(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンの被験者のための治療法を決定するためにバイオマーカーのレベルを測定する方法であって、前記バイオマーカーが、
（ａ）被験者から採られた生物学的試料中のＭｃｍ２から７の少なくとも１つから選択される第１バイオマーカー；および
（ｂ）被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、およびＫｉ６７の少なくとも１つから選択される第２バイオマーカーであり、
所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルと、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルとの組み合わせが、前記被験者に処方される治療法を表し、
所定値と比較した前記第１バイオマーカーのレベルが低く、所定値と比較した前記第２バイオマーカーのレベルが低い場合、治療法の選択肢が、
（ｉ）モニタリング；
（ｉｉ）非細胞周期特異的化学療法薬剤による治療；および
（ｉｉｉ）これらの組み合わせ
であり、
所定値と比較した前記第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した前記第２バイオマーカーのレベルが低い場合、治療法の選択肢が、
（ｉ）モニタリング；
（ｉｉ）Ｇ１または非細胞周期特異的化学療法薬剤による治療；
（ｉｉｉ）非ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期特異的化学療法薬剤による治療；および
（ｉｖ）これらの組み合わせ
であり、
所定値と比較した前記第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した前記第２バイオマーカーのレベルが高い場合、治療法の選択肢が、
（ｉ）手術；
（ｉｉ）ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期特異的化学療法薬剤による治療；および
（ｉｉｉ）これらの組み合わせ
である、方法。
【請求項２】
レベルを測定される前記バイオマーカーが、前記被験者から採られた生物学的試料中のＨ３Ｓ１０ｐｈである第３バイオマーカーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が、腫瘍生検、全血、血漿、血清、子宮頸部スメア、尿、気管支洗浄検体、唾液、および消化管擦過検体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２バイオマーカーのレベルが、免疫学的アッセイ法を利用して測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫学的アッセイ法が、ドットブロット分析、スロットブロット分析、ＲＩＡ、ペプチドマイクロアレイ、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２バイオマーカーのレベルが、分子生物学系アッセイ法を利用して測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分子生物学系アッセイ法が、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、核酸配列系増幅アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、およびコンピューター化検出マトリックスからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者が、乳ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガン、上皮性卵巣ガン、肺ガン、前立腺ガン、腎ガン、膀胱ガン、口腔粘膜のガン、食道ガン、リンパ細網系のガン、脳腫瘍、尿生殖器ガン、皮膚ガン、結腸ガン、胃ガン、膀胱ガン、尿管のガン、および気道消化管のガンからなる群から選択されるガンを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第２バイオマーカーが、連続的にも同時にも測定できる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１バイオマーカーのレベルが、前記第２バイオマーカーのレベル測定前に測定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的にガンの分野に関する。詳細には、本発明は、ガンの予後および治療のプロトコルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの体内の細胞の大多数は非増殖性の周期外の状態にあり、ほんのわずかな集団が活発に周期をなしている。これらの周期をなしている細胞は主に、子宮頸部、結腸または皮膚などの自己再生組織の幹−一過性増殖コンパートメントに位置する。対照的に、機能細胞（例えば肝細胞）のほとんどは休止（Ｇ０）して可逆的に停止した状態にあるか、または細胞の有糸分裂周期から不可逆的に退き、最終分化状態（例えば、ニューロン、筋細胞、または表面結腸上皮細胞）になっている。一方、ガンは制御されない細胞成長により特徴づけられ、したがって周期をなす細胞を高比率で含む。
【０００３】
細胞は、制限点と呼ばれる、Ｇ１における不連続の時間にそれらの環境中でマイトジェンに応答する。細胞がＧ１における感受性の高い期間に戻るまで、マイトジェンがなくてもＳ、Ｇ２、およびＭ期を通る細胞周期の進行に影響はない。高い細胞密度またはマイトジェン欠乏に応答し、細胞は２Ｎ  ＤＮＡ内容物とともに蓄積し、Ｇ０へと出る。細胞周期の遷移はサイクリン−ＣＤＫの組の変化により進められている。サイクリンＤ−ＣＤＫ４、サイクリンＤ−ＣＤＫ６、およびサイクリンＥ−ＣＤＫ２はＧ０／Ｇ１を制御し、完全なＥ２Ｆ活性のために必要とされ、Ｓ期はサイクリンＡ−ＣＤＫ２により開始され、サイクリンＢ−ＣＤＫ１はＧ２を通る進行および有糸分裂への進入を制御する。周期外の状態にある細胞と周期中にある細胞を何が区別するのかは、未だ解明されないままである。
【０００４】
ガンは、遺伝子突然変異蓄積により起こされる異種疾患の複雑な集まりであり、突然変異は、細胞増殖を刺激する調節遺伝子の活性を増加させ、通常それを抑制するタンパク質の活性を低下させる。点突然変異、遺伝子増幅、過剰メチル化、転座、またはウイルス性腫瘍性タンパク質との相互作用による、優性な刺激性発ガン遺伝子の活性化または劣性な腫瘍抑制遺伝子の不活性化は、マイトジェン、マイトジェン成長因子受容体、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＡＢＬ、ｐ１６ＩＮＫ４Ａなどの分子の上流のＰＩ３キナーゼＡＫｔ、Ｍｙｃ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ｐＲＢおよび下流のｐ５３を含む成長シグナル伝達経路のレベルのいずれにも影響を与えうる。
【０００５】
マイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングは、腫瘍形成を特徴付け、現在ガンの診断および予後のために利用可能な独特な分子サインの特定を目的とする集中的な研究分野である、遺伝子発現の複雑な多因子的、相互的、且つ段階的な変化の分析に理想的に適している。興味深いことに、発現アレイは、増殖サイン、発現パターンが腫瘍のグレード（分化状態）と相関している遺伝子、細胞周期状態、および倍加時間を含む。この増殖サインは、誘導される元の組織にかかわらず、腫瘍データセットに見られる最も顕著な遺伝子発現パターンの１つであり、Ｅ２Ｆ１、ＢＵＢ１、ＰＬＫ１、サイクリンＥ１、Ｄ１、およびＢ１など細胞周期に制御される多くの遺伝子を含む。
【０００６】
残念なことに、遺伝子発現を利用する予測ルールの実際の性能は、多くの腫瘍の種類について最初に示唆されたほど情報に富まないことが分かり、特定される遺伝子のリストは非常に不安定になりうる。例えば、遺伝子発現を利用する最も予測性の高いルールは、従来の臨床病理的な基準、例えば腫瘍の分化状態、拡がりの程度および増殖指数などに比べ、著しく向上した乳ガンの予後分類を与えなかった。実際に、ガンにおける遠隔転移のない生存期間を予測する発表済みの遺伝子サインの多くは、分化状態と有意に相関があるとわかっている。
【０００７】
臨床的に有用な増殖サインの同定のためのグローバルマイクロアレイアプローチには潜在的に無理がある。第１に、マイクロアレイアプローチは、ある程度、単一コンパートメント腫瘍モデルを仮定しており、そのモデルにおいて腫瘍は増殖し指数成長する細胞から構成されている。しかし、新生物は、個々の腫瘍細胞の細胞周期状態に関して非常に異質である。例えば、高分化型で低グレードの腫瘍において、クローン原性腫瘍細胞のごくわずかが周期をなしているが、大部分はその分化プログラムを達成しており不可逆的に周期から退き分化状態になっている（不稔コンパートメント）。したがって良性の過剰増殖状態（例えば過形成）および生理学的修復成長、多数の有糸分裂細胞を含む反応性病的状態は、高分化型ガンより高い増殖サインを与えることがある。
【０００８】
第２に、インビボの腫瘍細胞は、可逆的に周期から退き、非増殖Ｇ０状態になることがある。実際に、多くの腫瘍において、非増殖性細胞が大多数である。すなわち、成長割合（全細胞に対する増殖性細胞の比）は０．５未満である。この状態は恐らく驚くべきものでなく、なぜなら正常な組織は、増殖性と非増殖性要素から構成されており、この複雑な挙動のいくらかの名残がほとんどのガンに組み込まれているからである。汚染を起こす良性新生物細胞、腫瘍間質、リンパ球濾胞、腫瘍内および腫瘍周囲の炎症性浸潤、ならびに血管などの他の結合組織の存在もまた、追加の複雑な細胞周期速度論を持つ大量の細胞を加えることにより分析をゆがめる。したがって、個々の腫瘍内の複雑で異種の細胞周期速度論は、臨床的に有用なマイクロアレイ増殖サインの同定を妨げる可能性があり、日常の診療におけるフローサイトメトリーの使用を妨げた問題である。
【０００９】
フローサイトメトリーの使用は、臨床のサンプルがそのような分析に適していないことも多いため、その影響が限定されている。これは、部分的には、固定化のアーティファクト、不十分な量の組織により、反応性間質および／または良性の因子由来の汚染を起こす集団による解釈の困難さによる。
【００１０】
細胞増殖マーカーの評価は、以前は予後および予測に関する解決を何も与えず、当分野の専門家は増殖マーカーが有用な臨床情報を与えるであろうことに懐疑的であった。細胞増殖のパラメータを測定すると、腫瘍に関する客観的な情報が得られるという確信はあるが、多くの研究にもかかわらず、特定の細胞増殖マーカーの使用が、実際に、最適に利用されている従来の組織学的評価に対する改善になるという直接的な証拠はほとんどない。標準的な組織病理学的グレーディングおよびステージングに比べた増殖マーカーの相対値に関する重要な問題に取り組んでいる研究すらほとんどなかった。
【００１１】
遺伝子発現はガンにおいて結果の予測に応用されてきたが、遺伝子発現を利用する予測ルールの実際の性能は、最初に示唆されたほど情報に富むとは分かっていない。例えば、遺伝子発現を利用する現在最も予測性の高いルールは、乳ガンにおける従来のＮＰＩ予後因子に比べて、予後分類を著しく向上させていない。したがって、よく見られるガンの予後評価を向上させる新しいバイオマーカーの同定が緊急に求められている。
【００１２】
乳ガンはよく見られるガンの一例であり、その形態的および生物学的異質性、化学療法抵抗性を得る傾向、およびその病原の下にあるいくつかの分子メカニズムの存在により、複雑な疾患である。乳ガンの局所領域的治療を受ける女性の半分は二度と再発しないであろうが、残りの半分は最終的に転移性ガンにより死亡するであろう。したがって、これら患者の２群を明確に区別することが最適な臨床管理のために必須である。残念なことに、乳ガンの予後マーカーは現在限定されている。特に、成長制御および細胞周期遷移に関与する重要なキナーゼを標的とする新世代の小分子阻害剤の状況において、最適な抗ガン剤の選択を可能にする試験（予測試験）も不足している。例えば、乳ガンでは、現在、予測試験はＨｅｒ２免疫発現プロファイリングに限定されている。
【００１３】
上皮性卵巣ガン（ＥＯＣ）は、もう１つのよく見られるガンであり、米国および英国の女性に４番目によく見られるガンである。患者は、診察時には進行した疾患があることが多く、薬剤療法の進歩にもかかわらず生存率は低い。現在では、腫瘍ステージが最も重要な予後因子である。術後の残存病変、組織学的なサブタイプ、および腫瘍グレードも生存率を予測するが、ステージの進行および結果の原因となる生物学的変数に関して情報をほとんど与えない。
【００１４】
ガンまたは前ガン性の状態などの異常な増殖により起こされる疾患への改善された診断、予後、および予測アプローチが必要とされたままである。
【００１５】
本発明は、従来技術に関連する少なくとも１つの欠点を解決することを対象とする。
【００１６】
本明細書における文書、装置、動作、または知識の議論は、本発明の文脈を説明するために含まれる。どの資料も、本明細書の開示および請求項の優先日以前に関連分野の従来技術基準または共通一般知識の一部を形成すると認めるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Barkley et al., Exp Cell Res 313:3789-3799, 2007
【非特許文献２】Blow and Hodgson, Trends Cell Biol 12:72-78, 2002
【非特許文献３】Dudderidge et al. Clin Cancer Res 11 :2510-7, 2005
【非特許文献４】Dudderidge et al., Clin Cancer Res 11 :25110-2517, 2005
【非特許文献５】Dunkler et al. Eur J Cancer, 43:745-751, 2007
【非特許文献６】Eward et al., J Cell Sci 117:5875-5886, 2004
【非特許文献７】Gonzalez et al., J Pathol 204:121-130, 2004
【非特許文献８】Gritsko et al. Clin Cancer Res 9:1420-6, 2003
【非特許文献９】Haroske et al. Anal Cell Pathol 1998; 17:189-200, 1997
【非特許文献１０】Kingsbury et al., Exp Cell Res 309:56-67, 2005
【非特許文献１１】Krude et al. Cell; 88:109-19, 1997
【非特許文献１２】Shetty et al. Br J Cancer 93:1295-300, 2005
【非特許文献１３】Shetty et al., Br J Cancer 93: 1295-1300, 2005
【非特許文献１４】Stoeber et al. J Cell Sci, 114:2027-41, 2001
【非特許文献１５】Stoeber et al., EMBO J 17:7219-7229, 1998
【非特許文献１６】Stoeber et al., J Cell Sci 114:2027-2041, 2001
【非特許文献１７】Sudbo et al. N Engl J Med 344:1270-8, 2001
【非特許文献１８】Wharton et al. Br J Cancer; 91:262-9, 2004
【非特許文献１９】Williams and Stoeber, Curr Opin Cell Biol 19:672-679, 2007
【発明の概要】
【００１８】
本発明の適応性のさらなる範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内で種々の変更および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかになるので、詳細な説明および具体的な例が、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、説明のためのみに与えられることを理解されたい。
【００１９】
第１の実施形態において、本発明は、個体から採った生体試料(body sample)中の異常増殖細胞または細胞成長の異常の有無を測定する方法であって、試料中のバイオマーカーを検出する工程を含み、前記バイオマーカーが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびその基質であるヒストンＨ３（以下、「Ｈ３Ｓ１０ｐｈ」と称する）、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００２０】
一実施形態において、前記バイオマーカーは、前記バイオマーカーの標的ポリペプチドに対する特異的結合因子を利用して検出される。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、組織を（ｉ）正常または（ｉｉ）潜在的または実際に前ガンまたはガン性の異形成または新生物として分類する方法であって、バイオマーカーに対する特異的結合因子の組織試料への結合を測定する工程を含み、前記バイオマーカーが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、前記特異的結合因子は、前記バイオマーカーの標的ポリペプチドに対するものである。
【００２３】
一実施形態において、結合のパターンまたは程度は、公知の正常試料および／または公知の異常試料のものと比較することができる。
【００２４】
一実施形態において、あるバイオマーカー対さらなるバイオマーカーの比が測定される。
【００２５】
第３の態様において、本発明は、組織試料中の異常細胞を標識する方法であって、標的ポリペプチドに対する特異的結合因子に試料を接触させる工程を含み、特異性結合因子が異常増殖細胞に結合し正常細胞には結合しない条件下で、前記標識ポリペプチドが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００２６】
第４の態様において、本発明は、組織またはその試料における、異常細胞増殖、細胞成長の異常、腫瘍細胞周期速度論、細胞周期分布、異形成、新生物、または潜在的もしくは実際に前ガンもしくはガン性の状態の有無を測定、評価、または診断するための、標的ポリペプチドに対する特異性結合因子の使用を提供する。
【００２７】
一実施形態において、前記標的ポリペプチドは、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される２種以上のマーカーを含む。
【００２８】
第５の態様において、本発明は、ガンにおける療法への応答を予測する方法または疾患の進行を予測する方法であって、個体から採った生体試料における異常増殖細胞または細胞成長の異常の有無を測定する工程を含み、前記試料中の標的ポリペプチドを検出する工程を含み、前記標的ポリペプチドが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００２９】
第６の態様において、本発明は、療法薬剤開発研究に対する応答をモニタリングする方法であって、生体試料中でバイオマーカーを検出する工程を含み、前記バイオマーカーが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記バイオマーカー発現を評価して、試料中の異常細胞増殖、細胞成長の異常、腫瘍細胞周期速度論、細胞周期分布、異形成、新生物、または潜在的もしくは実際に前ガンもしくはガン性の状態の有無を測定する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
一実施形態において、前記薬剤開発研究は、前臨床薬剤開発研究である。
【００３１】
一実施形態において、前記薬剤開発研究は、前臨床薬剤開発研究である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前臨床薬剤開発研究はインビボ異種移植腫瘍モデルである。
【００３３】
第７の態様において、本発明は、被験者のガンの進行の予後を測定する方法であって、（ａ）被験者から採られた生物学的試料(biological sample)中のＭｃｍ２〜７の少なくとも1つから選択される第１バイオマーカーのレベルを評価する工程；および
（ｂ）被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択される第２バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者のガンの進行を表す方法を提供する。
【００３４】
一実施形態において、被験者のガンの進行を測定する前記方法は、被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択され、前記第２バイオマーカーとは異なる第３バイオマーカーのレベルを評価する工程をさらに含む。
【００３５】
第８の態様において、本発明は、ガンの被験者のための治療プロトコルを決定する方法であって、
（ａ）被験者から採られた生物学的試料中のＭｃｍ２〜７の少なくとも1つから選択される第１バイオマーカーのレベルを評価する工程；および
（ｂ）被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択される第２バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者に処方される治療法を表す方法を提供する。
【００３６】
一実施形態において、ガンの被験者のための治療プロトコルを決定する前記方法は、被験者から採られた生体学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択され、前記第２バイオマーカーとは異なる第３バイオマーカーのレベルを評価する工程をさらに含む。
【００３７】
第９の態様において、本発明は、ガンの被験者の治療的処置の効力を測定する方法であって、
（ａ）被験者から採られた生物学的試料中のＭｃｍ２〜７の少なくとも1つから選択される第１バイオマーカーのレベルを評価する工程；および
（ｂ）被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択される第２バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルの組み合わせが、治療的処置の効力を表す方法を提供する。
【００３８】
本発明のさらなる開示、目的、利点、および態様は、説明のためのみに与えられ本発明の範囲を限定するものではない添付図面と組み合わせ好ましい実施形態の以下の記載を参照すると、当業者により良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】細胞の有糸分裂周期の間のＫｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡおよびＨ３Ｓ１０ｐｈの存在を示す。Ｍｃｍ２〜７ＤＮＡ複製ライセンス化因子のレベルは、細胞周期の通過の間大きく変動せず、内因性ライセンス化抑制タンパク質ジェミニンの発現はＳ−Ｇ２−Ｍ期に制限されている。ジェミニン発現の増加はいくつかの悪性腫瘍に見られ、増殖と正に相関している。特に、この増加した発現は、侵襲性腫瘍においてすら、常にＳ−Ｇ２−Ｍ期に限定されている。オーロラＡ（およびＰＬＫ１；データ示さず）レベルはＧ１の間無視できるほどであり、Ｓ期の間に増加し、Ｇ２／Ｍの間に極大に達する。Ｈ３Ｓ１０ｐｈの存在は、有糸分裂に限定されており、そのため有糸分裂マーカーとして使用できる。Ｍｃｍ２〜７タンパク質発現を利用して、組織中の細胞周期状態を決定することができる。Ｍｃｍ２〜７は、細胞周期中にある細胞を特定するが（Ｇ１−Ｓ−Ｇ２−Ｍ期）、休止（Ｇ０）、分化、および老化「周期外」状態へ退いた後で厳しくダウンレギュレートされる。Ｋｉ６７は増殖細胞の細胞周期全体で発現されるので、Ｓ−Ｇ２−Ｍ期またはＭ期マーカーとＫｉ６７の比（例えば、ジェミニン／Ｋｉ６７、オーロラＡ／Ｋｉ６７、またはＨ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７）は、Ｇ１期の相対的な長さの指標として使用でき、したがって細胞周期進行の速度の指標として使用できる。
【図２】自己再生組織のＤＮＡ複製ライセンス化因子発現の概略図を示す。このモデルは、幹細胞コンパートメント、分裂−通過コンパートメント、および機能的コンパートメントを含む。これらのコンパートメントを通る細胞の流れは連続的である。新しい細胞は幹細胞コンパートメント（Ｓ）から供給され、その数は分裂−通過コンパートメント（Ｔ）で増幅される。成熟コンパートメント（Ｍ）に入ると、細胞は完全に分化し機能的に能力を持つようになる。幹細胞コンパートメントは、ＤＮＡ複製ライセンス化因子Ｍｃｍ２〜７の低い発現を示す。Ｍｃｍ２〜７のレベルは、細胞が分裂−通過コンパートメントに入ると急速に増加する。細胞が分化し、完全に分化した機能的表現型をとると、Ｍｃｍ２〜７の段階的なダウンレギュレーションがある。しかし、細胞が分裂−通過コンパートメントを出て、Ｍｃｍ２〜７ローディング因子Ｃｄｃ６のダウンレギュレーションに結合すると、増殖能力は、分化プログラムの達成の間に早期に失われる。明らかに、ガン、特に高グレードの腫瘍を特徴づける停止した分化は、Ｍｃｍ２〜７のダウンレギュレーションの失敗に関連づけられる。
【図３】乳ガンの細胞周期進行を示す。Ｍｃｍ２、Ｋｉ６７、ジェミニン、オーロラＡおよびＨ３ｐに関して免疫染色された２つの乳ガン生検検体を（Ａ）および（Ｂ）に示す。両ケースは、高いＭｃｍ２タンパク質発現により特徴づけられており、腫瘍細胞の大部分が細胞分裂周期にあることを示している。両腫瘍検体はＭｃｍ２発現により定義される高い成長比率を示すが、Ｓ−Ｇ２−ＭマーカージェミニンおよびオーロラＡならびに有糸分裂マーカーＨ３Ｓ１０ｐｈの発現に著しい差がある。（Ａ）この腫瘍ではジェミニンおよびオーロラＡの発現が非常に低いレベルであり、少数の細胞がセリン１０でのヒストンＨ３のリン酸化を示し（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）、停止または長期化したＧ１期を示している。（Ｂ）対照的に、この腫瘍はジェミニンおよびオーロラＡの高発現レベルおよび増加したＨ３Ｓ１０リン酸化を示し、迅速な細胞周期進行を示している。したがって、（Ｂ）に示される腫瘍は、ＳまたはＧ２／Ｍ細胞周期特異的薬剤に対して、より応答性が高いと仮定できる。
【図４】予後および予測ガン試験のための、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、およびこれらの組み合わせのマルチパラメータ分析を示す。マルチパラメータ分析においてこれらのマーカーの組み合わせを使用すると、腫瘍細胞が周期から退いたか（すなわち、不稔腫瘍細胞）どうかを決定することができるが、これは細胞周期に対する抗ガン剤および放射に耐性を持つであろう集団である。さらに、周期中にある腫瘍細胞では（Ｍｃｍ２〜７陽性）、細胞周期進行の速度を決定することが可能である。
【図５Ａ】バイオマーカーマルチパラメータ分析の確認を示す。（Ａ）Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈに対する抗体を含む非同期ＭＣＦ−７全細胞溶解物の免疫ブロット。
【図５Ｂ】バイオマーカーマルチパラメータ分析の確認を示す。Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈに対する抗体により免疫組織化学的に染色されたグレード３の乳ガンのパラフィン包埋組織切片の顕微鏡写真（元の倍率４００倍）。挿入写真は、正常乳房の免疫染色を示す（倍率８００倍）。
【図６】乳ガンシリーズの腫瘍グレードにわたるオーロラＡおよびＰｌｋ１発現を示す。
【図７】図７は、乳ガンシリーズの（Ａ）ＮＰＩ、（Ｂ）Ｐｌｋ１、および（Ｃ）オーロラＡによる再発までの時間曲線を示す。
【図８】図８
【図９】乳ガンシリーズの（Ａ）ＮＰＩおよびＰｌｋ１ならびに（Ｂ）ＮＰＩおよびオーロラＡによる再発までの時間曲線を示す。
【図１０Ａ】Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、オーロラＢ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈに対する抗体を含む非同期Ｈｅｌａ  Ｓ３全細胞溶解物の免疫ブロットを示す。
【図１０Ｂ】同期化Ｈｅｌａ  Ｓ３細胞由来の全細胞溶解物のバイオマーカーおよびアクチン（ローディングコントロール）の免疫ブロット。２時間間隔の同期化Ｈｅｌａ  Ｓ３細胞のＦＡＣＳプロファイル。
【図１０Ｃ】Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、オーロラＢ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈに対する抗体により免疫組織化学的に染色された上皮性卵巣ガン（ＥＯＣ）のパラフィン包埋組織切片の顕微鏡写真。元の倍率４００倍；挿入写真１０００倍。
【図１１】腫瘍グレード（ＥＯＣシリーズ）にわたるオーロラＡの発現を示す。
【図１２Ａ】ＥＯＣシリーズのオーロラＡ、腫瘍倍数体状態、および患者の生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。シリーズ全体にわたるオーロラＡ（最低三分位＜１１．３％、中央三分位１１．３〜２１．３％、最高三分位＞２１．３％）と無病生存期間；ログランク検定、ｐ＝０．０１。
【図１２Ｂ】ＥＯＣシリーズのオーロラＡ、腫瘍倍数体状態、および患者の生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。シリーズ全体にわたる腫瘍倍数体状態と無病生存期間；ログランク検定、ｐ＝０．０３。
【図１２Ｃ】ＥＯＣシリーズのオーロラＡ、腫瘍倍数体状態、および患者の生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。初期ステージサブグループのオーロラＡ（最低三分位＜８．７％、中央三分位８．７〜１９．６％、最高三分位＞１９．６％）と無病生存期間；ログランク検定、ｐ＝０．００４。
【図１２Ｄ】ＥＯＣシリーズのオーロラＡ、腫瘍倍数体状態、および患者の生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。初期ステージサブグループの腫瘍倍数体状態と無病生存期間；ログランク検定、ｐ＝０．０４。
【図１２Ｅ】ＥＯＣシリーズのオーロラＡ、腫瘍倍数体状態、および患者の生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。初期ステージサブグループのオーロラＡ（最低三分位＜８．７％、中央三分位８．７〜１９．６％、最高三分位＞１９．６％）と全生存期間；ログランク検定、ｐ＝０．０１。
【図１２Ｆ】ＥＯＣシリーズのオーロラＡ、腫瘍倍数体状態、および患者の生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。初期ステージサブグループの腫瘍倍数体状態と全生存期間；ログランク検定、ｐ＝０．０８。
【図１３】研究試料中のＭｃｍ２発現の分布を示すグラフ表示である。乳ガン患者コホートにわたるＭｃｍ２タンパク質発現の頻度（平均＝６４．４１０１、標準偏差＝３０．４６３２、Ｎ＝１８２）。
【図１４】３つの異なる細胞周期表現型を定義する細胞周期バイオマーカー発現の分布を示すグラフ表示である：（Ｉ）周期外状態；（ＩＩ）周期中Ｇ１遅延／停止状態；（ＩＩＩ）活発な周期状態。中央値（黒線）、四分位範囲（箱形）、および異常ケースを除くロバスト範囲（囲まれた線）が示される。異常ケースは、孤立した点により示される（ＬＩ：標識率）
【図１５】細胞周期表現型と無病生存期間の間の関連を示すカプラン・マイヤー曲線のグラフ表示を示す。（Ｉ）周期外状態；（ＩＩ）周期中Ｇ１遅延／停止状態；（ＩＩＩ）活発な周期状態。表現型ＩＩＩを表現型ＩおよびＩＩを合わせたものと比較する単変量分析では、ＨＲ＝３．９０（１．８１〜８．４０）、ｐ＜０．００１。ＰＩについて調整された多変量分析では、ＨＲ＝２．７１（１．１８〜６．２３）、ｐ＝０．１９。
【図１６】細胞周期表現型と乳ガンサブタイプとの間の関係を示すグラフ表示である。パネルは、細胞周期表現型Ｉ（周期外）、ＩＩ（Ｇ１遅延／停止）およびＩＩＩ（活発な周期）を示す、各乳ガンサブタイプの比率を示す。特に、Ｈｅｒ−２およびトリプルネガティブ腫瘍の大部分は、活発に周期をなす状態の表現型（ＩＩＩ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（詳細な説明）
臨床的有用性を含むバイオマーカーの有用性およびこれらバイオマーカーの分析が他の重要な細胞周期調節因子と組み合わされて患者の腫瘍試料中の細胞周期速度論および期の分布に関する情報を与える方法が提供される。この分析は、予後評価を改善するための診断アルゴリズムを与えることができ、細胞周期特異的薬剤に対する治療応答を予測する可能性も有する。これは、マルチパラメータ細胞周期分析が、ＤＮＡ複製ライセンス化経路および有糸分裂機構のコア成分を形成するバイオマーカーを利用して、ルーチンの患者腫瘍生検材料に行われるアプローチである。このアルゴリズムは、予後ツールを与えるだけでなく、細胞周期特異的薬剤（放射を含む）または上流の成長調節経路を阻害する薬剤の予測試験としても利用できる。このアルゴリズムは、前臨床研究（インビボ異種移植腫瘍モデル）および臨床試験における新規薬剤候補の効力を評価するのにも利用できる。
【００４１】
第１の態様において、本発明は、個体から採った生体試料中の異常増殖細胞または細胞成長の異常の有無を測定する方法であって、試料中のバイオマーカーを検出する工程を含み、前記バイオマーカーが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびその基質であるヒストンＨ３（以下、「Ｈ３Ｓ１０ｐｈ」と称する）、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００４２】
一実施形態において、前記バイオマーカーは、前記バイオマーカーの標的ポリペプチドに対する特異的結合因子を利用して検出される。
【００４３】
「生体試料」とは、バイオマーカーの発現が検出できる細胞、組織、または体液の採取試料を意味する。そのような生体試料の例には、血液、リンパ、尿、婦人科的液体、生検、および塗抹標本があるが、これらに限定されない。生体試料は、例えば、ある部分をひっかくかまたは綿棒で拭くことにより、或いは針を使って体液を吸引することによるなどの種々の技術により患者から得られる。種々の生体試料を回収する方法は当分野に公知である。生体試料をガラススライドに移して、倍率を上げて見ることができる。検体の保護および検査の容易化のために、ガラススライド上の細胞に固定液および染色液を塗布できる。
【００４４】
一実施形態において、生体試料は、子宮頸部スメア試験を含む子宮頸部、乳房、尿路悪性腫瘍（生検組織試料および尿細胞スメアの両方を試験）、結腸、肺、膀胱、皮膚、咽頭、食道、気管支、リンパ節、および血液学的悪性腫瘍、転移性肉腫および癌腫のエビデンスには血液および血清のいずれかから誘導される。いくつかに実施形態において、本発明は、頸部腺上皮細胞（腺上皮内新生物、ＧＩＮ）の前ガン状態異常または他の組織の前ガン状態異常の評価にさらに利用できる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、新生物細胞の検出、または反応性変化を示す細胞からのそれらの区別が非常に困難な場合に他の臨床検体の細胞学的または生化学的評価に使用するのが特に適切なことがある。そのような検体には、唾液、気管支肺胞洗浄検体、尿、および消化管（食道、胃、および膵臓、胆管および膵管を含む）の擦過検体がある。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明は、増殖の評価が、臨床結果のより正確な予測および／または療法のより合理的な選択を可能にする、組織の組織学的または生物学的評価に適用できる。検体には、腺細胞（例えば、肺、乳房、結腸、前立腺、胃）、扁平細胞（例えば、肺、皮膚、食道）または他の上皮細胞タイプ（例えば、膀胱、尿管、腎臓、卵巣）の悪性腫瘍がある。
【００４７】
一実施形態において、Ｍｃｍ２、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、ジェミニン、オーロラＡおよびオーロラＢ、およびその基質ヒストンＨ３のマルチパラメータ分析を利用して、ＥＯＣの進行を評価し、インビトロまたはインビボでこの腫瘍タイプの細胞周期速度論を評価できる。
【００４８】
第２の態様において、本発明は、組織を（ｉ）正常または（ｉｉ）潜在的または実際に前ガンまたはガン性の異形成または新生物として分類する方法であって、バイオマーカーに対する特異的結合因子の組織試料への結合を測定する工程を含み、前記バイオマーカーが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００４９】
一実施形態において、前記特異的結合因子は、前記バイオマーカーの標的ポリペプチドに対するものである。
【００５０】
一実施形態において、結合のパターンまたは程度は、公知の正常試料および／または公知の異常試料のものと比較することができる。
【００５１】
一実施形態において、あるバイオマーカー対さらなるバイオマーカーの比が測定される。
【００５２】
「バイオマーカー」は、生物学的試料中のその発現レベルが、所定レベルのものに比べ変化している遺伝子またはタンパク質である。所定のレベルは、正常または健常被験者から採られた生物学的試料中に見られるレベルでよい。本発明のバイオマーカーは、異常増殖細胞または細胞成長の異常に対し選択的である。
【００５３】
本発明の他の実施形態において、バイオマーカーは、生物学的試料中の所定の発現レベルに比べそのレベルが変化している遺伝子またはタンパク質である。例えば、生物学的試料中の第１バイオマーカーの所定値は、生物学的試料中の第１バイオマーカーに陽性な細胞の２０％超、２５％超、または３０％以上である。
【００５４】
関連した態様において、生物学的試料中の第２または第３のバイオマーカーの所定値は、生物学的試料中の第２または第３のバイオマーカーに陽性な細胞の２０％未満、１５％未満、１０％未満、または７％以下である。
【００５５】
本発明のバイオマーカーには、遺伝子およびタンパク質、ならびにそのバリアントおよびフラグメントがある。そのようなバイオマーカーには、前記バイオマーカーをコードする核酸配列の全体配列または部分配列或いはそのような配列の相補配列(complement)を含むＤＮＡがある。バイオマーカー核酸には、目的とする核酸配列のいずれかの全体配列または部分配列を含むＲＮＡがある。バイオマーカータンパク質は、本発明のＤＮＡバイオマーカーによりコードされるか、またはそれに相当するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、バイオマーカータンパク質またはポリペプチドのいずれかの全体または部分的なアミノ酸配列を含む。
【００５６】
本発明は、ルーチンに固定化されている手術生検材料における免疫発現プロファイリングにより、Ｇ１−Ｓ期遷移を制御するＤＮＡ複製ライセンス化経路のバイオマーカー（例えば、Ｍｃｍ２、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、およびジェミニン）とＧ２−Ｍ遷移に関与する有糸分裂機構のバイオマーカー（例えば、オーロラＡおよびその基質Ｈ３）を組み合わせて標的とすると、これらの腫瘍の細胞周期速度論への独特な洞察を与えるという意外な発見に基づいている。マルチパラメータ分析においてマーカーのこれらの組み合わせを利用して、腫瘍細胞が周期から退いたかどうか（すなわち、不稔腫瘍細胞）を決定できるが、これらは細胞周期に対する抗ガン剤および放射に耐性であろう集団である。さらに、細胞周期中の腫瘍細胞（Ｍｃｍ２〜７陽性）では、細胞周期進行の速度を決定することができる。
【００５７】
進行が遅く主にＧ１にとどまっている腫瘍は、ＳおよびＧ２期に対する薬剤（表１）に対して示す応答が低そうであり、したがってＧ１に対する薬剤により治療しなければならない（腫瘍表現型−Ｍｃｍ２〜７のレベルは高いが、低レベルのジェミニン、オーロラＡ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈと関連し、ジェミニン／Ｋｉ６７比は０に向かう）。対照的に、細胞周期進行が加速された腫瘍では、ＳおよびＧ２／Ｍに対する薬剤（表１）に対して良好な応答を示しそうである（腫瘍表現型−高レベルのＭｃｍ２〜７、高ジェミニン、高オーロラＡ、高Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、ジェミニン／Ｋｉ６７比は１に向かう）。細胞周期進行が加速され、高比率のＧ２−Ｍを示す腫瘍は、放射にも最良の応答を示しそうである。ＤＮＡ複製ライセンス化経路のコア成分（Ｍｃｍ２〜７ファミリーのタンパク質およびジェミニン）に対する結合分子および有糸分裂機構のコア成分（オーロラＡ、ポロ様キナーゼ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ）に対する結合分子が特に有用である。細胞周期進行の速度を分析可能にするアルゴリズムの中で、他のバイオマーカーをさらなるパラメータとして使用できる。細胞周期進行の速度を分析可能にするバイオマーカーにはＫｉ６７がある。
【００５８】
一実施形態において、本発明は、ルーチンに処理される手術生検材料における腫瘍集団の細胞周期速度論を決定する方法を提供する。マルチパラメータアルゴリズムにより、細胞周期特異的薬剤および放射に抵抗力のある非増殖性の周期外（不稔）細胞を、活発に周期をなす細胞から区別できる。マルチパラメータ分析により、正確な腫瘍細胞周期速度論が測定でき、特定の患者を治療するために最適な、細胞周期に対する薬剤が選択できる（個別化医療）（表１）。治療介入を導く潜在的に強力な予測試験を実施するほかに、このマルチパラメータ分析は、再発までの時間（無病生存期間／無再発期間）および死亡までの時間（全生存期間）を決定する強力な予後ツールを提供する。
【００５９】
第３の態様において、本発明は、組織試料中の異常細胞を標識する方法であって、標的ポリペプチドに対する特異的結合因子に試料を接触させる工程を含み、特異性結合因子が異常増殖細胞に結合し正常細胞には結合しない条件下で、前記標識ポリペプチドが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００６０】
試料中の異常増殖細胞の存在を確認するために、特異的結合因子が試料に結合するか否かを測定できる。
【００６１】
第４の態様において、本発明は、組織またはその試料における、異常細胞増殖、細胞成長の異常、腫瘍細胞周期速度論、細胞周期分布、異形成、新生物、または潜在的もしくは実際に前ガンもしくはガン性の状態の有無を測定、評価、または診断するための、標的ポリペプチドに対する特異性結合因子の使用を提供する。
【００６２】
一実施形態において、標的プリペプチドは、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される２種以上のマーカーを含む。
【００６３】
各細胞分裂周期の間のＤＮＡの正確な複製はゲノム安定性のために必須であり、厳しく制御された開始事象により達成される。ＤＮＡ複製開始は、有糸分裂後期およびＧ１期初期の間の複製開始点での複製前複合体の集合に依存する。複製前複合体の集合は、複製開始点認識複合体（ＯＲＣ）、Ｃｄｃ６、Ｃｄｔ１、およびＭｃｍ２〜７が開始点に連続的に結合するものであり、Ｓ期の間にクロマチンがＤＮＡ合成に関して「ライセンス化」されるようにする。Ｍｃｍ２〜７タンパク質レベルなどＤＮＡ複製ライセンス化因子の制御は、ヒトの組織において細胞増殖を制御する強力な下流機構を与える。Ｍｃｍ２〜７の調節不全は、多段階の腫瘍形成における初期の事象である。複製前複合体の再集合の阻害は、開始点が細胞周期あたりただ一度だけ刺激されることを保証し、ゲノム完全性の維持のために重要である。
【００６４】
ライセンス化抑制因子ジェミニンはＳ−Ｇ２−Ｍ期の間に高レベルで発現され、Ｃｄｔ１との相互作用によりクロマチンへのＭｃｍ２〜７の再ローディングを阻害する。インビボのヒトの細胞集団では、ジェミニンが枯渇すると、ＤＮＡの過剰複製による甚大なゲノム不安定性が生じ、巨大な異数体核を持つ細胞が出現するが、これは侵襲性ガンの形態的／病理学的特徴である。ジェミニンの不活性化もまた中心体の過剰複製を起こし、Ｇ２−Ｍチェックポイント機構の抑止と共に、染色体不分離および異数性を促進するであろう多数の有糸分裂欠陥を生じる。これらの知見は、細胞周期の多数のステージでゲノム完全性を維持するにあたりジェミニンが果たす主要な役割を強調するものである。
【００６５】
有糸分裂事象の厳格な制御は、姉妹染色分体分離および細胞分裂が失敗せずに完了するために必須である。ＣＤＫは有糸分裂進入の支配的な制御因子であるが、それらは単独では作用しない。ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、オーロラＡ、およびオーロラＢは、重大な有糸分裂事象のサブセットを制御する３つの追加のプロテインキナーゼである。有糸分裂を通過する遷移は、ポロ様キナーゼ（ＰＬＫ）およびオーロラキナーゼなどのプロテインキナーゼに依存している。オーロラキナーゼは、中心体成熟および分離、染色体の配向および分離、ならびに細胞分裂を含む、有糸分裂のいくつかのステージの重要な制御因子である。
【００６６】
ジェミニン同様に、オーロラキナーゼの内因性レベルは、細胞周期依存的に厳密に制御されており、Ｇ１−Ｓでは低レベル、Ｇ２−Ｍ中に蓄積、有糸分裂の最後で迅速に分解する。
【００６７】
腫瘍の細胞周期速度論は、予後のアルゴリズムに影響を与えるだけでなく、細胞周期特異的薬剤（上記参照）への応答を予測するためにも重要である。出願者らは、単純な免疫組織学的技術を利用し、ルーチンの手術生検材料に直接適用される細胞周期機構のコア成分の分析が、インビボで機能している腫瘍細胞周期速度論プロファイルへの詳細且つ独特な洞察を与えることを示した。
【００６８】
先に議論のとおり、Ｍｃｍ２、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、およびＭｃｍ７（本明細書では「Ｍｃｍ２〜７」または「Ｍｃｍ２から７」と称する）の発現は、周期中を通る細胞を、「周期外」状態にある細胞と区別することを可能にする。開始点ライセンス化阻害剤ジェミニンは、有糸分裂キナーゼＰＬＫ１、オーロラＡ、およびオーロラＢと同様に、Ｓ−Ｇ２−Ｍ期の間だけ検出可能である。ヒストンＨ３はオーロラキナーゼの基質であり、有糸分裂の間だけリン酸化される。このように、ホスホヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）はＭ期のマーカーである。したがって、このようなＧ１／ＳおよびＧ２／Ｍ制御因子のマルチパラメータ分析は、手術生検材料（ルーチンに固定化および処理される）における細胞周期状態の詳細なキャラクタリゼーションを与える。例えば、休止している閉経前の乳房では、Ｍｃｍ２〜７の発現は高いが、ジェミニン、オーロラＡ／Ｂ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈタンパク質レベルは低く、乳房内腔上皮がＧ１延長または停止状態にあることを示すが、これは前ガン状態の病巣および緩慢に成長する新生物にも見られる表現型である。対照的に、急速に成長する侵襲性腫瘍では、Ｍｃｍ２〜７の発現レベルが高いだけでなく、Ｓ−Ｇ２−ＭおよびＭ期のマーカーの発現も増加する。このプロファイルは、腫瘍グレードの上昇（分化の進んでいない状態）、ゲノム不安定性の増加および生存期間の低下と関連がありそうな加速した細胞周期進行を示している。
【００６９】
したがって、細胞周期バイオマーカー分析は、特に細胞周期特異的薬剤に関して、治療応答の予測因子として重要性がある。例えば、オーロラＡおよびＰＬＫ１は、小分子阻害剤の潜在的な標的であるが、その発現レベルは卵巣ガンおよび乳ガンで大きく変動する。これらの腫瘍は、非常に異なる細胞周期速度論および細胞周期分布も示す。加速された細胞周期進行およびこれら標的タンパク質の高レベル発現を示す腫瘍は、そのような機構に基づく治療介入に最も大きな応答を示しそうである。
【００７０】
細胞周期速度論の分析を利用し、異常増殖細胞および細胞成長の異常におけるチェックポイント経路の活性化により細胞周期進行に影響を与える薬剤への応答をモニターすることもできる。例えば、治療前および治療後の生検材料におけるジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、およびジェミニン／Ｋｉ６７の免疫発現分析は、ＵＣＮ―０１の耐容量を決める情報を与えることができ、次いでそれを利用して、シスプラチンに誘起された細胞周期停止を抑止することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、抗体を利用して、個体から採った試料中のバイオマーカーポリペプチドの過剰発現を検出する免疫細胞化学技術が提供される。本発明のこの態様において、対象とする特定のバイオマーカーに対する少なくとも１種の抗体が使用される。過剰発現は、例えば、ハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲなど核酸に基づく技術によっても検出できる。本発明の方法を実施するための試薬を含むキットもさらに提供される。
【００７２】
本発明の方法は、疾患の検出のために患者の試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの検出を必要とするが、いくつかの実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上のバイオマーカーを使用して本発明を実施できる。生体試料中の２種以上のバイオマーカーの検出を利用して疾患の事実を特定できることが認識される。したがって、いくつかの実施形態において、２種以上のバイオマーカーが使用され、より好ましくは２種以上の相補的なバイオマーカーが使用される。「相補的」とは、生体試料中のバイオマーカーの組み合わせの検出が、バイオマーカーの一方だけ使用される場合に疾患が同定されるであろう場合よりも高いパーセンテージで疾患を失敗せず同定できるものである。このように、いくつかの場合で、少なくとも２種のバイオマーカーを使用してより正確に疾患を同定できる。
【００７３】
したがって、少なくとも２種のバイオマーカーが使用される場合、個々のバイオマーカーポリペプチドに対する少なくとも２種の抗体が使用され、本明細書に開示される免疫細胞化学方法が実施されるであろう。前記複数の抗体は、同時にでも、並行にでも、生体試料と接触させてよい。
【００７４】
一実施形態において、第１から第５の態様のいずれかによる方法は、試料中のさらなる標的ポリペプチドを検出する工程を含むことがあるが、前記標的ポリペプチドは、Ｇ１／Ｓ期境界またはＳ期に特異的な細胞周期に制御される遺伝子からなる群から選択される。そのような遺伝子には、ヘリカーゼ（ＤＤＸ１１）、ウラシルＤＮＡグリコラーゼ（ＵＮＧ）、Ｅ２Ｆ５、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）、サイクリンＥ２（ＣＣＮＥ２）、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＤＣ６、ｐ２１  ＷＡＦ−１（ＣＤＫＮ１Ａ）、ＣＤＫＮ３、Ｅ２Ｆ１、ＮＰＡＴ、ＰＣＮＡ、ステムループＢＰ（ＳＬＢＰ）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ２Ｃ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＭＳＨ２、ＮＡＳＰ、リボヌクレオチドレダクターゼＭ１（ＲＲＭ１）、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）、チミジンシンセターゼ（ＴＹＭＳ）、複製因子Ｃ４（ＲＦＣ４）、ＲＡＤ５１、クロマチン因子１Ａ（ＣＨＡＦ１Ａ）、クロマチン因子１Ｂ（ＣＨＡＦ１Ｂ）、トポイソメラーゼＩＩＩ（ＴＯＰ３Ａ）、ＯＲＣ１、プライマーゼ２Ａ（ＰＲＩＭ２Ａ）、ＣＤＣ２７、プライマーゼ１（ＰＲＩＭ１）、フラップ構造エンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ１）、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＮＡＣＡ）、ＰＫＭＹＴ１、および複製タンパク質Ａ２（ＲＰＡ２）があるが、これらに限定されない。対象となる他のＳ期遺伝子には、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、ＤＮＡポリメラーゼＩα（ＤＮＡ  ＰＯＬ１）、ＤＮＡリガーゼ１、Ｂ−Ｍｙｂ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ  ＭＥＴ）、ペリセントリン（ＰＥＲ）、ＫＩＦ４、ＤＰ−１、ＩＤ−３、ＲＡＮ結合タンパク質（ＲＡＮＢＰ１）、ギャップ結合α６（ＧＪＡ６）、アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＤＨ）、ヒストン２Ａ  Ｚ（Ｈ２Ａ．Ｚ）、スペルミンシンターゼ（ＳｐｍＳ）、プロリフェリン２、Ｔリンパ球活性化タンパク質、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、およびＬ６抗原（Ｌ６）がある。
【００７５】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはＥ２Ｆ転写因子により誘起される遺伝子を含む。そのような遺伝子には、チミジル酸シンターゼ、チミジンキナーゼ１、リボヌクレオチドレダクターゼＭ１、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２、ＣＤＫ２、サイクリンＥ、ＰＣＮＡ、ＤＮＡプライマーゼの小サブユニット、トポイソメラーゼＩＩＡ（Ｔｏｐｏ２Ａ）、ＤＮＡリガーゼ１、フラップエンドヌクレアーゼ１、ＲＡＤ５１、ＣＤＣ２、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、ＫＩＦＣ１、ＦＩＮ１６、ＢＵＢ１、インポーチンα−２、ＨＭＧ２、ゼスト(zeste)のエンハンサー、ＳＴＫ−１、ヒストンステムループＢＰ、Ｒｂ、Ｐ１８−ＩＮＫ４Ｃ、アネキシンＶＩＩＩ、ｃ−Ｍｙｂ、ＣＤＣ２５Ａ、サイクリンＤ３、サイクリンＥ１、デオキシシトシンキナーゼ、ＤＰ−１、エンドセリン変換酵素、エノラーゼ２、Ｐ１８  ＩＮＫ４Ｃ、リビヌクレオチドレダクターゼ、およびウラシルＤＮＡグリコラーゼ２があるが、これらに限定されない。特別な実施形態において、対象となるバイオマーカーは、細胞周期制御およびＤＮＡ複製に関与するＥ２Ｆ転写因子により誘起される遺伝子であり、例えばサイクリンＥ２、ｐ５７ＫＩＰ２、ＲＡＮＢＰＭ、および複製タンパク質Ａ１がある。対象となるＥ２Ｆ誘起遺伝子のいくつかはアポトーシスに関与しており、ＡＰＡＦ１、Ｂｃｌ−２、カスパーゼ３、ＭＡＰ３キナーゼ５、およびＴＮＦ受容体関連因子がある。他のＥ２Ｆ誘起遺伝子は転写の制御に関与しており、例えば、アシュ(ash)２様、ポリホメオティック２、胚性外胚葉タンパク質、ゼストのエンハンサー、スプリットのヘアリーエンハンサー、ホメオボックスＡ１０、ホメオボックスＡ７、ホメオボックスＡ９、ホメオドメインＴＦ１、前Ｂ細胞白血病ＦＴ３、ＹＹ１  ＴＦ、ＰＯＵドメインＴＦ、ＴＡＦＩＩ１３０、ＴＢＰ−因子１７２、基本ＴＦ３、ブロモドメイン／ジンクフィンガー、ＳＷＩ／ＳＮＦ、ＩＤ４、ＴＥＡ−４、ＮＦＡＴＣ１、ＮＦＡＴＣ３、ＢＴ、ＣＮＣ−１、ＭＡＦ、ＭＡＦＦ、ＭＡＦＧ、コア結合タンパク質、Ｅ７４様因子４、ｃ−ＦＯＳ、ＪＵＮＢ、ジンクフィンガーＤＮＡ  ＢＰ、およびＣｂｐ／ｐ３００トランス活性化因子である。シグナル伝達に関与しているＥ２Ｆ誘起遺伝子も対象となる潜在的なバイオマーカーであり、ＴＧＦβ、フォリスタチン、骨形成タンパク質２、ＢＭＰ受容体１Ａ型、フリズルドホモログ１、ＷＮＴ１０Ｂ、スフィンゴシンキナーゼ１、二重特異性ホスファターゼ７、二重特異性（Ｙ）ホスファターゼ、ＦＧＦ受容体３、プロテインチロシンホスファターゼ、二重特異性（Ｙ）ホスファターゼＤ６６５５、インスリン受容体、成熟Ｔ細胞増殖１、ＦＧＦ受容体２、ＴＧＦα、ＣＤＣ４２エフェクタータンパク質３、Ｍｅｔ、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＴＡＣＣ１、およびＴＥＡＤ４がある。
【００７６】
本発明による組織試料中の異常検出に基づき、組織が潜在的にまたは実際に前ガンまたはガン性であると分類された場合、適切な診断および／または臨床の経過観察が求められるであろう。
【００７７】
本発明は、診断された病気の療法の方針を決定するための予測的方法も提供する。
【００７８】
したがって、第５の態様において、本発明は、ガンにおける療法への応答を予測する方法または疾患の進行を予測する方法であって、個体から採った生体試料における異常増殖細胞または細胞成長の異常の有無を測定する工程を含み、前記試料中の標的ポリペプチドを検出する工程を含み、前記標的ポリペプチドが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００７９】
細胞成長の異常には、前ガン性またはガン性細胞、他の細胞増殖障害、例えば限定はされないが、乾癬、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患がある。
【００８０】
それ自体細胞増殖障害であることに加え、炎症性腸疾患は、全ての患者においてではないがガン状態になる前兆である場合もあるので、本発明によるそれらの検出を利用して、より徹底的な経過観察に貴重な結果を与えることができる。炎症性腸疾患では、結腸および腸の細胞の脱落があることがあり、便の試料およびそのような試料から採った細胞の組織標本の分析を実施することができる。
【００８１】
本発明の異なる実施形態によれば、本発明の種々の態様による特異的結合因子と接触されるべき試料は、標的ポリペプチドへの特異的結合分子の結合、核酸レベル、酵素活性などの測定を可能にする任意の利用可能な技術を利用して調製してよい。種々な技術は、免疫組織化学のための細胞固定化に使用されるとおり（標的ポリペプチドに結合する抗体などの分子）の当分野に標準的である。
【００８２】
コントロールおよび被験試料上の抗体などの特異的結合因子の検出は、任意の適切な手段により測定される。個々のレポーター分子による標識付けは１つの可能性である。レポーター分子は、検出可能で、好ましくは測定可能なシグナルを、直接的にも間接的にも生じることができる。レポーター分子の結合は、直接でも、間接でも、例えばペプチド結合など共有結合でも、非共有結合でもよい。ペプチド結合による結合は、遺伝子融合コード化結合分子(gene fusion encoding binding molecule)（例えば抗体）とレポーター分子のリコンビナント発現の結果のことがある。
【００８３】
ある好ましい様式は、スペクトル的に隔離された吸収または発光特性を持つ個別の蛍光色素、蛍光体、またはレーザー色素を持つ各結合因子の共有結合による。好適な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドがある。好適な発色色素にはジアミノベンジジンがある。
【００８４】
他のレポーターには、着色され、磁性または常磁性であるラテックスビーズなどの高分子コロイド粒子または粒子材料ならびに検出可能なシグナルを、直接または間接に、視覚により観察可能に、電子的に検出可能に、または他の方法で記録するようにできる生物学的または化学的に活性な薬剤がある。これらの分子は、例えば、色を生みだし、または色を変え、或いは電気的性質を変化させる反応を触媒する酵素でもよい。それらは、エネルギー状態の間の電子遷移が特性スペクトル吸収または発光を生み出すように、分子的に励起可能である。それらは、バイオセンサーと組み合わせて使用される化学物質を含むことがある。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出システムを利用してよい。さらなる例は、西洋わさびペルオキシダーゼと化学発光である。
【００８５】
特異的結合分子はキットで提供することができ、本発明による使用の説明書を含んでよい。そのようなキットは、本発明のさらなる態様として提供される。１種以上の他の試薬、例えば標識分子を含んでよい。試薬は、密封されたバイアルなど、外的環境から試薬を守る容器内に提供できる。キットは、対象とする組織によって被験試料自体を提供するための１つ以上の物品、例えば、口腔から細胞を除去するための綿棒、血液試料を除去するための針、頸部スメアを採るためのスパチュラ、バイオプシーガンなど（そのような部品は一般的に滅菌されている）を含んでよい。
【００８６】
キットは、非特異的染色を減らすブロッキング剤、保存の間の結合分子活性を保つための貯蔵緩衝液、抗体染色の間に使用すべき染色緩衝液および／または洗浄緩衝液、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールなどの任意の組み合わせまたは全てを含んでよい。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを使用して、本発明により使用されキット内に提供してよい試薬の活性および正しい使用法を確認できる。コントロールは、本明細書に記載の１種以上のバイオマーカーなど、標的の存在に対して陽性または陰性になると知られている、組織切片、カバースリップに固定された細胞などの試料を含んでよい。コントロールの設計および使用は標準的であり、当業者の日常的な能力内にある。
【００８７】
試料は、任意の便利な手段および技術を利用して体から除去できる。スパチュラまたは綿棒を利用して、内皮細胞を、例えば子宮頸部または口腔から除去できる。血液および他の体液試料を、シリンジまたは針を利用して除去できる。他の組織試料は、生検または組織切開により除去できる。
【００８８】
第６の態様において、本発明は、療法薬剤開発研究に対する応答をモニタリングする方法であって、生体試料中でバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーが、ＤＮＡ複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ｋｉ６７、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記バイオマーカー発現を評価して、試料中の異常細胞増殖、細胞成長の異常、腫瘍細胞周期速度論、細胞周期分布、異形成、新生物、または潜在的もしくは実際に前ガンもしくはガン性の状態の有無を測定する工程を含む方法を提供する。
【００８９】
一実施形態において、前記薬剤開発研究は、前臨床薬剤開発研究である。
【００９０】
一実施形態において、前記薬剤開発研究は、前臨床薬剤開発研究である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、前臨床薬剤開発研究はインビボ異種移植腫瘍モデルである。
【００９２】
本発明の第７の態様は、被験者のガンの進行の予後を測定する方法であって、
（ａ）被験者から採られた生物学的試料中のＭｃｍ２〜７の少なくとも1つから選択される第１バイオマーカーのレベルを評価する工程；および
（ｂ）被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択される第２バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者のガンの進行を表す方法を提供する。
【００９３】
関連した実施形態において、ガンの進行の予後を測定する前記方法は、被験者の生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択され、前記第２バイオマーカーとは異なる第３のバイオマーカーのレベルを評価する工程をさらに含む。
【００９４】
さらなる実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが低く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが低い場合、被験者の予後はガン進行の可能性が低いことを示す。
【００９５】
関連した実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが低く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが低い場合、被験者の予後は、８０％超、８５％超、または８９％超の５年生存率を示す。
【００９６】
他の実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが低い場合、被験者の予後はガン進行の可能性が低いことを示す。
【００９７】
関連した実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが低い場合、被験者の予後は、８０％超、８５％超、または８７％超の５年生存率を示す。
【００９８】
さらなる実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが高い場合、被験者の予後はガン進行の可能性が高いことを示す。
【００９９】
関連した実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが高い場合、被験者の予後は、７０％未満、６０％未満、または５６％未満の５年生存率を示す。
【０１００】
本発明のバイオマーカーのレベルは、当業者に公知の任意の手段を利用して測定できる。一態様において、バイオマーカーのレベルは、ドットブロット、スロットブロット、ＲＩＡ、マイクロアレイ、およびＥＬＩＳＡなどがあるがこれらに限定されない免疫学的アッセイ方法を利用して測定できる。他の態様において、バイオマーカーのレベルは、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、核酸配列系増幅アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、コンピューター化検出マトリックスなどがあるが、これらに限定されない分子生物学系アッセイ方法を利用して測定できる。
【０１０１】
第１、第２、第３、またはその次のバイオマーカーのレベルが測定される順序は重要でないことに留意することが重要である。例えば、バイオマーカーを全て同時に測定してよい。別法としては、第２または第３またはその次のバイオマーカーを、第１バイオマーカーのレベルの前に評価してもよい。
【０１０２】
第８の態様において、本発明は、ガンの被験者のための治療プロトコルを決定する方法であって、
（ａ）被験者から採られた生物学的試料中のＭｃｍ２から７の少なくとも1つから選択される第１バイオマーカーのレベルを評価する工程；および
（ｂ）被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択される第２バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者に処方される治療法を表す方法を提供する。
【０１０３】
関連する態様において、被験者のための治療プロトコルを決定する前記方法は、前記被験者から採られた生体学的試料中のジェミニン、オーロラＡ、Ｐｌｋ１、Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの少なくとも１つから選択され、前記第２バイオマーカーとは異なる第３バイオマーカーのレベルを評価する工程をさらに含む。
【０１０４】
さらなる実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが低く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが低い場合、治療法は、以下の１つ以上から選択される：
（ａ）モニタリング；および
（ｂ）非細胞周期特異的化学療法薬剤による治療。
【０１０５】
他の実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが低い場合、治療法は、以下の１つ以上から選択される：
（ａ）モニタリング；
（ｂ）Ｇ１または非細胞周期特異的薬剤による治療；および
（ｃ）非ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期特異的化学療法薬剤による治療。
【０１０６】
さらなる実施形態において、所定値と比較した第１バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した第２バイオマーカーのレベルが高い場合、治療法は、以下の１つ以上から選択される：
（ａ）手術；および
（ｂ）ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期特異的化学療法薬剤による治療。
【０１０７】
非細胞周期化学療法薬剤には、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、１−（４−アミノ−２−メチルピリミジン−５−イル）−メチル−３−（２−クロロエチル）−３−ニトロソウレア塩酸塩（ＡＣＮＵ）、およびナイトロジェンマスタード（ＨＮ２）、シスプラチン、４−ヒドロペルオキシ−シクロ−ホスファミド、フラボピリドールがあるが、これらに限定されない。
【０１０８】
Ｓ期細胞周期薬剤には、５−フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、エピルビシン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロラシル、５−フルオロデオキシウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、クラドリビン、チオグアニン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド、テニポシド、アントラサイクリン、エピルビシン）があるが、これらに限定されない。
【０１０９】
Ｇ１細胞周期薬剤には、アスパラギナーゼ、プレドニゾロンがあるが、これらに限定されない。
【０１１０】
Ｇ２／Ｍ細胞周期薬剤には、エトポシド、シスプラチン、スタウロスポリン、ＺＭ４４７４３９、ビンカアルカロイド、（ビンデシン、ビネロブリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ブレオマイシン、スタウロスポリン、ＺＭ４４７４３９（オーロラキナーゼＡおよびＢ阻害剤）、ＢＩ２５３６（ポロ様キナーゼＩ阻害剤）があるが、これらに限定されない。
【０１１１】
Ｍ細胞周期薬剤には、ドセタキセル、ＢＩ２５３６があるが、これらに限定されない。
【０１１２】
細胞周期内の多数の段階で作用する薬剤にはフラボピリドールがあるが、これに限定されない。
【０１１３】
本発明が具体的な実施形態と共に説明されてきたが、さらなる修飾（複数可）が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理に従い本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の全ての変形、使用または改造を、本発明の関する分野の公知または通例の業務内にあり本明細書にすでに述べられた基本的な特徴に適用できるものとして、網羅するものである。
【０１１４】
本発明は、本発明の基本的な特性の精神から逸脱せずにいくつもの形態で実施できるので、上述の実施形態は、特記されない限り、本発明を限定するものでなく、むしろ添付される請求項に定義される本発明の精神および範囲内で広く解釈すべきであると理解されたい。種々の修飾および等価な構成が、本発明および添付される請求項の精神および範囲に含まれるものとする。
【０１１５】
本明細書では「含む／含んでいる(comprises/comprising)」は、述べられた特徴、整数、工程、または構成成分の存在を明示するが、１つ以上の他の特徴、
整数、工程、構成成分、またはその群の存在または追加を排除しない。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：ＤＮＡ複製ライセンス化因子および有糸分裂キナーゼは増殖状態を規定し、乳ガンの臨床結果に関連する
研究コホート
浸潤性乳ガンと診断された１８２人の患者を、英国、ロンドンのＵＣＬ病院、外科に保管されている乳ガンデータベースから特定した。研究した全患者は、通常の術後臨床評価を受け、断面分析に貢献した。１０人は追跡不能であり、５人はガンが再発し、そのうち２人は乳ガンで死亡した。１６７人の患者は生存期間および再発の前向き分析に貢献したが、そのうち２４人（１４％）は研究期間中にガンで死亡し、１２人は他の無関係な原因で死亡し、１３１人は最近の経過観察時に生存していた。再発およびガンによる死亡を含む４０（２４％）の再発事象があった。経過観察期間中央値は４７ヶ月（範囲：１〜９２ヶ月）であった。再発した人の中で再発までの平均時間は２６ヶ月（標準偏差（ＳＤ）＝１５ヶ月、範囲：２〜５５ヶ月）。未だ再発していない人の平均経過観察時間は５２ヶ月（ＳＤ＝２０ヶ月、範囲：２〜９２ヶ月）であった。死亡した人の平均生存時間は２１ヶ月（ＳＤ＝１２ヶ月、範囲：４〜４４ヶ月）であった。死亡していない人の平均経過観察時間は５０ヶ月（ＳＤ＝２１ヶ月、範囲：１〜９２ヶ月）であった。これらの患者から採ったホルマリン固定パラフィン包埋手術乳房組織を、ブルームアンドリチャードソン法（Bloom and Richardson method）のノッチンガム修飾（Nottingham modification）により決定された組織学的グレード（１〜３）を３種全て含む病理保管庫から取り出した。全ての症例で、組織学的な報告およびスライドが利用可能である。それらには、１４２例の充実腺管ガン、２６例の小葉ガン、４例の粘液ガン、１例の微小乳頭ガン、および９例の混合型があった。記録されたパラメータには、組織学的グレード、腫瘍の大きさ、腫瘍の種類、リンパ節の状態、リンパ血管浸潤（ＬＶＩ）、年齢、およびＮＰＩがあった。発明者らは、乳房縮小術を受けた２１人の閉経前女性の正常な乳房細胞を無作為に選択した症例も研究した。研究に対する地方研究倫理委員会の認可が、ヒトの研究に関する倫理のＵＣＬ／ＵＣＬＨジョイント委員会（joint UCL/UCLH Committees on the Ethics of Human Research）から得られた。
【０１１７】
抗体
ヒトのジェミニンに対するウサギのポリクローナル抗体を、記載のとおり(Wharton SB,
Hibberd S, Eward KL, et al. Br J Cancer 2004;91:262-9)発生させた。Ｋｉ６７  ＭＡｂ（ｃｌｏｎｅ  ＭＩＢ−１）をＤＡＫＯ（グロストラップ、デンマーク）から、Ｍｃｍ２  ＭＡｂ（ｃｌｏｎｅ  ４６）をＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（レキシントン、ケンタッキー州）から、エストロゲン受容体−α（ＥＲ）ＭＡｂ（ｃｌｏｎｅ  １Ｄ５）およびプロゲステロン受容体ＭＡｂ（ｃｌｏｎｅ  ＰｇＲ  ６３６）をＤＡＫＯから、オーロラＡ  ＭＡｂ  ＮＣＬ−Ｌ−ＡＫ２（ｃｌｏｎｅ  ＪＬＭ２８）をＮｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューキャッスル、英国）から、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）ＭＡｂ（ｃｌｏｎｅ  ３５−２０６）およびセリン１０でリン酸化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）  ＰＡｂをＵｐｓｔａｔｅ（レークプラシッド、ニューヨーク州）から入手した。
【０１１８】
細胞培養
ヒトＭＣＦ−７乳房上皮腺ガン細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）を、２ｍＭのグルタミン、１％非必須アミノ酸、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補ったＥＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）中で培養した。
【０１１９】
タンパク質抽出物の調製および免疫ブロッティング
ＭＣＦ７細胞をトリプシンによる処理により採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、溶解バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ４０）に２×１０7細胞／ｍｌで再懸濁させた。氷上で３０分間インキュベーションした後、溶解物を遠心分離（１３，０００ｇ、１５分間、４℃）により澄ませた。溶解物を、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７５μｇタンパク質／ウェル）により分離し、記載のとおり(Stoeber et al. J Cell Sci, 114:2027-41, 2001)免疫ブロットした。ブロッキング、抗体インキュベーション、および洗浄工程は、以下の条件で実施した：Ｍｃｍ２、オーロラＡ、およびＰＬＫ１にはＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／５％ミルク、ジェミニンにはＰＢＳ／１％  Ｔｗｅｅｎ−２０／１０％ミルク、Ｈ３Ｓ１０ｐｈにはＰＢＳ／５％ミルク。
【０１２０】
免疫組織化学
最初の診断時に得られた保管所のホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＰＷＥＴ）は全患者で利用可能であり、各検体で浸潤性腫瘍の代表的な試料を含むブロックを選択した。３μｍの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｖｉｓｉｏｎｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国）に切り出し、キシレンでパラフィンを除き、濃度の異なったアルコールから水へ通して再水和した。組織切片を、ｐＨ６．０の０．１Ｍクエン酸バッファ中で２分間加圧処理し、Ｂｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎキットおよびＢｏｎｄ（商標）−Ｍａｘ自動化システム（Ｖｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ニューカッスル・アポン・タイン、英国）を利用して免疫染色した。一次抗体を以下の希釈率で利用した：Ｋｉ６７（１／３００）、Ｍｃｍ２（１／２０００）、ジェミニン（１／６００）、ＥＲ（１／２００）、ＰＲ（１／２００）、オーロラＡ（１／７０）、ＰＬＫ１（１／１０００）およびＨ３Ｓ１０ｐｈ（１／３００）。ＨＥＲ−２免疫染色は、メーカーの説明に従い、ＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（ＤＡＫＯ）を利用して実施した。カバースリップを、Ｐｅｒｔｅｘ封入液（Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈ  Ｌｔｄ、ニュータウンポーイス、英国）とともに使用した。一次抗体なしのインキュベーションをネガティブコントロールとして使用し、結腸上皮切片をポジティブコントロールとして使用した。
【０１２１】
タンパク質発現プロファイル分析
タンパク質発現分析を、(Shetty et al. Br J Cancer 93:1295-300, 2005, Dudderidge
et al. Clin Cancer Res 11: 2510-7, 2005)に記載されるとおり、各腫瘍中のマーカーの標識率（ＬＩ）を測定して実施した。スライドを低倍率（１００倍）で評価し、染色強度の一番高い腫瘍の部分を特定した。選択されたこのような部分から、３〜５つの領域を４００倍の倍率で荷電結合素子カメラおよび分析ソフトウェア（ＳＩＳ、ミュンスター、ドイツ）により取り込んだ。その後、画像を定量分析のためにプリントしたが、定量分析は臨床病理変数を知らない観察者により実施された。領域中の陽性および陰性細胞の両方を数え、間質細胞または炎症細胞は除外した。陽性細胞の同定の基準は、バイオマーカーにより異なる：Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、ＥＲ、ＰＲ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈでは、どのような程度でも核染色を示す細胞を陽性とした；オーロラＡおよびＰＬＫ１では、どのような程度でも核染色または細胞質染色を示す細胞を陽性とした(Gritsko et al. Clin Cancer Res 9:1420-6, 2003)。各場合で、最低５００の細胞を数えた。以下の式を利用して、ＬＩを計算した：ＬＩ＝陽性細胞数／全細胞数×１００。ＨＥＲ−２タンパク質過剰発現の評価には、ＤＡＫＯにより推薦されるＦＤＡ認可評価システムに従い、細胞膜染色を評価した。
【０１２２】
ＤＮＡ画像サイトメトリー
各場合で、ＩＨＣにより評価されたのと同じブロックから得られた４０μｍのＰＷＥＴ切片１つを使用して細胞核を(Sudbo et al. N Engl J Med 344:1270-8, 2001. Haroske et al. Anal Cell Pathol 1998; 17: 189-200, 1997)記載のとおり調製した。Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｌｏｉｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ
Ｌｔｄ、ノッチンガム、英国）を画像処理、分析および分類に、(Sudbo et al. 2001 supra.)記載のとおり使用した。リンパ球およびプラズマ細胞を内部コントロールとして含め、高グレード膀胱腫瘍および正常な結腸組織の４０μｍ切片を、それぞれ異数体および二倍体集団の外部コントロールとして含めた。ヒストグラムは、発表されている基準により(Sudbo et al. 2001 supra, Haroske 1998 supra)分類した。ヒストグラムは、２人の独立した評価担当者により、臨床病理変数の知識なしで高度に一致して分類された。統計分析には、四倍体および倍数体腫瘍を、異数体腫瘍と共に分類した。
【０１２３】
統計分析
バイオマーカーを中央値および四分位範囲によりまとめた。マン・ホイットニーのＵ検定を利用し、各マーカーを、正常試料に対して、リンパ節ステージ、倍数体状態、およびグレード３と比較した。ヨンクヒール・タプストラのノンパラメトリックトレンド検定を利用し、マーカーをグレードおよびＨｅｒ２状態と比較した。スピアマンの順位相関係数を利用して、マーカーとＮＰＩとの間の関連を評価した。自由度１のｌｉｎｅａｒ  ｂｙ
ｌｉｎｅａｒ連関カイ二乗検定を利用して、Ｈｅｒ２と倍数体状態との間の関連を検定した。対応のないｔ検定を利用して、倍数体状態による平均ＮＰＩを比較した。
【０１２４】
線形回帰を利用して、Ｈｅｒ２にわたる平均ＮＰＩのトレンドを評価した。ガンの再発とガン死の分析においてコックス回帰を利用し、ハザード比を与え、単変量モデルおよびＮＰＩに関して調整する多変量モデルの両方において、中央値で２つのカテゴリーに分かれたマーカーの予測を評価した。カプラン・マイヤープロットを利用し、ＮＰＩカテゴリーを無視し、またＮＰＩカテゴリーにより分類してマーカーの評価される予測効果を示した。分析は全て両側検定であり、ＳＰＳＳソフトウェア（バーション１２．０．１）を使用して、効果を、信頼区間９５％を利用してまとめ、５％レベルで統計的に有意であると評価した。
【０１２５】
結果
バイオマーカーマルチパラメータ分析およびその生物学的意味の確認
Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈに対する抗体の単一特異性は、非同期ＭＣＦ７細胞からの全細胞抽出物において、対応するヒト抗原の報告済み電気泳動移動度と一致する分子量を持つ単一のタンパク質の検出により確認した（図５Ａ）。ＨｅＬａ  Ｓ３細胞およびＳＫ−ＯＶ３卵巣ガン細胞でのこのバイオマーカーセットの別な試験において、発明者らは、Ｍｃｍ２レベルは細胞周期の間に大幅に変化しないが、ジェミニンの発現はＳ−Ｇ２−Ｍに限定されていることを示した。オーロラＡおよびＰＬＫ１のレベルは、Ｇ１の間は無視でき、Ｓ期の間に上昇し、Ｇ２／Ｍの間に極大に達し、有糸分裂停止からの開放２〜４時間後分解が起こる。Ｈ３Ｓ１０ｐｈの存在は有糸分裂に限定され、有糸分裂マーカーとしてそれを使用する原理を強固にする。増殖マーカーＫｉ６７は細胞周期全体で増殖細胞中に存在するので、Ｋｉ６７に対するＳ−Ｇ２−Ｍ期またはＭ期マーカーの比（例えば、ジェミニン／Ｋｉ６７、オーロラＡ／Ｋｉ６７、またはＨ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７）は、Ｇ１期の相対的な長さの指標として、したがって細胞周期進行の速度の指標として使用できる。特に、ジェミニン発現増大は、侵襲性腫瘍においてすら、Ｓ−Ｇ２−Ｍ期に限定されている。
【０１２６】
これらの細胞周期マーカーのタンパク質発現分析を、最初に、乳房縮小術の後の正常な乳房検体（ｎ＝２１）で研究した。高レベルＭｃｍ２発現が、終末乳管小葉単位（ＴＤＬＵ）の上皮細胞で観察され、これらの細胞が、「周期中」状態にあることを示す（中央値：３３．５％）。Ｍｃｍ２発現のレベルは高いが、Ｋｉ６７は低レベルで発現されていた（中央値：２．８％）。特に、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１（Ｓ−Ｇ２−Ｍ期マーカー）およびＨ３Ｓ１０ｐｈ（Ｍ期マーカー）は、ＴＤＬＵの細胞のごく一部に（＜１％）のみ発現されており、細胞周期進行の阻害が示される。全部まとめると、この細胞周期表現型は、Ｇ１停止状態と一致する。対照的に、浸潤性乳ガンは、細胞周期進行を示す高レベルのバイオマーカー発現（図５Ｂ）を示した。正常と侵襲性グレード３腫瘍を比べた場合、Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈのタンパク質発現のレベルに大幅な増加があった（中央値：Ｍｃｍ２［３３．５対９２．３％、ｐ＜０．００１］、Ｋｉ６７［２．８対４０．２％、ｐ＜０．００１］、ジェミニン［０．９８対１７．４％、ｐ＜０．００１］、オーロラＡ［０対１１．７％、ｐ＜０．００１］、ＰＬＫ１［０．３７対１４．２％、ｐ＜０．００１］およびＨ３Ｓ１０ｐｈ［０対２．５％、ｐ＜０．００１］）。この増加は、Ｍｃｍ２／Ｋｉ６７比の大幅な低下と関連づけられた（中央値：９．３対１．７１％、ｐ＜０．００１）。Ｍｃｍ２／Ｋｉ６７値の低下は、ライセンス化された非増殖Ｇ１停止状態から、活発に増殖する状態への切り替えを反映しており、細胞周期進行を示すＳ−Ｇ２−Ｍ期マーカーの発現と関連している。
【０１２７】
バイオマーカー、腫瘍ＤＮＡ倍数体状態、および臨床病理変数の間の関係
本研究の臨床病理特性を表２にまとめる。第１に、発明者らは、細胞周期バイオマーカー発現と腫瘍の分化状態との間の関係を検討した。６種のバイオマーカーの発現レベルはいずれも腫瘍グレードと強く関連（表３）していたが、グレードの間でバイオマーカーレベルの分布にいくらか重複がある（例えば、オーロラＡおよびＰＬＫ１レベル、図６）。これらのデータは、腫瘍退形成の増加とともに周期をなしている細胞の比率も増えることを示すが、バイオマーカーが、各グレード内の全患者に対してグレードの間を完全に区別しないことも示す。これらの知見と一致して、腫瘍グレードと倍数体状態のとの間に非常に有意な関連が見いだされた（ｐ＜０．００１）。ジェミニン／Ｋｉ６７、オーロラＡ／Ｋｉ６７、オーロラＢ／Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７の比は、グレードの上昇に伴う大幅な変化を示さず、停止した分化が、高グレード腫瘍中の加速された細胞周期進行速度と関連しないことを示している（表３）。これは、腫瘍退形成の増加と共に加速された細胞周期進行が見られた、卵巣ガンにおける発明者らの知見とは明らかに対照的である（ジェミニン／Ｋｉ６７：ｐ＜０．００７、オーロラＡ／Ｋｉ６７：ｐ＜０．０００２、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７：ｐ＜０．０００２）。対照的に、そして他の腫瘍タイプにおける発明者らの知見と一致して、Ｍｃｍ２／Ｋｉ６７比は、腫瘍グレードの上昇と共に低下し、高分化型腫瘍中のＤＮＡ複製ライセンス化されているが非増殖性の細胞から、低分化型腫瘍中の活発に周期をなす細胞への比率の変化を反映している（表３）。ジェミニン発現と腫瘍脱形成およびゲノム不安定性の増大との間の正の相関は、この開始点ライセンス化リプレッサーが、乳ガンの中で腫瘍抑制因子として振る舞っていないようであることを示す。これは、例えば末梢性Ｂ細胞リンパ腫および卵巣ガンなど他の腫瘍タイプでも観察されており、それらにおいてジェミニンを発現する細胞の数は、細胞増殖指数に比例する。
【０１２８】
バイオマーカーとゲノム不安定性との間の関係を研究するため、発明者らは、それらの発現プロファイルを腫瘍ＤＮＡ含量に関連づけた（表４）。Ｋｉ６７（ｐ＜０．００１）、Ｍｃｍ２（Ｐ＝０．００９）、ジェミニン（ｐ＜０．００１）、オーロラＡ（ｐ＜０．００１）、ＰＬＫ１（ｐ＝０．００２）、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ（ｐ＜０．００１）を含む全細胞周期バイオマーカーの発現レベルとゲノム不安定性の間には非常に有意な関連があった。Ｍｃｍ２／Ｋｉ６７比は有意に減少した（ｐ＝０．００４）。全て合わせると、これらのデータは、二倍体腫瘍に比べ異数体腫瘍において活発に周期をなしている細胞の比率が高いことを示している。興味深いことに、やはり、これらの腫瘍の分化状態の場合と同様に、異数体腫瘍における加速された細胞周期進行の証拠はなく、いくつかの細胞周期バイオマーカー／Ｋｉ６７比が上昇する卵巣ガンでの発明者らの知見と対照的である。
【０１２９】
Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１発現とリンパ節転移との間には有意な関連は全く見られなかった（表５）。Ｈ３Ｓ１０ｐｈ発現との弱い関連が見られた（ｐ＝０．０２）。ＥＲ（Ｐ＝０．００７）およびＰＲ（ｐ＝０．００５）発現と強い逆相関があった。これは卵巣での発明者らの知見と対照をなすが、卵巣では、オーロラＡ（ｐ＝０．００６）、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ（ｐ＝０．００２）、オーロラＡ／Ｋｉ６７（ｐ＝０．００３）、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７（ｐ＝０．００５）と腫瘍ステージとの間に有意な関連が見られ、初期上皮卵巣腫瘍形成およびさらに進んだステージの疾患への進行におけるオーロラＡ調節不全の役割を反映している。Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、Ｈ３Ｓ１０ｐｈの発現レベルはＮＰＩスコアの上昇と強い正の相関を示し、ＥＲおよびＰＲは負の相関を示した（表６）。Ｍｃｍ２／Ｋｉ６７比の著しい低下もあり、ＮＰＩスコアの上昇と共にライセンス化された非増殖状態から活発に増殖する状態への切り替えを意味している。細胞周期バイオマーカー発現は、Ｈｅｒ２状態と有意に関連していないが、ＰＲ発現と強い逆相関があった（ｐ＜０．００１）（表７）。ＮＰＩスコアの上昇とＨｅｒ２過剰発現の間にも関連があり、異数体とＮＰＩスコアの上昇との間に弱い関連があった（表８）。Ｈｅｒ２スコア上昇と異数体との間にも弱い関連が見られた（カイ二乗＝３．０３、ｐ＝０．０８２）。
【０１３０】
バイオマーカー、腫瘍ＤＮＡ倍数体状態、および患者の結果との間の関係
単変量分析
ＮＰＩスコアは、この患者コホートにおける乳ガン再発および死亡の強力な予測因子であり、再発のハザードはＮＰＩスコアの単位あたりちょうど２倍未満に増え（ＨＲ＝１．８１［１．４７−２．２３］、ｐ＜０．００１）、死亡のハザードはＮＰＩスコアの単位あたりちょうど２倍超増えた（ＨＲ＝２．１５［１．６１−２．８８］、ｐ＜０．００１）。患者の年齢は予測因子ではなかった（表９）（図７Ａ）。Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈを乳ガン再発の強力な予測因子であると同定した（それぞれ、ＨＲ＝２．７７［１．４４−５．３０］、ｐ＝０．００２；ＨＲ＝３［１．５６−５．７６］、ｐ＜０．００１；ＨＲ＝３．９３［１．９８−７．８０］、ｐ＜０．００１；ＨＲ＝３．３１［１．６７−６．５７］、ｐ＜０．００１；ＨＲ＝４．４８［２．２１−９．０９］、ｐ＜０．００１；ＨＲ＝３．４９［１．７６−６．９２］、ｐ＜０．００１）（図７Ｂおよび７Ｃ）。これらの関連は生存期間にも見られたが、このコホートにおける事象数が小さいためそれほど強くはなかった（Ｍｃｍ２：ＨＲ＝２．３２［０．９９−５．４３］、ｐ＝０．０５；ジェミニン：ＨＲ＝２．４３［１．０４−５．６８］、ｐ＝０．０４；オーロラＡ：ＨＲ＝２．１８［０．９３−５．１２］、ｐ＝０．０７；ＰＬＫ１：ＨＲ＝３．４６［１．３７−８．７１］、ｐ＝０．００９；Ｈ３Ｓ１０ｐｈ：ＨＲ＝３．２９［１．３１−８．３０］、ｐ＝０．０１）。より低い再発ハザードが二倍体群に見られたが、これは有意でなかった（ＨＲ＝０．６２［０．３３−１．１８］、ｐ＝０．１４）。Ｈｅｒ２発現のカテゴリー増加により再発ハザードおよび死亡ハザードの有意な増加傾向があった（それぞれ、ＨＲ＝１．４４［１．１３−１．８３］、ｐ＝０．００３およびＨＲ＝１．４０［１．０２−１．９４］、ｐ＝０．０４）。
【０１３１】
ＮＰＩ以上のバイオマーカーの予測値
多変量分析は、これらの細胞周期バイオマーカーの効果が、ＮＰＩに対して調整した後でも統計的に有意なままであり、ガン再発を予測するものであることを示している。Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈを、ＮＰＩ以上の、強力で独立した乳ガンの予測因子であると同定した（それぞれ、ＨＲ＝２．１３［１．０８−４．２３］、ｐ＝０．０３；ＨＲ＝２．２２［１．１２−４．４１］、ｐ＝０．０２；ＨＲ＝２．６４［１．２７−５．４９］、ｐ＝０．０１；ＨＲ＝２．８２［１．３７−５．８０］、ｐ＝０．００５；ＨＲ＝３．３１［１．５７−６．９７］、ｐ＝０．００２；ＨＲ＝２．０７［１．０２−４．２０］、ｐ＝０．０４）（図８および９）。１つの細胞周期バイオマーカーを使用して再発を予測することに有用性があったものの、２つ以上のマーカーを含めることにより追加される有用性はなかった。これは、部分的には、マーカーと臨床病理変数との間に相関があったためである。興味深いことに、有糸分裂キナーゼ、オーロラＡおよびＰＬＫ１は、乳ガン再発の最も強力な独立した予測因子であると同定された。
【０１３２】
細胞周期表現型、臨床病理変数、および患者の結果の間の関係
発明者らは、個々の細胞周期特異的バイオマーカーが乳ガンにおける強力で独立した予後マーカーであることを見いだした。これにより、腫瘍の細胞周期速度論または細胞周期表現型が、この特定の腫瘍タイプの病理生物学に影響を与えるかどうかという疑問が起こる。発明者らは、インビトロＤＮＡ複製アッセイにおいて、ＤＮＡヘリカーゼの構成要素であるＭｃｍ２〜７ライセンス化因子のダウンレギュレーションが、いたるところで見られる下流機構であり、それにより、細胞が細胞分裂周期を出て、休止（Ｇ０）、分化された、または老化した周期外状態になる時に、細胞の増殖能力が低下することを既に示した(Williams and Stoeber, Curr Opin Cell Biol 19:672-679, 2007; Blow and Hodgson, Trends Cell Biol 12:72-78, 2002; Stoeber et al., EMBO J 17:7219-7229, 1998; Stoeber et al., J Cell Sci 114:2027-2041, 2001 ; Kingsbury et al., Exp Cell Res 309:56-67, 2005; Barkley et al., Exp Cell Res 313:3789-3799, 2007)。細胞周期表現型を決定するために、Ｍｃｍ２タンパク質発現に３０％のカットポイントを選択し、腫瘍細胞の大部分が周期外状態にある群（Ｍｃｍ２＜３０％、表現型Ｉ）を定義した（図１３、図１４）。この群（表現型）は、全腫瘍の１８％であり、ジェミニンレベルが７％未満であった。これは、細胞が休止（Ｇ０）および分化された周期外状態に入るとジェミニンも厳しくダウンレギュレーションされるという、インビトロアッセイおよび自己再生組織での発明者らの観察と一致する(Williams and Stoeber, 2007 supra; Eward et al., J Cell Sci 117:5875-5886, 2004; Kingsbury et al., 2005 supra; Barkley et al., 2007 supra)（図４、表１）。対照的に、ほとんどのガンではＭｃｍ２発現レベルは３０％を越え（Ｍｃｍ２＞３０％）、腫瘍細胞の大部分が周期中の状態にある(Williams and Stoeber, 2007 supra)（図１３、図１４、表１５）。これらの腫瘍の５８％（表現型ＩＩＩ）は、周期外状態の標識率により定義されるカットポイントである７％を超えるジェミニンレベルにより示される活発な細胞周期進行を示した（図１４、表１５）。特に、多くの乳ガン（表現型ＩＩ）、全腫瘍の２４％は、周期中表現型（Ｍｃｍ２＞３０％）を示すが、７％未満のジェミニンレベルを発現し、Ｇ１遅延または停止状態を表す（Williams and Stoeber, 2007 supra; Stoeber et al., 2001 supra; Blow and Hodgson, 2002 supra; Shetty et al., Br J Cancer 93:1295-1300, 2005; Dudderidge et al., Clin Cancer Res 11:25110-2517, 2005; Gonzalez et al., J Pathol 204:121-130, 2004)（図１４、表１５）。重要なことに、前記３群の中の他のＳ−Ｇ２−Ｍバイオマーカーの分布は、ジェミニンで観察されたことを正確に再現しており、３つの異なる細胞周期表現型への分離をさらに強化している（図１４）。
【０１３３】
次に、発明者らは、細胞周期表現型が、インビボの挙動およびＮＰＩを含む臨床病理変数とのその関連に影響を与えるかについて検討した。特に、年齢、腫瘍サイズ、リンパ節転移、ＥＲ／ＰＲ、またはＨｅｒ−２受容体状態とは全く関連がなかった。しかし、より高い比率のグレード３の腫瘍、停止した分化を示しているものは、活発に周期をなしている表現型を示した。この細胞周期プロファイルは、高いＮＰＩスコアとも関連していた（ｐ＜０．００１）（表１５）。単変量およびＮＰＩに関して調整された多変量分析は、細胞周期表現型が、無病生存期間の強力な予測因子であることも示した。活発に周期をなす表現型（表現型ＩＩＩ）は、単変量および多変量分析の両方で、表現型ＩおよびＩＩよりも、はるかに高い再発ハザードを示し、それぞれＨＲ＝３．９０（１．８１−８．４０）、ｐ＜０．００１およびＨＲ＝２．７１（１．８１−６．２３）、ｐ＝０．０１９）であった（図１５）。興味深いことに、高分化型周期外腫瘍とＧ１遅延／停止表現型（表現型ＩおよびＩＩ）を示す高グレード腫瘍との間にほとんど同様な低い再発ハザードが見られた（ＨＲ＝１．００［０．２２−４．４６］、ｐ＝０．９９；図１５）。特に、乳ガンサブタイプと細胞周期表現型との間に、強く有意な関連が見られた（ｐ＜０．００１）。活発に周期をなす表現型（表現型ＩＩＩ）を持つ患者の比率は、Ｈｅｒ−２サブタイプ（９１％、１０／１１）（ｐ＝０．００３）およびトリプルネガティブサブタイプ（９６％、２５／２６）（ｐ＜０．００１）において、ルミナルサブタイプ（４９％、７１／１４５）よりも有意に高かった（図１６）。周期外表現型（表現型Ｉ）およびＧ１遅延／停止表現型（表現型ＩＩ）を示すホルモン受容体陰性腫瘍の比率は、それぞれわずか４％（１／２６）および９％（１／１１）であった一方で、ルミナルサブタイプでは、前記比率は５１％（７４／１４５）であり、２１％は（３０／１４５）は表現型Ｉを、３０％（４４／１４５）は表現型ＩＩを示した（図１６）。
【０１３４】
考察
増殖、分化、アポトーシス、およびＤＮＡ損傷応答などの過程を制御する複雑で冗長な経路の全ゲノム的分析による分析は、乳ガンの予後ツールとして制約を受けていることが分かりつつある（Dunkler et al. Eur J Cancer, 43:745-751, 2007)。ここで、発明者らは、細胞周期進行に影響する複雑なシグナル伝達経路の下流にあり、したがってそのような経路を通って伝達される情報の統合点として見なすことのできる、進化的保存性の高い細胞周期機構に着目した。発明者らは、この新規な形態のマルチパラメータ細胞周期分析が、腫瘍の細胞周期速度論への新規な洞察を与えるだけでなく、前立腺ガン、腎ガン、および卵巣ガンを含む、ある範囲の腫瘍タイプにおいて重要な予後的意義を持つことを示した。
【０１３５】
発明者らのＤＮＡ複製ライセンス化因子および有糸分裂制御因子の分析は、閉経前乳房組織における普通でない細胞周期状態をさらに特徴づける。標準的な増殖マーカーＫｉ６７により確認される増殖比率は小さいが、ＴＤＬＵ内の多数の乳房上皮細胞がＭｃｍ２を発現し、多数の細胞がライセンス化されており、したがって「周期中」であるらしいことを示している。しかし、これらの細胞は、Ｓ−Ｇ２−Ｍマーカーであるジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、および有糸分裂マーカーＨ３Ｓ１０ｐｈを含む細胞周期進行のマーカーを発現せず、これらの細胞がＧ１停止状態にあることを示している。非増殖性の乳房におけるこのプライムされライセンス化された状態は、妊娠への迅速な応答を見込んだ進化的適応であるかもしれないが、ＤＮＡ複製ライセンス化経路をダウンレギュレーションしないことにより、制御されない細胞増殖への遷移をより容易に達成できるようにするかもしれない。
【０１３６】
発明者らの乳ガンの細胞周期分析は、腫瘍分化のレベル低下およびゲノム不安定化の増大、侵襲性の高い腫瘍の特徴が、細胞周期中にある細胞の比率上昇を示しているＭｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈのレベル上昇と関連していることを示している。しかし、卵巣とは対照的に、腫瘍分化および異数性のレベル低下は、加速された細胞周期進行と関連がなかった。さらに、腫瘍ステージと細胞周期バイオマーカーとの間に全く関連が見られず、やはりオーロラＡ、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、および腫瘍ＦＩＧＯステージとの間に非常に有意な関連がある卵巣とは対照的である。これは、異なる腫瘍タイプの間で、異なるガン遺伝的背景に関連するかもしれない細胞周期機構の調節不全に根本的な違いがあることを意味する。
【０１３７】
発明者らの乳ガンの分析は、ＤＮＡ複製ライセンス化経路（Ｇ１−Ｓ制御因子）および有糸分裂機構（Ｇ２−Ｍ制御因子）のコア成分が、乳ガンの強力な独立した予後マーカーであり、ＮＰＩスコアのみの予後値の他に重要性を加えることを示した。興味深いことに、再発および生存期間の最も強力な予後マーカーは、有糸分裂キナーゼオーロラＡおよびＰＬＫ１であり、どちらも現在、小分子阻害剤抗ガン剤発見プログラムの主な中心である。これは、生検腫瘍試料のマルチパラメータ細胞周期分析が、細胞周期機構を標的とする小分子の予測試験として利用できる可能性を高める。重要なことには、ＰＬＫ１およびオーロラＡ発現は、グレードおよびステージ間で大幅な重複を示し、従来の臨床病理変数がおそらく治療応答の予測には不十分であることを示す。発明者らのデータは、診療に新規小分子阻害剤をコスト効果よく導入するためのバイオマーカーと個別化標的療法の共進化という概念を支持する。機序に基づく治療薬に加え、マルチパラメータ細胞周期分析は、従来の化学療法剤および電離放射線への応答を予測するのにも重要性があるであろう。周期から退いた非増殖細胞は、Ｓ期および有糸分裂に関連した薬剤に反応を示さないので化学療法に特別な意義を持つ。さらに、細胞周期の期は、腫瘍細胞の相対的な放射線感受性を決定するが、細胞はＧ２−Ｍ期により放射線感受性が高まり、Ｇ１では感受性が低下し、Ｓ期後期の間は感受性が最低となる。
【０１３８】
Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、ＰＬＫ１、およびＨ３Ｓ１０ｐｈを含む、研究された細胞周期マーカーの多くは、乳ガン再発に関連していた。重要なことに、ＮＰＩに対して調整した後も効果は統計的に有意なままであり、したがって独立な予後因子である。しかし、細胞周期機構のこのような重要な成分は、前初期遺伝子および遅延応答遺伝子の下流の有糸分裂シグナル伝達経路とＥ２Ｆ転写調節制御システムの集中点にある。
【０１３９】
まとめると、発明者らは、上流の成長調節経路の統合点である、細胞周期機構のコア成分が乳ガンの予後評価を大きく向上させることができ、標準的な臨床病理変数および統合されたＮＰＩスコアに追加の情報を与えることを示した。オーロラＡおよびＰＬＫ１には、予後に関する特別な重要性があるようであり、したがって、治験に入りつつある選択的な有糸分裂キナーゼ阻害剤の予測マーカーとしての可能性があるかもしれない。
【０１４０】
実施例２：ＤＮＡ複製ライセンス化因子およびオーロラキナーゼは、上皮性卵巣ガンにおいて異数性および臨床結果に関連する
研究コホート
１９９９年１月１日から２００４年１２月３１日の間ＥＯＣと診断された１４３人の患
者を、腫瘍学部（ロンドン大学付属病院婦人科ガンセンター、ＵＣＬ病院、ロンドン、英国）に保管されている卵巣ガンデータベースから特定した。利用可能な組織学的資料により患者を選択した。組織検体は、診断時に婦人科腫瘍病理医により調査されており、ＷＨＯ基準に従い組織サブタイプおよび核のグレードに関して評価されていた。ほとんどの患者は、治療終了後３から６ヶ月毎に２年間、その後年に１回調査されていた。以下の臨床情報を、患者の病院記録から直接得た：生年月日、診断日、残存病変の量を含む手術による知見、診療および外科診査での知見に基づく世界産婦人科連合（ＦＩＧＯ）ステージならびに細胞学的結果、診断時および再発時のＣＡ１２５値、化学療法開始時の活動状態、再発日、最新の経過観察の日、ならびに死亡の日および原因。１４３人の患者のうち、６７人（４７％）は研究期間内に再発した。再発した人の再発までの平均時間は、１６．９ヶ月であった（ＳＤ、１１．０ヶ月；範囲０−４７ヶ月）。未だ再発していない人の平均経過観察時間は、３３．２ヶ月であった（ＳＤ、１８．５ヶ月；範囲５−７５ヶ月）。３４人の患者（２４％）が研究期間中に死亡し、１０７人は最近の経過観察時に生存していた。死亡した患者の平均生存期間は、２１．９ヶ月（ＳＤ、１５．６ヶ月；範囲０−６０ヶ月）であった。未だ死亡していない患者の平均経過観察時間は、３３．３ヶ月（ＳＤ、１８．８ヶ月；範囲、５−７５ヶ月）。２人の患者は追跡不能であった。倫理委員会の認可が、ヒトの研究に関する倫理のＵＣＬ／ＵＣＬＨジョイント委員会から得られた。
【０１４１】
抗体
ヒトのジェミニンに対するウサギのポリクローナル抗体を、記載のとおり(Wharton et al. Br J Cancer 91:262-9, 2004)発生させた。Ｋｉ６７モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＭＩＢ−１）をＤＡＫＯから、Ｍｃｍ２モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ４６）をＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、オーロラＡモノクローナル抗体ＮＣＬ−Ｌ−ＡＫ２（ｃｌｏｎｅ  ＪＬＭ２８）をＮｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、オーロラＢポリクローナル抗体Ａｂ２２５４をＡｂｃａｍ  ＰＬＣから、およびセリン１０でリン酸化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０ｐｈ）ポリクローナル抗体をＵｐｓｔａｔｅから入手した。
【０１４２】
細胞培養および同期化
ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ８７１１０９０１）を、記載のとおり(Stoeber et al. 2001 supra)培養および同期化した。細胞周期の同期化は、先に報告されたとおり(Krude et al. Cell; 88:109-19, 1997)、単離した核のフローサイトメトリーにより確認した。タンパク質抽出物の調製および免疫ブロッティング。ＨｅＬｅ  Ｓ３細胞をトリプシンによる処理により採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、溶解バッファ（５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ４０）に２×１０7細胞／ｍＬで再懸濁させた。氷上で３０分間インキュベーションした後、溶解物を遠心分離（１３，０００×ｇ、１５分間、４℃）により澄ませた。溶解物を、４％から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７５μｇタンパク質／ウェル）により分離し、記載のとおり(Stoeber et al. 2001 supra)免疫ブロットした。ブロッキング、抗体インキュベーション、および洗浄工程は、以下の条件で実施した：Ｍｃｍ２およびオーロラＡにはＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５％ミルク、ジェミニンにはＰＢＳ／１％  Ｔｗｅｅｎ２０／１０％ミルク、オーロラＢおよびＨ３Ｓ１０ｐｈにはＰＢＳ／５％ミルク。
【０１４３】
免疫細胞化学
最初の診断時に得られた保管所のホルマリン固定パラフィン包埋組織は全患者で利用可能であり、各検体で浸潤性腫瘍の代表的な試料を含むブロックを選択した。各パラフィン包埋組織ブロックから切り出した連続的な一連の切片を免疫細胞化学のために使用した。３マイクロメートルの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｖｉｓｉｏｎｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に切り出し、キシレンでパラフィンを除き、濃度の異なったアルコールから水へ通して再水和した。組織切片を、ｐＨ６の０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファ中で２分間加圧処理し、Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｆｉｎｅ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎキットおよびＢｏｎｄ−Ｘ自動化システム（Ｖｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を利用して免疫染色した。一次抗体を以下の希釈率で利用した：Ｋｉ６７（１：１００）、Ｍｃｍ２（１：２０００）、ジェミニン（１：６００）、オーロラＡ（１：５０）、オーロラＢ（１：２００）およびＨ３Ｓ１０ｐｈ（１：３００）。カバースリップを、Ｐｅｒｔｅｘ封入液（Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈ  Ｌｔｄ）とともに使用した。一次抗体なしのインキュベーションをネガティブコントロールとして使用し、結腸上皮切片をポジティブコントロールとして使用した。
【０１４４】
タンパク質発現プロファイル分析
タンパク質発現分析を、(Shetty et al. 2005 supra, Dudderidge et al. 2005 supra)に記載されるとおり、各腫瘍中のマーカーの標識率を測定して実施した。スライドを低倍率（１００倍）で評価し、染色強度の一番高い腫瘍の部分を特定した。選択されたこのような部分から、３〜５つの領域を４００倍の倍率で荷電結合素子カメラおよび分析ソフトウェア（ＳＩＳ）により取り込んだ。その後、画像を定量分析のためにプリントしたが、定量分析は臨床病理変数を知らない観察者により実施された。領域中の陽性および陰性細胞の両方を数え、間質細胞または炎症細胞は除外した。陽性細胞の同定の基準は、バイオマーカーにより異なり、Ｋｉ６７、Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＢ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈでは、どのような程度でも核染色を示す細胞を陽性とした。オーロラＡでは、どのような程度でも核染色または細胞質染色を示す細胞を陽性とした(Gritsko et al. 2003 supra)。各場合で、最低５００の細胞を数えた。以下の式を利用して、標識率を計算した：標識率＝陽性細胞数／全細胞数×１００。独立した評価担当者により無作為に選択された１０の症例を再評価したところ、高度の一致を示した。
【０１４５】
ＤＮＡ画像サイトメトリー
各場合で、免疫細胞化学により評価されたのと同じブロックから得られた４０μｍのパラフィン包埋組織切片１つを使用して、記載のとおり細胞核を調製した(Sudbo et al. 2001 supra, Haroske et al. 1997 supra)。Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｌｏｉｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｔｄ）を、画像処理、分析および分類に、(Sudbo et al. 2001 supra.)記載のとおり使用した。リンパ球およびプラズマ細胞を内部コントロールとして含め、高グレード膀胱腫瘍および正常な結腸組織の４０μｍ切片を、それぞれ異数体および二倍体集団の外部コントロールとして含めた。ヒストグラムは、発表されている基準により(Sudbo et al. 2001 supra, Haroske et al. 1998 supra)分類した。ヒストグラムは、２人の独立した評価担当者により、臨床病理変数の知識なしで高度に一致して分類された。統計分析には、四倍体および倍数体腫瘍を、異数体腫瘍と共に分類した。
【０１４６】
統計分析
スピアマンの順位相関係数を利用して、バイオマーカー間の関連を調べた。バイオマーカー発現と腫瘍グレード、ステージ、倍数体状態との間の関係を、適宜、ノンパラメトリックヨンクヒール・タプストラ検定およびマン・ホイットニーのＵ検定を利用して評価した。次いで、データを、コホートにわたって観察された標識率の中央値および四分位範囲としてまとめた。無病生存期間および全生存期間データの分析を、カプラン・マイヤープロット（バイオマーカーの三分位値を使用）、ログラング検定、およびコックス回帰（特記しない限り、バイオマーカーを連続変数として処理）を利用して実施した。各バイオマーカーに対して、コホートを、標識率に基づき三分位群に分けた。各三分位群内で、無病または全生存期間に対し、それぞれ、無病または生存のいずれかのままである比率を、カプラン・マイヤー法により計算した。バイオマーカーの信頼区間９５％（９５％ＣＩ）のハザード比（ＨＲ）を、最初に調整せずに求め、次いで、年齢、グレード、およびステージについて調整した。不完全なデータを持つ患者は、多変量分析から除外した。候補バイオマーカーを、補足表Ｓ１に列記する。検定は全て両側であり、有意水準０．０５を使用し、多重仮説検定を見込まなかった。分析は、ＳＰＳＳソフトウェア１２．０（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。
【０１４７】
結果
バイオマーカーマルチパラメータ分析およびその生物学的意味の確認
Ｍｃｍ２、ジェミニン、オーロラＡ、オーロラＢ、およびＨ３Ｓ１０ｐｈに対する抗体の単一特異性は、非同期ＨｅＬａ  Ｓ３細胞からの全細胞抽出物において、対応するヒト抗原の報告済み電気泳動移動度と一致する分子量を持つ単一のタンパク質の検出により確認した（図１０Ａ）。ＨｅＬａ  Ｓ３細胞系は、特徴がはっきりした細胞周期遷移時間および確立された同期化プロトコルを持つので、この細胞をインビトロ研究で第一に選択した。同期化細胞からの全細胞溶解物を、キャラクタリゼーションされた抗体により免疫ブロットした（図１０Ｂ）。Ｍｃｍ２レベルは細胞周期の通過の間に大幅に変化しなかったが、ジェミニンの発現はＳ−Ｇ２−Ｍに限定されていた。オーロラＡレベルはＳ期の間に上昇し、有糸分裂の間に極大に達し、有糸分裂停止からの開放２〜４時間後分解が起きた。同様に、オーロラＢレベルは、Ｇ１期の間に無視でき、Ｓ期の間に徐々に上昇し、Ｇ２−Ｍの間に極大に達し、有糸分裂後に低下した。Ｈ３Ｓ１０ｐｈの存在は有糸分裂に限定され、有糸分裂マーカーとしてそれを使用する原理を強固にする。これらのバイオマーカーの全く同じ細胞周期依存的発現が、同期化ＳＫ−ＯＶ３卵巣ガン細胞に観察された（データ示さず）。Ｋｉ６７は増殖細胞中で細胞周期全体にわたり発現され、ジェミニン発現はＳ−Ｇ２−Ｍ期に限定されているので、発明者らは、ジェミニン／Ｋｉ６７比を、Ｇ１の相対的な長さの指標として、したがって細胞周期進行の速度の指標として使用できることを提案した。上述のデータは、オーロラＡおよびオーロラＢの細胞周期依存性発現により、Ｋｉ６７に対するそれらの比を、細胞周期進行の指標として使用できることを確認する。ジェミニン発現増大は、高度に侵襲性腫瘍においてすら、常にＳ−Ｇ２−Ｍ期に限定されている。したがって、発明者らのインビトロの知見は、オーロラＡまたはオーロラＢとジェミニンとの間の相対比（比＞１）の増加が、細胞周期の間のキナーゼの過剰発現を示すであろうことも示している。発明者らのインビトロの知見の予後的意義およびＥＯＣにおけるその生物学的意味を評価するため、発明者らは、一連の１４３の症例におけるバイオマーカーの発現を分析した（図１０Ｃ）。タンパク質発現を、正常卵巣組織の５例でも研究した。バイオマーカーの発現は、正常な卵巣表面上皮では非常に低く（＜４％）、その低下した増殖能力と一致している（データ示さず）。対照的に、ＥＯＣは高レベルのバイオマーカー発現を示し、細胞周期への再進入および増殖を示している。
【０１４８】
次には、発明者らは、腫瘍シリーズにわたりバイオマーカーの組の間の相関を検討した。オーロラＡおよびオーロラＢの発現レベルは、その基質Ｈ３Ｓ１０ｐｈのレベルと強い正の相関を示した（スピアマン相関、それぞれ、０．５７（９５％ＣＩ、０．４５−０．６７）および０．５２（９５％ＣＩ、０．３９−０．６３）。Ｍｃｍ２、ジェミニン、およびＨ３Ｓ１０ｐｈの発現レベルは、Ｋｉ６７レベルと強い正の相関を示し（スピアマン相関、それぞれ、０．７３（９５％ＣＩ、０．６４−０．８）；０．７４（９５％ＣＩ、０．６６−０．８１）；および０．５２（９５％ＣＩ、０．３９−０．６３））、その増殖マーカーとしての役割を支持している。特に、ジェミニン／Ｋｉ６７およびオーロラＡ／Ｋｉ６７比は、正に、だがあまり強くなくＨ３Ｓ１０ｐｈと相関しており（スピアマン相関、それぞれ、０．２５（９５％ＣＩ、０．０９−０．４０）および０．４２（９５％ＣＩ、０．２７−０．５５））、Ｓ内またはＧ２−Ｍチェックポイント経路の活性化により起こるかもしれない延長したＳ−Ｇ２−Ｍ遷移時間に対するＧ１の相対的な長さの変化を反映している。
【０１４９】
これは、腫瘍細胞がその集団倍加の大部分、全体で４０のうちおよそ３０の倍加を過ぎてからでないと腫瘍量が臨床的に検知できないことと一致している。この集団倍加の数は、ほとんどの細胞周期チェックポイント機構が無効になった体性クローン進化（somatic clonal evolution）における点、生命と適合性のある最大質量を表す。
【０１５０】
バイオマーカー、腫瘍ＤＮＡ倍数体状態、および臨床病理特性の間の関係
研究コホートの臨床病理特性を表１０にまとめる。バイオマーカーとゲノム不安定性との間の関係を調査するため、発明者らは、その発現プロファイルを腫瘍ＤＮＡ含量と関連づけた。バイオマーカー全ての発現レベルおよびいくつかのバイオマーカー／Ｋｉ６７比とゲノム不安定性との間に非常に有意な関連があり（表１１）、二倍体腫瘍と比べ異数体腫瘍中での周期をなしている細胞の比率増加および加速した細胞周期進行を反映している。
【０１５１】
６種のバイオマーカーは全て腫瘍グレードと強い相関があった（表１２）。しかし、グレード間でバイオマーカーレベルの分布に幾分重複がある（例えばオーロラＡレベル；図１１）。これらのデータは、腫瘍退形成の増加に伴う周期をなしている細胞の比率増加を確かにするが、バイオマーカーが各グレード内の全患者のグレード間を完全には区別しないことも示している。
【０１５２】
これらの知見と一致して、腫瘍グレードと倍数体状態との間の非常に有意な関連が見いだされた（ｐ＜０．００１）。ジェミニン／Ｋｉ６７、オーロラＡ／Ｋｉ６７、オーロラＢ／Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７の間の比も腫瘍分化と有意に関連しており（表１２）、高グレード腫瘍での細胞周期進行の加速を示した。対照的に、そして他の腫瘍タイプでの発明者らの知見と一致して、Ｍｃｍ２／Ｋｉ６７比は腫瘍グレードの増加と共に減少し（表１２）、高分化型腫瘍中のＤＮＡ複製ライセンス化されているが非増殖性の細胞から、低分化型腫瘍中の活発に周期をなす細胞への比率の変化を反映している。ジェミニン発現と増加する腫瘍脱形成およびゲノム不安定性の間の正の相関（表１１および１２）は、このライセンス化リプレッサーが、ＥＯＣの中で腫瘍抑制因子として振る舞っていないことを示す。
【０１５３】
オーロラＡ、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、オーロラＡ／Ｋｉ６７、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ／Ｋｉ６７と腫瘍ステージとの間に有意な相関が見いだされた（表１３）。これは、オーロラＡ調節不全が、初期の上皮卵巣腫瘍形成および進行ステージの疾患への進行における重要な事象であるかもしれないことを示唆している。さらに、進行ステージの疾患は、オーロラＡ／ジェミニン比の増加（ｐ＝０．０４；表１３）と有意に相関しており、やはりオーロラＡ調節不全と腫瘍進行との間の関連を支持している。
【０１５４】
バイオマーカー、腫瘍ＤＮＡ倍数体状態、および患者の結果との間の関係
単変量分析
オーロラＡ（ｐ＝０．０１；図１２Ａ）、オーロラＡ／Ｋｉ６７、オーロラＢ／Ｋｉ６７、およびＨ３Ｓ１０ｐｈ（表１４）は、より短い無病生存期間と有意に関連していたが、全生存期間とは関連していなかった。患者年齢、腫瘍グレード、およびステージも、若い患者、高分化型腫瘍で、特に再発までの時間が著しく長い初期の疾患で無病生存期間を予測するものであった（それぞれ、ＨＲ、１．０２（１．００−１．０５）、ｐ＝０．０５；ＨＲ、１．５９（１．０３−２．４５）、ｐ＝０．０４；ＨＲ、２．０７（１．５８−２．７１）、ｐ＜０．０００１）。患者の年齢および腫瘍のステージは全生存期間も予測したが（それぞれ、ＨＲ、１．０５（１．０２−１．０９）、ｐ＝０．００３；ＨＲ、３．２１（１．３３−７．７９）、ｐ＝０．０１）、腫瘍グレードは全生存期間を予測せず（ｐ＝０．７０）、現行のグレーディングシステムの限界を強調している。腫瘍倍数体状態も、無病生存期間と有意に相関しており（ＨＲ、１．８０（１．０５−３．０８）、ｐ＝０．０３；図１２Ｂ）、異数体腫瘍を持つ患者の全生存期間が短くなる傾向があったが、これは統計的な有意には達しなかった（ＨＲ、１．９５（０．８８−４．３１）、ｐ＝０．１０）。
【０１５５】
発明者らは、発明者らのシリーズを、初期の疾患（ＦＩＧＯステージＩおよびＩＩ）および進行したステージの疾患（ＦＩＧＯステージＩＩＩおよびＩＶ）の２群に再分し、バイオマーカーが予後に関する特別な重要性を持つ特定のサブグループをより正確に定義した。オーロラＡおよびオーロラＡ／Ｋｉ６７比の両方は、初期ステージのサブグループにおいて、短い無病生存期間（それぞれ、ＨＲ、１．７２（１．１９−２．４８）、ｐ＝０．００４（図１２Ｃ）；ＨＲ、１．５９（１．１３−２．２４）、ｐ＝０．００８）および全生存期間（それぞれ、ＨＲ、１．８１（１．１４−２．８７）、ｐ＝０．０１（図１２Ｅ）；ＨＲ、１．６８（１．１１−２．５４）、ｐ＝０．０１）を強く予測した。この関連は、進行したステージのサブグループには見られなかった（それぞれ、無病生存期間には、ＨＲ、１．０６（０．８１−１．３７）、ｐ＝０．６７；ＨＲ、１．０４（０．９０−１．２０）、ｐ＝０．５８；および全生存期間には、ＨＲ、０．８８（０．５８−１．３３）、ｐ＝０．８８；ＨＲ、０．８９（０．６９−１．１５）、ｐ＝０．３６）。腫瘍倍数体状態も、初期ステージのサブグループでは、無病生存期間を予測したが（ＨＲ、４．５８（１．０４−２０．１９）、ｐ＝０．０４；図１２Ｄ）、異数体腫瘍を持つ患者ではより短い全生存期間の傾向がある（ＨＲ、６．３４（０．８２−４９．１８）、ｐ＝０．０８；図１２Ｄ）。しかし、それは、進行したステージのサブグループでは予測値を失った（無病生存期間および全生存期間に対してそれぞれ、ＨＲ、１．４７（０．８１−２．６６）、ｐ＝０．２１およびＨＲ、１．３６（０．５５−３．３３）、ｐ＝０．５）。
【０１５６】
多変量分析
コックス回帰生存分析は、腫瘍ステージが無病生存期間の有意な独立した唯一の予測因子であることを示した（ＨＲ、２．０６（１．４９−２．８５）、ｐ＜０．０００１）。患者の年齢および腫瘍ステージは、より高齢の患者およびより短い全生存期間を持つ進行したステージの腫瘍では、全生存期間の独立した予測因子であった（それぞれ、ＨＲ、１．０５（１．０１−１．０９）、ｐ＝０．００７；ＨＲ、３．１９（１．３１−７．７５）、ｐ＝０．０１）。いくつかのバイオマーカーが単変量分析において有意な予後因子であったが、年齢、グレードおよびステージに対して調整した後、どれも無病生存期間または全生存期間の有意な予測因子でなかった。これは、部分的には、バイオマーカーと腫瘍のグレードおよびステージとの間に非常に有意な関連があり、それらの独立した効果を分離するのが困難であることによる。
【０１５７】
考察
本研究を実施して、予後および予測に関する重要性があり、その病理学へのより深い理解をもたらすかもしれない、ＥＯＣの生物学的マーカーへのさらなる洞察を得た。発明者らの知見は、Ｍｃｍ２およびジェミニン複製ライセンス化因子ならびにオーロラＡおよびＢキナーゼは、その基質であるＨ３Ｓ１０ｐｈと共に、ＥＯＣにおいて予後に関する重要性があることを示す。腫瘍の分化とこのバイオマーカーの組との間に見いだされた関連は、現行のグレーディングシステムにおけるさらなる改善の可能性を持つ増殖マーカーとしての使用を意味する。発明者らのマルチパラメータ分析は、それが患者の腫瘍試料における細胞周期進行についての情報、重要な予後の情報に解釈されるデータを与えるかもしれないことを示している。
【０１５８】
これらの知見は、乳ガンおよび腎ガンのライセンス化因子の分析と一致する。さらに、バイオマーカーのこの組と腫瘍倍数体状態との間に見いだされた非常に有意な関連は、ライセンス化機構および有糸分裂キナーゼの調節不全がＥＯＣにおけるゲノム不安定性の進展に複雑に関連していることを示す。オーロラＡは、Ｇ２−Ｍ遷移のいくつかの重要な段階で調節的な役割を果たしている。ここで、発明者らは、オーロラＡの異常な制御とＥＯＣ進行との間の興味深い関連を報告する。発明者らのデータは、オーロラＡ、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、および腫瘍ＦＩＧＯステージとの間の非常に有意な関連を示し、オーロラＡ調節不全が上皮卵巣発ガン現象の初期の事象であるかもしれないという見解を支持し、その調節不全が進行した疾患への進行に役割を果たしているかもしれないことを示唆している。
【０１５９】
これらの知見に一致して、オーロラＡ／ジェミニン比は進行したステージの腫瘍で著しく高く、オーロラＡの過剰発現が、腫瘍進行に役割を果たすか、腫瘍進行の結果であるかもしれないことも示唆する。インビボでは、そのような過剰発現は、遺伝子増幅によるだけでなく、転写活性化およびタンパク質分解の抑制など他の機構によっても制御されているようである。発明者らのデータは、オーロラＡおよびＨ３Ｓ１０ｐｈのマルチパラメータ分析が、臨床ステージング法の補完に使用できるかもしれない分子ステージングを可能にすることを示唆する。ＦＩＧＯステージは、ＥＯＣにおいて重要な予後に関する指標であるが、外科的および放射線医学的なステージング方法には限界がある。無作為試験は、アジュバント化学療法が、ステージＩ疾患のサブオプティマルにステージングされた患者において特別な利益となることを示した。しかし、最近の大規模な無作為比較試験において、ガイドラインに従い最適にステージングされていたのは、わずか３４％の患者だった（Vegote I et al Curr. Op. Oncol. 2003; 15:452-5)。不適切にステージングされている患者において、これらのバイオマーカーは、真のステージＩまたはより進行した疾患の支持的なエビデンスを提供するかもしれず、アジュバント化学療法の利用についての決断を支援する。ＩＣＯＮ  １／ＡＣＴＩＯＮ試験の知見は、アジュバント化学療法に小さな全体的利益を示唆するが(Trimbos JB et al J Natl Cancer Inst 2003;95:105-12)、ステージＩ疾患を持つ適切にステージングされたどの患者が本当に化学療法を必要とするかは不明確なままである。
【０１６０】
オーロラＡ、Ｈ３Ｓ１０ｐｈ、およびゲノム不安定性は、この研究コホートにおいて無病生存期間の有意な予測因子である。さらなるサブグループ分析は、初期の疾患において、オーロラＡおよび腫瘍倍数体状態が無病生存期間を予測する（オーロラＡ発現は全生存期間も予測する）ものであることを示した。しかし、この関連は、年齢およびステージなどの予後因子を考慮に入れると低下する。対照的に、これらの変数は、進行した疾患においてその予測に関する重要性を失い（例えば、オーロラＡのＨＲは、初期のステージ疾患での１．７２（１．１９−２．４８）から進行したステージの疾患の１．０６（０．８１−１．３７）へと低下した）、他の生物学的因子が、これらの患者の再発および結果に優先的に影響することを示唆している。さらに、治療法の複雑さおよび不均質性が、進行したステージでのこれらのバイオマーカーの予測値を隠すかもしれない。
【０１６１】
全部まとめると、発明者らのデータは、腫瘍形成の間の初期の点でオーロラＡ調節不全が遺伝的不安定性の原因になることがあり初期のステージの疾患を持つ患者のサブグループにおいて侵襲性の腫瘍および生存期間の短縮を生み出す生物学的機構を支持している。
【０１６２】
ＤＮＡ複製ライセンス化因子および有糸分裂キナーゼは細胞周期進行の重要な制御因子であり、そのため現在の治療薬開発プログラムの焦点である。本明細書において、発明者らは、Ｇ１−ＳおよびＧ２−Ｍ遷移のコア制御因子のマルチパラメータ発現分析により、腫瘍の生物学的挙動に関連した変数である、個々の患者の腫瘍試料における細胞周期進行速度を評価できることを示した。この種の分析を、細胞周期機構または細胞周期進行を加速する上流の成長シグナル伝達経路を標的とする小分子の予測試験として利用できる。さらに、オーロラＡ発現がグレード間を完全に区別しないという観察は、従来の臨床病理変数が、治療応答の予測を常に可能にするわけでないことを示し、バイオマーカーおよび個別化標的治療の共進化の概念を支持している。特異的なオーロラキナーゼ阻害剤の最近の開発を鑑み、発明者らのデータは、バイオマーカーおよび潜在的な治療標的としてオーロラＡを使用するために、予後、予測および治療に関する重要な意味を持つ。
【０１６３】
【表１】
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【０１６４】
【表２】
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【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
【表５】
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【０１６８】
【表６】
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【０１６９】
【表７】
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【０１７０】
【表８】
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【０１７１】
【表９】
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【０１７２】
【表１０】
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【０１７３】
【表１１】
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【０１７４】
【表１２】
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【０１７５】
【表１３】
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【０１７６】
【表１４】
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【０１７７】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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