(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆残渣および糖類を含有する培地中で、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母、Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属の酵母、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の酵母、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母、Ｂｕｌｌｅｒａ属の酵母、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属の酵母、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属の酵母、及びＹａｒｒｏｗｉａ属の酵母から選ばれる少なくとも何れかの一種の酵母を培養し、得られた培養上清にエタノールを加えて、皮膚におけるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を得る、皮膚におけるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項２】
前記Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｐｏｒｕｓである、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項３】
前記Ｐｉｃｈｉａ属の酵母が、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ又はＰｉｃｈｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉｉである、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項４】
前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母が、キャンディダ・ジラノイデス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ）、キャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・ステアトリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅａｔｏｌｙｔｉｃａ）、キャンディダ・ブチリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｕｔｙｒｉ）、キャンディダ・ラギー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｈａｇｉｉ）又はキャンディダ・メタプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項５】
前記デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が、デバリオマイセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）またはデバリオマイセス・バンリジエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｖａｎｒｉｊｉａｅ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項６】
前記Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の酵母が、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ又はＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｎｇａｒｉｃｕｓである、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項７】
前記ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母が、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はハンセヌラ・シフェリイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項８】
前記ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属の酵母が、ブレラ・ツガエ（Ｂｕｌｌｅｒａ  ｔｓｕｇａｅ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項９】
前記Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母が、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１０】
前記スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が、スポロボロミセス・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラ
ミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１１】
前記ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が、ブレタノマイセス・クラウセニィ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１２】
前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１３】
前記糖類は葡萄糖である、請求項１〜１２の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１４】
前記培地は、大豆残渣、葡萄糖及び水からなるものである、請求項１３に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１５】
前記培地の中に前記大豆残渣を８〜１２ｗ／ｖ％、前記糖類を０．８〜１．２ｗ／ｖ％含有する、請求項１４に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１６】
前記培養の温度は２７〜３５℃である、請求項１〜１５の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１７】
前記培養時間は１〜７日間である、請求項１〜１６の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１８】
前記培養して得られた培養液を遠心分離により、前記上清を得る、請求項１〜１７の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項１９】
上記エタノールを加えたものを、さらに、超音波処理、遠心分離、ろ過、真空乾燥処理で精製して、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として得る、請求項１〜１８の何れか一項に記載のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法。
【請求項２０】
大豆残渣および糖類を含有する培地中で、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母、Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属の酵母、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の酵母、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母、Ｂｕｌｌｅｒａ属の酵母、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属の酵母、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属の酵母、及びＹａｒｒｏｗｉａ属の酵母から選ばれる少なくとも何れかの一種の酵母を培養し、得られた培養上清にエタノールを加えて得られる大豆残渣の発酵エキスの皮膚におけるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための非治療目的の使用。
【請求項２１】
前記Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｐｏｒｕｓである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記Ｐｉｃｈｉａ属の酵母が、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ又はＰｉｃｈｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉｉである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母が、キャンディダ・ジラノイデス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ）、キャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・ステアトリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅａｔｏｌｙｔｉｃａ）、キャンディダ・ブチリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｕｔｙｒｉ）、キャンディダ・ラギー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｈａｇｉｉ）又はキャンディダ・メタプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が、デバリオマイセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）またはデバリオマイセス・バンリジエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｖａｎｒｉｊｉａｅ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の酵母が、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ又はＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｎｇａｒｉｃｕｓ  である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
前記ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母が、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はハンセヌラ・シフェリイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
前記ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属の酵母が、ブレラ・ツガエ（Ｂｕｌｌｅｒａ  ｔｓｕｇａｅ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２８】
前記Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母が、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２９】
前記スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が、スポロボロミセス・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項３０】
前記ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が、ブレタノマイセス・クラウセニィ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項３１】
前記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生を促進させることができるセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法に関する。特に、本発明は、特定微生物を利用し、食品加工業等の副産物である大豆残渣を培地の主原料として用いることで、皮膚のセラミド／グルコシルセラミド産生を促進させることができる、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚はセラミド（ceramide）及びグルコシルセラミド(glucosylceramide)を産生する能力を有する。皮膚では、特に表皮角質層において、表皮細胞によって合成分泌されたセラミドが集積しており、細胞間脂質の主成分となっている。スフィンゴ脂質の一つであるセラミドは皮膚の角質層に存在し、角質層中で細胞間脂質の約５０％を占めている。スフィンゴ脂質（sphingolipid）とは、スフィンゴシン骨格を含む複合脂質の総称である。また、グルコシルセラミドは、セラミドにグルコースが結合したスフィンゴ脂質の一種である。皮膚表皮細胞で合成されたセラミドは一旦グルコシルセラミドまたはスフィンゴミエリン（sphingomyelin）の形で蓄えられたあと、細胞外へ排出されて、βグルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）とスフィンゴミエリナーゼ（sphingomyelinase）の作用を受けて、再びセラミドとなり、細胞間脂質として機能する。皮膚におけるセラミド及びグルコシルセラミドは、皮膚の保湿機能及び皮膚のバリヤ機能を向上させるなどの生理作用を有する。
【０００３】
従来、セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド等のスフィンゴ脂質は、角質層の水分保持能力を亢進し、肌荒れの改善に効果があることが知られている（特許文献１〜２）。また、皮膚はセラミド／グルコシルセラミドを産生する能力を有するが、近来、環境、気候等の影響によって、皮膚が乾燥になりやすい。従って、皮膚自らのセラミド等の産生により皮膚の保湿機能を向上させる能力が十分ではなくなる。
【０００４】
従って、外部から皮膚にセラミドを補充する方法が考えられる。例えば、特許文献３には、キャンディダ（Candida）属に属するキャンディダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＪＰＣＣＹ０００４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５７０）を培養してグルコシルセラミドを製造する方法が記載されている。当該グルコシルセラミドをヒトの乾燥性の皮膚へ塗布することによって皮膚の保湿機能を向上できる。しかし、その方法はセラミド／グルコシルセラミド産生促進剤に関与せず、培養後の菌体中に多く存在するグルコシルセラミドを直接に取得する方法に過ぎないので、その方法で合成されたグルコシルセラミドのセラミド骨格は、２重結合が２箇所に存在し、且つ、分岐を有するため、ヒト生体中に存在するセラミド類のセラミド骨格と異なる。よって、このような、微生物の体内から直接に取得されたグルコシルセラミドを人の皮膚へ塗布すると、皮膚に適応できず、使用上の安全性に関する問題を生じる恐れがある。
【０００５】
また、外部から皮膚にセラミドを補充する方法は、従来から用いられていた保湿剤などと同様に、保湿効果の持続性の点で不十分であるという問題もある。また、皮膚の状態によって、外部から補充されたセラミド等を吸収することが不十分であり、保湿効果が十分発揮されない場合がある。
【０００６】
一方、皮膚自らのセラミド又はグルコシルセラミド産生能力を増強または促進させることができれば、外からセラミド又はグルコシルセラミドを補充する必要がなく、皮膚自身がセラミド及び／又はグルコシルセラミドを産生することで皮膚のバリヤ機能、水分保持機能を向上させることが可能であると考えられている。さらに、このように得られたセラミド及び／又はグルコシルセラミドは皮膚自身から産生されたものであるため、通常の皮膚が有する構造のセラミドなどが合成され、皮膚への適応性がよくない等の安全性問題が無くなると考えられる。
【０００７】
そこで、最近では、皮膚の角質層において、表皮セラミドの生成の促進を目的とした物質を生産する研究が活発に進められている。ここでセラミドの生成を促進し得る物質としては、マンネンタケ、ビーポーレン（Ｂｅｅ Ｐｏｌｌｅｎ）、センキュウなどの抽出物を有効成分とするセラミド産生促進剤が報告されている（特許文献４〜６）。しかし、これらのセラミド産生促進剤はいずれも植物性原料から抽出したものであり、この抽出操作には長時間を要し、天然資源の利用可能性には制限があるため、製造コストは高い。
【０００８】
また、特許文献７には、皮膚表層内部で表皮細胞自身のセラミド合成を活発化させ得る、ニコチン酸および/またはニコチンアミドを含む菌培養物を有効成分とするセラミド合成促進剤であって、当該菌培養物は乳酸菌培養物、ビフィズス菌培養物、きのこ菌体培養物または酵母菌培養物であってもよいことが開示されている。しかし、特許文献７の実施例からみれば、ニコチン酸および/またはニコチンアミドを含まない乳酸菌培養物または酵母菌培養物（比較例１〜４）のセラミド産生量はコントロールに比べて、著しい変化がないことが分かる。そのため、当該セラミド合成促進剤は、ニコチン酸および/またはニコチンアミドを実質的な有効成分として含み、そのセラミド／グルコシルセラミド産生促進効果が十分と言えないため、改善する余地がある。また、そのセラミド合成促進剤を調製するために用いられる培地は、実質的にニコチン酸および/またはニコチンアミドを有効成分とするため、製造コストが高いと言える。
【０００９】
酵母菌は、自然界に広く分布している単細胞の真菌であり、主に湿った糖分を含む酸性環境で育ち、酸素欠乏環境下の中で生き残ることができる。酵母菌は、醸造の製造に用いられることができる。従来、1000種類以上の酵母が知られており、Schizosaccharomyces属の酵母、Pichia属の酵母、Candida属の酵母、Debaryomyces属の酵母、Cryptococcus属の酵母、Hansenula属の酵母、Bullera属の酵母、Rhodotorula属の酵母、Sporobolomyces属の酵母、Brettanomyces属の酵母、及びYarrowia属の酵母が挙げられる。
【００１０】
シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）は発酵によりアルコールを生じ、食品の加工に古くから利用されており、また生物学の研究材料としても用いられている。
【００１１】
また、Pichia属の酵母は以下のような性質、用途などを具備する。
【００１２】
Pichia属の酵母の細胞が、球形、楕円形、長形を呈し、時折錐の形を呈し、ただ尖頂を形成しない。無性繁殖方式は多辺の芽のために殖やして、ある種類は節胞子を形成可能である。一般に、個々の子嚢は１〜４個の子嚢胞子を含み、時折４個より多い子嚢胞子を含む。胞子は、帽子状、半球の形又は角を有する球形を呈す。子嚢成熟以後は、通常裂けて、少数は裂けなくて、接合又は接合せず子嚢を形成する。接合は、雌の細胞と芽体の間に、又は、２個の独立細胞間に発生している。菌糸と擬菌糸が何れも子嚢とするが、それらの形態は大きくなりあるいは紡錘の形になることがなく、一門あるいは異なった門で配合する。Pichia属の酵母は硝酸塩を同化でき、DBBの反応で陰性を呈す。
【００１３】
Pichiaの類別に関する位置は、Ascomycota―Hemiascomycetes―Saccharomycetales―Saccharomycetaceae―Pichiaである。
【００１４】
Pichia属の酵母の用途としては、例えば、メタノールを利用して抗生物質、生物蛋白などの有用な物質を生じること；あるいは遺伝子工学の菌として利用することが可能である。ピキアパストリスが還元型グルタチオンの生産に用いられ、Pichia属の酵母の他の一部が特定のタンパク質/酵素の生産に用いられる。
【００１５】
また、キャンディダ（Candida）属に属する微生物は、以下のような用途があることが知られている。例えば、キャンディダ・バリダ（Candida valida）はリパーゼの生産に用いられる。キャンディダ・メタプシローシス（Candida metapsilosis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）などは醸酒、グリセリン、食用酵母、有機酸及び酵素剤などの生産、並びに飼料工業にも用いることができる。また、キャンディダ（Candida）属に属する微生物は、工業・農業副産物加工業における廃棄物の処理、食用蛋白の生産に有用である。
【００１６】
また、デバリオマイセス（Debaryomyces）に属する微生物は、一般的な工業上の用途では、例えば、ブドウ糖を発酵してD-アラビトールを生産できること、あるいはキシロースをキシリトールに変換できることが知られている。
【００１７】
また、Cryptococcus属の微生物に対する研究がされている。例えば、変異型クリプトコッカスがβ-ガラクトシダーゼを生産することが報告されている。さらに、Cryptococcus laurentiiが、Geotrichum citri-aurantiiのストレージに対する抑制作用を示す。
【００１８】
また、ハンセヌラ（Hansenula）属に属する微生物の大部分が酢酸エチルを産生して、製造物の香りを高めることができるため、通常、酒の醸造や食品工業に利用されることが知られている。
【００１９】
また、ブレラ（Bullera）属に属する微生物が発酵食品、例えば、発酵ソーセージなどに、一般に使用されていることが知られている。
【００２０】
また、Rhodotorula属の微生物に対する研究がされている。例えば、Rhodotorula属のいくつかの種が炭化水素に対して弱く酸化できるという作用を有し、且つβ-カロチンを合成できる。例えば、Rhodotorula glutinis がアルカンを酸化して乾燥バイオマスの50〜60％の量の脂肪を生成できる。特定の条件下で、α-アラニンとグルタミン酸を生成することができ、メチオニン生産能力は強いで、産生量が乾燥バイオマスの1％にすることができる。
【００２１】
また、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属に属する微生物は、コエンザイムQ10を菌体内に蓄積するなど産業上有用な酵母であることが知られている。また、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属に属する微生物はこの他にもカロテノイド類やL-カルニチンなどの有用物質の生産菌としても注目されている。
【００２２】
また、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属に属する微生物は、酵母の一種で、自然界に広く存在する。樽貯蔵中に増殖してエチルフェノールを生産することが良く知られている。一般的に醸酒上、ビールやワインの香りに悪い影響を与えるものとして嫌われている。
【００２３】
また、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）等のヤロウィア（Yarrowia）属に属する微生物は、多価不飽和脂肪酸「ＰＵＦＡ」の生成にとって特に有用なものであることが良く知られている。
【００２４】
しかし、従来、酵母菌（特に、上記の各属の酵母）によって、セラミド又はグルコシルセラミドを産生促進剤を製造することはまだ報告されていない。
【００２５】
【特許文献１】特開昭６１−２６０００８号公報
【特許文献２】特開昭６１−２７１２０５号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２２１７号公報
【特許文献４】特開２００５−１９４２４０号公報
【特許文献５】特開２０１０−７０４９９号公報
【特許文献６】特開２０１０−１５０２３７号公報
【特許文献７】特開平９−１９４３８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、上記従来技術のある課題を解決するためになされたものであり、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、大豆残渣および糖類を含有する培地中で酵母を培養して、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得ることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００２８】
本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で酵母を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を得る、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法を提供する。
【００２９】
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で酵母を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための使用に関する。
【００３０】
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で酵母を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としての使用に関する。
【００３１】
また、本発明は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で酵母を培養して得られる、大豆残渣の発酵エキスのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造のための使用に関する。
【００３２】
本発明では、酵母は、Schizosaccharomyces属の酵母、Pichia属の酵母、Candida属の酵母、Debaryomyces属の酵母、Cryptococcus属の酵母、Hansenula属の酵母、Bullera属の酵母、Rhodotorula属の酵母、Sporobolomyces属の酵母、Brettanomyces属の酵母、及びYarrowia属の酵母から選ばれる少なくとも何れか一種のものであってもよい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る製造方法によれば、特定微生物を利用し大豆残渣のような入手が容易であるものを培地の主原料として用いることで、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を安価で効率良く得ることができる。当該促進剤は、皮膚の持つセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能力を効率的に向上させることができるため、皮膚の保湿機能を有効に向上させることもできる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の製造方法は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で酵母を培養し、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を得ることである。
【００３５】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造に使用できる微生物）
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造に使用され得る微生物としては、Schizosaccharomyces属の酵母、Pichia属の酵母、Candida属の酵母、Debaryomyces属の酵母、Cryptococcus属の酵母、Hansenula属の酵母、Bullera属の酵母、Rhodotorula属の酵母、Sporobolomyces属の酵母、Brettanomyces属の酵母、及びYarrowia属の酵母から選ばれる少なくとも何れか一種のものであってもよい。
【００３６】
本発明に使用できるSchizosaccharomyces属に属する微生物としては、食品工業分野に一般的に使われる、Schizosaccharomyces octoporus、Schizosaccharomyces pombe等が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。
【００３７】
このうち、得られる製造物がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Schizosaccharomyces octoporusが好ましい。
【００３８】
本発明に使用できるPichia属に属する微生物としては、食品工業分野に一般的に使われる、Pichia anomala、Pichia guilliermondii、Pichia norvegensis、Pichia membranifaciens、Pichia burtonii、Pichia farinose、Pichia Kluyveri等が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。
【００３９】
このうち、得られる製造物がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Pichia anomala、Pichia guilliermondii、Pichia norvegensis、Pichia membranifaciens、Pichia burtoniiが好ましい。
【００４０】
また、Pichia membranifaciensは、Pichia membranaefaciens、Pichia alcoholophila 、Pichia hyalospora 、 Pichia scaptomyzae、 Willia belgica又は Zygopichia guilliermondiiとも言われる。
【００４１】
また、Pichia burtoniiは、Candida fibrae、 Dematium chodati 、 Endomycopsis chodati 、 Hyphopichia burtonii 又はTrichosporon behrendiiとも言われる。
【００４２】
本発明に使用できるキャンディダ(Candida)属に属する微生物としては、食品分野に使われる、キャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・ステアトリチカ（Candida steatolytica）、キャンディダ・ブチリ（Candida butyri）、キャンディダ・ラギー（Candida rhagii）、キャンディダ・メタプシローシス（Candida metapsilosis）、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・ホルミイ(Candida holmii)、またはキャンディダ・バリダ（Candida valida）から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、好ましくはキャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・ステアトリチカ（Candida steatolytica）（異名：Candida hellenical）、キャンディダ・ブチリ（Candida butyri）、キャンディダ・ラギー（Candida rhagii）又はキャンディダ・メタプシローシス（Candida metapsilosis）である。
【００４３】
本発明に使用できるデバリオマイセス（Debaryomyces）属に属する微生物としては、食品分野に使われる、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、デバリオマイセス・ポリモファス（Debaryomyces polymorphus）、またはデバリオマイセス・バンリジエ（Debaryomyces vanrijiae）等から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有することから、好ましくはデバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）またはデバリオマイセス・バンリジエ（Debaryomyces vanrijiae）である。
【００４４】
本発明に使用できるCryptococcus属に属する微生物としては、食品工業分野に一般的に使われる、Cryptococcus laurentii、Cryptococcus hungaricus 、Cryptococcus terreus等が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。
【００４５】
なかでは、得られる製造物がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Cryptococcus laurentii 、Cryptococcus hungaricusが好ましい。
【００４６】
本発明に使用できるハンセヌラ（Hansenula）属に属する微生物としては、食品分野に使われる、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ハンセヌラ・シフェリイ（Hansenula ciferrii）、ハンセヌラ・サブペリクローサ（Hansenula subpelliculosa）、ハンセヌラ・サターナス（Hansenula saturnus）、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）等から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有することから、好ましくはハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（異名：ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ハンセヌラ・アングスタ（Hansenula angusta）、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha））、又はハンセヌラ・シフェリイ（Hansenula ciferrii）である。
【００４７】
本発明に使用できるブレラ（Bullera）属に属する微生物としては、食品分野に使われる、ブレラ・ツガエ（Bullera tsugae）、ブレラ・バリアビリス（Bullera variabilis）、ブレラ・アルバス（Bullera albus）等から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有することから、好ましくはブレラ・ツガエ（Bullera tsugae）（異名：スポロボロミセス・ツガエ（Sporobolomyces tsugae））である。
【００４８】
本発明に使用できるRhodotorula属に属する微生物としては、Rhodotorula mucilaginosa、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula minuta、Rhodotorula pallida、Rhodotorula rubra等が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。
【００４９】
なかでは、得られる製造物がより高いセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有するという観点から、Rhodotorula mucilaginosa、Rhodotorula glutinisが好ましい。
【００５０】
本発明に使用できるスポロボロミセス（Sporobolomyces）属に属する微生物としては、食品分野に使われる、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、スポロボロミセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor）又はスポロボロミセス・ルバー（Sporobolomyces ruber）等から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有することから、好ましくはスポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）である。
【００５１】
本発明に使用されるブレタノマイセス（Brettanomyces）属に属する微生物としては、食品分野に使われ、ブレタノマイセス・クラウセニィ（Brettanomyces claussenii）又はブレタノマイセス・アノマラス（Brettanomyces anomalus）等から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有することから、好ましくはブレタノマイセス・クラウセニィ（Brettanomyces claussenii）である。
【００５２】
本発明に使用できるヤロウィア（Yarrowia）属に属する微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）等又は、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）等の微生物を常法に基づき得られた変異株が挙げられる。前記微生物は、大豆残渣および糖類を含有する培地中で培養することで、培養上清から、表皮細胞のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生能を向上させる剤が得られる作用を示す。その中でも、本発明で得られる剤が、よりセラミド産生促進効果及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有することから、好ましくはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）（異名：キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・パラリポリティカ（Candida paralipolytica）、サッカロマイコプ シス・リポリティカ（Saccharomycopsis lipolytica）、エンドマイコプシス・リポリティカ（Endomycopsis lipolytica）、Pseudomonilia deformans）である。
【００５３】
本発明にかかる微生物（酵母）は、何れも、中国普通微生物保蔵管理中心（CGMCC）及び中国典型培養物保蔵中心（CCTCC）、江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIM）などの商業ルートで購入できるものである。
【００５４】
また、本発明の製造方法においては、上記微生物（酵母）を１種類単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００５５】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法）
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造方法は、酵母を、大豆残渣および糖類を含有する培地で培養することで、培養上清からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を得る。該方法の詳細を以下に記載する。
【００５６】
<培地>
本発明では、上記の微生物の少なくとも１種又は２種以上を、液体培地中で培養することが望ましい。
【００５７】
本発明において用いる培地としては、大豆残渣と糖類とを主成分として含有するものである。大豆残渣も糖類も入手やすい原料であるため、本発明の培地が従来より安価上で優れた利点を有する。また、その他には、例えば、１％のペプトン、０.５％の酵母粉等を適宜添加してもよい。
【００５８】
その中では、大豆残渣とは、大豆を水に浸漬し、水を十分に吸収させて、粉砕、濾過を経て、水を除去して、乾燥して、得られたものである。食品産業において豆乳を搾り取ったという大豆製品を製造する工程で残した大豆残渣を用いることも可能である。
【００５９】
糖類としては、例えば葡萄糖、麦芽糖、蔗糖などが挙げられる。また、それらの、いずれかを単独、または混合して使用できる。発酵生産性及び利用性を高める観点、並びにセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を向上させるという観点から、葡萄糖を好適に用いることができる。
【００６０】
本発明においては、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高めるという観点から、培地は、大豆残渣、葡萄糖及び水からなるのが好ましい。その中に大豆残渣を５〜２０％（ｗ/ｖ）、より好ましくは８〜１２％（ｗ/ｖ）、葡萄糖を０．２〜２％（ｗ/ｖ）、より好ましくは０.８〜１．２％（ｗ/ｖ）含有することが好ましい。
【００６１】
<培養条件>
前記微生物の菌体を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地に直接接種することにより行う。セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造するための培養条件としては、酵母微生物の生理的な特性、酵母微生物の成長に必要な温度・時間の最適化、並びにセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を高める観点から、２０〜４０℃、好ましくは２７〜３５℃の培養温度で、１〜７日、好ましくは４８〜９６時間、より好ましくは６８〜７６時間で培養するのが好ましい。
【００６２】
<セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の回収、精製>
製造物の純度を高める観点から、前記培養により得られた培養液を精製して、上清を得る。精製の方法としては、ろ過、遠心分離、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化などの通常用いられる操作を必要に応じて適宜組み合わせて行われてもよい。また、遠心分離により上清を得ることが好ましい。遠心分離の回転数は、２０００〜４０００rpmが好ましく、２５００〜３５００rpmがより好ましい。遠心分離の時間は、０〜２０分が好ましく、５〜１５分がより好ましい。
【００６３】
具体的には、遠心分離して得られた上記上清にエタノールを加えて殺菌し、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としてもよい。
【００６４】
また、遠心分離して培養液から菌体を除去し、次いで超音波処理し、遠心分離して上清を回収する。再び、回収した上清をろ過して夾雑物などを除き、さらに真空で乾燥処理して本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としてもよい。
【００６５】
本発明の酵母を培養し、培養上清から得た大豆残渣の発酵エキスは、正常ヒト角化細胞において、セラミド及び／又はグルコシルセラミドの量を増加させる作用を有する。
【００６６】
従って、本発明の酵母を培養し、培養上清から得られた大豆残渣の発酵エキスは、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進のための治療目的又は非治療目的の使用ができ、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤としての治療目的又は非治療目的の使用もできる。非治療目的の使用には、美容目的の使用や、健康状態の維持のための使用などが含まれる。また、上記の治療目的の使用と、非治療目的の使用は、分けて行うこともできる。
【００６７】
また、本発明の酵母を培養し、培養上清から得た大豆残渣の発酵エキスは、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造するために使用できる。
【００６８】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、角質層中のセラミド及び／又はグルコシルセラミドを増加させ、皮膚のバリア機能及び保湿機能を回復及び向上するための医薬品、医薬部外品、化粧品等としても使用できる。また、当該セラミド又はグルコシルセラミド産生促進剤は、セラミド又はグルコシルセラミド産生促進をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した医薬部外品、化粧品として使用することもできる。
【００６９】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の使用形態としては、培養細胞へ添加するための添加剤とすることができ、皮膚洗浄剤、メイクアップ化粧料などの皮膚外用剤へ配合することもできる。例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の形態で提供することができる。外用剤の基剤としては、公知の外用基剤でよく、特に限定されない。このような種々の皮膚外用剤を調製するには、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を単独で、又は、皮膚洗浄剤、メイクアップ化粧料などの皮膚外用剤に配合する、通常の油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００７０】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を、培養表皮細胞系へ添加してセラミド及び／又はグルコシルセラミド合成を促進する場合の添加量は、促進剤の乾燥物として、０．０００１〜１０ｗ/ｖ％、さらに０．００１〜５ｗ/ｖ％が好ましい。添加量が０．０００１ｗ/ｖ％以上であると、産生促進の効果を十分にすることになる。添加量が１０ｗ/ｖ％以下であると、表皮細胞への刺激が少ないという点で好ましい。
【００７１】
本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の皮膚外用剤への配合量は、大豆残渣の発酵エキスの乾燥物として、セラミド及び／又はグルコシルセラミド合成を十分に促進しして皮膚の保湿能力を効率的に高め、しかも培養物の色や臭いが出にくいことから、全皮膚外用剤の０．０１〜２０ｗ/ｖ％とするのが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０ｗ/ｖ％である。
【実施例】
【００７２】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００７３】
（実施例１-１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造（発酵液の処理）＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
【００７４】
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Schizosaccharomyces octoporus（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0123として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【００７５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料１-Ａ、１-Ｂとし、さらに、試料１-Ａ、１-Ｂをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【００７６】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【００７７】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料１-Ａ、１-Ｂ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）をそれぞれ当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【００７８】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【００７９】
（セラミド/グルコシルセラミド促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【００８０】
（１）セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量に供した。
【００８１】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【００８２】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させ、冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【００８３】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表１に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミド量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【００８４】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【００８５】
表１から明らかなように、本発明品１-Ａ、１-Ｂは、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果が確認された。
【００８６】
【表１】
0005639713.tif 000002
【００８７】
なお、試料１-Ａ〜１-Ｂについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例１-１と同様にした。その結果は、試料１-Ａ〜１-Ｂの何れかにもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【００８８】
これから、本発明の製造物自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製造物が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用いることができる。
【００８９】
（実施例２−１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造（発酵液の処理）＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
【００９０】
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Pichia anomala（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号３６０−２０−３として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【００９１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤（試料２-A）とし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【００９２】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【００９３】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製造物（試料２-A）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）を当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【００９４】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【００９５】
（セラミド/グルコシルセラミド促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）の溶媒を加え攪拌し、次に、２０分間振動した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【００９６】
（１）セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）の溶媒を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量に供した。
【００９７】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【００９８】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させ、冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【００９９】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表２−１〜表２−３に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表２に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【０１００】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０１０１】
表２−１〜表２−３から明らかなように、本発明品２-Aは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０１０２】
（実施例２−２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomalaを Pichia guilliermondii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号422-19-3として受託されている。）に替え、また、大豆残渣の発酵後に得られた上清に２．５倍体積のＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。乾燥の試料を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤２-B、２-Cとし、さらに、乾燥の試料２-B、２-Cを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、それぞれ１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。上記以外は、実施例２-１と同様にして、試料２-B、２-Cのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の効果を評価した。結果は表２−１〜表２−３に示す。
表２−１〜表２−３から明らかなように、本発明品２-B、２-Cは、セラミド産生促進効果が確認された。
【０１０３】
（実施例２−３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomalaをPichia norvegensis（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0151として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１０４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１０５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｅ、２-Ｆとし、さらに、試料２-Ｅ、２-Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１０６】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｄ、２-Ｅ、２-Ｆのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１０７】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−３の試料２-Ｄ、２-Ｅ、２-Ｆは、セラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１０８】
（実施例２−４）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia anomala（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0297として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１０９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｇとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１１０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｈとし、さらに、試料２-Ｈを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１１１】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｇ、２-Ｈのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１１２】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−４の試料２-Ｇ、２-Ｈは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１１３】
（実施例２−５）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia anomala（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0349として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１１４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｉとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１１５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｊ，２-Ｋとし、さらに、試料２-Ｊ，２-Ｋをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１１６】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｉ、２-Ｊ、２-Ｋのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１１７】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−５の試料２-Ｉ、２-Ｊ、２-Ｋは、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１１８】
（実施例２−６）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia membranifaciens（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0360として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１１９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｌとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１２０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｍ、２-Ｎとし、さらに、試料２-Ｍ、２-Ｎをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１２１】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｌ、２-Ｍ、２-Ｎのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１２２】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−６の試料２-Ｌ、２-Ｍ、２-Ｎは、セラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１２３】
（実施例２−７）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia anomala（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0420として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｏとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１２５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｐ、２-Ｑとし、さらに、試料２-Ｐ、２-Ｑをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１２６】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｏ、２-Ｐ、２-Ｑのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１２７】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−７の試料２-Ｏ、２-Ｐ、２-Ｑは、セラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１２８】
（実施例２−８）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia anomala（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0421として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１２９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｒとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１３０】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｓ、２-Ｔとし、さらに、試料２-Ｓ、２-Ｔをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１３１】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｒ、２-Ｓ、２-Ｔのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１３２】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−８の試料２-Ｒ、２-Ｓ、２-Ｔは、セラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１３３】
（実施例２−９）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia burtonii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0424として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１３４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｕとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１３５】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｖとし、さらに、試料２-Ｖを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１３６】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｕ、２-Ｖのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１３７】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−９の試料２-Ｕ、２-Ｖは、セラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１３８】
（実施例２−１０）
実施例２に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia guilliermondii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0440として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１３９】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｗとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１４０】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｗのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１４１】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−１０の試料２-Ｗは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１４２】
（実施例２−１１）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia guilliermondii（江南大学工業微生物資源および情報センターCICIMに番号CICIM Y0326として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１４３】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｘとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１４４】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｙとし、さらに、試料２-Ｙを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０．１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１４５】
実施例２−１と同様にして、試料２-Ｘ、２-Ｙのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３示した。
【０１４６】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−１１の試料２-Ｘ、２-Ｙは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１４７】
（実施例２−１２）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia guilliermondii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0329として受託されている。）に替えた以外、実施例２-１と同様に培養した。
【０１４８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-Ｚとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０１４９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-aとし、さらに、試料２-aを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１５０】
実施例２−１と同様にして、試料２-Z、２-aのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１５１】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２−１２の試料２-Z、２-aは、セラミド及び/又はグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１５２】
（実施例２−１３）
実施例２−１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Pichia anomala（番号360-20-3）をPichia guilliermondii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0414として受託されている。）に替えた以外、実施例２−１と同様に培養した。
【０１５３】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料２-ｂとし、さらに、試料２-ｂを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０１５４】
実施例２-１と同様にして、試料２-ｂのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表２−１〜表２−３に示した。
【０１５５】
表２−１〜表２−３から明らかなように、実施例２-１３の試料２-ｂは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０１５６】
【表２−１】
0005639713.tif 000003
【０１５７】
【表２−２】
0005639713.tif 000004
【０１５８】
【表２−３】
0005639713.tif 000005
【０１５９】
なお、試料２-A〜２-Z及び２-a、２-bについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例２-１と同様にした。その結果は、試料２-A〜２-Z及び２-a、２-bの何れかにもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０１６０】
これから、本発明の製造物自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製造物が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることができる。
【０１６１】
（実施例３-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号４７２-２０-１）を使用した。
【０１６２】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０１６３】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物（本発明品３-Ａ−１）とした。
【０１６４】
さらに、その粗抽出物を、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１６５】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度（本発明品３-Ａ−２）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１６６】
（実施例３-２）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号４０６-２０-１）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｂ−１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１６７】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｂ−２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｂ−３）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１６８】
（実施例３-３）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号５１４-２０-３）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｃ−１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１６９】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度（本発明品３-Ｃ−２）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１７０】
（実施例３-４）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号５２５-２０-２）を使用し、実施例３-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１７１】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｄ−１）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｄ−２）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１７２】
（実施例３-５）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・メタプシローシス（Candida metapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号５１０-１９-３）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｅ−１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１７３】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｅ−２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｅ−３）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１７４】
（実施例３-６）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0314）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｆ-１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１７５】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｆ-２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｆ-３）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１７６】
（実施例３-７）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0322）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｇ-１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１７７】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｇ-２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｇ-３）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１７８】
（実施例３-８）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0366）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｈ-１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１７９】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度（本発明品３-Ｈ-２）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１８０】
（実施例３-９）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・メタプシローシス（Candida metapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0439）を使用し、実施例３-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０１８１】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｉ−１）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｉ−２）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１８２】
（実施例３-１０）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0443）を使用し、実施例３-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０１８３】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｊ−１）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｊ−２）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１８４】
（実施例３-１１）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0184）を使用し、実施例３-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０１８５】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｋ−１）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｋ−２）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１８６】
（実施例３-１２）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0207）を使用し、実施例３-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０１８７】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｌ−１）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１８８】
（実施例３-１３）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ステアトリチカ（Candida steatolytica）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0221）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｍ-１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とし、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１８９】
（実施例３-１４）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ブチリ（Candida butyri）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0233）を使用し、実施例３-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０１９０】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｎ−１）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１９１】
（実施例３-１５）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ラギー（Candida rhagii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0248）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｏ−１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１９２】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｏ−２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｏ−３）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１９３】
（実施例３-１６）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・ジラノイデス（Candida zeylanoides）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0428）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｐ−１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１９４】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｐ−２）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１９５】
（実施例３-１７）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0325）を使用し、実施例３-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物を得た（本発明品３-Ｑ−１）。さらに、その粗抽出物を精製して得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０１９６】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品３-Ｑ−２）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０１９７】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）の培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０１９８】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、それぞれ上述実施例３-１〜３-１７で得たの大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０１９９】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とう混合した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０２００】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃の水浴で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２０１】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動混合し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０２０２】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０２０３】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表３−１〜表３−２に示した。
【０２０４】
【数１】
0005639713.tif 000006
【０２０５】
【表３−１】
0005639713.tif 000007
【０２０６】
【表３−２】
0005639713.tif 000008
【０２０７】
表３−１〜表３−２に示すように、実施例３-１、実施例３-６、３-７及び実施例３-１７で得た本発明品はセラミド産生促進効果及びグルコシルセラミド産生促進効果を示した。また、実施例３-２、実施例３-９〜３-１３及び実施例３-１５で得た本発明品は著しいグルコシルセラミド産生促進効果を示した。実施例３-３〜３-５、実施例３-８、実施例３-１４及び実施例３-１６で得た本発明品は著しいセラミド産生促進効果を示した。
【０２０８】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、そのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２０９】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例３-１〜３-１７で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
【０２１０】
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。
【０２１１】
（実施例４-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号４７６-２０-１）を使用した。
【０２１２】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０２１３】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、さらに、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２１４】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２１５】
（実施例４-２）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、原始番号５１４-２０-４）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２１６】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２１７】
（実施例４-３）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0356）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２１８】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２１９】
（実施例４-４）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0286）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２２０】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２２１】
（実施例４-５）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0287）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２２２】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２２３】
（実施例４-６）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0289）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２２４】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２２５】
（実施例４-７）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0290）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２２６】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２２７】
（実施例４-８）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・バンリジエ（Debaryomyces vanrijiae）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0198）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２２８】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０．１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２２９】
（実施例４-９）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0351）を使用し、実施例４-１と同様の方法で得た大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２３０】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２３１】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０２３２】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、それぞれ上述実施例４-１〜４-９の１％w/v含有量の大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０２３３】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０２３４】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２３５】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０２３６】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０２３７】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表４に示した。
【０２３８】
【数１】
0005639713.tif 000009
【０２３９】
【表４】
0005639713.tif 000010
【０２４０】
表４に示すように、実施例４-１及び実施例４-９で得た本発明品はセラミド産生促進効果及びグルコシルセラミド産生促進効果を示した。また、実施例４-２及び実施例４-４〜４-７で得た本発明品は著しいセラミド産生促進効果を示したが、実施例４-３及び実施例４-８で得た本発明品は著しいグルコシルセラミド産生促進効果を示した。
【０２４１】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２４２】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例４-１〜４-９で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。
【０２４３】
（実施例5-１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造（発酵液の処理）＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
【０２４４】
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Cryptococcus laurentii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0232として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【０２４５】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ａとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２４６】
当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｂ、5-Ｃとし、さらに、試料5-Ｂ、5-Ｃをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２４７】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０２４８】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料5-A、5-Ｂ、5-Ｃ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）をそれぞれ当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【０２４９】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０２５０】
（セラミド/グルコシルセラミド促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【０２５１】
（１）セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量に供した。
【０２５２】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【０２５３】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させ、冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２５４】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表５に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表５に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【０２５５】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０２５６】
表５から明らかなように、本発明品5-Ａ、5-Ｂ、5-Ｃは、セラミド産生促進効果が確認された。
【０２５７】
（実施例5-２）
実施例5-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Cryptococcus laurentii（番号CICIM Y0232）をCryptococcus hungaricus（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0203として受託されている。）に替えた以外、実施例5-１と同様に培養した。
【０２５８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２５９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｅ、5-Ｆとし、さらに、試料5-Ｅ、5-Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２６０】
実施例5-１と同様にして、試料5-Ｄ、5-Ｅ、5-Ｆのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０２６１】
表５から明らかなように、実施例5-２の試料5-Ｄ、5-Ｅ、5-Ｆは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０２６２】
（実施例5-３）
実施例5-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Cryptococcus laurentii（番号CICIM Y0232）をCryptococcus laurentii（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0218として受託されている。）に替えた以外、実施例5-１と同様に培養した。
【０２６３】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｇとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２６４】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｈとし、さらに、試料Ｈを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２６５】
実施例5-１と同様にして、試料5-Ｇ、5-Ｈのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０２６６】
表５から明らかなように、実施例5-３の試料5-Ｇ、5-Ｈは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０２６７】
（実施例5-４）
実施例5-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Cryptococcus laurentii（番号CICIM Y0232）をCryptococcus hungaricus（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0219として受託されている。）に替えた以外、実施例5-１と同様に培養した。
【０２６８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｉとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０２６９】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料5-Ｊとし、さらに、試料5-Ｊを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０２７０】
実施例5-１と同様にして、試料5-Ｉ、5-Ｊのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表５に示した。
【０２７１】
表５から明らかなように、実施例5-４の試料5-Ｉ、5-Ｊは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０２７２】
【表５】
0005639713.tif 000011
【０２７３】
なお、試料5-A〜5-Jについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例5-１と同様にした。その結果は、試料5-A〜5-Jの何れかにもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０２７４】
これから、本発明の製品自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製品が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが分かる。
【０２７５】
（実施例6-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0234）を使用した。
【０２７６】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０２７７】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、さらに、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０２７８】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１％（本発明品6-Ａ−１）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２７９】
（実施例6-２）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0205）を使用して、実施例6-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得て、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤（本発明品6-Ｂ−１）とし、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２８０】
（実施例6-３）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0257）を使用して、実施例6-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得て、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０．１ｖ/ｖ％の濃度（本発明品6-Ｃ-１）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２８１】
（実施例6-４）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0122）を使用して、実施例6-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得て、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤（本発明品6-Ｄ-１）とした。さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品6-Ｄ−２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品6-Ｄ−３）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２８２】
（実施例6-５）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0135）を使用して、実施例6-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得て、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤（本発明品6-Ｅ−１）とし、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２８３】
（実施例6-６）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・シフェリイ（Hansenula ciferrii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0150）を使用して、実施例6-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得て、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度（本発明品6-Ｆ-１）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２８４】
（実施例6-７）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0197）を使用して、実施例6-１と同様の方法で大豆残渣の発酵エキスを得て、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤（本発明品6-Ｇ-１）とした。さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品6-Ｇ−２）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品6-Ｇ−３）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０２８５】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０２８６】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、それぞれ上述実施例6-１〜6-７で得たの大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０２８７】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０２８８】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０２８９】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０２９０】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０２９１】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表６に示した。
【０２９２】
【数１】
0005639713.tif 000012
【０２９３】
【表６】
0005639713.tif 000013
【０２９４】
表６に示すように、実施例6-２で得た本発明品はセラミド産生促進効果及びグルコシルセラミド産生促進効果を示した。また、実施例6-１、実施例6-３及び実施例6-６で得た本発明品は著しいセラミド産生促進効果を示したが、実施例6-４及び実施例6-７で得た本発明品は著しいグルコシルセラミド産生促進効果を示した。
【０２９５】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０２９６】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例6-１〜6-７で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
【０２９７】
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。
【０２９８】
（実施例7-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ブレラ・ツガエ（Bullera tsugae）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0259）を使用した。
【０２９９】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０３００】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤含有の粗抽出物（本発明品7-Ａ）とした。
【０３０１】
さらに、その粗抽出物を、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０３０２】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％（本発明品7-Ｂ）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品7-Ｃ）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３０３】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０３０４】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、上述実施例7-１で得たの大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液（本発明品7-Ａ〜7-Ｃ）を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０３０５】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０３０６】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０３０７】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０３０８】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０３０９】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表７に示した。
【０３１０】
【数１】
0005639713.tif 000014
【０３１１】
【表７】
0005639713.tif 000015
【０３１２】
表７に示すように、実施例7-１で得た本発明品7-Ａ〜7-Ｃのいずれは著しいセラミド産生促進効果を示した。
【０３１３】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０３１４】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例7-１で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
【０３１５】
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。
【０３１６】
（実施例8-１）
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造（発酵液の処理）＞
まず、以下の方法で培地を調製した。大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させた。水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、滴り乾燥し、大豆残渣を得た。当該大豆残渣を、大豆残渣の濃度が１０ｗ/ｖ％、ブドウ糖の濃度が１ｗ/ｖ％になるように、ブドウ糖及び水と混合して、培地とした。
【０３１７】
次いで、上記培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、Rhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0250として受託されている。）を規定の量で接種し、３０℃で３日間培養した。
【０３１８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ａとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０３１９】
当該ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｂ、8-Ｃとし、さらに、試料8-Ｂ、8-Ｃをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３２０】
＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の評価＞
（細胞培養）
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。継代培養した後のヒト表皮角化細胞を１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０３２１】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更し、本発明の製品（試料8-Ａ、8-Ｂ、8-Ｃ）及びコントロール（50v/v%のエタノール溶液）をそれぞれ当該１２well Plate（n=2）に添加した。同じ条件で３日間培養した。
【０３２２】
その後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々の細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０３２３】
（セラミド/グルコシルセラミド促進効果の確認）
前記回収された細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍｌ：１．２５ｍｌ）加え攪拌し、次に、２０分間振とうした。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清aと沈殿bを取り分けて、その上清aをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿bを次のタンパク量解析に供した。
【０３２４】
（１）セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析
上清aにPBS：クロロホルム（１．２５ｍｌ：１．２５ｍｌ）を入れ、２０分間振動し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収されたクロロホルム層を３０℃、窒素雰囲気で乾固させた。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量に供した。
【０３２５】
セラミド（又はグルコシルセラミド）標準品と試料溶液とを乾燥のTLC板に入れ、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を解析した。
【０３２６】
（２）タンパク量の解析
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量の解析を行った。上記沈殿ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ナトリウム）溶液を入れ、混合し、６０℃で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させ、冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法（タンパク量の解析用のキット）によりタンパク量（Proと記する。μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０３２７】
（３）解析の結果
本発明品とコントロールの試料のそれぞれに対して、下式のように、Cer/ProとGlyCer/Proを測定した。前記コントロールのCer/ProとGlyCer/Proのそれぞれを１とした場合の、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出して表８に示した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００とした場合の、本発明のwellあたりのタンパク量の相対値（Pro.（％））を算出して、それによりwellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表８−１〜表８−２に示した。
Cer/Well=Cer/Pro×Pro.(%)
GlyCer/Well=GlyCer/Pro×Pro.(%)
【０３２８】
なお、Cer/Pro（又はCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がセラミド産生促進効果を有すると見なされる。また、GlyCer/Pro（又はGlyCer/Well）が１（コントロール）よりも高い場合、当該試料がグルコシルセラミド産生促進効果を有すると見なされる。
【０３２９】
表８−１〜表８−２から明らかなように、本発明品8-Ａ、8-Ｂ、8-Ｃは、セラミド産生促進効果が確認された。
【０３３０】
（実施例8-２）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0433として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３３１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｄとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０３３２】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｅ、8-Ｆとし、さらに、試料8-Ｅ、8-Ｆをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３３３】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｄ、8-Ｅ、8-Ｆのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３３４】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-２の試料8-Ｅ、8-Ｆは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３３５】
（実施例8-３）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0430として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３３６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｇとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０３３７】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｇのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３３８】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-３の試料8-Ｇは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３３９】
（実施例8-４）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula glutinis（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0148として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３４０】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｈとし、さらに、試料8-Ｈを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３４１】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｈのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３４２】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-４の試料8-Ｈは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３４３】
（実施例8-５）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0324として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３４４】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｉ、8-Ｊとし、さらに、試料8-Ｉ、8-Ｊをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３４５】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｉ、8-Ｊのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３４６】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-５の試料8-Ｉ、8-Ｊは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３４７】
（実施例8-６）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0337として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３４８】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｋとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０３４９】
実施例8-１と同様にして、試料Ｋのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３５０】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-６の試料8-Ｋは、グルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３５１】
（実施例8-７）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0394として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３５２】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｌとし、さらに、試料8-Ｌを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３５３】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｌのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３５４】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-７の試料8-Ｌは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３５５】
（実施例8-８）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（CICIMに番号CICIM Y0418として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３５６】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、1mlの混合液を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｍとし、４℃の冷蔵庫で保存して、細胞培養に供する。
【０３５７】
上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｎ、8-Ｏとし、さらに、試料8-Ｎ、8-Ｏをそれぞれ５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％及び０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３５８】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｍ、8-Ｎ、8-Ｏのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３５９】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-８の試料8-Ｍ、8-Ｎ、8-Ｏは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３６０】
（実施例8-９）
実施例8-１に記載の＜セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造＞において、Rhodotorula mucilaginosa（江南大学工業微生物資源および情報センター（番号CICIM Y0250）をRhodotorula mucilaginosa（CICIMに番号CICIM Y0423として受託されている。）に替えた以外、実施例8-１と同様に培養した。
【０３６１】
得られた培養液に対して、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離を行った。残した培養上清に対して、２．５倍体積のＥｔＯＨを加え、上記ＥｔＯＨを加えた混合液を、超音波処理装置で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で乾燥処理して一定の重さになった。当該乾燥品を本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の試料8-Ｐとし、さらに、試料8-Ｐを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％の濃度の溶液に調製した後、４℃の冷蔵庫で保存して、次の細胞培養に供した。
【０３６２】
実施例8-１と同様にして、試料8-Ｐのセラミド/グルコシルセラミド産生促進効果を評価した。その結果を合わせて表８−１〜表８−２に示した。
【０３６３】
表８−１〜表８−２から明らかなように、実施例8-９の試料8-Ｐは、セラミド及びグルコシルセラミド産生促進効果を示すことが確認された。
【０３６４】
【表８−１】
0005639713.tif 000016
【０３６５】
【表８−２】
0005639713.tif 000017
【０３６６】
なお、試料8-Ａ〜8-Ｐについて、それらを上記ヒトの活性化角化細胞を含む１２well Plateに加えることを行わない（即ち、上記細胞培養を行わない）ままで、セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析を行った。上記以外は、上記実施例8-１と同様にした。その結果は、試料8-Ａ〜8-Ｐの何れかにもセラミド又はグルコシルセラミドが存在しないことが確認された。
【０３６７】
これから、本発明の製造物自身には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、本発明の製造物が、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進の効果を有し、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが分かる。
【０３６８】
（実施例9-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0247）を使用した。
【０３６９】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０３７０】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の粗抽出物（本発明品9-Ａ）を得た。さらに、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３７１】
（実施例9-２）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0193）を使用し、実施例9-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の粗抽出物を得た。さらに、その粗抽出物を、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０３７２】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％（本発明品9-Ｂ）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３７３】
（実施例9-３）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0132）を使用し、実施例9-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の粗抽出物を得た（本発明品9-Ｃ）。さらに、その粗抽出物を、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０３７４】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１ｖ/ｖ％の濃度（本発明品9-Ｄ）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３７５】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）の培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０３７６】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、それぞれ上述実施例9-１〜9-３で得たの大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０３７７】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とう混合した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０３７８】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃の水浴で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０３７９】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動混合し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０３８０】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０３８１】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表９に示した。
【０３８２】
【数１】
0005639713.tif 000018
【０３８３】
【表９】
0005639713.tif 000019
【０３８４】
表９に示すように、実施例9-１及び実施例9-３で得た本発明品は著しいグルコシルセラミド産生促進効果を示した。実施例9-２で得た本発明品は著しいセラミド産生促進効果を示した。
【０３８５】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、そのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０３８６】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例9-１〜9-３で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
【０３８７】
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。
【０３８８】
（実施例10-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ブレタノマイセス・クラウセニィ（Brettanomyces claussenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0125）を使用した。
【０３８９】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０３９０】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、さらに、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０３９１】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度（本発明品10-Ａ）に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３９２】
（実施例10-２）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ブレタノマイセス・クラウセニィ（Brettanomyces claussenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0251）を使用し、実施例10-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０３９３】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、０.１ｖ/ｖ％（本発明品10-Ｂ）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３９４】
（実施例10-３）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ブレタノマイセス・クラウセニィ（Brettanomyces claussenii）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、受託番号CICIM Y0127）を使用し、実施例10-１と同様の方法で本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として大豆残渣の発酵エキスを得た。
【０３９５】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、それぞれ１ｖ/ｖ％（本発明品10-Ｃ）及び０.１ｖ/ｖ％（本発明品10-Ｄ）の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０３９６】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）の培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０３９７】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、それぞれ上述実施例10-１〜10-３で得たの大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０３９８】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とう混合した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０３９９】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃の水浴で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０４００】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動混合し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０４０１】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０４０２】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１０に示した。
【０４０３】
【数１】
0005639713.tif 000020
【０４０４】
【表１０】
0005639713.tif 000021
【０４０５】
表１０に示すように、実施例10-１で得た本発明品はセラミド産生促進効果及びグルコシルセラミド産生促進効果を示した。また、実施例10-２及び実施例10-３で得た本発明品は著しいグルコシルセラミド産生促進効果を示した。
【０４０６】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、そのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０４０７】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例10-１〜10-３で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
【０４０８】
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。
【０４０９】
（実施例11-１）
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤の製造）
大豆残渣からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を製造する微生物として、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）（江南大学から購入され、中国高校工業微生物資源および情報センターCICIMに受託され、委託番号CICIM Y0311）を使用した。
【０４１０】
ＹＰＤ培地（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）で３０℃培養して得られたの上記菌株を、セラミド／グルコシルセラミド産生促進剤製造培地（１０ｗ/ｖ％大豆残渣、１ｗ/ｖ％葡萄糖）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。その中、大豆残渣は大豆を水に入れ、１２時間含浸し、大豆に水を十分に吸収させて、水を吸収した大豆を研削して粉砕し、濾過、乾燥を経て調製した。
【０４１１】
得られた培養液中からセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を精製するために、３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎｓ遠心分離で菌体を除き、回収した培養上清に対して、２．５倍体積の無水ＥｔＯＨを加え、さらに、超音波処理装置（Branson社製）で１０分間処理し、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎｓ遠心分離で上清を回収した。その上清（約７０ｍＬ）をろ紙でろ過して、さらに濾過液を真空乾燥機で（４０℃以下）乾燥処理して一定の重さになった大豆残渣の発酵エキスを、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤とした。
【０４１２】
さらに、その大豆残渣の発酵エキスを５０ｖ/ｖ％ＥｔＯＨで溶解し、１％の濃度に調製後、４℃で保存して、次のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験に供する。
【０４１３】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進試験）
＜角化細胞（Keratinocytes）の培養＞
まず、正常ヒトの活性化角化細胞（Cascade Co., Ltd）を初代細胞として、７５ｃｍ2の培養フラスコ（増殖因子を含有する培地２ｍｌ）に、７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで培養した。継代細胞を１７５ｃｍ2の培養フラスコに８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまでに持続培養した。さらに１２well Plate （細胞数１×１０5個/ｍＬ）に２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターにて８０〜９０％コンフルエントの状態に達するまで持続培養した。
【０４１４】
次いで、上記１２well Plateにおいて増殖因子を含有しない培地を変更して、それぞれ上述実施例11-１で得たの大豆残渣の発酵エキスのエタノール溶液を２０μｌ/Ｗｅｌｌずつ添加した。なお、コントロールとしてエタノールのみ（セラミド及びグルコシルセラミド産生促進剤無添加）を添加した。同じ条件で７２時間培養した。７２時間培養した後、上清の培養液を除去し、PBS（２ｍＬ/Ｗｅｌｌ）にて細胞を２回洗浄した後、１ｍＬＰＢＳを入れ、各々細胞をセルハーベスターで試験管に回収した。それを、後のセラミド、グルコシルセラミド及び蛋白質の解析用の試料とした。
【０４１５】
＜脂質抽出＞
脂質抽出は、Bligh & Dyer法を用いて行った。具体的には、前記回収した細胞を含むＰＢＳ液に、まず、メタノール：クロロホルム（２．５ｍＬ：１．２５ｍＬ）加え攪拌し、次に、２０分間振とう混合した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清Ａと沈殿Ｂを取り分けて、その上清Ａをセラミド量及びグルコシルセラミド量解析に供し、沈殿Ｂを次のタンパク量解析に供する。
【０４１６】
＜タンパク量解析＞
細胞中のセラミド量及びグルコシルセラミド量を表示するためにタンパク量解析を行った。回収した沈殿Ｂに、９００μｌ  ＳＤＳ溶液を入れ、混合し、６０℃の水浴で２時間加熱した後、タンパク質を変性・分解させるように冷却した。次いで、１００μｌ  ２Ｎ  ＨＣｌを加え、ＢＣＡ  Ｋｉｔ法によりタンパク量（μｇ/ｍＬ）を測定した。
【０４１７】
＜セラミド量及びグルコシルセラミド量の解析＞
残った上清ＡにPBS：クロロホルム（１．２５ｍＬ：１．２５ｍＬ）を入れ、２０分間振動混合し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、下相にあるクロロホルム層を単離、回収した。回収したクロロホルム層を３０℃、窒素還流下で乾固させて乾燥品を得た。乾燥品をクロロホルム−メタノール混合溶媒（容量比＝２.５ｍｌ：１.２５ｍｌ）１００μｌに溶解し、下記の薄層クロマトグラフィーによりセラミド及びグルコシルセラミドの定量（それぞれをCer及びGlyCerとし、単位μｇ/ｍＬ）を行った。
【０４１８】
乾燥のTLC板を利用して、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のトップに到達した後、ドライヤーで展開剤を乾燥した。次いで上記操作を１回繰り返した。その後、展開溶媒であるクロロホルム：メタノール：アセトン＝７６：２０：４（ｖ/ｖ/ｖ）で薄層クロマトグラフィーを行った。展開剤がＴＣＬ板のボタムからの２．５ｃｍの位置に到達した後、展開を停止し、ドライヤーで展開剤を乾燥した。硫酸銅のリン酸溶液を噴霧し、乾燥して、ＴＣＬ板を１８０℃のヒータに置き７分間加熱して顕色させた。顕色されたTLC板をスキャンしてセラミド（又はグルコシルセラミド）の量を解析した。
【０４１９】
その後、下式１より、得られた値を各々のタンパク量で割り、Cer/ProとGlyCer/Proが得られる。前記コントロールのそれぞれCer/ProとGlyCer/Proを１として、本発明のCer/ProとGlyCer/Proの相対値を算出した。また、前記コントロールのwellあたりのタンパク量を１００として、wellあたりのセラミドの量及びグルコシルセラミド量（それぞれをCer/Well及びGlyCer/Wellとし、コントロールに対する相対量）を求めた。合わせて表１１に示した。
【０４２０】
【数１】
0005639713.tif 000022
【０４２１】
【表１１】
0005639713.tif 000023
【０４２２】
表１１に示すように、実施例11-１で得た本発明品は著しいグルコシルセラミド産生促進効果を示した。
【０４２３】
従って、本発明のセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤は、そのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果が認められた。
【０４２４】
（セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤にセラミド及び／又はグルコシルセラミドが存在しないことを証明する試験）
上記細胞培養を行わなく、TLC法のみで上記実施例11-１で得たのセラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤を解析して、その結果として、本発明品の中にはセラミド／グルコシルセラミドは存在しないことを示した。
【０４２５】
このことから、本発明品自体には、セラミド又はグルコシルセラミドが存在しないが、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進効果を有し、さらに、セラミド及び／又はグルコシルセラミド産生促進剤として用い得ることが確認された。