(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液のｐＨによって分解と結合が起こる性質を持つタンパク質を用いて金属ナノ粒子を選択的に配置する方法であって、
前記タンパク質の第１末端が第１無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾され、第２末端が第２無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾される修飾工程と、
溶液のｐＨを調製して前記タンパク質を分解し、金属ナノ粒子と、前記タンパク質とを、前記第１無機材料結合性ペプチドユニットまたは前記第２無機材料結合性ペプチドユニットのいずれかを介して結合する金属ナノ粒子結合工程と、
溶液のｐＨを調製して前記タンパク質を結合し、前記金属ナノ粒子結合工程によって形成したタンパク質結合金属ナノ粒子と、基板上に存在する無機材料とを、金属ナノ粒子に結合していない無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合する無機材料結合工程とを含む
金属ナノ粒子の選択的配置方法。
【請求項２】
溶液のｐＨによって分解と結合が起こる性質を持つタンパク質を用いて金属ナノ粒子を選択的に配置する方法であって、
前記タンパク質が内部中空を有する多量体タンパク質を形成するタンパク質であって、多量体タンパク質を形成した際に、内部中空に位置する末端が第１無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾され、多量体タンパク質の外側に位置する末端が第２無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾される修飾工程と、
溶液のｐＨを調製して前記タンパク質を分解し、金属ナノ粒子と、複数の前記タンパク質とが前記第１無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合する金属ナノ粒子結合工程と、
溶液のｐＨを調製して前記タンパク質を結合し、複数の無機材料結合性タンパク質が前記金属ナノ粒子を内包する金属ナノ粒子内包工程と、
前記金属ナノ粒子内包工程によって形成した前記タンパク質に内包された金属ナノ粒子と、基板上に存在する無機材料とを、前記第２無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合する無機材料結合工程とを含む金属ナノ粒子の選択的配置方法。
【請求項３】
溶液のｐＨによって分解と結合が起こる性質を持ち、かつ、内部中空を有する多量体タンパク質を形成するフェリチンにおいて、
内部中空に位置するＣ末端に第１無機材料結合性ペプチドユニットが修飾され、
外側に位置するＮ末端に第２無機材料結合性ペプチドユニットが修飾されたことを特徴とする無機材料結合性タンパク質。
【請求項４】
前記第１無機材料結合性ペプチドユニットに結合する無機材料が金属ナノ粒子であり、
前記フェリチンが溶液のｐＨによってフェリチンモノマーに分解され、該フェリチンモノマーが溶液中で前記金属ナノ粒子と結合し、溶液のｐＨによって金属ナノ粒子を包含した多量体タンパク質を形成し得ることを特徴とする請求項３に記載の無機材料結合性タンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載の無機材料結合性タンパク質が形成するタンパク質に前記第１無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合した前記金属ナノ粒子が、
前記第２無機材料結合性ペプチドユニットを介して、基板上に存在する前記第２無機材料結合性ペプチドユニットに結合可能な無機材料表面上に所定間隔で存在することを特徴とするプラズモン素子。
【請求項６】
請求項５に記載のプラズモン素子において、
前記第１無機材料結合性ペプチドユニットに結合する前記金属ナノ粒子がＡｕ、
前記第２無機材料結合性ペプチドユニットに結合する無機材料がＴｉ、ＳｉまたはＡｇのいずれかであることを特徴とするプラズモン素子。
【請求項７】
請求項５に記載のプラズモン素子において、
前記第１無機材料結合性ペプチドユニットに結合する前記金属ナノ粒子がＡｕであり、前記第２無機材料結合性ペプチドユニットに結合する無機材料が基板上に存在する無機材料であり、
前記Ａｕが非対称性形状を有することを特徴とするプラズモン素子。
【請求項８】
請求項５に記載のプラズモン素子において、
前記第１無機材料結合性ペプチドユニットに結合する前記金属ナノ粒子がＡｕであり、前記第２無機材料結合性ペプチドユニットに結合する無機材料が基板上に存在する無機材料であり、
前記Ａｕの形状がロッド状、リング状、または直方体状であることを特徴とするプラズモン素子。
【請求項９】
請求項６から８のいずれかに記載のプラズモン素子において、プラズモンとカップルしたラマン分光を行うことを特徴とするプラズモン素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、ナノスケールで様々な形状をもつナノ粒子を、無機材料基板などに位置選択的に固定することを目的とする手法に関するものである。更に、本手法に用いるタンパク質および、本手法によって作製されるプラズモン素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体を中心とするエレクトロニクス、オプトエレクトロニクス、メカトロニクス、医療など様々な分野においてナノスケール材料の必要性がますます高まっている。特に、半導体エレクトロニクスにおいては、素子の微細化によって、高機能、高性能、低消費電力化などが実現されてきた。このような進歩に対し、従来の微細加工（トップダウン）技術は、技術障壁や経済障壁に阻まれ、大きな困難に遭遇している。一方、自己組織化機能を有するナノスケール材料を利用するボトムアップ手法は、微細加工技術が直面する課題の有力な解決策として注目されている。
【０００３】
ナノスケールの材料、例えば半導体ナノ粒子や金属ナノ粒子は、その量子効果によって、用いられる素子に新たな機能をもたらしてきた。ここでナノスケールの材料とは、数nmから数百nmの範囲の大きさの材料をいう。例えば、ナノ粒子をもちいたフローティングゲートメモリは、用いない場合の構造に対し、信頼性が向上することはよく知られている。従って、シリコンナノ粒子や金属ナノ粒子を用いたフローティングメモリ（不揮発性メモリ）は、次世代のメモリとして有望と見られている。このようなメモリの報告例として、非特許文献１および非特許文献２などが挙げられる。ナノ粒子を形成する方法は、これまで、化学的な方法、物理的な方法など数多くの提案がなされている。
【０００４】
また、ナノスケール材料の他の応用事例として、金属のナノ粒子を用いたプラズモン素子がある。金属表面には、ある波長の光に対し、プラズモン効果（プラズマ振動現象）によって光との共鳴現象によって光を狭い領域に閉じ込めることが可能でなる。また、ラマン分光を行うことにより、表面状態の変化を敏感に検知することが可能となり、センサ応用が期待されている。その金属ナノ粒子の形状をナノドットやナノロッドにすることにより、感度が飛躍的に増強するために、大きな関心が寄せられている。
【０００５】
特許文献1には、フェリチンの選択的配置方法として、複数の無機材料からなる基板上に、フェリチンと界面活性剤を用いてフェリチンを基板上の所定箇所に選択的に配置する方法が提案されている。その配置方法は、フェリチンのＮ末端を所定の極性電荷アミノ基で修飾することによりフェリチンの化学的特性を変化させ、基板上の無機材料に対する吸着力をコントロールするものである。
【０００６】
特許文献２には、基質ペプチドと分散媒に相溶する部位からなる有機物を吸着した金ナノロッドおよび当該金ナノロッドの特定部位への集積方法が提案されている。その集積方法は、金ナノロッドを修飾している有機物の分解を利用したものであり、酵素によって基質ペプチドが分解され、分散媒へ相溶する部位が金ナノロッドから脱離して、金ナノロッドが凝集し、特定酵素が存在する部位へ集積するものである。
【０００７】
【非特許文献１】A.Miura et al., J.Appl.Phys., 103, 7, 074503 (2008)
【非特許文献２】A.Miura et al., Nanotechnology, 20, 125702 (2009)
【特許文献１】ＷＯ２００６／６４６４０
【特許文献２】特開２０１０−７１６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ナノスケール材料を活用するためにナノ粒子を形成する方法は、これまで化学的な方法、物理的な方法など種々の提案がなされている。しかし、ナノ粒子は形成できても、それを必要な場所に配置する方法については、決定的な方法が確立されていないという問題がある。半導体基板上に素子を作製する場合、いうまでもなく素子以外の箇所には、ナノ粒子は必要ではなく、必要でない箇所に存在するナノ粒子は却って、他の機能の低下を招くことになる。従って、必要な部分にのみ選択的に配置する方法が非常に強く望まれてきた。また、プラズモン素子をセンサへ応用する際にも、金属のナノ粒子を基板上に密度を制御しながら選択的に配置する方法はなく、問題となっている。
【０００９】
特許文献１の配置方法において、フェリチンが内包する金属は、フェリチンがその性質固有に内包可能な金属に限られるため、フェリチンに内包させて基板上に配置する金属を自由に選択することができないという問題がある。
【００１０】
特許文献２の集積方法は、酵素の存在する箇所へ金ナノロッドを集積させるものであって、金属ナノ粒子が凝集してしまうため所定部位への整列配置が達成できないという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、タンパク質の２つの末端が、異なる無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾された無機材料結合性タンパク質を用いた金属ナノ粒子の選択的配置方法を提供するものである。その方法は、少なくとも、基板上に配置される金属ナノ粒子、基板上に存在する無機材料、および金属ナノ粒子と基板上に存在する無機材料を結合可能な無機材料結合性タンパク質を用いる。この無機材料結合性タンパク質は、タンパク質の一方の末端が無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾され、他方の末端が一方の末端を修飾するものとは異なる無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾されている。そして、そのいずれか一方の無機材料結合性ペプチドユニットは金属ナノ粒子に結合するものである。
【００１２】
本発明の選択的配置方法は、（１）金属ナノ粒子と、無機材料結合性タンパク質とを、タンパク質を修飾する一方の無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合する工程、（２）基板上に存在する無機材料と、工程（１）によって形成したタンパク質結合金属ナノ粒子とを、金属ナノ粒子に結合していないほうの無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合する工程、の少なくとも二つの工程を含む。
【００１３】
更に、本発明の選択的配置方法においては、用いるタンパク質を、内部中空を有する多量体タンパク質を形成するタンパク質（単量体）としてもよい。この場合、タンパク質（単量体）によって形成される多量体タンパク質の内部中空側に位置する末端が第１無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾され、多量体タンパク質の外側に位置する末端が第２無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾された無機材料結合性タンパク質を用いる。
【００１４】
配置方法は少なくとも、（１）金属ナノ粒子と、複数の無機材料結合性タンパク質とが第１無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合する工程と、（２）複数の無機材料結合性タンパク質が金属ナノ粒子を内包する工程と、（３）工程（１）および工程（２）によって形成した無機材料結合性タンパク質に内包された金属ナノ粒子を、第２無機材料結合性ペプチドユニットを介して基板上に存在する第２無機材料に結合する工程とを含む。なお、工程（１）および工程（２）は、順次進行してもよく、また同時に進行してもよい。
【００１５】
本発明の無機材料結合性タンパク質を用いて、基板上に金属ナノ粒子の選択的配置を行うことで、基板上の無機材料表面に、無機材料結合性タンパク質を介して、金属ナノ粒子を配置したプラズモン素子を作製することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の金属ナノ粒子の選択的配置方法は、金属ナノ粒子を、基板上に存在する無機材料上に選択的に配置することができるため、基板上におけるナノ粒子を用いた素子作成の位置制御を高精度に行うことができる。また、本発明の無機材料結合性タンパク質によれば、所望の金属を、本発明の方法に適用することができるので、半導体素子、プラズモン素子をはじめ、種々の金属ナノ粒子を用いた高性能デバイスの作製を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施の形態を示す模式図
【図２】本発明のタンパク質単量体の一例を示す図
【図３】本発明のフェリチンタンパク質の精製度を示す図
【図４】本発明のフェリチンタンパク質（ＦＧ、ＴＦＧ）のＴＥＭ観察写真
【図５】本発明のフェリチンタンパク質のｐＨ変化に伴うＨＰＬＣチャート
【図６】本発明の金ナノ粒子内包フェリチンタンパク質を含有する溶液の観察写真
【図７】本発明の金ナノ粒子内包フェリチンタンパク質のＴＥＭ観察写真
【図８】本発明の金ナノ粒子とフェリチンタンパク質単量体との結合割合の計算結果
【図９】本発明のシリコン基板上の金ナノ粒子内包フェリチンのＳＥＭ観察写真
【図１０】本発明のフェリチンタンパク質による金属内包プロセスの模式図
【図１１】本発明のシリコン基板上の金ナノ粒子内包フェリチンのＳＥＭ観察写真
【図１２】本発明の実施の形態を示す模式図
【図１３】（ａ）本発明のフェリチンタンパク質に内包された金ナノ粒子の消光特性を示す吸収スペクトル図、（ｂ）本発明のフェリチンに内包された金ナノ粒子のＳＥＭ観察写真
【図１４】本発明による界面活性剤を用いた場合の選択配置を示すＳＥＭ観察写真
【図１５】（ａ）本発明のフェリチンに内包された金ナノ粒子のＡＦＭ観察写真、（ｂ）本発明のフェリチンに内包された金ナノ粒子のプラズモン特性を示す消光特性スペクトル図
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の金属ナノ粒子は、無機材料結合性タンパク質を介して基板上に配置される。その金属ナノ粒子の大きさは、最長部分が数nmから数百nmの範囲の大きさであればよく、特にプラズモン素子に用いる場合には、平均粒径が10nmから100nmの範囲であることが望ましい。金属ナノ粒子の形状は、特に限られるものではなく、球状のような対称形状、円柱状、直方体状、ロッド状、リング状などの非対称形状が挙げられる。金属ナノ粒子は、無機材料結合性ペプチドユニットにより結合可能な金属元素であればいずれでもよいが、特に、Ａｕとした場合は、高感度のプラズモン素子などへ適用することができる。
【００１９】
本発明の金属ナノ粒子が配置される基板は、材質はいずれでもよいが、無機材料結合性タンパク質によって結合される無機材料が表面に存在する必要がある。基板上の無機材料は、基板材料そのものであってもよく、基板材料とは異なる無機材料を基板上に形成したものであってもよい。基板上への無機材料の形成方法は特に限られるものではない。基板上の無機材料は、無機材料結合性ぺプチドユニットにより結合可能な無機材料元素であればいずれでもよく、Ｔｉ、ＳｉまたはＡｇなどが好ましい。
【００２０】
本発明の無機材料結合性タンパク質は、タンパク質の末端が異なる無機材料結合性ペプチドユニットによって修飾されている。無機材料結合性ペプチドユニットによる修飾は、タンパク質の末端に無機材料結合性ペプチドユニットが直接結合していてもよく、またリンカーを介して結合していてもよい。リンカーは特に限定されず、その種類や鎖長はタンパク質と金属結合性ペプチドユニットの特性に合わせて適宜選択することができる。更には、無機材料結合性ペプチドユニットが修飾する部位は、タンパク質の最末端に限られず、末端付近の官能基を修飾してもよい。
【００２１】
本発明の無機材料結合性タンパク質を修飾する無機材料結合性ペプチドユニットは、タンパク質の一方の末端（第１末端）と他方の末端（第２末端）とを修飾する。一方の末端を修飾する無機材料結合性ペプチドユニットと他方の末端を修飾する無機材料結合性ペプチドユニットは、異なる無機材料を認識する金属結合性ペプチドユニットである必要がある。また、一方の末端を修飾する無機材料結合性ペプチドユニットは、本発明の方法により選択配置する金属ナノ粒子を結合する性質を有し、他方の末端を修飾する無機材料結合性ペプチドユニットは基板上の無機材料と結合する性質を有することが必要である。金属ナノ粒子に無機材料結合性ペプチドユニットを介して、複数の無機材料結合性タンパク質が結合し、金属ナノ粒子の表面を覆うことで、金属ナノ粒子は、無機材料結合性タンパク質によって内包された状態となる。
【００２２】
本発明の内部中空を有する多量体タンパク質として、フェリチンに代表される球状タンパク質が挙げられる。フェリチンは、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質である。このような多量体タンパク質への無機材料結合性ペプチドユニットの修飾は、多量体タンパク質の内部中空に面するＣ末端に本発明の選択的配列の対象である金属ナノ粒子に結合する無機材料結合性ペプチドユニットにより修飾し、多量体タンパク質の外側に面するＮ末端に本発明の選択的配列を行う基板上の無機材料に結合する無機材料結合性ペプチドユニットにより修飾することが好ましい。これにより、タンパク質（単量体）が多量体タンパク質を構成するための結合と、金属ナノ粒子に結合する無機材料結合性ペプチドユニットの結合との両方の作用によって、タンパク質による金属ナノ粒子の内包が達成される。
【００２３】
なお、前記内部中空を有する多量体タンパク質を構成するタンパク質(単量体)を無機材料結合性ペプチドユニットで修飾するに当たり、前記の修飾とは逆に、Ｎ末端を選択的配列の対象である金属ナノ粒子に結合する無機材料結合性ペプチドユニットにより修飾し、Ｃ末端を基板上の無機材料に結合する無機材料結合性ペプチドユニットにより修飾してもよい。この場合、金属ナノ粒子と無機材料結合性ペプチドユニットとの結合の作用によって、タンパク質による金属ナノ粒子の内包が達成される。
【００２４】
１または複数の無機材料結合性タンパク質が結合した金属ナノ粒子は、無機材料が存在する基板上に接することで、金属ナノ粒子に結合していない無機材料結合性ペプチドユニットを介して、基板上の無機材料に結合することによって、基板上に配置される。基板上に存在する無機材料の量、位置を制御することで、金属ナノ粒子の配置を制御することができる。更には、無機材料結合性タンパク質が結合した金属ナノ粒子が基板表面に接する際に、基板上の無機材料を認識する任意の無機材料結合性タンパク質を同時に存在させることでも、金属ナノ粒子の配置密度を制御することができる。
【００２５】
本発明のプラズモン素子は、前記無機材料結合性タンパク質を用いて、基板上に存在する無機材料と、無機材料結合性タンパク質とを、無機材料結合性ペプチドユニットを介して結合し、更に、その無機材料結合性タンパク質と、金属ナノ粒子とを、無機材料結合性タンパク質の他方の無機材料結合性ペプチドユニットを介して、結合することによって作製される、基板上に金属ナノ粒子が配列したプラズモン素子である。無機材料結合性タンパク質は、プラズモン素子として利用するために、基板上に存在していてもよいが、存在していなくてもよい。プラズモン素子上の無機材料結合性タンパク質を除去する方法は、特に限定されないが、ＵＶオゾン処理、熱処理、薬剤処理などによって除去することができる。
【００２６】
本発明の無機材料結合性ペプチドユニットの選定については、近年、特定の無機材料を認識するペプチドアプタマーを見つける方法が提案され、現在では非常に多くの種類のペプチドが報告されている。ここで、複数のアミノ酸が組み合わされてできたものをペプチドという。特にファージディスプレイを使って、短時間で効率的に見つける手法は進化分子工学とよばれ、盛んに研究されている。このような無機材料を認識するペプチドをタンパク質に修飾することで、タンパク質全体を無機材料に固定化することが可能となる。本発明では、特に、複数の種類の異なるペプチドをタンパク質の異なる位置に修飾することにより、ある特定の無機材料を内包しながら、他の無機材料に固定することが可能となる。
【実施例１】
【００２７】
本発明にかかる実施例１を説明する。ここでは、２４量体のモノマーからなるフェリチンと呼ばれるタンパク質を用いた。このタンパク質は、溶液のｐＨによって、分解と結合が起こる性質を持っている。酸性では、分解が起こり、アルカリ性では結合が起こる。フェリチンの単量体のＣ末端に金を認識するペプチドを結合して修飾し、Ｎ末端にチタンを認識するペプチドを結合して修飾したものを用いることにより、金のナノ粒子を半導体基板上のチタンに吸着することを試みた。
【００２８】
第１図に示すように、前記修飾済みのフェリチンを酸性溶液の中で、サブユニットモノマーに分解し、溶液中に金のナノドットを加える。これにより、前記修飾済みのフェリチンモノマーのＣ末端に結合した金認識ペプチドの作用によってフェリチンモノマーは溶液中の金ナノドットを結合する。その後、溶液のｐＨをアルカリ性に変化させることによって、金を認識するペプチドの作用によって、金のナノドットを内包したタンパク質の多量体に変化する。一方のＮ末端に修飾したチタンを認識するペプチドによって、そのタンパク質の外側には、チタンを認識する機能を有している。従って、この金のナノドットを内包したフェリチンタンパク質（多量体）溶液を半導体基板上にパターニングされたチタンに塗布することで、選択的に配置が可能となる。タンパク質はＵＶオゾン処理や酸素雰囲気中の熱処理によって除去することができ、半導体基板上に金のナノ粒子を固定することが可能となる。
【００２９】
この発明を実証するために行った実験について順を追って説明する。第２図に示すように、金ナノ粒子を内包・デリバリ（配置）するため、無機材料結合性ペプチドユニットにより修飾した２種類のフェリチン変異体を作製した。一つは、フェリチンの内側にあるＣ末端に金結合ペプチド（以下「GBP）という。）を挿入したもので（以下「FG」という。）、もう一つは、Ｃ末端にGBPを挿入した上、さらに外側にあるＮ末端にシリコンに結合能力を持つチタン結合ペプチド（以下「TBP」という。）を挿入したもの（以下「TFG」という。）である。フェリチンモノマーのＮ末端八残基削除したFer8を親プラスミドとして、このように、遺伝子改変フェリチン発現プラスミドを作製し、大腸菌Noba-blueで大量発現させた。
【００３０】
大量発現したタンパク質を熱処理、インイオン交換カラム、ゲルろ過にて精製した。第３図に示すようにその精製度は、SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にて確認した。さらに、MS-TOF（飛行時間型質量分析装置）にて測定したところ、FGやTFGの分子量は、予想値とほぼ一致した。なお、FGの分子量は20808.4、TFGの分子量は21662.4である。よって、目的タンパク質FGとTFGは、作製できたと考えられる。FGとTFGのTEM観察結果を第４図に示す。FGとTFGは、フェリチンに特徴的な球状構造をとり、 挿入したGBPとTBPは、立体構造に影響しないことが確認される。
【００３１】
次に、FGとTFGのｐＨ調整による構造変化をHPLC（高速液体クロマトグラフィー）にて調べた結果を第５図に示す。実線は、タンパク質溶液のｐＨが８の場合の溶出カーブを示す。点線は、タンパク質溶液のｐＨが２の場合の溶出カーブを示す。Fer8と同様に、FGもTFGもｐＨを８から２に下げると、分解が起こり、サブユニットダイマーとなり、HPLCでは遅れて溶出される。ここでは示していないが、三者とも分解した後、もう一度ｐＨを８付近に調整すると、サブユニットモノマーが２４量体のフェリチンを再構成することを確認した。
【００３２】
次に、各フェリチンを用いて金ナノ粒子（以下「GNPs」という。）の内包を行った。Fer8、FG、TFG含有溶液のｐＨを２に調整し、分解した後、予めｐＨを８．５に調整してあった金ナノ粒子溶液と混合し、各フェリチンの再構成させるとともに、金ナノ粒子を内包させた。１２時間反応した混合液をショ糖密度勾配遠心した。第６図で示したように、溶液の下層には、赤色のタンパク質にコートされた金ナノ粒子が観察された。各サンプルをTEMで観察した結果を第７図に示す。ただの金ナノ粒子と比べ、Fer8で内包を行う場合、金ナノ粒子の周りに、薄く白い層が観察されている。それに比べ、FGまたはTFGの場合、金ナノ粒子の周りに、完全な白いタンパク質層ができ、タンパク質に効率よく内包されているのが確認される。
【００３３】
溶液中の金ナノ粒子の濃度とタンパク質濃度を測定算出し、一つの金ナノ粒子につき、いくつのフェリチンサブユニットモノマーが結合しているのを計算した結果を第８図に示す。その結果 fer8、FG、TFGはそれぞれ、６、３２、３１となった。Fer8より、変異体フェリチンの方は、明らかに金ナノ粒子へ結合力が強く、その変化は、Ｃ末端のGBP修飾によるものだと考えられる。
【００３４】
フェリチンタンパク質による金ナノ粒子の内包プロセスについて第１０図に示す。まず、ｐＨ調整によるフェリチンの分解後、サブユニットモノマーは、金ナノ粒子の表面に結合し、一層目のタンパク質層を形成する。そのとき、サブユニットモノマーの間に、すき間ができ、そこにほかのサブユニットモノマーがＣ末端を差し込み、二層目の層を形成する。このため、前記のように、金ナノ粒子を内包するフェリチンは、通常のフェリチンが２４量体で構成されるにもかかわらず、２４を超えるモノマーによって構成されている。その結果、内部のアミノ酸配列が溶液に暴露し、それがFGのシリコン表面吸着に寄与すると考えられる。
【００３５】
金ナノ粒子および、変異体フェリチンにコートされた金ナノ粒子を親水化処理したシリコン表面に滴下し、その後、純水洗浄行い、SEM観察を行った結果を第９図に示す。図で示したように、外表面修飾してない金ナノ粒子は、シリコン上に吸着せず、一方、変異体フェリチンにて内包した金ナノ粒子はシリコン表面に吸着している。よって、コーティングにより、金ナノ粒子はシリコンに吸着できる特性を得たと結論できる。なお、外表面にシリコン結合ペプチドを修飾していないFG/GNPsもシリコン表面に吸着することが観察された。
【００３６】
そこで、洗浄液に界面活性剤（Tween20：東京化成工業株式会社製ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を添加し、フェリチンタンパク質に内包された金ナノ粒子の溶液を基板上に滴下した後、前記界面活性剤含有洗浄液により洗浄を行った。この洗浄液の界面活性剤の濃度は、0.1 wt%である。純水洗浄の場合、FGまたはTFGにて内包した金ナノ粒子はシリコン表面に吸着しているが、洗浄液中に低濃度の界面活性剤があるとき、FGにて内包した金ナノ粒子は、シリコン表面に吸着できなくなった。一方、第１１図に示すように、TFGにて内包した金ナノ粒子は、シリコン表面への吸着が観察された。 FGで内包した金ナノ粒子より、TFGで内包した金ナノ粒子は強くシリコン表面に強く結合し、それはTFGの外表面にあるTBPの働きだと考えられる。
【００３７】
以上示したように、遺伝子改変したフェリチンにて金ナノ粒子を内包することができ、さらにシリコン表面へデリバリすることに成功した。第１２図に示すように内部および外表面修飾のペプチドは、活性を示し、金属ナノ粒子の種類によって、修飾ペプチドを選択すれば、様々な金属ナノ粒子の内包および選択配置に応用できる。
【実施例２】
【００３８】
次に本発明による金ナノ粒子のプラズモン応用についての実施例２を説明する。プラズモン効果をより発揮するには、金ナノ粒子（金ナノドット）の直径は最低10nmが必要であることが知られている。そこで粒径15nmの金ナノ粒子を用いた。この金ナノ粒子の消光特性を第１３図（ａ）に示す。この金ナノ粒子による急峻な信号ピークを520nmに確認することができる。実施例１で述べた方法によって、フェリチンに内包した金ナノ粒子のTEM観察写真を第１３図（ｂ）に示し、また、このプラズモンの信号ピークを第１３図（ａ）に示した。また、表面プラズモンの共鳴によって、やや長波長側にシフトしている。これは、金属の表面に付着したタンパクによって、まわりの媒質の屈折率が局所的に変化したことを意味している。また、第１３図（ｂ）によれば、金ナノ粒子の周りをタンパク質がきれいに囲っていることが確認できる。この膜の厚みは第１３図（ｂ）により2nm程度であると計算されるが、これはフェリチンのサブユニットモノマーの厚みに対応している。球の形状は維持されており、15nmの金ナノ粒子がそれぞれの構造において、中心に位置していることが確認できる。
【００３９】
次に基板上に配置された金ナノドットの光学特性を評価するために、基板配置を検討した。Ｔｉを認識するチタン認識ペプチドは、Ｔｉ、Ｓｉ、Ａｇに強い結合能力を示すが、一方で、Ａｕ、Ｃｒ、Ｐｔ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅは認識しない。さらに、メカニズムは不明だが、界面活性剤Tween20は、Ｔｉへの認識能力を促進することがわかっている。
【００４０】
2nmのＴｉを熱酸化されたＳｉ基板の上に堆積し、フォトリソグラフィーとリフトオフプロセスによってパターニングした。基板洗浄のために、ＵＶオゾン処理を行ったところ、Ｔｉ表面も酸化され、ＴｉＯ２に変化している。この基板上に実施例1の方法により金内包フェリチンを配置したところ、SEM観測によって以下のことが明らかになった。SEM観察写真を第１４図に示す。ペプチド修飾していない金ナノ粒子は、Ｓｉ表面にもＴｉ表面にも吸着されず、ペプチド修飾した金ナノ粒子は、どちらにも吸着した。しかし、面活性剤Tween20を用いることで、第１４図（ａ）に示すように、金内包フェリチンはTi表面にのみ、選択的に吸着されている。さらに、第１４図（ｂ）に示すように、400nmの間隔で、直径20nmのＴｉ島にもきれいに選択吸着されている。
【００４１】
第１５図（ａ）に示すようにガラス基板の上に１nmの厚みで、面積5×5mm2のＴｉを形成し、ペプチド修飾した金ナノ粒子を高い密度で配置した。第１５図（ｂ）にAFMによる観測結果を示す。ペプチド修飾した金ナノ粒子は、高密度でランダムに配置されていることが確認できた。密度は1011particles/cm2である。AFM観測結果の断面プロファイルから、金ナノ粒子は粒径25nmであり、金ナノ粒子をサブユニットモノマーでカバーした場合の直径に対応している。
【００４２】
形成された金ナノ粒子のプラズモン特性を評価した。第１５図（ｃ）に示すように、525nmの位置に急峻な消光のピークが現れている。一般的に、結合したプラズモンの強さは粒子の半径の６乗に比例し、粒子間距離の６乗に反比例することがわかっている。これらの結果は、粒子が密に詰まっており、それぞれの粒子が孤立化していることを示している。参照用として、ペプチド修飾していない粒子をＴｉ上に堆積した場合、それぞれの粒子は凝集し、消光特性のピークがブロードになった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の選択的配置方法によれば、金属を所望の箇所に整列配置することができ、金属ナノ粒子の活用の場面をさらに拡大することが可能である。金属ナノ粒子の整列配置方法は半導体素子、センサ素子、液晶素子など素子作製をはじめ各種の分野に適用することができる。また、本発明のタンパク質単量体、プラズモンセンサ素子によれば、高感度の表面プラズモンセンサを作製することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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