(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
複数の生体試料が外面に配置される第１の平面と、前記光源からの光が入射され、前記第１の平面の内面で全反射された光が出射され、前記複数の生体試料が配置された領域それぞれに対応して、所定の方向に所定の周期で配置された複数のプリズムが外面に形成された第２の平面とを有する基板と、
前記全反射により前記第１の平面の外面で生じたエバネッセント場で励起される前記生体試料から発せられる光を検出する、前記基板に対して前記第１の平面の外面側に配置された検出器と、
前記基板を、前記複数の生体試料のうち第１の生体試料を測定した後に第２の生体試料を測定するように、前記複数のプリズムの配置の前記所定の周期だけ移動させる駆動部とを有し、
前記複数のプリズムの各プリズムは、該プリズムに入射する前記光源からの光が隣接するプリズムから離間するように、入射面内において互いに連接して配置されており、
前記基板において前記光源からの光が入射する領域は、前記所定の方向に前記所定の周期で複数配置されること
を特徴とする蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透明材質の基板の表面上にエバネッセント場を生成し、基板表面上に供給された液体試料中の蛍光標識された生体分子をエバネッセント場で励起し、その結果生体分子から放射された蛍光を検出することにより、生体分子を定性的に検出あるいは定量する分析技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、励起光源から出力された励起光を透明なサンプル基板に照射し、その内部で励起光を全反射させることにより、基板表面に生じるエバネッセント場を利用した蛍光１分子観察が行われている。
例えば非特許文献１では、蛍光１分子観察において、エバネッセント場を生成するために、プリズム平面とサンプル基板を平行かつ向かい合わせに配置し、その間を両者の屈折率を整合させるマッチング液で満たす構成が用いられている。【０００３】
また、非特許文献２では、全反射エバネッセント照射検出方式を用いた単分子レベルのＤＮＡシーケンシングを行っている。レーザとして波長５３２ｎｍおよび６３５ｎｍを用いて、それぞれ蛍光体Ｃｙ３および蛍光体Ｃｙ５の蛍光検出に利用している。溶液で満たされたサンプル基板上に、単一のターゲットＤＮＡ分子をビオチン−アビジンのタンパク質結合を利用して固定化し、溶液中にＣｙ３一分子で標識されたプライマを溶液交換によって一定濃度になるように導入すると、単一の蛍光標識プライマ分子がターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイズする。この時、Ｃｙ３はエバネッセント場に存在するため、ターゲットＤＮＡ分子の結合位置を蛍光検出によって確認することができる。確認後、Ｃｙ３を高出力の５３２ｎｍの励起光で照射することによって蛍光退色させ、以降の蛍光発光を抑制する。次に溶液中に、ポリメラーゼ、およびＣｙ５一分子で標識された一種類の塩基のｄＮＴＰ（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれか）を、溶液交換によってそれぞれ一定濃度になるように導入すると、ターゲットＤＮＡ分子に対して相補関係である場合に限り、蛍光標識ｄＮＴＰ分子がプライマ分子の伸長鎖に取り込まれる。この時、Ｃｙ５はエバネッセント場に存在するため、ターゲットＤＮＡ分子の結合位置における蛍光検出によって相補関係を確認することができる。確認後、Ｃｙ５を高出力の６３５ｎｍの励起光で照射することによって蛍光退色させ、以降の蛍光発光を抑制する。以上のｄＮＴＰの取り込み反応プロセスを、塩基の種類を例えばＡ→Ｃ→Ｇ→Ｔ→Ａ→のように順次段階的に繰り返すことによって（段階的伸長反応）、ターゲットＤＮＡ分子と相補関係にある塩基配列を決定することが可能である。また、蛍光検出イメージの同一視野内に複数のターゲットＤＮＡ分子を固定化し、上記のｄＮＴＰの取り込み反応プロセスを並列処理することによって、複数のターゲットＤＮＡ分子の同時ＤＮＡシーケンシングが可能となる。この際の同時並列処理数は、従来の電気泳動をベースにしたＤＮＡシーケンシングと比較して飛躍的に大きくすることできると期待されている。【０００４】
サンプル基板上にエバネッセント場を生成する方法として、非特許文献３のように、サンプル基板の両端を加工し、斜面を持たせ、そこからレーザ光を導入し、サンプル基板内での多重反射を利用して伝播させることで、サンプル固定部を照射する方法もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｕｎａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ． ３７４， ５５５-５５９ (１９９５).
【非特許文献２】Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．， ＰＮＡＳ Ｖｏｌ． １００， ３９６０-３９６４ (２００３).
【非特許文献３】Ｈ．−Ｐ．Ｌｅｈｒ  ｅｔ  ａｔ．， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ． ７５， ２４１４-２４２０ (２００３)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の蛍光１分子観察において、サンプル基板を配置する際、プリズムとサンプル基板の間に空気が入らないようにマッチング液で満たす必要がある。この際、気泡が存在したり、充填量が少なくて空気層が残ったりすると、そこで励起光が散乱して背景光を高くしたり、光路が変化したりして、良好なエバネッセント照射検出ができなくなる。一方、マッチング液が多ければ、サンプル基板の交換時など、マッチング液が垂れて装置を汚すことになる。このように、マッチング液を用いる場合、熟練が必要となる。【０００７】
また、非特許文献３のように、サンプル基板の両端に斜面を設けたりすることで、マッチング液を不要とすることができる。しかし、これらの技術においては、サンプル基板の端に設けた斜面からレーザ光を導入し、サンプル基板内を多重全反射させるため、複数のエバネッセント場が生成する。観察視野外の蛍光分子は、前記エバネッセント場により消光する可能性があるため、複数視野を蛍光１分子計測することは困難となり、スループットが低下するためＤＮＡシーケンサへの応用は困難である。【０００８】
このように上記の従来技術においては、操作性が良好かつ、複数視野の蛍光１分子計測を可能にするエバネッセント場を形成できる装置構造については十分考慮されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の蛍光検出装置は、光源と、複数の生体試料が第１の面の外面に配置された基板であって、基板は、光源からの光が入射され、第１の面の内面で全反射された光が出射される第２の面を有し、全反射により第１の面の内面で生じたエバネッセント場で励起される生体試料から発せられる光を検出する基板に対して第１の面側に配置された検出器と、基板を、複数の生体試料のうち第１の生体試料を測定後に第２の生体試料を測定するように移動させる駆動部とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
サンプル基板上にプリズムまたは回折格子構造を持たせることで、観察視野内のサンプル固定領域を全反射照明した励起光が、視野外のサンプル領域を照射することなく、前記構造部より射出することができる。これにより、観察領域以外の蛍光分子の退色を防ぐことができ、サンプル基板駆動により複数視野の観察が可能となる。すなわちスループットが向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例１の構成図(Ａ)サンプル基板周辺の拡大斜視図(Ｂ)全体構成図
【図２】実施例１におけるサンプル基板の励起光路を含む断面図
【図３】実施例１における角度と屈折率の説明
【図４】実施例１における入射角の垂直性が破れたときの照射ずれ
【図５】(Ａ)実施例１におけるプリズム部の変形型(Ｂ)プリズム部の配置方法
【図６】実施例１における流路への送液機構構成図
【図７】実施例１におけるサンプル領域周辺の (Ａ)正面図(Ｂ)破線Ｃに関する断面図
【図８】実施例１におけるリアルタイム塩基配列決定法の概念図
【図９】実施例１における測定工程のフローチャート
【図１０】実施例２におけるサンプル基板の励起光路を含む断面図
【図１１】実施例３の構成図
【図１２】実施例４におけるサンプル基板の励起光路を含む断面図
【図１３】実施例４における０次回折光と１次回折光が重なるときの説明図
【図１４】実施例５におけるサンプル基板の励起光路を含む断面図
【図１５】実施例５におけるプリズム部の変形型
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面に従って本発明の実施例を説明する。
【実施例１】
【００１３】
図１に本発明の実施例１の構成図を示す。サンプル基板８およびその周辺の構成は拡大斜視図として図１(Ａ)に示した。ＸＹＺ軸を図１(Ａ)のように定義する。サンプル基板８上にプリズム部１８を設け、１つのプリズム部１８の反対面には、図２のように複数のサンプル領域２１がある。サンプル領域とは、生体分子（本実施例ではＤＮＡ）が固定された領域のことであり、サンプル基板８に一様に固定された生体分子のうち、スキャンによって対物レンズ９により観察される領域をさしてもよい。図２のように対物レンズ９が観察する視野領域に合わせてサンプル領域を形成させたほうが無駄がなくてよい。励起光は、実質的にプリズム入射面に垂直に入射させる。【００１４】
図１(Ａ)のサンプル支持部材１０１は、サンプル基板８をサンプルステージ１７に押し付けて、強固に固定するためのものである。これにより、測定中のドリフトによる不規則なサンプル基板８の位置ズレを防止することができる。【００１５】
本実施例では、サンプル支持部材１０１に厚さ２ｍｍ大きさ３５ｍｍ×５ ｍｍのポリカーボネート板２枚を使用し、それぞれの両端にネジを通すキリ穴を空け、サンプル基板８を挟んでサンプルステージ１７のネジ穴を使用して締めつけることで、サンプル基板８を強固に固定した。この他、サンプル支持部材１０１として、板バネのようなものを用いることも可能である。【００１６】
サンプル基板８はＸＹγ軸方向に移動可能なサンプル駆動部１０２に固定されており、これを手動または制御部１５で自動制御することでサンプル基板８をＸＹ方向にスキャンしたり、γ軸を駆動させて傾けたりすることができる。ここでγはＸＺ平面内でＸ軸となす角度である。γ軸はサンプル基板８の傾きを補正するだけではなく、γ軸を駆動させてプリズム部１８の入射面を傾けることで、ＸＺ平面と平行に入射する励起光の全反射角のずれを補正することができる。サンプル領域側に形成されるエバネッセント場の強度は、全反射角に依存するため、全反射角のずれによる蛍光シグナルのバラつきを抑制することができる。またサンプル基板８の傾き補正手段として、γ軸の他にδ軸を設けても良い。ここでδはＹＺ平面内でＹ軸となす角度である。サンプル駆動部１０２は、さらにＺ軸を付加して蛍光観察時のフォーカス補正などに利用してもよい。本実施例におけるフォーカス合わせは、対物レンズ９を固定する対物駆動部１０のＺ軸を、駆動させて行った。この際、制御部１５を用いて、イメージセンサ１４で検出したサンプル基板表面の画像変化を対物レンズ駆動部１０の動きにフィードバックさせながら、自動でフォーカスを合わせた。【００１７】
以下に図１の光学系周辺を説明する。励起光源１ａ、１ｂ、１ｃから射出された励起光は励起フィルター３ａ、３ｂ、３ｃでスペクトル純度を高めたのち、λ/４板４ａ、４ｂ、４ｃで円偏光となり、ダイクロイックミラー５ａ、５ｂまたはミラー５ｃで反射して、同一光路に統合し、入射角調整用のミラー６で反射し、集光レンズ７で絞られたあと、プリズム部１８に入射し、さらにサンプル基板８に入射する。サンプル基板８に入射した励起光はサンプル基板８とサンプル水溶液２３との界面で全反射し、サンプル基板８の表面にエバネッセント場を生成する（図２）。エバネッセント場によって励起されたサンプル基板８表面からの発光が、対物レンズ９で集光されて、平行化された後、発光フィルター１１ａ、１１ｂによって、発光のうち励起光と同一の波長を持つ成分（弾性散乱光）を除去する。その後、分散プリズム１２で波長ごとに異なる方向へ分けられ、結像レンズ１３でイメージセンサ１４の光電面上に結像させる。イメージセンサ１４で得られた画像は、演算、記憶および制御機能を備えたコンピュータとしての機能を有する制御部１５に記録される。【００１８】
本実施例では光源１ａとして波長３５５ｎｍのダイオード励起固体レーザを、光源１ｂとして波長４８８ｎｍと５１４.５ｎｍのＡｒ−ｉｏｎレーザを、光源１ｃとして波長約６３３ｎｍのレーザーダイオードを、それぞれ使用したが、もちろんＮｄ−ＹＡＧの第二高調波レーザ、ヘリウムネオンレーザ、半導体レーザなどを用いても良い。本実施例では、スペクトルが分離した、赤外、緑色、赤色、オレンジ色の発光波長帯域を持つ蛍光体を用いた。上記の場合、それぞれ励起波長が異なるため、対応した励起光源として２つの光源１ｂと１ｃを用いた。装置の簡略化を図るため、光源を１つにする方法として、励起波長帯域が蛍光体に比べて広い量子ドットや蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの発光体を利用することができる。ただし、前者では発光体の粒子サイズが大きいため、酵素活性が落ちて後述の伸長反応効率が下がり、塩基配列決定の時間が増大する。また、後者では、前者同様に発光体の分子サイズの問題に加え、ＦＲＥＴ効率が悪い場合、蛍光シグナルの検出効率が低下し、塩基配列決定の精度も低下する。尚、光源１ａは伸長反応を開始するための脱保護化として用いたが、異なる反応系であれば用いる必要はない。前記光源の照射タイミングは、後述する測定方法に合わせて、シャッター２ａ〜２ｃを開閉することで実施した。前記動作は、制御部１５により自動制御した。発光フィルター１１ａに波長５２５ｎｍ以上を透過させるロングパスフィルター、１１ｂに６２０ｎｍ-６４５ｎｍを遮断するノッチフィルタを用いているが、検出する波長範囲を透過させるバンドパスフィルタでももちろん良い。分散プリズム１２として、材質ＢＫ７のウエッジプリズムを用いたが、用いる色素の発光波長領域において吸収および自家蛍光の少ないものが望ましい。また、プリズムの他に回折格子を用いることもできる。【００１９】
次に、本発明に最適なプリズム部１８の形状を説明する。図３はプリズム部１８とサンプル基板８に関して励起光路を含む断面である。θｉはサンプル基板８に垂直な軸を基準としたときのプリズム部入射面３１への励起光の入射角、αはサンプル基板と入射面３１の成す角、θｐはプリズム部１８から接着層２２への入射角、ｎｐ、ｎａｑはそれぞれ、プリズム部１８、サンプル溶液２３の屈折率である。サンプル領域側のサンプル基板表面で励起光を全反射させ
るための条件は、
θｐ＞ｓｉｎ−１(ｎａｑ／ｎｐ)            （数１）
α≦θｐのとき、ｓｉｎ(θｉ−α)＝ｎｐｓｉｎ(θｐ−α)            （数２）
α＞θｐのとき、ｓｉｎ(α-θｉ)＝ｎｐｓｉｎ(α−θｐ)            （数３）
である。
また、全反射した励起光をプリズム部外へ射出させるための、プリズム部出射面３２の角度βの条件は、
β＞θｐ−ｓｉｎ-１(１／ｎｐ)            （数４）
本実施例では、１つのプリズム部１８に対し、Ｘ軸方向にサンプル領域２１を複数設けたため、励起光のプリズム部入射面３１への入射角は実質的に９０度となるようにした。図４に示すように、入射角が入射面３１に対して垂直から大きくずれた場合、励起光が入射面３１で屈折するので、隣のサンプル領域２１に観察視野を移動させた時、照射領域４１が観察視野から外れてしまう可能性があるためである。
垂直入射の場合、α＝θｐ＝θｉなので、（数１）よりα>ｓｉｎ-１(ｎａｑ／ｎｐ)となるように入射面の角度を調整した。プリズム部出射面３２とサンプル基板８の成す角に関しては、照射無駄を起こさず、より密にサンプル領域２１を配置するため、 
β≒９０°−θp      （数５）
とすることが望ましい。【００２０】
本実施例におけるサンプル基板８の作成は、α=６０°、β＝３０°、三辺が５ｍｍ×１０ｍｍ×８.６６ｍｍの直角三角形を底面とする高さ１０ｍｍの三角柱プリズム部１８を１８ｍｍ×８０ｍｍ×１ｍｍ（横×縦×厚み）の石英のサンプル基板上に、図１(Ａ)のように接着層を介して隙間なく接着させることで実施した。このとき、プリズム部の素材は、S-ＢＡＬ１４（ｎｐ=１.５７）であり、サンプル溶液の屈折率はｎａｑ＝１.３３ゆえ、θｐ＞５７.９度となり、上記プリズム部形状は（数１）〜（数５）の条件を満たす。ちなみに、（数１）満たさない角度で入射すると、励起光は全反射せずにサンプル溶液２３を透過するので、水のラマン散乱などによる背景光の影響で測定感度が低下し、結果として蛍光単分子の測定精度は著しく低下する。プリズム部１８とサンプル基板の接着層２２には、ＰＤＭＳを用いた。接着作業は気泡が入らないように注意しながら、プリズム部-サンプル基板間の厚みが０.１ｍｍ以下になるように貼り付けた。接着層２２には、プリズム部１８の屈折率と同程度のもの望ましいが、プリズム部１８と接着層２２の界面で全反射が起こらない屈折率であれば良く、励起波長に対して吸収および自家蛍光の小さいものが好適に使用できる。前記方法の他、接着層を用いず、十分に厚いサンプル基板からプリズム部を切削したり、樹脂を型に流し込んだりして作成することもできる。プリズム部１８及びサンプル基板８の素材は、Ｓ−ＢＡL１４だけでなくＢａｋ４、石英など任意のガラスでもよく、樹脂でも可能であり、つまりは励起波長に対して吸収および自家蛍光の少ないものが望ましい。【００２１】
プリズム部の形状は、本実施例で用いた三角柱のほか（図５(Ａ)-１）、底面が長方形（図５(Ａ)-２）や台形（図５(Ａ)-３）の四角柱でもよい。また、サンプル基板８に対するプリズム部の並べ方は、本実施例のように、Ｙ軸方向に長いプリズムを一次元に並べる他に（図５(Ｂ)-１）、より小さなプリズムを二次元に並べても良い（図５(Ｂ)-２）。また、サンプル領域２１が少ない場合は、究極的には図５(Ｂ)-３のようにプリズム部を１つにすることができる。この場合、βの角度は（数５）を満たす必要はない。ただし、サンプル領域２１が多く、サンプル基板８のスキャン距離が大きくなると、スキャン距離の増大と共に図４で示した照射位置ズレが顕著になるため、入射角の調整には厳密さが要求される。【００２２】
次に図１に示したプリズム部１８以外の部材に関して説明する。【００２３】
サンプル基板８内は図６に示すように流路６１を形成している。これは、１８ｍｍ×８０ｍｍ×１ｍｍの石英ガラスに、流路６１が彫られた同じ大きさのＰＤＭＳ基板を貼り合わせることで実施した。前記ＰＤＭＳの両端に結合した流入路１９ａと流出路１９ｂを通して、サンプル基板８内の観察領域に目的の溶液を流し、溶液交換を行える仕組みとした。溶液交換の際は、送液ユニット６２を自動制御により溶液保管ユニット６３に収められた目的の溶液リザーバ（サンプルリザーバ６４ａ、バッファーリザーバ６４ｂ、反応液リザーバ６４ｃ）と接続して実施する。廃液は、流出路１９ａを通して廃液タンク６５に貯蔵される。溶液保管ユニット６３には温調機能が備わっており、長時間の測定でもリザーバ内の溶液を変質させることなく保存することができる。【００２４】
図７は本実施例におけるサンプル領域２１周辺の拡大図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は破線Ｃに関する断面図である。予め、送液ユニット６２とサンプルリザーバ６４ａを接続し、配列を決定したい一本鎖のターゲットＤＮＡとプライマがハイブリダイズした二本鎖複合体７２を含む溶液を流路６１に展開し、金を素材とする金属構造物７３表面に固定した。金属構造物表面にはストレプトアビジンが固定されているため、プライマ５’末端のビオチンとの特異的相互作用により固定することができる。ビオチンの他、チオールを用いることで、金表面に特異的に結合させることも可能である。金属構造物７３は５０ｎｍ以下の大きさに制御されており、この程度であれば、二本鎖複合体７２同士の静電反発や立体障害が十分作用し、実質的に金属構造物７３一個に対し、二本鎖複合体７２が一分子だけ結合する構成となる。金属構造物７３は半導体プロセスを利用して１μｍピッチの格子状に配置した。本実施例では製造プロセスとしてＥＢ描画を用いたが、ドライエッチング、ウェットエッチングを用いても良い。また、金属構造物７３は金、銅、アルミ、クロム等で、励起光の波長以下の大きさを有する形状であり、直方体、円錐、円柱、一部が突起状のものを有する構造を使用する。【００２５】
本実施例では、図１の構成を用いて、図８に示すような反応過程でターゲットＤＮＡの塩基配列をリアルタイムに決定した。３５５ｎｍの光源１ａを照射して、伸長反応防止用に二本鎖複合体７２のプライマ３’末端に結合した保護基８１を外した（脱保護化）（図８Ａ）。光源１ｂと１ｃの照射下で、蛍光修飾された塩基７１ｔ、７１ａ、７１ｃ、７１ｇと、伸長反応を起こすための酵素が含まれている反応液を展開して伸長反応を開始させる（図８Ｂ）。ここで７１ｔは赤外で発光する蛍光体で修飾されたチミン、７１ａは緑で発光する蛍光体で修飾されたアデニン、７１ｃは赤色で発光する蛍光体で修飾されたシトシン、７１ｇはオレンジ色で発光する蛍光体で修飾されたグアニンである。光源１ｂと１ｃとしてＡｒ−ｉｏｎレーザとレーザーダイオードでサンプル基板８に全反射照明をすることで、ＤＮＡ一本鎖に塩基が取り込まれて相補鎖が伸長する度に、伸長した塩基に対応した発光が基板上のエバネッセント場で励起され放射される（図８Ｃ）。ここで、蛍光修飾された塩基７１ａと７１ｇの蛍光体を光源１ｂで、 ７１ｔと７１ｃの蛍光体を光源１ｃでそれぞれ励起する。色素が消光または切り離されることで発光がなくなり（図８Ｄ）、次の塩基が取り込まれる。同様の過程を繰り返すことで伸長が進み（図８Ｅ）、その際に発光するスポットの色の違いによりイメージセンサ１５に入射するスペクトル形状が異なる。これを利用して、塩基配列を決定する。前記過程における脱保護化の目的は、観察視野以外で伸長反応が開始しないように制御するためである。本実施例では、保護基８１としてアリル基を用いたが、他の官能基を用いても構わない。【００２６】
図９は塩基種判定の詳細なアルゴリズムを示したフローチャートである。Ｔｈ１及びＴｈ２はそれぞれ、予め設定された、構造物の発光を判定する閾値、及び生体分子の発光を判定する閾値である。【００２７】
第一ステップ(１)として、送液ユニット６２をバッファーリザーバ６４ｂに接続し、流入路１９ａからサンプル基８板内の流路６１に蛍光修飾塩基及び酵素を含まない溶液（バッファー）が注入される。この状態では金の金属構造物のみの発光が観測される。第二のステップ(２)として、光源１ａの光を観察視野内に照射し、脱保護化を行う。第三のステップ(３)として、光源１ａまたは１ｂまたは１ｃ照射下で、この金属構造物のみの発光像を２０フレーム取得し、時間軸で平均化する。金の発光は退色しないので、このように多数のフレーム（すなわち長時間測定で得られたフレーム）を平均化することにより、発光が弱い場合においても良好なＳ／Ｎを得ることができる。第四のステップ(４)として、横方向にＮピクセル(Ｎ＞２)以上連続して輝度値がＴｈ１以上である領域を金の発光スポットとして平均化した画像から抽出する。本実施例では金の発光波長（５５０〜７００ｎｍ）が６ピクセルに分散されるようプリズムの頂角が設定されているので、Ｎ>５とした。ここで抽出された領域の個数をｎとし、ｉ番目の領域をＡｉ、輝度配列をＢｉとあらわす。ここで第五のステップ(５)として、この後の測定ループ(７)−(９)で用いられる変数を初期化する。第六のステップ(６)として、送液ユニット６２の接続を反応液リザーバ６４ｃに切り替え、蛍光修飾塩基、酵素を含む反応溶液（反応バッファ）を注入する。ここから、金微粒子に固定されたＤＮＡへの塩基の結合反応及び修飾蛍光体の発光が開始するとともに、測定終了まで(７)、(８)、(９)のループを繰り返す。【００２８】
(５)で初期化された変数は以下のように用いられる。フレーム番号変数ｊは測定ループ開始以降に連続的に取得された画像の累積フレーム数、ｉ番目のスポットＡｉに塩基が結合して蛍光体の発光が開始したフレーム番号を記憶する変数がｋｉ、 同スポットに結合した塩基から蛍光体が除去されて蛍光体の発光が終了したフレーム番号を記憶する変数がlｉ、スポットＡｉへの蛍光体の結合・除去が繰り返された回数を記憶する変数がｍｉ=１〜Ｎである。ｍｉはすなわちスポットＡｉに対して読み取られた塩基数である。また、各スポットに対して読み取られた塩基配列を記憶するためのＮ個の配列Ｘｉを確保する。【００２９】
ステップ(７)で新しいフレームｊが取得されるたび、ｎ個の領域に対して以下ステップ(８)が行われる。以下では、ｉ番目の領域に関する処理として説明する。まず領域Ａｉの新しいフレームにおける輝度配列Ｓｉと既に記録済みの金だけの発光に対する輝度配列Ｂｉとの差が所定の閾値Ｔｈ２を越えたらｉ番目スポットに蛍光体、すなわち何らかの塩基が結合していると判断し、ｋｉ＜０ならば前のフレームの段階では結合していなかったので、新たな結合が起こったとして結合開始フレーム番号ｋｉ＝ｊ、ｋｉ≧０ならばｊ−１以前のフレームで既に結合した蛍光体が光続けているだけなのでｋｉは変更せずｉ＝ｉ＋１として次のスポットに対する処理に進む。ＳｉとＢｉとの差がＴｈ２以下である場合、蛍光体は結合していないと判断し、ｋｉ＜０ならば前フレームからすでに蛍光体は結合していなかったので、ｉ＝ｉ＋１として次の領域に対する処理に進む。ｋｉ≧０ならば結合していた蛍光体が除去されたと判断し、ｋｉからｊの間に取得されたフレームに対するＳｉ平均値とＢｉとの差（これが蛍光体の発光スペクトルとなる）を計算し、この配列の重心となるｉｎｄｅｘを求め、Ｂｉの重心ｉｎｄｅｘとの差ｄを求める。このｄが蛍光体発光スペクトルの中心波長を表す。本実施例で用いた蛍光体特性に基づき、−３≦ｄ＜−１ならアデニンを修飾した蛍光体、−１≦ｄ＜１ならばグアニンを修飾した蛍光体、１≦ｄ<２.５ならばシトシンを修飾した蛍光体、２．５≦ｄ＜４ならばチミンを修飾した蛍光体と判定する。ステップ(９)として、ｋｉ＝−１、ｍｉ＝ｍｉ＋１とし、Ｘ[ｍｉ]に対応した塩基を記憶させる。【００３０】
以上のステップをフレームごとにすべてのスポットに対して行い、すべてのスポットに対してｍｉ≧３０となるまで繰り返す。このことにより、すべてのスポットに対して３０塩基以上の配列が読み取られる。ステップ(１０)として、サンプル駆動部１０２を用いてサンプル基板８を動かし、対物レンズ９の視野を隣のサンプル領域に移動する。その後、上記(１)〜(１０)のステップを繰り返し、全サンプル領域をスキャンする。【００３１】
本実施例ではメッセンジャーＲＮＡの発現解析をターゲットアプリケーションとしており、３０塩基解読できれば十分であるためｍｉ≧３０を測定終了条件とした。より長い解読塩基長が必要なアプリケーション、例えばドラフト配列未定のゲノムの解読等の場合には測定終了条件をより大きい数値、例えばｍｉ≧１００あるいはｍｉ≧４００などとすれば良い。このように、本実施例の構成により、操作性の悪いマッチング液を不要とすることに加え、サンプル基板内での多重反射を防ぐことで多視野の測定が可能となり、結果としてサンプル処理能力を向上させることができる。
【実施例２】
【００３２】
実施例２の特徴は、Ｘ軸方向のサンプル領域間隔とプリズム部間隔を等しくすることである。【００３３】
実施例１では、同一のプリズム部入射面に対して、サンプル基板をスキャンさせて複数のサンプル領域を照射し、観察した。この場合、励起光をプリズム部入射面に対して垂直に入射させる必要がある。この制限から外れた場合、図４に示すように、スキャンと共に照射領域が観察視野から外れてしまうため、光路補正等の対策が必要となる。Ｘ軸方向で同一のプリズムを共有するサンプル領域数が増えるほど、上記問題は顕著になる。【００３４】
そこで、本実施例では、図１０に示すように、Ｘ軸方向にプリズム部１８の間隔とサンプル領域２１の間隔が同じになるように並べた。そのほかの構成に関しては、図１と同じである。前記構成における利点は、サンプル基板を駆動させて、測定視野を次のサンプル領域に移動させたとしても、プリズム部１８に対する励起光の入射位置が変化しないため、常に観察視野内に配置されたサンプル領域２１を照射することができるところにある。【００３５】
プリズム部の形状に関して、斜面の角度は全反射条件（数１）〜（数３）および出射条件（数４）を満たす必要があり、さらに、サンプル領域２１を密に配置するため、（数５）を満たすことが望ましい。本実施例では、石英のサンプル基板８をエッチングにより図１０のような形状θｐ＝６６.８°に加工しており、α＝６０°、β＝２５°とした。このとき、励起光をサンプル基板８に対してθｉ＝７０°で入射すると、石英製のプリズム部１８の屈折率は１.４６ゆえ、となり、（数１）の右辺は６５.６°なので、これを満たす。また、（数４）の右辺は２３.６°なので、この条件も満たす。【００３６】
プリズムの幅を図１０に示すｌｐで定義すると、
（プリズム幅ｌｐ）≒（サンプル領域間隔）≒(励起光照射領域)≧(観察視野)
を満たすようにすることで、サンプル領域を無駄なく配置することができる。本実施例では、対物レンズ９の倍率として６０倍、結像レンズ１３の点距離８５ｍｍ、イメージセンサ１４として、画素サイズが６.４５μｍ角、１３４４×１０２４画素のCCDカメラを用いているため、観察視野は２３３μm×３０６μｍとなる。そこで、集光レンズ７の焦点距離と位置を調整し、サンプル基板上での励起光照射領域を３００μｍ×８４０μｍ（Ｙ軸×Ｘ軸）とし、プリズム幅ｌｐ＝１０００μｍ、サンプル領域間隔を１０００μｍとなるように、プリズム部１８およびサンプル領域２１を作成した。プリズムのY軸方向の長さを１０ｍｍとして、プリズム部１つに対して複数のサンプル領域がカバーできるようにしたが、３００μｍにして、１サンプル領域視野のみをカバーするような形状でもかまわない。サンプル領域２１は２３０μｍ×３００μｍ(Ｙ軸×Ｘ軸)内に１μｍ間隔で金属構造物７３を配置して作成した。
本実施例の構成によると、スキャンによる照射領域のずれを防ぎ、プリズム部を小さくすることによる材料費低減の効果がある。
【実施例３】
【００３７】
プリズムの屈折率は波長によって異なる。実施例２のように、垂直から外れた角度で複数波長の励起光をプリズム部１８に入射させた場合、図１のような２つの光源１ｂと１ｃを同一光路にする入射方法では、プリズム内で同一光路からのズレが生じてしまう。これにより、最終的にはサンプル基板８上で数百μｍ程度照射位置がずれる可能性がある。照射領域位置の微調整は、集光レンズ７の位置やあおりを微調整することで良好に行えるが、前記においては、複数の波長光路が同時に動くため役に立たない。そこで、ダイクロイックミラー５ｂまたは５ｃの角度を調整することが考えられるが、サンプル基板までの光路長が長いと、数百μｍ程度の微調整は困難である。【００３８】
前記課題を解決する手段として、本実施例では、図１１に示すようにミラー６a〜６c、１２０ａ〜１２０ｃ、集光レンズ７ａ〜７ｃを用いて、光源からサンプル基板までの光路を違える構成とした。プリズム部１８の特徴は、入射面または射出面が、それぞれ射出面または入射面を兼ねることにある。前記により、照射領域の位置やサイズの微調整を集光レンズ７ａ〜７ｃの位置やあおりの微動機構を利用して行うことで操作性が向上する。本実施例の形態は、実施例１〜２に組み込んでも良い。ただし、実施例１においては、プリズム部の底面をα＝βの二等辺三角形とすることが望ましい。
【実施例４】
【００３９】
本実施例では、実施例２同様、スキャンによる照射位置ずれ防止およびプリズム部１８の材料費低減に効果のある構成を示す。図１２は、サンプル基板周辺の拡大図である。サンプル基板８上に励起波長に対応した格子周期の異なる回折格子部１３０ａと１３０ｂを設けたことに特徴がある。そのほかの構成は、図１または図１１と同様である。
回折格子部の格子周期dは、θpを回折角として
θp ＝ｓｉｎ-１（ｎλ／ｄ）            （数６）
かつ、ｎｐを回折格子部の屈折率とした（数１）を満たすように作成した。ここで、ｎは０次以外の回折次数（０以外の整数）、λは励起光の波長である。励起にはどの回折次数を用いても良いが、一般的に一次の回折効率が良いことからｎ＝＋１として回折格子部を設計した。とくに本実施例では、ブレーズド回折格子を用いて、θpがブレーズド角となるようにしたが、ホログラフィック回折格子やラミナー回折格子などを用いてもかまわない。入射した励起光は、サンプル溶液２３とサンプル基板８の界面で全反射し、その後、回折格子部１３０ａまたは１３０ｂより出射することができる。【００４０】
また、図１３に示すように、励起光のビーム径に対して、サンプル基板８の厚みLが小さいと０次回折光が観察視野に入り、背景光が高くなる問題が生じる。そこで、サンプル基板の厚みは以下の（数７）を満たすように設計する必要がある。【００４１】
Ｌ×ｔａｎθp＞ Ｄb /２＋ｂ／２          （数７）
ここで、Ｄbは励起光のビーム径、ｂは回折方向（本実施例ではｘ軸方向）の視野サイズである。【００４２】
本実施例では、蛍光計測に用いる光源１ｂと１ｃの波長で１次の回折角が大きく異なるため、それぞれに最適化された回折格子部を設け、反対方向から入射させたが、２つの光源の波長が近かったり、単一の光源を用いたりして、単一の回折格子の使用が可能であればより製造コストを抑えることができる。単一の回折格子の場合、サンプル基板８上全面に回折格子部を設けても良い。回折格子部の作成は、石英のサンプル基板８を切削加工して実施したが、サンプル基板８上に接着層を介して市販の回折格子を貼り付けたり、石英以外の樹脂などの素材をマスター格子から転写させたりして作成してもよい。本実施例固有の効果は、回折格子部１３０ａ、１３０ｂの大きさを数μｍ以下に抑えることができるため、プリズムを用いる場合にくらべて材料は低減できることに加え、励起光をサンプル基板に対して垂直に入射することができるため、光軸調整を簡便化できることにある。
【実施例５】
【００４３】
図１４に示すように、本実施例では、励起光の入射面にプリズム部１８ａを、出射面に回折格子部１３０ｃを用いることを特徴とする。そのほかの構成は、図１と同じである。実施例４のように入射面に回折格子部を設けた場合、回折角が異なるため、複数波長の励起光を同一回折格子部に入射させることは難しい。実施例４では、図１２のように、２種類の励起光に対応した回折格子を設けることでこれを解決した。しかし、蛍光観察に用いる蛍光体の組み合わせによっては、３種類以上の励起光が必要となり、それぞれに対応した回折格子を組み込んだ構成は困難である。そこで、入射面にプリズム部１８ａを用いることで、上記課題を解決することができる。一方、出射面に回折格子部１３０ｃを用いることで、実施例２に比べて、材料費を低減することができる。なお、図１５に示すようなプリズム部１８ａの出射面に回折格子部１３０ｃを設けた構成を用いても良い。本実施例は、実施例１のように、Ｘ軸方向に関して、複数のサンプル領域２１が同一のプリズム部を共有する場合や、実施例２のようにプリズム部とサンプル領域の間隔を実質的に等しくする場合に用いても構わない。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
伸長反応を利用したＤＮＡシーケンサ、全反射蛍光方式のＤＮＡマイクロアレイリーダーなどに利用できる。
【符号の説明】
【００４５】
１ａ、１ｂ、１ｃ：励起光源
２a、２b、２c：シャッター
３ａ、３ｂ、３ｃ：励起フィルター
４ａ、４ｂ、４ｃ：λ/４板
５ａ、５ｂ：ダイクロイックミラー、５ｃ：ミラー
６、６ａ、６ｂ、６ｃ、 １２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ：ミラー
７、７ａ、７ｂ、７ｃ、：集光レンズ
８：サンプル基板
９：対物レンズ
１０：対物レンズ駆動部
１１ａ、１１ｂ：発光フィルター
１２：分散プリズム
１４：イメージセンサ
１５：制御部
１７：サンプルステージ
１８、１８ａ：プリズム部
１９ａ：流入路、１９ｂ：流出路
２１：サンプル領域
２２：接着層
２３：サンプル溶液
３１：プリズム部入射面
３２：プリズム部出射面
４１：照射領域
６１：流路        
６２：送液ユニット
６３：溶液保管ユニット
６４ａ：サンプルリザーバ、６４ｂ：バッファーリザーバ、６４ｃ：反応液リザーバ
６５：廃液タンク
７１ｔ、７１ａ、７１ｃ、７１ｇ：蛍光修飾された塩基
７２：二本鎖複合体
７３：金属構造物
８１：保護基
１０１：サンプル支持部材
１０２：サンプル駆動部
１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ：回折格子部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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