(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の存在下で、式（Ｉ）：
【化１】
0005532928.tif 000007
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）：
【化２】
0005532928.tif 000008
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させ、式（ＩＩＩ）：
【化３】
0005532928.tif 000009
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるセリン誘導体を生成させるセリン誘導体の製造方法であって、
前記酵素が、下記（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１〜４０個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質、からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質である、セリン誘導体の製造方法。
【請求項２】
前記（Ｂ）のタンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第３３９番目の部位に位置するチロシンが、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換された配列を備えるタンパク質である、請求項１に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
前記（Ｂ）のタンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第１９番目の部位に位置するアスパラギンがセリンに置換された配列を備えるタンパク質である、請求項１または２に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記酵素を生産する微生物と、前記式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸および式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを混合し、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、請求項１から３のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記酵素を生産する微生物を含む培養物と、前記式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸および前記式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを混合し、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、請求項１から３のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記酵素を生産する微生物の菌体処理物と、前記式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸および前記式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを混合し、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、請求項１から３のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記式（Ｉ）に示されアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニン、アラニン、システイン、トリプトファン、イソロイシン、シクロヘキシルアラニン、２−アミノ−ｎ−酪酸、２−アミノ吉草酸、および２−アミノヘキサン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上のアミノ酸である、請求項１から６のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項８】
前記式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、α−フェニルアラニンであり、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体がα−ベンジルセリンである、請求項１から６のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、α−ロイシンであり、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体がα−イソブチルセリンである、請求項１から６のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、α−メチオニンであり、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体がα−メチルチオエチルセリンである、請求項１から６のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）：
【化４】
0005532928.tif 000010
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）：
【化５】
0005532928.tif 000011
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとから、式（ＩＩＩ）：
【化６】
0005532928.tif 000012
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１〜４０個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するタンパク質、
からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質。
【請求項１２】
前記（Ｂ）のタンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第３３９番目の部位に位置するチロシンが、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群より選ばれるいずれかの一つのアミノ酸に置換された配列を備える、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記（Ｂ）のタンパク質が、さらに、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第１９番目の部位に位置するアスパラギンがセリンに置換された配列を備える、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
下記（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、９０％未満の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズしないストリンジェントな条件下において、配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）：
【化７】
0005532928.tif 000013
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
のα−アミノ酸と下記式（ＩＩ）：
【化８】
0005532928.tif 000014
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）：
【化９】
0005532928.tif 000015
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、エシェリヒア・コリを宿主として形質転換された細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリン誘導体の製造方法に関する。また、本発明は、セリン誘導体の製造法に用いる、酵素活性を有するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリン誘導体、例えばα位に光学活性を有するアミノ酸（β−ヒドロキシ−α−Ｌ−アミノ酸、β−ヒドロキシ−α−Ｄ−アミノ酸）などのアミノ酸は、医薬品の中間体などとしての利用が期待される物質である。そのため工業的にも有利なセリン誘導体の製造方法について開発が進められている。【０００３】
酵素を用いたセリン誘導体の製造方法としては、例えば、キサントモナス属の微生物を利用してα−メチル−β−ヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法（特許文献１）や、ラルストニア（Ralstonia）属、バリオボラックス（Variovorax）属、ボセア（Bosea）属およびシリシバクター（Silicibacter）属の微生物又はこれに由来するタンパク質を利用して、光学選択的にＬ−セリン誘導体を製造する方法（特許文献２）などが開示されている。【０００４】
【特許文献１】特開平７−３２７６８８号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１２３７４５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように光学活性アミノ酸の製法については様々な手法が研究されている。しかし、光学活性アミノ酸やセリン誘導体の種類は多く、より簡便な手法、またはより効率よく、様々なセリン誘導体を生成する方法が求められている。本発明は、簡便な手法によるセリン誘導体およびその光学活性体を生成する新たな方法およびこれに用いられる酵素等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等はセリン誘導体の新たな製法について鋭意研究したところ、α−アミノ酸と所定のアルデヒドとを反応させる系において、その反応を触媒する新たなタンパク質を見出した。さらに、このタンパク質を用いることにより、簡便にセリン誘導体を生成できることが見出された。本発明は係る知見に基づくものであり、下記セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素などを提供するものである。【０００７】
〔１〕  酵素の存在下で、式（Ｉ）：
【化１】
0005532928.tif 000002
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）：
【化２】
0005532928.tif 000003
（式（ＩＩ）においてＲ2は、水素、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させ、式（ＩＩＩ）：
【化３】
0005532928.tif 000004
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は、式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ2は式（ＩＩ）中のＲ2と同じ）
に示されるセリン誘導体を生成させるセリン誘導体の製造方法であって、
前記酵素が、下記（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質、
からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質である、セリン誘導体の製造方法。
〔２〕  前記（Ｂ）のタンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第３３９番目の部位に位置するチロシンが、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群より選ばれるいずれかの一つのアミノ酸に置換された配列を備えるタンパク質である、上記〔１〕に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔３〕  前記（Ｂ）のタンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第１９番目の部位に位置するアスパラギンがセリンに置換された配列を備えるタンパク質である、上記〔１〕または〔２〕に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔４〕  ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来し、式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとから、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質の存在下で、式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを反応させて式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、セリン誘導体の製造方法。
〔５〕  前記酵素を生産する微生物と、前記式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸および式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを混合し、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、上記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔６〕  前記酵素を生産する微生物を含む培養物と、前記式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸および前記式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを混合し、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、上記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔７〕  前記酵素を生産する微生物の菌体処理物と、前記式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸および前記式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを混合し、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成せしめる、上記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔８〕  前記式（Ｉ）に示されアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニン、アラニン、システイン、トリプトファン、イソロイシン、シクロヘキシルアラニン、２−アミノ−ｎ−酪酸、２−アミノ吉草酸、および２−アミノヘキサン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上のアミノ酸である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔９〕  前記式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、α−フェニルアラニンであり、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体がα−ベンジルセリンである、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔１０〕  前記式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、α−ロイシンであり、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体がα−イソブチルセリンである、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔１１〕  前記式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、α−メチオニンであり、前記式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体がα−メチルチオエチルセリンである、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のセリン誘導体の製造方法。
〔１２〕  ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来し、式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとから、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
〔１３〕  式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸と、式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとから、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するタンパク質、
からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質。
〔１４〕  前記（Ｂ）のタンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第３３９番目の部位に位置するチロシンが、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群より選ばれるいずれかの一つのアミノ酸に置換された配列を備える、上記〔１３〕に記載のタンパク質。
〔１５〕  前記（Ｂ）のタンパク質が、さらに、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第１９番目の部位に位置するアスパラギンがセリンに置換された配列を備える、上記〔１４〕に記載のタンパク質。
〔１６〕  上記〔１２〕から〔１５〕のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１７〕  下記（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のα−アミノ酸と下記式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１８〕  上記〔１６〕または〔１７〕に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
〔１９〕  前記細胞が、エシェリヒア・コリを宿主として形質転換された細胞である、上記〔１８〕に記載の細胞。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、様々なセリン誘導体を簡便な反応系によって製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の製造方法で用いられる反応系を示す図である。
【図２】図２は、本発明の製造方法で用いられる反応系の一つの実施形態を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第４版、村松ら編、羊土社（２００３年）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。また、本明細書において、酵素とは化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。【００１１】
本発明のセリン誘導体の製造方法は、酵素を触媒とし、式（Ｉ）のα−アミノ酸と、式（ＩＩ）に示されるアルデヒドとを反応させ、式（ＩＩＩ）を生成する反応系が用いられる（図１）。【００１２】
式（Ｉ）におけるＲ1をより具体的に示すと以下の通りである。
Ｒ1が炭素数１〜７のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル基、イソヘキシル基などが例示される。また、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有するアルキル基の具体例として、シクロヘキシルメチル基などが挙げられる。【００１３】
また、Ｒ1が炭素数６〜１４のアリール基である場合とは、具体例を示すと、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などが例示される。【００１４】
Ｒ1が炭素数３〜１０のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプタニル基、シクロオクタニル基、シクロノナニル基、シクロデカニル基などが例示される。【００１５】
Ｒ1が炭素数７〜１９のアラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基、トリチル基などのフェニルアルキル基、シンナミル基、スチリル基、ナフチルアルキル基などが例示される。【００１６】
Ｒ1が炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素数１〜１０のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、フェノキシ基、ヘプトキシ基、オクトキシ基、ノナノキシ基、デカノキシ基、およびウンデコキシ基から選ばれる基が置換されたものが例示される。【００１７】
Ｒ1は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
Ｒ1が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭化水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が例示される。【００１８】
また、Ｒ1は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む炭化水素基であってもよい。
さらに、上記Ｒ1は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、上記Ｒ１は炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよい。脂環炭化水素構造としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどの炭素骨格から１個または２個以上の水素基が脱離した置換基構造などが挙げられる。
また、Ｒ1は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換および／または付加されたものであってもよい。【００１９】
式（Ｉ）に示されるα−アミノ酸としては、例えば、それぞれα−型の、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、２−アミノ−ｎ−酪酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノ吉草酸（ノルバリン）、２−アミノヘキサン酸（ノルロイシン）などが挙げられ、好ましくは、前記式（Ｉ）に示されアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニン、アラニン、システイン、トリプトファン、イソロイシン、シクロヘキシルアラニン、２−アミノ−ｎ−酪酸、２−アミノ吉草酸、２−アミノヘキサン酸など、より好ましくはフェニルアラニン、ロイシン、メチオニンなどが例示される。【００２０】
式（ＩＩ）におけるＲ2をより具体的に示すと次の通りである。
Ｒ2は水素であってもよい。
Ｒ2が炭素数１〜７のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。また、炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有するアルキル基の具体例として、シクロヘキシルメチル基などが挙げられる。【００２１】
また、Ｒ2が炭素数６〜１４のアリール基である場合とは、具体例を示すと、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などが挙げられる。【００２２】
Ｒ2が炭素数３〜１０のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプタニル基、シクロオクタニル基、シクロノナニル基、シクロデカニル基などが挙げられる。【００２３】
Ｒ2が炭素数７〜１９のアラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基、トリチル基などのフェニルアルキル基、シンナミル基、スチリル基、並びにナフチルアルキル基などが挙げられる。【００２４】
Ｒ2が炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素数１〜１０のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、フェノキシ基、ヘプトキシ基、オクトキシ基、ノナノキシ基、デカノキシ基、およびウンデコキシ基から選ばれる基が置換されたものなどが挙げられる。【００２５】
Ｒ2は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
Ｒ2が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。【００２６】
また、Ｒ2は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む炭化水素基であってもよい。
さらに、上記Ｒ2は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、上記Ｒ２は炭素骨格中に脂環炭化水素構造を有していてもよい。脂環炭化水素構造としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどの炭素骨格から１個または２個以上の水素基が脱離した置換基構造などが挙げられる。
また、Ｒ2は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換および／または付加されたものであってもよい。【００２７】
式（ＩＩ）に示される化合物としては、好ましくはホルムアルデヒド及びアセトアルデヒドが例示される。【００２８】
式（ＩＩＩ）におけるＲ1およびＲ2はそれぞれ式（Ｉ）および式（ＩＩ）におけるそれらと同じである。【００２９】
本発明における好ましい一形態としては、例えば図２に示すように、Ｌ−α−フェニルアラニンとホルムアルデヒドとを反応させて、α−ベンジル−Ｌ−セリンを生成する系などが挙げられる。図２に例示されるように、ホルムアルデヒドを、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸などを介さずに、直接的にＬ−アミノ酸と反応させてＬ−セリン誘導体を生成する反応系が用いられている。このように、本発明の製造方法の一形態では、シンプルな反応系でＬ−セリン誘導体を得ることができる。また、ホルムアルデヒドを用いる場合、少量のホルムアルデヒドを逐次的に反応系に添加していってもよい。ホルムアルデヒドを逐次添加することにより、副産物等の生成を抑制し得る。【００３０】
本発明における好ましい別の形態としては、例えば、Ｌ−ロイシンとホルムアルデヒドとを反応させてα−イソブチル−セリンを生成する系、及びＬ−メチオニンとホルムアルデヒドとを反応させてα−メチルチオエチル−セリンを生成する系などが挙げられる。【００３１】
反応温度は、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応系のｐＨは、好ましくは４〜１０であり、より好ましくは６〜９である。【００３２】
上記反応終了後の酵素反応液からは、例えば、以下の様にしてセリン誘導体の単離を行うことができる。
酵素反応液のｐＨを下げ、加熱殺菌と共に、溶存タンパクの凝集を行った後、遠心分離、ろ過、ＵＦ（ウルトラフィルトレーション：限外ろ過）等の手段により、除菌・除タンパクを行う。この液中には、無機塩類が含まれるため、晶析時に、これらの析出を回避する為、脱塩を行う。方法は、ＮＦ（ナノフィルトレーション：ナノろ過）、電気透析、イオン交換樹脂等何れの方法を用いてもよい。【００３３】
必要に応じ上記の脱塩処理を行った後、反応液を濃縮していくとＬ−セリン誘導体の結晶が析出してくるが、性状は微細であり、結晶分離に際し、溶解度が高い故、高回収率が得られない上に、粘性も大きく取り扱いが困難であることが多い。その為、液を必要に応じてある程度予備的に濃縮した後に貧溶媒添加晶析を行うのが好ましい。予備的濃縮は、例えば結晶が析出し始めるまで行ってもよい。ここで添加する貧溶媒としては、水溶性である低級アルコールやアセトンが好適である。貧溶媒晶析の後に、冷却晶析を組み合わせて、晶析率を上げることも可能である。このスラリーを分離し、湿ケーキを乾燥することにより、Ｌ−セリン誘導体の結晶を得ることができる。【００３４】
本発明において、式（ＩＩ）のアルデヒドと、α−アミノ酸との反応は所定の酵素の存在下において行われる。この反応を触媒し得る酵素としては、例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物から得ることができる。より具体的には、例えば、ロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、さらに具体的には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１株が挙げられる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１株は、下記寄託機関に寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０４２の受託番号が付されて受託管理されている菌株である。ＦＥＲＭ番号が付与された菌株は、受託番号を参照の上、所定の手続により分譲を受けることができる。【００３５】
名称：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０４２
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
上記寄託機関に受託された日：２００７年３月２９日【００３６】
なお、上記微生物は、上記受託された日（すなわち、２００７年３月２９日）時点において受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２８１の番号が付されて受託されたが、その後、同寄託機関内における移管手続によって、改めて受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０４２の番号が付され、引き続き同寄託機関にて受託管理されているものである。【００３７】
また、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１株は、上記受託された日（すなわち、２００７年３月２９日）においては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ（ロドコッカス  ペルコラタス）  ＡＪ１１０６１１株として受託されたが、その後の再同定の結果、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．に属すると分類すべき微生物であることが判明した。そのため、微生物の名称が変更され、現在、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１株として上記受託機関に保存されている。なお、上記の変更は、名称についての変更のみであり、上記受託された日に受託された微生物自体には変わりはない。【００３８】
本発明においてセリン誘導体を生成する反応に用いられる酵素としては、より具体的には下記のタンパク質が例示される。
（Ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（全長アミノ酸残基数：３６５）
（Ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）のα−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質
上記のタンパク質を用いることにより、セリン誘導体を簡便に生成することができる。【００３９】
配列番号５に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ａ）は、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）から単離し得る。タンパク質（Ａ）は下記実施例にて実証されているとおり、広い基質特異性を有している。【００４０】
本発明においては、タンパク質（Ａ）と実質的に同一のタンパク質も用い得る。タンパク質（Ａ）と実質的に同じタンパク質として、（Ｂ）に示すタンパク質が提供される。アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、「１又は数個」の用語は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。「１又は数個」の用語が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。ただし、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列において１または数個の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ７−８の条件下で、タンパク質（Ａ）の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。【００４１】
上記タンパク質（Ｂ）に示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びタンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。【００４２】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、および付加等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、タンパク質（Ａ）と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。【００４３】
また、タンパク質（Ａ）とそれぞれ実質的に同一のタンパク質として、アミノ酸配列による相同性が、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％の相同性の配列を有するタンパク質が例示される。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性の計算は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長をもちいて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ  ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値またはこれと同等の計算手法による数値である。【００４４】
上記タンパク質（Ｂ）としては、例えば、次のような変異型タンパク質が挙げられる。（Ｂ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、第３３９番目の部位のチロシンが、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群より選ばれるいずれかの一つのアミノ酸に置換された配列を備えるタンパク質。
これらの変異型タンパク質は、式（Ｉ）のアミノ酸と式（ＩＩ）アルデヒドとから式（ＩＩＩ）のセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性がタンパク質（Ａ）よりも高い。これらの中でも、第３３９番目の部位のチロシンがセリンに置換されたアミノ酸配列を備える変異型タンパク質は特に上記の活性が高い。なお、アミノ酸配列の置換については、元のアミノ酸の略号／変異部位の番号／置換後のアミノ酸略号の順に表記される場合がある。例えば、第３３９番目の部位のチロシンがセリンに置換されたアミノ酸配列を備える変異型タンパク質は、「Ｙ３３９Ｓ」のような略号表記によって識別され得る。アミノ酸の略号には、学術的に、一文字略号および三文字略号が認められており、上記は一文字略号による表記である。他の変異型についても同様である。【００４５】
さらに、他の好ましい変異型タンパク質としては、次のタンパク質（Ｂ２）が挙げられる。
（Ｂ２）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、第１９番目の部位のアスパラギンがセリンに置換された配列を備えるタンパク質。
タンパク質（Ｂ２）の変異は、「Ｎ１９Ｓ」と略号表記される。Ｎ１９Ｓの変異も、これらの変異型タンパク質は、式（Ｉ）のアミノ酸と式（ＩＩ）アルデヒドとから式（ＩＩＩ）のセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性に関与している。【００４６】
さらに好ましい変異型タンパク質としては、配列番号５に記載のアミノ酸配列において第３３９番目のアミノ酸と第１９番目のアミノ酸の双方に変異を導入した形態が挙げられる。すなわち、組合せとしては、次の（１）から（３）の組合せが挙げられる。
（１）「Ｙ３３９Ｓ」および「「Ｎ１９Ｓ」
（２）「Ｙ３３９Ｈ」および「「Ｎ１９Ｓ」
（３）「Ｙ３３９Ｎ」および「「Ｎ１９Ｓ」
これらのうちでも「Ｙ３３９Ｓ」および「Ｎ１９Ｓ」の双方の変異が導入されたアミノ酸配列を備えるタンパク質は、式（Ｉ）のアミノ酸がアラニンである場合に特に高い酵素活性を示す傾向がある。【００４７】
本発明は、上記タンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチドも提供する。コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドとして、上記タンパク質（Ａ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ａ）が挙げられる。【００４８】
上記ポリヌクレオチド（ａ）は、タンパク質（Ａ）をコードしており、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１株から単離し得る。【００４９】
さらに、本発明のポリヌクレオチドの他の形態としては、例えば、上記タンパク質（Ｂ１）、（Ｂ２）およびこれらの変異の組合せによる変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。これらの変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４に記載の塩基配列において、対応するアミノ酸の部位の配列をコドン表に従って置換した塩基配列を備える。例えば、「Ｙ３３９Ｓ」の変異が導入されたタンパク質の場合、配列番号４の塩基配列において塩基番号１０１５〜１０１７における「ｔａｃ」の塩基配列を、「ｔｃｔ」などのセリンをコードする塩基配列に置換すればよい。【００５０】
単離の方法について説明する。配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．の染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）等参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、例えば本発明の方法における反応を触媒する活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、配列番号４に記載された塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、コード領域を挟むように、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーの組み合わせを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。【００５１】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などを用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。【００５２】
また、上記ポリヌクレオチド（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ポリヌクレオチド（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして、例えば、下記ポリヌクレオチド（ｂ）が挙げられる。【００５３】
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のα−アミノ酸と式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるセリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド【００５４】
ハイブリダイズさせるポリヌクレオチドとしては、例えばプローブを用い得る。それぞれの場合において、プローブは、配列番号４に記載の塩基配列などに基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブは、プラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。また、一旦、上記のような実質的に同一のポリヌクレオチドが検出された後は、ＰＣＲ等によって増幅することも定法により可能である。【００５５】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、塩基配列についての相同性（％）の計算は各遺伝子のＯＲＦ全体（終止コドンを含む）をもちいて、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ  ＝  ６、ｐｉｃｋ  ｕｐ  ｌｏｃａｔｉｏｎ＝１の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた数値またはこれと同等の計算手法による数値として表示する。また、他の例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。【００５６】
なお、上記のように上記ポリヌクレオチド（ｂ）の場合には、それぞれ３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ａ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。【００５７】
本発明において用いられる酵素は、上記のような反応を触媒し得る状態で反応系内に存在すれば、その形態に特に限定はない。すなわち、酵素の存在下で反応を行う際の、反応系内における酵素の具体的な存在形態としては、例えば、酵素を生産する微生物を含む培養物、その培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物を含む培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質、及びこれらの混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される無細胞抽出物や粗精製タンパク質、これらをさらに精製した精製タンパク質などが含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。【００５８】
次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形質転換体の作製方法について、上記（Ａ）のタンパク質を一例として説明する。他の変異型タンパク質についても同様に実施可能である。【００５９】
上記（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体は、上記のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ組換えポリヌクレオチドを作製し、これを用いて作製することができる。例えば、配列番号４に示される塩基配列を有するＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡを作製して適切な宿主に導入することにより、（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体を得ることができる。配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。培養等の取り扱いが簡便で、高価な成分を要せずとも培養できる宿主を用いることにより、セリン誘導体の大量生産をより簡便に、また安価に行うことができる。【００６０】
配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡを宿主に導入するために用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモータとしては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．などに由来する上記酵素をコードする遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、配列番号４などのＤＮＡに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。【００６１】
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８，  ３２６  （１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。【００６２】
目的のタンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、そのタンパク質を生産する形質転換体内でそのタンパク質を会合させたタンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化および活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。【００６３】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。【００６４】
形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。【００６５】
本発明で用いられる触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。【００６６】
本発明で用いられるタンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには、そのタンパク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性および再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。【００６７】
これらの遺伝子とタンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。【００６８】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。【００６９】
触媒活性を有するタンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。【００７０】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例えば、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）など）。【００７１】
プロモータ、所定の活性を有する目的タンパク質またはその目的タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。【００７２】
得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、所定のタンパク質またはその融合タンパク質が発現生産される。【００７３】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、目的タンパク質内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いて目的タンパク質を切り出せるようにしてもよい。【００７４】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。【００７５】
目的のタンパク質またはこれを含む融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。目的タンパク質あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、目的タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、目的タンパク質あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化し、変性剤を透析等により除去して目的タンパク質を得ることができる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、下記実施例において用いられているＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０６１１株は、上記にて説明したとおり、寄託機関に受託された日（すなわち、２００７年３月２９日）においては、その名称としてＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ  ＡＪ１１０６１１株とされていたが、その後の再同定の結果、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．に属すると分類すべき微生物であることが判明した微生物である。
＜実施例１＞２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性の検出（野生株の活性確認）
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社）で調製した寒天培地で、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）を、３０℃、２４時間培養した。得られた微生物の菌体を、３ｍｌの０．２％  α−ベンジル−ＤＬセリンおよび０．１７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社）を含む液体培地（ｐＨ７．０）に１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間、振とう培養した。培養後、菌体を遠心分離し、１ｍｌの０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で、菌体を２回洗浄した。洗浄菌体と０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）とを用いて、全量０．３ｍｌの菌体懸濁液を調製した。得られた菌体懸濁液を、４℃にて超音波破砕処理した。超音波処理後に遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）を行って得られる上清を、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、無細胞抽出液とした。【００７７】
５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  α−ベンジル−ＤＬセリン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸の組成を有する反応液Ａに、０．０３ｍｌの無細胞抽出液を添加して全量０．１ｍｌとした反応混合物を、３０℃にて、１０分間反応させた。１０分後、ホルムアルデヒドキット−テストワコー（和光純薬工業）に付属されたアルカリ試液（５Ｎ−水酸化カリウム）を０．１ｍｌ混和させることで反応を停止した。【００７８】
以降、キット付帯のマニュアルに従い、ホルムアルデヒドの検出反応を行い、５５０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ１１）。対照として、前記反応液Ａにおいてα−ベンジル−ＤＬセリンの代わりに水を添加したものを用いて行った反応により得られる反応液の吸光度（Ｅ１０）を同様に測定した。測定値Ｅ１１およびＥ１０から、α−ベンジル−ＤＬセリン特異的な吸光度変化（ＥΔ１＝Ｅ１１−Ｅ１０）を算出したところ、１．２５の値を示した。以上の結果より、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）から調製された無細胞抽出液について、２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性が確認された。【００７９】
＜実施例２＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの精製
（１）無細胞抽出液の調製
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社）で調製した寒天培地で、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）を、３０℃、２４時間培養した。得られた微生物の菌体を、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、２５℃、１２０往復／分で１９時間、振とう培養した。５００ｍｌ容の坂口フラスコ内に、０．２％  α−ベンジル−ＤＬセリンおよび０．１７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を５０ｍｌを注入したものを２０本用意し、得られた培養液を０．２５ｍｌずつ、各坂口フラスコ内の液体培地に接種した。接種後、２５℃、１２０往復／分で２４時間、振とう培養を行った。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌し、１０ｍｌの０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液Ａ（ｐＨ７．４）で、菌体を２回洗浄した。さらに、０．０２ｍＭ  ピリドキサールリン酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液Ｂ（ｐＨ７．４）で、菌体を２回洗浄し、４０ｍｌの菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心分離（８，０００×ｇ、２０分）で得られる上清を、さらに超遠心分離（２００，０００×ｇ、３０分）にかけ、リン酸カリウム緩衝液Ｂを用いて透析し、無細胞抽出液を得た。【００８０】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記（１）にて得られた無細胞抽出液を、予め０．０２ｍＭ  ピリドキサールリン酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液Ｂ（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＨＰ  １６／１０カラム（アマシャムバイオサイエンス製）にアプライし、０−１Ｍ  塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。得られたフラクションを酵素源として実施例１の方法に従って酵素活性を測定したところ、０．３−０．４Ｍ  塩化ナトリウム相当の画分に、２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性が検出された。【００８１】
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー
上記（２）で得られた酵素の活性画分を、０．０２ｍＭ  ピリドキサールリン酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液Ｂ（ｐＨ７．４）に透析し、等量の２Ｍ  硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂと混和した。得られた混和物を、予め１Ｍ  硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂで平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＨＰ１６／１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし、１−０Ｍ  硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により、酵素を溶出した。得られたフラクションを酵素源として、実施例１の方法に従って酵素活性を測定したところ、０．７−０．６Ｍ  硫酸アンモニウム相当の画分に２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を検出した。【００８２】
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー
上記（３）で得られた酵素の活性画分を濃縮し、予め０．０２ｍＭ  ピリドキサールリン酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  １６／６０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし、酵素を溶出した。得られたフラクションを酵素源として、実施例１の方法に従って酵素活性を測定したところ、２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性は６４−６８ｍｌの溶出位置に検出された。【００８３】
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記（４）にて得られた酵素の活性画分を、予め０．０２ｍＭ  ピリドキサールリン酸、１ｍＭＥＤＴＡを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ５/５カラム（アマシャムバイオサイエンス製）にアプライし、０−０．７Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。得られたフラクションを酵素源として、実施例１の方法に従って酵素活性を測定したところ、０．４５−０．５５Ｍ塩化ナトリウム相当の画分に２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を検出した。【００８４】
上記（１）から（５）の工程を経て得られた精製酵素の活性画分は、比活性１．８２Ｕ／ｍｇであった。また、得られた精製酵素を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でゲルを染色させたところ、分子量約４０ｋＤａの位置に均一なバンドが検出された。【００８５】
＜実施例３＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の決定および遺伝子クローニング
実施例２で調製した精製酵素１００ｐｍｏｌ相当を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した。得られたサンプルを島津製作所社製プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−２１Ａに供し、Ｎ末アミノ酸配列を２３アミノ酸残基分決定した（配列番号１）。【００８６】
次いで、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）のゲノムＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ（７５Ｕ）にて切断した後、ＴａＫａＲａＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）のマニュアル記載の方法に従って、ＰｓｔＩカセットとライゲートした。ライゲートミックスを鋳型として、カセットプライマーＣ１とプライマーＳＥＱＡ（配列番号２）の組み合わせによって、ＰＣＲ（９４℃：３０秒、５０℃：３０秒、７２℃：４分、３０サイクル）を行った。次いでこのＰＣＲ反応液を鋳型として、カセットプライマーＣ２とプライマーＳＥＱＢ（配列番号３）を用いて、２回目のＰＣＲ（９４℃：３０秒、５０℃：３０秒、７２℃：４分、３０サイクル）行った。増幅が確認された約０．６ｋｂ長の断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔｅａｓｙ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲートし、増幅断片が挿入されたプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。【００８７】
約０．６ｋｂの断片について塩基配列を決定したところ、目的タンパク質のＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。この約０．６ｋｂ長の遺伝子断片をプローブとして、染色体ＤＮＡを各種制限酵素処理後、サザン解析したとろ、ＳａｃＩ処理した場合に約５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。次いで、染色体ＤＮＡをＳａｃＩ処理後、アガロース電気泳動し、約５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１８のＳａｃＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブを用いてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＵＣＲＨＭＴ５Ｋと命名した。ｐＵＣＲＨＭＴ５Ｋに挿入されている配列について塩基配列を決定したところ、３６５アミノ酸をコードするＯＲＦが存在した（配列番号４）。【００８８】
＜実施例４＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる発現（発現菌ＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４の作製）
ｐＵＣＲＨＭＴ５Ｋを鋳型として、プライマーＳ１１Ｆ（配列番号６）およびプライマーＳ１２Ｒ（配列番号７）を用いて、ＰＣＲにより２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＯＲＦ領域１．１ｋｂを増幅した。増幅された断片をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理した後、予めＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理したｐＴｒｐ４ベクター（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００５，３２，２０５−２１１）とライゲートした。得られたベクターを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド（ｐＴｒｐ４ＲＨＭＴ）を有する形質転換体を得た。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４ＲＨＭＴと命名した。【００８９】
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４ＲＨＭＴ一白金耳分を、３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液０．３ｍＬを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液について、２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、０．０１７Ｕ／ｍｇであった。なお、ＰＣＲ産物を挿入していないｐＴｒｐ４をＪＭ１０９に導入した形質転換体；ＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４を用い、その他は上記の方法と同様にして得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は、検出限界以下であった。【００９０】
＜実施例５＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる発現（発現菌ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴの作製）
実施例４で作製したプラスミドｐＴｒｐ４ＲＨＭＴをＢａｍＨＩ処理した後、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）のマニュアル記載の方法に従って末端平滑化を行い、続いてＮｄｅＩ処理することによって２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を調製した。次にｐＳＦＮベクター（国際公開第２００６／０７５４８６号パンフレット）をＰｓｔＩ処理した後、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）のマニュアル記載の方法に従って末端平滑化を行い、続いてＮｄｅＩ処理を行った。このベクターと先に調製した遺伝子をライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド（ｐＳＦＮＲＨＭＴ）を有する形質転換体を得た。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴと命名した。【００９１】
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ一白金耳分を、３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で２０時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、同緩衝液０．３ｍＬを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液について、２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、０．０１４Ｕ／ｍｇであった。【００９２】
＜実施例６＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによるα−ベンジル−Ｌ−セリン生成反応−野生株によるＢｎＳ合成
１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に、実施例２で調製した精製酵素溶液を５０μｌ添加し、３０℃で３０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物１００μｌに４ｍＭ硫酸銅を１００μｌ加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液（１０％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、８．９ｍＭのα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【００９３】
＜実施例７＞酵素反応で生成するベンジルセリンの立体決定
α−ベンジル−Ｌ−セリンを合成するために文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００４，４３，２３８２−２３８５）に従い、エチルベンズイミデート塩酸塩９３９．２ｍｇ、Ｌ−セリン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩１ｇを溶解させた塩化メチレン溶液に、トリエチルアミン１．４１ｍｌを加え、２．５時間加熱還流した後、室温で１９時間撹拌した。反応混合物に塩化メチレン５０ｍｌを加え、水２０ｍｌで２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウム除去後溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル５／1−４／１）にて精製した。溶媒留去後、２−フェニル−２−オキサゾリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを７５９ｍｇ得た。２−フェニル−２−オキサゾリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを５２．４ｍｇ、水酸化カリウム５６．１ｍｇ、（Ｓ，Ｓ）−３，４，５−トリフルオロフェニル−ＮＡＳ  ブロミド９．５５ｍｇ（和光純薬製、コード番号：２０１−１６４０１）を懸濁させたトルエン溶液にベンジルブロミド０．１２ｍｌを加え、０℃にて８時間撹拌した。反応混合物に酢酸エチル２０ｍｌを加え、水５ｍｌで２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウム除去後溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル８／1−５／１）にて精製した。溶媒留去後、４−ベンジル−２−フェニル−２−オキサゾリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを５１ｍｇ得た。ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＤ−Ｈ（４．６×２５０ｍｍ）によりＨＰＬＣ分析（移動相：ヘキサン／イソプロピルアルコール＝９９／1、カラム温度：室温、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）を行ったところ、光学純度は９８．４％ｅ．ｅ．であった。４−ベンジル−２−フェニル−２−オキサゾリン−４−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル４２ｍｇにエタノール１ｍｌ、６Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え１時間加熱還流した後、６ＮＨＣｌ１ｍｌを加え２時間加熱還流した。ｐＨを中性に調整し、不溶物を除去することでα−ベンジル−Ｌ−セリンを含む溶液を得た。【００９４】
得られたα−ベンジル−Ｌ−セリンの溶液を、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液（１０％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、酵素反応で得られるα−ベンジルセリンと同じ保持時間を示すことがわかった。以上の結果から酵素反応で得られるα−ベンジルセリンはα−ベンジル−Ｌ−セリンであることがわかった。【００９５】
＜実施例８＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−ベンジル−Ｌ−セリン生成（発現菌ＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４ＲＨＭＴによるＢｎＳ合成：ＣＦＥ）
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４ＲＨＭＴ一白金耳分を、３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液０．３ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を、１０ｍＭホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に３０μｌ添加し、３０℃で３０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物１００μｌに４ｍＭ硫酸銅を１００μｌ加えた。【００９６】
得られた溶液１００μｌに水１００μｌを加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ硫酸銅（１０％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果５．２ｍＭのα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。なお、ＰＣＲ産物を挿入していないｐＴｒｐ４をＪＭ１０９に導入した形質転換体；ＪＭ１０９／ｐＴｒｐ４を用い、その他は上記と同様の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は、検出限界以下であった。【００９７】
＜実施例９＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−ベンジル−Ｌ−セリン生成（発現菌ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴによるＢｎＳ合成：ＣＦＥ）
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ一白金耳分を３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１７時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液０．３ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に３０μｌ添加し、３０℃で１時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物１００μｌに４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（１０％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、７．８ｍＭのα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【００９８】
＜実施例１０＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−ベンジル−Ｌ−セリン生成（発現菌ｐＳＦＮＲＨＭＴによるＢｎＳ合成：ｃｅｌｌ）
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ一白金耳分を、３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１６．５時間培養を行った。得られた菌体を、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に２．５ｍｌ接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた培養液１０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、１０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液１ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ加え、菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（１０％  イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、６．２ｍＭのα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【００９９】
＜実施例１１＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−イソブチル−セリン生成（発現菌ｐＳＦＮＲＨＭＴによるｉＢｕＳ合成：ｃｅｌｌ）
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ一白金耳分を、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で一晩振とう培養した。得られた培養液１０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、１０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液１ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−ロイシン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ硫酸銅を１００μｌ加え、菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液（５％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、０．６ｍＭのα−イソブチル−セリンの生成が確認された。【０１００】
＜参考例＞α−メチルチオエチル−セリンの合成
文献（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．２００１，７，６１９−６２５）に従い、ＤＬ−メチオニン１０ｇに水２０ｍｌ、６Ｎ  ＮａＯＨ１１．５ｍｌを加え溶解した。ｐＨを１０．５−１１．５に維持しながら、ベンゾイルクロリド８．６ｍｌを加え、室温で２時間撹拌した。得られた反応混合物をろ過後、ジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸を徐々に加え、ｐＨを１に調整し、結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄後、減圧下乾燥し、Ｎ−ベンゾイルメチオニンを１６．２ｇ得た。得られたＮ−ベンゾイルメチオニン４．９ｇに無水酢酸２４ｍｌを加え、１００℃で４時間加熱した後、溶液を室温まで冷却し、溶媒を留去した。残留物にトルエン２４ｍｌを加え、溶媒留去することを２回繰り返した。残留物をピリジン２．５ｍｌに溶解させ、３５％  ホルムアルデヒド溶液１０ｍｌを加え室温で１７時間撹拌した。得られた反応混合物に水４０ｍｌを加えた後、酢酸エチル４０ｍｌで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウム除去後溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル４／1−１／１）にて精製した。溶媒留去後、５−ベンゾイルアミノ−５−メチルチオエチル−４−オキソ−１，３−ジオキサンを２．５６ｇ得た。得られた５−ベンゾイルアミノ−５−メチルチオエチル−４−オキソ−１，３−ジオキサン１．０６ｇに、６Ｎ塩酸７．５ｍｌを加え、７時間加熱還流した。反応溶液をろ過後、溶媒を留去した。残留物に水５ｍｌを加え、イオン交換樹脂（アンバーライト１２０）を用いて精製した。溶媒留去後、得られた結晶を水／エタノールから再結晶し、減圧下乾燥することにより、α−メチルチオエチル−セリンを１２９ｍｇ得た。この化合物のＮＭＲを測定したところ、文献記載値とほぼ一致した。【０１０１】
＜実施例１２＞Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるα−メチルチオエチル−セリン生成−発現菌ｐＳＦＮＲＨＭＴによるＨｍＭｅｔ合成：ｃｅｌｌ
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ一白金耳分を、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で一晩振とう培養した。得られた培養液１０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、１０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液１ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−メチオニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ硫酸銅を１００μｌ加え、菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（２％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、２．８ｍＭのα−メチルチオエチル−セリンの生成が確認された。【０１０２】
＜実施例１３＞変異株Ｙ３３９Ｓ、Ｙ３３９Ｈ、Ｙ３３９Ｎの作製
変異型２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを構築するために実施例５で作成したｐＳＦＮＲＨＭＴをＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。Ｙ３３９Ｓの変異はストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)社（アメリカ）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、Ｙ３３９Ｓ変異型酵素に対応するプライマーＹ３３９ＳＦ（配列番号８）およびプライマーＹ３３９ＳＲ（配列番号９）を用いて導入した。同様に変異型酵素に対応するプライマーＹ３３９ＨＦ（配列番号１０）およびプライマーＹ３３９ＨＲ（配列番号１１）を用いてＹ３３９Ｈの変異をプライマーＹ３３９ＮＦ（配列番号１２）およびプライマーＹ３３９ＮＲ（配列番号１３）を用いてＹ３３９Ｎの変異を導入した。ＰＣＲ反応の生成物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミドを有する形質転換体を得た。この形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｈ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｎと命名した。【０１０３】
＜実施例１４＞変異株Ｙ３３９Ｓ、Ｙ３３９Ｈ、Ｙ３３９Ｎの反応
実施例１３で作成したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｈ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｎをそれぞれ３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で終夜培養を行った。得られた菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、同緩衝液０．３ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  α−ベンジル−ＤＬセリン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸の組成を有する反応液に、０．０２ｍｌの無細胞抽出液を添加して全量０．０６ｍｌとした反応混合物を、３０℃にて、１０分間反応させた。１０分後、ホルムアルデヒドキット−テストワコー（和光純薬工業）に付属されたアルカリ試液（５Ｎ−水酸化カリウム）を０．０６ｍｌ混和させることで反応を停止した。以降、キット付帯のマニュアルに従い、ホルムアルデヒドの検出反応を行い、５５０ｎｍの吸光度を測定し、生成したホルムアルデヒド量を求め活性を算出した。結果を表１に示す。【０１０４】
【表１】
0005532928.tif 000005
【０１０５】
＜実施例１５＞変異株Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓの作製
変異型２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを構築するために実施例１３で作成したｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９ＳをＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異はストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)社（アメリカ）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、変異型酵素に対応するプライマーＮ１９ＳＦ（配列番号１４）およびプライマーＮ１９ＳＲ（配列番号１５）を用いて導入した。ＰＣＲ反応の生成物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミドを有する形質転換体を得た。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓと命名した。作成したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で終夜培養を行った。得られた菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、同緩衝液０．３ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  α−ベンジル−ＤＬセリン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸の組成を有する反応液に、０．００５ｍｌの無細胞抽出液を添加して全量０．０６ｍｌとした反応混合物を、３０℃にて、５分間反応させた。５分後、ホルムアルデヒドキット−テストワコー（和光純薬工業）に付属されたアルカリ試液（５Ｎ−水酸化カリウム）を０．０６ｍｌ混和させることで反応を停止した。以降、キット付帯のマニュアルに従い、ホルムアルデヒドの検出反応を行い、５５０ｎｍの吸光度を測定し、生成したホルムアルデヒド量を求め活性を算出した。結果を表２に示す。【０１０６】
【表２】
0005532928.tif 000006
【０１０７】
＜実施例１６＞ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを用いたＢｎＳの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ一白金耳分を、３ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１６．５時間培養を行った。得られた菌体を、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に２．５ｍｌ接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた培養液１０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、１０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液０．２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ加え、菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（１０％  イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、定量的なα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【０１０８】
＜実施例１７＞ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを用いたｉＢｕＳの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ一白金耳分を、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で一晩振とう培養した。得られた培養液１０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、１０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液１ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−ロイシン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ硫酸銅を１００μｌ加え、菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（５％イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、４．６ｍＭのα−イソブチル−セリンの生成が確認された。【０１０９】
＜実施例１８＞ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを用いたＢｎＳの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦ
ＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを３５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃で１７時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、５０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、反応溶液に加えた（３０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、４５ｍＭ  ホルムアルデヒド、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍｌ）。３０℃で５時間撹拌した後、反応混合物２０μｌに４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ、水８０μｌを加え菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（１０％  イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、２８．２ｍＭのα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【０１１０】
＜実施例１９＞ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを用いたＢｎＳの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦ
ＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを７００ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃で１７時間培養を行った。培養液を２つ（３５０ｍｌ）にわけ、それぞれを遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、５０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄した。洗浄後、３５０ｍｌ分の菌体を反応溶液に加えた（６０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、９０ｍＭ  ホルムアルデヒド、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍｌ）。３０℃で６．５時間撹拌したところで３５０ｍｌ分の菌体を加えさらに１５時間撹拌した。反応終了後、反応混合物２０μｌに４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ、水８０μｌを加え菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（１０％  イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、５７．６ｍＭのα−ベンジル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【０１１１】
＜実施例２０＞α−ベンジル−Ｌ−セリンの精製
実施例１８で得られた反応混合物から遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により簡単に除菌を行った。得られた溶液に硫酸を加え、ｐＨを３に調整し、５０℃にて２時間溶存タンパクの加熱凝集を行った。これを０．２μｍのＭＦにてろ過を行った。この溶液を強酸性カチオン交換樹脂（アルドリッチ製  アンバーライトＩＲ１２０）４０ｍｌを充填したカラムにフィードし、α−ベンジル−Ｌ−セリンを吸着させた。樹脂量の２．５倍の水を貫流して洗浄した後、１Ｍ  アンモニア水を用いて溶離させ、１０ｍｌごとに集めた。得られたフラクションの２番目から１０番目までを減圧下濃縮を行い、アンモニアを概ね除去した。得られた結晶を減圧下５０℃にて一晩乾燥することにより、１．５７ｇ（９３ｗｔ％）のα−ベンジル−Ｌ−セリンの結晶を得た。【０１１２】
＜実施例２１＞α−ベンジル−Ｌ−セリンの精製
実施例２０と同様に強酸性カチオン交換樹脂（アルドリッチ製  アンバーライトＩＲ１２０）の精製で得られた１８４ｍｇのα−ベンジル−Ｌ−セリンを含む粗結晶８４１ｍｇ（２２ｗｔ％）を約５ｍｌの水に溶解し、この溶液を合成吸着剤（三菱化学製  ＳＰ２０７）１７ｍｌを充填したカラムにフィードし、水で溶出させた。α−ベンジル−Ｌ−セリンを含むフラクションを集め、減圧下濃縮を行い、減圧下５０℃にて一晩乾燥することにより、１７４ｍｇ（９７ｗｔ％）のα−ベンジル−Ｌ−セリンの結晶を得た。この結晶の旋光度を測定したところ［α］２０Ｄ＝＋１６．８（Ｃ  ０．７９、Ｈ２Ｏ）であり文献記載値と一致を示した。文献値［α］２０Ｄ＝＋１６．４（Ｃ  ０．８１、Ｈ２Ｏ）（Ｓｙｎｌｅｔｔ  １９９７、２５３．）【０１１３】
＜実施例２２＞α−メチルチオエチル−Ｌ−セリンの合成
1００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを７５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃で１７時間培養を行った。遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、５０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、反応溶液に加えた（６０ｍＭ  Ｌ−メチオニン、９０ｍＭ  ホルムアルデヒド、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍｌ）。３０℃で２３時間撹拌後、反応混合物２０μｌに４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ、水８０μｌを加え菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）後、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−５０００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：２ｍＭ  硫酸銅水溶液（２％  イソプロピルアルコール）、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、４６ｍＭのα−メチルチオエチル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【０１１４】
＜実施例２３＞α−メチルチオエチル−Ｌ−セリンの精製
1００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを７５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃で１７時間培養を行った。培養液を２つ（３５０ｍｌ＋４００ｍｌ）にわけ、それぞれを遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、５０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄した。洗浄後、３５０ｍｌ分の菌体を反応溶液に加えた（６０ｍＭ  Ｌ−メチオニン、９０ｍＭ  ホルムアルデヒド、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍｌ）。３０℃で４時間撹拌し、４００ｍｌ分の菌体を加えさらに１８時間撹拌し、残存量に合わせて菌体とホルムアルデヒドを加えた。反応混合物から遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により簡単に除菌を行った。得られた溶液に硫酸を加え、ｐＨを２．５に調整し、５０℃にて１時間溶存タンパクの加熱凝集を行った。不溶物を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により除去し、０．４５μｍのＭＦにてろ過を行った。この溶液を強酸性カチオン交換樹脂（アルドリッチ製  アンバーライトＩＲ１２０）４０ｍｌを充填したカラムにフィードし、α−メチルチオエチル−Ｌ−セリンを吸着させた。樹脂量の２．５倍の水を貫流して洗浄した後、１Ｍ  アンモニア水を用いて溶離させ、１０ｍｌごとに集めた。得られたフラクションの２番目から１０番目までを減圧下濃縮を行い、アンモニアを概ね除去した。得られた結晶を減圧下５０℃にて一晩乾燥することにより、１．４０ｇ（９８ｗｔ％）のα−メチルチオエチル−Ｌ−セリンの結晶を得た。この結晶の旋光度を測定したところ［α］２０Ｄ＝−２１．７（Ｃ  １、５Ｎ  ＨＣｌ）であり文献記載値と一致を示した。文献値［α］２０Ｄ＝−１０．５（Ｃ  １、５Ｎ  ＨＣｌ）（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．２００１、７、６１９．）【０１１５】
＜実施例２４＞α−メチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液５０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−アラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−メチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１１６】
＜実施例２５＞α−カルバモイルメチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液５０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−アスパラギン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−カルバモイルメチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１１７】
＜実施例２６＞α−チオメチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液５０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−システイン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−チオメチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１１８】
＜実施例２７＞α−インドールメチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液５０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−インドールメチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１１９】
＜実施例２８＞α−ｓｅｃ−ブチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液５０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−イソロイシン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−ｓｅｃ−ブチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１２０】
＜実施例２９＞α−ｐ−ヒドロシキ−ベンジルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃で１８時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、５０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液５ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を１ｍＭＬ  チロシン、３ｍＭ  ホルムアルデヒド、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に５３．３μｌ添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−ｐ−ヒドロシキ−ベンジルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１２１】
＜実施例３０＞α−シクロヘキシルメチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１７時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、５０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液５ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を１２．５ｍＭ  シクロヘキシルアラニン、３ｍＭ  ホルムアルデヒド、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液に５９μｌ添加し、３０℃で３０分間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−シクロヘキシルメチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１２２】
＜実施例３１＞ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを用いたメチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃、１２０往復／分で１６時間培養を行った。得られた培養液の１０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、１０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液１ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）により集菌した菌体に、３０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−アラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ硫酸銅を１００μｌ加え、菌体を遠心分離（１８，０００×ｇ、５分）した。得られた溶液の１００μｌに水１００μｌを加えＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、３．４ｍＭのα−メチル−Ｌ−セリンの生成が確認された。【０１２３】
＜実施例３２＞α−エチルセリン合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた培養液の１０ｍｌから菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｓ−２−アミノ−ｎ−酪酸、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−エチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１２４】
＜実施例３３＞α−プロピルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた培養液の１０ｍｌから菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−ノルバリン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−プロピルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１２５】
＜実施例３４＞α−ブチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃、１２０往復／分で１７時間培養した。得られた培養液の１０ｍｌから菌体を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）にて集菌した後、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを用いて洗菌し、同じ緩衝液１０ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液２ｍｌから遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により集菌した菌体に、１０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−ノルロイシン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液１００μｌを添加し、３０℃で１時間反応した。反応終了後、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）により得られる上澄み液のＥＳＩ−ＭＳ分析を行ったところ、α−ブチルセリンの分子イオンピークが観測された。【０１２６】
＜実施例３５＞ＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓの無細胞抽出液を用いたメチルセリンの合成
１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩培養したＪＭ１０９／ｐＳＦＮＲＨＭＴ−Ｙ３３９Ｓ−Ｎ１９Ｓを、５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール）に接種し、３７℃、１２０往復／分で１６時間培養を行った。得られた培養液の４０ｍｌから遠心分離（８，０００×ｇ、１０分）により集菌した後、４０ｍｌの０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて菌体を洗浄し、同じ緩衝液４ｍｌを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理して菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）を行い、得られる上澄み液を無細胞抽出液とした。３０ｍＭ  ホルムアルデヒド、３０ｍＭ  Ｌ−アラニン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、および５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）の組成を有する反応液に、０．０３４ｍｌの無細胞抽出液を添加して全量０．１ｍｌとした反応混合物を、３０℃にて、１時間反応させた。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。反応終了後、反応混合物に４ｍＭ  硫酸銅を１００μｌ加え、遠心分離（１８，０００×ｇ、５分、４℃）した。得られた溶液の１００μｌに水１００μｌを加えＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：０．５ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：３０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２３０ｎｍ）。その結果、１９．５ｍＭのα−メチル−Ｌ−セリンの生成が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明はアミノ酸の製法に係る産業において有用である。本発明は、各種のセリン誘導体、光学活性アミノ酸の製造に寄与し、例えば医薬中間体などの製法として利用されることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号１：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのＮ末端アミノ酸配列
配列番号２：プライマーＳＥＱＡ
配列番号３：プライマーＳＥＱＢ
配列番号４：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列（ＯＲＦ）
配列番号５：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（ＡＪ１１０６１１株）由来２−ベンジルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号６：プライマーＳ１１Ｆ
配列番号７：プライマーＳ１２Ｒ
配列番号８：プライマーＹ３３９ＳＦ
配列番号９：プライマーＹ３３９ＳＲ
配列番号１０：プライマーＹ３３９ＨＦ
配列番号１１：プライマーＹ３３９ＨＲ
配列番号１２：プライマーＹ３３９ＮＦ
配列番号１３：プライマーＹ３３９ＮＲ
配列番号１４：プライマーＮ１９ＳＦ
配列番号１５：プライマーＮ１９ＳＲ
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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