(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質であるメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを生成物である２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに、少なくとも６０％の立体異性体過剰率（％）で変換することができるケトレダクターゼポリペプチドであって、該ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２または４または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を含み、ここで該参照配列は、以下の特徴：
Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである；
Ｘ１９９に対応する残基がヒスチジンである；および
Ｘ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンである、
を有し、但し、該ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ９４に対応する該残基が、アラニンまたはトレオニンであり；Ｘ１９９に対応する該残基が、アラニン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり；およびＸ２０２に対応する該残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ９４に対応する前記残基がトレオニンである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ４に対応する残基が、システインである；
Ｘ１１に対応する残基が、フェニルアラニンである；
Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ８６に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、バリンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１０５に対応する残基が、グリシンである；
Ｘ１２９に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである；
Ｘ１５３に対応する残基が、アラニンまたはセリンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、ヒスチジンまたはプロリンである；
Ｘ１９５に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、フェニルアラニンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、バリンである；
Ｘ２４８に対応する残基が、リジン、またはアルギニンである；
Ｘ２４９に対応する残基が、トリプトファンである；
の１つ以上をさらに有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６、５０、５２、５４、５６、または５８からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
ａ）少なくとも９０％の立体異性体過剰率（％）で、前記基質を前記生成物に変換することができるか；または
ｂ）少なくとも９５％の立体異性体過剰率（％）で、該基質を該生成物に変換することができるか；または
ｃ）少なくとも９９％の立体異性体過剰率（％）で、該基質を該生成物に変換することができるか；または
ｄ）配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも１５倍大きい比率で、該基質を該生成物に変換することができるか；または
ｅ）配列番号４８の該参照ポリペプチドよりも少なくとも３０倍大きい比率で、該基質を該生成物に変換することができるか；または
ｆ）配列番号４８の該参照ポリペプチドよりも少なくとも４０倍大きい比率で、該基質を該生成物に変換することができるか；または
ｇ）配列番号４８の該参照ポリペプチドよりも少なくとも５０倍大きい比率で、該基質を該生成物に変換することができる、
ポリペプチド。
【請求項７】
ａ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４２、５０、５２、５６、または５８からなるアミノ酸配列を含むか、
ｂ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、４２、５０、５２、５６、または５８からなるアミノ酸配列を含むか、
ｃ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、２０、２２、２４、３０、３２、または３４からなるアミノ酸配列を含むか、
ｄ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または５０からなるアミノ酸配列を含むか、
ｅ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３４からなるアミノ酸配列を含むか、
ｆ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、または２２からなるアミノ酸配列を含むか、または
ｇ）のポリペプチドが、配列番号６、８、１０、または１２からなるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４５、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６７、７１、７３、７５、７７、または８１からなる配列である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
宿主細胞において発現を指図するのに適した制御配列に作動可能に連結された請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のケトレダクターゼ、および式（Ｉ）の化合物であるメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートまたは式（ＩＩ）の化合物である２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートを含む、組成物。
【請求項１３】
前記基質が、式（Ｉ）の化合物であり、前記生成物が、式（ＩＩ）の化合物である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
式（Ｉ）の基質であるメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを、式（ＩＩ）の生成物である２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元する方法であって、該方法は、該基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するのに適した反応条件下で、該基質を請求項１〜７のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるか、またはインキュベーションすることを含む、方法。
【請求項１５】
前記生成物が９９％より大きい立体異性体過剰率（％）で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式（ＩＶａ）：
【化３６】
0005646328.tif 000062
（式中、Ｒ１はＨまたは水酸基の保護基であり、Ｒ１０はハロゲンまたは−ＯＡｃであり、ここでＡｃはアセタートである）の中間体を合成する方法であって、
該方法での工程は、式（Ｉ）の基質を請求項１〜７のいずれか１項に記載のケトレダクターゼと、該基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
【請求項１７】
構造式（ＩＸ）
【化３７】
0005646328.tif 000063
（式中、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル（例えば、−ＣＨ３）であり；Ｒ３は、Ｈまたは水酸基の保護基であり；Ｒ４は、Ｈ、カルボキシ基の保護基、アンモニア基、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属であり；およびＸは、ＯＨまたは脱離基である）の中間体を合成する方法であって、
該方法での工程は、式（Ｉ）の基質を請求項１〜７のいずれか１項に記載のケトレダクターゼと、該基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
【請求項１８】
構造式（Ｖ）：
【化３８】
0005646328.tif 000064
(式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ５は置換または非置換アルキル、置換また
は非置換アリール、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、および置換または非置換ヘテロアリールアルキルから選択され；およびＲ６は、Ｈまたは加水分解可能なエステル基である）のカルバペネムまたはその溶媒和物、水和物、および塩を合成する方法であって、
該方法での工程は、式（Ｉ）の基質を請求項１〜６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼと、該基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
【請求項１９】
ａ）前記カルバペネムが、構造式（Ｘ）：
【化３９】
0005646328.tif 000065
を有するか：または
ｂ）該カルバペネムが、構造式（ＸＩ）：
【化４０】
0005646328.tif 000066
を有するか：または
ｃ）該カルバペネムが、構造式（ＸＩＩ）：
【化４１】
0005646328.tif 000067
を有するか：または
ｄ）該カルバペネムが、構造式（ＸＩＩＩ）：
【化４２】
0005646328.tif 000068
を有する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００７年１０月１日に出願された米国特許出願第６０／９７６，５５５号の利益を、米国特許法§１１９（ｅ）のもとに主張する。米国特許出願第６０／９７６，５５５号の内容は、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
（配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照）
米国特許法施行規則１．８２１のもと、ファイル名３７６２４７−０２２．ｔｘｔとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータ読み取り可能形態（ＣＲＦ）で本明細書と同時に提出された配列表は、その全体が参考により本明細書中に援用される。該配列表の電子コピーは、２００８年１０月１日に、１５０Ｋｂｙｔｅのファイルサイズで作製された。
【背景技術】
【０００３】
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロ立体異性体ケトン基質または対応するラセミのアルデヒド基質から光学活性アルコールを合成するのに有用である。ＫＲＥＤは、典型的には、ケトンおよびアルデヒド基質を対応するアルコール生成物に変換するが、ＫＲＥＤはまた、逆反応（アルコール基質の対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化反応）を触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンやアルデヒドの還元およびアルコールの酸化は、補因子（最も一般的には、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ））を、酸化反応のために必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子ドナーとして働き、他方で、ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体として働く。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、リン酸化補因子または非リン酸化補因子のいずれか（その酸化された状態および還元された状態にある）を受け取ることが、しばしば観察される。
【０００４】
ＫＲＥＤ酵素は、広範囲の細菌および酵母において見出すことができる（概観のためには：非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。いくつかのＫＲＥＤ遺伝子およびＫＲＥＤ酵素の配列が報告されている。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）。
【０００５】
重要な化合物の製造のための多くの化学合成手順を回避するために、ケトレダクターゼが、様々なケト基質とアルデヒド基質をキラルアルコール生成物に変換するためにますます使用されている。これらの適用は、生体触媒的なケトンの還元のために全細胞、または全細胞中に複数のケトレダクターゼが存在する場合、所望の生成物の立体純度および収率に悪影響を与えるこうした場合の精製酵素を使用することができる。インビトロでの適用については、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ホルメートデヒドロゲナーゼなどの酵素を再生する補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）が、ケトレダクターゼとともに使用される。有用な化学的化合物を生成するためにケトレダクターゼを用いる例としては、４−クロロアセト酢酸エステル類の不斉還元（非特許文献４；非特許文献５；米国特許第５，５５９，０３０号；米国特許第５，７００，６７０号；米国特許第５，８９１，６８５号）、ジオキソカルボン酸類の還元（例えば、米国特許第６，３９９，３３９号）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサノエート（例えば、米国特許第６，６４５，７４６号および特許文献１）、ピロロトリアジン系化合物の還元（例えば、米国特許出願公開番号２００６／０２８６６４６）；置換アセトフェノン類の還元（例えば、米国特許第６，８００，４７７号）；およびケトチオラン類の還元（特許文献２）が挙げられる。
【０００６】
様々なケト基質をその対応するキラルアルコール生成物に変換するのに使用することができる他のケトレダクターゼ酵素を同定することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０１／４０４５０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５４４９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｒａｕｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌｓ．１＆２．ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９５
【非特許文献２】Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２０００
【非特許文献３】Ｈｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｋｕｌａ，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：１−１３
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３  １０５：５９２５−５９２６
【非特許文献５】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）１９８４：１３２−１３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート（「基質」）のラセミ混合物を２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（「生成物」）に還元する能力を有するケトレダクターゼポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該ポリペプチドを使用するための方法を提供する。２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートは、（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｒ）−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）エチル）−４−オキソアゼチジン−２−イルアセタート（「アゼチジノン；アセトキシアゼチジノン」；ＣＡＳ登録番号７６８５５−６９−１）の合成の中間体であり、そしてそれは、種々のカルバペネム抗生物質の製造において使われる中間体（最後から２番目の中間体）である。２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートから合成できるカルバペネム抗生物質は、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、ビオペネム、パニペネム、およびチエナマイシンに類似した他の化合物を含むが、これらに限定されるものではない。本開示の組み換えケトレダクターゼポリペプチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ（「Ｌ．ｋｅｆｉｒ」；配列番号４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（「Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ」；配列番号２），またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ（「Ｌ．ｍｉｎｏｒ」；配列番号８６）から得られる天然に存在する野生型のケトレダクターゼ酵素と比較して、特定の基質を対応するキラルアルコール生成物に還元する際に改良された特性を有する。いくつかの実施形態では、組み換えケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４８などの別の組み換えケトレダクターゼポリペプチドに比べて、改良された性質を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、２、および８６の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒ  ＫＲＥＤの配列に関して、少なくとも以下の特徴：残基２０２は、バリンまたはロイシンである、を有する。いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、配列番号４、２、および８６の配列に関して、以下の特徴の少なくとも２つを有する：（１）位置９４（すなわち、Ｘ９４）に対応する残基は、脂肪族、または極性の残基である、（２）位置１９９（すなわち、Ｘ１９９）に対応する残基は、脂肪族、極性、または拘束性の残基である、および（３）位置２０２（すなわち、Ｘ２０２）に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４、２、および８６の配列に関して、少なくとも以下の特徴：（１）位置Ｘ９４に対応する残基は、極性の残基である、（２）位置Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性の残基である、および（１）位置Ｘ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである、を有する。
【００１１】
上述した特徴に加えて、ケトレダクターゼは、配列番号２、４、または８６と比較して、他の残基位置で１つ以上の残基の違いを有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書のケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性の残基、特にアラニンまたはトレオニンである；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性の残基、特にアラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；およびＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである、を有する配列番号２、４または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより大きい同一性のアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴、すなわち、Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性の残基である；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性の残基である；およびＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである、を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、改良された性質が単一の残基の違い、または残基の違いの特定の組み合わせに由来するような場合には、組み換えケトレダクターゼは、参照配列と比較して、ポリペプチド中の他の位置における１つ以上の残基の違いを場合により含むことができる。いくつかの実施形態では、残基の違いは、保存的な突然変異を含む。いくつかの実施形態では、他の残基位置におけるさらなる残基の違いが取り込まれて、酵素特性でのさらなる改良を生じることができる。これらの改良は、定義された基質についての酵素活性をさらに増大し得るが、立体選択性、熱安定性、溶媒安定性、および／または還元型生成物の抑制における増大を含むこともできる。１つ以上の改良された酵素特性をもたらすことのできるいろいろな残基の違いは、詳細な説明において提供される。いくつかの実施形態では、改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８７（またはその領域、例えば残基９０〜２１１など）で配置される配列式に対応するアミノ酸配列を含む。配列番号８４は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ（配列番号４）の野生型アミノ酸配列に基づき；配列番号８３は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼ（配列番号２）の野生型アミノ酸配列に基づき；そして配列番号８７は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒケトレダクターゼ（配列番号８６）の野生型アミノ酸配列に基づく。配列番号８３、８４、および８７の配列式は、Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族、または極性の残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性、または極性の残基であり；そして、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであることを特定している。配列式は、詳細な説明において提供されるように、他の残基位置での特徴をさらに特定する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、組み換えケトレダクターゼポリペプチドは、基質を生成物に還元するための野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して、酵素活性を増大させることができた。酵素活性の改良は、ケトレダクターゼポリペプチドの特異的活性を標準的な酵素アッセイを用いて野生型ケトレダクターゼ酵素のそれと比較することによって測定することができる。改良の程度は、対応する野生型または参照ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の１．５倍（または１．５×）から、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上の大きさまで変動することができる。特定の実施形態では、組み換えケトレダクターゼ酵素は、野生型または参照ケトレダクターゼ酵素の酵素活性よりも、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍大きい改良された酵素活性を示す。酵素活性の改良は、また、立体選択性、立体特異性、熱安定性、溶媒安定性、または還元型生成物の抑制における増大を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、配列番号４８、および／または配列番号６６と比較して，酵素活性のそれらの比率（すなわち、基質を生成物に変換するそれらの比率）に関して、改良される。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４または配列番号９０の比率に対して、少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、５００倍、または１０００倍の比率で基質を生成物に変換することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率（％）または野生型Ｌ．Ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ（配列番号４）よりも大きい立体異性体過剰率（％）で変換することができる。この性質を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これに限定されるものではない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、少なくとも約６０〜８９％の立体異性体過剰率（％）および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約１〜１５倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これに限定されるものではない。配列番号４８のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドは、基質をある比率（例えば、ｐＨ８の５０％ＩＰＡ中、ＫＲＥＤの約１０ｇ／Ｌを用いて、１ｇ／Ｌの基質を２０時間で１００％変換）および野生型（配列番号４）に対して改良された立体選択性でもって、生成物に変換することができるので、配列番号４８に対して改良された本明細書のポリペプチドは、また、野生型に対しても改良される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、少なくとも約９０〜９４％の立体異性体過剰率（％）で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４２、５０、５２、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、少なくとも約９５〜９９％の立体異性体過剰率（％）で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、４２、５０、５２、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率（％）で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、３０、３２、３４、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約１５〜３０倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、５０、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約３０〜４０倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、３０、３４、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約４０〜５０倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、２２、２４、および６０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約５０倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、および１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約５０倍大きい比率および少なくとも９９％の立体異性体過剰率（％）で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、８、１０、および１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、４０℃で２１時間、加熱処理した後に、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換する能力を保持することができるケトレダクターゼポリペプチドを提供する。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６、１０、および４４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
別の態様では、本開示は、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができるケトレダクターゼポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、これらのケトレダクターゼは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率（％）で変換することができる。典型的なポリペプチドは、配列番号６８、７２、７４、７６、７８、および８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約１倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０および８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ある立体異性体過剰率および野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ（配列番号４）よりも大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができるので、配列番号６６に対して改良された任意のポリペプチドは、また、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤに対しても改良される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，２Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約１〜２倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、および８０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，２Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約５倍大きい比率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号６４、７０、７２、７６、７８、および８０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，２Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約５倍大きい比率および少なくとも８５％の立体異性体過剰率で変換することができる。この特性を有する典型的なポリペプチドは、配列番号７２および７８に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記述された組み換えケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドまたは高度にストリンジェントな条件下でそのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、コードされた組み換えケトレダクターゼの発現のために有用なプロモーターと他の制御エレメントを含むことができ、特定の望ましい発現系のために最適化されたコドンを利用することができる。典型的なポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、および８１を含むが、これらに限定されるものではない。典型的なポリヌクレオチドは、また、配列番号８３、８４、および８７の配列式に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。
【００３２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記述されたポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒを含むことができ、あるいはまた、それらは別の生物であってもよい。宿主細胞は、本明細書に記述された組み換えケトレダクターゼ酵素の発現および単離のために使用することができ、あるいはまた、それらは、基質を立体異性体生成物に変換するために直接使用することもできる。
【００３３】
全細胞、細胞抽出物または精製ケトレダクターゼ酵素を用いる方法を実施するかどうかに関わらず、単一のケトレダクターゼ酵素が使われてもよいし、あるいはまた、２つ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が使われてもよい。
【００３４】
上記したように、いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）：
【００３５】
【化１】
0005646328.tif 000002
の化合物（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート（「基質」））中のケト基を、構造式（ＩＩ）：
【００３６】
【化２】
0005646328.tif 000003
の対応する立体異性体アルコール生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（「生成物」））とする還元反応を触媒することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）の化合物中のケト基の還元反応を触媒して、構造式（ＩＩＩ）：
【００３８】
【化３】
0005646328.tif 000004
の対応する立体異性体アルコール生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（これはまた、「生成物」と呼ぶこともできる）とすることができる。
【００３９】
したがって、いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）の基質を構造式（ＩＩ）または構造式（ＩＩＩ）のアルコール生成物に還元するための方法が、本明細書で提供され、該方法は、基質を構造式（ＩＩ）または構造式（ＩＩＩ）の生成物に還元するのに適した反応条件下で、本開示のケトレダクターゼポリペプチドと基質を接触させるか、またはインキュベーションすることを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、構造式（ＩＩ）の生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）は、スキーム３：
【００４１】
【化４】
0005646328.tif 000005
で示されるように、中間体やカルバペネム化合物を合成するのに用いることができる。
【００４２】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＩＶａ）：
【００４３】
【化５】
0005646328.tif 000006
(式中、Ｒ１はＨまたは水酸基の保護基であり、Ｒ１０は、ハロゲン（例えば、Ｃｌ）、または−ＯＡｃ（Ａｃは、アセタートである）である)の中間体を合成するための方法で使用することができる。したがって、構造式（ＩＶａ）の中間体の合成のための方法では、該方法の工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するか、または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＶＩ）：
【００４５】
【化６】
0005646328.tif 000007
(式中、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル（例えば、−ＣＨ３）であり；Ｒ３は、Ｈまたは水酸基の保護基であり；Ｒ４は、Ｈ、カルボキシ基の保護基、アンモニア基、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属であり；そしてＸは、ＯＨまたは脱離基である)の中間体の合成に使用することができる。典型的な脱離基は、限定されるものではないが、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）またはＯＳ（Ｏ２）Ｒ”であり、そこではＲ’とＲ”は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルカリル、アリール、パーフルオロＣ１−Ｃ６アルキルである。したがって、いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）の中間体の合成のための方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（Ｖ）：
【００４７】
【化７】
0005646328.tif 000008
(式中、Ｒ２はＨまたは−ＣＨ３であり；Ｒ５は，いろいろな置換基（限定されるものではないが、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、および置換または非置換ヘテロアリールアルキルを含む）であることができ；そして、Ｒ６はＨまたは加水分解可能なエステル基などのプロ基である)のカルバペネム系治療化合物またはその溶媒和物、水和物、塩、およびプロドラッグを合成するためのプロセスで使用することができる。したがって、構造式（Ｖ）の化合物の合成方法では、該方法での工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含むことができる。構造式（Ｖ）の典型的なカルバペネムは、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、ビオペネム、およびパニペネムを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、スロペネム化合物を合成する方法での、およびスロペネムの合成に使用される中間体でのケトレダクターゼの使用をさらに提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに、少なくとも約６０％の立体異性体過剰率（％）で変換することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２）
以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである；Ｘ１９９に対応する残基がヒスチジンである；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンである、を有する配列番号２または４または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％が同一であるアミノ酸配列を含み、但し、Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族または極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する、項目１記載のポリペプチド。
（項目３）
Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）
Ｘ９４に対応する残基が、極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）
Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり、Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ４に対応する残基が、塩基性残基またはシステインである；
Ｘ１１に対応する残基が、非極性、脂肪族、または芳香族残基である；
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ８６に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１０５に対応する残基が、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；
Ｘ１２９に対応する残基が、非極性、または極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１５３に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９０に対応する残基が、芳香族、または拘束性残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２４８に対応する残基が、非極性、または塩基性残基である；  
Ｘ２４９に対応する残基が、芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有し、ここで該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目８）
ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ４に対応する残基が、システインである；
Ｘ１１に対応する残基が、フェニルアラニンである；
Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ８６に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、バリンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１０５に対応する残基が、グリシンである；
Ｘ１２９に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである；
Ｘ１５３に対応する残基が、アラニンまたはセリンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、ヒスチジンまたはプロリンである；
Ｘ１９５に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、フェニルアラニンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、バリンである；
Ｘ２４８に対応する残基が、リジン、またはアルギニンである；
Ｘ２４９に対応する残基が、トリプトファンである；
の１つ以上をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
の１つ以上をさらに有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性であるか、芳香族であるか、非極性であるか、または脂肪族である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２４８に対応する残基が、非極性、または塩基性残基である；
Ｘ２４９に対応する残基が、芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有する、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ４に対応する残基が、塩基性残基またはシステインである；
Ｘ１１に対応する残基が、非極性、脂肪族、または芳香族残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ８６に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ１０５に対応する残基が、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；
Ｘ１２９に対応する残基が、非極性、または極性残基である；
Ｘ１５３に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９０に対応する残基が、芳香族、または拘束性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性、または芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有する、項目９または１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
を有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
を有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである、を有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである、を有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである；およびＸ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである、を有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ケトレダクターゼポリペプチドが、以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである；Ｘ１９９に対応する残基がヒスチジンである；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンである、を有する配列番号２、４または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対して、少なくとも８５％が同一であるアミノ酸配列を有する領域またはドメインを含み；但し、該ケトレダクターゼドメインまたは領域は、Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族または極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基がロイシンまたはバリンであるアミノ酸配列を有する、項目１記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ９４に対応する残基がトレオニンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ１９９に対応する残基がアラニン、ヒスチジンまたはアスパラギンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ９４に対応する残基が極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ９４に対応する残基がトレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基がアラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２３）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１０５に対応する残基が、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；
Ｘ１２９に対応する残基が、非極性、または極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１５３に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９０に対応する残基が、芳香族、または拘束性残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性、または芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメインでの他のアミノ酸残基位置において１つ以上の違いを場合により有する、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２４）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、バリンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１０５に対応する残基が、グリシンである；
Ｘ１２９に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである；
Ｘ１５３に対応する残基が、アラニンまたはセリンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、ヒスチジンまたはプロリンである；
Ｘ１９５に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、フェニルアラニンである；
の１つ以上をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメインでの他のアミノ酸残基位置において１つ以上の違いを場合により有する、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２６）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２７）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２８）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２９）
少なくとも約９０％の立体異性体過剰率（％）で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３０）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４２、５０、５２、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３１）
少なくとも約９５％の立体異性体過剰率（％）で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３２）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、４２、５０、５２、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３１に記載のポリペプチド。
（項目３３）
少なくとも約９９％の立体異性体過剰率（％）で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３４）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、３０、３２、３４、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３５）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも１５倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３６）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、５０、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３５に記載のポリペプチド。
（項目３７）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも３０倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３８）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、３０、３４、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３７に記載のポリペプチド。
（項目３９）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも４０倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４０）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２２、および６０に対応するアミノ酸配列を含む、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４１）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも５０倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４２）
配列番号６、８、１０、および１２に対応するアミノ酸配列を含む、項目４１に記載のポリペプチド。
（項目４３）
基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを生成物２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率（％）で変換することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目４４）
配列番号６８、７２、７４、７６、７８、および８２に対応するアミノ酸配列を含む、項目４３に記載のポリペプチド。
（項目４５）
項目１〜４２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目４６）
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４５、４９、５１、５３、５５、５７、５９、または６１に対応する配列である、項目４５に記載のポリヌクレオチド。
（項目４７）
項目４３または４４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目４８）
配列番号６７、７１、７３、７５、７７、または８１に対応する配列である、項目４７に記載のポリヌクレオチド。
（項目４９）
宿主細胞での発現を方向づけるのに適した制御配列に作動可能に連結された項目４５または４７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目５０）
前記制御配列がプロモーターを含む、項目４９に記載の発現ベクター。
（項目５１）
前記プロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターを含む、項目５０に記載の発現ベクター。
（項目５２）
前記制御配列が分泌シグナルを含む、項目５０に記載の発現ベクター。
（項目５３）
項目４９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目５４）
Ｅ．ｃｏｌｉである、項目５３に記載の宿主細胞。
（項目５５）
項目１〜４２のいずれか１項に記載のケトレダクターゼ、および化合物メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートまたは化合物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートを含む、組成物。
（項目５６）
前記化合物が、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートである、項目５５に記載の組成物。
（項目５７）
補因子再生系をさらに含む、項目５５に記載の組成物。
（項目５８）
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース；ホルメートデヒドロゲナーゼとホルメート；またはイソプロパノールと第２級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを、生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元する方法であって、該方法は、基質を生成物に還元するのに適した反応条件下で、該基質を項目１〜４２のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるか、またはインキュベーションすることを含む、方法。
（項目６０）
前記生成物が約９９％より大きい立体異性体過剰率（％）で存在する、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施される、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、還元反応が、ケトレダクターゼのための補因子および場合により補因子のための再生系の存在下で実施される、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース；ホルメートデヒドロゲナーゼとホルメート；またはイソプロパノールと第２級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６４）
前記第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
式（ＩＶａ）：
【化３６】
0005646328.tif 000009
（式中、Ｒ１はＨまたは水酸基の保護基であり、Ｒ１０はハロゲンまたは−ＯＡｃであり、ここでＡｃはアセタートである）の中間体を合成する方法であって、
該方法の工程は、基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを項目１〜４２のいずれか１項に記載のケトレダクターゼと、該基質を生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
（項目６６）
構造式（ＩＸ）
【化３７】
0005646328.tif 000010
（式中、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ３は、Ｈまたは水酸基の保護基であり；Ｒ４は、Ｈ、カルボキシ基の保護基、アンモニア基、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属であり；およびＸは、ＯＨまたは脱離基である）の中間体を合成する方法であって、
該方法での工程は、基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを項目１〜４２のいずれか１項に記載のケトレダクターゼと、該基質を生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
（項目６７）
構造式（Ｖ）：
【化３８】
0005646328.tif 000011
(式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ５は置換または非置換アルキル、置換また
は非置換アリール、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、および置換または非置換ヘテロアリールアルキルから選択され；およびＲ６は、Ｈまたはプロ基である）のカルバペネムまたはその溶媒和物、水和物、塩もしくはプロドラッグを合成する方法であって、
該方法での工程は、基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを項目１〜４２のいずれか１項に記載のケトレダクターゼと、該基質を生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
（項目６８）
前記カルバペネムが、構造式（Ｘ）：
【化３９】
0005646328.tif 000012
を有する、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記カルバペネムが、構造式（ＸＩ）：
【化４０】
0005646328.tif 000013
を有する、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記カルバペネムが、構造式（ＸＩＩ）：
【化４１】
0005646328.tif 000014
を有する、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記カルバペネムが、構造式（ＸＩＩＩ）：
【化４２】
0005646328.tif 000015
を有する、項目６７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】式（Ｉ）の基質化合物の式（ＩＩ）の対応する生成物への変換におけるケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）の役割を示す。この還元は、本発明のＫＲＥＤとＮＡＤＰＨなどの補因子を使用する。イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）は、ＮＡＤＰＨへのＮＡＤＰ＋の変換／再生に使用される。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（詳細な説明）
１．１  定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００５１】
「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、カルボニル基をその対応するアルコールに還元する酵素能を有するポリペプチドを意味するために本明細書では互換的に使用される。より詳しくは、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、式（Ｉ）（上記）の化合物を式（ＩＩ）（上記）の対応する生成物に立体選択的に還元することができる。ポリペプチドは、一般的に、還元剤として補因子の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を利用する。本明細書で使用される場合、ケトレダクターゼは、天然に存在する（野生型）ケトレダクターゼのみならず、人間の操作によって生成する天然に存在しない組み換えポリペプチドを含む。
【００５２】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）のその部分を意味する。
【００５３】
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を意味する。例えば、天然に存在する、または野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然資源から単離することができ、そして人間の操作により意図的に改変されていない生物に存在する配列である。
【００５４】
例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに言及して使われる場合の「組み換え」は、そうでなければ天然には存在しない方法で改変された、またはそれと同一であるが、合成材料から、および／または組み換え技術を用いる操作によって生産または誘導される材料、または材料の天然のもしくは未変性の形態に対応する材料を意味する。非限定的な例は、特に、細胞の未変性（非組み換え型）な形態では見られない遺伝子を発現する、またはそうでなければさまざまなレベルで発現される未変性の遺伝子を発現する組み換え細胞を含む。
【００５５】
「配列の同一性パーセント」および「パーセント相同性」は、ポリヌクレオチドとポリペプチドとの間の比較を意味するために本明細書では互換的に使用され、比較ウインドウでの２つの配列の最適配列の比較により決定されるが、そこでは比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、参照配列（それは、付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（つまり、ギャップ）を含み得る。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在して一致する位置の数を与えるその位置での位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウでの位置の総数により割り、その結果を１００倍して配列の同一性のパーセントを得ることにより算出される。あるいはまた、パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基のいずれかが、両方の配列中に存在して、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップをもって配列されて一致する位置の数を与えるその位置での位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウでの位置の総数により割り、その結果を１００倍して配列の同一性のパーセントを得ることにより算出される。当業者であれば、２つの配列を一列に並べるために利用可能な多くの確立したアルゴリズムがあることを理解する。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、相同性アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、類似度法の検索（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化手段（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、または視覚検査（一般的にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）。配列の同一性パーセントと配列類似性を決定するのにふさわしいアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムがあり、それらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通して一般に公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一長さの単語と整列化した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するかまたはこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別することを含む。Ｔを隣接単語スコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットは、それを含むさらに長いＨＳＰを見出だす検索を開始するためのシードとしての機能を果たす。次に、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、単語ヒットは各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合には、パラメータＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、またはどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。配列アライメントと％配列同一性の典型的な測定は、提供されるデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）で、ＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【００５６】
「参照配列」は、配列比較の根拠として使われる確定済み配列を指す。参照配列は、より大きな配列（例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメント）のサブセットである場合がある。通常、参照配列は、長さにおいて少なくとも２０個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基、長さにおいて少なくとも２５個の残基、長さにおいて少なくとも５０個の残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列の間で類似している配列（すなわち、完全な配列の一部）を含むことができ、そして（２）２つの配列の間で異なる配列をさらに含み得るので、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、「比較ウインドウ」上の２つのポリヌクレオチドの配列を比較して配列類似性の局所領域を特定し、比較することにより一般的に実行される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、「参照配列」は、主要なアミノ酸配列に基づくことができ、そこでは、参照配列は主要な配列中に１つ以上の変化を有することできる配列である。例えば、「Ｘ２０２に対応する残基ロイシンまたはバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」は、配列番号４のＸ２０２に対応する残基がロイシンまたはバリンに変えられた参照配列を意味する。
【００５８】
「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の隣接ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを意味し、そこでは、配列が少なくとも２０の隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され、そして、比較ウインドウ中の配列の部分が、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（それは、付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０の隣接する残基より長くてもよく、そして、場合により、３０、４０、５０、１００またはそれより長いウインドウを含むことができる。
【００５９】
「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウに対する参照配列と比べて、しばしば少なくとも３０〜５０残基のウインドウに対する参照配列と比べて、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、および８９〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味し、そこでは、配列同一性のパーセントは、比較ウインドウ上の参照配列の合計２０％以下の付加または欠失を含む配列と参照配列とを比較することにより算出される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、例えば、デフォルト・ギャップ・ウエイトを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより、最適に一列配列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上の配列同一性（例えば９９％の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。
【００６０】
所定のアミノ酸またはポリヌクレオチドのナンバリングの文脈において使用されるとき、「〜に対応する」、「〜を参照して」または「〜と比較して」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する場合、特定の参照配列の残基のナンバリングを意味する。言い換えると、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の実際の番号位置によるよりもむしろ参照配列に関して示される。例えば、所定のアミノ酸配列（組み換えケトレダクターゼなどの配列）は、２つの配列の間で残基のマッチングを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に整列させることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の残基のナンバリングは、それが整列した参照配列に関してなされる。
【００６１】
「立体選択性」は、一方の立体異性体の他方の立体異性体に対する化学反応または酵素反応における優先的な形成を意味する。立体選択性は、部分的であり、そこでは、一方の立体異性体の形成が他方に対して有利に働くか、一方の立体異性体だけが形成されて反応が終了する。立体異性体がエナンチオマーであるとき、立体選択性はエナンチオ選択性（両方の合計中の一方のエナンチオマーの分数（一般にパーセントとして報告される））と呼ばれる。あるいはまた、それは、エナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として、当該分野で（一般的にパーセントとして）報告されており、それは式［主要エナンチオマー−微量エナンチオマー］／［主要エナンチオマー＋微量エナンチオマー］に従い、そこから計算される。立体異性体がジアステレオマーである場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性と呼ばれ、それは２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの分数（パーセントとして一般に報告される）として、通常は互換的にジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告されている。エナンチオマー過剰率とジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の類型である。
【００６２】
「高度立体選択性の」は、基質を化学式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有する対応する生成物に、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で変換または還元することができるケトレダクターゼポリペプチドを意味する。
【００６３】
「立体特異性」は、一方の立体異性体の別の立体異性体に対する化学反応または酵素反応における優先的な変換を意味する。立体特異性は、部分的であり、そこでは、一方の立体異性体の形成が他方に対して有利に働くか、一方の立体異性体だけが変換されて立反応が終了する。
【００６４】
「化学的選択性」は、一方の生成物の別の生成物に対する化学反応または酵素反応における優先的な形成を意味する。
【００６５】
「改良された酵素特性」は、参照ケトレダクターゼと比較して任意の酵素特性の改良を示すケトレダクターゼポリペプチドを意味する。本明細書に記述される組み換えケトレダクターゼポリペプチドに関して、比較は通常、野生型ケトレダクターゼ酵素に対してなされるが、しかし、いくつかの実施形態では、参照ケトレダクターゼは、別の改良された組み換えケトレダクターゼであってもよい。改良が望ましい酵素特性は、限定されるものではないが、酵素活性（それは、基質の変換率（％）により表記できる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子要件、阻害剤（例えば、生成物阻害）に対する抵抗性、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）を含む。
【００６６】
「増大した酵素活性」は、組み換えケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性を意味し、それは、参照ケトレダクターゼ酵素と比較して、特異的活性（例えば、産生された生成物／時間／タンパク質量）の増加または生成物への基質の変換率（％）の増加（例えば、特定量のＫＲＥＤを使用した、特定時間に開始量の基質の生成物への変換率（％））によって表わすことができる。酵素活性を測定する典型的な方法は、実施例に提供される。酵素活性に関する任意の特性は、影響を受けるかもしれないが、それは、その変化が増加した酵素活性をもたらすことができるＫｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む。酵素活性の改良は、対応する野生型ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、天然に存在するケトレダクターゼまたは別の組み換えケトレダクターゼ（それからケトレダクターゼポリペプチドが誘導された）よりも、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれより大きい酵素活性である。特定の実施形態では、組み換えケトレダクターゼ酵素は、親のケトレダクターゼ酵素のそれより１．５〜５０倍、１．５〜１００倍大きな範囲で、改良された酵素活性を示す。任意の酵素の活性は、触媒のターンオーバー率が、基質（任意の必要とされる補因子を含む）の拡散率を超えることができないように任意の酵素の拡散が制限されることは、当業者に理解される。拡散限界の理論的最大値、ｋｃａｔ／Ｋｍは、通常、約１０８〜１０９（Ｍ−１ｓ−１）である。したがって、ケトレダクターゼの酵素活性のいかなる改良も、ケトレダクターゼ酵素の作用を受ける基質の拡散率に関して上限を有する。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために使用される標準的なアッセイのいずれかによって測定（例えば、アルコールへのケトンの同時還元を伴うＮＡＤＰＨの酸化による吸光度または蛍光の減少、または共役アッセイで生じる生成物の測定）することができる。酵素活性の比較は、本明細書でさらに詳述するように、確定した酵素製剤、設定された条件下での確定したアッセイ、および１つ以上の確定した基質を用いて行われる。通常、細胞溶解物が比較されるとき、細胞の数とアッセイされるタンパク質の量が測定されるのみならず、宿主細胞によって生産され、そして細胞溶解物中に存在する酵素量における変動を最小にするために、同一の発現系と同一の宿主細胞が使用される。
【００６７】
「変換」は、対応する生成物に基質を酵素的に還元することを意味する。「変換率（％）」は、特定の条件下で一定期間内に生成物に還元される基質のパーセントを意味する。このように、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「変換率（％）」として表記することができる。
【００６８】
「熱安定性」は、未処理の酵素と比較して、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）、高い温度（例えば、４０〜８０℃）に曝された後、同様の活性（例えば、６０％〜８０％よりも大きい）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを意味する。
【００６９】
「溶媒安定性」は、未処理の酵素と比較して、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）、種々の濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、その他）へ曝した後、同様の活性（例えば、６０％〜８０％より大きい）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを意味する。
【００７０】
「ｐＨ安定性」は、未処理の酵素と比較して、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）、高ｐＨまたは低ｐＨ（例えば、４．５〜６または８〜１２）に曝した後、同様の活性（例えば、６０％〜８０％より大きい）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを意味する。
【００７１】
「熱安定性および溶媒安定性」は、熱安定性のみならず、溶媒安定性であるケトレダクターゼポリペプチドを意味する。
【００７２】
組み換えケトレダクターゼ酵素の文脈において本明細書で使用される「由来の」は、ケトレダクターゼ酵素起源、および／または組み換えがそれに基づくそのようなケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を識別する。例えば、配列番号６０の組み換えケトレダクターゼ酵素は、配列番号４のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒのケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を何世代にも渡って人工的に進化させることにより得た。このように、この組み換えケトレダクターゼ酵素は、配列番号４の野生型ケトレダクターゼに「由来」する。
【００７３】
「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２，１９８４）の標準化された共通疎水性度スケールに従ってゼロ未満の疎水性度を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）を含む。
【００７４】
「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれるとき、約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。酸性アミノ酸は、水素イオンの喪失により、生理的ｐＨで負に帯電した側鎖を一般的に有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸は、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）を含む。
【００７５】
「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれるとき、約６より大きいｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの会合により、生理的ｐＨで正に帯電した側鎖を一般的に有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸は、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）を含む。
【００７６】
「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで帯電されていないが、しかし、２つの原子によって共通して共有される電子対が原子のうちの１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる極性アミノ酸は、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）を含む。
【００７７】
「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２，１９８４）の標準化された共通疎水性度スケールに従ってゼロより大きい疎水性度を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸は、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）を含む。
【００７８】
「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香環またはヘテロ芳香環を含む側鎖を有する親水性もしくは疎水性のアミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸は、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）を含む。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａのために、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、しばしば塩基性アミノ酸として、あるいはその側鎖がヘテロ芳香族環を含んでいるので芳香族残基として分類されるけれども、本明細書でのヒスチジンは、親水性残基として、または「拘束性残基」として分類される（下記を参照のこと）。
【００７９】
「拘束性アミノ酸または残基」は、拘束幾何形状を有するアミノ酸または残基を意味する。本明細書では、拘束性アミノ酸は、Ｌ−ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−ｈｉｓ（Ｈ）を含む。ヒスチジンは、拘束幾何形状を有するが、これは、比較的小さなイミダゾール環を有するからである。プロリンは、拘束幾何形状を有するが、これは、５員環をも有するからである。
【００８０】
「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで帯電しないで、２つの原子によって共通して共有される電子対が２つの原子のうちのそれぞれによって平等に保持される結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は、極性ではない）を有する疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸は、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）を含む。
【００８１】
「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を意味する。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）を含む。
【００８２】
「システイン」またはＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、それが他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル−またはスルフヒドリル−含有アミノ酸とでジスルフィド橋を形成することができるという点で珍しい。「システイン様残基」は、システインおよびジスルフィド橋の形成に使えるスルフヒドリル部分を含む他のアミノ酸を含む。還元型遊離−ＳＨまたは酸化型ジスルフィド橋のいずれかの形態でペプチド中に存在するＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）が、正味の疎水性または親水性の性質をペプチドに与えるかどうかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、上記）の標準化共通スケールによって０．２９の疎水性度を示すけれども、本開示の目的のために、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自身のユニークなグループに分類されることを理解すべきである。
【００８３】
「小さなアミノ酸または残基」は、合計３個以下の炭素原子および／またはヘテロ原子（α−炭素と水素を除く）から成る側鎖を有するアミノ酸または残基を意味する。小さなアミノ酸または残基は、上記の定義に従って、脂肪族の、非極性の、極性の、または酸性の小さなアミノ酸または残基にさらに分類され得る。遺伝的にコードされる小さなアミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）を含む。
【００８４】
「水酸基含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含むアミノ酸を意味する。遺伝的にコードされる水酸基含有アミノ酸は、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）を含む。
【００８５】
「保存的」アミノ酸置換または変異は、類似した側鎖を有し、したがってポリペプチド中のアミノ酸が同一または類似した定義済みクラス内でのアミノ酸による置換を一般に含む残基の互換性を意味する。しかし、本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、保存的な変異が、その代わりに、脂肪族残基から脂肪族残基への、非極性残基から非極性残基への、極性残基から極性残基への、酸性残基から酸性残基への、塩基性残基から塩基性残基への、芳香族残基から芳香族残基への、または拘束性残基から拘束性残基への置換であるならば、保存的な変異は、親水性残基から親水性残基への、疎水性残基から疎水性残基への、水酸基含有残基から水酸基含有残基への、または小さな残基から小さな残基への置換を含まない。さらに、本明細書で使用される場合、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩは、別の脂肪族残基に、または別の非極性残基に保存的に変異することができる。下記の表は、典型的な保存的置換を表す。
【００８６】
【表１】
0005646328.tif 000016
「非保存的置換」は、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸でポリペプチド中のアミノ酸を置換または変異させることを意味する。非保存的な置換は、上にリストされた定義済みグループ内よりもむしろ、グループ間のアミノ酸を使用することができる。１つの実施形態では、非保存的な変異は、（ａ）置換領域でのペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに対するプロリン）（ｂ）疎水性度の変化、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。
【００８７】
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を意味する。欠失は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸の除去を含むことができ、そして、それは酵素活性を保持および／または組み換えケトレダクターゼ酵素の改良された特性を保持しながら、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数の最高１０％の欠失、アミノ酸の総数の最高２０％の欠失、またはアミノ酸の総数の最高３０％の欠失である。欠失は、ポリペプチドの内部の部分および／または終端の部分に向けることができる。いろいろな実施形態では、欠失は連続セグメントから成ることができるか、あるいは非連続的であり得る。
【００８８】
「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を意味する。いくつかの実施形態では、改良された組み換えケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入のみならず、他の改良されたケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部の部分、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対してである。本明細書で使用される場合、挿入は、当該分野で知られているように、融合タンパク質を含む。挿入はアミノ酸の隣接セグメントであってもよく、あるいは天然に存在するポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸により分離されていてもよい。
【００８９】
「断片」は、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを意味するが、残存するアミノ酸配列は、配列中の対応する位置が同一である。断片は、少なくとも１４個のアミノ酸の長さ、少なくとも２０個のアミノ酸の長さ、少なくとも５０個のアミノ酸の長さ、またはそれより長い長さであることができ、全長ケトレダクターゼポリペプチド（例えば、配列番号２、４、または８６のポリペプチド）の最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％を占める。
【００９０】
「単離ポリペプチド」は、生来的にそれを伴う他の汚染物質（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されるポリペプチドを意味する。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。改良されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在するか、細胞媒体に存在するか、またはいろいろな形態（例えば、細胞溶解物または単離製剤など）で調製され得る。このように、いくつかの実施形態においては、改良されたケトレダクターゼ酵素は、単離ポリペプチドであり得る。
【００９１】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な種（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、それが他のどの個々の高分子種よりもその組成物中で豊富である）であり、対象種が高分子種の少なくとも約５０％（モル％または重量％）から成るとき、一般に実質的に精製された組成物である組成物を意味する。一般に、実質的に精製されたケトレダクターゼ組成物は、モル比または％重量で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上を含むであろう。いくつかの実施形態では、対象種は、本質的な均一性（すなわち、汚染物質種が従来の検出方法ではその組成物中に検出できない）まで精製され、そこでは、組成物は単一の高分子種から本質的に成る。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。いくつかの実施形態では、単離され、改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００９２】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、その下で核酸ハイブリッドが安定である条件に言及するために本明細書では使用される。当業者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）で反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのためのＴｍ値は、融点を予測する既知の方法を使用して算出することができる（参照：例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら、１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：６４０９−６４１２（誤植，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら，編集），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＷｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７−２５９。全ての刊行物は、引用により本明細書に取り込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードして、本開示の組み換えケトレダクターゼ酵素をコードする配列の相補体と適度のストリンジェンシー条件下または高ストリンジェンシー条件下などの定義済みの条件下でハイブリダイズする。
【００９３】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションでの洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件を意味する。通常、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件下で行われ、次いで種々の、高ストリンジェンシーで洗浄される。「適度のストリンジェントハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸を標的ＤＮＡに結合することを可能とする条件を意味する；標的ポリヌクレオチドに対しては約９０％超の同一性を有する。典型的な適度のストリンジェンシー条件は、４２℃における５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションに等価な条件であり、次いで、４２℃において０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で洗浄される。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、定義されたポリヌクレオチド配列の溶液条件下で測定される、約１０℃または熱融解温度Ｔｍより低い条件を一般に意味する。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌ中に安定なハイブリッドを形成するこれらの核酸配列だけのハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。（つまり、ハイブリッドが６５℃での０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定でないならば、本明細書で考察されるように、それは高ストリンジェンシー条件の下で安定でない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃における５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに等価な条件でのハイブリダイゼーション、次いで、６５℃での０．１×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳでの洗浄により提供される。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃での０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションに等価な条件でのハイブリダイゼーションおよび６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣによる洗浄である。他の高ストリンジェンシー条件は、適度のストリンジェンシー条件と同様に、上記の引用文献に記載されている。
【００９４】
「異種」ポリヌクレオチドは、実験室的技術によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを意味し、宿主細胞から除去され、実験室的操作を受けて、それから宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００９５】
「最適化されたコドン」は、コードされたタンパク質が関心のある生物で効率的に発現されるように、特定の生物で優先して使われるコドンへの、タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおけるコドンの変化を意味する。遺伝子暗号は、大部分のアミノ酸がいくつかのコドン（「同義語」または「同義の」コドンと呼ばれる）によって表わされる点で縮重するけれども、特定の生物によるコドン使用頻度は、無作為でなくて、特定のコドントリプレットに偏ることは周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所定の遺伝子、共通機能または先祖起源の遺伝子、高発現タンパク質対低コピー数のタンパク質、および生物ゲノムの集積タンパク質コード領域に関してより高い場合がある。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物から最適生産のために最適化されたコドンであり得る。
【００９６】
「好ましい最適の高いコドン使用頻度偏りコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンより、タンパク質コード領域で高い頻度で使われるコドンを互換的に意味する。好ましいコドンは、１つの遺伝子、共通機能または起源の一組の遺伝子、高発現遺伝子、全生物の集積タンパク質コード領域のコドン頻度、関連生物の集積タンパク質コード領域のコドン頻度、またはそれらの組合せで、コドン使用頻度に関して決定され得る。頻度が遺伝子発現レベルとともに増加するコドンは、一般に発現のための最適コドンである。いろいろな方法が、特定の生物でコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）およびコドン選択を決定することに関して知られており、例えば、クラスタ分析または対応分析および遺伝子で使われる有効数のコドンを用いる多変量解析を含む（参照：ＧＣＧ  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；Ｃｏｄｏｎ  Ｗ，Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９）。コドン使用頻度表は、生物の成長リストに利用できる（参照：例えば、Ｗａｄａら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら、２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら、前出；ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”１９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、編集、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードできる任意の利用できるヌクレオチド配列に依拠することができる。これらのデータセットは、発現されたタンパク質（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現された配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測コード領域をコードすることが実際に知られている核酸配列を含む（参照：例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら、１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０）。
【００９７】
「制御配列」は、本開示のポリペプチドの発現のために必要かまたは有利な全ての構成要素を含むことが、本明細書中で規定される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来的であっても外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
「作動可能に連結された」は、制御配列が関心のあるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を方向づけるか、または制御するように、制御配列が関心のあるポリヌクレオチドに対する位置に適切に配置される（つまり、機能的関係で）構成として本明細書に定義される。
【００９９】
「プロモーター配列」は、関心のあるポリヌクレオチド（例えばコード配列）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列である。制御配列は、適切なプロモーター配列を含むことができる。プロモーター配列は、転写制御配列を含み、それは関心のあるポリヌクレオチドの発現を媒介する。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であって、これらの核酸配列としては、変異プロモーター、トランケートプロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられ、そしてこれらの核酸配列は、その宿主細胞に対して相同性または異種性のいずれかの細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１００】
１．２  ケトレダクターゼ酵素
１つの態様では、本開示は、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート（「基質」）のラセミ混合物を２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（「２Ｓ，３Ｒ生成物」）に立体選択的に還元または変換することができる組み換えケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。これらのケトレダクターゼポリペプチド（また、「２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼ」とも本明細書では称する）は、Ｌ．ｋｅｆｉｒ（配列番号４）、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ（配列番号２）またはＬ．ｍｉｎｏｒ（配列番号８６）から得られる天然に存在する、野生型ＫＲＥＤ酵素と比較したとき、あるいは他の組み換えケトレダクターゼ酵素と比較したとき、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元または変換するための改良された特性を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、野生型または別の組み換えポリペプチド（例えば、配列番号６４）と比べて、改良された特性は、基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元または変換するための立体選択性の増大、すなわち、本明細書では、生成物の立体異性体過剰率の増加に関する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性は、より大きなパーセントの基質を生成物へ変換または還元するその能力における増加に関するものである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性は、基質の生成物へのその変換率における増加に関し、そして、それは生成物の同じ量の変換または還元するために野生型または他の参照配列と比較して、改良されたポリペプチドのより少ない量を使う能力によって明らかにすることができる。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性は、その安定性または耐熱性に関するものである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、複数の改良された特性（例えば増加した立体選択性と改良された酵素活性）を有する。
【０１０２】
本開示は、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート（「基質」）のラセミ混合物を２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（「２Ｒ，３Ｒ生成物」）に立体選択的に還元または変換することのできる組み換えケトレダクターゼ酵素をさらに提供する。２Ｓ，３Ｒ生成物を生産する組み換えケトレダクターゼポリペプチドと同様に、２Ｒ，３Ｒ生成物（また、本明細書では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼとしても記載される）を生産することのできる組み換えケトレダクターゼは、野生型または別の組み換えポリペプチド（例えば、配列番号６６など）と比較して改良された特性を有する。いくつかの実施形態では、改良された特性は、基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元または変換するための立体選択性に関する。いくつかの実施形態では、改良された特性は、基質を２Ｒ，３Ｒ生成物に還元するための酵素活性に関する。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性は、その安定性または熱安定性に関する。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、複数の改良された特性（例えば、増加した立体選択性や改良された酵素活性）を有する。
【０１０３】
以下により詳細に記述するように、基質を２Ｓ，３Ｒ生成物に変換することができるケトレダクターゼポリペプチドは、アミノ酸配列を含み、そこでは、配列番号２、４、または８６のＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、アミノ酸配列を含み、そこでは、配列番号２、４、または８６のＸ９４に対応する残基は、脂肪族または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンである；そして、配列番号２、４または８６のＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、アミノ酸配列を含み、そこでは、配列番号２、４、または８６のＸ９４に対応する残基は、脂肪族または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンであり；配列番号２、４、または８６のＸ１９９に対応する残基は、拘束性、極性、または脂肪族残基、特にヒスチジン、アスパラギン、またはアラニンであり；そして、配列番号２、４、または８６のＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。
【０１０４】
上記のように、本開示のケトレダクターゼは、Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒの天然に存在するケトレダクターゼ（また、「ＡＤＨ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」とも呼ばれる）または他の組み換えケトレダクターゼのアミノ酸配列を参照して記述することができる。このように、アミノ酸残基位置は、開始メチオニン（Ｍ）残基（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）から始まるケトレダクターゼで測定されるが、この開始メチオニン残基は、生物学的処理機構（例えば、宿主細胞またはインビトロ翻訳系において）で除去されて、開始メチオニン残基を欠く成熟タンパク質を生成することが当業者には理解される。特定のアミノ酸またはアミノ酸変化がアミノ酸配列に存在するアミノ酸残基位置は、時々、「Ｘｎ」または「位置ｎ」により記述され、そこでは、ｎは残基位置を指す。同じ残基位置のアミノ酸残基が、ケトレダクターゼの間で異なるとき、異なる残基は、「ｋｅｆｉｒ残基／ｂｒｅｖｉｓ残基／ｍｉｎｏｒ」の配置の「／」によって示される。異なるアミノ酸残基との置換変異（それは参照配列中のアミノ酸残基、例えば配列番号２、配列番号４、および配列番号８６の野生型ケトレダクターゼの置換である）は、シンボル「→」によって示される。ここに、いくつかの実施形態では、変異は時々、アミノ酸の「あるタイプへ」の変異として記述される。例えば、配列番号４の残基１９９は、極性残基へ変異させることができる。しかし、「〜へ」のフレーズの使用は、あるクラスの１つのアミノ酸から同じクラスの別のアミノ酸への変異を除外するものではない。例えば、配列番号４の残基１９９は、脂肪族残基（ロイシン）であるが、しかし、それは異なる脂肪族残基に変異させることができ、例えば、その変異は、「Ｌ１９９Ａ」（１９９→Ａ）変異である。Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒの天然に存在するケトレダクターゼ（また、「ＡＤＨ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」と呼ばれる）のアミノ酸配列は、ケトレダクターゼ活性をコードすることが知られているポリヌクレオチドから得ることができる（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６またはＬ．ｋｅｆｉｒに関する配列番号３；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＤ６６６４８  ＧＩ：２８４００７８９またはＬ．ｂｒｅｖｉｓに関する配列番号１；およびＬ．ｍｉｎｏｒに関する配列番号８６）。
【０１０５】
いくつかの態様では、本明細書のケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列（例えば、天然に存在するポリペプチドまたは組み換えポリペプチド）に対して、多数の改変を有することができ、改良されたケトレダクターゼ特性をもたらす。本明細書で使用されるように、「改変」は、アミノ酸の置換、欠失、および挿入を含む。改変の任意の１つまたは組み合わせは、天然に存在するまたは組み換えポリペプチドに導入することができ、組み換え酵素を生成する。そのような実施形態では、アミノ酸配列に対する改変の数は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸を含むことができ、それは参照ポリペプチド配列のアミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の１５％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％までを構成する。いくつかの実施形態では、改良されたケトレダクターゼ特性を生じる天然ポリペプチドまたは組み換えポリペプチドへの改変の数は、参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、または約１〜４０の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５、または約４０のアミノ酸残基である。改変は、挿入、欠失、置換、またはそれらの組合せを含むことができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、改変は、参照配列に対するアミノ酸置換を含む。改良されたケトレダクターゼ特性を生じることができる置換は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸においてであり、それは参照酵素配列のアミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％までを構成する。いくつかの実施形態では、改良されたケトレダクターゼ特性を生じる天然ポリペプチドまたは組み換えポリペプチドに対する置換の数は、参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、または約１〜４０のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５、または約４０のアミノ酸残基である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ２０２に対応する残基においてロイシンまたはバリンを有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、または９９％超が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ２０２に対応する残基がロイシンまたはバリンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ２０２に対応する残基がロイシンである。いくつかの実施形態では、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照アミノ酸配列と比べて、他の残基の位置に１つ以上の残基の違いを有することができる。その違いは、置換、欠失、および挿入などのさまざまな改変を含む。置換は、非保存的置換、保存的置換、または非保存的置換と保存的置換の組み合わせである。いくつかの実施形態では、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基において、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いを場合により有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０，３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４８である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンであり；Ｘ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである、を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、または９９％超が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前記の特徴（すなわち、Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基であり；そしてＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、Ｘ９４に対応する残基が、極性残基であり、そして、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり、そして、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比べて、他のアミノ酸残基位置において、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いを場合により有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２６または２８である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族、または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンである；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性、または極性残基、特にアラニン、アスパラギン、またはヒスチジンである；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである、を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、または９９％超が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前記の特徴（すなわち、Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基である；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性残基である；およびＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ９４に対応する残基は、極性残基であり、Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；そして、Ｘ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、アスパラギン、またはヒスチジンであり；そして、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照アミノ酸配列と比べて、他の残基の位置に１つ以上の残基の違いを有することができる。その違いは、置換、欠失、および挿入などのさまざまな改変を含む。置換は、非保存的置換、保存的置換、または非保存的置換と保存的置換の組み合わせである。いくつかの実施形態では、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いを場合により有することができる。いくつかの実施形態では、残基の違いの数は、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０，３５または約４０残基の違いである。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２２，２４または３０である。
【０１１０】
前記を考慮して、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、Ｘ９４、Ｘ１９９、およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組合せの特徴に関して記述されることができる。例えば、Ｘ９４とＸ２０２に対応する残基における特徴によって特徴づけられる２Ｓ，３Ｒ選択的ポリペプチドは、特定の残基位置の組合せについて本明細書に提供される記述を参照する。同様に、Ｘ９４、Ｘ１９９、およびＸ２０２に対応する残基における特徴によって特徴づけられる２Ｓ，３Ｒ選択的ポリペプチドは、特定の残基位置の組合せについて本明細書に提供される記述を参照する。さらに以下に記すように、これらのケトレダクターゼは、参照配列と比較してアミノ酸配列で１つ以上のさらなる特徴を有することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８７（または残基９０〜２１１などのその領域）に記載される配列式に基づくアミノ酸配列を含む。配列番号８４は、Ｌ．ｋｅｆｉｒのケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号４）に基づき、配列番号８３は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓのケトレダクターゼ（配列番号２）のアミノ酸配列（配列番号２）に基づき、そして配列番号８７は、Ｌ．ｍｉｎｏｒのケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号８６）に基づく。配列番号８３、８４または８７は、Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族または極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が脂肪族、拘束性、または極性残基であり；そして、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであることを特定する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書に記載されたようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基の様々な組み合わせに関しての特定された特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下から選択される１つ以上のさらなる特徴を有することができる：Ｘ２に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ４に対応する残基は、塩基性残基またはシステインである；Ｘ１１に対応する残基は、非極性、脂肪族、または芳香族残基である；Ｘ４０に対応する残基は、拘束性、または塩基性残基である；Ｘ８０に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基である；Ｘ８６に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基である；Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１０５に対応する残基は、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；Ｘ１２９に対応する残基は、非極性または極性残基である；Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１９０に対応する残基は、芳香族、または拘束性残基である；Ｘ１９５に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１９６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基である；Ｘ２２６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ２４８に対応する残基は、非極性、または塩基性残基である；Ｘ２４９に対応する残基は、芳香族残基である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多い特徴を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７（またはその領域）に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、上記のＸで特定されない残基位置で、さらに１つ以上の残基の違いを有することができる。いくつかの実施形態では、違いは、上記のＸで特定されない他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含むポリペプチドは、配列番号２、４または８６のアミノ酸配列と比較して、１つ以上の保存的な変異を有することができる。典型的な保存的な変異は、アミノ酸置換を含み、例えば、Ｘ２１のバリン（Ｖ）に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、イソロイシン）で置換すること；Ｘ７８のグルタミン酸（Ｅ）に対応する残基を別の酸性残基（例えば、アスパラギン酸）で置換すること；Ｘ１４５のグルタミン酸（Ｅ）に対応する残基を別の酸性残基（例えば、アスパラギン酸）で置換すること；Ｘ１５３のロイシン（Ｌ）に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、アラニン）で置換すること；Ｘ１９５のロイシン（Ｌ）に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、バリン）で置換すること；Ｘ１９６に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、ロイシン）で置換すること；Ｘ２２６のイソロイシン（Ｉ）に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、バリン）で置換すること、を含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で上記したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下から選択される１つ以上のさらなる特徴を有することができる：Ｘ２に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、もしくはアスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にセリン、トレオニン、またはアラニン）である；Ｘ４に対応する残基は、アルギニン、もしくはリジン、またはシステイン（特にアルギニンまたはシステイン）である；Ｘ１１に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にイソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニン）である；Ｘ４０に対応する残基は、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン（特にヒスチジンまたはアルギニン）である；Ｘ８０に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはアスパラギン（特にアラニンまたはトレオニン）である；Ｘ８６に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にトレオニンまたはイソロイシン）である；Ｘ９６に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にセリン、アスパラギン、バリン、またはフェニルアラニン）である；Ｘ１０５に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸（特にグルタミン酸、リジン、アラニン、またはグリシン）である；Ｘ１２９に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはアスパラギン（特にメチオニンまたはトレオニン）である；Ｘ１４７に対応する残基は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にフェニルアラニン、メチオニン、またはロイシン）である；Ｘ１５３に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にロイシン、アラニン、またはセリン）である；Ｘ１９０に対応する残基は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、またはプロリン（特にチロシン、ヒスチジンまたはプロリン）である；Ｘ１９５に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にロイシンまたはバリン）である；Ｘ１９６に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にロイシン）である；Ｘ２０６に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にメチオニンまたはフェニルアラニン）である；Ｘ２２６に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン（特にイソロイシンまたはバリン）である；Ｘ２４８に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、またはアルギニン（特にグリシン、リジン、またはアルギニン）である；およびＸ２４９に対応する残基は、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にチロシンまたはトリプトファン）である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれより多い特徴を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列（またはその領域）を含むポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、上記Ｘで特定されない残基位置において、さらに１つ以上の残基の違いを有することができる。いくつかの実施形態では、違いは上記のＸで特定されない他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で上記したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴から選択される１つもしくは複数、または少なくともすべてをさらに有することができる：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基（特にアルギニン）であり；Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴に加えて、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にフェニルアラニンまたはバリン）である；Ｘ１９５に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である；Ｘ１９６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にロイシン）である；Ｘ２２６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である；Ｘ２４８に対応する残基は、非極性または塩基性残基（特にアルギニンまたはリジン）である；およびＸ２４９に対応する残基は、芳香族残基（特にトリプトファン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴に加えて、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ２に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基（特にアラニン）である；Ｘ４に対応する残基は、塩基性残基またはシステイン（特にシステイン）である；Ｘ１１に対応する残基は、非極性、脂肪族、または芳香族残基（特にフェニルアラニン）である；Ｘ８０に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性の残基（特にトレオニン）である；Ｘ８６に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基（特にイソロイシン）である；Ｘ１０５に対応する残基は、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基（特にグリシン）である；Ｘ１２９に対応する残基は、非極性または極性残基（特にトレオニン）である；Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基（特にアラニン）である；Ｘ１９０に対応する残基は、芳香族、または拘束性残基（特にヒスチジンまたはプロリン）である；およびＸ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基（特にフェニルアラニン）である。当業者にとって明らかであるように、前記の特徴のいろいろな組み合わせは、本開示のケトレダクターゼを形成するのに用いることができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記載したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴の１つもしくは複数、または少なくともすべてをさらに有することができる：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基（特にアルギニン）であり；そしてＸ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、Ｘ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にバリンまたはフェニルアラニン）であり；そしてＸ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、Ｘ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基（特にアルギニン）であり；Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にバリンまたはフェニルアラニン）であり；そしてＸ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、Ｘ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にバリンまたはフェニルアラニン）であり；Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）であり；Ｘ１９５に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）であり；およびＸ１９６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ２に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基（特にアラニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ４に対応する残基は、システインまたは塩基性残基（特にシステイン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１１に対応する残基は、非極性、脂肪族、または芳香族残基（特にフェニルアラニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基（特にアルギニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ８０に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基（特にトレオニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ８６に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基（特にイソロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にフェニルアラニンまたはバリン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１０５に対応する残基は、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基（特にグリシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１２９に対応する残基は、非極性または極性残基（特にトレオニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基（特にアラニンまたはセリン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１９０に対応する残基は、芳香族、または拘束性残基（特にヒスチジンまたはプロリン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１９５に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１９６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基（特にフェニルアラニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ２２６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ２４８に対応する残基は、非極性、または塩基性残基（特にリジンまたはアルギニン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ２４９に対応する残基は、芳香族残基（特にトリプトファン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基（特にアルギニン）であり；およびＸ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にメチオニンまたはロイシン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴に加えて、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である；Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基（特にロイシン）である；Ｘ２２６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基（特にバリン）である；Ｘ２４８に対応する残基が、非極性、または塩基性残基（特にアルギニンまたはリジン）である；およびＸ２４９に対応する残基が、芳香族残基（特にトリプトファン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴に加えて、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ２に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ４に対応する残基は、塩基性残基またはシステインである；Ｘ１１に対応する残基は、非極性、脂肪族、または芳香族残基である；Ｘ８０に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基である；Ｘ８６に対応する残基は、非極性、脂肪族、極性残基である；Ｘ１０５に対応する残基は、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；Ｘ１２９に対応する残基は、非極性、または極性残基である；Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１９０に対応する残基は、芳香族、または拘束性残基である；およびＸ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基である。当業者にとって明らかであるように、前記の特徴のいろいろな組合せは、本開示のケトレダクターゼを形成するのに用いることができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ２０２に対応する残基（すなわち、バリンまたはロイシン）において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基（特にアラニンまたはセリン）である。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４６、５２または５４）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４６、５２または５４）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にメチオニンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４４）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４４）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ８０に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基であり；そしてＸ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基、特にアラニンまたはセリンである；いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１８）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１８）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４とＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１６）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１６）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ１９９とＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基、特にアラニンまたはセリンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４２、５０、５６）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４２、５０、５６）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基、特にアルギニンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１２）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１２）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にメチオニンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号６）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号６）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基、特にアラニンまたはセリンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号３４または３６）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号３４または３６）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基、特にアルギニンであり；そしてＸ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にメチオニンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１０）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号１０）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ１０５に対応する残基は、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基、特にグリシンであり；Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基、特にアラニンであり；そしてＸ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基、特にフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号３８）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号３８）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）を含み、本明細書で記述したようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基において特定の特徴を有する改良されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴をさらに含む：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にセリン、バリン、またはフェニルアラニンであり；Ｘ１２９に対応する残基は、非極性、または極性残基、特にトレオニンであり；そしてＸ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基、特にフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４０）を有する配列番号２、４または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（例えば、配列番号４０）を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも前記の特徴を有する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示の改良されたケトレダクターゼは、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ２０２に対応する残基において前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼのドメインまたは領域は、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示の改良されたケトレダクターゼは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含み、そこでは、領域またはドメインは、以下の特徴を有する：Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンであり；そしてＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、Ｘ９４に対応する残基が、極性残基であり、そしてＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり；そしてＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼのドメインまたは領域は、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示の改良されたケトレダクターゼは、以下の特徴を有する配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性または極性残基、特にアラニン、アスパラギンまたはヒスチジンであり；そしてＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、Ｘ９４に対応する残基は、極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；そしてＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、アスパラギン、またはヒスチジンであり；そしてＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼのドメインまたは領域は、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を有し、本明細書で記述されるようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有する本開示の改良されたケトレダクターゼは、以下のものから選択される１つ以上の特徴を領域またはドメインにさらに含むことができる：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基であり；Ｘ１０５に対応する残基は、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基であり；Ｘ１２９に対応する残基は、非極性、または極性残基であり；Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基であり；Ｘ１５３に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基であり；Ｘ１９０に対応する残基は、芳香族、または拘束性残基であり；Ｘ１９５に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基であり；Ｘ１９６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基であり；そしてＸ２０６に対応する残基は、非極性、または芳香族残基である。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、上記Ｘで特定されない他のアミノ酸残基において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、ドメインでの他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、上記したように、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列を有するドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または８６の対応するドメインのアミノ酸配列と比較して、１つ以上の保存的な変異をドメインまたは領域に有することができる。そのような保存的な変異の例としては、アミノ酸置換を含み、例えば、Ｘ１４５のグルタミン酸（Ｅ）に対応する残基を別の酸性残基（例えば、アスパラギン酸）で置換すること；Ｘ１５３のロイシン（Ｌ）に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、アラニン）で置換すること；Ｘ１９５のロイシン（Ｌ）に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、バリン）で置換すること；そしてＸ１９６に対応する残基を別の脂肪族残基（例えば、ロイシン）で置換することを含むが、これらに限定されない。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を有し、本明細書で記述されるようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは、以下のものから選択される１つ以上の特徴を領域またはドメインにさらに含むことができる：Ｘ９６に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にアスパラギン、セリン、バリン、またはフェニルアラニン）であり；Ｘ１０５に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸（特にグルタミン酸、リジン、アラニン、またはグリシン）であり；Ｘ１２９に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはアスパラギン（特にメチオニンまたはトレオニン）であり；Ｘ１４７に対応する残基は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にフェニルアラニン、メチオニン、またはロイシン）であり；Ｘ１５３に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にロイシン、アラニン、またはセリン）であり；Ｘ１９０に対応する残基は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、またはプロリン（特にチロシン、ヒスチジンまたはプロリン）であり；Ｘ１９５に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にロイシンまたはバリン）であり；Ｘ１９６に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にロイシン）であり；Ｘ２０６に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にメチオニンまたはフェニルアラニン）である。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、上記Ｘで特定されない他のアミノ酸残基位置において約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、ドメインでの他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を有し、本明細書で記述されるようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは、領域またはドメインに以下の特徴をさらに含むことができる：Ｘ１４７に対応する残基は、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にメチオニンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるドメインまたは領域を有するアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼのドメインまたは領域は、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を有し、本明細書で記述されるようにＸ９４、Ｘ１９９およびＸ２０２に対応する残基のいろいろな組み合わせのために特定の特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは、領域またはドメインで以下の特徴をさらに含むことができる：Ｘ９６に対応する残基は、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基、特にバリンまたはフェニルアラニンであり；およびＸ１４７に対応する残基は、芳香の、非極性、または脂肪族残基、特にメチオニンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるドメインまたは領域を有するアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼのドメインまたは領域は、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができ、そこでは、ドメインまたは領域は、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ２に対応する残基は、極性、非極性、または脂肪族残基であり；Ｘ４に対応する残基は、塩基性残基またはシステインであり；Ｘ１１に対応する残基は、非極性、脂肪族、または芳香族残基であり；Ｘ４０に対応する残基は、拘束性、または塩基性残基であり；Ｘ８０に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基であり；およびＸ８６に対応する残基は、非極性、脂肪族、または極性残基である。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない残基位置において、１つ以上の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない他のアミノ酸残基位置において、対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、または１〜１６残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができ、そこでは、ドメインまたは領域は、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ２に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミンもしくはアスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にセリン、トレオニン、またはアラニン）であり；Ｘ４に対応する残基は、アルギニンもしくはリジン、またはシステイン（特にアルギニンまたはシステイン）であり；Ｘ１１に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にイソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニン）であり；Ｘ４０に対応する残基は、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン（特にヒスチジンまたはアルギニン）であり；Ｘ８０に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはアスパラギン（特にアラニンまたはトレオニン）であり；およびＸ８６に対応する残基は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン（特にトレオニンまたはイソロイシン）である。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない残基位置において、１つ以上の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない他のアミノ酸残基位置において、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、または１〜１６残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができ、そこでは、ドメインまたは領域は、少なくとも以下の特徴を有することができる：Ｘ４０に対応する残基は、拘束性または塩基性残基、特にアルギニンである。いくつかの実施形態では、配列番号１１１、１１２、または１３９の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４、または１１４の参照配列と比較して、他の残基位置において、１つ以上の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインまたは領域と比較して、他のアミノ酸残基位置において１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、または１〜１６残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、ドメインでの他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼの領域またはドメインは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そこでは、アミノ酸配列は、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができ、そこでは、ドメインまたは領域は、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ２２６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基であり；Ｘ２４８に対応する残基は、非極性、または塩基性残基であり；およびＸ２４９に対応する残基は、芳香族残基である。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない残基位置において、１つ以上の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができ、そこでは、ドメインまたは領域は、以下の特徴の１つ以上を有することができる：Ｘ２２６に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン（特にバリン）であり；Ｘ２４８に対応する残基は、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、またはアルギニン（特にグリシン、リジン、またはアルギニン）であり；およびＸ２４９に対応する残基は、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン（特にチロシンまたはトリプトファン）である。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない残基位置において、他の残基位置において、１つ以上の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いは、配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、上記Ｘによっては特定されない他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基位置において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができ、そこでは、ドメインまたは領域は、少なくとも以下の特徴を有する：Ｘ２２６に対応する残基は、非極性、または脂肪族残基、特にバリンである。いくつかの実施形態では、配列番号８３、８４または８７の配列式の残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６の参照配列と比較して、他の残基位置において、１つ以上の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、ドメインでの他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的変異を含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼの領域またはドメインは、少なくとも前記の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そこでは、アミノ酸配列は、前記の特徴を有する配列番号２、４、または８６に基づく参照配列の残基２１２〜２５２に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１６４】
下記の表２は、典型的な２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼ（配列番号１〜６２）をそれらの関連活性とともに提供する。下記の配列は、特に明記しない限り、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒのケトレダクターゼ配列（配列番号３と４）に由来する。下記の表２において、各々の列は、２つの配列番号を記載し、そこでは、奇数は、偶数により提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。変異の番号（♯）を記載する欄は、配列番号４のＬ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤアミノ酸配列と比較したアミノ酸置換の数に関し、そして、特定の置換は、「ｋｅｆｉｒからの変異」の欄に記載される。活性欄では、１つの「＋」は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの基質を式（ＩＩ）の生成物に変換するための能力と比較して、１〜１５倍の改良に対応する。２つのプラス記号「＋＋」は、配列番号４８と比較して、ポリペプチドが約１５〜３０倍改良されることを示す。３つのプラス記号「＋＋＋」は、配列番号４８と比較して、ポリペプチドが３０〜４０倍改良されることを示す。４つのプラス記号「＋＋＋＋」は、配列番号４８と比較して、ポリペプチドが４０〜５０倍改良されることを示す：および５つのプラス記号「＋＋＋＋＋」は、配列番号４８と比較して、ポリペプチドが５０倍より大きく改良されることを示す。安定性の欄の下の「＋」記号は、ポリペプチドが４０℃、２１時間の加熱処理の後、基質を式（ＩＩ）の生成物に変換するための酵素活性を保持することができることを示す。選択性の欄について、１つのプラス記号「＋」は、ポリペプチドが、約６０〜８９％の立体異性体過剰率で基質を式（ＩＩ）の生成物に変換することができることを示す；２つのプラス記号「＋＋」は、ポリペプチドが、約９０〜９４％の立体異性体過剰率で基質を式（ＩＩ）の生成物に変換することができることを示す；３つのプラス記号「＋＋＋」は、ポリペプチドが、約９５〜９９％の立体異性体過剰率で基質を式（ＩＩ）の生成物に変換することができることを示す；および４つのプラス記号「＋＋＋」は、ポリペプチドが、約９９％を超える立体異性体過剰率で基質を式（ＩＩ）の生成物に変換することができることを示す。したがって、いくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０または６２に対応する配列を含むことができる。
【０１６５】
【表２−１】
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【０１６６】
【表２−２】
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【０１６７】
【表２−３】
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いくつかの実施形態では、改良された２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または６２に基づく参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、少なくとも以下の特徴を有する：Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性または極性残基、特にアラニン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり；およびＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、改良された２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または６２に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、配列番号２、４、または８６と比較して、表２にリストされたポリペプチド配列のいずれか１つに含まれる変異の組のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率（％）または野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ（配列番号４）より大きい立体異性体過剰率（％）で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約６０〜８９％の立体異性体過剰率（％）および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率より少なくとも約１〜１５倍大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。配列番号４８のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドは、一定の比率（例えば、ｐＨ８の５０％ＩＰＡ中、ＫＲＥＤの約１０ｇ／Ｌを用いて、１ｇ／Ｌの基質を２０時間で１００％変換）および野生型（配列番号４）に対して改良された立体選択性で、基質を生成物に変換することができるので、配列番号４８に対して改良された本明細書のポリペプチドは、野生型に対しても改良される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９０〜９４％の立体異性体過剰率（％）で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４２、５０、５２、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９５〜９９％の立体過剰率（％）で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、４２、５０、５２、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率（％）で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、３０、３２、３４、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約１５〜３０倍大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、５０、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約３０〜４０倍大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、３０、３４、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約４０〜５０倍大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、２２、または６０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約５０倍大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、または１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約５０倍大きい比率および少なくとも約９９％の立体異性体過剰率（％）で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、および１２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を、４０℃で２１時間処理した後に、生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換する能力を保持することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、１０、または４４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１８０】
上記したように、いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼは、式（Ｉ）の基質を式 (ＩＩＩ)の生成物へ立体選択的に還元または変換することができる。下記の表３は、典型的な２Ｒ，３Ｒ特異的ケトレダクターゼ（配列番号６３〜８２）をそれらの関連活性とともに提供する。下記の配列は、特に明記しない限り、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒのケトレダクターゼ配列（配列番号３および４）に由来する。下記の表３では、各々の列は、２つの配列番号を記載し、そこでは、奇数番号は、偶数番号により提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。変異数を記載する欄は、配列番号４のＬ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤアミノ酸配列と比較したアミノ酸置換の数に関し、そして、「配列−コード変異」の欄は、配列番号４と比較した置換をリストする。活性欄では、１つの「＋」は、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドの基質を式（ＩＩＩ）の生成物に変換するための能力と比較して、約１倍の改良に相当する。２つのプラス記号「＋＋」は、配列番号６６と比較して、ポリペプチドが約１〜２倍より大きく改良されることを示す。３つのプラス記号「＋＋＋」は、配列番号６６と比較して、ポリペプチドが約５倍より大きく改良されることを示す。選択性の欄に関して、１つのプラス［＋）記号は、ポリペプチドが約８５％未満の立体異性体過剰率で基質を式（ＩＩＩ）の生成物に変換することができることを示す；２つのプラス記号「＋＋」は、ポリペプチドが、約８５％より大きい立体異性体過剰率で基質を式（ＩＩＩ）の生成物に変換することができることを示す。したがって、いくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、または８２に対応する配列を含むことができる。
【０１８１】
【表３−１】
0005646328.tif 000020
【０１８２】
【表３−２】
0005646328.tif 000021
いくつかの実施形態では、改良された２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、または８２に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列は、配列番号２または４または８６と比較して、表３にリストされたポリペプチド配列のいずれか１つに含まれる変異の組のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基位置において、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０の残基の違いをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、違いの数は、他のアミノ酸残基において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０の残基の違いである。いくつかの実施形態では、違いは、保存的な変異を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約８５％の立体過剰率（％）で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６８，７２，７４、７６，７８、または８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約１倍大きい比率で、生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６４、６８，７０、７２、７４，７６，７８、８０、または８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ある立体異性体過剰率および野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ（配列番号４）よりも大きい比率で、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができるので、配列番号６６に対して改良された任意のポリペプチドは、また、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤに対しても改良される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約１〜２倍大きい比率で、生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、または８０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約５倍大きい比率で、生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６４、７０、７２、７６、７８、または８０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、基質（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート）を、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドによる可能な比率より少なくとも約５倍大きい比率および少なくとも８５％の立体異性体過剰率で、生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）に変換することができる。有能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号７２または７８に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本開示の２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２または配列番号４または配列番号８６（またはその領域もしくはドメイン、例えば、残基９０〜２１１など）に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むことができるが、但し、配列番号２または配列番号４または配列番号８６の残基２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンであり、配列番号２または４または８６の残基９４に対応する残基は、トレオニンであり；および配列番号２または４または８６の残基１９９に対応する残基は、ヒスチジンであり、さらに、ポリペプチドが野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の組み換えケトケトレダクターゼ（例えば、配列番号４８など）に対してさらに改良（立体選択性、酵素活性および／または熱安定性に関して）されるような以下の置換の１つ以上をさらに有する：２→Ａ；４→Ｃ；１１→Ｆ；４０→Ｈ；８０→Ｔ；８６→Ｉ；９６→Ｆ、Ｖ；１０５→Ｇ；１２９→Ｔ；１４７→Ｍ、Ｌ；１５３→Ａ、Ｓ；１９５→Ｖ；１９６→Ｌ；２０６→Ｆ；２２６→Ｖ；２４８→Ｋ；および２４９→Ｗ。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４もしくは８６（またはその領域もしくはドメイン、例えば、残基９０〜２１１など）に対して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が同一であるアミノ酸配列を含むことができるが、但し、配列番号２、４または８６の残基２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンであり、配列番号２、４または８６の残基９４に対応する残基は、トレオニンであり；そして、配列番号２、４または８６の残基１９９に対応する残基は、ヒスチジンであり、さらに、ポリペプチドが野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の組み換えケトケトレダクターゼ（例えば、配列番号４８など）に対してさらに改良（立体選択性、酵素活性および／または熱安定性に関して）されるような以下の置換の１つ以上をさらに有する：４０→Ｈ；および１４７→Ｌ、Ｍ。
【０１９０】
当業者に理解されるように、特別に他に明示しない限り、アミノ酸残基の上で定義されたカテゴリのいくつかは、互いに排他的ではない。したがって、２つ以上の物理化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリに含まれることができる。任意のアミノ酸または残基の適切な分類は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして当業者には明らかとなろう。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、改良された組み換えケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクはターゼポリペプチドの欠失または他の組み換えケトレダクターゼポリペプチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記述された改良された組み換えケトレダクターゼポリペプチドの各々は、本明細書に記述されたポリペプチドの欠失を含むことができる。したがって、本開示のケトレダクターゼポリペプチドの各実施形態および全ての実施形態に関して、欠失は、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、８個以上のアミノ酸；１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸を含むことができ、それは、ケトレダクターゼ活性の機能的活性が維持される限り、ケトレダクターゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％、またはアミノ酸の総数の最大３０％までを占める。いくつかの実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、または２０のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
【０１９２】
本明細書に記述されるように、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、融合ペプチドの形態であることができ、そこでは、ケトレダクターゼポリペプチドが他のポリペプチドに融合している（例えば、例示として、限定されるものではないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、ヒスチジンタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル））。したがって、ケトレダクターゼポリペプチドは、他のポリペプチドとの融合の有無にかかわらず使うことができる。
【０１９３】
本明細書に記述されるポリペプチドは、遺伝的にコード化されたアミノ酸に制限されない。遺伝的にコード化されたアミノ酸に加えて、本明細書に記述されるポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸および／または合成非コード化アミノ酸の全体または一部を含むことができる。本明細書に記述されるポリペプチドが構成され得る特定の一般的に遭遇する非コード化アミノ酸は、限定されるものではないが、以下のものを含む：遺伝的にコード化されたアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（Ｍｅｌｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓＡｌａ）；アウスリル（ａｕｔｈｒｙｌ）アラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシンｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書に記述されるポリペプチドが構成され得るさらなる非コード化アミノ酸は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎの１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬの３〜７０頁およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。なお、これらの全ては引用により取り込まれる）。これらのアミノ酸は、Ｌ−配置またはＤ−配置のいずれであってもよい。
【０１９４】
当業者であれは、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基もまた本明細書に記載されたポリペプチドを構成し得ることを認識するであろう。そのような保護アミノ酸（それはこの場合、芳香族の範疇に属する）の非限定的な例は、以下のもの（保護基は括弧内に記載）を含むが、これらに限定されない。Ａｒｇ（トシル）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（トシル）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（トシル）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）、およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
【０１９５】
本明細書に記載されたポリペプチドを構成し得る、立体配置的に拘束性の非コードアミノ酸は、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−配置）：１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
上述したように、組み換えケトレダクターゼ酵素を生成するために天然に存在するポリペプチドに導入される種々の改変は、酵素の特定の性質を標的とすることができる。
【０１９７】
１．３  組み換えケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド
別の態様では、本開示は、組み換えケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組み換え型ポリヌクレオチドを作製するために遺伝子発現を制御する１つ以上の異種制御配列に作動的に連結され得る。組み換えケトレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、適切な宿主細胞に導入されて対応するケトレダクターゼポリペプチドを発現することができる。
【０１９８】
様々なアミノ酸に対応するコドンに関する知識により、タンパク質配列の有用性は、対象をコード化できるすべてのポリヌクレオチドの記述を提供する。遺伝暗号の変質（そこでは、同じアミノ酸が代替または同義のコドンによってコード化される）は、非常に多くの核酸が作られるのを可能にし、それらのすべては、本明細書に開示される改良されたケトレダクターゼ酵素をコード化する。したがって、特定のアミノ酸配列を同定して、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって異なる任意の数の核酸を作製することができた。この点に関しては、本開示は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作ることができるポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変化を具体的に考慮し、そして、そのようなすべての変化は、本明細書に開示された任意のポリペプチドに対して具体的に開示されたとみなすべきであり、それは表１にリストされたアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
いろいろな実施形態では、コドンはタンパク質が生産される宿主細胞に適合するように望ましくは選択される。例えば、細菌で使われる好ましいコドンは、細菌で遺伝子を発現するのに用いられる；酵母で使われる好ましいコドンは、酵母の発現のために使われる；そして、哺乳類で使われる好ましいコドンは、哺乳類の細胞の発現のために使われる。例示として、配列番号１のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化されたコドンであったが、別の状況では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの天然に存在するケトレダクターゼをコードする。
【０２００】
ある実施形態では、ケトレダクターゼのコドン使用頻度を最適化するためにすべてのコドンを置換する必要はなく、それは、天然の配列が好ましいコドンから成り、そして、好ましいコドンの使用がすべてのアミノ酸残基のために必要とされるというわけではないからである。従って、ケトレダクターゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％で、または９０％超で好ましいコドンを含むことができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記述された参照組み換えケトレダクターゼポリペプチドのいずれかに対して、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するケトレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族、または極性残基、特にアラニンまたはトレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性または極性残基、特にアラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり；そしてＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである、を有する配列番号２、４または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超が同一であるアミノ酸配列をコードするが、但し、コード化されたケトレダクターゼポリペプチドは、前記の特徴（すなわち、Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性または極性残基であり；そしてＸ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである）を有するアミノ配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり；そして、Ｘ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有するケトレダクターゼをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８に対応するアミノ酸配列をコードする。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、６０、または６２に対応するアミノ酸を含むポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、または９９％超の配列が同一であるアミノ酸配列を有するケトレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０または８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、または９９％超の配列が同一であるアミノ酸配列を有するケトレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、または８１から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、または８１を含むポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、そこでは、高ストリンジェントにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、式（Ｉ）の基質を式（ＩＩ）の生成物に立体選択的に還元または変換する、あるいは式（Ｉ）の基質を式（ＩＩＩ）の生成物に立体選択的に還元または変換することのできるケトレダクターゼをコードする。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記述されて、組み換えケトレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対して、ヌクレオチドレベルで、約８０％、または８０％超の配列同一性を有し、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の、または９９％超の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、または８１から選択される。
【０２０６】
改良されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、いろいろな方法で操作してポリペプチドの発現を提供する。ベクターへの挿入前に、単離されたポリヌクレオチドを操作することは、発現ベクターに依存して、望ましいか、または必要である場合がある。組み換えＤＮＡ法を利用して、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当該分野でよく知られている。指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８（２００６年改訂版）に提供されている。
【０２０７】
細菌の宿主細胞については、本開示の核酸構築物の転写を方向づけるための適切なプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐオペロン、バクテリオファージλ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのマルトジェニックアミラーゼ遺伝子  （ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡ  ａｎｄ  ｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）のみならず、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）を含む。さらに、プロモーターは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４の“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”およびＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載されている。
【０２０８】
糸状菌類の宿主細胞については、本開示の核酸構築物の転写を方向づけるための適切なプロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの耐酸性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのトリオースホスファートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）に対する遺伝子から得られたプロモーターのみならず、ＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのトリオースホスファートイソメラーゼに対する遺伝子からのプロモータ−のハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、トランケーション体、およびハイブリッドプロモーターを含む。
【０２０９】
酵母宿主においては、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの３−ホスホグリセラートキナーゼのための遺伝子由来である。酵母宿主細胞に対する他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８に記載されている。
【０２１０】
制御配列は、また、適切な転写終結配列（転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列）である。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞で機能的である任意のターミネーターは、本発明で使用することができる。
【０２１１】
例えば、糸状菌類の宿主細胞のための典型的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡのアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸合成酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得ることができる。
【０２１２】
酵母宿主細胞のための典型的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼのための遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞に対する他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、（１９９２、上記）に記載されている。
【０２１３】
制御配列は、また、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞で機能的である任意のリーダー配列は、使用することができる。糸状菌類の宿主細胞のための典型的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡのアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのトリオースホスファートイソメラーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの３−ホスホグリセラートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。
【０２１４】
制御配列は、また、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列）であってもよく、そして、それは、転写されたとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される。選択された宿主細胞で機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための典型的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡのアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸合成酵素、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼに対する遺伝子から由来することができる。酵母宿主細胞のための有用ポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ（１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  １５：５９８３−５９９０）により記載されている。
【０２１５】
制御配列は、また、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、細胞の分泌経路にコード化されたポリペプチドを方向づけるシグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌ポリペプチドをコード化するコード領域のセグメントと翻訳読み枠で生来的に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含み得る。あるいはまた、コード配列の５’末端は、コード配列に外因性のシグナルペプチドコード領域を含むことができる。コード配列が生来的にシグナルペプチドコード領域を含まない場合には、外因性のシグナルペプチドコード領域が必要とされる。
【０２１６】
あるいはまた、外因性のシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を強化するために、天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換えることが可能である。しかし、選択された宿主細胞の分泌経路に発現されたポリペプチドを方向づけるどんなシグナルペプチドコード領域でも、本発明において使用され得る。
【０２１７】
細菌の宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣＩＢ  １１８３７のマルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのα−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのβ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ（１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５７：１０９−１３７）により記述されている。
【０２１８】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡのアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓのセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【０２１９】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼの遺伝子由来である。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら（１９９２、上記）によって記述されている。
【０２２０】
制御配列は、また、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはある場合にはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは、通常、不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドへの触媒的または自己触媒的な解裂によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのラクターゼ（ＷＯ９５／３３８３６）の遺伝子から得ることができる。
【０２２１】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合は、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、そして、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０２２２】
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の制御を可能にする制御配列を付加することがまた所望される。制御系の例は、制御化合物の存在を包含する、化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始または停止を引き起こすそれらの系である。原核生物の宿主細胞では、適切な制御系は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレータ系を含む。酵母宿主細胞においては、適切な制御系は、例えば、ＡＤＨ２システムまたはＧＡＬ１システムを含む。糸状菌においては、適切な制御配列は、ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターを含む。
【０２２３】
制御配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核系においては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列と作動可能に連結される。
【０２２４】
したがって、別の実施形態では、本開示はまた、組み換えケトレダクターゼポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドと１つ以上の発現制御領域（例えばプロモーターおよびターミネーター）、複製起源、その他を含む組み換え発現ベクターに、それらが導入される宿主のタイプに依存して、向けられる。上記の種々の核酸および制御配列は、１つ以上の便利な制限部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするためにそれらの部位で含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。あるいはまた、本開示の核酸配列は、核酸配列または前記配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創製する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列と作動可能に連結される。
【０２２５】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付すことができ、そしてポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウィルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状または閉環された環状プラスミドであってもよい。
【０２２６】
発現ベクターは、自律複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。あるいはまた、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体（複数を含む）と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中に導入される全ＤＮＡまたはトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用することができる。
【０２２７】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤またはウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、および同様のものを提供する。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）またはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。
【０２２８】
糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、ならびにそれらの均等物を含むが、これらに限定されない。アスペルギルス属細胞に使用するための実施形態は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子を含む。
【０２２９】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込み、またはゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素（複数可）を含む。宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同または非相同組換えによるゲノム中へのベクターの組み込みのためのポリペプチドまたはベクターのいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。
【０２３０】
あるいはまた、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるためのさらなる核酸配列を含むことができる。そのさらなる核酸配列は、染色体（複数を含む）における正確な位置（複数を含む）での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は、好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００個の塩基対、好ましくは４００〜１０，０００個の塩基対、および最も好ましくは８００〜１０，０００個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コードまたはコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０２３１】
自律複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能にする複製の起点を含んで成る。複製の細菌起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ（図５のプラスミドに示される）またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（当該プラスミドは、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉを有する）、またはｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、またはｐＡＭβ１の複製の起点である。酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、すなわちＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合わせである。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する起点である（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４３３を参照のこと）。
【０２３２】
本発明の核酸配列の２つ以上のコピーが、遺伝子生成物の生成を高めるために宿主細胞中に挿入され得る。核酸配列のコピー数の上昇は、宿主細胞ゲノム中に配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、または核酸配列と共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより、核酸配列の追加のコピーが、適切な選択剤の存在下で前記細胞を培養することによって選択され得る。
【０２３３】
本発明に用いられる発現ベクターの多くは、市販され入手可能である。適切な市販の発現ベクターは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯからのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクターを含み、これは  哺乳類の宿主細胞での発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位およびＥ．ｃｏｌｉでの増幅のための複製のｐＢＲ３２２起点およびアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（それらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ  ＣＡから商業的に入手可能である）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５７：１９３−２０１）に由来するプラスミドである。
【０２３４】
１．４  ケトレダクターゼポリペプチド発現のための宿主細胞
別の態様において、本開示は、本開示の改良されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチドは、宿主細胞でのケドレダクターゼ酵素の発現のために、１つ以上の制御配列に作動可能に連結される。本発明の発現ベクターによってコードされるＫＲＥＤポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当該分野において周知であり、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ登録番号２０１１７８））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培地および増殖条件は、当該分野において周知である。
【０２３５】
ケトレダクターゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当該分野において公知のいろいろな方法で細胞に導入することが可能である。技術としては、中でも、エレクトロポーレーション、遺伝子銃を用いる方法、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合を含む。細胞にポリヌクレオチドを導入する種々の方法が当業者には明らかであろう。
【０２３６】
典型的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。発現ベクターは、改良されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドをｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００に作動可能に連結することによって作製した。この発現ベクターはまた、複製のＰ１５ａ起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０で対象ポリヌクレオチドを含む細胞は、細胞をクロラムフェニコールによる選択に付すことによって単離された。
【０２３７】
１．５  組み換えケトレダクターゼポリペプチドの生成方法
いくつかの実施形態では、本開示の改良されたＫＲＥＤポリヌクレオチドとポリペプチドを作製するために、還元反応を触媒する天然に存在するケトレダクターゼ酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒから得られる（または派生する）。いくつかの実施形態では、親のポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞でケトレダクターゼの発現を強化するために最適化されたコドンである。具体例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６）で利用できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ配列の既知のポリペプチド配列に基づいて製造されたオリゴヌクレオチドから構築された。親のポリヌクレオチド配列（配列番号１として示される）は、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化されたコドンであり、コドン最適化ポリヌクレオチドは、発現ベクターにクローン化されて、ケトレダクターゼ遺伝子の発現をｌａｃプロモーターとｌａｃＩ抑制遺伝子の制御下に置いた。Ｅ．ｃｏｌｉで活性ケトレダクターゼを発現するクローンは、同定され、そして、遺伝子がそれらの同一性を確認するために配列決定された。示される配列（配列番号１）は、大部分の実験およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼから進化した組み換えケトレダクターゼのライブラリーの構築の起点として利用された親配列であった。
【０２３８】
組み換えケトレダクターゼは、上で議論したように、天然に存在するケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定方向進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に付すことにより得ることができる。典型的な定方向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されたような突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである。使用することができる他の定方向進化手順は、中でも、付着伸長法（ＳｔＥＰ）、インビトロ組み換え（Ｚｈａｏら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１）、突然変異誘発性ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、１９９４、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）、およびカセット突然変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９）を含む。
【０２３９】
突然変異誘発処置後に得られたクローンは、所望の改良された酵素活性を有する組み換えケトレダクターゼについてスクリーニングされる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるのに伴うＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の減少比率（吸光度または蛍光の減少を介した）をモニタリングする、標準的な生物化学的技術を用いて実施できる（例えば、実施例７を参照のこと）。この反応において、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、ケトレダクターゼがケトン基質を対応する水酸基に還元するにつれて、そのケトレダクターゼによって消費される（酸化される）。単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の減少比率は、吸光度または蛍光の減少により測定される場合、一定量の上記細胞溶解物（またはそれから作製された凍結乾燥粉末）における、ＫＲＥＤポリペプチドの相対的（酵素）活性を示す。改良された所望の酵素活性特性が熱安定性である場合、酵素活性は、酵素製剤を一定の温度に曝し、加熱処理後に残存する酵素活性の量を測定することにより、測定される。ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローンは、次いで単離され、ヌクレオチド配列変化（もし、あるならば）を同定するために配列決定され、宿主細胞で酵素を発現するのに使用される。
【０２４０】
組み換えポリペプチドの配列が既知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、既知の合成方法に従って標準的な固相法により製造することができる。いくつかの実施形態では、約１００個までの塩基の断片は、個々に合成することができ、そして任意の所望の連続配列を形成するために結合することができる（例えば、酵素的または化学的連結方法またはポリメラーゼ媒介法により）。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１、Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９−６９）またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−０５）により記述された古典的なホスホルアミダイト法（例えば、典型的には自動化合成法で実施されるように）を用いて、化学的合成により製造することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザーで合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターにクローン化される。さらに、基本的に、任意の核酸は、任意のいろいろな民間の供給元（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ，  Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ、および多くの他の供給元）から得ることができる。
【０２４１】
宿主細胞で発現される組み換えケトレダクターゼ酵素は、細胞および／または培地から、タンパク質精製のための１つ以上の周知の技術（特に、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィを含む）を用いて採取することができる。溶解用の適切な溶液および細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質の高効率抽出物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）のＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）の商品名で市販されている。
【０２４２】
ケトレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術は、特に、逆相クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィを含む。特定の酵素を精製するための条件は、部分的には、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形、その他などの要因に依存し、当業者にとって明らかである。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、親和性技術は、改良されたケトレダクターゼ酵素を単離するのに用いることが可能である。親和性クロマトグラフィ精製のために、特にケトレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の生産のために、ウサギ、マウス、ラット、他を含むが、これに限らない、いろいろな宿主動物は、組み換えポリペプチドを用いて注射されて免疫化され得る。ポリペプチドは、適切なキャリア（例えばＢＳＡ）に側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによって結合されてもよい。いろいろなアジュバントは、宿主種に依存して、免疫学的応答を増大するに用いることができ、限定されるものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲルアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤アジュバント（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトのアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）を含む。
【０２４４】
１．６  組み換えケトレダクターゼ酵素の使用方法とそれを用いて製造された化合物
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）：
【０２４５】
【化８】
0005646328.tif 000022
の化合物（メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラート（「基質
」））のケト基の還元反応を触媒することができ、構造式（ＩＩ）：
【０２４６】
【化９】
0005646328.tif 000023
の対応する立体異性体アルコール生成物（２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（「生成物」））とすることができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）の基質は、式（Ｉａ）：
【０２４８】
【化１０】
0005646328.tif 000024
で示されるように、ラセミ混合物であり、そして、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、下記のスキーム１：
【０２４９】
【化１１】
0005646328.tif 000025
で示される反応においてラセミの基質を還元または変換するのに用いることができ、式（ＩＩ）の生成物を製造することができる。
【０２５０】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（Ｉ）の基質を構造式（ＩＩ）の対応する生成物に少なくとも約６０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元する方法において使用することができ、この方法は、式（Ｉ）または式（Ｉａ）の基質を本開示の２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドと、基質を式（ＩＩ）の生成物へ還元または変換するのに適した反応条件下で、接触またはインキュベーションすることを含む。本方法のいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の生成物は、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で製造される。本方法のいくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、２、および８６の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒのＫＲＥＤ配列に関して、少なくとも以下の特徴：残基２０２は、バリンまたはロイシンである、を有する。いくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、２、および８６の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒのＫＲＥＤ配列に関して、少なくとも以下の特徴：（１）Ｘ９４に対応する残基は、脂肪族、または極性残基であり；（２）Ｘ１９９に対応する残基は、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；および（３）Ｘ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである、を有する。いくつかの実施形態では、２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、２、および８６の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒのＫＲＥＤ配列に関して、少なくとも以下の特徴：（１）９４に対応する残基は、極性残基であり；（２）１９９に対応する残基は、拘束性残基であり；および（３）Ｘ２０２に対応する残基は、バリンまたはロイシンである、を有する。
【０２５１】
基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換する方法のいくつかの実施形態では、基質は構造式（ＩＩ）の生成物に、少なくとも約６０〜８９％の立体異性体過剰率（％）および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約１〜１５倍大きい比率で変換される。この方法で使用することが可能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２５２】
基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換する方法のいくつかの実施形態では、基質は、少なくとも約９０〜９４％の立体異性体過剰率（％）で、生成物に変換される。この方法で使用することが可能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４２、５０、５２、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２５３】
基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換する方法のいくつかの実施形態では、基質は、少なくとも約９５〜９９％の立体異性体過剰率（％）で生成物に変換される。この方法で使用することが可能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、４２、５０、５２、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）の化合物のケト基の、構造式（ＩＩＩ）：
【０２５５】
【化１２】
0005646328.tif 000026
の対応する立体異性体アルコール生成物（２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート）（これは、「生成物」とも称することができる）への還元反応を触媒することができる。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、（Ｉ）の基質は、式（Ｉａ）で示されるように、ラセミ混合物であり、そして、２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼは、下記のスキーム３：
【０２５７】
【化１３】
0005646328.tif 000027
で示される反応において、ラセミの基質を還元または変換するのに用いて式（ＩＩＩ）の生成物を製造することができる。
【０２５８】
基質を構造式（ＩＩＩ）の生成物に変換する方法のいくつかの実施形態では、基質は、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率（％）で、生成物に変換される。この方法で使用することが可能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６８、７２、７４、７６、７８、および８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２５９】
基質を構造式（ＩＩＩ）の生成物に変換する方法のいくつかの実施形態では、基質は、配列番号６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより可能な比率よりも少なくとも約１倍大きい比率で生成物に変換される。この方法で使用することが可能な典型的なポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号６４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、および８２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるケトレダクターゼは、カルバペネムを合成する方法で使用することができ、該方法は、下記（スキーム３）：
【０２６１】
【化１４】
0005646328.tif 000028
で示される一般的なプロセスを含み、ここで、ＫＲＥＤは、本明細書に開示されたケトレダクターゼポリペプチドのいずれか１つであり得る。一般式（Ｖ）のカルバペネムは、以下にさらに詳細に記載される。いろいろなカルバペネム系治療剤の合成のために、重要な中間体は、構造式（ＩＶａ）：
【０２６２】
【化１５】
0005646328.tif 000029
（式中、Ｒ１は、Ｈまたは水酸基の保護基であり、そしてＲ１０は、ハロゲン（例えば、Ｃｌ）、または−ＯＡｃ（Ａｃは、アセテートである））の化合物である。いろいろな水酸基の保護基は、当該分野で公知であり、例示として、限定されるものではないが、シリルエーテル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル）および置換ベンジルエーテル（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９を参照のこと）が挙げられる。したがって、構造式（ＩＶａ）の中間体を合成するための方法では、この方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を、本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。Ｒ１０が−ＯＡｃである式（ＩＶａ）の中間体の合成は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２２９３（１９８２）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：２３９９（１９８３）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：２５０５（１９８３）；ＥＰ０２９０３８５；およびＥＰ０３６９６９１に記載されており；すべてのこれらの参考文献は、引用により本明細書に取り込まれる。いくつかの実施形態では、Ｒ１０が−ＯＡｃである式（ＩＶａ）の中間体は、スキーム４：
【０２６３】
【化１６】
0005646328.tif 000030
で示されるように合成することができる。
【０２６４】
スキーム４において、この方法は、（ａ）基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するのに適した反応条件下で、基質を本開示の２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼと接触または反応させることにより、式（Ｉ）の基質を式（ＩＩ）の生成物に還元すること；（ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５基を除去して化合物（ＶＩ）を形成すること；（ｃ）式（ＶＩ）の化合物を、トリフェニルホスフィンとＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ベンゾチアゾリルスルフェンアミドと反応させることにより式（ＶＩＩ）のβ−ラクタムに変換すること（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６（２１）：３７０３を参照のこと）；（ｄ）ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）と反応させて式（ＶＩＩＩ）の化合物を形成すること；および（ｅ）式（ＶＩＩＩ）の化合物を過酢酸とルテニウムの存在下でアセトキシル化して式（ＩＶ）の中間体を形成すること（例えば、Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、１９９０、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２（２１）：７８２０−７８２２を参照のこと）を含む。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、カルバペネム系治療剤の合成における別の中間体は、構造式（ＩＸ）：
【０２６６】
【化１７】
0005646328.tif 000031
（式中、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル（例えば、−ＣＨ３）であり；Ｒ３は、Ｈまたは水酸基の保護基であり；Ｒ４は、Ｈ、カルボキシ保護基、アンモニア基、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属であり；およびＸは、ＯＨまたは脱離基である）の中間体である。典型的な脱離基としては、限定されるものではないが、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）またはＯＳ（Ｏ２）Ｒ”（ここで、Ｒ’およびＲ”は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルカリル、アリール、パーフルオロＣ１−Ｃ６アルキルである）が挙げられる。Ｒ４のための保護基は、限定されるものではないが、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、およびメトキシメチルである。構造式（ＩＸ）の中間体の説明とその合成は、いろいろな参考文献（例えば、米国特許第５，３１７，０１６号、米国特許第４，９３３，３３３号；およびＷＯ０２３６５９４に示される；これらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。したがって、いくつかの実施形態では、式（ＩＸ）の中間体の合成のための方法において、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（Ｖ）：
【０２６８】
【化１８】
0005646328.tif 000032
（式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ５は、いろいろな置換基（限定されるものではないが、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、および置換または非置換ヘテロアリールアルキルを含む）であり；およびＲ６は、Ｈまたはプロ基（例えば、加水分解性エステル基）である）のカルバペネム系治療化合物またはそれらの溶媒和物、水和物、塩、およびプロドラッグの合成のためのプロセスに使うことができる。本明細書で使用されるように、プロ基は、活性薬剤中の官能基をマスクしてプロモエティ（ｐｒｏｍｏｉｅｔｙ）を形成するのに使用されるとき、薬剤をプロドラッグに変換する保護基の種類を指す。プロ基は、使用される特定の条件下で切断される結合を介して薬剤の官能基に一般的に結合している。このように、プロ基は、使用される特定の条件下で官能基を放出するために切断するプロモエティの部分である。カルボキシル基は、エステル（シリルエステルおよびチオエステルを含む）、アミドまたはヒドラジドプロモエティとしてマスクされることができ、そして、それはインビボで加水分解されてカルボキシル基を提供する。適切なプロ基とそれらのそれぞれのプロモエティの他の特定の例は、当業者には明らかであろう。したがって、構造式（Ｖ）の化合物の合成のための方法では、この方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含むことができる。いろいろなカルバペネム系治療化合物の合成は、特に、米国特許第４，９２５，８３６号；同５，３１７，０１６号；ＷＯ０２／０３６５９４；ＷＯ２００４／０６７５３２；およびＷＯ２００７／１０４２２１に記述されており；これらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、以下の構造（Ｘ）：
【０２７０】
【化１９】
0005646328.tif 000033
のイミペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成のために使用することができる。イミペネムは、好気性および嫌気性のグラム陽性菌とグラム陰性菌に対して広域活性スペクトルを有する。それは、緑膿菌と腸球菌種に対して特に有効である。したがって、構造式（Ｘ）のイミペネムの合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。構造式（ＶＩ）の中間体からイミペネムを製造するプロセスは、ＷＯ０２３６５９４で記述されており、これは引用により本明細書に取り込まれる。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＩ）：
【０２７２】
【化２０】
0005646328.tif 000034
のドリペネム、またはその溶媒和物、水和物、または塩の合成に使用することができる。ドリペネムは、イミペネムまたはエルタペネムと同様に、グラム陽性球菌に対するスペクトルと力価、およびメロペネムと同様のグラム陰性菌に対する活性を有する。したがって、構造式（ＸＩ）のドリペネムの合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。式（ＶＩ）の中間体からドリペネムを製造するプロセスは、米国特許第５，３１７，０１６号に記述されており、これは引用により本明細書に取り込まれる。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＩＩ）：
【０２７４】
【化２１】
0005646328.tif 000035
のメロペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成に使用することができる。メロペネムは、腹腔内感染症（例えば、虫垂炎および腹膜炎）の治療；細菌性髄膜炎の治療；および感受性の微生物に起因する皮膚及び皮膚構造の感染症の治療に対して適応される。したがって、構造式（ＸＩＩ）のメロペネムの合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。メロペネムを製造するプロセスは、ＷＯ２００７／１０４２２１に記述されており、これは引用により本明細書に取り込まれる。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＩＩＩ）：
【０２７６】
【化２２】
0005646328.tif 000036
のエルタペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成に使用することができる。エルタペネムは、グラム陰性菌に対して有効であるが、ＭＲＳＡ、アンピシリン耐性腸球菌、緑膿菌またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種に対しては活性ではない。エルタペネムはまた、嫌気性菌に対して臨床的に有用な活性を有する。エルタペネムは、主に、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生−および高レベルＡｍｐＣ産生−グラム陰性菌に対して使用される。したがって、構造式（ＸＩＩＩ）のエルタペネムの合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。エルタペネムを製造するプロセスは、米国特許第５，４７８，８２０号および米国特許第７，３４２，００５号に記述されており、これは引用により本明細書に取り込まれる。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＩＶ）：
【０２７８】
【化２３】
0005646328.tif 000037
のビアペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、または塩の合成に使用することができる。ビアペネムは、広域グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対しての抗菌活性を有し、ヒト腎臓デヒドロペプチダーゼ−Ｉ（ＤＨＰ−Ｉ）に対して安定である。それはまた、嫌気性菌に対してインビトロで活性を示す。したがって、式（ＸＩＶ）のビアペネムの合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。中間体（ＩＶａ）からビアペネムを製造するプロセスは、米国特許第４，９２５，８３６号に記述されており、これは引用により本明細書に取り込まれる。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＩＩ）：
【０２８０】
【化２４】
0005646328.tif 000038
のパニペネム、またはその溶媒和物、水和物、および塩の合成に使用することができる。したがって、式（ＸＶ）のパニペネムの合成のための方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。式（ＩＩ）の中間体からパニペネムを製造するプロセスは、Ｍｉｙａｄｅｒａらの１９８３，Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（Ｔｏｋｙｏ）３６（８）：１０３４−１０３９およびＨｉｒａｉらの１９９９，Ｊ．Ｓｙｎｔｈ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７（５）：３８２−３８６に記述されており、これらは引用により本明細書に取り込まれる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＶＩ）：
【０２８２】
【化２５】
0005646328.tif 000039
のスロペネム化合物（式中、Ｒ６は、Ｈまたはプロ基であり；Ｒ８は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル、または−ＳＲ９（ここで、Ｒ９は、Ｒ８に対して記述された置換基である）である）の合成方法で使用することができる。生物学的に活性なスロペネムの治療化合物においてのＲ８に対する他の置換基は、当該分野で公知であり、それらのいくつかは、さらに以下に詳細に記述される。スロペネムについての記載は、特に、米国特許第３，９５１，９５４号；米国特許第４，２３４，５７９号、米国特許第４，２８７，１８１号；米国特許第４，４５２，７９６号；米国特許第４，３４３，６９３号；米国特許第４，３４８，２６４号；米国特許第４，４１６，８９１号；米国特許第４，４５７，９２４号；および米国特許第５，０１３，７２９号；米国特許第５，５０６，２２５号；Ｖｏｌｋｍａｎｎら、１９９２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３５２−４３６１；およびＶｏｌｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，１９９１，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｃｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ  １３，ｐｇ  ４８５−５３４に見ることができ；それらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。したがって、構造式（ＸＶＩ）のスロペネムの合成のための方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＶＩＩ）：
【０２８４】
【化２６】
0005646328.tif 000040
（式中、Ｒ６は、Ｈまたはプロ基である）のスロペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法で使用することができる。したがって、構造式（ＸＶＩＩ）の化合物の合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。式（ＸＶＩＩ）のスロペネムの合成のためのプロセスは、米国特許第５，０１３，７２９号に記述されている。Ｒ６に対するいろいろなプロ基は、米国特許出願公開番号２００８／０００９４７４，米国特許出願公開番号２００８／０１２５４０８、およびＷｕｊｃｉｋら、２００８，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２２：３１９５−３２０６に記載されており、それらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＶＩＩＩ）：
【０２８６】
【化２７】
0005646328.tif 000041
（式中、Ｒ６は、Ｈまたはプロ基である）のスロペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法で使用することができる。したがって、式（ＸＶＩＩＩ）のパニペネムの合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。式（ＸＶＩＩＩ）のスロペネムの合成のためのプロセスは、米国特許第５，５０６，２２５号、およびＷＯ２００７／０３９８８５に記載されている。
【０２８７】
本明細書に開示されたケトレダクターゼを使用して合成することができる別のスロペネム化合物は、式（ＸＩＸ）：
【０２８８】
【化２８】
0005646328.tif 000042
のスロペネムである。したがって、式（ＸＩＸ）の化合物、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法において、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。構造式（ＸＩＸ）のリチペネムは、米国特許第４，４８２，５６５号に記述されている。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＸ）：
【０２９０】
【化２９】
0005646328.tif 000043
のスロペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法で使用することができる。したがって、式（ＸＸ）の化合物の合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。構造式（ＸＸ）の化合物は、ＥＰ１３３６６１２に記載されており；引用により本明細書に取り込まれる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＸＩ）：
【０２９２】
【化３０】
0005646328.tif 000044
の化合物、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法で使用することができる。したがって、式（ＸＸＩ）の化合物の合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。構造式（ＸＸＩ）の化合物は、ＪＰ２００２１１４７８８に記載されており；引用により本明細書に取り込まれる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＸＩＩ）：
【０２９４】
【化３１】
0005646328.tif 000045
のスロペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法で使用することができる。したがって、式（ＸＸＩＩ）の化合物の合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。構造式（ＸＸＩＩ）の化合物は、米国特許第６，９２４，２７９号および米国特許第７，０３４，１５０号に記載されており、その開示は引用により本明細書に取り込まれる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、構造式（ＸＸＩＩＩ）：
【０２９６】
【化３２】
0005646328.tif 000046
のスロペネム、またはその溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および塩の合成方法で使用することができる。したがって、式（ＸＸＩＩＩ）の化合物の合成方法では、該方法における工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む。構造式（ＸＸＩＩＩ）の化合物は、ＷＯ２００８／０４７９０９および米国特許第５，６５９，０４３号に記載されており、その開示は引用により本明細書に取り込まれる。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、本開示のケトレダクターゼは、組成物として、例えば、ケトレダクターゼにより作用を受ける基質および／またはケトレダクターゼ反応により生産される生成物とともに反応組成物として存在することができる。したがって、いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼと構造式（Ｉ）の基質を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の２Ｓ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼと構造式（ＩＩ）の生成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の２Ｓ，３Ｒケトレダクターゼ、式（Ｉ）の基質、および式（ＩＩ）の生成物を含むことができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼと構造式（Ｉ）の基質を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の２Ｒ，３Ｒ選択的ケトレダクターゼと構造式（ＩＩＩ）の生成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の２Ｒ，３Ｒケトレダクターゼ、式（Ｉ）の基質、および式（ＩＩＩ）の生成物を含むことができる。
【０２９９】
ケトレダクターゼ反応は、補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生系の存在下に実施することができるので、反応条件は補因子再生系の要素をさらに含むことができ、それらは下記に詳細に記述される。したがって、いくつかの実施形態では、ケトレダクターゼの前述の組成物は、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース；ホルメートデヒドロゲナーゼとホルメート；またはイソプロパノールと第２級アルコールデヒドロゲナーゼから成る補因子再生系をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、組み換えケトレダクターゼである。補因子再生のために使うことができる他の酵素と基質は、当業者にはよく知られている。
【０３００】
当業者に知られているように、ケトレダクターゼ−触媒還元反応は、一般に補因子を必要とする。本明細書に記述された組み換えケトレダクターゼ酵素により触媒される還元反応もまた、一般に補因子を必要とするが、しかし、組み換えケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素で触媒される反応より、はるかに少ない補因子を必要とする。本明細書で使用されるように、「補因子」という用語は、ケトレダクターゼ酵素と組み合わされて作用する非タンパク質化合物を指す。本明細書に記載される組み換えケトレダクターゼ酵素の使用に適した補因子は、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元型）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元型）を含むが、これに限定されるものではない。通常、補因子の還元型は、反応混合物に加えられる。還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、補因子再生系を用いて、場合により酸化型ＮＡＤ（Ｐ）＋から再生することができる。
【０３０１】
「補因子再生系」という用語は、補因子（例えば、ＮＡＤＰＨへのＮＡＤＰ＋）の酸化型を還元する反応に関与する一連の反応物質を指す。ケト基質のケトレダクターゼ−触媒還元により酸化された補因子は、補因子再生系によって還元型で再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源であり、補因子の酸化型を還元し得る化学量論的還元剤を含む。補因子再生系は、還元剤によって補因子の酸化型の還元を触媒する触媒（例えば、酵素触媒）をさらに含んでもよい。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生する補因子再生系は、当該分野で公知であり、本明細書に記述された方法において使用することができる。
【０３０２】
使用され得る典型的な補因子再生系は、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ホルメートとホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートとグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、第２級アルコール（例えば、イソプロピルアルコール）と第２級アルコールデヒドロゲナーゼ、亜リン酸と亜リン酸デヒドロゲナーゼ、分子状水素とヒドロゲナーゼなどを含むが、これらに限定されない。これらの系は、補因子としてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのいずれかと組み合わせて使用され得る。ヒドロゲナーゼを使用した電気化学的再生もまた、補因子再生系として使用され得る。例えば、米国特許第５，５３８，８６７号および同第６，４９５，０２３号を参照のこと（これらの両方は、引用により本明細書に取り込まれる）。金属触媒および還元剤（例えば、分子状水素またはホルメート）を含む化学的な補因子再生系もまた適切である。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０００／０５３７３１を参照のこと（これは、引用により本明細書に取り込まれる）。
【０３０３】
本明細書中では、用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、Ｄ−グルコースとＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のグルコン酸とＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変換をそれぞれ触媒するＮＡＤ＋依存性酵素またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を言及するために互換的に使用される。下記の式（１）は、グルコースによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のグルコースデヒドロゲナーゼ触媒還元を記載する。
【０３０４】
【化３３】
0005646328.tif 000047
本明細書に記載の方法の実施において使用するのに適切なグルコースデヒドロゲナーゼは、天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼと同様に天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼの両方を含む。遺伝子をコードする天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼは、文献に報告されている。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７ＧＤＨ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、その天然の宿主中で生成される酵素と同一の物理化学的特性を示すことが報告された（Ｖａｓａｎｔｈａら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８５）。Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１２２７６に相当するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列は、Ｌａｍｐｅｌらによって報告（１９８６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２３８−２４３）され、ＹａｍａｎｅらによってＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｄ５０４５３として訂正型が報告された（１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３０４７−３０５６）。天然に存在するＧＤＨ遺伝子はまた、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９由来のＧＤＨをコードする遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：８７−９１；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＧＤＨをコードする遺伝子（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８，１７４：４８５−４９０、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９０，７０：３６３−３６９、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ２１６２７０）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、配列番号１０および１２として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９に提供される（それぞれ、該ＰＣＴ公開公報の配列番号９および１１に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）が、その開示は、引用により本明細書に取り込まれる。
【０３０５】
天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、例えば、変異誘発、定方向進化などの公知の方法を使用して生成され得る。天然に存在するか、または天然に存在しないかにかかわらず、適切な活性を有するＧＤＨ酵素は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されたアッセイを使用して容易に同定することができ、そのＰＣＴ出願の開示は、引用により本明細書に取り込まれる。例示的な天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、配列番号６２、６４、６６、６８、１２２、１２４、および１２６として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９に提供される。これらをコードするポリヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９で、それぞれ、配列番号６１、６３、６５、６７、１２１、１２３、および１２５として提供される。これらの配列の全ては、引用により本明細書に取り込まれる。本明細書で開示されるケトレダクターゼ−触媒還元反応で使用されるのに適した、さらなる、天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開番号２００５／００９５６１９および同２００５／０１５３４１７に提供され、それらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。
【０３０６】
本明細書に記載されたケトレダクターゼ−触媒還元反応で使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されるアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、時には少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇまたは約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、最大約１０４μｍｏｌ／分／ｍｇ、あるいはそれを超える活性を示し得る。
【０３０７】
本明細書に記載されるケトレダクターゼ−触媒還元反応は、一般に、溶媒中で実施される。適切な溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例えば、１−エチル４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、水性溶媒（水および水性共溶媒系を含む）が使用される。
【０３０８】
代表的な水性共溶媒系は、水および１種以上の有機溶媒を有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、その有機溶媒成分が、ケトレダクターゼ酵素を不活化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載される酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において、目的の定義済み基質で特定された組み換えケトレダクターゼ酵素の酵素活性を測定することによって容易に同定することができる。
【０３０９】
水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性であり、単一の液体相を提供するか、または水性成分と部分的に混和性または非混和性であり、２つの液体相を提供する。一般的には、水性共溶媒系が使用される場合、２相であるように選択され、水が有機溶媒中に分散されるか、またはその逆である。一般的に、水性共溶媒系が利用される場合、水相から容易に分離され得る有機溶媒を選択することが望ましい。一般的に、共溶媒系中の水：有機溶媒の比は、典型的には、約９０：１０〜約１０：９０（ｖ／ｖ）の範囲の有機溶媒：水、および８０：２０と２０：８０（ｖ／ｖ）との間の有機溶媒：水である。共溶媒系は、反応混合物に添加する前に予め形成され得るか、または反応容器中、インシチュで形成され得る。
【０３１０】
水性溶媒（水または水性共溶媒）は、ｐＨ緩衝化されていてもｐＨ緩衝化されていなくてもよい。一般的に、還元は、約ｐＨ１０以下、通常、約５から約１０の範囲内のｐＨで実施され得る。いくつかの実施形態では、還元は、約９以下のｐＨ、通常は、約５〜約９の範囲内で実施される。いくつかの実施形態では、還元は、約８以下のｐＨで、しばしば約５〜約８の範囲内で、通常は約６〜約８の範囲内で実施される。また、還元は、約７．８以下のｐＨまたは７．５以下のｐＨで実施される。あるいはまた、還元は、中性のｐＨ、すなわち、約７で実施され得る。
【０３１１】
還元反応の過程で、反応混合物のｐＨは変わるかもしれない。反応混合物のｐＨは、還元反応の過程で酸または塩基を添加することにより望ましいｐＨまたは望ましいｐＨ範囲内に維持され得る。あるいはまた、ｐＨは、緩衝剤を含む水性溶媒を用いて制御し得る。望ましいｐＨ範囲を維持する適切な緩衝剤は、当該分野で公知であり、例えば、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤などを含む。緩衝化および酸または塩基の添加の組み合わせも、また、使用し得る。
【０３１２】
グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系が使用される場合、式（３）に示されるようなグルコン酸（ｐＫａ＝３．６）の共生成は、生じる水性グルコン酸が、他に中和されない場合に、反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝化技術（ここで、緩衝液は、提供される緩衝能までグルコン酸を中和する）により、または変換の経過と共に塩基を添加することによって所望のレベルに維持され得る。緩衝化と塩基添加の組み合わせも、使用されてよい。望ましいｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝剤は、上記される。グルコン酸の中和のための適切な塩基は、有機塩基（例えば、アミン、アルコキシドなど）、無機塩基（例えば、水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４など）などである。変換経過と同時の塩基の添加は、手動で行われ、その間、反応混合物のｐＨがモニタリングされ、あるいは、より便利には、ｐＨスタットとして自動滴定器が用いられる。部分的緩衝能と塩基の添加の組み合わせは、また、プロセス制御のために使用することができる。
【０３１３】
塩基の添加が、ケトレダクターゼ−触媒還元反応中に放出されるグルコン酸を中和するために使用される場合、変換の進行は、ｐＨを維持するために添加される塩基の量によってモニターされ得る。一連の還元過程にわたって緩衝化されていないかまたは部分的に緩衝化された反応混合物に添加される塩基は、典型的には水溶液に添加される。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、補因子再生系は、ホルメートデヒドロゲナーゼを含むことができる。用語「ホルメートデヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」は、それぞれ、ホルメートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤ＋依存性酵素またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では互換的に使用される。本明細書で記述されるケトレダクターゼ−触媒還元反応での補因子再生系として使用するために適切なホルメートデヒドロゲナーゼは、天然に存在するホルメートデヒドロゲナーゼ、および天然に存在しないホルメートデヒドロゲナーゼの両方を含む。ホルメートデヒドロゲナーゼとしては、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９の配列番号７０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）および７２（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）に対応するものが挙げられ、それらは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９の配列番号６９および７１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされ、それらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。天然であるか、非天然であるかに関係なく、本明細書で記述される方法で使用されるホルメートデヒドロゲナーゼは、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時折少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、最大約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、あるいはそれ以上の活性を示すことができ、そしてＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されるアッセイで活性について容易にスクリーニングできる。
【０３１５】
本明細書中で使用されるように、用語「ホルメート」とは、ホルメートアニオン（ＨＣＯ２−）、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）、およびそれらの混合物を指す。ホルメートは、塩の形態（代表的には、アルカリ塩またはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２Ｎａ、ＫＨＣＯ２ＮＨ４など））、ギ酸の形態（代表的には、水性ギ酸）、またはそれらの混合物の形態で提供され得る。ギ酸は、中程度の酸である。そのｐＫａ（水中でｐＫａ＝３．７）に関していくつかのｐＨ群の範囲内の水溶液中で、ホルメートは、平衡濃度においてＨＣＯ２−およびＨＣＯ２Ｈの両方として存在する。約４より上のｐＨにて、ホルメートは、ＨＣＯ２−として優先的に存在する。ホルメートがギ酸として提供される場合、反応混合物は、典型的には所望のｐＨ（典型的には、約５以上のｐＨ）を提供するために塩基を添加することによって緩衝化されるかまたは酸性が弱められる。ギ酸の中和のために適切な塩基は、有機塩基（例えば、アミン、アルコキシドなど）、無機塩基（例えば、水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４など）であるが、これらに限定されるものではない。
【０３１６】
ホルメートがＨＣＯ２−として優先的に存在する約ｐＨ５より上のｐＨ値について、下記の式（２）：
【０３１７】
【化３４】
0005646328.tif 000048
は、ホルメートによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のホルメートデヒドロゲナーゼ−触媒還元反応を説明する。
【０３１８】
ホルメートおよびホルメートデヒドロゲナーゼが、補因子再生系として使用される場合、反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝化技術（ここで、緩衝液は、提供される緩衝能までプロトンを放出する）により、または変換の経過と共に塩基を添加することによって所望のレベルに維持され得る。ｐＨを維持するために反応の過程で添加する適切な酸としては、有機酸（例えば、カルボン酸、スルホン酸、リン酸など）、鉱酸（例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩酸）、硫酸、リン酸など）、酸性塩（例えば、リン酸２水素塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、重硫酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４）などが挙げられる。いくつかの実施形態は、ギ酸（それによってギ酸塩濃度と溶液のｐＨが維持される）を利用する。
【０３１９】
酸の添加が、ホルメート／ホルメートデヒドゲナーゼ補因子再生系を使用して、還元反応の過程でのｐＨを維持するために使用される場合、変換の進行は、ｐＨを維持するために添加された酸の量によってモニターされ得る。典型的には、一連の変換にわたって緩衝化されていないかまたは部分的に緩衝化された反応混合物に添加される酸は、典型的には水溶液として添加される。
【０３２０】
用語「第２級アルコールデヒドロゲナーゼ」および「ｓＡＤＨ」は、第２級アルコールおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をケトンおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへそれぞれ変換するのを触媒するＮＡＤ＋依存性酵素またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために本明細書では互換的に使用される。下記の式（３）：
【０３２１】
【化３５】
0005646328.tif 000049
は、イソプロパノールで例示される第２級アルコールによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の還元を説明する。
【０３２２】
本明細書に記述されるケトレダクターゼ−触媒反応での補因子再生系としての使用に適した第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在する第２級アルコールデヒドロゲナーゼと同様に天然に存在しない第２級アルコールデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然に存在する第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ由来の既知アルコールデヒドロゲナーゼを含み、そして、天然に存在しない第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、それに由来する組み換えアルコールデヒドロゲナーゼを含む。天然に存在するかまたは天然に存在しないかを問わず、本明細書で開示される方法で使用される第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時折少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、最大約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇあるいはそれ以上の活性を示すことができる。
【０３２３】
適切な第２級アルコールは、低級の第２級アルカノールおよびアリールアルキルカルビノールを含む。低級の第２級アルコールの例としては、イソプロパノール、２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノールなどが挙げられる。１つの実施形態では、第２級アルコールは、イソプロパノールである。適切なアリールアルキルカルビノールは、非置換および置換の１−アリールエタノールを含む。
【０３２４】
第２級アルコールと第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、補因子再生系として使用される場合、得られるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋は、第２級アルコールデヒドロゲナーゼによる第２級アルコールのケトンへの連結酸化により還元される。いくつかの組み換えケトレダクターゼはまた、第２級アルコール還元剤を脱水素する活性を有する。第２級アルコールを還元剤として用いるいくつかの実施形態では、組み換えケトレダクターゼと第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、同じ酵素である。
【０３２５】
補因子再生系を使用する、本明細書に記述されるケトレダクターゼ−触媒還元反応の実施形態を実施する際に、補因子の酸化型または還元型のいずれかが、最初に提供され得る。上記したように、補因子再生系は、酸化型補因子をその還元型に変換し、それは次にケトレダクターゼ基質の還元において利用される。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、補因子再生系は、使用されない。補因子再生系を使わずに実施される還元反応については、補因子は、還元型で反応混合物に添加される。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、プロセスが宿主生物の全細胞を使って実施されるとき、全細胞は、先天的に補因子を提供し得る。代替的に、または組み合わせて、細胞は先天的に、または組み換えられてグルコースデヒドロゲナーゼを提供し得る。
【０３２８】
本明細書に記載された立体選択的還元反応を実施する際には、組み換えケトレダクターゼ酵素および場合により補因子再生系を含む任意の酵素は、精製した酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞、および／または細胞抽出物および／またはそのような細胞の溶解物の形態で、反応混合物に添加することができる。組み換えケトレダクターゼ酵素および場合により補因子再生酵素をコードする遺伝子（複数可）は、別個に宿主細胞に、または同じ宿主細胞に一緒に形質転換することができる。例えば、いくつかの実施形態において、一組の宿主細胞は、組み換えケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができ、そして別の組は、補因子再生酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換されることができる。形質転換細胞の両方の組は、全細胞、またはそこから由来する細胞溶解物もしくは細胞抽出物の形態で反応混合物中で一緒に使用することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、組み換えケトレダクターゼ酵素および補因子再生系の酵素の両方をコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができる。
【０３２９】
組み換えケトレダクターゼ酵素および／または場合により補因子再生酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された全細胞、またはその細胞溶解物および／または細胞抽出物は、様々な異なる形態で用いることが可能であり、その形態は、固体（例えば、凍結乾燥された形態、噴霧乾燥された形態、その他）または半固体（例えば、粗製のペースト）を含む。
【０３３０】
細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、加熱処理またはその他により部分的に精製され、凍結乾燥の前に脱塩処理（例えば、限外濾過、透析、その他）される。細胞調整物のいずれもが、既知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）を用いる架橋化または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃなど）への固定化により安定化され得る。
【０３３１】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、エマルジョン、懸濁液などを含む）で反応に供することができる。この反応物は、当業者に公知の方法および装置を用いて、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、そのタンパク質溶液は、少量の一定分量で−８０℃に凍結することができ、次いで、予め冷却した凍結乾燥室に入れ、続いて、真空にする。サンプルから水分を除去した後、温度は、典型的には、真空を解徐して凍結乾燥サンプルを回収する前に、２時間にわたって４℃まで昇温させる。
【０３３２】
還元反応で使用される反応物質の量は、一般的に、望まれる生成物の量、および同時に、使用されるケトレダクターゼ基質の量によって変化する。以下の指針は、使用されるケトレダクターゼ、補因子、および随意の補因子再生系の量を決定するために使用することができる。一般的に、ケト基質は、約５０ｍｇ〜約５ｇのケトレダクターゼおよび約１０ｍｇ〜約１５０ｍｇの補因子を使用して、約２０〜３００グラム／リットルの濃度で使用することができる。当業者は、これらを所望のレベルの生産性および生成スケールに調整するために、これらの量を変化させる方法を理解している。随意の補因子再生系の適切な量は、使用される補因子および／またはケトレダクターゼの量に基づくルーチンの実験によって容易に決定され得る。一般的に、還元剤（例えば、グルコース、ホルメート、イソプロパノール）は、ケトレダクターゼ基質の実質的に完全な変換または完全に近い変換を達成するために、ケトレダクターゼ基質の等モルレベルより上のレベルで使用される。
【０３３３】
反応物質の添加の順序は、重要ではない。反応物質は、溶媒（例えば、単相溶媒、２相水性共溶媒系など）中に同時に一緒に添加され得るか、あるいは、反応物質のうちいくつかは別個に添加でき、そしていくつかは異なる時間に一緒に添加され得る。例えば、補因子再生系、補因子、ケトレダクターゼ、およびケトレダクターゼ基質は、最初に溶媒に添加してもよい。
【０３３４】
水性共溶媒系が使用される場合の改良された混合効率のために、補因子再生系、ケトレダクターゼ、および補因子は、最初に水相に添加されて混合され得る。次いで、有機相が、添加されて混合され、その後、ケトレダクターゼ基質が添加され得る。あるいはまた、ケトレダクターゼ基質は、水相に添加される前に、有機相中で予備混合されてもよい。
【０３３５】
本明細書に記述されたケトレダクターゼ−触媒還元反応を行うための適切な条件は、ルーチン実験で容易に最適化できる広範囲の条件を含み、限定されるものではないが、組み換えケトレダクターゼ酵素と基質を実験的ｐＨおよび温度で接触させ、生成物を、例えば、本明細書で提供される実施例に記述された方法を用いて検出することを含む。
【０３３６】
ケトレダクターゼ触媒還元反応は、典型的には、約１５℃〜約７５℃の範囲の温度で実施される。いくつかの実施形態については、反応は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で実施される。さらに別の実施形態では、反応は、約２０℃〜約４５℃の範囲の温度で実施される。反応はまた、周囲条件下で実施されてもよい。
【０３３７】
還元反応は、一般に、本質的に完全な、またはほぼ完全な基質の還元が得られるまで進行させる。生成物への基質の還元は、基質および／または生成物を検出する既知の方法を使用してモニターできる。適切な方法には、ガスクロマトグラフィ、ＨＰＬＣなどが挙げられる。反応混合物中に生じたアルコール還元生成物の変換収率は、一般に約５０％より大きく、また、約６０％より大きく、また、約７０％より大きい場合があり、また、約８０％より大きい場合があり、また、９０％より大きい場合があり、そして、しばしば約９７％より大きい場合がある。
【実施例】
【０３３８】
本開示の様々な特徴と実施形態は、以下の代表的な実施例で示されるが、これらは例示的なものであり、限定するものではない。
【０３３９】
実施例１：ケトレダクターゼ粉末の生産；フラスコ振とう法手順
目的のケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉの単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１％のグルコースを含む５０ｍｌのトリプシンブロス（１２ｇ／Ｌのバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｍｌ／Ｌのグリセリン、６５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０）に、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、接種した。細胞を、孵卵器中、３０℃、２５０ｒｐｍで振とうしながら一晩（少なくとも１６時間）増殖させた。培養物を２５０ｍｌのテリフィックブロス（１リットルフラスコ中に１ｍＭのＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む）に６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．２となるまで希釈し、３０℃で増殖させた。ケトレダクターゼ遺伝子の発現を、培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８であるときに、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、一晩（少なくとも１６時間）インキュベーションした。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、、１５分、４℃）により採取し、上清液は廃棄した。細胞ペレットをｐＨ７．０の冷たい（４℃）１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝剤（ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＢの場合、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４およびそれから由来する組み換えケトレダクターゼを含む）の等容積で再懸濁し、上記のように遠心分離して採取された。洗浄された細胞を、冷たいトリエタノールアミン（塩化物）緩衝剤の１２ｍｌに再懸濁し、４℃に維持しながら、１２０００ｐｓｉでフレンチプレスを２回通過させた。細胞破片を遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）により除去した。透明な細胞溶解上清液を回収し、−２０℃で保存した。凍結された透明な細胞溶解液の凍結乾燥は、粗製のケトレダクターゼ酵素の乾燥粉末を与えた。
【０３４０】
実施例２：ケトレダクターゼの生産；発酵手順
通気攪拌されている１５Ｌ発酵槽中で、０．８８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、０．９８ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、１２．５ｇ／Ｌのリン酸水素２カリウム３水和物、６．２５ｇ／Ｌのリン酸２水素カリウム、６．２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母エキス、０．０８３ｇ／Ｌのクエン酸第２鉄アンモニウム、および８．３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム２水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン１水和物、１ｇ／Ｌの硫酸第１銅の７水和物、０．１ｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４水和物、および０．０２ｇ／Ｌの４ホウ酸ナトリウム１０水和物を含む）を含む成長培地の６．０Ｌを３０℃の温度とした。発酵槽に、目的のケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の後期指数増殖期の培養物（実施例３に記載されているように振とうフラスコ中で０．５〜２．０の開始ＯＤ６００まで増殖）を接種した。発酵槽を５００〜１５００ｒｐｍで攪拌し、空気を発酵槽に１．０〜１５．０Ｌ／分で供給して３０％飽和以上の溶存酸素レベルを維持した。培養物のｐＨは、２０％（ｖ／ｖ）の水酸化アンモニウムを添加して７．０に制御した。培養物の成長は、５００ｇ／Ｌのセレロース、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、および１０．４ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム７水和物を含む供給溶液の添加により維持された。培養物が５０のＯＤ６００に達した後に、ケトレダクターゼの発現は、１ｍＭの最終的な濃度までイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘導された。培養物は、さらに１４時間増殖させた。次いで、培養物を４℃に冷却し、採取するまで４℃に維持した。細胞は、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機で遠心分離（５０００Ｇ，４０分間、４℃）して採取した。採取した細胞は、以下の下流での採取プロセスで直接使用されるか、または４℃でそのような使用まで保存された。
【０３４１】
細胞ペレットを、湿潤細胞ペーストの各容量に対して２容量の１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ６．８）に４℃で再懸濁した。細胞内ケトレダクターゼは、１２０００ｐｓｉｇの圧力を使用して２段均質化弁アセンブリを装備したホモジナイザを通過させることにより細胞から放出された。細胞ホモジネートは、破砕直後に４℃に冷却された。１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液（ｐＨ７．２）を、０．５％（ｗ／ｖ）の最終的な濃度となるように細胞溶解液へ添加し、３０分間攪拌した。得られた懸濁液を標準の実験室遠心分離機中、３０分間、５０００Ｇで遠心分離して澄明化した。透明な上澄み液をデカンテーションし、３０Ｋｄの分子量カットオフを有するセルロース限外濾過膜を使用して１０倍に濃縮した。最終的な濃縮物を浅い容器中に分配し、−２０℃に凍結し、粉末に凍結乾燥した。ケトレダクターゼ粉末は、−８０℃で保存された。
【０３４２】
実施例３：メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート立体異性体の検出のための分析方法
ルーチン分析のため、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの２つの立体異性体、およびメチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートの４つの立体異性体を、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡカラム（４．６×１５０ｍｍ  （Ｃｈｉｒａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号８０３２４）；均一濃度（９２％ヘプタン、８％エタノール）；４０℃；流速１．５ｍＬ／分；検体容量：１０μＬ；検出：２５４ｎｍでのＵＶ吸収）上で順相のキラルＨＰＬＣにより分離した。保有時間：２Ｓ，３Ｒ−立体異性体：６．８分、２Ｒ，３Ｓ−ジアステレオマー：８．１分、２Ｒ，３Ｒ−立体異性体：９．３分、２Ｓ，３Ｓ−ジアステレオマー：１０．１分、基質立体異性体：１１．６分および１３．５分。
【０３４３】
実施例４：イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に活性な変異体を同定するハイスループットＮＡＤＰＨ蛍光プレスクリーニング
定方向進化によって得られた、そして、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含むプラスミドライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で形質転換し、１％のグルコースと３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス上にプレーティングした。３０℃で少なくとも１６時間、インキュベーションした後に、コロニーを、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットによるコロニー採取器（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）で、９６穴の浅いウェルのマイクロタイタープレート（１８０μＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）、１％のグルコース、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）、および２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）に釣り上げた。細胞を一晩２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で増殖させた。次いで、この培養物の２０μＬを９６−ディープ・ウェル・プレート（３８０μＬのテリフィックブロス（ＴＢ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、および３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含む）に移した。ディープ・ウェル・プレートを３０℃で２５０ｒｐｍ、２．５〜３時間（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）振とうしながらインキュベーションした後、細胞培養物による組み換え遺伝子発現が、最終濃度１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導された。次いで、プレートを３０℃で、２５０ｒｐｍ、１５〜３０時間振とうさせながらインキュベーションした。
【０３４４】
細胞を遠心分離によりペレット化し、４００μＬの細胞溶解緩衝液に再懸濁して、室温で少なくとも１時間振とうすることによって溶解させた。細胞溶解緩衝液は、１００ｍＭのトリエタノールアミン（硫酸塩）緩衝剤（ｐＨ７．０〜７．２）、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、２００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢ硫酸塩、および２ｍＭのＭｇＳＯ４を含んでいた。次に、プレートを、４℃において４０００ＲＰＭで１０分間、遠心分離機で回転させ、澄明な上澄み液（透明な上清液）は、蛍光アッセイで使用される。
【０３４５】
９６穴の黒いマイクロタイタープレートで、２０μｌの細胞溶解物（１００ｍＭのトリエタノールアミン（硫酸塩）緩衝剤（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈）を、１００ｍＭのトリエタノールアミン（硫酸塩）緩衝剤（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｇ／ＬのＮＡＤＰ、および５０％イソプロピルアルコールから成るアッセイ混合物の１８０μｌに添加し、反応の進行は、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）での３３０ｎｍにおける励起後、４４５ｎｍでのＮＡＤＰＨの蛍光の増加を追跡することにより測定された。
【０３４６】
実施例５：補因子再生のためのイソプロピルアルコールを使用するメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートに関するケトレダクターゼ活性のためのハイスループットＨＰＬＣアッセイ
細胞溶解物は、実施例４に記載されたように調製された。ケトレダクターゼ活性は、細胞溶解物の測定量をＣｏｓｔａｒのディープ・ウェル・プレート（カタログ番号３９６１）に移すことによって測定された。１００ｍＭのトリエタノールアミン（硫酸塩）緩衝剤（ｐＨ７．０）中の３ｍｇ／ｍｌのＮａ−ＮＡＤＰの５０μｌ、ＩＰＡ中の３．３ｍｇ／ｍｌのメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの１５０μｌに、１００μＬの透明な細胞溶解液を加えた。プレートは、アルミニウム／ポリプロピレンラミネート熱シールテープ（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、カタログ番号０６６４３−００１）で熱シールし、室温で２４時間振とうしながらインキュベーションした。反応終了時に、９９０μＬのＭＴＢＥを各ウェルに加え、プレートを再シールし、２０分間振とうした。遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分、４℃）により、有機層を水相から分離し、実施例３に記載された方法を用いて、２００μＬの有機層を新しい浅いウェル（分析用９６穴プレート）に移した。
【０３４７】
実施例６：補因子再生に対する高基質濃度でのイソプロピルアルコールを使用するメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートに関するケトレダクターゼ活性のためのハイスループットＨＰＬＣアッセイ
９６穴マイクロタイタープレートのウェルに、１００ｍＭのトリエタノールアミン（硫酸塩）緩衝剤（ｐＨ７．０）中の０．６ｍｇ／ｍｌのＮａ−ＮＡＤＰの１０μＬ、ＩＰＡ中の１００ｍｇ／ｍｌのエチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの１５０μＬ、１０μＬの透明な細胞溶解液および１００ｍＭのＴＥＡの１３０μＬを添加した。プレートを、熱シールし、室温で２４時間振とうしながらインキュベーションした。反応終了時に、９９０μＬのＭＴＢＥを各ウェルに加え、プレートを再熱シールし、２０分間振とうした。遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分、４℃）により、有機層を水相から分離し、実施例３に記載された方法を用いて、２００μＬの有機層を新しい浅いウェル（分析用９６穴プレート）に移した。
【０３４８】
この実施例は、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの立体選択的還元のために改良されたＫＲＥＤ変異体を同定するために使用された方法を説明する。
【０３４９】
実施例７：メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの還元のためのＡＤＨ−ＬＫ変異体の評価
いくつかのＡＤＨ−ＬＫ変異体は、実施例５に記載されたメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの立体選択的還元について評価された。検体は、実施例３に記載されるように分析された。
【０３５０】
表４は、ケトレダクターゼに対応する配列番号、ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸変異数、所望の（２Ｓ，３Ｒ）−立体異性体の変換率（％）およびパーセントを記載する。
【０３５１】
【表４】
0005646328.tif 000050
配列番号９０のＡＤＨ−ＬＫ変異体は、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートの生産のための効率的なＫＲＥＤのさらなる進化のために使用された。同様に、主として（２Ｒ，３Ｒ）立体異性体を与えたＡＤＨ−ＬＫと比較して、１０個の変異を含む配列番号９４のＡＤＨ−ＬＫ変異体は、（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートの生産のための効率的なＫＲＥＤのさらなる進化のために使用された。
【０３５２】
この実施例は、ＡＤＨ−ＬＫの変異体が、メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの立体選択的還元に有用であることを示す。配列番号９０と９４の新しい変異体が生成されたが、そこでは、内部のＢｇｌＩ部位が取り除かれた。対応する新しい配列は、それぞれ配列番号４８と配列番号６６である。
【０３５３】
実施例８：ＡＤＨ−ＬＫ由来のさらなる組み換えケトレダクターゼによるメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートへの還元
配列番号４８を有するＡＤＨ−ＬＫ変異体由来の改良されたケトレダクターゼは、実施例６に記載された方法により、増加した活性および（２Ｓ，３Ｒ）−立体選択性について評価された。
【０３５４】
【表５−１】
0005646328.tif 000051
【０３５５】
【表５−２】
0005646328.tif 000052
実施例９：ＡＤＨ−ＬＫ由来組み換えケトレダクターゼによるメチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートの（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートへの還元
配列番号６６を有するＡＤＨ−ＬＫ変異体由来の改良されたケトレダクターゼは、実施例６に記載された方法により、増加した活性および（２Ｒ，３Ｒ）−立体選択性について評価された。
【０３５６】
【表６−１】
0005646328.tif 000053
【０３５７】
【表６−２】
0005646328.tif 000054
実施例１０：（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートの分取規模生産
オーバーヘッドの撹拌器を備えた２５０ｍｌの３頸フラスコに、メチル２−ベンズアミドメチル−３−ケトブチラート（２５ｇ）、イソプロピルアルコール（３７．５ｍｌ）および０．１Ｍのトリエタノールアミン（塩化物）／０．０４ＭのＭｇＳＯ４緩衝剤（ｐＨ７．２；３０ｍｌ）を充填した。反応混合物を攪拌し、油浴を用いて温度を３７℃とした。反応は、１９ｇ／ＬのＮＡＤＰ−Ｎａ（０．５ｍｌ）の添加から開始し、次いで配列番号１０の３０ｇ／ＬのＫＲＥＤ（２．５ｍｌ）を加えた；両方とも０．１Ｍのトリエタノールアミン（塩化物）／０．０４ＭのＭｇＳＯ４緩衝剤（ｐＨ７．２）中の溶液である。反応進展の後に、反応の過程で５μｌの一定分量を取り、それを１ｍｌのアセトニトリルで希釈し、０．２５μｍのシリンジフィルタで濾過し、実施例３に記載されているように分析した。変換率が９６％を超えたとき、飽和塩化ナトリウム水溶液（１２．５ｍｌ）を反応混合物に加え、次いで、４０ｍｌの酢酸エチルを添加した。反応混合物をさらに１５分間攪拌し、真空下、セライトパッド（フリットガラスフィルタに５ｇ）を通して濾過した。濾過ケーキを２０ｍｌの酢酸エチルで洗浄し、濾液の２相を分離させた。有機層を２０ｍｌの水で３回洗浄し、ロータリーエバポレータで恒量の油まで濃縮した。酢酸エチルを除去した後、トルエン（１０ｍｌ）を加え、真空下で蒸留した。（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラート（２６．４７ｇ）を、１Ｈ−ＮＭＲ−ＣＤＣｌ３で決定した〜１０％トルエンを含む油として得た。
【０３５８】
本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献が、引用によりあらゆる目的のために取り込まれることが個別にあたかも示されると同じ程度に、引用することによりその全体があらゆる目的のためにそれにより取りこまれる。
（項目１）
基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに、少なくとも約６０％の立体異性体過剰率（％）で変換することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２）
以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである；Ｘ１９９に対応する残基がヒスチジンである；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンである、を有する配列番号２または４または８６に基づく参照配列に対して、少なくとも約８５％が同一であるアミノ酸配列を含み、但し、Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族または極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を有する、項目１記載のポリペプチド。
（項目３）
Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）
Ｘ９４に対応する残基が、極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が、脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）
Ｘ９４に対応する残基が、トレオニンであり、Ｘ１９９に対応する残基が、アラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり；およびＸ２０２に対応する残基が、バリンまたはロイシンである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ４に対応する残基が、塩基性残基またはシステインである；
Ｘ１１に対応する残基が、非極性、脂肪族、または芳香族残基である；
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ８６に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１０５に対応する残基が、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；
Ｘ１２９に対応する残基が、非極性、または極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１５３に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９０に対応する残基が、芳香族、または拘束性残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２４８に対応する残基が、非極性、または塩基性残基である；  
Ｘ２４９に対応する残基が、芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有し、ここで該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目８）
ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ４に対応する残基が、システインである；
Ｘ１１に対応する残基が、フェニルアラニンである；
Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ８６に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、バリンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１０５に対応する残基が、グリシンである；
Ｘ１２９に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである；
Ｘ１５３に対応する残基が、アラニンまたはセリンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、ヒスチジンまたはプロリンである；
Ｘ１９５に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、フェニルアラニンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、バリンである；
Ｘ２４８に対応する残基が、リジン、またはアルギニンである；
Ｘ２４９に対応する残基が、トリプトファンである；
の１つ以上をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
の１つ以上をさらに有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性であるか、芳香族であるか、非極性であるか、または脂肪族である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２４８に対応する残基が、非極性、または塩基性残基である；
Ｘ２４９に対応する残基が、芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有する、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ２に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ４に対応する残基が、塩基性残基またはシステインである；
Ｘ１１に対応する残基が、非極性、脂肪族、または芳香族残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ８６に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ１０５に対応する残基が、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；
Ｘ１２９に対応する残基が、非極性、または極性残基である；
Ｘ１５３に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９０に対応する残基が、芳香族、または拘束性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性、または芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有する、項目９または１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：
Ｘ４０に対応する残基が、拘束性、または塩基性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
を有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
を有し、ここで、該アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである、を有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである、を有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下のさらなる特徴：Ｘ４０に対応する残基が、アルギニンである；およびＸ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである、を有する、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ケトレダクターゼポリペプチドが、以下の特徴：Ｘ９４に対応する残基がトレオニンである；Ｘ１９９に対応する残基がヒスチジンである；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンである、を有する配列番号２、４または８６に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対して、少なくとも８５％が同一であるアミノ酸配列を有する領域またはドメインを含み；但し、該ケトレダクターゼドメインまたは領域は、Ｘ９４に対応する残基が、脂肪族または極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基がロイシンまたはバリンであるアミノ酸配列を有する、項目１記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ９４に対応する残基がトレオニンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ１９９に対応する残基がアラニン、ヒスチジンまたはアスパラギンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ９４に対応する残基が極性残基であり；Ｘ１９９に対応する残基が脂肪族、拘束性、または極性残基であり；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ９４に対応する残基がトレオニンであり；Ｘ１９９に対応する残基がアラニン、ヒスチジン、またはアスパラギンであり；およびＸ２０２に対応する残基がバリンまたはロイシンであるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２３）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１０５に対応する残基が、非極性、脂肪族、塩基性、または酸性残基である；
Ｘ１２９に対応する残基が、非極性、または極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１５３に対応する残基が、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９０に対応する残基が、芳香族、または拘束性残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性、または芳香族残基である；
の１つ以上をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメインでの他のアミノ酸残基位置において１つ以上の違いを場合により有する、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２４）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、バリンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１０５に対応する残基が、グリシンである；
Ｘ１２９に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、メチオニンまたはロイシンである；
Ｘ１５３に対応する残基が、アラニンまたはセリンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、ヒスチジンまたはプロリンである；
Ｘ１９５に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、フェニルアラニンである；
の１つ以上をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメインでの他のアミノ酸残基位置において１つ以上の違いを場合により有する、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２６）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２７）
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９６に対応する残基が、極性、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９５に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性、または脂肪族残基である；
をさらに有し、ここで、前記アミノ酸配列は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基位置において１つ以上の残基の違いを場合により有する、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２８）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２９）
少なくとも約９０％の立体異性体過剰率（％）で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３０）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４０、４２、５０、５２、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３１）
少なくとも約９５％の立体異性体過剰率（％）で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３２）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、４２、５０、５２、５６、５８、６０、または６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３１に記載のポリペプチド。
（項目３３）
少なくとも約９９％の立体異性体過剰率（％）で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３４）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、３０、３２、３４、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３５）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも１５倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３６）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、５０、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３５に記載のポリペプチド。
（項目３７）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも３０倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３８）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２０、２２、２４、２６、３０、３４、６０、および６２に対応するアミノ酸配列を含む、項目３７に記載のポリペプチド。
（項目３９）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも４０倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４０）
配列番号６、８、１０、１２、１４、２２、および６０に対応するアミノ酸配列を含む、項目３９に記載のポリペプチド。
（項目４１）
配列番号４８の参照ポリペプチドよりも少なくとも５０倍大きい比率で、基質を生成物に変換することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４２）
配列番号６、８、１０、および１２に対応するアミノ酸配列を含む、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４３）
基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを生成物２Ｒ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率（％）で変換することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目４４）
配列番号６８、７２、７４、７６、７８、および８２に対応するアミノ酸配列を含む、項目４３に記載のポリペプチド。
（項目４５）
項目１〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目４６）
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４５、４９、５１、５３、５５、５７、５９、または６１に対応する配列である、項目４５に記載のポリヌクレオチド。
（項目４７）
項目４３または４４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目４８）
配列番号６７、７１、７３、７５、７７、または８１に対応する配列である、項目４７に記載のポリヌクレオチド。
（項目４９）
宿主細胞での発現を方向づけるのに適した制御配列に作動可能に連結された項目４４または４７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目５０）
前記制御配列がプロモーターを含む、項目４９に記載の発現ベクター。
（項目５１）
前記プロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターを含む、項目５０に記載の発現ベクター。
（項目５２）
前記制御配列が分泌シグナルを含む、項目５０に記載の発現ベクター。
（項目５３）
項目４９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目５４）
Ｅ．ｃｏｌｉである、項目５３に記載の宿主細胞。
（項目５５）
項目１〜４２のいずれか１項に記載のケトレダクターゼ、および式（Ｉ）の化合物メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートまたは式（ＩＩ）の化合物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートを含む、組成物。
（項目５６）
基質が、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物である、項目５５に記載の組成物。
（項目５７）
補因子再生系をさらに含む、項目５５に記載の組成物。
（項目５８）
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース；ホルメートデヒドロゲナーゼとホルメート；またはイソプロパノールと第２級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
式（Ｉ）の基質メチル−２−ベンズアミドメチル−３−オキソブチラートを、式（ＩＩ）の生成物２Ｓ，３Ｒ−メチル−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブチラートに還元する方法であって、該方法は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するのに適した反応条件下で、該基質を項目１〜４４のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるか、またはインキュベーションすることを含む、方法。
（項目６０）
前記生成物が約９９％より大きい立体異性体過剰率（％）で存在する、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施される、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、還元反応が、ケトレダクターゼのための補因子および場合により補因子のための再生系の存在下で実施される、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース；ホルメートデヒドロゲナーゼとホルメート；またはイソプロパノールと第２級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６４）
前記第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
式（ＩＶａ）：
【０３５９】
【化３６】
0005646328.tif 000055
（式中、Ｒ１はＨまたは水酸基の保護基であり、Ｒ１０はハロゲンまたは−ＯＡｃであり、ここでＡｃはアセタートである）の中間体を合成する方法であって、
該方法の工程は、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
（項目６６）
構造式（ＩＸ）
【０３６０】
【化３７】
0005646328.tif 000056
（式中、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル（例えば、−ＣＨ３）であり；Ｒ３は、Ｈまたは水酸基の保護基であり；Ｒ４は、Ｈ、カルボキシ基の保護基、アンモニア基、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属であり；およびＸは、ＯＨまたは脱離基である）の中間体を合成する方法であって、
該方法での工程は、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、接触または反応させることを含む、方法。
（項目６７）
構造式（Ｖ）：
【０３６１】
【化３８】
0005646328.tif 000057
(式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ３であり；Ｒ５は置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、および置換または非置換ヘテロアリールアルキルから選択され；およびＲ６は、Ｈまたはプロ基である）のカルバペネムまたはその溶媒和物、水和物、塩もしくはプロドラッグを合成する方法であって、
該方法での工程は、基質を式（ＩＩ）の生成物に還元または変換するのに適した反応条件下で、式（Ｉ）の基質を本開示のケトレダクターゼと接触または反応させることを含む、方法。
（項目６８）
前記カルバペネムが、構造式（Ｘ）：
【０３６２】
【化３９】
0005646328.tif 000058
を有する、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記カルバペネムが、構造式（ＸＩ）：
【０３６３】
【化４０】
0005646328.tif 000059
を有する、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記カルバペネムが、構造式（ＸＩＩ）：
【０３６４】
【化４１】
0005646328.tif 000060
を有する、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記カルバペネムが、構造式（ＸＩＩＩ）：
【０３６５】
【化４２】
0005646328.tif 000061
を有する、項目６７に記載の方法。
【図１】
0005646328.tif 000069
【配列表】
0005646328000001.app