(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドを少なくとも２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する組成物であって、該第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化され、該組成物は二価の金属カチオンを１０ｍＭより高い濃度で含有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度が３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)より低い組成物。
【請求項２】
前記ＰＥＧ部分が、少なくとも３００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＥＧ部分が４０ｋＤａの分子量を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記二価の金属カチオンが、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｓｍ２＋からなる列挙から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドがヒト第ＶＩＩａ因子である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子配列変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在している、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
４．０〜８．０の範囲のｐＨを有する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記二価の金属カチオンが、少なくとも２０ｍＭの濃度で存在している、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
浸透圧調節剤をさらに含有し、浸透圧調節剤が、中性塩、アミノ酸、２−５のアミノ酸残基のペプチド、単糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される少なくとも一である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも一の浸透圧調節剤が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群から選択される中性塩である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された粘度が、２５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)より低い、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物の粘度を低下させる方法であって、該方法が、１０ｍＭより高い最終濃度になるまで、二価の金属カチオンを添加することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペグ化されたＧＬＡ-ドメイン含有タンパク質を含む組成物に関する。特に本発明は、低粘度の液状組成物に関する。本発明は、第Ｘ因子ポリペプチド(ＦＸ／ＦＸａ)、第ＩＸ因子ポリペプチド(ＦＩＸ／ＦＩＸａ)、第ＶＩＩ因子ポリペプチド(ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ)、及び抗凝固プロテインＣ、特に第ＶＩＩ因子ポリペプチドから選択される凝固因子の組成物の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫ依存性タンパク質とも称されるＧＬＡ-ドメイン含有タンパク質は、分子のアミノ末端部分に共通する構造的特徴を共有することで、他のタンパク質とは区別される。Ｇｌａ-ドメインとも称されるこれらのタンパク質のＮ末端は、酵素γ-グルタミルカルボキシラーゼにより触媒されるビタミンＫ依存性反応においてグルタメートから合成される普通でないアミノ酸γ-カルボキシグルタミン酸に富む。約２〜１２のＧｌａ残基が存在するため、Ｇｌａ-ドメインは二価のカチオン、例えばＣａ２＋に結合可能であることによって特徴付けられる。金属イオンの結合の際、これらのタンパク質は、円二色性及び蛍光放射等の、いくつかの技術により測定可能な立体構造変化を受ける。
多くの場合、貯蔵及びデリバリーの双方に適したＧＬＡ-ドメイン含有タンパク質の高濃度組成物が所望されている。通常、薬剤製品は液体として保存され、投与される。また、薬剤製品は凍結乾燥、すなわちフリーズドライされ、患者に使用する前に、適切な希釈剤を添加することにより再構成される。
【０００３】
しかしながら、このようなＧＬＡ-ドメイン含有タンパク質がＰＥＧ部分とコンジュゲートされると、このような組成物は、薬剤製品を濃縮した場合に、粘度が増加してしまう。従って、この発明の目的は、高濃度のペグ化されたＧＬＡ-ドメイン含有タンパク質を含有する低濃度の組成物を提供することにある。米国特許出願第20050175603号は、低減した粘度を有する濃縮タンパク質製剤に関する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者は、少なくとも一の二価の金属カチオンと共に、ペグ化されたビタミンＫ依存性タンパク質を含有する組成物が、二価のカチオンを含有しないこれらの組成物と比較して、低減した粘度を示すことを発見した。
よって、広い態様では、本発明は、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する組成物に関し、ここで関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、該組成物は二価の金属カチオンを１０ｍＭより高い濃度で含有する。
【０００５】
本発明の第２の態様は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する組成物に関し、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、該組成物は二価の金属カチオンを１０ｍＭより高い濃度で含有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度は３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下である。
【０００６】
本発明の第３の態様は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する液状の水性製薬用組成物に関し、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、該組成物は二価の金属カチオンを１０ｍＭより高い濃度で含有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度は３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下であり；医薬として使用される。
【０００７】
本発明の第４の態様は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する液状の水性製薬用組成物の使用に関し、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、該組成物は二価の金属カチオンを１０ｍＭより高い濃度で含有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度は３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下であり；関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＶＩＩ因子反応性症候群を治療する医薬を製造するための第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。
【０００８】
本発明の第５の態様は、第ＶＩＩ因子反応性症候群を治療する方法に関し、該方法は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する液状の水性製薬用組成物を有効量、それを必要とする被験者に投与することを含み、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、該組成物は１０ｍＭより高い濃度で二価の金属カチオンを有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度は３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下であり、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。
【０００９】
本発明の第６の態様は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する組成物の粘度を低下させる方法に関し、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度は３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下であり、該方法は、１０ｍＭより高い最終濃度になるまで、二価の金属カチオンを添加する工程を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
(発明の詳細な記述)
上述したように、本発明は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する新規の組成物を開発することにあり、ここで、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、該組成物は二価の金属カチオンを１０ｍＭより高い濃度で有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度は３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下である。
【００１１】
ここで使用される場合、「関心あるビタミンＫ依存性」タンパク質なる用語は、ＧＬＡ-ドメイン含有タンパク質を意味する。ビタミンＫ依存性タンパク質には、限定されるものではないが、次のタンパク質：ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第ＩＩ因子(プロトロンビン)、トロンビン、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、プロテインＣ、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、プロテインＺ、膜貫通ガンマ-カルボキシグルタミン酸タンパク質１、膜貫通ガンマ-カルボキシグルタミン酸タンパク質２、膜貫通ガンマ-カルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通ガンマ-カルボキシグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルチンが含まれる。
【００１２】
一実施態様において、二価の金属カチオンは、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｍ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｓｍ２＋からなる列挙から選択される。特定の一実施態様において、二価の金属カチオンはＣａ２＋である。
【００１３】
種々の実施態様において、ＰＥＧ部分は少なくとも３００Ｄａ、例えば少なくとも５００Ｄａ、例えば少なくとも１０００Ｄａ、例えば少なくとも５ｋＤａ、例えば少なくとも１０ｋＤａの分子量を有する。
種々の実施態様において、ＰＥＧ部分は少なくとも４０ｋＤａの分子量を有する。
【００１４】
種々の実施態様において、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、例えばヒト第ＶＩＩａ因子である。
種々の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子配列変異体である。
【００１５】
種々の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比率は、ここに記載されるような「インビトロタンパク質分解アッセイ」でテストした場合に、少なくとも１．２５である。
種々の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも３５ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも４０ｍｇ／ｍＬ、例えば２０-５０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば２０-４０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば２０-３０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在している。
【００１６】
種々の実施態様において、本発明の組成物は、約４．０〜約８．０の範囲のｐＨを有する。
種々の実施態様において、二価の金属カチオンは、少なくとも２０ｍＭ、例えば少なくとも３０ｍＭ、例えば少なくとも４０ｍＭ、例えば少なくとも５０ｍＭ、例えば少なくとも６０ｍＭ、例えば１０-１００ｍＭの範囲の濃度で存在している。
【００１７】
種々の実施態様において、本発明の組成物は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、グリシンアミド、リン酸、酢酸、乳酸、及びコハク酸の酸及び塩からなる群から選択される緩衝剤をさらに含有する。一実施態様において、この緩衝剤の濃度は１-１００ｍＭである。
種々の実施態様において、本発明の組成物は、ポリソルバート類、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エチレン／ポリプロピレンブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリオキシエチレンステアラート、及びポリオキシエチレンヒマシ油からなる群から選択される非イオン性界面活性剤をさらに含有する。
【００１８】
種々の実施態様において、本発明の組成物は、浸透圧調節剤をさらに含有する。一実施態様において、浸透圧調節剤は、中性塩、アミノ酸、２-５のアミノ酸残基のペプチド、多糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される少なくとも一である。
一実施態様において、少なくとも一の浸透圧調節剤は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群から選択される中性塩である。
一実施態様において、浸透圧調節剤は、少なくとも１ｍＭの濃度で存在している。
【００１９】
種々の実施態様において、本発明の組成物は、酸化防止剤をさらに含有する。一実施態様において、酸化防止剤は、Ｌ-メチオニン、Ｄ-メチオニン、メチオニン類似体、メチオニン含有ペプチド、メチオニンホモログ、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、及びシススタチオニン(cysstathionine)から選択される。一実施態様において、酸化防止剤は０．１-５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在している。
【００２０】
種々の実施態様において、本発明の組成物は、保存料をさらに含有する。一実施態様において、保存料は、フェノール、ベンジルアルコール、オルト-クレゾール、メタ-クレゾール、パラ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンザエトニウム(benzaethonium chloride)からなる群から選択される。
【００２１】
種々の実施態様において、本発明の組成物は液状の水性製薬用組成物である。
種々の実施態様において、本発明の組成物は、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、トロンビン、及びプロテインＣからなる列挙から選択される、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する。
【００２２】
種々の実施態様において、本発明の組成物は、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合、２５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下、例えば２０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下、例えば１５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下、例えば１０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下、例えば５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下の粘度を有する。
特定の実施態様において、二価の金属カチオンはカルシウム(Ｃａ２＋)であり、前記薬剤の濃度は少なくとも１０ｍＭである。
【００２３】
ここで使用される場合「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、野生型第ＶＩＩ因子(すなわち、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド)、並びに野生型第ＶＩＩ因子に対して、実質的に同等又は改善された生物活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体が含まれる。「第ＶＩＩ因子」なる用語は、それらの未切断(チモーゲン)形態にある第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びに第ＶＩＩａ因子と命名されてもよい、それぞれの生物活性形態が生じるようにタンパク質分解的にプロセシングされたものを含むことを意図している。典型的には、第ＶＩＩ因子は残基１５２と１５３の間が切断されて、第ＶＩＩａ因子を生じる。また、「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、第ＶＩＩａ因子の生物活性が、野生型第ＶＩＩａ因子に対して、実質的に同等又はある程度低減している変異体を含む、ポリペプチドを含む。これらのポリペプチドには、限定されるものではないが、特定のアミノ酸配列変化がポリペプチドの生物活性を修正又は破壊するように導入された第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子が含まれる。血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)組織因子(ＴＦ)に結合し、(ｉｉ)第ＩＸ因子又は第Ｘ因子をタンパク質分解的に切断し、活性化した第ＩＸ因子又は第Ｘ因子(それぞれ、第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子)を生成する能力に由来する。
【００２４】
本発明の目的について、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性(「第ＶＩＩ因子の生物活性」)は、例えば米国特許第5,997,864号又は国際公開第92/15686号に記載されているようにして、又は明細書のアッセイ４(以下参照)に記載されているようにして、第ＶＩＩ因子-欠損血漿及びトロンボプラスチンを使用し、血液凝固を促進させる調製物の能力を測定するアッセイにより定量化されてよい。また、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)第Ｘ因子、及び脂質膜に包埋したＴＦを含む系において、活性化した第Ｘ因子(第Ｘａ因子)を生成する、第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの能力を測定し(Perssonら, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ｉｉ)水系における第Ｘ因子の加水分解度を測定し(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、以下のアッセイ２)；(ｉｉｉ)表面プラズモン共鳴をベースにした装置を使用し、ＴＦに対する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ関連ポリペプチドの物理的結合度を測定し(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(ｉｖ)第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩ関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解度を測定し(「インビトロ加水分解アッセイ」、以下のアッセイ１)；又は(ｖ)インビトロ系における、ＴＦ-非依存性での、トロンビン生成度を測定する(以下のアッセイ３)ことにより定量化されてよい。
【００２５】
野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に同等又は改善された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、一又は複数の上述した凝血アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイでテストされる場合、同じ細胞系で生成される第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示すものが含まれる。野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に低減した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、一又は複数の上述した凝血アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイでテストされる場合、同じ細胞系で生成される野生型第ＶＩＩａ因子の特異的活性の約２５％未満、例えば約１０％未満、又は約５％未満を示すものである。野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に変化した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、限定されるものではないが、ＴＦ-非依存性第Ｘ因子タンパク質分解活性を示す第ＶＩＩ因子変異体、及びＴＦに結合するが、第Ｘ因子を切断しないものが含まれる。
【００２６】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同等又は良好な生物活性を示す、又は野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に変化又は低減した生物活性を示すに関わらず、 第ＶＩＩ因子変異体には、限定されるものではないが、一又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換による、野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００２７】
野生型第ＶＩＩ因子と比較して実質的に同等な生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ(Linoら, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第5,580,560号に開示されたような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク質分解的に切断された第ＶＩＩａ因子(Mollerupら, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第ＶＩＩａ因子の酸化形態(Kornfeltら, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；PCT/DK02/00189に開示されているＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第02/38162号に開示されたような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体(Scripps Research Institute)；国際公開第99/20767号(ミネソタ大学)に開示されたような、高められた膜結合性を示し、修飾されたＧｌａ-ドメインを有するＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第01/58935号(Maxygen ApS)に開示されたようなＦＶＩＩ変異体が含まれる。
【００２８】
野生型ＦＶＩＩａと比較して増加した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、国際公開第01/83725号、国際公開第02/22776号、国際公開第02/077218号、国際公開第03/027147号、国際公開第03/37932号；国際公開第02/38162号(Scripps Research Institute)に開示されたようなＦＶＩＩ変異体；及び日本国特許第2001061479号(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示されたような高められた活性を有するＦＶＩＩａ変異体が含まれる。
野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に低減した又は変化した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｒ１５２Ｅ-ＦＶＩＩａ(Wildgooseら, Biochem 29:3413-3420、1990)が含まれる。
【００２９】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの非限定的例には、限定されるものではないが、野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ-ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４���／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ���９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１
５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ-第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ-第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインが欠失した第ＦＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、及びＩｌｅ１５３-Ａｒｇ２２３のアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。
【００３０】
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはヒト第ＶＩＩａ因子(ｈＦＶＩＩａ)、好ましくは組換え的に作製されたヒト第ＶＩＩａ因子(ｒｈＶＩＩａ)である。
他の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子配列変異体である。
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子とは異なるグリコシル化を有する。
【００３１】
様々な実施態様、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＶＩＩ因子配列変異体である実施態様において、本明細書に記載されたような「インビトロタンパク質分解アッセイ」(アッセイ２)でテストされる場合、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ)の活性との比率は、少なくとも約１．２５、好ましくは少なくとも約２．０又は４．０、最も好ましくは少なくとも約８．０である。
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチド、特に変異体であり、ここで、「インビトロ加水分解アッセイ」(以下の「アッセイ」を参照)でテストされる場合、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ)の活性との比率は少なくとも約１．２５であり；他の実施態様において、該比率は少なくとも約２．０であり；さらなる実施態様において、該比率は少なくとも約４．０である。
【００３２】
一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されている関心あるビタミンＫ依存性タンパク質であって、ここでは第ＶＩＩ因子ポリペプチドである、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質には、限定されるものではないが、国際公開第03/31464号及び米国特許出願第US 20040043446号、US 20040063911号、US 20040142856号、US 20040137557号、US 20040132640号、国際公開第2007022512号、及びUS 20070105755号(Neose Technologies, Inc.)に開示されたようなグリコペグ化されたＦＶＩＩ誘導体；国際公開第01/04287号、米国特許出願第20030165996号、国際公開第01/58935号、国際公開第03/93465号(Maxygen ApS)及び国際公開第02/02764号、米国特許出願第20030211094号(ミネソタ大学)に開示されたようなペグ化されたＦＶＩＩコンジュゲートが含まれる。
【００３３】
第ＶＩＩａ因子の濃度は、便宜的にｍｇ／ｍＬ又はＩＵ／ｍＬとして表され、通常、１ｍｇは４３０００−５６０００ＩＵ又はそれ以上を表す。
【００３４】
液状にするために、哺乳動物、例えばヒトへの直接的非経口投与に有用な液状の水性製薬用組成物は、通常、組成物のｐＨ値が所定の限界内、例えば約４．０〜約９．０で保持されることが必要である。付与された条件下で、適切なｐＨ値を確実にするために、製薬用組成物は、約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持するのに適切な緩衝剤(ｉｉ)をさらに含有する。
「緩衝剤」なる用語は、約４．０〜約９．０の許容範囲に溶液ｐＨを維持する薬剤又は薬剤の組合せを含む。本用語は、安定化する二価金属イオンに結合する能力が適切に制限された(すなわち、本発明による酸化状態＋ＩＩの第１遷移系列金属との金属錯体の形成の制限)薬剤又は薬剤の組合せをさらに包含する。一実施態様において、組成物における緩衝剤又は薬剤と二価の金属イオンとの組合せは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する二価の金属イオンの結合親和性と比較して、約１％又はそれ以下の結合親和性を示す。
【００３５】
一実施態様において、緩衝剤(ｉｉ)は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、グリシンアミド、ヒスチジン(例えばＬ-ヒスチジン)、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グルタル酸、クエン酸(例えば、クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム)、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、リン酸(例えば、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム)、酢酸(例えば、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又は酢酸カルシウム)、乳酸、及びコハク酸等の酸及びその塩からなる群から選択される、少なくとも一の成分である。緩衝剤は、２又はそれ以上の成分の混合物を含んでいてもよく、ここで該混合物は、特定の範囲のｐＨ値を提供可能なものであると理解されるべきである。例として、酢酸及び酢酸ナトリウム、酢酸及びヒスチジン等を挙げることができる。
緩衝剤の濃度は、溶液が好ましいｐＨを維持できるように選択される。種々の実施態様において、緩衝剤の濃度は、１−１００ｍＭ；１−５０ｍＭ；１−２５ｍＭ；又は２−２０ｍＭである。
【００３６】
一実施態様において、組成物のｐＨは、約４．０〜約９．０；例えば約５．０〜約９．０、約４．０〜約８．０、約４．０〜約７．５、約４．０〜約７．０；約４．５〜約７．５；約４．５〜約７．０；約５．０〜約７．５；約５．０〜約７．０；約５．０〜約６．５；約５．０〜約６．０；約５．５〜約７．５；約５．５〜約７．０；約５．５〜約６．５；約６．０〜約７．５；約６．５〜約７．５；又は約６．０〜約７．０；約６．４〜約６．６、又は約６．５、約５．２〜約５．７、又は約５．５で維持されている。
【００３７】
製薬用組成物は、非イオン性界面活性剤をさらに含有していてもよい。「界面活性剤」(洗浄剤としても公知)には、空気／溶液界面誘発性のストレス、及び溶液／表面誘発性のストレス(例えば、タンパク質凝集に至る)からタンパク質を保護する薬剤が含まれる。
典型的な種類の非イオン性界面活性剤は、ポリソルバート(polysorbates)、ポロキサマー(poloxamers)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレン／ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリオキシエチレンステアラート、及びポリオキシエチレンヒマシ油である。非イオン性界面活性剤の例証例は、トゥイーン(Tween)(登録商標)、ポリソルバート２０、ポリソルベート８０、ビリジ(Brij)-３５(ポリオキシエチレンドデシルエーテル)、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ＰＥＧ８０００、プルロニック(Pluronic)(登録商標)ポリオール類、ポリオキシ-２３-ラウリルエーテル、ピリジ３５、ミリジ(Myrj)４９、及びクレモフォア(Cremophor)Ａである。
一実施態様において、非イオン性界面活性剤は、０．００５−２．０重量％の量で存在している。
【００３８】
４つの必須の成分に加えて、液状の水性製薬用組成物は、組成物の調製、処方、安定化、又は投与に有益なさらなる成分を含有していてもよい。
組成物は浸透圧調節剤(ｖ)をさらに含有していてもよい。
ここで使用される場合、「浸透圧調節剤」なる用語には、溶液の浸透圧に寄与する薬剤が含まれる。浸透圧調節剤(ｖ)には、中性塩、アミノ酸、２〜５のアミノ酸残基のペプチド、単糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される、少なくとも一が含まれる。いくつかの実施態様において、組成物は、２又はそれ以上のこのような薬剤の組合せを含有する。
「中性塩」とは、水溶液に溶解したときに、酸でも塩基でもない塩を意味する。
【００３９】
一実施態様において、少なくとも一の浸透圧調節剤(ｖ)は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、カルシウムラエブラート(laevulate)、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、及びマグネシウムラエブラートからなる群から選択される中性塩である。
さらなる実施態様において、浸透圧調節剤(ｖ)には、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム、及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一と組合せて、塩化ナトリウムが含まれる。
さらなる実施態様において、浸透圧調節剤(ｖ)は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも一である。
【００４０】
種々の実施態様において、浸透圧調節剤(ｖ)は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１５００ｍＭ、少なくとも１８００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、又は少なくとも２２００ｍＭの濃度で存在している。
一連の実施態様において、浸透圧調節剤(ｖ)は、５−２２００ｍＭ、例えば２５−２２００ｍＭ、５０−２２００ｍＭ、１００−２２００ｍＭ、２００−２２００ｍＭ、４００−２２００ｍＭ、６００−２２００ｍＭ、８００−２２００ｍＭ、１０００−２２００ｍＭ、１２００−２２００ｍＭ、１４００−２２００ｍＭ、１６００−２２００ｍＭ、１８００−２２００ｍＭ、又は２０００−２２００ｍＭ；５−１８００ｍＭ、２５−１８００ｍＭ、５０−１８００ｍＭ、１００−１８００ｍＭ、２００−１８００ｍＭ、４００−１８００ｍＭ、６００−１８００ｍＭ、８００−１８００ｍＭ、１０００−１８００ｍＭ、１２００−１８００ｍＭ、１４００−１８００ｍＭ、１６００−１８００ｍＭ；５−１５００ｍＭ、２５−１４００ｍＭ、５０−１５００ｍＭ、１００−１５００ｍＭ、２００−１５００ｍＭ、４００−１５００ｍＭ、６００−１５００ｍＭ、８００−１５００ｍＭ、１０００−１５００ｍＭ、１２００−１５００ｍＭ；５−１２００ｍＭ、２５−１２００ｍＭ、５０−１２００ｍＭ、１００−１２００ｍＭ、２００−１２００ｍＭ、４００−１２００ｍＭ、６００−１２００ｍＭ、又は８００−１２００ｍＭの濃度で存在している。
【００４１】
本発明の一実施態様において、少なくとも一の浸透圧調節剤(ｖ)は、イオン強度調節剤(ｖ／ａ)である。
ここで使用される場合、「イオン強度調節剤」なる用語には、溶液のイオン強度に寄与する薬剤が含まれる。前記薬剤には、限定されるものではないが、中性塩、アミノ酸、２〜５のアミノ酸残基のペプチドが含まれる。いくつかの実施態様において、組成物は、２又はそれ以上のこのような薬剤の組合せを含有する。
イオン強度調節剤(ｖ／ａ)の非限定的例には、中性塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムである。一実施態様において、前記薬剤(ｖ／ａ)は塩化ナトリウムである。
【００４２】
「イオン強度」なる用語は、等式：μ＝１／２ Σ(［ｉ］(Ｚｉ２))で定められる、溶液のイオン強度(μ)であり、ここでμはイオン強度であり、[ｉ]はイオンのミリモル濃度であり、Ｚｉはそのイオンの電荷(＋又は−)である(例えば、Solomon, Journal of Chemical Education, 78(12):1691-92, 2001;James Fritz and George Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979を参照)。
【００４３】
本発明の種々の実施態様において、組成物のイオン強度は、少なくとも５０ｍＭ、例えば少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも６５０ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１６００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、少なくとも２４００ｍＭ、少なくとも２８００ｍＭ、又は少なくとも３２００ｍＭである。
いくつかの特定の実施態様において、浸透圧調節剤(ｖ)とイオン強度調節剤(ｖ／ａ)の全濃度は、１-１０００ｍＭ、例えば１-５００ｍＭ、１-３００ｍＭ、１０-２００ｍＭ、又は２０-１５０ｍＭ；又は例えば１００-１０００ｍＭ、２００-８００ｍＭ、又は５００-８００ｍＭの範囲であり、浸透圧及びイオン強度を有し得る、任意の他の成分の影響にも依存する。
【００４４】
一実施態様において、組成物は等張であり；また他では高張である。
「等張」なる用語は「血清と等張」、すなわち約３００±５０ミリオスモル／ｋｇであることを意味する。浸透圧は、投与前の溶液の浸透圧を測定することを意味する。「高張」なる用語は、血漿の生理的レベル以上の浸透圧レベル、例えば３００±５０ミリオスモル／ｋｇ以上のレベルを称することを意味する。
【００４５】
さらなる実施態様において、組成物は酸化防止剤(ｖｉ)をさらに含有する。種々の実施態様において、酸化防止剤は、Ｌ-メチオニン、Ｄ-メチオニン、メチオニン類似体、メチオニン含有ペプチド、メチオニンホモログ、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、及びシススタチオニンからなる群から選択される。
好ましい実施態様において、酸化防止剤はＬ-メチオニンである。
酸化防止剤の濃度は、典型的には０．１−５．０ｍｇ／ｍＬ、例えば０．１−４．０ｍｇ／ｍＬ、０．１−３．０ｍｇ／ｍＬ、０．１−２．０ｍｇ／ｍｌ、又は０．５−２．０ｍｇ／ｍＬである。
【００４６】
上述した酸化防止剤の例は本発明に適用されるものではあるが、多くの特定の化合物、例えばメチオニンは、金属を含有する薬剤(類)(ｉｉｉ)の金属イオンと錯体を形成する可能性があると考えられる。これにより、金属を含有する薬剤(類)(ｉｉｉ)の効果的な濃度はわずか低くなる可能性がある。
この理由のため、特定の実施態様において、組成物は酸化防止剤を含有しないが、その代わり、酸化に対する第ＶＩＩ因子ポリペプチドの感受性を、大気を除去することによりコントロールする。もちろん、酸化防止剤の使用を、大気のコントロールされた除去と組合せてもよい。
【００４７】
よって、本発明は、ここで定められる、液状の水性製薬用組成物と、場合によっては不活性ガスを収容する気密容器(例えばバイアル又はカートリッジ(例えば、シリンジアセンブリ又はペン状アプリケータ用のカートリッジ))を提供する。不活性ガスは、窒素、アルゴンからなる群から選択されてよい。容器(例えばバイアル又はカートリッジ)は、典型的にはガラス又はプラスチック、特にガラスで作製され、場合によってはゴム隔膜、又は製薬用組成物の完全性を保ちながら貫通を可能にする他の閉塞手段により閉塞されていてもよい。特定の実施態様において、組成物は酸化防止剤(ｖｉ)を含有しない。さらなる実施態様において、容器は、シールされたバッグ、例えばシールされたプラスチックバッグ、特にラミネートされたもの(例えば、金属(特にアルミニウム)でラミネートされたプラスチックバッグ)に封入されるバイアル又はカートリッジである。
【００４８】
必須の成分に加えて、製薬用組成物は、保存料(ｖｉｉ)をさらに含有していてよい。
保存料は、微生物の成長を遅らせるために組成物に含有せしめられ、よってＦＶＩＩポリペプチドの「複数回使用」包装を可能にする。保存料の例には、フェノール、ベンジルアルコール、オルト-クレゾール、メタ-クレゾール、パラ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。保存料は、通常は、ｐＨの範囲及び保存料の種類に応じて、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される。
【００４９】
さらに、組成物は、脱アミド化及び異性体化を阻害可能な、一又は複数の薬剤を含有していてもよい。
【００５０】
ここで使用される場合、「約」として特定されるｐＨ値は、±０．１であると理解され、例えば約ｐＨ８．０はｐＨ８．０±０．１を含む。
パーセンテージは、溶液に溶解した固体、及び溶液に混合された液体を言及する場合、双方とも(重量／重量)である。例えば、トゥイーンについては、１００％ストックの重量／溶液の重量である。
【００５１】
本発明の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの製薬用組成物は、安定した、好ましい使用準備が整った組成物として有用である。さらに、ここで付与される原則、指針及び特定の実施態様は、変更すべきところは変更して、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの大量保存に、等しく適用されると考えられる。組成物は、２℃〜８℃の範囲の温度で保存される場合、典型的には少なくとも６ヶ月、好ましくは３６ヶ月まで安定している。また組成物は、２℃〜８℃で、少なくとも６ヶ月保存された場合、化学的及び／又は物理的に安定、特に化学的に安定している。
「安定」なる用語は、(ｉ)２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、組成物が、本質的に本明細書のアッセイ４に記載したような、一工程の凝血アッセイで測定した場合に、最初の生物活性の少なくとも５０％を保持している；又は(ｉｉ)２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、重鎖分解生成物の含有量の増加度が、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの最初の含有量の、最大４０％(ｗ／ｗ)であることを意味することを意図している。
「最初の含有量」なる用語は、組成物の調製時、組成物に添加される第ＶＩＩ因子ポリペプチドの量に関する。
【００５２】
種々の実施態様において、安定化組成物は、２〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の生物活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持している。
種々の実施態様において、安定化組成物における重鎖分解生成物の含有量の増加度は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの最初の含有量の、約３０％(ｗ／ｗ)以下、約２５％(ｗ／ｗ)以下、約２０％(ｗ／ｗ)以下、約１５％(ｗ／ｗ)以下、約１０％(ｗ／ｗ)以下、約５％(ｗ／ｗ)以下、又は約３％(ｗ／ｗ)以下である。
【００５３】
重鎖分解生成物の含有量を測定する目的で、粒子径５μｍ及び孔サイズ３００Åを有する、所有する４．５ｘ２５０ｍｍのブチル結合シリカカラムにおいて、逆相ＨＰＬＣを実施した。カラム温度：７０℃。Ａバッファー：０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸。Ｂバッファー：０．０９％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、８０％ｖ／ｖのアセトニトリル。３０分、Ｘから(Ｘ＋１３)％Ｂの直線状勾配を用い、カラムを溶出させた。約２６分の保持時間で、ＦＶＩＩａが溶出されるように、Ｘを調節した。流速：１．０ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。充填：２５μｇのＦＶＩＩａ。
【００５４】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「物理的安定性」なる用語は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのダイマー、オリゴマー及びポリマー形態での、不溶性及び／又は溶解性の凝集体の形成、並びに分子の任意の構造的変形及び変性に関する。物理的に安定した組成物には、視覚的に透明性を保持している組成物が含まれる。多くの場合、組成物の物理的安定性は、組成物を種々の時間、異なる温度で保存した後の濁度及び視覚検査で評価される。組成物の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライトにおいて実施される。組成物は、視覚的濁りを示す場合に、物理的に不安定であると分類される。
【００５５】
「化学的安定性」なる用語は、本質的に、本明細書のアッセイ４に記載されているような、一工程の凝血アッセイで測定した場合に、２〜８℃で６ヶ月保存した後、その最初の生物活性の少なくとも５０％を保持している組成物を含むことを意図している。
「化学的安定性」なる用語は、促進条件下で、溶液での保存時、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおける任意の化学的変化の形成に関連していることを意図している。具体例は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのフラグメント形成に至る、加水分解、脱アミド化、及び酸化、並びに酵素的分解である。特に、硫黄含有アミノ酸は、対応するスルホキシドの形成を伴い酸化する傾向にある。
【００５６】
本発明の組成物は、製薬用処方に適しているばかりでなく、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質の製造プロセス中、例えば製造プロセスの精製工程中に得られる組成物であってもよい。
【００５７】
(使用方法)
理解されるように、ここで定められた液状の水性製薬用組成物は、医薬の分野で使用することができる。よって、特に本発明は、薬剤、特に第ＶＩＩ因子反応性症候群を治療する薬剤として使用される、ここで定められた液状の水性製薬用組成物を提供する。
従って、本発明は、第ＶＩＩ因子反応性症候群を治療する薬剤を調製するための、ここで定められた液状の水性製薬用組成物の使用、並びに第ＶＩＩ因子-反応性症候群を治療するための方法を提供するものであって、該方法は、ここで定められた液状の水性製薬用組成物を有効量、それを必要とする被験者に投与することを含む。
本発明の調製物は、任意の第ＶＩＩ因子反応性症候群、例えば凝固因子欠乏症(例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＸＩ凝固因子欠乏症、第ＶＩＩ凝固因子欠乏症)；血小板減少症又はフォン・ヴィルブランド病、又は凝固因子インヒビターに起因するものを含む出血性疾患、及び脳内出血、又は任意の原因による過度の出血の処置に使用されてよい。また調製物は、手術又は他の外傷のある患者、又は抗凝固治療を受けている患者に投与されてよい。
【００５８】
「有効量」なる用語は、所望する応答を達成するための用量を設定する有資格者により決定される有効な用量である。用量を考慮するための要因には、作用強度、生物学的利用能、所望する薬物動態／薬力学的プロフィール、処置状況、患者関連の要因(例えば、体重、健康状態、年齢等)、同時投与される薬物(例えば、抗凝固剤)の存在、投与時間、又は医療実施者に公知の他の要因が含まれる。
「処置」なる用語は、病気、病状又は疾患に抗することを目的として、被験者、例えば哺乳動物、特にヒトを管理及び世話することとして定義され、徴候又は合併症の発症を予防し、又は徴候又は合併症を軽減し、又は病気、病状又は疾患を排除するために、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む。第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明の製薬用組成物は、このような処置を必要とする被験者に、非経口的に投与されてよい。非経口的投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジ等の手段により、皮下、筋肉内、又は静脈内注射にて実施するされてよい。また、非経口投与は注入ポンプ等の手段により実施することもできる。
重要な実施態様において、製薬用組成物は、当該技術で公知の方法に従い、皮下、筋肉内、又は静脈内注射に適している。
【００５９】
ここで定められる製薬用組成物における可能な限り高濃度の塩分は、ある群の患者には不利益になり得る。よって本発明は、液状の水性製薬用組成物における塩分濃度を低下させる使用前方法を提供するもので、該方法は、イオン交換物質、脱塩に適した物質と、ここで定められる液状の水性製薬用組成物とを接触させる工程、及び／又は組成物を希釈する工程を含む。
ここで定められる製薬用組成物における可能な限り高濃度の金属イオンは、ある群の患者には不利益になり得る。よって本発明は、液状の水性製薬用組成物における金属イオン濃度を低下させる使用前方法を提供するもので、該方法は、カチオン交換物質と、ここで定められる液状の水性製薬用組成物とを接触させる工程を含む。
カチオン交換物質の例は、シェレックス(Chelex)-１００(Fluka-Riedel/Sigma-Aldrich)である。カチオン交換物質、例えばシェッレクス-１００は、好ましくは適切な容器、例えばガラス又はプラスチックカートリッジに収容されている。
液状の水性製薬用組成物は、例えば使用直前に、カチオン交換物質を収容したカートリッジを通すことにより、カチオン交換物質と接触させられると考えられる。特定の実施態様において、カートリッジはシリンジアセンブリの必要部分であると考えられる。
【００６０】
(実施態様)
一般的方法
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性を測定するのに適したアッセイ
本発明で有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、インビトロテストにおける簡単な予備試験として実施することが可能な、適切なアッセイにより選択され得る。よって、本明細書は第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性のための簡単なテスト(「インビトロ加水分解アッセイ」と題される)を開示する。
【００６１】
インビトロ加水分解アッセイ(アッセイ１)
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド(双方とも、以後「第ＶＩＩａ因子」と称する)は、活性についてアッセイされてよい。またそれらは平行にアッセイされて、それらの活性と直接比較されてもよい。アッセイはマクロタイタープレート(Max-iSorp, Nunc, Denmark)において実施される。発色基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２２８８、Chromogenix, Sweden)、最終濃度１ｍＭを、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有する、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に第ＶＩＩａ因子(最終濃度１００ｎＭ)が入ったものに添加する。４０５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックス(SpectraMax)ＴＭ３４０プレートリーダー(Molecular Devices, USA)にて、連続的に測定する。酵素を含有しないブランクウェルにおける吸光度を減算した後、２０分のインキュベートの間に発生した吸光度を、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子の活性の比率を算出するのに使用する：
比率＝(Ａ４０５ｎｍでの第ＶＩＩ因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍでの野生型第ＶＩＩａ因子)
それに基づき、天然第ＶＩＩａ因子より低い、同程度、又は高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドと同定され、ここで第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然第ＶＩＩ因子(野生型ＦＶＩＩ)の活性との比率は、約１．０対１．０超である。
【００６２】
また、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性は、１００-１０００ｎＭの濃度に適した、生理的基質、例えば第Ｘ因子(「インビトロタンパク質分解アッセイ」)を使用して測定されてもよく、ここで生成した第Ｘａ因子は、適切な発色基質(例えば、Ｓ-２７６５)を添加した後に測定される。さらに、活性アッセイは生理的温度で実施される。
【００６３】
インビトロタンパク質分解アッセイ(アッセイ２)
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド(双方とも、以後「第ＶＩＩａ因子」と称する)を平行してアッセイし、それぞれの特異的活性を直接比較する。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)において実施される。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有する、１００μＭ ５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４に、第ＶＩＩａ因子(１０ｎＭ)及び第Ｘ因子(０．８マイクロＭ)が入ったものを、１５分インキュベートする。ついで、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有する、５０μＬ ５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４を添加することにより、第Ｘ因子切断を停止させる。生成した第Ｘａ因子の量を、発色基質Ｚ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２７６５、 Chromogenix, Sweden)、最終濃度０．５ｍＭを添加することにより測定する。４０５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックスＴＭ３４０プレートリーダー(Molecular Devices, USA)にて、連続的に測定する。ＦＶＩＩａを含有しないブランクウェルの吸光度を減算した後、１０分間で発生した吸光度を、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性の比率を算出するのに使用する。
比率＝(Ａ４０５ｎｍでの第ＶＩＩ因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍでの野生型第ＶＩＩａ因子)
それに基づき、天然第ＶＩＩａ因子より低い、同程度、又は高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドと同定され、ここで第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然第ＶＩＩ因子(野生型ＦＶＩＩ)の活性との比率は、約１．０対１．０超である。
【００６４】
トロンビンを生成する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドの能力は、生理学的濃度(血友病Ａの病状を模倣する場合は第ＶＩＩＩ因子を引く)で、インヒビターと全ての関連する凝固因子、及び活性化した血小板を含むアッセイ(アッセイ３)において測定可能である(参照としてここに導入される、Monroeら.(1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547のp. 543に記載)。
【００６５】
また、一工程凝固アッセイ(アッセイ４)を使用することにより、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性を測定してもよい。この目的のために、テストされるサンプルは、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ-バッファー(ｐＨ７．５)、０．１％のＢＳＡで希釈され、４０μｌが、４０μｌの第ＶＩＩ因子欠損血漿、及び１０ｍＭのＣａ２＋と合成リン脂質を含有する８０μｌのヒト組換え組織因子と共にインキュベートする。凝固時間を測定し、平行線アッセイにおいて参照標準体を使用し、標準体曲線と比較する。
【００６６】
第ＶＩＩポリペプチドの調製及び精製
本発明での使用に適した精製されたヒト第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、例えばHagenら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986に記載されたような、又は欧州特許第0200421号(ZymoGenetics, Inc.)に記載されたような、ＤＮＡ組換え技術により作製される。
また第ＶＩＩ因子は、Broze及びMajerus, J. Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980、及びHedner及びKisiel, J. Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983により記載されているような方法により生成されてよい。これらの方法により、検出可能な量の他の血液凝固因子を用いることなく、第ＶＩＩ因子が生じる。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物でさえ、最終精製工程として、付加的なゲル濾過を含むことにより得られる。ついで、第ＶＩＩ因子は、公知の手段、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、特に第ＸＩＩａ因子、第ＩＸ因子又は第Ｘａ因子により、活性化した第ＶＩＩａ因子に転換される。また、Bjoernら(Research Disclosure, 269 9月, 1986, pp. 564-565)により記載されているように、第ＶＩＩ因子は、イオン交換クロマトグラフィー用カラム、例えばモノＱ(登録商標)(Pharmacia fine Chemicals)等に通すことにより、又は溶液における自己活性化により活性化されてもよい。
【００６７】
第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子を修飾、又は組換え技術により生成されてもよい。野生型第ＶＩＩ因子と比較した場合、変化したアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子-関連ポリペプチドは、公知の手段、例えば部位特異性突然変異生成により、天然の第ＶＩＩ因子をコードする核酸中のアミノ酸コドンのいくつかを除去することにより、又はアミノ酸コドンを変化させることにより、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することで生成され得る。
【００６８】
置換が、第ＶＩＩａ因子分子の機能にとって重要な領域外でなされ、さらに活性化ポリペプチドに至ることは、当業者には明らかであろう。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性化に必須であり、よって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当該問題で公知の手順、例えば部位特異的突然変異生成又はアラニン-スキャンニング突然変異生成(例えば、Cunningham及びWells, 1989, Science 244:1081-1085)により同定されてよい。後者の技術において、突然変異は、分子の全ての正に帯電した残基に導入され、得られた突然変異分子は、血液凝固性、それぞれの架橋結合活性についてテストされ、分子の活性に対して重要なアミノ酸残基が同定される。また、基質-酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学、又は光親和性標識等の技術により決定される三次元構造を分析することで、決定することができる(Vosら,1992, Science 255:306-312; Smithら, 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaverら, 1992, FEBS Lett. 309:59-64を参照)。
【００６９】
一つのヌクレオチドを別のヌクレオチドに交換するために、核酸配列に変異を導入することは、当該技術で公知の任意の方法を使用する、部位特異的突然変異生成により達成される。特に有用なのは、関心ある挿入物、及び所望の突然変異を有する２つの合成プライマーと共に、スーパーコイル状(super coiled)の二本鎖ＤＮＡベクターを利用する手順である。それぞれベクターの他方のストランドを補完する、オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの手段により、温度サイクルの間、伸長する。プライマーの導入において、ねじれ型ニックを有する突然変異プラスミドが生じる。温度サイクルに続き、メチル化、及びヘミメチル化されたＤＮＡに特異的なＤｐｎＩを用いて、生成物を処理し、親ＤＮＡテンプレートを消化させ、突然変異含有の合成ＤＮＡについて選択する。変異体の生成、同定及び単離について、当該技術で公知の他の手順、例えば遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術を使用してもよい。
【００７０】
起源となる細胞からのポリペプチドの分離は、限定されるものではないが、接着細胞培養からの、所望の生成物を含有する細胞培養培地の除去；非接着細胞を除去する遠心分離又は濾過等を含む、当該技術で公知の任意の方法により達成される。
【００７１】
場合によっては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはさらに精製されてよい。精製は、限定されるものではないが、例えば、抗-第ＶＩＩ因子抗体カラムにおけるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Wakabayashiら, J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; 及びThimら, Biochem. 27:7785, 1988を参照)；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順(例えば調製用の電点電気泳動(ＩＥＦ)、微分溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈降)、又抽出等を含む、当該技術で公知の任意の方法を使用して達成され得る。一般的には、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 及びProtein Purification, J.C. Janson及びLars Ryden,編, VCH Publishers, New York, 1989を参照。精製後、調製物は、好ましくは約１０重量％未満、さらに好ましくは約５重量％未満、最も好ましくは約１重量％未満の、宿主細胞から誘導された非-第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子、又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、及びトロンビンを使用し、タンパク質分解的切断により活性化されてもよい。例えば、Osterudら, Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 米国特許第4,456,591号;及びHednerら, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)を参照。また、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばモノＱ(登録商標)(Pharmacia)等に通すことにより、又は溶液における自己活性化によって活性化されてもよい。ついで、得られた活性化した第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、本出願に記載するように処方され、投与されてよい。
以下の実施例は、本発明の実施を例証するものである。これらの実施例は、例証目的のみを含み、何らの方法においても、請求された本発明の範囲を限定することを意図しているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、１００ｍＭ又は１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサンプルにおける、タンパク質濃度に対するペグ化された第ＶＩＩ因子(１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．７５のバッファーに、０、１０、２３及び３８ｍｇ／ｍＬのペグ化された第ＶＩＩ因子)の粘度を表す。
【図２】図２は、１００ｍＭ又は１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサンプルにおける、タンパク質濃度に対するペグ化された第ＶＩＩ因子(１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０７ｍｇ／ｍＬのポリソルバート８０、０．５ｍｇ／ｍＬのＬ-メチオニン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ５．７５のバッファーに、０、６、２１及び４１ｍｇ／ｍＬのペグ化された第ＶＩＩ因子)の粘度を表す。
【実施例】
【００７３】
ＮＮ７１２８粘度特許
サンプルの調製
まず、ペグ化された第ＶＩＩ因子のサンプルを、ＮＡＰ-２５カラム(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)を使用し、関連するバッファーに交換されたバッファーとした。第２に、アミコン・ウルトラ(Amicom Ultra)-１５遠心分離濾過装置(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)を使用し、所望のタンパク質濃度まで、サンプルを濃縮した。
【００７４】
レオメーター粘度アッセイ
タンパク質溶液の粘度をＣ５０１ストレステック(StressTech)レオメーター(Rheologica Instruments, Lund, Sweden)を使用して測定した。各測定を、ピペットを使用し、付与されたサンプルの５５０μＬ溶液を同心円筒系に移すことにより開始した。０-１０Ｐａのずり応力に相応するトルク範囲で、粘度の測定を実施した。全ての測定を２０℃で実施した。１００ｓ−１のずり速度で測定された粘度を、サンプル比較に使用する。全ての粘度をミリパスカル・秒(ｍＰａ・ｓ)で報告する。
【００７５】
実施例１
タンパク質濃度に対するペグ化された第ＶＩＩ因子の粘度を、上述したようにして測定した。２セットのペグ化された第ＶＩＩ因子のサンプルを調製した。一方のセットは、次の：１０ｍＭのＬ-ヒスチジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．７５のバッファーに、０、１０、２３及び３８ｍｇ／ｍＬのペグ化された第ＶＩＩ因子を含有する。他のセットは、１０ｍＭのＬ-ヒスチジン、１００ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．７５のバッファーに、０、１１、２６及び４７ｍｇ／ｍＬのペグ化された第ＶＩＩ因子を含有する。図１は、２つのセットのサンプルのタンパク質濃度に対する粘度を示す。驚くべきことに、ペグ化された第ＶＩＩ因子の濃度が〜２３ｍｇ／ｍＬ以上であるならば、１００ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサンプルの粘度は、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサンプルと比較して、かなり低いことが観察された。
【００７６】
実施例２
タンパク質濃度に対するペグ化された第ＶＩＩ因子の粘度を、上述したようにして測定した。２セットのペグ化された第ＶＩＩ因子のサンプルを調製した。一方のセットは、次の：１０ｍＭのＬ-ヒスチジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０７ｍｇ／ｍＬのポリソルバート８０、０．５ｍｇ／ｍＬのＬ-メチオニン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ５．７５のバッファーに、０、６、２１及び４１ｍｇ／ｍＬのペグ化された第ＶＩＩ因子を含有する。他のセットは、１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＣａＣｌ２、０．０７ｍｇ／ｍＬのポリソルバート８０、０．５ｍｇ／ｍＬのＬ-メチオニン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ５．７５のバッファーに、０、７、２２及び４２ｍｇ／ｍＬのペグ化された第ＶＩＩ因子を含有する。図２は、２つのセットのサンプルのタンパク質濃度に対する粘度を示す。驚くべきことに、ペグ化された第ＶＩＩ因子の濃度が〜２３ｍｇ／ｍＬ以上であるならば、１００ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサンプルの粘度は、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサンプルと比較して、かなり低いことが観察された。
【００７７】
本発明の好ましい特徴：
１．少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する組成物であって、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質が、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、１０ｍＭより高い濃度で二価の金属カチオンを有しており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度が３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下である組成物。
２．前記ＰＥＧ部分が、少なくとも３００Ｄａ、例えば少なくとも５００Ｄａ、例えば少なくとも１０００Ｄａ、例えば少なくとも５ｋＤａ、例えば少なくとも１０ｋＤａの分子量を有する、第１項の組成物。
３．前記二価の金属カチオンが、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｍ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｓｍ２＋からなる列挙から選択される、第１項又は第２項のいずれかの組成物。
【００７８】
４．前記関心あるビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、例えばヒト第ＶＩＩａ因子である、上述した項のいずれかの組成物。
５．第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子配列変異体である、第４項の組成物。
【００７９】
６．第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子(野生型ＦＶＩＩａ)の活性との間の比率が、ここに記載されるような「インビトロタンパク質分解アッセイ」でテストした場合に、少なくとも１．２５である、第５項の組成物。
７．第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも３５ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも４０ｍｇ／ｍＬ、例えば２０-５０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば２０-４０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば２０-３０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在している、上述した項のいずれかの組成物。
【００８０】
８．約４．０〜約８．０の範囲のｐＨを有する、上述した項のいずれかの組成物。
９．前記二価の金属カチオンが、少なくとも２０ｍＭ、例えば少なくとも３０ｍＭ、例えば少なくとも４０ｍＭ、例えば少なくとも５０ｍＭ、例えば少なくとも６０ｍＭ、例えば１０-１００ｍＭの範囲の濃度で存在している、上述した項のいずれかの組成物。
【００８１】
１０．前記組成物が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、グリシンアミド、リン酸、酢酸、乳酸、及びコハク酸の酸及び塩からなる群から選択される緩衝剤をさらに含有する、上述した項のいずれかの組成物。
１１．緩衝剤の濃度が１-１００ｍＭである、第１０項の組成物。
１２．前記組成物が、ポリソルバート類、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エチレン／ポリプロピレンブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリオキシエチレンステアラート、及びポリオキシエチレンヒマシ油からなる群から選択される非イオン性界面活性剤をさらに含有する、上述した項のいずれかの組成物。
【００８２】
１３．浸透圧調節剤をさらに含有する、上述した項のいずれかの組成物。
１４．浸透圧調節剤が、中性塩、アミノ酸、２-５のアミノ酸残基のペプチド、多糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される少なくとも一である、第１３項の組成物。
１５．少なくとも一の浸透圧調節剤が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩からなる群から選択される中性塩である、第１３項の組成物。
１６．浸透圧調節剤が少なくとも１ｍＭの濃度で存在している、上述した項のいずれかの組成物。
【００８３】
１７．酸化防止剤をさらに含有する、上述した項のいずれかの組成物。
１８．酸化防止剤が、Ｌ-メチオニン、Ｄ-メチオニン、メチオニン類似体、メチオニン含有ペプチド、メチオニンホモログ、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、及びシススタチオニンから選択される、第１７項の組成物。
１９．酸化防止剤が０．１-５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在している、第１７項又は第１８項のいずれかの組成物。
【００８４】
２０．保存料をさらに含有する、上述した項のいずれかの組成物。
２１．保存料が、フェノール、ベンジルアルコール、オルト-クレゾール、メタ-クレゾール、パラ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンザエトニウムからなる群から選択される、第２０項の組成物。
【００８５】
２２．液状の水性製薬用組成物である、上述した項のいずれかの組成物。
２３．前記関心あるビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、トロンビン、及びプロテインＣからなる列挙から選択される、上述した項のいずれかの組成物。
【００８６】
２４．ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された粘度が、２５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下、例えば２０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下、例えば１５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下、例えば１０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下、例えば５ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ×ｓ)以下である、上述した項のいずれかの組成物。
２５．医薬として使用される、第２２項の液状の水性製薬用組成物。
【００８７】
２６．関心あるビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＶＩＩ因子反応性症候群を治療する医薬を製造するための第ＶＩＩ因子ポリペプチドである、第２２項の液状の水性製薬用組成物の使用。
【００８８】
２７．第ＶＩＩ因子反応性症候群を治療する方法であって、第２２項の液状の水性製薬用組成物を有効量、それを必要とする被験者に投与することを含み、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質が第ＶＩＩ因子ポリペプチドである方法。
２８．少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、関心あるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する組成物の粘度を低下させる方法であって、該関心あるビタミンＫ依存性タンパク質が、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で官能化されており、ここに記載の「レオメーター粘度アッセイ」で測定された場合の粘度が３０ｍパスカルｘ秒(ｍＰａ・ｓ)以下であり、該方法が、１０ｍＭより高い最終濃度になるまで、二価の金属カチオンを添加する工程を含む方法。
【図１】
0005642065.tif 000002
【図２】
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