(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化酵素を有し、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトース、スクロースについて、小腸において消化される消化性糖質と、小腸において消化されない難消化性糖質とに区別して定量する糖質定量キットであって、
前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備え、
前記低分子糖質消化酵素は、切除して得られた動物小腸の上部を破砕し、遠心分離して得られた沈殿物を懸濁した小腸粘膜刷子縁の懸濁液からなる
ことを特徴とする糖質定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子糖質消化酵素を用いた糖質定量方法、および低分子糖質消化酵素を備えた糖質定量キットに関するものである。より具体的には、本発明は、動物由来の低分子糖類消化酵素を用いたオリゴ糖（消化性オリゴ糖、難消化性オリゴ糖）の定量方法、および動物由来の低分子糖類消化酵素を備えたオリゴ糖（消化性オリゴ糖、難消化性オリゴ糖）の定量キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、国民の健康志向が高まり、砂糖とは異なった生理作用を有する甘味糖質であるオリゴ糖の開発が盛んである。オリゴ糖とは、その重合した構成糖の数が概ね２個以上１０個未満のものをいい、消化酵素によって消化されるもの（消化性オリゴ糖）と、消化されないものあるいは極めて消化されにくいもの（難消化性オリゴ糖）等がある。すでに開発されている健康に対する付加価値を有するオリゴ糖は、多くのものが消化酵素で消化されないものか、あるいは極めて消化されにくい難消化性ものものである。【０００３】
難消化性オリゴ糖は、特定保健用食品などの健康志向食品に使用されているが、これらの難消化性オリゴ糖は、ショ糖やデンプンなどの消化性糖質とは異なる経路で代謝される。経口摂取された難消化性オリゴ糖は、α−アミラーゼや小腸粘膜二糖類水解酵素による消化を免れて大腸に到達する。そこで常在の腸内細菌による発酵を受け、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸などの短鎖脂肪酸の他、炭酸ガス、水素ガス、メタンガス、菌体成分等に代謝される。このうち、短鎖脂肪酸は大腸から吸収されて宿主の唯一のエネルギー源として利用される。つまり、消化・吸収されない糖質であっても、大腸で発酵・吸収されることで生体にエネルギーを供給している。【０００４】
現在、特定保健用食品は、７４１品目認可されているが、そのうち難消化性オリゴ糖を使用したものは９３品目ある（平成１９年１１月２６日現在）。関与する成分として、９種類の難消化性オリゴ糖が特定保険用食品に使用されているが、それらの定量は、開発メーカー独自の方法でそれぞれ行われており、共通の定量方法は未だ確立されていない。その理由としては、難消化性オリゴ糖は小腸できわめて消化されにくいものだけではなく、部分的に消化されるものが含まれており、構成糖や構造が難消化性オリゴ糖によって異なるために、各オリゴ糖の安定性や加水分解酵素の作用機序等に差異があるからである。【０００５】
食物繊維定量法であるＰｒｏｓｋｙの酵素−重量法は、加水分解酵素により消化性糖質およびタンパク質を完全に消化させ、残存する分子量の大きい未消化物重量を測定する方法である。高分子である食物繊維は、Ｐｒｏｓｋｙの酵素−重量法のように確立された定量法で定量できるが、低分子の難消化性オリゴ糖ならびに糖アルコールは、この酵素−重量法では定量できない。近年、難消化性オリゴ糖および糖アルコールが、様々な健康志向食品に使用されるようになってきたため、これらに共通の定量法が検討されるようになった。【０００６】
ＡＯＡＣ（Association of Official Analytical Chemists）で難消化性オリゴ糖の定量方法として認可されている一つに、Ｐｒｏｓｋｙの酵素−重量法による食物繊維定量法を一部改変した酵素−ＨＰＬＣ法がある（図６参照）。図６に示すように、酵素−ＨＰＬＣ法は、食物繊維定量法と同様に、加水分解酵素で消化性成分を加水分解後、エタノールで沈殿しない難消化性の低分子物質を特定のカラムを用いてＨＰＬＣで分析・定量する方法である。この方法は、生体の消化管における酵素処理過程を想定していることから、小腸で消化を免れて大腸に到達する量、すなわち、難消化性オリゴ糖が腸内細菌によって利用される量を推定できることになる。【０００７】
【特許文献１】特許第３１８３５００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、酵素−ＨＰＬＣ法に用いられている糖質消化酵素である耐熱性α−アミラーゼおよびアミログルコシターゼは、高分子多糖は消化できるが、オリゴ糖等の低分子糖質を酵素の性質により消化しにくいことが考えられる。事実、難消化性オリゴ糖といわれているフラクトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖をヒトに摂取させると、腸内細菌による発酵のみによって産生される水素ガスが、フラクトオリゴ糖は摂取２時間前後から呼気に排出されはじめ、３〜４時間でピークになるのに対し、イソマルトオリゴ糖ではほとんど呼気水素ガス排出は観察されない。また、フラクトオリゴ糖の一過性下痢に対する最大無作用量は体重１ｋｇあたり０．３〜０．４ｇであるのに対して、イソマルトオリゴ糖は体重１ｋｇあたり１．２ｇ以上で、消化されないオリゴ糖に比べて非常に高いのが特徴である。これらの報告は、フラクトオリゴ糖は消化されないが、イソマルトオリゴ糖は消化されることを示唆している。【０００９】
ＡＯＡＣ公定法である酵素−ＨＰＬＣ法でイソマルトオリゴ糖を定量すると、上述したように、「オリゴ糖等の低分子糖質を酵素の性質により消化しにくい」ため、本来は消化されると考えられるイソマルトオリゴ糖が、難消化性オリゴ糖として検出される。このことは、酵素−ＨＰＬＣ法に問題があることを明確に示している。また、酵素−ＨＰＬＣ法にて用いられる消化酵素には、β−ガラクトシダーゼが欠如していることから、消化されるはずのラクトース等も難消化性オリゴ糖として定量される可能性がある。【００１０】
すなわち、ＡＯＡＣ公定法である酵素−ＨＰＬＣ法では、難消化性オリゴ糖ならびに消化性オリゴ糖のいずれであっても、難消化性オリゴ糖として定量されるという問題があった。【００１１】
そこで、本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたものであって、糖質をより正確に定量可能な糖質定量方法を提供することを課題とする。また、本発明は、糖質をより正確に定量可能な糖質定量キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、前記消化酵素が、動物由来の低分子糖質消化酵素であることを特徴としている。
具体的には、本発明の第一態様は消化酵素を用いた糖質定量方法であって、前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素が用いられ、前記低分子糖質消化酵素は、破砕した動物小腸を懸濁した小腸粘膜刷子縁膜の懸濁液からなることを特徴としている。
さらに詳細には、消化酵素を有し、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトース、スクロースについて、小腸において消化される消化性糖質と、小腸において消化されない難消化性糖質とに区別して定量する糖質定量キットであって、前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備え、前記低分子糖質消化酵素は、切除して得られた動物小腸の上部を破砕し、遠心分離して得られた沈殿物を懸濁した小腸粘膜刷子縁の懸濁液からなることを特徴としている。
【００１３】
また、本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、耐熱性α―アミラーゼを用いた第一反応工程と、プロテアーゼおよびアミログルコシダーゼを用いた第二反応工程と、動物由来の低分子糖質消化酵素を用いた第三反応工程とを備えたことを特徴としている。
具体的には、本発明は、前記第一態様にかかる糖質定量方法であって、耐熱性α―アミラーゼを用いた第一反応工程と、プロテアーゼおよびアミログルコシダーゼを用いた第二反応工程と、動物由来の前記低分子糖質消化酵素を用いた第三反応工程とを備えたことを特徴としている。
【００１４】
さらに、本発明にかかる糖質定量方法においては、前記低分子糖質消化酵素として、動物由来の小腸粘膜水解酵素が用いられる構成が好ましい。【００１５】
また、本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、消化酵素を有する糖質定量キットであって、前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備えたことを特徴としている。
具体的には、本発明は、消化酵素を有する糖質定量キットであって、前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備え、前記低分子糖質消化酵素は、破砕した動物小腸を懸濁した小腸粘膜刷子縁膜の懸濁液からなることを特徴としている。
【００１６】
さらに、本発明にかかる糖質定量キットにおいては、前記消化酵素として、動物由来の小腸粘膜水解酵素を備えた構成であることが好ましい。より具体的には、本発明にかかる糖質定量キットは、前記消化酵素として、耐熱性α−アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ、および動物由来の小腸粘膜水解酵素を備えた構成であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、糖質をより正確に定量可能な糖質定量方法を得ることができる。また、本発明によれば、糖質をより正確に定量可能な糖質定量キットを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第一実施例にかかる糖質定量方法の操作手順図を示したものである。
【図２】標準物質として用いたフラクトオリゴ糖、ラクチュロース、ならびにガラクトシルスクロースのクロマトグラフを示したものである。
【図３】標準物質として用いたイソマルトオリゴ糖、スクロース、ならびにラクトースのクロマトグラフを示したものである。
【図４】本発明の第一実施例にかかる糖質定量方法を用いた場合におけるフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）に関する難消化性糖質画分の定量結果を示したグラフである。
【図５】本発明の第一実施例にかかる糖質定量方法を用いた場合におけるスクロースおよびラクトースに関する難消化性糖質画分の定量結果を示したグラフである。
【図６】従来技術にかかるＰｒｏｓｋｙの酵素−重量法による食物繊維定量法を一部改変した酵素−ＨＰＬＣ法の操作手順図を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明する。【００２０】
本発明の第一実施形態にかかる糖質定量方法は、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素が用いられることを特徴としている。【００２１】
本発明の第二実施形態にかかる糖質定量方法は、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、耐熱性α−アミラーゼを用いた第一反応工程と、プロテアーゼおよびアミログルコシダーゼを用いた第二反応工程と、動物由来の低分子糖質消化酵素を用いた第三反応工程とを備えたことを特徴としている。【００２２】
また、本発明の第三実施形態は、上記第一実施形態あるいは第二実施形態にかかる糖質定量方法にて、前記低分子糖質消化酵素として、動物由来の小腸粘膜水解酵素が用いられることを特徴としている。【００２３】
本発明の第４実施形態にかかる糖質定量キットは、消化酵素を有する糖質定量キットであって、前記消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備えたことを特徴としている。【００２４】
また、本発明の第５実施形態は、上記第４実施形態にかかる糖質定量キットにて、前記消化酵素として、動物由来の小腸粘膜水解酵素を備えたことを特徴としている。【００２５】
すなわち、上述した本実施形態にかかる糖質定量方法は、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を用いることを特徴としている。より具体的には、本実施形態にかかる糖質定量方法における酵素処理反応系に、動物由来の低分子糖質消化酵素を添加することを特徴としている。また、本実施形態にかかる糖質定量キットは、上述した糖質定量方法を実施可能なキットであれば、どのような構成であってもよく、消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備えたことを特徴としている。本発明（上述した各実施形態および以下に説明する実施例等）において、「動物」とは、微生物を除く概念である。すなわち「動物由来の低分子糖質消化酵素」とは、「微生物由来の低分子糖質消化酵素」を除く概念である。【００２６】
本発明の実施形態にかかる糖質定量方法および後述する実施例にかかる糖質定量方法においては、動物由来の低分子糖質消化酵素として、ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液を用いている。以下、ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液の調製方法について説明する。【００２７】
ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液の調製は、Ｋｅｓｓｌｅｒらの方法（Kessler M, Acuto O, Storelli C, Murer H, Muller M, Semenza G (1978) A modified procedure for the rapid preparation of efficiently transporting vesicles from small intestinal brush border membranes. Biochim Biophys Acta 506 : 136-54.）に準じて行った。【００２８】
長崎県食肉衛生検査場より供与されたブタ小腸は、氷冷したバット上で小腸に付着している脂肪等を丁寧に切り離し、二糖類水解酵素活性が高い小腸上部約１／２を１０ｃｍ間隔に切り分けた。切り分けた小腸は、氷冷ガラスプレート上で縦に切り開き、小腸管腔内を生理食塩水で２〜３度洗浄した後、ペーパータオルで水滴を除去し、小腸を広げた状態で積み重ね、ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液の調製まで−８０℃で保存した。【００２９】
冷凍保存したブタ小腸（約３００ｇ）を凍結した状態で、細かく包丁で切り、５０ｍＭマンニトール入り２ｍＭ Tris-Cl緩衝液（ｐＨ７．１）１９倍量を加えて氷冷したワーリングブレンダーを用いて６０秒間のインターバルで約９０秒間均一化した。【００３０】
さらに、その懸濁液を超音波装置（ＵＳ−４，（株）エスエヌディ製）で２０分間破砕した。そして、この懸濁液に最終濃度が１０ｍＭとなるように粉末状塩化カルシウムを加え、氷冷下で２０分間静置した。【００３１】
その後、３０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、得られた上清をさらに２７０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。沈殿物の小腸粘膜刷子縁膜画分を洗浄するために、５０ｍＭマンニトール入り２ｍＭ Tris-Cl緩衝液（ｐＨ７．１）で沈殿物を懸濁し、２７０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。この操作をもう一度繰り返し、得られた沈殿物を適当量の０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁し、２７０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、二糖類水解酵素に対して阻害作用のあるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で置換した。【００３２】
そして、得られた沈殿物（精製した刷子縁膜）を適当量の０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁後、１０ｍＬ用プラスチックチューブに分注し、実際の糖質定量に供するまで−８０℃で凍結保存した。【００３３】
以下、図面等に基づいて、上述したブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液（動物由来の低分子糖質消化酵素）を用いて行われる、本発明の実施例にかかる糖質定量方法を説明する。【００３４】
＜第一実施例＞
図１は、本発明の第一実施例にかかる糖質定量方法の操作手順図を示したものである。より具体的には、図１は、本実施例にかかる酵素−ＨＰＬＣ法による糖質定量の操作手順図を示したものである。【００３５】
本実施例においては、難消化性オリゴ糖（糖質）としてＦＯＳ（フラクトオリゴ糖）およびＩＭＯ（イソマルトオリゴ糖）を用い、消化性糖質（糖質）としてスクロースおよびラクトースを用いた。つまり、これらの難消化性糖質と消化性糖質とを用いて、糖質をより正確に定量可能な本実施例にかかる糖質定量方法について説明する。【００３６】
図１に示すように、本実施例においては、各難消化性糖質および各消化性糖質１ｇを秤量し、トールビーカー（容量５００ｍＬ）に入れ、０．０５Ｍ MES/TRIS緩衝液（ｐＨ６．３）４０ｍＬに溶解した（糖質溶解工程）。【００３７】
次いで、上記溶解後、α−アミラーゼ処理を行う。具体的には、消化酵素である耐熱性α−アミラーゼ（Bacillus licheniformis由来）２００μＬを添加し、トールビーカーをアルミニウム箔で覆い、ＤＩＧＩＴＡＬ  ＨＯＴ  ＰＬＡＴＥ／ＳＴＩＲＲＥＲ  ＤＰ−１Ｍ（アズワン（株）製）を用いて、トールビーカー内の液温が９５℃に到達後、３０分間攪拌しながら反応させた（第一反応工程）。【００３８】
次いで、上記第一反応工程後、０．０５Ｍ MES/TRIS緩衝液（ｐＨ６．３）１０ｍＬをトールビーカーに加え、室温まで冷却後、消化酵素であるプロテアーゼ（Bacillus thermoproteolyticus  由来）およびアミログルコシダーゼ（Aspergillus niger由来）をそれぞれ２００μＬずつ添加し、トールビーカーをアルミニウム箔で覆い、トールビーカー内の液温が６０℃に到達後、３０分間攪拌しながら反応させた（第二反応工程）。【００３９】
次いで、上記第二反応工程後、ブタ小腸二糖類水解酵素処理を行う。具体的には、オリゴ糖を消化するために、動物由来の低分子糖質消化酵素を添加して、３７℃で１時間反応させた（第三反応工程）。ここでは、「動物由来の低分子糖質消化酵素」として、動物由来の小腸粘膜水解酵素を用いた。より具体的には、上述のように自家調製したブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液（ｐＨ７．０）を用いた。また、この第三反応工程の前には、動物由来の低分子糖質消化酵素がプロテアーゼによる分解を受けないように、プロテアーゼを失活させた（失活工程）。【００４０】
次いで、上記第三反応工程後、あらかじめ６０℃に加温しておいた９５％エタノール４倍量を反応液に加え、室温で正確に６０分間静置して、高分子のものを沈殿させた（沈殿工程）。【００４１】
次いで、上記沈殿工程後、エタノール沈殿して得た上清は、あらかじめセライトでろ過層を形成しておいたガラスろ過器にＡＳＰＩＲＡＴＯＲ  Ａ−３Ｓ（東京理科器械（株）製）で吸引しながら反応溶液を注入し、残渣と上清とに分別した（ろ過分別工程）。【００４２】
次いで、上記ろ過分別工程後、トールビーカーの内壁およびガラスろ過器上の残渣を７８％エタノール２０ｍＬで３回、９５％エタノール１０ｍＬで２回、さらにアセトン１０ｍＬで２回洗浄し、三角フラスコに洗浄液を回収した（洗浄工程）。【００４３】
次いで、回収した上清（ろ液）のアルコールをロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２００，柴田科学（株）製）で蒸発させた（蒸発工程）。【００４４】
次いで、蒸発させた溶液を少量の水に溶解させ、両性イオン交換樹脂（アンバーライト  ＭＢ−３，オルガノ（株）製）で脱塩した（脱塩工程）。【００４５】
次いで、回収した溶液は、メスシリンダーを用いて５０ｍＬに定容後、メンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｉｌｅ  ０．２２μｍ×１３ｍｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，  ＵＳＡ）を用いてタンパク質等の不純物をろ過してＨＰＬＣの分析試料とした。【００４６】
ＨＰＬＣを用いた各糖質定量のための分析は以下の通りである。【００４７】
測定機器        ＬＣ−２０ＡＤ（（株）島津製作所製）
カラム          Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２
（８．０φ×３００ｍｍ，昭和電工（株）製）
カラム温度      ７０℃
移動相          Ｈ２Ｏ
流速            ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
試料流入量      １０μＬ
検出器          示差屈折計  ＲＩＤ−１０Ａ（（株）島津製作所製）【００４８】
本実施例にかかる糖質定量方法（酵素−ＨＰＬＣ法の改良方法）の一連の酵素処理によって分解されなかった各難消化性糖質および消化性糖質は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２カラムを用いてカラム温度７０℃で分析した。標準液としては、蒸留水に溶解した各難消化性糖質溶液および消化性糖質溶液（それぞれ５．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。【００４９】
ここで、図２および図３は、ＨＰＬＣによる各難消化性糖質および消化性糖質の定量に用いる標準物質溶液の溶出プロファイルを示したものである。【００５０】
また、酵素処理後の各糖質の未消化物の回収率は、下式により算出した。
未消化物の回収率（％）＝（（（Ａ／Ｂ）×希釈倍率）／試料重量（ｇ））×１００
ここで、Ａ：酵素処理後の糖質のピークエリア
Ｂ：標準物質溶液のピークエリア【００５１】
本実施例にかかる糖質定量方法は、以上のような構成を有することによって、以下のような結果を得ることができる。【００５２】
上述した本実施例にかかる糖質定量方法の結果を示したのが図４および図５である。ここで、図４は、本実施例にかかる糖質定量方法を用いた場合におけるフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）に関する難消化性糖質画分の定量結果を示したグラフである。また、図５は、本実施例にかかる糖質定量方法を用いた場合におけるスクロースおよびラクトースに関する難消化性糖質画分の定量結果を示したグラフである。【００５３】
これらの図から明らかなように、ＦＯＳは、ブタ小腸由来の二糖類水解酵素を酵素処理反応系に添加してもほとんど消化されず、未消化物の回収率は９８．２％と極めて高かった（図４参照）。【００５４】
一方、難消化性糖質とされているＩＭＯは、ブタ小腸由来の二糖類水解酵素を酵素処理反応系に添加することにより、ほぼ完全に消化され、ＩＭＯの最小構成単位であるグルコースのみが検出された（図４参照）。【００５５】
また、スクラーゼにより消化されるスクロースにおいてもＩＭＯと同様、ブタ小腸由来の二糖類水解酵素を酵素処理反応系に添加することにより、ほぼ完全に消化された（図５参照）。【００５６】
しかしながら、ラクターゼによって消化されるラクトースは、ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液のラクターゼ活性が低いことから５６．８％しか消化されなかった。また、ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液と反応させることにより、ラクトース以外の二糖が新たに生成されることも確認された（図５参照）。【００５７】
先にも説明したように、従来技術にかかる酵素−ＨＰＬＣ法に用いられている糖質消化酵素は、その性質上、高分子多糖は消化できるが、低分子オリゴ糖は消化しにくいと考えられる。そのため、ＩＭＯはヒトやラットの小腸粘膜酵素で容易に消化されるにもかかわらず、従来技術にかかる食物繊維定量用の加水分解酵素では僅かしか加水分解されない。このことは、ＡＯＡＣ公定法である酵素−ＨＰＬＣ法は、消化性ならびに難消化性オリゴ糖のいずれであっても、難消化性オリゴ糖として定量される欠陥を有することを示している。【００５８】
これに対して、本実施例によれば、上述した従来技術の欠陥を無くし、糖質をより正確に定量可能な糖質定量方法を得ることができる。つまり、酵素−ＨＰＬＣ法に現在用いられている糖質消化酵素には、低分子糖質を消化するα−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが欠如しているので、この両方を反応系へ加えることによって、より正確に糖質（オリゴ糖）を定量可能となる。本実施例においては、そのために、ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液（ブタ小腸粘膜消化酵素）を用いている。【００５９】
より具体的には、本実施例は、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、消化酵素が、動物由来の低分子糖質消化酵素であることを特徴としている。また、本実施例は、消化酵素を用いた糖質定量方法であって、耐熱性α−アミラーゼを用いた第一反応工程と、プロテアーゼおよびアミログルコシダーゼを用いた第二反応工程と、動物由来の低分子糖質消化酵素を用いた第三反応工程とを備えたことを特徴としている。さらに、本実施例は、低分子糖質消化酵素として、動物由来の小腸粘膜水解酵素が用いられている。【００６０】
このような構成に基づき、本実施例によれば、難消化性糖質および消化性糖質を区別して定量できることが可能となり、正確に難消化性オリゴ糖を定量することができる。【００６１】
ところで、本実施例の特徴は、加水分解反応系に動物由来の低分子糖質消化酵素を加えることであるため、この特徴を有する構成であれば、どのようなキット（糖質定量キット）も本発明の技術的範囲に属する。【００６２】
具体的には、本発明は、消化酵素を有する糖質定量キットであって、消化酵素として、動物由来の低分子糖質消化酵素を備えたことを特徴としている。また、本発明にかかる糖質定量キットは、消化酵素として、耐熱性α−アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ、および動物由来の小腸粘膜水解酵素を備えたことを特徴としている。さらに、本発明にかかる糖質定量キットにおいては、消化酵素として、動物由来の小腸粘膜水解酵素を備えた構成であることが好ましい。【００６３】
＜その他の実施例等＞
なお、本発明は、上記実施形態および実施例（以下「実施形態等」という。）に限定されるものではなく、必要に応じて種々の変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。【００６４】
例えば、上記実施形態等においては、「動物由来の低分子糖質消化酵素」として「ブタ由来の低分子糖質消化酵素（ブタ小腸粘膜刷子縁膜懸濁液）」を用いた場合について説明したが、本発明はこの構成に限定されるものではなく、その活性が「ヒト」と類似しているものであれば、「他の動物」由来の低分子糖質消化酵素を用いることも可能である。したがって、例えば、ラット、牛等の他の動物の小腸粘膜水解酵素を用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
食物繊維ならびに難消化性オリゴ糖・糖アルコールは、健康に対して従来の糖質とは異なった特殊な生理作用を持ち、生活習慣病等の予防に深く関わっていることが明らかにされている。また、国民の価値観の変化によって健康志向が強まり、食品メーカーや医薬品メーカーによる種々の生理機能を強調した特定保健用食品等の機能性食品の開発も盛んである。【００６６】
このような背景の下、食物繊維や難消化性オリゴ糖・糖アルコールを添加した特定保健用食品は数多く許可されている。そして、特定保健用食品をはじめとする加工食品には、健康増進法に定められている栄養表示基準制度によって、栄養成分を表示することが義務付けられている。加工食品へ添加された成分の機能発現は、それに添加された成分含量に依存するので、その定量は重要である。【００６７】
しかしながら、現在の（従来技術にかかる）公定法である食物繊維定量法や難消化性オリゴ糖定量法は、過大評価をしていると考えられるため、虚偽の表示にもなりかねない。消費者は、科学的根拠に基づいた正しい情報を知る権利がある。【００６８】
そこで、先に説明した本発明にかかる糖質定量方法および糖質定量キットを用いれば、正確に難消化性糖質および消化性糖質を区別して定量できることが可能となり、消費者に対し正しい情報を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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