(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍の治療に使用するための第１の組成物の製造における第２の組成物の使用方法であって、該第２の組成物は、ｐＨ７でアニオン的に荷電されている水不溶性の水膨潤性ポリビニルアルコールポリマーの微小球と、放出可能な形態で該ポリマーと静電的に結合しているカチオン性荷電化学療法剤とを含み、さらにアルギン酸塩である粘度調整剤を含み、該治療において、該第１の組成物が脳に導入されて、該化学療法剤が該微小球から放出され、該微小球は、３７℃で水と平衡したとき、ポリマー＋水の重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含むことを特徴とする、使用方法。
【請求項２】
化学療法剤がアントラサイクリン化合物である、請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
化学療法剤がイリノテカンである、請求項１記載の使用方法。
【請求項４】
化学療法剤がカンプトテシン化合物である、請求項１記載の使用方法。
【請求項５】
ポリマーが、分子１つあたり２個以上のエチレン性不飽和側基を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）マクロマーから、該エチレン性基のラジカル重合によって形成される、請求項４記載の使用方法。
【請求項６】
ＰＶＡマクロマーがエチレン性不飽和モノマーと共重合する、請求項５記載の使用方法。
【請求項７】
モノマーが、一般式Ｉ：
Ｙ1ＢＱ1      Ｉ
〔式中、Ｙ1は、下記：
【化１】
0005559035.tif 000023
ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−ＣＨ2−Ｏ−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）−Ｏ−、ＣＨ2＝Ｃ（Ｒ10）ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−、Ｒ12ＯＯＣＣＲ10＝ＣＲ10Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、Ｒ10ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｒ10ＣＨ＝Ｃ（ＣＯＯＲ12）ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、
【化２】
0005559035.tif 000024
から選択され、
ここで、
Ｒ10は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｒ11は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｒ12は、水素又はＣ1-4アルキル基、又はＢＱ1であり、ここでＢ及びＱ1は、下記に定義されているとおりであり；
Ａ1は、−Ｏ−又は−ＮＲ11−であり；
Ｋ1は、基−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ2）rＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ2）rＣ（Ｏ）ＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ2）rＯＣ（Ｏ）ＮＲ13−、−（ＣＨ2）rＮＲ13Ｃ（Ｏ）ＮＲ13−（ここで複数の基Ｒ13は同一又は異なっている）、−（ＣＨ2）rＯ−、−（ＣＨ2）rＳＯ3−、又は、Ｂと組み合わせて、原子価結合であり、ｒは、１〜１２であり、Ｒ13は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり；
Ｂは、ペルフルオロ化鎖までを含む１個以上のフッ素原子を含有してもよい、直鎖若しくは分岐鎖の、アルカンジイル、オキサアルキレン、アルカンジイルオキサアルカンジイル若しくはアルカンジイルオリゴ（オキサアルカンジイル）鎖であるか、又は、Ｑ1若しくはＹ1が、Ｂに結合している末端炭素原子を含有する場合、原子価結合であり；そして
Ｑ1は、アニオン性基である〕
を有するイオン性モノマーを含む、請求項６記載の使用方法。
【請求項８】
Ｑ1が、カルボン酸塩、炭酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ホスホン酸塩、又はリン酸塩基である、請求項７記載の使用方法。
【請求項９】
Ｙ1が基ＣＨ2＝ＣＲ10ＣＯＡ1−であり、ここで、Ｒ10が、Ｈ又はメチルであり、Ａ1がＮＨであり、そしてＢが、炭素原子２〜６個のアルカンジイル基である、請求項７又は８記載の使用方法。
【請求項１０】
ＰＶＡモノマーが、１０００〜５００，０００Ｄの範囲の平均分子量を有する、請求項５〜９のいずれか１項記載の使用方法。
【請求項１１】
エチレン性側基が、隣接ヒドロキシル基からの酸素原子と、環状アセタール結合を介して結合しており、該結合はＮ−（アルク）アクリルアミノ置換アルデヒドの反応により、ジアルキルアセタールの形態として形成される、請求項５〜１０のいずれか１項記載の使用方法。
【請求項１２】
ポリビニルアルコールが、ビニルアルコールとアニオン性アクリルモノマーのコポリマーである、請求項１記載の使用方法。
【請求項１３】
アニオン性アクリルモノマーがアクリル酸である、請求項１２記載の使用方法。
【請求項１４】
脳に導入される組成物が放射線増感剤を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の使用方法。
【請求項１５】
放射線増感剤が化学療法剤である、請求項１４記載の使用方法。
【請求項１６】
治療において、組成物を脳に注入する、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用方法。
【請求項１７】
治療において、組成物を脳内の減量腫瘍の切除周辺部に注入する、請求項１６記載の使用方法。
【請求項１８】
治療において、組成物を脳腫瘍に直接注入する、請求項１〜１６のいずれか１項記載の使用方法。
【請求項１９】
ＰＶＡモノマーが、１０，０００〜１００，０００Ｄの範囲の平均分子量を有する、請求項１０記載の使用方法。
【請求項２０】
ジアルキルアセタールがＮアクリルアミノアセトアルデヒドジメチルアセタールである、請求項１１記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳腫瘍の治療のための微小球の使用方法に関し、ここで微小球は、水不溶性ポリマー及びカチオン性荷電化学療法剤を含む。微小球を含む組成物及び脳腫瘍の治療方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
グレード４星状細胞腫としても知られている多形性グリア芽細胞腫（ＧＢＭ）は、最も一般的な原発性の侵襲型脳腫瘍であり、原発性脳腫瘍の全症例の５２％及び頭蓋内腫瘍の全症例の２０％を占める。その治療は、化学療法、放射線療法及び外科手術を伴う可能性があり、これらは        姑息的手段として知られている。この疾患の５年間の生存期間は、過去３０年間変わることなく、３％未満である。利用できる最良の治療と組み合わせた腫瘍の完全な外科的切除によっても、ＧＢＭの生存率は非常に低いままである。
【０００３】
典型的な治療は、外部ビーム放射及び化学療法と共に、最大無腫瘍周辺部の切除（「減量」）を伴う。腫瘍部位での線量増量（１５００〜２０００ｃＧｙ）を伴う総頭蓋照射（４５００ｃＧＹ）によって、生存を５か月間延ばすことができる。化学療法剤カルムスチンの単独の添加は、生存率を僅かに増加する。大多数の腫瘍専門医は、プロカルバジン、ロムスチン及びビンクリスチン（ＰＣＶレジメン）から構成される多剤併用化学療法を好む。別の組み合わせには、カルボプラチン及びシスプラチンが含まれる。これらの効能は限定的であり、特にＰＣＶレジメンによる毒性は、かなりのものになりうる。近接照射療法（放射性ビーズ又は針の移植）及び高線量焦点放射線治療（定位放射線手術）は、生存期間の増加を示していない。
【０００４】
大規模第ＩＩＩ相試験において、一次切除時のＢｉＣＮＵ含浸ウエハ（商標名Glidel Wafers）の移植は、悪性神経膠腫と新たに診断された患者において、プラセボウエハ（Ｐ＝０．０３）を移植した場合の僅か１１．６か月と比較して、生存の中央値を１３．９か月に改善した。
【０００５】
外科手術又は放射線の後の腫瘍の再発は、通常、元の部位から２cm以内においては、ほぼ避けることができず、およそ１０％の患者は、遠位部位にも新たな病巣を発症する場合がある。再手術又は近接照射療法が試みられてきたが、結果は不確実なものであった。
【０００６】
典型的には、全ての未治療患者は、３か月以内に死亡する。加齢（６０歳超）に伴い、より高い予後危険性が生じる。死亡は、通常、脳浮腫又は頭蓋内圧の上昇に起因する。
【０００７】
標準的な治療（放射線治療及びテモゾロミド）では、生存の中央値は、およそ１４か月間である（Stupp R. et al. “Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma”, N Engl J Med 352 (10): 987-96）。これらの患者の１０％未満しか５年間を過ぎて生存していない。しがって、脳腫瘍のより効果的な治療を提供することが望まれている。
【０００８】
脳内の腫瘍部位への治療剤の直接的な局所送達のための薬剤送達系の開発についての相当な研究が報告されている。上記に記載されているＢＣＮＵ  Ｇｌｉａｄｅｌウエハは、市販されている数少ない系のうちの１つである。文献に他の多くの系が記載されており、特に、薬剤送達微小球は、比較的容易に注入することができ、広範囲の治療剤の放出を制御するように設計できることを考慮すると、一般的な選択となっている。
【０００９】
例えば、Bremらは、神経膠腫の治療に使用する生分解性ＰＬＧＡ微小球にＢＣＮＵを封入することを記載し（J. Control Release 2001 Jul 6; 74(1-3):63-7）、ＢＣＮＵ耐性腫瘍を治療するために、他の化学療法薬及びその組み合わせへの拡大の必要性に言及している。Emerichら（Cell Transplant 2002; 11(1):47-54）は、腫瘍又は手術後の高い腫瘍再発率にさらされている周囲組織への化学療法薬の局所的及び持続的送達を提供するために、脳に容易に注入することができる、ポリマー微小球を記載する。
【００１０】
神経膠腫の治療に微小球からの５−ＦＵの送達を使用することが、極めて興味深い。フランスのPhilippe Meneiのグループが、これらの系を詳細に評価している（Acta Neurochir Suppl. 2003; 88:51-5）。このグループは、５−ＦＵ制御送達が、神経膠腫を放射線増感するための有望な戦略であり（Pharm Res. 2004 Sep;21 (9):1558-63）、薬剤送達系製剤が、治療の反応及び毒性副作用の制限の両方に明白に関与していることを見出した。
【００１１】
更に、Meneiらは、移植可能で生分解性の微小球を使用して脳に薬剤を送達する新たな方法を開発した（Cancer 2004 Jan 15; 100(2):405-10）。この研究では、微小球を、定位脳手術により、深部に位置し手術不能な脳腫瘍の中に移植した。
【００１２】
Cheungらは、微小球からのドキソルビシンの局所領域放出を評価する方法を記載している（J. Control Release 2004 Nov 5; 100(1): 121-33）。Bremらは、生分解性微小球からドキソルビシンを送達し、ドキソルビシンとＩＬ−２の両方が、局所的に送達されたとき、実験的な頭蓋内神経膠肉腫に対する有効な単独治療剤であることを示した。ドキソルビシンとＩＬ−２の併剤療法は、それぞれの作用物質が単独の場合よりも有効であった（J. Neurooncol 2005 Sep;74(2): 135-40）。
【００１３】
他の人々は、肝臓の化学塞栓のために、ドキソルビシンを装填したアルギン酸微小球（Yao Xue Xue Bao. 2006 Aug; 41 (8):778-83）又は、ドキソルビシンを装填した、スルホン酸基で改質したＰＶＡヒドロゲルビーズ（Clin Cancer Res. 2006 Apr 15;12(8):2563-7）を評価し、インビボにおける持続的な送達を実証した。これらの系は、塩酸ドキソルビシンのようなカチオン性荷電薬剤を封鎖するポリマーのイオン交換特性を使用し、体内の特定の部位への制御された持続性の動脈内・後送達の方法を提供する。また、本発明者は、以前に公開した特許出願ＷＯ０４／０７１４９５及びＷＯ０６／０２７５６７において、水不溶性ポリマーを含み、アニオン性の全電荷を有し、アントラサイクリン又はカンプトテシン化合物をポリマーと静電的に結合して有する微小球を記載している。微小球を使用して、腫瘍、例えば肝細胞癌に、塞栓を形成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
最も侵襲性の腫瘍に対しても効能があり、同時に従来技術に関連する望ましくない副作用を回避する、脳腫瘍の治療のための薬剤送達系を提供するという、未だに満たされていない要求が残っている。この送達系は、脳腫瘍を容易に標的にする必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この満たされていない要求に従って、本発明では、脳腫瘍の治療に使用するための組成物の製造における、微小球の使用方法が提供されるが、この微小球は、ｐＨ７でアニオン的に荷電されている水不溶性の水膨潤性ポリマーと、放出可能な形態でポリマーと静電的に結合しているカチオン性荷電化学療法剤とを含み、この治療において、組成物が脳に導入されて、化学療法剤が微小球から放出され、微小球は、３７℃で水と平衡したとき、ポリマー＋水の重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含むことを特徴とする。
【００１６】
また本発明により、脳腫瘍の治療に使用するための微小球を含む組成物も提供されるが、この微小球は、ｐＨ７でアニオン的に荷電されている水不溶性の水膨潤性ポリマーと、放出可能な形態でポリマーと静電的に結合しているカチオン性荷電化学療法剤とを含み、この治療において、組成物が脳に導入されて、化学療法剤が微小球から放出され、微小球は、３７℃で水と平衡したとき、ポリマー＋水の重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明はまた、脳腫瘍の治療方法にも関し、この方法は、微小球を含む組成物を脳に導入することを含み、微小球は、ｐＨ７でアニオン的に荷電されている水不溶性の水膨潤性ポリマーと、放出可能な形態でポリマーと静電的に結合しているカチオン性荷電化学療法剤とを含み、治療において、化学療法剤が微小球から放出され、微小球は、３７℃で水と平衡したとき、微小球がポリマー＋水の重量に基づいて少なくとも４０重量％の水を含むことを特徴とする。
【００１８】
上記に定義された微小球は、カチオン性荷電化学療法剤を、イオン交換機構を介して放出し、それにより、脳腫瘍へカチオン性荷電化学療法剤を制御送達するデポー剤として作用する。この薬剤は、減量脳腫瘍の切除周辺部へ、又は切除不能腫瘍の腫瘍内に、定位脳手術により送達してもよい。微小球を含むポリマーの変形可能な性質は、微小球を所望の部位へ直接注入する針による送達を可能にする。微小球は、分解性であっても、非分解性であってもよいし、放射線治療と組み合わせた微小球治療を可能にするため、放射線増感剤と組み合わせてもよい。
【００１９】
ポリマーは水不溶性物質である。薬剤がポリマーマトリックスの表面の浸食により実質的に放出されうるように、ポリマーは生分解性であってもよいが、好ましくは、ポリマーは実質的に生安定性（すなわち、非生分解性）である。
【００２０】
ポリマーは水膨潤性である。本発明における水膨潤性ポリマーは、３７℃で水により膨潤したとき、重量分析によると、少なくとも４０重量％、好ましくは４０〜９９重量％の範囲、最も好ましくは７５〜９５重量％の範囲の平衡含水量を有する。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様において、脳に導入される組成物は、水膨潤性で水不溶性ポリマーの微小球の、液体担体中の懸濁液という形態である。典型的には、微小球は、３７℃で水と平衡したとき、１〜１０００μmの範囲、より好ましくは５０〜５００μmの範囲、最も好ましくは１００〜３００μmの範囲のサイズを有する。好ましくは、微小球は、実質的に球状である。直径は、好ましくは、カチオン性荷電化学療法剤による装填の前に、微小球のサイズを測定することによって決定される。微小球は、好ましくは実質的に球状であるが、回転楕円、又は規則性の低い形状であってもよい。非球状の微小球の直径は、その最大直径である。
【００２２】
一般に、ポリマーは共有結合で架橋されているが、少なくとも部分的にイオン結合で架橋されていることが、ポリマーにとって適している場合もある。
【００２３】
アルブミン、アルギン酸塩、ゼラチン、デンプン、キトサン又はコラーゲンのような天然供給源に由来するポリマーを、本発明の１つに実施態様において使用してもよい。アルギン酸塩が特に好ましい。アルギン酸微小球は、典型的には、実施例８において更に記載されているように、高Ｇ又は高Ｍ含有量の超純粋アルギン酸塩から、特定の濃度のアルギン酸塩溶液を金属（例えば、カルシウム又はバリウム）イオンのゲル化浴の中に押し出すことにより調製される。
【００２４】
別の実施態様において、ポリマーは、エチレン性不飽和モノマーを、二官能又はより多官能の架橋モノマーの存在下で重合することにより形成される。エチレン性不飽和モノマーには、イオン性（双性イオン性を含む）モノマーが含まれてもよい。
【００２５】
ヒドロキシエチルメタクリレートと、アクリル酸と、エタフィルコンＡ系のコンタクトレンズに使用されるエチレングリコールジメタクリレート又はメチレンビスアクリルアミドのような、架橋モノマーとのコポリマーを使用してもよい。Ｎ−アクロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールとＮ，Ｎ−ビスアクリルアミドとのコポリマーも使用してもよい。
【００２６】
他のポリマーは、例えば、分離媒体又はイオン交換媒体として使用される種類の、イオン置換基との架橋スチレンポリマーである。
【００２７】
水膨潤性の水不溶性マトリックスの形成に使用することができる別の種類のポリマーは、架橋ポリビニルアルコールである。ポリマーを、例えば、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド型架橋剤を使用して、架橋してもよい。そのような生成物では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を、イオン性官能基含有化合物とヒドロキシル基との反応によりイオン性側基をもたらすことによって、イオン性にすることができる。ヒドロキシル基との反応に適した官能基の例は、カルボン酸若しくはその誘導体、又はエステルを形成することができる他の酸性基のような、アクリル化剤である。
【００２８】
ポリビニルアルコールは、代替的には、高吸収性ポリマーとして使用される種類の、ビニルアルコールと、アクリル酸のようなアニオン性アクリルモノマーとのコポリマーであってもよい。
【００２９】
本発明は、ポリマーのマトリックスが、分子１つあたり２個以上のエチレン性不飽和側基を有するポリビニルアルコールマクロマーから、エチレン性基のラジカル重合により形成される場合に、特に価値がある。好ましくは、このＰＶＡマクロマーは、例えば、非イオン性モノマー及び／又はアニオン性モノマーを含むイオン性モノマーを含む、エチレン性不飽和モノマーと共重合される。
【００３０】
ＰＶＡマクロマーは、例えば、１０００〜５００，０００Ｄの範囲、好ましくは１０，０００〜１００，０００Ｄの範囲のような、適切な分子量のＰＶＡポリマーに、ビニル側基又はアクリル側基をもたらすことによって形成してもよい。アクリル側基は、例えば、アクリル酸又はメタクリル酸とＰＶＡとを反応させて、幾つかのヒドロキシル基の間にエステル結合を形成することによってもたらしてもよい。ポリビニルアルコールに重合可能なビニル基を付与する他の方法は、例えば、ＵＳ４，９７８，７１３、並びに、好ましくはＵＳ５，５０８，３１７及び５，５８３，１６３に記載されている。したがって、好ましいマクロマーは、（アルク）アクリルアミノアルキル部分が環状アセタール結合を介して結合しているポリビニルアルコールの主鎖を含む。実施例１は、一般名ネルフィコンＢとして知られているようなマクロマーの合成例を記載している。好ましくは、ＰＶＡマクロマーは、分子１つあたり、約２〜２０個、例えば５〜１０個のエチレン性側基を有する。
【００３１】
ＰＶＡマクロマーが、イオン性モノマーを含むエチレン性不飽和モノマーと共重合される場合、イオン性モノマーは、好ましくは、一般式Ｉ：
Ｙ１ＢＱ１      Ｉ
〔式中、Ｙ１は、下記：
【化１】
0005559035.tif 000002
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１０）−ＣＨ２−Ｏ−、ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１０）−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１０）ＯＣ（Ｏ）−、ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１０）−Ｏ−、ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１０）ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）−、Ｒ１２ＯＯＣＣＲ１０＝ＣＲ１０Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、Ｒ１０ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｒ１０ＣＨ＝Ｃ（ＣＯＯＲ１２）ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、
【化２】
0005559035.tif 000003
から選択され、
ここで、
Ｒ１０は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり；
Ｒ１１は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり；
Ｒ１２は、水素又はＣ１−４アルキル基、又はＢＱ１であり、ここでＢ及びＱ１は、下記に定義されているとおりであり；
Ａ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ１１−であり；
Ｋ１は、基−（ＣＨ２）ｒＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ２）ｒＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ２）ｒＮＲ１３−、−（ＣＨ２）ｒＮＲ１３Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲ１３−、−（ＣＨ２）ｒＮＲ１３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（ＣＨ２）ｒＯＣ（Ｏ）ＮＲ１３−、−（ＣＨ２）ｒＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３−（ここで複数の基Ｒ１３は同一又は異なっている）、−（ＣＨ２）ｒＯ−、−（ＣＨ２）ｒＳＯ３−、又は場合によりＢと組み合わせて、原子価結合であり、ｒは、１〜１２であり、Ｒ１３は、水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり；
Ｂは、場合により、ペルフルオロ化鎖までを含む１個以上のフッ素原子を含有する、直鎖若しくは分岐鎖の、アルカンジイル、オキサアルキレン、アルカンジイルオキサアルカンジイル若しくはアルカンジイルオリゴ（オキサアルカンジイル）鎖であるか、又はＱ１若しくはＹ１が、Ｂに結合している末端炭素原子を含有する場合、原子価結合であり；そして
Ｑ１は、イオン性基である〕
を有する。
【００３２】
好ましくは、アニオン性基Ｑ１を含むような化合物が含まれる。
【００３３】
アニオン性基Ｑ１は、例えば、カルボン酸塩、炭酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ホスホン酸塩、又はリン酸塩基であってもよい。モノマーを、遊離酸として又は塩形態で重合してもよい。好ましくは、共役酸のｐＫａは５未満である。
【００３４】
適切なカチオン性基Ｑ１は、好ましくは基Ｎ＋Ｒ１４３、Ｐ＋Ｒ１５３、又はＳ＋Ｒ１５２であり、ここで、複数の基Ｒ１４は、同一又は異なって、それぞれ水素、Ｃ１−４アルキル又はアリール（好ましくはフェニル）であるか、或いは基Ｒ１４のうちの２つは、それらが結合しているヘテロ原子と一緒になって、５〜７個の原子を含有する飽和又は不飽和複素環を形成する。複数の基Ｒ１５は、それぞれ、ＯＲ１４又はＲ１４である。好ましくは、カチオン性基は、永久的にカチオン性であり、すなわちＲ１４は、それぞれ水素以外である。好ましくは、カチオン性基ＱはＮ＋Ｒ１４３であり、ここでＲ１４は、それぞれＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである。
【００３５】
双性イオン性基Ｑ１は、全電荷を有してもよく、それは、例えば１つの二価アニオン性電荷中心及び１つの一価カチオン性電荷中心を有する若しくはその逆を有することによるか、又は、２つのカチオン性電荷中心及び１つのアニオン性電荷中心を有する若しくはその逆を有することによってでもよい。しかし、好ましくは、双性イオンは、全電荷を有さず、最も好ましくは、１つの一価カチオン性電荷中心及び１つの一価アニオン性電荷中心を有する。
【００３６】
本発明においてＱとして使用することができる双性イオン性基の例は、ＷＯ−Ａ−００２９４８１に開示されている。
【００３７】
例えば、エチレン性不飽和モノマーが双性イオン性モノマーを含む場合、このことは、粒子の親水性、潤滑性、生体適合性、及び／又は血液適合性を増大することができる。適切な双性イオン性モノマーは、本発明者の先行公報ＷＯ−Ａ−９２０７８８５、ＷＯ−Ａ−９４１６７４８、ＷＯ−Ａ−９４１６７４９及びＷＯ−Ａ−９５２０４０７に記載されている。好ましくは、双性イオン性モノマーは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）である。
【００３８】
一般式Ｉのモノマーにおいて、好ましくは、Ｙ１は基ＣＨ２＝ＣＲ１０ＣＯＡ１−であり、ここで、Ｒ１０は、Ｈ又はメチル、好ましくはメチルであり、そしてＡ１は、好ましくはＮＨである。Ｂは、好ましくは、炭素原子１〜１２個、好ましくは２〜６個のアルカンジイル基である。そのようなモノマーは、アクリルモノマーである。
【００３９】
エチレン性不飽和モノマーに、希釈剤モノマー、例えば非イオン性モノマーを含めることができる。そのようなモノマーは、酸性基のｐＫａを制御するため、生成物の親水性又は疎水性を制御するため、ポリマーに疎水性領域をもたらすため、又は単に不活性希釈剤として作用するために、有用でありうる。非イオン性希釈剤モノマーの例は、例えば、アルキル（アルク）アクリレート及び（アルク）アクリルアミドであり、特に、炭素原子１〜１２個のアルキル基を有するような化合物、ヒドロキシ及びジ−ヒドロキシ置換アルキル（アルク）アクリレート及び−（アルク）アクリルアミド、ビニルラクタム、スチレン、並びに他の芳香族モノマーである。
【００４０】
ポリマーマトリックスにおいて、アニオンのレベルは、好ましくは０．１〜１０meq g−１の範囲、好ましくは少なくとも１．０meq g−１である。好ましいアニオンは、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩及びホスホン酸塩のような強酸から誘導される。
【００４１】
ＰＶＡマクロマーを他のエチレン性不飽和モノマーと共重合する場合、ＰＶＡマクロマーと他のモノマーの重量比は、好ましくは５０：１〜１：５の範囲、より好ましくは２０：１〜１：２の範囲である。エチレン性不飽和モノマーにおいて、アニオン性モノマーは、好ましくは、１０〜１００mol％の範囲、好ましくは少なくとも２５mol％の量で存在する。
【００４２】
架橋ポリマーは、例えば、連続不混和性担体の分散相においてエチレン性不飽和モノマーの液滴を重合することによって、微粒子形態のままで形成することができる。このことは、ポリビニルアルコールマクロマーに基づく重合にとって特に適している。膨潤しているときに、所望のサイズを有する微小球を生成するのに適している油中水重合の例は、知られている。例えば、ＵＳ４，２２４，４２７は、水溶性モノマーを、懸濁剤の存在下で連続溶媒相に分散することによる、直径が５mmまでの均一球状ビーズ（微小球）を形成する方法を記載する。予め形成された分散体重合液滴の架橋を使用することもできる。予め形成された分散体液滴中のポリマーの架橋を使用することもできる。分散相粒子のサイズの制御を可能にするための、安定剤及び界面活性剤が存在してもよい。重合及び／又は架橋した後、架橋された微小球を、既知の方法で回収し、洗浄し、場合により滅菌する。好ましくは、微小球は、水性液体で膨潤し、サイズに従って分類される。
【００４３】
カチオン性荷電化学療法剤（本明細書では以後「活性剤」又は「薬剤」とも呼ぶ）は、好ましくは活性剤の制御放出を一定期間にわたって可能にするように、ポリマーと結合される。この期間は、数分間から数週間、好ましくは少なくとも数日間まで、好ましくは７２時間までであってもよい。活性剤は、ポリマーに静電結合している。ポリマー中のアニオン性基の存在は、カチオン性荷電活性剤の放出の制御を可能にする。
【００４４】
本発明において、薬剤はポリマーマトリックスに共有結合していないことが重要である。
【００４５】
活性剤を、多様な技術によりポリマーマトリックスに組み込んでもよい。一つの方法において、活性剤を、ポリマーの前駆体と、例えばモノマー若しくはマクロマー混合物、又は架橋性ポリマー及び架橋剤の混合物と、重合又は架橋の前に混合することができる。あるいは、活性剤を架橋した後に、ポリマーに装填することができる。例えば、乾燥微粒子ポリマーを、好ましくは水又はエタノールのようなアルコール中の活性剤の溶液で膨潤させ、続いて場合により非吸収作用物質を除去する及び／又は溶媒を蒸発することができる。アルコールのような有機溶媒中の、又はより好ましくは水中の、活性剤の溶液を、微小球の移動床に噴霧し、それによって薬剤を微小球の本体に吸収させ、同時に溶媒を除去してもよい。最も好都合には、水のような連続液体ビヒクル中に懸濁した膨潤微小球を、薬剤のアルコール水溶液と、一定期間にわたって単に接触させ、それにより薬剤を微小球の本体に吸収させることが可能であることが、本発明者らによって見出された。微小球に薬剤を固着させる技術は、装填レベルを増大することができ、例えば、装填懸濁液のｐＨを活性剤が比較的不溶性の形態になる値にシフトすることによる沈殿である。続いて膨潤ビヒクルを除去してもよいが、都合良くは生成物の一部として微小球と共に保持させてもよい。膨潤微小球を、スラリーの形態の、すなわち膨潤微小球の外側に水が全く又はあまり無い状態の、膨潤形態で使用することができる。あるいは、微小球の懸濁液を、残留した薬剤装填溶液から取り出し、医薬系製品の乾燥に用いられる伝統的な技術のいずれかにより、微小球を乾燥することができる。これには、室温若しくは高温又は減圧下若しくは真空下での空気乾燥、伝統的な凍結乾燥、大気圧凍結乾燥、超臨界液の溶液促進分散（ＳＥＤＳ）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、有機溶媒を使用して一連の工程により水と置換し、続いてより揮発性の有機溶媒を蒸発させて、薬剤装填微小球を脱水することができる。薬剤にとって非溶解性である溶媒を選択するべきである。
【００４６】
簡潔には、典型的な伝統的凍結乾燥方法は、以下のように進行するであろう：試料を等分して、部分共栓ガラスバイアルに分けて入れ、凍結乾燥機中の冷却された温度制御棚に置く。棚の温度を下げ、規定の均一の温度にして、試料を凍結する。完全に凍結した後、乾燥機の圧力を規定圧力に下げて、一次乾燥を開始する。一次乾燥の間に、水蒸気が昇華により凍結物質から漸進的に除去され、一方、棚温度は、一定の低温に制御されている。二次乾燥を、棚温度の増加及びチャンバ圧の更なる低減により開始し、これにより、半乾燥物質に吸収されていた水を、残留含水量が所望のレベルに減少するまで除去できる。バイアルを、必要であれば保護環境下、その場で密閉することができる。
【００４７】
大気圧凍結乾燥は、非常に乾燥した空気を凍結生成物の周りに急速に循環することにより達成される。伝統的な凍結乾燥方法と比較して、真空を用いない凍結乾燥は、幾つかの利点を有する。循環乾燥ガスは、風の強い日に洗濯物が素速く乾くのと同じ方法で、凍結試料からの改善された熱伝達及び物質移動を提供する。この領域の研究は、大部分が食品生産に関するものであって、揮発性芳香族化合物の保持の増加が観察されているが、生物の乾燥におけるこの潜在的な利益は、未だに特定されていない。特に興味深いことは、大気噴霧乾燥方法を使用することによって、ケーキの代わりに微細の自由流動粉末が得られることである。サブミクロンの直径を有する粒子を得ることができ、これは、摩砕によって一般的に得ることができるものよりも１０倍小さい。高表面積を有する粒状の性質は、容易に再水和されうる生成物をもたらし、現在のところは、吸入及び経皮用途に必要とされる微小球のサイズに対する微調整は不可能であるが、この領域において潜在性がある。
【００４８】
組成物を、投与の直前に、ポリマー及びカチオン性荷電化学療法剤（活性剤）から作製してもよいが、組成物は予め形成されていることが好ましい。乾燥したポリマー−活性剤微小球を、使用直前に水和してもよい。あるいは、提供される組成物は、完全に配合されていてもよく、好ましくは、吸収又は吸着された活性化合物と、吸収された水、例えば生理食塩水とを有するポリマー微小球、及び、粒子外液、例えば食塩水を含む。
【００４９】
投与される組成物中の活性剤のレベルは、好ましくは、組成物１mlあたり０．１〜５００mg、好ましくは、１mlあたり１０〜１００mgの範囲である。好ましくは、治療は、１〜５回繰り返され、それぞれの用量において、投与される活性剤の量は、１mlあたり０．１〜１００mg、好ましくは１mlあたり１０〜１００mgの範囲である。通常の治療において投与される組成物の量は、１〜６mlの範囲である。投与される活性剤の１用量あたりの総量は、好ましくは１０〜１００mg、より好ましくは５０〜２５０mgの範囲である。下記の実施例で示される放出データに基づいて、本発明者らは、これは腫瘍に対する治療有効濃度を示し、有意なレベルの細胞内送達が生じるはずであり、それにより治療効果が達成されると考える。活性剤投与に関する有害な副作用は回避されるはずである。
【００５０】
本発明で使用される化学療法剤（活性剤）は、カチオン的に荷電され、脳腫瘍に対して治療上活性である任意の化合物であってもよい。化学療法剤は、プロドラッグであってもよい、すなわち、インビボで活性化されて活性剤を形成する化合物であってもよい。化学療法剤は、代替的には放射線増感剤であってもよい。例えば、ドキソルビシン及び５−ＦＵは、両方とも放射線増感剤である。放射線増感剤は、化合物に放射線治療を適用することにより活性化される化合物である。
【００５１】
活性剤は、アントラサイクリン化合物又はその類似体であってもよく、アミン糖が結合しているアントラキノン基を含んでもよい。糖にあるアミノ基は、ポリマーマトリックスのアニオン性基と結合して、高レベルの装填及び投与後の制御送達を可能にすると考えられる。
【００５２】
適切なアントラサイクリンの例は、一般式ＩＩを有する：
【化３】
0005559035.tif 000004
【００５３】
多様な腫瘍に対する効能が十分に試験されてきたドキソルビシンが、特に興味深い装填及び放出特性を有することが、本発明者らによって見出された。この薬剤は、ポリ（ビニルアルコール−グラフト−アクリルアミドプロパンスルホン酸）に特に親和性を有すると思われ、このことによって、高レベルのドキソルビシンをポリマーに組み込み、何日間にもわたって放出することが可能になる。
【００５４】
本発明に使用することができるアントラサイクリン類似体には、ミトキサントロンのようなアントラセンジオンファミリーが含まれる：
【化４】
0005559035.tif 000005
【００５５】
ピクサントロン（ＢＢＲ２８８７）は、別のアザ−アントラセンジオンＤＮＡ挿入剤である。複製ＤＮＡへの挿入によって、これらの化合物は、トポイソメラーゼＩＩ仲介ＤＮＡ切断を刺激する。ミトキサントロンとは異なり、ピクサントロンは、これらの薬剤に関連する心毒性の原因であると考えられる５，８−ジヒドロキシ置換基を欠いている。
【００５６】
【化５】
0005559035.tif 000006
【００５７】
ＡＱ４Ｎ（バノキサントロン）は、多様な癌を治療する広範囲な潜在性を有する新規作用物質である。ＡＱ４Ｎは、腫瘍の低酸素領域を標的にするＡＱ４のプロドラッグである。プロドラッグ形態で、ＡＱ４は、毒性が極めて少なく、血液脳関門を透過することができる。多くの腫瘍に存在する低酸素領域内に表れると、ＡＱ４は非常に強力なＡＱ４Ｎに変換される。ＡＱ４及びＡＱ４Ｎの構造を下記に示す。
【００５８】
【化６】
0005559035.tif 000007
【化７】
0005559035.tif 000008
【００５９】
活性剤は、カンプトテシン又はその類似体であってもよい。
【００６０】
カンプトテシン化合物は、好ましくは、少なくとも僅かに水溶性であり、例えば、室温で少なくとも０．００１g/l、好ましくは０．００２g/lを超える、より好ましくは０．０１g/lを超える濃度まで水に可溶性である。カンプトテシン化合物は、ｐＨ７でカチオン的に荷電されていることが好ましい。カチオン性基は、第一級アミン基であってもよいが、好ましくは第二級、第三級、又は第四級アミンである。
【００６１】
適切な化合物の一つのファミリーは、一般式ＩＩＩ：
【化８】
0005559035.tif 000009
〔式中、Ｒ１は、Ｈ、場合によりヒドロキシル、アミン、アルコキシ、ハロゲン、アシル若しくはアシルオキシ基で置換されている低級（Ｃ１−６）アルキル、又はハロゲンであり；そして
Ｒは、塩素又はＮＲ２Ｒ３であり、ここで、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、それぞれ水素原子、置換若しくは非置換Ｃ１−４アルキル基、又は置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ２及びＲ３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは−ＮＲ４−で中断されていてもよい、場合により置換されている複素環を形成し、ここでＲ４は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ１−４アルキル基、又は置換若しくは非置換フェニル基であり；
ここで基−Ｏ−ＣＯ−Ｒは、カンプトテシン化合物（その塩を含む）のＡ環の９、１０又は１１位のいずれかに位置する炭素原子と結合している〕
を有する。
【００６２】
基−Ｏ−ＣＯ−Ｒは１０位で結合していることが、好ましい。
【００６３】
【化９】
0005559035.tif 000010
【００６４】
Ｒ１は、好ましくはＣ１−４アルキル、最も好ましくはエチルであり、そしてｍは、好ましくは１である。
【００６５】
ハロゲン原子Ｒは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、好ましくはＦ又はＣｌである。Ｒ１〜Ｒ４は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔ−ブチルであってもよく、好ましくはメチルである。
【００６６】
Ｒ及びＲ１中の置換基は、好ましくは、ハロゲン原子、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フェノキシ、ＣＯＯＲ６、ＳＯ３Ｒ６及びＰＯ３（Ｒ６）２、アリール、ＮＲ８Ｒ９及びＣＯＮＲ８Ｒ９、ＱＡＯＲ５、ＱＡＮＲ８Ｒ９及びＱＡＱＲ５から選択され、ここで、Ｒ５は、Ｃ１−４アルキル又はアリールであり、Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシであり、Ｒ７は、水素、ハロゲン又はＣ１−４アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、それぞれＨ又はＣ１−４アルキルであるか、或いはＲ８及びＲ９は、共に、Ｃ３−６アルカンジイルを表し；
Ｑは、ＯＣＯ又は−ＣＯＯ−であり、そしてＡは、Ｃ２−４アルカンジイルである。
【００６７】
好ましくは、Ｒは、ＮＲ２Ｒ３であり、ここでＲ２及びＲ３は、窒素原子と一緒になって、５又は６員環、好ましくは場合により置換基を有する飽和環を形成する。置換基は、好ましくは−ＮＲ８Ｒ９である。そのような置換基において、Ｒ８及びＲ９は好ましくは共にＣ４−５アルカンジイルである。そのような基は、塩基性であり、ｐＨ７でカチオン的に荷電される傾向がある。最も好ましくは、Ｒは、下記：
【化１０】
0005559035.tif 000011
である。
【００６８】
適切な化合物の別のファミリーは、一般式ＩＶ： 
【化１１】
0005559035.tif 000012
〔式中、Ｒ２０及びＲ２３は、それぞれヒドロキシ若しくは水素であるか、又は共にＣＨ２ＯＣＨ２であり；
Ｒ２１及びＲ２２のうちの一方はＨであり、他方はＣＨ２ＮＲ２４Ｒ２５であり、ここで、Ｒ２３及びＲ２４は、同一又は異なって、それぞれ水素原子、置換若しくは非置換Ｃ１−４アルキル基、又は置換若しくは非置換の炭素環式若しくは複素環式基を表すか、或いはＲ２３及びＲ２４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−若しくは−ＮＲ４−で中断されていてもよい、場合により置換されている複素環を形成し、ここでＲ４は、水素原子、置換若しくは非置換Ｃ１−４アルキル基、又は置換若しくは非置換フェニル基である〕
を有し、その塩及び第四級誘導体が含まれる。この式を有する適切な化合物の一つの例は、トポテカンであり、この場合、Ｒ２０は、ヒドロキシであり、Ｒ２２及びＲ２３は、水素であり、Ｒ２１は、ＣＨ２ＮＲ２４Ｒ２５であり、そしてＲ２４及びＲ２５は、両方ともメチルである。
【００６９】
好ましくは、本発明で定義されている治療において、組成物は、典型的には針を使用して、脳に注入される。あるいは、ＷＯ９４／２４２６３に記載されている無針注入系を使用することができる。ＵＳ２００７／００２６０８１は、微小球をどのように無針注入に使用できるかを記載している。
【００７０】
脳に導入される組成物は、更に、ドキソルビシンのような放射線増感剤を含むことができる。このことは、有利には、治療と放射線療法との組み合わせを可能にする。あるいは、又は同時に、組成物は従来の放射線不透剤又は染料のような画像化剤を含むことができる。導入される組成物は、他の治療活性剤と混合してもよいし、又は、他の活性剤と共に、別々にではあるが、組み合わせて導入されてもよい。
【００７１】
脳に導入される組成物は、吸収された活性剤を含有する膨潤微小球の水性懸濁液である。上記に考察された追加の作用物質のいずれも、送達する前に、懸濁液と混合することが望ましい。あるいは又は追加的に、微小球をこれらの追加の作用物質のいずれかで予め装填してもよい。
【００７２】
脳に注入されたとき、微小球は組織内圧により押し出される傾向があることが見出されている。この問題を克服するために、脳に導入される組成物は、追加的に粘度調整剤を含んでもよい。粘度調整剤は、組成物の粘度を増加するべきである。粘度調整剤は、例えば、アルギン酸塩、カルボキシセルロース又はＰＶＰのような生分解性ポリマーであってもよい。アルギン酸塩が粘度調整剤として使用される場合、アルギン酸塩は、有利には、いったん注入されると、周囲組織から拡散するカルシウムイオンとの架橋によりゲルを形成する。
【００７３】
あるいは、組成物を、急速な高圧系を使用して脳に注入してもよく、この場合、組成物全体がシリンジを使用して注入される。
【００７４】
本発明の一つの実施態様において、組成物は、減量された脳腫瘍の切除周辺部に注入される。切除周辺部は、幾つかの散在腫瘍を有する、大部分は健康な組織を含む。この実施態様において、好ましくは、イリノテカンのような毒性の低い活性剤をポリマー微小球と結合させる。毒性の低い活性剤は、散在腫瘍組織に対してより選択的である可能性があり、それによって重要な脳組織の保存に役立つ。
【００７５】
本発明の異なる実施態様において、組成物は、切除不能な脳腫瘍（すなわち、物理的に除去することができない深部の脳腫瘍）の治療に使用される。この実施態様において、組成物は、腫瘍塊の中心に直接挿入される長針を使用して、腫瘍の中に移植される。好ましくは、より攻撃的な活性剤を使用して腫瘍塊を破壊する。ドキソルビシン又はその類似体の１つは、本発明のこの実施態様に適した活性剤である。
【００７６】
本発明において治療される被験者は、一般に哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００７７】
以下の実施例において本発明を更に説明する。幾つかの結果を、添付の図面で示すが、図面については、実施例においてより詳細に記載しているが、以下に簡潔に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Bead Blockの低及び高ＡＭＰＳ配合物へのドキソルビシンの装填を示す。
【図２】高ＡＭＰＳ Bead Blockからのドキソルビシンのインビトロ溶出を示す。
【図３】薬剤量の増加に伴う装填ビーズの平均直径の変化を示す（平均±標準偏差、ｎ＝５）。
【図４】薬剤量の増加に伴う装填ビーズの圧縮抵抗を示す（平均±標準偏差、ｎ＝５）。
【図５】ｐＨ５及びｐＨ８でのＡＱ４のＵＶ走査である。
【図６Ａ】ｐＨ３．１のクエン酸緩衝液でのＡＱ４ＮのＵＶスペクトルである（挿入曲線は、０．００１mg/mlのものである）。
【図６Ｂ】ＡＱ４Ｎの濃度に対する６１０nmと６６０nmでの吸光度の比率である。
【図７】薬剤装填のないDC Bead（５００〜７００μm）の写真である。
【図８】ＡＱ４装填DC Bead（２０mg/ml）の外観を示す。
【図９】ＡＱ４Ｎ装填DC Bead（２０mg/ml）の外観を示す。
【図１０】ＡＱ４装填あり及びなしのDC Beadのサイズ分布を示す。
【図１１】DC Bead（５００〜７００μm）のＡＱ４及びＡＱ４Ｎ装填プロフィールを示す。
【図１２】室温におけるDC BeadからＰＢＳ  ２００mLへのＡＱ４及びＡＱ４Ｎの溶出を示す。
【図１３】Ｔ装置により３７℃で試験した、DC Bead（２０mg/mlで装填された０．５mLのビーズ）からＰＢＳへのＡＱ４Ｎの溶出を示す。
【図１４】異なる注入速度で製造したアルギン酸ビーズのサイズを比較する。
【図１５】異なる空気流量で製造したアルギン酸ビーズのサイズを比較する。
【図１６】異なるサイズの針を使用して製造されたアルギン酸ビーズのサイズを比較する。
【図１７】異なるサイズの空気流配向器を使用して製造されたアルギン酸ビーズのサイズを比較する。
【図１８】ドキソルビシンを装填した実施例８のアルギン酸ビーズのサイズ分布を示す。
【図１９】実施例８のアルギン酸ビーズからのドキソルビシンの溶出プロフィールを示す。
【図２０Ａ−Ｂ】５９．７０mg/mLのドキソルビシンを装填した２％高Ｇ（ＬＢ４０）の、凍結乾燥及び滅菌の前の、異なる背景光での写真である。
【図２１】５９．７０mg/mLのドキソルビシンを装填した２％高Ｇ（ＬＢ４０）の写真である：Ａ＝凍結乾燥ビーズ；Ｂ＝ＰＢＳ中に一晩。
【図２２】細胞移植１８日後のラット脳におけるＢＴ４Ｃａ腫瘍を示す。
【図２３】ビーズを脳に送達する「発射」技術の結果を示す：左＝実施例１のドキソルビシン装填ビーズ；右＝実施例１の未装填ビーズ。
【図２４】（ａ）Ｄｏｘ  ＤＥＢによる治療１日後の腫瘍；（ｂ）Ｄｏｘ  ＤＥＢによる治療５日後の腫瘍；（ｃ）未治療腫瘍対照を示す。
【図２５】Ｄｏｘ  ＤＥＢの１μl、３μl及び５μl（左から右）で治療した腫瘍を示す。
【図２６】Ｉｒｉ  ＤＥＢの１μl、３μl及び５μl（左から右）で治療した腫瘍を示す。
【図２７】多様な腫瘍内治療を行ったＢＴ４Ｃラット神経膠腫を有するラットのカプラン・メイヤー生存曲線である。
【図２８】実施例１５のアルギン酸塩懸濁液６μlあたりのビーズの数を示す。
【図２９】アルギン酸ビーズ懸濁液からのＤｏｘ（１０mg/mlのDox Bead）の溶出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
＜参照例：微小球の調製方法の概説＞
微小球は、ＷＯ２００４／０００５４８に記載されている方法により、「低ＡＭＰＳ」又は「高ＡＭＰＳ」生成物として合成される。簡潔には、アセタール結合エチレン性不飽和基を有するポリビニルアルコールマクロマーと２−アクリルアミド−２−メチル−プロパンスルホネートとの重量比約１：１の水性混合物を、酢酸酪酸セルロース安定剤を含有する酢酸ブチルの連続相中で撹拌機を用いて懸濁し、レドックス開始剤を使用してラジカル重合して、ビーズを形成し、それを洗浄し、染色し、後の実施例で使用される、３００〜５００μm、５００〜７００μm及び７００〜９００μmの画分を含むサイズ画分にふるい分けする。微小球の平衡含水量は、９４〜９５重量％である。
【００８０】
＜実施例１ａ：ドキソルビシンの装填＞
この実験のために、参照実施例で調製された低ＡＭＰＳ微小球を使用した。使用するビーズのそれぞれのサイズについて、０．５ml分を、１本目には薬剤を入れ、２本目は対照として機能する、２本の１mlシリンジに移した。実験のために選択したサイズは、１０６〜３００μm、３００〜５００μm、５００〜７１０μm及び８５０〜１０００μmであった。加えて、手順を確認するために、５００〜７１０μmの生成物を入れた更に３本のシリンジを準備した。１１個の１０mlガラスバイアルをホイルで覆って、実験の間の光によるドキソルビシンの分解を防いだ。標準曲線を作成した。８０mlの２０mg/ml薬剤溶液を使用して、以下の濃度を調製し、それらの吸光度（４８３nm）を測定した：１００μg/ml、５０μg/ml、２５μg/ml、１２．５μg/ml、６．２５μg/ml及び３．１２５μg/ml。得られた吸光度をグラフにプロットし、直線の方程式を使用して、実験においてビーズにより取り込まれた薬剤の濃度を計算した。４個のバイアルには、ビーズが添加されたときに対照として使用するために、５mlの蒸留水（ROMIL）を充填した。残りの７個のバイアルには、５mlの薬剤溶液を所望の濃度で加えた。溶液の当初の吸光度、したがって濃度は、標準曲線の調製によって既に分かっていた。２０mg/mlの溶液の吸光度を測定するために、濃度１００μg/mlを使用して、２００倍に希釈する必要があった。この１：２００の希釈は、ビーズによる溶液の取り込みを測定している間中実施した。ストップウオッチを、第１セットの微小球を第１薬剤含有バイアルに加えると直ぐに始動させ、微小球を残りの６個のバイアルに最小から最大までの順にそれぞれ加えた。キャップを使用して密閉すると、ロータリーミキサーに設置した。この方法を対照試料で繰り返した。吸光度を、バイアルの設定と同じ順番で、０．１６７時間（１０分間）、０．５時間、１時間、２時間、２４時間および９６時間の時間間隔により測定した。データから、微小球１mlあたりの薬剤の量（mg）及び１mlの微小球による薬剤の取り込み％を計算することができた。結果を図１に示す。
【００８１】
＜実施例１ｂ：微小球からのドキソルビシンの溶出＞
高ＡＭＰＳ微小球には、多様な濃度のドキソルビシンを装填し、微小球を、２５０mlの蒸留水に溶出させた（図２）。
【００８２】
１３３．２μg/ml及び２μg/mlを装填した微小球からの薬剤溶出は、３時間後も依然として検出限界より低かった。より高い薬剤装填では、バースト効果が最初の数分間で明白であり、その後により遅い放出が長時間続く。バーストは、微小球内に保持された水からの自由薬剤溶出を表し、一方、長時間の溶出は、荷電された基の間のイオン相互作用により実質的に球体に「結合」している薬剤がもたらしていると推測される。最も高い薬剤（２０mg/mlの装填溶液）の装填では、バースト効果は、球体の総薬剤装填のおよそ４５％で表れ、残りは、担体から完全に溶出するまで数日かかっている。研究は、１００％の薬剤が最終的に微小球から溶出することを示した。薬剤装填ビーズを、凍結乾燥して水を除去し、ガンマ線照射を使用して滅菌した。
【００８３】
＜実施例１ｃ：予備装填生成物−凍結乾燥による重量低減＞
本発明のドキソルビシン装填微小球を、凍結乾燥に付した。重量低減率を、全ての微小球のサイズの範囲にわたって５、１０、２０及び４５g/mlの用量で決定し、装填微小球の％として表した。一貫した重量低減が得られ、凍結乾燥前の装填微小球の重量のいかなる違いも、凍結乾燥後の生成物に対して影響を与えないことを示した。このデータは、水の損失に起因した、一貫して８２％を超える凍結乾燥後の重量低減があることを示した。
【００８４】
＜実施例２：イリノテカン装填ＰＶＡヒドロゲルビーズ（Ｉｒｉ  ＤＥＢ）の調製＞
この実験では、微小球を参照例に詳述したように調製した。
【００８５】
＜実施例２ａ：微小球装填容量の調査＞
イリノテカン装填含有量及び装填効率は、５００〜７００μmの微小球を使用して決定した。ビーズスラリーを計算量のイリノテカン溶液（２０mg/ml）と回転混合により少なくとも４時間混合した。溶液を３６９nmのＵＶで測定し、ビーズにおけるイリノテカン濃度及び薬剤装填を決定した（枯渇法）。ビーズにおけるイリノテカン含有量は、低濃度（５０mg/ml未満）の装填量で直線的に増加した。これを超えると、装填効率は著しく下がり、ビーズの飽和を示した。
【００８６】
＜実施例２ｂ：凍結乾燥イリノテカン微小球からの溶出＞
イリノテカンは、異なるカンプトテシン装填を行った凍結乾燥微小球から、ＰＢＳ緩衝液の中に溶出した。溶出速度は、非凍結乾燥試料と比較すると、凍結乾燥した後では遅くなった。また、より高い薬剤装填は、より低いものと比較して遅い溶出を示した。薬剤装填ビーズを、凍結乾燥して水を除去し、ガンマ線照射を使用して滅菌した。
【００８７】
＜実施例３：ミトキサントロンの装填及びビーズの物理的特性に対する効果の、ドキソルビシンとの比較＞
本発明の微小球を参照例に記載されているとおりに調製した。サイズの範囲が７００〜９００μmの試料ビーズに、ビーズをドキソルビシンＨＣｌ（Ｄｏｘ）及びミトキサントロン２ＨＣｌ（Ｍｉｔｏｘ）の各水溶液に浸けることによって装填した。装填は、２つの薬剤のそれぞれの吸収極大の波長（それぞれ、４８３nm及び６６０nm）でＵＶ−可視分光法を使用してモニタリングした。ビーズをサイズで分類し、Colorview IIIカムコーダーを備えたOlympus BX50F4顕微鏡を使用して画像化した。圧縮性は、５０Nロードセルを備えたlnstron 4411を使用して測定した。
【００８８】
ビーズは、Ｄｏｘ及びＭｉｔｏｘの両方を活発に取り込んだ。Ｍｉｔｏｘの最大装填容量は、Ｄｏｘのおよそ半分であり、このことは、正電荷基がＤｏｘでは１個であるのに比べて２個であることに一致している（表１）。
【００８９】
【表１】
0005559035.tif 000013
表１：ＤＥＢ（薬剤溶出ビーズ）の平均最大容量。ＣＶ＝変動係数。
【００９０】
両方の薬剤で、装填後のサイズ変化が起こるが、用量の増加に伴い平均直径が減少する（図３）。最初のサイズ変化は、イオン性スルホン酸塩基の周りの水分子がより疎水性で嵩高の薬剤に置換されることによって生じる。しかし、ビーズの濃度が１mLあたり１０mgを超えると、Ｍｉｔｏｘ装填ビーズは、同じ用量でＤｏｘ装填ビーズよりも低い平均直径を有する。これは、Ｍｉｔｏｘの２個の結合基が、ビーズの直径を物理的に制限するように作用し、構造を効果的に架橋するために生じる。
【００９１】
Ｄｏｘ及びＭｉｔｏｘ装填ビーズは、両方とも、圧縮に対して同様の抵抗を示すが、これは用量と共に徐々に増加する（図４）。濃度が最大容量に近づくと、Ｄｏｘ装填ビーズは、未装填ビーズに比べて圧縮に対して有意に高い抵抗性を有するようになる。これは、二量体を形成するアントラサイクリン芳香族環の静電的相互作用を介して自己会合し得るＤｏｘの能力に起因する。高濃度では、ビーズ内の二量体の形成は、構造を架橋するように作用することもできる。Ｍｉｔｏｘも自己会合して二量体を形成しうる可能性があるが、最大装填容量の２０mgは、ビーズの物理的特性を有意に変える二量体を形成するには不十分である。
【００９２】
Ｍｉｔｏｘ及びＤｏｘを使用したＤＥＢの最大装填容量は、利用可能な荷電基の数により直接制御される。装填されると、ビーズは、用量の増加に伴い、平均ビーズ直径の低減及び圧縮に対する抵抗の増加を示す。この挙動は、（ｉ）含水量の低減と、（ｉｉ）薬剤自体の物理的制限及び／又は薬剤の自己会合を介した、薬剤による構造の架橋と、の組み合わせにより引き起こされる。
【００９３】
＜本発明のビーズへのＡＱ４及びＡＱ４Ｎの装填及び溶出＞
＜実施例４：ＡＱ４及びＡＱ４Ｎ溶液のＵＶスペクトル＞
ＡＱ４は、低い水溶性を有する外観が暗色の粉末である。５．１６７mg/mLのＡＱ４水溶液は、ＨＣｌ溶液（１M）のアリコートの添加により薬剤を溶解することによって調製した。ＡＱ４のｐＨ５及びｐＨ８でのＵＶスペクトルを図５に示す。低ｐＨでは、可視領域において、２つの吸収ピークが６０８nm及び６５９nmにおいて存在する。ｐＨをｐＨ６超に上昇させると、プロトン化第三級アミンの中和によって、吸収極大は５６１nmにシフトした。
【００９４】
ＡＱ４Ｎは、暗色の粉末であり、低い水溶性を有する。ＨＣｌによる酸性化の後でのみ水に可溶性になる。図６Ａは、ｐＨ３．１のクエン酸緩衝液中の異なる濃度でのＡＱ４ＮのＵＶ走査を示し、２つの吸収ピークを可視領域の６１０nmと６６０nmに有する。ＰＢＳ緩衝液において、ＡＱ４Ｎもほぼ同じスペクトルを示す。これら２つのピークの相対吸光度は、ＡＱ４Ｎ濃度と共に変わったことが留意される。６１０nm及び６６０nmでの吸光度の比率は、ＡＱ４Ｎ濃度が０．００００５８mg/mLから０．１mg/mLに増加すると、０．７３から１．６７に増加した（図６Ｂ）。このことは、濃度が約０．００２mg/mlに増加した溶液における薬剤分子の凝集の可能性を示唆している。
【００９５】
水溶液中のＡＱ４の標準曲線を構築することができ、以下のような薬剤濃度と吸光度との関係が得られる：
ＡＱ４の濃度＝吸光度＠６６０nm×０．０２４５。
【００９６】
ＡＱ４Ｎの標準曲線も、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．１）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）の溶媒中において構築した。２つの曲線は、基本的に互いに重複し、このことは溶媒の影響力の弱さを示唆している。薬剤濃度と６１０nmでの吸光度との関係は、以下である：
ＡＱ４Ｎの濃度＝０．０００７×吸光度３＋０．００４×吸光度２＋０．０２９６×吸光度（クエン酸緩衝液）。
ＡＱ４Ｎの濃度＝０．００５６×吸光度３−０．００６７×吸光度２＋０．０３４５×吸光度（ＰＢＳ）。
【００９７】
＜実施例５：ＡＱ４及びＡＱ４Ｎ装填DC Beadの形態及びサイズ分布＞
塞栓形成化学療法のためのDC Beadは、主にＡＭＰＳ基（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネートナトリウム塩）を有するＰＶＡヒドロゲルから構成され、青色染料で着色されている（図７）。ＡＱ４を装填した後、DC Beadは、図８に示されているように、元の透明なDC Beadから黒色で非透明に変化した。図９は、黒色のＡＱ４Ｎ装填DC Beadを示し、高い薬剤装填も示している。２つの写真から、これらの２つの薬剤装填ビーズは、球状を保持している。ＡＱ４及びＡＱ４Ｎ装填有り及び無しのDC Beadのサイズ分布の変化を図１０に示す。装填ビーズのサイズは、ビーズの疎水性の増加に起因して減少する傾向があり、その結果として水分子をビーズの外に排除する。表１は、DC Beadサイズ変化のパラメーターを示す。この表から、ＡＱ４装填及びＡＱ４Ｎ装填ビーズの平均サイズ（約３４６μm）、最大及び最小サイズは、ほぼ同一である。薬剤のないDC Beadと比較すると、平均サイズは約１８０μm減少している。
【００９８】
【表２】
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表２：ＡＱ４装填有り及び無しのDC Beadのサイズ
【００９９】
＜実施例６：ＡＱ４及びＡＱ４Ｎ装填プロフィール＞
プロトン化ＡＱ４及びＡＱ４Ｎを、静電荷との相互作用を介して負荷電スルホン酸塩基を担持するDC Beadに装填することができる。装填ビーズが水中に設置されたときに薬剤の溶出が観察されず、対照的に、薬剤が生理食塩水又はＰＢＳ緩衝液の中で放出されたことから、イオン交換機構が実証された。
【０１００】
図１１は、１mLのDC Bead（５００〜７００μm）への２０mgのＡＱ４及びＡＱ４Ｎの装填プロフィールを示す。装填の目標は２０mg/ml（室温）であった。これらの２つの薬剤の装填速度は非常に速い。最初の１０分以内に、約７５％のＡＱ４及びＡＱ４Ｎが装填された。３時間後、装填効率は９９％超であった。
【０１０１】
５００〜７００μmのDC Beadの最大装填容量は、０．５mLのDC BeadをＡＱ４Ｎ溶液と２０時間混合すること（装填目標６０mg/mL）により研究した。DC BeadにおけるＡＱ４Ｎの最大装填容量の測定値は２６．９mg/mLである。この値は、DC Beadにおけるドキソルビシンの装填容量（４０mg/mL）よりも低く、それはドキソルビシンの単独電荷と比較してＡＱ４Ｎでは二重電荷であることに起因する。理論的には、各ドキソルビシンは１つのスルホン酸塩基を組み合わせ、したがって、２個の電荷を有するＡＱ４Ｎは、２個のスルホン酸塩基を結合すると予測される。
【０１０２】
DC BeadにおけるＡＱ４Ｎの装填容量の実験は、最大約２６×４＝１０４mgのＡＱ４Ｎを、４mLの装填DC Beadを用いる典型的なＴＡＣＥ（経動脈化学塞栓形成）により、腫瘍内に送達できることを示唆している。
【０１０３】
＜実施例７：溶出実験＞
図１２は、薬剤装填DC BeadをＰＢＳと混合したＡＱ４及びＡＱ４Ｎの溶出プロフィールを示す。装填目標は２０mg/mlであった。この手順において、２０mg/mLのＡＱ４又はＡＱ４Ｎを有する１mLのＡＱ４装填DC Beadを、２００mLのＰＢＳと混合し、室温でローラー混合した。特定の時点で試料を収集して、ＵＶ吸光度を測定した。図１２は、２つの非常に異なる溶出プロフィールを示し、ＡＱ４の溶出は進行が遅く、３０時間後に１．１８mg（総装填の６％）のＡＱ４しかＰＢＳに溶出しなかった。しかし、ＡＱ４Ｎは、非常に速い溶出を示し、１９．８mgのＡＱ４ＮがＰＢＳと混合した１時間後に溶出した。
【０１０４】
ＡＱ４分子は、酸によりプロトン化されてDC Bead内のスルホン酸塩基との強力な結合力をもたらしうる、４個の窒素を有する。ＡＱ４Ｎには、プロトン化されうる２個の窒素がある。プロトン化窒素の正電荷は、隣接するベンゼン環により容易に局在化されうる。したがって、スルホン酸塩基とＡＱ４Ｎの相互作用は、かなり弱いものになる可能性があり、装填ビーズからの薬剤の速い溶出をもたらす。
【０１０５】
Ｔ装置は、ビーズが血管の非常に狭い領域に限定され詰め込まれているという、インビボでの塞栓形成ビーズからの薬剤の溶出をシミュレートするように設計した。したがって、薬剤溶出速度は有意に低下した。図１３は、薬剤装填DC BeadからのＡＱ４Ｎ溶出プロフィールを示す。この実験において、１０mgのＡＱ４Ｎを有する０．５mLのDC Beadを、３００mLのＰＢＳ緩衝液に３７℃で入れた。ＡＱ４Ｎ溶出を６１０nmでモニタリングした。曲線から、開始時には薬剤のバーストはなく、約９０％の薬剤が２０時間後に溶出した。この溶出プロフィールは、ＡＱ４ＮがインビボにおいてDC Beadから一貫して溶出しうることを実証している。
【０１０６】
ＡＱ４及びＡＱ４ＮをDC Beadに比較的容易に装填することができる。DC BeadにおけるＡＱ４Ｎの最大装填容量は２６mg/mLビーズである。薬剤装填DC Beadは、強い黒色を有する球状を保持し、薬剤装填のないビーズと比較してサイズが減少している。装填ビーズのサイズ分布は、元のDC Beadと同じである。DC BeadからＰＢＳへのＡＱ４の溶出は、薬剤のカチオン性荷電基とポリマービーズのスルホン酸塩基との強力な相互作用のため、非常にゆっくりである。ＡＱ４Ｎの溶出は、相互作用が穏やかなカチオン性の第二級アミン基に依存しているので、比較的速い。Ｔ装置実験は、放出過程の拡散及び対流成分のインビボ状況をより緊密に模倣する。これは、ＡＱ４ＮがDC Beadから約２０時間かけて一貫して溶出することができ、治療上有意義な持続的放出を提供することを実証している。
【０１０７】
＜実施例８：アルギン酸微小球の調製＞
アルギン酸微小球は、下記に記載されているように、高Ｇ又は高Ｍ含有量の超高純度アルギン酸塩から、特定の濃度のアルギン酸塩溶液をカルシウム又はバリウムイオンのゲル化浴（通常２０mM）の中に押し出すことにより調製した。
【０１０８】
＜実施例８ａ：エアナイフ押出法を使用したアルギン酸ビーズの製造＞
アルギン酸ナトリウム溶液（アルギン酸塩濃度＝０．６％）及び塩化バリウム溶液（濃度＝２９０mM）を超純水で作製した。アルギン酸ビーズを製造するのに使用した機械の針は、使用前に生理食塩水で洗浄した。一定の空気圧（Ｐ＝１bar）下で、およそ２mLのアルギン酸塩溶液を、３mLのシリンジを使用するエアナイフ押出機の針から、プラスチックペトリ皿の中にある１０mLの塩化バリウム溶液に注入し、それを約２０分間放置して架橋させた。架橋した後、得られたビーズを、生理食塩水で３回洗浄し、フィルター（１００μm）を通して過剰バリウム溶液及び極小サイズのビーズを除去した。基部上に組み立てられた部品（基部、針、ジェット及び空気流配向器などを含む）を、使用後その都度、生理食塩水、ＥＤＴＡ及び脱イオン水で洗浄した。 
【０１０９】
＜実施例８ｂ：異なる注入速度で製造されたアルギン酸ビーズ＞
（空気流量−４L/分、針径−０．７mm、空気流配向器のサイズ−２．５mm）
【０１１０】
【表３】
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表３：異なる注入速度でのサイズの比較
【０１１１】
注入速度を５から３０mL/分に増加すると、アルギン酸ビーズのサイズは徐々に増加することが、図１４及び表３から観察することができる。しかし、注入速度の増加は、大部分のビーズが３００〜５００μmの範囲にあるので、アルギン酸ビーズのサイズに有意な影響を与えない。大部分のビーズはそれぞれの条件下で全て均一のサイズ及び形状を有する。ほとんどのビーズは、使用される注入速度に関わりなく非常に平滑な表面を有する。
【０１１２】
実施例８ｃ：異なる空気流量で作製されたアルギン酸ビーズ＞
（注入速度−１０mL/分、針径−０．７mm、空気流配向器のサイズ−２．５mm）
【０１１３】
【表４】
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表４：異なる空気流量でのサイズの比較
【０１１４】
表４及び図１５によると、ビーズのサイズと空気流量の相関関係は、空気流量が特に４から２L/分に低減するとアルギン酸ビーズのサイズが著しく増加するので、反比例している。２〜４L/分のある時点で、それより小さくなるとビーズが非常に大きくなる流量境界があると思われる。
【０１１５】
２L/分未満の空気流量で製造されるより大きいビーズは、４及び６L/分の空気流量で製造されるものと比較して、サイズ及び形状に関してより良好な均一性を有する。多くの非常に小さいビーズ（１００μm未満）が６L/分の画像で観察される。これらは、フィルター範囲よりも小さいので濾過されなかった。サイズの差にもかかわらず、大部分のビーズは、形態に関して非常に良好な品質を有する。
【０１１６】
＜実施例８ｄ：異なる針径で製造されたアルギン酸ビーズ＞
（空気流量−４L/分、注入速度−１０L/分、空気流配向器のサイズ−２．５mm）
【０１１７】
【表５】
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表５：異なる針径でのサイズの比較
【０１１８】
表５及び図１６で観察されるように、針径１．０mmで製造されたアルギン酸ビーズは、針径０．７mmで作製されたものより大きい。
【０１１９】
針径を変えることは、両方の種類のビーズが非常に丸い形状及び平滑な表面を有するので、ビーズ形態に関して有意な差をもたらさない。
【０１２０】
＜実施例８ｅ：異なる空気流配向器で作製されたアルギン酸ビーズ＞
（空気流量−４L/分、注入速度−１０L/分、針径−０．７mm）
【０１２１】
【表６】
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表６：異なる空気流配向器でのサイズの比較
【０１２２】
空気流配向器の幅が広いほど、製造されるビーズが大きくなると考えるのは、当然のことである。これは、２．５mmの空気流配向器により作製されるビーズの平均サイズが、２．０mmの空気流配向器により作製されるものの平均サイズよりも約７０μm大きいという、表６に提供されているデータにより支持されている。図１７によると、２．０mmの空気流配向器により作製されるビーズは、より広いサイズ範囲：１００〜４００μmにわたって分布されており、一方、２．５mmの空気流配向器により作製されるものの大部分は、２６０〜４０μmの範囲内であることが分かる。２．５mmの空気流配向器により作製されるアルギン酸ビーズは、２．０mmの空気流配向器により作製されるビーズよりも、その形状及びサイズに関してより均一である。これら２種類のビーズの別の差は、形態である。２．５mmの空気流配向器により製造されるビーズは、２．０mmの空気流配向器により製造されるものよりも比較的平滑であるように見える。
【０１２３】
＜アルギン酸ビーズ形成に対する異なるパラメーターの効果のまとめ＞
アルギン酸ビーズのサイズは、上記の実験パラメーターをそれぞれ変えることにより変更することができるが、空気流量の変更が、サイズに対して最も顕著な影響をもたらす。
【０１２４】
＜実施例９：アルギン酸ビーズへのドキソルビシンの装填＞
装填容量試験：０．２mLの２％及び０．３mLの０．６％アルギン酸ビーズ（平均直径２００μm）を、２mLのピペットの使用により測定した。リンゲル液（１Ｌの脱イオン水中に８．６ｇのＮａＣｌ、０．３ｇのＫＣｌ、０．４３７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を加えて、測定及びビーズの移動を促進した。続いて充填溶液を、先端に綿フィルターを備えたガラスピペットを使用して除去した。
【０１２５】
１．３９mLの１０．０７mg/mL塩酸ドキソルビシン水溶液を、それぞれ２％ビーズでは７０mg/mL及び０．６％ビーズでは４７mg/mLの装填目標で、アルギン酸ビーズと混合した。続いて混合物をIKA KS 260ベーシックシェーカーによりモーター速度１５０/分で一晩振とうした。次に装填溶液を５０倍に希釈し、ＵＶ分光法により４８３nmで測定して、溶液中の残留ドキソルビシン濃度を決定した。
【０１２６】
アルギン酸ビーズの装填容量の測定値を表７に示す。より高いアルギン酸塩濃度を有するビーズが、より高いグルロン酸（Ｇ）／マンヌロン酸（Ｍ）含有量のため、したがってアニオン性の薬剤結合部位の数の増加のために、より多くのドキソルビシンを装填するという、論理的な傾向に従うと考えられる。データから、同じアルギン酸塩濃度で、高Ｇビーズは高Ｍビーズと比較してより高い装填容量を有することも明らかである。
【０１２７】
【表７】
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表７：実施例８のアルギン酸ビーズの装填容量
【０１２８】
ドキソルビシンを装填した実施例８のアルギン酸ビーズのサイズ分布を図１８に示す。未装填ビーズのデータを含む対応するパラメーターを表８に提示する。一般に、ビーズは、薬剤装填の後では狭いサイズ分布を維持する。しかし、サイズは、薬剤装填ビーズの疎水性の増加に起因して、ドキソルビシン装填により減少する。高Ｇビーズのサイズは、同じアルギン酸塩濃度で高Ｍ対応物と比較して低減が少ない。高Ｇビーズは、より多くの薬剤を保持する傾向があるが（表７）、ここでは、より高度に架橋された高Ｇビーズのより大きい剛性が、収縮に対する抵抗に主要な役割を果たしている。
【０１２９】
表８では、低アルギン酸塩濃度（０．６％）の薬剤装填ビーズのサイズは、高アルギン酸塩濃度（２％）よりも相当減少した。同じビーズ容量では、ビーズ内の低ポリマー含有量が、薬剤装填の後では、容量のより大きな減少をもたらし、このことはより多くの水がビーズから排除されたことを意味する。ポリマー含有物の欠如により引き起こされる構造崩壊は、変形した球状をもたらしうる。
【０１３０】
【表８】
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表８：ドキソルビシンあり／なしの実施例８のアルギン酸ビーズの比較
【０１３１】
＜実施例１０：アルギン酸微小球からのドキソルビシンの溶出＞
図１９は、実施例８のアルギン酸ビーズからのドキソルビシンの溶出プロフィールを示す。図１９Ａは、２％高Ｇ／Ｍビーズを示し、Ｂは、０．６％高Ｇ／Ｍビーズを示す。溶出条件は、０．２mLの２％高Ｇ／Ｍビーズ、０．３mLの０．６％高Ｇ／Ｍビーズ、２００mLのＰＢＳ（新たなＰＢＳを溶液抜き取り後に添加した）、室温、ローラー混合機であった。高装填ビーズからの溶出（図１９Ａ）は、図１９Ｂに示されている低装填からの溶出と比較して遅くなる傾向がある。一方、２％高Ｇ／Ｍビーズからのドキソルビシンの溶出速度は、ほぼ同じである。図１９Ｂでは、０．５％高Ｍビーズからの溶出は、高Ｇビーズよりも僅かに速い。
【０１３２】
この研究において、０．２又は０．３mLのアルギン酸ビーズを溶出試験に使用し、シンク条件に近いものを、新たなＰＢＳの補充によって維持した。したがって、溶出速度は比較的速かった。溶出の速度は、ビーズの構造及び薬剤量だけでなく、ビーズに対する溶出媒質の容量比にも依存していることが見出された。最後の要因は、薬剤溶出のイオン交換型機構の特性であり、これは、媒質によりもたらされるイオン濃度は、交換のためには、十分に高いか、ビーズにおける薬剤と少なくとも同等でなければならないことを意味する。
【０１３３】
＜実施例１１：ドキソルビシン装填アルギン酸ビーズの凍結乾燥及び滅菌後の画像化＞
２％高Ｇ含有量のアルギン酸ビーズは、凍結乾燥及びガンマ線照射後に最高品質のビーズを生成することが分かった（図２０及び２１）。図２０の縮尺目盛りは、１００μmであり、図２１では２００μmである。
【０１３４】
＜実施例１２：ラット腫瘍モデルにおける薬剤装填ビーズの移植＞
ラット神経膠腫細胞株（ＢＴ４Ｃ）は、神経膠肉腫の組織病理学的外観を有する神経膠の腫瘍として特徴決定されている。この細胞株は、Institute for Cell Biology, University Essen, Hufelandstr. 55, 45122 Essenから得た。神経膠腫細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターにおいてＤＭＥＭ培地中の培養で維持した。フラスコを、対数増殖期で保持し、細胞を３〜４日毎に継代させた。
【０１３５】
ラットに、ケタミン及びメデトミジンを使用して麻酔をかけた。頭部を剃毛し消毒した。正中頭皮切開した後、前脳に３mmの穿頭孔を開けた。次に動物を定位枠の中に置き、８０００個の神経膠腫細胞を移植した。確実に止血した後、創傷を縫合糸により閉鎖した。図２２は、細胞の移植のおよそ１８〜２３日後に典型的に得られる塊状の腫瘍を示す（これは通常動物に死をもたらす）。
【０１３６】
ビーズの移植は、典型的には細胞移植の１週間後に同じ孔を通して実施した。ビーズは、全容量をシリンジの急激な注入により注入する「発射」技術を使用して移植した（図２３）。図２３の左側は、実施例１のドキソルビシン装填ビーズを示し、右側は実施例１の未装填ビーズを示す。ゆっくりした投与は、組織からのビーズの排除を引き起こすことが見出された。薬剤未装填ＰＶＡヒドロゲルビーズは、有害反応を伴うことなく脳組織に極めて良好に受容されているように見られた。
【０１３７】
この研究は、異なる用量の薬剤装填ビーズによる健康なラットの処置における毒性を決定した。表９に示したように、動物は３群であった。試験群において、３つの用量のビーズ／薬剤を試験した。ラットを無作為に群に割り当てた。各群は６匹のラットを有し、６匹のラットをそれぞれの用量レベルで試験した。
【０１３８】
【表９】
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（処置当日は、０日目とする。）
表９：ラット腫瘍モデルにおいて評価した群
【０１３９】
図２４は、高用量のＤｏｘ  ＤＥＢで処置した及びしない腫瘍の組織学的切片を示す。処置の１日後（ａ）、腫瘍は鮮明に見え、退行性組織変化を示した。有意な有害作用は見られず、脳水腫も炎症性反応もなかった。小さい矢印は、腫瘍中のＤｏｘ  ＤＥＢの位置を示している。５日目（ｂ）、腫瘍は壊死し、おそらく壊死の結果として引き起こされた腫瘍周囲の炎症の証拠が幾つかあった。隣接した脳組織は影響を受けないままであった。切片（ｃ）は、多数の細胞核及び分裂細胞を示している、腫瘍細胞を暗緑色染色した非処置対照腫瘍を示す。
【０１４０】
図２５は、Ｄｏｘ  ＤＥＢの１〜５μLの注入を使用した用量所見研究の結果を示す。これは、発射技術により投与した僅か１μLのＤｏｘ  ＤＥＢは、腫瘍の壊死をもたらすと同時に、５μLの場合に見られる組織内の血液貯留という毒性副作用を回避することのできる、妥当な容量であると思われる。
【０１４１】
図２６は、Ｉｒｉ  ＤＥＢを使用する同様の用量所見研究を示し、この場合、全ての用量は血腫の兆候及び用量依存性壊死がなく十分に許容されたが、Ｄｏｘ  ＤＥＢのような広範囲にわたる効能はなかった。
【０１４２】
動物を生存分析により評価するとき、カプラン・メイヤー曲線を構築したが（図２７）、これは、Ｄｏｘ  ＤＥＢが１μLの用量で処置したラットの生存を、生存期間を２倍にして有意に延ばしたことを示している。
【０１４３】
Ｄｏｘ  ＤＥＢによる処置のおよそ１６日後、未変性組織学切片及び対応する切片を蛍光顕微鏡法下で観察した。その結果は、ドキソルビシンが励起により赤色の蛍光を発したことで見られるように、ラット神経膠腫への注入後にビーズから実質組織への薬剤の溶出を明確に示した。この時点である程度の薬剤が幾つかのビーズに依然として残っていることも示した。
【０１４４】
これらの結果は、薬剤溶出ビーズが神経膠腫の治療に臨床的に有効であり、外科手術及び放射性シードの移植のような現行の治療方法を補完する新たな治療用品を提供するはずであることを確認する。
【０１４５】
＜実施例１３：定位注入のためアルギン酸ビーズ懸濁液＞
凍結乾燥したドキソルビシン装填高ＡＭＰＳビーズ（２５mg Ｄｏｘ/mLビーズ、原容量２mL）のバイアルを、２mLの注入用の水で再水和した。
２mlのアルギン酸塩溶液（高粘度、高Ｍ含有超高純度アルギン酸塩、CellMed）をこのバイアルに直接加え、vortexerを使用して１０秒間混合した。６μLの得られた懸濁液を、アルギン酸塩溶液のみで完全に予備充填されている５０μLのハミルトンシリンジに吸引した。
【０１４６】
ハミルトンシリンジの総容積は、ガラスシリンダーの容積と、注入針の容積からなっている。シリンダーは、５０μLを含有し、さらに１９Ｇ針は約２８μLを含有する。充填手順において、シリンジのガラスシリンダー及び針を、最初にアルギン酸塩溶液で完全に充填した。次に、６μLを押し出し、続いて６μLのアルギン酸ビーズ懸濁液をシリンジの中に引き込んだ。この方法により、６μLの容量のアルギン酸ビーズ懸濁液を、シリンジ針の先端に配置した。
【０１４７】
＜実施例１４：アルギン酸ビーズ懸濁液の定位注入＞
ラットへの注入のために、脳の計算した座標に針を挿入し、７μLの容量を可能な限り素速く注入した（「発射注入」）。次にシリンジを２mm引き抜き、３μLのアルギン酸塩をさらに注入して、注入道を密封した。ゲル化過程の完了のために針をこの位置に１５分間残した。
【０１４８】
＜実施例１５：アルギン酸ビーズ懸濁液の注入可能性（インビトロ所見）＞
上記に記載された動物実験の混合プロトコールを使用して、注入可能性について、未装填高ＡＭＰＳビーズ、並びにイリノテカン及びドキソルビシンを装填したビーズを試験した。ビーズに薬剤が装填されているかに関係なく、シリンジからの完全な排出を達成することは容易であった。この点において、ビーズをアルギン酸塩と混合することは、ビーズ単独、特にドキソルビシンビーズ単独の使用と比較すると改善である。注入容量６μLあたりのビーズの数を推定するために、シリンジには、未装填ビーズと、イリノテカン及びドキソルビシンを装填したビーズ（０．５、１及び１０mg）を充填した。次にシリンジの内容物をガラススライドの上に噴出させ、ビーズの総数を数えた。結果を図２８に示す。最多数のビーズが未装填群において見出され、最小数がＤｏｘ１０群において見出される。群間の差は、Ｄｏｘ１０対Ｄｏｘ１を除いて、全て有意であった（ANOVA、チューキーの多重比較試験）。
【０１４９】
＜実施例１６：注入容量６μLあたりの薬剤投与量の計算＞
上記に記載された混合プロトコールに基づいて、得られた薬剤投与量を注入容量６μLで計算した（表１０）。
【０１５０】
【表１０】
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表１０：用量の計算
【０１５１】
＜実施例１７：注入可能性−大脳注入後の形態学的所見＞
試験的動物実験を、アルギン酸ビーズ懸濁液の大脳内注入後に、ビーズ分布及び脳組織内のインビボ毒性を試験するために実施した。
【０１５２】
組織分布：
上記に記載したとおりに、動物に、６μLのアルギン酸ビーズ懸濁液を注入し、４μLのアルギン酸塩を追加的に注入した。針を抜く前に、アルギン酸塩の注入後１５分間待つことによって、アルギン酸塩懸濁液のゲル化をもたらし、ビーズ又はアルギン酸塩のいずれにも関連する逆流が観察されなかった。
【０１５３】
未装填ビーズを移植したラット及びドキソルビシン装填又はイリノテカン装填ビーズを移植したラットの顕微鏡写真を写した。動物を移植処置の直後に固定した。注入道に沿って僅かな出血が見られたが、大きな組織損傷は見られなかった。注入用量あたりの粒子数のインビトロでの推定に対応して、最多数の移植ビーズが未装填ビーズで見出され、最小数がドキソルビシン装填ビーズで見出された。
【０１５４】
＜実施例１８：アルギン酸ビーズ懸濁液の毒性実験＞
６μLのドキソルビシン又はイリノテカンのアルギン酸塩懸濁液（＋注入道の密封のため４μL）を健康なラットに注入した。６日後に脳を組織学的に調査した。健康な脳組織への注入は、注入道に沿ったビーズの円柱状分布を明らかにした。移植の６日後、低から中悪性度の脳組織壊死及び極僅かな出血に囲まれた、密集したビーズ堆積を見ることができた。
【０１５５】
＜実施例１９：試験的効能実験＞
６匹の動物に腫瘍細胞を接種した。５日後、これらのうちの３匹に未装填ビーズを注入し、残りの３匹の動物にＤｏｘ１０ビーズを注入した。６日後に脳を組織学的に検査した。動物は、実験の期間中、全身状態に関して有意な機能障害を示さず、神経障害も示さなかった。組織学的所見は、非懸濁ビーズの注入後の結果と同様の、ドキソルビシン及びイリノテカンアルギン酸塩懸濁液の効能を示している。ドキソルビシンにより引き起こされる出血の程度は許容可能なものであると思われた。未装填ビーズを移植した脳の顕微鏡写真では、密集ビーズ堆積は、進行腫瘍組織により周りを囲まれていた。Ｄｏｘ１０ビーズを移植した脳の顕微鏡写真では、腫瘍内部構造は破壊され、大きな壊死領域及び幾つかの腫瘍出血を見ることができた。
【０１５６】
混合手順及び移植手順は、健康な脳及び腫瘍組織内に再現可能なビーズ堆積を作り出す。アルギン酸ビーズ配合物は注入を促進する。アルギン酸塩のゲル化は、注入道からのビーズの逆流を防ぐ。この適用技術は再現可能であり、かつ効率的であると考えられる。
【０１５７】
＜実施例２０：インビボでのアルギン酸ビーズ懸濁液からのＤｏｘの溶出＞
１mLの凍結乾燥Ｄｏｘビーズ（１０mg Ｄｏｘ/mLビーズ）を、実施例１３に記載したように水で水和した。ビーズをアルギン酸塩溶液に懸濁し、アルギン酸塩の最終必要濃度（０．５、１又は１．５重量％）にするために必要であれば、水を加えた。アルギン酸ビーズ懸濁液を、アルギン酸塩をゲル化して薬剤の溶出のためのイオンをもたらすために、４００mLのリンゲル液を含有するボトルに注入することによって、薬剤の溶出を測定した。溶液を周期的に試料採取し、４８３nmでＵＶ−可視分光法を使用して、薬剤濃度を決定した。図２９は、溶出プロフィールを示しており、アルギン酸塩懸濁液の中では、最初の２４時間におけるＤｏｘ放出にいくらかの遅延があることを示す。アルギン酸塩の濃度は、ほとんど影響を与えないと思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図２４】
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