(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７〜８のいずれか１つの標的結合配列からなる配列、５’ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および５’非標的特異的５’テール末端配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号７または８の配列からなることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）標的配列を検出する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズする工程、および（ｂ）ＨＳＶ−１標的配列を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
（ａ）配列番号８又は７のいずれか１つの標的結合配列からなるＨＳＶ−１標的結合部位を有する配列、５’ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および５’非標的特異的５’テール末端配列を含む第一の増幅プライマーを用いて、ＨＳＶ−１標的配列を増幅する工程、
（ｂ）配列番号１８を含むか、または配列番号９〜１７のいずれか１つの標的結合配列からなるＨＳＶ−１標的結合部位を有する配列を含む第二の増幅プライマー配列を用いて、ＨＳＶ−１標的配列を増幅する工程、および
（ｃ）増幅されたＨＳＶ−１標的配列を検出する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のプライマーが配列番号７または配列番号８の配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法であって、
（ｉ）  増幅反応が鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応であるか、または
（ｉｉ）検出方法が、直接検出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、転写介在増幅手法（ＴＭＡ）、自己持続性配列複製法（Self-Sustaining Sequence Replication）（３ＳＲ）、ローリングサークル増幅法（Rolling Circle Amplification）（ＲＣＡ）、Ｑβレプリカーゼシステム、および核酸配列をベースとする増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ）からなる群から選択されるか、または
（ｉｉｉ）第一の増幅プライマーが、ヘアピン、ｇ−カルテット、およびアッセイプローブに結合する配列から選択される配列をさらに含むか、または
（ｉｖ）第一の増幅プライマーが、蛍光部分である検出可能な標識をさらに含むか、または
（ｖ）第一の増幅プライマーが、制限酵素認識部位およびＲＮＡポリメラーゼプロモータから選択される配列を含むか、または
（ｖｉ）前記方法が、内部増幅対照（ＩＡＣ）を増幅する工程をさらに含む
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
（ｉ）ＩＡＣが配列番号２６〜２７から選択されるか、または
（ｉｉ）前記方法が、増幅されたＩＡＣを検出する工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｉｉ）の増幅されたＩＡＣを検出する工程において、増幅されたＩＡＣが増幅された標的配列とは異なる手段で検出されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載の方法であって、
（ａ）配列番号１８を含むか、または配列番号９〜１７のいずれか１つの標的結合配列からなるＨＳＶ−１標的結合部位を有する配列を含む１以上のポリヌクレオチドをハイブリダイズする工程、および
（ｂ）ＨＳＶ−１標的配列を検出する工程であって、前記１以上のポリヌクレオチドが、蛍光部分である検出可能な標識をさらに含む工程
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項４または５において規定された１以上の第一のプライマーを含むことを特徴とする配列を検出するためのキット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットであって、
（Ｉ）（ｉ）配列番号９〜１８から選択される増幅プライマー、または
（ｉｉ）配列番号２３〜２５から選択されるバンパープライマー、または
（ｉｉｉ）配列番号１９〜２２から選択されるアダプタプライマー、および
（ｉｖ）配列番号３０〜３５から選択される検出プライマー
をさらに含むか、或いは
（ＩＩ）前記キットはＨＳＶ−１標的配列を検出するためのものであり、配列番号７〜８からの１つ、および配列番号９〜１８からの少なくとも１つから選択される増幅プライマーの１つ以上；および配列番号２３〜２５から選択されるバンパープライマーを含む
ことを特徴とするキット。
【請求項１２】
請求項１１に記載のキットであって、前記キットは、
（ｉ）配列番号１９〜２２から選択される１以上のアダプタプライマー；および
（ｉｉ）配列番号３０〜３５からなる群から選択される１以上の検出プライマー；および／または
（ｉｉｉ）配列番号２６〜２７から選択される１以上のＩＡＣ標的配列；および
（ｉｖ）配列番号２８〜２９からなる群から選択される１以上のＩＡＣアダプタプライマーをさらに含む
ことを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項４または５において定義された１以上の第一のプライマーを含むことを特徴とするＨＳＶ−１を検出するための組成物。
【請求項１４】
（Ｉ）配列番号９〜１８および配列番号２３〜２５のいずれか１つの標的結合配列からなる１以上のプライマーをさらに含むこと、および／または
（ＩＩ）（ａ）アダプタプライマーの３’末端に位置する標的結合配列を介して標的配列にハイブリダイズすることができるアダプタプライマー配列であって、このアダプタプライマーが５’ジェネリックテールを含み、かつこのアダプタプライマーが配列番号１９〜２２からなる群から選択されるもの；および
（ｂ）検出プライマーの３’部分を介してアダプタプライマーの５’テールにハイブリダイズすることができる検出プライマー配列であって、この検出プライマー配列が５’制限酵素認識部位、ならびに、蛍光部分、放射性同位体、化学発光剤、目で見える反応生成物を生じることができる酵素基質、およびリガンドで検出可能に標識されたリガンド結合パートナーからなる群から選択される検出可能な標識を含むもの
をさらに含み、
（ｉ）前記検出プライマー配列がヘアピンおよびカルテットからなる群から選択される構造部分を含むか、または
（ｉｉ）前記検出可能な標識が蛍光部分であり、この蛍光部分が、フルオロセイン（ＦＡＭ）／ローダミン（ＲＯＸ）；ＦＡＭ／Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；ＲＯＸ／ＤＡＢＣＹＬ；フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；ＦＩＴＣ／テキサスレッド（商標）；ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）；ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ペンタンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ；ＦＩＴＣ／ローダミン  Ｘ；およびＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）からなる群から選択されるドナーおよびクエンチャー色素対を含むか、または
（ｉｉｉ）前記検出プライマーが配列番号３０〜３５からなる群から選択されるものであること；および／または
（ＩＩＩ）増幅反応によってサンプル中のＨＳＶ−１標的配列の検出のためのプライマーを含み、このプライマーは、
（ａ）ＨＳＶ−１標的配列にハイブリダイズできる第一の増幅プライマー配列であって、第一の増幅プライマーが配列番号７〜８からなる群から選択されるもの、
（ｂ）ＨＳＶ−１標的配列の相補体にハイブリダイズできる第二の増幅プライマー配列であって、第二の増幅プライマーが配列番号９〜１８からなる群から選択されるもの、
（ｃ）第一の増幅プライマーの上流でＨＳＶ−１標的配列にハイブリダイズできる第一のバンパープライマー配列であって、第一のバンパープライマーが配列番号２３であるもの、および
（ｄ）第二の増幅プライマーの上流でＨＳＶ−１標的配列の相補体にハイブリダイズできる第二のバンパープライマー配列であって、第二のバンパープライマーが配列番号２４〜２５からなる群から選択されるもの
を含むこと
を特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
サンプル中のＨＳＶ−１標的配列の存在を検出するための請求項３に記載の方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号７〜８からなる群から選択される第一の増幅プライマー、および配列番号９〜１８からなる群から選択される第二の増幅プライマーにサンプルを添加し、増幅されたＨＳＶ−１核酸生成物を産生する工程、および
（ｂ）増幅されたＨＳＶ−１核酸生成物を検出する工程であって、増幅生成物の検出がサンプル中のＨＳＶ−１の存在を示す工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
（ｉ）前記増幅されたＨＳＶ−１核酸生成物が、ユニバーサル検出、ゲル電気泳動、および定量的ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出されること、または
この方法が、
（ｃ）配列番号２３の第一のバンパープライマーおよび配列番号２４または配列番号２５の第二のバンパープライマーをサンプルに添加する工程をさらに含むこと
を特徴とする方法。
【請求項１７】
検出工程が、
（ｄ）第一の増幅プライマーおよび配列番号１９〜２２からなる群から選択されるアダプタプライマーを増幅されたＨＳＶ−１標的配列にハイブリダイズする工程であって、アダプタプライマーが第一の増幅プライマーの下流でハイブリダイズする工程、
（ｅ）第一の増幅プライマーおよびアダプタプライマーの３’末端を伸長し、アダプタプライマー伸長生成物を産生する工程であって、第一の増幅プライマーの伸長がアダプタプライマー伸長生成物を置換する工程、
（ｆ）第二の増幅プライマーをアダプタプライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
（ｇ）第二の増幅プライマーの３’末端を伸長し、アダプタプライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖分子を産生する工程であって、各鎖がニック可能な制限酵素部位を含む工程、
（ｈ）二本鎖分子をニッキングし、５’部分および３’部分を造り出す工程であって、５’部分がニッキングされたテールを含み、３’部分がニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物を含む工程、
（ｉ）ニッキングされたテールの３’末端を伸長し、ニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物を置換する工程であって、置換され、ニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物が一本鎖である工程、
（ｊ）一本鎖相補性アダプタプライマー伸長生成物へ検出プライマーをハイブリダイズする工程であって、検出プライマーが検出可能な標識を含み、ＨＳＶ−１標的配列を検出する工程、
（ｋ）検出プライマーおよび相補性アダプタプライマー伸長生成物の３’末端を伸長し、検出プライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖検出分子を産生する工程であって、各鎖が開裂可能な制限酵素認識部位を含む工程、
（ｌ）二本鎖検出分子を開裂する工程、および
（ｍ）検出可能な標識を検出する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｎ）配列番号２６〜２７からなる群から選択される内部増幅対照（ＩＡＣ）標的配列を増幅する工程、
（ｏ）第一の増幅プライマーおよび配列番号２８〜２９からなる群から選択されるＩＡＣアダプタプライマーをＩＡＣにハイブリダイズする工程であって、アダプタプライマーが第一の増幅プライマーの下流でハイブリダイズする工程、
（ｐ）第一の増幅プライマーおよびＩＡＣアダプタプライマーの３’末端を伸長し、ＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物を産生する工程であって、第一の増幅プライマーの伸長がＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物を置換する工程、
（ｑ）ＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物へ第二の増幅プライマーをハイブリダイズする工程、
（ｒ）第二の増幅プライマーの３'末端を伸長し、ＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖分子を産生する工程であって、各鎖がニック可能な制限酵素部位を含む工程、
（ｓ）二本鎖分子をニッキングする工程、
（ｔ）相補性ＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物のニッキングされたテール末端を伸長し、一本鎖でニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物を置換する工程、
（ｕ）一本鎖相補性ＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物にＩＡＣ検出プライマーをハイブリダイズする工程であって、ＩＡＣ検出プライマーが検出可能な標識を含み、ＩＡＣを検出する工程、
（ｖ）ＩＡＣ検出プライマーおよび一本鎖相補性ＩＡＣアダプタプライマー伸長生成物の３’末端を伸長し、検出プライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖検出分子を産生する工程であって、各鎖が開裂可能な制限酵素認識部位を含む工程、
（ｗ）二本鎖検出分子を開裂する工程、および
（ｘ）検出可能な標識を検出する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＳＶ−１標的配列をサンプル中で検出するための請求項３に記載の方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号７〜８からなる群から選択される配列を有する第一の増幅プライマーをＨＳＶ−１標的配列へハイブリダイズする工程、
（ｂ）配列番号２３の第一のバンパープライマーをＨＳＶ−１標的配列へハイブリダイズする工程であって、第一のバンパープライマーが第一の増幅プライマーの上流でＨＳＶ−１標的配列にハイブリダイズし、第二のバンパープライマーが第二の増幅プライマーの上流で相補性ＨＳＶ−１標的配列にハイブリダイズする工程、
（ｃ）第一のバンパープライマーおよび第一の増幅プライマーの３’末端を伸長し、第一の増幅プライマー伸長生成物を産生する工程であって、第一のバンパープライマーの伸長が第一の増幅プライマー伸長生成物を置換する工程、
（ｄ）配列番号９〜１８からなる群から選択される配列を有する第二の増幅プライマーを第一の増幅プライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
（ｅ）配列番号２４〜２５からなる群から選択される配列を有する第二のバンパープライマーを第一の増幅プライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
（ｆ）第二のバンパープライマーおよび第二の増幅プライマーの３’末端を伸長し、第二の増幅プライマー伸長生成物を産生する工程であって、第二のバンパープライマーの伸長が第二の増幅プライマー伸長生成物を置換する工程、
（ｇ）第一の増幅プライマーを第二の増幅プライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
（ｈ）工程（ｇ）の第一の増幅プライマーの３’末端を伸長し、第二の増幅プライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖分子を産生する工程であって、各鎖がニック可能な制限酵素部位を含む工程、
（ｉ）二本鎖分子をニッキングし、５’部分と３’部分を造り出す工程であって、５’部分はニッキングされたテールを含み、３’部分はニッキングされた第二の増幅プライマー伸長生成物およびその相補体を含む工程、
（ｊ）ニッキングされたテールの３’末端を伸長し、ニッキングされた第二増幅プライマー伸長生成物を置換する工程であって、ニッキングされた相補性第二増幅プライマー伸長生成物が一本鎖である工程、
（ｋ）ニッキングされたテールの３’末端を伸長し、ニッキングされた相補性第二増幅プライマー伸長生成物を置換する工程であって、ニッキングされた相補性第二増幅プライマー伸長生成物が一本鎖である工程、
（ｌ）第一の増幅プライマーおよび第二の増幅プライマーを、各一本鎖分子に別々にハイブリダイズし、工程（ｈ）〜（ｋ）を繰り返し、これによってＨＳＶ−１標的配列を増幅することによって２種類の一本鎖分子を指数関数的に増幅する工程、
（ｍ）増幅されたＨＳＶ−１標的配列を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅法により単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を同定するための診断方法と核酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、特願２００６−５１３３１５の分割出願である。
【０００３】
単純ヘルペスは、ヒトにおける初感染および回帰感染の原因であり、伝染性単球増加症（エプスタイン−バーウイルス）、水痘および帯状疱疹（水痘帯状疱疹ウイルス）を起こすウイルスに関連する、エンベロープで包まれた二本鎖ＤＮＡウイルスである。単純ヘルペスウイルス感染の症状には、皮膚または粘膜上の小さな疱疹の出現が含まれる。疱疹の出現が収まった後、ウイルスは、感染した領域に神経繊維を供給する神経細胞群（神経節）の内側に休眠（潜伏）状態で生き残っている。周期的に、ウイルスは再活性化し、再度成長を開始し、神経繊維を通して皮膚に戻って行き、これによって先の感染と同じ皮膚領域に疱疹の出現を引き起こす。明確な疱疹がない場合であっても、ウイルスはしばしば、皮膚または粘膜に存在することがある。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は２種類のタイプ、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に分類される。ヒトＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の完全なゲノムは配列決定されている（例えば、NCBI Accession Nos. X14112 and Z86099（非特許文献１）参照）。
【０００４】
ＨＳＶは、失明および脳炎を含めた種々の疾患に寄与するかまたは疾患を引き起こすことが示されている。局所的な発生の他に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２は脳炎に関連する。この脳炎の病体生理学は、ヒトでは理解が不十分である。動物モデルでは、このウイルスは末梢神経を通して中枢神経系に入り脳の炎症を引き起こすことが示唆されている。ＨＳＶ−１は成人の脳炎の一般的な原因である。ＨＳＶ−２は、母親の性器感染に関連する新生児脳炎の一般的な原因である。ＨＳＶ−２は、社会における最も一般的な性感染症の１つである。ＨＳＶに関連する脳炎は、１００万人あたり１から４人の年間発症率を有し、全てのタイプの脳炎のうち死亡率が最も高い。ＨＳＶ脳炎は、全年齢の人を、一年のうちのいずれの時期においても冒す。成人では、ＨＳＶに関連する脳炎は潜伏したウイルスの再活性化によると考えられる。症状には、発熱、頭痛、痙攣（seizures）、意識レベルの変化および人格変化が含まれうる。他の病患に対するこれらの症状の類似点が臨床診断を困難にしている。治療しないままでいると、単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）の死亡率は、治療を受けたものの中での１９パーセント程度の低さと比べ、７０パーセント程度の高さになる。治療された患者の中では、約３８パーセントが、最終的に正常機能に戻ることが報告されている。従って、早期にＨＳＶ感染を診断できることが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＥＰ  ０  ４９７  ２７２
【特許文献２】米国特許第５，０１０，１８３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８６０，９３７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７２８，８２２号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９９０，３０１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２６１，７８５号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４５５，１６６号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２７０，１８４号明細書
【特許文献９】米国特許第５，５４７，８６１号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９２８，８６９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，５９３，８６７号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５５０，０２５号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，９３５，７９１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，８８８，７３９号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，８４６，７２６号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】NCBI Accession Nos. X14112 and Z86099
【非特許文献２】Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354
【非特許文献３】Wu et al., 1989, Genomics 4: 560-569
【非特許文献４】Barringer et al., 1990, Gene 89: 117-122
【非特許文献５】Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193
【非特許文献６】Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177
【非特許文献７】Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878
【非特許文献８】Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6: 1197-1202
【非特許文献９】Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396
【非特許文献１０】Walker et al., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1691-1696
【非特許文献１１】T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982
【非特許文献１２】J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989
【非特許文献１３】Current Protocols in Molecular Biology, Eds. F. M. Ausubel et al., Vol. 1, "Preparation and Analysis of DNA", John Wiley and Sons, Inc., 1994-1995, Suppls. 26, 29, 35 and 42; pp. 2.10.7-2.10.16
【非特許文献１４】G. M. Wahl and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152: 399-407)
【非特許文献１５】A. R. Kimmel, 1987; Methods of Enzymol. 152: 507-511
【非特許文献１６】Nadeau, et al., 1999 Anal. Biochem. 276:177-187
【非特許文献１７】J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＨＳＶ感染の診断は、一般に、適切な臨床サンプルについて細胞培養を用いて行われる。しかし、細胞培養物内のＨＳＶを単離する能力は、古い病巣、宿主の免疫応答の存在、および再活性化の症状の出現で低下する。血清学的診断法、特に髄液（ＣＳＦ）中のＨＳＶの診断法は、感度または特異性が十分ではなく、脳炎の初期治療介入の選択を含む決定に使用するには時間がかかりすぎる。ＨＳＶは細胞培養を用いた脳脊髄液中では滅多に検出されず、僅かに４パーセントの場合が培養物陽性であった。血清学的方法はまた、初期感染後、抗体応答が現れるのに２から３週間の間遅れることにより、ＨＳＥの診断には適さない。脳生検を含む診断である「ゴールドスタンダード」法は、侵襲的であり、長期の罹病率の重大なリスクが問題となる。コンピューター断層撮影法および磁気共鳴映像法は、診断ツールとしては特異的でなく、感度が不足している。
【０００８】
現時点では、ＨＳＶの検出のための免疫学的方法は、信頼できず且つ実施するのが困難である。分子法の検出は、感度を高め、結果に至る時間が従来の手段で可能であるよりも早まる可能性を提供する。迅速で、高感度で、且つ特異的なＨＳＶ疾患の診断が絶対必要であるという事実が存在する。従って、ＨＳＶの診断を助ける迅速且つ高感度なツールの開発の、臨床上の必要性が存在する。ＨＳＶ感染の型を決めるためのツールの必要性も残っている。ウイルス感染に関連する特異的な原因物質の迅速な同定は、短い時間内で適切な治療法を決定するのに用いることができる情報を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、哺乳動物内の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、特に単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）または単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）を検出する方法および組成物に関する。この方法は、プライマーを用いて単純ヘルペスウイルス標的配列を増幅し、検出することを含む。一実施形態は、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤＡ）の増幅技術を使用する。
【００１０】
本発明の核酸プライマーは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２中の標的配列を一義的に増幅し、これによってＨＳＶの高感度な検出および型の同定を可能にする。本発明はまた、ユニバーサル蛍光エネルギー移動プローブを用いるリアルタイムな検出を含むＨＳＶの検出のための鎖置換増幅（ＳＤＡ）をベースとする方法を指向する。本発明のプローブおよびプライマーは、直接、迅速、且つ高感度なＨＳＶ核酸の検出を提供し、従って、免疫学的アッセイに、魅力的な代替法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプローブおよびプライマーは、培養された微生物の正体を確認するための手段として、サンプルを培養した後に使用されうる。別法として、これらは公知の増幅方法を用いてＨＳＶ核酸の検出および同定をするために、培養に先立って、または培養に代えて用いることができる。本発明のプローブ、プライマーおよび組成物、並びにこのプローブ、プライマーおよび組成物を用いたアッセイ法は、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の核酸標的配列を迅速に識別する手段を提供し、一般に依拠されている時間のかかる免疫学的および生化学的手順に頼ることなく、医者がＨＳＶを同定し、診断し、治療することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）遺伝子のコンセンサス配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】ＨＳＶ−１標的領域（配列番号２）のゲノム配列の位置、および、ＨＳＶ−１ＤＮＡの特異的検出用に設計されたプライマー、バンパー、およびアダプタの配置を示すマップである。
【図３】「ＭＯＴＡ」発現の結果を示すグラフである。
【図４】ＢＤプローブテック（商標）ＥＴシステムを用いた「ＰＡＴ」アルゴリズムを示すグラフである。
【図５】種々のＨＳＶ−１系統の希釈物についてのＳＤＡ法の分析感度を表す図である。
【図６】単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）のフラグメントのコンセンサス配列（配列番号３）の図である。
【図７】ＨＳＶ−２標的領域（配列番号４）のゲノム配列、および、ＨＳＶ−２ＤＮＡの特異的検出用に設計されたプライマー、バンパー、およびアダプタの配置を示すマップである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の種々の目的、利点、および新規な特徴は、添付の図面と組み合わせた以下の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【００１４】
本発明は、核酸増幅反応における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の型の特異性を示す、単離され精製された核酸、ポリヌクレオチド、増幅プライマーおよびアッセイプローブを提供する。本発明のプローブおよびプライマーを用いてＨＳＶ核酸を検出および同定する方法も提供する。
【００１５】
本発明の一実施形態は、標的核酸配列の存在を検出する増幅方法であって、標的結合配列を有する１以上の増幅プライマーを用い、増幅された標的配列を産生し、この標的配列を検出する増幅方法に関する。増幅方法の非制限的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354（非特許文献２）参照。参照文献として本明細書に取り込む）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Wu et al., 1989, Genomics 4: 560-569; Barringer et al., 1990, Gene 89: 117-122; Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193（非特許文献３、４、５）参照。この全てを参照文献として本明細書に取り込む）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、転写介在増幅手法（ＴＭＡ、Kwoh etal., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 1173-1177（非特許文献６）参照。参照文献として本明細書に取り込む）、自己持続性配列複製法（Self-Sustaining Sequence Replication（３ＳＲ、Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878（非特許文献７）参照。参照文献として本明細書に取り込む）、ローリングサークル増幅法（Rolling Circle Amplification）（ＲＣＡ）、核酸配列をベースとする増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ）、Ｑβレプリカーゼシステム（Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6: 1197-1202（非特許文献８）。参照文献として本明細書に取り込む）、および、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）を含めた鎖置換増幅法（ＳＤＡ、Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396; Walker et al., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1691-1696（非特許文献９、１０）およびＥＰ  ０  ４９７  ２７２（特許文献１）この全てを参照文献として本明細書に取り込む）が含まれる。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、ＨＳＶ標的配列の指数関数的増幅によってサンプル中のＨＳＶ核酸配列の存在を検出する鎖置換増幅（ＳＤＡ）法に関する。さらなる実施形態では、ＳＤＡは、選択された検出（detector）プライマーを用いて、米国特許第５，６４８，２１１号明細書（特許文献２）に記載されるように約５２℃で実施され、米国特許第５，９１９，６３０号明細書；同５，９２８，８６９号明細書；同５，９５８，７００号明細書および同６，２６１，７８５号明細書（特許文献３〜６）に記載されるように増幅の間に標的を検出する（これらの文献は全て、参照により本明細書に取り込む）。ＳＤＡで一般的なように、制限酵素およびポリメラーゼのような試薬、プライマー、酵素、および他の成分を反応マイクロウェル、容器、または、レセプタクルに添加する。ＳＤＡはサンプルからＤＮＡ配列を増幅するが、この方法では、一度全ての成分を互いに混合し、重要な成分が使い尽くされるまで反応を継続する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは対照的に、ＳＤＡは等温反応プロセスであり、従って、一度反応が開始されると反応の進行中に外部から制御をしない。
【００１７】
本発明のＳＤＡ法は、増幅を開始するのに少なくとも２種類のＨＳＶ増幅プライマーおよび２種のバンパープライマーを必要とする。増幅プライマーはＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に高度に特異的であるように設計されている。ＳＤＡ法は、混合物中での同時増幅反応を含み、ＰＣＲ増幅法で必要な温度サイクルのための別々のフェーズとサイクルを必要としない。本発明のＳＤＡのさらなる利点は、指数関数的な増幅である。ＤＮＡポリメラーゼ伸張、ニッキング、置換およびニック部位の再生のステップが、どちらかの末端に部分的制限酵素部位（例えばＢｓｏＢＩ部位）を持つ、置き換えられた単鎖分子で起こり、この分子は続いて、培養され、増幅プライマーによって捕捉され、これによって、ＨＳＶ標的配列が指数関数的に増幅される。ＳＤＡ法はまた、特に高スループット法に対するワークフローを改善する。ＳＤＡは、マイクロアレイをベースとする適用例に組み込まれうる。この適用例では、小容積量（ナノリットル）のサンプルおよび試薬を使用して、単一のプラットホームで複数のＳＤＡアッセイを実施することにより、ＨＳＶ標的ＤＮＡを増幅し、マイクロチップアレイ上で増幅サンプルを検出する。等温増幅プロセスには、このプラットホームの設計および維持における技術的難題が極めて僅かしか存在しないので、サンプル中のＨＳＶを検出するためのＳＤＡ法の主たる利点は、労働力の必要性を最小限にすることと、高スループットの可能性である。
【００１８】
本明細書で使用する用語「標的」または「標的配列」とは、増幅および検出されるＨＳＶ核酸配列、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２をいう。これらには、増幅される本来のＨＳＶ核酸配列、増幅される本来のＨＳＶ核酸配列の相補性第二鎖、および増幅反応で産生される本来のＨＳＶ配列のコピーのどちらかの鎖が含まれる。これらのコピーは、増幅プライマーがアニールする配列のコピーを含有するので、増幅可能な標的として機能する。増幅反応中に生成される標的配列のコピーは、増幅産物、アンプリマーまたはアンプリコンと称される。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２標的配列は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のゲノム配列の遺伝子の糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）に局在化している。ＨＳＶ−１標的配列は、図１のコンセンサス配列の５５５から６８０塩基の間に位置する。ＨＳＶ−２標的配列は、図６のコンセンサス配列の８６７から９９０塩基の間に位置する。糖タンパク質Ｇ（ＵＳ２４）遺伝子は、図２および図７のＨＳＶ−１ゲノム配列の１３６７４４から１３７４６０の間におよびＨＳＶ−２のゲノム配列の１３７８７８から１３９９７７の間の位置にそれぞれ位置する。
【００１９】
本明細書で使用する「増幅プライマー」は、標的配列にアニールし、増幅によって伸張されうるプライマーである。標的配列に結合する増幅プライマーの領域は標的結合配列である。増幅技術には、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）を含めた鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、自己持続性配列複製法（Self-Sustaining Sequence Replication（３ＳＲ））、ローリングサークル増幅法（Rolling Circle Amplification）（ＲＣＡ）、核酸配列をベースとする増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ）、および転写介在増幅手法（ＴＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
一実施形態では、増幅プライマーは鎖置換増幅（ＳＤＡ）法に使用される。増幅プライマーは、３’末端にＨＳＶ標的配列に結合する標的結合配列部分を含み、５'末端に標的配列に結合またはアニールしない部分を含む。標的配列に結合しないＳＤＡ増幅プライマーの部分はまた、米国特許第５，４５５，１６６号明細書（特許文献７）および米国特許第５，２７０，１８４号明細書（特許文献８）（これらは参照文献として本明細書に取り込む）に記載されているような、標的結合配列の上流の、テール、および制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含む。この認識部位は、Ｗａｌｋｅｒら（非特許文献９および１０）に記載されているように、この認識部位が半修飾（hemimodified）されている場合に、ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼに特異的である。テールは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列の上流にあり、増幅プライマーの残りの部分がＳＤＡ中にニックを入れられ、置換されるときに、ポリメラーゼ再プライミング部位として機能する。テールの再プライミング機能は、ＳＤＡ反応を維持し、単一の標的分子から多数のアンプリコンの合成を可能にする。テールの長さおよび配列は一般に重要ではなく、型通りに選択でき、且つ修飾することができる。
【００２１】
本発明の一実施形態は、増幅プライマーに標的特異性を付与する標的結合配列に基づく。ここで、本発明で例示される標的結合配列は、ＨＳＶの検出のための他の種々の方法に使用できることも理解されるべきである。例えば、他の選択肢として、本明細書に開示されている標的結合配列は、事前の増幅を用いずに、または増幅後のアッセイにおいてＨＳＶの直接の検出のためにハイブリダイゼーションプローブとして使用されうる。このようなハイブリダイゼーション法は当分野で周知であり、典型的には、ハイブリダイゼーションの検出を促進するために標的結合配列と会合された、またはこれに連結された検出可能な標識を使用する。さらに、表１および表２にプライマー配列（それぞれ配列番号：５〜２５および３６〜４７）を列挙したが、これには大文字を使用しておよびアンダーラインを引いて示した標的結合配列が含まれている。これらの標的結合配列は、追加の特化された配列を必要としない増幅反応（例えばＰＣＲ）のプライマーとして使用できるか、または、ＮＡＳＢＡ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＴＭＡ、３ＳＲ、プライマーの標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモータを必要とする増幅プライマーをベースとする他の転写、または任意の他のプライマー伸長増副反応に追加されうる。プライマー中の特化された非標的結合配列を必要とするこれらの増幅法は、増幅反応を進行するのに必要であり、典型的には、標的配列に特化した配列を追加するように機能する。
例えば、制限酵素認識部位は、ＳＤＡで起こる指数関数的増幅に必要である（米国特許第５，４５５，１６６明細書および同５，２７０，１８４号明細書（特許文献７、８）参照）。対照的に、自己持続性配列複製法（３ＳＲ）および核酸配列をベースとする増幅法（ＮＡＳＢＡ）は、５’末端近傍にポリメラーゼプロモータを含む（３ＳＲアッセイは、Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878（非特許文献７）に開示されている。）。このプロモータは、標的結合配列に追加され、テンプレートの複数のＲＮＡコピーの転写を指示することによって増幅反応を推進する働きをする。選択された増幅反応に使用するために、このような特化した配列を標的結合配列に連結することは、通常行われることであり、当業者に周知である。
【００２２】
対照的に、標的の末端に特化された配列を必要としないＰＣＲのような増幅方法は、一般に、標的結合配列のみからなる増幅プライマーを使用する。これらの他の増幅方法における検出の目的に対しては、当業者によって理解されるように、プライマーが検出可能に標識されうる。
【００２３】
核酸はアニールするためには完全な相補性を必要としないので、当業者は、本明細書に開示されたプローおよびプライマー配列がＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２特異的プライマーおよびプローブとしての有用性を損なうことなくある程度まで修飾できることを理解するであろう。用語「相同性」は相補性の程度を言う。部分的相同性または完全相同性があり得、完全相同性は同一と同義である。同一の配列を標的核酸へハイブリダイゼーションするのを阻害する部分的相同性配列は、「実質的に相同性である」と称される。標的配列への完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（例えばサザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて試験することができる。実質的に相同性である配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で標的配列への、完全に相補的な配列またはプローブの結合（すなわちハイブリダイゼーション）に競合し且つこの結合を阻害する。それにもかかわらず、低ストリンジェンシー条件は、非特異的結合を許さず、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の他方への結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを必要とする。
【００２４】
当業者によって理解されるように、アニーリングのストリンジェンシーは同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更されうる。熟練した専門家によってさらに理解されるように、融解温度、Ｔｍは、ヌクレオチドの数でのプライマーまたはプローブの長さ、またはアニーリングバッファの成分および条件のような多くのパラメータに依存して、当分野で公知のように式で近似することができる（例えば、T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982およびJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. F. M. Ausubel et al., Vol. 1, "Preparation and Analysis of DNA", John Wiley and Sons, Inc., 1994-1995, Suppls. 26, 29, 35 and 42; pp. 2.10.7-2.10.16; G. M. Wahl and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152: 399-407);およびA. R. Kimmel, 1987; Methods of Enzymol. 152: 507-511（非特許文献１１〜１５）参照）。一般的指針として、Ｔｍは、配列相同性が１％減少するごとに約１℃から１．５℃低下する。温度範囲は約５０℃から６２℃で変化しうるが、増幅プライマーは５２℃で最適化されるように設計されうる。しかし、５０℃未満の温度はプライマーに特異性を欠如させ、一方６２℃を超える温度はハイブリダイゼーションを引き起こさない。増幅プライマーを設計する場合にさらに考慮することは、グアニンとシトシンの含有量である。一般には、プライマーに対するＧＣ含有量は、約６０〜７０％であるが、これはより少なくてもよく、当業者によって適切に調節することができる。標的結合配列のハイブリダイゼーション領域は、約４２〜４８℃のＴｍを有しうる。アニーリングの相同性および部分相同性核酸配列は、アニーリングの条件を変更してストリンジェンシーを増加または減少すること（すなわち、アニーリング温度またはバッファの塩の含有量を調節すること）によって得ることができる。このような開示された配列のマイナーな変更、およびＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の特異性を維持するための必要なアニーリング条件の調節には、決まりきった実験手順のみが必要であり、そのような変更および調節は当業者の範囲内にある。
【００２５】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２標的配列の検出用に設計された増幅プライマーは、それぞれ、配列番号７〜１８および３８〜４３として表１および２に同定されている。これらの増幅プライマーは、標的配列が高相同性コンセンサス糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）遺伝子領域にアニールするように設計されている（図１〜２および６〜７参照）。ＨＳＶ標的ＤＮＡ配列にアニールするか、またはこれらに対して相補的である増幅プライマー内のＨＳＶ標的結合配列領域は、アンダーラインを付し、大文字で示した（表１および２参照）。ＳＤＡ検出プライマー配列の残っている５’部位は、ＳＤＡ反応が進行するのに必要であるＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）（小文字のイタリック体で示した）、並びに、ジェネリックな非標的特異的５’テール末端配列を含む。
【００２６】
それぞれ配列番号７〜８および３８のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２増幅プライマーは左側（「第一」）Ｓ１増幅プライマーであり、それぞれ配列番号９〜１８および３９〜４３は右側（「第二」）Ｓ２増幅プライマーである。増幅の目的では、少なくとも１つの左側および右側プライマー対が反応中に存在するように、特異型の一対のＨＳＶ増幅プライマーを単独（すなわち、１つのＨＳＶ−１左側増幅プライマーおよび１つのＨＳＶ−１右側増幅プライマー）で使用するか、または組み合わせて（すなわち、１つのＨＳＶ−１ＳＤＡ左側プライマーと２つのＨＳＶ−１ＳＤＡ右側増幅プライマー）を使用する。多数の増幅プライマーを使用して、標的配列の幾つかの領域を増幅することができる。プライマーの濃度は、ＨＳＶ−１の第１増幅プライマーが５００ｎＭの濃度で唯一の第一増幅プライマーとして使用され、２つのＨＳＶ−１右側増幅プライマーが併用して使用される場合には、各々２５０ｎＭの濃度を有するように適切に調節されうる。
【００２７】
用語「伸長生成物」は、一般に、ポリメラーゼのような酵素を用いてプライマーまたは標的配列を伸長することによって産生される配列を言う。一実施形態では、増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよびテンプレートとしてＨＳＶ標的配列を用いるポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長は、増幅プライマー伸長生成物を産生する。
【００２８】
「バンパープライマー」または「外部プライマー（external primer）」は、バンパープライマーが下流の増幅プライマーおよびその伸張生成物を置換するように増幅プライマーの上流で標的配列にアニールするプライマーである。本明細書で使用する場合、用語「バンパープライマー」は、ＨＳＶ標的結合配列を含むポリヌクレオチドをいう。有用なバンパープライマーは、表１および２に、それぞれ配列番号２３〜２５および４６〜４７として同定されている。左側または第一のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２バンパープライマーは、それぞれ配列番号２３および４６であり、一方右側または第二のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２バンパープライマーはそれぞれ配列番号２４〜２５および４７である。バンパープライマーは、増幅プライマーの標的結合部位に十分近接し、バンパープライマーの伸張後に増幅プライマー伸張生成物の置換を可能にする増幅プライマーの上流の位置で増幅プライマーの側面に位置する配列の保存領域から誘導される。例えば、配列番号２３（ＨＳＶ１ＧＧＬＢ１．０）のＨＳＶ−１第一バンパープライマーの５’末端はＨＳＶ−１ゲノム配列の塩基１３７，２５６に位置する（図２）。配列番号２５（ＨＳＶ１ＧＧＲＢ１．１）のＨＳＶ−１第二バンパープライマーの５’末端は、ＨＳＶ−１ゲノム配列の塩基１３７，３８２に位置する。ＳＤＡの初期のラウンドの間に、バンパープライマーはＨＳＶ標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼ伸張、すなわち下流の増幅プライマー伸張生成物によって置換され、複製および／または指数関数的増幅のさらなるラウンドを受けうる単鎖ＤＮＡの生成を引き起こす。
【００２９】
用語「アッセイプローブ」は、核酸の検出または同定を促進するために使用される任意の核酸を言う。例えば、本発明の一実施形態では、アッセイプローブはＨＳＶ核酸の検出または同定に使用される。以下に記載される検出プローブ、検出プライマー、キャプチャープローブおよびプライマーはアッセイプローブの例である。
【００３０】
特に、特異的なＨＳＶ−型を検出および同定するのに有用な「検出プローブ」は標識化されるかまたはタグ付けされる。検出プローブの検出可能な標識は、直接的または間接的に検出され、標的核酸配列の存在を示しうる部分である。直接検出については、アッセイまたは検出プローブは放射性同位体でタグ付けされ、オートラジオグラフィーで検出されるか、または、蛍光部分でタグ付けされ、当分野で公知の通りの蛍光によって検出する。あるいは、アッセイプローブは、検出を可能にする追加の試薬で標識することによって間接的に検出することができる。間接的に検出可能な標識には、例えば、化学発光剤、視覚化または着色された反応生成物をもたらす酵素、および、リガンドで検出可能に標識されたリガンド結合パートナーであって、リガンド（例えばハプテン、抗体または抗原）を標識されたリガンド−特異的結合パートナーへ結合することによって検出できるものが含まれる。
【００３１】
増幅生成物の検出に対しては、本明細書で開示された標的結合配列を含む増幅プライマーが当分野で公知の方法で標識されうるか、または、開示された標識結合配列を含む標識された検出プライマーを、増幅のリアルタイム均一検出に対して米国特許第５，５４７，８６１、米国特許第５，９２８，８６９、米国特許第５，５９３，８６７号明細書、米国特許第５，５５０，０２５号明細書、米国特許第５，９３５，７９１号明細書、米国特許第５，８８８，７３９号明細書、米国特許第５，８４６，７２６号明細書（特許文献９〜１５に開示された増幅プライマーと共に使用することができる。このような検出プライマーは直接的にまたは間接的に検出可能な配列を含み、この検出可能な配列は、初期には標的にハイブリダイズしないが、一旦標的にハイブリダイズして伸長されると検出プライマーの検出を促進する。例えば、このような検出可能な配列は、制限部位を含む配列、または、ヘアピンおよびｇ−カルテット配列（これらに限定されない）のような、近傍にフルオロフォアおよびクエンチャー部分を結合する二次構造を形成する配列、または、当分野で公知である標識されたオリゴヌクレオチド（しばしばレポータープローブと言われる）へ線状配列の相補体をハイブリダイゼーションすることによって検出される線状配列でありうる。あるいは、増幅生成物は、リアルタイムに、または、挿入色素（intercalating dye）の使用を介した増幅後に、もしくは選択した一連の増幅プライマーの範囲に入る本明細書で開示された任意の標的結合配列から選択されるプローブのハイブリダイゼーションによる増幅後に検出されうる。
【００３２】
末端および内部標識法は当分野で公知であり、検出プライマーのそれぞれの位置でドナー色素およびアクセプター色素を連結するのに使用される。５'-末端標識法の例には、ａ）５’−対−５’カップリングしたリボヌクレオチドの過ヨウ素酸塩酸化とこれに続くアミン含有標識との反応、ｂ）エチレンジアミンと５’−ホスホリル化ポリヌクレオチドの縮合とこれに続くアミン反応性標識との反応、およびｃ）固相ＤＮＡ合成でアミノヘキシルホスファイト試薬を用いた脂肪族アミン置換基の導入とこれに続くアミン反応性標識との反応が含まれる。標識はまた、特別な脂肪族アミン含有ヌクレオチドホスホラミダイト試薬を用いて特定の位置で、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドに連結される。検出プライマーへ選択された標識を連結し、連結した試薬を働かせるための適切な方法を選択することは、当分野ではごく普通の手順である。
【００３３】
他の実施形態は、検出される標的配列に依存して多数の検出プライマーを必要とする、特異的標的配列にハイブリダイズする検出プライマーを使用する。しかし、特異的ＨＳＶ型の検出および同定のための実施形態では、Ｎａｄｅａｕら（１９９９）によって記載されているリアルタイムＳＤＡ検出法を修飾したユニバーサル検出システム（Universal detection system）を使用する。ユニバーサル検出システムは、多数のアッセイに対して同じ蛍光検出プライマーの対を使用することができ、経費、時間、および技術的な複雑さを低減するような幾つかの利点を提供する。
【００３４】
「シグナル」または「アダプタ」プライマーは、ＨＳＶ標的配列にハイブリダイズする標的結合部分およびジェネリックでＨＳＶ標的配列に結合しないテール部分を有する。アダプタプライマーはユニバーサル検出用の検出プライマーと共に使用される。検出プライマーは、相補性アダプタプライマーのテール部分（すなわち、非標的結合配列）にハイブリダイズする。シグナルまたはアダプタプライマーは、第一および第二増幅プライマーの間の介在領域に少なくとも部分的に位置する標的配列の領域にハイブリダイズし、シグナルまたはアダプタ配列が増幅反応中に置換されるように設計される。配列番号１９〜２２および４４〜４５を有するＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２シグナルまたはアダプタプライマーは、それぞれ表１および２に示されている。
【００３５】
検出プローブは、「ユニバーサル検出プライマー」または「検出プライマー」であってもよく、検出可能に標識された５'テール末端部分と、相補性アダプタプライマーテール配列に結合する３'末端部分を有する。一般に、検出プライマーの３’末端は、ＨＳＶまたは内部増幅対照（Internal Amplification Control）（ＩＡＣ）標的配列に対する任意の十分な相補性を有する配列を含まない。検出プライマーはまた、５'末端に制限酵素認識部位を有する。
【００３６】
手短には、このユニバーサル検出システムは、増幅のためのＳＤＡ法と同時に、且つ同じ反応容器中で使用することができる。ユニバーサル検出システムは、未標識のアダプタプライマーの標的依存的伸長を含む。アダプタプライマーは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２標的特異的３'配列および５’ジェネリックテールを含み、それぞれ配列番号１９〜２２および配列番号４４〜４５と、その相補体で例示される。アダプタプライマーは、Ｓ１増幅プライマーの下流で、増幅されたＨＳＶ標的配列にハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼは、アダプタ配列およびＳ１増幅プライマーの３’末端から伸長し、この場合、増幅プライマーの伸長はアダプタプライマー伸長生成物を置換する。Ｓ２増幅プライマーは、アダプタプライマー伸長生成物にアニールする。ＤＮＡポリメラーゼはＳ２増幅プライマーの３’末端を伸長し、アダプタプライマー伸長生成物およびその相補体を含み、ニッキング可能な制限酵素認識部位を有する二本鎖分子を産生する。ニッキングとは、ＤＮＡ二重鎖の２つの鎖のうちの１つのみのホスホジエステル結合を切断することを言う。対応する制限酵素は、制限酵素認識部位で二本鎖分子をニッキングし、ニッキングされた短いテールを含む５’部分と、ニッキングされた長い相補性アダプタプライマー伸長生成物を含む３’部分を生じる。ＢｓｏＢＩ酵素のような対応する制限酵素で制限酵素部位をニッキングし、ニッキングされた部位から鎖を伸長すると、アダプタプライマー相補体の単鎖コピーが置換される。ＤＨＡポリメラーゼはニッキングされたテールの３’末端を伸長し、これによってニッキングされた単鎖の相補性アダプタプライマー伸長生成物を置換する。Ｓ１増幅プライマー伸長生成物および伸長されたＨＳＶ標的配列は、さらにＳＤＡによって指数関数的に増幅される。次に、置換された相補性アダプタプライマー伸長生成物は検出プライマーによって捕獲されるが、この捕獲では、検出プライマーの３'末端が相補性アダプタプライマー伸長生成物の５’部分にアニールする。検出プライマーは、検出可能な標識を含み、標的配列を検出する。検出プライマーの３'末端からのＤＮＡポリメラーゼ伸長および相補性アダプタプライマー伸長生成物は、存在する場合にはヘアピンを開き、検出プライマー伸長生成物とその相補体を含む二本鎖検出分子を産生する。各鎖は、開裂可能な制限酵素認識部位を含み、開裂されたときに、ドナーおよびクエンチャー色素を切り離し、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を切り離し、標的特異的蛍光を生じる。この切り離しによって、クエンチャーはもはやフルオロフォアによって発光された蛍光を抑制することができない。二本鎖化された検出プライマー制限酵素認識部位の完全な開裂は、フルオロフォアとクエンチャーを切り離すことによって蛍光シグナルを増加させる。
【００３７】
本発明の一実施形態では、検出プライマーは、蛍光ドナー部分（またはフルオロフォア）およびクエンチャー部分であって、各部分が制限酵素認識部位に隣接しているものにより蛍光検出用にタグ付けされうる。表１および２は、配列番号３０〜３５を有する検出プライマー配列を示す。ユニバーサル検出では、標的配列を検出するための検出プライマーが、一般にアダプタプライマーと共に使用される。ドナー色素、すなわちローダミン（ＲＯＸ）およびクエンチャー色素、すなわちＰ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）で標識された、配列番号３０〜３３を有する検出プライマーは、本発明でＨＳＶ標的配列の検出に使用される。他のドナーおよびクエンチャー色素対は、ＳＤＡで使用するために、クエンチャー色素がドナー色素によって放出される蛍光を十分に吸収するように、当業者によって容易に選択されうる。例えば、ドナーおよびクエンチャー色素は異なる波長での吸収によって容易に検出され、識別される。ドナーおよびクエンチャー色素に依存して、クエンチャー色素はある場合にはクエンチャーとして、そして他の場合にはドナー色素として作用してもよい。
【００３８】
この実施形態では、配列番号３０〜３５の検出プライマーは、検出プライマーの５'末端に位置する制限酵素認識部位によって切り離されるドナーおよびクエンチャー色素対を有する。さらに、配列番号３０の検出プライマーは、ドナーおよびクエンチャー部分の間に位置するヘアピン構造配列であって、制限酵素認識部位がこの中に存在するヘアピン構造配列を含む配列を有する。ヘアピン構造は、ドナー色素によって放出される蛍光がクエンチャー色素によって抑制されるように２つの色素を近接した位置に持ってくる。しかし、配列番号３１〜３５の検出プライマーは、２つの色素の間に線状の配列を有し、この線状の配列は、クエンチャーがフルオロフォアによって放出される蛍光を吸収するのに十分短い長さである。
【００３９】
当分野で知られている多くのドナー／クエンチャー色素対が本発明の実施形態で有用である。これらには、フルオレセイン（ＦＡＭ（商標）;Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）／ローダミン（ＲＯＸ（商標）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ＲＯＸ／Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ（商標）；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ＦＡＭ／ＤＡＢＣＹＬ；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；ＦＩＴＣ／テキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）；ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ペンタンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ；ＦＩＴＣ／ローダミン  Ｘ；およびＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）が含まれるが、これらに限定されない。特定のドナー／クエンチャー対の選択は、重要ではない。
【００４０】
しかし、エネルギー移動消光メカニズムについては、ドナーフルオロフォアの放出波長がクエンチャーの励起波長とオーバーラップしていること、すなわち２つの色素の間で、十分なスペクトルのオーバーラップが存在し、十分なエネルギー移動、電荷移動または蛍光消光が可能であることのみが必要である。ＲＯＸはＥＭｍａｘ＝６０８ｎｍを有し、ＦＡＭはＥＭｍａｘ＝５２０ｎｍを有する。当業者は、適切なドナーおよびクエンチャー色素対を選択することにおいて豊富な知識を有するであろう。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、非蛍光性クエンチャー色素であり、隣接するフルオロフォア、例えばＦＡＭまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）からの蛍光を効果的に消光する。特定のドナー／クエンチャー対をこの開示で例示するが、他のものも当業者には明かであり、本発明でも有用である。消光を起こすメカニズムにかかわらず、本発明の検出プライマーにおいて蛍光の消光をもたらす任意の色素対が本発明の方法で使用するのに適している。他のクエンチャーの非制限的な例には、ブラックホールクエンチャー（Black Hole Quencher）（商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．；Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびアイオワブラック（Iowa Black）（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｏｒｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）が含まれる。
【００４１】
蛍光は、特定の増幅生成物の蓄積をモニタするために核酸増幅反応過程中に測定される。蛍光シグナルは、産生された特定のアンプリコンの量に比例する。ＨＳＶ標的核酸配列の存在下では、蛍光は増強されるであろう。標的がない場合、蛍光は反応の間一貫して低いままであろう。蛍光の増加、または実質的に蛍光の変化がないことは、それぞれＨＳＶ標的配列の存在および非存在を示す。
【００４２】
サンプルの蛍光は、典型的には、サンプルがＨＳＶ  ＤＮＡを含むかどうかを決定するために所定時間にわたって測定される。一実施形態では、蛍光は１時間の過程で６０パスモニターされる。手短には、ほぼ１分ごとに、サンプル容器中で測定された蛍光の量、補正値（必要であれば）、および各カラムに対するキャーリブレータに関するデータを集める。データを、グラフの曲線の下の領域に換算した結果を表す「ＭＯＴＡ」（メトリック・アザー・ザン・アクセラレーション（Metric Other Than Acceleration））法を用いて分析することができる。グラフは、パスの数（Ｘ−軸）対相対蛍光単位（Ｙ−軸）（図３参照）を測定する。ＭＯＴＡ領域が大きければ大きいほど、生成される蛍光は大きく、且つ増幅された生成物の検出の効率がよい。
【００４３】
さらに別の実施形態では、図４に示されるパス・アフター・スレッシュホールド（Passes After Threshold）（ＰＡＴ）アルゴリズムを使用し、これはＢＤプローブテック（BD ProbeTec）（商標）ＥＴシステムで使用するために特に開発されている。ＭＯＴＡと同様に、より高いＰＡＴスコアーは、ＳＤＡ反応がより効果的なことを示す。ＰＡＴアルゴリズムを用いる場合、バックグラウンドで集められた蛍光強度のシグナルが予め決められた閾値を越える時点をＴ３（「タイム−トゥ−スレッシュホールド（Time-To-Threshold）」と表す。このグラフも、パスの数対相対蛍光単位を測定する。同じＴ３閾値を各サンプルに対して使用する。ＰＡＴスコアーは６０マイナスＴ３の値に等しい。陰性サンプルは、蛍光の最低閾値に達しておらず、従ってゼロのＰＡＴ値が割り当てられる。陽性サンプルは、アッセイおよび標的のレベルに依存して、０よりも大きなＰＡＴ値、好ましくは１から６０の間、より好ましくは４０〜５５の間のＰＡＴ値を有する。より低いＴ３スコアーおよび対応するより高いＰＡＴ値が、より効果的なＳＤＡと相関する。ＰＡＴアルゴリズムは、最も再現性のある増幅曲線の領域にのみ利用する。結果として、ＰＡＴアルゴリズム法は、ウェル間またはサンプル間の認識できる差を最小限にし、検出物を比較する他の方法よりも正確である。ＰＡＴはＢＤプローブテック（商標）ＥＴシステムによって自動で行うことができる。ＢＤプローブテック（商標）ＥＴの出力は、ＰＡＴスコアーおよび報告できる結果を提供する。
【００４４】
さらなる実施形態では、「内部増幅対照」（「ＩＡＣ」）は、陰性の結果を確認するため、および潜在的な阻害検体を特定するため、またはサンプル中に入り込んだ微生物、例えばウイルス、細菌、および菌類（これらに限定されない）の定量化を促進するために、存在している方法に取り込むことができる。診断への応用では、２つの異なるＤＮＡ配列、すなわちＨＳＶ標的配列およびＩＡＣ標的配列の同時増幅と検出がＩＡＣの使用を可能にする。「ＩＡＣ標的配列」または「ＩＡＣ配列」は、配列番号２６〜２７および配列番号４８〜４９のＩＡＣ標的配列がＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２標的配列と比べて約５〜１０塩基ミスマッチしていることを除いて、ＨＳＶ標的配列と同じである。これらの修飾塩基がＩＡＣアダプタプライマーの特異的なアニーリングを可能にするのに十分である。
【００４５】
「ＩＡＣアダプタプライマー」は、ＩＡＣアダプタプライマーがＩＡＣ結合配列を介して「ＩＡＣ標的配列」または「ＩＡＣ配列」にハイブリダイズすることを除いて、シグナルまたはアダプタプライマーと同じように機能する。ＩＡＣアダプタプライマーはまた、ＩＡＣ標的配列とハイブリダイズしないジェネリックな配列を含む５'テール部分を有する。どちらかと言えば、検出プライマーはＩＡＣアダプタプライマー相補体のテール部分にハイブリダイズすることができる。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＳＤＡアッセイで使用されるＩＡＣアダプタプライマーは、それぞれ配列番号２８〜２９および５０〜５１から選択でき、ＩＡＣ標的配列の増幅に有用である。ＩＡＣアダプタプライマーの３’末端に位置するＩＡＣ標的結合配列は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２アダプタプライマーがハイブリダイズしないか、またはＩＡＣ標的配列の増幅を妨げるように十分にＨＳＶ標的配列と異なっている。表１および２において、ＩＡＣアダプタプライマーの３’末端のＩＡＣ標的結合配列は小文字にアンダーラインを付すことによって示した。ＩＡＣアダプタプライマーは、陰性の結果を確認し、反応を阻害する検体をモニタするのに有用である。定量ＳＤＡでは、ＩＡＣと陰性の標的配列の間で律速試薬を競合させることも有用であるかもしれない（Nadeau, et al., 1999 Anal. Biochem. 276:177-187（非特許文献１６）。
【００４６】
本発明の検出プライマーは、ＨＳＶ標的配列またはＩＡＣ標的配列のいずれかを検出するのに使用することができる。しかし、本発明の一実施形態では、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２標的配列を検出するために使用される検出プライマーは、配列番号３０〜３３のものである。ＩＡＣ標的配列を検出するのに有用な検出プライマーは、ドナーおよびクエンチャー色素対がそれぞれフルオレセイン（ＦＡＭ）およびＤＡＢＣＹＬである配列番号３４〜３５から選択されるものであり、本明細書で「ＩＡＣ検出プライマー」と称される。当業者は、ＩＡＣ標的配列の同定がＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２標的配列の検出から明確に区別できるように、標識を有する適切な検出プライマーを選択する知力を有するであろう。従って、ＨＳＶ標的配列およびＩＡＣ標的配列の検出に使用される検出プライマーは交換することができ、その結果、配列番号３０〜３３の検出プライマーがＩＡＣ標的配列の検出に使用でき、配列番号３４〜３５がＨＳＶ標的配列の検出に使用できる。
【００４７】
本発明の他の実施形態は、高スループットプロセスで、同時に複数のサンプルをアッセイすることに関する。サンプルには、脳脊髄液（ＣＳＦ）、生殖器病変、口腔病変、粘膜病変、眼の病変、皮膚病変、直腸スワブ、膣スワブ、膣分泌物、尿、末梢血白血球および組織（例えば脳生検からのもの）から集めたものが含まれるが、これらに限定されない。サンプルは、プレート、スライド、ウェル、皿、ビーズ、粒子、カップ、ストランド、チップおよびストリップでアッセイすることができる。一実施形態では、この方法は、ＢＤプローブテック（商標）ＥＴ  ＧＴ／ＧＣで増幅されたＤＮＡのアッセイで使用するのに適合した形態の９６マイクロウェルプレートで行われる。この方法は、乾燥されたマイクロウェルの形態であって、乾燥された組成物が多数のサンプルを同時にアッセイするのに使用するための、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のＳＤＡ検出を行うのに必要な全てのプライマーおよびプローブを含む形態で実施される。
【００４８】
本発明の方法によって選択された標的配列の存在を検出するアッセイは、溶液または固相で行うことができる。検出核酸がプライマーとして機能する、リアルタイムまたは終点均一アッセイ（endpoint homogeneous assay）は、典型的には、溶液で実施される。本発明の検出プライマーを用いるハイブリダイゼーションアッセイは、溶液で行うことができるだけでなく、標的のリアルタイムまたは終点検出のための固相アッセイに特に適切である。固相アッセイでは、検出オリゴヌクレオチドを、当分野で公知の方法を用いて内部または末端標識を介して固相（例えば、ビーズ、膜または反応容器）に固定する。例えば、ビオチン標識された検出オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的に曝したときに蛍光の変化をもたらすアビジンで修飾された固相上に固定することができる。この方法では、標的の捕獲はサンプルから標的の分離を促進し、アッセイのシグナルまたは他の特徴の検出を妨げうるサンプル中の物質を除去することができる。
【００４９】
ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２標的配列を検出し同定するために使用されるプライマーおよびプローブを表１に列記した。特異的ＨＳＶ標的結合配列にはアンダーラインを付し、大文字で示し、一方、制限酵素エンドヌクレアーゼ部位は小文字のイタリック体で示した。ＩＡＣアダプタプライマーについては、ＩＡＣ標的結合配列を小文字にアンダーラインを付すことにより示した。全てのプライマーは、５’→３’の方向に位置づけされている。
【００５０】
【表１−１】
0005587276.tif 000002
【００５１】
【表１−２】
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【００５２】
ＨＳＶ−２標的配列を検出し同定するために使用されるプライマーおよびプローブを表２に列記した。
【００５３】
【表２−１】
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【００５４】
【表２−２】
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【００５５】
本発明の核酸プライマーは、種々の系統についてのＨＳＶ遺伝子の糖タンパク質Ｇ（Glycoprotein G）（ＵＳ４）を分析することによって生じるコンセンサス配列に基づいて設計される（図１および６、表１および２参照）。ＳＤＡおよびユニバーサル検出法で使用するためのバンパープライマー、アダプタプライマー、および検出プライマーも示されている。設計されたＨＳＶ−１プライマーは、表４に例示されるように全ての系統に認められるＨＳＶ−１標的配列を特異的に増幅する。ＨＳＶ−２プライマーは、表７に例示されるように全ての系統に認められるＨＳＶ−２標的配列を特異的に増幅する。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２標的配列の間の相同性は約９０％であるので、プライマーは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の間を特異的に明確に区別するために注意深く設計される。標的結合配列に実質的に相同である配列および表１および２に列挙されたこのような実質的に相同な標的結合配列を含むプライマーもまた本発明に包含される。
【００５６】
本発明の一実施形態では、ＨＳＶ−１標的領域は、まず、ヒトＨＳＶ−１の完全なＨＳＶ−１ゲノム配列、すなわち１５２，２６１塩基長を有する系統１７（ＮＣＢＩアクセス番号Ｘ１４１１２）から選択される。糖タンパク質「ＵＳ４」遺伝子は、１３６，７４４〜１３７，４６０塩基に位置する。ＨＳＶ−１左側バンパープライマー（ＨＳＶ１ＬＢ１．０）（５'末端）は、核酸１３７，２５６に位置する。ＨＳＶ−１右側バンパープライマー（ＨＳＶ１ＲＢ１．１）（５'末端）は、核酸１３７，３８２に位置する。全てのＨＳＶ−１ＳＤＡシステム用のプライマーは、これらのバンパープライマー座標（coordinates）の範囲内に位置する。
【００５７】
本発明の他の実施形態はヒトＨＳＶ−２の完全なＨＳＶ−２ゲノム配列、すなわち１５４，７４６塩基長を有する系統ＨＧ５２（ＮＣＢＩアクセス番号Ｚ８６０９９）に関する。糖タンパク質Ｇ「ＵＳ４」遺伝子は、１３７，８７８〜１３９，９７７塩基に位置する。ＨＳＶ−２左側バンパープライマー（ＨＳＶ２ＬＢ１．０）（５'末端）は、位置１３９，７７３に位置する。ＨＳＶ−２右側バンパープライマー（ＨＳＶ２ＲＢ１．０）（５'末端）は、位置１３９，８９６に位置する。全てのＨＳＶ−２ＳＤＡシステム用のプライマーは、このバンパープライマー座標（coordinates）の範囲内に位置する。
【００５８】
ＰＣＲ増幅プライマーは、ＨＳＶ標的ＤＮＡをプラスミドベクターへクローニングするために設計される。配列番号５〜６および配列番号３６〜３７のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ＰＣＲ増幅プライマーは、それぞれ、ＨＳＶゲノムの高度に保存された標的配列領域に対して相補的である。ＰＣＲ増幅プライマーは、ＨＳＶの糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）遺伝子のＤＮＡフラグメントを含むＨＳＶ標的配列領域を増幅する。ＨＳＶ標的領域を含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムの増幅されたフラグメントは、手頃な制限酵素部位を含むプラスミドベクターに指向性を持ってクローニングされる。ＨＳＶフラグメントは、当業者によって理解されるように任意のプラスミドベクターにクローニングすることができるが、一実施形態では、増幅されたＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２フラグメントは、選択されたＨＳＶ標的領域に特異的なＰＣＲ増幅プライマーを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉプラスミドベクター、ｐＵＣ１９（ジーンバンク／ＥＭＢＬアクセス番号Ｌ０９１３７）およびｐＵＣ１８（ジーンバンク／ＥＭＢＬアクセス番号Ｌ０９１３６）にそれぞれクローニングされる。ＨＳＶフラグメントはＨＳＶ標的ストックと称される。標的ＨＳＶ  ＤＮＡは、ピコグリーン（PicoGreen）（登録商標）二本鎖ＤＮＡ定量アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて定量されうる。表１および表２に列記されたプライマーの名前の中の「Ｌ」または「Ｒ」の存在は、増幅反応に使用されたときに、それぞれ「左側」または「右側」プライマーを示す。
【００５９】
本発明の一実施形態では、ＰＣＲ増幅プライマー、配列番号５〜６および３６〜３７は、最初に、それぞれＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２遺伝子の糖タンパク質Ｇ遺伝子の１５２および２５４塩基対フラグメントを増幅する。それぞれ配列番号５および３６のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２左側ＰＣＲプライマーは、各々ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含めて設計される。それぞれ配列番号６および３７のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２右側ＰＣＲプライマーは、各々ＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する。このフラグメントは、次に、適切な位置でｐＵＣプラスミドベクターにクローニングされる。例示されたプラスミドベクターは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対してそれぞれｐＵＣ１９およびｐＵＣ１８であり、これらは制限酵素部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを有する。制限酵素消化によって精製および線状化した後、続いて、ＨＳＶ標的フラグメントをＨＳＶ増幅プライマーおよびバンパープライマーを用いて指数関数的に増幅する。
【００６０】
本発明の標的結合配列およびプライマーは核酸増幅に有用である。一実施形態では、プライマーは鎖置換増幅（ＳＤＡ）に特に有用である。これは、プライマーの伸長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位のニッキング、単鎖伸長生成物の置換、伸長生成物（または本来の標的配列）へのプライマーのアニーリング、および引き続きのプライマーの伸長が反応混合物中で同時に起こる等温の核酸増幅法である。さらに、ＳＤＡは１５分未満で１０１０倍を超える標的配列の複製を可能にする。一方、ＰＣＲでは、反応のステップは反応中の温度サイクルの結果として、別々のフェーズおよびサイクルで起こる。好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）は、本質的に、熱に安定なポリメラーゼおよび熱に安定な制限エンドヌクレアーゼの置き換えを伴う、本明細書で、および、ｗａｌｋｅｒら（1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA. USA 89:392-396および1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696（非特許文献９および１０））によって記載された従来のＳＤＡ方法として実施することができる。温度は、置換された酵素に適したより高い温度に調整することができる。
【００６１】
ＨＳＶ増幅生成物または増幅された標的配列を検出する別の方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動であって、アガロースが臭化エチジウムで染色されるものによって特徴的なサイズを検出することによるものである。ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２増幅プライマーを用いて生成された増幅生成物は、定量的ハイブリダイゼーション、または分子生物学の分野で熟練した者に公知の核酸検出のための等価な技術（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, NY (1989)（非特許文献１２））によって検出することができる。
【００６２】
表１および２に列記したプライマーは、サンプル中のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の検出および同定に有用である。本明細書で使用される場合、Ｓ１およびＳ２増幅プライマーは、それぞれ第一および第二の増幅プライマーを表し、一方Ｂ１およびＢ２バンパープライマーは、それぞれ第一および第二のバンパープライマーを表す。手短には、ＳＤＡ法では、Ｓ１増幅プライマーは単鎖ＨＳＶ標的配列にハイブリダイズする。Ｓ１増幅プライマーのちょうど上流または５’で、第一のバンパープライマー、Ｂ１、が単鎖ＨＳＶ標的配列にハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂ１バンパープライマーおよびＳ１増幅プライマーの３'末端を伸長するが、この場合、Ｂ１バンパープライマーの伸長は、最終的に、Ｓ１ＳＤＡ伸長生成物を置換する。Ｓ１ＳＤＡ伸長生成物は、Ｓ２増幅プライマー、およびＳ２増幅プライマーの上流でアニールするＢ２バンパープライマーによって捕獲される。ＤＮＡポリメラーゼはＳ２ＳＤＡおよびＢ２バンパープライマーの３’末端を伸長し、この場合、Ｂ２バンパープライマーの伸長は、下流のＳ２ＳＤＡ増幅プライマー伸長生成物を置換する。Ｓ１増幅プライマーは置換されたＳ２増幅プライマー伸長生成物にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼはハイブリダイズしたＳ１増幅プライマーの３’末端を伸長し、Ｓ２増幅プライマー伸長生成物およびその相補鎖を有する二本鎖分子を生じる。各鎖は、いずれかの末端でニック可能な制限酵素認識部位を有する。対応する制限酵素を添加して、チオレート化されたシトシンを含む修飾されたＤＮＡ鎖をニッキングし、ニック部位の３’に、短いニッキングされたテールおよび長い伸長産物を形成する。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’方向に、ニッキングされた短いテールの３’からニッキングされた短いテールを伸長し、長い単鎖伸長生成物を置換する。手短には、Ｓ２増幅プライマー伸長生成物のニッキングされたテールとその相補体のニッキングされたテールは、それぞれ、ニッキングされた単鎖Ｓ２増幅プライマー伸長生成物と、ニッキングされた単鎖相補性Ｓ２増幅プライマー伸長生成物を置換する。一実施形態では、ＢｓｏＢＩ酵素を使用して、配列番号５２〜５３および５４〜５５の配列をそれぞれ有する各鎖をニッキングし、且つ開裂または切断する。以下に示されるニック部位は、増幅プライマー配列に組み込まれ、半ホスホロチオエート化された認識配列（ｄＣｓＴＰ、チオエート化されたシトシン）を必要とする。ニック部位であっても、配列番号５３は、ｄＣｓＴＰの存在下でさえ、二本鎖開裂をする傾向があり、ニッキング可能な増幅プライマーを設計する場合には好ましい配列ではない。
【００６３】
ニック部位：５’−ＣＴＣＧＧＧ−３’（配列番号５２）および５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’（配列番号５３）
切断部位：５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号５４）および５’−ＣＣＣＧＡＧ−３’（配列番号５５）
【００６４】
本発明のさらなる実施形態では、検出プローブはＨＳＶ標的配列を検出するのに有用である。ＨＳＶ標的配列に特異的なＳ１増幅プライマーおよび検出プライマーを使用することができ、この場合、検出プライマーはＨＳＶ標的結合配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｓ１プライマーおよび検出プライマーの３‘末端から伸長する。Ｓ１プライマーの伸長は、下流の検出プライマー伸長生成物を溶液中に置換し、この場合、これは捕獲されて相補性Ｓ２増幅プライマーにハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｓ２増幅プライマーの３’末端を伸長し、検出プライマーの二次構造を開き、二本鎖制限酵素部位を形成し、２つの色素をクエンチャーの消光能力を無能力化して蛍光を生じるような距離まで引き離す。追加の蛍光は、制限酵素認識部位を開裂し、フルオロフォアとクエンチャーをさらに引き離すことによって生じる。
【００６５】
ＳＤＡ法に有用な酵素は、半ホスホロチオエート化認識配列に単鎖ニックを生じさせるものであり、この場合、ホスホロチオエート化された核酸の取り込みはニッキングおよび修復のさらなるラウンドを妨げない。これらの特徴を有する酵素の非制限的な例には、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｏＢＩ、ＡｖａＩ、ＮｃｉＩ、およびＦｎｕ４ＨＩが含まれる。有用なＤＮＡポリメラーゼは、単鎖ニック部位でＤＮＡ合成を開始し、伸長した核酸鎖にホスホロチオエート化されたヌクレオチドを組み込み、そして５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たない鎖を置換するものである。開裂は、二本鎖または単鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合の切断をいう。これらの特性を示すＤＮＡポリメラーゼの非制限的な例には、エキソヌクレアーゼ欠損クレノウ、およびＢｓｔポリメラーゼおよびＢｃａポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠損フラグメントが含まれる。他のＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素はＳＤＡに適している（Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 89, pp. 392-396, January 1992, Applied Biological Sciences（非特許文献９））が、エキソ−ＢｓｔポリメラーゼおよびＢｓｏＢＩがこれらの熱特性および互いの適合性によって選択された。本発明の一実施形態では、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が使用され、これはイタリック体で示されている（表１および２参照）。ＨＳＶ標的結合配列を単独で使用して、専用の配列または構造を必要とすることなく反応中にＨＳＶ標的を増幅できること、および、ＳＤＡ以外の増幅反応（たとえばＲＮＡポリメラーゼプロモータ）で必要とされる他の専用の配列が、このシステムで、たとえば本明細書に記載されているＲＥＲＳ含有配列に置き換えられることは容易に認識できるであろう。
【００６６】
次に、標的ストックは、増幅プライマーの存在下で、増幅プライマー単独またはバンパープライマー、ユニバーサル検出用のシグナル／アダプタプライマー、およびユニバーサル検出プライマーと組み合わせて増幅される。増幅反応については、１つの「左側」増幅プライマーを含む少なくとも１対が選択され、１つの「右側」増幅プライマーが選択されて、ＨＳＶ標的ストック配列の各鎖を増幅する。左側および右側増幅プライマーに加えて、ＳＤＡ反応では、１つの左側および右側バンパープライマー対を最初に使用する。さらに、検出用に、シグナル／アダプタプライマーおよび検出プライマーを、ＨＳＶ標的ストック配列を検出し、同定するために使用する。
【００６７】
ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ＤＮＡを特異的に増幅し、検出するいくつかのＨＳＶシステムが本発明に包含される。例えば、ＨＳＶ−１システムは以下のプライマーを含む：ＨＳＶ１ＧＧＬＰ１．１、ＨＳＶ１ＧＧＲＰ５．２、ＨＳＶ１ＧＧＡＤ２．１、ＨＳＶ１ＧＧＬＢ１．０、ＨＳＶ１ＧＧＲＢ１．１、およびＴＢＤ１６（Ｄ／Ｒ）、または、そのほかには、ＨＳＶ１ＧＧＬＰ１．１、ＨＳＶ１ＧＧＲＰ５．２、ＨＳＶ１ＧＧＡＤ３．０またはＨＳＶ１ＧＧＡＤ３．１、ＨＳＶ１ＧＧＬＢ１．０、ＨＳＶ１ＧＧＲＢ１．１、ＭＰＣ．ＤＲ、ＨＳＶ１ＩＡＣ  ＡＤ８．１またはＨＳＶ１ＩＡＣＡＤ８．７、ＭＰＣ２．ＦＤ。他の実施形態では、プライマーの種々の組み合わせを用いたＨＳＶ−２システムを表３に列記した。プライマーの他の組み合わせが意図されるが、当業者は、サンプル中のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を検出するためにプライマーを組み合わせる知力を有するであろう。プライマーは、表１および２に列記されたものから選択され、サンプル中のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を同定するために統計学的に設計された実験で試験される。あるいは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に特異的であり、表１および２に列記されたものと実質的に相同であるプライマーをＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２標的配列の検出に使用することもできる。
【００６８】
【表３】
0005587276.tif 000006
【００６９】
商業的な利便性のためには、核酸の特異的な検出および同定のための増幅プライマーはキットの形態でパッケージングすることができる。一般にこのようなキットは、少なくとも１対のＨＳＶ増幅プライマーを含有する。核酸増幅反応を実施するための試薬、例えば、バッファー、追加のプライマー、ヌクレオチドトリホスフェート、酵素などを標的特異的増幅プライマーに含むことができる。キットの成分は、本発明の方法の特定の実施形態を実施するための使用説明書を含む、一般的な容器内に一緒にパッケージングされる。他の任意成分、例えばアッセイプローブとして使用するのに適した標識をタグ付けしたプライマー、および／またはその標識を検出するための試薬または手段をキットに含むことができる。
【００７０】
本発明の一実施形態では、第一の増幅プライマーすなわちＳ１ＳＤＡ増幅プライマー、および第二の増幅プライマーすなわちＳ２ＳＤＡ増幅プライマーを含むキットを提供する。このキットは、第一のＢ１バンパープライマーおよび第二のＢ２バンパプライマー、検出プライマー、並びに、任意選択的に、ＩＡＣアダプタプライマーおよびＩＡＣ標的配列を含む内部増幅対照（ＩＡＣ）標的配列を同時に検出するための試薬をさらに含むことができる。キットは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に特異的なプライマーから構成されていてもよく、または、キットは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方を指向するプライマーから構成されていてもよい。この場合、当業者は、ＨＳＶ−１を検出し同定する増幅反応がＨＳＶ−１プライマーを利用し、ＨＳＶ−２を検出し同定する増幅反応がＨＳＶ−２プライマーを利用することを理解するであろう。サンプルがＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ＤＮＡを含有するかどうかを同定するために、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のためのプライマーは混合されるべきではない。
【００７１】
さらに別の実施形態では、本発明のキットおよびプライマーは、臨床サンプルがＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を含有するかどうかを検出し診断するために使用することができる。臨床サンプルは、ＳＤＡ増幅プライマーを用いて増幅および検出することができるか、またはバンパープライマー、アダプタプライマー、および検出プライマーをさらに含むＳＤＡ反応に使用することができる。本発明の一実施形態では、ＩＡＣアダプタプライマーは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に対する陽性および陰性対照に添加して反応の内部増幅対照として使用することができる。当業者は、本明細書の記載を読むことによって、および、当分野で一般的な方法および技術から、サンプル中のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の検出および同定用のプライマーをどのように作成し使用するかを理解するであろう。
【００７２】
さらに、商業的な実施形態では、本発明のプライマーおよびＳＤＡ用試薬を含む組成物を乾燥形態または液体形態で提供することができる。組成物は乾燥形態の場合により安定で容易に取り扱うことができる。乾燥された組成物は、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、または他の適切な容器のような固相に添加されるか、またはそのような固相にあらかじめ処理することができる。この場合、サンプルおよびＳＤＡバッファを加えることのみが必要である。この形態は、多数のサンプルを同時にアッセイすることを容易にし、高スループット法に有用である。本発明の一実施形態では、ＢＤプローブテック（商標）ＥＴ装置を使用することができる。
【００７３】
標的結合配列、および、任意選択的に、選択された増幅反応に必要な配列または選択された検出反応に必要な配列からなる本発明に従った核酸が、スペーサー、リンカー、酵素の標識または結合のための配列、または他のものとして機能する他の特定の配列を含んでもよいことは理解されるべきである。このような追加の配列は、選択された反応中の核酸の最適な機能を得るために必要であることは一般に知られている。
【００７４】
本明細書で引用した、すべての特許、特許出願、刊行されたＰＣＴ出願および物品、本、参照文献、参照マニュアルおよび要約は、本発明が関係する分野の状態をより完全に説明するためにその全体を参照により本明細書に取り込む。
【００７５】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上記の主題に種々の変更を行うことができるので、上記説明に含まれるかまたは添付の特許請求の範囲で定義されるすべての主題は本発明の記述および例示として解釈されることが意図される。本発明の多くの修飾および変更が上記教示に照らして可能である。
【実施例】
【００７６】
本明細書の実施例は、本発明を実施する種々の側面を例示することを意味し、本発明の範囲をいずれの方法においても制限することを意図しない。実施例には、ベクターの構築またはそのようなベクターへのｃＤＮＡの挿入のような、使用される従来法の詳細な説明は含まれない。このような方法は、当業者に周知であり、多くの刊行物、例えばJ. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, (2001)（非特許文献１７）に説明されている。
【００７７】
（実施例１）
ＨＳＶ−１糖タンパク質−Ｇ鎖置換増幅標的領域のクローニング
表１に同定されている配列番号５および配列番号６のＰＣＲ増幅プライマーを用いてＨＳＶ−１（系統ＡＴＣＣ：ＶＲ−５３９）からのＤＮＡについてＰＣＲを行った。これらのプライマーを使用して、ＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）遺伝子内の１５２塩基対フラグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをｐＵＣ１９プラスミドベクター（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に挿入した。組み換えクローンをＨＳＶＩＧＧプラスミド＃１と命名した。プラスミド＃１ＤＮＡをＢａｍＨ１制限酵素で消化することによって精製および線状化した。次に、ＤＮＡをＱＩＡクイック（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）スピンカラムを用いて精製し、蛍光ピコグリーン（登録商標）試薬で分析することによって定量した。将来の実験のために標的ＨＳＶ−１ＤＮＡの希釈物を１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡを含む水中で調製した。特異的ＨＳＶ−１系統の希釈物および各希釈物中のＨＳＶ−１検出の結果を図５に示した。「プラス」の記号はサンプル中にＨＳＶ−１の存在を示し、「マイナス」の記号は、サンプル中にＨＳＶ−１がないことを示し、疑問符はサンプルの汚染の疑いを示す。すべての系統は、サンプルＯ−２５２６を除いて、ストックの１：１０希釈で陽性であった。ストックの１：１，０００希釈で２３系統のうち２０系統が陽性であった。ストックの１：１００，０００希釈では、２３系統のうち１５系統が陽性であった。
【００７８】
（実施例２）
クローニングされたＨＳＶ−１ＤＮＡの増幅
ＨＳＶ−１ＤＮＡを検出するためのアッセイの最初のステップとして、実施例１で説明した標的核酸法を用いてＨＳＶ−１ＤＮＡの増幅のためのＳＤＡシステムを開発した。ＤＮＡ増幅アッセイの分析感度はクローニングされたプラスミドの希釈物を用いて評価した。８つの複製ＳＤＡ反応を各標的レベルで実施した。これら８つの反応は、反応あたり１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および０コピーの二本鎖ＤＮＡに等しい。増幅は、ＢＤプローブテックＥＴ装置（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）を使用し、各５０ｎＭのＨＳＶ１ＧＧＬＢ１．０およびＨＳＶ１ＧＧＲＢ１．０バンパープライマー、１００ｎＭのＨＳＶ１ＧＧＬＰ１．０左側増幅プライマー、５００ｎＭのＨＳＶ１ＧＧＲＰ１．０右側増幅プライマー、２５０ｎＭのＨＳＶ１ＧＧＡＤ１．０アダプタプライマー、５００ｎＭのＴＢＤ１０．２  Ｄ／Ｒ検出プライマーを用いて実施した。これらのプライマーの配列は表１に列記されている。最終のバッファ条件は、以下の通りである：１４３ｍＭビシン（Bicine）、８２ｍＭＫＯＨ、２５ＭＭＫｉＰＯ４、１２．５％ＤＭＳＯ、５ｍＭ酢酸マンガン、５００ｍＭ２’−デオキシシトシン−５−ｏ−（１−チオトリホスフェート)（ｄＣｓＴＰ）、それぞれ１００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１００ｎｇ／μｌＢＳＡ、約１２単位のＢｓｔポリメラーゼ、および約３０単位のＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ。
【００７９】
蛍光を、１時間の過程で６０パスモニターした。結果を曲線の下の領域の換算、すなわち「ＭＯＴＡ」スコアーで表した。陽性のＭＯＴＡスコアーは、決まりきった実験によって容易に決定することができる。本発明の目的では、３５００以上のＭＯＴＡスコアーを「陽性」とみなした。アッセイが１００％の陽性の結果を与える最も低いレベルのＨＳＶ１ＧＧ標的ＤＮＡは反応あたり１００コピーである。８つの複製のうちの７つ（８７．５％）が反応あたり５０コピーの標的ＤＮＡでも陽性であった。
【００８０】
(実施例３）
ＳＤＡによる単純ヘルペス１ウイルス粒子の検出
ＨＳＶ−１を検出するための本発明のプライマーおよびプローブの能力を確認するために、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得たＨＳＶ−１の４系統、Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から得た１０系統、およびオハイオ州立大学（ＯＳＵ）からの１４の分類されていないＨＳＶサンプルについてＳＤＡを実施した。
【００８１】
ＨＳＶの分類されていない系統は、ＰＣＲによってＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の領域を増幅することにより特徴づけた。１セットの増幅プライマーを設計して、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方の同じ領域を増幅した。この２つのタイプのウイルスは、ＨＳＶ−１の系統から生成されるＰＣＲ産物中には存在しないＨＳＶ−２ＰＣＲフラグメント中のＡｐａｌ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の存在によって明確に区別できた。Ａｐａｌ制限酵素でインキュベートした場合、ＨＳＶ−２由来の増幅生成物を２つの短いフラグメントに開裂し、一方ＨＳＶ−１から得られるものは無傷のままである。制限されたフラグメントは、適切な対照とともにアガロースゲル電気泳動で解析した。
【００８２】
ＳＤＡシステムでＨＳＶの存在および非存在を評価するために使用されたウイルスストックの濃度は未知であった。ウイルスストックをリン酸塩緩衝食塩水で１：１０に希釈し、この懸濁液の１０μｌをＳＤＡで試験した。結果を表４に示す。ＨＳＶ−１のすべての系統がＨＳＶ−１増幅プライマーを用いて検出され、多様な起源からのＨＳＶ−１の系統を検出するための、開示されたプライマーおよびプローブの能力が実証された。Ａｐａｌ制限消化物によって分類されたＨＳＶの、以前には分類されていない１４の系統のうち、９つがＨＳＶ−１であると決定され、４つがＨＳＶ−２であると決定され、１つがＰＣＲによって増幅されなかった（表４および５参照）。
【００８３】
【表４】
0005587276.tif 000007
【００８４】
（実施例４）
ＳＤＡ法の分析感度
本発明で開示されたプライマーおよびプローブを使用したＨＳＶ−１アッセイの検出限界を決定するために、クローニングした標的核酸の希釈物およびウイルス粒子の一連の希釈物についてＳＤＡ反応を実施した。ウイルス粒子のストックを電子顕微鏡（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ）で数えた。１６の複製を各標的レベルで試験した。
【００８５】
アッセイの感度および特異性を確認するために、種々の地理的な位置から得た２３系統のＨＳＶ−１を、微生物ストックの１：１０、１：１，０００および１：１００，０００希釈で試験した。以前に分類されていない系統から、およびＱｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓからのサンプルの力価は未知であった。ＡＴＣＣからのＨＳＶ−１の２つのストックの力価はほぼ以下の通りであった：ＶＲ２６０、１．５×１０４ＴＣＩＤ／μｌおよびＶＲ−５３９、２．０×１０５ＴＣＩＤ／μｌ。結果を図５に示す。系統＃０−２５２６を除いて、すべての系統がストック懸濁液の１：１０希釈で陽性であった。２３系統のうち、試験した２０系統がストックの１：１０００希釈で陽性であり、試験した１５の系統が１：１００，０００の希釈で陽性であった。
【００８６】
（実施例５）
ＨＳＶ−１ＤＮＡに対するＳＤＡの特異性
ＨＳＶ−２の１６の系統をＨＳＶ１ＧＧＳＤＡシステムで試験した。ＨＳＶ−２希釈物の１０ミリリットルの各懸濁液を反応あたり添加した。試験した１７のストックのうちの１つがＨＳＶ１ＧＧシステムで陽性であった。結果を表５に示す。加えて、２３の他の微生物を、開示された本発明の方法のプライマーおよびプローブを用いて試験した。これらの微生物には、細菌、酵母および臨床標本中で遭遇するであろう他のウイルスが含まれる。試験された微生物のいずれもＨＳＶ−１に対して陽性ではなかった。結果を表６に示す。
【００８７】
【表５】
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【００８８】
【表６】
0005587276.tif 000009
【００８９】
（実施例６）
ＨＳＶ−２糖タンパク質−ＧＳＤＡ標的領域のクローニング
プライマーＨＳＶ２ＰＣＲＲおよびＨＤＶ２ＰＣＲＬを用いてＨＳＶ−２系統のＡＴＣＣ  ＶＲ−５４０からのＤＮＡについて、６９℃のアニーリング温度でＰＣＲを実施した。これらのプライマーは、ＨＳＶ−２の糖タンパク質Ｇ（ＵＳ４）遺伝子の範囲内の２５４塩基対フラグメントを増幅する。ｐＵＣ１８プラスミドベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に増幅したＤＮＡを挿入した。組み換えクローンにはｐＨＳＶ２−ＮＴ＃９−１という名を付けた。プラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化することにより精製し線状化した。ＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡクイックスピンカラムを用いて精製し、蛍光ピコグリーン（登録商標）試薬による分析で定量した。将来の実験のための標的ＤＮＡの希釈物を７ｎｇ／μｌのサーモン精子ＤＮＡを含有する水中で調製した。
【００９０】
（実施例７）
クローニングされたＨＳＶ−２ＤＮＡの増幅
ＤＮＡ増幅アッセイの分析感度はクローニングされたプラスミドの希釈物を用いて評価した。８つの複製ＳＤＡ反応をステム２．０および５．２を用いて各標的レベルで実施した。これら８つの反応は、反応あたり５００、２５０、１００、５０、２５、１０、および０コピーの二本鎖ＤＮＡに等しい。増幅は、ＢＤプローブテックＥＴ装置を使用し、各５０ｎＭのＨＳＶ２ＧＧＬＢ１．０およびＨＳＶ２ＧＧＲＢ１．０、１００ｎＭのＨＳＶ２ＧＧＬＰ１．０、５００ｎＭのＨＳＶ２ＧＧＲＰ２．０もしくは５．２、２５０ｎＭのＨＳＶ２ＧＧＡＤ１．０、５００ｎＭのＭＰＣ．Ｄ／Ｒを用いて実施した。これらのプライマーの配列は表２に列記されている。最終のバッファ条件は、以下の通りである：７１ｍＭビシン（Bicine）、５６．６ｍＭＫＯＨ、２３．９ｍＭＫＰＯ４、１５．４％ＤＭＳＯ、５ｍＭ酢酸マンガン、５００ｍＭ２’−デオキシシトシン−５−ｏ−（１−チオトリホスフェート)（ｄＣｓＴＰ）、それぞれ１００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１００μｇ／μｌＢＳＡ、約３．５１５単位のＢｓｔポリメラーゼ、および約３０単位のＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ。
【００９１】
蛍光を、１時間の過程で６０パスモニターした。結果を曲線の下の領域の換算、すなわち「ＭＯＴＡ」スコアーおよびＰＡＴスコアー（パス・アフター・スレッシュホールド）で表した。本発明の目的では、３５００以上のＭＯＴＡスコアーおよび０を超えるＰＡＴスコアーを「陽性」とみなした。アッセイが１００％の陽性の結果を与える最も低いレベルのＨＳＶ２ＧＧ標的ＤＮＡは、システム２．０および５．２の両方に対して反応あたり５０コピーである。８つの複製のうちの７つが、システム２．０に対して２５コピーで陽性であり、８つの複製のうちの６つが、システム５．２に対して２５コピーで陽性であった。
【００９２】
（実施例８）
ＳＤＡによるＨＳＶ−２ウイルス粒子の検出
ＨＳＶ−２を検出するための本発明のプライマーおよびプローブの能力を確認するために、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得たＨＳＶ−２の２系統、Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から得た９系統、およびＡｐａＩ分析によってＨＳＶ−２として分類されたオハイオ州立大学（ＯＳＵ）からの５系統についてＳＤＡを実施した。
【００９３】
ＯＳＵから得た系統は、ＰＣＲによってＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の領域を増幅することにより特徴づけた。１セットのＰＣＲプライマーを設計して、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方の同じ領域を増幅した。この２つのタイプのウイルスは、ＨＳＶ−１の系統から生成されるＰＣＲ産物中には存在しないＨＳＶ−２ＰＣＲフラグメント中のＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の存在によって明確に区別できた。ＡｐａＩ制限酵素でインキュベートした場合、ＨＳＶ−２由来のＰＣＲ生成物を２つの短いフラグメントに開裂し、一方ＨＳＶ−１から得られるものは無傷のままである。制限されたフラグメントは、適切な対照とともにアガロースゲル電気泳動で解析した。
【００９４】
ＳＤＡシステムを評価するために使用されたウイルスストックの濃度は未知であった。ウイルスストックをリン酸塩緩衝食塩水で１：１０に希釈し、この懸濁液の１０μｌをＳＤＡで試験した。結果を表７に示す。ＨＳＶ−２のすべての系統がシステム１．０、２．０および５．２からの増幅プライマーを用いて検出され、多様な起源からのＨＳＶ−１の系統を検出するための、開示されたプライマーおよびプローブの能力が実証された。
【００９５】
【表７−１】
0005587276.tif 000010
【００９６】
【表７−２】
0005587276.tif 000011
【００９７】
（実施例９）
ＨＳＶ−２ＤＮＡに対するＳＤＡの特異性
ＨＳＶ−１の２５の系統をＨＳＶ２ＧＧＳＤＡシステム１．０、２．０および５．２で試験した。ＨＳＶ−１希釈物の１０ミリリットルの各懸濁液を反応あたり添加した。試験した２５の系統のいずれもＨＳＶ−２システムで検出されなかった。結果を表８に示す。加えて、他の微生物のパネルを、開示された本発明の方法のプライマーおよびプローブを用いて試験した。これらの微生物には、細菌、酵母および臨床標本中で遭遇するであろう他のウイルスが含まれる。試験された微生物のいずれもＨＳＶ−１に対して陽性ではなかった。結果を表９に示す。
【００９８】
【表８−１】
0005587276.tif 000012
【００９９】
【表８−２】
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【０１００】
【表９】
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【図１】
0005587276.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
0005587276000001.app