(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体組成物または液体凍結組成物であって、該組成物は、
（ａ）改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、またはその改変体もしくは誘導体；
および
（ｂ）マンニトール
を含み、（ｂ）は該組成物の唯一の安定化剤であり、該組成物には実質的に非ウイルスタンパク質がない、組成物。
【請求項２】
マンニトールが、１０℃と０℃との間の保存温度で安定化効果を提供する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がワクチンであるか、または哺乳動物における遺伝子療法、ウイルス療法、免疫療法、もしくはがん療法での使用のためである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が生ワクチンである、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペス、水痘・帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニア、大痘瘡、小痘瘡、ロタウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、アルボウイルス、Ａｆｉｐｉａ  ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉおよびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓからなる群より選択される微生物により引き起こされる、疾患または状態に対するワクチン接種のためである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が実質的に水性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
０．０１％と４０％（ｗ／ｖ）との間のマンニトールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
０．１％と１０％（ｗ／ｖ）との間のマンニトールを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
約５％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
改変されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、またはその改変体もしくは誘導体を含む、液体組成物または液体凍結組成物を安定化する方法であって、該方法は、十分な量のマンニトールを添加する工程を包含し、マンニトールは該組成物の唯一の安定化剤であり、該組成物には実質的に非ウイルスタンパク質がない、方法。
【請求項１２】
前記組成物が、請求項３から５のいずれか１項に定義されるとおりの目的のためである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物の前記ウイルスが、請求項６に定義されるとおりのものである、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、請求項７から１０のいずれか１項に定義されるとおりのものである、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
改変されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、またはその改変体もしくは誘導体を含む、液体組成物または液体凍結組成物を安定化するためのマンニトールの使用であって、マンニトールが、該組成物の唯一の安定化剤であり、該組成物には実質的に非ウイルスタンパク質がない、使用。
【請求項１６】
前記組成物が、請求項３から５のいずれか１項に定義されるとおりの目的のためである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記組成物の前記ウイルスが、請求項６に定義されるとおりのものである、請求項１５から１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物が、請求項７から１０のいずれか１項に定義されるとおりのものである、請求項１５から１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定した、ウイルス製剤およびウイルスを基にしたワクチンに関連する。水の凍結点より下の温度でウイルスを安定化することに関して難しいのは、凍結および融解の間、構造構成要素および機能構成要素の物理的な崩壊を防ぐことである。保存の間、安定性を確実にするために、一般に感染性ウイルスのストックは≦−６０℃で保存されていた。その上、チルド冷却された（ｃｈｉｌｌｅｄ）（例えば、５−８℃）ウイルスの調製物は、限定された安定性を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
改変されたワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）は、高度に弱毒化された、ポックスウイルス科オルトポックスウイルス属の一員である。外来遺伝子を発現するように操作されたポックスウイルスは、生物医学的研究における、標的タンパク質の合成およびワクチン開発のための確立されたツールである。その有利な特性としては、組換えＤＮＡをパッケージングする大きな収容力、標的遺伝子発現についての正確なウイルス特異的制御、宿主内での持続性の欠如または宿主内でのゲノム組込みの欠如、ワクチンとしての高い免疫原性、ならびにベクターおよびワクチン生産の容易さが挙げられる。
【０００３】
安全性についての懸念により、ヒトの細胞での複製に欠陥のあるウイルスの開発が開始された後、ＭＶＡは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチンに代わるものとして現れた。ニワトリ胚線維芽細胞における５７０回より多い回数の継代培養後、ＭＶＡは、ヒトの細胞を含む哺乳類に由来する多くの細胞で有効には増殖できず、ＶＶの広い細胞宿主域を失った。ＭＶＡは、深刻な問題なく１００，０００人より多くの人の一次痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチン接種に使用されており、かつ、実験動物において試験後、毒性がないとみなされた。
【０００４】
ほとんどの目的のために、ＭＶＡベクターの生成には、ＶＶ特異的プロモーターの制御下で配置された１つまたは２つの組換え遺伝子を有するプラスミドからの、単一のゲノムの挿入が必要である。ＭＶＡゲノム内でか、またはＶＶタンパク質チミジンキナーゼもしくは血球凝集素をコードする遺伝子座内で天然に存在する欠失部位が、組換え遺伝子配列の挿入部位として機能する。
【０００５】
多くの先行研究が、ヒトについての複数のウイルス感染に対するＭＶＡ組換えワクチンの候補の開発に捧げられている。このウイルス感染としては、ＡＩＤＳを引き起こすもの、インフルエンザ、学齢期前呼吸器疾患（ｅａｒｌｙ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、麻疹、日本脳炎、デング熱、またはマラリアが挙げられる。ＡＩＤＳに対して有効なワクチンが緊急に必要とされているので、免疫不全ウイルス抗原を生産する組換えＭＶＡは、ヒトにおける候補ワクチンとして評価されるべき最初のベクターウイルスの中の１つである。
【０００６】
ウイルスは、細胞区画と細胞外液との間でかなり変動し得るそのウイルスのネイティブ環境外でしばしば不安定である。特定の条件が維持されない場合、精製されたウイルスは、適切に機能しないことがあり得、または可溶性のままでいられないことがあり得る。さらに、ウイルスタイターは、タンパク質分解、凝集、および最適に及ばない緩衝条件によって影響され得る。例えば、ワクチン接種での使用のための精製されたウイルスは、そのウイルスのもともとの構造の完全性および／または活性を保持しながら、長期間保存されることがしばしば必要である。保存の程度「貯蔵寿命」は、数週間と１年より長い期間との間で変動し得、かつウイルスの性質および使用される保存条件に依存している。
【０００７】
安定性を確実にするために、治療のためのウイルス製剤は、別個にパッケージされた水溶性希釈剤中で使用直前に溶解されるべき凍結乾燥された物質として一般に供給される；しかしながら、このプロセスは、製造原価を増大させ、かつ、その凍結乾燥されたタンパク質は、使用直前に溶解されることが必要であるので不適当な投与の危険性が高まることを包含し、そして、通例、その凍結乾燥プロセス後に、感染タイターの損失が見られる。あるいは、治療のためのウイルス製剤は、安定性を改良するための添加物を含む液剤として供給され得る。例えば、タンパク質液剤を製剤にするのに有用な遊離アミノ酸（例えば、ロイシン、トリプトファン、セリン、アルギニンおよびヒスチジン）のような添加物が提案されてきた。現在、市場で入手することができるある種のウイルス製剤は、安定剤としてタンパク質を含む。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または精製されたゼラチンが、ウイルス液剤中での化学変化および物理変化を抑えるために使用され得る。しかしながら、これらのタンパク質の添加は、ウイルスコンタミネーションを除去する複雑なプロセスを包含する。さらに、それらは、それらの使用を限定する強いアナフィラキシー反応をもたらし得る。
【０００８】
液体ウイルス製剤は、一般に凍結された固体として保存される。従来の低温保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）は、ガラス化を促進するためにある範囲の添加物を利用する。ガラス化は、熱のすばやい除去もしくは添加によるか、または添加物と混ぜることによって物質をあらゆる結晶性構造のないガラスのようなアモルファス固体に変えるプロセスである。ガラス状固体の凝固は、ガラス転移温度（過冷却に起因して融解温度、Ｔｍより低い温度）で起こる。低温生物学で使用される添加物、または極地に生息する生物によって天然に生産される添加物は、凍害防御物質（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）と呼ばれる。従来の凍害防御（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）は、生物学的物質の長期保存に最も有利である固体状態を達成すること、すなわち液体状態から固体状態への転移に焦点を合わせる。
【０００９】
しかしながら、一旦、固体凍結状態が達成されると、ウイルス組成物が不安定であり得るのは、本研究の驚くべき発見である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の局面は、液体組成物または液体凍結組成物を提供し、その組成物は、以下：
（ａ）改変されたワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）ウイルス、またはその改変体もしくは誘導体；
および
（ｂ）マンニトール
を含み、
ここで、（ｂ）はその組成物の唯一の安定化剤である。
本発明の上記組成物は、安定である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
液体組成物または液体凍結組成物であって、該組成物は、
（ａ）改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、またはその改変体もしくは誘導体；
および
（ｂ）マンニトール
を含み、（ｂ）は該組成物の唯一の安定化剤である組成物。
（項目２）
マンニトールが、１０℃と０℃との間の保存温度で安定化効果を提供する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
上記組成物がワクチンであるか、または哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける遺伝子療法、ウイルス療法、免疫療法、もしくはがん療法での使用のためである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
上記組成物が生ワクチンである、項目３に記載の組成物。
（項目５）
上記ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペス、水痘・帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニア、大痘瘡、小痘瘡、ロタウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、アルボウイルス、Ａｆｉｐｉａ  ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉおよびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓからなる群より選択される微生物により引き起こされる、疾患または状態に対するワクチン接種のためである、項目４に記載の組成物。
（項目６）
上記組成物が実質的に水性である、項目１に記載の組成物。
（項目７）
０．０１％と４０％（ｗ／ｖ）との間のマンニトールを含む、項目１に記載の組成物。
（項目８）
０．１％と１０％（ｗ／ｖ）との間のマンニトールを含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
約５％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含む、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
改変されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、またはその改変体もしくは誘導体を含む、液体組成物または液体凍結組成物を安定化する方法であって、該方法は、十分な量のマンニトールを添加する工程を包含し、マンニトールは該組成物の唯一の安定化剤である方法。
（項目１１）
上記組成物が、項目３または４のいずれか１項に定義されるとおりの目的のためである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記組成物の上記ウイルスが、項目５に定義されるとおりのものである、項目１０または１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
上記組成物が、項目６から９のいずれか１項に定義されるとおりのものである、項目１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
改変されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、またはその改変体もしくは誘導体を含む、液体組成物または液体凍結組成物を安定化するためのマンニトールの使用であって、マンニトールが、該組成物の唯一の安定化剤である使用。
（項目１５）
上記組成物が、項目３または４のいずれか１項に定義されるとおりの目的のためである、項目１４に記載の使用。
（項目１６）
上記組成物の上記ウイルスが、項目５に定義されるとおりのものである、項目１４から１５に記載の使用。
（項目１７）
上記組成物が、項目６から９のいずれか１項に定義されるとおりのものである、項目１４から１６に記載の使用。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
マンニトールは、凍結乾燥されたウイルスワクチン製剤中で、充填剤またはケーキング（ｃａｋｉｎｇ）剤としてたびたび使用される。例えば、Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、９３（７）：１９１２−１９２３）は、マンニトール、デキストランおよびイノシトールを含む噴霧凍結乾燥（ｓｐｒａｙ−ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）インフルエンザワクチン製剤を開示する。著者らは、初めはマンニトールを吸湿性の薬剤として使用していたが、さらに、ワクチンの安定性が脱水された粒子の機械的な強さの増大によって改良されるとも仮定した。
【００１２】
凍結乾燥された、ＭＶＡを基にしたワクチン中での安定剤としてのマンニトールの使用は、当該分野において公知である。Ｚａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｕ．、２３（３）：３２９−３３２）は、トレハロース、マンニトール、デキストランおよびイノシトールを含む、安定した、凍結乾燥されたＭＶＡワクチン組成物を記載した。トレハロースおよびデキストランは、ネイティブタンパク質構造の保護を促進すると報告された。他方、マンニトールおよびイノシトールはフリーラジカル酸化インヒビターとして作用すると言われていた。
【００１３】
マンニトールはまた、ＭＶＡを基にしたワクチンを含む液体ワクチン製剤中でも使用されてきた。米国特許出願第１１／２０２，５１６号は、トレハロースおよび／またはデキストランと一緒にマンニトールを可能性のある賦形剤として、その概括的な開示において列挙した。しかしながら、マンニトールについて所望される特性は、ひとつも記載されなかった。同様に、米国特許出願第１０／３７９，５７２号は、ＡＦＦＡ（栄養等級の魚油）、ヘタスターチ、およびグリセロールを含む他の賦形剤とともにマンニトールを必要に応じて含む、経口ＭＶＡ−痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチン製剤を開示した。ここでもまた、マンニトールの所望する機能上の特性は、ひとつも記載されなかった。米国特許第７，２５６，０３７号は、等張剤としてマンニトールを必要に応じて含むＭＶＡ液体製剤を記載した。
【００１４】
液体ウイルスワクチン組成物および液体凍結ウイルスワクチン組成物中での安定化剤としてのマンニトールの使用もまた報告されてきた。国際公開第２００１／０６６１３７号および国際公開第２００５／０５２１１６号において、マンニトールは、凍害防御物質およびフリーラジカルスカベンジャーの両方であるとの理由で、ウイルス安定剤として言及された。国際公開第２００１／０６６１３７号はまた、その組成物（複数）のウイルスは、必要に応じてワクシニアウイルスであり得るとも述べた。さらに、米国特許第４，１４７，７７２号もまた、液体ワクチン製剤の安定剤としてマンニトールに言及した。しかしながら、これらの開示のどれも唯一の安定化剤としてマンニトールを利用しなかった。むしろ、安定性は、マンニトールを含み得る賦形剤の組合せを用いて達成された。
【００１５】
用語「改変体」は、本明細書において、ウイルスゲノムが、改変されたワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６０３３５５、ＶＲＬ２００４年５月１５日）の核酸配列と１００％の核酸配列の同一性を共有しないが、依然として痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）に対する免疫を与え得、かつニワトリ胚線維芽細胞を感染させ得、他方ヒトＨｅＬａ細胞系において複製し得ないことを意味する。例えば、そのゲノムは、ＭＶＡの核酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含み得、より好ましくは、上記核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列に対して、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【００１６】
同一性％は、当該分野において周知である方法によって決定され得る。例えば、グローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティ−１４、エクステンディングギャップペナルティ−４をパラメーターとして用いるＥｘｐａｓｙファシリティーサイトのＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７）を用いて決定され得る。
【００１７】
用語「誘導体」は、本明細書において、ゲノムの挿入、ゲノムの欠失および／またはゲノムの置換を含む組換えＭＶＡを意味する。
【００１８】
用語「安定である」は、本明細書において、８℃±２℃または−２３℃±５℃で４週間の保存後の組成物についてのウイルスタイターが、保存前の、その組成物のもともとのウイルスタイターの少なくとも２０％であることを意味し、好ましくは、もともとの感染力の、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％を意味し、そして、最も好ましくは、もともとのウイルスタイターの、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を意味する。好ましくは、その組成物のウイルスタイターは、少なくとも３ヶ月の保存後にこの／これらのレベルで維持され、好ましくは、６ヶ月の保存後に、１年の保存後に、２年の保存後に、３年の保存後に、または４年の保存後にこの／これらのレベルで維持され、最も好ましくは、５年の保存後またはそれより長い年数の保存後にこの／これらのレベルで維持される。
【００１９】
用語「安定化剤」は、本明細書において、薬剤であって、その薬剤を欠いている同等の組成物と比較して、ウイルスタイターの維持を促進する薬剤を意味する。代表的に、不安定性は、凍結保存１ヶ月〜複数月以内に比較研究において検出され得る。しかしながら、本発明の薬剤によって提供される安定化効果は、５年またはそれより長い年数であり得る組成物の全寿命に及び得る。好ましくは、安定化剤を含む組成物が、８℃±２℃または−２３℃±５℃での４週間の保存後にその安定化剤を欠いている同等の組成物より少なくとも２０％大きなウイルスタイターを有し、より好ましくは、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、より大きなウイルスタイターを有する。好ましくは、その安定剤を含む組成物のウイルスタイターが、その安定化剤を欠いている同等の組成物と比較して、少なくとも３ヶ月の保存後にこの／これらのレベルで維持され、そして、好ましくは、６ヶ月の保存後に、１年の保存後に、２年の保存後に、３年の保存後に、または４年の保存後にこの／これらのレベルで維持され、そして、最も好ましくは、５年の保存後またはそれより長い年数の保存後にこの／これらのレベルで維持される。用語「安定化剤」は、本明細書において、代表的な薬学的組成物賦形剤を含まない。その薬学的組成物賦形剤としては、例えば、保存剤、緩衝剤、抗菌剤、充填剤／増量剤、粘性剤、等張剤、洗剤、乳化剤、および界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
反対に、本明細書において、用語「安定化剤」としては、単純な糖（例えば、スクロース、デキストロース、グルコースおよびフルクトース）；糖アルコール／ポリオール（例えば、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、エリトリトールおよびイノシトール）；および血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））が挙げられる。
【００２１】
ウイルスタイターは、プラークアッセイ（適切な場合）またはＴＣＩＤ５０アッセイなどのような、当該分野において公知である任意の標準技術を用いて測定され得る。ウイルスプラークアッセイにおいて、ある種の栄養培地に含まれる目に見える構造が細胞培養物中に形成される。細胞培養物中で繁殖させることによって、ウイルスは、プラークとして知られる細胞破壊ゾーンを生み出す。これらのプラークは、ウイルスタイターを決定するために、時には肉眼で、および時には他の技術（例えば、染色法、顕微鏡法、血球吸着または免疫蛍光法）によって、視覚により検出され得る。
【００２２】
ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）アッセイは、感染因子（例えば、ウイルス）が一定数の感受性組織培養物上に接種されるときの、個々の培養物の５０％を感染させる感染因子（例えば、ウイルス）の量を決定する。
【００２３】
ＴＣＩＤ５０を決定するために、ニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）が調製される。例えば、以下に本質的に記載するように、米国特許第５，３９１，４９１号の（血清を用いる、または血清を用いない）方法にしたがって、調製される。マイクロタイタープレートに、５×１０５±２０％細胞／ｍｌの濃度で、１００μｌのＣＥＣ懸濁物が播種される。そのプレートはＣＯ２インキュベーター内において３６±２℃で一晩中インキュベートされる。
【００２４】
サンプルおよびコントロール調製物（コントロール）は、希釈前に超音波で処理される。サンプルおよびコントロールは、細胞培養培地で１０倍ずつの段階で希釈され、整数ログ（ｉｎｔｅｇｅｒ  ｌｏｇ）または半対数（ｈａｌｆ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）の段階をカバーする希釈系列を生成する。適切な希釈段階の数は、予想されるウイルスタイターによる。組換えＭＶＡプラシーボサンプルは、希釈されていないサンプルで開始して試験される。
【００２５】
調製された、サンプル希釈物またはコントロール希釈物は、ＣＥＣ単層を含む、調製されたマイクロタイタープレートにそれぞれ８回、各１００μｌ移動される。さらなる８ウェルに細胞培養培地がネガティブ（細胞）コントロールとして接種される。続いて、そのマイクロタイタープレートは、ＣＯ２インキュベーター内において３６±２℃で５±１日間インキュベートされる。
【００２６】
細胞層における局所性病変（ＭＶＡによって引き起こされる細胞変性効果（ＣＰＥ））について、マイクロタイタープレートのウェルがリバース光学顕微鏡の下で検査される。各希釈でのＣＰＥを示しているウェルの割合からＴＣＩＤ５０が計算される。
【００２７】
上記細胞コントロールにＣＰＥがなく、かつ、ポジティブコントロールのウイルスタイターが所望される値の範囲にある場合、本アッセイは有効であるとみなされる。ＴＣＩＤ５０の統計計算は、適切なコンピュータープログラムを使って、公知のアルゴリズム（例えば、Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ、１９３８、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．、２７：４９３−４９７）にしたがって行われる。１つのサンプルについて２重の決定または多重の決定の計算は、代表的に個々に行われる。全ての有効な個々の結果についての算術平均は、次の式を用いて計算される：
【００２８】
【数１】
0005642080.tif 000002
Ｘ＝算術平均、サンプルのウイルスタイター[ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］
Ｘｉ＝有効な個々の結果、サンプルのウイルスタイター[ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］
ｎ＝個々の決定の数
凍結された食物の長期保存に使用される、従来のフリーザーまたは従来の低温室は、一般に生ワクチンの保存にも使用される。それらは、≦−１５℃で作動するように設計されるが、頻繁に−１８℃と−２６℃との間の温度に達する。
【００２９】
ワクチン組成物は、従来のフリーザー温度より低い温度（例えば、（生物学的物質の長期保存のための産業用フリーザーにおいて）−８０℃または（液体窒素中において）−１６０℃）で保存され得る。従来の冷蔵温度（例えば、２℃〜８℃）または周囲温度でワクチンを保存することが好ましいことがあり得る。
【００３０】
ワクチンの凍結保存は、費用がかかるのと環境上損害を与えるという両方であり、それは、冷やすこと（ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｉｏｎ）が原因の、電気消費および化学物質の生成／放出に起因する。とりわけ、暑い気候の地域において、そして特に製造所（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から利用場所までの低温度保存ラインの維持が必要とされる場合に、冷やすことが不十分になり得るか、または冷やすことが遮られ得る。ゆえに、偶然に高温に曝されるときに劣化によく耐える力のある、安定した、耐熱のワクチンを提供することが好ましい。保存および出荷（ｓｈｉｐｍｅｎｔ）についての極めて徹底的な制限に従うことによってさえ、ワクチンの、保存および出荷の間にそのワクチンが高温に曝されることを避けることが常に可能とは限らない。このことは、上記ワクチンのウイルスタイターの損失を引き起こし得、それゆえに、そのワクチンの活性の損失を引き起こし得る。このように、過冷蔵温度（ｈｙｐｅｒ−ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）でのウイルスの安定性をも改良する添加物を提供することが望ましい。
【００３１】
好ましくは、上記組成物が固体状態にあるときに（例えば、その組成物が凍結温度より低い（すなわち、液体凍結組成物である）ときに）その組成物のウイルスに対しての安定化効果をマンニトールが提供する。また、上記組成物が固体状態にないときに（例えば、その組成物が凍結温度より高い（すなわち、液体組成物である）ときに）マンニトールが安定化効果を提供することも好ましい。好ましくは、上記組成物の上記マンニトールが、１０℃と０℃との間（例えば、８℃と２℃との間、６．５℃と３．５℃との間、または５℃と３℃との間）の保存温度で安定化効果を提供し得る。
【００３２】
マンニトールは、上記組成物の再結晶ウインドー（ｗｉｎｄｏｗ）において安定化効果を提供し得る。用語「再結晶ウインドー（ｗｉｎｄｏｗ）」は、温度範囲を指し、その範囲では、所定の圧力で、（例えば、氷またはクラスレート水和物における）ある結晶構造が異なる結晶構造に転移することができるものであり、アモルファス構造から結晶構造に、または結晶構造からアモルファス構造に転移することができる。この物理的転移は、凍結された液体中に懸濁される物質に、またはそうでない場合に凍結された液体中に含まれる物質に機械的応力（例えば、圧縮またはせん断）をもたらす。ウイルスを適度に低い温度（例えば、≦−１５℃かつ≧−２８℃）での不活性化から守る重要な要素は、凍結および保存の間に上記構造および機能構成要素の、変性または破壊（ｒｕｐｔｕｒｅ）を防ぐことである。
【００３３】
用語「再結晶」は固体状態の液体（例えば、氷）の相転移に関係する。普通の、氷および雪は、六角結晶構造（氷Ｉｈ）を有する。変動する、温度および／または圧力に左右されるため、氷は１２の異なる相より多くの相において形成し得る。これらは、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸを含み；これらのそれぞれが雰囲気圧で形成され得る。氷の異なるタイプは、その氷の、結晶性構造、秩序化、および密度によって区別される。また、圧力下での氷についての２つの準安定相があり、両方とも完全に水素が無秩序、すなわちＩＶおよびＸＩＩである。
【００３４】
結晶性形状および固体の水（ｓｏｌｉｄ  ｗａｔｅｒ）は、固体状態においてアモルファス固体の水（ＡＳＷ；ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｏｌｉｄ  ｗａｔｅｒ）として存在し得る。アモルファス氷（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｉｃｅ）は、結晶構造を欠いている氷であり、かつ少なくとも３つの形状が存在する：気圧またはそれより低い圧力で形成される低密度のアモルファス氷（ＬＤＡ）、より高い圧力で形成する、高密度のアモルファス氷（ＨＤＡ）および非常に高密度のアモルファス氷（ＶＨＤＡ）。ＬＤＡは、液体の水を極めてすばやく冷却することにより形成するか（「過急冷ガラス状水」、ＨＧＷ；ｈｙｐｅｒｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｇｌａｓｓｙ  ｗａｔｅｒ）、非常に低温の基質上に水蒸気を蒸着すること（ｄｅｐｏｓｉｔｉｎｇ）により形成するか（「アモルファス固体の水」、ＡＳＷ）、または雰囲気圧で氷の高密度形状を熱することにより形成する（「ＬＤＡ」）。しかしながら、ウイルス組成物中における多数の溶質の存在は、純粋な氷では見られない、結晶形および相転移が可能であることを意味する。
【００３５】
この組成物の再結晶ウインドーは、例えば、−１０℃と−３０℃との間、または、−２０℃と−２３．５℃の間であり得る。
【００３６】
再結晶ウインドーは、示差熱分析（ＤＴＡ）または示差走査熱分析（ＤＳＣ）などを用いて決定され得る。
【００３７】
熱分析は、物質の物理的性質が温度の関数として測定される一群の技術を含み、そして、その物質は制御された温度プログラムにかけられる。示差熱分析において、サンプルと不活性基準物質との両方が同一の熱処理を受ける場合に、そのサンプルとその不活性基準物質との間に生じる温度差異が測定される。示差走査熱分析の関連する技術は、上記サンプルおよび基準を同一の温度で維持するために必要とされるエネルギーの差異に依存する。物質を熱処理にかける際に起こる、長さ変化または体積変化は膨張計測において検出される；Ｘ線または中性子線回折の両方もまた、寸法変化（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）を測定するために使用され得る。熱重量測定および発生気体分析は、上昇した温度で分解するサンプルに依存する技術である。前者は、熱する際の試料の質量における変化をモニターし、他方、後者は、サンプルを熱する際に発生するガスに基づく。上記技術からのデータは、物質の欠陥密度（ｄｅｆｅｃｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ）における変化に関連し得るか、または相転移（例えば、結晶化または再結晶化）を調べることに関連し得る。
【００３８】
例えば、結晶化および他の相転移は、（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡから入手することができる）ＤＣＳ  Ｑ１０００示差走査熱量計を用いて、製造業者の指示にしたがって決定され得る。
【００３９】
本組成物は、ワクチンであり得るか、または遺伝子療法、ウイルス療法（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）、免疫治療法、もしくはがん療法での使用のためであり得る。好ましくは、その組成物は、生ワクチンである。その組成物は、哺乳動物の、好ましくは、ヒトのワクチン接種のためであり得る。
【００４０】
遺伝子療法は、疾患、および欠陥を有する変異対立遺伝子が機能的なものと入れ替わる遺伝病を処置するための、個人の細胞および個人の組織への遺伝子の挿入である。このテクノロジーは、依然としてその初期にあるが、ある種の成功を伴い使用されてきた。アンチセンス療法は、厳密には遺伝子療法の形式ではないが、遺伝子媒介療法（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）であり、しばしば他の方法と合わせて考えられる。
【００４１】
ウイルス療法は、健康な細胞が損傷を受けないまま、がん性細胞を標的攻撃するために改変されるウイルスを用いた、がん治療の形式である。免疫治療法は、個人の受動免疫であって、別の個人において能動的に生成される、前もって形成された抗体（血清またはγグロブリン）の投与による個人の受動免疫である；だんだん意味が広がって、この用語は、免疫増強物質の使用、免疫応答性リンパ組織（例えば、骨髄または胸腺）の置換などを含むようになった。
【００４２】
ウイルスは、以下から選択されるウイルス科におけるウイルスによって引き起こされる疾患または状態に対するワクチン接種のためであり得る；アデノウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘルパドナウイルス科（Ｈｅｒｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科およびトガウイルス科。
【００４３】
ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペス、水痘・帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニア、痘瘡（ｖａｒｉｏｌａ）、ロタウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、アルボウイルスにより引き起こされる疾患または状態に対するワクチン接種のためであり得るか、またはＡｆｉｐｉａ  ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉおよびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含む細胞内病原体／細胞内寄生体により引き起こされる疾患または状態に対するワクチン接種のためであり得る。
【００４４】
特に、ウイルスは、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）または黄熱に対するワクチン接種のためであり得る。
【００４５】
あるいは、ウイルスは、免疫療法（組換えウイルスによって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）による免疫応答の誘導）、（腫瘍親和性を伴う生ウイルスによる腫瘍崩壊性療法を含む、上記参照の）がん療法、またはウイルス関連悪性疾患の治療のためであり得る。
【００４６】
ウイルスは、エンベロープのないウイルスまたはエンベロープのあるウイルスであり得る。ウイルスは、ポックスウイルス（例えば、改変されたワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）ウイルス）であり得る。好ましくは、ウイルスは、組換えの改変されたワクシニアアンカラウイルスである。
【００４７】
ウイルスは、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）に対するワクチン接種に使用される非組換えＭＶＡであり得る。
【００４８】
ウイルスは、腫瘍関連抗原をコードする遺伝子を送達する組換えＭＶＡポックスウイルスであり得る。このような改変されたウイルスは、免疫応答を誘導するためにがん療法において使用される。
【００４９】
本組成物は、薬学的組成物を作り出すときに使用される、１つもしくはそれより多くの、保存剤、緩衝剤、等張剤、または他の従来の構成要素、（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）ポリソルベート、ポリエチレングリコール、塩化カルシウム、レシチン（例えば、ホスファチジルコリン）、ホスフェート、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、レチニルパルミテート、セレン、メチオニン、クエン酸、クエン酸ナトリウムまたは合成保存剤（例えば、メチルパラベンおよびプロピルパラベン））を含み得る。本組成物は、例えば、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でｐＨ緩衝化されたものであり得る。
【００５０】
この組成物のｐＨは、６と９との間であり得、例えば、６．５と８．５との間、７と８．５との間、７．５と８．５との間、または８と８．５との間であり得る。この組成物のｐＨは、８．２であり得る。
【００５１】
この組成物は、好ましくは実質的にヒト血清アルブミンがなく、好ましくは実質的にあらゆる血清アルブミンがない。この組成物はまた、好ましくは実質的に非ウイルスタンパク質がない。
【００５２】
用語「実質的にヒト血清アルブミンがない」は、本明細書において、組成物が、０．１％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンを含むか、またはそれより少ないヒト血清アルブミンを含むことを意味する。例えば、その組成物は、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０００１％（ｗ／ｖ）または０．００００１％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンを含み得る。好ましくは、存在するヒト血清アルブミンがない。
【００５３】
用語「実質的に非ウイルスタンパク質がない」は、本明細書において、組成物が、０．１％（ｗ／ｖ）の非ウイルスタンパク質を含むか、またはそれより少ない非ウイルスタンパク質を含むことを意味する。例えば、その組成物は、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０００１％（ｗ／ｖ）または０．００００１％（ｗ／ｖ）の非ウイルスタンパク質を含み得る。好ましくは、存在する非ウイルスタンパク質がない。
【００５４】
組成物は、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）と４０％（ｗ／ｖ）との間のマンニトールを含み、例えば、０．１％と１０％との間、１％と２０％との間、１％と１０％との間、２％と９％との間、３％と８％との間、または４％と６％との間のマンニトールを含む。最も好ましくは、組成物は約５％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含む。組成物はまた、２０ｍＭのトリス、１３５ｍＭのＮａＣｌも含み得、かつＨＣｌを用いてｐＨ８．２に調整され得る。
【００５５】
本発明にしたがった、経口投与に適した組成物は、分離した単位（例えば、カプセル剤またはカシェ剤）として提供され得、そのそれぞれは、その組成物のあらかじめ決められた量を；水性の液体中での液剤もしくは非水性の液体中での液剤として；またはｏ／ｗ型液体乳剤もしくはｗ／ｏ型液体乳剤として含む。その組成物はまた、ボーラス、舐剤またはパスタ剤としても提供され得る。
【００５６】
好ましくは、本発明の組成物は、非経口投与に適している。その非経口投与としては、水性および非水性の滅菌非発熱性注射液剤ならびに水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。この注射液剤は、緩衝剤、静菌剤および上記組成物を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含み得る。この懸濁物は、懸濁化剤および増粘剤を含み得る。その組成物は、単位用量または複数回用量の容器（例えば、密封された、アンプルおよびバイアル）の中に提供され得る。１つの実施形態において、その組成物は、実質的に水性である。
【００５７】
上で特に言及された成分のほかに、本発明の製剤は、問題となる組成物のタイプを考慮して、当該分野における従来の他の薬剤を含み得ると理解されるべきであり、例えば、経口投与に適した製剤は、フレーバリング剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含み得ると理解されるべきである。
【００５８】
本発明の第二の局面は、改変されたワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）、またはその改変体もしくは誘導体を含む、液体または液体凍結組成物を安定化する方法を提供し、十分な量のマンニトールを添加することを含む方法であって、ここで、マンニトールはその組成物の唯一の安定化剤である。
【００５９】
その薬剤は上に定義されるように安定化効果を提供し得、かつ上記組成物は上に定義されるような目的のためであり得る。その組成物のウイルスは、上に定義されるようなものであり得、かつその組成物自体は上に定義されるようなものであり得る。
【００６０】
本発明の第三の局面は、改変されたワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）またはその改変体もしくは誘導体を含む、液体または液体凍結組成物を安定化するためのマンニトールの使用を提供し、ここで、マンニトールはその組成物の唯一の安定化剤である。
【００６１】
その薬剤は上に定義されるような安定化効果を提供し得、かつ上記組成物は上に定義されるような目的のためであり得る。その組成物のウイルスは、上に定義されるようなものであり得、かつその組成物自体は上に定義されるようなものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、−６０℃と−８０℃との間のＭＶＡ  ＴＢＳ（液体凍結）組成物のＴＣＩＤ５０値。２つのＭＶＡ  ＴＢＳ組成物（バッチＡおよびＢ）は、−６０℃（±５℃）で３９ヶ月間保存された。サンプルは間隔をおいて取り出され、ＴＣＩＤ５０値が決定された。製剤は、試験期間にわたって安定であった。
【図２】図２は、−２３℃（±２℃）でのＭＶＡ  ＴＢＳ（液体凍結）組成物のＴＣＩＤ５０値。ＭＶＡ  ＴＢＳ組成物（バッチＡ）は、−２３℃（±２℃）で３６ヶ月間保存された。サンプルは間隔をおいて取り出され、ＴＣＩＤ５０値が決定された。製剤は、試験期間にわたって不安定であった。
【図３】図３は、＋２℃〜＋８℃でのＭＶＡ  ＴＢＳ（液体）組成物のＴＣＩＤ５０値。ＭＶＡ  ＴＢＳ組成物（バッチＡ）は、＋２℃〜＋８℃で３６ヶ月間保存された。サンプルは間隔をおいて取り出され、ＴＣＩＤ５０値が決定された。製剤は、試験期間にわたって不安定であった。
【図４】図４は、＋２℃〜＋８℃での組換えＭＶＡ  ＴＢＳ−マンニトール（液体）組成物のＴＣＩＤ５０値。３つの組換えＭＶＡ  ＴＢＳ−マンニトール（５ｗ／ｖ％）組成物（バッチＤ、ＥおよびＦ）は、＋２℃〜＋８℃で１２ヶ月間保存された。サンプルは間隔をおいて取り出され、ＴＣＩＤ５０値が決定された。どの製剤も試験期間にわたって安定であった。
【図５】図５は、−２３℃での組換えＭＶＡ  ＴＢＳ−マンニトール（液体）組成物のＴＣＩＤ５０値。５つの組換えＭＶＡ  ＴＢＳ−マンニトール（５ｗ／ｖ％）組成物（バッチＤ〜Ｈ）は、−２３℃で１８ヶ月保存された。サンプルは間隔をおいて取り出され、ＴＣＩＤ５０値が決定された。各製剤は、試験期間にわたって安定であった。
【００６３】
本発明の例示的な局面は、上の図面を参考にして以下の非限定的な実施例において記載される。
【実施例】
【００６４】
実施例Ａ−凍結された液体ワクチン製剤は、従来の保存温度において不安定である。マンニトールの添加は、従来の保存温度でのワクチン製剤に安定性を与える。
【００６５】
序論
本研究は、試験物として組換えＭＶＡおよびＭＶＡを使って行った。その組換えＭＶＡは、遺伝子を基にした、抗がん性免疫治療用物質である。改変されたワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）痘瘡（Ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチンは、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）の予防および制御のための、弱毒化生ワクチンである。本研究の目的は、従来の冷蔵条件下で保存された液体製剤の安定性を試験することであった。
【００６６】
材料および方法
製剤
ＭＶＡの大規模な生産を、米国特許第５，３９１，４９１号に記載された方法の無血清の改変で達成した。製剤を、１×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの標的タイターまで、ＴＢＳで希釈によるバッチＭＶＡの希釈によって行った。
【００６７】
保存の特徴付け
製剤を：
（ｉ）−２３℃±２℃；
（ｉｉ）＜−６０℃
で保存した。
【００６８】
ＴＣＩＤ５０の決定
マイクロタイタープレートに、５×１０５±２０％細胞／ｍｌの濃度で、１００μｌのＣＥＣ懸濁物を播種した。そのプレートをＣＯ２インキュベーター内において３６±２℃で一晩中インキュベートした。
【００６９】
サンプルおよびコントロール調製物（コントロール）を希釈前に超音波で処理した。サンプルおよびコントロールを、細胞培養培地で１０倍ずつの段階で希釈して、整数ログ（ｉｎｔｅｇｅｒ  ｌｏｇ）または半対数（ｈａｌｆ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）の段階をカバーする希釈系列を生成した。適切な希釈段階の数は、予想されるウイルスタイターによった。
【００７０】
調製された、サンプル希釈物またはコントロール希釈物を、ＣＥＣ単層を含む、調製されたマイクロタイタープレートにそれぞれ８回、各１００μｌ移動した。さらなる８ウェルに細胞培養培地をネガティブ（細胞）コントロールとして接種した。続いて、そのマイクロタイタープレートを、ＣＯ２インキュベーター内において３６±２℃で５±１日間インキュベートした。
【００７１】
細胞層における局所性病変（ＭＶＡによって引き起こされる細胞変性効果（ＣＰＥ））について、マイクロタイタープレートのウェルをリバース光学顕微鏡の下で検査した。各希釈でのＣＰＥを示しているウェルの割合からＴＣＩＤ５０を計算した。
【００７２】
上記細胞コントロールにＣＰＥがなく、かつ、ポジティブコントロールのウイルスタイターが所望される値の範囲にある場合、本アッセイを有効であるとみなした。ＴＣＩＤ５０の統計計算を、適切なコンピュータープログラムを使って、公知のアルゴリズム（例えば、Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ、１９３８、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．、２７：４９３−４９７）にしたがって行った。
【００７３】
コントロールサンプルは、（−６０℃より低い温度で、冷凍された何百ものアリコートで保存された）ＴＢＳに入った標準ＭＶＡ調製物であり、その調製物について何回か（１０−２０回またはそれより多い回）タイターの決定をした。タイターの決定を繰り返すと、平均タイター値が安定し、これをタイター決定の標準として用いることができる。
【００７４】
結果
ＭＶＡ組成物は、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ；Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）の中で−６０℃より低い温度で３９ヶ月間安定であることが見出された（図１を参照のこと）。通常の凍結条件下（すなわち、約−２０℃）で保存された液体凍結製剤（ｌｉｑｕｉｄ  ｆｒｏｚｅｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）もまた、安定であるという一般的な考えがあった。したがって、同じＭＶＡ  ＴＢＳ製剤が、通常の凍結温度で安定であると予想されていた。
【００７５】
しかしながら、図２に示すように、驚いたことにＭＶＡ  ＴＢＳ製剤は、３６ヶ月間にわたって−２３℃で不安定であることが見出された。５％マンニトールの添加は、そのような組成物のウイルスを安定させるのに十分であった（図５を参照のこと）。
【００７６】
考察
液体ＭＶＡ  ＴＢＳ製剤は、−２２℃〜−２３．４℃で不安定であることが見出された。この不安定性の原因は、この製剤についてのこの温度範囲に起こる水相の再結晶であり得る。その製剤は、５％（ｗ／ｖ）マンニトールの添加により、この温度範囲で安定化された。したがって、液体ＭＶＡ  ＴＢＳ−マンニトール製剤は、代表的な保存温度の−２３℃±２℃で安定である。
【００７７】
実施例Ｂ−液体ＴＢＳワクチン製剤は、＋２℃〜＋８℃で不安定であったが、ＴＢＳ−マンニトールワクチン製剤は、上記温度で安定である。
【００７８】
序論
本液体製剤研究の目的は、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）ワクチン製剤へのマンニトールの添加が、冷蔵（非凍結）保存の間にこの製剤の安定性に影響を与えるかどうかを決定することであった。
【００７９】
材料および方法
製剤
ＭＶＡの大規模な生産を、米国特許第５，３９１，４９１号に記載された方法の無血清の改変で達成した。製剤を、１×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの標的タイターまで、ＴＢＳで希釈によるバッチＭＶＡの希釈によって行った。５％の終濃度になるようにマンニトールを添加した。
【００８０】
保存条件
（ｉ）５℃±３℃
ＴＣＩＤ５０の決定
（上の）実施例Ａのように。
【００８１】
結果
保存の安定性
ＭＶＡ  ＴＢＳ組成物は、２℃〜８℃で１２ヶ月〜３６ヶ月の期間にわたって保存される場合、不安定であることが見出された（図３を参照のこと）。しかしながら、５ｗ／ｖ％のマンニトールを含む３つのＭＶＡ  ＴＢＳ組成物は、１８ヶ月の試験期間にわたって安定であることが見出された（図４を参照のこと）。
【００８２】
考察
液体ＴＢＳワクチン製剤は、冷蔵温度（＋２℃〜＋８℃）で不安定であったが、５％マンニトールの添加が安定化効果を与えたことを、上記データは示唆する。
【図１】
0005642080.tif 000003
【図２】
0005642080.tif 000004
【図３】
0005642080.tif 000005
【図４】
0005642080.tif 000006
【図５】
0005642080.tif 000007