(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化を解析する工程を含む、食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項２】
ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化が、当該遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、又は発現低下である、請求項１に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項３】
ＰＣＤＨ１７遺伝子の不活性化が、ＣｐＧアイランドのメチル化による当該遺伝子の不活性化であることを確認する、請求項２に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項４】
ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、アレイＣＧＨ法、ＣＯＢＲＡ法、及びバイサルファイト・シーケンシング法からなる群から選択される少なくとも一つの手法により解析する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項５】
ＰＣＤＨ１７遺伝子から転写されるｍＲＮＡ又は翻訳されるタンパク質を検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する、請求項２に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項６】
ＰＣＤＨ１７遺伝子から翻訳されるタンパク質を免疫染色法により検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する、請求項５に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項７】
前記検体が、食道組織である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項８】
検出又は予後を予測する食道癌が、食道扁平上皮癌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項９】
検体としてpN0（リンパ節転移を認めない）食道癌の検体を使用して、食道癌の検出の予後を予測する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の食道癌の検出又は予後の予測を補助するための方法。
【請求項１０】
ＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子を含有する食道癌抑制剤であって、前記相同遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子であって、食道癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子である、食道癌抑制剤。
【請求項１１】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１０に記載の食道癌抑制剤。
【請求項１２】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項１１に記載の食道癌抑制剤。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載の食道癌抑制剤。
【請求項１４】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１０に記載の食道癌抑制剤。
【請求項１５】
ＰＣＤＨ１７タンパク質又はその相同タンパク質を含有する食道癌抑制剤であって、前記相同タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、食道癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、食道癌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抑制遺伝子の発現の変化を解析することによる食道癌の検出又は予後の予測のための方法、及び該癌抑制遺伝子を利用した食道癌抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌は、世界における癌関連の死因において６番目に頻度の高い癌であり（非特許文献１参照）、食道扁平上皮癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；以下、ＥＳＣＣと称す。）は、アジア諸国で診断された食道癌のうち９０％程度を占める。癌遺伝子を活性化したり、又は腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ;以下、ＴＳＧと称す。）の機能の喪失に導くＤＮＡ配列における変異又は破壊という手段により、ＥＳＣＣの発生に関与する様々な遺伝的な事象が調べられている。しかし、ＥＳＣＣにおいて同定された遺伝的変化は当該疾患の病原性を十分に説明するものではない。両アレル欠失は稀有な事象であり、点変異やエピジェネティックな異常（非特許文献２を参照）などの他の要因はＴＳＧの機能的な不活性化に多大に寄与する可能性があるが、癌細胞ゲノム内のホモ接合性の欠失領域は、新規のＴＳＧを同定するための有用な指標となる（非特許文献３、４、５及び６を参照）。従って、機能的な不活性化の主因にかかわらず、癌細胞におけるホモ接合性欠失の高解像度のマッピングは、ＴＳＧの迅速な同定にとって大いに役立つ。
【０００３】
本発明者らは以前、８００のＢＡＣクローンを含む細菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ;ＢＡＣ）を用いて作製したゲノムアレイ（ＭＣＧ Ｃａｎｃｅｒ  Ａｒｒａｙ−８００、非特許文献７を参照）を用いて、ＥＳＣＣ細胞株のパネルのアレイを基盤とした比較ゲノムハイブリダイゼイション（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ;以下、 アレイＣＧＨと称す。）分析を行った。その結果、ある細胞株から検出される２ｑ２２．１におけるホモ接合性欠失から、ホモ接合性欠失あるいはＤＮＡのメチル化のいずれにもよって高頻度で不活性化されるＥＳＣＣの潜在的なＴＳＧとして、低密度リポタンパク受容体関連タンパク質１Ｂ（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ｂ；ＬＲＰ１Ｂ）を同定することに成功した（非特許文献８を参照）。ホモ接合性欠失は通常小さいので、高解像度のアレイを用いたコピー数の変化のゲノム・ワイドな探索（非特許文献９を参照）により、より多くの食道癌に関係するＴＳＧが同定されることが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. (2005)., Global Cancer Statistics, 2002. CA Cancer J Clin 55: 74-108.
【非特許文献２】Jones PA, Baylin SB. (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet 3: 415-428.
【非特許文献３】Friend SH, Bernards R, Rogelj S, Weinberg RA, Rapaport JM, Albert DM, Dryja TP. (1986). A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature 323: 643-646.
【非特許文献４】Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, Liu Q, Harshman K, Tavtigian SV, et al. (1994). A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science 264: 436-440.
【非特許文献５】Hahn SA, Schutte M, Hoque AT, Moskaluk CA, da Costa LT, Rozenblum E, et al. (1996). DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science 271: 350-353.
【非特許文献６】Li J, Yen C, Liaw D, Podsypanina K, Bose S , Wang SI, et al. (1996). PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science 275: 1943-1947.
【非特許文献７】Inazawa J, Inoue J, Imoto I. (2004). Comparative genomic hybridization (CGH)-arrays pave the way for identification of novel cancer-related genes. Cancer Sci 95: 559-563.
【非特許文献８】Sonoda I, Imoto I, Inoue J, Shibata T, Shimada Y, Chin K, et al. (2004). Frequent silencing of low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B) expression by genetic and epigenetic mechanisms in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res 64: 3741-3747.
【非特許文献９】Gorringe KL, Jacobs S, Thompson ER, Sridhar A, Qiu W, Choong DYH, Campbell IG. (2007). High-resolution single nucleotide polymorphism array analysis of epithelial ovarian cancer reveals numerous microdeletions and amplifications. Clin Cancer Res 13: 4731-4739.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、食道癌に関する癌抑制遺伝子を新たに見出して、当該抑制遺伝子の変化を解析することによる食道癌を検出又は予後の予測する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該癌抑制遺伝子を含有する食道癌抑制剤を提供することを課題とする。さらに、本発明は、当該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する食道癌抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、高密度オリゴヌクレオチド・アレイを用いたアレイＣＧＨによってＥＳＣＣ細胞株パネルのコピー数変化をスクリーニングするプログラムの過程を経て、プロトカドヘリン１７遺伝子（ＰＣＤＨ１７、１３ｑ２１．２）のホモ接合性欠失を同定し、 当該遺伝子の発現は、通常の食道組織では存在するものの、大半のＥＳＣＣ細胞株では消失していることを見出した。幾つかのプロトカドヘリン（ＰＣＤＨ）、すなわちＰＣＤＨ８、ＰＣＤＨ１０及びＰＣＤＨ２０を含むカドヘリン・スーパーファミリーの主要なサブファミリー（Gorringe KL, Jacobs S, Thompson ER, Sridhar A, Qiu W, Choong DYH, Campbell IG. (2007). High-resolution single nucleotide polymorphism array analysis of epithelial ovarian cancer reveals numerous microdeletions and amplifications. Clin Cancer Res 13: 4731-4739.）は、欠失、変異又はプロモーターのメチル化により、乳癌、鼻咽頭癌及び肺癌のそれぞれにおいて高頻度に発現抑制され、細胞遊走、又は足場依存性若しくは足場非依存性の増殖を阻害している（Imoto I, Izumi H, Yokoi S, Hosoda H, Shibata T, Hosoda F, et al. (2006). Frequent silencing of the candidate tumor suppressor PCDH20 by epigenetic mechanism in non-small-cell lung cancers. Cancer Res 66: 4617-4626.；Ying J, Li H, Seng TJ, Langford C, Srivastava G, Tsao SW, et al. (2006). Functional epigenetics identifies a protocadherin PCDH10 as a candidate tumor suppressor for nasopharyngeal, esophageal and multiple other carcinomas with frequent methylation. Oncogene 25: 1070-1080.；Yu JS, Koujak S, Nagase S, Li CM, Su T, Wang X, et al. (2008). PCDH8, the human homolog of PAPC, is a candidate tumor suppressor of breast cancer. Oncogene 27: 4657-4665. ；Yu J, Cheng YY, Tao Q, Cheung KF, Lam CN, Geng H, et al. (2009). Methylation of protocadherin 10, a novel tumor suppressor, is associated with poor prognosis in patients with gastric cancer. Gastroenterology 136: 640-651.）。この結果は、それらプロトカドヘリンがＴＳＧとして機能することができることを示唆している。ＰＣＤＨ１７は、ＥＳＣＣにおけるその生物学的役割及び臨床的な重要性は不明であるものの、ＰＣＤＨ８及びＰＣＤＨ１０と同じサブグループ、すなわちPcdhδ2サブグループに属することから、本発明者らは、食道のＴＳＧの候補としてＰＣＤＨ１７に注目した。ＥＳＣＣの細胞株及び臨床検体を用いた更なる分析により、ＰＣＤＨ１７は、ＥＳＣＣにおいてＤＮＡのメチル化により主に発現抑制され、発現によりＥＳＣＣ細胞の増殖を抑制するよう機能することが判明し、ＰＣＤＨ１７遺伝子の発現抑制がＥＳＣＣの病原性に関係することを突き止め、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明の一の態様によれば、検体において、ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化を解析する工程を含む、食道癌の検出又は予後の予測のための方法が提供される。
ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化は、当該遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、又は発現低下であることが好ましい。
好ましくは、ＰＣＤＨ１７遺伝子の不活性化が、ＣｐＧアイランドのメチル化による当該遺伝子の不活性化であることを確認する。
好ましくは、ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、アレイＣＧＨ法、ＣＯＢＲＡ法、及びバイサルファイト・シーケンシング法からなる群から選択される少なくとも一つの手法により解析する。
【０００８】
好ましくは、ＰＣＤＨ１７遺伝子から転写されるｍＲＮＡ又は翻訳されるタンパク質を検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する。
好ましくは、ＰＣＤＨ１７遺伝子から翻訳されるタンパク質を免疫染色法により検出することにより、当該遺伝子の発現低下を検出する。
好ましくは、前記検体が、食道組織である。
好ましくは、検出又は予後を予測する食道癌が、食道扁平上皮癌である。
好ましくは、検体としてpN0（リンパ節転移を認めない）食道癌の検体を使用して、食道癌の検出の予後を予測する。
【０００９】
また、本発明の別の態様によれば、ＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子を含有する食道癌抑制剤が提供される。
【００１０】
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている。
好ましくは、前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
好ましくは、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている。
【００１１】
さらに、本発明の別の態様によれば、ＰＣＤＨ１７タンパク質又はその相同タンパク質を含有する食道癌抑制剤が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たに見出した癌抑制機能を有するＰＣＤＨ１７遺伝子の変化を解析する工程を含む、食道癌の検出又は予後の予測のための方法が提供される。本発明の食道癌の検出又は予後の予測のための方法によれば、ＰＣＤＨ１７遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態、そのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量、ＰＣＤＨ１７タンパク質の発現量等を調べることにより、当該遺伝子の変化を解析することから、個々の食道癌患者の癌悪性度ないし余命等を予測することが可能であり、その解析した情報は治療方針の決定に役立つ。また、本発明の食道癌抑制剤は、食道癌の特性に基づいた優れた食道癌の治療効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（図１Ａ）高密度オリゴヌクレオチド・アレイＣＧＨによるＥＳＣＣ細胞株の１３ｑ２１．１におけるホモ接合性欠失の候補遺伝子座の検出を示す図である。アレイＣＧＨにより決定されたＫＹＳＥ１１７０細胞における１３ｑ２１．１の代表的なコピー数プロファイルを示している。黒矢印は、１３ｑ２１．１におけるホモ接合性欠失のパターン（log 2 ratio＜−２）を示す候補スポットを有する領域を指している。灰色矢印は、ホモ接合性欠失の候補遺伝子座周辺に位置するＰＣＤＨ１７遺伝子を指している。（図１Ｂ）４３のＥＳＣＣ細胞株のパネルにおけるＰＣＤＨ１７のエクソン１〜４及びコントロールのＧＡＰＤＨを示すゲノムＰＣＲ実験から得られた画像を表す図である。ゲノムＰＣＲによって、二つのＥＳＣＣ細胞株（星印）においてＰＣＤＨ１７の一部（エクソン１〜３）にホモ接合性欠失が検出された。（図１Ｃ）定量リアル・タイムＰＣＲアッセイによって検出された、ＥＳＣＣ細胞株及び正常食道におけるＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現パターンを表す図である。結果は、正常食道の値に対してmeans±ＳＤ（バー）で示されている。図１Ｂにおいてホモ接合性欠失を伴った細胞株は星印で示されている。ＰＣＤＨ１７のホモ接合性欠失を有しない４１のＥＳＣＣ細胞株のうち、３９（９５．１％）株は正常食道と比較してほぼ完全な当該遺伝子の発現消失を示した。（図１Ｄ）５日間、５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ、５μｍｏｌ／Ｌ）、及び／又は最後の１２時間トリコスタチンＡ（ＴＳＡ、３００ｎｍｏｌ／ｍＬ）で処理した後のＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡ発現の回復を示唆した定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲの結果を表す図である。結果は、核細胞株について処理しなかったものの値に対してmeans±ＳＤ（バー）で示されている。
【図２】ＥＳＣＣ細胞株におけるエクソン１周辺のＰＣＤＨ１７ＣｐＧ−リッチ領域のメチル化状態を説明する図である。（図２Ａ）ＰＣＤＨ１７のエクソン１周辺のＣｐＧ−ｒｉｃｈ領域の模式図である。縦の目盛は、広がる軸上のCpGサイトを表す。水平のオープン・ボックスはエクソン１を表す。黒線はＣｐＧアイランドを示す。水平の両矢印は、ＣＯＢＲＡ法及び／又はバイサルファイト・シーケンシング（ＢＧＳ）法において調査した領域を示す。黒及び白の下向きの矢印の頭は、ＣＯＢＲＡ法のために用いた、それぞれ、ＴａｑＩ及びＢｓｔＵＩの制限酵素サイトを表す。灰色の線は、プロモーター・アッセイで調査した断片を表す（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ 1 及び２）。（図２Ｂ）Ｔａｑ１及びＢｓｔＵＩで消化後のＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７ＣｐＧ−リッチ領域内にある領域１〜３に対するＣＯＢＲＡ法の結果を表す図である。ゲルをエチジウム・ブロマイドで染色した後、密度測定により、メチル化されているアレルの強度をパーセンテージとして計算した。メチル化密度カット・オフポイント２０％を有意義であると考慮した（非特許文献８参照）。上向きの矢頭は、メチル化アレル（メチル化陽性）からの制限酵素処理した断片を含むサンプルを示している。黒の下向きの矢印は、ＰＣＤＨ１７の発現を保持している細胞株を示し、星印はＰＣＤＨ１７のホモ接合性欠失を有する細胞株を示す。矢印は、メチル化されたＣｐＧとして確認されたサイトで特異的に制限酵素処理された断片を示し、太いバーは、メチル化されていないＣｐＧを示す消化されなかった断片を示す。メチル化ＤＮＡ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を陽性コントロールとして使用した。（図２Ｃ）ＰＣＤＨ１７発現ＥＳＣＣ細胞株（＋）及び非発現ＥＳＣＣ細胞株（−）について調査した、ＰＣＤＨ１７ＣｐＧリッチ領域内の領域１〜３のＢＧＳの結果を表す図である。各四角は、ＣｐＧサイトを示し、白の四角はメチル化されていないことを示し、黒の四角はメチル化されていることを示す。黒及び白の下向きの矢印の頭は、ＣＯＢＲＡ法におけるＴａｑＩ及びＢｓｔＵＩの制限酵素サイトをそれぞれ示す。灰色の線は、プロモーター・アッセイで調査した断片を示す（ｆｒａｇｍｅｎｔ 1及び２）。（図２Ｄ）ＰＣＤＨ１７ＣｐＧ−リッチ領域のプロモーター活性を示す図である。ｐＧＬ３の基本の空ベクター（mock）及び断片１又は２（図２Ａ及びＣ）の配列を含むコンストラクトを、ＰＣＤＨ１７の発現があるＫＹＳＥ１４０、又はＰＣＤＨ１７の発現がないＫＹＳＥ３０、ＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００のＥＳＣＣ細胞株に形質転換した。ルシフェラーゼ活性を内部コントロールに対して標準化し、結果は、細胞株ごとに、ｐＧＬ３の基本のからベクター（ｍｏｃｋ）を形質転換した細胞の値の相対値として示されている。棒グラフは、３回の別々の実験の平均値を示し、各実験は３組行い、バーは、ＳＤを現す。
【図３】ＥＳＣＣの臨床検体におけるＰＣＤＨ１７のメチル化及び発現状態について説明する図である。（図３Ａ）外科的に切除した臨床検体ＥＳＣＣ腫瘍（Ｔ）及び対応する非癌部の食道粘膜（Ｎ）について、ＣＯＢＲＡ法により領域(ｒｅｇｉｏｎ)１及び２（図２Ａ）を調査した結果を表す図である。図２Ｂに対する説明を参照。上向きの矢頭は、メチル化アレル（メチル化陽性）からの制限酵素処理した断片を有するサンプルを示す。（図３Ｂ）外科的に切除した臨床検体ＥＳＣＣ腫瘍（Ｔ）及び対応する非癌部の食道粘膜（Ｎ）について、ＣＯＢＲＡ法で調査した二つの代表ケース（ケース８及び２６）のＢＧＳの結果である。図２Ｃに対する説明を参照。（図３Ｃ）定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲにより検出されたＥＳＣＣ臨床腫瘍組織におけるＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの相対レベルを示す図である。腫瘍サンプルにおけるＰＣＤＨ17ｍＲＮＡの発現パターンは、症例ごとに、対応する非癌部サンプルの値の相対値として、平均±ＳＤ（バー）で示されている。星印は、図３Ａで示された腫瘍特異的メチル化を伴うケースである。（図３Ｄ）非癌部の食道粘膜（左上）、腫瘍の端（左下）及び対となる非癌部組織と二つのメチル化腫瘍（右）におけるＰＣＤＨ１７タンパク質の免疫組織化学染色による結果を表す図である。近傍の非腫瘍性組織では、内皮細胞を含む、有棘細胞層及びいくらかの間葉細胞中の食道上皮細胞において、ＰＣＤＨ１７が染色された斑点のある膜（矢印）が観察されたが、基底層では観察されなかった。Ｔは腫瘍を示し、ＮＭは非癌部粘膜を示し、ＮＳは非癌部粘膜下層を示す。バーは、２０μｍを現す。倍率は２００倍である。（図３Ｅ）ｐＮ０ＥＳＣＣを伴った患者の全体的な生存率を表すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す図である。本研究期間中、ｐＮ０ＥＳＣＣ腫瘍を伴ったＰＣＤＨ１７が陽性のグループ（ｎ＝１０）では、死亡は確認されなかった。一方、統計上の有意義な差異は算出されなかったものの、陰性グループでは４４人の患者のうち９人（２０．５％）が死亡した。
【図４】ＥＳＣＣ細胞におけるＰＣＤＨ１７発現の細胞増殖及び移動／浸潤に対する影響を説明する図である。（図４Ａ）ＰＣＤＨ１７を含むＣ末端にＭｙｃペプチドが付加されたコンストラクト（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＰＣＤＨ１７）又はコントロールとして空のベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ｍｏｃｋ）を、ＣｐＧ−リッチ領域の過剰メチル化に起因してＰＣＤＨ１７遺伝子の発現を欠いたＫＹＳＥ３０又はＫＹＳＥ１７０細胞に導入した。１０μｇのタンパク質抽出物、ａｎｔｉ−Ｍｙｃ抗体及び内部コントロール抗体（ａｎｔｉ−β−アクチン）を用いたウェスタン・ブロット分析（左）によれば、ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＰＣＤＨ１７を一過性で形質転換した細胞はＭｙｃが付加されたＰＣＤＨ１７タンパク質を発現することが示された。形質転換及びその後の薬剤耐性コロニーの選抜の３週間後（右）、ＰＣＤＨ１７形質転換ＥＳＣＣ細胞により形成されたコロニーは、空ベクター（ｍｏｃｋ）形質転換細胞により形成されたコロニーよりも数が少なかった。ＥＳＣＣ細胞におけるコロニー形成の定量分析のために、２ｍｍよりも大きいコロニーを数えた。棒グラフは、三回の別々の実験の平均値を示し、各実験は三組で行い、バーは、ＳＤを示す。Ｐ＜０．０５ｖｓ．各タイム・ポイントにおける空ベクター形質転換コントロール（ストゥーデントｔ検定）。（図４Ｂ）内部リボソームエントリー部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ; ＩＲＥＳ）により結合した、二つのトランス遺伝子、ＧＦＰ及びＣ末端にＦＬＡＧペプチドを付加したＰＣＤＨ１７を有しているベクター（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７）又はコントロールとして空のベクター（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ｍｏｃｋ）を、Ｇ４１８を用いた選抜により、ＰＣＤＨ１７の発現を欠いたＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００細胞に安定に導入した。Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫蛍光細胞化学法により、ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７を安定に形質転換したほとんど全てのＫＹＳＥ１７０又はＫＹＳＥ２００細胞はＦＬＡＧペプチドが付加されたＰＣＤＨ１７を発現していることが示された（図Ｂ上）。２４ウェル・プレートに播種（１×１０5細胞／ウェル）した後に水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）を用いて安定形質転換体の細胞生育アッセイ（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ）を行った結果、コントロール対象物よりも、ＰＣＤＨ１７形質転換細胞の増殖活性は低いことが判明した。三つの別々の実験により平均値で示し、各実験は三組で行った。Ｐ＜０．０５ｖｓ．各タイム・ポイントにおける空ベクター形質転換コントロール（ストゥーデントｔ検定）。（図４Ｃ）ＰＣＤＨ１７安定形質転換ＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００細胞及びコントロール対象物について、ＦＡＣＳ（左）及びウェスタン・ブロッティング（右）により評価した細胞周期の分析及びｐ２１、ｐ２７、ＣＣＮＤ１等の細胞周期に関連する分子のタンパク質発現の結果を表す図である。（図４Ｄ）細胞の運動性は、スクラッチ傷害アッセイ（左）及びトランスウェル・移動アッセイ（右）で評価し、細胞の浸潤性はトランスウェル・浸潤アッセイ（右）で評価した。図４Ｄ左図：図４Ｃに示す安定形質���換体を用いたスクラッチ傷害アッセイ及び結果の定量については実施例で説明する。０時間におけるスクラッチ領域は任意に１．０とした（Ｐ＜０．０５ｖｓ．各タイム・ポイントにおける空ベクター形質転換コントロール（ストゥーデントｔ検定））。図４Ｄ右図：トランスウェル移動／浸潤アッセイは、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ; ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社製）を使用したものと、使用しないものの２４ウェル改良ボイデン・チャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ）において行った。細胞（２×１０4細胞／ウェル）を上方のチャンバーに移し、フィルターの下面上に移動した又は浸潤した細胞を固定及び染色し、４８時間のインキュベーション後に数えた。実験は、三組で行った。浸潤インデックス（コントロール対象物における試験細胞の非被覆フィルターを通した移動(migration)に対する、マトリゲル被覆フィルターを通したパーセンテージ浸潤の比）を計算することにより浸潤可能性を評価した。棒グラフは平均値を示し、バーはＳＤを現す。Ｐ＜０．０５ｖｓ．各タイム・ポイントにおける空ベクター形質転換コントロール（ストゥーデントｔ検定）。
【図５】ＴａｑＩ又はＢｓｔＵＩで消化した後のＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７ＣｐＧ−リッチ領域内の領域４〜１０に対するＣＯＢＲＡ法の結果を表す図である。ＰＣＤＨ１７を発現している非癌部食道上皮組織（ケース２９）及びＫＹＳＥ１４０からのＤＮＡサンプル、及びＣｐＧｅｎｏｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を試験サンプル及び陽性コントロールとしてそれぞれ使用した。矢印は、メチル化されたＣｐＧとして確認されたサイトにおいて特異的に切断された断片を示し、黒のバーは、非メチル化ＣｐＧを示す消化されなかった断片を示す。ＰＣＤＨ１７発現組織及びＥＳＣＣ細胞株からのＤＮＡは、領域１及び２と比較して領域４〜１０において圧倒的なＣｐＧメチル化を示した。
【図６】ヒトＰＣＤＨ１７からの１５アミノ酸ペプチド（ＤＨＰＮＲＤＬＧＲＥＳＶＤＡＥ）に対して作成され、アフィニティ・カラムを通して生成されたａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７ウサギ・ポリクローナル抗体の特性の評価が示されている。（図６Ａ）ワイルド・タイプのＰＣＤＨ１７を含むＦＬＡＧペプチドを付加したコンストラクト（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７）又は空のベクター（ｍｏｃｋ）を安定に形質転換したＫＹＳＥ１７及びＫＹＳＥ２００細胞からのタンパク質に対する、ａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体を用いたウェスタン・ブロッティングの結果を表す図である。矢印は、３×ＦＬＡＧペプチドを付加したＰＣＤＨ１７タンパク質を示す。星印は、より小さい断片を示し、これはＰＣＤＨ１７の部分的なタンパク質分解から産生されたものであろう。（図６Ｂ）ＦＬＡＧペプチドを付加したワイルド・タイプのＰＣＤＨ１７（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７）を安定に形質転換したＫＹＳＥ１７０細胞、非形質転換ＫＹＳＥ１１７０細胞、及び陰性コントロールｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＰＣＤＨ１７をターゲットとしたｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉTM ｓｉＲＮＡ＃Ｈｓｓ１７８３８３８３、 ＃ＨＳＳ１７８３８３８４及び＃ＨＳＳ１７８３８３８５;Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したもの、未添加のもののＫＹＳＥ１４０細胞、それぞれの細胞からのタンパク質に対するａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体を用いたウェスタン・ブロッティングの結果を表す図である。矢印は、３×ＦＬＡＧペプチド付加したＰＣＤＨ１７タンパク質（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７で形質転換したＫＹＳＥ１７０）又は内在性のＰＣＤＨ１７タンパク質（ＫＹＳＥ１４０細胞）を示している。ＰＣＤＨ１７特異的ｓｉＲＮＡによる処理では、内在性のＰＣＤＨ１７タンパク質の発現はノック・ダウンされ、ａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体は、内在性のＰＣＤＨ１７を認識できることが示された。（図６Ｃ）野生型ＰＣＤＨ１７を含むＦＬＡＧペプチドが付加されたコンストラクト（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７）で一過性に形質転換したＫＹＳＥ１７０（図上）及びＰＣＤＨ１７発現ＥＳＣＣ腫瘍（ケース３３、図下）（×４００）の免疫組織染色におけるａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体を用いた吸着試験の結果である。図右側は、合成ペプチド１０００×モル濃度の合成ペプチドと共に、室温で一晩、インキュベートしたａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体を用いたものであり、図左側は、合成ペプチドと共にそのようなインキュベートをしなかった当該抗体を使用したものである。バーは、２０μｍを示す。
【図７】ＥＳＣＣを伴った１４５人の患者全ての全体の生存率に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を表す図である。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定による全体の生存率の単変量解析によれば、ＰＣＤＨ１７発現状態と患者の全体の生存率との間において有意義な関係は示されなかった（Ｐ＝０．２９８２）。
【図８】マウス・モノクローナルａｎｔｉ−ＭＹＣ ｔａｇ抗体及びウサギ・ポリクローナルａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体を用いた、トランジェントにｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４−ＰＣＤＨ１７を形質転換したＫＹＳＥ１７０細胞における免疫蛍光細胞化学法による画像を示す図である。それぞれの抗体は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４４８及び５９４で可視化した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）食道癌の検出又は予後の予測のための方法
本発明による食道癌の検出又は予後の予測のための方法は、検体において、ＰＣＤＨ１７（Ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ １７； ＰＣＤＨ１７）遺伝子の変化を解析する工程を含むことを特徴とする。ここで、ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化としては、当該遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、発現低下などが挙げられ、これらを検出することにより食道癌の検出又は予後の予測が可能となる。特に本発明では、pN0（リンパ節転移を認めない）食道癌の検体において、ＰＣＤＨ１７遺伝子の変化を解析することによって、予後を予測することができる。
【００１５】
ＰＣＤＨ１７遺伝子のホモ接合性欠失、不活性化、発現低下等を検出する対象となる食道由来の細胞や食道組織は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。この検体組織細胞は、健常人の食道に由来する細胞か、食道癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、食道粘膜などに癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または食道扁平上皮癌であることが確定しているが、その悪性度、進行度又は予後を判定する必要がある当該癌組織等が主な対象となり得る。
【００１６】
本発明の方法により、「検査等の結果、食道に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるＰＣＤＨ１７遺伝子の欠失、不活性化、発現低下が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか或いは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「食道癌であることが確定しているが、その悪性度、進行度又は予後を判定する必要がある食道癌の組織」におけるＰＣＤＨ１７遺伝子の欠失、不活性化、発現低下等が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることや、予後が悪いことを意味し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された食道癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或いはＲＮＡの調製をおこない、本発明の方法をおこなう対象とすることができる。
【００１７】
＜ＰＣＤＨ１７遺伝子のホモ接合性欠失の検出＞
本発明において、ＰＣＤＨ１７遺伝子のホモ接合性欠失の検出する手法としては、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、アレイＣＧＨ（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、ゲノムＰＣＲ法（ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ）、サザン・ブロット法等を挙げることができる。
【００１８】
ゲノム・ワイドな高解像度の解析が可能となる点では、アレイＣＧＨにより解析することが好ましい。また、このようにアレイＣＧＨで検出されたＰＣＤＨ１７遺伝子のホモ接合性欠失領域の範囲を決定するために、ゲノムＰＣＲを行うことができる。
ＦＩＳＨ法に関しては、ＰＣＤＨ１７遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、ＰＣＤＨ１７遺伝子の有無、すなわち欠失を検出することができる。
【００１９】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２０】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２１】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２２】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２３】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２４】
また、ＰＣＤＨ１７遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を用いることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ＰＣＤＨ１７遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００２５】
＜ＰＣＤＨ１７遺伝子の不活性化の検出＞
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ  ＡＰ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９９，４５１−４５４，１９９９）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域の高度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６９４−６７０２，２００２）。後述するように、実際、ＰＣＤＨ１７遺伝子のエキソンに存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有している。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、食道扁平上皮癌でのＰＣＤＨ１７遺伝子発現の抑制と強く相関することがある。
【００２６】
したがって、食道癌を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ＰＣＤＨ１７遺伝子発現を回復させることができる。このことから、ＣｐＧアイランドの高度メチル化が食道癌における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度で起こす原因の一つであることが理解できる。
【００２７】
上述した検出手段により、ＰＣＤＨ１７遺伝子の発現量が減少していることが判明した検体細胞（臨床癌組織に由来する癌細胞）に対して、脱メチル化剤（５−アザデオキシシチジンなど）を作用させて、遺伝子発現量の回復を検討することができる。すなわち、検体細胞に脱メチル化剤を作用させて、ＰＣＤＨ１７遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ＣｐＧアイランドのメチル化であり、検体提供者に、脱メチル化作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。
【００２８】
メチル化ＤＮＡを検出する手法としては、例えば、バイサルファイト−リストリクション結合分析（Ｃｏｍｎｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ;ＣＯＢＲＡ法）を用いることができる。具体的には、検体試料より調整したゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理することにより、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換する。メチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。選択した二種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で該ＤＮＡの部分配列を増幅させ、メチル化の影響を受ける制限酵素（例えば、ＢｓｔＵＩ、ＴａｑＩ）で増幅させＰＣＲ産物を処理し、電気泳動を行うことにより、任意のゲノムＤＮＡ部位についてメチル化の状態を調べることができる。
【００２９】
さらに、上記ＣＯＢＲＡ法により得られたＰＣＲ産物をサブ・クローン化し、塩基配列の決定（バイサルファイト・ゲノム・シーケンシング法；ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ; ＢＧＳ法）を行えば、詳細なメチル化プロファイリングが可能となる。
【００３０】
上述の通り、癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されていることから、本発明では、特にＰＣＤＨ１７のＣｐＧアイランドを含むＣｐＧ−リッチ領域について上記メチル化の検出を行うことが好ましい。また、後述の通り、ＰＣＤＨ１７遺伝子の転写開始サイト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ； ＴＳＳ）周辺におけるＧｐＣサイトのメチル化は当該遺伝子の転写レベルの発現抑制に関与している点で、ＰＣＤＨ１７遺伝子のＴＳＳ周辺のＧｐＣサイトについてもメチル化の検出を行うことが好ましい。さらに、ＰＣＤＨ１７プロモーター領域の異常なメチル化は食道の癌形成の初期に生じることから、ＰＣＤＨ１７プロモーター領域についてメチル化の検出を行うことも好ましい。
【００３１】
＜ＰＣＤＨ１７遺伝子の発現低下の検出＞
本発明において、ＰＣＤＨ１７遺伝子の発現低下を検出する方法としては、ＰＣＤＨ１７からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出する手法、又は、ＰＣＤＨ１７遺伝子から翻訳されたタンパク質を検出する手法が挙げられる。具体的には、食道癌が疑われる検体と正常食道組織とについて、ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現量ないしＰＣＤＨ１７タンパク質の発現量を適宜の手法により比較することでＰＣＤＨ１７遺伝子の発現低下を評価することが可能である。
【００３２】
本発明において、ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡを検出する手法としては、該ＲＮＡ配列を含むプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）等が挙げられる。特に、リアル・タイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡ発現レベルが定量的に評価できる点で、本手法の使用は好ましい。
【００３３】
ＰＣＤＨ１７のタンパク質レベルでの発現を検出する手法としては、ＰＣＤＨ１７特異的抗体を用いた免疫染色法、例えば、イムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色、免疫組織化学法、免疫蛍光細胞化学法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ウェスタン・ブロッティング法、あるいは質量分析法等が挙げられる。これら手法の一種以上を組み合わせて用いれば、ＰＣＤＨ１７タンパク質の発現量、組織における発現の分布等について詳細に調べることができる。
【００３４】
上記手法に用いるＰＣＤＨ１７タンパク質に対する抗体（以下、ＰＣＤＨ１７抗体という）は、ＰＣＤＨ１７タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＰＣＤＨ１７タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＰＣＤＨ１７タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＰＣＤＨ１７タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００３５】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００３６】
上記のようにして調製したＰＣＤＨ１７タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＰＣＤＨ１７タンパク質の発現量を知ることができる。測定した検体試料中のＰＣＤＨ１７タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＰＣＤＨ２０遺伝子の発現が抑制されていることになり、後述する本発明の食道癌抑制剤の適用対象となる癌を選別することができる。
【００３７】
（２）食道癌抑制剤
本発明の一態様によれば、本発明の食道癌抑制剤は有効成分としてＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の食道癌抑制剤は有効成分としてＰＣＤＨ１７タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
【００３８】
ＰＣＤＨ１７遺伝子の塩基配列及びＰＣＤＨ１７タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており、ヒトＰＣＤＨ１７遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ のデータベース（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ: ＮＭ＿００１０４０４２９）にて登録されている。ＰＣＤＨ１７遺伝子の塩基配列（ＰＣＤＨ１７タンパク質コード領域）は配列番号１に記載する通りであり、ＰＣＤＨ１７タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００３９】
本明細書において「ＰＣＤＨ１７遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＰＣＤＨ１７タンパク質」というのは、該ＰＣＤＨ１７遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００４０】
ＰＣＤＨ１７遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより化学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００４１】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００４２】
本発明において、「ＰＣＤＨ１７遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、食道癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、食道癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子をいう。また、ＰＣＤＨ１７遺伝子の相同遺伝子にはＰＣＤＨ１７遺伝子の断片も含まれる。
【００４３】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００４４】
上記の「食道癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＰＣＤＨ１７タンパク質が有する食道癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「食道癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００４５】
従って、「ＰＣＤＨ１７遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく食道癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来のものが好ましい。
【００４６】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、食道癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００４７】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４９】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、食道癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００５０】
本発明において、「ＰＣＤＨ１７タンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、食道癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、食道癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００５１】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００５２】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００５３】
ＰＣＤＨ１７タンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００５４】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００５５】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例を示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００５６】
本発明の食道癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００５７】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００５８】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ， １０８， １９３−２００， １９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００５９】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００６０】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００６１】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００６２】
本発明の食道癌抑制剤のうち、有効成分としてＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子を含む食道癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＰＣＤＨ１７遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００６３】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００６４】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＰＣＤＨ１７遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００６５】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００６６】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００６７】
また、本発明の食道癌抑制剤のうち、有効成分としてＰＣＤＨ１７タンパク質又はその相同タンパク質を含む食道癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＰＣＤＨ１７タンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００６８】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００６９】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００７０】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００７１】
上記食道癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記食道癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって食道癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００７２】
本明細書でいう「食道癌抑制」とは、食道癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに食道癌細胞の増殖を抑制したり、食道癌を縮小することによって食道癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００７３】
本発明の食道癌抑制剤の適用対象は、食道の組織における癌であれば特に限定されるものではく、食道扁平上皮癌、食道腺癌などを挙げることができるが、好ましくは食道扁平上皮癌である。
【００７４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
１．材料及び方法
＜細胞培養、薬剤処理及び臨床組織サンプル＞
全部で４３のＥＳＣＣ細胞株を用いたが、そのうち３１の細胞株は外科的に切除した腫瘍から確立したＫＹＳＥシリーズ（Shimada Y, Imamura M, Wagata T, Yamaguchi N, Tobe T. (1992). Characterization of 21 newly established esophageal cancer cell lines. Cancer 69: 277-284）に属し、１２の細胞株は東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターから提供されたＴＥ−シリーズ株である。全てのＥＳＣＣ細胞は、既報の方法により維持した（上述の非特許文献８参照）。ＰＣＤＨ１７の回復を分析するために、細胞を、５日間、５μｍｏｌ／Ｌの５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）、及び／又は最後の１２時間１００ｎｇ／ｍＬのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、それぞれの存在下又は非存在下で処理した。
【００７６】
腫瘍の摘出を受けた１３人のＥＳＣＣ患者から手術中に得た、臨床腫瘍サンプル及び対応する非癌部の食道粘膜を液体窒素中で直ちに凍結し、供試するまで−８０℃で保存した。上述の１３のサンプルを含む、全部で１４５のＥＳＣＣ腫瘍サンプルが、ＥＳＣＣ患者から得られ、それらは２４時間のホルマリン固定後にパラフィンに封入した。関連する臨床上及び生存率のデータが、全ての患者について利用可能であった。いずれのグループにおいても、手術の前に化学療法又は放射線治療を受けた患者はいない。ＴＮＭ分類（Sobin LH, Wittekind CH (ed). (2002) International Union Against Cancer (UICC): TNM Classification of Malignant Tumors 6th edn. Wiley-Less: New York）、及び、食道癌の日本の分類（Japan Esophageal Society. (2009). Japanese Classification of Esophageal Cancer tenth edition: part I. Esophagus 6: 1-25.）に従って、疾患のステージを定義した。本実施例においては、非治癒的な切除により治療された患者、あるいは他の疾患により死亡した患者は含まれていない。生存患者の追跡期間中央値は、５３ヶ月（１〜１１０ヶ月に渡る）であった。
【００７７】
＜高密度オリゴヌクレオチド・アレイＣＧＨ分析＞
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＣＧＨ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ ２４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、当該細胞株におけるコピー数変化のゲノム・ワイドな分析を行った。ラベリング及びハイブリダイゼーションは、上記キットの製造業者によって提供されるプロトコルに従って行った。アレイは、アジレント・スキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｃａｎｎｅｒ）を用いてスキャンし、データ抽出、フィルタリング及び標準化は、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。ＣＧＨＡｎａｌｙｔｉｃｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｖｅｓｉｏｎ ３．４．４０（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、他の分析プログラムにおいて使用するためのアレイＣＧＨデータを書き出した。
＜ホモ接合性欠失及び変異を検出するためのゲノムＰＣＲ＞
ホモ接合性欠失は、ゲノムＰＣＲ（ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で確認した。ＰＣＤＨ１７のコード領域における変異は、エクソン部分の増幅及びダイレクト・シーケンシングにより分析した。サンプルにおいて検出した全ての塩基の変化は、各産物を両方向から配列決定して確認した。プライマーは、各エクソン周辺のゲノム配列に設計した（表１参照）。
【００７８】
【表１】
0005557139.tif 000002
【００７９】
＜定量リアル・タイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
ｍＲＮＡの発現レベルは、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用い、定量リアル・タイム蛍光検出法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、当該製造業者のマニュアルに従って測定した。遺伝子発現値は、ＰＣＤＨ１７遺伝子（Ｈｓ００２０５４５７＿ｍ１;Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び試料から分離したＲＮＡの量に対する標準化因子を提供する内部基準遺伝子（β−アクチンのHs99999903_m1、ＡＣＴＢ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の比で表され、続いて、コントロールにおける値で標準化される（相対発現レベル）。正常ヒト食道に由来する全ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）から購入した。各アッセイは、各サンプルにつき二組で行った。
【００８０】
＜バイサルファイト−リストリクション結合分析法（Ｃｏｍｎｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ;ＣＯＢＲＡ法）及びバイサルファイト・ゲノム・シーケンシング法（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ; ＢＧＳ法）＞
ゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理し、任意の領域を増幅するために設計したプライマーセット（表２参照）を用いたＰＣＲに供試した。ＣＯＢＲＡ法のため、ＰＣＲ産物をＢｓｔＵＩ又はＴａｑＩで制限酵素処理を行い、電気泳動を行った（Xiong Z, Laird PW. (1997). COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res 25: 2532-2534.）。ゲルをエチジウム・ブロマイドで染色しいた後、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ ２．０（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いた密度測定により、メチル化されたアレルの強度（パーセンテージとして）を測定した。メチル化密度カットオフポイントである２０％を有意義と考慮した（Sonoda I, Imoto I, Inoue J, Shibata T, Shimada Y, Chin K, et al. (2004). Frequent silencing of low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B) expression by genetic and epigenetic mechanisms in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res 64: 3741-3747.）。ＢＧＳ分析のため、ＰＣＲ産物はサブクローニングし、塩基配列を決定した。
【００８１】
【表２】
0005557139.tif 000003
【００８２】
＜プロモーター・レポーターアッセイ＞
ＰＣＤＨ１７のＣｐＧ−ｒｉｃｈ領域周辺の任意のゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲにより得て、ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Promega社製）に挿入した。各コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）又は空のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター等量を、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、内部コントロールベクター（ｐＲＬ−ｈＴＫ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と共に、細胞に導入した。トランスフェクションの３６時間後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ホタルルシフェラーゼ及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。相対的なルシフェラーゼ活性を計算し、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した。
【００８３】
＜ウェスタン・ブロット分析＞
Ａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７ウサギ・ポリクローナル抗体を、ヒトＰＣＤＨ１７由来のペプチド（ＤＨＰＮＲＤＬＧＲＥＳＶＤＡＥ; Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に対して産生し、アフィニティ・カラムを通して精製した。Ａｎｔｉ−Ｍｙｃ−Ｔａｇ抗体は、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手し、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ−Ｔａｇ 抗体及びａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ抗体は、Ｓｉｇｍａ社から入手し、ａｎｔｉ−ｐ２１抗体、ａｎｔｉ−ｐ２７抗体及びａｎｔｉ−ＣＣＮＤ１抗体は、それぞれ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。内在性のＰＣＤＨ１７の発現をノックアウトするために、ＰＣＤＨ１７をターゲットとするｓｉＲＮＡのそれぞれ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉTM ｓｉＲＮＡ #HSS17838383、 #HSS17838384、及び #HSS17838385; Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）又はネガティブ・コントロール（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、当該製造業者の指示に従って、ＥＳＣＣ細胞にトランスフェクションした（１０ ｎｍｏｌ／Ｌ）。細胞溶解物を既報の通りウェスタン・ブロッティングにより分析した（Kozaki K, Imoto I, Mogi S, Omura K, Inazawa J. (2008). Exploration of tumor-suppressive microRNAs silenced by DNA hypermethylation in oral cancer. Cancer Res 68: 2094-2105.）。
【００８４】
＜免疫組織化学法＞
シラン・コートガラススライド上に据え付け、かつ０．３％の過酸化水素を含有するメタノールに浸潤したホルマリン固定パラフィン封入組織切片（厚さ３μｍ）に対して、間接免疫組織化学法を行った。クエン酸緩衝液（ｐＨ９．０、ニチレイ社製）において、マイクロ波前処理により、抗原を回収した。２％の通常ブタ血清でブロッキングした後、室温下、一晩の間、ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ−ＰＣＤＨ１７抗体（１：３０００）でインキュベートし、アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）キット（Ｒ．Ｔ．Ｕ．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ジアミノベンジジン四塩酸塩及び過酸化水素を用いて、抗原抗体反応を可視化した。スライドは、メイヤーズ・ヘマトキシリンで対比染色した。
【００８５】
後述のホルマリン固定ＰＣＤＨ１７コンストラクト導入ＫＹＳＥ１７０細胞、及び空のベクターを導入したＫＹＳＥ１７０細胞を、それぞれ、陽性コントロール及び陰性コントロールとして使用した。抗体の特異性は、ウェスタン・ブロッティング及び合成ペプチドを用いた吸着試験により確認した（図６参照）。全ての切片について、臨床的特徴及び結果を把握していない二人の病理学者により、光学顕微鏡下で分析した。一つのスライド毎に２０の代表視野について、２００倍で調査した。ＰＣＤＨ１７が陽性の腫瘍領域は、間質細胞に囲まれた高濃度で染色された細胞膜を持った腫瘍細胞を含むものと定義した（図６参照）。ＰＣＤＨ１７が陽性である患者は、２００倍における２０の画像において少なくとも２０の陽性領域を有するものとして定義した。
【００８６】
＜免疫蛍光細胞化学法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ; ＩＦＣ）＞
Ｃ末端にｍｙｃペプチドを付加したＰＣＤＨ１７を発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−３Ｔaｇ４Ａ−ＰＣＤＨ１７）、及び、内部リボソームエントリー部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ; ＩＲＥＳ）によりＧＦＰを融合させ、かつＣ末端にＦＬＡＧペプチドを付加したＰＣＤＨ１７を発現するプラスミド（ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７）を、３×Ｍｙｃ及び３×ＦＬＡＧエピトープとイン・フレームであるＰＣＤＨ１７の全コード配列のＲＴ−ＰＣＲ産物を真核細胞発現ベクターｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）及びｐＩＲＥＳ−ＨＧＦＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のそれぞれにクローニングすることによって取得した。各コンストラクト又は空のベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ｍｏｃｋ）を導入した細胞を滅菌カバーガラスに播種した。エピトープを付加したタンパク質を発現する細胞は、メタノールで１５分間、−２０℃で固定し、３５分間１％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、マウス・モノクローナルａｎｔｉ−ＭＹＣ又はａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（１：１００）、及び／又は、ウサギ・ポリクローナルａｎｔｉ-ＰＣＤＨ１７抗体（１：１００）に保蔵した。洗浄した細胞は、ａｎｔｉ-マウス又はａｎｔｉ-ウサギ抗体をコンジュゲートしたＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８又は５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１：１００で希釈したものとインキュベートし、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＰＩ、０．１５μｇ／ｍＬ）で対比染色した。
【００８７】
＜増殖アッセイ＞
コロニー・フォーメーションアッセイ（非特許文献８を参照）のために、ｐＣＭＶ−３ＴＡＧ4Ａ−ＰＣＤＨ17又は空のベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ｍｏｃｋ）コントロールを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞に導入した。導入後４８時間後に、ＰＣＤＨ１７タンパク質の発現をウェスタン・ブロッティング及び免疫蛍光細胞化学法（ＩＦＣ）により確認した。コロニー・フォーメーションアッセイのため、Ｇ４１８の適切な濃度下で６ウェル・プレートにおいて１０日間インキュベーションした後、細胞を７０％エタノールで固定し、クリスタル・バイオレットで染色した。
【００８８】
ＰＣＤＨ１７安定形質転換体及びコントロール対象物は、ｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩ−ＰＣＤＨ１７又は空のｐＩＲＥＳ−ｈＧＦＰＩＩを、ＰＣＤＨ１７の発現を欠いたＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００細胞に導入することによって得た。細胞増殖の測定のため、１×１０4個の細胞を２４ウェル・プレートに播種した。播種後２４〜７２時間の時点で、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）アッセイにより、生細胞数を算定した。細胞周期は、既報の通りＦＡＣＳ法（Suzuki E, Imoto I, Pimkhaokham A, Nakagawa T, Kamata N, Kozaki KI, et al. (2007). PRTFDC1, a possible tumor-suppressor gene, is frequently silenced in oral squamous-cell carcinomas by aberrant promoter hypermethylation. Oncogene; 26: 7921-732. ）により評価した。
【００８９】
＜スクラッチ・傷害アッセイ（Ｓｃｒａｔｃｈ ｗｏｕｎｄ ａｓｓａｙ）＞
安定に形質転換したＥＳＣＣ細胞は、コンフルエントになるまで、６ウェル・プレートで培養した。細胞層を、滅菌２０μｌチップを用いて注意深く傷つけ、新しい培地で二回洗浄し、２４時間培養した。０、６、１２及び２４時間の時点で、ＣＣＤカメラに接続した位相差顕微鏡により、傷つけた単層の画像を得た。写真をＴＩＦＦイメージに変換した後、傷つけた領域をＣＴ−ＡＳソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ社製）を用いて、ピクセル数を数えて測定した。実験は３組で行った。
【００９０】
＜トランスウェル移動／浸潤アッセイ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）＞
トランスウェル移動／浸潤アッセイを、２４ウェルに改良したボイデン・チャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ）（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）において行った（Shinoda Y, Kozaki K, Imoto I, Obara W, Tsuda H, Mizutani Y, et al. (2007). Association of KLK5 overexpression with invasiveness of urinary bladder carcinoma cells. Cancer Sci 98: 1078-1086.）。８μｍの孔を有する直径６．４ｍｍのフィルターの上面をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ＢＤ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社製）でコーティングしたもの（浸潤アッセイ）と、コーティングしていないもの（移動アッセイ）を準備した。安定形質転換体（２×１０4細胞／ウェル）を上方のチャンバーに移した。４８時間インキュベートした後、フィルターの上面における移動していない細胞（ｎｏｎ−ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ）又は浸潤した細胞(ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｌｌ)を滅菌綿棒で取り除いた。フィルターの下面における移動していない細胞（ｎｏｎ−ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ）又は浸潤した細胞(ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｌｌ)は固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ ｓｔａｉｎ（Ｓｙｓｍｅｘ社製）で染色し、染色した細胞核を直接、３組で数えた。浸潤インデックスを計算することにより、浸潤可能性を算定した。浸潤インデックスとは、コントロール対象物における試験細胞の非被覆フィルターを通した移動(ｍｉｇｒａｔｉｏｎ)に対する、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターを通したパーセンテージ浸潤の比である。
【００９１】
＜統計分析＞
サブグループの間における違いは、スチューデントのt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で試験した。臨床腫瘍組織におけるＰＣＤＨ１７の発現と、対応する患者に関係する臨床病理学的因子との相関は、Χ2又はフィッシャーの直接確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）を用いて、統計的有意差を分析した。生存分析のために、一変量の予測因子に基づくグループに対してはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を構築し、グループ間の差異についてｌｏｇ−ｒａｎｋ検定により検定した。差異は、ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ検定を用いて評価し、Ｐ＜０．０５レベルで優位であると判断した。
【００９２】
２．結果
（１）オリゴヌクレオチド・アレイＣＧＨ
オリゴヌクレオチド・アレイＣＧＨにより、ＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７のホモ接合性欠失を同定した。高密度オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＣＧＨ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ ２４４Ｋ）を用いて、４３のＥＳＣＣ細胞株において、様々な注目すべきコピー数の獲得（高レベル増幅、log 2 ratio＞２．０）及びコピー数の欠失（ホモ接合性欠失、log 2＜２．０）が検出された。予想した通り、いくつかの小さなホモ接合性の欠失した領域が検出されたが、これら領域は、通常のＢＡＣアレイＣＧＨ（Pimkhaokham A, Shimada Y, Fukuda Y, Kurihara N, Imoto I, Yang ZQ, et al. (2000). Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res 91: 1126-1133.；非特許文献８）では同定されていないものであった。これらの新規に同定された領域のうち、１３ｑ２１．２におけるホモ接合性の欠失が、ＫＹＳＥ８９０及びＫＹＳＥ１１７０細胞株において検出された（図１Ａ参照）。この１３ｑ２１．２におけるホモ接合性の欠失はＰＣＤＨ１７遺伝子内にあり、以前報告された二つのＴＳＧ、 すなわち、ＰＣＤＨ８（Yu JS, Koujak S, Nagase S, Li CM, Su T, Wang X, et al. (2008). PCDH8, the human homolog of PAPC, is a candidate tumor suppressor of breast cancer. Oncogene 27: 4657-4665.）、及びＰＣＤＨ２０（Imoto I, Izumi H, Yokoi S, Hosoda H, Shibata T, Hosoda F, et al. (2006). Frequent silencing of the candidate tumor suppressor PCDH20 by epigenetic mechanism in non-small-cell lung cancers. Cancer Res 66: 4617-4626.）の近傍に位置する。これらの細胞株におけるＰＣＤＨ１７のホモ接合性欠失を確認し、この部分がほかのＥＳＣＣ株においてホモ接合的に欠失しているか否か決定するため、当該遺伝子のエクソン１〜４に設計したプライマーを用いてゲノムＰＣＲを行った。その結果、ＫＹＳＥ８９０及びＫＹＳＥ１１７０細胞のみにおいて、エクソン１及び３の間においてＰＣＤＨ１７の一部のホモ接合性欠失が検出された（図１Ｂ参照）。従来、ＰＣＤＨ１７の欠失はＥＳＣＣを含む癌において全く報告されていないので、当該遺伝子は、食道の癌形成に関係するＴＳＧの候補であるかどうかを調べた。
【００９３】
（２）ＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７の高頻度の転写レベルの発現抑制
次に、全てのＥＳＣＣ細胞株及び正常な食道について、リアル・タイム定量逆転写ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ；ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＰＣＤＨ１７のｍＲＮＡの発現について調べた。正常な食道と比較して、ＫＹＳＥ８９０及びＫＹＳＥ１１７０細胞は、１３ｑ２１．２にホモ接合性欠失を有しない他のＥＳＣＣ細胞株（４１の内の３９、９５．１％）の大多数と同様に、ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現を欠いていた（図１Ｃ参照）。二つのＥＳＣＣ細胞株（ＫＹＳＥ１１０及びＫＹＳＥ１４０）及び正常食道では、ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡが発現しており、エピジェネティックな事象を含む、ゲノム上の欠失以外のメカニズムから生じる、腫瘍における発現の喪失が示唆された。４１株のうち１１株は、アレイＣＧＨ分析においてＰＣＤＨ１７周辺にホモ接合性欠失のパターンを示し、そのうち１０株は、当該遺伝子を発現していなかった（図１Ｃ参照）。初めに、当該遺伝子のホモ接合性欠失を有しない４１のＥＳＣＣ細胞株の一群と５０のＥＳＣＣ臨床腫瘍組織について、ＰＣＤＨ１７のタンパク質コード配列内の塩基置換をスクリーニングした（表３参照）。コドン５６におけるＧｌｙからＡｒｇの変異、及び、コドン７７６におけるＧｌｕからＬｙｓの変異のそれぞれに繋がる、一つのヘテロ接合性の塩基置換及び一つのホモ接合性の塩基置換が、ＫＹＳＥ７０及びＫＹＳＥ１１０／ＫＹＳＥ２００細胞のそれぞれにおいて同定された。ＥＳＣＣ臨床腫瘍組織において検出された、二つのサイレントなヘテロ接合性の塩基置換は、対をなす非癌部の食道組織においても観察された（表３参照）。これらの結果から、これらの変異は一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）であることが示唆された。アミノ酸の変異を伴う観察された変異は、ＳＮＰデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ 及び http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/）では報告されていないが、タンパク質コード配列内の塩基置換は、ＰＣＤＨ１７の発現抑制に重要な役割を果たしてはいないようである。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
近年、確認されている通り、ＴＳＧの候補は、両アレルの遺伝的な不活性化のみというよりも、エピジェネティックな不活性化（プロモーターのメチル化）又は遺伝的な不活性化（一のアレルの変異）とエピジェネティックな不活性化（他のアレルのメチル化）との組合せを通して、より高頻度に不活性化される（Jones PA, Baylin SB. (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet 3: 415-428.）。ＣｐＧＰＬＯＴプログラム（http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/）により、ＰＣＤＨ１７の転写開始サイト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ; ＴＳＳ）周辺にＣｐＧアイランドを含むＣｐＧ−リッチ領域が同定されているので、ＤＮＡの脱メチル化がＰＣＤＨ１７の発現を回復させるかどうか調べた。いくつかの細胞株では、５−アザ−デオキシシチジンと共にトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を添加することによりＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現が増強されたが、ＰＣＤＨ１７の発現を欠くＥＳＣＣ細胞株を５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）で処理することにより、ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現が回復した（図１Ｄ参照）。これにより、ヒストンの脱アセチル化が、メチル化されたＥＳＣＣ細胞において、ＰＣＤＨ１７の転写レベルの発現抑制に何らかの役割を果たしていることが示唆された。
【００９６】
（３）ＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７ＣｐＧアイランドのメチル化
ＰＣＤＨ１７の発現抑制においてＣｐＧアイランド周辺のメチル化の潜在的な役割を示すため、当該遺伝子の発現が在るもの及び無いもののＥＳＣＣ細胞株についてバイサルファイト−リストリクション結合分析（ＣＯＢＲＡ法）及びバイサルファイト・ゲノム・シーケンシング（ＢＧＳ法）を行うことにより、ＥＳＣＣ細胞株におけるＰＣＤＨ１７ＣｐＧアイランド周辺のメチル化状態をスクリーニングした（図２Ａ参照）。ＣＯＢＲＡ法を用いた予備的なスクリーニングにより、ＰＣＤＨ１７の発現状態に関わらず、ＥＳＣＣ細胞株において大抵のＣｐｇアイランドは高度にメチル化されていることが証明されたので（図２Ｂ及び図５参照）、更なる分析からこれら領域は除外して、転写開始サイト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ；ＴＳＳ）周辺の領域に注目した（図２Ａにおける領域１〜３）。ＰＣＤＨ１７発現ＥＳＣＣ細胞株はほとんど脱メチル化されているか、あるいは部分的にメチル化されているのに対し、非発現細胞株ではＰＣＤＨ１７−ＴＳＳ周辺のＣｐＧサイトは、広範囲にメチル化されている傾向にあった（図２Ｂ及び図２Ｃ参照）。ＰＣＤＨ１７−ＴＳＳ周辺のＣｐｇリッチ領域の一部は、メチル化のターゲットとなるようであり、当該遺伝子の転写レベルの発現抑制に密接に関係しているようであった。よって、この領域を含み、またその領域内にある二つの断片（９７８ｂｐ及び１７１ｂｐ；図２Ａにおける各ｆｒａｇｍｅｎｔ１及び２）をルシフェラーゼ・レポーターに接続し、ＥＳＣＣ細胞において当該領域のプロモーター活性を調べた。ＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現状態に関わらず、転写活性における顕著な増加は、ｆｒａｇｍｅｎｔ １を含むコンストラクトの特徴であった（図２Ｄ参照）。これにより、プロモーター活性を示す特定のＣｐＧサイト周辺の領域が、ＰＣＤＨ１７を発現抑制するためのＤＮＡメチル化の潜在的なターゲットであることが示された。
【００９７】
（４）ＥＳＣＣ臨床腫瘍組織におけるＰＣＤＨ１７プロモーター領域のメチル化
ＥＳＣＣ臨床腫瘍組織において、ＰＣＤＨ１７の異常なメチル化がどの程度、当該遺伝子の発現抑制に関与しているかを決定するために、領域１及び２（図２Ａ及び図３Ａ参照）についてＣＯＢＲＡ法を行うことにより、対応する非癌部の食道組織と共に、１３の臨床ＥＳＣＣ検体の凍結切片について、当該遺伝子のメチル化状態を調べた。ＰＣＤＨ１７の異常なメチル化は、１３のＥＳＣＣ臨床腫瘍組織のうち９検体（６９．２％）において、主に領域２において検出され、対応する非癌部の食道組織については、９検体のうち２検体（２２．２％）においても検出された。これにより、ＰＣＤＨ１７プロモーター領域の異常なメチル化は食道の癌形成の初期に生じることが示唆された。対応する非癌部組織と共に、代表となるＥＳＣＣ臨床腫瘍組織からの個々のアレルについて領域１及び２のＢＧＳ法を行った結果（図３Ｂ参照）、ＣＯＢＲＡ法においてメチル化が陽性であったＥＳＣＣ腫瘍では異常なメチル化が確認されたが、メチル化が陰性であった非癌部の食道組織では異常なメチル化は確認されなかった。これらの知見は、ＰＣＤＨ１７プロモーターのメチル化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞系統の継代中に生じた単なる修飾（ａｒｔｉｆａｃｔ）ではなく、ＥＳＣＣの発症機序において癌に関係する真の事象であることが示された。
【００９８】
ＰＣＤＨ１７のメチル化状態と発現状態を比較するため、１３の症例のうちいくつかについてはパラフィン封入組織内において非癌部組織検体は利用不可能であったものの、臨床腫瘍検体及び対応する非癌部の組織について定量リアル・タイム逆転写ＰＣＲ（quantitative real-time RT-PCR）及び免疫組織化学法(ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)を行った。メチル化状態及びｍＲＮＡ発現状態が１３の症例のうち５つにおいては合致しなかったものの、腫瘍特異的な過剰メチル化を伴った７つの症例のうち４つにおいて（５７．１％）、また、腫瘍特異的な過剰メチル化が無い５つの症例のうち２つにおいて（４０％）、対となる非癌部組織と比較して腫瘍ではＰＣＤＨ１７ｍＲＮＡの発現が減少していることが観察された（図３Ｃ参照）。ＥＳＣＣ臨床腫瘍組織及び非癌部の食道粘膜におけるＰＣＤＨ１７のタンパク質発現状態を調べるために、ＰＣＤＨ１７特異的抗体を用いて免疫組織化学分析を行った（図３Ｄ及び図６参照）。非癌部の食道粘膜では、ＰＣＤＨ１７の免疫反応は有棘細胞層における上皮細胞の膜上に点状のパターンとして観察された。ＰＣＤＨ１７の免疫染色は、いくらかの間葉系細胞、すなわち内皮細胞において観察された。ＤＮＡのメチル化を伴ったＥＳＣＣ腫瘍の代表的ケース及び近傍の非癌部の組織を用いた免疫組織化学染色によれば、ＰＣＤＨ１７タンパク質の発現は正常な内皮細胞では検出されたが、腫瘍細胞では検出されなかった（図３Ｄ参照）。この少数のケースでさえ、これらの結果により、ＰＣＤＨ１７のプロモーター領域内のメチル化はＥＳＣＣ臨床腫瘍組織において生じており、発現消失に関係していることが示された。
【００９９】
（５）臨床症例における臨床病理学的な特徴とＰＣＤＨ１７タンパク質の発現との間の関係
ＥＳＣＣ臨床腫瘍組織におけるＰＣＤＨ１７発現の低下を検証し、その臨床病理学的な意義を決定するために、１４５の臨床腫瘍組織検体についてＰＣＤＨ１７タンパク質の免疫組織化学分析を行った。表４は、ＰＣＤＨ１７タンパク質の発現状態と臨床病理学的特徴との間の関係を要約したものである。１４５のＥＳＣＣ検体のうち、１８検体（１２．４％）はＰＣＤＨ１７に対して免疫反応を示し（表４及び図６において陽性）、１２７検体（８７．６％）は免疫反応を示さなかった（表４及び図３Ｄにおいて陰性）。十分に／適度に分化した腫瘍（病理組織的分類、Ｐ＝０．０３２、フィッシャーの直接確率検定）よりも、男性のケース（Ｐ＝０．０１５、Χ2検定）及び不十分に分化した腫瘍において、より高頻度にＰＣＤＨ１７の発現が陰性であった。また、ｐＮ０腫瘍よりもｐＨ１腫瘍の方がよりＰＣＤＨ１７の発現が陰性である傾向にあった（Ｐ＝０．０８６、Χ2検定）。しかし、各腫瘍におけるＰＣＤＨ１７タンパク質発現は他の特徴に関係していなかった。Log rank検定を用いた全体の生存の単変量解析では、ＰＣＤＨ１７の発現状態と患者の全体的な生存との間に有意義な関係を証明することはできなかった（図７参照）。しかし、本研究中、pN0 ESCC腫瘍をもったＰＣＤＨ１７陽性患者（ｎ＝１０）では死亡したものはおらず、それに対し、陰性グループにおける４４人の患者中９人（２０．５％）が死亡した（図３Ｅ参照）。ｐＮ０ ＥＳＣＣ腫瘍を伴ったケースでは、ＰＣＤＨ１７が陽性及び陰性のグループの間では、臨床病理学的な差異は観察されなかった（表５参照）。これにより、陰性のＰＣＤＨ１７の免疫反応性は、この不利なグループにおいて治療手段の選択を予測するために有用であることが示された。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
（６）ＥＳＣＣ細胞株でのＰＣＤＨ１７発現の回復後における細胞増殖及び移動の抑制
ＥＳＣＣ細胞株及び臨床腫瘍検体におけるプロモーターのメチル化を介したＰＣＤＨ１７の高頻度な発現消失から、ＰＣＤＨ１７は有効なＴＳＧであることが示唆された。ＰＣＤＨ１７発現の回復が、当該遺伝子の発現を欠いたＥＳＣＣ細胞の増殖を抑制するかどうか調べるため、ＰＣＤＨ１７の全コード配列を有する発現コンストラクトを用いたコロニー・フォーメーションアッセイを行った（図４Ａ参照）。トランスフェクション及び続く薬剤耐性コロニーの選抜の後１０日目、空のベクターを導入した対照物のものと比較すると、ＰＣＤＨ１７を導入したＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００細胞によって産生された大きなコロニーの数は減少した。予想通り、免疫蛍光染色によれば、異所的に発現したＰＣＤＨ１７タンパク質は主に細胞膜に位置していた（図８参照）。細胞増殖アッセイを、安定形質転換したＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００細胞に対して行った（図４Ｂ参照）。ＦＬＡＧペプチドを付加したＰＣＤＨ１７を安定に発現する細胞（図参照）はわずかに増殖したが、空のベクターを導入した細胞よりも圧倒的に増殖が遅かった（Ｐ＜０．０５、スチューデントのt検定）。ＥＳＣＣ細胞におけるＰＣＤＨ１７が誘発する増殖阻害のメカニズムをさらに調べるため、安定にＰＣＤＨ１７を形質転換したＫＹＳＥ１７及びＫＹＳＥ２００細胞において、細胞周期及び細胞周期に関連する遺伝子の発現に対するＰＣＤＨ１７の異所性発現の影響について調べた（図４Ｃ参照）。蛍光標識細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ； ＦＡＣＳ）分析において、空ベクター(ｍｏｃｋ)の形質転換対照物と比較して、ＰＣＤＨ１７形質転換細胞では、Ｇ0〜Ｇ1期において細胞の蓄積が、Ｓ及びＧ2〜Ｍ期の細胞においては減少が観察されたが、一方、サブＧ1期の細胞において増加は観察されなかった。これにより、ＰＣＤＨ１７は、アポトーシスを誘発することなく、Ｇ1−ＳチェックポイントにおけるＥＳＣＣ細胞の停止（Ｇ0-Ｇ1停止）に貢献していることが示された。コントロール対象物と比較して、ＰＣＤＨ１７形質転換ＫＹＳＥ１７０及びＫＹＳＥ２００細胞では、ｐ２１及びｐ２７タンパク質発現における上昇傾向が、また、ＣＣＮＤ１タンパク質発現における下降傾向が観察された。
【０１０３】
ＥＳＣＣ細胞の運動性に対するＰＣＤＨ１７発現の回復の影響について、上述のスクラッチ傷害アッセイにより評価した。ＰＣＤＨ１７安定発現ＫＹＳＥ１７０細胞は、空のベクターを形質転換した対象物より圧倒的にゆっくりと傷つけた端に沿って広がった（図４Ｄ参照）。この結果により、ＰＣＤＨ１７は、腫瘍細胞の遊走も阻害することが示された。さらに、ＰＣＤＨ１７を形質転換したＫＹＳＥ１７０細胞の浸潤可能性を調べるために、マトリゲル浸潤アッセイを行った。非被覆膜（移動アッセイ）又はマトリゲル被覆膜（浸潤アッセイ）を通して下方のチャンバーに移動した細胞の数、及び浸潤インデックス、マトリゲル被覆膜を通して移動した細胞と比較した非被覆膜を通して移動した細胞の数は、コントロール細胞よりも、ＰＣＤＨ１７安定発現ＫＹＳＥ１７０細胞のほうが圧倒的に低かった（図４Ｄ参照）。これにより、ＰＣＤＨ１７は、ＥＳＣＣ細胞の浸潤可能性を阻害することも示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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