(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量の生物学的材料を取り扱うための器具であって、
構造体と、該構造体を遊離可能なように保持する、粘着力を備えた弾性基材とを有し、前記構造体は、前記粘着力によって、前記器具の外表に前記構造体の一部が露出した状態で前記基材の表面に保持され、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面の少なくとも一部は微量の生物学的材料を接着させることができるような処理が施され、前記構造体は前記弾性基材に応力を加えることによって該弾性基材から遊離されることを特徴とする、微量の生物学的材料を取り扱うための器具。
【請求項２】
さらに基板を有し、前記弾性基材は、前記構造体との反対面に接して該基板上に配置されることを特徴とする、請求項１に記載の微量の生物学的材料を取り扱うための器具。
【請求項３】
前記微量の生物学的材料は１個の前記構造体につき１個の細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の器具。
【請求項４】
前記生物学的材料は動物細胞であり、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面は１個の前記動物細胞だけが伸展できる寸法を有することを特徴とする、請求項３に記載の器具。
【請求項５】
前記微量の生物学的材料は、前記構造体２個又は３個以上につき１個の動物細胞であり、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面は１個の動物細胞が伸展できる寸法より小さく、前記１個の動物細胞は前記２個又は３個以上の構造体を引き寄せて立体的な細胞足場を形成することを特徴とする、請求項１又は２に記載の器具。
【請求項６】
前記構造体は光学的な透過性があることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の器具。
【請求項７】
前記構造体は自己組織的に組み上がる機能を有することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の器具。
【請求項８】
前記自己組織的に組み上がる機能は、前記構造体の表面に凹陥部と凸出部とが設けられ、１個の構造体の表面の凹陥部が他の１個の構造体の表面の凸出部と相補的に嵌合することにより達成されることを特徴とする、請求項７に記載の器具。
【請求項９】
前記自己組織的に組み上がる機能は、前記構造体の表面に親水性部分及び／又は疎水性部分が設けられ、１個の構造体の表面の親水性部分が他の１個の構造体の表面の親水性部分と接し、及び／又は、１個の構造体の表面の疎水性部分が他の１個の構造体の表面の疎水性部分と接することにより達成されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の器具。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１つに記載の器具と、生物学的材料とを含むことを特徴とする、微量の生物学的材料を解析するためのキット。
【請求項１１】
前記生物学的材料の微量が前記器具に接着されていることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記生物学的材料は細胞であることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
基板に支持部を介して一体成形された請求項１に記載の構造体を、該構造体を遊離可能なように保持できる粘着力を備えた弾性基材の表面に保持させるステップと、
前記弾性基材上の前記構造体に生物学的材料を懸濁した液体を戴置して、微量の前記生物学的材料を前記構造体の表面の少なくとも一部に接着させるステップと、
前記生物学的材料が接着した前記構造体を前記弾性基材に応力を加えることによって該弾性基材から遊離させるステップと、
前記生物学的材料が接着した前記構造体を移動するステップとを含むことを特徴とする、微量の生物学的材料を取り扱う方法。
【請求項１４】
前記構造体を遊離可能なように保持できる粘着力を備えた弾性基材の表面に保持させるステップは、前記弾性基材を押し付けることにより、前記構造体を前記弾性基材の表面に圧着させるステップであり、前記圧着させるステップの後に、前記押し付けることにより生じる圧力である押圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記構造体を前記弾性基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造体を前記弾性基材の表面に圧着させるステップと、前記基板から分離させるステップとは、複数の構造体について別々に実施され、
前記複数の構造体のうちの１つが保持された弾性基材に他の構造体が保持された弾性基材を押し付けることにより、前記複数の構造体の１つの表面に前記他の構造体が接着された立体的な形状の構造体が形成されるステップを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記弾性基材は粘着力を備えた弾性基材であり、
前記構造体を前記弾性基材の表面に圧着させるステップは、基板に支持部を介して一体成形された構造体に、前記粘着力を備えた弾性基材を押し付けることにより、該弾性基材に生じる弾性力を利用して前記構造体を前記弾性基材の表面に圧着させるステップであり、
前記基板から分離させるステップは、前記押圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記粘着力により前記構造体を前記弾性基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップであり、
前記生物学的材料が接着した前記構造体を前記弾性基材に応力を加えることによって該弾性基材から遊離させるステップは、前記弾性基材に応力を加えて変形させることにより、前記生物学的材料が接着した前記構造体を前記弾性基材から遊離させるステップであることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記保持させるステップの前に、前記生物学的材料と前記構造体との接着を増強させる処理を施すステップを含むことを特徴とする、請求項１４ないし１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記微量の生物学的材料は１個の前記構造体につき１個の細胞であることを特徴とする、請求項１３ないし１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記微量の生物学的材料は２個又は３個以上の前記構造体につき１個の細胞であることを特徴とする、請求項１３ないし１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記構造体は自己組織的に組み上がる機能を有することを特徴とする、請求項１３ないし１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
請求項７ないし９のいずれか１つに記載の器具を２個又は３個以上用意するステップであって、前記器具に含まれる構造体は、異なる器具由来の構造体だけが自己組織的に組み上がり、同じ器具由来の構造体の間では自己組織的に組み上がらないように設計される、前記器具を２個又は３個以上用意するステップと、
微量の生物学的材料を前記２個又は３個以上の器具のそれぞれの外表に露出した前記構造体の表面に接着させるステップと、
前記微量の生物学的材料が接着した構造体をそれぞれの器具の前記弾性基材から遊離させるステップと、
前記微量の生物学的材料が接着した構造体を混合して自己組織的に組み上がらせて、異なる器具由来の構造体からなる集合体を形成させるステップと、
前記集合体を形成した前記構造体の表面に接着した前記微量の生物学的材料の間で相互作用が起こるように反応させるステップと、
前記微量の生物学的材料の間での相互作用を前記集合体ごとに解析するステップとを含むことを特徴とする、微量の生物学的材料の間の相互作用を解析する方法。
【請求項２２】
それぞれの前記器具ごとに異なる種類の前記微量の生物学的材料を前記構造体に接着させることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の生物学的材料を取り扱うための器具及び方法と、微量の生物学的材料の間の相互作用を解析する方法とに関し、より具体的には、基質に接着した状態の単一細胞を取り扱うための器具及び方法と、単一細胞どうしの相互作用を個別に解析する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
微量の生物学的材料、例えば、基質に接着した状態の単一細胞を個別に取り扱う技術を開発することは、生命現象を１分子計測により理解し工学的に応用するために重要な課題である。従来技術で報告された１つのアプローチは、ＭＥＭＳ技術を用いて加工したパリレン製ステンシルを用いて、同一の培養容器の基質の細胞接着特性を逐次的に変化させることにより、特定のパターンで複数の細胞タイプの細胞が配置されるように細胞を接着させて混合培養することである（非特許文献１）。また、別のアプローチでは、微細加工された櫛状の構造体を複数用意して、それぞれの櫛状の構造体の表面に異なる細胞タイプの細胞を接着させておいたうえで、両方の構造体の櫛状部分が嵌合させることにより、所定の間隔を置いて複数の細胞タイプの細胞が配置されるように混合培養することである（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【０００３】
【非特許文献１】Wright, D.ら、Lab on a Chip, 7: 1272-1279 (2007)
【非特許文献２】Hui, E. E.及びBhatia, S. N.、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 104: 5722-5726 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながらこれらの従来技術では、異なる細胞タイプの細胞集団の間での相互作用が起こっており、厳密には、同一の細胞タイプの細胞間の相互作用と、異なる細胞タイプの細胞間の相互作用とが混在していて、異なる細胞タイプの細胞間の相互作用のみを観測することはできない点が問題である。そこで、異なる細胞タイプのそれぞれの細胞の細胞数や細胞の２次元又は３次元的配置を制御して、単一細胞間の相互作用だけを観測するために、微量の生物学的材料を取り扱うための技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、微量の生物学的材料を取り扱うための器具を提供する。本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具は、構造体と、該構造体を遊離可能なように保持する基材とからなり、前記構造体は、前記器具の外表に前記構造体の一部が露出した状態で前記基材の表面に保持され、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面の少なくとも一部は微量の生物学的材料を接着させることができるような処理が施されることを特徴とする。【０００６】
前記本発明の器具において、前記基材は粘着力を備えた弾性基材であり、前記構造体は、前記粘着力によって、前記器具の外表に前記構造体の一部が露出した状態で前記弾性基材の表面に保持され、前記構造体は前記弾性基材に応力を加えることによって該弾性基材から遊離されることを特徴とする場合がある。【０００７】
前記本発明の器具は、前記微量の生物学的材料が１個の前記構造体につき１個の細胞であることを特徴とする場合がある。【０００８】
前記本発明の器具は、前記生物学的材料が動物細胞であり、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面が１個の前記動物細胞だけが伸展できる寸法を有することを特徴とする場合がある。【０００９】
前記本発明の器具は、前記微量の生物学的材料が、前記構造体２個又は３個以上につき１個の動物細胞であり、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面が１個の動物細胞が伸展できる寸法より小さく、前記１個の動物細胞は前記２個又は３個以上の構造体を引き寄せて立体的な細胞足場を形成することを特徴とする場合がある。【００１０】
前記本発明の器具は、前記構造体が光学的な透過性があることを特徴とする場合がある。【００１１】
前記本発明の器具は、前記構造体が自己組織的に組み上がる機能を有することを特徴とする場合がある。【００１２】
前記本発明の器具において、前記自己組織的に組み上がる機能は、前記構造体の表面に凹陥部と凸出部とが設けられ、１個の構造体の表面の凹陥部が他の１個の構造体の表面の凸出部と相補的に嵌合することにより達成されることを特徴とする場合がある。【００１３】
前記本発明の器具において、前記自己組織的に組み上がる機能は、前記構造体の表面に親水性部分及び／又は疎水性部分が設けられ、１個の構造体の表面の親水性部分が他の１個の構造体の表面の親水性部分と接し、及び／又は、１個の構造体の表面の疎水性部分が他の１個の構造体の表面の疎水性部分と接することにより達成されることを特徴とする場合がある。【００１４】
本発明は、微量の生物学的材料を解析するためのキットを提供する。本発明のキットは、前記本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具と、生物学的材料とを含むことを特徴とする。【００１５】
前記本発明のキットは、前記生物学的材料の微量が前記器具に接着されていることを特徴とする場合がある。【００１６】
前記本発明のキットは、前記生物学的材料が細胞であることを特徴とする場合がある。【００１７】
本発明は、微量の生物学的材料を取り扱う方法を提供する。本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法は、基板に支持部を介して一体成形された構造体を、該構造体を遊離可能なように保持できる基材の表面に保持させるステップと、前記押圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記構造体を前記基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップと、前記基材上の前記構造体に生物学的材料を懸濁した液体を戴置して、微量の前記生物学的材料を前記構造体の表面の少なくとも一部に接着させるステップと、前記構造体を前記基材から遊離させるステップと、前記生物学的材料が接着した前記構造体を移動するステップとを含むことを特徴とする。【００１８】
前記本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法において、前記構造体を遊離可能なように保持できる基材の表面に保持させるステップは、前記基材を押し付けることにより、前記構造体を前記基材の表面に圧着させるステップであり、前記圧着させるステップの後に、前記押し付けることにより生じる圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記構造体を前記基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップを含むことを特徴とする場合がある。【００１９】
前記本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法において、前記構造体を前記基材の表面に圧着させるステップと、前記基板から分離させるステップとは、複数の構造体について別々に実施され、前記複数の構造体のうちの１つが保持された基材に他の構造体が保持された基材を押し付けることにより、前記複数の構造体の１つの表面に前記他の構造体が接着された立体的な形状の構造体が形成されるステップを含むことを特徴とする場合がある。【００２０】
前記本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法において、前記基材は粘着力を備えた弾性基材であり、前記構造体を前記基材の表面に圧着させるステップは、基板に支持部を介して一体成形された構造体に、前記粘着力を備えた弾性基材を押し付けることにより、該弾性基材に生じる弾性力を利用して前記構造体を前記弾性基材の表面に圧着させるステップであり、前記基板から分離させるステップは、前記押圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記粘着力により前記構造体を前記弾性基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップであり、前記生物学的材料が接着した前記構造体を前記基材から遊離させるステップは、前記弾性基材に応力を加えて変形させることにより、前記生物学的材料が接着した前記構造体を前記弾性基材から遊離させるステップであることを特徴とする場合がある。【００２１】
前記本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法は、前記圧着させるステップの前に、前記生物学的材料と前記構造体との接着を増強させる処理を施すステップを含むことを特徴とする場合がある。【００２２】
前記本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法において、前記微量の生物学的材料は１個の前記構造体につき１個の細胞であることを特徴とする場合がある。【００２３】
本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法において、前記微量の生物学的材料は２個又は３個以上の前記構造体につき１個の細胞であることを特徴とする場合がある。【００２４】
本発明の微量の生物学的材料を取り扱う方法において、前記構造体は自己組織的に組み上がる機能を有することを特徴とする場合がある。【００２５】
本発明は、微量の生物学的材料の間の相互作用を解析する方法を提供する。本発明の微量の生物学的材料の間の相互作用を解析する方法は、前記構造体が自己組織的に組み上がる機能を有することを特徴とする本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具を２個又は３個以上用意するステップであって、前記器具に含まれる構造体は、異なる器具由来の構造体だけが自己組織的に組み上がり、同じ器具由来の構造体の間では自己組織的に組み上がらないように設計される、前記器具を２個又は３個以上用意するステップと、微量の生物学的材料を前記２個又は３個以上の器具のそれぞれの外表に露出した前記構造体の表面に接着させるステップと、前記微量の生物学的材料が接着した構造体をそれぞれの器具の前記基材から遊離させるステップと、前記微量の生物学的材料が接着した構造体を混合して自己組織的に組み上がらせ、異なる器具由来の構造体からなる集合体を形成させるステップと、前記集合体を形成した前記構造体の表面に接着した前記微量の生物学的材料の間で相互作用が起こるように反応させるステップと、前記微量の生物学的材料の間での相互作用を前記集合体ごとに解析するステップとを含むことを特徴とする。【００２６】
前記本発明の微量の生物学的材料の間の相互作用を解析する方法においては、それぞれの前記器具ごとに異なる種類の前記微量の生物学的材料を前記構造体に接着させる場合がある。【００２７】
本発明は、微量の生物学的材料を取り扱うための器具を提供する。本発明の器具は、構造体と、該構造体を溶媒中で保持することができる基材とからなり、前記構造体の表面の少なくとも一部は微量の生物学的材料を接着させることができるような処理が施され、前記構造体の表面の別の一部と前記基材の表面の一部との特異的な相互作用によって、前記構造体は前記基材に保持されることを特徴とする、微量の生物学的材料を取り扱うための器具である。【００２８】
前記器具において、前記構造体はポリパラキシリレンでできており、前記溶媒は水溶液であり、前記微量の生物学的材料を接着させることができるような処理はＯ２プラズマ照射処理の場合がある。【００２９】
前記器具において、前記特異的な相互作用は疎水性相互作用の場合がある。【００３０】
前記器具において、前記構造体の表面の別の一部は疎水性処理が施される場合がある。【００３１】
前記器具において、前記基材の表面の一部は疎水性処理が施され、油滴が付着している場合がある。【００３２】
前記器具において、前記特異的な相互作用は電磁気学的相互作用の場合がある。【００３３】
前記器具において、前記電磁気学的相互作用は、電界とそれにより誘導された電気双極子モーメントとの相互作用である場合がある。【００３４】
前記器具において、前記特異的な相互作用は、生体分子と、該生体分子に対する特異的結合パートナーとの相互作用の場合がある。【００３５】
前記器具において、前記特異的な相互作用は、糖類とレクチンとの特異的な相互作用の場合がある。【００３６】
前記器具において、前記特異的な相互作用は、抗原と抗体との特異的な相互作用の場合がある。【００３７】
前記器具において、前記特異的な相互作用は、核酸の相補的対合による特異的な相互作用の場合がある。【００３８】
前記器具において前記特異的な相互作用は、金属イオンと、該金属イオンに特異的なキレート剤との相互作用の場合がある。【００３９】
本発明は、微量の生物学的材料を取り扱うための器具を提供する。本発明の器具は、少なくとも２個の構造体と、該構造体を遊離可能なように保持する基材とからなり、前記構造体は、前記器具の外表に前記構造体の一部が露出した状態で前記基材の表面に保持され、前記器具の外表に露出した前記構造体の表面の少なくとも一部は微量の生物学的材料を接着させることができるような処理が施される。【００４０】
前記器具において、前記微量の生物学的材料は１個又は２個以上の細胞であり、該細胞の少なくとも１個が前記少なくとも２個の構造体の表面に接着して、該少なくとも２個の構造体を引き寄せて立体的な細胞足場を形成する場合がある。【００４１】
前記器具において、前前記少なくとも２個の構造体は、前記立体的な細胞足場が凸多面体又はその一部を形成するように配置される場合がある。【００４２】
本発明は、細胞と構造体とからなる集合体の作成方法を提供する。本発明の集合体の作成方法は、本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具と、細胞とを用意するステップと、前記細胞の少なくとも１個が前記器具の少なくとも２個の構造体の表面に接着するように播種して培養するステップと、培養下で、前記細胞が前記少なくとも２個の構造体を引き寄せて、該構造体の表面が前記細胞を取り囲んで、立体的な細胞足場を形成させるステップとを含み、前記立体的な細胞足場は、前記構造体の表面が凸多面体又はその一部となる。【００４３】
前記集合体の作成方法において、前記構造体は物理的性質のセンサーを含む場合がある。【００４４】
本発明は、細胞の物理的性質を測定する方法を提供する。本発明の細胞の物理的性質を測定する方法は、本発明の細胞と構造体とからなる集合体の作成方法によって作成された細胞と構造体とからなる集合体を用意するステップと、前記構造体のうち少なくとも１個に含まれる物理的性質のセンサーを用いて、前記細胞の物理的性質を測定するステップとを含む。【００４５】
本発明の細胞の物理的性質を測定する方法において、前記細胞の物理的性質は、弾性、硬度、電位及び膜輸送からなるグループから選択される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】基質に接着して伸展したＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ａ）及びＨｅｐＧ２細胞（Ｂ）を示す顕微鏡写真。
【図２】本発明の器具及び方法を示す模式図。
【図３】基材の表面に圧着するステップの直前の本発明の構造体の光学顕微鏡写真（Ａ）、走査電子顕微鏡写真（Ｂ）及び断面模式図（Ｃ）。
【図４】３Ｔ３細胞が、基材ではなく、該基材の上に保持された構造体に選択的に接着していることを示す顕微鏡写真（Ａ）及び断面模式図（Ｂ）。
【図５】細胞が接着した構造体をガラス管を用いて基材から遊離させる様子の模式図（Ａ）と、前記構造体を前記ガラス管の液流により移動させる様子の模式図（Ｂ）。
【図６】細胞が接着した構造体をガラス管からの液流で移動させる様子をしめす連続写真。
【図７】異なる形状の構造体を用いて異なる細胞タイプの細胞を同時に取り扱う様子をしめす模式図（Ａ）と、顕微鏡写真（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）。
【図８】本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具の製造方法を示す模式図。
【図９】本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具を用いて、細胞と構造体とからなる集合体を作成する実施例の実験結果を示す顕微鏡写真。
【図１０】本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具のさらなる実施例
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本明細書における生物学的材料とは、生物に由来するいずれかの材料を指し、生物個体、臓器、組織及び細胞と、ミトコンドリア、葉緑体、染色体、分裂装置、リソソーム、ゴルジ体等の細胞内小器官と、ウイルス、ＤＮＡ複製酵素複合体、転写／ＲＮＡプロセッシング複合体、リボソーム、イオンチャンネル、細胞表面レセプター複合体等の分子集合体と、核酸、タンパク質、炭水化物等の生体高分子と、ホルモン、セカンドメッセンジャー、酵素基質、代謝中間体等の他の生物学的材料と相互作用を起こす全ての化合物とを含むが、これらに限定されない。好ましい生物学的材料は、細胞、特に、固体である基質に接着した状態で他の細胞タイプの細胞と相互作用を起こす多細胞生物の細胞である。【００４８】
本発明において「微量」の生物学的材料とは、少なくとも１個の構造体について１個の細胞、１分子の生体高分子又は化合物、あるいは、最小単位の分子集合体を指すが、１個の細胞、１分子の生体高分子又は化合物、あるいは、最小単位の分子集合体の位置を前記構造体の表面において制御して取り扱うことが可能であることを条件として、少なくとも１個の構造体について複数個の細胞、複数分子の生体高分子又は化合物、あるいは、複数個の最小単位の分子集合体を指す場合がある。【００４９】
本発明における生物学的材料の接着とは、固体基質である構造体の表面と当該生物学的材料との接着をいう。前記生物学的材料が、細胞内小器官、分子集合体、生体高分子及び化合物の場合には、静電気的な荷電による吸着を含む、いずれかの共有結合及び／又は非共有結合による構造体への不動化をいう。前記生物学的材料が細胞の場合には、前記いずれかの共有結合及び／又は非共有結合による構造体への不動化のような非生理的現象と、細胞−基質間接着のような細胞の生理現象とを含む。前記細胞が２個または３個以上の場合には、細胞−細胞間接着も含む。【００５０】
本発明において、微量の生物学的材料を接着させることができるような処理とは、それぞれの構造体に接着する生物学的材料の個数を制御する処理をいう。さらに、それぞれの構造体に接着する生物学的材料の構造体の表面上の位置も制御できる場合がある。前記処理の具体的な手順は、前記生物学的材料が細胞の場合と、細胞内小器官、分子集合体、生体高分子及び／又は化合物の場合とで異なる。前記生物学的材料が細胞の場合には、それぞれの構造体の表面に接着する細胞の個数は、例えば、当該細胞が伸展するときに占める基質の寸法に基づいて、前記構造体の表面の寸法を設計することにより制御することができる。また、前記構造体の表面の形状や、表面の細胞との接着特性を変化させることによって、前記構造体の表面の特定の部分にだけ細胞が接着するように制御することができる。２個又は３個以上の構造体について１個の細胞が接着する状態は、例えば、それぞれの構造体の表面の寸法が当該細胞が伸展するときに占める基質の寸法より小さいが、本発明の器具の表面に当該細胞を接触させるとき前記構造体が隣接して配置され、２個又は３個以上の構造体の表面に１個の細胞が接着する場合に得られる。１個の細胞が伸展するときに占める基質の寸法は、細胞タイプの他、基質の細胞接着特性、細胞周期等に応じて異なるが、例えば静止期のマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞では約５０ないし７５μｍの直径である（図１）。前記生物学的材料が、分子集合体、生体高分子及び化合物の場合には、いわゆる１分子操作技術として知られる手法を用いて、構造体に接着する生物学的材料の数及び位置を制御することができる。【００５１】
本発明の構造体は、複数個の細胞からなる細胞塊に複数の構造体が接着する場合もある。例えば、隣接して基材上に配置された構造体に接着した１個又は２個以上の細胞が増殖して、複数の構造体に接着した細胞塊に成長する場合がある。また、自己組織的に組み上がる機能を有する構造体に細胞を接着させてから、構造体を基材から遊離させ、構造体を自己組織的に組み上がらせる場合や、あらかじめ自己組織的に組み上がらせた構造体の集合体に細胞を接着させる場合がある。【００５２】
本発明において、生物学的材料と構造体との接着を増強させる処理とは、構造体の表面に、コラーゲンの他、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、von Willebrand因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、エラスチン、プロテオグリカン等の細胞と基質との接着に関与することが知られている物質をコーティングする処理をいう。また、構造体の表面に、プラズマ処理、フッ酸処理又は紫外線照射処理を施すことによって、前記構造体を基板から分離させる際に破壊した支持部のうち前記構造体の表面に残った部分を除去すること、及び／又は、前記構造体の表面を清浄にすることも、生物学的材料と構造体との接着を増強させる処理に含まれる。【００５３】
本発明において、生物学的材料を取り扱うとは、該生物学的材料を運搬すること、異なる組成のメディウムに移すこと、一定の温度、ｐＨ、溶存ガス組成の下で静置培養すること、蛍光物質等で標識すること、顕微鏡の視野内に置いて観察すること、顕微鏡下で物質を注入又は吸引するか、電極を穿刺するか、固体プローブを前記生物学的材料に接触させて剛性等の物性を測定すること、光ピンセットその他の物理的手段で非接触的に細胞運動、細胞内小器官の運動、分子の挙動等を測定すること等を含むが、これらに限定されないさまざまな作業をいう。前記生物学的材料の運搬は、該生物学的材料が接着した構造体をホールディングピペット等の固体で保持して移動することのほか、ピペットからメディウムを噴出させる等によって生じた液流によって前記構造体を運搬することを含むが、これらに限定されない。【００５４】
本発明において、生物学的材料の間の相互作用とは、細胞分化、形態形成のような発生現象に伴う相互作用と、ニューロン−ニューロン間、ニューロン−筋肉細胞間、ニューロン−感覚細胞間等における神経生理学的な相互作用と、抗原提示細胞とＴ細胞、抗原提示細胞とＢ細胞等における免疫学的な相互作用と、上皮細胞−間葉細胞間、ニューロン−グリア細胞間等における相互作用と、ホルモン、サイトカイン等の液性因子とその標的細胞との相互作用とを含む細胞レベルの相互作用の他、細胞内小器官レベルでの相互作用や、複製、転写、翻訳、シグナル伝達、呼吸、代謝等に関与する分子集合体レベルでの相互作用や、酵素と基質及び／又は調節因子との相互作用や、生体高分子の立体構造や会合状態の変化を含むが、これらに限定されない。【００５５】
本発明における生物学的材料の間の相互作用の解析とは、細胞や細胞内小器官の形態の変化、遺伝子発現、タンパク質その他の生体分子の産生、細胞内のイオン濃度の変化、酵素活性、分子集合体又は生体高分子の会合状態の変化等の生化学的な変化、細胞膜の流動性、膜の興奮性等の物理的な変化を含むが、これらに限定されない。これらのうち、細胞や細胞内小器官の形態の変化は光学顕微鏡を用いて観察することができる。遺伝子発現その他の生化学的な変化や、細胞膜の流動性のような物理的な変化の一部は、発色反応や蛍光標識技術、さらには１分子イメージング技術により光学顕微鏡を用いて観察することができる。また細胞内のイオン濃度の変化や膜の興奮性の変化は、細胞を接着させる構造体の表面に微細加工を施して電極を設けることによって測定することができる。【００５６】
本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具は、構造体と、該構造体を遊離可能なように保持する基材とからなる。前記基材は、粘着力を備えた弾性基材の場合がある。前記器具は、基板に支持部を介して一体成形された構造体を、該構造体を遊離可能なように保持できる基材の表面に保持させるステップと、前記押圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記構造体を前記基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップとにより作成される場合がある。前記構造体を遊離可能なように保持できる基材の表面に保持させるステップは、前記基材を押し付けることにより、前記構造体を前記基材の表面に圧着させるステップであり、前記圧着させるステップの後に、前記押し付けることにより生じる圧力により前記支持部を破壊するとともに、前記構造体を前記基材の表面に保持し、前記基板から分離させるステップを含む場合がある。前記器具を作成する方法は、前記構造体を前記基材の表面に圧着させるステップと、前記基板から分離させるステップとが、複数の構造体について別々に実施され、前記複数の構造体のうちの１つが保持された基材に他の構造体が保持された基材を押し付けることにより、前記複数の構造体の１つの表面に前記他の構造体が接着された立体的な形状の構造体が形成されるステップを含む場合がある。【００５７】
前記基板は、前記支持部及び前記構造体を形成できる形状又は材料からなる基板であれば、特定のものに限定されないが、金属，半導体、セラミックス，ガラス，樹脂等及び／又はこれらの複合材料を素材とする基板であるのが好ましい。前記支持部は、前記支持部上に前記構造体を形成して支持できる形状又は材料からなる支持部であれば、特定のものに限定されないが、前記基板と前記構造体との間に形成した支持材料の少なくとも一部を除去することにより形成するのが好ましい。前記支持材料の少なくとも一部を除去することによって支持部を形成することにより、前記構造体の配置を変えずに、前記構造体を支持する前記支持部を形成することができる。また、前記支持部は、前記基板に連通する連通部を有する犠牲膜を前記基板上に形成し、前記犠牲膜の前記連通部を埋めるように前記構造体を形成した後に、前記犠牲膜を除去することによって形成してもよい。この場合、前記連通部が支持部となる。前記犠牲膜を除去することによって支持部を形成することにより、前記構造体の配置を変えずに、前記構造体を支持する前記支持部を形成することができる。【００５８】
さらに、前記支持部の形状は、外部からの圧力により破壊することのできる形状であれば、特定のものに限定されないが、柱状であるのが好ましい。前記支持部の形状が柱状であることにより、前記支持部は前記構造体を支持するだけでなく、前記構造体の上部方向からの押圧力によって前記支持部を破壊することができるようになる。【００５９】
本発明の器具は、接着させる生物学的材料や解析したい相互作用の種類に応じて、無菌処理を施したり、生体毒性のない素材及び製造方法で製作される。【００６０】
本発明の構造体は、形状又は材料などが特定のものに限定されることがなく、自然界に存在する構造体又は人工的に形成された構造体であってもよい。本明細書の実施例の構造体は平板、ディスク状又は円錐台の形状であるが、微量の生物学的材料を接着できることを条件として、いかなる形状のものであってもよい。例えば、四面体、ピラミッド又は四角錐を含む３次元形状のものであってもよい。また、一体として形成されるものの他、複数のセグメントからなり、該セグメントの連結部分が固定されるか、あるいは、可動になっているものを含む。【００６１】
本発明の構造体は、例えば、光リソグラフィ、エッチング等の従来の微細加工技術を組合せて、犠牲層の除去により立体的な構造とすることができる（ＥＥ  Ｔｅｘｔ  センサ・マイクロマシン工学、藤田博之編著、オーム社（２００５））。代替策として、以下に説明する押印転写法（特願２００７−１０８６７号明細書及びOnoe, H.ら、Journal of Micromechanics and Microengineering, 17: 1818-1827 (2007)）を利用する場合がある。本発明の実施例では押印転写法は、基板と支持部で連結した構造体に基材を押印すると、基板から構造体が分離されて基材上に保持されることにより、分離された構造体が基材上に転写される。このを複数回繰り返すことによって立体的な形状を有する構造体を作成することができる。すなわち、第１の基板から分離されて第１の基材上に保持された第１の構造体と、第２の基板から分離されて第２の基材上に保持された第２の構造体とを用意して、第１の構造体と第２の構造体とを圧着させて得られる第１の構造体と第２の構造体との複合体を第１の基材又は第２の基材の上に保持させることにより、立体的な形状を有する構造体を作成することができる。これをさらに、第３の基材上に保持された第３の構造体、第４の基材上に保持された第４の構造体、・・・について繰り返すこともできる。また、従来の微細加工技術と前記押印転写法とを組み合わせて立体的な形状を有する構造体を作成することもできる。【００６２】
本発明の構造体は、従来の微細加工技術及び／又は前記押印転写法を、単独で、あるいは、組み合わせて作成された立体的な形状を有する鋳型を使って作成される成形品の場合がある。前記成形品は、プラスチック、セラミック及びハイドロゲルと、これらの複合材料とを含むが、これらに限定されない材料を用いて作成される場合がある。【００６３】
本発明の基材は、遊離可能なように構造体を保持することができる基材であれば、いかなるものでもかまわない。遊離可能なように基材が構造体を保持するには、物理的な原理による方法と、化学的な原理による方法とがある。前者には、応力、圧力、振動、超音波、光、電気、熱、静電気等を基材に適用することによって構造体が基材から遊離するものが含まれる。後者には、イオンその他の物質の濃度やイオン強度を変化させることによって構造体が基材から遊離するものが含まれる。【００６４】
物理的な原理によって遊離可能なように構造体を保持することができる基材、特に、応力、圧力、振動、超音波、光、電気、熱、静電気等に応答して、粘弾性、表面の親水性、表面張力、表面の平坦性、表面の帯電状態等が変化する物質は、本発明の技術分野の専門家に周知である。本発明の構造体を保持することができ、かつ、応力、圧力、振動、超音波等に応答して前記構造体を遊離することができる基材の好ましい具体例は、シリコンゴム、ポリイミド、ＰＥＴ又はＰＤＭＳを含むが、これらに限られない、粘着力のある弾性基材である。【００６５】
化学的な原理によって遊離可能なように構造体を保持することができる基材も本発明の技術分野の専門家に周知である。抗原と抗体との反応や、酵素と基質との間又は酵素と阻害剤との間の相互作用や、ポリヒスチジンとニッケルイオンとの間の相互作用等を含むが、これらに限られない、分子識別の特異性が利用される場合がある。例えば、特異的に相互作用する１対の分子の一方を構造体に、他方を基材に結合させておき、両者の間の相互作用によって基材が構造体を保持され、両者のいずれかを固相に結合しない状態で添加することにより、構造体が基材から遊離される。また、基材と構造体とを接着させる接着剤と、該接着剤を不活性化できる試薬とを用いる場合がある。さらに、基材と構造体の素材の組合せによっては、もともと基材と構造体とが接着しやすいが、基材と構造体との結合を弱める界面活性剤等の物質を添加することによって基材から構造体が遊離される場合がある。【００６６】
本発明の基材が粘着力のある弾性基材であって、応力を加えるだけで構造体を遊離することができる場合には、構造体に接着した生物学的材料には何ら影響を与えずに基材から構造体を遊離することができる。その他の物理的原理又は化学的原理によって基材から構造体を遊離させる場合には、生物学的材料の種類又は性質に応じて、あるいは、該生物学的材料が接着した構造体の用途に応じて、本発明の技術分野の専門家が適当な方法を選択できる。【００６７】
構造体を基材にアレイ状に配列しておくことにより、ハイスループットで特定の組合せの微量の生物学的材料の間での相互作用を解析することができる。【００６８】
本発明の基材において、該構造体を保持する部分が、突起部として形成される場合がある。本発明の基材としてシリコンゴム、ポリイミド、ＰＥＴ又はＰＤＭＳからなる弾性基材を用いることにより、前記基材に前記構造体を保持したまま、前記弾性基材の前記突起部の少なくとも一部を局所的に変形させて、前記構造体を支持する前記支持部を間接的に破壊することができる。また、配置における位置精度を低下させることなく前記構造体を前記基板から分離することができる。【００６９】
前記突起部は、前記構造体の少なくとも一部と接触し、局所的に変形して前記支持部を破壊する突起部であれば、特定のものに限定されない。前記突起部は、粘着力を付与することができる弾性基材からなることが好ましい。前記突起部が弾性基材からなることにより、前記基材に前記構造体を保持したまま、前記基材の前記突起部の少なくとも一部を局所的に変形させて、前記構造体を支持する前記支持部を間接的に破壊することができる。【００７０】
また、前記基材の前記突起部は、複数設けて、各々の前記突起部と、各々の前記突起部と接触する各々の前記構造体とが偏心するように配置又は形成してもよい。前記突起部が複数設けられることにより、一度に多数の構造体を分離することができる。また、各々の前記突起部と、各々の前記突起部と接触する各々の前記構造体とが偏心するように配置又は形成されることにより、前記基材の各々の前記突起部が局所的に変形して、前記構造体を支持する前記支持部を間接的に破壊することができる。また、配置における位置精度をより低下させることなく前記構造体を前記基板から分離することができる。【００７１】
さらに、前記基材の前記突起部は、一部の前記突起部の高さが他の前記突起部の高さと異なっていてもよい。一部の前記突起部の高さが他の前記突起部の高さと異なることにより、前記基板上に備えた前記支持部により支持した前記構造体のうち、前記基材の各々の前記突起部と接触する位置に備えられた高さの異なる複数の前記構造体を前記基板から選択的に分離することができる。【００７２】
またこれにより、基材上における構造体の配置密度の制御が可能となる。具体的には、基板上に高密度に配置又は形成された構造体の一部分のみを選択的に分離することによって、構造体を基材上に低密度に配置することもできる。これを繰り返すことにより、基材上のより広範囲な任意の位置に構造体を配置することもできる。このような、配置密度の制御は、特に、高価な材料を集積する際にコスト的にも有効となる。【００７３】
加えて、前記突起部の形状又は寸法は特定のものに限定されず、角状，球状又は柱状などからなる任意の大きさを有する各種形状であってもよい。【００７４】
本発明における構造体の支持部の破壊は、該支持部を破壊することができれば、特定のものに限定されないが、前記押圧力の応力による破壊又はせん断などを用いた機械的な破壊であるのが好ましい。前記押圧力の応力又はせん断などを用いて機械的に破壊することにより、前記構造体を支える前記支持部を間接的に破壊することができ、配置における位置精度を低下させることなく前記構造体を前記基板から分離することができる。【００７５】
本発明において光学的な透過性とは、可視光領域の波長の光が構造体を透過することをいう。構造体の表面に接着した生物学的材料を落射蛍光観察法又は全反射照明蛍光観察法で鏡検する場合には、紫外領域の波長の光が構造体を透過することが望ましい。また赤外線顕微鏡を用いる場合には、赤外領域の波長の光が構造体を透過することが望ましい。さらに本発明の構造体は、その表面が平坦であること、その内部の屈折率等の光学特性が均一であることの他、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、光ピンセット法等のさまざまな光学的な技術の利用に適した光学特性を備えることが望ましい場合がある。【００７６】
本発明の構造体について自己組織的に組み上がるとは、摩擦力、表面張力、疎水結合、磁力、静電気を含むがこれらに限定されない物理的な引力及び／又は斥力か、化学的又は生物学的な結合か、を用いて、メディウム中で構造体がランダムに衝突していくうちに、構造体の集合体が形成され、該集合体においてそれぞれの構造体は予め定められたパターンに従って配置されることをいう。本発明の構造体について自己組織的に組み上がる機能は、例えば、前記構造体の表面に凹陥部と凸出部とが設けられ、１個の構造体の表面の凹陥部が他の１個の構造体の表面の凸出部と相補的に嵌合することにより達成される場合（例えば、Yeh, H. J. J.及びSmith, J. S.、 Ieee Photonics Technology Letters: 6, 706-708 (1994）を参照せよ。）があり、あるいは、前記構造体の表面に親水性部分及び／又は疎水性部分が設けられ、１個の構造体の表面の親水性部分が他の１個の構造体の表面の親水性部分と接し、及び／又は、１個の構造体の表面の疎水性部分が他の１個の構造体の表面の疎水性部分と接することにより達成される場合（例えば、Bowden, N.ら、Langmuir :17, 1757-1765 (2001)を参照せよ。）がある。また、抗原と抗体との反応や、酵素と基質との間又は酵素と阻害剤との間の相互作用や、ポリヒスチジンとニッケルイオンとの間の相互作用等を含むが、これらに限られない、分子識別の特異性を利用した、化学的又は生物学的な結合により達成される場合がある。さらに、これらのいずれかの組合せにより達成される場合がある。【００７７】
平板又はディスク状の形状の構造体は、メディウム中で３次元的に自由に運動できるとき、集合体を形成できない場合がある。かかる場合には、前記メディウム中に、該メディウムに不溶性の液体を添加して、前記メディウムと前記不溶性の液体との間の界面に構造体を浮かべることにより、構造体が２次元的な自由運動しかできないようにすると、集合体の形成を促進できる場合がある。前記メディウムに不溶性の液体は、前記メディウムより比重が大きい液体や、基材との間の表面張力が前記メディウムと基材との表面張力より小さい液体であることが好ましい。【００７８】
集合体を構成する構造体の数や配置パターンを制御して、自己組織的に組み上がるように構造体を設計すると、それぞれの集合体に接着する生物学的材料を特定の組合せだけにすることができる。例えば、２種類の構造体Ｓ１及びＳ２が１個ずつ集合するように設計して、構造体Ｓ１のみを含む器具Ｔ１と、構造体Ｓ２のみを含む器具Ｔ２と、異なる細胞タイプの細胞Ｃ１及びＣ２とを用意して、細胞Ｃ１の単離懸濁液を器具Ｔ１に接触させ、細胞Ｃ２の単離懸濁液を器具Ｔ２に接触させる。その後Ｔ１及びＴ２から構造体Ｓ１及びＳ２を遊離させ、メディウム中で混合することにより構造体Ｓ１と構造体Ｓ２とが１個ずつからなる集合体が形成される。そして、前記集合体の表面では、１個の細胞Ｃ１と１個の細胞Ｃ２とだけの相互作用が起こる。なお、構造体Ｓ１及びＳ２の表面に特定の配向で細胞Ｃ１及びＣ２が接着するように微細加工を施すことも可能である。例えば、細胞Ｃ１がニューロンで細胞Ｃ２が筋細胞のとき、構造体Ｓ１とＳ２が集合体を形成すると、ニューロンの軸索に隣接して筋細胞が配置することができる。このような集合体を用いると、単一のニューロンと単一の筋細胞との間のシナプス形成を同時に多数のサンプルについてリアルタイムで解析することができる。【００７９】
本発明の構造体と基材とからなる微量の生物学的材料を取り扱うための器具において、該基材が前記構造体を保持する溶媒は、水性溶媒と油性溶媒と両媒性溶媒とを含む。前記生物学的材料が細胞のとき、前記溶媒は、該細胞に適した水溶液、例えば、培養液であることが好ましい。【００８０】
前記構造体の表面の別の一部と前記基材の表面の一部との特異的な相互作用は、疎水性相互作用及び電磁気学的相互作用の他、生体分子と、該生体分子に対する特異的結合パートナーとの相互作用や、金属イオンと、該金属イオンに特異的なキレート剤との相互作用を含むが、これらに限定されない。前記疎水性相互作用は、前記構造体の表面の別の一部と、前記基材の表面の一部とがともに疎水性処理が施され、表面どうしが直接接触することによって発生する場合がある。代替的には、油滴のような疎水性の液体を介在することによって発生する場合がある。前記疎水性処理は、例えば、自己組織化法のような周知の表面処理技術を用いてアルカンチオールのような疎水性分子を構造体及び基材の前記表面に結合させることによって達成することができる。前記電磁気学的相互作用には、静電気又は表面荷電による引力を利用するものと、磁石による磁界を利用するものと、電界とそれにより誘導された電気双極子モーメントを利用するものとを含むが、これらに限定されない。電界とそれにより誘導された電気双極子モーメントを利用する電磁気学的相互作用には、誘導誘電泳動、静電配向等を含むが、これらに限定されない。前記生体分子と、該生体分子に対する特異的結合パートナーとの相互作用には、糖類とレクチンとの相互作用、抗原と抗原との相互作用、核酸の相補的対合による相互作用とを含むが、これらに限定されない。また、前記構造体と前記基材とが嵌合可能な形状を有することによって、特定の配向で嵌合することによる相互作用や、前記構造体が、前記基材に設けた開口を塞栓する静水圧による相互作用の組み合わせによって前記構造体が前記基材に保持される場合がある。また、以上に列挙される相互作用の２つ以上の組み合わせによって前記構造体が前記基材に保持される場合がある。【００８１】
本発明の構造体と基材とからなる微量の生物学的材料を取り扱うための器具において、少なくとも２個の構造体と、該構造体を遊離可能なように保持する基材とは、例えばゼラチンのように微小な力で容易に剥離できる物質の層を前記基材の表面にコーティングしてその上に前記構造体を戴置するように周知の微細加工技術によって作成される場合がある。前記微小な力とは、前記微量の生物学的材料が発生する力をいう。前記微量の生物学的材料が細胞の場合に、前記基材が前記構造体を遊離可能なように保持するとは、前記基材は前記器具を移動したり、前記基材上に溶液を注いだりする際に前記構造体が予め定めた位置から動かないように保持しつつ、該細胞の運動によって発生する力によって前記構造体を引き寄せるときに前記基材から前記構造体が容易に離れることができることをいう。【００８２】
少なくとも２個の構造体と、該構造体を遊離可能なように保持する基材とからなる本発明の器具は、細胞の立体的な足場として、細胞を特定の立体的な配向状態に保ちながら培養したり、１個又は２個以上の細胞を構造体が実質的に凸多面体を形成するように覆う集合体を形成させたりするために用いることができる。これによって、細胞を生体組織により近似した状態で培養することができるので、再生医療等の細胞医薬の作成に有用である。【００８３】
本発明の細胞と構造体とからなる集合体に用いる構造体は、アクテュエーターを含むか、あるいは、外部の動力源に接続するかによって、１個ずつ、あるいは、２個又は３個以上を同時に、駆動することができる。あるいは、心筋細胞のような形態変化を起こす細胞を含む構造体では、細胞の動きによって前記構造体を駆動することができる。前記アクテュエーターは、周知の微細加工技術又はＭＥＭＳ技術によって作成することができる。本発明の細胞と構造体とからなる集合体を用いて、１個又は２個以上の細胞の表面の物理的性質を測定することができる。ここで物理的性質とは、弾性、硬度、表面電位及び膜輸送を含むが、これらに限定されない。前記膜輸送に関する物理的性質には、浸透圧、能動輸送、その他の生体膜による物質の移動に関係する性質を含む。かかる細胞表面の物理的性質を測定するときには、前記構造体には物理的性質のセンサー、例えば、変位、速度、力、圧力などの機械量を検出するセンサーや、イオン選択性電極、イオン感応電界トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）などのイオンセンサーを含むことが望ましい。かかる物理的性質のセンサーは周知の微細加工技術によって作成することができる（ＥＥ  Ｔｅｘｔ  センサ・マイクロマシン工学、藤田博之編著、オーム社、２００５年を参照せよ。）。さらに、前記構造体及び／又は前記基材は細胞と接触するプリント配線による電極を設けて、前記構造体が前記基材と嵌合するときに外部から電気的に接続して電気刺激を行ったり電位を測定したりする場合がある。また、前記構造体及び／又は前記基材を貫通する細孔であって、細胞膜によって電気的にシールすることができるように細胞より小さな孔径を有する貫通孔を設けて、いわゆるオートパッチ法による電気生理学的な測定を行う場合がある。この場合には、前記構造体が前記基材と嵌合するとき、前記構造体に設けた貫通孔が基材に設けた貫通孔が連通するように配置される場合がある。かかるプリント配線及び貫通孔も周知の微細加工技術又はＭＥＭＳ技術によって作成することができる。【００８４】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００８５】
細胞培養
基質との接着性がある細胞として使用された細胞は、マウス繊維芽細胞株のＮＩＨ３Ｔ３細胞と、ヒト肝癌細胞株のＨｅｐＧ２である。両方の細胞とも、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｆ７５２４、ＳＩＧＭＡ）と、５％のＬ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇ１１４６、ＳＩＧＭＡ）とを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、１１８８５、Ｇｉｂｃｏ）を用いて３７°Ｃ、５％ＣＯ２雰囲気下で培養された。細胞は、コンフルエント状態に達すると、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｔ４０４９、ＳＩＧＭＡ）を用いて解離させて、１：５の割合で継代した。細胞の蛍光標識は、蛍光細胞リンカーキット（ＭＩＮＩ２６−１ＫＴ  ＰＫＨ２６赤色蛍光リンカー及びＭＩＮＩ６７−１ＫＴ  ＰＫＨ緑色蛍光リンカー）を用いて製造者の提供するプロトコールに従って実施した。蛍光顕微鏡観察には、蛍光フィルター（ダブルバンドフィルターＵ＝Ｍ５１００３Ｄ／ＴＲ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を装着した微分干渉顕微鏡を用いた。【００８６】
細胞の基質接着特性
細胞を本発明の器具に接触させる際に、細胞は、弾性基材の表面に比べて構造体の表面に選択的に接着することが望ましい。そこで、３Ｔ３細胞とＨｅｐＧ２細胞とについて、実施例の構造体の材料である加熱成長２酸化ケイ素の表面と、実施例の弾性基材の材料であるポリ−ジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）の表面とへの接着特性を検討した。両者とも、酸素プラズマ処理（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｅｔｃｈｅｒ  ＦＡ−１、Ｓａｍｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、５０Ｗ、１０ｍＬ／ｓ酸素、１分間）か、コラーゲン処理（１ｍＭ塩酸（関東化学）中の５％  コラーゲンＩ−Ｐ（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ、タイプＩ−Ｐ、新田ゼラチン）に３時間浸漬）か、未処理かの条件で実験を行った。【００８７】
表１に示すとおり、３Ｔ３細胞及びＨｅｐＧ２細胞の両方ともコラーゲン処理された２酸化ケイ素の表面には接着できたが、未処理のＰＤＭＳの表面には全く接着できなかった。そこで、以下の実施例では、構造体の細胞と接着する表面はコラーゲン処理された２酸化ケイ素を用い、弾性基材は未処理のＰＤＭＳを用いた。【００８８】
【表１】
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【実施例２】
【００８９】
本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具の加工
本発明の器具は以下のとおり作成された。ＳｉＯ２でできた構造体は微細加工技術により製造され、ＰＤＭＳの基材上に固定された。本発明の構造体の微細加工に用いた押印転写法は、特願２００７−１０８６７号明細書及びOnoe, H.ら、Journal of Micromechanics and Microengineering, 17: 1818-1827 (2007)に詳しく説明される。簡潔に説明すると、出発材料は、シリコン・オン・インシュレータ（ＳＯＩ）ウェーハ（デバイスケイ素層厚３μｍ、埋め込み酸化物（ＳｉＯ２）層厚２μｍ、基板ケイ素層厚４５０μｍ、信越化学）であった。前記埋め込み酸化物層を構造体の素材とした。デバイスケイ素層は、Ｓ１８０５フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ）をマスキング層として用いる誘導結合プラズマ−反応性イオンエッチング法（ＩＣＰ?ＲＩＥ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｒ、ＳＴＳ）によりエッチングされた。前記フォトレジスト層を除去した後、前記埋め込み酸化物層は、フッ酸（ＨＦ、５０％、ＳＴＥＬＬＡ  Ｃｈｅｍｉｆａ）によりエッチングされ、構造体の形状が形成された（図２（Ｂ））。本実施例の構造体は直径５０ないし７５μｍのサイズになるように設計された。【００９０】
ＳｉＯ２層上に残存したデバイスケイ素層は、ＩＣＰ?ＲＩＥ法により除去され、ＳｉＯ２層の下の基板ケイ素層は８０°Ｃの水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ、２２％、関東化学）で異方性エッチングされた。前記異方性エッチング反応は、基板ケイ素層からＳｉＯ２層が完全に分離する直前に停止された。構造体を支持するピラミッド状のケイ素構造が形成された（図２（Ｃ））。図３に示すとおり、本実施例の構造体は、前記ケイ素のピラミッド状構造の尖端の数平方μｍの狭い面積で支持されているので、前記尖端の支持部を破壊することによって、ウェーハの基板ケイ素層から前記構造体を分離することは容易である。前記構造体を分離する前に、細胞と構造体との接着を増強させるために、実施例１で説明したコラーゲンの塩酸溶液にウェーハ上の構造体を３時間浸漬した。【００９１】
その後前記構造体は、押印転写法を用いてＳＯＩウェーハから分離され、ＰＤＭＳの弾性基材の上に粘着力によって保持された。１ｍｍ厚のＰＤＭＳシートがウェーハ上の構造体の上に戴置され（図２（Ｄ））、剥離された（図２（Ｅ））。このようにして、前記構造体はその一部が外表に露出した状態で前記弾性基材の表面に保持された本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具が製造された。前記構造体の前記弾性基材への転写の効率は高く、約９０％の構造体がウェーハ上での配列パターンのまま前記弾性基材の表面に保持された（図２（Ｆ））。
【実施例３】
【００９２】
細胞が接着した構造体
細胞が構造体に選択的に接着していることを確認するために、約１ｘ１０５個／ｍＬの３Ｔ３細胞を懸濁した実施例１の培養液が実施例２の器具の表面に戴置された。本実施例の器具の構造体は直径５０μｍで、これは１個の３Ｔ３細胞が伸展した状態の寸法とほぼ同じである。【００９３】
図４は、ＰＤＭＳシートの弾性基材上にアレイ状に保持された構造体の表面で４日間培養された３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である。図４に示すとおり、３Ｔ３細胞はＳｉＯ２の構造体にのみ接着しており、ＰＤＭＳシートの弾性基材の上には細胞はいなかった。これは、コラーゲンでコーティングされたＳｉＯ２の構造体への細胞の選択的接着がうまく達成できたことを示す。細胞が接着した構造体は全ての構造体の約５０％であった。
【実施例４】
【００９４】
細胞が接着した構造体の取り扱い
細胞が接着した構造体は細胞培養の後で弾性基材から物理的に遊離された。牽引加工されたガラス管（尖端直径約１５０μｍ）をマイクロマニピュレータに装着し、図５（Ａ）に示すように前記構造体を水平方向に押して前記弾性基材から遊離させた。そして、前記ガラス管から培養液を吐出してその液流で前記構造体を前記弾性基材の上で移動させた。【００９５】
図６の連続写真は、ＰＤＭＳシートの弾性基材から遊離した後で、３Ｔ３細胞が接着した構造体が、ガラス管からの液流によって前記弾性基材の上を滑って移動する様子を示す。いったん弾性基材から遊離した前記構造体は、二度と弾性基材に粘着することはなかった。ガラス管の液流は、構造体を動かすのには十分な強さではあるが、該構造体から細胞を引きはがすほど強くはないので、細胞が接着した状態で前記構造体を液流によって移動させることができた。構造体を弾性基材から遊離し、移動させた後で、トリパンブルー（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）による染色を試みた。しかし細胞内に色素が侵入しなかったので、構造体の遊離及び移動の後も構造体に接着した細胞は生存していたことがわかった。液流によって構造体に接着した細胞を浮遊細胞と同様に取り扱うことができた。さらに、構造体に液流を吹きかけないときには、細胞が接着した構造体は弾性基材上で同じ位置に止まっていた。したがって本発明は、基質に接着した状態の細胞を自在に取り扱うことを可能にしたといえる。
【実施例５】
【００９６】
異なる細胞タイプの細胞の取扱い
本発明の器具及び方法は、異なる細胞タイプの細胞を取り扱うことができることを以下に示す。図７（Ａ）は、構造体の表面に凹陥部と凸出部とが設けられ、１個の構造体の表面の凹陥部が他の１個の構造体の表面の凸出部と相補的に嵌合することにより自己組織的に組み上がることができる構造体の概念図である。本実施例では、突出部を有する構造体の上に３Ｔ３細胞を接着させ、凹陥部を有する構造体の上にＨｅｐＧ２細胞を接着させた。本実施例の構造体は、凸出部及び凹陥部がなければ直径７５μｍとなるようなサイズで、非特異的な集合を防止するために棘状の小突起が構造体の周囲に設けた。突出部を有する構造体と、凹陥部を有する構造体とをそれぞれ別々の弾性基材の上に保持した器具を作成し、それぞれの器具に３Ｔ３細胞又はＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を戴置して４日間培養した（図７（Ｂ?１）から（Ｂ?４））。その後構造体は、弾性基材から遊離され、ガラス管からの液流を吹き付けることによってそれぞれの器具から１枚の５ｃｍ（２インチ）径培養ディッシュに移された。【００９７】
図７（Ｃ）及び（Ｄ）は培養ディッシュ上で２種類の構造体が共存している様子を示す。図７（Ｃ）では、３Ｔ３細胞が接着した構造体とＨｅｐＧ２細胞が接着した構造体との距離は約５００μｍであった。図７（Ｄ）では、３Ｔ３細胞が接着した構造体とＨｅｐＧ２細胞が接着した構造体との距離は約１００μｍであった。これらの結果から、本発明の器具及び方法は、異なる細胞タイプの細胞を単一細胞又は数個の細胞のレベルで取り扱うことを可能にしたといえる。
【実施例６】
【００９８】
図８は、本発明の別の微量の生物学的材料を取り扱うための器具の製造方法を示す模式図である。図８（ａ）ではポリパラキシリレンでできた本発明の構造体を戴置したガラス基板の作成の手順を示す。Ｓ１８１８フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ）の犠牲層（約３μｍ厚）をガラス基材の上に形成して（ａ１）、前記構造体との接触領域を露出させた。ここで前記接触領域は、前記構造体が容易にガラス基板から遊離できるように十分狭くした。つぎに、Ｌａｂｃｏａｔｅｒ  ＰＤＳ２０１０システム（Ｓｈｉｐｌｅｙ）を用いて、前記犠牲層の上にポリパラキシリレン層（約５μｍ厚）を形成した（ａ２）。さらに、アルミニウム（ａ３）とＳ１８１８（ａ４）とを積層し、Ｏ２プラズマ処理によるエッチングを行った（ａ５）。Ｏ２プラズマ処理エッチングは２５Ｗ、酸素１０ｍｌ／ｓ、１８分間の条件で行い、アルミニウムでマスキングされない部分のポリパラキシリレン及びＳ１８１８の層は完全に除去した。その後、アルミニウム層を除去した。この状態で露出したポリパラキシリレンの表面は疎水性であるが、もう一度Ｏ２プラズマ処理を行うことによって、Ｏ２プラズマに曝露された表面だけを親水性にした（ａ６）。ポリパラキシリレンのガラス基板に相対する表面と、ガラス基板と接触している表面とは、Ｏ２プラズマに曝露されなかったため、疎水性のままである。このようにして形成された構造体（直径約５０μｍ）に細胞を播種したところ（ａ７）、構造体の表面のうち、親水性の表面の部分に細胞が接着した（ａ８）。【００９９】
図８（ｂ）は前記構造体を疎水性相互作用によって保持する基材のの作成の手順を示す。ガラス基板上にクローム及び金を蒸着し（ｂ１）、Ｓ１８１８（ｂ２）を用いてクローム及び金の層が前記構造体と同じ寸法（直径約５０μｍ）となるようにエッチングを行った（ｂ３）。前記金の層にＯ２プラズマ処理を２５Ｗ、酸素１０ｍｌ／ｓ、１０秒間の条件で行い、エタノールでリンスし、窒素雰囲気下で乾燥させることによって、金表面に自己組織化単分子層（ＳＡＭ）が均一に形成出来るようにした。その後、１ｍＭ  １−オクタデカンチオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むエタノール溶液に前記金表面を３０分間浸漬し、エタノールで数回リンスして、金表面の疎水性処理を行った（ｂ４）。前記細胞用の培養液を満たした容器の液面をシリコーンゴムのシートで包囲して、その内側にスクアレンを重層した。図８（ｂ４）の疎水性処理を施した基材を前記スクアレンが重層された液面から前記培養液中にゆっくりと（毎秒約１ｃｍ）沈めると、前記疎水性処理された金表面だけにスクアレンの油滴が捕捉された（ｂ５）。図８（ａ９）のようにピペッティングによる水流でガラス基板から遊離させた細胞の付着した構造体を前記スクアレンを捕捉した基材の入った培養液に移すと、前記構造体の疎水性表面が前記スクアレン油滴と接触して付着する（ｂ６）。このようにして、前記細胞が付着した構造体を予め定めた配置パターンにしたがって前記基材の上に戴置することができた。スクアレン油滴を介して戴置された前記構造体は、前記基材の上に安定に保持された。
【実施例７】
【０１００】
図９は、本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具を用いて、細胞と構造体とからなる集合体を作成する実施例の実験結果を示す顕微鏡写真である。本発明に用いる器具は以下のとおりの手順で作成された。ガラス基板に２％ゼラチン水溶液を２００ｒｐｍでスピンコーティングし、その上にポリパラキシリレン層を形成し、アルミニウムでマスキングしてＯ２プラズマ処理し、マスキングされないポリパラキシリレン及びゼラチン層を除去した。その後、親水性のリン脂質ポリマー（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、以下、「ＭＰＣポリマー」という。）をスピンコーティングし、テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＮＭＤ−３、東京応化社製）を用いてアルミニウムマスクを除去し、アルミニウム層の上のＭＰＣポリマーをリフトオフ法で除去した。ここでは、前記ポリパラキシリレン層は正５角形で、互いに近接して配置される。図９−Ａでは、前記構造体の上に３Ｔ３細胞を播種して１日後の顕微鏡写真である。前記構造体は基材の上にあって、平面状に展開している。ここで前記基材をガラス管で突いてやると、図９−Ｂ（位相差顕微鏡写真）及び図９−Ｃ（明視野顕微鏡写真）に示すとおり、前記構造体が前記細胞に引き寄せられて起き上がり、前記細胞を取り囲む集合体を形成する。このように、本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具を用いると、細胞を人工的な構造体で取り囲んだ凸多面体状の集合体を細胞に形成させることができる。また、サイズの異なる複数の集合体が入れ子になるように含まれる集合体を形成することもできる。
【実施例８】
【０１０１】
図１０は、本発明の微量の生物学的材料を取り扱うための器具のさらなる実施例を示す。図１０（Ａ）の構造体は、細胞２が戴置した構造体１には、円柱状の微小な磁石４が埋め込まれており、構造体１には貫通孔４が設けられている。図１０（Ｂ）では、細胞２が戴置した構造体１が基材５に嵌合している。基材５の表面には導電体の配線６がプリントされており、細胞の一部に電圧を印加して刺激することができる。図１０（Ｂ）では、構造体１が基材５に嵌合した後、基材５の表面に細胞２が偽足を伸ばし、その一部がプリント配線６に触れている様子を示す。また基材５には貫通孔７が構造体１の貫通孔４と液体連通するように設けられている。これにより、構造体１に付着した状態の細胞２についてパッチクランプ法による電気生理学的測定を行うことができる。なお、微小な磁石４を用いて基材５の上に戴置した状態で構造体１の配置及び／又は配向を変化させることができる。図１０（Ｂ）では、構造体１にはプリント配線が含まれないが、構造体の表面にもプリント配線が設けられ、基材と構造体とが嵌合するとき、基材のプリント配線と構造体のプリント配線とが電気的に接続される実施例も本発明に含まれる。前記構造体表面のプリント配線は、細胞が接着する表面で細胞の特定の部位に触れるように配置される場合がある。かかるプリント配線は、細胞が接着する表面の一部にだけ細胞が接着できるような処理を施すこと、及び／又は、前記表面の別の一部に細胞が接着しにくい処理、例えば、疎水性処理を施すことと組み合わせることによって実現される場合がある。図１０には、磁石、貫通孔、プリント配線が全て含まれる実施例が示されるが、これらの素子その他のセンサー又はアクテュエーターが少なくとも１つか、あるいは、これらのいずれかの組み合わせかで含まれる構造体及び／又は基材も本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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