(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、
増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの第一のメンバーは、長さが１００個までの塩基であり、配列番号１４に含まれる少なくとも１５個の連続した塩基に相補的であり、ここで増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第一のメンバーの３’末端配列は配列番号１０８であり、
配列番号１４からなるポリヌクレオチドが鋳型依存性プライマー伸長反応の鋳型である場合、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの第二のメンバーは長さが１００個までの塩基であり、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの第一のメンバーの伸長生成物の少なくとも１５個の連続した塩基に相補的であり、ここで増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第二のメンバーは、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択される、工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかを検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示し、
ここで、前記検出する工程は、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含む、工程と
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｃ）で検出される前記増幅生成物が、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの１メンバーの１７個の連続した塩基、および増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの他のメンバーの１７個の連続した塩基の相補体を含む一本鎖核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、配列番号１６４、配列番号１８４および配列番号１８５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜３，４００コピー数／ｍｌの範囲である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜２００コピー数／ｍｌの範囲である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて前記増幅生成物を検出することを含み、前記試験試料中の前記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が１００コピー数／ｍｌと３，４００コピー数／ｍｌとの間である場合、前記カットオフ値より多い量の前記増幅生成物を検出する確率は、少なくともほんの９５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第一のメンバーが、配列番号１０８の上流に位置するファージＴ７プロモーター配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６４である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１８３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
塩濃度が０．６〜０．９Ｍの範囲にある場合、４２℃のストリンジェントな条件下で、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第一のメンバーが、配列番号１４からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、増幅オリゴヌクレオチドの前記セットの前記第二のメンバーが、同じストリンジェントな条件下で前記伸長生成物とハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記カットオフ値が、（ｉ）前記ＣＨＩＫＶ核酸配列の既知の濃度を用いて実施される複数の増幅反応、および（ｉｉ）前記ＣＨＩＫＶ核酸配列の不在下で実施される複数の陰性対照増幅反応で得られる結果の統計分析によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記カットオフ値が、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含まない陰性対照反応の平均ハイブリダイゼーションシグナル読取値、加えて前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含まない陰性対照反応の３つの標準偏差を用いる統計分析によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号４８の１５〜４８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号４８の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１０８である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号１８６の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１８６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択される、第二のプライマーと、
（ｃ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４０塩基数までであって、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６４からなる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記第一のプライマーが前記任意選択の第一プライマー５’配列を含み、前記第一プライマー５’配列がファージＴ７プロモーター配列を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、配列番号１８４および配列番号１８５からなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
長さが１００塩基数までであって、配列番号１８６の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含み、前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１８６の配列に完全に含まれ、前記第三のプライマーが、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含み、前記第三のプライマーが前記第二のプライマーと異なる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
互いに異なる前記第二および第三の各プライマーが、配列番号１８７の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４８である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３からなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
互いに異なる前記第二および第三の各プライマーが、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３１の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９１である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５１の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３１である、第二のプライマーと、
（ｃ）長さが１００塩基数までで、配列番号５２の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３２である、第三のプライマーと、
（ｄ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ組成物と
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項２４】
前記ハイブリダイゼーションプローブ組成物が、長さが３９塩基数までで配列番号７０の１５〜３９個の連続した塩基を含む第一のハイブリダイゼーションプローブ、および長さが３９塩基数までで配列番号７１の１５〜３９個の連続した塩基を含む第二のハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記第一のハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５０を含み、前記第二のハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５１を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３１の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９１である、第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５１の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３１である、第二のプライマーと、
（ｉｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５２の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３２である、第三のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
【請求項２７】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３２の１５〜４６個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９２である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５３の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５３の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３３である、第二のプライマーと、
（ｃ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項２８】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４２塩基数までであって、配列番号７２の１５〜４２個の連続した塩基を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５２を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３２の１５〜４６個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９２である、第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５３の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５３の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３３である、第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す、工程と
を含む、方法。
【請求項３１】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３６の１５〜５１個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９６である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５７の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３７である、第二のプライマーと、
（ｃ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項３２】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが３７塩基数までであって、配列番号７５の１５〜３７個の連続した塩基を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５５を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３６の１５〜５１個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９６である、第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５７の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３７である、第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
【請求項３５】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３７の１５〜３７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９７である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５８の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５８の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３８である、第二のプライマーと、
（ｃ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項３６】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４４塩基数までであって、配列番号７６の１５〜４４個の連続した塩基を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５６を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３７の１５〜３７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号３７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号９７である、第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５８の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５８の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１３８である、第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
【請求項３９】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号４６の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号４６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１０６である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号６５の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号６５の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４５である、第二のプライマーと、
（ｃ）長さが１００塩基数までで、配列番号６６の１５〜４３個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号６６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４６である、第三のプライマーと、
（ｄ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項４０】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが３９塩基数までであって、配列番号８２の１５〜３９個の連続した塩基を含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６２を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号４６の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号４６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１０６である、第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号６５の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号６５の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４５である、第二のプライマーと、
（ｉｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号６６の１５〜４３個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号６６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第三のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４６である、第三のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
【請求項４３】
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号５０の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５０の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１１０である、第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号６９の１５〜３９個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号６９の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４９である、第二のプライマーと、
（ｃ）前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
前記プライマーおよび前記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
【請求項４４】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４０塩基数までであって、配列番号８５の１５〜４０個の連続した塩基を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６５を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）前記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５０の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号５０の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第一のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１１０である、第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号６９の１５〜３９個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号６９の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含み、ここで前記第二のプライマーの前記標的相補的３’末端配列が配列番号１４９である、第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの前記セットと一緒に前記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、前記試験試料が前記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）前記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある前記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
前記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在することを示し、
前記増幅生成物を前記カットオフ値より少ない量で検出することは、前記ＣＨＩＫＶ核酸配列が前記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００８年４月２１日に出願された米国仮出願第６１／０４６，７３４号の利益を主張する。この関連出願の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、チクングニヤウイルスの核酸を検出するための診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
１９５２年の南タンザニアでの大発生時に初記載されたチクングニヤ熱は、カによって伝播するウイルス性疾患である。疾患の症状には、発熱および重度の関節痛が含まれ、筋肉痛、頭痛、吐き気、倦怠および発疹がしばしば付随する。疾患の名称は、衰弱性関節痛で苦しむ患者の外観を指して、「くねらせる」を意味するＫｉｍａｋｏｎｄｅ語の動詞に由来する。場合によっては、関節痛は、数カ月または数年も持続することがある。治療法がないので、疾患の処置は症状の軽減に集中する。（ＷＨＯ  Ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ  ３２７号、２００８年３月を参照）
ウイルスは、感染した雌のカの咬創によって、ヒトからヒトに媒介される。最も一般的なベクターは、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉおよびＡｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓであり、これら２つのベクターは、デング熱を含む、カによって媒介される他のウイルスも媒介する。アジアのタイガーモスキート（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）も、チクングニヤ熱の媒介のための有効なベクターであることが示されている。この後者の種は、ヒトの間で。それにもかかわらず、２００５年および２００６年のＬａ  Ｒｅｕｎｉｏｎ島での大発生時に、７８５，０００人の人口のほぼ４０％が感染したことが明示するように、昆虫に基づく伝播様式は非常に効率的である。（ＷＨＯ  Ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ  ３２７号（２００８年３月）、非特許文献１および「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ」ＣＤＣ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒ−Ｂｏｒｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓを参照）
チクングニヤウイルスは、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ属に分類される。一般的に、アルファウイルスは、約１２ｋｂの一本鎖、正のセンスＲＮＡ分子からなるゲノムを含む、外被付き粒子である。５’末端は７−メチルグアノシンでキャップされ、３’末端はポリアデニル化される。非構造タンパク質は、ゲノムＲＮＡの５’末端の２／３から直接翻訳される。ゲノムＲＮＡの３’末端の１／３に同じである２６Ｓ  ＲＮＡと呼ばれるサブゲノムのプラス鎖のＲＮＡは、マイナス鎖のＲＮＡ中間体から転写される。この後者のＲＮＡは、ウイルスの構造タンパク質の合成のためのｍＲＮＡの役目を果たす。（非特許文献２）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７年１２月）３１８巻：１８６０〜６１頁
【非特許文献２】Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ（２００２年）８３巻：３０７５〜８４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。先ず、試験試料の核酸を１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。オリゴヌクレオチドセットの第一のメンバーは、長さが１００塩基数までで、配列番号１４に含まれる少なくとも１５個の連続した塩基に相補的である。配列番号１４からなるポリヌクレオチドが鋳型依存性プライマー伸長反応の鋳型である場合、オリゴヌクレオチドセットの第二のメンバーは長さが１００塩基数までで、オリゴヌクレオチドセットの第一のメンバーの伸長生成物の少なくとも１５個の連続した塩基に相補的である。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかを検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。好ましい実施形態では、本方法で検出される増幅生成物は、増幅オリゴヌクレオチドセットの１メンバーの１７個の連続した塩基、さらに増幅オリゴヌクレオチドセットの他のメンバーの１７個の連続した塩基の相補体を含む一本鎖核酸である。異なる好ましい実施形態では、第一の増幅オリゴヌクレオチドは長さが５５塩基数までで、第二の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号６８の１９個の連続した塩基を含む。非常に好ましい一実施形態では、第一の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端配列は配列番号１０８である。別の好ましい実施形態では、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７２および配列番号１７３からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態では、検出工程は、ハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅生成物を検出することを含む。そのような場合、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６４、配列番号１８４および配列番号１８５のいずれでもよい。さらに別の好ましい実施形態では、検出工程はハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅生成物を検出することを含み、試験試料中のＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜約３，４００コピー数／ｍｌの範囲である場合、カットオフ値より多い量の増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である。さらに別の好ましい実施形態では、検出工程はハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅生成物を検出することを含み、試験試料中のＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜約２００コピー数／ｍｌの範囲である場合、カットオフ値より多い量の増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である。さらに別の好ましい実施形態では、検出工程はハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅生成物を検出することを含み、試験試料中のＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が約１００コピー数／ｍｌ〜３，４００コピー数／ｍｌである場合だけ、カットオフ値より多い量の増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である。本発明の方法の一般的な実施形態では、第一の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端塩基配列は配列番号１０８であり、検出工程はハイブリダイゼーションプローブを用いて増幅生成物を検出することを含み、試験試料中のＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜約２００コピー数／ｍｌの範囲である場合、カットオフ値より多い量の増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である。このような場合、第一の増幅プライマーは、配列番号１０８の上流に位置するファージＴ７プロモーター配列を含むことができる。別の好ましい実施形態では、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号６８の１９個の連続した塩基または配列番号８４の１７個の連続した塩基を含む。さらに別の好ましい実施形態では、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８、配列番号１７４および配列番号１７６のいずれかである。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６４である。さらに別の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１８３である。本発明の方法の別の一般的な実施形態では、第一の増幅オリゴヌクレオチドは長さが５５塩基数までで、第二の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号８４の１７個の連続した塩基を含む。このような場合、第二の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６のいずれでもよい。本発明の方法の別の一般的な実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドセットの第二のメンバーは、配列番号１８６の配列に含まれる１７〜２０個の連続した塩基を含む。より好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドセットの第二のメンバーは、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６のいずれかである。本発明の方法の別の一般的な実施形態では、塩濃度が０．６〜０．９Ｍの範囲にある場合、４２℃のストリンジェントな条件下で、増幅オリゴヌクレオチドセットの第一のメンバーは、配列番号１４からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズし、増幅オリゴヌクレオチドセットの第二のメンバーは、同じストリンジェントな条件下で伸長生成物にハイブリダイズする。本発明の方法の別の一般的な実施形態では、カットオフ値は、（ｉ）ＣＨＩＫＶ核酸配列の既知の濃度を用いて実施される複数の増幅反応、および（ｉｉ）ＣＨＩＫＶ核酸配列の不在下で実施される複数の陰性対照増幅反応で得られる結果の統計分析によって決定される。本発明の方法の別の一般的な実施形態では、カットオフ値は、ＣＨＩＫＶ核酸配列を含まない陰性対照反応の平均ハイブリダイゼーションシグナル読取値、加えてＣＨＩＫＶ核酸配列を含まない陰性対照反応の３つの標準偏差を用いる統計分析によって決定される。
【０００６】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ（ｐａｃｋａｇｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ））に関する。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４８の１５〜４８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。この第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４８の配列中に完全に含まれる。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列（すなわち、上流配列）を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号１８６の１５〜４７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーも含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１８６の配列中に完全に含まれる。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列（すなわち、上流配列）を任意選択で含むことができる。一般に、キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、（ｉ）長さが１５〜４７塩基数で、配列番号１８７の配列中に完全に含まれるか、（ｉｉ）長さが１５〜３９塩基数で、配列番号６８の配列中に完全に含まれるか、または（ｉｉｉ）長さが１５〜４０塩基数で、配列番号８４の配列中に完全に含まれる。別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４０塩基数までで、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基を含む。異なる好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１０８である。より好ましくは、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１８７の配列中に完全に含まれてもよい。このような場合、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４０塩基数までで、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基を含むことができる。あるいは、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６８の配列中に完全に含まれてもよい。さらに異なる代替形態の下では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２および配列番号１７３のいずれでもよい。より好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６４からなる。別の一般的に好ましい実施形態に従って、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列が配列番号１０８である場合、第一のプライマーは任意選択の第一プライマー５’配列を含み、それはファージＴ７プロモーター配列を含む。異なる好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列が配列番号１０８である場合、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号８４の配列中に完全に含まれる。より好ましくは、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６のいずれかである。さらにより好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１８４および配列番号１８５のいずれかである。本発明のキットの一般的な実施形態に従って、第���のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６８中に完全に含まれる。本発明のキットの別の一般的な実施形態に従って、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号８４中に完全に含まれる。本発明のキットのさらに別の一般的な実施形態に従って、長さが１００塩基数までで、配列番号１８６の１５〜４７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーがさらに含まれる。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１８６の配列中に完全に含まれてもよい。同様に、第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマーの５’配列を任意選択で含むことができる。注目すべきことに、第三のプライマーは、キットの第二のプライマーと異なる。より好ましくは、互いに異なる第二および第三の各プライマーは、配列番号１８７の１５〜４７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む。このような場合、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１４８でもよい。より好ましくは、第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３のいずれかである。配列番号１８７で見られる連続塩基配列を有する第二および第三のプライマーを含む代わりに、第二および第三の各プライマーは、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基である標的相補的３’末端配列を含むことができる。
【０００７】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４６の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４６の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６５の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６５の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６６の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６６の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。最後に、キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１０６である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１４５である。さらに別の好ましい実施形態では、第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１４６である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが３９塩基数までで、配列番号８２の１５〜３９個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６２を含むことができる。
【０００８】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、３つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号４６の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４６の配列中に完全に含まれる。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６５の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６５の配列中に完全に含まれる。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む。最後に、長さが１００塩基数までで、配列番号６６の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーがある。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６６の配列中に完全に含まれる。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含む。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【０００９】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５０の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５０の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６９の１５〜３９個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６９の配列中に完全に含まれる。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。最後に、キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１１０である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１４９である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４０塩基数までで、配列番号８５の１５〜４０個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６５を含むことができる。
【００１０】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号５０の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５０の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６９の１５〜３９個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６９の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００１１】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３１の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３１の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマーの５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５１の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５１の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５２の１５〜３８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５２の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。最後に、キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ組成物をさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９１である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３１である。さらに別の好ましい実施形態では、第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３２である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブ組成物は、長さが３９塩基数までで配列番号７０の１５〜３９個の連続した塩基を含む第一のハイブリダイゼーションプローブ、および長さが３９塩基数までで配列番号７１の１５〜３９個の連続した塩基を含む第二のハイブリダイゼーションプローブを含む。例えば、第一のハイブリダイゼーションプローブは配列番号１５０を含むことができ、第二のハイブリダイゼーションプローブは配列番号１５１を含むことができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、３つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３１の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３１の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５１の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５１の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。最後に、長さが１００塩基数までで、配列番号５２の１５〜３８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーがある。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５２の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００１３】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３２の１５〜４６個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３２の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５３の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５３の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。最後に、キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９２である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３３である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４２塩基数までで、配列番号７２の１５〜４２個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５２を含むことができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３２の１５〜４６個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３２の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５３の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５３の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００１５】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３６の１５〜５１個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３６の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５７の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５７の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９６である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３７である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが３７塩基数までで、配列番号７５の１５〜３７個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５５を含むことができる。
【００１６】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３６の１５〜５１個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３６の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５７の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５７の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００１７】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３７の１５〜３７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３７の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５８の１５〜３８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５８の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９７である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３８である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４４塩基数までで、配列番号７６の１５〜４４個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５６を含むことができる。
【００１８】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３７の１５〜３７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３７の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５８の１５〜３８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５８の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００１９】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３３の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３３の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３４の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３４の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５４の１５〜３９個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５４の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５５の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第四のプライマーをさらに含む。第四のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５５の配列中に完全に含まれてもよい。第四のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第四のプライマーの５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９３である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９４である。別の好ましい実施形態では、第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３４である。別の好ましい実施形態では、第四のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３５である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４４塩基数までで、配列番号７３の１５〜４４個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５３を含むことができる。
【００２０】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、４つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３３の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３３の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３４の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３４の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５４の１５〜３９個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５４の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５５の１５〜４４個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第四のプライマーをさらに含む。第四のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５５の配列中に完全に含まれてもよい。第四のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第四プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００２１】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４０の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４０の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４１の１５〜４５個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４１の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６１の１５〜３８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６１の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１００である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１０１である。別の好ましい実施形態では、第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１４１である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが３８塩基数までで、配列番号７９の１５〜３８個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５９を含むことができる。
【００２２】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、３つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号４０の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４０の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４１の１５〜４５個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４１の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６１の１５〜３８個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６１の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００２３】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４２の１５〜４２個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４２の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４３の１５〜４７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４３の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６２の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６２の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１０２である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１０３である。別の好ましい実施形態では、第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１４２である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが３８塩基数までで、配列番号８０の１５〜３８個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６０を含むことができる。
【００２４】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、３つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号４２の１５〜４２個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４２の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４３の１５〜４７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４３の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６２の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含む。第三のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６２の配列中に完全に含まれてもよい。第三のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００２５】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号４７の１５〜４６個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４７の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６７の１５〜３７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６７の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１０７である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１４７である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが３８塩基数までで、配列番号８３の１５〜３８個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１６３を含むことができる。
【００２６】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号４７の１５〜４６個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号４７の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号６７の１５〜３７個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号６７の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００２７】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３８の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３８の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５９の１５〜３９個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５９の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９８である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３９である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが３８塩基数までで、配列番号７７の１５〜３８個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５７を含むことができる。
【００２８】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３８の１５〜４０個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３８の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５９の１５〜３９個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５９の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００２９】
本発明の別の態様は、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅、検出するためのキット（すなわち、一括した組合せ）に関する。一般的に、キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号３５の１５〜４３個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーを含む。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３５の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５６の１５〜４１個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５６の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。キットは、前記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号９５である。別の好ましい実施形態では、第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は配列番号１３６である。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは長さが４０塩基数までで、配列番号７４の１５〜４０個の連続した塩基を含む。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１５４を含むことができる。
【００３０】
本発明の別の態様は、核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法に関する。本方法に従って、先ず、試験試料の核酸を、２つのプライマーを含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程がある。長さが１００塩基数までで、配列番号３５の１５〜４３個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーがある。第一のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号３５の配列中に完全に含まれてもよい。第一のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。オリゴヌクレオチドセットは、長さが１００塩基数までで、配列番号５６の１５〜４１個の連続した塩基の標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーをさらに含む。第二のプライマーの標的相補的３’末端配列は、配列番号５６の配列中に完全に含まれてもよい。第二のプライマーは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含むことができる。次に、増幅オリゴヌクレオチドセットと一緒に試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程がある。試験試料がＣＨＩＫＶ核酸配列を含むならば、増幅生成物が生成される。最後に、本発明の方法は、インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程を含む。増幅生成物がカットオフ値より多い量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在することを示す。あるいは、増幅生成物がカットオフ値より少ない量で検出される場合、このことは、ＣＨＩＫＶ核酸配列が試験試料に存在しないことを示す。
【００３１】
定義
本明細書で明示的に否定されていなければ、以下の用語は、本開示において以下の意味を有する。
【００３２】
本明細書で用いるように、「生体試料」は、ヒト、動物または環境試料から得られる任意の組織またはポリヌクレオチド含有物質である。本発明に従う生体試料には、末梢血、血漿、血清または他の体液、骨髄または他の器官、生検組織または生物起源の他の物質が含まれる。生体試料を処理して組織または細胞構造を破壊し、それによって、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤などを含むことができる溶液の中へ細胞内成分を放出することができる。
【００３３】
本明細書で用いるように、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡに加えて、配列中に存在することができ、相補的配列を有する第二の分子とのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻止しない任意の合成ヌクレオチド類似体または他の分子を意味する。
【００３４】
本明細書で用いるように、「検出可能な標識」は、検出することができるか、検出可能な応答をもたらすことができる化学種である。本発明に従う検出可能な標識は、直接または間接にポリヌクレオチドプローブに連結することができ、その例には、放射性同位体、酵素、ハプテン、発色団、例えば検出可能な色を付与する色素または粒子（例えば、ラテックスビーズまたは金属粒子）、発光化合物（例えば、生物発光性、リン光性または化学発光性部分）および蛍光化合物が含まれる。
【００３５】
「均一な検出可能な標識」は、標的配列とハイブリダイズしたプローブ上に標識があるかどうか判定することによって、均一的な方法で検出することができる標識を指す。すなわち、均一な検出可能な標識は、標識または標識されたプローブのハイブリダイズした形態をハイブリダイズしていない形態から物理的に除去することなく検出することができる。ＣＨＩＫＶ核酸を検出するための標識されたプローブを用いる場合、均一な検出可能な標識が好ましい。均一な標識の例が、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳述されている。均一アッセイで用いるのに好ましい標識には、化学発光化合物が含まれる（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号およびＡｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．ら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照）。好ましい化学発光標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準のＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルソ−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルソ−ジブロモ−ＡＥ、オルソ−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルソ−メトキシ−ＡＥ、オルソ−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルソ−メチル−ＡＥ、オルソ−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルソ−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥおよび２−メチル−ＡＥ）である。
【００３６】
「均一アッセイ」は、特異的プローブハイブリダイゼーションの程度を判定する前に、ハイブリダイズしていないプローブからのハイブリダイズしたプローブの物理的分離を必要としない検出方法を指す。本明細書に記載のものなどの例示的な均一アッセイは、適当な標的とハイブリダイズしたときに蛍光シグナルを放射する分子ビーコンまたは他の自己報告プローブ、ハイブリッド二重鎖で存在しない限り化学手段によって選択的に破壊することができる化学発光アクリジニウムエステル標識、および当分野の技術者が熟知している他の均一的に検出可能な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）標識を利用することができる。
【００３７】
本明細書で用いるように、「増幅」は標的核酸配列、その相補体またはその断片の複数のコピーを得るための、インビトロの方法を指す。１ラウンドの逆転写、または逆転写とそれに続く第二鎖ｃＤＮＡ合成およびクローニングは、インビトロ増幅とみなされない。従来は、増幅は、開始鋳型鎖の少なくとも４つの合成コピーの生成を包含するものとされる。好ましくは、合成コピーは、配列特異的ポリヌクレオチド合成の以降のラウンドのために、鋳型の役目を果たす。
【００３８】
「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅される標的核酸配列は、２つの逆配置されたプライマーの間に位置し、プライマーの各々に完全に相補的である標的核酸部分を含む。
【００３９】
「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的領域」は、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部、およびそれに相補的であるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む、特異的デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００４０】
「転写関連増幅」は、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写産物を生成するためにＲＮＡポリメラーゼを用いる、任意の種類の核酸増幅を意味する。「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる転写関連増幅方法の一例は、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸およびプロモーター−鋳型相補的オリゴヌクレオチドを使用し、任意選択で１つまたは複数の類似したオリゴヌクレオチドを含むことができる。Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ国際公開第９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ国際公開第８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ国際公開第８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ国際公開第９４／０３４７２号；およびＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ国際公開第９５／０３４３０号で詳細に開示されているように、ＴＭＡの変形形態は当技術分野で周知である。本明細書で開示される種類の核酸増幅手順を行うために、Ｋａｃｉａｎらの方法が好ましい。
【００４１】
本明細書で用いるように、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２つ、一般に約５〜約１００個の化学サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、および線状空間配置でサブユニットを結合する連結部分を含む。一般的なヌクレオチド塩基部分はグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合が可能な他の稀であるか改変されたヌクレオチド塩基が当分野の技術者に周知である。オリゴヌクレオチドは、糖部分、塩基部分および骨格構成要素のいずれかの類似体を任意選択で含むことができる。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００個の残基のサイズ範囲内である。オリゴヌクレオチドは天然に存在する原料から精製することができるが、様々な周知の酵素的または化学的方法のいずれかを使用して好ましくは合成される。
【００４２】
本明細書で用いるように、「プローブ」は、核酸、好ましくは増幅された核酸の標的配列と、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で特異的にハイブリダイズして、検出可能なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。プローブは、プローブの末端（複数可）に結合することができるか、内部にあることができる、検出可能な部分を任意選択で含むことができる。プローブの配列の内部にある検出可能な部分がそうであるように、標的ポリヌクレオチドと結合するプローブのヌクレオチドは、厳密に連続する必要はない。検出は、直接でもよく（すなわち、標的配列または増幅核酸と直接にハイブリダイズするプローブから生じる）、間接でもよい（すなわち、プローブを標的配列または増幅核酸に連結する中間分子構造とハイブリダイズするプローブから生じる）。プローブの「標的」は、標準の水素結合（すなわち、塩基対形成）を用いてプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする増幅核酸配列の中に含まれる配列を一般に指す。プローブは、標的特異的配列、および任意選択で、検出される予定の標的配列に非相補的である他の配列を含むことができる。これらの非相補的配列は、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、またはプローブの三次元立体構造に寄与する配列を含むことができる（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に記載のように）。「十分に相補的である」配列は、プローブの標的特異的配列に完全には相補的でない標的配列との、プローブオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする。
【００４３】
本明細書で用いるように、「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその相補体とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、核酸増幅反応に関与する。増幅オリゴヌクレオチドの例には、増幅プライマー、またはより単純に「プライマー」が含まれる。プライマーは、鋳型核酸とハイブリダイズすることができ、ＤＮＡポリメラーゼ活性で延長することができる３’末端を有する、任意選択で改変されたオリゴヌクレオチドである。プライマーは、下流側ＣＨＩＫＶ相補的配列、および任意選択で、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない上流側配列を有する。任意選択の上流側配列は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの役目を果たすことができるか、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むことができる。一般的に言って、増幅オリゴマー（例えば、プライマー）は、標的核酸配列に相補的な少なくとも１２個の連続した塩基、またはより好ましくは、増幅または検出する予定の標的核酸配列に相補的な少なくとも１５個の連続した塩基を有する。同様に、特定の非常に好ましい増幅オリゴマーは、本明細書で示す例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸配列とハイブリダイズすることができる。
【００４４】
「実質的に相同」、「実質的に対応性の」または「実質的に対応する」は、対象オリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物を除外する）に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に、少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、最も好ましくは１００％相同である少なくとも１０個の連続した塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。当分野の技術者は、許容されないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを予防しつつ、標的配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする様々な割合の相同性で、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に加えることができるであろう改変を容易に理解する。類似性の程度は２つの配列を占める核酸塩基の順序を比較することで決定され、構造的な差が相補的塩基との水素結合を阻止しないならば、２つの配列の間に存在することができる他の構造的な差を考慮しない。２つの配列間の相同性の程度は、比較されている少なくとも１０個の連続した塩基の各セットに存在する塩基ミスマッチの数で表すこともでき、それは０〜２個の塩基の差であってもよい。
【００４５】
「実質的に相補的」は、対象オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物を除外する）に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に、少なくとも７０％相補的、好ましくは少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、最も好ましくは１００％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当分野の技術者は、許容されないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを予防しつつ、標的配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする様々な割合の相補性で、ハイブリダイゼーションアッセイ条件に加えることができるであろう改変を容易に理解する。）相補性の程度は２つの配列を占める核酸塩基の順序を比較することで決定され、構造的な差が相補的塩基との水素結合を阻止しないならば、２つの配列の間に存在することができる他の構造的な差を考慮しない。２つの配列間の相補性の程度は、比較されている少なくとも１０個の連続した塩基の各セットに存在する塩基ミスマッチの数で表すこともでき、それは０〜２個の塩基ミスマッチであってもよい。
【００４６】
「十分に相補的」は、一連の相補的塩基の間の水素結合によって別の塩基配列とハイブリダイズすることができる、連続した核酸塩基配列を意味する。相補的塩基配列は、標準の塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対合）を用いてオリゴヌクレオチドの塩基配列の各位置で相補的であってもよく、または標準の水素結合（無塩基「ヌクレオチド」を含む）を用いて相補的でないが、全体の相補的塩基配列が適当なハイブリダイゼーション条件下で別の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることができる、１つまたは複数の残基を含むことができる。連続した塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする予定の配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは約１００％相補的である。適当なハイブリダイゼーション条件は当分野の技術者に周知であるか、塩基配列組成に基づいて容易に予測することができるか、通常の試験を用いて経験的に決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９年）の§§１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１および１１．４７〜１１．５７、特に§§９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７および１１．５５〜１１．５７を参照）。
【００４７】
「捕捉オリゴヌクレオチド」は、標的配列および固定化オリゴヌクレオチドを塩基対ハイブリダイゼーションによって特異的に結合するための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは２つの結合性領域、すなわち、通常同じオリゴヌクレオチドの上で連続している標的配列結合性領域および固定化プローブ結合性領域を含むことができるが、捕捉オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のリンカーによって結合される２つの異なるオリゴヌクレオチドの上に存在する標的配列結合性領域および固定化プローブ結合性領域を含むことができる。例えば、固定化プローブ結合性領域は、第一のオリゴヌクレオチドの上に存在することができ、標的配列結合性領域は第二のオリゴヌクレオチドの上に存在することができ、これら２つの異なるオリゴヌクレオチドは、第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列と特異的にハイブリダイズする配列を含む第三のオリゴヌクレオチドであるリンカーによる水素結合によって結合される。
【００４８】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」は、捕捉オリゴヌクレオチドを固定化支持体に直接または間接に結合する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の未結合の物質からの結合した標的配列の分離を促進する、固体支持体に結合されるオリゴヌクレオチドである。
【００４９】
「分離」または「精製」は、生体試料の１つまたは複数の成分が、試料の１つまたは複数の他の成分から切り離されることを意味する。試料成分は、一般に水性液相中の核酸を含み、それは、タンパク質、炭水化物、脂質および標識プローブなどの物質を含むこともできる。好ましくは、分離または精製工程は、試料中に存在する他の成分の少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％を除去する。
【００５０】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物」または「ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基」は、同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物は異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡではウラシルが存在し、ＤＮＡではチミンが存在することによって異なることができる。それらの同等物は特定の配列に対して同じ程度の相補性を有するので、ＲＮＡとＤＮＡ同等物間の差は、相同性の差に寄与しない。
【００５１】
「から本質的になる」は、本発明の基本特性および新規特性を大きく変化させない追加の成分（複数可）、組成物（複数可）または方法工程（複数可）が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれてもよいことを意味する。そのような特性には、全血または血漿などの生体試料中のＣＨＩＫＶ核酸を選択的に検出する能力が含まれる。本発明の基本特性および新規特性に大きな影響を及ぼす任意の成分（複数可）、組成物（複数可）または方法工程（複数可）は、この用語から外れるであろう。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、
上記セットの第一のメンバーは、長さが１００個までの塩基であり、配列番号１４に含まれる少なくとも１５個の連続した塩基に相補的であり、
配列番号１４からなるポリヌクレオチドが鋳型依存性プライマー伸長反応の鋳型である場合、上記セットの第二のメンバーは長さが１００個までの塩基であり、増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの第一のメンバーの伸長生成物の少なくとも１５個の連続した塩基に相補的である、工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかを検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す、工程と
を含む方法。
（項目２）
工程（ｃ）で検出される上記増幅生成物が、増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの１メンバーの１７個の連続した塩基、および増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの他のメンバーの１７個の連続した塩基の相補体を含む一本鎖核酸である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記第一の増幅オリゴヌクレオチドが、長さが５５個までの塩基であり、上記第二の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号６８の１９個の連続した塩基を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記第一の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端配列が配列番号１０８である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７２および配列番号１７３からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記検出工程が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて上記増幅生成物を検出することを含む、項目３に記載の方法。
（項目７）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、配列番号１６４、配列番号１８４および配列番号１８５からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて上記増幅生成物を検出することを含み、上記試験試料中の上記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜約３，４００コピー数／ｍｌの範囲である場合、上記カットオフ値より多い量の上記増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である、項目３に記載の方法。
（項目９）
工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて上記増幅生成物を検出することを含み、上記試験試料中の上記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜約２００コピー数／ｍｌの範囲である場合、上記カットオフ値より多い量の上記増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である、項目３に記載の方法。
（項目１０）
工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて上記増幅生成物を検出することを含み、上記試験試料中の上記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が約１００コピー数／ｍｌと約３，４００コピー数／ｍｌとの間である場合、上記カットオフ値より多い量の上記増幅生成物を検出する確率は、少なくともほんの９５％である、項目３に記載の方法。
（項目１１）
第一の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端塩基配列が配列番号１０８であり、工程（ｃ）が、ハイブリダイゼーションプローブを用いて上記増幅生成物を検出することを含み、上記試験試料中の上記ＣＨＩＫＶ核酸配列の濃度が２６コピー数／ｍｌ〜約２００コピー数／ｍｌの範囲である場合、上記カットオフ値より多い量の上記増幅生成物を検出する確率は少なくとも９５％である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記第一の増幅プライマーが、配列番号１０８の上流に位置するファージＴ７プロモーター配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号６８の１９個の連続した塩基または配列番号８４の１７個の連続した塩基を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
上記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号１４８、配列番号１７４および配列番号１７６からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６４である、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１８３である、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
上記第一の増幅オリゴヌクレオチドが、長さが５５個までの塩基であり、上記第二の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号８４の１７個の連続した塩基を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記第二の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの上記第二のメンバーが、配列番号１８６の配列に含まれる１７〜２０個の連続した塩基を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの上記第二のメンバーが、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
塩濃度が０．６〜０．９Ｍの範囲にある場合、４２℃のストリンジェントな条件下で、増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの上記第一のメンバーが、配列番号１４からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、増幅オリゴヌクレオチドの上記セットの上記第二のメンバーが、同じストリンジェントな条件下で上記伸長生成物とハイブリダイズする、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記カットオフ値が、（ｉ）上記ＣＨＩＫＶ核酸配列の既知の濃度を用いて実施される複数の増幅反応、および（ｉｉ）上記ＣＨＩＫＶ核酸配列の不在下で実施される複数の陰性対照増幅反応で得られる結果の統計分析によって決定される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
上記カットオフ値が、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含まない陰性対照反応の平均ハイブリダイゼーションシグナル読取値、加えて上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含まない陰性対照反応の３つの標準偏差を用いる統計分析によって決定される、項目１に記載の方法。
（項目２４）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号４８の１５〜４８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号４８の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号１８６の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１８６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目２５）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、
（ｉ）長さが１５〜４７塩基数であって、配列番号１８７の配列中に完全に含まれるか、
（ｉｉ）長さが１５〜３９塩基数であって、配列番号６８の配列中に完全に含まれるか、または
（ｉｉｉ）長さが１５〜４０塩基数であって、配列番号８４の配列中に完全に含まれるかのいずれかである、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４０塩基数までであって、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２７）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号１０８である、項目２４に記載のキット。
（項目２８）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号１８７の配列中に完全に含まれる、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４０塩基数までであって、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基を含む、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号６８の配列中に完全に含まれる、項目２８に記載のキット。
（項目３１）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号１４８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２および配列番号１７３からなる群から選択される、項目２８に記載のキット。
（項目３２）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６４からなる、項目３１に記載のキット。
（項目３３）
上記第一のプライマーが上記任意選択の第一プライマー５’配列を含み、上記第一プライマー５’配列がファージＴ７プロモーター配列を含む、項目２７に記載のキット。
（項目３４）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号８４の配列中に完全に含まれる、項目２７に記載のキット。
（項目３５）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択される、項目３４に記載のキット。
（項目３６）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、配列番号１８４および配列番号１８５からなる群から選択される、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号６８に完全に含まれる、項目２４に記載のキット。
（項目３８）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号８４に完全に含まれる、項目２４に記載のキット。
（項目３９）
長さが１００塩基数までであって、配列番号１８６の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーをさらに含み、上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１８６の配列に完全に含まれ、上記第三のプライマーが、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含み、上記第三のプライマーが上記第二のプライマーと異なる、項目２４に記載のキット。
（項目４０）
互いに異なる上記第二および第三の各プライマーが、配列番号１８７の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む、項目３９に記載のキット。
（項目４１）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１４８である、項目４０に記載のキット。
（項目４２）
上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３からなる群から選択される、項目４１に記載のキット。
（項目４３）
互いに異なる上記第二および第三の各プライマーが、配列番号８４の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む、項目３９に記載のキット。
（項目４４）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３１の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５１の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）長さが１００塩基数までで、配列番号５２の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含む第三のプライマーと、
（ｄ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ組成物と
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目４５）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号９１である、項目４４に記載のキット。
（項目４６）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１３１である、項目４４に記載のキット。
（項目４７）
上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１３２である、項目４４に記載のキット。
（項目４８）
上記ハイブリダイゼーションプローブ組成物が、長さが３９塩基数までで配列番号７０の１５〜３９個の連続した塩基を含む第一のハイブリダイゼーションプローブ、および長さが３９塩基数までで配列番号７１の１５〜３９個の連続した塩基を含む第二のハイブリダイゼーションプローブを含む、項目４４に記載のキット。
（項目４９）
上記第一のハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５０を含み、上記第二のハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５１を含む、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３１の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５１の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５１の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｉｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５２の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含む第三のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
（項目５１）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３２の１５〜４６個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５３の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５３の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目５２）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号９２である、項目５１に記載のキット。
（項目５３）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１３３である、項目５１に記載のキット。
（項目５４）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４２塩基数までであって、配列番号７２の１５〜４２個の連続した塩基を含む、項目５１に記載のキット。
（項目５５）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５２を含む、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３２の１５〜４６個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３２の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５３の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５３の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す、工程と
を含む、方法。
（項目５７）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３６の１５〜５１個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５７の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目５８）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号９６である、項目５７に記載のキット。
（項目５９）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１３７である、項目５７に記載のキット。
（項目６０）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが３７塩基数までであって、配列番号７５の１５〜３７個の連続した塩基を含む、項目５７に記載のキット。
（項目６１）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５５を含む、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３６の１５〜５１個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５７の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
（項目６３）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号３７の１５〜３７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号５８の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５８の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目６４）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号９７である、項目６３に記載のキット。
（項目６５）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１３８である、項目６３に記載のキット。
（項目６６）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４４塩基数までであって、配列番号７６の１５〜４４個の連続した塩基を含む、項目６３に記載のキット。
（項目６７）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５６を含む、項目６６に記載のキット。
（項目６８）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号３７の１５〜３７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号３７の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５８の１５〜３８個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５８の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
（項目６９）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号４６の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号４６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号６５の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号６５の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）長さが１００塩基数までで、配列番号６６の１５〜４３個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号６６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含む第三のプライマーと、
（ｄ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目７０）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１０６である、項目６９に記載のキット。
（項目７１）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１４５である、項目６９に記載のキット。
（項目７２）
上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１４６である、項目６９に記載のキット。
（項目７３）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが３９塩基数までであって、配列番号８２の１５〜３９個の連続した塩基を含む、項目６９に記載のキット。
（項目７４）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６２を含む、項目７３に記載のキット。
（項目７５）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号４６の１５〜４４個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号４６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号６５の１５〜４０個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号６５の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｉｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号６６の１５〜４３個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第三のプライマーであって、上記第三のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号６６の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第三プライマー５’配列を任意選択で含む第三のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
（項目７６）
チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列を増幅および検出するためのキットであって、
（ａ）長さが１００塩基数までで、配列番号５０の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５０の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｂ）長さが１００塩基数までで、配列番号６９の１５〜３９個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号６９の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと、
（ｃ）上記プライマーを用いて合成される核酸増幅生成物を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
を含み、
上記プライマーおよび上記ハイブリダイゼーションプローブが互いに一括した組み合わせ中にある、キット。
（項目７７）
上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１１０である、項目７６に記載のキット。
（項目７８）
上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号１４９である、項目７６に記載のキット。
（項目７９）
上記ハイブリダイゼーションプローブが、長さが４０塩基数までであって、配列番号８５の１５〜４０個の連続した塩基を含む、項目７６に記載のキット。
（項目８０）
上記ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６５を含む、項目７９に記載のキット。
（項目８１）
核酸を含む試験試料中にチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）核酸配列が存在するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）上記試験試料の核酸を、
（ｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号５０の１５〜４７個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第一のプライマーであって、上記第一のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号５０の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第一プライマー５’配列を任意選択で含む第一のプライマーと、
（ｉｉ）長さが１００塩基数までで、配列番号６９の１５〜３９個の連続した塩基からなる標的相補的３’末端配列を含む第二のプライマーであって、上記第二のプライマーの上記標的相補的３’末端配列が配列番号６９の配列に完全に含まれ、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的でない第二プライマー５’配列を任意選択で含む第二のプライマーと
を含む１セットの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）増幅オリゴヌクレオチドの上記セットと一緒に上記試験試料の核酸を鋳型として用いて、インビトロの核酸増幅反応を実施する工程であって、それによって、上記試験試料が上記ＣＨＩＫＶ核酸配列を含む場合、増幅生成物が生成される工程と、
（ｃ）上記インビトロの核酸増幅反応で生成されている可能性のある上記増幅生成物のいずれかをハイブリダイゼーションプローブで検出する工程であって、
上記増幅生成物をカットオフ値より多い量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在することを示し、
上記増幅生成物を上記カットオフ値より少ない量で検出することは、上記ＣＨＩＫＶ核酸配列が上記試験試料に存在しないことを示す工程と
を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、チクングニヤ熱ウイルス核酸（太い水平線によって表す）内の標的領域を検出するために用いることができる様々なポリヌクレオチドを例示する概要図である。以下の核酸の位置を、標的領域と比較して示す：「捕捉オリゴヌクレオチド」は、増幅の前に標的核酸とハイブリダイズさせ、それを捕捉するために用いられる核酸を指し、そこで「Ｔ」は、相補的配列（示されない）を有する固定化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるために用いられるテール配列を指す；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プロモーター−プライマー」は、ＴＭＡを行うために用いられる２つの増幅プライマーを表し、そこで「Ｐ」は、Ｔ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示す；および「プローブ」は、増幅された核酸を検出するために用いられるプローブを指す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ウイルス溶解物、血液、血清、血漿または他の体液もしくは組織などの生体試料中のチクングニヤ熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）の核酸を選択的に検出するための組成物、方法およびキットが本明細書で開示される。本発明のプローブ、プライマーおよび方法は、環境試験のために、もしくは診断用途で、または感染性粒子を含む可能性のある献血血液および血液製品もしくは他の組織のスクリーニングのために用いることができる。さらに別の用途には、カのプールなどの環境試料の、ウイルスの存在についてのスクリーニングが含まれる。
【００５４】
序論および概要
本発明は、生体試料中のＣＨＩＫＶ核酸を検出するために特に有用である組成物（核酸捕捉オリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ）、方法およびキットを含む。そのような用途に適当なオリゴヌクレオチド配列を設計するために、公知のＣＨＩＫＶ核酸配列を先ず比較して、診断アッセイで試薬の役目を果たすことができるウイルスゲノムの候補領域を同定した。これらの比較の結果、図１に図式的に示す捕捉オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブを用いる検出のための標的として、ＣＨＩＫＶゲノムの異なる領域を選択した。比較した配列の間の比較的少数の変異体を含む配列の部分を、増幅された配列の捕捉、増幅および検出で使用するために適する合成オリゴヌクレオチドの設計の出発点として選択した。
【００５５】
これらの分析に基づいて、下に示す捕捉オリゴヌクレオチド、増幅プライマーおよびプローブ配列を設計した。当分野の技術者は、ＣＨＩＫＶまたは他の標的に特異的である、Ｔ７プロモーター配列を有するか有しない任意のプライマー配列を、下記の様々なプライマーベースのインビトロ増幅方法においてプライマーとして用いることができることを理解する。本明細書で開示される配列を有するオリゴヌクレオチドが、ＣＨＩＫＶ核酸を検出するアッセイにおいて代替機能の役目を果たすことができることも想定される。例えば、本明細書で開示される捕捉オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブの役目を果たすことができ、本明細書で開示されるハイブリダイゼーションプローブは増幅プライマーとして用いることができ、本明細書で開示される増幅プライマーは代替検出アッセイでハイブリダイゼーションプローブとして用いることができよう。
【００５６】
さらに、詳細に開示されているプローブ配列をプライマーとして用いることができ、詳細に開示されているプライマーをプローブとして用いることができるが、開示されているプローブドメインおよびプライマードメインについても同じである。本明細書で開示されるプローブドメインは、プライマードメインとしての使用も意図される（例えば、同定されたプローブドメインの少なくとも１５個の連続した塩基、またはより好ましくは１７個の連続した塩基がプライマーとして機能することができる）。同様に、本明細書で開示されるプライマードメインは、プローブドメインとしての使用も意図される（例えば、同定されたプライマードメインの少なくとも１５個の連続した塩基、またはより好ましくは１７個の連続した塩基がプローブとして機能することができる）。本明細書の実施例２は、この機能的互換性の証拠を提示する。
【００５７】
２つの異なる開示された系からのオリゴヌクレオチドの併用も、本発明の範囲内であることが想定される。例えば、１つの系からのプローブ配列は、インビトロの増幅方法において、異なる系からの反対鎖のオリゴヌクレオチドと合わせて用いることができるプライマーとして使用することができる。
【００５８】
本明細書で開示される増幅プライマーは、いくつかのアンプリコン種を標的特異的プライマーの組合せから生成することができる多重増幅反応の成分としてさらに想定される。例えば、それらのアッセイの感度を実質的に損なうことなく無関係なウイルスのポリヌクレオチドを増幅することができる多重増幅反応で、本明細書で開示される特定の好ましいＣＨＩＫＶ特異的プライマーを用いることができることが想定される。これらの無関係なウイルスの特定の例には、西ナイルウイルスおよびデングウイルスが含まれる。同様に、本明細書で開示される増幅系の２つ以上を組み合わせて、標的検出のためのその能力が頑健および広範である多重アッセイをもたらすことができる。
【００５９】
有用な増幅方法
本発明に関連して有用な増幅方法には、以下のものが含まれる。転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および自己複製型のポリヌクレオチド分子および複製酵素、例えばＭＤＶ−１  ＲＮＡおよびＱ−β酵素を用いる増幅方法。これらの様々な増幅技術をそれぞれ実施する方法は、米国特許第５，３９９，４９１号、欧州特許出願公開第０  ５２５  ８８２号、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，４７２，８４０号およびＬｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６巻：１１９７頁（１９８８年）で見ることができる。核酸増幅反応を実施する方法を記載するこれらの文書の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本発明の非常に好ましい実施形態では、ＣＨＩＫＶ核酸配列は、ＴＭＡプロトコルを用いて増幅される。このプロトコルによると、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素は、内因性ＲＮアーゼＨ活性も有する。この方法で用いられるプライマーの１つは、増幅される標的核酸の１つの鎖に相補的である配列の上流に位置するプロモーター配列を含む。増幅の第一段階では、プロモーター−プライマーは、規定部位でＣＨＩＫＶ標的ＲＮＡとハイブリダイズする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの３’末端からの伸長によって標的ＲＮＡの相補的ＤＮＡコピーを作製する。新しく合成されたＤＮＡ鎖との反対側鎖のプライマーの相互作用の後、逆転写酵素によってＤＮＡの第二鎖がプライマーの末端から合成され、それによって二本鎖のＤＮＡ分子を形成する。ＲＮＡポリメラーゼはこの二本鎖のＤＮＡ鋳型のプロモーター配列を認識して、転写を開始する。新しく合成されたＲＮＡアンプリコンの各々は、ＴＭＡ過程に再突入し、新ラウンドの複製のための鋳型の役目を果たし、それによってＲＮＡアンプリコンの指数関数的な増殖をもたらす。ＤＮＡ鋳型の各々はＲＮＡアンプリコンの１００〜１０００個のコピーを作製することができるので、この増殖は１時間未満で１０，０００，０００，０００個のアンプリコンの生成をもたらすことができる。全過程は自触媒的であり、一定の温度で実施される。
【００６１】
プライマーの構造的な特徴
上で示すように、「プライマー」は、核酸増幅反応に関与することができる任意選択で改変されたオリゴヌクレオチドを指す。好ましいプライマーは、鋳型核酸とハイブリダイズすることができ、ＤＮＡポリメラーゼ活性で延長することができる３’末端を有する。プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的であってもよい。５’非相補的領域がプロモーター配列を含む場合、それは「プロモーター−プライマー」と呼ばれる。当分野の技術者は、プライマーとして機能することができる任意のオリゴヌクレオチド（すなわち、標的配列と特異的にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長が可能な３’末端を有するオリゴヌクレオチド）を改変して、５’プロモーター配列を含むようにすることができ、したがってプロモーター−プライマーとして機能することができるであろうことを理解する。同様に、任意のプロモーター−プライマーは、プロモーター配列の除去、またはそれなしの合成によって改変し、しかもプライマーとして機能することができる。
【００６２】
プライマーのヌクレオチド塩基部分は、改変された塩基部分がＧ、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵと非共有結合を形成する能力を保持する限り、および少なくとも１つの改変されたヌクレオチド塩基部分または類似体を含むオリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸とハイブリダイズすることを立体配置的に阻止されない限り、改変されてもよい（例えば、プロピン基の付加によって）。有用なプローブの化学組成に関連して下に示すように、本発明に従うプライマーの窒素性塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その公知の類似体（例えば、その塩基部分としてヒポキサンチンを有するイノシンまたは「Ｉ」；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５〜３６頁、Ａｄａｍｓら編、第１１版、１９９２年を参照）、プリンまたはピリミジン塩基の公知の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシガウノシン（ｄｅｏｘｙｇａｕｎｏｓｉｎｅ）、デアザ−もしくはアザ−プリンおよびデアザ−もしくはアザ−ピリミジン、５または６の位置に置換基を有するピリミジン塩基、２、６または８の位置に改変または交替された置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジンおよびＯ４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公開第９３／１３１２１号を参照）ならびにポリマーの１つまたは複数の残基のために骨格が窒素性塩基を含まない「無塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）でもよい。プライマー骨格を含む一般的な糖部分は、リボースおよびデオキシリボースを含むが、２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）、ハロゲン化糖および他の改変糖部分を用いることもできる。通常、プライマー骨格の連結基はリン含有部分、最も一般的にはホスホジエステル結合であるが、他の結合、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン非含有結合、例えば「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）で見られるペプチド様結合も、本明細書で開示されるアッセイでの使用が意図される。
【００６３】
有用なプローブ標識系および検出可能な部分
特異的核酸ハイブリダイゼーションを監視するために用いることができる本質的にいかなる標識系および検出系も、本発明と組み合わせて用いることができる。一群の有用な標識には、放射性標識、酵素、ハプテン、連結オリゴヌクレオチド、化学発光分子、蛍光部分（単独でまたは「消光剤」部分との併用で）、および電子的検出方法に適合する酸化還元活性部分が含まれる。好ましい化学発光分子には、均一保護アッセイと一緒に用いられる、米国特許第５，２８３，１７４号でＡｒｎｏｌｄらが開示する種のアクリジニウムエステル、および単一反応で複数の標的を定量化するアッセイと一緒に用いられる、米国特許第５，６５６，２０７号でＷｏｏｄｈｅａｄらが開示する種のものが含まれる。これらの特許文書に含まれる開示は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい電子的標識および検出手法は、米国特許第５，５９１，５７８号および第５，７７０，３６９号ならびに国際特許出願公開第９８／５７１５８号に開示され、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明での標識として有用な酸化還元活性部分には、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、ＦｅおよびＲｕなどの遷移金属が含まれる。
【００６４】
本発明に従うプローブのための特に好ましい検出可能な標識は、均一アッセイ系で検出可能である（すなわち、混合物において、未結合の標識プローブと比較して、結合した標識プローブが安定性または差別的分解などの検出可能な変化を示す）。蛍光標識および電子的に検出可能な標識などの他の均一に検出可能な標識を本発明の実施で使用することが意図されるが、均一アッセイに用いられる好ましい標識は化学発光化合物である（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号でＷｏｏｄｈｅａｄらが；米国特許第５，６５８，７３７号でＮｅｌｓｏｎらが；または米国特許第５，６３９，６０４号でＡｒｎｏｌｄらが記載のように）。特に好ましい化学発光標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準のＡＥまたはその誘導体、例えば、ナフチル−ＡＥ、オルソ−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルソ−ジブロモ−ＡＥ、オルソ−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルソ−メトキシ−ＡＥ、オルソ−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルソ−メチル−ＡＥ、オルソ−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルソ−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥおよび２−メチル−ＡＥが含まれる。
【００６５】
一部の適用では、検出前のハイブリダイズしていないプローブの除去を最初に必要とせずに試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を促進するために、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブが望ましい。例として、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、連結領域によって連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件の下でお互いとハイブリダイズする自己相補性の異なる領域（「標的結合ドメイン」および「標的クロージングドメイン」と命名）を含むように設計されている。変性条件に曝露されると、分子トーチの２つの相補的領域（完全または部分的に相補的でもよい）は溶解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復するときに、標的結合ドメインを標的配列とのハイブリダイゼーションのために利用可能な状態にする。分子トーチは、標的結合ドメインが標的クロージングドメインよりも標的配列とのハイブリダイゼーションを有利にするように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的クロージングドメインは、分子トーチが標的核酸とハイブリダイズする場合と反対に分子トーチが自己ハイブリダイズする場合に異なるシグナルが生成され、それによって、それに関連する生存可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように置かれる相互作用標識（例えば、蛍光／消光剤）を含む。分子トーチは、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３６１，９４５号に完全に記載されている。
【００６６】
本発明と一緒に用いることができる自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般に「分子ビーコン」と呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補的配列を有する核酸分子、標的核酸配列不在下で閉じた立体構造のプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じた立体構造のときに相互作用する標識対を含む。標的核酸および標的相補的配列のハイブリダイゼーションは親和性対のメンバーを分離し、それによってプローブを開いた立体構造へ移行させる。開いた立体構造への移行は、例えば蛍光団および消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であってもよい標識対の相互作用の減少のために検出可能である。分子ビーコンは、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２５，５１７号に完全に記載される。ＣＨＩＫＶ特異的核酸配列の検出に有用な分子ビーコンは、本明細書で開示されるプローブ配列の１つのいずれかの末端に、蛍光団を含む第一の核酸アームおよび消光剤部分を含む第二の核酸アームを追加することによって作製することができる。この配置では、本明細書で開示されるＣＨＩＫＶ特異的プローブ配列は、生じた分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分の役目を果たす。
【００６７】
分子ビーコンは、好ましくは検出可能な相互作用的標識対で標識される。相互作用的標識対のメンバーとして好ましい検出可能な標識の例は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー転移機構によって相互作用する。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、熱エネルギーへの変換がなく、供与体および受容体が動態学的衝突に陥らない、原子間距離よりかなり大きな距離にわたる、発色団間の共鳴相互作用による、吸収部位から分子または分子系内でのその利用の部位へのエネルギー量子の無放射性伝達を含む。「供与体」は、最初にエネルギーを吸収する部分であり、「受容体」は、エネルギーがその後伝達される部分である。ＦＲＥＴに加えて、励起エネルギーを供与体から受容体分子へ移すことができる他の少なくとも３つの「非ＦＲＥＴ」エネルギー転移過程がある。
【００６８】
２つの標識が十分に近くに保持され、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴ機構によって、１つの標識が放射するエネルギーを第二の標識が受け取るか吸収することができる場合、２つの標識は互いに「エネルギー転移関係」にあると言われる。例えば、分子ビーコンがステム二重鎖の形成によって閉じられた状態で維持される場合がそうであり、プローブの１つのアームに結合している蛍光団からの蛍光発光は、反対側アームの上の消光剤部分によって失活する。
【００６９】
発明の分子ビーコンのための非常に好ましい標識部分は、蛍光団および蛍光消光特性（すなわち、「消光剤」）を有する第二の部分を含む。この実施形態では、特徴的なシグナルは特定の波長の蛍光のようであるが、あるいは可視光シグナルであるかもしれない。蛍光が含まれる場合、発光の変化は好ましくはＦＲＥＴによるものであるか、または放射エネルギー転移もしくは非ＦＲＥＴ様式によるものである。閉じられた状態の相互作用標識の対を有する分子ビーコンが、適当な周波数の光によって刺激される場合、蛍光シグナルは第一のレベルで生成され、それは非常に低くてもよい。この同じプローブが開いた状態にあり、適当な周波数の光によって刺激される場合、蛍光団および消光剤部分は互いに十分に分離され、それらの間のエネルギー転移は実質的に妨げられる。その状態の下で、消光剤部分は、蛍光団部分からの蛍光を失活させることができない。蛍光団が適当な波長の光エネルギーによって刺激される場合、第一のレベルより高い第二のレベルの蛍光シグナルが生成される。２つのレベルの蛍光の間の差は、検出および測定可能である。蛍光団および消光剤部分をこのように用いると、分子ビーコンは「開いた」立体構造でのみ「オン」であり、プローブは容易に検出可能なシグナルを発散させることによって標的に結合されることを示す。プローブの立体配置的状態は、標識部分の間の相互作用を調節することによってプローブから生成されるシグナルを変化させる。
【００７０】
ＦＲＥＴと非ＦＲＥＴ対とを区別することなく、本発明に関連して用いることができる供与体／受容体標識対の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロレセイン（ｆｌｕｏｒｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。当分野の技術者は、供与体および受容体色素が異なる場合、受容体の増感蛍光の出現によって、または供与体蛍光の消光によってエネルギー転移を検出することができることを理解する。供与体および受容体の種類が同じ場合、エネルギーは生じる蛍光偏光解消によって検出することができる。ＤＡＢＣＹＬなどの非蛍光受容体およびＱＳＹ７色素は、直接（すなわち、非増感）受容体励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的問題を有利に除去する。供与体−受容体対の１メンバーとして用いることができる好ましい蛍光団部分には、フルオレセイン、ＲＯＸおよびＣＹ色素（ＣＹ５など）が含まれる。供与体−受容体対の別のメンバーとして用いることができる非常に好ましい消光剤部分には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）から入手可能であるＤＡＢＣＹＬおよびＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分が含まれる。
【００７１】
合成技術および核酸に標識を結合して標識を検出する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）、第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号、およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０７４７７０６号を参照）。
【００７２】
プローブの化学組成
本発明に従うプローブは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体を含み、任意選択で、それに共有結合される検出可能な標識を含むことができる。プローブのヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、窒素性複素環塩基または塩基類似体を含み、そこにおいてヌクレオシドは、例えばリン酸ジエステル（ｐｈｏｓｐｏｈｄｉｅｓｔｅｒ）結合によって連結されてポリヌクレオチドを形成する。したがって、プローブは従来のリボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むことができるが、これらの分子の化学類似体を含むこともできる。プローブの「骨格」は、１つまたは複数の糖−リン酸ジエステル結合、ペプチド−核酸結合（Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ国際公開第９５／３２３０５号によって記載されるように「ペプチド核酸」と呼ばれることもある）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合またはそれらの組合せを含む、当技術分野で公知である様々な結合で作製することができる。プローブの糖部分はリボースもしくはデオキシリボース、または公知の置換、例えば２’−Ｏ−メチルリボースおよび２’ハライド置換（例えば、２’−Ｆ）を有する類似した化合物であってもよい。窒素性塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの公知の類似体（例えば、イノシンまたは「Ｉ」；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５〜３６頁、Ａｄａｍｓら編、第１１版、１９９２年を参照）、プリンまたはピリミジンの公知の類似体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシガウノシン、デアザ−もしくはアザ−プリンおよびデアザ−もしくはアザ−ピリミジン、５または６の位置に置換基を有するピリミジン塩基、２、６または８の位置に改変または交替された置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公開第９３／１３１２１号を参照）、ならびに、骨格が、ポリマーの１つまたは複数の残基のための窒素性塩基を含まない「無塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）であってもよい。プローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡでは見られる従来の糖、塩基および結合だけを含むことができるか、または従来の成分および置換（例えば、メトキシ骨格を通して連結される従来の塩基または従来の塩基および１つまたは複数の塩基類似体を含む核酸）の両方を含むことができる。
【００７３】
ＣＨＩＫＶ核酸の検出のために異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いることができるが、本発明で好ましいプローブは、最高１００個のヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは最高６０個のヌクレオチドの長さを有する。発明のオリゴヌクレオチドの好ましい長さ範囲は、１０〜１００個の塩基の長さ、より好ましくは１５〜５０個の塩基の長さ、さらにより好ましくは１５〜３０個の塩基の長さである。しかし、下で記載される特異的プローブ配列は、核酸クローニングベクターもしくは転写産物または他のより長い核酸で提供することもでき、しかも、ＣＨＩＫＶ核酸を検出するために用いることができる。
【００７４】
ＣＨＩＫＶ特異的増幅プライマーおよび検出プローブの選択
所望の特性を有する増幅プライマーおよびプローブを設計するための有用なガイドラインが、本明細書で記載される。ＣＨＩＫＶ核酸の増幅およびプロービングのための最適部位は、長さがそれぞれ約１５個を超える塩基、好ましくは約２００個以内の塩基の連続した配列である、２つ、好ましくは３つの保存されている領域を含む。１セットのプライマーまたはプロモーター−プライマーで観察される増幅の程度は、それらの相補的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力、および酵素的に伸長されるそれらの能力を含むいくつかの因子によって決まる。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性はいくつかの因子の影響を受けるので、それらの因子の操作は、その標的に完全に相補的であろうがなかろうが特定のオリゴヌクレオチドの正確な感受性および特異性を決定する。異なるアッセイ条件の影響は当分野の技術者に公知であり、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４０，４８８号でＨｏｇａｎらによって記載されている。
【００７５】
標的核酸配列の長さ、したがってプライマー配列またはプローブ配列の長さが重要のことがある。場合によっては、特定の標的領域から、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプライマーまたはプローブを与える、場所および長さが異なるいくつかの配列があることがある。完全には相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、通常、完全に相同な塩基配列の最長の一続きが主にハイブリッド安定性を決定する。
【００７６】
増幅プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的（すなわち、標的核酸に類似した配列を有する核酸）核酸ハイブリッドの安定性を最小にするように置かれるべきである。増幅プライマーおよび検出プローブが、標的と非標的配列とを区別することができることが好ましい。プライマーおよびプローブの設計において、これらのＴｍ値の差は可能な限り大きくすべきである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。
【００７７】
非特異的伸長（プライマー−二量体または非標的複製）の程度も、増幅効率に影響を及ぼすことがある。この理由から、プライマーは、特に配列の３’末端に低い自己または交差相補性を有するように選択される。偽のプライマー伸長を減少させるために、長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量は回避される。設計のこの側面に、市販のコンピュータソフトウェアを援用することができる。利用可能なコンピュータプログラムには、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ（商標）２．０（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｔｄ．）およびＯＬＩＧＯバージョン６．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ；Ｃａｓｃａｄｅ、ＣＯ）が含まれる。
【００７８】
当分野の技術者は、水素結合した二本鎖を形成するために、ハイブリダイゼーションが２本の単一鎖の相補的核酸の結合を含むことを理解する。２本の鎖の１つがハイブリッドに完全に、または部分的に含まれる場合、その鎖は、新しいハイブリッドの形成に関与する能力が低くなることは既定である。関心のある配列の実質的な部分が一本鎖であるようにプライマーおよびプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度を大きく増大させることができる。標的が組み込まれたゲノム配列である場合、それは当然二本鎖形で存在する（ポリメラーゼ連鎖反応の生成物と同様に）。これらの二本鎖の標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに当然阻害的で、ハイブリダイゼーション工程の前に変性を必要とする。
【００７９】
ポリヌクレオチドがその標的とハイブリダイズする速度は、標的結合性領域の標的二次構造の熱安定性の尺度である。ハイブリダイゼーション速度の標準測定値は、リットルあたりのヌクレオチドのモル数に秒数をかけたものとして測定される、Ｃ０ｔ１／２である。したがって、それは、プローブの濃度に、その濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が起こる時間をかけたものである。この値は、一定時間に様々な量のポリヌクレオチドを一定量の標的とハイブリダイズさせることによって決定される。Ｃ０ｔ１／２は、当分野の技術者が精通している標準手順によって、グラフを用いて得られる。
【００８０】
増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションプローブのための好ましいドメイン
表１に示すゲノム配列は、ＣＨＩＫＶ核酸を増幅および検出するための、本明細書で開示される様々な増幅および検出系の標的ドメインを表す。より具体的には、表１の記載事項は、ＣＨＩＫＶ核酸を増幅および検出することができる配列を表す。これは、例えば、第一のプライマーの標的相補的３’末端配列（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のための基質）が、表の配列の少なくとも１５個の連続した塩基に相補的な配列からなる、２つのプライマーの対向セットを用いて達成することができる。当然、当業者は、異なる長さの範囲も実行可能であることを理解する。例えば、好ましい長さ範囲には、表の配列の１５〜４８個の連続した塩基、より好ましくは１５〜４０個の連続した塩基、より好ましくは１７〜４０個の連続した塩基、より好ましくは２８〜４０個の連続した塩基、または１８〜３１個の塩基が含まれる。鋳型として表の配列の１つを用いる第一のプライマーの伸長生成物は、第二のプライマーの標的を定義する。したがって、第二のプライマーの標的相補的配列は、鋳型として表の配列を用いる場合、第一のプライマーの伸長生成物に相補的な配列からなることができる。第二のプライマーのための好ましい長さ範囲は、第一のプライマーで用いるものに一般に類似している。同じく、第二のプライマーは、その標的鎖と少なくとも１５個の連続した塩基の相補性を一般に有する。２７〜３４個の連続した塩基の範囲の第二のプライマー、および１７〜２４個の連続した塩基の相補性を用いて良好な結果が得られたので、それらも好ましい。同じく、すべてのプライマーの標的相補的３’末端配列（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のための基質）は、少なくとも１５個の連続した塩基の配列をそれらの標的配列に一致させることが一般に好ましい。標的配列は、本明細書で開示される配列によって、またはそれらの相補体（示すように）によって定義することができる。当然、いずれのプライマーも、その５’末端にＣＨＩＫＶ標的配列に相補的でない追加の塩基（例えば、ファージプロモーター配列）を含むことができる。特定の適用において、表の配列は、下に記載の方法によって合成されるアンプリコンの配列に対応する。好ましい実施形態では、２つの対立するプライマーのためのプライマー結合部位は、ＣＨＩＫＶ標的核酸またはその相補体に沿っていかなる位置も共有しない。換言すると、増幅がプライマーの伸長によって達成される（すなわち、リガーゼ媒介反応と区別される）実施形態では、ＣＨＩＫＶ標的核酸の配列に沿った塩基位置（またはその相補体）のいずれも、対向する両プライマーによって共通されない。
【００８１】
表１の記載事項はＤＮＡ配列として示されるが、増幅されるＣＨＩＫＶゲノム配列はＲＮＡ配列であることを理解すべきである。本明細書で記載される組成物および方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物（すなわち、お互いにＵおよびＴ塩基が置換されるポリヌクレオチド）を包含するものとする。
【００８２】
【表１−１】
0005646455.tif 000002
【００８３】
【表１−２】
0005646455.tif 000003
表２は、ＣＨＩＫＶ核酸を増幅および検出するための、本明細書で開示される様々な増幅および検出系の非常に好ましい標的ドメインを表す。表２の配列は、表１の標的ドメインの中に完全に含まれる。表２の記載事項は、ＣＨＩＫＶ核酸を増幅および検出することができる配列を表す。同じく、これは、例えば２つのプライマーの対向セットを用いて達成することができる。長さ範囲が本明細書で与えられるが、第一のプライマーの標的相補的配列が、表の配列の約１５〜４０個、より好ましくは１５〜３０個、より好ましくは１７〜３０個、または１８〜３１個の連続した塩基に相補的な配列からなる状況を包含する。非常に好ましい実施形態では、第一のプライマーの標的相補的配列は、表の配列の３’末端に完全に相補的である１８〜３１個の塩基からなる。第二のプライマーの標的相補的配列は、鋳型として表の配列を用いる場合、第一のプライマーの伸長生成物の約１８〜３１個の塩基に完全に相補的な配列からなることができる。この記載は、第一のプライマーの標的相補的配列の５’末端が、表の配列の３’末端塩基に対応することができる（すなわち、相補的である）ことを意味する。さらに、第二のプライマーの標的相補的配列の５’末端は、表に示す配列の５’末端塩基に対応することができる（すなわち、相同である）。当然、いずれのプライマーも、その５’末端にＣＨＩＫＶ標的配列に相補的でない追加の塩基（例えば、ファージプロモーター配列）を含むことができる。特定の適用において、表の配列は、下に記載の方法によって合成されるアンプリコンの配列に対応する。
【００８４】
表２の記載事項はＤＮＡ配列として示されるが、増幅されるＣＨＩＫＶゲノム配列、およびそれから合成される増幅生成物は、ＲＮＡ配列であってもよいことを理解すべきである。本明細書で記載される組成物および方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物（すなわち、お互いにＵおよびＴ塩基が置換されるポリヌクレオチド）を包含するものとする。
【００８５】
【表２】
0005646455.tif 000004
表３は、第一鎖の増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の標的相補的配列のための好ましいドメインの配列を示す。実際、ＣＨＩＫＶ核酸を増幅するために用いられる第一鎖の増幅オリゴヌクレオチドは、表３の配列内に完全に含まれる標的相補的配列を好ましくは有する。当然、第一鎖のプライマーは、その５’末端にＣＨＩＫＶ標的配列に相補的でない追加の塩基（例えば、ファージプロモーター配列）を含むことができる。好ましい第一鎖の増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、表３に示す配列に含まれる１８〜３１個の連続した塩基からなる標的相補的配列を有する。
【００８６】
【表３】
0005646455.tif 000005
表４は、第二鎖の増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の標的相補的配列のための好ましいドメインの配列を示す。ＣＨＩＫＶ核酸を増幅するために用いられる第二鎖の増幅オリゴヌクレオチドは、表４の配列内に完全に含まれる標的相補的配列を好ましくは有する。当然、第二鎖のプライマーは、その５’末端にＣＨＩＫＶ標的配列に相補的でない追加の塩基（例えば、ファージプロモーター配列）を含むことができる。さらに、単一の伸長可能なプライマーの使用に基づく特定の増幅手順の実施のために用いられる場合、増幅オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ重合酵素による伸長を阻止する化学部分をその３’末端に配置しているものでもよい。好ましい第二鎖の増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、表４に示す配列に含まれる１５〜３４個、より好ましくは１７〜３４個の連続した塩基からなる標的相補的配列を有する。
【００８７】
【表４】
0005646455.tif 000006
表５は、ハイブリダイゼーション検出プローブのための好ましいドメインの配列を示す。２つの相補鎖のいずれかを用いてＣＨＩＫＶ核酸増幅生成物を検出することが可能であるので、表の配列の相補体もハイブリダイゼーション検出プローブのための好ましいドメインである。非常に好ましいプローブは、表５の配列またはその相補体に完全に含まれる１１〜２４個の連続した塩基、より好ましくは１５〜２４個の連続した塩基、さらにより好ましくは１６〜２４個の連続した塩基の標的相補的配列を有する。１５個の連続した塩基より短い長さが一般に好まれる。
【００８８】
表５の記載事項はＤＮＡ配列として示されるが、増幅されるＣＨＩＫＶゲノム配列はＲＮＡ配列であり、プローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物（すなわち、お互いにＵおよびＴ塩基が置換されるポリヌクレオチド）を含むことができることを理解すべきである。
【００８９】
【表５】
0005646455.tif 000007
表６は、捕捉オリゴヌクレオチドの標的相補的配列のための好ましいドメインの配列を示す。好ましい標的捕捉オリゴヌクレオチドは、表６の配列に完全に含まれる２８〜５１個の連続した塩基からなる標的相補的配列を有する。非常に好ましい標的捕捉オリゴヌクレオチドは、ＳＩＤ識別番号１８８〜１９１の配列またはその相補体を有する。これらの配列はハイブリダイゼーションプローブとして、ならびにプライマーとして用いるのにも好ましい。これらのポリヌクレオチド配列のＲＮＡおよびＤＮＡ同等物バージョン、ならびに２’−ＯｍｅおよびＰＮＡ（タンパク質核酸）を組み込む類似体も本発明に包含される。
【００９０】
【表６】
0005646455.tif 000008
好ましい増幅プライマー
増幅反応を行うために有用なプライマーは、標的結合に関与せず、増幅または検出手順に実質的に影響を及ぼすことができない無関係な配列の存在を受け入れるために、異なる長さを有することができる。例えば、本発明に従って増幅反応を実施するために有用なプロモーター−プライマーは、ＣＨＩＫＶ標的核酸とハイブリダイズする最小限の配列、およびその最小限の配列の上流に置かれたプロモーター配列を少なくとも有する。しかし、標的結合性配列とプロモーター配列との間への配列の挿入は、増幅反応でその有用性を損なうことなく、プライマーの長さを変えることができるであろう。さらに、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチドの配列が所望の相補的配列をハイブリダイズさせるための最小限の必須要件に適合する限り、選択の問題である。
【００９１】
表７、８および９は、ＣＨＩＫＶ核酸の増幅のための好ましいプライマー配列の具体例を示す。表７および８は、核酸の１つの鎖の上のＣＨＩＫＶ配列に相補的なプライマー配列を示す。表７は好ましいＣＨＩＫＶ標的相補的プライマー配列を示し、表８は、本発明の開発中に用いたプロモーター−プライマーの完全配列を示す。特に、表７および８の増幅オリゴヌクレオチドならびに表９の増幅オリゴヌクレオチドは、ＣＨＩＫＶ核酸の反対側鎖に相補的である。上に示すように、すべてのプロモーター−プライマーは、ＣＨＩＫＶ標的配列に相補的な配列をそれらの３’末端に、およびＴ７プロモーター配列をそれらの５’末端に含んでいた。したがって、表８のオリゴヌクレオチドは、ＣＨＩＫＶ標的核酸に存在しない上流プロモーター配列をさらに含む、表７のオリゴヌクレオチドに対応する。すべてのプロモーター−プライマーは、標的相補的配列の上流に、Ｔ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号９０）を含んでいた。
【００９２】
本明細書で述べるように、ＣＨＩＫＶ核酸の増幅に有用な増幅オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含むこともできる。例えば、増幅オリゴヌクレオチドは、アデニン塩基の代わりにヒポキサンチン塩基類似体の置換を含むことができる。
【００９３】
【表７】
0005646455.tif 000009
表８のＴ７プロモーター配列の配列は、小文字によって示す。表８のプライマーの標的相補的部分は、大文字によって示す。好ましいプライマーには、表に示すＣＨＩＫＶ標的相補的配列が含まれる。
【００９４】
【表８】
0005646455.tif 000010
表９は、ＣＨＩＫＶ核酸配列の増幅のために用いたＣＨＩＫＶ標的相補的オリゴヌクレオチド配列を示す。表９に示す増幅オリゴヌクレオチドは、表７および８に記載の増幅オリゴヌクレオチドの伸長生成物とハイブリダイズすることができる標的相補的配列を含む。
【００９５】
【表９】
0005646455.tif 000011
ＣＨＩＫＶ配列の増幅のためのプライマーの好ましいセットには、ＣＨＩＫＶ標的配列（表８に記載のプライマーの１つなど）とハイブリダイズする第一のプライマー、および第一のプライマー（表９に記載のプライマー配列の１つなど）の伸長生成物の配列に相補的である第二のプライマーが含まれる。非常に好ましい実施形態では、第一のプライマーは、その５’末端にＴ７プロモーター配列を含むプロモーター−プライマーである。
【００９６】
好ましい検出プローブ
本発明の別の態様は、ＣＨＩＫＶ核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる、オリゴヌクレオチドに関する。ＣＨＩＫＶの核酸に存在する標的核酸配列を増幅する方法は、アンプリコンを検出するための任意選択のさらなる工程を含むことができる。この方法は、標的核酸配列またはその相補体と優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと試験試料とをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによって、検出のために安定しているプローブ：標的二重鎖を形成する工程を好ましくは含む。次に、試験試料中のＣＨＩＫＶ核酸の有無の指標として試験試料中にハイブリッドが存在するかどうかについて判定する工程がある。これは、プローブ：標的二重鎖を検出することを含むことができ、好ましくは均一アッセイ系を含むことができる。
【００９７】
ＣＨＩＫＶ核酸配列の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ＣＨＩＫＶ標的核酸配列に実質的に相補的である塩基配列を含む。したがって、本発明のプローブは、ＣＨＩＫＶ標的核酸配列の１つの鎖またはその相補体とハイブリダイズする。これらのプローブは、ＣＨＩＫＶ核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい、標的核酸領域の外部の追加の塩基を任意選択で有することができる。
【００９８】
好ましいプローブは、塩濃度が０．６〜０．９Ｍの範囲である場合に約４２℃、より好ましくは約６０℃に対応するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズするために、標的核酸に十分に相同である。好ましい塩には塩化リチウムが含まれるが、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの他の塩もハイブリダイゼーション溶液で用いることができる。例示的な高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４２℃、より好ましくは約６０℃、ならびに０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ならびにそれぞれ１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによって、または、０．６Ｍ  ＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウムならびにそれぞれ１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによって代わりに提供される。
【００９９】
本発明に従うプローブは、ＣＨＩＫＶゲノムの異なるドメインに相補的であるか対応する配列を有する。ＣＨＩＫＶ核酸配列の検出に好ましい特定のプローブは、１０〜１００個のヌクレオチドの長さ範囲の、検出される核酸に相補的でない任意の塩基配列と一緒に標的相補的塩基配列を含むプローブ配列を有する。ＣＨＩＫＶ核酸配列の検出に好ましい特定の特異的プローブは、１５〜３０個、１６〜２４個、１８〜２２個、または１８〜２０個のヌクレオチドの長さ範囲の標的相補的配列を有する。当然、これらの標的相補的配列は線状配列であることができるか、または検出されるＣＨＩＫＶ標的配列に非相補的である１つまたは複数の任意選択の核酸配列を有する分子ビーコンまたは他の構築物の構造に含まれてもよい。上で示すように、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組合せ、核酸類似体から作製することができるか、１つまたは複数の改変ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含むことができる。
【０１００】
簡潔には、本発明に関連して関心のある標的核酸を検出するのに好ましいプローブは、いくつかの既定のプローブドメインまたはその相補体の１つまたは複数に含まれる配列を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物、ヌクレオチド類似体、最高１０％のミスマッチ塩基、およびさらに最高２０％のミスマッチ塩基の存在を可能にする。
【０１０１】
本発明に従う特定の好ましいプローブは、検出可能な標識を含む。一実施形態では、この標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合されるアクリジニウムエステルである。例えば、検出プローブは、米国特許第５，５８５，４８１号、および米国特許第５，６３９，６０４号に実質的に記載のように、特にカラム１０第６行からカラム１１第３行にかけて、および実施例８に記載されるように、リンカーを通して結合される化学発光アクリジニウムエステル化合物で標識することができる。これらの特許文書に含まれる開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
表１０は、ＣＨＩＫＶアンプリコンの検出のために用いたハイブリダイゼーションプローブのいくつかの塩基配列を示す。ＣＨＩＫＶ核酸配列を検出するための代替プローブはＣＨＩＫＶの反対側のセンス鎖とハイブリダイズすることができるので、本発明は、表に示す配列に相補的であるオリゴヌクレオチドも含む。さらに、ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物塩基（すなわち、ＵおよびＴ塩基がお互いに置換される）を含むオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いて、本発明を実施することができることを理解すべきである。
【０１０３】
【表１０】
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上に示すように、発明のハイブリダイゼーションプローブの核酸塩基配列のための足場として、任意数の異なる骨格構造を用いることができる。特定の非常に好ましい実施形態では、ＣＨＩＫＶアンプリコンの検出のために用いられるプローブ配列は、メトキシ骨格、または少なくとも１つのメトキシ結合を核酸骨格に含む。
【０１０４】
捕捉オリゴヌクレオチドの選択および使用
好ましい捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上での固定化のための標的の役目を果たす第二の配列（すなわち、「テール」配列）に共有結合されるＣＨＩＫＶ配列（すなわち、「ＣＨＩＫＶ標的配列」）に相補的である第一の配列を含む。捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列を連結する任意の骨格を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメトキシ結合を骨格に含む。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端にあるテール配列は、相補的塩基配列とハイブリダイズして、生体試料中の他の成分に優先してハイブリダイズされた標的ＣＨＩＫＶ核酸を捕捉するための手段を提供するために用いられる。
【０１０５】
相補的塩基配列とハイブリダイズする任意の塩基配列をテール配列で用いることができるが、ハイブリダイズする配列が約５〜５０個のヌクレオチド残基の長さにわたることが好ましい。特に好ましいテール配列は実質的にホモポリマーであり、約１０〜約４０個のヌクレオチド残基、より好ましくは約１４〜約３０個の残基を含む。本発明による捕捉オリゴヌクレオチドは、ＣＨＩＫＶ標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する第一の配列、および固体支持体に固定されるオリゴ（ｄＴ）索に特異的に結合する第二の配列を含むことができる。
【０１０６】
図１に例示する成分を用いて、生体試料中のＣＨＩＫＶ配列を検出するための１つのアッセイは、捕捉オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を捕捉する工程、少なくとも２つのプライマーを用いて捕捉された標的領域を増幅する工程、および増幅核酸に含まれる配列に最初に標識プローブをハイブリダイズさせ、結合した標識プローブから生じるシグナルを次に検出することによって増幅核酸を検出する工程を含む。
【０１０７】
捕捉工程は、好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドを用い、そこにおいて、ハイブリダイズする条件下で、捕捉オリゴヌクレオチドの１つの部分が標的核酸中の配列と特異的にハイブリダイズし、テール部分は、試料の他の成分から標的領域を分離させる、リガンド（例えば、ビオチン−アビジン結合対）などの結合対の１つの構成成分の役目を果たす。好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分は、固体支持体粒子に固定される相補的配列とハイブリダイズする配列である。好ましくは、液相ハイブリダイゼーション動態を利用するために、最初、捕捉オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は液状である。ハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分と相補的固定化配列とのハイブリダイゼーションを通して固定化プローブに結合することができる、捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体を生成する。したがって、標的核酸、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固定化プローブを含む複合体は、ハイブリダイゼーション条件下で形成される。好ましくは、固定化プローブは反復配列であり、より好ましくは、テール配列に相補的であり固体支持体に結合するホモポリマー配列（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＣまたはポリＧ）である。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分がポリＡ配列を含む場合、固定化プローブはポリＴ配列を含むことになるが、相補的配列の任意の組合せを用いることができる。捕捉オリゴヌクレオチドは、標的とハイブリダイズする塩基配列と固定化プローブとハイブリダイズするテールの塩基配列との間に位置する１つまたは複数の塩基である、「スペーサー」残基を含むこともできる。標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド複合体に結合するために、任意の固体支持体を用いることができる。有用な支持体は、溶液中で遊離のマトリックスまたは粒子（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよび、好ましくは、磁気誘引粒子）であることができる。固体支持体に固定化プローブを結合する方法は、周知である。支持体は、好ましくは、標準の方法（例えば、遠心分離、磁性粒子の磁気誘引など）を用いて溶液から回収することができる粒子である。好ましい支持体は、常磁性の単分散粒子（すなわち、均一サイズ±約５％）である。
【０１０８】
標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を回収することは、標的核酸を（生体試料中のその濃度と比較して）効果的に濃縮し、生体試料に存在することがある増幅阻害剤から標的核酸を精製する。捕捉された標的核酸を１回または複数回洗浄し、例えば、結合した標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体と一緒に粒子を洗浄液に再懸濁し、上に述べたように洗浄液から結合した複合体と一緒に粒子を次に回収することによって、標的をさらに精製することができる。好ましい実施形態では、捕捉工程は、捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸と逐次的にハイブリダイズさせ、次に、固定化相補的配列との捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分のハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件を調節することによって起こる（例えば、ＰＣＴ国際公開第９８／５０５８３号に記載のように）。捕捉工程および任意選択の洗浄工程が完了した後、標的核酸を次に増幅することができる。取扱い工程数を制限するために、任意選択で、標的核酸は、捕捉オリゴヌクレオチドから遊離させることなく増幅させることができる。
【０１０９】
有用な捕捉オリゴヌクレオチドは、増幅する配列を含むＣＨＩＫＶ核酸とそのミスマッチ配列がハイブリダイズする限り、上に示す配列とのミスマッチを含むことができる。本明細書で記載される各捕捉オリゴヌクレオチドは、その３’末端でポリ−（ｄＡ）テールに連結される表１１に示すＣＨＩＫＶ相補的配列の１つを含んでいた。捕捉オリゴヌクレオチドのすべては、ＣＨＩＫＶ相補的配列とポリ−（ｄＡ）テールとの間に挿入される３つの任意選択のチミジンヌクレオチドを含んでもいた。ポリ−（ｄＡ）テールおよび３つのチミジンヌクレオチドは小文字で示し、ＣＨＩＫＶ相補的配列は大文字で示す。これらのチミジンヌクレオチドの存在は、捕捉方法の成功に必須であるとは考えられていない。３つのチミジンヌクレオチドおよびポリ−（ｄＡ）テールはＤＮＡ前駆体を用いて合成し、オリゴヌクレオチドのＣＨＩＫＶ相補的部分は２’−ＯＭｅヌクレオチド類似体を用いて合成した。
【０１１０】
【表１１】
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ＣＨＩＫＶポリヌクレオチド配列を増幅および検出するための好ましい方法
本発明の好ましい方法は、下に示す実施例によって記載および例示する。図１は、ＣＨＩＫＶゲノム（水平の太い実線によって示す）の標的領域を検出するために用いることができる１つの系を模式的に図示する。この系は、４つのオリゴヌクレオチド（より短い実線によって示す）を含む：標的領域中のＣＨＩＫＶ配列と特異的にハイブリダイズする配列、および生体試料に存在する標的領域を捕捉する、固体支持体上に固定される相補的配列とハイブリダイズするテール（「Ｔ」）を含む１つの捕捉オリゴヌクレオチド；標的領域中のＣＨＩＫＶ配列と特異的にハイブリダイズする配列、および、二本鎖の場合Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための機能的プロモーターの役目を果たすＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）を含む１つのＴ７プロモーター−プライマー；Ｔ７プロモーター−プライマーを用いて標的領域配列から作製される第一鎖のｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする配列を含む１つの非Ｔ７プライマー；ならびに、２つのプライマーを用いて増幅される標的領域の部分と特異的にハイブリダイズする配列を含む１つの標識プローブ。
【０１１１】
上に示すように、２つのプライマーを用いて捕捉標的領域を増幅することは、当分野の技術者によく知られているであろう様々な公知の核酸増幅反応のいずれかによって達成することができる。好ましい実施形態では、転写関連の増幅反応、例えばＴＭＡが使用される。そのような実施形態では、多くの核酸鎖が標的核酸の単一コピーから生成され、このように、増幅配列に結合するプローブを検出することによる標的の検出を可能にする。好ましくは、転写関連増幅は、２種類のプライマー（１つは、図１で「Ｐ」と表示されるＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むのでプロモーター−プライマーと呼ばれる）、２つの酵素（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、ならびに基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を溶液中の適当な塩および緩衝剤と用いて、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写産物を生成する。
【０１１２】
図１については、転写媒介増幅の間、捕捉された標的核酸は、Ｔ７プロモーター−プライマーとして示す第一のプライマーとハイブリダイズさせられる。逆転写酵素を用いて、相補的ＤＮＡ鎖は、標的ＤＮＡを鋳型として用いてＴ７プロモーター−プライマーから合成される。非Ｔ７プライマーとして示す第二のプライマーは、新しく合成されたＤＮＡ鎖とハイブリダイズし、逆転写酵素の作用で伸長してＤＮＡ二重鎖を形成し、それによって二本鎖のＴ７プロモーター領域を形成する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、この機能的Ｔ７プロモーターを用いることによって複数のＲＮＡ転写産物を次に生成する。ＴＭＡの自己触媒的機構は、追加の転写産物を生成する鋳型としてＲＮＡ転写産物を用い、それによって標的領域特異的核酸配列を増幅するｃＤＮＡ合成工程に続いて、反復ハイブリダイゼーションおよび重合工程を使用する。
【０１１３】
検出工程は、それが上記の増幅されたＲＮＡ転写産物またはアンプリコンに特異的に結合する少なくとも１つの検出プローブを用いる。好ましくは、検出プローブは、均一検出系を用いて検出することができる標識で標識される。例えば、標識プローブは、上に述べたように化学発光シグナルを生成することができ、それを検出することができるアクリジニウムエステル化合物で標識することができる。あるいは、標識プローブは、蛍光団または蛍光団および消光剤部分を含むことができる。分子ビーコンは、均一検出系で用いることができるそのような標識プローブの一実施形態である。
【０１１４】
ＣＨＩＫＶ核酸を検出するためのキット
本発明は、ウイルス核酸鋳型を用いてポリヌクレオチド増幅反応を実施するためのキットも包含する。特定の好ましいキットは、塩基の標的相補的配列、および任意選択で、検出される標的を増幅するためのプライマーまたは他の補助的オリゴヌクレオチドを含む、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む。他の好ましいキットは、インビトロの増幅反応で標的核酸を増幅するために用いることができる、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。例示的なキットは、増幅されるＣＨＩＫＶ核酸配列の反対鎖に相補的である第一および第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む。キットは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含むことができる。本発明に従うさらに他のキットは、増幅の前に他の種からＣＨＩＫＶ鋳型核酸を分離精製するための、捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。
【０１１５】
本発明の一般原理は、以下のそれには限定されない実施例を参照してより完全に理解することができる。
【０１１６】
ＣＨＩＫＶ核酸を増幅および検出するための好ましいプライマーおよびプローブの組合せは、核酸鋳型の原料としてウイルス溶解物を使用した一連の方法で特定された。溶解物は、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒ−Ｂｏｒｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅから得られ、２００６年にインド旅行から米国に帰国した旅行者から単離された株である。溶解物が調製されたウイルス株の力価は、１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌであると推定された。０〜１０ＰＦＵ／ｍｌの範囲の希釈溶液系を調製して、この方法で用いた。ウイルスＲＮＡのコピー数は、当初、約２００コピー数／ＰＦＵであると推定された。下記方法を用いて、プロモーター−プライマーおよび反対鎖プライマーを組み合わせてスクリーニングした。転写媒介増幅（ＴＭＡ）プロトコルを用いてこれらの方法を特に実施したが、当分野の技術者によく知られているであろう代替のインビトロの核酸増幅方法によってアンプリコンを生成するために、本明細書で開示されるプライマーを用いることができる。
【０１１７】
実施例１は、ＣＨＩＫＶ核酸の増幅および検出に有用なプライマーおよびプローブを同定した方法を記載する。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
ＣＨＩＫＶ核酸の増幅
高力価ウイルス溶解物は、反対セットのプライマーを用いた増幅反応で、ＣＨＩＫＶ鋳型配列の原料の役目を果たした。ウイルス陰性緩衝液を用いて、０〜１０ＰＦＵ／ｍｌに等しい核酸に対応する希釈溶液系を調製した。上に示した配列を有するＣＨＩＫＶ標的捕捉オリゴヌクレオチドを用いて鋳型を捕捉したことを除き、国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／１８６８５号に開示されている手順に基本的に従う増幅の前に、核酸を試料処理および標的捕捉にかけた。特に、捕捉オリゴヌクレオチドは、アッセイの増幅または検出工程に関与しない。磁気ビーズ上のオリゴヌクレオチドを捕捉するために、核酸放出およびハイブリダイゼーションを促進するために、０．５ｍｌの量のウイルス含有試料を標的−捕捉試薬と合わせた。ＴＭＡ反応は、米国特許第５，３９９，４９１号にＫａｃｉａｎらによって記載されるように基本的に実施し、この米国特許の開示は参照により上で本明細書に組み込まれている。１００μｌの反応緩衝液中の約１０ピコモルの各プライマーを用いて、様々なプライマー組合せについて増幅反応を実施した。単離した標的核酸を標準の核酸増幅緩衝液中でプライマーと合わせ、６０℃に１０分間加熱し、次に４２℃に冷却してプライマーアニーリングを促進した。次に、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（５，６００単位／反応）およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（３，５００単位／反応）を混合液に加えた。当分野の技術者がよく知るように、ＫＣｌ、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸、リボヌクレオシド５’−三リン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むトリス緩衝液（ｐＨ８．２〜８．５）で増幅反応を実施した。
【０１１９】
４２℃で１時間のインキュベーションの後、１００μｌの増幅反応全体を、２’−Ｏｍｅヌクレオチド類似体を用いて調製したプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイにかけた。すべてのプローブを約２×１０８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性にアクリジニウムエステルで標識し、次に、各プローブについて約５×１０６ＲＬＵに相当する量をハイブリダイゼーション反応で用いた。米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号に記載される方法に従って、内部の非ヌクレオチドリンカーによってオリゴヌクレオチド構造に連結されたＡＥ部分でプローブを各々標識したが、これらの特許の開示は参照により組み込まれている。ハイブリダイゼーション反応に続いて、０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）の一定分量、および１％トリトンＸ−１００（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を加えた。これらの混合液を６０℃で１０分間先ずインキュベートして、ハイブリダイズしていないプローブに連結された化学発光標識を不活性化し、４℃に短時間冷却した後にハイブリダイゼーションシグナルを読み取った。各試料のハイブリダイズしたプローブによる化学発光は、１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎ水酸化ナトリウム含有溶液の注入の構成にしたＬＵＭＩＳＴＡＲ  ＧＡＬＡＸＹ発光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．；Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて分析した。化学発光反応の結果は、相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。この方法では、シグナル／ノイズ値は、特異的にハイブリダイズしたプローブに結合している標識によって生成された化学発光シグナル（ＲＬＵで測定）を、標的核酸の不在下で測定したバックグラウンドシグナルで割ったものに対応した。試験は、トリプリケートで行った。正の結果と判断されるためには、プローブハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルがアッセイで５０，０００ＲＬＵを超えなければならなかったか、またはＳＮ比（バックグラウンドノイズは陰性増幅対照反応で測定）が少なくとも１０でなければならなかった。表１２〜２６は、陽性結果だけを用いて計算した平均ＳＮ値を示す。
【０１２０】
これらの方法からの代表的な結果を、表１２〜２６に要約する。
【０１２１】
【表１２】
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【０１２２】
【表１３】
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【０１２３】
【表１４】
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【０１２４】
【表１５】
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特に、系４で用いたハイブリダイゼーションプローブは、表５に示す標的相補的配列、および検出する標的配列に相補的でなかった３’末端Ｇ残基を含んでいた。無関係な塩基の存在は、ＣＨＩＫＶ核酸の検出に実質的な影響を及ぼさないと考えられた。
【０１２５】
【表１６】
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【０１２６】
【表１７】
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【０１２７】
【表１８】
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【０１２８】
【表１９】
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【０１２９】
【表２０】
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【０１３０】
【表２１】
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【０１３１】
【表２２】
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【０１３２】
【表２３】
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【０１３３】
【表２４】
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【０１３４】
【表２５】
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【０１３５】
【表２６】
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上の表の結果に基づき、特定の増幅および検出系（すなわち、対向するプライマーおよびプローブ（複数可）を含む）が他より良好な結果を与えた。特に好ましい増幅および検出系には、系１、系２、系４、系５、系６、系１２、系１４および系１５が含まれた。
ＣＨＩＫＶ核酸の増幅および検出のための好ましいドメイン内の代替アッセイ設計
前の実施例は、異なるレベルの感受性のＣＨＩＫＶ核酸を増幅および検出するために用いることができる多数の異なる系を証明した。以下の実施例は、例示目的のために系１４によって増幅した標的領域を用いた個々のアッセイの設計の柔軟性を例示する。
【０１３６】
一般に、特定の好ましい増幅アッセイは、鋳型として表１か表２に示すＣＨＩＫＶ配列の１つを有するインビトロ合成転写産物を用いるオリゴヌクレオチドの１つの伸長生成物が、他のプライマーとハイブリダイズすることができるように配置された、増幅オリゴヌクレオチドの対のセットを使用する。したがって、２つの増幅オリゴヌクレオチドは、増幅するＣＨＩＫＶ標的核酸の反対鎖に相補的であった。増幅反応生成物は、表１または表２に示す配列の長さまでで、表２に示す配列またはその相補体の１つからなるかそれに含まれる核酸標的配列とハイブリダイズすることができる配列を有する核酸鎖を含む。好ましいハイブリダイゼーション条件には、本明細書に記載のものが含まれる。特定のアンプリコンがこのハイブリダイゼーションが可能かどうかは、当分野の技術者は容易に証明することができる。
【０１３７】
上に示すように、本明細書に示す異なるオリゴヌクレオチド配列は、複数の目的を果たすことができる。例えば、表１０に示すプローブ配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）はプライマーの役目を果たすことができ、また、例えば表８に示すプライマー、またはこれらの配列に含まれる標的相補的配列を有するプライマー（例えば、表７に示す配列）と組み合わせて用いることができる。例示すると、配列番号１６４の系１４プローブの配列（置換またはＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基を可能にする）は、表１に示す好ましい系１４ドメインの鋳型配列中に含まれるＣＨＩＫＶ核酸配列を増幅するための、配列番号１２８に含まれる標的相補的配列（例えば、配列番号１０８）を有する第二のオリゴヌクレオチドと一緒に、増幅オリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号１７４）として用いることができる。同様に、表１０に示すプローブ配列の相補体（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）はプライマーの役目を果たすことができ、また、例えば表９に示す対応する増幅系のプライマーと組み合わせて用いることができる。同様に、プライマー用として本明細書で開示される標的相補的配列は、ハイブリダイゼーションプローブの役目を果たすことができる。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、オリゴヌクレオチド配列は増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーとして本明細書で開示される配列よりも短くてもよいことが特に想定される。例えば、配列番号１２８の系１４増幅オリゴヌクレオチドに含まれるが、少なくとも１７個の塩基の長さのＣＨＩＫＶ標的相補的配列は、ＣＨＩＫＶ核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブの役目を果たすことができよう。
【０１３８】
ＣＨＩＫＶ核酸配列を増幅および／または検出するために用いたさらなるオリゴヌクレオチドを、表２７〜２９に示す。
【０１３９】
【表２７】
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【０１４０】
【表２８】
0005646455.tif 000030
あらゆる場合、配列番号１４からなるＣＨＩＫＶ鋳型配列と接触する場合、表２８のプライマーは、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させて伸長生成物を形成することができる。その伸長生成物は、表２７に記載のプライマー配列だけでなく、表２９に記載のプライマーとして機能することができるプローブ配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基の置換も可能）にも相補的な配列を含む。前の表の配列に関し、配列番号１０９の標的結合性配列は、配列番号９０のＴ７プロモーター配列の下流に置かれ、結果として配列番号１２９のＴ７プロモーター−プライマー配列がもたらされた。配列番号１０８の標的結合性配列は、配列番号９０のＴ７プロモーター配列の下流に置かれ、結果として配列番号１２８のＴ７プロモーター−プライマー配列がもたらされた。プロモーター配列中の偶然の塩基は、プロモーター−プライマーが配列番号１７７の標的相補的配列を含んでいたことを意味した。配列番号１７８の標的結合性配列は、配列番号９０のＴ７プロモーター配列の下流に置かれ、結果として配列番号１８２のＴ７プロモーター−プライマー配列がもたらされた。プロモーター配列中の偶然の塩基（ａ  ｆｏｒｔｕｉｔｏｕｓ  ｂａｓｅ）は、プロモーター−プライマーが配列番号１７９の標的相補的配列を含んでいたことを意味した。単一の塩基ミスマッチを可能にすると、配列番号１８２の配列は、配列番号１８０の標的相補的配列を含んでいた（すなわち、配列番号１８０の位置２は、配列番号１４の標的配列の対応する位置に相補的でない）。２つの塩基ミスマッチを可能にすると、配列番号１８２の配列は、配列番号１８１の標的相補的配列を含んでいた（すなわち、配列番号１８１の位置２および４は、配列番号１４の標的配列の対応する位置に相補的でない）。本発明は、試験試料中のＣＨＩＫＶ核酸を増幅および／または検出するための、標的結合性配列、完全Ｔ７プロモーター−プライマー配列、またはＴ７プロモーター−プライマーに含まれるＣＨＩＫＶ相補的配列のいずれかの使用を包含する。
【０１４１】
【表２９】
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実施例２は、系１４（すなわち、表１を参照）のＣＨＩＫＶ核酸標的領域を増幅し、次に検出するために用いたオリゴヌクレオチドの多数の組合せを記載する。ファージプロモーターの下流の配列番号１４（位置５０、５６および１１６は、それぞれＴ、ＣおよびＣによって占められる）によって与えられるＤＮＡ配列を含んでいた線状化プラスミドベクターから合成したウイルス溶解物またはインビトロ転写産物を用いて方法を実施した。増幅反応で用いる前に、インビトロ転写産物を精製、定量化した。本実施例でのインビトロ転写産物の使用は、反応割合を測定することによってアッセイ感度を正確に定量化するための方法を有利に提供した。
【０１４２】
（実施例２）
アッセイ設計の柔軟性
以下の方法は、上に示す配列番号１４によって例示される標的領域に含まれるＣＨＩＫＶ核酸配列を増幅および検出するための代替戦略を証明した。すべての例で、陰性対照反応の平均ＲＬＵ読取値に加えて３つの標準偏差を用いてカットオフを確立することによって、反応割合を判定した。２の値の下の読取値は、陰性と評価した。表に示すデータは、このカットオフに基づく。表のシグナル値は、化学発光シグナル読取値を示す。
【０１４３】
表３０は、Ｔ７プロモーター−プライマーを組合せではなく別々に用いたこと以外は、基本的に実施例１の系１４について記載したように実施した方法で得られた結果を示す。同様に、方法で試験したウイルス溶解物の最も高い投入レベル（すなわち、０．０１ＰＦＵ／ｍｌ）は、表２５に示す方法の最も低い投入レベルに対応した。これらの結果は、個々のＴ７プロモーター−プライマーに関するアッセイ感度に対する洞察を提供した。より具体的には、配列番号１２８と同定されたプライマー（すなわち、配列番号１０８のＣＨＩＫＶ標的結合性配列を含む）が、この方法で試験した投入鋳型の非常に低いレベルでの効果的な増幅の役割を主に担ったことを結果は示した。
【０１４４】
【表３０】
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既知の量のインビトロ合成転写産物をウイルス溶解物の代わりに置換したこと以外は、基本的に実施例１に記載されるように以下の手順を実施した。ＲＮＡ鋳型は、配列番号１４（上に示す）によって与えられるＤＮＡ配列に対応する配列を含み、増幅生成物は、増幅反応を実施するために用いた条件、または本明細書で開示される他のハイブリダイゼーション条件の下で、この配列からなる核酸鎖とハイブリダイズすることができた。すべての方法は、ＣＨＩＫＶ鋳型核酸を指示濃度で含む０．５ｍｌの試料量を用いて実施した。したがって、例えば、５０コピー数／ｍｌのインビトロ転写産物から作製された試料の０．５ｍｌを用いて実施された反応は、２５コピー数の鋳型核酸を含むことになる。
【０１４５】
表３１は、表２５に示す系１４の増幅および検出オリゴヌクレオチドを用いたが、増幅可能な鋳型の原料としてウイルス溶解物の代わりにインビトロ合成ＣＨＩＫＶ転写産物を置換して得られた結果を示す。これらの結果は、代替増幅および検出フォーマットの感度パラメータを比較するためのベースラインを確立した。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、１１１コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の９コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１４６】
【表３１】
0005646455.tif 000033
表３２は、前の表に記載の２つのプロモーター−プライマーの１つだけを用いて実施した増幅および検出反応の結果を示す。示すように、これらの結果は、配列番号１２８によって同定されたプライマーが、ＣＨＩＫＶ鋳型核酸を３００コピー数／ｍｌ以下で用いて実施した増幅アッセイにおいて非常に活性であることを示した。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、７４コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の８コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１４７】
【表３２】
0005646455.tif 000034
表３３は、基本的に前の表で例示した方法であるが、増幅反応にさらなるＴ７プロモーター−プライマーを含む方法で得られた結果を示す。反応割合の傾向で観察された変動は、方法で用いた非常に低い鋳型レベルによると考えられた。この例での２つのＴ７プロモーター−プライマーの組合せは、実質的な利点を提供すると考えられなかった。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、３７８コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１０コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１４８】
【表３３】
0005646455.tif 000035
表３４は、前の表に記載の２つのプロモーター−プライマーの１つだけを用いて実施した増幅および検出反応の結果を示す。示すように、これらの結果は、配列番号１８２のＴ７プロモーター−プライマーが増幅反応で活性であったが、全体のシグナル／ノイズ比はより低く、アッセイ感度は本明細書で開示される他のアッセイよりもいくらか低かったことを示した。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、３３３４コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の３０２コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１４９】
【表３４】
0005646455.tif 000036
表３５は、単一のＴ７プロモーター−プライマーと一緒に２つの非Ｔ７プライマーを用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、５２コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の７コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５０】
【表３５】
0005646455.tif 000037
表３６は、単一のＴ７プロモーター−プライマーと一緒に２つの非Ｔ７プライマーを用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、９０コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１６コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５１】
【表３６】
0005646455.tif 000038
表３７は、単一のＴ７プロモーター−プライマーと一緒に２つの非Ｔ７プライマーを用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、１６０コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１１コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５２】
【表３７】
0005646455.tif 000039
表３８は、高感度の増幅および検出反応からの結果を示す。完全性のために、分析に含まれる試験数を示す欄を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、２６コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の４コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５３】
【表３８】
0005646455.tif 000040
表３９は、ハイブリダイゼーションプローブとして前に用いたオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）を非Ｔ７プライマーとして用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。方法での成功は、プローブおよびプライマー配列が代替機能を果たすことができることを確認した。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、８８コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１１コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５４】
【表３９】
0005646455.tif 000041
表４０は、ハイブリダイゼーションプローブとして前に用いたオリゴヌクレオチドと十分な配列同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を共有するオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）を非Ｔ７プライマーとして用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、２５４コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１９コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５５】
【表４０】
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表４１は、ハイブリダイゼーションプローブとして前に用いたオリゴヌクレオチドと十分な配列同一性を共有するオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）を非Ｔ７プライマーとして用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、４５コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１１コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５６】
【表４１】
0005646455.tif 000043
表４２は、ハイブリダイゼーションプローブとして前に用いた１つのオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）およびハイブリダイゼーションプローブとして前に用いたオリゴヌクレオチドと十分な配列同一性を共有する第二のオリゴヌクレオチドを非Ｔ７プライマーとして用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、１２５コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の２５コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５７】
【表４２】
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表４３は、ハイブリダイゼーションプローブとして前に用いた１つのオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）およびハイブリダイゼーションプローブとして前に用いたオリゴヌクレオチドと十分な配列同一性を共有する第二のオリゴヌクレオチドを非Ｔ７プライマーとして用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、８８コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の１１コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。
【０１５８】
【表４３】
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表４４は、ハイブリダイゼーションプローブとして前に用いたオリゴヌクレオチドと十分な配列同一性を共有する２つのオリゴヌクレオチド配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基も可能）を非Ｔ７プライマーとして用いて実施した増幅および検出反応からの結果を示す。結果の統計分析に基づいて、このアッセイは、４８コピー数／ｍｌでの確率９５％の検出、およびＣＨＩＫＶ核酸標的の８コピー数／ｍｌでの確率５０％の検出によって特徴づけられた。このアッセイは、非常に高かったシグナル／ノイズ値によって有利に特徴づけられた。
【０１５９】
【表４４】
0005646455.tif 000046
実施例３は、鋳型の原料としてウイルス溶解物を用いて実施した増幅反応で得られたデータの分析を記載する。
【０１６０】
（実施例３）
異なる増幅系の感度の定量化
配列番号１２８、配列番号１２９および配列番号１４８を増幅オリゴヌクレオチドとして用い、配列番号１６４をハイブリダイゼーション検出プローブ（すなわち、元の系１４アッセイからのオリゴヌクレオチド）として用いて実施したアッセイからの結果を用いて、ウイルス溶解物の核酸標的濃度を確立することができた。簡潔には、溶解物試料（すなわち、ＰＦＵ／ｍｌで測定）およびインビトロ転写産物（すなわち、コピー数／ｍｌで測定）の確率９５％の検出を相関させることによってこれは達成された。特に、この方法で用いたインビトロ転写産物は、用いたウイルス溶解物を原料鋳型として用いて合成された。したがって、溶解物中の標的の配列は、インビトロ転写産物の配列と一致した。この手法によって、１ＰＦＵがＣＨＩＫＶ核酸標的の約７，０００コピー数に対応すると推定することが可能であった。
【０１６１】
アッセイスクリーニングのための鋳型原料としてウイルスの溶解物を用いて得たオリジナルデータを処理し、実施例２で使用した陽性反応の同じ基準を用いて反応割合を判定したが、これらの方法の結果を表１２〜２６に示す。次に、ＳＡＳ（登録商標）システムソフトウェア（バージョン９．１．３）（Ｃａｒｙ、ＮＣ）のプロビット関数を用いる回帰分析を用いて、９５％および５０％の検出レベルを計算した。以下の表は、表１２〜２６に示す結果を与えた様々なアッセイ系についてのこの感度分析の結果を示す。特に、記載事項は、最も感度の高いアッセイの群から下に向けてランクづけされている。系のすべては高感度のアッセイを作製する目的で設計されたが、表４５および４６に示す結果は驚くべき範囲の感度を示した。これらの表は、確率９５％の検出（表４５）または確率５０％の検出（表４６）を達成するために必要とされる、ＰＦＵ／ｍｌで表したＣＨＩＫＶの濃度、および対応するコピー数／ｍｌを特定する。例えば、系１〜２、５〜６、１２および１４のすべては、確率９５％の検出を達成するために、有利なことに約０．０１ＰＦＵ／ｍｌ以下のＣＨＩＫＶ溶解物、または約７０コピー数／ｍｌ以下のＣＨＩＫＶ標的核酸を必要としたにすぎない。対照的に、系８は、同じ確率の検出を達成するために、約７，４００倍多くのＣＨＩＫＶ標的を必要とした。これは、増幅系のすべてが同等であったわけではないことを例示する。
【０１６２】
【表４５】
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【０１６３】
【表４６】
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本発明は、いくつかの具体的な実施例およびその実施形態に関して記載された。当然、上記の詳細な説明の精査により、本発明のいくつかの異なる実施形態が当分野の技術者に思いつくであろう。したがって、本発明の真の範囲は、添付の請求項への参照によって決定されるべきである。
【図１】
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【配列表】
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