０．５〜５ミリ秒、印加電圧及びｄｓＤＮＡセグメントの長さに依存する）。例えば、長さが３から９塩基に及ぶ平滑末端ヘアピン、一本鎖突出を有しないヘアピンは、Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅら（２００１；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９（３）：２４８−２５２、及びＶｅｒｃｏｕｔｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１：１３１１−１３１８）により使用されており、ｓｓＤＮＡの３’及び５’末端を構成する末端塩基対を同定（配列決定）するために、機械学習法が延長滞留時間事象に適用された。
【０２０３】
実施例ＸＸ：ＦＳＭ／ＦＰＧＡを使用する電圧制御
ナノポアシステムは、０．３ｍＭＫＣｌ溶液における構成である。パッチクランプ増幅器、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製ＡｘｏＰａｔｃｈ  ２００Ｂが印加電圧を調節し、チャネルを通るイオン電流を測定する。データは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａデジタイザを使用して記録し、５０ｋＨｚでサンプリングし、４極ベッセルフィルタを用いて５ｋＨｚでローパスフィルタリングした。
【０２０４】
電圧制御論理は、Ｌａｂ  ＶＩＥＷ  ８ソフトウェア内でＦＳＭを使用してプログラムする。ＦＳＭ論理は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）ハードウェアシステム、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製ＰＣＩ−７８３１Ｒに実装する。ＦＰＧＡは、迅速な測定及び電圧反応時間（１μｓｅｃ出力サンプリング時間）を可能にする再編成可能なハードウェアプラットフォームである。ＦＳＭは、プログラム実行が一連の個々の状態に分割される論理構築体である。各状態はそれに関連するコマンドを有し、状態間の遷移はシステム測定の関数である。細孔電流の測定は、入力として処理されＦＳＭに渡される。必要に応じてＦＳＭ制御論理の変更を行なうが、ＦＰＧＡ上で実行するために設計を再コンパイル及び迂回させる必要はない。これは、システムが１マイクロ秒オーダーで事象に反応することが可能になる一方、必要に応じて実験間で制御論理を再構成することも可能になることによって、速度と柔軟性とのバランスを達成する。
【０２０５】
実施例ＸＸＩ：ＤＮＡ及び酵素結合ＤＮＡ事象を判断するための、フィルタリングされた電流の平均のＦＳＭモニタリング
封鎖電流及び滞留時間により定量化される封鎖事象は、ＦＳＭ／ＦＰＧＡを使用してリアルタイムに検出及びモニターできる。ＦＰＧＡの入力電流信号に適用される平均フィルタは、ピーク間雑音の大部分を除去する。具体的には、ＦＰＧＡは、５．３μｓｅｃ毎にイオン電流をサンプリングし、窓平均振幅を計算する。ＦＰＧＡは、平均が事前指定範囲内にあれば、最初の検出後０．２ミリ秒毎に平均を検査し続ける。４回の連続検査で平均がこの範囲内に入域及び留まる場合、ＦＳＭ論理は、封鎖をＤＮＡヘアピン事象と判断する。ＤＮＡ移動事象とＤＮＡ移動事象判断との間の時間遅延は、通常１．３５ミリ秒；最初に１７．２から２２．８ｐＡの範囲に入域する窓平均に０．７５ミリ秒、及び更なる３回の確認検査に０．６ミリ秒、及び計算遅延に０．６５ミリ秒である。フィルタリングされた電流の平均は、ＤＮＡ事象判断に使用され、ＦＳＭ制御論理の状態間の遷移を開始する。
【０２０６】
ナノポアシステムを使用してＤＮＡ単独か又はＤＮＡ／酵素複合体かを区別するために、ＦＳＭ制御論理を使用した。更に、ＦＳＭを使用して電流信号に存在する最終ステップを検出するために、ＤＮＡからの酵素解離をリアルタイムで検出及び反応することができる。この報告で詳述されるように、ＫＦがＤＮＡヘアピンに結合し、正しいヌクレオチドがシステムに存在する場合、細孔中のＤＮＡ及びＤＮＡ／酵素複合体の両方を検出するＦＳＭの能力は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ間の接合部位の塩基のリアルタイム同定を可能にすることができる。
【０２０７】
更に、単一ＤＮＡヘアピン分子の検出及び制御は、ＤＮＡの単一複製を使用したＫＦ捕捉の繰り返しを含むように拡張することができる。ナノポアを使用すると、ＫＦがＤＮＡヘアピンから引き離される際に、塩基を１つ同定することができる。捕捉とＤＮＡの同一複製からのＫＦ解離との繰り返しは、単一塩基でラチェットするポリメラーゼ反応用の方法が見出されれば、多塩基の配列決定を可能にし得る。現行の配列決定法は、約１キロベースの解読長（１０００塩基対が同定される）に制限されているが、ナノポアに基づく配列決定法は、従来のバルク配列決定法に比べてずっと長い解読長の可能性を有する。
【０２０８】
将来の研究の大部分では、フィルタリングの向上及びより長いＤＮＡヘアピンの使用によって電流信号の信号対雑音を増加させることにより、検出頑健性を向上させることに専心する。また、酵素が解離したことを保証する再検査体系を実装するだろう。異なる複合体の検出限界を見出すために、ＫＦ及びｄＮＴＰの濃度を変動させる実験も実施するだろう。
【０２０９】
実施例ＸＸＩＩ：分子複合体の検出
ＤＮＡと大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ＫＦ）との相互作用は、ナノポアシステムでプローブすることができる。ＫＦの非存在下で、一定１８０ｍＶにおける２０ｂｐｈｐの捕捉及びその後の解体により、２０ｐＡの平均振幅及び４ミリ秒の滞留時間中央値での電流封鎖が明らかにされる。ＫＦと、ＫＦ触媒部位のＤＮＡテンプレート塩基に相補的なｄＮＴＰとの添加は、三元（ＤＮＡ／ＫＦ／ｄＧＴＰ）複合体に起因する、封鎖滞留時間の相当な増加を生み出した（ｄＧＴＰの場合、１１０ミリ秒中央値の存続時間）。そのような封鎖をより綿密に調査すると、９７％を越える封鎖で２ステップパターンが明らかにされ、第１のステップは２４ｐＡの平均振幅であり、第２の（最終）ステップは２０ｐＡの平均振幅であり、ヘアピン動力学のみと一致して４ｍｓ続く。ステップ１からステップ２への転移は、まずＫＦがＤＮＡから解離することに帰着し、その後ヘアピンは解体が起こるまで細孔前庭に入り込むことが実証された。酵素結合ＤＮＡの電圧制御における初期努力として、個々の三元複合体の効率的自動検出（＜３ミリ秒）を、特徴的な２４ｐＡ振幅と、２０ミリ秒後の電圧反転による封鎖時間の切捨てとに基づいて実証した。正しいｄＮＴＰの存在下では事象の６０％が２０ミリ秒より長く、正しいｄＮＴＰを欠く検出範囲では、事象の２％だけが２０ミリ秒より長いので、２０ミリ秒のカットオフを使用し、２０ミリ秒より長い事象は、通常三元複合体事象に対応することを示した（図１４）。検出は、信号の１．５ミリ秒前と１７．２から２２．８ｐＡの検出範囲とを使用して窓平均を計算するための、節１．２．２に記述されている機序に基づいていた。この範囲を選ぶ根拠は、約２０ｐＡが、１８０ｍＶでの１４及び２０ｂｐｈｐ事象、並びに最終ステップの振幅中央値であるということである（図１９）。
【０２１０】
リアルタイムで個々の事象を判断する能力は、このシステムを配列決定に拡張する可能性を示す。単一の長期滞留時間事象（＞２０ミリ秒）は、三元複合体事象の可能性が高いことを示す。付加される次の塩基の同一性は、システムに存在するｄＮＴＰに基づいて同定し、単一塩基配列決定を達成することができる。多塩基解読の場合、ヌクレオチドの付加に沿って前進するには、塩基重合の調節が必要である。付加された塩基毎について、細孔に存在する酵素結合ＤＮＡは、三元複合体の存在をプローブすることができ、正しいｄＮＴＰが重合用に存在することを確認する。ここに提示された実験では、ｄＮＴＰは、重合が停止するようにジデオキシ末端化されており、１つを越える塩基がヘアピンに付加されることを防止する。このジデオキシターミネーターの使用は、今日使用されているほとんどの配列決定法の基礎である。
【０２１１】
実施例ＸＸＩＩＩ：個々のＤＮＡ分子の制御
迅速な検出（＜２ミリ秒）は、イオン電流の最後の０．７５ミリ秒に基づいて、フィルタリングされた平均振幅をリアルタイムで計算することと、ＤＮＡヘアピン封鎖と一致する振幅範囲（２０±２．８ｐＡ）と比べて平均値をモニターすることに基づく。検出に際して、電圧制御の２つの方法を実証した。
【０２１２】
第１の方法では、速やかな電圧低減により滞留時間延長を達成し、低減電圧はヘアピンが解体するまで印加される。捕捉用の高電圧は、検査される分子の数を増加させ、捕捉後の低減電圧は滞留時間増加させ、原理的には配列決定を容易にする。特に、細孔中のＤＮＡヘアピンの寿命を伸ばすことは、機械学習法を使用した末端塩基同定を達成し得る時間を増加させる。
【０２１３】
第２の方法は、事前に設定した時間（１０ミリ秒）電圧を低減させ、その後、ヘアピンが解体する前に分子を押し出すために電圧を反転させる。これは、何百もの封鎖事象の滞留時間を凝集する制御権限を実証する。更に、それは過去の研究を補足し、ＤＮＡ酵素封鎖及びＤＮＡヘアピン封鎖の両方を検出する能力を確認する。各封鎖タイプ間をリアルタイムで区別する能力の確認は、将来の研究のために重要である。最終的に、ナノポアに基づく酵素力学の特徴付けは、酵素に対する複数のＤＮＡ立体配置の直接検出及び制御を必要とするであろうし、無酵素ＤＮＡの直接制御は、この能力の開発に向けた前提条件である。
【０２１４】
ナノポア中のｓｓＤＮＡの直接制御は実証されており、ＤＮＡ検出は、未処理振幅を閾値レベルと比較してモニターすることに基づいている。ここで使用されたものに匹敵する電圧レベル変化は、ｓｓＤＮＡ−細孔相互作用に対するゼロ及び低電圧効果を探究するために命令された。未処理電流振幅の閾値化とは対照的に、ここで使用された窓振幅平均は、電流雑音をフィルタリングする。更に、検出は、多連続比較用の事前に設定された振幅範囲（ばらつきが＜６ｐＡ）内に平均値が留まることに依存し、単一閾値比較より少ない数の誤検出に帰着する。
【０２１５】
実施例ＸＸＩＶ：実験及び結果
ナノポア中の単一ＤＮＡ分子の直接ＦＳＭ／ＦＰＧＡ制御の実証をこれから記述する。最初の実験では、目的は、ＤＮＡヘアピン事象を一度に１分子ずつ効率的に検出し、検出の際に１８０ｍＶから１５０ｍＶに印加電圧を低下させることにより、封鎖滞留時間を増加させることであった。これを「滞留時間延長制御」と呼ぶ。この目的を達成した後、延長された封鎖滞留時間の凝集を、１５０ｍＶで１０ミリ秒後に電圧を−５０ｍＶに反転させることを使用してＤＮＡを押し出すことにより求めた。これを「滞留時間凝集制御」と呼ぶ。動機は、名目上のヘアピン滞留時間を増加させるがヘアピンを解体する前に、分子を押し出すことだった。延長された滞留時間事象の分布とは対照的な、凝集された滞留時間事象のより狭い分布は、目的が満たされたことを示すだろう。
【０２１６】
１８０ｍＶ定電圧での典型的な２０ｂｐｈｐ事象を、図１３及び２１ａＩに示す。滞留時間を底を１０とする対数にした確率ヒストグラム（図２１ａＩＩＩ、黒塗りバー）は、２．８ミリ秒の滞留時間中央値を有する単一モードである。図２１ａＩＩの事象プロットの振幅中央値は、２０．９ｐＡであり、四分位範囲（ＩＱＲ）は１．７ｐＡである。事象の６％のみが、１３から１８ｐＡのサブセット範囲にある（図２１ａＩＩＩ、白抜きバー）。１５０ｍＶ定電圧での同じ実験（データ非表示）の場合、１４．７ｐＡの振幅中央値付近の事象クラスター及び１５０ｍＶ事象の８７％は、１３から１８ｐＡの範囲にある。したがって、検出事象の全てで電圧が１５０ｍＶに低減される延長及び凝集制御下では、より多くの割合の封鎖が、１３から１８ｐＡの範囲内の平均振幅を有するべきである。
【０２１７】
実施例ＸＸＶ：滞留時間延長制御（図２１ｂ）
フィルタリングされた電流の平均を使用してＤＮＡヘアピン事象を判断する際には、ヘアピンが解体し、ＤＮＡが細孔を通って移動するまで、コマンド電圧を１５０ｍＶに低減させる。捕捉に１８０ｍＶを使用すると、１５０ｍＶより多くの事象に帰着し、１５０ｍＶに低減すると、ヘアピンの寿命が延長される。また、滞留時間延長は、機械学習法による配列決定に有用である。延長された時間は、平均が各状態に対応する振幅閾値内に留まらなければならない時間を増加させることにより、ＤＮＡ又はＤＮＡ酵素構成（状態）を正確に検出する可能性を増加させるために使用することができる。各転位置の後、ＦＰＧＡは電圧を１８０ｍＶに再設定する。代表的な事象を図２１ｂＩに示す。事象プロット（図２１ｂＩＩ）パターンは、約１．４ミリ秒の名目上の判断時間より迅速な事象が延長制御により影響を受けず、より長い滞留時間を有する事象は、予想通り約１５ｐＡの平均振幅に集中することを示す。凹形の傾向は、各事象の平均振幅計算とも一致している。特に、２１ｐＡで１．４ミリ秒の事象と１５ｐＡでχミリ秒の事象の場合、
0005646987.tif 000004
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であり、χが約２４ミリ秒の場合、図２１ｂＩで示されているように、
0005646987.tif 000006
サブセット範囲１３から１８ｐＡ内の事象の割合は４１％に増加し、確率（黒塗りバー）ヒストグラムに重ねられた白抜きバーヒストグラムに示されている（図２１ｂＩＩＩ）。
【０２１８】
実施例ＸＸＶＩ：滞留時間凝集制御（図２１ｃ）
目的は、ヘアピン事象の判断時に１０ミリ秒の間１５０ｍＶを印加し、その後５ミリ秒の間−５０ｍＶに電圧反転することにより、延長された事象の滞留時間を凝集することだった。５ミリ秒の反転時間は、チャネルからＤＮＡを十分に取り除き、次の事象のための細孔を準備するのに十分であることが知られている。凝集制御は、個々の分子事象の制御に加えて、事象の分布を制御する尺度を意味するであろう。代表的な事象を図２１ｃＩに示す。上記のように、事象プロット（図２１ｃＩＩ）パターンは、約１．４ミリ秒の名目上の判断時間より迅速な事象が、凝集制御により影響されないことを示す。上記の等式を使用すると、２１ｐＡで１．４ミリ秒の事象及び１５ｐＡで１０ミリ秒の事象の場合、近似的な事象平均振幅は
0005646987.tif 000007
１３から１８ｐＡのサブセット範囲内では、中央値は、０．７ｐＡのＩＱＲを有する１６ｐＡであり、まさに近似的平均計算の通りである。サブセット範囲１３から１８ｐＡ内の事象の割合は５５％に増加し、黒塗りバー確率ヒストグラムに重ねられた白抜きバーヒストグラムに示されている（図２１ｃＩＩＩ）。事象のサブセットの場合、１２．４ミリ秒の滞留時間中央値は、ヘアピン状態を判断するために必要な短時間の遅延と１０ミリ秒の延長時間との合計に相応している。白抜きバーサブセットヒストグラムのＩＱＲが０．１であることは、凝集目的が達成されたことを示す。事象分布の制御の影響に関して、図２１ｃＩＩの全事象の４３％は、１２〜１３ミリ秒の滞留時間範囲内及び１３〜１８ｐＡの振幅範囲内に入る。
【０２１９】
実施例ＸＸＶＩＩ：係留ＤＮＡ
予備実験は、ＫＦを２０塩基対ＤＮＡヘアピン（２０ｂｐｈｐ）に結合させて実行した。単一２０ｂｐｈｐは、ＫＦがＤＮＡと複数回結合するように、細孔を前後に通り抜ける。この実験では、１μＭの１００ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２μＭのＫＦ、及び２００μＭのｄＧＴＰが、細孔のシスウェルに存在していた。ｓｓＤＮＡオリゴマーは、２０ｍｅｒのヘアピンが３’末端で形成するように設計した。トランス側には、シス側のＤＮＡヘアピンの５’末端の配列に相補的な２０塩基対（２０ｍｅｒ）プライマーが２μＭ存在した。
【０２２０】
電圧を印加すると、ＤＮＡは細孔を通って引き込まれ、最初に５’末端を移動させる。ｓｓＤＮＡ移動事象に特徴的な２０ｐＡ事象が検出された場合、ＦＳＭは、電位を、細孔に分子を保持するのには十分であるが、ヘアピンをせん断するほどは強くない５０ｍＶのレベルに低減した。酵素結合ＤＮＡに特徴的な２４ｐＡ事象が検出された場合、酵素が解離して細孔に裸ＤＮＡが残るまで電圧の印加を継続し、その時点で電圧を５０ｍＶに低減して細孔に分子を保持した。２０ｍｅｒプライマーが２μＭのプライマー濃度でＤＮＡの５’末端にアニーリングするのに十分であることが見出された時間である２０秒間、分子を細孔に保持した。ＤＮＡの両端を構成する２０ｍｅｒの二本鎖セグメントによって上記分子が直ちに移動することを抑制した。プライマーアニーリング待機時間の後、ＦＳＭは、電圧を−２０ｍＶに反転させ、溶液中にＤＮＡをぶら下げるのに十分であるがトランス側プライマーを煎断しないほどの力で、ＤＮＡを細孔のシス側に向かって引き込んだ。電圧を５秒間−２０ｍＶで一定にさせ、その後、ＦＳＭが電圧を１８０ｍＶに変化させ、細孔にある分子の同一性；ＤＮＡ単独、ＤＮＡ／ＫＦ二元複合体、又はＤＮＡ／ＫＦ／ｄＧＴＰ三元複合体のいずれであるかを判断した。酵素結合が推定される約２４ｐＡが観察されれば、ＦＳＭは、最終ステップである２０ｐＡの電流信号、即ちＫＦは解離したがＤＮＡが移動する前の時点をモニターし、別のＫＦの捕捉を試みるために電圧を−２０ｍＶに反転させた。ＦＳＭがＤＮＡ分子を移動前に検出しなければ、電流は約６０ｐＡの開口チャネル電流に戻り、ＦＳＭは、別のＤＮＡ移動事象の電流をモニターし、フィッシング過程を繰り返すだろう（図２２）。特定のフィッシング試行中に酵素が捕捉されない場合、ＦＳＭは、酵素捕捉が生じるまで再びフィッシングを試みた。この実験から分析されたデータの場合、５つのＤＮＡコピーが捕捉され、ＫＦをフィッシングするために使用された。長期滞留時間事象（即ち、＞２０ミリ秒の事象）は、フィッシング試行の９５．１％で記録されたが、ＦＳＭが正確に反応したＫＦ解離事象の数を決定するための分析は行われていない。
【０２２１】
初期概念実証実験を実施した後、２順目のフィッシング実験を実行し、より良好な結果がもたらされた。０．５２１秒のフィッシング時間を使用して、ＦＳＭは、同一ＤＮＡヘアピンの８つの複製を捕捉し、３８０秒の時間にわたる３３７回の潜在的ＫＦ解離事象に反応した。データの事後分析は、ＦＰＧＡが、ＫＦ捕捉の７１．８６％について酵素解離事象を正確に検知及び反応したことを示し、例えば、３３７回の潜在的解離事象のうち７４回は偽陽性だった。
【０２２２】
実施例ＸＸＶＩＩＩ  酵素解離誤検出の軽減
上記で提示されたデータでは、酵素の解離は、ナノポア電流信号を平均フィルタリングし、それが選択された振幅範囲内にあるかどうかを検査することにより検出する。この平滑化法は、多数の誤検出を生み出した。このフィルタリング体系の改良として、指数加重移動平均（ＥＷＭＡ）フィルタは、ＦＰＧＡが使用した平均フィルタを置換することができる。ＥＷＭＡフィルタは、電気工学的応用における信号平滑化に一般に使用されるアナログＲＣフィルタのデジタル実装である。このフィルタは、過去のサンプリングにより少ない有意性を課す移動平均を計算する。ＥＷＭＡフィルタリングはまた、その再帰的実装によって単純移動平均より効率的に信号平滑化を実施する。しかしながら、ナノポア電流信号分析用のフィルタを調整するために、実験的試験を行う必要がまだあるだろう。
【０２２３】
より頑健的に酵素解離事象を検出するためには、ＫＦ解離検査を実装して、フィッシングが裸ＤＮＡで行われていることを保証する必要がある。ＦＰＧＡがＫＦ解離を検出すると、ＦＰＧＡは、十分に高速でありしたがってＫＦが結合しない期間の間フィッシングし、その後酵素の存在についてＤＮＡをチェックするだろう。裸ＤＮＡのみが判断されると（電流は約２０ｐＡである）、酵素は解離し、システムは、別の酵素の捕捉を試みることができる。この検査は、反復事象に関する情報を収集するための実験の実施に重要である。データが有効で統計的に正確であるためには、各検出事象は、新しい酵素結合事象でなければならない。
【０２２４】
大多数の長期滞留時間事象は、強力なＫＦ結合事象に対応し、例えば、飽和レベルのＫＦ及び正しいｄＮＴＰが存在する場合、テンプレート鎖に付加される次のｄＮＴＰはナノポアシステムに存在する。繰り返される連続的な長期滞留時間事象は、付加される正しいｄＮＴＰが存在する場合より存在しない場合で、更により低い頻度で生じるため、連続した複数の長期滞留時間事象は、塩基同定における信頼性を向上させる。ここに、ＫＦフィッシングが有用性を示すであろう点がある。滞留時間事象をポアソン過程としてモデル化するための研究が別途行われており、Ｐｈｒｅｄ品質スコア（Ｐｈｒｅｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を、繰り返される連続的な長期滞留時間事象の数に基づく塩基同一性判断に適用できる。Ｐｈｒｅｄシステムは、ＤＮＡ配列決定で一般に使用される正確さの測定基準である。例えば、９０％の正確性要求は、ＰｈｒｅｄスコアではＱ１０であり、９９％の正確性要求はＱ２０であろう。Ｑ２０は、執筆時においてＤＮＡ配列決定の品質の標準レベルと見なされている。
【０２２５】
酵素事象終了時の電流ステップの検出能を向上させる別の方法は、より長いヘアピンを使用し、高電圧で実験を実行することである。チャネル電流の信号対雑音は、チャネルを通るより高いイオン流によって向上し、最終ステップをより明確にするだろう。
【０２２６】
実施例ＸＸＩＸ：電圧滴定実験
最終ステップの振幅及び継続期間と印加電圧との間に、より定量的な関連性を作ることができる。ここでの目標は、最終ステップの再現性を明らかにし、その構造が、異なる電圧でＤＮＡ単独とどのように一致するかを示すことである。最終ステップの詳細な特徴付けにより、最終ステップのより良好な制御が可能になる。定電圧実験は、４つの異なる電圧でＤＮＡ単独及びＤＮＡ／ＫＦ／ｄＮＴＰ三元複合体を用いて、飽和レベルの各基質（それぞれ１μＭ、２μＭ、及び２００μＭ）を使用して実行する。電圧は、２２０、２００、１８０、及び１６０ｍＶである。高電圧で滞留時間を延長する他の係留実験で使用される２０ｂｐｈｐではなく、２４ｂｐｈｐを使用する。高電圧を最初に実行して、検出可能な最終ステップ事象継続期間（１ミリ秒）を生み出す印加電圧の実用的な上限を決定する。
【０２２７】
実施例ＸＸＸ：最終ステップ制御実験
上述のように、最終ステップを正確に検出及び反応することを示すことが必要である。先に述べたように、酵素結合事象の９７％が最終ステップを示し、したがってこれが理論的な最大検出率である。最終ステップの検出及び反応は、検出時の電圧反転により示され、最終ステップ継続期間を凝集するだろう。上記で使用されたような高プローブ電圧は、結合及び未結合電流レベル間のより高い分解能を示す。飽和レベルの各基質を使用し、ＤＮＡ単独及びＤＮＡ／ＫＦ／ｄＮＴＰ三元複合体を用いて実験を実行する。偽陽性に対する頑健性は、オフラインで正確な検出を確認することにより示すことができる。
【０２２８】
実施例ＸＸＸＩ：最終ステップ制御実験：フィッシング時間滴定を有する係留ＤＮＡ構成
上記で達成されたものの反復を実施するが、係留ＤＮＡを用いてである。フィッシング時間の滴定を実施して、非係留ＤＮＡ実験における比率に匹敵する、三元複合体事象に対するＤＮＡ単独事象の比率を再現する。この情報は、フィッシング時間の限度設定を支援し、シスウェル内容物の代表的サンプリングを維持する。飽和レベルの各基質を使用し、ＤＮＡ単独及びＤＮＡ／ＫＦ／ｄＮＴＰ三元複合体を用いて実験を実行する。
【０２２９】
実施例ＸＸＸＩＩ：フィッシング滴定実験
ＫＦ及びｄＧＴＰの滴定を実施する。長期事象の割合を、ＫＦ及びｄＧＴＰ濃度の関数として記録する。上記と同じ高捕捉電圧で実験を実行する。Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｔａｔｅ  ｍａｃｈｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓに投稿中の追録と同じＫＦ及びｄＧＴＰの濃度間隔：（ＫＦ＝［０、０．２５、０．５、１．０、２．０、２．０、２．０、２．０、２．０、２．０、２．０、２．０］μＭ；ｄＧＴＰ＝［０、０、０、０、０、２．５、７．５、１５、３０、６０、１２０、２００］μＭ）を使用する。
【０２３０】
実施例ＸＸＸＩＩＩ：他の酵素研究
ＦＰＧＡ／ＦＳＭナノポアシステムは、他の酵素研究にも使用することができる。ＤＮＡ／酵素複合体の捕捉時に電圧勾配を印加すると、電圧力分光法を使用して結合エネルギー地形を計算するためのデータを生成することができる。また、ＤＮＡと細孔との相互作用は、印加電圧のフィードバック制御を使用して特徴付けることができる。酵素触媒作用の調節は、細孔を占めるＤＮＡに張力を適用して、酵素の前進力を打ち消すことにより達成できる。
【０２３１】
実施例ＸＸＸＩＶ：ゲノムＤＮＡの単離
肺カテーテルによって患者から血液試料（２〜３ｍｌ）を収集し、使用まで−８０℃のＥＤＴＡ含有チューブで保存する。ゲノムＤＮＡを、メーカーの説明書に従いＤＮＡ単離キット（ＰＵＲＥＧＥＮＥ、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国ミネソタ州）を使用して、血液試料から抽出する。ＤＮＡ純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ社製分光光度計で測定した、２６０及び２８０ｎｍにおける吸光度の比率（１ｃｍの光路；Ａ２６０／Ａ２８０）として測定する。
【０２３２】
実施例ＸＸＸＶ：ＳＮＰの同定
患者のＤＮＡ試料に由来する遺伝子の領域を、その領域に特異的に設計したプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ産物を、上記で開示されていたような方法を使用して配列決定する。配列トレースに同定されたＳＮＰは、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄソフトウェアを使用して確認し、ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータバンクに寄託されている公知のＳＮＰと比較する。
【０２３３】
実施例ＸＸＸＶＩ：ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーを、哺乳動物組織から単離されたＲＮＡを使用して構築する。冷凍組織は、イソチオシアン酸グアニジン溶液中で、ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ウェストベリー、米国ニュージャーシー州）を使用してホモジナイズし及び溶解する。溶解産物を、周囲温度で１８時間２５，０００ｒｐｍで、Ｌ８−７０Ｍ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、フラートン  米国カリフォルニア州）のＳＷ２８ローターを使用して、５．７ＭＣｓＣｌクッション上で遠心分離する。ＲＮＡは、酸フェノール、ｐＨ４．７で抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容積のエタノールを使用して沈殿させ、無ＲＮＡｓｅ水に再懸濁し、３７℃でＤＮＡｓｅ処理し、ＲＮＡ抽出及び沈殿を上記のように繰り返す。ｍＲＮＡは、ＯＬＩＧＯＴＥＸキット（Ｑｉａｇｅｎ社、チャッツワース  米国カリフォルニア州）で単離し、ｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用する。
【０２３４】
ｍＲＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミド系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で推奨されている手順に従って取り扱う。ｃＤＮＡは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ４Ｂカラム（ＡＰＢ社）で分画し、４００ｂｐを越えるｃＤＮＡは、発現プラスミドにライゲーションする。プラスミドは、その後、ＤＨ５ａａコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換する。
【０２３５】
実施例ＸＸＸＶＩＩ：ｃＤＮＡの調製及び配列決定
ｃＤＮＡは、ＤＮＡ  ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）と組み合せて、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ社、リーノー、米国ネバダ州）を使用して調製し、ＰＲＩＳＭ３７７型又は３７３型ＤＮＡ配列決定システム（ＡＢＩ社）を使用して、サンガー及びクールソン法（１９７５；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４１−４４８）により配列決定する。リーディングフレームは、標準的技術を使用して決定する。
【０２３６】
配列表のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、及びＰｉｍａＩＩデータベースの配列をクエリーする。ＢＬＡＳＴにより、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアラインメントを生成し、配列類似性を決定した。アラインメントの局所的性質のため、ＢＬＡＳＴは、正確な一致の決定、又は原核生物（細菌）若しくは真核生物（動物、真菌、又は植物）起原であってよい相同体の同定に使用する。一次配列パターン及び二次構造ギャップぺナルティを扱う場合は、Ｓｍｉｔｈら（１９９２；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５：３５−５１）のアルゴリズム等の他のアルゴリズムを使用することができた。本出願で開示された配列は、少なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、未判定塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴではなく、Ｎが記録される）を１２％しか有していない。
【０２３７】
ＢＬＡＳＴ手法は、クエリー配列とデータベース配列との一致を検索する。ＢＬＡＳＴは、見出された任意の一致の統計的有意差を評価し、使用者が選択した有意性の閾値を満たす一致のみを報告した。本出願では、閾値は、ヌクレオチドの場合は１０−２５、ペプチドの場合は１０−１０に設定する。
【０２３８】
実施例ＸＸＸＶＩＩＩ：ｃＤＮＡの伸長
ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを使用して伸長する。一方のプライマーは、公知の断片の５’伸長を開始するように、他方は、公知の断片の３’伸長を開始するように合成する。初期プライマーは、プライマー分析ソフトウェアを使用して、長さが約２２から３０個のヌクレオチドであり、約５０％以上のＧＣ含量を有し、約６８℃から約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように設計する。ヘアピン構造及びプライマー間の二量体化に帰着するであろう、あらゆる１つ続きのヌクレオチドを回避する。
【０２３９】
選択したｃＤＮＡライブラリーは、配列を伸長するためのテンプレートとして使用する。伸長を複数回実施する場合、一式の追加的プライマー又はネステッドプライマーを設計する。好ましいライブラリーは、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択し、遺伝子の５’又は上流領域を有するより多くの配列を含有するようにランダムプライムする。ゲノムライブラリーは、５’プロモーター結合領域へ伸長する調節エレメントを取得するために使用することができる。
【０２４０】
米国特許第５，９３２，４５１号で示された方法を使用したＰＣＲにより、高フィデリティ増幅を取得する。ＰＣＲは、ＤＮＡ  ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して、９６ウェルプレートで実施する。反応混合物は、以下のパラメーターの、ＤＮＡテンプレート、２００ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、及びβ−メルカプトエタノールを含有する反応緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡＰＢ社）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有していた。そのパラメーターとはは、１：９４℃、３分；２：９４℃、１５秒；３：６０℃、１分；４：６８℃、２分；５：２、３、及び４の２０回繰り返し；６：６８℃、５分；及び７：４℃で保存である。代替的には、プライマー対、Ｔ７及びＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のパラメーターは、以下の通りである：１：９４℃、３分；２：９４℃、１５秒；３：５７℃、１分；４：６８℃、２分；５：２、３、及び４の２０回繰り返し；６：６８℃、５分；及び７：４℃で保存。
【０２４１】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１００ｍｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量化試薬（１×ＴＥ中で０．２５％試薬、ｖ／ｖ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）及び０．５ｍｌの未希釈ＰＣＲ産物を不透明な蛍光計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、アクトン  米国マサチューセッツ州）に分注し、ＤＮＡの試薬への結合を可能にすることにより決定する。プレートを、ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ社、ヘルシンキ、フィンランド）で走査して、試料の螢光を測定し、ＤＮＡ濃度を定量する。反応混合液の５ｍｌから１０ｍｌ等量を、１％アガロースミニゲルの電気泳動により分析して、どの反応液が配列の伸長に成功しているかを決定する。
【０２４２】
伸長されたクローンを脱塩、濃縮して、３８４ウェルプレートに移動させ、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、マディソン、米国ウィスコンシン州）で消化し、ｐＵＣ１８ベクター（ＡＰＢ社）への再ライゲーション前に超音波処理又はせん断する。ショットガン配列の場合は、消化されたヌクレオチド配列を低濃度（０．６〜０．８％）アガロースゲルで分離し、断片を切除し、寒天をＡＧＡＲＡＣＥ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で消化する。伸長されたクローンは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用してｐＵＣ１８ベクター（ＡＰＢ社）に再ライゲーションし、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で処理して制限部位突出を埋め、大腸菌コンピテント細胞に形質移入する。形質転換された細胞は、抗生物質を含有する培地で選択し、個々のコロニーをピックし、ＬＢ／２×カルベニシリン液体培地中で３８４ウェルプレートで３７℃で終夜培養する。
【０２４３】
細胞を溶解し、ＤＮＡは、プライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡＰＢ社）、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、以下のパラメーターで増幅する：１：９４℃、３分；２：９４℃、１５秒；３：６０℃、１分；４：７２℃、２分；５：２、３、及び４の２９回繰り返し；６：７２℃、５分；及び７：４℃で保存。ＤＮＡは、上述のようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用して定量する。ＤＮＡ回収が低い試料は、上述された条件を使用して再増幅する。試料は、２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；１：２、ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣエネルギー伝達配列決定プライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ  ＤＩＲＥＣＴサイクル配列決定キット（ＡＰＢ社）又はＰＲＩＳＭ  ＢＩＧＤＹＥターミネーターサイクル配列決定キット（ＡＢＩ社）を使用して配列決定する。
【０２４４】
実施例ＸＸＸＩＸ：ポリヌクレオチドの伸長
ポリヌクレオチド組み立てに使用されるポリヌクレオチドの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドプライマーを使用したｃＤＮＡクローンの伸長により産生する。一方のプライマーは、公知の断片の５’伸長を開始するように、他方は、公知の断片の３’伸長を開始するように合成する。初期プライマーは、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、長さが約２２から３０個のヌクレオチドであり、約５０％のＧＣ含量を有し、約５５℃から約６８℃の温度で標的配列にアニーリングするように設計する。ヘアピン構造及びプライマー間の二量体化に帰着するであろう、あらゆる断片を回避する。選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを、分子を伸長するために使用する。複数回の伸長が必要な場合、一式の追加的プライマー又はネステッドプライマーを設計する。
【０２４５】
ＤＮＡ  ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して、９６ウェルプレートでＰＣＲを実施することにより、高フィデリティ増幅を取得する。反応混合物は、ＤＮＡテンプレート、２００ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、及びβ−メルカプトエタノールを含有する反応緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有しており、プラズミドから選択されたプライマー対の場合、以下のパラメーターを用いる：ステップ１：９４℃、３分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６０℃、１分；ステップ４：６８℃、２分；ステップ５：ステップ２、３、及び４の２０回繰り返し；ステップ６：６８℃、５分；ステップ７：４℃で保存。代替的には、プラスミドベクターに挿入された配列を使用する場合、プライマー対、Ｔ７及びＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）用のパラメーターは以下の通りである：ステップ１：９４℃、３分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：５７℃、１分；ステップ４：６８℃、２分；ステップ５：ステップ２、３、および４の２０回繰り返し；ステップ６：６８℃、５分；ステップ７：４℃で保存。
【０２４６】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１×ＴＥに溶解された１００ｍｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量化試薬（０．２５％、ｖ／ｖ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）及び０．５ｍｌの未希釈ＰＣＲ産物を、不透明な蛍光計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ社、アクトン  米国マサチューセッツ州）の各ウェルに分注し、ＤＮＡの試薬への結合を可能にすることにより決定する。プレートを、ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ社、ヘルシンキ、フィンランド）で走査して、試料の螢光を測定し、ＤＮＡの濃度を定量する。反応混合液の５ｍｌから１０ｍｌ等量を、１％アガロースミニゲルの電気泳動により分析して、どの反応液がより長い配列の産生に成功しているかを決定する。
【０２４７】
伸長された配列を脱塩、濃縮して、３８４ウェルプレートに移動させ、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、マディソン  米国ウィスコンシン州）で消化し、ｐＵＣ１８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）への再ライゲーション前に超音波処理又はせん断する。ショットガン配列決定の場合、消化された断片を、約０．６〜０．８％アガロースゲルで分離し、紫外線下で視覚化させて断片を切除し、寒天をＡＧＡＲＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で除去／消化した。伸長された断片は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用してｐＵＣ１８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に再ライゲーションし、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で処理して制限部位突出を埋め、コンピテント大腸菌細胞に形質転換する。形質転換された細胞は、抗生物質を含有する培地で選択し、個々のコロニーをピックし、ＬＢ／２×カルベニシリン液体培地中で３８４ウェルプレートで３７℃で終夜培養する。
【０２４８】
細胞を溶解し、ＤＮＡは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、以下のパラメーターで増幅する：ステップ１：９４℃、３分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６０℃、１分；ステップ４：７２℃、２分；ステップ５：ステップ２、３、及び４の２９回繰り返し；ステップ６：７２℃、５分；ステップ７：４℃で保存。ＤＮＡは、上述のようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で定量する。ＤＮＡ回収が低い試料は、上述された条件を使用して再増幅する。試料は、２０％ジメチルスルホキシド（１：２、ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣエネルギー伝達配列決定プライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ  ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）又はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢＩＧＤＹＥターミネーターサイクル配列決定キット（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して配列決定する。
【０２４９】
同様に、上記の手順、外側伸長用に設計したオリゴヌクレオチド、及びゲノムＤＮＡライブラリーを使用して調節配列を取得するために、配列番号１〜１６３のポリヌクレオチドを使用する。
【０２５０】
実施例ＸＬ：プローブの標識及びハイブリダイゼーション分析
核酸を生物学的供給源から単離し、下記方法の１つにより、標準的ハイブリダイゼーション手順用の基材に添加する。標的核酸、ゲノムＤＮＡの制限消化物の混合物を、１×ＴＡＥ［トリス−アセテート−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］ランニング緩衝液中での０．７％アガロースゲルによる電気泳動により分画し、２０×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を使用して毛細管移動によりナイロン膜に移動させる。或いは、標的核酸を個々にベクターへライゲーションし、ライブラリーを形成するために細菌宿主細胞に挿入する。下記方法の１つにより、標的核酸を基材上に配置する。第１の方法では、個々のクローンを含有する細菌細胞を、ロボット制御でピックし、ナイロン膜上に配置する。細菌増殖培地、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天上に膜を配置し、１６時間３７℃でインキュベートする。細菌コロニーを変性、中和、及びプロテイナーゼＫで消化する。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ紫外線架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中で、ナイロン膜を紫外線照射に曝露させて、ＤＮＡを膜に架橋させる。
【０２５１】
第２の方法では、インサートを隣接するベクター配列に相補的なプライマーを使用した３０サイクルのＰＣＲにより、標的核酸を細菌ベクターから増幅する。増幅された標的核酸は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用して精製する。ガラス顕微鏡スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、コーニング  米国ニューヨーク州）上に、精製された標的核酸をロボット制御でアレイ化させる。スライドは、事前に、０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス  米国ミズーリ州）でコーティングされ、１１０℃で硬化されている。アレイ化されたガラススライド（マイクロアレイ）を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ紫外線架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中で紫外線照射に曝露した。
【０２５２】
ｃＤＮＡプローブは、ｍＲＮＡテンプレートから作製する。５マイクログラムのｍＲＮＡを、１ｍｇのランダムプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と混合し、１０分間７０℃でインキュベートし、凍結乾燥する。凍結乾燥した試料を、ｄＮＴＰ混合物、［ａ−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、ジチオスレイトール、及びＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有した、５０ｍｌの１×ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ緩衝液（ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に再懸濁し、４２℃で１〜２時間インキュベートする。インキュベーション後、プローブを４２ｍｌのｄＨ２Ｏで希釈し、３分間９５℃に加熱し、氷上で冷却する。プローブ中のｍＲＮＡは、アルカリ分解により除去する。プローブを中和し、ｍＲＮＡを分解させ、非取り込みヌクレオチドは、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ  Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用して除去する。プローブは、放射性ヌクレオチド、［３２Ｐ］ｄＣＴＰの代りに、蛍光マーカー、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ又はＣｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で標識することができる。
【０２５３】
ハイブリダイゼーションは、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中で６５℃で実行する。ハイブリダイゼーション緩衝液中で基材を少なくとも２時間６５℃でインキュベートした後、緩衝液は、プローブを含有する１０ｍｌの新しい緩衝液と置換する。６５℃で１８時間インキュベーションした後、ハイブリダイゼーション緩衝液を取り除き、６５℃で４０ｍＭリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡまでの徐々にストリンジェントな条件下で、基材を順次洗浄する。膜上でハイブリダイズされた放射性標識プローブにより生成された信号を検出するために、基材をＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲカセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に曝露させ、画像は、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴデータ分析ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用して分析する。マイクロアレイ上でハイブリダイズされた蛍光プローブにより生成された信号を検出するために、基材を共焦点レーザ顕微鏡法で検査し、画像は、遺伝子発現分析ソフトウェアを使用して収集及び分析する。
【０２５４】
実施例ＸＬＩ：相補的ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドに相補的な分子、またはその断片を、遺伝子発現を検出、減少、又は阻害するために使用する。約１５から約３０個までの塩基対で構成されるオリゴヌクレオチドの使用を記述するが、同じ手順は、より大きい断片若しくはより小さな断片、又はそれらの誘導体（例えば、ペプチド核酸、ＰＮＡ）で使用される。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び配列番号１〜１６３を使用して設計する。転写因子のプロモーターへの結合を防止することにより転写を阻害するために、相補的オリゴヌクレオチドは、もっとも好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドン前の約５００から１０ヌクレオチドで、最も固有な５’配列に結合するように設計する。翻訳を阻害するために、相補的オリゴヌクレオチドは、哺乳類タンパク質をコードするｍＲＮＡへのリボソームの結合を防止するように設計する。
【０２５５】
実施例ＸＬＩＩ：特異的抗体の産生
ポリヌクレオチド及びその結合タンパク質の複合体を含む抱合体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して精製し、マウス又はウサギの免疫に使用する。抗体は、下記の手順を使用して産生する。ウサギを完全フロインドアジュバント中の複合体で免疫する。免疫は、その後ある間隔で不完全フロイントアジュバント中で繰り返す。マウスの場合は最低７週、又はウサギの場合は１２週後に、抗血清を採取し、抗ペプチド活性を検査する。検査には、ペプチドをプラスチックに結合させること、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングすること、ウサギ抗血清と反応させること、洗浄すること、及び放射性ヨウ素標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることを伴う。当技術分野で周知の方法を使用して、抗体価及び複合体形成量を決定する。
【０２５６】
実施例ＸＬＩＩＩ：ポリヌクレオチド又はタンパク質抱合体との特異的結合する分子のスクリーニング
ポリヌクレオチド又はその断片を、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、若しくはＣｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、又はＢＩＯＤＩＰＹ若しくはＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン  米国オレゴン州）でそれぞれ標識する。同様に、ポリヌクレオチド及びその結合タンパク質の複合体を含む抱合体は、放射性核種又は蛍光プローブで標識することができる。事前に基材上に配置された候補分子又は化合物のライブラリーを、標識ポリヌクレオチド又はタンパク質の存在下でインキュベートする。ポリヌクレオチド又はアミノ酸分子のいずれかの条件下でインキュベーションした後、基材を洗浄し、特異的結合又は複合体形成を示す、標識を保持する基材上の任意の位置をアッセイし、リガンドを同定する。異なる濃度のポリヌクレオチド又はタンパク質を使用して取得したデータを使用して、標識ポリヌクレオチド又はタンパク質と結合分子との親和性を計算する。
【０２５７】
当業者であれば、今記述した実施形態の種々の改作及び改変は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱せずに構成できることを理解しよう。当技術分野で公知の他の好適な技術及び方法は、本明細書中に記載の本発明の記述に照らして、当業者により多数の特定の様式に適用することができる。したがって、本発明は、本明細書中に特に記載されている以外にも実行できることが理解されるべきである。上記の記述は例示的であり、限定的とは意図されていない。上記の記述を精査すると、当業者であれば他の多くの実施形態が明白になろう。したがって、本発明の範囲は、そのような特許請求の範囲が与えられる十分な範囲の等価物と共に、添付の特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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