(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酒粕に超臨界二酸化炭素を接触させて得られる抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
酒粕に超臨界二酸化炭素を接触させて得られる抽出物を有効成分とする酸化ストレス改善剤。
【請求項３】
酒粕に超臨界二酸化炭素を接触させる工程を含むことを特徴とする、抗酸化剤の製造方法。
【請求項４】
酒粕に超臨界二酸化炭素を接触させる工程を含むことを特徴とする、酸化ストレス改善剤の製造方法。
【請求項５】
超臨界二酸化炭素が、圧力７ＭＰａ以上及び温度３１℃以上の条件下のものである請求項３記載の抗酸化剤の製造方法又は請求項４記載の酸化ストレス改善剤の製造方法。
【請求項６】
抽出時間が、１分間〜２４時間である請求項３〜５の何れか１項記載の抗酸化剤の製造方法又は酸化ストレス改善剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酒粕由来の抗酸化作用を有する抽出物の製造方法及びその抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸化物質（成分）は、生体内で産生される活性酸素の抑制に有効な成分として知られている。
この生体内で産生される活性酸素は、適当であれば生体調節、抗菌活性、抗ウイルス活性等の生体の恒常性維持に利用される一方で、ストレス、紫外線被爆等によって産生される活性酸素が過剰となると、核酸分解、タンパク質変性、脂質過酸化等を引き起こして細胞にダメージを与え、様々な病態の誘引の一因となってしまう。このような体内で過剰な活性酸素が産生されることによって、誘発又は助長される疾患としては、循環器疾患、脳神経系疾患、消化器系疾患、腎疾患、呼吸器系疾患、代謝・内分泌疾患、アレルギー疾患、眼疾患、老化・老人性疾患等が考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
この抗酸化成分が含まれている原料として酒粕（「酒絞り粕」とも云う）が用いられている。
例えば、日本酒の酒粕からの抗酸化作用を有する物質（「抗酸化成分」とも云う）を含む抽出物、すなわち抗酸化作用を有する抽出物を得る方法としては、例えば、酒粕を７０％以上のエタノール水溶液で室温抽出して得られた抽出物を水に溶解し酢酸エチル等によって油分を除去して、水溶性活性画分を得る方法（特許文献１）；酒粕を水に加えて４５℃で１０時間攪拌し、そこから９０℃まで煮沸して温水抽出活性画分を得る方法及び酒粕を６０％エタノール水溶液で室温抽出して含水エタノール抽出活性画分を得る方法（特許文献２）；酒粕を疎水有機溶剤であるヘキサンで室温抽出してヘキサン抽出活性画分を得る方法（特許文献３）が知られている。
また、焼酎の酒粕からの抗酸化作用を有する抽出物を得る方法としては、例えば、米焼酎の蒸留残液（特許文献２）、芋焼酎又は麦焼酎の酒粕をヘキサンで室温抽出してヘキサン抽出活性画分を得る方法（特許文献４）が知られている。
しかしながら、酒粕由来の抗酸化作用を有する物質を含む抽出物を効率良く得るには至っていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２８４６３２号公報
【特許文献２】特開平５−３１０５９０号公報
【特許文献３】特開２００９−１３１１０号公報
【特許文献４】特開２００９−１３２７９号広報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】板倉  弘重、Eiyo-Hyouka To Tiryo. Vol. 19, No. 3, 293-298, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヘキサン等の疎水性有機溶剤の抽出法では強い抗酸化活作用を有する抽出物を酒粕から得ることができるものの、疎水性有機溶剤は溶剤除去等の取り扱い難いため工業的な大量生産には余り適していない。一方で、一般的に安全性や作業効率性の点から工業的な大量生産に用いられているアルコールといった水溶性溶剤や水を用いた抽出法では強い抗酸化作用を有する抽出物が酒粕から得ることができないと云う問題があった。
そこで、本発明は、斯かる実情に鑑み、効率のよい、酒粕由来の抗酸化作用を有する抽出物の製造方法又はその抽出方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、酒粕由来の抗酸化作用を有する抽出物の製造方法について検討を行なったところ、意外にも、酒粕を超臨界状態にある流体（以下、「超臨界流体」とも云う）にて抽出すれば、強い活性酸素抑制作用を有する抽出物を効率よく得ることができ、斯かる酒粕由来の超臨界流体抽出物が抗酸化効果を発揮する医薬品、食品等として有効であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に係る発明を提供するものである。
（１）  酒粕に超臨界流体を接触させる工程を含むことを特徴とする、抗酸化作用を有する抽出物の製造方法。
（２）  超臨界流体が、超臨界二酸化炭素である上記記載の製造方法。
（３）  超臨界二酸化炭素が、圧力７ＭＰａ以上及び温度３１℃以上の条件下のものである上記記載の製造方法。
（４）  抽出時間が、１分間〜２４時間である上記記載の製造方法。
（５）  酒粕に超臨界流体を接触させて抽出することを特徴とする、抗酸化作用を有する抽出物の抽出方法。
（６）  超臨界流体が、超臨界二酸化炭素である上記記載の抽出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法は、強い抗酸化作用を有する抽出物を効率よく得ることができ、得られた抽出物を製剤の製造のために使用することができる。当該製剤は、体内の過剰な活性酸素を抑制することができるので、循環器疾患、アレルギー疾患、老化・老人性疾患等の活性酸素過剰産生によって誘発又は助長される症状及び疾患の予防、治療及び／又は改善効果を発揮する医薬品、食品等の有効成分として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、酒粕に超臨界流体を接触させる工程を含むものである。当該工程により、酒粕に含有する抗酸化成分を超臨界流体に溶解させて抽出することができる。
ここで、「超臨界流体」とは、臨界点以上の温度・圧力下においた物質の状態を云い、気体の拡散性と液体の溶解性を併せもつものを云う。
【００１１】
前記酒粕は、日本酒（清酒）や焼酎等を製造するときのもろみを圧搾した際に残った副産物又は蒸留されずに残った副産物であり、絞り粕、残渣とも云われる。
前記酒粕の形態は、特に限定されず、そのままの状態で、又はこれの細断、破砕や乾燥等の処理物を使用してもよい。当該形態としては、例えば、液状、ペースト状、固形状の何れでもよいが、凍結乾燥、冷風乾燥、温風乾燥、熱風乾燥等の乾燥手段を用いて、水分含量を低減させた粉末状や固形状等が、抗酸化成分の回収率を向上させる点から、好ましい。当該乾燥手段としては、凍結乾燥や４〜４０℃の冷風若しくは温風乾燥が、抗酸化成分の変質を防止する点から、好ましい。
このときの酒粕の水分含量は、特に限定されないが、０．０１〜１０質量％、より０．０１〜５質量％であるのが好ましい。
【００１２】
因みに、日本酒（清酒）の製造方法は、一般的な製造方法であればよく、例えば、蒸した米と米麹とを水と酵母を加えて発酵させた清酒もろみを作り、熟成後、圧搾して清澄した酒を得、これを更にろ過、火入れする方法等が挙げられる。
ここで云う日本酒（清酒）は、一般的には原料や製法によって普通酒や特定名称酒（本醸造酒、吟醸酒、純米酒等）等に分けることもできるが、特に限定されず、これらを全て含むものである。
【００１３】
また、焼酎の製造方法は、一般的な製造方法であればよく、例えば、米麹（又は麦麹）に水と酵母を加えて発酵させたもろみ（一次もろみ）を作り、これに蒸した主原料（蒸した米、大麦、サツマ芋、蕎麦、砂糖キビ等）と水とを仕込み、発酵醸成させ、二次もろみとし、次いで、二次もろみを蒸留して、蒸留酒を得る方法が挙げられる。
ここで、焼酎製造における主原料は、穀類又は芋類等でんぷんを含む食物であればよく、例えば、米、大麦、小麦、サツマ芋、蕎麦、砂糖キビ、胡麻、ジャガイモ、山芋、サトイモ、にんじん、豆類、栗、しそ等が挙げられ、２種以上組み合わせてもよい。好ましくは芋類及び／又は麦類である。
【００１４】
前記酒粕に超臨界流体を接触させる手段としては、例えば、水、エタン、エチレン、プロパン、亜酸化窒素、二酸化炭素等から選ばれる１種以上の物質を超臨界の状態（超臨界流体）とし、これを抽出可能な状態で酒粕に接触させ、酒粕から抗酸化成分を超臨界流体に抽出することができる手段等が挙げられる。
より具体的な抽出手段の態様としては、例えば、酒粕中に超臨界流体を通過させて抽出する手段；超臨界流体中で酒粕を攪拌、振とう又は浸漬して抽出する手段等が挙げられるが、このうち、酒粕中に超臨界流体を通過させて抽出する手段が好ましい。この他の抽出手段としては、例えば、還流抽出手段、超音波抽出手段、マイクロ波抽出手段、遠心抽出手段等が挙げられる。これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
次いで、得られた抽出物を回収する工程を含んでいてもよい。具体的には、酒粕に超臨界流体を接触させた後、適宜、遠心分離、ろ過やクロマト等の分離手段によって、抽出後の酒粕の残渣と、酒粕由来の抗酸化成分を含む超臨界流体抽出物とを分別し、当該抽出物を回収してもよく、更に回収物を用いて製剤を製造してもよい。
斯様な抽出に用いられる装置としては、超臨界流体抽出装置、超臨界二酸化炭素抽出装置等が挙げられる。
【００１５】
前記超臨界流体のうち、安全かつ容易に脱溶剤を行なうことができる点で、超臨界二酸化炭素が好ましい。
超臨界二酸化炭素は、７ＭＰａ以上の圧力又は３１℃以上の温度の条件下で流体状態になった二酸化炭素を意味する。このときの圧力条件は、抽出効率の点から、圧力７〜１００ＭＰａ、より７〜５０ＭＰａ、更に７〜３０ＭＰａであるのが好ましく、また、温度条件は、温度３１〜１００℃、より３１〜７０℃、更に３１〜５０℃であるのが好ましい。このうち、圧力７〜５０ＭＰａかつ温度３１〜１００℃、より圧力７〜３０ＭＰａかつ３１〜５０℃の超臨界二酸化炭素が好ましい。
【００１６】
抽出の際の超臨界二酸化炭素の使用量は、酒粕（乾燥物換算）１質量部に対して、５〜５００質量部、より１０〜２５０質量部、更に１５〜１５０質量部であるのが好ましい。
また、抽出時間は、１分間〜２４時間、１０分間〜１０時間であるのが好ましい。
また、酒粕を充填した容器に超臨界二酸化炭素を通過させて酒粕に接触させる際の二酸化炭素の通液速度は、容器の容量によっても異なるが、酒粕（乾燥物換算）１質量部に対して、０．１〜１００質量部／ｈ、より１〜２５質量部／ｈであるのが好ましい。
【００１７】
得られた超臨界流体抽出物は、原液、希釈液や濃縮液、懸濁液等の液状；乾燥物、粉砕物や粉末等の個体状；ペースト等の半固体状等の状態に、水やエタノール等の溶剤の配合や乾燥等により適宜調製してもよい。
また、得られた超臨界流体抽出物は、適宜公知の分離・精製技術、例えば、液液抽出、固液抽出、ろ過、活性炭処理、吸着樹脂等の方法によって不活性な不純物を除去し、更に精製してもよい。
【００１８】
後記実施例に示すように、酒粕に超臨界二酸化炭素を接触させて抽出した場合、ヘキサン抽出物と同等の抗酸化作用を有する超臨界二酸化炭素抽出物を得ることができる。しかも、超臨界二酸化炭素抽出法によれば、ヘキサン抽出法の約３倍も酒粕由来の抗酸化成分の回収率が向上する。よって、酒粕から超臨界流体を用いて抗酸化成分を抽出し、強い抗酸化作用を有する超臨界流体抽出物を回収すれば、効率よく抗酸化剤又は酸化ストレス改善剤を製造することができる。
【００１９】
従って、本発明の酒粕由来の超臨界流体抽出物は、抗酸化剤又は酸化ストレス改善剤（以下、「抗酸化剤等」とする。）として使用することができ、更にこの製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該抗酸化剤等には、酒粕由来の超臨界流体抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
当該抗酸化剤等は、生体内において活性酸素によって誘発又は助長される疾患、例えば、動脈硬化、糖尿病、高脂血症及び癌等の生活習慣病を予防、改善又は治療するための食品、医薬部外品、医薬品、飼料等の有効成分として配合して使用可能である。また、抗酸化剤等は、ベッドレス者、生活習慣病予備軍（生活習慣病には至っていないがその状態に近い（境界領域）の集団）に対しても有用である。また、当該食品は、抗酸化、生活習慣病等の予防、改善や治療をコンセプトとして、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
ここで、「生体内において活性酸素によって誘発又は助長される疾患」としては、循環器疾患、脳神経系疾患、消化器系疾患、腎疾患、呼吸器系疾患、代謝・内分泌疾患、アレルギー疾患、眼疾患、老化・老人性疾患等が挙げられる（非特許文献１）。
また、「酸化ストレス」とは、生体内の活性酸素産生系と消去系とのバランスが崩れ、過剰な活性酸素が産生されるようになった、生体にとって好ましくない状態を云う。「酸化ストレスを改善する」と云うのは、この崩れたバランスを正常の状態に戻すことを主として云う。
【００２０】
本発明の抗酸化剤等を、医薬品の有効成分として用いた場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば、経口、経腸、経粘膜、経皮、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。また非経口投与のものとしては、例えば、静脈内注射剤、筋肉注射剤、座剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００２１】
また、斯かる製剤では、本発明の抗酸化剤等を単独で、又はこれと薬学的に許容され得る担体とを適宜組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００２２】
これらの投与形態のうち、経口投与が好ましく、経口投与剤の有効成分として用いる場合の該製剤中の本発明の超臨界流体抽出物の含有量は、通常乾燥物換算で、製剤全質量の０．０００１〜２０質量％であるのが好ましく、０．０００２〜５質量％であるのがより好ましく、０．００１〜１質量％であるのが更に好ましい。
【００２３】
上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人（６０ｋｇ）１人当りの１日の投与量は、通常乾燥物換算で、有効成分の超臨界流体抽出物として６０〜６００００ｍｇであるのが好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与させ得るが、１日１回〜数回投与するのが好ましく、その投与間隔は４〜２４時間が好ましく、６〜１２時間がより好ましい。
【００２４】
本発明の抗酸化剤等を食品の有効成分として用いた場合、当該食品の形態は、固形、半固形又は液状でもよい。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、澱粉加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、及びそれらの原料が挙げられる。また、上記経口投与製剤と同様のように、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
【００２５】
種々の形態の食品を調製するには、本発明の抗酸化剤等を単独で、またはこれと食品に許容され得るもの、例えば他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油脂、乳化剤、防腐剤、香料、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて使用してもよい。
【００２６】
また、食品中の本発明の超臨界流体抽出物の含有量は、通常乾燥物として、飲料等の液状形態の場合、飲料中０．０００１〜２０質量％であるのが好ましく、０．０００２〜５質量％であるのがより好ましく、０．００１〜２質量％であるのが更に好ましい。また、錠剤や加工食品等の固形又は半固形形態の場合、全組成物中、０．０００１〜２０質量％であるのが好ましく、０．０００２〜５質量％であるのがより好ましく、０．００１〜２質量％であるのが更に好ましい。
【００２７】
また、本発明の抗酸化剤等を飼料の有効成分として用いた場合には、当該飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、本発明の抗酸化剤等を単独で、又はこの他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて配合し、常法により当該飼料を加工製造することがきできる。
また、飼料中における本発明の超臨界流体抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．０００２〜５質量％が好ましく、０．００１〜２質量％がより好ましい。
【００２８】
本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
製造例１
市販の日本酒の酒粕（小林酒造：澤の鶴）を室温（20〜30℃）にて風乾し、乾燥酒粕を得た。乾燥酒粕の水分含量は２〜３質量％であった。
乾燥酒粕400ｇを、オスターブレンダーST-1（大阪ケミカル株式会社）を用いて10分間粉砕した後、半回分式超臨界二酸化炭素抽出装置（三菱化工機（株）社製）に仕込み、30MPa及び40℃の条件下の二酸化炭素で6.5時間処理した。このとき処理に用いた二酸化炭素量は9.2kgであった。なお、通液速度は、酒粕1質量部に対して、超臨界二酸化炭素 3.5質量部/hであった。
抽出物は、二酸化炭素の圧力を臨界圧力以下の5.5MPa、および臨界温度以下の30℃とすることで、二酸化炭素と分離・回収し、超臨界二酸化炭素抽出物2.68g（回収率0.67％）を得た。
なお、回収の際、臨界圧力以下に戻すことによって二酸化炭素が気化するので作業性がよく、かつ、二酸化炭素には毒性がないので、安全である。
【００３０】
製造例２
市販の日本酒の酒粕（小林酒造：澤の鶴）を室温（20〜30℃）にて風乾して得られた乾燥酒粕100ｇにヘキサン100mLを加えて室温下、１時間攪拌した。濾過後、ヘキサン抽出物を回収し、ヘキサン抽出物214mg（回収率0.21％）を得た。
【００３１】
なお、これら抽出物のGLC分析（Agilent J&W GC カラムDB-1（30m,0.25mm,0.25μm）：80℃で1分間保持後、10℃/minで昇温し、340℃にて保持：検出FID）を行った。超臨界二酸化炭素抽出物には、主要ピークとして３つのピーク（保持時間16.9分、17.3分、18.8分）が認められ、これらのピークはヘキサン抽出物の主要ピークの保持時間とほぼ一致していた。
【００３２】
製造例３
上記製造例１で得られた乾燥酒粕200ｇを、オスターブレンダーST-1（大阪ケミカル株式会社）を用いて10分間粉砕した後、半回分式超臨界二酸化炭素抽出装置（三菱化工機（株）社製）に仕込み、30MPa及び40℃の条件下の二酸化炭素で８時間処理した。このとき処理に用いた二酸化炭素量は12.4ｋｇであった。なお、通液速度は、酒粕1質量部に対して、超臨界二酸化炭素 7.8質量部/hであった。
抽出物は、二酸化炭素の圧力を臨界圧力以下の5.5MPa、および臨界温度以下の30℃とすることで、二酸化炭素と分離・回収し、超臨界二酸化炭素抽出物1.12g（回収率0.56％）を得た。
【００３３】
試験例１
上記製造例１又は製造例２で得られた超臨界二酸化炭素抽出物又はヘキサン抽出物を、抽出物10mg/mLになるようにエタノールに溶解し、試料１及び２を調製した。これを、以下のようにして、ラットから単離した白血球を用いて抗酸化活性を測定した。
動物は、SDラット（10〜16週齢、雄）を使用した。当該SDラットから、フォーレン(アボットジャパン社製)麻酔下で、頚動脈採血を行った。この血液サンプルを、血球分離用試薬(SIGMA社製)に重層して遠心分離した後、白血球画分を回収した。
回収した白血球画分に、各試料を0.01mg/mLとなるよう加え、室温で1時間反応させた後、蛍光試薬10μM 5,6-CM-H2DCFDA（Invitrogen社製）を、10容量％(v/v)固定試薬（BECKMAN COULTER社製）を添加し、室温で20分放置した。その後、白血球の細胞内の活性酸素を、Flowcyteometory（フローサイトメーター：Becton Dickinson社製）にて測定した。
試料無添加にて上記と同様にして細胞内の活性酸素を測定し、無添加（コントロール）における活性酸素産生量を、活性酸素産生抑制率０％とした。
【００３４】
超臨界二酸化炭素抽出物は、コントロールを活性酸素抑制率0％とした場合、活性酸素抑制率40％であり、強い抗酸化活性を有していた。なお、ヘキサン抽出物は活性酸素抑制率48％であった。
【００３５】
以上のとおり、超臨界二酸化炭素抽出物は、ヘキサン抽出物の主成分とほぼ同じものを主成分とすると考えられ、またヘキサン抽出物とほぼ同等の強い抗酸化活性を有していた。しかも、本発明の超臨界二酸化炭素抽出法を用いれば、抽出原料である酒粕からの回収率が、ヘキサン抽出法の場合に比し、約３倍であるので、酒粕由来の抗酸化成分（抗酸化物質）を含む抽出物を、安全かつ効率よく回収できる。